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UNIVERSIDADE DE TAUBATÉ

Renato Zanotta Rebelo

Avaliação longitudinal dos efeitos clínicos,

microbiológicos e salivares de um anti-séptico bucal

contendo óleos essenciais utilizado no protocolo

terapêutico “desinfecção de boca-total em estágio único”

Taubaté – SP

2008

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UNIVERSIDADE DE TAUBATÉ

Renato Zanotta Rebelo

Avaliação longitudinal dos efeitos clínicos,

microbiológicos e salivares de um anti-séptico bucal

contendo óleos essenciais utilizado no protocolo

terapêutico “desinfecção de boca-total em estágio único”

Dissertação apresentada para obtenção do Título

de Mestre pelo Programa de Pós-graduação do

Departamento de Odontologia da Universidade de

Taubaté.

Área de Concentração: Periodontia.

Orientador: Prof

Sheila Cavalca Cortelli

Co-orientador: Prof. Dr. Fernando de Oliveira Costa

Taubaté – SP

2008

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RENATO ZANOTTA REBELO

Data: __________

Resultado: _______________

BANCA EXAMINADORA:

Prof. Dr.______________________ Universidade de Taubaté

Assinatura____________________

Prof. Dr.______________________ Universidade _________

Assinatura____________________

Prof. Dr.______________________ Universidade _________

Assinatura____________________

Dedico este trabalho a minha família que esteve

em todos os momentos ao meu lado...

... em especial para Juliana minha querida

noiva.

AGRADECIMENTOS

A Profa. Dra. Sheila Cavalca Cortelli pela dedicação com que me orientou durante

todas as fases do nosso trabalho.

Ao Prof. Dr. Fernando de Oliveira Costa pela co-orientação.

Aos colegas e professores que me ajudaram durante a fase clínica do nosso

trabalho.

- Prof. Dr. José Roberto Cortelli

- Profa. Dra. Marinella Holzhausen

- Alan Salinas Sonagere

- Aline Mantovane

- Juliana Silva Drumond da Costa

- Karina Machado

- Vanessa Barbosa de Medeiros

Aos colegas e professores que me ajudaram durante a fase laboratorial do nosso

trabalho.

- Prof. Dr. Celso da Silva Queiroz

- Prof. Dr. Gilson César Nobre Franco

- Jonas de Carvalho Filho

- Juliana Guimarães do Santos

Ao colega M. Davi Romeiro Aquino pela ajuda com a análise estatística dos dados.

A todas as pessoas que forneceram direta ou indiretamente ajuda para que esse

trabalho pudesse ser realizado.

A todos os pacientes que participaram do estudo.

Agradeço a Capes que me forneceu a bolsa de estudo, tornando assim possível a

realização desse trabalho.

Agradeço a empresa Johnson & Johnson Consumer & Personal Products Worldwide

a Division of Johnson & Johnson Consumer Companies Inc., Morris Plains, NJ

USA pela concessão do Independent investigator research Grant.

Rebelo RZ. Avaliação longitudinal dos efeitos clínicos, microbiológicos e salivares de

um anti-séptico bucal contendo óleos essenciais utilizado no protocolo terapêutico

“desinfecção de boca total em estágio único” [Dissertação de mestrado]. Taubaté:

Universidade de Taubaté, Departamento de Odontologia, 2008. 71p.

Resumo

Hipótese do estudo: Hipotetizou-se que a incorporação dos óleos essenciais no

protocolo “desinfecção de boca total em estágio único” acarretaria benefícios

adicionais comparativamente a solução placebo. Objetivos: Avaliar

longitudinalmente através de parâmetros clínicos, microbiológicos e salivares os

efeitos de um anti-séptico bucal contendo óleos essenciais como o agente químico

usado no protocolo “desinfecção de boca total em estágio único”. Metodologia:

Profundidade de sondagem, índice de placa e índice gengival modificado foram

mensurados pelo mesmo examinador calibrado, em todos os dentes presentes, de

cinquenta indivíduos com periodontite leve que procuraram atendimento no

Departamento de Odontologia da Unitau. A presença de Porphyromonas gingivalis,

Tannerella forsythia, Campylobacter rectus e Streptococcus sanguinis foi

determinada por PCR em amostras de saliva não estimulada, dorso da língua e de

biofilme subgengival. Fluxo de saliva estimulada e não estimulada, pH salivar,

dosagem de proteína total e de fosfatase alcalina foram mensurados nos três

tempos do experimento. Os indivíduos foram distribuídos aleatoriamente em um dos

seguintes grupos: “desinfecção de boca total em estágio único” associada aos óleos

essenciais (n = 25) ou “desinfecção de boca-total em estágio único” associada a

placebo (n = 25). Após a realização dos procedimentos mecânicos os participantes

realizaram bochechos duas vezes ao dia por sessenta dias consecutivos. Todos os

parâmetros foram monitorados inicialmente (T0), aos sessenta (T1) e aos 180 (T2)

dias. Resultados: Completaram o estudo 23 participantes no grupo placebo e 22 no

grupo teste. Inicialmente os grupos foram estatisticamente iguais em relação aos

parâmetros clínicos. A análise inter-grupos demonstrou maiores reduções de IPI e

IGM no grupo teste em relação ao placebo (ANOVA e teste t Student, p<0,05).

Apenas as análises intra-grupos revelaram diferenças estatisticamente significativas

para as prevalências bacterianas (Qui-quadrado, p <0.05). Em ambos os grupos, P.

gingivalis não reduziu em nenhum sítio em ambos os grupos. Aos 6 meses C. rectus

aumentou para ambos os grupos enquanto T. forsythensis reduziu para o grupo

teste nas amostras subgengivais. S. sanguinis aumentou entre T0 e T1, exceto

subgengivalmente no grupo controle. Apenas o grupo teste apresentou redução do

nível total de proteína na saliva enquanto a dosagem de fosfatase alcalina não foi

alterada por esse tipo de terapia periodontal (Kruskal-Wallis, p<0,05). Conclusões:

Os óleos essenciais no protocolo “desinfecção de boca-total em estágio único”

acarretaram benefícios clínicos adicionais, principalmente na redução de placa e

inflamação gengival sem alterar parâmetros salivares básicos. O protocolo

terapêutico possibilitou aumento da espécie bacteriana benéfica pesquisada.

Palavras-chave: Óleos essenciais; Estudos clínicos; Terapia; Bactérias; Saliva.

Rebelo RZ. Long-term clinical, microbiological and salivary effects of an essential-oils

containing mouthrinse used in the “one-stage full-mouth disinfection” therapeutic

protocol. [Dissertação de mestrado]. Taubaté: Universidade de Taubaté,

Departamento de Odontologia, 2008. 71p.

Abstract

Hypothesis: The hypothesis of this study was that introducing essential oils into the

“one-stage, full-mouth disinfection” protocol would result in additional benefits

compared to placebo. Objectives: To evaluate through clinical, microbiological and

salivary parameters, the long-term effects of an essential-oils containing mouth-rinse

as the active chemical agent applied in the of “one-stage full-mouth disinfection”

protocol. Methods: The same calibrated examiner measured probing depth, plaque

and modified gingival indices of all teeth in fifty subjects with mild periodontitis

consulting the Department of Dentistry of Unitau. The presence of Porphyromonas

gingivalis, Tannerella forsythia, Campylobacter rectus and Streptococcus sanguinis

was determined by PCR in non-stimulated saliva, tongue dorsum and subgingival

biofilm samples. In addition, stimulated and non-stimulated salivary flow, salivary pH

and total level of protein and alkaline phosphatases were ensured. The subjects were

randomly allocated into the two following groups: “one-stage full-mouth disinfection”

plus essential oils (n= 25) or “one-stage full-mouth disinfection” plus placebo (n= 25).

After finishing the mechanical procedures the subjects performed mouth rinsing twice

a day for sixty consecutive days. All parameters were monitored at baseline (T0),

sixty (T1) and 180 days (T2). Results: 23 subjects in the placebo group and 22 in

the test-group completed the study. At baseline, both groups were statistically alike

referring to clinical parameters. The inter-group analysis showed higher reductions of

PII and MGI in the test-group compared to the placebo group (ANOVA and Student-t

test, p <0.05). Only the intra-group analyses revealed statistically significant

differences for the bacterial prevalence (Chi-square, p<0,05). For both groups,

P.gingivalis did not reduce in any sampled site. At 6-months C.rectus increased for

both groups while T.forsythensis reduced subgingivally for test group. S.sanguinis

increased from baseline to 2-months, except subgingivally in placebo group. Only the

test group revealed a reduction of the total protein level in the saliva, while this type

of periodontal therapy did not alter the level of alkaline phosphatases (Kruskal-Wallis,

p<0,05). Conclusions: Essential oils provided additional clinical benefits especially

in reducing plaque and gingival inflammation without alter basic characteristics of

saliva when used in the OSFMD. The therapeutic protocol allowed increasing in the

prevalence of the tested beneficial bacterial species.

Key words: Essential; Oils; Clinical trials; Therapy; Bacteria; Saliva.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Óleos essenciais

2.2 Desinfecção de boca-total em estágio único

2.3 Parâmetros periodontais

3. PROPOSIÇÃO

4. METODO

4.1 Delineamento experimental

4.2 Considerações éticas

4.3 Cálculo amostral

4.4 População estudada

4.5 Análise clínica

4.6 Análise microbiológica

4.7 Análise salivar

4.8 Terapia periodontal

4.8.1 Aderência dos participantes

4.8.2 Tempos experimentais

4.8.3 Análise estatística

5. RESULTADOS

5.1 Resultados clínicos

5.2 Resultados microbiológicos

5.3 Resultados salivares

6. DISCUSSÃO

7. CONCLUSÕES

REFERÊNCIAS

ANEXOS

1 INTRODUÇÃO

A importância do controle do biofilme para a saúde bucal já é conhecida

desde os anos 60 quando Löe et al. (1965) verificaram que através do acúmulo do

biofilme inicia-se o processo de gengivite, o qual pode em alguns indivíduos

susceptíveis evoluir para periodontite. Assim, agentes químicos podem oferecer

benefícios adicionais aos procedimentos mecânicos uma vez que eles alteram ou

inibem o desenvolvimento do biofilme sem romper o equilíbrio biológico da cavidade

bucal (Baehni & Takeuchi, 2003).

Embora muitos componentes possam ser utilizados como anti-sépticos

bucais, como agentes anti-placa e anti-gengivite a clorexidina e os óleos essenciais

possuem o selo de aprovação da American Dental Association – ADA

(http://www.ada.org/ada/seal/category.asp).

A clorexidina é um agente antimicrobiano de alta substantividade e eficaz no

controle das infecções bucais, todavia, apresenta efeitos colaterais decorrentes do

uso contínuo. Alteração de paladar, pigmentação extrínseca de dentes e

restaurações, aumento da deposição de cálculo supragengival são alguns dos

inconvenientes que podem surgir após 15 ou mais dias de enxágüe bucal com

soluções de clorexidina 0,12% (Fishman, 1994).

Deste modo, inúmeras pesquisas têm sido conduzidas a fim de identificar

outros agentes químicos, inclusive produtos naturais, com adequada atividade

antimicrobiana, mas, com menos efeitos colaterais. Os óleos essenciais possuem

efeitos benéficos para o controle da gengivite por diminuírem a síntese de

prostaglandinas e a quimiotaxia para neutrófilos, reduzindo os sinais clínicos de

Introdução _______________________________________________________

inflamação (Mendes et al. 1995). Comercialmente, o Listerine® é composto por uma

combinação padronizada de óleos essenciais da qual decorre sua comprovada

atividade antimicrobiana. Ao contrário dos colutórios a base de clorexidina, essa

combinação de óleos essenciais pode ser utilizada em protocolos terapêuticos

curativos e preventivos.

Devido aos conhecimentos sobre os padrões de recolonização microbiana

bem como dos efeitos dos procedimentos periodontais sobre a microbiota supra e

subgengivais, foi proposto por Quirynen et al. (1995) o protocolo terapêutico -

periodontal designado “desinfecção de boca-total em estágio único” no qual os

procedimentos mecânicos são efetuados em intervalo de tempo reduzido em

associação ao agente químico clorexidina. Os resultados reportados na literatura

parecem demonstrar que os benefícios alcançados decorrem parcialmente da

concentração da terapia mecânica e parcialmente pelos agentes químicos. Devido à

carência de dados sobre os óleos essenciais nesse protocolo específico, Cortelli et

al. (2008) realizaram um estudo preliminar e obtiveram resultados clínicos

promissores em indivíduos com periodontite crônica moderada. Assim, o presente

estudo teve por objetivo verificar longitudinalmente os efeitos clínicos,

microbiológicos e salivares desse protocolo terapêutico modificado pela utilização

prolongada de uma anti-séptico bucal contendo óleos essenciais no tratamento da

periodontite crônica leve.

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Óleos essenciais

Para que um produto seja comercialmente aceito como quimioterápico no

controle do biofilme e da gengivite ele deve possuir algumas características

preconizadas pela American Dental Association (1997) recebendo esses um selo de

aprovação. Devido o biofilme ser o agente etiológico primário para a gengivite e

outras doenças bucais, os produtos quimioterápicos utilizados em periodontia devem

possuir eficácia na diminuição do biofilme, e também redução clinicamente

comprovada da gengivite. Assim, os quimioterápicos além de inibir ou modificar o

biofilme, reduzem ou previnem a gengivite. E por isso, a avaliação da eficácia do

produto incluía a mensuração através da redução da quantidade ou da

patogenicidade do biofilme.

Uma combinação específica de óleos essenciais (timol 0,064%; mentol

0,042%; eucaliptol 0,092% e salicilato de metila 0,06%) e a clorexidina são aceitos

pela ADA (http://www.ada.org/ada/seal/category.asp) como produtos quimioterápicos

para o controle da placa e gengivite. E, vinculado ao programa regulatório, a própria

Associação oferece algumas informações importantes

(http://www.ada.org/ada/seal/mouthrinses.asp), as quais se encontram abaixo

resumidas.

A população e os profissionais da área da saúde em geral utilizam soluções

para bochechar por alguma das seguintes razões: refrescar o hálito, prevenir ou

Revisão da Literatura________________________________________________

controlar o aparecimento de lesões cariosas, reduzir a placa ou biofilme, prevenir ou

reduzir a gengivite, diminuir a velocidade na qual o cálculo se forma sobre os dentes

ou ainda oferecer uma combinação desses mesmos efeitos. Tais produtos são

compostos por ingredientes básicos como água, álcool, agentes de limpeza,

flavorizantes e corantes em adição aos ingredientes ativos que podem ser

agrupados em quatro categorias básicas:

a) agentes antimicrobianos: atuam diretamente sobre as bactérias auxiliando na

redução da placa, diminuindo a gravidade da gengivite ou controlando a

halitose;

b) fluoretos: auxiliam na redução de lesões de cárie no esmalte e aumentam a

resistência desse tecido à cárie;

c) sais adstringentes: atuam como desodorizantes de ação temporária que

mascaram o mau hálito;

d) neutralizadores de odores: promovem a inativação química dos componentes

que causam o mau hálito.

Como pode ser observado, os ingredientes ativos é que conferem as

propriedades almejadas pelos usuários. Assim, de acordo com os ingredientes ativos

os enxaguatórios são divididos em cosméticos e terapêuticos. Os primeiros

controlam ou reduzem o mau hálito deixando a cavidade bucal com sabor agradável,

todavia, eles não são eficazes contra os agentes que causam a halitose. Tais

ingredientes não têm ação bactericida nem tampouco inativam quimicamente os

compostos que provocam o mau hálito. Finalmente os produtos cosméticos não

reduzem placa, gengivite ou cárie. Ao contrário essas reduções são oferecidas pelos

enxaguatórios terapêuticos. Nesta categoria, deve-se salientar que a destruição de

bactérias ou suas toxinas ocorre na placa dentária não removida mecanicamente e

Revisão da Literatura________________________________________________

por extensão alcança bactérias presentes em sítios não dentários. Assim, os

quimioterápicos com reconhecida ação anti-placa e anti-gengivite na verdade

reduzem as contagens e inibem a atividade bacteriana em magnitude suficiente para

interferir na doença gengivite.

Em uma revisão de literatura Moshrefi (2002) apontou a clorexidina como o

padrão-ouro dentre os anti-sépticos bucais, entretanto, o uso contínuo de solução a

0,12% por períodos iguais ou superiores a 15 dias, acarreta efeitos colaterais

indesejáveis como pigmentação extrínseca de dentes e restaurações, pigmentação

lingual, alterações de paladar, acúmulo de cálculo supragengival eventualmente e

dermatite alérgica de contato.

Solhein et al. (1980) avaliando a pigmentação extrínseca dos dentes em

pacientes que fizeram uso durante dez dias de clorexidina, constatou que esse efeito

adverso estava diretamente relacionado ao poder de retenção do produto nos

dentes. Outro estudo conduzido por McCoy et al. (2008) avaliou os efeitos adversos

durante o uso de solução contendo clorexidina. Esse estudo foi realizado em 140

pacientes diabéticos que apresentavam doença peridontal. Os pacientes foram

submetidos ao tratamento periodontal convencional e utilizaram a clorexidina

durante os procedimentos de raspagem e em casa. Dos 140 pacientes, quarenta e

quatro (31%) apresentaram desconforto pelo uso da clorexidina. Perda de paladar,

pigmentação dos dentes, irritação da língua foram relatados pelos pacientes. Outro

fator que restringe o uso da clorexidina em situações específicas é a necessidade de

se usar a clorexidina trinta minutos após as escovações pois os íons livres,

monofosfato de sódio e detergentes dos dentifrícios, diminuem sua adesão, podendo

assim comprometer sua efetividade (Fishman 1994).

Revisão da Literatura________________________________________________

Ross et al. (1989) avaliaram os estudos clínicos controlados de seis ou mais

meses de duração disponíveis na época sobre os óleos essenciais e reportaram

ações anti-placa e anti-gengivite comprovadas por quatro estudos. Adicionalmente,

dois estudos que incluíram análise microbiológica indicaram que o uso prolongado

de óleos essenciais não selecionou microrganismos resistentes nem possibilitou o

aparecimento de espécies oportunistas ou aumento de patógenos. Posteriormente,

Kato et al. (1990) testaram in vitro a ação dos óleos essenciais contra 54 amostras

bacterianas isoladas de saliva e biofilme dentário. Os óleos essenciais exibiram

potente ação bactericida sendo que a maioria das espécies foi destruída após trinta

segundos de exposição.

Os óleos essenciais possuem atividade antimicrobiana contra bactérias

plantônicas e o mais importante, sobre bactérias presentes no biofilme. Fine et al.

(2001) compararam os efeitos in vitro de três formulações diferentes para controle de

placa. Os autores observaram uma grande diminuição do biofilme para todos os

produtos. Interessantemente, Ouhayoun (2003) também evidenciou o poder de

penetração no biofilme de solução contendo óleos essenciais.

Além de bons resultados laboratoriais, segundo Ciancio et al. (1995) os óleos

essenciais têm demonstrado efeitos anti-placa e anti-gengivite em diferentes

condições clínicas. Gautier et al. (2000) comparam a ação sobre várias espécies

bacterianas de seis anti-sépticos bucais. A avaliação das populações bacterianas

dos voluntários foi realizada antes e após o tratamento. Observou-se uma maior

redução bacteriana para o anti-séptico contendo óleos essenciais. Bauroth et al.

(2003) analisaram a eficácia no uso de fita dental e bochecho contendo óleos

essenciais no controle da gengivite. Os pacientes foram alocados em três grupos

experimentais: escovação dos dentes e bochecho com óleos essenciais (BEO),

Revisão da Literatura________________________________________________

escovação dos dentes e uso de fita para limpeza interdental (FB) e escovação dos

dentes e bochecho com produto controle (B). Os grupos BEO e FB apresentaram

menor índice gengival modificado em relação ao grupo B. O grupo BEO apresentou

índice de placa menor do que os outros dois grupos em três e seis meses de

acompanhamento, sugerindo assim a importância do uso de bochechos contendo

óleos essenciais para o controle de placa e gengivite. Nesse mesmo ano Santos

(2003), analisando a efetividade dos óleos essenciais e da clorexidina pode

constatar que ambos os produtos possuíam efetividade na redução da inflamação

gengival.

Fine et al. (2005) conduziram dois estudos cruzados para determinar a ação

antimicrobiana, de solução contendo óleos essenciais, observada 12 horas após a

realização de um único bochecho e 12 horas após duas semanas de uso contínuo

duas vezes ao dia. Amostras bacterianas foram coletadas da placa supragengival e

do dorso da língua e analisadas por cultura. As contagens bacterianas foram

menores para os indivíduos que utilizaram óleos essenciais nos dois sítios coletados

e nos diferentes tempos experimentais, quando comparadas ao placebo. O uso de

óleos essenciais demonstrou efeitos prolongados sobre a contagem total de

bactérias anaeróbias, sobre as anaeróbias Gram-negativas bem como sobre as

bactérias produtoras de compostos sulfurados voláteis. Esses achados podem

explicar parcialmente a ação do produto sobre a redução da placa supragengival e

gengivite e ainda controle da halitose.

Sharma et al. (2008) testaram a ação de anti-sépticos bucais sobre o índice

de placa, o índice gengival modificado além dos níveis de interleucina 2 e interferon

gama em oitenta adolescentes com gengivite crônica. Os resultados demonstraram

que após duas semanas de uso os óleos essenciais além de reduzirem o índice de

Revisão da Literatura_______________________________________________

placa e o índice gengival modificado também acarretaram redução significativa nas

citocinas pró-inflamatórias.

Tufekci et al. (2008) testaram em estudo de seis meses o efeito da

incorporação de bochechos contendo óleos essenciais na higiene bucal diária de

cinqüenta pacientes com aparelho ortodôntico. Os pacientes foram divididos em dois

grupos: escovação e uso de fio dental, ou, escovação, uso do fio dental e bochechos

com óleos essenciais. Inicialmente todos os pacientes foram instruídos da correta

higienização dos dentes. Índice gengival modificado e índice de placa foram

mensurados no início e no fim do estudo. Para todos os índices mensurados, o

grupo que utilizou bochecho contendo óleos essenciais apresentou as maiores

reduções.

2.2 Desinfecção de boca-total em estágio único

Van der Velden et al. (1986) relataram que bactérias encontradas em

diferentes locais intra-bucais poderiam recolonizar sítios já tratados

periodontalmente atentando assim para a necessidade de se controlar amplamente

os patógenos e não apenas nos sítios periodontais ou mais especificamente no

biofilme subgengival.

Tradicionalmente, os procedimentos de raspagem e alisamento radicular são

executados em quadrantes ou sextantes com intervalos regulares de uma ou duas

semanas. Sabe-se atualmente que o sucesso clínico desse modelo tradicional

decorre sobre tudo da redução de patógenos periodontais em geral acompanhada

Revisão da Literatura_______________________________________________

de aumento das bactérias chamadas benéficas (Ali et al., 1992). Entretanto, a

microbiota estabelecida após o término da terapia periodontal parece rapidamente

retornar aos padrões anteriores. Sbordone et al. (1990) avaliaram a recolonização

dos sítios subgengivais após uma única sessão de raspagem e aplainamento

radicular em pacientes com periodontite. Oito pacientes participaram desse estudo

em que três sítios com doença periodontal foram monitorados clinica e

microbiologicamente inicialmente aos sete, 21, e sessenta dias após o tratamento.

No dia sete do estudo a avaliação da microbiota foi igual à de uma região sem

doença periodontal, no entanto no 21

dia esse padrão já estava alterado, e no 60

dia já havia retornado a condição anterior ao tratamento aos sessenta dias.

Nesse contexto, a periodontia tem buscado novas opções terapêuticas que

ofereçam alterações microbiológicas mais duradouras e capazes de sustentar a

saúde periodontal restabelecida. E, algumas dessas opções combinam

procedimentos mecânicos ao uso de agentes químicos como antibióticos locais e

sistêmicos ou anti-sépticos.

Apoiado pela concepção de que um quadrante periodontalmente tratado

poderia ser reinfectado por periodontopatógenos originários de outros sítios

intrabucais ainda não tratados, Quirynen et al. (1995) introduziram um protocolo de

terapia periodontal não cirúrgica designado “one-stage full-mouth disinfection”

traduzido como “desinfecção de boca-total em estágio único”. Este protocolo

mecânico-químico inovou basicamente por dois aspectos, a raspagem supra e

subgengivais executadas no prazo de 24 horas e a ampla e extensa aplicação de

clorexidina.

Bollen et al. (1996) compararam pelo período de oito meses os benefícios

clínicos da terapia de desinfecção de boca total em 24 horas associada ao uso da

Revisão da Literatura_______________________________________________

clorexidina e encontraram melhores resultados para o grupo teste (desinfecção total)

em relação ao grupo controle (terapia clássica: quatro sessões de raspagem e

aplainamento radicular com intervalos semanais) para todos os parâmetros

avaliados (índice gengival, índice de placa, profundidade de sondagem e recessão

gengival). Mongardini et al. (1999), ao compararem as duas modalidades de

tratamento periodontal, encontraram melhores resultados também no grupo de

desinfecção de boca total, tanto para periodontite crônica como para periodontite

agressiva.

Apesar dos bons resultados obtidos em estudos prévios (Bollen et al., 1996;

Bollen et al., 1998; Mongardini et al., 1999) Quirynen et al. (2000) avaliaram o papel

da clorexidina no protocolo “desinfecção de boca-total em estágio único” e

concluíram que os maiores benefícios provavelmente decorriam da terapia mecânica

em 24 horas e não propriamente da ação química da clorexidina. Entretanto, um

pouco mais tarde esse mesmo grupo (Quirynen et al., 2006) observaram resultados

contraditórios. Ao compararem a utilização da clorexidina com fluoreto amino

estanhoso ou ausência de solução química concluíram que os efeitos benéficos

eram parcialmente associados ao curto espaço de tempo e parcialmente aos

agentes químicos. Koshy et al. (2004) já haviam sugerido que outros anti-sépticos

poderiam vir a substituir a clorexidina no protocolo original, a fim de potencializar os

resultados clínicos até então alcançados. Contudo, especificamente em relação aos

óleos essenciais nesse protocolo Quirynen et al. (1999) não examinaram seus

efeitos clínicos e/ou microbiológicos. Ao contrário, o parâmetro avaliado foi o nível de

halitose, o qual foi reduzido em aproximadamente 90%.

Com base no trabalho inicial de Quirynen et al. (1995), Cortelli et al. (2008)

propuseram uma modificação no protocolo pela incorporação dos óleos essenciais

Revisão da Literatura _______________________________________________

(Figura 1). Nesse estudo preliminar foram avaliados parâmetros clínicos e

microbiológicos de vinte indivíduos portadores de periodontite crônica moderada.

Profundidade de sondagem, índices de placa e gengival foram monitorados por seis

meses. A presença de A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis e T. forsythia foi

determinada por PCR tanto na saliva não-estimulada como no dorso da língua e em

amostras subgengivais. Os autores constataram efeitos benéficos na utilização dos

óleos essenciais nesse protocolo em relação aos parâmetros clínicos, já com relação

as análises microbiológicas os resultados foram menos consistentes, sugerindo

assim a necessidade de pesquisas adicionais.

Revisão da Literatura_______________________________________________

Protocolo Original

Protocolo Modificado

Raspagem e aplainamento radicular

(dentição completa em duas

consultas consecutivas em período

de 24horas, isto é, duas manhãs

consecutivas) sob anestesia local.

Raspagem e aplainamento radicular (dentição

completa em duas consultas consecutivas em

período de 24horas, isto é, duas manhãs

consecutivas) sob anestesia local.

Polimento dos quadrantes tratados

com pasta abrasiva.

Polimento dos quadrantes tratados com pasta

abrasiva.

Aplicação do dorso da língua por um

minuto com gel de clorexidina a 1%

Fricção do dorso da língua com swab de

algodão estéril embebido em 0,2mL de

óleos essenciais por um minuto.

Bochechos duas vezes ao dia

durante um minuto e borrifar a

faringe com spray, solução de

clorexidina a 0,12%

Bochechos duas vezes ao dia com 20mL de

óleos essenciais por trinta segundos

(durante os últimos dez segundos, o

indivíduo gargarejou).

Irrigação subgengival de todas as

bolsas periodontais por três vezes

consecutivas, com gel de clorexidina

a 1% após ambas sessões de

raspagem e aplainamento radicular e

no oitavo dia.

Irrigação subgengival de todas as bolsas

periodontais (PS≥4mm), por três vezes

consecutivas, com óleos essenciais

(5mL/irrigação/bolsa) após ambas sessões

de raspagem e aplainamento radicular e no

oitavo dia.

Instruções de higiene bucal incluindo

escovação dos dentes, limpeza

interdental e escovação da língua.

PROFISSIONAL

Instruções de higiene bucal incluindo

escovação dos dentes, limpeza interdental e

escovação da língua e doação mensal de kits

padronizados.

Bochecho com 10ml de clorexidina a

0,2% duas vezes ao dia por um

minuto durante duas semanas

consecutivas.

No período de 15 dias: bochechos caseiros

duas vezes ao dia com 20mL de óleos

essenciais durante trinta segundos; fricção

do dorso da língua com swab de algodão

estéril embebido em óleos essenciais ou

placebo por um minuto.

Escovação dos dentes, limpeza

interdental e escovação da língua.

PESSOAL

Escovação dos dentes e da língua, limpeza

interproximal com fio e/ou escova interdental.

Figura 1 – Quadro comparativo entre o protocolo original proposto por Quirynem et al. (1995) e o

protocolo modificado utilizado por Cortelli et al. (2008)

Baseado nesses resultados promissores, o presente estudo também se

propôs a avaliar os efeitos dos óleos essenciais em “desinfecção de boca-total em

estágio único”, todavia foram selecionados indivíduos com menor gravidade da

doença periodontal e o tempo de uso caseiro do produto foi aumentado para dois

meses.

Revisão da Literatura_______________________________________________

2.3 Parâmetros periodontais

Dentre os parâmetros clínicos empregados para mensuração das mudanças

decorrentes do tratamento periodontal, o grau de inflamação tecidual é bastante

utilizado. Entretanto alguns índices, como o de Löe & Silness (1963) utilizam pressão

o que pode acarretar superestimação dos valores obtidos. O índice gengival

modificado proposto por Lobene et al. (1986) não utiliza pressão para provocar

sangramento e redefine as categorias de inflamação leve e moderada (Figura 2).

Löe & Silness (1963)

Lobene et al. (1986)

Ausência de inflamação

Inflamação Leve: Leve alteração na

cor, pequena mudança de textura

Inflamação leve: Ligeira mudança de

cor, pequena mudança na textura

sem comprometimento da papila

gengival marginal

Inflamação moderada: brilho

moderado; vermelhidão; edema;

hipertrofia; sangramento sob pressão

(sondagem)

Inflamação leve: Maior envolvimento

da papila gengival na porção marginal

Inflamação moderada: Aspecto

brilhante, vermelhidão, edema, e ou

hipertrofia da papila gengival marginal

Inflamação avançada: Aumento da

vermelhidão e hipertrofia; tendência

ao sangramento espontâneo

Inflamação avançada: Rubor, edema

e ou hipertrofia da papila gengival

marginal com espontâneo

sangramento, congestão ou

ulceração.

Figura 2 – Quadro comparativo entre índice gengival de Löe & Silness (1963) e índice gengival

modificado de Lobene et al. (1986)

A saliva é um fluido que banha os tecidos moles e duros encontrados na

cavidade bucal, produzida por três glândulas maiores, parótidas, submandibulares e

sublinguais juntamente com inúmeras glândulas menores. Esse fluido contribui de

Revisão da Literatura_______________________________________________

forma significativa para a homeostasia bucal exibindo diversas funções específicas

as quais segundo Sahingur & Cohen (2004) incluem:

a) capacidade tampão;

b) remoção e aderência da microbiota bucal;

c) preparo dos alimentos e digestão;

d) formação das biopelículas intra-bucais;

e) lubrificação e proteção das interfaces entre tecidos moles e calcificados;

f) remineralização dentária;

g) gustação.

Nakamura & Slots (1983) analisaram as atividades enzimáticas na saliva de

dez indivíduos com saúde periodontal, dez adultos com doença periodontal e quatro

indivíduos com periodontite juvenil localizada. Saliva total foi coletada de todos os

indivíduos e aqueles com saúde periodontal apresentaram baixa atividade

enzimática enquanto ambos os grupos doentes (adulto e juvenil) apresentaram

atividade enzimática alta sem diferenças estatísticas entre eles. Dentre as enzimas

encontradas no grupo adulto pode-se citar fosfatase alcalina, esterase, β-

glucuronidase e outras aminopeptidases.

A saliva pode ser analisada de forma total (mista) ou como fluido proveniente

de uma glândula específica. A saliva total não estimulada é composta por secreções

das glândulas maiores e menores, fluido gengival, células epiteliais descamadas,

microrganismos, leucócitos, sangue e resíduos alimentares. Pelo fato de representar

um método não invasivo e ser de fácil obtenção atualmente a saliva tem sido

utilizada na pesquisa periodontal. Todavia deve-se lembrar que a composição salivar

Revisão da Literatura_______________________________________________

é susceptível a ação de muitos fatores como dieta, uso de agentes farmacológicos e

condições bucal e sistêmica (Mandel, 1987).

Em periodontia a análise salivar tem incluído determinações qualitativas e/ou

quantitativas não apenas de imunoglobulinas, enzimas e constituintes do fluido

gengival, como também bactérias (Cortelli et al., 2005). Enzimas salivares podem

ser produzidas pelas próprias glândulas, mas também podem ser o produto advindo

de microrganismos, leucócitos ou células epiteliais. A fosfatase alcalina salivar

parece estar aumentada em indivíduos com doença periodontal comparativamente a

indivíduos saudáveis o que pode estar relacionado com a reabsorção óssea alveolar

característica dessa doença (Totan et al., 2006). Por isso, Yoshie et al. (2007)

sugeriram a fosfatase alcalina como um importante marcador para monitorar a

resposta à terapia periodontal.

Niemienen et al. (1993) mensuraram a atividade enzimática na saliva de 24

adultos com doença periodontal e 25 adultos com saúde periodontal. Os pacientes

receberam tratamento periodontal e receberam um acompanhamento de vinte

meses. Após o tratamento os níveis de proteínas na saliva diminuíram. Com esse

trabalho os autores puderam concluir que a atividade de enzimas na saliva está

diretamente relacionada com saúde e doença periodontal.

O início e a progressão da doença periodontal têm sido atribuídos ao aumento

nos níveis de espécies patogênicas no sulco gengival. A transição entre estágios de

saúde para doença é acompanhada por alterações na composição microbiana do

biofilme. Na saúde gengival o biofilme é composto basicamente por espécies Gram-

positivas enquanto em sítios afetados por doença periodontal predominam os

microrganismos anaeróbios Gram-negativos (Tanner et al., 1996).

Revisão da Literatura_______________________________________________

Campylobacter rectus é uma espécie que tem sido associada principalmente

com lesões periodontais iniciais (Maiden et al., 1998) e gengivite (Gmür et al., 2004).

Por outro lado, Porphyromonas gingivalis e Tannerella forsythia tem sido implicados

como patógenos periodontais verdadeiros (Ximines-Fyvie et al., 2000; Cortelli et al.,

2005; Morikawa et al., 2008). Entretanto, deve-se mencionar que tais espécies

bacterianas também tem sido observadas em populações com menor

comprometimento periodontal e em diferentes sítios intra-bucais (Mager et al., 2003;

Cortelli et al., 2008).

Streptococcus sanguinis é uma espécie considerada como benéfica aos

tecidos periodontais (Kawashima et al., 2003) podendo atuar como espécie

antagônica à colonização por patógenos periodontais (Van Hoogmoed et al., 2008).

Essa espécie bacteriana parece sofrer aumento após a terapia periodontal (Carvalho

et al., 2005). Kamma et al. (2000) também observaram aumento de S. sanguinis em

sítios periodontais que sofreram ou não debridamento mecânico, todavia no estudo

deles todos os participantes receberam a administração sistêmica de. ornidazol.

3 PROPOSIÇÃO

O objetivo deste estudo foi monitorar longitudinalmente os efeitos clínicos,

microbiológicos e salivares decorrentes da aplicação do protocolo terapêutico

periodontal designado “desinfecção de boca-total em estágio único”, tendo como

agente químico um anti-séptico bucal contendo óleos essenciais.

4 MÉTODO

4.1 Delineamento experimental

O presente estudo clínico longitudinal apresentou as características

metodológicas abaixo citadas:

a) tipo de mascaramento: duplo-cego;

b) grupos experimentais: teste (Listerine® cool mint ) e placebo;

c) período total de acompanhamento dos participantes: seis meses;

d) randomização: de acordo com Consolidated Standards of Reporting Trials

(CONSORT) o processo de randomização adotado no presente estudo é

designado aleatorização estratificada por bloco. Assim, para contribuir para a

homogeneidade entre os grupos, para cada bloco de dez indivíduos

selecionados foi feita uma estratificação com base na gravidade da doença.

Em seguida a seqüência de alocação em relação aos grupos experimentais

obedeceu a ordem estabelecida por uma tabela seqüencial gerada em

computador.

4.2 Considerações éticas

O presente projeto de pesquisa atendeu a Resolução n

196, de 16 de outubro

de 1996, do Conselho Nacional de Saúde, e ao Código de Ética Profissional

Método__________________________________________________________

Odontológico (Resolução CFO n

042/2003). A todos os indivíduos recrutados foram

oferecidas explicações verbais e escritas sobre os objetivos, método, benefícios e

eventuais riscos relacionados à participação na pesquisa. Assim, os indivíduos que

aceitaram participar assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido,

previamente avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa envolvendo

seres humanos da UNITAU sob o número 328/2006 (ANEXO A).

4.3 Cálculo amostral

O tamanho da amostra foi calculado com base em um estudo piloto (Cortelli et

al., 2008), conduzido com vinte indivíduos entre os anos 2005 e 2006. De acordo

com os parâmetros clínicos analisados, adotando-se poder do teste = 0,90 e nível

alfa = 0,05 o teste t de Student para amostras independentes sugeriu como valor

mínimo 39 participantes. Assim, adicionando-se 10% para margem de erro e uma

perda esperada para estudos de longa duração de mais 10%, estimou-se como

necessária a inclusão inicial de 48 indivíduos (n grupo = 24).

4.4 População estudada

A amostra de conveniência incluída no presente estudo foi composta por

cinqüenta indivíduos que se apresentaram para tratamento na Clínica de Periodontia

Método__________________________________________________________

do Departamento de Odontologia da Universidade de Taubaté, entre setembro de

2006 e fevereiro de 2007 e que atenderam aos critérios abaixo descritos.

Critérios de inclusão:

a) gênero: feminino ou masculino;

b) idade: entre trinta e cinqüenta anos;

c) número mínimo de 15 dentes e máximo de 28 dentes.

d) gravidade da doença: periodontite crônica leve (Armitage, 1999);

e) distribuição da doença: generalizada (mais que 30% dos sítios

periodontais comprometidos pela doença).

Critérios de exclusão:

a) tabagismo, etilismo;

b) diabete melito, imunossupressão, gestação e lactação;

c) envolvimento de bifurcação: classes I, II ou III;

d) dispositivos ortodônticos ou protéticos extensos, móveis ou fixos;

e) tratamento periodontal prévio: período de 12 meses;

f) antibióticoterapia local ou sistêmica: nos seis meses prévios ao início

do estudo;

g) uso esporádico ou freqüente de anti-sépticos bucais: nos seis meses

que antecederam o início do estudo.

Todas as informações pessoais, assim como a história médico-odontológica,

foram obtidas por questionário e anotadas no prontuário modelo padrão da

Disciplina de Periodontia do Departamento de Odontologia da UNITAU.

Método__________________________________________________________

4.5 Análise clínica

Calibração dos examinadores:

Cada parâmetro clínico foi obtido por um único examinador cegado em

relação ao grupo e previamente calibrado conforme metodologia descrita por Araujo

et al. (2003). Para a variável contínua profundidade de sondagem foi utilizado o EPM

(erro padrão da medida) e para a variável categórica índice gengival modificado foi

utilizado o teste Kappa. Os examinadores foram considerados calibrados mediante

EPM ≤ 0,8 e K > 0,8 e < 0,95.

O erro intra-examinador foi repetido antes da avaliação de seis meses.

Parâmetros avaliados:

Os participantes foram submetidos a exame periodontal completo, sendo as

mensurações obtidas em seis pontos por dente (mesio-vestibular; medio-vestibular;

disto-vestibular; mesio-palatino; médio-palatino e disto-palatino), em todos os dentes

presentes excetuando-se os terceiros molares, com auxílio de uma sonda

periodontal manual

‡

a) profundidade de sondagem (PS) – distância em mm entre a margem

gengival e o fundo do sulco/bolsa periodontal;

b) índice de placa (Silness & Löe,1964):

0 – ausência de placa na área gengival;

1 – presença de uma fina camada de placa na margem gengival;

‡

PCPUNC 15 Hu-friedy Mfg Co Inc. Chigago IL

Método__________________________________________________________

2 – moderado acúmulo de depósitos moles na margem/sulco

gengival;

3 – abundante acúmulo de depósitos moles na margem/sulco

gengival.

c) Índice gengival - (Lobene et al., 1986):

0 – ausência de inflamação;

1 – inflamação leve: ligeira mudança de cor, pequena mudança

na textura sem comprometimento total da papila ou gengival marginal;

2 – inflamação leve: ligeira mudança de cor com envolvimento

de toda a unidade da papila ou gengiva marginal;

3 – inflamação moderada: brilho, vermelhidão, edema, e ou

hipertrofia da papila gengival marginal;

4 – inflamação avançada: vermelhidão marcante, edema e ou

hipertrofia da unidade gengival marginal ou papilar com espontâneo

sangramento, congestão ou ulceração.

4.6 Análise microbiológica

Obtenção das amostras

As amostras bacterianas subgengivais foram coletadas de oito sítios

periodontais (Cortelli et al. 2005) selecionados antes da terapia, equivalentes aos

dois maiores valores de PS por quadrante (associados a sangramento a sondagem

e perda de inserção clínica), em dentes isolados e faces dentais não contíguas.

Cada dente previamente selecionado foi isolado com roletes de gaze esterilizada e o

Método__________________________________________________________

biofilme supragengival também foi removido com gaze estéril. Um cone de papel

absorvente autoclavado, número trinta (Tanari) foi cuidadosamente inserido na

porção mais apical da bolsa periodontal e mantido em posição por um minuto (Figura

3).

Amostras da língua foram coletadas com swab de algodão esterilizado, sendo

cada swab rotacionado seis vezes em seu próprio eixo numa área central do dorso

da língua com aproximadamente 1cm² (Figura 4). Adicionalmente, amostras de

saliva total não estimulada foram coletadas em tubos plásticos tipo Falcon estéril, e

imediatamente 0,1mL diluído em 1mL de solução de Ringer reduzida. As demais

amostras clínicas também foram colocadas em microtubo tipo eppendorf contendo

1,0mL de solução de Ringer reduzida, transportadas até o laboratório de Biologia

Molecular da Universidade de Taubaté e congeladas (-20C) até o processamento.

Figura 3 – Cone de papel absorvente número trinta inserido em bolsa periodontal na face

distal do dente 11 para coleta do primeiro sítio periodontal do quadrante superior direito

Método__________________________________________________________

Figura 4 – Coleta de amostras da língua. Rotação do swab de algodão esterilizado seis vezes em

uma área central do dorso da língua em uma área aproximada de 1cm

Espécies bacterianas pesquisadas:

a) Campylobacter rectus;

b) Porphyromonas gingivalis;

c) Streptococcus sanguinis;

d) Tannerella forsythia.

Processamento das amostras:

a) Extração de DNA genômico

Para o procedimento de extração do DNA genômico, os microtubos (contendo

swab, saliva ou cone de papel) foram homogeneizados em agitador mecânico por 15

segundos (Vortex

, Phoenix, AP56). Após esta etapa, 500μL de cada amostra foram

transferidos para um novo microtubo previamente identificado, e esse submetido à

centrifugação por dez minutos (12000rpm). Ao término do processo de

Método__________________________________________________________

centrifugação, o sobrenadante foi removido e 200μL de Matriz comercial de extração

e purificação de DNA (Instagene, Bio-Rad

) foram adicionados ao pellet formado.

Após homogeneização por 15 segundos, o microtubo foi mantido em banho-

maria por trinta minutos a 56

C. Em seguida, o microtubo foi novamente

homogeneizado por trinta segundos e então mantido por oito minutos em banho-

maria a 100ºC. Ao término desse período, a conclusão do processo de extração e

purificação deu-se pela homogeneização por trinta segundos e centrifugação por

três minutos (12000rpm).

b) Detecção dos Periodontopatógenos

As amostras foram amplificadas para a realização da reação em cadeia da

polimerase (PCR) utilizando-se primers específicos para identificação das cepas de

P.gingivalis, sense: 5’AGGCAGCTTGCCATACTGCGG3’, e antisense: 5’-

ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3’ (404bp); T.forsythia, sense: 5’-

GCGTATGTAACCTGCCCGCA-3’, e antisense:

5’-TGCTTCAGTGTCAGTTATACCT-3’ (641bp); C.rectus, sense:

5’-TTTCGGAGCGTAAACTCCTTTTC-3’, e antisense:

5’-TTTCTGCAAGCAGACACTCTT-3’ (598bp) e S.sanguinis, sense:

5’-GAAGCCATTTTGCCTAGATTGATGG-3’ e antisense:

5’-CCATACCGATTCCTTACTCTAAATTT-3’(475bp)

A PCR foi realizada em um termociclador tipo Mastercycler Gradient

(Eppendorf

) com as seguintes especificações: Um ciclo inicial a 94ºC/5min, 35

ciclos 94ºC/30seg, 55ºC/30seg, 72ºC/1min, e um ciclo final de 72ºC/5min. Para a

análise dos produtos amplificados pela PCR foi empregada eletroforese em gel de

agarose a 1,5% corados com SYBR Safe

(Invitrogen

). A eletroforese foi

Método__________________________________________________________

conduzido a 5V/cm

em solução tamponada (TAE) por 120min. A visualização dos

produtos gerados pela amplificação pela PCR foi realizada em câmara de irradiação

ultravioleta (UV). Marcador de peso molecular (Ladder 100 – Invitrogen

), bem

como, controles positivos e negativos foram empregados em todos os géis, para a

confirmação dos resultados obtidos pela PCR. Os géis foram fotografados e

comparados com os produtos amplificados a partir de cepas padrão.

4.7 Análise salivar

Coleta de saliva

Amostras de saliva (estimulada e não estimulada) foram coletadas entre 9h e

11h da manhã para evitar efeitos do ciclo circadianos. A ingestão de alimentos

líquidos ou sólidos foi suprimida nas duas horas que antecederam as coletas.

Durante a coleta de saliva, realizada em ambiente calmo, ventilado e

privativo, os voluntários permaneceram sentados com a cabeça ligeiramente

inclinada (cerca de 45°). Inicialmente, o pesquisador instruiu cada participante a

coletar a saliva não estimulada produzida no período de um minuto em um copo

descartável. Essa primeira amostra foi desprezada e em seguida uma segunda

amostra foi coletada em tubo de plástico tipo Falcon por um período de cinco

minutos (Navazesh et al., 1992).

Após intervalo de cinco minutos, os voluntários foram re-instruídos a mascar

um bloco de parafilm

por mais cinco minutos. O pesquisador solicitou então que os

indivíduos expelissem a saliva produzida a cada minuto. O fluido acumulado nos

Método__________________________________________________________

dois primeiros minutos foi desprezado e análise então realizada com o volume

adicional produzido nos três minutos subseqüentes (Navazesh et al., 1992).

Fluxo e pH salivares

Imediatamente à coleta o pH salivar foi mensurado com pHmetro portátil

calibrado (Marconi P200) com pH 7.0 e 4.0. Adicionalmente, o fluxo salivar, definido

como o volume total produzido por unidade de tempo (ml/min.), foi determindao

considerando-se o volume de saliva (ml) como a diferença entre o peso (g) do tubo

de plástico anterior e posterior à coleta. Assim, a densidade da coleta foi

considerada 1,0 (Navazesh, 1993).

A taxa de fluxo salivar estimulado foi considerada normal mediante valores

entre 1,0 e 3,0 ml/min enquanto o fluxo salivar não estimulado foi considerado

normal entre 0,3 e 0,5 ml/min.

Níveis de proteína total e fosfatase alcalina

Anteriormente à análise as amostras de saliva foram centrifugadas a

12.000rpm por 5min e o sobrenadante coletado e utilizado nas análises

subseqüentes.

A quantificação de proteína total foi realizada pelo método do biureto com

auxílio de kit específico (Gold Analisa Diagnóstica, MG - Brazil). O método se baseia

na reação entre as pontes peptídicas da proteína e Cu

para produzir um complexo

azul violáceo. A absorbância foi lida em espectofotomêtro em comprimento de onda

de 540nm. A quantificação salivar de fosfatase alcalina também foi realizada usando

kit comercial colorimétrico (Gold Analisa Diagnóstica, MG - Brazil) e mensurada em

590nm.

Método__________________________________________________________

4.8 Terapia periodontal

A terapia periodontal foi conduzida de acordo com os grupos experimentais

como descrito na Figura 5 e ilustrado pela Figura 6. Os participantes previamente

selecionados foram divididos em três blocos, cujas datas de início do tratamento

periodontal foram respectivamente: fevereiro, março e abril de 2007.

Raspagem e aplainamento radicular (dentição completa em duas consultas

consecutivas em período de 24horas, isto é, duas manhãs consecutivas) sob

anestesia local.

Polimento dos quadrantes tratados com pasta abrasiva.

Fricção do dorso da língua com swab de algodão estéril embebido em 0,2mL de

óleos essenciais ou placebo por um minuto.

Bochechos duas vezes ao dia com 20mL de óleos essenciais ou placebo por

trinta segundos (durante os últimos dez segundos, o indivíduo gargarejou).

Irrigação subgengival de todas as bolsas periodontais (PS≥4mm), por três

vezes consecutivas (sem interrupção), com óleos essenciais ou placebo

(5mL/irrigação/bolsa) após ambas sessões de raspagem e aplainamento

radicular e no oitavo dia.

Instruções de higiene bucal e doação mensal de kits padronizados

No período de sessenta dias: bochechos caseiros duas vezes ao dia com 20mL

de óleos essenciais ou placebo durante trinta segundos;

Escovação dos dentes e da língua, limpeza interproximal com fio e/ou escova

interdental.

PROFISSIONAL

PESSOAL

Figura 5 – Modificações propostas a partir do protocolo original “one stage full-mouth disinfection”

introduzido por Quirynen et al. (1995)

Método__________________________________________________________

F E

Figura 6 – Procedimentos terapêuticos realizados: A – Participante realizando bochecho no início da

consulta; B – Participante realizando o gargarejo como conclusão do bochecho no início da consulta;

C – Umedificação do swab com o volume padronizado de 0,2mL para fricção do dorso da língua; D –

Raspagem e aplainamento radicular realizada em 24 horas; E – Seringa descartável contendo 5mL

de solução utilizada para irrigação subgengival das bolsas periodontais com mais de 4mm de

profundidade; F – Procedimentos supervisionados de higiene bucal

Os procedimentos de raspagem foram realizados com curetas Gracey e

McCall por seis periodontistas previamente treinados. A cada nove participantes, os

instrumentos periodontais usados foram substituídos por outros novos (Millenium).

Mensalmente cada participante recebeu re-instrução de higiene bucal e um kit para

Método__________________________________________________________

controle mecânico do biofilme supragengival contendo um tubo de dentifrício

fluoretado (Colgate tripla ação), uma escova de dentes multitufos com cabeça

pequena e cerdas macias (Johnson & Johson – Reach – profesional extreme 30),

quatro escovas interdentais (cônica, Oral B) para substituição semanal e um rolo

pequeno de fio dental (Johnson & Johnson – Reach – expansion plus).

Com a finalidade de garantir o cegamento dos participantes, tanto os óleos

essenciais/Listerine® cool mint como a solução placebo, foram dispensados em

frascos plásticos idênticos com o volume suficiente para uma semana (Figura 7).

Após esse período, cada participante recebeu um novo frasco contendo o mesmo

volume anterior.

Figura 7 – Frascos idênticos sem rótulos contendo solução de mesma cor para ambos os

grupo

Além disso, todos os participantes receberam copos plásticos com uma marca

indicando o volume de 20mL. O primeiro

bochecho foi realizado no próprio local do

estudo de forma supervisionada.

Método__________________________________________________________

A solução placebo (solução de sorbitol 15%; álcool 21,6%; sacarina sódica

0,05%; ácido benzóico 0,1%; essência de menta QS; corante verde QS e água QSP

para um litro) foi manipulada (Byofórmula, São José dos Campos, Brasil) de acordo

com a fórmula do Listerine® excluindo-se os ingredientes ativos (timol 0,064%;

mentol 0,042%; eucaliptol 0,092% e salicilato de metila 0,06%).

Anteriormente ao armazenamento da solução placebo, os frascos foram

lavados com água destilada cinco vezes ao dia (dez minutos cada lavagem) por

cinco dias, eliminando possíveis resíduos.

4.8.1 Aderência dos participantes

A aderência dos participantes foi incentivada e avaliada pelas estratégias abaixo

descritas:

a) questionário: efeitos favoráveis e adversos percebidos por cada paciente

foram avaliados mensalmente;

b) similaridade entre Listerine® e Placebo: incluindo frascos, cor e sabor;

c) conteúdo do frasco: 240ml suficientes para seis dias exigindo o retorno

periódico do paciente, permitindo controle do volume de cada bochecho;

d) copos com marcação de 20ml: para auxiliar no controle do volume de cada

bochecho;

e) kit de higiene bucal: distribuído mensalmente;

Método___________________________________________________________

f) ligações telefônicas: realizadas diariamente, pela manhã e a noite durante

a fase ativa da terapia (entre T0 e T1) e quinzenalmente até o final do

estudo (entre T1 e T2);

g) tratamento em blocos: os participantes foram divididos em três grupos

seguindo a data de início do tratamento periodontal a saber; fevereiro,

março e abril de 2007.

4.8.2 Tempos experimentais

Os parâmetros clínicos, microbiológicos e salivares foram mensurados em

três tempos experimentais. Anteriormente aos procedimentos terapêuticos ocorreu a

primeira avaliação (T0). A segunda mensuração (T1) coincidiu com o término da fase

ativa da terapia periodontal, isto é, após os procedimentos realizados nas primeiras

24 horas do estudo bem como os sessenta dias consecutivos de auto-controle

químico do biofilme supragengival (óleos essenciais ou placebo). Finalmente a

terceira avaliação ocorreu seis meses após o término da fase ativa da terapia

periodontal. Assim:

a) (T0) – inicial;

b) (T1) – dois meses pós-terapia;

c) (T2) – seis meses pós-terapia.

A Figura 8 representa sucintamente as diferentes fases do estudo.

Método__________________________________________________________

Pacientes Triados 296

Selecionados = 56

Divisão aleatória dos

pacientes = (GT e GC)

Pacientes Excl

uidos

Acompanhamento e

Análise dos dados

Grupo Controle n = 25

Grupo Teste n = 25

Atendidos = 25

Perdas = 2

Final = 23

Atendidos = 25

Perdas = 3

Final = 22

Figura 8 – Fluxograma de recrutamento até o final do acompanhamento dos participantes

4.8.3 Análise estatística

Primeiramente foi aplicado um teste para verificar a homogeneidade dos

grupos. Como os valores médios iniciais não apresentaram diferenças entre os

grupos e apresentaram distribuição normal os dados clínicos foram analisados

utilizando-se os testes ANOVA e t-Student, os dados microbiológicos aplicando-se o

teste Qui-quadrado enquanto os dados salivares foram analisados pelo teste

Kruskal

Wallis

. As diferenças entre os grupos teste e controle e entre os tempos

experimentais foram consideradas estatisticamente significativas quando p<0.05. A

análise estatística foi conduzida com auxílio dos softwares Biostat 5.0 e SPSS ®

11.5.

5 RESULTADOS

Os participantes foram alocados nos grupos de maneira equiparada tanto com

relação a idade (teste - 40,68 ± 7,04 anos; placebo - 41,22 ± 6,71 anos) como

gênero (teste - 11 homens: 11 mulheres; placebo – 13 homens: dez mulheres). Três

(12%) participantes do grupo teste e dois (8%) do grupo controle não completaram o

estudo. O número de participantes que completou a avaliação de seis meses (22

teste/23 placebo) foi superior ao mínimo estabelecido pelo cálculo amostral. Efeitos

adversos que pudessem ser relacionados a terapia periodontal ou especificamente

aos agentes químicos não foram relatados. Apenas dois participantes, um do grupo

teste e um do grupo placebo, relataram sensação de ardência nos primeiros três

dias de uso.

5.1 Resultados clínicos

Para avaliar o impacto clínico do modelo terapêutico testado, três parâmetros

periodontais foram selecionados, PS, IPl e IGM. Antes da terapia ambos os grupos

apresentaram o mesmo padrão e gravidade de doença periodontal revelados pela

ausência de diferenças estatisticamente significativas entre-grupos para os três

parâmetros considerados.

A análise intra-grupo demonstrou que apenas o grupo teste exibiu redução

nos valores médios de PS (Figura 9). Já a análise inter-grupos, que comparou teste

Resultados ______________________________________________________

e controle em cada tempo experimental, não revelou diferenças estatisticamente

significativas (Figura 9).

0. 5

1. 5

2. 5

3. 5

T0 T1 T2 T0 T1 T2

CONTROLE TESTE

Figura 9 – Análise comparativa dos valores médios de PS entre os grupos teste e controle

considerando-se os diferentes tempos experimentais

T0 = inicial; T1 = dois meses; T2 = seis meses

Análise intra-grupo revelou diferença estatisticamente significativa (*) (ANOVA e teste t Student p <

0,05)

Análise inter-grupo não revelou diferença estatisticamente significativa (ANOVA e teste t Student p >

0,05)

Em relação ao índice de placa, a análise intra-grupo revelou redução para os

grupos teste e controle (T0 > T1 = T2). Entretanto, a análise inter-grupos demonstrou

que o grupo teste apresentou maiores reduções nos dois tempos de avaliação após

o término da terapia periodontal (T1 e T2). Esses dados estão apresentados na

Figura 10 enquanto a Figura 11 exibe os achados referentes ao índice gengival

modificado. Deve-se salientar que os resultados de IG foram iguais aos de IPl

considerando-se tanto o comportamento intra-grupo como o inter-grupos.

Resultados _______________________________________________________

0. 5

1. 5

2. 5

T0 T1 T2 T0 T1 T2

CONTROLE TES TE

Figura 10 – Análise comparativa dos valores médios de índice de placa (IPl) entre os grupos teste e

controle considerando-se os diferentes tempos experimentais

T0 = inicial; T 1 = dois meses; T2 = seis meses

Análise intra-grupo revelou diferenças estatisticamentes significativas (*) (ANOVA e teste t Student, p

< 0,05)

Análise inter-grupos revelou diferenças estatisticamente significativas (†) (ANOVA e teste t Student, p

> 0,05)

0. 5

1. 5

2. 5

T0 T1 T2 T0 T1 T2

CONTROLE TES TE

Figura 11 – Análise comparativa dos valores médios do índice gengival modificado (IGM) entre os

grupos teste e controle considerando-se os diferentes tempos experimentais

T0 = inicial; T 1 = dois meses; T2 = seis meses

Análise intra-grupo revelou diferenças estatisticamentes significativas (*) (ANOVA e teste t Student, p

< 0,05)

Análise inter-grupo revelou diferenças estatisticamente significativas (†) (ANOVA e teste t Student, p

>0,05)

†

Os dados numéricos relativos às mensurações clínicas da população

estudada antes da terapia e durante o seu monitoramente estão dispostos na Tabela

Tabela 1 – Comparação dos parâmetros clínicos entre os grupos teste e controle considerando-se os

tempos experimentais

Tempo

Parâmetro

Clínico

Pré-tratamento

(T0)

Dois meses

(T1)

Seis meses

(T2)

Resultados _______________________________________________________

Teste

3,51 ± 1,34 2,55 ± 0,71 2,5 ± 0,75

Média ± DP

Controle

3,52 ± 1,43 3,02 ± 1,22 2,97 ± 1,22

Teste 2,11 ± 0,61 0,48 ± 0,41 0,52 ± 0,43

IPl

Média ± DP

Controle 2,12 ± 0,63 1,23 ± 0,68 1,3 ± 0,66

Teste 2,74 ± 0,23 0,47 ± 0,36 0,56 ± 0,39

IGM

Média ± DP

Controle 2,52 ± 0,55 1,39 ± 0,62 1,48 ± 0,66

PS – profundidade de sondagem; IPl – índice de placa; IGM – índice gengival modificado; DP –

desvio padrão

Teste – desinfecção de boca-total em estágio único (Listerine® cool mint)

Controle - desinfecção de boca-total em estágio único (Placebo)

5.2 Resultados microbiológicos

Foram avaliadas as prevalências de quatro espécies bacterianas nos

diferentes períodos experimentais em amostras subgengivais, do dorso da língua e

saliva total não estimulada. Apenas as análises intra-grupos revelaram diferenças

estatisticamente significativas ao longo do tempo (Tabela 2).

Para P. gingivalis não foi observada redução em nenhum sítio teste. Essa

bactéria sofreu aumento em T2 nas amostras de saliva do grupo controle. Houve

Resultado_________________________________________________________

tendência numérica de aumento nos dois grupos entre T0 e T1. Já C. rectus, em T2,

sofreu aumento em todos os sítios intra-bucais pesquisados para ambos os grupos

(Tabela 2). A prevalência subgengival de T. forsythia reduziu para o grupo teste em

T2, e, aumentou em T1 no dorso lingual e saliva não estimulada do grupo controle.

Finalmente, as alterações para S. sanguinis foram similares entre os grupos.

Excetuando-se a ocorrência nas bolsas periodontais do grupo controle, de T0 para

T1 observou-se aumento nos três sítios intra-bucais.

Resultados _______________________________________________________

Tabela 2 – Prevalência de P. gingivalis, C. rectus, T. forsythia e S. sanguinis nos grupos teste e

controle, de acordo como sítio de coleta microbiológica e o tempo experimental

Tempos

P. gingivalis

(T0) (T1) (T2)

Teste 23,53 47,37 33,33 Bolsa

periodontal

Controle 21,05 38,10 42,11

Teste 17,65 31,58 27,78 Língua

Controle 27,78 45,45 21,05

Teste 42,86 47,37 33,33 Saliva

Controle 53,33(A/B) 37,78 (A) 70,00 (B)

Tempos

C. rectus

(T0) (T1) (T2)

Teste 29,41(B) 63,16(A) 83,33(A) Bolsa

periodontal

Controle 47,37(B) 66,67(A/B) 84,21(A)

Teste 64,71(B) 73,68(A/B) 100,00(A) Língua

Controle 66,67 (B) 72,09 (A/B) 89,47 (A)

Teste 64,29(B) 57,09(B) 100,00(A) Saliva

Controle 60,00(B) 70,00(A/B) 94,44(A)

Tempos

T. forsythia

(T0) (T1) (T2)

Teste 68,42(A) 61,90(A) 31,58(B) Bolsa

periodontal

Controle 41,18 57,89 33,33

Teste 41,18 68,42 44,44 Língua

Controle 33,33(B) 72,73(A) 36,84(B)

Teste 50,00 63,16 44,44 Saliva

Controle 38,89 (B) 70,00 (A) 50,00 (B)

Tempos

S. sanguinis

(T0) (T1) (T2)

Teste 16,67(B) 52,94(A) 57,89(A) Bolsa

periodontal

Controle 21,05(B) 21,05(B) 52,38(A)

Teste 38,89(B) 70,59(A) 73,68(A) Língua

Controle 42,11(B) 77,78(A) 54,55(A/B)

Teste 55,56(B) 92,86(A) 78,55(A/B) Saliva

Controle 27,78(B) 86,67(A) 55,00(A/B)

T0 = inicial; T 1 = dois meses; T2 = seis meses

Análise intra-grupo revelou diferenças estatisticamente significativas entre os tempos experimentais

(letras maiúsculas diferentes em uma na mesma linha) (Qui-quadrado p < 0,05)

Análise inter-grupos, em cada tempo experimental, não revelou diferença estatisticamente

significativa (Qui-quadrado p > 0,05)

Resultados _______________________________________________________

5.3 Resultados salivares

A Tabela 3 mostra os resultados provenientes das análises salivares. O anti-

séptico testado no protocolo desinfecção de boca-total em estágio único não alterou

o fluxo e o pH salivares. Apenas o grupo teste apresentou redução do nível total de

proteína na saliva. A dosagem de fosfatase alcalina não foi alterada por esse tipo de

terapia periodontal.

Tabela 3 – Análise comparativa dos parâmetros salivares para ambos os grupos considerando-se os

diferentes períodos experimentais

Tempos

(T0)

Média ± DP

(T1)

Média ± DP

(T2)

Média ± DP

Teste 0,38 ± 0,15 0,30 ± 0,14 0,31 ± 0,16 Fluxo de

saliva não

estimulada

Controle 0,38 ± 0,16 0,33 ± 0,12 0,45 ± 0,21

Teste 7,16 ± 0,36 7,31 ±0,23 7,15 ± 0,33 pH

Controle 7,25 ± 0,55 7,19 ± 0,21 7,17 ± 0,33

Teste

697,07±142,36

758,22 ± 241,22

629,95 ±132,17

Proteína

Total

Controle 679,77 ± 130,34 981,86 ± 241,06 654,31 ± 116,80

Teste 62,30 ± 8,63 66,42 ± 6,32 63,10 ± 8,82 Fosfatase

alcalina

Controle 62,29 ± 10,20 69,51 ± 6,07 63,62 ± 7,35

T0 = inicial; T 1 = dois meses; T2 = seis meses

Análise intra-grupo revelou diferenças estatisticamente significativas entre os tempos experimentais

(letras maiúsculas diferentes em uma mesma linha) (Kruskal Wallis < 0,05)

Análise inter-grupos, em cada tempo experimental, não revelou diferença estatisticamente

significativa (Kruskal Wallis)

6 DISCUSSÃO

Tradicionalmente, a terapia periodontal não cirúrgica de raspagem e

alisamento radicular é executada por sessões, onde se trabalha semanalmente ou

quinzenalmente quadrantes ou sextantes. Embora seja reconhecido que o sucesso

desse protocolo está diretamente relacionado com a redução de patógenos

periodontais (Ali et al., 1992) alguns estudos (Sbordone et al., 1990; Van der Velden

et al., 1986) evidenciaram uma rápida recolonização do sulco/bolsa periodontal

pelas espécies bacterianas periodontopatogênicas pouco tempo após os

procedimentos de raspagem a aplainamento radicular.

Dessa maneira, protocolos terapêuticos que possam obter resultados

sustentáveis ao longo do tempo têm sido pesquisados. Assim, o objetivo do presente

estudo foi monitorar os efeitos clínicos, microbiológicos e salivares decorrentes da

aplicação do protocolo “desinfecção de boca-total em estágio único”, tendo como

agente químico um anti-séptico bucal contendo óleos essenciais.

O protocolo “desinfecção de boca-total em estágio único” tem sido comparado

ao protocolo terapêutico tradicional a fim de testar sua efetividade ao longo do

tempo. Bollen et al. (1996) comparam os dois protocolos citados, e após o

acompanhamento longitudinal por oito meses, concluíram que para todos os

parâmetros clínicos periodontais avaliados (Índice Gengival, Índice de Placa,

Profundidade de Sondagem e Recessão Gengival) os indivíduos incluídos no grupo

teste (“desinfecção de boca total em estágio único”) apresentaram os melhores

resultados. Esses achados estão de acordo com os obtidos por Mongardini et al.

(1999) que observaram também melhores resultados para indivíduos tratados com

Discussão________________________________________________________

“desinfecção de boca-total em estágio único” quando incluídos indivíduos portadores

de periodontite crônica e agressiva.

No presente estudo, o grupo teste apresentou redução de PS comparando T0

com T1. E, tal redução foi mantida até o final do período experimental. Todavia,

provavelmente pelo fato do grupo controle também ter apresentado uma tendência

numérica de melhora (embora não suficiente para alcançar significância estatística)

a análise inter-grupos não revelou diferenças. É interessante ressaltar que em

estudo preliminar (Cortelli et al., 2008) nosso grupo observou diferenças

significativas entre os grupos teste e controle. Entretanto, naquele trabalho foram

incluídos pacientes com maior gravidade da doença periodontal, i.e, periodontite

crônica moderada. E, segundo Müller (2007) já poderia se esperar uma redução

mais evidente pelos próprios valores iniciais de PS terem sido maiores (teste: 4,90 ±

0,47mm; controle: 5,02 ± 0,51mm) que aqueles encontrados nesse estudo (teste:

3,51 ± 1,34mm; controle: 3,52 ± 1,43).

Sobre IPl e IGM, ambos os grupos apresentaram melhora mas, os óleos

essenciais acarretaram maiores reduções quando comparados ao grupo controle

(Tabela 1). As ações anti-placa e anti-gengivite dos óleos essenciais têm sido

evidenciadas por estudos clínicos (Mendes et al., 1995; Charles et al., 2001; Charles

et al., 2004; Witt et al., 2005). Em relação à redução da gengivite deve-se ressaltar

que apesar da maior parte dos estudos clínicos incluírem populações com gengivite

nossos resultados com periodontite leve foram bastante evidentes. A manutenção

das reduções até os seis meses pode ter sido favorecida pelo controle mecânico.

Sharma et al. (2004) já haviam reportado benefícios adicionais decorrentes do uso

de óleos essenciais por pacientes com gengivite os quais utilizaram fio dental e

escova multitufos regularmente.

Discussão________________________________________________________

Embora em determinadas populações tenha sido sugerido que os benefícios

do protocolo “Desinfecção de boca-total em estágio único” possam decorrer mais da

redução do prazo para realização dos procedimentos do que propriamente dos

agentes químicos (Quirynem et al., 2000), nossos resultados parecem corroborar

com os achados posteriores desse mesmo grupo (Quirynen et al., 2006b) uma vez

que o grupo tratado com óleos essenciais apresentou benefícios adicionais em

relação a redução de PS. Na publicação de 2006 esses autores atribuíram as

melhoras clínicas decorrentes do protocolo em parte ao tempo reduzido e em parte a

ação do anti-séptico.

Alguns pesquisadores têm observado resultados contraditórios em relação a

“Desinfecção de boca-total em estágio único”, entretanto segundo Quirynen et al.

(2006a) muitos deles não reproduziram adequadamente o protocolo original. Nesse

sentido, no presente estudo tentou-se uma reprodução adequada. Como os óleos

essenciais no Brasil são veiculados apenas na forma líquida para a desinfecção do

dorso da língua usamos como artifício um swab de algodão embebido na solução

em substituição ao gel de clorexidina (Quirynen et al., 1995). Adicionalmente, foi

padronizado em 5mL o volume utilizado para cada irrigação subgengival.

Embora alguns estudos que testaram a “desinfecção de boca-total em estágio

único” (Bollen et al., 1998; Quirynen et al., 1999) assim como aqueles que avaliaram

o uso de óleos essenciais em diferentes situações clínicas (Witti et al., 2005; Charles

et al., 2000; Fine et al., 2007) tenham observado efeitos antibacterianos e/ou

reduções bacterianas, no presente estudo, T. forsythensis reduziu para o grupo teste

subgengivalmente enquanto P. gingivalis não sofreu redução em nenhum sítio teste.

Na verdade, tanto grupo teste como placebo exibiram tendência numérica de

aumentar entre T0 e T1. Fine et al. (2007) ao utilizar a cultura para determinar a

Discussão________________________________________________________

contagem de P. gingivalis, F. nucleatum e Veillonella sp. relataram reduções da

ordem de 66,3% a 79,2% para o grupo que utilizou óleos essenciais.

Já C. rectus, em T2, sofreu aumento em todos os sítios intra-bucais

pesquisados para ambos os grupos (Tabela 2). O papel de C. rectus como patógeno

periodontal ainda não está completamente elucidado (Renvert et al., 1996). Mas, se

considerarmos essa bactéria um membro do complexo laranja esse resultado

observado aos seis meses pode não ser favorável uma vez que esse complexo

precede a colonização por espécies mais patogênicas (Socransky et al., 1998). Van

der Weijden et al. (1998) ao testarem a ação de extratos herbais sobre espécies

bacterianas não observaram nenhum efeito dos mesmos sobre C. rectus.

As alterações para S. sanguinis foram similares entre os grupos. Excetuando-

se a ocorrência nas bolsas periodontais do grupo controle, de T0 para T1 observou-

se aumento nos três sítios intra-bucais. Esse aumento já foi encontrado após o

tratamento com outro protocolo terapêutico (Carvalho et al., 2005) e parece ser

favorável uma vez que essa espécie é considerada benéfica ao periodonto por

competir com patógenos periodontais interferindo com sua colonização (Kawashima

et al., 2003).

Deve-se mencionar que algumas diferenças entre os nossos resultados e

aqueles reportados por outros estudos podem decorrer da aplicação de técnicas

menos sensíveis (Quirynen et al. 1999; Fine et al. 2007) que a PCR. Mas,

principalmente os resultados microbiológicos devem ser considerados em conjunto

com os achados clínicos cuja melhora perdurou até os seis meses. Em estudos

futuros pode-se testar o retorno ao uso dos anti-sépticos entre três e seis meses

associado ou não a novas intervenções mecânicas.

Discussão________________________________________________________

Por se tratar de técnica simples e não invasiva de coleta, aliada a uma rica

constituição do fluido corpóreo as análises salivares tem crescido em periodontia. A

fim de se testar possíveis efeitos indesejáveis decorrentes do uso relativamente

longo (dois meses) do anti-séptico contendo óleos essenciais investigou-se o fluxo e

pH salivares. Por outro lado alterações nos níveis totais de proteína e de fosfatase

alcalina na saliva foram respectivamente avaliados como possíveis indicadores de

inflamação e reabsorção óssea nos diferentes tempos experimentais.

Muitos anti-sépticos bucais contêm álcool denaturado, e especificamente o

produto aqui testado contém 21.6% de etanol USP. Além da preocupação entre uma

possível relação entre álcool com ressecamento bucal, descamação epitelial e,

sobretudo desenvolvimento de câncer bucal, o baixo pH de determinados anti-

sépticos também tem sido questionado. Claffey (2003) publicou uma revisão de

literatura na qual relatou baseado em estudos prévios a não alteração do pH salivar

decorrente do uso de óleos essenciais. Kerr et al. (2007) não observaram diferenças

nas medidas objetivas e subjetivas de secura bucal, utilizadas para determinar se

anti-sépticos contento álcool teriam influência negativa sobre o fluxo salivar de

indivíduos sem xerostomia.

Os óleos essenciais no protocolo “desinfecção de boca-total em estágio

único” não alteraram os parâmetros salivares básicos, i.e., fluxo e pH. De acordo

com Sahingur & Cohen (2004) o fluxo salivar é de fundamental importância para a

homeostasia bucal assim, nossos achados vêm sustentar a possibilidade de uso

prolongado de anti-sépticos bucais contendo óleos essenciais sem efeitos colaterais

significativos.

Interessantemente, apenas o grupo teste apresentou redução do nível total de

proteína na saliva que segundo Nieminem et al. (1993) pode refletir o grau de

Discussão________________________________________________________

inflamação na cavidade bucal. Nesse contexto, a redução encontrada no grupo teste

parece ser compatível com a maior redução do índice gengival modificado. Ação

antiinflamatória de enxaguatório contendo óleos essenciais foi previamente sugerida

por Sekino & Ramberg (2005) e comprovadas por Sharma et al. (2008) em seu

trabalho realizado com pacientes portadores de gengivite crônica que fizeram uso de

enxaguatório, reduzindo os níveis das citocinas pró-inflamatórias IL 2 e IFN-gamma.

A fosfatase alcalina salivar parece estar aumentada em indivíduos com

doença periodontal comparativamente a indivíduos saudáveis fato esse que parece

estar relacionado com a reabsorção óssea alveolar característica dessa doença

(Totan et al., 2006). Por isso, Yoshie et al. (2007) sugeriram a fosfatase alcalina

como um importante marcador para monitorar a resposta a terapia periodontal.

Todavia, para o tratamento de indivíduos com periodontite leve o protocolo testado

não alterou as dosagens salivares de fosfatase alcalina.

Independente do tipo sabe-se que um dos fatores decisivos para o sucesso

da terapia periodontal bem como a manutenção dos resultados obtidos é o nível de

comprometimento dos pacientes. No presente estudo a aderência dos participantes

foi alta, tendo completado o período experimental 23 pacientes no grupo placebo e

22 no grupo teste. Mongardini et al. (1999) já haviam citado a maior aderência dos

pacientes periodontais a “desinfecção de boca-total em estágio único”

comparativamente ao esquema terapêutico tradicional. O fato dos participantes

terem recebido ligações telefônicas diárias durante toda fase ativa do estudo com

certeza contribuiu para os resultados alcançados. Adicionalmente ambos os

tratamentos parecem ter sido bem tolerados já que efeitos indesejáveis não foram

relatados.

Discussão________________________________________________________

Em síntese o protocolo “desinfecção de boca-total em estágio único” parecer

ser uma boa alternativa para o tratamento de indivíduos com periodontite leve. E,

conjuntamente os resultados desse estudo de seis meses sugerem que o anti-

séptico contendo óleos essenciais pode ser empregado como coadjuvante da

terapia periodontal.

7 CONCLUSÕES

1. Quando utilizado no protocolo “desinfecção de boca-total em estágio único”

para tratar indivíduos com periodontite leve o anti-séptico bucal contendo

óleos essenciais ofereceu benefícios clínicos adicionais principalmente na

redução de placa e gengivite.

2. Os maiores benefícios microbiológicos foram a redução subgengival do

periodontopatógeno T. forsythia e o aumento da espécie benéfica S.

sanguinis.

3. Os resultados salivares parecem confirmar a ação antiinflamatória e a

possibilidade de uso prolongado dos óleos essenciais com segurança.

4. Em conjunto os resultados sugerem que pacientes com periodontite leve

podem se beneficiar desse tratamento periodontal de rápida execução e

sugerem também que os óleos essenciais podem ser um agente

antimicrobiano alternativo para ser utilizado na desinfecção de boca-total em

estágio único.

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ANEXOS

A – Cópia da declaração do Comitê de Ética em Pesquisa

B – Cópia do artigo resumido publicado IADR/2008

C – Cópia do artigo em fase final de elaboração para ser

submetido para publicação no J Clin Periodontol

Taubaté, agosto de 2008

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial desta

obra, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para

fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.

Renato Zanotta Rebelo

Ficha catalográfica elaborada pelo

SIBi – Sistema Integrado de Bibliotecas / UNITAU

R291a Rebelo, Renato Zanotta

Avaliação longitudinal dos efeitos clínicos, microbiológicos e salivares

de um anti-séptico bucal contendo óleos essenciais utilizado no protoclo

terapêutico “desinfecção de boca total em estágio único” / Renato Zanotta

Rebelo. - 2008.

71f.: il.

Dissertação (mestrado) - Universidade de Taubaté, Programa de Pós-

graduação em Odontologia, 2008.

Orientação: Profa. Dra. Sheila Cavalca Cortelli, Departamento de

Odontologia.

Co-orientação: Prof. Dr. Fernando de Oliveira Costa, Departamento de

Odontologia.

1. Óleos essenciais. 2. Estudos clínicos. 3. Terapia. 4. Bactérias.

5. Saliva. I. Título.

For Peer Review

Essential oils in one stage full-mouth disinfection: double blind,

randomized clinical trial of long-term clinical, microbial and salivary

effects

Journal: Journal of Clinical Periodontology

Manuscript ID: draft

Manuscript Type: Original Article Clinical Periodontology

Date Submitted by the

Author:

n/a

Complete List of Authors: Cortelli, Sheila; University of Taubaté, Dentistry, Periodontics

Research Division

Rebelo, Renato; University of Taubate, Periodontology

Sonagere, Alan; University of Taubate, Periodontology

Cortelli, José; University of Taubaté, Dentistry, Periodontics

Research Division

Holzhausen, Marinella; University of Taubaté, Dentistry,

Periodontics Research Division

Franco, Gilson; University of Taubate, Oral Biology

Queiroz, Celso; University of Taubate, Dentistry

Costa, Fernando; Faculdade de Odontologia da Universidade

Federal de Minas Gerais, Clínica, Patologia e Cirurgia

Topic: Treatment

Keywords: Periodontal disease, full-mouth disinfection, essential oils

Main Methodology: Clinical Trial

Journal of Clinical Periodontology - PROOF

For Peer Review

Essential oils in one stage full-mouth disinfection: double blind, randomized

clinical trial of long-term clinical, microbial and salivary effects

Sheila Cavalca Cortelli*, Renato Zanotta Rebelo

‡

, Alan Salinas Sonagere

‡

, José

Roberto Cortelli*, Marinella Holzhausen*, Gilson Cesar Nobre Franco**, Celso da

Silva Queiroz**, Fernando Oliveira Costa

* DDS, MS, PhD. Department of periodontology, University of Taubaté, SP - Brazil

** DDS, MS, PhD. Department of oral biology, University of Taubaté, SP – Brazil

‡

Research Assistant, University of Taubaté, SP – Brazil

DDS, MS, PhD. Department of periodontology, Federal University of Minas

Gerais, MG - Brazil

Running title: Essential oils in full-mouth disinfection

Key – words: Oils, essential, clinical trials, periodontitis, therapy, full-mouth

disinfection

Corresponding author address:

Sheila Cavalca Cortelli

Rua Professor Nelson Freire Campelo, 343 – Jardim Eulália

Taubaté, São Paulo, Brazil

Zip code 12010-700e-mail

cavalcacortelli@uol.com.br

Phone +55 12 36312373

Mobile + 55 12 91776115

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Conflict of Interest and Sources of Funding Statement: This study was

supported by an independent investigator Grant from Johnson & Johnson

Consumer & Personal Products Worldwide a Division of Johnson & Johnson

Consumer Companies Inc., Morris Plains, NJ, USA. The authors declare that they

have no conflict of interests. This study was designed and conducted and had the

found data analyzed by the University of Taubaté and Federal University of Minas

Gerais staffs, and was completely under their supervision and control.

Clinical relevance

Scientific rationale for study: Full-mouth disinfection seems to be beneficial for

improving oral health. We investigated whether mild periodontitis patients would

benefit from using essential-oils as antiseptic for full-mouth disinfection.

Principal findings: Our results corroborate those of reports stating that essential-

oils have anti-plaque and anti-gingivitis effects. The anti-inflammatory properties of

these oils were reinforced by the observation of a reduction in total protein level.

Essential-oils didn’t alter basic salivary characteristics. Full-mouth disinfection

didn’t reduce periodontopathogens, but it was accompanied by an increase in the

prevalence of S.sanguinis.

Practical implications: These results indicate that periodontal patients can be

treated using a less time consuming approach and suggest that these mouthrinse

can be used for the full-mouth disinfection.

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Journal of Clinical Periodontology - PROOF

For Peer Review

Abstract

Aim: This randomized, double-blind, placebo-controlled trial evaluated the long-

term effects of treatment with an essential oils-containing mouthrinse for full-mouth

disinfection. Material and Methods: Fifty patients (mild generalized chronic

periodontitis) were randomly assigned to groups receiving full-mouth disinfection

with either essential oils or placebo. At baseline, 2- and 6-months a calibrated

examiner monitored periodontal pocket depth, plaque index, modified gingival

index and presence (PCR) of P.gingivalis, T.forsythensis, C.rectus, S.sanguinis in

subgingival, saliva and tongue samples. Additional monitoring included flows, pH,

total protein and alkaline phosphatase salivary levels. The following statistics

employed: ANOVA, Student’s t-test (clinical); Chi-Square (microbial); Kruskal-

Wallis (salivary) (p<0.05). Results: PPD reduced only in test-group. PlI and MGI

showed greater reductions in test-group at 2 and 6-months compared to placebo-

group. P.gingivalis wasn’t reduced in any site. At 6-months, C.rectus increased in

both groups, while T.forsythensis decreased subgingivally in test-group.

S.sanguinis increased, except subgingivally, in placebo-group. Salivary pH and

flows weren’t altered. Total protein reduced only in test-group. Alkaline

phosphatase didn’t change in either group. Conclusions: Essential oils for full-

mouth disinfection showed clinical benefits, namely reducing plaque and gingival

inflammation without altering basic salivary parameters. The therapeutic protocol

resulted in an increase in the prevalence of the tested beneficial bacterial species.

Introduction

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Journal of Clinical Periodontology - PROOF

For Peer Review

Many oral diseases are plaque-related. Dental plaque is a microbial biofilm

that is formed by organisms tightly bound to a solid substrate and to each other by

means of an exopolymer matrix. Physical, metabolic and physiological interactions

can contribute to the changes in the microbial composition of the biofilm that are

observed in the progression from a healthy oral environment to periodontal

disease. As such, periodontal therapy aims to reduce periodontal pathogens and

increase the presence of beneficial bacterial species.

Traditionally, in conservative periodontal treatment, scaling and root planing

is often performed over the course of two-three months (one quadrant or sextant at

a time with a one to two week interval between treatments). However, though this

method has a well-documented success rate (Badersten et al, 1981; Hämmerle et

al., 1991), this standard strategy seems to allow for rapid recolonization and intra-

oral bacterial translocation from untreated sites to recently disinfected sites (Van

der Velden et al. 1986, Sbordone et al. 1990).

To avoid this rapid colonization, Quirynen et al. (1995) proposed a one-

stage full-mouth disinfection protocol in which mechanical therapy is performed

within 24 hours in conjunction with the full-mouth application of chlorhexidine.

Although few reports failed to find greater improvements with this method

(Apatzidou & Kinane, 2004; Apatzidou et al., 2004) when compared to the standard

quadrant-by-quadrant treatment, one-stage full-mouth disinfection seems to

provide satisfactory clinical (Quirynen et al, 1995b, Vandekerckhove et al., 1996,

Bollen et al., 1998, Quirynen et al., 2000) and microbiological results (Bollen et al.,

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Journal of Clinical Periodontology - PROOF

For Peer Review

1996, Bollen et al., 1998, Quirynen et al, 1995b, Quirynen et al., 1999, Quirynen et

al., 2000, De Soete et al, 2001).

Quirynen et al. (2006b) reported that these additional benefits could be

partially explained by the mechanical procedures being conducted over a short

time period and partially explained by the selected chemical agent. More recent

studies have focused on modifications of the original protocol such as full-mouth

scaling and root planing in conjunction with azithromycin treatment (Gomi et al.

2007) or one-stage periodontal debridement with an ultrasonic instrument in

combination with 0.5% povidone (pvp)-iodine (Zanatta et al. 2006). It is interesting

to note that Kinane & Papageorgakopoulos (2008) reviewed manuscripts related to

comparisons between the two protocols in an attempt to elucidate the clinician’s

choice.

Essential oils possess anti-plaque and anti-gingivitis properties (Charles et

al. 2001, Charles et al. 2004, Witt et al. 2005, Patel et al. 2007) as demonstrated

by their action against oral microorganisms (Fine et al. 2007a and b) with only

minimal side effects. Therefore, it seems reasonable to evaluate whether essential

oils work for one-stage full-mouth disinfection. Cortelli et al. (2008) conducted a

preliminary study and found promising clinical results in patients with generalized

moderate chronic periodontitis who received scaling and root planing in 24 hours in

combination with treatment with essential oils and rinsing twice a day for 15 days

with the same essential oils

In the present study, we report the results from a randomized, double blind

placebo-controlled clinical trial conducted to evaluate whether a mouthrinse

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Journal of Clinical Periodontology - PROOF

For Peer Review

containing essential oils would result in additional benefits for mild periodontitis

patients treated with “one-stage full-mouth disinfection” and who rinsed with this

same product for two months.

Materials and methods

Study design

It was hypothesized that one-stage full-mouth disinfection performed in

conjunction with the long-term use of a mouth rinse containing essentials oils

would provide additional oral benefits without altering the pH and salivary flow in

the mouths of mild periodontitis patients. Therefore, we investigated, in a

randomized, double blind, placebo-controlled clinical trial, the long-term clinical,

microbial and salivary effects of a mouthrinse containing essential oils used for a

one-stage full-mouth disinfection.

All patients of both genders requesting periodontal treatment at the Dental

clinic, University of Taubaté, SP, Brazil who were between 30 and 50 years of age

with at least 15 teeth were candidates for inclusion (from September/2006 to

February/2007) in the study. They were not enrolled in the study if any of the

following criteria were present: (1) no diagnosis of mild generalized chronic

periodontitis or diagnosis any type of gingival overgrowth, (2) any furcation lesions,

(3) current or former smoking, (4) diabetes and/or immunological disease, (5)

pregnancy or breast-feeding, (6) subjects wearing orthodontic devices, extended

prosthetic devices or having iatrogenic restorations, (7) periodontal treatment 12

months before the beginning of the study, (8) use of local/systemic antibiotics

within the past six months, (9) a need for antibiotics prophylaxis, (10) routine use of

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Journal of Clinical Periodontology - PROOF

For Peer Review

mouthrinse in the previous six months, (11) alcohol abuse and (12) unwillingness

to return for follow-up.

The desired sample size of 20 subjects per group was based on results of a

preliminary study (Cortelli et al., 2008) and was calculated to provide 90% power (T

= 0.05) to detect any possible between-group differences. We included 5 additional

subjects per group to account for the estimated drop out generally observed in

longitudinal studies.

Data and personal information related to the medical and dental histories

were obtained by questionnaire. All subjects signed an informed consent form,

which was previously approved by the Institutional Committee on Research

Involving Human Subjects (protocol number 328/06).

Cinical examinations

A complete periodontal examination was carried out. Measurements of

periodontal pocket depth

‡

, plaque index

‡

(Silness & Löe.1964) and modified

gingival index (Lobene et al. 1986) were obtained by one blinded, trained and

calibrated examiner as previously described (Araujo et al. 2003) in six sites per

tooth (mesio-buccal, buccal, disto-buccal, mesio-lingual, lingual and disto-lingual).

The examiner was considered calibrated if standard error of measurement - SEM >

0.8 (for continuous variable) and Kappa - K > 0.80 and < 0.95 (for categorical

variable). Intra-examiner error was recalculated one week prior to the six month

evaluation.

Microbiological examinations

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Journal of Clinical Periodontology - PROOF

For Peer Review

Microbial samples were obtained as previously reported [8]. Briefly, 8

periodontal sites, two in each quadrant (PPD [ 4 mm associated with bleeding on

probing and clinical attachment loss), were selected for each subject. Each

selected tooth was isolated with sterile cotton rolls and the supragingival plaque

was removed with sterile cotton pellets. A sterilized paper point (number thirty) was

carefully inserted to the depth of the periodontal pocket, and kept in position for 60

seconds. The pooled subgingival samples were stored at -80

C in microtubes

containing 1 mL of reduced Ringer’s solution.

Microbial samples from the dorsum of the tongue were obtained from areas

of approximately 1 cm

, using a swab with reduced Ringer’s solution, which was

rotated 6 times. Each swab was placed in a microtube containing 1 ml of reduced

Ringer’s solution. Samples of non-stimulated saliva were also collected in sterile

tubes. Immediately after collection, 0.1 ml of whole saliva was diluted in 1 ml of

reduced Ringer’s solution.

The presence of Campylobacter rectus, Porphyromonas gingivalis,

Tannerella forsythia and Streptococcus sanguinis were established by polymerase

chain reaction (PCR) using specific primers [P.gingivalis, sense:

5’AGGCAGCTTGCCATACTGCGG3’, and antisense: 5’-

ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3’ (product size: 404 bp); T.forsythia, sense:

5’-GCGTATGTAACCTGCCCGCA-

3’, and antisense:

5’-TGCTTCAGTGTCAGTTATACCT-3’ (product size: 641

bp); C.rectus, sense:

5’-TTTCGGAGCGTAAACTCCTTTTC-3’, and a

ntisense:

‡

PCPUNC 15 Hu-friedy Mfg Co Inc. Chicago IL

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Journal of Clinical Periodontology - PROOF

For Peer Review

5’-TTTCTGCAAGCAGACACTCTT-3’ (product size: 598 bp) and S.sanguinis,

sense: 5’-GAAGCCATTTTGCCTAGATTGATGG-3’ and

antisense: 5’-

CCATACCGATTCCTTACTCTAAATTT-3’(product size: 475 bp)] under standard

conditions. The DNA was extracted using InstaGene Matrix

and the PCR was

performed in a Mastercycler Gradient (Eppendorf



) thermocycler as follows: one

cycle 94ºC for 5 min., 35 cycles 94ºC for 30 sec., 55ºC for 30 sec., 72ºC for 1 min.,

and a final extension of 72ºC for 5 min.

After electrophoresis in 1.5% agarose gel the DNA fragments were stained

with SYBR Safe

(Invitrogen

) and visualized by UV illumination. The PCR

amplificates were compared with both positive and negative controls. Molecular

weight marker (Ladder 100) was added in each set.

Salivary examinations

Saliva samples (unstimulated and stimulated) were collected from the

volunteers between 9:00 and 11:00 am to avoid circadian rhythms effects. No food

or drink was permitted for two hours prior to collection. During the sample

collection, the volunteers remained in a seated position, with their head tilted

forward (approximately 45°). The procedure was accomplished in a quiet and well-

ventilated room. Initially, the examiner instructed each individual to collect

unstimulated whole saliva produced during a 1-minute period. This first sample

‡

PCPUNC 15 Hu-friedy Mfg Co Inc. Chicago IL

BioRad Laboratories, Hercules, CA.

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Journal of Clinical Periodontology - PROOF

For Peer Review

was discarded and afterward, a second sample was collected over a 5 minute-

period into a preweighed plastic tube (Navazesh et al. 1992).

After an interval of 5 minutes, the volunteers were instructed to chew a

parafilm



block for 5 minutes. The examiner asked the individuals to spit out saliva

each minute. The first two minutes of collection were discarded, so the analyses

were performed using the last three collections (Navazesh et al. 1992).

Immediately after collection, the salivary pH was measured using a portable

pH meter (Marconi P200). Its glass electrode was washed with deionized water

and calibrated with buffer solutions pH 7.0 and 4.0.

Additionally, the salivary flow rate, which is defined as the total volume of

saliva produced per unit time (ml/min), was determined considering the volume of

saliva (ml) as the difference between the weight (g) of the plastic tube before and

after collection. The density of saliva was considered to be 1.0 (Navazesh. 1993).

A stimulated salivary flow rate between 1.0 and 3.0 ml/min was considered normal,

while values <0.7 ml/min indicated a reduced flow rate. For unstimulated saliva,

values between 0.3 and 0.5 ml/min were considered a normal flow.

Prior to biochemical analyses, the saliva samples were centrifuged at

12,000 rpm for 5 min and the resulting supernatant was collected and used for the

following analyses. Total protein quantification was performed using the biuret

method using a specific analytical kit (Gold Analisa Diagnóstica, MG, Brazil). This

method is based on the reaction between peptide bonds of the protein and Cu

which produces a blue-violet colored complex. The absorbance at a wavelength of

540 nm was read using a spectrophotometer. Salivary phosphatase alkaline

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Journal of Clinical Periodontology - PROOF

For Peer Review

quantification was also performed using a colorimetric commercial kit (Gold Analisa

Diagnóstica, MG, Brazil) with absorbance measured at 590 nm.

Periodontal therapy

Participants with mild periodontitis were randomly allocated to receive either

one-stage full-mouth disinfection plus essential oils/Listerine® cool mint (test

group) or one-stage full-mouth disinfection plus placebo (control group) as detailed

in Table 1. The pharmacy Byofórmula (São José dos Campos, SP, Brazil)

produced the placebo solution (Sorbitol solution 15%; ethanol USP 21.6%; Sodium

saccharin 0.05%; Benzoic acid 0.1%; mint flavoring QS; Sodium benzoate; Dye

green QS and water QSF 1 liter) according to the Listerine® cool mint formula

except for active agents (thymol 0.064%; menthol 0.042%; eucalyptol 0.092% and

methyl salicylate 0.06%).

One independent specialist in pharmacology dispensed 240 ml of either

essential oils or placebo in identical bottles numbered with the randomization code

on the label, but no other identifying information, according to a computer-

generated randomization list provided by the statistician. A researcher responsible

for seeing the periodontal patients allocated the next available number upon the

patient’s entry into the trial. Participants and researchers that had any contact with

those participants were blinded to treatment assignment for the duration of the

study.

Before packaging the placebo in Listerine® bottles, these containers were

washed with distilled water five times a day (10 minutes each) for three

consecutive days. After six days, each participant received a new bottle with the

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Journal of Clinical Periodontology - PROOF

For Peer Review

same volume as before. All participants also received cups with a mark to indicate

a 20 ml volume. The initial rinse was performed under supervision at the study

center, and the remaining rinses were performed unsupervised at home.

Active periodontal treatment was provided between March 2007 and July

2007.Scaling and root planing was performed with Gracey and McCall curettes and

Hirschfield periodontal files by the same trained periodontist. Periodontal scalers

were discarded after six uses, The time required for each quadrant was

approximately one hour and quadrants I-IV were treated clockwise. Every month,

each subject received a standard kit for mechanical supragingival plaque control

containing fluoride dentifrice (Colgate tripla ação, Colgate), a toothbrush (Reach –

profissional extreme 3, Johnson & Johson), interdental toothbrushes (Cônica, Oral

B) and dental floss (Reach – expansion plus, Johnson & Johson).

Patients were encouraged to comply with the study protocol. Compliance,

desirable and undesirable side-effects were evaluated by questionnaire.

Participants were reminded daily to rinse twice a day (morning and evening) via

telephone call for the first 60 days. Additional phone calls were made every 15

days up to 6-months.

At baseline (T0), 2 (T1) and 6 (T2) months the examiners collected the

clinical, microbial and salivary data.

Statistical analysis

The primary endpoint with respect to benefits in one-stage full-mouth

disinfection was the reduction in mean values of pocket depth, the amount of

plaque present and gingival inflammation from baseline to 6 months and any

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difference between the essential oils and placebo groups. Additional analyses were

performed to evaluate changes in bacterial prevalence. Finally, the lack of changes

in pH and salivary flow was considered a positive outcome as was a reduction in

both total protein and alkaline phosphatase levels.

All statistical analyses were carried out using SPSS ® 11.5 and Biostat 5.0.

Initially, between group homogeneity was tested. Baseline data presented a normal

distribution and did not show between-group differences. Due to the lack of

differences, clinical data were analyzed using ANOVA and Student’s t-tests.

Microbial data were analyzed by applying a Chi-Square test while salivary data

was analyzed using a Kruskal-Wallis test. Differences were considered statistically

significant when p<0.05.

Results

Figure 1 shows the flow of participants throughout the study while table 2

shows the distribution of study population according to their initial demographic

characteristics. Eligible participants were recruited from December 2006 to

February 2007. Participants attended monitoring clinic visits at baseline and at 2

months and at 6 months after the initial therapy in addition to visits related to

periodontal treatment. Three patients (12%) from test group and 2 (8%) from the

placebo group did not complete the 6-month of follow-up. Patients did not report

adverse events that could be either therapy or drug-related. In the present study,

we performed the primary analysis as intention-to-treat involving all participants.

Clinical results

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Aiming to evaluate the clinical effects of the tested therapeutic protocol, we

chose to examine three periodontal parameters, PPD, PlI and MGI. The mean

values for these parameters are shown in table 3. At baseline, both groups showed

the same pattern and severity of periodontal disease revealed by the lack of

statistically significant differences between groups in any of the clinical parameters.

Intra-group analysis demonstrated that only the test group showed mean PPD

reductions over the course of the study (Figure 2). However, comparisons between

the test and placebo group at each time point did not reveal significant differences

between groups (Figure 2).

Regarding the plaque index (PlI), intra-group analysis showed a reduction in

both groups (T0 > T1 = T2). Furthermore, inter-group comparisons demonstrated

greater reductions for the test group at the two- and six-month evaluations. These

data are shown in Figure 3, while Figure 4 describes MGI findings. Interestingly,

MGI showed intra- and inter-groups profiles of reduction similar to PlI.

Microbial results

We evaluated the frequency of three periodontal pathogens and one

beneficial bacterial species in samples collected from patients’ subgingival biofilm,

unstimulated whole saliva and the dorsum of the tongue. Only intra-group analyses

demonstrated significant differences (Table 4).

P. gingivalis was not reduced in any sampled site. This bacterium increased

at 6 months in saliva samples from the placebo group. Furthermore, a tendency to

increase for both groups was observed from baseline to 2 months. C. rectus at 6

months, increased in all sampled sites for both groups (Table 4). T. forsythensis

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reduced for test groups at 6 months, and increased at 2 months in saliva and

tongue samples for the placebo group. Changes in the prevalence of S. sanguinis

were similar for both groups, except for the periodontal pockets in the placebo

group, which showed increases from baseline to 2 months that were not observed

in the test group.

Salivary results

Table 5 shows the results of the salivary analyses. The tested mouthrinse

containing essential oils, when used in the one-stage full-mouth disinfection, did

not alter the pH or flow of saliva. Moreover, only the test group showed a reduction

in total protein levels. Levels of alkaline phosphatase were not influenced by this

kind of periodontal therapy.

Discussion

Although scaling and root planing result in periodontal improvements, the

field of periodontics still seeks a well-tolerated therapeutic protocol that also

produces sustained clinical and microbial changes. One-stage full-mouth

disinfection shows good acceptance by periodontal patients if it is conducted for a

short time, which an important aspect for busy people.

Essential oils have a 125-year history of usage, well-documented anti-

plaque and anti-gingivitis properties and are easily incorporated into a daily oral

care routine. Because these two treatment paradigms seem to both have positive

effects, it seems appropriate to combine one-stage full-mouth disinfection with

essential oils to treat chronic periodontitis patients, especially considering the

worldwide prevalence of this type of disease. This paper focused on clinical,

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microbial and salivary long-term effects associated with mechanical procedures

performed in a short time period and in conjunction with a mouthrinse containing

essential oils.

Quadrant-by-quadrant periodontal treatment reduces periodontal pathogens

(Ali et al. 1992), however the process is time-consuming and seems to be followed

by a rapid pathogenic recolonization (Sbordone et al. 1990, Van der Velden et al.

1986). One-stage full-mouth disinfection has shown promising results in preventing

this recolonization when compared to the standard protocol. Bollen et al. (1996), in

a eight month study, reported better improvements for gingival index, plaque index,

periodontal pocket depth and gingival recession among subjects from one-stage

full-mouth disinfection. Later, Mongardini et al. (1999) presented similar findings

after treating chronic and aggressive periodontitis patients.

In the present study, the test group showed a PPD reduction from baseline

to 2-months in comparison to the placebo group. This reduction obtained at 2-

months remained unchanged until the end of the experimental period. However,

between-group comparisons did not reveal any significant difference, most likely

due to the tendency toward improvement observed in the placebo group. In

contrast, in a preliminary study conducted by our group (Cortelli et al. 2008), we

observed significant differences between test and placebo groups. According to

Müller (2007), the deeper a periodontal pocket is, the better the expected

therapeutic result should be in terms of pocket depth reduction. Then, as in the

preliminary study, we included patients with more severe periodontitis (moderate

chronic periodontitis), they showed higher baseline PPD values (test: 4.90 ± 0.47

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mm; placebo: 5.02 ± 0.51 mm) compared to the baseline values found in the

current study (test: 3.51 ± 1.34 mm; placebo: 3.52 ± 1.43 mm). These differences

could contribute to the more evident PPD changes observed in the preliminary

research.

The most important clinical improvements occurred from baseline to 2-

months. Despite both groups showing improvements in PlI and MGI, treatment with

essential oils resulted in greater reductions than placebo treatment (Table 1).

Therefore, our results corroborate studies that showed the anti-plaque and anti-

gingivitis effects of essential oils (Mendes et al. 1995, Charles et al. 2001, Charles

et al. 2004, Witt et al. 2005, Gunsolley 2006, Patel et al. 2008). Furthermore, it is

important to emphasize that even with cessation of mouthrinse usethe PlI and MGI

mean values observed at 6-months were close to those observed at 2-months,

suggesting the residual effect of the essential oils in the test group. As previously

reported for gingivitis patients (Sharma et al. 2004), the residual effects observed

at 6-months in our periodontitis patients were probably facilitated by mechanical

plaque self-control.

Our clinical findings are in agreement with the paper published by Quirynen

et al. (2006b), which attributes the benefits of one-stage full-mouth disinfection o

both reductions in short-term conduction of bacteria and the antimicrobial actions

of the chemical agent. A few authors, such as Apatzidou & Kinane (2004), did not

observe clinical improvements after full-mouth disinfection. However, according to

Quirynen (2006a), we need to keep in mind that some discrepant results reported

in the literature pertaining to one-stage full-mouth disinfection can be explained by

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major differences in the evaluated treatment protocol. In fact, some researchers

failed to properly reproduce the original treatment protocol (Quirynen et al. 1995).

Although studies that tested either one-stage full-mouth disinfection with

chlorhexidine (Bollen et al. 1998, Quirynen et al. 1999) or essential oils in different

clinical conditions (Witti et al. 2005, Charles et al. 2000, Fine et al. 2007) did find

good antimicrobial effects, in the present study, T. forsythensis was only reduced

subgingivally at 6-months in the test group whereas P. gingivalis did not show any

reduction in these samples. The amount of this last bacterium increased at 6-

months in saliva samples from the placebo group. Actually, a tendency toward an

increase in P. gingivalis was observed for both groups. Our results differ from De

Soete et al. (2001), who reported an additional benefit from one-stage full-mouth

disinfection regarding P. gingivalis reduction, and from Fine et al. (2007), who

found a 66.3% reduction in P. gingivalis counts using a culture methodology.

At 6-months, C. rectus increased at all sampled sites for both groups.

Despite its uncertain definition as a periodontal pathogen (Renvert et al. 1996) and

its presence in periodontally healthy patients (Cortelli et al. 2008), and considering

that C. rectus is a member of the orange complex, which precedes colonization by

more pathogenic species (Socransky et al. 1998), this is not considered a

favorable result. Van der Weijden et al. (1998) conducted an in vitro study to

establish the inhibitory effect of an herbal extract mixture on a select number of

micro-organisms and to test, in vivo, the effect of a mouthwash containing 6.3

mg/ml herbal extract mixture on plaque formation and gingivitis development. The

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authors used a mouthrinse lacking active ingredients as a control and they did not

observe any effect of the herbal extracts against C. rectus.

The S. sanguinis increases were similar between groups, except for the

subgingival sample in the placebo group (from baseline to 2-months). This shift

was also observed with the implementation of another therapeutic protocol

(Carvalho et al. 2005), and seems to be a favorable result since S. sanguinis is

considered to be a beneficial bacterial species that, through competition, limits

periodontopathogens colonization (Kawashima et al. 2003, Van Hoogmoed et al.

2008).

Because the limit of detection of any laboratory technique influences results,

the microbial findings of the present study need to be considered in conjunction

with clinical improvements. Further studies should be conducted to test whether

the additional use of mouthrinse containing essential oils between the third and

sixth months post-treatment can result in different microbial data.

Many salivary components appeared to be useful biochemical markers that

could offer a cost-effective non-invasive approach for monitoring the health-

disease process in the mouth. Many oral antiseptics contain alcohol in their

composition, and the tested mouthrinse containing essential oils specifically

contains 21.6% ethanol USP. The possible relationship between the alcohol, as

well as the low pH of oral products, and oral dryness, epithelial desquamation and

oral cancer are of concern. Therefore, to screen for undesirable side effects related

to the extensive and 60 day continuous use of the tested product, salivary pH and

stimulated and unstimulated salivary flow were monitored from baseline to until 6-

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months. In the present study, the mouthrinse containing essential oils did not alter

pH or salivary flows. According to Sahingur & Cohen (2004), appropriate salivary

flow is a key factor in the maintenance of oral homeostasis. Kerr et al. (2007) did

not observe differences in subjective and objective measurements of oral dryness

applied to determine the influence of alcohol-containing mouthrinses in the salivary

flow of non-xerostomic subjects. In 2003, after revising the literature, Claffey noted

that the previous studies did not observe pH changes resulting from the use of

essential oils.

Moreover, total protein and alkaline phosphatase levels were measured as

indicators of oral inflammation (Nieminem et al.1993) and alveolar bone resorption

(Totan et al. 2006), respectively. Interestingly, only the test group showed a

reduction in total protein level that seem to be compatible with the gingival index

and periodontal pocket depth reductions, also confirming the findings of Nieminem

et al. (1993). The anti-inflammatory property of essential oils was suggested by

Sekino & Ramberg, (2005) and confirmed by Sharma et al. (2008), who observed

IL-2 and IFN-gamma reductions after treatment with essential oils. Using a different

protocol, a 45-minute full-mouth debridement with an ultrasonic instrument,

associated with 0.5% pvp-iodine irrigation, in patients with chronic periodontitis,

Zanatta et al. (2006) observed a reduction in trypsin activity as evaluated by the

chair-side BANA test 3 months after treatment.

Alkaline phosphatase levels are higher in subjects with periodontal disease

than in periodontally healthy patients (Totan et al. 2006). Based on this concept,

Yoshie et al. (2007) identified alkaline phosphatase as an important marker to be

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utilized when monitoring responses to periodontal therapy. However, in our study

population, the provided treatment did not change the salivary levels of this

enzyme. Although our baseline values were higher (test: 62.30 ± 8.63; placebo 62.29

± 10.20) than periodontal disease salivary values (34.38+/-1.5 UI/L) reported by

Totan et al. (2006), they did not meet the 75 UI/L cut-off value suggested by

Kugahara et al. (2008) to distinguish between pregnant women with periodontitis

and the others without periodontitis. Additional studies should be conducted with

more severe periodontitis patients who present more alveolar bone resorption.

A key point for successful periodontal therapy is the patients’ compliance. In

the present study, 23 patients from the placebo group and 22 from the test group

completed the follow-up period. Mongardini et al. (1999) cited a better compliance

by periodontal patients undergoing one-stage full-mouth disinfection than those

receiving quadrant-by-quadrant therapy. We believe that daily phone calls to

remind patients about their appropriate self-chemical plaque control may have

contributed to our good results. In addition, therapy was well-tolerated as no

inconvenient or undesirable side effects were reported.

In summary, the mouthrinse containing essential oils with the one-stage full-

mouth disinfection provided additional clinical benefits, especially in reducing

plaque and gingivitis. The inflammatory properties of essential oils anti- as well as

the safety in long term use were also reinforced by our salivary findings. The main

microbial benefit was related to the protocol and not to the chemical agent as

increases in S. sanguinis prevalence was observed in both groups. Together, the

results of the present investigation help to confirm that mild periodontitis patients

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can be treated using a less time-consuming approach and suggests that essential

oils could be an alternative mouthrinse for the full-mouth disinfection.

Acknowledgments: The authors are grateful to Coordination for the Improvement

of Higher Education Personnel (Capes) and to The National Council for Scientific

and Technological Development (CNPq) for their scholarships, and to Davi R.

Aquino, Aline Mantovane and Karina Machado for their valuable assistance.

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49. Van der Velden, U., Van Winkelhoff, A.J., Abbas, F. & De Graaff, J. (1986)

The habitat of periodontopathic micro-organisms. Journal of Clinical

Periodontology 13, 243-248.

50. Van der Weijden, G.A., Timmer, C.J., Timmerman, M.F., Reijerse, E.,

Mantel, M.S. & Van der Velden, U. (1998) The effect of herbal extracts in an

experimental mouthrinse on established plaque and gingivitis. Journal of

Clinical Periodontology 25, 399-403.

51. Van Hoogmoed, C.G., Geertsema-Doornbusch, G.I., Teughels, W.,

Quirynen, M., Busscher, H.J. & Van der Mei, H.C. (2008) Reduction of

periodontal pathogens adhesion by antagonistic strains. Oral microbiology

and immunology 23, 43-48.

Page 30 of 40

Journal of Clinical Periodontology - PROOF

For Peer Review

52. Vandekerckhove, B.N., Bollen, C.M., Dekeyser, C., Darius, P. & Quirynen

M. (1996) Full- versus partial-mouth disinfection in the treatment of

periodontal infections. Long-term clinical observations of a pilot study.

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53. Witt, J.J., Walters, P., Bsoul, S., Gibb, R., Dunavent, J. & Putt, M. (2005)

Comparative clinical trial of two antigingivitis mouthrinses. American Journal

of Dentistry 18, 15-17.

54. Yoshie, H., Tai, H., Kobayashi, T., Oda-Gou, E., Nomura, Y., Numabe Y, Ito,

K., Kurihara, H. & Kamoi, K. (2007) Salivary enzyme levels after scaling and

interleukin-1 genotypes in Japanese patients with chronic periodontitis.

Journal of Periodontology 78, 498-503.

55. Zanatta, G.M., Bittencourt, S., Nociti, F.H. Jr., Sallum, E.A., Sallum, A.W. &

Casati, M.Z. (2006) Periodontal debridement with povidone-iodine in

periodontal treatment: short-term clinical and biochemical observations.

Journal of Periodontology 77, 498-505.

Page 31 of 40

Journal of Clinical Periodontology - PROOF

For Peer Review

Table 1 – One-stage full-mouth disinfection plus a mouthrinse containing essential

oils or placebo as conducted in the present study.

Full-mouth scaling and root planing (the entire dentition in 2 visits within 24 hours,

i.e., 2 consecutives mornings) under local anesthesia.

Polishing of the treated quadrants with abrasive paste.

Friction twice (at the beginning and at the end of each visit) of the dorsum of the

tongue by rubbing with a sterilized cotton swab soaked with 0.2 mL of essential oils

or placebo for 1 minute.

Mouth rinsing twice (at the beginning and at the end of each visit) with 20 mL of

essential oils or placebo mouthrinses for 30 seconds (during the last 10 seconds,

the subject had to gargle).

Subgingival irrigation of all pockets (PPD [ 4 mm) three times within 10 minutes

with essential oils or placebo mouthrinses (5 mL/irrigation/pocket) after both

sessions of scaling and root planing. This was repeated on day 8.

Mouth rinsing at home with 20 mL of essential oils or placebo mouthrinses twice

daily for 30 seconds for the following 2 months.

Oral hygiene instructions including tooth brushing, flossing or interdental cleaning

with interdental brushes and tongue brushing.

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For Peer Review

Table 2 – Baseline demographic characteristics of participants who completed the

study.

Characteristic Test group

(n = 25)

Placebo group

(n = 25)

Mean age ± SD, years 40.68 ± 7.04 41.22 ± 6.71

Sex, male/female 12/13 14/11

Periodontal pocket depth, mm 3.51 ± 1.34 3.52 ± 1.43

Plaque index, 0-3 2.11 ± 0.61 2.12 ± 0.63

Modified gingival index, 0-4 2.74 ± 0.23 2.52 ± 0.55

Table 3 – Clinical parameters comparisons between test and placebo groups

considering the examination time-points

Evaluation

Clinical

parameter

(T0)

Baseline

Test (n = 25)

Placebo (n = 25)

(T1)

2 months

Test (n = 23)

Placebo (n = 24)

(T2)

6 months

Test (n = 22)

Placebo (n = 23)

Test 3.51 ± 1.34 2.55 ± 0.71 2.5 ± 0.75 PPD

Mean ± SD Placebo 3.52 ± 1.43 3.02 ± 1.22 2.97 ± 1.22

Test 2.11 ± 0.61 0.48 ± 0.41 0.52 ± 0.43 PlI

Mean ± SD Placebo 2.12 ± 0.63 1.23 ± 0.68 1.3 ± 0.66

Test 2.74 ± 0.23 0.47 ± 0.36 0.56 ± 0.39 MGI

Mean ± SD Placebo 2.52 ± 0.55 1.39 ± 0.62 1.48 ± 0.66

PPD – periodontal pocket depth; PlI – Plaque index; MGI – Modified Gingival Index; SD – standard

deviation

Intra-group ((Different capital letters within the same line) and inter-groups (Different lower-case

letters within the same column) analysis revealed significant differences (ANOVA and Student t test,

p < 0.05)

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For Peer Review

Table 4 – Prevalence changes of P. gingivalis, C. rectus, T. forsythensis and S. sanguinis

for test and placebo groups considering the sampled sites and examination time-points

Time-points

P. gingivalis

Baseline

Test (n = 25)

Placebo (n = 25)

2 months

Test (n = 23)

Placebo (n = 24)

6 months

Test (n = 23)

Placebo (n = 24)

Test 23.53 47.37 33.33

Periodontal

pocket

Placebo 21.05 38.10 42.11

Test 17.65 31.58 27.78 Tongue

dorsum

Placebo 27.78 45.45 21.05

Test 42.86 47.37 33.33 Saliva

Placebo 53.33(A/B) 37.78 (A) 70.00 (B)

Time-points

C. rectus

Baseline

Test (n = 25)

Placebo (n = 25)

2 months

Test (n = 23)

Placebo (n = 24)

6 months

Test (n = 23)

Placebo (n = 24)

Test 29.41(B) 63.16(A) 83.33(A)

Periodontal

pocket

Placebo 47.37(B) 66.67(A/B) 84.21(A)

Test 64.71(B) 73.68(A/B) 100.00(A) Tongue

dorsum

Placebo 66.67 (B) 72.09 (A/B) 89.47 (A)

Test 64.29(B) 57.09(B) 100.00(A) Saliva

Placebo 60.00(B) 70.00(A/B) 94.44(A)

Time-points

T. forsythensis

Baseline

Test (n = 25)

Placebo (n = 25)

2 months

Test (n = 23)

Placebo (n = 24)

6 months

Test (n = 23)

Placebo (n = 24)

Test 68.42(A) 61.90(A) 31.58(B)

Periodontal

pocket

Placebo 41.18 57.89 33.33

Test 41.18 68.42 44.44 Tongue

dorsum

Placebo 33.33(B) 72.73(A) 36.84(B)

Test 50.00 63.16 44.44 Saliva

Placebo 38.89 (B) 70.00 (A) 50.00 (B)

Time-points

S. sanguinis

Baseline

Test (n = 25)

Placebo (n = 25)

2 months

Test (n = 23)

Placebo (n = 24)

6 months

Test (n = 23)

Placebo (n = 24)

Test 16.67(B) 52.94(A) 57.89(A)

Periodontal

pocket

Placebo 21.05(B) 21.05(B) 52.38(A)

Test 38.89(B) 70.59(A) 73.68(A) Tongue

dorsum

Placebo 42.11(B) 77.78(A) 54.55(A/B)

Test 55.56(B) 92.86(A) 78.55(A/B) Saliva

Placebo 27.78(B) 86.67(A) 55.00(A/B)

Intra-group analysis revealed significant differences among time-points (Different Capital letters

within the same line; Chi-Square test, p < 0.05) while inter-group analysis did not (Chi-Square test,

p > 0.05)

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Table 5 – Salivary parameters comparisons between test and placebo groups

considering the examination time-points

Examination time-points

Baseline

Test (n = 25)

Placebo (n = 25)

2 months

Test (n = 23)

Placebo (n = 24)

6 months

Test (n = 23)

Placebo (n = 24)

Mean ± SD Mean ± SD Mean ± SD

Test 0.38 ± 0.15 0.30 ± 0.14 0.31 ± 0.16

Unstimulated

salivary flow,

ml/min.

Placebo

0.38 ± 0.16 0.33 ± 0.12 0.45 ± 0.21

Test 2.1 ± 0.72 2.0 ± 0.53 2.1 ± 0.42 Stimulated

salivary flow,

ml/min.

Placebo

2.3 ± 0.62 2.05 ± 0.59 2.2 ± 0.55

Test 7.16 ± 0.36 7.31 ±0.23 7.15 ± 0.33 pH

Placebo 7.25 ± 0.55 7.19 ± 0.21 7.17 ± 0.33

Test

697.07±142.36 A/B 758.22 ± 241.22 A 629.95 ±132.17 B

Total protein

(mg/ml) Placebo 679.77 ± 130.34 981.86 ± 241.06 654.31 ± 116.80

Test 62.30 ± 8.63 66.42 ± 6.32 63.10 ± 8.82 Alkaline

Phosphatase

(UI/L)

Placebo

62.29 ± 10.20 69.51 ± 6.07 63.62 ± 7.35

Intra-group analysis revealed significant differences among time-points (Different capital letters

within the same line; Kruskal Wallis test, p < 0.05) while inter-group analysis did not (Kruskal Wallis

test, p > 0.05)

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For Peer Review

Figure 1 –

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For Peer Review

Figure 2 –

Page 37 of 40

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For Peer Review

Figure 3 –

†

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For Peer Review

Figure 4 –

†

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For Peer Review

Figure legends

Figure 1 – Study design since screening phase until completion the trial

Figure 2 – Mean Periodontal Pocket Depth (PPD) comparisons between test (n =

22) and placebo (n = 23) groups considering the experimental times.

T0 = baseline; T 1 = 2 months; T2 = 6 months

Intra-group analysis revealed significant differences (*) while inter-group analysis did not (ANOVA

and Student t test, p < 0.05)

Figure 3 – Mean Plaque Index (PlI) comparisons between test (n = 22) and

placebo (n = 23) groups considering the experimental times.

T0 = baseline; T 1 = 2 months; T2 = 6 months

Intra-group (*) and inter-groups (†) analysis revealed significant differences (ANOVA and Student t

test, p < 0.05)

Figure 4 – Mean Modified Gingival Index (MGI) comparisons between test (n = 22)

and placebo (n = 23) groups considering the experimental times.

T0 = baseline; T 1 = 2 months; T2 = 6 months

Intra-group (*) and inter-groups (†) analysis revealed significant differences (ANOVA and Student t

test, p < 0.05)

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