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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA
Avaliação de diferentes células apresentadoras de
antígeno em vacinas de DNA – Papel da célula B
nesse modelo
Luciana Previato de Almeida
Ribeirão Preto
2008
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LUCIANA PREVIATO DE ALMEIDA
Avaliação de diferentes células apresentadoras de
antígeno em vacinas de DNA – Papel da célula B nesse
modelo
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para a
obtenção do título de Mestre em Ciências – Área de
concentração: Imunologia Básica e Aplicada.
Orientadora: Profa. Dra. Arlete A. M. Coelho-Castelo
Ribeirão Preto
2008
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Trabalho realizado no Laboratório de Imunoterapia Gênica, Departamento de
Bioquímica e Imunologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto –
Universidade de São Paulo, com auxílio financeiro da FAPESP (05/03087-3)
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL
DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU
ELETRÔNICO PARA FINS DE ESTUDO OU PESQUISA, DESDE QUE
CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central do Campus Administrativo de
Ribeirão Preto/USP
Almeida, Luciana Previato
Avaliação de diferentes células apresentadoras de antígeno em vacinas de
DNA – Papel da célula B nesse modelo
Analysis of different APC in DNA Vaccines and the main role of B cells in this
vaccine model
Ribeirão Preto, 2008
90 pp. 28cm
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto/USP – Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada
Orientadora: Prof. Dra. Arlete A. M. Coelho-Castelo
1. Vacina de DNA 2. Linfócitos B
3. Apresentação de antígeno
Para podermos confiar em nossa
intuição é preciso examiná-la
através da razão.
Luiz Alberto Py
Dedico aos meus pais, pelo apoio em todos os momentos de minha vida e
exemplos de dedicação.
Obrigada!
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Profa. Dra Arlete A. M. Coelho-Castelo, pela
dedicação e pelo exemplo de pesquisadora e ser humano, além da intensa
contribuição para minha formação científica e acadêmica;
Aos Professores Dr. Célio Lopes Silva e Dra. Vânia Luiza D. Bonato
Martins, pelo apoio científico e estrutural em diversas fases deste trabalho;
Aos Professores Dr. Luis Carlos de Souza Ferreira (ICB-USP) e Dr. João
Santana da Silva (FMRP-USP) pela atenção, sugestões e participação na banca de
defesa desta dissertação;
À Dra. Ana Paula Trombone pela atenção, apoio e amizade desde o
primeiro momento;
À Ana Flávia Gembre, Izaíra Tincani Brandão e Ana Paula Masson, pelo
apoio técnico e amizade;
Ao Valter Turato, pelo apoio indispensável na aquisição e análise dos
dados de citometria de fluxo;
Aos demais colegas de laboratório: Alan, Carolina, Isabela, José Eduardo,
Júlio César, Renata, Ricardo, Thiago, William, Cássia, Carlos Rodrigo, Deison,
Denise, Fábio, Giovanna, Juliana, Liliana, Luis Henrique, Marina, Marininha,
Paola, Patrícia, Pryscilla, Rodrigo, Rogério, Rosiane, Rubens, Sheila e Wendy,
pelo apoio e amizade;
Às minhas amigas Ana, Lia, Léia e Paula, pela amizade duradoura e pelos
momentos de descontração;
Aos todos os docentes da área de pós-graduação em Imunologia Básica e
Aplicada que, direta ou indiretamente, contribuíram para minha formação;
Aos secretários Ana Cristine e Ronaldo pela competência e ajuda
dispensada a todos;
A todos os outros funcionários que contribuem para o bom funcionamento
estrutural do departamento;
À FAPESP, CNPq, FAEPA e Rede TB pelo apoio financeiro para a
realização do projeto de pesquisa e à FAPESP pela concessão da bolsa de
mestrado (processo 05/03087-3).
ÍNDICE
ABREVIATURAS...................................................................................................i
RESUMO...............................................................................................................iii
ABSTRACT............................................................................................................v
1 – INTRODUÇÃO............................................................................................1
1.1 – Vacinas de DNA ........................................................................................1
1.2 – Apresentação de antígenos em vacinas de DNA.......................................7
1.3 – Participação dos linfócitos B na apresentação antigênica .....................10
2 – OBJETIVOS ..............................................................................................14
3 - MATERIAL E MÉTODOS........................................................................15
3.1 – Animais....................................................................................................15
3.2 – Extração e purificação da vacina pcDNA3-HSP65................................15
3.3 - Quantificação e avaliação da integridade dos plasmídeos purificados..16
3.4 – Análise da pureza da vacina gênica........................................................17
3.5 – Obtenção da proteína HSP65 recombinante..........................................19
3.6 – Imunizações.............................................................................................20
3.7 – Separação dos linfócitos T CD4 e T CD8 ...............................................20
3.8 – Obtenção de células apresentadoras de antígeno...................................21
3.8.1 – Obtenção de células dendríticas provenientes de baço......................... 21
3.8.2 – Obtenção de macrófagos peritoniais e linfócitos B.............................. 22
3.9 – Ensaios de apresentação de antígenos ....................................................23
3.9.1 – Eletroporação das células apresentadoras de antígeno.........................23
3.9.2 – Ensaio de linfoproliferação por CFSE................................................. 23
3.10 – Determinação do perfil de citocinas por Reação em cadeia da
polimerase em tempo real (“Real-time PCR”)................................................24
3.10.1 – Co-cultura de células apresentadoras de antígeno e linfócitos T........ 24
3.10.2 – Extração de RNA total...................................................................... 24
3.10.3 – Obtenção do DNA complementar (cDNA) ....................................... 25
3.10.4 – Reação em cadeia da polimerase em tempo real (“Real-time PCR”).. 25
3.11 – Imunização de animais deficientes de linfócitos B com células
eletroporadas com pcDNA3-HSP65................................................................26
3.11.1 – Transferência adotiva de linfócitos B eletroporados.......................... 26
3.11.2 – Imunofenotipagem das células do baço.............................................27
3.11.3 – Preparo do inóculo de Mycobacterium tuberculosis .......................... 28
3.11.4 – Desafio com Mycobacterium tuberculosis ........................................ 29
3.11.5 – Coleta, digestão e obtenção de células do pulmão............................. 30
3.11.6 – Obtenção do lisado de M. tuberculosis.............................................. 31
3.11.7 – Ensaio imunoenzimático (ELISA) para a dosagem de citocinas no
lisado pulmonar após transferência adotiva e desafio com M. tuberculosis. .... 31
3.11.8 – Ensaio imunoenzimático para a dosagem de Fator de Necrose
Tumoral-alfa (TNF-) no sobrenadante do lisado pulmonar ...........................33
3.11.9 – Determinação do número de unidades formadoras de colônia (UFC) de
M. tuberculosis ..............................................................................................33
3.11.10 – Análise histológica .........................................................................34
3.12 – Análise estatística ..................................................................................34
4 - RESULTADOS........................................................................................... 35
4.1 – Avaliação do perfil dos linfócitos T induzidos pelas diferentes APCs,
após vacinação com DNA plasmideal..............................................................35
4.2 – Ensaios de apresentação de antígenos por células eletroporadas..........35
4.3 – Análise do perfil de citocinas induzido nas células T CD4 e T CD8 frente
a diferentes APCs.............................................................................................39
4.4 – Ensaios de transferência celular para animais deficientes de linfócitos
B........................................................................................................................42
4.4.1 – Imunofenotipagem de células de memória ..........................................42
4.4.2 – Proteção contra infecção experimental por M. tuberculosis.................45
5 - DISCUSSÃO...............................................................................................53
6 - CONCLUSÕES...........................................................................................65
7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................66
i
ABREVIATURAS
- AIDS: Acquired Immunodeficiency Syndrome – Síndrome da Imunodeficiência
Adquirida
- APC: célula apresentadora de antígeno
- BKO: camundongo deficiente de linfócitos B
- Breg: célula B reguladora
- CFSE: carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster
- CpG: dinucleotídeos citosina guanina
- DMT: dimicolato de trealose
- DNA: ácido desoxirribonucléico
- ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay - ensaio imunoenzimático
- GM-CSF: fator estimulador de colônias de granulócitos e monócitos
- HSP65: proteína de choque térmico de 65 kDa de Mycobacterium leprae
- IFN-: interferon gama
- IL: interleucina
- MHC: complexo de histocompatibilidade principal
- MyD88: myeloid differentiation primary respose gene 88
- PBS: solução fosfato tamponada
- pcDNA3: DNA plasmideal utilizado como vetor da vacina de DNA
-pcDNA3-HSP65: DNA plasmideal contendo o gene da HSP65 utilizado como
vacina de DNA
- PCR: reação em cadeia da polimerase
- PLGA: co-polímero derivado dos ácidos lático e glicólico
ii
- RNA: ácido ribonucléico
- SBF: soro bovino fetal
- TGF-: fator transformador de crescimento beta
- Th: resposta imune de linfócito T "helper" (auxiliar)
- TNF-: fator de necrose tumoral alfa
- TLR9: receptor tipo Toll 9
- Treg: célula T reguladora
- UFC: unidades formadoras de colônia
iii
RESUMO
Embora as células B sejam importantes células apresentadoras de antígeno,
ainda é desconhecido seu papel em modelo de vacinação com DNA. Nesse
trabalho foi demonstrado que células B podem atuar como apresentadoras de
antígenos in vitro e in vivo após a vacinação com DNA, usando como modelo o
plasmídeo pcDNA3-hsp65. Após a imunização intramuscular, a ativação das
subpopulações de linfócitos T CD4 e T CD8 com perfil de Th1, Th2 ou
regulatória apresentaram uma cinética que está relacionada ao tempo após o final
do processo de vacinação e também com a APC em questão. Desse modo quinze
dias após o termino da vacinação as principais APCs são células dendríticas e
linfócitos B. As células dendríticas ativaram linfócitos TCD4 FoxP3+ enquanto os
linfócitos B ativaram ambas populações com perfil diferente T CD8 GATA3+ e
TCD4 FoxP3+. Trinta dias após, as principais células apresentadoras são
macrófagos que induzem uma população de linfócitos TCD4 FoxP3+ , enquanto
os linfócitos B ativam TCD8 que expressam t-bet. Para verificar a importância das
células B nesse modelo, realizou-se a transferência adotiva de linfócitos B
eletroporados com o plasmídeo ou vetor para animais deficientes ou não de
células B. A transferência dos linfócitos B eletroporados com plasmideo HSP65
induziu a ativação de linfócitos T CD8 de memória com fenótipo CD44
hi
CD62
hi
.
Esses animais mostraram uma redução no número de UFC após o desafio com M.
tuberculosis quando comparados as selvagens, sugerindo a importância dessas
células na indução de células T CD8 e o clearance da bactéria. Por outro lado, a
análise histológica do pulmão desse grupo de animais mostrou intenso infiltrado
iv
inflamatório em relação aos demais grupos. Como o processo de obtenção de
células B a serem transferidas exclui o pool de células B com atividade
regulatória. Esse dado nos permite inferir que o resultado observado foi devido a
ausência das células B regulatórias que, se presentes, apresentariam papel
imunomodulador no controle dos linfócitos B. Assim, embora as células B sejam
importantes para indução de proteção após vacinação com DNA plasmideal,
também necessitam de controle, para evitar resposta imune exacerbada. Os dados
sobre a cinética de ativação de linfócitos T após a vacinação intramuscular são
inéditos e, em conjunto, abrem perspectivas para diferentes intervenções vacinais.
v
ABSTRACT
Analysis of different APC in DNA Vaccines and the main role of B cells in
this vaccine model
Although B cells are important as antigen presenting cells (APC), their
role in DNA vaccination models is unknown. In the current study, we
demonstrated that B cells can present antigens in vitro and in vivo after DNA
vaccination with pcDNA3 constructed with 65 kDa-heat shock protein gene from
M. leprae (pcDNA3-HSP65). After intramuscular immunization, different APC
such as dendritic cells (DC), B cells, and macrophages was cocultured with CD4
and CD8 T lymphocytes subsets from immunized mice to determine their ability
in antigen presentation. Fifteen days after DNA immunization, DC and B cells,
but not macrophages, induced activation of T cells. DC activated mainly CD4
regulatory T cells (Treg, FoxP3+), whereas B cells activated both CD4 T helper
(Th) 2 cells (GATA3+) and CD8 Treg (FoxP3+). Thirty days after immunization,
macrophages and B cells activated CD4 Treg and CD8 T (T-bet+) cells,
respectively, whereas no cells was activated by dendritic cells. To evaluate if
pcDNA3-HSP65-transfected B cells induced immune activation and memory, we
carried out adoptive transfer of transfected B cells to B cell-deficient mice (Bko).
Bko reconstituted with pcDNA3-hsp65-transfected B cells produced memory
CD8 T cells (CD44
hi
and CD62
hi
). Moreover, mice challenged with virulent
Mycobacterium tuberculosis on day seven after adoptive transfer presented, on the
day 30 postinfection, fewer number of colony-forming units (CFU) than WT
mice, suggesting that B cells play important role in the induction of CD8 T cells
vi
and bacterial clearance. On the other hand, histopathology analysis of
reconstituted Bko mice showed more severe inflammation than control mice.
Since the B cell isolation protocol eliminated B regulatory (Breg) cells, we
hypothesized that Breg absence could increase the lung damage. Altogether, our
data demonstrate that B cells can play a crucial role in the success of DNA
vaccination and immunomodulation.
1
1 – INTRODUÇÃO
1.1 – Vacinas de DNA
O campo da vacinologia, de modo geral, tem avançado muito nos últimos
anos. As vacinas começaram a ser utilizadas como estratégia terapêutica e não
apenas como profilaxia. Além disso, o desenvolvimento e as novas pesquisas
buscam, além do controle de doenças infecciosas, intervenções contra câncer, uso
como contraceptivos, entre outros. A busca de novas estratégias e adjuvantes
também tem sido um alvo constante para obtenção de vacinas eficazes contra
diversas patologias como malária, síndrome da imunodeficiência adquirida
(AIDS), leischimaniose, esquistossomose, etc. (Poland, Murray et al., 2002). Uma
das estratégias mais recentes em vacinologia são as chamadas vacinas de DNA
(ácido desoxiribonucleico). Embora o antígeno possa ser veiculado por vetores
virais, classicamente o termo é adotado para se referir a antígenos veiculados por
DNA plasmideal.
Em geral, as vacinas de DNA são formadas quando um gene de interesse é
clonado em um plasmídeo bacteriano engenheirado para expressá-lo de maneira
eficiente em células eucarióticas. A expressão do antígeno in vivo age na ativação
do sistema imune com o intuito de conferir proteção contra o antígeno em questão
ou contra o parasita ao qual pertença. Para ser funcional, o plasmídeo deve conter
uma origem de replicação bacteriana que permita seu crescimento em bactérias,
um gene de resistência a antibióticos para seleção das bactérias transformadas, um
2
promotor de atuação forte para expressão em células de mamíferos - em geral os
promotores virais são os escolhidos - e seqüências de poliadenilação para a
estabilização dos RNA (ácido ribonucléico) mensageiros transcritos (Gurunathan,
Klinman et al., 2000).
A transferência de material genético para a expressão gênica in vivo data
de 1950, quando Stasney e col injetaram cromatina de células tumorais em ratos e
estes desenvolveram tumor (Stasney, Cantarow et al., 1950). Porém, foi só em
1990 que a expressão de DNA nu no local de injeção foi demonstrada pela
primeira vez. Logo depois, foi demonstrada a produção da proteína codificada por
material genético in vivo, após a injeção de microgramas de DNA ou RNAm
(Wolff, Malone et al., 1990).
O uso de DNA plasmideal como vacina pode ser considerado uma
estratégia recente. A partir dos anos 90, com os trabalhos de Tang et al. (1992)
Fynan et al. (1993) e Ulmer et al. (1993), essa estratégia ganhou evidência e
credibilidade, desde que com o uso de genes repórteres esses pesquisadores
demonstraram a expressão in vivo da proteína, com conseqüente indução da
resposta imune humoral e celular. Essa estratégia foi demonstrada através da
proteção contra o vírus influenza em camundongos utilizando-se uma vacina de
DNA (Ulmer, Donnelly et al., 1993). Um dos mecanismos que chamou a atenção
para esse tipo de imunização foi baseado no fato da vacinação com DNA
plasmideal mimetizar o efeito de vacinas vivas atenuadas, pois gera antígenos
endógenos, sem a necessidade de se introduzir um microorganismo atenuado e
com menor custo de produção e armazenamento (Gurunathan, Klinman et al.,
2000), além de poder ser utilizada em indivíduos imunocomprometidos (Huygen,
3
2005). Assim, estava consolidada a estratégia de vacinas de DNA visando a
aplicação clínica.
Na verdade, por fornecer apenas genes que codificam antígenos contra os
quais a resposta imune é desejada, uma vacina de DNA pode induzir respostas
imunes mais específicas e favorecer a construção de vacinas múltiplas contendo
moduladores imunológicos como citocinas, quimiocinas etc. Outra manipulação
bastante atraente é a construção com diferentes antígenos para diferentes
patógenos, tornando-a uma vacina multifuncional (Srivastava, 2002).
As vacinas gênicas veiculadas por vírus apresentam eficiência na primeira
imunização, no entanto, a resposta imune gerada contra as proteínas do capsídeo
viral, em geral, inviabiliza novos desafios ou booster (Gurunathan, Klinman et al.,
2000).
Do ponto de vista da resposta imune, as vacinas de DNA têm se mostrado
um método eficiente para a geração de uma resposta imune humoral e celular
protetora (Huygen, 1998), com estimulação de células T CD8
+
citotóxicas (Silva,
Silva et al., 1996) e células T CD4
+
de padrão T ”helper” tipo 1 (Th1), ambas
produtoras de interferon-gama (IFN-) (Bonato, Lima et al., 1998). A vacina que
utiliza a proteína de choque térmico de 65 kD de Mycobacterium leprae (HSP65),
codificada pelo plasmídeo pcDNA3-HSP65, foi desenvolvida no atual Núcleo de
Pesquisa em Tuberculose (NPT). Em modelos experimentais murinos, a vacina se
mostrou capaz de induzir proteção contra infecção desafio com uma cepa
virulenta de M. tuberculosis, levando a um padrão de resposta imune do tipo Th1,
com produção de IFN- e linfócitos T CD8
+
citotóxicos específicos ao antígeno.
Por outro lado, o padrão de anticorpos sugeria a presença de citocinas também do
4
padrão T ”helper” tipo 2 (Th2), mesmo que em baixas doses. Isso deve ter
contribuído para a ausência de lesão pulmonar (Lowrie, Silva et al., 1997; Bonato,
Lima et al., 1998; Lima, Dos Santos et al., 2003). Além do efeito profilático,
também apresentou efeito terapêutico isoladamente ou combinada a
quimioterapia, o que parece levar à eliminação dos bacilos (Lowrie, Tascon et al.,
1999). Os dados obtidos em murinos também foram confirmados em cobaias (De
Paula, Silva et al., 2007). Esse estudo culminou com o uso da vacina em testes
clínicos em pacientes com tumor de cabeça e pescoço. Embora o ensaio ainda
esteja em fase I e II já foi possível observar uma melhora significativa no tempo
de vida dos pacientes (dados não publicados). A ação da vacina nesse caso seria
terapêutica, atuando como imunoestimulante. Cabe lembrar, no entanto, que por
se tratar de material genético e antígenos diferentes os resultados não podem ser
generalizados, cabendo uma análise para cada construção a ser utilizada.
Por serem de origem procariótica, os plasmídeos utilizados em vacinação
possuem uma propriedade adjuvante inerente em sua estrutura. Esta propriedade
imunoestimulante é atribuída a seqüências palindrômicas específicas, contendo
motivos citosina-guanina (CpG) não metilados (Yamamoto, Yamamoto et al.,
1992). Essas seqüências são reconhecidas por receptores do tipo Toll e ativam a
resposta imune inata, desde o início da imunização. Assim, quando sequências
contendo CpG são internalizadas pelas células em repouso, ligam-se aos
receptores do tipo Toll 9 (TLR9) presentes, principalmente, em vesículas
intracelulares. A migração para um compartimento celular rico em CpG parece ser
através de um processo de fusão à membrana plasmática no local de formação do
endossomo (Latz, Schoenemeyer et al., 2004). A ligação entre TLR9 e sequências
5
CpG leva a uma polarização da resposta imune para o padrão Th1, passando pela
sinalização de MyD88 com produção de interleucina (IL) 12 e IFN- em linfócitos
T citotóxicos e CD4
+
(Krieg, 2002; Tudor, Dubuquoy et al., 2005).
Oligonucleotídeos contendo essas seqüências têm sido utilizados como adjuvantes
no tratamento de asma em estudos clínicos (Simons, Shikishima et al., 2004).
Além da injeção intramuscular do DNA “nu”, que é o tipo mais simples de
imunização, as vacinas gênicas podem ser administradas por outras vias, como
intradérmica, intranasal, oral e por diversos métodos mecânicos, elétricos e
químicos, com objetivo de favorecer a ativação da resposta imune ou diminuir a
dose utilizada (Luo e Saltzman, 2000). A injeção intramuscular seguida de
eletroporação está sendo largamente utilizada atualmente e com resultados
bastante promissores (Rizzuto, Cappelletti et al., 1999; Capone, Zampaglione et
al., 2006; Onodera, Ohshima et al., 2007; Zhang, Divangahi et al., 2007). Dentre
os métodos mecânicos destaca-se o bombardeamento intradérmico de partículas
de ouro recobertas com o material genético, chamado de gene gun, capaz de gerar
resposta imune humoral e celular em modelos animais. Essa estratégia já foi
utilizada com diferentes construções vacinais, incluindo o pcDNA3-HSP65
(Pertmer, Eisenbraun et al., 1995; Leutenegger, Boretti et al., 2000; Lima, Dos
Santos et al., 2003). Outra estratégia visando à diminuição da doses de DNA que
tem sido abordada pelo nosso grupo, inclui o uso de formulações lipossomais
veiculadas pela rota intranasal (Rosada, 2006) e de microesferas de polímeros de
ácidos lático e glicólico (PLGA) contendo DNA encapsulado juntamente com
dimicolato de trealose (DMT). Ambas as estratégias visam a liberação de forma
6
controlada do DNA plasmideal por mais tempo (Luo e Saltzman, 2000; Lima,
Santos et al., 2003).
Dentro desse conceito, um ponto importante a ser considerado com relação
às vacinas de DNA diz respeito a sua biossegurança. Em geral, as doses utilizadas
para imunização e terapia são relativamente elevadas: 300 g em modelos
murinos e 1000 g ou mais em seres humanos. Assim, a chance de ocorrer uma
integração genômica é um risco a ser considerado (Gurunathan, Klinman et al.,
2000). A liberação para uso clínico inclui, então, a checagem da não integração
genômica e outras variáveis como o não desenvolvimento de doenças auto-
imunes, principalmente em nosso modelo, já que utilizamos uma proteína de
choque térmico de M. leprae que apresenta similaridade antigênica com proteínas
eucarióticas. Análise de nosso laboratório mostrou que após a injeção
intramuscular de 100 g de pcDNA3-HSP65 ocorria uma vasta biodistribuição,
sendo que o plasmídeo podia ser recuperado de diversos órgãos até seis meses
após a inoculação. Porém, o RNA mensageiro permanecia detectável até o décimo
quinto dia após o inóculo. A avaliação do perfil de metilação do plasmídeo
mostrou que o mesmo, embora presente nos órgãos por seis meses, não havia se
replicado nem se integrado ao genoma do hospedeiro (Coelho-Castelo, Trombone
et al., 2006). Também foi demonstrado, em modelos de diabetes auto-imunes, que
a vacinação com pcDNA3-HSP65 não leva ao agravamento do quadro (Santos-
Junior, Sartori et al., 2005). Em conjunto esses dados mostram a biossegurança da
vacina pcDNA3-HSP65.
Porém, um dos pontos chaves no desenvolvimento de vacinas é o
entendimento da geração de memória, para que possíveis intervenções possam
7
melhorar a eficácia da mesma. Do ponto de vista das vacinas de DNA, pouco se
conhece sobre as células envolvidas na geração de memória. Dados obtidos da
literatura mostram que, após a vacinação intramuscular com o DNA nu, o mesmo
pode ser detectado em células dendríticas CD11c+ e macrófagos CD11b+ (Liu,
Wahren et al., 2006). No entanto, dados de nosso laboratório mostraram que, além
das células CD11c+ e CD11b+, os linfócitos B da medula óssea ou linfonodos
também eram capazes de capturar o plasmídeo e expressar o antígeno, usando
duas construções plasmideais diferentes (Coelho-Castelo, Santos Junior et al.,
2003). Quando a vacinação era veiculada por microesferas de PLGA observou-se
uma biodistribuição ampla, contudo com ativação principalmente de células
CD11c+ (Trombone, Silva et al., 2007), sugerindo que o modo de oferecer o
DNA plasmidial ao sistema imune pode influenciar na captura do antígeno e, por
conseqüência, no tipo de resposta imunitária a ser desenvolvida. Outro aspecto
importante e pouco explorado, diz respeito a influência e células T reguladoras
nesses modelos (Toka, Suvas et al., 2004).
1.2 – Apresentação de antígenos em vacinas de DNA
Uma das hipóteses para explicar a ativação da resposta imunitária, após
injeção intramuscular, é baseada na ação das células musculares como
apresentadoras do antígeno. Essas células são multinucleadas, portanto prováveis
produtoras de alta taxa da proteína em questão, porém, por não possuírem
moléculas co-estimulatórias, essas células não são consideradas como clássicas
células apresentadoras de antígeno (Corr, Lee et al., 1996; Gurunathan, Klinman
8
et al., 2000). Além disso, se o local da injeção intramuscular for retirado logo
após a imunização não há diferenças nos níveis de anticorpos nem na resposta
citolítica, sugerindo a dispersão das moléculas quer via sangüínea ou linfática. Por
outro lado, a injeção no músculo leva a um aumento da pressão hidrostática, o que
favorece o recrutamento de células apresentadoras para o local. Essas células,
então, capturariam o antígeno liberado em vesículas ou como proteína nativa
(Torres, Iwasaki et al., 1997). Após a injeção intramuscular de DNA marcado,
este pode ser observado até vinte e quatro horas, entre as fibras musculares ou em
pequenas vesículas dentro de células mononucleares. Neste período, também pode
ser detectado vesículas em células CD11b+ dos linfonodos drenantes (Dupuis,
Denis-Mize et al., 2000). Uma outra hipótese aventada propõe que a resposta
imunitária só seja ativada após o DNA plasmidial ser capturado por células do
fenótipo CD11c+ ou CD11b+. Nesse caso, o plasmídeo, após ser capturado por
uma célula em questão, levaria a produção da proteína podendo ativar linfócitos T
diretamente, ou por mecanismos de cross priming (Doe, Selby et al., 1996). De
qualquer modo, os modelos explicam apenas o início da resposta e não a ativação
celular e ou geração de células de memória, bem como não esclarecem a
contribuição de cada célula apresentadora de antígeno (APC) nesse modelo
vacinal.
A transfecção direta de células leva à apresentação do antígeno via
complexo principal de histocompatibilidade de classe I (MHC I) e é importante
para primar linfócitos T citotóxicos. Os antígenos sintetizados endogenamente são
degradados no citossol por proteases e os peptídeos gerados são transportados
para o retículo endoplasmático, onde se juntam as moléculas de classe I e migram
9
para a superfície celular. Antígenos expressos por outras células podem levar à
apresentação via MHC de classe II (MHC II). O processamento desses antígenos
ocorre no fagolisossomo, após sofrerem endocitose ou macropinocitose (Howarth
e Elliott, 2004). Trombone e col, usando baixas doses de DNA plasmideal,
demonstraram que a captura do DNA plasmidial em células dendríticas e/ou
macrófagos ocorre independente de TLR9, dados que outros autores também já
haviam demonstrado com doses mais elevadas (Latz, Schoenemeyer et al., 2004;
Trombone, 2007). No trabalho de Trombone e col, embora independente de Toll
9, o recrutamento da molécula de MyD88 para a vesícula lisossomal dá inicio a
sinalização para indução da produção de citocinas do padrão Th1, como IFN-γ e
IL-12.
Como já descrito, o processamento de antígenos internalizados que
escapam para o citossol ocorre por degradação pelo proteassoma e apresentação
cruzada via MHC de classe I. A ativação de linfócitos T CD4 se daria pelo
mecanismo de apresentação direta via MHC de classe II (Gurunathan, Klinman et
al., 2000). No modelo das vacinas de DNA, dependendo da dose usada esse
paradigma pode ser alterado. Assim, avaliando o tráfego intracelular do DNA
plasmidial percebe-se que a forma de veiculação da molécula de DNA pode levar
a ativar preferencialmente um dos mecanismos. Isso tem conseqüência direta no
design de vacinas e na rota principal da resposta imune que se deseja ativar.
Curiosamente, trabalhando com baixas doses de DNA para avaliar o tráfego
intarcelular do plasmídeo, observamos que baixas doses do DNA plasmidial o
mantém dentro de vesículas, e de um modo ainda não entendido, impede a
acidificação das mesmas. Dentro dessas vesiculas que não chegam a lisosomas, a
10
molécula de DNA atinge a membrana perinuclear (Trombone, 2007). Por outro
lado, a veiculação em microesferas contendo PLGA, provavelmente libera DNA
no citossol, por alterar a bomba de sódio potássio como ocorre com veiculação de
lipossomas ou pelo próprio tamanho que apresentam (Trombone, Silva et al.,
2007; Trombone, 2007). Com relação às células apresentadoras de antígenos, a
participação dos linfócitos B em vacinas de DNA tem sido restrita a alguns
modelos. Foi mostrado que essas células podem participar do processo de
apresentação cruzada, apenas após a imunização por gene-gun (Hon, Oran et al.,
2005). A apresentação cruzada para linfócitos T citotóxicos também pode se
observada usando antígeno proteico conjugado com DNA contendo seqüências
CpG (Heit, Huster et al., 2004). Por outro lado, Zanetti e col mostram a
importância da participação de células B como APC, após a vacinação intra-
esplênica (Zanetti, Castiglioni et al., 2004).
1.3 – Participação dos linfócitos B na apresentação antigênica
Na indução da resposta imunitária, classicamente, os macrófagos e
principalmente as células dendríticas são consideradas as principais células
envolvidas na ativação de linfócitos T naive. Isso, em parte, é decorrente de duas
de suas principais propriedades que são a eficiência de endocitose/
macropinocitose e da apresentação antigênica, sendo capazes de capturar e
apresentar antígenos mesmo quando em concentrações extremamente baixas
(Watts e Amigorena, 2000). A captura de antígeno é particularmente eficiente em
células dendríticas, devido ao seu elevado nível de macropinocitose, podendo
11
capturar uma área correspondente ao seu próprio volume em uma hora (Sallusto,
Cella et al., 1995).
A capacidade de apresentação de antígenos em células dendríticas é
modificada durante seu processo desenvolvimento. Enquanto células imaturas
apresentam uma alta capacidade de macropinocitose e ineficiência do ponto de
vista de apresentação antigênica, as células maduras praticamente não realizam
macropinocitose, mas são excelentes apresentadoras de antígeno. Assim, a
eficiência na apresentação de antígeno pelas células dendríticas está relacionada à
sua alta capacidade de capturar antígenos quando imatura em sítios periféricos e a
sua alta capacidade de apresentar antígenos em órgãos linfóides quando madura,
devido a um aumento de expressão, em sua superfície, de moléculas de MHC e
co-estimulatórias durante o processo de maturação (Cella, Engering et al., 1997).
A participação dos linfócitos B na apresentação antigênica e proliferação
de linfócitos T foi demonstrada utilizando-se camundongos deficientes desse tipo
celular. Neste modelo, a presença de linfócitos B para apresentação antigênica
mostrou-se necessária para a expansão de linfócitos T CD4 (Crawford, Macleod et
al., 2006). Através da reconstituição desses animais, foi mostrado que a captura
do antígeno ocorre pelo receptor de linfócito B (BCR) específico, levando a um
aumento da expressão de moléculas co-estimulatórias, processamento e
apresentação do antígeno (Rivera, Chen et al., 2001). O processo de endocitose
mediada por receptor permite às células B concentrar quantidades pequenas de
antígeno específico e apresentá-lo eficientemente, já que a sinalização do BCR
favorece a apresentação de antígenos internalizados por essa via (Rodriguez-
Pinto, 2005). Além do reconhecimento do antígeno pelo receptor específico, a
12
estimulação primária de linfócitos T CD4 pelos linfócitos B é dependente da
ligação entre CD40 e seu ligante CD154 (Rodriguez-Pinto e Moreno, 2005). O
reconhecimento de antígenos apresentados por células B por linfócitos T CD8
parece ser um mecanismo mais complexo. O auxílio de células T CD4
previamente ativadas, por meio de liberação de citocinas ou através da ligação
CD40/CD40L e OX40L/OX40 entre linfócitos B e T, parece ser necessário para a
ativação primária de linfócitos T CD8 in vitro (Castiglioni, Gerloni et al., 2005).
Porém, já foi demonstrado também que células B ativadas com CD40 ligante são
capazes de induzir resposta primária de linfócitos T citotóxicos (Von Bergwelt-
Baildon, Vonderheide et al., 2002). Outra maneira de aumentar a expressão de
CD40 e moléculas co-estimulatórias é através do uso de motivos CpG como
adjuvantes, que atuam nos receptores do tipo Toll 9, ativando os linfócitos B
(Wheeler, Cortez-Gonzalez et al., 2006). Recentemente, uma subpopulação de
células B reguladoras, denominadas Breg, tem sido relacionada com controle da
reposta imunitária, semelhante ao que ocorre com as T reguladoras (Treg). Essas
células, no contexto de inflamação crônica parecem exercer papel
imunomodulador através da produção de IL-10 ou fator tranformador de
crescimento beta (TGF-) (Mizoguchi e Bhan, 2006).
A importância do linfócito B em vacinas de DNA é ressaltada em modelos
de imunização intra-esplênica, usando-se vetores que apresentam promotores de
imunoglobulinas que visam a expressão seletiva do antígeno em linfócitos B
(Xiong, Gerloni et al., 1997). Quando esse modelo foi aplicado em animais
deficientes de células dendríticas, houve indução normal da resposta imunitária
após a vacinação com DNA plasmideal, sugerindo a participação de células B
13
como apresentadoras de antígeno (Langlade-Demoyen, Garcia-Pons et al., 2003).
Além disso, através da transgenese espontânea de esplenócitos in vitro (Filaci,
Gerloni et al., 2004) com plasmídeos codificando proteínas do vírus influenza
demonstrou-se, em um modelo de imunização endovenosa, a capacidade dos
linfócitos B em gerar resposta T CD4 e CD8 específica e protetora contra
posterior desafio contra o vírus influenza (Gerloni, Rizzi et al., 2004). Essa
resposta protetora é mediada por células T CD8 de memória central,
eficientemente gerada por células B manipuladas geneticamente (Castiglioni,
Gerloni et al., 2004), reafirmando a participação dessas células na apresentação
antigênica em modelos vacinais. Porém os modelos citados utilizam vacinas de
DNA com promotores dos genes de imunoglobulina, o que favorece a expressão
em células B. Além disso o mecanismo de imunização intra-esplênica é um
mecanismo invasivo, difícil de ser usado em larga escala. Assim a vacinação
convencional por via intramuscular para a avaliação do papel das células B e
demais apresentadoras de antígenos in vitro, bem como o padrão de linfócitos T
de memória ativado, poderá nos fornecer dados mais completos sobre os
mecanismos de atuação dessas vacinas.
14
2 – OBJETIVOS
O presente trabalho teve como objetivos:
Geral:
Avaliar a participação de células apresentadoras de antígenos in vitro,
representadas por macrófagos, células dendríticas e linfócitos B, na resposta
imune induzida por vacinas de DNA, usando como modelo a vacina pcDNA3-
HSP65 contra tuberculose experimental.
Específicos:
Determinar o perfil fenotípico das células T ativadas in vitro pelas
diferentes APCs e avaliar a participação de células B como APC e na proteção
contra a tuberculose experimental.
15
3 - MATERIAL E MÉTODOS
3.1 – Animais
Foram utilizados camundongos C57BL/6 deficientes ou não de células B,
[cadeia µ-/- (Jackson laboratories)], do mesmo background, SPF (Specific
Patogen Free), com seis a oito semanas de idade, provenientes do Biotério de
Animais Isogênicos da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP. Os
animais foram mantidos em isoladores de animais, com temperatura, umidade,
fluxo de ar e ciclo de luz /escuro controlados, com livre acesso à água e ração.
3.2 – Extração e purificação da vacina pcDNA3-HSP65
Os plasmídeos recombinante pcDNA3-HSP65 e o parental pcDNA3
(Invitrogen Corporation, Carsbad, CA, USA), gentilmente cedidos pelo Prof Dr
Célio Lopes Silva, foram purificados por cromatografia de troca iônica,
utilizando-se colunas da QIAGEN Giga Plasmid Purification Kit (Qiagen Inc.,
Santa Clarita, CA, USA).
Bactérias E. coli DH5-α, transformadas com cada plasmídeo em questão,
foram plaqueadas em meio LB Agar (Sigma Chemical Corporation, Saint Louis,
MO, USA) contendo 100 µg/mL de ampicilina, por 16 horas a 37ºC. Após esse
período, uma colônia foi inoculada em 5,0 mL de meio LB líquido (USB
Corporation, Cleveland, OH, USA) contendo ampicilina (100 µg/mL) e incubada
16
durante 8 horas, com agitação de 250 rpm a 37°C. A seguir, essa cultura foi
diluída 1/500 em 2,5 litros de LB líquido (USB), contendo ampicilina (100
µg/mL), e incubada novamente a 37ºC sob agitação (250 rpm) durante 16 horas.
Após esse período, o material foi centrifugado a 6.650 g por 15 minutos a 4ºC, o
sobrenadante desprezado e cerca de sete gramas do precipitado foi ressuspendido
em 125 mL de tampão P1 (Tris-HCl 50 mM pH 8,0; EDTA 10 mM e RNAse 100
µg/ml). Logo após, foram adicionados 125 mL de tampão P2 (NaOH 200 mM;
SDS1%) e esperou-se 5 minutos para a completa lise da parede bacteriana. Em
seguida, adicionou-se 125 mL do tampão P3 (acetato de potássio 3,0 M pH 5,5), o
material foi filtrado e mantido no gelo por 30 minutos após adição de tampão para
remoção de endotoxinas.
O filtrado foi aplicado em uma coluna de cefarose (Qiagen) previamente
equilibrada com tampão QBT (NaCl 750 mM; MOPS 50 mM pH 7,0; etanol 15%
e Triton X-100 0,15 %). Após a aplicação do filtrado, a resina foi lavada com 600
mL de tampão QC (NaCl 1,0 M; MOPS 50 mM pH 7,0; etanol 15 %) e o DNA
plasmidial foi eluído com 30 mL de tampão QN (NaCl 1,25 M; MOPS 50 mM pH
7,0; etanol 15 %). O DNA eluído foi precipitado com isopropanol e centrifugado a
20.600 g por 45 minutos a 4°C. Finalmente o sedimento foi ressuspendido em
cerca de 1,0 mL de água estéril livre de endotoxinas.
3.3 - Quantificação e avaliação da integridade dos plasmídeos purificados
Após a purificação dos plasmídeos foi realizada a quantificação e a
avaliação da integridade dos produtos purificados. A quantificação dos
plasmídeos se fez em espectrofotômetro GeneQuant II
TM
(Amershan-Pharmacia,
17
BioSciences, USA), usando a razão obtida entre os comprimentos de onda de 260
e 280nm. A caracterização dos plasmídeos pcDNA3 e pcDNA3-HSP65 foi
realizada por padrão de restrição, utilizando-se as enzimas de restrição BamHI e
NotI (Invitrogen). Aproximadamente 1µg de cada plasmídeo foi incubada a 37°C
por 4 horas com as enzimas (1U/µg) e seus tampões. Os produtos da digestão de
cada amostra, bem como os plasmídeos não digeridos, foram submetidos a
eletroforese em gel de agarose 1%. As amostras foram ressuspendidas em tampão
de eletroforese seis vezes concentrado (0,25% azul de bromofenol; 40% de
sacarose em água) e o material submetido a eletroforese em tampão TAE (Tris-
acetato 40mM; EDTA 1mM pH 8,3). O padrão 1Kb Plus DNA Ladder
(Invitrogen) foi utilizado como marcador de peso molecular; o gel foi corado com
0,5mg/mL de brometo de etídio (Sigma) e a visualização das bandas foi feita em
luz ultravioleta no aparelho Image Master
®
VDS (Pharmacia Biotech, NJ, USA).
3.4 – Análise da pureza da vacina gênica
A determinação da presença de endotoxinas bacterianas no DNA
plasmidial foi realizada através do teste cromogênico usando o lisado de
amebócito de Limulus polyphemus (LAL), que é um teste quantitativo para
mensuração de endotoxinas de bactérias gram-negativas. Foi utilizado o “QCL-
1000 LAL kit - Quantitative Cromogenie” (Cambrex Bioscience Walkersville
Inc., Walkersville, MD, USA). Primeiramente, a endotoxina foi reconstituída
através da adição de 1 mL de água fornecida pelo próprio kit seguido de agitação
vigorosa e homogeneização em vórtex (Ika Works Inc., Wilmington, NC, USA)
por 15 min. Com o auxílio de uma seringa de 10 mL, foi reconstituído o substrato
18
cromogênico com a adição de 6,5 mL de água. O frasco foi protegido da luz e
posteriormente incubado em placa de 96 poços, a 37ºC, até o momento do uso. A
seguir, o LAL foi reconstituído pela adição de 1,4 mL de água com auxílio de
uma seringa. Uma vez com os reagentes reconstituídos, retirou-se a placa da
estufa e preparou-se a curva padrão através de diluições sucessivas da endotoxina
partindo de uma concentração 1 Unidade de Endotoxina por mL (UE/mL) até 0,1
UE/mL. Posteriormente as amostras foram depositadas na placa, adicionados 50
µL do LAL e incubada a 37ºC por 10 min. Com auxílio de uma micropipeta,
foram depositados 100L do substrato cromogênico em todos os poços (amostras
e curva), seguidos de homogeneização e incubação a 37ºC por 6 min.
Posteriormente foram acrescentados 100 L de uma solução de ácido acético 25%
para interrupção da reação. Finalmente foi feita a determinação das densidades
ópticas (D.O.) em espectrofotômetro Shimadzu UV 1650-PC (Shimadzu
Corporation, Hong Kong, Japan) a 405 nm. Os resultados foram obtidos pela
correlação da curva padrão com as diluições das amostras, levando-se em
consideração a absorbância e a concentração de endotoxina para cada uma das
amostras, em relação à curva padrão. A fórmula aplicada para calcular a
quantidade de LPS por micrograma de DNA foi:
UE/mL X diluição
UE/µg DNA =
________________________
amostra µg/mL
Consideram-se amostras livres de endotoxina, aquelas que apresentam
valores menores a 0,1 UE/µg DNA.
19
3.5 – Obtenção da proteína HSP65 recombinante
Bactérias E. coli ER2566 transformadas com o plasmídeo pET28a
(Novagen, USA) contendo o gene da HSP65 seguido por cauda de histina, foram
cultivadas em 2,5L de meio LB líquido (USB) contendo kanamicina na
concentração de 100g/mL e 300 mM do indutor Isopropiltio--D-Galactosídeo -
IPTG (Invitrogen), a 37°C sob agitação de 250 rpm por 18 h. Após incubação, as
bactérias foram coletadas por centrifugação a 5000g por 15 minutos em centrífuga
J2HS em rotor JS-7.5 (Beckman, Coulter, Inc, CA, USA), ressuspensas em 20 mL
de tampão fosfato e lisadas em gelo por ultassom, utilizando a sonda Vibra cell™
(Sonics & Materials Inc., Danbury, CT, EUA), com cinco pulsos de 30 segundos a
60 Hz. Após centrifugação a 20600g por 20 minutos, o sobrenadante foi
descartado e o sedimento ressuspenso em 30mL de tampão fosfato contendo uréia
a 2M. A suspensão foi então centrifugada a 20600g por mais 20 min e o
sobrenadante coletado e submetido à cromatografia de afinidade utilizando-se a
coluna HiTrap Chelating HP (Amersham Pharmacia), conforme o protocolo
especificado pelo fornecedor. A amostra de proteína foi eluída da coluna por
concentrações crescentes de imidazol. Após eluição a proteína foi dialisada contra
solução de fosfato tamponada (PBS) durante 16 h a 4°C.
Para a quantificação da proteína HSP65 recombinante utilizou-se
Coomassie® Protein Assay Reagent (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) e
para a quantificação de endotoxinas o teste QCL-1000 LAL kit – Quantitative
Cromogenie (CAMBREX Bioscience).
20
3.6 – Imunizações
Os animais C57BL/6 foram imunizados com 3 doses de plasmídeo
pcDNA3-HSP65 (100 µg/dose, com intervalos de 15 dias cada). O DNA
plasmidial foi diluído em sacarose 25%. As injeções foram feitas em dois sítios
(músculos quadríceps), usando 50 µL por injeção. Quinze ou trinta dias após a
última imunização, os animais foram sacrificados para obtenção de células T CD4
e CD8 HSP65 específicas.
3.7 – Separação dos linfócitos T CD4 e T CD8
Os animais C57BL/6, imunizados como descrito acima, foram
eutanasiados e seus baços retirados de maneira estéril. Os órgãos foram
macerados em meio RPMI 1640 (GIBCO™ Invitrogen Corporation, Grand Island,
NY, USA) e as hemácias foram lisadas com tampão contendo TRIS-base (0,17M
pH 7,65) e 0,16M de cloreto de amônio, estéril e livre de endotoxinas. Cada órgão
foi mantido em cultura com macrófagos peritoniais do próprio animal e 50 g de
HSP65 recombinante em RPMI 1640 (GIBCO), suplementado com 10% de soro
bovino fetal (SBF) (GIBCO), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100
mg/mL), gentamicina (10 mg/mL) (GIBCO) polimixina (30 g/mL) (Sigma) e
50mM de 2-mercaptoetanol (Sigma) por cinco dias a 37
o
C e 5% de CO
2.
Após a coleta das células não aderentes, foi feita a determinação do
número de células viáveis em câmara de Neubauer (corante azul de tripan).
Foram, então, ressuspendidas em tampão fosfato livre de cálcio e magnésio
contendo 2mM de EDTA e 0,5% de soro bovino fetal, e incubadas com o
anticorpo anti-CD8a ligado a beads magnéticas (MACS
MicroBeads system -
21
Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). As células marcadas
magneticamente ficam presas na coluna dentro de um campo magnético e a fração
livre de linfócitos CD8 é coletada para posterior marcação. Após a retirada da
coluna do campo magnético, obtivemos apenas as células CD8 positivas. A fração
restante é incubada posteriormente com beads ligadas ao anticorpo anti CD4. Da
mesma maneira as células marcadas ficam presas na coluna e as CD4 negativas
são eluídas. As células CD4 positivas são obtidas após a retirada do campo
magnético. Todo o processo foi feito seguindo-se o protocolo recomendado pelo
fabricante.
3.8 – Obtenção de células apresentadoras de antígeno
3.8.1 – Obtenção de células dendríticas provenientes de baço
Células totais de baço de camundongos C57BL/6 normais foram
maceradas e filtradas em filtros apropriados de nylon de 70 µm em meio RPMI
1640 (GIBCO) contendo 10% de soro fetal bovino (GIBCO). As células foram
lavadas com meio de cultura duas vezes a 400 g por 5 minutos (rotor 5810R –
Eppendorf, Hamburg, Germany) para eliminação dos debris celulares. Por fim,
foram ressuspendidas em 12 mL de meio RPMI com 10% de soro fetal bovino,
suplementado com piruvato, aminoácidos essenciais, 10 ng/mL de fator
estimulador de colônias de granulócitos e monócitos (GM-CSF) murino (BD
Pharmingen™, San Diego, CA, USA) e 1 ng/mL de TGF- (R&D System,
Minneapolis, MN, USA). Foram distribuídas em placas de seis poços de baixa
aderência (Costar® Corning Incorporated, Corning, NY, USA) e mantidas em
22
estufa de CO
2
5% a 37º C. Após quatro dias adicionou-se a cada poço 1 mL de
meio RPMI completo contendo as duas citocinas. Três dias após foram removidos
2 mL do meio e adicionou-se 2 mL de meio novo. Esse passo foi repetido a cada
dois dias, a partir de então. Após 14 dias as células dendríticas imaturas estavam
prontas para uso. A caracterização do fenótipo das células foi realizada por
FACSort™, usando o programa Cell Quest (BD Biosciences, Mountain View,
CA, USA). A figura 1 mostra a caracterizacão fenotípica das células obtidas.
Figura 1- Análise fenotípica das células dendríticas do baço por citometria de fluxo. As
células foram marcadas com anticorpos monoclonais anti-CD11c conjugado com FITC e anti-I-A
b
conjugado com PE (BD PharMingen). A análise foi feita no aparelho FACSort (BD Biosciences).
3.8.2 – Obtenção de macrófagos peritoniais e linfócitos B
Os macrófagos foram obtidos da cavidade peritonial por lavagem com
salina gelada e os linfócitos B por seleção negativa de células do baço.
Rapidamente, após a lise das hemácias (descrito anteriormente), as células do
baço foram incubadas com o anticorpo anti-CD43 ligado a beads magnéticas
(MACS
MicroBeads system – Miltenyi Biotec). A fração não marcada é
26.5%
64.5%
23
constituída por linfócitos B em repouso e é coletada seguindo-se o protocolo do
fabricante.
3.9 – Ensaios de apresentação de antígenos
3.9.1 – Eletroporação das células apresentadoras de antígeno
As células apresentadoras obtidas foram eletroporadas no GenePulser
Xcell™ (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA), a 300 V, 150 F e 100
, em meio Opti-MEM (GIBCO), com 10 g de pcDNA3-HSP65 ou vetor para
cada 1x10
6
células (5x10
6
/mL) e plaqueadas na concentração de 1x10
5
em placas
de 96 poços com fundo em U. As células foram mantidas em cultura a 37
o
C em
meio RPMI 1640 com 10% de SBF inativado, 2-mercaptoetanol e antibióticos
(completo) por três dias. Após esse período foram colocadas em contato por mais
três dias com 1x10
6
linfócitos T CD4 ou CD8 provenientes de animais imunizados
e sacrificados quinze ou trinta dias após a última dose. Como controles foram
utilizadas células eletroporadas somente com meio de cultura (mock) e linfócitos
T tratados com concanavalina A (4g/mL).
3.9.2 – Ensaio de linfoproliferação por CFSE
A proliferação dos linfócitos T CD4 e CD8, obtidos como descrito acima,
foi medida utilizando-se o corante citoplasmático carboxifluoresceína diacetato
succinimidil éster (CFSE) (Sigma). Os linfócitos T foram marcados com 2,5 M
do corante diluído em tampão fosfato estéril e livre de endotoxinas na
concentração de 5-10 x10
6
células/mL por cinco minutos a temperatura ambiente
24
com agitação periódica. O processo de marcação foi interrompido adicionando-se
5% de SBF, posteriormente as células foram lavadas com PBS e centrifugadas a
400 g por cinco minutos. Após serem ressuspendidas em meio RPMI completo as
células foram incubadas com as células apresentadoras de antígeno por três dias e
coletadas em PBS para a análise por citometria de fluxo (FACSort™ - BD
Bioscience)
3.10 – Determinação do perfil de citocinas por Reação em cadeia da
polimerase em tempo real (“Real-time PCR”)
3.10.1 – Co-cultura de células apresentadoras de antígeno e linfócitos T
Após a eletroporação, as células apresentadoras foram cultivadas na
densidade de 2x10
5
em placas de 24 poços por três dias a 37
o
C em meio RPMI
completo. Posteriormente, foram adicionados os linfócitos T CD4 e CD8 (obtidos
como descrito anteriormente, item 3.7) na concentração de 2x10
6
e deixados em
cultura por mais três dias. Após esse período o sobrenadante da cultura foi
coletado e as células foram congeladas em 1 mL de TriZol
®
(Invitrogen) para
análise de expressão gênica.
3.10.2 – Extração de RNA total
As células mantidas em TriZol
®
foram descongeladas e mantidas na
temperatura ambiente por cinco minutos para dissociação dos complexos
nucleoproteicos. Foram adicionados 200 L de clorofórmio com agitação manual
e posterior incubação de três minutos à temperatura ambiente. Após centrifugação
25
a 12000 g por quinze minutos a 4ºC, a fase aquosa foi separada e adicionada de
700 L de isopropanol gelado. As amostras foram incubadas a -70º C durante no
mínimo 16 horas para a precipitação do RNA. Posteriormente foi feita uma nova
centrifugação a 12000 g por quinze minutos a 4ºC, lavagem do precipitado com
etanol 75% gelado e secagem por dez minutos no gelo. O RNA foi ressuspendido
em 20 L de água livre de RNAses (GIBCO) e estocado a -70º C.
3.10.3 – Obtenção do DNA complementar (cDNA)
Todo o RNA obtido foi tratado com DNase I amplification grade
(Invitrogen) segundo o protocolo do fabricante. O DNA complementar foi
sintetizado a partir do primer oligo (dT)12-18 (Invitrogen) com a enzima
transcriptase reversa Superscript II (Invitrogen) em solução contendo tampão da
enzima, DTT, cloreto de magnésio e dinucleotídeos sintéticos (adenina, guanina,
citosina e timidina). O produto foi dosado por espectrofotometria nos
comprimentos de onda de 260 a 280nm utilizando-se o aparelho GeneQuant II
(Amershan-Pharmacia).
3.10.4 – Reação em cadeia da polimerase em tempo real (“Real-time PCR”)
Em cada reação foram utilizados 200 ng de cDNA, 0,1 g/L de cada
primer (sense e anti-sense) e Platinum
®
SYBR
®
Green qPCR SuperMix-UDG
(Invitrogen) em um volume final de reação de 25 L. A temperatura de
anelamento utilizada foi de 58ºC, e os genes amplificados e os primers utilizados
estão descritos na Tabela 1.
26
Tabela 1. Primers utilizados nas reações de PCR em tempo real
-actina sense AGC TGC GTT TTA CAC CCT TT
-actina anti-sense AAG CCA TGC CAA TGT TGT CT
GATA-3 sense AGG AGT CTC CAA GTG TGC GAA
GATA-3 anti-sense TTG GAA TGC AGA CAC CAC CT
T-bet sense CCC CTG TCC AGT CAG TAA CTT
T-bet anti-sense CTT CTC TGT TTG GCT GGC T
Foxp3 sense ACA ACC TGA GCC TGC ACA AGT
Foxp3 anti-sense GCC CAC CTT TTC TTG GTT TTG
As reações foram feitas no aparelho Rotor-gene (Corbett Life Science,
Mortlake, NSW, Australia) e a expressão relativa de cada gene nas amostras de
APCs eletroporadas com vetor ou vacina foi feita relação às eletroporadas com
meio de cultura, utilizando-se o programa Rotor-gene 6000. A amplificação da
beta-actina foi usada apenas como controle da integridade das amostras.
3.11 – Imunização de animais deficientes de linfócitos B com células
eletroporadas com pcDNA3-HSP65
Para transferência adotiva de células B foram utilizados camundongos
nocautes da cadeia µ de imunoglobulina (deficientes de linfócitos B) e C57BL/6,
SPF (Specific Patogen Free), com 6 a 8 semanas de idade.
3.11.1 – Transferência adotiva de linfócitos B eletroporados
Os linfócitos B foram eletroporados, como descrito anteriormente, e
injetados por via endovenosa pelo plexo retro-orbital de cada animal, deficiente
27
ou não de células B, na concentração de 1x10
6
por animal em salina. Os grupos
experimentais foram: animais que receberam linfócitos B eletroporados apenas
com meio de cultura (mock), eletroporados com o vetor pcDNA3 e eletroporados
com a vacina pcDNA3-HSP65.
3.11.2 – Imunofenotipagem das células do baço
Sete dias após a imunização os animais foram eutanasiados e o baço
retirado e macerado. Após determinação do número de células, estas foram
distribuídas em tubos de poliestireno, 1x10
6
células em 100L por tubo, e
incubadas durante 30 min, a 4ºC, com anticorpo anti-CD16/CD32 (Fc Block
TM
-
BD PharMingen), na concentração de 0,5g/10
6
células. Esta incubação visa
minimizar as ligações inespecíficas. Posteriormente, essas células foram
incubadas com os respectivos anticorpos monoclonais de interesse, de acordo com
a Tabela 2 (0,5 – 0,75g de anticorpo/1x10
6
células), durante 30 min, a 4ºC, no
escuro. Após o tempo de incubação as células foram lavadas com 2mL de PBS
contendo 2% de SFB, centrifugadas a 400 g, por 10 min a 4ºC e ressuspensas em
300l de PBS contendo 1% de formol tamponado para a fixação das células. As
preparações celulares foram adquiridas no aparelho FACSort
TM
(BD Bioscience).
Foram adquiridas 10.000 células por tubo, de acordo com parâmetros de tamanho
(foward side scatter - FSC), granularidade (side scatter - SSC) e intensidade de
fluorescência dos anticorpos marcados com ficoeritrina (PE), isotiocianato de
fluoresceína (FITC) e CyChrome 5 (Cy5).
Inicialmente, foi determinada a população de linfócitos, baseada nos
parâmetros FSC e SSC, para detecção das porcentagens de linfócitos T (CD4
+
e
28
CD8
+
). A expressão de CD44
hi
e CD62L
lo
ou CD62L
hi
foi analisada nas
populações de linfócitos CD4
+
ou CD8
+
pelo programa CellQuest® (BD
Biosciences).
Tabela 2. Anticorpos utilizados para imunofenotipagem celular de células do baço.
FITC PE
Cy5
Controle IgG2a de rato Controle IgG2a de rato Controle IgG2b de rato
CD4 CD8
CD62L CD44 CD4
CD62L CD44 CD8
3.11.3 – Preparo do inóculo de Mycobacterium tuberculosis
A suspensão de Mycobacterium tuberculosis, linhagem H37Rv (ATCC
27294) foi obtida a partir de uma alíquota congelada a -70º C, na qual foi
observada viabilidade superior a 85%. O volume total da alíquota (1 mL) foi
semeado em 2,5 mL de meio Middlebrook 7H9 (DIFCO Laboratories, Detroit,
MI, USA). A cultura foi incubada por sete dias, a 37º C. Após este período, a
cultura foi centrifugada a 2200 g por 20 minutos, o sedimento foi ressuspendido
em 1 mL de solução salina estéril e em seguida transferido para tubo contendo
pérolas de vidro. Esta suspensão foi agitada em vórtex (Ika Works Inc.) por 2 a 3
minutos até adquirir aspecto homogêneo. Adicionou-se salina estéril a esta
suspensão até que a mesma atingisse a turbidez equivalente à Escala de Mc
Farland n
o
1, o que equivale a uma concentração de 1x10
7
bacilos/mL. Para o
preparo do inóculo de infecção, diluiu-se a suspensão com turbidez equivalente à
escala numa proporção de dez vezes, obtendo-se assim uma suspensão com a
29
concentração de 1x10
6
bacilos/mL. A viabilidade da cultura foi verificada, de
acordo com a metodologia descrita por McDonough & Kress, incubando-se por
10 minutos a 37ºC, cerca de 100 L desta suspensão de bactérias com 100 L de
diacetato de fluoresceína a 2 g/mL (Acros Organics, New Jersey, USA) e 100 L
de brometo de etídeo a10 g/mL (Sigma). A seguir, a suspensão de micobactérias
foi observada em microscópio de fluorescência modelo Aristoplan (Leitz Wetzlar,
Germany). As bactérias viáveis apresentam coloração verde enquanto as bactérias
mortas coram-se com a solução de brometo, apresentando-se com uma coloração
avermelhada. Outros controles realizados foram: coloração de Ziehl-Neelsen,
contagem de bacilos presentes por mililitro de inóculo por meio da semeadura de
várias diluições do mesmo em meio 7H11 e a semeadura da cultura original em
ágar-sangue. Todos os procedimentos de cultura da micobactéria, preparo do
inóculo e desafio dos animais foram realizados em laboratório de biossegurança
nível III.
3.11.4 – Desafio com Mycobacterium tuberculosis
Sete dias após a imunização com a construção vacinal ou com vetor, cada
animal foi desafiado com 100µL da suspensão contendo 1x10
5
bacilos de M.
tuberculosis H37Rv por via intranasal. Como controle experimental, foi
acrescentado um grupo não imunizado que recebeu solução salina por via
intranasal ao invés do desafio com a bactéria.
30
3.11.5 – Coleta, digestão e obtenção de células do pulmão
Os lóbulos destinados aos ensaios de UFC (unidades formadoras de
colônia) e cultura de células, foram pesados, cortados em pequenos fragmentos e
transferidos para um tubo de fundo cônico de poliestireno de 50mL contendo 15
mL de solução de digestão estéril. Essa solução foi preparada em meio de cultura
RPMI-1640 incompleto contendo 0,5 µg/mL de Liberase (Liberase Blendzymez –
Roche, Basel, Switzerland) e 25 U/mL de Desoxiribonuclease I (GIBCO). Após a
adição da solução de digestão, os tubos foram incubados a 37ºC, sob agitação
constante, durante 30 minutos. Após a digestão as células foram dispersas com
auxílio de uma seringa de 10mL e centrifugadas a 400 g por 10 min, a 4ºC. O
sedimento foi ressuspenso em 1mL de RPMI-1640 incompleto. Uma alíquota de
100µL dessa suspensão foi retirada para o protocolo de UFC e o restante foi
novamente centrifugado e o sedimento ressuspenso em 5mL de meio RPMI-1640
contendo 10% de SFB para inibir a atividade da enzima liberase. As células
presentes foram separadas do restante da matriz digerida utilizando-se organza
estéril, seguida de lavagem da malha com mais 10mL de meio RPMI-1640
completo. As células obtidas foram centrifugadas a 400 g por 10 min, a 4ºC,
ressuspensas em 1mL de meio RPMI-1640 completo e contadas em câmara de
Neubauer. A concentração final foi acertada para 1x10
6
células/mL. Essas células
foram plaqueadas em placas de 24 poços (1ml por poço) e estimuladas com 10
g/ml de HSP65 recombinante ou lisado de micobactéria. Como controle negativo
um poço não recebeu estímulo e como controle positivo foi utilizada a
concanavalina A (40 g/ml). Após 48 horas o sobrenadante foi coletado para a
dosagem de citocinas por ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay).
31
3.11.6 – Obtenção do lisado de M. tuberculosis
Para a preparação do lisado de Mtb, foi utilizada uma alíquota de M.
tuberculosis da cepa H37RV (ATCC 27294) congelada a –70ºC (com viabilidade
superior a 85%). Cerca de 200L dessa alíquota foram distribuídos em 10mL de
meio Middlebrook 7H9 (DIFCO Laboratories, USA) enriquecido com
Middlebrook ADC
TM
(BD Biosciences, USA), e incubado por 7 dias a 37ºC. A
suspensão de micobactérias obtida foi centrifugada a 2200 g por 20 minutos e o
sedimento ressuspenso em 1mL de PBS estéril e agitado vigorosamente por 2 a 3
min em tubo contendo pérolas de vidro, até adquirir aspecto homogêneo. Após
serem homogeneizadas, as micobactérias foram mortas a 80ºC por 2 h, lisadas
pelo sonicador Vibra cell™ (Sonics & Materials), com aproximadamente 3 pulsos
de 60 Hz de 15 min cada, e filtradas em filtro 0,22m (Corning Incorporated).
A quantificação da quantidade de proteína foi feita por Coomassie®
Protein Assay Reagent (Pierce) e para a quantificação de endotoxinas o teste
QCL-1000 LAL kit – Quantitative Cromogenie (CAMBREX Bioscience).
3.11.7 – Ensaio imunoenzimático (ELISA) para a dosagem de citocinas no lisado
pulmonar após transferência adotiva e desafio com M. tuberculosis
Placas de 96 poços de poliestireno (Maxisorp Nunc-Immuno Plates,
Rochester, NY, USA) foram sensibilizadas com 100L da solução de anticorpo
monoclonal purificado específico para interleucina 5 (IL-5), interleucina 10 (IL-
10), IL-12 ou IFN- ( BD PharMingen) diluído em tampão de ligação (Na
2
HPO
4
0,1M pH 9,0) numa concentração final de 1mg/mL. As placas foram incubadas à
4ºC por 16h. Após sucessivas lavagens com solução PBS contendo 0,05% de
32
Tween 20 (Vetec, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) as placas foram incubadas com
200L/poço da solução de bloqueio, constituída de PBS contendo 10% de soro
bovino fetal, durante 1 hora, a temperatura ambiente. As placas foram novamente
lavadas e foram adicionadas 100L/poço das amostras juntamente com a curva
padrão de das respectivas citocinas recombinantes, diluídas em PBS/SBF
10%/Tween 0,05% e incubadas por 16h a 4°C. Após lavagem, foi feita incubação
por 1h a temperatura ambiente com os anticorpos monoclonais adequados
conjugados com biotina (BD Pharmingen), adicionando-se 100L/poço do
anticorpo diluído em PBS / SBF 10%/Tween 20 0,05% numa concentração final
de 0,5mg/mL. Após lavagem, adicionou-se 100L/poço de solução de avidina
biotina peroxidase StrepAB kitTM (Dako, Carpinteria, CA, USA) sendo incubada
por 30 minutos a temperatura ambiente. As placas foram reveladas pela adição do
substrato OPD (Sigma) após novo procedimento de lavagem. A reação foi
interrompida pela adição de 50L/poço de ácido sulfúrico 16% (Merck,
Germany). A leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro de placa
(µQuant, Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA) a 490 nm. A
determinação das concentrações de citocinas nas amostras foi feita por
interpolação dos resultados de absorbância obtidos em relação aos da curva
padrão.
33
3.11.8 – Ensaio imunoenzimático para a dosagem de Fator de Necrose Tumoral-
alfa (TNF-) no sobrenadante do lisado pulmonar
A dosagem de TNF foi feita utilizando-se o kit BD OptEIA™ Set (BD
Biosciences, San Diego, CA, USA) seguindo-se o protocolo do fabricante. As
placas fornecidas são sensibilizadas pelo anticorpo de captura e incubadas a à 4ºC
por 16h. Após lavagem com solução PBS contendo 0,05% de Tween 20 (Vetec),
foi realizado o bloqueio por uma hora e adição das amostras e curva padrão. Após
incubação por duas horas a temperatura ambiente, foi adicionado o anticorpo
biotinilado juntamente com a solução de detecção fornecida. Uma hora depois a
placa é lavada e a solução com o substrato tetrametilbenzidina (TMB) é
adicionada. A reação é interrompida pela adição de ácido sulfúrico 2N. A leitura
da absorbância foi realizada em espectrofotômetro de placa (Quant Bio-Tek
Instruments Inc.) a 450 nm. A determinação das concentrações de citocinas nas
amostras foi feita por interpolação dos resultados de absorbância obtidos em
relação aos da curva padrão.
3.11.9 – Determinação do número de unidades formadoras de colônia (UFC) de
M. tuberculosis
A partir da alíquota de 100L do pulmão digerido (item 3.11.5), foram
feitas diluições em PBS 1X de 10, 100, 1000 e 10000 vezes. As diluições (100L)
foram plaqueadas em meio sólido 7H11, 7H9 (Difco™ BD, Sparks, MD, USA)
acrescido de ágar bacteriológico (Difco™ BD). Foram adicionados 100L de cada
diluição sobre as placas, as quais foram vedadas e incubadas a 37ºC por 30 dias.
Após o período de incubação, as colônias de micobactérias foram contadas, o
34
número de colônias foi corrigido de acordo com as diluições e o peso dos pulmões
e expresso em Log
10
do número de UFC por pulmão.
3.11.10 – Análise histológica
Para a análise histológica do pulmão dos animais desafiados, imunizados
ou não, o lóbulo superior direito do pulmão de cada animal foi coletado e fixado
em formol tamponado com fosfato. O material foi processado e foram realizados
os cortes histológicos (5m). As lâminas obtidas foram coradas com Hematoxilina
e Eosina e analisadas em microscópio de luz (Nikon Eclipse, Japan). As análises
foram realizadas pela Prof Dra Simone Gusmão Ramos do Departamento de
Patologia, da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP.
3.12 – Análise estatística
Para realização da análise estatística utilizou-se o programa GraphPad
Prism 4.0 (GraphPad Software Inc.) e foi empregado o teste ANOVA seguido do
teste de Tukey.
35
4 - RESULTADOS
4.1 – Avaliação do perfil dos linfócitos T induzidos pelas diferentes APCs,
após vacinação com DNA plasmidial
Para avaliarmos a capacidade de apresentação de antígenos após o
estímulo com DNA vacinal optamos, inicialmente, por transfectar as APCs
utilizadas, células B, macrófagos e células dendríticas, com 20 ug de DNA
plasmideal pcDNA3-HSP65, irradiar as APCs e, após diferentes tempos, avaliar a
proliferação celular por incorporação de timidina a e produção de IL-2. Os
resultados obtidos não foram conclusivos apresentando muita variação (dados não
mostrados). Partimos então para uma nova estratégia envolvendo eletroporação.
4.2 – Ensaios de apresentação de antígenos por células eletroporadas
Quinze dias após a terceira imunização com pcDNA3-HSP65, os animais
foram eutanasiados e células totais do baço foram reestimuladas in vitro com a
proteina HSP65 recombinante, durante cinco dias. Após esse período, os
linfócitos T CD4 e T CD8 específicos foram purificados, marcados com CFSE, e
colocados frente a células apresentadoras de antígeno, previamente eletroporadas
com o plasmídeo pcDNA3-HSP65. Após três dias de co-cultivo os linfócitos
foram recuperados e analisados por citometria de fluxo para verificar a
linfoproliferação. Como mostra a figura 2, nenhuma das APCs utilizadas foi capaz
de induzir proliferação estatisticamente significativa, nem na população CD4,
nem CD8. Assim, nosso próximo passo foi avaliar a linfoproliferação 30 dias após
o processo de imunização, utilizando o mesmo delineamento. A
figura 3 mostra
36
que tanto os macrófagos quanto os linfócitos B, eletroporados com pcDNA3-
HSP65, foram capazes de induzir proliferação, estatisticamente significante, dos
linfócitos T CD4 e T CD8 HSP65 específicos, quando comparado aos controles.
No entanto, as células dendríticas mostraram apenas uma pequena porcentagem de
indução apenas na população CD8, que não foi estatisticamente significante, em
relação aos demais grupos. A indução da proliferação da população CD4 foi
mínima.
37
Figura 2. Proliferação de linfócitos T CD8 e T CD4 obtidos 15 dias após a imunização com
pcDNA3-HSP65. As células T CD4 e CD8 foram isoladas do baço dos animais 15 dias após a
última dose da vacina e incubadas por três dias junto às células apresentadoras de antígeno
previamente submetidas a eletroporação com o vetor pcDNA3 ou pcDNA3-HSP65. Eletoporação
controle foi feita apenas na presença de meio. A porcentagem de proliferação foi avaliada por
citometria de fluxo usando o corante CFSE. O gráfico representa a média e desvio padrão de dados
de três animais induviduais. Os resultados foram repetidos duas vezes.
C D 8
Macrófagos Linfócitos B Células dendríticas
0
10
20
30
40
M e io
p c D N A 3 -H S P 6 5
p c D N A 3
cé lu la s a p r es e n t ad o r a s d e a n tíg en o
% proliferação
C D 4
Macrófagos Linfócitos B Células dendríticas
0
10
20
30
40
c é lu la s a p r e s e n t a d o r a s d e a n t íg e n o
% proliferação
38
Figura 3. Proliferação de linfócitos T CD8 e T CD4 obtidos 30 dias após a imunização com
pcDNA3-HSP65. As células T CD4 e CD8 foram isoladas do baço dos animais 15 dias após a
última dose da vacina e incubadas por três dias junto às células apresentadoras de antígeno
previamente submetidas a eletroporação com o vetor pcDNA3 ou pcDNA3-HSP65. Eletoporacão
controle foi feita apenas na presença de meio. A porcentagem de proliferação foi avaliada por
citometria de fluxo usando o corante CFSE como descrito na figura 2.
* p< 0,05 em relação aos demais estímulos (ANOVA seguido de Tukey).
C D 8
macrófagos linfócitos B células dendríticas
0
10
20
30
M e io
p c D NA 3 -H S P 6 5
p c D NA 3
*
*
C é lu las ap r esen tad or a s
% proliferação
C D 4
macrófagos linfócitos B células dendríticas
0
10
20
30
*
*
C é lu las ap r es en t ad o ra s
% proliferação
39
4.3 – Análise do perfil de citocinas induzido nas células T CD4 e T CD8 frente
a diferentes APCs.
Para determinar o perfil de citocinas dos linfócitos T CD4 e T CD8
induzidos pelas diferentes APCs realizamos PCR em tempo real para detecção de
GATA-3, T-bet e Foxp3 (Figuras 4 e 5). Os linfócitos B induziram a expressão de
GATA-3 e T-bet nos linfócitos T CD8 e, principalmente, de Foxp3 nos linfócitos
T CD4 obtidos quinze dias após a última imunização (Figura 4A). Nesse período,
os linfócitos estimulados pelos macrófagos não mostraram padrão fenotípico
definido (Figura 4B). As células dendríticas também induziram a expressão de
Foxp3 apenas nos linfócitos T CD4, como observado para os linfócitos B (Figura
4C e 4A, respectivamente). No entanto,quando a análise foi realizada após trinta
dias, a expressão de T-bet nas células T CD8 estimuladas pelos linfócitos B
apresentou aumento relativo de expressão, enquanto que com GATA 3 isso não
ocorreu (Figura 5A). Com relação aos linfócitos CD4 as células B não
mantiveram a expressão observada aos 15 dias para nenhum dos marcadores
(Figura 5A). Por outro lado, nesse período, os macrófagos passaram a induzir a
expressão de Foxp3 e também de T-bet apenas na população de linfócitos T CD4
(Figura 5B). Curiosamente as células dendriticas, por sua vez, também alteraram
drasticamente a indução na expressão dos marcadores 30 dias após. A Figura 5C
mostra que nem os linfócitos T CD4 nem T CD8 mostraram expressão dos
marcadores avaliados.
40
Figura 4. Quantidade relativa de expressão de GATA-3, T-bet e Foxp3 em linfócitos TCD4 e
CD8 estimulados com diferentes APCS. Linfócitos T CD4 e CD8 obtidos de baço de animais 15
dias após a imunização com três doses de pcDNA3-HSP65 foram incubados como descrito
anteriormente e colocados em cultura com as células apresentadoras de antígeno, previamente
eletroporadas na presença apenas de meio, de pcDNA3 ou de pcDNA3-HSP65. As células foram
coletadas para a extração de RNA e avaliação da expressão gênica. O aumento de expressão está
representado considerando-se a célula eletroporada somente com meio de cultura como padrão.
GATA-3
T-bet Foxp3
GATA-3
T-bet Foxp3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Linfócitos B + T CD8 Linfócitos B + T CD4
quantidade relativa
GATA-3 T-bet Foxp3 GATA-3 T-bet Foxp3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Macrófagos + T CD8 Macrófagos + T CD4
pcDNA3
pcDNA3-HSP65
quantidade relativa
GATA-3 T-bet Foxp3 GATA-3 T-bet Foxp3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
células dendríticas + T CD8 céulas dendríticas + T CD4
quantidade relativa
A
B
C
41
Figura 5. Quantidade relativa de expressão de GATA-3, T-bet e Foxp3 em linfócitos TCD4 e
CD8 estimulados com diferentes APCS. Linfócitos T CD4 e CD8 obtidos de baço de animais 30
dias após a imunização com três doses de pcDNA3-HSP65 foram incubados como descrito
anteriormente e colocados em cultura com as células apresentadoras de antígeno, previamente
eletroporadas na presença apenas de meio, de pcDNA3 ou de pcDNA3-HSP65. As células foram
coletadas para a extração de RNA e avaliação da expressão gênica. O aumento de expressão está
representado considerando-se a célula eletroporada somente com meio de cultura como padrão.
A
B
C
30 dias
GATA-3 T-bet Foxp3 GATA-3 T-bet Foxp3
1.0
1.5
2.0
Linfócitos B + T CD8 Linfócitos B + T CD4
quantidade relativa
GATA-3 T-bet Foxp3 GATA-3 T-bet Foxp3
1.0
1.5
2.0
Macrófagos + T CD8 Macrófagos + T CD4
pcDNA3-HSP65
pcDNA3
quantidade relativa
GATA-3 T-bet Foxp3 GATA-3 T-bet Foxp3
1.0
1.5
2.0
células dendríticas + T CD8 céulas dendríticas + T CD4
quantidade relativa
42
4.4 – Ensaios de transferência celular para animais deficientes de linfócitos B
4.4.1 – Imunofenotipagem de células de memória
Baseados nos dados da proliferação, onde as células B se mostraram mais
efetivas na ativação principalmente de linfócitos T CD8 e nos dados de real time,
onde 30 dias após a vacinação as células B eram capazes de induzir população de
célula T CD8 T-bet +, optamos por avaliar a real importância de linfócitos B in
vivo, usando modelos de transferência adotiva, em animais deficientes de células
B (BKO). Além disso, é o único modelo disponível para avaliar APC nesse
sentido. Desse modo, células B foram eletroporadas com pcDNA3-HSP65 e
transferidas para os animais deficientes de linfócitos B. Após sete dias da injeção
das células, avaliamos o fenótipo das populações T CD4 e T CD8. Podemos
observar, pela análise da figura 6, que após a transferência das células B
transfectadas com HSP65, houve aumento da população TCD8 CD44
hi
no baço
dos animais deficientes de células B, quando comparados aos animais selvagens
(WT). Por outro lado, a porcentagem de células T CD4 com fenótipo CD44
hi
não
mostrou diferença entre os animais WT e animais deficientes de células B.
Quando analisamos a expressão de CD62L em células CD44
hi
notamos
também que apenas as células T CD8 apresentaram alta expressão desse marcador
nos animais BKO que receberam linfócitos B eletroporados com pcDNA3-HSP65
em relação aos animais selvagens que receberam o mesmo tratamento, ou mesmo
quando as células foram eletroporadas com o vetor sem inserto (Figura 7).
43
Figura 6. Análise fenotípica de células do baço. Fenotipagem por citometria de fluxo de células
do baço de animais sete dias após a transferência adotiva de linfócitos B (1x 10
6
) previamente
eletroporados com pcDNA3-hsp65, com o vetor ou apenas meio (mock).
p< 0,05 em relação ao animal selvagem (ANOVA seguido de Tukey)
CD8 CD44
hi
mock pcDNA3 pcDNA3-HSP65
0
10
20
30
40
50
60
*
C57Bl/6
KO Linfócitos B
% células
CD4 CD44
hi
mock pcDNA3 pcDNA3-HSP65
0
10
20
30
40
50
60
C57Bl/6
KO Linfócitos B
% células
44
Figura 7. Análise fenotípica de células de memória após transferência adotiva de células B
transfectadas com vacina. Fenotipagem por citometria de fluxo de células do baço de animais
que receberam transferência adotiva de linfócitos B (1x 10
6
) previamente eletroporados com
pcDNA3-hsp65, com o vetor ou apenas meio (mock).*p< 0,05 em relação ao animal selvagem que
recebeu linfócitos B eletroporados com pcDNA3 ou pcDNA3-HSP65 (ANOVA seguido de
Tukey).
CD4
CD44 hi
CD62L lo
CD44 hi
CD62L hi
0
5
10
15
% células
CD8
CD44 hi
CD62L lo
CD44 hi
CD62L hi
0
5
10
15
*
% células
B KO + Linfo B
B KO + Linfo B pcDNA3
BKO + Linfo B pcDNA3-HSP65
WT + Linfo B
WT + Linfo B pcDNA3
WT + Linfo B pcDNA3-HSP65
45
4.4.2 – Proteção contra infecção experimental por M. tuberculosis
Diante dos resultados obtidos, decidimos testar a capacidade de linfócitos
B transfectados in vitro com o pcDNA3-HSP65 em conter a infecção, tanto em
animais selvagens como nos deficientes de células B. Comparando-se com os
animais selvagens, os animais deficientes de células B que receberam
transferência adotiva de linfócitos B transfectados com a vacina, mostraram
redução de unidades formadoras de colônia (UFC). Os animais deficientes,
reconstituídos com as células eletroporadas com vetor ou o mock, mostraram
número de unidades formadoras de colônia (UFC) semelhante ao animal
“knockout” que recebeu as células transfectadas com pcDNA3-HSP65. Entre os
animais selvagens não houve diferença. (Figura 8).
46
Figura 8. Determinação das unidades formadoras de colônia (UFC) de Mycobacterium
tuberculosis no pulmão dos animais após a transferência adotiva de células B. Animais
selvagens ou deficientes de células B receberam, por via endovenosa, 1x 10
6
células B
eletroporados apenas com meio, pcDNA3 ou pcDNA3-HSP65. Sete dias após foram desafiados
com 1x 10
5
micobacterias e após 30 dias foram eutanasiados para retirada do pulmão e detecção da
UFC.*p< 0,05 em relação aos grupos de animais selvagens tratados com linfócitos B apenas ou
com transfectados pela vacina.
B
KO
-
H
s
p6
5
B
K
O-
Ve
tor
B
K
O-S
a
li
na
BKO-B+pc
D
NA
3
H
s
p6
5
BK
O
-
B
+pcD
N
A3
BKO-B
+
Meio
0
1
2
3
4
5
6
7
log10 CFU/pulmão
*
47
Nosso próximo passo foi avaliar o perfil de citocinas das células
pulmonares nos animais que receberam ou não a transferência adotiva de
linfócitos B e que foram, posteriormente, desafiados com Mtb. Assim optamos
por avaliar as principais citocinas do padrão Th1 e Th2, na tentativa de
correlacionar esses dados com a proteção observada pela UFC.
Após 30 dias, o perfil de citocinas mostra que a produção de IL-12 pelos
animais deficientes de células B e selvagens não mostrou diferença
estatisticamente significante entre si, quando estimulados com o lisado de Mtb ou
com proteína HSP65 (Figuta 9A). Interessantemente, a produção de IFN- γ ,
(Figura 9A) e TNF-α (Figura 9B) só foi observada nas células pulmonares dos
animais selvagens em resposta ao em estímulo ao lisado de Mtb. A produção após
a transferência de células B eletroporadas não mostrou significância quando
comparado ao estímulo de micobatéria ou animais selvagens. A produção de IL-
10 também se mostrou semelhante em ambos os grupos, após o estímulo com
lisado de Mtb (Figura 9B), embora, novamente, a transferência de linfócitos B não
levou a procudução significativa das citocinas avaliadas. Não foi possível a
detecção de IL-5 em nenhumas das amostras (dados não mostrados).
48
Figura 9A. Produção de IL-12 e IFN-γ
γγ
γ no sobrenadante de cultura de células do pulmão,
que receberam células B e foram desafiados com M. tuberculsois. Os animais foram
imunizados com linfócitos B eletroporados apenas com meio, pcDNA3 ou pcDNA3-HSP65 e
transferidos, por via endovenosa, para animais defecientes ou não de células B. Após sete dias
foram desafiados com M. tuberculosis e eutanasiados trinta dias após a infecção para retirada do
pulmão. As células pulmonares foram colocadas em cultura na presença de proteína HSP65
recombinante (rHSP65) ou lisado de micobactéria (Mtb). Após 48 horas o sobrenadante foi
coletado para dosagem de citocinas.
* p< 0,05 em relação as células que não receberam estímulo (meio) em cada grupo.
IL-12
BKO meio BKO vetor BKO hsp65 WT meio WT vetor WT hsp65 WT branco
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
*
*
*
pg/ml
IFN-γ
γγ
γ
BKO meio BKO vetor BKO hsp65 WT meio WT vetor WT hsp65 WT branco
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
*
*
*
pg/ml
meio
rHSP65
Mtb
49
Figura 9B. Detecção de IL-10 e TNF-α
αα
α no sobrenadante de cultura de células do pulmão, que
receberam células B e foram desafiados com M. tuberculsois. Os animais foram imunizados
com linfócitos B eletroporados apenas com meio, pcDNA3 ou pcDNA3-HSP65 e transferidos, por
via endovenosa, para animais defecientes ou não de células B. Após sete dias foram desafiados
com M. tuberculosis e eutanasiados trinta dias após a infecção para retirada do pulmão. As células
pulmonares foram colocadas em cultura na presença de proteína HSP65 recombinante (rHSP65)
ou lisado de micobactéria (Mtb). Após 48 horas o sobrenadante foi coletado para dosagem de
citocinas. * p< 0,05 em relação as células que não receberam estímulo (meio) em cada grupo.
meio
rHSP65
Mtb
IL-10
BKO meio BKO vetor BKO hsp65 WT meio WT vetor WT hsp65 WT branco
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
*
*
*
*
*
pg/ml
TNF-α
αα
α
BKO meio BKO vetor BKO hsp65 WT meio WT vetor WT hsp65 WT branco
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
pg/ml
50
A análise histológica do pulmão, realizada no mesmo dia da retirada de
células para avaliação das citocinas, mostrou uma nítida diferença do padrão
inflamatório dos animais selvagens e os deficientes de linfócitos B. Os animais
selvagens apresentaram uma inflamação mais localizada, sem grandes diferenças
entre os três grupos experimentais (Figura 10). Já os animais deficientes de
células B apresentaram um maior infiltrado inflamatório e de aspecto mais difuso,
principalmente os animais que receberam linfócitos B transfectados com a vacina
pcDNA3-HSP65, com aproximadamente 90% do parênquima comprometido. A
transferência de céulas B transfectadas apenas com o vetor também causou
infiltrado inflamatório, enquanto que os linfócitos B não transfectados induziram
menos inflamação (50-60%), com uma tendência de reação multifocal mais
parecida com os animais selvagens. (Figura 11)
51
Figura 10. Cortes histológicos de pulmão de animais selvagens após a transferência adotiva e
desafio com micobactéria. Após obtenção dos pulmões, os mesmos foram submetidos a
tratamento adequado e os cortes corados por hematoxilina-eosina e analisados em microscópio
óptico. Foto com aumento 100x.
WT – B+pcDNA3-HSP65 WT – B+pcDNA3
WT – B+meio
Não infectado
52
Figura 11. Cortes histológicos de pulmão de animais deficienetes de células B, após
transferência adotiva e desafio com micobacteria. Após obtenção dos pulmões, os mesmos
foram submetidos a tratamento adequado e os cortes corados por hematoxilina-eosina e analisados
em microscópio óptico. Foto com aumento 100x.
BKO – B+pcDNA3-HSP65 BKO – B+pcDNA3
BKO – B+meio
Não infectado
53
5 - DISCUSSÃO
Os resultados apresentados nesse trabalho mostram que após a vacinação
com DNA plasmidial, pela via intramuscular, ocorre ativação de linfócitos T CD4
e T CD8 antígeno específicos, cuja cinética se altera no decorrer do processo de
vacinação. Baseado nos ensaios in vitro, o tipo de célula apresentadora de
antígeno envolvida na estimulação desse linfócito parece desempenhar papel
crucial no seu desenvolvimento. Além disso, esse trabalho mostra a importância
dos linfócitos B nesse tipo de estratégia vacinal, quer seja como APC ou com ação
de imunorregulação.
A resposta imune induzida após a vacinação com DNA plasmidial, de
modo geral, pressupõe que após a entrada do plasmídeo em uma célula
eucariótica, o mesmo seja transcrito e traduzido. Do ponto de vista imunológico, a
indução da resposta imune ocorreria de forma eficiente se o DNA plasmidial fosse
capturado, principalmente, por células apresentadoras de antígeno profissionais
(Gurunathan, Klinman et al., 2000). Dessa forma, optamos por avaliar in vitro,
inicialmente, a influência da APC na ativação de linfócitos T CD4 e T CD8 pré-
estimulados in vivo, após o processo de vacinação.
Em nossos primeiros experimentos, as diferentes células apresentadoras de
antígeno foram estimuladas in vitro com DNA plasmidial e, após diferentes
tempos, irradiadas e colocadas frentes a linfócitos TCD4 ou TCD8 provenientes
dos animais vacinados, cuja última dose ocorrera quinze dias antes. A capacidade
de apresentação antigênica foi avaliada por linfoproliferação medida pela
incorporação de timidina tritiada e produção de interleucina 2. No entanto, em
54
todos ensaios realizados, não houve proliferação dos linfócitos induzida por
nenhuma célula apresentadora. Como a viabilidade celular dos linfócitos T CD4 e
T CD8 foi checada antes da incubação, excluímos a possibilidade que a morte dos
mesmos pudesse ser responsável pela ausência de proliferação. Por outro lado, os
lotes de timidina muitas vezes apresentam problemas, ou mesmo o processo de
irradiação pode ter interferido com os resultados. Acreditamos que alguma
alteração nesse sentido foi responsável pelos dados negativos obtidos (dados não
mostrados). Optamos, então, pelo ensaio usando a coloração com CFSE.
Quinze dias após a terceira imunização com pcDNA3-HSP65, os animais
foram eutanasiados para obtenção dos linfócitos T CD4 e CD8 HSP65
específicos. Esses linfócitos T, quando colocados frente a células apresentadoras
de antígeno, eletroporadas com o plasmídeo contendo o gene para HSP65, não
foram capazes de proliferar (Figura 2), sugerindo que nessa fase ainda não há um
número substancial de células T CD4 ou CD8 HSP65 específicas para reestímulo
in vitro. A hipótese de que a não responsividade das células T poderia ser
decorrente da não expressão da HSP65 pelas APCS pode ser descartada, desde
que nos experimentos de 30 dias observou-se a proliferação de células T (Figura
3). Ao analisarmos o padrão de expressão de marcadores nessas células,
observamos que tanto linfócitos B como células dendríticas induziram
preferencialmente a ativação de uma população de linfócitos T CD4 com
marcador para Foxp3, porém um menor numero de células também estava
comprometida com a expressão de GATA 3 e T-bet (quando a APC foi célula B)
(Figura 4). Assim, curiosamente, podemos inferir que nessa fase pós vacinação, as
células T CD4 predominantes são do tipo T reguladoras (Treg), o que poderia
55
explicar a ausência da linfoproliferação observada na figura 2. Interessantemente,
nessa fase, a população de T CD8 foi mais ativada por células B e exibiram maior
expressão do fator GATA3. Macrófagos nessa fase não induziram a expressão de
nenhum dos marcadores usados (Figura 4). Em conjunto, nossos resultados
sugerem um cenário oposto ao esperado, após 15 da ultima dose vacinal. Nesse
período, pelos dados de literatura, esperava-se que a maioria das células T
ativadas apresentassem um padrão de resposta do tipo Th1, no entanto, nossos
dados mostram que nessa fase os linfócitos TCD4 HSP65 específicos mostram
populações comprometidas com o padrão Th2 e Th1 (GATA 3 e T-bet,
respectivamente), podendo ser caracterizado como um padrão misto de resposta, o
que muitas vezes se reflete nos isotipos de imunoglobulinas encontrados. No
entanto, surpreendentemente, a maior população de células T CD4 parece ser do
tipo regulatória, ou Treg. O aumento de células Treg foi vista nessa fase,
principalmente, quando estimulada por células B. Embora não tenhamos dados
suficientes, podemos sugerir que a presença de altas doses de DNA, com motivos
CpGs, leva a uma estimulação inespecífica, cuja ação das células Treg seria
necessária.
Do ponto de vista da vacinologia esses fatos trazem implicações
importantes, principalmente quando o desafio é feito 15 dias depois. No cenário
que mostramos a chance de uma resposta imune efetora eficiente fica
comprometida se a intenção é a proteção conferida por um padrão Th1. Nesse
caso, um tempo maior entre a última imunização pode ser preferencial.
Trinta dias após o processo de imunização, tanto os macrófagos quanto os
linfócitos B, foram capazes de induzir proliferação dos linfócitos T CD4 e CD8.
56
Porém, um fato que nos chamou a atenção foi que as células dendríticas não
foram eficientes em induzir a linfoproliferação das células específicas, obtidas
nesse período (Figura 3). Embora o processo de eletroporação possa ser mais
drástico para um tipo celular do que para outro, acreditamos que a ausência de
linfoproliferação não seja devido a tal fato. As evidências que suportam nossa
hipótese são: a) embora não estatisticamente significante, houve indução
proliferação células T CD8 (Figura 3) e indução de marcadores celulares (Figura
4); b) o protocolo de eletroporação é o mesmo usado em diferentes trabalhos
(Ribas, 2005; Artusio, Hathaway et al., 2006; Landi, Babiuk et al., 2007). Desse
modo, a partir de nossos dados in vitro podemos inferir que, 30 dias após a
vacinação, as principais células envolvidas na apresentação de antígeno são as
células B e macrófagos, induzindo a linfoproliferação de ambas as populações de
linfócitos T. Além disso, os dados da figura 5 mostram que aos 30 dias após a
vacinação os linfócitos HSP65 específicos, quando estimulados por linfócitos B,
in vitro, apresentavam um compromentimento com padrão Th1, devido a
expressão de T-bet, enquanto os linfócitos T CD4 quando estimulados por
macrófagos apresentavam aumento relativo na expressão de Foxp3, possivelmente
atuando como célula T reguladora nesse período também. As células dendríticas
nessa fase parecem não participar efetivamente da manutenção da população de
células T. Esses dados podem servir como base para delineamentos experimentais
em vacinologia, onde a alteração da data de desafio pode comprometer toda a
resposta imune protetora.
Do ponto de vista vacinal, esses resultados mostram dados inéditos e que
podem esclarecer alguns mecanismos em vacinas de DNA e/ou levar a
57
intervenções mais eficazes, com uso de menores doses desafio, uso de sistemas de
liberação controlada ou mesmo o tempo decorrido entre o final da vacinação e o
desafio. Assim, extrapolando nossos resultados para outros modelos de vacinas de
DNA, quando o desafio é dado após sete ou 14 dias após a última dose, o
microambiente não estará propício para o desenvolvimento de uma resposta
imunitária, pois a população de células T CD4 seria do tipo T reguladora, quer
seja estimulada por uma célula B ou por uma célula dendrítica. Como as células
Tregs estão associadas ao controle da resposta imune, alguns autores têm
mostrado a presença de Treg regulando a população de células T CD8 de memória
contra o vírus do herpes simples (Toka, Suvas et al., 2004). Além disso, no
período citado, as células dendríticas ativam populações T CD4 que apresentam a
expressão de GATA-3+ e Foxp3, comprometidas com a repsota Th2 e regulatória,
o que culminaria num microambiente mais regulador do que indutor da resposta
imune. Assim, como já comentado, essa fase não seria a ideal para se verificar a
eficácia de uma vacina de DNA para microorganismos que precisam de ação de
Th1 para controle. Por outro lado, após 30 dias, o microambiente embora continue
apresentando células T CD4 com perfil de T reguladoras após estímulo com
macrófago, apresentam também células T CD8 induzidas por linfócitos B (Figura
5). A presença de células Treg nessa fase pode tanto inibir a eficácia da vacina,
como controlar uma resposta imune exacerbada. Interessantemente, como a
maioria dos desafios são realizados 30 dias ou mais após a ultima dose, é possível
que a presença de linfócitos TCD8-Tbet+ atue como efetores da resposta Th1. No
entanto, a presença de linfócitos TCD4 Foxp3+, nessa mesma fase, deve ser
levada em consideração tanto do ponto de vista do controle de uma resposta
58
exacerbada, como na inibição da ação das células Th1. Assim, somente após um
delineamento experimental com o uso da construção vacinal em questão, poderá
se estabelecer o melhor esquema vacinal.
Nos dados apresentados até o momento, três fenômenos chamam a
atenção: a) após a vacinação com DNA plasmidial, pela via intramuscular, o
padrão ou fenótipo da célula T proveniente do baço a ser ativada parece depender
da APC que o ativará; b) diferentes APCs participam mais ativamente em
determinadas fase pós- vacinação e c) linfócitos B podem fazer apresentação
cruzada (cross priming ), ativando linfócitos T CD8
+
.
A ativação por cross priming é um fenômeno comum em células
dendríticas (Brode e Macary, 2004), e também foi observada em nossos dados
após 30 dias da vacinação, mas não aos 15 dias. Assim, durante a ativação da
resposta imune por vacinas de DNA, veiculadas nu e por via intarmuscular, parece
que todas as APCS são capazes de desempenhar o cross priming, amplificando a
resposta imunitária. Aqui cabe ressaltar que o antígeno utilizado é uma proteína
de choque térmico e esse tipo de antígeno tem envolvimento direto com cross-
priming (Srivastava, 2002). Assim, não podemos excluir que tais características
de apresentação cruzada sejam ligadas apenas à vacinação de DNA e a rota e dose
utilizadas.
Do ponto de vista das células B, elas são as únicas que participam da
indução dos linfócitos quer seja aos 15 ou 30 dias após a vacinação, sugerindo um
envolvimento efetivo nesse tipo de vacinação. Coelho-Castelo et al (2003)
mostraram que após a imunização intramuscular, o DNA poderia ser capturado e
expresso também por linfócitos B. Na época levantou-se a hipótese de que células
59
B pudessem participar como APC após a vacinação com DNA plasmideal. Os
dados mostrados nesse trabalho comprovam a hipótese aventada e, além disso,
mostram que as células B podem também participar de mecanismos de
apresentação cruzada desde que foi capaz de estimular in vitro células T CD8.
Esse resultado é interessante, pois até o momento as células envolvidas em
apresentação cruzada nesse modelo, eram macrófagos e células dendríticas
(Gurunathan, Klinman et al., 2000; Liu, Wahren et al., 2006)
Os linfócitos B participam ativamente durante a indução da ativação de
linfócitos T e, aos 30 dias, pode-se perceber que como APC induz células do
padrão Th1, sendo assim um componente importante na indução da resposta
imunitária, após a vacinação com DNA plasmidial.
Em geral, a ativação de célula CD8 é dependente de CD4 (Castiglioni,
Gerloni et al., 2005). No caso específico das vacinas de DNA é de se esperar uma
ativação maior de linfócitos T CD8, uma vez que o antígeno é endógeno. No
entanto, mesmo nesse modelo, a ativação de CD4 também ocorre, conforme
revisto por Guranathan et al. (2000). A linfoproliferação observada em nossos
experimentos demonstra que os macrófagos levam a indução de um maior número
de células CD8, quando comparada à proliferação de células CD4. O mesmo
ocorreu com linfócitos B e células dendríticas (Figura 3). Assim esse mecanismo
não parece ser decorrente apenas da APC envolvida, mas ser uma característica
das vacinas de DNA. Esses dados são importantes pois sugerem que a vacinação
gênica pode apresentar eficácias distintas de proteção em função do patógeno em
questão ser intracelular ou extracelular. Além disso a construção da vacina de
DNA também pode levar a resultados distintos dos aqui obtidos, uma vez que a
60
estrutura da molécula de DNA plasmidial ativa a resposta imune inata que vai ser
refletida na resposta imune adaptativa.
Desde que as células B estavam envolvidas na indução de linfoproliferação
nos dois períodos avaliados, optamos por avaliar a sua participação como APC in
vivo, usando animais deficientes de células B. Desse modo, as células B foram
eletroporadas, como já descrito nos ensaios de apresentação de antígeno no item
3.9.1, e transferidas para animais deficientes ou não de células B. Pela análise da
figura 6, podemos observar que não houve diferença na porcentagem de células T
CD4 com fenótipo CD44
hi
entre os animais selvagens e animais deficientes de
células B, sete dias após a transferência adotiva. O mesmo não foi observado para
as células CD8, onde se observa um aumento da porcentagem de linfócitos TCD8
CD44
hi
no baço dos animais deficientes de células B, após a transferência adotiva,
quando comparados aos animais selvagens (Figura 6). Quando analisamos a
expressão de CD62L nessa população, notamos também que apenas as células T
CD8 apresentaram alta expressão desse marcador nos animais “knockout” que
receberam linfócitos B eletroporados com pcDNA3-HSP65 em relação aos
animais selvagens que receberam o mesmo tratamento (ou mesmo quando as
células foram eletroporadas com o vetor sem inserto) (Figura 7). Esses resultados
sugerem que a transferência de células B agindo como APCs in vivo apresentam
antígeno preferencialmente para linfócitos T CD8, induzindo, principalmente, a
geração de uma população de memória antígeno específica contra o antígeno em
questão. Assim, podemos aventar a hipótese de que os linfócitos B atuem como
APC após processos de vacinação com DNA plasmideal. No entanto, como os
linfócitos já estavam transfectados, favorecendo sua atuação como APC, durante o
6
1
curso da vacinação normal, outras células podem capturar o antígeno e agir como
APCs, contudo esse fato não invalida a sugestão de que in vivo, linfócitos B atuem
como APC no modelo de vacinas gênicas, contribuindo para a modulação de
linfócitos T observada.
A geração de células TCD8 com fenótipo de memória de 3 a 7 dias após a
imunização também tem sido observada por outros autores (Joshi, Cui et al.,
2007; Kedzierska, Stambas et al., 2007). Isso indica que, como visto com outras
APCs e desafios, células B e vacinação com DNA plasmideal podem gerar
microambiente propício para indução da proteção. Nossos resultados de memória
estão de acordo com os de Castiglioni e col. (2004) que mostraram a indução de
células CD8 de memória após transferência de linfócitos B trangênicas para
epítopo do citomegalovirus.
O aumento de células TCD4 e TCD8 nos animais que receberam apenas
células B eletroporadas (mock) nos chamou a atenção desde o início e, atualmente,
pode ser considerado como um artefato da técnica. Recentemente foi demonstrado
que o cultivo das células, a serem transferidas adotivamente, em meio contendo
soro fetal bovino levava a indução de células T responsivas aos antígenos contidos
no soro fetal bovino e que, provavelmente, eram ativadas in vivo, por
reconhecimento específico ou de reação cruzada (Rubakova, Petrovskaya et al.,
2007). Rubakova e col. mostraram ainda que a manutenção das células a serem
eletroporadas em soro de camundongo normal diminuía o efeito de
linfoproliferação vistos nos animais que recebiam apenas as células mock. Dessa
forma os resultados obtidos em nossos experimentos com as células mock não
62
invalidam os obtidos com as células transfectadas e transferidas para os animais
deficientes ou não de células B.
Com base nos dados da transferência adotiva de células B eletroporadas na
geração de células de memória, optamos por avaliar a participação indireta dessa
memória após o desafio com M. tuberculosis. A participação de células B na
proteção contra a tuberculose experimental tem se mostrado controversa na
literatura (Taylor, Ordway et al., 2005; Maglione, Xu et al., 2007). Um dos
desafios em conciliar os dados obtidos é decorrente dos modelos utilizados,
usando diferentes cepas e/ou vias de infecção, o que dificulta uma comparação
mais acurada.
Assim, lançando mão do nosso modelo, onde observávamos a indução de
células T CD8 de memória por linfócitos B, realizamos os experimentos de
profilaxia contra a tuberculose experimental. A figura 8 mostra que quando os
animais selvagens receberam células B transfectadas ou não com pcDNA3-HSP65
o número de UFC não se alterou. Por outro lado, quando os animais deficientes de
células B receberam células transfectadas com pcDNA3-HSP65 houve uma
redução estatisticamente significante no numero de UFC recuperado, sugerindo
que a as células CD8 de memória induzidas por esses linfócitos estariam lisando a
micobactéria. Infelizmente, nossos ensaios de citotoxicidade não se mostraram
conclusivos (dados não mostrados). Utilizamos um kit colorimétrico da Roche
baseado na ação da lactato desidrogenase. Seguindo o protocolo do kit não nos foi
possível obter um resultado claro, desde que o meio já induzia lise. A substituição
do soro fetal bovino por BSA 1% nas culturas reduziu, mas não eliminou o
backgroud.
63
No entanto, se analisarmos em conjunto apenas os animais deficientes que
receberam a transferência adotiva nas diferentes situações e posteriormente foram
desafiados, eles apresentaram redução da UFC. Embora paradoxal, esses
resultados sugerem a importância das células B reguladoras (Bregs) nos resultados
obtidos. O papel destas células reguladoras tem sido debatido mais recentemente,
podendo agir como reguladoras por diferentes mecanimos. A ação final, no
entanto, é o controle da inflamação (Mizoguchi e Bhan, 2006; Lin, Peacock et al.,
2007). Interessantemente, como a purificação de células B foi realizada por
seleção negativa usando anticorpo anti-CD43, não purificamos células B com
fenótipo de regulatórias, desde que esse tipo celular expressa esse marcador
(Mizoguchi e Bhan, 2006). Desse modo, ao transferirmos as células B
transfectadas, estávamos transferindo apenas a população de linfócitos B
destituída das células que poderiam apresentar um papel imuorregulador in vivo.
Isso é evidenciado pelas análises histológicas, no grupo que recebeu células
transfectadas com HSP65. Embora o número de UFC esteja reduzido, o pulmão
estava com 90% de lesão inflamatória (Figura 11). Comparado aos animais
selvagens, cuja UFC não diminui significativamente, a lesão nesses últimos foi
bem mais restrita com aproximadamente 50 a 70 % (Figura 10).
Esperávamos uma diminuição da UFC também nos animais selvagens, a
despeito dessa cepa de camundongo ser mais resistente a infecção com M.
tuberculosis. Não observamos diminuição nas UFC dos animais selvagens que
receberam células B transfectadas com gene da HSP65. Uma hipótese para
explicar esses resultados pode ser atribuída ao fato de que, ao fazermos a
transferência adotiva de células B eletroporadas, em animais com o pool de
64
células B normais, a ação das transfectadas podia ficar diluído e não levar ao
efeito desejado. Além disso, para equilibrar o pool normal de células é provável
que ocorra uma homeostase com lise de células em excesso. Contudo, esses dados
nos permitem inferir que nos animais selvagens, onde a população de linfócitos B
estava completa, as células Bregs conseguiram conter parcialmente a inflamação,
o que não ocorria no grupo knockout, como pode ser evidenciado nas análises
histológicas (Figuras 10 e 11). No entanto, novas abordagens se fazem necessárias
para confirmar tal hipótese.
Embora, na maioria dos casos, a análise de citocinas após a infecção com
M. tuberculosis se mostre de difícil interpertação, optamos por avaliar algumas
citocinas chaves no modelo da transferência adotiva com posterior desafio.
Embora os dados histológicos mostrem quadros de lesão inflamatória em maior
ou menor grau, as dosagens das citocinas não mostraram um perfil que
pudéssemos associar aos dados já obtidos (Figura 9). Os animais responderam
preferencialmente ao lisado de M. tuberculosis, indicando que a infecção per si,
mascara os dados que poderiam ser obtidos após transferência adotiva.
Nossos dados com relação a participação de B e a cinética de ativação de
células T após a imunização intramuscular são inéditos e servem como base para
novas abordagens bem como para delineamentos experimentais que resultem em
proteção mais efetiva contra o patógeno em questão.
65
6 - CONCLUSÕES
Esse trabalho nos permite concluir que:
- Durante a vacinação intramuscular com a vacina de DNA pcDNA-HSP65,
ocorre uma cinética de ativação de células T CD4 e T CD8 com fenótipos
diferentes dependendo do tempo após a última imunização;
- in vitro, diferentes populações de APCs foram capazes de induzir populações de
linfócitos T HSP65 específicas, sugerindo que, in vivo, a participação da APC
desempenha papel importante na ativação ou modulação da resposta imune;
- Células B participam como apresentadoras de antígeno in vitro e in vivo,
induzindo preferencialmente a ativação de linfócitos T CD8 com fenótipo de
memória;
- A transferência adotiva de células B eletroporadas com a vacina para animais
deficientes de células B reduziu o numero de UFC, porém levou a um aumento na
lesão inflamatória do pulmão.
66
7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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dendritic cells with native tumor DNA induces antigen-specific T-cell responses
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