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UNESP - Universidade Estadual Paulista
Faculdade de Odontologia de Araraquara
GUSTAVO SIVIERI DE ARAÚJO
AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DO EFEITO DO LASER DE
BAIXA INTENSIDADE NA RESPOSTA DO TECIDO
CONJUNTIVO AO CIMENTO ENDOFILL
ARARAQUARA
2008
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UNESP - Universidade Estadual Paulista
Faculdade de Odontologia de Araraquara
GUSTAVO SIVIERI DE ARAÚJO
AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DO EFEITO DO LASER DE
BAIXA INTENSIDADE NA RESPOSTA DO TECIDO
CONJUNTIVO AO CIMENTO ENDOFILL
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Endodontia, da Faculdade de Odontologia de
Araraquara, Universidade Estadual Paulista, para
obtenção do Título de Doutor em Endodontia.
Orientador:
Prof. Dr. Fábio Luiz Camargo Villela Berbert
ARARAQUARA
2008
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Araújo, Gustavo Sivieri de.
Avaliação histológica do efeito do laser de baixa intensidade na
resposta do tecido conjuntivo ao cimento Endofill / Gustavo Sivieri
de Araújo. – Araraquara: [s.n.], 2008.
84 f. ; 30 cm.
Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista,
Faculdade de Odontologia
Orientador : Prof. Dr. Fábio Luiz Camargo Villela Berbert
1. Endodontia 2. Cimento de óxido de zinco e eugenol
3. Lasers 4. Tecido conjuntivo 5. Mastócitos 6. Fibrose I. Título.
Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Ceres Maria Carvalho Galvão de Freitas, CRB-8/4612
Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação da Faculdade de Odontologia de Araraquara / UNESP
Gustavo Sivieri de Araújo
AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DO EFEITO DO LASER DE
BAIXA INTENSIDADE NA RESPOSTA DO TECIDO
CONJUNTIVO AO CIMENTO ENDOFILL
COMISSÃO JULGADORA
TESE PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR
Presidente e Orientador: Prof. Dr. Fábio Luiz Camargo Villela Berbert
2º Examinador: Profa. Dra. Lizeti Toledo de Oliveira Ramalho
3º Examinador: Prof. Dr. Idomeo Bonetti Filho
4º Examinador: Profa. Dra. Denise Bertulucci Rocha Rodrigues
5º Examinador: Profa. Dra. Yara Teresinha Correa Silva Sousa
Araraquara, 27 de março de 2008.
Dados Curriculares
Gustavo Sivieri de Araújo
Nascimento 08/03/1972 - Uberaba - MG
Filiação Carlos Francisco de Araújo
Cecília Maria Sivieri de Araújo
1991/1995 Curso de Graduação em Odontologia
Universidade de Uberaba (UNIUBE) - Uberaba-MG
1997/1997 Curso de Atualização em Endodontia
Faculdade de Odontologia de Araraquara - Universidade Estadual
Paulista “Júlio de Mesquita Filho”- (FOAr-UNESP) - Araraquara-SP
1998/1999 Curso de Especialização em Endodontia
Faculdade de Odontologia de Araraquara - Universidade Estadual
Paulista “Júlio de Mesquita Filho”- (FOAr-UNESP) - Araraquara-SP
2000/2000 Curso de Atualização (Nivelamento) em Patologia Geral
Universidade Federal do Triângulo Mineiro - Faculdade de Medicina
(FM-UFTM) - Uberaba-MG
2004/2008 Curso de Pós-Graduação em Endodontia - Doutorado
Faculdade de Odontologia de Araraquara - Universidade Estadual
Paulista “Júlio de Mesquita Filho”- (FOAr-UNESP) - Araraquara-SP
Associações IADR - International Association for Dental Research
SBPqO - Sociedade Brasileira de Pesquisa Odontológica
“Atrás de cada vitória, sempre existe um grande sacrifício.
Tudo exige persistência, coragem e dedicação,
para que o sonho possa se concretizar!”
DEDICATÓRIA
DEDICATÓRIA
Dedico esta Tese...
Aos meus pais, Cecília e Carlos, vocês são meu maior exemplo de vida. Vocês
que sempre: estiveram ao meu lado, foram meu porto seguro, me apoiaram e incentivaram
incondicionalmente em minhas decisões, me estimularam a continuar minha caminhada,
nunca mediram esforços para que meus sonhos se concretizassem. Tudo que sou devo a
vocês, que sempre acreditaram em mim. Hoje vocês colhem um pouco do que tanto
lutaram e batalharam para minha formação como filho, como pessoa, e como profissional.
Obrigado pela educação que recebi e por tudo que me ensinaram e me passaram de
exemplo de vida, caráter, honestidade, responsabilidade, dignidade. Fica até difícil
expressar por palavras o que vocês representaram para mim... Este momento não é só meu,
é nosso!!! Meu muito obrigado por tudo!!! AMO MUITO VOCÊS!!!
A minha irmã Adriana, pela convivência e amor que sempre tivemos, pelo apoio
e incentivo de sempre, principalmente nas horas em que mais precisei. Você sempre me
ajudou seja pelas palavras e/ou gestos de carinho e conforto que sempre me ajudaram a
buscar forças para seguir meu caminho e vencer obstáculos para realizar meus sonhos e
objetivos. Tenho certeza, que deve estar orgulhosa no dia de hoje e você também faz parte
desta história!!!
Ao meu irmão Marcelo, pela convivência e amor que sempre esteve presente em
minha vida, acreditando e confiando em mim. Saiba que você é um dos responsáveis pela
minha escolha profissional e também pelas influências recebidas de você em seguir a
carreira acadêmica, afinal somos além de irmãos cirurgiões-dentistas e professores.
Obrigado pelo apoio, carinho e incentivo nos meus primeiros passos na Odontologia, seja
como aluno e depois como profissional. Você também participou desta conquista e desta
fase que concluo hoje!!!
Aos meus sobrinhos, Thiago, Thaíssa, Samuel e Mariana e meus cunhados,
Antônio José e Janeide, pelo apoio, carinho, amor, incentivo, conselhos, amizade sempre
presentes em todos os momentos!!!
Aos meus 4 eternos avós (in memorian), que foram os responsáveis pela
formação de toda nossa família, que sempre foram exemplos de vida, trabalho,
perseverança, honestidade e orgulho para nós. Vocês construíram nossa árvore
genealógica, me sinto orgulhoso de ser um ramo desta.
À todos meus familiares, que de alguma forma contribuíram para minha formação
como pessoa e pela colaboração de alguma forma dessa vitória e conquista no dia de
hoje!!!
A TODOS VOCÊS DEDICO ESTE TRABALHO!!!
MINHA ETERNA E SINCERA GRATIDÃO...
ESTA VITÓRIA NÃO É SÓ MINHA É NOSSA!!!
“Que um verdadeiro amigo vai conosco até o fim.
Que o silêncio muitas vezes fala mais de mil palavras.
Que nada é mais aconchegante do que um caloroso abraço.”
A
GRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS
Agradeço esta Tese...
À Deus, pelo dom de viver e pela sua constante presença em minha vida,
orientando e iluminando os caminhos a serem seguidos, ouvindo as minhas preces, me
acolhendo e dando a luz tão imprescindível nos momentos mais difíceis.
Ao meu orientador Prof. Dr. Fábio Luiz Camargo Villela Berbert, pela
orientação, atenção, ensinamentos e confiança em todos estes anos de convívio
depositados em mim. Pelo apoio, amizade que foram fundamentais para realização deste
trabalho.
À Profa. Dra. Lizeti Toledo de Oliveira Ramalho, pela amizade, pelas valiosas
orientações e ensinamentos repassados, atenção e confiança, pelos conselhos e
experiências de vida profissional, de docência e pesquisa transmitidos neste período de
convivência.
À Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita - UNESP, na presença de
seu Magnífico Reitor Prof. Dr. Marcos Macari e Vice-Reitor, Prof. Dr. Herman
Jacobus Cornelis Voorwald.
À Faculdade de Odontologia de Araraquara da Universidade Estadual
Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - (FOAr - UNESP), nas pessoas de sua atual
Diretora, Profa. Dra. Rosemary Adriana Chiérici Marcantonio, e seu Vice-Diretor,
Prof. Dr. José Cláudio Martins Segalla, por todas as oportunidades oferecidas para a
realização de minha Pós-Graduação, desse trabalho de Tese e de todos os outros trabalhos
de pesquisa em que tive oportunidade de participar.
Ao Programa de Pós-Graduação em Endodontia da FOAr-UNESP, na pessoa
de seu atual Coordenador, Prof. Dr. Mário Tanomaru-Filho, por sempre se mostrar
uma pessoa serena, atencioso, amigo e incentivador da vida, do ensino, da docência e da
pesquisa.
Ao Departamento de Odontologia Restauradora, principalmente aos Profs. Drs.
da Disciplina de Endodontia da FOAr-UNESP: Mário Roberto Leonardo, Roberto
Miranda Esberard, Idomeo Bonetti-Filho, Mário Tanomaru-Filho, Renato de Toledo
Leonardo, Fábio Luiz Camargo Villela Berbert e Juliane Maria Guerreiro Tanomaru,
pelos ensinamentos e conhecimentos transmitidos, amizade, atenção, incentivo e
orientações nas aulas, seminários, clínicas, Tese e todas as pesquisas durante todos estes
anos, que contribuíram para minha formação profissional como docente e pesquisador.
Gostaria que soubessem que eu sinto muito orgulho de ter sido aluno de vocês desde meu
Curso de Atualização em 1997, chegando até hoje na conclusão do Curso de Doutorado.
Agradeço também por me darem a oportunidade de realizar este meu sonho pessoal e
profissional, se hoje sou um verdadeiro Discípulo da Endodontia da FOAr-UNESP, devo
esta formação que obtive de vocês. Eu cresci muito com vocês e espero tê-los como
eternos amigos e Mestres!!!
À Universidade de Uberaba - UNIUBE, nas pessoas das Profas. Dras. Denise
Bertulucci Rocha Rodrigues e Sanívia Aparecida Lima Pereira, da Disciplina de
Patologia do Curso de Odontologia, pela amizade, incentivo, confiança e pela
oportunidade ímpar da realização de parte desta Tese em seu laboratório.
Ao Prof. Dr. Jayme Maurício Leal (in memorian), pelos ensinamentos e
aprendizados que obtive por sua pessoa, durante o meu Curso de Especialização na
Endodontia da FOAr-UNESP, pela convivência maravilhosa e simplicidade que nos
encantava. Esteja onde estiver, levarei comigo os conhecimentos recebidos e suas sábias
palavras!!!
Ao Prof. Dr. Homero Habel Rodrigues (in memorian), sua presença se faz sentir,
mesmo na sua ausência sem fim... Seus ensinamentos, ideais e profissionalismo, como suas
orientações, tornaram-se presentes, onde os fatos, o mundo e as pessoas adquirem sentido.
Que o mistério de cada um seja sempre um convite a contemplar sua presença sobre a
terra. Se hoje concluo este sonho da Pós-Graduação, o Senhor tem uma grande
responsabilidade e parcela na minha decisão certa de seguir a carreira acadêmica, por meio
das inúmeras conversas, conselhos e ensinamentos de experiências de vida, docência e
pesquisa que me delineou, mudando minha maneira de pensar, enquanto fui seu estagiário.
Na eterna saudade, a minha gratidão!!!
Aos Docentes do Departamento de Morfologia, Disciplina de Histologia da
FOAr-UNESP, Profas. Dras. Lizeti, Eleny, Estela e ao Prof. Dr. Paulo, pela amizade e
enorme contribuição nesta Tese.
À Profa. Dra. Rosane de Fátima Zanirato Lizarelli, IFSC-USP - São Carlos-SP,
pela amizade e contribuição nos ensinamentos em sua Disciplina de Laser em Odontologia.
Aos colegas do Curso de Pós-Graduação em Endodontia da FOAr-UNESP, das
turmas novas e antigas de Mestrado e Doutorado: Adriana, Alexandre, Anderson,
Arnaldo, Bier, Cláudia, Cristiane, Denise, Eduardo, Erick, Erica, Fabíola, Fernanda,
Fernando (Tander), Fernandão, Fernandinho, Fred, Freddy (peruano), Guilherme
(X), Henrique (in memorian), Hugo, José Carlos (mexicano), Júlio Cezar
(colombiano), Marco Aurélio, Maurício (equatoriano), Norberto, Paula, Regina,
Renata, Renatinho, Ronaldo, Santiago, Sérgio e Vivian, pela convivência, aprendizado,
amizade e bons momentos vividos.
Ao colega do Curso de Pós-Graduação em Endodontia da FOAr-UNESP
Henrique (in memorian), que nos deixou no ano passado...descanse em paz na morada
eterna amigo...
Aos grandes amigos, Bier, Eduardo, Norberto, obrigado por terem sido amigos
de verdade, por todos os bons momentos compartilhados comigo, as conquistas,
experiências e oportunidades tanto em nossa Pós-Graduação, quanto nas horas de lazer e
descontração. Por sempre estarem dispostos a ajudar e pela vontade de quererem crescer
juntos na Endodontia. Vocês foram meus verdadeiros irmãos em Araraquara. Espero que
nossas amizades não se percam e possamos vencer as barreiras da distância e do tempo, e
que tenhamos oportunidades de realizar muitas atividades de ensino e pesquisa juntos ao
longo de nossas vidas.
Aos colegas dos outros Programas de Pós-Graduação da FOAr-UNESP, pela
amizade e convivência nestes anos.
Aos colegas pós-graduandos do laboratório do Departamento de Morfologia,
Disciplina de Histologia da FOAr-UNESP, Ana Paula, Frank, Hermes, Rubens e
Simone pela amizade, convivência e ajuda no laboratório.
Aos funcionários do Departamento de Odontologia Restauradora da FOAr-
UNESP, em especial à Célinha, Creusa, Pedro, Marinho, Adriana, Cida, Conceição,
pelo convívio amigo, atenção que sempre me dispensaram e atendimento sempre eficiente
e cordial.
Aos funcionários da Seção de Pós-Graduação da FOAr UNESP, Rosângela,
Alexandre, Flávia, e em especial a Mara pela amizade, educação, carinho e respeito com
que sempre me trataram.
À Diretora da Biblioteca da FOAr-UNESP, Maria Helena, pela amizade,
conselhos e orientações na organização desta Tese e de outros trabalhos de pesquisa, assim
como agradeço aos funcionários da Biblioteca, Adriano, Ceres, Eliane, Maria Inês,
Marley, Odete, Silvia, os quais sempre me atenderam com muita atenção, educação e
amizade.
Aos funcionários do Departamento de Morfologia, Disciplina de Histologia da
FOAr-UNESP, Pedrinho e Luiz pela acolhida e ajuda nestes anos.
À pós-graduanda e também funcionária do Laboratório de Patologia do Curso
de Odontologia da UNIUBE, Polyanna Miranda Alves, pela contribuição na realização
de parte das lâminas desta Tese.
Aos animais de laboratório que foram imprescindíveis para realização desta Tese.
À CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pela
concessão da bolsa de estudos.
À Empresa DMC, que generosamente nos emprestou o aparelho de laser utilizado
nesta Tese.
A todos as minhas amigas e amigos de Uberaba, que de alguma forma me
acompanharam nesta minha trajetória dos últimos anos.
À todas as pessoas que de alguma forma direta ou indireta citados aqui ou
não, colaboraram e contribuíram na minha formação durante estes 4 anos tornando
possível a realização deste sonho de realizar minha Pós-Graduação...
...A MINHA ETERNA
E SINCERA GRATIDÃO
E O MEU MUITO OBRIGADO!!!
“Determinação, coragem e autoconfiança
são fatores decisivos para o sucesso.
Não importam quais sejam os
obstáculos e as dificuldades.
Se estivermos possuídos de uma
inabalável determinação,
conseguiremos superá-los.
Independentemente das circunstâncias,
devemos ser sempre humildes,
recatados e despidos de orgulho.”
Dalai Lama
“As dificuldades muitas vezes, ensinam grandes lições,
e que o medo nunca nos atrapalhe de executar grandes projetos.”
SUMÁRIO
S
UMÁRIO
PREFÁCIO-------------------------------------------------------------------------------------------17
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS------------------------------------18
RESUMO---------------------------------------------------------------------------------------------20
ABSTRACT------------------------------------------------------------------------------------------22
INTRODUÇÃO--------------------------------------------------------------------------------------24
PROPOSIÇÃO--------------------------------------------------------------------------------------33
CAPÍTULO 1----------------------------------------------------------------------------------------35
CAPÍTULO 2----------------------------------------------------------------------------------------57
CONCLUSÃO---------------------------------------------------------------------------------------75
REFERÊNCIAS-------------------------------------------------------------------------------------77
ANEXOS----------------------------------------------------------------------------------------------83
PREFÁCIO
Esta Tese foi dividida em dois Capítulos, que correspondem a dois artigos
científicos, intitulados:
1) “
Efeito do laser de baixa intensidade na resposta
tecidual ao implante de cimento Endofill
”
Artigo a ser submetido para publicação no periódico Photomedicine and Laser Surgery
2) “
Quantificação de fibrose e mastócitos na resposta do
tecido conjuntivo ao cimento Endofill irradiado por
laser de baixa intensidade
”
Artigo a ser submetido para publicação no periódico Lasers in Medical Science
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ADA - American Dental Association
ANSI/ADA - American National Standards Institute/American Dental Association
AsGaAl - Arseneto de Gálio Alumínio
CEEA - Comitê de Ética em Experimentação Animal
COBEA - Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
D - Dose ou densidade de energia ou fluência de energia
E - Energia
HE - Hematoxilina e Eosina, Hematoxylin and Eosin
Hertz - Hz
HILT - High Intensity Laser Treatment
InGaAlP - Índio Gálio Alumínio Fósforo
ISO - International Organization for Standardization
J - Joule
J/Cm
2
- Joule por centímetro quadrado
LASER - Amplificação da Luz por Emissão Estimulada de Radiação, Light Amplification
by Stimulated Emission of Radiation
LBI - Laser de baixa intensidade
LILT - Low intensity laser therapy
LIV - LBI infravermelho
LLLT - Low level laser therapy
LV - LBI vermelho
M/mm
2
- Mastócitos por milímetro quadrado
MASER - Microwave Amplification by Stimulated Emission of Radiation
MC - Mast cells
MMP-2 - Matriz de Metalloproteinase-2
MTA - Mineral trióxido agregado
mW - MiliWatts
OZE - Cimento de óxido zinco e eugenol
P - Potência
TM - Tricrômico de Masson, Masson Trichrome
ZOE - Zinc oxide and eugenol sealer
λ - Comprimento de onda
μm - Micrômetros
ηm - Nanômetro
“Tudo que nos acontece nos traz experiência
ou desenvolve alguma qualidade que nos faltava”
Sakarawa
RESUMO
Araújo GS. Avaliação histológica do efeito do laser de baixa intensidade na resposta do
tecido conjuntivo ao cimento Endofill [tese doutorado]. Araraquara: Faculdade de
Odontologia da UNESP; 2008.
RESUMO
O objetivo do presente estudo foi realizar uma avaliação histológica do efeito do laser de
baixa intensidade (LBI) na resposta do tecido conjuntivo subcutâneo de camundongos ao
implante dos tubos contendo cimento de óxido zinco e eugenol (OZE) Endofill, que foram
irradiados imediatamente e 24 horas após o implante dos tubos. Foram utilizados sessenta
camundongos (Mus muscullus albinus), distribuídos em 3 grupos (n=20): GI (controle), os
animais receberam implante do tubo de polietileno com Endofill e não receberam a
irradiação LBI; GII implante do tubo com Endofill e irradiação LBI vermelho (InGaAlP),
λ685ηm, D=72J/Cm
2
,
E=2J, T=58s, P=35mW; GIII implante do tubo com Endofill e
irradiação LBI infravermelho (AsGaAl), λ830ηm, D=70J/Cm
2
, E=2J, T=40s, P=50mW.
Os animais foram mortos nos períodos de 7 e 30 dias, os blocos de tecido foram
seccionados com de 6µm de espessura e as lâminas foram coradas com: Hematoxilina e
Eosina/Tricrômico de Masson, com o propósito de verificar as reações teciduais;
Picrosírius para identificar o padrão de fibrose e Azul de Toluidina para quantificar os
mastócitos. Os resultados foram analisados ao microscópio optico comum e de luz
polarizada para a fibrose. A análise estatística realizada foi quali-quantitativa. A ação do
LBI sobre o tecido conjuntivo diminuiu o efeito irritante oferecido pelo cimento Endofill,
no período pós-operatório de 7 dias (P>0,05). Aos 30 dias ocorreu reparo tecidual,
independente da irradiação do LBI. A irradiação LBI não ofereceu melhoria no padrão de
fibrose, e proporcionou queda significativa de mastócitos independente do período
estudado.
Palavras-chave: Endodontia; cimento de óxido de zinco e eugenol; lasers; tecido
conjuntivo; mastócitos; fibrose.
“E preferível a angústia da busca do que a paz da acomodação”
Marisa de Toledo Leonardo
ABSTRACT
Araújo GS. Histological evaluation of the effect of the low level laser therapy in the
response of the conjunctive tissue to the Endofill sealer [tese doutorado]. Araraquara:
Faculdade de Odontologia da UNESP; 2008.
ABSTRACT
The aim of the present study was to perform a histological evaluation of the effect of the
low level laser therapy (LLLT), in the response of the subcutaneous conjunctive tissue of
mice to the tubes implant with to the zinc oxide and eugenol sealer (ZOE) Endofill, that
were immediately irradiated and again 24h after the implant of the tubes. Sixty mice (Mus
muscullus albinus) were used, distributed into 3 groups (n=20): GI (control), the animals
received the polyethylene tube implant with the Endofill and no LLLT irradiation; GII,
tube implant with the Endofill and red LLLT irradiation (InGaAIP), λ685ηm, D=72J/Cm
2
,
E=2J, T=58s, P=35mW; GIII, tube implant with the Endofill and infrared LLLT irradiation
(AsGaAl), λ830ηm, D=70J/Cm
2
, E=2J, T=40s, P=50mW. The animals were killed after 7
and 30 days; the blocks of tissue were cut into serial 6µm thick sections and glass slides
were stained with: Hematoxylin and Eosin/with Masson Trichrome, in order to verify the
tissue reactions; Picrosírius, to identify the fibrosis rate and Toluidine Blue, to quantify
mast cells (MC). The results were analyzed through the normal use optical microscope and
a polarized light one for fibrosis. The statistical analysis carried out was quali-quantitative.
The action of the LLLT on the connective tissue reduced the irritating effect produced by
the Endofill sealer, at the post-operative period of 7 days (P>0,05). In 30
th
days there was
tissue repair independent of the irradiation of LLLT. The LLLT irradiation didn't offer an
improvement of the fibrosis rate, and provided a significant fall in the concentration of
MC independent of the studied period.
Keywords: Endodontics; zinc oxide and eugenol sealer; lasers; connective tissue; mast
cells; fibrosis.
“De tudo ficaram três coisas:
A certeza de que estamos sempre recomeçando...
A certeza de que precisamos continuar...
A certeza de que seremos interrompidos antes de terminar...
Portanto, devemos fazer da interrupção um caminho novo...
Da queda, um passo de dança...
Do medo, uma escada...
Do sonho, uma ponte...
Da procura, um encontro...”
Fernando Pessoa
INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO
A Endodontia em decorrência do seu desenvolvimento técnico-científico é
considerada como um dos mais importantes ramos da Odontologia, chegando a atingir
elevados índices de sucesso, refletindo ao profissional da área a resolução da maior parte
dos casos clínicos.
Uma das principais finalidades da terapia endodôntica é a remoção dos agentes
físicos, químicos ou biológicos que são prejudiciais aos tecidos apicais e periapicais,
permitindo assim que o organismo recupere sua condição de normalidade fisiológica
reparando os tecidos lesados (Leonardo
25
, 2005).
De acordo com os princípios técnicos e biológicos que regem a Endodontia atual,
todas as fases do tratamento endodôntico devem ser vistas com a mesma atenção e
importância, por serem considerados atos operatórios interdependentes. Alguma falha em
uma das etapas inevitavelmente pode condenar o sucesso do tratamento. Uma das fases da
Endodontia, a obturação dos canais radiculares, devemos preencher todo o espaço
anteriormente ocupado pela polpa dental, por materiais que sejam inertes aos tecidos ou
que possuam boas propriedades biológicas. Tais materiais devem oferecer propriedades
anti-sépticas e apresentar a capacidade de preencher e selar toda extensão dos canais
radiculares. Assim sendo, caso o material obturador venha interferir após o tratamento
endodôntico, que seja para estimular o reparo apical e periapical (Leal
24
, 2005).
Encontramos no comércio materiais obturadores em estado sólido (cones de guta-
percha e cones de resilon) e materiais em estado plástico (pastas e cimentos obturadores).
Um cimento obturador “ideal” deveria possuir propriedades como: estimular o
reparo apical e periapical; ter ação antimicrobiana; não ser mutagênico ou carcinogênico;
ser reabsorvido em caso de extravasamento acidental; ter bom selamento marginal; boa
INTRODUÇÃO ____________________________________________________________26
viscosidade; ser radiopaco, fácil inserção; não ser solúvel; dentre outras propriedades
(Leal
24
, 2005).
Na Endodontia, encontramos cimentos obturadores com diferentes composições:
cimento à base de óxido de zinco e eugenol (OZE); cimento à base de resina epóxica;
cimento à base de hidróxido de cálcio, cimento à base de silicone, cimento à base de
ionômero de vidro, cimentos resinosos, cimento experimental à base de polímero de
mamona e cimento à base de MTA.
Em 1936, Grossman introduziu no mercado o cimento OZE, que nos dias atuais,
ainda é utilizado com grande difusão e freqüência pelos diversos países, e em diferentes
marcas comerciais. Este cimento apresenta boas propriedades físico-químicas, no entanto
não apresenta biocompatibilidade, sendo irritante aos tecidos apicais e periapicais. O
potencial irritante do material obturador tem influência direta e significativa no reparo
tecidual após o término do tratamento de canais radiculares, e o comportamento do
cimento OZE não é adequado aos tecidos, levando à agressão atribuída à presença de
eugenol livre. Os resultados das reações histológicas do cimento OZE foram bem
evidenciados há décadas, foi comprovado que o eugenol é citotóxico (Langeland et al.
23
,
1969; Rodrigues et al.
38
, 1976; Lindqvist, Otteskog
27
, 1980; Barbosa et al.
7
, 1993), resulta
reações adversas em animais experimentais e humanos
(Lindqvist, Otteskog
27
, 1980),
provoca dermatite de contato
(Barkin et al.
8
, 1984) e reação alérgica verdadeira (Koch et
al.
20
, 1973; Barkin et al.
8
, 1984), e apresenta infiltrado inflamatório severo quando
comparado com ao cimento à base de hidróxido de cálcio Sealapex (Tanomaru Filho et
al.
41
, 1998).
Dentre os testes secundários recomendados para analisar o potencial de toxicidade
e biocompatibilidade de amostras de materiais odontológicos, o uso da técnica de
implantes de tubo de polietileno no tecido conjuntivo subcutâneo para avaliar as respostas
INTRODUÇÃO ____________________________________________________________27
biológicas de materiais endodônticos é muito conhecida e preconizada, inclusive para o
cimento de OZE (ADA
4
, 1972; Makkes et al.
32
, 1977; ANSI/ADA
5
, 1982; ISO 7405
14
:
1997). Esta metodologia já era preconizada por Torneck
42
, 1966; Torneck
43
1967;
Langeland et al.
23
, 1969, porque os tubos apresentaram comportamento inerte diante do
tecido conjuntivo, não interferindo na resposta tecidual.
Apesar dos avanços tecnológicos dos novos cimentos, o cimento de OZE é ainda
bastante utilizado, devido seu baixo custo e fácil aquisição. O emprego do cimento de OZE
teve uma crescente propagação em todo mundo como também no Brasil, portanto, a idéia
de buscar um recurso que vise minimizar o efeito irritante deste cimento é bastante
pertinente mesmo nos dias atuais.
Com o advento do laser, surgiram novas alternativas nos tratamentos médico,
odontológico, fisioterápico, devido às suas diversas propriedades terapêuticas.
A palavra LASER é um acrônimo de origem inglesa que significa: Light
Amplification by Stimulated Emission of Radiation, que traduzida na língua portuguesa
significa: Amplificação da Luz por Emissão Estimulada de Radiação.
O laser é uma radiação eletromagnética não ionizante, sendo uma fonte luminosa
com características especiais, que se diferencia das outras fontes de luz, como por
exemplo, a luz incandescente.
Einstein em 1917 postulou a Teoria da Emissão Estimulada de Radiação, onde
afirmava que os fótons, ao incidir sobre os átomos, podem fazê-los produzir uma grande
quantidade de luz. O primeiro aparelho em que usou emissão estimulada foi o MASER
(Microwave Amplification by Stimulated Emission of Radiation) por meio de um campo
elétrico onde estimulava o gás amônia a produzir um feixe de microondas.
Em 1960, Maiman
31
, elaborou o primeiro aparelho laser, usando um cristal de rubi,
que gerava luz de curta duração e alta densidade de energia, operando em 694,3
INTRODUÇÃO ____________________________________________________________28
nanômetros (ηm). Entretanto, um dos primeiros trabalhos para avaliar o efeito do laser na
cicatrização de feridas de tecido mole foi realizado por Mester et al.
33
, 1971, que utilizaram
o laser de rubi com comprimento de onda de 694,3 ηm.
A radiação laser é composta por fótons, todos de mesma cor e com o mesmo
comprimento de onda, freqüência e energia, portanto, é uma luz pura e esta característica é
conhecida como monocromaticidade (Knappe et al.
19
, 2004).
A coerência é uma característica do laser, onde a emissão estimulada gera fótons
cujas energias se somam e viajam na mesma direção, movendo-se em mesma fase no
tempo e no espaço (Knappe et al.
19
, 2004).
A radiação laser é unidirecional e paralela ao eixo do tubo que a produz, o feixe de
fótons é conseqüentemente colimado ou paralelo. Sua direcionalidade permite a obtenção
de alta densidade de energia concentrada em pequenos pontos. Com o auxílio de
dispositivos ópticos, sua radiação pode ainda ser polarizada. Estas características especiais
desse tipo de luz que a faz ter propriedades terapêuticas e cirúrgicas importantes (Knappe
et al.
19
, 2004).
A radiação laser requer algumas condições especiais, para sua produção, tais como
o “meio ativo” que pode ser (sólido, líquido, gasoso ou misto), que gera luz quando
excitadas por uma fonte de energia externa. Este processo é denominado de
“bombeamento”. A função do bombeamento é transformar o meio ativo em meio
amplificador de radiação, promovendo o fenômeno denominado “inversão de população”.
Na inversão de população, os elétrons da camada de valência do meio absorvem energia
bombeada e saltam para um nível de energia mais externo, logo, seu nível de energia será
maior, porque este segundo nível está mais distante da influência do núcleo. Quando o
primeiro elétron decai, ou seja, retorna ao seu nível de energia original, portanto menor,
ocorre à liberação de uma energia altamente concentrada, denominada de Fóton. Isto gera
INTRODUÇÃO ____________________________________________________________29
um processo em cascata e em progressão geométrica, resultando na emissão estimulada de
radiação (Bagnato
6
, 2001).
O laser é classificado em dois grupos: laser de alta intensidade ou laser de alta
potência ou laser cirúrgico ou HILT (High Intensity Laser Treatment); e laser de baixa
intensidade (LBI) ou laser de baixa potência ou laser terapêutico ou LILT (Low Intensity
Laser Therapy) ou LLLT (Low Level Laser Therapy).
As radiações ópticas produzidas pelos lasers têm basicamente as mesmas
características, porém os efeitos são diferentes para cada tipo de laser utilizado. Quando
trabalhamos com o laser em tecido vivo, buscamos resultados clínicos bastante específicos,
a célula tem um determinado limiar de sobrevivência, isto depende do tecido onde está
localizada e também do estado fisiológico da mesma (Karu
18
, 2003). Se utilizarmos o laser
com a intenção de respeitar esse limiar de determinada célula, oferecemos uma baixa
intensidade de energia, que será utilizada por ela de maneira a estimular sua membrana, e
as membranas de suas mitocôndrias
(Karu
18
, 2003). Dessa forma estaremos induzindo essa
célula à biomodulação, ou seja, a célula trabalhará buscando um estado de normalização da
região afetada. Neste caso o laser trabalhará em baixa densidade de potência. A
biomodulação tecidual ocorre por meio de proliferação, adesão, respiração, produção de
proteínas e outros produtos celulares (Almeida-Lopes et al.
2
, 2001). Este tipo de terapia
passou a ser chamado de laser therapy ou laserterapia, empregado o LBI para fins
terapêuticos.
Como indicações do LBI podemos citar: potencialização do processo de reparo nos
quadros de pós-operatório e cicatrização de tecido mole (Garcia et al.
13
, 1996), tecido
ósseo e nervoso; quadros de edema instalado (onde se busca uma mediação do processo
inflamatório) e quadros de dor crônica e/ou aguda
(Almeida-Lopes
1
, 2004).
INTRODUÇÃO ____________________________________________________________30
Quando se trabalha com o laser operando em um nível de intensidade muito alta de
energia a ponto dessa energia transformar-se em dano térmico e ultrapassar o limiar de
sobrevivência dessa célula, levando a uma lise e conseqüentemente a morte celular,
estaremos utilizando o laser com finalidade cirúrgica denominado laser cirúrgico ou HILT
(Almeida-Lopes
1
, 2004).
O comprimento de onda (λ) é à distância percorrida por uma onda em sua oscilação
completa, medida em ηm e a freqüência de suas oscilações em Hertz (Hz). O comprimento
de onda é de fundamental importância na interação laser-tecido. A radiação laser pode ser
refletida, transmitida, absorvida ou espalhada “scattering” pelo tecido. A
monocromaticidade do laser determina a absorção seletiva por parte dos cromóforos, com
resposta afim a um ou a vários comprimentos de onda, fenômeno conhecido como
ressonância a uma determinada freqüência. Cada comprimento de onda, portanto, terá um
tipo diferente de interação segundo o tecido alvo (Knappe et al.
19
, 2004; Vladimirov et
al.
44
, 2004).
As ações terapêuticas do laser sobre os tecidos induzem os efeitos trófico-
regenerativos, antiinflamatórios e analgésicos. Há trabalhos que demonstram um aumento
na microcirculação local (Kujawa et al.
21
, 2004; Maier et al.
30
, 1990; Miró et al.
34
, 1984;
Moore et al.
35
, 2005), no sistema linfático (Lievens
26
, 1991), proliferação de células
epiteliais (Steinlechner, Dyson
40
, 1993) e fibroblastos
(Lubart et al.
29
, 1995; Webb et al.
45
,
1998), bem como aumento da síntese de colágeno dos fibroblastos (Enwemeka et al.
11
,
1990; Skinner et al.
39
, 1996). Em estudos clínicos (Bihari, Mester
9
, 1989; Reddy
37
, 2004),
confirmaram esses efeitos observados in vitro. Os estudos in vitro sobre fibroblastos
descrevem um efeito proliferativo e/ou ativador da síntese protéica, dependendo das
características e parâmetros do laser utilizado como: comprimento de onda, forma de
INTRODUÇÃO ____________________________________________________________31
emissão, densidade de potência e densidade de energia utilizada. Desta forma, Segundo Al-
Watban, Zhang
3
, 1994; Karu
17
, 1990,
que demonstraram por trabalhos in vitro e in vivo
com fibroblastos, principal célula responsável no reparo tecidual, a redução do tempo de
cicatrização de feridas cutâneas e de mucosas.
Na Odontologia, o LBI vem sendo utilizado para finalidades terapêuticas efetivas,
atuando como coadjuvante aos tratamentos, devido à sua ação analgésica, antiinflamatória,
antiedematosa, bioestimuladora e indutora de reparo tecidual (Almeida-Lopes
1
, 2004,
Lizarelli
28
, 2005).
O tecido conjuntivo apresenta diversos tipos de células separadas por um abundante
material extracelular, que integra o sistema imunitário de defesa contra proteínas estranhas
presentes nas bactérias, vírus, células tumorais, etc. Diversos mecanismos de defesa
dependem das células e dos elementos intercelulares do tecido conjuntivo, pois este
participa do processo inflamatório. A inflamação é uma reação defensiva, celular e
vascular, contra elementos estranhos que possam penetrar no tecido conjuntivo ou algum
tipo de substância química que possa agredir e irritar este tecido (Junqueira, Carneiro
16
,
2004; Kumar et al.
22
, 2005).
Os mastócitos são células residentes do tecido conjuntivo, que quando maduras
apresentam-se globulosos, grandes e com citoplasma repleto de grânulos que se coram
intensamente. O núcleo é pequeno, esférico, central e de difícil observação por estar
freqüentemente encoberto pelos grânulos citoplasmáticos. Os grânulos secretores contêm
mediadores químicos como histamina e glicosaminoglicanas. Os mastócitos colaboram
com as reações imunes e tem papel fundamental na proteção do organismo, como por
exemplo, na inflamação, nas respostas alérgicas e na expulsão de parasitas
(Junqueira,
INTRODUÇÃO ____________________________________________________________32
Carneiro
16
, 2004). Os mastócitos têm função relevante na gênese do tecido conjuntivo,
incluindo a liberação de mediadores que estimulam a proliferação de fibroblastos e síntese
de colágeno (Garbuzenko et al.
12
, 2002; Jordana
15
, 1993; Pereira et al.
36
, 2007). Estudos
demonstram a relação entre a presença de mastócitos e fibroses na pele (Garbuzenko et
al.
12
, 2002), língua (Pereira et al.
36
, 2007) e glândulas salivares
(Diao
10
, 1993).
O efeito do LBI no tecido conjuntivo em relação à reação irritante causada pelo
cimento de OZE ainda é desconhecido e deve ser melhor esclarecido e pesquisado, por
meio de estudos histológicos, uma vez que o LBI possui diferentes parâmetros de aplicação
para cada caso, tornando a literatura contratidória e não conclusiva.
“Pode um homem tornar-se culto pela
cultura dos outros, mas só se torna
sábio pelas suas próprias experiências.”
Mansour Chalita
PROPOSIÇÃO
OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito das aplicações imediata e após 24 horas do LBI vermelho ou
infravermelho na reação do tecido conjuntivo subcutâneo de camundongos, causadas pelo
cimento endodôntico OZE Endofill, nos períodos de 7 e 30 dias, mediante os objetivos
específicos:
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Esta Tese foi dividida em dois Capítulos que correspondem a dois Artigos
Científicos:
Capítulo 1 - Realizar uma análise histológica;
Artigo 1 - “Efeito do laser de baixa intensidade na resposta tecidual ao implante de
cimento Endofill”
Capítulo 2 - Identificar e quantificar o padrão de fibrose e de mastócitos;
Artigo 2 - “Quantificação de fibrose e de mastócitos na resposta do tecido conjuntivo ao
cimento Endofill irradiado por laser de baixa intensidade”
“Quando pensar em desistir, lembre-se da luta que
foi começar e chegar até aqui...não desista nunca!”
Efeito do laser de baixa intensidade na resposta tecidual ao implante
de cimento Endofill
∗
CAPÍTULO 1

∗
Artigo a ser submetido para publicação no periódico Photomedicine and Laser Surgery
Qualis Capes: A Internacional; Fator de Impacto: 1.280.
RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar as reações do tecido conjuntivo ao implante de tubos de
polietileno contendo o cimento endodôntico de óxido de zinco e eugenol (OZE) Endofill
submetidos à irradiação do laser de baixa intensidade (LBI), imediatamente e 24 horas após o
implante. Foram utilizados sessenta camundongos (Mus muscullus albinus), distribuídos em três
grupos experimentais (n=20): GI (controle), os animais receberam o implante do tubo contendo
Endofill e não receberam a irradiação LBI; GII, implante do tubo com Endofill e irradiação LBI
vermelho (InGaAIP) λ685ηm, D=72J/Cm
2
,
E=2J, T=58s, P=35mW; GIII, implante do tubo com
Endofill e irradiação LBI infravermelho (AsGaAl) λ830ηm, D=70J/Cm
2
, E=2J, T=40s,
P=50mW. Os animais foram mortos depois de 7 e 30 dias, os blocos de tecidos foram
confeccionados e seccionados em cortes seriados de 6µm de espessura e as lâminas coradas com
Hematoxilina e Eosina e Tricrômico de Masson e analisadas ao microscópio óptico comum. Ao
7° dia, o GI apresentou picnose nuclear, ausência de vasos sangüíneos e macrófagos ativos; GII
fibroblastos e macrófagos ativos, poucos capilares sangüíneos; GIII inflamação reduzida,
angiogênese, fibroblastos ativos. Ao 30° dia, GI apresentou pouco tecido inflamado e poucos
vasos sangüíneos; GII ausência de inflamação, fibroblastos com redução de volume, poucos
macrófagos e vasos sangüíneos; GIII ausência de inflamação, numerosos fibroblastos, capilares
sangüíneos com hemácias. Foi realizada uma análise estatística quali-quantitativa. A ação do LBI
sobre o tecido conjuntivo diminuiu o efeito irritante oferecido pelo cimento Endofill, no período
pós-operatório de 07 dias (P>0,05).
Palavras-chave: Endodontia, cimento óxido de zinco e eugenol, lasers, tecido conjuntivo.
CAPÍTULO 1________________________________________________________________________________37
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the reactions of the connective tissue to the implant of
polyethylene tubes containing the endodontic zinc oxide and eugenol sealer (ZOE) Endofill
submitted to irradiation of the low level laser therapy (LLLT), immediately and 24h after the
implant. Sixty mice were used (Mus muscullus albinus), distributed into three experimental
groups (n=20): GI (control), the animals received the implant of the tube with Endofill and no
LLLT irradiation; GII, implant of the tube with Endofill and red LLLT irradiation (InGaAIP)
λ685ηm, D=72J/Cm
2
,
E=2J, T=58s, P=35mW; GIII, implant of the tube with Endofill and
infrared LLLT irradiation (AsGaAl) λ830ηm, D=70J/Cm
2
, E=2J, T=40s, P=50mW. The animals
were killed after 7 and 30 days, the blocks of tissue were cut into serial 6µm thick sections and
glass slides were stained with Hematoxylin and Eosin and Masson Trichrome and then analyzed
to the normal use optical microscope. At the 7
th
day, GI showed nuclear pyknosis, absence of
blood vessels and active macrophages; GII showed fibroblasts and active macrophages, few
bloodies capillaries; GIII showed reduced inflammation, angiogenesis and active fibroblasts. At
the 30
th
day, GI showed few inflammation and few blood vessels; GII showed inflammation
absence, fibroblasts with volume reduction, few macrophages and blood vessels; GIII showed
inflammation absence, numerous fibroblasts, bloodies capillaries with erythrocytes. The
statistical analysis carried out was quali-quantitative. The action of the LLLT on the connective
tissue reduced the irritating effect produced by the Endofill sealer, at the post-operative period of
7 days (P>0,05).
Key-words: Endodontics, zinc oxide and eugenol sealer, lasers, connective tissue.
CAPÍTULO 1________________________________________________________________________________38
INTRODUÇÃO
As etapas da terapia endodôntica, como o diagnóstico, abertura coronária, preparo
biomecânico, curativo de demora e obturação dos canais radiculares, quando bem executadas,
são consideradas de fundamental importância para a obtenção do sucesso pós-tratamento
1,2
.
No que diz respeito à obturação dos canais radiculares, o material obturador deve
apresentar boas propriedades biológicas quanto físico-químicas, demonstradas nos diversos
níveis de pesquisa, apresentando-se compatíveis para a aplicação clínica.
Com o avanço tecnológico da Endodontia, vários cimentos obturadores foram
introduzidos no mercado. Dentre os cimentos endodônticos disponíveis, o cimento obturador à
base de óxido de zinco eugenol (OZE), apresenta propriedades físico-químicas aceitáveis,
entretanto, não apresenta comportamento biológico favorável ao tecido conjuntivo. Diversos
estudos demonstram que o OZE é citotóxico, por conter eugenol em sua composição
1-4
, não
apresentando boa resposta tecidual aos testes de compatibilidade biológica dos materiais
endodônticos
3-7
. Apesar de sua limitação no que tange aos aspectos biológicos, o cimento de
OZE é mundialmente usado por diversas décadas até os dias atuais. Este fato torna oportuna a
busca de um recurso que vise minimizar a resposta tecidual inflamatória atribuída pelo efeito
irritante deste cimento.
Com o advento do laser de baixa intensidade (LBI), uma nova tecnologia passou a ser
estudada com a finalidade de atenuar o efeito de determinada agressão como também de
melhorar o reparo dos tecidos que foram agredidos.
CAPÍTULO 1________________________________________________________________________________39
O LBI foi descrito como um recurso coadjuvante na intenção de promover a
bioestimulacão e biomodulacão da cicatrização de feridas
8
. O recurso visa acelerar a proliferação
e diferenciação dos fibroblastos e osteoblastos
9
, reduzir o processo inflamatório e acelerar o
reparo dos tecidos moles
10,11
.
O efeito da bioestimulacão do LBI também foi observado em células da polpa dental e na
biomodulacão da dentinogênese, promovendo uma redução no processo inflamatório
12
.
As ações terapêuticas do LBI sobre os tecidos induzem os efeitos trófico-regenerativos,
antiinflamatórios e analgésicos, demonstrando aumento: na microcirculação local
13,14
, na
drenagem do sistema linfático
15
e na proliferação de células epiteliais
16
.
O objetivo deste estudo foi avaliar a modulação da resposta tecidual em camundongos ao
implante de tubos de polietileno contendo o cimento de OZE Endofill, quando submetidos à
irradiação imediata e após 24 horas do LBI vermelho ou LBI infravermelho.
MATERIAL E MÉTODO
Este trabalho está de acordo com os princípios éticos na experimentação animal adotados
pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal - COBEA e foi aprovado pelo Comitê de
Ética em Experimentação Animal - CEEA, da Faculdade de Odontologia de Araraquara-UNESP
(Processo CEEA-FOAr N° 002/2005).
Sessenta camundongos, machos, Mus muscullus albinus, pesando em média 40 gramas
foram usados no experimento. Os animais foram divididos em três grupos de vinte camundongos
cada, com períodos experimentais de 7 e 30 dias, respectivamente (Tabela 1).
CAPÍTULO 1________________________________________________________________________________40
Tabela 1 - Distribuição dos grupos de acordo com o material testado, períodos
experimentais e número de animais
O cimento Endofill foi preparado de acordo com as recomendações do fabricante e
posteriormente inserido em tubos de polietileno (Kit de selantes Delton - Johnson & Johnson,
São José dos Campos, SP, Brasil). Estes tubos mediam 1,5mm de diâmetro interno; 2mm de
diâmetro externo, 10 mm de comprimento. Os tubos tiveram uma das extremidades seladas a
quente e foram previamente esterilizados em autoclave. Foi utilizado um instrumento Lentulo
(Dentsply/Maillefer - Maillefer Instruments AS, Ballaigues, Switzerland) acionado por um motor
elétrico (Nouvag TCM Endo, USA) numa rotação de 1000 rpm, para inserir o cimento
espatulado dentro dos tubos evitando-se a formação de bolhas. Qualquer excesso de cimento foi
removido com auxílio de uma gaze estéril. Imediatamente, estes tubos foram implantados em
tecido subcutâneo dos camundongos.
Os camundongos foram anestesiados, por injeção intramuscular de cloridrato de cetamina
- Ketamina 10% (Agener União Química Farmacêutica Nacional, Embu-Guaçu, SP, Brasil),
anestésico geral na dosagem de 0,1 ml/100g de peso corpóreo, associado ao relaxante muscular e
analgésico cloridrato de tiazina - Rompun (Bayer S.A. - Saúde Animal, São Paulo, SP, Brasil) na
dosagem de 0,04ml/100g de peso corpóreo.
Foi realizada a tricotomia na região dorsal média, seguida da anti-sepsia do campo
operatório com detergente de mamona Endoquil (Poliquil, Ltda., Araraquara, SP, Brasil). Na
linha média, eqüidistante da inserção caudal e da cabeça do animal, foi realizada uma incisão
Grupos Material Testado 7 Dias 30 Dias Total
I Endofill sem LBI (controle) 10 animais 10 animais 20 animais
II Endofill + LBI vermelho 10 animais 10 animais 20 animais
III Endofill + LBI infravermelho 10 animais 10 animais 20 animais
CAPÍTULO 1________________________________________________________________________________41
transversal de aproximadamente 4mm de comprimento em relação ao corpo do animal com
tesoura cirúrgica de ponta fina. Com tesoura de ponta romba, foi realizado a divulsão lateral do
tecido subcutâneo, confeccionado uma loja cirúrgica para acomodação do implante.
Os tubos foram preenchidos com o material a ser testado, evitando a formação de bolhas
com auxilio do instrumento Lentulo (Dentsply/Maillefer - Maillefer Instruments AS, Ballaigues,
Switzerland) acionado por um motor elétrico (Nouvag TCM Endo, USA) numa rotação de 1000
RPM. Posteriormente foram implantados na loja cirúrgica, as bordas da ferida foram
aproximadas e suturadas com Vicryl 4-0 estéril (Ethicon, Johnson & Johnson, São José dos
Campos, SP, Brasil).
Os grupos experimentais GII e GIII receberam a irradiação LBI, imediatamente e 24
horas após o ato cirúrgico. O LBI utilizado foi o Thera Lase (DMC, Equipamentos Ltda. E.P.P.,
São Carlos, SP, Brasil), com os respectivos parâmetros: GII, LBI vermelho (InGaAIP) λ685ηm,
D=72J/Cm
2
,
E=2J, T=58s, P=35mW; GIII, LBI infravermelho (AsGaAl) λ830ηm, D=70J/Cm
2
,
E=2J, T=40s, P=50mW.
O estado geral dos animais foi avaliado diariamente, sendo estes mantidos em gaiolas
plásticas individuais, antes e após o procedimento cirúrgico e até a morte dos mesmos, sob
condições controladas de limpeza, temperatura, umidade, luz e alimentados com ração
balanceada e água ad libitum. Os animais não receberam medicação pós-operatória com a
intenção de não provocar resultados alterados.
Depois de 7 e 30 dias, os fragmentos teciduais contendo tecido cutâneo, subcutâneo e
tubo de polietileno foram removidos com suficiente margem de segurança sob anestesia geral.
Em seguida os animais foram mortos por overdose anestésica de hidrato de cloral a 10%, a 0,4%
CAPÍTULO 1________________________________________________________________________________42
ml por 100g de peso, injetado via intra-peritoneal. Os animais foram colocados temporariamente
no freezer e posteriormente incinerados.
Os fragmentos foram fixados em formalina a 10%, por 72 horas, desidratados, incluídos
em parafina e seccionados em cortes histológicos de 6 μm em plano longitudinal, passando pela
abertura do tudo de polietileno e incluindo toda interface entre o material e o tecido conjuntivo.
As lâminas foram confeccionadas e coradas com Hematoxilina e Eosina (HE), para
analisar a morfologia celular e Tricrômico de Masson (TM), para analisar a qualidade da
substância intercelular. A avaliação microscópica foi feita com emprego de microscópico óptico
comum (Zeiss, modelo Jenaval, Germany). A resposta do tecido conjuntivo em contato com o
cimento testado foi avaliada por análise subjetiva e comparativa, por dois observadores, que não
tinham conhecimento da ordem dos gurpos analisados, em duas ocasiões diferentes. O grau de
reação do tecido conjuntivo provocados pelos materiais de teste segundo o grau de inflamação
foi avaliado pela presença de células inflamatórias, alteração na população das células residentes
do tecido conjuntivo, alterações da sustância intercelular amorfa e da sustância intercelular
fibrosa. O material foi classificado em escores obtidos segundo a ISO 7405: 1997
17
: 0 - Ausência
de inflamação, 1 - Inflamação leve, 2 - Inflamação moderada, 3 - Inflamação severa, 4 - Presença
de tecido necrótico. Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística pelos métodos
estatísticos não-paramétricos, Teste de Kruskal-Wallis e Teste de Comparação Múltipla de
Dunn, com nível de significância de 5%, utilizando o software GraphPad InStart 3 (DATASET
1. ISD, San Diego - USA).
CAPÍTULO 1________________________________________________________________________________43
RESULTADOS
Análise Histológica
GI (Controle) - 07 Dias - HE
Na análise feita aos 7 dias, na abertura do tubo formou-se uma saliência constituída por
células e substância intercelular com restos necróticos. Houve ausência de vasos sangüíneos em
meio ao tecido pobremente celularizado, sendo que as células apresentavam, núcleos picnóticos,
aliado a presença de macrófagos ativos. (Fig. 1a).
GI (Controle) - 07 Dias - TM
Por esta coloração, observa-se o tecido conjuntivo com a população de células
morfologicamente alterados na forma e no volume nuclear. A substância intercelular está
desorganizada e pouco estruturada com relação às fibrilas colágenas. A porção central do tubo
encontra-se preenchida por células do sistema imune, principalmente macrófagos (Fig. 1b).
GI (Controle) - 30 Dias - HE
Aos 30 dias de análise, a organização do colágeno ao longo da abertura do tubo apresenta
adiantado estado de arranjo tecidual, há pouco tecido inflamado e as células apresentam forma
normal. Os fibroblastos encontram-se ao redor das fibras colágenas, são achatados com núcleos
alongados, ocorre também à presença de macrófagos ocasionais. Além disso, os vasos
sangüíneos são poucos numerosos e ocorre a presença de alguns capilares linfáticos (Fig. 1c).
GI (Controle) - 30 Dias - TM
Por meio desta coloração, percebem-se as fibras colágenas orientadas em meio às células
do tecido conjuntivo e presença de alguns capilares linfáticos (Fig. 1d).
CAPÍTULO 1________________________________________________________________________________44
Figura 1 - Resultados histológicos do GI, aos 7 dias. Nas colorações HE (a) e TM (b),
é nítido o grande número de macrófagos ativos (Æ). Já aos 30 dias, a maturação
organizacional das fibras colágenas e a diminuição no número de células inflamatórias
podem ser observadas HE (c) e TM (d).
GII (LBI vermelho) - 07 Dias - HE
Aos 7 dias de análise, a abertura do tubo encontra-se com ligeiro acúmulo de líquido
tissular entre as células e fibrilas colágenas. Há um grande número de células residentes do
tecido conjuntivo, os fibroblastos e os macrófagos exuberantes, volumosos e ativos. Os capilares
sangüíneos são pouco numerosos (Fig. 2a).
GII (LBI vermelho) - 07 Dias - TM
Esta coloração nos permite analisar que, aos 7 dias, os fibroblastos ativos produzem
fibrilas colágenas que rodeiam a população de células conjuntivas. Na abertura do tubo, há uma
concentração de macrófagos ativos (Fig. 2b).
c
d
400x
400x
a
b
400x
400x
CAPÍTULO 1________________________________________________________________________________45
GII (LBI vermelho) - 30 Dias - HE
Neste período de análise, o LBI vermelho provocou uma diminuição no número de
células, os fibroblastos apresentaram uma redução de volume e as fibras colágenas da substância
intercelular encontram-se em processo de amadurecimento. Há presença de poucos vasos
sanguíneos e os macrófagos em número reduzido encontram-se na abertura do tubo (Fig. 2c).
GII (LBI vermelho) - 30 Dias - TM
Pelo TM, observa-se o amadurecimento de fibras colágenas e o reduzido número de
células do tecido conjuntivo (Fig. 2d).
Figura 2 - Resultados histológicos do GII, aos 7 dias. Nas colorações HE (a) e TM (b),
pode se ver um tecido conjuntivo com uma concentração elevada de macrófagos ativos (Æ).
Aos 30 dias, a redução no número de células e o aumento na concentração de fibrilas
colágenas são exuberantes HE (c) e TM (d).
c
d
400x
400x
a
b
400x
400x
CAPÍTULO 1________________________________________________________________________________46
GIII (LBI infravermelho) - 07 Dias - HE
Na análise feita aos 7 dias, nos foi permitido averiguar que na abertura do tubo, há
resíduos do cimento Endofill, corados em negro e em contato com o tecido conjuntivo do dorso
do animal. O tecido conjuntivo apresentou inflamação reduzida com hipertrofia vascular com
estase sangüínea e pouca marginação leucocitária. As células adjacentes aos vasos se
apresentaram como leucócitos pouco numerosos e escassos polimorfonucleares. Há presença de
fibroblastos em atividade rodeados por fibrilas colágenas e presença de macrófagos ocasionais.
O tecido conjuntivo apresentou-se muito celularizado. Junto à abertura do tubo em meio a
células do conjuntivo ocorre uma intensa angiogênese (Fig. 3a).
GIII (LBI infravermelho) - 07 Dias - TM
Por meio desta coloração, comprova-se a presença de fibrilas colágenas rodeando os
fibroblastos ativos. Há também um ligeiro acúmulo de líquido tecidual que promove um ligeiro
afastamento da malha fibrilar. Na abertura do tubo percebe-se macrófagos ocasionais (Fig. 3b).
GIII (LBI infravermelho) - 30 Dias - HE
No período de 30 dias de análise, na abertura do tubo, persistem resíduos do cimento
corados em negro. O tecido conjuntivo encontra-se amadurecido, com grande número de
fibroblastos maduros exuberantes, com núcleos volumosos, citoplasma claro com a forma das
células alongadas. Foram observadas fibrilas colágenas em processo de amadurecimento,
ausência de inflamação e capilares sangüíneos localizados a distância do tubo exibindo hemácias
preenchendo a luz e ausência de marginação leucocitária (Fig. 3c).
CAPÍTULO 1________________________________________________________________________________47
GIII (LBI infravermelho) - 30 Dias -TM
Pela análise das lâminas coradas pelo TM confirma-se o processo de amadurecimento das
fibras colágenas e grande atividade metabólica das células conjuntivas.
Figura 3 - Resultados histológicos do GIII, aos 7 dias. Nas colorações HE (a) e TM (b),
pode se notar a presença de macrófagos ocasionais em meio a um tecido conjuntivo
moderadamente organizado. Aos 30 dias, a organizaçào do tecido conjuntivo é elevada,
com fragmentos do material ainda visíveis (*), a neovascularização também é evidente (Æ)
em HE (c) e TM (d).
Análise Estatística
Os dados de escores referentes à intensidade da inflamação causada pelos materiais
implantados e irradiados com LBI foram analisados estatisticamente mediante uma abordagem
não paramétrica que, em geral testa a hipótese de igualdade de valores medianos entre grupo de
estudo. Com a finalidade de se avaliar o efeito dos materiais implantados sobre os valores de
inflamação em cada período observado, efetuaram-se, para os tempos de 7 e 30 dias, o Teste de
b
400x 400x
a
c
d
400x
400x
CAPÍTULO 1________________________________________________________________________________48
Kruskal-Wallis (Tabela 2) e o Teste de Comparação Múltipla de Dunn (Tabela 3). O nível de
significância adotado foi o valor convencional de 5%.
Tabela 2 - Teste de Kruskal-Wallis, com nível de significância de 5%, para os grupos experimentais
nos períodos de 7 e 30 dias
__________________________________________________________________________
Grupo N° de Amostras Soma dos Graus Média dos Graus
__________________________________________________________________________
GI - C 07 Dias 10 483.50 48.350
GII - LV 07 Dias 10 329.00 32.900
GIII - LIV 07 Dias 10 314.00 31.400
GI - C 30 Dias 10 261.00 26.100
GII - LV 30 Dias 10 234.50 23.450
GIII - LIV 30 Dias 10 208.00 20.800
__________________________________________________________________________
Observa-se na Tabela 3, que houve diferença estatisticamente significante entre o GI - C
07 dias com três grupos de período experimental de 30 dias (GI 30 dias, GII 30 dias, GIII 30
dias), respectivamente. Nos demais grupos não houve diferença estatística significante entre os
grupos e períodos.
Tabela 3 - Teste de Comparação Múltipla de Dunn
_____________________________________________________________________________________
Comparação Grau de Diferença Significativa Valor de P
_____________________________________________________________________________________
GI - C 07 Dias vs. GII - LV 07 Dias 15.450 ns P>0.05
GI - C 07 Dias vs. GIII - LIV 07 Dias 16.950 ns P>0.05
GI - C 07 Dias vs. GI - C 30 Dias 22.250 * P<0.05
GI - C 07 Dias vs. GII - LV 30 Dias 24.900 * P<0.01
GI - C 07 Dias vs. GIII - LIV 30 Dias 27.550 * P<0.01
GII - LV 07 Dias vs. GIII - LIV 07 Dias 1.500 ns P>0.05
GII - LV 07 Dias vs. GI - C 30 Dias 6.800 ns P>0.05
GII - LV 07 Dias vs. GII - LV 30 Dias 9.450 ns P>0.05
GII - LV 07 Dias vs. GIII - LIV 30 Dias 12.100 ns P>0.05
GIII - LIV 07 Dias vs. GI - C 30 Dias 5.300 ns P>0.05
GIII - LIV 07 Dias vs. GII - LV 30 Dias 7.950 ns P>0.05
GIII - LIV 07 Dias vs. GIII - LIV 30 Dias 10.600 ns P>0.05
GI - C 30 Dias vs. GII - LV 30 Dias 2.650 ns P>0.05
GI - C 30 Dias vs. GIII - LIV 30 Dias 5.300 ns P>0.05
GII - LV 30 Dias vs. GIII - LIV 30 Dias 2.650 ns P>0.05
_____________________________________________________________________________________
* - Com diferença estatisticamente significante entre os grupos
ns - Sem diferença estatisticamente significante entre os grupos
CAPÍTULO 1________________________________________________________________________________49
legenda
Figuras 4 e 5 - Representação gráfica dos escores médios dos fenômenos histológicos de cada grupo experimental
nos períodos de avaliação de 7 e 30 dias.
DISCUSSÃO
A técnica de emprego de implantes de tubo de polietileno em tecido subcutâneo de
animais com a intenção de avaliar in vivo a biocompatibilidade e respostas biológicas permite
que o material a ser testado fique em contato direto com o tecido conjuntivo. Os resultados
obtidos nesta técnica servem como substrato para interpretar a biocompatibilidade dos cimentos
endodônticos, como o cimento de OZE
17-21
.
O cimento endodôntico deve possuir propriedades biológicas e físico-químicas, contudo
as biológicas devem prevalecer e serem consideradas como mais importantes
6,22
. Pelos testes de
biocompatibilidade podemos pesquisar se o material é bem tolerado pelos tecidos. O cimento de
OZE tem satisfatório desempenho em relação a suas propriedades físico-químicas. Contudo, não
apresenta comportamento biológico adequado, por conter eugenol em sua composição
22
. A
Fig.4‐7Dias
Fig.5‐30Dias
CAPÍTULO 1________________________________________________________________________________50
presença do eugenol livre atua levando a injúrias teciduais, bem como depressor celular
23,24
. O
eugenol pode permanecer por longos períodos de tempo de até 10 anos, atuando como irritante
ao tecido, este fato poderia explicar a persistência do processo inflamatório
24
.
Neste estudo, os cimentos foram implantados imediatamente depois de preparados,
seguindo as recomendações do fabricante. O implante colocado logo depois da manipulação do
cimento pode melhor refletir as condições clínicas normais, devido ao contato direto do material
com o tecido conjuntivo.
Conhecendo a reação que o cimento Endofill promove, utilizamos neste estudo o LBI,
para direcionar a uma resposta tecidual mais favorável, já que a intenção é de respeitar o limiar
celular.
O LBI promove a bioestimulação e biomodulação, ou seja, fornece à célula uma baixa
intensidade de energia, para estimular a membrana celular e suas organelas, reparando o tecido
lesado
8-11
. Como as ações terapêuticas dos LBI levam ao aumento da microcirculação local,
angiogênese, proliferação de células epiteliais e fibroblastos, aumento da síntese de colágeno,
ação antiinflamatória
25,26
, o seu emprego em nosso estudo pode ser justificado com a finalidade
de minimizar o efeito irritante do cimento Endofill.
Contudo, a literatura não demonstra estudos que avaliaram a reação tecidual do implante
de cimento de OZE com posterior irradiação de LBI.
O camundongo foi utilizado neste estudo como modelo animal, porque apresenta melhor
metabolismo em relação ao rato, ou seja, melhores respostas biológicas, pois é um animal
geneticamente definido que permite resultados mais uniformes. O camundongo é intensamente
utilizado e conhecido cientificamente, sendo o modelo mais utilizado em pesquisas no mundo
27
.
CAPÍTULO 1________________________________________________________________________________51
O sistema de rodízio de implantes de tubos em animais poderia reduzir o número dos
mesmos em nosso estudo, contudo, devido ao fato do efeito biológico fotoelétrico do LBI, que é
bastante conhecido na literatura
11,26,28
, não o utilizamos. Este efeito poderia interferir e atuar
sobre células, moléculas e átomos, tornando-se inviável o uso do sistema de rodízio de tubos no
mesmo animal.
O LBI apresenta efeitos primários ou diretos, como bioquímicos, bioelétricos e
bioenergéticos, e efeitos secundários ou indiretos, como, estímulo a microcirculação e ao
trofismo celular. Na atuação sistêmica do LBI, a resposta fotobiológica age diretamente na célula
e produz efeito imediato ou primário, levando ao aumento do metabolismo celular, atuando sobre
as cristas mitocondriais, favorecendo a produção de energia celular
28
.
Empregamos duas aplicações LBI, uma imediata ao implante dos tubos e outra 24 horas
após. Esta conduta está de acordo com resultados obtidos em estudos
29,30
, que mostraram que a
melhor resposta celular, proliferação de celular e aumento de metabolismo foram mais
freqüentes quando se utilizou duas aplicações em intervalos de tempo de 24 horas. Os
parâmetros do LBI utilizados neste trabalho foram determinados devido aos resultados positivos
encontrados em estudo realizado em tecido conjuntivo
31
.
Embora os testes de biocompatibilidade dos materiais odontológicos em tecido
conjuntivo subcutâneo não possam ser extrapolados diretamente ao ser humano, eles são
recomendados como preliminares e indicativos
17, 20,21
para comparar o grau de irritabilidade do
material testado. Apesar do tecido conjuntivo subcutâneo não reproduzir as condições pulpares e
periapicais, esta metodologia é relativamente simples para identificar as possíveis reações
teciduais que serão causadas.
CAPÍTULO 1________________________________________________________________________________52
De acordo com os respectivos parâmetros do LBI utilizados, nossos resultados obtidos
demonstraram uma melhor resposta tecidual aos 7 dias nos grupos irradiados com LBI, quando
comparados com o grupo controle.
Baseando-se nos resultados encontrados, apesar de não haver diferença estatística
significante entre os grupos, o uso coadjuvante do LBI mostrou-se válido quando do emprego de
um cimento pouco biológico, como o cimento de OZE. Tanto o emprego do LBI vermelho
quanto o LBI infravermelho mostrou determinada capacidade de biomodulação, ao período de 7
dias. Já no período de 30 dias ocorreu o processo de reparo tecidual em todos os grupos,
ilustrando a menor diferença em favor dos grupos irradiados.
Esse trabalho ilustra a necessidade de outros estudos futuros com a intenção de
fundamentar os melhores parâmetros para irradiação do LBI visando a biomodulação na resposta
tecidual ao efeito irritante causado, não só pelo cimento de OZE, como também por outros
materiais, de modo que estes possam ser extrapolados para seu emprego clínico, já que este
mecanismo de ação é desconhecido na literatura.
CONCLUSÃO
Considerando-se os padrões de condições de execução deste trabalho e de acordo com a
metodologia empregada, nos permitem concluir que:
A ação do LBI, sobre o tecido conjuntivo, diminuiu o efeito irritante oferecido pelo
cimento Endofill, no período de 7 dias. Aos 30 dias ocorreu reparo tecidual, independente da
utilização do LBI.
CAPÍTULO 1________________________________________________________________________________53
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) e a Faculdade de Odontologia de Araraquara da Universidade Estadual Paulista
(FOAr-UNESP).
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“Se você quer o melhor das pessoas,
dê o máximo de si, já que a vida lhe deu tanto”
Quantificação de fibrose e mastócitos na resposta do tecido
conjuntivo ao cimento Endofill irradiado por laser de baixa
intensidade
*
CAPÍTULO 2

∗
Artigo a ser submetido para publicação no periódico Lasers in Medical Science
Qualis Capes: A Internacional; Fator de Impacto: 1.186.
RESUMO
O laser de baixa intensidade (LBI) acelera o processo de reparo dos tecidos após injúrias,
aumentando a proliferação dos fibroblastos e a síntese de colágeno. Os mastócitos induzem
proliferação de fibroblastos e desenvolvimento de fibrose local. O objetivo deste estudo foi
quantificar o padrão de neoformação do tecido conjuntivo fibroso (fibrose) e a densidade
de mastócitos na reação do tecido conjuntivo subcutâneo de camundongos frente ao
implante de tubos de polietileno preenchidos com cimento endodôntico óxido de zinco e
eugenol (OZE) Endofill, quando submetidos à irradiação LBI, imediatamente e 24 horas
pós-implante. Foram utilizados sessenta camundongos (Mus muscullus albinus), divididos
em 3 grupos (n=20): GI (controle), os animais receberam o implante do tubo contendo
Endofill e não receberam a irradiação LBI; GII, implante do tubo com Endofill e LBI
vermelho (InGaAIP) λ685ηm, D=72J/Cm
2
,
E=2J, T=58s, P=35mW; GIII, implante do tubo
com Endofill e irradiação LBI infravermelho (AsGaAl) λ830ηm, D=70J/Cm
2
, E=2J,
T=40s, P=50mW. Os animais foram mortos nos períodos de 7 e 30 dias, as lâminas foram
confeccionadas e coradas com Picrosírius para fibrose e Azul de Toluidina para
mastócitos. Os resultados foram analisados ao microscópio optico comum e de luz
polarizada para a fibrose. A análise estatística realizada foi quali-quantitativa. Aos 30 dias,
o tecido conjuntivo reagiu ao cimento Endofill de forma menos favorável, quando
submetido à irradiação LBI vermelho. A irradiação LBI não ofereceu melhoria no padrão
de fibrose, porém proporcionou queda significativa na concentração de mastócitos
independente do período estudado.
Palavras-chave: Endodontia, cimento óxido de zinco e eugenol, lasers, fibrose,
mastócitos, morfometria.
CAPÍTULO 2__________________________________________________________________________59
ABSTRACT
The low level laser therapy (LLLT) is able to accelerate the healing process of tissue after
an injury, by increasing fibroblast cell proliferation and collagen synthesis. The mast cells
(MC) induce fibroblast proliferation and development of local fibrosis. The aim of this
study was to quantify the rate of the fibrous connective tissue neoformation (fibrosis) and
density of the MC in the reaction of the subcutaneous connective tissue of the mice after
the implant of polyethylene tubes filled with the zinc oxide and eugenol sealer (ZOE)
Endofill, when submitted to the LLLT irradiation, immediately and 24h after implant.
Sixty mice were used (Mus muscullus albinus), divided into 3 groups (n=20): GI (control),
the animal received the polyethylene tube implant with the Endofill and no LLLT
irradiation; GII, tube implant with Endofill and red LLLT irradiation (InGaAIP), λ685ηm,
D=72J/Cm
2
,
E=2J, T=58s, P=35mW; GIII, tube implant with Endofill and infrared LLLT
irradiation (AsGaAl), λ830ηm, D=70J/Cm
2
, E=2J, T=40s, P=50mW. The animals were
killed in the periods of 7 and 30 days, the glass slides were stained with Picrosirius for
fibrosis and Toluidine Blue for MC. The results were analyzed through the normal use
optical microscope and a polarized light one for fibrosis. The statistical analysis carried out
was quali-quantitative. In the post-operative period of 30 days the connective tissue reacted
in a less favorable way to the sealer Endofill, when submitted to the irradiation of red
LLLT. The LLLT irradiation didn't improve the fibrosis rate, however it provided
significant fall in the concentration of MC independent of the studied period.
Key-words: Endodontics, zinc oxide eugenol sealer, lasers, fibrosis, mast cells,
morphometry.
CAPÍTULO 2__________________________________________________________________________60
INTRODUÇÃO
Com o avanço técnico-científico da Odontologia, o laser de baixa intensidade (LBI)
passou a ser utilizado buscando diversos benefícios, principalmente na perspectiva de
reparar os tecidos lesados. Estudos demonstram que o LBI é eficiente na redução do
processo inflamatório, acelera o reparo dos tecidos moles, aumenta a síntese de ATP, bem
como estimula síntese de DNA e proliferação celular [1, 2]. O LBI promove angiogênese,
aumenta depósito de fibras colágenas e aumenta a proliferação de fibroblastos [2-7]
provocando fibrose intersticial, especialmente ao redor dos vasos capilares [8] e
conseqüentemente redução no número de mastócitos [9].
O cimento à base de óxido de zinco eugenol (OZE), é utilizado como material
obturador dos canais radiculares na Endodontia. Por diversas décadas, o OZE é
amplamente empregado em muitos países sob variadas marcas comerciais, por ser de fácil
aquisição devido ao seu baixo custo e apresentar adequadas propriedades físico-químicas.
Estudos clássicos relataram que o OZE não apresenta comportamento biológico
favorável, sendo citotóxico, por conter eugenol em sua composição [10-13]. Portanto, o
eugenol leva à resposta tecidual desfavorável [14, 15], provocando quadros de inflamação
severa, necrose tecidual, perda tecidual direta, dermatite de contato
e reação alérgica
verdadeira em animais e seres humanos testados, nos diferentes níveis de pesquisa para
avaliação da compatibilidade biológica dos materiais odontológicos [12, 16].
Os mastócitos têm papel relevante, na formação do tecido conjuntivo, liberação de
mediadores que estimulam a proliferação de fibroblastos e síntese de colágeno [17]. Há
uma relação entre a presença de mastócitos e fibrose demonstrada em estudos [18-20]. No
entanto, relatos desta analogia, na reação do tecido conjuntivo frente ao cimento de OZE
submetido à irradiação LBI não foram realizados.
CAPÍTULO 2__________________________________________________________________________61
A proposta deste estudo foi quantificar a densidade de tecido conjuntivo fibroso e a
densidade de mastócitos nas reações do tecido conjuntivo subcutâneo de camundongos
frente ao implante de tubos de polietileno contendo o cimento de OZE Endofill, quando
submetidos à irradiação imediata e 24 horas do LBI.
MATERIAL E MÉTODO
Este trabalho está de acordo com os princípios éticos na experimentação animal
adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal - COBEA e foi aprovado pelo
Comitê de Ética em Experimentação Animal - CEEA, da Faculdade de Odontologia de
Araraquara-UNESP (Processo CEEA-FOAr N° 002/2005).
Foram utilizados 60 camundongos Mus muscullus albinus, machos, pesando em
média 40 gramas. Os animais foram anestesiados, por injeção intramuscular de cloridrato
de cetamina - Ketamina 10% (Agener União Química Farmacêutica Nacional, Embu-
Guaçu, SP, Brasil), anestésico geral na dosagem de 0,1 ml/100g de peso corpóreo,
associado ao relaxante muscular e analgésico cloridrato de tiazina - Rompun (Bayer S.A. -
Saúde Animal, São Paulo, SP, Brasil) na dosagem de 0,04ml/100g de peso corpóreo.
Os animais foram colocados em mesa cirúrgica própria e imobilizados. Foi
realizada a tricotomia na região dorsal média, com uma máquina elétrica (Wahl Clipper
Corp, Model Mc, USA), completada por um aparelho de gilete com lâmina de aço
inoxidável (Gillette do Brasil Ltda., São Paulo, SP, Brasil). Foi realizada anti-sepsia do
campo operatório com detergente de mamona Endoquil (Poliquil, Polímeros Químicos
Ltda., Araraquara, SP, Brasil).
Na linha média, eqüidistante da inserção da cauda e da cabeça do animal, foi
realizada uma incisão transversal de aproximadamente 4mm de comprimento em relação
CAPÍTULO 2__________________________________________________________________________62
ao corpo do animal com tesoura cirúrgica de ponta fina. Com tesoura de ponta romba, foi
realizado a divulsão lateral do tecido subcutâneo, confeccionado uma loja cirúrgica para
acomodação do implante.
O Endofill foi preparado, obtendo-se uma mistura homogênea, seguindo as
recomendações do fabricante (3 gotas de líquido adicionadas ao pó de forma gradativa até
conseguir uma consistência tal que, ao colocar a espátula sobre a mistura e levantá-la
formar-se um fio de cimento que se rompe quando atingir um comprimento de
aproximadamente 2 cm). Os tubos de polietileno (Kit de selantes Delton - Johnson &
Johnson, São José dos Campos, SP, Brasil), medindo 1,5mm de diâmetro interno; 2mm de
diâmetro externo, 10mm de comprimento tiveram uma das extremidades fechada à quente.
Os tubos e todo material clínico foram previamente autoclavados à temperatura de 120ºC
durante 20 minutos. Os tubos foram preenchidos com o material a ser testado, evitando a
formação de bolhas com auxilio do instrumento Lentulo (Dentsply/Maillefer - Maillefer
Instruments AS, Ballaigues, Switzerland) acionado por um motor elétrico (Nouvag TCM
Endo, USA) numa rotação de 1000 RPM. Posteriormente foram implantados na loja
cirúrgica, as bordas da ferida foram aproximadas e suturadas com Vicryl 4-0 estéril
(Ethicon, Johnson & Johnson, São José dos Campos, SP, Brasil). Os animais foram
divididos eqüitativamente em 3 grupos (Tabela 1):
Tabela 1 - Distribuição dos grupos de acordo com o material testado, períodos experimentais e
número de animais
Grupos Material Testado 7 Dias 30 Dias Total
I Endofill sem LBI (controle) 10 animais 10 animais 20 animais
II Endofill + LBI vermelho 10 animais 10 animais 20 animais
III Endofill + LBI infravermelho 10 animais 10 animais 20 animais
CAPÍTULO 2__________________________________________________________________________63
Os grupos experimentais II e III receberam a irradiação LBI, imediatamente e 24
horas após o ato cirúrgico, colocando-se a ponta do cabo de fibra óptica o mais próximo
possível da abertura do tubo, conforme os seguintes parâmetros: GII - LBI vermelho
(InGaAIP) λ685ηm, D=72J/Cm
2
,
E=2J, T=58s, P=35mW; GIII - LBI infravermelho
(AsGaAl) λ830ηm, D=70J/Cm
2
, E=2J, T=40s, P=50mW. A Unidade LBI utilizada foi o
Thera Lase (DMC, Equipamentos Ltda. E.P.P., São Carlos, SP, Brasil).
Os animais foram mantidos em gaiolas plásticas individuais, antes e após o
procedimento cirúrgico e até a morte dos mesmos, sob condições controladas de limpeza,
temperatura, umidade e luz, sendo alimentados com ração balanceada e água ad libitum.
Os animais não receberam medicação pós-operatória afim de não provocar resultados
alterados. O estado geral dos animais foi avaliado diariamente.
Decorridos os períodos de 7 e 30 dias, os fragmentos teciduais contendo tecido
cutâneo, subcutâneo e tubo de polietileno foram removidos com suficiente margem de
segurança sob anestesia geral. Somente após a remoção destes fragmentos, os animais
foram mortos por overdose anestésica de hidrato de cloral a 10%, a 0,4% ml por 100g de
peso, injetado via intra-peritoneal, sendo colocados temporariamente no freezer e
posteriormente incinerados.
Os fragmentos foram fixados em formalina a 10%, por 72 horas, desidratados,
incluídos em parafina e seccionados em cortes histológicos de 6 μm em plano
longitudinal, passando pela abertura do tudo de polietileno e incluindo toda interface entre
o material e o tecido conjuntivo. As lâminas foram coradas com Picrosírius para fibrose e
Azul de Toluidina para mastócitos [20].
A quantificação morfométrica de fibrose (Fig.1a) foi realizada, na parte
correspondente a abertura do tubo. Foi utilizado um sistema analisador de imagem
CAPÍTULO 2__________________________________________________________________________64
automático constituído por microscópio, câmara capturadora de imagem e computador
com o programa KS300 (Kontron Zeiss, Germany). Para avaliação morfométrica do tecido
conjuntivo fibroso foram utilizadas as lâminas coradas pela coloração de Picrosírius,
utilizando um filtro de luz polarizada e o sistema analisador de imagem automático
descrito anteriormente. Utilizamos aumento final de 100x, sendo a imagem lançada no
monitor. Na imagem polarizada o tecido conjuntivo fibroso apresentava birrefringência
com coloração amarelo-avermelhada (Fig.1b), sendo dessa forma quantificado
automaticamente. Foram avaliados todos os campos de cada caso.
A contagem dos mastócitos foi realizada em todas as lâminas, na parte
correspondente a abertura do tubo. Para a quantificação dos mastócitos utilizamos as
lâminas coradas pelo Azul de Toluidina (Fig.1c, Fig.1d), sendo observadas em um
microscópio de luz comum, com aumento final de 1600x. Foi realizada contagem dos
mastócitos em todos os campos dos cortes. Para a obtenção da área avaliada, com o auxílio
uma ocular micrometrada calculamos a área de cada campo. Com o número de mastócitos
e a área, calculamos a densidade de mastócitos, sendo expressa em número de mastócitos
por mm
2
.
Os resultados foram submetidos à análise estatística pelos testes Kruskal-Wallis e
teste de Comparação Múltipla de Dunn para fibrose, e ANOVA e teste de Tukey, para
mastócitos, com o software SigmaStat 2.03.
RESULTADOS
Os dados morfométricos do padrão de fibrose e contagem de mastócitos obtidos do
tecido conjuntivo subcutâneo dos animais foram analisados. O grupo irradiado com LBI
infravermelho, não apresentou diferença no padrão de tecido conjuntivo fibroso em ambos
CAPÍTULO 2__________________________________________________________________________65
os períodos experimentais, quando comparado com grupo controle (p>0,05; Tabela 2 e
Gráfico1).
O GII aos 7 dias não apresentou melhora no padrão de fibrose (p>0,05). No
entanto, aos 30 dias mostrou um padrão inferior de tecido conjuntivo fibroso em relação ao
GI 30 dias (p<0,05; Tabela 2 e Gráfico1).
Em ambos os períodos experimentais, 7 dias e 30 dias, a atuação do LBI vermelho
e infravermelho reduziu de forma significativa (p<0,05) o valor médio de mastócitos em
relação aos grupos controles 7 e 30 dias (Tabela 3 e Gráfico1).
Figura 1 - Achados histológicos no tecido conjuntivo subcutâneo dos animais:
a - Tecido conjuntivo fibroso, em vermelho, ao longo da abertura do tubo, com finas fibras próximo ao
cimento Endofill. Pricrosirius, 100x.
b - Tecido conjuntivo fibroso, em vermelho, mostrando fibras colágenas maduras visíveis na abertura do tubo
com alta birefringência. Pricrosirius, luz polarizada, 100x.
c - Mastócitos na região onde se encontrava a reação tecidual frente ao cimento, Azul de Toluidina, 1600x.
d - Mastócitos sendo evidenciados na região da reação tecidual frente ao cimento
Endofill, Azuis de Toluidina, 1600x.
a
b
c
d
CAPÍTULO 2__________________________________________________________________________66
Tabela 2 - Comparação estatística do padrão do tecido conjuntivo fibroso entre os grupos avaliados
___________________________________________________________________________________
Comparação Diferença dos Ranks Q Valor de P<0,05
___________________________________________________________________________________
G III 30DIAS vs G III 7DIAS 456,219 16,301 SIM
G III 30DIAS vs G I 7DIAS 410,097 11,991 SIM
G III 30DIAS vs G II 7DIAS 351,407 11,078 SIM
G III 30DIAS vs G II 30DIAS 218,515 9,951 SIM
G III 30DIAS vs G I 30DIAS 70,358 2,207 NÃO
G I 30DIAS vs G III 7DIAS 385,861 11,314 SIM
G I 30DIAS vs G I 7DIAS 339,739 8,631 SIM
G I 30DIAS vs G II 7DIAS 281,049 7,549 SIM
G I 30DIAS vs G II 30DIAS 148,158 5,046 SIM
G II 30DIAS vs G III 7DIAS 237,703 9,475 SIM
G II 30DIAS vs G I 7DIAS 191,581 6,011 SIM
G II 30DIAS vs G II 7DIAS 132,891 4,551 SIM
G II 7DIAS vs G III 7DIAS 104,812 3,086 SIM
G II 7DIAS vs G I 7DIAS 58,690 1,496 NÃO
G I 7DIAS vs G III 7DIAS 46,122 1,271 NÃO
___________________________________________________________________________________
Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Comparação Múltipla de Dunn, com nível de significância de 5%,
observados para os grupos Controle (GI), LBI vermelho (GII), LBI infravermelho (GIII).
Tabela 3 - Comparação estatística da quantificação de mastócitos entre os grupos avaliados
____________________________________________________________________________________
Comparações Dif. das Médias q P P<0,050
____________________________________________________________________________________
G I 7DIAS vs G III 30DIAS 4,375 12,846 <0,001 SIM
G I 7DIAS vs G II 30DIAS 3,819 11,213 <0,001 SIM
G I 7DIAS vs G III 7DIAS 3,333 9,786 <0,001 SIM
G I 7DIAS vs G II 7DIAS 2,916 8,562 <0,001 SIM
G I 7DIAS vs G I 30DIAS 1,181 3,468 0,157 NÃO
G I 30DIAS vs G III 30DIAS 3,194 9,378 <0,001 SIM
G I 30DIAS vs G II 30DIAS 2,638 7,746 <0,001 SIM
G I 30DIAS vs G III 7DIAS 2,152 6,319 <0,001 SIM
G I 30DIAS vs G II 7DIAS 1,735 5,094 0,009 SIM
G II 7DIAS vs G III 30DIAS 1,459 4,284 0,041 SIM
G II 7DIAS vs G II 30DIAS 0,903 2,651 0,429 NÃO
G II 7DIAS vs G III 7DIAS 0,417 1,224 0,953 NÃO
G III 7DIAS vs G III 30DIAS 1,042 3,060 0,272 NÃO
G III 7DIAS vs G II 30DIAS 0,486 1,427 0,913 NÃO
G II 30DIAS vs G III 30DIAS 0,556 1,633 0,856 NÃO
____________________________________________________________________________________
ANOVA seguido pelo Teste de Tukey com nível de significância de 5%, observados para os grupos Controle
(GI), LBI vermelho (GII), LBI infravermelho (GIII).
CAPÍTULO 2__________________________________________________________________________67
Gráfico 1 - Representação gráfica do padrão do tecido fibroso e número de mastócitos em
GI, GII e GIII aos 7 e 30 dias.
DISCUSSÃO
Para que um cimento endodôntico seja dito “ideal”, este deve preencher diversas
propriedades biológicas e físico-químicas, sendo as propriedades biológicas consideradas
como as mais importantes. Por meio dos testes de biocompatibilidade verificamos se o
material será bem tolerado pelos tecidos.
O cimento de OZE não apresenta comportamento biológico favorável [21], por
conter em sua composição o eugenol. O eugenol livre seria responsável por danos
teciduais, atuando como depressor celular [22, 23].
No presente estudo, utilizamos o LBI como um possível recurso tecnológico para
minimizar o efeito irritante causado pelo cimento de OZE Endofill. Empregamos o LBI
com a finalidade de realizar a bioestimulação, ou seja, oferecer à célula uma baixa
intensidade de energia, que estimularia o reparo do tecido agredido.
3,33
3,84
2,5
9,09
5,94
11,29
7,28
4,37
3,95
6,1
3,46
2,91
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
C7d L V7d LIV7d C30d LV30d LIV30d
Padrãodefibro se
Númerodemastócitos
CAPÍTULO 2__________________________________________________________________________68
Devido às ações terapêuticas dos LBI sobre os tecidos em induzir efeitos tais como,
antiinflamatório, aumento na microcirculação local [24, 25], estimulo a drenagem linfática
[26], proliferação de células epiteliais [27] e fibroblastos [28], bem como aumento da
síntese de colágeno pelos fibroblastos [29], justifica-se o seu estudo com o propósito de
promover a biomodulação no processo inflamatório mediante o efeito irritante do Endofill.
Foi utilizada a técnica de implantes de tubo de polietileno em tecido subcutâneo de
camundongos, com intuito de avaliar in vivo a compatibilidade e as respostas biológicas do
cimento Endofill. Esta metodologia é bastante conhecida e difundida na literatura, pois
permite que o material a ser testado fique em contato direto com o tecido conjuntivo. Os
resultados oriundos deste método podem ser usados como fontes pré-eliminares para as
informações da biocompatibilidade dos cimentos endodônticos
[30-34].
Há estudos que demonstram relação entre a presença de fibrose e o número
mastócitos na pele [17], no fígado [19], na língua de pacientes chagásicos [20], glândulas
salivares [35]. Entretanto, não foi encontrado nenhum relato prévio, sobre a analogia da
presença do padrão de fibrose com o número de mastócitos na reação do tecido conjuntivo
ao cimento de OZE. Também não há estudos sobre a reação tecidual ao implante de tubos
contendo o cimento de OZE e posteriormente irradiados com LBI.
Estudos têm demonstrado uma melhor resposta tecidual com a irradiação de LBI [8,
35]. Na presente pesquisa, demonstrou-se que a irradiação LBI vermelho interferiu de
forma significativa o aumento no padrão de tecido fibroso aos 30 dias. Já o LBI
infravermelho aos 30 dias apresentou padrão de tecido fibroso superior ao controle 30 dias,
porém sem diferença estatística significante (p>0,05). A divergência dos nossos resultados
com os outros estudos, poderia ser justificada pela diferença nos parâmetros do LBI
utilizados, já que estes ainda são controversos na literatura.
CAPÍTULO 2__________________________________________________________________________69
Há estudos que mostram a relação dos biomateriais em produzir efeitos
inflamatórios in vivo, pois a reação inflamatória pode se determinada por diferentes tipos
de células, como por exemplo, os mastócitos [36]. A atuação do LBI vermelho ou LBI
infravermelho, diminuiu de forma marcante o número de mastócitos aos 7 e 30 dias em
comparação aos respectivos grupos controle.
Determinadas proteínas como metaloproteinase (MMP-2), podem induzir
inflamação em resposta aos materiais odontológicos testados no tecido conjuntivo. Esse
relato foi encontrado quando se avaliou o papel dos mastócitos e fibrose nesses materiais
[37]. Em nosso estudo sugerimos também que MMP-2 pode estar envolvida na resposta
biológica, contudo são necessários estudos para confirmar este resultado.
No entanto novas pesquisas para determinarem os melhores parâmetros para
irradiação do LBI na resposta tecidual devem ser realizadas com a intenção de demonstrar
a melhor relação do padrão fibrose e o número de mastócitos no reparo tecidual, frente ao
cimento de OZE.
Os resultados deste estudo podem servir como um guia, para futuros trabalhos
direcionados nesta linha de pesquisa, onde o mecanismo de ação da irradiação do LBI na
reação do tecido conjuntivo ao cimento OZE ainda é desconhecido na literatura.
CONCLUSÃO
Considerando os resultados obtidos de acordo com a metodologia empregada,
podemos concluir que:
CAPÍTULO 2__________________________________________________________________________70
A irradiação LBI não ofereceu melhoria no padrão de fibrose, porém proporcionou
queda significativa na concentração de mastócitos independente do período estudado.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES), Faculdade de Odontologia de Araraquara da Universidade Estadual
Paulista (FOAr-UNESP) e Universidade de Uberaba (UNIUBE).
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“A persistência supera o que os fracos consideram impossível”
Tácito
CONCLUSÃO
CONCLUSÃO
Nas condições experimentais em que esta pesquisa foi conduzida, de acordo com a
metodologia empregada e com base nos resultados obtidos nos permitem concluir que:
1) O tecido conjuntivo reagiu de forma mais favorável ao cimento Endofill, quando
submetido à irradiação do LBI, no período de 7 dias. Aos 30 dias ocorreu reparo
tecidual, independente da utilização do LBI.
2) Entre os grupos irradiados com LBI, o GIII (LBI infravermelho) apresentou
melhores resultados histológicos, quando comparado com o GII (LBI vermelho),
porém sem diferença estatística significante tanto aos 7 como aos 30 dias.
3) Nos grupos onde houve irradiação do LBI, houve menor número de mastócitos e
menor presença de fibrose, principalmente no GIII (LBI infravermelho),
conseqüentemente, abreviou-se o tempo do processo de cicatrização e reparo
tecidual.
“Todos os dias temos motivos pra agradecer!!!
Aprendemos com a vida...
Que é necessário viver cada dia como se fosse único.
Que temos a liberdade de fazer as nossas escolhas.
Que o conhecimento precisa ser aprimorado a cada dia”
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in cell culture. Lasers Surg Med. 1998; 22:294-301.
“Entrega o teu caminho ao Senhor, confia nele, e ele tudo fará.”
Salmo 37,5
ANEXOS
ANEXOS
Anexo 1 - Certificado do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal - COBEA e
Comitê de Ética em Experimentação Animal - CEEA, da Faculdade de Odontologia de
Araraquara-UNESP (Processo CEEA-FOAr N° 002/2005)
Autorizo a reprodução deste trabalho.
(Direitos de publicação reservado ao autor)
Araraquara, 27 de março de 2008.
GUSTAVO SIVIERI DE ARAÚJO
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