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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
Universidade Federal de São Carlos
CARACTERIZAÇÃO MORFOFUNCIONAL DAS
BRÂNQUIAS DE Arapaima gigas, DURANTE A
TRANSIÇÃO DA RESPIRAÇÃO AQUÁTICA PARA
RESPIRAÇÃO AÉREA
Aluno: Cleverson Agner Ramos
Orientadora: Profa. Dra. Marisa Narciso Fernandes
São Carlos – 2008
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Cleverson Agner Ramos
CARACTERIZAÇÃO MORFOFUNCIONAL DAS BRÂNQUIAS DE
Arapaima gigas, DURANTE A TRANSIÇÃO DA RESPIRAÇÃO
AQUÁTICA PARA RESPIRAÇÃO AÉREA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Fisiológicas do Centro de
Ciências Fisiológicas do Centro de Ciências
Biológicas e da Saúde da Universidade Federal de
São Carlos, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Ciências
Fisiológicas
Orientadora: Profa. Dra. Marisa Narciso Fernandes
São Carlos – 2008
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Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da
Biblioteca Comunitária da UFSCar
R175cm
Ramos, Cleverson Agner Ramos.
Caracterização morfofuncional das brânquias de Arapaima
gigas, durante a transição da respiração aquática para
respiração aérea / Cleverson Agner Ramos. -- São Carlos :
UFSCar, 2008.
79 f.
Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São
Carlos, 2008.
1. Branquias – anatomia. 2. Respiração aérea. 3.
Morfologia (Biologia). I. Título.
CDD: 591.49 (20
a
)
ORIENTADORA:
_______________________________
Marisa Narciso Fernandes
Aos meus pais, Irene e José
e aos meus irmãos Everton e Stephany,
por tudo que representam para mim.
AGRADECIMENTOS
Á Profª Dra. Marisa Narciso Fernandes pela oportunidade, confiança, orientação,
apoio imprescindível e exemplo de profissional.
Á Universidade Federal do Amazonas, em especial aos profs. Wallice P. Duncan
e Oscar Tadeu F. da Costa pela coleta dos animais, possibilitando assim, a realização
deste trabalho.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Técnológico – CNPq,
pela bolsa concedida.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas (PPG-CF) da
Universidade Federal de São Carlos (UFSCar) e ao seu corpo docente.
Ao Centro de Microscopia eletrônica da UFPR e seus técnicos, pelo auxílio nas
análises de microscopia eletrônica de varredura.
Aos amigos do Laboratório de Zoofisiologia e Bioquímica Comparativa pelos elos
de amizade construídos e pela ajuda direta ou indiretamente.
Aos meus familiares por sempre me incentivarem sempre e acreditarem nos
meus projetos.
O que importa é a cultura, o meio ambiente e os peixes.
Piracumã Yawalapiti
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
1.1. A respiração aquática nos peixes
01
1.2. A estrutura branquial dos peixes teleósteos
03
1.3. A respiração aérea em peixes
07
1.4. A respiração em Arapaima gigas (Pirarucu)
08
1.5. As hipóteses desse estudo
10
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivos gerais
11
2.2. Objetivos e Metas
11
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Material Biológico – Considerações sobre a espécie Arapaima gigas
12
3.2. Local da coleta dos animais
13
3.3. Procedimento para retirada das brânquias
14
3.4. Processamento laboratorial e análise das brânquias
15
3.4.1. Processamento para microscopia de luz em historesina
15
3.4.1.1. Análise da estrutura interna dos filamentos e morfometria dos
elementos branquiais
16
3.4.1.2. Análise do número de células mucosas
17
3.4.2. Processamento para microscopia de luz em parafina
17
3.4.2.1. Imunohistoquímica para marcação de células-cloreto
18
3.4.2.2. Imunohistoquímica para marcação de células em proliferação
19
3.4.2.3. Imunohistoquímica para marcação de células em apoptose
20
3.4.3. Processamento para microscopia eletrônica de transmissão
21
3.4.4. Processamento para microscopia eletrônica de varredura
22
3.4.4.1. Área fracional e densidade das células-cloreto
22
3.5. Análise estatística
23
4. RESULTADOS
4.1. Morfologia das brânquias durante a fase de transição da respiração
aquática para a respiração totalmente aérea de A. gigas
24
4.1.1. Aspectos gerais das brânquias
24
4.1.2. Aspectos gerais da morfologia interna das brânquias
30
4.2. Morfometria dos elementos branquiais de relevância para as
trocas gasosas
40
4.3. Atividade celular nas brânquias de Arapaima gigas
45
4.3.1. Parâmetros pertinentes ao desenvolvimento dos filamentos
(Proliferação e morte celular)
45
4.3.2. Parâmetros pertinentes à atividade osmoregulatória nas brânquias
de Arapaima gigas
49
4.3.2.1. Células imunoreativas para o anticorpo anti-Na
+
/K
+
-ATPase
49
4.3.2.2. Área fracional de células-cloreto (AFCC) e densidade
49
4.3.3. Parâmetros pertinentes à secreção de mucopolisacarídeos
(histoquímica para células mucosas - PAS e Alcian Blue)
53
5. DISCUSSÃO
5.1. Morfologia branquial de Arapaima gigas
57
6. CONCLUSÕES
66
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
67
8. APÊNDICES
8.1. Apêndice I – Licença para coleta e transporte
79
LISTA DE FIGURAS
Figura 01: Esquema geral das estruturas respiratórias nos peixes de respiração
aquática. Bolsas branquiais em peixes-bruxa (A e E) e lampreias (B e F) e arcos
branquiais em elasmobrânquios (C e G) e teleósteos (D e H).
(Traduzido de EVANS et al., 2005).
02
Figura 02: Disposição dos arcos branquiais em um peixe teleósteo.
Há quatro pares de arcos na cavidade faríngea, sendo quatro em cada lado (A).
Perpendicularmente a cada arco partem duas fileiras de filamentos (B), sendo que em
cada lado do filamento há uma fileira de lamelas perpendiculares a este (C e D). As
setas azuis mostram o sentido do fluxo de água, que atravessa as lamelas em um
sentido contrário ao fluxo sanguíneo e no detalhe da lamela em E podem ser
observados seus principais componentes. F= Filamento; L= Lamela; Aa= Artéria
aferente; Ae= Artéria eferente; M= músculo branquial adutor.
(Adaptado de BONE et al., 1995; HILDEBRAND, 1995; EVANS et al., 2005)
05
Figura 03: Modelo de transporte iônico em peixes de água doce e de ambiente marinho.
Pode ser observado que os teleósteos marinhos há secreção de íons, mediada por
duas células; Na membrana basolateral o transporte de Cl
-
ocorre por um co-
transportador Cl
-
/Na
+
/K
+
, sendo que há reabsorção do Na
+
por transporte ativo,
realizado por uma Na
+
/K
+
-ATPase e a reabsorção do K
+
ocorre através de um canal de
K
+
; na membrana apical o Cl
-
é transportado através de um canal de Cl
-
enquanto que o
Na
+
é transportado via paracelular, auxiliado de uma célula acessória. A absorção de
íons nos peixes dulcícolas ocorre por quatro células onde pode ser observado que na
membrana basolateral há grande quantidade de proteínas que realizam transporte ativo
(~) sendo observados: uma Na
+
/K
+
-ATPase (NKA), uma Ca
2+
-ATPase e uma V-
ATPase; o Ca
2+
também é absorvido através de um trocador 3Na
+
/Ca
2+
, o Cl
-
é
absorvido através de canais e ainda na membrana basolateral observa-se a presença
de V-ATPase; na membrana apical observa-se a absorção de Ca
2+
e Na
+
através de
canais, sendo que o Na
+
também é absorvido através de um trocador Na
+
/H
+
, o Cl
-
é
absorvido através de um trocador Cl
-
/HCO
3
-
e na membrana apical observa-se,
também, uma V-ATPase.
(Traduzido de Hirose et al., 2003)
06
Figura 04: Exemplar de Arapaima gigas (Schinz, 1822). Barra de escala: 10cm.
12
Figura 05: Local onde os exemplares de A. gigas foram coletados, o sistema de lagos
do Jacaré, Baixo Rio Solimões. (cedido por Wallice P. Duncan)
14
Figura 06: Parâmetros mensurados nas brânquias de A. gigas. A: Altura total da lamela;
B: Altura potencialmente funcional da lamela; C: Espessura do epitélio do filamento; D:
Espessura do Epitélio da lamela; E: Distância entre lamelas (interlamelar); F: Largura
da lamela (região basal). (Modificado de Hughes, 1984)
16
Figura 07: Células mucosas com reação positiva pelo método de PAS em A; células
com reação positiva ao método de Alcian blue, em pH de 2,5.
17
Figura 08: Face interna dos quatro arcos branquiais esquerdos de um exemplar de A.
gigas de 5020g. Cada arco é formado pelos ossos ceratobranquial (c) e o epibranquial
(e), podem ser observados rastros longos na região externa (setas claras) e curtos na
região interna (setas escuras), principalmente nos dois primeiros arcos branquiais (AbI
e AbII). Os filamentos (f) estão voltados para a cavidade opercular.
24
Figura 09: Aspecto geral dos filamentos branquiais (F) de Arapaima gigas em diferentes
etapas de desenvolvimento (A-105g, B-575g, C-1343g, D-5020g). Em A e B a presença
de lamelas (L) são facilmente identificadas ao longo do filamento, enquanto que em C e
D estas estruturas não são tão evidentes. Nestes animais é possível observar apenas a
presença de dobras no epitélio do filamento (setas).
26
Figura 10: Detalhe do filamento branquial de animais com 105g (A), 1343g (B) e 5020g
(C e D). Note células pavimentosas (setas claras) com aspecto convexo, na lamela (L) e
filamento (F). As setas escuras indicam as dobras no epitélio do filamento de animais
acima de 1000g. Em D observa-se que estas células não têm um limite celular definido.
27
Figura 11: A: Células pavimentosas no septo branquial do animal de 2g (A) apresentam
limites celulares visíveis por microdobras da membrana (setas claras), enquanto que
em outras regiões da brânquia (B) estes limites celulares são definidos por depressões
entre as células e em animais acima desta massa corpórea as características das
células pavimentosas são as mesmas. Observe em (A) microdobras curtas com
distribuição aleatória na superfície apical e baixa densidade (setas pontilhadas) no
septo do animal de 2g, enquanto que em outras regiões do filamento (B) são curtas e
estão em alta densidade. No animal de 105g (C) e 1343g (D) as células pavimentosas
têm sua superfície convexa e as microdobras exibem o mesmo padrão do animal de 2g.
28
Figura 12: Células-cloreto (cc) no epitélio do filamento em animais com diferentes
massas corpóreas, incluindo as dobras no epitélio do filamento de animais acima de
1000g (A: 46g, B: 575g, C e D: 5020g). As células mucosas (setas claras) têm menor
área de contato com o meio aquático e estão distribuídas entre células pavimentosas.
Em algumas regiões observada a presença de muco (setas escuras).
29
Figura 13: Modificação na estrutura das brânquias ao longo do desenvolvimento de A.
gigas (A: 2g, B: 46g, C: 105g, D: 575g, E:1343g, F:4995g). Note lamelas (L) bem
evidentes no filamento das brânquias de animais com até aproximadamente 600g (D).
Em animais acima de 1000g (E e F) as lamelas sofrem modificações, e o espaço
interlamelar torna-se reduzido (setas transparentes). O sistema de células pilares (setas
pontilhadas) fica distante do meio externo. São observadas também células-cloreto
(setas escuras) e células mucosas (setas brancas).
33
Figura 14: Detalhe do filamento branquial (F) de animais acima de 1000g. Note o
sistema de células pilares (setas pontilhadas) atrofiado e embebido no tecido do
filamento (A e B). Todos seus elementos podem ser observados, o canal marginal (cm),
células pilares (cp), os espaços delimitados pelas flanges das células pilares (ep) e
eritrócitos (er) nestes espaços. As setas claras indicam células mucosas e as setas
escuras indicam as células-cloreto.
34
Figura 15: Lamelas e estruturas lamelares em A. gigas. A e B: Animal com 105g. Note a
presença de lamelas bem definidas. C: Animal com 575g. Note o aumento da
espessura do epitélio lamelar e redução do sistema de células pilares. D: Animal com
1343g. Note projeções citoplasmáticas entre as células que constituem a lamela e o
espaço intercelular. Eritrócitos (setas escuras). (cp) células pilares, (pv) células
pavimentosas, (ei) espaço intersticial, (ep) espaços delimitados pelas flanges das
células pilares.
35
Figura 16: Localização dos principais tipos celulares no epitélio branquial de A. gigas.
(A) Células-cloreto no epitélio da lamela, próximas ao canal marginal (a seta escura
indica a presença de eritrócitos); (B) Célula mucosa (m) ao lado de célula-cloreto (cc)
em processo de necrose; (C) Células-cloreto (cc) próximas ao meio externo e em (D)
células-cloreto com conteúdo citoplasmático mais electrondenso que em (C).
36
Figura 17: Células-cloreto (cc) no epitélio branquial de A. gigas. As setas mostram
diferentes tipos de contato com o meio externo destas células: criptas em (A), projeções
citoplasmáticas em (B e C). Em (A), célula-cloreto no espaço interlamelar e em (D)
célula-cloreto em necrose. Observe mitocôndrias (mt) e um sistema tubular
citoplasmático (seta pontilhada) desorganizado.
37
Figura 18: Células mucosas no epitélio branquial de A. gigas. Células mucosas
electronopacas são observadas em “A” e electrondensas em “B”. Observe uma célula
mucosa com núcleo basal (N) liberando muco para o meio externo em “C” e detalhes
dos grânulos de secreção presentes neste tipo celular em “D”.
38
Figura 19: Células “Rodlet” em diferentes estágios de maturação; A e C: célula imatura.
B: Célula matura em contato como meio externo. D: Célula liberando o conteúdo celular
e desligamento do epitélio. Note cápsula fibrosa (setas escuras), núcleo basal (N), halo
de “rodlet” (setas pontilhadas) e estilete voltado para o ápice da célula (setas
transparentes) em todas as células.
39
Figura 20: Altura total (ATL) e potencialmente funcional (APFL) em relação a massa
corpórea (Mc) de A. gigas. As curvas são: ATL = 32,02Mc
0,16
(n= 7, r
2
= 0,91, P< 0,001)
e APFL = 25,60Mc
0,10
(n= 7, r
2
= 0,79, P< 0,01).
41
Figura 21: Espessura do epitélio do filamento (EPF) e da lamela (EPL) em relação a
massa corpórea (Mc) de A. gigas. As curvas são: EPF = 4,70Mc
0,40
(n= 7, r
2
= 0,91, P<
0,001) e EPL = 0,76Mc
0,47
(n= 7, r
2
= 0,93, P< 0,001 ).
42
Figura 22: Largura total da lamela (LTL) em relação a massa corpórea (Mc) de A. gigas.
A curva é: LTL = 5,22Mc
0,32
(n= 7, r
2
= 0,91, P< 0,001).
43
Figura 23: Distância interlamelar em A. gigas. Há um aumento até animais com
aproximadamente 100g, ocorrendo uma redução na distância interlamelar até
aproximadamente 5000g. * indica diferença significativa (p<0,05) em relação ao ponto
anterior.
44
Figura 24: Imunohistoquímica para células em proliferação celular (setas escuras). O
maior aumento do número de células PCNA + ocorre no animal de 575g, diminuindo
novamente nos animais acima dessa Mc.
46
Figura 25: Imunohistoquímica para células em apoptose (setas escuras). Em todos os
animais observados o número de células marcadas foi semelhante.
47
Figura 26: Proliferação celular e apoptose (morte celular programada) nos filamentos
branquiais de A. gigas. Observe um aumento da proliferação celular até
aproximadamente 500-600g, com posterior redução a partir dessa Mc. O número de
células em apoptose se mantém baixo e sem variações significativas entre os animais
observados. * indica diferença significativa (P<0,05) em relação ao ponto anterior.
48
Figura 27: Imunohistoquímica atividade da enzima Na
+
/K
+
-ATPase, presente em
células-cloreto. As setas escuras indicam células fortemente coradas devido a uma
maior atividade da enzima, enquanto que as setas pontilhadas indicam células
fracamente coradas devida a uma menor atividade da enzima. Nos animais que
apresentam lamelas a maior incidência destas células é nas regiões interlamelares.
50
Figura 28: Variações na média de células-cloreto em diferentes etapas do
desenvolvimento de A. gigas. Nas lamelas, observa-se que ocorre um aumento no
número dessas células apenas em animais acima de aproximadamente 1000g. Observe
que nos filamentos ocorre um aumento no número destas células tanto para claras
(CCclf) quanto para escuras (CCcef). As curvas são: CCclf = 5,62Mc
0,32
(n= 6, r
2
= 0,91,
P< 0,001) e CCcef = 13,20Mc
0,27
(n= 6, r
2
= 0,93, P< 0,001 ).
51
Figura 29: Morfometria da superfície de animais em diferentes etapas de
desenvolvimento. (A) Área fracional das CCs; (B) Densidade de CCs, e o aumento da
densidade pode ser observado pela uma curva: CCden = 6,60Mc0,1337 (n= 5, r²= 0,9,
P<0,001). * indica diferença significativa em relação ao animal anterior (P<0,05).
52
Figura 30: Células PAS+ (setas escuras) são observadas nas regiões interlamelares
nos animais de 46g e 105g e estão nas primeiras camadas do epitélio branquial, em
todos os animais observados. Pode se observar ainda, um aumento visível no número
de células PAS+ ao longo do desenvolvimento do peixe.
54
Figura 31: Células AB+ (setas escuras) assim como as células PAS+, estão
frequentemente observadas nas regiões interlamelares nos animais de 46g e 105g e
em todos os peixes analisados, estão nas primeiras camadas do epitélio branquial.
Para esta técnica histoquímica, também é observado um aumento visível no número de
células AB+ ao longo do desenvolvimento do peixe.
55
Figura 32: Análise quantitativa do número de células mucosas (PAS+ e AB+) de peixes
em diferentes etapas de desenvolvimento. Observe até aproximadamente 100-200g há
um aumento quantitativo em ambos os tipos de células mucosas em um animal na faixa
de 500g ocorre aumento significativo apenas nas células PAS+. * Indica diferença
significativa em relação ao ponto anterior. (P<0,05).
56
LISTA DE TABELAS
TABELA I – Animais coletados no sistema de lagos do Jacaré
13
RESUMO
A estrutura das brânquias do peixe amazônico Arapaima gigas, um respirador
aéreo obrigatório, foi analisada durante a transição para a respiração aérea obrigatória
e os dados obtidos foram relacionados ao seu modo de respiração. Brânquias de
exemplares com massa corpórea entre 2g a 5000g foram coletadas, fixadas e
processadas para análises de morfometria, histoquímica, imunohistoquímica,
microscopia eletrônica de transmissão e varredura (área fracional de células-cloreto -
AFCC e densidade). Nas etapas iniciais de desenvolvimento da espécie a estrutura
branquial é semelhante à de respiradores aquáticos obrigatórios, mas profundas
alterações ocorrem à medida que o animal cresce, influenciando na respiração e nas
trocas iônicas. As lamelas mantêm sua estrutura organizacional, incluindo a circulação
de eritrócitos, mas tornam-se vestigiais em animais a partir de 1000g permanecendo
parcialmente imersas no epitélio do filamento. Os principais tipos celulares que compõe
o epitélio branquial são as células-cloreto (CCs), células mucosas (CMs) e células
pavimentosas (CPs). As CPs apresentam forma irregular e microdobras dispostas
aleatoriamente na superfície celular. Dois processos celulares envolvem alterações em
brânquias, proliferação e morte celular programada (apoptose) predominando um
intenso aumento de células em proliferação até 500-600g. Células em apoptose foram
escassas em todos os animais. As CCs, pouco presentes em animais abaixo de 100-
200g ocupam uma grande porção no epitélio do filamento em animais acima de
aproximadamente 1000g, assim como a AFCC e densidade. Dois tipos de CMs foram
observadas, PAS positivas e Alcian Blue positivas. Ocorreu aumento significativo na
incidência de ambas até animais com 100-200g e PAS positivas até 500-600g. Na
transição para a respiração aérea e conseqüentemente a perda da dependência da
respiração aquática devem acarretar as alterações nas brânquias de A. gigas, dessa
forma as brânquias desempenham outras funções importantes, como regulação iônica
e equilíbrio ácido base, que são otimizadas pelos tipos celulares presentes nesse
epitélio e sua configuração.
ABSTRACT
The gill structure of the Amazon fish Arapaima gigas, an obligatory air breather,
was analyzed during its transition to obligatory air breathing behavior and the obtained
data was related to its breathing mode. Gills of fish weighing between 2 to 5000g were
collected, fixed and processed for morphometric analysis, histochemistry,
imunohistochemistry, transmission (TEM) and scanning (SEM) electron microscopy
(chloride cell fractional area, CCFA and density). In the first stages of development the
gill filaments is as those of water-breathers, but there’s intense changes while the
animal grow, with influence on respiratory function and ionic exchanges. The lamellae
keeps its organizational structure, including red cells passing through it, but them
become to vestigial in fish since 1000g, being the interlamellar regions filled with
filament cells. The most important cell types of the gill epithelia are the chloride cells
(CCs), mucous cells (MCs) and the pavement cells (PCs). The PCs shows irregular
shape and random microridges on the cell surface. Two cell processes are involved to
gill changes, cells proliferation and programmed death cells (apoptosis); there is an
intense proliferating cells until animals reach 500-600g. Apoptotics cells were low in all
the animals observed. The number of CCs are low in animals under 100-200g and
increased in the filament and lamellar epithelia in animals up to 1000g as well as the
CCFA. Two kinds of MCs were observed, PAS positive and Alcian Blue positive. There
was a significant raise in both cells until animals with 100-200g and PAS positives until
500-600g. These cells seem to play an important role relation with ion regulation. The
transition to air breathing and the restriction for aquatic respiration result in gill changes
in A. gigas, and the gills may play other important functions like ion and acid-base
regulation, optimized by its epithelia cell kinds and its design.
1
. Introdução
1. INTRODUÇÃO
1.1. A respiração aquática nos peixes
A respiração consiste numa seqüência de reações de oxidação, sendo definida
como um processo fisiológico através do qual o oxigênio é captado pelo sangue ao
mesmo tempo em que o dióxido de carbono, produto do metabolismo celular, é
liberado para o meio externo (FLOREY, 1968). Os peixes de respiração
exclusivamente aquática são organismos muito mais adaptados a esse modo de
respiração do que o homem para a respiração aérea. Os peixes têm uma extração
de até 80% do oxigênio dissolvido na água que passa através das brânquias
(FERNANDES e RANTIN, 1989), enquanto que o homem extrai apenas 25% do
oxigênio contido no ar inspirado (WEST, 1996). Essa eficiência dos peixes na
extração do oxigênio dissolvido na água se deve a dois fatores, o primeiro deles é
pela estrutura branquial e seu sistema de circulação e o segundo é pelo fluxo
contínuo de água através das brânquias, que ocorre em qualquer ciclo da respiração
(GREENWOOD, 1975).
Há uma grande diversidade quanto a estrutura das brânquias em peixes (Figura
01); nos peixes bruxas (uma linhagem dos agnatas), que estão entre os mais basais,
a respiração ocorre por meio de bolsas branquiais, estruturas que têm uma
organização anatômica única, quando comparada a outros peixes (EVANS et al.,
2005). Segundo o autor, estes animais apresentam de 7 a 15 pares de bolsas
branquiais (evaginações da farínge) e a comunicação com o meio externo ocorre
através de ductos inalantes e exalantes (Figura 01: A e E). Diferentemente dos
outros peixes não há associação de estruturas ósseas com essas bolsas e de sua
parede interna partem, em direção ao centro, inúmeras dobras epiteliais que ocupam
toda a dimensão da bolsa branquial. Em outra linhagem dos agnatas, as lampréias,
as bolsas branquiais são diferentes daquelas dos peixes-bruxa, pois o ducto para a
entrada de água é o mesmo para saída (Figura 01: B e F). Segundo o autor, essa
diferença em relação ao outro grupo de deve ao modo de alimentação do animal.
Os elasmobrânquios e teleósteos apresentam estruturas respiratórias muito
semelhantes, entretanto deve-se ressaltar a presença de um septo interbranquial
muito desenvolvido nos elasmobrânquios (Figura 01: C e G); a diferença no
2
. Introdução
comprimento do septo é um fator que interfere no fluxo de água através das
brânquias (Figura 01: C, D, G, H). Nos teleósteos, a respiração ocorre nas lamelas
dos filamentos dos arcos branquiais (Figura 01: D e H) cuja estrutura e organização
serão descritos no próximo item. O fluxo de água que passa pelas brânquias
depende da freqüência de abertura da boca e dos opérculos, cuja pressão da bomba
bucal e opercular é sincronizada a um gradiente de pressão buco-opercular que
favorece ao ciclo respiratório (ROMER e PARSONS, 1985). O refluxo de água é
evitado por uma membrana na margem ventroposterior do opérculo e desta forma a
cavidade bucal e a câmara branquial atuam como um sistema de sucção e pressão
para manter um fluxo contínuo de água (HUGHES, 1984).
Figura 01: Esquema geral das estruturas respiratórias nos peixes de respiração aquática.
Bolsas branquiais em peixes-bruxa (A e E) e lampreias (B e F) e arcos branquiais em
elasmobrânquios (C e G) e teleósteos (D e H).
(Traduzido de EVANS et al., 2005).
3
. Introdução
1.2. A estrutura branquial dos peixes teleósteos
A figura 02 mostra a organização das brânquias e sua estrutura. A maioria
dos peixes teleósteos apresenta um total de oito arcos branquiais, dispostos quatro
a quatro lateralmente na cavidade orofaríngea, protegidos e separados do meio
externo pelo opérculo. Na região faríngea, de cada arco branquial, formado pelos
ossos epi- e ceratobranquial, partem expansões denominadas rastros, que se
direcionam para a cavidade orofaríngea (Figura 02: A). Os rastros possuem células
quimioreceptoras, denominadas botões gustativos, e dependendo da espécie, a
forma, tamanho e quantidade de rastros variam , evidenciando uma íntima relação
com os hábitos alimentares dos peixes (EIRAS-STOFELLA, 1994).
No lado oposto aos rastros, voltados para cavidade opercular, partem duas
fileiras de filamentos branquiais unidos até certa extensão por um septo (septo
interbranquial) (Figura 02: B e C). Cada filamento, acima e abaixo do seu eixo
longitudinal, apresenta lamelas transversais (Figura 02: C-E), que são as estruturas
efetivas para as trocas gasosas. Além das trocas gasosas (O
2
e CO
2
) que ocorrem
nas lamelas, o epitélio branquial é responsável por várias outras funções, como os
ajustes do equilíbrio ácido-base (GOSS et al., 1998) e iônico (HIROSE et al., 2003) e
eliminação de produtos nitrogenados (EVANS et al., 2005). Há, portanto uma
separação das funções respiratória e íon-osmorregulatória, sendo que as estruturas
celulares envolvidas na regulação iônica ocorrem principalmente no epitélio do
filamento branquial. Conseqüentemente, a vasculatura das brânquias consiste em
dois circuitos sanguíneos, o artério-arterial e o artério-venoso. A circulação artério-
arterial esta relacionada a troca de gases nas lamelas e é constituída pela artéria
branquial aferente, artéria primária aferente, arteríola lamelar aferente, lamela,
arteríola lamelar eferente, artéria primária eferente, artéria branquial eferente (Figura
02: C). A circulação artério-venosa é a responsável por irrigar órgãos e tecidos e é
relacionada ao transporte de O
2
e nutrientes para estes locais e pela captação de
CO
2
e produtos do metabolismo. Quanto a regulação iônica, Hirose et al. (2003)
propõem um modelo molecular para as proteínas de membrana das células-cloreto
(CCs) envolvidas no transporte de íons, tanto em ambiente marinho quanto em
ambiente dulcícola (Figura 03). Na proposta desses autores é possível observar o
antagonismo existente entre o desafio osmótico em ambiente marinho e dulcícola.
4
. Introdução
No ambiente marinho, onde a estratégia utilizada é a secreção de íons, nesta
revisão observa-se transporte ativo na membrana basolateral e a presença de
canais de Cl
-
em sua membrana apical e secreção de Na
+
por uma via paracelular,
com auxílio de uma célula acessória.
Dentre os tipos celulares encontrados no epitélio branquial, os principais são
as células pavimentosas (CPs) que são as mais numerosas; as células mucosas
(CMs) que são responsáveis pela secreção de mucosubstâncias, e as células-
cloreto (CCs), que são responsáveis pela absorção de íons Cl
-
e Ca
2+
nos peixes de
água doce e excreção de Na
+
e Cl
-
nos peixes marinhos. As CMs e CCs estão
distribuídas entre as CPs no epitélio que reveste o filamento branquial e,
dependendo das características físicas e químicas da água, pode ocorrer
proliferação das CCs no epitélio da lamela, o que aumenta a distância de difusão
água-sangue. O aumento da barreira água-sangue nas lamelas reduz a absorção de
O
2
da água e, conseqüentemente, sua transferência para o sangue (PERRY, 1997;
SAKURAGUI et al., 2003).
Esta organização anatômica altamente complexa tem sido objeto de vários
estudos tanto em relação à caracterização estrutural/ultraestrutural e morfometria
(OLSON e FROMM, 1973; HUGHES, 1972; HOSSLER et al., 1985; MORON e
FERNANDES, 1996; PERNA e FERNANDES, 1996; SAROGLIA et al., 2002;
KARAKATSOULI et al., 2006; COSTA et al., 2007) quanto à comparação
morfológica e morfométrica entre as diferentes espécies com relação a eficiência da
função respiratória, crescimento e taxonomia (GRAY, 1954; HUGHES, 1984; OJHA
e MISHRA, 1993; FERNANDES et al., 1994; SANTOS et al., 1994; PERNA e
FERNANDES, 1996; MATTIAS et al., 1996; MAZON et al., 1998; EIRAS-STOFELLA
et al., 2001; FERNANDES e PERNA-MARTINS, 2002; COSTA et al., 2007) e às
alterações que possam comprometer essa função devido aos efeitos diretos e
indiretos de contaminantes no meio aquático (WOOD, 2001; MAZON et al., 2002;
FERNANDES et al., 2007).
5
. Introdução
Figura 02: Disposição dos arcos branquiais em um peixe teleósteo.
Há quatro pares de arcos na cavidade faríngea, sendo quatro em cada lado (A).
Perpendicularmente a cada arco partem duas fileiras de filamentos (B), sendo que em cada
lado do filamento há uma fileira de lamelas perpendiculares a este (C e D). As setas azuis
mostram o sentido do fluxo de água, que atravessa as lamelas em um sentido contrário ao
fluxo sanguíneo e no detalhe da lamela em E podem ser observados seus principais
componentes. F= Filamento; L= Lamela; Aa= Artéria aferente; Ae= Artéria eferente; M=
músculo branquial adutor.
(Adaptado de BONE et al., 1995; HILDEBRAND e GOSLOW, 2006; EVANS et al., 2005)
6
. Introdução
Figura 03: Modelo de transporte iônico em peixes de água doce e de ambiente marinho.
Pode ser observado que os teleósteos marinhos há secreção de íons, mediada por duas
células; Na membrana basolateral o transporte de Cl
-
ocorre por um co-transportador Cl
-
/Na
+
/K
+
, sendo que há reabsorção do Na
+
por transporte ativo, realizado por uma Na
+
/K
+
-
ATPase e a reabsorção do K
+
ocorre através de um canal de K
+
; na membrana apical o Cl
-
é
transportado através de um canal de Cl
-
enquanto que o Na
+
é transportado via paracelular,
auxiliado de uma célula acessória. A absorção de íons nos peixes dulcícolas ocorre por
quatro células onde pode ser observado que na membrana basolateral há grande
quantidade de proteínas que realizam transporte ativo (~) sendo observados: uma Na
+
/K
+
-
ATPase (NKA), uma Ca
2+
-ATPase e uma V-ATPase; o Ca
2+
também é absorvido através de
um trocador 3Na
+
/Ca
2+
, o Cl
-
é absorvido através de canais e ainda na membrana
basolateral observa-se a presença de V-ATPase; na membrana apical observa-se a
absorção de Ca
2+
e Na
+
através de canais, sendo que o Na
+
também é absorvido através de
um trocador Na
+
/H
+
, o Cl
-
é absorvido através de um trocador Cl
-
/HCO
3
-
e na membrana
apical observa-se, também, uma V-ATPase.
(Traduzido de Hirose et al., 2003)
7
. Introdução
1.3. A respiração aérea em peixes
A transição da respiração aquática para a respiração aérea foi de suma
importância na história evolutiva dos vertebrados. O desenvolvimento do modo de
respiração aérea, segundo GANS (1970) provavelmente surgiu de forma acidental
em peixes que nadavam rente à superfície durante períodos de baixa disponibilidade
de O
2
. Provavelmente essa transição começou no período Cambriano; pois desde
esta época, hipóxia e anóxia em rios e lagos têm sido eventos comuns na história
evolutiva dos peixes (RANDALL et al., 1981). Até os dias atuais, períodos de
hipóxia/anóxia são observados em vários sistemas aquáticos, como em algumas
planícies alagadas da Amazônia (VAL e ALMEIDA-VAL, 1995). A respiração aérea,
segundo GANS (1970), trouxe vantagens para os peixes, pois a utilização do ar
como uma fonte de O
2
permitiu uma independência das variações de O
2
na água,
permitindo a colonização de outros ambientes e uma redução de tamanho no órgão
de respiração aquática. A respiração aérea apareceu independentemente e diversas
vezes até o clímax na radiação dos peixes, sendo que diferentes estruturas de
trocas com o ambiente aéreo são descritas em diferentes grupos (VAL e ALMEIDA-
VAL, 1995).
Podemos classificar os peixes de respiração aérea em duas categorias:
peixes de respiração aérea facultativa e peixes de respiração aérea obrigatória. Os
peixes de respiração aérea facultativa obtêm O
2
do ar apenas quando há baixa
disponibilidade de O
2
na água, enquanto que os que possuem respiração aérea
obrigatória dependem exclusivamente do O
2
atmosférico para a manutenção do
metabolismo aeróbico.
Os órgãos adaptados para a respiração aérea em peixes possuem intensa
irrigação sanguínea e são supridos com uma rede de finos capilares (VAL e
ALMEIDA-VAL, 1995). Dentre esses órgãos podem ser: o epitélio da superfície
bucal, faringeal, branquial e cavidade opercular como ocorre em Synbranchus
marmoratus (Bloch, 1795), Hypopomus brevirostris (Steindachner, 1868) e Anguila
anguila (Linnaeus, 1758) (MUNSHI, 1976), bolsas adjacentes a faringe, ou seja, a
câmara suprabranquial localizada no teto da faringe acima das brânquias como em
Clarias batrachus (Linnaeus, 1758), Channa striatus (Bloch, 1793) e Anabas
8
. Introdução
testudineus (Bloch, 1792) (MUNSHI, 1961; HUGHES e DATTA-MUNSHI, 1973;
HUGHES e MUNSHI, 1973), parte do sistema digestório como o estômago ou o
intestino em Pterygoplichthys multiradiatus (Hancock, 1828), Hypostomus regani
(Ihering, 1905), Pterygoplichthys anisitsi (Eigenmann e Kennedy, 1903) e Corydoras
aeneus (Gill, 1858) (CARTER e BEADLE, 1931; GEE e GRAHAM, 1978; PODKOWA
e GONIAKOWSKA-WITALINSKA, 2002) e modificação da bexiga natatória como em
Hoplerythrinus unitaeniatus (Spix e Agassiz, 1829), Piabucina festae (Boulenger,
1899) e Arapaima gigas (Schinz, 1822), sendo este último um respirador aéreo
obrigatório GRAHAM, 1997). Finalmente, nos dipnóicos as trocas gasosas ocorrem
em um pulmão funcional, como em Lepidosiren paradoxa (Fitzinger, 1837).
Considerando a grande diversidade de estruturas para as trocas gasosas no meio
aéreo em peixes, há o interesse na morfologia dessas estruturas e alterações que
ocorrem nos órgãos respiratórios durante o crescimento do animal de forma a
permitir uma maior compreensão da fisiologia respiratória nesses peixes e uma
possível classificação sistemática com base nestas estruturas, como a relatada em
GRAHAM (1997) e PERRY e SANDER (2004).
1.4. A respiração em Arapaima gigas (Pirarucu)
Nos peixes que possuem respiração aérea obrigatória observam-se profundas
modificações na estrutura branquial durante o desenvolvimento do animal. Por
exemplo, em L. paradoxa os alevinos recém eclodidos apresentam brânquias
externas, sendo que durante o seu desenvolvimento ocorre uma atrofia e
desaparecimento deste órgão reduzindo o desenvolvimento das brânquias internas,
sendo que em animais adultos as brânquias não têm participação nas trocas
gasosas (MORAES et al., 2005).
O peixe amazônico Arapaima gigas, popularmente conhecido como pirarucu,
é um peixe que apresenta os dois modos de respiração, aquática e aérea, em
etapas distintas do seu desenvolvimento. Até o oitavo ou nono dia após a eclosão
dos ovos essa espécie apresenta exclusivamente respiração branquial e, em
animais jovens, a estrutura branquial é semelhante aquela dos peixes teleósteos de
respiração exclusivamente aquática e há, até certo tamanho, uma dependência das
9
. Introdução
brânquias para a respiração (GRAHAM, 1997). Em animais adultos embora possa
ocorrer absorção de O
2
através do epitélio branquial, esta não é suficiente para
suprir a demanda de O
2
no animal, sendo que a maior absorção de O
2
ocorre
através da bexiga natatória modificada, que é muito semelhante ao pulmão dos
peixes pulmonados, entretanto este órgão apresenta apenas uma câmara
diferentemente dos pulmões que são, geralmente, órgãos pares (VAL e ALMEIDA-
VAL, 1995). Utilizando microscopia eletrônica de varredura (MEV), BRAUNER et al.
(2004) verificaram que a morfologia branquial de um exemplar de 10g é típica dos
peixes com respiração exclusivamente aquática, entretanto um exemplar de 100g
(45 dias após eclosão) começa a apresentar profundas modificações da estrutura do
filamento que são bem evidentes em exemplares com 1000g (4~5 meses) nos quais
não é possível observar a presença de lamelas.
Nos últimos anos A. gigas tem sido alvo de diversos estudos, tanto por razões
ecológicas quanto por razões econômicas, uma vez que a atividade pesqueira na
região amazônica tem aumentado e que esta espécie apresenta grande
produtividade em sistemas de piscicultura (VAL e ALMEIDA-VAL, 1995; GOMES et
al., 2006), e que a espécie pode atingir 4kg em apenas 1 ano (VAL e ALMEIDA-VAL,
1995). Estudos quantitativos sobre as alterações nos elementos branquiais ao longo
do desenvolvimento de A. gigas são escassos principalmente na fase de transição
de respiração aquática para exclusivamente aérea. Considerando que a fase de
transição da respiração aquática para a respiração aérea pode ser crítica para o
desenvolvimento do animal e que isso ocorre nos primeiros 5-6 meses de vida este
estudo descreve a configuração dos elementos branquiais e as alterações
morfológicas das brânquias de A. gigas durante o desenvolvimento, assim como as
possíveis implicações da remodelagem das brânquias na função respiratória e na
regulação iônica.
10
. Introdução
1.5. As hipóteses desse estudo
1) Os elementos que constituem as unidades de troca de gases (lamelas) sofrem
alterações morfofuncionais ao longo do desenvolvimento de A. gigas, de forma a
reduzir drasticamente a absorção de O
2
do meio aquático?
2) Os processos envolvidos nas alterações das lamelas implicam em remodelamento
do tecido branquial que incluem proliferação celular e morte celular programada?
3) A redução na superfície respiratória implica em modificações morfo-funcionais
envolvendo as demais funções das brânquias, principalmente em relação a
regulação iônica via proliferação de células-cloreto ou aumento da área fracional
(AFCC) das CCs?
11
. Objetivos
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivos gerais
Caracterizar a organização e as modificações dos elementos branquiais
respiratórios e não respiratórios de A. gigas durante o seu desenvolvimento,
relacionando estas modificações com a função respiratória das brânquias, ajustes
iônicos e secreção de mucopolissacarídeos.
2.2. Objetivos e Metas
• Estimar as variações da barreira de difusão de gases nos peixes em
diferentes etapas de desenvolvimento, utilizando ferramentas de análises
morfométricas;
• Identificar as modificações que ocorrem na configuração e estrutura dos
filamentos branquiais ao longo do desenvolvimento do animal e suas
relações com a mudança do modo de respiração;
• Identificar quais os principais processos responsáveis pela modificação da
estrutura branquial através de técnicas de imunohistoquímica para detecção
de células em apoptose nas lamelas ou proliferação celular;
• Verificar se ocorrem alterações na produção de mucopolissacarídeos ao
longo do desenvolvimento de A. gigas, utilizando técnicas de histoquímica
para a identificação de mucopolissacarídeos;
• Verificar se há alteração nas estruturas branquiais associadas a regulação
iônica através da quantificação das células de cloreto.
12
. Materiais e Métodos
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Material Biológico – Considerações sobre a espécie Arapaima gigas
A espécie Arapaima gigas (Figura 04), popularmente conhecida como
pirarucu tem a seguinte classificação sistemática:
Phylum: Chordata
Classe: Actinopterygii
Ordem: Osteoglossiformes
Família: Arapaimidae
Subfamília: Heterotidinae
Gênero: Arapaima
Figura 04: Exemplar juvenil de Arapaima gigas com 212g. Barra de escala: 10cm.
Este peixe é considerado o maior teleósteo de água doce no mundo, podendo
atingir 4,5m e pesar 200 kg (GRAHAM, 1997). A espécie é encontrada nos rios da
parte setentrional da América do Sul, vivendo em lagos e rios tributários, de águas
claras, brancas e pretas, com pH ligeiramente alcalino e com temperaturas variando
entre 24° a 37°C. Em geral, a espécie não é encontrada em zona de fortes
13
. Materiais e Métodos
correntezas e águas ricas em sedimentos. Na época da seca, A. gigas é capaz de
atravessar grandes distâncias em terra firme procurando água, durante esse período
os peixes formam casais, procurando em seguida ambientes calmos para preparar o
seu ninho, reproduzindo-se durante a enchente. Após a eclosão dos ovos há
cuidado parental por aproximadamente seis meses (SALVO-SOUZA e VAL, 1990).
Os animais jovens nadam em grupo e, com o desenvolvimento do modo de
respiração aérea, 8 a 9 dias após a eclosão dos ovos, o comportamento de emergir
para a superfície e tomada de O
2
também é em grupos (GRAHAM, 1997).
A. gigas é bastante vulnerável à ação dos pescadores e o abate dos machos
após as desovas expõe os filhotes à predadores. Há uma longa fase de imaturidade
sexual que dura de 3 a 5 anos e a pesca dessas espécies juvenis, chamados
"bodecos", variando entre 30 e 40 Kg diminui o sucesso reprodutivo.
3.2. Local da coleta dos animais
Exemplares de A. gigas com massa corpórea entre 1,67g e 5010g (TABELA I)
foram coletados utilizando arrasto de rede e peneiras, no sistema de lagos do Jacaré
(Figura 05) (S03° 31’537” W60° 40’181”) que é um conjunto de pequenos lagos que
têm comunicação direta com o rio Solimões, próximo a cidade de Manacapuru,
aproximadamente 100 km de Manaus. A coleta foi realizada mediante licença
ambiental do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renováveis (IBAMA / MMA) n° 15/2004 (Apêndice I).
TABELA I – Animais coletados no sistema de lagos do Jacaré
Animais Coletados
Comprimento
Total (cm)
6,9 X 19,8 19,0 25,1 31,0 X 53,5 79,5 81
Massa
Corpórea (g)
1,675 34 46,5 54,5 105,6 211,9 575 1343 4995 5020
14
. Materiais e Métodos
As coletas foram realizadas no período de setembro/outubro de 2004/2005,
na vazante do Rio Solimões por pescadores locais sob a coordenação dos
Professores da Universidade Federal do Amazonas, Oscar T. F. da Costa e Wallice
P. Duncan. Nos pontos de coleta o pH variou entre 6,25 e 6,7 e a temperatura (°C)
entre 28,3 e 29,7. O rio Solimões é um exemplo típico de rio de água branca.
Figura 05: Local onde os exemplares de A. gigas foram coletados, o sistema de
lagos do Jacaré, Baixo Rio Solimões.
(cedido por Wallice P. Duncan)
3.3. Procedimento para retirada das brânquias
Imediatamente após a coleta, os animais foram anestesiados em (p-
aminobenzoato de etila, benzocaína) 0,9mlL
-1
. Os arcos branquiais foram removidos,
lavados em solução fisiológica de NaCl 0,9% e fixados em glutaraldeído (GTA) 2,5%
em tampão fosfato 0,1M, pH 7,3 a 4°C. Após um período de 24h, as amostras foram
transferidas para uma solução de manutenção constituída de GTA 0,5% com o
mesmo tampão. O glutaraldeído é um ótimo fixador por apresentar uma ótima
preservação das organelas, seu mecanismo básico de ação é a ligação em
grupamentos amino (NH2) que ocorrem nas proteínas, com alteração mínima da
configuração terciária das cadeias polipeptídicas, e liga-se também nos radicais
15
. Materiais e Métodos
aminados de fosfolipídios das membranas (SOUZA et al., 1998). As amostras
coletadas foram enviadas para o Laboratório de Zoofisiologia e Bioquímica
Comparativa (DCF/UFSCar) para processamento e análise.
3.4. Processamento laboratorial e análise das brânquias
No laboratório os arcos branquiais foram divididos em três regiões: dorsal,
mediana e ventral e, posteriormente cada uma destas regiões, aleatoriamente
sorteadas, foram separadas para um tipo de análise. As amostras utilizadas para
análise em microscopia de luz foram processadas de forma a ser posteriormente
aplicada técnicas de histoquímica para a identificação de mucosubstâncias das
células mucosas ou morfometria de elementos branquiais e técnicas de
imunohistoquímica para detecção de células de cloreto (a-5 positivas), proliferação
celular (PCNA positivas) e apoptose (TUNEL positivas). As amostras utilizadas para
microscopia eletrônica de varredura e transmissão foram processadas para a
observação da morfologia ultraestrutural das brânquias e mensurações de
parâmetros referentes ao número e superfície das células-cloreto.
3.4.1. Processamento para microscopia de luz em historesina
O processamento em historesina permite a obtenção de cortes do tecido
branquial sem distorções e menos espessos do que 5 µm, condição necessária para
análises morfométricas. As amostras foram desidratadas gradualmente em álcool
nas concentrações de 50% até 95%, uma hora em cada etapa da bateria de
desidratação sendo posteriormente embebidas e incluídas com historesina comercial
(Leica Historesin Embedding Kit), em histomoldes para a obtenção de cortes em
posição sagital. Em um micrótomo (HM 360 MICROM), os cortes obtidos com
espessura de 3µm foram colocados em lâminas histológicas, sendo então aplicadas
técnicas de histoquímica (azul de toluidina, azul de toluidina+fucsina básica e
métodos de PAS e Alcian blue). As análises do material e o registro de imagens foi
16
. Materiais e Métodos
feito em um microscópio Olympus-Micronal BX51 acoplado a uma câmera de vídeo
ligada a um computador, utilizando o software C.A.S.T System (Olympus, Denmark).
3.4.1.1. Análise da estrutura interna dos filamentos e morfometria dos
elementos branquiais
As lâminas histológicas com cortes sagitais das amostras de brânquias foram
coradas com azul de toluidina e fucsina básica. Na figura 06 estão apresentados os
parâmetros mensurados, sendo: altura total ou estrutural (A) da lamela que tem
início anatomicamente no canal proximal, no interior do filamento e se estende até o
canal marginal ou ápice da lamela; região potencialmente funcional (B) da lamela,
que representa a região funcional da lamela responsável pelas trocas de gases e
tem início no término do epitélio do filamento e se estende até o canal marginal; a
espessura do epitélio do filamento (C) e epitélio da lamela (D); a largura da lamela
(E) e a distância entre as lamelas (interlamelar) (F). Para calcular o valor médio de
cada parâmetro mensurado, em cada animal, foram realizadas 20 mensurações em
campos não contínuos e os dados foram então transferidos para uma planilha do
software Excel para posterior análise estatística.
Figura 06: Parâmetros
mensurados nas
brânquias de A. gigas. A:
Altura total da lamela; B:
Altura potencialmente
funcional da lamela; C:
Espessura do epitélio do
filamento; D: Espessura
do Epitélio da lamela; E:
Distância entre lamelas
(interlamelar); F: Largura
da lamela (região basal).
(Modificado de Hughes,
1984)
17
. Materiais e Métodos
3.4.1.2. Análise do número de células mucosas
A determinação do tipo e número de células mucosas durante o
desenvolvimento de A. gigas foram efetuadas considerando a reação das
mucosubstâncias aos corantes utilizados (Figura 07). As células que apresentaram
mucosubstâncias com hexoses neutras, açúcares e/ou ácidos siálicos foram
identificadas utilizando o método do ácido periódico-Schiff (PAS). As células
mucosas que possuíam mucopolissacarídeos contendo grupos carboxil e éster-
sulfato foram identificadas utilizando Alcian Blue (AB) em pH de 2,5. Após a reação
histoquímica, as lâminas foram analisadas ao microscópio de luz. Com aumento de
200x, vinte campos aleatórios e não contínuos foram aleatoriamente selecionados e
as células de cada campo foram identificadas e contadas, sendo os dados
transferidos e armazenados em uma planilha no software Excel.
Figura 07: Células mucosas com reação positiva pelo método de PAS em A; células com
reação positiva ao método de Alcian blue, (pH de 2,5) em B.
3.4.2. Processamento para microscopia de luz em parafina
Para técnicas de imunohistoquímica é necessário que o material seja incluído
em parafina de forma que após a remoção da parafina durante o processamento,
possa ocorrer a ligação dos anticorpos com o antígeno. No processamento de
inclusão em parafina as amostras foram gradualmente desidratadas em álcool,
18
. Materiais e Métodos
desde as concentrações de 70% até 100%, uma hora em cada etapa da bateria de
desidratação, sendo posteriormente diafanizados em xilol 100%, embebidas e
incluídas em parafina histológica (INLAB). Os blocos de parafina foram fixados em
um suporte de madeira, de forma a obter cortes em posição sagital em relação aos
filamentos branquiais e posteriormente foram trimados. Os cortes com espessura de
aproximadamente 8µm foram efetuados em um micrótomo (HM 360 MICROM), e
colocados em lâminas histológicas. Técnicas de imunohistoquímica para a marcação
de células-cloreto, células em proliferação e células em apoptose foram então
aplicadas.
3.4.2.1. Imunohistoquímica para marcação de células-cloreto
Para a determinação do número de CCs nas brânquias, foi empregada a
técnica de DANG et al. (2000), com pequenas modificações. As lâminas histológicas
contendo os cortes de brânquias foram desparafinadas e reidratadas em uma série
decrescente de etanol e lavadas em tampão tris salino + triton (TBS-T) diluído por 10
minutos. As amostras foram pré-incubadas com soro de cabra normal 20% (NSG)
para bloquear sítios de ligação não específicos; o primeiro anticorpo, a5 anti Na
+
/K
+
-
ATPase IG (1:300) (Developmental Studies Hybridoma Bank, Departament of
Biologial Sciences, the University of Iowa, USA ), foi incubado “overnight” em câmara
úmida e a temperatura ambiente. Este anticorpo conjuga-se à subunidade a5 da
enzima Na
+
/K
+
-ATPase que esta presente em grande quantidade nas CCs. No dia
seguinte as secções foram novamente lavadas em TBS-T diluído (10 min) e
incubadas com o segundo anticorpo, cabra anti-camundongo (GAM, Sigma), (1:150)
por 1 hora. Este anticorpo conjuga-se ao primeiro. Após lavagem em TBS-T diluído
(10min) o complexo foi incubado com o anticorpo peroxidase anti-peroxidase
(PAP/mouse, Sigma) (1:800) por 1 hora e lavado em tampão tris (TB) por 10
minutos. O complexo foi visualizado utilizando a coloração com DAB-Ni (3,3’-
diaminobenzidina, Sigma) (menos que 1%) e H
2
O
2
; esta solução reage com a
peroxidase formando um complexo escuro e a intensidade de cor do complexo
depende das unidades de Na
+
/K
+
-ATPase nas CCs e esta relacionado a sua
atividade sendo possível diferenciar células forte e fracamente coradas. Controles
19
. Materiais e Métodos
negativos para o primeiro e o segundo anticorpos foram obtidos suprimindo-se a
aplicação do primeiro anticorpo em uma lâmina e do segundo anticorpo em outra.
Estes foram incubados e corados como as demais secções microscópicas. As
lâminas foram montadas em “Kaiser’s Glicerol Gelatine” e após secagem, no
microscópio Olympus-Micronal BX51 foram escolhidos aleatoriamente 20 campos
não contínuos e as células-cloreto forte e fracamente coradas em cada campo foram
contadas. As CCs encontradas nas lamelas e nos filamentos foram contadas
separadamente. Os dados coletados foram gravados em uma planilha do software
Excel para a análise estatística e determinação da porcentagem total de células forte
e fracamente coradas em cada estrutura branquial.
3.4.2.2. Imunohistoquímica para marcação de células em proliferação
Para a determinação de proliferação celular no tecido branquial de A. gigas,
foi utilizado um anticorpo monoclonal (PC10 Oncogene), específico para o antígeno
de núcleos em divisão, ou seja, proliferação celular (PCNA). O antígeno nuclear para
células em proliferação é uma proteína nuclear (36 Kda, não-histona), a qual é uma
proteína auxiliar da DNA polimerase. O protocolo com PCNA foi o mesmo usado
para identificação da Na
+
/K
+
-ATPase, incluindo os controles. Após desparafinização,
durante o processo de re-hidratação do tecido, a atividade de peroxidases
endógenas foram inibidas através da imersão das amostras em uma solução de
metanol com 1% e H
2
O
2
por 30 minutos. Após a re-hidratação dos cortes
histológicos, as lâminas que os continha foram imersas em uma cuba histológica
contendo uma solução aquosa de ZnSO
4
1% a 45°C e mantidas nesta solução por 5
minutos, as amostras foram então colocadas em outra cuba contendo água destilada
gelada (4
o
C) por 5 minutos. Este procedimento foi repetido para que o choque
térmico rompesse a membrana nuclear, permitindo a ligação do anticorpo ao
antígeno PCNA. Após lavagem das amostras em tampão TBS-T diluído por 20
minutos o material foi incubado com um primeiro anticorpo PCNA PC10 (Oncogene
Research Products, Calbiochem) (1:1000) em câmara úmida “overnight”. As
amostras foram novamente lavadas em tampão TBS-T diluído por 20 minutos e
incubadas com o segundo anticorpo, cabra anti-camundongo (GAM, Sigma), (1:150)
20
. Materiais e Métodos
por 1 hora em câmara úmida. Após lavagem em tampão TBS-T diluído (20min) o
complexo foi incubado com o anticorpo peroxidase anti-peroxidase (PAP/mouse,
Sigma) (1:800) por 1 hora em câmara úmida e lavado em tampão tris (TB) por 20
minutos. O complexo foi visualizado utilizando a coloração com DAB-Ni (3,3’-
diaminobenzidina, Sigma) (menos que 1%) e H
2
O
2
; esta solução reage com a
peroxidase formando um complexo escuro. As lâminas foram montadas em Kaiser’s
Glicerol Gelatine e após secagem foram observadas em microscópio de luz. Vinte
campos não contínuos foram selecionados aleatoriamente e as células escuras de
cada campo foram contadas. Os dados coletados foram transferidos e salvos em
uma planilha do software Excel para a análise estatística.
3.4.2.3. Imunohistoquímica para marcação de células em apoptose
Para a imunomarcação de células apoptóticas foi utilizado o kit “ApopTag
Plus Peroxidase in situ” (Chemicon). Este kit contém todos os anticorpos e tampões
necessários e tem como base o ensaio de TUNEL (terminal uridine deoxynucleotidyl
transferase dUTP nick end labeling), que marca extremidades livres OH
-
de
fragmentos terminais de DNA, existente em células apoptóticas. Nesta técnica, as
amostras depois de re-hidratadas foram submetidas a um pré-tratamento com
proteinase K (Chemicon International), que remove nucleases e outras proteínas
ligadas aos fragmentos de DNA. Após 15 minutos as amostras foram lavadas em
água destilada por 4 minutos e a atividade das peroxidases endógenas foram
inibidas pelo tratamento do tecido em H
2
O
2
3% em tampão salino de fosfato (PBS)
por 5 minutos. As amostras foram, então, tratadas com um tampão de cacodilato de
potássio (Apoptag® Equilibration Buffer) por 1 hora. As lâminas foram incubadas
com a enzima deoxynucleotidil terminal transferase (Apoptag® TdT Enzyme) e os
nucleotídeos trifosfato (Apoptag® Reaction Buffer) por 1 hora em câmara úmida. A
TdT cataliza a adição de nucleotídeos trifosfatos na extremidade 3’OH
-
dos
fragmentos de DNA e os nucleotídeos incorporados formam um oligômero composto
de um conjugado de digoxigenina e nucleotídeos. As amostras receberam
tratamento com um tampão específico do kit (Apoptag® Stop/Wash Buffer), para
interromper a atividade da TdT, por 10 minutos em cama úmida. Após lavagem em
21
. Materiais e Métodos
PBS (3min) as amostras foram incubadas com um anticorpo anti-digoxigenina
peroxidase (Apoptag® Anti-digoxigenin conjugate) em câmara úmida, durante 30
minutos. Após lavagem em PBS (6min), o substrato para peroxidase, fornecido pelo
kit (Apoptag® DAB Dilution Buffer + DAB Substrate), foi adicionado. O conjugado
formado tornou as células em apoptose escuras. Controles negativos foram obtidos
suprimindo-se a aplicação da enzima TdT e aplicando proteinase K para controlar
incorporações de nucleotídeos não específicas. Após montagem e secagem das
lâminas em “Kaiser’s Glicerol Gelatine” as lâminas foram levadas ao microscópio de
luz e vinte campos não contínuos aleatoriamente selecionados de cada lâmina foram
contadas, sendo os dados, posteriormente transferidos e salvos para uma planilha
do software Excel e análises estatísticas foram efetuadas.
3.4.3. Processamento para microscopia eletrônica de transmissão
Para um registro das modificações ultraestruturais das células de A. gigas
durante o desenvolvimento, amostras foram selecionadas e processadas para
microscopia eletrônica de transmissão. As amostras fixadas em GTA tamponado
foram lavadas na mesma solução tampão, com a mesma osmolaridade e mesmo
pH. A amostras foram pós-fixadas em OsO4 1%, contrastadas em bloco com acetato
de uranila e sacarose 10,56% (em bloco), desidratadas em série crescente de
acetona (30% a 100%) e embebidas em resina SPURR Low Viscosity-Embedding
Kit (EMS) e finalmente incluídas em moldes de silicone, em posição sagital aos
filamentos. Após a inclusão foi realizada a trimagem do bloco e cortes semi-finos
foram obtidos e corados com azul de toluidina para selecionar uma região a ser
observada em MET. Após nova trimagem, cortes ultrafinos foram obtidos com o
ultramicrótomo Leica UltraCut R. e colocados em uma grade de cobre (Specimen
Grid 3.05 diameter, 0.8 trickness Copper 200 mesh T200-Cu). As amostras na grade
foram contrastadas em acetato de uranila saturada e solução de Reynolds (citrato de
chumbo). As amostras foram observadas e fotografadas em um microscópio
eletrônico de transmissão JEOL JEM1200-EXII – Transmission Electron Microscope
e as imagens obtidas foram armazenadas em arquivo digital, formato “tif”.
22
. Materiais e Métodos
3.4.4. Processamento para microscopia eletrônica de varredura
As análises em MEV foram realizadas para observar as alterações na
morfologia externa das brânquias e superfície das células que as constituem,
principalmente a das células-cloreto para cálculo de sua área fracional. As amostras
fixadas em GTA tamponado foram lavadas em tampão fosfato 0,1M, pH 7,3, em
seguida receberam um tratamento com glicerol 16% e etanol 20% (24h cada) para a
remoção de muco. As amostras foram desidratadas em uma série crescente de
trocas em álcool, de 50% a 100%, por aproximadamente 10 minutos cada troca,
sendo a última repetida 2 vezes. Em seguida, o material foi quimicamente
desidratado em 1,1,1,3,3,3-hexadimetildisilazano (Aldrich) e seco em temperatura
ambiente. Após a secagem, as amostras foram coladas com cola adesiva de prata
(Degusa) em suportes de alumínios apropriados para o microscópio eletrônico de
varredura. Posteriormente, as amostras foram cobertas com uma camada de ouro
(Degusa 99%), em um Sputtering FCD 004 BAUSER a vácuo. O material foi, então,
observado e fotografado em um microscópio eletrônico de varredura DSM 940
ZEISS e as imagens foram armazenadas em arquivo digital, formato “tif”.
3.4.4.1. Área fracional e densidade das células-cloreto
A determinação da área fracional das células-cloreto (AFCC) e a sua
densidade no epitélio branquial foi determinada a partir de 20 registros fotográficos
de campos aleatórios e não contínuos, obtidos em MEV, de acordo com a
metodologia descrita por BINDON et al. (1994: a & b) e MORON et al. (2003).
Utilizando o software SigmaScan Pro 3.0 (Jandel Scientific Inc.) o perímetro das CCs
(totalmente ou parcialmente visíveis) de cada imagem foi delineado e o software
calculou a área ocupada por cada célula. A análise foi comparativa entre animais em
diferentes etapas de desenvolvimento, de acordo com as seguintes equações:
23
. Materiais e Métodos
AFCC = ? área de todas as células-cloreto
Área da fotografia
Densidade = a AFCC a
Área das células-cloreto
Apesar de que este método não apresenta uma estimativa real da área de
superfície apical das CCs, pois não é considerada a área de microcriptas,
microdobras ou depressões, esta metodologia nos permite observar variações na
fração da área das células-cloreto por unidade de área do epitélio entre animais em
diferentes etapas de desenvolvimento.
3.5. Análise estatística
Os resultados quantitativos estão apresentados como média + erro padrão da
média (EPM) e a análise estatísticas dos dados foi realizada pelo software GrapPad
Instat 3.0. O teste de Barlett foi utilizado para determinar a homogeneidade dos
dados e definir a aplicação dos testes estatísticos e quando os dados não passaram
no teste, a conversão para valores em log10 foi realizada para uma
homogeneização dos dados. A análise estatística dos dados obtidos foi efetuada
utilizando-se análise de variância (ANOVA) para verificar se ocorreram diferenças
significativas. O pós-teste de Tukey para múltiplas comparações, com intervalo de
confiança de 95%, foi aplicado para verificar onde ocorreram as diferenças sempre
que foi detectada a significância entre os valores obtidos.
A relação entre os parâmetros branquiais foi analisada de acordo com a
equação “Y=aWb”, onde Y é o parâmetro a ser analisado, W é o peso corpóreo, a é
a constante referente a massa unitária e b é a constante referente ao potencial do
desenvolvimento do parâmetro analisado. As equações aloméricas resultantes,
juntamente com os gráficos, foram estimadas e confeccionadas através do software
SigmaPlot 10.0.
24
. Resultados
4. RESULTADOS
4.1. Morfologia das brânquias durante a fase de transição da respiração
aquática para a respiração totalmente aérea de A. gigas
4.1.1. Aspectos gerais das brânquias
A. gigas tem quatro arcos branquiais de cada lado da faringe. Cada arco
branquial é formado pelos ossos cerato e epibranquial sendo que o epibranquial é
muito curto em relação ao ceratobranquial. O comprimento dos arcos diminuem a
medida que se localizam mais internamente na câmara opercular. Dos arcos
branquiais partem duas fileiras de expansões que se direcionam para a cavidade
orofaríngea, os rastros (Figura 08). Os rastros são longos na face externa e curtos
na face interna do arco branquial. Os rastros mais longos estão localizados no 1
o
e
2
o
arcos branquiais (Figura 08).
Figura 08: Face interna dos quatro arcos branquiais esquerdos de um exemplar de A. gigas
de 5020g. Cada arco é formado pelos ossos ceratobranquial (c) e o epibranquial (e), podem
ser observados rastros longos na região externa (setas claras) e curtos na região interna
(setas escuras), principalmente nos dois primeiros arcos branquiais (AbI e AbII). Os
filamentos (f) estão voltados para a cavidade opercular.
Voltado para a câmara opercular, cada arco branquial possui duas fileiras
filamentos ou holobrânquias, os filamentos estão unidos por um septo interbranquial
25
. Resultados
reduzido e acima e abaixo do eixo longitudinal de cada filamento são observadas
lamelas bem definidas e regularmente espaçadas, apenas em animais até
aproximadamente 500-600g (Figura 09: A e B). Nos animais acima desta massa
corpórea há uma tendência a redução da altura das lamelas e aumento da
espessura do epitélio do filamento, sendo que em aumentos pequenos (50x) apenas
o filamento branquial é observado; a presença de pequenas dobras e sulcos
irregulares no epitélio do filamento branquial (setas brancas) é observada apenas
em aumentos acima de 100x. As dobras do epitélio do filamento correspondem a
localização das lamelas e os sulcos são os espaços interlamelares que foram
reduzidos devido a proliferação celular (Figura 09: C e D).
A superfície do filamento é irregular, apresentando depressões profundas do
epitélio branquial e as células pavimentosas têm superfície convexa (Figura 10: A-
D). Independente do tamanho do animal a morfologia das células do epitélio
branquial apresenta as mesmas características. As células pavimentosas do septo
branquial (Figura 11: A) apresentam limites celulares bem definidos por microdobras
longas na membrana apical, enquanto que nos filamentos e lamelas as células
pavimentosas têm uma superfície convexa e os limites celulares não são
perfeitamente delimitados por microdobras (Figuras 10: D e 11: B-D). Em toda
superfície apical das células pavimentosas as microdobras são curtas e têm uma
distribuição aleatória sem formar um arranjo definido (Figuras 11: B); na região do
septo branquial (Figura 11: A) as microdobras possuem as mesmas características,
mas ocorre uma diminuição de sua densidade na superfície da célula.
Além das células pavimentosas, os tipos de células encontrados com maior
freqüência na superfície das brânquias são as células-cloreto (CC) e as células
mucosas (CM) (Figura 12, 13 e 14). As CCs foram observadas na região de
filamento e regiões interlamelares em animais com até aproximadamente 500-600g.
As CCs são morfologicamente distintas das células pavimentosas por formar uma
cripta no epitélio branquial com projeções da membrana apical conferindo a elas um
aspecto esponjoso (Figura 12, A-D). Nos animais maiores (acima de 600g) que não
apresentam lamelas facilmente identificáveis, as CCs foram observadas tanto nas
regiões de lamela (Figura 12, C) quanto nas dobras no epitélio do filamento (Figura
12, D).
26
. Resultados
As células mucosas localizam-se abaixo das células pavimentosas (Figura 13:
D e E e 14: D) e o contato com a superfície restringe-se a uma superfície, em geral,
inferior à das CCs (≅0,15 µm de diâmetro) e estão distribuídas entre as células
pavimentosas do epitélio na região do filamento.
Figura 09: Aspecto geral dos filamentos branquiais (F) de Arapaima gigas em diferentes
etapas de desenvolvimento (A-105g, B-575g, C-1343g, D-5020g). Em A e B a presença de
lamelas (L) são facilmente identificadas ao longo do filamento, enquanto que em C e D estas
estruturas não são tão evidentes. Nestes animais é possível observar apenas a presença de
dobras no epitélio do filamento (setas).
A B
C
D
L
L
f
f
f
f
27
. Resultados
Figura 10: Detalhe do filamento branquial de animais com 105g (A), 1343g (B) e 5020g (C e
D). Note células pavimentosas (setas claras) com aspecto convexo, na lamela (L) e
filamento (F). As setas escuras indicam as dobras no epitélio do filamento de animais acima
de 1000g. Em D observa-se que estas células não têm um limite celular definido.
A B
C D
L
f
f
f
28
. Resultados
Figura 11: A: Células pavimentosas no septo branquial do animal de 2g (A) apresentam
limites celulares visíveis por microdobras da membrana (setas claras), enquanto que em
outras regiões da brânquia (B) estes limites celulares são definidos por depressões entre as
células e em animais acima desta massa corpórea as características das células
pavimentosas são as mesmas. Observe em (A) microdobras curtas com distribuição
aleatória na superfície apical e baixa densidade (setas pontilhadas) no septo do animal de
2g, enquanto que em outras regiões do filamento (B) são curtas e estão em alta densidade.
No animal de 105g (C) e 1343g (D) as células pavimentosas têm sua superfície convexa e
as microdobras exibem o mesmo padrão do animal de 2g.
A
B
C
D
f
L
29
. Resultados
Figura 12: Células-cloreto (cc) no epitélio do filamento em animais com diferentes massas
corpóreas, incluindo as dobras no epitélio do filamento de animais acima de 1000g (A: 46g,
B: 575g, C e D: 5020g). As células mucosas (setas claras) têm menor área de contato com o
meio aquático e estão distribuídas entre células pavimentosas. Em algumas regiões
observada a presença de muco (setas escuras).
A
B
C D
cc
cc
cc
cc
cc
cc
cc
30
. Resultados
4.1.2. Aspectos gerais da morfologia interna das brânquias
O epitélio do filamento é estratificado e constituído por várias camadas de
células que aumentam a medida que o animal cresce concomitantemente com o
aumento do tecido e de pequenos vasos sangüíneos que constituem o próprio
filamento. As células epiteliais que constituem a camada mais externa do filamento
branquial são electrondensas e, embora identificadas como do tipo pavimentoso,
são espessas e possuem forma irregular. Estas células têm zona de adesão extensa
sendo que as células localizadas nas camadas mais internas apresentam expansões
citoplasmáticas que contatam células adjacentes ocorrendo a formação de grandes
espaços intercelulares (Figuras 15 e 16). Células-cloreto, mucosas e “rodlet” são
encontradas distribuídas entre as células epiteliais. Em geral, estas células
apresentam região apical em contato com o meio externo reduzida, sendo que a
maior parte da célula localiza-se entre as células das camadas mais internas do
epitélio do filamento (Figuras 13,14 e 15).
As CCs são coradas fracamente pelo azul de toluidina, seu núcleo é basal e o
nucléolo evidente (Figuras 13 e 14) e ultraestruturalmente apresentam diferentes
níveis de electrondensidade. Nos animais com menor massa corpórea estas células
são mais escassas e presentes principalmente nas regiões interlamelares sendo que
em animais com aproximadamente e acima de 600g, há uma intensa proliferação de
CCs tanto nas regiões interlamelares quanto nas lamelas, confirmando as
observações prévias em MEV (Figuras 11 e 12). De acordo com a orientação no
plano de corte, estas células podem apresentar diferentes formatos (Figura 16: C e
D). A característica mais evidente da morfologia destas células é um formato elíptico
com uma grande quantidade de mitocôndrias e um sistema tubular electrondenso.
Nos locais onde esta célula tem contato com o meio externo observa-se dois tipos
de configuração da membrana apical: em forma de criptas ou projeções da
membrana para o meio externo (Figura 17: A-C) e processos de necrose pode ser
observado em algumas células-cloreto (Figura 17: D).
As células mucosas, na microscopia de luz mostram coloração pela fucsina
(Figuras 13 e 14) e são menos freqüentes do que as CC. Nos animais com massa
corpórea acima de aproximadamente 600g, estas células podem ser observadas nas
31
. Resultados
lamelas (Figura 14: D). Essas células têm um núcleo basal e seus grânulos de
secreção apresentam diferente electrondensidade e aspecto fibroso (Figura 18: A-
D). Estas células são encontradas nas primeiras camadas epiteliais e não foi
observada uma relação entre o contraste dos grânulos de secreção com a posição
que a célula mucosa ocupa no tecido branquial.
Células “rodlet” foram outro tipo celular freqüentemente encontrando nas
brânquias de A. gigas. Estas células podem ser encontradas nas camadas mais
externas do filamento (Figura 19: A, B e D) ou em camadas mais profundas desse
epitélio (Figura 19: C). As células “rodlet” apresentam contorno ovalado, sendo que a
porção apical é mais afilada. A sua membrana plasmática possui uma cápsula
fibrosa e espessa que é característica dessa célula. O núcleo ocupa a porção basal
da célula. As estruturas “rodlet”, que dão nome a célula, são alongadas e
electrondensas e apresentam um eixo central, em forma de estilete, sempre voltado
ao ápice celular. A presença de células “rodlet” em contato com o meio externo,
rompendo a cápsula fibrosa e liberando seu conteúdo para o meio externo
juntamente com toda a célula pode ser observada no epitélio do filamento (Figura
19: D).
Quanto à morfologia geral das lamelas, em animais com até
aproximadamente 600g as lamelas são semelhantes à de peixes com respiração
aquática; são constituídas por duas camadas de células pavimentosas e entre elas e
o sistema de células pilares há um espaço intersticial (Figura 14: A-C), com o
aumento da massa corpórea há um aumento da espessura do epitélio da lamela que
passa a ser constituída por várias camadas de células e principalmente por células-
cloreto na camada mais externa (Figura 13) e há um aumento do espaço intersticial
próximo ao sistema de células pilares e flanges (Figura 14: D). Em animais com
massa corpórea até aproximadamente 200-600g o sistema de células pilares é bem
desenvolvido (Figuras 13; 14: D e 15: A e B), sendo que acima dessa massa
corpórea ocorre atrofia do sistema de células pilares que é caracterizado por uma
redução dos espaços sanguíneos formados pelas flanges dessas células e redução
da área de secção transversal do canal marginal (Figuras 14 e 15: C e D) mas ainda
é possível a circulação eritrocitária (Figura 14: D). Em animais acima de 1000g estas
estruturas estão parcialmente ou completamente envolvidas pelas células do epitélio
32
. Resultados
do filamento que aumenta a sua espessura a medida que o animal cresce (Figura
14: A-C). Nesses animais os espaços sanguíneos apresentam projeções
filamentosas das flanges das células pilares (Figura 15: D).
33
. Resultados
Figura 13: Amostras coradas com azul de toluidina, mostrando a modificação na estrutura
das brânquias ao longo do desenvolvimento de A. gigas (A: 2g, B: 46g, C: 105g, D: 575g,
E:1343g, F:4995g). Note lamelas (L) bem evidentes no filamento das brânquias de animais
com até aproximadamente 600g (D). Em animais acima de 1000g (E e F) as lamelas sofrem
modificações, e o espaço interlamelar torna-se reduzido (pontas de seta). O sistema de
células pilares (setas pontilhadas) fica distante do meio externo. São observadas também
células-cloreto (setas escuras) e células mucosas (setas brancas).
F
A
B
L
f
L
L
L
f
f
f
f
f
C
D
E
34
. Resultados
Figura 14: Detalhe do filamento branquial (F) de animais acima de 1000g. Note o sistema de
células pilares (setas pontilhadas) atrofiado e envolvido no tecido do filamento (A e B).
Todos seus elementos podem ser observados, o canal marginal (cm), células pilares (cp), os
espaços delimitados pelas flanges das células pilares (ep) e eritrócitos (er) nestes espaços.
As setas claras indicam células mucosas e as setas escuras indicam as células-cloreto.
cm
cm
A
B
C
D
cm
er
cp
ep
35
. Resultados
Figura 15: Lamelas e estruturas lamelares em A. gigas. A e B: Animal com 105g. Note a
presença de lamelas bem definidas. C: Animal com 575g. Note o aumento da espessura do
epitélio lamelar e redução do sistema de células pilares. D: Animal com 1343g. Note
projeções citoplasmáticas entre as células que constituem a lamela e o espaço intercelular.
Eritrócitos (setas escuras). (cp) células pilares, (pv) células pavimentosas, (ei) espaço
intersticial, (ep) espaços delimitados pelas flanges das células pilares.
A
B
C
D
cm
ep
cp
cp
ep
ep
cp
ei
ei
pv
cm
36
. Resultados
Figura 16: Localização dos principais tipos celulares no epitélio branquial de A. gigas. (A)
Células-cloreto no epitélio da lamela, próximas ao canal marginal (a seta escura indica a
presença de eritrócitos); (B) célula mucosa (CM) ao lado de célula-cloreto (cc) em processo
de necrose; (C) células-cloreto (cc) próximas ao meio externo e em (D) células-cloreto com
conteúdo citoplasmático mais electrondenso que em (C).
A
B
C
D
cc
cc
CM
cc
cc
cc
cc
cc
cc
37
. Resultados
Figura 17: Células-cloreto (cc) no epitélio branquial de A. gigas. As setas mostram diferentes
tipos de contato com o meio externo destas células: criptas em (A), projeções
citoplasmáticas em (B e C). Em (A), célula-cloreto no espaço interlamelar e em (D) célula-
cloreto em necrose. Observe mitocôndrias (mt) e um sistema tubular citoplasmático (seta
pontilhada) desorganizado.
A
B
C D
cc
cc
CM
mt
cc
cc
cc
38
. Resultados
Figura 18: Células mucosas (CM) no epitélio branquial de A. gigas. Células mucosas
electronopacas são observadas em “A” e electrondensas em “B”. Observe uma célula
mucosa com núcleo basal (N) liberando muco para o meio externo em “C” e detalhes dos
grânulos de secreção (g) presentes neste tipo celular em “D”.
A
B
C D
cc
CM
cc
g
CM
N
g
39
. Resultados
Figura 19: Células “Rodlet” em diferentes estágios de maturação; A e C: célula imatura. B:
Célula matura em contato como meio externo. D: Célula liberando o conteúdo celular e
desligamento do epitélio. Note cápsula fibrosa (setas escuras), núcleo basal (N), halo de
“rodlet” (setas pontilhadas) e estilete voltado para o ápice da célula (setas transparentes) em
todas as células.
A
B
C
D
N
N
N
40
. Resultados
4.2. Morfometria dos elementos branquiais de relevância para as trocas
gasosas
As análises morfométricas do epitélio branquial mostraram um aumento
significativo na altura total e na altura potencialmente funcional da lamela (região da
lamela em contato com o meio externo) em animais até 200-300g. Acima dessa
massa corpórea, a altura total da estrutura total lamelar foi significativamente maior
em animais com 1000g em relação aos com 500-600g, mas não em relação aos de
5000g e a altura potencialmente respiratória da lamela permaneceu
aproximadamente constante. A Figura 20 descreve a relação entre a altura total e
potencialmente funcional das lamelas de A. gigas durante o crescimento do animal
evidenciando um aumento muito reduzido na superfície funcional das lamelas à
medida que o animal cresce.
A espessura do epitélio do filamento (EpF) aumenta com o crescimento do
animal (b = 0,40) enquanto que aumento da espessura do epitélio da lamela é
relativamente pequeno em animais com massa corpórea entre 200-300g, torna-se
mais acentuado em animais acima dessa massa resultando em um b = 0,46 (Figura
21). Os maiores aumentos da espessura do epitélio da lamela e, conseqüentemente,
da largura total da lamela (Figura 22) foram observados nos animais acima de
1000g. O aumento do epitélio da lamela causa um aumento na largura da lamela
que, entretanto apresenta um crescimento menor do que o do epitélio lamelar devido
a atrofia do sistema de células pilares. Esse padrão de alteração no epitélio lamelar
e largura total da lamela em relação ao tamanho do animal resulta em um aumento
da distância interlamelar (DsL) em animais até 100-300g e acima desse tamanho há
uma progressiva redução na distância interlamelar (Figura 23). Esse aumento e
redução resulta em duas curvas: para animais com Mc menor que 200-300g
(DSL
(/mc<200-300)
= 6,11Mc
0,32
- n= 3, r²= 0,90, P<0,001) e para animais com Mc acima
de 300g (DSL
(/mc>300)
= 166,51Mc
-0,39
- n= 5, r²= 0,89, P<0,001)
41
. Resultados
MASSA CORPÓREA (g)
1 10 100 1000 10000
ALTURA MÉDIA (µm)
25
50
100
ALTURA TOTAL DA LAMELA
ALTURA POTENCIALMENTE FUNCIONAL DA LAMELA
Figura 20: Altura total (ATL) e potencialmente funcional (APFL) em relação a massa
corpórea (Mc) de A. gigas. As curvas são: ATL = 32,02Mc
0,16
(n= 7, r
2
= 0,91, P< 0,001) e
APFL = 25,04Mc
0,11
(n= 7, r
2
= 0,77, P< 0,01).
42
. Resultados
MASSA CORPÓREA (g)
1 10 100 1000 10000
ESPESSURA MÉDIA (µM)
0,1
1
10
100
1000
ESPESSURA EPITELIAL
ESPESSURA LAMELAR
Figura 21: Espessura do epitélio do filamento (EPF) e da lamela (EPL) em relação a massa
corpórea (Mc) de A. gigas. As curvas são: EPF = 6,63Mc
0,36
(n= 7, r
2
= 0,96, P< 0,001) e EPL
= 0,76Mc
0,47
(n= 7, r
2
= 0,93, P< 0,001 ).
43
. Resultados
MASSA CORPÓREA (g)
1 10 100 1000 10000
LARGURA LAMELAR MÉDIA (µm)
1
10
100
1000
LARGURA LAMELAR
Figura 22: Largura total da lamela (LTL) em relação a massa corpórea (Mc) de A. gigas. A
curva é: LTL = 5,22Mc
0,32
(n= 7, r
2
= 0,94, P< 0,001).
44
. Resultados
MASSA CORPÓREA (g)
0 1000 2000 3000 4000 5000
DISTÂNCIA INTERLAMELAR (µm)
0
5
10
15
20
25
30
*
*
*
*
Figura 23: Distância interlamelar em A. gigas. Há um aumento até animais com
aproximadamente 100g, ocorrendo uma redução na distância interlamelar até
aproximadamente 5000g. * indica diferença significativa (p<0,05) em relação ao ponto
anterior.
45
. Resultados
4.3. Atividade celular nas brânquias de Arapaima gigas
4.3.1. Parâmetros pertinentes ao desenvolvimento dos filamentos
(Proliferação e morte celular)
As células que apresentaram marcação específica para o antígeno de
proliferação celular (PCNA-positiva) foram observadas no filamento branquial, sendo
ausentes nas lamelas (Figura 24). Quantitativamente, o número de células PCNA-
positiva (Figura 26) revelou que ocorre um ligeiro aumento destas até animais com
aproximadamente 500-600g, que pode ser descrita pela equação: Cpcna
(/mc<500-600)
=
26,11Mc
0,39
(n= 3, r²= 0,83, P<0,001). Posteriormente, a partir dessa massa corpórea
há uma diminuição da intensidade da proliferação celular, sendo descrita pela curva:
Cpcna
(/mc>500-600)
= 2021,10Mc
-0,29
(n= 3, r²= 1, P<0,001).
As células em apoptose-positivas (TÚNEL-positivas), não apresentam
diferenças significativas, independentemente do estágio de desenvolvimento de A.
gigas, (Figuras 25 e 26) e apresenta valores médios de 15 ± células por mm². Estas
células foram encontradas no epitélio do filamento sendo ausentes nas lamelas
(Figura 25).
46
. Resultados
Figura 24: Imunohistoquímica para células em proliferação celular (setas escuras). O maior
aumento do número de células PCNA + ocorre no animal de 575g, diminuindo novamente
nos animais acima dessa Mc.
34g
212g
575g
1343g
4995g
47
. Resultados
Figura 25: Imunohistoquímica para células em apoptose (setas escuras). Em todos os
animais observados o número de células marcadas foi semelhante.
34g
212g
575g
1343g
4995g
48
. Resultados
MASSA CORPÓREA
0 1000 2000 3000 4000 5000
MÉDIA DE CÉLULAS/mm² x 10²
0
50
100
150
200
250
300
350
CÉLULAS PCNA +
CÉLULAS TUNEL+
*
*
*
*
Figura 26: Proliferação celular e apoptose (morte celular programada) nos filamentos
branquiais de A. gigas. Observe um aumento da proliferação celular até aproximadamente
500-600g, com posterior redução a partir dessa Mc. O número de células em apoptose se
mantém baixo e sem variações significativas entre os animais observados. * indica diferença
significativa (P<0,05) em relação ao ponto anterior.
49
. Resultados
4.3.2. Parâmetros pertinentes à atividade osmoregulatória nas
brânquias de A. gigas
4.3.2.1. Células imunoreativas para o anticorpo anti-Na
+
/K
+
-ATPase
As células-cloreto estão particularmente distribuídas nos filamentos em
animais com massa corpórea até 500-600g, enquanto que em animais acima de
aproximadamente 1000g as CCs são freqüentes nas lamelas (Figuras 27 e 28). Dois
tipos de células positivas para a Na
+
/K
+
-ATPase, foram identificadas no tecido
branquial de A. gigas: CCs fracamente e fortemente coradas. A intensidade da
coloração das CCs esta diretamente relacionada à densidade de unidades α da
enzima Na
+
/K
+
-ATPase e, indiretamente reflete a atividade das CCs. Em animais
com até 600g, aproximadamente, o filamento branquial exibe células fortemente
coradas e nos animais acima de 1000g tanto o filamento quanto as lamelas
apresentam essas células, sendo que nas lamelas o número de CCs intensamente
coradas é maior que nos filamentos. Ao longo do desenvolvimento do animal,
observa-se que há um aumento no número de células-cloreto tanto claras (b= 0,31)
quanto escuras (b= 27) no filamento branquial (Figura 28). A área individual das
células-cloreto também é maior em animais de menores, aproximadamente 2g
(5,32µm²), diminuindo até 500-600g (p<0,001), atingindo em média 3,4µm².
4.3.2.2. Área fracional de células-cloreto (AFCC) e densidade
Após a mensuração e cálculos para determinar a AFCC e a densidade
(Figura 29), os resultados obtidos de AFCC revelam que o animal de 105g apresenta
um valor significativamente menor que o animal de 2g e a partir do animal de 575g
ocorre um aumento progressivo da AFCC, sendo que o animal de 5020g é
observado o maior valor para a AFCC. Nos resultados de densidade observa-se que
há um aumento ao longo do desenvolvimento de A. gigas (b= 0,13), sendo que em
1000g, aproximadamente, os valores encontrados são próximos de um animal de
500-600g e finalmente, um animal de aproximadamente 5000g é registrado o maior
valor de densidade, acima do encontrado no animal de 1000g (p<0,001).
50
. Resultados
Figura 27: Imunohistoquímica atividade da enzima Na
+
/K
+
-ATPase, presente em células-
cloreto. As setas escuras indicam células fortemente coradas devido a uma maior atividade
da enzima, enquanto que as setas pontilhadas indicam células fracamente coradas devida a
uma menor atividade da enzima. Nos animais que apresentam lamelas a maior incidência
destas células é nas regiões interlamelares.
34g
105g
212g 575g
1343g
4995g
51
. Resultados
CÉLULA-CLORETO CLARA NA LAMELA
10 100 1000 10000
1
10
100
1000
CÉLULA-CLORETO ESCURA NA LAMELA
10 100 1000 10000
1
10
100
1000
CÉLULA-CLORETO CLARA NO FILAMENTO
MASSA CORPÓREA (g)
10 100 1000 10000
Média de CC/mm² x 10²
10
100
CÉLULA-CLORETO ESCURA NO FILAMENTO
10 100 1000 10000
10
100
1000
Figura 28: Variações na média de células-cloreto em diferentes etapas do desenvolvimento
de A. gigas. Nas lamelas, observa-se que ocorre um aumento no número dessas células
apenas em animais acima de aproximadamente 1000g. Observe que nos filamentos ocorre
um aumento no número destas células tanto para claras (CCclf) quanto para escuras
(CCcef). As curvas são: CCclf = 5,62Mc
0,32
(n= 6, r
2
= 0,91, P< 0,001) e CCcef = 13,20Mc
0,27
(n= 6, r
2
= 0,93, P< 0,001 ).
52
. Resultados
MASSA CORPÓREA (g)
0 1000 2000 3000 4000 5000
AFCC (% DO FILAMENTO)
2
3
4
5
6
7
8
9
*
*
*
*
MASSA CORPÓREA (g)
1 10 100 1000 10000
DENSIDADE (N° CELS/mm²)x10³
1
10
100
Figura 29: Morfometria da superfície de animais em diferentes etapas de desenvolvimento.
(A) Área fracional das CCs; (B) Densidade de CCs, e o aumento da densidade pode ser
observado pela uma curva: CCden = 6,60Mc0,1337 (n= 5, r²= 0,9, P<0,001). * indica
diferença significativa em relação ao animal anterior (P<0,05).
B
A
53
. Resultados
4.3.3. Parâmetros pertinentes à secreção de mucopolisacarídeos
(histoquímica para células mucosas - PAS e Alcian Blue)
Nas observações em microscopia de luz, a reação histoquímica da fucsina
básica revelou a presença de células mucosas nas brânquias de A. gigas (Figuras
13 e 14, setas claras) e os métodos histoquímicos mais específicos revelam que
tanto as células PAS positivas (PAS+) quanto as células Alcian Blue positivas (AB+)
são encontradas nas brânquias de A. gigas, revelando nos animais que apresentam
lamelas bem definidas que estas células são observadas na região interlamelar,
enquanto que nos animais onde as lamelas estão atrofiadas e o filamento é
observado como uma estrutura uniforme, com as dobras no epitélio branquial, as
células mucosas são observadas nas primeiras camadas do epitélio (Figuras 30 e
31). Os resultados da análise quantitativa do número de células mucosas (Figura 32)
revelaram que essas células têm uma menor incidência nos animais com
aproximadamente 50g (Figuras 30, 31 e 32), com aumento até animais com 100-
200g. Para animais com massa corpórea de aproximadamente 500g ocorre apenas
aumento significativo (P<0,05) no número de células PAS+, enquanto que o número
médio de células AB+ por mm² se mantém próximo ao observado em animais com
100-200g. A partir de 1000g, aproximadamente, não foram observadas diferenças
significativas tanto para células PAS+ quanto para células AB+.
54
. Resultados
Figura 30: Células com grânulos de secreção reativos ao método de PAS+ (setas escuras)
são observadas nas regiões interlamelares nos animais de 46g e 105g e estão nas primeiras
camadas do epitélio branquial, em todos os animais observados. Pode se observar ainda,
um aumento visível no número de células com grânulos reativos PAS+ ao longo do
desenvolvimento do peixe.
46g 105g
212g
575g
1343g 4995g
55
. Resultados
Figura 31: Células com grânulos reativos ao corante Alcian Blue, AB+, (setas escuras).
Assim como as células PAS+, estão frequentemente observadas nas regiões interlamelares
nos animais de 46g e 105g e em todos os peixes analisados, estão nas primeiras camadas
do epitélio branquial. Para esta técnica histoquímica, também é observado um aumento
visível no número de células com grânulos de secreção AB+ ao longo do desenvolvimento
do peixe.
46g
105g
212g
575g
1343g
4995g
56
. Resultados
MASSA CORPÓREA (g)
0 1000 2000 3000 4000 5000
MÉDIA Nº CELS/mm² x 10²
0
10
20
30
40
50
CÉLULAS PAS POSITIVAS
CÉLULAS ALCIAN BLUE POSITIVAS
*
Figura 32: Análise quantitativa do número de células mucosas (PAS+ e AB+) de peixes em
diferentes etapas de desenvolvimento. Observe até aproximadamente 100-200g há um
aumento quantitativo em ambos os tipos de células mucosas em um animal na faixa de
500g ocorre aumento significativo apenas nas células PAS+. * Indica diferença significativa
em relação ao ponto anterior. (P<0,05).
57
. Discussão
5. DISCUSSÃO
5.1. Morfologia branquial de Arapaima gigas
A organização do tecido branquial requer não apenas uma arquitetura
eficiente para a troca de gases, mas também que atenda aos requerimentos básicos
que permitam a regulação iônica, ácido-base e a excreção de produtos
nitrogenados. Em geral, as brânquias de diferentes espécies apresentam um padrão
estrutural básico, mas a forma, distribuição e principalmente as dimensões dos
elementos branquiais variam consideravelmente de espécie para espécie (HUGHES
e MORGAN, 1973). A forma e dimensões dos arcos branquiais e dos filamentos
mostram uma relação com a forma da cabeça, espaço da cavidade opercular e
hábito alimentar do animal (MAZON et al., 1998).
Estudos com diferentes espécies de ciclídeos mostraram que o número e
comprimento de filamentos nas diferentes espécies são características morfo-
plásticas adaptadas à forma do músculo esternohióideo relacionado à expansão das
cavidades bucal e operculares, ao comprimento do ceratobranquial, cavidade bucal
e forma externa da cabeça (GALIS e BAREL, 1980). Os filamentos branquiais
apresentam variações quanto ao número e ao comprimento ao longo do arco
branquial sendo mais longos na região do ceratobranquial e mais curtos nas
extremidades dos arcos branquiais e na região de articulação dos ossos epi- e
ceratobranquial. A forma das lamelas varia na região basal, mediana e apical do
filamento; as lamelas proximais ao arco branquial apresentam formato retangular,
com comprimento maior e largura menor que aquelas localizadas na região distal do
filamento, que apresentam formato triangular (HUGHES, 1984; HUGHES e
MORGAN, 1973). Tanto o número quanto o tamanho das lamelas variam
dependendo do modo de vida e habitat do animal (PERNA e FERNANDES. 1986,
LAURENT e PERRY, 1991).
Em peixes que possuem respiração aérea acessória, as alterações são mais
acentuadas e se manifestam em todos os níveis de organização branquial, dos
arcos brânquiais às lamelas. Essas modificações corroboram a hipótese de que
peixes que possuem respiração aérea apresentam uma redução da superfície
respiratória que, por sua vez podem refletir o grau de dependência da respiração
aérea (GRAHAM, 1997; GRAHAM et al., 2007). Por exemplo, em C. batrachus, C.
striatus e em peixes pulmonados, alguns arcos brânquiais funcionam como desvios
58
. Discussão
da circulação branquial por possuírem filamentos muito curtos e não possuírem
lamelas (GRAHAM, 1997; MORAES et al., 2005); nesses animais o comprimento
dos filamentos pode ser muito reduzido quando comparados ao de espécies com
respiração aérea facultatica, como em jeju (Hoplerythrinus unitaeniatus, Spix &
Agassiz, 1829) e espécies que apresentam respiração exclusivamente aquática,
como a traíra (Hoplias malabaricus, Bloch, 1794) (CAMERON e WOOD, 1978;
FERNANDES et al., 1994); além de alterações morfométricas nos filamentos, a
morfometria das lamelas pode ser alterada de forma a reduzir a superfície branquial,
como no peixe asiático Monopterus cuchia (Hamilton, 1822), que apresenta lamelas
menos numerosas, menores e mais espessas (HUGHES e DATTA-MUNSHI, 1979;
MUNSHI et al., 1989). Essas características conduzem a uma superfície respiratória
branquial reduzida e uma maior distância de difusão entre a água e o sangue,
enquanto que os órgãos modificados para a respiração aérea, que complementam
as necessidades de O
2
dos peixes que possuem respiração aérea acessória tendem
a ter extensa superfície e distância ar-sangue é muito reduzida semelhante aos
pulmões dos anfíbios e outros vertebrados (BURGGREN, 1989; FERNANDES et al.,
1994; MORAES et al., 2005; COSTA et al., 2007).
A. gigas, espécie que possui respiração aérea obrigatória, possui 4 arcos
branquiais e filamentos em todos os arcos branquiais como nos demais teleósteos.
Indivíduos jovens, até 200-300g possuem brânquias com características similares
aos peixes com respiração aquática, ou seja, duas fileiras de filamentos em cada
arco branquial e lamelas acima e abaixo do filamento. Durante o período de
desenvolvimento que compreende a transição entre a respiração aquática e a
respiração exclusivamente aérea (200-300g a 1000-2000g), as brânquias de A.
gigas sofrem drástica modificação. O volume dos filamentos e lamelas em um animal
com 100g é aproximadamente 70% do volume total das brânquias enquanto que em
um animal com 1kg corresponde a aproximadamente 40% das brânquias o que
evidencia um crescimento acentuado do volume dos ossos epi e ceratobranquial e
rastros em detrimento dos filamentos nos quais se encontram as lamelas, estruturas
em que ocorrem as trocas gasosas. Como nos demais teleósteos, os filamentos de
A. gigas apresentam variações no comprimento ao longo do arco branquial sendo
também mais curtos na região de articulação dos ossos epi- e ceratobranquial. O
comprimento médio do filamento de A. gigas apresenta aumento muito baixo (b =
0,17) à medida que o animal cresce de forma que a diferença no comprimento médio
59
. Discussão
do filamento entre um animal de 500g e um com 5000g é de apenas 2 mm
(SADAUSKAS-HENRIQUE, 2005) e a equação que descreve o aumento do
comprimento total do filamento (CTF) é 484,6Mc
0,364
, que representa o aumento do
número e do comprimento médio do filamento em relação ao aumento da massa
corpórea.
Durante o período de transição respiração aquática para respiração aérea
obrigatória, o epitélio do filamento apresenta intensa proliferação celular enquanto
que processos de apoptose são relativamente baixos o que contribui para um
aumento de camadas de células nesse epitélio com o crescimento do animal de
forma a reduzir drasticamente a altura potencialmente respiratória da lamela, as
quais ficam envolvidas no epitélio do filamento. Em geral, uma intensa proliferação
celular acompanhada por células em processo de apoptose pode ser o reflexo de
alterações no meio aquático, sendo o aumento destas células são consideradas
como uma resposta ao estresse ambiental via ação do cortisol (WENDELAR-
BONGA, 1997). No caso de A. gigas, as alterações no filamento das brânquias não
são um reflexo direto de alterações ambientais imediatas, mas o resultado de uma
seqüência de eventos que tiveram início durante o processo evolutivo e conduziu a
uma redução da função respiratória das brânquias.
O aumento da espessura do epitélio lamelar deve-se a alteração da
morfologia das células desse epitélio que passam de uma forma cúbica para colunar
e provavelmente por migração de células a partir do epitélio do filamento, uma vez
que não foi observada proliferação celular nas lamelas. A presença de extensos
espaços intersticiais entre as células do epitélio do filamento e lamelas sugere
possível movimento de fluido linfático, semelhante ao descrito por WRIGHT (1974),
MORGAN e WRIGHT (1989) e MORAES et al. (2005) para o peixe pulmonado,
Lepidosiren paradoxa, e indica, segundo WRIGHT (1974), participação nos
processos de transporte iônico.
Os estudos preliminares efetuados por BRAUNER et al. (2004) mostraram a
ausência de lamelas no filamento de A. gigas em animais com massa corpórea igual
a 1kg. Este dado, entretanto se deve ao reduzido aumento (aproximadamente 100x)
utilizado por esses autores nas observações em MEV. De fato há uma acentuada
redução na altura potencialmente respiratória das lamelas à medida que o animal
cresce, mas os dados do presente estudo evidenciaram a presença de lamelas em
animais com massa corpórea de aproximadamente 5kg. As estruturas básicas que
60
. Discussão
constituem as lamelas tais como o sistema de células pilares, canal marginal e a
presença de eritrócitos no interior dos espaços sanguíneos formados pelas flanges
das células pilares, permanecem durante o desenvolvimento de A. gigas sendo
porém envolvidas pelas células do epitélio do filamento que aumenta a sua
espessura. Considerando que em animais acima de 1kg, as lamelas são muito
pequenas, quase vestigiais, e a distância água-sangue é maior (até
aproximadamente 40 µm) do que aquela encontrada nos animais menores (100g,
distância água-sangue = 7,7 µm, COSTA et al., 2007), essas estruturas devem ter
pouca participação na troca de gases o que foi confirmado por BRAUNER e VAL
(1996) que mostraram que em animais com 1,7kg, apenas 22% da absorção de O
2
é
efetuada pelas brânquias e o animal tem completa dependência da respiração aérea
para suprir suas necessidades. Nesse caso, o papel da estrutura das lamelas pode
ser principalmente um veículo de transporte de nutrientes e O2 pelo sangue às
células do tecido branquial, pois as células mucosas e CCs têm alta demanda de
energia.
Estudos recentes demonstraram que carpa (Carassius carassius, Linnaeus
1758) e o peixe dourado (Carassius auratus, Linnaeus 1758), peixes com respiração
exclusivamente aquática, tem as lamelas inseridas no filamento branquial quando
em normoxia e baixa temperatura (SOLLID et al., 2003; SOLLID e NILSON, 2006;
SARDELLA e BRAUNER, 2007), semelhante ao que foi encontrado em A. gigas na
fase em que há completa dependência da respiração aérea. No caso de C.
carassius e C. auratus a ausência de lamelas projetadas para fora do epitélio do
filamento durante normoxia pode ser explicada pela alta afinidade hemoglobina-O
2
dessas espécies que poderia não necessitar de extensa área respiratória para
saturar a hemoglobina com O
2
. Quando em hipóxia as lamelas ficam expostas
aumentando a superfície respiratória em até 7,5 vezes. Estas alterações
morfológicas mostraram ser reversível e causada por um aumento de apoptose
combinada com reduzida proliferação celular. SAROGLIA et al. (2000, 2007) avaliou
as alterações na distância de difusão água-sangue em Dicentrarchus labrax
(Linnaeus, 1758) exposto em condições de normoxia e hiperóxia durante o verão e
outono e verificou que a distância de difusão aumentou com o aumento do oxigênio
dissolvido. De acordo com estes autores, a lamelas embebidas no filamento
branquial ou o aumento da distância de difusão parecem ser benéficas para a
manutenção da regulação iônica nestas espécies maximizando o compromisso entre
61
. Discussão
difusão de O
2
nas lamelas e a perda ou ganho de íons e água, uma vez que quando
as lamelas estão projetadas para fora do epitélio ou a distância de difusão é muito
pequena não ocorre completa compensação ao influxo de água e/ou perda de íons
(SOLLID et al., 2003; SAROGLIA et al., 2007).
A. gigas com aproximadamente 100g possuem lamelas bem desenvolvidas e
área de superfície respiratória igual a 77mm
2
/g (COSTA et al., 2007) semelhante a
outros peixes que possuem respiração aérea como Channa punctata (Bloch)
(HUGHES e MUNSHI, 1973), Anabas testudineus (HUGHES e DATTA-MUNSHI,
1973) e Hypostomus plecostomus (Linnaeus, 1758)) (PERNA e FERNANDES, 1996)
e diminui acentuadamente à medida que o animal cresce sendo aproximadamente 1
mm
2
/g em exemplares com 1kg (SADAUSKAS-HENRIQUE et al., 2005). A superfície
branquial em peixes de respiração exclusivamente aquática é, em geral, maior do
que a superfície corporal e a distância água-sangue varia de 2-5 µm (HUGHES,
1990). Em geral, peixes ativos e de natação rápida tem maior superfície branquial
que está associada a um maior número de lamelas/mm de filamento do que peixes
bentônicos e hábitos lentos os quais possui poucas lamelas/mm de filamento e
maior espaço interlamelar (GRAY, 1954; HUGHES, 1972). Estas características
devem-se a uma maior demanda energética em animais ativos, embora, conforme
enfatizado por FERNANDES et al. (1994) e FERNANDES (1996) as características
físicas e químicas ambientais como baixo nível de O
2
podem influenciar na
freqüência de lamelas no filamento e, mesmo animais pouco ativos como H.
malabaricus, podem ter extensa área de superfície respiratória. O aumento do
comprimento total de filamentos, número total de lamelas e altura das lamelas são
os elementos que mais contribuem para o aumento da área branquial à medida que
o animal cresce (MATTIAS et al., 1996). Em peixes de respiração aquática, um
reduzido desenvolvimento da superfície branquial respiratória sugere uma
dependência maior de mecanismos compensatórios bioquímicos e fisiológicos
quando em condição de hipóxia (MATTIAS et al., 1996). Em peixes de respiração
aérea o reduzido desenvolvimento da superfície respiratória (filamentos curtos, baixa
freqüência e lamelas curtas e longas) pode indicar o grau de dependência do ar
atmosférico.
Em A. gigas a superfície respiratória muito reduzida das brânquias esta
relacionada à existência de um órgão acessório, a bexiga natatória altamente
vascularizada, para a respiração no meio aéreo, menos denso do que a água e com
62
. Discussão
maior disponibilidade de O
2
. As brânquias podem ter, possivelmente, maior
importância na regulação iônica e equilíbrio ácido-base, principalmente quando o
animal passa a ter respiração aérea obrigatória. O aumento da espessura do epitélio
do filamento e das lamelas e, conseqüentemente o aumento da largura da lamela,
pode ser uma resposta morfológica, como já discutido anteriormente, contra a perda
de íons e O
2
para o meio por espessamento da barreira água-sangue nas lamelas
vestigiais.
Nos animais acima de 500g, o aumento da espessura do epitélio lamelar e do
filamento ocorre concomitantemente com o aumento da densidade das CCs e
aumento da AFCC. Em peixes de água doce, as CCs, em geral, localizadas no
epitélio do filamento, na base aferente das lamelas ou na região interlamelar são as
principais responsáveis pela absorção de Na
+
, Cl
-
e Ca
2+
enquanto que as células
pavimentosas têm pouca participação na regulação iônica (absorção de Na
+
) e
equilíbrio ácido-base (excreção de H
+
) (HIROSE et al., 2003). O número de CCs
varia entre espécies e depende, principalmente, do meio em que o animal vive
(PERRY, 1998). MORON et al. (2003), comparando dois eritrinídeos, H. malabaricus
e H. unitaeniatus, mostrou que H. unitaeniatus apresenta maior número de CCs
quando comparado com H. malabaricus do mesmo ambiente e sugeriu que essa
diferença pode estar relacionada à eficiência destas espécies em manter o equilíbrio
iônico.
Estudos efetuados por LAURENT e HEBIBI (1989); GRECO et al., (1995)
mostraram que peixes que vivem em águas pobres em íons apresentam proliferação
de CCs e aumento da AFCC. Assumindo que a superfície apical das CC em contato
com o meio é o sítio de absorção de íons em peixes de água doce os estudos de
fluxo iônico (Na
+
e Cl
-
) efetuados por PERRY et al. (1992) mostraram que há uma
relação direta entre a AFCC e a absorção de íons, ou seja, maior AFCC maior a
absorção de Na
+
e Cl
-
.
As profundas modificações morfológicas que ocorrem nas brânquias de A.
gigas durante o desenvolvimento, parecem favorecer a regulação iônica, uma vez
que em animais acima de 1 kg há intensa proliferação de CCs no epitélio do
filamento e inclusive no epitélio da lamela. As águas da bacia Amazônicas têm baixa
quantidade de osmólitos e pH baixo (VAL e ALMEIDA-VAL, 1995) de forma que a
63
. Discussão
proliferação de CCs com concomitante aumento da AFCC pode favorecer a
absorção de íons. De acordo com BRAUNER et al. (2004), um exemplar com 1000g
apresenta forte marcação fluorescente da enzima Na
+
/K
+
-ATPase, principal proteína
das CCs e responsável pelo transporte de íons. No presente estudo, as observações
em MEV e microscopia de luz, via imunomarcação da enzima Na
+
/K
+
-ATPase, de
animais acima de 1000g também revelaram a presença de CCs distribuídas por todo
o epitélio branquial o que sugere um aumento na capacidade de absorção ativa de
Na
+
, Cl
-
e Ca
2+
. Entretanto, a atividade total da Na
+
/K
+
-ATPase nas brânquias de A.
gigas é 12 menor que em Osteoglossum bicirrhosum (Cuvier, 1829) e o fluxo
unidirecional de Na
+
em exemplares de 1 kg, em repouso, é baixo (70 nmol g
-1
h
-1
)
em relação a outros peixes de água doce (BRAUNER et al., 2004). Comparando o
fluxo de íons de A. gigas com o peixe de respiração aérea facultativa tamoata,
Hoplosternum littorale (Hancock, 1828), BALDISSEROTTO et al. (2008) observaram
que as espécies apresentam diferenças em seus mecanismos de osmorregulação,
entretanto a resposta à exposição em água preta acidificada leva a perdas iônica em
ambas as espécies, sendo que os autores consideraram a alta permeabilidade
branquial pode explicar as perdas iônicas de animais submetidos à águas pretas.
O remodelamento do epitélio do filamento e lamelar, via aumento do número
de camadas de células (espessura do epitélio do filamento e lamela), a medida que
reduz a absorção de O
2
possivelmente reduz também a perda de íons de forma que
o aumento das CC, embora com baixa atividade da Na
+
/K
+
-ATPase como descrito
por BRAUNER et al. (2004) pode manter a regulação iônica e/ou ácido-base.
A análise morfológica do epitélio branquial de A. gigas mostrou que as
células pavimentosas possuem microdobras curtas. De acordo com KENDALL e
DALE (1979), as microdobras podem representar uma expansão da área de
superfície no epitélio de trocas e criar um fluxo de água sobre as células mais lento
de forma a otimizar as trocas gasosas. Em relação às trocas gasosas, essa hipótese
tem sido questionada pelo fato de que essas células são cobertas por glicocalix e
que uma fina camada de muco fica retida entre as microdobras. OJHA et al. (1987)
corroborando com SPERRY & WASSERSUG (1974) consideram que as microcriptas
formam microcanais que auxiliam na retenção do muco liberado pelas células
mucosas. O filme de muco que recobre o epitélio branquial, segundo HUGHES e
WRIGHT (1970), tem uma função de proteção do epitélio contra atrito ou choques
mecânicos de partículas, prevenção contra infecções causadas por bactérias e
64
. Discussão
fungos, prevenção contra ataques de parasitas e atração de íons que favoreceriam
as trocas iônicas. Pode-se especular que este é talvez o mais importante papel do
muco nas brânquias de A. gigas, pois tanto células PAS+ quanto AB+ aumentam
durante o desenvolvimento do animal, se mantendo em um nível aproximadamente
semelhante, nos animais a partir de 500-600g. Considerando o tipo de água em que
o animal é encontrado, o espessamento do epitélio e o aumento da atividade de CCs
nestes animais, a hipótese de que o muco produzido pelas células mucosas tem
papel na atração de íons para o favorecimento das trocas iônicas é aceitável; além
disso, diversos estudos (WOOD et al., 2003; GONZALES et al., 2005; STEINBERG
et al., 2006; MATSUO e VAL, 2007) relatam que as substâncias húmicas dissolvidas
na água contribuem para a prevenção de perdas iônicas.
O padrão das microdobras geralmente é diferente de uma espécie para outra
(HUGHES e WRIGHT, 1970; OJHA et al., 1987; MORON et al., 2003). Em A. gigas
as microdobras são morfologicamente semelhantes àquelas encontradas em
Oncorhynchus mykiss (Walbaum, 1792) (OLSON e FROMM, 1973), Mugil platanus
(Günther, 1880) e M. curema (Valenciennes, 1836) (EIRAS-STOFELLA et al., 2001)
e não apresentam diferenças entre as células pavimentosas da lamela e filamento
como descrito por MORON e FERNANDES (1996) para H. malabaricus.
Modificações no padrão das microdobras do filamento e/ou lamelas em uma mesma
espécie podem ser causadas por mudanças na temperatura ou salinidade (FERRI
1982, 1983; AVELLA et al., 1993) e exposição a poluentes (MAZON et al., 2002).
Sobre as células de “Rodlet”, encontradas nas brânquias de A. gigas, nas
análises em MET, estas podem ser localizadas no epitélio de diversos órgãos de
teleósteos (MORRISON e ODENSE, 1978). RICHARDS et al. (1994) consideraram
que está célula se trata de um organismo invasor em Cyprinus carpio (Linnaeus,
1758), entretanto a hipótese mais aceita é que esta estrutura se trata de uma célula
diferenciada (CHAICHARN e BULLOCK, 1967; REITE, 1997; KRAMER e POTTER,
2003). Sua origem e função no epitélio branquial não são claras, mas diversos
estudos têm revelado uma relação entre estas células e parasitismo (REIDE, 1997;
PALENZUELA et al., 1999; DEZFULI et al., 2000; DEZFULI et al., 2004) e também a
sua relação com alterações no meio, pela presença de xenobiontes (MANERA et al.,
2001; DEZFULI et al., 2003) e KOPONEN e MYERS (2000) descrevem uma relação
65
. Discussão
entre sazonalidade e o número de células de rodlet de Abramis brama (Linnaeus,
1758) coletados em um lago poluído.
Outros dois aspectos relacionados às transformações que ocorrem nas
brânquias de A. gigas referem-se à eliminação de CO
2
e a excreção de produtos
nitrogenados. Devido à alta solubilidade do CO
2
em água, a maior parte do CO
2
em
peixes de respiração aérea é excretado na água, via brânquias. Em A. gigas 79% da
excreção do CO
2
é em água, via brânquias, e isso se deve à alta pressão parcial de
CO
2
(P
CO2
) no sangue que reduz a dependência da desidratação do HCO
3
-
durante a
excreção de CO
2
(BRAUNER e VAL, 1996). Considerando que a excreção de
nitrogênio em peixes de água doce ocorre através das brânquias, principalmente por
difusão passiva de NH
3
(WOOD, 1993; WILKIE, 1997) e que, portanto é facilitada
com a presença de lamelas não embebidas no filamento, a ausência dessas lamelas
em A. gigas implica em um desvio desta função das brânquias para os rins. Essa
hipótese é corroborada pela presença do trocador Na
+
/NH
4
+
nos rins de A. gigas,
mas não em O. bicirrhosum, espécie de respiração aquática próxima de A. gigas, o
que sugere um possível papel dos rins na excreção de nitrogênio nesta espécie
(BRAUNER et al., 2004).
66
. Conclusões
6. CONCLUSÕES
A morfologia das brânquias de A. gigas nos estágios juvenis é semelhante à
da maioria dos teleósteos de respiração aquática e em exemplares adultos, acima
de aproximadamente 200g profundas alterações são observadas no filamento
branquial. Essas alterações devem ser uma conseqüência da perda da dependência
da respiração aquática branquial para a respiração aérea através da bexiga
natatória, que passa a ser o principal órgão para as troca de gases.
Entretanto, apesar de uma perda na capacidade de trocas gasosas pelas
brânquias, essas alterações podem permir uma eficiente regulação iônica e ácido-
base através das brânquias pelo aumento da atividade das células cloreto, aumento
de sua exposição ao meio e aumento na sua proliferação a medida em que o animal
cresce. O muco secretado pelas células mucosas provavelmente têm relação com o
papel de ajuste iônico, pois este muco secretado deve permitir que todo o epitélio
receba um delgado revestimento que provavelmente atua na atração de íons,
otimizando assim a regulação iônica.
67
. Referências Bibliográficas
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79
. Apêndices
8. APÊNDICES
8.1. Apêndice I – Licença para coleta e transporte
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