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Universidade de São Paulo
Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL REGENERATIVO DA MATRIZ ÓSSEA
BOVINA INORGÂNICA / P15 PARTICULADA EM LESÃO DE
BIFURCAÇÃO GRAU III.
ESTUDO HISTOMORFOMÉTRICO EM CÃES
Flávia Adelino Suaid
Ribeirão Preto
2008
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FLÁVIA ADELINO SUAID
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL REGENERATIVO DA MATRIZ ÓSSEA
BOVINA INORGÂNICA / P15 PARTICULADA EM LESÃO DE
BIFURCAÇÃO GRAU III.
ESTUDO HISTOMORFOMÉTRICO EM CÃES
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de
São Paulo como parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de Mestre em Periodontia.
Orientador: Prof. Dr. Márcio Fernando de Moraes Grisi
Ribeirão Preto
2008
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Suaid, Flávia Adelino
Avaliação do potencial regenerativo da matriz óssea bovina
inorgânica / P15 particulada em lesão de bifurcação grau III.
Estudo histomorfométrico em cães..
.
93p.:il.; 30cm
Orientador: Grisi, Márcio Fernando de Moraes
Dissertação apresentada no Departamento de Cirurgia,
Traumatologia Buco-Maxilo-Facial e Periodontia
1. Regeneração 2. Bifurcação 3. ABM/P15 4. Cães
Dedicatória
Aos meus pais Haylton e Marisa, que sempre me apoiaram nesta difícil e longa
batalha, incentivando à luta a cada dia e momento de minha vida. A cada obstáculo
encontrado não faltava amor, carinho, dedicação e amparo para que eu pudesse
vencer sempre. Muito obrigada por existirem, estarem sempre ao meu lado e me
tornar vencedora.
Aos meus irmãos Carla e Ricardo pelo apoio, carinho e cumplicidade em todo
este tempo ajudando a tornar os momentos mais difíceis em simples passagens. .
Ao meu namorado Antônio, que é um exemplo de pessoa batalhadora e
vencedora, sempre mostrando que não existem momentos difíceis para aqueles
que são persistentes. Não há palavras para descrever o quanto a sua presença foi
importante para mim nesta caminhada, assim como sua dedicação, seu amor e
carinho foram incondicionais neste tempo.
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Márcio Fernando de Moraes Grisi pelo convívio profícuo,
ensinamentos, confiança, disposição e paciência na orientação deste trabalho. Muito
Obrigada por me enriquecer profissionalmente e pessoalmente através de seus
ensinamentos e de suas virtudes.
Ao Prof. Dr. Arthur Belém Novaes Júnior pelo incentivo e confiança que me
fortaleceram profissionalmente.
Ao Prof. Dr. Sérgio Luís Scombatti de Souza pelo constante apoio clínico e
científico que foram fundamentais para a conclusão do mestrado.
Ao Prof. Dr. Mário Taba Júnior que acreditou no meu trabalho gerando
oportunidades a partir da iniciação científica que me impulsionaram para a vida
acadêmica.
À Professora. Dra. Daniela Bazan Palioto pela disponibilidade e apoio clínico
durante o decorrer do curso.
Ao Prof. Dr. Paulo Tambasco, pela inestimável contribuição entusiástica na
análise histológica deste trabalho.
Ao meu grande amigo Guilherme que através de seu esforço, dedicação, ajuda
e infinitas outras qualidades indescritíveis, foi uma das pessoas mais importantes
para que este trabalho chegasse ao fim, e principalmente para que eu me tornasse
uma profissional qualificada. Muito obrigada.
Às minhas amigas Germana, Adriana, Priscila Paganini, Anelissa e Pri pelo
companheirismo, amizade e principalmente pela valiosa ajuda nesses dois anos de
grandes emoções. Torço muito pelo sucesso de vocês.
Ao amigo Fábio, que na função de veterinário, mostrou esforço e dedicação
durante a fase experimental contribuindo para o sucesso deste trabalho.
Aos funcionários e técnicos do Laboratório de Histologia Sebastião e Junia,
pelos ensinamentos metodológicos e valiosa ajuda.
Aos funcionários do biotério Aldo e Edson pelo apoio prestado durante a fase
experimental.
Às secretárias do Departamento de Cirurgia e Periodontia Tatiana e Dulce pela
constante ajuda e pelos bons momentos durante este longo percurso.
Muito Obrigada!
LISTA DE ABREVIATURAS
Mm - Milímetro
mm
2
– Milímetro quadrado
µm - Micrômetro
ATF: Área total furca
ANT: Área de novo tecido
AE: Área de epitélio
ATC: Área de conjuntivo
ANO: Área de novo osso
DO: densidade óssea
EF: Extensão da furca
EC: Extensão do cemento
ED: extensão do defeito
ENT: Extensão do novo tecido
EO:extensão osso
SUMÁRIO
Justificativa................................................................................................................10
Resumo.....................................................................................................................19
Introdução .................................................................................................................23
Proposição ................................................................................................................28
Material e Métodos....................................................................................................30
Resultados ................................................................................................................40
Discussão..................................................................................................................50
Conclusões................................................................................................................57
Referências Bibliográficas.........................................................................................59
Artigo em Inglês .......................................................................................................66
Justificativa
11
A regeneração dos periodonto, após episódios destrutivos das várias formas de
doenças periodontais, tem sido uma formidável mudança na periodontia. No entanto,
para que a verdadeira regeneração ocorra é necessário que haja a neoformação de
cemento, ligamento periodontal e osso alveolar, através da migração e proliferação
de células do ligamento periodontal para a lesão
1
. Neste âmbito, a RTG tem sido a
técnica mais estudada e utilizada para o tratamento de lesões de bifurcação e
defeitos infra-ósseos, podendo esta ser associada com outros biomateriais
2-3
.
A regeneração do periodonto em defeitos infra-ósseos apresenta maior
previsibilidade quando comparada aos defeitos ósseos nas áreas de bifurcações
4
. As
lesões de furca possuem resultados e prognósticos diferentes, quando submetidas à
RTG, dependendo do grau de envolvimento. As lesões de bifurcação grau II têm sido
reportadas, como aquelas que respondem favoravelmente ao processo regenerativo,
principalmente as presentes nas faces livres dos molares inferiores
5
.
No entanto, nas lesões de bifurcação grau III, por apresentar gravidade maior, a
RTG tem demonstrado resultados conflitantes, imprevisíveis e menos favoráveis em
modelos animais e humanos
2,3,6,7
. O sucesso da RTG neste defeito crítico depende,
entre outros fatores, do tamanho do defeito ou da distância da base do defeito até o
teto da furca. Segundo alguns autores, defeitos ósseos maiores que 4 mm tendem a
apresentar baixo índice de regeneração dos tecidos periodontais
8,10
. Outros estudos
mostram que é possível o fechamento total ou parcial da lesão de bifurcação grau III
utilizando-se somente a RTG ou a associação desta com diferentes
biomateriais
2,9,10,11,12,13
. Pode-se notar que as lesões de furca grau III tornaram-se um
grande desafio tanto para a obtenção da regeneração quanto para maximizar o
potencial regenerativo dos diversos enxertos ósseos.
12
Os enxertos ósseos recentemente têm desenvolvido um importante papel na
regeneração periodontal
14,15,16
. Estes biomateriais podem ser de origem bovina
(xenógenos), de indivíduos da mesma espécie (alógenos) ou sintética. Em função da
quantidade limitada a ser utilizada dentre outros fatores do enxerto autógeno, os
materiais sintéticos, em procedimentos cirúrgicos periodontais, têm sido mais
utilizados para a reconstrução de defeitos ósseos
17,18
.
Dentre os materiais sintéticos, o mais recentemente desenvolvido, foi um
enxerto ósseo que é composto por um componente inorgâncio – a matriz mineral
óssea bovina – cuja função é servir como arcabouço para a migração celular, além
de fonte de cálcio, essencial para a formação óssea, e um componente orgânico que
é representado por uma seqüência de quinze aminoácidos derivados do colágeno
primário (PepGen P15), que são responsáveis pela quimiotaxia e adesão celular,
fenômenos essenciais para que haja nova formação óssea
19,20,21
. Este novo enxerto
ósseo pode ser encontrado em forma de gel (Flow) ou sólidas (particulada), e ambas
as formas estão sendo utilizadas em muitos estudos
22,23,24,25
.
Segundo Kubler et al.
26
, no estudo in vitro, a matriz óssea inorgânica/P15,
mostrou maior índice de proliferação e diferenciação celular quando comparado ao
Bio-Oss, Algipore, e Osteograf. Os resultados relativos a este novo enxerto, podem
ser visualizados no trabalho de Scarano et al.
27
, no qual houve de 78 a 98% de
preenchimento ósseo nos defeitos criados na tíbia de coelhos. Da mesma forma,
estudos em cães, demonstram que a matriz óssea inorgânica/P15 promoveu
resultados significativos em relação à regeneração tanto em frenestrações ósseas
28
como em defeitos crônicos alveolares
29
.
Estudos clínicos e histológicos em humanos demonstram que a matriz óssea
inorgânica/P15 (particulada ou em gel), promoveu resultados satisfatórios em relação
13
à formação óssea em defeitos periodontais infra-ósseos, em levantamento de seios
maxilares e em defeitos ósseos de rebordos
24,30,31,32,33
. Mostrou também
superioridade no preenchimento ósseo, em comparação com outros enxertos, ou
com a RTG
25,34,35
.
Desta forma, é possível verificar que a matriz óssea inorgânica/P15, foi utilizada
em inúmeros estudos e em diversas situações, mostrando resultados satisfatórios até
o momento. Porém, o potencial regenerativo deste novo enxerto ósseo, ainda não
havia sido testado e comprovado em um dos defeitos periodontais mais difíceis de
ser regenerado: o defeito de bifurcação grau III.
Recentemente, a forma “Flow” deste novo enxerto foi testada em lesões de
bifurcações grau III, em cães. Porém devido à baixa viscosidade deste material, e ao
escoamento, os resultados referentes à regeneração periodontal foram
insatisfatórios
36
. Assim justifica-se a realização desta pesquisa, para avaliar o
potencial regenerativo da matriz óssea bovina inorgância/P15 particulada em lesões
de bifurcação grau III.
14
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histomorphometric study in dogs. J Periodontol. 2006 Mar; 77(3): 490-7.
19
Resumo
20
Introdução: A falta de previsibilidade no tratamento periodontal regenerativo de
defeito de furca grau III, têm estimulado o estudo de alternativas para melhorar os
resultados, através do emprego de diferentes técnicas e biomateriais. Um novo
enxerto ósseo enriquecido com peptídeos - Matriz óssea bovina inorgânica/P15
(PepGen P15) - foi desenvolvido recentemente e, segundo a literatura, mostrou
resultados significantes em relação à neoformação tecidual nos defeitos infra-ósseos
testados. Assim, o presente estudo teve como objetivo verificar o potencial
regenerativo da matriz óssea inorgânica/P15 particulada, no tratamento de defeitos
de furca grau III em cães associado ou não ao uso de membrana de PTFE-e
Material e Métodos: Foram utilizados seis cães, nos quais defeitos de furca
grau III nos pré-molares inferiores foram confeccionados, sendo que no grupo teste
foi utilizado a membrana de PTFE-e e a matriz óssea inorgânica/P15, no grupo
controle foi utilizada somente a membrana e no grupo controle negativo, nos 2° pré-
molares, não foi colocado biomaterial. Os defeitos foram confeccionados e
preenchidos com material de impressão (Impregum F) e após 21 dias foram
debridados, as raízes aplainadas com cureta Gracey (Hu-friedy) e os dentes
submetidos à profilaxia semanal com ultra-som e limpeza diária com digluconato de
clorexidina a 0,12% durante 15 dias. Na segunda fase cirúrgica, foram realizadas
marcações do nível ósseo nas raízes mesial e distal dos dentes P2, P3 e P4,
colocação das membranas e do enxerto ósseo nos respectivos defeitos. Os dentes
P3 e P4 foram aleatoriamente escolhidos para ser o grupo teste ou controle. Quatro
semanas após a colocação das membranas, estas foram retiradas e, doze semanas
após a remoção, os animais foram sacrificados. Os dentes e seus tecidos
periodontais de proteção e suporte foram removidos, fixados em formalina
tamponada a 10%, descalcificados em ácido tricloroacético a 10%, desidratados e
21
seccionados no plano mésio-distal em cortes semi-seriados com 7µm de espessura
cada. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) ou tricrômico de
Mallory (TM) sendo selecionados para a análise histomorfométrica 5 cortes
representativos da porção central da bifurcação. Foram realizadas medidas da área
total da bifurcação (AT), área de novos tecidos formados (ANT), área de epitélio
(AE), área de tecido conjuntivo (ATC), área de novo osso (ANO) e medidas lineares
da extensão representativa da altura do defeito (ED), extensão do novo tecido
extensão (ENT), extensão do novo osso (EO), extensão da bifurcação (EB) e
extensão do novo cemento (EC).
Resultados: A análise histológica demonstrou características morfológicas
similares entre os grupos avaliados. Adicionalmente, o grupo teste apresentou
grânulos do enxerto ósseo, envoltos por uma matriz óssea imatura, aprisionado
entre os tecidos neoformados. Os resultados das médias das medidas lineares
(mm) e das medidas de área (mm
2
) foram respectivamente os seguintes para o
grupo teste: 14,11 ± 1,74 (EF) e 17,62 ± 2,39 (ATF); 8,61 ± 3,24 (EC) e 14,66 ± 3,73
(ANT); 4,71 ± 0,54 (ED) e 0,90 ± 0,80 (AE); 3,78 ± 0,85 (ENT) e 5,36 ± 2,41 (ATC);
1,77 ± 1,54 (EO) e 6,52 ± 5,69 (ANO); 4,82 ± 2,98 (DO). As seguintes médias
lineares e de área para o grupo controle respectivamente: 13,19 ± 2,03 (EF) e 15,11
± 3,29 (ATF); 8,52 ± 3,54 (EC) e 11,88 ± 2,09 (ANT); 4,59 ± 0,65 (ED) e 0,95 ± 0,71
(AE); 3,54 ± 0,61 (ENT) e 5,19 ± 2,17 (ATC); 1,64 ± 1,06 (EO) e 4,17 ± 3,40 (ANO);
2,58 ± 1,71 (DO). E as seguintes médias lineares e de área para o grupo controle
negativo respectivamente: 13,54 ± 1,41 (EF) e 14,99 ± 3,13 (ATF); 6,56 ± 2,11 (EC)
e 11,13 ± 3,25 (ANT); 4,62 ± 0,47 (ED) e 0,95 ± 0,78 (AE); 3,59 ± 0,28 (ENT) e 5,89
± 0,87 (ATC); 0,98 ± 0,48 (EO) e 2,88 ± 2,49 (ANO); 2,35 ± 2,00 (DO). A análise
estatística dos dados, realizada através da aplicação do teste de Friedman Test (ρ<
22
0,05), demonstrou haver diferenças estatisticamente significantes entre o grupo
teste e controle negativo no parâmetro referente à ANO.
Conclusão: Pode-se concluir que a matriz óssea inorgânica/P15 apresentou
resultados semelhantes aos outros grupos em relação à regeneração periodontal
do defeito. No entanto, quando a matriz óssea permaneceu no defeito, apresentou
resultados satisfatórios através da formação óssea que circunscreveu as partículas.
Palavras-chave: Membrana de politetrafluoretileno expandido, lesão de
bifurcação grau III, Matriz óssea bovina inorgânica/P15, regeneração periodontal.
23
Introdução
24
Um dos principais objetivos da terapia periodontal é o de possibilitar a
regeneração dos tecidos
1
e o restabelecimento da função e arquitetura em um
periodonto acometido por doenças periodontais inflamatórias
2,3
.
O processo de regeneração periodontal requer nova formação de osso,
cemento e ligamento periodontal, através da migração, proliferação e diferenciação
de células do ligamento periodontal (cementoblastos, fibroblastos e osteoblastos)
1
e
células mesenquimais indiferenciadas
4,5,6
para a área do coágulo formado após as
diferentes terapias periodontais
5
.
Na tentativa de reparação dos tecidos lesionados no processo inflamatório, as
células da lâmina própria do tecido gengival migram para o defeito levando à
formação de epitélio juncional longo
4,7
. Adicionalmente, as células derivadas do
tecido conjuntivo também migram e podem acarretar a reabsorção óssea e provocar
como conseqüência a anquilose, desta forma impedindo o processo de regeneração
periodontal
8
. Com exceção, as células do ligamento periodontal representam a
população celular que levam à formação de nova inserção e favorecem a nova
formação tecidual
8
.
A utilização de barreiras físicas como as membranas, absorvíveis ou não, na
técnica de regeneração tecidual guiada (RTG), tem sido a técnica mais utilizada para
o alcance da regeneração periodontal. Quando interposta entre a ferida cirúrgica e o
tecido gengival conjuntivo, impede a migração das células do tecido epitelial e do
conjuntivo para a superfície radicular, permitindo, como conseqüência, o
repovoamento desta e do coágulo formado pelas células do ligamento periodontal e
do endósteo,
9,10,11
tornando possível a neoformação de cemento, ligamento
periodontal e osso
3,6,12
. Dentre os variáveis tipos de barreiras testados, a membrana
25
de politetrafluoretileno expandido (PTFE-e), é um material não absorvível
semipermeável que atinge estes requisitos. O seu comportamento biológico já foi
amplamente avaliado em estudos clínicos e histológicos
6-11
.
Muitos trabalhos, utilizando membranas de PTFE-e demonstram a formação
de novas inserções e ganho ósseo no tratamento de lesões de furca grau II e
defeitos infra-ósseos verticais ou angulares
6,13,14,15,16
.
A obtenção de resultados consistentes, em relação à aplicação da RTG, nos
tratamentos de defeitos de bifurcação, são muito mais difíceis que os defeitos infra-
ósseos segundo Mehlbauer et al
22
. Dentre os defeitos de bifurcação, aqueles
considerados grau II são mais favoráveis ao tratamento regenerativo, principalmente
os presentes nas faces livres dos molares inferiores
17,20
.
Os defeitos de bifurcação grau III são menos previsíveis e não promovem
resultados satisfatórios
18
, devido à sua morfologia, altura (maior que 4 mm) e largura
do defeito, dificuldade de descontaminação das superfícies radiculares, quantidade
de células do ligamento periodontal disponíveis, provindas das paredes ósseas
remanescentes, entre outros fatores, diminuindo a chance de ocorrência de
completa regeneração
14,19
. No entanto, existem estudos que mostram resultados
significativos, através do fechamento parcial ou total da lesão de bifurcação grau III
utilizando-se somente a RTG ou a associação desta com diferentes
biomateriais
19,21,22
. Outros trabalhos mostram o fechamento parcial da lesão de furca
III frente a diferentes terapias regenerativas e salientam que a taxa de sucesso é
reduzida
3,17,23,24,25
. Por estas razões muitos trabalhos têm utilizado modelos
experimentais de furca grau III para testar o potencial de novos biomateriais
2,20,27
.
Vários biomateriais estão sendo empregados na técnica de RTG,
principalmente em defeitos de furca grau III, o qual tem representado um grande
26
desafio
21
. Funcionando como materiais de preenchimento e mantenedores de
espaço,
9
os enxertos ósseos possuem potencial osteogênico através da
osteoindução ou osteocondução
22,11,12
e podem contribuir para o fechamento dos
defeitos de bifurcação grau III, porém os resultados são diversos e imprevisíveis.
Mais recentemente tem sido realizadas pesquisas com um novo enxerto
ósseo, o qual é a combinação de uma parte inorgânica (matriz óssea mineral bovina
inorgânica-MOMBI) que contém cálcio, essencial para a formação óssea e de uma
parte orgânica que é uma seqüência sintética de 15 aminoácidos do colágeno tipo I
(P15), responsável pela adesão celular e iniciação de outros eventos celulares
(migração, proliferação e diferenciação) necessários para o reparo ósseo
26,27,28,29
.
Este enxerto ósseo mostra ser bastante seguro quanto à imunogenicidade e a
transmissibilidade de doenças, sendo que a matriz óssea mineral bovina inorgânica
é processada de forma que elimina toda matéria orgânica. O P15 é produzido
sinteticamente e, portanto exclui qualquer associação com derivados naturais do
colágeno
30,31
.
A matriz óssea inorgânica/P15 aumenta a ligação dos fibroblastos e a
migração, proliferação e diferenciação de células do ligamento periodontal para as
superfícies radiculares, as quais promovem o aumento da formação da matriz óssea
25,26,29,30,31,32
indicando o potencial osteogênico deste material simulando
biologicamente o osso autógeno. Este novo enxerto tem sido citado como um
biomaterial que leva à verdadeira regeneração periodontal
28,32,33
.
A matriz óssea inorgânica/P15 pode ser encontrada no mercado na forma
particulada (seco) ou em gel. Ambas as formas, quando utilizadas, proporcionam
aumento significativo de nova formação óssea no defeito
28,29
.
Há relatos de que o
P15 flow (gel) quando utilizado em alvéolos frescos e defeitos infra-ósseos em
27
humanos, promoveu formação óssea comprovada por análise histomorfométrica e
radiografias respectivamente
34,35
. Porém, a baixa viscosidade do P15 flow, e a
chance de escoamento, podem levar à resultados insatisfatórios quando utilizados
em defeitos críticos
36
. A matriz óssea inorgânica/P15 particulada, não apresenta esta
desvantagem e tem as mesmas propriedades do flow.
Estudos in vitro relatam que a matriz óssea inorgânica/P15 particulada
promoveu maior índice de proliferação e migração de células do ligamento
periodontal, quando analisado isoladamente ou comparativamente à outros enxertos
ósseos empregados
27,31,33,37
. Esta propriedade da matriz óssea inorgânica/P15 pode
ser demonstrada clinicamente, através do alcance de um maior preenchimento do
defeito ósseo, se comparado ao tratamento com o enxerto ósseo desmineralizado e
liofilizado (DFDBA) e ao uso da hidroxiapatita derivada de matriz bovina
inorgânica
26,38
. Em um estudo, no qual a matriz óssea inorgânica/P15 particulada foi
empregado em um defeito infra-ósseo e foi realizada análise histológica, pode ser
observada regeneração periodontal
32
. Portanto, de acordo com Yukna
32
, matriz
óssea inorgânica/P15 resulta na regeneração periodontal em uma superfície
radicular humana previamente contaminada.
Devido ao potencial da matriz óssea bovina inorgânica/P15 e considerando o
fato do defeito de furca grau III ser o modelo experimental que apresenta maior
dificuldade em se obter a regeneração é que se baseia o fundamento deste estudo.
28
Proposição
29
O presente trabalho teve como objetivo avaliar histomorfometricamente em cães
o potencial regenerativo da matriz óssea bovina inorgânica/P15 particulada na
regeneração periodontal de lesões de bifurcação grau III mandibulares.
30
Material e Métodos
31
SELEÇÃO DO ANIMAL:
Neste estudo foram utilizados seis (6) cães adultos de raça indefinida com peso
médio de 20 Kg cada. Os animais gozavam de boa saúde geral, possuindo dentes
maxilares e mandibulares intactos e sem traumas oclusais primários ou lesões bucais
de natureza viral ou fúngica avaliadas clinicamente.
A parte experimental clínica seguiu o seguinte cronograma:
2 semanas
21 dias
4 semanas15 dias 8 semanas
Preparo Inicial
Remoção do
Material de
Moldagem
Cirurgia 3
Sacrifício
Cirurgia 1
Cirurgia 2
Onde:
- Cirurgia 1 - Confecção dos defeitos
- Cirurgia 2 – Colocação da membrana e da matriz óssea inorgânica/P15 nos
grupos Controle e Teste
- Cirurgia 3 - Remoção das membranas 4 semanas após sua colocação -
A seguir, será feita a descrição dos procedimentos realizados.
PREPARO INICIAL: Tratamento pré-cirúrgico
Quinze dias antes da primeira cirurgia, os animais receberam complexos
vitamínicos na dose estipulada para a necessidade de cada cão, vacinas e
tratamento antiparasitário e foram submetidos à limpeza de seus dentes com o uso
do ultra-som
Φ
para remoção de placa e cálculo dentários.
Φ
Cavitron 3000, Dentsply Mfg. Co, USA.
32
CIRURGIA 1: Confecção dos defeitos ósseos.
Os animais foram mantidos em jejum desde a noite anterior ao ato cirúrgico.
Receberam injeção intramuscular do pré-anestésico Zolazepan a
0,10 ml/kg e
Acepromazina a 0,10ml/kg. A manutenção anestésica foi realizada com anestésico
volátil diluído em oxigênio- Isoflurano
δ
- até o fim do ato cirúrgico.
Para a confecção dos defeitos de furca grau III, foram realizadas incisões
intrasulculares, com lâmina de bisturi número 15C
θ
colocada em cabo próprio, nas
faces vestibular e lingual dos dentes P2, P3 e P4 mandibulares e retalhos
mucoperiosteais foram rebatidos. Após o deslocamento do retalho, sob irrigação
com solução salina, foi realizado osteotomia na área da bifurcação com brocas
cirúrgicas
€
(números 1014 e 1016) diamantadas em alta rotação com irrigação e
cinzéis de Ochsenbein
β
(números 1 e 2).
Os defeitos de bifurcação preparados, nos pré-molares, apresentaram 3 mm de
remoção de tecido ósseo no sentido ápico-oclusal, padronizados com o auxílio de
sonda periodontal graduada milímetro a milímetro
¥
. No sentido mésio/distal foram feitas
remoções uniformes de osso no lado vestibular e lingual. No sentido vestíbulo/lingual, a
remoção óssea foi feita até ocorrer a comunicação vestíbulo- lingual entre as raízes.
Após o preparo das cavidades ósseas, as mesmas foram preenchidas com
material de moldagem tipo poliéter
γ
(Impregum F), com a finalidade de induzir uma
resposta inflamatória e dificultar a reparação espontânea do defeito, além de favorecer
o acúmulo de placa bacteriana. Os retalhos foram reposicionados e suturados através
sutura interrompida, com fio seda 4.0
&
. A remoção da sutura foi feita após 10 dias.
δ
Isoflurano, Instituto Biochímico, Atibaia-SP.
θ
Becton Dickinsson, Juiz de Fora-MG, Brasil.
€
KG Sorensen
,São Paulo, Brasil.
β
Hu-Friedy MFG. Co.Inc., Chicago, USA.
¥
PCPUNC15, Hu-Friedy MFG. Co.Inc., Chicago, USA.
γ
Impregum F, 3M do Brasil LTDA, Sumaré-SP, Brasil
&
Seda, ethicon Inc., Johnson & Johnson Company, São José dos Campos – SP, Brasil.
33
REMOÇÃO DO MATERIAL DE MOLDAGEM E DESCONTAMINAÇÃO
RADICULAR
O material de impressão permaneceu na área da furca por 21 dias e após
este período, o Impregum através de raspagem e alisamento radicular com curetas
tipo Gracey
§
(Hu-friedy), em campo fechado. Os dentes foram submetidos a
profilaxia com ultra-som semanalmente e, aplicação da solução de digluconato de
clorexidina a 0,12%
π
, com gaze diariamente durante 15 dias.
CIRURGIA 2: Realização dos grupos experimentais
Duas semanas após o regime de controle de placa, foram iniciadas as
cirurgias para a realização dos tratamentos. Foi efetuado o mesmo procedimento de
sedação e anestesia idêntica à primeira cirurgia. Este segundo procedimento
cirúrgico, foi precedido por profilaxia com ultra-som e aplicação de digluconato de
clorexidina com gaze. Em seguida, as incisões intrasulculares foram realizadas tanto
por vestibular como por lingual permitindo desta forma a exposição dos defeitos de
bifurcação bilateralmente. Após o deslocamento dos retalhos mucoperiosteais, os
defeitos e as raízes foram raspados e alisados com curetas tipo Gracey (Hu-Friedy)
e os defeitos ósseos medidos no sentido ápico-oclusal, mésio-distal e vestíbulo-
lingual com sonda milimetrada padronizada. Para a análise histomorfométrica, foram
realizados os notches (marcações) com broca esférica 33 e ½
φ
sob abundante
irrigação com solução de cloreto de sódio a 0,9% estéril.
Foram realizados três grupos experimentais: grupo teste, controle e controle
negativo e estes foram aleatorizados em sorteios selecionando o lado da mandíbula
§
Hu-Friedy Mfg. Co. Inc., Chicago-IL, EUA.
π
Periogard, Colgate-Palmolive Company, New York, EUA.
φ
KG Sorensen, São Paulo, Brasil.
34
e os dentes, P3 e P4, que receberam os respectivos grupos sorteados, com exceção
do P2.
Grupos Experimentais:
Os grupos experimentais e os tratamentos realizados foram os seguintes:
-Grupo Teste (T): foi utilizada a matriz óssea inorgânica/P15 (Pepgen P15)
þ
particulada e a membrana de politetrafluoretileno – PTFE-e tipo GTW2
₣
(Gore-tex),
sendo uma membrana por vestibular e outra por lingual, no defeito de furca grau III
do dente sorteado.
-Grupo Controle (C): foi utilizada somente a membrana de PTFE-e tipo GTW2
no lado vestibular e lingual no defeito de furca grau III do dente sorteado.
-Grupo Controle Negativo (CN): realizado somente no P2 e não foi utilizado
biomaterial e membrana no defeito de furca grau III.
Após a realização dos tratamentos descritos acima, os retalhos foram
reposicionados e suturados com fio 5.0 de PTFEe
ß
.
Tratamento Pós-Cirúrgico:
As suturas foram removidas 10 dias após o ato cirúrgico e neste período os
cães foram alimentados com ração pastosa. Foi administrado antibiótico
Espiramicina
(Stomorgyl 10)
Ħ
na proporção de 1 comprimido /10 Kg durante 10 dias
e antiinflamatório (Ketofen 20)
Ə
na proporção de 1 comprimido /20 Kg durante 3
dias.
þ
PepGen P15 (Particulada), Dentsply, Friadent-Ceramed, Lakewood, CO, USA.
₣
Gore-Tex, W.L.Gore and Associates. Inc., Flagstaff, AZ, USA.
ß
Gore-Tex, Periodontal Material, AZ, USA.
Ħ
Stomorgyl 10, Merial Saúde Animal LTDA, Paulínia, SP.
Ə
Ketofen, Merial Saúde Animal LTDA, Paulínia, SP.
35
O controle da cicatrização foi periódico: os animais foram submetidos a
aplicações diárias de digluconato de clorexidina a 0,12% e, semanalmente, sob
sedação, receberam profilaxia com ultra-som para a remoção de resíduos
supragengivais, evitando as áreas das membranas.
CIRURGIA 3: Remoção das membranas quatro semanas após a colocação
Este terceiro procedimento cirúrgico foi precedido por profilaxia com ultra-som e
aplicação de digluconato de clorexidina com gaze. Foi efetuada a mesma sequência
de sedação e anestesia idêntica à primeira cirurgia. Em seguida, através de
pequenas incisões intrasulculares nos dentes P3 e P4, as membranas foram
removidas, tanto do grupo teste como do grupo controle e suturados com fio seda
4.0.
Controle pós-operatório
Após a Cirurgia 3 e até o sacrifício, os animais receberam controle de placa
bacteriana diário, através de escovação e aplicação de digluconato de clorexidina a
0,12%, e semanal, através de profilaxia com ultra-som (sob sedação).
SACRIFÍCIO DOS CÃES
Os animais foram sacrificados 12 semanas após a Cirurgia 2 – colocação das
membranas- com uma dose letal de tiopental sódico.
36
Figura 1 A-L: A - Aspecto inicial mucosa; B - Retalho mucoperiósteo; C - Medida da altura do defeito;
D - Defeitos criados; E - Colocação do Impregum; F - Reposicionamento do retalho e sutura; G -
Aspectos dos defeitos na reabertura do retalho para a cirurgia 2; H - Posicionamento das membranas;
I - Colocação do enxerto ósseo (PepGen P15); J - Reposicionamento do retalho e sutura; K - Aspecto
da mucosa após a remoção das membranas; L - Pós-operatório na data do sacrifício.
D
E
F
H
I
A
C
B
L
J
L
K
G
37
PROCESSAMENTO DAS PEÇAS:
Imediatamente após o sacrifício, foi realizada a dissecação das mandíbulas e
redução das peças para se remover os dentes e os tecidos circunvizinhos envolvidos
na pesquisa. As peças foram fixadas em solução de formalina tamponada a 10% em
pH 7 por um período de 48 horas e, em seguida, lavadas em água corrente. A
seguir, cada peça foi amarrada separadamente por uma gaze e colocada suspensa
num recipiente contendo ácido tricloroacético a 10%, a fim de ser descalcificada por
múltiplos banhos. Foi usado um volume de solução 10 vezes maior que o da peça,
trocando-se o líquido a cada 2 dias. O período de descalcificação foi de 30 dias. Em
seguida, as peças foram colocadas em uma solução de sulfato de sódio a 5%, para
realizar a neutralização do ácido. O passo seguinte foi desidratação em
concentrações crescentes de álcool: 70% durante a noite, 80% por duas horas, 85%
por duas horas, 90% por duas horas, 95% por duas horas, 100% durante a noite.
Após isso, as peças foram diafanizadas em Xilol com três trocas de solução a cada
duas horas. Por fim, as peças foram incluídas em parafina aquecida a 60°C.
Com o auxílio de um micrótomo, foram feitos cortes semi-seriados (intervalo de
70 µm entre os cortes) no plano mésio-distal, com 7µm de espessura cada, até que
fosse atingido o fim do defeito. As lâminas foram coradas com hematoxilina e eosina
(HE) ou tricrômico de Mallory (TM): a cada dez lâminas, cinco foram coradas com
HE, e cinco com TM.
ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA
Para a análise microscópica foram selecionados 5 cortes representativos da
porção central da bifurcação
35
. Um microscópio óptico
1
acoplado a uma câmera
2
1
Leica DM R, Leica Microsystems Nussloch GmbH, Heidelberger, Nussloch, Germany.
2
Leica DC-100, Leica Microsystems Nussloch GmbH, Heidelberger, Nussloch, Germany.
38
para digitalização e posterior análise foi utilizado para a análise histomorfométrica,
na qual foram obtidas medidas de área, em milímetros quadrados (mm
2
), e medidas
lineares em milímetros (mm). Como medidas de área foram avaliadas: área total da
bifurcação (AT), área de novo tecido formado (ANT), área de epitélio (AE), área de
tecido conjuntivo (ATC), área de novo osso (ANO) e densidade óssea (Figura 2 A).
Como medidas lineares foram analisadas: extensão representativa da altura do
defeito (ED); extensão do novo osso (EO), extensão da bifurcação (EB) e extensão
do novo cemento (EC) e extensão do novo tecido (ENT) (Figura 2 B). Para a
obtenção das medidas, o término das marcações das raízes representou a
referência do limite apical dos defeitos. Foi realizada também a análise histológica
descritiva dos tecidos formados em ambos os grupos. A histomorfometria foi
realizada com o auxílio de programa de computador apropriado
3
. A representação
do valor das estruturas descritas foi obtida a partir da média dos cinco cortes de
cada dente.
AC
AO
AT
AE
AN T
ED
EO
EC
EB
EC
Figura 2 A, B: A - Esquema representativo das medidas de área; B - Esquema representativo das
medidas lineares.
3
Image-Pro Plus, Media Cybernetics, LP, Silver Spring, USA.
39
ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística foi realizada através da aplicação de teste Friedman, verificando
a existência ou não de diferença estatisticamente significante (p < 0,05, n = 6) na
regeneração do periodonto entre os grupos teste, controle e controle negativo.
40
Resultados
41
OBSERVAÇÕES CLÍNICAS
Todos os animais toleraram bem os procedimentos cirúrgicos, não
apresentando complicações pós-operatórias. Entretanto, em quatro dos seis animais
da pesquisa, houve exposição das membranas a partir do décimo quinto dia da
colocação destas, tanto no grupo controle como no teste. Em dois cães apenas, não
houve exposição das membranas.
No período final da permanência das membranas, observou-se uma retração
da margem gengival colaborando este fato para a exposição da membrana
previamente descrita.
Durante a fase do controle de placa, após a remoção das membranas,
verificou-se que em quatro animais houve recessão gengival e constatou-se
exposição de parte da bifurcação. Nestes dentes observou-se a comunicação da
face vestibular com a lingual, constituindo-se em um defeito clínico de bifurcação
classe III, constatada pela utilização da sonda Nabers, tanto no grupo teste como no
grupo controle e controle negativo.
AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA
No grupo controle e controle negativo foram avaliados 12 dentes em cada
grupo, tendo sido observada a formação de novos tecidos periodontais (osso,
ligamento periodontal e cemento) acima do limite apical da marcação radicular
(figura 3 A, B). Em todos os espécimes houve a presença de um tecido epitelial
pavimentoso estratificado na porção mais coronal da formação tecidual na área
(figura 3 A, B). O tecido conjuntivo mostrou-se denso, de feixes de fibras colágenas
inseridos em novo cemento (figura 3 A, B), havendo freqüentemente fibras de
42
Sharpey ao longo da extensão de bifurcação e sem células inflamatórias
mononucleares.
O osso formado foi do tipo imaturo (woven bone), apresentando uma matriz
com aspecto entrelaçado e fibras de sharpey inseridas (figura 3 E, F). Em algumas
áreas a matriz óssea também se encontrava organizada de maneira concêntrica ao
redor de algumas lamelas (figura 3 E). Foi observada a pavimentação de
osteoblastos tanto na superfície interna das lamelas quanto na superfície externa do
osso formado (figura 3 F). Também pôde ser observada a presença de matriz
osteóide na superfície externa do novo osso (figura 3 E, F).
Foi formado um novo cemento do tipo celular de fibras mistas em toda a
extensão do defeito, exceto em áreas onde houve a presença do tecido epitelial
(figura 3 C, D), Foram observadas linhas incrementais entre o cemento novo e a
dentina. Este tecido, freqüentemente foi depositado sobre áreas irregulares
indicativas de reabsorção da superfície dentinária.
As fibras do ligamento periodontal apresentaram-se orientadas num sentido
oblíquo e orientadas em direção às raízes (figura 3 C, D). Houve neste ligamento a
presença de fibras de Sharpey tanto em novo osso quanto em novo cemento (figura
3 D).
No grupo teste foram avaliados 12 dentes observando-se também a formação
de novos tecidos periodontais (osso, cemento e ligamento periodontal) acima do
limite apical da marcação da raiz (figura 4 A, B). Houve formação de epitélio
pavimentoso estratificado na parte mais coronal da formação tecidual na área em 10
dentes (figura 4 A). O tecido conjuntivo apresentou-se denso, com fibras colágenas
inseridas em um novo cemento, havendo freqüentemente fibras de Sharpey ao
longo da extensão da bifurcação (figura 4 A).
43
O osso formado foi considerado do tipo imaturo (Woven bone), apresentando
uma matriz com aspecto predominantemente entrelaçado e fibras de Sharpey
inseridas (figuras 5 C, D, E, F). Contudo em algumas áreas pôde ser observada a
presença de lamelas circundadas por uma matriz óssea concêntrica (figura 5 C). Foi
observada a pavimentação de osteoblastos tanto na superfície interna das lamelas
quanto na superfície externa do osso formado (figura 4 B).
Em meio à formação do novo tecido ósseo foi possível observar a presença de
grânulos do enxerto ósseo (figura 4 C). Estas partículas encontravam-se dispersas
na região correspondente à nova formação óssea, à parte mais apical do tecido
conjuntivo e/ou no ligamento periodontal (figuras 4 D, F). Observou-se que ao redor
do grânulo houve formação de uma matriz óssea imatura com características
próprias (figuras 4 D, E, F). Adicionalmente, pôde ser observado que o grânulo
envolto por matriz óssea estava “anquilosado” à superfície do cemento, com a união
entre ambas as estruturas (figura 4 E).
O tipo de cemento formado foi predominantemente celular de fibras mistas
(figuras 5 A, B), sendo gradualmente menos espesso em direção do teto da
bifurcação e presente ao longo de todo o defeito, havendo interrupção deste nas
áreas de formação epitelial. Este tecido foi freqüentemente depositado sobre áreas
irregulares indicativas de reabsorção da superfície dentinária (figura 4 B).
As fibras do ligamento periodontal apresentaram-se predominantemente
orientadas em um sentido oblíquo (figuras 5 A, B, E). Houve neste ligamento a
presença de fibras de Sharpey tanto em novo osso (figuras 5 E, F) quanto em novo
cemento (figuras 5 A, B).
44
HISTOMETRIA
Os resultados da análise histomorfométrica estão apresentados nas Tabelas 1
e 2. Os valores percentuais da densidade óssea (DO) em relação à área total óssea
(ANO), das áreas ocupadas pelos novos tecidos formados (ANT), pelo osso (ANO),
tecido conjuntivo (ATC) e epitélio (AE) em relação à área total da bifurcação (ATF),
da extensão do novo osso (EO) e do novo tecido (ENT) em relação à extensão
representativa da altura do defeito (ED) e da extensão do cemento (EC) em relação
à extensão da bifurcação (EB) estão demonstrados na Tabela 3. Houve diferença
estatisticamente significante (Friedman Test, ρ < 0,05) entre os grupos teste e
controle negativo em relação à área novo osso (tabela 2). Comparando-se os outros
parâmetros, foi constatado que não houve diferenças estatisticamente significante
(Friedman Test ρ < 0,05) entre os grupos controle negativo, controle e teste (tabelas
1 e 2).
No grupo controle negativo o tecido epitelial ocupou uma área (AE) de 0,95 ±
0,78 mm
2
representando 7% da área total da bifurcação (AT). O tecido conjuntivo
(ATC) apresentou uma formação média de 5,89 ± 0,87 mm
2
, preenchendo cerca de
40% da área total dos defeitos (Tabelas 2 e 3). A média de formação do tecido
ósseo (ANO) foi de 2,88 ± 2,49 mm
2
, representando 20% da AT, ocupando uma
extensão (EO) de 0,98 ± 0,48 mm
2
(21% da extensão representativa da altura do
defeito). A densidade deste novo tecido ósseo foi de 2,35 ± 2,00 (81,5% em relação
à área total óssea). O novo cemento ocupou uma extensão (EC) de 6,56 ± 2,11mm
representando 48,4% da extensão da bifurcação (EB) (tabelas 1 e 3).
No grupo controle, o tecido epitelal (AE) ocupou uma média de 0,95 ± 0,71
mm
2
representando 7% da área total da bifurcação (AT). O tecido conjuntivo (ATC)
apresentou uma formação média de 5,19 ± 2,17 mm
2
, preenchendo cerca de 35%
45
da área total dos defeitos.O novo osso (ANO) apresentou uma formação média de
4,17 ± 3,40 mm
2
, representando 28% da AT, e uma extensão (EO) de 1,64 ± 1,06
mm (35% da extensão representativa da altura do defeito). A densidade deste novo
tecido ósseo foi de 2,58 ± 1,71 (61,8% em relação à área total óssea). O novo
cemento ocupou uma extensão (EC) de 8,52 ± 3,54 mm
representando 65% da
extensão da bifurcação (EB) (tabelas 1 e 3 ).
No grupo teste o tecido epitelial ocupou uma área (AE) de 0,90 ± 0,80 mm
2
representando 5% da área total da bifurcação (AT). O tecido conjuntivo (ATC)
apresentou uma formação média de 5,36 ± 2,41 mm
2
, preenchendo cerca de 31%
da área total dos defeitos (Tabelas 2 e 3). A média de formação do tecido ósseo
(ANO) foi de 6,52 ± 5,69 mm
2
, representando 37% da AT, ocupando uma extensão
(EO) de 1,77 ± 1,54 mm
2
(37,5% da extensão representativa da altura do defeito). A
densidade deste novo tecido ósseo foi de 4,82 ± 2,98 mm
2
em (80% em relação à
área total óssea) O novo cemento ocupou uma extensão (EC) de 8,61 ± 3,24 mm
representando 61% da extensão da bifurcação (EB) (tabelas 1 e 3 ).
Tabela 1 – Média e desvio-padrão das medidas lineares (mm), para os grupos
controle negativo (CN), controle (C) teste (T).
EF EC ED ENT EO
CN
13,54 ± 1,41 6,56 ± 2,11 4,62 ± 0,47 3,59 ± 0,28 0,98 ± 0,48
C
13,19 ± 2,03 8,52 ± 3,54 4,59 ± 0,65 3,54 ± 0,61 1,64 ± 1,06
T
14,11± 1,74 8,61 ± 3,24 4,71 ± 0,54 3,78 ± 0,85 1,77 ± 1,54
ρ
0,31 0,31 0,31 0,85 0,31
EF: Extensão da furca; EC: Extensão do cemento; ED: extensão do defeito; ENT:
Extensão do novo tecido; EO:extensão osso
(Friedman Test, ρ<0,05)
46
Tabela 2 - Média e desvio-padrão dos parâmetros medidos em área (mm
2
) para os
grupos controle negativo (CN), controle (C) teste (T).
ATF ANT AE ATC ANO DO
CN
14,99 ± 3,13 10,13 ± 3,25 0,95 ± 0,78 5,89 ± 0,87
2,88 ± 2,49*
2,35 ± 2,00
C
15,11 ± 3,29 10,58 ± 2,09 0,95 ± 0,71 5,19 ± 2,17 4,17 ± 3,40 2,58 ± 1,71
T
17,62 ± 2,39 13,00 ± 3,73 0,90 ± 0,80 5,36 ± 2,41
6,52 ± 5,69*
4,82 ± 2,98
ρ
0,31 0,22 0,57 0,85
0,03
*
0,12
ATF: Área total furca; ANT: Área de novo tecido; AE: Área de epitélio; ATC: Área de
conjuntivo; ANO: Área de novo osso; DO: densidade óssea.
(Friedman Test, ρ<0,05)
*Diferença estatisticamente significante entre os grupos controle negativo e teste
para o parâmetro ANO (ρ = 0,03).
Tabela 3 - Média dos parâmetros em %.
EC ENT EO ANT ANO ATC AE DO
CN
48,4%
77%
21% 67% 20% 40% 7% 81,5%
C
65% 77% 35% 70% 28% 35% 7% 61,8%
T
61% 80% 37,5% 73% 37% 31% 5% 80%
EC: Extensão cemento; ENT: Extensão do novo tecido; Eo: Extensão novo osso; ANT:
Área novo tecido; ANO: Área novo osso; ATC: Área tecido conjuntivo; AE: Área
epitélio; DO: Densidade óssea
47
Figura 3 A-F: Secções histológicas mésio-distais das lesões de bifurcação grau III tratadas, demonstrando
a similaridade do padrão histológico dos novos tecidos formados. A – Grupo controle negativo; B – Grupo
controle (Tricrômico de Mallory, aumento origianl de 2,5X). C – Grupo controle negativo: formação de
cemento celular (CC), ligamento periodontal com fibras em direção oblíqua (LP), e osso alveolar (OA). D –
Grupo controle: formação de cemento celular (CC), ligamento periodontal com fibras oblíquas (LP), fibras
de sharpey (FS) e osso imaturo (OI) (Tricrômico de Mallory, aumento original 40x). E – Grupo controle
negativo: presença osteóide (OT) e osso imaturo (OI) (Tricrômico de Mallory, aumento original 40x). F –
Grupo controle: setas indicam pavimentação de osteoblastos (OB), osteóide (OT) e osso imaturo (OI)
(Tricrômico de Mallory, aumento original 40x).
B
F
OT
OI
OI
OT
LP
LP
LP
LP
OI
OI
CC
CC
A
CD
E
FS
OB
48
Figura 4 A-F: Secções histológicas demonstrando aspectos dos novos tecidos formados no grupo teste.
A. – secção mésio-distal da lesão de bifurcação grau III tratada (tricrômico de Mallory, aumento original 2.5
x). B – formação de cemento celular (CC), ligamento periodontal com fibras em direção oblíqua (LP), osso
imaturo (OI), osteóide (OT) e pavimentação de osteoblastos (OB) (tricrômico de Mallory, aumento original
40x). C – grânulos da matriz óssea bovuna/P15 no interior do defeito (GP) (tricrômico de Mallory, aumento
original 10x). D – grânulo da matriz óssea bovuna/P15 (GP) isolado no ligamento periodontal (LP)
(hematoxicilina e eosina, aumento original 10x). E – grânulo da matriz óssea bovina/P15 (GP), com
formação óssea (OI) ao redor e unido ao ligamento periodontal (tricrômico de Mallory, aumento original
40x). F – grânulo da matriz óssea bovina/P15 (GP), formação óssea (OI) e a pavimentação de
osteoblastos (OB) (tricrômico de Mallory, aumento original 20x).
AB
C D
F E
OI
OI
LP
LP
OT
OB
CC
GP
GP
OI
GP
OI
OB
GP
OI
LP
CC
OB
49
Figura 5 A-F: Secções histológicas demonstram aspectos morfológicos do cemento, osso alveolar e
ligamento periodontal no grupo teste. A – As setas indicam cementócitos no interior do cemento (CC)
e fibras de Sharpey (Tricrômico de Mallory, aumento original de 40X). B – Formação de cemento
celular de fibras mistas (CC) e das fibras de sharpey sob luz polarizada (Tricrômico de Mallory,
aumento original de 40X). C – Aspecto do osso imaturo formado (Tricrômico de Mallory, aumento
original de 20X). D – Aspecto osso imaturo sob luz polarizada (Tricrômico de Mallory, aumento
original de 20X). E – As setas indicam fibras de sharpey no osso imaturo (Tricrômico de Mallory,
aumento original de 40X). F – Fibras de sharpey inseridas no osso imaturo sob luz polarizada
(Tricrômico de Mallory, aumento original de 40X).
F
D
B
E
C
A
LP
FS
CC
CC
LP
OI OI
OI
OI
LP
FS
LP
FS
FS
50
Discussão
51
Tratamentos efetivos dos defeitos de bifurcação grau III, representam um
grande desafio na periodontia. Apesar de existirem muitas técnicas incluindo a RTG
e a associação com os diversos materiais de enxertos ósseos, a efetividade em
longo prazo da aplicação destas técnicas, em termos de ganho de inserção ou
resolução do defeito, tem causado grandes desilusões e ao mesmo tempo gerado
muitas pesquisas
40
. Uma grande variedade de biomateriais foi testada na furca grau
III, porém a matriz óssea inorgânica/P15 particulada, recentemente descoberta,
ainda não havia sido utilizado neste defeito, no entanto demonstrando excelentes
resultados em defeitos infra-ósseos
26,32,38,39
.
O presente estudo avaliou, em cães, o potencial regenerativo da matriz óssea
inorgânica/P15 particulada, associado ou não, à membrana de Politetrafluoretileno
Expandido (PTFEe) na regeneração periodontal de lesões de bifurcação grau III
mandibulares. Os resultados demonstraram que o grupo teste apresentou resultados
regenerativos que estão de acordo com trabalhos prévios
28,29,38,41,42,
, que indicaram
a formação de novo osso, cemento e ligamento periodontal após a utilização da a
matriz óssea inorgânica/P15 particulada em diversos modelos experimentais.
Apesar de ter ocorrido nova formação dos tecidos periodontais de suporte nos
três grupos experimentais, esta não foi suficiente para que ocorresse o fechamento
completo dos defeitos, deixando uma área com ausência de formação tecidual. De
acordo com Pontoriero et al
14,43
e Mehlbauer et al
22
, defeitos que possuem altura
maior que 4mm, apresentam uma possibilidade menor de regeneração total do
defeito. Esta afirmação também é refletida no trabalho de Lindhe et al
20
, no qual o
tamanho do defeito levou a uma situação de extrema dificuldade de tratamento, o
que pôde ter contribuído grandemente para o não fechamento das bifurcações em
nenhum dos grupos tratados. No presente trabalho, a altura dos defeitos de
52
bifurcação grau III, medidos imediatamente após a confecção destes, foi 3mm. Após
a cronificação das lesões com material de impressão, a altura média dos defeitos
passou de 3 para 4,8 mm em média em todos os grupos. De acordo com Roriz et
al,
36
uma possível hipótese para o fato ocorrido seria o aumento da reabsorção,
observado após o período de cronificação da lesão, estimulado pelo material de
impressão.
Além do tamanho do defeito, a morfologia deste pode ter influenciado muito
na resposta da cicatrização, pois se tratava de um extenso defeito horizontal com
apenas uma parede óssea como fonte potencial para o fornecimento das células,
essenciais para desencadear a regeneração periodontal
14
. Segundo Lindhe et al.
8
a
formação de uma nova inserção, neste tipo de defeito, é portanto dependente do
crescimento coronal do tecido do ligamento periodontal, o qual dificulta a
neoformação tecidual.
Segundo Scantlebury
44
, vários fatores contribuem para o sucesso das
terapias com RTG, dos quais se destacam: a exclusão do epitélio juncional e do
tecido conjuntivo, a estabilidade da ferida, a adesão do coágulo de fibrina à
superfície radicular e maturação deste, e a manutenção de um espaço adequado,
proporcionado pela membrana. Tratando-se de extensos defeitos presentes no
estudo, o risco de colabamento (vestíbulo-lingual) da membrana tornou-se provável,
interferindo na estabilização do coágulo
45
e diminuindo o espaço para a proliferação
celular. A estabilização da ferida e a adesão do coágulo são fatores essenciais para
que haja a regeneração periodontal
7,46,47
e, podem ter sido prejudicados por
situações pertinentes ao modelo experimental. Segundo Caton & Greenstein
48
, a
falta de adesão do coágulo de fibrina na superfície radicular, prejudica o vedamento
marginal, que pode ter contribuído para a migração do epitélio juncional e do tecido
53
conjuntivo, conduzindo a uma menor formação de tecido ósseo no grupo controle e
teste.
A migração do epitélio juncional e do tecido conjuntivo favoreceram, nos
grupos controle e teste, a formação de epitélio na parte mais coronal do defeito e a
presença de uma grande porção de tecido conjuntivo. Estes achados também foram
encontrados em estudos prévios
20,49
e este fato foi atribuído à retração do retalho no
período pós-operatório, expondo a membrana e o fórnix da furca e ao tamanho do
defeito
20
. Klinge et al.
50
analisaram a influência da posição do retalho e o tamanho
do defeito e observaram que reposicionamento adequado do retalho, pode prevenir
a retração marginal do tecido, mas que o tamanho pouco influencia neste aspecto.
Adicionalmente à exposição da membrana e do fórnix da furca, que ocorreu
após os primeiros quinze dias de pós-operatório, devido à retração do retalho e
favorecendo a migração do epitélio, há outro indício de que a presença da placa com
a ação contínua bacteriana, também podem levar um menor sucesso na
regeneração dos defeitos de bifurcação grau III
49
.
O grupo teste apresentou um diferencial que foi a presença da matriz óssea
inorgânica/P15 particulada, o qual obteve as mesmas interferências citadas
anteriormente em relação ao grupo controle, porém alcançou uma média de
formação óssea maior e diferenças estatisticamente significantes quando comparado
com o grupo controle negativo. Deve-se ressaltar que o preenchimento do defeito
através da neoformação tecidual, neste grupo, foi comparativamente maior em
relação aos outros grupos, sendo que mais de 50 % dos tecidos foi composta por
nova formação óssea.
O fato de não haver diferença significativa entre o grupo teste e controle, pode
estar relacionado ao fato de que em dois cães grupos teste, não foram encontrados
54
grânulos do enxerto ósseo, e nos outros cães, a quantidade encontrada foi
relativamente menor quando comparada àquela colocada no defeito no ato cirúrgico,
podendo dessa forma diminuir o potencial regenerativo do tratamento. Estes
achados também foram encontrados no trabalho de Roriz et al.
36
no qual foi utilizada
a matriz óssea inorgânica/P15 flow em defeitos de bifurcação grau III e observou-se
que não havia a presença de grânulos em nenhum dos dentes do grupo teste,
reduzindo desta forma a formação óssea neste grupo.
Uma provável hipótese para o fato ocorrido e citado anteriormente é de que o
defeito de grau III apresenta-se somente com uma parede óssea como limite apical,
as raízes dentais como limites proximais, a membrana nas faces livres, além do teto
da bifurcação como limite superior. Dessa forma, em contato com o enxerto existiam
várias superfícies pouco viáveis. Entretanto, não de deve deixar de lado a
possibilidade do material de enxerto ter sido parcialmente substituído por novo osso,
ao invés de ter sido perdido.
No entanto, como citado anteriormente, os dentes referentes ao grupo teste
de quatro cães apresentaram partículas da matriz óssea inorgânica/P15 particulada
após as 12 (doze) semanas da colocação. Nestas peças, foi possível observar uma
formação óssea maior no defeito envolvendo os grânulos do enxerto ósseo, com
uma densidade óssea de 80% em relação à área total óssea.
Histologicamente pode ser observado que os grânulos concentravam-se
próximos à base do defeito, com uma formação óssea ao redor dos grânulos
encontrados em meio ao novo tecido em formação, além de uma área óssea
formada acima do nível das partículas. A matriz óssea estava em contato direto com
as partículas do biomaterial e não havia intervalos entre o enxerto ósseo e o novo
osso. Estes achados estão de acordo com estudos prévios realizados em modelos
55
animais
42,28,41
e humanos
26,29,32,51
, nos quais o tempo médio de avaliação foi de 4 a
12 semanas para os experimentos em animais e de 4 a 6 meses para a avaliação
em humanos, evidenciando nova formação óssea nos grupos que continham a
matriz óssea inorgânica/P15. A formação de novo osso ao redor de uma partícula
que se encontrava no interior do defeito torna-se indicativa do potencial regenerativo
deste biomaterial. Adicionalmente Hahn
52
, confirmou a estabilidade deste enxerto
ósseo, no período de 8 anos, após a colocação do biomaterial em um alvéolo fresco,
através da manutenção do trabeculado ósseo e da estabilidade da parede
enxertada.
Este provável potencial regenerativo da matriz óssea inorgânica/P15
particulada exibido anteriormente, pode ser explicado através da estimulação de
fibroblastos do ligamento periodontal a se proliferarem mais rapidamente dentro de
um defeito recentemente preenchido por partículas
27
, iniciando um processo
regenerativo. Esta ocorrência pode ser atribuída à cadeia de quinze aminoácidos -
P15 - presente na matriz óssea bovina, o qual tem mostrado facilitar o processo
fisiológico de forma similar ao colágeno
31
. Portanto, a matriz óssea inorgânica/P15
pode ser denominada como um enxerto ósseo com propriedades osteoindutoras.
Além da formação óssea, novo cemento foi observado no grupo teste e
controle com aspectos histológicos similares para ambos os tecidos (qualitativo).
Listgarten
53
e Nalbandian & Frank
54
demonstraram que o cemento que se forma
sobre as raízes que foram expostas cirurgicamente se apresenta relativamente fino,
com células e com a predominância de fibras colágenas intrínsecas e paralelas à
superfície radicular, características estas corroboradas por Roriz et al.
36
. Neste
último trabalho citado, os autores analisaram a regeneração das bifurcações grau III,
56
e encontraram características histológicas do cemento bastante semelhantes às
observadas no presente estudo.
Apesar do presente trabalho não ter mostrado uma quantidade de
neoformação de tecidos mineralizados aproximada aos valores apresentados em
outros estudos
26,38,51
provavelmente pelas dificuldades encontradas nesta pesquisa,
a qualidade destes tecidos parece não ter sido prejudicada.
Trabalhos prévios mostraram resultados clínicos e histológicos bastante
satisfatórios com a utilização da matriz óssea inorgânica/P15 particuladas em
defeitos periodontais. Neste trabalho, ao ser testado em defeitos mais difíceis de
alcançar a regeneração periodontal, o potencial regenerativo deste biomaterial
parece ter sido demonstrado, quando presente no grupo teste, evidenciando a
formação óssea que gerou ao seu redor. A formação de novo cemento e ligamento
periodontal, também foi encontrada de forma satisfatória juntamente à área de novo
osso.
Porém, para que haja uma confirmação do absoluto potencial deste
biomaterial, serão necessários novos trabalhos que o testem nas mais diferentes
situações clínicas, com o objetivo de se obter regeneração total e absoluta do
defeito.
57
Conclusões
58
Em relação à regeneração periodontal do defeito através da neoformação
tecidual, pode ser observada uma similaridade entre os resultados do grupo teste,
controle e controle negativo para todos os parâmetros. Houve diferença
estatisticamente significante apenas entre os grupos teste e controle negativo em
relação à área de formação óssea. Para todos os outros itens avaliados não houve
diferença significativa.
No entanto, o potencial regenerativo da matriz óssea bovina inorgânica/P15
presente no grupo teste pode ser demonstrado através da maior formação de área
óssea em relação aos outros grupos, considerando as dificuldades inerentes do
modelo experimental. Adicionalmente, quando a Matriz Óssea Inorgânica/P15
permaneceu nos defeitos, pode-se observar evidente formação óssea
circunscrevendo as partículas.
Porém, um modelo crítico como o apresentado, não permite evidências
conclusivas quanto ao potencial regenerativo da matriz óssea bovina
inorgânica/P15.
59
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healing of experimental furcation defects. Journal of Clinical Periodontology. 1981;8:
236-248.
51. Matos SM, Guerra FA, Krauser J, Marques F, Ermida JM, Sanz M. Clinical
evaluation of the combination of a anorganic bovine-derived hydroxyapatite
matrix/cell-binding peptide (P15) in particulate and hydrogel form as a bone
replacement graft material in human periodontal osseous defects: 6-month reentry
controlled clinical study. J Periodontol 2007; 78: 1855-1863.
52. Hahn J. 8-year onlay bone graft and ridge augmentation with PepGen P15: a
clinical and radiographic case study. Implant Dent 2004; 13: 228-231.
53. Listgarten MA. Electron microscopic study of the junction between surgically
denuded root surfaces and regenerated periodontal tissues. J Periodontal Res. 1972;
7(1): 68-90.
54. Nalbandian J, Frank RM. Electron microscopic study of the regeneration of
cementum and periodontal connective tissue attachment in the cat. J Periodontal
Res. 1980; 15(1): 71-89.
66
Artigo em Inglês
67
Regenerative potencial of an anorganic bone matrix/synthetic cell-binding
peptide grafts using the class III furcations lesion model: A histologic and
histomorphometric study in dogs
Flávia A. Suaid, Graduate student of Periodontology*
Guilherme O. Macedo, Graduate student of Periodontology*
Germana J. Borges, Graduate student of Periodontology*
Arthur B. Novaes Jr., Chairman of Periodontology*
Sérgio L.S. Souza, Professor of Periodontology*
Mário Taba Jr, Professor of Periodontology*
Daniela B. Palioto, Professor Periodontology*
Márcio F.M. Grisi, Professor of Periodontology*
*Department of Buco-Maxillo-Facial Surgery an Traumatology and Periodontology,
School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, SP,
Brazil.
Address for correspondence and reprints:
Márcio Fernando de Moraes Grisi
Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto (USP)
Departamento de CTBMF e Periodontia, Av. do Café, s/n, 14040-904. Ribeirão
Preto, SP, Brazil.
E—mail: [email protected]
68
ABSTRACT
Background: The aim of this study was to verify the regenerative potential of
particulate ABM/Synthetic Peptide in class III furcation defects associated or not with
ePTFE membranes.
Material and Methods: Six dogs were used and class III furcation defects
were produced in the lower pre-molars and filled with impression material. After 21
days, the membranes and the bone grafts were inserted and P3 and P4 were
randomized to form the test and control groups. P2 was the negative control. The
animals were sacrificed 3 months post-treatment.
Results: Comparisons between groups by the Friedman Test (ρ<0.05)
showed statistically significant differences between the test and negative control
groups, based on NBA parameter. In the negative control group, a new bone area
(NBA) of 20% was observed. In the test group, a new bone area of 37% was
observed. There was no statistically significant difference between the groups to the
others parameters.
Conclusions: The statistical analysis using Friedman Test (ρ<0.05) showed
statistically significant differences between the test and negative control groups,
based on NBA parameter. Furthermore, when the Inorganic Bone Matrix/P15
remained inside the defects, it could be clearly observed that new bone formation
not only circumscribed the particles but formed above the level of the particles.
Keywords: Expanded polytetrafluorethylene membrane, class III furcation
lesion, ABM/Synthetic Peptide, GTR.
69
INTRODUCTION
One of the main goals of periodontal therapy is to allow tissue to regenerate¹ and
to reestablish the function and structure of the periodontal tissues that were damaged
or destroyed by inflammatory periodontal diseases.
2,3
Periodontal regenerative processes requires the neo-formation of bone, cement
and periodontal ligament, through migration, proliferation and differentiation of
periodontal ligament cells (cemetoblasts, fibroblasts and osteoblasts)
1
and
undifferentiated mesenchymal cells
4,5,6
towards the bone clot that is formed after
different periodontal therapies.
5
When attempting to repair the tissues damaged by the inflammatory process, the
cells from the lamina propria from the gingival tissues migrate to the defect, leading to
the formation of a long junctional epithelium.
4,7
Furthermore, cells derived from the
connective and bone tissue migrate, leading, respectively, to root resorption and
anchylosis, and, thus, impeding the periodontal regenerative process.
8
On the other
hand, the periodontal ligament cells represent the cellular group that leads to the
formation of new attachment and favor the production of new tissues.
8
Utilizing physical barriers, such as membranes, absorbable or not, during guided
tissue regeneration (GTR), has been the most commonly used technique aimed at
periodontal regeneration. When the membrane is placed between the surgical wound
and the gingival connective tissue, it impedes the migration of the epithelial and
connective tissue cells to the root surface, allowing the repopulation of the root
surface area and the blood clot, by cells of the periodontal ligament and
endosteum.
9,10,11
, leading to the neo-formation of cementum, periodontal ligament and
bone.
3,6,12
There are several types of membranes available, the expanded
polytetrafluorethylene membrane (ePTFE) among them, it’s non-absorbable and
70
semi-permeable as is required. Its biological acceptance has been widely analyzed in
several histological and clinical studies.
6,11
Several studies, utilizing ePTFE membranes demonstrated the formation of new
attachment and osseous gain during the treatment of class II furcation defects and
vertical or angular infraosseous defects.
6,13,14,15,16
When it comes to the usage of GTR, obtaining consistent results in the treatment
of furcation defects is much more difficult than in the treatment of infraosseous
defects, according to Mehlbauer.
22
Amongst the furcation defects, the class II lesion
molars have more predictable results .
17,20
Class III furcation defects are less predictable and don’t allow for very
satisfactory results
18
due to the morphology, height (more than 4mm), width of the
defect, difficulty of decontamination of the root surfaces, source of periodontal cells
from the remaining bone structure, amongst other factors, which diminish the
possibility of completely regenerating the tissues.
14,19
However, there are studies that
show significative results by completely enclosing a class III furcation defect and
solely utilizing GTR or associating this technique with other biomaterials.
19,21,22
Other
studies show partial healing of class III furcation defects after other regenerative
therapies and they highlight that their success rate is reduced.
3,17,23,24,25
For these
reasons, many studies have utilized the class III furcation lesions as an experimental
model to test the potential of new biomaterials.
2,20,7
Several biomaterials are being employed with GTR, mainly in class III furcation
defects.
21
Functioning as filling and space making materials
9
, bone grafts have a large
osteogenic potential through osteoinduction or osteoconduction
22,11,12
and may
contribute to the healing of class III defects; although the results are shown to be
diverse and unpredictable.
71
Recently, more studies are being carried out using ABM/Synthetic Cell Binding
Peptide
‡
grafts. This graft is the result of the combination of an inorganic portion
(inorganic bovine bone mineral matrix - IBBMM) which contains calcium and essential
minerals for bone production, and an organic portion which is comprised of a synthetic
sequence of 15 type I collagen amino acids, responsible for cellular adhesion and for
initiation of several other cellular events (migration, proliferation and differentiation)
that are necessary for bone repair.
26,27,28,29
This bone graft has been shown to be safe regarding immunogenicity and the
transmissibility of diseases, as the anorganic bovine bone mineral matrix is processed
in order to remove all organic material and the amino acid sequence is synthetically
produced, eliminating any association with natural collagen-derived substances.
30,31
ABM/Synthetic Peptide increases fibroblasts bonding and periodontal cells
migration, proliferation and differentiation towards the root surfaces, thus, promoting
an increase in bone matrix formation
25,26,29,30,31,32
, indicating the osteogenic potential
of this material, which resembles biological autogenous bone grafts. ABM/Synthetic
Peptide has been cited as a biomaterial that leads to true periodontal
regeneration.
28,32,33
ABM/Synthetic Peptide can be found in the market as a
particulate mixture (dry) or in gel form. When either form is used, it offers
significatively increased new bone formation in the defect.
28,29
There are reports that
when ABM/Synthetic Petide flow (gel) is used in fresh alveoli and infraosseous
defects in humans, it promoted bone formation that was proved through
histomorphometric and radiographic analysis.
34,35
However, due to its low viscosity
and high flowage, the gel presentation of this material might lead to dissatisfactory
results when utilized in more critical areas
36
. ABM/Synthetic Peptide in its particulate
‡
PepGEN P15, Dentsply Friadent CeraMed, Lakewood, CO.
72
presentation does not show this disadvantage and has the same properties as the
flow counterpart.
In vitro studies have reported that particulate ABM/Synthetic Peptide permitted a
more of periodontal ligament cell migration and proliferation when used alone or when
compared to other bone grafting materials.
27,31,33,37
This inherent property of the
ABM/Synthetic Peptide can be clinically supported by the fact that it fills the bone
defect more thoroughly when compared to demineralized freeze-dried bone allograft
(DFDBA) or to anorganic bovine bone matrix derived hydroxyapatite.
26,38
In a study in
which ABM/Synthetic Peptide was used in an infraosseous defect and histological
analysis was performed, periodontal regeneration was observed.
32
According to
Yukna et al
32
, ABM/Synthetic Peptide assists the periodontal regeneration of a
previously contaminated root surface area.
Due to the fact that class III furcation defects are the experimental model of
highest difficulty to achieve satisfactory regeneration, the objective of this study is
available the regenerative potencial of an ABM/Synthetic cell-binding peptide grafts
using class III furcation lesion model.
73
MATERIALS AND METHODS
Six (6) dogs of mixed races weighting an average of 20kg were selected. The
animals had good overall health, intact teeth, did not present any primary occlusal
traumas or buccal lesions of viral or fungal nature.
One week prior to the first surgery, full mouth prophylaxis with ultrasonic points
was perfomed. One night before the surgical procedure the animals were kept in fast.
For surgery, they were pre-anesthetized with Zolazepan at 0.10mL/kg and
Acepromazin at 0.10mL/kg and were anesthetized and maintained with the oxygen
volatile anesthetic Isoflurane
δ
..
To produce the class III furcation defects, intrasulcular incisions were performed
in the buccal and lingual surfaces of the mandibular P2, P3 and P4s, and
muccoperiosteal flaps were raised. After raising the flaps, osteotomy was performed
in the furcation area using surgical diamond burs and Ochsenbein chisels
β
. The
defects in the pre-molars were made with the removal of 3mm of bone tissue in the
apico-occlusal direction, and were standardized using a periodontal probe
ϕ
. The
interradicular bone until a buccal-lingual communication between the roots was
established.
After the preparation of the furcations lesions, these were filled with polyether
impression material (Impregum F)
4
to induce an inflammatory response, to reduce
natural bone repair and to favor formation of a biofilm. The flaps were repositioned
and sutured using 4.0 silk sutures. The sutures were removed 10 days later. The
impression material was left in the furcation area for 21 days and, then, removed
δ
Isoflurane, Instituto Biochímico, Atibaia-SP
β
Ochsenbein chisel, Hu-Friedy, Chicago, IL.
ϕ
PCPUNC 15, Hu-Friedy.
4
Impregum F
®
, 3M do Brasil Ltda., Sumaré-SP, Brasil
74
through scaling and root planing with Gracey curettes
£
. The animals underwent
periodontal prophylaxis with ultrasound
þ
, weekly, and chlorhexidine digluconate at
0.12%
§
, daily.
After two weeks into the plaque control regimen, the surgical procedures for the
treatment were initiated. The same sedation and anesthetic steps used in the first
surgery were carried out. Then, the intrasulcular incisions were preformed both
buccally and lingually exposing the furcation defects. The defects and roots were
scaled and root planed with Gracey curettes (Hu-Friedy) and then measured in the
apico-occlusal, mesio-distal and buccal-lingual directions using a marked periodontal
probe. For the histomorphometric analysis, notches were made on the roots at the
bone level. The animals were grouped as follows: test group – association of particle
ABM/Synthetic Peptide and expanded polytetrafluorethylene membrane – ePTFE –
(GTW2)
†
with one membrane placed bucally and the other lingually; control group –
ePTFE membrane (GTW2) placed buccally and lingually and negative control group
(P2) no biomaterials were used. The hemi-mandibles teeth (P3 and P4) for the test
and control groups were randomly selected. The dogs were fed with pasty dog ration
and the sutures removed after 10 days. The antibiotic, spiramycin was administered
for 10 days at the ratio of 1pill/10kg of weight and the anti-inflammatory ketoprofen
π
was administered for 3 days at the ratio of 1pill/20kg of weight. Wound-healing control
was performed using chlorhexidine digluconate at 0.12% over the wound area at a
daily basis and by weekly prophylaxis.
After 4 weeks of plaque control, following the same sedation and anesthetic
steps of the first surgery, the membranes were removed from the control and test
£
Hu-Friedy
þ
Cavitron 3000, Dentsply.
§
Periogard, Colgate-Palmolive Company, New York, NY.
†
Gore-Tex, W.L.Gore & Associates Flagstaff, AZ.
π
Ketofen, Merial Saúde Animal LTDA, Paulínia, SP
75
groups with small intrasulcular incisions in the P3 and P4 teeth and the wound was
sutured using 4.0 silk sutures. A daily prophylactic treatment using chlorhexidine
digluconate at 0.12% and a weekly prophylactic treatment using ultrasound was
initiated. Both were carried out until euthanasia.
The animals were sacrificed with a lethal dose of sodium thiopental; 12 weeks
after the membranes had been inserted.
After mandible dissection, the blocks were fixed in formalin buffered at 10%, pH
7, for 48 hours and, afterwards, placed in 10% trichloric acetic acid for decalcification
for a period of 45 days. The blocks were dehydrated using increasing concentrations
of alcohol and diaphanized in xylol, and, finally, included in paraffin. Non-consecutive
sections, 7µm thick, were obtained in the mesio-distal plane, until the end of the
defect was reached. The samples were dyed using hematoxillin-eosin (HE) and
Mallory’s trichromic™ stain.
Histomorphometric analysis was conducted with a microscope attached to a
photographic camera, with which area and linear measurements of the defects were
obtained. The following area measurements were taken into consideration: furcation
total area (FTA), newly formed tissue area (NTA), epithelium area (EA), connective
tissue area (CTA), newly formed bone area (NBA). Bone density (BD) was also
measured. The following linear measurements were taken into consideration: defect
height extension (DE), newly formed tissue extension (NTE), newly formed bone
extension (BE), furcation extension (FE) and newly formed cement extension (CE).
Each final measurement was calculated using the arithmetic mean obtained from 5
different sections from each tooth. The statistical analysis was performed using a
non-parametric test – Friedman (p < 0,05, n = 6) – for the test groups, control groups
and negative control groups.
76
RESULTS
CLINICAL FINDINGS
All animals endured the surgical procedures very well, and did not present any
post-operatory complications. However, in four out of six animals there was exposure
of the membrane after the fifteenth day following its insertion, both in the control and
test groups, due to marginal gingival recession.
Following membrane removal, it was verified that four animals presented some
degree of gingival recession with exposure of part of the furcation region.
HISTOLOGICAL EVALUATION
In the control group and negative control group, 12 teeth were evaluated and
new periodontal tissue formation was observed (bone, periodontal ligament and
cementum) above the apical limit of the root notch (figure 2 A, C). In all animals, a
stratified squamous epithelium was found in the coronal-most region (figure 2 A). The
connective tissue was dense, containing bundles of collagen fibers attached to newly
formed cementum, which was present throughout the extension of the furcation
region (figure 2 A).
The newly formed bone was immature; it was circumscribed by osteoids and
paved with osteoblasts both in the interior and exterior of the lamellae (figure 2 C). In
some areas, bone matrix was also organized concentrically around some lamellae
(figure 2 E).
The newly formed cementum was of the cellular mixed fiber type, showing
inclusions of cells and intrinsic and extrinsic collagen fibers; it was found throughout
the extension of the defect, except in areas where epithelial tissue was present
77
(figure 2 C). Incremental lines were observed between the newly formed cementum
and dentin. This new tissue was frequently laid over irregular areas which were an
evidence of dentinary surface absorption.
In the test group, 12 teeth were analyzed and newly formed periodontal tissues
(bone, cementum and periodontal ligament) were also observed above the apical
limits of the root notch (figure 2 B, D). In 10 teeth, stratified squamous epithelium
appeared in the coronal-most region of the newly formed tissues (figure 2 B). The
connective tissue was dense, with inserted collagen fibers in newly formed
cementum. Sharpey fibers were frequent throughout the extension of the furcation
area (figure 2 B).
The bone that was formed was considered immature (woven bone); presenting
a predominantly interlaced-like matrix and inserted Sharpey fibers (figures 2 F and 3
B). However, in some areas, lamellae circumscribed by a concentric bone matrix
were evident (figure 3 B). A covering of osteoblasts both in the internal and external
surfaces of the lamellae of the newly formed bone was present (figure 2 D).
Amongst the newly formed bone, it was possible to observe the presence of
ABM/Synthetic Peptide bone graft particles (figure 3 D, E, F). These particles were
dispersed in the region corresponding to the area of new bone formation, towards the
apical-most region of the connective tissue and/or periodontal ligament (figure 3 D).
Around the particles, the formation of an immature bone matrix occurred, allowing for
distinguishing characteristics (figure 3 D, E, F). Furthermore, it was noted that the
particles involved by this bone matrix was ankylosed to the cementum surface, and
both structures were physically united. (figure 3 E).
The newly cementum was also predominantly encountered (figure 3 E),
becoming thinner and thinner towards the top of the furcation area and present
78
throughout the entire defect, except in the areas of epithelial formation where
cementum presence was interrupted. This tissue was of the cellular mixed fiber type,
showing inclusions of cells and intrinsic and extrinsic collagen fibers (figure 3 E) and
frequently laid over irregular areas indicating dentinary surface absorption (figure 3 B)
Periodontal ligament fibers were predominately oblique (figure 3 A). Sharpey
fibers were found in this ligament both in newly formed bone and cementum
HISTOMETRY
The characteristics in the newly formed tissues in the test group were very
similar to the ones found in the control and negative control groups, differing only on
the values of the areas that were measured. Table number 1 shows linear
measurement comparisons, scaled in mm, for all groups; there is no statistically
significant difference between any of the parameters. Table number 2 shows area
measurement comparisons, scaled in mm
2
, for all the groups; there is statistically
significant difference between the test group and negative control group when new
bone formation area (NBA) is the compared parameter. The other parameters do not
produce statistically significant differences. (Friedman Test, ρ < 0,05). Table number
3 shows percentage values obtained from all the groups.
79
DISCUSSION
Treating class III furcation defects effectively has been a great challenge in
periodontology. Despite the existence of several techniques including GTR and the
association with innumerous materials and bone grafts, the long-term effectivity of
these techniques, when it comes to periodontal attachment gain or the resolution of
the problem itself, has generated disappointment and, at the same time, inspired
lots of studies.
40
A great variety of biomaterials have been tested for class III
furcation defects. However, the recently discovered particulate ABM/Synthetic
Peptide had not yet been tested in this particular defect, and it had already showed
excellent and promising results in infrabony defects.
26,32,38,39
The present study has evaluated, in dogs, the regenerative potential of
particulate ABM/Synthetic Peptide bone grafts, associated or not, with expanded
polytetrafluorethylene membranes (ePTFE) for periodontal regeneration of
mandibular class III furcation defects. The obtained results demonstrate that the test
groups reached the regenerative success of other previous studies.
28,29,38,41,42
, which
was indicated by formation of new bone, cementum and periodontal ligaments, after
using ABM/Synthetic Peptide in several experimentation models.
Although the formation of new periodontal tissues was evident in all three
experimental groups, it did not suffice to seal the defects completely, and an area
lacking tissue formation was still encountered. According to Pontoriero et al
14,43
and
Mehlbauer et al
22
, defects that are more than 4mm high have a smaller chance of
exhibiting full defect regeneration. Lindhe et al
20
has also stated it in one his studies
that the size of the defect led to severe treatment difficulty; and that may have also
contributed to the lack of fully-healed defects in all of the studied groups of the
present work. The height of the class III furcation defects, in the present work,
80
measured immediately after they had been produced, was 3mm in height. After
chronification with impression material, the average height increased from 3mm to
4.8mm. According to Roriz et al.
36
one possible hypothesis for this increased tissue
resorption due to lesion chronification period, stimulated by the impression material.
Besides being a large defect, another factor that may have contributed to
generate the observed healing response was the morphology of the defect. It was a
large horizontal defect comprised of a single intact bone wall that had the potential
to supply the area with the cells that would be paramount to periodontal
regeneration.
14
According to Lindhe et al.
20
, the formation of a new periodontal
attachment, in this particular kind of defect, is highly dependent on the coronal
growth of the periodontal ligament.
According to Scantlebury
44
, many factors contribute to the success of GTR
therapies, amongst which the following must be highlighted: the removal of the
junctional epithelium and connective tissue, wound stability, fibrin clot adhesion to
the root surface and maturation of the latter, and adequate space maintenance
provided by the membrane. As the extension of the defects that were dealt with in
this study was prominent, the risk of membrane collapsing (bucco-lingually) became
fairly possible, which hampered clot stability
45
and diminished the space for cell
proliferation. The stability of the wound and clotting are decisive factors for
periodontal regeneration
7,46,47
and they might have been jeopardized by
circumstances pertaining to the experiment model. According to Caton &
Greenstein,
48
the lack of adhesion of the fibrin clot on the root surface impairs
marginal sealing, which might have contributed to junctional epithelium and
connective tissue migration, leading to a smaller bone formation in the test and
control groups.
81
Junctional epithelium and connective tissue migration favored, in the test and
control groups, epithelium formation in the coronal-most part of the defect and the
presence of large amounts of connective tissue. These findings were also present in
previous studies
20,49
and it has been attributed to flap retraction during the post-
operative period leading to membrane and furcation fornix
20
exposure. Klinge et al.
50
analyzed flap positioning and defect size as influential factors on marginal tissue
recession. Adequate flap positioning might help prevent marginal tissue recession,
and defect size has little influence in it.
Besides membrane and furcation fornix exposure, which occurred 15 days into
the post-operative period, due to flap recession – what has favored epithelium
migration –, there is also evidence that continuous microbial plaque presence and
its constant bacterial action may also contribute to reduced success rates in class III
defect regeneration.
49
The test group had a differentiating characteristic and that was the use of
particulate ABM/Synthetic peptide grafts. This group had the same experimental
difficulties as the control group, but obtained higher means in bone formation and
statistically significant differences when compared to the negative control group. Not
having statistically significant differences between the test and control groups may
be related to the fact that in the test groups of two dogs no bone graft particles were
found, and, in the other dogs, the quantity found in the sections was smaller than the
amount that had been inserted into the defect during the surgery. This may have
reduced the regenerative potential of the treatment. These findings were also
reported in the work of Roriz et al., in which flow ABM/Synthetic Peptide was utilized
in class III furcation defects, and it was discovered that no graft particles were to be
found in the test group teeth, thus reducing bone formation in this group.
82
One possible hypothesis for these findings is that in class III furcation lesions
there is only one bone wall left to serve as apical limitation, only the roots as
proximal limitation, only the membrane to serve as limitation on the buccal and
lingual furcation entrances and the furcation roof as superior limitation. Having that
said, it is notable that there were surfaces of small viability in direct contact with the
graft. Nonetheless, what can’t be left aside is the possibility of the bone graft being
replaced by newly formed bone, instead of being lost.
As previously cited, the teeth of 4 dogs that belonged to the test group still
presented ABM/Synthetic Peptide particles 12 weeks of healing. In these sections, it
was possible to observe more intense bone formation involving bone graft particles
within the defects. Despite the presence of these particles, bone density in this
group reached 80%, when compared to the total area of newly formed bone.
Histologically, it could be observed that the particles were mainly present at
the base of the defect, and new bone formation was evident around the particles and
amidst newly formed tissues. The bone matrix was in direct contact with the
biomaterial particles and there were no gaps between the graft and the bone. These
findings corroborate with those of previous studies which were also conducted in
animal models
42,28,41
- with a mean evaluation time ranging from 4 to 12 weeks - and
human models
26,29,32,51
, - with a mean evaluation time ranging from 4 to 6 weeks. In
such studies, new bone formation was encountered in the groups that made use of
the inorganic bone matrix/P15. New bone formation around a particle inserted into
connective or bone tissue indicates the regenerative potential of this biomaterial.
More importantly, Hahn confirmed the stability of this graft in an 8-year study, in
which this biomaterial was inserted into a fresh alveolus and the bone trabecular, as
well as the grafted bone wall were maintained.
83
This regenerative potential portrayed by ABM/Synthetic Peptide can be
explained through stimulation of fibroblasts from the periodontal ligament to
proliferate faster inside a defect that has been recently filled with graft particles
27
,
initiating a regenerative process. The development of this process can be related to
the 15 amino acid chain – P15 – present in the bovine bone matrix, which has been
shown to facilitate the physiological regenerative process as similarly as collagen
does.
31
Therefore, ABM/Synthetic Peptide can be characterized as a type of bone
graft with osteoinducing properties.
Besides bone formation, newly formed cementum was also observed in the test
and control groups and similar histological aspects were noticed for both tissues in
both groups (qualitatively). Listgarten
53
and Nalbandian & Frank
54
demonstrated that
the cementum that is formed over the surgically exposed root surfaces is relatively
thin, containing cells and being predominantly made of intrinsic collagen fibers which
are parallel to the root surface; characteristics that corroborate with Roriz et al.
36
. In
this last cited study, the authors analyzed class III furcation defect regeneration and
found characteristics that are much alike to the ones encountered in this present
study.
Although the present study did not demonstrate a quantity of mineralized tissue
neoformation similar to other studies
26,38,51
much likely due to the difficulties met
during this particular study, the quality of the newly formed tissues does not seem to
have been jeopardized.
Previous studies have demonstrated interestingly satisfactory clinical and
histological results using particulate ABM/Synthetic Peptide in periodontal defects.
In this present study, the regenerative potential of this biomaterial seems to have
been demonstrated after using it in the defect that is least conducive to good results
84
in terms of periodontal regeneration, and achieving bone formation around the
particles that were found embedded in connective tissue of the test group. New
cementum and periodontal ligament formation was also found satisfactorily in the
area of newly formed bone.
However, to reach absolute confirmation of the full potential of this biomaterial,
new testing and studies are made necessary under other clinical conditions, so that
total and complete defect regeneration can be reached.
85
CONCLUSIONS
Based on the results and within the limitations of this study, it may be
concluded that although some parameters yielded quite similar results, there was
statistically significant difference between the test and negative control groups,
based on NBA parameter.
Furthermore, the regenerative potential of anorganic bone matrix/P15 was
showed when it remained inside the defects and could be observed that a new bone
formation not only circumscribed the particles but formed above the level of the
particles.
86
ILUSTRATION LEGENDS
Figure 1 A-H.: A - Initial aspect of the mucosa; B - Mucoperiosteal flap; C – Defect height measurement;
D – Visual aspects of the defects in surgery number 2; E – Insertion of bone graft (ABM/Synthetic
Peptide); F – Flap repositioning and suture; G – Visual aspect of the mucosa after membrane removal;
H – Post-operatory view on the day of sacrifice .
Figure 2 A-F: A – Control Group (Mallory’s trichromic™, 2.5x magnification); B – Test Group
(hematoxillin-eosin, 2.5x magnification). C – Control Group: cellular cementum formation (CC),
periodontal ligament with oblique fibers (PL), sharpey Fibers (SF) and alveolar bone (AB). D – Test
Group: cellular cementum formation (CC), periodontal ligament with oblique fibers (PL), osteoblasts’
paving (OB), osteiods (OT) and alveolar bone (AB) (Mallory’s trichromic™, 40x magnification). E –
Control Group: the arrows show osteiods (OT), immature bone (WB), osteoblasts’ paving (OB)
(Mallory’s trichromic™, 40x magnification). F – Test Group: immature bone (WB) (Mallory’s
trichromic™, 20x magnification).
Figure 3 A-F: Histological sections showing aspects of the newly formed tissues in the test group. A –
The arrows show cementocytes inside the cementum (CC) and sharpey fibers in periodontal ligament
(Mallory’s trichromic™, 40x magnification). B – Aspect of the immaturely formed bone (Mallory’s
trichromic™, 20x magnification). C – The arrows show sharpey fibers (SF) and immature bone (WB)
(Mallory’s trichromic™, 40x magnification). D – ABM/P15 particles inside the defect (G) (Mallory’s
trichromic™, 10x magnification). E – ABM/P15 particle (G), with Woven bone (WB) around it and
attached to the periodontal ligament (Mallory’s trichromic™, 40x magnification). F – ABM/P15 particle
(G), bone formation (WB) e osteoblasts’ paving (OB) (Mallory’s trichromic™, 20x magnification).
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