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1
Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Avaliação da resistência a Xylella fastidiosa Wells et al. e Xanthomonas
axonopodis pv. citri Vauterin et al. em plantas transgênicas de Citrus sinensis
L. Osbeck expressando os genes atacina A ou Xa21
Suane Coutinho Cardoso
Tese apresentada para obtenção do título de Doutor em
Agronomia. Área de concentração: Fitotecnia
Piracicaba
2008
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2
Suane Coutinho Cardoso
Engenheiro Agrônomo
Avaliação da resistência a Xylella fastidiosa Wells et al. e Xanthomonas axonopodis pv. citri
Vauterin et al. em plantas transgênicas de Citrus sinensis L. Osbeck expressando os genes
atacina A ou Xa21
Orientador:
Prof. Dr. FRANCISCO DE ASSIS ALVES MOURÃO FILHO
Tese apresentada para obtenção do título de Doutor em
Agronomia. Área de concentração: Fitotecnia
Piracicaba
2008
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Dados
Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Cardoso, Suane Coutinho
Avaliação da resistência a Xylella fastidiosa Wells et al. e Xanthomonas
axonopodis pv. citri Vauterin et al. em plantas transgênicas de Citrus sinensis L.
Osbeck expressando os genes atacina A ou Xa21 / Suane Coutinho Cardoso. - -
Piracicaba, 2008.
99 p. : il.
Tese (Doutorado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2008.
Bibliografia.
1. Cancro – Doença de planta 2. Clorose variegada dos citros 3. Laranja 4.
Plantas transgênicas 5. Variação genética em plantas 6. Xanthomonas I. Título
CDD 634.31
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
3
Dedico
A meus queridos pais, Francisca e Agostinho (in memorian) e meus irmãos que sempre torceram
pela minha felicidade.
“..... A minha alma engrandece ao Senhor,
E o meu espírito se alegra em Deus, meu Salvador” (Lucas 1, 46-47).
“Deus é o que me cinge de força e aperfeiçoa o meu caminho” (Salmo 18, 32).
Ofereço
A meu marido, Alexsandro, por ser uma benção em minha vida.
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por me conceder a vida e por estar sempre me guiando a caminhos
maravilhosos.
Ao meu marido Alexsandro pelo companheirismo, paciência, ensinamentos, amor e apoio
incondicional.
A minha família maravilhosa pelo apoio, incentivo e por, mesmo de longe, transmitir toda
energia positiva necessária para me fortalecer em qualquer situação.
Ao professor Dr. Francisco de Assis Alves Mourão Filho pela orientação, confiança,
atenção constante e ensinamentos.
À professora Dra. Beatriz Madalena Januzzi Mendes pela co-orientação, atenção constante
e pelas preciosas sugestões.
Ao professor Dr. João Roberto Spotti Lopes pela colaboração, valiosas sugestões e pela
infra-estrutura nas avaliações de resistência a Xylella fastidiosa.
Ao professor Dr. Armando Bergamin Filho pela infra-estrutura e apoio nas avaliações de
resistência a Xanthomonas axonopodis pv. citri.
Ao professor Dr. Antonio Vargas Figueira e Dra. Jeanne Molfeta Blanco, pela colaboração
nas análises de PCR quantitativo.
Ao Dr. Rock Seille Carlos Christiano pela colaboração nos experimentos com cancro
cítrico, ensinamentos, paciência e amizade.
À técnica do Laboratório Biotecnologia Vegetal do CENA, Renata Beatriz Cruz, a Dra.
Janaynna M. Barbosa-Mendes e as estagiárias Joyce Banin e Simone Kerbauy pela contribuição
fundamental nas análises de Southern blot.
Ao mestrando Amancio José de Souza pela valiosa colaboração na realização das análises
moleculares (Southern blot e northern blot), pela paciência, predisposição em ajudar e amizade.
Ao João Geraldo Brancalion, funcionário do Laboratório de Instrumentação e Informática
(CENA/USP), pelos serviços de computação gráfica.
Ao professor Carlos Tadeu dos Santos Dias pelo auxílio nas análises estatísticas.
A Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Departamento de Produção Vegetal e
Programa de Pós-Graduação em Fitotecnia, pela oportunidade de realização do curso de
doutorado.
5
A FAPESP pela concessão da bolsa de estudo e recursos financeiros para o
desenvolvimento do trabalho.
Aos amigos do Laboratório de Biotecnologia de Plantas Hortícolas da Esalq: Alexandra
Pavan, Amancio Souza, Dayse Carvalho, Eduardo Girardi, Evandro Schinor, Fernando Azevedo,
Juliana Bonin, Leandro Branco, Lívia Castro, Luis Gustavo de Paoli, Pamela Fávero, Rosely
Silva e Waner Junior, pelo apoio, aprendizado, colaboração, momentos de descontração e por
proporcionarem um doce convívio durante o curso.
Aos amigos do Laboratório Biotecnologia Vegetal do CENA: Alessandra Monteiro-Hara,
Alice, Ana Paula Pinto, Andréa Koehler, Eveline Tavano, Fabiana Muniz, Jannayna Barbosa-
Mendes, Liliane Stipp, Luciana Castelotti, Renata Cruz e Vânia Nakano, pelo apoio, momentos
de descontração e agradável convívio.
Aos amigos do Laboratório de Insetos Vetores da Esalq: Marcelo, Rodrigo, Daniele,
Patrick, Rudinei, Cristiane, Flávio, Lucas e Alexandre, pela agradável convivência e em especial
a Matê, Fernanda, Joice e Érica, pelo apoio nas análises com Xylella fastidiosa.
Aos funcionários e alunos do Setor de Fitopatologia: Silvia, Sr. Pedro, Rock, Silvio, Davi,
Ivan, Isolda e Fabrício, pelo convívio e apoio.
À estagiária Pamela Fávero pelo valioso auxílio na realização desse trabalho.
Aos amigos baianos: Amancio Souza, Bruno Almeida, Edmilson Silva, Elaine Pereira,
Jovan, Jurema Queiroz, Laércio Carvalho, Marcelo Miranda, Onildo de Jesus, Rosely Silva,
Tales Miller e Taís Abreu, pelas reuniões maravilhosas e amizade.
Às amigas queridas, Elaine Pereira, Eloise Viana e Rosely Silva, pelo doce convívio,
momentos de descontração, apoio e amizade.
À querida amiga Emile, que mesmo de longe, contribuiu muito com sua amizade, apoio e
carinho.
Aos amigos de outros programas de Pós-graduação: Eulália Sobreira, Jaedson Mota,
Melissa Oda, Monita Abreu e Roberto Tarazi, pelo agradável convívio e amizade.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Fitotecnia: Angelo Jacomino, João
Alexio e Pedro Christofoletti, por contribuírem para minha formação e aprendizado.
Aos funcionários do Depto. de Produção Vegetal, Setor do Campo: Aparecido Serrano,
David Ulrich e Eder Cintra, pelo apoio e agradável convívio e em especial ao Sr. José Volpato,
pela grandiosa ajuda na condução dos experimentos.
6
Às secretárias do Depto. de Produção Vegetal, Luciane, Célia e Bete, por todo apoio,
convívio e atenção.
Aos funcionários D. Helena, Ilze, Edleuza e Chico, pelo apoio.
Aos colegas do Programa de Pós-graduação em Fitotecnia: Luzia, Hector, Eliane, Fernanda,
Jovan, Vitória e Erik, pelo convívio.
À Eliana Maria Garcia, bibliotecária chefe da Divisão de Biblioteca e Documentação da
ESALQ/USP, pela correção das referências.
Aos professores da UFRB, Ana Cristina Soares, Maria Angélica, Weliton Almeida, Clóvis
Peixoto e Carlos Alfredo Carvalho, por todo apoio e incentivo.
E a todos que direta ou indiretamente contribuíram para realização desse trabalho.
7
SUMÁRIO
RESUMO ........................................................................................................................................9
ABSTRACT..................................................................................................................................10
LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................................11
LISTA DE TABELAS ..................................................................................................................16
LISTA DE ABREVIATURAS......................................................................................................17
1 INTRODUÇÃO..........................................................................................................................18
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...................................................................................................21
2.1 Aspectos gerais da citricultura.................................................................................................21
2.2 Clorose variegada dos citros....................................................................................................23
2.3 Cancro cítrico ..........................................................................................................................26
2.4 Transformação genética em citros para resistência a doenças ................................................28
2.5 Peptídeo antibacteriano atacina e gene maior de resistência Xa21 .........................................31
3 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................................35
3.1 Material Vegetal......................................................................................................................35
3.2 Análises moleculares das plantas de laranja doce transformadas com os genes atacina A
(attA) e Xa21 para confirmação da integração e transcrição dos genes........................................35
3.2.1 Análise de “Southern blot”...................................................................................................35
3.2.2 Análise de “northern blot”....................................................................................................36
3.3 Propagação das plantas transgênicas.......................................................................................36
3.4 Avaliação da resistência à Xylella fastidiosa e Xanthomonas axonopodis em plantas de
laranja doce transformadas com o gene atacina A (attA).............................................................37
3.4.1 Inoculação de Xylella fastidiosa...........................................................................................37
3.4.2 Isolamento e quantificação de X. fastidiosa .........................................................................39
3.4.3 Análises moleculares............................................................................................................40
3.4.3.1 Reação de polimerase em cadeia (PCR) para detecção de X. fastidiosa...........................40
8
3.4.3.2 Quantificação de X. fastidiosa em plantas de laranja doce transformadas com o gene
attA por PCR quantitativo (qPCR)................................................................................................41
3.4.4 Avaliação dos sintomas foliares de clorose variegada dos citros (CVC).............................44
3.4.5 Inoculação de Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) em plantas de laranja doce
transformadas com o gene attA.....................................................................................................44
3.4.6 Quantificação de cancro cítrico............................................................................................46
3.5 Avaliação da resistência à Xanthomonas axonopodis (Xac) em plantas de laranja doce
transformadas com o gene Xa21....................................................................................................46
3.6 Avaliação do desenvolvimento da X. fastidiosa em plantas laranja doce não transgênicas
juvenis e adultas ............................................................................................................................47
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...............................................................................................49
4.1 Análises moleculares das plantas de laranja doce transformadas com os genes atacina A
(attA) e Xa21 para confirmação da integração e transcrição dos genes........................................49
4.1.1 Análise de “Southern blot”...................................................................................................49
4.1.2 Análise de “northern blot”....................................................................................................51
4.2 Avaliação da resistência à Xylella fastidiosa e à Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac)
em plantas de laranja doce transformadas com o gene attA..........................................................53
4.2.1 Avaliação da resistência à Xylella fastidiosa........................................................................53
4.2.1.1 Quantificação de X. fastidiosa em plantas de laranja doce transformadas com o gene
attA por PCR quantitativo (qPCR)................................................................................................62
4.2.2 Avaliação do desenvolvimento da Xylella fastidiosa em plantas laranja doce não
transgênicas juvenis e adultas........................................................................................................69
4.2.3 Avaliação da resistência à Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) em plantas de
laranja doce transformadas com o gene attA.................................................................................75
4.3 Avaliação da resistência à Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) em plantas de laranja
doce transformadas com o gene Xa21...........................................................................................80
5 CONCLUSÕES..........................................................................................................................85
REFERÊNCIAS............................................................................................................................86
ANEXO.........................................................................................................................................98
9
RESUMO
Avaliação da resistência a Xylella fastidiosa Wells et al. e Xanthomonas axonopodis pv. citri
Vauterin et al. em plantas transgênicas de Citrus sinensis L. Osbeck expressando os genes
atacina A ou Xa21
A citricultura brasileira vem sendo constantemente ameaçada por doenças que causam
sérios prejuízos à produção e a qualidade dos frutos, a exemplo da clorose variegada dos citros e
do cancro cítrico. A transformação genética de plantas tem sido considerada uma importante
ferramenta para os programas de melhoramento de citros, principalmente com relação à
resistência a doenças. Este trabalho teve como objetivo avaliar a resistência a Xylella fastidiosa e
Xanthomonas axonopodis pv. citri em plantas de Citrus sinensis
transformadas com os genes
atacina A (attA) ou Xa21. Plantas transgênicas de laranja doce, cvs. ‘Hamlin’, ‘Natal’, ‘Pêra’ e
‘Valência’, contendo o gene attA ou Xa21 foram propagadas por enxertia em limão ‘Cravo’ para
avaliação de resistência aos patógenos. A resistência a X. fastidiosa foi avaliada com a inoculação
mecânica com alfinete da suspensão de bactéria nas plantas transgênicas contento o gene attA. As
plantas foram avaliadas em quatro experimentos distintos, sendo oito plantas de laranja ‘Hamlin’
(H), sete de laranja ‘Natal’ (N), cinco de laranja ‘Pêra’ (P) e nove de laranja ‘Valência’ (V). O
delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 10 repetições e cada experimento
foi repetido duas vezes. Aos quatro e oito meses da inoculação foram determinadas as populações
bacterianas de todas as plantas por isolamento em meio de cultura e sete plantas (Hat8, Nat1,
Nat2, Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) foram selecionadas pelo isolamento para serem analisadas por
PCR quantitativo (qPCR), visando quantificar a população bacteriana em relação às plantas
testemunhas. A resistência a X. axonopodis pv. citri foi avaliada nas plantas transgênicas
contendo os genes attA ou Xa21. As mudas, apresentando folhas novas e sem ferimentos, foram
inoculadas por aspersão, para penetração via estômatos, com suspensão bacteriana e encubadas
em câmara de crescimento. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 7 a 10
repetições e cada experimento foi repetido três vezes. A severidade da doença foi determinada 30
dias após inoculação, avaliando-se duas folhas por planta com lesões de cancro cítrico, utilizando
um software de quantificação de doença (QUANT v.1.0). Dentre as plantas transgênicas
contendo o gene attA, quatro (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) apresentaram menores populações
bacterianas de X. fastidiosa e 16 apresentaram redução na severidade de cancro cítrico em relação
à testemunha. Entre as plantas transgênicas contendo o gene Xa21, 11 apresentaram redução na
severidade de cancro cítrico em comparação a testemunha.
Palavras-chave: Clorose variegada dos citros; Cancro cítrico; Transformação genética
10
ABSTRACT
Evaluation of Xylella fastidiosa Wells et al. and Xanthomonas axonopodis pv. citri Vauterin
et al. resistance in transgenic Citrus sinensis L. Osbeck plants expressing the attacin A or
Xa21 genes
The Brazilian citrus industry is constantly threatened by diseases that cause severe
damage to production and fruit quality such as the citrus variegated chlorosis and citrus canker.
Genetic transformation has been considered an important tool in citrus breeding programs
especially regarding disease resistance. This research objective was to evaluate the resistance to
Xylella fastidiosa and Xanthomonas axonopodis pv. citri in Citrus sinensis plants, transformed
with the genes attacin A (attA) or Xa21. Transgenic sweet orange plants from cultivars ‘Hamlin’,
‘Valencia’, ‘Natal’ and ‘Pera’ containing the attA or Xa21 genes were graft propagated on
Rangpur lime for pathogen resistance evaluation. The resistance to X. fastidiosa was evaluated by
mechanic inoculation of the transgenic plants containing the attA gene, using bacterial
suspension and pin perforation of plant tissue. The plants were evaluated in four different
experiments including, eight ‘Hamlin’ sweet orange plants (H), seven ‘Natal’ sweet orange plants
(N), five ‘Pera’ sweet orange plants (P) and nine ‘Valencia’ sweet orange plants (V). The
experimental design was fully randomized with ten replications and each experiment was
repeated twice. After four and eight months from inoculation, the bacterial population of all
plants was determined by isolation in culture medium and seven plants (Hat8, Nat1, Nat2, Pat6,
Pat7, Vat2 e Vat12) were selected to be analyzed by quantitative PCR (qPCR) aiming to estimate
the bacterial population in relation to control plants. The resistance to X. axonopodis pv. citri was
evaluated in transgenic plants containing the attA or Xa21 genes. Seedlings showing new leaves
and free from wounds, were spray-inoculated with bacterial suspension for stomatal penetration,
and incubated in growth chamber. The experimental design was fully randomized with seven to
ten repetitions and each experiment was repeated three times. The symptom severity of citrus
canker was determined 30 days after inoculation, by evaluating two leaves per plant with citrus
canker lesions, using a disease quantification software (Quant v.1.0). Within the transgenic plants
containing the attA gene, four (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) showed smaller bacterial populations of
X. fastidiosa and 16 had reduction in the severity of citrus canker in relation to control plants.
Within the transgenic plants containing the Xa21 gene, 11 presented reduction in symptom
severity of citrus canker related to control plants.
Keywords: Citrus variegated chlorosis; Citrus canker; Genetic transformation
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 -
Inoculação da bactéria X. fastidiosa. A) Suspensão bacteriana em tampão PBS; B)
Aplicação de 5µl de suspensão bacteriana em um dos pontos marcados no caule da
planta; C) Perfuração da planta com um estilete no ponto de inoculação, para a
absorção da suspensão bacteriana......................................................................................
38
Figura 2 -
Isolamento de X. fastidiosa. A) Corte das nervuras com lâmina; B) Trituração das
nervuras em homogeneizador (Turrax
®
); C) Plaqueamento das suspensões em meio
PWG..................................................................................................................................
40
Figura 3 -
Inoculação de Xac; A) Inoculação por aspersão nas plantas com suspensão de bactérias
na concentração de 10
6
UFC mL
-1
; B) Câmara úmida após a inoculação; C) Plantas em
câmara de crescimento após retirada da câmara úmida.....................................................
45
Figura 4 -
Análise de “Southern blot” das plantas transgênicas de laranja contendo o gene attA.
C+ = controle positivo (fragmento do gene attA amplificado por PCR); C- = Controle
negativo (planta não transgênica); Colunas identificadas com letras e números
correspondem ao DNA, digerido com a enzima HindIII, das plantas de laranja
‘Hamlin’ (A), ‘Natal’ (B), ‘Pêra’ (C) e ‘Valência’(D)......................................................
50
Figura 5 -
Análise de “Southern blot” das plantas transgênicas de laranja contendo o gene Xa21.
C+ = controle positivo (fragmento do gene Xa21 amplificado por PCR); C- = Controle
negativo (planta não transgênica); Colunas identificadas com letras e números
correspondem ao DNA, digerido com a enzima KpnI, das plantas de laranja ‘Hamlin’
(A), ‘Natal’ (B), ‘Pêra’ (C) e ‘Valência’(D)......................................................................
51
Figura 6 -
Análise de “northern blot” das plantas transgênicas de laranja contendo o gene attA. C-
= controle negativo (planta não transgênica); colunas identificadas com letras e
números correspondem ao RNA das plantas de laranja ‘Hamlin’ (A), ‘Natal’ (B),
‘Pêra’ (C) e ‘Valência’ (D)................................................................................................
52
Figura 7 -
Análise de “northern blot” das plantas transgênicas de laranja contendo o gene Xa21.
C- = controle negativo (planta não transgênica); colunas identificadas com letras e
números correspondem ao RNA das plantas de laranja ‘Hamlin’ (A), ‘Natal’ (B),
‘Pêra’ (C) e ‘Valência’ (D)................................................................................................
53
Figura 8 -
População bacteriana de X. fastidiosa (Log UFC g tecido
-1
) em plantas de laranja
‘Hamlin’ transformadas com gene attA, aos 4 e 8 meses após inoculação. Médias de
dois experimentos independentes. Barras de erro representam o erro padrão da média.
Médias seguidas de mesma letra em cada época de avaliação não diferem entre si pelo
teste de Tukey (P<0,05).....................................................................................................
56
12
Figura 9 -
População bacteriana de X. fastidiosa (Log UFC g tecido
-1
) em plantas de laranja
‘Natal’ transformadas com gene attA, aos 4 e 8 meses após inoculação. Médias de dois
experimentos independentes. Barras de erro representam o erro padrão da média.
Médias seguidas de mesma letra em cada época de avaliação não diferem entre si pelo
teste de Tukey (P<0,05).....................................................................................................
56
Figura 10 -
População bacteriana de X. fastidiosa (Log UFC g tecido
-1
) em plantas de laranja
‘Pêra’ transformadas com gene attA, aos 4 e 8 meses após inoculação. Médias de dois
experimentos independentes. Barras de erro representam o erro padrão da média.
Médias seguidas de mesma letra em cada época de avaliação não diferem entre si pelo
teste de Tukey (P<0,05).....................................................................................................
57
Figura 11 -
População bacteriana de X. fastidiosa (Log UFC g tecido
-1
) em plantas de laranja
‘Valência’ transformadas com gene attA, aos 4 e 8 meses após inoculação. Médias de
dois experimentos independentes. Barras de erro representam o erro padrão da média.
Médias seguidas de mesma letra em cada época de avaliação não diferem entre si pelo
teste de Tukey (P<0,05).....................................................................................................
57
Figura 12 -
A) Experimentos com plantas de laranja ‘Pêra’ transformadas com gene attA, em casa
de vegetação com 9 meses após inoculação com X. fastidiosa; B) Sintomas de CVC na
face superior das folhas de planta transgênica; C) Sintomas de CVC na face inferior
das folhas de planta transgênica........................................................................................
59
Figura 13 -
A) Experimentos com plantas de laranja ‘Valência’ transformadas com gene attA, em
casa de vegetação com 13 meses após inoculação com X. fastidiosa; B) Sintomas de
CVC em folhas de laranja ‘Valência’ transformada..........................................................
59
Figura 14 -
Curva padrão de X. fastidiosa por PCR quantitativo usando Sybr
®
Green Super mix, a
partir de diluição serial do DNA da bactéria (10
-2
a 10
-6
). Coeficiente de linearidade R
2
= 099598. Cada ponto da curva representa uma diluição com a média de três repetições
da reação de amplificação. CT – Ciclo “Threshold”.........................................................
62
Figura 15 -
Curvas de amplificação de X. fastidiosa por PCR quantitativo usando Sybr
®
Green
Super mix, a partir de diluição serial do DNA da bactéria (10
-2
a 10
-6
da esquerda para
direita). Cada triplicata de curvas representa uma diluição...............................................
63
Figura 16 -
Derivada das curvas de amplificação de X. fastidiosa por PCR quantitativo usando
Sybr
®
Green Super mix, a partir de diluição serial do DNA da bactéria (10
-2
a 10
-6
da
esquerda para direita).
O “Threshold” foi de 0,1. Cada triplicata de curvas representa
uma diluição......................................................................................................................
63
Figura 17 -
Curva de “melt” das diluições (10
-2
a 10
-6
) do DNA genômico de X. fastidiosa por
PCR quantitativo usando Sybr
®
Green Super mix............................................................
65
13
Figura 18 -
Curvas de amplificação de X. fastidiosa em algumas amostras de DNA das plantas de
laranja ‘Hamlin’ transformadas com o gene attA e inoculadas com X. fastidiosa,
obtidas por PCR quantitativo usando Sybr
®
Green Super mix. Cada triplicata de curvas
representa uma amostra de DNA.......................................................................................
66
Figura 19 -
Derivada das curvas de amplificação de X. fastidiosa em algumas amostras de DNA
das plantas de laranja ‘Hamlin’ transformadas com o gene attA e inoculadas com X.
fastidiosa, obtidas por PCR quantitativo usando Sybr
®
Green Super mix. O
“Threshold” foi de 0,1. Cada triplicata de curvas representa uma amostra de DNA........
66
Figura 20 -
População bacteriana de X. fastidiosa (Log UFC g tecido
-1
) em plantas de laranja doce
determinadas por isolamento aos 4 e 8 meses após inoculação. Médias de 15 plantas.
PJ – Pêra juvenil; PA – Pêra adulta; VJ – Valência juvenil e VA – Valência adulta.
Barras de erro representam o erro padrão da média. Médias seguidas de mesma letra
em cada época de avaliação não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05). As
variedades foram comparadas separadamente...................................................................
71
Figura 21 -
Plantas de laranja ‘Pêra’ e ‘Valência’ inoculadas com X. fastidiosa. PJ – ‘Pêra’ juvenil;
PA – ‘Pêra’ adulta; VJ – ‘Valência’ juvenil e VA – ‘Valência’ adulta. A) Porcentagem
de plantas com sintomas de CVC aos 4 e 8 meses após inoculação; B) Porcentagem de
folhas com sintomáticas aos oito meses após inoculação. Médias de 15 plantas. Os
dados de porcentagem de folhas sintomáticas foram transformados em √X+1. Barras
de erro representam o erro padrão da média. Letras diferentes no topo das barras,
representam diferença pelo teste de Tukey (P<0,05). As variedades foram comparadas
separadamente...................................................................................................................
72
Figura 22 -
A) Plantas juvenis e adultas de laranja ‘Pêra’ e ‘Valência’ em casa de vegetação com
seis meses após inoculação com X. fastidiosa; B) Sintomas de CVC em folhas de
plantas juvenis de laranja ‘Pêra’........................................................................................
72
Figura 23 -
População bacteriana de X. fastidiosa (Log UFC g tecido
-1
) em plantas de laranja
‘Pêra’ transformadas com gene attA, aos 4 e 8 meses após inoculação. Médias de dois
experimentos independentes. Barras de erro representam o erro padrão da média.
Médias seguidas de mesma letra em cada época de avaliação não diferem entre si pelo
teste de Tukey (P<0,05).....................................................................................................
74
Figura 24 -
População bacteriana de X. fastidiosa (Log UFC g tecido
-1
) em plantas de laranja
‘Valência’ transformadas com gene attA, aos 4 e 8 meses após inoculação. Médias de
dois experimentos independentes. Barras de erro representam o erro padrão da média.
Médias seguidas de mesma letra em cada época de avaliação não diferem entre si pelo
teste de Tukey (P<0,05).....................................................................................................
75
14
Figura 25 -
Severidade de cancro cítrico em plantas de laranja ‘Hamlin’ transformadas com o gene
attA, comparadas com testemunha (planta não transgênica). Cada barra representa a
média de no mínimo 14 folhas de três experimentos independentes. Barras de erro
indicam o erro padrão da média. Letras diferentes no topo das barras representam
diferença significativa pelo teste de Tukey (P<0,05)........................................................
77
Figura 26 -
Severidade de cancro cítrico em plantas de laranja ‘Natal’ transformadas com o gene
attA, comparadas com testemunha (planta não transgênica). Cada barra representa a
média de no mínimo 14 folhas de três experimentos independentes. Barras de erro
indicam o erro padrão da média. Letras diferentes no topo das barras representam
diferença significativa pelo teste de Tukey (P<0,05)........................................................
77
Figura 27 -
Severidade de cancro cítrico em plantas de laranja ‘Pêra’ transformadas com o gene
attA, comparadas com testemunha (planta não transgênica). Cada barra representa a
média de no mínimo 14 folhas de três experimentos independentes. Barras de erro
indicam o erro padrão da média. Letras diferentes no topo das barras representam
diferença significativa pelo teste de Tukey (P<0,05)........................................................
78
Figura 28 -
Severidade de cancro cítrico em plantas de laranja ‘Valência’ transformadas com o
gene attA, comparadas com testemunha (planta não transgênica). Cada barra
representa a média de no mínimo 14 folhas de três experimentos independentes. Barras
de erro indicam o erro padrão da média. Letras diferentes no topo das barras
representam diferença significativa pelo teste de Tukey (P<0,05)...................................
78
Figura 29 -
Sintomas de cancro cítrico em folhas de laranja transgênica, contendo o gene attA, e
não transgênica, aos 30 dias após a inoculação com Xac..................................................
79
Figura 30 -
Severidade de cancro cítrico em plantas de laranja ‘Hamlin’ transformadas com o gene
Xa21, comparadas com testemunha (planta não transgênica). Cada barra representa a
média de no mínimo 14 folhas de três experimentos independentes. Barras de erro
indicam o erro padrão da média. Letras diferentes no topo das barras representam
diferença significativa pelo teste de Tukey (P<0,05)........................................................
81
Figura 31 -
Severidade de cancro cítrico em plantas de laranja ‘Natal’ transformadas com o gene
Xa21, comparadas com testemunha (planta não transgênica). Cada barra representa a
média de no mínimo 14 folhas de três experimentos independentes. Barras de erro
indicam o erro padrão da média. Letras diferentes no topo das barras representam
diferença significativa pelo teste de Tukey (P<0,05)........................................................
82
15
Figura 32 -
Severidade de cancro cítrico em plantas de laranja ‘Pêra’ transformadas com o gene
Xa21, comparadas com testemunha (planta não transgênica). Cada barra representa a
média de no mínimo 14 folhas de três experimentos independentes. Barras de erro
indicam o erro padrão da média. Letras diferentes no topo das barras representam
diferença significativa pelo teste de Tukey (P<0,05)........................................................
82
Figura 33 -
Severidade de cancro cítrico em plantas de laranja ‘Valência’ transformadas com o
gene Xa21, comparadas com testemunha (planta não transgênica). Cada barra
representa a média de no mínimo 14 folhas de três experimentos independentes. Barras
de erro indicam o erro padrão da média. Letras diferentes no topo das barras
representam diferença significativa pelo teste de Tukey (P<0,05)...................................
83
Figura 34 -
Sintomas de cancro cítrico em folhas de laranja transgênica, contendo o gene Xa21, e
não transgênica, aos 30 dias após a inoculação com Xac..................................................
84
16
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 -
Porcentagem de plantas infectadas determinadas pelo isolamento em meio de
cultura e PCR e porcentagem de plantas com sintomas de CVC (aos 12 meses da
inoculação) em plantas de laranja ‘Hamlin’, ‘Natal’, ‘Pêra’ e ‘Valência’,
transformadas com o gene attA, inoculadas com X. fastidiosa. Médias de dois
experimentos independentes, total de 20 plantas por tratamento.............................
54
Tabela 2 -
Legendas das amostras de diluição do DNA genômico de X. fastidiosa. Ciclo
“Threshold” (CT) e unidades formadoras de colônias (UFC mL
-1
).........................
64
Tabela 3 -
População bacteriana de X. fastidiosa estimada por PCR quantitativo e por
isolamento em meio de cultura de plantas de laranja doce transformadas com o
gene attA e inoculadas com o patógeno. Ciclo “Threshold” – CT (piso de
fluorescência)...........................................................................................................
67
Tabela 4 -
Porcentagem de plantas infectadas determinadas pelo isolamento em meio de
cultura e PCR em plantas juvenis e adultas de laranja ‘Pêra’ e ‘Valência’,
inoculadas com X. fastidiosa....................................................................................
70
17
LISTA DE ABREVIATURAS
ap1 – gene apetala1
attA – gene atacina A
bO – gene da bacterio-opsina
cecropin MB39 - gene isolado de Hyalophora cecropia
CTAB – Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide
CTV – Citrus Tristeza Virus
CVC – Clorose variegada dos citros
EDTA – Ethylenediaminetetracetic Acid
gna – gene lectina (Galanthus nivalis aglutinina)
hal2 – gene 3’(2’), 5’-bifosfato nucleotidase
lfy – gene leafy
LPS – Lipopolissacarídeos
MSC – Morte súbita dos citros
PBS – Phosphate Buffered Saline
PCR – Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia da polimerase)
Proteína RP – proteínas relacionadas à patogênese
PWG - Periwinkle wilt gelrite
qPCR - Reação em cadeia da polimerase quantitativa
SDS – Sodium dodecyl Sulfate
TBE – tampão Tris, ácido Bórico,
Tris – 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol
UFC – Unidades formadoras de colônias
Xac - Xanthomonas axonopodis pv. citri
18
1 INTRODUÇÃO
O Brasil mantém a posição de maior produtor mundial de citros, com 20,39 milhões de
toneladas em 2006 (FAO, 2007) e também o maior produtor e exportador de suco de laranja
concentrado congelado. O Estado de São Paulo é responsável por 81% da produção nacional de
citros e a laranja representa 79% dessa produção (FNP CONSULTORIA & COMÉRCIO, 2007).
No entanto, a citricultura paulista vem sendo ameaçada por graves doenças como a clorose
variegada dos citros (CVC), o cancro cítrico, a tristeza dos citros, a morte súbita (MSC), a
gomose e mais recentemente o Huanglonbing (greening).
O surgimento constante desses problemas fitossanitários pode estar relacionado ao fato da
citricultura paulista estar fundamentada em quatro cultivares copa de laranja doce (Citrus sinensis
L. Osbeck) (‘Pêra’, ‘Natal’, ‘Valência’ e ‘Hamlin’) e três cultivares porta enxerto, com
predominância do limão ‘Cravo’(Citrus limonia Osbeck). Além disso, os citros são multiplicados
vegetativamente resultando em plantios clonais potencialmente mais suscetíveis ao ataque de
pragas e doenças.
A clorose variegada dos citros, causada pela bactéria Xylella fastidiosa Wells et al., atinge
todas as variedades comerciais de laranja doce. Restrita ao xilema da planta, a bactéria provoca o
entupimento dos vasos responsáveis por levar água e nutrientes da raiz para a copa da planta.
Essa doença é considerada de grande importância econômica devido afetar, principalmente, o
tamanho e a qualidade dos frutos, tornando-os inadequados tanto para a comercialização "in
natura" como para a indústria de suco concentrado.
O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri Vauterin et al.
(Xac), afeta a maioria das espécies de Citrus e provoca graves sintomas nas folhas, ramos e
frutos. Os frutos afetados são depreciados para o comércio e caem precocemente, reduzindo a
produção da planta. Além disso, induz a restrições na comercialização nacional e internacional de
mudas e frutos “in natura” para regiões livres do patógeno. É uma doença de fácil disseminação e
apresenta alto custo para erradicação.
Essas duas doenças causam grandes perdas econômicas no agronegócio citrícola de São
Paulo. Para minimizar os prejuízos causados por essas doenças, os programas de melhoramento
de citros têm buscado desenvolver variedades resistentes e/ou tolerantes a doenças. Entretanto, o
19
melhoramento convencional de citros é um processo longo e dificultado pela a biologia
reprodutiva desse gênero, como poliembrionia, alta heterozigose, esterilidade do óvulo e pólen e
juvenilidade (GROSSER; GMITTER JUNIOR, 1990). Assim, a obtenção de plantas
geneticamente modificadas tornou-se uma ferramenta biotecnológica muito promissora, pois
permite a introdução de genes específicos no genoma de plantas, encurtando o período para se
obter uma nova variedade (MACHADO et al., 2005).
Os trabalhos de obtenção de plantas transgênicas de citros resistentes a doenças têm se
concentrado no uso da resistência derivada do patógeno (genes da capa proteíca de vírus da
tristeza), na introdução de genes que estimulam o sistema de defesa da planta (bO e hrpN), genes
de origem não vegetal que codificam proteínas antibacterianas (atacina e cecropina), bem como
uso de genes maiores (R) de resistência (Xa21).
O peptídeo atacina A isolado do inseto Trichoplusia ni (KANG; LUNDSTROM;
STEINER, 1996) pertence a uma das maiores classes de peptídeos antibacterianos (LAZZARRO;
CLARK, 2001). As atacinas atuam na parede celular das bactérias Gram-negativas, provocando
alterações na permeabilidade da membrana, devido se ligarem aos lipopolissacarídeos (LPS) da
membrana externa. Essa ligação também causa inibição da síntese de várias proteínas específicas
da membrana externa, limitando a capacidade das bactérias de restaurar a função da membrana
(ERGSTROM et al., 1984; CARLSSON et al., 1991; 1998). A ação antibacteriana das atacinas
foi observada em Erwinia amylovora (NORELLI et al., 1994; REYNORD et al., 1999), em X.
axonopodis pv. passiflorae (MONTEIRO, 2005) e em X. axonopodis pv. citri (BOSCARIOL et
al., 2006).
O gene Xa21, clonado de uma espécie silvestre de arroz (Oryza longistaminata) confere
resistência a mais de 30 isolados da bactéria Xanthomonas oryzae pv. oryzae, o agente causal do
crestamento bacteriano em Oryza sativa (SONG et al., 1995; WANGA et al., 1996). Este gene
codifica para uma proteína quinase (“receptor kinase like-protein”), possui domínio da serina-
treonima quinase, domínio transmembrânico e domínio extracelular com regiões ricas em
leucina. Por apresentar esta estrutura, sugere-se que a ação deste gene ocorra no reconhecimento
da superfície celular do patógeno, com subseqüente ativação de respostas de defesa intracelulares
(SONG et al., 1995). Baseando-se na característica do gene Xa21 apresentar ação contra bactérias
do gênero Xanthomonas, foi levantada por alguns autores (DENG; GMITTER, 2003;
20
BOSCARIOL, 2004; OMAR; SONG; GROSSER, 2007), uma hipótese de que o gene Xa21 pode
auxiliar na obtenção de resistência a bactéria X. axonopodis pv citri, agente causal do cancro
cítrico.
Considerando-se que ainda não existem variedades de laranja doce comerciais resistentes
a clorose variegada dos citros e ao cancro cítrico e que o uso de resistência varietal é o melhor
método de controle de doenças de plantas, esse trabalho tem como objetivo avaliar a resistência a
Xylella fastidiosa e Xanthomonas axonopodis pv. citri em plantas transgênicas de Citrus sinensis,
cultivares ‘Hamlin’, ‘Natal’, ‘Pêra’ e ‘Valência’, expressando os genes atacina A e Xa21.
21
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Aspectos gerais da citricultura
As plantas cítricas do gênero Citrus pertencem à família Rutaceae e subfamília
Aurantioideae e são nativas da região sudeste do continente asiático (SWINGLE; REECE, 1967;
SOOST; CAMERON, 1975). São cultivadas em diferentes regiões do mundo, sendo que a
exploração comercial concentra-se, predominantemente, nas regiões tropicais e subtropicais entre
as latitudes de 20º e 40º dos dois hemisférios, onde os regimes térmicos e hídricos são mais
satisfatórios (SENTELHAS, 2005).
Os citros ocupam o primeiro lugar em volume de produção dentre as fruteiras no mundo,
com aproximadamente 105,4 milhões de toneladas, seguidas pelas culturas da banana, uva e
maçã. O Brasil é o maior produtor mundial de citros, com 20,39 milhões de toneladas em 2006,
seguido da China com 16,3 milhões t e dos Estados Unidos com 11,5 milhões t (FAO, 2007). O
país também é o maior produtor e exportador de suco de laranja do mundo, com uma exportação
de US$ 1,47 bilhão referente a suco de laranja em 2006, o que representa 82% do mercado
mundial, cujo consumo cresce a uma taxa de 2% a 4% ao ano. Cerca de 60% dessa exportação
destina-se a União Européia e 17% aos EUA (NEVES et al., 2007). Embora ocupe uma posição
de destaque no mercado mundial, a produtividade média brasileira de citros, em torno de 2,0
caixas/planta/ano, ainda é baixa, quando comparada com outras regiões produtoras, como a
Flórida, que possui uma média de 6,0 caixas/planta/ano. Essa baixa produtividade, associada ao
fato de grande parte dos plantios não serem irrigados, deve-se, principalmente, a problemas
fitossanitários e às estratégias de manejo do pomar e pós-colheita dos frutos (MACHADO et al.,
2005).
Os citros são produzidos na maioria dos Estados brasileiros, no entanto, o Estado de São
Paulo é responsável por 81% da produção nacional de citros, dominando a produção de laranja,
lima ácida ‘Tahiti’ e tangerinas. Dentre os demais Estados produtores destacam-se Bahia,
Sergipe, Minas Gerais e Paraná (BOTEON; NEVES, 2005; IBGE, 2007). O Estado de São Paulo
possui quatro pólos produtores de citros: a região central (São Carlos - Araraquara), a norte
(Bebedouro - São José do Rio Preto), a sudeste (Araras - Mogi Guaçu) e o novo pólo centro - sul
22
(Bauru - Itapetininga). O foco comercial da cadeia citrícola é a produção e comercialização
industrial da laranja. Atualmente, 70 a 80% da produção paulista destina-se a indústria de suco e
maior parte dessa produção é oriunda dos pólos situados nas regiões norte e central que se
especializaram no cultivo de laranja para fins industriais (BOTEON; NEVES, 2005).
As variedades copa de citros cultivadas em plantios comerciais são, basicamente,
representadas pelas laranjas, tangerinas, limões, limas ácidas e pomelos. As laranjas (C. sinensis)
predominam na maioria dos países citrícolas com, aproximadamente, dois terços dos plantios,
ficando o restante para as demais espécies. No Brasil, e particularmente no Estado de São Paulo,
elas encontram, de maneira geral, boas condições edafoclimáticas para o cultivo comercial.
Dentre as laranjas comerciais destacam-se ‘Pêra’, ‘Natal’, ‘Valência’ e ‘Hamlin’. As três
primeiras variedades perfazem mais de 80% da citricultura paulista (PIO et al., 2005).
Diversos problemas fitossanitários têm surgido ao longo do estabelecimento da
citricultura no país. Doenças causadas por fungos, bactérias, vírus e até de etiologia desconhecida
vêm causando sérios prejuízos à cultura. As principais doenças fúngicas que afetam os citros são:
pinta preta (Guignardia citricarpa Kiely), podridão floral (Colletotrichum acutatum Simmonds),
verrugose (Elsinoe spp.), melanose (Diaporthe citri Wolf), rubelose (Erythricium salmonicolor
Berk. & Br. Burdsall) e a gomose de Phytophthora (Phytophthora spp.), esse último patógeno
não é mais considerado fungo e foi reclassificado como do Reino Straminipila (FUNDECITRUS,
2008).
Dentre as doenças causadas por vírus, destacam-se a tristeza dos citros (Citrus tristeza
virus - CTV) e a leprose dos citros (Citrus leprosis virus) (MÜLLER et al., 2005). A leprose é
reconhecida como a doença viral de maior importância econômica para a citricultura paulista, em
virtude dos altos custos com o controle químico do ácaro vetor, por meio da aplicação de
acaricidas, resultando em gastos anuais na ordem de 75 milhões de dólares (FREITAS-ASTÚA et
al., 2005).
As doenças bacterianas de importância econômica nos citros são a clorose variegada dos
citros (CVC) (Xylella fastidiosa), o cancro cítrico (Xanthomonas axonopodis pv. citri ), e mais
recentemente, o huanglongbing (Candidatus Liberibacter spp.) também conhecido como
greening (LARANJEIRA et al., 2005). As perdas econômicas na citricultura paulista ocasionadas
apenas pela CVC são estimadas em 100 milhões de dólares anuais (LOPES et al., 2004).
23
As doenças de etiologia ainda desconhecida são a morte súbita dos citros (MSC) e o
declínio dos citros. O agente causal da doença MSC ainda não foi confirmado, mas existem
hipóteses de que seja um variante do vírus da tristeza dos citros que sofreu uma alteração no seu
genoma, pois os sintomas da doença e sua distribuição são muito semelhantes aqueles observados
na tristeza (MÜLLER et al., 2005; LARANJEIRA et al., 2005).
A presença das doenças MSC e CVC nas maiores regiões produtoras de citros do Estado
de São Paulo, regiões norte e central, influenciou o deslocamento da citricultura para as regiões
sudoeste e sul do Estado. Essa migração é uma alternativa encontrada para reduzir os prejuízos
provocados por essas doenças, cuja proliferação tornou o controle fitossanitário oneroso e, muitas
vezes, tem levado a danos irreversíveis como a erradicação do pomar (NEVES et al., 2007).
O desenvolvimento de variedades tolerantes ou resistentes a doenças tem sido um dos
principais objetivos dos programas de melhoramento de citros, no entanto, o melhoramento
genético convencional dos citros encontra dificuldades de ordem botânica e genética, tais como
esterilidade de pólen e óvulo, incompatibilidade sexual, poliembrionia, embrionia nucelar, alta
heterozigosidade e longo período de juvenilidade (GROSSER; GMITTER JUNIOR, 1990). Com
isso, a introdução de ferramentas biotecnólogicas como a hibridação somática e a transformação
genética têm contribuído para superação desses problemas, permitindo a obtenção de genótipos
melhorados (ASTUA-MONGE; FREITAS-ASTUA; MACHADO, 2004).
2.2 Clorose variegada dos citros
A clorose variegada dos citros (CVC), também conhecida como “amarelinho dos citros”,
é causada pela bactéria Xylella fastidiosa. Foi constatada pela primeira vez em 1987, em pomares
do Triângulo Mineiro e do norte e nordeste do Estado de São Paulo (ROSSETTI et al., 1990;
ROSSETTI; DE NEGRI, 1990), de onde se disseminou para as demais regiões produtoras
brasileiras. A CVC afeta todas as plantas de laranja doce enxertadas nos principais porta-enxertos
utilizados no país (FEICHTENBERGER; MULLER; GUIRADO, 1997). É responsável por
perdas anuais estimadas em 100 milhões de dólares (LOPES et al., 2004) e em 2006 apresentou
incidência de 43,84% (plantas com sintomas) nos pomares do Estado de São Paulo e sul de Minas
Gerais (FUNDECITRUS, 2008).
24
A bactéria X. fastidiosa é gram-negativa, aeróbica, possui forma de bastonete com 0,9 a
3,5 µm de comprimento por 0,25 a 0,50 µm de diâmetro, apresenta parede celular enrugada, não
móvel (não possui flagelo), com crescimento lento em meio de cultura, mesmo em condições
ótimas de temperatura entre 26 e 28 ºC e pH entre 6,5 e 6,9 (WELLS et al., 1987). É chamada de
fastidiosa pelas suas exigências nutricionais, crescendo apenas em meio de cultura específico
(FERREIRA; SALGADO, 1995). Essa bactéria encontra-se limitada aos vasos do xilema de seus
hospedeiros (MOLLENHAUER; HOPKINS, 1976), onde se distribui de forma irregular (HILL;
PUCELL, 1995b). A obstrução desses vasos por agregados de células bacterianas, levando ao
estresse hídrico, é a hipótese mais aceita para explicar o mecanismo de patogênese da X.
fastidiosa (HOPKINS, 1995).
X. fastidiosa pode ser transmitida por meio de borbulhas contaminadas ou por insetos
vetores das famílias Cicadellidae e Cercopidae, que se alimentam nos vasos do xilema das
plantas (PURCELL, 1994). Até o momento, já foram identificadas 11 espécies de cigarrinhas
transmissoras apenas no Estado de São Paulo (FUNDECITRUS, 2008). Entre as espécies de
cigarrinhas transmissoras Dilobopterus costalimai, Acrogonia sp e Oncometopia facialis são as
mais importantes (GRAVENA et al., 1997; ROBERTO; YAMAMOTO, 1998; LOPES, 1999).
Os sintomas da CVC manifestam-se em ramos, folhas e frutos. Nas folhas maduras são
observados os sintomas mais típicos da doença, que são caracterizados como manchas cloróticas
esparsas, de formato irregular, localizadas principalmente, próximo às bordas foliares. Na face
dorsal, em correspondência às áreas cloróticas na face ventral, surgem pequenas pontuações de
cor marrom-claro, que evoluem tornando-se necróticas, de coloração marrom-escuro e
ligeiramente salientes (ROSSETTI, 1991; LOPES et al., 2004; LARANJEIRA et al., 2005).
Os ramos afetados têm, comumente, entrenós encurtados, resultando em aspecto
“envassourado”. Pode acorrer subdesenvolvimento ou morte de ramos ponteiros e número
excessivo de folhas diminutas, diferindo do padrão das brotações normais. As folhas jovens
podem apresentar redução da expansão, permanecendo afiladas e encurvadas para cima
(acanoadas) e clorose semelhante ao sintoma típico de deficiência de zinco (ROSSETTI; DE
NEGRI, 1990; LARANJEIRA et al., 1997).
Os frutos de plantas afetadas pela doença são pequenos, endurecidos e amadurecem
precocemente (ROSSETTI et al., 1990; HUANG; CHIARADIA, 1998). A perda de peso do fruto
25
pode chegar a 75% (FUNDECITRUS, 2008). Internamente, o fruto tem suas características
organolépticas bastante afetadas, apresentando aumento no teor de sólidos solúveis e acidez
(LARANJEIRA; PALAZZO, 1999). Por serem de baixa qualidade, os frutos doentes não são
aceitos no mercado de frutas frescas, nem nas indústrias de processamento de suco (HUANG;
CHIARADIA, 1998) e o endurecimento dos frutos pode causar danos às máquinas de moagem
das fábricas de suco concentrado (LARANJEIRA, 1997). Ayres (2000) constatou, em
levantamento amostral nas diversas regiões produtoras de São Paulo, que as perdas da produção
chegaram a 80% para a laranja ‘Pêra’, 67% para ‘Natal’ e 76% para a ‘Valência’.
Os pomares cítricos situados nas regiões norte e nordeste do Estado de São Paulo têm a
CVC como principal ameaça, inclusive em estágio mais avançado de severidade (plantas com
sintomas em frutos). Por conseqüência, tais regiões têm produzido frutos menores, fazendo com
que a indústria demande cerca de 10% a mais de laranja para produzir a mesma quantidade de
suco (NEVES et al., 2007).
As laranjas doces (C. sinensis) apresentam comportamentos diferentes em relação à CVC.
Laranjeira e Pompeu Junior (2002) classificaram as variedades Barão, Pêra Lima, Rubi, Cadenera
17 e 51, Berna e Valência como altamente suscetíveis a CVC, pois apresentaram uma
porcentagem estimada de danos variando de 72 a 98%. Souza et al. (2006) utilizando a laranja
‘Pêra’ como padrão de suscetibilidade a CVC, observaram que essa variedade apresenta elevado
nível de severidade da doença. Machado et al. (1997), estudando variedades de laranjas
sobreenxertadas em laranja ‘Pêra’ com sintomas típicos de CVC, observaram que todas as
variedades de laranja apresentaram sintomas, porém houve diferenças na velocidade de
expressão. As laranjas ‘Pêra’ e ‘Barão’ mostraram sintomas mais rapidamente, enquanto a laranja
‘Hamlin’ embora tenha sido positiva nos testes sorológicos, apresentaram expressão de sintomas
mais tardiamente.
As medidas de controle recomendadas para esta doença são na sua maioria preventivas,
sendo o uso da resistência varietal o método mais eficiente de controle (COLETA-FILHO;
MACHADO, 2002). As principais medidas preventivas adotadas no manejo da CVC são a poda
e/ou erradicação de plantas sintomáticas, controle das cigarrinhas transmissoras e a utilização de
mudas sadias, adquiridas em viveiros certificados (FUNDECITRUS, 2008).
26
2.3 Cancro cítrico
O cancro cítrico, também conhecido como cancro cítrico asiático ou cancrose A, é
causado pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri. Foi constatado pela primeira vez no
Brasil em 1957, na região de Presidente Prudente, SP, (ROSSETTI, 1977; ROSSETTI,
FEICHTENBERGER; SILVEIRA, 1981), de onde se disseminou para outras regiões produtoras
do Estado de São Paulo e para outros Estados como Mato Grosso do Sul, Paraná, Santa Catarina,
Rio Grande do Sul, Mato Grosso, Minas Gerais e Roraima (AMARAL, 1957;
FEICHTENBERGER; MULLER; GUIRADO, 1997; MACIEL; DUARTE; AYUB, 1998;
NASCIMENTO et al., 2003). Essa doença afeta a maioria das espécies de Citrus e outros gêneros
da família Rutaceae (RODRIGUES NETO, 2004). Por se tratar de uma doença quarentenária, os
países com ocorrência de cancro cítrico estão sujeitos à imposição de barreiras fitossanitárias, que
visam impedir a entrada do patógeno em áreas livres da doença, dificultando a comercialização
da produção (STALL; CIVEROLO, 1991; GOTTWALD et al., 2001).
A bactéria X. axonopodis pv. citri apresenta reação gram-negativa, respiração aeróbica,
formato baciliforme e motilidade por um flagelo polar (monótriquia) (FERREIRA; SALGADO,
1995). Normalmente apresenta exsudação de polissacarídeos extracelulares, que ajudam na sua
dispersão e sobrevivência (GOTO; HYODO, 1985). Essa bactéria cresce na maioria dos meios de
culturas usados em microbiologia e é facilmente isolada de tecido cítrico infectado. Colônias da
bactéria são visíveis em meio de cultura com agar após dois a três dias de incubação a 28
o
C
(ROSSETTI; FEICHTENBERGER; SILVEIRA, 1981).
O cancro cítrico é considerado altamente contagioso devido à bactéria X. axonopodis pv.
citri apresentar rápida multiplicação e fácil disseminação (FUNDECITRUS, 2008). A principal
fonte de inóculo da bactéria são as plantas de citros infectadas, em folhas, ramos e frutos com
sintomas, nos quais a bactéria pode sobreviver durante vários anos (GRAHAM et al., 2000). A
disseminação do patógeno pode ser feita pelo vento acompanhado de chuvas, pelo trânsito
indiscriminado de pessoas nos pomares, materiais vegetais infectados como frutos, material
propagativo e mudas, assim como por meio de materiais de colheita como ferramentas, caixas e
veículos (LEITE JUNIOR, 1990; GRAHAN et al., 2004). A bactéria penetra no hospedeiro por
aberturas naturais, principalmente, por estômatos, e ferimentos causados por espinhos, pelo
27
homem ou por insetos. A face inferior das folhas é mais suscetível à penetração da bactéria,
devido a maior densidade de estômatos (GRAHAM et al., 1992). As folhas jovens com 85% de
expansão são mais suscetíveis à infecção (GOTO, 1990; GOTTWALD; GRAHAN, 1992),
devido à menor resistência do mesófilo (STAL et al., 1982).
Os primeiros sintomas aparecem nas folhas, posteriormente nos frutos e ramos. São lesões
salientes de coloração amarela, que logo se tornam amarronzadas. É a única doença conhecida
com lesões salientes que aparecem dos dois lados da folha e não induzem a deformações. Em
estágio mais avançado, as lesões nas folhas ficam corticosas, aspecto eruptivo, com centro
marrom e um anel amarelado em volta (FEICHTENBERGER; MULLER; GUIRADO, 1997).
Em altas severidades pode ocorrer desfolha, queda de frutos e seca de ramos (GOTTWALD;
McGUIRE; GARRAM, 1988; GOTTWALD; TIMMER; McGUIRE, 1989).
Nos frutos, a doença se manifesta pelo surgimento de pequenas manchas amarelas, com
um ponto marrom no centro, que aos poucos vão crescendo e podem ocupar grande parte da
casca do fruto. As manchas são salientes, mais superficiais, parecidas com verrugas, de cor
marrom no centro. Em estágio avançado, as lesões provocam o rompimento da casca
(ROSSETTI, 2001; LARANJEIRA et al., 2005).
O gênero Citrus apresenta uma ampla variação nos níveis de resistência a X. axonopodis
pv. citri. Em relação às laranjas doces, são classificadas como resistentes as variedades Folha
murcha e Moro; como moderadamente resistentes as variedades Lima Verde, Navelina, Valência
e Pêra premunizada; como moderadamente suscetíveis a variedade Natal e como suscetíveis as
variedades Bahia, Baianinha, Hamlin, Seleta Vermelha e Piralima (LEITE JUNIOR, 1990).
O controle do cancro cítrico baseia-se principalmente em medidas de exclusão e
erradicação das plantas doentes e das demais plantas suspeitas de contaminação
(FEICHTENBERGER; MULLER; GUIRADO, 1997; BARBOSA et al., 2001). As principais
medidas preventivas recomendadas para o controle do cancro cítrico são a desinfestação de todos
os veículos que entram na propriedade por arco-rodolúvio com amônia quaternária, queima dos
restos de colheita; desinfestação de equipamentos de trabalho, construção de reservatórios de
frutos no limite da propriedade para evitar a entrada de caminhões durante a colheita, uso de
mudas sadias (de viveiros certificados), implantação de quebra-ventos arbóreos, controle do
minador dos citros e inspeção rotineira do pomar (KIMATI; BERGAMIN FILHO, 1995;
28
RODRIGUES NETO et al., 2004). Durante a inspeção no pomar, se no talhão houver mais de
0,5% de árvores contaminadas, todo ele deve ser erradicado. Se o número de plantas
contaminadas for menor ou igual a 0,5%, são eliminadas a(s) planta(s) foco e as que estão num
raio de 30 metros (FUNDECITRUS, 2008).
A campanha de erradicação do cancro cítrico do Estado de São Paulo, apesar de não
conseguir eliminar a bactéria dos seus pomares, não permitiu a introdução do patógeno na área
nobre da citricultura paulista durante várias décadas (RODRIGUES NETO et al., 2004). A partir
de 1996, com o surgimento no Brasil da lagarta minadora dos citros (Phyllocnistis citrella) que
causa ferimentos na planta, facilitando o acesso da bactéria, houve um aumento considerável na
severidade de cancro cítrico no Estado de São Paulo (BERGAMIN FILHO et al., 2001). Com
isso, a campanha de erradicação se intensificou e tem conseguido manter a doença em baixo nível
de incidência nas principais áreas citrícolas do Estado de São Paulo (BARBOSA et al., 2001).
Em 2006 o levantamento amostral, revelou que o índice de contaminação por cancro cítrico foi
de 0,19% nos talhões de citros do Estado de São Paulo e sul do Triângulo Mineiro (MASSARI;
BELASQUE JÚNIOR, 2006), esse índice reduziu para 0,10% em 2007. Essa redução reflete a
eficiência da campanha de erradicação da doença no Estado (FUNDECITRUS, 2008). Entretanto,
o emprego de cultivares resistentes é fundamental no manejo integrado da doença, pois,
corresponde ao método mais econômico e eficiente de controle (LEITE JUNIOR, 1990;
BESPALHOK FILHO et al., 2001).
2.4 Transformação genética em citros para resistência a doenças
A transformação genética vem sendo, cada vez mais, incorporada aos programas de
melhoramento de plantas. Essa técnica possibilita transferência de genes específicos e com
importância agronômica para uma determinada variedade, reduzindo o tempo para obtenção de
uma nova variedade em relação ao melhoramento convencional (PEÑA et al., 1995a). Esses
genes podem ser isolados de outras plantas ou mesmo de microrganismos e animais (PERIANI et
al., 1986). Além de possibilitar a introdução de material genético em situações em que os
organismos são incompatíveis, a transformação genética evita a transferência de genes
indesejáveis ou deletérios, como ocorre no melhoramento convencional (MACHADO et al.,
2005).
29
Em relação aos citros, a técnica de transformação genética apresenta-se como uma
importante ferramenta de auxílio ao seu melhoramento convencional, que possui uma série de
limitações atribuídas pela sua biologia (ALMEIDA et al., 2003), tais como a poliembrionia
nucelar, elevada heterozigose, esterilidade gametofítica e longo período de juvenilidade
(GROSSER; GMITTER, 1990).
O primeiro relato de transformação genética em citros vem do final da década de 80 por
Kobayashi e Uchimiya (1989), quando utilizaram polietilenoglicol (PEG) para a introdução direta
de DNA em protoplastos de laranja ‘Trovita’. Atualmente, a maioria dos trabalhos utiliza o
sistema de transformação via Agrobacterium tumefaciens para obtenção de plantas cítricas
transformadas. As estirpes de A. tumefaciens mais utilizadas são EHA105 e EHA101, por
apresentarem melhores resultados (PEÑA et al., 1995b; MENDES et al., 2002). Dentre os genes
de interesse agronômico introduzidos em citros com sucesso até o momento, tem-se o gene HAL2
que confere tolerância à salinidade, introduzido em citrange ‘Carrizo’ (CERVERA et al., 2000),
os genes LFY e AP1, que controlam o florescimento, também introduzidos em citrange ‘Carrizo’
(PEÑA et al., 2001), o gene gna, que confere resistência a afídeos vetores do vírus da tristeza,
introduzidos em pomelo (YANG et al, 2000), o gene CS-ACS1, que confere resistência a baixas
temperaturas, introduzido em diversas espécies cítricas (WONG et al., 2001) e genes visando
resistência a doenças.
A busca por plantas cítricas resistentes a doenças tem sido um dos maiores objetivos dos
programas de melhoramento de citros, devido os grandes prejuízos econômicos provocados pelas
doenças. Além disso, o uso de plantas resistentes constitui-se no método de controle mais
eficiente e econômico. Os trabalhos de obtenção de plantas transgênicas de citros resistentes a
doenças têm se concentrado no uso de resistência derivada do patógeno (genes da capa proteíca
de vírus da tristeza), na introdução de genes que estimulam o sistema de defesa da planta (bO e
hrpN), genes relacionados à patogênese (proteínas RP), genes de origem não vegetal que
codificam proteínas antibacterianas (atacina e cecropina), bem como uso de genes maiores (R) de
resistência (Xa21).
Em relação aos genes que estimulam o sistema de defesa das plantas, o gene bO foi
introduzido em limão Cravo e resultou na redução dos sintomas causados por Phytophthora
(AZEVEDO et al., 2005). Recentemente, Barbosa-Mendes (2007) introduziu o gene hrpN em
30
plantas de laranja doce e verificou em testes preliminares, que plantas de laranja ‘Hamlin’
demonstraram redução dos sintomas de cancro cítrico.
Trabalhos baseados no uso da resistência derivada do patógeno, com a introdução do gene
da capa proteíca do vírus da tristeza dos citros (CTV), permitiram a obtenção de plantas
transgênicas de laranja azeda (Citrus aurantium L.), lima mexicana (Citrus aurantifolia
(Christm.) Swing) (DOMÍNGUEZ et al., 2000; GUTIÉRREZ-E; LUTH; MOORE, 1997),
pomelo (FEBRES et al., 2003) e laranja doce e limão ‘Cravo’ (SCHINOR, 2006).
O gene PR-5 de uma proteína relacionada com patogênese (proteína RP), foi introduzido
em laranja ‘Pineapple’ e resultou em redução significativa no desenvolvimento de lesões
causadas por Phytophthora citrophthora (FAGOAGA et al., 2001). O gene p12, que codifica uma
proteína RP, encontrada em plantas com sintomas de declínio e ausente em plantas sadias, foi
introduzido em plantas de citrange ‘Carrizo’ visando resistência ao declínio, porém as plantas
ainda não foram avaliadas (KAYIM et al., 2004).
A respeito dos peptídeos antibacterianos, as cecropinas isoladas da hemolinfa de insetos
(Hyalophora cecropia) exibem atividade lítica e antibacteriana contra muitas bactérias
(BOMAN; HULTMARK, 1987). Esse peptídeo foi introduzido em plantas de laranja doce
visando à resistência as bactérias X. fastidiosa e X. axonopodis pv. citri. Em avaliações
preliminares detectou-se tolerância a X. axonopodis pv. citri. (AZEVEDO, 2005). Recentemente,
Paoli et al. (2007) obtiveram plantas transgênicas de laranja doce com o gene da cecropina
(cecropin MB39), dirigido pelo promotor do gene da fenilalanina amônia-liase que confere
expressão gênica nos vasos do xilema, visando resistência a X. fastidiosa. Paoli (2007) avaliou
plantas de laranja ‘Valência’ transformadas com o gene da cecropina (cecropin MB39) quanto à
resistência a X. fastidiosa e uma planta revelou resistência ao patógeno. Bespalhok Filho et al.
(2001) obtiveram plantas transgênicas de laranja ‘Pêra’ contendo o gene da sarcotoxina (peptídeo
antibacteriano isolado de larvas de Sarcophaga peregrina, pertencente ao grupo das cecropinas) e
os resultados da avaliação de resistência a X. axonopodis pv. citri revelaram que as plantas
apresentando maiores quantidades de sarcotoxina foram mais resistentes à bactéria.
Boscariol et al. (2006) introduziram o peptídeo antibacteriano atacina A em laranja doce
cv. ‘Hamlin’, visando resistência a X. axonopodis pv. citri e obteve plantas transgênicas com
redução da severidade de cancro cítrico em comparação a plantas não transgênicas.
31
2.5 Peptídeo antibacteriano atacina e gene maior de resistência Xa21
Os peptídeos antibacterianos são componentes importantes no mecanismo de defesa de
muitos animais, principalmente os insetos, e têm ação bactericida contra bactéria gram-negativas
e gram-positivas (MOURGUES; BRISSET; CHEVREAU, 1998). Esses peptídeos têm potencial
para aumentar os mecanismos de resistência em plantas devido à rápida habilidade bioestática
contra as células alvo, à atividade em baixas concentrações e a sua natureza não tóxica para
células eucarióticas superiores (REED; EDWARDS; GONZALES, 1997). São descritos mais de
500 tipos de peptídeos com essas características, procedentes de uma grande variedade de
organismos tais como bactérias, fungos, insetos, plantas e vertebrados (ZASLOFF, 2002).
O peptídeo atacina pertence a uma das maiores classes de peptídeos antibacterianos
(LAZZARRO; CLARK, 2001). Os genes que codificam a proteína atacina foram isolados de
diferentes insetos como Hyalophora cecropia (HULTMARK et al., 1983), Drosophila
melanogaster (ASLING; DUSHAY; HULTMARK, 1995) e Trichoplusia ni (KANG;
LUNDSTROM; STEINER, 1996). Seis atacinas isoladas de H. cecropia, apresentando massa
molecular de 20 a 23 kDa, foram divididas em dois grupos de acordo com a composição de
aminoácidos, sendo quatro básicas (A, B, C e D) e duas ácidas/neutras (E e F) (HULTMARK et
al.,1983). O gene atacina A também foi isolado de Trichoplusia ni e apresentou alta similaridade
com a forma ácida da atacina de H. cecropia, com 63% de homologia com a parte madura da
proteína (KANG; LUNDSTROM; STEINER, 1996). Este gene possui 1601 pb, com dois introns
e com peptídeo sinal de 54 pb, capaz de exportar a proteína para os espaços intercelulares
(BOSCARIOL, 2004).
A ação das atacinas nas bactérias gram-negativas ocorre principalmente na parede celular,
mais especificamente na membrana externa (ERGSTROM et al., 1984), acarretando uma
alteração na permeabilidade da membrana, devido as atacinas se ligarem aos lipopolissacarídeos
(LPS) da membrana externa. Essa ligação também causa inibição da síntese de várias proteínas
específicas da membrana externa, limitando a habilidade das bactérias de restaurar a função da
membrana (CARLSSON et al., 1991; 1998). A alteração na permeabilidade da membrana
propicia o acesso de outras proteínas antibacterianas como lisozima e cecropina. Além disso,
32
altas concentrações de atacinas podem causar lise de células bacterianas (ERGSTROM et al.,
1984).
O efeito da proteína atacina foi confirmado em trabalhos de transformação de espécies
frutíferas e olerícolas. Plantas transgênicas de macieira contendo o gene atacina A apresentaram
alto nível de resistência a Erwinia amylovora, agente causal do “fire blight” (NORELLI;
ALDWINCKLE, 1993). O gene atacina E introduzido em macieira (NORELLI et al., 1994; KO
et al., 2002) e em pereira (REYNORD et al., 1999) apresentaram aumento na resistência a E.
amylovora. Arce et al. (1999) introduziram o gene atacina E em batata e obtiveram aumento de
resistência à bactéria Erwinia carotovora atroseptica. Monteiro (2005) introduziu o gene atacina
A em maracujá amarelo visando resistência X. axonopodis pv. passiflorae e testes preliminares
“in vitro” revelaram resistência ao patógeno.
Genes maiores de resistência ou genes R são responsáveis pelo reconhecimento de genes
avr complementares do patógeno, e assim, quando um gene avr é reconhecido, mecanismos de
defesa da planta são ativados. Este mecanismo de reconhecimento foi melhor entendido após a
clonagem dos genes de avirulência (avr) no patógeno e genes de reconhecimento (R) na planta
(HAMMOND-KOSACK; JONES, 1997). Existem muitos genes de resistência de plantas
clonados, como por exemplo o gene Bs2 do pimentão (MINSAVAGE et al., 1990), os genes Pto
(MARTIN et al., 1993) e Cf-9 (JONES et al., 1994) do tomate, o gene Dm3 da alface (MEYRS et
al., 1998) os genes Xa21 (SONG et al., 1995) e Xa1 (YOSHIMURA et al., 1998) do arroz e o
gene RB de batata (SONG et al., 2003).
Segundo Song et al. (1995), a transferência intergenérica de genes de resistência pode
acarretar na aquisição de resistência a patógenos em diferentes espécies. Como exemplos dessa
transferência, têm-se o gene Pto de tomate quando introduzido em tabaco resultou em plantas
transgênicas resistentes a P. syringae pv. tabaci (RONALD et al., 1992), o gene Bs2 de pimentão
introduzido em tomate conferiu resistência contra Xanthomonas campestris (TAI et al., 1996) e o
gene RB clonado da espécie silvestre de batata (Solanum bulbocastanum) conferiu resistência ao
patógeno Phytophthora infestans em variedade comercial de batata (Solanum tuberosum) (SONG
et al., 2003).
33
O gene Xa21, isolado de uma espécie silvestre de arroz (Oryza longistaminata), foi o
primeiro gene de resistência de planta clonado e transferido para cereais (SONG et al., 1995;
WANGA et al., 1996), confere resistência ao patógeno Xanthomonas oryzae pv. oryzae, causador
do crestamento bacteriano em Oryza sativa (RONALD, 1997). Este gene pertence a uma família
multigênica e codifica para uma proteína quinase (“receptor kinase like-protein”), possuindo
domínio da serina-treonima quinase, domínio transmembrana e domínio extracelular com 23
regiões ricas em leucina. Por apresentar esta estrutura, sugere-se que a ação deste gene ocorra no
reconhecimento da superfície celular do patógeno, com subseqüente ativação de respostas de
defesa intracelulares (SONG et al., 1995). O Xa21 é o único gene de resistência de plantas que
apresenta essa estrutura (CENTURY et al., 1999). Segundo Ronald (1997) uma hipótese do
mecanismo de ação das proteínas Xa21 consiste em três fases: uma que detecta os sinais da
bactéria, outra que expande a membrana da célula vegetal e uma terceira fase que gera a
mensagem dentro da célula, ocorrendo à ativação dos mecanismos de defesa da planta.
A ação do gene Xa21 no controle da bactéria X. oryzae pv. oryzae foi relatada em vários
trabalhos. Wanga et al. (1996) e Tu et al. (1998), quando introduziram o gene Xa21 em cultivares
comerciais de arroz obtiveram aumento da resistência a diferentes isolados a X. oryzae pv.
oryzae. Ronald (1997) obteve 75% a 90% de redução nas lesões do crestamento bacteriano em
arroz comercial suscetível, transformado com o gene Xa21. Tu et al. (2000) relatam que a
geração F2 de plantas transgênicas de arroz contendo o gene Xa21 mantiveram o mesmo espectro
de resistência ao crestamento bacteriano da geração F1.
Century et al. (1999) relataram que a expressão do Xa21 em arroz é independente do
estágio de desenvolvimento da planta, da infecção com o patógeno ou de ferimento, embora
aumentos progressivos de resistência a X. oryzae pv. oryzae tenham sido observados mediante o
avanço nos estágios fenológicos do arroz.
Segundo Song et al. (1995), devido o gênero Xanthomonas infectar várias espécies de
planta em todo o mundo, a transferência do gene de resistência Xa21 para outras culturas pode
ajudar no controle de doenças provocadas por outras espécies de bactérias desse gênero. Essa
hipótese tem sido levantada por outros autores, como Deng e Gmitter (2003) que clonaram e
identificaram genes candidatos de resistência à doença em citros da classe de proteínas receptora
de quinase, semelhante à classe do gene Xa21, e encontraram estruturas similares a este gene,
34
como o mesmo número de repetições ricas em leucina e os domínios transmembrana e quinase.
Assim, esses autores sugerem que plantas de citros resistentes a X. axonopodis pv. citri (agente
causal do cancro cítrico) podem ser obtidas com a introdução do gene Xa21 do arroz e de
possíveis genes R de resistência em citros. Baseando-se também na hipótese de que o gene Xa21
pode ter largo espectro para bactérias do gênero Xanthomonas, recentemente, Omar, Song e
Grosser (2007), introduziram o gene Xa21 em protoplastos de laranja doce ‘Hamlin’ usando
polietilenoglicol (PEG), visando resistência a X. axonopodis pv. citri.
35
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material Vegetal
As plantas transgênicas de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck) contendo os genes
atacina A (attA) ou Xa21 (variedades ‘Hamlin’, ‘Natal’, ‘Pêra’ e ‘Valência’), dirigidas pelo
promotor 35S duplicado, foram obtidas por Boscariol (2004), em transformação genética via
Agrobacterium tumefaciens. Essas plantas são mantidas em casa de vegetação, específica para o
cultivo de plantas transgênicas e com Certificado de Qualidade em Biossegurança (CQB),
instalada na área experimental do Departamento de Produção Vegetal da Escola Superior de
Agricultura “Luiz de Queiroz” (ESALQ) - Universidade de São Paulo, Piracicaba.
3.2 Análises moleculares das plantas de laranja doce transformadas com os genes atacina A
(attA) e Xa21 para confirmação da integração e transcrição dos genes
As análises de “Southern blot” e “Northern blot foram realizadas no Laboratório de
Biotecnologia Vegetal do Centro de Energia Nuclear na Agricultura – CENA/USP.
3.2.1 Análise de “Southern blot”
Análises de “Southern blot” foram realizadas para confirmar a integração dos transgenes
nas plantas obtidas nos experimentos de transformação genética e identificadas como
transgênicas por PCR. O DNA total das plantas matrizes e das plantas não transformadas
(controle negativo) foi extraído de folhas jovens pelo método de CTAB (DOYLE; DOYLE,
1990), acrescentando-se uma lavagem com fenol e uma com clorofórmio:álcool isoamílico (24:1)
para uma melhor purificação. Aproximadamente 60 µg de DNA de cada planta foram digeridos
com as enzimas de restrição HindIII e KpnI (para as plantas transformadas com os genes attA e
Xa21, respectivamente) separados, em gel de agarose 1%, por eletroforese e transferidos para
membrana de nylon (Hybond-N
+
, Amersham Biosciences).
As sondas para os genes attA e Xa21 foram preparadas por PCR e os fragmentos
amplificados de 350 pb e 1,4 Kb, respectivamente, foram purificados utilizando o kit “QIAEX®
36
II Gel Extraction” (Qiagen, Hilden, Germany) e submetidos à marcação com o kit “AlkPhos
Direct Labelling Reagents” (Amershan Biosciences). As hibridações foram realizadas a 60 ºC
(attA) e 65 ºC (Xa21) e a detecção foi realizada com “CDP-Star
TM
Detection Reagent”
(Amersham Biosciences).
3.2.2 Análise de “northern blot”
As análises de “northern blot” foram realizadas para confirmar a transcrição dos genes nas
plantas transgênicas. O RNA total das plantas transgênicas das plantas não transformadas
(controle negativo) foi extraído usando-se o produto comercial TRIzol (Invitrogen), seguido as
instruções do fabricante. A eletroforese em gel desnaturante com 1% de agarose, foi realizada
com 30 µg (attA) e 40 µg (Xa21) de cada amostra de RNA. O RNA separado foi transferido para
membrana de nylon (Hybond-N
+
, Amersham Biosciences) e hibridizado com a mesma sonda
utilizada nas análises de “Southern blot”. As hibridações foram realizadas a 60 ºC (attA) e 65 ºC
(Xa21) e a detecção foi realizada com “CDP-Star
TM
Detection Reagent” (Amersham
Biosciences).
3.3 Propagação das plantas transgênicas
As mudas foram produzidas por enxertia do tipo borbulhia, utilizando o porta-enxerto
limão ‘Cravo’ (Citrus limonia Osbeck), cultivado em sacos plásticos (3,5 L) e tubetes (19,5 cm x
5,0 cm) contendo substrato comercial de casca de pinus (Rendmax
®
Eucatex
®
) misturado com
adubo Osmocote
®
(N-22, P-4 e K-7), na proporção 200 g do adubo para cada 25 kg do substrato.
As borbulhas das plantas transgênicas foram retiradas das plantas matrizes (variedades Hamlin,
Natal, Pêra e Valência). As borbulhas das plantas testemunhas (não transgênicas), oriundas de
borbulheira certificada, foram gentilmente cedidas pela Sanicitrus mudas cítricas, Araras, SP,
Brasil. Todos os experimentos de avaliação de resistência a X. axonopodis pv. citri foram
conduzidos em porta-enxerto limão ‘Cravo’ (C. limonia), com exceção do experimento com
laranja ‘Hamlin’ que foi conduzido em porta-enxerto tangerina ‘Cleopatra’ (Citrus reshni hort.
ex.Tanaka).
37
3.4 Avaliação da resistência à Xylella fastidiosa e Xanthomonas axonopodis em plantas de
laranja doce transformadas com o gene atacina A (attA)
Os experimentos foram desenvolvidos no Laboratório de Insetos Vetores (LIV) e no
Laboratório de Epidemiologia, do Departamento de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia
Agrícola, e nas casas de vegetação do Departamento de Produção Vegetal, da ESALQ/USP.
3.4.1 Inoculação de Xylella fastidiosa
O isolado da estirpe de citros de X. fastidiosa utilizado nas inoculações dos experimentos
foi o CCT6570 (isolado de plantas infectadas em Bebedouro, SP, Brasil), cedido pelo Prof. Dr.
João Roberto Spotti Lopes (Laboratório de Insetos Vetores do Departamento de Entomologia,
Fitopatologia e Zoologia Agrícola da ESALQ/USP).
A bactéria foi retirada do ultrafreezer (-80
o
C) e repicada por duas vezes em meio de
cultura sólido “periwinkle wilt gelrite” - PWG (HILL; PURCELL, 1995a) (anexo), totalizando
cerca de 15 a 20 dias de incubação, a 28 ºC. Após esse período de cultivo, preparou-se uma
suspensão bacteriana com tampão fosfato salino (“phosfhate buffer saline” - PBS) (10 mM
Na
2
HPO
4
; 1,7 mM KH
2
PO
4
; 0,14 mM NaCl; 2,7 mM KCL; pH 7,0) (HILL; PURCELL, 1995b).
Para quantificação bacteriana dessa suspensão concentrada de bactérias em UFC mL
-1
(unidades
formadoras de colônias), foi feita uma diluição serial até 10
-9
, e plaqueamento de 40 µL de todas
as diluições em meio de cultura sólido PWG. As placas foram acondicionadas em estufa, a 28 ºC.
Após 15 dias do plaqueamento, foi realizada a contagem do número de unidades formadoras de
colônias com auxílio de uma lupa estereoscópica. Foram determinadas concentrações bacterianas
variando de 10
9
a 10
10
UFC mL
-1
.
Para os experimentos com X. fastidiosa foram utilizadas as mudas produzidas em sacos
plásticos (3,5 L). As mudas com aproximadamente três meses da enxertia, apresentado caule
tenro e sob stress hídrico por 24 h, foram previamente marcadas com dois pontos de inoculação
no caule com caneta permanente. A suspensão bacteriana foi inoculada mecanicamente,
depositando-se uma gota de 5 µl em cada ponto de inoculação no caule (perfazendo um total de
10 µl por planta), perfurando-se, em seguida, o local por 10 vezes com alfinete entomológico nº0.
Como controle negativo de cada experimento, quatro plantas não transgênicas foram inoculadas
38
A
B
B
A C
apenas com tampão (PBS), (Figura 1). Os experimentos com as laranjas ‘Hamlin’, ‘Natal’ e
‘Valência’ foram inoculados com suspensão bacteriana de 10
10
UFC mL
-1
e os experimentos com
a laranja ‘Pêra’ foram inoculados com suspensão bacteriana de 10
9
UFC mL
-1
. O método de
inoculação por alfinete foi escolhido por apresentar uma eficiência média de inoculação superior
a 70% (ALMEIDA et al., 2001). Durante todo o período experimental as mudas foram mantidas
em casa de vegetação protegida contra a entrada de cigarrinhas, vetoras de X. fastidiosa, e com
Certificado de Qualidade em Biossegurança (CQB).
Figura 1 - Inoculação da bactéria X. fastidiosa. A) Suspensão bacteriana em tampão PBS; B) Aplicação de 5µl de
suspensão bacteriana em um dos pontos marcados no caule da planta; C) Perfuração da planta com um
estilete no ponto de inoculação, para a absorção da suspensão bacteriana
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado para todos os experimentos e
cada experimento foi repetido 2 vezes. Os experimentos foram os seguintes:
Experimento com a laranja ‘Hamlin’ (H): Foram avaliadas oito plantas transgênicas
(eventos de transformação - Hat1, Hat2, Hat3, Hat5, Hat8, Hat9, Hat10 e Hat11) mais a
testemunha (planta de laranja ‘Hamlin’ não transgênica), com 10 repetições por tratamento
(sendo que uma planta corresponde a uma repetição).
Experimento com a laranja ‘Natal’ (N): Foram avaliadas sete plantas transgênicas
(eventos de transformação - Nat1, Nat2, Nat4, Nat5, Nat7, Nat8 e Nat9) mais a testemunha
(planta de laranja ‘Natal’ não transgênica), com 10 repetições por tratamento.
Experimento com a laranja ‘Pêra’ (P): Foram avaliadas cinco plantas transgênicas
(eventos de transformação - Pat6, Pat7, Pat8, Pat10 e Pat15) mais a testemunha (planta de laranja
‘Pêra’ não transgênica), com 10 repetições por tratamento.
39
Experimento com a laranja ‘Valência’ (V): Foram avaliadas nove plantas transgênicas
(eventos de transformação - Vat2, Vat10, Vat11, Vat12, Vat13, Vat16, Vat17, Vat18 e Vat20)
mais a testemunha (planta de laranja ‘Valência’ não transgênica), com 10 repetições por
tratamento.
3.4.2 Isolamento e quantificação de X. fastidiosa
Para o isolamento de X. fastidiosa e quantificação da população bacteriana das plantas de
citros inoculadas utilizou-se o método de isolamento primário em meio de cultura descrito por
Hill e Purcell (1995b) adaptado por Almeida et al. (2001).
Os isolamentos foram realizados em todas as plantas inoculadas aos quatro e oito meses.
Aos quatro meses foram coletadas duas folhas na região do ponto de inoculação para avaliação da
eficiência de inoculação e a população bacteriana e, aos oito meses foram coletadas duas folhas a
50 cm do ponto de inoculação para observação da população e movimentação bacteriana. O
pecíolo e parte da nervura central de cada amostra foram destacados com uma lâmina e pesados
em balança semi-analítica (0,1 - 0,2 g amostra
-1
). Em câmara de fluxo laminar, utilizando apenas
materiais estéries, cada amostra passou por cinco banhos de imersão de dois minutos em
recipientes contendo álcool (92,8%) (1x), hipoclorito de sódio (2%) (1x) e água destilada estéril
(3x) para desinfestação superficial. Após a desinfecção, as amostras foram cortadas em secções
de 1 - 2 mm sobre papel filtro, com o auxílio de uma lâmina esterilizada, e colocadas em tubos de
ensaio contendo 2 mL de tampão PBS autoclavado. Nestes tubos de ensaio as amostras foram
trituradas em homogeneizador tipo Turrax
®
(modelo MA102, Marconi Equipamentos para
Laboratório S.A.) por 15 s, com a rotação da haste giratória de aproximadamente 25.000 rpm. A
cada trituração, a haste foi desinfestada por imersão em recipientes contendo água destilada
estéril (5 s), álcool 92,8% (15 s) e novamente água destilada estéril (5 s). Em câmara de fluxo
laminar a suspensão homogeneizada foi diluída 10x em tampão PBS e plaqueadas duas alíquotas
de 20 µL de cada amostra em meio de cultura sólido PWG. A suspensão inicial também foi
plaqueada em meio PWG (Figura 2). Os plaqueamentos foram acondicionados em estufa a 28 ºC,
sendo avaliadas em estereoscópico após 15 dias de incubação, determinando-se o número médio
de unidades formadoras de colônias (UFC) nas duas alíquotas. Para confirmação da identidade da
40
A B C
bactéria X. fastidiosa foi realizada PCR (Reação de polimerase em cadeia) em 30% das colônias,
de cada tratamento, obtidas no isolamento.
A concentração bacteriana (C), medida em número de UFC por grama de tecido vegetal
(UFC g
-1
) foi calculada com base na massa inicial das amostras foliares e nas diluições no
material vegetal em tampão PBS, utilizando-se a fórmula: C = 100.(1/p). UFC.(10), onde p é a
massa da amostra foliar (g) e 10 é o fator de diluição.
Figura 2 – Isolamento de X. fastidiosa. A) Corte das nervuras com lâmina; B) Trituração das nervuras em
homogeneizador (Turrax
®
); C) Plaqueamento das suspensões em meio PWG
Os dados de quantificação bacteriana obtidos no isolamento (Log UFC g de tecido
-1
)
foram submetidos à análise exploratória para verificar as pressuposições da análise paramétrica,
tais como teste de normalidade (Shapiro-Wilks e Kolmogorov), independência dos erros e pontos
discrepantes. Quando tais pressuposições não foram validadas, recorreu-se a análise da variância
não paramétrica de Kruskall-Wallis. As médias foram comparadas pelo teste de Tukey (P<0,05),
sendo que para a análise não paramétrica o teste de Tukey foi aplicado às médias dos postos das
observações.
3.4.3 Análises moleculares
3.4.3.1 Reação de polimerase em cadeia (PCR) para detecção de X. fastidiosa
A extração de DNA foi baseada no protocolo desenvolvido por Murray e Thompson,
(1980). Foram utilizadas as mesmas folhas usadas no isolamento aos quatro meses, retirando-se a
parte restante da nervura central com auxílio de uma lâmina. As amostras foram cortadas em
pedaços pequenos e maceradas com a ajuda de um pistilo em cadinho.
41
Para a amplificação do DNA extraído das plantas, utilizaram-se os oligonucleotídeos
CVC-1 (AGATGAAAACAATCATGCAA) e 272-2-int (GCCGCTTCGGAGAGCATTCCT)
(POOLER; HARTUNG, 1995), que amplificam um fragmento de 500 pb e são específicos para
X. fastidiosa de citros (COLETTA FILHO; MACHADO, 2001). A reação de PCR foi realizada
para um volume final de 25 µl contendo os seguintes reagentes: 2,5 µL de tampão 10x (200mM
Tris-HCL pH 8,4; 500 mM KCl); 1,0 µL de Mg Cl
2
(50 mM); 0,5 µL de mix dNTP (10 mM); 1
unidade de Taq DNA polimerase (Invitrogen
®
); 1,0 µL de cada oligonucleotídeo (10 µM) e 3 µL
de DNA da amostra. A amplificação foi realizada em termociclador, programado para as
seguintes condições: 1 ciclo inicial a 94 ºC por 4 min.; 30 ciclos envolvendo desnaturação a 94
ºC por 1 min; anelamento a 62 ºC por 1,5 min e extensão a 72 ºC por 1,5 min; e 1 ciclo final de
extensão a 72 ºC por 10 min; estabilizando a 4 ºC por tempo indeterminado (POOLER;
HARTUNG, 1995).
Para a confirmação da identidade de X. fastidiosa das colônias desenvolvidas no
isolamento, selecionaram-se aleatoriamente três amostras de cada tratamento, retirou-se uma
colônia com alça de platina, a qual foi diluída em 50 µL de TE (10 mM de Tris HCl; 1m M
EDTA – ácido etileno diamonotetracético), dessa solução utilizou-se 2 µL para reação de PCR,
seguindo o mesmo procedimento da amplificação de DNA de folha.
Após amplificação, foram adicionados 2 µl de corante de bromofenol (0,25% e sacarose
40%) por amostra e o produto da amplificação (fragmento de 500 pb) foi visualizado por
eletroforese em gel de agarose a 1,0% (p/v), suplementado com brometo de etídio (0,5 µg mL
-1
),
em tampão TBE 1x (TRIS-HCl, 45 mM; ácido bórico, 45 mM; EDTA pH 8,0, 1 mM). A
eletroforese foi conduzida à corrente elétrica de 100 V, durante 50 min e o gel visualizado em luz
ultravioleta.
3.4.3.2 Quantificação de X. fastidiosa em plantas de laranja doce transformadas com o gene
attA por PCR quantitativo (qPCR)
As análises de PCR quantitativo foram realizadas no Laboratório de Melhoramento
Vegetal do Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA), da Universidade de São Paulo,
Piracicaba, com a colaboração do Prof. Dr. Antonio Vargas Figueira e da Dra. Jeanne Blanco de
Molfetta Machado.
42
A) Determinação da curva padrão de X. fastidiosa
O isolado de X. fastidiosa (CCT6570) foi cultivado em meio de cultura sólido PWG nas
mesmas condições citadas para inoculação (Item 3.4.1). A bactéria foi diluída em 1000 µL de
tampão PBS (quatro placas para 1000 µL de PBS), em seguida foi feita uma diluição serial até
10
-9
e o plaqueamento de 40 µL de todas as diluições em meio sólido PWG. As placas foram
acondicionadas em estufas a 28
o
C e após 15 dias foi feita à contagem do número de unidades
formadoras de colônias (UFC mL
-1
). A extração de DNA da bactéria foi realizada de acordo com
o protocolo desenvolvido por Ausubel et al. (1987), usando 900 µL da suspensão bacteriana
inicial. O DNA extraído foi quantificado em espectrofotômetro (A
260nm
)
e diluído em série (10
-1
-
10
-6
)
Para a reação de amplificação do DNA da bactéria, foram utilizados os oligonucleotídeos
CVC-1 (AGATGAAAACAATCATGCAA) e 272-2-int (GCCGCTTCGGAGAGCATTCCT)
(POOLER; HARTUNG, 1995) e o Kit PLatinum
®
Sybr
®
Green
qPCR Super Mix UDG
(Invitrogen). A mistura da reação (15 µL) foi preparada usando 267 nM de cada
oligonucleotídeo; 7,5 µL do Sybr
®
Green Super Mix e 2,0 µL do DNA diluído (cinco diluições:
10
-2
a 10
-6
). Cada amostra foi testada em triplicata e foram adicionadas duas amostras como
controle negativo (água). A reação foi conduzida em RotorGene 3000 (Colbertt Research),
programado para as seguintes condições: uma temperatura inicial (“Hold” 1) de 50 ºC por 2 min.;
uma segunda temperatura (“Hold” 2) de 95 ºC por 2 min; 50 ciclos envolvendo desnaturação a 95
ºC por 30 s, anelamento a 60 ºC por 30 s e extensão a 72 ºC por 40 s; e uma incubação final
(“Hold” 3) a 72 ºC por 5 min. Após o término dos ciclos, o aparelho foi programado para detectar
a temperatura de desnaturação do fragmento amplificado. Para tanto, foi adotada uma rampa
linear de 72 - 95
o
C , a qual se inicia em 72
o
C por 45 s, aumentando 1
o
C a cada 5 s até atingir 95
o
C.
A partir dos valores de CT (ciclo onde ocorre o piso de fluorescência – “Threshold“ de
0,1), o programa gerou uma reta com os pontos de diluição. Buscou-se a obtenção de um
coeficiente de linearidade (R
2
) de aproximadamente 0,99. As análises foram realizadas pelo
software Rotor-Gene Real-Time.
43
B) PCR quantitativo (qPCR) das plantas de laranja doce transformadas com o gene attA e
inoculadas com X. fastidiosa
Para a quantificação de X. fastidiosa nas plantas cítricas transgênicas inoculadas com o
patógeno, foram selecionadas sete plantas (Hat8, Pat6, Pat7, Vat2, Vat12, Nat1 e Nat2). O
critério para a seleção de tais plantas baseou-se na ordem de grandeza da população bacteriana
obtida no isolamento em meio de cultura aos oito meses após a inoculação (Figuras 8, 9,10 e 11).
Para cada planta selecionada, utilizaram-se três repetições (plantas) que foram positivas
no isolamento em meio de cultura e PCR. Foi realizada uma coleta de duas folhas de cada planta,
a 50 cm do ponto de inoculação, para extração de DNA. No período da coleta, a planta Hat8
estava com 20 meses da inoculação e as plantas Pat6, Pat7, Vat2, Vat12, Nat1 e Nat2 estavam
com 14 meses da inoculação. Como controle positivo foram utilizadas as plantas testemunhas
(não transformadas e inoculadas) de cada variedade e uma planta transformada e inoculada de
cada variedade (Hat2, Pat10 e Vat18), que obteve população bacteriana tão alta quanto a
testemunha. Como controle negativo foram utilizadas as plantas testemunhas, não transformadas
e não inoculadas, também de cada variedade.
O DNA genômico das folhas foi extraído de acordo o protocolo descrito por Laranjeira et
al. (1998). O pecíolo e a nervura central de duas folhas maduras foram retirados com auxílio de
uma lâmina e cortados em pedaços pequenos, em seguida macerados em nitrogênio líquido em
almofariz. O DNA extraído foi quantificado em espectrofotômetro (A
260nm
).
Para a amplificação de qPCR, utilizou-se a mesma mistura da reação para o DNA da
bactéria X. fastidiosa, com volume final de 15 µL e 100 ng de DNA das amostras. Cada amostra
foi testada em triplicata e foram adicionadas duas amostras como controle negativo (água). As
reações foram conduzidas em RotorGene 3000 (Colbertt Research) programado com o mesmo
ciclo de amplificação citado anteriormente (Item A). A cada corrida importou-se a curva padrão
realizada com o DNA de X. fastidiosa e o programa comparou e estimou a quantidade de
unidades formadoras de colônias (UFC ng DNA
-1
) de cada amostra de DNA de planta. As
análises foram realizadas pelo software Rotor-Gene Real-Time.
44
3.4.4 Avaliação dos sintomas foliares de clorose variegada dos citros (CVC)
As avaliações dos sintomas de CVC foram visuais e realizadas a cada dois meses. A
porcentagem de plantas sintomáticas foi determinada pela proporção de plantas sintomáticas em
relação ao total de plantas. As avaliações foram encerradas aos 12 meses após inoculação,
quando os sintomas de CVC nas folhas começaram a ser confundidos com sintomas de
deficiência de nutrientes e/ou senescência, devido à limitação do recipiente em que as plantas
foram cultivadas e competição por luminosidade,
3.4.5 Inoculação de Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) em plantas de laranja doce
transformadas com o gene attA
Nos experimentos com X. axonopodis pv. citri foram utilizadas mudas de laranja doce
(variedades ‘Hamlin’, ‘Natal’, ‘Pêra’, e ‘Valência’) produzidas em tubetes (19,5 cm x 5,0 cm).
Os experimentos foram conduzidos em sala fechada, de acordo com as normas de
segurança fitossanitária para o cancro cítrico, com acesso restrito as pessoas envolvidas no
projeto e dentro de câmaras de crescimento com temperatura e fotoperíodo controlados.
O isolado de X. axonopodis pv. citri (estirpe IBSBF 1421), utilizado em todos os
experimentos, foi fornecido pelo Dr. Júlio Rodrigues Neto, do Laboratório de Bacteriologia, do
Instituto Biológico de São Paulo, Campinas, SP. A bactéria foi preservada, a curto período (seis
meses), pelo método Castellani (1939) e, por longo período, congelada a -80
o
C em glicerol 10%,
garantindo assim a viabilidade do inóculo durante o período de condução dos experimentos. O
inóculo foi preparado a partir de cultura da bactéria cultivada em meio ágar nutriente (NA), por
48 h, a 26 – 28
o
C. A bactéria foi suspendida em água estéril destilada e a concentração calibrada
por colorímetro a 480 nm e diluída para 10
6
UFC mL
-1
.
As mudas com aproximadamente dois meses após enxertia, apresentando folhas novas e
imaturas, sem ferimentos, foram inoculadas em ambos os lados com suspensão de Xac, com o
auxílio de um aspersor acoplado a uma bomba a vácuo. Este tipo de inoculação favorece a
penetração da bactéria por estômatos. As mudas foram mantidas em câmara úmida, feita com
sacos plásticos transparentes, por 72 h e mantidas em câmara de crescimento (Conviron
®
modelo
PGW 36) a ± 28
o
C e fotoperíodo de 12 h (Figura 3). Após a retirada da câmara úmida, as plantas
45
A
B
C
permaneceram na câmara de crescimento, nas mesmas condições de temperatura e fotoperíodo,
por 27 dias.
Figura 3 – Inoculação de Xac; A) Inoculação por aspersão nas plantas com suspensão de bactérias na concentração
de 10
6
UFC mL
-1
; B) Câmara úmida após a inoculação; C) Plantas em câmara de crescimento após
retirada da câmara úmida
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado para todos os experimentos e
cada experimento foi repetido três vezes. Cada planta transgênica (evento de transformação) foi
considerada como um tratamento com 7 a 10 repetições (uma planta por parcela). O número de
repetições (plantas) foi variável em alguns tratamentos devido à dificuldade no pegamento da
enxertia e na padronização do tamanho das mudas. Cada experimento apresentou um tratamento
com plantas testemunhas, ou seja, plantas não transgênicas da mesma variedade em análise. Os
experimentos foram os seguintes:
Experimento com a laranja ‘Hamlin’ (H): Foram avaliadas oito plantas transgênicas
(eventos de transformação) Hat1, Hat2, Hat5, Hat8, Hat9, Hat10, Hat11 e Hat12.
Experimento com a laranja ‘Natal’ (N): Foram avaliadas sete plantas transgênicas
(eventos de transformação) Nat1, Nat2, Nat4, Nat5, Nat7, Nat8 e Nat9.
Experimento com a laranja ‘Pêra’ (P): Foram avaliadas sete plantas transgênicas
(eventos de transformação) Pat6, Pat7, Pat8, Pat10, Pat11, Pat12 e Pat15.
Experimento com a laranja ‘Valência’ (V): Foram avaliadas dez plantas transgênicas
(eventos de transformação) Vat2, Vat7, Vat10, Vat11, Vat12, Vat13, Vat16, Vat17, Vat18 e
Vat20.
46
3.4.6 Quantificação de cancro cítrico
A severidade da doença foi avaliada 30 dias após a inoculação, coletando-se o segundo
par de folhas abaixo do ápice de cada planta com lesões de cancro cítrico. A escolha do segundo
par de folhas para coleta e avaliação da doença foi baseada na observação dos autores Gottwald e
Grahan (1992); Grahhan et al. (1992), os quais citam que as folhas novas de citros, com 2/3 de
área expandida são as mais suscetíveis à infecção pela bactéria Xac.
As folhas foram digitalizadas e a severidade determinada por um software de
quantificação de doença, QUANT v.1.0 (VALE et al., 2001), que estima a área foliar afetada em
relação à área sadia. Os dados de severidade foram foram submetidos à análise exploratória para
verificar as pressuposições da análise paramétrica, tais como teste de normalidade (Shapiro-
Wilks e Kolmogorov), independência dos erros e pontos discrepantes. Quando tais
pressuposições não foram validadas, recorreu-se a análise da variância não paramétrica de
Kruskall-Wallis. As médias foram comparadas pelo teste de Tukey (P<0,05), sendo que para a
análise não paramétrica o teste de Tukey foi aplicado às médias dos postos das observações.
Após finalização de cada experimento as plantas foram autoclavadas (120
o
C) e
descartadas.
3.5 Avaliação da resistência à Xanthomonas axonopodis (Xac) em plantas de laranja doce
transformadas com o gene Xa21
Em todos os experimentos de avaliação de resistência a bactéria Xac foram utilizadas
mudas transgênicas de laranja doce (variedades ‘Hamlin’, ‘Natal’, ‘Pêra’ e ‘Valência’), contendo
o gene Xa21, produzidas em tubetes, de acordo com os procedimentos descritos no item 3.3.
Os procedimentos de inoculação, delineamento experimental e quantificação da
severidade de cancro cítrico foram os mesmos descritos nos itens 3.4.5 e 3.4.6. Os experimentos
foram os seguintes:
Experimento com a laranja ‘Hamlin’ (H): Foram avaliadas oito plantas transgênicas
(eventos de transformação) Hxa1, Hxa3, Hxa4, Hxa5, Hxa6, Hxa7, Hxa10 e Hxa11.
Experimento com a laranja ‘Natal’ (N): Foram avaliadas oito plantas transgênicas
(eventos de transformação) Nxa1, Nxa3, Nxa4, Nxa5, Nxa6, Nxa9, Nxa10 e Nxa11.
47
Experimento com a laranja ‘Pêra’ (P): Foram avaliadas quatro plantas transgênicas
(eventos de transformação) Pxa9, Pxa10, Pxa13 e Pxat14.
Experimento com a laranja ‘Valência’ (V): Foram avaliadas seis plantas transgênicas
(eventos de transformação) Vxa1, Vxa3, Vxa4, Vxa5, Vxa7 e Vxa8.
3.6 Avaliação do desenvolvimento da X. fastidiosa em plantas laranja doce não transgênicas
juvenis e adultas
Esse experimento adicional buscou avaliar uma possível diferença no desenvolvimento da
bactéria X. fastidiosa em plantas de citros não transformadas juvenis e adultas. Foram avaliadas a
população e movimentação bacteriana na planta e principalmente a expressão dos sintomas de
clorose variegada dos citros (CVC) nas plantas.
As mudas de laranja ‘Pêra’ e ‘Valência’ foram propagadas por enxertia em porta enxerto
de limão ‘Cravo’ (C. limonia Osbeck), cultivadas em sacos plásticos (3,5 L). As borbulhas
juvenis foram retiradas de plantas jovens com 18 meses de idade obtidas de sementes cultivadas
em casa de vegetação com tela antiafídica. As borbulhas adultas oriundas de borbulheira
certificada foram gentilmente cedidas pela Sanicitrus mudas cítricas, Araras, SP, Brasil. O
experimento foi conduzido em casa de vegetação protegida contra a entrada de cigarrinhas,
vetoras de X. fastidiosa.
A inoculação das plantas com a bactéria X. fastidiosa, na concentração 10
10
UFC mL
-1
, foi
realizada dois meses após a enxertia, seguindo o mesmo procedimento citado no item 3.4.1.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com quatro tratamentos e 15
repetições (sendo uma planta considerada como uma repetição). Os tratamentos foram: PJ -
plantas de laranja ‘Pêra’ juvenil; PA - plantas de laranja ‘Pêra’ adulta; VJ - plantas de laranja
‘Valência’ juvenil e VA - plantas de laranja ‘Valência’ adulta.
Foram realizados isolamentos em meio de cultura aos quatro e oito meses após
inoculação, PCR aos quatro meses após inoculação, PCR quantitativo aos oito meses após
inoculação e avaliação de sintomas de CVC, mensalmente, a partir dos quatro meses após
inoculação, por meio da porcentagem de plantas e folhas sintomáticas. A porcentagem de plantas
sintomáticas foi determinada pela proporção de plantas sintomáticas em relação ao total de
48
plantas e a porcentagem de folhas sintomáticas foi estabelecida pela proporção de folhas
sintomáticas em relação ao total de folhas da planta.
Os dados de quantificação bacteriana (Log UFC g de tecido
-1
) e porcentagem de folhas
sintomáticas foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de
Tukey (P<0,05).
49
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Análises moleculares das plantas de laranja doce transformadas com os genes atacina A
(attA) e Xa21 para confirmação da integração e transcrição dos genes
4.1.1 Análise de “Southern blot”
As análises de “Southern blot” confirmaram a integração dos transgenes no genoma das
plantas matrizes com PCR positivo, por meio da hibridização com as sondas dos respectivos
genes attA e Xa21. As plantas transgênicas apresentaram de um a quatro eventos de inserção do
transgene (Figuras 4 e 5).
Em relação às plantas transgênicas de laranja contendo o gene attA, foram analisadas
nove plantas de laranja ‘Hamlin’ (Figura 4A), sete plantas de laranja ‘Natal’ (Figura 4B), sete
plantas de laranja ‘Pêra’ (Figura 4C) e dez plantas de laranja ‘Valência’(Figura 4). As análises de
“Southern blot” das plantas laranja ‘Hamlin’ (Figura 4A), ‘Natal’ (Figura 4B) e ‘Valência’
(Figura 4) foram realizadas pela equipe de trabalho da profa. Beatriz M. Januzzi Mendes do Lab.
de Biotecnologia Vegetal do CENA/USP.
Para as plantas transgênicas contendo o gene Xa21 foram analisadas oito plantas de
laranja ‘Hamlin’ (Figura 5A), oito plantas de laranja ‘Natal’ (Figura 5B), quatro plantas de
laranja ‘Pêra’ (Figura 5C) e seis plantas de laranja ‘Valência’ (Figura 5D). As plantas Nxa11
(Figura 5B) e Vxa7 (Figura 5D) apesar de apresentarem PCR positivos (BOSCARIOL, 2004),
não apresentaram bandas definidas no “Southern blot”, mesmo após a análise ter sido repetida
por três vezes. Isto pode ter ocorrido, provavelmente, por problemas na análise ou na qualidade
do DNA.
As análises de “Southern blot” das plantas transgênicas de laranja contendo o gene Xa21
(Figura 5) foram realizadas em colaboração com a equipe de trabalho da profa. Beatriz M.
Januzzi Mendes do Lab. de Biotecnologia Vegetal do CENA/USP.
Não foram observadas hibridizações nas amostras de DNA das plantas controle (plantas
não transgênicas) em todas as análises realizadas.
50
Figura 4 - Análise de “Southern blot” das plantas transgênicas de laranja doce contendo o gene attA. C+ = controle
positivo (fragmento do gene attA amplificado por PCR); C- = Controle negativo (planta não transgênica);
Colunas identificadas com letras e números correspondem ao DNA, digerido com a enzima HindIII, das
plantas de laranja ‘Hamlin’ (A), ‘Natal’ (B), ‘Pêra’ (C) e ‘Valência’(D). Os resultados das plantas laranja
‘Hamlin’ (A) foram publicados por Boscariol et al., (2006).
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B
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Figura 5 - Análise de “Southern blot” das plantas transgênicas de laranja doce contendo o gene Xa21. C+ = controle
positivo (fragmento do gene Xa21 amplificado por PCR); C- = Controle negativo (planta não
transgênica); Colunas identificadas com letras e números correspondem ao DNA, digerido com a enzima
KpnI, das plantas de laranja ‘Hamlin’ (A), ‘Natal’ (B), ‘Pêra’ (C) e ‘Valência’(D)
4.1.2 Análise de “northern blot”
As análises de “northern blot” detectaram variações nos níveis de transcrição do gene attA
nas plantas de laranja ‘Hamlin’, ‘Natal’, ‘Pêra’ e ‘Valência’ (Figura 6). Das 33 plantas
transgênicas de laranja contendo o gene attA analisadas, 19 plantas (Hat3, Hat5, Nat2, Nat5,
Nat7, Nat9, Pat6, Pat7, Pat8, Pat12, Pat15, Vat2, Vat7, Vat10, Vat12, Vat13, Vat16, Vat18 e
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52
Vat20) apresentaram altos níveis de transcrição, 13 plantas (Hat1, Hat2, Hat8, Hat9, Hat10,
Hat11, Hat12, Nat4, Nat8, Pat10, Pat11, Vat11 e Vat17) revelaram baixos níveis e para uma
planta (Nat1) não foi possível detectar transcrição, provavelmente por problemas na análise.
Figura 6 - Análise de “northern blot” das plantas transgênicas de laranja contendo o gene attA. C- = controle
negativo (planta não transgênica); colunas identificadas com letras e números correspondem ao RNA das
plantas de laranja ‘Hamlin’ (A), ‘Natal’ (B), ‘Pêra’ (C) e ‘Valência’ (D). Os resultados das plantas laranja
‘Hamlin’ (A) foram publicados por Boscariol et al., (2006).
Para as plantas transgênicas de laranja doce ‘Hamlin’, ‘Natal’, ‘Pêra’ e ‘Valência’
contendo o gene Xa21, os níveis de transcrição desse gene foram relativamente semelhantes em
todas as plantas (Figura 7). Das 26 plantas analisadas, cinco plantas (Hxa1, Hxa3, Hxa4, Hxa10 e
Vxa1) apresentaram níveis um pouco mais expressivos que as demais, 15 plantas (Hxa5, Hxa6,
Hxa11, Nxa3, Nxa5, Nxa6, Nxa9, Nxa10, Nxa11, Pxa9, Pxa13, Pxa14, Vxa5, Vxa7 e Vxa8)
revelaram baixos níveis e para seis plantas (Hxa7, Nxa1, Nxa4, Pxa10, Vxa3 e Vxa4), não foi
possível detectar transcrição do gene Xa21, provavelmente por problemas na análise ou na
qualidade do RNA.
Não foram detectadas transcrições no RNA das amostras controle (plantas não
transgênicas) em todas as análises realizadas.
Vat2 Vat7 Vat10 Vat11 Vat12 Vat13 Vat16 Vat17 Vat18 Vat20 C-
C- Nat1 Nat2 Nat4 Nat5 Nat7 Nat8 Nat9
C- Pat6 Pat7 Pat8 Pat10 Pat11 Pat12 Pat15
C
A
C- Hat1 Hat2 Hat3 Hat5 Hat8 Hat9 Hat10 Hat11 Hat12
B
D
Vat2 Vat7 Vat10 Vat11 Vat12 Vat13 Vat16 Vat17 Vat18 Vat20 C-
C- Nat1 Nat2 Nat4 Nat5 Nat7 Nat8 Nat9
C- Pat6 Pat7 Pat8 Pat10 Pat11 Pat12 Pat15
C
A
C- Hat1 Hat2 Hat3 Hat5 Hat8 Hat9 Hat10 Hat11 Hat12
B
D
53
Figura 7 - Análise de “northern blot” das plantas transgênicas de laranja contendo o gene Xa21. C- = controle
negativo (planta não transgênica); colunas identificadas com letras e números correspondem ao RNA das
plantas de laranja ‘Hamlin’ (A), ‘Natal’ (B), ‘Pêra’ (C) e ‘Valência’(D)
4.2 Avaliação da resistência à Xylella fastidiosa e à Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac)
em plantas de laranja doce transformadas com o gene attA
4.2.1 Avaliação da resistência à Xylella fastidiosa
As plantas transgênicas de laranja doce contendo o gene attA foram propagadas por
enxertia e inoculadas com X. fastidiosa para avaliação da resistência ao patógeno.
Em todos os experimentos com as plantas transgênicas de laranja doce (‘Hamlin’,
‘Valência’, ‘Natal’ e ‘Pêra’), foram encontradas altas porcentagens de plantas infectadas com X.
fastidiosa, detectadas pelo isolamento em meio de cultura (médias de 82 a 88%) e PCR (médias
de 66 a 88%), aos quatro meses da inoculação, demonstrando que houve uma boa eficiência na
inoculação mecânica com alfinete (Tabela 1). Almeida et al. (2001) também relataram alta
percentagem de infecção de X. fastidiosa (em torno de 80%) em “seedlings” de laranja doce,
utilizando o mesmo isolado da bactéria (CCT6570) em inoculação mecânica com alfinete.
C- Hxa1 Hxa3 Hxa4 Hxa5 Hxa6 Hxa7 Hxa10 Hxa11
A
C- Nxa1 Nxa3 Nxa4 Nxa5 Nxa6 Nxa9 Nxa10 Nxa11
C- Pxa9 Pxa10 Pxa13 Pxa14
C
C- Vxa1 Vxa3 Vxa4 Vxa5 Vxa7 Vxa8
D
B
54
Tabela 1 – Porcentagem de plantas infectadas por X. fastidiosa, determinadas pelo isolamento em meio de
cultura e PCR e porcentagem de plantas com sintomas de clorose variegada dos citros em
plantas de laranja ‘Hamlin’(H), ‘Natal’ (N), ‘Pêra’ (P) e ‘Valência’ (V), transformadas com o
gene attA
Plantas infectadas (%)
1,2
Tratamentos
Isolamento
4 meses após
inoculação
PCR +
4 meses após
inoculação
Plantas sintomáticas
(%)
1,3
12 meses após inoculação
Hat1 65 60 60
Hat2 95 95 75
Hat3 90 90 70
Hat5 90 60 60
Hat8 70 50 30
Hat9 90 50 70
Hat10 90 60 65
Hat11 80 70 90
Testemunha
4
80 70 55
Média 83 67 64
Nat1 100 80 35
Nat2 100 90 95
Nat4
70 70
50
Nat5 90 85 40
Nat7 70 45 45
Nat8
85 50
45
Nat9 95 50 65
Testemunha
4
85 70 5
Média 87 66 48
Pat6 90 90 95
Pat7 75 65 85
Pat8
60 60 60
Pat10 90 80 90
Pat15 85 95 90
Testemunha
4
90 100 100
Média 82 82 87
Vat2 90 85 70
Vat10
80 80
35
Vat11 80 80 50
Vat12 95 90 65
Vat13
95 90
50
Vat16 100 95 90
Vat17 95 90 75
Vat18 90 95 80
Vat20
70 90
75
Testemunha
4
80 80 30
Média
88 88
62
1
Médias de dois experimentos independentes;
2
Porcentagem de plantas infectadas em relação ao total de 20 plantas avaliadas;
3
Porcentagem de plantas com sintomas de CVC em relação ao total de 20 plantas avaliadas;
4
Plantas não transgênicas de laranja ‘Hamlin’, ‘Natal’, ‘Pêra’ e ‘Valência’.
55
O estágio de desenvolvimento das plantas jovens (três meses após enxertia), homogêneas,
com caules tenros, e a alta concentração bacteriana inoculada (10
9
e 10
10
UFC mL
-1
) pode ter
influenciado positivamente na eficiência de inoculação. Além disso, a inoculação efetuada em
dois pontos no caule das plantas provavelmente aumentou a eficiência da infecção (Tabela 1). De
acordo com Almeida et al. (2001), a observação da rápida colonização de X. fastidiosa e
expressão dos sintomas de CVC em “seedlings” de laranja doce, inoculadas mecanicamente com
alfinete, indicam que essa técnica de inoculação é uma metodologia eficiente em diversos estudos
de fisiologia e patogenicidade de plantas.
A porcentagem de plantas com PCR positivo para X. fastidiosa nas folhas, aos quatro
meses após a inoculação, foi semelhante à porcentagem de isolamento positivo para a maioria das
plantas avaliadas, demonstrando eficiência de detecção da bactéria por esses dois métodos.
Embora a porcentagem média de detecção por PCR entre as variedades tenha sido alta (66 a
88%), observou-se uma variação de 45 a 100% na porcentagem entre as plantas avaliadas (Tabela
1). Essa diferença na porcentagem de detecção por PCR entre os tratamentos também foi
observada por Coletta-Filho et al. (2007), onde, avaliando a resistência a X. fastidiosa em 20
híbridos de laranja ‘Pêra’ x tangor Murcott inoculadas mecanicamente com alfinete, encontraram
uma porcentagem de detecção entre 40 e 100%, com média de 70%.
O método de isolamento em meio de cultura, além de detectar a presença do patógeno,
possibilita a recuperação das células viáveis e a quantificação da população bacteriana através da
contagem das unidades formadoras de colônias (UFC). As médias populacionais de X. fastidiosa
recuperadas nos isolamentos aos quatro e oito meses da inoculação variaram de 10
3
a 10
6
UFC g
tecido
-1
entre as plantas transgênicas e não transgênicas avaliadas (Figuras 8, 9, 10 e 11). Essas
médias populacionais foram similares às observadas por Almeida et al. (2001), que inocularam
em laranja doce o mesmo isolado de X. fastidiosa (CCT6570). Aos quatro meses da inoculação,
apenas a planta Vat2 apresentou menor população bacteriana de X. fastidiosa em relação ao
tratamento testemunha (planta não transgênica de laranja ‘Valência’) (Figura 11).
56
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
ab
ab
ab
b
a
ab
b
b
0
1
2
3
4
5
6
7
Hat1 Hat2 Hat3 Hat5 Hat8 Hat9 Hat10 Hat11 TEST
Plantas de citros
População bacteriana
(Log UFC g tecido
-1
)
4 meses 8 meses
Figura 8 – População bacteriana de X. fastidiosa (Log UFC g tecido
-1
) em plantas de laranja ‘Hamlin’
transformadas com gene attA, aos 4 e 8 meses após inoculação. Médias de dois experimentos
independentes. Barras de erro representam o erro padrão da média. Médias seguidas de mesma
letra em cada época de avaliação não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05)
ab
a
a
a
b
ab
ab
ab
b
ab
a
a
a
ab
a
ab
0
1
2
3
4
5
6
Nat1 Nat2 Nat4 Nat5 Nat7 Nat8 Nat9 TEST
Plantas de citros
População bacteriana
(Log UFC g tecido
-1
)
4 meses 8 meses
Figura 9 – População bacteriana de X. fastidiosa (Log UFC g tecido
-1
) em plantas de laranja ‘Natal’
transformadas com gene attA, aos 4 e 8 meses após inoculação. Médias de dois experimentos
independentes. Barras de erro representam o erro padrão da média. Médias seguidas de mesma
letra em cada época de avaliação não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05)
57
ab
b
ab
ab
ab
a
abab
a
abc
c
c
0
1
2
3
4
5
6
7
Pat6 Pat7 Pat8 Pat10 Pat15 TEST
Plantas de citros
População bacteriana
(Log UFC g tecido
-1
)
4 meses 8 meses
a
ab
a
a
a
ab
b
a
ab
ab
d
d
bcd
d
abcd
ab
abc
a
abcd
d
0
1
2
3
4
5
6
7
Vat2 Vat10 Vat11 Vat12 Vat13 Vat16 Vat17 Vat18 Vat20 TEST
Plantas de citros
População bacteriana
(Log UFC g tecido
-1
)
4 meses 8 meses
Figura 10 – População bacteriana de X. fastidiosa (Log UFC g tecido
-1
) em plantas de laranja ‘Pêra’
transformadas com gene attA, aos 4 e 8 meses após inoculação. Médias de dois experimentos
independentes. Barras de erro representam o erro padrão da média. Médias seguidas de mesma
letra em cada época de avaliação não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05)
Figura 11 – População bacteriana de X. fastidiosa (Log UFC g tecido
-1
) em plantas de laranja ‘Valência’
transformadas com gene attA, aos 4 e 8 meses após inoculação. Médias de dois experimentos
independentes. Barras de erro representam o erro padrão da média. Médias seguidas de mesma
letra em cada época de avaliação não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05)
A quantificação bacteriana aos oito meses, determinada pelo isolamento das folhas
coletadas a 50 cm do ponto da inoculação, comprovou a ocorrência da movimentação sistêmica
da bactéria nas plantas. Foi observada uma redução da população bacteriana para a maioria das
58
plantas avaliadas, sendo que a redução mais expressiva foi para as plantas Hat8, Nat1, Vat10 e
Vat12 (Figuras 8, 10 e 11). Hill e Purcell (1995b) sugerem que para haver uma movimentação
sistêmica da X. fastidiosa na planta é necessária uma alta concentração bacteriana, entre 10
7
a 10
9
UFC mL
-1
. Essa redução da população bacteriana aos oito meses da inoculação para a maioria
das plantas avaliadas e até mesmo para o tratamento testemunha já era prevista, pois o isolamento
aos quatro meses foi realizado com folhas retiradas no ponto da inoculação, local onde
teoricamente teria maior colonização bacteriana. No caso do isolamento aos oito meses a 50 cm
do ponto de inoculação, foi detectada apenas a população bacteriana que migrou até a
proximidade da copa da planta. Além disso, deve-se considerar a influência da distribuição
irregular da bactéria nos vasos do xilema (MIZUBUTI; MATSUOKA; PARIZZI, 1994; ALVES,
2003), a flutuação populacional (HOPKINS, 1985), a possibilidade de mortalidade bacteriana em
certos hospedeiros (PURCELL; SAUNDERS,1999) e, para as plantas transgênicas, pode-se
considerar também uma possível ação da proteína atacina A no desenvolvimento bacteriano.
Aos oito meses da inoculação, as plantas Pat6 e Pat7 apresentaram menor população
bacteriana em relação às plantas não transgênicas (Figura 10). Assim, sugere-se que para essas
plantas a presença da proteína atacina A, expressa pelo gene attA, pode ter influenciado no
desenvolvimento da bactéria.
A ação antibacteriana da proteína atacina A também foi observada em outras bactérias
fitopatogênicas. Plantas transgênicas de macieira contendo o gene atacina A apresentaram alto
nível de resistência a Erwinia amylovora, agente causal do “fire blight” (NORELLI;
ALDWINCKLE, 1993). Testes “in vitro” com folhas de maracujá amarelo contendo o gene
atacina A revelaram resistência a X. axonopodis pv. passiflorae causadora da bacteriose
(MONTEIRO, 2005). Boscariol et al., (2006) avaliando a resistência a X. axonopodis pv. citri em
plantas transgênicas de laranja ‘Hamlin’, revelaram influência da proteína atacina A na redução
da severidade de cancro cítrico.
Os testes de PCR das colônias crescidas no isolamento aos quatro e oito meses
confirmaram que a bactéria era X. fastidiosa.
Para os testes de PCR quantitativo foram selecionadas as plantas Hat8, Nat1, Nat2, Pat6,
Pat7, Vat2 e Vat12 por apresentarem menores populações bacterianas aos oito meses da
inoculação, apesar de apenas as plantas Pat6 e Pat7 terem diferido da testemunha.
59
A
B
O início do aparecimento dos sintomas de CVC foi aos quatros meses nas plantas de
laranja ‘Pêra’, aos cinco meses nas plantas de laranja ‘Natal’ e ‘Valência’ e aos oito meses nas
plantas de laranja ‘Hamlin’. Os sintomas típicos da doença, lesões cloróticas irregulares, surgiram
nas folhas maduras das plantas transgênicas e não transgênicas (testemunha) (Figuras 12 e 13). O
aparecimento dos sintomas nos experimentos ocorreu no final da primavera ou durante o verão.
Palazzo e Carvalho (1992), avaliando plantas de citros no campo, verificaram aumento da
incidência e severidade de sintomas da CVC na época em que ocorre maior desenvolvimento
vegetativo, ou seja, na primavera e no verão.
Figura 12 – A) Experimentos com plantas de laranja ‘Pêra’ transformadas com gene attA, em casa de vegetação com
9 meses após inoculação com X. fastidiosa; B) Sintomas de CVC na face superior das folhas de planta
transgênica; C) Sintomas de CVC na face inferior das folhas de planta transgênica
Figura 13 – A) Experimentos com plantas de laranja ‘Valência’ transformadas com gene attA, em casa de vegetação
com 13 meses após inoculação com X. fastidiosa; B) Sintomas de CVC em folhas de laranja ‘Valência’
transformada
BC
A
60
A precocidade no aparecimento dos sintomas nas plantas de laranja ‘Pêra’ em relação as
outras variedades de laranjas ‘Hamlin’, ‘Natal’ e ‘Valência’, provavelmente está relacionada a
maior suscetibilidade da laranja ‘Pêra’ a expressão dos sintomas de CVC. Esse comportamento
da laranja ‘Pêra’ está de acordo com os resultados encontrados por Souza et al. (2006), quando
utilizaram a laranja ‘Pêra’ como padrão de suscetibilidade à CVC, no estudo em campo da reação
de variedades e clones de laranja a X. fastidiosa, a partir da inoculação do patógeno por encostia
com mudas infectadas.
O surgimento mais tardio dos sintomas de CVC nas plantas de laranja ‘Hamlin’ indica
que, para essa variedade, a bactéria necessita de um maior período de incubação para expressar os
sintomas da doença. Machado et al. (1997), estudando variedades de laranjas sobreenxertadas em
laranja ‘Pêra’ com sintomas típicos de CVC, observaram que todas as variedades de laranja
apresentaram sintomas, porém, houve diferenças na velocidade de expressão. As laranjas ‘Pêra’ e
‘Barão’ mostraram sintomas mais rapidamente, enquanto a laranja ‘Hamlin’, apesar de ser
positiva nos testes sorológicos, expressaram sintomas mais tardiamente.
Após 12 meses da inoculação, a porcentagem de plantas com sintomas de CVC variou de
5% a 100% entre os tratamentos de todos os experimentos (Tabela 1). As plantas Hat8, Nat1 e
Vat10 apresentaram menores porcentagens de plantas sintomáticas (30%, 35% e 35%
respectivamente) em relação à média geral do experimento e crescimento bacteriano moderado
em comparação com as outras plantas (Tabela 1; Figuras 8, 9 e 11). No entanto,
surpreendentemente, foi observado que as plantas testemunhas (não transformadas) de laranja
‘Hamlin’ ‘Valência’ e ‘Natal’ apresentaram baixas porcentagens de plantas sintomáticas (55%,
30% e 5%, respectivamente), embora tenham apresentado altas porcentagens de infecção (80% ,
85% e 88%, respectivamente). Além disso, as médias populacionais dessas plantas (em torno 10
4
UFC g tecido
-1
) foram semelhantes ou inferiores as plantas transgênicas (Tabela 1; Figuras, 8, 9 e
10). A partir desse resultado, surgiu a hipótese de que o estágio de desenvolvimento das plantas
cítricas (maturação de tecidos) pode ter influenciado no desenvolvimento da bactéria e
principalmente na expressão dos sintomas de CVC, pois as borbulhas utilizadas na propagação
das plantas testemunhas foram oriundas de borbulheiras comerciais, portanto tecido adulto, e as
borbulhas das plantas transgênicas foram retiradas de plantas matrizes (com dois ou três anos de
idade), originadas de segmentos de epicótilo de plântulas germinadas “in vitro”,
consequentemente, tecido juvenil. Sabendo-se que o estágio de desenvolvimento dos citros
61
influência em muitas técnicas utilizadas em cultura de tecidos, como a dificuldade de regeneração
de tecido adulto, por apresentar-se diferenciado, com pouca capacidade morfogênica (CEVERA
et al., 1998; ALMEIDA et al., 2003), e que os estágios de desenvolvimento das plantas e de
maturação de seus tecidos podem influenciar na resposta à colonização de patógenos e
manifestação de sintomas de doenças (ANDRADE; CASELA; ABREU, 2000), sugere-se que as
plantas de citros oriundas de tecido adulto (borbulheiras) apresentam menor expressão de
sintomas de CVC que as plantas oriundas de tecido juvenil.
Para avaliação dessa hipótese, foi conduzido um experimento adicional com inoculação
da bactéria X. fastidiosa em plantas de citros não transgênicas, juvenis e adultas. As plantas
juvenis foram propagadas com borbulhas retiradas de plantas jovens com 18 meses de idade,
obtidas de sementes e as plantas adultas foram propagadas com borbulhas oriundas de
borbulheira (tecido adulto) (Itens 3.6 e 4.2.2).
Comparando-se a média geral de plantas com sintomas de CVC de cada experimento
(Tabelas 1), observa-se que a variedade Natal apresentou a menor média geral de plantas
sintomáticas (48%) e a variedade Pêra a maior média (87%), enquanto que as variedades Hamlin
e Valência apresentam médias de plantas sintomáticas semelhantes (64% e 62%). Esses
resultados confirmam a maior suscetibilidade da laranja ‘Pêra’ a CVC. Lopes et al. (2005),
também obtiveram maior porcentagem de plantas de laranja ‘Pêra’ com sintomas de CVC (93%)
em comparação com a laranja ‘Valência’ (83%) e ‘Natal’ (77%), em inoculação de X. fastidiosa
via injeção no caule de “seedlings”.
Nas plantas testemunha negativas, não transgênicas e inoculadas apenas com tampão PBS,
de todos os experimentos não foram detectadas colônias de X. fastidiosa nos isolamentos, não
houve PCR positivo e nem apareceram sintomas de CVC, comprovando assim, que não houve
qualquer disseminação da bactéria dentro da casa de vegetação, nem contaminação durante a
realização das análises.
As plantas testemunhas de todos os experimentos, por serem oriundas de borbulheiras
(tecido adulto), apresentaram suas características de precocidade como florescimento e
frutificação, além da ausência ou redução de espinhos.
62
4.2.1.1 Quantificação de X. fastidiosa em plantas de laranja doce transformadas com o gene
attA por PCR quantitativo (qPCR)
A) Determinação da curva padrão de X. fastidiosa
A curva padrão da bactéria X. fastidiosa é necessária para estimar a quantidade de
unidades formadoras de colônias nas amostras de DNA de plantas amplificadas por qPCR, sendo
determinada a partir dos valores de CT (ciclo onde ocorre o piso de fluorescência – “Threshold”
de 0,1) da amplificação de cinco diluições do DNA genômico da bactéria, com concentrações
conhecidas. Este DNA foi extraído de 900 µL de suspensão de X. fastidiosa. O coeficiente de
linearidade (R
2
) foi de 0,99598, demonstrando alta precisão e homogeneidade das amostras
(Figura 14, 15 e 16).
Figura 14 – Curva padrão de X. fastidiosa por PCR quantitativo usando Sybr
®
Green Super mix,
a partir de diluição serial do DNA da bactéria (10
-2
a 10
-6
). Coeficiente de
linearidade R
2
= 099598. Cada ponto da curva representa uma diluição com a média
de três repetições da reação de amplificação. CT – Ciclo “Threshold”
A quantificação das diluições do DNA genômico de X. fastidiosa amplificadas no PCR
quantitativo em UFC ng DNA
-1
, foi determinada a partir da comparação de cada produto
amplificado com o número de colônias estimado para cada diluição do DNA usado na reação.
Essa estimativa foi baseada na contagem de colônias do plaqueamento da diluição serial (10
-1
-
10
-9
) da mesma suspensão de bactérias em meio de cultura, que foi de 10
1
a 10
6
UFC mL
-1
(Tabela 2).
As curvas de amplificações mostram a emissão de fluorescência de cada diluição de DNA
genômico de X. fastidiosa (10
-2
a 10
-6
) em relação aos ciclos de amplificações. Cada triplicata de
curvas representa uma diluição (legenda das cores representada na Tabela 2). O início de
63
detecção da fluorescência foi entre os ciclos 10 e 15 para a diluição 10
-2
. A diluição 10
-1
apresentou uma quantidade de DNA muita alta que interferiu na reação, por isso foi excluída da
curva. Os valores de CT variaram de 18,19 a 42,78 em relação à concentração de DNA das
diluições (Figura 15; Tabela 2).
Figura 15 – Curvas de amplificação de X. fastidiosa por PCR quantitativo usando Sybr
®
Green
Super mix, a partir de diluição serial do DNA da bactéria (10
-2
a 10
-6
da esquerda para
direita). Cada triplicata de curvas representa uma diluição
Figura 16 – Derivada das curvas de amplificação de X. fastidiosa por PCR quantitativo usando
Sybr
®
Green Super mix, a partir de diluição serial do DNA da bactéria (10
-2
a 10
-6
da
esquerda para direita).
O “Threshold” foi de 0,1. Cada triplicata de curvas representa
uma diluição
64
Tabela 2 - Legendas das amostras de diluição do DNA genômico de X. fastidiosa. Ciclo “Threshold”
(CT)
No Colour Name Type CT
Given Conc
(ufc/mL)
Calc Conc
(ufc/ng DNA)
% Var
1
DNA G Xylella -2 Standard 18.29 2.00E+06 1.54E+06 22.8%
2
DNA G Xylella -2 Standard 18.19 2.00E+06 1.60E+06 19.9%
3
DNA G Xylella -2 Standard 18.38 2.00E+06 1.49E+06 25.5%
4
DNA G Xylella -3 Standard 22.55 2.00E+05 2.95E+05 47.3%
5
DNA G Xylella -3 Standard 22.69 2.00E+05 2.79E+05 39.6%
6
DNA G Xylella -3 Standard 23.02 2.00E+05 2.46E+05 22.8%
7
DNA G Xylella -4 Standard 29.09 2.00E+04 2.33E+04 16.3%
8
DNA G Xylella -4 Standard 29.71 2.00E+04 1.83E+04 8.6%
9
DNA G Xylella -4 Standard 28.76 2.00E+04 2.64E+04 31.9%
10
DNA G Xylella -5 Standard 34.72 2.00E+03 2.60E+03 30.2%
11
DNA G Xylella -5 Standard 35.17 2.00E+03 2.18E+03 9.2%
12
DNA G Xylella -5 Standard 35.19 2.00E+03 2.17E+03 8.4%
13
DNA G Xylella -6 Standard 41.59 2.00E+02 1.81E+02 9.7%
14
DNA G Xylella -6 Standard 42.78 2.00E+02 1.14E+02 43.1%
15
DNA G Xylella -6 Standard 41.99 2.00E+02 1.55E+02 22.7%
16
Água mQ NTC
17
Água mQ NTC
A curva de “melt” (desnaturação) mostra que não houve formação de dímeros de
“primers” e que o fragmento amplificado está especifico para o gene de X. fastidiosa em que os
oligonucleotídeos CVC-1 e 272-2-int amplificam. Não houve formação de outro produto nos
controles negativos (água), que continha todos os reagentes menos o DNA genômico da bactéria
(Figura 17).
65
Figura 17 – Curva de “melt” das diluições (10
-2
a 10
-6
) do DNA genômico de X. fastidiosa por
PCR quantitativo usando Sybr
®
Green Super mix
B) PCR quantitativo das plantas de laranja doce transformadas com gene attA e inoculadas
com X. fastidiosa
As análises de qPCR das plantas transgências Hat8, Vat2, Vat12, Pat6, Pat7, Nat1 e Nat2
foram realizadas com o objetivo de detectar maiores diferenças na população bacteriana de X.
fastidiosa em comparação as plantas testemunhas (não transgênicas).
Em todas as amostras de DNA (padronizadas para 100 ng) das plantas de laranja doce
transformadas e plantas testemunhas (não transgênicas), inoculadas com X. fastidiosa, foram
observadas emissões de fluorescência, indicando que houve amplificação específica do fragmento
(500 pb) do gene de X. fastidiosa flanqueado pelos oligonucleotídeos CVC-1 e 272-2-int. O
início de detecção da fluorescência nas amostras foi entre os ciclos 28 e 35 (Figuras 18 e 19 –
exemplo das curvas de amplificação das plantas em estudo). O CT
(Ciclo “Threshold” – piso de
fluorescência) variou de 33,14 (planta Vat18) a 46,19 (planta ‘Natal’ testemunha) entre as
amostras de DNA de plantas. A média do CT variou de 34,25 (planta Vat18) a 43,10 (planta
‘Pêra’ testemunha) entre as plantas analisadas. Os menores valores de CT indicam uma maior
concentração do template (produto amplificado) e, consequentemente, maior população
bacteriana de X. fastidiosa (Tabela 3).
66
Figura 18 – Curvas de amplificação de X. fastidiosa em algumas amostras de DNA das plantas de
laranja ‘Hamlin’ transformadas com o gene attA e inoculadas com X. fastidiosa, obtidas
por PCR quantitativo usando Sybr
®
Green Super mix. Cada triplicata de curvas
representa uma amostra de DNA
F
igura 19 – Derivada das curvas de amplificação de X. fastidiosa em algumas amostras de DNA das
plantas de laranja ‘Hamlin’ transformadas com o gene attA e inoculadas com X.
fastidiosa, obtidas por PCR quantitativo usando Sybr
®
Green Super mix. O “Threshold”
foi de 0,1. Cada triplicata de curvas representa uma amostra de DNA
Legenda das Figuras (18 e 19)
Planta H2 (planta transgênica e inoculada com X. fastidiosa - controle positivo)
Planta H2 (planta transgênica e inoculada com X. fastidiosa - controle positivo)
Planta H2 (planta transgênica e inoculada com X. fastidiosa - controle positivo)
Planta H8 (planta transgênica e inoculada com X. fastidiosa)
Testemunha (não transgênica e inoculada com X. fastidiosa - controle positivo)
Testemunha (não transgênica e inoculada com X. fastidiosa - controle positivo)
Controle negativo (planta não transgênica e não inoculada com X. fastidiosa)
Controle negativo (água)
67
Após a importação da curva padrão de X. fastidiosa para comparação e quantificação dos
produtos amplificados em cada reação, foi estimada a população bacteriana
(UFC ng DNA
-1
) das
amostras de DNA das plantas. A população bacteriana encontrada nas amostras de DNA de
plantas variou de 3,2 x 10
1
a 4,88 x 10
3
UFC ng DNA
-1
(ou Log 1,51 a Log 3,69 UFC ng DNA
-1
),
com médias variando de Log 2,03 a Log 3,50 UFC ng DNA
-1
(Tabela 3). Esses valores médios
de população bacteriana foram semelhantes aos encontrados por Coletta-Filho et al. (2007), em
que analisaram a resistência a X. fastidiosa em híbridos de laranja ‘Pêra’ x tangor ‘Murcott’,
inoculadas mecanicamente com alfinete. O erro padrão encontrado entre as repetições das
amostras de DNA variou de 0,01 a 0,08, demonstrando precisão na análise. Não houve
amplificação em nenhuma amostra dos controles negativos (planta de laranja doce não
transgênica e não inoculada, e água).
Tabela 3 - População bacteriana de X. fastidiosa estimada por PCR quantitativo e por isolamento em
meio de cultura de plantas de laranja doce
‘Hamlin’(H), ‘Natal’ (N), ‘Pêra’ (P) e ‘Valência’ (V),
transformadas com o gene attA e inoculadas com o patógeno. Ciclo “Threshold” – CT (piso
de fluorescência)
Plantas
CT
2
Log UFC ng DNA
-1
(qPCR
2,3
)
Log UFC g tecido
-1
(Isolamento 8 meses
4
)
Hat8
*
38,64 2,77 ± 0,13
5
b 2,85 ± 0,55 b
5
Hat2
**
36,09 3,20 ± 0,62 a 5,89 ± 0,48 a
‘Hamlin’ testemunha
1
38,33 2,83 ± 0,09 b 4,28 ± 0,54 b
Nat1
*
35,92 3,23 ± 0,04 a 3,18 ± 0,43 a
Nat2
*
35,20 3,35 ± 0,08 a 4,52 ± 0,43 a
‘Natal’ testemunha
1
40,21 2,51 ± 0,43 b 4,26 ± 0,62 a
Pat6
*
36,54 3,12 ± 0,06 b 5,16 ± 0,16 b
Pat7
*
35,10 3,49 ± 0,07 a 4,84 ± 0,17 b
Pat10
**
37,65 2,94 ± 0,12 b 5,94 ± 0,16 a
‘Pêra’ testemunha
1
43,10 2,03 ± 0,07 c 5,82 ± 0,16 a
Vat2
*
37,99 2,88 ± 0,09 c 3,39 ± 0,45 b
Vat12
*
37,20 3,01 ± 0,04 c 2,78 ± 0,45 b
Vat18
**
34,25 3,50 ± 0,04 a 5,83 ± 0,44 a
‘Valência’ testemunha
1
35,77 3,25 ± 0,02 b 3,22 ± 0,74 b
*Planta transgênica com menor população bacteriana determinada pelo isolamento aos 8 meses da inoculação;
**Planta transgênica com alta população bacteriana determinada pelo isolamento aos 8 meses da inoculação,
considerada como controle +;
1
Planta testemunha = planta não transgênica e inoculada com X. fastidiosa, também considerada como controle +;
2
Médias de três plantas por tratamento e três repetições;
3
As plantas de laranja ‘Hamlin’ foram analisadas aos 20 meses após a inoculação e as plantas de laranja ‘Valência’,
‘Pêra’ e ‘Natal’ foram analisadas com 14 meses após inoculação;
4
Médias de dois experimentos, total de 20 plantas por tratamento, após nova análise estatística separadamente das
demais plantas do experimento;
5
Erro padrão da média;
Médias seguidas de mesma letra em cada variedade não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05)
68
A possibilidade da análise de qPCR estimar população bacteriana mínima de 10
1
UFC ng
DNA
-1
indica maior sensibilidade de quantificação em relação ao isolamento em meio de cultura,
que permitiu estimar população mínima de 10
3
UFC g tecido
-1
.
De maneira geral, a análise de
qPCR permitiu detectar maiores diferenças nas populações bacterianas entre as plantas estudadas
(Tabela 3). Essa sensibilidade da análise de qPCR detectar 10
1
UFC, também foi relatada por
Oliveira et al. (2002) quando avaliaram plantas de citros inoculadas com de X. fastidiosa.
Nesse trabalho não foi possível fazer uma correlação entre as populações bacterianas
estimadas pelo qPCR e pelo isolamento em meio de cultura aos oito meses da inoculação,
provavelmente devido a diferenças na sensibilidade de detecção da bactéria entre essas análises
ou devido as análises serem realizadas em épocas diferentes, pois as plantas de laranja ‘Hamlin’
foram analisadas por qPCR aos 20 meses após a inoculação e as plantas de laranja ‘Valência’,
‘Pêra’ e ‘Natal’ foram analisadas por qPCR aos 14 meses após inoculação, e no isolamento em
meio de cultura todas as plantas foram avaliadas aos oito meses após inoculação. Além da
influência da época de coleta na variação da população bacteriana, deve-se considerar a
influência da distribuição irregular da bactéria nos vasos do xilema (MIZUBUTI; MATSUOKA;
PARIZZI, 1994; ALVES, 2003) e a flutuação populacional da bactéria na planta (HOPKINS,
1985). Embora não tenha sido possível fazer uma correlação entre as populações bacterianas
estimadas pelas duas análises, foi observado no resultado de qPCR que as plantas de laranja
‘Hamlin’ e ‘Valência’ apresentaram a mesma tendência descrita no isolamento em meio de
cultura, onde as plantas transgênicas selecionadas (Hat8, Vat2 e Vat12) com menores populações
bacterianas mantiveram esse resultado.
Na análise de qPCR da planta de laranja ‘Hamlin’ Hat8 comparada com os controles
positivos planta de laranja ‘Hamlin’ transgênica Hat2 (planta com alta população bacteriana
determinada pelo isolamento) e planta de laranja ‘Hamlin’ testemunha (não transgênica), foi
observado que a planta Hat8 apresentou população bacteriana de X. fastidiosa semelhante a
testemunha e menor que a planta Hat2, confirmando a quantificação bacteriana realizada pelo
isolamento em meio de cultura (Tabela 3).
As plantas transgênicas de laranja ‘Natal’ Nat1 e Nat2 apresentaram maiores populações
bacterianas de X. fastidiosa que a planta testemunha de laranja ‘Natal’, usada como controle
positivo (Tabela 3). Esse resultado também foi observado para as plantas transgênicas de laranja
‘Pêra’, Pat6 e Pat7, que apresentaram populações bacterianas de X. fastidiosa significativamente
69
superiores ao controle positivo planta de laranja ‘Pêra’ testemunha (não transgênica). Esses
resultados foram diferentes dos observados no isolamento em meio de cultura aos oito meses,
onde as plantas Nat1 e Nat2 apresentaram populações bacterianas semelhantes à testemunha e as
plantas Pat6 e Pat7 tiveram crescimento bacteriano inferior à testemunha (Tabela 3).
As plantas de laranja ‘Valência’ Vat2 e Vat12 apresentaram menores populações
bacterianas que os controles positivos ‘Valência’ testemunha (não transgênica) e Vat18 (planta
com alta população bacteriana determinada pelo isolamento). Esses resultados foram similares
aos obtidos no isolamento em meio de cultura, no qual as plantas Vat2 e Vat12 apresentaram
menor população bacteriana que a planta Vat18, no entanto, foram semelhantes à testemunha
(Tabela 3).
A análise de qPCR das plantas transgênicas de laranja demonstrou que as plantas
testemunhas (não transgênicas), com exceção da laranja ‘Valência’ testemunha, mantiveram a
mesma tendência observada no isolamento, apresentando populações bacterianas similares ou
menores que as plantas transgênicas. Baseando-se nos resultados do experimento com avaliação
do desenvolvimento de X. fastidiosa em plantas de laranja doce juvenil e adulta (Item 4.2.2),
sugere-se que o estágio de desenvolvimento das plantas testemunha (tecido adulto) pode ter
influenciado no desenvolvimento da bactéria X. fastidiosa, dificultando a comparação da
população bacteriana entre as plantas em estudo. Embora as plantas testemunhas (tecido adulto)
tenham sido inadequadas, a análise de qPCR permitiu detectar duas plantas (Vat2 e Vat12) com
menores populações bacterianas que a testemunha. No entanto, nessa análise não foi possível
confirmar o resultado das plantas Pat6 e Pat7 no isolamento aos oito meses após inoculação, onde
apresentaram menores populações bacterianas em comparação com a testemunha.
4.2.2 Avaliação do desenvolvimento da Xylella fastidiosa em plantas laranja doce não
transgênicas juvenis e adultas
Plantas não transgênicas de laranja doce juvenis e adultas, propagadas por enxertia, foram
inoculadas com X. fastidiosa para avaliação do desenvolvimento da bactéria e expressão dos
sintomas de clorose variegada dos citros.
A porcentagem de plantas infectadas com X. fastidiosa determinada pelo isolamento em
meio de cultura aos quatro meses da inoculação foi de 100% em todos os tratamentos avaliados.
70
A detecção da bactéria nas folhas por PCR aos quatro meses variou de 54 a 93% (Tabela 4). A
alta porcentagem de plantas infectadas confirma a eficiência da inoculação mecânica com
alfinete. Resultados similares na porcentagem de plantas infectadas com X. fastidiosa foram
encontrados por Lopes et al. (2005) em que a inoculação mecânica com alfinete “em seedlings”,
resultou em 95% e 96% de plantas infectadas para as laranjas ‘Pêra’ e ‘Valência’,
respectivamente.
Tabela 4 – Porcentagem de plantas infectadas determinadas pelo isolamento em meio de cultura e PCR em
plantas juvenis e adultas de laranja ‘Pêra’ e ‘Valência’, inoculadas com X. fastidiosa
Plantas infectadas (%)
1
Tratamentos
Isolamento (4 meses) PCR + (4 meses)
‘Pêra’ juvenil
100 87
‘Pêra’ adulta
100 87
‘Valência’ juvenil
100 93
‘Valência’ adulta
100 54
1
Porcentagem de plantas infectadas em relação ao total de 15 plantas avaliadas, determinada pelo isolamento em meio de cultura
e PCR aos quatro meses da inoculação.
Em relação à população bacteriana recuperada pelo isolamento em meio de cultura aos
quatro e oito meses da inoculação, foi observado que os tratamentos com plantas juvenis de
laranja ‘Pêra’ e ‘Valência’ apresentaram crescimento bacteriano significativamente superior em
comparação às plantas adultas, para as duas variedades comparadas separadamente. Aos oito
meses, observou-se uma redução da população bacteriana em todos os tratamentos, com exceção
da laranja ‘Valência’ adulta (VA), que teve sua população um pouco elevada. Essa variação na
população bacteriana aos oito meses da inoculação também foi encontrada nos experimentos com
as plantas transgênicas contendo o gene attA (Figura 20).
As plantas juvenis de laranja ‘Pêra’ apresentaram aumento de 5% e 22% na população
bacteriana em relação às plantas adultas da mesma variedade, aos quatro e oito meses,
respectivamente. E as plantas juvenis de laranja ‘Valência’ apresentaram aumento de 14% e 37%
na população bacteriana em comparação às plantas adultas da mesma variedade, aos quatro e oito
meses, respectivamente.
Os testes de PCR das colônias crescidas no isolamento aos quatro e oito meses
confirmaram que a bactéria era X. fastidiosa.
71
b
a
b
a
a
b
a
b
0
1
2
3
4
5
6
7
PJ PA VJ VA
Pêra Valência
População bacteriana
(Log UFC g tecido
-1
)
4 meses 8 meses
Figura 20 - População bacteriana de X. fastidiosa (Log UFC g tecido
-1
) em plantas de laranja doce
determinadas por isolamento aos 4 e 8 meses após inoculação. Média de 15 plantas. PJ – Pêra
juvenil; PA – Pêra adulta; VJ – Valência juvenil e VA – Valência adulta. Barras de erro
representam o erro padrão da média. Médias seguidas de mesma letra em cada época de
avaliação não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05). As variedades foram comparadas
separadamente
O início de aparecimento dos sintomas de CVC foi aos quatro meses após a inoculação
em todos os tratamentos, sendo que a maior porcentagem de plantas sintomáticas foi observada
no tratamento laranja ‘Pêra’ juvenil (53%). Na avaliação dos sintomas aos oito meses da
inoculação, as plantas juvenis de laranja ‘Pêra’ e laranja ‘Valência’ apresentaram o dobro de
plantas sintomáticas em relação às plantas adultas. O tratamento laranja ‘Pêra’ juvenil, desde os
seis meses apresentou todas as suas plantas com sintomas de CVC. Essa precocidade da laranja
‘Pêra’ confirma sua característica de maior suscetibilidade a CVC (Figura 21A e 22).
Em relação à porcentagem de folhas sintomáticas, os tratamentos com plantas juvenis das
duas variedades apresentaram uma porcentagem superior em comparação às plantas adultas. As
plantas juvenis de laranja ‘Pêra’ apresentaram uma porcentagem de folhas sintomáticas duas
vezes maior que as plantas adultas e as plantas juvenis de laranja ‘Valência’ apresentaram uma
porcentagem de folhas sintomáticas três vezes maior que as plantas adultas da mesma variedade
(Figura 21B).
72
A B
Figura 21 – Plantas de laranja ‘Pêra’ e ‘Valência’ inoculadas com X. fastidiosa. PJ – ‘Pêra’ juvenil; PA – ‘Pêra’
adulta; VJ – ‘Valência’ juvenil e VA – ‘Valência’ adulta. A) Porcentagem de plantas com sintomas
de CVC aos 4 e 8 meses após inoculação; B) Porcentagem de folhas com sintomáticas aos oito meses
após inoculação. Média de 15 plantas. Os dados de porcentagem de folhas sintomáticas foram
transformados em √X+1. Barras de erro representam o erro padrão da média. Letras diferentes no
topo das barras, representam diferença pelo teste de Tukey (P<0,05). As variedades foram
comparadas separadamente
Figura 22 - A) Plantas juvenis e adultas de laranja ‘Pêra’ e ‘Valência’ em casa de vegetação com seis meses
após inoculação com X. fastidiosa; B) Sintomas de CVC em folhas de plantas juvenis de laranja
‘Pêra’
b
a
b
a
0
5
10
15
20
25
30
PJ PA VJ VA
Pêra Valência
Folhas sintomáticas (%)
B
0
20
40
60
80
100
120
PJ PA VJ VA
Pêra Valência
Plantas sintomáticas (%)
4 meses 8 meses
A
73
Esses resultados indicam que o estágio juvenil das laranjas ‘Pêra’ e ‘Valência’ influenciou
tanto na colonização da bactéria como na expressão dos sintomas de CVC. Assim, sugere-se que
nas plantas juvenis de laranja doce a bactéria X. fastidiosa está se movimentando e colonizando
os vasos do xilema com maior facilidade. De acordo com Fry; Milholland, (1990) e Hopkins
(1995), a oclusão dos vasos do xilema pela formação de agregados de células, dificultando a
translocação de água e nutrientes, é a hipótese mais aceita para explicar o mecanismo de
patogênese da X. fastidiosa.
Dessa forma, esse resultados justificam o comportamento das plantas testemunhas de
laranja doce (tecido adulto) nos experimentos com as plantas de laranja ‘Hamlin’, ‘Natal’, ‘Pêra’
e ‘Valência’ transformadas com o gene attA e inoculadas com X. fastidiosa, nos quais as plantas
testemunhas apresentaram populações bacterianas semelhantes ou inferiores às plantas
transgênicas e menores porcentagens de plantas com sintomas de CVC. Assim, a comparação das
plantas transgênicas e a distinção de plantas potencialmente tolerantes ao patógeno foi dificultada
nestes experimentos.
A) Análise dos experimentos com as plantas transgênicas de laranja ‘Valência’ e ‘Pêra’
contendo o gene attA ajustando a diferença encontrada no experimento com plantas juvenis
e adultas de laranja doce
Na tentativa de estimar o resultado dos experimentos com as plantas transgênicas de
laranja doce contendo o gene attA, caso tivessem sido analisadas e comparadas com plantas
testemunhas juvenis, foi realizado um acréscimo na população bacteriana de X. fastidiosa do
tratamento testemunha (tecido adulto) e realizada nova análise estatística dos dados. Esse
acréscimo refere-se à diferença encontrada na população bacteriana das plantas de laranja doce
juvenis e adultas do experimento acima.
No experimento com as plantas transgênicas de laranja ‘Pêra’ foi realizado um acréscimo
de 5% e 22% na população bacteriana do tratamento testemunha determinada pelo isolamento aos
quatro e oito meses após inoculação, respectivamente. Após nova análise estatística, estimou-se
que aos quatro meses após inoculação, as populações bacterianas das plantas transgênicas
continuaram semelhantes à testemunha. No entanto, aos oito meses todas as plantas transgênicas
74
a
ab
ab
ab
b
ab
c
c
bc
b
b
a
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Pat6 Pat7 Pat8 Pat10 Pat15 TEST
Plantas de citros
População bacteriana
(Log UFC g tecido
-1
)
4 meses 8 meses
apresentaram menores populações bacterianas em comparação à testemunha (plantas não
transgênicas) (Figura 23).
Figura 23 – População bacteriana de X. fastidiosa (Log UFC g tecido
-1
) em plantas de laranja ‘Pêra’
transformadas com gene attA, aos 4 e 8 meses após inoculação. Médias de dois experimentos
independentes. Barras de erro representam o erro padrão da média. Médias seguidas de mesma
letra em cada época de avaliação não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05)
Para o experimento com as plantas transgênicas de laranja ‘Valência’ foi realizado um
acréscimo de 14% e 37% na população bacteriana do tratamento testemunha determinada pelo
isolamento em meio de cultura aos quatro e oito meses após inoculação, respectivamente. Após
nova análise estatística, estimou-se que aos quatro meses após inoculação, cinco plantas
transgênicas (Vat2, Vat11, Vat12, Vat13 e Vat20) apresentaram menores populações bacterianas
quando comparadas à testemunha. Entretanto, aos oito meses essas plantas não diferiram da
testemunha, pois as plantas testemunhas apresentaram uma expressiva redução na população
bactariana aos oito meses, assim, mesmo com o acréscimo de 37% não foi possível manter a
diferença observada aos quatro meses (Figura 24).
Esses resultados confirmam que estágio de desenvolvimento dos tecidos das plantas
testemunhas de laranja (tecido adulto) influenciou na distinção de plantas potencialmente
resistentes ao patógeno.
75
bc
bc
ab
c
bc
abc
ab
abc
bc
a
abc
abc
a
abc
ab
abc
c
bc
c
c
0
1
2
3
4
5
6
7
Vat2 Vat10 Vat11 Vat12 Vat13 Vat16 Vat17 Vat18 Vat20 TEST
Plantas de citros
População bacteriana
(Log UFC g tecido
-1
)
4 meses 8 meses
Figura 24 – População bacteriana de X. fastidiosa (Log UFC g tecido
-1
) em plantas de laranja ‘Valência’
transformadas com gene attA, aos 4 e 8 meses após inoculação. Médias de dois experimentos
independentes. Barras de erro representam o erro padrão da média. Médias seguidas de mesma
letra em cada época de avaliação não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05)
Embora a avaliação de resistência a X. fastidiosa em plantas transgênicas de laranja doce,
contendo o gene attA, tenha sido influenciada pelo estágio de maturação dos tecidos das plantas
testemunhas, as análises de isolamento em meio de cultura aos oito meses e PCR quantitativo
permitiram identificar quatro plantas (Pat6, Pat7, Vat2 e Vat12) com menores populações
bacterianas, quando comparadas às plantas testemunhas (não transgênicas) (Figura 10; Tabela 3).
Essa redução na população bacteriana, mesmo não considerando a influência do estágio de
maturação dos tecidos das plantas testemunhas, foi atribuída a uma provável ação bactericida da
proteína atacina A. No entanto, novos estudos devem ser realizados para avaliar a influência
dessa proteína no desenvolvimento da X. fastidiosa.
4.2.3 Avaliação da resistência à Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) em plantas de
laranja doce transformadas com o gene attA
Os primeiros sintomas de cancro cítrico foram observados entre quatro e cinco dias da
inoculação com Xac nas plantas de laranja ‘Hamlin’ (transgênicas e não transgênicas) e entre
sétimo e oitavo dia nas plantas de laranja ‘Natal’, ‘Pêra’ e ‘Valência’. Essa diferença no
76
aparecimento dos sintomas pode está relacionada com as características de suscetibilidade ao
patógeno entre as variedades. De acordo com Leite Júnior (1990), as variedades Valência e Pêra
são classificadas como moderadamente resistentes à bactéria Xac, a variedade Natal como
moderadamente suscetível e a variedade Hamlin como suscetível. Os sintomas iniciais da doença
em todas as variedades foram pequenas lesões translúcidas distribuídas irregularmente na folha,
vistas com maior facilidade na fase inferior do limbo e quando colocadas contra a luz. A partir do
décimo dia, as lesões foram aumentando de tamanho e tornando-se amareladas, após 30 dias da
inoculação, as lesões ficaram amarronzadas, com formato redondo a irregular, salientes nos dois
lados da folha e apresentado halo amarelado (Figura 29). Além dos sintomas nas folhas, foram
observadas também lesões no caule e nos espinhos da variedade de laranja ‘Hamlin’. Essa
característica confirma a maior suscetibilidade dessa variedade ao patógeno. Segundo Stall e
Seymour (1983), lesões em ramos são encontradas, principalmente, em cultivares muito
suscetíveis a doença.
Lesões de cancro cítrico foram observadas em todos os tratamentos (plantas transgênicas
e testemunhas) de todos os experimentos. A incidência média da doença variou de 73 a 100%
entre as plantas de todos os experimentos, sendo que a maioria dos tratamentos apresentou
incidência acima 90% e apenas a planta Nat1 apresentou 73% de incidência. A quantificação da
severidade da doença foi realizada 30 dias após inoculação em todos os experimentos. Os dados
de severidade das plantas transgênicas foram calculados em função da porcentagem de
severidade da testemunha.
A quantificação da doença das plantas transgênicas de laranja ‘Hamlin’ contendo o gene
attA, revelou que sete das oito plantas avaliadas apresentaram redução significativa na severidade
de cancro cítrico, sendo que as plantas Hat2, Hat8 e Hat12 apresentaram redução na severidade
em torno de 60% em comparação com a testemunha (Figura 25). Os resultados desse
experimento foram incluídos em trabalho já publicado (BOSCARIOL et al., 2006).
Entre as plantas de laranja ‘Natal’ foi observado que apenas a planta Nat1 apresentou
redução significativa na severidade de cancro cítrico (66%), quando comparada à testemunha.
(Figuras 26 e 29). Para as plantas de laranja ‘Pêra’ foi observado que nenhuma planta apresentou
redução significativa na severidade, quando comparada à testemunha (Figura 27). Entretanto,
para as plantas de laranja ‘Valência’, a quantificação da doença mostrou que oito das dez plantas
avaliadas apresentaram redução significativa na severidade de cancro cítrico, variando de 51 a
77
a
e
cde
de
bc
e
ab
e
bcd
0
20
40
60
80
100
120
Hat1 Hat2 Hat5 Hat8 Hat9 Hat10 Hat11 Hat12 TEST
Plantas de Citros
Severidade da doença
( % da testemunha)
ab
abc
a
ab
bc
bc
c
0
50
100
150
200
250
Nat1 Nat2 Nat4 Nat5 Nat7 Nat8 Test
Plantas de citros
Severidade da doença
(% da Testemunha)
77,8% quando comparadas à testemunha, com destaque para as plantas transgênicas Vat16 e
Vat17, que apresentaram reduções na severidade da doença de 73,5% e 77,8%, respectivamente
(Figuras 28 e 29).
Figura 25 - Severidade de cancro cítrico, 30 dias após inoculação com Xac, em plantas de laranja ‘Hamlin’
transformadas com o gene attA, comparadas com testemunha (planta não transgênica). Cada
barra representa a média de no mínimo 14 folhas de três experimentos independentes. Barras de
erro indicam o erro padrão da média. Letras diferentes no topo das barras representam diferença
significativa pelo teste de Tukey (P<0,05)
Figura 26 - Severidade de cancro cítrico, 30 dias após inoculação com Xac ,em plantas de laranja ‘Natal’
transformadas com o gene attA, comparadas com testemunha (planta não transgênica). Cada
barra representa a média de no mínimo 14 folhas de três experimentos independentes. Barras de
erro indicam o erro padrão da média. Letras diferentes no topo das barras representam diferença
significativa pelo teste de Tukey (P<0,05)
78
ab
ab
ab
b
ab
a
b
ab
0
40
80
120
160
200
Pat6 Pat7 Pat8 Pat10 Pat11 Pat12 Pat15 Test
Plantas de citros
Severidade da doença
(% da testemunha)
a
cd
abc
d
cd
cd
cd
cd
bcd
ab
cd
0
20
40
60
80
100
120
140
Vat2 Vat7 Vat10 Vat11 Vat12 Vat13 Vat16 Vat17 Vat18 Vat20 Test
Plantas de citros
Severidade da doença
(% da testemunha)
Figura 27 - Severidade de cancro cítrico, 30 dias após inoculação com Xac, em plantas de laranja ‘Pêra’
transformadas com o gene attA, comparadas com testemunha (planta não transgênica). Cada
barra representa a média de no mínimo 14 folhas de três experimentos independentes. Barras de
erro indicam o erro padrão da média. Letras diferentes no topo das barras representam diferença
significativa pelo teste de Tukey (P<0,05)
Figura 28 - Severidade de cancro cítrico, 30 dias após inoculação com Xac, em plantas de laranja ‘Valência’
transformadas com o gene attA, comparadas com testemunha (planta não transgênica). Cada
barra representa a média de no mínimo 14 folhas de três experimentos independentes. Barras de
erro indicam o erro padrão da média. Letras diferentes no topo das barras representam diferença
significativa pelo teste de Tukey (P<0,05)
79
Figura 29 - Sintomas de cancro cítrico em folhas de laranja transgênica, contendo o gene
attA, e não transgênica, aos 30 dias após a inoculação com Xac
Valência test
Vat17
Natal test
Pêra test
Pat7
Nat1
Hamlin test
Hat8
Valência test
Vat17
Natal test
Pêra test
Pat7
Nat1
Hamlin test
Hat8
80
A redução da severidade de cancro cítrico, observada na maioria das plantas dos
experimentos com laranja ‘Hamlin’ e ‘Valência’, sugere que o gene attA apresenta potencial para
o aumento da resistência de plantas de laranja doce a Xac. A influência da proteína atacina A no
desenvolvimento de resistência a bactérias também foi observado por Norelli; Aldwinckle
(1993), quando introduziram o gene attA em plantas de macieira e observaram alto nível de
resistência a Erwinia amylovora, agente causal do “fire blight”. Do mesmo modo, a proteína
atacina E aumentou a resistência a E. amylovora de macieira (KO et al., 2002) e pereira
(REYNORD et al., 1999) transformadas com o gene atacina E.
Entre as plantas transgênicas de laranja doce contendo o gene attA avaliadas quanto a
resistência as bactérias X. fastidiosa e Xac, as plantas Vat2 e Vat12 apresentaram redução no
crescimento de X. fastidiosa, determinada pelo qPCR aos 14 meses após inoculação (Tabela 3), e
redução na severidade de cancro cítrico determinada 30 dias após a inoculação com Xac (Figura
28). Embora tenha sido relatado por Reynord et al. (1999) e Boscariol et al.(2006) que nem
sempre os níveis de transcrição dos transgenes correspondem a expressão da resistência a
patógenos, para essas duas plantas observou-se altos níveis de expressão do gene attA (Figura
6D). Dessa forma, sugere-se que a proteína atacina A influenciou nos níveis de resistência a esses
patógenos.
4.3 Avaliação da resistência à Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) em plantas de laranja
doce transformadas com o gene Xa21
Os sintomas de cancro cítrico foram os mesmos observados nas plantas de laranja doce
transformadas com o gene attA (Item 4.2.3) (Figura 34). O início de aparecimento dos sintomas
da doença também foi mais precoce nas plantas (transgênicas e não transgênicas) de laranja
‘Hamlin’, entre quatro e cinco dias da inoculação com Xac, enquanto que nas outras variedades
(‘Natal’, ‘Pêra’ e ‘Valência’), foi entre o sétimo e oitavo dia da inoculação. Todos os tratamentos
(plantas transgênicas e testemunhas) de todas as variedades apresentaram lesões de cancro cítrico.
As plantas de laranja ‘Hamlin’ também apresentaram lesões no caule e nos espinhos confirmando
a suscetibilidade dessa variedade ao patógeno.
81
b
b
b
b
b
b
b
a
b
0
30
60
90
120
Hxa1 Hxa3 Hxa4 Hxa5 Hxa6 Hxa7 Hxa10 Hxa11 TEST
Plantas de citros
Severidade da doença
(% da testemunha)
A incidência média da doença variou de 70 a 100% entre as plantas, sendo que a maioria
das plantas dos experimentos com as laranjas ‘Hamlin’, ‘Pêra’ e ‘Valência’ apresentou incidência
acima 90%. As plantas de laranja ‘Natal’, Nxa16, Nxa9, Nxa10 e Nxa11, apresentaram 70% de
incidência. A quantificação da severidade da doença foi realizada 30 dias após inoculação em
todos os experimentos. Os dados de severidade das plantas transgênicas foram calculados em
função da porcentagem de severidade da testemunha.
Todas as plantas transgênicas de laranja ‘Hamlin’ apresentaram reduções significativas na
severidade de cancro cítrico variando de 35 a 58% em relação à testemunha, com destaque para
as plantas Hxa4 e Hxa11, que apresentaram reduções na severidade de 54% e 58%,
respectivamente (Figuras 30 e 34).
Figura 30 - Severidade de cancro cítrico, 30 dias após inoculação com Xac, em plantas de laranja ‘Hamlin’
transformadas com o gene Xa21, comparadas com testemunha (planta não transgênica). Cada
barra representa a média de no mínimo 14 folhas de três experimentos independentes. Barras de
erro indicam o erro padrão da média. Letras diferentes no topo das barras representam diferença
significativa pelo teste de Tukey (P<0,05)
Nos experimentos com as plantas transgênicas de laranja ‘Natal’ e ‘Pêra’, as plantas
Nxa11 e Pxa9 apresentaram reduções significativas na severidade da doença de 60% e 68%
respectivamente, em comparação as testemunhas. No experimento com a laranja ‘Valência’,
nenhuma planta transgênica diferiu da testemunha em relação à severidade de cancro cítrico
(Figuras 31, 32, 33 e 34).
82
a
a
a
a
b
0
30
60
90
120
Pxa9 Pxa10 Pxa13 Pxa14 Test
Plantas de citros
Severidade da doença
(% da testemunha)
d
cd
cd
cd
a
ab
abc
abc
abc
0
40
80
120
160
Nxa1 Nxa3 Nxa4 Nxa5 Nxa6 Nxa9 Nxa10 Nxa11 Test
Plantas de citros
Severidade da doença
(% da testemunha)
Figura 31 - Severidade de cancro cítrico, 30 dias após inoculação com Xac, em plantas de laranja ‘Natal’
transformadas com o gene Xa21, comparadas com testemunha (planta não transgênica). Cada
barra representa a média de no mínimo 14 folhas de três experimentos independentes. Barras de
erro indicam o erro padrão da média. Letras diferentes no topo das barras representam diferença
significativa pelo teste de Tukey (P<0,05)
Figura 32 - Severidade de cancro cítrico, 30 dias após inoculação com Xac, em plantas de laranja ‘Pêra’
transformadas com o gene Xa21, comparadas com testemunha (planta não transgênica). Cada
barra representa a média de no mínimo 14 folhas de três experimentos independentes. Barras de
erro indicam o erro padrão da média. Letras diferentes no topo das barras representam diferença
significativa pelo teste de Tukey (P<0,05)
83
ab
a
b
ab
ab
b
ab
0
30
60
90
120
150
180
Vxa1 Vxa3 Vxa4 Vxa5 Vxa7 Vxa8 Test
Plantas de citros
Severidade da doença
(% da testemunha)
Figura 33 - Severidade de cancro cítrico, 30 dias após inoculação com Xac, em plantas de laranja ‘Valência’
transformadas com o gene Xa21, comparadas com testemunha (planta não transgênica). Cada
barra representa a média de no mínimo 14 folhas de três experimentos independentes. Barras de
erro indicam o erro padrão da média. Letras diferentes no topo das barras representam diferença
significativa pelo teste de Tukey (P<0,05)
Com base nesses resultados de redução de severidade do cancro cítrico em todas as
plantas de laranja ‘Hamlin’ e nas plantas Nxa11 e Pxa9 de laranja de ‘Natal’ e ‘Pêra’,
respectivamente, sugere-se que o gene Xa21 apresenta potencial para conferir resistência à
bactéria Xac em plantas de laranja doce. Esse resultado está de acordo à hipótese levantada por
alguns autores (DENG; GMITTER, 2003; BOSCARIOL, 2004; OMAR; SONG; GROSSER,
2007) de que o gene Xa21, por apresentar ação contra bactérias do gênero Xanthomonas
(WANGA et al., 1996; TU et al., 1998), pode auxiliar na obtenção plantas de citros com
resistência a bactéria X. axonopodis pv citri.
Analisando-se os resultados das plantas transgênicas de laranja contendo o gene attA e
das plantas contendo o gene Xa21 com relação a avaliação de resistência à bactéria Xac, observa-
se que nos experimentos com a variedade Hamlin foi possível detectar maior número de plantas
transgênicas com menor severidade de cancro cítrico em comparação a testemunha.
Considerando-se que os experimento foram conduzidos nas mesmas condições, com igual
concentração do isolado de Xac e que a variedade ‘Hamlin’ é mais suscetível ao patógeno em
estudo, sugere-se que os diferentes graus de suscetibilidade das variedades de laranja podem
influenciar na resposta dos transgenes.
84
Figura 34 - Sintomas de cancro cítrico em folhas de laranja transgênica, contendo o gene
Xa21, e não transgênica, aos 30 dias após a inoculação com Xac
Natal test
Hxa4
Valência test
Nxa11
Pêra test
Vxa4
Pxa9
Hamlin test
Natal test
Hxa4
Valência test
Nxa11
Pêra test
Vxa4
Pxa9
Hamlin test
85
5 CONCLUSÕES
O nível de resistência de plantas de laranja doce a X. fastidiosa pode ser influenciado pela
presença da proteína atacina A, produzida pelo transgene attA;
A suscetibilidade de plantas de laranja doce a X. axonopodis pv. citri é reduzida pela
presença da proteína atacina A;
A introdução do gene Xa21 de arroz no genoma de Citrus sinensis influencia o nível de
resistência a X. axonopodis pv. citri.
86
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98
ANEXO
99
Meio de cultura sólido para Xylella fastidiosa – “Periwinkle wilt gelrite” (PWG)
Água destilada 900 mL.L
-1
Phytone Peptone 4,0 g.L
-1
Tryptcase Peptone 1,0 g. L
-1
MgSO
4
y 7H
2
O (Sulfato de Magnésio) 0,4 g. L
-1
K
2
HPO
4
y 3H
2
O (Fosfato de Potássio Dibásico) 1,2 g. L
-1
KH
2
PO
4
(Fosfato de Potássio Monobásico) 1,0 g. L
-1
Phenol Red (solução estoque 0,2%) 10 g. L
-1
Hemin Cloride (solução estoque) 10 g. L
-1
Gelrite Gellan Gum 8,0 g. L
-1
L-glutamina 4,0 g. L
-1
/ 50 mL.L
-1
BSA (Albumina de soro bovino) 3,0 g / 100 mL.L
-1
Autoclavar por 20 minutos, a uma pressão de 15 psi 15 psi
Meio de cultura sólido para Xantomonas axonopodis pv citri – Ágar nutrientes (NA)
Extrato de carne 3,0 g. L
-1
Peptona 5,0 g. L
-1
Ágar 20 g. L
-1
Água destilada 1000 mL
-1
pH 7.2
Autoclavar por 20 minutos, a uma pressão de 15 psi
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