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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E BIOFÍSICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS:
FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PAPEL DOS RECEPTORES CANABINÓIDES
EM UM MODELO EXPERIMENTAL DE
ANGIOGÊNESE INFLAMATÓRIA
Rodrigo Guabiraba Brito
2007
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Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E BIOFÍSICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS:
FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PAPEL DOS RECEPTORES CANABINÓIDES EM
UM MODELO EXPERIMENTAL DE ANGIOGÊNESE
INFLAMATÓRIA
Dissertação apresentada
ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências Biológicas:
Fisiologia e Farmacologia,
do Instituto de Ciências
Biológicas, Universidade
Federal de Minas Gerais,
como pré-requisito para a
obtenção do título de mestre
em Ciências Biológicas:
Ênfase em Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Mauro Martins Teixeira
Aluno: Rodrigo Guabiraba Brito
Belo Horizonte
2007
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Aos sempre supercondutores
do livre pensamento e do
conhecimento irrestrito, Frank
Zappa, Sir Henry Dale e Adélia
Prado.
Ensinamento
Minha mãe achava estudo
a coisa mais fina do mundo.
Não é.
A coisa mais fina do mundo é o sentimento.
Aquele dia de noite, o pai fazendo serão,
ela falou comigo:
"Coitado, até essa hora no serviço pesado".
Arrumou pão e café, deixou tacho no fogo com água quente.
Não me falou em amor.
Essa palavra de luxo.
Adélia Prado
“…There was wanting, it
seemed to me, only one item
of evidence to justify
certainty as to the nature
of this substance, namely, a
proof that acetylcholine
itself, and not merely some
choline ester of closely
similar properties, was an
actual constituent of the
animal body…”
Sir Henry Dale, Nobel
Lecture, 1936
“…The pojama people are
boring me to pieces; They
make me feel like I am
wasting my time…”
Frank Zappa, Po-Jama People,
1975
Este trabalho foi desenvolvido com o apoio financeiro
do CNPq (CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO
CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO).
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo sistema completo, pelo todo.
Ao meu orientador, Mauro, pelos já “longos” anos de
ensinamentos científicos, repreensões construtivas, bom-humor
alternativo e apoio quase irrestrito às minhas incursões
entusiásticas pelo mundo experimental. Este trabalho também é
fruto de sua maquinaria produtiva.
A minha mãe, exemplo raro de perseverança e amor, pelo apoio
incondicional desde os primórdios. Hei de agradecer também
pelo carinho e pela ajuda no caminhar mais preciso.
Aos familiares realmente próximos, querida madrinha e
padrinho, pelas palavras de fé nas recaídas freqüentes do
viver na intrépida odisséia humana.
A Amanda Coelho, companheira de labuta e amiga, pela
participação mais que fundamental no desenvolvimento de todo
este trabalho. Devo muito desta criação à sua boa vontade e
altruísmo.
Aos sempre presentes colegas do Laboratório de
Imunofarmacologia, pelo apoio moral, imoral, técnico e
científico, em especial ao amigo Adriano, pela formação mais
do que complementar em “ciência geral”, a Lucíola, pelos
ensinamentos valiosos, a Ester pelo carinho e companheirismo,
ao Remo, pela amizade e delírio e também aos essenciais:
Angélica, Flávio, F. Lopes, Caio, Vanessa, Antônio, Kátia,
Michele, Cris, Rafael, Letícia, Carol, Valdinéria, Dani Sachs
e tantos outros bons amigos, sem os quais a sobrevivência
diária nestes últimos seis anos beiraria o absurdo maior.
Aos grandes amigos, imemoriais, Vinícius, Daniel Camargos,
Léo, companheiros inconstantes e ainda assim tão responsáveis
por toda esta forma nada convencional de “estudar” as coisas.
Aos amigos de “formação”, tão especiais, Lu, Thiago, Híggor,
André, Ana e Mateus, pelas conquistas divididas e pelos sempre
excelentes momentos de convívio dentro e fora deste Instituto
de Ciências Biológicas.
Aos amigos de alta afinidade, megalomania & non sense,
caríssimos Daniel Mansur, Chico, Bruno Eduardo, Diogo,
Gabriel Magno e Taíssa. Porque o mundo ainda realmente será
como deve ser: infinito.
A querida professora Salete, pela forma apaixonante de
traduzir ciência e vida em momentos mais do que agradáveis.
Este aprendizado é para a vida toda.
A Profa. Sílvia Passos e aos colegas do Laboratório de
Angiogênese, por todo apoio e colaboração durante este
trabalho.
A Profa. Mônica Ferreira, pela colaboração com as preparações
histológicas.
A Sanofi-Aventis, por ceder gentilmente os antagonistas
canabinóides utilizados neste estudo.
Ao Prof. Ary Corrêa Jr., pelo apoio com as fotografias.
A coordenação e membros da Pós-Graduação em Fisiologia e
Farmacologia, pelo incentivo.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS................................................................................................ XII
LISTA DE ABREVIATURAS.................................................................................XVIII
ABSTRACT.............................................................................................................XXI
RESUMO................................................................................................................XXII
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................23
1.1. INFLAMAÇÃO....................................................................................................23
1.1.1. O processo inflamatório ...........................................................................23
1.1.2. Resolução do processo inflamatório e reparo tecidual.............................25
1.1.3. Mediadores do processo inflamatório.......................................................27
1.2. ANGIOGÊNESE.................................................................................................28
1.2.1. Etapas do processo de neovascularização..............................................29
1.2.2. Regulação do processo angiogênico .......................................................31
1.2.3. Relação entre leucócitos e a resposta angiogênica.................................32
1.2.4. Modelos experimentais para o estudo da angiogênese...........................33
1.2.4.1. Modelo de implantação subcutânea de esponja................................34
1.3. CANABINÓIDES ................................................................................................35
1.3.1. Visão geral ...............................................................................................35
1.3.2. Os receptores canabinóides.....................................................................38
1.3.3. Os endocanabinóides...............................................................................40
1.3.4. Agonistas e antagonistas dos receptores canabinóides...........................44
1.3.5. Sistemas de sinalização dos receptores canabinóides............................46
1.3.5.1. Modelos de agonismo inverso ...........................................................49
1.3.6. Os canabinóides na inflamação e na angiogênese..................................51
2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS...........................................................................58
2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS..............................................................................59
3. MATERIAL E MÉTODOS .....................................................................................61
3.1 - Animais .............................................................................................................62
3.2 - Implantação da matriz esponjosa......................................................................62
3.3 – Quantificação da angiogênese pela dosagem de hemoglobina.......................64
3.4 - Quantificação da infiltração de neutrófilos no tecido pelo método de atividade
da mieloperoxidase (MPO)........................................................................................64
3.5 - Quantificação da infiltração de macrófagos no tecido pelo método de atividade
da n-acetilglicosaminidase (NAG) .............................................................................65
3.6 - Ensaio de ELISA para detecção de citocinas e quimiocinas.............................66
3.7 - Análise histológica das matrizes esponjosas....................................................68
3.8 - Análise estatística .............................................................................................68
3.9 – Delineamento experimental..............................................................................69
4. RESULTADOS......................................................................................................71
4.1. Efeitos do tratamento sistêmico com os antagonistas dos receptores CB1 e
CB2, SR141716A e SR 144528, respectivamente....................................................71
4.1.1. Efeitos sobre a concentração de hemoglobina na matriz esponjosa........71
4.1.2. Efeitos sobre o recrutamento celular para a matriz esponjosa.................72
4.1.3. Efeitos sobre a concentração de citocinas e quimiocinas na matriz
esponjosa...........................................................................................................75
4.2. Efeitos do tratamento sistêmico com agonista misto dos receptores
canabinóides WIN 55,212-2......................................................................................80
4.2.1. Efeitos sobre a concentração de hemoglobina na matriz esponjosa........80
4.2.2. Efeitos sobre o recrutamento celular para a matriz esponjosa.................81
4.2.3. Efeitos sobre a concentração de citocinas e quimiocinas na matriz
esponjosa...........................................................................................................83
4.3. Efeitos do tratamento local com agonista misto dos receptores canabinóides
WIN 55,212-2............................................................................................................87
4.3.1. Efeitos sobre a concentração de hemoglobina na matriz esponjosa........87
4.3.2. Efeitos sobre o recrutamento celular para a matriz esponjosa.................88
4.3.3. Efeitos sobre a concentração de citocinas e quimiocinas na matriz
esponjosa...........................................................................................................90
4.4. Análise histológica dos implantes de esponja após tratamentos com os
antagonistas canabinóides SR141716A (CB
1
) e SR144528 (CB
2
), e com o agonista
canabinóide misto WIN 55,212-2 ..............................................................................94
4.4.1 – Efeitos do tratamento com antagonistas dos receptores canabinóides
sobre o perfil histológico da matriz esponjosa após implante subcutâneo.........95
4.4.2 – Efeitos do tratamento com o agonista misto dos receptores canabinóides
sobre o perfil histológico da matriz esponjosa após implante subcutâneo.........98
5. DISCUSSÃO .......................................................................................................103
6. CONCLUSÃO .....................................................................................................122
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................124
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Esquema simplificado mostrando as etapas do recrutamento leucocitário,
mais precisamente de neutrófilos..............................................................................24
FIGURA 2: Mediadores e células envolvidas no processo de reparo tecidual e
formação do tecido de granulação após lesão inflamatória (neutrófilos, macrófagos,
plaquetas e fibroblastos). ..........................................................................................26
FIGURA 3: Esquema simplificado das etapas envolvidas na neovascularização.....30
FIGURA 4: Estrutura molecular do fitocanabinóide Δ-9-THC....................................36
FIGURA 5: Estrutura de alguns dos endocanabinóides mais estudados. (A):
anandamida; (B): 2-Araquidonoilglicerol (2-AG); (C): 2-Araquidonoildopamina; (D):
Virodamina................................................................................................................42
FIGURA 6: Mecanismo bioquímico de formação da anandamida em tecidos
biológicos. .................................................................................................................43
FIGURA 7: Mecanismos de ação intracelulares do endocanabinóide 2-AG (2-
araquidonoilglicerol), mediados por receptor canabinóide. .......................................44
FIGURA 8: Agonistas e antagonistas canabinóides. (A) O agonista “não clássico”
CP55,940; (B) O aminoalquilindóis WIN 55,212-2; Os antagonistas di-aril-pirazóis
SR141716A (C) e SR144528 (D)..............................................................................45
FIGURA 9: Sistema de sinalização dos receptores canabinóides.............................48
FIGURA 10: Mecanismo intracelular após ativação de receptor canabinóide em
célula endotelial ou tumoral, por exemplo.................................................................55
XII
FIGURA 11: Matriz esponjosa. Aspecto da esponja antes da implantação (A) e após
14 dias de implantação (B)........................................................................................63
FIGURA 12: Tabela esquemática para o delineamento experimental proposto........69
FIGURA 13: Efeito do tratamento com os antagonistas canabinóides SR141716
(CB
1
) e SR144528 (CB
2
), 10 mg/Kg (200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre
a formação de novos vasos, quantificada através da dosagem de hemoglobina na
esponja (método de Drabkin)....................................................................................72
FIGURA 14: Efeito do tratamento com os antagonistas canabinóides SR141716
(CB
1
) e SR144528 (CB
2
), 10 mg/Kg (200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre
o recrutamento de neutrófilos, quantificado através da dosagem da atividade da
mieloperoxidase (MPO).............................................................................................74
FIGURA 15: Efeito do tratamento com os antagonistas canabinóides SR141716
(CB
1
) e SR144528 (CB
2
), 10 mg/Kg (200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre
o recrutamento de macrófagos, quantificado através da dosagem da atividade da N-
acetilglicosaminidase (NAG). ....................................................................................75
FIGURA 16: Efeito do tratamento com os antagonistas canabinóides SR141716
(CB
1
) e SR144528 (CB
2
), 10 mg/Kg (200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre
a concentração de TNF-α, quantificada por ELISA...................................................77
FIGURA 17: Efeito do tratamento com os antagonistas canabinóides SR141716
(CB
1
) e SR144528 (CB
2
), 10 mg/Kg (200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre
a concentração de VEGF, quantificada por ELISA....................................................77
XIII
FIGURA 18: Efeito do tratamento com os antagonistas canabinóides SR141716
(CB
1
) e SR144528 (CB
2
), 10 mg/Kg (200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre
a concentração de CXCL1-3/KC, quantificada por ELISA.........................................78
FIGURA 19: Efeito do tratamento com os antagonistas canabinóides SR141716
(CB
1
) e SR144528 (CB
2
), 10 mg/Kg (200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre
a concentração de CCL5/RANTES, quantificada por ELISA.....................................79
FIGURA 20: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2, 3
e 10 mg/Kg (200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre a formação de novos
vasos, quantificada através da dosagem de hemoglobina na esponja (método de
Drabkin).....................................................................................................................81
FIGURA 21: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2, 3
e 10 mg/Kg (200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre o recrutamento de
neutrófilos, quantificado através da dosagem da atividade da mieloperoxidase
(MPO)........................................................................................................................82
FIGURA 22: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2, 3
e 10 mg/Kg (200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre o recrutamento de
macrófagos, quantificado através da dosagem da atividade da N-
acetilglicosaminidase (NAG). ....................................................................................83
FIGURA 23: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2, 3
e 10 mg/Kg (200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre a concentração de TNF-
α, quantificada por ELISA. ........................................................................................84
FIGURA 24: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2, 3
e 10 mg/Kg (200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre a concentração de
VEGF, quantificada por ELISA..................................................................................85
XIV
FIGURA 25: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2, 3
e 10 mg/Kg (200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre a concentração de
CXCL1-3/KC, quantificada por ELISA.......................................................................86
FIGURA 26: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2, 3
e 10 mg/Kg (200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre a concentração de
CCL2/JE, quantificada por ELISA. ............................................................................86
FIGURA 27: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2,
30 e 100 μg/local (50 μL/local/animal), durante 7 e 14 dias, sobre a formação de
novos vasos, quantificada através da dosagem de hemoglobina na esponja (método
de Drabkin)................................................................................................................88
FIGURA 28: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2,
30 e 100 μg/local (50 μL/local/animal), durante 7 e 14 dias, sobre o recrutamento de
neutrófilos, quantificado através da dosagem da atividade da mieloperoxidase
(MPO)........................................................................................................................89
FIGURA 29: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2,
30 e 100 μg/local (50 μL/local/animal), durante 7 e 14 dias, sobre o recrutamento de
macrófagos, quantificado através da dosagem da atividade da N-
acetilglicosaminidase (NAG). ....................................................................................90
FIGURA 30: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2,
30 e 100 μg/local (50 μL/local/animal), durante 7 e 14 dias, sobre a concentração de
TNF-α, quantificada por ELISA. ................................................................................91
FIGURA 31: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2,
30 e 100 μg/local (50 μL/local/animal), durante 7 e 14 dias, sobre a concentração de
VEGF, quantificada por ELISA..................................................................................92
XV
FIGURA 32: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2,
30 e 100 μg/local (50 μL/local/animal), durante 7 e 14 dias, sobre a concentração de
CXCL1-3/KC, quantificada por ELISA.......................................................................93
FIGURA 33: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2,
30 e 100 μg/local (50 μL/local/animal), durante 7 e 14 dias, sobre a concentração de
CCL2/JE, quantificada por ELISA. ............................................................................93
FIGURA 34: Cortes histológicos, corados por H.E., representativos do tecido
fibrovascular induzido, em implantes subcutâneos de matriz esponjosa, em animais
tratados com os antagonistas canabinóides SR141716A e SR144528 (10 mg/Kg) por
7 dias.........................................................................................................................96
FIGURA 35: Cortes histológicos, corados por H.E., representativos do tecido
fibrovascular induzido, em implantes subcutâneos de matriz esponjosa, em animais
tratados com os antagonistas canabinóides SR141716A e SR144528 (10 mg/Kg) por
14 dias.......................................................................................................................97
FIGURA 36: Cortes histológicos, corados por H.E., representativos do tecido
fibrovascular induzido, em implantes subcutâneos de matriz esponjosa, em animais
tratados sistemicamente com o agonista canabinóide WIN 55,212-2 por 7 dias. .....99
FIGURA 37: Cortes histológicos, corados por H.E., representativos do tecido
fibrovascular induzido, em implantes subcutâneos de matriz esponjosa, em animais
tratados sistemicamente com o agonista canabinóide WIN 55,212-2 por 14 dias. .100
FIGURA 38: Cortes histológicos, corados por H.E., representativos do tecido
fibrovascular induzido, em implantes subcutâneos de matriz esponjosa, em animais
tratados localmente com o agonista canabinóide WIN 55,212-2 por 14 dias..........100
XVI
LISTA DE ABREVIATURAS
Δ-9-THC - delta-9-tetrahidrocanabinol
2-AG - 2-araquidonoilglicerol
AKT (PKB) - Proteína quinase B
AMPc - Monofosfato de adenosina cíclico
Ang2 - Angiopoietina 2
BSA - soroalbumina bovina
CB
1
- Receptor canabinóide do tipo 1
CB
2
- Receptor canabinóide do tipo 2
cDNA - DNA complementar
CCL2 (JE) - Proteína quimiotática para monócito – 1 (MCP-1)
CXC - Grupo de quimiocionas com uma cisteína entre os dois resíduos amino-
terminais
CXCL1-3 (KC) - Quimiocina derivada de queratinócito
dH
2
O - água destilada
DMSO - dimetilsulfóxido
EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético (“EthyleneDiamineTetrAcetic acid”).
ERK - extracelular signal-regulated kinase
ELISA - “Enzyme-linked immunosorbent assay”
EPM - Erro padrão da média
FAN - fator associado com a ativação neutra da esfingomielinase
g - Gramas
GPCRs - Receptores acoplados à proteína G
GTP - Trifosfato de Guanina
H
2
O
2
- Peróxido de hidrogênio
H
2
SO
4
- Ácido sulfúrico
H.E. - Hematoxilina e Eosina
HTAB - Brometo de “hexadecyltrimethylammonium”.
HU-210 - dexabinol
i.p. - Intraperitoneal
ICAM ( ) - Molécula de adesão celular (“Cell Adhesion Molecule”) ( )
IFN-γ - Interferon do tipo gama
XVIII
IL - ( ) - interleucina ( )
IL-1 - Interleucina -1
IL-6 - Interleucina -6
IL-10 - Interleucina -10
IP - Intra-peritoneal
kD - Kilodalton
Kg - Kilogramas
LPS - Lipopolissacarídeo da parede bacteriana
M - Matriz
MadCAM - Adressina vascular de mucosa
MAP - mitogen-activated protein
MEK - mitogen-activated protein kinase kinase
MCP-( ) - Proteína quimiotática para monócito – ( )
MCP-1 - Proteína quimiotática para monócito - 1
mg - Miligramas
Milli-Q H
2
O - água ultra pura
min - Minutos
MIP-1α (CCL3) - Macrophage inflammatory protein 1
α
mL - Mililitros
mM - Milimolar
MMP ( ) - Metaloproteinase de matriz tipo ( )
MMPs - Metaloproteinases de matriz (“Matrix Metalloproteinases”)
MPO - Mieloperoxidase.
MMPs - Metaloproteinases
μg - microgramas
μm - micrometros
n - número de animais
NaCl - Cloreto de sódio
NaEDTA - EDTA de sódio
NAG - N-acetilglicosaminidase
NAPE - N-araquidonoil fosfatidiletanolamina
NaPO
4
- Fosfato de sódio
NF-κB - Fator nuclear κB
XIX
nM - NanoMolar
nm - Nanômetro
NO - Óxido nítrico
NO-sintase - Óxido nítrico sintase
O. D. - Densidade óptica
o
C - Graus celsius
PAF - Platelet activating factor (Fator de ativação plaquetária)
PBS - Tampão fosfato de sódio (“Phosphate-buffered saline”).
PE 10 - polipropileno 10
PECAM - Molécula de adesão celular endotélio-plaqueta
pg - picogramas
PI3K - fosfoinositídio 3´-quinase
PKA - Proteína quinase A
PKC - Proteína quinase C
PLC - Fosfolipase C
RANTES (CCL5) - Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and
Secreted
rpm - Rotações por minuto
s.c. - Subcutâneo
SDS - Dodecil sulfato de sódio Sodium dodecyl sulfate
TGF-β - Fator de crescimento transformador beta (“Transforming growth factor β”)
TIMP - Inibidores teciduais de metaloproteinases de matriz (“Tissue inhibitor of
MMPs”)
TNF-α - Fator de necrose tumoral alfa
tPA - Ativador de plasminogênio tipo tecidual (“Tissue type plasminogen
activator”)
Tris - (Hydroxymethyl)aminomethane
uPA - Ativador de plasminogênio tipo uroquinase (“Urokinase-type plasminogen
activator”)
uPAR - receptor uPA
VCAM ( ) - moléculas de adesão em células vasculares ( )
VEGF - Fator de crescimento vascular endotelial (Vascular endothelial growth
factor)
XX
ABSTRACT
Angiogenesis depends on a complex network of cells and mediators. The
activation or blockade of cannabinoid receptors showed to be an interesting
pharmacological strategy to attenuate the angiogenic and/or inflammatory response
in many experimental models. Here we investigated how this strategy may interfere
in inflammatory angiogenesis. Polyester-polyurethane sponges were implanted in
C57BL/6 mice. Animals received daily doses (10 mg/kg, s.c.) of the cannabinoid
antagonists SR141716A (CB
1
) and SR144528 (CB
2
), separately, or 3 and 10 mg/Kg
(30 or 100 μg/mice, for the local treatment) (s.c.) of the cannabinoid CB
1
/CB
2
agonist
WIN 55212-2, for 7 or 14 days. The implants were then collected for ELISA,
hemoglobin, myeloperoxidase and N-acetylglucosaminidase measurements, used as
indexes for angiogenesis, neutrophil and macrophage accumulation, respectively.
Histological analysis was also conducted. CB
1
or CB
2
receptor antagonist treatment
was able to reduce cellular influx to the sponge at 7 and 14 days, with distinctive
pattern for macrophages and neutrophils. The CB
1
/CB
2
agonist also reduced cellular
influx. Both treatments affected angiogenesis. These alterations were accompanied
by changes in the levels of TNF-α, VEGF, CXCL1-3/KC, CCL2/JE and RANTES,
depending on the treatment. All changes correspond to a similar pattern in the
histological analysis. The blockade or activation of cannabinoid receptors showed to
be effective in reducing inflammatory and angiogenic responses. Altough acting in a
similar way, levels of cytokines, chemokines and endocannabinoids may help explain
this paradoxal response. Partial agonism / inverse agonism activity and receptor
desensitization is another explanation for these responses.
Keywords: angiogenesis, inflammation, cannabinoid receptors, cytokines
XXI
RESUMO
A angiogênese é controlada por uma complexa rede de células e mediadores.
A ativação ou bloqueio de receptores canabinóides demonstram ser uma
interessante estratégia farmacológica para atenuar a resposta angiogênica e/ou
inflamatória em vários modelos experimentais. Aqui investigamos como esta
estratégia pode interferir na angiogênese inflamatória. Esponjas de polyester-
poliuretana foram implantadas em camundongos C57BL/6. Os animais receberam
doses diárias (10 mg/Kg, s.c.) dos antagonistas canabinóides SR141716A (CB1) and
SR144528 (CB2), separadamente, ou 3 e 10 mg/Kg (30 ou 100 μg/animal, para o
tratamento local) (s.c.) do agonista CB
1
/CB
2
WIN 55,212-2, por 7 ou 14 dias. Os
implantes foram coletados para análises por ELISA, hemoglobina, mieloperoxidase e
N-acetilglicosaminidase, utilizadas, respectivamente, como index para mediadores
protéicos, angiogênese e acúmulo de neutrófilos e macrófagos, respectivamente. O
tratamento com os antagonistas CB
1
ou CB
2
levou à redução do influxo celular para
a matriz esponjosa nos dias 7 e 14, com padrões distintos para macrófagos e
neutrófilos. O agonista CB
1
/CB
2
também reduziu o influxo celular. Ambos os
tratamentos interferiram na angiogênese. Estas alterações foram acompanhadas por
mudanças nos níveis de TNF-α, VEGF, CXCL1-3/KC, CCL2/JE e RANTES,
dependendo do tratamento. Todas as mudanças apresentam padrões similares na
análise histológica. A ativação ou bloqueio de receptores canabinóides parece ser
efetivo em reduzir as respostas angiogênica e inflamatória. Embora agindo de forma
similar, níveis de citocinas, quimiocinas e endocanabinóides podem explicar esta
resposta paradoxal. Desensibilização dos receptores e atividade agonista parcial /
agonista inverso são outras explicações plausíveis para estas respostas.
Palavras chave: angiogênese, inflamação, receptores canabinóides, citocinas
XXII
PAPEL DOS RECEPTORES CANABINÓIDES EM UM MODELO EXPERIMENTAL DE
ANGIOGÊNESE INFLAMATÓRIA
INTRODUÇÃO
Introdução
1. INTRODUÇÃO
1.1. INFLAMAÇÃO
1.1.1. O processo inflamatório
A inflamação, o mecanismo filogenético e ontogeneticamente mais antigo,
(MAGOR, B. & MAGOR, K., 2001). É uma designação generalista para o conjunto
elaborado de reações que ocorrem em tecidos vascularizados após lesão
(mecânica, física ou química), infecções ou estimulação imunológica, com o objetivo
de eliminar o agente agressor e restaurar a integridade tecidual (ABBAS et al.,
2000).
Os principais eventos do processo inflamatório são a ativação do endotélio
vascular e o recrutamento e a ativação de leucócitos (MANTOVANI et al., 1997),
eventos estes regulados pela produção de mediadores também responsáveis pela
iniciação, amplificação e finalização da resposta inflamatória. Apesar de possuir um
caráter fundamentalmente protetor (objetivando levar à restauração do tecido
lesado), a resposta inflamatória pode ser potencialmente nociva, causando doenças
debilitantes (ex. artrite reumatóide, esclerose múltipla e fibrose pulmonar) ou mesmo
levando ao óbito (BUCKLE & HEDGECOCK, 1997; McINTYRE et al., 1997).
Após a exposição do tecido ao estímulo inflamatório, mediadores derivados
de células residentes e da desgranulação de plaquetas desencadeiam uma cascata
inflamatória que culmina com o recrutamento de leucócitos para o sítio de lesão
(WEYRICH et al., 2003; GARCÍA-RAMALLO, et al., 2002). A reação inflamatória
local caracteriza-se, inicialmente, por vasoconstrição arteriolar transitória (causada
23
Introdução
pela contração do músculo liso vascular), seguida por vasodilatação e por aumento
da permeabilidade da microvasculatura (devido a alterações no endotélio vascular),
resultando em aumento no fluxo sanguíneo local (hiperemia) e na exsudação de
líquido rico em proteínas (edema). Segue-se, então, nas vênulas pós-capilares,
alterações na capacidade adesiva do endotélio, com conseqüente aumento do
rolamento de leucócitos ao longo deste e posterior migração direcional e seletiva
destes da circulação sanguínea para o sítio lesado (Figura 1) (CARA et al., 2000;
BUTCHER, 1991).
FIGURA 1: Esquema simplificado mostrando as etapas do recrutamento leucocitário, mais
precisamente de neutrófilos.
Neutrófilo, em repouso, após insulto inflamatório, margeia o endotélio ativado, expressando selectinas
(P-selectina, E-selectina) e começa o rolamento. O processo rolamento / adesão favorece a ativação
celular. Adesão firme da célula ao endotélio mediada por ICAM-1 / VCAM-1. Migração através do
endotélio. (Adaptado de LAROUX, 2004).
Dentre os tipos celulares predominantes, os neutrófilos são particularmente
prevalentes e importantes produtores de mediadores inflamatórios durante a fase
inicial do processo. São responsáveis pela resposta fagocítica imediata e pela ação
potencialmente destrutiva de seus conteúdos granulares (THEILGAARD-MÖNCH et
al., 2004; FAURSCHOU & BORREGAARD, 2003). Os fagócitos mononucleares e as
24
Introdução
linhagens linfocitárias se acumulam no sítio lesado em um segundo momento e, uma
vez ativados, também produzem moléculas inflamatórias responsáveis pela
amplificação e potencial cronicidade do processo. Os macrófagos exercem
importante atividade fagocítica envolvida na destruição celular e na remoção de
restos celulares e teciduais. Estes macrófagos fagocíticos desaparecerão,
posteriormente, por apoptose ou deslocamento para os vasos linfáticos (CHERTOV,
2000; D´AMBROSIO et al., 2000).
1.1.2. Resolução do processo inflamatório e reparo tecidual
Ao final de uma resposta inflamatória aguda, de curta duração, se o agente
que desencadeou o processo for eliminado, ocorrerá a resolução do processo
inflamatório. Isto implica no término do recrutamento leucocitário, na reversão da
vasodilatação e da permeabilidade vascular, na remoção dos restos celulares e
teciduais e na restauração da função fisiológica tecidual normal (GILROY et al.,
2004).
Embora essencialmente benéfica ao organismo, a inflamação pode se
prolongar como resultado da persistência do estímulo inflamatório e causar
destruição tecidual, podendo, inclusive, evoluir para um processo crônico. Quando
há pouca destruição tecidual, ocorre a reposição das células do parênquima por
novas células do mesmo tipo (processo de regeneração). Por outro lado, como
decorrência de lesão tissular mais extensa, acontecem tentativas de restauração da
arquitetura normal mediante substituição do tecido não regenerado por tecido
conjuntivo em um processo denominado “reparo funcional”. No entanto, a resposta
fibroproliferativa característica do reparo tecidual pode, em condições patológicas,
25
Introdução
resultar em cicatrização excessiva (ex. Fibrose pulmonar), pobre (ex. Diabetes) ou
mesmo ausente (ex. Tumores sólidos) (GILROY et al., 2004; NATHAN, 2002;
WALSH & PEARSON, 2001).
O reparo tecidual é um processo dinâmico, regulado por mediadores solúveis
e elementos da matriz extracelular, com coordenada ativação, migração, proliferação
e/ou diferenciação de diversos tipos celulares, entre eles células inflamatórias,
células endoteliais e fibroblastos (Figura 2). Ao mesmo tempo, vigorosa resposta
angiogênica é essencial para a reparação tecidual normal, pois, além de prover
nutrientes e mais células inflamatórias para o tecido lesado, contribuindo para a
inflamação crônica, os novos vasos sanguíneos facilitam a remoção de material
tecidual e auxiliam no desenvolvimento do tecido de granulação (LINGEN, 2001;
NISSEN et al., 1998).
FIGURA 2: Mediadores e células envolvidas no processo de reparo tecidual e formação do tecido de
granulação após lesão inflamatória (neutrófilos, macrófagos, plaquetas e fibroblastos).
Observar a participação de diversos fatores de crescimento (FGF: fator de crescimento de
fibroblastos; TGF: fator de crescimento transformador; PDGF: fator de crescimento derivado de
plaquetas; VEGF: fator de crescimento do endotélio vascular). (Adaptado de www.rndsystems.com).
26
Introdução
1.1.3. Mediadores do processo inflamatório
Os mediadores inflamatórios são moléculas solúveis que atuam localmente,
no sítio da lesão (ou, em maior amplitude, sistemicamente), desencadeando,
controlando e/ou modificando a inflamação. Estes mediadores podem se originar do
plasma, de células inflamatórias ou dos próprios tecidos lesados e apresentam
considerável redundância funcional (GILROY, et al. 2004, NATHAN, 2002).
Após lesão tecidual, alguns dos primeiros mediadores atuantes são as aminas
vasoativas, as quais são liberadas a partir de grânulos secretores pré-formados de
mastócitos, basófilos e/ou plaquetas (DVORAK et al., 1986). Além disso, sistemas
enzimáticos derivados do plasma como o sistema do complemento (CARROL,
1998), o sistema de coagulação/fibrinolítico (BECKER et al., 2000; BROWDER et al.,
2000) e o sistema de cininas (MARGOLIUS, 1995) são ativados e seus produtos de
clivagem serão mediadores, propriamente ditos, responsáveis pela expressão das
propriedades inflamatórias inerentes a estes sistemas (Chertov, Yang et al. 2000).
Em paralelo, mediadores derivados de células como, por exemplo,
mediadores lipídicos (ex. prostaglandinas, leucotrienos, lipoxinas e PAF), citocinas
(ex. TNF-α, IFN-γ e IL-1), quimiocinas inflamatórias (MCP´s e GRO´s) e óxido nítrico
(NO) são sintetizados de novo e liberados para o meio extracelular. Ainda,
neutrófilos e macrófagos, entre outras células, quando ativados podem liberar seus
conteúdos granulares e espécies reativas de oxigênio (ROS) e de nitrogênio
diretamente no meio extracelular ou no interior de fagolisossomas (PETERS-
GOLDEN et al, 2004; D´AMBROSIO et al., 2003; SCHWENTKER et al., 2002;
SERHAN et al., 1996; ARAI et al., 1990; WEISS, 1989).
27
Introdução
1.2. ANGIOGÊNESE
Angiogênese é o termo utilizado em referência ao processo de neoformação
de estruturas vasculares a partir de capilares e vênulas pós-capilares pré-existentes
em resposta a diversos estímulos, denominados estímulos angiogênicos (FOLKMAN
& HAUDENSCHILD, 1980; FOLKMAN & KLAGSBRUN, 1987).
O fenômeno angiogênico é fundamental em uma variedade de processos
biológicos e a neovascularização desregulada é um fato importante na patogênese e
na progressão de várias doenças (CARMELIET, 2003). Durante processos
fisiológicos, como, por exemplo, o desenvolvimento embrionário (ex. vascularização
do cérebro e do rim) (AUERBACH, R. & AUERBACH, W, 1997), o ciclo reprodutivo
feminino (ex. proliferação endometrial, desenvolvimento do folículo ovariano e
formação da rede capilar placentária) (FREDERICK et al., 1984) e processos (ex.
cicatrização de feridas) (NISSEN et al. 1998), os neovasos contribuem para o
suprimento de oxigênio e de nutrientes, bem como para a remoção de produtos de
excreção (WHALEN & ZETTER, 1992).
O crescimento excessivo e persistente de neovasos, entretanto, é
característico de várias condições patológicas categorizadas como “doenças
angiogênicas” (FOLKMAN & KLAGSBRUN, 1987) e, neste caso, está geralmente
associado à continuidade e à cronicidade de tais enfermidades. Dentre estas se
incluem a artrite reumatóide (CLAVEL et al., 2003), os tumores sólidos (CARMELIET
& JAIN, 2000), os tumores hematológicos (PEREZ-ATAYDE et al., 1997), a psoríase
(CREAMER et al., 1997) e a retinopatia diabética (RUDERMAN et al., 1992).
Por outro lado, diversas outras condições patológicas estão associadas à
vascularização insuficiente. Exemplos destas são as doenças isquêmicas cardíacas
(ex. infarto do miocárdio e insuficiência cardíaca congestiva), a diabetes, a doença
28
Introdução
oclusiva vascular e as malformações congênitas decorrentes de falhas na
vascularização durante a embriogênese (CARMELIET, 2003; HENRY, 1999;
FOLKMAN, 1998).
1.2.1. Etapas do processo de neovascularização
O crescimento vascular requer essencialmente migração e proliferação de
células endoteliais, porém, estes eventos ocorrem em baixas taxas no organismo
adulto normal, quando comparados com as altas taxas de renovação dos tecidos
epitelial e hematopoiético (HOBSON & DENEKAMP, 1984). Apesar disso, o amplo
espectro funcional do endotélio reflete sua pronta responsividade a programas de
ativação e diferenciação (SUMPIO et al., 2002; van HINSBERGH, 2001; BECKER et
al., 2000)
O desenvolvimento vascular obedece a uma seqüência altamente organizada
de eventos os quais requerem coordenado aparecimento espacial e temporal de
células e de moléculas específicas (LIEKENS et al., 2001). Após estímulo
desencadeador da resposta angiogênica, a primeira fase desta está associada com
a alteração das interações adesivas entre células endoteliais adjacentes e células
murais (pericitos) (SCHLINGEMANN et al., 1991). As células endoteliais tornam-se
ativadas e começam, então, a produzir novas moléculas como, por exemplo,
enzimas proteolíticas responsáveis pela degradação da membrana basal e da matriz
extracelular (Figura 3) (STETLER-STEVENSON, 1999; MOSES, 1997).
29
Introdução
FIGURA 3: Esquema simplificado das etapas envolvidas na neovascularização.
A: Células endoteliais são ativadas por estímulo angiogênico; B: Células endoteliais secretam
proteases para degradação da membrana basal e matriz extracelular; C: Broto capilar é formado
como resultado da migração direcional de células endoteliais; D: Crescimento por mitose e migração
celular; E: Formação de um lúmen e de uma nova membrana basal; F: Dois brotos se juntam para a
formação de um loop capilar; G: Brotos capilares de segunda geração começam a se formar.
(Adaptado de GRIZZI et al, 2005).
Em seguida as células endoteliais microvasculares migram em direção ao
sítio de origem do estímulo angiogênico, ocasionando a formação de brotos
capilares. Conseguinte a estas células migratórias, as células endoteliais proliferam
e se diferenciam, alinhando-se para a formação do lúmem tubular (PAPETTI &
HERMAN, 2002; BUSSOLINO et al., 1997).
Durante a fase de maturação e estabilização do novo vaso sanguíneo, novos
componentes da matriz extracelular são produzidos e depositados sob a forma de
30
Introdução
nova membrana basal e os pericitos migram para o local do vaso neoformado,
associando-se intimamente à superfície das células endoteliais, provendo suporte
estrutural e contribuindo para o controle do crescimento deste. O fluxo sanguíneo é,
então, estabelecido e a neovasculatura pode persistir como capilares, diferenciar-se
em vênulas ou arteríolas maduras ou sofrer regressão (GRIFFIOEN & MOLEMA,
2000; BECK Jr & D´AMORE, 1997).
1.2.2. Regulação do processo angiogênico
Considerando a complexidade dos processos biológicos, a angiogênese,
como tal, implica na presença de vários sistemas de controle (positivos ou
negativos), os quais podem se alternar ou mesmo agirem simultaneamente, mas
sempre com a prevalência de algum deles em determinado momento. A aquisição
do fenótipo angiogênico é dependente do balanço local entre fatores pró- e
antiangiogênicos. Embora a estimulação de fatores angiogênicos seja necessária
para o desencadeamento do processo, simultâneo controle por fatores
antiangiogênicos também é necessário para a precisa continuidade do processo
(CAO, 2001; IRUELA-ARISPE & DVORAK, 1997).
Os diversos fatores que regulam a angiogênese se alternam entre
mediadores solúveis e moléculas de ligação à membrana celular. Estes fatores
podem atuar diretamente nas células endoteliais ou podem atuar indiretamente em
outras células-alvo (ex. células inflamatórias e fibroblastos), estimulando a liberação
de mediadores por estas (LIEKENS et al., 2001; BEN-AV et al., 1995).
Dentre os mediadores solúveis, as citocinas e quimiocinas são capazes de
modular direta ou indiretamente todas as etapas da angiogênese (ROSENKILDE &
31
Introdução
SCHWARTZ, 2004; ROMAGNANI et al., 2004). Também podemos ainda citar os
fatores de crescimento, dentre os quais o VEGF (vascular endothelial growth factor)
é considerado uma das principais moléculas responsáveis pela iniciação e
progressão da angiogênese (D´AMORE & SMITH, 1993; HOEBEN et al., 2004),
além das proteinases e seus inibidores (uPA, PAI, MMP´s e TIMP´s), a angiostatina
e a endostatina (CAO, 2001; IOZZO & SAN ANTONIO, 2001; HENRIET et al., 1999;
STETLER-STEVENSON, 1999; BLEI et al, 1993;).
Além disso, integrinas (ex: α
v
β
3
) e moléculas de adesão celular (ex. VE-
caderina) contribuem para a migração e a proliferação das células endoteliais, sendo
responsáveis por mediarem interações célula-célula e célula-matriz extracelular,
além de sinais antiapoptóticos (STORGARD et al., 1999; BISCHOFF, 1995;
BROOKS et al., 1994). Ainda é importante se frisar que a força mecânica mediada
pelo fluxo sanguíneo é capaz de estabilizar o vaso sanguíneo neoformado
(LIEKENS et al., 2001).
1.2.3. Relação entre leucócitos e a resposta angiogênica
Leucócitos e células vasculares podem se influenciar reciprocamente de
várias maneiras. Por exemplo, durante o raparo tecidual, a angiogênese, além de
auxiliar na restauração da perfusão vascular do tecido lesado, facilita o acesso de
leucócitos, tais como neutrófilos e macrófagos, para o local da inflamação. Estes
leucócitos, por sua vez, são capazes de produzir uma grande quantidade de
moléculas reguladoras da angiogênese, incluindo proteinases (como as
metaloproteinases), VEGF, TGF-β, TNF-α, quimiocinas e angiostatina. Importante
ressaltar que, além de sustentar a indução do crescimento de novos vasos
32
Introdução
sanguíneos, os quais sustentam o recrutamento de mais leucócitos para o local
inflamado, estes tipos celulares exercem importante papel na inibição do
crescimento dos novos vasos sanguíneos, uma vez que podem secretar mediadores
que contribuem para a regressão dos vasos neoformados (CROWTHER et al., 2001;
BENELLI et al., 2002; LINGEN, 2001).
1.2.4. Modelos experimentais para o estudo da angiogênese
A angiogênese pode ser mensurada qualitativa e quantitativamente por uma
variedade de modelos experimentais in vitro e in vivo (JAIN et al.,1997). A maioria
das etapas da cascata angiogênica pode ser monitorada in vitro, utilizando-se
cultura de células endoteliais. Os ensaios mais utilizados são o de migração celular
em câmara de Boyden (e suas variações) e o de proliferação, cujos estudos se
baseiam, geralmente, na contagem celular, incorporação de timidina ou técnicas de
coloração para proliferação ou morte celular (MAIER et al., 1999; LYNCH et al.,
1999). Além disso, ensaios para o estudo de processos mais complexos baseados
na dissolução de matrizes e na diferenciação de vasos (ex. formação de estruturas
parecidas com tubos a partir de células endoteliais cultivadas sobre géis de
colágeno ou fibrina) também são utilizados (BISCHOFF, 1995; FOLKMAN &
HAUDENSCHILD, 1980). Entretanto, apesar da grande contribuição na identificação
de moléculas que estimulam ou inibem essas etapas da angiogênese, nestes
ensaios in vitro, as células endoteliais precisam ser removidas dos seus
microambientes naturais, podendo ter as suas propriedades fisiológicas alteradas
(GRIFFIOEN & MOLEMA, 2000).
33
Introdução
No caso dos modelos in vivo, estes geralmente fornecem informações mais
quantitativas. Dentre esses modelos, os mais utilizados são as câmaras
transparentes em roedores (orelha de coelho, dorso de camundongo, bochecha de
hamster e câmaras cranianas); as preparações teciduais exteriorizadas, cuja mais
utilizada é a da membrana corioalantóica de embriões de galinha. As preparações in
situ, das quais os principais modelos são a córnea de roedores, as bolsas de ar
subcutâneas, a cicatrização de feridas cutâneas e a isquemia coronariana e de
membros inferiores, além dos modelos de implantes de matrizes de polímeros
biocompatíveis, os quais permitem o estudo da contribuição relativa de processos
inflamatórios precedentes (CARMELIET et al., 1998; ENGELHARDT et al., 1998;
JAIN et al., 1997; COLVILLE-NASH et al., 1995; ROESEL & NANNEY, 1995;
ANDRADE et al., 1987).
1.2.4.1. Modelo de implantação subcutânea de esponja
O modelo de implantação subcutânea de esponjas em animais foi descrito
inicialmente por Grindlay & Waugh (1951) e modificado por Andrade et al. (1987). A
implantação de matrizes sintéticas, inicialmente acelulares, induz uma reação
inflamatória com conseqüente formação de tecido de granulação rico em novos
vasos sanguíneos, representando um sistema interessante para o estudo da
angiogênese inflamatória. Dessa maneira, por exemplo, processos naturais como a
vascularização de feridas em cicatrização podem ser mimetizados utilizando este
modelo. Além disso, uma vez que o estímulo inflamatório é persistente, é presumível
o estudo de processos inflamatórios crônicos.
34
Introdução
Ainda, o modelo de implante de esponjas permite o estudo temporal do
infiltrado inflamatório, a análise bioquímica dos fluidos coletados, o efeito de drogas
sobre o processo, além de estudos histológicos e morfométricos (JAIN et al., 1997;
BAILEY, 1988). Este modelo é bastante utilizado por ser facilmente reprodutível e
possibilitar objetividade na avaliação da neovascularização, bem como o
monitoramento contínuo e a investigação morfo-funcional do processo em condições
fisiológicas e patológicas, além de possibilitar a avaliação da contribuição relativa do
processo inflamatório instalado na matriz esponjosa (JAIN et al., 1997; FORD et al.,
1989).
1.3. CANABINÓIDES
1.3.1. Visão geral
O estudo da farmacologia dos canabinóides como conhecemos hoje começou
há aproximadamente quarenta anos, quando o delta-9-tetrahidrocanabinol (Δ-9-
THC) foi isolado e sintetizado (GAONI & MECHOULAN, 1964), revelando-se o
principal componente químico com propriedades psicoativas presente na Cannabis
sativa, popularmente conhecida como “marijuana” ou maconha (Figura 4). Uma série
de compostos análogos foram sintetizados e têm sido testados em diversos modelos
animais, incluindo aqueles para avaliação da antinocicepção, da resposta
inflamatória, da memória, do aprendizado, entre outros (HOWLETT et al., 2004).
A Cannabis sativa é a droga ilícita mais comumente usada nos Estados
Unidos e Europa, assim como em outras partes do mundo, com mais de 46,1% dos
jovens entre 17 e 18 anos sendo usuários. Embora a taxa de uso da Cannabis seja
35
Introdução
inferior a de drogas legais, como o tabaco ou o álcool, ela é significativamente maior
do que a de outras drogas ilícitas, como a cocaína e o ecstasy (KLEIN, 2005).
FIGURA 4: Estrutura molecular do fitocanabinóide Δ-9-THC.
Suas aplicações terapêuticas continuam a crescer, tanto que, no início do
século vinte, a terapia com a maconha era sido utilizada para aliviar os sintomas de
uma variedade de doenças, da epilepsia a gonorréia (BAKER, et al., 2003).
Entretanto, a popularidade da Cannabis na terapêutica declinou assim que novos
fármacos, mais potentes e específicos, foram sintetizados, e também quando a
Cannabis foi reconhecida como potencial droga de abuso, sendo seu uso como
fármaco abolido ainda no início dos anos quarenta (KLEIN, 2005; BAKER, et al.,
2003). As propriedades psicoativas do Δ-9-THC foram prontamente reconhecidas,
mas a estrutura química peculiar da droga não oferecia nenhuma pista quanto ao
seu mecanismo de ação. A natureza hidrofóbica do Δ-9-THC indicava que o
composto provavelmente agiria interferindo na fluidez da membrana plasmática e
não atuando sobre um receptor específico. Este impasse foi resolvido com o
desenvolvimento de novas classes de análogos potentes e seletivos do Δ-9-THC, o
que levou à eventual identificação farmacológica de sítios de ligação “sensíveis a
canabinóides” no cérebro (DEVANE et al., 1988; MELVIN & JOHNSON, 1987).
36
Introdução
O receptor canabinóide CB
1
foi molecularmente clonado do cérebro de rato
em 1990, já o receptor CB
2
foi identificado por homologia de seqüência três anos
mais tarde (MATSUDA et al., 1990; MUNRO et al., 1993). Tais descobertas não
somente estabeleceram o mecanismo de ação do Δ-9-THC, estimulando o
desenvolvimento de antagonista e agonistas seletivos para cada subtipo de receptor,
como também iniciou a busca por ligantes endógenos desta classe de receptores.
De forma surpreendente, a primeira substância Δ-9-THC-like a ser isolada foi um
lípide, sendo que o esperado, com base nos precedentes existentes para a morfina
e encefalinas, seria um peptídeo. A molécula foi identificada como a amida do ácido
araquidônico com uma etanolamina, sendo nomeada anandamida, com base na
palavra ananda, do sânscrito “bem-aventurança” (DEVANE et al., 1992).
Apesar de não se assemelhar a nenhum dos neurotransmissores conhecidos,
a anandamida compartilha afinidades com os eicosanóides, importantes mediadores
na inflamação e na dor, com importantes funções na comunicação neuronal. Embora
inicialmente controverso, o papel da anandamida na sinalização foi confirmado pela
elucidação de uma via metabólica única para o composto assim como a
demonstração de sua liberação no cérebro vivo (Di MARZO et al., 1994). Como a
busca por compostos Δ-9-THC-like continua ativa, outros lípides bioativos foram
extraídos de tecidos animais. Estes incluem o 2-araquidonoilglicerol (2-AG), o éter
de noladina, a virodamina e a N-araquidonoildopamina (MECHOULAN et al., 1995;
HANUS et al., 2001; PORTER et al, 2002; HUANG et al., 2002).
37
Introdução
1.3.2. Os receptores canabinóides
A aparente baixa estereoseletividade dos canabinóides, em conjunto com sua
alta lipossolubilidade, fez com que se especulasse que estes compostos não agiriam
através de um receptor e sim que mudariam as propriedades das membranas
lipídicas assim que interagissem com estas (GILL, 1976). Howlett & Fleming (1984),
demonstraram que os canabinóides inibiam a ativação da adenilato ciclase em uma
linhagem celular de neuroblastoma, com uma potência que mostrava boa correlação
com efeitos comportamentais apresentados por humanos e animais. Devane et a,l
(1988), caracterizou um sítio de ligação no cérebro de rato para o [
3
H] CP55,940,
que mostrou a seguinte ordem de potência, para ligantes não marcados: CP55,940
≥ Δ-9-THC > canabinol. Estes dados foram consistentes com a potência observada
em bioensaios para a função de canabinóides.
Herkenham et al (1990) demonstrou que sítios de ligação com alta afinidade
para o [
3
H] CP55,940 no cérebro eram mais densos no gânglio basal, no hipocampo
e no cerebelo, sugerindo papéis para os canabinóides na cognição e no movimento.
Autoradiografias mostraram poucos sítios de ligação nos centros de controle
cardiovascular e respiratório, o que é consistente com a baixa toxicidade do Δ-9-
THC. Um receptor, agora designado CB
1
, foi então clonado por Matsuda et al (1990)
e por Gerard et al (1991), a partir de uma biblioteca de cDNA do tronco encefálico
humano. Um segundo receptor, o CB
2,
com 48% de homologia com o receptor CB
1
,
foi clonado do baço por Munro et al (1993). Até o momento estes são os dois únicos
subtipos de receptores canabinóides reconhecidos, além de uma variante splice do
receptor CB
1
, denominada “receptor CB
1a
”, que parece ser expressa em baixos
níveis em roedores mas não em humanos (SHIRE et al,1995). Um terceiro receptor
38
Introdução
canabinóide putativo, GPR55, que se liga seletivamente a ligantes canabinóides já
conhecidos, foi recentemente descrito (BAKER et al, 2006); entretanto, é necessária
uma caracterização adicional para identificar o receptor GPR55 como membro da
família de receptores canabinóides, ou receptor CB
3
.
A seqüência de aminoácidos do receptor CB
1
é relativamente conservada em
diversas espécies, incluindo mamíferos, peixes, moluscos, hidra, sanguessuga e
outros (ELPHICK & EGERTOVA, 2005), mas não parece ser expresso em insetos
(McPARTLAND et al, 2001). Os receptores CB
1
são predominantemente
encontrados nos terminais pré-sinápticos do sistema nervoso central; entretanto eles
também são encontrados em baixa abundância na periferia, incluindo o sistema
imune, testículos, endotélio vascular, intestino delgado, fígado e sinapses nervosas
periféricas (KUNOS et al, 2002; BATKAI et al, 2001; SALIO et al, 2001; PERTWEE,
1997). Embora os receptores CB
1
sejam encontrados em diversos pontos do
cérebro, eles são mais densos no córtex, hipocampo, gânglio basal, cerebelo e
medula; esta distribuição é bastante consistente com o efeito dos canabinóides
sobre a memória, cognição, movimento e nocicepção (GLASS et al, 1997;
HERKENHAM et al, 1990)
Em contraste com o receptor CB
1
, o receptor CB
2
é primariamente expresso
em células do sistema imune na periferia e parece ter papel na modulação deste
sistema (LYNN & HERKENHAM, 1994; MUNRO et al, 1993). Os receptores CB2
também estão expressos em tonsilas, na medula óssea, timo, pâncreas, na retina do
rato adulto e em terminais nervosos periféricos no vas deferens de camundongos
(GRIFFIN et al, 1997). Altos níveis de expressão são encontrados em linfócitos B e
células natural killer (NK).
39
Introdução
A sinalização através de CB
2
parece mediar a inibição da proliferação de
linfócitos T causada por canabinóides, modular a secreção de citocinas pró-
inflamatórias e a resposta de linfócitos B (HOWLETT et al, 2002). Embora
originalmente descrito como ausente no sistema nervoso central (MUNRO et al,
1993), o mRNA para o receptor CB
2
foi detectado em células granulares cerebelares
(SKAPER et al, 1996) e sua expressão é aumentada no tecido nervoso
(upregulation) após estímulo inflamatório (BENITO et al, 2003; 2005). Evidências
recentes sugerem, de fato, que há expressão significativa de receptores CB
2
no
sistema nervoso central, particularmente em regiões do tronco cefálico (VAN
SICKLE et al, 2005). Vários ligantes não são capazes de distinguir entre os
receptores CB
1
e CB
2
, mesmo havendo somente cerca 44% de afinidade entre
seqüências de aminoácidos para estes receptores. Este comportamento pode ser
explicado pela similaridade entre seus domínios de ligação ortostéricos (identidade
de 68%).
1.3.3. Os endocanabinóides
A descoberta de que o fitocanabinóide Δ-9-THC se liga especificamente a
receptores com estrutura protéica e desencadeiam eventos de sinalização foi um
claro indicativo da existência de um ou mais compostos endógenos que poderiam
apresentar a função de neurotransmissor ou hormônio sobre receptores CB
1
e CB
2
no sistema nervoso central ou na periferia. O endocanabinóides são agora
reconhecidos como importantes moléculas lipídicas capazes de ativar vias de
sinalização intracelulares ao se ligarem a receptores canabinóides presentes no
40
Introdução
sistema nervoso central e na periferia, regulando funções fisiológicas,
comportamentais e emocionais (FELDER et al, 2006).
Desde a descoberta da anandamida, diversas moléculas formadas por ácidos
graxos com atividade agonista total ou parcial sobre o receptor CB
1
e/ou CB
2
têm
sido extraídas de tecidos animais ou quimicamente sintetizadas. Estas moléculas,
entretanto, não modulam diretamente a sinalização do receptor canabinóide, elas
afetam uma variedade de proteínas, incluindo canais iônicos (ex: TRPV1),
receptores acoplados à proteína G (GPCRs) (ex: receptores para a serotonina) e
enzimas (BEN-SHABAT et al, 1998; MECHOULAM et al, 1998). A formação de
moléculas mensageiras lipídicas a partir de ácidos graxos polinsaturados de cadeia
longa é reminiscente das famílias de moléculas bioativas dos prostanóides e
eicosanóides. É possível que vários outros mediadores lipídicos sejam ainda
descobertos com o advento do “lipidoma”.
Além da anandamida, como citado, os endocanabinóides mais estudados
incluem o 2-araquidonoilglicerol (2-AG), o éter de noladina, a virodamina e a N-
araquidonoildopamina (MECHOULAN et al., 1995; HANUS et al., 2001; PORTER et
al, 2002; HUANG et al., 2002) (Figura 5). Os níveis de 2-AG no cérebro estão
frequentemente maiores que os de anandamida em uma ou duas ordens de
magnitude, embora a relevância fisiológica desta diferença de concentração seja
desconhecida. Ainda é necessário se definir com precisão a relação
neurotransmissor específico versus receptor canabinóide em termos de seletividade
a uma determinada subclasse de receptor, localização das proteínas envolvidas na
síntese e degradação da molécula transmissora, concentrações locais relevantes
(próximas aos receptores) e crosstalk de sinalização com outros sistemas de
neurotransmissores (FELDER et al, 2006).
41
Introdução
A C
B D
FIGURA 5: Estrutura de alguns dos endocanabinóides mais estudados. (A): anandamida; (B): 2-
Araquidonoilglicerol (2-AG); (C): 2-Araquidonoildopamina; (D): Virodamina.
Ao contrário de outras moléculas neurotransmissoras, que são tipicamente
armazenadas em vesículas até o momento de sua liberação, a anandamida é
sintetizada por demanda, na membrana plasmática (Figura 6). Uma das vias
predominantes para a síntese e liberação da anandamida começa com a
transferência do ácido araquidônico da posição sn-1, dos fosfolípides raros, para a
posição sn-3 da fosfatidiletalonamina, criando-se a N-araquidonoil
fosfatidiletanolamina (NAPE). A reação é catalisada por uma N-acil transferase
dependente de Ca
3+
(NAT). Uma enzima específica dependente de Ca
2+
hidrolisa a
ligação fosfodiéster da NAPE, liberando a anandamida na sinapse, seja da mebrana
pré- ou pós-sináptica. Embora originalmente chamada NAPE-PLD, esta enzima é
um membro da família das enzimas zinco metalohidrolases (OKAMOTO et al, 2004;
WILSON & NICOLL, 2002; Di MARZO et al, 1999; PIOMELLI et al, 1998).
42
Introdução
FIGURA 6: Mecanismo bioquímico de formação da anandamida em tecidos biológicos.
Observar a seqüência de reações, o substrato e a enzima responsável pela modificação
subseqüente. Tradução: Phosphatidylethanolamine: Fosfatidiletanolamina; N-acyltransferase: N-
aciltransferase; N-arachidonoyl-PE: N-araquidonoil fosfatidiletanolamina; Phospholipase D:
Fosfolipase D; Anadamide: Anandamida. (Adaptado de PIOMELLI, 2003).
Ésteres de ácidos graxos, como o 2-AG, são gerados pela remoção do
grupamento inositol da cabeça da molécula através da Fosfolipase C (PLC) e
subseqüente desacetilação com a sn-1 diacilglicerol lipase. Uma segunda via utiliza
as fosfolipases A1 e C para remover os constituintes em sn-1 e sn-3. Enquanto a
Fosfolipase C já é conhecida há algum tempo, sn-1 diacilglicerol lípases importantes
para a formação do 2-AG somente foram clonadas e caracterizadas recentemente
(PIOMELLI, 2003). Mecanismos intracelulares de ação do 2-AG estão na figura 7.
43
Introdução
FIGURA 7: Mecanismos de ação intracelulares do endocanabinóide 2-AG (2-araquidonoilglicerol),
mediados por receptor canabinóide.
Interação com IP
3
(trifosfato de inositol) e cAMP (AMP cíclico); Indução da liberação de Ca
2+
do
retículo endoplasmático (mediado principlamente por CB
1
); Ativação de receptores CB
2
pode levar à
inibição da formação de cAMP, fazendo com o que o 2-AG iniba ativação de MAPK (proteína quinase
ativada por mitógeno), inibindo ativação de fatores ligados à proliferação celular, como krox-24;
Inibição do cAMP também leva a inibição da ativação de PKA (proteína quinase A) e
consequentemente ativação de CRE (elemento de ligação responsivo ao cAMP), NF-κB (fator de
ativação nuclear κB) e iNOS (óxido nítrico sintase indutível). Abreviações: PLC: fosfolipase C; AArG:
sn-1-acil-2-araquidonoil-glicerol; AC: adenilato ciclase. Adaptado de (DI MARZO, 1998).
1.3.4. Agonistas e antagonistas dos receptores canabinóides
Os canabinóides foram divididos em quatros grupos separados por estrutura
química: os derivados de ácidos graxos (a maioria eicosanóides, como os
endocanabinóides), canabinóides “clássicos” (dibenzopirenos tricíclicos),
canabinóides “não-clássicos” (análogos bicíclicos e tricíclicos do Δ-9-THC) e os
aminoalquilindóis. Os canabinóides “clássicos” são aqueles que podem ser extraídos
de plantas ou então seus análogos sintéticos, que incluem o Δ-9-THC, Δ-8-THC e
44
Introdução
HU-210 (dexabinol) ou ainda (-)11-hidroxi-Δ-8-THC-dimetil-heptil (HILEY & FORD,
2004). Todos estes compostos são ativos tanto nos receptores CB
1
como CB
2
,
embora o Δ-9-THC seja agonista parcial em ambos os receptores, sendo
antagonista em alguns receptores CB
2
(BAYEWITCH et al, 1996). Os chamados
canabinóides “não clássicos” foram primeiramente sintetizados por químicos da
farmacêutica Pfizer e caracterizados como sendo compostos bi- ou tricíclicos sem o
anel di-hidropireno dos compostos “clássicos”. O mais utilizados destes compostos é
o CP55,940, que possui alta afinidade tanto pelos receptores CB
1
como CB
2
.
(PACHECO et al, 1993). Os aminoalquilindóis, dos quais o WIN 55212,2 é o mais
comumente utilizado, foram derivados da pravadolina, um inibidor da cicloxigenase
com perfil farmacológico diferente dos agentes anti-inflamatórios não esteroidais
clássicos (WARD et al, 1990). O WIN 55,212-2, o enantiômero R-(+), é ativo tanto
em CB
1
como CB
2
, embora mostre maior seletividade para o último (FELDER et al,
1995). A estrutura dos agonistas e antagonistas canabinóides mais comuns podem
ser visualizadas na figura 8.
A B
C
D
FIGURA 8: Agonistas e antagonistas canabinóides. (A) O agonista “não clássico” CP55,940; (B) O
aminoalquilindóis WIN 55,212-2; Os antagonistas di-aril-pirazóis SR141716A (C) e SR144528 (D).
45
Introdução
Os dois antagonistas mais utilizados para se definir o subtipo de receptor
envolvido em uma determinada resposta são o SR141716A (seletivo para o receptor
CB
1
; RINALDI-CARMONA et al, 1994) e o SR144528 (seletivo para o receptor CB
2
;
RINALDI-CARMONA et al, 1998). Ambos são di-aril-pirazóis, sintetizados
primeiramente pela Sanofi-Aventis. Ambos podem atuar como agonistas inversos,
exibindo efeitos biológicos opostos àqueles exercidos por agonistas na ausência de
ativação do receptor canabinóide (BOUABOULA et al, 1997), sugerindo que os
receptores possuem uma ativação tônica de mecanismos intracelulares na ausência
de um agonista.
1.3.5. Sistemas de sinalização dos receptores canabinóides
Tanto o receptor CB
1
quanto o receptor CB
2
são receptores acoplados à
proteína G (GPCR´s), da superfamília da rodopsina. Suas respostas são sensíveis à
toxina pertussis, o que sugere que suas ações sejam mediadas através da ativação
de G
i/o
(HOWLETT et al, 1986). Ensaios de marcação por fotoafinidade com o
[
32
P]azidoanilina GTP demonstraram que a estimulação do receptor canabinóide em
membranas celulares leva à ativação de quatro subunidades G
α
(G
iα2
, G
iα3
, G
oα1 e
G
oα1
) (HO et al, 2000).
Ambos são, portanto, capazes de inibir a adenilato ciclase
ligada à membrana. Células de neuroblastoma N18TG2 possuem receptores CB
1
e
a atividade da adenilato ciclase na membrana destas células pode ser inibida pelo
endocanabinóide anandamida (CHILDERS et al, 1994). De forma semelhante,
quando os receptores CB
2
estão expressos em células CHO, o 2-AG e o HU-210
irão inibir a estimulação da adenilato ciclase pela forscolina, embora a anandamida
seja um agonista parcial fraco neste sistema e pode atuar como antagonista
46
Introdução
(GONSIOREK et al, 2000). Facci et al (1995), documentaram que a anandamida é
um antagonista funcional do receptor CB
2
em mastócitos, o que sugeriria que os
endocanabinóides poderiam participar da modulação da resposta inflamatória
através da regulação de receptores CB
2
.
Após G
i/o
ter sido inibida pela toxina pertussis, o acúmulo de AMPc pode ser
estimulado pelos receptores CB
1
(GLASS & FELDER, 1997). Isso parece estar
relacionado com o tipo de adenilato ciclase presente (RHEE et al, 1998). No caso do
receptor CB
1
, o efeito inibitório sobre a adenilato ciclase leva à inibição de canais de
K
+
do tipo D e aumenta a atividade de canais do tipo A. A ativação de receptores
CB
1
também leva à inibição de canais de Ca
2+
dos tipos P, Q e N, mas não do tipo L
(HO et al, 2000). Entretanto, a anandamida e o WIN 55,212-2 inibem correntes de
Ca
2+
do tipo L em células musculares lisas de artérias cerebrais em gatos
(GEBREMEDHIN et al, 1999). Este mecanismo é sensível tanto à toxina pertussis
quanto ao SR141716A, e se correlaciona com o relaxamento de anéis de artérias
cerebrais em gatos.
A sinalização através do receptor CB
2
parece não influenciar a atividade de
canais iônicos, mas tanto este receptor como o CB
1
possuem efeitos mediados por
MAP (mitogen-activated protein) quinases, podendo assim modular, por exemplo, a
morte celular. A anandamida é capaz de tanto induzir como inibir a apoptose em
células humanas de neuroblastoma e linfoma (MACCARRONE et al, 2000). A
apoptose é induzida pela estimulação de receptores vanilóides, sendo inibida pela
estimulação de receptores canabinóides sensíveis ao antagonista seletivo do
receptor CB
1,
SR141716A, e ao antagonista seletivo do receptor CB
2
, SR144528.
Uma das vias implicadas na inibição da apoptose é a ativação da PI3K
(fosfoinositídio 3´-quinase) e proteína quinase B (AKT) (AIKAWA et al, 2000), sendo
47
Introdução
que a última medeia a inibição da apoptose de células cardíacas em um modelo de
isquemia e reperfusão induzido por insulina (JONASSEN et al, 2001). Como os
receptores CB
1
estão acoplados à PI3K e AKT, é possível que a inibição da
apoptose seja mediada por esta via (Figura 8) (DEL PULGAR et al, 2000).
Um importante papel dos canabinóides na regulação da proliferação e
migração celular foi identificado com a descoberta de que a ativação de receptores
CB
1
expresso em uma linhagem de células endoteliais, derivadas de cordão
umbilical humano, pode levar à ativação de MAP quinase, p38 quinase e c-Jun
quinase (LIU et al, 2000). A via da ceramida parece ser a ligação entre os receptores
canabinóides e a cascata de sinalização mediada por ERK (extracelular signal-
regulated kinase) (GUZMÁN et al, 2001).
FIGURA 9: Sistema de sinalização dos receptores canabinóides.
Os receptores canabinóides são receptores acoplados à proteína G, com sete domínios
transmembrana. Observar os mecanismos representados à esquerda da figura, proteína-G-
dependentes (ativação de canais de K
+
, PI3K/Akt; inibição da adenilato ciclase). À direita, a via da
ceramida, ativada por mecanismos proteína-G-independentes (ceramida, Raf1, MEK, ERK).
Abreviações: Akt: proteína quinase B; CB: canabinóide; ERK: quinase regulada por sinal extracelular;
GIRK: canais de K
+
ativados por proteína G; MEK: proteína quinase ativada por mitógeno; PI3K:
fosfatidilinositol 3-quinase; PKA: proteína quinase A; SMase: esfingomielinase; SPT: serina
palmitoiltransferase. (Adaptado de HILEY & FORD, 2004)
48
Introdução
A geração de ceramida ocorre em um intervalo de tempo de minutos,
dependendo da ação catalítica de esfingomielinases, as quais hidrolisam a
esfingomielina a ceramida e fosforilcolina (KOLESNICK, 2002). O acoplamento
funcional de receptores a esfingomielinases envolve diferentes proteínas
adaptadoras. Um destes fatores é o “fator associado com a ativação neutra da
esfingomielinase” ou FAN. O FAN se liga a um motivo ácido citoplasmático, com
nove aminoácidos e 55 kD, no receptor do fator de necrose tumoral (TNF),
acoplando o receptor, desta forma, à quebra da esfingomielina. Um papel para o
FAN na hidrólise da esfingomielina mediada por CB
1
é sustentado por experimentos
de co-imunoprecipitação, onde se evidencia a ligação do FAN a receptores CB
1
ativados; também se evidencia a resistência à quebra da esfingomielina mediada por
canabinóides em células que não expressam FAN (SÁNCHEZ et al, 2001;
VELASCO et al, 2005).
1.3.5.1. Modelos de agonismo inverso
Evidências de que os receptores canabinóides podem existir em estados
intercambiáveis, “on” e “off”, são descritos em diversos experimentos com tecidos
e/ou células expressando principalmente o receptor CB
1
(PERTWEE, 2005).
O agonismo inverso em receptores é explicado pelo modelo de “dois estados”
(LEFF, 1995). Pelo menos alguns tipos de receptores podem existir em duas
conformações intercambiáveis: um estado constitutivamente ativo ou “on” (R
*
), nos
quais os receptores estão acoplados aos seus mecanismos efetores, mesmo na
ausência de um agonista endógeno ou exógeno, e um estado constitutivamente
49
Introdução
inativo ou “off”, que não está espontaneamente acoplado aos mecanismos efetores
do receptor. Baseado neste modelo, os agonistas aumentam a proporção de
receptores no estado “on”, agonistas inversos aumentam a proporção de receptores
no estado “off” e antagonistas neutros deixam inalterado o número de receptores em
cada estado. Para receptores acoplados à proteína G, como os receptores
canabinóides, o estado “on” pode ser representado como o receptor acoplado a uma
forma ativa da proteína G (R
*
G
GTP
) e o estado “off” como o receptor acoplado a uma
forma inativa da proteína G (RG
GDP
) ou não acoplado de forma alguma a proteína G
(R). Isto gera a possibilidade de duas variantes do modelo de “dois estados”,
R
*
G
GTP
⇔ RG
GDP
e R
*
G
GTP
⇔ R (VÁSQUEZ & LEWIS, 1999).
Existe boa evidência de que antagonistas canabinóides no receptor CB
1
,
como o SR141716A e o AM251, podem induzir efeitos “canabimiméticos” inversos,
em sistemas biológicos expressando o receptor CB
1
de forma natural ou após
transfecção. Três mecanismos foram propostos para explicar tal efeito (PERTWEE,
2005):
• Antagonismo competitivo nos receptores CB
1
, impedindo a ligação de
canabinóides endógenos.
• Agonismo inverso resultante de uma modulação negativa da atividade
constitutiva dos receptores CB
1
, possivelmente através de um mecanismo
alostérico, que faz com que os receptores CB
1
passem de um estado
constitutivamente ativo “on” para um ou mais estados constitutivamente
inativos “off”.
• Mecanismos CB
1
-independentes como, por exemplo, o antagonismo
exercido pelo SR141716A e pelo AM251 sobre os receptores A1 de
adenosina.
50
Introdução
1.3.6. Os canabinóides na inflamação e na angiogênese
Diversas linhas de pesquisa buscam entender até que ponto os ligantes dos
receptores canabinóides podem ser agentes efetivos no tratamento, por exemplo, da
dor, da inflamação, de doenças neurodegenerativas como a esclerose múltipla e da
êmese associada à AIDS e à quimioterapia do câncer. Agonistas dos receptores
canabinóides foram desenvolvidos por indústrias farmacêuticas para atuarem como
anti-inflamatórios não-esteroidais e analgésicos não-opióides, entretanto a sua
utilidade terapêutica tem sido criticada por seus efeitos colaterais, como a sedação e
a disfunção cognitiva. Até o presente momento, drogas com alta eficácia e potência,
atuando tanto como agonistas como antagonistas sobre os receptores canabinóides,
mas sem causar nenhum tipo de efeito psicoativo, estão em fase de
desenvolvimento (ZURIER, 2003; HOWLETT et al., 2002, 2004; FOX & BEVAN,
2005; KLEIN, 2005; PIOMELLI, 2005).
Quanto ao seu potencial anti-inflamatório e também anti-angiogênico / anti-
tumoral, diversos trabalhos bastante recentes mostraram que análogos sintéticos
potentes do Δ-9-THC, de diferentes grupos químicos ou mesmo similares, e também
antagonistas específicos dos receptores canabinóides, podem modular respostas
fisiológicas desempenhadas por estes em diversas condições patológicas
associadas à inflamação e ao câncer (ZURIER, 2003; VELASCO et al., 2004,
KLEIN, 2005; PIOMELLI, 2005).
Agonistas sintéticos como o WIN 55, 212-2 (potente agonista misto em CB1 e
CB2) e o HU-210 (potente agonista em CB
1
), assim como os antagonistas
SR141716A (Acomplia
®
ou Rimonabant
®
) e o SR144528, antagonistas em CB
1
e
CB
2
respectivamente, podem modular negativamente a resposta inflamatória em
51
Introdução
modelos de endotoxemia em camundongos e também em modelos de peritonite; em
ambos os modelos as drogas interferem na liberação e expressão de citocinas e
outras moléculas inflamatórias, assim como diretamente sobre o recrutamento de
leucócitos para o sítio inflamatório (SMITH et al., 2000; 2001). A participação do
receptor CB
2
e sua ativação no miocárdio de camundongos já foi descrita como um
mecanismo atenuante na lesão induzida por isquemia e reperfusão, fator associado
à redução significativa da produção de citocinas e quimiocinas, assim como na
redução do recrutamento de leucócitos (DI FILLIPO et al., 2003). De forma
interessante, já foi observado um efeito protetor sobre o miocárdio induzido pelo
lipopolissacarídeo da parede bacteriana (LPS), onde foi sugerida a participação de
endocanabinóides através do receptor CB
2
, proteção esta que pode estar
relacionada a um cross-talk com o óxido nítrico (NO
•
) (LEGNEUX & LAMONTAGNE,
2001). Também em modelos de isquemia cerebral os receptores canabinóides,
assim como os endocanabinóides, parecem modular, de forma significativa, a
resposta inflamatória associada (MUTHIAN et al., 2004). Estudo recente, e bastante
interessante, demonstra uma redução na formação da placa aterosclerótica em
camundongos, diminuição esta relacionada à administração de baixas doses de
canabinóides exógenos (Δ-9-THC), efeito este mediado por uma diminuição bastante
significativa da resposta inflamatória associada, incluindo a redução da produção de
quimiocinas como o MCP-1 (JE/CCL2), e citocinas como o IFN-γ e IL-12, com
participação predominante de receptores CB
2
(STEFFENS et al., 2005)
Há também trabalhos consistentes demonstrando potente efeito de
canabinóides sobre a dor inflamatória, sugerindo tanto a participação de receptores
CB
1
como CB
2
(CLAYTON et al., 2002; IBRAHIM, et al., 2005; PIOMELLI, 2005). O
sistema endocanabinóide parece participar ativamente, e de forma protetora, em
52
Introdução
modelos de inflamação do cólon, efeito este mediado principalmente por receptores
CB
1
(MASSA et al., 2004). Em outros modelos de inflamação intestinal, os
receptores CB
1
parecem exercer papel importante, cuja atividade anti-inflamatória
parece estar relacionada à diminuição da produção da citocina TNF-α (CROCI et al.,
2003).
Estudos recentes demonstram que o endocanabinóide 2-AG pode induzir a
migração de vários tipos celulares, como, por exemplo, eosinófilos humanos, células
B Raji e células dendríticas de camundongos derivadas da medula. Acredita-se que
os endocanabinóides estão envolvidos na migração celular por funcionarem como
agentes quimiotáticos, juntamente com citocinas e outras proteínas classicamente
descritas como “quimiocinas” (MAESTRONI, 2004; RAYMAN et al, 2004; OKA et al,
2004). Adicionalmente à indução da expressão de endocanabinóides e a
subseqüente quimiotaxia de células do sistema imune, existem evidências de que a
ativação de células inflamatórias pelo LPS ou outros estímulos pode modular a
expressão dos receptores canabinóides CB
1
E CB
2
nestas células (KLEIN, 2005).
Assim como podem suprimir a produção de citocinas, os canabinóides
demonstraram também poder aumentar a produção de citocinas (incluindo TNF-α,
IL-1, IL-6 e IL-10) quando administrados juntamente com bactérias ou outros
antígenos, ou também, em alguns casos, quando são administrados sozinhos
(DEROCQ et al, 2000; SMITH et al, 2001). Portanto, in vivo, estes agentes podem
tanto suprimir quanto aumentar a produção destas moléculas pró-inflamatórias,
dependendo tanto da natureza do estímulo inflamatório como do tipo de canabinóide
usado.
No que diz respeito à atividade anti-tumoral, e também anti-angiogênica dos
canabinóides, vários estudos demonstram um efeito bastante significativo sobre a
53
Introdução
proliferação de diferentes linhagens de células tumorais e também sobre a produção
de substâncias responsáveis pela manutenção do tumor, efeito este mediado, por
exemplo, por fatores de crescimento (HART et al., 2004, RUBOVITCH et al., 2004;
VELASCO et al., 2004). Os canabinóides parecem ter papel tanto anti-tumoral
quanto pró-tumoral, efeito este que parece depender da expressão diferencial dos
receptores canabinóides CB
1
e CB
2
nestas células (DE PETROCELLIS et al., 2000;
VELASCO et al., 2004).
Análises funcionais e imunohistoquímicas, em modelos murinos de gliomas e
de carcinoma de pele, demonstraram que a administração de canabinóides modifica
a hiperplasia vascular, característica de tumores em crescimento, para um padrão de
vasos sanguíneos caracterizados por capilares pequenos, impermeáveis e
diferenciados. Isto é associado com uma redução na expressão de VEGF e outras
citocinas pró-angiogênicas (VELASCO et al, 2004). De forma interessante, a inibição
farmacológica da síntese de ceramida de novo abole o efeito anti-tumoral dos
canabinóides in vivo, assim como a inibição da produção de VEGF por células de
gliomas. É também demonstrado que a ativação de receptores canabinóides em
células endoteliais vasculares inibe sua migração e sobrevivência, o que contribui
para a redução da neovascularização em processos de crescimento tumoral, por
exemplo (BLÁZQUEZ et al, 2003).
Estudos bastante recentes demonstram que os canabinóides parecem
influenciar de maneira significativa a angiogênese tumoral em gliomas e
astrocitomas. Agonistas CB
2
foram capazes de diminuir a migração de células
endoteliais para o tumor e também induziram a apoptose destas células. De forma
ainda mais interessante, agonistas CB
2
interferiram na produção e expressão de
fatores pró-angiogênicos como o VEGF e a Angiopoietina 2 (Ang2) (BLÁZQUEZ et
54
Introdução
al., 2003; 2004). Um potente análogo do endocanabinóide anandamida foi capaz de
inibir a expressão de VEGF, e também de um de seus receptores funcionais, através
da ativação do receptor CB
1
em uma linhagem celular de carcinoma pulmonar,
efeitos estes atenuados com a utilização de um antagonista CB
1
específico. Esta
inibição foi associada à diminuição do crescimento do tumor e metástase,
demonstrando o importante papel da ativação do sistema canabinóide na redução
da progressão de tumores (PORTELLA et al., 2003). Efeitos semelhantes foram
observados em tumores de pele (não-melanomas), com diminuição da
vascularização do tumor e diminuição da expressão de fatores pró-angiogênicos
(Figura 9) (CASANOVA et al., 2003).
FIGURA 10: Mecanismo intracelular após ativação de receptor canabinóide em célula endotelial ou
tumoral, por exemplo.
O tratamento com canabinóides pode induzir a atividade da SPT (serino palmitoiltransferase) e
promovendo o acúmulo de ceramida e a inibição de Akt (proteína quinase B), o que diminuiria a
fosforilação de Akt e outras moléculas downstream. A ceramida induz a estimulação mantida de Raf-1
/ MEK / ERK, vias envolvidas na apoptose mediada por canabinóides. A ceramida também pode
atenuar a produção de VEGF. (Adaptado de VELASCO et al, 2004)
55
Introdução
Já foi demonstrado também um importante papel do agonista misto WIN
55,212-2 sobre a diminuição da expressão de VEGF e outros fatores pró-
angiogênicos, e também sobre a indução da apoptose, em células de
adenocarcinoma de tecido prostático humano (SARFARAZ et al., 2005).
Entretanto, é de importância observar que nenhum estudo estabelece um
papel claro para os receptores canabinóides, e também para os endocanabinóides,
no sítio inflamatório em reparo, mais precisamente seus papéis na regulação global
da angiogênese e sua influência sobre moléculas envolvidas neste processo. A
forma pela qual a ativação ou bloqueio destes receptores poderia influenciar a
angiogênese inflamatória, sendo modulando o recrutamento de células para o sítio
inflamatório, modificando a ativação de células residentes, interferindo diretamente
no processo local de neovascularização ou também interferindo na produção de
mediadores envolvidos nesta sobreposição de processos, é, de sobremaneira,
pouco explorada.
56
PAPEL DOS RECEPTORES CANABINÓIDES EM UM MODELO EXPERIMENTAL DE
ANGIOGÊNESE INFLAMATÓRIA
JUSTIFICATIVA
& OBJETIVOS
Justificativa e Objetivos
2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
Apesar dos diversos estudos sugerindo a participação do sistema
canabinóide, com seus ligantes endógenos e receptores, na inflamação e nos
processos angiogênicos relacionados tanto ao processo inflamatório como ao
câncer, diversas lacunas ainda devem ser preenchidas principalmente no que diz
respeito aos tipos de receptor canabinóide predominantemente envolvido nestes
processos, assim como sua influência na expressão e liberação de moléculas pró-
inflamatórias e pró-angiogênicas pelas diversas células envolvidas nestas
manifestações fisiopatológicas. Estabelecer a estrutura básica na qual o sistema
canabinóide modula a angiogênese relacionada à inflamação se torna um objetivo
necessário para o progresso dos estudos farmacológicos sobre esta classe de
mediadores com evidente potencial terapêutico.
Nosso objetivo, desta forma, é investigar o papel dos receptores
canabinóides, mais precisamente sua ativação ou bloqueio, em um modelo murino
de angiogênese inflamatória avaliada após implante subcutâneo de uma matriz
esponjosa, explorando como a administração exógena de antagonistas e agonistas
dos receptores canabinóides podem influenciar na angiogênese e no recrutamento
celular para o sítio inflamatório, avaliando concomitantemente a influência destes
fármacos na produção de mediadores pró-inflamatórios, e também pró-
angiogênicos, por estas células.
58
Justificativa e Objetivos
2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Investigar o efeito do tratamento sistêmico com antagonistas (SR141716A,
antagonista CB
1
, e SR144528, antagonista CB
2
) e agonista dos receptores
canabinóides (WIN 55,212-2, agonista misto CB
1
/CB
2
), e do tratamento
local com agonista destes receptores, 7 e 14 dias após implante
subcutâneo de uma matriz esponjosa, sobre a vascularização e o
recrutamento de neutrófilos e macrófagos para a matriz onde se evidencia
um processo inflamatório.
2. Investigar o efeito do tratamento sistêmico de antagonistas e agonistas
dos receptores canabinóides, e do tratamento local com agonistas destes
receptores, sobre a produção de mediadores inflamatórios e pró-
angiogênicos pelas células endoteliais e inflamatórias recrutadas para a
matriz após 7 e 14 dias, mais precisamente a citocina TNF-α, as
quimiocinas CCL5/RANTES, CXCL1-3 / KC e CCL2 / JE, além do fator de
crescimento VEGF, moléculas notadamente importantes neste modelo
experimental (BARCELOS et al, 2004, 2005, dados não publicados; BELO
et al, 2004).
3. Obter e analisar cortes histológicos da matriz esponjosa, para visualização
do infiltrado celular e vascularização, após os respectivos tratamentos
supracitados, 7 e 14 dias após o implante.
59
PAPEL DOS RECEPTORES CANABINÓIDES EM UM MODELO EXPERIMENTAL DE
ANGIOGÊNESE INFLAMATÓRIA
MATERIAL
& MÉTODOS
Material e Métodos
3. MATERIAL E MÉTODOS
Em nosso delineamento experimental, os animais receberam tratamento
sistêmico (por via subcutânea), 200 μL/animal e/ou local (intra-implante), 50 μL/local,
de fármacos durante 7 e 14 dias. A via de escolha para o tratamento se deveu a
experimentos pilotos previamente realizados e a dados da literatura, além, inclusive,
da disponibilidade dos fármacos em questão (ver tabela no item 3.8):
• Grupo controle: PBS (tampão fosfato de sódio pH 7.4) + Cremophor (Sigma-
Aldrich) + DMSO (dimetilsulfóxido, Veco) – Veículo (local e sistêmico), 7 e
14 dias.
• Grupos 1 e 2: SR141716A (antagonista CB1, cedido pela Sanofi-Aventis,
França) - tratamento sistêmico, 7 e 14 dias.
• Grupo 3 e 4: SR144528 (antagonista CB2, cedido pela Sanofi-Aventis,
França) - tratamento sistêmico, 7 e 14 dias.
• Grupo 5 e 6: WIN 55,212-2 (agonista misto CB1/CB2, Sigma-Aldrich) –
tratamento sistêmico, 7 e 14 dias
• Grupo 7 e 8: WIN 55,212-2 (agonista misto CB1/CB2, Sigma-Aldrich) –
tratamento local, 7 e 14 dias
Os tempos escolhidos para avaliação dos parâmetros bioquímicos e
histológico de interesse para o estudo da angiogênese inflamatória tiveram como
base trabalhos anteriores do grupo que demonstram importantes fenômenos de
recrutamento celular e formação de tecido fibrovascular entre os dias 7 e 14 após
implante subcutâneo de esponja em camundongos C57BL/6 (BARCELOS et al,
2005).
61
Material e Métodos
A proporção de PBS (tampão fosfato de sódio pH 7.4) / Cremophor / DMSO
(dimetilsulfóxido, VECO) no veículo é de 18:1:1, proporção esta que, de acordo com
a literatura, não apresenta efeitos biológico apreciáveis. O mesmo veículo foi
utilizado para todos os fármacos em estudo.
Projeto aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal
(CETEA/COEP – UFMG), Protocolo nº 147/06.
3.1 - Animais
Foram utilizados camundongos C57BL/6 machos, com aproximadamente 10
semanas, pesando entre 20-25 gramas, provenientes do Centro de Bioterismo da
Universidade Federal de Minas Gerais (CEBIO, UFMG). Os animais foram mantidos
no biotério do Laboratório de Imunofarmacologia, ICB / UFMG, com livre acesso a
ração e água, e sob ciclo claro/escuro, até o momento dos experimentos. O número
de animais estipulado para cada grupo experimental foi de 6-8 animais.
3.2 - Implantação da matriz esponjosa
Discos de esponja de poliéster poliuretano (Vitafoam Ltda.) de 8 mm de
diâmetro por 5 mm de espessura, canulados centralmente com cânulas de polivinil
(PE 20 - Bio Vida) de 12 mm de comprimento, foram devidamente confeccionados e
mantidos em álcool a 70% durante, pelo menos, 24 horas antes da implantação.
Para o procedimento cirúrgico, os animais foram anestesiados com quetamina
(Rompum
®
)/xilazina (Calmium
®
) (respectivamente 3,2 mg/animal e 0,16 mg/animal,
em solução salina a 0.9%, numa proporção de 4:1:5 (quetamina:xilazina:salina), 25-
62
Material e Métodos
30 μL/animal, e submetidos a tricotomia e assepsia da região dorsal com álcool
iodado. Em seguida, foi feita uma incisão de aproximadamente 1 cm na pele de tal
região e, após delicada apartação do tecido subcutâneo, foi introduzido o disco de
esponja, previamente lavado em água destilada e submetido a fervura durante 15
minutos. A cânula foi exteriorizada através de um orifício na pele da região cervical,
suturada junto à pele e sua extremidade superior ocluída com massa de
modelagem. Finalmente, a incisão dorsal foi suturada. Após a cirurgia os animais
foram mantidos sob aquecimento artificial até completo restabelecimento de suas
funções vitais, sendo mais tarde distribuídos em gaiolas individuais e mantidos no
Laboratório de Angiogênese, Departamento de Fisiologia e Biofísica, ICB/UFMG,
com livre acesso a ração e água.
A C
B D
FIGURA 11: Matriz esponjosa. Aspecto da esponja antes da implantação (A) e após 14 dias de
implantação (B).
Visualização do implante de esponja na região cervical de um camundongo Balb/C (C) e aspecto do
implante aderido ao tecido subcutâneo, já coberto por tecido conjuntivo (14 dias após implantação).
63
Material e Métodos
3.3 – Quantificação da angiogênese pela dosagem de hemoglobina
Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e os implantes
cuidadosamente removidos. A cânula foi separada e em seguida os implantes foram
pesados. Cada implante foi homogeneizado em reagente de Drabkin (Labtest, São
Paulo) e centrifugado a 10.000 g por 15 min (DRABKIN & AUSTIN, 1932). Os
sobrenadantes foram filtrados em filtros de 0,22 μm (Millipore). A hemoglobina
presente nas amostras foi quantificada colorimetricamente a 540 nm em um
espectrofotômetro (E max – Molecular Devices). A concentração de hemoglobina foi
calculada a partir de uma curva padrão. Os resultados foram expressos em μg de
hemoglobina / ml / mg de tecido úmido (peso da esponja).
3.4 - Quantificação da infiltração de neutrófilos no tecido pelo método de
atividade da mieloperoxidase (MPO)
Os pellets obtidos após a centrifugação dos homogenatos das matrizes
esponjosas (ver o método para dosagem de hemoglobina) foram cuidadosamente
divididos em duas porções iguais e ressuspendidos em dois diferentes tampões,
específicos para a medida da atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e N-
acetilglicosaminidase (NAG) (BAILEY, 1988; McMILLAN, 1981). Uma das porções
de cada amostra foi ressuspendida em 1 ml de tampão fosfato (pH 4.7), a 4ºC,
sendo então homogeneizada em vortex e centrifugada por 15 min. a 10.000 g (4ºC).
Os pellets obtidos foram ressuspendidos em 1 ml de tampão fosfato (pH 5.4),
contendo 0,5% de hexa-1,6-bis-deciltrimetilamônio (HTAB, Sigma-Aldrich). As
suspensões foram congeladas e descongeladas por três vezes em nitrogênio líquido
64
Material e Métodos
(N
2
) e em seguida centrifugadas por 15 min. a 10.000 g. Os sobrenadantes foram
estocados a - 20ºC até o momento do ensaio.
Para o ensaio foram utilizados 25 μL de 3,3´-5,5´- tetrametilbenzidina (TMB,
Sigma-Aldrich), dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO, Veco) a uma concentração
final de 1,6 mM; 100 μL de H
2
O
2
dissolvida em tampão fosfato (pH 5.4), contendo
HTAB, a uma concentração final de 0,003% e 25 μL das suspensões estocadas. A
reação foi iniciada a 37ºC por 5 min. em placas de 96 poços após a adição das
suspensões e da solução de TMB. Após este período, a solução de H
2
O
2
foi
adicionada e a placa novamente incubada a 37ºC por 5 min. A reação foi parada
pela adição de 100 μL de H
2
SO
4
a 4M e quantificada em espectrofotômetro a 450
nm. O conteúdo de neutrófilos foi calculado a partir de uma curva padrão da
atividade de MPO expressa em aumento de absorbância a partir de neutrófilos
obtidos da cavidade peritoneal de camundongos mediante injeção de uma solução
de caseína a 5%. O lavado peritoneal foi realizado após um tempo máximo de 6
horas pós-injeção. Os resultados foram expressos em número relativo de neutrófilos
por miligrama (mg) de tecido úmido (peso da esponja). A unidade obtida por este
procedimento é expressa como “número relativo de neutrófilos”.
3.5 - Quantificação da infiltração de macrófagos no tecido pelo método de
atividade da n-acetilglicosaminidase (NAG)
A outra porção de matriz esponjosa, de cada amostra, cuidadosamente
dividida (ver ensaio para detecção da atividade de MPO), foi ressuspendida em
solução salina 0,9% (4ºC) contendo 0,1% v/v de Triton X-100 (Merck). Logo em
seguida foi homogeneizada em vortex e centrifugada a 4ºC por 10 min. a 1.500 g.
65
Material e Métodos
Os sobrenadantes foram imediatamente recolhidos e utilizados para o ensaio de
NAG.
A reação foi iniciada após a adição de 100 μL de p-nitrofenil-N-acetil-
β
-D-
glicosaminidase (Sigma-Aldrich), dissolvida em tampão citrato/fosfato (pH 4.5), a
uma concentração final de 2,24 mM, a 100 μL do sobrenadante recolhido após
centrifugação das matrizes esponjosas. A reação se processou a 37ºC por 10 min,
em placas de 96 poços. O término da reação foi dado pela adição de 100 μL de
tampão glicina 0.2 M (pH 10,6) e quantificada em espectrofotômetro a 405 nm. O
conteúdo de macrófagos foi calculado a partir de uma curva padrão da atividade de
NAG expressa em aumento de absorbância a partir de macrófagos obtidos da
cavidade peritoneal de camundongos, mediante injeção de uma solução de
tioglicolato de sódio a 3%. O lavado peritoneal foi realizado após um tempo máximo
de 4 dias pós-injeção. Os resultados foram expressos em número relativo de
macrófagos por miligrama (mg) de tecido úmido (peso da esponja). A unidade obtida
por este procedimento é expressa como “número relativo de macrófagos”.
3.6 - Ensaio de ELISA para detecção de citocinas e quimiocinas
Os sobrenadantes obtidos após a centrifugação dos homogenatos das
matrizes esponjosas (ver o método para dosagem de hemoglobina) foram utilizados
para detectar os níveis das citocinas e quimiocinas propostas pelo projeto,
respectivamente TNF-α, VEGF, CXCL1-3/KC, CCL2/JE e CCL5/RANTES. Os
ensaios foram realizados utilizando-se kits murinos específicos (R&D systems) e
seguindo as orientações do fabricante.
66
Material e Métodos
Basicamente, 100 μL/poço do anticorpo de captura (5,5 μL/ml), diluídos em
PBS estéril (pH 7.4), foram adicionados a cada placa (NUNC FLAT, 96-poços,
FALCON). Estas foram então vedadas e incubadas a 4ºC overnight. O conteúdo de
cada placa foi então retirado e esta foi lavada 3 vezes (300 μL/poço) com um
tampão de lavagem (PBS/TWEEN 20 a 0,05%). Após este procedimento, foram
adicionados 300 μL/poço do tampão de bloqueio (BSA - bovine serum albumine - 1%
em PBS). As placas foram incubadas a temperatura ambiente por no mínimo uma
hora. Repetiu-se o procedimento de lavagem e adicionou-se 100 μL/poço das
amostras de sobrenadante e padrões diluídos em tampão de diluição (BSA 0,1% em
PBS). As placas foram novamente incubadas overnight. Repetiu-se o procedimento
de lavagem e adicionou-se 100μL/poço do anticorpo de detecção biotinilado (5,55
μL/ml) diluído em tampão de diluição (o mesmo das amostras e padrões). As placas
foram incubadas a temperatura ambiente por 2 horas. Após outro procedimento de
lavagem, adicionou-se 100 μL/poço de estreptavidina – HRP (1:200), em tampão de
diluição, e incubou-se as placas a temperatura ambiente por 20 minutos. Novamente
as placas foram lavadas e adicionou-se 100 μL/poço do substrato OPD (em tampão
citrato pH 5,0 com H
2
O
2
). As placas foram incubadas por 20-30 minutos, em
temperatura ambiente, protegidas da luz. Após este período, adicionou-se 50
μL/poço de H
2
SO
4
1M para interromper a reação. As placas foram lidas em
espectrofotômetro a 492 nm. A concentração de citocinas e quimiocinas foi obtida
partir de curvas padrões. O resultado foi expresso em pg/ml de citocinas ou
quimiocinas por peso úmido de tecido em mg (peso da esponja).
67
Material e Métodos
3.7 - Análise histológica das matrizes esponjosas
Após 7 e 14 dias de implante, esponjas representativas de cada grupo
experimental (2 a 3 esponjas por grupo) foram cuidadosamente fixadas em solução
de formol a 10% em PBS (pH 7.4). Após o tempo de fixação mínimo de 48 horas, os
implantes foram submetidos a etapas de desidratação, diafanização, banho e
inclusão em parafina. Em seguida, foram realizados cortes em micrótomo (seccções
de 5 μm) e as lâminas foram coradas com hematoxilina e eosina (H.E), para
avaliação do infiltrado inflamatório, formação de conjuntivo e vascularização. Os
cortes foram analisados ao microscópio óptico e registrados fotograficamente
(objetiva de 20X, ocular de 10 X, aumento de 200 vezes). Cada corte teve o registro
fotográfico de pelo menos 10 campos, sendo apenas uma imagem representativa do
corte selecionada para fins de comparação entre grupos submetidos a tratamento
farmacológico. Toda a preparação do material histológico foi realizada no
Departamento de Patologia do Instituto de Ciências Biológicas (ICB/UFMG).
3.8 - Análise estatística
Os resultados estão representados como a média ± erro padrão da média.
Comparações entre dois grupos foram feitas utilizando-se o teste t de Student, para
dados não pareados. Para três ou mais grupos, as comparações foram feitas
utilizando-se análise de variância (One-way ANOVA), e as diferenças entre os
grupos foram certificadas utilizando-se o pós-teste Newman-Keuls. Um valor de p
inferior a 0,05 foi considerado significativo. A análise estatística e elaboração dos
68
Material e Métodos
gráficos aqui representados foram realizadas utilizando-se o software GraphPad
Prism 3.0.
3.9 – Delineamento experimental
Espécie Grupo
Animais
/ grupo
Procedimento
CONTROLE
8
Veículo, 7 dias, experimento ANTAGONISTAS
CONTROLE
8
Veículo, 7 dias, experimento AGONISTA LOCAL
CONTROLE
8 Veículo, 7 dias, experimento AGONISTA SISTÊMICO
CONTROLE
8
Veículo, 14 dias, experimento ANTAGONISTAS
CONTROLE
8
Veículo, 14 dias, experimento AGONISTA LOCAL
CONTROLE
8
Veículo, 14 dias, experimento AGONISTA SISTÊMICO
Mus musculus
1 8
SR141716A, 7 dias (ANTAGONISTA CB
1
) 10 mg/Kg
(C57BL/6) 2 8
SR141716A, 14 dias (ANTAGONISTA CB
1
) 10 mg/Kg
3 8
SR144528, 7 dias (ANTAGONISTA CB
2
) 10 mg/Kg
4 8
SR144528, 14 dias (ANTAGONISTA CB
2
) 10 mg/Kg
5 8
WIN 55,212-2, 7 dias (AGONISTA) SISTÊMICO 3, 10 mg/Kg
6 8
WIN 55,212-2, 14 dias (AGONISTA) SISTÊMICO 3 mg/Kg
7 8 WIN 55,212-2, 7 dias (AGONISTA) LOCAL 30, 100 μg/local
8 8 WIN 55,212-2, 14 dias (AGONISTA) LOCAL 30 μg/local
FIGURA 12: Tabela esquemática para o delineamento experimental proposto.
Modelo também anexado ao protocolo n º 147/06 (CETEA/COEP – UFMG).
69
PAPEL DOS RECEPTORES CANABINÓIDES EM UM MODELO EXPERIMENTAL DE
ANGIOGÊNESE INFLAMATÓRIA
RESULTADOS
Resultados
4. RESULTADOS
4.1. Efeitos do tratamento sistêmico com os antagonistas dos receptores CB1
e CB2, SR141716A e SR 144528, respectivamente.
4.1.1. Efeitos sobre a concentração de hemoglobina na matriz esponjosa
O tratamento sistêmico diário (10 mg/Kg, 200 μL/animal/s.c.) com os
antagonistas dos receptores CB
1
e CB
2,
SR141716A e SR144528, durante 7 e 14
dias, foi capaz de inibir de maneira significativa, a concentração de hemoglobina nos
implantes avaliados. A dosagem do conteúdo de hemoglobina pelo método de
Drabkin é utilizada como medida indireta da formação de vasos sanguíneos.
Para o antagonista CB
1,
a concentração de hemoglobina estava
significativamente reduzida no sétimo dia pós-implante (P<0.05), sendo o perfil da
resposta mantido no décimo quarto dia pós-implante (P<0.01), mostrando-se um
efeito anti-angiogênico considerável após bloqueio deste subtipo de receptor
canabinóide. Resultado similar foi observado para o tratamento com o antagonista
dos receptores CB
2
, SR144528, sendo que tanto no sétimo dia (P<0.01), como no
décimo quarto dia (P<0.05) houve diminuição significativa da resposta angiogênica
nos implantes. Os resultados podem ser verificados na figura 13. Desta forma, o
bloqueio de ambos os subtipos de receptores canabinóides neste modelo
experimental é capaz de reduzir a angiogênese, assim quantificada pela
concentração de hemoglobina na esponja. Não houve diferença entre os
tratamentos com os dois antagonistas nos dois dias escolhidos para avaliação da
resposta.
71
Resultados
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
*
#
Veículo
CB1 CB2
(10 mg/kg/dia) s.c
7 dias 14 dias
#
*
Veículo
CB1
CB2
(10 mg/kg/dia) s.c
Hemoglobina
(
μ
g/peso úmido de esponja)
FIGURA 13: Efeito do tratamento com os antagonistas canabinóides SR141716 (CB
1
) e SR144528
(CB
2
), 10 mg/Kg (200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre a formação de novos vasos,
quantificada através da dosagem de hemoglobina na esponja (método de Drabkin).
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. N = 6-8 animais/grupo. *
p<0.05; # p<0.01 em relação ao veículo.
4.1.2. Efeitos sobre o recrutamento celular para a matriz esponjosa.
A medida da atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e N-
acetilglicosaminidase (NAG) dos implantes foi utilizada como indicativo da presença
de neutrófilos e de macrófagos, respectivamente, na matriz esponjosa. Há um
progressivo aumento do infiltrado inflamatório ao longo das duas semanas de
experimento. O pico de infiltrado neutrofílico, verificado pela atividade da
mieloperoxidase, é máximo no sétimo dia, mantendo-se estável até o décimo quarto
dia. O pico de atividade máxima da N-acetilglicosaminidase aparece após o sétimo
dia, mantendo-se elevado até o décimo quarto dia (BARCELOS et al, 2005).
72
Resultados
O tratamento sistêmico diário (10 mg/Kg, 200
μL/animal/s.c.) com os
antagonistas dos receptores CB
1
e CB
2,
SR141716A e SR144528, durante 7 e 14
dias, foi capaz de inibir de maneira significativa, com padrão diferenciado, o
recrutamento de neutrófilos e macrófagos para a matriz esponjosa, como avaliado
pelos ensaios bioquímicos supracitados. Os resultados sugerem que o bloqueio dos
receptores canabinóides é capaz de modular o recrutamento celular para a matriz
esponjosa após implante subcutâneo.
O tratamento com o antagonista CB
1
, SR141716A, foi eficaz em inibir o
recrutamento de neutrófilos no sétimo dia (p<0.05), sendo que o tratamento parece
manter este perfil de inibição, que é semelhante no décimo quarto dia após implante
(p<0.05). Quanto ao antagonista CB
2
, SR144528, o perfil de inibição é notadamente
diferente. O tratamento com o antagonista CB
2,
SR144528, leva à inibição
significativa do recrutamento de neutrófilos no sétimo dia após implante (p<0.05),
perfil de resposta que não é observada no décimo quarto dia após implante, ao
contrário do tratamento com o antagonista dos receptores CB
1
. Os resultados estão
ilustrados na figura 14.
73
Resultados
0
10
20
30
*
*
*
7 dias 14 dias
Veículo
CB1 CB2
Veículo
CB2
(10 mg/kg/dia) s.c
(10 mg/kg/dia) s.c
CB1
Número relativo de neutrófilos
FIGURA 14: Efeito do tratamento com os antagonistas canabinóides SR141716 (CB
1
) e SR144528
(CB
2
), 10 mg/Kg (200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre o recrutamento de neutrófilos,
quantificado através da dosagem da atividade da mieloperoxidase (MPO).
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. N = 6-8 animais/grupo. *
p<0.05 em relação ao veículo.
Foi também observado, no tratamento sistêmico diário com o antagonista do
receptor CB
1,
SR141716A, somente após 14 dias de tratamento, a inibição do
recrutamento de macrófagos para a matriz esponjosa. O tratamento com ambos os
compostos não causou nenhuma alteração no perfil de recrutamento deste tipo
celular no sétimo dia pós-implante, mas o tratamento com o antagonista do receptor
CB
1
, SR141716A, levou à diminuição significativa do recrutamento de macrófagos
para a esponja no décimo quarto dia após implante (p<0.05). Os resultados estão
ilustrados na figura 15.
74
Resultados
0
1
2
3
*
Veículo
CB1 CB2
Veículo
CB2
(10 mg/kg/dia) s.c
(10 mg/kg/dia) s.c
7 dias 14 dias
CB1
Número relativo de macrófagos
FIGURA 15: Efeito do tratamento com os antagonistas canabinóides SR141716 (CB
1
) e SR144528
(CB
2
), 10 mg/Kg (200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre o recrutamento de macrófagos,
quantificado através da dosagem da atividade da N-acetilglicosaminidase (NAG).
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. N = 6-8 animais/grupo. *
p<0.05 em relação ao veículo.
4.1.3. Efeitos sobre a concentração de citocinas e quimiocinas na matriz
esponjosa.
Diversos mediadores inflamatórios são produzidos localmente após o
implante subcutâneo da matriz esponjosa, notadamente quimiocinas e citocinas,
moléculas notadamente importantes no processo inflamatório, assim como na
neovascularização e no reparo tecidual. Neutrófilos e macrófagos são importantes
fontes locais destes mediadores. As citocinas e quimiocinas são capazes de modular
de forma direta e indireta o processo de angiogênese, seja influenciando o
recrutamento e/ou ativação de células endoteliais, seja influenciando no
recrutamento e/ou ativação de células responsáveis pela produção de mediadores
também importantes para a neovascularização (BARCELOS, 2004; 2005; dados não
75
Resultados
publicados). Foram avaliadas as concentrações de quatro importantes citocinas
envolvidas na angiogênese inflamatória, a citocina TNF-
α, as quimiocinas RANTES,
CXCL1-3 / KC, além do fator de crescimento VEGF.
O tratamento sistêmico diário (10 mg/Kg, 200
μL/animal/s.c.) com os
antagonistas dos receptores CB
1
e CB
2,
SR141716A e SR144528, durante 7 e 14
dias, foi capaz de inibir de maneira significativa, e com padrão diferenciado, a
concentração destes mediadores na matriz esponjosa, como avaliado por ELISA. Os
resultados sugerem que o bloqueio dos receptores canabinóides é capaz de modular
a produção local de citocinas e quimiocinas. O bloqueio dos receptores CB
1
levou à
diminuição bastante significativa da concentração local de TNF-
α, importante
mediador pró-angiogênico e pró-inflamatório, tanto no sétimo (p<0.05), quanto no
décimo quarto dia (p<0.001) pós-implante. Já o bloqueio dos receptores CB
2
somente se mostrou eficaz na diminuição da concentração local de TNF-
α no sétimo
dia pós-implante (p<0.01). Estes resultados estão ilustrados na figura 16.
Quanto aos efeitos do tratamento diário com os antagonistas dos receptores
CB
1
e CB
2
sobre a concentração local de VEGF, importante mediador pró-
angiogênico, é possível se observar diminuição significativa da concentração deste
mediador na matriz esponjosa, após bloqueio dos receptores canabinóides, somente
no sétimo dia pós-implante (CB
1
, p<0.05; CB
2
p<0.01), momento onde está
representado o pico deste mediador neste modelo experimental (BARCELOS
et al,
2005). Não foi observado nenhum efeito do tratamento proposto sobre a
concentração de VEGF no décimo quarto dia pós-implante. Observar estes
resultados na figura 17.
76
Resultados
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
*
#
**
7 dias 14 dias
TNF-
α
(pg/peso úmido de esponja)
Veículo
CB1 CB2
Veículo
CB2
(10 mg/kg/dia) s.c (10 mg/kg/dia) s.c
CB1
FIGURA 16: Efeito do tratamento com os antagonistas canabinóides SR141716 (CB
1
) e SR144528
(CB
2
), 10 mg/Kg (200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre a concentração de TNF-α,
quantificada por ELISA.
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. N = 6-8 animais/grupo. *
p<0.05; # p<0.01; ** p<0.001 em relação ao veículo.
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
*
#
7 dias 14 dias
Veículo
CB1 CB2
Veículo
CB2
(10 mg/kg/dia) s.c (10 mg/kg/dia) s.c
CB1
VEGF
(pg/peso úmido de esponja)
FIGURA 17: Efeito do tratamento com os antagonistas canabinóides SR141716 (CB
1
) e SR144528
(CB
2
), 10 mg/Kg (200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre a concentração de VEGF,
quantificada por ELISA.
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. N = 6-8 animais/grupo. *
p<0.05; # p<0.01 em relação ao veículo.
77
Resultados
O tratamento diário com os antagonistas dos receptores CB
1
e CB
2
levou à
diminuição na concentração local da quimiocina CXCL1-3/KC, quimiotática para
neutrófilos, no sétimo dia pós-implante (CB
1
, p<0.05; CB
2
p<0.01). O tratamento até
o décimo quarto dia somente foi efetivo com o antagonista do receptor CB
1
,
SR141716A, quando houve uma diminuição bastante significativa na concentração
local da quimiocina (p<0.05). Figura 18.
0
10
20
*
#
*
*
7 dias 14 dias
Veículo
CB1 CB2
Veículo
CB2
(10 mg/kg/dia) s.c (10 mg/kg/dia) s.c
CB1
CXCL1-3/KC
(pg/peso úmido de esponja)
FIGURA 18: Efeito do tratamento com os antagonistas canabinóides SR141716 (CB
1
) e SR144528
(CB
2
), 10 mg/Kg (200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre a concentração de CXCL1-3/KC,
quantificada por ELISA.
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. N = 6-8 animais/grupo. *
p<0.05; # p<0.01 em relação ao veículo.
O mesmo esquema de tratamento foi capaz de alterar as concentrações
locais da quimiocina CCL5/RANTES, molécula descrita como reguladora do
processo angiogênico por nosso grupo de trabalho (dados não publicados). De
forma interessante, o tratamento com os antagonistas dos receptores CB
1
e CB
2
não
alterou as concentrações da quimiocina no sétimo dia pós-implante, mas o
78
Resultados
antagonista do receptor CB
2
, SR144528, levou a um aumento significativo desta
quimiocina no décimo quarto dia pós-implante (p<0.05). Figura 19.
0.0
2.5
5.0
7.5
#
7 dias 14 dias
Veículo
CB1 CB2
Veículo
CB2
(10 mg/kg/dia) s.c (10 mg/kg/dia) s.c
CB1
CCL5/RANTES
(pg/peso úmido de esponja)
FIGURA 19: Efeito do tratamento com os antagonistas canabinóides SR141716 (CB
1
) e SR144528
(CB
2
), 10 mg/Kg (200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre a concentração de CCL5/RANTES,
quantificada por ELISA.
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. N = 6-8 animais/grupo. #
p<0.01 em relação ao veículo.
79
Resultados
4.2. Efeitos do tratamento sistêmico com agonista misto dos receptores
canabinóides WIN 55,212-2
Para se investigar os efeitos da ativação dos receptores canabinóides,
escolheu-se aminoalquilindol WIN 55212,2, o enantiômero
R-(+), um dos agonistas
canabinóides mais comumente utilizado, com alta seletividade para CB
1
e CB
2
. As
doses escolhidas foram baseadas na literatura, em estudos onde se investigou o
efeito anti-inflamatório, após administração sistêmica deste fármaco, em diversos
modelos experimentais. Apesar de haver considerável efeito central após a
administração, com os animais apresentando notável perda de tônus muscular e
confusão (DREWS
et al, 2005), estes efeitos são transitórios, desaparecendo com
no máximo 2 horas após administração, sem aparente interferência em seus efeitos
anti-inflamatórios e/ou anti-angiogênicos.
4.2.1. Efeitos sobre a concentração de hemoglobina na matriz esponjosa
A administração diária do agonista canabinóide misto WIN 55,212-2 (3 ou 10
mg/Kg, 200
μL/animal/s.c.) levou à redução na concentração de hemoglobina na
matriz esponjosa, no sétimo dia pós-implante, em ambas as doses (p<0.05). No
décimo quarto dia pós-implante, a dose de 3 mg/Kg foi capaz de manter esta
redução na concentração de hemoglobina (p<0.05). Dados representados na Figura
20.
80
Resultados
Veículo 3 10 Veículo 3
0
1
2
3
*
*
*
WIN 55212-2
(mg/kg/dia) s.c
7 dias 14 dias
WIN 55212-2
(mg/kg/dia) s.c
Hemoglobina
(
μ
g/peso úmido de esponja)
FIGURA 20: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2, 3 e 10 mg/Kg
(200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre a formação de novos vasos, quantificada através da
dosagem de hemoglobina na esponja (método de Drabkin).
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. N = 6-8 animais/grupo. *
p<0.05 em relação ao veículo.
4.2.2. Efeitos sobre o recrutamento celular para a matriz esponjosa.
A administração diária do agonista canabinóide misto WIN 55,212-2 (3 ou 10
mg/Kg, 200
μL/animal/s.c.) levou a redução significativa, e dose-dependente, do
recrutamento de neutrófilos para a matriz esponjosa no sétimo dia pós-implante
(p<0.05). O mesmo efeito foi observado para a dose de 3 mg/Kg no décimo quarto
dia pós-implante (p<0.05). Figura 21.
81
Resultados
Veículo 3 10 Veículo 3
0.0
1.5
3.0
4.5
6.0
7.5
9.0
*
*
*
7 dias 14 dias
WIN 55212-2
(mg/kg/dia) s.c
WIN 55212-2
(mg/kg/dia) s.c
Número relativo de neutrófilos
FIGURA 21: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2, 3 e 10 mg/Kg
(200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre o recrutamento de neutrófilos, quantificado através
da dosagem da atividade da mieloperoxidase (MPO).
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. N = 6-8 animais/grupo. *
p<0.05 em relação ao veículo.
O mesmo sistema de tratamento levou à inibição dose-dependente do
recrutamento de macrófagos para a matriz esponjosa no sétimo dia pós-implante
(p<0.05). Este perfil de inibição foi mantido no décimo quarto dia pós-implante, com
o tratamento na dose de 3 mg/Kg (p<0.05). Figura 22.
82
Resultados
Veículo 3 10 Veículo 3
0
1
2
*
*
WIN 55212-2
(mg/kg/dia) s.c
7 dias 14 dias
WIN 55212-2
(mg/kg/dia) s.c
Número relativo de macrófagos
FIGURA 22: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2, 3 e 10 mg/Kg
(200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre o recrutamento de macrófagos, quantificado através
da dosagem da atividade da N-acetilglicosaminidase (NAG).
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. N = 6-8 animais/grupo. *
p<0.05 em relação ao veículo.
4.2.3. Efeitos sobre a concentração de citocinas e quimiocinas na matriz
esponjosa.
Foram avaliadas as concentrações de quatro importantes citocinas envolvidas
na angiogênese inflamatória, a citocina TNF-
α, as quimiocinas CXCL1-3 / KC e
CCL2 / JE, além do fator de crescimento VEGF. A quimiocina RANTES, ao contrário
do experimento com os antagonistas dos receptores canabinóides, não foi
examinada por questões meramente estratégicas, uma vez que estes experimentos
foram realizados em momentos distintos durante o desenrolar do projeto.
A administração diária do agonista canabinóide misto WIN 55,212-2 (3 ou 10
mg/Kg, 200
μL/animal/s.c.) levou à redução significativa, e de maneira dose-
83
Resultados
dependente, da concentração da citocina TNF-
α na matriz esponjosa no sétimo dia
pós-implante, sendo este efeito observado na dose de 3 mg/Kg (p<0.01) e
notadamente na dose de 10 mg/Kg (p<0.001). O mesmo perfil foi observado com o
tratamento até o décimo quarto dia pós-implante (p<0.05). Figura 23.
Perfil bastante semelhante foi observado quanto à concentração do fator de
crescimento VEGF. O tratamento com o agonista misto WIN 55,212-2 é capaz de
inibir a concentração do mediador na matriz esponjosa no sétimo e no décimo quarto
dia pós-implante (p<0.05). Figura 24.
Veículo 3 10 Veículo 3
0.00
0.15
0.30
0.45
0.60
**
#
7 dias 14 dias
*
WIN 55212-2
(mg/kg/dia) s.c
WIN 55212-2
(mg/kg/dia) s.c
TNF-
α
(pg/peso úmido de esponja)
FIGURA 23: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2, 3 e 10 mg/Kg
(200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre a concentração de TNF-α, quantificada por ELISA.
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. N = 6-8 animais/grupo. *
p<0.05; # p<0.01 em relação ao veículo.
84
Resultados
Veículo 3 10 Veículo 3
0
1
2
3
4
5
*
*
*
WIN 55212-2
(mg/kg/dia) s.c
7 dias 14 dias
WIN 55212-2
(mg/kg/dia) s.c
VEGF
(pg/peso úmido de esponja)
FIGURA 24: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2, 3 e 10 mg/Kg
(200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre a concentração de VEGF, quantificada por ELISA.
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. N = 6-8 animais/grupo. * p
<0.05 em relação ao veículo.
Quanto ao efeito do tratamento diário com o agonista canabinóide misto WIN
55,212-2 sobre a concentração de quimiocinas na matriz esponjosa, os resultados
foram distintos. O tratamento é capaz de reduzir a concentração da quimiocina
CXCL1-3/KC na matriz esponjosa no sétimo (de maneira dose-dependente) e
décimo quarto dia pós-implante (p<0.05). Resultados ilustrados na figura 25. No que
diz respeito à quimiocina responsável pelo recrutamento de
mononucleares/macrófagos pra a matriz esponjosa, CCL2/JE, o tratamento com o
WIN 55,212-2 não foi capaz de reduzir a concentração do mediador na matriz
esponjosa nos dois momentos escolhidos para avaliação da resposta (Figura 26).
85
Resultados
Veículo 3 10 Veículo 3
0
1
2
3
4
*
*
*
WIN 55212-2
(mg/kg/dia) s.c
7 dias 14 dias
WIN 55212-2
(mg/kg/dia) s.c
CXCL1-3/KC
(pg/peso úmido de esponja)
FIGURA 25: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2, 3 e 10 mg/Kg
(200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre a concentração de CXCL1-3/KC, quantificada por
ELISA.
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. N = 6-8 animais/grupo. * p
<0.05 em relação ao veículo.
Veículo 3 10 Veículo 3
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
WIN 55212-2
(mg/kg/dia) s.c
7 dias 14 dias
WIN 55212-2
(mg/kg/dia) s.c
CCL2/JE
(pg/peso úmido de esponja)
FIGURA 26: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2, 3 e 10 mg/Kg
(200 μL/animal/s.c.), durante 7 e 14 dias, sobre a concentração de CCL2/JE, quantificada por ELISA.
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. N = 6-8 animais/grupo.
86
Resultados
4.3. Efeitos do tratamento local com agonista misto dos receptores
canabinóides WIN 55,212-2
Para se investigar os efeitos da ativação dos receptores canabinóides com o
aminoalquilindol WIN 55,212-2, agonista misto dos receptores canabinóides, sobre a
angiogênese inflamatória, sem interferência de nenhum fator sistêmico, optamos
pelo tratamento local, intra-esponja, com a administração de duas concentrações do
fármaco: 30 e 100
μg/local (50 μL/animal/local). A administração local, com seringa
de insulina, pode causar pequena resposta inflamatória, mas o mesmo procedimento
é feito com o grupo controle, descartando qualquer possibilidade de se mascarar os
dados obtidos. Não foi observado nenhum efeito central aparente após a
administração local do fármaco durante os 7 ou 14 dias de tratamento.
4.3.1. Efeitos sobre a concentração de hemoglobina na matriz esponjosa
A administração diária local do agonista canabinóide misto WIN 55,212-2 (30
ou 100
μg/local, 50 μL/animal/local) levou à redução na concentração de
hemoglobina na matriz esponjosa, no sétimo dia pós-implante, em ambas as doses
(p<0.05). No décimo quarto dia pós-implante, a dose de 30
μg/local foi capaz de
manter esta redução na concentração de hemoglobina (p<0.05). Dados
representados na Figura 27.
87
Resultados
Veículo Veículo
0.0
2.5
5.0
7.5
*
*
*
30
100
WIN 55212-2
(
μg/local)
30
WIN 55212-2
(
μg/local)
7 dias 14 dias
Hemoglobina
(
μ
g/peso úmido de esponja)
FIGURA 27: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2, 30 e 100 μg/local
(50 μL/local/animal), durante 7 e 14 dias, sobre a formação de novos vasos, quantificada através da
dosagem de hemoglobina na esponja (método de Drabkin).
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. N = 6-8 animais/grupo. *
p<0.05 em relação ao veículo.
4.3.2. Efeitos sobre o recrutamento celular para a matriz esponjosa.
A administração diária local do agonista canabinóide misto WIN 55,212-2 (30
ou 100
μg/local, 50 μL/animal/local) levou a redução significativa do recrutamento de
neutrófilos para a matriz esponjosa no sétimo dia pós-implante (p<0.05). O mesmo
efeito foi observado para a dose de 100
μg/local no décimo quarto dia pós-implante
(p<0.05). FIGURA 28.
88
Resultados
Veiculo 30 100 Veículo 30
0
10
20
30
40
*
*
*
WIN 55212-2
(
μg/local)
WIN 55212-2
(
μg/local)
7 dias 14 dias
Número relativo de
neutrófilos
FIGURA 28: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2, 30 e 100 μg/local
(50 μL/local/animal), durante 7 e 14 dias, sobre o recrutamento de neutrófilos, quantificado através da
dosagem da atividade da mieloperoxidase (MPO).
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. N = 6-8 animais/grupo. *
p<0.05 em relação ao veículo.
Diferentemente do tratamento sistêmico, a administração diária local do
agonista canabinóide misto WIN 55,212-2 (30 ou 100
μg/local, 50 μL/animal/local)
levou à inibição do recrutamento de macrófagos para a matriz esponjosa no sétimo
dia pós-implante (p<0.05) somente na concentração de 30
μg/local. Este perfil de
inibição não foi observado no décimo quarto dia pós-implante, com o tratamento na
dose de 100
μg/local. Figura 29.
89
Resultados
Veículo Veículo
0
5
10
15
30
100
WIN 55212-2
(
μg/local)
*
30
WIN 55212-2
(
μg/local)
7 dias 14 dias
Número relativo de
macrófagos
FIGURA 29: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2, 30 e 100 μg/local
(50 μL/local/animal), durante 7 e 14 dias, sobre o recrutamento de macrófagos, quantificado através
da dosagem da atividade da N-acetilglicosaminidase (NAG).
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. N = 6-8 animais/grupo. *
p<0.05 em relação ao veículo.
4.3.3. Efeitos sobre a concentração de citocinas e quimiocinas na matriz
esponjosa.
Assim como no tratamento sistêmico, foram avaliadas as concentrações de
citocinas e quimiocinas reconhecidamente importantes na angiogênese inflamatória:
a citocina TNF-
α, as quimiocinas CXCL1-3 / KC e CCL2 / JE, e fator de crescimento
VEGF. A administração diária local do agonista canabinóide misto WIN 55,212-2
WIN 55,212-2 (30 ou 100
μg/local, 50 μL/animal/local) levou à redução significativa
da concentração da citocina TNF-
α na matriz esponjosa, no sétimo dia pós-implante,
em ambas as concentrações (p<0.01). O mesmo perfil foi observado com o
tratamento até o décimo quarto dia pós-implante (p<0.05). Figura 30.
90
Resultados
Perfil bastante semelhante foi observado quanto à concentração do fator de
crescimento VEGF. O tratamento local com o agonista misto WIN 55,212-2 é capaz
de inibir a concentração do mediador na matriz esponjosa no sétimo e no décimo
quarto dia pós-implante, nas duas concentrações estudadas (p<0.05). FIGURA 31.
Veículo 30 100 Veículo 30
0
1
2
3
#
#
*
WIN 55212-2
(
μg/local)
WIN 55212-2
(
μg/local)
7 dias 14 dias
TNF-
α
(pg/peso úmido de esponja)
FIGURA 30: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2, 30 e 100 μg/local
(50 μL/local/animal), durante 7 e 14 dias, sobre a concentração de TNF-α, quantificada por ELISA.
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. N = 6-8 animais/grupo. *
p<0.05; # p<0.01 em relação ao veículo.
91
Resultados
Veículo 30 100 Veículo 30
0
10
20
30
*
*
*
WIN 55212-2
(
μg/local)
WIN 55212-2
(
μg/local)
7 dias 14 dias
VEGF
(pg/peso úmido de esponja)
FIGURA 31: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2, 30 e 100 μg/local
(50 μL/local/animal), durante 7 e 14 dias, sobre a concentração de VEGF, quantificada por ELISA.
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. N = 6-8 animais/grupo. *
p<0.05 em relação ao veículo.
Em relação ao efeito do tratamento diário local com o agonista canabinóide
misto WIN 55,212-2 sobre a concentração de quimiocinas na matriz esponjosa, os
resultados foram distintos, mas ainda bastante similares ao tratamento sistêmico
com o mesmo fármaco. O tratamento é capaz de reduzir a concentração da
quimiocina CXCL1-3/KC na matriz esponjosa no sétimo e décimo quarto dia pós-
implante (p<0.05). Resultados ilustrados na figura 32. No que diz respeito à
quimiocina CCL2/JE, o tratamento com o WIN 55,212-2 não foi capaz de reduzir a
concentração do mediador na matriz esponjosa em nenhum dos dois momentos
escolhidos para avaliação da resposta (Figura 33).
92
Resultados
Veículo 30 100 Veículo 30
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
*
*
*
WIN 55212-2
(
μg/local)
WIN 55212-2
(
μg/local)
7 dias 14 dias
CXCL1-3/KC
(pg/peso úmido de esponja)
FIGURA 32: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2, 30 e 100 μg/local
(50 μL/local/animal), durante 7 e 14 dias, sobre a concentração de CXCL1-3/KC, quantificada por
ELISA.
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. N = 6-8 animais/grupo. *
p<0.05 em relação ao veículo.
Veículo 30 100 Veículo 30
0.0
2.5
5.0
7.5
WIN 55212-2
(
μg/local)
WIN 55212-2
(
μg/local)
7 dias 14 dias
CCL2/JE
(pg/peso úmido de esponja)
FIGURA 33: Efeito do tratamento com o agonista canabinóide misto WIN 55,212-2, 30 e 100 μg/local
(50 μL/local/animal), durante 7 e 14 dias, sobre a concentração de CCL2/JE, quantificada por ELISA.
Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média. N = 6-8 animais/grupo. *
p<0.05 em relação ao veículo.
93
Resultados
4.4. Análise histológica dos implantes de esponja após tratamentos com os
antagonistas canabinóides SR141716A (CB
1
) e SR144528 (CB
2
), e com o
agonista canabinóide misto WIN 55,212-2
A implantação da matriz esponjosa estimula progressiva infiltração de um
tecido conjuntivo fibrovascular cujo perfil histológico demonstra crescente invasão de
vasos sanguíneos neoformados, células inflamatórias e fibroblastos, culminando
com a formação de um tecido de granulação característico de um processo de
reparação tecidual. No sétimo dia pós-implantação, os implantes apresentam
discreta formação vascular, com significativo infiltrado inflamatório e moderada
formação colágena, encontrando-se preenchidos por um tecido conectivo
frouxamente arranjado. Posteriormente, no décimo quarto dia pós-implantação, a
matriz esponjosa se encontra preenchida por densa malha fibrovascular,
caracterizada pela presença principal de polimorfonucleares, fibroblastos e
apreciável formação neovascular. Interessantemente, pode ser observada a
presença de leucócitos circulantes ou aderidos, dentro de alguns vasos
neoformados. Finalmente, nos implantes de décimo quarto dia, observou-se maior
organização e compactação do tecido fibrovascular, característico de reações
granulomatosas crônicas, com rede neovascular madura, presença acentuada de
leucócitos e matriz extracelular abundante.
94
Resultados
4.4.1 – Efeitos do tratamento com antagonistas dos receptores canabinóides
sobre o perfil histológico da matriz esponjosa após implante subcutâneo.
O tratamento com os antagonista canabinóide SR141716A (CB
1
), 10 mg/Kg,
até o sétimo dia após implantação da matriz esponjosa, leva a uma redução
sensível do infiltrado celular para a esponja assim como a uma menor e bastante
evidente formação de tecido fibrovascular, quando comparado aos animais tratados
com veículo somente, onde a malha de fibras conjuntivas está bem composta. O
mesmo tratamento, até o décimo quarto dia após implantação, leva a uma redução
bastante significativa da formação do tecido fibrovascular na matriz esponjosa, uma
vez que o grupo tratado somente com veículo apresenta rede neovascular bastante
desenvolvida. Para o antagonista SR144528 (CB
2
), o tratamento na dose de 10
mg/Kg levou a resultados muito semelhantes ao do tratamento com o antagonista
dos receptores CB
1
, SR141716A. Tanto no sétimo quanto no décimo quarto dia após
implantação, há uma redução do tecido fibrovascular e do infiltrado celular, sendo
que para o infiltrado esta resposta é mais evidente no sétimo dia. No décimo quarto
dia é notável a diminuição da rede neovascular. A análise histológica reflete com
bastante clareza os resultados obtidos com os ensaios bioquímicos para avaliação
do infiltrado celular e da neovascularização (ensaio de hemoglobina) (Figuras 34 e
35).
95
Resultados
M
M
A B
M
C
FIGURA 34: Cortes histológicos, corados por H.E., representativos do tecido fibrovascular induzido,
em implantes subcutâneos de matriz esponjosa, em animais tratados com os antagonistas
canabinóides SR141716A e SR144528 (10 mg/Kg) por 7 dias.
(A) Corte representativo de animal tratado com veículo. (B) Corte representativo de animal tratado
com SR141716A. (C) Corte representativo de animal tratado com SR144528. Aumento de 200X
(objetiva de 20X). M: Matriz.
96
Resultados
M
M
A B
M
C
FIGURA 35: Cortes histológicos, corados por H.E., representativos do tecido fibrovascular induzido,
em implantes subcutâneos de matriz esponjosa, em animais tratados com os antagonistas
canabinóides SR141716A e SR144528 (10 mg/Kg) por 14 dias.
(A) Corte representativo de animal tratado com veículo. (B) Corte representativo de animal tratado
com SR141716A. (C) Corte representativo de animal tratado com SR144528. Aumento de 200X
(objetiva de 20X).
97
Resultados
4.4.2 – Efeitos do tratamento com o agonista misto dos receptores
canabinóides sobre o perfil histológico da matriz esponjosa após implante
subcutâneo.
O tratamento sistêmico com o agonista misto WIN 55,212-2, 3 e 10 mg/Kg,
até o sétimo dia após implantação da matriz esponjosa leva a notável redução do
infiltrado celular para a esponja. A formação de tecido fibrovascular, característica
deste momento, está bastante reduzida quando comparada aos animais tratados
com veículo somente, onde a malha de fibras conjuntivas está bem definida. O
tratamento, até o décimo quarto dia após implantação, na dose de 3 mg/Kg, leva a
uma redução marcante da formação do tecido fibrovascular na matriz esponjosa,
uma vez que o grupo tratado somente com veículo apresenta rede neovascular
bastante desenvolvida (Figuras 36 e 37).
Para o tratamento local com o mesmo agonista, nas concentrações de 30 e
100
μg/animal, os resultados apresentados foram muito semelhantes ao do
tratamento sistêmico como o mesmo fármaco. Tanto no sétimo quanto no décimo
quarto dia após implantação (concentração de 30
μg/animal), há redução do tecido
fibrovascular e também do infiltrado celular, sendo que para o infiltrado esta resposta
é mais evidente no sétimo dia, quando este fenômeno é exacerbado. No décimo
quarto dia é evidente a diminuição da rede neovascular. A análise histológica reflete
com bastante clareza os resultados obtidos com os ensaios bioquímicos para
avaliação do infiltrado celular e da neovascularização (ensaio de hemoglobina)
(Figuras 38 e 39).
98
Resultados
M
M
A B
M
C
FIGURA 36: Cortes histológicos, corados por H.E., representativos do tecido fibrovascular induzido,
em implantes subcutâneos de matriz esponjosa, em animais tratados sistemicamente com o agonista
canabinóide WIN 55,212-2 por 7 dias.
(A) Corte representativo de animal tratado com veículo. (B) Corte representativo de animal tratado
com WIN 55,212-2 (3 mg/Kg). (C) Corte representativo de animal tratado com WIN 55,212-2 (10
mg/Kg). Aumento de 200X (objetiva de 20X). M: Matriz.
99
Resultados
M
M
A B
FIGURA 37: Cortes histológicos, corados por H.E., representativos do tecido fibrovascular induzido,
em implantes subcutâneos de matriz esponjosa, em animais tratados sistemicamente com o agonista
canabinóide WIN 55,212-2 por 14 dias.
(A) Corte representativo de animal tratado com veículo. (B) Corte representativo de animal tratado
com WIN 55,212-2 (3 mg/Kg). Aumento de 200X (objetiva de 20X). M: Matriz.
M
M
A B
FIGURA 38: Cortes histológicos, corados por H.E., representativos do tecido fibrovascular induzido,
em implantes subcutâneos de matriz esponjosa, em animais tratados localmente com o agonista
canabinóide WIN 55,212-2 por 14 dias.
(A) Corte representativo de animal tratado com veículo. (B) Corte representativo de animal tratado
com WIN 55,212-2 (30 μg/local/animal). Aumento de 200X (objetiva de 20X). M: Matriz.
100
Resultados
M
M
M
os por H.E., representativos do tecido fibrovascular induzido,
resentativo de animal tratado
do com WIN 55,212-2
μg/local/animal). Aumento de 200X (objetiva de 20X). M: Matriz.
BA
C
FIGURA 39: Cortes histológicos, corad
em implantes subcutâneos de matriz esponjosa, em animais tratados localmente com o agonista
canabinóide WIN 55,212-2 por 7 dias.
(A) Corte representativo de animal tratado com veículo. (B) Corte rep
WIN 55,212-2 (30 μg/local/animal). (B) Corte representativo de animal tratacom
(100
101
PAPEL DOS RECEPTORES CANABINÓIDES EM UM MODELO EXPERIMENTAL DE
ANGIOGÊNESE INFLAMATÓRIA
DISCUSSÃO
Discussão
5. DISCUSSÃO
Durante processos inflamatórios crônicos, a angiogênese é considerada
essencial não apenas para a manutenção da perfusão tecidual adequada, mas
também contribuindo para o aumento do recrutamento celular para o sítio de
inflamação (FOLKMAN, 1995). Embora a participação das citocinas como moléculas
mediadoras tanto no processo inflamatório como angiogênico seja amplamente
discutida na literatura, pouco se conhece sobre o papel destas na modulação da
rede molecular e também dos eventos celulares envolvidos na regulação do fenótipo
angiogênico durante a angiogênese inflamatória.
No presente estudo, investigou-se como a ativação ou bloqueio dos
receptores canabinóides CB
1
e CB
2,
seja pela administração sistêmica de
antagonistas destes receptores, seja pela administração local e também sistêmica
de um agonista misto tanto em CB
1
quanto em CB
2
, buscando entender como a
ativação ou inativação deste sistema (considerando que este esteja exercendo uma
função ativa, uma vez que canabinóides endógenos podem estar sendo produzidos
no local), influenciaria a ativação e/ou recrutamento celular pra o local estudado,
assim como a intervenção neste sistema influenciaria a produção de mediadores
importantes no controle da angiogênese inflamatória.
Utilizando o modelo de implantação subcutânea de discos de esponja em
camundongos (ANDRADE
et al, 1987), os dados obtidos indicam que o influxo de
células inflamatórias e a angiogênese, como quantificado pela dosagem de
hemoglobina, estão bastante reduzidos em relação ao grupo controle, tanto quando
há tratamento com os antagonistas como quando há tratamento com o agonista
misto. Alguns importantes mediadores da angiogênese inflamatória, como a
103
Discussão
quimiocina CXCL1-3/KC, o TNF-
α e o VEGF apresentaram redução significativa de
suas concentrações na matriz esponjosa após os tratamentos, no momento em que
estão em seu pico de produção (BARCELOS
et al, 2004)
A lesão promovida pela introdução da esponja no compartimento subcutâneo
dos camundongos induziu resposta local similar àquela observada em processos
inflamatórios crônicos e de cicatrização de feridas, onde se observa o
desencadeamento de uma cascata complexa e organizada de eventos, resultando
no acúmulo celular e vascular no local da lesão (WITTE & BARBUL, 1997).
Juntamente com os eventos celulares, a angiogênese é controlada pela
complexa interação entre inibidores e ativadores, cujo balanço apropriado leva à
iniciação e à manutenção do processo (IRUELA-ARISPE & DVORAK, 1997). A
maioria das moléculas angiogênicas conhecidas são citocinas (incluindo os fatores
de crescimento e as quimiocinas) que, além de serem importantes mediadores
inflamatórios, são capazes de regular diretamente o recrutamento e ativação de
células endoteliais (BENELLI
et al, 2006).
O delta-9-THC e seus análogos sintéticos exibem uma série de efeitos
biológicos através de seu potente efeito sobre receptores denominados “receptores
canabinóides”. Dois receptores canabinóides específicos, CB1 e CB2, ambos
acoplados à proteína G,
foram clonados e caracterizados em tecidos de mamíferos.
Os receptores CB1 são abundantes no cérebro, mas também presentes na periferia,
como no endotélio vascular e no baço. Os receptores CB2 estão presentes
principalmente em células do sistema imune. Estudos moleculares e farmacológicos
demonstraram que a ativação dos receptores canabinóides pode levar à inibição ou
ativação da adenilato ciclase (dependendo do tipo de proteína G acoplado ao
receptor), sendo que a ativação de CB1 também leva à modulação do
104
Discussão
funcionamento de canais iônicos. Os receptores canabinóides também modulam
diversas vias de sinalização, principalmente aquelas envolvidas na proliferação
celular e na sobrevivência, como, por exemplo, ERK, MAP e PI3K (HOWLETT
et al.,
2004; DE PETROCELLIS
et al., 2004).
A existência de receptores canabinóides específicos apontou imediatamente
para a possibilidade de o organismo sintetizar ligantes endógenos para estes
receptores. Os assim chamados “endocanabinóides”, compostos eicosanóides
derivados do ácido araquidônico, mostraram ser um grupo relativamente
diversificado, com pelo menos 2 membros já bastante estudados: a anandamida e o
2-araquidonoilglicerol (2-AG). Estes dois compostos são tanto produzidos no cérebro
como em tecidos periféricos, além de serem secretados por diversos tipos celulares.
Os endocanabinóides são produzidos e ativam os receptores canabinóides em
diversas condições fisiológicas, sendo que a maioria destas ainda carece de
detalhes em nível molecular e celular (DE PETROCELLIS
et al., 2004).
No presente estudo, escolhemos duas estratégias farmacológicas para
averiguarmos de qual maneira o sistema canabinóide estaria envolvido nos
processos de reparo tecidual e angiogênese inflamatória, abordagem esta a que se
propõe o modelo experimental de implante de esponja. Quanto ao bloqueio dos
receptores canabinóides, com dois antagonistas específicos destes receptores, já
bem representados na literatura especializada, observamos um potente efeito anti-
inflamatório e também anti-angiogênico, tendo escolhido como momentos para
avaliação os dias 7 e 14 após a implantação, com tratamento sistêmico diários,
pontos estes já demonstrados em trabalhos do grupo (BARCELOS
et al., 2004;
2005) como sendo ideais para avaliação das respostas requeridas.
105
Discussão
O bloqueio tanto de CB
1
como de CB
2
levou a uma diminuição da resposta
angiogênica, como avaliados nos dias 7 e 14 após implantação, pela dosagem do
conteúdo de hemoglobina. O mesmo perfil é observado nas análises de cortes
histológicos nestes mesmos momentos, onde há diminuição sensível da rede
neovascular e do tecido fibrovascular adjacente. Este perfil de diminuição é
acompanhado por uma redução sensível dos níveis de VEGF no sétimo dia pós-
implante. Barcelos
et al. (2005) mostra o pico de VEGF no sétimo dia de
implantação. Uma redução sensível nos níveis deste mediador poderia de forma
contundente retardar a neovascularização dos implantes, refletindo na diminuição da
concentração de hemoglobina nos mesmos. A diminuição do recrutamento
neutrofílico para o foco inflamatório é nítida, como analisado por MPO. Neutrófilos
são produtores potenciais de VEGF e TNF-
α, duas moléculas reconhecidamente
pró-angiogênicas (BENELLI
et al., 2006; FOLKMAN et al., 1995).
O recrutamento celular para a esponja esta reduzido, e de forma diferencial,
após o tratamento com os antagonistas CB
1
e CB
2
. Ambas as estratégias levam à
redução do infiltrado neutrofílico após o sétimo dia de tratamento. Já para o décimo
quarto dia, apenas o antagonista CB
1
, SR141716A é capaz de levar a uma inibição
deste recrutamento, mesmo que no décimo quarto dia este fenômeno já não seja tão
importante para os eventos marcantes neste modelo experimental, como a formação
do tecido fibrovascular. Em relação ao recrutamento de macrófagos para a matriz
esponjosa, somente o antagonista CB
1
,
SR141716A, foi capaz de reduzir o influxo
deste tipo celular. Os níveis da quimiocina CCL2/JE, essencial para o recrutamento
de macrófagos nos momentos iniciais pós-implante (BARCELOS
et al, 2005), não se
mostram alterados em nenhum momento após o tratamento (dados não mostrados),
demonstrando que a interferência sobre o recrutamento de macrófagos para a matriz
106
Discussão
esponjosa parece não depender desta quimiocina. Outras quimiocinas, como, por
exemplo, CCL3/MIP-1
α, e, até em um outro momento, CCL5/RANTES, poderiam
também ser os moduladores do recrutamento de macrófagos para a matriz neste
modelo experimental.
Os níveis da citocina TNF-
α estão bastante reduzidos após o tratamento com
os antagonistas CB
1
e CB
2
, 7 e 14 dias pós-implantação. Somente o antagonista CB
2
não foi capaz de levar a uma redução da concentração da citocina após o décimo
quarto dia. A citocina TNF-
α, reconhecidamente pró-angiogênica, pode levar à
liberação de controladores da resposta angiogênica dependendo do local e da
concentração desta no meio. A citocina pode controlar a angiogênese, por exemplo,
regulando a síntese de VEGF e CXCL1-3/KC (YOSHIDA
et al, 1997). É interessante
observar que os baixos níveis desta citocina estão correlacionados, nos resultados
apresentados, com os baixos níveis de VEGF e CXCL1-3/KC, e consequentemente,
a uma menor neovascularização e também menor recrutamento para o sítio
inflamatório. O mecanismo do TNF-
α neste sistema poderia ser, justamente, através
do sinergismo com estas moléculas relacionadas, ou, em certo ponto, com a
ativação local de células inflamatórias, como o neutrófilo. A idéia central, desta
forma, seria: Menos infiltrado celular, pela redução da concentração de CXCL1-
3/KC, menos produção de TNF-
α e moléculas associadas (incluindo uma menor
indução da produção de outras moléculas pelo próprio TNF-
α) ou o antagonista seria
capaz de, diretamente, reduzir a produção de TNF-
α pelos tipos celulares na matriz
esponjosa (local), o que já foi citado na literatura para o infiltrado celular em um
modelo de resposta inflamatória sistêmica (CROCI
et al, 2003). A última hipótese é
menos válida, uma vez que a análise histológica já revela uma nítida redução no
infiltrado celular após tratamento com os fármacos.
107
Discussão
O influxo celular para a esponja está bastante reduzido, como avaliado pela
análise histológica (e pelas análises bioquímicas relacionadas). Os níveis,
principalmente da quimiocina fundamental para o recrutamento de neutrófilos,
CXCL1-3/KC, está bastante reduzido, o que justifica não somente a menor presença
de neutrófilos no sítio, assim como também, e diretamente, a neovascularização,
uma vez que esta quimiocina é capaz de regular a angiogênese
per si (BELPERIO
et al, 2000). Interessante observar que somente o tratamento com o antagonista CB
1
mantém baixos os níveis da quimiocina CXCL1-3/KC e da citocina TNF-
α após o
décimo quarto dia de tratamentos. Estes dados se correlacionam perfeitamente com
o menor influxo neutrofílico no décimo quarto dia.
A análise histológica demonstra uma notável redução na formação de tecido
fibrovascular, com o menor acúmulo de fibras conjuntivas e menor
neovascularização após o tratamento com ambos os antagonistas. Estas alterações
fisiopatológicas estão diretamente ligadas aos pontos discutidos anteriormente, e
também à discussão subseqüente, onde a menor presença de infiltrado celular
leucocitário, notadamente o produtor da maior quantidade de mediadores pró-
inflamatórios, e a conseqüente diminuição da concentração local de fatores pró-
angiogênicos e pró-fibróticos, seja pelo menor recrutamento celular, seja também
pelo efeito direto sobre a produção destes mediadores pelas células residentes, leva
a um menor rearranjo da matriz em formação.
A quimiocina RANTES, até então pouco avaliada como mediador fundamental
no processo de angiogênese inflamatória, vem sendo uma quimiocina de interesse
em nossos trabalhos (BARCELOS
et al, dados não publicados). CCL5/RANTES
pode levar à indução de sinais pró-apoptóticos em células inflamatórias através de
sua ligação ao receptor CCR1 e CCR5 (VLAHAKIS
et al, 2002; BARCELOS et al.,
108
Discussão
dados não publicados). De forma interessante, a neovascularização corneal está
inibida em camundongos
knock out para o receptor CCR5 (AMBATI et al, 2003). No
presente estudo observamos um aumento na concentração de RANTES no décimo
quarto dia após implantação e tratamento, fenômeno este que poderia contribuir
para a menor formação de tecido fibrovascular na matriz esponjosa. Dados de nosso
grupo demonstram que CCL5/RANTES exógeno é capaz de inibir a
neovascularização através do receptor CCR5, já a atividade anti-angiogênica
endógena deste receptor parece ser redundante com a atividade do receptor CCR1.
O tratamento com o antagonista canabinóide CB
2
leva a um aumento significativo na
concentração desta quimiocina na esponja, sugerindo que este efeito é mediado
pelo mesmo mecanismo que modula a produção de outros mediadores em nosso
estudo. Esta elevação contribuiria sinergisticamente para a redução da resposta
angiogênica também relacionada ao tratamento com este antagonista.
A compreensão de eventos celulares envolvidos na angiogênese inflamatória
e da regulação molecular desses eventos possui extensas implicações clínicas. A
multiplicidade de alvos existentes, os quais estão envolvidos em uma complexa rede
de interações, provê alvos terapêuticos para o tratamento de uma variedade de
doenças dependentes deste processo. O número de alvos potenciais e de
compostos em estudo para uma “terapia anti-angiogênica”, por exemplo, está em
constante expansão, mas, ainda, em estágios iniciais (TARABOLETTI &
MARGOSIO
, 2001).
O tratamento com os antagonistas canabinóides CB
1
e CB
2
se mostrou uma
estratégia eficaz na redução da resposta inflamatória e angiogênica associadas a
um modelo experimental de implante de matriz esponjosa. A administração sistêmica
dos fármacos leva à redução do infiltrado celular, da angiogênese e à menor
109
Discussão
produção de mediadores relacionados a estes fenômenos. É de importância lembrar
que o antagonista CB
1
, SR141716A, já se encontra no mercado farmacêutico como
Rimonabant ou Acomplia, indicado para o tratamento da obesidade, fenômeno este
que também possui uma resposta inflamatória associada (FANTUZZI
et al, 2005).
Importante frisar que, até o momento, pouco é discutido na literatura
especializada sobre um relevante papel pró-inflamatório para os endocanabinóides
em diversas condições patológicas, seja pela discrepância existente entre alguns
estudos referentes à concentração destas moléculas no sítio inflamatório em
questão, seja pela variedade de modelos experimentais utilizados, impossibilitando a
construção exata de um mecanismo de ação para esta classe de moléculas
(CROXFORD & YAMAMURA, 2005; KLEIN, 2005). O 2-AG é o endocanabinóide
com a participação na resposta inflamatória melhor estabelecida, principalmente no
que diz respeito a sua influência sobre o recrutamento de tipos celulares e indução
da produção de moléculas pró-inflamatórias, como as citocinas. A anandamida
parece não ser o endocanabinóide mais atuante na resposta inflamatória, pelo
menos na periferia, uma vez que no sistema nervoso central esta molécula é capaz
de regular diversas respostas celulares, mediadas principalmente por células da glia
(KARANIAN & BAHR, 2006; GOKOH
et al, 2005; KLEIN, 2005; OKA et al, 2005).
A expressão de receptores canabinóides está aumentada em células
inflamatórias como neutrófilos, linfócitos T
helper, monócitos/macrófagos, células
dendríticas, dentre outras. A maioria destes tipos celulares é capaz de sintetizar
endocanabinóides no sítio inflamatório, e estas moléculas são capazes de agir de
forma autócrina, regulando a atividade destas células na resposta inflamatória
(CROXFORD & YAMAMURA, 2005; KLEIN, 2005; SUGIURA
et al, 2004).
110
Discussão
Em nossa estratégia experimental, é plausível sugerir que o bloqueio tanto
dos receptores CB
1
quanto dos receptores CB
2
levaria à ruptura da interação entre
endocanabinóides no sítio inflamatório, no caso, a matriz esponjosa, uma vez que
todos os tipos celulares ali presentes são passíveis de terem suas respostas
moduladas por esta classe de moléculas (KLEIN, 2005; PIOMELLI, 2003). O
receptor CB1 já foi reconhecido na periferia, principalmente em terminações
nervosas, já o receptor CB
2
é abundante tanto no endotélio vascular quanto em
células do sistema imune, notadamente - e de nosso interesse - em macrófagos e
neutrófilos (AMAYA
et al, 2006; KLEIN, 2005; KELLY et al, 2003).
Os endocanabinóides, através da ativação do receptor CB
2
, poderiam
estimular vias relacionadas ao recrutamento celular e à mobilização do
citoesqueleto, como a AKT/PI3K (SELVATICI
et al, 2006). Uma vez que em nosso
modelo experimental o recrutamento neutrofílico e a conseqüente produção local de
mediadores inflamatórios por este tipo celular, como as quimiocinas CXCL1-3/KC, a
citocina TNF-
α e o fator de crescimento VEGF, todos importantes reguladores da
angiogênese inflamatória, é plausível sugerir que o bloqueio dos receptores CB
2
geraria uma resposta da forma supracitada, por inibição da ligação de
endocanabinóides. É também descrito que a ativação de CB
2
por mediadores
endógenos é capaz de levar à ativação da via MAP quinase (p42/44 MAP quinase)
dependente de PKC, e a MEK, o que levaria à transcrição, por exemplo, de
moléculas pró-inflamatórias (BOUABOULA
et al, 1996). Todos os fenômenos
supracitados foram capazes de serem revertidos após administração de antagonista
seletivo para CB
2
nestes modelos experimentais.
A sinalização mediada pela ativação CB
1
difere em alguns aspectos daquela
mediada por CB
2
. A ativação de CB
1
, acoplado a proteína G
s
, pode levar ao acúmulo
111
Discussão
considerável de AMPc em células inflamatórias, assim como modular a atividade de
canais de K
+
sensíveis a ATP e também canais Ca
2+
, diferentemente dos receptores
CB
2
, fenômenos estes relacionados a um perfil anti-inflamatório em diversos
modelos experimentais, seja influenciando no recrutamento celular para o sítio
inflamatório, seja pela influência na liberação de mediadores inflamatório no local
(como a relação acúmulo de AMPc
versus menor produção de TNF-α e outros
mediadores). Já foi relatado também que a anandamida é capaz de ativar a PLC
através da sua ligação a receptores CB
1
, o que, de certa forma, levaria a sua
biossíntese através da liberação de NAPE, seu precursor, presente na membrana
plasmática de macrófagos e outras células inflamatórias. O PAF, mediador
inflamatório lipídico de importância, é capaz de induzir, através da ativação de seu
receptor, a biossíntese do 2-AG, criando uma alça sinergística pró-inflamatória
(POMPERMAYER
et al, 2007; LIU et al, 2006; DEMUTH & MOLLEMAN, 2005;
BERDYSHEV
et al, 2001; ESCOFIER et al, 1999; CALANDRA et al, 1999).
A escolha da dose dos antagonistas a ser administrada sistemicamente foi
baseada na literatura (RINALDI-CARMONA
et al, 1994; 1998), de maneira que não
se esperasse um efeito inespecífico do fármaco relacionado à dose de escolha. A
escolha da via sistêmica para administração dos fármacos supracitados reflete na
abordagem mais coerente quando se tenta estreitar a relação “terapêutica
versus
ciência básica”. Com alta afinidade pelos receptores canabinóides CB
1
e CB
2
em
mamíferos, o SR141716A (Ki = 2 nM) e o SR144528 (Ki = 0.04 nM) (valores de Ki
para estes receptores em camundongos) não possuem afinidade biologicamente
significativa por nenhum outro receptor até então relatado (PERTWEE, 1997). De
qualquer forma, a literatura para o intrincado sistema canabinóide, como ele hoje se
apresenta, aponta para outros possíveis mecanismos de ação para estes
112
Discussão
antagonistas, uma vez que a ativação dos receptores canabinóides, seja por
agonistas sintéticos ou mesmo por endocanabinóides,
in vitro ou in vivo, por muito
tempo esteve relacionada à modulação negativa da resposta inflamatória, seja pela
inibição do recrutamento celular para diversos sítios inflamatório, seja pela inibição
da expressão e secreção de diversos mediadores inflamatórios, entre eles citocinas,
quimiocinas e mediadores lipídicos. A divergência existente na literatura recente,
desta forma, aponta para outros mecanismos de ação destes antagonistas.
(FELDER
et al, 2006; KLEIN, 2005; HOWLETT et al, 2004; BAKER et al, 2003;
PERTWEE, 1997)
.
Alguns estudos demonstram que a administração do SR141716A ou do
SR144528 é capaz, por si só, de induzir respostas centrais e periféricas,
principalmente sobre a produção de citocinas, de forma quantitativa e
qualitativamente similar aos efeitos imunossupressores do HU-210 e do WIN 55,212-
2 (ROCHE
et al, 2006). Efeitos imunossupressores e anti-inflamatórios do
SR141716A já foram descritos (CROCI
et al, 2003; SMITH et al, 2000). Croci et al
(2003) demonstraram uma diminuição da concentração de TNF-
α induzida por LPS
em camundongos após tratamento com SR141716A (10 mg/Kg). Smith
et al. (2000)
observaram efeitos similares, fazendo com que estes autores sugerissem um efeito
agonista parcial para o SR141716A sobre os receptores CB
1
. Roche et al. (2006)
observaram efeitos similares, tanto no sistema nervoso central como na periferia,
onde o SR141716A é capaz, por si só, de levar a uma redução na concentração de
citocinas pró-inflamatórias após estímulo com LPS. Pouco se sabe a respeito do
potencial efeito “agonista parcial” para o antagonista CB
2
SR144528, mas Smith et al
(2001) descrevem um efeito similar para o SR144528, após administração
113
Discussão
intracerebroventricular do fármaco, uma vez que este contribui para a diminuição
dos níveis séricos de IL-12 e TNF-
α após estímulo com LPS.
Hurst
et al. (2002) e Bouaboula et al. (1997) descrevem um mecanismo de
ação diferenciado para o SR141716, sendo que o fármaco atuaria como agonista
inverso no receptor CB
1
. Considerando que o receptor CB
1
existiria em algumas
conformações e tipos celulares em um estado pré-ativado, acoplado à proteína G
i/o
,
a ligação do antagonista CB
1
levaria a uma inibição da via ERK / MAP quinase,
fenômeno que estimularia a inibição da transcrição de diversos fatores pró-
inflamatórios por alguns tipos celulares comuns, incluindo a inibição da produção de
citocinas e quimiocinas. Hurst
et al. (2002) demonstram que o SR141716A tem alta
afinidade pelo estado R do receptor CB
1
, e que esta afinidade é devido a uma
ligação do tipo ponte de hidrogênio entre um substituinte C3 do fármaco e um
resíduo K3.28 (192), apresentado pelo receptor CB
1
somente quando este está no
estado R. De qualquer forma, descartando qualquer mecanismo não-antagonista
para o SR141716A ou para o SR144528, e possível também que ao inibir a ligação
de endocanabinóides a seus receptores, considerando que estas moléculas
apresentariam um perfil pró-inflamatório, os antagonistas estariam mascarando o
efeito de endocanabinóides sobre sítios não-canabinóides, como os receptores
vanilóides TRPV1 e os receptores PPAR-gama, uma vez que estas moléculas
estariam em concentrações elevadas no sítio inflamatório, não havendo receptores
canabinóides disponíveis para ligação.
Neste caso, por exemplo, a ligação de 2-AG em PPAR-gama levaria a um
efeito anti-inflamatório para a molécula (inibição da síntese de IL-2, por exemplo),
contribuindo para um efeito anti-inflamatório global e sinergístico se considerarmos
um provável efeito agonista inverso, ou agonista parcial, para o antagonista
114
Discussão
canabinóide (importante frisar que ao se ligar ao receptor canabinóide ele também
exibiria um efeito “antagonista neutro”, competindo com o 2-AG pelo sítio de ligação,
e no caso, por maior afinidade, impedindo que o 2-AG se ligue ao receptor
canabinóide em questão) (CRISTINO
et al, 2006; ROCKWELL et al, 2006;
PERTWEE, 2005).
De forma paradoxal, mas não menos importante, ao avaliarmos de que forma
a resposta angiogênica e inflamatória em nosso modelo experimental seria afetada
após a ativação tanto do receptor CB
1
como do receptor CB
2
, com o agonista misto
WIN 55,212-2, observamos efeitos bastante similares àqueles observados para os
antagonistas canabinóides. A estratégia de tratamento escolhida, por via sistêmica e
local, procurou excluir fatores que pudessem intervir na resposta desejada, uma vez
que o agonista é capaz de causar alterações centrais consideráveis, mesmo em
baixas doses, assim como efeitos cardiovasculares apreciáveis (DREWS
et al, 2005;
PFITZER
et al, 2004). Não foi observado nenhum efeito central após a
administração local do fármaco, ao contrário do que foi observado para a
administração sistêmica, onde há notável efeito central, mesmo que transitório. O
efeito central permanece mesmo após os 14 dias de tratamento por via sistêmica,
mostrando que o fármaco, pelo menos a nível central, não apresenta aparente
tolerância.
O tratamento diário com o WIN 55,212-2 por via sistêmica foi capaz de inibir a
angiogênese, como avaliado pelo conteúdo de hemoglobina na matriz esponjosa,
tanto no sétimo quanto no décimo quarto dia após implantação. Fenômeno
semelhante foi observado para o influxo de neutrófilos, inibido de forma significativa
nos dois tempos de avaliação. O influxo de macrófagos também está reduzido no
sétimo dia após implantação. Estes resultados estão diretamente relacionados com
115
Discussão
a concentração de quimiocinas e citocinas avaliadas na matriz esponjosa, onde
observamos inibição significativa da concentração da citocina TNF-
α e da quimiocina
CXCL1-3/KC (estas duas relacionadas diretamente a ativação e recrutamento
neutrofílico, assim como à resposta angiogênica) e também do fator de crescimento
VEGF (relacionado diretamente com a estimulação da resposta angiogênica e
comumente produzido por neutrófilos sob influência do TNF-
α). Não foi observada
nenhuma alteração para os níveis de CCL2/JE, sendo que desta forma apontamos o
provável envolvimento de outra quimiocina relacionada a mononucleares (ex.
CCL3/MIP-1
α).
A análise histológica após tratamento sistêmico com o WIN 55,212-2
apresenta perfil bastante semelhante àquele observado para o tratamento com
antagonistas canabinóides. Uma vez que o influxo celular está bastante reduzido,
assim como os mediadores envolvidos neste processo (e também a resposta
angiogênica consequentemente se encontra prejudicada) a formação do tecido
fibrovascular, com a neovascularização e a deposição de fibras colágenas e
elementos de matriz, apresenta-se reduzida nos animais tratados com as duas
doses do agonista misto.
O tratamento local buscou eliminar qualquer efeito anti-inflamatório mediado
por vias centrais, como o eixo HPA (Hipotálamo – Pituitária - Adrenal), importante na
liberação de corticosteróides e susceptível à ação de canabinóides (ROCHE
et al,
2006). A estratégia acabou por revelar resultados bastante semelhantes àqueles
observados para o tratamento sistêmico. As concentrações escolhidas foram
baseadas em dados experimentais onde não foram observadas lesões teciduais e
nenhum tipo de resposta local atípica (OKA
et al, 2006).
116
Discussão
Tanto a resposta angiogênica (em menor extensão), quanto o infiltrado
neutrofílico e macrofágico encontram-se reduzidos em ambas as concentrações
estudadas. O infiltrado de macrófagos apenas apresenta discreta inibição no sétimo
dia de tratamento, efeito este provavelmente relacionado à inibição discreta de
fatores quimiotáticos para este tipo celular, incluindo quimiocinas cuja inibição local
se torna ineficaz em reter o influxo celular. Para os mediadores TNF-
α, VEGF e
CXCL1-3/KC os tratamentos se mostram eficazes em manter estas moléculas em
baixas concentrações na matriz esponjosa, explicando, da mesma forma pela qual
justificamos os dados anteriores para os outros fármacos, o porquê do menor influxo
celular, da menor resposta angiogênica e da menor formação de tecido fibrovascular
na matriz esponjosa.
O agonista misto WIN 55,212-2 apresenta maior afinidade pelo receptor CB
2
do que pelo receptor CB
1
(SONG et al, 1999). O mecanismo pelo qual o agonista
misto pode exibir sua atividade anti-inflamatória já é bastante descrito, apesar de
não totalmente elucidado. Sinalizando principalmente através de CB
2
, o receptor
canabinóide mais abundante na periferia, principalmente em células inflamatórias e
órgãos linfóides, o WIN 55,212-2 é capaz de reduzir a translocação do fator de
transcrição NF
κB, importante para a produção de moléculas pró-inflamatórias com o
TNF-
α e o CXCL1-3/KC, e também é capaz de inibir a expressão de moléculas de
adesão e quimiocinas induzida por IL-1 em células inflamatórias, assim como inibir o
recrutamento de neutrófilos ativados por TNF-
α após adição de IL-8 in vitro
(MORMINA
et al, 2006; NILSSON et al, 2006; CURRAN et al, 2005).
Estes mecanismos contribuem tanto para a ativação como para o
recrutamento de células inflamatórias para um determinado sítio após estímulo, o
que justificaria parte dos resultados apresentados neste trabalho no que diz respeito,
117
Discussão
principalmente, à inibição da produção de mediadores pró-inflamatórios e pró-
angiogênicos e, consequentemente, a influência desta inibição sobre o recrutamento
celular para a matriz esponjosa e também sobre a redução da neovascularização.
Importante frisar novamente que, uma vez no sítio inflamatório, os tipos celulares
são capazes de secretar mediadores em momentos distintos, capazes, assim, de
atuar em sinergismo, mantendo a progressiva resposta inflamatória que culminará
com o desenvolvimento de um sistema de reparo e formação de tecido fibrovascular
característico de um processo crônico.
O WIN 55,212-2 é também capaz de influenciar diretamente a resposta
angiogênica. A ativação tanto de receptores CB
1
como CB
2
em células tumorais, e
também no endotélio vascular, pode levar ao aumento dos níveis intracelulares de
ceramida, molécula sinalizadora capaz de, diretamente, inibir a síntese de VEGF por
estes tipos celulares, fenômeno mediado pela ativação intracelular de AKT/PI3K,
assim como ativar a via de controle de proliferação celular Raf-1 / MEK / ERK
(VELASCO
et al, 2004; 2005; CASANOVA et al, 2003). Este perfil de resposta pode
variar com o tipo de proteína G acoplado ao receptor canabinóide em questão.
Desta forma, através de seu combinado potencial anti-inflamatório e anti-
angiogênico, o WIN 55,212-2 é capaz de reduzir o fenômeno global da angiogênese
inflamatória no modelo experimental de implante de matriz esponjosa.
De forma importante, convém atestar que, até este ponto, é intrigante notar
que a ativação dos receptores canabinóides por um agonista misto pode levar a um
perfil de resposta anti-inflamatória / anti-angiogênica assim como o bloqueio destes.
Como citado anteriormente, endocanabinóides atuariam neste sistema estimulando
a resposta inflamatória, seja pela indução da liberação de mediadores inflamatórios,
seja pela influência direta sobre o recrutamento celular, ou até mesmo levando ao
118
Discussão
aumento da expressão de mais receptores canabinóides nas células do sistema
imune, no endotélio vascular e em órgãos linfóides, construindo toda a arquitetura
necessária para o desenvolvimento da resposta inflamatória.
Em alguns modelos experimentais, demonstrou-se que o WIN 55,212-2 é
capaz de inibir o recrutamento de células HL-60 induzido pelo endocanabinóide 2-
AG (KURIHARA
et al, 2006). O agonista misto também foi capaz de reduzir a
inflamação tópica induzida pelo TPA e pelo 2-AG em orelha de camundongo (OKA
et al, 2006). O WIN 55,212-2 é capaz de agir como agonista total sobre o receptor
CB
2
(SUGIURA et al, 2000), e é de certa forma surpreendente que este agonista
misto seja capaz, assim como o antagonista SR 144528, de inibir a resposta
induzida pelo 2-AG em alguns modelos experimentais. Uma possível explicação
para este fenômeno é a ocorrência de uma condição anérgica prolongada, causada
pela desensibilização e subseqüente internalização do receptor canabinóide, o que
ocorreria após a estimulação com o WIN 55,212-2. Estudos recentes com células
HL-60 demonstram o perfil de restauração dos receptores após o estado de anergia
induzido pelo WIN 55,212-2, até o momento em que as células se tornam
novamente responsivas ao 2-AG. O 2-AG é uma molécula metabolicamente lábil,
enquanto o WIN 55,212-2 é uma molécula estável, e, por este motivo, mantém o
estado anérgico por tempo prolongado. Esta é uma possível razão pela qual o WIN
55,212-2 poderia interferir na ação de endocanabinóides, como o 2-AG, e se
comportar como um antagonista sobre os receptores canabinóides em algumas
situações
in vivo. Considerando o tratamento prolongado com o agonista misto WIN
55,212-2, em doses onde há considerável ativação tanto dos receptores CB
1
quanto
CB
2
, não podemos excluir a possibilidade deste fármaco estar atuando como um
antagonista em função da desensibilização e internalização dos receptores
119
Discussão
canabinóides, onde no final obteríamos uma resposta bastante similar àquela
observada para os antagonistas estudados. Assim, os endocanabinóides
participariam como mediadores pró-inflamatórios e pró-angiogênicos neste modelo
experimental.
De qualquer forma, ainda é impreciso afirmar qual mediador estaria envolvido
nestes perfis de resposta, assim como qual receptor canabinóide seria predominante
neste complexo sistema.
120
PAPEL DOS RECEPTORES CANABINÓIDES EM UM MODELO EXPERIMENTAL DE
ANGIOGÊNESE INFLAMATÓRIA
CONCLUSÃO
121
Conclusão
6. CONCLUSÃO
O presente trabalho sugere o claro envolvimento dos receptores canabinóides
nos fenômenos de recrutamento celular e produção de mediadores pró-inflamatórios
e pró-angiogênicos em um modelo experimental de angiogênese inflamatória. Tanto
a ativação quanto o bloqueio destes receptores parece modular negativamente as
respostas associadas à inflamação, à neovascularização e à formação de tecido
fibrovascular associada. Apesar de não ser possível elucidar qual endocanabinóide,
ou mediador molecularmente relacionado, estaria envolvido nestas respostas, assim
como qual receptor canabinóide é predominante neste sistema, é coerente apontar
que intervenções farmacológicas no sistema endocanabinóide podem revelar um
potencial terapêutico apreciável em fisiopatologias de caráter inflamatório e/ou
angiogênico.
Apesar da dificuldade em se determinar o mecanismo de ação dos fármacos
em estudo, uma vez que a plasticidade do sistema canabinóide permite uma
multiplicidade de interações, os resultados apontam para um sistema onde a
resposta está sendo mediada por endocanabinóides, e onde o impedimento
funcional destes receptores, seja por antagonismo direto, seja por desensibilização
de receptores, parece ser a estratégia farmacológica de escolha para o estudo desta
rede de eventos celulares e moleculares.
122
PAPEL DOS RECEPTORES CANABINÓIDES EM UM MODELO EXPERIMENTAL DE
ANGIOGÊNESE INFLAMATÓRIA
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