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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
LUDOVICO MIGLIOLO
Construção de modelos de interação in silico e in vitro do
inibidor do tipo Kunitz de Adenanthera pavonina L.
para as enzimas cisteínicas e serínicas
Natal/RN
2008
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LUDOVICO MIGLIOLO
Construção de modelos de interação in silico e in vitro do
inibidor do tipo Kunitz de Adenanthera pavonina L.
para as enzimas cisteínicas e serínicas
Dissertação apresentada ao Departamento de
Bioquímica da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em Bioquímica.
Orientador: Maurício Pereira de Sales.
Natal/RN
2008
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LUDOVICO MIGLIOLO
Construção de modelos de interação in silico e in vitro do inibidor do tipo
Kunitz de Adenanthera pavonina L. para as enzimas cisteínicas e serínicas
Dissertação apresentada ao Departamento de
Bioquímica da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em Bioquímica.
Aprovado em:
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________
Dr. Mauricio Pereira de Sales
Departamento de Bioquímica - UFRN
Orientador
____________________________________________________
Prof. Octavio Luiz Franco
Departamento de Bioquímica – UFPE
1º Examinador
____________________________________________________
Prof. João Paulo Matos Santos Lima
Departamento de Bioquímica – UFRN
2º Examinador
Dedico esta obra
A todas as pessoas que participaram de maneira direta e indireta
dessa conquista, mas principalmente a algumas que foram e são bastante
especiais e que considero muito importante para que esse trabalho tenha
sido um sonho realizado.
Professor Doutor Maurício Pereira de Sales, Doutora Adeliana
Oliveira e Professor Doutor Elizeu Antunes dos Santos pelos tempos
dedicados ao meu aprender.
Dedico também as não menos importantes pessoas que me
apoiaram indiretamente; à minha família incluindo a mais nova integrante
Renata Bezerra Duarte (TAAA) e a Dona Lúcia (mãe da Renata).
AGRADECIMENTOS
Eu agradeço sinceramente a todas as pessoas do laboratório de bioquímica e
função de proteínas bioativas - LQFPB. Principalmente ao Professor Doutor Maurício
Pereira de Sales, Doutora Adeliana Silva de Oliveira e Professor Doutor Elizeu Antunes
dos Santos.
Agradeço eternamente a Maurício Pereira de Sales a paciência e a persistência
em sempre mostrar o caminho. A Elizeu Antunes dos Santos sendo uma pessoa muito
inteligente, tranqüila e prática. A mulher mais inspiradora cientificamente que já
conheci, Adê, uma grande mulher no tamanho e também na garra.
Gostaria de agradecer as duas pessoas que mais investiram esses últimos anos
no meu aprendizado chamados Elizabete Luzia Fioravante (minha mãe) e Eugênio
Carlos Lavra (meu pai), amo demais esses veios. A também minha grande (Sophia
Migliolo) e pequena (Liss Fioravante Lavra) irmãs que amo muito.
Gostaria de agradecer de modo muito especial à pessoa que amo demais
Renata Bezerra Duarte (minha noiva) a qual me deu muito apoio e principalmente me
escutou muito nessa jornada, muito obrigado por estar em minha vida. A minha sogra
que também amo muito (quando esta durmindo) por ter criado tão bem sua filha e por
ter aprendido a fazer ótimas comidas, principalmente o PIRÃO (ai gosto dela acordada).
Gostaria de agradecer ao amigo Rodrigo Oliveira de Aquino um grande irmão e
companheiro em vários momentos que mesmo um pouco distante por motivos pessoais
meus andamos por muito tempo lado a lado.
Aos alunos de iniciação cientifica brasileiros Dayse, Hugo, Janison, Thales, Ibson
que continuam atrás de suas conquistas e a aluna de iniciação cientifica gringa Sofia.
Aos novos alunos de iniciação cientifica Rafael (Russo), Tafarel, Daniele e aos
mais novos Anderson (Negão) e Aline pelos momentos em reunião e risadas.
Aos companheiros da turma de mestrado Sérgio, Virginia, Daniela, Micheline,
Ana Celly, Adriana, Lissandra, Videany, Pablo, Rodrigo e Juliana pelas boas horas de
estudo, risadas e muito entusiasmo em nossas jornadas de leitura de artigos e o
cumprimento das disciplinas da educação e de bioestatística.
A todos os mestrandos que passaram pelo Laboratório de Química e Função de
Proteínas Bioativas (Fabiano, Kátia, Leonardo, Ticiana, Gioconda, Daniele) e aos que
ainda lá residem (Norberto, Sheila, Rodrigo e Cleysyvan).
Aos professores Adriana Uchôa, Kátia Scortecci, Alexandre Queiroz e Umberto
que participaram da minha banca examinadora de pré e qualificação e foram de grande
importância na construção desse sonho.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), Banco do Nordeste (BNB) e Fundo de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNDECI) que contribuíram com recursos
financeiros para a realização deste trabalho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo
apoio financeiro.
"NENHUMA BATALHA JAMAIS FOI GANHA SEM O PODER DO
ENTUSIASMO”.
(JOHN LORD O BRIAN)
RESUMO
Os inibidores de proteinases serínicas (IPs) estão extensamente distribuídos na
natureza e inibem a atividade enzimática in vitro e in vivo. Estes IPs em sementes de
leguminosas compreendem sete famílias, no entanto as famílias Bowman-Birk e do tipo
Kunitz são as mais estudadas e representam um papel importante na primeira linha de
defesa contra insetos pragas. Alguns inibidores do tipo Kunitz possuem atividades para
proteinases serínicas e cisteínicas sendo denominados inibidores bifuncionais, como o
inibidor ApTKI da semente de Adenanthera pavonina. O inibidor de A. pavonina por
apresentar essa característica incomum aos inibidores dessa família foi utilizado para o
estudo da interação entre as proteinases serínica (tripsina) e cisteínica (papaína). Para
determinar a interação in vitro de ApTKI e as enzimas alvo foi realizada a purificação do
inibidor a partir de técnicas cromatográficas e ensaios de inibição. O modelo 3D do
inibidor bifuncional ApTKI foi construído pelo programa SWISS-MODEL através da
metodologia de modelagem por homologia utilizando como molde o inibidor de tripsina
de soja (STI, pdb:1ba7) que apresentou 40% de identidade com a proteína alvo. A
qualidade do modelo foi avaliada pelo programa PROCHECK. Para a análise do
complexo in silico entre as enzimas alvo e o inibidor foi utilizado o programa HEX 4.5.
Estes resultados confirmaram os ensaios inibitórios in vitro, onde ApTKI apresentou a
capacidade de inibir simultaneamente tripsina e papaína. Algumas das diferenças
observadas nos resíduos do sitio reativo explicam a forte afinidade para tripsina e a
fraca para papaína.
Palavras Chaves: Adenanthera pavonina; inibidor bifuncional; modelagem comparativa;
estudos de interação.
ABSTRACT
Serines proteinases inhibitors (PIs) are widely distributed in nature and are able
to inhibit both in vitro and in vivo enzymatic activites. Seed PIs in than leguminous are
classified in seven families, Bowman-Birk and Kunitz type families that most studied
representing an important role in the first line of defense toward insects pests. Some
Kunitz type inhibitors possess activities serine and cysteine for proteinases named
bifunctional inhibitor, as ApTKI the inhibitor isolate from seed of Adenanthera pavonina.
The A. pavonina inhibitor presenting the uncommon property and was used for
interaction studies between proteinases serine (trypsin) and cysteine (papain). In order
to determinate the in vitro interaction of ApTKI against enzymes inhibitor purification was
carried cut by using chromatographic techniques and inhibition assays. The 3D model of
the bifunctional inhibitor ApTKI was constructed SWISS-MODEL program by homology
modeling using soybean trypsin inhibitor (STI, pdb:1ba7), as template which presented
40% of identity to A. pavonina inhibitor. Model quality was evaluated by PROCHECK
program. Moreover in silico analyzes of formed complex between the enzymes and
ApTKI was evaluated by HEX 4.5 program. In vitro results confirmed the inhibitory
assays, where the inhibitor presented the ability to simultaneously inhibit trypsin and
papain. The residues encountered in the inhibitor model of folder structural three-
dimensional that make contact to enzymes target coud explain the specificity pattern
against serine and cysteine proteinases.
Keywords: Adenanthera pavonina; bifunctional inhibitor; homology modeling; docking
study.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Diagrama modificado do modelo do domínio ancestral que sofreu sucessivos
eventos genéticos até a conformação final β-folha proposto por Murkhopadhyay (1999),
em que os IPs do tipo Kunitz se originaram de um domínio ancestral. ........................ 26
Figura 2. Estrutura do inibidor tipo Kunitz de Delonix regia. ....................................... 27
Figura 3. (a) Sobreposição estrutural do esqueleto das alças de ligação dos inibidores
tipo Kunitz, Glycine max em azul, Delonix regia em vermelho, Erythrina caffra em
amarelo, Copaifera langsdorffii em ciano, Psophocarpus tetragonolobus (WBA) em
preto, Hordeum vulgare em salmom e Psophocarpus tetragonolobus (WCI) em verde.
...................................................................................................................................... 28
Figura 4. Foto ilustrativa da leguminosa da subfamília Mimosoideae Adenanthera
pavonina. ..................................................................................................................... 32
Figura 5. Alinhamento múltiplo da seqüência dos inibidores tipo Kunitz em leguminosas.
Os três grupos taxonômicos Mimosoideae, Caesalpinoideae e Papilionoideae estão
representados em “m”, “c” e “p”, respectivamente. ..................................................... 42
Figura 6. Alinhamento da seqüência primária dos inibidores tipo Kunitz da subfamília
Mimosoideae. ............................................................................................................... 43
Figura 7. Alinhamento da seqüência primária dos inibidores tipo Kunitz da subfamília
Caesalpinoideae. .......................................................................................................... 44
Figura 8. Alinhamento da seqüência primária dos inibidores tipo Kunitz da subfamília
Papilionoideae. ............................................................................................................. 45
Figura 9. Árvore filogenética não enrraizada construída relacionando o inibidor de
Adenanthera pavonina com as três classes de especificidade. ................................... 48
Figura 10. Alinhamento entre as seqüências primárias dos inibidores bifuncionais de
Adenanthera pavonina e Prosopis juliflora. .................................................................. 49
Figura 11. Perfil cromatografico da fração F2 em gel filtaração S100. ........................ 52
Figura 12. (A) Perfil cromatográfico da amostra F2-3 aplicada no sistema de purificação
ÄKTA. (B) Curva de calibração de molecular para o inibidor ApTKI. ........................... 53
Figura 13. Curva de titulação do inibidor ApTKI. ......................................................... 55
Figura 14. Alinhamento entre as seqüências dos inibidores do tipo Kunitz ApTKI e o
molde 1ba7. .................................................................................................................. 58
Figura 15. Mapa de Ramachandran, no qual estão mostradas as regiões fisicamente
permitidas para os aminoácidos do modelo ApTKI. ..................................................... 60
Figura 16. Resumo dos dados estatística dos resíduos de aminoácidos situados no
mapa de Ramachandran. ............................................................................................. 61
Figura 17. Análise dos diferentes parâmetros de fatores G do modelo ApTKI. ........... 61
Figura 18. Conjunto de gráficos mostrando o comportamento da estrutura ApTKI
comparado a estruturas bem refinadas em resolução similar (no caso 2.0Å), para a
cadeia principal (A) e lateral (B). .......................................................................... 62 e 63
Figura 19. Sobreposição estrutural do modelo ApTKI (azul) com a estrutura
experimental do inibidor de soja - 1ba7 (rosa). ............................................................ 64
Figura 20. Modelo do inibidor tipo Kunitz de A. pavonina construído com o programa
SWISS-MODEL. ........................................................................................................... 65
Figura 21. Visão geral da interação entre o modelo do inibidor ApTKI (marrom) e a
tripsina (azul), destacando a alça reativa (verde) e os resíduos de aminoácido da
enzima (vermelho). ....................................................................................................... 68
Figura 22. Visualização da formação do complexo entre o inibidor ApTKI (marrom) e a
proteinase serínica tripsina (azul). ................................................................................ 69
Figura 23. Visão geral da interação entre o modelo do inibidor ApTKI (marrom) e a
papaína (rosa), destacando os resíduos do inibidor (verde) que interagem com os
resíduos da enzima (vermelho). ................................................................................... 71
Figura 24. Visualização da formação do complexo entre o inibidor ApTKI (marrom) e a
proteinase cisteínica papaína (rosa). ............................................................................ 72
Figura 25. Visualização geral da formação do complexo ternário entre o inibidor
Papaína–ApTKI–Tripsina. Papaína (rosa), ApTKI (marrom) e tripsina (azul). .............. 73
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Distribuição botânica e especificidade de alguns exemplos de inibidores de
proteinases. .................................................................................................................. 22
Tabela 2. Família de inibidores de proteinases de plantas. ......................................... 24
Tabela 3. Inibidores bifuncionais. ................................................................................. 30
Tabela 4. Classificação dos inibidores de proteinase do tipo Kunitz de acordo com o
domínio STI encontrado no inibidor da semente de soja. ............................................ 47
Tabela 5. Comparação dos resíduos do sitio ativo do inibidor para tripsina (resíduo na
posição 64) e papaína (resíduos nas posições 60, 89, 109) de P. juliflora com os demais
integrantes da subfamília Mimosoideae. ...................................................................... 51
Tabela 6. Inibição da tripsina e papaína por ApTKI, ApTKI pré-incubada com ambas
enzimas e atividade proteolítica das proteinases serinica e cisteínica. ........................ 56
Tabela 7. Distribuição da estrutura secundária de ApTKI. ........................................... 66
LISTA DE ABREVIATURAS/ SIGLAS/ EXPRESSÕES
3D – Tridimensional.
Docking – Um método utilizado para detectar sítios de ligação em proteína e avaliar
interações proteína-proteína ou proteína-ligante, utilizando para cálculo a energia livre
de ligação entre as moléculas. É dividido em docking rígido e flexível.
PDB – (Protein Data Bank) É uma coleção de estruturas 3D de proteínas determinadas
principalmente por cristalografia de raios X ou ressonância magnética nuclear. É
acessível em http://www.rcsb.gov/pdb.
RMSD – (Root Mean Square Deviation) Mede a diferença estrutural entre duas
estruturas sobrepostas.
Restrições estereoquímica – Estas restrições espaciais estão implicadas pela
topologia covalente da molécula. Elas incluem restrições sobre os comprimentos de
ligação, ângulos diedros, ângulos de ligação, planaridade de anéis e quiralidade de
centros quirais.
Fator G – Medida de quão “normal” ou de quão “incomum” está a estrutura
tridimensional em estudo.
RMN – Ressonância Magnética Nuclear.
Seqüência Alvo – Seqüência primária de proteína utilizada na modelagem para
determinação de sua estrutura.
Swiss-Prot – Banco de dados de seqüências primárias.
Template – Estrutura resolvida experimentalmente presente no PDB utilizada como
molde na modelagem comparativa.
Bootstrap – é um método estatístico de re-amostragem com reposição pseudoaleatória
dos dados. O número de dados amostrados mantém-se constante.
Árvore Filogenética não enrraizada – explica relações de topologia, só não especifica
a ancestralidade do grupo em estudo.
Método de Máxima Parcimônia – hipótese mais simples que identifica a árvore que
apresenta o menor número de etapas ou passos para explicar os dados.
PjTKI – Prosopis juliflora.
AcTKI – Acacia confusa.
ApTKI – Adenanthera pavonina.
LlTKI – Leucaena leucocephala.
EcTKI – Enterolobium contortisiliquum.
DrTKI – Delonix regia.
EvTKI – Erythrina variegata.
ElTKI – Erythrina latíssima.
EcTKI – Erythrina caffra.
BrTKI – Bauhinia ruffa.
BbTKI – Bauhinia bauhinioides.
CaTKI – Cicer arietinum.
GmTKI – Glycine max.
MtTKI – Medicago truncatula.
PtTKI – Psophocarpus tetragonolobus.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 19
1.1 Aspectos Gerais 19
1.2 Inibidores de proteinases como uma defesa das plantas 19
1.3 Distribuição botânica dos inibidores tipo Kunitz 21
1.4 Classificação de inibidores de proteinases de plantas 24
1.5 Inibidores da Família Kunitz 25
1.6 Filogenia dos inibidores de proteinase do tipo Kunitz de leguminosas 26
1.7 Estrutura dos Inibidores de proteinases do Tipo Kunitz 2
1.8 Mecanismo de inibição dos Inibidores de proteinases do Tipo Kunitz 28
1.9 Inibidores de proteinase bifuncionais 29
2 OBJETIVOS 30
3 MATERIAL E MÉTODOS 32
3.1 Sementes 32
3.1.1 Reagentes 32
3.1.2 Equipamentos 33
3.1.3 Programas 33
3.2 Filogenia 34
3.3 Modelo de interação Enzima-Inibidor 35
3.3.1 Preparo da farinha de Adenanthera pavonina 35
3.3.2 Preparo do extrato bruto da farinha 35
3.3.3 Fracionamento com sulfato de amônia 35
3.3.4 Cromatografia de exclusão molecular Sephacryl S100 36
3.3.5 Determinação das concentrações proteícas 36
3.3.6 Determinação da atividade antitríptica 36
3.3.7 Determinação da atividade antipapainásica 37
3.3.8 Análise da interação enzima-inibidor por cinética enzimática 37
3.3.9 Modelagem do inibidor ApTKI 38
a) Identificação e seleção de proteínas-molde 38
b) Alinhamento das seqüências de resíduos de aminoácidos 38
c) Construção do modelo 39
d) Validação do modelo 38
3.3.10 Acoplamento do Inibidor Kunitz em complexo com Tripsina e com Papaína 40
4 RESULTADOS 41
4.1 Filogenia 41
4.1.1Análise da seqüência primária dos IPs tipo Kunitz de leguminosas e Distribuição
filogenética 41
4.1.2 Análise da seqüência primária dos IPs do tipo Kunitz em Mimosoideae 50
4.2 Modelo de interação in vitro de ApTKI para as enzimas tripsina e papaína 51
4.2.1 Purificação de ApTKI 51
4.2.2 Relação equimolar de ApTKI para as enzimas papaína e tripsina 54
4.2.3 Padrões de interação in vitro ApTKI-Tripsina e ApTKI-Papaína 56
4.3 Modelo de interação in silico de ApTKI para as enzimas tripsina e papaína 57
4.3.1 Modelagem de ApTKI 57
a) Seleção do molde 57
b) Alinhamento das seqüências de ApTKI e o inibidor de tripsina de soja (1ba7) 57
c) Avaliação do modelo 3D de ApTKI 58
4.3.2. Modelo de ApTKI 65
4.3.3 Padrão de interação in silico ApTKI-Tripsina 67
4.3.4 Geometria do sitio reativo do complexo in silico ApTKI-Tripsina 67
4.3.5 Padrão de interação in silico ApTKI-papaína 70
4.3.6 Geometria do sítio reativo do complexo in silico ApTKI-Papaína 70
4.3.7 Formação do complexo ternário 73
5 DISCUSSÃO 74
6 CONCLUSÃO 81
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 82
19
1 INTRODUÇÃO
1.1 ASPECTOS GERAIS
O isolamento e a caracterização de genes e produtos gênicos presentes em
plantas é uma das vertentes de grande destaque na pesquisa biotecnológica. Proteínas
vegetais, como as enzimas, lectinas, arcelinas, vicilinas, proteínas inativadoras de
ribossomos e inibidores de enzimas estão envolvidas em vários processos biológicos,
incluindo sua ação como proteínas de reserva, de reguladores endógenos e de defesa
das plantas. Esta última característica é a mais estudada, devido ao seu emprego como
ferramenta biotecnológica para deter a herbivoria excessiva de insetos pragas e
patógenos (XAVIER-FILHO, 1992).
A busca por inibidores de proteinases serínicas e cisteínicas, vem recebendo
atenção especial na tentativa de elucidar questões relacionadas à estrutura, papel
fisiológico, mecanismo de ação, evolução e principalmente o envolvimento nos
mecanismos de defesa das plantas (NORIOKA, et al., 1987; BRZIN; KIDRIC, 1995;
SONG; SUH, 1998; BODE; HUBER, 1992, 2000; KRAUCHENCO, et al., 2003, 2004;
GOMES, et al., 2005a; ARAÚJO, et al., 2005a; BHATTACHARYYA, et al., 2006). Esses
inibidores ligam-se especificamente a proteinases presentes no trato digestivo dos
insetos, diminuindo a assimilação de nutrientes, causando retardo no desenvolvimento
e aumento da taxa de mortalidade (FRANCO, et al., 2002; OLIVEIRA, et al., 2003;
GOMES, et al., 2005). Portanto a purificação e caracterização de inibidores de
proteinases presente em sementes, a determinação da especificidade de inibição e os
estudos in silico dos inibidores são de grande importância para direcionar a indicação
de proteínas inibidoras candidatas em estudos de transformação de plantas e como
bioinseticidas (XAVIER-FILHO, 1992; SATTAR, et al., 2003; LOPES, et al., 2004).
1.2 INIBIDORES DE PROTEINASES COMO UMA DEFESA DAS PLANTAS
As plantas, ao longo da evolução, desenvolveram mecanismos de defesa contra
o ataque de predadores. Estas defesas podem ser físicas e químicas. A defesa de
natureza física pode ser representada pela presença de tegumentos resistentes, de
20
pêlos, espinhos e tricomas. A defesa química é dividida em defesa química não-
protéica, que envolve compostos alcalóides, aminoácidos não protéicos e flavonóides.
A defesa química protéica pode ser representada pela expressão de lectinas, inibidores
de amilases e de proteinases. As defesas químicas protéicas podem ser ainda divididas
em constitutivas, as quais são sintetizadas durante o desenvolvimento e formação da
planta e induzidas, que são sintetizadas em resposta a estímulos bióticos ou abióticos
(XAVIER-FILHO, 1992).
Os inibidores de proteinases (IP) são de ocorrência comum no Reino Plantae.
Estes IPs em plantas são geralmente proteínas pequenas que têm sido principalmente
descritas em tecidos de reserva, tal como tubérculos e sementes, mas são também
encontrados em outras partes das plantas (DE LEO; GALLERANI, 2002). Em folhas,
eles são induzidos em resposta a injúrias ou ataques de insetos ou patógenos (RYAN,
1990; BATISTA, et al., 1996; SHEWRY; LUCAS, 1997). Uma das importantes
estratégias de defesa que são encontradas em plantas para combater predadores
envolve estes IPs que são particularmente efetivos contra insetos fitófagos e
microorganismos. A capacidade defensiva destes IPs em plantas é causada pela
inibição das proteases presentes no intestino dos insetos ou secretada por
microorganismos, resultando em uma redução na quantidade dos aminoácidos
necessários para seu crescimento e desenvolvimento (LAWRENCE; KOUNDAL, 2002).
Os IPs encontrados em plantas são proteínas ou peptídeos que têm a
capacidade de suprimir a atividade de enzimas proteolíticas endógenas, durante o
desenvolvimento das sementes e também podem inibir a atividade de enzimas
exógenas in vitro e in vivo formando complexos estáveis. Eles comportam-se como
pseudosubstratos enzimáticos altamente específicos ao interagir em sítios particulares,
conhecidos como sítio reativo (TSCHECHE, 1974; LASKOWSKI; KATO, 1980;
RICHARDSON, 1991). As especificidades frente às enzimas proteolíticas variam
consideravelmente, alguns inibem somente tripsina, outros têm atividade contra a
tripsina e a quimotripsina e outros inibem proteinases diferentes, de origem vegetal
como a papaína ou de origem microbiana (BELITZ; GROSH, 1997).
21
1.3 DISTRIBUIÇÃO BOTÂNICA DOS INIBIDORES TIPO KUNITZ
Os IPs ocorrem na natureza em vários grupos sistemáticos de plantas e diferem
entre si por suas propriedades (TABELA 1). Os IPs são ubíquos, geralmente proteínas
regulatórias pequenas presentes em concentrações de 5 à 15% das proteínas totais, e
são encontrados em sementes de Fabaceae, Brassicaceae, Poaceae e tubérculos de
Solanaceae (RYAN, 1981; BOLTER; JONGSMA, 1997; SCHULER, et al., 1998;
ASCENZI, et al., 1999; OLIVA, et al., 2000).
22
Tabela 1. Distribuição botânica e especificidade de alguns exemplos de inibidores de proteinases.
Fonte
Família
Especificidade
Referência
Daucus carota Apiaceae P OJIMA, et al., 1997
Colocasia esculenta Araceae T, Q OLIVEIRA, 2001
Helianthus annus Asteraceae P, F, CH, CB, CL
KOZUMA, et al., 1996
Brassica juncea Brassicaceae T MANDAL, et al., 2002
Carica papaya Caricaceae P, Qp, Car, PIV SONG, et al., 1995
Carica papaya Caricaceae T, Q ODANI, et al., 1996
Dianthus caryophyllus Caryophyllaceae
P KIM, et al., 1999
Curcubita maxima Curcubitaceae P, F LEVLEVA, et al., 1997
Acasia confusa Fabaceae T, Q HUNG, et al., 1994
Adenanthera pavonina Fabaceae T, Q, P MACEDO, et al., 2004
Archidendron ellipticum Fabaceae T, Q BHATTACHARYYA, et al., 2006
Bauhinia variegata Fabaceae T OLIVA, et al., 2001
B. ruffa Fabaceae E SUMIKAWA, et al., 2006
Caesalpinia bonduc Fabaceae T, Q BHATTACHARYYA, et al., 2007
C. echinata Fabaceae T CRUZ-SILVA, et al., 2004
Cassia obtusifolia Fabaceae T LIAO, et al., 2007
Copaifera langsdorffii Fabaceae T KRAUCHENCO, et al., 2004
Crotalaria pallida Fabaceae T, Q, E, P GOMES, et al., 2005a
Delonix regia Fabaceae T PANDO, et al., 2001
Dimorphandra mollis Fabaceae T MACEDO, et al., 2000
Enterolobium contortisiliquum Fabaceae T, Q BATISTA, et al., 1996
Erythrina variegata Fabaceae T, Q IWANAGA, et al., 2005
Glycine max Fabaceae T, Q, P KOIDE, et al., 1973; MISAKA, et al., 1996
Hordeum vulgare Fabaceae P, F, Qp GADDOUR, et al., 2001
Inga laurina Fabaceae T MACEDO, et al., 2007
Leucaena leucocephala Fabaceae T, Q OLIVA, et al., 2000
Peltophorum dubium Fabaceae Q MACEDO, et al., 2003
23
Fonte
Família
Especificidade
Referência
Phaseolus lunatus Fabaceae P, CH, CB, CL BRZIN, et al., 1998
Pithecellobium dulce Fabaceae T DELGADO-VARGAS, et al., 2006
Pithecellobium dumosum Fabaceae T, Q, P OLIVEIRA, et al., 2007
Prosopis juliflora Fabaceae T, Q, P OLIVEIRA, et al., 2002
Psophocarpus tetragonolobus Fabaceae Q KORTT, 1980
Schizolobium parahyba Fabaceae Q, E TELES, et al., 2004
Swartizia pickelli Fabaceae T, Q CAVALCANTI, et al., 2002
Tamarindus indica Fabaceae T ARAÚJO, et al., 2005a
Vigna unguiculata Fabaceae P FERNANDES, et al., 1993
Wisteria floribunda Fabaceae P HIRASHIKI, et al., 1990
Castanea sativa Fagaceae P, F, Qp, T PERNAS, et al., 1998
Oryza sativa Gramineae P, CH, CB, CL ABE, et al., 1987
Pennisetum glaucum Gramineae P JOSHI, et al., 1998
Zea mays Gramineae P, CH, CB, CL ABE, et al., 1992
Persea americana Lauraceae P KIMURA, et al., 1995
Artocarpus intergrifolia Moraceae T, Q BHAT, et al., 1989
Chelidonium majus Papaveraceae P, CH, CL ROGELJ, et al., 1998
Malus domestica Rosaceae P, F, CB RYAN, et al., 1998
Murraya koenigii Rutaceae T SHEE, et al., 2007
Lycopersicon esculento Solanaceae P JACINTO, et al., 1998
Solanum tuberosum Solanaceae P, T, Q WALDRON, et al., 1993; VALUEVA, et al., 1998
Legenda de especificidade: P, papaína; T, tripsina; Q, quimotripsina; F, ficina; CH, catepsina H; CB, catepsina B; CL, catepsina L; Qp,
quimopapaína; Car, caricaína; PIV, protease de mamão; E, elastase.
24
1.4 CLASSIFICAÇÃO DE INIBIDORES DE PROTEINASES DE PLANTAS
Os IPs em plantas têm sido agrupados dentro de famílias levando em
consideração a classe de enzimas que inibem, a seqüência aminoacídica, a homologia
estrutural e o sitio reativo (TABELA 2) (NEURATH, et al., 1996; KOIWA, et al., 1997;
VALUEVA; MOSOLOV, 1999; DE LEO; GALLERANI, 2002; LASKOWSKI, et al., 2003;
HABIB; FAZILLI, 2007).
Tabela 2. Família de inibidores de proteinases de plantas.
Proteinases Classe Família de Inibidores
Serínicas
Inibidores de proteinases
serínicas
Bowman-Birk
Kunitz
Batata I
Batata II
Superfamília de Cereais
Taumatina
Ragi I-2/milho
Cisteínicas
Inibidores de proteinases
cisteínicas
Fitocistatinas
(cistatina de planta)
Aspárticas
Inibidores de proteinases
aspárticas
Inibidores de proteinases
aspárticas
Metalo-proteinases
Inibidores de metalo-
proteinases
Inibidores de carboxipeptidases A
e B
Os inibidores de proteinases serínicas em plantas são descritos em sete famílias,
entretanto a família de inibidores tipo Kunitz é intensamente investigada em
leguminosas (Fabacea).
25
1.5 INIBIDORES DA FAMÍLIA KUNITZ
A família dos inibidores de proteinases do tipo Kunitz é agrupada com relação à
similaridade da seqüência primária, e por este motivo os inibidores formam uma família
separada apresentando cerca de 180 resíduos de aminoácidos. Os inibidores do tipo
Kunitz são amplamente distribuídos em plantas e são descritos em leguminosas,
cereais e tubérculos (ISHIKAWA, et al., 1994; LASKOWSKI; KATO, 1980). Os inibidores
tipo Kunitz geralmente tem massa molecular por volta de 18 a 26 KDa, tem duas pontes
dissulfeto, apresentam uma ou duas cadeias polipeptídicas e um sitio reativo. Os
membros desta família de inibidores são na maioria ativos contra proteinases serínicas
como tripsina, quimotripsina, elastase e subtilisina (LAING; MCMANUS, 2002;
HEIBGES, et al., 2003; GOMES, et al., 2005a; PARK, et al., 2005), mas eles também
inibem outras classes de proteinases, incluindo as aspárticas como a catepsina D,
catepsina L, as amilases de insetos e de plantas, e as cisteínicas como a papaína
(KEILOVA; TOMASEK, 1976; RITONJA, et al., 1990; RODENBURG, et al., 1995;
MACEDO, et al., 2004; OLIVEIRA, et al., 2002; GOMES, et al., 2005; OLIVEIRA, et al.,
2007).
1.6 FILOGENIA DOS INIBIDORES DE PROTEINASE DO TIPO KUNITZ DE
LEGUMINOSAS
A diversidade biológica, ou seja, as diferenças entre os grupos de organismos
são entendidas hoje como o resultado do processo evolutivo. Os seres vivos não são
entidades estáticas, mas se transformam ao longo de gerações sob influência biótica e
abiótica (CHRISTELLER, 2005). Os IPs do tipo Kunitz em sementes de leguminosas
são os tipos de inibidores mais antigos. De acordo com o modelo proposto por
MURKHOPADHYAY (1999) os IPs tipo Kunitz em leguminosas surgiram de uma
proteína ancestral com o tamanho e a forma do subdomínio β-folha, que após
sucessivas duplicações e eventos genéticos (mutações, inserções, por exemplo)
originou a família dos inibidores tipo Kunitz (FIGURA 1).
26
Figura 1. Diagrama modificado do modelo proposto por Murkhopadhyay (1999), em que os IPs do tipo
Kunitz se originaram de um domínio ancestral que sofreu sucessivos eventos genéticos até a
conformação final β-folha.
1.7 ESTRUTURA DOS INIBIDORES DE PROTEINASES DO TIPO KUNITZ
A estrutura tridimensional da família de inibidores tipo Kunitz é conhecida como
família β-folhas sendo composta por 12 conformações betas anti-paralelas conectadas
por longas alças. O inibidor pode ser dividido em três subdomínios, cada um contendo
cerca de 60 resíduos de aminoácidos. Cada subdomínio consiste de quatro folhas beta
conectadas por longas alças, estruturalmente organizadas como A-β1-A-β2-A-β3-A-β4,
em que “A” refere-se as alças que conectam as folhas beta (FIGURA 2). A estabilidade
da estrutura tridimensional de muitos inibidores da família tipo Kunitz é dada pela
presença de inúmeras pontes de hidrogênio em conjunto com as pontes dissulfeto
presentes na estrutura do inibidor (SONG; SHU, 1998; KRAUCHENCO, et al., 2003,
2004; SATTAR, et al., 2004; KRAMRUI, et al., 2005). As pontes disulfeto são interações
covalentes entre dois resíduos de aminoácido de cisteína que conectam duas
subunidades dos IPs, elas podem ser formadas tanto intra ou intercadeias quanto
ambas simultaneamente conferindo maior estabilidade a estrutura tridimensional do
27
inibidor. Os IPs que não apresentam duas cadeias polipeptídicas podem apresentar a
formação de pontes dissulfeto.
Figura 2. Estrutura do inibidor tipo Kunitz de Delonix regia. A proteína é formada de conformações beta
com três repetições A-C, pintadas em azul, vermelho e amarelo, respectivamente (KRAUCHENCO et al.,
2003).
Os IPs da família tipo Kunitz apresentam estruturalmente uma alça de ligação
exposta, que é conservada em todos os representantes (FIGURA 3a), essa estrutura é
denominada de conformação canônica (BODE; HUBER, 1992). Esses inibidores que
apresentam a conformação canônica formam complexos estáveis com a proteinase
alvo, a qual se dissocia lentamente (RITONJA, et al., 1990). A alça de ligação (FIGURA
3b), embora freqüentemente hidrofóbica, é estabilizada por interações adicionais entre
os resíduos que flanqueiam o local do sitio reativo e o núcleo do inibidor (GRÜTTER, et
al., 1988).
28
FIGURA 3. (a) Sobreposição estrutural do esqueleto das alças de ligação dos inibidores tipo Kunitz,
Glycine max em azul, Delonix regia em vermelho, Erythrina caffra em amarelo, Copaifera langsdorffii em
ciano, Psophocarpus tetragonolobus (WBA) em preto, Hordeum vulgare em rosa e Psophocarpus
tetragonolobus (WCI) em verde. (b) Alça de ligação demonstrando o resíduo de arginina na posição 64
característico da família dos inibidores tipo Kunitz.
1.8 MECANISMO DE INIBIÇÃO DOS INIBIDORES DE PROTEINASES DO TIPO
KUNITZ
Os IPs do tipo Kunitz interagem com a enzima de acordo com o resíduo de
aminoácido na posição P1, arginina ou lisina, que é o resíduo de maior importância na
formação do complexo dos inibidores de tripsina, o resíduo de aminoácido P1 do
inibidor é acolhido pelo vale formado pelos dobramentos das estruturas secundárias da
enzima, denominado sitio catalítico S1, composto por resíduos que determinam a
especificidade do inibidor (por exemplo, o resíduo P1 do inibidor de tripsina interage
com o resíduo de serina S1 da tripsina). Essa interação direta do resíduo do sitio reativo
do inibidor com o sitio catalítico da enzima caracteriza um mecanismo de inibição
competitivo, comum para inibidores de tripsina da família Kunitz (BODE; HUBER, 1992,
2000; FRANCO et al., 2002; MANDAL et al., 2002, BHATTACHARYYA et al., 2006).
Entretanto a interação direta do resíduo do sitio reativo do inibidor com outro sitio, que
não o catalítico da enzima, caracteriza um mecanismo de inibição não competitivo,
pouco comum para os inibidores de tripsina da família Kunitz (PRABHU et al., 1980).
Além desses, há o mecanismo de inibição misto que envolve tanto inibição competitiva
(A) (B)
29
como não competitiva incomum para os inibidores tipo Kunitz (BHATTACHARYYA et
al., 2007).
1.9 CLASSES DE INIBIDORES BIFUNCIONAIS
Nos últimos anos, os estudos em relação aos inibidores de proteinases
bifuncionais (Tabela 3) em leguminosas vêm recebendo atenção especial devido ao
fato dessas proteínas possuírem a capacidade de suprimir a atividade proteolítica de
classes diferentes de proteinases. Esses inibidores bifuncionais interferem nos
processos digestivos de insetos pragas interagindo em classes diferentes de enzimas
(Oliveira et al. 2002; Macedo et al. 2004; Gomes et al. 2005a; Oliveira et al. 2007).
Essas enzimas são causadoras de danos em grãos de cereais e leguminosas
armazenados, acarretando grandes perdas econômicas na agricultura mundial.
Portanto a purificação e caracterização de inibidores de proteinases bifuncionais
presentes nas sementes, à determinação da especificidade de inibição, à determinação
dos mecanismos de inibição e os estudos in silico da especificidade dos inibidores
bifuncionais, associada a sua evolução em plantas são de grandes importâncias para
direcionar a indicação de proteínas inibidoras candidatas em estudos de transformação
de plantas. Dentro desse contexto, nenhum estudo in silico foi desenvolvido sobre a
interação do inibidor bifuncional de Adenanthera pavonina (ApTKI) e as enzimas
serínica (tripsina) e cisteínica (papaína).
30
Tabela 3. Inibidores bifuncionais.
Fonte Atividade Inibitória Referência
Cevada
α-amilase de inseto, planta
e subtilisina
ABE; SIDENIUS, SVENSSON,
1993
Arroz
α-amilase de inseto, planta
e subtilisina
YAMAGATA, et al., 1998
Trigo
α-amilase de inseto
e subtilisina
ZEMKE, et al., 1991
Milho α-amilase de inseto e tripsina
SCHIMOLER-OROURKE;
RICHARDSON;
SELITRENNIKOFF, 2001
Milheto α-amilase de inseto e tripsina STROBL, et al., 1998
Feijão
α-amilase de inseto
e quitinase
DAYLER, et al., 2005
Lágrima de Jó
α-amilase de inseto
e quitinase
ARY; RICHARDSON;
SHEWRY, 1989
Abacaxi
tripsina, quimotripsina, papaína,
catepsina L, bromélaina e ficina
LENARCIC, et al., 1993,
PERLSTEIN; KEZDY, 1973
Crotalaria
tripsina, quimotripsina, elastase e
papaína
GOMES, et al., 2005a
Algaroba
tripsina, quimotripsina
e papaína
OLIVEIRA, et al., 2002
Carolina
tripsina, quimotripsina
e papaína
MACEDO, et al., 2004
Jurema branca
tripsina, quimotripsina
e papaína
OLIVEIRA, et al., 2007
31
2 OBJETIVOS
Determinar, in silico, se os sítios de interação para tripsina e papaína
encontrados no inibidor bifuncional tipo Kunitz de Prosopis juliflora são conservados em
outros inibidores do tipo Kunitz em Mimosoideae.
Determinar, in vitro, o modelo de interação entre o inibidor tipo Kunitz de
Adenanthera pavonina (ApTKI) e as enzimas tripsina e papaína através de ensaios de
inibição.
Propor, in silico, o modelo de interação entre o inibidor ApTKI e as enzimas
tripsina e papaína pela metodologia de modelagem por homologia, indicando dessa
maneira um novo candidato no desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas no
controle de insetos pragas.
32
3 MATERIAL E MÉTODOS
MATERIAL
3.1 SEMENTES
As sementes secas de Carolina, Adenanthera pavonina (Figura 4) foram
coletadas na Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN, situada na cidade
de Natal/ RN, para o isolamento e purificação do inibidor tipo Kunitz.
A. pavonina, pertence à família Fabaceae, subfamília Mimosoideae e tribo
Mimoseae, é uma árvore que atinge cerca de 4,5 m de altura, nativa da Índia e China,
mas atualmente é encontrada em regiões tropicais.
Figura 4. Foto ilustrativa da leguminosa da subfamília Mimosoideae Adenanthera pavonina.
3.1.2 REAGENTES
Albumina sérica bovina – BSA (Sigma-USA);
BApNA (α-benzoil-DL-arginine-ρ-nitroanilide/ Sigma-USA);
Azocaseína (Sigma-USA);
33
DMSO (dimetilsulfóxido/BDH GPR);
SDS (duodecil sulfato de sódio - Reagen);
Acrilamida e N’N’-metilenobisacrilamida; (Sigma-USA)
Papaína (Sigma-USA);
Tripsina (Sigma-USA);
Padrões de peso moleculares para eletroforese (AMERSHAM – Pharmacia
Biotech);
Comassie Blue G-250 e R-250 (Sigma-USA);
Todos os demais reagentes utilizados foram de grau analítico e obtidos
comercialmente.
3.1.3 EQUIPAMENTOS
Agitador Magnético Tecnal TE-081
Espectrofotômetro HITACHI U-2000
Banho-Maria (Tecnal TE-056)
Balança analítica eletrônica – SCIENTCH AS 210
Microcentrífuga Eppendorf 5410
Centrifuga HITACHI CR 21
Coletor de frações REDFRAC modelo 2112 da LKB (Bromma, Suécia)
Sistema de Purificação: ÄKTA PURIFIER
Computador Athlon AMD 64 processador 3800+ com 2G de memória RAM e 256
MB de placa de vídeo.
3.1.4 PROGRAMAS
PSI-BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov);
ClustalW (http://pbil.univ-lyon1.fr/);
PAUP versão 4.0 (SWOFFORD, 1999);
34
SPDBV versão 4.0 (GUEX, et al., 1999);
BioEdit versão 7.0 (HALL, 1997);
SWISS-MODEL (ARNOLD, et al., 2006; KOPP; SCHWEDE, 2004; SCHWEDE et
al., 2003; GUEX; PEITSCH, 1997);
PROCHECK versão 3.5 (LASKOWSKI, et al., 1998);
HEX versão 4.5 (RITCHIE, 1996);
3DSS (3-Dimensional Structural Superposition) (SUMATHI, et al., 2005).
MÉTODO
3.2 FILOGENIA
As seqüências usadas para análise filogenética foram às seqüências de
inibidores de proteinases tipo Kunitz das espécies da família Fabaceae disponíveis no
banco de dados do Centro Nacional de Informação Biotecnológica (NCBI) com o
número de acesso Prosopis juliflora cadeia beta (gi: 417177) e cadeia alfa (gi: 417176);
Acacia confusa cadeia alfa (gi: 299509) e cadeia beta (gi: 299508); Adenanthera
pavonina cadeia alfa (gi: 124152) e cadeia beta (gi: 124153); Leucaena leucocephala
cadeia alfa (gi: 18202442) e cadeia beta (18202443); Enterolobium contortisiliquum
(Batista et al., 1995); Delonix regia (gi: 47115660); Erythrina variegata (gi: 262754);
Erythrina latissima (gi: 60392436); Erythrina caffra (gi: 124154); Bauhinia ruffa (gi:
110279026); Bauhinia bauhinioides (gi: 25089820); Cicer arietinum (gi: 14161088);
Glycine max (gi: 125023); Medicago truncatula (gi: 22001349); Psophocarpus
tetragonolobus (gi: 417198). O alinhamento automático foi realizado com o programa
ClustalW (THOMPSON; HIGGINS; GIBSON, 1994) e conferido visualmente pelo
BioEdit. Os dados do alinhamento utilizando a matrix BLOSUM62 foram adquiridos no
formato PIR e transformados para o formato NEXUS (MADDISON; SWOFFORD, 1997).
O método de máxima parcimônia foi utilizado para procurar todas as topologias
possíveis para identificar a árvore adequada. A análise de bootstrap foi usada para
avaliar a robustez da árvore com 100 réplicas (FELSENSTEIN, 1985).
35
3.3 MODELO DE INTERAÇÃO ENZIMA-INIBIDOR
3.3.1 PREPARO DA FARINHA DE ADENANTHERA PAVONINA
As sementes foram trituradas em liquidificador industrial e passadas no moinho
elétrico para a obtenção de uma farinha de granulação fina.
3.3.2 PREPARO DO EXTRATO BRUTO DA FARINHA
O extrato bruto da farinha da semente de A. pavonina foi obtido a partir da
homogeneização em tampão tetraborato de sódio 50 mM, pH 7,5 na proporção de 1:10
(p/v) sob agitação constante por 2 horas à temperatura ambiente. O homogenato foi
centrifugado a 12.000 x g por 30 minutos a 4 °C. Os precipitados foram descartados e o
sobrenadante filtrado em lã de vidro e denominado de EB (extrato bruto).
3.3.3 FRACIONAMENTO COM SULFATO DE AMÔNIA
O extrato bruto foi fracionado com sulfato de amônio em três etapas de
saturação: 0-40%, 40-60%, 60-90%. Após cada etapa de saturação, a solução
permaneceu a 4°C por aproximadamente 20 horas e posteriormente foi centrifugada a
12.000 x g por 30 minutos a 4 °C. Os precipitados resultantes de cada fracionamento
foram ressuspensos no menor volume possível de água destilada, e submetidos à
diálise contra a água destilada por aproximadamente 18 horas. Após diálise as frações
de ambas as amostras foram liofilizadas e denominadas F0-40, F40-60, F60-90, de
acordo com o grau de saturação.
36
3.3.4 CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR SEPHACRYL S100
Para o isolamento dos inibidores de proteinases serínicas, presentes nas
sementes de A. pavonina, foram utilizados 50 mg de proteínas da fração F40-60%.
Essa quantidade de proteínas foi aplicada na coluna de gel filtração Sephacryl S100
previamente equilibrada com tampão tetraborato de sódio 50 mM pH 7,5 sob um fluxo
de 0,75 ml/min. Cerca de 1,5 ml das amostras foram coletadas e a absorbância medida
a 280 nm. Ensaios de atividades antitrípticas foram realizados para a identificação dos
picos de inibição. Identificado o pico de inibição, o pico protéico com inibição foi
coletado dialisado em água destilada e liofilizado. O material liofilizado foi aplicado na
coluna Superose 12 do sistema de purificação ÄKTA.
3.3.5 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PROTÉICA
As proteínas foram quantificadas pelo método de Bradford (1976), utilizando
albumina sérica bovina (BSA) como padrão. Medidas de densidade óptica a 280nm
foram mensuradas para acompanhamento de corridas cromatográficas.
3.3.6 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITRÍPTICA
As atividades anti-tríptica da fração foi determinada com alíquotas de 10µL das
soluções de tripsina bovina (0,3 mg/mL tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5). A enzima foi
pré-incubada com 610 µL de tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5, 120 µL de HCl 0,0025 M e
50 µL da amostra por 15 minutos a 37 °C. Após esse período de tempo a reação foi
iniciada adicionando 500 µL de solução de substrato especifico (BApNA 1,25 mM). A
reação foi processada por mais 15 minutos nas mesmas condições de incubação, e em
seguida foi paralisada adicionando 120 µL de solução de ácido acético 30%. Todos os
ensaios foram realizados em triplicata e as provas em branco em duplicata. A
absorbância foi medida a 410 nm. Uma unidade de inibidor (UI) foi definida como a
37
quantidade de inibidor que diminuiu a atividade da enzima em 0,01 da absorbância a
410 nm.
3.3.7 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPAPAINÁSICA
Para a determinação da atividade anti-papainásica foi determinada com alíquotas
de 10 µL da solução de papaína (1 mg/mL em tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5). A
enzima foi pré-incubada com 400 µl de tampão fosfato de sódio, pH 6,0, 40 µL de
solução ativadora contendo L-cisteína 0,05 M e EDTA 0,02 M pH 8,0 e 50 µL da
amostra por um período de 10 minutos a 37 °C. Passados 10 minutos a reação foi
iniciada acrescentando 200 µL de solução de substrato especifico (BANA 1 mM). A
reação foi paralisada com 500 µL de HCl 2% em etanol após 20 minutos de reação, e
em seguida foi adicionado 500 µL de reagente de cor (0,06% de p-
Dimetilaminocinamaldeido em 100 mL de etanol). Decorridos 20 minutos após adição
do reagente de cor, a absorbância foi medida a 540 nm. O ensaio controle foi realizado
na ausência da fração inibidora, nas mesmas condições acima descrita. Os ensaios
foram realizados em triplicata e as provas em branco em duplicata para controle da
reação.
3.3.8 ANÁLISE DA INTERAÇÃO ENZIMA-INIBIDOR POR CINÉTICA ENZIMÁTICA
Amostras contendo alíquotas do complexo inibidor-papaína, inibidor-tripsina,
enzimas e inibidor separados foram pré-incubados com tampão Tris-HCl 0,05 M, pH
7,5, 120 µL de HCl 0,0025 M (ensaio tripsina) ou 40 µL de solução ativadora (ensaio
papaína) a 15 minutos a 37 °C. A reação foi iniciada com a adição de 200 µL de
azocaseína 1% e após 30 minutos na mesma temperatura a reação foi paralisada com
TCA 20%. A mistura de reação foi centrifugada por 10 minutos a 12000 x g. Alíquotas
de 500 µL dos sobrenadantes foram adicionados a 500 µL de NaOH 2 N, e a
absorbância foi medida a 440 nm. O ensaio controle foi realizado na ausência da fração
inibidora, nas mesmas condições acima descrita.
38
3.3.9 MODELAGEM DO INIBIDOR APTKI
A metodologia de modelagem por homologia foi constituída basicamente por
quatro etapas sucessivas: a identificação da(s) proteína(s)-molde, o alinhamento entre
as seqüências, a construção das coordenadas e a validação do modelo. A seguir foram
descritos os processos utilizados em cada uma das etapas.
a) Identificação, seleção de proteínas-molde
O passo inicial na modelagem comparativa foi identificar todas as proteínas
relacionadas à seqüência alvo, selecionando quais serão usadas como molde. A
seqüência correspondente ao inibidor resolvido experimentalmente com alto percentual
de identidade foi selecionada para a criação do modelo tridimensional do inibidor de A.
pavonina. O programa BlastP (Altschul et al. 1997), que busca por regiões contendo
similaridade local entre duas seqüências, foi utilizado na busca por estruturas molde,
para a aplicação da metodologia de modelagem molecular comparativa. Este programa
compara as seqüências de proteínas contra bancos de dados (o utilizado foi o Banco de
Dados de Proteína ou PDB). A estrutura do inibidor 1ba7 corresponde ao inibidor
tripsina de soja resolvido por difração de raio-X. Essa estrutura foi selecionada como
molde, devido a sua similaridade seqüencial mais significativa ao inibidor tipo Kunitz em
estudo.
b) Alinhamento entre as seqüências
Definido o molde, nessa etapa, foi realizado o alinhamento múltiplo entre as
seqüências do inibidor em estudo e o inibidor resolvido por cristalografia, utilizando o
programa ClustalW (Thompson et al. 1994), com as configurações padrão.
39
c) Construção do modelo
A modelagem por homologia foi empregada para a construção do modelo 3D da
proteína alvo, com o resultado do alinhamento da seqüência alvo e o molde. O método
utilizado para a construção do modelo 3D foi o de modelagem pela satisfação de
restrições espaciais. Este método calcula as restrições espaciais da estrutura molde e
usando o alinhamento múltiplo, as aplica a seqüência alvo. O modelo é derivado da
minimização das violações das restrições espaciais, e construído pela imposição
dessas restrições de ângulos e distâncias na seqüência alvo, derivadas do alinhamento
com o molde.
O programa SWISS-MODEL (Arnold et al., 2006; Kopp and Schwede 2004;
Schwede et al., 2003; Guex and Peitsch, 1997), foi utilizado na construção do modelo
tridimensional da proteína alvo, este programa automático on line utiliza a seqüência no
formato PDB adquirida do alinhamento com o molde pelo programa SPDBV (Guex et
al., 1999), para a construção do modelo levando em conta as parâmetros
estereoquímicos anteriormente citados e otimiza a estrutura através da minimização de
energia (minimização mecânica).
A estrutura do inibidor com o código PDB, 1ba7, foi responsável por toda a
construção do modelo 3D da seqüência do inibidor em estudo.
d) Validação do modelo
A etapa final do processo de modelagem consiste em avaliar os diferentes níveis
de organização estrutural. Nessa etapa analisam-se os vários níveis de empacotamento
global da proteína, os possíveis erros estruturais em regiões localizadas e os
parâmetros estequiométricos.
O programa utilizado na avaliação dos parâmetros estereoquímicos foi o
PROCHECK (Laskowski et al., 1998), o qual avalia os comprimentos de ligação, os
ângulos planos, a planaridade dos anéis de cadeias laterais, a quiralidade, as
conformações das cadeias laterais, a planaridade das ligações peptídicas, os ângulos
torcionais da cadeia principal e das cadeias laterais, o impedimento estérico entre pares
40
de átomos não ligados e a qualidade do Mapa de Ramachandran (Ramachandran,
1968).
O programa 3DSS (Sumathi et al, 2005), foi usado para o calculo do RMSD e a
sobreposição estrutural do modelo obtido por modelagem comparativa e a estrutura
resolvida por difração de raio-X utilizada como molde.
3.3.10 ACOPLAMENTO DO INIBIDOR KUNITZ EM COMPLEXO COM TRIPSINA E
COM PAPAÍNA
As coordenadas, para a criação do complexo com tripsina foi extraído da
estrutura com o código PDB, 1ba7. O complexo protéico foi criado utilizando o modelo
do inibidor e a estrutura resolvida por cristalografia da tripsina adquirida no PDB com o
código 1fn6. No complexo protéico realizado para papaína a estrutura adquirida foi
retirada do PDB com o código 9pap.
O programa HEX versão 4.5 (Ritchie, 1996), foi utilizado para construção das
interações entre o inibidor e as enzimas, o docking foi realizado com os parâmetros de
total rotação para os receptores e os ligantes, utilização da superfície e das cargas das
proteínas, como filtro foi utilizado a opção de reentrância, a qual diminui o espaço entre
o complexo encaixando-o na superfície e todos os complexos foram energeticamente
minimizados. Foram construídas 500 soluções para as duas proteinases. As interações
foram analisadas buscando os melhores resultados.
41
4 RESULTADOS
4.1 FILOGENIA
4.1.1 ANÁLISE DA SEQÜÊNCIA PRIMÁRIA DOS IPS TIPO KUNITZ DE
LEGUMINOSAS E DISTRIBUIÇÃO FILOGENÉTICA
O alinhamento múltiplo de 15 seqüências dos inibidores de proteinase (IPs) do
tipo Kunitz de sementes das três subfamílias de leguminosas (3 Caesalpinoideae, 7
Papilionoideae e 5 Mimosoideae) revelaram vários níveis de similaridades. De acordo
com o tamanho e similaridade, as seqüências dos 15 IPs do tipo Kunitz apresentaram
17% de similaridade entre as seqüências primárias completas que foram analisadas
(Figura 5). A subfamília Caesalpinoideae, considerada a mais primitiva entre as plantas
da família das leguminosas, apresentou 56% de similaridade entre as 3 seqüências
alinhadas (Figura 6); os inibidores da subfamília Papilionoideae, os quais são
consideradas o grupo de plantas mais recentes, apresentaram cerca de 40% de
similaridade entre 7 seqüências primárias (Figura 7). A subfamília Mimosoideae
apresentou alto grau de similaridade, cerca de 65% entre todos os 5 inibidores
alinhados, com 18% de forte similaridade, 10% de fraca similaridade e 37% de
identidade entre os resíduos de aminoácidos alinhados (Figura 8).
42
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
| | | | | | | | | |
AcTKI_m KELLDADGDILRNGGAYYILPALRGKGGG-LTLAKTGDESCPLTVVQAQSETKRGLPAVIWTPPKIAILT-PGFYLNFEFQPRDLPACLQKYSTLPWKVE
EcTKI_m KELLDSDGDILRNGGTYYILPALRGKGGG-LELAKTGDETCPLNVVQARGETKRGRPAIIWTPPRIAILT-PAFYLNIEFQTKDLPACLREYSRLPREEE
PjTKI_m QELLDVDGEILRNGGSYYILPAFRGKGGG-LELAKTEGETCPLTVVQARSETDRGLPASIWSPPRIAIIR-PGFSLNIEFRPRNPSACHRESSLQWKVEE
ApTKI_m RELLDVDGNFLRNGGSYYIVPAFRGKGGG-LELARTGSETCPRTVVQAPAEQSRGLPARLSTPPRIRYIG-PEFYLTIEFEEQKPPSCLRDSNLQWKVEE
LlTKI_m QVLVDLDGDPLYNGMSYYILPVARGKGGG-LELARTGSESCPRTVVQTRSETSRGLPARLASPYRILIG--SNIPLTIEFQPQKPYSCHGHSSRSLQWKV
BrTKI_c SVVLDTKGQPVRNAADAYYLEPVARGDGG-LALAKVGNEAEPKAVVLDPNHRP-GLTVRFETPLRINIIK-ESFFLNIKFVPSS------SESEVWEVRQ
BbTKI_c SVVVDTNGQPVSNGADAYYLVPVSHGHAG-LALAKIGNEAEPRAVVLDPHHRP-GLPVRFESPLRINIIK-ESYFLNIKFGPSS------SDSGVWDVIQ
EcTKI_p -VLLDGNGEVVQNGGTYYLLPQVWAQGGG-VQLAKTGEETCPLTVVQSPNELSDGKPIRIESRLRSAFIP-DDDKVRIGFAYAPKCAPSP----WWTVVE
ElTKI_p -VLLDGNGEVVQNGGTYYLLPQVWAQGGG-VQLAKTGEETCPLTVVQSPNELSDGKPIRIESRLRSTFIP-DDDEVRIGFAYAPKCAPSP----WWTVVE
EvTKI_p -VLLDGNGEVVQNGGTYYLLPQVWAQGGG-VQLAKTGEETCPLTVVQSPNELSNGKPIRIESRLRSAFIP-DDDKVRIGFAYAPKCAPSP----WWTVLE
PtTKI_p EPLLDSEGELVRNGGTYYLLPDRWALGGG-IEAAATGTETCPLTVVRSPNEVSVGEPLRISSQLRSGFIP-DYSLVRIGFANPPKCAPSP----WWTVVE
GmTKI_p DFVLDNEGNPLSNGGTYYILSDITAFGG--IRAAPTGNERCPLTVVQSRNELDKGIGTIISSPFRIRFIA-EGNPLRLKFDSFAVIMLCVGIPTEWSVVE
CaTKI_p -QVLDINGNPIFPGGKYYILPAIRGPPGGGVRLDKTGDSECPVTVLQDYKEVINGLPVKFVIPGISPGIIFTGTPIEIEFTKKPNCAE----SSKWLIFV
MtTKI_p -QVLDINGNPIFPGGQYYILPALRGPGGGGVRLGRTGDLKCPVTVLQDRREVKNGLPVKFTIPGISPGIIFTGTPLEIEYTKKPSCAA----STKWLIFV
DrTKI_c EKVYDIEGYPVFLGSEYYIVSAIIGAGGGGVRPGRTRGSMCPMSIIQEQSDLQMGLPVRFSSPEESQGKIYTDTELEIEFVEKPDCAE----SSKWVIVK
110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
| | | | | | | | | |
AcTKI_m G---ESQEVKIAPKEK---EQFLVGSFKIKPYRDD----YKLVYCE--GN-SDDESCKDLGISIDDE-NNRRLVVKDGHPLAVRFEKAHRSG--------
EcTKI_m ----QHSEVKIAPKE----EAAAFGXEKLKPYRDD----YKIVYCE--GG-SDDDSCKDLGISIDDE-NNRRLVVKDGDPLAVRFVKAHRRG--------
PjTKI_m ----ESQQVKIAVKE----DARGFGPFRIRPHRDD----YKLVYCDE-GQ-KRSDRCKDLGISIDEE-NNRRLVVKDGDPLAVRFVKANRRG--------
ApTKI_m ----ESQIVKIASKE----EEQLFGSFQIKPYRDD----YKLVYCEP-QQ-GGRLECKDLGISIDDD-NNRRLAVKEGDPLVVQFVNADREGN-------
LlTKI_m E---KTQMVKIASSDE---EQRLFGPFQIQPYRNH----YKLVYCESESR-NHHDDCRDLGISIDDQ-QNRLLVVKNGDPLVVQFAKANRGGDD------
BrTKI_c Q---YPEGLAVKVTD----TKSLVGPFRVEKEGEG----YKIVYYP--DR-GETGLDIGL---VHRN-EKYYLAVKDGEPFVFKIRKATDE---------
BbTKI_c Q---DPIGLAVKVTD----TKSLLGPFKVEKEGEG----YKIVYYP--ER-GQTGLDIGL---VHRN-DKYYLAVKDGEPCVFKIRKATDE---------
EcTKI_p D---EQEGLSVKLSED---ESTQFDYPFKFEQVSDQLHSYKLLYCEG-----KHEKCASIGINRDQK-GYRRLVVTEDYPLTVVLKKDESS---------
ElTKI_p D---EQEGLSVKLSED---ESTQFDYPFKFEQVSDKLHSYKLLYCEG-----KHEKCASIGINRDQK-GYRRLVVTEDNPLTVVLKKDESS---------
EvTKI_p D---EQEGLSVKLSED---ESTQFDYPFKFEQVSDKLHSYKLLYCEG-----KHEKCASIGINRDQK-GYRRLVVTEDNPLTVVLKKDESS---------
PtTKI_p D---QPQQPSVKLSEL---KSTKFDYLFKFEKVTSKFSSYKLKYCA------KRDTCKDIGIYRDQK-GYARLVVTDENPLVVIFKKVESS---------
GmTKI_p D---LPEGPAVKIGEN---KDAVDGWFRIERVSDDEFNNYKLVFCTQ--Q-AEDDKCGDIGISIDHDDGTRRLVVSKNKPLVVQFQKVDKESL-------
CaTKI_p DDTIDKACIGIGGPENYSGKQTLSGTFNIQKYGSG--FGYKLGFCVKGSP-----ICLDIGRYDNDE-GGRRLNLTEHEAFRVVFV--------------
MtTKI_p DNVIGKACIGIGGPENYPGVQTLKGKFNIQKHASG--FGYNLGFCVTGSP-----TCLDIGRFDNDE-AGRRLNLTEHEVYQVVFVDAATYEAEYIKSVV
DrTKI_c D--SGEARVAIGGSEDHPQGELVRGFFKIEKLGS---LAYKLVFCPKSSSG----SCSDIGINYEGR-RSLVLKSSDDSPFRVVFVKPRSGSETES----
Figura 5. Alinhamento múltiplo da seqüência dos inibidores tipo Kunitz em leguminosas. Os três grupos taxonômicos Mimosoideae,
Caesalpinoideae e Papilionoideae estão representados em “m”, “c” e “p”, respectivamente. Em vermelho, verde e azul os resíduos de aminoácido
idênticos, com forte similaridade e fraca similaridade, respectivamente. AcTKI, Acacia confusa; EcTKI, Enterolobium contortisiliquum; PjTKI,
Prosopis juliflora; ApTKI, Adenanthera pavonina; LlTKI, Leucaena leucocephala; BrTKI, Bauhinia ruffra; BbTKI, Bauhinia bauhinoides; EcTKI,
Erythrina caffra; ElTKI, Erythrina latissinia; EvTKI, Erythrina variegata; PtTKI, Psopocarphus tetragonolobus; GmTKI, Glycine max; CaTKI, Cicer
arientum; MtTKI, Medicago truncatula; DrTKI, Delonix regia.
43
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
| | | | | | | | | |
ApTKI RELLDVDGNFLRNGGSYYIVPAFRGKGGGLELARTGSETCPRTVVQAPAEQSRGLPARLSTPPRIRYIGPEFYLTIEFEEQKPPSCLRDS--NLQWKVEE
LlTKI QVLVDLDGDPLYNGMSYYILPVARGKGGGLELARTGSESCPRTVVQTRSETSRGLPARLASPYRILIG-SNIPLTIEFQPQKPYSCHGHSSRSLQWKVEK
AcTKI KELLDADGDILRNGGAYYILPALRGKGGGLTLAKTGDESCPLTVVQAQSETKRGLPAVIWTPPKIAILTPGFYLNFEFQPRDLPACLQKYSTLPWKVEGE
EcTKI KELLDSDGDILRNGGTYYILPALRGKGGGLELAKTGDETCPLNVVQARGETKRGRPAIIWTPPRIAILTPAFYLNIEFQTKDLPACLREYSRLPREEE-Q
PjTKI QELLDVDGEILRNGGSYYILPAFRGKGGGLELAKTEGETCPLTVVQARSETDRGLPASIWSPPRIAIIRPGFSLNIEFRPRNPSACHRESSLQWKVEE-E
110 120 130 140 150 160 170 180
| | | | | | | |
ApTKI ESQIVKIASKEEEQLFGSFQIKPYRDDYKLVYCEPQ-QGGRLECKDLGISIDDDNNRRLAVKEGDPLVVQFVNADREGN-
LlTKI TQMVKIASSDEEQRLFGPFQIQPYRNHYKLVYCESESRNHHDDCRDLGISIDDQQNRLLVVKNGDPLVVQFAKANRGGDD
AcTKI SQEVKIAPKEKEQFLVGSFKIKPYRDDYKLVYCE--GNSDDESCKDLGISIDDENNRRLVVKDGHPLAVRFEKAHRSG--
EcTKI HSEVKIAPKE-EAAAFGXEKLKPYRDDYKIVYCE--GGSDDDSCKDLGISIDDENNRRLVVKDGDPLAVRFVKAHRRG--
PjTKI SQQVKIAVKE-DARGFGPFRIRPHRDDYKLVYCDE-GQKRSDRCKDLGISIDEENNRRLVVKDGDPLAVRFVKANRRG--
Figura 6. Alinhamento da seqüência primária dos inibidores tipo Kunitz da subfamília Mimosoideae. Em vermelho, verde e azul os
resíduos de aminoácido idênticos, com forte similaridade e fraca similaridade, respectivamente.
44
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
| | | | | | | | | |
BrTKI SVVLDTKGQPVRNAADAYYLEPVA-RGDGGLALAKVGNEAEPKAVVLDP-NHRPGLTVRFETPLRIN-IIKESFFLNIKFV--PSSSESEVWEVRQ----
BbTKI SVVVDTNGQPVSNGADAYYLVPVS-HGHAGLALAKIGNEAEPRAVVLDP-HHRPGLPVRFESPLRIN-IIKESYFLNIKFG--PSSSDSGVWDVIQ----
DrTKI EKVYDIEGYPVFLGSEYYIVSAIIGAGGGGVRPGRTRGSMCPMSIIQEQSDLQMGLPVRFSSPEESQGKIYTDTELEIEFVEKPDCAESSKWVIVKDSGE
110 120 130 140 150 160 170 180
| | | | | | | |
BrTKI -QYPEGLAVKVTDTKSLVGPFRVEKEG-EGYKIVYYPDRGE-TGLDIGLVHRNEK-YYLAVKDGEPFVFKIRKATDE-----
BbTKI -QDPIGLAVKVTDTKSLLGPFKVEKEG-EGYKIVYYPERGQ-TGLDIGLVHRNDK-YYLAVKDGEPCVFKIRKATDE-----
DrTKI ARVAIGGSEDHPQGELVRGFFKIEKLGSLAYKLVFCPKSSSGSCSDIGINYEGRRSLVLKSSDDSPFRVVFVKPRSGSETES
Figura 7. Alinhamento da seqüência primária dos inibidores tipo Kunitz da subfamília Caesalpinoideae. Em vermelho, verde e azul os
resíduos de aminoácido idênticos, com forte similaridade e fraca similaridade, respectivamente.
45
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
| | | | | | | | | |
EcTKI -VLLDGNGEVVQNGGTYYLLPQVWAQGGG-VQLAKTGEETCPLTVVQSPNELSDGKPIRIESR-LRSAFIPDDDKVRIGFAYAPKCAPSP----WWTVVE
EvTKI -VLLDGNGEVVQNGGTYYLLPQVWAQGGG-VQLAKTGEETCPLTVVQSPNELSNGKPIRIESR-LRSAFIPDDDKVRIGFAYAPKCAPSP----WWTVLE
ElTKI -VLLDGNGEVVQNGGTYYLLPQVWAQGGG-VQLAKTGEETCPLTVVQSPNELSDGKPIRIESR-LRSTFIPDDDEVRIGFAYAPKCAPSP----WWTVVE
PtTKI EPLLDSEGELVRNGGTYYLLPDRWALGGG-IEAAATGTETCPLTVVRSPNEVSVGEPLRISSQ-LRSGFIPDYSLVRIGFANPPKCAPSP----WWTVVE
GmTKI DFVLDNEGNPLSNGGTYYILSDITAFGG--IRAAPTGNERCPLTVVQSRNELDKGIGTIISSP-FRIRFIAEGNPLRLKFDSFAVIMLCVGIPTEWSVVE
CaTKI -QVLDINGNPIFPGGKYYILPAIRGPPGGGVRLDKTGDSECPVTVLQDYKEVINGLPVKFVIPGISPGIIFTGTPIEIEFTKKPNCAESS---KWLIFVD
MtTKI -QVLDINGNPIFPGGQYYILPALRGPGGGGVRLGRTGDLKCPVTVLQDRREVKNGLPVKFTIPGISPGIIFTGTPLEIEYTKKPSCAAST---KWLIFVD
110 120 130 140 150 160 170 180 190
| | | | | | | | |
EcTKI DEQEGLSVKLSEDESTQFDYPFKFEQVSDQLHS---YKLLYCEG--KHEKCASIGINRDQK-GYRRLVVTEDYPLTVVLKKDESS---------
EvTKI DEQEGLSVKLSEDESTQFDYPFKFEQVSDKLHS---YKLLYCEG--KHEKCASIGINRDQK-GYRRLVVTEDNPLTVVLKKDESS---------
ElTKI DEQEGLSVKLSEDESTQFDYPFKFEQVSDKLHS---YKLLYCEG--KHEKCASIGINRDQK-GYRRLVVTEDNPLTVVLKKDESS---------
PtTKI DQPQQPSVKLSELKSTKFDYLFKFEKVTSKFSS---YKLKYCA---KRDTCKDIGIYRDQK-GYARLVVTDENPLVVIFKKDESS---------
GmTKI DLPEGPAVKIGENKDAVDGWFRIERVSDDEFNN---YKLVFCTQQAEDDKCGDIGISIDHDDGTRRLVVSKNKPLVVQFQKVDKESL-------
CaTKI DTIDKACIGIGGPENYSGKQTLSGTFNIQKYGSGFGYKLGFCVK--GSPICLDIGRYDNDE-GGRRLNLTEHEAFRVVFV--------------
MtTKI NVIGKACIGIGGPENYPGVQTLKGKFNIQKHASGFGYNLGFCVT--GSPTCLDIGRFDNDE-AGRRLNLTEHEVYQVVFVDAATYEAEYIKSVV
Figura 8. Alinhamento da seqüência primária dos inibidores tipo Kunitz da subfamília Papilionoideae. Em vermelho, verde e azul os
resíduos de aminoácido idênticos, com forte similaridade e fraca similaridade, respectivamente.
46
Esses IPs de leguminosas podem ser agrupados de acordo com a especificidade
de inibição frente as classe mecanística de suas enzimas alvos, tendo como base o
domínio STI (Inibidor de Tripsina de Soja) que é uma referência para a família de
inibidores do tipo Kunitz (Tabela 4). De acordo com a especificidade, os IPs foram
classificados como: STI clássicos (atuam somente inibindo um tipo de enzima e são
classificados como inibidores de tripsina, inibidores de quimotripsina, inibidores de
elastase ou inibidores de subtilisina); STI duplos (atuam inibindo dois tipos de enzimas
de uma mesma classe mecanística, por exemplo, inibidor de tripsina que ao mesmo
tempo inibe qualquer outra proteinase serínica); e STI bifuncionais (atuam sobre
enzimas de classe mecanística diferentes, por exemplo, os inibidores de proteinases
serínicas e cisteínicas).
A análise filogenética dos 15 IPs (Figura 9), cruzando os parâmetros homologia e
classificação de acordo com a especificidade, indicou que os inibidores que
apresentaram o caráter STI clássico foram reunidos em dois grupos taxonômicos, um
representado pelo grupo de inibidores da subfamília Papilionoideae e o outro
representado pelo grupo de inibidores da subfamília Caesalpinoedeae. A exceção foi o
inibidor da semente de soja, um STI duplo, representante da família Papilionoideae que
ficou agrupado dentre os grupos de IPs STI clássicos.
A subfamília Mimosoideae, que apresentou um alto grau de conservação de suas
seqüências primárias, formou um único grupo, onde o caráter STI duplo e STI
bifuncional foram predominantemente encontrados. A árvore filogenética não
enrraizada construída mostrou que a classe STI bifuncional ficou agrupada claramente
na subfamília Mimosoideae, representado pelos únicos inibidores com seqüência
completa de Prosopis juliflora (PjTKI) e Adenanthera pavonina (ApTKI), que
apresentaram entre si alto grau de similaridade das seqüências (Figura 10). Entretanto
um aumento das seqüências primárias disponíveis em banco de dados e as
caracterizações bioquímicas com relação à especificidade de inibição de outros
inibidores desta subfamília poderiam dar um maior suporte a este resultado.
47
Tabela 4. Classificação dos inibidores de proteinase do tipo Kunitz de acordo com o domínio STI encontrado no inibidor
da semente de soja.
Nome Científico Sigla Subfamília Especificidade Classificação
Delonix regia DrTKI Caesalpinioideae Trip STI clássico
Bauhinia ruffa BrTKI Caesalpinioideae Trip STI clássico
Bauhinia bauhinioides BbTKI Caesalpinioideae Trip STI clássico
Cicer arietinum CaTKI Papilionoideae Trip STI clássico
Medicago truncatula MtTKI Papilionoideae Trip STI clássico
Psophocarpus tetragonolobus PtTKI Papilionoideae Trip STI clássico
Erythrina variegata EvTKI Papilionoideae Trip STI clássico
Erythrina latissima ElTKI Papilionoideae Trip STI clássico
Erythrina caffra EcTKI Papilionoideae Trip STI clássico
Glycine max GmTKI Papilionoideae Trip-Quim STI duplo
Acacia confusa AcTKI Mimosoideae Trip-Quim STI duplo
Leucaena leucocephala LlTKI Mimosoideae Trip-Quim STI duplo
Enterolobium contortisiliquum EcTKI Mimosoideae Trip-Quim STI duplo
Prosopis juliflora PjTKI Mimosoideae Trip-Quim-Pap STI bifuncional
Adenanthera pavonina ApTKI Mimosoideae Trip-Quim-Pap STI bifuncional
48
Figura 9. Árvore filogenética construída relacionando o inibidor de Adenanthera pavonina com as três
classes de especificidade. A análise filogenética destas seqüências foi realizada utilizando o método de
máxima parcimônia com o programa PAUP. Todos os ramos resultaram de bootstrap acima de 50%.
PjTKI – Prosopis juliflora. AcTKI – Acacia confusa. ApTKI – Adenanthera pavonina. LlTKI – Leucaena
leucocephala. EcTKI – Enterolobium contortisiliquum. DrTKI – Delonix regia. EvTKI – Erythrina variegata.
ElTKI – Erythrina latíssima. EcTKI – Erythrina caffra. BrTKI – Bauhinia ruffa. BbTKI – Bauhinia
bauhinioides. CaTKI – Cicer arietinum. GmTKI – Glycine max. MtTKI – Medicago truncatula. PtTKI –
Psophocarpus tetragonolobus.
49
ApTKI RELLDVDGNFLRNGGSYYIVPAFRGKGGGLELARTGSETCPRTVVQAPAEQSRGLPARLSTPPRIRYIGPEFYLTIEFEEQKPPSCLRDSNLQWKVEEE
PjTKI QELLDVDGEILRNGGSYYILPAFRGKGGGLELAKTEGETCPLTVVQARSETDRGLPASIWSPPRIAIIRPGFSLNIEFRPRNPSACHRESSLQWKVEEE
:*******: *********:*************:* .**** ***** .* .******: :**:* * . : *.***. :.* :* *.* ********
110 120 130 140 150 160 170 180
| | | | | | | |
ApTKI SQIVKIASKEEEQLFGSFQIKPYRDDYKLVYCEPQQGGRLECKDLGISIDDDNNRRLAVKEGDPLVVQFVNADREGN
PjTKI SQQVKIAVKEDARGFGPFRIRPHRDDYKLVYCDEGQKRSDRCKDLGISIDEENNRRLVVKDGDPLAVRFVKANRRG-
** **** **: ** *:*:*:*********: * .*********::*****.**:****.*:**:*.* *
Figura 10. Alinhamento entre as seqüências primaria dos inibidores bifuncionais de Adenanthera pavonina e Prosopis juliflora. Em vermelho,
verde e azul os resíduos de aminoácido idênticos, com forte similaridade e fraca similaridade, respectivamente.
50
4.1.2 ANÁLISE DA SEQÜÊNCIA PRIMÁRIA DOS IPS DO TIPO KUNITZ EM
MIMOSOIDEAE
Dentre os dois inibidores bifuncionais, apenas o inibidor de Prosopis juliflora
(PjTKI) teve seu modelo de interação frente as suas duas enzimas alvos (tripsina e
papaína) resolvido in silico (FRANCO, et al., 2002). Os resíduos de aminoácidos,
triptofano (Trp60), arginina (Arg64) e dois ácidos glutâmicos (Glu89 e Glu109) estavam
envolvidos na interação do inibidor de Kunitz de P. juliflora com a enzima papaína.
Estes resíduos foram então usados para se saber se estes eram conservados nos
outros 5 inibidores de Kunitz pertencentes a esta subfamília. Na análise pode-se
observar que o inibidor STI bifuncional de A. pavonina (ApTKI) possuia os resíduos de
aminoácidos arginina (Arg64) e ácido glutâmico (Glu109) conservados, e que o resíduo
de ácido glutâmico (Glu89) no inibidor de P. juliflora foi substituído por um resíduo de
ácido aspártico (Asp89) na mesma posição, ambos aminoácidos de mesma natureza
ácida provavelmente desempenhando a função observada no inibidor de P. juliflora.
Outros integrantes dessa subfamília apresentaram esses resíduos completamente
idênticos como é o caso do inibidor de E. contortisiliquum (EcTKI), mas a sua
especificidade in vitro frente à proteinase cisteínica não foi ainda identificada, sendo
ainda classificado apenas como um inibidor STI duplo. O inibidor da semente de A.
confusa (AcTKI) apresentou o resíduo de arginina substituído pelo de lisina (Lys64), o
resíduo de triptofano foi conservado, mas em contra partida apresentou dois resíduos
de lisina (Lys89 e Lys109) que possivelmente desfavoreceria a interação frente à
papaína. O inibidor de L. leucocephala (LlTKI) apresentou conservado somente o
resíduo de arginina (Arg64) na seqüência de interação e provavelmente por esta razão
este inibidor não possuiria atividade frente à enzima papaína, pois não haveria uma
interação favorável para a formação do complexo (Tabela 5).
51
Tabela 5. Comparação dos resíduos do sitio ativo do inibidor para tripsina (resíduo na
posição 64) e papaína (resíduos nas posições 60, 89, 109) de P. juliflora com os demais
integrantes da subfamília Mimosoideae.
Mimosoidea
Sitio de Interação
P. juliflora (PjTKI)
Trp60 Arg64 Glu89 Glu109
A.pavonina (ApTKI)
Ser60
Arg64
Asp89
Glu109
E. contorsiliquum (EcKTI)
Trp60
Arg64
Glu89
Glu109
A. confusa (AcTKI)
Trp60
Lys64*
Lys89
Lys109
L. leucocephala (LlTKI)
Ala60
Arg64
Ser89
Asp109
* resíduos de lisina do sitio reativo do inibidor de Acacia confusa.
4.2 MODELO DE INTERAÇÃO IN VITRO DE APTKI PARA AS ENZIMAS TRIPSINA E
PAPAÍNA
4.2.1. PURIFICAÇÃO DE APTKI
Para o estabelecimento dos padrões de interação in vitro de ApTKI frente às
proteinases tripsina e papaína, foi realizado o isolamento e purificação do inibidor
usando os seguintes passos de purificação: obtenção da fração 40-60% de saturação
com sulfato de amônio, que foi denominado F2. Essa fração F2, com alta atividade anti-
tríptica, foi submetida a uma cromatografia de exclusão molecular em Sephacryl S-100
(Figura 11). O perfil cromatográfico apresentou três picos protéicos bem definidos,
sendo que o terceiro com inibição contra tripsina. As frações referentes ao terceiro pico
protéico foram dialisadas contra água destilada e liofilizadas, esse material foi
denominado F2-3.
52
Figura 11. Perfil cromatografico da fração F2 em gel filtaração S100. A coluna foi previamente equilibrada
com tampão Bórax, pH 7,5. As frações protéicas foram coletadas em fluxo constante de 0,75 mL/min, ▲
densidade óptica medida a 280 nm e ● atividade anti-triptica avaliada usando 50 µL de cada fração.
A fração protéica F2-3 foi submetida a outra cromatografia de exclusão molecular
em matriz Superose 12, previamente calibrada com os marcadores de massa
molecular, β-amilase (200 KDa), alcool desidrogenase (150 KDa), anidrase carbônica
(29 KDa), inibidor do tipo Kunitz de soja (21 KDa). O inibidor de A. pavonina apresentou
massa molecular de 22,5 KDa (Figura 12A e B).
53
0
500
1000
1500
2000
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
mL
mAU
4.0
4.3
4.5
4.8
5.0
5.3
5.5
1 1.25 1.5 1.75 2
RF
Log (Peso Molecular)
1
2
3
4
5
Figura 12. (A) Perfil cromatográfico da amostra F2-3 aplicada no sistema de purificação ÄKTA. A coluna
foi previamente equilibrada com tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5. As frações protéicas foram coletadas
em fluxo constante de 0,5 mL/min. (B) Curva de calibração de molecular para o inibidor ApTKI.
Marcadores de massa molecular (1) β-amilase (200 KDa), (2) álcool desidrogenase (150 KDa), (3)
anidrase carbônica (29 KDa) e (4) ApTKI, (5) inibidor do tipo Kunitz de soja (21 KDa).
54
4.2.2. RELAÇÃO EQUIMOLAR DE APTKI PARA AS ENZIMAS PAPAÍNA E
TRIPSINA
A relação equimolar de ApTKI para as proteinases serínica (tripsina) e cisteínica
(papaína) foram determinados para dar suporte ao modelo de interação in silico de
ApTKI. O ApTKI apresentou uma relação equimolar de 1,97 x 10
-10
mM (4,2 µg) para a
tripsina (Figura 13A) . Para a papaína foi encontrado uma razão equimolar de 5,91 x 10
-
9
mM (124µg) (Figura 13B).
55
0
20
40
60
80
100
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Razão Molar ApTKI:Tripsina
Atividade Residual (%)
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Razão Molar ApTKI:Papaína
Atividade Residual (%)
Figura 13. Curva de titulação do inibidor ApTKI. (A) efeito da atividade inibitória de ApTKI sobre a
proteinase serínica (tripsina) e (B) sobre a proteinase cisteínica (papaína).
A
Razão Molar ApTKI:Tripsina
B
Razão Molar ApTKI:
Papaína
56
4.2.3. PADRÕES DE INTERAÇÃO IN VITRO APTKI-TRIPSINA E APTKI-PAPAÍNA
Para o estabelecimento dos padrões de interação foi utilizado a razão equimolar
(inibidor:enzima) que resultasse na inibição de 100% da enzima do complexo e 100%
da enzima teste. O inibidor ApTKI foi incubado com tripsina e testado contra papaína,
também foi incubado com papaína e testado contra tripsina para revelar a hipótese de
sobreposição do sitio de interação. Os resultados apresentados na tabela 6 indicam que
os sítios para tripsina e papaína não são sobrepostos, pois o complexo binário ApTKI-
Tripsina ou ApTKI-papaína não perdeu a atividade inibitória atingindo o valor de inibição
semelhante quando o inibidor foi incubado com as enzimas em separado.
Tabela 6. Inibição da tripsina e papaína por ApTKI, ApTKI pré-incubada com ambas
enzimas e atividade proteolítica das proteinases serinica e cisteínica.
Atividade (U) % Inibição
Tripsina 31.7 0.0
Tripsina + ApTKI 1.7 97
(Papaína + ApTKI) + Tripsina 2.5 91
Papaína 45.4 0.0
Papaína + ApTKI 23.6 48
(Tripsina + ApTKI) + Papaína 24.6 46
Ensaio foi realizado em triplicatas e azocaseína 1% como substrato.
57
4.3. MODELO DE INTERAÇÃO IN SILICO DE APTKI PARA AS ENZIMAS TRIPSINA
E PAPAÍNA
4.3.1. MODELAGEM DE APTKI
A construção do modelo do inibidor de proteinase do tipo Kunitz ApTKI foi
realizada pela obtenção da seqüência primária armazenada no banco de dados de
seqüência do Centro Nacional de Informação Biotecnológica (NCBI) e consistiu das
etapas:
a) Seleção do molde
Na construção do modelo da estrutura tridimensional do inibidor de A. pavonina
foi utilizado o programa BlastP. A seqüência primária do inibidor ApTKI foi comparada
com as seqüências de aminoácidos que possuíam estruturas resolvidas
experimentalmente, por difração de raio-X, e depositadas no banco de dados de
proteínas (PDB) do servidor SWISS-PROT. A seqüência do inibidor do tipo de Kunitz de
soja por apresentar 40% de identidade com a seqüência do inibidor ApTKI foi escolhida
como molde. O inibidor de soja possui a estrutura tridimensional resolvida por difração
de raio-X, com resolução de 2,5Å, com número de acesso PDB, 1ba7, no banco de
dados de proteínas.
b) Alinhamento das seqüências de ApTKI e o inibidor de tripsina de soja (1ba7)
Alinhamento seqüencial e estrutural foi realizado no programa SPDBV com a
finalidade de construir um perfil estrutural do inibidor ApTKI. O inibidor apresentou cerca
de 70% dos resíduos similares à seqüência primaria do inibidor de soja e 40% desses
resíduos foram idênticos (Figura 14).
58
10 20 30 40 50
| | | | |
ApTKI RELLDVDGNFLRNGGSYYIVPAFRGKGGGLELARTGSETCPRTVVQAPAE
1ba7 DFVLDNEGNPLENGGTYYILSDITAFGG-IRAAPTGNERCPLTVVQSRNE
60 70 80 90 100
| | | | |
ApTKI QSRGLPARLSTPPRIRYIGPEFYLTIEFEEQKPPS-CLRDSNLQWKVEE-
1ba7 LDKGIGTIISSPYRIRFIAEGHPLSLKFDSFAVIMLCVGIPTEWSVVEDL
110 120 130 140 150
| | | | |
ApTKI -ESQIVKIASKEEEQLFGSFQIKPYRDD----YKLVYCEPQQGGRLECKD
1ba7 PEGPAVKIG-ENKDAMDGWFRLERVSDDEFNNYKLVFC-PQQAEDDKCGD
160 170 180
| | |
ApTKI LGISIDDDN-NRRLAVKEGDPLVVQFVNADREGN
1ba7 IGISIDHDDGTRRLVVSKNKPLVVQFQKLDKESL
Figura 14. Alinhamento entre as seqüências dos inibidores do tipo Kunitz ApTKI e o molde 1ba7. A
estrutura secundária do inibidor está representada por: setas, folha β, retas, alças e cilindro, alfa hélice.
Regiões em vermelho compreendem os resíduos idênticos (40%); em azul, forte similaridade (18%); em
verde fraca similaridade (12%).
c) Avaliação do modelo 3D de ApTKI
O modelo de ApTKI foi construído por modelagem comparativa utilizando o
programa SWISS-MODEL, e sua estrutura resultante foi validada pelo programa
PROCHECK que avalia diversos parâmetros estereoquímicos, tais como ângulos
torsionais da cadeia principal (Φ e Ψ), ângulos torsionais das cadeias laterais, maus
contatos (ou impedimentos estéricos), energias das ligações de hidrogênio, planaridade
das ligações peptídicas, desvios em relação à geometria tetraédrica dos carbonos-ɑ,
dentre outros.
59
A avaliação do modelo apresentado pelo mapa de Ramachandran apresentou
um modelo confiável com 98,6% dos resíduos presentes em regiões fisicamente
aceitáveis do mapa (Figura 15). Desses 80,1% dos resíduos estavam situados na
maioria em regiões de resíduos mais favoráveis, 14,4% estavam em regiões
adicionalmente permitidas, 4,1% estavam em regiões generosamente permitidas e
somente dois resíduos, Arg88 e Asp143, estavam em regiões desfavoráveis para a
formação das estruturas secundárias em relação aos ângulos torsonais phi (Φ) e psi
(Ψ), respectivamente (Figura 16).
O valor adquirido para o fator G, que é sempre referido como uma determinada
resolução estrutural, na qual existe um valor médio de cada parâmetro associado à
proteína envolvida na avaliação. No caso do ApTKI o total foi de –0,26, esse resultado
demonstrou a normalidade da estrutura do modelo tridimensional, que foi obtido através
do total de diferentes fatores G de cada resíduo de aminoácido (Figura 17).
60
Figura 15 Mapa de Ramachandran, no qual estão mostradas as regiões fisicamente permitidas para os
aminoácidos do modelo ApTKI. As regiões de estrutura secundária estão de acordo com: A – regiões de
α hélices mais favoráveis; a – regiões de α hélices adicionalmente permitidas; ~a – regiões de α hélices
generosamente permitidas; B – regiões de folhas β mais favoráveis; b – regiões de folhas β
adicionalmente permitidas; ~b – regiões de folhas β generosamente permitidas; L – regiões de α hélices
de mão esquerda mais favoráveis; l – regiões de α hélices de mão esquerda adicionalmente permitidas;
~l – regiões de α hélices de mão esquerda generosamente permitidas; p – regiões para glicina
adicionalmente permitidas; ~p – regiões para glicina generosamente permitidas.
61
Mapa Estatístico
Resíduos em regiões favoráveis [A,B,L] 117 80.1%
Resíduos em regiões aceitáveis [a,b,l,p] 21 14.4%
Resíduos em regiões generosamente aceitáveis [~a,~b,~l,~p] 6 4.1%
Resíduos em regiões desfavoráveis 2 1.4%
Número de resíduos sem glicina e sem prolina 146 100%
Número de resíduos finais (excl. Gly e Pro) 2
Número de resíduos de glicina (mostrados como triângulos) 16
Número de resíduos de prolina 12
Número total de resíduos 176
Figura 16. Resumo dos dados estatístico dos resíduos de aminoácidos situados no mapa de
Ramachandran.
Figura 17. Análise dos diferentes parâmetros de fatores G do modelo ApTKI.
62
A estrutura da cadeia principal mostrou a qualidade do modelo estrutural
comparada com estruturas bem refinadas já resolvidas. O resultado indicou que o
modelo ApTKI construído apresentou seus resíduos de aminoácido dentro da média
dos parâmetros observados. Por outro lado à estrutura da cadeia lateral foi considerada
bem posicionada, quando comparada às estruturas experimentais com a mesma
resolução, no caso uma resolução de 2.0Å (Figura18 A e B).
(A)
63
(B)
Figura 18. Conjunto de gráficos mostrando o comportamento da estrutura ApTKI (representada pelos
pequenos quadrados negros) comparado a estruturas bem refinadas em resolução similar (no caso
2.0Å), para a cadeia principal (A) e lateral (B).
64
A diferença entre a estrutura cristalizada do inibidor de soja (1ba7) e a estrutura
do modelo ApTKI resultado de modelagem comparativa foram calculados pela
sobreposição de ambas as estruturas (Figura 19). O valor de RMSD entre a estrutura
resolvida por difração de raio-X e o modelo de ApTKI foi calculado através do carbono
alfa e a cadeia principal resultando em 0.36Å. O valor de RMSD (raiz quadrada do
desvio médio) que mede a acurácia do modelo (quando igual a zero indica um ajuste
perfeito) indicou a pequena variabilidade entre o modelo ApTKI e a estrutura
experimental (1ba7:inibidor de Kunitz de soja) que por conseqüência refletiu a forte
similaridade no padrão de dobramento entre esses inibidores.
Figura 19. Sobreposição estrutural do modelo ApTKI (azul) com a estrutura experimental do inibidor de
soja - 1ba7 (rosa). RMSD entre as duas estruturas foi somente 0.36Å.
65
4.3.2. MODELO DE ApTKI
O inibidor ApTKI após validação apresentou conformação estrutural similar ao
dos inibidores de proteinase serínicas do tipo Kunitz. A conformação possui 12 folhas β
conectadas por longas alças, que foram divididos em três subdomínios (azul, amarelo e
vermelho), cada um com aproximadamente 60 resíduos de aminoácidos e cada
subdomínio consistindo de quatro folhas β antiparalelas. A organização estrutural do
modelo apresentou a ordem A-β1-A-β2-A-β3-A-β4, onde “A” denota as alças que
conectam as folhas β (Figura 20).
Figura 20. Modelo do inibidor tipo Kunitz de A. pavonina construído com o programa SWISS-MODEL. As
folhas β antiparalelas se dividem em três subdomínios (azul, “A”, vermelho “B” e amarelo “C”) constituído
de quatro folhas β, em verde são as alças e em roxo indicado pela seta o sitio reativo para tripsina
conservados nos inibidores do tipo Kunitz.
66
Os elementos da estrutura secundária de ApTKI está representado na Tabela 7.
O modelo demonstrou que as interações entre os diferentes subdomínios são mais
fortes do que os contatos intra-subdomínios. As conformações β antiparalelas intra-
subdomínio são estabilizadas pelos padrões básicos de pontes de hidrogênio.
Tabela 7. Distribuição da estrutura secundária de ApTKI.
Conformação
β
Alças Pontes Dissulfeto
N-terminal 1-013
A1 14-21
A1-A2 22-26
A2 27-32
A2-A3 33-41 Cys40
A3 42-46
A3-A4 47-55
A4 56-59
A4-B1 60-72 Sitio reativo
B1 73-77
B1-B2 78-93 Cys86
B2 94-96
B2-B3 97-103
B3 104-106
B3-B4 107-115
B4 116-119
B4-C1 120-133
Cys131
C1 134-137
C1-C2 138-145
Cys141
C2 146-153
C2-C3 154-157
C3 157-163
C3-C4 164-170
C4 171-175
67
4.3.3 PADRÃO DE INTERAÇÃO IN SILICO ApTKI-TRIPSINA
O modelo refinado do inibidor ApTKI e a estrutura da enzima serínica tripsina
(pdb: 1fn6) resolvido por difração de raio-X, foram utilizados para o estudo do
mecanismo de acoplamento enzima-inibidor. O modelo de interação resultou no
mecanismo de inibição do tipo não competitivo, o qual demonstrou uma pequena
mudança conformacional na tríade catalítica observado pela sobreposição do inibidor
livre e o inibidor complexado com a enzima alvo. O resíduo de aminoácido arginina
(Arg64) na posição P1 do inibidor interagiu com o resíduo serina (Ser37) na posição S1
da tripsina formando uma ponte de hidrogênio (Figura 20).
4.3.4 GEOMETRIA DO SITIO REATIVO DO COMPLEXO IN SILICO ApTKI-TRIPSINA
A geometria do grupo carbonil da posição P1 do inibidor é de grande importância
na formação da interação entre o inibidor e a proteinase durante a catálise. O carbono
carbonil interage para formar uma ponte de hidrogênio com NH da Ser37 da tripsina no
complexo ApTKI-Tripsina, a distância entre a Arg64 do inibidor e a Ser37 da enzima foi
de 3,48Å. Outras pontes de hidrogênio foram formadas na ligação entre o inibidor e a
proteinase estabilizando o complexo, o resíduo na posição P1 do inibidor interage com
o resíduo de histidina (His40) da enzima com distância de 3,32Å, já o resíduo de
isoleucina (Ile65) do inibidor na posição P2 também interage com o resíduo de histidina
(His40) da enzima formando uma ponte de hidrogênio com distância de 3,39Å e o
resíduo de arginina (Arg66) do inibidor na posição P3 formou uma ponte salina com o
ácido aspártico (Asp74) da enzima com distância de 3,08Å. A alça reativa foi
estabilizada intramolecularmente através de ligações polares do tipo ponte de
hidrogênio entre o resíduo de asparagina (Asn13) e os resíduos de prolina (Pro62),
arginina (Arg64) e isoleucina (Ile65), o que favoreceu a ligação à tripsina (Figura 21).
68
Figura 21. Visão geral da interação entre o modelo do inibidor ApTKI (marrom) e a tripsina (azul), destacando a alça reativa (verde) e os resíduos
de aminoácido da enzima (vermelho). Os resíduos do sitio catalítico estão representado em amarelo na forma de bastão. O mecanismo de
inibição apresentou ser do tipo não competitivo in silico.
69
Figura 22. Visualização da formação do complexo entre o inibidor ApTKI (marrom) e a proteinase serínica
tripsina (azul). A representação da interação é feita em bastão e bola mostrando a formação das pontes
de hidrogênio, nos círculos estão mostrados os resíduos P1 (Arg64), P2 (Ile65) e P3 (Arg66) fazendo
contato com os resíduos Ser37, Ser39, His40 e Asp74 da ezima.
70
4.3.5. PADRÃO DE INTERAÇÃO IN SILICO ApTKI-PAPAÍNA
O modelo do inibidor ApTKI e a enzima cisteínica papaína (9pap) resolvida por
difração de raio-X, foram utilizados para a análise do mecanismo de interação enzima-
inibidor. O inibidor apresentou um mecanismo de inibição do tipo não competitivo, esta
interação proporcionou uma mudança conformacional no sitio catalítico devido a
formação do complexo determinando a perda da atividade catalítica. O carbono carbonil
do resíduo de ácido glutâmico (Glu109) interagiu para formar uma ponte salina com NH
da lisina (Lys190) da proteinase cisteínica papaína (Figura 23).
4.3.6. GEOMETRIA DO SÍTIO REATIVO DO COMPLEXO IN SILICO ApTKI-PAPAÍNA
A formação do complexo entre o modelo ApTKI e a enzima papaína mostrou
poucas interações. O complexo foi estabilizado por contatos do tipo ponte de hidrogênio
intra e intercadeia. Os resíduos de ácido glutâmico (Glu38), serina (Ser85), ácido
aspártico (Asp89), ácido glutâmico (Glu109) do inibidor ApTKI formaram uma região
carregada negativamente devido à natureza química desses aminoácidos, com exceção
da serina que é um aminoácido não carregado, mas polar. Os resíduos de aminoácido
que fazem parte do sitio de interação da papaína foram os resíduos, valina (Val150),
arginina (Arg188) e lisina (Lys190). A ponte de hidrogênio entre os resíduos Glu38 do
inibidor e Arg188 da enzima foi formada através da ligação do oxigênio (OE1) e o
hidrogênio (NH2) respectivamente; o resíduo Glu109 (carregado negativamente) do
inibidor e Lys190 (carregado positivamente) da enzima forma uma ponte salina entre o
oxigênio (OE1) e o nitrogênio (NZ) com distância de 3,37Å; a interação observada entre
os resíduos de Ser85 do inibidor e Val150 da enzima proporcionou a formação de uma
ponte de hidrogênio de 3,25 Å, por último foi observado uma interação hidrofóbica entre
o resíduo Asp89 do inibidor e a Val150 da enzima (Figura 24).
71
Figura 23. Visão geral da interação entre o modelo do inibidor ApTKI (marrom) e a papaína (roxo), destacando os resíduos do inibidor (verde) que
interagem com os resíduos da enzima (vermelho). Os resíduos do sitio catalítico estão representado em amarelo na forma de bastão. O
mecanismo de inibição apresentou ser do tipo não competitivo in silico.
72
Figura 24. Visualização da formação do complexo entre o inibidor ApTKI (marrom) e a proteinase cisteínica papaína (roxo). A representação da
nteração é feita em bastão e bola mostrando a formação das pontes de hidrogênio e os contatos hidrofóbicos. Os círculos estão representando os
resíduos Glu38, Ser85, Glu89 e Glu109 fazendo contato com os resíduos de Val150, Arg188 e Lys190 da ezima.
73
4.3.7. FORMAÇÃO DO COMPLEXO TERNÁRIO
O inibidor da semente de A. pavonina, interessantemente, forma com as
proteinases serínicas e cisteínicas um complexo ternário que foi mostrado in vitro e
comprovado in silico (Figura 25). Esse inibidor forma esse complexo ternário através de
mecanismos não competitivos e foi capaz de inibir fortemente a tripsina e
moderadamente a papaína, indicando que este inibidor é de fato um STI bifuncional.
Figura 25. Visualização geral da formação do complexo ternário entre o inibidor Papaína–
ApTKI–Tripsina. Papaína (rosa), ApTKI (marrom) e Tripsina (azul) e.
74
5 DISCUSSÃO
Inibidores de proteinases da família do tipo Kunitz são amplamente investigados
sob os mais diversos aspectos, tais como: caracterização bioquímica, relacionamento
filogenético, estrutura tridimensional e especificidade para diversas classes de enzimas
(NORIOKA, et al., 1988; RYAN, 1990; JONGSMA; BOLTER, 1997; OLIVEIRA, et al.,
2002; FRANCO, et al., 2002; KRAUCHENCO, et al., 2003; GARCIA, et al., 2004;
BHATTACHARYYA, et al., 2007). Essa especificidade de inibição frente a diferentes
enzimas de mesma classe mecanística tem sido extensivamente estudada (OLIVEIRA,
et al., 2002; FRANCO, et al., 2002; MACEDO, et al., 2004; GOMES, et al., 2005;
OLIVEIRA, et al., 2007). Usando a especificidade de inibição e o domínio STI, os
inibidores do tipo Kunitz foram classificados por nós em inibidores STI clássicos (Kunitz
que inibe somente uma enzima serínica) e STI duplos (Kunitz que inibem duas enzimas
serínicas). Recentemente uma nova classe foi adicionada e denominada de STI
bifuncional (Kunitz que inibem enzima serínica e cisteínica), nesta classe o primeiro
inibidor purificado e caracterizado foi o da semente de Prosopis juliflora e sua interação
bifuncional in silico também foi à primeira proposta (OLIVEIRA, et al., 2002; FRANCO,
et al., 2002). Baseando-se nos resultados obtidos no estudo para P. juliflora e
observando que este inibidor possuía alta similairidade com o inibidor de proteinase do
tipo Kunitz da semente de Adenanthera pavovnina (ApTKI), Macedo e colaboradores
(2004), mostraram in vitro que ApTKI também inibia a enzima papaína (proteinase
cisteínica), propriedade que permitia a inclusão deste inibidor na classe de inibidores
STI bifuncionais.
Por meio da análise das seqüências primárias e cruzando com os dados de
especificidade in vitro foi construída uma árvore filognética para se observar a
distribuição desta característica bifuncional sendo geral ou residindo em alguma
subfamília das leguminosas. Para isso, 15 seqüências aminoacídicas completas de
inibidores da família do tipo Kunitz disponíveis no banco de dados NCBI foram usadas
na construção de uma árvore filogenética não enraizada. Esta árvore apresentou
valores de bootstrap acima de 50% suportados por cem (100) réplicas. A análise da
distribuição filogenética dos 15 inibidores da família do tipo Kunitz em leguminosas
75
demonstrou que as seqüências ficaram nitidamente agrupadas nas classes de
especificidade, onde os inibidores STI clássicos formaram dois grupos, um composto
pelos inibidores da subfamília Papilionideae e outro constituído pelos inibidores da
subfamília Caesalpinoideae. A especificidade para inibir duas proteinases de mesma
classe mecanística, STI duplo, foi observado na subfamília Mimosoideae entre os
inibidores das sementes de A. confusa, L. leucocephala e E. contortisiliquum e em um
único inibidor na subfamília Papilionideae, o inibidor da semente de Glycine max, que
apresenta alto grau de identidade com os inibidores da subfamília Mimosoideae. Os
inibidores da classe STI bifuncional formaram um grupo bem definido, P. juliflora e A.
pavonina, ambos pertencentes à subfamília Mimosoideae.
Os inibidores da classe STI bifuncional adquiriram esta característica
possivelmente devido à pressão biótica de insetos predadores que apresentavam
proteinases de classes diferentes (CHRISTELLER, et al., 2005) para digerirem as
proteínas da dieta. Para contrapor esta característica dos predadores, as plantas
possivelmente desenvolveram durante sua co-evolução com as pragas, inibidores
capazes de serem ativos contra as diferentes classes de proteinases desses insetos
(XAVIER-FILHO, 1992). Os inibidores de proteinase das sementes da subfamília
Mimosoideae, Prosopis juliflfora (OLIVEIRA, et al., 2002), Adenanthera pavonina
(MACEDO, et al., 2004), Pithecellobium dumosum (OLIVEIRA, et al., 2007) são
exemplos de inibidores que possuem a capacidade de inibir enzimas de classes
mecanísticas diferentes. Essa história co-evolutiva, entre insetos predadores e
inibidores de proteinases, foi bem relatada nos últimos anos por Jongsma et al. (1997);
Rawlings et al. (2004); Lopes et al. (2004).
A interação in vitro e in silico dos inibidores bifuncionais tem sido alvo de
investigação, pois estes inibidores são excelentes candidatos nos processos de
transgenia e também nos estudos de especificidade ezima:inbidor (ZENKE, et al., 1991;
FURTADO, et al., 2003). O ApTKI, ao lado do inibidor de P. juliflora (PjTKI), até então
são os únicos representantes STI bifuncionais com suas seqüências completas e
apenas PjTKI teve seu modelo de interação in silico resolvido. Neste estudo foi feito a
avaliação da interação in vitro e in silico de ApTKI frente as enzimas tripsina e papaína.
76
Para isso ApTKI foi purificado segundo a metodologia desenvolvida por Macedo et al.,
(2004) e usado nos ensaios in vitro.
O ApTKI purificado foi capaz de suprimir a atividade proteolítica da tripsina em
97%, e foi menos efetivo para a proteinase cisteínica papaína suprimindo sua atividade
em 48%, dado similar ao observado na purificação do mesmo inibidor por Macedo et al.
(2004) que atingiu 52% de inibição. Outros inibidores de sementes de leguminosas
apresentaram essa característica bifuncional similar, como os purificados da semente
da P. juliflora que suprimiu a atividade catalítica da papaína em 65% (FRANCO, et al.,
2002), Crotalaria pallida, que suprimiu atividade da papaína em 43,9% (GOMES, et al.,
2005a) e os inibidores de Pithecellobium dumosum que apresentaram efeito sobre a
papaína variando entre 32% a 49% (OLIVEIRA, et al., 2007). O inibidor ApTKI é efetivo
contra tripsina através do mecanismo de inibição do tipo não competitivo, mecanismo
esse menos comum para inibidores do tipo Kunitz. O resultado, portanto está de acordo
com relatos mostrados para outras leguminosas como Crotalaria pallida (GOMES, et al.,
2005a) e Tamarindus indica (ARAÚJO, et al., 2005a) e esse mecanismo também pode
ser visto em inibidores de tripsina purificados de tubérculos de Colocasia esculenta
(OLIVEIRA, 2001) e C. antiquorum (SUMAHI; PATTABIRAMAN, 1979) que inibem não
competitivamente a atividade catalítica da tripsina. Macedo et al. (2004) observou que o
inibidor ApTKI foi capaz de suprimir a atividade proteolítica da proteinase cisteínica
papaína de forma não competitiva. Esse resultado é freqüentemente encontrado para
fitocistatinas, inibidores específicos de enzimas cisteínicas (ABE, et al., 1987; 1994;
FERNANDES, et al., 1991; ZHAO, et al., 1996; PERNAS, et al., 1998; JACINTO, et al.,
1998; HAARD, 2000; OLIVEIRA, et al., 2002; MACEDO, et al., 2004; OLIVEIRA, et al.,
2007).
Na análise in silico da interação de APTKI com as enzimas alvos, a construção
do modelo tridimensional de ApTKI mostrou que este apresentou 12 folhas betas,
antiparalelas conectadas por longas alças formando um barril beta. Essa característica
é encontrada nos inibidores tipo Kunitz, tais como, Glycine max, Delonix regia, Erythrina
caffra, Copaifera langsdorffii, Psophocarpus tetragonolobus os quais possuem suas
estruturas resolvidas por técnicas experimentais como difração de raio-X. Por esta
razão esses inibidores são chamados de inibidores da família beta (SONG; SUH, 1998;
77
BATISTA, et al., 2001; KRAUCHENCO, 2003, 2004; KHAMRUI, et al., 2005). O
resultado para a validação do modelo tridimensional de ApTKI realizado pelo programa
PROCHECK e confirmado pelo mapa de Ramachandran mostrou que o modelo
apresentava 98,6% dos resíduos de aminoácido em regiões fisicamente aceitáveis, com
80,1% dos resíduos situados em regiões mais favoráveis, 14,4% estão em regiões
adicionalmente permitidas, 4,1% estão em regiões generosamente permitidas e
somente dois resíduos um de arginina e outro de ácido aspártico (Arg88 e Asp143)
encontram-se em regiões desfavoráveis para a formação das estruturas secundárias
em relação aos ângulos torsionais phi e psi. Esse resultado esta de acordo com
encontrado para outro inibidor de proteinase do tipo Kunitz L. leucocephala da mesma
subfamília, construído pelo método de modelagem por homologia e avaliado pelo
PROCHECK. A análise do mapa de Ramachandran apresentou um total de 99,4% dos
resíduos de aminoácido em regiões fisicamente aceitáveis, com 81,3% dos resíduos
situados em regiões mais favoráveis, 13,2% estão em regiões adicionalmente
permitidas, 4,9% estão em regiões generosamente permitidas e somente o resíduo
treonina (Thr98) encontra-se em região desfavorável. A sobreposição estrutural entre o
inibidor ApTKI e o inibidor de soja (1ba7) apresentou valor de RMSD igual a 0.36Å. O
resultado obtido é menor do que o observado para o modelo construído por modelagem
comparativa do inibidor de L. leucocephala que apresentou valores de RMSD para os
cristais de STI:PPT (orto e tetragonal) entre 0,58 e 0,47Å. Os resultados do mapa de
Ramachandran, do valor de RMSD, dos parâmetros de cadeia principal e lateral de
ApTKI demonstraram que o modelo do inibidor é aceitável e que a qualidade
estereoquímica e a forte similaridade no padrão de dobramento é semelhante a aqueles
encontrados entre os inibidores da família Kunitz (SATTAR, et al., 2004).
Além do mais, na construção do modelo ApTKI o resultado do fator G foi de –
0,26 um valor aproximado do valor também encontrado para o modelo de P. juliflora
que apresentou valor total do fator G entre -0,23 e -0,29 para os modelos construídos
com moldes variando entre 83 a 91% dos resíduos em regiões fisicamente aceitáveis
no mapa de Ramachandran (FRANCO, et al., 2002).
Os modelos 3D de interação de ApTKI com as enzimas demonstraram que
ApTKI formou um complexo com a tripsina de acordo com o mecanismo de inibição do
78
tipo não competitivo, comprovando os resultados de Prabhu; Pattabiraman (1980) e
Macedo et al. (2004). O inibidor ApTKI interagiu com a tripsina em uma região favorável
diferente do sitio catalítico. O sitio catalítico ficou exposto perdendo sua atividade
enzimática possivelmente pela mudança conformacional, torção dos resíduos da tríade
promovidos pela interação com o inibidor.
A formação de pontes de hidrogênio na interação frente à proteinase serínica
apresentou dois contatos polares de distâncias 3,32 e 3,48Å entre o P1 (Arg64) do
inibidor e os resíduos de Ser37 e His40 da enzima. Os resíduos dos sítios P2 do
inibidor (Ile65) forma com a histidina (His40) da enzima uma ponte de hidrogênio com
distância de 3,39Å e entre o resíduo P3 do inibidor (Arg66) e o resíduo de acido
aspártico da enzima (Asp74) uma outra ponte de hidrogênio com distância de 3,08Å.
Essas distâncias são similares as encontradas para a formação do complexo LTI:PPT
do inibidor de L. leucocephala a qual apresenta distância entre o P1 (Arg62) e a Ser195
com valor de 2,76 e 2,71Å para os modelos construídos com as estruturas cristalizadas
do inibidor de soja orto e tetragonal respectivamente (SONG; SUH, 1998; SATTAR, et
al., 2004). Essa interação menos comum no inibidor de A. pavonina entre a Arg64 e
Ser37 contrasta com os resultados observados na maioria dos inibidores tipo Kunitz
que formam o complexo enzima-inibidor através dos resíduos de Arg64 (P1) e Ser195
(S1) da tríade catalítica (HUBER, et al., 1974; MARQUART, et al., 1983; BODE;
HUBER, 1992; SATTAR, et al., 2004). Iwanaga et al. (2004) relataram uma
característica dos inibidores de proteinase tipo Kunitz, o resíduo de asparagina (Asn13)
é conservada e possui um papel fundamental na atividade inibitória formando pontes de
hidrogênio intracadeia com os resíduos da alça reativa. O modelo de ApTKI apresentou
esse resíduo de aminoácido asparagina conservado. A asparagina (Asn13) no modelo
ApTKI apresentou na estrutura terciária a formação de pontes de hidrogênio com os
resíduos do sitio reativo P1 (oxigênio da Arg64), P2 (oxigênio da Ile65) e formação um
contato polar entre o nitrogênio da asparagina e o oxigênio da prolina (Pro62) P2’.
Outro resultado semelhante pode ser observado para o inibidor de quimotripsina de
Psophocarpus tetragonolobus, um inibidor da subfamília Papilionoideae da divisão STI
clássico, que apresenta o resíduo de asparagina (Asn14) possuindo uma função
79
importante na estabilidade e conformação da alça do sitio reativo (RAVICHANDRAN,
2001).
Os resultados observados in vitro indicaram que ApTKI inibe papaína e o sitio de
interação para tripsina não impedia a interação com a papaína, portanto os sítios não
estavam sobrepostos. Esse resultado foi diferente daquele encontrado na interação do
inibidor de P. julifora o qual possui o sitio reativo sobreposto para papaína e tripsina
(FRANCO, et al., 2002). O mecanismo de inibição resultante in silico foi do tipo não
competitivo corroborando o resultado in vitro e aquele encontrado por Macedo et al.
(2004). A atividade do inibidor frente à papaína foi menor do que aquele encontrado
para PjKTI, o que poderia ser explicado devido a mudanças nos resíduos envolvidos na
interação com a papaína, onde somente o resíduo de ácido glutâmico (Glu109) foi
conservado, quando comparado com a seqüência dos resíduos de aminoácidos
envolvidos na interação de PjKTI:papaína. Entretanto o resíduo de ácido glutâmico
(Glu89) foi substituído por ácido aspártico (Asp89) mantendo dessa maneira a natureza
aminoacídica (aminoácidos ácidos), o que poderia favorecer também a interação de
ApTKI com a papaína. Quando comparado o sítio de interação do PjKTI:papaína foi
constatado que ApTKI apresentou em seu sitio de interação os resíduos de Glu109 e
Asp89 envolvidos na ligação a papaína, e a presença de outros dois novos resíduos
(Glu38 e Ser85) também foram importantes para estabilizar a formação do complexo.
Outra diferença observada foi que no modelo de interação de P. juliflora (PjTKI) os
sítios de interação estavam sobrepostos (FRANCO, et al., 2002) e no caso de
ApTKI:papaína foram mostrados por análise in vitro e in silico que os sítios não estavam
sobrepostos. Também, possivelmente a falta do resíduo aromático triptofano (Trp60)
posicionado no centro da ligação entre a papaína e o inibidor ApTKI justifica a
moderada eficiência da atividade inibitória, pois diferentemente do observado na
interação entre o complexo PjTKI:papaína, a qual possui alta especificidade para a
proteinase cisteínica, foi observado interação hidrofóbica através do resíduos triptofano
(Trp60) do inibidor e as cadeias laterais dos resíduos de triptofano (Trp69), tirosina
(Tyr67) e arginina (Arg59) da papaína (FRANCO, et al., 2002).
Os inibidores de proteinase da Família do Tipo Kunitz apresentam alto grau de
conservação tanto na seqüência primária quanto na estrutura tridimensional. Os
80
estudos através da metodologia modelagem comparativa, realizados para os inibidores
das sementes de P. juliflora e A. pavonina proporcionaram interessantes informações
sobre esses inibidores, igualmente adquirido através dos modelos resolvidos por
metodologias experimentais. A família das leguminosas, mais precisamente a
Subfamília Mimosoideae apresentam alto grau de identidade entre as seqüências
primárias, e por este motivo provavelmente outros inibidores dessa subfamília
apresentam na estrutura terciária uma informação valiosa sobre esta característica de
inibir classes diferentes de proteinases. Os inibidores do tipo Kunitz das sementes de E.
contorsiliquum e A. confusa provavelmente sejam fortes candidatos para o estudo de
analise conformacional do mecanismo de inibição destes inibidores.
81
6 CONCLUSÃO
O inibidor ApTKI tipo Kunitz da semente de A. pavonina, apresentou sua
estrutura tridimensional confiável, após a validações.
O inibidor ApTKI demonstrou ser um eficiente inibidor frente à proteinase serínica
tripsina in vitro, inibindo essa proteinase de forma não competitiva reforçanda in silico, e
portanto esses dados estão de acordo com o encontrado por Prabhu; Pattabiraman,
1980.
A atividade inibitória do inibidor ApTKI sobre a proteinase cisteínica papaína foi
moderada demonstrada in vitro, apresentando pouca similaridade entre os resíduos de
interação exibidos pelo inibidor da semente de P. juliflora. ApTKI suprimiu a atividade
catalítica da papaína, através do mecanismo de inibição do tipo não competitivo in
silico, comprovando os resultados observados por Macedo et al. 2004.
Os sítios de interação do inibidor ApTKI não são sobrepostos como visto em P.
juliflora por FRANCO, et al., 2002, e esse inibidor, tem a capacidade de formar um
complexo ternário visto in vitro e in silico. Portanto, esse inibidor tem a interessante e
exclusiva habilidade de interagir com duas proteinases, serínica (tripsina) e cisteínica
(papaína); podendo contribuir dessa forma no desenvolvimento de ferramentas
biotecnológicas, para deter a atividade de enzimas digestivas alvos de insetos pragas.
Os estudos in silico e in vitro do inibidor ApTKI sobre as enzimas alvos puderam
elucidar a especificidade de ligação desse inibidor bifuncional e, assim propor um
candidato no modelo de pirimidalização de proteínas de defesa.
82
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