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JULIANA GARCIA DE OLIVEIRA
Expressão de fragmentos de anticorpos humanos recombinantes capazes de inibir a
atividade fosfolipásica e de influenciar atividades farmacológicas induzidas pelo veneno
de Crotalus durissus terrificus
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de
São Paulo para obtenção do título de Mestre em
Imunologia Básica e Aplicada.
Orientador: Prof. Dr. José Elpídio Barbosa
Ribeirão Preto
2006
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2
Aos meus pais Raul e Sandra, pela dedicação,
amor e incentivo nas minhas escolhas.
À minha irmã Monica, pela amizade e carinho.
Ao Fabiano, pelo amor e apoio constantes.
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3
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. José Elpidio Barbosa, pela orientação, amizade, e
principalmente por contribuir para que eu desenvolvesse um pensamento
crítico e uma visão científica.
Aos amigos do Laboratório de Imunopatologia Molecular, onde este
trabalho foi realizado:
Ao André, por sua alegria e determinação contagiantes, pela amizade,
convívio e até pelas “briguinhas” que me fazem rir agora ao lembrá-las.
À Vânia, pelas conversas e experiências compartilhadas no convívio de
laboratório, amizade e apoio experimental.
À Mirela, pela amizade desde os tempos da graduação, pelo apoio em
todas as fases deste Mestrado e por tornar tudo isso mais fácil com nossas
brincadeiras e “loucuras”.
Ao Sandro, por me apoiar desde o início deste trabalho, pela ajuda nos
experimentos e nas discussões, fundamental para o desenvolvimento desta
dissertação.
4
Ao Prof. Dr. José Roberto Giglio por ceder as amostras de veneno e por
sua valiosa participação, contribuição e sugestões para o desenvolvimento
desta dissertação.
Ao Prof. Dr. Andreimar Martins Soares, pelas amostras de toxinas
cedidas, pela ajuda nos ensaios in vivo, me recebendo em seu laboratório e
compartilhando de sua experiência, que muito valorizaram a discussão dos
resultados.
À aluna de pós-graduação Silvana Marcussi, pela ajuda nos ensaios in
vivo, que foram muito importantes para a conclusão deste trabalho e pela
disponibilidade em ajudar sempre.
Ao aluno de pós-graduação Clayton Oliveira, pela ajuda nos ensaios in
vivo e por torcer junto comigo para obtermos bons resultados. Valeu!!!
Ao Dr. Ivan Fiore de Carvalho, pelas discussões de alguns
experimentos e pelos ensinamentos.
Ao Prof. Dr. Eduardo Brancht de Oliveira, pelo auxílio na produção
das colunas de afinidade.
Ao Beto, pela disponibilidade em ajudar sempre e pelos reagentes
químicos cedidos.
5
À Verinha, ao Gilberto, Ruiter e ao Pancinha, que sempre foram muito
prestativos na ajuda com a liofilização dos materiais.
Aos funcionários do Biotério Central, especialmente ao Rinaldo, ao
Élder e ao Rato pela coleta de sangue dos carneiros.
Aos amigos Daniela e Mauro por sempre estarem dispostos a ajudar e
contribuírem para o desenvolvimento deste trabalho.
A todos os professores da Imunologia, que contribuíram para minha
formação.
A todos os alunos da pós-graduação da Imunologia, pela amizade e
convivência. Agradeço especialmente ao Trança, pela contribuição valorosa
em alguns experimentos e por sempre estar disposto a ajudar.
À Ana Cristine, sem palavras para dizer o que ela representa para
todos os alunos da pós-graduação da “Imuno”.
À minha avó Luzia e meus tios e tias que mesmo de longe sempre
torceram e se preocuparam em me incentivar.
À minha irmã Mônica, que mesmo sem saber sempre me ajudou com
sua alegria contagiante e me ensinou muito com seu jeito único de encarar a
vida.
6
Ao Fabiano, por fazer parte de minha vida nestes últimos anos, por
compartilhar momentos difíceis e alegres, por mesmo de longe conseguir me
dar força para não desistir dos meus objetivos e por tornar tudo mais leve e
alegre. Obrigada pelo amor, dedicação, carinho e incentivo.
Aos meus pais Raul e Sandra, por sempre acreditarem no meu
potencial e por proporcionarem condições que me levaram a este mestrado e
à sua conclusão. Obrigada pela educação de qualidade que vocês sempre
primaram, por nunca me deixarem desistir e por tudo que sou hoje. Amo
vocês demais!!!!
7
“O que sabemos é uma gota, o
que ignoramos é um oceano.”
Isaac Newton
(1643-1727)
8
RESUMO
Oliveira, J.G. Expressão de fragmentos de anticorpos humanos recombinantes capazes
de inibir a atividade fosfolipásica e de influenciar atividades farmacológicas do veneno
de Crotalus durissus terrificus. 2006. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006.
No Brasil são notificados cerca de 20.000 acidentes ofídicos anualmente ao
Ministério da Saúde, sendo que as serpentes do gênero Crotalus são responsáveis por apenas
7% desses envenenamentos. Apesar da freqüência destes acidentes ser inferior à de acidentes
com serpentes do gênero Bothrops, eles se tornam importantes não apenas pela alta incidência
em certas regiões, mas por possuírem um potencial de produzir quadros clínicos graves, até
mesmo fatais. No entanto, há mais de um século, a única terapia específica para
envenenamento são os antivenenos constituídos de soro eqüino. Embora a imunoterapia tenha
provado a sua eficácia na redução da mortalidade e morbidade em casos de picadas de
serpentes, um dos maiores problemas no uso de soros hiperimunes de eqüinos como
antivenenos, é que alguns indivíduos podem ficar sensibilizados às proteínas de eqüinos.
Portanto, têm-se buscado alternativas para a produção destes antivenenos, e uma delas é a
produção de fragmentos de anticorpos humanos pela tecnologia de “phage display”. Neste
trabalho, buscou-se a produção de anticorpos monoclonais capazes de inibir a atividade
fosfolipásica do veneno de Crotalus durissus terrificus, utilizando-se a biblioteca de
fragmentos de anticorpos humanos (scFv) “Griffin.1”, produzida no “Medical Research
Council” – MRC, Cambridge, Reino Unido. O protocolo adotado para a seleção dos fagos-
anticorpos contra o veneno bruto foi o de imobilização das proteínas em superfície sólida. Foi
realizado um total de quatro turnos de seleção, sendo que os fagos-anticorpos selecionados
9
foram analisados por ELISA para a escolha do turno com o maior título de fagos específicos
para o veneno. O quarto turno de seleção foi escolhido para a produção de quatro placas de
cultura de 96 poços de fagos-anticorpos monoclonais. Como o ELISA demonstrou que a
maioria dos clones monoclonais foi capaz de reconhecer as proteínas do veneno, foi
constituida uma placa com os clones mais positivos para a realização dos ensaios de inibição
de hemólise. Dois clones produtores de fagos-anticorpos selecionados foram utilizados para a
produção de fragmentos de anticorpos solúveis. Dada a ausência de marcadores que facilitam
a detecção destes anticorpos, a purificação total do scFv não foi obtida, optando-se por uma
purificação parcial por gel filtração em resina Sephadex G-75. Após a obtenção de uma fração
enriquecida de scFv, confirmou-se a capacidade de inibição da atividade enzimática por estes
anticorpos. Resolveu-se, então, verificar a influência desta atividade em atividades
farmacológicas causadas pelo veneno. Para isso, foram realizados ensaios de neutralização
das atividades miotóxica, de indução de edema, anticoagulante e, por fim, da letalidade. Os
ensaios de neutralização foram feitos com a subunidade CB da crotoxina, principal
componente tóxico do veneno de Crotalus durissus terrificus, sendo responsável por 90% de
sua toxicidade. Apenas no ensaio de letalidade testamos a atividade dos clones produtores de
scFv contra crotoxina e veneno bruto. Os clones selecionados foram capazes de inibir
parcialmente a atividade miotóxica e a indução de edema num período mais tardio, mas não
tiveram nenhum efeito na atividade anticoagulante de CB. Nos ensaios de letalidade da
crotoxina e do veneno bruto houve um aumento da sobrevida dos animais com os dois clones
selecionados, sendo este aumento mais efetivo para a toxina isolada.
10
ABSTRACT
Oliveira, J.G. Expression of human recombinant antibody fragments capable of
inhibiting the phospholipase activity and of affecting the pharmacological activities of
Crotalus durissus terrificus venom. 2006. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006.
Every year, approximately 20,000 cases of snakebite are reported to the Brazilian
Ministry of Health, with snakes in the genus Crotalus being responsible for 7% of these
accidents. Although lower in frequency than snakebites by Bothrops, these events are
important due to their high incidence in some particular regions of the country, as well as the
potential of resulting in serious clinical conditions or even in death. Still, for over a century,
the only specific treatment against Crotalus venom is the use of antivenoms derived from
equine serum. Although this therapy has proven effective in reducing the mortality and
morbidity, one of its main drawbacks is the risk of some patients developing sensitivity to
equine proteins. Therefore, alternative methods for production of these antivenoms, such as
the phage display technology, have been studied. This work aimed to produce monoclonal
antibodies capable of inhibiting the phospholipase activity of Crotalus durissus terrificus
venom, using the Griffin.1 scFv library produced in the Medical Research Council – MRC in
Cambridge, United Kingdom. The protocol used to select the phage-antibodies against the
crude venom was the immobilization of proteins on a solid surface. Four rounds of selection
were performed, and phages selected in each round were analyzed by ELISA in order to
identify the round yielding the highest specific antibody titer against the proteins. The fourth
round was chosen for production of monoclonal phage-antibodies in four 96-well culture
plates. ELISA demonstrated that most clones were able to recognize the venom, and one plate
11
was formed with the clones showing higher reactivity for hemolysis inhibition assays. Two of
these clones were selected and used to produce soluble antibody fragments; however, due to
the lack of markers to detect these antibodies, purification of the scFv was not possible and
partial purification by gel filtration in Sephadex G-75 resin was performed instead. After an
enriched fraction of scFv was obtained and the enzyme-inhibiting ability of these antibodies
was confirmed, their action was tested in pharmacological activities induced by the venom.
Essays were developed to evaluate the ability to neutralize myotoxic, edema-inducing, anti-
clotting, and lethal activities of the venom. The CB crotoxin subunit, the main component in
Crotalus durissus terrificus venom and responsible for 90% of its toxicity was used in the
neutralization essays. In the lethality essay only, we tested the activity of scFv-producing
clones against both crotoxin and crude venom. The selected clones were capable of partially
inhibiting the myotoxic and edema-induction activities, but had no effect on the anticoagulant
activity of CB. In the lethality essays, both crotoxin and crude venom resulted in an increase
in the survival rate of the animals with both clones selected, with crotoxin being more
effective.
12
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA1: “Bio-panning” utilizando biblioteca de “phagedisplay”........................................24
FIGURA 2: Sítio de hidrólise do fosfolipídeo pela fosfolipase A
2
..........................................27
FIGURA 3: Representações da estrutura tridimensional de uma PLA
2
...................................28
FIGURA 4: Esquema de seleção de fagos-anticorpos contra o veneno bruto de Crotalus
durissus terrificus......................................................................................................................36
FIGURA 5: Esquema de amplificação dos fagos-anticorpos eluídos selecionados contra o
veneno bruto..............................................................................................................................39
FIGURA 6: Resultado da seleção de fagos-anticorpos.............................................................52
FIGURA 7: ELISA policlonal de fagos-anticorpos..................................................................54
FIGURA 8: ELISA monoclonal de fagos-anticorpos...............................................................56
FIGURA 9: Padronização da curva de hemólise em ensaio cinético espectrofotômetro.........58
FIGURA 10: Ensaio cinético de inibição da hemólise indireta em leitor de ELISA usando
fagos-anticorpos monoclonais...................................................................................................59
FIGURA 11: Verificação da capacidade de reconhecimento das toxinas CTX e CB pelos dois
clones produtores de fagos-anticorpos selecionados.................................................................61
FIGURA 12: Perfil cromatográfico das amostras de scFv e perfil eletroforético das frações
obtidas ......................................................................................................................................63
FIGURA 13: Padronização de ensaio cinético de hemólise em leitor de ELISA com venenno
bruto e CB.................................................................................................................................65
13
FIGURA 14: Ensaio de inibição da atividade hemolítica indireta do veneno bruto de C.
durissus terrificus e de CB usando scFv dos dois clones selecionados....................................66
FIGURA 15: Ensaio de atividade anticoagulante de CB..........................................................68
FIGURA 16: Ensaio da atividade miotóxica de CB in vivo.....................................................70
FIGURA 17: Ensaio de indução de edema de CB in vivo........................................................72
FIGURA 18: Ensaio de letalidade causada por veneno bruto de C. durissus terrificus e
crotoxina....................................................................................................................................74
14
LISTA DE SIGLAS
CaCl
2
– cloreto de cálcio
CB – crotoxina B
Cdt – Crotalus durissus terrificus
CTX – crotoxina
D.O. – densidade óptica
HBV – “vírus da hepatite B”
HCV – “vírus da hepatite C”
HIV – vírus da imunodeficiência humana
HTLV I/II – vírus T-linfotrópicos humanos tipo I e II
IPTG – isopropil-β-D-tiogalactosídeo
MPBS – solução fosfato salina contendo leite em pó
MRC – “Medical Research Council”
NaCl – cloreto de sódio
OPD – orto-fenileno diamino
PBS – solução salina tamponada com fosfato
PBST – solução salina tamponada com fosfato contendo Tween
PEG/NaCl – solução de polietilenoglicol contendo cloreto de sódio
PLA
2
- Asp49 – fosfolipase A
2
com o resíduo aspartato na posição 49
scFv – “ single-chain Fv ” (fragmento de anticorpo recombinante contendo apenas a porção variável)
SDS-PAGE – sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
15
SUMÁRIO
Resumo ....................................................................................................................................8
Abstract ...................................................................................................................................10
Introdução................................................................................................................................18
Objetivos .................................................................................................................................30
Material e Métodos.................................................................................................................32
1.Veneno e toxinas....................................................................................................................33
2. Animais.................................................................................................................................33
3. Amostras de sangue de carneiro e plasma humano...............................................................34
4. Biblioteca de anticorpos........................................................................................................35
5. Seleção dos fagos-anticorpos contra veneno bruto...............................................................35
- 5.1 Seleção por imobilização da proteína em superfície sólida....................................35
- 5.2 . Amplificação dos fagos-anticorpos eluídos..........................................................37
6. Análise dos fagos-anticorpos selecionados por ELISA.......................................................39
7. Produção de fagos-anticorpos monoclonais contra o veneno bruto de Crotalus durissus
terrificus....................................................................................................................................40
8. Ensaio de inibição da hemólise indireta in vitro causada pelo veneno bruto de Crotalus
durissus terrificus usando fagos-anticorpos monoclonais........................................................42
9. ELISA monoclonal de fagos-anticorpos contra as toxinas CTX e sua porção fosfolipásica
CB.............................................................................................................................................43
10. Produção de fragmentos solúveis de anticorpos (scFv) usando os clones selecionados em
ensaio de inibição da hemólise indireta in vitro........................................................................44
11. Ensaio cinético de inibição da ação hemolítica indireta do veneno bruto e de CB usando
fração enriquecida de scFv dos clones selecionado..................................................................45
16
- 11.1. Determinação da curva de hemólise do veneno de Crotalus durissus terrificus e
de CB................................................................................................................................45
- 11.2.Ensaio de inibição da atividade hemolítica indireta in vitro...................................46
12. Ensaio da inibição da atividade anticoagulante de CB.......................................................46
13. Ensaio de inibição da atividade miotóxica de CB in vivo...................................................47
14. Ensaio de inibição de indução de edema causada por CB in vivo......................................48
15. Ensaio de inibição da letalidade causada por veneno bruto e CTX....................................48
16. Análise estatística................................................................................................................49
Resultados................................................................................................................................50
1. Seleção de fagos-anticorpos contra o veneno bruto de Crotalus durissus
terrificus....................................................................................................................................51
2. Análise dos fagos-anticorpos selecionados por ELISA........................................................53
3. Análise dos fagos-anticorpos monoclonais por ELISA........................................................55
4. Ensaio de inibição da atividade hemolítica indireta in vitro causada pelo veneno bruto de
Crotalus durissus terrificus.......................................................................................................57
5. ELISA monoclonal de fagos-anticorpos contra as toxinas CTX e sua subunidade
fosfolipásica CB
presentes no veneno de Crotalus durissus terrrificus...................................60
6. Obtenção de fração enriquecida com scFv a partir de sobrenadante de cultura...................62
7. Ensaio de inibição da hemólise indireta in vitro causada por veneno bruto e CB, usando
scFv ..........................................................................................................................................64
8. Ensaio de inibição da atividade anticoagulante causada por CB..........................................67
9. Ensaio da inibição da atividade miotóxica in vivo causada por CB......................................69
10. Ensaio da inibição da indução de edema por CB in vivo....................................................71
17
11. Ensaio de inibição da letalidade causada por veneno e CTX..............................................73
Discussão..................................................................................................................................75
Conclusões................................................................................................................................91
Referências Bibliográficas .....................................................................................................93
Apêndice.................................................................................................................................108
18
19
As serpentes brasileiras de importância médica se dividem em quatro gêneros:
Bothrops, Crotalus, Lachesis e Micrurus, compreendendo cerca de 60 espécies, responsáveis
por cerca de 20.000 acidentes notificados anualmente ao Ministério da Saúde e um índice de
letalidade em torno de 0,43%. Cerca de 75% dos casos notificados são atribuídos às serpentes
do gênero Bothrops, 7% ao gênero Crotalus, 1,5% ao gênero Lachesis, 3% devido às
serpentes não peçonhentas e 0,5% por Micrurus (MS/ FUNASA, 2001).
No entanto, estes índices variam de acordo com a região. As regiões centro e nordeste
do Estado de São Paulo têm mantido nos últimos anos, índices de acidentes crotálicos ao
redor de 20% do total de acidentes ofídicos, conforme levantamento do Centro de Controle de
Intoxicações (CCI) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
(HC-FMRP/USP) e do Serviço de Moléstias Infecciosas e Parasitárias da Faculdade de
Medicina de Botucatu- UNESP (MANCIN, 2001).
As serpentes do gênero Crotalus, popularmente conhecidas como cascavéis,
encontram-se amplamente distribuídas no Brasil em seis subespécies:
1- Crotalus durissus terrificus, encontrada nas zonas altas e secas do
Brasil, desde o Rio Grande do Sul até Minas Gerais;
2- Crotalus durissus collineatus, distribuída nas regiões secas da região
Centro-Oeste do Brasil, desde Mato-Grosso, Mato Grosso do Sul, Goiás, Minas
Gerais até o Norte do Estado de São Paulo;
3- Crotalus durissus cascavella, encontrada nas áreas da caatinga do
Nordeste do Brasil, desde o Maranhão até o Norte do Estado de Minas Gerais;
4- Crotalus durissus ruruima, distribuída em algumas regiões de Roraima,
Amapá, Pará, Amazonas e Rondônia;
5- Crotalus durissus marajoensis, encontrada na ilha de Marajó;
6- Crotalus durissus trigonicus, encontrada em Roraima.
20
De modo geral, essas serpentes são freqüentes nas regiões secas e pedregosas do
Brasil. São geralmente menos agressivas que as serpentes do gênero Bothrops e apresentam
na porção terminal da cauda o guizo ou chocalho, uma característica peculiar desse gênero de
serpentes, que facilita sua identificação (MANCIN, 2001).
A freqüência de acidentes com a cascavel sul-americana, Crotalus durissus terrificus,
é inferior à de acidentes com serpentes do gênero Bothrops. Porém estes acidentes são
importantes não apenas pela alta incidência em certas regiões, mas por possuírem um
potencial de produzir quadros clínicos graves e até mesmo fatais, alcançando um índice de
mortalidade de 72% nos casos não tratados com soro anticrotálico e 11% nos casos tratados
(ROSENFELD, 1971).
Os venenos de serpentes são compostos por aproximadamente 25% de sólidos totais,
dos quais 70 a 90% são constituídos por proteínas, compreendendo grande variedade de
enzimas e toxinas não enzimáticas. As frações não protéicas são representadas por
carboidratos, aminas biogênicas, lipídios e compostos de baixa massa molecular como
nucleosídeos e constituintes inorgânicos (FRANÇA; FAN, 1992).
Até o início da década de 80, acreditava-se que o veneno da cascavel sul-americana
possuía como principais componentes toxinas com atividade hemólitica e neurotóxica. Sua
patologia mais grave, a necrose tubular aguda, era atribuída a um efeito hemolítico do veneno,
podendo estar associado a um efeito neurotóxico (ROSENFELD, 1971). Hoje são atribuídas
ao veneno de Crotalus durissus terrificus atividades: nefrotóxica, hepatotóxica , neurotóxica,
hematotóxica e miotóxica (AMORIM; MELLO, 1952; BANCHER et al, 1973; AMARAL et
al, 1980; AZEVEDO-MARQUES et al., 1982). Amorim e Mello (1952), os primeiros a
estudar as alterações renais nos acidentes crotálicos, evidenciaram a ação indireta da
mioglobinúria, decorrente de uma rabdomiólise, sobre as células renais. Entre os mecanismos
propostos hoje para explicar a necrose tubular aguda, que é a principal causa de morte por
21
envenenamento crotálico, encontram-se a obstrução tubular por cristais de mioglobina e a
lesão tóxica direta dos túbulos por este pigmento. Alguns outros fatores podem também
evidenciar a lesão renal, como desidratação, hipotensão arterial, acidose metabólica e choque
(MANCIN, 1997).
O fracionamento do veneno de Crotalus durissus terrificus em coluna de Sephadex
revelou as seguintes frações enzimáticas: 5-nucleotidases, fosfodiesterases, enzima tipo
trombina, L-aminoacidoxidases, enzimas tipo calicreína tecidual e hidrolase do NAD+
(ROSENFELD, 1971; ROSA et al., 1973; LAURE, 1975a,b; BERCOVICI et al, 1987). As
toxinas isoladas foram as seguintes: crotoxina (SLOTTA; FRAENKEL-CONRAT, 1938-
1939), crotamina (GONÇALVES; VIEIRA, 1950), giroxina (BARRIO, 1961) e convulxina
(PRADO-FRANCESCHI, 1970).
A fração do veneno mais conhecida do ponto de vista fisiopatológico é a crotoxina.
Esta representa aproximadamente 50% do peso do veneno; é o principal componente
tóxico do mesmo (FAURE; BON, 1987) e também a principal neurotoxina, atuando na
pré-sinapse, inibindo a liberação de acetilcolina (FAURE; BON, 1987; OWNBY, 1998),
mas também pós-sináptica (BON et al, 1979). Esta toxina é constituída por duas
subunidades, uma proteína básica, a fosfolipase A
2
(PLA
2
ou CB), tóxica e
enzimaticamente ativa, e uma proteína ácida chamada crotapotina (CA), não tóxica. As
duas subunidades da crotoxina agem de forma sinérgica. Apesar de não ser tóxica, a CA
aumenta a letalidade da CB em mais de 10 vezes quando as duas subunidades são injetadas
conjuntamente em camundongos. Estudos realizados, visando elucidar o mecanismo de
potencialização do efeito pré-sináptico da CB pela CA em diafragma de camundongo
demonstraram que esta aumenta a estabilidade da CB, reduzindo a sua ligação não
específica e sua destruição por componentes presentes nas células da musculatura
esquelética, funcionando assim, como uma chaperona (MANCIN, 2001). Diversas
22
variantes moleculares desses dois componentes (isoformas ou isotoxinas) podem estar
presentes no veneno de um mesmo indivíduo, sugerindo que eles derivam da expressão de
diversos isogenes da mesma serpente (FAURE; BON, 1987). Essa variação na composição
do veneno pode estar associada com diferentes manifestações clínicas nas vítimas
envenenadas (RANGEL-SANTOS et al, 2004)
A crotamina é um polipeptídeo básico que, diferentemente da crotoxina, está
presente apenas no veneno de cascavéis de certas regiões (BARRIO; VITAL BRAZIL,
1951). Esta miotoxina é considerada 18 vezes menos tóxica que a crotoxina (CHANG;
TSENG, 1978). A giroxina e convulxina são neurotoxinas responsáveis por convulsões,
distúrbios respiratórios e circulatórios característicos na fase inicial do envenenamento
(BARRIO, 1961).
Há mais de um século, a única terapia específica para envenenamento são os
antivenenos constituídos de soro eqüino puro (CHIPPAUX; GOYFFON, 1998), que
consistem de uma solução rica em anticorpos, concentrada e ampolada, obtida a partir do
plasma tratado com pepsina, seguido de purificação por precipitação com sulfato de amônio
(Manual de Vigilância Epidemiológica, IMESP, 1993). Estes anticorpos são obtidos a partir
de inóculo, em cavalos, de amostras contra as quais se deseja uma resposta imune. O cavalo,
pelo seu grande porte, permite a coleta de grandes volumes de plasma, ricos em anticorpos
antiveneno (SCHVARTSMAN, 1992). Contudo, estes animais apresentam decaimento de sua
resistência orgânica que pode resultar em óbito (10% dos animais utilizados na produção de
soro morrem durante o processo de imunização) devido à alta toxicidade do veneno e também
pela utilização de adjuvantes (RIBEIRO et al., 1993). Considerando-se que o rebanho eqüino
destinado para esta finalidade é escasso, e que a sua manutenção é onerosa, qualquer perda é
econômica e clinicamente significativa.
23
Devido então a esta alta toxicidade, o veneno deve sofrer uma preparação prévia para a
produção de soros hiperimunes, processo denominado detoxificação que é utilizado para
manter a imunogenicidade. O mais utilizado é a formação de complexos com aldeídos tais
como formalina ou glutaraldeído. A ótima dose de imunização para obter um título de
anticorpos geralmente é obtida por tentativa e erro. Dez a quinze injeções aplicadas em um
período de 3 a 15 meses podem ser necessárias para obter a hiperimunização, quando então o
sangue do animal é coletado (CHIPPAUX ; GOYFFON, 1998).
Além dessas dificuldades, um dos maiores problemas no uso de soros hiperimunes
de eqüinos como antivenenos, é que alguns indivíduos podem ficar sensibilizados às
proteínas de eqüinos. Portanto, têm-se buscado alternativas para a produção destes
antivenenos, utilizando-se anticorpos oriundos de outros animais como carneiros, bovinos,
coelhos ou mesmo o uso de IgY de galinha (LALLO; THEAKSTON, 2003). No entanto,
os anticorpos produzidos a partir de outros animais não mostraram ser menos
imunogênicos do que aqueles provenientes de cavalos (RIVIÉRE et al., 1997).
Uma alternativa terapêutica seria o uso de anticorpos monoclonais contra toxinas
específicas dos venenos. A tecnologia do hibridoma introduzida em 1975 por Kohler e
Milstein, onde os anticorpos monoclonais (Mabs) são produzidos pela fusão de células do
baço de um animal imunizado, geralmente camundongo ou rato, com células de mieloma para
obter o hibridoma, tornou-se uma opção. Mas a aplicação clínica destes anticorpos tornou-se
prejudicada por fatores como a habilidade variável destes anticorpos em interagir com
receptores para a sua porção Fc, a meia vida diminuída destes anticorpos, alto custo de
preparo e, principalmente, o desenvolvimento de anticorpos humanos contra os monoclonais
(BREEDVELD, 2000).
24
Com o advento da biologia molecular e o crescente conhecimento da estrutura gênica
dos anticorpos, de sua regulação e expressão in vivo, tornou-se possível a produção de
anticorpos humanos in vitro (WINTER; MILSTEIN, 1991).
Better et al. (1988) e Skerra & Plückthun (1988) descobriram que fragmentos de
anticorpos (Fab ou "single-chain" Fv) eram funcionalmente expressos em Escherichia coli
quando eram secretados dentro do periplasma da bactéria, a qual simulava o ambiente
naturalmente oxidante do retículo endoplasmático. Aplicando-se a técnica de PCR, bibliotecas
de anticorpos puderam ser expressas em E. coli (HOOGENBOOM; CHAMES, 2000).
McCafferty et al. (1990) mostrou que fragmentos de anticorpos poderiam ser dispostos
na superfície de fagos filamentosos pela fusão de genes variáveis de anticorpos a uma das
proteínas que cobrem o fago. Desta forma, a informação genética da proteína (fragmento de
anticorpo) estaria contida dentro do DNA do fago após sua replicação na bactéria e assim, o
fago e a proteína expressa estariam fisicamente conectados (PLÜCKTHUN, 1998).
A habilidade de expressar anticorpos em bactérias é ideal para criar e analisar grande
número de diferentes anticorpos devido a fácil manipulação genética, eficiente transformação,
rápido crescimento, simples fermentação e favorável economia (MARKUS, 1995).
Bibliotecas de anticorpos podem ser feitas de linfócitos B de indivíduos não imunizados ou de
indivíduos imunizados por determinados antígenos (PERSSON et al., 1991), expostos aos
agentes infecciosos, com doenças auto-imunes (GRAUS et al., 1997) ou com câncer (CAI;
GAREN, 1995).
Atualmente, a técnica de “Phage display” tem sido a mais amplamente usada, pois
permite a seleção in vitro de anticorpos com a especificidade de interesse no meio de um
amplo repertório (MAYNARD; GEORGIOU, 2000). Com esta técnica, pode-se mimetizar a
estratégia usada pelo sistema imune humoral para produzir anticorpos completamente
humanos ou fragmentos de anticorpos (scFv) in vivo podendo-se dispensar o processo de
25
imunização ou a construção de hibridomas. Os genes de imunoglobulinas podem ser de
doadores imunizados (animal ou humano) ou “naive” (não imunizado) (ROQUE; LOWE;
TAIPA, 2004).
A seleção dos anticorpos ou de fragmentos de anticorpos é feita por um processo
denominado “bio-panning” (Figura 1), onde os fagos-anticorpos são selecionados após
incubação da biblioteca de fagos-anticorpos com o antígeno de interesse imobilizado
(CLACKSON et al., 1991). Removem-se então os fagos-anticorpos não ligados por um
processo de lavagem, sendo que os fagos com especificidade para o antígeno são eluídos e
posteriormente amplificados através da infecção em Escherichia coli. Neste passo de
amplificação é utilizado um fago auxiliador M13 que fornece todas as proteínas estruturais
requeridas para a geração de um fago- anticorpo completo. Isto porque o vetor fagomídeo dos
fagos-anticorpos possui apenas as origens de replicação do fago e do plasmídeo, gene da
proteína III, sítios de clonagem apropriados e um gene de resistência a antibióticos.
Entretanto, eles perdem todos os outros produtos gênicos estruturais e não estruturais
requeridos para a geração de um fago completo. Assim, fagomídeos podem crescer como
plasmídeos ou alternativamente serem empacotados como fagos recombinantes M13, com a
ajuda dos fagos auxiliadores, que contêm um pequeno defeito em sua origem de replicação, e
por isso não são montados, fornecendo apenas as proteínas para o encapsulamento dos fagos-
anticorpos de interesse (AZZAZY; HIGHSMITH, 2002).
26
Figura 1: “Bio-panning” utilizando biblioteca de fagos-anticorpos (modificado de Hans
de Haard, 1998).
Sendo assim, a partir de uma biblioteca sintética de fragmentos de anticorpos
humanos (scFv) podem-se selecionar anticorpos contra veneno sem a necessidade de um
pré-tratamento, tornando-se uma alternativa viável para substituição da soroterapia
existente atualmente, eliminando o uso de animais para a imunização e os inconvenientes
do uso de soros heterólogos. É possível assim, produzir anticorpos polivalentes ou
monovalentes contra os principais venenos ofídicos ou de outros animais peçonhentos de
interesse.
Além de todas essas vantagens, a tecnologia de “phage display” permite que
direcionem a produção dos anticorpos monoclonais humanos visando à inibição de atividades
enzimáticas ou farmacológicas específicas dos venenos de serpentes. Dentre os principais
efeitos tóxicos ocasionados pelos venenos, há aqueles decorrentes direta ou indiretamente da
27
atividade fosfolipásica. As fosfolipases A
2
(PLA
2
) estão presentes de forma abundante nos
venenos de serpentes, e são enzimas que catalisam a hidrólise da ligação 2-acil éster de 3-sn-
fosfolipídeos, liberando como produtos da reação ácidos graxos livres e lisofosfolipídios
(Figura 2) (VAN DEENEN; DE HAAS, 1963; GLASER et al.,1993). Essas enzimas são
amplamente distribuídas na natureza, sendo encontradas tanto no interior como no exterior
das células (VAN DEN BOSH, 1980). As PLA
2
extracelulares são abundantes em tecidos
pancreáticos e nos venenos de serpentes e de artrópodes. Elas foram divididas em diferentes
grupos com base no peso molecular, seqüência primária e na localização das pontes de
dissulfeto (RENETSEDER et al.,1985; DENNIS, 1994). Todas as PLA
2
de serpentes são
reunidas nos grupos I (serpentes elapídicas ou hidrofídicas) ou II (serpentes viperídicas)
(DENNIS, 1994), possuindo no sítio ativo os resíduos His48, Asp49, Tyr52 e Asp99 em
posições altamente conservadas. No entanto, a diferença entre as PLA
2
s destes dois grupos se
baseia na presença de uma ponte de dissulfeto invariável entre os resíduos de meia cistina 11
e 77 no grupo I, que está ausente no grupo II (ARNI; WARD, 1996).
Figura 2: Produtos da hidrólise do fosfolipídeo pelas fosfolipases A
2
, que catalisam
especificamente a ligação éster sn2 e liberam ácido graxo e lisofosfolipídeo.
28
Podemos destacar como importante fosfolipase A
2
no veneno de Crotalus durissus
terrificus, a porção CB do complexo enzimático crotoxina. Essa porção possui um peso
molecular compreendido entre 14.500 e 16.500, com um ponto isoelétrico (pI) de 8,6
(RÜBSAMEN et al., 1971). Ela consiste de uma única cadeia polipeptídica de 133
resíduos (FRAENKEL-CONRAT et al., 1980), que possui no seu sítio ativo um resíduo de
aspartato na posição 49 que é essencial para a ligação de íons cálcio, necessários para a
estabilização de uma conformação catalítica (VERHEIJ et al., 1980). A integridade do
resíduo His48 é um requerimento adicional juntamente com três oxigênios carbonil da
cadeia principal dos resíduos Tyr28, Gly 30 e Gly32 também envolvidos na ligação do íon
cálcio (THUNNINSEN et al., 1990), que funciona como um cofator no mecanismo de
hidrólise (VERHEIJ et al., 1981; SCOTT et al., 1990), e na sua ausência as PLA
2
s são
inativas (Figura 3).
Figura 3: Representação estrutural da PLA
2
-Asp49 de Bothrops jararacussu
(SIIISPIIB). Os aminoácidos considerados importantes para a catálise e ligação dos íons
cálcio (D49, H48, Y52 e D99) estão incluídos. A esfera representa um íon Ca
2+
(modificado de Ketelhut et al, 2003).
29
Independentemente de sua função catalítica primária, as fosfolipases A
2
de venenos
de serpentes podem induzir diversos efeitos farmacológicos adicionais como
neurotoxicidade pré ou pós sináptica, cardiotoxicidade, miotoxicidade, indução ou inibição
de agregação plaquetária, edema, hemólise, anticoagulação, convulsão, hipotensão, efeito
bactericida e anti-HIV (BON et al., 1879; FLETCHER et al., 1980; HUANG, 1984;
ALAVARADO; GUTIÉRREZ, 1988; MANCUSO et al., 1995; LORET; MORENO, 1993;
YUANG et al., 1993; PÁRAMO et al., 1998; OWNBY, 1998; FERNAND et al., 1999).
Sendo assim, as fosfolipases A
2
são enzimas de grande interesse médico-científico,
tanto pelo seu envolvimento em uma grande variedade de doenças inflamatórias, como pelo
seu papel nos envenenamentos ofídicos. Diante disso, a inibição da atividade fosfolipásica de
diferentes toxinas do veneno pode representar uma importante redução em seus efeitos
tóxicos, fazendo com que este componente dos venenos de serpentes seja um importante
candidato para a produção de anticorpos monoclonais específicos. Além da produção destes
anticorpos visarem uma soroterapia para envenenamentos, podem também ser usados como
ferramenta de estudo da relação desta atividade catalítica com outras atividades
farmacológicas induzidas por essas toxinas.
30
31
Os objetivos deste trabalho foram:
1. Selecionar fagos-anticorpos de uma biblioteca de fragmentos de
anticorpos humanos recombinantes capazes de neutralizar a
atividade fosfolipásica do veneno de Crotalus durissus
terrificus;
2. Produzir fragmentos solúveis de anticorpos monoclonais humanos
dos clones selecionados pela capacidade de inibição da
atividade fosfolipásica do veneno bruto de Crotalus durissus
terrificus e de sua principal toxina;
3. Verificar se os anticorpos selecionados quanto à capacidade de
inibir a atividade fosfolipásica do veneno influenciam nas
atividades farmacológicas de anticoagulação, miotoxicidade e
formação de edema induzidas por CB e na letalidade induzida
pelo veneno bruto de Crotalus durissus terrificus e crotoxina.
32
33
1. Veneno e toxinas
Para a seleção dos fagos-anticorpos, foi utilizado veneno bruto de Crotalus durissus
terrificus (Cdt), gentilmente cedido pelo Prof. Dr. José Roberto Giglio, do Departamento de
Bioquímica e Imunologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de
São Paulo. Foram recebidos 50 mg de veneno bruto liofilizado. Esta amostra foi diluída em
10mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e dividida em 10 alíquotas de 1 mL na
concentração final de 5 mg/mL, em tubos tipo Eppendorf. O conteúdo de um dos tubos foi
então dividido em alíquotas menores de 50 µL cada, armazenadas em 20 tubos tipo
Eppendorf.
Para os ensaios da atividade enzimática e das atividades farmacológicas foram
utilizados, além do veneno bruto, a crotoxina e a sua fração CB (fosfolipase A
2
- PLA
2
), que
foram recebidas já purificadas e liofilizadas, cedidas pelo Prof. Dr. Andreimar Martins Soares
da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. A
quantidade recebida de cada uma dessas enzimas foi de 1mg de proteína. As amostras foram
diluídas em 1mL de PBS e divididas em 20 alíquotas de 50 µL, numa concentração final de 1
mg/mL.
Todas as amostras foram identificadas e congeladas à temperatura de – 20ºC.
2. Animais
Nos ensaios in vivo de inibição das atividades de miotoxicidade, de indução de edema
e de letalidade foram utilizados camundongos da linhagem Swiss, machos e com peso
variando entre 18-22g, cedidos pelo Biotério Central da Faculdade de Medicina de Ribeirão
34
Preto. O protocolo n° 129/2005 de experimentação animal do referente trabalho foi aprovado
pela Comissão de Ética e Experimentação Animal (CETEA).
3. Amostras de sangue de carneiro e plasma humano
A atividade hemolítica indireta do veneno bruto de Cdt e de sua fração CB foi medida
em ensaio com hemácias de carneiro. Para isso foram colhidos cerca de 10 mL de sangue de
carneiro do Biotério Central da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto utilizando heparina
como anticoagulante. O sangue colhido foi centrifugado por 10 minutos a 300xg, à 4°C.
Foram então retirados o plasma e a camada de leucócitos, deixando somente as hemácias. As
hemácias foram lavadas duas a três vezes com tampão Tris-NaCl-CaCl
2
(10mM de Tris,
140mM de NaCl, 2,5mM de CaCl
2
) pH 7,4 e estocadas neste mesmo tampão contendo 1mM
de azida sódica, de forma a se obter uma suspensão estoque de hemácias a 10%, mantida a
4°C.
No ensaio farmacológico de anticoagulação foram utilizadas amostras de plasma
humano cedidas pelo Hemocentro de Ribeirão Preto, vinculado ao Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Cinco bolsas de
diferentes doadores, contendo aproximadamente 200 mL de plasma fresco, com sorologia
negativa para Doença de Chagas, HIV, HCV, HTLV I/II, HBC, HbsAg e sífilis foram
homogeneizadas e aliqüotadas em tubos com 5 mL cada e imediatamente congeladas a -20°C.
4. Biblioteca “Griffin. 1”.
Foi utilizada neste trabalho a biblioteca genômica de bacteriófagos denominada
“Griffin. 1” (H. Griffin, MRC, Cambridge, Reino Unido, dados não publicados), que
juntamente com os estoques iniciais de E.coli TG1, E.coli HB2151 e fago auxiliar
35
VCSM13, foram gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Sir Greg Winter do “Medical Research
Council - Centre for Protein Engineering”, Cambridge, Reino Unido.
Esta biblioteca foi reconstituída pela reclonagem sintética das regiões variáveis
das cadeias leve (V
L
) e pesada (V
H
) de vetores da biblioteca lox (GRIFFITHS et al., 1994)
dentro do vetor de fagomídeo pHEN2 e contém repertório de aproximadamente 1x10
10
clones. A biblioteca produz fragmentos de anticorpos humanos do tipo scFv, que são
clonados em fusão com a proteína g3p (pIII) do bacteriófago M13.
5. Seleção de fagos-anticorpos
5.1. Seleção por imobilização de proteínas em superfície sólida
A seleção de fagos-anticorpos foi feita pelo método de imobilização em superfície
sólida das proteínas do veneno bruto de Crotalus durissus terrificus (um esquema do processo
de seleção está representado na Figura 4). Para isso um imunotubo de poliestireno (Nunc,
Kamstrup, Dinamarca) foi sensibilizado com 250 µg do veneno bruto diluído em 4 mL de
tampão carbonato-bicarbonato 0,05 M pH 9,6, durante uma noite a 4ºC. No dia seguinte, a
solução contida no imunotubo foi aproveitada para revestir uma placa de 96 poços (Costar,
Corning Inc.), sendo distribuídos 100 µL desta solução de veneno em cada poço, para
posterior uso em ensaios imunoenzimáticos. A placa foi vedada e mantida a 4°C, em
geladeira. O imunotubo foi então lavado três vezes com PBS e em seguida adicionada uma
solução de bloqueio composta de PBS e leite em pó 2% (MPBS 2%), para preencher os
eventuais sítios livres na sua superfície. Depois de selado com parafilme, incubou-se o
imunotubo a 37ºC por 2 horas. Após esse tempo, repetiu-se o processo de lavagem com PBS e
36
então foi feita a adição de 1 mL da biblioteca de fagos-anticorpos diluída em 3 mL de MPBS
2%. O imunotubo, devidamente vedado com parafilme e acondicionado em tubo Falcon de
50 mL para evitar que algum vazamento levasse a perda de material, foi colocado em rotação
à temperatura ambiente por 30 minutos e, em seguida, permaneceu por mais 90 minutos em
repouso. Após a incubação, o conteúdo do imunotubo foi desprezado e este lavado para
eliminar os fagos-anticorpos não ligantes. Para o primeiro turno de seleção, o tubo foi lavado
dez vezes com PBS contendo 0,05% de Tween 20 (PBST) e mais dez vezes com PBS para
remover o detergente. Para o segundo e subseqüentes turnos de seleção, os tubos foram
lavados vinte vezes com PBST e mais vinte vezes com PBS. Após a lavagem, os fagos-
anticorpos ligados foram eluídos com 1 mL de solução de trietilamina 100 mM (70 µL de
trietilamina – Sigma Chemical Co. - em 5 mL de água milli-Q) que foi colocada no
imunotubo por dez minutos, sendo este mantido em rotação lenta e à temperatura ambiente. O
conteúdo do imunotubo foi transferido rapidamente para um tubo tipo Eppendorf contendo
500 µL de Tris 1M, pH 7,4 para neutralização da trietilamina.
Figura 4: Esquema da seleção dos fagos-anticorpos contra veneno bruto.
Imunotubo
62,5 µg/mL
em tampão
carbonato-
bicarbonato
pH 9.6
1
noite
4
o
C
3 lavagens
PBS
Bloqueio
MPBS 2%
37
o
C
2h
3 lavagens
PBS
1 mL biblioteca
(1x10
10
)
3 mL MPBS 2%
Rotação por 30 minutos
Repouso por 90 minutos
- 10 lavagens
PBS/Tween 0,5%
-
10 lavagens PBS
1 mL
trietilamina
100 mM
10 minutos
rotor
500
µ
L
Tris 1M
pH 7.4
750
µ
L fagos eluídos
estoque
-
20
o
C
750
µ
L fagos eluídos
9,25 mL TG1
D.O.
600
0,4
banho-maria
37
o
C, 30 min
Titulação
Centrifuga e
plaqueia para
amplificação
Seleção de fagos
-
anticorpos
37
5.2. Amplificação dos fagos-anticorpos eluídos
Para a amplificação dos fagos-anticorpos eluídos nos turnos de seleção foi feita
infecção em cultura de bactérias (um esquema está representado na Figura 5). A cepa utilizada
nesta fase foi a E. coIi TG1 (GIBSON, 1984), linhagem supressora [K12, D(lac-pro), supE,
thi, hsdD/F'traD36, proA+B+, Iaclq, lacZDMlS]).
Paralelamente aos períodos de incubação para a seleção dos fagos-anticorpos foi
preparada uma cultura de bactérias TG1, conforme os seguintes passos:
No primeiro dia, uma alíquota de TG1 do estoque, que foi mantida em glicerol a -80ºC,
foi inoculada em 5 mL de meio LB Broth Base (Gibco BRL, Nova York, EUA) e incubada
por uma noite a 37ºC, sob agitação constante de 300 rpm. No dia seguinte, 500 µL do inóculo
de TG1 foram diluídos em 50 mL de meio LB e incubados a 37ºC sob agitação constante de
300 rpm, até que a densidade óptica em comprimento de onda a 600 nm (DO
600
) fosse 0,4, o
que levou aproximadamente cerca de duas horas de agitação. Ao atingir essa absorbância
foram transferidos 9,25 mL dessa cultura de TG1 em crescimento exponencial para um tubo
Falcon® de 50 mL e adicionados 0,75 mL da solução de fagos eluídos do primeiro turno de
seleção. Essa mistura ficou em banho-maria 37ºC por 30 minutos, para permitir a infecção das
bactérias. Foram então plaqueados em placas de Petri contendo meio LB-ágar, suplementado
com 100 µg/mL de ampicilina e 1% de glicose, 50 µL de quatro diluições seriadas de 1:100,
sendo as placas armazenadas de forma invertida por uma noite a 37 ºC. O restante da cultura
de TG1 infectada foi centrifugada a 3000 rpm por 10 minutos e o precipitado ressuspendido
em 1 mL de meio LB. Esse conteúdo foi então distribuído em uma placa de cultura quadrada
de 500 cm
2
(Nunc Bio-Assay dish, Gibco-BRL) contendo meio LB-ágar, suplementado com
100 µg/mL de ampicilina e 1% de glicose, e incubado, também de forma invertida, a 30ºC
durante uma noite.
38
O próximo passo foi determinar o título dos fagos-anticorpos obtidos neste primeiro
turno de seleção. Para isso, foi feita a contagem das colônias presentes nas placas de Petri e os
números obtidos foram aplicados na seguinte fórmula {[(número de colônias X fator de
diluição)/volume aplicado na placa] x 1000}. Após registrar o número de colônias presentes
nas placas de Petri foram adicionados 5 mL de meio LB contendo 20% de glicerol para
raspagem das colônias com o auxílio de uma haste preparada com uma pipeta Pasteur de
vidro, recurvada para um ângulo de 90º. A suspensão de células obtida foi estocada a -80ºC.
Uma alíquota desta E.coli TG1 infectada foi então inoculada em 50 mL de meio LB, contendo
100 µg/mL de ampicilina e 1% de glicose, em frasco tipo Erlenmeyer descartável (Corning
Inc., Nova York, EUA) de 250 mL. O volume da alíquota utilizada foi determinado com base
na necessidade de a DO
600
inicial do meio ser menor que 0,1. Essa cultura foi então incubada
a 37ºC sob agitação constante de 300 rpm até a DO
600
atingir 0,5. Neste momento, 10 mL
dessa cultura foram transferidos para um tubo Falcon® (Corning Inc, Nova York, EUA) de 50
mL e infectados com fagos auxiliadores VCSM13 na proporção de 1:20 (número de bactérias
: partículas de fagos, levando-se em conta que 1 DO
600
de bactéria corresponde a cerca de
8x10
8
bactérias/mL). A cultura ficou em banho-maria a 37ºC por 30 minutos, para permitir a
infecção. Após este período, a cultura foi centrifugada a 3000 xg por 30 minutos. O
sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspendido em 50 mL de meio LB, contendo
100 µg/mL de ampicilina e 25 µg/mL de canamicina, sendo em seguida transferido para um
frasco do tipo Erlenmeyer de 250 mL. Essa nova cultura foi incubada por uma noite a 30ºC
sob agitação constante de 300 rpm.
No dia seguinte, separou-se 40 mL dessa cultura que foram centrifugados a 3000 xg
por 30 minutos, a 4ºC. O sobrenadante foi transferido para um tubo Falcon® de 50 mL e a ele
adicionados 8 mL (1/5 do volume) de uma solução de PEG/NaCl (20% de polietilenoglicol
6000 em solução 2,5 M de NaCl). A mistura foi fortemente agitada e deixada por duas horas
39
ou mais em gelo e, após este tempo, centrifugada a 3000 xg por uma hora, a 4ºC. O
sobrenadante foi desprezado e o precipitado ressuspendido em 2 mL de PBS e novamente
centrifugado em microcentrífuga a 11.600 xg por 5 minutos, para remover o restante dos
“debris” celulares. Obtivemos nesta fase, os fagos-precipitados do primeiro turno de seleção,
sendo que metade do volume destes fagos (1 mL) foram utilizados em um segundo turno de
seleção usando imunotubo sensibilizado com a mesma concentração de veneno bruto. Assim,
repetiram-se todos os passos de seleção e amplificação descritos acima, contabilizando um
total de quatro turnos.
Figura 5: Esquema da amplificação dos fagos-anticorpos selecionados
6. Análise dos fagos-anticorpos selecionados
Os fagos-anticorpos produzidos em cada turno de seleção foram analisados por ELISA
para identificar em qual destes turnos estariam presentes os anticorpos mais relevantes, ou
seja, aqueles fagos-anticorpos capazes de reconhecer o(s) antígeno(s) estudado(s) e, por isso,
Amplificação dos fagos
-
anticorpos selecionados
Raspagem da placa
5 mL LB + g
licerol
Estoque TG1 infectada com fagos eluídos
50 mL LB
Ampicilina
glicose
300 RPM
37
o
C
D.O.
600 nm
0,4
Alíquota p/ DO
600
<0,1
1 DO
600
= 8X10
8
bactérias/mL
Banho-maria
37
o
C
30 minutos
- Centrifuga
- Ressuspende precipitado
em 50 mL LB + 100 µg/mL
ampicilina + 25µg/mL
canamicina
Cultivo por 16H
300 RPM
30
o
C
40 mL da cultura
precipitação por PEG/NaCl
Precipitado ressuspendido
com 2 mL de PBS
1 mL estoque
-
20
o
C
1 mL usado em novo turno de seleção
Alíquota de 10 mL
+
VCSM13 1:20
40
denominamos este passo de ELISA policlonal.
Para tal experimento foi utilizada a placa de ELISA já sensibilizada com o conteúdo
dos imunotubos (100 µL de suspensão de veneno/poço) dos quatro turnos de seleção e
guardada a 4°C. Para controle positivo, dois poços foram sensibilizados com VCSM13 na
concentração de 10
8
u.f.p./poço. O conteúdo dos poços foi descartado e a placa foi lavada três
vezes com PBS (200 µL/poço de PBS para cada lavagem). Os poços foram bloqueados com
200 µL de MPBS 2%, por 2 horas, a 37
o
C. A placa foi novamente lavada três vezes com PBS
e incubada com 50 µL dos fagos-anticorpos eluídos e 10 µL de fagos-anticorpos precipitados
de cada turno de seleção, diluídos em MPBS 2%. O ensaio foi feito em duplicata e como
controle negativo, dois poços sensibilizados com o antígeno foram incubados com 10
8
u.f.p
1
./poço de fago auxiliar VCSM13 em MPBS 2%. Os fagos-anticorpos foram incubados
por 60 minutos, à temperatura ambiente. A placa foi lavada três vezes com PBST e três vezes
com PBS. Após a lavagem, 100 µL de anticorpos policlonais de coelho anti-VCSM13
marcados com peroxidase (SOARES, 2005) diluídos 1:1000 em MPBS 2%, foram
adicionados a cada poço. Após 60 minutos de incubação a temperatura ambiente, as placas
foram novamente lavadas e adicionou-se a cada poço 100 µL de substrato OPD-H
2
O
2
[2 mg
de OPD (Acros Organics, Fisher Scientific International, Inc., Hampton, EUA) em 10 mL de
PBS e 30 µL de H
2
O
2
30
volumes]. Aguardou-se o desenvolvimento da cor por 15 minutos
com a placa protegida da luz, sendo a reação interrompida com a adição de 50 µL de ácido
sulfúrico 1M. A leitura foi feita em leitor de ELISA (Molecular Devices, Sunnyvale, EUA)
em comprimento de onda de 490 nm.
7. Produção de fagos-anticorpos monoclonais
Utilizando palitos de dente estéreis, foram picadas colônias isoladas de bactérias TG1
infectadas, crescidas em placas de Petri, e que foram utilizadas para titulação dos fagos
41
eluídos de cada turno de seleção. As colônias picadas foram transferidas individualmente para
poços de placas de cultura de 96 poços contendo 100 µL de meio LB suplementado com 100
µg/mL de ampicilina e 1% de glicose por poço. As placas foram mantidas sob agitação
constante de 300 rpm, por uma noite, à 37ºC. No dia seguinte, com auxílio de um replicador
de 96 poços (Boekel Scientific, Feasterville, EUA) cerca de 2 µL de meio de cultura de cada
poço foram transferidos para novas placas de cultura (placas secundárias) contendo 200 µL de
meio LB com 100 µg/mL de ampicilina e 1% de glicose por poço. Estas placas foram
mantidas sob agitação constante de 300 rpm, a 37ºC por três horas. Nas placas originais foram
adicionados 100 µL/poço de solução crioprotetora (65% de glicerol, 0,1M MgSO
4
e 0,025M
de Tris-HCl pH 8,0) e estas placas, agora denominadas placas-mãe, foram estocadas a –80ºC.
Para cada poço das placas secundárias foram adicionados 25 µL de meio LB contendo 100
µg/mL de ampicilina, 1% de glicose e 10
9
u.f.p. de fago auxiliar VCSM13. As placas foram
incubadas por 30 minutos em estufa a 37ºC para permitir a infecção e então foram
centrifugadas a 1800 xg, por 10 minutos, a 4ºC. O sobrenadante dos poços foi descartado e o
precipitado ressuspendido em 200 µL de meio LB contendo 100 µg/mL de ampicilina e 25
µg/mL de canamicina. As placas foram incubadas por uma noite a 30ºC, sob agitação
constante de 300 rpm.
No dia seguinte, as placas foram centrifugadas a 1800 xg por aproximadamente 10
minutos à temperatura de 4ºC, sendo o sobrenadante utilizado em ensaio imunoenzimático
para reconhecimento de proteínas do veneno bruto, passo este que se denominou de ELISA
monoclonal. Este ensaio foi feito conforme descrito anteriormente para os fagos policlonais e
foi utilizada uma placa de ELISA de 96 poços sensibilizada com 10 µg por poço de veneno
bruto diluídos em 100µL de tampão carbonato-bicarbonato pH 9,6 no dia anterior ao ensaio e
guardada em geladeira.
42
8. Seleção de fagos-anticorpos capazes de inibir a ação hemolítica indireta do veneno.
Os fagos-anticorpos monoclonais produzidos anteriormente foram selecionados
quanto à capacidade de inibir a ação hemolítica indireta do veneno bruto de Cdt. Para isso foi
realizado um ensaio cinético em leitor de ELISA em DO
700,
por 50 minutos e intervalos de
leitura de 3 minutos, a uma temperatura de 37ºC, anteriormente desenvolvido e padronizado
em nosso laboratório por Tamarozzi (2005).
Primeiramente, foi determinada a concentração mínima necessária de veneno bruto
nas condições experimentais do ensaio para obter-se hemólise total das hemácias, para isso
foram testadas três quantidades diferentes do veneno de Cdt (5,0; 2,5 e 1,0µg). A quantidade
de veneno bruto a ser utilizada no ensaio foi determinada em 2,5 µg, que foram em seguida
incubadas com 190 µL de sobrenadantes contendo fagos-anticorpos monoclonais, (produzidos
conforme descrito no item 7) em uma placa de cultura de 96 poços por 1 hora a 4°C. Após o
período de incubação adicionou-se em cada poço1 µL de emulsão de gema de ovo (1 parte de
gema para 4 partes de solução cloreto de sódio 0,9%) e solução de hemácias a 0,5% em
volume suficiente para obter uma DO
700
entre 0,3 e 0,4. A solução final em cada poço foi
ajustada para 200 µL com tampão Tris-NaCl-CaCl
2
(10 mM de Tris, 140 mM de NaCl
2,5mM). Como controles, poços foram utilizados contendo as mesmas soluções, porém, um
com veneno incubado com VCSM13 (controle negativo) e outro poço contendo hemácias sem
a presença do veneno (controle positivo). Como branco, utilizou-se hemácias hemolisadas
com água.
43
9. ELISA monoclonal de fagos-anticorpos contra a Crotoxina e sua porção fosfolipásica
Crotoxina B.
Os dois clones selecionados no ensaio de inibição da atividade hemolítica do veneno
foram testados quanto à capacidade de reconhecimento do principal componente tóxico do
veneno, a crotoxina (CTX) e sua porção contendo a região conservada de atividade
fosfolipásica, a Crotoxina B (CB). Para isto, poços de uma placa de ELISA foram
sensibilizados com 1 µg das toxinas diluído em 100 µl de tampão carbonato-bicarbonato pH
9,6. A placa foi incubada a 4°C por uma noite. Como controle, poços foram sensibilizados
com 10
8
u.f.p de VCSM13. No dia seguinte, a placa foi lavada três vezes com PBS e os poços
completados até a borda com uma solução bloqueadora de MPBS 2% por no mínimo 2 horas,
a 37°C. Após o período de incubação e nova lavagem com PBS, os poços receberam 100 µl
do sobrenadante de cultura dos clones produtores de fagos-anticorpos monoclonais
selecionados previamente. Como controles negativos, adicionaram-se 100 µl de PBS
contendo 10
8
u.f.p de VCSM13 nos poços contendo as toxinas e 100 µl de PBS nos poços
sensibilizados com VCSM13. A placa foi mantida por 90 minutos à temperatura ambiente,
sendo então lavada três vezes com PBST e três vezes com PBS, antes de se acrescentar 100 µl
de anticorpos policlonais de coelho anti-VCSM13 marcados com peroxidase, diluídos na
razão de 1:1000 em solução de MPBS 1%, na tentativa de se evitar ligações inespecíficas e
consequentemente falsos positivos. Após 1 hora de incubação em temperatura ambiente os
poços foram novamente lavados com PBST e PBS e a reação foi revelada com 100 µl do
substrato de OPD-H
2
O
2
. Após a adição deste substrato, manteve-se a placa protegida da luz
por 15 minutos, parando a reação com 50 µl de ácido sulfúrico 1M por poço. A leitura foi
feita no comprimento de onda de 490 nm. Os antígenos foram testados em duplicatas.
44
10. Produção de fragmentos solúveis de anticorpos (scFv) usando clones selecionados em
ensaio de inibição da hemólise indireta in vitro
Para a obtenção dos fragmentos solúveis de anticorpos (scFv) foram utilizadas
bactérias E. coli da linhagem HB2151 (CARTER et al., 1985), linhagem não supressora [K12,
ara, D(lac-pro), thi/F’proA+B+, laclqZDMl5]. Assim, o fago-anticorpo selecionado foi
amplificado e precipitado conforme descrito anteriormente e utilizado para infectar esta cepa
de bactéria que, devidamente induzida, produz fragmentos solúveis scFv de anticorpos. Para
tanto, um inóculo de E. coli HB2151 foi adicionado em 5 mL de meio LB contidos em tubo
Falcon de 50 mL e deixados sob agitação constante de 300 rpm, a 37
º
C, por uma noite. No
dia seguinte, 500 µL da cultura saturada foram transferidos para frasco do tipo Erlenmeyer
contendo 50 mL de meio LB. A cultura foi incubada a 37
º
C, sob agitação constante de 300
rpm, até atingir a DO
600
de aproximadamente 0,4. Após atingir a DO
600
requerida, 10 mL da
cultura foram transferidos para um tubo tipo Falcon de 50 mL e adicionado a ele 1 µL do
fago-anticorpo precipitado. O tubo foi incubado em banho-maria 37ºC por trinta minutos.
Após esse período, uma alíquota da cultura foi retirada para fazer diluições sucessivas de
1:100 em tubos tipo Eppendorf contendo 200 µL de meio LB. Em seguida, 50 µl de cada
diluição foram espalhados em placas de Petri contendo meio LB-ágar, suplementado com 100
µg/mL de ampicilina e 1% de glicose e as placas incubadas durante uma noite a 37ºC de
forma invertida. No dia seguinte, foram adicionados em cada placa 1 mL de meio LB
contendo 15% de glicerol e as colônias foram raspadas com o auxílio de uma haste preparada
com uma pipeta Pasteur de vidro, recurvada para um ângulo de 90º. Um inóculo deste estoque
de E.coli HB2151 infectado com o fago-anticorpo do clone selecionado foi transferido para 5
mL de meio LB contido em tubo Falcon de 50 mL e incubado por uma noite a 37
o
C, sob
agitação constante de 300 rpm. No dia seguinte, 50 µL da cultura saturada foram transferidos
45
para outro tubo Falcon contendo 5 mL de meio LB, com 100 µg/mL de ampicilina e 1% de
glicose e cultivado por quatro horas a 37
o
C, sob agitação constante (300 rpm). Em seguida,
esta cultura foi transferida para frasco de Erlenmeyer contendo 500 mL de meio LB, com 100
µg/mL de ampicilina e 0,1% de glicose e cultivada nas mesmas condições até atingir a DO
600
de 0,9. Neste momento, adicionou-se solução de IPTG para uma concentração final de 1M e
a cultura passou a ser incubada a 30
o
C por 16 horas. Após este período, a cultura foi
centrifugada a 10.800 xg, por 15 minutos, a 4
o
C e o sobrenadante foi filtrado em filtro
Millipore de 0,2 µm. Este sobrenadante foi liofilizado e ressuspendido com água milliQ no
menor volume necessário para tal.
Para a separação da fração enriquecida contendo scFv, cerca de 1 mL do sobrenadante
concentrado do clone foi aplicado em uma coluna de cromatografia com dimensões de 45x2
cm contendo resina Sephadex G-75. As amostras foram eluídas com tampão 50 mM de
bicarbonato de amônio em fluxo de 0,5 mL por minuto. Foram colhidas amostras de 1,5 mL e
a presença de proteína foi determinada em espectrofotômetro com DO
280.
O perfil
eletroforético do concentrado de scFv aplicado na coluna e das amostras eluídas no processo
cromatográfico foi avaliado em gel de poliacrilamida 12% (SDS-PAGE), sendo aplicado 15
µL e 50 µg, respectivamente.
11. Ensaio cinético utilizando fração enriquecida de scFv dos clones selecionados
11. 1. Determinação da concentração de veneno bruto de Cdt e CB
Não havendo mais a necessidade de se testar uma grande quantidade de clones de uma
só vez, optou-se por realizar os ensaios com as frações enriquecidas de scFv dos dois clones
selecionados, em espectrofotômetro com suporte para leitura simultânea de seis cubetas. A
hemólise é medida em função do tempo em densidade ótica de 700nm (DO
700
) utilizando-se
46
programa de cinética à temperatura de 37°C por 50 minutos e intervalos de leitura de 180
segundos, condições determinadas anteriormente em nosso laboratório (Tamarozzi, 2005). As
quantidades mínimas de veneno bruto de Cdt e da fosfolipase isolada (CB) necessárias para se
obter uma curva de hemólise, foram determinadas utilizando hemácias de carneiro a 0,5% em
quantidade suficiente para se obter um volume final com DO
700
entre 0,7 e 0,8 e 5 µL de
emulsão de gema de ovo, quantidades estas que foram ajustadas para as novas proporções do
ensaio que passou a ter como volume final 1 mL de solução. Optou-se também por
acrescentar 2,5 mM de CaCl
2
em solução final, melhorando assim as condições de ensaio e
conseguindo diminuir a quantidade de veneno bruto utilizada anteriormente. As novas
quantidades testadas foram de 1,0; 2,0; 2,5; 3,0 e 4,0 µg de veneno bruto de C. durissus
terrificus e de 2,0; 4,0 e 8,0 µg de CB.
11.2. Ensaio de inibição da atividade hemolítica indireta in vitro.
Quatro quantidades diferentes das amostras contendo scFv (15, 25, 50 e 100 µg) foram
então incubadas com 1,0 µg de Cdt ou 4,0 µg de CB por 1 hora a 4°C. As leituras foram
feitas em espectrofotômetro nas condições descritas acima.
12. Ensaio de inibição da atividade anticoagulante de CB.
A metodologia para a medição da atividade anticoagulante foi descrita por Mota
(2006), o ensaio cinético realizado em DO
405
permite a observação da formação das redes de
fibrina. Assim, utilizando-se 200 µL de plasma humano descongelado em banho
termostatizado a 37°C e incubado por 10 minutos nesta mesma temperatura com 50 µL de
seis diferentes quantidades da toxina CB (0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 2,5 e 5,0 µg) dissolvidas em
47
PBS, em uma placa de cultura de 96 poços. Após o período de incubação, foram adicionados
50 µL de CaCl
2
0,25M por poço e a placa foi imediatamente lida em leitor de ELISA. Os
controles foram incubados somente com PBS ou PBS e CaCl
2
0,25 M. Após a determinação
da concentração ideal da toxina, três diferentes proporções das frações enriquecidas de scFv
dos dois clones selecionados (CB:scFv - 1:24; 1:48 e 1:96) foram incubados por 1 hora a
37°C com 2,5 µg de CB, antes da adição do plasma e CaCl
2
0,25M. Além dos controles com
PBS e PBS e CaCl
2
0,25M, também incubou a toxina com 60 µg de cada um dos clones
testados.
13. Ensaio de inibição da atividade miotóxica de CB in vivo.
Grupos de quatro camundongos receberam injeção intramuscular (i.m.) no músculo
gastrocnemius direito, de 15 µg da toxina CB incubados por uma hora a 37°C com três
proporções diferentes de fragmentos de anticorpos (CB: scFv - 1:6; 1:12 e 1:24) dos dois
clones selecionados, dissolvidos em PBS para um volume final de 50 µL. Camundongos
controles receberam apenas PBS ou 90 µg de cada um dos clones. Três horas após a injeção, o
sangue dos camundongos foi colhido pela cauda em capilares heparinizados e imediatamente
centrifugado a 4000 rpm. A atividade da enzima creatina-cinase (CK) foi quantificada em 4
µL de plasma de cada camundongo, utilizando-se o Kit CK-NAC CINÉTICO (Bioclin, Belo
Horizonte, BR). O procedimento consistiu em incubar o plasma com 1 mL de reagente por 3
minutos cronometrados, a 37°C e realizar leituras a (DO
340
) imediatamente após este período.
A atividade creatina-cinase foi expressa em unidade por litro (U/L), constituindo uma unidade
o resultado da fosforilação de um nanomol de creatina por minuto, a 37°C.
48
14. Ensaio de inibição da indução de edema por CB in vivo.
Grupos de quatro camundongos foram utilizados no ensaio de inibição da indução de
edema causado por 10 µg de CB. Inicialmente, todos os animais tiveram a pata inferior direita
medida no tempo zero com o auxílio de um paquímetro (mm). Os animais então receberam
injeção na região subplantar da pata inferior direita contendo fração enriquecida de scFv dos
dois clones selecionados incubada por 1hora a 37°C com 10 µg de CB, numa proporção de
1:24 (CB: scFv), num volume total de 50 µL. Os grupos controles receberam somente PBS,
10 µg de CB ou 240 µg de cada um dos clones testados. Foram então realizadas medições das
patas nos tempos 30, 60, 120 e 180 minutos após a aplicação inicial.
15. Ensaio de letalidade do veneno bruto e da crotoxina.
Grupos de seis camundongos foram usados no ensaio de letalidade provocada por 15
µg do veneno bruto de Crotalus durissus terrificus e de 10 µg da toxina isolada crotoxina,
quantidades capazes de matar 100% dos animais entre 1 ou 2 horas. Inicialmente, incubou-se
por 1 hora a 37°C a toxina e o veneno de Cdt na proporção de 1:48 com as frações
enriquecidas de scFv dos dois clones selecionados. Após o período de incubação injetou-se
intraperitonialmente (i.p.) 100 µL do incubado por animal, volume final este completado com
PBS. Os grupos controles receberam ou PBS ou 15 µg de Cdt ou 10 µg de CTX ou 240 µg de
cada um dos clones testados. Os animais foram então observados, sendo anotada a hora morte
de cada um dos animais.
16. Análises Estatísticas
Os resultados do ensaio miotóxico foram submetidos à análise de variância (ANOVA)
e as médias foram comparadas utilizando o teste de Dunnett. Enquanto os dados obtidos no
49
ensaio de indução de edema foram submetidos à análise de variância (ANOVA) multifatorial
e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey. As análises foram realizadas com o
auxílio do software estatístico MINITAB Release 14, versão 14.20, 2005 Minitab Inc.
50
51
1. Seleção de fagos-anticorpos contra veneno bruto de Crotalus durissus terrificus.
Foram realizados quatro turnos de seleção de fagos-anticorpos para veneno bruto. A
partir do segundo turno, foi aumentado o número de lavagens do imunotubo, na tentativa de
eliminar fagos ligados inespecificamente. Não houve variação na quantidade de fagos-
anticorpos eluídos do primeiro para o segundo turno, o que indica que não houve perda de
fagos-anticorpos, porém, observou-se uma queda no título de fagos-anticorpos eluídos do
segundo para o terceiro turno (Figura 6A). Apesar desta queda, optou-se por realizar um
quarto turno de seleção, onde se observou a retomada do crescimento do título de fagos-
anticorpos.
No caso dos fagos-anticorpos precipitados, o esperado é que o seu título seja superior
ao de fagos-eluídos do mesmo turno, indicando um bom rendimento na amplificação, o que
foi observado nos resultados (Figura 6B).
52
Figura 6: Resultado da seleção de fagos-anticorpos contra veneno bruto de Crotalus durissus
terrificus. Foram realizados quatro turnos de seleção e os fagos eluídos do imunotubo (A),
bem como os precipitados após amplificação com auxílio de fagos VCSM13 (B) foram
titulados após infecção e cultivados em meio sólido de bactérias E. coli TG1.
A
0 1 2 3 4 5
10
4
10
5
10
6
10
7
10
8
Turnos de seleção
u.f.p./mL
B
0 1 2 3 4 5
10
12
10
13
10
14
10
15
10
16
Turnos de seleção
u.f.p./mL
53
2. Análise dos fagos-anticorpos dos quatro turnos de seleção.
Nesta fase, os fagos-anticorpos selecionados nos quatro turnos de seleção foram
analisados quanto às suas especificidades para o veneno bruto de Crotalus durissus terrificus,
por meio de um imunoensaio enzimático (ELISA). A realização deste ensaio é importante
para se determinar em qual destes turnos de seleção existe a maior quantidade de fagos
específicos para a proteína de interesse. Isto se torna importante porque durante os turnos de
seleção podem ocorrer perdas de ligantes específicos, além de ter havido uma diminuição no
título de fagos-anticorpos no terceiro turno de seleção. Na Figura 7 são apresentados os
resultados da leitura da absorbância para os fagos-precipitados, pois os fagos eluídos
encontravam-se em concentrações não detectáveis para o ensaio. Como controle foi utilizado
o fago auxiliar VCSM13, que difere fenotipicamente dos fagos-anticorpos apenas pela
ausência do scFv em fusão com a proteína gpIII. Nos dois primeiros turnos, observou-se uma
quase ausência de fagos-anticorpos específicos para o veneno em questão, sendo que, no
terceiro turno, apesar da diminuição brusca de fagos-anticorpos recuperados na seleção,
obteve-se uma boa quantidade de fagos específicos, o que foi ainda mais evidente no quarto
turno de seleção. Assim, optou-se por produzir placas de cultura contendo fagos-anticorpos
monoclonais deste último turno de seleção, que apresentou um maior número de fagos-
anticorpos específicos para o veneno bruto.
54
Figura 7: ELISA policlonal utilizando fagos-anticorpos precipitados, obtidos de quatro turnos
de seleção contra veneno bruto de Crotalus durissus terrificus. Poços de uma placa de ELISA
foram sensibilizados com o conteúdo dos imunotubos (100 µL de solução de veneno/poço)
dos quatro turnos de seleção. Para o ensaio foram usados 10 µL de fagos-anticorpos
precipitados acrescidos de 90 µL de MPBS 2%. Como controle negativo foram utilizados 10
8
u.f.p. de VCSM13 diluídas em MPBS 2%. A presença de anticorpos específicos foi revelada
utilizando-se como substrato OPD/H
2
O
2
.
55
3. Análise dos fagos-anticorpos monoclonais por ELISA
Quatro placas de cultura do quarto turno de seleção que continham em cada poço
fagos-anticorpos com especificidade única (monoclonais) foram utilizadas para ensaios de
ELISA para verificar a existência de clones capazes de produzir fagos-anticorpos específicos
para o veneno bruto. Na Figura 8, observa-se o resultado dos clones mais positivos para o
veneno, de quatro ensaios realizados e que foram agrupados numa só placa armazenada a -
80ºC. Estes clones serão utilizados nos ensaios de inibição da atividade hemolítica do veneno
bruto de Cdt.
56
A1
B1
C1
D1
E1
F1 G1
H1
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Clones
D.O.490 nm
Figura 8: ELISA monoclonal utilizando sobrenadante de cultura de clones de fagos-
anticorpos oriundos de quatro placas de cultura de 96 poços. Os clones foram obtidos por
meio da infecção de E.coli TG1 com fagos-anticorpos eluídos do quarto turno de seleção.
Poços de uma placa de ELISA de 96 poços foram sensibilizados na noite anterior com 10 µg
de veneno bruto diluídos em 100 µL de tampão carbonato-bicarbonato pH 9,6. Para o ensaio
foram usados 100 µL de sobrenadante de cultura e o ensaio foi realizado em duplicata. A
presença de fagos-anticorpos específicos foi revelada utilizando-se como substrato
OPD/H
2
O
2
.
57
4. Seleção de fagos-anticorpos capazes de inibir a ação hemolítica indireta do veneno.
Para verificar a capacidade de inibição da atividade fosfolipásica pelos clones que
foram escolhidos e agrupados numa só placa de cultura de 96 poços, 190 µL do sobrenadante
de cultura de cada poço foi previamente incubado com 2,5 µg de veneno, quantidade esta que
foi previamente determinada (Figura 9). Dos 96 clones analisados em ensaio cinético que está
representado na Figura 10A, dois clones foram selecionados como capazes de inibir a
atividade hemolítica indireta do veneno. Estes clones receberam o nome dos poços
correspondentes na placa de cultura de 96 poços (C3 e F7), e pode-se observar o perfil
cinético detalhado de cada um deles na Figura 10B.
58
Figura 9: Padronização da quantidade mínima necessária de veneno bruto de Crotalus
durissus terrificus para obtenção de uma curva de hemólise para os ensaios de inibição de
fosfolipase in vitro. O ensaio foi feito utilizando um programa de cinética a 37°C no leitor de
ELISA. Foram testadas concentrações de 5,0; 2,5 e 1,0µg de veneno bruto. O controle foi
feito com ausência de veneno e o branco com hemácias hemolisadas com água.
0 1000 2000 3000
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
Controle
1.0 µg Cdt
2.5 µg Cdt
5.0 µg Cdt
TEMPO (s)
D.O.700nm
59
A
B
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
0.1
0.2
0.3
0.4
Clone C3
Controle (+)
Controle (-)
TEMPO
D.O. 700nm
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Clone F7
Controle (-)
Controle (+)
TEMPO
D.O.700nm
Figura 10: Ensaio cinético de inibição da hemólise indireta em leitor de ELISA usando
microplaca de 96 poços. (A) Ensaio cinético simultâneo de 96 clones de fagos-anticorpos
monoclonais; 190 µL do sobrenadante de cultura de cada poço foi previamente incubado com
2,5 µg de veneno. Controles com ausência (controle +) e presença (controle -) de veneno
estão representados nos poços H10 e H11, respectivamente. (B) Perfil detalhado do ensaio
cinético do clone C3 e do clone F7, respectivamente.
60
5. ELISA monoclonal de fagos-anticorpos contra a Crotoxina e sua porção fosfolipásica,
a Crotoxina B.
Após a seleção de dois clones que inibiram a atividade enzimática do veneno bruto de
Cdt em ensaio hemolítico in vitro, verificou-se a capacidade destes fagos-anticorpos de
reconhecer a crotoxina e sua porção fosfolipásica, a crotoxina B, que possui o sítio
conservado responsável por esta atividade enzimática. As duas toxinas foram utilizadas em
um ensaio de ELISA e, conforme demonstrado na Figura 11, os dois clones produtores de
fagos-anticorpos selecionados foram capazes de reconhecer as toxinas. Neste ensaio foi
observado que os clones reconheceram mais fracamente a crotoxina em relação a sua porção
isolada CB, porém C3 reconheceu CB com maior intensidade do que o clone F7.
61
Figura 11: ELISA para verificação da capacidade de reconhecimento da principal toxina do
veneno bruto de Cdt, a crotoxina, e de sua porção contendo o sítio conservado da atividade
fosfolipásica, CB, pelos dois clones produtores de fagos-anticorpos selecionados. Poços de
uma placa de ELISA de 96 poços foram sensibilizados com 1µg de CTX ou CB em 100 µL
de tampão carbonato-bicarbonato pH 9,6 e como controle positivo dois poços foram
sensibilizados com 10
8
u.f.p. de VCS-M13. Para o ensaio foram usados 10 µL de fagos-
anticorpos precipitados acrescidos de 90 µL de MPBS 1%. Como controle negativo foram
utilizados 10
8
u.f.p. de VCS-M13 diluídos em MPBS 1%. A presença de anticorpos
específicos foi revelada utilizando-se como substrato OPD/H
2
O
2.
62
6. Produção de fração enriquecida de scFv a partir de sobrenadante de cultura.
Para a realização de ensaios de inibição da atividade fosfolipásica in vitro utilizando
scFv dos clones selecionados, foi necessária a produção de fração enriquecida de scFv de cada
clone, já que ainda não se conseguiu obter o scFv purificado, devido a perda dos “tags”. Para
isso, foram produzidos 500 mL de meio de cultura rico em scFv de cada clone, que foi
liofilizado e aplicado em coluna de cromatografia de 45 x 2 cm contendo resina de Sephadex
G-75. O perfil cromatográfico obtido está representado na Figura 12A, onde se observa dois
picos principais. Como já demonstrado em trabalho anterior em nosso laboratório a fração
rica em scFv foi a primeira fração eluída da coluna cromatográfica (TAMAROZZI, 2005),
utilizada nos ensaios cinéticos de inibição da atividade fosfolipásica. O sobrenadante de
cultura concentrado e as frações obtidas por cromatografia foram analisados por SDS-PAGE
(Figura 12B).
63
A
B 1 2 3 4
Figura 12: Perfil cromatográfico das amostras de scFv e perfil eletroforético das duas frações
obtidas. (A) 500mL de sobrenadante de cultura do clone F7 foram concentrados por
liofilização, sendo aplicado 1 mL em coluna de cromatografia de 45x2cm, contendo Sephadex
G-75. A amostra foi eluída com tampão 50mM de bicarbonato de amônio em fluxo de 0,5 mL
por minuto. Foram colhidas amostras de 1,5 mL e a presença de proteína foi determinada em
espectrofotômetro, em DO
280
. (B) Gel de poliacrilamida a 12% contendo padrão de peso
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
1
2
3
TUBOS
O.D.280nm
64
molecular (1), 15 µL de sobrenadante de cultura concentrado do clone F7 (2) e 50 µg das
frações 1 (3) e 2 (4), obtidas na cromatografia. A seta indica a localização no gel do
fragmento de anticorpo (scFv).
7. Ensaio de inibição da hemólise indireta in vitro utilizando scFv monoclonais.
Não havendo mais a necessidade de se testar uma grande quantidade de clones de uma
só vez, optou-se por realizar os ensaios com as frações enriquecidas de scFv dos dois clones
selecionados, em espectrofotômetro com suporte para leitura simultânea de seis cubetas, a
37°C. Devido aos ajustes no ensaio cinético, foram testadas novamente quatro quantidades
diferentes de veneno bruto, sendo assim, a quantidade de 1 µg de veneno de Cdt passou a ser
utilizada para se obter hemólise total das hemácias (Figura 13A). Foi testada também a
capacidade de inibição dos dois clones na atividade hemolítica da fosfolipase CB. Para isso,
foram analisadas três concentrações de CB, para verificar qual a quantidade mínima
necessária para conseguir hemólise total nas condições do ensaio. A quantidade de 4 µg
passou a ser utilizada nos ensaios cinéticos (Figura 13B).
Os ensaios de inibição estão representados na Figura 14, onde 15, 25, 50 e 100 µg de
fração enriquecida de scFv de cada clone foi incubada por 1 hora a 4°C com 1 µg de Cdt ou 4
µg de CB, respectivamente. Tanto para o veneno bruto como para a fosfolipase isolada, 25 µg
de cada um dos clones foi capaz de inibir totalmente a hemólise.
65
A
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Controle
4,0µg veneno
3,0µg veneno
2,5µg veneno
2,0µg veneno
1,0µg veneno
TEMPO (s)
D.O.700nm
B
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
0.00
0.15
0.30
0.45
0.60
0.75
0.90
Controle
4.0µg CB
8.0µg CB
2.0µg CB
TEMPO (s)
D.O.700nm
Figura 13: Padronização da quantidade mínima necessária de veneno bruto (A) e CB (B) para
obtenção de uma curva de hemólise para os ensaios de inibição de fosfolipase in vitro. O
ensaio foi realizado em espectrofotômetro com suporte para leitura simultânea de seis cubetas.
A hemólise é medida em função do tempo em densidade ótica de 700nm (DO
700
) utilizando-
se programa de cinética à temperatura de 37°C por 50 minutos. Foram testadas 5 quantidades
de veneno bruto (4,0; 3,0; 2,5; 2,0 e 1,0 µg) e 3 de CB (8,0; 4,0 e 2,0 µg). Os controles foram
feitos com ausência de veneno ou de CB, respectivamente.
66
A
B
Figura 14: Ensaio de inibição da atividade hemolítica indireta do veneno bruto de C. durissus
terrificus (A) e da fosfolipase CB (B) usando os clones C3 e F7 de scFv respectivamente. O
sobrenadante das culturas foi liofilizado e aplicado em coluna de cromatografia de 42 x 2 cm,
contendo Sephadex G-75. Diferentes quantidades da fração 1 do perfil cromatográfico: 15, 25,
50 e100 µg foram pré-incubadas por 1 hora a 4
º
C com 1 µg de veneno ou 4 µg de CB. Como
controles, foram utilizadas hemácias sem a presença de anticorpos e veneno ou CB e
hemácias e veneno sem a presença de anticorpos. Cinética realizada a 37°C.
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
Controle
Cdt (1µg)
Clone C3 (15µg)
Clone C3 (25µg)
Clone C3 (50µg)
Clone C3 (100µg)
TEMPO (s)
D.O.700nm
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
Controle
Cdt (1µg)
Clone F7 (15µg)
Clone F7 (25µg)
Clone F7 (50µg)
Clone F7 (100µg)
TEMPO (s)
D.O.700nm
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
Controle
CB (4.0µg)
Clone F7 (15µg)
Clone F7 (25µg)
Clone F7 (50µg)
Clone F7 (100µg)
TEMPO (s)
D.O.700nm
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
0.00
0.15
0.30
0.45
0.60
0.75
0.90
Controle
CB (4,0µg)
Clone C3 (15µg)
Clone C3 (25µg)
Clone C3 (50µg)
Clone C3 (100µg)
TEMPO (s)
D.O.700nm
67
8. Ensaio de inibição da atividade anticoagulante.
Após demonstrar a capacidade de inibição da atividade hemolítica tanto do veneno
bruto como da fosfolipase CB pelos dois clones de scFv passou-se a testá-los em outros
ensaios de inibição in vivo e in vitro, para verificar-se a possível relação entre o sítio ativo
enzimático e os sítios de outras atividades farmacológicas.
Antes do ensaio de inibição da atividade anticoagulante, foi determinada a quantidade
mínima necessária da toxina CB para inibir a coagulação do plasma humano. Os resultados
demonstraram que 2,5 µg de CB (Figura 15A) foram suficientes para inibir a coagulação de
200 µl de plasma humano na presença de cálcio. Para se testar a ação dos clones selecionados
sobre a atividade anticoagulante da toxina CB, foram incubadas três proporções diferentes dos
clones C3 ou F7 de scFv ( CB: scFv- 1:24; 1:48; 1:96), por 1 hora a 37°C, com a quantidade
previamente determinada de CB. Conforme demonstrado na Figura 15B, nenhum dos clones
foi capaz de inibir a atividade anticoagulante da toxina, nas condições do ensaio.
68
A
B
Figura 15: Ensaio de atividade anticoagulante. (A) Foram testadas diferentes concentrações
da toxina CB, verificando-se que a partir de 2,5 µg esta toxina apresenta atividade
anticoagulante detectável. (B) A atividade anticoagulante da toxina CB não foi inibida em
nenhuma das proporções utilizadas de scFv, capazes de inibir a atividade fosfolipásica.
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
CB (0,1µg)
CB(0,25µg)
CB(0,5µg)
CB(1,0µg)
CB(2,5µg)
CB(5,0µg)
PBS
Ca
++
Tempo (s)
D.O. 405 nm
0 250 500 750 1000 1250
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
CB (2,5µg)
C3 (60µg)
F7 (60µg)
CB+C3 (1:24)
CB+C3 (1:48)
CB+C3 (1:96)
CB+F7 (1:24)
CB+F7 (1:48)
CB+F7 (1:96)
PBS
Ca
++
Tempo (s)
D.O. 405 nm
69
9. Ensaio de inibição da atividade miotóxica in vivo.
Para o ensaio de inibição da atividade miotóxica de CB, determinou-se inicialmente a
quantidade mínima necessária da toxina capaz de resultar em níveis mensuráveis de creatina-
cinase. De quatro quantidades testadas (5, 10, 15 e 20 µg) optou-se por realizar o ensaio com
15 µg da toxina, que gerou a melhor resposta dos animais (dados não mostrados). Incubou-se
com esta quantidade de CB, três diferentes proporções do clone C3 (Figura 16A) e do clone
F7 (Figura 16B) de scFv (CB:scFv - 1:6; 1:12 e 1:24), em uma temperatura de 37°C, por 1
hora. O clone C3 nas proporções 1:6; 1:12 e 1:24 inibiu a miotoxicidade causada por CB em
16%; 34,12% e 38,9%, respectivamente, enquanto que o clone F7, utilizado nas mesmas
proporções, inibiu em 8,4%; 57,5% e 57,4%, respectivamente, sendo mais eficiente se
comparado ao clone C3 de scFv. Sendo assim, os resultados indicam que houve uma inibição
parcial da atividade miotóxica de CB pelos dois clones testados, de forma proporcional à
quantidade de fração enriquecida de scFv utilizada no ensaio. Isto indica que a inibição da
atividade fosfolipásica implica em redução parcial da atividade miotóxica.
70
A
PBS
g)
µ
µ
µ
µ
CB (15
g)
µ
µ
µ
µ
Clone C3 (90
CB + C3 (1:6)
CB + C3 (1:12)
CB + C3 (1:24)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
*
*
*
CK (U/L)
B
PBS
g)
µ
µ
µ
µ
CB (15
g)
µ
µ
µ
µ
Clone F7(90
CB + F7 (1:6)
CB + F7(1:12)
CB + F7(1:24)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
*
*
CK (U/L)
Figura 16: Ensaio de inibição da atividade miotóxica causada por CB in vivo. Grupos de
quatro camundongos foram injetados com 15 µg da toxina CB ou da toxina incubada com três
diferentes quantidades de fragmentos de anticorpos dos clones C3 (A) ou F7 (B).
Camundongos controles receberam apenas PBS ou apenas os anticorpos scFv. A liberação de
CK no plasma foi quantificada após três horas da injeção, utilizando-se o “kit“ CK-NAC
CINÉTICO (Bioclin, Belo Horizonte, BR). Os resultados foram submetidos à análise de
71
variância (ANOVA) e teste de Dunnett de múltiplas comparações. * p<0,01 em relação ao
controle PBS.
10. Ensaio de inibição da indução de edema in vivo.
Procurou-se também investigar a atividade destes clones de scFv em inibir a indução
de edema causada por 10 µg da crotoxina B do veneno de Cdt. Neste ensaio, todos os animais
tiveram sua pata inferior direita medida no tempo zero e nos tempos de 30, 60, 120 e 180
minutos após a injeção de 10 µg de CB previamente incubado com scFv, medição esta feita
com o auxílio de um paquímetro de baixa pressão (mm). Os grupos controles receberam
somente PBS, 10 µg de CB ou 240µg de cada um dos clones em tela. Os resultados obtidos
nos tempos após a injeção foram subtraídos da leitura inicial, sendo feita uma média dos
quatro animais de cada grupo, representada em milimetros nos gráficos da Figura 17A (clone
C3) e da Figura 17B (Clone F7). Os resultados foram submetidos à análise de variância
(ANOVA) multifatorial e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey. Este teste permite
a comparação dos diferentes inóculos em cada um dos tempos. Assim, o inóculo CB incubado
com o anticorpo C3 induziu edema nos animais a níveis estatísticos iguais ao grupo controle
que recebeu apenas CB, nos tempos 30, 60 e 120 minutos. Sendo que, houve uma diferença
significativa na indução de edema entre estes grupos apenas 180 minutos após a inoculação.
Entretanto, o inóculo CB incubado com o anticorpo F7, passou a diferenciar-se
estatisticamente do grupo controle CB a partir dos 120 minutos e manteve esta diferença em
180 minutos após a inoculação. Mesmo assim, os grupos que receberam os anticorpos
incubados com CB não chegaram a ter um nível de edema estatisticamente igual ao grupo que
recebeu apenas PBS. Estes resultados demonstraram que os anticorpos, na quantidade
utilizada, foram capazes de inibir parcialmente o edema ocasionado por CB.
72
A
0 30 60 90 120 150 180
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
PBS
CB
C3
CB+C3
*
Tempo (min.)
Edema (mm)
B
0 30 60 90 120 150 180
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
PBS
CB
F7
*
*
CB+F7
Tempo (min.)
Edema (mm)
Figura 17: Ensaio de inibição do edema causado por CB. Grupos de 4 camundongos foram
injetados com uma solução de 50 µL na região subplantar de pata inferior direita contendo 10
µg de CB ou um incubado de CB com o clone C3 (A) ou clone F7 (B) na proporção de 1:24.
Os grupos controles receberam PBS ou os anticorpos. Os gráficos estão representando as
médias do edema em milímetros e respectivos desvios padrões. Os resultados foram
73
submetidos à análise de variância (ANOVA) multifatorial e as médias foram comparadas pelo
teste de Tukey. * p<0,05 em relação a CB.
11. Ensaio de inibição da letalidade do veneno bruto de Crotalus durissus terrificus e da
Crotoxina.
Por último, foi verificada a capacidade de inibição da letalidade de 15 µg de Cdt e 10
µg de CTX pelos dois clones selecionados, quantidades estas capazes de matar os animais em
um período máximo de 2 horas. Os animais dos grupos controles, que receberam apenas o
veneno ou a crotoxina, morreram em um intervalo de tempo, de 64 a 78 minutos e 70 a 82
minutos, respectivamente, após a aplicação intraperitonial. Enquanto que aqueles que
receberam Cdt previamente incubado com o clone C3 morreram no intervalo de tempo de 87
a 112 minutos e com o clone F7 no intervalo de 103 a 188 minutos, tendo uma sobrevida um
pouco maior. Quando se testou os dois clones quanto à capacidade de inibição da letalidade
da principal neurotoxina isolada do veneno bruto, a crotoxina, os dois clones também
conseguiram aumentar a sobrevida dos animais. Os animais que receberam toxina incubada
com o clone C3 passaram a morrer no intervalo de tempo entre 117 e 400 minutos após
aplicação, e os animais que receberam a toxina incubada com o clone F7 de scFv morreram
no intervalo de 150 e 420 minutos após a aplicação. Os resultados expressos em forma de
gráfico na Figura 18, indicam que os dois clones conseguiram aumentar a sobrevida dos
animais nos dois casos, sendo ambos mais eficientes contra a crotoxina. O clone F7 de scFv
demonstrou também ser mais eficiente do que o clone C3 tanto para retardar a letalidade do
veneno bruto de Crotalus durissus terrificus como para a crotoxina.
74
Figura 18: Ensaio de inibição da letalidade do veneno bruto de Cdt (A) e CTX (B) pelos
clones C3 e F7 de fragmentos de anticorpos. Foram usados no ensaio 15 µg do veneno bruto
de Crotalus durissus terrificus e 10 µg da crotoxina. Injetaram-se intraperitonialmente (i.p.)
100 µL do incubado de Cdt ou CTX na proporção de 1:48 com os clones C3 ou F7 de scFv.
Os grupos controles receberam ou PBS ou 15 µg de Cdt ou 10 µg de CTX ou 240 µg de cada
um dos clones testados. O gráfico representa em porcentagem a sobrevida dos animais de
cada um dos grupos.
0 25 50 75 100 125 150 175 200
0
25
50
75
100
Cdt (15µg)
Cdt + C3 (1:48)
C3 (480mg)
Tempo (minutos)
% Sobrevivência
0 25 50 75 100 125 150 175 200
0
25
50
75
100
Cdt (15mg)
Cdt + F7 (1:48)
F7 (480mg)
Tempo (minutos)
% Sobrevivência
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
0
25
50
75
100
CTX (10µg)
CTX+C3 (1:48)
C3 (480mg)
Tempo (minutos)
% Sobrevivência
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
0
25
50
75
100
CTX (10mg)
CTX+F7(1:48)
F7(480mg)
Tempo(minutos)
% Sobrevivência
A
B
75
76
A seleção é um passo chave em qualquer tecnologia molecular de expressão, como a
do “phage-display”, e a escolha das condições utilizadas neste passo pode determinar a
eficiência da seleção e discriminar entre fagos com diferentes afinidades para o mesmo
antígeno. As seleções com antígenos purificados são essencialmente feitas de duas maneiras.
O antígeno pode ser preso a uma superfície sólida (plástico, resina ou esferas), a biblioteca de
fagos é colocada em contato com o antígeno, os fagos específicos continuam ligados após
lavagem e são eluídos com soluções ácidas ou alcalinas. Alternativamente, a seleção pode ser
feita com o antígeno em solução, usando antígeno biotinilado e os fagos anticorpos
específicos podem ser resgatados por incubação com esferas magnéticas marcadas com
estreptavidina ou outros ligantes que capturem o antígeno, como anticorpos. Os fagos-
anticorpos recuperados são subsequentemente amplificados por infecção em Escherichia coli
e posteriormente outros turnos de seleção são realizados, obtendo-se uma mistura de fagos-
anticorpos policlonais. Para se obter fagos-anticorpos monoclonais, células de E. coli são
infectadas com os fagos, plaqueadas e colônias isoladas são picadas. A principal vantagem de
este procedimento ser feito in vitro é que se pode escolher e manipular os passos. Assim, a
escolha da concentração do antígeno e do tempo e quantidade de lavagens podem definir a
eficiência da seleção, junto com a alta afinidade de anticorpos na população da biblioteca de
fagos-anticorpos. Por exemplo, anticorpos de baixa afinidade poderiam ser retidos pelo uso de
lavagens curtas ou uma alta densidade de cobertura do antígeno na superfície sólida.
(HOOGENBOOM et al, 2000; WINTER et al, 1994).
O método de seleção utilizado para este trabalho foi o de “bio-panning”, onde o
antígeno de interesse, no caso, o veneno bruto de Crotalus durissus terrificus, foi imobilizado
em uma superfície sólida, um imunotubo de poliestireno. Foram realizados quatro turnos de
seleção, sendo mantida a mesma concentração de antígeno em todos os passos, aumentando
apenas as lavagens a partir do segundo turno na tentativa de eliminar fagos-anticorpos de
77
baixa afinidade ou de ligantes inespecíficos. O aumento do título dos fagos-anticorpos eluídos
é um indicativo de sucesso na obtenção de fagos ligantes para os antígenos imobilizados
(McCAFFERTY; HOOGENBOOM; CHISWELL, 1996) e a diminuição do título de fagos-
anticorpos pode significar a perda de ligantes específicos. Neste trabalho, evidenciou-se no
terceiro turno uma queda no título de fagos eluídos, chegando a aproximadamente 1000 vezes
menos fagos recuperados do que no turno anterior, havendo uma boa recuperação apenas no
quarto turno de seleção, onde se verificou um aumento de 10.000 vezes mais fagos-anticorpos
se comparado ao terceiro turno de seleção (Figura 6A). Com relação aos fagos anticorpos
precipitados, o resultado do processo de amplificação foi satisfatório, já que o título de fagos
recuperados foi maior que o daqueles eluídos no mesmo turno de seleção (Figura 6B).
Observou-se apenas uma queda brusca no título dos fagos-precipitados do segundo para o
terceiro turno, o mesmo ocorrido com o título dos fagos eluídos, o que pode indicar uma falha
experimental neste turno.
A quantidade de fagos-anticorpos específicos para o veneno nos quatro turnos de
seleção foi acompanhada por ensaios imunoenzimáticos, utilizando os fagos-anticorpos
precipitados (Figura 7). Como resultado, obteve-se uma quase indetectável presença de fagos
específicos nos dois primeiros turnos, isto nas condições do ensaio, provavelmente pela baixa
afinidade dos fagos resgatados nestes primeiros turnos. A partir do terceiro turno de seleção
pode-se observar um aumento linear do título destes fagos-anticorpos capazes de se ligar ao
antígeno de interesse, o que demonstra o enriquecimento da afinidade adquirido em cada ciclo
de seleção (AZZAZY; HIGHSMITH, 2002). Portanto, a queda no título de fagos-anticorpos
viáveis no terceiro turno não resultou na perda de fagos específicos para o veneno bruto.
O próximo passo do trabalho foi a obtenção de fagos-anticorpos monoclonais
específicos para o antígeno estudado, para isso foram analisadas quatro placas de fagos
monoclonais produzidas a partir de fagos do quarto turno de seleção, já que, de acordo com o
78
ensaio de ELISA policlonal realizado, este foi o turno com o maior título de fagos-anticorpos
específicos para o veneno. Partiu-se então para a análise destas placas através de um ensaio de
ELISA monoclonal para se avaliar a capacidade de reconhecimento individual dos clones para
o veneno bruto. Neste passo pode-se verificar se a maioria dos clones isolados nas quatro
placas está realmente reconhecendo o antígeno de interesse e, caso não se obtivesse este
resultado, poder-se-ia confeccionar novas placas picando novas colônias de E. coli infectadas
com fagos-anticorpos do quarto turno de seleção. As análises feitas demonstraram que a
maioria dos clones presentes foi capaz de reconhecer o antígeno (dados não mostrados), sendo
que os mais positivos foram agrupados numa só placa (Figura 8). O próximo passo foi então
verificar se dentre os clones específicos agrupados nesta placa, um ou mais seriam capazes de
inibir a atividade fosfolipásica do veneno, que é induzida por várias toxinas e está relacionada
a outros efeitos tóxicos e biológicos provocados por ele. Lafaye et al (1996) e Cardoso et al
(2000), utilizaram-se de bibliotecas de fagos-anticorpos para selecionarem fagos específicos
para a crotoxina do veneno de Crotalus durissus terrificus, capazes de reconhecer epítopos
localizados na sua subunidade CB-PLA
2
. Nos dois trabalhos, os clones isolados foram
testados para a atividade enzimática de CB, no primeiro na forma de fago-anticorpo e no
segundo na forma de fragmento de anticorpo solúvel (scFv), mas nenhum clone foi capaz de
inibir essa atividade. Os autores obtiveram um clone capaz de potencializar a atividade
enzimática, mas nenhuma correlação com outras atividades farmacológicas foi observada.
Como já discutido por Tamarozzi (2005), a grande quantidade de clones a ser testada
quanto à capacidade de inibição da atividade fosfolipásica, induziu à padronização de um
novo ensaio em nosso laboratório, um método cinético em preferência aos métodos estáticos
existentes na literatura. A ação das toxinas com atividade fosfolipásica foi analisada, de forma
indireta, através do rompimento de membranas de hemácias em ensaio cinético de
turbidimetria. O ensaio é realizado em um comprimento de onda de 700nm, que nos permite
79
dizer que a absorbância da suspensão de eritrócitos de carneiro é diretamente proporcional à
concentração de células. Quando ocorre a ruptura de células, a absorbância da suspensão cai
numa proporção direta à de células lisadas. O ensaio se baseia na capacidade de as toxinas
agirem sobre a fosfatidilcolina da gema de ovo, quebrando-a em lisofosfatidilcolina
(MARINETTI, 1965). A lisofosfatidilcolina se acumula na membrana das hemácias
provocando o rompimento das mesmas. A hemólise medida é diretamente proporcional à
quantidade de lisofosfatidilcolina formada, que por sua vez correlaciona-se com a quantidade
de fosfolipase presente no meio. Outro fator importante é a presença íons cálcio no meio de
reação, já que a atividade fosfolipásica é cálcio-dependente. Este método permite obter
múltiplos dados a partir de uma única reação, aumentando a confiabilidade dos resultados.
Após determinar-se a quantidade de veneno bruto necessária para causar hemólise
total (Figura 9), passou-se a buscar clones candidatos à inibição da atividade fosfolipásica.
Para isso, analisou-se um total de 96 clones, que tinham sido agrupados de acordo com sua
especificidade ao veneno, como dito anteriormente. Foram identificados dois clones capazes
de inibir esta atividade estudada (Figura 10). Verificou-se então a capacidade de estes fagos-
anticorpos reconhecerem a crotoxina e sua porção fosfolipásica, a crotoxina B, que possui o
sítio conservado responsável pela atividade hemolítica. Esta toxina do veneno de Crotalus
durissus terrificus é responsável por 90% da toxicidade do veneno bruto e foi isolada por
Fraenkel-Conrat (1938), sendo a primeira neurotoxina animal a ser purificada e isolada
(FAURE; BON, 1987). Estudos indicaram um peso molecular de 30.000 e um ponto
isoelétrico (pI) de 4,7. Inicialmente, atribuiu-se a esta toxina tanto a atividade neurotóxica
como a capacidade hemolítica indireta do veneno (HENDON; FRAENKEL-CONRAT,
1971). Mais tarde, estas atividades foram atribuídas a proteínas diferentes. Estudos de
purificação da crotoxina revelaram a presença de duas subunidades heterogêneas em sua
composição. Uma proteína básica composta por uma única cadeia polipeptídica de 122
80
aminoácidos, de seqüência similar a de outras fosfolipases A
2
(FRAENKEL-CONRAT et al.,
1980; AIRD et al., 1986)
.
O peso molecular desta proteína tóxica e enzimaticamente ativa
varia entre 14.500 e 16.500, com um pI de 8,6 (HENDON; FRAENKEL-CONRAT, 1971).
Um outro componente ácido, não tóxico e sem atividade enzimática é formado por três
cadeias polipeptídicas ligadas por sete pontes dissulfeto (BREITHAUPT et al., 1974), tem
peso molecular entre 8.000 e 9.000 e pI de 3,4 (HORST et al., 1972). O resultado do ensaio
de ELISA revelou que os dois clones selecionados foram capazes de reconhecer tanto a
crotoxina na sua forma nativa como a sua porção básica isolada. Embora com intensidades
diferentes, ficou clara a maior afinidade de ambos os clones para CB, o que indica que esses
clones estariam se ligando à região do sítio catalítico que é conservado entre as fosfolipases
(Figura 11).
Após verificar a viabilidade dos fagos-anticorpos em reconhecer a principal
fosfolipase do veneno de Crotalus durissus terrificus, o passo seguinte foi produzir
fragmentos de anticorpos (scFv) solúveis destes clones para testar se a capacidade de inibição
da atividade fosfolipásica seria mantida. Durante a seleção de fagos-anticorpos, foram
utilizadas bactérias E. coli da linhagem TG1 (K12, ∆(lac-pro), supE, thi, hsdD5/F’traD36,
proA
+
B
+
, lacI
q
, lacZ∆M15) supressora para o códon de terminação UAG. Como este códon
de terminação está localizado na junção entre as seqüências dos genes para o scFv e para a
proteína pIII no vetor pHEN2 (H. Griffin, MRC, Cambridge, Reino Unido, dados não
publicados), a linhagem supressora não o reconhece e permite a produção da proteína pIII
fusionada ao scFv (HOOGENBOOM et al., 1991). A supressão do códon de terminação na
linhagem TG1 é apenas cerca de 20% eficiente e sendo assim, anticorpos solúveis (scFv)
podem ser produzidos durante os turnos de seleção (AMERSHAM BIOSCIENCES, 1995).
Porém, para a produção em quantidade adequada dos fragmentos de anticorpos solúveis,
foram utilizadas bactérias E. coli da linhagem não supressora HB2151 (K12, ara, ∆(lac-pro),
81
thi/F’proA
+
B
+
, lacI
q
Z∆M15). Esta linhagem, quando infectada por fagos-anticorpos, é capaz
de reconhecer o códon de terminação na extremidade 3’ do gene do scFv, promovendo a
síntese desta proteína separada da proteína viral pIII. O scFv produzido fica solúvel e é capaz
de ser secretado do periplasma para o meio extracelular, sendo facilmente recuperado no
meio de cultura. Para a eficiente produção de scFv, acrescentou-se ao meio de cultura IPTG,
um análogo da lactose, não metabolizável e capaz de induzir a expressão dos genes clonados
via o promotor lac, por meio da redução da afinidade do repressor lacI
q
ao seu sítio de ligação
DNA específico (GLASCOCK; WEICKERT, 1998). As bactérias foram cultivadas à
temperatura de 30
º
C, para o correto dobramento da proteína (GLICK, 1995).
Os fragmentos de anticorpos produzidos pela biblioteca “Griffin.1” apresentam
ligados a eles, peptídeos que facilitam a detecção e purificação das moléculas. Neste caso, os
peptídeos, ou “tags”, utilizados são o c-myc, um segmento da proteína oncogênica humana de
10 aminoácidos e 1200 Daltons, detectado pelo anticorpo monoclonal 9E10, e uma cauda de
hexa histidina (6xH), com 840 Daltons e que exibe forte interação com matriz de íons
metálicos imobilizados (revisão em TERPE, 2003). Soares (2005) utilizando a mesma
biblioteca, demonstrou uma aparente perda da atividade destes epítopos nos clones
produzidos, resultando na não identificação em ensaio de ELISA dos scFv produzidos,
quando se utilizou o anticorpo monoclonal 9E10. O mesmo se repetiu quando coluna IMAC
foi à escolhida para purificação. O mesmo tipo de problema foi enfrentado pelo grupo de
Lafaye (1997), que se utilizando a biblioteca de anticorpos provida por Nissim et al (1994),
selecionou anticorpos específicos para a crotoxina, mas ao tentar expressar fragmentos
solúveis (scFv), não conseguiu detectar qualquer ligação destes anticorpos à crotoxina em
ensaio de ELISA. Assim, eles não foram capazes de detectar qualquer expressão de scFv e os
ensaios de inibição das atividades enzimática e neurotóxica foram realizados com fagos-
anticorpos. A utilização de fagos-anticorpos limitaria a possibilidade de ensaios
82
farmacológicos que poderiam ser realizados em nosso trabalho, já que uma parte destes
ensaios seria in vivo. Desta forma, optou-se pela utilização de uma fração enriquecida de
scFv, obtida através de 500 mL de meio de cultura rico em scFv de cada clone, que foi
liofilizado e aplicado em coluna de cromatografia de 45x2cm contendo Sephadex G-75. O
perfil cromatográfico obtido indicou dois picos principais (Figura 12A). Como já
demonstrado em trabalhos anteriores no nosso laboratório a fração rica em scFv foi a primeira
fração eluída da coluna cromatográfica (TAMAROZZI, 2005), que corresponde ao volume de
exclusão da coluna, sugerindo que o fragmento de anticorpo poderia estar formando
agregados no meio de cultura. A formação destes agregados pode explicar a falha na detecção
dos “tags” observada por Soares (2005), pois este fenômeno pode resultar no mascaramento
do braço de histidina e do “myc-tag”. Os ensaios cinéticos de inibição da atividade
fosfolipásica foram realizados com esta fração 1 (Figura 14).
Depois de confirmada a capacidade de inibição da atividade enzimática pelos
anticorpos, resolveu-se verificar se a ligação destes interferia em outras atividades induzidas
pelo veneno. As fosfolipases compreendem uma grande família de proteínas, com mesma
função enzimática e considerável homologia. Elas compartilham entre 40-99% de identidade
na sua seqüência de aminoácidos. Estas enzimas têm sido identificadas e caracterizadas em
tecidos de mamíferos, artrópodes e venenos de serpentes. Recentemente, PLA
2
de mamíferos
têm sido implicadas em numerosos processos fisiopatológicos, incluindo reumatismos, asma,
psoríase e choque séptico (revisão MURAKAMI; KUDO, 2002). A estrutura primária de mais
de 150 PLA
2
s têm sido determinada e a estrutura tridimensional de muitas delas elucidadas
por cristalografia de raios-X e por ressonância magnética nuclear (revisão ARNI; WARD,
1996). Como enzimas elas catalisam a hidrólise da ligação 2-acil éster de 3-sn-fosfolipídeos,
liberando como produtos da reação ácidos graxos livres e lisofosfolipídeos. O íon Ca
2+
, um
cofator essencial e um resíduo Asp na posição 49 são requeridos para a lise de substratos
83
artificiais. A integridade do resíduo His48 é um requerimento adicional e a sua alquilação por
BPB causa uma perda da atividade enzimática e de alguns efeitos farmacológicos
relacionados (RODRIGUES et al., 1998; SOARES et al., 2000a, b; SOARES et al, 2001a, b).
Em adição a sua função catalítica primária de hidrólise dependente de Ca
2+
, fosfolipases A
2
de
veneno de serpentes apresenta muitos efeitos biológicos, como neurotoxicidade pré ou pós-
sináptica, cardiotoxicidade, miotoxicidade, indução ou inibição de agregação plaquetária,
edema, hemólise, anti-coagulação, convulsão e hipotensão (ROSENBERG, 1989; KINI,
1997; GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1997; OWNBY, 1998; OWNBY et al., 1999). As relações
entre estrutura e função de muitas fosfolipases A
2
têm sido extensivamente estudadas e muitas
metodologias têm sido exploradas para esta finalidade, como modificações químicas de
resíduos de aminoácidos específicos, mutagênese sítio dirigida, técnicas cristalográficas,
espectrofotométricas e fluorométricas, ressonância magnética nuclear além de estudos de
ligação com inibidores e substratos naturais e artificiais. A tradicional modificação química de
aminoácidos específicos e os conseqüentes efeitos nas atividades enzimáticas e
farmacológicas das PLA
2
s tem sido a principal estratégia usada para explorar a relação
estrutura-função (revisão em SOARES; GIGLIO, 2003). A crotoxina, principal componente
do veneno das serpentes da espécie Crotalus durissus terrificus, tem responsabilidade pela
maioria dos efeitos neurotóxicos e miotóxicos característicos do envenenamento por esta
espécie. Em adição, a crotoxina constitui um interessante caso de sinergismo molecular onde
a sua subunidade A, não tóxica, potencializa a toxicidade da subunidade B, enzimaticamente
ativa. CB, uma PLA
2
-Asp49, apresenta atividade de bloqueio neuromuscular e induz
miotoxicidade. Ainda assim, a toxicidade desta subunidade é menor do que o do complexo
crotoxina (BON, 1997). Nossos resultados se estendem ao perfil farmacológico de CB, desde
que este induz atividade anticoagulante, efeitos miotóxicos, de indução de edema, bactericida
84
e de ruptura lipossomal (VERHEIJ et al., 1980) e à letalidade do complexo crotoxina e
veneno total.
Neste trabalho, utilizando os dois clones produtores de scFv selecionados com
capacidade comprovada de inibição da atividade enzimática de CB-PLA
2
, não observou-se, in
vitro, inibição da atividade anticoagulante desta mesma toxina (Figura 15). Este resultado
veio confirmar estudos realizados em nosso laboratório, onde foram isolados quatro clones de
scFv, capazes de inibir a atividade enzimática das principais fosfolipases do veneno de B.
jararacussu, mas que também não interferiram na atividade anticoagulante de BthTx-II
(TAMAROZZI, 2005). Na literatura, temos encontrado trabalhos conflitantes sobre a relação
entre as atividades enzimática e anticoagulante. Boffa e Boffa (1976) em estudos também
realizados com anticorpos, no caso policlonais, contra uma toxina anticoagulante de Vipera
berus sugere que não há participação do sítio catalítico na atividade anticoagulante. Em
contrapartida, Soares et al (2001b), através de modificações químicas na estrutura da
crotoxina B com brometo de p-bromofenacila (BPB), um reagente que alquila
especificamente o resíduo de histidina no sítio ativo das moléculas de fosfolipase A
2
,
verificaram que a atividade anticoagulante foi modificada similarmente à atividade
enzimática, evidenciando a dependência deste efeito catalítico na atividade anticoagulante.
Apesar disto, os autores sugerem uma mudança conformacional causada por BPB em outras
regiões da molécula, que não o sítio catalítico, questionando assim estes estudos de estrutura-
função. A ocorrência de uma modificação conformacional na toxina após o reconhecimento
pelos anticorpos monoclonais também é uma possibilidade que não pode ser descartada neste
trabalho. Mas, o resultado obtido com os dois clones que foram utilizados de forma distinta no
ensaio somado com os resultados obtidos por Tamarozzi (2005), onde foram testados quatro
clones de scFv, que possivelmente reconhecem epítopos distintos nas fosfolipases A
2
testadas,
quase impossibilita as chances de estar ocorrendo a mesma mudança conformacional.
85
As miotoxinas apresentam estrutura de fosfolipase A
2
podendo ou não apresentar
atividade catalítica. Ou seja, podendo ou não hidrolisar fosfolipídeos da gema do ovo.
Aquelas que são cataliticamente ativas possuem um resíduo aspartato na posição 49,
responsável pela ligação do cálcio, enquanto que aquelas sem atividade ou com atividade
catalítica residual apresentam, na posição 49, um resíduo de lisina. Muitas observações com
fosfolipases A
2
-Lys49 miotóxicas de veneno de Bothrops sp, mostram que modificações
feitas nos resíduos de histidina com BPB reduzem parcialmente a atividade miotóxica e outras
atividades farmacológicas das variantes enzimaticamente inativas. Desta forma, pode-se
sugerir que a atividade enzimática e miotóxica estão dissociadas. Porém, Gopalakrishnakone
(1984) mostrou que neurotoxicidade e miotoxicidade da crotoxina são drasticamente
reduzidas depois da alquilação do resíduo His48, indicando a influência da atividade
enzimática na atividade miotóxica. Soares et al (2001b) concordaram com estes resultados,
mostrando que a atividade enzimática, bem como, letalidade e miotoxicidade, foram
drasticamente reduzidas por esta modificação, estreitando a hipótese de que a hidrólise
fosfolipídica enzimática está envolvida nestes efeitos, enquanto que a indução de edema foi
somente parcialmente afetada neste mesmo trabalho. Tendo em vista a publicação de
resultados conflitantes acerca da influência da atividade fosfolipásica sobre as atividades
farmacológicas, os dois clones foram também testados em ensaios de neutralização das
atividades miotóxica e de indução de edema da PLA
2
– CB e em ensaios de neutralização da
letalidade do veneno bruto de Cdt e da crotoxina.
Os dois anticorpos selecionados foram capazes de inibir totalmente a atividade
enzimática da PLA
2
-CB, como foi discutido anteriormente. Com relação ao ensaio de
miotoxicidade, os resultados obtidos indicam que estes anticorpos, ao se ligarem à enzima,
influenciam este efeito farmacológico, induzindo uma inibição parcial (Figura 16). O clone F7
foi mais eficiente em inibir a miotoxicidade de CB, comparado com C3. No entanto, os
86
resultados demonstram que este clone é incapaz de inibir totalmente a atividade miotóxica nas
condições do ensaio, haja vista que não houve diferença nos níveis de CK quando se usou o
clone F7 nas proporções de 1:12 e de 1:24. Assim, apesar de o fato da miotoxicidade
depender da habilidade de CB em interagir e desorganizar membranas, como acontece na
atividade enzimática, a correlação parcial entre estas duas atividades sugere que diferentes
mecanismos ou regiões moleculares distintas podem estar envolvidos.
Gutiérrez e Lomonte (1995; 1997) propuseram uma hipótese para o mecanismo de
ação das miotoxinas de venenos botrópicos, onde as miotoxinas ligar-se-iam a um sítio não
identificado (uma proteína, fosfolipídio ou receptor) na membrana plasmática de células
musculares. Assim, poderia haver uma interação eletrostática entre o sítio catiônico das
toxinas e grupos carregados negativamente na membrana. Após a ligação inicial, as
miotoxinas penetrariam a bicamada por uma interação hidrofóbica mediada pela região
citotóxica da molécula, distinta do sítio catalítico. Desta forma, o (s) domínio (s) tóxico (s)
hipotético deveria estar presente tanto nas variantes enzimaticamente ativas quanto nas
inativas. A penetração da região citolítica no centro hidrofóbico da bicamada seria
responsável pela desorganização e ruptura, levando a um prejuízo na regulação da
permeabilidade de íons e macromoléculas. Além dessa perturbação inicial na estrutura da
membrana, as variantes miotóxicas enzimaticamente ativas induziriam, também, um dano
devido à hidrólise dos fosfolipídeos da bicamada. A conseqüência mais relevante do distúrbio
causado na membrana seria provavelmente o influxo de cálcio, responsável pelo início de
uma variedade de mecanismos degenerativos (SOARES, 2000).
No caso da miotoxina Lys-49 II de B. asper, que apresenta reação cruzada
imunológica com CB, tem sido proposto que resíduos básicos e hidrofóbicos, localizados na
região C-terminal da molécula, são responsáveis pelos efeitos miotóxicos e citolíticos
ocasionados por esta toxina. (GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1997; LOMONTE et al, 1994). Isso
87
veio confirmar resultados obtidos por Francis et al (1951) que observaram que PLA
2
s
miotóxicas de venenos de serpentes, incluindo CB, têm uma série de resíduos Tyr localizados
nesta região C-terminal da molécula. Estes resíduos de tirosina podem contribuir para a
combinação hidrofóbico-catiônica proposta como tendo papel na miotoxicidade e
citotoxicidade (GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1997). Outros estudos têm mostrado que uma
série de resíduos Lys localizados na superfície das PLA
2
s tóxicas apresenta papel na
miotoxicidade (SOARES et al, 2001b). Todos estes resultados indicam que outras regiões
moleculares, fora do sítio catalítico, estão envolvidas na miotoxicidade. Já do ponto de vista
imunológico, os anticorpos mostraram sua relevância, já que duas atividades importantes do
veneno foram inibidas ou parcialmente inibidas, sendo assim, fortes candidatos para um
imunoterápico.
A mesma influência parcial dos anticorpos testados foi observada quanto à atividade
de indução de edema e de letalidade. Os resultados obtidos no ensaio de indução de edema
corroboram com os resultados de Soares et al (2001b), ambos mostrando a influência parcial
da atividade enzimática nesta atividade farmacológica de CB (Figura 17). Tem sido sugerido
que pelo menos um mecanismo de indução de edema envolva a liberação do ácido aracdônico
e de fosfolipídios de membrana mostrando, assim, a influência da atividade catalítica na
indução de edema (CHAVES, BARBOZA & GUTIÉRREZ, 1995). Estudos realizados por
modificação química com BPB em PLA
2
-Asp49 de Bothrops asper (Basp-III) demonstraram
a manutenção de 40 a 50% da atividade de indução de edema na toxina modificada em
relação à toxina nativa. Estes resultados sugerem a participação da atividade catalítica na
formação do edema, provavelmente através da liberação de precursores da biossíntese de
eicosanóides e de fatores de agregação de plaqueta (CHAVES et al., 1998). As observações
obtidas neste trabalho sugerem que há influência da atividade enzimática na formação do
edema.
88
No ensaio de letalidade conseguiu-se obter um aumento da sobrevida dos animais com
os dois clones testados, sendo o efeito de inibição mais evidente contra a letalidade
ocasionada pela crotoxina em relação ao veneno total (Figura 18). Este resultado pode ser
explicado pelo fato de o veneno bruto ser composto por muitas outras toxinas, além das
fosfolipases A
2,
para as quais os anticorpos monoclonais em questão foram selecionados. Até
o início da década de 80, acreditava-se que o veneno da cascavel sul-americana possuía, como
principais componentes, toxinas com atividade hemolítica e neurotóxica (ROSENFELD,
1971). Hoje, são atribuídas à peçonha de C. durissus terrificus atividades miotóxica,
neurotóxica, hematotóxica, nefrotóxica e hepatotóxica, decorrentes de uma série de toxinas
presentes em sua composição (crotoxina, crotamina, giroxina e convulxina) e outros
componentes como 5-nucleotidases, fosfodiesterases, enzima tipo trombina, L-
aminoacidoxidases, enzimas tipo calicreína tecidual e hidrolase do NAD+ (ROSENFELD,
1972; ROSA et al., 1973; LAURE, 1975a,b; BERCOVICI et al, 1987). Provavelmente os
anticorpos foram mais eficientes em relação à letalidade ocasionada pela crotoxina, devido à
ausência de muitos destes componentes e por esta ter em sua composição uma fosfolipase A
2
(CB) com a região enzimática conservada que é reconhecida pelos anticorpos em teste. Desta
forma, estes resultados nos sugerem que, como observado para as atividades miotóxica e de
edema, outras atividades como a neurotoxicidade e toxicidade, podem estar sendo
influenciadas pela ligação dos anticorpos. Soares et al (2001b), através de modificações
químicas em resíduos específicos na molécula de CB, demonstraram a influência da atividade
enzimática na toxicidade desta fosfolipase A
2
. Além disso,
discutiram que a região N-terminal
e parte do sítio de reconhecimento interfacial das fosfolipases A
2
estariam envolvidas na
toxicidade em um número destas toxinas, como também evidenciado em outros trabalhos
(DIAZ et al., 1994; SOARES et al., 2000a).
89
Os resultados obtidos com o uso de anticorpos monoclonais podem trazer grandes
avanços nos estudos da correlação de estrutura-função das diferentes toxinas. Modificações
químicas, amplamente usadas atualmente para este objetivo, podem afetar outras regiões da
molécula além do sítio catalítico. Diferentes aminoácidos estão envolvidos no sítio catalítico
da atividade fosfolipásica e anticorpos monoclonais capazes de interagir com este sítio, porém
em pontos distintos, podem diminuir o efeito da mudança conformacional sobre outras regiões
da molécula, conforme sugerido acima. Estudos realizados com miotoxinas PLA
2
-Lys49 de
Bothrops pirajai (PrTX-I) mostraram que o tratamento com brometo cianogênico (CNBr)
revelou detectáveis mudanças na estrutura secundária desta toxina (SOARES et al., 2001a).
Blacwell e Flower (1983) já demonstraram que BPB liga-se irreversivelmente, além de
na histidina 48, em grupos tiol e em outros aminoácidos presentes em enzimas que não
possuem a atividade fosfolipásica. Desta forma, os resultados obtidos com os anticorpos
indicam, de maneira mais clara, a participação parcial da atividade catalítica nas atividades
miotóxica e de indução de edema, mas não na anticoagulante de CB. Além disso, esta
atividade influencia na letalidade da crotoxina e do veneno bruto de Crotalus durissus
terrificus. Dúvidas sobre esta afirmação poderão ser sanadas após um estudo mais
aprofundado, utilizando anticorpos purificados aliados a técnicas como cristalografia e
seqüenciamento para a determinação dos epítopos reconhecidos pelos anticorpos e possíveis
mudanças conformacionais ocorridas nas toxinas. Além disso, esses anticorpos, após uma
completa purificação, seriam candidatos promissores a participar de uma mistura de
anticorpos monoclonais humanos específicos para as diferentes toxinas presentes nos
venenos, uma nova alternativa à soroterapia existente atualmente.
90
91
Com base nos resultados obtidos, pode-se concluir que:
1. A estratégia de seleção de fagos-anticorpos contra o veneno bruto de
Crotalus durissus terrificus utilizada neste trabalho demonstrou ser eficaz
para a identificação de antígenos de interesse e obtenção de fagos-
anticorpos monoclonais específicos para toxinas do veneno com
atividade fosfolipásica.
2. A biblioteca “Griffin.1” se apresentou como uma ferramenta viável para a
obtenção de fagos-anticorpos específicos para os antígenos estudados.
Dificuldades encontradas na obtenção de fragmentos solúveis de
anticorpos puros serão posteriormente investigadas.
3. Os anticorpos monoclonais selecionados capazes de inibir a atividade
fosfolipásica mostraram ser também capazes de inibir parcialmente as
atividades miotóxica e de formação de edema da PLA
2
-CB em ensaios in
vivo. Também foram capazes de aumentar a sobrevida dos animais no
ensaio de letalidade com veneno bruto de Crotalus durissus terrificus e
crotoxina, sugerindo a possibilidade de uma influência da atividade
catalítica nestas atividades.
4. Os resultados aqui obtidos indicam, promissoramente, a possível utilização
dos anticorpos selecionados como imunoterápicos.
92
93
- AIRD, S.D.; KAISER, I.I.; LEWIS, R.V. E KRUGGEL, W.G. A complete amino acid
sequence for the basic subunit of crotoxin. Arch Biochem Biophys. Sep;249(2):296-300,
1986.
- AMARAL, C.F.S.; SILVA, O.A.; LOPEZ, M.; PEDROSO, E.R.P. Afibrinogenenia
following snake bite (Crotalus durisssus terrificus). Amer. J. Trop. Hyp.29, 1453-1455,
1980.
- ALVARADO, J.; GUTIÈRREZ, J.M. Anticoagulant effect of myotoxic phospholipase A
2
isolated from the venom of the snake Bothrops asper (Viperidae). Rev. Biol. Trop., v. 36,
n. 2B, p. 563-565, 1988.
- AMERSHAM BIOSCIENCES, 1995. HRP/anti-E tag conjugate, instructions. Disponível:
<https://www.jp.amershambiosciences.com/tech_support/manual/pdf/
recrpas/xy0620001_v1.pdf. Acesso em: 23 jun. 2005.
- AMORIN, M.F.; MELLO, R.F. Nefrose do néfron intermediário no envenenamento
crótálico humano. Estudo anatomatológico. Mem. Inst. Butantan 24, 281-316.
- ARNI, R.K.; WARD, R.J. Phospholipase A
2
– A structural review. Toxicon, v. 34,
p. 827-841, 1996.
- AZZAZY, H.M.; HIGHSMITH, W.E. Jr. Phage display technology: clinical applications
and recent innovations. Clin Biochem. Vol. 35(6):425-45, 2002.
- AZEVEDO-MARQUES, M.M.; CUPO, P.; COIMBRA, T.M.; HERING, S.E.; ROSSI,
M.A.; OLIVEIRA, J.A. Mionecrose e inuficiência renal aguda mioglobinúrica após
acidente crotálico. Anais do Congresso da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 18,
J2. Ribeirão Preto- SP, 1982.
94
- BANCHER, W.; ROSA, R.R.; FURLANETO R.S. Estudos sobre a fixação seletiva e
quantitativa do veneno de Crotalus durissus terrificus nos tecidos nervoso, renal, hepático
e muscular de Mus musculus linnaeu, 1758. Menb. Inst. Butantan 37, 139-148, 1973.
- BARRIO, A. Gyroxin a new neurotoxin of Crotalus durissus terrificus venom. Acta.
Physiol. Latinoam. 11 (4), 221, 1961.
- BARRIO, A.; VITAL BRAZIL, O. Neuromuscular action of the Crotalus durissus
terrificus (Laur.) poisons. Acta. Physiol. Latinoam. 1, 291, 1951.
- BERCOVICI, D.; CHUDZINISKI, A.M.; DIAS, N.º; ESTEVES, M.I.; HIRAICHI, E.;
OISHI, N.Y.; PICARELLIL, Z.P.; ROCHA, M.C.; UEDA, C.M.P.M.; YAMANOUYE,
N.; RAW, L. A systematic fraction of Crotalus durissus terrificus venom. Mem. Inst.
Butantan 49, 69-78, 1987.
- BETTER M., CHANG C.P., ROBINSON R.R., HORWITZ A.H. Escherichia coli
secretion of an active chimeric antibody fragment. Science, 240:1041-1043, 1988.
- BLACKWELL, G.J.; FLOWER, R.J. Inhibition of phospholipase. Br Med Bull. Review
Jul;39(3):260-4, 1983.
- BOFFA M.C.; BOFFA, G.A. A phospholipase A
2
with anticoagulant activity. II.
Inhibition of the phospholipid activity in coagulation. Biochim. Biophys. Acta, v. 429, p.
839–852, 1976.
- BON, C. Multicomponent neurotoxic phospholipases A2, in: R.M. Kini (Ed.), Venom
phospholipase A2 Enzymes: Structure, Function and Mechanism, Wiley, Chichester. pp.
269–285, 1997.
- BON, C.; CHANGEUX, J.P.; JENG, T.W.; FRAENKEL-CONRAT, H. Postsynaptic
effects of crotoxin and of its isolated subunits. Eur. J. Biochem., v. 99, n. 3, p. 471-481,
1979.
95
- BREEDVELD, F.C. Therapeutic monoclonal antibodies. Lancet. 26;355(9205):735-40.
Review, 2000.
- BREITHAUPT, H.; RUBSAMEN, K.; HABERMANN, E. Biochemistry and
pharmacology of the crotoxin complex. Biochemical analysis of crotapotin and the basic
Crotalus Phospholipase A
2
. Eur J Biochem. Nov 15;49(2):333-45, 1974.
- CAI, X.; GAREN, A. Anti-melanoma antibodies from melanoma patients immunized with
genetically modified autologous tumor cells: selection of specific antibodies from single-
chain Fv fusion phage libraries. Proc Natl Acad Sci U S A. 3;92(14):6537-41, 1995.
- CARDOSO, D.F.; NATO, F.; ENGLAND, P.; FERREIRA, M.L.; VAUGHAN, T.J.;
MOTA, I.; MAZIE, J.C.; CHOUMET, V.; LAFAYE, P. Neutralizing human anti crotoxin
scFv isolated from a nonimmunized phage library. Scand. J. Immunol., v. 51, p. 337-344,
2000.
- CARTER, P.; BEDOUELLE, H.; WINTER, G. Improved oligonucleotide site-directed
mutagenesis using M13 vectors. Nucleic Acids Research, v. 13, n. 12, p. 4431-4443, 1985.
- CHANG C.C., TSENG K.H. Effect of crotamine, a toxin of South American rattlesnake
venom, on the sodium channel of murine skeletal muscle. Br J Pharmacol. Vol 63(3):551-
9, 1978.
- CHAVES, F.; BARBOZA, M.; GUTIÈRREZ, J.M. Pharmacological study of edema
induced by venom of the snake Bothrops asper (terciopelo) in mice. Toxicon, v. 33, n. 1,
p. 31-39, 1995.
- CHAVES F., LEON G, ALVARADO V.H., GUTIERREZ J.M. Pharmacological
modulation of edema induced by Lys-49 and Asp-49 myotoxic phospholipases A2
isolated from the venom of the snake Bothrops asper (terciopelo). Toxicon. Vol
36(12):1861-9, 1998.
96
- CHIPPAUX, J.P.; GOYFFON, M. Venoms, antivenoms and immunotherapy. Toxicon, v.
36, n. 6, p. 823-846, 1998.
- CLACKSON, T.; HOOGENBOOM, H.R.; GRIFFITHS, A.D.; WINTER, G. Making
antibodies fragments using phage display libraries. Nature, v. 352, p. 624-628, 1991.
- van Deenen, L.L.M; de Haas, G.H. The substrate specificity of phospholipase A
2.
Biochim. Biophys. Acta 70, 538-553, 1963.
- DENNIS, E.A. Diversity of group types, regulation, and function of phospholipase A
2
. J
Biol. Chem., v. 269, n. 18, p.13057-13060, 1994.
- DIAZ C.; ALAPE A.; LOMONTE, B.; OLAMENDI, T.; GUTIERREZ, JM. Cleavage of
the NH2-terminal octapeptide of Bothrops asper myotoxic lysine-49 phospholipase A2
reduces its membrane-destabilizing effect. Arch Biochem Biophys. Vol 1;312(2):336-
9,1994.
- FALCONI, M.; DESIDERE, A.; RUFINI, S. Membrane-perturbing activity of Viperidae
myotoxins: an electrostatic surface potential approach to a puzzling problem, J. Mol.
Recogn. 13 14–19, 2000.
- FAURE, G.; BON, C. Several isoforms of crotoxin are present in individual venoms from
the South American rattlesnake Crotalus durissus terrificus. Toxicon 25, 229-234, 1987.
- FERNAND, D.; LAMBEAU, G.; VALENTIN, E.; LEFEBVRE, J.C.; LAZDUNKY, M.;
DOGLIO, A. secreted phospholipase A
2
, a new class of HIV inhibitors that blocks virus
entry into host cells. J. Clin. Invest. 104, 611-618., 1999.
- FLETCHER, J.E.; RAPUANO, B.E.; CONDREA, E.; YANG, C.C.; RYAN, M.;
ROSENBERG, P.Comparison of a relatively toxic phospholipase A
2
from Naja nigricollis
snake venom with that of a relatively non-toxic phospholipase A
2
from Hemachatus
97
haemachatus snake venom II. Pharmacological properties in relationship to enzymatic
activity. Biochem Pharmacol., v. 29, n. 11, p. 1565-74, 1980.
- FRAENKEL-CONRAT, H.; JENG, T.W.; HSTANG, M. Biological activities and amino
acid sequence of crotoxin B. In: Natural toxins. Inter-Symps. Animal, Plant and microbial
toxins 6 Proc. (Faker, D. & Wadström, T. eds.) Oxford, New York, Pergamon Press,
1980.
- FRANÇA, F.O.S.; FAN, H.W. In: Plantas venenosas e animais peçonhentos.
(Schvartsman, S. ed.). 2
ª
ed., Sarvier, São Paulo, 1992.
- GIBSON, T.J. Studies on the Epstein-Barr virus genome. 1984. Ph.D. thesis, University of
Cambridge, Cambridge, United Kingdom.
- GLASCOCK, C.B.; WEICKERT, M.J. Using chromosomal lacIQ1 to control expression
of genes on high-copy-number plasmids in Escherichia coli. Gene, v. 223, n. 1-2, p. 221-
231, 1998.
- GLASER, K.B.; MOBILIO, D.; CHANG, J.Y.; SENKO, N. Phospholipase A
2
enzymes:
regulation and inhibition. Trends Pharmacol. Sci., v. 14, n. 3, p. 92-98, 1993.
- GLICK, B.R. Metabolic load and heterologous gene expression. Biotechnology Advances,
v. 13, n. 2, p. 247-261, 1995.
- GOPALAKRSHNAKONE, P.; DEMPSTER, D.W.; HAWGOOD, B.J.; ELDER, H.Y.
Cellular and mitochondrial changes induced in the structure of murine skeletal muscle by
crotoxin, a neurotoxic phospholipase A2 complex. Toxicon, v. 22, p. 85-98, 1984.
- GONÇALVES, J.M. & VIEIRA, L.G. Estudos sobre venenos de serpentes brasileiras I.
Análise eletroforética. Anais Acad. Bras. Ciênc. 22,141, 1950.
- GRAUS, Y.F., de BAETS, M.H., PARREN, P.W., BERRIH-AKNIN, S., WOKKE, J.,
VAN BREDA VRIESMAN, P.J., BURTON, D.R. Human anti-nicotinic acetylcholine
receptor recombinant Fab fragments isolated from thymus-derived phage display libraries
98
from myasthenia gravis patients reflected predominant specificities in serum and block the
action of pathogenic serum antibodies. J. Immunol., 158:1919-1929, 1997.
- GRIFFITHS, A.D.; WILLIAMS, S.C.; HARTLEY, O.; TOMLINSON, I.M.;
WATERHOUSE, P.; CROSBY, W.L.; KONTERMANN, R.E.; JONES, P.T.; LOW,
N.M.; ALLISON, T.J.; PROSPERO, T.D.; HOOGENBOOM, H.R.; NISSIM, A.; COX,
J.P.L.; HARRISON, J.L.; ZACCOLO, M.; GHERARDI, E.; WINTER, G. Isolation of
high-affinity human-antibodies directly from large synthetic repertoires. EMBO Journal,
v. 13, n. 14, p. 3245-3260, 1994.
- GUTIÉRREZ J.L., LOMONTE, B. Phospholipase A2 myotoxins from Bothrops snake
venoms, in: R.M. Kini (Ed.), Venom Phospholipase A62 Enzymes: Structure, Function,
and Mechanism, Wiley, England, pp. 321–352, 1997.
- de HAARD, H.; HENDERIKX, P.; HOOGENBOOM, H. R. Creating and engineering
human antibodies for immunotheraphy. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 31, p. 5-31,
1998.
- HENDON, R.A.; FRAENKEL-CONRAT, H. Biological roles of the two components of
crotoxin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68 1560–1563, 1971.
- HOOGENBOOM, H.R.; GRIFFITHS, A.D.; JOHNSON, K.S.; CHISWELL, D.J.;
HUDSON, P.; WINTER, G. Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage:
methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Nucleic Acids
Research, v. 19, p. 4133-4137, 1991.
- HOOGENBOOM H.R.; CHAMES, P. Natural and designer binding sites made by phage
display technology. Immunol Today. Review. Vol. 21(8):371-8, 2000.
- HUANG, H.C. Release of slow reacting substance from the guinea-pig lung by
phospholipases A2 of Vipera russelli snake venom. Toxicon, v. 22, n. 3, p. 359-372, 1984.
99
- KETELHUT, D.F.; DE MELLO, M.H.; VERONESE, E.L.; ESMERALDINO, L.E.;
MURAKAMI, M.T.; ARNI, R.K.; GIGLIO, J.R.; CINTRA, A.C.; SAMPAIO, S.V.
Isolation, characterization and biological activity of acidic phospholipase A2 isoforms
from Bothrops jararacussu snake venom.Biochimie. Vol. 85(10):983-91, 2003.
- KINI, R.M.; EVANS, H.J. A common cytolytic region in myotoxins, hemolysins,
cardiotoxins and antibacterial peptides. Int J Pept Protein Res. Vol. 34(4):277-86, 1989.
- KINI R.M., EVANS H.J., Structure-function relationships of phospholipases. The
anticoagulant region of phospholipases A2, J. Biol. Chem. Vol. 262, 14402–14407, 1987.
- KÖHLER, G.; MILSTEIN, C. Continuous culture of fused cells secreting antibody of
predefined specificity. Nature, v. 256, p. 495-497, 1975.
- LAFAYE, P.; NATO, F.; MAZIE, J.C.; DOYEN, N. Similar binding properties for a
neutralizing anti-tetanus toxoid human monoclonal antibody and its bacterially expressed
Fab. Res Immunol. Vol. 147(1):61, 1996.
- LAFAYE, P.; CHOUMET, V.; DEMANGEL, C.;BOM, C.; MAZIE, J.C. Biologically
active human anti-crotoxin scFv isolated from a semi-synthetic phage library.
Immunotechnology. Vol.3(2):117-25, 1997.
- LALLOO, D.G.; THEAKSTON, R.D. Snake antivenoms. J. Toxicol. Clin. Toxicol., v. 41,
n. 3, p.277-290, 2003.
- LLORET, S.; MORENO, J.J. Edema formation and degranulation of mast cells by
phospholipase A
2
purified from porcine pancreas and snake venoms. Toxicon 31, 949-956.
- LAURE, C.J. Estrutura primária da crotamina. Tese de livre Docência-Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto-USP, 1975 a.
- LAURE, C.J. Die Primärstruktur des crotamins. Hoppe_Zeyller’s. Phisiol. Chem. 365,
213-215, 1975 b.
100
- MANCIN, A.C. Aspectos estruturais e funcionais da crotamina nativa e quimicamente
modificada. 2001. 165 f. Tese (Doutorado em Ciências, área de concentração em
bioquímica)- Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo,
Ribeirão Preto, 2001.
- MANCIN, A.C. Ação analgésica da crotamina e de outros peptídeos da peçonha de
Crotalus durissus terrificus. 1997. 106 f. Dissertação (Mestrado em Ciências, área de
concentração em bioquímica)- Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de
São Paulo, Ribeirão Preto, 1997.
- MANCUSO, L.C.; CORREA, M.M.; VIEIRA, C.A.; CUNHA, O.A.; LACHAT, J.J.; DE
ARAUJO, H.S.; OWNBY, C.L.; GIGLIO, J.R. Fractionation of Bothrops pirajai snake
venom: isolation and characterization of piratoxin-I, a new myotoxic protein. Toxicon, v.
33, n. 5, p. 615-26, 1995.
- Manual de Vigilância Epidemiológica: Acidentes por animais peçonhentos. Identificação,
Diagnóstico e Tratamento. Secretaria de Estado da Saúde, Imprensa Oficial do Estado de
São Paulo, IMESP, 1993.
- MARINETTI, G.V. The action of phospholipase A on lipoproteins. Biochim. Biophys.
Acta, v. 98, p. 554-565, 1965.
- MARKUS, J.D. Human monoclonal antibodies from V-generepertoires expressed on
bacteriophage. In Antibody Engineering. Borrebaeck, C.A.K., Oxford University Press,
Oxford, 2
º
Ed., 1995.
- MAYNARD, J.; GEORGIOU, G. Antibody engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng., v. 2,
p. 339-376, 2000.
- McCAFFERTY, J.; HOOGENBOOM, H.R.; CHISWELL, D.J. In:_____. Antibody
engineering: a pratical approach. 2º ed. Oxford: Oxford University Press, 1996.
101
- MCCAFFERTY, J.; GRIFFITHS, A.D.; WINTER, G.; CHISWELL, D.J. Phage
antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains.
Nature. 6;348(6301):552-4, 1990.
- MS (Ministério da Saúde) /FUNASA (Fundação Nacional de Saúde). Manual de
Diagnóstico e Tratamento de Acidentes por Animais Peçonhentos. Brasília:
MS/FUNASA, 2001.
- NISSIM, A.; HOOGENBOOM H.R.; TOMLINSON I.M. FLYNN, G.; MIDGLEY, G.;
LANE, D.; WINTER, G. Antibody fragments from a 'single pot' phage display library as
immunochemical reagents. EMBO J Vol 1;13(3):692-8, 1994.
- MOTA Jr, A.O. Inibição da atividade de uma nova serinoprotease isolada do veneno de
Botrops jararacussu utilizando a biblioteca de fragmentos de anticorpos recombinantes
Griffin.1. Ribeirão Preto, 2006. 103 f (Mestrado em Imunologia Básica e Aplicada).
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – São Paulo, 2006.
- MURAKAMI, M.; KUDO, I.; Phospholipase A2. J Biochem (Tokyo). Mar;131(3):285-92.
Review, 2002.
- OWNBY, CL. Structure, function and biophysical aspects of the myotoxins from snake
venoms. J.Toxicol. Toxins Reviews. v. 17, p. 213-238, 1998.
- OWNBY, C.L.; SELISTRE DE ARAUJO, H.S.; WHITE, S.P.; FLETCHER, J.E. Lysine
49 phospholipase A
2
proteins.Toxicon, v. 37, n. 3, p. 411-45, 1999.
- PÁRAMO L., LOMONTE B., PIZARRO-CERDA J., BENGOECHEA, J.A., GORVEL,
J.P., MORENO, E. Bactericidal activity of Lys49 and Asp49 myotoxic phospholipases
A2 from Bothrops asper snake venom. Synthetic Lys49 myotoxin II- (115–129)-peptide
identifies its bactericidal region, Eur. J. Biochem. Vol. 253 452–461, 1998.
102
- PERSSON, M.A.; CAOTHIEN, R.H.; BURTON, D.R. Generation of diverse high-affinity
human monoclonal antibodies by repertoire cloning. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88:2432-
2436, 1991.
- PLÜCKTHUN, A. Studying structure and function by directed evolution. Examples with
engineered antibodies. In Protein dynamics, function and design. Jardetzky et al., Plenum
Press, New York, 1998.
- PRADO-FRANCESCHI, J.. Estudo sobre convulxina. Tese de Doutoramento.
UNICAMP. Campinas-SP, 1970.
- RANGEL-SANTOS, A.; LIMA, C.; LOPES-FERREIRA, M. E CARDOSO, D.F.
Immunosuppresive role of principal toxin (crotoxin) of Crotalus durissus terrificus venom.
Toxicon. 44(6):609-16, 2004.
- RENETSEDER, R.; BRUNIE, S.; DIJKSTRA, B.W.; DRENTH J.; SIGLER, P.B. A
comparison of the crystal structures of phospholipase A
2
from bovine pancreas and
Crotalus atrox venom. J. Biol. Chem., v. 260, n. 21, p. 11627-11634, 1985.
- RIBEIRO, L.A.; PIRES DE CAMPOS, V.A.F.; ALBUQUERQUE, M.J.; TAKAOKA,
N.Y. Acidente ofídico no Estado de São Paulo. Rev. Assoc. Med. Brasil., v. 39, p. 4-7,
1993.
- RIVIERE, G.; CHOUMET, V.; AUDEBERT, F.; SABOURAD, A.; DEBRAY, M.;
SCHERRMANN, J.M.; BON, C. Effect of Antivenom on Venom Pharmacokinetics in
Experimentally Envenomed Rabbits: Toward an Optimization of Antivenom Therapy. J.
Pharmacol. Exp. Ther., v. 281, n. 1, p. 1-8, 1997.
- RODRIGUES, V.M.; SOARES, A.M.; MANCIN, A.C.; FONTES, M.R.; HOMSI-
BRANDEBURGO, M.I.; GIGLIO, J.R. Geographic variations in the composition of
myotoxins from Bothrops neuwiedi snake venoms: biochemical characterization and
103
biological activity. Comp Biochem Physiol - A Mol.Integr.Physiol., v. 121, n. 3, p. 215-
22, 1998.
- ROQUE, A.C.; LOWE, C.R.; TAIPA, M.A. Antibodies and genetically engineered
related molecules: production and purification. Biotechnol. Prog., v. 20, n. 3, p. 639-654,
2004.
- ROSA, R.R.; FOURLANETO, S.M.P.; VILAROEL, M.S. & ZELANTE, F. Contribuição
ao estudo da determinação da DL
50
do veneno de Crotalus durissus terrificus
(Laurenti,1768), em Mus musculus linnaeus, 1758, Mem. Inst. Butantan 37, 131-137,
1973.
- ROSENBERG, P. Phospholipases, in: W.T. Shier, D. Mebs (Eds.), Handbook of
Toxicology, Marcel Dekker, New York. pp. 67–277, 1990.
- ROSENFELD, G. Symptomatology, pathology and treatment of snake bites in South
America. In: ______. Venomous animals and their venomous 2, p. 345-403 (Bucherl, W
and Buckley, E.E., Eds). New York: Academic Press, 1971.
- RUBSAMEN, K.; BREITHAUPT, H.; HABERMANN, E. Biochemistry and
pharmacology of the crotoxin complex. I. Subfractionation and recombination of the
crotoxin complex. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmakol. 270(3):274-88, 1971.
- SCHVARTSMAN, S. Plantas Venenosas e Animais Peçonhentos: Soroterapia - Ed.
Sarvier, 288 pp., 1992.
- SCOTT, D.L.; WHITE, S.P.; OTWINOWSKI, Z.; YUAN, W.; GELB, M.H.; SIGLER,
T.B. Interfacial catalysis: the mechanism of phospholipase A
2
. Science, v. 250, p. 1541-
1546, 1990.
- SELISTRE-DE-ARAÚJO, H.S., WHITE, S.P., OWNBY, C.L. cDNA cloning and
sequence analysis of a lysine-49 phospholipase A2 myotoxin from Agki6strodon
contortrix laticinctus snake venom, Arch. Biochem. Biophys. 326 21–30, 1996.
104
- SKERRA A. & PLÜCKTHUN, A. Assembly of a functional immunoglobulin Fv
fragment in Escherichia coli. Science, 240:1038-1041, 1988.
- SLOTTA, C.H. & FRAENKEL-CONRAT, H. Estudos químicos sobre os venenos
ofídicos. Purificação e cristalização do veneno de cobra cascavel. Mem. Inst. Butantan 12,
505, 1938-1939.
- SOARES, A.M. Estrutura, função e inibição de miotoxinas homólogas a fosfolipases A
2
isoladas de venenos de serpentes. Ribeirão Preto, 2000. 200 f (Doutorado em
Bioquímica). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – São Paulo, 2000.
- SOARES A.M., ANDRIÃO-ESCARSO S.H., ANGULO Y., LOMONTE B.,
GUTIERREZ J.M., MARANGONI S., TOYAMA M.H. ARNI R.K. GIGLIO J.R.
Structural and functional characterization of myotoxin I, a Lys49 phospholipase A
2
homologue from Bothrops moojeni (Caissaca) snake venom. Arch Biochem Biophys. Vol
1; 373 (1):7-15, 2000a.
- SOARES A.M., ANDRIÃO-ESCARSO S.H., BORTOLETO R.K., RODRIGUES-
SIMIONI L., ARNI R.K., WARD R.J., GUTIERREZ J.M., GIGLIO J.R. Dissociation of
enzymatic and pharmacological properties of piratoxins-I and -III, two myotoxic
phospholipases A2 from Bothrops pirajai snake venom. Arch Biochem Biophys. Vol 15;
387(2):188-96, 2001a.
- SOARES A.M., MANCIN A.C., CECCHINI A.L., ARANTES E.C., FRANCA S.C.,
GUTIERREZ J.M., GIGLIO J.R. Effects of chemical modifications of crotoxin B, the
phospholipase A(2) subunit of crotoxin from Crotalus durissus terrificus snake venom, on
its enzymatic and pharmacological activities. Int J Biochem Cell Biol. Vol 33(9):877-88,
2001b.
- SOARES A.M., GUERRA-SÁ, R., BORJA-OLIVEIRA C.R., RODRIGUES V.M.,
RODRIGUES-SIMIONI L., RODRIGUES V., FONTES M.R., LOMONTE B., GUTI,
105
J.M., GIGLIO, J.R., Structural and functional characterization of BnSP-7, a Lys49
myotoxic phospholipase A(2) homologue from Bothrops neuwiedi pauloensis venom.
Arch Biochem Biophys. Vol 15; 378(2):201-9, 2000b.
- SOARES, A.M; GIGLIO, J.R. Chemical modifications of phospholipases A
2
from snake
venoms: effects on catalytic and pharmacological properties. Toxicon, v.42, n. 8, p. 855-
868, 2003.
- SOARES, S.G. Produção de anticorpos humanos recombinantes e sua aplicação na
identificação de antígenos sexo específicos em espermatozóides bovinos. 2005. 108 f.
Tese (Doutorado em Imunologia Básica e Aplicada) – Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2005.
- TAMAROZZI, M.B. Expressão de fragmentos de anticorpos humanos recombinantes
capazes de inibir a atividade fosfolipásica do veneno de Bothrops jararacussu. 2005. 101
f. (Mestrado em Imunologia Básica e Aplicada) - Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2005.
- TERPE, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical
fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol., v. 60, p. 523-533,
2003.
- THUNNINSEN, M.M.G.M.; ELSO, A. B.; KALK, K.H.; DRENTH, J.; DIJKISTRA,
B.W.; KUIPERS, O. P.; DIJKMAN, R.; DE HAAS, G.H., VERHEIJ, H.M. X-Ray
structure of phospholipase A
2
complexed with a substrate-derived inhibitor. Nature, v.
347, p. 689-691, 1990.
- VAN DEN BOSH, H. Intracellular phospholipase A. Biochim. Byophis. Acta., v. 604, p.
191-246, 1980.
- VERHEIJ, H.M.; VOLWERK, J.J.; JANSEN, E.H.J.M.; PUYG, HW.C.; DIJKSTRA,
B.W.; DRENTH, J.; de HAAS, G.H. Methylation of histidine-48 in pancreatic
106
phospholipase A
2
role of histidina and calcium ion in catalytic mechanism. Biochem. 19,
743-750, 1980.
- VERHEIJ, H.M.; SLOTBOOM, A.J.; DE HAAS, G.H. Structure and function of
phospholipase A
2
. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. v. 91, p. 91-2003, 1981.
- WINTER, G.; GRIFFITHS, A.D.; HAWKINS, R.E.; HOOGENBOOM, H.R. Making
antibodies by phage display technology. Annu. Rev. Immunol., v. 12, p. 433-455, 1994.
- WINTER, G.; MILSTEIN, C. Man-made antibodies. Nature, v. 349, p. 293-299, 1991.
- YUAN, Y.; JACKSON, S.P.; MITCHELL, C.A.; SALEM, H.H. Purification and
characterization of a snake venom phospholipase A
2
: a potent inhibition of platelet
aggregation. Thromb. Res., v. 70, p. 471-481, 1993.
107
108
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) - pH 7,2 - 7,4
10x concentrada
Reagentes Quantidade
NaCl 5,84g
Na
2
HPO
4
4,72g
NaH
2
PO
4
. H
2
O 2,64g
Água milli-Q q.s.p 1L
Meio LB caldo
Meio LB Agar
Obs: Só ocorre dissolução total do ágar após autoclavagem.
Meio LB com ampicilina e glicose
Reagentes Quantidade
Meio LB caldo 50 ml
Ampicilina (100 mg/ml) 50 µl
Glicose 20% 2,5 ml
Reagentes Quantidade
LB 20 g
Àgua milli-Q q.s.p 1L
Reagentes Quantidade
Agar 12 g
Meio LB 1L
109
Meio LB com ampicilina e kanamicina
Reagentes Quantidade
Meio LB caldo 50 mL
Ampicilina (100 µg/ml) 50 µL
Kanamicina (50 mg/ml) 25 µL
Solução PEG 20% - NaCl 2,5M
Reagentes
Quantidade
PEG 6000 200 g
NaCl 146 g
Água destilada q.s.p. 1L
Tampão Carbonato – Bicarbonato 0,05 M, pH 9,6
Reagentes
Quantidade
Na
2
CO
3
0,0635 g
NaHCO
3
0,1176 g
Água destilada q.s.p. 40 mL
Solução Crioprotetora-Frozen Stocks
Reagentes
Quantidade
Glicerol 65% 65 mL
MgSO
4
0,1M 2,4647 g
Tris 0,025M 2,5 mL
Água destilada q.s.p. 100 mL
110
Gel de Poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)
Gel de separação (12%)
Reagentes Quantidade
Tris/HCl 2 M, pH 8,8 1,13 mL
Acrilamida:Bis (30:0,8%) 2,4 mL
Àgua milli-Q 2,3 mL
TEMED
7 µL
Persulfato de amônio 10%
38 µL
Gel de Empilhamento (12%)
Reagentes Quantidade
Tris/HCl 2 M, pH 6,8
125 µL
Acrilamida:Bis (30:0,8%)
332 µL
SDS 10%
20 µL
Àgua milli-Q 1,47 mL
TEMED
3 µL
Persulfato de amônio 10%
25 µL
111
Soluções para corrida e coloração do Gel
Tampão Superior do Eletrodo (tampão de corrida)
Reagentes Quantidade
Tris 3 g
Glicina 14,4 g
SDS 10% 10 mL
Àgua milli-Q q.s.p. 1000 mL
Acrilamida : Bisacrilamida (30:0,8%)
Reagentes Quantidade
Acrilamida 30 g
Bisacrilamida 0,8 g
Àgua milli-Q q.s.p. 100 mL
Solução Fixadora
Reagentes Quantidade
Metanol 50%
Ácido acético 10%
Solução Corante Comassie
Reagentes Quantidade
Metanol 500 mL
Ácido acético 100 mL
Comassie 1 g
Àgua milli-Q q.s.p. 1000 mL
Solução Descorante
112
Reagentes Quantidade
Etanol 30%
Ácido acético 10%
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