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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ
CAMPUS DE MARECHAL CÂNDIDO RONDON
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
NÍVEL MESTRADO
CLAIR APARECIDA VIECELLI
CONTROLE DA MANCHA ANGULAR E ANÁLISE BIOQUÍMICA DE
RESISTÊNCIA EM FEIJOEIRO TRATADO COM EXTRATOS DE
Pycnoporus sanguineus
MARECHAL CÂNDIDO RONDON
JANEIRO/2008
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CLAIR APARECIDA VIECELLI
CONTROLE DA MANCHA ANGULAR E ANÁLISE BIOQUÍMICA DE
RESISTÊNCIA EM FEIJOEIRO TRATADO COM EXTRATOS DE
Pycnoporus sanguineus
Dissertação apresentada à Universidade
Estadual do Oeste do Paraná, como parte
das exigências do Programa de Pós-
Graduação em Agronomia - Nível
Mestrado, para obtenção do título de
Mestre.
ORIENTADOR: PROF. DR. JOSÉ
RENATO STANGARLIN
MARECHAL CÂNDIDO RONDON
JANEIRO/2008
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2
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(Biblioteca da UNIOESTE – Campus de Marechal Cândido Rondon – PR., Brasil)
Viecelli, Clair Aparecida
V656c Controle da mancha angular e análise bioquímica de
resistência em feijoeiro tratado com extratos de Pycnoporus
sanguineus/ Clair Aparecida Viecelli. – Marechal Cândido
Rondon, 2008.
61p.
Orientador : Prof. Dr. José Renato Stangarlin
Dissertação (Mestrado) – Curso de Pós-Graduação
Agronomia,Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Campus
de Marechal Cândido Rondon, 2008.
1.Feijoeiro. 2. Phaseolus vulgaris. 3.Pseudocercospora
griseola. 4.Phaeoisariopsis griseola. 5.Controle de
doenças.I. Universidade Estadual do Oeste do Paraná. II.
Título.
CDD 21.ed. 635.652
CIP-NBR 12899
Ficha catalográfica elaborada por Helena Soterio Bejio CRB-9ª/965
Ao Deus Unipotente e a seu filho, Jesus
Cristo, meu Senhor
Minha fonte inesgotável
Dedico
3
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela benção recebida, acompanhada de força, luz e
coragem para enfrentar os obstáculos da vida nos caminhos que escolhi.
A Nossa Senhora Aparecida, pela sua intercessão.
A minha mãe (in memorian), que nos momentos difíceis senti sua presença
mais perto de mim como nunca. Ao meu pai e meus irmãos pelo exemplo da
persistência.
Ao meu marido, Nelson, que foi compreensivo pelas vezes que estive
ausente, por acreditar em mim e me apoiar neste grande sonho.
Ao professor Dr. José Renato Stangarlin, exemplo de organização e ética
profissional, pela oportunidade, paciência e orientação para a conclusão deste
trabalho.
Ao prof. Dr. Odair José Kuhn, pela colaboração no desenvolvimento deste
projeto.
A prof. MSc Claudia T. A. da Cruz Silva e ao prof. Dr. Renato Cassol de
Oliveira, pela amizade e incentivo durante o mestrado.
A Unioeste, pelo programa de pós-graduação. Por disponibilizar a estrutura,
laboratório e todo o material necessário para a conclusão da pesquisa.
A Fag, por disponibilizar a casa de vegetação e a área a campo para o
desenvolvimento do trabalho.
Aos amigos do laboratório da Unioeste e Fag: Gilmar, Luciana, Sandra,
Mauriceli, Cris, Erica, Ariane, Silvia, Elaine C., Tati, Franciele, Jhony, Eliseu, Elaine
K. e Suzana pela companhia e apoio durante as análises.
Expresso reconhecimento a todas as pessoas que de forma direta ou
indiretamente contribuíram para a concretização deste estudo.
4
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS.....................................................................................................i
LISTA DE TABELAS ...................................................................................................ii
RESUMO.................................................................................................................... iii
ABSTRACT................................................................................................................iv
1 INTRODUÇÃO................................................................................................ ......11
2 REVISÃO DE LITERATURA
................................................................................ 12
2.1 A CULTURA DO FEIJOEIRO............................................................................. 12
2.2 DOENÇAS DO FEIJOEIRO ............................................................................... 12
2.2.1 Mancha angular - Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & Braun.............13
2.2.1.1 Sintomas.........................................................................................................13
2.2.1.2 Etiologia..........................................................................................................14
2.2.1.3 Controle..........................................................................................................14
2.3 CONTROLE DE DOENÇAS.................................................................................14
2.3.1 Controle alternativo de doenças...................................................................... 15
2.3.1.1 Indução de resistência.................................................................................. 15
2.3.1.1.1 Alterações bioquímicas da indução de resistência ................................... 16
2.3.1.1.1.1 Peroxidase.............................................................................................. 16
2.3.1.1.1.2 Polifenoloxidase ..................................................................................... 17
2.3.1.1.1.3 β-1,3-glucanase...................................................................................... 17
2.3.1.1.2 Alterações fisiológicas da indução de resistência ..................................... 18
2.3.1.1.2.1 Proteínas................................................................................................ 18
2.3.1.1.2.2 Clorofilas ................................................................................................ 19
2.3.1.2 Indutores de resistência ............................................................................... 19
2.3.2 Potencial de cogumelos no controle de doenças ........................................... 20
2.3.2.1 Pycnoporus sanguineus.............................................................................. 21
3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 23
3.1 OBTENÇÃO E MANUTENÇÃO DE P. griseola.................................................. 23
3.2 OBTENÇÃO DO EXTRATO AQUOSO DE BASIDIOCARPOS DE P.
sanguineus...................................................................................................23
3.3 OBTENÇÃO DO FILTRADO DE CULTURA E EXTRATO DE MICÉLIO DE P.
sanguineus................................................................................................. 23
5
3.4 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA in vitro ............................................................ 24
3.4.1 Inibição de crescimento micelial...................................................................... 24
3.4.2 Inibição de esporulação................................................................................... 24
3.4.3 Inibição de germinação de esporos................................................................. 25
3.5 MATERIAL VEGETAL....................................................................................... 26
3.5.1 Cultivo em casa de vegetação ........................................................................ 26
3.5.1.1 Aplicação dos tratamentos em casa de vegetação ...................................... 26
3.5.2 Cultivo a campo............................................................................................... 27
3.5.2.1 Aplicação dos tratamentos a campo............................................................. 27
3.5.3 Avaliação da severidade ................................................................................. 28
3.6 COLETA DAS AMOSTRAS PARA ANÁLISES BIOQUÍMICAS.......................... 28
3.6.1 Obtenção dos extratos protéicos..................................................................... 29
3.6.2 Atividade de peroxidase ................................................................................. 29
3.6.3 Atividade de polifenoloxidase ......................................................................... 29
3.6.4 Atividade de β-1,3 glucanase.......................................................................... 30
3.6.5 Teor de proteína.............................................................................................. 30
3.6.6 Teor de clorofila............................................................................................... 31
3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................... 31
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................ 32
4.1 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA in vitro............................................................. 32
4.1.1 Inibição de crescimento micelial...................................................................... 32
4.1.2 Inibição de esporulação................................................................................... 33
4.1.3 Inibição de germinação de esporos................................................................. 34
4.2 AVALIAÇÃO DA SEVERIDADE EM CASA DE VEGETAÇÃO........................... 35
4.3 AVALIAÇÃO DA SEVERIDADE A CAMPO........................................................ 36
4.4 ALTERAÇÕES BIOQUÍMICAS DA INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA .................... 38
4.4.1 Atividade de peroxidase ................................................................................. 38
4.4.2 Atividade de polifenoloxidase ......................................................................... 41
4.4.3 Atividade de β-1,3 glucanase.......................................................................... 43
4.5 ALTERAÇÕES FISIOLÓGICOS DA INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA................... 45
4.5.1 Teor de proteína.............................................................................................. 45
4.5.2 Teor de clorofila a............................................................................................ 47
6
4.5.3 Teor de clorofila b............................................................................................ 49
4.5.4 Teor de clorofila total....................................................................................... 51
5 CONCLUSÕES..................................................................................................... 53
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................... 54
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Basidiocarpos de Pycnoporus sanguineus. Fonte: o autor......................21
Figura 2 Inibição in vitro do crescimento micelial de Pseudocercospora griseola em
função do tratamento com extrato aquoso de micélio de Pycnoporus
sanguineus, esterilizado por filtração em membrana Millipore. ...............32
Figura 3 Efeito dos extratos de micélio de P. sanguineus sobre o crescimento
micelial in vitro de P. griseola. (A) autoclavado e (F) filtrado em membrana
Millipore ...................................................................................................33
Figura 4 Inibição in vitro da esporulação de Pseudocercospora griseola em função
do tratamento com extrato aquoso de micélio de Pycnoporus sanguineus,
esterilizado por filtração em membrana Millipore.....................................34
Figura 5 Inibição in vitro da germinação de esporos de Pseudocercospora griseola
em função do tratamento com extrato aquoso de micélio de Pycnoporus
sanguineus, esterilizado por filtração em membrana Millipore. ...............35
Figura 6 Atividade de peroxidase em plantas de feijoeiro inoculadas com
Pseudocercospora griseola três dias após os tratamentos com os extratos
aquosos de P. sanguineus.......................................................................40
Figura 7 Atividade de polifenoloxidase em plantas de feijoeiro inoculadas com
Pseudocercospora griseola três dias após os tratamentos com os extratos
aquosos de P. sanguineus.......................................................................42
Figura 8 Atividade de β-1,3-glucanase em plantas de feijoeiro inoculadas com
Pseudocercospora griseola três dias após os tratamentos com os extratos
aquosos de P. sanguineus.......................................................................44
Figura 9 Teor de proteína em plantas de feijoeiro inoculadas com Pseudocercospora
griseola três dias após os tratamentos com os extratos aquosos de P.
sanguineus ..............................................................................................46
Figura 10 Teor de clorofila a em plantas de feijoeiro inoculadas com
Pseudocercospora griseola três dias após os tratamentos com os extratos
aquosos de P. sanguineus.......................................................................48
Figura 11 Teor de clorofila b em plantas de feijoeiro inoculadas com
Pseudocercospora griseola três dias após os tratamentos com os extratos
aquosos de P. sanguineus.......................................................................50
Figura 12 Teor de clorofila total em plantas de feijoeiro inoculadas com
Pseudocercospora griseola três dias após os tratamentos com os extratos
aquosos de P. sanguineus.......................................................................52
i
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) para mancha
angular causada por P. griseola em feijoeiro em função dos tratamentos
com extratos aquosos de Pycnoporus sanguineus, na terceira folha
tratada e na quarta folha apenas inoculada, em condições de casa de
vegetação........................................................................................................36
Tabela 2 Área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) para mancha
angular causada por P. griseola em feijoeiro em função dos tratamentos
com extratos aquosos de Pycnoporus sanguineus, em condições de
campo ............................................................................................................... 38
ii
9
RESUMO
O controle alternativo de doenças de plantas visa minimizar impactos ambientais por
meio da utilização de produtos naturais. Com a possibilidade de utilizar extratos de
Pycnoporus sanguineus no controle de fitopatógenos, realizou-se esse trabalho com
o objetivo de verificar a atividade antimicrobiana in vitro contra Pseudocercospora
griseola e a indução de enzimas de defesa em feijoeiro como peroxidase,
polifenoloxidase e β-1,3-glucanase e ativação de mecanismos fisiológicos
relacionados ao fornecimento de energia, como proteínas e clorofilas. Os
experimentos in vitro e em casa de vegetação foram constituídos pelos extratos do
basidiocarpo, micélio e filtrado de cultura de P. sanguineus, além dos controles água,
acibenzolar-S-metil (ASM: 75 mg i.a. L
-1
) e fungicida (azoxystrobin: 40 mg i.a. L
-1
). In
vitro o extrato de micélio esterilizado por filtração inibiu significativamente o
crescimento micelial, a esporulação e a germinação de esporos de P. griseola a
partir da concentração 5%, o que não ocorreu no extrato esterilizado em autoclave,
indicando a presença de compostos termolabeis. Em casa de vegetação, plantas de
feijão foram tratadas três dias antes da inoculação do patógeno, avaliando-se a
severidade e a atividade de enzimas envolvidas no processo de defesa, na 3º folha
tratada bem como na 4º folha não tratada, para verificar a ocorrência da resistência
local e/ou sistêmica respectivamente. A severidade em casa de vegetação foi
reduzida na 3ª folha em 82,4 e 77% e na 4ª folha em 71,6 e 69,4% com os extratos
de P. sanguineus em concentrações de 10% e 20%, respectivamente. A campo,
reduções de até 19,2% e 63,8% na 1ª e 2ª aplicação, respectivamente, foram
observadas, em relação ao controle água. A atividade das enzimas peroxidase e
polifenoloxidase, o teor de proteínas e clorofilas foram maiores nas plantas tratadas
com os extratos de P. sanguineus. Estes resultados indicam a eficiência de P.
sanguineus para o controle alternativo da mancha angular do feijoeiro.
Palavras-chave: Indução de resistência, Phaseolus vulgaris, Pseudocercospora
griseola, Phaeoisariopsis griseola.
iii
10
ABSTRACT
The alternative control of plants disease aims to minimize ambient impacts by the
use of natural products. With the possibility of using Pycnoporus sanguineus extracts
for the control of pathogenic fungus, this work was conduced to verify the
antimicrobial activity in vitro against Pseudocercospora griseola and the induction of
enzyme defense in bean plant as peroxidase, polyphenol oxidase and β-1,3-
glucanase and activation of physiological mechanisms related to the energy supply,
as proteins and chlorophyll. The experiments in vitro and in greenhouse had been
constituted by extracts from basidiocarps, mycelium and liquid medium culture filtrate
of P. sanguineus. Water, acibenzolar-S-methyl (ASM: 75 mg i.a. L
-1
) and fungicide
(azoxystrobin: 40 mg i.a. L
-1
) were the control treatments. In vitro, the extract of
mycelium at 5%, sterilized by filtration, significantly inhibited the mycelial growth,
sporulation and conidia germination of P. griseola, what did not occur in the extract
sterilized in autoclave, indicating the presence of thermo-sensible compounds. In
greenhouse, bean plants had been treated three days before the inoculation with the
pathogen and were evaluated the severity and the activity of plant defense enzymes
peroxidase, β-1,3-glucanase and polyphenol oxidase in 3
rd
leaves treated as well as
in 4
th
leaves not treated, to verify the occurrence of local or systemic resistance
induction, respectively. Severity was reduced in 82.4% and 77% in 3
rd
leaves and in
71.6% and 69.4% in 4
th
leaves to P. sanguineus extracts at concentrations of 10%
and 20%, respectively. In the field, severity was reduced in 19.2% and 63.8% in 1
st
and 2
nd
application, respectively, in relation to the control water. The activities of
peroxidase, polyphenol oxidase, proteins and chlorophylls had an increment in plants
treated with extracts. These results indicate the potential of P. sanguineus for
alternative control of the angular leaf spot in bean plants.
Key words: Induced resistance, Phaseolus vulgaris, Pseudocercospora griseola,
Phaeoisariopsis griseola.
iv
11
1 INTRODUÇÃO
A cultura do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) é suscetível a muitas doenças
que ocorrem durante seu ciclo, causando perdas acentuadas na produtividade. As
características climáticas da região Oeste do Paraná favorecem a ocorrência de
várias doenças que causam prejuízos aos agricultores, como a mancha angular,
causada por Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & Braun (sin. Phaeoisariopsis
griseola (Sacc.) Ferraris), patógeno da parte aérea da planta que representa uma
das principais doenças do feijoeiro.
Tradicionalmente o controle da mancha angular tem sido feito com o
emprego de cultivares resistentes, sementes livres de patógenos e aplicação de
fungicidas. Este último, a curto prazo, tem suas vantagens mas a longo prazo pode
causar problemas devido aos resíduos acumulados (GHINI & KIMATI, 2000) e, em
função disso, é necessário desenvolver métodos alternativos de controle de doenças
como a indução de resistência em plantas.
A indução de resistência em plantas envolve a ativação de mecanismos de
defesa latentes existentes nas plantas em resposta ao tratamento com agentes
eliciadores (HAMMERSCHMIDT & DANN, 1997). Agentes eliciadores são moléculas
capazes de ativar um mecanismo de defesa na planta, protegendo-a contra infecção
subseqüente por patógenos. Entre os eliciadores não convencionais podem-se
incluir os extratos de plantas medicinais e óleos essenciais e os extratos obtidos de
cogumelos.
Entre os cogumelos com propriedades eliciadores destaca-se Pycnoporus
sanguineus, utilizado desde a medicina popular ao controle alternativo de doenças
de plantas, com potencial para a indução de resistência, tornando-se promissor em
pesquisas relacionadas.
Em vista do exposto, este trabalho teve como objetivos, investigar o potencial
de P. sanguineus no controle da mancha angular do feijoeiro, através de avaliações
da atividade antimicrobiana direta contra P. griseola, da indução de enzimas de
resistência como peroxidase, polifenoloxidase e β-1,3-glucanase e da ativação de
mecanismos fisiológicos relacionados ao fornecimento de energia, como proteínas e
clorofilas.
12
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A CULTURA DO FEIJOEIRO
O feijoeiro é considerado como uma das mais importantes leguminosas
comestíveis e encontra-se distribuído desde os trópicos até as zonas temperadas,
atingindo os cinco continentes. Esta ampla difusão deve-se ao seu valor nutritivo,
conferido pelo conteúdo protéico (VIEIRA & HEMP, 1992), carboidratos e ferro
(BORÉM & CARNEIRO, 2006). No Brasil representa a fonte de proteína vegetal
mais significativa da alimentação do brasileiro (RODRIGUES et al., 1999).
Embora no Brasil essa espécie seja exótica, com prováveis centros de
origem da América Central e região Andina da América do Sul (ZIMMERMANN &
TEIXEIRA, 1988
1
apud VIEIRA & HEMP, 1992), ela se encontra amplamente
adaptada as condições de clima e solo brasileiros (BORÉM & PETERNELLI, 1997).
Taxonomicamente, o feijoeiro é do gênero Phaseolus, que inclui
aproximadamente 100 espécies, das quais apenas quatro são cultivadas: P. vulgaris
L. (feijão comum), P. coccineus L. (feijão ayocote), P. acutifolius F. (feijão tepari) e P.
lunatus L. (feijão de lima). O feijão comum é a principal espécie deste gênero. É uma
planta anual herbácea e termófila, isto é, não suporta geada. Seu cultivo visa
principalmente a produção de grãos (VIEIRA & HEMP, 1992).
A produção nacional total de feijão em grãos para a safra em 2007 foi
reduzida em 2,8% de área plantada (3.907.467 ha), 3,1% da produção (3.330,435 t)
e 0,5% da produtividade (852 kg/ha) (IBGE, 2007). Além das condições climáticas,
problemas fitossanitários da cultura são responsáveis pela queda da produção
agrícola de feijão no Brasil (BORÉM & CARNEIRO, 2006).
2.2 DOENÇAS DO FEIJOEIRO
O feijoeiro é afetado por mais de 300 doenças causadas por vírus, bactérias,
_________________________________
1
ZIMMERMANN, M.J.O.; TEIXEIRA, M.G. Origem e evolução. In: ZIMMERMANNM.J.O.; ROCHA, M.;
YAMADA, T. Cultura do feijoeiro; fatores que afetam a produtividade. Piracicaba: Associação
brasileira para pesquisa da potassa e do fosfato, p.79-85, 1988.
13
fungos e nematóides, as quais contribuem para o seu baixo rendimento, em todas as
regiões do mundo onde é praticada (SARTORATO et al., 1996).
Muitas doenças podem causar, dependendo das condições do ambiente,
danos totais na produção ou, então, dependendo do nível de contaminação,
inviabilizar determinadas áreas para o cultivo (PAULA JUNIOR & ZAMBOLIM, 1998).
2.2.1 Mancha angular - Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & Braun
A mancha angular do feijoeiro, causada pelo fungo P. griseola, ocorre na
maioria das regiões produtoras de feijão do Brasil. Essa doença é atualmente um
dos principais problemas para a cultura do feijão em áreas irrigadas (VALE et al.,
1997). As perdas variam de 7,9 a 11,5%, dependendo da resistência do cultivar
(SARTORATO & RAVA, 1992). No Paraná, a mancha angular vem merecendo
atenção, principalmente em regiões agrícolas que fazem o plantio consecutivo de
variedades suscetíveis (CARNEIRO et al., 1997).
2.2.1.1 Sintomas
Os sintomas da doença manifestam-se no caule, folhas e vagens. Nas folhas
primárias, as lesões são geralmente circulares, de cor castanha ou marrom-
avermelhada. Nas folhas trifoliadas formam-se lesões necróticas de coloração
acinzentada e formato irregular. Posteriormente, estas adquirem coloração marrom-
escura e formato angular, sendo delimitadas pelas nervuras. Com a ocorrência de
grande número de lesões, estas coalescem, causando necrose das folhas e
desfolha prematura. Em alguns casos, pode-se observar regiões cloróticas ao redor
das lesões. Dependendo da idade da folha, a presença de um pequeno número de
lesões necróticas já resulta em clorose e abscisão prematura da mesma (BIANCHINI
et al., 2005).
Nos ramos e pecíolos as lesões são alongadas e escuras. Nas vagens, as
manchas arredondadas e castanho-escuras, de tamanho variável, podem ser
diferenciadas das lesões de antracnose por não serem deprimidas e não
apresentarem o centro mais claro. Sementes podem ser infectadas principalmente
14
através do hilo. A infecção das sementes reduz a germinação e o desenvolvimento
das plântulas. P griseola produz sinemas e conidióforos escuros sobre as lesões
após períodos de 24 a 48 horas de contínua umidade (SARTORATO et al., 1996).
2.2.1.2 Etiologia
P. griseola pertence ao grupo dos fungos mitospóricos e produz sinemas na
face inferior da folha, com 250 µm de comprimento e 20-40 µm de largura,
compostos por conidióforos paralelos e escuros, formando tufos visíveis a olho nu.
Os conídios são de cor cinza, cilíndricos a fusiformes, às vezes curvos, com dois a
seis septos, medindo 35-70 µm de comprimento e 5-7,5 µm de largura no centro e
1,5-2 µm de largura na base. P. griseola sobrevive em sementes e restos de cultura,
sendo disseminado pelo vento, respingos de chuva e partículas de solo. A
viabilidade do fungo na semente diminui com o tempo. Os conídios germinam em
temperaturas entre 8 e 32 ºC, com ótimo a 20-28 ºC. O desenvolvimento da doença
ocorre em temperaturas entre 16 e 28 ºC, preferencialmente a 24 ºC. O fungo
penetra pelos estômatos e coloniza o hospedeiro. Os sintomas aparecem cerca de
8-12 dias após, quando então o estroma se desenvolve na cavidade sub-estomática.
A esporulação ocorre durante períodos de alta umidade (BIANCHINI et al., 2005).
2.2.1.3 Controle
O controle da mancha angular pode ser feito através do uso de sementes
sadias, eliminação dos restos culturais infectados, rotação de culturas, controle
químico ou variedades com bom nível de resistência (VALE et al., 1997).
2.3 CONTROLE DE DOENÇAS
O controle químico de doenças de plantas é, em muitos casos, a única
medida eficiente e economicamente viável de garantir alta produtividade e qualidade
de produção (KIMATI, 1995). No entanto, o uso indiscriminado de tais produtos pode
15
acarretar, em longo prazo, o surgimento de isolados dos fitopatógenos resistentes às
substâncias químicas utilizadas, além do ressurgimento de pragas e efeitos
negativos para a sociedade e ao meio ambiente (GHINI & KIMATI, 2000).
Aproximadamente meio milhão de toneladas de pesticidas e herbicidas são
produzidas anualmente para aplicação em culturas, apenas nos Estados Unidos.
Desse total, estimou-se que apenas 1% aproximadamente de fato alcança o
organismo alvo. A maior parte do restante pode chegar ao solo, à água ou a
organismos que não se deseja atingir no ecossistema. Assim, buscam-se métodos
menos danosos para melhorar os rendimentos agrícolas (RAVEN et al., 2001) e/ou
alternativas de controle de fitopatógenos que minimizem os impactos ambientais e
mantenham a alta produtividade agrícola. Neste contexto, a própria natureza vem
sendo investigada como fonte de soluções em potencial (SAITO & LUCHINI, 1998).
2.3.1 Controle alternativo de doenças
Um dos enfoques da agricultura alternativa é o controle alternativo de
doenças de plantas, no qual se incluem o controle biológico e a indução de
resistência (MORAES, 1992).
No controle biológico a ação se dá sobre o patógeno, enquanto que na
resistência induzida a ação é sobre a planta hospedeira, modificando a sua relação
com a praga ou o patógeno. A prática de controle alternativo quer de pragas ou de
doenças de plantas, não faz uso de defensivos agrícolas, embora possam estar
associadas, de maneira integrada aos métodos tradicionais de controle químico e/ou
práticas culturais a fim de aumentar a sua eficiência (MORAES, 1992).
2.3.1.1 Indução de resistência
As plantas não aceitam passivamente o ataque de patógenos e visam conter
essa agressão com barreiras existentes antes do ataque. Estas barreiras são
denominadas de defesa constitutiva e são representadas por estruturas como as
ceras, cutícula, parede celular espessa, tricoma e fibras vasculares, bem como
substâncias químicas pré-formadas, como os fenóis, alcalóides, lactonas
16
insaturadas, glicosídios fenólicos e cianogênicos, fototoxinas, inibidores protéicos e
enzimas hidrolíticas (RESENDE & MACHADO, 2000; PASCHOLATI & LEITE, 1995;
CAVALCANTI et al., 2005a). Entretanto, há mecanismos de defesa produzidos ou
ativados somente na presença do patógeno (ativos ou induzíveis). Estes
mecanismos envolvem a formação de estruturas como papilas, halos, lignificação,
camada de cortiça, tiloses e deposição de goma, além de compostos como
fitoalexinas, espécies reativas de oxigênio e proteínas relacionadas a patogênese
(Proteínas-RP) (RESENDE & MACHADO, 2000; PASCHOLATI & LEITE, 1995;
CAVALCANTI et al., 2005a; TAIZ & ZEIGER, 2006).
A indução de resistência envolve a ativação de mecanismos de defesa
latentes existentes nas plantas em resposta ao tratamento com agentes bióticos ou
abióticos (HAMMERSCHMIDT & DANN, 1997). As plantas ativam um conjunto de
respostas de resistência após o reconhecimento de um patógeno ou pela aplicação
exógena de indutores de resistência (GUZZO et al., 1999).
A expressão indução de resistência tanto pode ser utilizada para designar
uma proteção local, isto é, a indução de uma resistência apenas nos tecidos em que
foi realizado o tratamento com o agente indutor, como pode indicar uma resistência
sistêmica que se manifesta a distância do local onde foi aplicado o agente indutor
(MORAES, 1992).
Os mecanismos de defesa das plantas contra fitopatógenos envolvem
alterações bioquímicas que estão correlacionadas com mudanças na atividade de
enzimas chaves, como a peroxidase (FRIC, 1976), polifenoloxidases (PASCHOLATI
& LEITE, 1995) e β-1,3-glucanases (CORNELISSEN & MELCHERS, 1993), além de
alterações fisiológicas como a síntese de proteínas relacionadas a patogênese
(Proteínas-RP) (AGRIOS, 2005) e clorofila (STANGARLIN & PASCHOLATI, 2000).
2.3.1.1.1 Alterações bioquímicas da indução de resistência
2.3.1.1.1.1 Peroxidase
A enzima peroxidase (E.C. 1.11.1.7) e suas isoformas participam de vários
processos fisiológicos de grande importância, catalisando a oxidação e a eventual
17
polimerização de álcool hidroxicinâmico em presença de peróxido de hidrogênio,
originando lignina, um importante mecanismo físico de defesa vegetal (GASPAR et
al., 1982). São classificadas como proteínas relacionadas a patogênese (Proteínas-
RP), pertencentes a família PR-9 (VAN LOON & VAN STRIEN, 1999).
Mudanças na atividade das peroxidases têm sido freqüentemente
correlacionadas a resposta de resistência ou suscetibilidade em diferentes
patossistemas (BONATTI et al., 1994). Com relação à biossíntese de lignina, um
polímero complexo formado principalmente de unidades de fenilpropanóides, as
peroxidases são responsáveis pela remoção de átomos de hidrogênio dos grupos
álcoois hidroxicinâmicos, cujos radicais se polimerizam para formar a lignina. Esse
polímero, juntamente com celulose e outros polissacarídeos que ocorrem na parede
celular das plantas superiores, funciona como uma barreira física à penetração do
patógeno (PASCHOLATI & LEITE, 1994).
2.3.1.1.1.2 Polifenoloxidase
Polifenoloxidases agrupa um conjunto de enzimas responsáveis pela catálise
da reação de oxidação de polifenóis originando quinonas altamente tóxicas aos
microrganismos (PASCHOLATI & LEITE, 1995) e a insetos. Neste último, taninos na
forma fenólica são oxidados a quinonas apresentando alta reatividade com as
proteínas na dieta do inseto, impedindo que este possa digeri-las (TAIZ & ZEIGER,
2006).
As polifenoloxidases geralmente se mantêm na forma inativa no interior da
célula vegetal, compartimentalizada nos tilacóides dos cloroplastos, sendo liberadas
e iniciando a oxidação dos compostos fenólicos somente quando a planta
hospedeira sofre o ataque de insetos ou patógenos (MOHAMMADI & KAZEMI,
2002).
2.3.1.1.1.3 β-1,3-Glucanases
As enzimas β-1,3-glucanases pertencem à família PR-2 e são agrupadas em
três classes distintas, baseando-se nas seqüências de aminoácidos de suas
18
estruturas primárias. As glucanases de classe I são proteínas básicas e estão
localizadas no vacúolo da célula vegetal, especialmente na epiderme das folhas
inferiores e nas raízes de plantas sadias, enquanto que as classes II e III incluem as
proteínas ácidas extracelulares (SELITRENNIKOFF, 2001
2
apud GUZZO, 2003).
As β-1,3-glucanases hidrolizam polímeros de β-1,3-glucana, composto que
juntamente com a quitina são os principais componentes da parede celular fúngica
(CORNELISSEN & MELCHERS, 1993).
Na indução de resistência, o incremento da β-1,3-glucanase está relacionada
com a defesa da planta. Kuhn (2007) verificou aumento significativo da enzima
quando as plantas de feijão receberam tratamento com Acibenzolar-S-metil (indutor
de resistência comercial), e Stangarlin & Pascholati (2000) observaram aumento na
produção de β-1,3-glucanase em plantas de feijão (cv. Carioca) quando infectadas
com Uromyces appendiculatus.
2.3.1.1.2 Alterações fisiológicas da indução de resistência
2.3.1.1.2.1 Proteínas
O conteúdo de proteínas no tecido vegetal desafiado com um patógeno ou
tratado com eliciador indica a ativação dos mecanismos de defesa. É de suma
importância a verificação das enzimas chaves na indução de resistência, porém
deve-se considerar que aspectos fisiológicos também são alterados e a sinergia
entre o metabolismo primário e secundário, assim como os compostos produzidos,
agem de forma complexa na proteção da planta. Dessa forma, destaca-se a
importância de estudos que demonstram o teor de proteínas solúveis nas plantas
tratadas.
Entre as proteínas, há as relacionadas à patogênese (Proteínas-RP), as quais
são induzidas nos tecidos vegetais em função da inoculação com
patógenos/microrganismos, sistemicamente ou em parte destes, bem como pelo
tratamento com agentes químicos (GUZZO, 2003). A ativação da síntese protéica
_________________________________
2
SELITRENNIKOFF, C.P. Antifungical proteins. Appl. Environm. Microbiol. 67:2883-94, 2001.
19
leva a uma fase de resistência da planta (LARCHER, 2000).
Kuhn (2007) verificou redução no teor de proteínas em plantas de feijão
quando tratadas com Bacillus cereus, tendência contrária ao tratamento com
acibenzolar-S-metil, demonstrando a especificidade na resposta fisiológica do
hospedeiro ao tratamento.
2.3.1.1.2.2 Clorofila
A energia da luz solar é absorvida pelos pigmentos ativos no processo de
fotossíntese, encontrados no cloroplasto (RICKLEFS, 2003). Entre esses pigmentos,
as clorofilas a e b são as mais abundantes (TAIZ e ZEIGER, 2006). A clorofila b
difere da a apenas pela substituição do grupo metila ligado ao anel II da porfirina
desta última, pelo grupo formila (KERBAUY, 2004). Essas moléculas encontram-se
em diferentes proporções nos fotossistemas, sendo que a clorofila a é mais
abundante quando comparada a b (FERRI, 2004).
A energia gerada pelo processo de fotossíntese pode, em dado momento,
estar voltado para a produção de compostos do metabolismo secundário, como por
exemplo, no caso de ataque de patógenos (LARCHER, 2000).
Fungos hemibiotróficos como P. griseola podem implicar diretamente no grau
das alterações do hospedeiro, quer seja em nível de fotossíntese, quer seja em nível
de respostas de defesa frente à infecção (STANGARLIN et al. 2000).
2.3.1.2 Indutores de resistência
A indução de resistência local e sistêmica a doenças tem sido observada em
várias plantas em resposta ao tratamento prévio do hospedeiro com diferentes
agentes (KUC, 1995). Entre os agentes capazes de induzir resistência em plantas
estão os bióticos, como microrganismos viáveis ou inativos, ou abióticos, como ácido
aminobutírico (COHEN, 1996), ácido 2,6-dicloroisonicotínico (INA) (HIJWEGWN et
al., 1996) e acibenzolar-S-metil (ASM), além de metais pesados, luz ultravioleta,
ácido salicílico, fosfitos e silicatos, entre outros (CAVALCANTI et al., 2005b).
Moléculas de origem biótica ou abiótica, capazes de ativar e/ou induzir qualquer
20
resposta de defesa nas plantas são chamadas de eliciadores (KUC, 1995; SMITH,
1996).
Entre os eliciadores não convencionais pode-se incluir os extratos de plantas
medicinais e óleos essenciais (compostos secundários) com propriedades
antimicrobianas e/ou indutoras de resistência (STANGARLIN et al., 1999; SCHWAN-
ESTRADA et al., 2003; SCHWAN-ESTRADA & STANGARLIN, 2005), bem como os
extratos obtidos de cogumelos (DI PIERO et al., 2005).
2.3.2 Potencial de cogumelos no controle de doenças
Ainda que a diversidade dos Basidiomicotas em ecossistemas tropicais seja
vasta (HAWKSWORTH, 1991), no Brasil existem poucas pesquisas relacionadas
com a utilização de cogumelos ou orelhas de pau para o controle de doenças em
plantas, demonstrando a escassez de estudos relacionados ao potencial dos
mesmos para ativação de mecanismos de defesas em vegetais (FIORI-TUTIDA,
2003). As espécies de cogumelos mais facilmente reconhecidas como os
comestíveis (ISHIKAWA et al., 2001; PACCOLA et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2002)
ou medicinais, são alvo da maioria das investigações (SMÂNIA et al., 1995, 1997).
Di Piero & Pascholati (2004) demonstraram redução parcial na severidade
da antracnose em folhas de pepino pré-tratadas com extratos de Lentinula edodes e
Agaricus blazei, bem como sistemicamente. O efeito protetor foi dependente da
concentração do extrato de cogumelo utilizado e, em menor grau, do intervalo de
tempo entre indução-inoculação e o ambiente.
Fiori-Tutida (2003) verificou através dos extratos brutos dos cogumelos L.
edodes e A. blazei, potencial como eliciadores de respostas de defesa em plântulas,
uma vez que estimulou a produção de fitoalexinas em soja e em sorgo, indução de
proteínas-RP (β-1,3-glucanase e peroxidase) em trigo e ativaram rotas metabólicas
para a formação de papilas em mesocótilos de sorgo.
21
2.3.2.1 Pycnoporus sanguineus
Evidências genéticas e morfológicas indicam a presença de três espécies
para o gênero Pycnoporus: P. cinnabarinus (Jacq. Ex Fr.) Karst., que ocorre em
regiões de clima temperado no hemisfério Norte; P. coccineus (Fr.) Bond & Sing.,
que ocorre em regiões de clima temperado do hemisfério Sul e em países vizinhos à
Índia e oceano pacífico; e P. sanguineus (L. Ex Fr.) Murr. que ocorre em regiões
tropicais e subtropicais dos hemisférios Norte e Sul (NOBLES & FREW, 1962). É um
fungo saprofítico de crescimento lento comumente conhecido como orelha de pau e
faz parte da Divisão Basidiomycota e família Polyporaceae (MARQUES, 2001)
(Figura 1).
Figura 1 Basidiocarpos de Pycnoporus sanguineus. Fonte: o autor.
Esta espécie é utilizada como medicamento por indígenas na América
Latina (PÉREZ-SILVA et al., 1988). Em comunidades de Santa Catarina, o seu uso é
recomendado, na medicina popular, para tratamento de feridas supurativas
(SMÂNIA et al., 1995, 1997).
22
Smânia et al. (1995) verificaram que estirpes de P. sanguineus apresentam
atividade antimicrobiana contra 11 espécies de bactérias associadas a fontes
alimentares como Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas
aeruginosa, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus e gênero Streptococcus.
Watanabe et al. (2005) concluíram que P. sanguineus é bom produtor da
enzima lacase e, consequentemente, são capazes de tratar o efluente da indústria
farmacêutica. Para Silva et al. (2003), a presença de ligninase, Mn-peroxidase e β-
glucosidase na cepa amazônica de P. sanguineus indica-o como potencial para uso
industrial, especialmente em tratamento de efluentes de indústria papeleira.
Os efeitos medicinais relatados pelo uso de P. sanguineus são devidos à
síntese de uma variedade de metabólitos e entre estes, pigmentos vermelho-
alaranjados característicos do tipo 2-amino fenoxazina e esteróis. Entre os diversos
pigmentos isolados e identificados, cinabarina, o ácido cinabarínico e a
tramesanguina são os mais abundantes, enquanto entre os esteróis, o ergosterol e o
5,6-dihidroergosterol são os majoritários. A cinabarina é mais ativa contra bactérias
Gram-positiva do que contra Gram-negativa tanto de origem alimentar quanto de
origem humana (MARQUES, 2001).
P. sanguineus apresenta potencial biotecnológico para a biorremediação do
solo, produção de enzimas de interesse para a agricultura, indústria de alimentação,
fabricação de detergentes, fungicidas, inseticidas (SILVA et al., 2003) e no controle
alternativo de doenças em plantas (ASSI, 2005; BENINCA, 2007).
Assi (2005) verificou que extratos aquosos de basidiocarpos de P.
sanguineus controlaram a antracnose causada por C. lindemuthianum em feijoeiro, o
que pode ocorrer tanto por atividade antimicrobiana, através da inibição da
germinação de conídios, quanto por indução de resistência local e sistêmica, através
da ativação de peroxidases.
Beninca (2007) verificou que os extratos orgânicos diclorometânico, hexânico
e etanólico de basidiocarpos de Pycnoporus sanguineus não possuem atividade
indutora de fitoalexinas em cotilédones de soja, mas induzem a síntese de
deoxiantocianidinas em mesocótilos de sorgo.
23
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 OBTENÇÃO E MANUTENÇÃO DE P. griseola
O isolamento de P. griseola foi obtido a partir de lesões de plantas de
feijoeiro infectadas naturalmente com a doença, coletadas no município de
Cascavel. O fungo P. griseola foi cultivado de acordo com a metodologia adotada
por Stangarlin et al. (2000), em meio de suco de tomate (200 mL de suco de tomate
integral + 15 g de ágar + 4,5 g de CaCO
3
+ 800 mL de água destilada), por 14 dias.
3.2 OBTENÇÃO DO EXTRATO AQUOSO DE BASIDIOCARPOS DE P. sanguineus
A obtenção do extrato aquoso foi adaptada das metodologias de Assi (2005)
e Di Piero et al. (2006). Basidiocarpos de P. sanguineus foram coletados nas matas
da região Oeste do Paraná, identificados de acordo com chave taxonômica para
fungos (PEGLER, 1973) e, posteriormente, secos em temperatura constante de 30
ºC e moídos em moinho de esfera. O preparo dos extratos aquosos constituiu na
hidratação do pó seco de basidiocarpos por 24 h a temperatura de 4 ºC, na
proporção de 14 mL água destilada para 1 g de pó seco de basidiocarpo, sendo em
seguida filtrados em papel de filtro Whatman nº 1, obtendo dessa forma o extrato
bruto de basidiocarpo, do qual realizaram-se as diluições com água.
3.3 OBTENÇÃO DO FILTRADO DE CULTURA E EXTRATO DE MICÉLIO DE P.
sanguineus
Micélio de P. sanguineus foi cultivado em meio de cultura sólido (BDA) e
posteriormente repicados para meio líquido (BD), contendo 20 g dextrose em 1000
mL de água destilada.
Utilizaram-se frascos erlenmeyers de 250 mL contendo 100 mL de meio BD,
autoclavado a 120 ºC e 1 atm por 20 min. Cada frasco recebeu três discos (5 mm
cada) de meio de cultura sólido, contendo micélio do fungo isolado, obtidos de
24
colônias de 14 dias de idade. Após a repicagem os frascos foram mantidos em
agitação (150 rpm) sob temperatura de
26 ºC e luz ambiente (laboratório) por 30
dias de incubação. Após esse período, as colônias foram filtradas separadamente e
assepticamente em papel Whatman nº 41, obtendo-se dessa forma, o filtrado bruto
da cultura e micélio do fungo. O filtrado obtido foi mantido em geladeira a 4 ºC. O
micélio obtido foi seco em estufa a 45 ºC até peso constante e em seguida moído
em moinho de esfera. A hidratação desse pó de micélio foi da mesma forma que a
realizada para o pó de basidiocarpos (descrito no item 3.2).
3.4 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA in vitro
3.4.1 Inibição de crescimento micelial
Os extratos de P. sanguineus foram incorporados nas concentrações de 0,
1, 5, 10, 15 e 20%, em meio de cultura de suco de tomate. Os extratos foram
esterilizados em autoclave e também por filtração em membrana Millipore (0,45 µm
de diâmetro de poro). Utilizaram-se como tratamentos controles o fungicida
(azoxystrobin: 40 mg i.a. L
-1
) e acibenzolar-S-metil (ASM 75 mg i.a. L
-1
).
Para a repicagem de P. griseola nas placas de petri contendo os
tratamentos, uma alíquota de 100 µL de suspensão de esporo de uma cultura com
14 dias de idade foi adicionada nas placas e homogeneizado com alça de Drigalski.
As placas foram vedadas com filme plástico e mantidas a 24 ºC com escotofase
total.
As avaliações realizaram-se por meio de medições do diâmetro e número de
colônias 14 dias após a instalação do experimento.
3.4.2 Inibição de esporulação
Ao término do teste de inibição do crescimento micelial, avaliou-se a
esporulação de cada uma destas placas. Para isto, preparou-se uma suspensão de
esporos através da adição de 10 mL de água destilada por placa, raspagem da
25
colônia e filtragem em gaze, sendo determinado o número de esporos por mL em
câmara de Neubauer ao microscópio óptico. De acordo com a metodologia adaptada
de Assi (2005).
3.4.3 Inibição de germinação de esporos
O teste de inibição de germinação de esporo na presença dos extratos foi
realizado em lâmina de microscopia revestida por fina camada de ágar-água a 1 %
(700 µL por lâmina).
Alíquotas de 40 µL das concentrações dos extratos aquosos esterilizados
em autoclave ou filtrados em membrana Millipore (0,45 µm de diâmetro de poro),
corrigidas para se manter os mesmos valores indicados em 3.4.1 e alíquotas de 40
µL da suspensão de esporos de P. griseola (1x10
4
conídios mL
-1
) obtidos de uma
cultura com 14 dias de idade, foram distribuídos na superfície das lâminas. As quais
foram incubadas em câmara úmida com escotofase total a 24 ºC. Como controle
negativo utilizou-se água destilada esterilizada e os controles positivos com
presença de fungicida (azoxystrobin: 40 mg i.a. L
-1
) e acibenzolar-S-metil (ASM 75
mg i.a. L
-1
).
A porcentagem de germinação foi determinada 24 horas após a instalação
do experimento com a adição de uma alíquota de 40 µL de Lactofenol com azul de
algodão em cada lâmina, a fim de paralisar a germinação de esporos (DI PIERO &
PASCHOLATI, 2002). O esporo foi considerado germinado quando o comprimento
de seu tubo germinativo era maior ou igual ao menor diâmetro do esporo.
A avaliação do experimento 24 horas após a instalação do mesmo foi
baseada no resultado da curva de germinação de esporos, realizada previamente,
na qual obteve-se o tempo necessário para máxima porcentagem de germinação.
Para tanto, uma alíquota de 80 µL de suspensão de esporos (1x10
4
conídios
mL
-1
) foi adicionada sobre uma lâmina de microscopia revestida com fina camada de
ágar-água 1% (700 µL por lâmina). A paralisação da germinação foi feita através do
emprego de 40 µL de lactofenol azul de algodão a cada 4 h em três repetições, até
40 h. Ao final realizou-se a observação ao microscópio óptico.
26
3.5 MATERIAL VEGETAL
3.5.1 Cultivo em casa de vegetação
Os ensaios foram conduzidos em cultivo protegido na área pertencente ao
Centro de Desenvolvimento Tecnológico (CEDETEC) da Faculdade Assis Gurgacz,
Cascavel, com altitude de 712 m, longitude 53º 30’ 01” W e latitude 24º 56’ 09” S.
As plantas de feijoeiro (IAPAR 81 – Carioca) foram cultivadas em vasos
plásticos (capacidade para 3 L) contendo uma mistura de solo e areia esterilizados
(proporção 2:1). Não realizou-se adubação devido a análise de solo apresentar
resultados satisfatórios de nutrientes.
3.5.1.1 Aplicação dos tratamentos em casa de vegetação
Para o teste de indução de resistência, utilizaram-se os tratamentos com
extratos aquosos de basidiocarpo, micélio e filtrado de cultura de P. sanguineus
(como descritos nos itens 3.2 e 3.3), nas concentrações 10 e 20%, além de um
controle negativo: plantas tratadas com água destilada, e dois controles positivos:
fungicida sistêmico azoxystrobin (40 mg i.a. L
-1
) e acibenzolar-S-metil (75 mg i.a. L
-
1
).
Os tratamentos foram aplicados na fase vegetativa (V4), quando a 4ª folha
trifoliolada do feijoeiro atingiu 50% de área foliar e três dias antes da inoculação do
patógeno. Os extratos, em quantidades de 3 mL, foram aplicados na 3ª folha. A
inoculação dos esporos do patógeno realizou-se na 3ª folha, bem como na 4ª folha
não tratada, para se observar a ocorrência de proteção local e/ou sistêmica,
respectivamente.
A suspensão de esporos do fungo P. griseola foi preparada em água com
Tween 20 (uma gota/500 mL), sendo a concentração ajustada para 4x10
4
conídios
mL
-1
. Após a inoculação, as plantas foram mantidas em câmara-úmida e no escuro a
temperatura ambiente por 48 h e, posteriormente, mantidas em casa de vegetação,
segundo metodologia utilizada por Stangarlin et al. (2000).
27
3.5.2 Cultivo a campo
O cultivo a campo foi conduzido na área pertencente ao Centro de
Desenvolvimento Tecnológico (CEDETEC) da Faculdade Assis Gurgacz, Cascavel,
com altitude de 712m, longitude 53º 30’ 01” W e latitude 24º 56’ 09” S. As plantas de
feijoeiro (IAPAR 81 – Carioca) foram semeadas em novembro de 2006.
O experimento constituiu-se de três blocos casualizados, sendo que cada
bloco era composto por nove parcelas, e cada parcela dentro de um bloco
representava um tratamento. Cada tratamento foi constituído de três linhas de 3 m
de comprimento, espaçadas 0,5 m entre si, com dez plantas viáveis por metro linear.
A linha central, descontando-se 0,5 m da bordadura anterior e posterior, foi
considerada área útil para avaliação.
Foram aplicados 400 kg ha
-1
de NPK (04-14-08) no sulco da semeadura (de
acordo com análise de solo) e os demais tratos culturais como capinas foram
realizados sempre que necessário.
3.5.2.1 Aplicação dos tratamentos a campo
Para o teste de indução de resistência a campo, utilizaram-se os
tratamentos com extratos aquosos de basidiocarpo, micélio e filtrado de cultura de P.
sanguineus (como descritos nos itens 3.2 e 3.3), nas concentrações 10 e 20%, além
de um controle negativo: plantas tratadas com água destilada, e dois controles
positivos: fungicida sistêmico azoxystrobin (40 mg i.a. L
-1
) e acibenzolar-S-metil (75
mg i.a. L
-1
).
Realizaram-se duas aplicações dos extratos: a primeira na fase vegetativa
(V3) (05/12/2006) e a segunda na fase reprodutiva (R3) (26/12/2006), ambas três
dias antes da inoculação do patógeno.
Os extratos foram aplicados por aspersão em toda a planta (5 mL de
solução por planta). A inoculação realizou-se por aspersão da suspensão de
esporos de P. griseola, preparada em água com Tween 20 (uma gota/500 mL),
sendo a concentração ajustada para 4x10
4
conídios mL
-1
.
28
3.5.3 Avaliação de severidade
A severidade da doença em casa de vegetação foi avaliada nas 3ª e 4ª
folhas no 8º, 12º, 16º, 20° e 24º dias após a inoculação, com escala diagramática
elaborada por Godoy et al. (1997).
A campo as avaliações iniciaram quando surgiu o primeiro sintoma da
doença (sete dias após a inoculação), e obtendo-se cinco avaliações a cada quatro
dias da porção mediana inferior das plantas. Na segunda aplicação dos tratamentos,
a severidade foi avaliada da mesma forma que na primeira aplicação, porém
avaliando-se a porção mediana superior do feijoeiro.
Com as avaliações de severidade da doença, procedeu-se a construção da
curva de progresso da doença e a determinação da área abaixo da curva de
progresso da doença (AACPD) por meio da equação proposta por Campbell &
Madden (1990):
n = número de avaliações;
y = intensidade da doença na i-ésima avaliação;
t = tempo no momento da i-ésima.
3.6 COLETA DE AMOSTRA PARA ANÁLISES BIOQUÍMICAS
Discos de folha com 3,46 cm
2
(três discos/amostra) foram coletados 48, 72,
96 e 120h após a inoculação e também após o aparecimento dos sintomas. Durante
o procedimento, cada amostra coletada foi imediatamente acondicionada em
envelopes de papel alumínio e congelada a –20 °C. Coletaram-se amostras nas 3
as
folhas trifoliadas inoculadas, bem como as 4
as
folhas trifoliadas não-inoculadas
(STANGARLIN & PASCHOLATI, 2000).
29
3.6.1 Obtenção dos extratos protéicos
As amostras de folhas foram homogeneizadas mecanicamente em 2 mL de
tampão fosfato de sódio 0,01M (pH 6,0) (tampão de extração), em almofariz de
porcelana. O homogenato foi centrifugado a 6.500 g durante 10 min a 4 ºC, sendo o
sobrenadante obtido considerado como extrato enzimático, para posterior
determinação da atividade de peroxidase, polifenoloxidase, β-1,3-glucanase e
conteúdo protéico.
3.6.2 Atividade de peroxidase
A atividade de peroxidases foi determinada a 30 ºC, através de método
espectrofotométrico direto a 470 nm durante 2,15 min (LUSSO & PASCHOLATI,
1999). A mistura da reação continha 0,10 mL de extrato protéico (conforme 3.6.1) e
2,9 mL de solução com 12,5 mL de guaiacol a 2% e 360 µL de peróxido de
hidrogênio em 87,5 mL de tampão fosfato de sódio 0,01 M (pH 6,0). A cubeta de
referência continha 3 mL da solução com 12,5 mL de guaiacol a 2% e 360 µL de
peróxido de hidrogênio em 87,5 mL de tampão fosfato de sódio 0,01 M (pH 6,0). A
atividade da peroxidase foi expressa em absorbância min
-1
g
-1
de peso fresco.
3.6.3 Atividade de polifenoloxidase
A atividade de polifenoloxidase foi determinada de acordo com a
metodologia de Duangmal e Apenten (1999). O substrato foi composto por catecol,
na concentração de 20 mM, dissolvido em tampão fosfato de sódio 100 mM (pH 6,8).
A reação ocorreu misturando-se 950 µL do substrato e 50 µL do extrato enzimático
(item 3.6.1). A atividade foi determinada a 30 ºC, através de método
espectrofotométrico direto a 420 nm durante 2,15 min. Os resultados foram
expressos em absorbância min
-1
g
-1
peso fresco.
30
3.6.4 Atividade de β–1,3-glucanase
A atividade da β–1,3-glucanase foi avaliada segundo metodologia descrita
por Stangarlin et al. (2000). A reação foi determinada pela quantificação
colorimétrica de glicose liberada da laminarina, através do uso da hidrazida do ácido
p-hidroxibenzóico (HAPHB). A mistura da reação, incubada a 40 ºC por 1 h continha
100 µL do extrato enzimático (conforme 3.6.1) 150 µL de laminarina (2 mg/mL) e 50
µL de tampão fosfato de sódio 0,01 M (pH 6,0). Após esse período, retirou-se 30 µL
e transferiu-se para um novo tubo, acrescentando sobre este 1,5 mL de uma solução
de HAPHB (0,5 g dissolvidos em 20 mL de HCl 0,5 M, acrescido de 80 mL de NaOH
0,5 M), sendo em seguida essa mistura aquecida a 100 ºC por 10 min. Após
resfriamento em gelo das amostras, realizou-se a leitura em espectrofotômetro a 410
nm. As leituras de absorbância foram plotadas em curva padrão para glicose e os
resultados expressos em
g de glicose min
-1
g
-1
peso fresco, descontando-se os
valores de absorbância do controle (100 µL do extrato enzimático + 50 µL de tampão
fosfato de 0,01 M (pH 6,0) + 1,5 de HAPHB, a laminarina é adicionada após a
incubação a 40 ºC por 1 h).
3.6.5 Teor de proteína
O teor de proteínas totais foi avaliado pelo método de Bradford (1976). A
mistura da reação foi constituída de três réplicas, sendo que para cada réplica foi
utilizado 15 µL do extrato enzimático (item 3.6.1), 775 µL de tampão fosfato de sódio
0,01 M (pH 6,0) e 200 µL do reagente de Bradford, o qual foi adicionado sob
agitação. Após 5 min realizou-se a leitura de absorbância em espectrofotômetro a
595 nm. A concentração de proteínas, expressa em termos equivalentes de µg de
albumina de soro bovino (ASB) em um mL de amostra (µg proteína mL
-1
), foi
determinada utilizando-se curva padrão de concentrações de ASB, variando de 0 a
20 µg mL
-1
.
31
3.6.6 Teor de clorofila
Para a quantificação da clorofila foi utilizada a metodologia adaptada de
Arnon (1949). As amostras de tecido vegetal (0,100 g) foram acondicionadas em
frascos de vidro com 10 mL de acetona 80%, durante 7 dias. Após esse período
realizou-se leitura no espectrofotômetro a 663 nm e 645nm para clorofila a e b,
respectivamente. A concentração de clorofila a obteve-se pela fórmula (0,0127.A
663
)
– (0,00269.A
645
) e para clorofila b (0,0229.A
645
) – (0,00468.A
663
). O teor de clorofila
total foi obtido pela soma dos resultados. Os valores foram expressos em mg g
-1
peso fresco.
3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
O delineamento experimental in vitro foi inteiramente casualizado (DIC),
organizado em esquema fatorial 3 x 6 + 2 (três tipos de extratos: basidiocarpo,
micélio e filtrado de cultura, seis concentrações: 0, 1, 5, 10, 15 e 20% e dois
controles: fungicida e ASM) com cinco repetições por tratamento.
As análises bioquímicas foram organizadas em esquema fatorial 3 x 2 + 3
(três tipos de extratos, duas concentrações e três controles). Cada tratamento
apresentava três repetições, sendo que cada repetição foi representada por três
discos de tecido vegetal.
A severidade em casa de vegetação e a campo apresentou-se em blocos ao
acaso, em esquema fatorial 3 x 2 + 3 (três tipos de extratos, duas concentrações e
três controles). Sendo que em casa de vegetação havia 10 plantas por tratamento e
a campo 30 plantas.
A análise de variância foi realizada através do programa estatístico JMP
(Statistical Analysis System SAS Institute Inc. EUA, 1989 – 2000 versão 4.0.0.), e a
comparação das médias dos tratamentos com os controles foi realizada com a
aplicação do teste de Dunnett’s em nível de 5% de probabilidade.
32
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA in vitro
4.1.1 Inibição do crescimento micelial
A análise de variância do efeito das concentrações do extrato de P.
sanguineus sobre o crescimento micelial de P. griseola foi significativa apenas para
o extrato obtido do micélio e esterilizado por filtração em membrana Millipore (Figura
3), não apresentando diferença estatística para os extratos de basidiocarpo e filtrado
de cultura (dados não mostrados). Esse extrato promoveu redução do crescimento
micelial em 100% na maior concentração (20%) quando comparada ao controle
água, não diferindo estatisticamente do fungicida, e as concentrações 5, 10 e 15 %
foram tão fungitóxicas quanto o ASM (Figura 2).
ASMFungicida
Crescimento micelial (cm
2
)
0
1
2
3
0 5 10 15 20 25
y = -0,0136x
2
+ 0,3695x + 2,2102
R
2
= 0,8561
A
a
Bb
Ab
Bb
Ba
Ab
Ab
Concentração (%)
Figura 2. Inibição
in vitro
do crescimento micelial de
Pseudocercospora griseola
em função do
tratamento com extrato aquoso de micélio de Pycnoporus sanguineus, esterilizado por
filtração em membrana Millipore. Médias seguidas de mesma letra (maiúscula para
comparação com ASM e minúscula para comparação com Fungicida) não diferem
estatisticamente pelo teste de Dunnett´s a 5% de probabilidade. ASM: acibenzolar-S-metil
(75 mg i.a. L
-1
). Fungicida: azoxystrobin (40 mg i.a. L
-1
).
Esse resultado indica a presença de compostos termolabeis no micélio de P.
sanguineus, onde o extrato autoclavado não apresentou efeito sobre a variável
avaliada.
33
Estudos realizados por Anke (1995) relatam a diversidade de componentes
isolados de Basidiomicetos que promovem a inibição do crescimento de
microrganismos que compõem seu microhabitat, ressaltando a importância das
substâncias antimicrobianas produzidas por esses fungos.
Figura 3 Efeito dos extratos de micélio de P. sanguineus sobre o crescimento micelial in vitro de P.
griseola. (A) autoclavado e (F) filtrado em membrana Millipore.
4.1.2 Inibição da esporulação
O extrato aquoso obtido de micélio de P. sanguineus esterilizado por filtração,
apresentou redução significativa na esporulação de P. griseola, o qual foi reduzido
em 100% a partir da concentração 5% (Figura 4), não se verificando efeito com o
mesmo extrato autoclavado, assim como os extratos obtidos de basidiocarpo e
filtrado de cultura (dados não mostrados).
A esporulação é um importante mecanismo de perpetuação e disseminação
do patógeno, assim produtos que reduzem a esporulação minimizam a quantidade
de inóculo inicial e, consequentemente, a infecção. A eficiência de produtos naturais,
como extratos de plantas com atividade in vitro sobre a esporulação são relatadas
por Franzener et al. (2003) utilizando cânfora (Artemisia camphorata) sobre
Bipolaris sorokiniana, inibindo completamente a esporulação a partir do extrato a
10%.
Entre os Basidiomicetos, a família Polyporaceae tem sido a mais estudada,
sendo que aproximadamente 75% de suas espécies apresentam grande atividade
ASM
Água
Fungicida
A 1%
A 5% A 10%
A 15%
A 20%
F 1%
F 5%
F 10%
F 15%
F 20%
34
antimicrobiana. Numerosos componentes desses fungos, como polissacarídeos
derivados da parede celular, apresentam atividade antiviral, citotóxica e/ou anti-
neoplásica, atraindo a atenção de pesquisadores nos últimos anos (WASSER,
2002).
ASMFungicida
Esporulação (10
3
.cm
2
)
0
1
2
3
4
5
0 5 10 15 20 25
y = -0,029x
2
+ 0,783x + 4,4903
R
2
= 0,8891
A
a
Bb
Ba
Bb
Ba
Ba
Ba
Concentração (%)
Figura 4 Inibição in vitro da esporulação de Pseudocercospora griseola em função do tratamento
com extrato aquoso de micélio de Pycnoporus sanguineus, esterilizado por filtração em
membrana Millipore. Médias seguidas de mesma letra (maiúscula para comparação com
ASM e minúscula para comparação com Fungicida) não diferem estatisticamente pelo
teste de Dunnett´s a 5% de probabilidade. ASM: acibenzolar-S-metil (75 mg i.a. L
-1
).
Fungicida: azoxystrobin (40 mg i.a. L
-1
).
4.1.3 Inibição da germinação de esporos
Os extratos aquosos de basidiocarpo, micélio e filtrado de cultura de P.
sanguineus autoclavados e basidiocarpo e filtrado de cultura esterilizados por
filtração não apresentaram efeito sobre a germinação de esporos de P. griseola
(dados não mostrados). Ao passo que, o extrato obtido do micélio esterilizado por
filtração inibiu a germinação de esporos de acordo com a concentração utilizada,
(Figura 5).
Dados semelhantes são descritos por Assi (2005) com inibições de até 96%
na germinação de C. lindemuthianum utilizando extratos aquosos de P. sanguineus.
O ativador químico ASM apresentou atividade fungitóxica in vitro, inibindo o
crescimento micelial e esporulação de P. griseola, não apresentando atividade sobre
a germinação de esporos, contrariando os resultados relatados por Jesus Jr et al.
35
(1999), o qual destaca que o ASM não apresentou atividade de inibição in vitro sobre
Phaeoisariopsis griseola.
y= -0,1009x
2
+ 3,896x + 71,982
R
2
=0,8687
0 5 10 15 20 25
A
ASM Fungicida
Germinação de Esporos (%)
0
20
40
60
80
100
a
Ab
Ba
Bb
Bb
Bb
Bb
Concentração (%)
Figura 5 Inibição in vitro da germinação de esporos de Pseudocercospora griseola em função do
tratamento com extrato aquoso de micélio de Pycnoporus sanguineus, esterilizado por
filtração em membrana Millipore. Médias seguidas de mesma letra (maiúscula para
comparação com ASM e minúscula para comparação com Fungicida) não diferem
estatisticamente pelo teste de Dunnett´s a 5% de probabilidade. Dados transformados por
√x + 0,5. ASM: acibenzolar-S-metil (75 mg i.a. L
-1
). Fungicida: azoxystrobin (40 mg i.a. L
-1
).
4.2 AVALIAÇÃO DA SEVERIDADE EM CASA DE VEGETAÇÃO
A severidade em casa de vegetação apresentou-se baixa, provavelmente
devido às condições climáticas no período de inoculação, o qual não foi favorável ao
desenvolvimento do patógeno.
De acordo com a área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD)
obtida para a 3ª folha trifoliolada tratada, bem como para a 4ª folha trifoliolada não
tratada (Tabela 1), observa-se uma redução significativa na 3ª folha, em todos os
tratamentos quando comparados ao controle água, com reduções de até 82,4 % da
AACPD no filtrado de cultura a 10%. O basidiocarpo (10 e 20%) não proporcionou o
mesmo controle que o fungicida, ao passo que o filtrado de cultura (10 e 20%) e o
micélio (10 e 20%) não diferiram do mesmo. Os extratos de basidiocarpo (10 e 20%),
36
filtrado e micélio (20%) foram superiores ao ASM, enquanto filtrado e micélio a 10%
não diferiram do mesmo.
A 4ª folha não tratada e apenas inoculada, apresentou baixa severidade, que
além do efeito sistêmico do extrato de P. sanguineus, pode estar relacionada à idade
da folha, a qual apresentava 50% de área foliar no momento da inoculação. Nesta
fase de crescimento a atividade fisiológica é alta, favorecendo a agilidade da
resposta bioquímica. Dessa forma, verificou-se diferença estatística dos extratos
(exceto basidiocarpo a 10%) com redução da AACPD quando comparados com a
água. Os tratamentos apresentaram efeito semelhante ao fungicida e ao ASM.
Tabela 1 - Área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) para mancha
angular causada por P. griseola em feijoeiro em função dos tratamentos
com extratos aquosos de Pycnoporus sanguineus, na terceira folha
tratada e na quarta folha apenas inoculada, em condições de casa de
vegetação.
AACPD
Tratamentos
3ª FOLHA 4ª FOLHA
Basidiocarpo 10%
Basidiocarpo 20%
Filtrado de cultura 10%
Filtrado de cultura 20%
Micélio 10%
Micélio 20%
Água
ASM
1
Fungicida
2
24,5
1,2,3
5,3
19,5
1,2,3
2,7
1
7,4
1
2,5
1
10,8
1,2
3,6
1
8,1
1
3,1
1
9,6
1,2
4,1
1
41,9 8,8
2,3 5,2
6,7 2,4
C.V (%) 31,4 7,3
Médias na coluna, seguida de letra indica diferença estatística a 5% pelo teste de Dunnett’s
quando comparada aos controles água (1), ASM (2) e Fungicida (3). Para análise estatística os
dados foram transformados por √ x + 0,5;
1
ASM: acibenzolar-S-metil (75 mg i.a. L
-1
);
2
Fungicida: azoxystrobin (40 mg i.a. L
-1
).
4.3 AVALIAÇÃO DA SEVERIDADE A CAMPO
Através das avaliações de severidade a campo, obteve-se a AACPD, para a
porção mediana inferior (1ª aplicação) e mediana superior (2ª aplicação) das plantas
de feijoeiro (Tabela 2).
37
Na porção mediana inferior, verificou-se diferença estatística com AACPD
superior em todos os tratamentos quando comparados ao fungicida, não diferindo da
água e do ASM. Efeito contrário se verificou na mediana superior para a 2ª
aplicação, onde todos os tratamentos apresentaram reduções significativas da
AACPD quando comparados com a água, com reduções de até 63,8% para o
tratamento basidiocarpo 20%. Os extratos obtidos de basidiocarpo (20%), filtrado de
cultura (10 e 20%) e micélio (20%) reduziram a AACPD, apresentando resultados
superiores ao indutor de resistência comercial (ASM). Quando comparados ao
fungicida, todos os tratamentos diferiram do mesmo, apresentando maior
severidade.
Observou-se um efeito aditivo no crescimento e coloração das plantas
tratadas com o filtrado de cultura, com atraso, inclusive na senescência.
Assi (2005) obteve resultados semelhantes com extrato aquoso de
basidiocarpos de P. sanguineus, reduzindo a severidade da antracnose em feijoeiro
de forma sistêmica.
Di Piero & Pascholati (2004) demonstraram redução parcial na severidade de
antracnose em folhas de pepino pré-tratadas com os extratos de Lentinula edodes e
Agaricus blazei, de forma sistêmica. O efeito protetor foi dependente da
concentração de cogumelo utilizada e, em menor grau, do intervalo de tempo entre a
indução e a inoculação e o ambiente.
A utilização dos extratos de P. sanguineus no controle de doenças de plantas
em cultivos orgânicos mostra-se promissora, já que apresentam níveis de controle
semelhantes ao indutor de resistência comercial e com custo inferior aos fungicidas
no cultivo convencional, além de não causar impactos ambientais, seja pela seleção
de isolados fitopatogênicos resistentes ou por contaminação pelo uso dos produtos
químicos.
38
Tabela 2 - Área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) para mancha
angular causada por P. griseola em feijoeiro em função dos tratamentos
com extratos aquosos de Pycnoporus sanguineus, em condições de
campo.
AACPD
Tratamentos
Porção Mediana
Inferior da planta
Porção Mediana
Superior da planta
Basidiocarpo 10%
Basidiocarpo 20%
Filtrado de cultura 10%
Filtrado de cultura 20%
Micélio 10%
Micélio 20%
Água
ASM
1
Fungicida
2
51,7
3
54,2
1,3
49,9
3
32,3
1,2,3
48,0
3
48,7
1,2,3
48,4
3
45,2
1,2,3
54,7
3
68,0
1,3
48,6
3
44,2
1,2,3
59,4 89,0
41,9 67,7
6,3 16,1
C.V (%)
47,5
53,9
Médias na coluna, seguida de letra indica diferença estatística a 5% pelo teste de Dunnett’s
quando comparada aos controles água (1), ASM (2) e Fungicida (3). Para análise estatística os
dados foram transformados por √ x + 0,5;
1
ASM: acibenzolar-S-metil (75 mg i.a. L
-1
);
2
Fungicida: azoxystrobin (40 mg i.a. L
-1
).
4.4 ALTERAÇÕES BIOQUÍMICAS DA INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA
4.4.1 Atividade de peroxidase
A atividade de peroxidase foi alterada em função dos tratamentos com
basidiocarpo, micélio e filtrado de cultura, na 3ª folha tratada, bem como na 4ª folha
não tratada e inoculada, demonstrando a sistemicidade do efeito em função dos
extratos de P. sanguineus (Figura 6).
Na 3ª folha, o extrato basidiocarpo 10% reduziu a atividade da enzima quando
comparado aos controles água e fungicida aos 3 dias após a inoculação (DAI). Aos 5
DAI diferiu do ASM e do fungicida e aos 7 dias do ASM. O basidiocarpo a 20%
apresentou aumento da atividade de peroxidase aos 4 DAI, e inibição aos 3, 5 e 7
DAI, quando comparado aos controles ASM, ASM e fungicida e ASM,
respectivamente.
39
O extrato aquoso de micélio a 10% reduziu a atividade de peroxidase aos 3, 5
e 7 DAI, quando comparados ao ASM e fungicida. Ao passo que o micélio 20%
apresentou-se superior quando comparado ao ASM e fungicida (2 DAI), a água e ao
fungicida (3 DAI), ao fungicida (4 DAI). Reduções comparadas com a água e ao
ASM foram verificadas a partir dos 5 DAI.
Filtrado de cultura induziu a atividade aos 4 DAI, para o extrato 10%,
comparado a água e fungicida, inibindo, posteriormente aos 5 e 7 DAI. O filtrado a
20% inibiu a síntese de peroxidase aos 5 e 7 DAI, em relação aos controles ASM e
fungicida e ASM, respectivamente.
A 4ª folha não tratada apresentou os mesmos efeitos que a 3ª folha sobre a
atividade da peroxidase, de forma mais ou menos acentuada.
Assi (2005) verificou ativação de peroxidase em feijoeiro tratadas com extrato
aquoso de P. sanguineus e desafiadas com C. lindemuthianum tanto local como
sistêmico, concordando com os resultados obtidos nesse trabalho.
Beninca (2007) avaliou o efeito de extratos orgânicos de basidiocarpos de P.
sanguineus, e verificou que o diclorometânico para sorgo e soja e etanólico para
soja, inibem a atividade de peroxidase, enquanto que o extrato hexânico promove a
atividade para sorgo e a atividade específica para soja.
Para Kuhn (2007), a atividade de peroxidase em feijoeiro foi influenciada em
função do tempo, do número de aplicações e do indutor. O indutor abiótico (ASM)
promoveu aumento da atividade de forma mais acentuada e mais rápida que o
indutor biótico (Bacillus cereus).
40
(a) (b)
Basidiocarpo
0
3
6
9
12
2 3 4 5 6 7
Abs min
-1
g
-1
PF
*
1,2
*
2
*
1,2,3
*
2,3
*
2,3
*
2
0
3
6
9
12
2 3 4 5 6 7
*
2
*
2,3
*
2
*
1,3
*
2,3
*
2
*
2,3
Micélio
0
3
6
9
12
2
3
4
5
6
7
Abs min
-1
g
-1
PF
*
2,3
*
2
*
1,3
*
3
*
2,3
*
1
*
2
*
2
0
3
6
9
12
2
3
4
5
6
7
*
2
*
1
*
1,3
*
2
*
1,3
*
1,2,3
*
1,2,3
Filtrado de cultura
0
3
6
9
12
2
3
4
5
6
7
Abs min
-1
g
-1
PF
*
1,3
*
1,3
*
2,3
*
1,2,3
*
2
0
3
6
9
12
2
3
4
5
6
7
*
2
*
2
*
1,3
*
1
*
2
*
2,3
*
1,2,3
*
1,2,3
Tempo (Dias após a inoculação) Tempo (Dias após a inoculação)
Figura 6 Atividade de peroxidase em plantas de feijoeiro inoculadas com
Pseudocercospora griseola
três dias após os tratamentos com os controles água (♦), Acibenzolar-S-metil (ASM 75 mg
i.a. L
-1
) (■) e Fungicida (Azoxystrobin
40 mg i.a. L
-1
) (▲) e os extratos aquosos de
Pycnoporus sanguineus obtidos do basidiocarpo a 10% e 20% (● e ×), Micélio 10% e 20% (●
e ×), Filtrado de cultura 10% e 20% (● e ×). (a) e (b) representam respectivamente a 3º folha
tratada e inoculada e a 4º folha apenas inoculada. Barras indicam a média ± o erro padrão.
*Seguido de número indica diferença estatística a 5% pelo teste de Dunnett’s quando
comparada aos controles água (1), ASM (2) e Fungicida (3). PF: peso fresco.
41
4.4.2 Atividade de polifenoloxidase
A atividade da polifenoloxidase foi influenciada pelos tratamentos com
extratos de P. sanguineus, na 3ª folha tratada, bem como na 4ª folha não tratada e
inoculada, demonstrando a sistemicidade do efeito (Figura 7).
Na folha tratada, o extrato de basidiocarpo a 10% reduziu a atividade da
enzima quando comparado aos controles água e ASM aos 3 DAI. Aos 4 DAI
estimulou quando comparado com a água e o fungicida e aos 5 DAI foi menor em
relação ao ASM. O basidiocarpo a 20% apresentou aumento da atividade de
polifenoloxidase em relação ao fungicida aos 3 DAI, aos 4 e 5 DAI, quando
comparado aos três controles e aos 7 DAI em relação ao fungicida.
O extrato aquoso de micélio a 10% reduziu a atividade enzimática aos 3, 5 e 7
DAI, quando comparados ao ASM, ASM e fungicida e ASM respectivamente, porém,
foi maior que a água e o fungicida aos 4 DAI. O micélio 20% apresentou-se superior
quando comparado ao fungicida (3 DAI), a água e ao fungicida (4 e 5 DAI),
apresentando redução em relação ao ASM, na presença do sintoma (7 DAI).
O extrato filtrado de cultura a 10% aumentou a atividade a partir do 3 DAI, em
relação ao fungicida, aos 4 e 6 DAI comparado a água e fungicida e aos 7 DAI
sofreu redução em relação a água e ASM.
A 4ª folha não tratada apresentou efeitos semelhantes a 3ª folha sobre a
atividade da polifenoloxidase, exceto para o extrato de basidiocarpo a 10% que aos
7 DAI apresentou aumento significativo em relação aos controles.
A ativação de enzimas de defesa como a peroxidase e polifenoloxidase nas
plantas de feijoeiro expostas aos extratos de P. sanguineus, caracterizam a indução
de resistência e demonstram a eficiência de produtos naturais na ativação de
respostas dos tecidos frente a tentativas de colonização pelo patógeno.
Romeiro (2007) ressalta a necessidade de investigar, com seriedade e
persistência, métodos alternativos para o controle de enfermidades de plantas, que
sejam, ao mesmo tempo, eficientes e menos agressivos à saúde humana e ao meio
ambiente. Ativar os mecanismos de defesa da planta deixando que ela própria se
proteja contra patógenos, em vez de saturá-la e intoxicá-la com defensivos, por certo
será a estratégia politicamente correta do futuro.
42
(a) (b)
Basidiocarpo
0
0,5
1
1,5
2
2
3
4
5
6
7
Abs min
-1
g
-1
PF
*
1,2
*
3
*
1,3
*
1,2,3
*
2
*
1,2,3
*
3
0
0,5
1
1,5
2
2 3 4 5 6 7
*
2,3
*
1
*
2
*
1
*
1,2,3
*
2
*
1
Micélio
0
0,5
1
1,5
2
2
3
4
5
6
7
Abs min
-1
g
-1
PF
*
2
*
3
*
1,3
*
1,3
*
2,3
*
1,3
*
2
*
2
0
0,5
1
1,5
2
2 3 4 5 6 7
*
1,3
*
3
*
2
*
1,3
*
1
Filtrado de cultura
0
0,5
1
1,5
2
2
3
4
5
6
7
Abs min
-1
g
-1
PF
*
3
*
2
*
1,3
*
2
*
1,3
*
1,3
*
1,2
0
0,5
1
1,5
2
2
3
4
5
6
7
*
3
*
2,3
*
1,3
*
1
*
2
*
1,3
*
2
Tempo (Dias após a inoculação) Tempo (Dias após a inoculação)
Figura 7 Atividade de polifenoloxidase em plantas de feijoeiro inoculadas com Pseudocercospora
griseola três dias após os tratamentos com os controles água (♦), Acibenzolar-S-metil
(ASM 75 mg i.a. L
-1
) (■) e Fungicida (Azoxystrobin 40 mg i.a. L
-1
) (▲) e os extratos aquosos
de Pycnoporus sanguineus obtidos do basidiocarpo a 10% e 20% (● e ×), Micélio 10% e
20% (● e ×), Filtrado de cultura 10% e 20% (● e ×). (a) e (b) representam respectivamente
a 3º folha tratada e inoculada e a 4º folha apenas inoculada. Barras indicam a média ± o
erro padrão. *Seguido de número indica diferença estatística a 5% pelo teste de Dunnett’s
quando comparada aos controles água (1), ASM (2) e Fungicida (3). PF: peso fresco.
43
4.4.3 Atividade de β-1,3-glucanase
A atividade da β-1,3-glucanase foi influenciada pelos tratamentos com
extratos de P. sanguineus, na 3ª folha tratada, bem como na 4ª folha não tratada e
inoculada, comprovando a sistemicidade do efeito também para essa enzima, como
já observado em peroxidase e polifenoloxidase (Figura 8).
Na folha tratada, os extratos de basidiocarpo 10 e 20% reduziram a atividade
da enzima em relação ao controle aos 5 DAI, e aos 7 DAI para o extrato a 20%
quando comparado a água e ao fungicida.
O micélio a 10%, em relação a água, estimulou aos 3 DAI e inibiu aos 5 DAI.
Ao passo que, o extrato a 20% inibiu a atividade da β-1,3-glucanase aos 3 DAI em
comparação ao fungicida e aos 5 DAI em relação a água.
O extrato de filtrado de cultura a 10% não apresentou efeito significativo e a
20% foi relativamente menor que a água aos 5 DAI.
A 4ª folha não tratada apresentou efeitos semelhantes a 3ª folha sobre a
atividade da β-1,3-glucanase, de forma ainda mais acentuada.
De acordo com Stangarlin et al. (2000), plantas de feijoeiro desafiadas com o
hemibiotrófico P. griseola não alteraram a atividade de β-1,3-glucanase, ao passo
que, quando desafiadas com o fungo biotrófico Uromyces appendiculatus, a indução
da atividade de β-1,3-glucanase foi verificada (STANGARLIN & PASCHOLATI,
2000). Dessa forma, supõe-se que existe uma relação entre o tratamento eliciador e
o patógeno desafiante, na ativação dos mecanismos de defesa em plantas. A planta
poderia investir em compostos que normalmente ela ativaria na presença do
patógeno, porém, com maior eficiência quando pré-disposta a um eliciador.
Cavalcanti et al. (2006) verificaram que acibenzolar-S-metil (ASM; 0,2 g L-1),
Ecolife (5 mL L-1), suspensão de quitosana (MCp; 200 g L-1) proveniente de micélio
de Crinipellis perniciosa, e extrato aquoso de ramos de lobeira (Solanum
lycocarpum) infectados por C. perniciosa (VLA; 300 g L-1) conferem capacidade
parcial de proteção em plantas de tomateiro desafiadas por Xanthomonas
campestris pv. vesicatoria. Essas substâncias promoveram o aumento na atividade
de quitinase e β-1,3-glucanase, relacionadas à patogênese em folhas de plantas de
tomateiro.
44
(a) (b)
Basidiocarpo
0
20
40
60
80
2 3 4 5 6 7
µg de Glicose min
-1
g
-1
PF
*
1
*
1
*
1,3
0
20
40
60
80
2 3 4 5 6 7
*
2
*
1,3
*
1,3
*
3
*
1,3
*
1,3
*
1,3
Micélio
0
20
40
60
80
2 3 4 5 6 7
µg de Glicose min
-1
g
-1
PF
*
1
*
3
*
1
*
1
0
20
40
60
80
2 3 4 5 6 7
*
1,3
*
1,3
*
1
*
3
*
3
Filtrado de cultura
0
20
40
60
80
2 3 4 5 6 7
µg de Glicose
min
-1
g
-1
PF
*
1
0
20
40
60
80
2
3
4
5
6
7
*
2
*
2
*
1,3
*
1,3
*
1,3
*
3
*
3
Tempo (Dias após a inoculação) Tempo (Dias após a inoculação)
Figura 8 Atividade de β-1,3-glucanase em plantas de feijoeiro inoculadas com Pseudocercospora
griseola três dias após os tratamentos com os controles água (♦), Acibenzolar-S-metil
(ASM 75 mg i.a. L
-1
) (■) e Fungicida (Azoxystrobin 40 mg i.a. L
-1
) (▲) e os extratos aquosos
de Pycnoporus sanguineus obtidos do basidiocarpo a 10% e 20% (● e ×), Micélio 10% e
20% (● e ×), Filtrado de cultura 10% e 20% (● e ×). (a) e (b) representam respectivamente
a 3º folha tratada e inoculada e a 4º folha apenas inoculada. Barras indicam a média ± o
erro padrão. *Seguido de número indica diferença estatística a 5% pelo teste de Dunnett’s
quando comparada aos controles água (1), ASM (2) e Fungicida (3). PF: peso fresco.
45
4.5 ALTERAÇÕES FISIOLÓGICAS DA INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA
4.5.1 Teor de proteína
Na literatura são encontrados trabalhos que ressaltam o papel das proteínas
nos mecanismos de resistência de plantas (PASCHOLATI & LEITE, 1995; MORAES,
1992). O teor de proteína foi significativamente alterado tanto na folha tratada como
na folha não tratada com os extratos de P. sanguineus (Figura 9).
O extrato obtido de basidiocarpo a 10% foi significativo a partir do 4 DAI,
estimulando o teor de proteínas em relação a água e ao fungicida. Aos 5 e 7 DAI o
efeito foi superior a água e ao ASM. O basidiocarpo a 20% foi superior a água e ao
fungicida (3 e 4 DAI) e aos 5 e 7 DAI maiores que os três controles.
O extrato de micélio estimulou a síntese protéica aos 4 DAI comparado aos
três controles, e aos 5 e 7 DAI em relação a água e fungicida e a água,
respectivamente. O extrato a 20% foi superior a água e ao fungicida (3 DAI), aos três
controles (4 DAI), a água e ASM (5 DAI) e a água (7 DAI).
O filtrado de cultura a 10% foi superior aos três tratamentos controles aos 4
DAI, aos 5 DAI maior que a água a ASM e aos 7 DAI superior ao fungicida. O extrato
a 20% foi inferior aos 3 DAI em relação ao ASM, com posterior aumento aos 4 DAI
comparado a água e fungicida e aos três controles aos 5 e 7 DAI.
O efeito dos extratos de P. sanguineus sobre o teor de proteínas é
semelhante no 4º trifólio não tratado. Verifica-se neste uma resposta mais rápida na
síntese protéica, considerando-se que houve diferença significativa aos 2 DAI, não
sendo verificado esse efeito na 3ª folha, podendo estar relacionado a idade da
mesma, a qual, no momento da aplicação dos tratamentos e inoculação do
patógeno, encontrava-se com 50% de área foliar e com provável atividade fisiológica
alta, otimizando a síntese de proteínas.
No geral, verifica-se uma alteração significativa no conteúdo protéico, dessa
forma, quando as enzimas investigadas nesse estudo eram divididas pelo conteúdo
protéico, o resultado era uma redução drástica das mesmas, ao passo que, quando
expressadas pelo peso das amostras, um resultado satisfatório era verificado.
Assim, mantiveram-se as enzimas citadas acima (peroxidase, polifenoloxidase e β-
1,3-glucanase) apresentadas pelo peso das amostras vegetais.
46
(a) (b)
Basidiocarpo
0
3
6
9
12
15
2 3 4 5 6 7
Proteína (mg g
-1
PF)
*
1,3
*
1,3
*
1,3
*
1,2,3
*
1,2
*
1,2
*
1,2,3
0
3
6
9
12
15
2
3
4
5
6
7
*
1,2,3
*
1
*
1,2,3
*
1,3
*
1,3
*
1,2,3
*
1
*
1
Micélio
0
3
6
9
12
15
2 3 4 5 6 7
Proteína (mg g
-1
PF)
*
1,3
*
1,3
*
1,2,3
*
1,2
*
1,3
*
1
*
1
0
3
6
9
12
15
2
3
4
5
6
7
*
1,2,3
*
1,2,3
*
1,3
*
1,2,3
*
1,2,3
*
1,3
*
1,2,3
*
3
*
1
Filtrado de cultura
0
3
6
9
12
15
2 3 4 5 6 7
Proteína (mg g
-1
PF)
*
2
*
1,2,3
*
1,3
*
1,2
*
1,2,3
*
3
*
1,2,3
0
3
6
9
12
15
2 3 4 5 6 7
*
1,2,3
*
1,2,3
*
1
*
1,2,3
*
1,2,3
*
1,2,3
*
1
*
2,3
*
1,2,3
Tempo (Dias após a inoculação) Tempo (Dias após a inoculação)
Figura 9 Teor de proteína em plantas de feijoeiro inoculadas com Pseudocercospora griseola três
dias após os tratamentos com os controles água (♦), Acibenzolar-S-metil (ASM 75 mg i.a.
L
-1
) (■) e Fungicida (Azoxystrobin 40 mg i.a. L
-1
) (▲) e os extratos aquosos de Pycnoporus
sanguineus obtidos do basidiocarpo a 10% e 20% (● e ×), Micélio 10% e 20% (● e ×),
Filtrado de cultura 10% e 20% (● e ×). (a) e (b) representam respectivamente a 3º folha
tratada e inoculada e a 4º folha apenas inoculada. Barras indicam a média ± o erro padrão.
*Seguido de número indica diferença estatística a 5% pelo teste de Dunnett’s quando
comparada aos controles água (1), ASM (2) e Fungicida (3). PF: peso fresco.
47
4.5.2 Teor de clorofila a
O teor de clorofila a nas plantas que receberam os extratos de P. sanguineus
apresentou-se alterado, como pode ser observado na Figura 10. No extrato de
basidiocarpo 10% verifica-se aumento no conteúdo de clorofila a, na 3ª folha tratada,
quando comparado a água (3, 4 e 7 DAI), ao ASM (5 e 7 DAI) e ao fungicida (2 e 4
DAI). Incremento também verificado no extrato a 20% e relação à água (3 e 7 DAI),
ao ASM (2, 3, 4 e 5 DAI) e ao fungicida (2, 4 e 7 DAI).
O extrato de micélio a 10% reduziu o teor de clorofila a aos 2 e 5 DAI, em
relação ao ASM, e a água e fungicida, respectivamente. Porém, aumentos
significativos são verificados em comparação com a água (3, 4 e 7 DAI), ao ASM (3,
4 e 7 DAI) e ao fungicida (4 DAI). O mesmo extrato na maior concentração
apresentou resultados superiores a água (3, 4 e 7 DAI), ao ASM (7 DAI) e ao
fungicida (2 e 4 DAI).
O filtrado de cultura 10% aumentou o conteúdo de clorofila a em relação à
água (2, 3, 4 e 7 DAI), ao ASM (3 e 5 DAI) e ao fungicida (2, 3 e 7 DAI). O extrato a
20% foi maior quando comparado a água (4 e 7 DAI), ao ASM (7 DAI) e ao fungicida
(2 e 4 DAI), porém inibições são observadas em relação a água (5 DAI), ao ASM (3
DAI) e ao fungicida (3 e 5 DAI).
A 4ª folha não tratada apresentou um padrão de respostas semelhante a folha
tratada, demonstrando que os extratos agiram de forma sistêmica também para essa
variável.
Trabalho realizado por Stangarlin et al. (2000) com plantas de feijoeiro
inoculadas com P. griseola, demonstram reduções significativas no teores de
clorofila a e b nas áreas verdes, próximas as regiões infectadas, em cultivar
moderadamente suscetível. Esse efeito não foi verificado quando se utilizou uma
cultivar altamente suscetível.
48
(a) (b)
Basidiocarpo
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
2
3
4
5
6
7
Clorofila a (mg
g
-1
PF)
*
3
*
2,3
*
1
*
1,2
*
1,3
*
2,3
*
2
*
2
*
1,2
*
1,3
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
2
3
4
5
6
7
*
3
*
3
*
3
*
1
*
1,2,3
*
1,3
*
1,3
*
1,3
Micélio
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
2
3
4
5
6
7
Clorofila a (mg g
-1
PF)
*
2
*
3
*
1,2
*
1
*
1,3
*
1,3
*
1,3
*
1,2
*
1,2
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
2
3
4
5
6
7
*
3
*
3
*
1
*
1
*
1,3
*
1,2,3
*
2,3
*
1,3
*
1,2
Filtrado de cultura
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
2 3 4 5 6 7
Clorofila a (mg g
-1
PF)
*
1,3
*
3
*
1,2
*
2,3
*
1,3
*
1,3
*
2
*
1,3
*
1,3
*
1,2
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
2
3
4
5
6
7
*
3
*
3
*
2,3
*
1,2,3
*
1,2,3
*
1,3
*
1,2
Tempo (Dias após a inoculação) Tempo (Dias após a inoculação)
Figura 10 Teor de clorofila a em plantas de feijoeiro inoculadas com Pseudocercospora griseola três
dias após os tratamentos com os controles água (♦), Acibenzolar-S-metil (ASM 75 mg i.a.
L
-1
) (■) e Fungicida (Azoxystrobin 40 mg i.a. L
-1
) (▲) e os extratos aquosos de Pycnoporus
sanguineus obtidos do basidiocarpo a 10% e 20% (● e ×), Micélio 10% e 20% (● e ×),
Filtrado de cultura 10% e 20% (● e ×). (a) e (b) representam respectivamente a 3º folha
tratada e inoculada e a 4º folha apenas inoculada. Barras indicam a média ± o erro padrão.
*Seguido de número indica diferença estatística a 5% pelo teste de Dunnett’s quando
comparada aos controles água (1), ASM (2) e Fungicida (3). PF: peso fresco.
49
4.5.3 Teor de clorofila b
O teor de clorofila b nas plantas de feijoeiro que receberam os extratos
apresentaram-se alteradas, conforme Figura 11. Na 3ª folha tratada, o extrato de
basidiocarpo 10% ocasionou um estímulo no teor de clorofila b, em relação aos
controles água (7 DAI), ao ASM (7 DAI) e ao fungicida (2 DAI). Incrementos foram
verificados no extrato a 20% e relação à água (3 e 7 DAI), ao ASM (7 DAI) e ao
fungicida (2 DAI). Houve reduções aos 2 e 7 DAI quando comparado ao ASM e ao
fungicida, respectivamente.
O extrato aquoso obtido de micélio a 10% reduziu o teor de clorofila b aos 2
DAI, em relação ao ASM. Porém, aumentos significativos são verificados em
comparação com a água (3, 4 e 7 DAI), ao ASM (7 DAI) e ao fungicida (4 DAI). O
micélio a 20% apresentou resultados superiores a água (4 e 7 DAI), ao ASM (7 DAI)
e ao fungicida (2, 4 e 7 DAI).
O filtrado de cultura a 10% aumentou o conteúdo de clorofila a em relação à
água (3, 4 e 7 DAI), ao ASM (3 e 7 DAI) e ao fungicida (2, 3 e 4 DAI) e inibiu quando
comparado ao fungicida, 7 dias após a inoculação. O extrato a 20% foi maior quando
comparado a água (4 e 7 DAI), ao ASM (7 DAI) e ao fungicida (2 e 4 DAI), porém
inibições são observadas em relação ao ASM e ao fungicida aos 3 dias após a
inoculação.
A 4ª folha não tratada apresentou um efeito semelhante a folha tratada,
demonstrando que os extratos agiram de forma sistêmica também para a clorofila b.
50
(a) (b)
Basidiocarpo
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
2
3
4
5
6
7
Clorofila b (mg g
-1
PF)
*
3
*
2,3
*
1
*
1,2
*
1,2,3
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
2
3
4
5
6
7
*
3
*
3
*
1
*
2,3
*
1,2,3
*
1,3
*
1,2,3
*
1,2,3
Micélio
0
0,02
0,04
0,06
0,08
2 3 4 5 6 7
Clorofila b (mg g
-1
PF)
*
2
*
3
*
1
*
1
*
1,3
*
1,3
*
1,2
*
1,2
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
2 3 4 5 6 7
*
3
*
1
*
1
*
1,3
*
1,2,3
*
1,3
*
1,2,3
Filtrado de cultura
0
0,02
0,04
0,06
0,08
2 3 4 5 6 7
Clorofila b (mg g
-1
PF)
*
3
*
3
*
1,2,3
*
2,3
*
1,3
*
1,3
*
1,2,3
*
1,2
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
2 3 4 5 6 7
*
3
*
3
*
2,3
*
1,3
*
1,2,3
*
3
*
1,2
Tempo (Dias após a inoculação) Tempo (Dias após a inoculação)
Figura 11 Teor de clorofila b em plantas de feijoeiro inoculadas com Pseudocercospora griseola três
dias após os tratamentos com os controles água (♦), Acibenzolar-S-metil (ASM 75 mg i.a.
L
-1
) (■) e Fungicida (Azoxystrobin 40 mg i.a. L
-1
) (▲) e os extratos aquosos de Pycnoporus
sanguineus obtidos do basidiocarpo a 10% e 20% (● e ×), Micélio 10% e 20% (● e ×),
Filtrado de cultura 10% e 20% (● e ×). (a) e (b) representam respectivamente a 3º folha
tratada e inoculada e a 4º folha apenas inoculada. Barras indicam a média ± o erro padrão.
*Seguido de número indica diferença estatística a 5% pelo teste de Dunnett’s quando
comparada aos controles água (1), ASM (2) e Fungicida (3). PF: peso fresco.
51
4.5.4 Teor de clorofila total
O conteúdo de clorofila total em plantas de feijoeiro tratadas com extratos
aquosos de P. sanguineus e desafiadas com P. griseola pode ser visualizado na
Figura 12.
O extrato obtido de basidiocarpo 10% estimulou o conteúdo de clorofila total
em relação aos controles água (3, 4 e 7 DAI), ASM (5 e 7 DAI) e fungicida (2 e 4
DAI). Alterações também são observadas no extrato a 20%, com aumento quando
comparados a água (3 e 7 DAI), ASM (3 e 5 DAI) e ao fungicida (2 DAI), e reduções
em relação ao ASM (2 e 4 DAI) e ao fungicida (7 DAI).
O micélio 10% reduziu o teor de total de clorofila aos 2 DAI, em relação ao
ASM. Porém, aumentos significativos são verificados em comparação com a água
(3, 4 e 7 DAI), ao ASM (3 e 7 DAI) e ao fungicida (4 DAI). O micélio a 20%
apresentou resultados superiores a água (3, 4 e 7 DAI), ao ASM (7 DAI) e ao
fungicida (2 e 4 DAI).
Filtrado de cultura a 10% aumentou o conteúdo de clorofila em relação à água
(2, 3, 4 e 7 DAI), ASM (3 DAI) e ao fungicida (2 e 4 DAI) e inibiu quando comparado
ao fungicida aos 7 dias após a inoculação. O extrato a 20% foi maior quando
comparado a água (4 e 7 DAI), ao ASM (7 DAI) e ao fungicida (2 e 4 DAI), porém
inibições são observadas em relação ao ASM e ao fungicida aos 3 DAI e apenas ao
ASM 5 dias após a inoculação.
Verifica-se um comportamento semelhante dos dados na 4ª folha não tratada,
ressaltando o efeito sistêmico de P. sanguineus sobre o conteúdo de clorofila total
em feijoeiro. Esses resultados sugerem a necessidade de produção de energia para
síntese dos compostos de defesa da planta, considerando-se que as moléculas de
clorofila a e b constituem os dois sistemas de pigmentos responsáveis pela absorção
e transferência de energia radiante (FERRI, 2004).
Na literatura há poucos trabalhos que verificam o teor de clorofila em plantas
tratadas com indutores e/ou desafiadas com um patógeno. Stangarlin & Pascholati
(2000) verificaram incremento no teor de clorofila em regiões infectadas com
Uromyces appendiculatus, o que ocorre tanto na cultivar de feijoeiro moderadamente
suscetível como altamente suscetível.
52
(a) (b)
Basidiocarpo
0,00
0,10
0,20
0,30
2 3 4 5 6 7
Clorofila total (mg g
-1
PF)
*
3
*
2,3
*
1
*
1,2
*
1,3
*
2
*
2
*
1,2
*
1,3
0,00
0,10
0,20
0,30
2 3 4 5 6 7
*
3
*
3
*
1
*
1
*
1,2,3
*
1,3
*
1,3
*
1,3
Micélio
0,00
0,10
0,20
0,30
2 3 4 5 6 7
Clorofila total (mg g
-1
PF)
*
2
*
3
*
1,2
*
1
*
1,3
*
1,3
*
1,2
*
1,2
0,00
0,10
0,20
0,30
2 3 4 5 6 7
*
3
*
3
*
1
*
1
*
1,3
*
1,2,3
*
2,3
*
1,3
*
1,2,3
Filtrado de cultura
0,00
0,10
0,20
0,30
2 3 4 5 6 7
Clorofila total (mg g
-1
PF)
*
1,3
*
3
*
1,2
*
2,3
*
1,3
*
1,3
*
3
*
1,3
*
1,2
0,00
0,10
0,20
0,30
2
3
4
5
6
7
*
3
*
3
*
2,3
*
1,2,3
*
1,2,3
*
1,3
*
1,2
Tempo (Dias após a inoculação) Tempo (Dias após a inoculação)
Figura 12 Teor de clorofila total em plantas de feijoeiro inoculadas com Pseudocercospora griseola
três dias após os tratamentos com os controles água (♦), Acibenzolar-S-metil (ASM 75 mg
i.a. L
-1
) (■) e Fungicida (Azoxystrobin 40 mg i.a. L
-1
) (▲) e os extratos aquosos de
Pycnoporus sanguineus obtidos do basidiocarpo a 10% e 20% (● e ×), Micélio 10% e 20%
(● e ×), Filtrado de cultura 10% e 20% (● e ×). (a) e (b) representam respectivamente a 3º
folha tratada e inoculada e a 4º folha apenas inoculada. Barras indicam a média ± o erro
padrão. *Seguido de número indica diferença estatística a 5% pelo teste de Dunnett’s
quando comparada aos controles água (1), ASM (2) e Fungicida (3). PF: peso fresco.
53
5 CONCLUSÕES
Os extratos obtidos de P. sanguineus controlaram a mancha angular do
feijoeiro causada por P. griseola.
O extrato não autoclavado obtido de micélio de P. sanguineus apresentou
atividade antimicrobiana direta, inibindo a germinação de esporos, crescimento
micelial e espoulação de P. griseola.
A indução de enzimas de defesa de resistência local e sistêmica, como
peroxidase e polifenoloxidase, foram superiores nas plantas tratadas com os
extratos aquosos de basidiocarpo, micélio e filtrado de cultura de P. sanguineus.
Efeito contrário foi verificado na atividade de β-1,3-glucanase.
Alterações fisiológicas como o teor de proteínas e clorofilas foram alteradas
acentuadamente nas plantas de feijoeiro tratadas com os extratos, indicando a
necessidade de energia para síntese de compostos de defesa.
54
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