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Universidade Federal de Santa Catarina
Centro de Ciências da Saúde
Programa de Pós-Graduação em Odontologia
Área de Concentração Implantodontia
Análise da viabilidade de enxertos de
tecido conjuntivo subepitelial submetido a um
processo de expansão mecânica: estudo
histológico em cães
Tese de Doutorado
Cesar Augusto Magalhães Benfatti
Florianópolis, 2008
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Cesar Augusto Magalhães Benfatti
Análise da viabilidade de enxertos de
tecido conjuntivo subepitelial submetido a um
processo de expansão mecânica: estudo
histológico em cães
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade
Federal de Santa Catarina como requisito para a obtenção do título de Doutor em
Odontologia – Área de concentração Implantodontia.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo de Sousa Magini (associado),
lotado no Departamento de Estomatologia da Universidade
Federal de Santa Catarina.
Co-orientador: Prof. Dr. Sebastião Luis Aguiar Gregui, lotado
no Departamento de Prótese da Faculdade de Odontologia de
Bauru, da Universidade de São Paulo.
Florianópolis, 2008
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Cesar Augusto Magalhães Benfatti
Análise da viabilidade de enxertos de tecido
conjuntivo subepitelial submetido a um processo
de expansão mecânica: estudo histológico em cães
Esta tese foi julgada adequada para a obtenção do título de Doutor em
Odontologia, Área de concentração Implantodontia, e aprovada na forma final pelo
Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Doutorado Acadêmico da Faculdade de
Odontologia da Universidade Federal de Santa Catarina.
Florianópolis, 12 de junho de 2008.
___________________________________________
Ricardo de Sousa Vieira
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Odontologia
Banca Examinadora
_________________________________
Orientador: Ricardo de Sousa Magini
__________________________________
Co-orientador: Sebastião Luis Aguiar Greghi
_________________________________
Carlos dos Reis Pereira de Araújo
__________________________________
José Mondelli
__________________________________
Geninho Tomé
Resumo
O objetivo deste trabalho foi avaliar histologicamente a viabilidade de enxertos
conjuntivos subepiteliais expandidos mecanicamente. Foram colhidas 16 amostras de
tecido conjuntivo do palato de 8 cães da raça Beagle. Metade das amostras foi submetida
ao tratamento de expansão. Após esse processo, elas foram enxertadas subepitelialmente
na região de canino. Na região contralateral realizou-se a enxertia, contudo o tecido
conjuntivo não foi expandido. Sessenta dias após, foram colhidas biópsias dessas áreas,
analisadas histologicamente por meio de microscopia óptica de luz, microscopia confocal
a laser e imuno-histoquímica para células endoteliais (anticorpo CD31). Em nenhuma das
análises realizadas foram observadas diferenças estatisticamente significantes entre o
grupo controle e o grupo teste. Com este trabalho, conclui-se que essa nova forma de
aumentar a área dos enxertos de tecido conjuntivo, além de ser biologicamente viável,
diminui os riscos cirúrgicos e a morbidade pós-operatória, sem gerar aumento do custo e
do tempo de procedimento.
Palavras-chave: Enxerto conjuntivo. Expansão tecidual. Microscopia confocal.
Abstract
The aim of this work was to do histological assessment if it is feasible to do subepithelial
connective graft mechanically released. It was taken 16 palatal connective tissue samples
of 8 dogs Beagle. A half of the samples were subjected to the expansion treatment. After
passing the tissue for the expansion device, this one was subepithelial grafting, in the
canine’s region. In the counter-side region, was did the grafting, however, the connective
tissue was not expanded. After sixty days, was taken the biopsy of these areas and did the
histological analysis, by optical microscopy of light, confocal microscopy laser and
Inmunohistochimic for endothelial cells (antibody CD31). No one of the analysis showed
significant statistic differences between the control and exam groups. The conclusion of
this work is that this new way of increase the connective graft tissues areas, beyond to be
biologically feasible, it decreases the surgical risk and postoperative morbidity, without
creating an increase of the cost and of the processing time.
Key-words: Connective graft. Tissue expansion. Confocal microscopy.
1 INTRODUÇÃO
Objetivando a obtenção da tríade saúde, função e estética dos tecidos
periodontais, desde a década de 60 as técnicas de enxertia vêm sendo utilizadas na
odontologia.
1
Muitos estudos demonstraram que a presença de mucosa ceratinizada ao
redor de dentes e implantes, bem como sua qualidade (espessura) e quantidade (largura),
é fator determinante para a obtenção dessa tríade.
2-4
A utilização de enxerto de tecido conjuntivo para sanar deficiências anatômicas
tanto periodontais quanto periimplantares, sejam elas estéticas ou funcionais, tem
crescido e se tornado um ato rotineiro nos consultórios odontológicos.
2-7
Existem, porém, fatores limitantes ou desfavoráveis nessa técnica, como
hemorragia da área doadora e quantidade insuficiente de tecido doador. Tanto a
hemorragia quanto a quantidade insuficiente de tecido estão relacionadas à área e ao
volume da região doadora. Além disso, a degeneração do epitélio que recobre a área
doadora do enxerto conjuntivo pode gerar uma exposição óssea nessa região.
8
Características anatômicas da região palatina, como tamanho e formato, determinam a
quantidade de tecido doador possível de ser removido. Outro fator limitante é o
posicionamento da artéria palatina maior.
9,10
Estudo utilizando cadáveres concluiu que a
área de pré-molares é a mais espessa do palato para remoção de tecido doador e que, se o
tamanho de enxerto for insuficiente, deve-se abrir mão do lado contralateral.
10
Apesar de
a região palatina ser a mais comumente utilizada como fonte doadora de tecido, também
se pode recorrer a outras fontes doadoras, como regiões retromolares, áreas edêntulas e
tecidos oriundos de gengivectomias internas, porém essas fontes são limitadas quando se
leva em consideração a quantidade de tecido disponível.
11
Alguns cirurgiões utilizam empiricamente a técnica de “esmagar” o tecido
removido com instrumentos como o cabo do cinzel de Ochsenbein, para aumentar a área
do tecido a ser enxertado, mas o resultado desse tipo de técnica é imprevisível, por tornar
o tecido irregular e por não haver controle sobre o grau de expansão tecidual.
Esta pesquisa teve por objetivo avaliar histologicamente áreas enxertadas com
tecido conjuntivo de origem palatina submetido a um tratamento mecânico de expansão,
vislumbrando minimizar a intervenção cirúrgica na área doadora por possibilitar o
aumento da área do tecido a ser enxertado.
2 MATERIAL E MÉTODO
Foram selecionados 8 cães da raça Beagle, com aproximadamente 10 meses,
sendo 4 machos e 4 fêmeas, com pesos variando entre 10 kg e 18 kg, provenientes do
Biotério Central da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC).
Previamente ao procedimento cirúrgico, cada cão recebeu uma injeção, por via
intramuscular, de sulfato de atropina 0,50 mg (Atropinon
®
, Hipolabor Farmacêutica
Ltda., Sabará, MG, Brasil), na dosagem de 0,44 mg/kg. Após 10 min, foi aplicada
xilazina (Rompun
®
, Bayer S.A., São Paulo, SP, Brasil), na dosagem de 3 mg/kg, e
cloridrato de quetamina 1,0 mg (Francotar
®
, Virbac, Saúde Animal, São Paulo, SP,
Brasil), na dosagem de 16 mg/kg, ambos por via intramuscular, em uma única injeção.
Em casos de necessidade, fez-se reforço anestésico com a metade da dose-mãe.
No ato cirúrgico, foi removida uma amostra de tecido conjuntivo de cada cão. No
intuito de padronizar o tamanho das amostras, utilizou-se um delimitador de área com 2
cm de comprimento por 1 cm de largura (FIG. 1). Esse delimitador era pressionado
contra a mucosa palatina, que era parcialmente incisada. Com um bisturi e uma lâmina
15C, completavam-se as incisões. As amostras foram removidas do lado direito ou do
lado esquerdo do palato, próximo à rafe mediana, na região dos primeiros molares do cão.
Figura 1 – Delimitador de área de 2,0 cm x 1,0 cm.
Após a remoção das amostras, estas foram lavadas com soro fisiológico e
divididas ao meio, sendo uma das metades integrante do grupo teste, e a outra, do grupo
controle, separação realizada de forma aleatória. As amostras do grupo teste foram
comprimidas gradualmente, de 0,5 mm em 0,5 mm, por um dispositivo de expansão
tecidual (FIG. 2), até atingirem a espessura aproximada final de 0,75 mm (FIG. 3). As
amostras do grupo controle não foram submetidas ao processo de expansão tecidual. Em
seguida, ambas foram enxertadas nas regiões dos caninos inferiores do mesmo animal,
sem o deslocamento para coronal do retalho, somente com incisões intra-sulculares e com
a divisão do retalho, mantendo-se o periósteo aderido ao osso. Nessas regiões foram
criadas, previamente à preparação dos leitos receptores, recessões de 5 mm x 5 mm.
Depois dos procedimentos cirúrgicos, os animais receberam ao longo dos 7 dias
subseqüentes um agente analgésico e antiinflamatório, flunixina meglumina (Banamine
®
injetável 10 mg, Schering Plough S.A., Rio de Janeiro, RJ, Brasil), administrado por via
intramuscular, na dose de 1,1 mg/kg, com o objetivo de controlar a dor e o edema da área
operada. Também receberam antibiótico (Pentabiótico Veterinário Pequeno Porte
®
1.200.000 U, Fort Dodge Saúde Animal Ltda., Campinas, SP, Brasil) durante 10 dias, por
via intramuscular, na dose de 24.000 U/kg por dia.
2.1 Método para a expansão tecidual
Para expandir o tecido removido do palato duro foi utilizado um dispositivo de
expansão tecidual desenvolvido na UFSC, pelos departamentos de Engenharia Mecânica
e de Estomatologia (FIG. 2 e 3).
Figura 2 – Dispositivo de expansão tecidual.
Figura 3 – Tecido conjuntivo sendo comprimido pelo dispositivo.
2.2 Análises histológicas
Após 60 dias, realizou-se a biópsia da área enxertada mediante a utilização de um
bisturi circular de 5 mm de diâmetro. As amostras de tecido foram lavadas com soro
fisiológico, fixadas em formol a 10% por 72 h, desidratadas a partir de uma seqüência de
álcoois, de 70% GL até absoluto, e incluídas em paraplast. Cortes semi-seriados, com
espessura de 5 µm, foram realizados, para posterior coloração em hematoxilina-eosina
(HE). Para cada amostra foram obtidos 3 cortes, e o melhor deles foi utilizado na análise
histomorfométrica.
Para a avaliação dos parâmetros histomorfométricos deste estudo, utilizaram-se o
microscópio confocal de varredura a laser (Leica TCS-SPE, Mannheim, Alemanha) e o
microscópio de luz (Zeiss Axioskop II, Alemanha) acoplado a um programa de análise
digitalizada (KS 300 Imaging System, Release 3.0©, Carl Vision GmbH, Alemanha).
2.2.1 Análise histológica
A análise histológica pela coloração HE consistiu no exame qualitativo das
diferenças teciduais das amostras teste e controle, analisando-se a presença ou a ausência
de alterações teciduais, como, por exemplo, a presença de infiltrado inflamatório (FIG. 4
e 5).
Figura 4 – Microscopia óptica de luz do grupo teste em HE. Observe a ausência de
infiltrado inflamatório (10x).
Figura 5 – Microscopia óptica de luz do grupo controle em HE. Observe a ausência de
infiltrado inflamatório (10x).
2.2.2 Análise histomorfométrica
Devido ao potencial fluorescente da eosina, para a avaliação morfológica, as
lâminas em HE foram levadas ao microscópio confocal de varredura a laser (Faculdade
de Odontologia de Bauru), com o qual foram obtidas imagens com aumento de 10x.
Fizeram-se análises comparativas da espessura do epitélio e mediu-se a área de
fibras colágenas existente no tecido conjuntivo subjacente, da maneira a seguir.
A. Espessura da ceratina: para quantificar a espessura de ceratina das amostras,
foram selecionados três pontos na camada de ceratina (D1, D2 e D3) e depois
calculada a média aritmética para a obtenção do valor (FIG. 6), sendo:
• D1 a medida da espessura da ceratina do canto esquerdo da lâmina;
• D2 a medida da espessura da ceratina do canto direito da lâmina; e
• D3 a medida da espessura da ceratina do centro da lâmina.
Figura 6 – Foto histológica em microscopia confocal ilustrando os pontos onde se mediu
a espessura da camada de ceratina (D1, D2 e D3).
B. Espessura do epitélio: para quantificar a espessura do epitélio das amostras,
foi definido o local da lâmina histológica com maior distância entre a papila
conjuntiva e a camada de ceratina. Em seguida, foram feitas três medidas
dessa posição e calculada a média aritmética para a obtenção do valor (FIG.
7), sendo:
• Q/P a medida da ceratina ao centro da papila conjuntiva;
• Q/C1 a medida do início da camada de ceratina ao centro da crista epitelial
esquerda; e
• Q/C2 a medida do início da camada de ceratina ao centro da crista epitelial
direita.
Figura 7 – Foto em microscopia confocal ilustrando as três medidas de espessura
do epitélio.
C. Área de fibras colágenas existente no tecido conjuntivo subjacente: para
determinar a área ocupada por fibras colágenas no tecido conjuntivo
subjacente ao epitélio, foi selecionada uma área de 50 µm
2
do centro da
lâmina original, de um total de 215,371 µm
2
(FIG. 8).
Figura 8 – Área de 50 µm
2
selecionada da imagem de 215,371 µm
2
.
50 µm
2
Após a seleção da área, a imagem foi analisada com o Programa KS 300 Imaging
System, Release 3.0, pelo qual foi obtida a quantidade de fibras colágenas existentes no
tecido conjuntivo subjacente ao epitélio.
2.2.3 Análise imuno-histoquímica
Para o estudo imuno-histoquímico foram obtidos cortes de 3 μm de espessura a
partir de espécimes teciduais fixados em formol a 10%, incluídos em parafina, que foram
estendidos em lâminas de vidro, previamente limpas e desengorduradas, preparadas com
adesivo à base de organossilano (3-aminopropiltrietoxissilano, Sigma Chemical Co.,
EUA). Os cortes obtidos foram corados pelo método da estreptoavidina-biotina (SABC,
do inglês Streptavidin-Biotin Complex), utilizando-se o anticorpo monoclonal CD31
(JC70A, Dako) para a identificação das células endoteliais, após recuperação antigênica
com a tripsina a 0,4% e incubação por 18 h a 4 ºC para o anticorpo.
Em seguida, realizou-se a contagem em microscopia óptica convencional (FIG.
9), realizada com aumento de 40x.
Figura 9 – Foto em microscopia óptica de luz do grupo teste. Note a coloração
avermelhada dos vasos sanguíneos marcados pelo CD31 (aumento de 40x).
As estruturas que apresentavam coloração marrom-acastanhada foram marcadas
com o anticorpo monoclonal CD31 para células endoteliais.
2.3 Análise estatística dos dados histológicos
Os
dados obtidos foram analisados por meio dos testes ANOVA e T-Student. O
programa utilizado foi o Estatistica 6.0.
3 RESULTADOS
Quando comparados os grupos controle e teste, levando-se em consideração a
análise qualitativa de alterações teciduais em HE, não houve diferenças estatisticamente
significantes. Em relação à análise histomorfométrica da espessura da camada de
ceratina, da espessura do epitélio e da quantidade de colágeno, também não houve
diferenças estatisticamente significantes, conforme é verificado nos Gráficos 1, 2 e 3.
±Std. Dev.
±Std. Err.
Mean
Gráfico da Espessura de Ceratina
Grupos
Espessura de Ceratina
6
8
10
12
14
16
18
20
Controle Teste
Gráfico 1 – Comparativo da espessura da camada de ceratina entre os grupos controle e
teste (p > 0,05).
±Std. Dev.
±Std. Err.
Mean
Gráfico da Espessura do Epitélio
Grupos
Espesura do Epitélio
100
120
140
160
180
200
220
240
260
Controle Teste
Gráfico 2 – Comparativo da espessura do epitélio dos grupos controle e teste (p > 0,05).
±Std. Dev.
±Std. Err.
Mean
Gráfico da Quantidade de Fibras Colágenas
Grupos
Área em Pixels
13000
15000
17000
19000
21000
23000
25000
Controle Teste
Gráfico 3 – Comparativo da área ocupada por fibras colágenas no tecido conjuntivo entre
os grupos controle e teste (p > 0,05).
Comparando-se a quantidade de vasos sangüíneos existentes nos grupos controle
e teste, mediante a utilização do anticorpo monoclonal CD31 (JC70A, Dako) para a
identificação das células endoteliais, não foram observadas diferenças estatisticamente
significantes entre os grupos (p > 0,05), conforme se pode verificar no Gráfico 4.
Desvio padrão
Erro da Amostra
Média
Gráfico da quantidade de vasos sangüíneos (CD31)
Grupo
Número de vasos sangüíneos
6
8
10
12
14
16
18
20
Teste Controle
Gráfico 4 – Análise estatística do número de vasos sangüíneos existentes nos grupos
controle e teste. Não houve significância entre os grupos (p > 0,05).
O aumento real da área dos enxertos conjuntivos submetidos ao processo
mecânico de expansão foi mensurado (Tabela 1). As mensurações prévia e posterior ao
tratamento dos enxertos permitiram obter uma média dos valores: o dispositivo aumentou
a área do tecido conjuntivo em aproximadamente 158% (Gráfico 5).
Tabela 1 – Tamanho dos enxertos, em milímetros e em porcentagem de expansão,
previamente ao tratamento e após o tratamento para aumento da área do tecido
conjuntivo.
Tamanho dos enxertos antes e após a expansão
Animais 1 2 3 4 5 6 7 8 Média
Conjuntivo pré-
expansão
5,5 x 6 6 x 5 8 x 6 4,5 x 9,5 8,5 x 7 7,5 x 8 5,5 x 6 6 x 8
Conjuntivo pós-
expansão
10,5 x 8 11 x 7 11 x 9 13 x 11 13,5 x 11,5 11 x 10 10 x 9 9,5 x 15
Porcentagem de
expansão
154,50% 156,60% 106,25% 234,50% 160,90% 83,33% 172,70% 196,90% 158,21%
Gráfico da área dos enxertos conjuntivos submetidos ao
processo de expansão
0
20
40
60
80
100
120
Conjuntivo prévio à expansão Conjuntivo após a expansão
Área em milímetros
Gráfico 5 – Grau de expansão dos enxertos do grupo teste.
4 DISCUSSÃO
Tanto a qualidade quanto a quantidade de mucosa ceratinizada são fatores
determinantes para a manutenção da saúde e da estética ao redor de dentes.
12
A ausência
dessas características teciduais promove um selamento marginal da mucosa inadequado,
devido ao aumento da mobilidade, o que favorece a colonização bacteriana subgengival.
13
Outros fatores a serem levados em consideração são a impermeabilidade e a capacidade
de proteção mecânica das mucosas mastigatórias, que protegem o periodonto de injúrias
químicas e físicas.
14
Devido a essas características, em uma mucosa ceratinizada, com
qualidade e quantidade adequadas, há maior dificuldade de estabelecimento do processo
inflamatório, o que inibe a perda de inserção e previne possíveis recessões gengivais.
15
A técnica de recobrimento radicular com enxerto conjuntivo subepitelial é
utilizada há várias décadas.
16
As principais limitações dessa técnica estão relacionadas
com o leito doador, pois há possibilidade de injúrias a algum plexo vasculonervoso.
Grandes quantidades de tecido conjuntivo tornam a técnica inviável ou com uma
morbidade pós-operatória elevada.
17
Sendo assim, quanto menor for o tecido removido,
menores serão os riscos gerados. A possibilidade de tirar-se uma quantidade pequena de
tecido e ampliá-la após a sua remoção, previamente à sua enxertia, tem sido foco de
pesquisas no mundo inteiro.
18
Exemplo disso é um trabalho em que se realizou a
expansão in vitro de uma amostra de tecido gengival com posterior enxertia, a qual, além
de ser uma técnica onerosa e demorada, não foi submetida a análise de citotoxicidade e
de genotoxicidade.
18
Outra técnica que vislumbra a expansão do tecido, porém por meio
de golpes com o cabo de um cinzel Ochsenbein, vem sendo executada por clínicos.
Contudo, pela inexistência de estudos que avaliem essa técnica, a sua eficácia científica e
clínica é questionável.
O estudo do dispositivo de expansão tecidual é uma referência científica da
possibilidade de expandir o explante de conjuntivo, mantendo a viabilidade dele para a
realização da técnica de enxertia subepitelial, bem como para reduzir a área doadora e,
por conseqüência, a morbidade pós-operatória e danos a estruturas anatômicas nobres.
Além de permitir a expansão dos enxertos de tecido conjuntivo, o dispositivo
promove a regularização da espessura deles. Tal fato permite uma melhor adaptação do
enxerto ao leito receptor e uma camada de coágulo mais fina, o que diminui a chance de
insucesso e o grau de contração do tecido, devido ao fato de o coágulo tornar-se uma
barreira à nutrição plasmática do enxerto nos períodos iniciais da cicatrização.
17
Outro
fator favorável é que, por haver diminuição na espessura, há maior facilidade de nutrição
das camadas mais internas do enxerto e maior rapidez no restabelecimento e no
amadurecimento dos plexos vasculares.
19
Porém, quando o objetivo é o ganho em
espessura da mucosa, essa técnica deve ser realizada com cautela, pois, ao se realizar a
compressão do tecido, ele aumenta em área e perde em espessura, podendo não se obter o
ganho almejado.
Neste estudo, por não ter havido alterações histológicas nos 60 dias subseqüentes
à cirurgia, pode-se dizer que a compressão gerada pelo dispositivo não é capaz de
promover alterações que inviabilizem o sucesso da técnica cirúrgica. Previamente a essa
pesquisa, mostrou-se que a pressão sobre a mucosa mastigatória gerada pelo dispositivo
não é capaz de romper vasos sangüíneos, células e a estrutura da matriz de colágeno,
imediatamente após a expansão.
20
Esse fator é de extrema relevância, pois é a matriz de
colágeno que determina a diferenciação e a proliferação celulares.
21
As proteínas
presentes na matriz (colágeno, elastina, fibronectina, proteoglicanas e outras) favorecem a
alteração fenotípica das células mesenquimais indiferenciadas, e a estrutura
tridimensional da matriz permite a adesão celular, fator essencial para que os fibroblastos
iniciem o processo de mitose ou produção de matriz extracelular. Isso posto, tão
importante quanto a presença de células viáveis no enxerto conjuntivo é a integridade da
estrutura de colágeno existente nele, sendo esse fator determinante para o sucesso da
técnica.
4
A capacidade de induzir a diferenciação epitelial dos enxertos conjuntivos não foi
foco deste estudo, mas, como não houve o deslocamento coronal do retalho, presume-se
que todo tecido formado sobre a recessão previamente criada está diretamente associado
ao enxerto realizado e à nutrição plasmática do leito receptor adjacente à recessão. O
deslocamento coronal do retalho poderia promover o recobrimento radicular, contudo tal
fato dificultaria prever a real viabilidade do enxerto, já que a presença de mucosa
ceratinizada, de boa qualidade e em grande quantidade, torna a técnica de deslocamento
coronal do retalho altamente previsível.
A quantidade de vasos, fibroblastos e fibras colágenas, a forma como essas
estruturas posicionam-se dentro do tecido e a espessura de epitélio e da camada de
ceratina são fatores que determinam a maturidade da gengiva formada após a enxertia.
19
Esses determinantes foram encontrados nos dois grupos analisados, o que permite
mostrar que a expansão mecânica dos tecidos não gera danos biológicos significantes.
5 CONCLUSÃO
Pode-se concluir, ante os resultados encontrados, analisados e discutidos, que essa
nova forma de aumentar a área dos enxertos de tecido conjuntivo, além de ser
biologicamente viável, diminui os riscos cirúrgicos e a morbidade pós-operatória, sem
gerar aumento do custo e do tempo de processamento.
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