( PDF ) Avaliação dos distúrbios metabólicos produzidos pela deleção genética do receptor de angiotensina (1-7), Mas em camundongos FVB/N

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Sérgio Henrique Sousa Santos

Avaliação dos distúrbios metabólicos

produzidos pela deleção genética do

receptor de angiotensina-(1-7), Mas, em

Camundongos FVB/N

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

Belo Horizonte

2007

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS –

FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

Avaliação dos distúrbios metabólicos

produzidos pela deleção genética do

receptor de angiotensina-(1-7), Mas, em

Camundongos FVB/N

Dissertação de mestrado apresentado ao

programa de Pós-graduação em Ciências

Biológicas – Fisiologia e Farmacologia da

Universidade Federal de Minas Gerais

Aluno: Sérgio Henrique Sousa Santos

Orientador: Prof. Dr. Robson Augusto

Souza dos Santos

Co-Orientadora: Prof. Dra. Jaqueline Isaura

Alvarez Leite

Belo Horizonte, 2007

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Agradecimentos

Agradeço a Deus por me proporcionar tantas graças e perdoar minhas

faltas. Tenho certeza que minhas conquistas não vieram apenas por meus

méritos e virtudes, mas sim por sua bondade e misericórdia.

Aos meus pais, que apesar de todas as dificuldades, priorizaram os

estudos dos filhos e assim possibilitaram essa vitória. Vocês sabem o quanto

amo vocês. Dedico cada conquista profissional ao esforço e zelo que tiveram

todos esses anos.

Obrigado as minhas irmãs, avó, tios, primos e amigos que torceram por

mim e rezaram para que meus sonhos se realizassem.

Obrigado ao meu orientador Robson Santos pela conduta e

ensinamentos que só um grande mestre e pesquisador poderia ter oferecido.

Obrigado aos meus colegas de laboratório e de faculdade pela força,

auxilio e incentivo oferecidos por todos esses anos na UFMG.

A todos vocês o meu muito obrigado.

"nem tudo o que é importante é prioritário, e nem tudo o que é

necessário é indispensável!"

"Antes tentar e errar que formar fila com os pobres de espírito que não conhecem

nem a vitória e nem a derrota!"

Resumo

A síndrome metabólica, também conhecida como síndrome de

resistência à insulina, é caracterizada pela coexistência variável de obesidade,

hiperinsulinemia, dislipidemia e hipertensão. A angiotensina-(1-7) apresenta um

importante papel contraregulatório dentro do Sistema Renina Angiotensina, se

opondo, na maioria das vezes, aos efeitos da angiotensina II. Tem sido

demonstrado que o receptor acoplado a proteína G, Mas, medeia várias ações

da angiotensina-(1-7). Observamos recentemente que camundongos machos

knockout para o receptor Mas (Mas-/-) com background genético FVB/N,

apresenta pressão sanguínea elevada e disfunção endotelial, alterações

presentes no quadro de síndrome metabólica.

O objetivo desse estudo foi verificar se a deleção genética do receptor

Mas altera o perfil lipídico e glicêmico desses animais e os mecanismos

envolvidos nesse processo. Camundongos WT e knockout machos com

aproximadamente dez semanas de vida foram utilizados. Curvas de glicemia

pelo tempo foram construídas após aplicação intraperitoneal de insulina

(0.75U/Kg) ou glicose (2g/Kg). Após o sacrifício os tecidos foram pesados e

reservados para western blotting e Real-Time PCR. O perfil lipídico e os níveis

plasmáticos de leptina e adiponectina foram avaliados utilizando kits de ELISA

e a expressão do mRNA do TGF-β, angiotensinogênio e do TNF-α foram

analisados pela técnica de Real-Time PCR.

Apesar de apresentar peso corporal igual ao do controle (24.7 ± 0.35 vs

24.8± 0.24 g no WT), os camundongos Mas-/- jovens apresentaram marcante

aumento no peso do tecido adiposo (epididimal= 1.704 ± 0.1516 vs 1.150 ±

0.1259 % do PC no WT e retroperitoneal= 0.6747 ± 0.08576 vs 0.3781 ±

0.04575 % do PC no WT). Além disso, esses animais apresentam resistência a

insulina e maior intolerância a glicose, bem como um aumento na glicemia de

jejum (86.6 ± 6.43 vs 56.40 ± 4.98 mg/dl no WT). Também foram encontrados

aumentos significativos nos níveis plasmáticos de colesterol total (92.2 ± 3.65

vs 74.6± 5.67 mg/dl no WT) e triglicérides (70.6 ± 13.3 vs 41.4± 4.07 mg/dl no

WT). Parte dessas alterações podem ser explicadas pelo aumento nos níveis

séricos de leptina (1.3 ± 0.25 vs 0.73 ± 0.17 ng/ml no WT) e pela diminuição na

expressão protéica do receptor Glut-4 no tecido adiposo epididimal dos Mas-/-.

A expressão do RNA mensageiro do TGF-β e do angiotensinogênio estão

aumentados no tecido adiposo, enquanto a expressão do TNF-α, o consumo

de comida e os níveis plasmáticos de adiponectina, não estão alterados.

Juntos, esses dados indicam um importante papel do receptor Mas na função

cardiovascular e metabólica em camundongos FVB/N e sugerem um quadro de

síndrome metabólica nos camundongos knockout Mas.

Abstract

The metabolic syndrome, also known as insulin resistance syndrome, is

characterized by the variable coexistence of obesity, insulin resistance,

dislipidemy and hypertension. The angiotensin-(1-7) presents an important

contaregulatory role inside Renin Angiotensin System, opposing some times to

angiotensina II effects. It has been shown that G protein-coupled receptor,

Mas, mediates many actions of angiotensin-(1-7). We have recently observed

that Mas-knockout male mice (Mas-/-) in the pure, FVB/N genetic background,

presents elevated blood pressure levels and endothelial dysfunction, alterations

present in the metabolic syndrome.

The aim of this study was to ascertain whether genetic deletion of Mas also

changes lipidic and glycemic profile and the mechanisms of these alterations.

Ten weeks old Mas-/- and WT mice were used. Curves of plasma glycemia

versus time were built after intraperitoneal application of insulin (0.75U/Kg BW)

or glucose (2g/Kg BW). After sacrifice, the tissues were weighted and reserved

for western blotting and Real-Time PCR. The lipidic profile and the plasma

levels of leptin and adiponectin were analyzed using ELISA kits and TGF-β,

angiotensinogen and TNF-α mRNA expression was analyzed by Real Time

PCR.

Despite of having normal body weight (24.7 ± 0.35 vs 24.8± 0.24 g in WT),

young Mas-/- mice presented a marked increase in the fat tissue mass

(epididimal= 1.704 ± 0.1516 vs 1.150 ± 0.1259 % of BW in WT and

retroperitoneal= 0.6747 ± 0.08576 vs 0.3781 ± 0.04575 % of BW in WT). In

addition, these animals presented a state of insulin resistance and glucose

intolerance as well as an increase in the fasting glycemia levels (86.6 ± 6.43 vs

56.40 ± 4.98 mg/dl in WT). Furthermore, a significant increase in total

cholesterol (92.2 ± 3.65 vs 74.6± 5.67 mg/dl in WT) and triglycerides (70.6 ±

13.3 vs 41.4± 4.07 mg/dl in WT) levels were observed. Part of these alterations

can be explained by the increase in the leptin plasma levels (1.3 ± 0.25 vs 0.73

± 0.17 ng/ml in WT) and the decreased Glut4 receptor protein in Mas-/- adipose

tissue. The mRNA expression of TGF-β and angiotensinogen was increased in

Mas-/- adipose tissue, while the expression of TNF-α, the food intake and

adiponectin plasma levels, were not altered.

These results show that Mas deficiency in FVB/N mice leads to dramatic

changes in glicemic and lipidic metabolism, inducing a metabolic syndrome- like

state.

Sumário

1- Introdução............................................................................................. 1

2- Revisão Bibliográfica........................................................................... 1

2.1 Sistema Renina Angiotensina.......................................................... 1

2.2 Angiotensina II.................................................................................. 2

2.3 Angiotensina-(1-7)............................................................................ 4

2.4 Camundongo Knock-out Mas........................................................... 8

2.5 TNF- α.............................................................................................. 11

2.6 Leptina.............................................................................................. 12

2.7 Resistina........................................................................................... 14

2.8 Adiponectina.................................................................................... 15

2.9 Interação do sistema renina-angiotensina com o metabolismo....... 17

2.10 Mecanismos moleculares podem correlacionar o SRA à SM........ 23

3- Objetivos............................................................................................... 24

3.1 Gerais............................................................................................... 24

3.2 Específicos ...................................................................................... 24

4- Materiais e Métodos............................................................................. 25

4.1 Animais............................................................................................ 25

4.2 Amostras de sangue........................................................................ 25

4.3 Peso Corporal e peso adiposo......................................................... 25

4.4 Ingestão alimentar............................................................................ 26

4.5 Determinação dos níveis plasmáticos de leptina e adiponectina..... 26

4.6 Determinação dos níveis de colesterol total.................................... 26

4.7 Determinação de colesterol HDL..................................................... 28

4.8 Determinação dos níveis de triglicerídeos....................................... 27

4.9 Histologia de tecido adiposo............................................................ 28

4.10 Genotipagem.................................................................................. 28

4.10.1 Extração do DNA genômico................................................ 28

4.10.2 PCR e detecção de amplificação em gel de agarose......... 29

4.11 RT e Real Time PCR..................................................................... 30

4.11.1 Extração de RNA total......................................................... 30

4.11.2 Eliminação de moléculas de DNA genômico da amostra

de RNA total........................................................................

4.11.3 Quantificação do RNA total................................................. 31

4.11.4 RT (Transcrição Reversa)................................................... 31

4.11.5 PCR Quantitativa................................................................ 32

4.12 Extração de proteínas totais.......................................................... 33

4.13 Western Blotting............................................................................. 33

4.14 Testes de Tolerância à Glicose e Sensibilidade Insulínica............ 34

4.15 Análises estatísticas e expressão dos resultados.......................... 35

5- Resultados............................................................................................

5.1 Peso corporal e peso adiposo.......................................................... 36

5.2 Ingestão de alimentos...................................................................... 38

5.3 Histologia do tecido adiposo epididimal........................................... 39

5.4 Perfil Lipídico.................................................................................... 40

5.5 Perfil Glicêmico................................................................................ 41

5.6 Western Blotting do receptor Glut4 no tecido adiposo .................... 43

5.7 Dosagem dos níveis plasmáticos de adipocitocínas ....................... 44

5.8 Expressão gênica de angiotensinogênio, TGF-β e TNF-∝ por Real

Time PCR do tecido adiposo.................................................................

6- Discussão.............................................................................................

7- Conclusão.............................................................................................

8- Referencias Bibliográficas..................................................................

Lista de Figuras e Quadros

Figura 1 – Esquema representativo do mecanismo hipotético de regulação

da leptina......................................................................................................13

Figura 2 – Alterações patofisiológicas associadas com a ativação do SRA

do tecido adiposo na obesidade...................................................................22

Figura 3 – Peso corporal em gramas dos grupos de animais.....................36

Figura 4 – Porcentagem da massa de tecido adiposo pelo peso corporal..37

Figura 5 – Massa de comida ingerida corrigida pelo peso corporal............38

Figura 6 – Análise histológica (HE) do tecido adiposo epididimal...............39

Figura 7 – Perfil lipídico dos camundongos.................................................40

Figura 8 – Perfil glicêmico dos camundongos.............................................42

Figura 9 – Western Blotting de amostras de tecido adiposo epididimal......43

Figura 10 – Níveis plasmáticos de leptina...................................................45

Figura 11 – Níveis plasmáticos de adiponectina.........................................46

Figura 12 –PCR em tempo real do RNA do tecido adiposo epididimal.......47

Quadro 1 – Primers e condições experimentais utilizadas para a PCR do

Mas...............................................................................................................30

Quadro 2 –

Primers e condições experimentais utilizadas para o Real Time

PCR .............................................................................................................32

Lista de Abreviaturas, Símbolos e Fórmulas Químicas

A-779 = Antagonista específico do receptor Mas

A-MSH = Hormônio estimulante de melanócitos

AdipoR1/2 = Receptores de adiponectina

AGT= Angiotensinogênio

Ang I = Angiotensina I

Ang II = Angiotensina II

Ang III = Angiotensina III

Ang IV = Angiotensina IV

Ang-(1-7) = Angiotensina-(1-7)

ApN = Adiponectina

= Receptor tipo 1 de angiotensina II

= Receptor tipo 2 de angiotensina II

= Receptor tipo 2 de bradicinina

C57Bl/6 = Linhagem de camundongos pretos

CART = Transcrito regulado por cocaína e anfetamina

cDNA = DNA complementar

CHO = Células de ovário de hamster chinês

CSF = Fator estimulador de colônias

CRH = Hormônio liberador de corticotropina

CV11974 = Antagonista específico do receptor AT

CVLM = Medula ventro lateral caudal

DEPC = Dietil pirocarbonato

DNA = Ácido desoxiribonucléico (Desoxiribonucleic Acid)

ECA = Enzima Conversora de Angiotensina

ECA 2 = Enzima Conversora de Angiotensina 2

EDTA = Ácido etilenediaminotetracético

E.L.I.S.A. = Enzime Linked Immunosorbent Assay

ET-1 = Endotelina 1

FVB/N = Linhagem de camundongos brancos

gApN = Fragmento da ApN

GLUT4 = Transportador de glicose do tipo 4

HAS = Hipertensão Arterial Sistêmica

HDL = Lipoproteína de alta densidade (High Density

Lipoprotein)

HE = Hematoxilina e Eosina

HOE-140 = Antagonista específico do receptor B

ICAM-1 = Molécula de adesão intercelular 1 (Intercellular Adhesion Molecule-1)

iECA = Inibidor da ECA

IFN = Interferons

IL = Interleucinas

IMC = Índice de massa corpórea

KO = Deleção genética de um determinado gene (Knockout)

LDL = Lipoproteína de baixa densidade (Low Density Lipoprotein)

Mas = Receptor especifico da Angiotensina-(1-7)

NEP = Endopeptidase Neutra

NF-κβ = Fator nuclear κβ

NO = Oxido Nítrico

NPY = Neuropeptídeo Y

ob = Gene da obesidade

PCP = Prolil-Carboxipeptidase

PCR = Reação da polimerase em cadeia (Polymerase Chain Reaction)

PD123319 = Antagonista específico do receptor AT

PEP = Prolil-Endopeptidase Neutra

PG = Prostaglandinas

PGI

= Prostaciclína

pH = Potencial hidrogeniônico

PKA = Proteína quinase A

PKB/AKT = Proteína quinase B

PKC = Proteína quinase C

POMC = Proopiomelanocortina

PPAR-α = Receptores nucleares alfa ativados por proliferadores de

peroxissomas

PPAR-γ = Receptores nucleares gama ativados por proliferadores de

peroxissomas

SD = Sprague Dawley

SM = Síndrome Metabólica

SNS = Sistema Nervoso Simpático

SRA = Sistema Renina Angiotensina

RI = Resistência a Insulina

RNA = Ácido ribonucléico (RiboNucleic Acid)

RNAm = RNA mensageiro

ROS = Espécies Reativas de Oxigênio

RPM = Rotações por minuto

RT = Transcrição reversa (reverse transcription)

RVLM = Medula ventro lateral rostral

TBS-T = Tris-Base com Tween

TGF-β = Fator de transformação de crescimento

TNF-α = Fator de necrose tumoral alfa (Tumor Necrosis Factor alpha)

VCAM-1 = Molécula de adesão da célula vascular (Vascular Cell Adhesion

Molecule-1)

VLDL = Lipoproteína de muita baixa densidade (Very Low Density Lipoprotein)

WT = Selvagem/Controle (Wild Type)

μg = Micrograma

μL = Microlitros

μm = Micrômetros

11- INTRODUÇÃO

A síndrome metabólica (SM) representa um quadro de alterações

metabólicas complexas, que envolvem a coexistência variável de resistência à

insulina com intolerância a glicose, aumento nos níveis plasmáticos de colesterol

e triglicérides, hipertensão e obesidade. Acredita-se que o desequilíbrio do

sistema renina-angiotensina (SRA) exerça um papel importante no

desencadeamento dessa síndrome.

Estudos recentes mostram o SRA não apenas como um controlador da

pressão arterial e homeostasia cardiovascular, mas também como um complexo

sistema hormonal envolvido em diversas funções no organismo. Dois importantes

efetores desse sistema são a angiotensina II (Ang II) e o heptapeptídeo

angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)]. A Ang-(1-7), apresenta uma série de ações

antagônicas às da Ang II, tanto em estados fisiológicos quanto patológicos,

funcionando assim como um contra-regulador dentro do SRA.

São conhecidas varias interações da Ang II com a insulina,assim como

com o metabolismo e função endócrina do tecido adiposo. Porém não existem

estudos sobre o papel fisiológico da Ang-(1-7), agindo via seu receptor Mas, no

controle fino do metabolismo glicêmico e lipídico.

2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Sistema Renina Angiotensina

O sistema renina-angiotensina constitui uma cascata hormonal

coordenada iniciada pela biossíntese da enzima renina pelas células

justaglomerulares das arteríolas aferentes renais. A renina é então liberada por

essas células através de exocitose, agindo enzimaticamente sobre o

angiotensinogênio (AGT) hidrolisando-o em um decapeptídeo inativo, a

angiotensina I (Ang I). Este peptídeo será catabolizado pela enzima conversora

de angiotensina (ECA) em um octapeptídeo biologicamente ativo, a Ang II.

A renina não possui ação (não enzimática) biológica direta identificada;

porém, seu precursor, a prorenina teve recentemente seu receptor identificado,

exercendo assim ações biológicas diretas (Nguyen, G. et. al.,1996; Nguyen, G. et.

al., 2002). A Ang II também pode ser formada por outras vias independentes da

renina, pela ação de catepsinas e quimases.

2.2 Angiotensina II (Ang II)

A Ang II é um dos mais potentes vasoconstritores conhecidos e é

considerada, ainda hoje o principal componente desse sistema.

Até há algum tempo, acreditava-se que a Ang II era metabolizada em

fragmentos de peptídeos biologicamente inativos por peptidases da circulação e

dos tecidos. No entanto, vários estudos mostraram que pelo menos três desses

produtos metabólicos apresentam atividade biológica. A Ang II pode ser

degradada à des-aspartil

-Ang II (Ang III) que é eqüipotente à Ang II em sua

interação com o receptor AT

, mas tem baixa eficácia in vivo devido ao seu

metabolismo acelerado na circulação. O segundo produto metabólico da Ang II é

o hexapeptídeo Ang IV, que tem demonstrado, em estudos, causar vasodilatação

e natriurese (Handa R. K. et. al., 2001).

A Ang II exerce seus efeitos via dois receptores distintos, AT

e AT

(Batenburg, W.W., et.al., 2004), sendo que os mais conhecidos efeitos

fisiológicos e patológicos da Ang II são mediados via receptores AT

, acoplados a

múltiplas interações com cascatas de transdução de sinal, comandando diversas

ações biológicas (Zhong Jian Cheng, et. al., 2005).

Dentre as principais ações via AT

a Ang II induz vasoconstrição vascular

(preferencialmente renal, cerebral e coronariana); a retenção renal de sódio ( via

liberação de aldosterona); retenção renal de água (via liberação de

vasopressina); supressão da renina (por feedback negativo); hipertrofia de

músculo liso e cardiomiócitos; estimulação de fibrose no miocárdio e vascular;

efeito inotrópico positivo (contração de cardiomiócitos); ativação do sistema

nervoso simpático (SNS); estimulação da secreção endotelial e estimulação da

formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) (Zhong Jian Cheng, et. al.,

2005).

O receptor AT

vem mostrando, na maioria das vezes, exercer efeitos

opostos às ações mediadas pelo receptor AT

. Sua expressão é muito alta no

período fetal e decai com o envelhecimento. Os principais efeitos de sua ativação

são o antiproliferativo, a inibição do crescimento celular; diferenciação celular;

reparação tecidual; apoptose; vasodilatação; desenvolvimento dos rins e trato

urinário e proteção contra isquemia cardíaca (Batenburg, W.W., et.al., 2004).

Sabe-se que doenças como hipertensão, hiperlipidemia, diabetes e

aterosclerose resultam em disfunção vascular e mudanças estruturais, incluindo

disfunção endotelial, alteração da contratilidade e remodelamento vascular;

alterações que podem ser geradas por aumento da atividade da Ang II (Giacchetti

G. et. al., 2005). Os eventos celulares relacionados com esse processo envolvem

mudanças no músculo vascular liso com relação ao crescimento, apoptose,

migração celular, inflamação e fibrose. Dentre os vários fatores que influenciam

as mudanças celulares, a Ang II aparece como um dos mais importantes (Zhong

Jian Cheng, et. al., 2005).

Evidências crescentes indicam que a Ang II induz

efeitos pleitrópicos vasculares através da formação de NADPH, gerando ROS,

que são importantes segundos mensageiros intracelulares e intercelulares,

modulando vários sinais moleculares, como as proteínas tirosina fosfatases,

proteínas tirosina quinases, fatores de transcrição, ativação de canais iônicos,

dentre outros. Sob condições patológicas as ROS contribuem para a disfunção

vascular e remodelamento através de danos oxidativos (Singh B.M., Mehta J.L.,

2003).

2.3 Angiotensina-(1-7)

A Ang-(1-7) é o terceiro e mais promissor metabólito da Ang II, visto que

estudos recentes já apontam seu possível papel terapêutico (Santos R.A.S. et.

al., 2005). Sabe-se que a Ang-(1-7) libera óxido nítrico (NO) e prostaglandinas

(PGI

) causando vasodilatação, inibindo a proliferação celular

muscular e a

trombogênese, (Rajendran S, et.al., 2005; Kucharewicz I. et. al., 2002),

atenuando o efeito vasoconstritor da Ang II (Lemos V.S. et. al., 2002; Clark M.A.

et. al., 2001) e inibindo a ECA (Deddish P.A. et. al., 1998). Desequilíbrios na

interação harmônica entre Ang II e Ang-(1-7) parecem contribuir para o início e

desenvolvimento de doenças.

A formação de Ang-(1-7) é controlada por pelo menos três enzimas que

estão presentes na circulação sangüínea e em alguns tecidos (Welches et al.,

1991; Yamamoto et al., 1992), podendo assim ser sintetizada a partir da Ang I

pela ação das endopeptidases teciduais denominadas prolil-endopeptidase (PEP)

e endopeptidase neutra (NEP) (Ferrario et al., 1997), ou sendo formada a partir

da Ang II pela ação da prolil-endopeptidase e da prolil-carboxipeptidase (PCP).

Recentemente, foi descrita uma nova via de formação da Ang-(1-7) por ação da

enzima conversora de angiotensina 2 (ECA 2) (Donoghue et al., 2000; Crackower

M.A. et. al., 2002). A ECA 2 é responsável pela conversão da Ang I em

angiotensina-(1-9), que pode ser posteriormente convertida em Ang-(1-7) por

ação da ECA ou de outras peptidases (Donoghue et al., 2000). A ECA 2

também promove a conversão direta da Ang II em Ang-(1-7) (Vickers et al.,

2002).

A Ang-(1-7) pode ser hidrolizada pela ECA formando a angiotensina-(1-5)

e a angiotensina-(1-3). Esta parece ser uma importante via de inativação da Ang-

(1-7) circulante e possivelmente também da forma tecidual desse peptídeo

(Yamada et al., 1998).

As concentrações plasmáticas da Ang-(1-7) são normalmente menores

que as da Ang II, tendo, em ratos, um valor aproximado de 10 a 40 fmol/ml

(Santos et al., 1996). O tempo de meia vida plasmática da Ang-(1-7) também é

menor que o da Ang II, sendo de aproximadamente 10 segundos, um quinto da

observada para a Ang II (Yamada et al., 1998).

Atualmente, sabe-se que a Ang-(1-7) apresenta ações tanto centrais

quanto periféricas e que estas podem ser similares, opostas ou diferentes das

induzidas pela Ang II (Santos et al., 2000; Ferrario et al., 1990). Vários trabalhos

mostram que a Ang-(1-7) participa do controle do balanço hidroeletrolítico (Santos

et al., 1996), promove inibição da proliferação de células musculares lisas

vasculares (Freeman et al., 1996;), inibe o crescimento de miócitos cardíacos

(Tallant et al., 2005), apresenta efeito antitrombótico (Kucharewicz et al., 2000) e

antiarrítmico (Ferreira et al.,2001), dentre outros. A produção renal de Ang-(1-7)

possui um importante papel na regulação da pressão arterial. Em ratos, a Ang-(1-

7) apresenta ação natriurética, tanto em rins isolados, como em animais

anestesiados (Handa et al., 1996), sugerindo que esse peptídeo exerçe um efeito

vasodilatador na microcirculação renal, com efeito antihipertensivo.

Quando microinjetada centralmente, a Ang-(1-7) pode apresentar efeitos

antagônicos, dependendo da área e da quantidade do peptídeo que está sendo

infundido. Por exemplo, a microinfusão de Ang-(1-7) na região da medula ventro

lateral rostral (RVLM) produz aumento da pressão arterial e taquicardia. Porém,

quando microinjetada na região da medula ventro lateral caudal (CVLM), a Ang-

(1-7) provoca queda da pressão arterial e da freqüência cardíaca (Silva et al.,

1993).

Além dos efeitos já discutidos, a Ang-(1-7) também desempenha um

importante papel no controle da pressão arterial agindo como um hormônio

vasodilatador em inúmeros leitos vasculares (Gorelik et al., 1998; Brosnihan et

al., 1998; Machado et al., 2002), embora, menos freqüentemente, também

produza vasoconstrição (Osei et al., 1993). De fato, várias evidências reforçam a

hipótese de que as principais ações do SRA na regulação da pressão arterial

sejam dependentes de um balanço entre os efeitos da Ang II e os da Ang-(1-7)

(Ferrario et al., 1997), sugerindo um importante papel para a Ang-(1-7) no

controle dos níveis pressóricos.

Recentemente foi descrito que a infusão de Ang-(1-7) promove um potente

efeito vasodilatador em ratos anestesiados atuando sobre diferentes leitos

vasculares (Sampaio et al., 2003). Na maioria dos leitos vasculares estudados, o

efeito vasorelaxante da Ang-(1-7) é completamente inibido pelo bloqueio da

formação de NO. Da mesma forma, na ausência de endotélio funcional o efeito

vasorelaxante da Ang-(1-7) também é abolido (Porsti et al., 1994; Ren et al.,

2002; Machado et al., 2002). Esses resultados sugerem que, na maioria dos

leitos vasculares estudados, a Ang-(1-7) induz dilatação através da produção de

NO endotelial. Acredita-se que o efeito vasodilatador desse heptapeptídeo possa

ocorrer através da potencialização do efeito vasodilatador da bradicinina (Pörsti et

al., 1994; Li et al., 1997), além da estimulação do seu receptor específico (Fontes

et al., 1994; Santos et. al, 2003), dependendo do leito vascular e da espécie

animal estudada.

Vários trabalhos demonstram uma possível interação entre a bradicinia e a

Ang-(1-7) ao nível vascular (Paula et al., 1995; Santos et al., 2000). A

administração de Ang-(1-7), antes da infusão de bradicinina, potencializa o efeito

vasodilatador induzido por esse último peptídeo. Esse efeito já foi descrito in vivo

em animais normotensos (Paula et al., 1995) e hipertensos (Fernandes et al.,

2001) e in vitro em artérias coronárias de cães (Le et al., 1997), dentre outros.

Além disso, também já foi demonstrado que, em alguns leitos vasculares, o efeito

vasodilatador induzido pela Ang-(1-7) pode ser inibido pelo HOE 140, um

antagonista específico do receptor B

da bradicinina (Porsti et al., 1994;

Bronsnihan et al., 1996). Os mecanismos implicados nesses efeitos ainda não

foram completamente elucidados. Um dos mecanismos sugeridos na literatura

para explicar a interação entre esses dois peptídeos é através da modulação

local da atividade da ECA pela Ang-(1-7) (Roks et al., 1999; Tom et al., 2001;

Jaspard et al., 1993). Sugere-se que a Ang-(1-7), inibindo a atividade da ECA,

possa estar promovendo aumento nos níveis de bradicinina e esse pode ser um

dos mecanismos através dos quais a Ang-(1-7) e a bradicinina se

interrelacionam. Outros trabalhos sugerem ainda que a Ang-(1-7) poderia

promover a potencialização do efeito vasodilatador da bradicinina através da

ressensibilização dos receptores B

(Tom et al., 2001).

Atualmente sabe-se que boa parte dos mecanismos através dos quais a

Ang-(1-7) promove seus efeitos ocorre por estímulo do seu receptor específico, o

Mas. A existência de um receptor específico para a Ang-(1-7) foi evidenciada por

Campagnole-Santos e colaboradores em 1992, observando que a

Ang-(1-7)

induzia um aumento significante na sensibilidade do barorreflexo. Tallant e

colaboradores em 1997 visualizaram por ligação radioativa através de

experimentos utilizando cultura de células endoteliais de aorta bovina, sítios

específicos de ligação para a Ang-(1-7).

Recentemente experimentos realizados em nosso laboratório

demonstraram que o receptor acoplado à proteína G, codificado pelo

protooncogene Mas, é um receptor funcional para a Ang-(1-7) (Santos et al.,

2003). Na ausência desse receptor, vários efeitos da Ang-(1-7) são abolidos.

Além disso, também foi demonstrado que em cultura de células CHO (ovário de

hamster chinês), transfectadas com Mas, a Ang-(1-7) apresenta alta afinidade de

ligação. Essa ligação da Ang-(1-7) ao receptor Mas pode ser deslocada pelo

antagonista específico, o A-779, mas não pelos antagonistas dos receptores AT

ou AT

da Ang II, CV11974 e PD123319, sugerindo que o A-779 é um

antagonista específico do receptor Mas. (Tallant et.al.,1997)

2.4 Camundongo Knockout Mas

O protooncogene Mas foi primeiramente detectado em células tumorais

sendo responsável pela codificação de proteínas indispensáveis para o

crescimento tumoral (Young et al., 1986).

Atualmente, sabe-se que o Mas codifica um receptor com estrutura similar

a dos membros da família dos receptores que apresentam sete domínios

transmembrana. De fato, o Mas codifica um receptor acoplado a proteína G que,

até então, era considerado como um receptor órfão; suspeitava-se apenas que

ele estaria envolvido com as ações das angiotensinas (Von Bohlen und Halbach

et al., 2000).

A Ang II foi considerada como um possível ligante para o receptor Mas,

porém, Ambroz e colaboradores (1991) mostraram que o aumento de cálcio

intracelular induzido pela Ang II em células transfectadas com Mas era

dependente da expressão do receptor AT

da Ang II, descartando, dessa forma,

essa possibilidade. Porém, outros experimentos demonstraram que o receptor

Mas modula a sinalização intracelular induzida pela estimulação dos receptores

(Von Bohlen und Halbach et al., 2000), mantendo, dessa forma, a hipótese de

que o Mas e as angiotensinas se interrelacionam.

Recentemente, foram desenvolvidos camundongos com deleção do

protooncogene Mas (KO Mas) a partir do camundongo C57Bl/6 e do

camundongo da linhagem FVB/N (Walther et al., 1998), o que permitiu estudar a

importância fisiológica da proteína codificada por esse gene.

Nos camundongos knockout, a expressão do mRNA para o Mas não está

presente nos principais órgãos onde esse gene é expresso em camundongos

adultos, como: coração, rins, testículos e cérebro (Alenina et al., 2002).

Apesar desse gene ser altamente expresso nos testículos, principalmente

em animais adultos, a deleção do protooncogene Mas não produziu alterações de

fertilidade ou de reprodução nos camundongos (Walther et al., 1998). Possiveis

alterações comportamentais podem ocorrer devido a alterações nos hormônios

gonodais, uma vez que o Mas é expresso em grande quantidade nos testículos

(Walther et al., 2000).

Devido a sua possível relação com o SRA, Walther e colaboradores (1998)

avaliaram a existência de alterações nos parâmetros cardiovasculares. A

princípio, não foram encontradas diferenças significativas da pressão arterial ou

da freqüência cardíaca nos animais KO Mas com background C57Bl/6 (Whalter

et al., 1998). Porém, novas analises verificaram uma diminuição da variabilidade

da freqüência cardíaca e um aumento do tônus simpático nos camundongos

knockout em relação aos controles, sendo essa diferença maior entre as fêmeas

(Walther et al., 2000b). Nos animais KO Mas com bacground FVB/N foi

observado, por Moura e colaboradores, que ocorre aumento significativo da

pressão arterial e disfunção endotelial associada a microalbuminúria (dados não

publicados).

Em camundongos C57Bl/6 Knockout para o Mas, a ligação e a sinalização

intracelular da Ang II nos rins não estão alteradas em relação aos camundongos

controle (Walther et al., 1998), indicando que o Mas não interfere na ligação da

Ang II aos seus receptores. Ao contrário do resultado obtido com a Ang II, a

ligação da Ang-(1-7) em fragmentos de rins é abolida nos camundongos

knockout, demonstrando que o Mas é importante para a ligação desse

heptapeptídeo (Santos et al., 2003).

Experimentos realizados utilizando camundongos deficientes para o receptor

Mas mostram que na ausência desse receptor, vários efeitos da Ang-(1-7) são

abolidos, como, por exemplo, o efeito antidiurético desse peptídeo em

camundongos com sobrecarga hídrica (Santos et al., 2003).

Apesar de bem definida a existência desse receptor para a Ang-(1-7), nem

todos os efeitos fisiológicos desse heptapeptídeo podem ser explicados por sua

interação com o Mas. Alguns efeitos da Ang-(1-7) não são completamente

inibidos na presença do A-779 (Bayorh et al., 2002), nem mesmo na presença

dos antagonistas dos receptores da Ang II, o que sugere fortemente a existência

de outros mecanismos de ação para esse peptídeo.

Embora os mediadores implicados no efeito relaxante da Ang-(1-7) estejam

parcialmente descritos, os receptores implicados nesse efeito ainda estão longe

de serem elucidados. Além disso, o papel desse receptor no metabolismo nunca

foi estudado; deixando perspectivas sobre o papel da Ang-(1-7) e do receptor

Mas no controle metabólico do organismo.

2.5 TNF- α

Citocina é o termo genérico empregado para designar um grupo muito

extenso de moléculas envolvidas na emissão de sinais entre as células durante o

desencadeamento das respostas imunes. Todas as citocinas são pequenas

proteínas ou peptídeos, algumas contendo moléculas de açúcar ligadas

(glicoproteínas). As diferentes citocinas podem ser enquadradas em diversas

categorias: interferons (IFN), interleucinas (IL), fator estimulador de colônias

(CSF), fator de necrose tumoral (TNF-α e TNF-β), e fator de transformação de

crescimento (TGF-β).

O TNF-α, uma citocina pró-inflamatória, além de participar na resposta

imunológica e na etiopatogenia de algumas neoplasias, também está envolvido

na gênese da resistência à insulina, por inibir a fosforilação de receptores de

insulina (Uysal et. al., 1994). Ele é expresso pelo tecido adiposo, e níveis

elevados do mesmo são encontrados em todos os modelos de obesidade

genética em roedores e em obesos humanos (Saghizadech et. al., 1996). Esta

citocina também se expressa em quantidades maiores nas células musculares

isoladas de diabéticos tipo 2 (Saghizadech et. al., 1996). Foi sugerido que o TNF-

α atua como fator adipostático e que, na obesidade humana, parte deste efeito

estaria envolvido nos mecanismos que levam à resistência à insulina. A ausência

completa do TNF-α ou de seus receptores resulta em melhora significativa da

sensibilidade à insulina em camundongos com obesidade induzida por dieta,

hipotalâmica ou genética (Ventre et. al., 1997; Uysal et. al., 1994). Além de se

registrar concentrações elevadas de TNF-α na obesidade, está citocina aumenta

a produção de endotelina-1 e de angiotensinogênio, refletindo a disfunção

endotelial que pode ocorrer em obesos hipertensos. O TNF-α atua em sinergismo

com outras citocinas durante a ativação de processos inflamatórios (Bédard et.

al., 1997), o que pode ser uma das explicações da associação entre

obesidade, resistência a insulina e aterosclerose.

2.6 Leptina

A leptina é o produto do gene da obesidade (ob) que é expresso,

predominantemente, nos adipócitos (Halaas et. al., 1995). Estudos em roedores

sugeriram que a leptina age como um fator de sinalização do tecido adiposo para

o sistema nervoso central, regulando a ingestão alimentar e o gasto energético e,

assim, fazendo a homeostase do peso corporal e mantendo constante a

quantidade de gordura (Caro et. al., 1996). A descoberta da leptina tem ajudado a

esclarecer o papel dos adipócitos como sistema endócrino e de que modo ocorre

a sinalização para a ingestão ou não de alimentos, bem como a regulação do

metabolismo energético. Assim, a coordenação do balanço energético e do peso

corporal envolve uma regulação entre a ingestão de alimentos e gasto de energia

em resposta a sinais agudos (insulina e catecolaminas como a adrenalina) e

crônicos (gravidez, desnutrição, inflamações, caquexia e leptina). Os níveis de

leptina circulantes parecem estar diretamente relacionados com a quantidade de

RNAm para leptina no tecido adiposo. Além disso, vários fatores metabólicos e

endócrinos contribuem para regular a transcrição dos genes da leptina em

adipócitos. Por exemplo, ocorre diminuição de leptina em resposta a baixos níveis

de insulina, havendo uma relação diretamente proporcional entre as

concentrações desses hormônios. (Considine et al. 1996).

A propriedade inibidora do apetite deve-se ao mecanismo de sinalização

deste no hipotálamo, estimulando a síntese de neuropeptídeos anorexigênicos

como POMC (Proopiomelanocortina), a-MSH (Hormônio Estimulante de a-

Melanócitos), CRH (Hormônio Liberador de Corticotropina) e CART (Transcrito

Regulado por Cocaína e Anfetamina) que diminuem a ingestão de alimentos

pela sensação de saciedade. Os neuropeptídeos anorexigênicos, por sua vez,

inibem a síntese de neuropeptídeo Y (NPY), que estimula a ingestão de

alimentos, inibe a termogênese e é diminuído por altos níveis séricos de insulina,

promovendo aumento da lipogênese, síntese proteica e armazenamento de

glicose. (Tritos et al. 1997).

A leptina, ao estimular a liberação de norepinefrina, induz os adipócitos a

ativar a via de sinalização do AMPcíclico e proteína quinase A (PKA),

estimulando a transcrição do gene para proteínas desacopladoras da fosforilação

oxidativa (Considine et al. 1996).

A leptina também age nos tecidos periféricos. Assim, demonstrou-se em

roedores, que a hiperleptinemia reduz a síntese de triglicerídeos e aumenta a

oxidação dos ácidos graxos em ilhotas pancreáticas normais (Shimabukuro et.

al., 1997),levando a uma disfunção das células beta, deprivando-as do sinal

lipídico necessário para a resposta insulínica a outros substratos (Koyama et. al.,

1997). Este achado, em conjunto com a observação de que a insulina estimula a

secreção de leptina, sugeriu a possível existência de uma regulação retrógrada

negativa entre a insulina e a leptina.

Figura 1- Esquema representativo do mecanismo hipotético de regulação da leptina.

(Adaptado de Sánchez 1997).

Considine e colaboradores (1996) desenvolveram trabalhos investigando a

hipótese de que a obesidade possa resultar de uma diminuição da sensibilidade

do organismo aos efeitos da leptina. Estudos genéticos têm mostrado que

sujeitos obesos não apresentam modificações genéticas frente a sujeitos magros

e que esses não tem déficit de leptina, e que, ao contrário, seus níveis

plasmáticos são elevados em proporção direta ao tecido adiposo e ao balanço

energético. Isso sugere que os adipócitos funcionam normalmente, e a obesidade

se associaria a um mecanismo de resistência endógena à leptina.

2.7 Resistina

Embora se reconhecesse há algum tempo que o diabetes tipo 2 está

associado ao excesso de tecido adiposo e à resistência à insulina, tanto em

humanos como em modelos experimentais da doença, a causa última desta

relação permanecia mal definida. Considerava-se que os ácidos graxos livres

provenientes dos adipócitos, por inibirem a captação de glicose pelo músculo

esquelético, eram a causa mais importante de resistência à insulina. Mais tarde,

proteínas e peptídeos também secretados pelo tecido adiposo passaram a ser

apontados como agentes decisivos da insensibilidade à insulina em vários tecidos

(Spiegelman et. al., 1996). Porém, para os pesquisadores dessa área, sempre foi

claro que outro elo ou elos adicionais poderiam existir para justificar, ao nível

celular, a relação tão estreita entre resistência à insulina e obesidade.

Em 2000, um grupo de pesquisadores liderados por Claire Steppan (Claire

et. al., 2001) da Universidade da Pensilvânia identificou no tecido adiposo um

mediador que denominaram resistina (de resistência à insulina). Essa proteína,

ao que tudo indica, se torna a explicação mais consistente dos eventos que

levam à resistência à insulina. Trabalhando com uma das tiazolidinedionas, a

rosiglitazona, em várias linhas celulares de adipócitos, caracterizaram um novo

RNAm expresso pelo tecido adiposo e que era suprimido por este fármaco. Assim

demonstraram que a proteína codificada por este RNAm se expressava

exageradamente em vários roedores obesos, e que as tiazolidinedionas reduziam

sua secreção tanto in vitro como na corrente sangüínea de camundongos (Claire

et. al., 2001). Levantaram a hipótese que as tiazolidinedionas, pela sua ação

sobre receptores nucleares gama ativados por proliferadores de peroxissomas,

os PPAR-γ, modulariam a expressão de um gene específico do adipócito, a

resistina, que estaria envolvido nas vias de sinalização moduladas pela insulina.

Os PPAR-γ pertencem a uma família de fatores de transcrição induzidos durante

a diferenciação dos adipócitos e que atuam na sensibilidade dessas células à

insulina (Braissant, et. al., 1996). Contudo, numerosas dúvidas ainda existem

sobre a resistina. Não se sabe, por exemplo, qual seria a ação da resistina em

outros alvos fisiológicos da insulina além dos adipócitos, como o fígado, músculo

e cérebro; nem quais seriam as características de seu receptor e o papel da

resistina na fisiologia normal. Entende-se menos ainda os mecanismos exatos de

sinalização resistino-mediada. (Yoshimoto et. al., 1999)

2.8 Adiponectina

A adiponectina (ApN) é uma adipocina secretada especificamente pelos

adipócitos e circula em concentrações relativamente altas na corrente sangüínea.

Ela desenvolve um papel fundamental na homeostase energética e na inflamação

(Lyon et. al., 2003). Essa proteína de 30-KDa é composta por uma porção N-

terminal domínio colágeno e uma porção C-terminal domínio globular. O

fragmento gerado (gApN) pela proteólise da ApN possui varias ações biológicas

(Fruebis et. al., 2001). Dois tipos de receptores de adiponectina já foram

caracterizados e medeiam suas ações, principalmente, via estimulação de AMPK,

PPAR- α, e p38 MAPK. O AdipoR1, que possui alta afinidade por gApN, é

abundantemente expresso em músculos esqueléticos. Já o AdipoR2, que possui

afinidade moderada por ambas as formas de ApN, é predominante no fígado

(Yamauchi et. al., 2003). Ambos receptores estão presentes nos adipócitos,

sugerindo que a ApN pode agir nessas células, possuindo assim ações tanto

autócrinas quanto parácrinas.

Ao contrário das demais adipocitocinas, a ApN circulante está diminuída

em humanos obesos e em desordens relacionadas, como diabetes tipo 2,

doenças cardiovasculares, e outros componentes do quadro de síndrome

metabólica (Guerre-Millo et. al., 2004). Foi demonstrado que o tratamento com

ApN em camundongos deficientes em apolipoproteína-E exerce efeito protetor

contra a formação de placas ateroscleróticas (Okamoto et. al., 2002). O

mecanismo implicado nesses efeitos benéficos se explica em parte pelo fato da

ApN alterar o metabolismo lipídico gerando aumento da oxidação de ácidos

graxos em vários tecidos, incluindo fígado e músculo, acelerando o clearance

plasmático dos mesmos (Yamauchi et. al., 2002). Alem disso, tem sido

demonstrado que a ApN aumenta a termogênese em vários órgãos.

Clinicamente foi documentada uma forte associação inversa entre níveis

séricos de adiponectina e risco de doença arterial coronariana. A associação

mostrou uma clara relação dose-resposta que persistiu mesmo após ajuste para

fatores de risco convencionais, incluindo diabetes e índice de massa corpórea

(IMC). A mais forte correlação ocorreu entre as concentrações plasmáticas de

colesterol HDL, e apolipoproteína A1, sabidamente essencial na formação da

partícula de HDL. A função anti-aterogênica mais importante desta partícula é a

participação no transporte reverso do colesterol, da circulação para o fígado onde

é disponibilizado sob a forma de sais biliares.

Observou-se uma correlação inversa com o TNF-, (pró-inflamatório), cuja

expressão é proporcional ao grau de resistência à insulina que pode ser um fator

inibidor da atividade promotora do gene da adiponectina e pode explicar, em

parte, a associação inversa observada entre o acúmulo de gordura visceral, a

secreção elevada de TNF- e os níveis diminuídos de adiponectina

(Rothenbacher et al., 2005).

2.9 Interação do sistema renina-angiotensina com o metabolismo

A síndrome metabólica, também conhecida como síndrome de resistência

à insulina, é caracterizada pela coexistência variável de obesidade,

hiperinsulinemia, dislipidemia e hipertensão (Grundy SM et. al., 2004). Outros

achados incluem estado pró-inflamatório, microalbuminúria e

hipercoagulabilidade. O conjunto de fatores de risco que identificam a síndrome

metabólica foi reconhecido, pela primeira vez, em 1983. Em 1988, Reaven

introduziu o termo síndrome X e identificou a resistência à insulina, definida como

a menor captação da glicose pelos tecidos periféricos, como o substrato

fisiopatológico comum da síndrome. Outros sinônimos têm sido utilizados para

denominar essa constelação de fatores de risco (dislipidemia, resistência à

insulina, hipertensão e obesidade), tais como síndrome plurimetabólica, síndrome

da resistência à insulina, quarteto mortal, dentre outros (Miranda et. al., 2005).

Em 1998, a Organização Mundial da Saúde estabeleceu o termo unificado

síndrome metabólica, pois os estudos não identificaram a presença de resistência

à insulina como único fator causal de todos os componentes da síndrome. A

patogênese da síndrome é multifatorial, sendo a obesidade, a vida sedentária,

a dieta e a interação com fatores genéticos os responsáveis pelo aparecimento

da mesma. Mutações e polimorfismos nos genes associados com resistência à

insulina, anormalidades nos adipócitos, hipertensão e alterações lipídicas ocupam

papel central na etiopatogenia da síndrome.

A dislipidemia, uma das principais alterações encontrada na síndrome

metabólica, é caracterizada pelo aumento dos ácidos graxos livres circulantes e

pela elevação dos triglicérides (conseqüente à reesterificação inadequada) que

pode ser parcialmente determinada por falha dos adipócitos em reter os ácidos

graxos livres em seu interior, aumentando assim seu fluxo para a circulação

(Singh B.M. et. al, 2003). Esse mecanismo é facilitado pela resistência à insulina.

Essas alterações aumentam a liberação de ácidos graxos livres para o fígado.

Na resistência à insulina, o fígado promove a reesterificação desses ácidos

graxos, formando triglicérides, os quais são liberados na circulação na forma de

lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL) (Miranda et. al., 2005).

Cassis e colaboradores (1993) apontaram que a angiotensina II teria um

papel potencial significativo na termogênese induzida pelo frio. Além disso, ratos

obesos fa/fa mostram reduzida atividade da renina plasmática e menor densidade

dos receptores AT

no tecido adiposo, que se associam a modesta resposta do

peptídeo quanto a liberação de norepinefrina, quando comparados aos animais

controle (Cassis LA et. al., 1996). Sabe-se que a infusão crônica de

angiotensina II é acompanhada de importante redução no peso e na ingestão de

alimentos, possivelmente pela maior liberação de norepinefrina, o que pode

contribuir para o aumento da atividade metabólica e elevação do dispêndio

energético (Cassis LA et. al., 1998b).

Vários componentes do SRA foram descritos no tecido adiposo.

(Massiera et. al., 2001). Estudos realizados nos últimos anos mostram que o SRA

modula de forma importante o metabolismo e a função endócrina nesse tecido.

No quadro de síndrome metabólica já foram descritos o aumento da atividade da

renina plasmática, maior nível plasmático de angiotensinogênio, maior atividade

da ECA, e maior nível plasmático de aldosterona (Engeli et. al., 2000). Os níveis

de mRNA de AGT são 60% maiores no tecido adiposo do que no fígado, que é

considerado principal fonte de AGT (Harp et. al., 1995). Além disso, a expressão

de AGT é mais elevada em adipócitos viscerais do que em adipócitos

subcutâneos tanto em ratos como em humanos (Safonova et. al., 1997). Os

adipócitos de ratos e de humanos apresentam dois subtipos de receptores

angiotensinérgicos, AT

e AT

, embora ainda não estejam claras as funções

especificas desencadeadas por esses receptores nessas células. In vivo, a

expressão do gene para o receptor AT

no tecido adiposo parece ser dependente

da idade, uma vez que foi observada uma menor densidade de receptores AT

nos ratos SD idosos e obesos quando comparados com ratos jovens e magros.

Os sítios de afinidade entre o receptor AT

e a angiotensina II têm cinética

semelhante aos de outros órgãos alvo do peptídeo sendo a densidade desse

receptor no tecido adiposo semelhante à do coração (Cassis LA et. al., 1998).

Estudos utilizando cultura de células adiposas mostraram que o AGT e a Ang II

participam da regulação e diferenciação do fenótipo do adipócito. É provável que

o aumento no conteúdo de triglicerídeos e da atividade de duas enzimas, a

sintetase de ácidos graxos e a glicerol–3-fosfato desidrogenase, sejam mediadas

pela Ang II, mostrando que esse peptídeo controla a adiposidade pela regulação

da síntese e armazenamento de lipídios. (Safonova et. al., 1997)

É interessante observar que em cultura de células adiposas, a Ang II é

um fator adipogênico, enquanto no animal vivo, atua como importante redutor do

peso e da massa adiposa. Sabe-se que existe uma correlação significativa entre

a pressão arterial, o índice de massa corporal, e os níveis do AGT plasmático em

indivíduos normotensos e magros (Engeli et. al., 2000). Aproximadamente 20%

da variação do AGT plasmático é determinada pelos níveis plasmáticos da

leptina, que serve como um indicador da massa de tecido adiposo, (Prasad et. al.,

2004) sugerindo que esse tecido contribua para os níveis de AGT plasmático.

Estudos experimentais sugerem que o SRA do tecido adiposo, regulado

por fatores hormonais e nutricionais, é influenciado pelo grau de obesidade, pelo

fato de que a Ang II pode modular o fluxo sanguíneo, por fatores de crescimento

e pelo metabolismo local. Assim, a ativação do SRA pode determinar efeitos

deletérios locais e sistêmicos em obesos e pode contribuir assim para o

surgimento da HAS e da resistência à insulina. A resistência à insulina, por sua

vez, está associada com o aumento da liberação de ácidos graxos livres, que são

convertidos no fígado em triglicerídeos e secretados em partículas lipoprotéicas

de muita baixa densidade (VLDL).

A hipertrigliceridemia leva a um estado dislipidêmico e altamente

aterogênico, através do aumento de síntese de partículas lipoprotéicas de baixa

densidade (LDL), facilmente oxidáveis, e ao mesmo tempo, à redução das

partículas lipoprotéicas de alta densidade (HDL) (Ginsberg et. al., 2000). Tanto no

estado de resistência à insulina quanto na síndrome metabólica, a disfunção

endotelial pode ser evidenciada de maneira importante, sendo primordialmente

acompanhada de redução da biodisponibilidade do NO.

Por sua vez, a redução de NO, resulta em maior produção de espécies

reativas de oxigênio (ROS), tais como os íons superóxido (O

). Os íons

superóxido inativam o NO para formar o peróxidonitrito, que por sua vez,

desacopla a óxido nítrico sintase endotelial pela oxidação de seu co-fator,

tetrahidrobiopterina, o que resulta em produção de mais O

em vez de síntese de

NO. Esta cascata de eventos é denominada de estresse oxidativo. Desta forma, a

redução de NO e de outros fatores relaxantes derivados do endotélio pode ser

acompanhada pelo aumento da produção de endotelina, prostanóides

vasoconstritores e Ang II (Schiffrin et. al., 2004).

A redução da biodisponibilidade do NO foi confirmada em modelos

experimentais de resistência à insulina, onde foi observado que existe uma

correlação entre a sensibilidade à insulina e a produção basal de NO em

indivíduos saudáveis (Singh B.M. et. al., 2003). Indivíduos insulino-resistentes

apresentam resposta vasodilatadora endotélio-dependente prejudicada e a

disfunção endotelial pode ser também detectada em indivíduos saudáveis com

primeiro grau de parentesco com os indivíduos diabéticos do tipo 2 (Shinozaki et.

al., 2004). Portanto, a disfunção endotelial parece ser um elo comum entre a

HAS, diabetes mellitus e a síndrome metabólica.

A Ang II está altamente correlacionada com a disfunção endotelial

presente nos indivíduos hipertensos, diabéticos, obesos e com a síndrome

metabólica. Esse peptídeo está implicado com o crescimento celular e com o

processo inflamatório. Desta forma, o estresse oxidativo provocado pela a Ang II

pode resultar em aumento da produção de endotelina (ET-1), das moléculas de

adesão como a molécula de adesão da célula vascular (VCAM-1) e a molécula de

adesão intercelular-1(ICAM-1), fator nuclear-k B (NF-kB), interleucina 6 (IL-6)

dentre outros mediadores inflamatórios (Cooper D. et.al., 2002).

Além da contribuição do SRA, principalmente via Ang II, na gênese da

síndrome metabólica já descrita acima, interações em diferentes níveis desse

sistema com a insulina são implicadas como fator fundamental para o

desenvolvimento da DM tipo II e síndrome metabólica.

Os estudos na literatura sugerem que a Ang II, via receptor AT

pode

modular as ações da insulina. Assim, a ativação do SRA induz o aparecimento de

resistência às ações metabólicas da insulina, provocando hiperglicemia e

elevação dos níveis de colesterol (VLDL), triglicérides, e potencializando o efeito

proliferativo da insulina. Além disso, a hiperglicemia e a hiperinsulinemia ativam o

SRA através do aumento da expressão de AGT, Ang II e receptores AT

, que, por

sua vez, podem induzir o aparecimento de hipertensão arterial, disfunção

cardiovascular e renal (Engeli et. al., 2003).

Assim, substâncias produzidas pelo tecido adiposo podem interagir com o

SRA reforçando suas ações, participando desta forma das alterações

cardiovasculares e renais associadas à obesidade e à síndrome metabólica (Blaj

et. al., 2003).

Figura 2- Alterações patofisiológicas associadas com a ativação do SRA do

tecido adiposo na obesidade. Todos os componentes do SRA estão presentes no

tecido adiposo. A expressão de AGT esta aumentada na obesidade, o que leva

ao super-aumento da concentração de Ang II no tecido adiposo, que por sua vez

induz a inibição da diferenciação do pré-adipócito e promove o acúmulo de

triglicérides nos adipócitos maduros devido ao seu efeito antilipolítico. O aumento

de adipócitos maduros repletos de triglicérides diminui a sensibilidade insulínica

do tecido adiposo. Supõe-se que o desvio do fluxo de moléculas de triglicérides

para o fígado e para o músculo esquelético (hipótese da lipotoxicidade), possa

gerar resistência a insulina. A hiperinsulinemia favorece a ativação simpática e a

retenção de sódio e água (resistência insulínica seletiva). Através da

hiperinsulinemia ocorre aumento dos níveis plasmáticos de angiotensinogênio

devido à hipersecreção do adipócito que ocorre na obesidade: isso pode ser o

fator responsável pelo aumento da produção de Ang II com subseqüente

vasoconstrição, elevação da retenção de sódio e água, levando a um quadro de

hipertensão. As linhas contínuas denotam ações estimulatórias e as linhas

pontilhadas denotam ação inibitória. AGT, angiotensinogênio; Ang II,

angiotensina II; RAS, sistema renina–angiotensina (Adaptado de Strazzullo et. al.,

2004).

2.10 Mecanismos moleculares que podem correlacionar o SRA à SM

Vários estudos têm demonstrado a convergência de vias metabólicas

relacionadas ao mecanismo intracelular de ação da insulina com o SRA,

especialmente com a Ang II (Marrero et. al., 2004; Touyz et. al., 2005; Watanabe

et. al., 2004)

Assim como outros fatores de crescimento, a insulina estimula a via MAPK

levando à proliferação e diferenciação celular (Marrero et. al., 2004). Por outro

lado, as respostas da Ang II nas células vasculares são mediadas por vários e

complexos sistemas efetores da membrana plasmática, tais como: fosfolipases

(A, C e D), adenilciclase, PKC e canais iônicos que são ativados em conjunto

com uma série de microdomínios protéicos formados principalmente por

proteínas adaptadoras. Essas vias proximais levam a ativação de cascatas

semelhantes, que juntas, promovem a ativação nuclear de genes que promovem

a proliferação celular (Watanabe et. al., 2004). Tallant e Clark (2003)

demonstraram justamente que os efeitos antiproliferativos da Ang-(1-7) no

músculo liso vascular estão relacionados com a inibição da atividade da ERK1/2

(p44/42 MAPK). Ou seja, a Ang-(1-7) poderia contraregular molecularmente os

efeitos da Ang II e insulina.

Recentemente, foi demonstrado que além da via clássica dependente de

cálcio, a formação de óxido nítrico pode ser modulada através da fosforilação

direta de aminoácidos específicos da sintase de NO endotelial. A fosforilação da

serina 1177, pela proteína quinase B/Akt, aumenta a atividade enzimática e a

produção de NO (Fulton et. al., 1999). Alguns dados na literatura sugerem que a

Ang II agindo em receptor AT

inibe a ação vascular da insulina interferindo na

cascata da PI3K, reduzindo a disponibilidade de NO. Essa alteração na via PI3K

também altera utilização e transporte da glicose. Também já foi demonstrado que

o aumento dos níveis de Ang II está associado à alteração no GLUT4. Sampaio

(2007) mostrou que o eixo Ang-(1-7)/Mas, ativa a via da AKT, que por sua vez

pode inibir a via MAPK estimulada pela insulina.

No entanto, não existe nenhum dado sobre a possível influência do eixo

Ang-(1-7)/Mas, no metabolismo glicêmico e lipídico.

3- OBJETIVOS

Gerais

Estudar as conseqüências da deleção genética do receptor de

angiotensina-(1-7), Mas, no metabolismo glicídico e lipídico de camundongos da

linhagem FVB/N e os mecanismos envolvidos nas possíveis alterações.

Específicos

 Comparar o peso corporal e o peso de diferentes tecidos entre

animais KO-Mas e seus controles WT FVB/N, bem como avaliar

possíveis alterações na ingestão alimentar;

 Estudar a regulação glicêmica nos animais KO-Mas, através de

testes de sensibilidade insulínica e tolerância a glicose, bem como

avaliar os níveis glicêmicos durante o jejum;

 Averiguar os níveis plasmáticos lipídicos, dosando

especificamente os níveis de triglicérides, colesterol total e HDL;

 Avaliar possíveis alterações na expressão de genes de citocinas e

hormônios relacionados a processos metabólicos e inflamatórios;

 Estudar os efeitos da deleção do receptor Mas na expressão gênica

do sistema renina-angiotensina no tecido adiposo.

 Comparar a histologia dos adipócitos epididimais entre os animais

KO-Mas e seus controles.

4- MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Animais

Para realização dos experimentos foram utilizados animais knockout para

o receptor Mas FVB/N (KO Mas) (Walther et. al., 1998) e seu controle WT FVB/N

(WT); com matrizes produzidas no Max-Delbrück-Center

For Molecular Medicine

(Berlin-Buch, Germany), com idade de aproximadamente 10 semanas de vida.

Todos os camundongos receberam dieta comercial, tiveram livre acesso à água

ad libitum, como também foram mantidos em gaiolas coletivas, em ambiente com

ciclos de luminosidade de 12 horas (7:00 às 19:00 h) com temperatura variando

entre 25 ± 2,0

4.2 Amostras de sangue

Após jejum de 10 a 12 horas amostras de sangue foram retiradas, por

exangüinação pela aorta abdominal em microtubos, após aplicação de anestesia

intraperitoneal de uma solução de ketamina (130mg/kg) e xilazina (0,3mg/kg). O

soro foi separado, por centrifugação a 3500 rpm / 10 minutos, em centrífuga de

mesa (Fanem Centrimicro 243).

4.3 Peso Corporal e peso adiposo

Para determinação do peso corporal os animais KO-Mas e WT FVB/N com

10 semanas foram pesados logo antes dos experimentos.

Para avaliação do peso do tecido adiposo os animais foram pesados e

anestesiados com Ketamina/Xilasina, com posterior sacrifício através de incisão

na aorta abdominal (como descrito). O tecido adiposo epididimal e o

retroperitoneal foram retirados e pesados em seguida. O peso do tecido adiposo

foi então corrigido pelo peso corporal e construiu-se assim um gráfico de

porcentagem de peso corporal dos animais.

4.4 Ingestão alimentar

A ingestão alimentar foi medida durante uma semana, com os animais

sendo colocados em gaiolas individuais. Diariamente, no mesmo horário, o peso

da comida foi mensurado em balança semi-analítica, subtraindo-se o valor obtido

após 24 horas do peso inicial. A massa de comida ingerida diariamente foi

corrigida pelo peso corporal. A média doas valores encontrados é apresentada na

figura 5.

4.5 Determinação dos níveis plasmáticos de leptina e adiponectina

Os níveis séricos de leptina (Linco Research , Missouri USA) e

adiponectina (AdipoGen, Seoul Korea) foram avaliados utilizando kits de ELISA

específicos, de acordo com as especificações do fabricante.

4.6 Determinação dos níveis de colesterol total

Os níveis de colesterol total foram medidos de acordo com o método da

colesterol oxidase (Allain et al., 1974), utilizando-se kit comercial da empresa

Doles, Brasil. O método consiste na hidrólise de ésteres de colesterol pela

colesterol esterase, produzindo colesterol livre. Este, em presença da colesterol

oxidase e de oxigênio, produz peróxido de hidrogênio que, pela ação da

peroxidase em presença de fenol e 4-aminoantipirina, produz um composto

róseo-avermelhado com absorção máxima em 505 nm. Os níveis de colesterol no

soro dos animais foram determinados por um ensaio em microplaca de 96 poços,

de acordo com Fazio et al. (1997). Em resumo, 10 L das amostras de soro

foram diluídas em água destilada (1:100), a fim de que as leituras de absorbância

fossem adequadas à variação linear do teste. À diluição foram adicionados 100

L de reagente de colesterol total. Após um período de incubação de 10 minutos

a 37

C, a absorbância foi lida a 492 nm em um leitor de microplaca (Thermo

Plate).

4.7 Determinação de colesterol HDL

Os níveis de colesterol HDL no soro foram dosados por meio do kit

enzimático Doles, Brasil. O princípio se baseia na precipitação seletiva de LDL e

VLDL por polietilenoglicol tamponado, restando apenas a fração HDL no

sobrenadante. Este foi separado para a dosagem de HDLc da seguinte forma: em

uma microplaca de 96 poços, 10 µL da amostra foram adicionados a 200 µL do

reagente de cor Colesterol 250 Doles/Colesterol Enzimático Líquido Doles. Após

uma incubação de 10 minutos a 37°C, a absorbância foi lida a 492 nm em leitor

de microplaca (Thermo Plate).

4.8 Determinação dos níveis de triglicerídeos

Os níveis de triglicerídeos séricos foram medidos de acordo com o

método enzimático colorimétrico (Fossati & Prencipe, 1982), utilizando kit

comercial da empresa Doles, Brasil. O método consiste na hidrólise dos

triglicerídeos pela lipase lipoprotéica, produzindo glicerol livre, fosforilado pela

glicerol quinase, cujo produto sofre a ação da glicerol-P-oxidase que, em

presença de oxigênio, produz peróxido de hidrogênio. Este, sob a ação da

peroxidase, do reagente fenólico (p-clorofenol) e da 4-aminoantipirina, produz um

composto róseo-avermelhado, com máximo de absorção a 500 nm.

As dosagens e a curva padrão foram feitas em microplacas, conforme

descrito para o colesterol.

4.9 Histologia de tecido adiposo

O tecido adiposo epididimal foi retirado e fixado em Bouin. Após 24 horas o

tecido foi transferido para uma solução de álcool etílico 70% onde permaneceu

até o momento da inclusão em parafina. Foram feitos cortes de 7 m de

espessura em micrótomo e montagem em lâminas de vidro. Cada lâmina teve um

total de 3 cortes retirados do bloco de parafina com uma distância mínima de 20

m. As lâminas foram coradas pelo método de HE (hematoxilina-eosína). A

análise foi feita em microscópio acoplado à câmera digital em um aumento de

20x. Foram selecionados três campos por corte nos quais se contou todos os

adipócitos existentes na área, medindo-se o diâmetro de 20 adipócitos em cada

campo. Fez-se a média dos resultados encontrados para cada camundongo para

realização da análise.

4.10 Genotipagem

Para confirmação da deleção do receptor Mas nos animais Knock-out

realizou-se extração do DNA genômico seguido de PCR.

4.10.1 Extração do DNA genômico:

Cada animal foi identificado e em seguida cortou-se um pequeno pedaço

da ponta de sua cauda. Em um microtubo foram adicionados 100 l de tampão

com 10 l de proteinase-K na concentração de 20mg/ ml, juntando-se ao tecido

coletado. Incubou-se o produto à temperatura de 55

C por duas horas, ou até que

tivesse ocorrido total digestão do tecido.

Em uma próxima etapa adicionou-se 750 l de tampão Tris-EDTA 1X, e

incubou-se novamente a amostra por 10 minutos à temperatura de 95

Do produto final foram utilizados 2 l para realização do PCR.

4.10.2 PCR e detecção de produtos amplificados em gel de agarose

Foram utilizados “primers” específicos para o DNA do receptor Mas de

camundongos. Análises dos pares de bases foram executadas através do

programa específico BLASTN, sintetizados pela empresa Invitrogen



(Quadro 1)

e aliquotados na concentração de 150 µM e guardados em freezer a –20

C. Uma

subseqüente diluição para 10 µM foi necessária.

A amostra da etapa anterior (2 l ) foi utilizada como fita molde para a

amplificação por PCR. Todas as reações foram realizadas num volume final de

50 l em tubos resistentes a temperaturas elevadas (Hot start) com os seguintes

reagentes: 1 µL (10 µM) de cada primer (sense e anti-sense), tampão para PCR

(concentrações finais: Tris-HCl 20 mM pH 8,4; KCl 50 mM), 2 µl de MgCl

50mM,

dNTPs (Deoxinucleotídeos trifosfato-: dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 0,2 mM) e 2,5

UI de Taq DNA polimerase. Para o processo de ciclagem térmica, realizou-se

desnaturação inicial por 4 minutos a 94

C seguida de 35 ciclos de

amplificação. Cada ciclo consistiu de desnaturação por 30 segundos a 94

anelamento por 30 segundos a 59

C e extensão por 1 minuto a 72

C. As

amostras foram incubadas por um período adicional de 10 minutos a 72

(extensão final) após o término do último ciclo. Realizou-se também PCR em

água estéril para avaliação de possível contaminação (branco). Uma alíquota de

8 µL de cada amostra foi analisada por eletroforese em gel de agarose 1%

contendo brometo de etídio (0,64 µg/mL). As bandas de amplicons foram

visualizadas em transiluminador sob luz ultra-violeta para verificação da presença

ou ausência de amplificação. O peso molecular dos produtos da PCR foi

determinado pela comparação com um marcador de massa molecular.

Quadro 1- Primers e condições experimentais utilizadas para a PCR do Mas

Alvo Seqüência (5’ para 3’)

Sense

Seqüência (5’ para 3’)

Antisense

Temperatura de

anelamento (

Ciclos

Mas

ACT GTC GGG CGG TCA

TCA TC

GGT GGA GAA AAG CAA

GGC GA

4.11 Retrotranscrição e Real Time PCR

4.11.1 Extração de RNA total

A extração de RNA total foi realizada utilizando-se o método “guanidino-

isotiocianato-fenol-clorofórmio”. Depois de completada a idade e passadas duas

semanas dos testes glicêmicos, os camundongos foram sacrificados e,

imediatamente, os órgãos de interesse foram removidos, sendo congelados em

nitrogênio líquido e estocados a -80

C. Em seguida, as amostras foram

homogeneizadas em tubos plásticos de 5 mL contendo o reagente TRIzol



(0,1 g

de tecido/1,0 mL do reagente extrativo; Invitrogen laboratories, USA), utilizando-

se um homogeneizador de tecido (PowerGen, 700. Ficher, USA). Os

recipientes plásticos contendo o homogenato foram incubados a temperatura

ambiente por 10 minutos. Após esse procedimento, adicionou-se 0,2 mL de

clorofórmio (Merck



). Os tubos foram vigorosamente agitados e deixados em

repouso por 5 minutos a 4

C, sendo, em seguida, centrifugados a 12.000 rpm

por 15 minutos. A camada superior (fase aquosa) foi recuperada em tubos para

microcentrífuga, com subseqüente adição de 0,5 mL de isopropanol. O material

foi levemente agitado e mantido em repouso a 4

C por 10 minutos. Após

centrifugação a 12.000 rpm por 10 minutos, à mesma temperatura utilizada

anteriormente, descartou-se o sobrenadante e adicionou-se 1 mL de etanol 70 %,

gelado (solução manufaturada em água tratada com dietil-pirocarbonato - DEPC),

agitando-se novamente. O sobrenadante foi descartado e os tubos foram

mantidos a temperatura ambiente até secagem das amostras. A redissolução do

RNA total foi realizada com adição de 0,05 mL de água tratada com DEPC.

4.11.2 Eliminação de moléculas de DNA genômico da amostra de RNA total

Para eliminação de uma possível contaminação com o DNA genômico nas

amostras de RNA total, utilizou-se a enzima desoxiribonuclease I proveniente da

empresa GibcoBRL



. O tratamento foi feito de acordo com o protocolo fornecido

pelo fabricante.

4.11.3 Quantificação do RNA total

Após os procedimentos descritos anteriormente, as amostras de RNA total

foram diluídas 50X e estimou-se a concentração em espectrofotômetro a 260 nm

(HITACHI



UV 160 A). Para o cálculo da concentração do nucleotídeo, utilizou-se

a seguinte equação: [RNA

total

] = A

260

x 40 x Fator de diluição, sendo o resultado

expresso em g/mL.

4.11.4 RT (Transcrição Reversa)

O RNA total foi utilizado para a síntese de cDNA, a qual foi realizada num

volume final de reação de 30 µL utilizando-se 1 µg de RNA total, 0,2 µg de

hexadeoxinucleotídeos, tampão para RT (concentrações finais: Tris-HCl 45 mM

pH 8,3; KCl 68 mM), 5 l de MgCl

50 mM, DTT 15 mM, dNTPs 1,8 mM e 150 UI

de transcriptase reversa. Reagentes da empresa Promega



Corporation (USA). O

cDNA (DNA complementar) foi sintetizado em termociclizador durante um período

de 60 minutos de incubação a 37

C. A reação foi paralisada pelo aquecimento a

C por 5 min.

4.11.5 PCR Quantitativa

As reações de PCR quantitativa foram feitas utilizando “primers”

específicos para o cDNA dos genes de interesse. A análise dos pares de bases

foi executada através do programa específico BLASTN, sintetizados pela

empresa Invitrogen



(Quadro 2). Alíquotas na concentração de 150 µM foram

feitas e guardados em freezer a –20

C. Uma subseqüente diluição para 1nmol/l

foi necessária para uso. Os primers do gene utilizado para normalização da

reação (controle endógeno), foram de HPRT (Quadro 2).

O cDNA obtido da etapa de RT (2 l ) foi utilizado como fita molde para a

amplificação por PCR. As reações de PCR quantitativa tiveram um volume final

de 20 l e foram feitas em duplicatas, utilizando 19 l do Máster Mix de SYBR

Green (Apllied Biosystem), 2 l de cada primer na concentração de 1nmol/l, e 2

l de cDNA. O aparelho para reação foi o ABI Prism 7000 (Apllied Biosystem,

EUA), sendo realizados 40 ciclos com temperatura de anelamento de 60

Quadro 2. Primers e condições experimentais utilizadas para o Real Time PCR

Alvo Seqüência (5’ para 3’)

Sense

Seqüência (5’ para 3’)

Antisense

Temperatura de

anelamento (

Ciclos

TNF-

CAT CTT CTC AAA ATT

CGA GTG ACA A

TGG GAG TAG ACA

AGG TAC AAC CC

TGF-

GGT TCA TGT CAT GGA

TGG TGC

TGA CGT CAC TGG AGT

TGT AGG G

AGT GAC GTG ACC CTG AGC

AGT CC

TGA GTC CCG CTC GTA

GAT GG

HPRT GTT GGA TAC AGG CCA

GAC TTT GTT

GAT TCA ACT TGC GCT

CAT CTT AGG C

4.12 Extração de proteínas totais

Para a extração de proteínas totais os tecidos, previamente removidos e

estocados no freezer -80

C, foram homogeneizados em 200 µl de tampão de lise

(1% Triton X-100, 0,15M NaCl, 20mM de Tris HCl, pH 7.0, 1mM MgCl2, 1mM

CaCl2, , 4µg/ml de leupeptina, 4µg/ml de aprotinina, 1mM de orthovanadato de

sódio, 0,5 mM PMSF). Após centrifugação as amostras foram incubadas sobre o

gelo por 30 minutos e em seguida o lisado foi coletado e centrifugado a 14000

rpm por 20 minutos a 4ºC em uma centrífuga Eppendorf modelo 5417R. O

sobrenadante foi coletado, e a concentração das proteínas totais determinada em

espectrofotômetro através do Kit Brada Lord.

4.13 Western Blotting

Trinta g dos extratos protéicos foram fracionados em gel de

poliacrilamida/SDS (PAGE) 12% a 100V por 1,5 h. Após a corrida eletroforética

as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose. As

membranas foram então coradas com "Ponceau" para verificar a eficiência da

transferência e para confirmar a quantidade de proteínas em cada canaleta. Após

esta etapa as membranas foram lavadas com Tris-Base 1M pH 7,6 (1x) contendo

0,1% de Tween (TBS-T) até se retirar todo o ponceau. Em seguida as ligações

não específicas foram bloqueadas com TBS 1x, contendo 5% de leite em pó

desnatado. Após o bloqueio as membranas foram incubadas com anticorpo

primário 1/1000 em TBS-T contendo 1% de leite em pó, por 18 horas a 4°C.

Foram utilizados anticorpos primários comerciais para todas as proteínas

testadas. As membranas foram então lavadas três vezes com TBS-T e incubadas

com o anticorpo secundário anti coelho diluído em TBS-T contendo 1% de leite

em pó desnatado. Após este tempo as membranas foram lavadas mais três

vezes com TBS-T e incubadas por 5 minutos com solução reveladora ECL. O

excesso da solução foi retirado e as membranas foram expostas contra filme de

raio X por diferentes tempos. Os filmes foram revelados utilizando-se soluções

reveladoras e fixadoras (Kodac), seguindo-se as instruções do fabricante.

4.14 Testes de Tolerância à Glicose e Sensibilidade Insulínica

Para avaliação do perfil glicêmico dos animais foram realizados testes de

sensibilidade insulínica e tolerância à glicose.

O teste de sensibilidade insulínica foi realizado pela manhã, com os

animais no estado alimentado, através da aplicação intraperitoneal de 0,75U de

insulina/kg de peso corporal. Com um pequeno corte na ponta da calda do

animal, coletou-se uma gota de sangue para verificação da glicemia, no momento

anterior à aplicação de insulina e com 15, 30 e 60 minutos após a aplicação. O

aparelho utilizado para leitura glicêmica foi o Accu-Chek® Advantage (Roche).

Com os resultados construiu-se uma curva de glicemia pelo tempo.

O teste de tolerância à glicose foi realizado pela manhã, com os animais

em jejum de 12 horas, através da aplicação intraperitoneal de 2 g de glicose/kg

de peso corporal. Com um pequeno corte na ponta da cauda do animal, coletou-

se uma gota de sangue para verificação da glicemia, no momento anterior à

aplicação da glicose (glicemia de jejum) e com 15, 30, 60 e 120 minutos após a

aplicação. O aparelho utilizado para leitura glicêmica foi o Accu-Chek®

Advantage (Roche). Com os resultados construiu-se uma curva de glicemia pelo

tempo. (Lee K. et. al., 2003).

4.15 Análises estatísticas e expressão dos resultados

Para análise dos dados do teste de sensibilidade insulínica e tolerância a

glicose foi utilizada a análise de variância de duas vias (Two-way ANOVA),

seguida do teste de comparação entre curvas do tipo BONFERRONI. Os demais

resultados obtidos foram analisados através de teste T de Student não pareado.

Valores de p<0,05 foram considerados estaticamente significativos.

Os cálculos e análises estatísticas foram realizados utilizando-se o

programa Graph Pad Prism 4.0 (San Diego, CA, USA).

5- Resultados

5.1 Peso corporal e peso adiposo

A análise do peso corporal dos animais KO Mas e WT FVB/N, mostrou que

não existe diferença entre os grupos (24.73 ± 0.349 vs 24.77 ± 0.236 no WT). A

figura 3 ilustra os resultados obtidos.

Após retirada e pesagem do tecido adiposo observou-se aumento da

massa adiposa, tanto epididimal (1.704 ± 0.152 vs 1.150 ± 0.126 no WT) (Figura

4 B) quanto retroperitoneal (0.6747 ± 0.0858 vs 0.3781 ± 0.0458 no WT)(Figura 4

A), nos animais KO Mas. A figura 4 mostra os gráficos da análise estatística do

peso de ambos os grupos e uma foto ilustrativa do tecido adiposo epididimal e

retroperitoneal (Figura 4 C).

WT FVBN KO Mas

Peso Corporal (g)

Figura 3 – Peso corporal em gramas do grupo de animais KO Mas (n=19) e do grupo

WT FVB/N (n=15). Os dados representam média ± EPM.

A B

Figura 4 – Porcentagem da massa de tecido adiposo dos animais KO Mas (n=5) e WT

FVB/N (n=5), pelo peso corporal. (A) Adiposo retroperitoneal (B) Adiposo epididimal (C)

Foto ilustrativa do tecido adiposo de ambos os grupos. Os dados representam média ±

EPM.

5.2 Ingestão alimentar

A ingestão de ração (quantidade de comida ingerida por peso corporal)

não diferiu entre os grupos (0.1785 ± 0.01098 vs 0.1762 ± 0.006781 g no WT),

como mostrado na figura 5.

WT FVB/N KO Mas

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

Peso da comida ingerida (g)/Peso Corporal(g)

Figura 5 – Massa de comida ingerida corrigida pelo peso corporal dos animais Ko Mas

(n=6) e WT FVB/N (n=6). Os dados representam média ± EPM.

5.3 Histologia do tecido adiposo epididimal

Tanto a contagem do número de células por campo (Figura 6C) quanto a

medida do diâmetro de vinte adipócitos por campo (Figura 6D) não revelaram

diferença significativa entre os animais KO Mas e WT FVB/N, mostrando

ausência de hipertrofia nas células adiposas dos animais KO Mas.

Figura 6 –

Análise histológica (HE) do tecido adiposo epididimal dos animais KO Mas

(n=3) e WT FVB/N (n=3). (A) Foto ilustrativa do tecido adiposo epididimal dos

camundongos KO Mas. (B) Foto ilustrativa do tecido adiposo epididimal dos

camundongos WT FVB/N. (C) Análise do numero de células por campo. (D) Análise do

diâmetro dos 20 maiores adipócitos por campo.

5.4 Perfil Lipídico

A dosagem plasmática do colesterol total (92.2 ± 3.65 vs 74.6± 5.67 mg/dl

no WT), do HDL (74.50 ± 3.25 vs 42.26 ± 1.93 mg/dl no WT) e do triglicérides

(70.6 ± 13.3 vs 41.4± 4.07 mg/dl no WT), mostrou que o animal KO Mas possui

um quadro de dislipidemia, apresentando aumento, com relação ao grupo

controle, em todas as análises (Figura 7).

Figura 7 –

Perfil lipídico dos camundongos WT FVB/N (n=6) e KO Mas (n=6). (A)

Dosagem dos níveis plasmáticos de colesterol total (B) Dosagem dos níveis plasmáticos

de HDL (C) Dosagem dos níveis plasmáticos de triglicérides. Os dados representam

média ± EPM e foram analisados através do teste-T de Student. Foi considerado

estatisticamente significante p<0.05.

5.5 Perfil Glicêmico

O teste de tolerância à glicose mostrou que os animais KO Mas

apresentam um quadro de menor tolerância a glicose que os seus controles WT

FVB/N, com aumento acentuado na glicemia após injeção de glicose e menor

queda durante o tempo experimental, como mostrado na figura 8A, onde se

observa diferença significativa entre as curvas dos grupos analisados e nos

tempos de 30, 60 e 120 minutos. A glicemia basal de jejum também se mostra

significativamente aumentada nos animais KO Mas (86.6 ± 6.43 vs 56.40 ± 4.98

mg/dl no WT) como mostrado na figura 8C.

O teste de resistência à insulina mostrou que os animais KO Mas

apresentam maior resistência a insulina que o seu grupo controle WT FVB/N,

com menor queda da glicemia após injeção de insulina intraperitoneal, com

aumento mais rápido dos níveis glicêmicos durante o tempo experimental. A

figura 8B mostra diferença significativa entre as curvas dos grupos analisados e

15 minutos após a injeção de insulina.

Figura 8 – Perfil glicêmico dos camundongos WT FVB/N (n=5) e KO Mas (n=5). (A)

Teste de tolerância à glicose e gráfico da área sob a curva; (B) Teste de sensibilidade à

insulina e gráfico da área sob a curva; (C) Glicemia de Jejum. Os dados representam

média ± EPM e foram analisados através do teste-T de Student (8C) e two-way ANOVA.

Foi considerado estatisticamente significante p<0.05.

5.6 Western Blotting para Glut4 no tecido adiposo

Para se averiguar as possíveis causas das alterações metabólicas

encontradas fez-se a analise da expressão do transportador Glut-4.

A análise da expressão protéica do transportador de glicose Glut4, no

tecido adiposo epididimal, mostrou uma diminuição significativa (0.3535 ±

0.06091 vs 0.5992 ± 0.1143 no WT) na expressão desse receptor nos animais

KO Mas com relação aos controles WT FVB/N (Figura 9).

Figura 9 –

Western Blotting de amostras de tecido adiposo epididimal de camundongos

WT FVB/N (n=3) e KO Mas (n=4), com foto ilustrativa do filme de revelação do western

blotting de ambos os grupos. Os dados representam média ± EPM e foram analisados

através do teste-T de Student. Foi considerado estatisticamente significante p<0.05.

5.7 Dosagem dos níveis plasmáticos de adipocitocinas

A dosagem plasmática dos níveis de leptina mostrou um aumento no

grupo KO Mas quando comparado com seu controle WT FVB/N (1.280 ± 0.247 vs

0.735 ± 0.172 N=10 ng/ml no WT), como mostrado na figura 10. Quando

comparamos o aumento da massa adiposa com o aumento dos níveis de leptina

através da análise de Pearson (Figura 10B) observamos uma forte correlação

tanto nos animais KO Mas (p=0,0153*) quanto nos WT FVB/N (p=0,0010***).

Porém, quando os valores de leptina foram corrigidos pela massa adiposa

epididimal os dois grupos apresentaram níveis semelhantes (Figura 10C).

Os valores encontrados na dosagem dos níveis séricos de adiponectina

foram semelhantes entre os dois grupos (5.802 ± 0.442 vs 5.853 ± 0.538 g/ml no

WT) como mostrado na figura 11A. Foi observada forte correlação entre o

aumento da massa adiposa e os níveis de adiponectina (Figura 11B) nos animais

KO Mas e WT FVB/N. Quando os valores de adiponectina foram corrigidos pela

massa adiposa epididimal o grupo KO Mas mostrou uma produção prejudicada

desse hormônio (7.420 ± 0.7169 vs 20.74 ± 6.485 g/ml no WT) como mostrado

na figura 11 C.

Figura 10 – Níveis plasmáticos de leptina nos camundongos WT FVB/N (n=10) e KO

Mas (n=10). (A) Nível plasmático de leptina (B) Correlação entre o peso do tecido

adiposo epididimal e os níveis séricos de leptina. (C) Razão entre a massa de tecido

adiposo e os níveis de leptina por animal



, r = 0,9054

, r = 0,7231

Figura 11 – Níveis plasmáticos de adiponectina em camundongos WT FVB/N (n=7) e

KO Mas (n=7). (A) Nível plasmático de adiponectina (B) Correlação entre o peso do

tecido adiposo epididimal e os níveis séricos de adiponectina. (C) Razão entre a massa

de tecido adiposo e os níveis de adiponectina por animal



, r = 0,7379

, r = 0,6885

5.8 Expressão gênica de angiotensinogênio, TGF- e TNF- por Real Time

PCR do tecido adiposo

A análise da expressão do mRNA para angiotensinogênio, TGF- e TNF-

por PCR em tempo real no tecido adiposo epididimal, mostrou um aumento

significativo na expressão de angiotensinogênio (2.156 ± 0.663 vs 0.858 ± 0.194

no WT) e TGF- (2.034 ± 0.437 vs 0.8020 ± 0.088 no WT) , sem alteração na

expressão de TNF- (1.049 ± 0.30 vs1.026 ± 0.27 no WT), como mostrado na

figura 12.

Figura 12 – Análise por PCR em tempo real do RNA extraído do tecido adiposo

epididimal de camundongos WT FVB/N (n=6) e KO Mas (n=6). (A) Expressão de

angiotensinogênio (B) Expressão de TGF- (C) Expressão de TNF-. Os dados

representam média ± EPM e foram analisados através do teste-T de Student. Foi

considerado estatisticamente significante p<0.05.

6- Discussão

O tecido adiposo é um órgão endócrino complexo e importante que tem

papel fundamental no metabolismo lipídico e glicídico (Strazzullo et. al. 2004).

A deleção genética de receptores é uma ferramenta que vem sendo muito

utilizada para se avaliar o papel de peptídeos e enzimas. Dessa forma, o

camundongo knockout para o receptor de angiotensina-(1-7), Mas, é uma

importante ferramenta para a avaliação do papel desse peptídeo via receptor Mas

na homeostasia. No presente estudo, procuramos avaliar as conseqüências da

deleção genética do receptor Mas no metabolismo lipídico e glicídico.

Os resultados obtidos mostraram que os animais KO Mas apresentam um

quadro de dislipidemia (aumento dos níveis plasmáticos de colesterol total e

triglicérides), menor tolerância a glicose com maior resistência a ação da insulina

e aumento dos níveis plasmáticos de leptina associados a uma maior massa de

tecido adiposo. Além disso, observou-se, no tecido adiposo epididimal, uma

expressão gênica aumentada de angiotensinogênio e TGF- e diminuição do

receptor Glut4; além de ausência de hipertrofia. A expressão de TNF- não está

alterada, bem como a ingestão alimentar, os níveis séricos de adiponectina e o

peso corpóreo.

A análise da relação do peso do tecido adiposo epididimal e retroperitoneal

mostrou que os animais KO Mas possuem um considerável aumento da massa

adiposa (em média 63%) em relação ao seu controle WT FVB/N, apesar de não

possuir diferença no peso corporal. Normalmente o aumento da massa adiposa

em um mamífero leva ao aumento do peso corporal. Dessa forma, uma

possibilidade para justificar o dado encontrado seria de que o animal KO Mas

possui, em algum(s) outro(s) tecido(s), perda de massa ou atrofia, como

conseqüência da ausência do receptor Mas.

A análise histológica do tecido adiposo foi feita para averiguar se o

aumento da massa adiposa deve-se a um processo hipertrófico, hiperplásico ou

ambos. Verificou-se que não existe diferença no diâmetro dos adipócitos e nem

uma diminuição do número de adipócitos por campo nos animais KO Mas. Dessa

forma, concluímos que o aumento da massa adiposa se deve a uma hiperplasia

tecidual e não a uma hipertrofia. Esse dado é corroborado pelo aumento da

expressão de TGF- no tecido adiposo, uma citocina que estimula a proliferação

tecidual e a formação de colágeno (Zhang R, 2006).

Outro dado interessante foi a ausência de alteração na ingestão de ração,

indicando que nesse modelo o aumento da massa adiposa se deve a alterações

metabólicas e não a mudança no comportamento alimentar.

Em nosso estudo constatamos que os camundongos KO Mas, já com dez

semanas, apresentam aumento dos níveis de triglicérides, colesterol total,

resistência a insulina e intolerância a glicose. A RI é o fator mais comum no

quadro de síndrome metabólica. Estudos recentes ligaram a resistência à

insulina à outros fatores de risco coronários, incluindo a formação de lipoproteína

de baixa densidade (LDL); altos níveis de gordura no sangue após as refeições;

altos níveis de ácido úrico, e altos níveis de plasminogênio, que diminui a

capacidade do organismo de diluir possíveis coágulos sangüíneos. (Shoelson

SE. et. al., 2006; Cassis LA, 2000)

As associações epidemiológicas entre inflamação, diabetes do tipo 2 e

obesidade já vêm de longa data, porém estudos epidemiológicos recentes

ampliaram esse conhecimento e foram encontrados vários marcadores de

processos inflamatórios associados com a resistência à insulina. Estudos atuais

mostram que o tecido adiposo produz várias citocínas, como o TNF-α, que

causa resistência à insulina em modelos experimentais e têm papel fundamental

na patogênese da resistência à insulina. (Shoelson SE. et. al., 2006)

Sabe-se que a ausência do TNF- ou de seus receptores resulta em

melhora significativa da sensibilidade à insulina em camundongos com obesidade

induzida por dieta, hipotalâmica ou genética (Ventre et. al., 1997; Uysal et. al.,

1994). Assim, a ausência de alteração nos níveis dessa citocina, encontrado em

nosso estudo, sugerem que pelo menos no tecido adiposo alterações no TNF-

não participam do mecanismo de resistência a insulina, que pode ser explicado,

pelo menos em parte, pela diminuição do receptor Glut4 no tecido adiposo dos

animais knockout .

Estudos mostram que a célula adiposa é uma das poucas células que

dispõem de todo o maquinário necessário para a síntese de angiotensina II

localmente. Estudos utilizando cultura de células adiposas mostraram que o

angiotensinogênio (AGT) e a Ang II participam da regulação e diferenciação do

fenótipo do adipócito (Cassis LA et. al., 1998b). As implicações da angiotensina

na gênese da hipertensão do obeso começam a se tornar cada vez mais óbvias.

Em cultura de células adiposas, a angiotensina II é fator adipogênico, enquanto

no animal vivo atua como importante redutor do peso e da massa adiposa. É

provável que a angiotensina II derivada do tecido adiposo exerça um papel chave

na modulação do metabolismo lipídico e atue também como elo entre obesidade

e hipertensão (Cassis LA., 2000). Além disso, a hipótese de que uma maior

expressão do gene do angiotensinogênio em obesos contribua para os

mecanismos perpetuantes do excesso de peso é bastante atraente, necessitando

de pesquisas adicionais sobre variação da ação tecidual da Ang II para sua

validação.

O aumento da expressão de AGT e sua secreção é uma importante

característica da diferenciação do adipócito, principalmente devido ao papel

fundamental da Ang II na maturação do pré-adipócito. Acredita-se que a Ang II

controle a adiposidade pela regulação da síntese e armazenamento de lipídeos,

aumentando o conteúdo de triglicérides e alterando a atividade de enzimas

lipogênicas (sintase de ácidos graxos e glicerol-3-fosfato desidrogenase)

(Strazzullo et. al. 2004). Assim a Ang II pode estimular a maturação adipocitária,

enquanto, paralelamente, aumenta a degradação lipídica.

Vários estudos têm demonstrando que na obesidade ocorre aumento da

expressão de AGT (Giacchetti et. al. 2002; Rankinen et. al. 1999). Adipócitos

de ratos obesos Zucker, por exemplo, possuem maior expressão e secreção de

AGT (Hainault et. al. 2002). Esses resultados corroboram os dados obtidos para

a expressão de AGT no tecido adiposo epididimal dos camundongos KO Mas,

que está aumentada. No tecido adiposo e no fígado de ratos SD a glicose possui

efeito estimulante e a insulina inibidor, da expressão de AGT (Gabriely et. al.

2001). Em ratos obesos o efeito de estímulos nutricionais está aumentado devido

ao quadro de resistência a insulina que gera supressão do efeito da mesma.

(Jones et. al. 1997). Esse mesmo efeito pode ser observado no animal KO Mas,

visto que ele apresenta resistência à insulina e intolerância a glicose com

aumento da glicemia de jejum. Assim a menor ação da insulina e o aumento da

glicose podem contribuir para o aumento da expressão de AGT.

A estimulação da expressão de AGT no tecido adiposo em camundongos

com maior massa adiposa, como o KO Mas, pode ser uma das explicações para

a maior pressão arterial nesses animais (Todiras et. al., 2006; Moura, 2007). No

caso do animal KO Mas sabemos que esse efeito deve estar também associado

à ausência do efeito vasodilatador do eixo Ang-(1-7)/Mas. (Brosnihan K.B.

et.al., 1998).

Os estudos que mostram a correlação do SRA com o peso corporal são

controversos e as vezes inconclusivos, indicando a participação da Ang II,

algumas vezes como adipogênica e outras como adipolítica (Katsuya et. al.

1995; Veda et. al. 1995; Nagi et. al. 1998; Jones et. al. 1997b). Sabendo-se

que o tratamento com os inibidores de ECA diminue a produção de Ang II e leva

ao aumento dos níveis de Ang-(1-7), e que os efeitos da Ang II podem ser

contrapostos pela Ang-(1-7), podemos supor que parte dos efeitos dos iECA se

deva a Ang-(1-7) (UK 1984; McGrath et. al. 1990; Campbell et. al. 1995). Os

dados do nosso estudo sugerem um papel do eixo Ang-(1-7)/Mas no controle da

massa gorda e podem explicar a perda de peso que ocorre após a administração

de iECA, tanto em roedores quanto em humanos. Benter e colaboradores (2007)

mostraram que o tratamento de ratos diabéticos com Ang-(1-7) ou com seu

análogo não peptídico AVE-0991, gerou melhora significativa no quadro de

proteinúria, nos danos vasculares e na função cardíaca, indicando um papel

protetor desse peptídeo nas patologias associadas ao quadro de diabetes.

Porém não foram encontradas evidências de que o tratamento melhore o

metabolismo glicídico. No entanto, o modelo utilizado (tratamento com

streptozotocina) não permite uma análise adequada dos possíveis efeitos

metabólicos da Ang-(1-7), considerando que o defeito primário é a lesão de

células  pancreáticas, com conseqüente hipoinsulinemia, e não a resistência à

insulina, como ocorre no diabetes tipo 2 e em nosso modelo experimental. Por

outro lado, Nogueira e colaboradores (2007) observaram que mulheres grávidas

com diabetes gestacional apresentam níveis circulantes diminuídos de Ang-(1-7),

reforçando a idéia de que o eixo Ang-(1-7)/Mas possa estar envolvido de forma

importante nos mecanismos de controle do metabolismo.

Velloso et. al. 1996 documentaram que a Ang II diminui a fosforilação da

tirosina insulina-estimulada aumentando a fosforilação da serina do receptor IRS-I

de insulina. Esse processo diminui a sinalização intracelular da insulina

diminuindo sua atividade (Folli et. al. 1999). Essa maquinaria alterada

correlaciona o aumento dos níveis de AGT e Ang II com o quadro de resistência a

insulina. Em indivíduos sadios a perfusão subcutânea do tecido adiposo com

Ang II por microdiálise leva a inibição da captação de glicose (Boschmann et. al.

2001). Em nosso estudo observamos que a deleção genética do Mas em

camundongos FVB/N produziu resistência a insulina e intolerância a glicose.

Como já mencionado, um dos fatores envolvidos nessas alterações é a redução

do Glut4. Nossos achados estão de acordo com o conceito de que, na maioria

das vezes, a Ang-(1-7) exerce um papel contraregulatório aos efeitos da Ang II.

Assim, podemos esperar que a abolição da ativação do eixo Ang-(1-7)/Mas nos

camundongos KO Mas possa ser a responsável pelo quadro de maior resistência

a insulina, intolerância à glicose e aumento da glicemia de jejum. Isso

provavelmente se deve a exarcebação do efeito inibidor da Ang II nas ações da

insulina ou mesmo devido à abolição de um efeito direto da Ang-(1-7), mediado

pelo receptor Mas, gerando um desequilíbrio dentro do SRA.

Em pacientes tratados com iECA e bloqueadores AT

, ocorre um aumento

significante da sensibilidade insulínica e restauração dos níveis de adiponectina

(Galletti et. al. 1999; Furuhashi et. al. 2003). Acredita-se que os bloqueadores

do SRA possam remover a inibição exercida pela Ang II, promovendo assim um

aumento dos níveis de adiponectina com aumento da sensibilidade insulínica

(Janke et. al. 2002). Em nosso modelo a análise da razão da massa adiposa

pelos níveis de adiponectina sugere uma redução na função de cada adipócito

em produzir esse hormônio, corroborando os dados da literatura que mostram

perda na produção de adiponectina associado ao aumento da massa gorda. Os

níveis totais só não estão menores no KO Mas devido ao aumento da massa do

tecido adiposo.

Resultados de estudo recente (Shorr U. et. al., 1998), em que se avaliou

a relação entre angiotensinogênio, leptina e níveis de pressão arterial em um

grupo de jovens normotensos, evidenciaram que o substrato da renina se

correlacionou significativamente com o índice de massa corporal, níveis

plasmáticos de leptina e pressão arterial, nos indivíduos com história familiar

positiva para hipertensão arterial. Concluiu-se que os níveis circulantes de

angiotensinogênio contribuíram para a relação entre peso corporal e pressão

arterial (Shorr U. et. al., 1998). Estudos mostram que a produção hormonal do

tecido adiposo está bastante alterada em indivíduos obesos, ocorrendo aumento

da produção de leptina e diminuição dos níveis de adiponectina (Weyer et. al.

2001). Uma vez que em pacientes que fazem uso de iECA os níveis de

adiponectina são restabelecidos, acredita-se que o aumento nos níveis de Ang II

seja importante na inibição da síntese de adiponectina, assim como ela é

fundamental na maturação de pré-adipócitos (Furuhashi et. al. 2003). Dessa

forma, a abolição do Mas pode ser responsável também pela menor síntese de

adiponectina nos animais KO Mas, por potencializar o efeito da Ang II devido a

ausência da ação contraregulatória da Ang-(1-7), ou mesmo pela ausência de

uma via direta que poderia desencadear uma cascata de sinalização pela

ativação do receptor Mas.

Segundo Prasad (2004), se tomarmos os níveis de leptina plasmática

como indicador de massa do tecido adiposo, podemos explicar a contribuição

deste tecido para o aumento dos níveis de AGT. Essa relação foi confirmada

nos animais KO Mas e WT FVB/N, visto que aumento da massa adiposa está

intimamente correlacionado com o aumento nos níveis de leptina. Observamos

que no knockout os níveis de leptina corrigidos pelo peso corporal são

semelhantes ao do WT FVB/N, indicando que a produção de leptina individual de

cada adipócito está normal, justificando assim o aumento nos níveis séricos

acompanhando o aumento da massa gorda.

7- Conclusão

Resultados recentes do nosso laboratório mostram que o camundongo

Knockout Mas da linhagem FVB/N possui pressão arterial elevada, disfunção

endotelial (Todiras et. al, 2006) e microalbuminúria (Velloso et.al.,1996). Esse

quadro, associado à dislipidemia, intolerância à glicose, resistência à insulina, e

aumento da massa adiposa, observadas no presente estudo, caracteriza esse

animal como um modelo de síndrome metabólica. Nossos dados sugerem que o

eixo Angiotensina-(1-7)/Mas possui um importante papel no controle do

metabolismo glicêmico e lipídico dos camundongos da linhagem FVB/N.

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