ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS:
Fisiologia e Farmacologia
ESTUDO DA NEUROTRANSMISSÃO DO QUIMIORREFLEXO
E DO BARORREFLEXO NA ÁREA A5 DE RATOS
NÃO-ANESTESIADOS
Guilherme Medeiros dos Santos
Belo Horizonte - MG
2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
ii
Guilherme Medeiros dos Santos
ESTUDO DA NEUROTRANSMISSÃO DO QUIMIORREFLEXO
E DO BARORREFLEXO NA ÁREA A5 DE RATOS NÃO ANESTESIADOS
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas: Fisiologia e Farmacologia,
Departamento de Fisiologia e Biofísica do Instituto
de Ciências Biológicas da Universidade Federal
de Minas Gerais, como requisito parcial para a
obtenção do grau de Mestre em Ciências
Biológicas.
Orientadora: Profa. Dra. Andréa Siqueira Haibara
ads:
iii
043
Santos, Guilherme Medeiros dos.
S237e
Estudo da neurotransmissão do quimiorreflexo e do barorreflexo na área
A5 de ratos não-anestesiados [manuscrito] / Guilherme Medeiros dos Santos.
– 2007.
104 f. : il. ; 29,5 cm.
Orientadora : Andréa Siqueira Haibara.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Minas Gerais,
Departamento de Fisiologia e Biofísica.
1. Sistema nervoso central – Teses. 2. Sistema cardiovascular – Teses. 3.
Barorreflexo – Teses. 4. Sinapse – Teses. 5. Rato como animal de laboratório -
Teses. I. Haibara, Andréa Siqueira. II. Universidade Federal de Minas Gerais.
Departamento de Fisiologia e Biofísica. III. Título.
CDU: 612.8
iv
Folha de aprovação
v
Dedico esse trabalho
aos meus pais, Vagner e Tânia,
pelos maiores ensinamentos, amor,
respeito, perseverança e responsabilidade.
vi
AGRADECIMENTOS
vii
O meu mais sinceros agradecimentos:
À minha família, pais Vagner e Tânia, irmãos Leandro e Luiz Henrique pelo amor,
carinho, apoio incondicional, vocês são a razão de tudo isso.
A minha amada Fernanda pelo amor, carinho, companheirismo, incentivo e por me
fazer ainda mais feliz.
À minha orientadora Prof
a
. Dr
a
. Andréa Haibara por acreditar, confiar, conselhos e
ensinamentos que certamente levarei por toda a vida.
À Gisele Maia, irmãzinha, super paciente e confidente. Aos demais membros da
família Haibara: Tatiane Murça, Shirley, Marina, Edson, Marcos Melo.
Aos professores do Laboratório de Hipertensão Dr. Robson Augusto Souza Santos,
Dr. Marco Antônio Pelik Fontes, Dr
a
. Maria José Campagnole-Santos, e demais
professores do Departamento de Fisiologia e Biofísica pelos valorosos ensinamentos.
Aos amigos Rodrigo, Gonzaga, Daniel e Sílvia.
Aos amigos, colegas e funcionários do Laboratório de Hipertensão. Agradecimento
especial a Prof
a
. Leonor Tapias da Mata Machado pelos primeiros passos na
Fisiologia; e Sr. José Roberto por sua alegria, amizade e competência, sempre
tornando os dias de trabalho agradáveis e possíveis.
Aos demais amigos do Programa de Pós-Graduação e ICB.
Aos funcionários dessa instituição, em especial ao Sr. Darcy, maior defensor dos
alunos da UFMG e funcionário exemplar.
Aos demais familiares, especialmente, minha tia e segunda mãe, Delça (in memorian)
por todo o amor e carinho. Sua luz sempre brilhará em meu coração.
À Leila e família, que ainda está crescendo.
viii
À Rosângela e Paulo, Paulinho, Mariana e Amanda e João Carlos, pelos bons
momentos e por tão bem me receberem e acolherem.
Aos amigos de todos os momentos Alexandre, André, Natália, Franco, Bruno,
Emanuel, Carlo Rachid, Priscila, André Vaz, Gléber, Ana Luiza e Gustavo.
ix
Í N D I C E
1. RESUMO .................................................................................................................................. 11
2. ABSTRACT .............................................................................................................................. 14
3. INTRODUÇÃO ......................................................................................................................... 17
3.1. Barorreceptores arteriais e quimiorreceptores periféricos ................................................ 18
3.2. Vias neurais do barorreflexo e quimiorreflexo .................................................................. 20
3.3. Área A5 ............................................................................................................................. 22
3.4. Área A5 e reflexos cardiovasculares ................................................................................ 24
4. OBJETIVOS ............................................................................................................................. 28
4.1. Objetivo geral .................................................................................................................... 29
4.2. Objetivo específicos .......................................................................................................... 29
5. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................................... 30
5.1. Animais ............................................................................................................................. 31
5.2. Implante de cânulas-guia dirigidas para a área A5 .......................................................... 31
5.3. Técnica para microinjeção de drogas na área A5 ............................................................ 32
5.4. Canulação da artéria e veia femoral ................................................................................. 32
5.5. Registro da pressão arterial e da freqüência cardíaca ..................................................... 33
5.6. Estimulação dos quimiorreceptores periféricos ................................................................ 33
5.7. Estimulação dos barorreceptores arteriais ....................................................................... 34
5.8. Drogas utilizadas .............................................................................................................. 35
5.9. Histologia .......................................................................................................................... 35
5.10. Análise estatística dos resultados ......................................................................... 36
5.11. Protocolos experimentais ...................................................................................... 36
5.11.1. Efeitos cardiovasculares induzidos pela microinjeção bilateral do ácido
kinurênico na área A5 sobre as respostas cardiovasculares induzidas pela
estimulação do quimiorreflexo ..............................................................................
36
5.11.2. Efeitos cardiovasculares induzidos pela microinjeção unilateral do agonista
glutamatérgico metabotrópico ACPD na área A5 .................................................
37
5.11.3. Efeitos cardiovasculares induzidos pela microinjeção bilateral do MCPG na
x
área A5 sobre as respostas cardiovasculares induzidas pela estimulação do
quimiorreflexo ........................................................................................................
38
5.11.4. Efeitos cardiovasculares induzidos pela microinjeção bilateral de bicuculina na
área A5 sobre as respostas cardiovasculares induzidas pela estimulação do
quimiorreflexo ........................................................................................................
38
5.11.5. Efeitos cardiovasculares induzidos pela microinjeção bilateral de muscimol na
área A5 sobre as respostas cardiovasculares induzidas pela estimulação do
barorreflexo ...........................................................................................................
39
5.11.6. Efeitos cardiovasculares induzidos pela microinjeção bilateral de muscimol na
área A5 sobre as respostas cardiovasculares induzidas pela estimulação do
barorreflexo ...........................................................................................................
40
6. RESULTADOS ......................................................................................................................... 42
6.1. Efeitos cardiovasculares induzidos pela microinjeção bilateral do ácido kinurênico na
área A5 sobre as respostas cardiovasculares induzidas pela estimulação do
quimiorreflexo ...................................................................................................................
43
6.2. Efeitos cardiovasculares induzidos pela microinjeção unilateral do agonista
glutamatérgico metabotrópico ACPD na área A5 .............................................................
49
6.3. Efeitos cardiovasculares induzidos pela microinjeção bilateral do MCPG na área A5
sobre as respostas cardiovasculares induzidas pela estimulação do quimiorreflexo .......
55
6.4. Efeitos cardiovasculares induzidos pela microinjeção bilateral de bicuculina na área A5
sobre as respostas cardiovasculares induzidas pela estimulação do quimiorreflexo ..........
59
6.5. Efeitos cardiovasculares induzidos pela microinjeção bilateral de muscimol na área A5
sobre as respostas cardiovasculares induzidas pela estimulação do barorreflexo ............
63
6.6. Efeitos cardiovasculares induzidos pela microinjeção bilateral de muscimol na área A5
sobre as respostas cardiovasculares induzidas pela estimulação do barorreflexo ............
70
6.7. Análise histológica ............................................................................................................ 73
7. DISCUSSÃO ............................................................................................................................ 75
8. SUMÁRIO E CONCLUSÕES ................................................................................................... 85
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................................... 88
1. RESUMO
12
O sistema circulatório é essencial para a manutenção da homeostase do
organismo. A regulação neural do sistema cardiovascular envolve a ativação de
vários grupos de sensores localizados na periferia gerando informações que são
enviadas para o sistema nervoso central, e a modulação dessa informação no SNC
com conseqüente modulação do sistema nervoso autônomo. Entre os sensores
periféricos podemos destacar os barorreceptores arteriais, receptores
cardiopulmonares e os quimiorreceptores periféricos.
A área A5 é uma região localizada no tronco encefálico, mais especificamente
na ponte, constituída por um grupamento de neurônios noradrenérgicos. Estudos
neuroanatômicos identificaram conexões da área A5 com várias áreas envolvidas no
controle cardiovascular. Estudo realizado em nosso laboratório demonstrou que a
estimulação da área A5 promove resposta pressora e taquicárdica e ainda atribuiu
aos neurônios noradrenérgicos dessa área um papel essencial ao componente
pressor do quimiorreflexo em ratos não anestesiados. Estudos anteriores
demonstraram que alterações dos níveis de pressão arterial modificam a atividade
espontânea dos neurônios da área A5, modificações estas dependentes da
integridade das vias aferentes barorreceptoras. No entanto o papel da área A5 na
integração das respostas barorreflexas em ratos não anestesiado permanece por ser
melhor investigado.
Dessa forma procuramos nesse trabalho avaliar a neurotransmissão do
componente simpato-excitatório do quimiorreflexo na área A5, bem como avaliar a
participação desta área na regulação do componente cardíaco do barorreflexo, em
ratos não-anestesiados.
Em nossos resultados observamos que o antagonista glutamatérgico
ionotrópico ácido kinurênico, assim como o antagonista glutamatérgico metabotrópico
MCPG, não alteraram as respostas cardiovasculares induzidas pela estimulação do
13
quimiorreflexo. Também observamos que o bloqueio dos receptores gabaérgicos da
área A5 não resultou em alteração da pressão arterial basal, bem como não alterou a
resposta pressora do quimiorreflexo, sugerindo que a neurotransmissão da resposta
simpato-excitatória deste reflexo na área A5 não ocorre por desinibição de seus
neurônios. Outro achado do presente estudo indica que a sensibilidade da bradicardia
bem como da taquicardia barorreflexa não foram alteradas após a inibição da área
A5.
O conjunto destes resultados indica que o neurotransmissor L-glutamato, não
está envolvido na integração do componente simpato-excitatório da resposta
quimiorreflexa. Em relação ao barorreflexo concluímos que a área A5 não participa de
forma importante da modulação do controle barorreflexo da freqüência cardíaca.
14
2. ABSTRACT
15
The circulatory system is essential for the maintenance of body homeostasis.
Neural regulation of the cardiovascular system involves the activation of several
groups of peripheral sensors that generates the information to central nervous system,
with consequent modulation of the autonomic nervous system. Among the peripheral
sensors the arterial baroreceptors, the cardiopulmonary receptors and the peripheral
chemoreceptors can be highlighted.
The A5 area is a region localized in the brainstem, more precisely in the pons,
and is comprised of noradrenergic neurons. Neuroanatomy studies have identified
connections between the A5 area and several areas involved in cardiovascular
control. Previous studies conducted in our laboratory demonstrated that stimulation of
the A5 area produced large pressor response and tachycardia. Additionally, this study
demonstrated the essential role of this area in the chemoreflex pressor component in
unanesthetized rats. Other studies have demonstrated that alterations in arterial
pressure modified the spontaneous activity of the A5 area neurons, in within
modifications depends of baroreceptor afferent input integrity. However, the role of the
A5 area in the integration of baroreflex responses in unanesthetized rats still needs to
be further investigated.
Moreover, we evaluated the neurotransmission of the chemoreflex sympatho-
excitatory component within the A5 area, as well, we evaluated the participation of this
area in the cardiac baroreflex regulation, in unanesthetized rats.
In our findings, both the ionotropic glutamatergic antagonist kynurenic acid, as
well as the metabotropic glutamatergic antagonist MCPG, did not altered
cardiovascular responses induced by chemoreflex stimulation. We also demonstrated
that the blockade of gabaergic receptors of the A5 area did not result in alterations in
basal arterial pressure. Additionally, this blockade did not alter the chemoreflex
pressor response, suggesting that the sympatho-excitatory neurotransmission in the
16
A5 area does not occur through disinhibition of these neurons. Other findings from the
present study indicate that the sensitivity of baroreflex bradycardia as well as the
baroreflex tachycardia was not altered after the inhibition of the A5 area.
Together these results indicate that the L-glutamate neurotransmitter was not
involved in the integration of the sympatho-excitatory component of the chemoreflex
response. Our data also showed that the A5 area does not participate in baroreflex
control of heart rate.
17
3. INTRODUÇÃO
18
O sistema cardiovascular tem papel fundamental na manutenção da
homeostase do organismo, proporcionando uma pressão de perfusão sanguínea
adequada para todos os tecidos e órgãos do organismo. Essa função depende da
ação integrada de mecanismos de controle local, humoral e neural. A regulação
neural do sistema cardiovascular envolve a ativação de vários grupos de sensores
localizados na periferia, os quais enviam informações referentes ao nível de pressão
arterial, volume sanguíneo circulante e tensão dos gases sanguíneos arteriais para o
sistema nervoso central, resultando na modulação da atividade autonômica eferente,
do padrão respiratório e da liberação de agentes humorais para produzir respostas
fisiológicas apropriadas. Entre os sensores periféricos podemos destacar os
barorreceptores arteriais, os receptores cardiopulmonares e os quimiorreceptores
periféricos (Spyer, 1990).
3.1 Barorreceptores arteriais e quimiorreceptores periféricos
Os barorreceptores arteriais são terminações nervosas livres, densamente
ramificadas, localizadas primordialmente nas paredes do arco aórtico e dos seios
carotídeos. As terminações barorreceptoras se distribuem na camada adventícia,
próximo à borda médio-adventicial da parede vascular, onde se ancoram fortemente
aos demais constituintes do vaso, envoltas por colágeno e elastina. São,
consequentemente, parte integrante da estrutura vascular (Kirchheim, 1976).
O principal mecanismo de ativação dos barorreceptores é a deformação
mecânica das terminações neurais, decorrentes da distensão da parede vascular
determinada pela onda de pulso. Desta forma, os barorreceptores constituem-se, em
última análise, em mecanorreceptores (Kirchheim, 1976).
A função primordial dos barorreceptores é manter a pressão arterial estável,
dentro de uma faixa estreita de variação, esteja o indivíduo em repouso ou em
19
atividade. Elevações súbitas da pressão arterial aumentam a atividade dos
barorreceptores, os quais reflexamente inibem a atividade tônica simpática (Bronk e
cols., 1936; Downing e Siegel, 1963) e aumentam a atividade vagal (Katona e cols.,
1970), produzindo redução da resistência periférica total, da freqüência cardíaca e do
débito cardíaco, contribuindo assim para o retorno da pressão arterial aos níveis
normais. Dessa forma os barorreceptores são os principais responsáveis pela
regulação rápida da pressão arterial momento-a-momento.
Além dos barorreceptores arteriais, os quimiorreceptores periféricos também
participam do controle da pressão arterial (Marshall, 1994). Os quimiorreceptores
periféricos encontram-se distribuídos em corpúsculos carotídeos e aórticos,
localizados bilateralmente na bifurcação da artéria carótida comum
(quimiorreceptores carotídeos) ou em pequenos corpúsculos espalhados entre o arco
aórtico e a artéria pulmonar (quimiorreceptores aórticos) (Sapru e Krieger, 1977).
Entretanto, de acordo com Easton e Howe. (1983) os corpúsculos aórticos estão
geralmente ausentes no coelho, rato e camundongo. O corpúsculo carotídeo é
irrigado por uma pequena artéria originada da artéria carótida comum, e em conjunto
com a drenagem venosa forma um complexo vascular que ocupa aproximadamente
um terço do volume do corpúsculo. Dessa forma o corpúsculo carotídeo é irrigado
numa proporção 5 a 6 vezes maior que a vascularização do cérebro (Gonzáles e
cols., 1994).
Os corpúsculos carotídeos são formados por dois tipos celulares, as células do
tipo I ou células glomais, quimiossensíveis, em maior número, intimamente
associadas aos capilares sanguíneos, e envoltas pelas células do tipo II ou células de
sustentação (Kock, 1951). As células glomais são altamente especializadas, capazes
de detectar alterações da pressão parcial de oxigênio e pressão parcial de dióxido de
carbono e concentração de hidrogênio do sangue (Biscoe, 1971).
20
Heymans e Bouckaert (1930) mostraram, através de experimentos de
circulação cruzada, que a perfusão in situ do seio carotídeo com sangue de um
animal doador submetido à hipoventilação, promovia reflexamente no animal receptor
respostas de hiperventilação, sugerindo que a composição química do sangue
influenciava reflexamente a atividade dos centros respiratórios. Dessa forma, a
ativação dos quimiorreceptores carotídeos resulta em ajustes ventilatórios que se
caracterizam por aumento do volume de ar corrente, aumento da freqüência
respiratória e aumento do volume minuto respiratório, exercendo, portanto, um
importante papel no controle reflexo da ventilação (Daly e cols., 1965). Além de
promover respostas ventilatórias, a estimulação dos quimiorreceptores periféricos
também modifica reflexamente os valores de pressão arterial e freqüência cardíaca
(Marshall, 1994). Estudos de Bernthal (1951), Franchini e Krieger (1993) e Haibara e
cols. (1995) demonstraram que a estimulação dos quimiorreceptores periféricos
promove reflexamente, além de taquipnéia, aumento da pressão arterial e
bradicardia. Dessa forma, o papel fisiológico dos quimiorreceptores periféricos está
relacionado com a promoção de ajustes ventilatórios e cardiovasculares no intuito de
proporcionar a manutenção da composição química do sangue em níveis ideais, bem
como uma pressão de perfusão sanguínea adequada para todos os tecidos.
3.2 Vias neurais do barorreflexo e quimiorreflexo
Os impulsos gerados nos barorreceptores são conduzidos pelos nervos vago e
glossofaríngeo até ao núcleo do trato solitário (NTS) localizado no bulbo, onde
estimulam neurônios de segunda ordem que se projetam para neurônios da área
bulbar ventrolateral caudal (CVL) (Dampney, 1994; Spyer, 1994). Os neurônios da
CVL, por sua vez, inibem os neurônios da área bulbar ventrolateral rostral (RVL),
através de sinapse gabaérgica (Li, 1991; Jeske, 1995). O RVL possui um grupo de
21
neurônios ativos ou ativados tonicamente que desempenham função essencial na
geração do tônus simpático vasomotor, contribuindo dessa forma para a manutenção
da pressão arterial (Lipski e cols., 2002). Também foi demonstrado em estudos de
Stuesse e Fish (1984) que o núcleo ambíguo (NA), uma área que constitui a origem
das fibras pré-ganglionares parassimpáticas cardíacas (McAllen e Spyer, 1976;
Stuesse 1982), recebe projeções diretas do NTS. Ainda, estudos de Cheng e cols.
(2004) demonstraram que a lesão química do NA atenua a bradicardia barorreflexa.
Dessa forma a estimulação dos barorreceptores produz redução reflexa da atividade
simpática e aumento da atividade parassimpática vagal, através da ativação de
projeções do NTS para o CVL, que por sua vez inibe o RVL, bem como do NTS para
o NA, resultando em dilatação arteriolar e venosa, redução da contratilidade
miocárdica e bradicardia (Aicher e cols., 2000).
Assim como ocorre com a transmissão da informação detectada pelos
barorreceptores, os impulsos gerados pelos quimiorreceptores, percorrem os nervos
vago e glossofaríngeo em direção ao bulbo, também realizando a sua primeira
sinapse no NTS (Mifflin, 1993; Chitravanshi e Sapru, 1995). Dessa forma, o NTS pode
ser considerado como a mais importante estação sináptica do tronco cerebral que
integra informações aferentes do sistema cardiovascular, produzindo ajustes
autonômicos e ventilatórios adequados às diferentes situações fisiológicas (Spyer,
1990). Estudos neuroanatômicos (Ross e cols. 1985; Aicher e cols., 1996) e
farmacológicos (Urbanski e Sapru 1988) sugerem a existência de uma via excitatória
direta do NTS para a área bulbar ventrolateral rostral (RVL). Dessa forma, é possível
sugerir que as vias neurais relacionadas à ativação dos quimiorreceptores periféricos
envolvam a ativação de projeções do NTS tanto para o RVL quanto para o NA,
determinado aumento do tônus simpático e parassimpático, respectivamente,
resultando nas respostas pressora e bradicárdica quimiorreflexas.
22
Estudos de Sun e Spyer (1991), Koshiya e cols. (1993) e Koshiya e Guyenet
(1996) suportam a hipótese levantada anteriormente sugerindo que o RVL participa,
ao menos em parte, da resposta simpato-excitatória do quimiorreflexo. Entretanto,
estudos de Amaral (1999) e Mauad e Machado (2001), realizados em ratos não
anestesiados, mostraram que o bloqueio do RVL com ácido kinurênico ou muscimol,
não alterou a resposta pressora à ativação dos quimiorreceptores carotídeos,
sugerindo que o RVL, nesta condição experimental, não participa de forma importante
da resposta simpato-excitatória do quimiorreflexo. Esses estudos sugerem ainda que
o componente pressor da resposta quimiorreflexa seja mediado devido à estimulação
de outras áreas do SNC, à partir do NTS, que não exclusivamente o RVL. Esta
hipótese é plausível uma vez que o RVL não é a única estrutura com projeções
diretas para os neurônios pré-ganglionares simpáticos da coluna intermédio lateral
(CIML). Além do RVL, a área bulbar ventromedial rostral, o núcleo caudal da rafe, a
área A5 e o núcleo hipotalâmico paraventricular também enviam projeções para a
CIML, podendo desempenhar importante papel no controle simpático vasomotor
(Strack e cols.; 1989).
3.3 Área A5
Vários estudos demonstram a importância dos neurônios catecolaminérgicos
centrais em diferentes circuitos neuronais responsáveis pela manutenção da atividade
eferente simpática e dos níveis normais de pressão arterial (Loewy e cols. 1979;
Westlund, 1983; Minson, 1990; Guyenet, 1990; Madden e cols. 1999). Entretanto, o
papel específico de cada grupo de neurônios catecolaminérgicos na regulação
cardiovascular permanece por ser melhor investigado. Entre esses grupos de
neurônios, Dahlström e Fuxe (1964) destacam cinco deles, denominados de área A1,
área A2, área A5, área A6 e área A7.
23
A área A5 está localizada na região ventrolateral da ponte, entre o núcleo da
oliva superior e fibras do nervo facial (Dahlström e Fuxe, 1964). A maioria dos
neurônios da área A5 é constituída por células que contém a enzima dopamina β-
hidroxilase, mas não a enzima feniletanolamina-N-metil-transferase (PNMT),
caracterizando-se assim como uma área predominantemente de células
noradrenérgicas (Swanson e Hartman, 1975).
Estudos neuroanatômicos mostram que a área A5 faz conexões com diferentes
regiões do SNC sabidamente envolvidas no controle cardiovascular. A área A5
recebe aferências do núcleo hipotalâmico paraventricular, área hipotalâmica
perifornical, núcleo parabraquial, NTS, núcleos da rafe e CVL (Byrum e Guyenet,
1987). A área A5 envia projeções para o NTS, área hipotalâmica lateral, núcleo
hipotalâmico paraventricular, substância cinzenta periaquedutal e núcleo central da
amígdala (Byrum e Guyenet, 1987). A área A5 também envia densas projeções
(cerca de 90% desses neurônios) para a CIML na medula espinhal torácica e lombar
(Loewy e cols., 1979; e Westlund e cols., 1983). Essas características anatômicas
sugerem que os neurônios da área A5 desempenhem papel importante na regulação
de funções autonômicas em geral, e em particular da pressão arterial.
Estudos funcionais em ratos anestesiados mostram a participação da área A5
na modulação cardiovascular. Estudos utilizando estimulação elétrica sugerem que a
área A5 tenha papel simpato-excitatório, uma vez que a estimulação desta área
promove resposta pressora (Loewy e cols. 1979; Andrade e Aghajanian, 1982; Byrum
e cols. 1984; Woodruff e cols. 1986; Huangfu e cols. 1991; Huangfu e cols. 1992). Por
outro lado, trabalhos realizados por Neil e cols. (1982); Stanek e cols. (1984); Drye e
cols. (1990); Huangfu e cols. (1992) e Dickerson e cols. (1997) utilizando
microinjeções de aminoácidos excitatórios diretamente na área A5 sugerem um papel
simpato-inibitório dessa área. Embora a microinjeção de L-glutamato ou N-metil-
24
aspartato na área A5 de ratos anestesiados promova hipotensão, indicando que esta
área tenha função predominantemente simpato-inibitória, estudos analisando o
registro da atividade eferente simpática em diferentes leitos vasculares confrontam
essa hipótese. Nesses estudos, Stanek e cols. (1984) e Huangfu e cols. (1992)
mostraram que a estimulação da área A5 com L-glutamato em ratos anestesiados
diminuiu a atividade simpática lombar, enquanto a atividade eferente simpática renal
e esplâncnica aumentou. Diante dessas evidências é razoável sugerir que seja
possível a ativação tanto de uma via simpato-inibitória quanto de uma via simpato-
excitatória a partir da área A5, pelo menos no que diz respeito ao efeito da
estimulação da área A5 em animais anestesiados.
Um aspecto importante que merece ser enfatizado em relação aos estudos
citados acima é o fato de todos terem sido realizados em ratos anestesiados.
Diferente do observado anteriormente a microinjeção de L-glutamato na área A5 de
ratos não-anestesiados promoveu aumento da pressão arterial e taquicardia de forma
dose-dependente (Ramos, 2002). Estes resultados indicam que a área A5, quando
estimulada numa condição experimental fisiologicamente mais adequada, evitando-se
a possível interferência dos efeitos dos anestésicos no processamento das
informações no SNC, apresenta-se preferencialmente como uma área pressora,
sugerindo um importante papel desse conjunto de neurônios no controle e/ou
modulação da atividade eferente simpática.
3.4 Área A5 e reflexos cardiovasculares
Em relação à participação da área A5 nos reflexos cardiovasculares, estudos
imunohistoquimicos de Erickson e Millhorn (1994) e de Hirooka e cols. (1997)
demonstraram a expressão da proteína Fos nos neurônios noradrenérgicos da área
A5 em animais submetidos à hipóxia, sugerindo que esses neurônios são estimulados
25
durante a ativação do quimiorreflexo. Estudos eletrofisiológicos de Guyenet e cols.
(1993) mostraram ainda que a hipóxia aumenta a freqüência de disparos dos
neurônios da área A5, acompanhado ainda de aumento da pressão arterial e da
atividade do nervo frênico, o que não foi observado em animais quimiodesnervados.
Estudos funcionais de Koshiya e Guyenet (1994b) demonstraram que a microinjeção
de muscimol na A5 promoveu redução de 68% do aumento da atividade simpática
induzida pela estimulação dos quimiorreceptores periféricos. Em outro estudo de
Koshiya e Guyenet (1994a), utilizando a neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA)
microinjetada na medula espinhal (ao nível de T2) e intracisternalmente,
demonstraram que os neurônios A5 desempenham papel facilitatório no
quimiorreflexo. Ramos (2002) utilizando muscimol e lidocaína microinjetadas
bilateralmente na área A5 de ratos não anestesiados, observou atenuação
significativa (82% e 86%, respectivamente) da resposta pressora do quimiorreflexo
induzido por cianeto de potássio (KCN). Quando os neurônios noradrenérgicos dessa
área foram lesados bilateralmente com 6-OHDA a resposta pressora quimiorreflexa
foi praticamente abolida. O conjunto desses estudos sugere que os neurônios
noradrenérgicos da área A5 desempenham papel essencial na resposta simpato-
excitatória do quimiorreflexo.
Com relação à neurotransmissão das sinapses envolvidas na mediação das
informações aferentes dos quimiorreceptores periféricos na área A5, ainda não está
esclarecido qual ou quais seriam os neurotransmissores, bem como os subtipos de
receptores que participam das mesmas.
Um possível candidato a neurotransmissor da informação quimiorreflexa na
área A5 é o aminoácido excitatório L-glutamato. Guyenet e cols. (1993) mostraram
que tanto a aplicação iontoforérica de L-glutamato na área A5 quanto a estimulação
dos quimiorreceptores por hipóxia promovem aumento da freqüência de disparos dos
26
neurônios dessa região. Em estudos anteriores de nosso laboratório (Ramos, 2002)
mostramos ainda que a microinjeção de L-glutamato na área A5 de ratos não
anestesiados promove respostas simpato-excitatórias (isto é, aumento da pressão
arterial e taquicardia) de forma dose-dependente, sugerindo que a área A5 é parte
integrante da resposta pressora do quimiorreflexo. Considerando o conjunto desses
trabalhos, o primeiro objetivo deste estudo foi avaliar o papel dos receptores
glutamatérgicos da área A5 na neurotransmissão do quimiorreflexo em ratos não
anestesiados.
Já é bem estabelecido na literatura que o L-glutamato atua em diferentes tipos
de receptores de aminoácidos excitatórios, ou seja, os receptores ionotrópicos,
aqueles acoplados diretamente à canais iônicos (receptores NMDA, AMPA e kaínico)
(Watkins e cols., 1981 e Davies, 1989), e receptores metabotrópicos, aqueles
acoplados à proteína G, dependente, portanto, da ativação intracelular do sistema de
segundos mensageiros (Shoepp e cols., 1990). Desta forma, ainda em relação à
avaliação da neurotransmissão glutamatérgica, também consideramos em nosso
estudo a possibilidade do L-glutamato atuar em diferentes subtipos de receptores de
aminoácidos excitatórios (ionotrópicos e metabotrópicos) na mediação do
quimiorreflexo na área A5.
Além do L-glutamato, outras substâncias e seus receptores já foram descritos
e identificados na área A5. Estudos de Burman e cols. (2003) demonstraram que
todos os neurônios da área A5 (>98%) expressam receptores GABA. Estudos
fisiológicos e farmacológicos têm demonstrado que os receptores GABA participam
da modulação da transmissão sináptica em neurônios catecolaminérgicos (Shefner e
Osmanovic, 1991; Ruggeri e cols., 1996; Morrison e cols., 1999). Kwiat e cols. (1993)
demonstraram ainda que os neurônios noradrenérgicos da área A5, com projeções
para a CIML, recebem densas terminações gabaérgicas, e sugerem que essas
27
terminações regulam, possivelmente através de mecanismos inibitórios, a atividade
dos neurônios da área A5. Entretanto, embora o GABA tenha sido encontrado na
área A5, seu papel como neurotransmissor e/ou neuromodulador das aferências
cardiovasculares nesta região permanece por ser determinado.
O papel da área A5 na modulação dos reflexos cardiovasculares não se
restringe apenas ao quimiorreflexo. Estudos na literatura sugerem que a área A5
também participa da integração do barorreflexo. Estudos de Coote e MacLeod (1974)
demonstraram que a integridade das vias eferentes noradrenérgicas para a CIML é
necessária para a expressão efetiva do componente simpato-inibitório do
barorreflexo. Considerando que os grupos de células noradrenérgicas localizados na
ponte são as únicas fontes de terminais noradrenérgicos na medula espinhal, como
demonstrado por Westlund (1983), é razoável supor a área A5 participe das
respostas reflexas à estimulação dos barorreceptores. Neste sentido, estudos
eletrofisiológicos de Andrade e Aghajanian (1982), Guyenet (1984) e Huangfu e cols.
(1991) demonstraram que a elevação da pressão arterial promove redução da
atividade dos neurônios da área A5, enquanto que a diminuição da pressão arterial
aumenta atividade desses neurônios. Guyenet (1984) demonstrou ainda que as
alterações dos disparos dos neurônios da área A5 não ocorrem em animais com
desnervação dos barorreceptores. Esse conjunto de resultados sugere que os
neurônios da área A5 participem da via neural do barorreflexo. Entretanto a
participação efetiva da área A5, bem como os neurotransmissores envolvidos na
modulação das respostas barorreflexas permanece por ser melhor caracterizado.
28
4. OBJETIVOS
29
4.1 Objetivo geral:
O objetivo principal deste estudo foi avaliar a neurotransmissão do componente
simpato-excitatório do quimiorreflexo na área A5, bem como avaliar a participação
desta área na regulação do componente cardíaco do barorreflexo, em ratos não-
anestesiados.
4.2 Objetivos específicos:
• Avaliar o efeito do bloqueio dos receptores de aminoácidos excitatórios
ionotrópicos da área A5 sobre as respostas cardiovasculares induzidas pela
estimulação do quimiorreflexo.
• Avaliar o efeito do bloqueio dos receptores de aminoácidos excitatórios
metabotrópicos da área A5 sobre as respostas cardiovasculares induzidas
pela estimulação do quimiorreflexo.
• Avaliar o efeito do bloqueio dos receptores gabaérgicos da área A5 sobre as
respostas cardiovasculares induzidas pela estimulação do quimiorreflexo.
• Avaliar o efeito do bloqueio da atividade dos neurônios da área A5 sobre as
respostas cardiovasculares induzidas pela estimulação do barorreflexo.
30
5. MATERIAL E MÉTODOS
31
5.1 Animais
Neste trabalho foram utilizados ratos Wistar, com peso entre 260 a 300
gramas, fornecidos pelo Centro de Bioterismo (CEBIO) do Instituto de Ciências
Biológicas da UFMG. Os animais foram mantidos em ambiente adequado com
temperatura e luminosidade controladas, alimentados com ração e água à vontade.
5.2 Implante de cânulas-guia dirigidas para a área A5
Através de um aparelho estereotáxico para animais de pequeno porte
(Stoelting Co.) cânulas-guia foram implantadas em direção a região da área A5. As
cânulas-guia (15mm) foram confeccionadas à partir de agulhas hipodérmicas de aço
inoxidável (25 x 7mm), e fixadas no suporte da torre do aparelho estereotáxico. O
animal foi anestesiado com tribromoetanol (250mg/Kg - Aldrich Chemical Company,
Inc.), submetido à tricotomia da região dorsal da cabeça, posicionado no aparelho
estereotáxico e por meio de duas barras auriculares a cabeça foi colocada em
posição fixa. Após a assepsia da pele com solução de álcool iodado, o anestésico
local xilocaína contendo vasoconstritor foi injetado subcutaneamente na região do
escalpo a ser aberta, a fim de se evitar sangramento. A seguir, foi realizada uma
incisão longitudinal na pele e tecido subcutâneo expondo-se a região da calota
craniana. A torre do estereotáxico foi colocada em posição vertical (angulação zero) e
a cabeça do animal ajustada até que os pontos bregma e lâmbda da calota craniana
ficassem nivelados. A partir do bregma foram realizadas as leituras dos parâmetros
ântero-posterior, latero-lateral e dorso-ventral. O ponto de introdução das cânulas-
guia direcionadas para a área A5, foram determinados à partir das coordenadas
estereotáxicas obtidas com o atlas de Paxinos e Watson (1986). As coordenadas
estereotáxicas utilizadas neste trabalho foram: ântero-posterior = -9,8mm; latero-
lateral = -2,2mm; dorso-ventral = -6,5mm. Determinado o ponto de introdução das
32
cânulas-guia, foi realizada a trepanação da calota craniana com o auxílio de uma
broca odontológica esférica acoplada a um motor de baixa rotação. Por esse orifício
foram introduzidas as cânulas, sendo que as extremidades inferiores destas ficaram
3,6mm acima da área A5. As cânulas-guia foram então fixadas ao crânio do animal
através de resina acrílica de uso odontológico e de pequenos parafusos de aço inox,
colocados na calota craniana previamente às leituras das coordenadas
estereotáxicas. Após a completa fixação das cânulas-guia, a torre do estereotáxico foi
removida e com o objetivo de se evitar a obstrução das cânulas foi introduzido nas
mesmas um mandril de aço inoxidável (15mm). Como medida profilática, após a
cirurgia estereotáxica todos os animais receberam 0,2ml de pentabiótico veterinário
por via intramuscular. Esses animais foram mantidos em caixas coletivas, em salas
com temperatura e luminosidade controladas por um período de 3 a 4 dias.
5.3 Técnica para microinjeção de drogas na área A5
As drogas utilizadas foram dissolvidas em solução salina fisiológica (NaCl
0,9%) e quando necessário o pH foi ajustado com bicarbonato de sódio (pH 7.0 –
7.4). As drogas foram manualmente injetadas na área A5 utilizando-se uma seringa
de 5µl Hamilton (Hamilton, Reno, NV), conectada por meio de um tubo de polietileno
PE-10 à uma agulha injetora (33 gauge). A fim de que as microinjeções atingissem
diretamente a área A5 o comprimento da agulha injetora foi 3,6mm mais longo que a
cânula-guia. O volume microinjetado na área A5 foi sempre de 100nl e a duração da
microinjeção de aproximadamente 5 segundos.
5.4 Canulação da artéria e veia femoral
Um dia antes dos experimentos foi realizada a canulação da artéria e veia
femoral. As cânulas utilizadas foram confeccionadas à partir de um tubo de polietileno
PE-10 (4cm para a artéria e 2cm para veia) soldado a outro tubo de polietileno PE-50
33
com o comprimento ajustado de acordo com o tamanho do animal (15 a 17cm). Antes
de serem implantadas, as cânulas foram preenchidas com solução fisiológica e
obstruídas na extremidade livre do PE-50 com pinos de metal. Nos animais sob
anestesia pelo tribromoetanol (250mg/Kg), as cânulas foram introduzidas na aorta
abdominal, através da artéria femoral, e na veia femoral. Nos protocolos de
estimulação do barorreflexo através de infusão de drogas vasoativas, foram
introduzidas cânulas nas duas veias femorais. Uma vez implantadas, com auxílio de
um trocarte, as cânulas foram dirigidas subcutaneamente para a cintura escapular,
onde foram exteriorizadas e fixadas com linha de sutura. A cânula arterial foi utilizada
para registro direto da pressão arterial e da freqüência cardíaca e a cânula venosa
para administração sistêmica de drogas.
5.5 Registro da pressão arterial e da freqüência cardíaca
Os registros da pressão arterial e da freqüência cardíaca foram realizados no
dia seguinte ao da canulação, em animais não-anestesiados e com livre
movimentação. A cânula arterial, previamente heparinizada (1:20), foi conectada a um
transdutor de pressão o qual foi acoplado a um sistema de aquisição de dados
analógico-digital (Biopac Systems, Inc.). Foi utilizado o programa de computador
Acqknowledge (Biopac Systems, Inc.), após prévia calibração do equipamento, para o
registro da pressão arterial pulsátil (PAP), pressão arterial média (PAM) e freqüência
cardíaca (FC). PAM e a FC foram calculadas pelo programa de computador a partir
dos valores de PAP.
5.6 Estimulação dos quimiorreceptores periféricos
Para a estimulação dos quimiorreceptores periféricos foi utilizada solução de
cianeto de potássio (KCN 40µg/0,1ml/rato), a qual foi injetada através da cânula
34
venosa previamente implantada. O cianeto é descrito na literatura como um potente
estímulo para os quimiorreceptores periféricos (Biscoe e Duchen, 1990; Gonzáles e
cols., 1994; Franchini e Krieger, 1993), atuando por inibição da enzima citocromo-
oxidase, a qual está envolvida na cadeia respiratória, impedindo a redução do
oxigênio, e portanto a sua utilização pela célula. Como conseqüência ocorre um
déficit energético celular associado à indisponibilidade de oxigênio, promovendo uma
hipóxia citotóxica, a qual é detectada pelas células quimiossensíveis do corpúsculo
carotídeo, ativando o quimiorreflexo. As respostas cardiovasculares e respiratórias
observadas são dependentes da ativação das células do corpúsculo carotídeo uma
vez que a ligadura da artéria que irriga o corpúsculo carotídeo abole essas respostas
(Franchini e Krieger, 1993; Haibara e cols., 1995).
5.7 Estimulação dos barorreceptores arteriais
Para a estimulação dos barorreceptores arteriais foram realizadas injeções em
bôlus (0,1ml) ou infusões (1,2ml/min, durante 15 segundos) intravenosas (i.v.) de
soluções de fenilefrina (5µg/ml) e nitroprussiato de sódio (NPS, 10µg/ml) através de
seringa 1ml conectada ao cateter venoso. A fenilefrina é um agonista α
1
-adrenérgico,
o qual promove vasoconstricção periférica, elevação da pressão arterial, estimulação
dos barorreceptores e conseqüente bradicardia barorreflexa. Entretanto o NPS é uma
droga capaz de elevar os níveis de óxido nítrico resultando assim em vasodilatação
periférica, redução da pressão arterial, desativação dos barorreceptores e
conseqüente taquicardia barorreflexa. A sensibilidade do barorreflexo foi avaliada
pela razão entre as alterações reflexas de FC, convertidas em intervalo de pulso (IP =
60.000/FC), induzidas por alterações transitórias da PAM (∆IP/∆PAM, ms/mmHg),
denominado índice de sensibilidade barorreflexa (Campagnole-Santos e cols., 1988).
35
5.8 Drogas utilizadas
Microinjetadas na área A5
• (+/-)-ácido-1-aminociclopentano-trans-1,3-dicarboxílico, ACPD (agonista
glutamatérgico metabotrópico - Tocris, Ballwin, MO);
•
Ácido kinurênico, KIN (antagonista glutamatérgico ionotrópico - Sigma Chemical, St. Louis,
MO);
•
α-metil-4-carboxifenilglicina, MCPG (antagonista glutamatérgico metabotrópico - Sigma
Chemical, St. Louis, MO);
•
Bicuculina, BIC (antagonista de receptores gabaérgicos - Sigma Chemical, St. Louis, MO);
•
L-glutamato, L-Glu (aminoácido excitatório - Sigma Chemical, St. Louis, MO);
•
Lidocaína, (anestésico local, Hipolabor Farmacêutica, Sabará, MG);
•
Muscimol, MUS (agonista de receptores GABA-A - Sigma Chemical, St. Louis, MO).
Estimulação dos reflexos cardiovasculares
• Cianeto de potássio, KCN (inibidor da citocromo oxidase - Sigma, St. Louis, MO);
•
Fenilefrina, Fenil (agonista
α
1
-adrenérgico - Sigma Chemical, St. Louis, MO);
•
Nitroprussiato de sódio, NPS (doador de óxido nítrico - Sigma Chemical, St. Louis, MO).
5.9 Histologia
Ao final dos experimentos foram realizadas microinjeções do corante Alcian
Blue (100nl) na área A5, a fim de se determinar os sítios específicos das
microinjeções. A seguir, os animais foram anestesiados (Tiopental, 40mg/Kg, i.p.) e
submetidos à abertura da região toráxica para exposição do coração, através do qual
foi feita a perfusão com solução de formol 10%. Para facilitar a perfusão cerebral, a
aorta descendente foi bloqueada com pinça hemostática e a cava superior
seccionada. O cérebro foi removido e mantido em solução de sacarose (20%) por 48
horas. Após esse período, secções transversais do tronco cerebral foram feitas em
36
micrótomo de congelamento em fatias de 50µm de espessura. Os cortes foram
corados pelo vermelho neutro 1% utilizando-se a técnica de Nissl, e analisados por
microscopia óptica. Somente os animais com confirmação histológica dos sítios de
microinjeção na área A5 foram considerados neste estudo.
5.10 Análise estatística dos resultados
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (x±epm).
Na análise estatística dos resultados dentro de cada grupo experimental foi aplicado o
teste-t pareado ou test-t não pareado. Para a comparação entre grupos foi utilizada a
análise de variância (ANOVA), seguido pelo teste de Newman-Keuls. As alterações
foram consideradas estatisticamente significativas com p<0,05.
5.11 Protocolos Experimentais
5.11.1 Efeito da microinjeção bilateral do ácido kinurênico na área A5 sobre as
respostas cardiovasculares induzidas pela estimulação do quimiorreflexo.
Como o objetivo de avaliar a participação dos receptores glutamatérgicos
ionotrópicos da área A5 na integração das respostas cardiovasculares induzidas pelo
quimiorreflexo, o antagonista ácido kinurênico (KIN; 2,5nmol/100nl) foi microinjetado
bilateralmente nessa região, e o quimiorreflexo estimulado antes e após esta
microinjeção. Para isso, foram utilizados animais previamente submetidos ao implante
bilateral de cânulas-guia em direção à área A5 e implante de cânulas na artéria e veia
femorais. No dia do experimento, após um período de adaptação do animal frente às
novas condições ambientais, o quimiorreflexo foi testado através de injeção
intravenosa de KCN (40µg/0,1ml). Após o retorno da pressão arterial e da freqüência
cardíaca aos valores basais, o ácido kinurênico (2,5nmol/100nl) foi microinjetado
37
bilateralmente na área A5. Dez, trinta e sessenta minutos após a microinjeção na
área A5, o quimiorreflexo foi novamente estimulado com KCN, e essas respostas
foram comparadas com a primeira (antes da microinjeção na área A5). O registro dos
parâmetros cardiovasculares foi realizado por aproximadamente 60 minutos após a
microinjeção do ácido kinurênico, tempo necessário para se verificar a completa
reversão dos efeitos deste antagonista (Colombari e cols., 1994). Com o objetivo de
verificar a eficácia do KIN, na dose utilizada, no bloqueio dos receptores
glutamatérgicos, em alguns animais o L-glutamato também foi microinjetado na área
A5 antes e 10 minutos após o antagonista KIN.
5.11.2
Efeitos cardiovasculares induzidos pela microinjeção unilateral do agonista
glutamatérgico metabotrópico ACPD na área A5.
Com o objetivo de avaliar as respostas cardiovasculares induzidas pela
ativação dos receptores glutamatérgicos metabotrópicos da área A5, o agonista
ACPD foi microinjetado nessa região. Para isso foram utilizados animais previamente
submetidos ao implante de cânulas-guia em direção à área A5 e implante de cânula
na artéria femoral. No dia do experimento, após um período de adaptação do animal
frente às novas condições ambientais, foi microinjetado o veículo salina (NaCl
0,9%/100nl), L-glutamato (2,5nmol/100nl) e o agonista glutamatérgico metabotrópico
ACPD (0,5, 1,0 e 2,5nmol/100nl) unilateralmente na área A5, e as alterações dos
parâmetros cardiovasculares foram registrados.
Com o intuito de observar a especificidade das alterações cardiovasculares
promovidas pela microinjeção do agonista glutamatérgico metabotrópico, a
microinjeção deste agonista foi avaliada antes e dez minutos após a microinjeção
38
ipsilateral do antagonista glutamatérgico metabotrópico MCPG (2,5nmol/100nl) na
área A5.
5.11.3
Efeito da microinjeção bilateral do MCPG na área A5 sobre as respostas
cardiovasculares induzidas pela estimulação do quimiorreflexo.
Com o objetivo avaliar a participação dos receptores glutamatérgicos
metabotrópicos da área A5 na integração das respostas cardiovasculares produzidas
pela estimulação do quimiorreflexo, o antagonista glutamatérgico metabotrópico
MCPG (2,5nmol/100nl) foi microinjetado bilateralmente nessa região, e o
quimiorreflexo foi estimulado antes e após essa microinjeção. Para isso os animais
foram previamente submetidos ao implante bilateral de cânulas-guia direcionadas à
área A5 e implantes de cânulas na artéria e veia femorais. No dia do experimento,
após um período de adaptação do animal frente às novas condições ambientais, o
quimiorreflexo foi testado através de injeção intravenosa de KCN (40µg/0,1ml). Após
o retorno da pressão arterial e da freqüência cardíaca aos valores basais, o MCPG
(2,5nmol/100nl) foi microinjetado bilateralmente na área A5. Dez, vinte e cinco,
quarenta e sessenta minutos após a microinjeção na área A5, o quimiorreflexo foi
novamente estimulado com KCN, e essas respostas foram comparadas com a
primeira (antes da microinjeção na área A5). O registro dos parâmetros
cardiovasculares foi realizado por aproximadamente 60 minutos após a microinjeção
do MCPG, tempo necessário para se verificar a completa reversão dos efeitos deste
antagonista (Haibara e cols., 1999).
5.11.4
Efeito da microinjeção bilateral de bicuculina na área A5 sobre as respostas
cardiovasculares induzidas pela estimulação do quimiorreflexo.
Como o objetivo de avaliar a participação dos receptores gabaérgicos da área
A5 na integração das respostas cardiovasculares induzidas pelo quimiorreflexo, o
39
antagonista gabaérgico bicuculina (10pmol/100nl) foi microinjetado bilateralmente
nessa região, e o quimiorreflexo estimulado antes e após esta microinjeção. Para isso
foram utilizados animais previamente submetidos ao implante bilateral de cânulas-
guia em direção à área A5 e implante de cânulas na artéria e veia femorais. No dia do
experimento, após um período de adaptação do animal frente às novas condições
ambientais, o quimiorreflexo foi testado através de injeção intravenosa de KCN
(40µg/0,1ml). Após o retorno da pressão arterial e da freqüência cardíaca aos valores
basais, a bicuculina (10nmol/100nl) foi microinjetada bilateralmente na área A5. Dez,
vinte e cinco, quarenta e sessenta minutos após a microinjeção na área A5, o
quimiorreflexo foi novamente estimulado com KCN, e as respostas foram comparadas
com a primeira (antes da microinjeção na área A5). O registro dos parâmetros
cardiovasculares foi realizado por aproximadamente 60 minutos após a microinjeção
da bicuculina, tempo necessário para se verificar a completa reversão dos efeitos
deste antagonista.
5.11.5
Efeito da microinjeção bilateral de muscimol na área A5 sobre as respostas
cardiovasculares induzidas pela estimulação do barorreflexo.
Como o objetivo de avaliar a participação dos neurônios da área A5 na
integração das respostas cardíacas induzidas pelo barorreflexo, o agonista
gabaérgico muscimol, nas doses de 250pmol/100nl e 1,0nmol/100nl, foi microinjetado
bilateralmente nessa região, e o barorreflexo estimulado (por fenilefrina e
nitroprussiato de sódio) antes e após esta microinjeção. Para isso foram utilizados
animais previamente submetidos ao implante bilateral de cânulas-guia em direção à
área A5 e implante de cânulas na artéria e veias femorais. No dia do experimento,
após um período de adaptação do animal frente às novas condições ambientais, o
40
barorreflexo foi testado por injeção em bôlus (0,1ml) ou infusão (1,2ml/min, durante
15 segundos) intravenosa de fenilefrina (Fenil, 5µg/ml) e nitroprussiato de sódio
(NPS, 10µg/ml). Após o retorno da pressão arterial e freqüência cardíaca aos valores
basais, o muscimol (250 pmol e 1,0nmol/100nl) foi microinjetado bilateralmente na
área A5. Dez e vinte e cinco minutos após a microinjeção do agonista na área A5, o
barorreflexo foi novamente estimulado com fenilefrina e NPS, e essas respostas
foram comparadas com as primeiras (antes da microinjeção na área A5). O registro
dos parâmetros cardiovasculares foi realizado por aproximadamente 30 minutos após
a microinjeção do muscimol, tempo necessário para se verificar a completa reversão
dos efeitos deste agonista (Ramos, 2002).
5.11.6
Efeito da microinjeção bilateral de lidocaína na área A5 sobre as respostas
cardiovasculares induzidas pela estimulação do barorreflexo.
Como o objetivo de avaliar a participação da área A5 na integração das
respostas cardíacas induzidas pelo barorreflexo, o anestésico local lidocaína
(2%/100nl) foi microinjetado bilateralmente nessa região. Para isso foram utilizados
animais previamente submetidos ao implante bilateral de cânulas-guia em direção à
área A5 e implante de cânulas na artéria e veias femorais. No dia do experimento,
após um período de adaptação do animal frente às novas condições ambientais, o
barorreflexo foi testado por injeção intravenosa em bôlus de fenilefrina (Fenil;
5µg/0,1ml) e nitroprussiato de sódio (NPS; 10µg/0,1ml). Após o retorno da pressão
arterial e freqüência cardíaca aos valores basais, a lidocaína foi microinjetada
bilateralmente na área A5. Dois, cinco, dez, vinte e trinta minutos após a microinjeção
do anestésico na área A5, o barorreflexo foi novamente estimulado com fenilefrina e
NPS, e essas respostas foram comparadas com a primeira (antes da microinjeção na
41
área A5). O registro dos parâmetros cardiovasculares foi realizado por
aproximadamente 30 minutos após a microinjeção da lidocaína, tempo necessário
para se verificar a completa reversão dos efeitos deste anestésico (Haibara e cols,
2002).
42
6. RESULTADOS
43
6.1 Efeito da microinjeção bilateral do ácido kinurênico na área A5 sobre as
respostas cardiovasculares induzidas pela estimulação do quimiorreflexo.
Com o objetivo de avaliar a participação dos receptores glutamatérgicos
ionotrópicos da área A5 na integração das respostas cardiovasculares induzidas pelo
quimiorreflexo, o antagonista ácido kinurênico (KIN; 2,5nmol/100nl) foi microinjetado
bilateralmente nessa região, e o quimiorreflexo estimulado (KCN 40µg/0,1ml) antes e
após esta microinjeção.
A figura 01 corresponde a um traçado representativo de um animal do grupo
estudado, mostrando as alterações da pressão arterial pulsátil (PAP, mmHg), pressão
arterial média (PAM, mmHg) e freqüência cardíaca (FC, bpm) em resposta a
estimulação do quimiorreflexo antes e após a microinjeção bilateral do ácido
kinurênico na área A5. Podemos observar que, como descrito em estudos anteriores
(Franchini e Krieger, 1993), a estimulação dos quimiorreceptores periféricos com KCN
promoveu resposta pressora e bradicárdica. Dez, trinta e sessenta minutos após a
microinjeção do ácido kinurênico na área A5 a magnitude dessas respostas
cardiovasculares não foi diferente do período controle.
A figura 02 representa os dados obtidos nesse grupo, mostrando que a
microinjeção bilateral na área A5 do antagonista glutamatérgico ionotrópico ácido
kinurênico, não promoveu alterações significativas sobre a resposta pressora (+45±4
vs. +41±3; +45±5; +44±5 mmHg) e bradicárdica (-212±21 vs. -202±23; -216±19; -
240±13 bpm) do quimiorreflexo (tabela 01).
A dose utilizada do ácido kinurênico (2,5 nmol/100nl) foi eficaz em bloquear os
receptores glutamatérgicos, uma vez que a resposta pressora (+22±3 mmHg) e a
taquicardia (+25±14 bpm) induzida pela microinjeção ipsilateral do agonista L-
glutamato na área A5 foram reduzidas em aproximadamente 70 e 80%,
44
respectivamente, após a microinjeção do ácido kinurênico (+6±2 mmHg, +3±6 bpm)
(figura 03, tabela 02).
Em relação aos parâmetros cardiovasculares basais (figura 04), a microinjeção
bilateral de ácido kinurênico não alterou significativamente os valores da pressão
arterial média (113±3 vs. 115±3 mmHg), bem como os valores de freqüência cardíaca
(394±18 vs. 411±20 bpm), quando comparados com o período controle, anterior à
microinjeção (tabela 03).
45
Ap
ós KIN
(
2
,
5nmol/100nl
)
KCN
KCN KCN
KCN
30`
Controle 10`
60`
2
00
PAP
(mmHg)
1
50
1
00
2
00
PAM
(mmHg)
150
100
4
00
FC
300
(bpm)
2
00
30 seg
Figura 01 - Traçado de um rato, representativo do grupo estudado, mostrando as alterações na
pressão arterial pulsátil (PAP, mmHg), pressão arterial média (PAM, mmHg) e freqüência cardíaca (FC,
bpm) em resposta à estimulação do quimiorreflexo com KCN (40µg/0,1ml, i.v.), antes (controle) e após
(10, 30 e 60 minutos) à microinjeção bilateral de ácido kinurênico (KIN 2,5nmol/100nl) na área A5.
46
controle 10 min 30 min 60min
0
10
20
30
40
50
antes KIN
após KIN
∆
PAM (mmHg)
-300
-200
-100
0
∆
FC (bpm)
Figura 02 - Alterações na pressão arterial média (∆ PAM, mmHg) e freqüência cardíaca (∆ FC, bpm),
produzidas pela injeção i.v. de KCN (40 µg/0,1ml) antes (controle) e após (10, 30 e 60 minutos) à
microinjeção bilateral de ácido kinurênico (KIN 2,5 nmol/100 nl) na área A5 de ratos não anestesiados
(n=13).
47
controle 10min 30min 60min
0
10
20
30
*
*
antes KIN
após KIN
*
∆
PAM (mmHg)
-15
0
15
30
45
60min10mincontrole 30min
∆
FC (bpm)
Figura 03 - Alterações na pressão arterial média (∆ PAM, mmHg) e freqüência cardíaca (∆ FC, bpm),
produzidas pela microinjeção de L-glutamato (2,5nmol/100nl) antes (controle) e após (10, 30 e 60
minutos) à microinjeção de ácido kinurênico (KIN, 2,5nmol/100nl) na área A5 de ratos não
anestesiados (n=07). (*) Diferença significativa em relação ao período controle (Teste-t pareado;
p<0,05).
48
0
25
50
75
100
125
antes KIN
após KIN
PAM (mmHg)
0
100
200
300
400
500
FC (bpm)
Figura 04 - Valores basais de pressão arterial média (PAM, mmHg) e freqüência cardíaca (FC, bpm),
antes e após microinjeção bilateral de ácido kinurênico (KIN, 2,5nmol/100nl) na área A5 de ratos não
anestesiados (n=13).
49
6.2 Efeitos cardiovasculares induzidos pela microinjeção unilateral do agonista
glutamatérgico metabotrópico ACPD na área A5.
Com o objetivo de avaliar as respostas cardiovasculares induzidas pela
ativação dos receptores glutamatérgicos metabotrópicos da área A5, o agonista
ACPD foi microinjetado nessa região.
A figura 05 corresponde a um traçado representativo de um dos animais dos
grupos estudados mostrando as alterações cardiovasculares induzidas pela
microinjeção unilateral na área A5 do veículo salina (NaCl; 0,9%/100nl), L-glutamato
(2,5nmol/100nl) e ACPD em duas doses (0,5 e 1,0nmol/100nl). A figura 06
corresponde a outro traçado representativo de outro animal dos grupos estudados
mostrando as alterações cardiovasculares promovidas pela microinjeção do agonista
ACPD na dose de 2,5nmol/100nl, antes e após a microinjeção ipsilateral do
antagonista glutamatérgico metabotrópico MCPG (2,5nmol/100nl) na área A5.
Os dados referentes a estes grupos estão agrupados nas figuras 07 e 08. A
figura 07 mostra que a microinjeção unilateral do agonista glutamatérgico
metabotrópico ACPD, na dose de 2,5nmol/100nl, promoveu respostas pressora (+6±1
vs. +16±3 mmHg) e taquicárdica (+7±2 vs. +58±15 bpm) significativas quando
comparadas às alterações promovidas pela microinjeção do veículo salina (controle)
(tabela 04). Ao passo que o agonista ACPD quando microinjetado nas doses 0,5 e
1,0nmol/100nl não promoveu alterações significativas dos parâmetros
cardiovasculares de pressão arterial (+6±1 vs. +7±1 e 6±1 mmHg) e freqüência
cardíaca (+7±2 vs. +15±6 e +9±4 bpm) quando comparadas ao controle (veículo
salina) (tabela 04). O L-glutamato foi utilizado como índice funcional de estimulação
dos neurônios da área A5. Como esperado, a microinjeção de L-glutamato promoveu
50
aumento da pressão arterial (+16±3 mmHg) e taquicardia (+24±7 bpm) em relação ao
grupo salina (tabela 04).
A figura 08 mostra que a microinjeção ipsilateral do antagonista glutamatérgico
metabotrópico MCPG (2,5nmol/100nl) na área A5 promoveu redução significativa da
resposta pressora (+16±3 vs. +7±0,4 mmHg) e taquicárdica (+58±15 vs. +31±13 bpm)
induzida pela microinjeção unilateral do agonista ACPD (2,5nmol/100nl) (tabela 05).
51
Figura 05 - Traçado de um rato, representativo do grupo estudado, mostrando as alterações na
pressão arterial pulsátil (PAP, mmHg), pressão arterial média (PAM, mmHg) e freqüência cardíaca (FC,
bpm) em resposta à microinjeção unilateral na área A5 de salina (NaCl 0,9%/100nl), L-glutamato (L-
Glu, 2,5nmnol/100nl) e ACPD (0,5 e 1,0nmol/100nl).
salina
150
100
50
150
100
50
400
300
200
FC
(bpm)
PAM
(mmHg)
PAP
(mmHg)
ACPD
(1.0nmol/100nl)
L-Glu
A
CPD
(0.5nmol/100nl)
(2.5nmol/100nl)
1min
52
ACPD
A
CPD
Antes MCPG
Após MCPG
150
PAP
100
(mmHg)
50
150
PAM
100
(mmHg)
50
400
FC
300
(bpm)
200
1min
Figura 06 - Traçado de um rato, representativo do grupo estudado, mostrando as alterações na
pressão arterial pulsátil (PAP, mmHg), pressão arterial média (PAM, mmHg) e freqüência cardíaca (FC,
bpm) em resposta à microinjeção unilateral na área A5 de ACPD (2,5nmol/100nl), antes e após a
microinjeção ipsilateral do antagonista MCPG (2,5nmol/100nl).
53
0
5
10
15
20
*
*
salina
L-Glu 2.5nmol/100nl
ACPD 0.5nmol/100nl
ACPD 1.0nmol/100nl
ACPD 2.5nmol/100nl
∆
PAM (mmHg)
0
25
50
75
*
∆
FC (bpm)
Figura 07 - Alterações na pressão arterial média (∆ PAM, mmHg) e freqüência cardíaca (∆ FC, bpm)
induzidas pela microinjeção unilateral de salina (NaCl 0,9%/100nl), L-glutamato (L-Glu, 2,5nmol/100nl)
e ACPD (0,5; 1,0 e 2,5nmol/100nl) (n=04). (*) Diferença significativa em relação ao grupo salina (Teste-
t não pareado, p<0,05).
54
0
5
10
15
20
salina
ACPD 2.5nmol/100nl
ACPD 2.5nmol/100nl após MCPG
*
#
∆
PAM (mmHg)
0
25
50
75
*
#
∆
FC (bpm)
Figura 08 - Alterações na pressão arterial média (∆ PAM, mmHg) e freqüência cardíaca (∆ FC, bpm)
induzidas pela microinjeção unilateral de salina (NaCl 0,9%/100nl; n=04), e ACPD (2,5nmol/100nl;
n=04) antes e após a microinjeção ipsilateral do antagonista glutamatérgico metabotrópico MCPG
(2,5nmol/100nl; n=04). (*) Diferença significativa em relação ao grupo salina (Teste-t não pareado,
p<0,05). (
#
) Diferença significativa em relação ao período antes do MCPG (Teste-t pareado, p<0,05).
55
6.3 Efeito da microinjeção bilateral do MCPG na área A5 sobre as respostas
cardiovasculares induzidas pela estimulação do quimiorreflexo.
Com o objetivo avaliar a participação dos receptores glutamatérgicos
metabotrópicos da área A5 na integração das respostas cardiovasculares produzidas
pela estimulação do quimiorreflexo, o antagonista glutamatérgico metabotrópico
MCPG (2,5nmol/100nl) foi microinjetado bilateralmente nessa região, e o
quimiorreflexo estimulado (KCN 40µg/0,1ml) antes e após esta microinjeção.
A figura 09 corresponde a um traçado representativo de um animal do grupo
estudado mostrando as respostas cardiovasculares induzidas pela estimulação do
quimiorreflexo antes e após a microinjeção bilateral do antagonista MCPG na área
A5. Podemos observar que a estimulação dos quimiorreceptores periféricos com KCN
promoveu resposta pressora e bradicárdica. A microinjeção de MCPG não modificou
as respostas cardiovasculares do quimiorreflexo.
A figura 10 representa os dados obtidos nesse grupo, mostrando que a
microinjeção bilateral na área A5 do antagonista glutamatérgico metabotrópico
MCPG, não promoveu alterações significativas sobre a resposta pressora (+42±4 vs.
+38±4; +45±5; +44±6; +38±3 mmHg) e bradicárdica (-199±11 vs. -245±16; -238±7; -
226±15; -240±11 bpm) do quimiorreflexo (tabela 06).
Em relação aos parâmetros cardiovasculares basais (figura 11), a microinjeção
bilateral de MCPG não alterou significativamente os valores da pressão arterial média
(120±3 vs. 122±3 mmHg), bem como não alterou os valores de freqüência cardíaca
(364±5 vs. 379±13 bpm), quando comparados com o período controle, anterior à
microinjeção do antagonista (tabela 07).
56
Ap
ós MCPG
(
2
,
5nmol/100nl
)
KCN KCN KCN KCN KCN
controle 10` 25` 40` 60`
200
150
PAP
(mmHg)
100
5
0
2
00
150
PAM
(mmHg)
100
50
400
30
0
FC
(
b
p
m
)
200
100
30 seg
Figura 09 - Traçado de um rato, representativo do grupo estudado, mostrando as alterações na
pressão arterial pulsátil (PAP, mmHg), pressão arterial média (PAM, mmHg) e freqüência cardíaca (FC,
bpm) em resposta à estimulação do quimiorreflexo com KCN (40µg/0,1ml, i.v.), antes (controle) e após
(10, 25, 40 e 60 minutos) à microinjeção bilateral do MCPG (2,5nmol/100nl) na área A5.
57
controle 10min 25min 40min 60min
0
10
20
30
40
50
antes MCPG
após MCPG
∆
PAM (mmHg)
-300
-200
-100
0
∆
FC (bpm)
Figura 10 - Alterações na pressão arterial média (∆ PAM, mmHg) e freqüência cardíaca (∆ FC, bpm),
produzidas pela injeção i.v. de KCN (40µg/0,1ml) antes (controle) e após (10, 25, 40 e 60 minutos) à
microinjeção bilateral do MCPG (2,5nmol/100nl) na área A5 de ratos não anestesiados (n=07).
58
0
50
100
150
antes MCPG
após MCPG
PAM (mmHg)
0
100
200
300
400
FC (bpm)
Figura 11 -
Valores basais de pressão arterial média (PAM, mmHg) e freqüência cardíaca (FC, bpm),
antes e após microinjeção bilateral de MCPG (2,5nmol/100nl) na área A5 de ratos não anestesiados
(n=07).
59
6.4 Efeito da microinjeção bilateral de bicuculina na área A5 sobre as respostas
cardiovasculares induzidas pela estimulação do quimiorreflexo.
Com o objetivo de avaliar a participação dos receptores gabaérgicos da área
A5 na integração das respostas cardiovasculares induzidas pelo quimiorreflexo, o
antagonista gabaérgico bicuculina (10pmol/100nl) foi microinjetado bilateralmente
nessa região, e o quimiorreflexo estimulado (KCN 40µg/0,1ml) antes e após esta
microinjeção.
A figura 12 corresponde a um traçado representativo de um animal do grupo
estudado, mostrando a resposta quimiorreflexa antes (controle) e após (10, 25 e 40
minutos) da microinjeção bilateral do antagonista bicuculina na área A5. A
microinjeção de bicuculina não promoveu alterações das respostas pressora e
bradicárdica do quimiorreflexo.
A figura 13 representa o conjunto desses resultados, e mostra que não houve
alterações significativas entre a magnitude da resposta pressora do quimiorreflexo
observada no período controle (+38±5 mmHg) e as obtidas nos tempos dez minutos
(+43±5 mmHg), vinte e cinco minutos (+39±4 mmHg), quarenta minutos (+38±5
mmHg) e sessenta minutos (+36±4 mmHg), após a microinjeção de bicuculina (tabela
08). Da mesma forma, a resposta bradicárdica do quimiorreflexo (-203±35 bpm) não
foi alterada pela bicuculina em nenhum dos tempos analisados (-184±32; -207±29; -
220±32 e -220±25 bpm, respectivamente) (tabela 07).
Em relação aos parâmetros cardiovasculares basais (figura 14), a microinjeção
bilateral de bicuculina não alterou significativamente os valores de pressão arterial
média (113±4 vs. 116±4 mmHg), bem como não alterou os valores de freqüência
cardíaca (357±12 vs. 361±12 bpm), quando comparados com o período controle
(tabela 09).
60
Ap
ós bicuculina
(
10
p
mol
/
100nl
)
KCN
KCN KCN
KCN
40’
controle 25’
10’
200
150
PAP
(mmHg)
100
150
PAM
(mmHg)
100
50
400
FC
(bpm)
300
200
30 seg
Figura 12 -
Traçado de um rato, representativo do grupo estudado, mostrando as alterações na
pressão arterial pulsátil (PAP, mmHg), pressão arterial média (PAM, mmHg) e freqüência cardíaca (FC,
bpm) em resposta à estimulação do quimiorreflexo com KCN (40µg/0,1ml, i.v.), antes (controle) e após
(10, 25 e 40 minutos) da microinjeção bilateral de bicuculina (10pmol/100nl) na área A5.
61
controle 10min 25min 40min 60min
0
10
20
30
40
50
antes BIC
após BIC
∆
PAM (mmHg
)
-300
-200
-100
0
∆
FC (bpm)
Figura 13 - Alterações na pressão arterial média (∆ PAM, mmHg) e freqüência cardíaca (∆ FC, bpm),
produzidas pela injeção i.v. de KCN (40µg/0,1ml) antes (controle) e após (10, 25, 40 e 60 minutos) da
microinjeção de bicuculina (BIC, 10pmol/100nl) na área A5 de ratos não anestesiados (n=08).
62
0
25
50
75
100
125
antes BIC
após BIC
PAM (mmHg)
0
100
200
300
400
FC (bpm)
Figura 14 - Valores de pressão arterial média (PAM, mmHg) e freqüência cardíaca (FC, bpm) basais,
antes e após microinjeção bilateral de bicuculina (BIC, 10pmol/100nl) na área A5 de ratos não
anestesiados (n=08).
63
6.5 Efeito da microinjeção bilateral de muscimol na área A5 sobre as respostas
cardiovasculares induzidas pela estimulação do barorreflexo.
Com o objetivo de avaliar a participação dos neurônios da área A5 na
integração das respostas cardíacas induzidas pelo barorreflexo, o agonista
gabaérgico muscimol, nas doses de 250pmol/100nl e 1,0nmol/100nl, foi microinjetado
bilateralmente nessa região, e o barorreflexo estimulado (por fenilefrina e
nitroprussiato de sódio) antes e após esta microinjeção.
As figuras 15 e 16 correspondem a traçados representativos de dois animais
dos grupos estudos, mostrando as respostas barorreflexas antes (controle) e nos
períodos de tempo dez e vinte e cinco minutos após a microinjeção bilateral do
muscimol na área A5 de ratos não anestesiados. A figura 15 corresponde ao traçado
de um animal que recebeu microinjeção bilateral de muscimol na dose de
250pmol/100nl, e submetido ao estímulo do barorreflexo por infusão de fenilefrina e
NPS. A figura 16 corresponde ao traçado de outro animal que recebeu microinjeção
bilateral de muscimol na dose de 1,0nmol/100nl, e submetido ao estímulo do
barorreflexo por injeção em bôlus de fenilefrina e NPS.
As figuras 17 e 18 mostram o conjunto dos dados obtidos nesses grupos
experimentais, onde observamos que a microinjeção bilateral do muscimol, nas duas
doses utilizadas, não promoveu alterações significativas na sensibilidade da
bradicardia e taquicardia barorreflexas em nenhum dos tempos analisados (tabelas
10, 11 e 12).
Em relação aos parâmetros cardiovasculares basais (figura 19), a microinjeção
bilateral de muscimol (250pmol/100nl ou 1,0nmol/100nl) também não alterou
significativamente os valores da pressão arterial média (113±4 vs. 112±4 mmHg;
108±6 vs. 113±4 mmHg, respectivamente), bem como não alterou os valores de
64
freqüência cardíaca (348±11 vs. 366±18 bpm; 374±08 vs. 379±23 bpm,
respectivamente), quando comparados com o período controle (antes da
microinjeção) (tabelas 13 e 14).
65
Após muscimol (250pmol/100nl)
Fenilefrina Fenilefrina Fenilefrina
A
controle 10min 25min
150
PAP
(mmHg)
100
50
150
PAM
(mmHg)
100
50
500
FC
(bpm)
400
300
B
NPS NPS NPS
controle 10min 25min
Figura 15 - Traçado de um rato, representativo do grupo estudado, mostrando as alterações na
pressão arterial pulsátil (PAP, mmHg), pressão arterial média (PAM, mmHg) e freqüência cardíaca (FC,
bpm) em resposta à estimulação do barorreflexo com infusão (1,2ml/min/15seg, i.v.) de fenilefrina
(5µg/ml – painel A) e nitroprussiato de sódio (NPS, 10µg/ml – painel B), antes (controle) e após (10 e
25 minutos) da microinjeção bilateral de muscimol (250pmol/100nl) na área A5.
150
PAP
(mmHg)
100
50
150
PAM
(mmHg)
100
50
500
FC
(bpm)
400
300
30 seg
66
Após muscimol (1nmol/100nl)
A
Fenilefrina
Fenilefrina
Fenilefrina
25’
10’
controle
150
PAP
(mmHg)
100
50
150
PAM
(mmHg)
100
50
500
FC
400
(bpm)
300
B
NPS NPS NPS
controle 10’ 25’
150
PAP
100
(mmHg)
50
150
PAM
100
(mmHg)
50
500
FC
400
(bpm)
300
1min
Figura 16 -
Traçado de um rato, representativo de dos grupos estudados, mostrando as alterações na
pressão arterial pulsátil (PAP, mmHg), pressão arterial média (PAM, mmHg) e freqüência cardíaca (FC,
bpm) em resposta à estimulação do barorreflexo com injeções em bôlus de fenilefrina (Fenil; 5µg/ml,
i.v. – painel A) e nitroprussiato de sódio (NPS; 10µg/ml, i.v. – painel B), antes (controle) e após (10 e
25 minutos) da microinjeção bilateral de muscimol (1,0nmol/100nl) na área A5.
67
A
10
20
30
40
50
-5
5
15
25
35
45
55
antes
após
∆ PAM (mmHg)
∆
IP (ms)
Controle 10min
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
antes MUS
após MUS
∆
IP/
∆
PAM
(ms/mmHg)
B
-30 -25 -20 -15 -10 -5
-40
-30
-20
-10
0
antes
após
∆ PAM (mmHg)
∆
IP (ms)
Controle 10min
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
antes MUS
após MUS
∆
IP/
∆
PAM
(ms/mmHg)
Figura 17 - Alterações da freqüência cardíaca, expressas em intervalo de pulso (∆ IP, ms), em
resposta as alterações de pressão arterial média (∆ PAM. mmHg) induzidas pela infusão de fenilefrina
(painel A) e NPS (painel B) (5µg/ml e 10µg/ml, respectivamente, a 1,2ml/min/15seg), antes e dez
minutos após a microinjeção bilateral de muscimol (MUS, 250pmol/100nl) na área A5 de ratos não
anestesiados (n=06). As linhas inclinadas representam as retas de melhor ajuste calculadas por
regressão linear. Os gráficos representam a sensibilidade do barorreflexo (∆ IP/∆ PAM, mmHg).
68
Bradicardia barorreflexa
controle 10min 25min
0.0
0.5
1.0
1.5
antes MUS
após MUS
∆
IP/
∆
PAM
(ms/mmHg)
Taquicardia barorreflexa
controle 10min 25min
0
1
2
3
antes MUS
após MUS
∆
IP /
∆
PAM
(ms/mmHg)
Figura 18 -
Alterações na bradicardia e taquicardia barorreflexa (∆IP/∆PAM) induzidas por injeção i.v.
de fenilefrina (0,5µg/0,1ml) e NPS (1,0µg/0,1ml) respectivamente, antes (controle) e após (10 e 25
minutos) a microinjeção bilateral de muscimol (MUS, 1,0nmol/100nl) na área A5 de ratos não
anestesiados (n=06).
69
A
0
25
50
75
100
125
PAM (mmHg)
0
100
200
300
400
500
antes MUS
após MUS
FC (bpm)
B
0
25
50
75
100
125
PAM (mmHg)
0
100
200
300
400
500
antes MUS
após MUS
FC (bpm)
Figura 19 - Valores de pressão arterial média (PAM, mmHg) e freqüência cardíaca (FC, bpm) basais,
antes e após microinjeção bilateral de muscimol (painel A, 250pmol/100nl, n=06) e (painel B,
1,0nmol/100nl, n=06) na área A5 de ratos não anestesiados.
70
6.6 Efeito da microinjeção bilateral de lidocaína na área A5 sobre as respostas
cardiovasculares induzidas pela estimulação do barorreflexo.
Os estudos anteriores da literatura que sugerem que a área A5 pode participar
da via neural do barorreflexo (Andrade e Aghajanian, 1982; Guyenet, 1984; Huangfu
e cols., 1991), entretanto em nossos estudos a microinjeção de muscimol, o qual
promove hiperpolarização neuronal, não modificou de forma significativa a
sensibilidade do barorreflexo. Com o objetivo de avaliar, ou descartar, a participação
da área A5 na integração do barorreflexo, o anestésico local Lidocaína (2%/100nl) foi
microinjetado bilateralmente nessa região, com o objetivo de promover um bloqueio
reversível da atividade dessa região.
A figura 20 mostra o conjunto dos dados desse grupo experimental, onde
podemos observar que a microinjeção bilateral do anestésico lidocaína (2%/100nl),
não promoveu alterações significativas na sensibilidade da bradicardia ou da
taquicardia barorreflexa em nenhum dos tempos analisados (tabela 15).
Em relação aos efeitos da Lidocaína sobre os parâmetros cardiovasculares
basais, podemos observar na figura 21 que a microinjeção bilateral do anestésico na
área A5, não alterou significativamente os valores basais de pressão arterial média
(112±6 vs. 112±3) e freqüência cardíaca (396±33 vs. 395±4) (tabela 16).
71
Bradicardia barorreflexa
controle 2min 5min 10min 20min 30min
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
antes lidocaína
após lidocaína
∆
IP/
∆
PAM
(ms/mmHg)
Taquicardia barorreflexa
controle 2min 5min 10min 20min 30min
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
∆
IP/
∆
PAM
(ms/mmHg)
Figura 20 -
Alterações na bradicardia e taquicardia barorreflexa (∆IP/∆PAM) induzidas por injeção i.v.
de fenilefrina (0,5µg/0,1ml) e NPS (1,0µg/0,1ml) respectivamente, antes (controle) e após (02, 05, 10,
20 e 30 minutos) a microinjeção bilateral de lidocaína (2%/100nl) na área A5 de ratos não anestesiados
(n=03).
72
0
25
50
75
100
125
antes lidocaína
após lidocaína
PAM (mmHg)
0
100
200
300
400
500
FC (bpm)
Figura 21 -
Valores de pressão arterial média (PAM, mmHg) e freqüência cardíaca (FC, bpm) basais,
antes e após microinjeção bilateral lidocaína (2%/100nl; n=03) na área A5 de ratos não anestesiados.
73
6.7 Análise Histológica
A figura apresentada a seguir (figura 22) corresponde à fotomicrografia de uma
secção transversal do tronco cerebral de um animal representativo do grupo
estudado, mostrando a localização da microinjeção do corante Alcian Blue. O painel A
da figura 22 mostra um sítio típico de microinjeção na área A5, localizado 426µm
anterior ao óbex. Podemos observar que a área A5 localiza-se na ponte ventrolateral,
logo abaixo do nervo facial. O painel B da figura 22 corresponde à representação
esquemática de um corte transversal do tronco cerebral de rato correspondente ao
sítio de microinjeção na área A5 da fotomicrografia.
74
A
B
Figura 22 - Painel A, fotomicrografia de uma secção transversal do tronco cerebral de um animal
representativo do grupo estudado, mostrando o sítio típico de microinjeção na área A5.
Painel B,
representação esquemática de um corte transversal do tronco cerebral de rato correspondente ao sítio
de microinjeção na área A5 da fotomicrografia acima. 7n, Nervo facial; A5, área A5. (modificado de
Paxinos e Watson, 1986)
75
7. DISCUSSÃO
76
Este estudo demonstrou que os receptores de aminoácidos excitatórios não
participam da neurotransmissão da resposta pressora do quimiorreflexo na área A5, e
ainda que a desinibição desta área não modifica esta resposta. Os resultados obtidos
nesse estudo também indicam que a área A5 não participa de forma importante da
modulação das respostas cardíacas reflexas à estimulação dos barorreceptores.
A participação da área A5 na regulação das repostas reflexas a estimulação
dos quimiorreceptores periféricos já é bem estabelecida na literatura. A estimulação
dos quimiorreceptores carotídeos através da inalação de N
2
aumenta
significativamente a atividade espontânea dos neurônios da área A5, além de
promover aumento da descarga do nervo frênico e aumento moderado da pressão
arterial (Guyenet e cols, 1993). Koshiya e Guyenet (1994) observaram que a
microinjeção de muscimol, um agonista gabaérgico, na área A5 de ratos
anestesiados, promoveu redução da resposta simpato-excitatória do quimiorreflexo.
Outros estudos, realizados em animais não-anestesiados, demonstraram ainda que a
integridade dos neurônios noradrenérgicos da área A5 é essencial para a expressão
da resposta pressora do quimiorreflexo (Ramos, 2002). Apesar das evidências
relacionando a área A5 com o quimiorreflexo, a neurotransmissão da informação
aferente dos quimiorreceptores na área A5 ainda não foi suficiente explorada.
A participação do aminoácido excitatório L-glutamato na regulação da atividade
dos neurônios da área A5 no controle cardiovascular tem sido sugerida
principalmente baseado no fato de que a microinjeção de aminoácidos excitatórios
nesta região promove respostas cardiovasculares, as quais são abolidas quando da
microinjeção prévia dos seus antagonistas seletivos (Close e cols., 1982; Drye e cols,
1990). Particularmente em relação ao quimiorreflexo foi observado que tanto a
estimulação dos quimiorreceptores quanto a microinjeção de L-glutamato na área A5
promovem respostas semelhantes, isto é aumentam a atividade dos neurônios dessa
77
região, bem como a atividade do nervo frênico (Guyenet e cols., 1993). Ainda, em
animais não-anestesiados, a microinjeção de L-glutamato na área A5 promove
respostas cardiovasculares simpato-excitatórias (aumento da pressão arterial e
taquicardia), sendo a área A5 uma região essencial para a expressão da resposta
pressora do quimiorreflexo (Ramos, 2002). Mais recentemente, Rosin e cols. (2006)
observaram a presença de terminais glutamatérgicos na área A5 provenientes do
núcleo retrotrapezóide, o qual é estimulado quando da ativação dos
quimiorreceptores carotídeos (Takakura e cols., 2006). Considerando este conjunto
de evidências é razoável supor que o L-glutamato participe da neurotransmissão do
quimiorreflexo na área A5.
Considerando que o L-glutamato atua em diferentes subtipos de receptores,
ionotrópicos e metabotrópicos (Cunningham e cols 1994), avaliamos ainda a
contribuição desses receptores na neurotransmissão do quimiorreflexo através dos
seus antagonistas seletivos.
Nossos resultados mostraram que o bloqueio dos receptores glutamatérgicos
ionotrópicos da área A5 com o antagonista ácido kinurênico não promoveu alteração
significativa das respostas cardiovasculares do quimiorreflexo. Este antagonista, na
dose utilizada, foi eficaz em bloquear os receptores glutamatérgicos, uma vez que as
respostas cardiovasculares induzidas pelo L-glutamato, na presença do ácido
kinurênico, foram significativamente atenuadas. Estudos realizados por Guyenet e
cols. (1993) em animais anestesiados demonstraram que o ácido kinurênico também
não foi capaz de atenuar o aumento da freqüência de disparos dos neurônios da área
A5 induzido pela estimulação do quimiorreceptores. Esses resultados indicam que os
receptores ionotrópicos da área A5 não participam da neurotransmissão das
respostas cardiovasculares do quimiorreflexo.
78
Antes de investigarmos o papel dos receptores metabotrópicos da área A5 na
regulação do quimiorreflexo, inicialmente avaliamos se esses receptores
desempenham papel relevante no controle cardiovascular. Com o intuito de investigar
os efeitos cardiovasculares à estimulação dos receptores glutamatérgicos
metabotrópicos dos neurônios da área A5, três doses do agonista metabotrópico
ACPD foram eleitas para os protocolos de microinjeção. Duas dessas (0,5 e
1,0nmol/100nl) são comumente utilizadas em estudos na literatura que realizam
estimulações de áreas envolvidas no controle cardiovascular (Braga e cols, 2006).
Como não foram observadas alterações dos parâmetros cardiovasculares com essas
doses, optamos em um outro grupo experimental utilizar uma dose com maior
concentração do agonista (2,5nmol/100nl). Nesse protocolo observamos que o ACPD
na área A5 promove, de forma semelhante ao L-glutamato, respostas pressora e
taquicárdica, as quais foram atenuadas na presença do antagonista glutamatérgico
metabotrópico MCPG (2,5nmol/100nl). Entretanto esta mesma dose do MCPG
quando microinjetada bilateralmente não foi capaz de modificar as respostas
cardiovasculares do quimiorreflexo. Esses resultados sugerem que os neurônios da
área A5 possuem receptores glutamatérgicos metabotrópicos que participam da
regulação cardiovascular, mas não da neurotransmissão do quimiorreflexo.
Diante dos resultados apresentados, sugerimos que o L-glutamato não é o
neurotransmissor responsável pela estimulação dos neurônios da área A5 durante a
transmissão da resposta simpato-excitatória do quimiorreflexo em ratos não
anestesiados.
Outros neurotransmissores já foram identificados na área A5, e podem estar
envolvidos na transmissão do componente simpato-excitatório da resposta
quimiorreflexa. Yao e cols. (2000) identificaram através de imunohistoquimica a
presença de receptores purinérgicos do tipo P2x nos neurônios noradrenérgicos da
79
área A5. Os receptores P2x são receptores de membrana ligados a canais iônicos,
ativados pela molécula de ATP, conferindo assim a propriedade de neurotransmissor
de ação rápida à molécula de ATP extracelular (Burnstock, 2006). Esses receptores
são encontrados em vários locais do SNC, dentre esses, áreas relacionadas com
controle motor, processos sensoriais e áreas relacionadas com a regulação
cardiovascular (Yao e cols., 2000; Burnstock, 2006). Alguns estudos indicam ainda
que o ATP, via seus receptores P2, estejam envolvidos no processamento das
respostas autonômicas do quimiorreflexo. Estudos de Zhang e Nurse (2004) e
Gourine e cols. (2005) demonstraram que o ATP participa da transdução da
quimiorrecepção central na RVL. No NTS também foi demonstrado que o
antagonismo dos receptores P2 bloqueou seletivamente os impulsos excitatórios do
quimiorreceptores periféricos (Paton e cols., 2002). De forma interessante, estudos
recentes de Braga e cols. (2007) mostraram que o bloqueio isolado dos receptores
purinérgicos ou glutamatérgicos do NTS não foram capazes de reduzir a resposta
simpato-excitatória do quimiorreflexo, o que só foi observado após o bloqueio
simultâneo desses receptores. De acordo com os estudos de Gu e Macdeermott
(1997), os receptores P2x estão localizados pré-sinapticamente em terminais de
neurônios excitatórios e podem facilitar a liberação do L-glutamato, sendo o ATP,
neste caso, um co-transmissor da liberação do L-glutamato. Desta forma,
considerando a existência de terminais glutamatérgicos e de receptores purinérgicos
P2x na área A5, e ainda que o bloqueio isolado dos receptores glutamatérgicos nesta
região não modificou as respostas cardiovasculares do quimiorreflexo, é possível que
o L-glutamato e o ATP também possam atuar como co-transmissores da informação
aferente dos quimiorreceptores na área A5. Entretanto até o momento nenhum
estudo mostrando que os receptores P2x da área A5 participam, de alguma forma, da
regulação cardiovascular foram ainda realizados.
80
Ainda em relação aos possíveis candidatos a neurotransmissores na área A5,
Allen e cols. (1991) em experimentos de autoradiografia in vitro de tecidos cerebrais
humanos, identificaram quantidades razoáveis do peptídeo angiotensina II ligados
aos seus receptores nos neurônios da área A5. Experimentos com a administração,
no quarto ventrículo cerebral, de angiotensina II demonstraram aumento da atividade
neuronal dos neurônios da área A5 através do aumento da expressão da proteína
Fos (Hirooka e cols., 1996). Estudos funcionais de Maiorov e cols. (1999)
demonstraram que a microinjeção bilateral de angiotensina II na área A5 de coelhos
não anestesiados produz aumento da descarga simpática para o nervo renal de forma
dose dependente. Entretanto se a angiotensina II participa da mediação da resposta
pressora do quimiorreflexo na área A5 isto ainda não é possível de ser definido.
Outra possibilidade a ser explorada em relação à neurotransmissão do
quimiorreflexo na área A5 refere-se ao papel dos receptores α
2
-adrenérgicos. A
clonidina é um agonista α
2
-adrenérgico, com efeitos anti-hipertensivos de ação
mediada centralmente (Kobinger, 1978). Em particular, tem sido mostrado que um
dos principais sítios da ação hipotensora da clonidina é a RVL (Bousquet e
Guertzenstein, 1973). Entretanto, a clonidina também afeta neurônios de outras
regiões do tronco cerebral. Hauesler (1974) demonstrou previamente que embora o
efeito hipotensor da clonidina não seja abolido pela destruição das vias
noradrenérgicas centrais, sua potência é reduzida em três vezes, sugerindo que esta
redução da potência hipotensora da clonidina é devido à perda do efeito inibitório pré-
sináptico da droga sobre os neurônios noradrenérgicos centrais. Huangfu e cols.
(1991) demonstraram que a clonidina é capaz de inibir os neurônios
catecolaminérgicos da área A5, sendo que 95% dos neurônios catecolaminérgicos da
área A5 possuem receptores α
2
-adrenérgicos (Guyenet e cols., 1994). A clonidina,
além do efeito inibitório sobre a atividade dos neurônios da área A5, também potencia
81
o efeito inibitório do barorreflexo sobre a atividade elétrica desses neurônios
(Guyenet, 1984). Além disso, estudos em andamento em nosso laboratório mostram
que a microinjeção de clonidina na área A5 abole a resposta pressora do
quimiorreflexo. Entretanto, apesar desse estudo demonstrar que a ativação dos
receptores α
2
-adrenérgicos da área A5 tem efeitos inibitórios importantes na
modulação da resposta simpato-excitatória do quimiorreflexo, não podemos afirmar
ainda que exista uma via tônica catecolaminérgica sobre os neurônios da área A5 e
que a diminuição da atividade desta via possa participar da ativação da área A5
produzindo o componente simpato-excitatório da resposta quimiorreflexa.
Desta forma, estudos adicionais são ainda necessários para identificar o
neurotransmissor envolvido na transmissão do componente simpato-excitatório da
resposta quimiorreflexa.
Estudos eletrofisiológicos demonstraram que os neurônios da área A5
possuem atividade espontânea, sendo que essa autoatividade pode ser silenciada
pela elevação da pressão arterial (Andrade e Aghajanian, 1982; Guyenet, 1984;
Byrum e cols., 1984; Huangfu e cols., 1991), sugerindo assim que esses neurônios
recebem sinapses inibitórias envolvidas na modulação da pressão arterial. Huangfu e
cols. (1991) relataram que a freqüência de disparos dos neurônios da área A5 se
correlaciona com as descargas elétricas do nervo simpático esplâncnico, e sugeriram
ainda que essa propriedade é semelhante aos neurônios excitatórios da RVL que se
projetam para os neurônios pré-ganglionares simpáticos na CIML. Estes neurônios da
RVL estão em constante modulação inibitória por sinapses vindas dos neurônios da
CVL (Li, 1991; Jeske, 1995). Em relação à área A5, Kwiat e cols. (1993) também
identificaram sinapses gabaérgicas nos neurônios noradrenérgicos dessa área e
ainda sugeriram que esses possam estar em constante inibição. Anteriormente já
havíamos observado que a ativação dos receptores GABA da área A5 com muscimol
82
abole a resposta pressora do quimiorreflexo (Ramos, 2002). Desta forma podemos
sugerir que a retirada dessa inibição possa ser o mecanismo pelo qual a ativação do
quimiorreflexo resulte na ativação da área A5 produzindo o componente simpato-
excitatório da resposta quimiorreflexa. Para investigar esta possibilidade avaliamos o
efeito da microinjeção do antagonista GABA-A, bicuculina, sobre as respostas
cardiovasculares do quimiorreflexo.
Em nossos resultados observamos que o bloqueio dos receptores gabaérgicos
da área A5 não resultou em alteração da pressão arterial basal, bem como não
alterou a resposta pressora do quimiorreflexo, sugerindo que a neurotransmissão da
resposta simpato-excitatória deste reflexo na área A5 não ocorre por desinibição de
seus neurônios.
Achados eletrofisiológicos de Guyenet (1984) e Huangfu e cols. (1991),
sugerem que os neurônios noradrenérgicos da área A5 possuem baixa atividade
espontânea. Huangfu e Guyenet (1997b) atribuem a baixa atividade espontânea dos
neurônios noradrenérgicos da área A5 a propriedades intrínsecas das células do que
influências sinápticas. Huangfu e Guyenet em outro trabalho (1997a) relataram que a
presença de receptores α
2
-adrenérgicos inibitórios nos neurônios da área A5
sugerem que essas células autoregulam a própria atividade ou são alvo de neurônios
noradrenérgicos de outras áreas do SNC que modulam a atividade elétrica desses
neurônios. As influências das sinapses gabaérgicas na área A5, portanto, podem
estar envolvidas na modulação de outras funções fisiológicas, como o controle
ventilatório ou com a nocicepção.
Além do quimiorreflexo, estudos anteriores têm sugerido que a área A5
também possa participar da regulação do barorreflexo. Estudos eletrofisiológicos
correlacionaram a atividade espontânea dos neurônios da área A5 com alterações na
pressão arterial, induzidas por administração i.v. de fármacos com vasopressina,
83
angiontensina II (Guyenet, 1984), fenilefrina (Huangfu e cols., 1991), noradrenalina
(NA), ou nitroprussiato de sódio (NPS) (Andrade e Aghajanian, 1982; Guyenet, 1984;
Guyenet e Byrum, 1985). Estes estudos observaram que elevações dos níveis
pressóricos se correlacionam com a diminuição da atividade espontânea dos
neurônios da área A5, enquanto que a redução da pressão arterial resulta em efeito
oposto. Achados do aumento da expressão da proteína Fos na área A5 resultante da
hipotensão obtida com infusão contínua de NPS (Li e Dampney, 1994; Polson e cols.,
2002), ou modelos de hemorragia (Chan e Sawchenko, 1994) corroboram com as
observações anteriores. Guyenet (1984) demonstrou ainda, em animais submetidos à
desnervação sino-aórtica, que as alterações na atividade dos neurônios da área A5
resultantes das alterações na pressão arterial dependem da integridade das vias
aferentes barorreceptoras. Uma vez que a ativação dos barorreceptores resulta em
redução da atividade eferente simpática e da pressão arterial, podemos sugerir que a
inibição dos neurônios da área A5 resultante da ativação dos barorreceptores
contribua para a geração da resposta simpato-inibitória do barorreflexo.
Demonstramos no presente estudo que a inibição dos neurônios da área A5
com o agonista gabaérgico muscimol, bem como a inibição da região que
compreende a área A5 com o anestésico local lidocaína, não alterou a bradicardia ou
mesmo a taquicardia barorreflexa. Diferente do observado em nosso estudo, Maiorov
e cols. (2000) realizando estudos em coelhos não anestesiados, demonstrou que a
inibição da área A5 com o agonista gabaérgico resulta em aumento do ganho
barorreflexo. É importante destacar que neste estudo de Maiorov e cols. (2000) a
análise do barorreflexo foi feita analisando-se as alterações na atividade simpática do
nervo renal. Essa diferença metodológica pode ter contribuído para a divergência de
respostas encontradas. Em acordo com nossos resultados, estudo de Madden e Sved
(2003) demonstrou que a destruição de aproximadamente 75% dos neurônios
84
noradrenérgicos da área A5, através da neurotoxina 6-hidroxidopamina, não alterou a
sensibilidade da bradicardia ou taquicardia barorreflexa. Esses resultados nos
indicam que a área A5 não é parte integrante ou não possui papel importante na
modulação do controle barorreflexo da freqüência cardíaca.
Nossos resultados mostraram ainda que o bloqueio bilateral desta área com
lidocaína ou muscimol não promoveu qualquer alteração significativa sobre os níveis
basais da pressão arterial e da freqüência cardíaca. Esses dados são confirmados
pelos estudos de Koshiya e Guyenet (1994) e Schreihofer e Guyenet (2000), os quais
também observaram que os neurônios da área A5 não contribuem para a
manutenção da atividade simpática basal.
85
8. SUMÁRIO E CONCLUSÕES
86
• A inibição dos receptores glutamatérgicos, ionotrópicos com ácido kinurênico ou
metabotrópicos com MCPG, não promoveu alterações das respostas pressora e
bradicardica do quimiorreflexo, bem como não alterou os parâmetros
cardiovasculares basais. Sugerindo assim que os receptores glutamatérgicos não
estão envolvidos na neurotransmissão da resposta simpato-excitatória do
quimiorreflexo na área A5; assim como esses receptores não estão envolvidos na
modulação da pressão arterial e freqüência cardíaca basais em ratos não
anestesiados.
• A inibição dos receptores gabaérgicos do tipo A nos neurônios da área A5 com
bicuculina, não alterou a respostas pressora e bradicárdica do quimiorreflexo bem
como não modificou os valores basais de pressão arterial e freqüência cardíaca.
Esses dados sugerem que a desinibição da área A5 não parece ser componente
integrante da neurotransmissão da resposta simpato-excitatória do quimiorreflexo
em ratos não anestesiados.
• A inibição dos neurônios da área A5 com o agonista gabaérgico muscimol ou com
o anestésico local lidocaína, não alterou a sensibilidade da bradicardia ou mesmo
da taquicardia barorreflexa, sugerindo assim que a área A5 não é parte integrante
ou não participa de forma importante para a modulação das respostas cardíacas
barorreflexas em ratos não anestesiados.
O conjunto desses resultados nos permite concluir que, em ratos não
anestesiados, a neurotransmissão da resposta pressora do quimiorreflexo na área A5
não ocorre através de sinapses glutamatérgicas, ou mesmo por desinibição desta
área. Os resultados obtidos nesse estudo indicam ainda que a área A5 não participa
87
de forma importante da modulação das respostas cardíacas reflexas à estimulação
dos barorreceptores.
88
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
89
Aicher SA, Milner TA, Pickel VM, e Reis DJ. Anatomical substrates for baroreflex
sympathoinhibition in the rat. Brain Research Bulletin 51: 107-110, 2000.
Aicher SA, Saravay RH, Cravo S, Jeske I, Morrison SF, Reis DJ, e Milner TA.
Monosynaptic projections from the nucleus tractus solitarii to C1 adrenergic
neurons in the rostral ventrolateral medulla: comparison with input from the
caudal ventrolateral medulla. The Journal of Comparative Neurology 373: 62-
75, 1996.
Allen AM, Paxinos G, McKinley MJ, Chai SY, e Mendelsohn FA. Localization and
characterization of angiotensin II receptor binding sites in the human basal
ganglia, thalamus, midbrain pons, and cerebellum. The Journal of Comparative
Neurology 312: 291-298, 1991.
Amaral FT. Estudo da neurotransmissão da área bulbar ventral e da substância
cinzenta periaquedutal dorsolateral sobre o componente simpato-excitatório do
quimiorreflexo em ratos não anestesiados. In: Centro Biomédico. Vitória:
Universidade Federal do Espírito Santo, 1999, p.135,
Andrade R, e Aghajanian GK. Single cell activity in the noradrenergic A-5 region:
responses to drugs and peripheral manipulations of blood pressure. Brain
Research 242: 125-135, 1982.
Bernthal T, e Woodcock CC, Jr. Responses of the vasomotor center to hypoxia after
denervation of carotid and aortic bodies. American Journal of Physiology 166:
45-54, 1951.
90
Biscoe TJ. Carotid body: structure and function. Physiology Reviews 51: 437-495,
1971.
Biscoe TJ, e Duchen MR. Responses of type I cells dissociated from the rabbit
carotid body to hypoxia. Journal of Physiology 428: 39-59, 1990.
Bousquet P, e Guertzenstein PG. Localization of the central cardiovascular action of
clonidine. British Journal of Pharmacology 49: 573-579, 1973.
Braga VA, e Machado BH. Chemoreflex sympathoexcitation was not altered by the
antagonism of glutamate receptors in the commissural nucleus tractus solitarii
in the working heart-brainstem preparation of rats. Experimental Physiology 91:
551-559, 2006.
Braga VA, Soriano RN, Braccialli AL, de Paula PM, Bonagamba LG, Paton JF, e
Machado BH. Involvement of L-glutamate and ATP in the neurotransmission of
the sympathoexcitatory component of the chemoreflex in the commissural
nucleus tractus solitarii of awake rats and in the working heart-brainstem
preparation. Journal of Physiology 581: 1129-1145, 2007.
Bronk DW, Ferguson LK, Magaria R, e Solandt DT. The activity of the cardiac
sympathetic centers. American Journal of Physiology 117: 237-249, 1936.
91
Burman KJ, Ige AO, White JH, Marshall FH, Pangalos MN, Emson PC, Minson
JB, e Llewellyn-Smith IJ. GABAB receptor subunits, R1 and R2, in brainstem
catecholamine and serotonin neurons. Brain Research 970: 35-46, 2003.
Burnstock G. Historical review: ATP as a neurotransmitter. Trends in
Pharmacological Sciences 27: 166-176, 2006.
Byrum CE, e Guyenet PG. Afferent and efferent connections of the A5 noradrenergic
cell group in the rat. The Journal of Comparative Neurology 261: 529-542,
1987.
Byrum CE, Stornetta R, e Guyenet PG. Electrophysiological properties of spinally-
projecting A5 noradrenergic neurons. Brain Research 303: 15-29, 1984.
Campagnole-Santos MJ, Diz DI, e Ferrario CM. Baroreceptor reflex modulation by
angiotensin II at the nucleus tractus solitarii. Hypertension 11: I167-171, 1988.
Chan RK, e Sawchenko PE. Spatially and temporally differentiated patterns of c-fos
expression in brainstem catecholaminergic cell groups induced by
cardiovascular challenges in the rat. The Journal of Comparative Neurology
348: 433-460, 1994.
Cheng Z, Zhang H, Yu J, Wurster RD, e Gozal D. Attenuation of baroreflex
sensitivity after domoic acid lesion of the nucleus ambiguus of rats. Journal of
Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology 96:
1137-1145, 2004.
92
Chitravanshi VC, e Sapru HN. Chemoreceptor-sensitive neurons in commissural
subnucleus of nucleus tractus solitarius of the rat. American Journal of
Physiology 268: R851-858, 1995.
Close JM, Neil JJ, e Loewy AD. Actions of N-methyl aspartate and its antagonist
aminophosphonovalerate on the A5 catecholamine cell group in rat. Brain
Research 249: 393-396, 1982.
Colombari E, Bonagamba LG, e Machado BH. Mechanisms of pressor and
bradycardic responses to L-glutamate microinjected into the NTS of conscious
rats. American Journal of Physiology 266: R730-738, 1994.
Coote JH, e Macleod VH. Evidence for the involvement in the baroreceptor reflex of a
descending inhibitory pathway. Journal of Physiology 241: 477-496, 1974.
Cunningham MD, Ferkany JW e Enna SJ. Excitatory amino acid receptors: A
gallery of new targets for pharmacological intervention. Life Science 54:135-
148, 1994.
Dahlstrom A, e Fuxe K. Localization of monoamines in the lower brain stem.
Experientia 20: 398-399, 1964.
Daly BM, Hazzledine JL, e Howe A. Reflex Respiratory and Peripheral Vascular
Responses to Stimulation of the Isolated Perfused Aortic Arch Chemoreceptors
of the Dog. Journal of Physiology 177: 300-322, 1965.
93
Dampney RA. Functional organization of central pathways regulating the
cardiovascular system. Physiological Reviews 74: 323-364, 1994.
Davies J. NMDA receptor in synaptic path ways. In: The NMDA receptor, edited by
Watkins JC e Collingridge GL. New York: Oxford University Press, 1989, p. 77-
91.
Dickerson LW, Panico WH, Kuhn FE, Willis AC, Fitzgerald JF, Meyer EL, Norman
WP, e Gillis RA. Stimulation of dog RVLM and A5 area changes sympathetic
outflow to vascular beds without effect on the heart. American Journal of
Physiology 272: R821-839, 1997.
Downing SE, e Siegel JH. Baroreceptor and chemoreceptor influences on
sympathetic discharge to the heart. American Journal of Physiology 204: 471-
479, 1963.
Drye RG, Baisden RH, Whittington DL, e Woodruff ML. The effects of stimulation of
the A5 region on blood pressure and heart rate in rabbits. Brain Research
Bulletin 24: 33-39, 1990.
Easton J, e Howe A. The distribution of thoracic glomus tissue (aortic bodies) in the
rat. Cell and Tissue Research 232: 349-356, 1983.
Erickson JT, e Millhorn DE. Hypoxia and electrical stimulation of the carotid sinus
nerve induce Fos-like immunoreactivity within catecholaminergic and
94
serotoninergic neurons of the rat brainstem. The Journal of Comparative
Neurology 348: 161-182, 1994.
Franchini KG, e Krieger EM. Cardiovascular responses of conscious rats to carotid
body chemoreceptor stimulation by intravenous KCN. Journal of the Autonomic
Nervous System 42: 63-69, 1993.
Gonzalez C, Almaraz L, Obeso A, e Rigual R. Carotid body chemoreceptors: from
natural stimuli to sensory discharges. Physiological Reviews 74: 829-898,
1994.
Gourine AV, Llaudet E, Dale N, e Spyer KM. ATP is a mediator of chemosensory
transduction in the central nervous system. Nature 436: 108-111, 2005.
Gu JG, e MacDermott AB. Activation of ATP P2X receptors elicits glutamate release
from sensory neuron synapses. Nature 389: 749-753, 1997.
Guyenet PG. Baroreceptor-mediated inhibition of A5 noradrenergic neurons. Brain
Research 303: 31-40, 1984.
Guyenet PG. Role of the Ventral Medulla Oblongata in Blood Pressure Regulation. In:
Central Regulation of Automonic Functions, edited by Loewy AD, e Spyer KM.
New York: Oxford University Press, 1990, p. 145-167.
95
Guyenet PG, e Byrum CE. Comparative effects of sciatic nerve stimulation, blood
pressure, and morphine on the activity of A5 and A6 pontine noradrenergic
neurons. Brain Research 327: 191-201, 1985.
Guyenet PG, Koshiya N, Huangfu D, Verberne AJ, e Riley TA. Central respiratory
control of A5 and A6 pontine noradrenergic neurons. American Journal of
Physiology 264: R1035-1044, 1993.
Guyenet PG, Stornetta RL, Riley T, Norton FR, Rosin DL, e Lynch KR. Alpha 2A-
adrenergic receptors are present in lower brainstem catecholaminergic and
serotonergic neurons innervating spinal cord. Brain Research 638: 285-294,
1994.
Haeusler G. Clonidine-induced inhibition of sympathetic nerve activity: no indication
for a central presynaptic or an indirect sympathomimetic mode of action.
Naunyn-Schmiedeberg`s Archives of Pharmacology 286: 07-111, 1974.
Haibara AS, Bonagamba LG, e Machado BH. Sympathoexcitatory
neurotransmission of the chemoreflex in the NTS of awake rats. American
Journal of Physiology 276: R69-80, 1999.
Haibara AS, Colombari E, Chianca DA, Jr., Bonagamba LG, e Machado BH.
NMDA receptors in NTS are involved in bradycardic but not in pressor
response of chemoreflex. American Journal of Physiology 269: H1421-1427,
1995.
96
Haibara AS, Tamashiro E, Olivan MV, Bonagamba LGH e Machado BH.
Involvement of the parabrachial nucleus in the pressor response to chemoreflex
activation in awake rats. Autonomic Neuroscience 101(1-2): 60-67, 2002.
Heymans C, e Bouckaert JJ. Sinus caroticus and respiratory reflexes: I. Cerebral
blood flow and respiration. Adrenaline apnoea. Journal of Physiology 69: 254-
266, 1930.
Hirooka Y, Head GA, Potts PD, Godwin SJ, Bendle RD, e Dampney RA. Medullary
neurons activated by angiotensin II in the conscious rabbit. Hypertension 27:
287-296, 1996.
Hirooka Y, Polson JW, Potts PD, e Dampney RA. Hypoxia-induced Fos expression
in neurons projecting to the pressor region in the rostral ventrolateral medulla.
Neuroscience 80: 1209-1224, 1997.
Huangfu D, e Guyenet PG. Alpha 2-adrenergic autoreceptors in A5 and A6 neurons
of neonate rats. American Journal of Physiology 273: H2290-2295, 1997a.
Huangfu D, e Guyenet PG. Autoactivity of A5 neurons: role of subthreshold
oscillations and persistent Na+ current. American Journal of Physiology 273:
H2280-2289, 1997b.
Huangfu D, Hwang LJ, Riley TA, e Guyenet PG. Splanchnic nerve response to A5
area stimulation in rats. American Journal of Physiology 263: R437-446, 1992.
97
Huangfu DH, Koshiya N, e Guyenet PG. A5 noradrenergic unit activity and
sympathetic nerve discharge in rats. American Journal of Physiology 261:
R393-402, 1991.
Jeske I, Reis DJ, e Milner TA. Neurons in the barosensory area of the caudal
ventrolateral medulla project monosynaptically on to sympathoexcitatory
bulbospinal neurons in the rostral ventrolateral medulla. Neuroscience 65: 343-
353, 1995.
Katona PG, Poitras JW, Barnett GO, e Terry BS. Cardiac vagal efferent activity and
heart period in the carotid sinus reflex. American Journal of Physiology 218:
1030-1037, 1970.
Kirchheim HR. Systemic arterial baroreceptor reflexes. Physiological Reviews 56:
100-177, 1976.
Kock LL. Histology of the Carotid Body. Nature 167:611-612, 1951.
Kobinger. Central alpha-adrenergic systems as targets for hypotensive drugs.
Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology 81: 39-100, 1978.
Koshiya N, e Guyenet PG. A5 noradrenergic neurons and the carotid sympathetic
chemoreflex. American Journal of Physiology 267: R519-526, 1994a.
98
Koshiya N, e Guyenet PG. NTS neurons with carotid chemoreceptor inputs arborize
in the rostral ventrolateral medulla. American Journal of Physiology 270:
R1273-1278, 1996.
Koshiya N, e Guyenet PG. Role of the pons in the carotid sympathetic chemoreflex.
American Journal of Physiology 267: R508-518, 1994b.
Koshiya N, Huangfu D, e Guyenet PG. Ventrolateral medulla and sympathetic
chemoreflex in the rat. Brain Research 609: 174-184, 1993.
Kwiat GC, Liu H, Williamson AM, e Basbaum AI. GABAergic regulation of
noradrenergic spinal projection neurons of the A5 cell group in the rat: an
electron microscopic analysis. The Journal of Comparative Neurology 330: 557-
570, 1993.
Li YW, e Dampney RA. Expression of Fos-like protein in brain following sustained
hypertension and hypotension in conscious rabbits. Neuroscience 61: 613-634,
1994.
Li YW, Gieroba ZJ, McAllen RM, e Blessing WW. Neurons in rabbit caudal
ventrolateral medulla inhibit bulbospinal barosensitive neurons in rostral
medulla. American Journal of Physiology 261: R44-51, 1991.
Lipski J, Lin J, Teo MY, e van Wyk M. The network vs. pacemaker theory of the
activity of RVL presympathetic neurons--a comparison with another putative
pacemaker system. Autonomic Neuroscience 98: 85-89, 2002.
99
Loewy AD, Gregorie EM, McKellar S, e Baker RP. Electrophysiological evidence
that the A5 catecholamine cell group is a vasomotor center. Brain Research
178: 196-200, 1979.
MacAllen RM, Spyer KM. The location of cardiac vagal preganclionic motoneurones
in the medulla of the cat. Journal of Physiology 258:187-204, 1976.
Madden CJ, Ito S, Rinaman L, Wiley RG, e Sved AF. Lesions of the C1
catecholaminergic neurons of the ventrolateral medulla in rats using anti-
DbetaH-saporin. American Journal of Physiology 277: R1063-1075, 1999.
Madden CJ, e Sved AF. Cardiovascular regulation after destruction of the C1 cell
group of the rostral ventrolateral medulla in rats. American Journal of
Physiology 285: H2734-2748, 2003.
Maiorov DN, Malpas SC, e Head GA. Influence of pontine A5 region on renal
sympathetic nerve activity in conscious rabbits. American Journal of Physiology
278: R311-319, 2000.
Maiorov DN, Wilton ER, Badoer E, Petrie D, Head GA, e Malpas SC. Sympathetic
response to stimulation of the pontine A5 region in conscious rabbits. Brain
Research 815: 227-236, 1999.
Marshall JM. Peripheral chemoreceptors and cardiovascular regulation. Physiological
Reviews 74: 543-594, 1994.
100
Mauad H, e Machado BH. Pressor response to unilateral carotid chemoreceptor
activation is not affected by ipsilateral antagonism of excitatory amino acid
receptors in the rostral ventrolateral medulla of awake rats. Autonomic
Neuroscience 91: 26-31, 2001.
Mifflin SW. Absence of respiration modulation of carotid sinus nerve inputs to nucleus
tractus solitarius neurons receiving arterial chemoreceptor inputs. Journal of the
Autonomic Nervous System 42: 191-199, 1993.
Minson J, Llewellyn-Smith I, Neville A, Somogyi P e Chalmers J. Quantitative
analysis of spinally projecting adrenaline-synthesising neurons of C1, C2 and
C3 groups in rat medulla oblongata. Journal of the Autonomic Nervous System
30: 209-220, 1990.
Morrison SF, Sved AF, e Passerin AM. GABA-mediated inhibition of raphe pallidus
neurons regulates sympathetic outflow to brown adipose tissue. American
Journal of Physiology 276: R290-297, 1999.
Neil JJ, e Loewy AD. Decreases in blood pressure in response to L-glutamate
microinjections into the A5 catecholamine cell group. Brain Research 241: 271-
278, 1982.
Paton JF, De Paula PM, Spyer KM, Machado BH, e Boscan P. Sensory afferent
selective role of P2 receptors in the nucleus tractus solitarii for mediating the
101
cardiac component of the peripheral chemoreceptor reflex in rats. Journal of
Physiology 543: 995-1005, 2002.
Paxinos G e Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. Second edition. New
South Wales: Academic Press Australia, 1986
Polson JW, Mrljak S, Potts PD, e Dampney RA. Fos expression in spinally
projecting neurons after hypotension in the conscious rabbit. Autonomic
Neuroscience 100: 10-20, 2002.
Ramos AS. Papel da área A5 na resposta simpato-excitatória do quimiorreflexo em
ratos não-anestesiados. In: Departamento de Fisiologia e Biofísica. Belo
Horizonte: Universidade Federal de Minas Gerais, 2002, p. 112.
Rosin DL, Chang DA, e Guyenet PG. Afferent and efferent connections of the rat
retrotrapezoid nucleus. The Journal of Comparative Neurology 499: 64-89,
2006.
Ross CA, Ruggiero DA, e Reis DJ. Projections from the nucleus tractus solitarii to
the rostral ventrolateral medulla. The Journal of Comparative Neurology 242:
511-534, 1985.
Ruggeri P, Cogo CE, Picchio V, Molinari C, Ermirio R, e Calaresu FR. Influence of
GABAergic mechanisms on baroreceptor inputs to nucleus tractus solitarii of
rats. American Journal of Physiology 271: H931-936, 1996.
102
Sapru HN, e Krieger AJ. Carotid and aortic chemoreceptor function in the rat. Journal
of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology 42:
344-348, 1977.
Schoepp D, Bockaert J, e Sladeczek F. Pharmacological and functional
characteristics of metabotropic excitatory amino acid receptors. Trends in
Pharmacological Sciences 11: 508-515, 1990.
Schreihofer AM, e Guyenet PG. Sympathetic reflexes after depletion of bulbospinal
catecholaminergic neurons with anti-DbetaH-saporin. American Journal of
Physiology 279: R729-742, 2000.
Shefner SA, e Osmanovic SS. GABAA and GABAB receptors and the ionic
mechanisms mediating their effects on locus coeruleus neurons. Progress in
Brain Research 88: 187-195, 1991.
Spyer KM. Annual review prize lecture. Central nervous mechanisms contributing to
cardiovascular control. Journal of Physiology 474: 1-19, 1994.
Spyer KM. The Central Nervous Organization of Reflex Circulatory Control. In:
Central Regulation of Autonomic Function, edited by Loewy AD, and Spyer KM.
New York: Oxford University Press, 1990, p. 169-188.
Stanek KA, Neil JJ, Sawyer WB, e Loewy AD. Changes in regional blood flow and
cardiac output after L-glutamate stimulation of A5 cell group. American Journal
of Physiology 246: H44-51, 1984.
103
Strack AM, Sawyer WB, Platt KB, e Loewy AD. CNS cell groups regulating the
sympathetic outflow to adrenal gland as revealed by transneuronal cell body
labeling with pseudorabies virus. Brain Research 491: 274-296, 1989.
Stuesse SL. Origins of cardiac vagal preganglionic fibers: a retrograde transport
study. Brain Research 236: 15-25, 1982.
Stuesse SL, e Fish SE. Projections to the cardioinhibitory region of the nucleus
ambiguus of rat. The Journal of Comparative Neurology 229: 271-278, 1984.
Sun MK, e Spyer KM. Responses of rostroventrolateral medulla spinal vasomotor
neurones to chemoreceptor stimulation in rats. Journal of the Autonomic
Nervous System 33: 79-84, 1991.
Swanson LW, e Hartman BK. The central adrenergic system. An
immunofluorescence study of the location of cell bodies and their efferent
connections in the rat utilizing dopamine-beta-hydroxylase as a marker. The
Journal of Comparative Neurology 163: 467-505, 1975.
Takakura AC, Moreira TS, Colombari E, West GH, Stornetta RL, e Guyenet PG.
Peripheral chemoreceptor inputs to retrotrapezoid nucleus (RTN) CO2-
sensitive neurons in rats. Journal of Physiology 572: 503-523, 2006.
104
Urbanski RW, e Sapru HN. Putative neurotransmitters involved in medullary
cardiovascular regulation. Journal of the Autonomic Nervous System 25: 181-
193, 1988.
Watkins JC, Davies J, Evans RH, Francis AA, e Jones AW. Pharmacology of
receptors for excitatory amino acids. Advances in Biochemical
Psychopharmacology 27: 263-273, 1981.
Westlund KN, Bowker RM, Ziegler MG, e Coulter JD. Noradrenergic projections to
the spinal cord of the rat. Brain Research 263: 15-31, 1983.
Woodruff ML, Baisden RH, e Whittington DL. Effects of electrical stimulation of the
pontine A5 cell group on blood pressure and heart rate in the rabbit. Brain
Research 379: 10-23, 1986.
Yao ST, Barden JA, Finkelstein DI, Bennett MR, e Lawrence AJ. Comparative
study on the distribution patterns of P2X(1)-P2X(6) receptor immunoreactivity in
the brainstem of the rat and the common marmoset (Callithrix jacchus):
association with catecholamine cell groups. The Journal of Comparative
Neurology 427: 485-507, 2000.
Zhang M, e Nurse CA. CO2/pH chemosensory signaling in co-cultures of rat carotid
body receptors and petrosal neurons: role of ATP and ACh. Journal
Neurophysiology 92: 3433-3445, 2004.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
