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ASPECTOS BIOLÓGICOS DO FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO
Aschersonia sp. CULTIVADO EM DIFERENTES MEIOS DE
CULTURA
IURI MONTANDON DE OLIVEIRA
2008
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IURI MONTANDON DE OLIVEIRA
ASPECTOS BIOLÓGICOS DO FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO
Aschersonia sp. CULTIVADO EM DIFERENTES MEIOS DE CULTURA
Dissertação apresentada à Universidade Federal de
Lavras como parte das exigências do Programa de
Pós-Graduação em Agronomia/Entomologia, área de
concentração em Entomologia Agrícola, para a
obtenção do título de “Mestre”.
Orientador
Prof. Dr. Alcides Moino Junior
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
2008
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Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da UFLA
Oliveira, Iuri Montandon de.
Aspectos biológicos do fungo entomopatogênico Aschersonia sp.
cultivado em diferentes meios de cultura / Iuri Montandon de Oliveira. –
Lavras : UFLA, 2008.
47 p.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Lavras, 2008.
Orientador: Alcides Moino Junior.
Bibliografia.
1. Controle biológico. 2.
Aschersonia. 3. Produção de fungos. I.
Universidade Federal de Lavras. II. Título.
CDD – 589.240461
IURI MONTANDON DE OLIVEIRA
ASPECTOS BIOLÓGICOS DO FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO
Aschersonia sp. CULTIVADO EM DIFERENTES MEIOS DE CULTURA
Dissertação apresentada à Universidade Federal de
Lavras como parte das exigências do Programa de
Pós-Graduação em Agronomia/Entomologia, área de
concentração em Entomologia Agrícola, para a
obtenção do título de “Mestre”.
APROVADA em 08 de maio de 2008
Prof. José Eduardo M. de Almeida Instituto Biológico de São Paulo
Prof. Ricardo Souza Cavalcanti UNIFENAS
Prof. Alcides Moino Junior
UFLA
(Orientador)
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela força que me fez atravessar incansável, por todas as portas,
pontes e elos, pela capacidade inesgotável de querer sonhar. Pelos horizontes
sempre à frente, pela capacidade de buscar. Pela saúde perfeita, liberdade,
independência.
À Universidade Federal de Lavras, UFLA, pela oportunidade de aprender
um pouco mais sobre a Entomologia.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior,
Capes, pela concessão da bolsa de estudos.
Ao orientador Prof. Dr. Alcides Moino Júnior, do DEN/UFLA, por todos
os conselhos e confiança, mas, principalmente, por toda a paciência.
Aos professores Dr. José Eduardo Marcondes Almeida, do Instituto
Biológico de São Paulo; Dr. Ricardo Sousa Cavalcanti, da UNIFENAS –
Faculdade de Agronomia e Dr. Luis Cláudio Paterno Silveira, DEN/UFLA, por
terem aceitado o convite e por toda a contribuição intelectual.
Ao Prof. Dr. Neliton Marques da Silva, Universidade Federal do
Amazonas, UFAM, pela cessão do isolado de
Aschersonia aleyrodis.
Ao Marco Aurélio, por ter sido um grande irmão pra mim. Pelas
conversas de alto teor intelectual e de extrema importância para todos. A todos
os momentos esportivos que passamos juntos, sejam eles no xadrez, no futebol
ou na peteca e, principalmente, por ter me aturado por dois anos, mesmo
querendo, por vezes, me despejar.
À Cristhiane, minha eterna veterana, por toda força e companheirismo
em todos os momentos, sejam eles felizes ou não. Pelas incontáveis risadas e
“brigas” que tivemos, pelos conselhos. Por ser sempre minha parceira em
qualquer forró.
Ao Fabiano, por ser um grande companheiro de conversa, dando-me
apoio e forças em momentos em que eu achei que tudo fosse desmoronar. Pelos
inúmeros conselhos, embora, infelizmente, não tenha seguido a todos.
Aos colegas de mestrado (Alexandre, Bruno e Thaiana), por toda a
convivência durante o período do mestrado.
Aos colegas de mestrado que se tornaram amigos, quase irmãos,
Cleidson, Heisler e Roberta, por todos os momentos que passamos juntos, por
todas as risadas e momentos felizes compartilhados.
Aos companheiros de churrasco e jogatina, Natália, Marlon e Daiane.
A todos os funcionários do Departamento de Entomologia, DEN, por
toda a cooperação no decorrer deste período.
Aos professores do Departamento de Entomologia, DEN, por todo o
ensinamento.
A todos os colegas do Laboratório de Patologia de Insetos (Grazielle,
Vanessa e Érica). Em especial, a Viviane, que me ajudou na montagem de
experimento até altas horas da noite.
Ao meu pai, Luiz Carlos, pelo apoio incondicional em todos os
momentos, mesmo sofrendo tanto quanto eu pela longa ausência e distância.
Pelo eterno exemplo de sabedoria, amor e confiança.
À minha mãe, Léia, pessoa de personalidade única, sempre alegre,
fazendo as suas sacanagens, dando os seus conselhos, às vezes não tão úteis, mas
sempre presentes. Pelas vezes que me deu colinho, ouvindo as minhas
lamentações, mas sempre me dando força pra continuar.
Ao meu irmão Igor, meu companheiro para todos os momentos,
inseparável, com uma energia de vida enorme, sempre sorrindo, sempre
brincando, alguém que pode contar comigo sempre.
À minha irmã Natila, por ser tão alegre, querida, empenhada e com um
temperamento forte. Por todos os momentos e instantes, inclusive aqueles em
que o choro parecia ser a melhor opção.
Aos meus melhores amigos, Halison e André que, mesmo distantes, de
alguma maneira estavam sempre presentes. Pelos inúmeros momentos que
passamos juntos, rindo um da cara do outro, mas também por aqueles momentos
sérios de estudos e de aconselhamentos, embora não tenham adiantado muito ao
Halison, que acabou se casando.
A todos os colegas de pós-graduação que, com certeza, auxiliaram muito
para esta dissertação.
Ao período que passei na UNIOESTE, onde fiz muitos amigos e adquiri
o conhecimento necessário parar que eu chegasse onde estou neste momento.
E a todos, não poucos, que um dia passaram por meu caminho nos
incontáveis quilômetros percorridos, me conduzindo até aqui, trazendo um novo
sentido a minha vida, mesmo que por instantes tão pequenos e aparentemente
insignificantes.
A todos, muito obrigado.
Sumário
RESUMO..............................................................................................................i
ABSTRACT.........................................................................................................ii
1 INTRODUÇÃO.................................................................................1
2 REFERENCIAL TEÓRICO............................................................4
2.1 Controle microbiano de insetos...........................................................4
2.2 Fungos entomopatogênicos.................................................................5
2.3
Aschersonia aleyrodis Webber............................................................8
2.4 Fatores que influenciam a virulência...................................................9
2.5 A família Aleyrodidae Westwood 1840............................................13
2.5.1
Aleurocanthus woglumi Ashby 1915.................................................14
2.5.2
Bemisia tabaci (Gennadius, 1889) ....................................................18
3 MATERIAL E MÉTODOS............................................................21
3.1 Material biológico.............................................................................21
3.2 Inoculação dos isolados nos meios de cultura...................................22
3.3 Bioensaios .........................................................................................22
3.3.1 Viabilidade dos conídios ...................................................................22
3.3.2 Crescimento radial das colônias........................................................23
3.3.3 Conidiogênese...................................................................................23
3.3.4 Virulência sobre
Bemisia tabaci........................................................23
3.3.5 Análise estatística..............................................................................25
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................26
4.1 Viabilidade dos conídios ...................................................................26
4.2 Crescimento radial de colônias..........................................................28
4.3 Conidiogênese...................................................................................29
4.4 Virulência..........................................................................................32
5 CONCLUSÕES ...............................................................................35
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS..........................................................36
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..........................................37
ANEXOS............................................................................................................45
i
RESUMO
OLIVEIRA, Iuri Montandon. Aspectos biológicos do fungo entomopatogênico
Aschersonia sp. cultivado em diferentes meios de cultura. 2008. 47 p.
Dissertação (Mestrado em Entomologia) - Universidade Federal de Lavras,
Lavras, MG.
1
Possibilitar a produção em grande escala de fungos entomopatogênicos e o seu
uso no controle biológico de pragas e conhecer algumas características são
extremamente importantes para a obtenção de um bom crescimento com alta
conidiogênese. O presente trabalho objetivou avaliar a influência de meios de
cultura baseados em fontes protéicas, principalmente provenientes de insetos,
sobre parâmetros biológicos do fungo
Aschersonia aleyrodis. Os experimentos
de viabilidade, crescimento radial e conidiogênse foram realizados em seis
meios de cultura: ME, SMAY, SDAY, BDA, BDAGm (BDAGm) e BDA +
Tenebrio sp. (BDAT). A virulência deste fungo foi avaliada em
Bemisia tabaci
biótipo “B” utilizando-se de três meios de cultura (BDA, BDAGm e BDAT). A
viabilidade foi avaliada em meio
AA, após um período de incubação de 24 horas,
enquanto o crescimento vegetativo e a conidiogênese foram avaliados nos
diferentes meios incubados em B.O.D. (26±1°C, 14 horas de fotofase) por 10
dias. Verificou-se maior viabilidade nos meios ME, BDA, BDAGm e BDAT,
com valores equivalentes a 76,3%, 78,4%, 78,7% e 83,3%, respectivamente.
Quanto ao crescimento radial, os melhores valores foram obtidos quando o
fungo foi produzido em meio BDAT, com média de 13,8 cm/colônia. Este
mesmo meio foi o que promoveu o maior aumento na conidiogênese,
quantificada em 4,8 x 10
6
conídios/colônia. O fungo produzido nos meios
BDAGm e BDAT proporcionou melhores resultados quanto à virulência em
B.
tabaci
, com valores iguais a 80,0% e 85,6% de mortalidade, respectivamente,
sugerindo a influência positiva dos componentes provenientes de insetos
adicionados à composição do meio de cultura.
1
Orientador: Alcides Moino Junior - UFLA
ii
ABSTRACT
OLIVEIRA, Iuri Montandon. Biological aspects of the entomopathogenic
fungus
Aschersonia sp. cultivated in different culture media. 2008. 47p.
Dissertation (Master degree in Entomology) - Universidade Federal de Lavras,
Lavras, MG.
2
To enable the production on a large scale of entomopathogenic fungi and allow
their use in biological control of pests, knowing some characteristics is very
important for achievement of good growth with high sporulation. The goal of
this work was to evaluate the influence of different culture media based in
protein sources, mainly that ones coming from insects, on biological parameters
of the fungus
Aschersonia aleyrodis. The viability, radial growth and conidia
production bioassay were developed in six different media: ME, SMAY, SDAY,
BDA, BDAGm (BDAGm) e BDA + Tenebrio sp. (BDAT). The virulence of this
fungus was evaluated in
Bemisia tabaci biotype “B” using up three culture
media (BDA, BDAGm e BDAT). The viability was evaluated in Water-Agar
after a time incubation of 24 hours, while the vegetative growth and conidia
production were evaluated on different media incubated in B.O.D. (26±1°C, 14
hours of fotofase) for ten days. There was a higher viability in ME, BDA,
BDAGm e BDAT media, with equivalent values to 76.3, 78.4, 78.7 e 83.3%;
respectively. For the radial growth, the best values were obtained when the
fungus was produced in BDAT, with 13.8 cm/colony. This was the same media
that promoted the largest increase in conidiogenesis, quantified in 4.8 x 10
6
conidia/colony. The fungus produced in media BDAGm and BDAT provided
better results on the virulence in
B. Tabaci, with values equal to 80.0 and 85.6%
of mortality, respectively, suggesting the positive influence of the components
from insects added the composition of the culture medium.
2
Advisor: Alcides Moino Junior
1
1 INTRODUÇÃO
Devido à grande diversidade de cultivares e climas nos quais os citrus se
desenvolvem, talvez esta seja uma das culturas com maior área de distribuição
que vai desde áreas com clima tropical e subtropical a áreas de clima temperado
ao redor do mundo. Conseqüentemente, uma grande variedade de organismos-
praga é relatada para os citros (Dolinski & Lacey, 2007).
Uma família que merece destaque como praga, devido à atual situação na
qual se encontra é a Aleyrodidae, na qual se concentram pragas chave de muitas
culturas em regiões tropicais e subtropicais, além de ocorrerem em áreas de
cultivo protegido em regiões de clima temperado (Brown et al., 1995). Entre
estas se destacam as moscas-brancas,
Aleurothrixus floccosus (Mask., 1895)
(HEMIPTERA: ALEYRODIDAE), as mosca-negra-dos-citros,
Aleurocanthus
woglumi
(Ashby, 1915) (HEMIPTERA: ALEYRODIDAE) (Gallo et al., 2002;
Dolinski & Lacey, 2007). São relatadas cerca de 30 espécies de moscas-branca e
de moscas-negra-dos-citros atacando citros ao redor de todo o mundo (Smith &
Pena, 2002, citado por Dolinski & Lacey, 2007).
Muitas características biológicas, incluindo o multivoltismo, grande
variedade de hospedeiros, habilidade migratória, altas taxas reprodutivas,
tolerância a altas temperaturas, possibilidade de ser vetor de ma grande
variedade de vírus fitopatogênicos e a facilidade de desenvolver resistência a
várias classes de inseticidas sustentam o potencial para se tornarem pragas e têm
contribuído para dificultar o desenvolvimento de sistemas de manejo
sustentáveis (Gerling & Mayer, 1996, citado por Naranjo, 2001).
A principal forma de controle dessas pragas é o uso de inseticidas à base
de moléculas orgânicas e inorgânicas. Os estudos sobre controle biológico de
insetos considerados pragas de importância econômica foram intensificados a
2
partir do momento em que se observou que o uso contínuo e indiscriminado dos
inseticidas acarretava problemas de resistência de insetos aos produtos químicos,
contaminação direta e indireta do ambiente, desequilíbrio ecológico e presença
de resíduos em alimentos. Sendo assim, uma alternativa para o controle dessas
pragas é o uso de microrganismos, particularmente os vírus, as bactérias e os
fungos (Azevedo & Messias, 1985; Alves, 1998).
Estudos indicam que os fungos são os principais causadores das doenças
de insetos. Cerca de 80% das doenças de insetos têm como agentes etiológicos
os fungos pertencentes a 90 gêneros e mais de 700 espécies. Além disso, uma
das principais vantagens no controle microbiano de insetos por fungos é a
grande variabilidade genética desses entomopatógenos. Portanto, com técnicas
apropriadas de bioensaios é possível selecionar isolados de fungos mais
virulentos, específicos ou não, com características adequadas para serem
utilizados como inseticidas microbianos visando ao controle do maior número
possível de pragas de culturas econômicas (Alves, 1998).
Aschersonia aleyrodis Webber (1897) é um fungo que, segundo Browning
& McCoy (1994), citados por Alves (1998), constitui um dos agentes mais
importantes que atuam no controle natural de pragas de citros. Ataca
cochonilhas e aleirodídeos na fase de conídios de coloração avermelhada que
recobrem todo o corpo do inseto, sendo comumente observado em epizootias
naturais.
A produção de conídios e a virulência dos fungos podem ser afetadas por
diversos fatores, tais como umidade relativa, temperatura, isolado selecionado,
hospedeiro, tempo e a composição do meio de cultura (Alves, 1998). Portanto,
sendo o meio de cultura um determinante de diversos caracteres, o principal
objetivo deste trabalho foi avaliar o crescimento, a conidiogênese e a virulência
de um isolado de
Aschersonia sp. sobre adultos de Bemisia tabaci (Gennadius,
1889), cultivado em diferentes meios de cultura.
3
Assim, este trabalho poderá trazer maior entendimento acerca da
influência direta dos componentes do meio de cultura sobre algumas
características do fungo
Aschersonia sp. E, nesse sentido, é importante
correlacionar a composição do meio de cultura sobre alguns caracteres
(viabilidade de conídios, crescimento radial, produção de conídios e virulência)
e, conseqüentemente, contribuir para o desenvolvimento de novas metodologias
de manipulação deste fungo, a fim de viabilizar a utilização do mesmo em
programas de manejo integrado de pragas.
4
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Controle microbiano de insetos
Os produtores, preocupados com as exigências do mercado interno e
externo por produtos de alta qualidade, lançam mão do uso de produtos
químicos para o controle de pragas, causando danos ecológicos, prejudicando o
solo e deixando resíduos nos alimentos, quando aplicados de maneira
indiscriminada (Chenarki et al., 2001).
Após algumas décadas, o grande interesse foi a utilização de pesticidas
químicos, diminuindo bastante a demanda por agentes de controle biológico.
Entretanto, este interesse foi retomado em 1960 (Evans & Hywel-Jones, 1990).
O controle biológico de insetos praga é uma maneira muito mais segura de
manter as populações em equilíbrio, limitando a rápida multiplicação destes, não
causando dano algum aos organismos não-alvo e ao solo (Alves, 1998).
O uso de microrganismos para o controle de insetos-praga não é novo e
vem sendo empregado em grande escala, principalmente após os anos 1970,
devido a problemas advindos da utilização dos inseticidas químicos. Assim,
vírus, fungos e bactérias são empregados com sucesso no controle de diversos
tipos de pragas e outros vários são pesquisados para futura utilização (Melo &
Azevedo, 1998).
A utilização de microrganismos entomopatogênicos para o controle de
pragas não é uma área de conhecimento recente, mas tomou grande impulso,
principalmente após a proibição do uso de inseticidas organoclorados e também
em decorrência do estabelecimento do manejo integrado de pragas (MIP) como
prática racional no controle de insetos-praga (Moino Jr., 2000).
A utilização de microrganismos para o controle de insetos apresenta
diversas vantagens, tais como: (1) protege a biodiversidade, agindo no
5
ecossistema; (2) não causa desequilíbrio, pois os entomopatógenos são
específicos, não afetando organismos não-alvo, como os polinizadores, mas
agindo com grande poder patogênico nos organismos alvo; (3) não deixa
resíduos em alimentos, água ou solo, mesmo em doses elevadas; (4) aumenta o
lucro do produtor, pois tem maior duração sem a necessidade de uma nova
aplicação, afetando as gerações seguintes, diminuindo a oviposição, a
viabilidade dos ovos e aumentando a sensibilidade da população a outros
agentes biológicos e químicos; eles podem ser empregados juntamente com
inseticidas seletivos em subdosagens visando à ação sinérgica e, portanto, um
controle mais rápido e eficaz da praga, sem os inconvenientes das superdosagens
dos inseticidas químicos; (5) os insetos dificilmente se tornarão resistentes aos
patógenos e (6) não necessita de matéria-prima, como o petróleo, para serem
produzidos. Entretanto, fatores como o planejamento das aplicações,
respeitando-se o período de incubação do patógeno, de modo que o inseto possa
ser eliminado antes de prejudicar economicamente a cultura, e a necessidade de
um conhecimento tecnológico, às vezes de difícil implementação, especialmente
pelo nível cultural do agricultor, podem ser encarados como desvantagens
(Alves, 1998).
As técnicas de produção massal desses controladores biológicos, a
otimização dos processos de aplicação e o melhoramento genético dos
microrganismos empregados, tornando-os mais eficientes, vêm sendo
desenvolvidos em laboratórios de todo o mundo (Leite et al., 2003).
2.2 Fungos entomopatogênicos
Juntamente com predadores e parasitóides, vários entomopatógenos são
encontrados causando doenças em indivíduos da família Aleyrodidae por todo o
mundo. Muitos fungos estão sendo considerados para o controle biológico
(Lacey et al., 1996). Para selecionar fungos patogênicos para o controle de
6
aleirodídeos é necessário selecionar isolados que combinem as melhores
características possíveis para matar o inseto alvo. Uma das características é a
boa produção massal, bem como a alta conidiogênese em meios de cultura
artificiais (Moore & Prior, 1993; Prior, 1992, citados por Meekes et al., 2002).
Muitos fungos, tais como
Beauveria bassiana (Bals.) Vuill., Paecilomyces
fumosoroseus
(Wize) Brown & Smith e Lecanicillium lecanii (Zimm.) Gams &
Zare, têm sido desenvolvidos como produtos comerciais (Bolckmans et al.,
1995) (Knauf and Wright, 1994; Ravensberg et al., 1990, citados por Meekes et
al., 2002). Pesquisas anteriores indicaram que
A. aleyrodis também é um
promissor agente de controle devido à sua tolerância a umidades relativas
inferiores a 50% e à sua longa persistência em superfícies foliares (Fransen,
1995).
Avanços na qualidade dos micoinseticidas abrirão nichos antes não
vislumbrados. A pressão crescente da sociedade por alimentos mais saudáveis, a
conscientização de profissionais do setor agropecuário brasileiro quanto às
adversidades causadas pelo uso abusivo de agrotóxicos e quanto à necessidade
de inclusão do controle biológico em estratégias de manejo de resistência de
insetos-praga, a implantação de legislações cada vez mais restritivas ao emprego
de produtos químicos e a expansão da agricultura orgânica e do cultivo
protegido, entre outros fatores, provavelmente, reverterão, nos próximos anos,
em demanda consideravelmente maior do que a atualmente observada. Resta,
então, às biofábricas investir no aumento de produtividade e na constante
melhoria de seus produtos (Faria & Magalhães, 2001).
Diferentemente das bactérias e vírus entomopatogênicos que invadem o
hospedeiro através do aparelho bucal (ingestão), os fungos possuem a
capacidade de penetrar ativamente pelo tegumento, devido a uma ação
combinada de pressão mecânica e ação de enzimas e, após a penetração,
proliferam na hemocele e, em seguida, produzem toxinas. Tais eventos podem
7
culminar com a morte do animal. Assim, a produção de enzimas e toxinas é um
importante fator de virulência de um fungo entomopatogênico (Alves, 1998).
O processo de infecção de fungos em seus hospedeiros ocorre em fases
sucessivas de germinação, diferenciação, penetração, colonização, reprodução e
disseminação (Schrank et al.
, 1993). Inicialmente, encontrando condições
favoráveis de umidade e temperatura, o fungo forma um tubo germinativo; na
extremidade deste tubo forma-se uma dilatação, denominada apressório, cuja
porção inferior apresentará uma saliência (grampo de penetração), a qual penetra
no tegumento do inseto. Na penetração estão envolvidos dois processos
principais: um físico (pela pressão da hifa que rompe áreas membranosas ou
esclerosadas) e um químico (resultante da elaboração de enzimas que facilitam a
pressão mecânica). A hifa que penetra sofre engrossamento e se ramifica
inicialmente no tegumento e, posteriormente, na cavidade geral (Hemocele); a
partir de então, formam-se pequenas colônias do fungo (Alves, 1998).
Durante a penetração da cutícula, componentes cuticulares devem ser
hidrolisados pelas enzimas produzidas e liberadas pelo fungo, que incluem
proteases, quitinases e lipases. Quando essas enzimas conseguem promover uma
abertura na cutícula do inseto hospedeiro, uma saliência conhecida como
grampo de penetração é introduzida, iniciando a infestação da hemocele do
inseto (Shimizu et al., 1992).
Devido ao modo de infecção do fungo, que se dá principalmente através
da cutícula, a utilização de fungos é uma solução viável como agente de controle
de insetos sugadores, entre eles os da ordem Hemiptera (Alves, 1998; Dolinski
& Lacey, 2007).
A morte do inseto ocorre devido a fatores como produção de micotoxinas,
mudanças patológicas na hemocele, ação histolítica, bloqueio mecânico do
aparelho digestivo devido ao crescimento vegetativo e outros danos físicos em
decorrência do crescimento do micélio. Tal evento ocorre de quatro a cinco dias
8
após a infecção, quando as hifas se desenvolvem invadindo os diversos órgãos
internos. Após o esgotamento dos nutrientes, as hifas se estendem para fora do
corpo do hospedeiro, formando um micélio que recobre a superfície do
tegumento, resultando na mumificação. Sob condições ambientais apropriadas,
ocorre a produção de conídios, que poderão ser disseminados pelo vento para
infectar outros insetos (Alves, 1998).
Devido à segurança atribuída aos fungos entomopatogênicos
,
especialmente em relação aos animais homeotérmicos (Crawford et al., 1998),
maiores conhecimentos acerca dos fatores de virulência permitirão o
desenvolvimento de novas metodologias de cultivo e aplicação, com a finalidade
de elevar as taxas de mortalidade associadas aos mesmos e reduzir a utilização
de controladores químicos, diretamente nocivos tanto para os animais quanto
para o ambiente.
2.3 Aschersonia aleyrodis Webber
O gênero Aschersonia é conhecido por causar severa epizootia em
moscas-brancas (Aleyrodidae) e em alguns coccídeos nas regiões tropicais e
subtropicais (Meekes et al., 2000). As espécies que atacam moscas-brancas
infectam, principalmente, o estágio imaturo. Embora seja considerado um dos
gêneros mais estudados para o controle de insetos (Alves, 1998) e cerca de 23
espécies tenham sido descritas em moscas-brancas, pouco se conhece sobre sua
efetividade no controle de aleirodídeos (Meekes et al., 2002).
A. aleyrodis foi um dos primeiros fungos utilizados no controle biológico
de insetos pragas na América do Norte. O sucesso no seu uso em culturas de
citrus na Flórida já é relatado desde 1900, quando citros com conídios de
A.
aleyrodis
foram introduzidos em culturas de citros a fim de iniciar epizootias na
população de moscas-branca (Berger, 1921 e Fawcett, 1936 citados por Liu et
al., 2006).
9
A. aleyrodis é um fungo que segundo Browning & McCoy (1994), citado
por Alves (1998), constitui um dos agentes mais importantes que atuam no
controle natural de pragas de citros. Atacam cochonilhas e moscas-brancas na
fase conidial. Na fase ascógena, é
Hypocrella (Ascomycetes) e ocorre sobre
coccídeos. Os conídios são hialinos, fusóides unicelaulares, originados em
picnídios formados na cavidade de um estroma hemisférico de coloração
avermelhada que recobre todo o corpo do inseto. É considerado o maior inimigo
natural das moscas-branca
Dialeurodes citri Ashmead (HEMIPTERA;
ALEYRODIDAE) e
Dialeurodes citrifolii (Morgan) (HEMIPTERA;
ALEYRODIDAE), em diferentes regiões do país. É muito comum ser observado
em epizootias naturais.
Na Bulgária, na China, no Japão e na União Soviética,
A. aleyrodis foi
utilizado contra moscas-branca em casas de vegetação. O fungo foi
desenvolvido comercialmente pela Koppert Biological Systems, na Holanda,
como um biopesticida adequado para aplicação em estufas (Evans & Hywel-
Jones, 1990).
No entanto, permanecem alguns obstáculos: espécies de
Aschersonia
apresentam culturas de crescimento lento e nem todas as fases de vida do
hospedeiro pode ser atacado (Ramakers & Samson 1984 citado por Liu et al.
2006). Estudos recentes sobre conidiogênese, germinação, e patogenicidade
permitiram melhor compreensão da biologia de
A. aleyrodis, a fim de
desenvolver ainda mais este promissor agente no controle biológico (Meekes et
al., 2002).
2.4 Fatores que influenciam a virulência
Vários fatores de patogenicidade estão envolvidos na colonização do
hospedeiro pelos fungos, tornando esse mecanismo bastante complexo. Dentre
estes fatores, está a produção de toxinas e de exoenzimas. Na maioria dos casos,
10
a infecção do inseto inicia-se com a deposição de conídios sobre a cutícula e ou
penetração mecânica (Heale et al., 1989; Lecuona et al., 1991).
Na superfície do conídio, ainda não germinado, foi detectada a presença
de enzimas que têm efeito de adesão, na aquisição preliminar de nutrientes e que
também causam modificações superficiais nas camadas externas da cutícula do
hospedeiro (St. Leger et al., 1989). O conídio é o propágulo mais adequado para
uso no controle biológico, já que é a mais resistente às condições adversas do
ambiente, podendo ser preservado por um tempo relativamente longo (Abreu et
al., 1983 citados por Leite et al., 2003). Além disso, os conídios são hidrófobos,
o que favorece a sua adesão na cutícula do hospedeiro (Boucias et al., 1988).
Após a infecção via tegumento, dependendo da presença de nutrientes
(glicose, quitina, nitrogênio, entre outros), o fungo germina de 12 a 18 horas. A
penetração tegumentar ocorre devido à ação mecânica e enzimática (Alves,
1998).
As enzimas, dentre elas as quitinases, são liberadas pelo tubo germinativo,
que tem fundamental importância na degradação da cutícula do inseto,
favorecendo o processo nutricional entre o fungo e o hospedeiro. A produção de
enzimas pelos fungos tem sido estudada com várias finalidades. Uma delas é
correlacioná-la com os processos de especificidade, patogenicidade e virulência
(Alves, 1998).
Paris & Segretaim (1978), citados por Alves (1998), relataram que a
virulência de
B. bassiana estava relacionada à produção de lipases, o que
facilitaria a seleção de raças com essas características. As lipases são
responsáveis pelo fracionamento dos lipídeos (óleos e gorduras) existentes na
superfície dos insetos, para posterior metabolização pelos microrganismos. Os
alcanos da camada de lipídeos da epicutícula podem ser utilizados como fonte de
nutrientes para os estágios iniciais de desenvolvimento dos fungos (St. Leger et
al., 1988).
11
Gupta et al., (1992) analisaram a produção de proteases por B. bassiana e
relataram a importância de estudar vários isolados, já que as diferenças
quantitativas na produção de proteases por diferentes isolados podem influenciar
diretamente a virulência do fungo. A importância de analisar a variabilidade
entre isolados quanto à produção de proteases é reforçada pelos dados de Leal et
al. (1997), os quais demonstraram variação significativa na seqüência de
nucleotídeos do gene PR1, que codifica para síntese de enzimas específicas,
entre diferentes isolados de fungos entomopatogênicos.
A composição do meio tem uma estreita relação com o custo e a qualidade
do fungo produzido, pois pode influenciar o tipo, o formato e a quantidade de
propágulo produzido, além da sua estabilidade após secagem e de sua
agressividade, medida em termos de virulência e patogenicidade. Portanto, no
desenvolvimento de um meio de cultura, é importante selecionar um meio
definido ou semidefinido que proporcione uma boa produção da forma desejada
do fungo, variando os componentes do meio, analisando o impacto na produção,
virulência, capacidade de suportar processos de secagem e estabilidade do
patógeno (Jackson, 1997).
Um meio de cultura deve possuir, basicamente, uma fonte de carbono
(amido, glicose, sacarose, dextrose e diversos outros açúcares) e nitrogênio
(extrato de soja e outros subprodutos vegetais, extrato de levedura e peptona ou
até mesmo ácido casamino), sais minerais e alguns fatores de crescimento (Leite
et al., 2003).
A utilização de meios sólidos, por não precisar de tecnologias mais
aprimoradas, é a forma mais comum na produção de fungos entomopatogênicos,
inclusive em escala comercial. Neste tipo de substrato, o crescimento e a
conidiogênese do fungo se dão sobre o substrato solidificado pela presença do
ágar, por exemplo, ou de outros agentes solidificantes (Moino Jr., 2000). Essa
forma de produção de fungos tem sido utilizada para a manutenção rotineira de
12
isolados e a produção em pequena escala de conídios, visando estudos de
laboratório, bem como para a produção em média e grande escala, visando testes
de campo e comercialização. O fungo é produzido na superfície do meio sólido,
dentro de diferentes recipientes, conforme o objetivo e a escala da produção
(Leite et al., 2003).
A conidiogênese em substratos sólidos é vantajosa, pois a maioria dos
fungos, naturalmente, realiza este processo em substratos sólidos, além de ser
facilmente mantido em laboratório. Geralmente, os conídios produzidos dessa
maneira tendem a ser mais tolerantes a dissecações e mais estáveis em ambientes
secos, comparados àqueles produzidos em meio líquido (Jackson, 1997).
O sucesso no uso do meio sólido para a produção de fungos
entomopatogênicos deve-se tanto ao mercado existente para o produto em locais
com elevado desenvolvimento tecnológico quanto ao mercado baseado em
baixos custos operacionais, como é o caso da produção em países considerados
de terceiro mundo (Jackson, 1997).
Os conídios são os principais veículos para dispersão, transmissão e
persistência de fungos entomopatogênicos. Para que os conídios iniciem a
infecção, eles devem entrar em contato com a cutícula do inseto, germinar e,
então, realizar a penetração (James, 2001).
Para um controle efetivo, os conídios, que são as unidades infectantes,
devem possuir alta viabilidade (isto é, alta habilidade para germinar) e virulência
contra o inseto praga a ser controlado. Os efeitos de diversos fatores ambientais,
incluindo temperatura, umidade, luz e concentração de gases na estabilidade de
conídios entomopatogênicos, vêm sendo constantemente examinados. Assim
como a viabilidade, a virulência do conídio deve ser mantida, mesmo após erto
período de estocagem do fungo, para que ela seja considerado um agente de
controle microbiano efetivo (Daoust & Roberts, 1982).
13
A germinação do conídio é um fator de grande importância na
determinação da virulência de um fungo entomopatogênico. Drummond et al.
(1987) demonstraram que isolados de
L. lecanii mais virulentos germinaram
mais rápido na superfície do inseto que isolados pouco virulentos. Em diversos
experimentos com diferentes espécies de fungos, a utilização de conídios já
germinada induziu a uma taxa de mortalidade maior e infecção mais rápida do
que conídios não-geminados.
Experimentos baseados na determinação da viabilidade de conídios
sofrem algumas dificuldades e limitações, tais como a dificuldade na
diferenciação de conídios não-germinados entre vivos e mortos; o tempo e o
trabalho requeridos para um válido e completo estudo; a influência dos efeitos
ambientais e substratos na germinação (Firstencel et al., 1990).
Previamente aos bioensaios com fungos entomopatogênicos, torna-se
necessário o teste de viabilidade, que é feito, em geral, utilizando-se meio
batata-dextrose-ágar (BDA) ou agar-água (AA). Dependendo do meio em que
germinam, diferentes isolados de uma mesma espécie podem se comportar de
maneira diferente quanto à germinação (Francisco et al., 2003).
2.5 A família Aleyrodidae Westwood 1840
A família Aleyrodidae, à qual pertencem a mosca-branca e a mosca-
negra-dos-citros, inclui 166 gêneros e 1.551 espécies, divididas em duas
subfamílias viventes (Aleurodicinae e Aleyrodinae) e uma fóssil (Bernaeinae). A
classificação genérica dos insetos desta família é baseada em estruturas do
quarto instar larval, também chamada de “pupário”, e não em estruturas de
adultos (Evans, 2007). Uma grande vantagem dessa identificação é que os
pupários são sésseis, sendo possível coletar e identificar plantas hospedeiras com
insetos. Infelizmente, algumas espécies polífagas variam a aparência de seus
pupários, dependendo da forma da cutícula da planta hospedeira na qual se
14
desenvolveram. Esta variação tem causado um número significativo de
identificações erradas e, portanto, deduções de associações com plantas
hospedeiras devem ser feitas com cautela (Mound & Halsey, 1978, citados por
Byrne & Bellows Jr., 1991).
Os aleirodídeos estão amplamente distribuídos geograficamente e vivem
sobre um grande número de plantas silvestres e ornamentais. Entretanto,
diversas espécies têm sido apontadas como pragas de culturas de importância
econômica, por simplesmente sugarem a seiva das plantas, outras por
transmitirem viroses e substâncias toxicogênicas, por facilitarem o ataque de
patógenos ou proporcionarem o aparecimento de fumagina sobre seus dejetos
(Cassino & Nascimento, 1999).
Morfologicamente, os aleirodídeos são semelhantes aos pisilídeos, embora
ecologicamente sejam equivalentes, nos trópicos, com afídeos, insetos
oportunistas com populações transitórias. O aparato bucal é similar ao dos
pisilídeos, mas, em contraste com este, a antena possui menos antenômeros e as
asas posteriores menos nervuras (Mound & Halsey, 1978 citado por Byrne &
Bellows Jr., 1991).
2.5.1 Aleurocanthus woglumi Ashby 1915
O gênero Aleurocanthus pertence à subfamília Aleyrodinae e apresenta
cerca de 80 espécies, distribuídas por todas as regiões do globo, embora apenas a
espécie
Aleurocanthus woglumi Ashby, 1915 tenha relatos de ocorrência em
todas elas (Evans, 2007).
A mosca-negra-dos-citros,
A. woglumi, é originária do Sudoeste da Ásia e
encontra-se disseminada em grande parte do mundo (África, Américas do Norte,
Central e do Sul). O seu primeiro relato ocorreu na Flórida em 1934, sendo
erradicada com sucesso. Entretanto, em 1976, foi relatada novamente na área de
Lauderdale. Desta vez, a infestação ocorreu mais difusa e a sua erradicação
15
julgada mais difícil, se não impossível. Muitas vespas parasitóides foram
liberadas e duas delas realizaram excelente trabalho no controle da infestação.
Entre os hospedeiros preferidos de
A. woglumi estão a manga e os citros. Altas
infestações por mais de um ano podem causar rápida deterioração das frutíferas.
Esses aleirodídeos são mais comuns na metade inferior das árvores de citros
(Fasulo & Brooks, 2001).
Em 1999, a Instrução Normativa nº 38, do Ministério de Agricultura
Pecuária e Abastecimento (MAPA), apresentou uma lista de pragas
quarentenárias para o Brasil, considerando
A. woglumi como uma praga em
potencial, mas ainda não presente no país (Brasil, 1999). Entretanto, em
julho/2001, foi relatada a sua ocorrência no Pará (Oliveira et al., 2001), sendo,
posteriormente, registrada no Maranhão em 2003, nas cidades de Boa Vista do
Gurupi, Imperatriz e Bacabal, em pomar de citros com dez anos. Em 2004, ainda
no Maranhão, novos registros foram feitos em Barra do Corda e em São Luís,
em citros e mangueira, verificando-se, naquela ocasião, a presença de mais de
100 pupários/folha (Lemos et al., 2006). Em dezembro de 2007, na Instrução
Normativa nº 59, foi feita nova lista de pragas quarentenárias (A2), na qual há o
relato da ocorrência desta praga nos estados do Amapá, do Amazonas e de
Tocantins (Brasil, 2007).
Em 2008, um laudo do Instituto Biológico de São Paulo confirmou a
ocorrência dos primeiros focos da mosca-negra-dos-citros em pomares na região
noroeste do Estado de São Paulo (Porto, 2008).
Para o estado de Minas Gerais ainda não foi relatada a ocorrência desta
praga, mas, ainda assim, o Instituto Mineiro de Agropecuária (IMA) desenvolve
ações de prevenção. Nas últimas semanas, a preocupação com a mosca-negra
cresceu no país, devido à identificação de focos em São Paulo e em Goiás
(Agência Minas, 2008).
16
O impacto negativo da introdução da mosca-negra-dos-citros em regiões
produtoras de frutas pode ter conseqüências desastrosas, não somente sob o
ponto de vista econômico, mas, também, o ambiental. Isso se deve aos efeitos
que as medidas de controle adotadas podem ter sobre os recursos naturais quanto
ao dano da praga na flora nativa e, ainda, à sua possível adaptação a outras
espécies comerciais, no momento não consideradas hospedeiras (Barbosa &
Paranhos, 2004).
A mosca-negra-dos-citros representa uma ameaça à citricultura brasileira
por ser uma praga quarentenária de alerta máximo (Batista et al., 2002; Lemos et
al., 2006), uma vez que são desconhecidas as formas de controle. Até 2004,
ainda não existiam recomendação oficial e registro, no Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento do Brasil, de produtos inseticidas para o
controle dessa praga (Lemos et al., 2004). Entretanto, vários inseticidas foram
testados para o seu controle, tais como monocrotofós, oxydemeton-metil,
fosfamidon e dimetoato, que são os mais usados (Barbosa & Paranhos, 2004).
A mosca-negra ataca mais de 300 espécies de plantas (Nguyen & Hamon,
1993), tendo como hospedeiros principais citros, caju e abacate. Porém, em
elevada densidade populacional, os adultos se dispersam para outras plantas
hospedeiras, como roseiras, macieiras, cafeeiros, mangueiras, figueiras,
mangueiras, goiabeiras, bananeiras, videiras, mamoeiros, pereiras, marmeleiros
e romãzeiras (Oliveira et al., 2001).
Tanto os adultos como as formas imaturas da mosca-negra causam danos,
pois se alimentam de grande quantidade de seiva, deixando a planta debilitada,
levando-a ao murchamento e, em muitos casos, à morte. Além disso, eliminam
uma excreção açucarada, induzindo o aparecimento de fungos saprófitos que,
por serem escuros, formam a chamada fumagina que, em grande quantidade,
reveste folhas, frutos e ramos, reduzindo a fotossíntese, impedindo a respiração
da planta e diminuindo o nível de nitrogênio nas folhas. Em elevada quantidade,
17
a fumagina interfere na formação dos frutos, reduzindo seu valor comercial. Os
prejuízos podem variar de 20% a 80% na produção (Oliveira et al., 2001;
Barbosa & Paranhos, 2004).
A mosca-negra ocorre durante todo o ano, entretanto, a sua reprodução é
baixa nos meses mais frios e chuvosos (Barbosa & Paranhos, 2004). Os ovos,
que são alongados e de coloração branco-cremosa, são depositados em espiral na
face abaxial das folhas, em grupos de 35 a 50. As fêmeas põem, em média, 100
ovos durante seu ciclo de vida. A eclosão das ninfas ocorre em 4 a 12 dias,
dependendo do clima (Oliveira et al., 2001; Lemos et al., 2006). As ninfas
recém-eclodidas são claras e também achatadas, mas, em pouco tempo, tornam-
se escuras. No primeiro ínstar são bastante ativas, com seis pernas, movem-se
por um curto período de tempo e, depois, inserem as peças bucais nas folhas e
começa, então, a sugar a seiva elaborada. O quarto e último instar é denominado
pupário, que é brilhante e circundado por secreção cerosa branca, com grandes
cerdas dorsais (Barbosa & Paranhos, 2004). O adulto é preto, com tons cinza-
azulados; a fêmea mede 1,24 mm e o macho 0,99 mm de comprimento (Nguyen
& Hamon, 1993). O ciclo biológico, em condições naturais, varia de 54 a 103
dias, com quatro gerações ao ano (Martinez, 1983). A fecundidade e a
sobrevivência de
A. woglumi estão diretamente relacionadas com a planta
hospedeira e seu desenvolvimento é favorecido por temperaturas entre 28º e
32ºC e umidade relativa do ar elevada, entre 70% e 80% (Barbosa & Paranhos,
2004).
O inseto é capaz de voar até 187 metros em 24 horas. A disseminação da
praga pode também ocorrer por meio de folhas infestadas, carregadas pelo vento
(Barbosa & Paranhos, 2004).
Trabalhos recentes foram desenvolvidos pela agrônoma Márcia Reis Pena,
na Universidade Federal do Amazonas (UFAM), em parceria com a Escola
Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ), da USP, avaliando o ciclo de
18
desenvolvimento de A. woglumi e o uso do fungo Aschersonia sp., tendo sido
obtidos bons resultados quanto ao controle da mosca-negra em condições de
laboratório (Agência USP, 2008).
2.5.2 Bemisia tabaci (Gennadius, 1889)
Estimam-se, na família Aleyrodidae, mais de 1.200 espécies descritas,
sendo 37 reconhecidas como pertencentes ao gênero
Bemisia (Mound & Halsey,
1978, citados por Byrne & Bellows Jr., 1991).
Em geral, atingiam pequenas populações, até o início da década de 1970,
quando ocorreram níveis alarmantes destes insetos no norte do Paraná e sul de
São Paulo, devido, principalmente, ao aumento do plantio de soja, que também é
hospedeiro para este inseto (Gallo et al., 2002).
Atualmente,
B. tabaci (Gennadius) é um complexo com vários biótipos e
tem como hospedeiros diferentes espécies de plantas de importância econômica,
plantas ornamentais e plantas daninhas (Brown et al., 1995). Entre elas, merece
destaque
B. tabaci (Gennadius) biótipo "B", por ser cosmopolita e polífaga,
traduzindo-se em sério problema para uma vasta gama de culturas de
importância econômica e ornamental, tanto pelos danos causados de forma
direta, por meio da sucção de seiva, quanto pela transmissão de geminivírus
(Caballero, 1993). Além disso, é altamente resistente aos inseticidas
tradicionalmente utilizados no controle de moscas brancas, sendo responsável
por prejuízos que giram em torno de alguns bilhões de dólares/ano, bem como
por índices de desemprego no campo superiores a 30%. É considerada uma das
principais pragas do século XX (Ferreira & Ávidos, 1998).
A importância de
B. tabaci tem aumentado e isso tem sido associado à
introdução e dispersão do biótipo “B”, em vários países das Américas e da
Europa. O biótipo “B” diferencia-se do biótipo “A” por apresentar maior
fecundidade, maior número de hospedeiros, resistência a vários inseticidas e
19
capacidade de induzir anomalias fisiológicas às plantas, tais como o prateamento
das folhas de cucurbitáceas e o amadurecimento irregular de frutos do tomateiro,
que são anomalias não causadas por nenhum outro biótipo (Brown et al., 1995).
A primeira constatação da mosca branca,
B. tabaci biótipo B (=Bemisia
argentifolii
), no Brasil, foi feita no estado de São Paulo, no início dos anos 1990.
Naquela ocasião, surtos populacionais do inseto foram observados em plantas
ornamentais, principalmente poinsétia (
Euphorbia pulcherrima) e crisântemo
(
Chrysanthemum morifolium) e em lavouras de tomate (Lycopersicon
esculentum
) e de abóbora (Cucurbita moschata), causando as anomalias
conhecidas como amadurecimento irregular dos frutos do tomateiro e folha
prateada da aboboreira (Lourenção & Nagai, 1994).
No verão de 1997/98, surtos populacionais de
B. tabaci biótipo B foram
observados no norte do estado de São Paulo, nos municípios de Guaíra e
Miguelópolis, importante pólo agrícola com agricultura diversificada e irrigada e
uma das poucas áreas paulistas onde ainda não haviam sido observadas
infestações do inseto.
As moscas-brancas, ao se alimentarem no floema, causam danos diretos e
indiretos às plantas. Como dano direto ocorre a sucção de seiva, que influencia
no desenvolvimento da planta, afetando seu crescimento, sua capacidade de
produção e a qualidade do produto final, sejam frutos ou folhagens. Outro dano
importante é a produção do
honeydew que, ao se depositar sobre as folhas e
frutos, serve como substrato para o desenvolvimento de fungos de coloração
preta do gênero
Capnodium, que formam a fumagina e encobre as partes verdes
da planta
, diminuindo a área fotossintética e a qualidade dos frutos (Norman et
al., 1996).
São insetos pequenos, de 1mm de comprimento, que apresentam seus dois
pares de asas cobertos por uma pulverulência branca. Os ovos são colocados nas
faces inferiores das plantas, dos quais eclodem ninfas, que já iniciam a sucção
20
foliar, movimentando-se apenas no início, fixando-se de maneira semelhante às
cochonilhas. O ciclo completo dura cerca de 15 dias, sendo a longevidade das
fêmeas algo em torno de 18 dias. O biótipo “B” deste inseto pode colocar, em
média, 300 ovos/dia (Gallo et al., 2002).
Existem, atualmente, cerca de 70 vírus transmitidos pela mosca-branca em
todo o mundo, em diferentes culturas e plantas invasoras, segundo Gerling
(1996). O inseto tem alta capacidade de adaptação em relação a mudanças
climáticas e se multiplica em grande número de hospedeiros. Assim, esta
combinação de características possibilita a distribuição nas principais culturas
economicamente importantes no mundo. A interação vírus-vetor é o aspecto
principal de disseminação da praga e a contaminação do inseto se dá pela picada
e a sucção de seiva em uma planta por, no mínimo, 60 minutos, seguidas de um
período de adaptação do vírus no inseto por cerca de 5 horas, para que, então, o
inseto inicie a transmissão.
21
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material biológico
Foi utilizado um isolado de Aschersonia sp., obtido sobre cadáver de A.
woglumi
, proveniente da Faculdade de Ciências Agrárias da Universidade
Federal no Amazonas (UFAM).
Para a obtenção do extrato de substâncias cuticulares foram utilizados
imaturos de
Galleria mellonella (L., 1758) (LEPIDOPTERA: PYRALIDAE) e
de
Tenebrio sp. desidratados em estufa, a 80ºC, por cerca de duas horas. Após a
secagem, os insetos foram triturados e adicionados à água destilada, numa
concentração de 10% sobre o volume, que foi posteriormente fervida, em forno
de microondas, por 8 minutos (Neves, 1991, adaptado). Após a fervura, foram
adicionados os ingredientes que compõem cada meio de cultura, seguindo-se a
esterilização em autoclave, durante 20 minutos, a 121ºC, para posterior
utilização nos bioensaios.
O fungo foi inoculado, com o auxílio de uma alça de Drigalski, em cinco
placas com meio BDA (batata-dextrose-ágar), sendo incubado em câmara BOD
(26±1ºC, 14 horas de fotofase) por um período de 10 dias. Após esse período, os
fungos foram raspados do meio de cultura com a utilização de uma pequena
espátula, a fim de se obter inóculo em quantidade necessária para os
experimentos.
Nos bioensaios, foram utilizados insetos adultos de
B. tabaci biótipo “B”,
criados em vasos com uma planta de couve,
Brassica oleracea (L., 1758), em
casa de vegetação do Departamento de Entomologia da UFLA.
22
3.2 Inoculação dos isolados nos meios de cultura
O fungo produzido previamente foi inoculado em placas de Petri contendo
os meios observados na Tabela 1, cujas composições se encontram no Anexo.
Cada um deles foi considerado um tratamento e, para cada um, foram preparadas
8 placas. As placas foram acondicionadas em câmara BOD (26±1ºC, 14 horas de
fotofase) por um período de 12 dias. Após o décimo segundo dia, o fungo que
estava se desenvolvendo sobre o meio de cultura foi raspado e armazenado em
tubos Eppendorfs para posterior montagem dos experimentos.
TABELA 1 Tratamentos utilizados nos experimentos e suas respectivas siglas
Meio de cultura Sigla
Meio para esporulação ME
Sabouraud maltose ágar com extrato de levedura SMAY
Sabouraud dextrose ágar com extrato de levedura SDAY
Batata-dextrose-ágar BDA
Batata-dextrose-ágar + extrato de
Galleria mellonella (10%)
BDAGm
Batata-dextrose-ágar + extrato de
Tenebrio sp. (10%)
BDAT
3.3 Bioensaios
3.3.1 Viabilidade dos conídios
Após a produção do fungo Aschersonia sp. nos diferentes meios de
cultura, o mesmo foi raspado, com o auxílio de uma espátula e a concentração de
conídios determinada sob microscópio óptico, em câmara de Neubauer, Foram
preparadas suspensões padronizadas em 10
7
conídios/mL, em água destilada
mais espalhante adesivo (Tween) 0,01%. Foram espalhados 100 µL desta
suspensão, com auxílio da alça de Drigalski, em cinco placas de Petri, contendo
uma fina camada de meio ágar-água (AA), para cada um dos inóculos
provenientes de diferentes meios de cultura. Essas placas foram acondicionadas
em câmara BOD (26±1ºC, 14 horas de fotofase), por 24 horas (Alves, 1998).
23
Após o período de incubação, os conídios foram observados diretamente
sob microscópio óptico, sendo contados pelo menos 450 conídios em cada uma
das placas inoculadas, distinguindo-os entre germinados e não germinados. O
procedimento foi repetido três vezes e os dados expressos em percentual de
conídios germinados.
3.3.2 Crescimento radial das colônias
Os conídios foram inoculados em três pontos, distintos e eqüidistantes
entre si, na superfície dos meios em estudo, em oito placas de Petri, utilizando-se
de agulha de platina estéril. Estas placas foram posteriormente acondicionadas
em BOD (26±1ºC, 14 horas de fotofase), durante 12 dias. Após esse período, foi
avaliado o crescimento radial das colônias, por meio de duas medições
perpendiculares, resultando num diâmetro médio.
3.3.3 Conidiogênese
Para avaliar a produção de conídios nos diferentes meios de cultura, as
colônias que tiveram seu diâmetro mensurado foram coletadas com auxílio de
um estilete e colocadas em tubos de fundo chato contendo 10 mL de água
destilada com espalhante adesivo (Tween 80) 0,01%. Os conídios foram
desprendidos por meio de agitação em vórtex e, posteriormente, realizadas
diluições sucessivas para a contagem e a quantificação em câmara de Neubauer.
Os dados foram expressos em número de conídios por colônia (Alves, 1998).
3.3.4 Virulência sobre Bemisia tabaci
Para este bioensaio foram utilizados apenas três meios (BDA, BDAGm e
BDAT), pois, após a análise da produção de conídios em todos os meios, foram
descartados meios que, aparentemente, seriam boas soluções para a produção
massal de
Aschersonia sp., como, por exemplo, os meios SMAY e SDAY, que
24
apresentaram bons valores de crescimento radial, mas que, por outro lado,
obtiveram produção quase que insignificante de conídios.
Foram preparadas suspensões com o fungo produzido nos três meios
citados acima, utilizando-se água destilada mais espalhante adesivo (Tween80)
0,01%. Após a determinação da concentração de conídios sob microscópio
óptico, com auxílio de uma câmara de Neubauer, foram preparadas suspensões
com concentração padronizada em 10
8
conídios/mL, acrescentando-se água
destilada mais espalhante adesivo.
Em 10 placas de Petri de 18 cm de diâmetro, para cada meio de cultura,
foram colocadas folhas de couve aderidas ao meio
AA, sobre as quais cerca de
50 adultos de
B. tabaci foram dispostos.
Sobre os adultos, utilizando um pulverizador manual e duas bombas a
vácuo, do tipo de aquário, ligadas em série, foi aplicado 1 ml da suspensão
fúngica. Para a testemunha, o mesmo procedimento foi realizado, aplicando-se
água destilada mais espalhante adesivo (Tween80) 0,01%.
Após a inoculação, as placas foram acondicionadas em câmara BOD
(26±1°C, 14 horas de fotofase), por um período de 12 dias, sendo as avaliações
realizadas diariamente.
Os insetos mortos foram, então, lavados em álcool 70% e, depois, em
água destilada e transferidos para uma câmara úmida (placa de Petri, com 7cm
de diâmetro, com papel-filtro levemente umedecido), que foi colocada em um
pote plástico fechado contendo espuma umedecida com água destilada no seu
interior. Estes potes foram, então, incubados em câmara BOD (26±1ºC, 14 horas
de fotofase) por até 12 dias, para confirmar o agente causal de mortalidade, por
meio da conidiogênese.
25
3.3.5 Análise estatística
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado e os dados
obtidos analisados estatisticamente, quanto à variância (teste F) e as médias
comparadas entre si (teste de Scott-Knott), com 5% de significância, utilizando-
se o programa Sisvar (Ferreira, 2000).
26
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Viabilidade dos conídios
Diferenças significativas foram constatadas na viabilidade de conídios, no
qual foram observados dois grupos. No primeiro, apresentam-se os fungos
produzidos em meio SMAY e SDAY, com baixa viabilidade e, no segundo
grupo, encontram-se ME, BDA, BDAGm e BDAT (Tabela 2).
TABELA 2: Viabilidade de conídios de
Aschersonia sp. produzidos em
diferentes meios de cultura após incubação por 24 horas em BOD (temperatura
26±1ºC, 14 horas de fotofase).
Meios de cultura
Viabilidade (%)
1, 2
SMAY 64,2±4,4a
SDAY 65,6±4,1a
ME 76,3±6,7b
BDA 78,4±7,4b
BDAGm 78,7±6,5b
BDAT 83,3±7,6b
1
Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si, a 5% de significância,
pelo teste de Scott-Knott.
2
x
_
±EP(
x
_
)
Embora Alves (1998) tenha mencionado que a germinação pode ser
influenciada pela presença de nutrientes, como aminoácidos, esteróis e hexoses,
entre outros, foi testada a viabilidade do fungo sobre a superfície de um meio de
cultura sem qualquer adição desses compostos.
27
Outros nutrientes podem ser acrescentados aos meios de cultivo com o
objetivo de incrementar o crescimento e a conidiogênese dos fungos. O extrato
de levedura é bastante utilizado, por ser excelente fonte de vitaminas do
complexo B, de nitrogênio e de aminoácidos, entre outros (Wenzel et al., 2007).
Estes mesmos autores verificaram que a suplementação do meio com extrato de
levedura promove o crescimento e a conidiogênese de alguns isolados do fungo
L. lecani.
Nesse sentido, Boucias et al. (1988), estudando processos iniciais sobre a
infecção de fungos entomopatogênicos, reportaram que conídios podem ter
atividades enzimáticas diversas, especialmente sobre carboidratos e proteínas. A
síntese e a secreção de tais enzimas dependem dos mecanismos de
indução/repressão gênicos, altamente influenciados pelo meio de cultura em que
os mesmos se encontram.
Hallsworth & Magan (1995), testando isolados de
Metarhizium anisopliae
(Metsch) Sorok, B. bassiana e Paecilomyces farinosus (Holmsk.) Brown &
Smith, constataram que o crescimento do tubo germinativo ocorreu mais
rapidamente nos conídios que possuíam altas concentrações intracelulares de
glicerol e eritritol; visto que as concentrações intracelulares desses componentes
são determinadas pelo meio de cultura do fungo, foi possível a correlação do
meio de cultura utilizado com a viabilidade dos conídios pelos autores.
Resultados contraditórios são freqüentemente publicados acerca da fase
de germinação de conídios. Algumas espécies são capazes de germinar
utilizando somente seus próprios nutrientes, enquanto outras necessitam de um
suplemento nutricional exógeno. Isso demonstra a necessidade de serem
realizados outros experimentos visando constatar a correlação direta entre
componentes cuticulares e a viabilidade de conídios, visto que todos os isolados
foram mantidos nas mesmas condições (temperatura, fotofase, período de
28
incubação e umidade), desconsiderando, portanto, a interferência de algum fator
ambiental sobre tais dados obtidos.
Mansilla & Alvarez (2005a) observaram porcentagens de conídios viáveis
de acordo com o meio no qual o fungo fora produzido, sendo o fungo produzido
em grãos de arroz o único a atingir viabilidade superior a 90%. Para os outros
meios utilizados, arroz + resíduos de soja, farinha de milho + resíduos de soja e
trigo moído, os resultados observados foram de 89%, 88% e 69%,
respectivamente.
4.2 Crescimento radial de colônias
Verificou-se que os meios de cultura testados são fatores determinantes no
perfil de crescimento do fungo
Aschersonia sp., visto que a adição de certos
componentes ao meio de cultura aumenta significativamente o diâmetro das
colônias.
Comparando-se os meios de cultura, aquele no qual o fungo apresentou o
maior crescimento radial, após 12 dias de incubação em câmara BOD (26±1
o
C e
14 horas de fotofase), foi o meio BDAT, seguido pelos meios SMAY, SDAY e
BDAGm, mas que não apresentaram diferenças entre si. O diâmetro das colônias
de fungos produzidas em meio ME atingiu valores inferiores. Entretanto, o
menor valor quanto ao diâmetro médio de colônias foi obtido a partir da
produção em BDA (Tabela 3).
Fungos que possuem maior e mais rápido crescimento são vantajosos no
controle biológico, pois a infecção do hospedeiro torna-se mais rápida e efetiva e
maior crescimento das hifas acarreta maior formação de metabólitos secundários
pelo fungo, dentre os quais as toxinas. Além disso, possibilita a produção em
larga escala, visando à obtenção de um produto comercial.
29
TABELA 3: Crescimento radial de colônias do fungo Aschersonia sp. produzido
em diferentes meios de cultura, após 10 dias de incubação em BOD (temperatura
26±1
o
C, 14 horas de fotofase).
Meios de cultura
Diâmetro médio (mm)
1,2
BDA 9,9±1,3a
ME 11,0±1,3b
BDAGm 11,9±1,0c
SDAY 11,9±1,7c
SMAY 12,5±1,0c
BDAT 13,8±0,6d
1
Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si, a 5% de significância,
pelo teste de Scott-Knott.
2
x
_
±EP(
x
_
)
Mansilla & Alvarez (2005b) produziram o fungo
A. aleyrodis em
diferentes meios BDA e SDAY e observaram valores de crescimento radial
equivalentes a 9-16 e 9-15 mm, respectivamente, que foram maiores em relação
ao valor obtido em ME, com crescimento radial de 5-9 mm. Estes resultados
diferem dos encontrados no presente trabalho, uma vez que o fungo produzido
em meio BDA atingiu valores menores que aquele produzido em ME ou SDAY.
4.3 Conidiogênese
Os meios de cultura SMAY e SDAY produziram, por colônia, valores
inferiores a 10
6
conidíos (Tabela 4), seguidos pela produção das colônias de
Aschersonia sp. cultivadas em meio ME. O fungo cultivado em meio BDA e
meio BDAGm atingiu valores maiores, mas que não diferiram entre si. As
colônias com maior produção de conídios foram observadas quando o fungo foi
produzido em meio BDAT.
30
O aumento na conidiogênese do fungo Aschersonia sp. pode estar
relacionado com o aumento das fontes de nutrientes proporcionado pela adição
de
Tenebrio sp. ou G. mellonella desidratados ao meio de cultura.
TABELA 4: Número de conídios do fungo
Aschersonia aleyrodis por unidade
de colônia, após 10 dias de incubação em BOD (temperatura 26±1
o
C,
fotoperíodo 14 horas), em diferentes meios de cultura.
Meios de cultura
Conídios/colônia (10
6
)
1,2
SDAY 0,22±0,13a
SMAY 0,38±0,09a
ME 2,20±0,39b
BDA 3,47±0,76c
BDAGm 4,10±0,96c
BDAT 4,80±1,43d
1
Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si, a 5% de significância,
pelo teste de Scott-Knott.
2
x
_
±EP(
x
_
)
Resultados obtidos por Santoro et al. (2005) indicaram que a presença de
farinha de crisálida do bicho-da-seda, tanto sozinha quanto combinada ao meio
BDA, aumentou a conidiogênese de
B. bassiana. Resultados semelhantes foram
encontrados por Neves (1991), ao adicionar o mesmo composto à batata, para o
fungo
Nomuraea rileyi Farlow.
Ao contrário do presente trabalho, Neves (1991) relatou melhor
conidiogênese para o meios SMAY, usando como justificativa a diferença que
existe entre as várias etapas de crescimento. Para o fungo produzido em meio
SMAY, a fase que antecede a formação de esporos dura mais tempo que quando
produzida em outros meios, como o BDA.
31
Mansilla & Alvarez (2005a) também constataram diferentes valores de
produção de conídios quando o fungo
A. aleyrodis foi produzido em diferentes
meios de cultura, tais como SDAY, BDA e ME, observando valores iguais a 10
8
,
10
8
e 10
5
conídios/ml, respectivamente. Estes resultados diferem do presente
trabalho, provavelmente devido ao tempo de produção, que foi maior no
trabalho de Mansilla & Alvarez (2005a), pois, como mencionado por Neves
(1991), há diferenças entre as etapas de crescimento. O fungo produzido em
meio SDAY leva mais tempo parar começar a conidiogênese.
Os meios SMAY e SDAY, devido à presença de extrato de levedura e da
peptona, são ricos em nitrogênio, semelhante ao meio ME. Entretanto, este não
parece ser um componente essencial para a conidiogênese ou, até mesmo,
prejudica este processo para o fungo
Aschersonia sp., necessitando de mais
pesquisas para esta comprovação.
Neves (1991) também relatou uma significativa melhora à conidiogênese
de
B. bassiana, quando foram adicionados componentes cuticulares ao meio
BDA.
Mansilla & Alvarez (2005b) também observaram diferenças nas
concentrações de conídios de
A. aleyrodis, quando produzidos em diferentes
meios de cultura, observando concentrações que variaram entre 1,1 x 10
6
,
quando produzidos em trigo moído e 4,1 x 10
8
conídios/mL, quando produzidos
em grãos de arroz.
Como os conídios são as unidades infectivas dos fungos
entomopatogênicos, a produção rápida e em grandes quantidades de conídios,
tanto em meios de cultura artificiais quanto durante o processo de conidiogênese
no cadáver, potencializa o uso de determinado isolado em planos de manejo (Liu
et al
., 2003; Arthurs & Thomas, 2001).
Sosa-Gomez & Alves (2000) ressaltam, em seu trabalho, que a produção
de conídios é um evento multifatorial, dependente da umidade relativa, da
32
temperatura, do isolado, do hospedeiro ou da composição do meio de cultura e
do tempo.
Os meios de cultura, devido à sua composição, influenciam no
desenvolvimento e na conidiogênese de fungos, de acordo com a necessidade
que esses microrganismos têm de fontes de carbono, nitrogênio, enxofre, ferro,
sódio, potássio e outros minerais (Leite et al., 2003).
As diferenças de comportamento no crescimento e na produção de
conídios dos fungos estão intimamente ligadas à composição do meio e à
capacidade de assimilação dos nutrientes neles encontrados. A esta informação
pode-se adicionar o fato de que alguns meios de cultura, considerados
compostos, possuem a sua composição química ignorada, como, por exemplo,
extratos de carne e levedura (Mayea, 1981, citado por Mansilla & Alvarez,
2005a) e, no caso específico deste trabalho, extrato de
Tenebrio sp. e G.
mellonella
.
4.4 Virulência
Os três inóculos testados (produzidos em BDA, BDAGm e BDAT)
apresentaram atividade patogênica para
B. tabaci. Os inóculos produzidos em
meio BDAT e em BDAGm apresentaram-se mais virulentos que o fungo
produzido em BDA sem a adição de qualquer outro componente (Tabela 5).
33
TABELA 5: Mortalidade confirmada de Bemisia tabaci pelo fungo Aschersonia
aleyrodis
produzido em diferentes meios de cultura.
Meios de cultura
Mortalidade (%)
1,2
BDA 63,0±4,3a
BDAGm 80,0±6,3b
BDAT 85,6±4,4b
1
Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si, a 5% de significância,
pelo teste de Scott-Knott.
2
x
_
±EP(
x
_
)
A composição da cutícula de insetos varia de acordo com a espécie e o
estágio de vida. Gupta et al. (1992) observaram que a maneira como o fungo
desempenha as suas funções está ligada especialmente à regulação da síntese
enzimática. Portanto, tais valores relativamente elevados de mortalidade
confirmada para os fungos produzidos em meios contendo insetos podem ser
atribuídos à regulação da produção enzimática, embora pesquisas mais
aprofundadas sejam necessárias para esta confirmação.
Conforme Hajaek & St. Leger (1994), considera-se como parâmetro de
seletividade de fungos valores de mortalidade total maior que 60%,
possibilitando o seu uso em futuros programas de manejo.
Tais resultados diferem dos obtidos por Neves & Alves (1995), que não
observaram diferença significativa quanto à virulência de
N. rileyi para a lagarta-
da-soja
Anticarsia gemmatalis Hübner, 1818 (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE),
quando este foi cultivado em meio acrescido de farinha de crisálida de
Bombyx
mori
L., 1758 (LEPIDOPTERA: BOMBICIDAE).
Os fungos entomopatogênicos têm sua virulência reduzida após passagens
sucessivas por meios de cultura artificiais. Daoust & Roberts (1982)
demonstraram o reestabelecimento e, em alguns casos, um aumento da
34
virulência de isolados de M. anisopliae, após passagem por larvas de Culex
pipiens
L., 1758 (DIPTERA: CULICIDAE). Tal aumento permaneceu estável,
mesmo após algumas inoculações em meios de cultura artificiais e novos
experimentos, sendo semelhante ao aqui observado, após a produção do fungo
em meio enriquecido com cutícula do inseto. Além disso, segundo James (2001),
uma fonte exógena de nitrogênio estimula um crescimento mais efetivo,
favorecendo a virulência do fungo.
35
5 CONCLUSÕES
Existe efeito da composição do meio de cultura sobre os aspectos
biológicos do fungo
Aschersonia sp.
Os inóculos fúngicos avaliados apresentam atividade patogênica para
Bemisia tabaci.
A adição de componentes cuticulares de insetos tem influência positiva
na virulência de
Aschersonia sp. sobre Bemisia tabaci.
36
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O fungo Aschersonia sp. pode ser considerado um importante agente de
controle biológico. Porém, há a necessidade da realização de mais estudos,
principalmente quanto a sua produção, pois, embora alguns meios testados nesse
trabalho tenham influenciado de maneira positiva a viabilidade, o crescimento, a
conidiogênese e a virulência sobre
Bemisia tabaci, ainda não é possível,
utilizando-se dessas formas de produção, realizar o controle biológico de pragas,
o que demanda produção em mais larga escala.
Entretanto, os meios BDAGm e BDAT podem ser utilizados como bons
pontos de partida para o desenvolvimento de meios alternativos, sejam eles
líquidos, sólidos ou bifásicos, dando-se, ainda, preferência para o meio BDAT,
que é obtido a partir de extratos de um inseto que é de fácil manutenção em
condições de laboratório e pode apresentar custo de produção cerca de cinco
vezes menor que o meio BDAGm.
Quanto à manutenção deste fungo em condições de laboratório, os meios
BDA e ME são os mais indicados, principalmente devido à facilidade de
produção e ao preço relativamente baixo
.
37
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AGÊNCIA MINAS. Ações do IMA previnem ocorrência da mosca negra dos
citros.
Noticias do Governo do Estado de Minas Gerais. 2008. Disponível em:
<http://www.agenciaminas.mg.gov.br/
detalhe_noticia.php?cod_noticia=18450>. Acesso em: 10 abr. 2008.
AGÊNCIA USP.
Mosca-negra que ataca plantações é alvo de estudo na
Esalq
. Universidade de São Paulo: USP, 2008. Disponível em:
<http://www2.usp.br/index.php/ciencias/36-ciencias/360-praga>. Acesso em: 15
maio 2008.
ALVES, S. B. Fungos entomopatogênicos. In: ALVES, S.B. (Ed.).
Controle
microbiano de insetos
. Piracicaba: Fealq, 1998.
ALVES, S. B.; ALMEIDA, J. E. M.; MOINO JR, A.; ALVES, L. F. A.
Técnicas de laboratório. In: ALVES, S.B. (Ed.).
Controle microbiano de
insetos
. Piracicaba: Fealq, 1998.
ARTHURS, S.; THOMAS, M. B. Effects of Temperature and relative humidity
on sporulation of
Metarhizium anisopliae var. acridum in mycosed cadavers of
Schistocerca gregaria. Journal of Invertebrate Pathology, v. 78, n. 2, p. 59-
65, 2001.
AZEVEDO, J. L.; MESSIAS, C. L. Aspectos genéticos do controle biológico de
insetos por fungos. In: ______.
Genética de microrganismos em biotecnologia
e engenharia genética
. Piracicaba: Fealq, 1985.
BARBOSA, F. R.; PARANHOS, B. J. Ameaça negra.
Revista Cultivar
Hortaliças e Frutas,
n. 25, 2004. Disponível em:
<http://www.grupocultivar.com.br/artigo.asp?id=670>. Acesso em: 26 mar.
2008.
BATISTA, T. F. C.; RODRIGUES, R. C.; OHASHI, O. S.; SANTOS, M. M. L.
S.; OLIVEIRA, F. C.; SOARES, A. C.; LIMA, W. G.; CASTRO, C. V. B.
Identificação de fungos entomopatogênicos para o controle da mosca-negra-dos-
citros
Aleurocanthus woglumi Ashby (Hemiptera: Homoptera: Aleyrodidae).
38
Praga quarentenária. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE FRUTICULTURA,
17., 2002. Belém.
Anais... Belém: Sociedade Brasileira de Fruticultura. 2002.
BOLCKMANS, G.; STERK, J.; EYAL, J.; SELS, B.; STEPMAN, W. Preferal,
(
Paecilomyces fumosoroseus strain apopka 97), a new microbial insecticide for
the biological control of whiteflies in greenhouses.
Mededelingen - Faculteit
Landbouwkundige
, Bélgica, v. 60, p. 707–711, 1995.
BOUCIAS, D. G.; PENDLAND, J. C.; LATGE, J. P. Nonspecific factors
involved in attachment of entomopathogenic deuteromycetes to host insect
cuticle.
Applied and Environmental Microbiology, v. 54, p. 1795-1805, 1988.
BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento.
Instrução Normativa
SDA Nº 38
, de 14 de outubro de 1999. Lista de pragas quarentenárias A1, A2 e
as não quarentenárias regulamentadas. Brasília. Disponível em:
<http://www.cenargen.embrapa.br/segbio/quarentena/arquivos/instnorm38.pdf.>
. Acesso em: 8 abr. 2008.
BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento.
Instrução Normativa
SDA Nº 59
, de 20 de dezembro de 2007. Lista de Pragas Quarentenárias
Presentes – (A2). Brasília. Disponível em: <http://www.jki.bund.de/nn_933804/
SharedDocs/07__AG/Publikationen/internat/br/br3-in2007-59.pdf,templateId
=raw,property=publicationFile.pdf/br3-in2007-59.pdf.>. Acesso em: 8 abr.
2008.
BROWN, J. K.; FROHLICH, D. R.; ROSSELL, R.C. The sweet potato or
silverleaf whiteflies: biotypes of
Bemisia tabaci or a species complex? Annual
Review of Enthomology
, v. 40, p. 511–534, 1995.
BYRNE, D. N.; BELLOWS Jr., T. S. Whitefly biology
. Annual Review of
Enthomology
, v. 36, p. 431-457, 1991.
CABALLERO, R. Moscas blancas neotropicales (Homoptera: Aleyrodidae):
hospedantes, distribucion, enemigos naturales e importancia economica. In:
HILJE, L.; ARBOLEDA, O.;
Las moscas blancas (Homoptera: Aleyrodidae)
en América Central y el Caribe
, Turrialba, Costa Rica: CATIE. 1993. p. 10-
15. (Série Técnica. Informe Técnico, 205).
CASSINO, P. C. R.; NASCIMENTO, F. N. Aleirodídeos (Homoptera:
Aleyrodidae) em plantas cítricas no Brasil: Distribuição e identificação.
Anais
da Sociedade Entomológica do Brasil,
v. 28, p. 75-83, 1999.
39
CHENARKI, A. M.; SOSA-GOMEZ, D. R.; ALMEIDA, L. M.; SOCCOL, C.
R. Susceptibilidade de
Alphitobius diaperinus (Coleoptera: Tenebrionidae) a
fungos entomopatogênicos. In: SIMPÓSIO DE CONTROLE BIOLÓGICO,
Sincobiol, 7., 2001, Poços de Caldas.
Anais… Poços de Caldas, MG:
UFL/Embrapa, 2001.p. 422.
CRAWFORD, P. J.; BROOKS, W. M.; ARENDS, J. J. Efficacy of field-
isolated strains of
Beauveria bassiana as microbial control agents of the lesser
mealworm
. Journal of Economic Entomology, v. 91, n. 06, p. 1295-1301,
1998.
DAOUST, R. A.; ROBERSTS, D. W. Virulence of natural and insect-passaged
strains of
Metarhizium anisopliae to mosquito larvae. Journal of Invertebrate
Pathology
, v. 40, p. 170-117, 1982.
DOLINSKI, C.; LACEY, L. A. Microbial control of arthropod pests of tropical
tree fruits.
Neotropical Entomology, v. 36, n. 2, p. 161-179, 2007.
DRUMMOND, J.; HEALE, J. B.; GILLESPIE, A. T. Germination and effects
of reduced humidity on expression of pathologinicity in
Verticillium lecanii
against the glasshouse whitefly Trialeurodes vaporariorum. Annals of Applied
Biology,
v. 111, p. 193-201, 1987.
EVANS, G. A.
The whiteflies (Hemiptera: Aleyrodidae) of the world and
their host plants and natural enemies.
USDA/Animal Plant Health Inspection
Service (APHIS), 2007. 73p. Disponível em: <
http://www.sel.barc.usda.gov:591/1WF/World-Whitefly-Catalog.pdf >. Acesso
em: 10 jan. 2008.
EVANS, H. C.; HYWEL-JONES, N. Aspects of the genera
Hypocrella and
Aschersonia as pathogens of coccids and whiteflies. In: INTERNATIONAL
COLLOQUIUM ON INVERTEBRATE PATHOLOGY AND MICROBIAL
CONTROL, 5., 1990, Adelaide.
Proceeding… Adelaide: Society for
Invertebrate Pathology, 1990. p. 111–115.
FARIA, M. R.; MAGALHÃES, B. P. O uso de fungos entomopatogênicos no
Brasil.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, Brasília, v.22, set./out.
2001.
FASULO, T. R.; BROOKS, R. F.
Whitefly pests of citrus. Flórida: University
of Florida/ Department of Entomology and Nematology/Florida Department of
Agriculture and Consumer Services/Division of Plant Industry, 2001.
40
FERREIRA, D. F. Análises estatísticas por meio do Sisvar para Windows
versão 4.0. In: REUNIÃO ANUAL DA REGIÃO BRASILEIRA DA
SOCIEDADE INTERNACIONAL DE BIOMETRIA, 45., 2000, São Carlos.
Anais... São Carlos, SP: UFSCar, 2000. p. 255-258.
FERREIRA, L. T.; ÁVIDOS, M.F.D. Mosca branca: presença indesejável no
Brasil.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, Uberlândia, MG, v. 4, p.
22-26, 1998.
FIRSTENCEL, H.; BUTT, T. M.; CARRUTHERS, R. I. A fluorescence
microscopy method for determining the viability of entomophthoralean fungal
spores
. Journal of Invertebrate Pathology, v. 55, p. 258-264, 1990.
FRANCISCO, E. A.; MOCHI, D. A.; CORREIA, A. D. B.; MONTEIRO, A. C.
Influência de meios de cultura utilizados em teste de viabilidade para isolados de
Verticillium lecanii . SIMPÓSIO DE CONTROLE BIOLÓGICO, Sincobiol, 8.,
2003, São Pedro.
Anais... São Pedro, SP: FIOCRUZ/UFP/UFRP, 2003.
FRANSEN, J. J. Survival of spores of the enthomopatogenic fungus
Aschersonia aleyrodis (Deuteromycotina: Coelomycetes) on leaf surfaces.
Journal of Invertebrate Pathology, v. 65, p. 73-75, 1995.
GALLO, D.; NAKANO, O.; SILVEIRA NETO, S.; CARVALHO, R. P. L.;
BAPTISTA, G. C.; BERTI FILHO, E.; PARRA, J. R. P.; ZUCCHI, R. A.;
ALVES, S. B.; VENDRAMIN, J. D.; MARCHINI, L. C.; LOPES, J. R. S.;
OMOTO, C.
Entomologia agrícola. Piracicaba: Fealq, 2002. 920p.
GERLING, D. Status of
Bemisia tabaci in the mediterranean countries:
opportunities for biological control.
Biological Control, n. 6, p. 11-22, 1996.
GUPTA, S. C.; LEATHERS T. D.; EL-SAYED G. N.; IGNOFFO C. M. Insects
cuticle-degrading enzymes from the entomopathogenous fungus
Beauveria
bassiana.
Experimental Mycology, v. 16, p. 132-137, 1992.
HAJAEK, A. K.; ST. LEGER, R. J. Interactions between fungal pathogens and
insects host.
Annual Review of Entomology, n. 39, p. 293-322, 1994.
HALLSWORTH, J. E.; MAGAN, N. Manipulation of intracellular glycerol and
erythitol enhances germination of conidia at low water availability.
Microbiology, v. 141, p. 1109-1115, 1995.
41
HEALE J. B.; ISAAC, J. E.; CHANDLER D. Prospects for strain improvement
in entomopathogenic fungi.
Pesticide Science, v. 26, n. 1, p. 79-92, 1989.
JACKSON, M. A. Optimizing nutricional conditions for the liquid culture
production of effective fungal biological control agents.
Journal of Industrial
Microbiology & Biotechnology
, v. 19, p. 180-187, 1997.
JAMES, R. R. Effects of exogenous nutrients on conidial germination and
virulence against the silverleaf whitefly for two hyphomycetes
. Journal of
Invertebrate Pathology,
v. 77, p. 99-107, 2001.
LACEY, L. A.; FRANSEN, J. J.; CARRUTHERS, R. Global distribution of
naturally occurring fungi of
Bemisia, their biologies and use as biological
control agents. In: GERLING, D.; MAYER, R. T.
Bemisia: taxonomy, biology,
damage, control and management. Andover, UK: Intercept, 1996.p. 401-433.
LEAL, S. C. M.; BERTIOLI, D. J.; BUTT, T. M.; CARDER, J. H.; BURROWS,
P. R.; PEBERDY, J. F. Amplification and restriction endonuclease digestion of
the pr1 gene for the detection and characterization of
Metarhizium strains.
Mycology Research, v. 101, p. 257-265, 1997.
LECUONA, R.; RIBA, G.; CASSIER, P.; CLEMENT, J. L. Alternation of
insects epicuticular hidrocarbon during infection with
Beauveria bassiana or B.
brongniartii.
Journal of Invertebrate Pathology, v. 58, p. 10-18, 1991.
LEITE, L. G.; BATISTA FILHO, A.; ALMEIDA, J. E. M.; ALVES, S. B.
Produção de fungos entomopatogênicos. Ribeirão Preto: Livroceres, 2003.
LEMOS, R. N. S.; SILVA, G. S.; ARAÚJO, J. R. G.; CHAGASI, E. F.;
MOREIRA, A. A.; SOARES, T. M. Ocorrência de
Aleurocanthus woglumi
Ashby (Hemiptera: Aleyrodidae) no Maranhão. Neotropical Entomology, v. 35,
n. 4, p. 558-559, 2006.
LEMOS, W. P.; VELOSO, C. A. C.; RIBEIRO, S. I.
Identificação e controle
das principais pragas em pomares de citros no Pará.
2004. (Comunicado
Técnico, 119). Disponível em:
<http://www.cpatu.embrapa.br/publicacoes_online/ comunicado-
tecnico/2004/identificacao-e-controle-das-principais-pragas-em-pomares-de-
citros-no-para-com-tec-119/at_download>. Acesso em: 26 mar. 2008.
LIU, H.; SKINNER, M.; BROWNBRIDGE, M.; PARKER, B. L.
Characterization of
Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae isolates for
42
management of tarnished plant bug, Lygus lineolaris (Hemiptera: Miridae).
Journal of Invertebrate Pathology, v. 82, n. 3, p. 139-147, 2003.
LIU, M.; CHAVERRI, P.; HODGE, K. T. A taxonomic revision of the insect
biocontrol fungus
Aschersonia aleyrodis, its allies with white stromata and their
Hypocrella sexual states. Mycological Research, n. 110, p. 537 -554, 2006.
LOURENCAO, A. L.; NAGAI, H.. Outbreaks of Bemisia tabaci in the São
Paulo State, Brazil.
Bragantia, Campinas, v. 53, n. 1, p. 53-59, 1994.
MANSILLA, A. A. H.; ÁLVAREZ, C. R. Evaluación preliminar del
crecimiento y la esporulación de
Aschersonia aleyrodis webber en medios de
cultivo convencionales
. Fitosanidad, v. 9, n. 3, p. 61-63, 2005a.
MANSILLA, A. A. H.; ÁLVAREZ, C. R. Medios de cultivo para la
reproducción masiva de
Aschersonia aleyrodis Webber. Fitosanidad, v. 9, n. 4,
p. 21-28, 2005b.
MARTÍNEZ, N. B. Biologia de la mosca prieta de los cítricos
Aleurocanthus
woglumi
(homoptera: aleyrodidae) en el campo. Agronomia Tropical, v. 31, p.
211-218, 1983.
MEEKES, E. T. M.; VAN VOORST, S.; JOOSTEN, N. N.; FRANSEN, J. J.;
VAN LENTEREN, J. C. Persistence of the fungal whitefly pathogen
Aschersonia aleyrodis, on three different plant species. Mycology Research, v.
104, n. 10, p. 1234-1240, Oct. 2000.
MEEKES, E. T. M.; FRANSEN, J. J.; VAN LENTEREN, J. C. Pathogenicity
of
aschersonia spp. against whiteflies Bemisia argentifolii and Ttrialeurodes
vaporariorum
. Journal of Invertebrate Pathology, v. 81, n. 1, p. 1-11, Sept.
2002.
MELO, I. S.; AZEVEDO, J. L. Controle microbiano de insetos-praga e seu
melhoramento genético. In: AZEVEDO, J. L.
Controle biológico. Jaguariúna,
SP: EMBRAPA, 1998.
MOINO Jr, A. Produção de fungos, vírus e bactérias entomopatogênicas. In:
BUENO, V. H. P.;
Controle biológico de pragas: produção massal e controle
de qualidade
. Lavras: UFLA, 2000.
43
NARANJO, S. E. Conservation and evaluation of natural enemies in ipm
systems for
Bemisia tabaci. Crop Prot., v. 20, p. 835–852, 2001.
NEVES, P. M. O. J.; ALVES, S. B. Produção de Nomuraea rileyi (Farlow)
Samson em meios à base de farinha de crisálida do bichio-da-seda.
Anais da
Sociedade Entomológica do Brasil,
Londrina, v. 24, n. 3, p. 605-612, 1995.
NEVES, P. M. O. J.
Produção de Nomuraea rileyi (FARLOW) SAMSON e
Beauveria basiana (BALS.) VUILL. utilizando meis de cultura à base de
farinha-de-crisálida do bicho-da-seda Bombyx mori L., 1758.
1991. 152p.
Dissertação (Mestrado em Entomologia) - Escola Superior de Agricultura “Luiz
de Queiroz”, Piracicaba, SP.
NGUYEN, R.; HAMON, A. B. Citrus blackfly, Aleurochantus woglumi Ashby
(Homoptera: Aleyrodidae).
Entomology Circular, Florida: Department of
Entomology and Nematology, Division of Plant and Industry, v. 360, p. 1-4,
1993.
NORMAN, J. W.; RILEY, D. G.; STANSLY, P. A.; ELLSWORTH, P. C.;
TOSCANO, N. C.
Management of silverleaf whitefly: a comprehensive
manual on the biology, economic impact and control tactics. Washington:
USDA. 1996.
OLIVEIRA, M. R.V.; HENNEBERRY, T. J.; ANDERSON, P. History, current
status, and collaborative research projects for
Bemisia tabaci. Crop Protection,
v. 20, n. 9, p. 709-723, Nov. 2001.
PORTO. G. Laudo confirma ocorrência de mosca-negra-dos-citros em SP.
Agência Estado. Disponível em:
<http://www.ae.com.br/institucional/ultimas/2008/mar/24/2468.htm>. Acesso
em: 7 abr. 2008.
SANTORO, P. H.; NEVES, P. M. O. J.; SILVA, R. Z.; AKIMI, S.; ZORZETTI,
J. Produção de esporos de Beauveria bassiana (Bals). Vuill. num processo
bifásico utilizando diferentes meios líquidos.
Semina: Ciências Agrárias,
Londrina, v. 26, n. 3, p. 313-320, 2005.
SCHRANK, A.; BASSANESI, M. C.; PINTO, J. R.; COSTA, S.V.; BOGO, M.
R.; SILVA, M. S. N. Superoxide dismutases in the entomopathogenic fungus
Metarhizium anisopliae. Ciências e Cultura, v. 45, p. 200-205, 1993.
44
SHIMIZU, S.; TSUCHITANI, Y.; MATSUMOTO, T. Serology and substrate
specificity of extracellular proteases from four species of entomophatogenic
hyphomycetes.
Journal of Invertebrate Pathology. Amsterdam: Elsevier, v.
61, n. 2, p. 192-195, 1992.
SOSA-GOMEZ, D. R.; ALVES, S. B. Temperature and relative humidity
requirements for conidiogenesis of
Beauveria bassiana (Deuteromycetes:
Moniliaceae).
Anais da Sociedade Entomológica do Brasil, Londrina, v. 29,
n. 3, p. 515-521, 2000.
ST. LEGER, R. J.; DURRANDS, P. K.; COOPER, R. M.; CHARNLEY, A. K.
Regulation of production o f proteolytic enzymes by the entomopathogenic
fungus
Metarhizium anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology, v. 150, p.
413-416, 1988.
St. LEGER, R.J.; BUTT, T. M.; STAPLES, R. C.; ROBERTS, D. W. Synthesis
of proteins including a cuticle-degrading protease during differentiation of the
entomopathogenic fungus
Metarhizium anisopliae. Experimental Mycology, v.
13, p. 253-262, 1989.
WENZEL, I. M.; MONTEIRO, A. C.; PEREIRA, G. T. Performance of
Lecanicillium lecanii culture media containing vitamins and yeast extract
concentrations.
Bragantia, Campinas, v. 66, n. 3, p. 413-421, 2007.
45
ANEXOS
Meios de cultura
Os meios de cultura foram produzidos com base na composição descrita por
Alves et al. (1998).
Batata-dextrose-ágar (BDA)
Batata para a extração de amido------------------------------------------200g
Dextrose ---------------------------------------------------------------------20g
Ágar --------------------------------------------------------------------------15g
Água destilada (q.s.p.) ------------------------------------------------1000mL
As batatas foram picadas e cozidas em água destilada e, posteriormente,
filtradas. Ao filtrado foram adicionados os componentes restantes do meio, que
foi esterilizado, a 121ºC, por 20 minutos.
Sabouraud dextrose ágar com extrato de levedura – modificado (SDAY)
Peptona bacteriológica ----------------------------------------------------10g
Dextrose ---------------------------------------------------------------------40g
Extrato de levedura---------------------------------------------------------10g
Ágar --------------------------------------------------------------------------15g
Água destilada (q.s.p.) ------------------------------------------------1000mL
46
Sabouraud maltose ágar com extrato de levedura – modificado (SMAY)
Peptona bacteriológica ----------------------------------------------------10g
Maltose- ---------------------------------------------------------------------40g
Extrato de levedura----------------------------------------------------------2g
Ágar --------------------------------------------------------------------------15g
Água destilada (q.s.p.) ------------------------------------------------1000mL
Meio sólido para a produção de esporos sólido - ME
NaNO
3
-------------------------------------------------------------------1,58g
KH
2
PO
4
-----------------------------------------------------------------0,36g
MgSO
4
x 7 H
2
O ---------------------------------------------------------0,6g
Na
2
HPO
4
x 7H
2
O -------------------------------------------------------1,05g
KCl -----------------------------------------------------------------------1,0g
Dextrose --------------------------------------------------------------------10g
Ágar -------------------------------------------------------------------------20g
Extrato de levedura --------------------------------------------------------5g
Água destilada -------------------------------------------------------1000mL
Após o preparo, o meio foi esterilizado em autoclave, por 20 minutos, a
121ºC.
47
Meio sólido para a produção de esporos, acrescido de cutícula 10%
Foram preparados 900mL de BDA, adicionando-se 100mL do caldo
formado após a fervura do extrato de cutícula em água, seguido de esterilização,
por 20 minutos, a 121ºC.
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