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NILZA DE LUCAS RODRIGUES BITTENCOURT
ATIVIDADE TRIPANOCIDA DE EXTRATOS, FRAÇÕES E
SUBFRAÇÕES OBTIDAS DE Anthemis tinctoria
Maringá, 2007
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NIVERSIDADE
E
STADUAL DE
M
ARINGÁ
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EPARTAMENTO DE
F
ARMÁCIA E
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ARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS
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GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
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NILZA DE LUCAS RODRIGUES BITTENCOURT
ATIVIDADE TRIPANOCIDA DE EXTRATOS, FRAÇÕES E
SUBFRAÇÕES OBTIDAS DE Anthemis tinctoria
Maringá, 2007
Trabalho apresentado ao Programa de Pós-graduação em Ciências
Farmacêuticas, área de concentração Produtos Naturais e Sintéticos
Biologicamente Ativos da Universidade Estadual de Maringá, como
requisito para a obtenção do título de mestre.
Orientador: Prof. Dr. Celso Vataru Nakamura.
Co-orientador: Prof. Dr. Diógenes Aparício Garcia Cortez
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DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho com muito
amor e carinho às minhas
sobrinhas, Natalia e Giovanna.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, obrigada por guiar meus passos. Obrigada por mais uma batalha
vencida.
Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas.
Ao professor e doutor Celso Vataru Nakamura pela atenção, ensino e paciência neste nosso
período de aprendizagem e aperfeiçoamento de meus conhecimentos.
Ao professor doutor Diógenes Aparício Garcia Cortez por todo seu conhecimento e grande
contribuição no estudo dos parâmetros fitoquímicos.
Ao doutor Cirino Correia Junior da EMATER-PR que muito contribuiu para a realização
deste trabalho com a identificação da planta estudada.
A doutora Cláudia Moraes de Rezende pela análise cromatográfica realizada no Instituto de
Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Aos professores, Tânia Ueda Nakamura, Benício Alves de Abreu Filho, Benedito Prado
Dias Filho, Maria Cristina, Tognim obrigado por todo o aprendizado nestes longos anos de
jornada.
A toda minha família, meu pai, minha mãe, meu irmão e cunhada, obrigada pela
participação e incentivo.
À Carlos Henrique Lopez, meu muito obrigada por estar ao meu lado sempre com
intusiasmo, reanimando-me nos momentos difíceis e não me deixando desistir nunca. Você
é meu melhor amigo e companheiro. É meu porto seguro.
A Adriana de Oliveira Santos meu muito obrigada pela ajuda na parte de microscopia e
outras dúvidas, sempre disposta e prestativa.
As Éricas: Izume e Ramos, pelas dicas e orientações na utilização dos equipamentos.
As colegas de turma, Simone Hernandes, Eliana H. Endo e Telma Onozato, obrigada por
terem sido prestativas no transcorrer dos créditos, num momento onde eu precisei de apoio
e ajuda.
Ao colega Rodrigo Hinojosa Valdez, pelas nossas longas jornadas em alguns experimentos.
A Raissa Pedroso Bocchi por estar sempre disposta e alegre, mesmo quando estava
ensinando a montar pranchas
A Andréia Koroishi e Amanda, obrigada pela amizade sincera.
A sempre colega Marinete Martinez Vicentim, obrigada pelo apoio e, desculpe-me por
alguma chatice.
A Márcio Guilhermeti, a professora Lourdes Botelho Garcia e ao professor Celso Luis
Cardoso, que apesar de alguns contratempos muito contribuiram para meu conhecimento no
trabalho de laboratório em Microbiologia
A D. Prisciliana , D. Zelita e Maria, muito obrigada, por toda a dedicação e trabalho
prestados, pois sem vocês a estrada teria sido muito mais longa, trabalhosa e com certeza
cansativa.
A todos os colegas que por aqui passaram, para outros caso tenha esquecido e para os
novos: obrigada pela convivência em harmonia, de respeito e cooperação.
A todos que de forma direta ou indireta tenham contribuído para a realização deste
trabalho.
PARA ALGUMAS PESSOAS MUITO ESPECIAIS
Minha família: meu Pai, minha Mãe, meu irmão Roberto, minha cunhada
Valdete e as minhas sobrinhas Nathalia e Giovanna. Vocês são muito
importantes para mim. Não tenho palavras , em fim só tenho que agradecê-los
por mais esta vitória, apesar de tantos contratempos. Vocês dão sentido maior
a tudo que busco e faço de melhor para minha vida.
Carlos Henrique Lopez: sem você tudo seria mais difícil e sem graça.
Obrigada meu amor por ter estado junto a mim, sempre.
Antônio Rodrigues de Souza: Tio Antonio: ao senhor serei eternamente
grata. Ensinou-me a não desistir nunca e, principalmente, o valor da
humildade. Sempre me incentivou com o seu otimismo, mesmo que não o
soubesse. Sua batalha em seus estudos, sua conseqüente vitória, e entusiasmo
por sua profissão é um exemplo para todos.
SUMÁRIO
1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
............................................................................. 01
2 OBJETIVOS......................
..................................................................................... 15
3 CONCLUSÃO..
......................................................................................................... 16
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................17
ANEXOS.........................................................................................................23
Revisão Bibliográfica
Os tripanosomatídeos pertencecente a família Trypanosomatidae, compreendem numerosas espécies
de protozoários uniflagelados, sem cloroplastos, e com uma estrutura citoplasmática característica
constituída por uma rede de DNA extranuclear compactada na mitocôndria única, o cinetoplasto
(HONIGBERG et al., 1964; LEVINE et al., 1980), que parasitam protozoários, metazoários invertebrados,
metazoários vertebrados, incluindo o homem e vegetais (VICKERMAN, 1976).
A família Trypanosomatidae abriga protozoários que são agentes de importantes doenças em
humanos e animais como a leishimaniose e a doença de Chagas. Nesta família também estão incluidos
protozoários causadores de doenças em plantas como as Phytomonas, e ainda alguns tripanosomatídeos
como a Crithidia, Blastocrithidia e Herpetomonas, que são protozoários monoxênicos geralmente
encontrados em hospedeiros que não são capazes de transmitir doenças parasitárias em hospedeiros
vertebrados (WALLACE, 1966).
A doença de Chagas é um importante problema médico da América Latina, afetando 18 milhões de
pessoas e causando doença em 45000 pacientes anualmente (WHO, 2002). A espécie Trypanosoma cruzi é
um protozoário flagelado que pertence ao filo Protozooa, classe Mastigophora, ordem Kinetoplastida, sub-
ordem Tripanosomatina, família Trypanosomatidae, sub-família Triatominae, gênero Trypanosoma, sub-
gênero Schizotrypanum (PESSOA, 1972) e, sendo portanto, o agente etiológico da doença de Chagas,
endêmica em muitos países da América Central e do Sul. O T. cruzi é transmitido por hospedeiros
mamíferos, incluindo o homem (MacRae, 2006).
Em anos recentes, importantes programas para a doença têm sido estabelecidos para o controle e
transmissão do parasita do inseto para o homem e, de pessoa para pessoa durante a transfusão de sangue.
Estudos usando análise enzimática, análise por marcação, atividade promotora do RNAr, seqüenciamento
gênico e marcação por sonda tem mostrado claras evidências que o T. Cruzi não é uma espécie separada
mas corresponde a dois subgrupos altamente divergentes geneticamente, designado como Tipo 1 e 2
(BRIONES, 1999). O Tipo 1 predomina no ciclo doméstico enquanto o Tipo 2 é muito mais representativa
no ciclo silvestre (BRISSE, 2001). Ambos subgrupos são patogênicas para o homem. Portanto, é
importante intensificar trabalhos básicos sobre a biologia do parasita e na seqüência desenvolver novas
estratégias no controle da doença. (De SOUZA, 2002).
Os protozoários da família Trypanosomatidae apresentam durante seu ciclo de vida, algumas formas
que podem facilmente ser identificadas por microscopia de campo claro e em preparações por coloração
de Giemsa. No caso do T. Cruzi as seguintes formas podem ser identificadas: Amastigota, também
conhecida como esferomastigota, forma aflagelada, ou forma leishimaniana. Estudos realizados usando
formas amastigotas obtidas de diferentes origens têm mostrado que eles são capazes de se dividirem e
também infectar células de vertebrados (CARVALHO e De SOUZA, 1986; LEY et al., 1990). Os
epimastigotas tem flagelo longo com 20-40 µm com kinetoplasto localizado anterior ao núcleo. Estas
formas são capazes de se dividir e podem ser observadas na fase logaritmica de crescimento e em culturas
axênicas. Epimastigotas são também encontradas em células de vertebrados no final do ciclo intracelular
quando as esferomastigotas transfrormam-se em tripomastigota (MEYER e DE OLIVEIRA, 1948;
TYLER e ENGMAN, 2001). Os tripomastigotas são formas que tem comprimento aproximado de 25 µm
e diâmetro em torno de 2 µm. O kinetoplasto está localizado posteriormente ao núcleo. Eles podem ser
observados em cultura de células e em sangue de hospedeiros vertebrados, no intestino posterior, nas fezes
e urina de hospedeiros invertebrados, na fase estacionária de crescimento de culturas axênicas e na fase
liquída em culturas de células (ZELEDON, 1997).
O T. cruzi apresenta ciclo de vida complexo em diferentes hospedeiros (BRENER, 1973). Em
mamíferos multiplica-se intracelularmente como amastigota e em seguida ao chegar a corrente sangüínea
passa a forma tripomastigota. Estas formas podem infectar novas células ao serem ingeridas pela picada
do triatomíneo. No intestino médio do inseto, formas tripomastigotas diferenciam-se em epimastigotas
sendo estas diferenciadas em tripomastigotas metacíclicas, formas infectantes, as quais são disseminadas
juntamente com as fezes do invertebrado penetrando via mucosa no momento da picada. Essas formas
infectantes podem chegar a circulação sangüínea e finalmente penetrar nas células, completando assim o
ciclo de vida do parasita (MENDONÇA-PREVIATO et al., 1983).
A estrutura organizacional da composição bioquímica da membrana plasmática de T. cruzi tem sido
objeto de vários estudos (De SOUZA, 2002). Um dos aspectos característicos dos protozoários
Trypanosomatidae é a presença de uma camada de microtúbulos localizada abaixo da membrana
plasmática e designada como microtubúlos subpeliculares. Esta associação é provavelmente responsável
pela rigidez da célula e dificulta encontrar a forma do mecanismo de ruptura da célula. Ocasionalmente
um ou mais microtúbulos podem ser necessários especialmente na região de conexão do flagelo ao corpo
celular do protozoário (BAETA SOARES e De SOUZA, 1977; SOUTO-PADRON et al., 1984).
Os membros da família Trypanosomatidae têm um flagelo que emerge de uma invaginação chamada
de bolsa flagelar. A proporção do comprimento total do flagelo depois que ele sai da região da bolsa
flagelar é variavel de acordo com o estágio de desenvolvimento. As formas esferomastigotas do T. cruzi
têm um flagelo curto com comprimento de 1 µm. Entretanto no final do ciclo intracelular do parasito
ocorre uma elongação do flagelo para aproximadamente 20 µm. Este fato faz com que o flagelo do T.
cruzi seja um modelo de estudo adequado para estudar o efeito no crescimento natural desta estrutura (
MARTINEZ-PALOMO et al., 1976; De SOUZA, 1978). Todo tripanosomatídeo apresenta uma região
conhecida como bolsa flagelar com aparência de uma depressão encontrada na região anterior da célula de
onde emerge o flagelo (WEBSTER e RUSSEL, 1993). Ela é formada por uma invaginação da membrana
plasmática a qual estabelece uma continuidade direta com a membrana do flagelo (De SOUZA, 1989).
O kinetoplasto e a mitocôndria são estruturas presentes em T. cruzi. Este protozoário bem como
outros membros da família Trypanosomatidae possuem somente uma mitocôndria, a qual se estende por
todo o corpo celular. Numa porção da mitocôndria localizada perto do corpo basal, há um arranjo
complexo de fibras de DNA na matriz mitocondrial o qual forma a estrutura conhecida como
Kinetoplasto. Esta estrutura identifica a ordem kinetoplastida a qual a família Trypanosomatidae pertence
(SIMPSON, 1972)
O estágio epimastigota dos membros do gênero Trypanosoma, pertencente ao sub-gênero
Schyzotrypanum, como Trypanosoma cruzi, Trypanosoma vespertilionis e Trypanosoma dionisii,
apresentam uma bolsa flagelar que difere na forma daquelas encontradas em outros estágios de
desenvolvimento. No caso das formas epimastigota e amastigota dos membros do sub-gênero
Schizotrypanum há uma estrutura altamente especializada conhecida como citóstoma. Esta estrutura tem
forma de funil formada por uma invaginação profunda da membrana plasmática que pode alcançar a
região nuclear. Esta complexa abertura conhecida como citóstoma pode atingir um diâmetro de 0,3 µm
(MARTINEZ-PALOMO et al.,1976; De SOUZA et al.,1978). Outra forma de estrutura tubular pode ser
observada na porção mais central desses protozoários (SOARES, 1992), os reservossomas. Todas as
formas epimastigotas apresentam diversos reservossomas localizados principalmente na região posterior
da célula. Esta organela pode ter diâmetro de 0,7 µm e estudos citoquímicos têm mostrado que a matriz é
formada principalmente de proteínas e inclusões contendo lipídeos (SOARES e De SOUZA, 1988).
Em cortes ultrafinos e longitudinais de tripanosomatídeos o retículo endoplasmático é vistos por toda
parte do corpo do protozoário. Em alguns casos o corte do retículo endoplasmático atinge a periferia da
célula estabelecendo contato com a membrana plasmática e microtúbulos (PIMENTA e De SOUZA,
1985). As cisternas do complexo de Golgi, as quais variam em tamanho de acordo com espécie são
também observadas no interior da porção do corpo próximo do kinetoplasto e da bolsa flagelar (ENGEL,
2000). O núcleo em T. cruzi e em outros tripanosomatídeos têm uma estrutura organizacional parecida
com a de outras células eucarióticas. Ele é pequeno medindo aproximadamente 2,5 µm. Portanto o núcleo
contém toda informação importante para a vida dos tripanosomatídeos e o controle de seus processos de
diferenciação e poucos estudos foram feitos com esta estrutura. Em tripomastigotas o núcleo é alongado e
localizado na porção central da célula (JOHNSTON et al., 1999).
A doença de Chagas apresenta uma fase aguda e outra crônica. A doença na fase aguda pode ser
sintomática (aparente) ou assintomática (inaparente), a mais freqüente. Ambas estão relacionadas com o
estágio imunológico do hospedeiro. Há predomínio da forma aguda sintomática na primeira infância,
levando a morte em cerca de 10% dos casos. A fase aguda inicia-se através de manifestações locais,
quando o protozoário penetra na conjuntiva, sinal de Romanã, ou na pele, chagoma de inoculação. Estas
lesões aparecem em 50% dos casos agudos dentro de 4 a 10 dias após a picada do barbeiro, regredindo em
um ou dois meses. A fase crônica também pode apresentar-se de forma assintomática e sintomática. A fase
crônica assintomática ocorre após a fase aguda sendo chamada de fase indeterminada ou latente, onde
ocorre a positividade de exames sorológicos e/ou parasitológicos; ausência de sintomas e/ou sinais da
doença; eletrocardiograma convencional normal e coração, esôfago e colón radiologicamente normais
(NEVES, 2000). Portanto, fase aguda é freqüentemente assintomática e o desenvolvimento da fase crônica
da doença ocorre geralmente 10 a 20 anos após a infecção afetando cerca de 10 a 30% dos indivíduos
infectados, sendo as manifestações comuns da fase crônica as patologias gastrointestinais e cardíacas
(VIOTTI et al., 1994).
A partir de 1985 passou-se a acreditar que os fatores autoimunes poderiam ser o primeiro fator
associado com a patologia da fase crônica da doença de Chagas (KALIL e CUNHA-NETO, 1996).
Investigações recentes mostram o parasita ligado com o desequilíbrio da resposta imune que pode incluir
reações autoimunes (ENGMAN e LEON, 2002) gerando a manutenção da resposta inflamatória nos
tecidos que estão sujeitos a lesões características da fase crônica da doença de Chagas (TARLETON,
2001). Esta descoberta indica que a eliminação do T. cruzi do paciente infectado pode ser um pré-requisito
para impedir a evolução da doença e evitar a longo prazo suas consequências irreverssiveis (SOSA et al.,
1998).
Infelizmente, apesar do impressionante avanço no entendimento da biologia do T. cruzi, as drogas
disponíveis para o tratamento são somente aquelas registradas a mais de 30 anos atrás, sendo estas o
nifurtimox e o benzonidazol desenvolvidos em 1960 e 1970. Estes compostos são ativos nos estágios
agudos da doença de Chagas com eficácia em torno de 80%, e o benzonidazol é eficaz em infecções
crônicas recentes (SOSA, 1998), mas tem efeito limitado na fase crônica avançada da doença. O efeito
colateral de ambos pode ser bastante severo (CROFT, 2005), como efeitos incluindo anorexia, vômito,
polineuropatia periférica e alergias dermatológicas (URBINA, 2002). São drogas altamente tóxicas ao
hospedeiro e possuem atividade limitada conforme a susceptibilidade de diferentes cepas de T. cruzi
(MAYA, 1997; VELOSO, 2001). O mecanismo de ação de drogas ativas contra o T. cruzi parece ser
através da liberação de radicais livres como no caso do nifurtimox e pela inibição da respiração, da síntese
de proteínas e RNA exercido pelo benzonidazol (POLAK & RICHLE, 1978; DOCAMPO & MORENO,
1985).
As substâncias que agem na biossíntese de esterol têm sido uma alternativa na quimioterapia
antimicrobiana. Muitos agentes antifúngicos que agem em enzimas ou produtos da biossíntese de esterol,
incluindo os antifúngicos azoles, alilamina e polienos, têm mostrado potente efeito contra T. cruzi (VIVAS,
1996; URBINA, 2003). O itraconazol usado no tratamento da doença de Chagas tem mostrado cura
parasitológica de 53% (APT, 1998). A terbinafina, droga antifúngica alilamina, mostrou ser sinérgica com o
cetoconazol contra culturas de T. cruzi (LAZARDI et al., 1990). Portanto vários outros caminhos são
promissores, como por exemplo os inibidores da síntese da tripanotiona (SCHMID et al., 2002) e inibidor do
metabolismo da guanina hipoxantina fosforribose transferase (URBINA, 2003)
Drogas tripanocidas com menos efeitos colaterais são urgentemente necessárias. Neste contexto as
plantas fornecem diversidade química e biológica a qual tem ajudado no desenvolvimento de centenas de
drogas farmacêuticas (CALIXTO, 2000). Diversos estudos têm mostrado que os extratos de plantas
apresentam notável atividade antiprotozoário. Serrano e colaboradores (2000) selecionaram 79 extratos de
diferentes famílias de plantas da América e testaram suas atividades frente a formas epimastigotas de T. cruzi
cepa Y. Neste estudo nove extratos mostraram-se ativos.
Portanto, como pode ser visto, o uso de plantas medicinais como medicamentos para o tratamento de
várias doenças é bastante comum e vêm de tempos antigos, sendo que até o século XIX os recursos
terapêuticos eram constituídos predominantemente por plantas e extratos vegetais (SCHENKEL et al., 2000).
As plantas são um recurso ao alcance do ser humano. Durante milênios, o homem empiricamente aprofundou
seus conhecimentos afim de melhoria nas condições de alimentação e cura de suas enfermidades,
demonstrando uma estreita inter-relação entre o uso das plantas e sua evolução. É de supor que no passado o
homem quando acometido de seus males, recorria à alguma fonte de poder curativo. O homem intuitivamente
buscava descobrir soluções para suas necessidades básicas, como nutrição, reprodução e proteção humana.
Gerido pela experiência, manifestava inteligência, fruto de sua própria evolução biológica para a produção de
alternativas que atendessem suas necessidades. Nesta perspectiva da pesquisa natural, o homem encontrou nas
chamadas plantas medicinais, virtudes, cujo valor tornou-se reconhecido e por tantas vezes, foi considerado
como mágico e até alquimista, sendo transmitido de geração à geração (MIGUEL, 2000).
Nas origens da história , a noção das plantas terapêuticas e tóxicas passou a ser objeto de interesse.
Estudos realizados na Tanzânia, com chimpanzés, verificaram que estes ingeriam em jejum, folhas de
certas plantas que os livraram de vermes intestinais. Arqueólogos encontraram em túmulos pré-históricos,
partes de plantas tidas como medicinais. No ano de 1975, no território atual do Iraque, foi descoberto um
esqueleto humano de quase 60 mil anos de idade. Junto a este foi encontrado petrificada pequena
quantidade de pólen concentrado de achilea e jacinto, utilizados até hoje por camponeses da região
(OTTE, 1994).
Inúmeros documentos importantes que marcaram a evolução histórica das plantas medicinais são
citados por Pelt (1993) e Otte (1994) entre eles, como, os fragmentos do Papyrus Ebers, considerado o
primeiro tratado de medicina egípcia, datado do séc. XVI a.C., o qual já relatava sedativos, extraidos de
Ephedra, o uso habitual do salgueiro e acácia. Da casca do salgueiro em 1829 foi isolado pela primeira vez
uma substância denominada salicina, que muitos anos depois na Alemanha viria a servir de precursor na
síntese química do ácido salicílico. Posteriormente em 1889 a Bayer alemã, produzia o ácido acetil
salicílico, analgésico de uso universal (GEREZ, 1993).
Num estágio mais avançado da história do uso de plantas medicinais foram criadas teorias e
observações que muito contribuíram para a atualidade da ciência médida moderna. Surge assim a
Fitoterapia, nome vindo da palavra grega fhtoi (plantas) e qerapa (tratamento), ou seja tratamento por
meio de plantas (GUYOT, 1990). No entanto, os produtos naturais, especialmente após a Segunda Guerra
Mundial, foram esquecidos, acreditando-se obter fármacos somente através da síntese de um grande
número de compostos e seu teste ao acaso, sem nenhuma orientação. Somente por volta de 1970, quando a
Organização Mundial da Saúde reconheceu os benefícios da medicina chinesa (paradigma oriental à base
de extratos = misturas), e com o surgimento de alguns importantes medicamentos obtidos de fontes
naturais, foi que cientistas e indútrias voltaram a se interessar por este ramo. Pode-se, assim, observar que,
atualmente, os produtos naturais são responsáveis, direta ou indiretamente, por cerca de 40% de todos os
fármacos disponíveis na terapêutica moderna e, se considerarmos os usados como antibióticos e
antitumorais, esta porcentagem é de aproximadamente 70%.
Durante estes anos, foi se realizando um processo de mudanças muito importantes. Podemos indicar
os avanços na área da biologia molecular que, com o mapeamento genético, possibilitou o surgimento de
novos alvos biológicos, passando de cerca de 5 mil para 10 a 15 mil. A pesquisa orgânica sintética,
através da química combinatória, e em pouco tempo mais da química biocombinatória, permite sintetizar
milhares de compostos em curto espaço de tempo, enquanto um bom químico medicinal conseguiria,
anteriormente, obter no máximo 100 novos compostos por ano (YUNES e CALIXTO, 2001).
Devemos considerar que a diversidade molecular, associada aos produtos naturais, é maior que
qualquer outra fonte (HENKEL et al., 1999). Assim, a diversidade molecular é um fator importante para a
procura em plantas de novas moléculas, significa, também, diferentes propriedades físico-químicas, que
representam um desafio para o químico que pretende isolar e determinar a estrutura de compostos ativos,
uma vez que um extrato de determinada planta pode conter centenas ou milhares de compostos
(HAMBURGER e HOSTETTMANN, 1991). Desta forma, numerosos métodos de extração e estudo de
compostos, oriundos de plantas, têm sido sugeridos pela literatura pertinente. Porém, no caso da procura
de princípios ativos, não interessa o composto mais fácil de separar, ou aquele que se encontra em maior
concentração, ou ainda, aquele que possui a estrutura mais complexa. O que realmente interessa, neste
caso, é descobrir compostos que apresentam atividade biológica. Daí a importância e necessidade de
estudos fitoquímicos guiados pelos bioensaios, seja in vivo ou in vitro (YUNES e CALIXTO, 2001)
As plantas, como medicamento, têm sido utilizadas por grande parte de nossa população, em
diversos países industrializados, estas possuem significativa representação, pois, como afirma Jorquera
(1993), dos 173 bilhoes de dólares em fármacos consumidos em 1990, a quase vinte anos, cerca de 25% já
continham pelo menos um componente de origem vegetal, ou eram sintetizados a partir destes. As plantas
são utilizadas em quase todo mundo como matéria-prima, na forma de extratos, óleos essenciais e
substâncias químicas puras e semi-sintéticas. No entanto, durante os últimos 20 anos, os fármacos de
origem natural que apareceram no mercado são, em proporção majoritária, oriundos de pesquisas
científicas realizadas na China, na Coréia e no Japão, sendo que a contribuíção dos países ocidentais neste
período foi bem menor (LOSOYA, 1997).
Muitas plantas estudadas cientificamente com efeito farmacológico já comprovado, marcam
importante contribuição à Fitoterapia, no uso cotidiano, como exemplo pode-se citar algumas como
ipecacuanha Cephaelis ipecacuanha (Rubiaceae) de onde se extrai a emetina, poderoso emético que, em
doses menores pode ser usado como expectorante, ou no combate às disenterias amebianas. Outra planta
muito utilizada é a beladona, Atropa belladona (Solanaceae), da qual se extrai atropina e hiociamina
utilizada como estimulante do sistema nervoso e antiespamódica, ou então o alho Allium sativum (família
Liliaceae) do qual se extrai a alicina com ação antimicrobiana e inibidor da agregação plaquetária, rico em
vitaminas A, B
1
, B
2
, C, ácido nicotínico (GUYOT, 1990). Assim poderíamos enumerar centenas de
vegetais já estudados e identificados.
Portanto, plantas medicinais têm sido usadas desde tempos antigos como medicamentos para o
tratamento de várias doenças. As plantas medicinais e seus extrativos constituíam a maioria dos
medicamentos, e pouco se diferenciavam dos remédios utilizados na medicina popular (SCHENKEL et
al., 2000). Apesar do grande avanço observado na medicina moderna em décadas recentes, as plantas
ainda têm uma importante contribuição nos cuidados com a saúde (CALIXTO, 2000). Um acentuado
crescimento no mercado de fitoterápicos mundial tem ocorrido nos últimos 15 anos. Estima-se que 25% de
todos os medicamentos modernos são direta ou indiretamente derivados de plantas (FARNSWORTH et
al., 1976; DE SMET, 1997; CRAGG et al., 1997; SHU, 1998). Assim, cerca de 75% dos compostos puros
naturais, empregados na indústria farmacêutica, foram isolados, seguindo recomendações da medicina
popular. Outros aspectos importantes que devem ser levados em consideração são as informações
botânico-taxonômicas e químico-taxonômicas. Como a constituição química, na maioria dos casos, difere
significativamente em relação às distintas partes da planta (CECHINEL e YUNES, 1998), parece mais
viável estudar, inicialmente, aquela empregada na medicina popular e, posteriormente, as outras partes da
planta, que também podem conter princípios ativos. Outro ponto a ser enfatizado é sobre a influência dos
fatores ambientais na biossíntese dos metabólitos secúndarios, como clima, tipo de solo, época de coleta,
etc. (VANHAELEN et al., 1991; BAUER; TITTEL 1996; HOUGHTON; RAMAN, 1998).
Portanto, as plantas medicinais têm significado um marco na história do desenvolvimento de diversas
nações. Alguns países tem tomado consciência de seu potencial em recursos naturais, e tem convertido
seus esforços em favorecimento de programas de desenvolvimento agrícola e industrial. A India, por
exemplo, tornou-se um dos maiores exportadores de grandes variedades de plantas medicinais e
condimentares; o Kênia satisfaz 70% das necessidades mundiais de piretrina utilizada como inseticida;
Servia e Montenegro (antiga Yugoslávia) destaca-se na exportação de sálvia; o República democrática do
Congo (antigo Zaire) na exportação de papaína e quinina; o Marrocos de verbena e sene; e o Panamá de
ipecacuanha (UGAZ, 1994).
Neste contexto, o Brasil tem exportado itens como o guaraná, as algas medicinais, o cumarú e a
arruda, resultando em arrecadação de um milhão de dólares. Por outro lado, importa em maiores
quantidades alcaçúz (Glycyrhiza glabra), o orégano (Origanum sativum) e o boldo (Peumus boldus).
Nossa potencialidade agrícola poderia reverter tal quadro se houvessem programas de incentivo ao cultivo
de espécies medicinais (MIGUEL, 2000), uma vez que, muitas plantas do bioma brasileiro, como cerrado,
floresta atlântica e amazônica tem sido usada pela medicina natural (ALVES et. al., 2000). Além disso,
muitas plantas exóticas foram introduzidas no Brasil e incorporadas na medicina folclórica (DUARTE,
2005).
Mesmo sendo grande a utilização de plantas na medicina popular, para a grande maioria dos
fitoterápicos comercializados faltam evidências laboratoriais comprovatórias de eficácia e segurança,
sendo que seus supostos méritos terapêuticos devem-se principalmente a informações empíricas e
subjetivas da medicina folclórica (BRAGANÇA, 1996). Segundo a Organização Mundial de Saúde, por
causa da pobreza e a dificuldade no acesso na medicina moderna, 65-80% da população mundial que vive
em países em desenvolvimento depende essencialmente de plantas para cuidados primários com a saúde
(BRAGANÇA, 1996). Estima-se que 25% de todos os medicamentos modernos são direta ou
indiretamente derivados de plantas (FARNSWORTH et al., 1976) e há dados que indicam a alta
correlação entre o uso popular e experimentos de atividade farmacológica (BRITO et al., 1993). A maioria
das Companhias Farmacêuticas tem demonstrado interesse na investigação de plantas como fontes de
novas estruturas e também para o desenvolvimento de fitoterápicos padronizados que mostrem eficácia,
segurança e qualidade (BREVOORT, 1995; DE SMET, 1997; BLUMENTHAL, 1999).
Urge neste momento um estudo sistematizado, amplo e globalizador, sob o enfoque
interdisciplinar, com a finalidade de viabilizar o desenvolvimento científico-tecnológico dos fitoterápicos
pela indústria nacional. De acordo com as perspectivas da modernidade, a saúde do futuro estará voltada
para a medicina preventiva, onde a ciência buscará na natureza meios profiláticos que auxiliem o homem
na defesa de seus males (MIGUEL, 2000). Portanto, as plantas as quais produzem uma variedade de
compostos com propriedades antimicrobianas, permitem o desenvolvimento de novas drogas como
tratamento (AHMAD e BEG, 2001) para as mais variadas doenças, entre elas a doença de Chagas. Assim,
a planta Anthemis tinctoria L. do gênero Anthemis, é uma das plantas estudadas na tentativa de se obter
uma nova droga que seja capaz de auxiliar no tratamento da doença de Chagas. O gênero Anthemis
pertence à ordem Asterales e a família Asteraceae ou Compositae, sendo que este compreende cerca de
1.100 gêneros com aproximadamente 25.000 espécies de ampla distribuição, bem representadas em
regiões subtropicais e temperadas (BARROSO, 1986).
A família Compositae é uma das mais numerosas entre as plantas do grupo das que produzem
flores, as Angiospermae. Esta família está distribuída através do mundo e seu desenvolvimento dentro do
processo evolutivo tem sido bastante ativo, estão incluidas entre as polinizadas por insetos e também pelo
vento (CRONQUIST,1988). Pouco frequentemente, Compositae polinizadas por insetos podem ter seu
polén produzindo sintomas alérgicos (LEWEIS, 1979 e COHEN, 1979). Desta maneira diversos casos de
reações anafiláticas têm sido relatadas depois da aplicação de cataplasma com chás de ervas contaminado
com polén da camomila (Matricaria chamomila), planta também pertencente a está mesma família
(BENNER, 1973 e SUBIZA, 1989).
O gênero Anthemis L., apontado por Brener (1994) tribo Anthemideae (sub-tribo Anthemidinae a
família Asteraceae abrange 210 espécies (ÇELIK, 2005) as quais ocorrem em regiões do Mediterrâneo,
sudeste e Ásia central e oeste e sul da África (OBERPRIELER, 2001). Sendo que 62 espécies encontram-
se na Europa (Fernandes, 1976) e 50 têm sido relatadas na Turquia (Daves, 1975) representando uma taxa
endêmica de 54% de seu total nessas regiões e ainda presentes em outras regiões do globo. Essas plantas
preferem lugares secos, abertos, florestas de estepes e terrenos com declive onde crescem especialmente
em sustratos calcários naturais (UZEL, 2004).
As espécies do gênero Anthemis são largamente usadas na indústria farmacêutica de cosméticos e
alimentos. Desde a antigüidade até o presente algumas delas são usadas como ervas medicinais, inseticidas
e tintas ou corantes (MABBERLEY, 1997) As flores têm seu uso bem conhecido como anti-séptico e
propriedades medicinais e apresentam compostos do tipo flavonóides bem como óleos essenciais
(VAVERKOA et al., 2001). Na Europa extratos, tinturas, chás e pomadas, são largamente usados como
anti-inflamátorios, antibacterianos, antiespamódicos e agentes sedativos (MANN e STABA, 1986). O
gênero Anthemis apresenta-se bastante rico em número de espécies, e com base em seu uso pela medicina
popular suas espécies têm sido muito estudas quanto a suas propriedades. Entre as espécies estudas pode-
se verificar uma grande variação de compostos químicos e óleos essenciais o que as tornam também um
grupo de estudo de grande interesse. Portanto, alguns grupos em especial podem ser destacados. Anthemis
xylopoda é uma planta endêmica da região da Turquia de distribuição bastante restrita. Ela está incluida
numa categoria de plantas perigosas (EKIM et al., 2000). No entanto, é conhecida com relação a sua
atividade antimicrobiana, característica de seu óleo essencial (UZEL, 2004). Na Turquia ainda se pode
encontrar distribuída de maneira endêmica a espécie Anthemis wiedemanniana, bem como em outras
regiões do oriente médio e também em muitas partes do mediterrâneo (DAVIS, 1975; STRID e TAN,
1999). Esta espécie é conhecida pela medicina folclórica no tratamento de tosse e resfriados (ÖZTÜRK e
ÖZÇELIK, 1991). A. wiedemanniana é uma espécie muito diferente de aparência em relação a outras de
mesmo parentesco, no entanto suas folhas são bastante parecidas com A. tinctoria (
KONSTANTINOPOULOU et al., 2003). Foi verificada a presença de lactonas sesquiterpênicas em A.
wiedemanniana por Çelik (2005).
Anthemis aetnensis cresce em cinzas vulcânicas do monte Étina na Sicília (FLORA EUROPAEA,
1976). Estudos com as partes aéreas da planta Anthemis hydruntina endêmica no sul da Itália tem levado
ao isolamento do composto hidruntinolideo (DI BENEDETTO, 1991). Pavlivić e colaboradores (2005)
descreveram a presença de constituintes fenólicos em uma erva perene A. triumfetti com 30-90 cm de
altura que cresce em bosque e lugares rochosos e montanhosos da região de Montenegro. Em terrenos
arenosos na parte leste da Sérvia cresce a A. arvensis. Nesta espécie foram encontrados cinco
poliacetilenos na raiz e seis nas folhas (BOHLMANN et al., 1963, 1965), e isolados lactonas
sesquiterpênicas por (VUCKOVIC et al., 2006).
Anthemis cotula, popularmente conhecida como “manzanilla del campo” é uma espécie nativa da
Europa e também cresce como uma erva daninha na Argentina. Ela é usada como febrifúgo e
antiespasmódico, e para o tratamento da disenteria e gota. A decocção das flores e folhas são também
usadas como inseticida (AMAT, 1983; ZARDINI, 1984). Seu extrato contém flavonóides que quando
testado em concentrações de 200 µg/ml, apresentaram atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-
negativas (QUARENGHI, 2000). Foi encontrado como constituinte de A cotula dentre as variedades de
lactonas, uma delas de estrutura não comum apresentando propriedades alérgicas (BOHLMANN et al.,
1969; BARUAH,1985). A. pseudocotula é uma espécie comum cultivada em lugares próximos ao monte
Sinai. O estudo feito com o extrato de suas partes aéreas revelou a presença lactonas sesquiterpênicas
(ABOU EL-ELA, 1990).
As espécies Anthemis cretica e Anthemis montana são originárias da parte norte posicionada
entre a Servia e a Macedônia. Estas espécies, geralmente ocorrem em terrenos altos, rochosos e cobertos
por gramíneas no sul da península dos Balquimas (GAJIC, 1975). Dois novos tipos de guanolídeos foram
identificados em A. cretica por Vajs e colaboradores, em 1999. Foram feitos também estudos da parte
aérea de A. carpatica coletada em locais diferentes das montanhas e foram descobertos vinte novos
guanolídeos oxigenados e seis deles contendo um grupo hidroperóxido (BULATOVIC et al., 1998). O sul
da Itália é uma região endêmica para a A. plutonia e o estudo com esta espécie demonstrou a presença de
lactona sesquiterpênica muito similar aos guaianolídeos já encontrados em A. hydrundina e A. aetnenses.
Um estudo feito com as partes aéreas de A. alpestre coletada na região da Espanha também revelou a
presença de uma lactona sesquiterpênica (BRUNO, 1998; 2002).
Anthemis nobilis L. ou camomila Romana é nativa no norte da Europa e oeste da Ásia, e é uma
das mais importantes ervas medicinais cultivadas no mundo. Suas flores têm sido usadas com finalidade
medicinal e seu óleo essencial geralmente obtido de suas partes aéreas é usado como fragrância em
shampoos, sabonetes e perfumes. O azuleno presente no óleo essencial tem excelente valor medicinal pois
apresenta propriedades anti-inflamatórias (ARCTANDER, 1960). Muitos estudos fitoquímicos têm sido
realizados com o óleo essencial de A. nobilis que crescem nos campos e já foram identificadas em torno de
100 substâncias (KLIMES, 1984; BICCHI, 1987). Omoto ( 1998) detectou um composto presente nas
raízes da planta que geralmente não é encontrado em outras plantas parentais de A. Nobilis chamado de
geranil.
Segundo Masterová (2005) a planta Anthemis tinctoria L. é uma erva perene cultivada nos países
do mediterrâneo, sendo que alguns metabólicos secundários foram identificados nesta espécie como óleos
voláteis, triterpenos, poliacetilenos, flavonóides entre outros. Na medicina tradicional, esta planta é usada
no tratamento da insuficiência hepática e ictirícia (LISZT et. al., 1972).
Informações sobre o emprego medicinal ou uso popular de A. tinctoria têm sido bastante
incomum e escassas. No entanto recentemente foram isolados alguns flavonóides do capítulo floral desta
planta. Um novo estudo do material da planta e uma cromatografia cuidadosa resultou em frações
contendo flavonóides procedentes de um glicosídeo flavonóide esterificado com ácido cafeínico o qual é
um novo composto natural. O fracionamento do extrato metanólico das flores de A. tinctoria com
solventes orgânicos seguidos por sepação em coluna de Sephadex produziu patuletina, patulitrina e cafeoil
esterificado, um cristal amarelo. Portanto a patuletina7-o-ß-D- 6”- cafeoilglicosídeo) foi obtida do extrato
metanólico das flores de A. tinctoria L (MASTEROVÁ, 2005).
O composto isolado foi identificado por espectroscopia seguido por comparação com amostra
autêntica depois de hidrólise enzimática. O novo flavonóide glicosilado, tintosídeo, de A. tinctoria foi
isolado desta planta pela primeira vez. Assim, alguns flavonóides junto com ácido cafeico podem indicar
possibilidade de uso terapêutico, com função antioxidativa e pro-oxidativa. Geralmente a substituição de
grupos hidroxila demonstra uma forte atividade antioxidativa e pro-oxidativa (MASTEROVÁ, 2005).
Portanto estudos químicos prévios vêm indicar que lactonas sesquiterpênicas são
sistematicamente importantes dentro do gênero. A presença de lactonas sesquiterpênicas em várias
espécies der Anthemis têm sido descritas por muitos pesquisadores. O primeiro relato na literatura trouxe
informação sobre o sabor amargo da nobilina, lactona sesquiterpênica da Anthemis nobilis L., uma planta
medicinal bem conhecida (BENESOVA et al., 1964). Foi isolada uma lactona acíclica e considerada
comum de Anthemis cotula L. (BOHLMANN et al., 1969; BARUAH et al., 1985), outras espécies de
Anthemis inclui a representação dos três maiores tipos de lactonas sesquiterpenicas sendo estes os
germacrolídeos, eudesmanolídeos e guaianolídeos (VAJS et al., 1999). Assim, a atividade antimicrobiana
do óleo essencial do extrato de diferentes espécies de Anthemis têm sido estudadas (HOLLA et al., 2000;
GRACE, 2002).
Objetivos
O presente trabalho teve como objetivos:
- Investigar a atividade biológica dos extratos, frações e subfrações sesquiterpênicas obitidos de
flores de Anthemis tinctoria em formas epimastigotas e trypomastigota de Trypanosoma cruzi cepa Y.
- Verificar alterações morfológicas e ultraestruturais das células tratadas com a subfração ativa o composto
obtido das flores de Anthemis tinctoria através da utilização de técnica de microscopia ótica e eletrônica
de varredura e de transmissão.
- Avaliar o potencial tóxico do extrato bruto, frações e subfrações composto isolados das flores de
Anthemis tinctoria sobre as células LLCMK
2
.
Conclusão
O extrato, frações e a subfração constituida por composto sesquiterpênico de Anthemis tinctoria
mostraram ser bastante eficientes sobre T. cruzi. Através dos resultados obtidos neste estudo foi possível
verificar que as plantas utilizadas na medicina popular podem apresentar, de fato, efeito curativo. Portanto,
produtos naturais podem ser uma fonte de novas drogas com alta atividade antiprotozoária e baixa toxicidade.
No entanto é necessário que se faça estudos complementares na investigação sobre a aplicabilidade dos
compostos isolados na terapia de doenças infecto parasitárias como na doença de Chagas.
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ANEXO
ATIVIDADE TRIPANOCIDA DE EXTRATOS, FRAÇÕES E
SUBFRAÇÃO OBTIDA DE Anthemis tinctoria
Nilza de Lucas Rodrigues Bittencourt
1
; Tânia Ueda-Nakamura
1,2
; Benedito Prado Dias Filho
1,2
; Diógenes
Aparício Garcia Cortez
1
; Celso Vataru Nakamura
1,2*
1
Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas;
2
Departamento de Análises Clínicas, Laboratório de
Microbiologia Aplicada aos Produtos Naturais e Sintéticos, Departamento de Análises Clínicas, Universidade
Estadual de Maringá, Maringá, Paraná, Brazil
* Address for correspondence: Celso Vataru Nakamura, Universidade Estadual de Maringá; Departamento
de Análises Clínicas, Laboratório de Microbiologia Aplicada aos Produtos Naturais e Sintéticos, Bloco I-90
Sala 123 CCS, Avenida Colombo, 5790; BR-87020-900, Maringá, PR, Brazil. Fax: +55 44 3261-4860; E-
mail: cvnakamura@uem.br
Resumo
A doença de Chagas constitui ainda hoje no Brasil e em diversos países da América Latina um grave
problema médico e social, no que reside a necessidade de se obter novas drogas mais potentes e com menores
efeitos colaterais. No presente trabalho foi investigado o efeito de extrato bruto, frações e mistura
sesquiterpênica obtida de extrato de flores de Anthemis tinctoria em Trypanosoma cruzi. O extrato bruto
aquoso apresentou um IC
50
de 2,3 µg/ml, a fração diclorometano de 1,8 µg/ml e a mistura de sesquiterpeno,
com atividade dose dependente com IC
50
de 1,5 µg/ml. Os resultados obtidos revelam que há um aumento na
atividade inibitória à medida que o composto vai sendo purificado. Para a investigação do efeito citotóxico do
extrato bruto aquoso, fração diclorometano e mistura sesquiterpênica foram utilizadas células LLCMK
2
. A
fração diclorometano foi a que apresentou maior citotoxicidade com CC
50
de 4,0 µg/ml. Foram observadas
alterações morfológicas e ultraestruturais como arredondamento das células, formação de “blebs” na
membrana flagelar e citoplasmática em formas epimastigotas, tratadas com a mistura de sesquiterpeno,
através de técnicas de microscopia ótica e eletrônica de transmissão e de varredura. Esses resultados mostram
uma boa atividade in vitro de A. tinctoria em T. cruzi provavelmente associado a um efeito de
desestabilização da membrana celular do parasita e demonstram também que produtos naturais podem ser
uma fonte de novas drogas com atividade antiprotozóario e baixa toxicidade. No entanto é necessário que se
façam estudos complementares para validar cientificamente à utilização dos compostos isolados de A.
tinctoria no tratamento de doenças infecto parasitária como a doença de Chagas.
1. Introdução
O uso de plantas medicinais como medicamentos para o tratamento de várias doenças vêm de
tempos antigos, sendo que até o século XIX os recursos terapêuticos eram constituídos
predominantemente por plantas e extratos vegetais (SCHENKEL et al., 2000). Muitas plantas do bioma
brasileiro, como cerrado, floresta atlântica e amazônica tem sido usada pela medicina natural (ALVES et
al., 2000), sendo que, muitas plantas exóticas foram ainda introduzidas no Brasil e incorporadas na
medicina folclórica (DUARTE, 2005). As plantas produzem uma variedade de compostos com
propriedades antimicrobianas o que permite desenvolver novas drogas para o tratamento de doenças
infecciosas (AHMAD e BEG, 2001).
Segundo a Organização Mundial de Saúde, por causa da pobreza e a dificuldade no acesso na
medicina moderna, 65-80% da população mundial que vive em países em desenvolvimento depende
essencialmente de plantas para cuidados primários com a saúde (BRAGANÇA, 1996). Estima-se que 25%
de todos os medicamentos modernos são direta ou indiretamente derivados de plantas (FARNSWORTH et
al., 1976) e há dados que indicam que é alta a correlação entre o uso popular e experimentos de atividade
farmacológica (BRITO et al., 1993).
O gênero Anthemis pertence à ordem Asterales e a família Asteraceae ou Compositae, sendo que
este compreende cerca de 1.100 gêneros com aproximadamente 25.000 espécies de ampla distribuição,
bem representadas em regiões subtropicais e temperadas (BARROSO, 1986). As espécies do gênero
Anthemis são largamente usadas na Indústria Farmacêutica de Cosméticos e Alimentos. As flores têm seu
uso bem conhecido como anti-séptico e propriedades medicinais e apresentam compostos do tipo
flavonóides bem como óleos essenciais (VAVERKOA et al., 2001). Na Europa extratos, tinturas, chás e
pomadas, são largamente usados como anti-inflamátorios, antibacterianos, antiespamódicos e agentes
sedativos (MANN e STABA, 1986). A planta Anthemis tinctoria L. é uma erva perene cultivada nos
países do mediterrâneo, sendo que alguns metabólitos secundários foram identificados nesta espécie como
óleos voláteis, triterpenos, poliacetilenos, flavonóides entre outros (Masterová, 2005). Na medicina
tradicional, esta planta é usada no tratamento da insuficiência hepática e “jaundice” ictirícia (LISZT et al.,
1972). A atividade antimicrobiana do óleo essencial do extrato de diferentes espécies do gênero Anthemis
têm sido estudadas (HOLLA et al., 2000; GRACE, 2002).
Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas que constitui ainda hoje no Brasil
e em diversos países da América Latina, um problema médico social grave. Estima-se que 18 milhões de
pessoas na América do Sul e Central estão infectadas com T. cruzi. A doença de Chagas é responsável
pela morte de 45.000 pacientes por ano (WHO, 1993). O ciclo biológico do T. cruzi é do tipo
heteroxênico, onde o parasita passa por uma fase de multiplicação intracelular no hospedeiro vertebrado o
homem ou mamífero, e extracelular no inseto vetor do gênero Triatoma (NEVES, 2000). A fase aguda da
doença de Chagas é freqüentemente assintomática e o desenvolvimento da fase crônica ocorre geralmente
10 a 20 anos após a infecção afetando cerca de 10 a 30% dos indivíduos acometidos. Patologias
gastrointestinais são as manifestações mais comuns da fase crônica (VIOTTI, 1994). Infelizmente, apesar
do impressionante avanço no entendimento da biologia do T.cruzi, as drogas disponíveis nifurtimox e
benzonidazol são ativas nos estágios agudos da doença de Chagas com eficácia em torno de 80%, mas é
limitado a eficácia contra doença crônica já estabelecida (SOSA, 1998). O efeito colateral de ambos pode
ser bastante severo (CROFT, 2005), sendo que os efeitos mais freqüentes dessas drogas incluem anorexia,
vômitos, polineuropatias periférica e alergia dermatológica (URBINA, 2002). Portanto, drogas
tripanocidas com menos efeitos colaterais são necessárias. Neste contexto as plantas fornecem diversidade
química e biológica a qual tem ajudado no desenvolvimento de centenas de drogas farmacêuticas
(CALIXTO, 2000). O objetivo deste trabalho foi investigar a atividade biológica dos extratos, frações e
composto obtidos da espécie Anthemis tinctoria em T. cruzi.
2. Materiais e Métodos
C
OLETA DA PLANTA
As flores de Anthemis tinctoria foram coletadas em novembro de 2004 no Horto de plantas
medicinais “Prof
a
. Irenice Silva” do campus da Universidade Estadual de Maringá. A espécie vegetal foi
identificada por comparação autêntica pelo Dr. Cirino Correia Junior da EMATER-PR e uma exsicata está
guardada como documento taxonômico no Herbário do Departamento de Biologia da Universidade Estadual
de Maringá, com o número de registro HUM 1133. O material coletado foi secado ao abrigo do sol sobre
esteiras, em temperatura ambiente por 8 dias, após isso acondicionado e armazenado em local seco e ao
abrigo da luz.
S
EPARAÇÃO DOS COMPONENTES
Das flores secas de A. tinctoria (130 g) foram extraídas frações solúveis em água e insolúveis na
proporção 1:10 (material vegetal:solvente) pelo processo de maceração durante 8 dias à temperatura ambiente
com soluções hidroetanólicas (etanol-água) preparadas à 90 % V/V (PRISTA et al., 1975). O solvente foi
removido à pressão reduzida em evaporador rotatório, à temperatura de 32
o
C. Após a eliminação do solvente
foi adicionada água destilada, sendo a parte solúvel em água, denominada de extrato bruto fase aquosa, que
foi posteriormente liofilizada (liofilizador-modelo: 1-2 CHRIST ALPHA). O liofilizado resultou em 21,01 g
de extrato-aquoso. A parte do extrato insolúvel em água (resíduo) foi solubilizada em acetato de etila e
denominada de extrato bruto fase acetato, com um rendimento de 4,71 g (Esquema 01). O extrato aquoso (13
g) foi submetido à coluna cromatográfica de sílica gel (32 g sílica) e eluído com diclorometano, hexano,
acetato de etila, metanol e metanol/água 9:1. Todas as frações foram submetidas a atividade tripanomicida. A
fração diclorometano foi cromatografada (500 mg) em coluna cromatográfica de Sephadex-LH-20 eluída com
clorofórmio/metanol 1:1 de onde se obteve 14 subfrações denominadas de F
A
a F
H
. A subfração F
G
foi
cromatografada por três vezes em Sephadex fase móvel clorofórmio/metanol 1:1. Em seguida foi feita uma
acetilação com 20 mg da subfração G e submetida a uma coluna de sílica de onde foi isolada 11 mg do
composto que apresentou maior atividade sobre o T. cruzi. As frações e subfrações após terem sido
submetidas aos ensaios biológicos, foram analisadas por cromatografia em camada delgada (CCD), eluídas na
fase móvel hexano/acetato de etila (1:1 v/v), observadas através de radiação UV e reveladas com solução de
vanilina sulfúrica (2%).
Análise cromatográfica
A análise cromatográfica foi realizada no Instituto de Química da Universidade
Federal do Rio de Janeiro - RJ pela Dra. Cláudia Moraes de Rezende. A identificação da
fração de sesquiterpenos foi realizada por cromatografia gasosa de alta resolução com
detector de massas computadorizado CGAR-EM. Para a análise cromatográfica, foi
utilizado um cromatógrafo Agilent 6890 Seis II acoplado a um espectro de massas Agilent
5973. Condições do detector: ionização por impacto de elétrons 70eV, interface 280
o
C.
Condições de operação no cromatógrafo: injetor no modo “splitless” (tempo de válvula 0,5
min) em 250
o
C; gás de arraste He com fluxo de 1ml/minuto; programação de aquecimento
do forno cromatogáfico: T
inicial
35
o
C a 60
o
C (1
o
C min
-1
), 200
o
C (8
o
C min
-1
), e 280
o
C (15
o
C min
-1
), permanecendo por 5 min. A coluna capilar utilizada foi a DB-5 (J&W) de 30m x
025 nm x 025 µm. Este sesquiterpeno foi utilizado em ensaios com T. cruzi.
P
ARASITAS
Formas epimastigota do T. cruzi cepa Y foram cultivadas no meio líquido de LIT (Liver Infusion
Triptose) (Camargo 1964) com 10% de soro fetal bovino (Gibco Invitrogen, New York, USA) por 96 h a 28
o
C.
A
TIVIDADE
A
NTIPROLIFERATIVA SOBRE
F
ORMAS
E
PIMASTIGOTA DE
T.
CRUZI
Os extratos brutos aquoso e acetato de etila, as frações hexano, diclorometano, acetato de etila,
metanol e metanol/água e a subfração G foram dissolvidos em dimetil sulfóxido (DMSO, Sigma Chemical,
St. Louis, MO, USA) em concentração final que não excedesse a 1%. Os ensaios sobre as formas
epimastigota foram realizados nas concentrações de 100 a 1,0 µg/ml em placas de poliestireno de 24 poços
com volume final de 1,0 ml. O inóculo (1 x 10
6
células/ml) utilizado foi obtido a partir de cultura do
protozoário em meio de LIT após crescimento por 96 h a 28
o
C. O crescimento foi avaliado através da
contagem das células em câmara hematocitométrica de Neubauer (Improved Doublé Neubauer Ruling).
E
FEITO SOBRE
P
ROTOZOÁRIOS
I
NTRACELULARES
Formas tripomastigota de T. cruzi foram suspensas em meio Dulbecco’ s Modified Eagle Medium
(DMEM) com 10% de soro fetal bovino e adicionadas na cultura de células de forma que se obtivesse 10
protozoários por célula LLCMK
2
(células de rim de macaca Mulata). Os protozoários foram colocados em
contato com as células durante 24 h e, em seguida, a cultura de células foi lavada 3 vezes com tampão fosfato
de potássio (PBS) para remover os parasitas não aderidos. Foi adicionado o meio DMEM e a fração
sesquiterpênica nas concentrações determinadas, e as células foram incubadas por 96 h. As lamínulas foram
lavadas 3 vezes com PBS, fixadas com metanol puro por 15 min e lavadas com tampão fosfato pH 7,2 coradas
com Giemsa 1:20 durante por 15 minutos, em seguida lavadas com água destilada e posteriormente as
lamínulas foram montadas em lâminas com Entellam e observadas em microscópio ótico composto
(OLYMPUS CX 31). O índice de internalização foi determinado pelo produto do número de célula infectada
e o número de parasita por célula (VIEIRA et al., 2002).
E
NSAIO DE CITOTOXICIDADE
Foram colocados 500 µl de uma suspensão padronizada de células LLCMK
2
(2,0 x 10
5
células/ml)
em cada um dos 24 poços de uma placa e incubados em estufa a 37
o
C com 5% de tensão de CO
2
por 48 h até
a formação de um tapete de células. Posteriormente, foi retirado o meio e adicionados 500 µl das soluções do
extrato bruto, frações e fração sesquiterpênica obtidas das flores de A. tinctoria. nas concentrações de 100, 50,
10, 5, e 1 µg/ml. Após 72 e 96 h de incubação em estufa a 37
o
C sob tensão de 5% de CO
2
as células foram
fixadas com 50 µl ácido tricloroacético 10% a 4
o
C por uma hora, lavadas em água corrente em baixa pressão
e após secar espontaneamente foram adicionados 50 µl de sulforodamina B 0,4% e a porcentagem de células
viáveis foi determinada através do leitor de microplaca (Bio Tek – Powe wave XS) a 540 nm.
A
VALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS
As alterações morfológicas nas formas epimastigota e tripomastigota de T. cruzi causadas pelo
composto obtido de A. tinctoria foi avaliada mediante tratamento das células com 5,0 µg/ml (IC
50
) da
substância em meio de LIT após 96 h a 37
o
C de incubação e coradas com o corante de Giemsa. Os aspectos
morfológicos das células tratadas foram observados ao microscópio ótico. As fotomicrografias foram obtidas
pelo programa Axiovision versão 4.1 acoplado ao microscópio ótico (Zeiss Axioskop).
Avaliação das alterações ultraestruturais
Microscopia eletrônica de transmissão
As células controle e tratadas com o composto obtido de A. tinctoria. foram lavadas em PBS 0,01 M
pH 7,2 e fixadas por 2 h com 2,5 % de glutaraldeido em tampão cacodilato 0,1 M pH 7,2. Em seguida as
células foram pós fixadas por 45 min a temperatura ambiente em solução de 1% de OsO
4
em 0,1 M de tampão
cacodilato, pH 7,2, contendo 0,8 M de ferrocianeto de potássio e CaCl
2
. As células pós-fixadas foram
desidratadas com concentrações crescentes de acetona e embebidas em Epon. Cortes ultrafinos foram
coletados em grades de cobre, contrastados com acetato de uranila e citrato de chumbo e observados em um
Microscópio Eletrônico de Transmissão (Zeiss EM-900).
Microscopia eletrônica de varredura
Na microscopia eletrônica de varredura, as células previamente fixadas foram aderidas a um suporte (chip), lavadas 2 vezes em
tampão cacodilato 0,1 M, pH 7,2 e desidratadas em etanol usando concentrações crescentes de 15, 30, 50, 70, 80, 90, 95, e 100%
durante 15 min em cada um. Em seguida, o material foi submetido ao ponto crítico, a metalização com ouro e observado em
Microscópio Eletrônico de Varredura Shimadzu (SS-550).
3. Resultados
A análise cromatográfica por CG/EM da fração ativa proveniente do fracionamento
da fração diclorometano mostrou duas classes de compostos sesquiterpênicos, o que pode
ser evidenciado pelos pesos moleculares observados nos espectros de massas. Esta mistura
de sesquiterpenos da fração diclorometano foi utilizada em ensaios com T. cruzi.
A Figura 01A mostra a porcentagem de inibição de crescimento de formas
epimastigota de T. cruzi tratada com extrato bruto aquoso (EBA) e extrato bruto acetato de
etila (EBE) obtido de flores de A. tinctoria, após 96 h de incubação a 28
o
C. EBA
apresentou uma atividade inibitória maior do que EBE onde concentrações de 5 e 10 µg/ml
inibiram 77,4 e 91,9 % no primeiro caso e 31,7 e 76,8 % no segundo, respectivamente. O
fracionamento do EBA em coluna de sílica resultou em 5 frações: hexano (FH),
diclorometano (FD), acetato de etila (FA), metanol (FM) e metanol mais água (FMA). A
FD foi a que apresentou maior atividade inibitória (Figura 01B), sendo que concentrações
acima de 5 µg/ml inibiram o crescimento de mais de 95% das formas epimastigota do T.
cruzi. Por outro lado, a FM apresentou a menor atividade inibitória. A FD foi submetida à
coluna de Sephadex de onde se obteve 8 subfrações, A, B, C, D, E, F, G e H. Na Figura
01C pode-se observar que as subfrações F, G, e H apresentaram atividade inibitória
considerável com um porcentagem de inibição de crescimento de T. cruzi acima de 90%
para todas as concentrações utilizadas. A subfração A foi a que mostrou menor atividade
com 87 % de inibição de crescimento para a concentração de 100 µg/ml.
Os efeitos do EBA, FD e da mistura de compostos sesquiterpenos de A. tinctoria no
crescimento de formas epimastigota de T. cruzi em meio LIT a 28
o
C está representado na
Figura 02. A atividade foi dose dependente, onde foi calculado um IC
50
de 2,3 µg/ml para o
extrato aquoso e inibição de 100 % na concentração de 1000 µg/ml (Figura 02A). Dentre as
frações obtidas a FD foi a que apresentou melhor atividade isto é, o menor valor de IC
50
com 1,8 µg/ml e a FM a menor atividade com IC
50
de 145 µg/ml (Figura 02B). O
sesquiterpeno apresentou uma atividade dose dependente. O IC
50
foi 1,5 µg/ml, e
percentagem de inibição foi maior que 95 % para todas as concentrações utilizadas (Figura
02C). Os resultados obtidos revelaram que há um atividade inibitória dose dependente.
Um importante critério para a investigação de substâncias sobre a atividade contra
T. cruzi é seu potencial terapêutico, e que eles não apresentem efeito citotóxico sobre as
células de hospedeiros mamíferos. Assim, foi avaliada a porcentagem de células LLCMK
2
vivas após 48 horas de tratamento com o extrato bruto aquoso, fração diclorometano e o
composto obtido de A. tinctoria nas concentrações de 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 µg/ml. A
Figura 03 mostra os valores de citotoxicidade apresentados pelo EBA, FD e a subfração
sesquiterpênica. A mistura de sesquiterpeno apresentou uma CC
50
(concentração citotóxica
de 50%) de 7,0 µg/ml e o EBA de 17,3 µg/ml. A FD foi a que apresentou maior
citotoxicidade com CC
50
de 4,0 µg/ml.
No presente estudo foi feito uma avaliação do efeito da mistura de sesquiterpêno
obtido de Anthemis tinctoria na interação do T. cruzi com células LLCMK
2
. As formas
tripomastigotas foram incubadas por 24 h na presença de células LLCMK
2
, em seguida as
células foram tratadas nas concentrações de 10, 5, 1, e 0,5 µg/ml da mistura sesquiterpênica
e incubadas por 96 h. Nas concentrações de 0,5 e 1 µg/ml a subfração de sesquiterpeno
apresentou uma taxa inibição acima de 50%. O tratamento com 5,0 µg/ml do composto
levou a uma diminuição do número de células internalizadas com parasitas e também do
número de parasitas internalizados por células LLCMK
2
(Figura 04).
Foram observadas alterações morfológicas através da microscopia ótica comum de
formas epimastigota tratadas com 2,0 µg/ml da mistura sesquiterpênica de A. tinctoria por
um período de 96 h a 28
o
C. Na Figura 05A pode-se observar as características
morfológicas de formas epimastigota não tratadas com uma forma alongada e o flagelo na
posição anterior, o cinetoplasto, o núcleo e membrana citoplasmástica características. O
T.cruzi na presença do composto sesquiterpênico (IC
50
), apresentou alterações na sua
morfologia com um aumento do volume celular, formato irregular e células arredondadas
(Figura 05B, C e D). Na presença do composto (IC
90
) apresentou uma diminuição do
número de parasitas por campo e também as células mostraram-se mais finas e com
estrutura bastante alteradas (Figura 05 E e F).
A microscopia eletrônica de varredura confirmou as alterações observadas através
da microscopia ótica comum. Na Figura 06 (B, C e D) é possível observar as alterações
provocadas pelo sesquiterpeno na membrana do parasita e ainda visualizar a presença de
mais de um flagelo saindo do mesmo ponto da bolsa flagelar. T. cruzi não tratados ou
tratados somente com DMSO apresentam uma morfologia alongada com um único flagelo
emergindo da bolsa flagelar, típico de formas epimastigota (Figura 06A). A microscopia
eletrônica de transmissão mostrou alterações ultraestruturais de formas epimastigota após
incubação e tratamento com o composto isolado de A. tinctoria. Os parasitas tratados com
este composto em concentrações de IC
50
(Figura 07B, C e D) e IC
90
(Figura 07E e F)
apresentaram alterações ultraestuturais bem evidentes. Na extremidade inferior do flagelo
de epimastigota foi observada a presença de “blebs” na membrana (Figura 07B e D).
Porções da membrana se destacaram do corpo celular formando “blebs” sendo que em
alguns casos houve até uma separação de partes da membrana do corpo da célula. A células
controle (Figura 07A) mostram uma forma alongada, flagelo terminal, bolsa flagelar,
cinetoplasto e membranas intactas característico do protozoário não tratado com a droga.
4. Discussão
Na tentativa de se obter novas drogas para o tratamento da doença de Chagas, vários
estudos são realizados tanto com compostos de origem natural quanto sintéticos. Diversas
pesquisas têm mostrado que os extratos de plantas apresentam atividade antiprotozoário.
Dentre muitos dos estudos realizados pode-se citar o trabalho com extratos brutos de 39
plantas medicinais do México que tiveram suas atividades testadas contra formas
epimastigota de T.cruzi. Trinta e dois extratos mostraram atividade frente a este
protozoário, sendo que, o extrato metabólico das raízes da Aristolochia taliscana
(Aristolochiaceae) localmente conhecida como “guaco”, imobiliza forma epimastigota. Do
fracionamento deste extrato neolignanas e lignanas isoladas, em concentrações de 5 e 75
µg/ml respectivamente, também imobilizam formas epimastigota (ABE et al., 2002). A
atividade antitripanosoma também foi investigada com extratos de plantas da Colômbia. Os
extratos de Conobea scoparioides, Otoba novogranatensis e Otoba paevifolia mostraram-
se ativos contra formas epimastigotas de T.cruzi (WENIGER et al., 2001). Panty et al.
(2004) verificaram que o composto 3-(bifenil-4il)-3-hidroxiquinoclidina (BPQ-OH)
apresentou um efeito dose dependente no crescimento de epimastigotas de T. cruzi cepa Y,
com um IC
50
de 24,38 ± 2,10 µM. O composto ER27856 mostrou efeito equivalente com
um IC
50
de 4,59 ± 0,36 µM. O efeito antiproliferativo in vitro contra T. cruzi com o
eupomatenóide isolado das folhas de Piper regnellii, planta da família Compositae, mesma
família da A. tinctoria, foi recentemente investigado. Este composto mostrou atividade
contra formas epimastigota de T.cruzi com IC
50
de 7,0 µg/ml (LUIZE et al., 2006). No
presente estudo foi observado que uma subfração composta por uma mistura de
sesquiterpenos obtida de flores de A. tinctoria apresenta um IC
50
de 1,5 µg/ml em formas
epimastigota de T. cruzi. Estes resultados mostraram que com fracionamento do extrato
bruto houve um aumento da atividade. Em comparação, os resultados obtidos da mistura
sesquiterpênica revelaram que este pode ser mais ativo que o Benzonidazol que apresetou
um IC
50
de 7 µg/ml e porcentagem de inibição de 84%.
Segundo Vuckovic (2006) três tipos de classes de metabólitos secundários têm sido
detectados no gênero Anthemis: poliacetilenos (CHRISTENSEN, 1992), flavonóides
(WILLIAMS et al., 2001) e lactonas sesquiterpênicas (BULATOVIC, 1998). Estudos
químicos prévios vêm indicar que lactonas sesquiterpênicas são sistematicamente
importantes dentro do gênero Anthemis. A presença de lactonas sesquiterpênicas em várias
espécies der Anthemis têm sido descritas por muitos pesquisadores. Uma das primeiras
literaturas informou sobre o sabor amargo da nobilina, lactona sesquiterpênica da Anthemis
nobilis L., uma planta medicinal de uso popular bem conhecida (BENESOVA et al., 1964),
sendo que foi também isolada um tipo de lactona acíclica considerada comum de Anthemis
cotula L. (BOHLMANN et al., 1969; BARUAH et al., 1985). Saroglou (2006) realizou um
estudo da composição de oito espécies do gênero Anthemis nativas da Grécia, entre elas a
espécie Anthemis tinctoria. A análise foi feita por GC e GC-MS e mostrou a presença de
uma mistura complexa de óleos essenciais, onde, os terpenóides foram considerados os
compostos majoritários. A taxa de sesquiterpenos variou entre as espécies, entretanto a
variedade Anthemis tinctoria teve a mais alta taxa de sesquiterpenos com 53,8%. Dentro do
grupo das espécies de Anthemis estão incluídos os três maiores tipos de lactonas
sesquiterpênicas sendo estes os germacrolídeos, eudesmanolideos e guaianolideos (VAJS et
al., 1999).
Uma grande porcentagem da população mundial não tem acesso a tratamentos
farmacológicos convencionais e o uso da medicina folclórica é muito comum e sugerem
que produtos naturais são inofensivos (RATES, 2001). No entanto, o uso tradicional destes
produtos não é garantia de segurança (EDZARD, 1998). Testes de citoxicidade com
produtos naturais são importantes, uma vez que é grande o interesse de drogas obtidas de
plantas significando que o tratamento médico convencional pode ser ineficiente ou resultar
em efeitos terapêuticos ineficientes (RATES, 2001). Ensaios para a investigação do efeito
citotóxico sobre células LLCMK
2
mostraram que a FD obtida a partir da planta A. tinctoria
foi a que apresentou maior citotoxicidade com CC
50
de 4,0 µg/ml.
Através da microscopia eletrônica de transmissão, em formas epimastigotas tratadas
com uma subfração constituida por compostos sesquiterpênicos foi observado a formação
de “blebs” na membrana do flagelo. A formação de “blebs” também foi verificado por
Braga e colaboradores (2004) em parasita tratado com o composto (3-bifenil-4il)-3-
hidroxiquinuclidina BPQ-OH, O ER27856. Estes compostos são inibidores da escaleno
sintetase (SQS) enzima envolvida na biossíntese de esterol substância presente na
membrana celular do T. cruzi. Porções da membrana se destacaram do corpo celular
formando “blebs” sendo que em alguns casos houve até uma separação de partes da
membrana do corpo da célula. Em todos os casos os microtúbulos do flagelo permaneceram
associados com as partes da membrana plasmática ou com o axonema flagelar. A mudança
na composição química alterando a taxa de fosfolipídeos e esterol interfere em alguns
caminhos de estabilidade de membranas, especialmente em algum domínio da ligação do
corpo celular e o flagelo, a qual inclui abundância de lipídeos ricos em esterois (DENNY et
al., 2001). Isto pode explicar as marcantes mudanças morfológicas observadas em células
tratadas com drogas particularmente em sistemas de membranas marcadas. A formação da
estrutura ramificada da bicamada é intrigante mas pode estar associada a alterações
atribuídas a estabilidade da bicamada modificando sua composição de lipídeos. O
resultado, em alguns casos, e toda membrana plasmática perde a conexão com os
microtúbulos subpeliculares característicos dessas células (DE SOUZA, 1984; DE SOUSA,
2002).
4. Conclusão
Os resultados mostraram um forte potencial in vitro da atividade antiproliferativa
dos extratos, frações e de uma subfração constituida por compostos sesquiterpênicos
obtidos de A. tinctoria sobre T. cruzi. Esta atividade pode estar associada a uma grande
desestabilização da membrana celular do parasita. Assim é importante a realização de
novos estudos sobre o efeito das flores de A. tinctoria nas membranas dos
tripanosomatídeos e sua influência nas alterações ultraestruturais dessas células para se
determinar os mecanismos de ação em T. cruzi. Portanto, produtos naturais podem ser uma
fonte de novas drogas com atividade antiprotozóario e baixa toxicidade, que podem ser
empregados na terapia de doenças infectos parasitárias como a doença de Chagas.
Acknowledgements:
This study was supported through grants from DECIT/SCTIE/MS and MCT by Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP),
Programa de Núcleos de Excelência (PRONEX/Fundação Araucária), and Programa de Pós-graduação em
Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Maringá.
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A=6,6mg B=3,0mg C= 3,6 mg D= 75 mg E=30 mg F=84 mg G=140 mg
H=110g
C1 =11 mg C2=8 mg C3=7mg
Sílica gel 60
130 g das flores de Anthemis tinctoria extraída
com etanol: água 90/10 V/V
Extrato aquoso (21,0g) Extrato residual (4,71 g)
F1=0,24 g
F2=3,42 g
F3=6,49 g F4=5,49 g
F5=0,042 g
LIOFILIZADO
Pré-fracionamento
SEPHADEX LH20 (metanol:água (1:1)
32,3 mg
Esquema 1:
fluxograma de separação das frações, subfrações e composto a partir do extrato bruto
hidroalcóolico das flores da planta Anthemis tinctoria.
5
6
7
8
0 24 48 72 96 120 144 168
log No cels./ml
5
6
7
8
9
0 24 48 72 96 120 144 168
log No céls./ml
5
6
7
8
9
0 24 48 72 96 120 144 168
Tempo (h)
Log do No céls./ml
Figura 02
-
Porcentagem de inibição de crescimento de formas epimastigota de
Trypanosoma cruzi tratadas com (A) Extrato aquoso; (B) fração diclorometano; (C)
subfração obtidas das flores de Anthemis tinctoria.
Controle;
1 µg/ml;
10
µg/ml;
5 µg/ml;
50 µg/ml;
100 µg/ml. 1000 mg/ml
A
B
C
0.00
50.00
100.00
1 10 100 1000
Concentração
% de inibição
Figura 03
-
Citotoxicidade de formas epimastigotas de Trypanossoma cruzi cepa Y
em
extrato aquoso;
fração diclorometano;
subfração obtida das flores de
Anthemis tinctoria.
0
20
40
60
80
100
0.5 1 5 10
Concentração (
µ
µµ
µ
g/ml)
% Células Infectadas
Figura 4
-
Interação de Trypanosoma cruzi, forma tripomastigota, tratado com as
concentrações de 0,5, 1, 5 e 10 mg/ml da subfração obtida de Anthemis tinctoris com
células LLCMK2.
Figura 5- Microscopia óptica comum de formas epimastigota de Trypanosoma cruzi
cultivada a 28ºC por 96 h na ausência (A), e presença da subfração obtida na concentração
de IC
50
(B, C e D) e IC
90
(E e F).
Ampliação = 100x.
Figura 6
-
Morfologia Ultraestrutural de Trypanosoma cruzi forma
epimastigota cultivado à 28ºC por 96 h na ausência (A) e presença da subfração
obtida na concentração de IC
50
(B,C e D) e IC
90
(E e F).Barra = 1 m
Figura 6
-
Morfologia Ultraestrutural de Trypanosoma cruzi forma
epimastigota cultivado à 28ºC por 96 h na ausência (A) e presença da subfração
obtida na concentração de IC
50
(B,C e D) e IC
90
(E e F).Barra = 1 m
Antitrypanosomal activity of a semi-purified subfraction rich in
labdane sesquiterpenes, obtained from flowers of Anthemis
tinctoria, against Trypanosoma cruzi
Nilza de Lucas Rodrigues BITTENCOURT
1
; Tânia UEDA-NAKAMURA
1,2
; Benedito Prado DIAS
FILHO
1,2
; Diógenes Aparício Garcia CORTEZ
1
; Celso Vataru NAKAMURA
1,2*
1
Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas;
2
Departamento de Análises Clínicas,
Laboratório de Microbiologia Aplicada aos Produtos Naturais e Sintéticos, Departamento de Análises
Clínicas, Universidade Estadual de Maringá, Maringá, Paraná, Brazil
* Address for correspondence: Celso Vataru Nakamura, Universidade Estadual de Maringá; Departamento
de Análises Clínicas, Laboratório de Microbiologia Aplicada aos Produtos Naturais e Sintéticos, Bloco I-90
Sala 123 CCS, Avenida Colombo, 5790; BR-87020-900, Maringá, PR, Brazil. Fax: +55 44 3261-4860; E-
mail: cvnakamura@uem.br
Summary:
In Brazil and several other Latin American countries, Chagas’ disease still constitutes a serious
medical and social problem, and there is a need to develop new, more-potent drugs with fewer side effects to
effectively treat this disease. We investigated the antitrypanosomal effect of a crude extract, fractions, and a
semi-purified subfraction rich in a mixture of isomeric labdane sesquiterpenes, obtained from flowers of
Anthemis tinctoria, against Trypanosoma cruzi. In epimastigote forms, the aqueous crude extract,
dichloromethane fraction, and semi-purified subfraction showed a dose-dependent inhibitory activity, with
IC
50
of 2.3 µg/ml, 1.8 µg/ml, and 0.2 µg/ml, respectively. In the interaction index, the semi-purified
subfraction showed a reduction in both the percentage of infected LLCMK
2
cells and the mean number of
trypomastigotes per infected cell. The cytotoxicity evaluation demonstrated that the cytotoxic concentrations
of the semi-purified subfraction were higher for LLCMK
2
cells than for the protozoans, with a selectivity
index of 35.0. Epimastigote forms treated with the semi-purified subfraction showed ultrastructural and
morphological alterations such as rounding of the cells and bleb formation in the flagellum and cytoplasmic
membrane. These results show that the flowers from A. tinctoria may be a source of new drugs with
antiprotozoal activity. However, additional in vitro and in vivo studies are needed to validate the use of A.
tinctoria in the treatment of Chagas’ disease.
Keywords: antiprotozoan activity, medicinal plants, Trypanosoma cruzi, ultrastructure alterations.
Introduction
About 65-80% of the population in developing countries essentially depends on plants for primary
health care. Some 25% of all modern medicines are derived directly or indirectly from plants (Farnsworth and
Morris 1976). Many plants from Brazilian ecosystems such as the savanna, and the Atlantic and Amazon
forests are used in traditional medicine (Alves et al. 2000). Also, many exotic plants that were introduced into
Brazil and incorporated into traditional medicine display curative properties (Duarte et al. 2005). Various
studies have demonstrated a strong correlation between popular use and experimentally demonstrated
pharmacological activity. Many plant extracts and essential oils have been shown to exert in vitro and in vivo
activity, which justifies research on plants used in traditional medicine (Martinez et al. 1996). Plants produce
a variety of compounds with antimicrobial properties, which have led to the development of new drugs for
treatment of infectious diseases (Ahmad and Beg 2001).
The family Compositae is one of the most species-rich among the flowering plants. Anthemis L. is
the second-largest genus in this family with approximately 25,000 species, widely distributed in subtropical
and temperate areas. Species of Anthemis are widely used in the pharmaceutical, cosmetic and food industries.
Anthemis tinctoria L. is a perennial herb cultivated in Mediterranean countries, and several secondary
metabolites have been identified in this species, such as volatile oils, triterpenes, polyacetylenes, and
flavonoids (Masterová et al. 2005). In traditional medicine, this plant is used to treat liver problems and
jaundice (Liszt et al. 1972). Its flowers have well-known antiseptic and medicinal properties, derived from
flavonoids as well as essential oils (Vaverkova et al. 2001). In Europe, extracts, dyes, teas, and ointments are
used as anti-inflammatory, antibacterial, antispasmodic, and sedative agents (Mann and Staba 1986). The
antimicrobial activity of essential oils and extracts from different species of Anthemis has been studied
previously (Holla et al. 2000; Grace 2002).
Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas’ disease, which in Brazil and several other Latin
American countries constitutes, a serious social and medical problem (WHO 2008). Transmission to
vertebrates occurs through feces of hemipteran insects contaminated with metacyclic trypomastigotes, the
infective stage of the parasite (de Souza 1984). The acute phase of Chagas’ disease is frequently
asymptomatic, and the chronic phase usually develops 10 to 20 years after the infection, affecting about 10 to
30% of infected individuals (Viotti et al. 1994).
In spite of the impressive progress in the understanding of the biology of T. cruzi, the drugs available
(nifurtimox and benzonidazole) are active on the acute stage of Chagas’ disease, with about 80%
effectiveness; but have limited utility against the established chronic disease (Sosa 1998). The side effects of
both compounds can be quite severe (Croft et al. 2005). Therefore, trypanocidal drugs with less-serious side
effects are necessary. In this context, plants are a reservoir of chemical and biological diversity that has led to
the development of hundreds of pharmaceutical drugs (Calixto 2000). The objective of the present study was
to investigate the activity of the extracts, fractions, and a sequiterpene-rich semi-purified subfraction, obtained
from flowers of A. tinctoria, against T. cruzi.
Materials and Methods
General experimental procedures
The NMR spectra were obtained in VARIAN GEMINI 300 (7.05T) spectrometers,
using deuterated solvent, TMS as the internal standard and a constant temperature of 298
K. Sephadex LH-20; Silica gel 60 (70-230 and 230-400 mesh); TLC: silica gel plates F
254
(0.25 mm thickness).
Collections of the plant
Flowers of Anthemis tinctoria were collected in November 2004 at the “Profa.
Irenice Silva” Garden of Medicinal Plants of the State University of Maringá. The plant
was identified through authentic comparison by Dr. Cirino Correia Júnior, and a voucher
specimen (No. HUM 1133) is deposited at the Herbarium of the State University of
Maringá, Paraná, Brazil.
Separation of the components
Dried flowers of A. tinctoria (130 g) were extracted with ethanol:water (9:1 v/v) by
maceration for 8 days at room temperature. The solvent was removed in a rotating
evaporator, to give an aqueous extract and a dark-green residue. The aqueous extract was
lyophilised (21.0 g) and the water-insoluble residue was diluted with ethyl-acetate, yielding
the ethyl-acetate extract (4.71 g). The aqueous and ethyl-acetate extracts were assayed
against the epimastigote form of T. cruzi. The aqueous extract (13 g) was submitted to
vacuum-column chromatography (32 g silica gel) and eluted with hexane,
dichloromethane, ethyl acetate, methanol, and methanol/water (9:1 v/v). Each fraction
(hexane, F1; dichloromethane, F2; ethyl acetate, F3; methanol, F4; and methanol/water 9:1,
F5) was assayed for antitrypanosomal activity. The dichloromethane fraction (500 mg),
which showed the highest inhibitory activity, was chromatographed by column
chromatography in Sephadex-LH-20 and eluted with chloroform/methanol (1:1 v/v). This
process yielded 8 subfractions, denominated F2a, F2b, F2c, F2d, F2e, F2f, F2g, and F2h.
Subfraction F2g (140 mg) was chromatographed in Sephadex phase with movable phase,
chloroform/methanol (1:1 v/v), yielding the subfraction (11 mg). The subfraction was
identified as a mixture of isomeric labdane sesquiterpenes by analyses of spectral data of
1
H and
13
C (Chart 1).
Parasites
Epimastigote forms of T. cruzi Y strain were cultured in LIT (Liver Infusion
Triptone broth) (Camargo 1964) with 10% fetal bovine serum (SFB) (Gibco Invitrogen
Corporation, New York, USA) at 28
o
C for 96 h. Amastigote and trypomastigote forms
were grown in monolayers of LLCMK
2
cells in DMEM medium (Gibco Invitrogen) with
10% SFB in 5% CO
2
at 37
o
C.
Antiproliferative activity against epimastigote forms
The aqueous and ethyl-acetate crude extracts, fractions (hexane, dichloromethane,
ethyl acetate, methanol, and methanol/water ) and the semi-purified subfraction were
dissolved in dimethyl sulphoxide (DMSO, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA)
at a final concentration not exceeding 1% (Yong et al. 2000) and assayed against the
epimastigote form of T. cruzi. The experiments were performed on 24-well polystyrene
plates containing 1 ml of diluted compound at different concentrations (from 1.0 to 1,000
µg/ml). The starting inoculum consisted of 10
6
parasites in logarithmic growth phase per
well. The cells were incubated at 28
o
C and the growth was determined by counting the
parasites with a Neubauer hemocytometer (Improved Double Neubauer Ruling) every 24 h
over a 7-day period. Benznidazole (N-benzyl-2-nitro-1-imidazolacetamide, Roche
Pharmaceuticals, Rio de Janeiro, Brazil) was used as a reference drug. The assays were
performed in duplicate on separate occasions.
Growth inhibition assay of mammalian-stage amastigote form of T. cruzi
LLCMK
2
cells (kidney cells from Mulatto monkey) were plated on glass coverslips
(diameter 13 mm) into 24-multiwell tissue culture plates and maintained in a humidified
5% CO
2
atmosphere at 37
o
C. The cells were infected with trypomastigote forms at a
parasite/cell ratio of 10:1. After 24 h, non-adhered parasites were washed out, and fresh
DMEM medium, and the semi-purified subfraction containing sesquiterpene in various
concentrations, was added. The cells were incubated in a humidified 5% CO
2
atmosphere at
37
o
C for 96 h. The coverslips were washed 3 times with PBS, fixed with methanol and
stained with Giemsa. Next, the coverslips were mounted on glass slides using Entellan
(Merck), and the percentage of LLCMK
2
cells with internalised parasites (1) and the
number of internalised parasites per LLCMK
2
cell (2) were determined by counting at least
200 cells per sample under a microscope (Olympus CX 31). The product of 1 and 2
determined the survival index.
Cytotoxicity activity
LLCMK
2
cells were seeded onto 24-well microtitre plates at a concentration of 2.0
x 10
5
cells/ml and allowed to proliferate for 48 h in DMEM containing 5% FBS at 37
o
C
with 5% CO
2
to form a cell monolayer. Different concentrations of the semi-purified
subfraction containing sesquiterpene were applied to the monolayer and incubated at 37
o
C
with 5% CO
2
for 72 h. Next, the cells were treated with 10% trichloroacetic acid at 4
o
C for
one hour, gently washed in tap water, and allowed to dry at room temperature. A solution
of 0.4% sulforhodamine B (in 1% acetic acid) was added to each well, and the plate was
kept protected from light for 30 min at 4
o
C. The wells were washed four times with 1%
acetic acid, and 150 µl of 10 mM Tris-base was added and homogenised for 15 min. The
absorbance was read at 530 nm in a microplate spectrophotometer (Bio Tek-Power Wave
XS). The CC
50
(concentration that lysed 50% of cells) of the subfraction was calculated.
Evaluation of morphological alterations by Scanning electron microscopy
Epimastigote forms treated with IC
50
(0.2 µg/ml) or IC
90
(1.0 µg/ml) of the semi-
purified sesquiterpene subfraction for 96 h were collected by centrifugation, washed in PBS
and fixed with 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer, pH 7.2, containing
1.0 mM CaCl
2
at 4 °C. After fixation, small drops of the sample were placed on a specimen
support with poly-L-lysine. Subsequently, the samples were dehydrated in graded ethanol,
critical-point dried in CO
2
, sputter-coated with gold and observed in a SHIMADZU SS-550
Scanning electron microscope.
Evaluation of the ultrastructural alterations in T. cruzi by Transmission electron
microscopy
After treatment with IC
50
or IC
90
of the semi-purified sesquiterpene subfraction for
96 h, epimastigote forms were washed in 0.01 M phosphate-buffered saline and fixed in
2.5% glutaraldehyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer, pH 7.2. The cells were postfixed
in a solution containing 1% OsO
4
and 0.8% potassium ferrocyanide in 0.1 M cacodylate
buffer, dehydrated in acetone, and embedded in Epon. Thin sections were collected on a
copper grid (300 mesh), stained with uranyl acetate and lead citrate, and observed in a Zeiss
900 transmission electron microscope.
Statistical analysis
Statistical analysis was performed with the program GraphPad Prism 4 (GraphPad
Software, San Diego, California, USA). One-Way Anova was applied, and a p-value less
than 0.05 was regarded as significant.
Results and Discussion
In the attempt to develop new drugs for treatment of infectious diseases, studies are
carried out with compounds of both natural and synthetic origin. Many studies have
demonstrated that crude extracts, fractions, and compounds isolated from medicinal plants
exhibit antiprotozoal activity (Weninger et al. 2001; Abe et al. 2002; Luize et al. 2005;
Lavaggi et al. 2007; Santoro et al. 2007; Izumi et al. 2008; Sala et al. 2008). In this study,
we evaluated the antitrypanosomal activity of the crude extract, fractions, and a subfraction
rich in a mixture of isomeric labdane sesquiterpenes, obtained from flowers of A. tinctoria,
against epimastigote, amastigote, and trypomastigote forms of T. cruzi.
The analyses of the
1
H and
13
C NMR spectrum of the semi-purified subfraction
showed a signal of a mixture of isomers of cross-conjugated terpenoid ketones derived
from labdane sesquiterpenes that are frequently found in the family Asteraceae (Kalsi et al.
1978). Three types of classes of secondary metabolites have been detected in Anthemis:
polyacetylenes (Christensen 1992), flavonoids (Williams and Greenham 2001), and
sesquiterpene lactones (Bulatovic 1998). Previous chemical studies of species of Anthemis
have shown the presence of sesquiterpene lactones (Baruah et al. 1985; Bruno et al. 1998;
Vajs et al. 2000; Konstantinopoulou et al. 2003; Saroglou 2006; Staneva et al. 2008;
Todorova et al. 2008). The three major types of sesquiterpene lactones are germacrolides,
eudesmanolides, and guaianolides (Vajs et al. 1999). Recently it was demonstrated that
anthecularin, a sesquiterpene lactone isolated from Anthemis auriculata, shows antimalarial
activity, and also antitrypanosomal activity against Trypanosoma brucei (Karioti et al.
2007).
The hydroalcoholic crude extracts, fractions, and semi-purified subfraction obtained
from A. tinctoria flowers were used in order to investigate the antiprotozoal activity of this
plant against T. cruzi. A progressive increase in the antitrypanosomal effect was observed
in the course of the purification process. Figure 1A shows the percentage of growth
inhibition of the epimastigote form treated with the aqueous phase of the crude extract for
96 h of incubation at 28
o
C. This extract showed a dose-dependent inhibitory activity of
77.4 and 91.9% at 5 and 10 µg/ml, respectively. In the same concentrations, the ethyl-
acetate extract showed an inhibitory activity of 31.7 and 76.8%. The 50% inhibitory
concentration (IC
50
) of the crude extract aqueous phase was 2.3 µg/ml. On the basis of this
finding, the crude aqueous extract was fractionated on silica gel into five fractions: hexane
(F1), dichloromethane (F2), ethyl-acetate (F3), methanol (F4), and methanol:water (F5).
The F2 fraction showed an IC
50
of 1.8 µg/ml (Figure 1B), and the F3 fraction an IC
50
of 5.0
µg/ml (data not shown). The other fractions (F1, F4, and F5) showed lower inhibitory
activity, with IC
50
of 26.8, 23.6, and 145 µg/ml, respectively. Subsequently, the F2 fraction
was submitted to the Sephadex column, yielding 8 subfractions: F2a, F2b, F2c, F2d, F2e,
F2f, F2g, and F2h. Figure 1C illustrates the inhibitory activity of the F2g subfraction, with
a percentage of inhibition of growth of the epimastigote form above 90% for all
concentrations used (1 - 1000 µg/ml). The F2g subfraction, which was rich in a mixture of
isomeric labdane sesquiterpenes, showed an IC
50
at 0.2 µg/ml. In comparison, Luize et al.
(2006) investigated the in vitro antiproliferative effect of eupomatenoid-5, a sesquiterpene
isolated from leaves of Piper regnellii var. pallecens, a plant of the same family
(Compositae) as A. tinctoria, against T. cruzi. Our results obtained with a mixture of
sesquiterpenes also showed that this mixture was more active than Benzonidazole.
The effect of the semi-purified subfraction obtained from flowers of A. tinctoria on
the interaction of T. cruzi with LLCMK
2
cells was evaluated. The treatment of LLCMK
2
cells infected with the amastigote form showed that the semi-purified subfraction had a
dose-dependent antitrypanosomal activity (Figure 2), leading to considerable reduction in
both the percentage of infected cells and the mean number of parasites per infected cell.
After 96 h of incubation, the percentage of LLCMK
2
cells with internalised parasites was
higher for the control than for cells treated with the semi-purified subfraction. At that time,
the control showed a mean of 34.1 amastigotes per cell, with 40.6% of cells infected. Cells
treated with 1.0 µg/ml showed a mean of 18.1 internalised amastigotes per cell, with 22.7%
of cells infected. Treatment of the cells with 5.0 µg/ml resulted in only 4.7% infected cells
and 4.2 parasites per cell.
Important criteria for the investigation of compounds with activity against T. cruzi
are both their therapeutic potential, and the lack of a cytotoxic effect on mammalian cells.
We evaluated the cytotoxicity in LLCMK
2
cells treated with the crude extract aqueous
phase, dichloromethane fraction, and the semi-purified subfraction (Figure 3). The 50%
cytotoxicity concentration (CC
50
) in LLCMK
2
cells treated with the crude extract aqueous
phase, dichloromethane fraction, and semi-purified subfraction were 17.3 µg/ml, 4.0 µg/ml,
and 7.0 µg/ml, respectively. The best selectivity index (SI) ratio (CC
50
for LLCMK
2
cells/IC
50
for protozoans) was obtained by the semi-purified subfraction, with SI of 35.0.
The dichloromethane fraction and crude extract showed SI of 2.2 and 7.5, respectively
(Table 1).
Morphological alterations in epimastigote forms treated with the semi-purified
subfraction were observed by scanning electron microscopy. Epimastigote forms in the
presence of the semi-purified subfraction at IC
50
(0.2 µg/ml) showed distortions of the
parasite cell body, and the cell shape was severely affected. Increase of the cell volume and
rounding of the cell body were observed (Figure 4B, C, and D). At IC
90
(1.0 µg/ml),
alterations were more evident (Figure 4 E and F). Figure 4A shows the characteristic
elongated shape of an untreated protozoan, or treated only with 1% DMSO (control), with a
terminal flagellum that emerges from the flagellar pocket and remains tightly attached to
the cell body along its length, typical of the epimastigote form.
Ultrastructural alterations of the epimastigote form treated with the semi-purified
subfraction were observed by transmission electron microscopy. Untreated T. cruzi or
epimastigotes treated with 1% DMSO showed the typical ultrastructure (Figure 5A).
Epimastigotes treated with the semi-purified sesquiterpene-rich subfraction at
concentrations of IC
50
(Figure 5B, C, and D) and IC
90
(Figure 5E and F) showed
ultrastructural alterations. One important change took place in the membrane lining the cell
body and flagellum, with portions of the membrane detached from the cell body, forming
blebs, and in some cases whole sections of the plasma membrane separated from the cell
body (Figure 5B and D). The formation of blebs was also observed in T. cruzi treated with
compounds ER27856 and BPQ-OH (3-biphenyl-4yl)-3-hydroxyquinuclidine BPQ-OH)
(Braga et al. 2004). These compounds are inhibitors of scalene synthase, the enzyme
involved in the biosynthesis of ergosterol. The change in the chemical composition of the
membrane alters the ratio of phospholipids and sterols, affecting the stability of the
membranes, and especially the integrity of the cell body (Denny et al. 2001). This may
explain the morphological changes observed in epimastigotes treated with the
sesquiterpene-rich subfraction of the flower of A. tinctoria. Pedroso et al. (2006) also
showed the presence of blebs in cell and flagellar-pocket membranes in Crithidia deanei
treated with essential oil from Cymbopogons citratus.
In conclusion, this study showed that extracts, fractions, and a semi-purified
subfraction containing sesquiterpene obtained from flowers of A. tinctoria have potential
antiproliferative activity in vitro against T. cruzi. Therefore, natural products may be a
source of new drugs with antiprotozoal activity that could be used to treat parasitic
infectious diseases such as Chagas’ disease.
Acknowledgements:
This study was supported through grants from DECIT/SCTIE/MS and MCT by
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Financiadora
de Estudos e Projetos (FINEP), Programa de Núcleos de Excelência
(PRONEX/Fundação Araucária), and Programa de Pós-graduação em Ciências
Farmacêuticas da Universidade Estadual de Maringá.
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Figure Legends
Chart 1. Fractionation scheme of sequiterpene from aqueous extract of flowers of Anthemis tinctoria
Figure 1. Effects of crude extract aqueous phase (A), dichloromethane fraction (B) and semi-purified
subfraction (C) obtained from flowers of Anthemis tinctoria, on the growth of Trypanosoma cruzi
epimastigote form. Control; 1000 µg/ml; ▲ 100 µg/ml; 50 µg/ml; 10 µg/ml; 5 µg/ml; 1
µg/ml
Figure 2. Growth inhibition assay of mammalian-stage amastigote form of Trypanosoma cruzi treated with a
semi-purified subfraction obtained from Anthemis tinctoria
Figure 3.
Cytotoxicity activity on LLCMK
2
cells. () aqueous extract, (▲)
dichloromethane fraction; () semi-purified subfraction obtained from flowers of Anthemis
tinctoria
Figure 4. Morphological alterations of Trypanosoma cruzi epimastigote form cultured at 28 ºC for 96 h,
observed by scanning electron microscopy, in the absence (A) and presence of the semi-purified subfraction
at concentrations of IC
50
(B, C, and D) and IC
90
(E and F). Bar = 1 µm
Figure 5. Ultrastructural alterations of Trypanosoma cruzi epimastigote forms cultured at 28 ºC for 96 h,
observed by transmission electron microscopy, in the absence (A) and presence of semi-purified subfraction
at concentrations of IC
50
(B,C and D) and IC
90
(E and F). er-endoplasmic reticulum; f-flagellum; g-
glycosome; m-mitochondrion; n-nucleus; v-vacuole. Bar = 1 µm
F2a=6.6 mg F2b=3.0 mg F2c= 3.6 mg F2d= 75 mg F2e=30 mg F2f=84 mg F2g=140 mg F2h=110 mg
Chart 1. Fractionation scheme of sequiterpene from aqueous extract of flowers of Anthemis tinctoria
130 g Dried flowers of Anthemis tinctoria extracted
with ethanol:water (9/1) v/v
Aqueous extract (21.0 g)
Ethyl-acetate extract (4.71 g)
F1=0.24 g
F2=3.42 g
F3=6.49 g
F4=5.49 g
F5=0.042 g
lyophilised
silica column
Sephadex
-
column LH20 choroform:methanol (1:1 v/v)
Sephadex-column LH20 choroform:methanol (1:1 v/v)
11 mg
mixture of isomeric labdanes sesquiterpenes
Table 1. Citotoxicity, growth inhibition and selectivity index of the crude
extract aqueous phase, dichlorometane fraction, and semi-purified
subfraction obtained of Anthemis tinctoria
CC
50
IC
50
Drugs
(µg/ml)
(µg/ml)
IS
Crude extract aqueous phase 17.3 2.3 7.5
Dichlorometane fraction 4.0 1.8 2.2
Semi-purified subfraction 7.0 0.2 35.0
IS = CC
50
/IC
50
Figure 1. Effects of crude extract aqueous phase (A), dichloromethane fraction (B) and semi-purified
subfraction (C) obtained from flowers of Anthemis tinctoria, on the growth of Trypanosoma cruzi
epimastigote form. Control; 1000 µg/ml; ▲ 100 µg/ml; 50 µg/ml; 10 µg/ml; 5 µg/ml; 1
µg/ml
Figure 2. Growth inhibition assay of mammalian-stage amastigote form of Trypanosoma cruzi treated with a
semi-purified subfraction obtained from Anthemis tinctoria
Figure 3.
Cytotoxicity activity on LLCMK
2
cells. () aqueous extract, (▲)
dichloromethane fraction; () semi-purified subfraction obtained from flowers of Anthemis
tinctoria
Figure 4. Morphological alterations of Trypanosoma cruzi epimastigote form cultured at 28 ºC for 96 h,
observed by scanning electron microscopy, in the absence (A) and presence of the semi-purified subfraction
at concentrations of IC
50
(B, C, and D) and IC
90
(E and F). Bar = 1 µm
Figure 5. Ultrastructural alterations of Trypanosoma cruzi epimastigote forms cultured at 28 ºC for 96 h,
observed by transmission electron microscopy, in the absence (A) and presence of semi-purified subfraction
at concentrations of IC
50
(B,C and D) and IC
90
(E and F). er-endoplasmic reticulum; f-flagellum; g-
glycosome; m-mitochondrion; n-nucleus; v-vacuole. Bar = 1 µm
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