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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
Instituto de Ciências Básicas da Saúde
Departamento de Fisiologia
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia
ASSOCIAÇÃO DO ESTRESSE OXIDATIVO CARDÍACO COM VIAS DE
SINALIZAÇÃO INTRACELULARES RELACIONADAS COM A
HIPERTROFIA CARDÍACA FISIOLÓGICA E PATOLÓGICA
MARIANE BERTAGNOLLI
Orientadora: Dra. Maria Cláudia Irigoyen
Co-orientadora: Dra Katya Rigatto
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências
Biológicas, área de concentração: Fisiologia, Universidade Federal do
Rio Grande do Sul, como requisito parcial para a obtenção do grau de
Doutor em Ciências Biológicas – Fisiologia
Porto Alegre, 2008
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
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AGRADECIMENTOS
A minha orientadora Maria Cláudia Irigoyen por todas as oportunidades
oferecidas, pela confiança e pelo exemplo de pesquisadora.
A minha co-orientadora e amiga Katya Rigatto pelo apoio incondicional e
dedicação ao nosso trabalho, e por me ensinar o caminho da pesquisa.
À professora Adriane Belló-Klein pelos ensinamentos e pelo exemplo de
perseverança e conquistas por mim testemunhadas.
À professora Maria Flávia Ribeiro pelo incentivo, apoio, ensinamentos técnicos
e confiança no meu trabalho.
Aos amigos e colegas do laboratório de fisiologia cardiovascular, pelo
companheirismo, amizade e alegrias compartilhadas.
Aos professores do departamento de fisiologia e do pós-graduação que de
uma forma ou outra contribuíram para a realização desta tese e para a
construção do meu conhecimento sobre a fisiologia.
Em especial aos Professores Ilma S. Brum da Silva e Edison Capp pela
inspiração desse trabalho durante as suas disciplinas.
Ao Fabrício e aos demais amigos pelo incentivo e apoio ao longo da minha
vida.
À minha família pelo amor e por me fazer ser o que sou, sempre perseverante
e otimista.
Àqueles que, segundo o Professor A. Belló, sempre tem a razão...
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ÍNDICE
LISTA DE FIGURAS_________________________________________ V
LISTA DE ABREVIATURAS ___________________________________ VI
RESUMO _________________________________________________ VIII
ABSTRACT ________________________________________________ X
1. INTRODUÇÃO____________________________________________ 1
1.1. Hipertrofia Cardíaca_______________________________________1
1.2. Vias de Sinalização Intracelulares Hipertróficas e Apoptóticas______7
1.3. Relação Estresse Oxidativo e Hipertrofia Cardíaca_______________12
1.4. Papel do Exercício sobre a Hipertrofia Cardíaca_________________ 15
2. HIPÓTESE________________________________________________19
3. OBJETIVOS_______________________________________________20
3.1. Objetivo Geral____________________________________________20
3.2. Objetivos Específicos______________________________________ 20
4. MATERIAIS E MÉTODOS____________________________________ 21
4.1. Animais_________________________________________________ 21
4.2. Protocolos Experimentais de Treinamento Físico ________________ 21
4.3. Tratamento com Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina ___ 23
4.4. Avaliações Hemodinâmicas_________________________________ 23
4.4.1. Procedimentos Cirúrgicos e Registro Intraarterial_______________ 23
4.4.2. Procedimentos Cirúrgicos e Registros Intraventriculares _________ 25
4.5. Medidas Morfométricas Cardíacas e Preparo do Tecido___________ 25
4.6. Atividade da Enzima Citrato Sintase __________________________ 26
4.7. Concentração da Norepinefrina Cardíaca ______________________ 27
4.8. Medidas de Dano Oxidativo_________________________________ 27
4.9. Atividade das Enzimas Antioxidantes__________________________28
4.10. Dosagem da Concentração de Peróxido de Hidrogênio __________ 30
4.11. Avaliação do Metabolismo da Glutationa______________________ 30
4.12. Determinação dos Nitratos Totais ___________________________31
4.13. Expressão Protéica por Western Blot_________________________ 32
5. ANÁLISE ESTATÍSTICA_____________________________________ 34
4
6. RESULTADOS ____________________________________________ 35
6.1. Artigo I: “Exercise training reduces sympathetic modulation on
cardiovascular system and cardiac oxidative stress in spontaneously
hypertensive rats” ____________________________________________ 36
6.2. Artigo II: “Cardiac oxidative stress and p38 activation in spontaneously
hypertensive rats pathological cardiac hypertrophy”__________________ 43
6.3. Artigo III: “Enalapril improves oxidative status and reduces p38 activation
and cardiac hypertrophy in spontaneously hypertensive rats” __________ 69
6.4. Artigo IV: “Renin-angiotensin system influence on physiological cardiac
hypertrophy: modulation of oxidative stress, hypertrophyc pathways and
epidermal growth factor” _______________________________________ 96
6.5. Artigo V: “Exercise training reduces pathological cardiac hypertrophy
through decreasing cardiac oxidative stress and stimulating intracellular
survival mechanisms” ________________________________________ 129
7. DISCUSSÃO CONCLUSIVA_________________________________ 158
8. PERSPECTIVAS__________________________________________ 168
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ___________________________ 169
5
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Apresentação do eixo elaborado a partir da hipótese e objetivos da
tese. Esta figura ilustra a seqüência dos mecanismos estudados.
Figura 2 – Eixo esquemático representando os mecanismos avaliados no
artigo I.
Figura 3 – Eixo esquemático representando os mecanismos avaliados no
artigo II.
Figura 4 – Eixo esquemático representando os mecanismos avaliados no
artigo III.
Figura 5 – Eixo esquemático representando os mecanismos avaliados no
artigo IV.
Figura 6 – Eixo esquemático representando os mecanismos avaliados no
artigo V.
6
LISTA DE ABREVIATURAS
AKT proteína cinase B
ASK cinase reguladora de sinais apoptóticos
AT1 receptor da angiotensina 1
CAT catalase
CHI “cardiac hypertrophy index”
DHBA diidroxibenzilamina
DNPH dinitro fenil hidrazina
EAO espécies ativas de oxigênio
ECA enzima conversora da angiotensina
EGF fator de crescimento epidermal
ERK cinase regulada por sinais extracelulares
FC frequência cardíaca
GPX glutationa peroxidase
GSH glutationa reduzida
GSK3β glicogênio sintase cinase-3 beta
GSSG glutationa oxidada
HCF hipertrofia cardíaca fisiológica
HCP hipertrofia cardíaca patológica
HPLC cromatografia líquida de alta performance
IGF1 fator de crescimento semelhante à insulina 1
JNK cinase c-jun-NH2 terminal
LVEDP pressão diastólica final do ventrículo esquerdo
LVSP pressão sistólica do ventrículo esquerdo
MAPK proteínas cinases ativadas por mitógenos
mTOR “mammalian target of rapamycin”
NADPH nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
PA pressão arterial
PAS pressão arterial sistólica
PAD pressão arterial diastólica
7
PI3K fosfatidil inositol-3-cinase
SHR ratos espontaneamente hipertensos
SNS sistema nervoso simpático
SOD superóxido dismutase
SRA sistema renina-angiotensina
TGF-β1 fator de crescimento tecidual β1
8
RESUMO
Baseado na hipótese de que a modulação do estresse oxidativo cardíaco é
diretamente associada à ativação de vias de sinalização de crescimento
celular, propomos estudar o perfil oxidativo cardíaco em modelos de
hipertrofia cardíaca patológica (HCP) e fisiológica (HCF). Além disso,
buscamos verificar se existe associação deste perfil com a ativação de vias de
sinalização de crescimento celular, bem como com a função cardíaca e se isto
é influenciado pelo exercício físico e pelos sistemas renina-angiotensina
(SRA) e nervoso simpático (SNS). Para isso, desenvolvemos cinco trabalhos
onde avaliamos parâmetros funcionais, morfológicos, bioquímicos e
moleculares que permitem avaliação dos mecanismos relacionados com o
objetivo desta tese. No primeiro artigo (I), mostramos o efeito do exercício em
animais SHR sobre a diminuição do estresse oxidativo e da atividade
simpática cardíaca, avaliada através da concentração de noradrenalina no
coração. Esses parâmetros apresentaram fortes correlações com a redução
da hipertrofia cardíaca patológica hipertensiva. Este primeiro estudo mostrou
que atividade do SNS sobre o coração está associada ao aumento do
estresse oxidativo, podendo, então, estimular o desenvolvimento da HCP. No
segundo estudo (artigo II), buscamos comparar o perfil oxidativo cardíaco em
ratos normotensos e hipertensos e associar estes parâmetros com a ativação
de vias de sinalização intracelulares. Verificamos que os animais SHR com
hipertensão estabelecida apresentam elevado estresse oxidativo cardíaco, e
isto está fortemente associado com o índice de hipertrofia cardíaca (IHC) e
com a ativação da p38. Por outro lado, verificamos uma associação inversa
entre o dano protéico oxidativo e a ativação da ERK1/2. Os resultados
demonstram, assim, que animais SHR com hipertensão estabelecida e HCP,
apresentam um quadro de estresse oxidativo cardíaco, e isso pode determinar
o predomínio da ativação de vias pró-apoptóticas, em detrimento das vias de
sobrevivência celular. Após, realizamos o terceiro estudo (artigo III), onde
avaliamos o efeito do enalapril, um inibidor da enzima conversora da
angiotensina (ECA) sobre os parâmetros avaliados no estudo anterior.
Mostramos através do uso do enalapril, que o SRA estimula o estresse
oxidativo cardíaco e a ativação da p38 nos animais SHR com hipertensão
estabelecida e HCP. No entanto, este sistema não exerce influência sobre a
Akt e a ERK1/2 nesta fase da hipertensão. Na seqüência, o artigo IV
possibilitou a avaliação do perfil oxidativo cardíaco e das vias e fatores
relacionados com o crescimento celular e o desenvolvimento da HCF induzida
pelo exercício de natação. Demonstramos, através deste estudo, que o
estresse oxidativo e o desequilíbrio redox não estão diretamente relacionados
com o desenvolvimento da HCF, uma vez que estes estavam diminuídos nos
animais treinados. No entanto, verificamos o aumento da fosforilação da Akt e
da ERK1/2 na HCF, e esta ativação de vias relacionadas ao crescimento
celular pode estar sendo estimulada pelo SRA, provavelmente via fatores de
crescimento, como o EGF avaliado neste estudo. Assim, realizamos o último
9
trabalho (artigo V) onde avaliamos os efeitos induzidos pelo exercício sobre a
redução da HCP de animais SHR, e a participação do SRA nesses
mecanismos. Verificamos que o exercício isolado diminuiu o estresse
oxidativo cardíaco, como já havíamos observado no artigo I, mas também
demonstramos que esse efeito parece determinar a diminuição da ativação da
p38 e o aumento da Akt. Esses achados indicam que o exercício parece
reduzir os fatores pró-apoptóticos cardíacos e estimular mecanismos de
sobrevivência, que no final resultam na melhora da função cardíaca. A
participação do SRA nesse mecanismo benéfico do exercício parece ser
discreta pela sua possível redução, porém influencia a ativação da Akt na
regressão da HCP. Dessa forma, concluímos que o estresse oxidativo está
diretamente associado ao desenvolvimento da HCP possivelmente
promovendo o desequilíbrio entre vias de sobrevivência e apoptose celulares,
determinando assim, em condições patológicas, o predomínio da última.
Nessas condições, o SRA e o SNS são importantes por estimular esse quadro
de estresse oxidativo, e o exercício, pelo contrário, atua sobre esses sistemas
melhorando o estado geral cardíaco. Em condições fisiológicas, a ativação de
vias relacionadas ao crescimento celular passa a desempenhar um papel
chave na determinação da HCF, e isso se deve à participação do SRA e de
fatores de crescimento sobre o coração.
10
ABSTRACT
Considering that oxidative stress is directly associated with cell growth
pathways activation, the aim of this study was to assess cardiac oxidative
stress profile in rat models of physiological (HCF) and pathological (HCP)
cardiac hypertrophy. In addition, we aimed to verify whether an association
exists with intracellular pathways activation and cardiac function. The
participation of renin-angiotensin (SRA) and sympathethic nervous (SNS)
systems and exercise training effect on cardiac hypertrophy were also
assessed. Therefore, we have evaluated functional, morphological,
biochemical, and molecular parameters to assess hypertrophic mechanisms.
The first study (I) demonstrated in spontaneously hypertensive rats (SHR) that
exercise training decreased cardiac oxidative stress and sympathetic activity,
assessed through cardiac norepinephrine concentration. The data were
strongly correlated with the reduction of pathological cardiac hypertrophy. The
first study therefore has shown that cardiac SNS activity is associated with the
increase of oxidative stress, which could determine HCP. In the second study
(II), we aimed to compare the cardiac oxidative status between normotensive
and hypertensive rats, and to establish an association with intracellular
pathways activation. We have observed that SHR with established
hypertension have increased cardiac oxidative stress, and it was directly
associated the cardiac hypertrophy index (CHI) and with p38 activation. On the
other hand, it was verified negative correlation between protein oxidative
damage and ERK1/2 activation. Thus, the results indicate that SHR with
established hypertension and HCP have high oxidative stress, which could
determine the predominance of proapoptotic mechanisms. Next, the third study
(III) has evaluated an angiotensin-converting enzyme (ECA) inhibitor, enalapril,
effect on the same parameters assessed in article II. We have shown in SHR
with established hypertension that SRA stimulates cardiac oxidative stress and
p38 activation, whereas enalapril has not modified Akt and ERK1/2 activation.
The fourth study (IV) investigated cardiac oxidative profile and cell grouth
related pathways on swimming training-induced HCF. We have demonstrated
that the decrease of oxidative stress and the enhanced redox status were not
directly associated with IHC. However, we verified increased Akt and ERK1/2
phosphorilation on HCF. This pathways response may be stimulated by SRA
through increasing growth factors such as EGF. Thus, the fifth study (V)
associated exercise training and enalapril to assess the exercise effect and
SRA participation on hypertrophic mechanisms. It was demonstrated that only
exercise decreased cardiac oxidative stress, as previously observed in article I,
but it has also decreased p38 activation while increased Akt. The findings
indicate that, in SHR, exercise may decreases cardiac proapoptotic factors and
stimulates survival mechanisms, improving the cardiac function. Moreover, in
SHR it is possible that exercise induces the decrease of angiotensin II or
inhibits its action whereas it was also observed a small SRA participation in
trained SHR by enalapril-induced decrease of Akt phosphorilation. Therefore,
11
the overall results indicate that oxidative stress is directly associated with HCP
and might promote the imbalance between cell survival and proapoptotic
pathways. Moreover, SRA and SNS stimulate cardiac oxidative stress while
exercise improves the overall cardiac function. On the other hand, in
physiologic conditions, the activation of cell growth-related pathways exerts a
key role on HCF development, and it depends on SRA participation.
12
1. INTRODUÇÃO
1.1. Hipertrofia Cardíaca
O remodelamento cardíaco é um dos principais elementos envolvidos
na patogênese de diversas doenças, incluindo a hipertensão e a insuficiência
cardíaca (Swynghedauw, 1999). Este processo pode ser definido como
modificações intersticiais, celulares e moleculares que promovem alterações
no formato e tamanho do coração, bem como de sua função após lesão ou
sobrecarga cardíaca (Cohn, Ferrari et al., 2000). O crescimento dos
cardiomiócitos durante o remodelamento cardíaco é diferente do observado
nas células cardíaca não musculares. Enquanto o crescimento pós-natal dos
cardiomiócitos acontece exclusivamente de forma hipertrófica, as células
fibroblásticas e endoteliais respondem com hipertrofia e hiperplasia. Assim, o
remodelamento cardíaco resulta da hipertrofia de miócitos, hipertrofia e
hiperplasia de células não miócitos e crescimento dos componentes
intersticiais (Swynghedauw, 1999).
Diante disso, pode-se dizer que a hipertrofia de cardiomiócitos constitui
uma importante característica do processo de remodelamento, sendo uma
adaptação inicial, tanto às condições fisiológicas, quanto patológicas,
associadas ao aumento do trabalho cardíaco. A resposta hipertrófica
inicialmente normaliza o estresse da parede cardíaca e mantém a função
ventricular (Bing, Conrad et al., 2002). No entanto, a sustentação do estímulo
hipertrófico determina alterações patológicas nas células do coração e
Introdução
13
predispõe ao desenvolvimento de insuficiência cardíaca, o que torna a sua
hipertrofia um importante fator de morbidade e mortalidade (Mosterd, Cost et
al., 2001).
De acordo com as adaptações miocárdicas e a natureza da carga
imposta ao coração, a hipertrofia cardíaca pode ser classificada como
patológica ou fisiológica, (Richey e Brown, 1998). Estes padrões de hipertrofia
apresentam diferentes características estruturais e funcionais, assim como
fatores bioquímicos e moleculares que influenciam no remodelamento
cardíaco (Iemitsu, Miyauchi et al., 2003).
O treinamento físico induz hipertrofia cardíaca, também chamada de
“coração do atleta” (Raskoff, Goldman et al., 1976). Essa hipertrofia é
considerada fisiológica, por ser uma resposta adaptativa que beneficia o
sistema cardiovascular, isto é, diminui a freqüência cardíaca de repouso e
submáxima, além de aumentar o tempo de enchimento ventricular. Esses
ajustes melhoram a função cardíaca e permitem que o coração suporte o
aumento da demanda durante o exercício (Richey e Brown, 1998).
Em atletas, o estudo do desenvolvimento da hipertrofia cardíaca
fisiológica vem acompanhando a evolução das técnicas de imagem,
principalmente ecocardiográficas. Um estudo envolvendo atletas de diferentes
modalidades verificou que em aproximadamente 50% dos atletas, existe
alguma evidência de remodelamento cardíaco (Maron e Pelliccia, 2006).
Dentre as evidências mais comuns, pode-se citar a alteração das dimensões
das câmaras ventriculares, tanto do ventrículo esquerdo quanto do direito,
associadas à normal função diastólica e sistólica do ventrículo esquerdo
Introdução
14
(Pelliccia, Maron et al., 1991). As alterações morfológicas observadas na
hipertrofia cardíaca fisiológica são reversíveis e, devido à ausência de fibrose,
não promovem efeitos deletérios tardios (Maron e Pelliccia, 2006). No entanto,
o aumento da incidência de morte súbita em atletas chamou a atenção para
os mecanismos associados ao desenvolvimento desta adaptação fisiológica. A
partir de então, foi evidenciado que o padrão de hipertrofia cardíaca fisiológica
apresenta uma associação de diversos fatores neuroendócrinos e genéticos
que podem potencializar este remodelamento, podendo então, evoluir para
uma situação patológica (Maron, Carney et al., 2003).
Em animais, a hipertrofia cardíaca induzida pelo exercício é
caracterizada pelo aumento da relação do peso do coração pelo peso
corporal, associado à melhora do retorno venoso e do volume diastólico final
(Iemitsu, Miyauchi et al., 2001). Essas alterações determinam o aumento do
volume sistólico e induzem a bradicardia de repouso (Geenen, Buttrick et al.,
1988; Iemitsu, Miyauchi et al., 2001). Assim, os modelos de hipertrofia
cardíaca fisiológica demonstram a melhora da função cardíaca associada às
modificações estruturais do coração.
Os fatores que desencadeiam a hipertrofia cardíaca fisiológica estão
normalmente relacionados a modificações da sobrecarga de volume ou
pressão imposta pelo treinamento e pela modalidade do exercício. Além disso,
estudos também apontam para o envolvimento de fatores neuroendócrinos e
parácrinos estimulados pelo exercício (Iemitsu, Miyauchi et al., 2003;
Evangelista e Krieger, 2006). Estudos prévios mostraram o aumento da
concentração do hormônio do crescimento e fatores de crescimento após o
Introdução
15
exercício (Kim, Wende et al., 2008). Como exemplo, a literatura indica o fator
semelhante à insulina (IGF) e o fator de crescimento epidermal (EGF)
(Heineke e Molkentin, 2006). Estes fatores atuam sobre receptores tirosina
cinases e desencadeiam a ativação de diversas vias intracelulares que
promovem, no final, o aumento da transcrição protéica e do volume celular.
Além disso, esses fatores podem também atuar sobre células intersticiais
estimulando a fibrose cardíaca (Shah e Catt, 2003).
O sistema renina-angiotensina (SRA) também está, atualmente, sendo
relacionado com o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca fisiológica, uma
vez verificado que o treinamento aumentou alguns dos seus componentes.
Um estudo prévio mostrou que o treinamento promoveu o aumento da
expressão de receptores AT1 no coração (Barauna, Junior et al., 2005). No
entanto, o papel do SRA no desenvolvimento da hipertrofia cardíaca é
controverso, uma vez que, este sistema também está associado a
mecanismos que determinam a hipertrofia cardíaca patológica.
O padrão patológico de hipertrofia cardíaca vem sendo extensamente
estudado buscando a compreensão dos principais mecanismos que
determinam a sua evolução para a insuficiência cardíaca (Bing, Conrad et al.,
2002). Para tanto, os principais modelos de hipertrofia utilizados são os
associados a doenças como a hipertensão arterial sistêmica e pós-infarto do
miocárdio. A sobrecarga pressórica imposta ao coração na hipertensão arterial
induz a hipertrofia cardíaca patológica. Este padrão de hipertrofia é uma
adaptação compensatória ao aumento do trabalho cardíaco e é acompanhada
por modificações estruturais do miocárdio, incluindo perda de cardiomiócitos,
Introdução
16
desenvolvimento vascular defeituoso e fibrose (González, Ravassa et al.,
2006).
O modelo genético de hipertensão experimental que utiliza ratos
espontaneamente hipertensos (SHR) apresenta sobrecarga pressórica e
gradualmente desenvolve a hipertensão e a hipertrofia cardíaca. Esse modelo
demonstra muitas similaridades com a hipertensão essencial em humanos,
como o período pré-hipertensivo seguido pelas fases de desenvolvimento e de
hipertensão sustentada (Okamoto e Aoki, 1963; Bell, Kelso et al., 2004).
Bell e colaboradores (Bell, Kelso et al., 2004), ao avaliarem o curso
temporal da hipertensão em animais SHR, verificaram que a pressão arterial
(PA) aumenta progressivamente a partir da 7° semana de vida até a 16°
semana, quando então é atingido o platô, caracterizando a fase sustentada da
hipertensão. A hipertrofia cardíaca acompanha parcialmente a elevação da PA
nesses animais, aumentando a partir da 16° semana, isto é, já na fase de
sustentação da hipertensão. Durante esta fase a hipertrofia encontra-se
estável e compensada, porém, após 18-24 meses, os SHR apresentam um
quadro de insuficiência cardíaca grave com disfunção mecânica, prejuízo da
contratilidade, dilatação das câmaras e fibrose (Bing, Conrad et al., 2002).
O tamanho das células cardíacas, bem como a massa protéica dos
cardiomiócitos, é maior nos animais SHR, comparados com seus controles
normotensos (Lushnikova e Nepomnyashchikh, 2003). No entanto, o
desenvolvimento da hipertrofia patológica é considerado multifatorial nesses
animais, e inclui fatores mecânicos e neuroendócrinos. Dentre esses fatores, o
aumento da atividade do SRA no coração, bem como do sistema nervoso
Introdução
17
simpático (SNS), estimula a hipertrofia e o remodelamento cardíaco (Fortuño,
Ravassa et al., 2001).
Sabe-se que tanto o SNS quanto o SRA estimulam a hipertrofia de
cardiomiócitos e, dependendo da intensidade das suas atividades, também
promovem a proliferação fibroblástica e aumento da fibrose cardíaca (Kim,
Zhan et al., 2000; Amin, Xiao et al., 2001). Esta ação de crescimento tecidual
é gerada a partir da ativação de diferentes sistemas intracelulares,
metabólicos e sinalizadores, que culminam na estimulação da transcrição de
alguns genes relacionados com a hipertrofia e hiperplasia celular (Heineke e
Molkentin, 2006). A intensidade elevada e a duração prolongada do estímulo
durante a hipertensão, associadas aos fatores hemodinâmicos e
neuroendócrinos sobre o coração, podem estimular a apoptose de
cardiomiócitos durante a hipertrofia patológica. A diminuição do número de
cardiomiócitos é, em seguida, compensada através da hipertrofia das células
remanescentes e da proliferação fibroblástica. (Iwata, Cowling et al., 2005).
Sendo assim, a hipertrofia cardíaca patológica pode ser subdividida em
etapas, sendo estas a fase de desenvolvimento hipertrófico, a fase de
sustentação e a fase de transição para a insuficiência cardíaca
(Swynghedauw, 1999). Cada fase apresenta características peculiares
morfofuncionais e bioquímicas que permitem a sua identificação e o seu
estudo. A fase de desenvolvimento hipertrófico é caracterizada por alterações
energéticas e bioquímicas que culminam no aumento do metabolismo tecidual
e da síntese protéica (Iemitsu, Miyauchi et al., 2003). Durante esta fase,
diversos mecanismos de regulação, sistêmicos e locais, equilibram o estresse
Introdução
18
gerado pelos fatores hipertróficos e promovem a adaptação celular. Durante a
fase de sustentação, os fatores desencadeantes passam a superar os
mecanismos de adaptação e, a partir de então, verifica-se o início de lesão
tecidual, alterações metabólicas e morfológicas que culminam com a
disfunção cardíaca. Esta fase também passa a ser conhecida como fase de
descompensação ou mal-adaptada (Opie, Commerford et al., 2006).
Durante a fase de descompensação cardíaca, o constante desequilíbrio
homeostático estimula mecanismos relacionados com a morte celular, como a
inflamação e necrose, mas também, a apoptose (Fortuño, Ravassa et al.,
2001; González, Ravassa et al., 2006). A evolução deste quadro gera a
transição para a insuficência cardíaca, onde praticamente todos os
mecanismos de compensação e regulação estão inibidos ou modificados
(Bing, Conrad et al., 2002).
Assim, durante a fase de sustentação da hipertrofia cardíaca
patológica, o estudo de fatores bioquímicos locais, associados à lesão celular,
assim como o estudo de fatores moleculares envolvidos neste processo,
importam na compreensão e prevenção da insuficiência cardíaca.
1.2. Vias de Sinalização Intracelulares Hipertróficas e Apoptóticas
Os diferentes fatores que determinam a hipertrofia cardíaca em animais
SHR ativam vias de sinalização intracelulares importantes para a proliferação
de miofilamentos, assim como para o aumento do tamanho e da força contrátil
dos cardiomiócitos. Duas importantes vias de sinalização intracelulares
Introduçã
o
19
associadas ao crescimento celular são as vias das MAPK e proteína cinase
B/Akt.
As proteínas cinases ativadas por mitógenos (do inglês “mitogen-
activated protein kinases”, MAPK) são proteínas ativadas pela fosforilação de
resíduos de treonina e tirosina, e podem ser classificadas em cinases
reguladas por sinais extracelulares (do inglês “extracellular signal-regulated
kinases”, ERK 1/2), grande MAPK (BMK1 ou ERK5), ou proteínas cinase
ativadas por estresse, como a cinase c-Jun N-terminal (JNK) e a p38 (Nishida
e Gotoh, 1993). Previamente, foi reportado que a família das ERK medeia a
diferenciação celular e crescimento, enquanto a JNK e a p38 atuam nos
mecanismos de apoptose e alteração da expressão gênica em resposta ao
estresse (Kyaw, Yoshizumi et al., 2004).
Estudos prévios com animais SHR mostraram o aumento da ativação
tanto da ERK1/2 quanto da JNK no coração desses animais durante os
estágios pré-hipertensivo e de estabelecimento da hipertensão (Izumi, Kim et
al., 2000; Kacimi e Gerdes, 2003). Estes achados indicam o envolvimento
dessas MAPK no mecanismo de desenvolvimento da hipertrofia cardíaca
patológica dos SHR. A ERK1/2 é uma cinase citoplasmática que é ativada
pela ação de uma cascata de outras cinases. No topo desta via estão
importantes fatores de estimulação relacionados a receptores de membrana.
O primeiro é a ativação de receptores acoplados à proteína G. Parte desses
receptores, ao serem ativados, estimulam fosfolipases e mecanismos de
ativação de segundos mensageiros que promovem a ativação da via Ras/Raf
(Heineke e Molkentin, 2006).
Introdução
20
A via Ras/Raf também está associada à ativação de receptores tirosina
cinases de fatores de crescimento, como o IGF e EGF, além de outros.
Quando ativados, através da fosforilação de resíduos de tirosina, estimulam
diversas moléculas sinalizadoras, incluindo o Ca
2+
, tirosinas cinases e
espécies ativas de oxigênio (EAO) (Clerk, Cullingford et al., 2007). Desta
forma, a ativação destes receptores pode também promover a ativação da
cascata de cinases que culmina na fosforilação e ativação da ERK1/2. Esta
MAPK, uma vez fosforilada é translocada para o núcleo e ativa a transcrição
gênica de proteínas hipertróficas (Sugden, 2001).
Por outro lado, situações de estresse celular oxidativo ou osmótico
promovem preferencialmente a ativação das MAPK p38 e JNK, (Tibbles e
Woodgett, 1999). O início da cascata de ativação destas MAPK
freqüentemente inicia com a ativação da cinase regulada por sinais
apoptóticos 1 (do inglês “apoptosis signal-regulating kinase 1”, ASK1). Essa
cinase é membro de uma família de cinases das MAPK e culmina na ativação
da p38 e da JNK. Esta via está fortemente relacionada com mecanismos
apoptóticos celulares (Matsuzawa e Ichijo, 2005).
Outra importante via proliferativa é a via da proteína cinase B, também
chamada de Akt. As proteínas ativadas pela Akt fosforilam uma grande
variedade de substratos intracelulares que regulam o crescimento, o
metabolismo e a sobrevivência celular (Debosch, Sambandam et al., 2006). A
Akt fosforila e inibe o produto do gene TSC2, um inibidor do importante fator
que promove o crescimento tecidual, o “mammalian target of rapamycin”
(mTOR) (Inoki, Li et al., 2002). A via do fosfatidil inositol-3-cinase (PI3K)/Akt
Introdução
21
está ativada no coração de ratos em resposta à sobrecarga de pressão e
também por fatores neuroendócrinos (Oh, Fujio et al., 1998). No entanto,
ainda existem muitas controvérsias em relação ao seu papel no
desenvolvimento da hipertrofia cardíaca patológica, pois os aumentos da sua
expressão e ativação foram também evidenciados em estudos com a
hipertrofia cardíaca fisiológica (Debosch, Treskov et al., 2006).
Outras vias intracelulares que desempenham importante papel na
determinação morfofuncional da hipertrofia cardíaca patológica são as vias
apoptóticas, como a via das caspases e da família bcl2. Estudos realizados
com ratos SHR mostraram um aumento da expressão da caspase-3 e da
relação Bax/Bcl2 no coração hipertrófico (Lee, Cho et al., 2006). Durante o
desenvolvimento da hipertrofia cardíaca patológica, verificou-se a perda
gradativa do número de cardiomiócitos, o que permite o maior
desenvolvimento das células remanescentes e a proliferação fibroblástica
(Iwata, Cowling et al., 2005). Assim, a ativação progressiva de vias
apoptóticas, estimuladas principalmente por fatores neuroendócrinos, deve ser
determinante para o desenvolvimento do padrão morfofuncional da hipertrofia
cardíaca patológica em animais SHR.
Na literatura científica existem achados que demonstram a ação da
angiotensina II sobre o seu receptor AT
1
e a ativação de importantes vias de
sinalização intracelulares. No tecido cardíaco, a angiotensina II apresenta
papéis controversos dependendo da célula estimulada e da sua concentração.
Estudos indicam o papel hipertrófico da angiotensina II, através da ativação de
vias de crescimento celular (Aoki, Richmond et al., 2000). No entanto, outros
Introdução
22
trabalhos demonstraram que altas concentrações deste peptídeo estimulam
vias apoptóticas (Fabris, Candido et al., 2007). Em cardiomiócitos, a
angiotensina II estimula a ativação da p38-MAPK que, por sua vez, ativa
proteínas ativadoras (AP-1), e estas, ativam o TGF-β1. Esse último fator de
crescimento tecidual pode apresentar, além do seu papel proliferativo, uma
ação pró-apoptótica e está associado ao desenvolvimento da insuficiência
cardíaca induzida por angiotensina II (Schröder, Heger et al., 2006).
Além do TGF-β1, membros da família bcl-2 também podem mediar a
apoptose no músculo cardíaco (Fortuño, Ravassa et al., 1998). A família bcl-2
é composta por mais de 15 membros, classificados como anti- ou pró-
apoptóticos. O bcl-2 é um fator de sobrevivência, enquanto o bax acelera o
processo apoptótico. Logo, a razão bax/bcl-2 determina a sobrevivência ou a
morte celular após um estímulo apoptótico (Diep, El Mabrouk et al., 2002).
Outros fatores envolvidos na regulação da apoptose são as proteases que
pertencem à família das caspases, especialmente a caspase-3 (Nicholson e
Thornberry, 1997). Em um estudo, utilizando o modelo de hipertensão
induzida por angiotensina II, verificou-se o aumento da expressão da caspase-
3 e aumento da razão bax/bcl2, sendo que o tratamento com losartan, um
bloqueador do receptor AT
1
, determinou a diminuição da expressão desses
fatores nos corações hipertrofiados (Diep, El Mabrouk et al., 2002). A
avaliação desses fatores em ratos SHR também demonstrou o aumento da
expressão do bax no ventrículo esquerdo (Fortuño, Ravassa et al., 1998).
Além disso, a administração de angiotensina II em cardiomiócitos de SHR
Introdução
23
elevou a expressão da caspase-3 assim como do bax (Ravassa, Fortuño et
al., 2000).
Dessa forma, ao estudarmos as vias de sinalização relacionadas com a
hipertrofia cardíaca, verificamos que os estudos não afirmam quais vias estão
exatamente associadas com o padrão fisiológico e quais estão com o padrão
patológico. O que verificamos na literatura é a constatação de que existem
vias relacionadas com a sobrevivência celular e outras com a morte. Assim,
acredita-se que o equilíbrio entre essas vias ou o predomínio de uma sobre a
outra determinem o desenvolvimento destes padrões hipertróficos. Nesse
aspecto, os diversos fatores neuroendócrinos, parácrinos e até mesmo
autócrinos que atuam sobre o coração desempenham um papel fundamental
no controle, na regulação e na estimulação destas vias.
1.3. Relação Estresse Oxidativo e Hipertrofia Cardíaca
O estresse oxidativo parece intermediar o desenvolvimento dos
diferentes padrões de hipertrofia cardíaca, e a sua estreita relação com
diversos fatores hipertróficos pode justificar esse papel. Sabe-se que na
hipertensão ocorre o aumento do estresse oxidativo e desequilíbrio redox
(Touyz, 2004). Fatores esses já citados na literatura como capazes de
diretamente ativar vias de sinalização intracelulares (Akao, Ohler et al., 2001).
Por outro lado, no exercício, apesar de haver aumento da produção de EAO,
também ocorre aumento das defesas antioxidantes (Bertagnolli, Campos et
al., 2006). Essa modulação do estresse oxidativo pode alterar o padrão de
Introdução
24
ativação de vias de sinalização intracelulares e determinar o desenvolvimento
da hipertrofia cardíaca fisiológica.
O aumento da produção de EAO está relacionado com diversos
mecanismos envolvidos com o remodelamento cardíaco. Em cardiomiócitos
isolados, o moderado aumento destas espécies induz hipertrofia e apoptose
(Siwik, Tzortzis et al., 1999). No entanto, já foi demonstrado que a utilização
de antioxidantes inibiu a hipertrofia induzida pela angiotensina II (Nakamura,
Fushimi et al., 1998). Além disso, o tratamento com a vitamina E preveniu o
desenvolvimento da hipertrofia cardíaca induzida por hipertireoidismo (Araujo,
Enzveiler et al., 2007). Esses achados mostram a participação do estresse
oxidativo nos mecanismos hipertróficos.
Os efeitos mitogênicos das EAO no coração podem envolver a
modulação de mecanismos de sinalização sensíveis ao estado redox, como
os mediados por MAPK. Essas ativam fatores transcricionais e induzem a
hipertrofia cardíaca patológica (Aikawa, Komuro et al., 1997; Sugden, 2001).
No estudo realizado por Li e colaboradores (Li, Gall et al., 2002), foi observado
que o aumento da atividade da NADPH oxidase em cardiomiócitos, um
importante gerador de ânion superóxido, foi acompanhado pela ativação das
MAPK ERK1/2, ERK5 e p38.
Em animais SHR, a angiotensina II parece estimular o estresse
oxidativo por aumentar a produção de ânion superóxido através da ativação
da nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase (Frank,
Eguchi et al., 2000). Além disso, o complexo da NADPH oxidase é formado
por um núcleo heterodímero constituído por duas subunidades: p22phox e
Introdução
25
gp91phox; e quatro subunidades reguladoras: p40phox, p47phox, p67phox e
rac1 (Babior, 1999). Alguns estudos mostraram a presença da NADPH
oxidase em cardiomiócitos de corações com hipertrofia de ventrículo esquerdo
(Mohazzab-H, Kaminski et al., 1997). Esses dados podem, assim, indicar a
maior produção de EAO pela NADPH oxidase durante a hipertrofia cardíaca
patológica.
Dessa forma, as EAO, assim como as MAPK, parecem estar envolvidas
no remodelamento vascular e cardíaco em diversas condições patológicas,
como na hipertensão (González, Fortuño et al., 2003). Sabe-se que as MAPK
são sensíveis ao estresse oxidativo. O peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) estimula
a atividade e a expressão de alguns membros da família das MAPK, como
ERK1/2, JNK e p38, em células musculares lisas da aorta de ratos
(Yoshizumi, Abe et al., 2000). O H
2
O
2
também pode diretamente ativar vias
apoptóticas, como a via da caspase-3 (Akao, Ohler et al., 2001). Além disso,
não apenas o aumento das EAO, mas também o estado redox pode contribuir
para a modulação de vias de sinalização. A alteração do estado redox
induzida pela angiotensina II ativa vias de sinalização como a p38 e TGF-β1,
sendo que a utilização de antioxidantes preveniu a ativação dessas vias
(Wenzel, Taimor et al., 2001). Esses achados indicam que a alteração do
estado oxidativo cardíaco, induzida pela angiotensina II, apresenta um papel
importante na mediação da ativação de vias de sinalização intracelulares.
Dessa forma, verificamos a importância da realização de estudos que
indiquem as vias de sinalização relacionadas com o desenvolvimento da
hipertrofia cardíaca, tanto patológica quanto fisiológica. Igualmente importante
Introdução
26
é a pesquisa em torno da associação destas vias de sinalização com o estado
redox e a função cardíaca. Este conhecimento facilitará o entendimento dos
mecanismos pelos quais diferentes formas de intervenções, farmacológicas ou
não, podem influenciar e modificar os padrões de remodelamento.
1.4. Papel do Exercício sobre a Hipertrofia Cardíaca
O estudo do papel do exercício sobre os mecanismos hipertróficos é
importante, não apenas pelo fato deste ser utilizado como uma ferramenta de
indução de hipertrofia fisiológica, mas também por agir sobre diversos
mecanismos celulares associados à hipertrofia cardíaca.
Em animais normotensos, o exercício crônico induz hipertrofia cardíaca,
embora esse efeito dependa do protocolo utilizado (Iemitsu, Miyauchi et al.,
2001). Atualmente o exercício de natação em ratos mostrou-se mais eficiente
para a indução de hipertrofia cardíaca quando comparado ao realizado em
esteira. Isto provavelmente se deve ao fato de que no ambiente aquático
ocorre um importante aumento da sobrecarga de volume e do retorno venoso
(Medeiros, Oliveira et al., 2004). Na água, a associação de exercícios
dinâmicos com o efeito da imersão deve colaborar para o aumento da
hipertrofia cardíaca. Em ratos submetidos ao treinamento de natação,
verificou-se o aumento do tamanho do coração associado à melhora da
função cardíaca (Iemitsu, Miyauchi et al., 2003; Medeiros, Oliveira et al.,
2004). Assim, o exercício freqüentemente é utilizado em experimentos que
Introdução
27
buscam elucidar os mecanismos relacionados com o desenvolvimento da
hipertrofia cardíaca fisiológica.
No entanto, o exercício também pode ser utilizado como uma forma de
intervenção sobre os mecanismos relacionados com a hipertrofia cardíaca
patológica. O treinamento físico moderado diminui os valores de pressão
arterial em animais SHR (Gava, Véras-Silva et al., 1995; Bertagnolli, Campos
et al., 2006), colaborando com a redução da hipertrofia cardíaca nesse
modelo. Embora o efeito do exercício sobre o peso cardíaco de ratos SHR
dependa da metodologia utilizada, estudos demonstraram que o exercício
crônico diminui discretamente a hipertrofia cardíaca em animais SHR, e
melhora o metabolismo e a função cardíaca (Iemitsu, Miyauchi et al., 2001;
Iemitsu, Miyauchi et al., 2003; Lee, Cho et al., 2006). Acredita-se que essa
redução da hipertrofia ocorra pela modificação do seu padrão patológico para
um padrão semelhante ao fisiológico, induzida pelo exercício crônico.
Diversos mecanismos fisiológicos induzidos pelo exercício podem
colaborar com a alteração da hipertrofia cardíaca em animais SHR. Dentre
eles, a diminuição da freqüência cardíaca, provavelmente induzida pela
diminuição da atividade simpática ao coração (Negrao, Moreira et al., 1992), e
da resistência vascular periférica (Grassi, Seravalle et al., 1994). Ambos
fatores promovem a diminuição do trabalho cardíaco e, conseqüentemente,
diminuem a hipertrofia cardíaca.
Em relação aos fatores neuroendócrinos, a modulação do SRA
cardíaco, induzida pelo exercício, pode alterar o padrão de hipertrofia
cardíaca. A realização de treinamento de resistência em ratos normotensos
Introdução
28
aumentou a expressão dos receptores AT
1
no coração (Barauna, Junior et al.,
2005). Neste mesmo estudo, o tratamento com losartan preveniu a hipertrofia
cardíaca induzida pelo treinamento. Estes achados indicam que o SRA local
exerce uma influência na determinação da hipertrofia cardíaca estimulada pelo
exercício.
Em um estudo realizado com ratos SHR, o treinamento de natação
promoveu a diminuição da concentração de angiotensina II plasmática,
embora não tenha reduzido a sua concentração no tecido cardíaco (Filho
(Filho, Ferreira et al., 2008). Neste mesmo estudo, foi observado o aumento
da concentração de angiotensina 1-7 no coração, sem alteração da sua
concentração plasmática. Estes resultados indicam que o treinamento físico
modulou o SRA cardíaco mesmo em animais SHR.
Assim, o exercício parece apresentar efeitos benéficos sobre os
mecanismos intracelulares que determinam a hipertrofia cardíaca. Esta ação
benéfica pode ser determinada pela ativação de vias de sinalização de
sobrevivência no tecido cardíaco. O exercício também diminui o estado
apoptótico cardíaco de ratos SHR (Lee, Cho et al., 2006). Dessa forma,
achados da literatura indicam que o exercício crônico previne a hipertrofia
cardíaca patológica de ratos SHR, provavelmente por alterar a expressão de
vias de sinalização proliferativas e apoptóticas, embora esta relação ainda não
esteja bem descrita na literatura.
Outro efeito cardioprotetor do exercício em animais SHR é a diminuição
do estresse oxidativo no miocárdio, induzido tanto pela diminuição da
produção de EAO, como pelo aumento da atividade das enzimas
Introdução
29
antioxidantes nesse tecido (Hong e Johnson, 1995). O exercício parece
exercer este efeito por modular a atividade simpática cardíaca e o SRA, dois
sistemas já descritos como geradores de EAO.
Assim, embora algumas evidências sugiram o papel benéfico do
exercício sobre a hipertrófica cardíaca patológica, ainda faltam estudos que
demonstrem os mecanismos bioquímicos e moleculares envolvidos. Além
disso, ao ser utilizado como uma ferramenta de indução de hipertrofia
cardíaca, o efeito pró-hipertrófico do exercício parece agir sobre mecanismos
diferentes daqueles ativados em situações patológicas.
Introdução
30
2. HIPÓTESE
H
1
: O exercício crônico diminui a atividade simpática, o estresse oxidativo e a
hipertrofia cardíaca patológica em ratos espontaneamente hipertensos.
H
2
: O aumento do estresse oxidativo cardíaco está associado à ativação de
vias de sinalização intracelulares pró-apoptóticas na hipertrofia cardíaca
patológica de ratos espontaneamente hipertensos.
H
3
: O enalapril diminui o estresse oxidativo e a ativação de vias pró-
apoptóticas cardíacas, contribuindo para a redução da hipertrofia e melhora da
função cardíaca em ratos espontaneamente hipertensos.
H
4
: O sistema renina-angiotensina estimula o estresse oxidativo e a ativação
de vias hipertróficas no desenvolvimento da hipertrofia cardíaca fisiológica.
H
5
: O treinamento físico promove a ativação de vias de sobrevivência e
inibição de vias pró-apoptóticas em ratos espontaneamente hipertensos.
Hipótese
31
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Avaliar o perfil do estresse oxidativo cardíaco em modelos de hipertrofia
cardíaca patológica e fisiológica, e verificar se existe associação com a
ativação de vias de sinalização de crescimento celular, bem como com a
função cardíaca.
3.2. Objetivos Específicos
Avaliar nos modelos de hipertrofia cardíaca fisiológica e patológica:
• O perfil do estresse oxidativo cardíaco;
• As diferenças morfofuncionais cardiovasculares;
• A ativação de vias de sinalização de sobrevivência e pró-apoptóticas;
• O papel dos sistemas nervoso simpático e renina-angiotensina, bem
como do exercício crônico sobre o estresse oxidativo cardíaco.
Objetivos
32
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Animais
Foram utilizados ratos machos Wistar-Kyoto e espontaneamente
hipertensos (SHR), com 15 semanas de idade e pesando entre 250 e 300
gramas, provenientes do Biotério da Universidade de São Paulo. Os animais
foram mantidos em caixas plásticas, sendo quatro animais por caixa, e
receberam ração e água ad libitum, em ambiente com temperatura controlada
(20°C-25°C) e com ciclo claro escuro de 12 horas (das 6:00 às 18:00). Todos
os protocolos realizados seguiram as normas da Comissão de Pesquisa e
ética em Saúde do Grupo de Pesquisa e da Pós-Graduação do Hospital de
Clínicas de Porto Alegre, RS e foram devidamente aprovados pelo Comitê de
Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto
Alegre. A divisão dos grupos, bem como o n deste estudo, estão descritos nos
materiais e métodos dos respectivos artigos.
4.2. Protocolos Experimentais de Treinamento Físico
Os animais SHR foram submetidos ao protocolo de exercício físico 5
dias por semana, durante 10 semanas, em esteira ergométrica com divisórias
de acrílico adaptada para ratos e camundongos (Imbramed TK-01). A duração
da sessão, bem como a velocidade utilizada, aumentaram gradativamente até
atingir o tempo de 1 hora e a velocidade de 25 m/min. Esta velocidade confere
Materiais e Métodos
33
ao protocolo uma intensidade de treinamento moderada de acordo com o
teste de esforço máximo e avaliação da variação da concentração de lactato
sangüínea previamente descritos por Bertagnolli e colaboradores (Bertagnolli,
Campos et al., 2006).
Os animais Wistar-Kyoto foram submetidos ao treinamento de natação,
por este ser considerado um modelo descrito na literatura de indução de
hipertrofia cardíaca fisiológica em camundongos e ratos (Evangelista, Brum et
al., 2003; Medeiros, Oliveira et al., 2004). O treinamento de natação foi
realizado 5 dias/semana e 1 hora de natação por dia. O protocolo foi realizado
em um tanque adaptado com 12 divisórias de vidro para o treinamento de
natação de ratos (1,00x0,80x0,80 m). A temperatura da água foi mantida em
30°C através de um sistema de aquecimento acoplado ao tanque.
A adaptação ao exercício de natação foi realizada a partir da 15°
semana de vida dos animais do experimento, sendo 15 minutos de exercício
livre por dia, para que os animais se adaptassem ao ambiente aquático. A
intensidade moderada do treinamento de natação foi determinada por um
sobrepeso de chumbo amarrado à cauda dos animais. De acordo com
Gobatto e colaboradores (Gobatto, De Mello et al., 2001), sobrepesos de 4-6%
do peso corporal do animal são considerados cargas aeróbicas e apresentam
steady-state de lactato. Os animais deste experimento receberam sobrepeso
equivalente a 4% do seu peso corporal.
Materiais e Métodos
34
4.3. Tratamento com Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina
Os animais normotensos e hipertensos foram submetidos ao tratamento
diário com enalapril (10 mg kg
-1
d
-1
), um inibidor da enzima conversora da
angiotensina, por 10 semanas. O tratamento foi administrado uma vez por dia
por gavagem intragástrica. Para tanto, os animais foram pesados
semanalmente para o ajuste da dose.
4.4. Avaliações Hemodinâmicas
4.4.1. Procedimento Cirúrgico e Registro Intraarterial
As avaliações hemodinâmicas foram realizadas através do
procedimento cirúrgico de canulação intraarterial e intraventricular. Para isso,
os animais foram anestesiados com ketamina (90 mg/kg) e Cloridrato de
Xylasina (20 mg/kg) para implantação dos cateteres confeccionados em tubos
tygon PE-50/PE-10 (Clay Adams, USA). As cânulas foram preenchidas com
soro fisiológico 0,9% e heparina sódica (Liquelme-Roche, 5000U), na
proporção de 0,5 mL para 0,02 mL, respectivamente. Através de uma incisão
na região inguinal esquerda, as extremidades das cânulas foram introduzidas
na artéria e veia femoral, para obtenção dos registros basais com o rato
consciente da PA, freqüência cardíaca (FC) e administração de drogas,
respectivamente. Após esses procedimentos, os animais eram colocados em
gaiolas individuais, aquecidos e receberam água e alimentos ad libitum.
Materiais e Métodos
35
Vinte e quatro horas após a cirurgia de canulação, a cânula arterial foi
conectada a um transdutor eletromagnético de pressão (Strain-Gauge - Narco
Biosystem Miniature Pulse Transducer RP-155, Houston, Texas, USA)
acoplado a um pré-amplificador de sinais (Pressure Amplifier HP 8805C). Os
sinais de PA e FC foram gravados em um microcomputador equipado com
sistema de aquisição de dados (AT/MCA CODAS-DATAQ Instruments, Akron,
OH, EUA) que permitiu a análise dos pulsos da pressão, batimento-a-
batimento, com uma freqüência de amostragem de 2000 Hz por canal.
Para a avaliação do reflexo cardiopulmonar foram administradas doses
intravenosas in bolus de of 5-HT (serotonina, 2, 4, 8 and 16 µg/kg, i.v., Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO, USA) para induzir respostas hipotensoras e
bradicárdicas. A comparação das respostas obtidas com os valores basais
pré-injeções foi utilizada para calcular os índices do reflexo cardiopulmonar.
A variabilidade da PAS (var PAS) foi avaliada no domínio da freqüência
através da analise espectral. O processamento foi feito a partir de séries
contínuas de 20 minutos de PAS, interpoladas a 250 Hz e decimadas para
torná-la igualmente espaçada no tempo. Após a remoção de tendências
lineares, a densidade espectral de potência foi obtida através da
Transformada Rápida de Fourier (FFT) utilizando o método de Welch, sobre
16.384 pontos e janelas de Hanning com sobreposição de 50%. A potência
espectral para as bandas de freqüências baixas (LF 0,02 - 0,75 Hz) e altas
(HF 0,75 - 4,00 Hz) foram calculadas através da integração da densidade
espectral de potência em cada banda de freqüência, utilizando uma rotina
implementada (MATLAB 6.0, Mathworks).
Materiais e Métodos
36
4.4.2. Procedimento Cirúrgico e Registros Intraventriculares
Após o registro intraarterial, os ratos foram anestesiados com
pentobarbital (45 mg/Kg) para a realização do procedimento intraventricular.
Antes da colocação do catéter P50 no ventrículo, a pressão arterial foi
registrada durante 2 minutos através da conexão da cânula arterial na carótida
a um transdutor de pressão ligado ao amplificador de sinais. Logo após este
registro, a cânula foi posicionada no ventrículo esquerdo e, após 5 minutos de
estabilização, a pressão ventricular sistólica esquerda (LVSP) e a pressão
diastólica final do ventrículo esquerdo (LVEDP) foram registradas. Os sinais
analógicos da pressão foram digitalizados (CODAS - Data Acquisition System,
PC 486) com taxa de amostragem de 2000 Hz.
4.5. Medidas Morfométricas Cardíacas e Preparo do Tecido
Imediatamente após a medida das pressões intraventriculares e ainda
sob efeito do anestésico, os animais do experimento foram pesados e mortos
por deslocamento cervical, obedecendo as normas estabelecidas pela
Comissão de Pesquisa e ética em Saúde do Grupo de Pesquisa e da Pós-
Graduação do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, RS. O coração e o
músculo sóleo foram rapidamente extraídos e pesados. A relação entre o peso
do coração, peso total dos ventrículos e peso do ventrículo esquerdo pelo
peso corporal (índice de hipertrofia cardíaca) foi expresso em
Materiais e Métodos
37
miligramas/gramas de peso corporal. Esta relação é aceita pela literatura
como uma medida adequada de hipertrofia cardíaca no rato.
4.6. Atividade da Enzima Citrato Sintase
Os músculos sóleos foram homogeneizados durante 40 segundos em
Ultra-Turrax, com tampão PBS (NaCl 136,8 mmol/L; KCl 2,7 mmol/L; KH
2
PO
4
0,9 mmol/L; Na
2
HPO
4
6,4 mmol/L, pH 7,4) na proporção 100 mg/1 mL mais
PMSF. Após, o homogeneizado foi centrifugado por 15 minutos a 3000 rpm
em centrífuga refrigerada a 4°C. O sobrenadante foi, então, retirado e
congelado em freezer –80°C para as posteriores dosagens.
A enzima citrato sintase é utilizada como um marcador da capacidade
aeróbica do tecido avaliado, sendo também um indicador de adaptação ao
treinamento físico. Sua atividade foi determinada utilizando a metodologia
descrita por Alp (Alp, Newsholme et al., 1976). A atividade enzimática foi
avaliada a partir da quantificação do complexo formado entre a CoA
(coenzima A) liberada com o DTNB do meio. O tampão utilizado consiste em
tris-aminometano 50 mmol/L, EDTA 1mmol/L, DTNB 0,2 mmol/L, oxaloacetato
0,5 mmol/L e Triton X-100 0,05% (v/v), ao qual é adicionado 10 µL do
homogeneizado. O volume total do ensaio é de 1 mL e o pH 8,1. A reação é
iniciada pela adição de oxaloacetato ao meio de incubação e a cinética da
reação se realiza a 25ºC, por um intervalo de 10 minutos. A leitura da
absorbância foi realizada em espectrofotômetro, com comprimento de onda de
412 nm.
Materia
is e Métodos
38
4.7. Concentração da Norepinefrina Cardíaca
A concentração da norepinefrina cardíaca foi realizada por
cromatografia líquida de alta performance (HPLC) utilizando uma fase reversa
ion-par de cromatografia acoplada a uma detecção eletroquímica (0,5 V),
como previamente descrito por Naffah-Mazzacoratti e colegas (Naffah-
Mazzacoratti, Casarini et al., 1992). A separação isocrática foi realizada
utilizando uma coluna RP 18 Brownlee (4,6 x 250 mm; Applied Biosystems,
San Jose, CA, USA) eluída com a seguinte fase móvel: 20 mmol/L sódio
dibásico fosfato, 20 mmol/L ácido cítrico, pH 2,64, contendo 10% methanol,
0,12 mmol/L Tris-EDTA, e 566 mg/L ácido heptanesulfônico. O tempo total
para a análise das amostras foi de 30 minutos. A quantificação da
norepinefrina foi realizada comparando as áreas dos picos das amostras com
as areas do padrão, utilizando diidroxibenzilamina (DHBA) como padrão
interno. Os corações foram homogeneizados em ácido perclórico 0,1 mmol/L
contendo 0,02% de sódio metabisulfite e 10 µL de 1 mmol/L de DHBA. Os
homogeneizados foram mantidos overnight a 4°C e, após, centrifugados a
10000 rpm durante 50 minutos. Após, o supernatante foi filtrado e 100 µL foi
injetado na coluna de fase reversa.
4.8. Medidas de Dano Oxidativo
O dano oxidativo aos lipídeos foi avaliado através da
quimiluminescência iniciada pelo hidroperóxido de tert-butil em solução
Materiais e Métodos
39
contendo homogeneizado cardíaco e avaliação da capacidade de resposta
produzida pela amostra. A quimiluminescência foi medida em um contador
beta (LKB Rack Beta Liquid Scintilation Spectrometer-1215; LKB Produkter
AB, Bromma, Sweden). O ensaio consiste em adicionar 3,5 mL de tampão
(140 mmol/L de KCl, 20 mmol/L de fosfatos, pH 7,4) e 0,5 mL de
homogeneizado para a realização da leitura basal. Adiciona-se ao meio de
reação 30 µL de t-BOOH (3 mmol/L) e realiza-se a segunda leitura (Gonzalez
Flecha, Llesuy et al., 1991).
O dano oxidativo às proteínas foi realizado utilizando o ensaio da
determinação das carbonilas (Reznick e Packer, 1994). A técnica é baseada
na reação das proteínas oxidadas do tecido com 2,4 dinitro fenil hidrazina
(DNPH) em meio ácido. Após sucessivas lavagens com ácidos e solventes
orgânicos, incuba-se o ensaio com guanidina. A absorbância das carbonilas
foi medida em espectrofotômetro a 360 nm.
4.9. Atividade das Enzimas Antioxidantes
A técnica utilizada neste trabalho para determinação da SOD foi
baseada na inibição da reação do radical superóxido com o pirogalol. O
superóxido é gerado pela auto-oxidação do pirogalol quando em meio básico.
A SOD presente na amostra em estudo compete pelo radical superóxido com
o sistema de detecção. A oxidação do pirogalol leva à formação de um
produto colorido, detectado espectrofotometricamente a 420 nm. A atividade
da SOD é determinada medindo-se a velocidade de formação do pirogalol
Materiais e Métodos
40
oxidado (Marklund, Oreland et al., 1983). Para tanto, foram utilizados 15 µl da
amostra previamente preparada, tampão Tris-base, 8 µl de pirogalol (24
mmol/L) e 4 µl de catalase (30 µmol/L). A variação na absorbância foi
acompanhada a 420 nm durante 2 minutos e os resultados expressos em
U/mg de proteína.
A atividade da CAT será avaliada através do consumo de H
2
O
2
. O
ensaio consiste em medir a diminuição da absorbância ao comprimento de
onda de 240 nm. O ensaio é realizado utilizando uma solução tampão de
fosfatos de sódio a 50 mmol/L em pH 7,4 e peróxido de hidrogênio 0,3 mol/L.
Os resultados foram expressos em pmoles/mg de proteína (Aebi, 1984).
A atividade da enzima GPX é determinada medindo-se o consumo de
NADPH na reação de redução acoplada à reação da GPX. Para tanto,
adiciona-se 330 µl de tampão de fosfatos 143 mmol/L e EDTA 1 mmol/L (pH
7,5), 500 µl de NADPH (0,24 mmol/L), 10 µL de azida sódica (1 mmol/L) para
inibir a atividade da catalase, 50 µl de GSH (5 mmol/L) e 10 µL de glutationa
redutase 0,25 U/mL. Após, adiciona-se 50 µl de hidroperóxido de tert-butila
(0,5 mmol/L), e a diminuição da absorbância, devido ao consumo de NADPH,
será monitorada por aproximadamente 5 minutos. A absorbância é registrada
a 340 nm e os resultados são expressos em nmoles/min/mg de proteína
(Flohé e Günzler, 1984).
A dosagem das proteínas foi realizada seguindo o método de Lowry e
colegas (Lowry, Rosebrough et al., 1951).
Materiais e Métodos
41
4.10. Dosagem da Concentração de Peróxido de Hidrogênio
O ensaio para a determinação da concentração do peróxido de
hidrogênio é baseado na oxidação mediada pela peroxidase de rabanete
(HRPO) e do vermelho de fenol através do peróxido de hidrogênio, levando à
formação de um composto que absorve a 610 nm. As fatias de tecido cardíaco
foram incubadas por 60 min a 37°C em um tampão fosfato à 10 mmol/L (NaCl
140 mmol/L e dextrose 5 mmol/L). Após, os sobrenadantes foram incubados
com vermelho de fenol 0,28 mmol/L e HRPO 8,5 U/mL. Após 5 minutos,
adicionou-se NaOH 1 mol/L e realizou-se a leitura a 610 nm. Os resultados
foram expressos em nmoles de H
2
O
2
/g de tecido (Pick e Keisari, 1980).
4.11. Avaliação do Metabolismo da Glutationa
A razão entre a concentração da glutationa reduzida e oxidada
(GSH/GSSG) foi determinada através da avaliação da concentração de
glutationa total e da sua forma oxidada no tecido cardíaco (100-200 mg) como
descrito por Akerboom e Sies (Akerboom e Sies, 1981). Para determinar a
concentração total de glutationa (expressa em mmol/mg de proteína), o tecido
foi desproteinizado com ácido perclórico 2 mol/L, centrifugado por 10 min
1000×g e o sobrenadante foi neutralizado com hidróxido de potássio 2 mol/L.
O ensaio foi realizado adicionando às amostras uma solução tampão de
fosfato 100 mmol/L (pH 7,2), ácido nicotinamida dinucleotídeo fosfato 2
mmol/L, glutationa redutase 0,2 U/mL e 5,5’ dithiobis (ácido 2-nitrobenzóico)
Materiais e Métodos
42
70 µmol/L. Para determinar a glutationa oxidada adicionou-se ao
sobrenadante 20 mmol/L de N-etilmaleimida (NEM) e, após, as amostras
também foram neutralizadas com hidróxido de potássio 2 mol/L. Após esta
etapa, seguiu-se o mesmo procedimento de ensaio utilizado para a glutationa
total. A leitura foi feita com um comprimento de onda de 412 nm. Os valores
foram expressos em mmol/grama de tecido.
4.12. Determinação dos Nitratos Totais
A concentração dos nitratos totais no tecido cardíaco foi medida pela
reação das amostras com o reagente de Griess. No meio da reação foram
adicionados 50 µL de amostra, 10 µL de NADPH 0,02 mmol/L, 7 µL de Tris (1
mol/L, pH 7,5), 23 µL de uma mistura de G6P/G6PDH (5 mmol/L e 10 U/mL,
respectivamente) e 10 µL de NR 1,0 U/mL. A mistura foi incubada à
temperatura ambiente, sob agitação, por 30 minutos. Após, foi adicionado 100
µL do reagente de Griess (1g de sulfanilamina, 0,1g de naftiletilenodiamina,
2,3 mL de ácido ortofosfórico 85%, 97,7 mL de água), o qual foi incubado,
novamente, à temperatura ambiente sob agitação, por mais 10 minutos e a
absorbância foi lida em ELISA a 540 nm.
Os resultados foram avaliados comparando-se com uma curva padrão
feita utilizando-se nitrato de sódio 1 mmol/L e expressos em mmol/L (Granger,
Anstey et al., 1999).
Materiais e Métodos
43
4.13. Expressão Protéica por Western Blot
A expressão protéica da Erk1/2, p38, Akt totais e fosforiladas, bem
como do EGF, foram realizados por Western Blot. Para tanto, parte do
coração (200-300 mg) foi homogeneizada em tampão contendo 20 mmol/L de
Tris, 150 mmol/L de NaCl, 5 mmol/L de EDTA, glycerol 10%, 20 µmol/L de
PMSF usando um homogenizador Politron por 40 segundos. As
concentrações de proteína foram analisadas pelo método de Bradford
(Bradford) e utilizadas para normalizar a quantidade de proteína. 80 µg de
proteína foram utilizadas para a eletroforese em gel monodimensional de
dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) em um sistema
descontínuo usando gel 10-14%. As proteínas separadas foram, em seguida,
transferidas para membranas de nitrocelulose utilizando tampão contendo Tris
20mmol/L, glicina 150 mmol/L, metanol 20% (v/v), SDS 0,02% (p/v) (pH= 8,2)
em uma unidade de transferência Bio-Rad resfriada. Após, os sítios de
proteínas inespecíficas foram bloqueados por 1 hora em incubação com
solução bloqueadora (5% (p/v) de leite desnatado) em tampão Tris salina
0,1% (p/v), tween-20. As membranas foram processadas por imunodetecção
utilizando-se os seguintes anticorpos primários: anticorpo anti-Akt total de
cabra e anti-Akt fosforilada de coelho, anticorpo anti-EGF de coelho e
anticorpo anti-ERK1/2 fosforilada de coelho (Santa Cruz Biotechnology, Santa
Cruz, CA, USA), e anticorpo anti-ERK1/2 total e anticorpo anti-p38 fosforilada
e total de coelho (Cell Signaling, Danvers, MA, USA). Como anticorpos
secundários foram utilizado os anticorpo anti-coelho e anticorpo anti-cabra
Materiais e Métodos
44
conjugados com peroxidase (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA,
USA). As membranas foram reveladas por quimiluminescência. Os filmes
autoradiográficos foram analisados e quantificados através de um
densitômetro de imagem (Imagemaster VDS CI, Amersham Biosciences
Europe, IT). Os pesos moleculares das bandas de proteínas foram
determinados utilizando como referência um padrão de peso molecular (RPN
800 rainbow full range Bio-Rad, CA, USA). Os resultados foram normalizados
através do método do Ponceau (Klein, Kern et al., 1995).
Materiais e Métodos
45
5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Com base nos resultados das análises, as médias e os seus desvios
padrões foram calculados e apresentados como média ± desvio padrão em
todos os artigos. Os dados apresentaram distribuição normal e
homocedasticidade, o que justificou a utilização de testes estatísticos
paramétricos para a obtenção das diferenças entre as médias. Os testes
utilizados foram: teste t de Student para amostras não pareadas, ao
compararmos apenas dois grupos (artigos I e II); ANOVA de duas vias
complementado pelo teste de Student-Newmann-Keuls ao compararmos
quatro grupos e considerando dois fatores de influência (artigos III, IV e V);
correlação de Pearson para realizarmos as associações entre os diferentes
parâmetros obtidos. O Software utilizado para a realização da análise
estatística foi o SigmaPlot, versão 11.0. As diferenças foram consideradas
significativas quando P<0.05.
Análise Estatística
46
6. RESULTADOS
Os resultados obtidos neste estudo foram descritos em forma de artigos
para a submissão em revistas internacionais. A divisão dos resultados em
cinco artigos, bem como a ordem da sua apresentação, seguem a seqüência
proposta na Figura 1 e tem como objetivo elucidar os mecanismos propostos
por este estudo.
Figura 1 – Apresentação do eixo elaborado a partir da hipótese e objetivos da
tese. Esta figura ilustra a seqüência dos mecanismos estudados.
Resultados
47
6.1. Artigo I
Título: “Exercise training reduces sympathetic modulation on
cardiovascular system and cardiac oxidative stress in
spontaneously hypertensive rats.”
Status: Artigo aceito – American Journal of Hypertension, 2008 [Epub
ahead of print]
Objetivo: Determinar in vivo as alterações da modulação simpática
cardíaca e do estresse oxidativo induzidas pelo exercício, e se
estes parâmetros estão associados com a hipertrofia cardíaca em
animais SHR.
Conclusão: O treinamento físico atenuou a modulação simpática e a
hipertrofia cardíaca patológica dos animais SHR. Estes
parâmetros estavam associados à redução do estresse oxidativo
cardíaco.
Figura 2 – Eixo esquemático representando os mecanismos avaliados no
artigo I.
Artigo I
48
6.2. Artigo II
Título: “Cardiac oxidative stress and p38 activation in spontaneously
hypertensive rats pathological cardiac hypertrophy”.
Status: Artigo submetido – Journal of Hypertension, 2008
Objetivo: Avaliar in vivo o estresse oxidativo cardíaco em ratos SHR com
hipertensão estabelecida e estabelecer associações com a
ativação de MAPK e com parâmetros morfológicos da hipertrofia
cardíaca.
Conclusão: Os resultados indicam o elevado estresse oxidativo cardíaco na
fase estabelecida da hipertensão, e esse está associado a
mecanismos pró-apoptóticos que determinam a hipertrofia
patológica e a disfunção cardíaca.
Figura 3 – Eixo esquemático representando os mecanismos avaliados no
artigo II.
Artigo II
49
6.3. Artigo III
Título:
“Enalapril improves oxidative status and reduces p38
activation and cardiac hypertrophy in spontaneously
hypertensive rats.”
Status: Artigo submetido – Hypertension, 2008 (Supplemental
Submission by Council of High Blood Pressure Research).
Objetivo: Avaliar in vivo os efeitos do enalapril sobre o perfil oxidativo e
hipertrofia cardíaca, e se esse tratamento modifica a ativação das
MAPK e Akt em SHR com hipertensão estabelecida.
Conclusão: O tratamento com o enalapril determinou efeitos benéficos sobre
o sistema cardiovascular por melhorar a função cardíaca e
diminuir a hipertrofia patológica, o estresse oxidativo e a ativação
da p38.
Figura 4 – Eixo esquemático representando os mecanismos avaliados no
artigo III.
Artigo III
50
6.4. Artigo IV
Título:
“Renin-angiotensin system influence on physiological
cardiac hypertrophy: modulation of oxidative stress,
hypertrophic pathways and epidermal growth factor.”
Status: Artigo Escrito.
Objetivo: Avaliar o estresse oxidativo cardíaco e mecanismos hipertróficos
em ratos treinados, e se o SRA participa no desenvolvimento da
hipertrofia cardíaca fisiológica.
Conclusão: O modelo de hipertrofia cardíaca fisiológica apresenta diminuição
do estresse oxidativo e aumento da ativação da ERK1/2 e Akt. O
SRA influencia o desenvolvimento desse padrão de hipertrofia,
provavelmente por estimular o EGF.
Figura 5 – Eixo esquemático representando os mecanismos avaliados no
artigo IV.
Artigo IV
51
6.5. Artigo V
Título:
“Exercise training reduces pathological cardiac hypertrophy
through decreasing cardiac oxidative stress and stimulating
intracellular survival mechanisms.”
Status: Artigo escrito.
Objetivo: Avaliar os efeitos do exercício em animais SHR sobre o estresse
oxidativo e vias intracelulares, e determinar a participação do
SRA no mecanismo de redução da hipertrofia cardíaca
patológica.
Conclusão: Os achados indicam que o exercício reduziu a hipertrofia cardíaca
patológica de SHR provavelmente por diminuir o estresse
oxidativo e a ativação da p38, e por ativar a Akt. O SRA parece
contribuir, ainda que discretamente, para alguns efeitos benéficos
induzidos pelo exercício, como a ativação da Akt.
Figura 6 – Eixo esquemático representando os mecanismos avaliados no
artigo V.
Artigo V
52
7. DISCUSSÃO CONCLUSIVA
A avaliação do perfil oxidativo cardíaco em diferentes modelos de
hipertrofia cardíaca indica a participação do estresse oxidativo apenas em
condições patológicas. Em situações fisiológicas, como na induzida pelo
exercício, o estresse oxidativo encontra-se diminuído e parece não estar
associado à promoção da hipertrofia cardíaca.
Os artigos I e II demonstraram a participação do estresse oxidativo na
hipertrofia cardíaca patológica de animais hipertensos. Nestes dois estudos
mostramos a associação direta de parâmetros do estresse oxidativo com o
índice de hipertrofia cardíaca. Apesar de não estabelecermos uma relação
causa/efeito, a correlação direta nos indica que, os mecanismos que
promovem a hipertrofia cardíaca patológica também interferem no estresse
oxidativo cardíaco.
No artigo I, ao utilizarmos o exercício como uma intervenção anti-
hipertensiva, verificamos que a redução da atividade simpática cardíaca em
animais treinados também está associada à diminuição do estresse oxidativo.
Este achado indica o provável papel do SNS promovendo este estresse e,
assim, estimulando o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca patológica. Na
literatura, outros estudos corroboram com este mecanismo e também
verificaram que a ação da noradrenalina sobre as células cardíacas estimula a
produção de EAO (Amin, Xiao et al., 2001). O estresse oxidativo presente nos
cardiomiócitos é desencadeado principalmente pela ativação de receptores
alfa-adrenérgicos e parece envolver também a ativação da NADPH oxidase
Discussão Conclusiva
53
(Xiao, Pimentel et al., 2002). Nesses estudos, o aumento das EAO está
associado aos estímulos hipertróficos dos cardiomiócitos. Assim, a redução da
atividade simpática sobre o coração não promove apenas a redução da
pressão arterial, mas também pode modificar mecanismos bioquímicos e
moleculares cardíacos que culminam na redução da hipertrofia cardíaca
patológica nos SHR.
Ao avaliarmos alguns possíveis mecanismos moleculares relacionados
com a hipertrofia cardíaca patológica, verificamos que a via das MAPK parece
desempenhar um papel importante neste desenvolvimento. No artigo II, ao
compararmos dois componentes dessa via em animais normotensos e
hipertensos, verificamos que, durante o estágio de hipertensão e hipertrofia
estabelecidas, a p38 MAPK encontra-se mais ativada. Por outro lado, a
ERK1/2 está inibida nesses animais hipertensos. Este desequilíbrio entre a
ativação das MAPK pode ser justificado pelo elevado estresse oxidativo
cardíaco, uma vez que verificamos fortes associações entre esses
parâmetros. Embora o estresse oxidativo esteja fortemente associado à
ativação da p38, a correlação inversa entre a oxidação protéica e a ativação
da ERK1/2 indica que essa MAPK pode estar sendo inibida em uma situação
de elevado estresse cardíaco.
De fato, a literatura nos mostra que a via da p38, também considerada
uma MAPK ativada pelo estresse celular, está elevada em condições de lesão
celular e situações pro-apoptóticas (Tibbles e Woodgett, 1999; Baines e
Molkentin, 2005). Além disso, a estreita relação desta MAPK com a ativação
de vias apoptóticas nos indica o estado pró-morte celular na fase de
Discussão Conclusiva
54
hipertensão e hipertrofia estabelecidas. Esse estado, apesar de promover a
perda de cardiomiócitos, também está relacionado com o acúmulo de tecido
intersticial e com a fibrose cardíaca (Fortuño, Ravassa et al., 2001). Um
estudo avaliou o envolvimento da p38 nos mecanismos de proliferação
fibroblástica, e verificou que, a utilização de inibidores da p38 diminuiu a
quantidade de tecido fibroso e melhorou a função cardíaca (See, Thomas et
al., 2004). Assim, o artigo II dessa tese mostra o desequilíbrio entre os
componentes da via das MAPK com o predomínio da ativação da p38, o que
sugere o estado pró-apoptótico do tecido cardíaco em animais SHR durante a
fase de hipertensão estabelecida.
Em condições patológicas, além do SNS, o SRA também parece
modular estes mecanismos hipertróficos. O artigo III mostra que o tratamento
de ratos normotensos e hipertensos com o enalapril, um inibidor da enzima
conversora da angiotensina, modificou o perfil oxidativo cardíaco e a ativação
da p38. A diminuição do estresse oxidativo cardíaco ocorreu tanto em animais
normotensos quanto hipertensos. Esse achado nos indica que a modulação
do estresse oxidativo cardíaco não depende apenas dos fatores mecânicos
agindo sobre esse tecido. Além disso, nosso estudo também mostrou que a
diminuição do estresse oxidativo, provavelmente induzida pela inibição do
SRA, interferiu apenas na ativação da p38 e não sobre a ERK1/2 e a Akt.
Outros estudos também demonstraram a relação da p38 com a angiotensina
II. Estudos in vitro com cardiomiócitos mostraram que elevadas concentrações
de angiotensina II estimulam a p38 e processos apoptóticos celulares (Yu,
Akishita et al., 2006). Além disso, o aumento da produção de EAO induzido
Discussão Conclusiva
55
pela angiotensina II mediou mecanismos apoptóticos em cardiomiócitos
(Hingtgen, Tian et al., 2006; Yu, Akishita et al., 2006). Assim, a angiotensina II
parece contribuir para o estabelecimento da hipertrofia patológica. Ainda,
através da sua influência sobre fatores bioquímicos e moleculares, o SRA
estimula mecanismos relacionados com processos apoptóticos e mal-
adaptativos no coração, o que resulta na piora da função cardíaca.
Assim, os três primeiros artigos deste estudo demonstram a associação
do estresse oxidativo na mediação de mecanismos hipertróficos e apoptóticos
cardíacos. Esse elevado estresse oxidativo, verificado em condições
patológicas, pode determinar o predomínio de vias relacionas com respostas
mal-adaptativas e corrobora com o estabelecimento da disfunção mecânica na
fase de sustentação e de transição para a insuficiência cardíaca.
Por outro lado, em situações fisiológicas, o estresse oxidativo parece
não intervir sobre os mecanismos hipertróficos. O artigo IV deste estudo nos
mostra que o estresse oxidativo cardíaco encontra-se significativamente
reduzido na hipertrofia cardíaca fisiológica. Esse modelo, induzido pelo
exercício, promoveu o aumento da defesa antioxidante enzimática cardíaca e
melhorou o balanço redox, avaliado através do metabolismo da glutationa. No
entanto, esta condição de baixo estresse oxidativo não ocasionou a redução
do tamanho do coração. Pelo contrário, o que verificamos foi um importante
aumento da hipertrofia cardíaca após o exercício crônico. Outros estudos
também mostraram que o exercício melhorou o perfil oxidativo no coração
(Kakarla, Vadluri et al., 2005; Watson, Reusch et al., 2007), principalmente por
aumentar as defesas antioxidantes, já que o elevado metabolismo oxidativo
Discussão Conclusiva
56
corporal, induzido pelo exercício, promove aumento da produção de EAO. O
aumento dessas espécies durante o exercício ocorre principalmente por via
mitocondrial e por ativação da xantina oxidase (Ascensão, Magalhães et al.,
2005). Estes mecanismos aumentam principalmente a produção de ânion
superóxido no músculo cardíaco. Assim, a produção de EAO, pode, de forma
compensatória, estimular o aumento da atividade das enzimas que dismutam
e catalisam essas espécies em moléculas menos reativas (Atalay e Sen,
1999; Ji, 2002; Ji, Gomez-Cabrera et al., 2006). Sendo assim, o aumento da
defesa antioxidante enzimática associada à hipertrofia cardíaca fisiológica
pode determinar a redução do estresse oxidativo cardíaco e a inibição dos
seus efeitos deletérios sobre o tecido.
Assim, como o estresse oxidativo cardíaco compensado parece não ser
o elemento chave na promoção da hipertrofia cardíaca fisiológica,
investigamos, então, a expressão do fator de crescimento epidermal (EGF) no
tecido cardíaco. De fato, a literatura mostra que essa expressão encontra-se
elevada na hipertrofia cardíaca fisiológica, e pode estar associada com a
ativação das vias de crescimento tecidual. Estes resultados demonstram o
papel hipertrófico do EGF sobre os cardiomiócitos. Além disso, o aumento da
expressão do EGF foi também verificado em humanos após uma sessão de
exercício (Konradsen e Nexø, 1988). O receptor do EGF apresenta atividade
tirosina cinase, isto é, pode ativar vias de sinalização independentes do
estresse oxidativo, como a Ras/Raf/ERK1/2 (Shah e Catt, 2003; Heineke e
Molkentin, 2006). Esses achados corroboram com os nossos resultados e
Discussão Conclusiva
57
demonstram que este fator pode ser importante para a determinação de
respostas adaptativas em situações fisiológicas como o treinamento físico.
O artigo IV também mostrou a ativação de vias envolvidas com
processos de sobrevivência e crescimento celular no modelo de hipertrofia
cardíaca fisiológica. Verificamos que tanto a ERK1/2 quanto a Akt
encontravam-se mais ativadas na hipertrofia fisiológica. Outros estudos
também mostraram o aumento da ativação da ERK1/2 cardíaca após o
treinamento físico (Melling, Thorp et al., 2007; Hunter, Koch et al., 2008). Além
disso, um modelo transgênico que apresenta aumentada ativação da ERK1/2
possui hipertrofia cardíaca compensada sem fibrose associada (Bueno, De
Windt et al., 2000).
De fato, a via da Akt desempenha um papel fundamental no
desenvolvimento hipertrófico do coração. A sua ativação está relacionada com
processos fisiológicos nesse tipo de hipertrofia (Kemi, Ceci et al., 2008). A Akt
pode contribuir para o desenvolvimento de repostas adaptativas cardíacas
através de dois mecanismos. Um deles, através da ativação do mTOR. O
mTOR age sobre os ribossomos estimulando a síntese protéica, sendo um
importante fator relacionado a situações de hipertrofia muscular (Heineke e
Molkentin, 2006). A outra contribuição da Akt para o desenvolvimento da
hipertrofia cardíaca é a inibição da cinase da glicogênio sintase-3β (GSK3β). A
GSK3β é uma cinase que inibe fatores transcricionais hipertróficos, como
NFAT e c-Myc (Proud, 2004). Sendo assim, a sua inibição pela Akt favorece o
estabelecimento da hipertrofia cardíaca (Heineke e Molkentin, 2006).
Discussão Conclusiva
58
O EGF pode também estimular a via da Akt e a ERK1/2 através da
ativação do seu receptor tirosina cinase (Heineke e Molkentin, 2006; Clerk,
Cullingford et al., 2007). Esse mecanismo pode justificar a ativação destas
vias sem a participação do estresse oxidativo. O baixo estresse oxidativo,
verificado nesse estudo, sugere a participação de outros mecanismos
relacionados, que podem participar do processo hipertrófico, tais como dos
receptores tirosina cinases e de subseqüentes vias como PI3K/Akt e
Ras/Raf/ERK1/2 no processo de hipertrofia fisiológica.
Dessa forma, ao compararmos os resultados do estresse oxidativo
cardíaco e da ativação das vias de sinalização entre os modelos de hipertrofia
cardíaca patológica e fisiológica, verificamos diferentes perfis que auxiliam na
compreensão dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos nesses processos.
Enquanto a hipertrofia patológica é caracterizada pelo elevado estresse
oxidativo e predomínio de ativação de vias pró-apoptóticas, a hipertrofia
fisiológica é caracterizada pelo baixo estresse oxidativo associado à ativação
de importantes vias de sobrevivência e crescimento celular. Esse raciocínio
também foi proposto por Matsuzawa e colaboradores (Matsuzawa e Ichijo,
2005) ao revisar as vias de sinalização intracelulares apoptóticas reguladas
pelo estresse e estado redox, porém não diretamente relacionadas com a
hipertrofia cardíaca. Assim, o nosso estudo mostra esses eixos de ativação e
ainda relaciona com características funcionais cardíacas e morfológicas, o que
contribuiu de maneira decisiva para a aceitação do mecanismo proposto.
Nesse contexto, buscamos então avaliar a participação do SRA nos
mecanismos hipertróficos fisiológicos. No artigo III, havíamos avaliado o papel
Discussão Conclusiva
59
deste sistema sobre a hipertrofia patológica. No artigo IV, ao inibirmos este
sistema através do enalapril em animais normotensos, nós verificamos que o
SRA participa de forma importante no desenvolvimento da hipertrofia cardíaca
fisiológica. Embora a associação do enalapril com o exercício tenha reduzido
discretamente a PAM e a PAD comparada ao grupo controle sedentário, as
diferenças observadas em relação aos parâmetros morfológicos, bioquímicos
e moleculares entre os dois grupos treinados apontam para uma significativa
ação pró-hipertrófica fisiológica do SRA.
Assim, em condições fisiológicas, nós propomos que o SRA,
provavelmente, por ação da angiotensina II, estimule o aumento do EGF e a
conseqüente ativação de vias de crescimento celular adaptativas, colaborando
para a melhora da função cardíaca pós-treinamento. Esse raciocínio é
reforçado por estudos na literatura que também mostraram a participação do
SRA no desenvolvimento da hipertrofia após treinamento de resistência.
Barauna e colaboradores (Barauna, Junior et al., 2005) demonstraram o
aumento da expressão do receptor AT1 no coração hipertrofiado. Além disso,
ao associarem o treinamento com o losartan, um bloqueador deste receptor, a
hipertrofia cardíaca foi significativamente reduzida. Assim, o nosso estudo é
um dos pioneiros nessa linha de pesquisa, por mostrar a participação do SRA
e o seu papel modulador sobre a ativação das vias de crescimento celular e
sobre o EGF.
Ainda nesse contexto, ao avaliarmos o papel do SRA sobre o
remodelamento cardíaco induzido pelo exercício em animais hipertensos, nós
verificamos que, em condições patológicas, onde este sistema já se encontra
Discussão Conclusiva
60
ativado, a sua participação é bem menos importante. Assim, no último artigo
(V) deste trabalho, ao avaliarmos o efeito isolado do treinamento físico em
esteira sobre a hipertrofia cardíaca patológica do SHR, verificamos que este
diminuiu o estresse oxidativo e promoveu uma importante alteração do padrão
de ativação das vias de sinalização intracelulares. Mostramos também que o
treinamento isolado diminuiu a ativação da p38 e aumentou a fosforilação da
Akt. A participação do SRA nesse modelo mostrou que, com a associação do
enalapril ao treinamento, a inibição desse sistema preveniu o aumento da
ativação da Akt. Porém, não sabemos ao certo se no grupo apenas treinado o
aumento da Akt se deve realmente ao SRA, uma vez que um estudo prévio
mostrou a diminuição da angiotensina II cardíaca em SHR após o treinamento
(Filho, Ferreira et al., 2008). Assim, verificamos a necessidade da realização
de uma avaliação mais aprofundada sobre o envolvimento do SRA no
remodelamento cardíaco induzido pelo exercício na hipertensão.
O efeito do treinamento físico isolado sobre a ativação da p38 em
animais SHR não foi ainda mostrado na literatura. No entanto, prévios estudos
mostraram que o exercício nesse animal diminuiu a expressão de fatores pró-
apoptóticos cardíacos, como caspase-3 e p53 (Sanchez-Prieto, Rojas et al.,
2000; Zhuang, Demirs et al., 2000). Esses resultados, então, corroboram com
o nosso ao mostrarem que as vias pró-apoptóticas, ativadas em situações
patológicas, são moduladas pelo exercício. E ainda, essa modulação
provavelmente contribui para a melhora da função cardíaca e redução da
hipertrofia do ventrículo esquerdo em animais SHR.
Discussão Conclusiva
61
A escolha pelo treinamento em esteira, no experimento do artigo V, se
deve ao fato de que, em um estudo prévio realizado em nosso laboratório com
animais SHR, foi observada a redução da relação peso do ventrículo esquerdo
pelo peso corporal utilizando o mesmo protocolo (Bertagnolli, Campos et al.,
2006). Além disso, um estudo realizado com o treinamento de natação nesse
mesmo modelo mostrou o aumento do índice de hipertrofia cardíaca,
considerando tanto o peso do coração quanto o peso do ventrículo esquerdo
pelo peso corporal (Filho, Ferreira et al., 2008). Desta forma, verificamos que,
em animais SHR, a modificação do padrão de hipertrofia cardíaca induzida
pelo exercício depende da metodologia utilizada, isto é, da modalidade do
exercício e da sua intensidade.
Assim, em conjunto, nossos resultados indicam o papel importante do
estresse oxidativo sobre a hipertrofia cardíaca patológica, bem como a sua
associação com a modulação das vias de sinalização intracelulares envolvidas
neste processo. O estresse oxidativo parece promover alterações no tecido
cardíaco que determinam a ativação de vias pró-apoptóticas e estimulam
respostas mal-adaptativas levando à disfunção deste órgão. No entanto, o
exercício, por modular a participação do SNS e SRA sobre o coração,
modifica o estresse oxidativo e promove a diminuição da ativação da via p38
pró-apoptótica e aumenta a via Akt de sobrevivência, o que contribui para a
melhora da função cardíaca. Por outro lado, em modelo de hipertrofia cardíaca
fisiológica, o baixo estresse oxidativo não está associado aos mecanismos de
trofismo celular. Nessa condição, a ativação de vias de crescimento e
sobrevivência celulares está provavelmente relacionada a fatores de
Discussão Conclusiva
62
crescimento, como o EGF, e ainda apontam para a participação do SRA
nesse mecanismo.
8. PERSPECTIVAS
A discussão dos resultados gerais obtidos nessa tese nos indica as
várias linhas de investigação que podem ser avaliadas. Verificamos a
necessidade de avaliar melhor o papel do SNS sobre a geração do estresse
oxidativo e sobre a ativação de vias de sinalização intracelulares. Assim,
poderemos estabelecer quais os efeitos atribuíveis ao SNS e/ou ao SRA. Em
relação ao SRA, devem-se avaliar os seus componentes em cada uma das
situações demonstradas, principalmente no modelo de hipertrofia fisiológica,
onde verificamos sua significativa participação. No que concerne às vias de
sinalização intracelulares, verificamos a importância da avaliação de vias
específicas apoptóticas e marcadores finais de sobrevivência e hipertrofia.
Também observamos que, a realização de análises de imagens dos corações
hipertróficos será importante para melhor caracterizarmos o efeito das
intervenções utilizadas sobre o número, tamanho e estrutura do cardiomiócito,
bem como das células não miócitos e tecido fibroso. Dessa forma, a profunda
caracterização dos modelos associada à avaliação dos fatores
neuroendócrinos e moleculares enriquecerão este trabalho e ajudarão na
compreensão exata dos mecanismos sugeridos nesta tese.
Perspectivas
63
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