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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
EDILSON HOLANDA COSTA FILHO
ESTUDO DA PRODUÇÃO ENZIMÁTICA DE BIODIESEL
UTILIZANDO ÓLEO RESIDUAL E ETANOL
Fortaleza – Ceará
2008
EDILSON HOLANDA COSTA FILHO
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ESTUDO DA PRODUÇÃO ENZIMÁTICA DE BIODIESEL
UTILIZANDO ÓLEO RESIDUAL E ETANOL
Fortaleza – Ceará
2008
Dissertação de Mestrado submetida à Coordenação do
Programa de Pós-graduação em Engenharia Química, da
Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial
para obtenção do título de Mestre em Engenharia Química.
Orientadora: Prof. Dra. Luciana Rocha Barros Gonçalves
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C870e Costa Filho, Edilson Holanda
Estudo da produção enzimática de Biodiesel utilizando óleo residual e
etanol / Edilson Holanda Costa Filho, 2008.
97 f. ;il. color. enc.
Orientador: Profa. Dra. Luciana Rocha Barros Gonçalves
Área de concentração: Sistemas de reações biotecnológicas
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de
Tecnologia. Depto. de Engenharia Química, Fortaleza, 2008.
1. Lípase imobilizada 2. Esterificação 3. Transesterificação I. Gonçalves,
Luciana Rocha Barros (orient.) II. Universidade Federal do Ceará – Programa
de Pós-Graduação em Engenharia Química
CDD 660
EDILSON HOLANDA COSTA FILHO
ESTUDO DA PRODUÇÃO ENZIMÁTICA DE BIODIESEL UTILZANDO ÓLEO
RESIDUAL E ETANOL
Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Engenharia
Química, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau
de Mestre em Engenharia Química na Área de Concentração de Sistemas de Reações
Biotecnológicas.
Aprovada em 09 / 10 / 2008.
BANCA EXAMINADORA
Aos meus pais, Edilson e Zenir,
pelo apoio e incentivo
durante essa caminhada
AGRADECIMENTOS
A Deus, por simplesmente tudo.
As professoras Luciana e Andréa, pela confiança, pela orientação e pela paciência que
tiveram comigo durante esses dois anos.
A minha prima Denise, ao seu esposo Diniz e aos seus filhos Pedro e Mariana.
Obrigado por esses quase 11 anos os quais vocês dividiram comigo o vosso lar. Obrigado pela
paciência. Uma parte do que sou hoje devo a vocês.
As minhas amigas Kelly, Louise e Izabelly, pela ajuda, pelos conselhos, pelas boas
gargalhadas que demos no laboratório e, principalmente, pela paciência que tiveram nos
momentos difíceis.
Aos bolsistas do laboratório de biotecnologia do Departamento de Engenharia
Química da UFC, especialmente a Ana Iraide pelas dúvidas tiradas e pela lípase fornecida.
A NOVOZYMES, pelo fornecimento da lípase.
Ao professor Rinaldo dos Santos Araújo, do Centro Federal de Educação Tecnológica
do Ceará (CEFET), pelas dúvidas tiradas e pelas análises de cromatografia gasosa.
Ao aluno de mestrado Bruno César Barroso Salgado, do CEFET, pelas análises de
cromatografia gasosa.
A empresa IRACEMA, pelo fornecimento do óleo de algodão.
Ao Jackson, da Fundação Núcleo de Tecnologia Industrial do Ceará (NUTEC), pelas
análises de índice de iodo.
A Rosilene, da empresa TECBIO, pelas dúvidas tiradas.
Ao Estélio, do Laboratório de Combustíveis e Lubrificantes (LCL) pelas análises de
densidade.
Ao CNPq, pela concessão da bolsa de estudos.
A todos que de certa forma contribuíram, direta ou indiretamente, para a conquista de
mais essa vitória, incluindo todos os colegas, professores e funcionários técnico-
administrativos da UFC e do Departamento de Engenharia Química.
"Não deixe que a saudade sufoque, que a rotina acomode, que o medo impeça de tentar.
Desconfie do destino e acredite em você. Gaste mais horas realizando que sonhando,
fazendo que planejando, vivendo que esperando
porque, embora quem quase morre esteja vivo, quem quase vive já morreu."
(Luiz Fernando Veríssimo)
RESUMO
O biodiesel é uma mistura de ésteres alquílicos de ácidos graxos resultante da reação entre
óleos vegetais e álcoois de cadeia curta, como metanol ou etanol, auxiliada por um
catalisador, que pode ser ácido, básico ou enzimático. Entretanto, o alto custo da matéria-
prima quando se utiliza óleo vegetal de grau alimentício tem inviabilizado economicamente a
produção desse biocombustível. Por isso, as pesquisas com óleo residual tem aumentado,
mostrando a viabilidade técnica da produção de biodiesel a partir de resíduos residenciais e
industriais. Outro fator que influencia a reação de produção de biodiesel é o tipo de álcool. No
Brasil, o uso do etanol é interessante desde que o nosso país se tornou um dos maiores
produtores mundiais de etanol vegetal, um produto mais barato e menos tóxico que o metanol,
diminuindo assim a nossa dependência do petróleo. O catalisador também exerce influência
nesse tipo de reação. Os catalisadores mais usados industrialmente são as bases, mas quando o
óleo vegetal tem um alto teor de ácidos graxos livres, o que acontece, geralmente, com os
óleos residuais, não é possível usar catalisador básico por favorecer a formação de sabão e
diminuir o rendimento em ésteres. Nesse caso, usa-se um catalisador ácido ou enzimático.
Partindo dessa premissa, os resultados constantes nessa dissertação correspondem ao estudo
da produção enzimática de biodiesel utilizando óleo residual e etanol. Avaliou-se o
comportamento da lipase comercial imobilizada de Cândida antarctica tipo B (Novozym
435) na esterificação do ácido oléico comercial, estudando as variáveis que influenciam no
processo. As variáveis escolhidas foram: temperatura (30-50
o
C), razão molar ácido:álcool
(1:1-1:6) e a concentração de água presente no meio (0-20%). As reações foram conduzidas
em erlenmeyers de 250 mL fechados contendo 10 g de óleo e a quantidade de álcool pré-
determinada pelo planejamento de experimentos, mantendo-se a agitação fixa em 200rpm e a
concentração de enzima em 5% m/m baseada na massa de óleo medida, obtendo-se uma
conversão máxima de 88,36% na condição de maior razão molar, menor temperatura e menor
concentração de água. Entretanto, pelo estudo cinético concluí-se que não é necessário um
excesso de álcool para conseguir boas conversões. Em seguida, avaliou-se o comportamento
de uma lípase do tipo B de Cândida antarctica imobilizada em quitosana na esterificação do
ácido oléico, observando um comportamento semelhante ao da Novozym 435 mas com uma
taxa inicial de reação mais lenta. Avaliou-se também o comportamento das duas lípases na
esterificação do óleo de coco residual ácido, observando uma boa estabilidade para ambos os
biocatalisadores que forneceram uma conversão acima de 80% com 60 minutos de reação e
puderam ser reutilizados por no mínimo 10 vezes consecutivas sem perda considerável de
atividade. Para comparar o comportamento da Novozym 435 em dois meios distintos,
realizou-se um planejamento experimental fatorial com um óleo de algodão residual de baixa
acidez livre, observando a mesma influência negativa da temperatura e da razão molar entre
reagentes, mas com um tempo de reação maior, pois uma conversão máxima de 82,66% só foi
atingida com 72 horas de reação. Para o cálculo da conversão, utilizou-se a redução do índice
de acidez quando a matéria-prima tinha um alto teor de ácidos graxos livres e o método do
periodato de sódio na determinação da glicerina quando a matéria-prima tinha uma baixa
acidez livre.
PALAVRAS-CHAVE: Biodiesel, óleo residual, etanol, lipase imobilizada, esterificação,
transesteresterificação.
ABSTRACT
Biodiesel is a mixture of fatty acid alkyl esters produced by the reaction between vegetable
oils and short chain alcohols, like methanol and ethanol, using a catalyst that can be acid,
basic or enzymatic. However, the high cost of the raw material when refined vegetable oil is
used, have made biodiesel production economically unattractive. Therefore, research with
waste oils has increased, showing the technical viability of the production of biodiesel using
the residential and industrial residues as raw material. Another variable that has influenced
this type of reaction is the type of alcohol. In Brazil, the use of ethanol is interesting because
the country has become one of the top worldwide producers of ethanol from vegetables
sources, a cheaper and less toxic product than methanol, decreasing our petroleum
dependence. The type of catalyst also influences biodiesel production. Alkali is the catalysts
that is more often used in industry, but when the vegetable oil has a high acid value, it can not
be used because soap is produced, diminishing the esters yield. In this case an acid or an
enzyme is used as a catalyst. Based on the previous explanation, the results of this work
correspond to the study of enzymatic production of biodiesel using waste oil and ethanol. The
immobilized Candida antarctica lipase (Novozym 435) behavior was studied in the oleic acid
esterification, studying the effect of the variables that has influence in the process. The
variables chosen were: temperature (30 – 50
o
C), molar ratio acid:alcohol (1:1 – 1:6) and water
content (0 – 20%). The reaction were performed in closed reactors with a capacity of 250 mL
containing 10 g of oil, a known amount content of alcohol, pre-determined by experimental
design and enzyme content of 5% p/p, based on the oil mass. The reaction medium was kept
under constant stirring, 200 rpm. Maximum conversion of 88,36% was achieved when high
molar ration, the lower temperature and water content values were used. However, by the
kinetic study, it can be concluded that it is not necessary to use an alcohol excess to achieve
good conversions. After that, the behavior of Candida Antarctica lipase B immobilized in
chitosan was studied in acid oleic esterification. A slower initial rate of reaction was observed
in comparison to Novozym 435. The behavior of both lipases was also studied in the
esterification of waste coconut oil, showing good stability and giving a conversion of about
80% in 60 minutes. Both biocatalyst could be reused 10 times, keeping the same activity. In
order to compare the behavior of Novozym 435 in two different mediums, an experimental
design was performed with waste cotton oil, which had a low acid value. The same negative
influence of the temperature and molar ratio was observed, but with a high reaction time,
getting a maximum conversion of 82,66% in 72 hours of reaction. To calculate the
conversions, the decreasing of the acid value was used when the raw material had a high acid
value, and when the raw material had a low acid value the glycerol production was used.
KEY WORDS: Biodiesel, waste oil, ethanol, immobilized lipase, esterification,
transesterification.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 2.1 Mecanismo da esterificação enzimática com etanol ......................
.........
26
FIGURA 2.2 Reação de transesterificação .......................................................... 27
FIGURA 2.3 Mecanismo da transesterificação enzimática com etanol .............. 28
FIGURA 3.1 Fluxograma do procedimento experimental para a reação de
alcoólise enzimática do ácido oléico e do óleo vegetal residual ....
50
FIGURA 4.1 Cromatograma do ácido oléico ...................................................... 57
FIGURA 4.2 Cromatograma do óleo de coco residual ........................................ 58
FIGURA 4.3 Cromatograma do óleo de algodão residual ................................... 59
FIGURA 4.4 Diagrama de Pareto indicando o efeito dos valores estimados
para as variáveis estudadas no planejamento experimental 2
3
com
triplicata do ponto central da esterificação enzimática do ácido
oléico ..............................................................................................
62
FIGURA 4.5 Valores preditos pelo modelo versus valores experimentais da
conversão em ésteres etílicos obtidos pelo planejamento
experimental 2
3
com triplicata do ponto central da esterificação
enzimática do ácido oléico .............................................................
65
FIGURA 4.6 Superfície de resposta representando a conversão em função da
razão molar entre os reagentes e concentração de água adicionada
ao meio ...........................................................................................
66
FIGURA 4.7 Influência da temperatura na esterificação enzimática do ácido
oléico com etanol utilizando Novozym 435 como catalisador na
razão molar 1:1 e concentração de água W=0% ............................
67
FIGURA 4.8 Influência da temperatura na esterificação enzimática do ácido
oléico com etanol utilizando Novozym 435 como catalisador na
razão molar 1:6 e concentração de água W=0% ............................
67
FIGURA 4.9 Influência da razão molar ácido:álcool na esterificação
enzimática do ácido oléico com etanol utilizando Novozym 435
como catalisador na temperatura de 30
o
C e na menor
concentração de água (W = 0%) ....................................................
69
FIGURA 4.10 Influência da razão molar ácido:álcool na esterifcação enzimática
do ácido oléico com etanol utilizando Novozym 435 como
catalisador na temperatura de 50
o
C e na menor concentração de
água (W = 0%) ...............................................................................
69
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 4.11 Influência da concentração de água na esterifcação enzimática do
ácido oléico com etanol utilizando Novozym 435 como
catalisador na temperatura de 30
o
C e na menor razão molar (R =
1:1) .................................................................................................
71
FIGURA 4.12 Influência do aumento da concentração de álcool com o aumento
da concentração de água na esterificação enzimática do ácido
oléico com etanol utilizando Novozym 435 como catalisador na
temperatura de 30
o
C ......................................................................
73
FIGURA 4.13 Comparação do comportamento da Lipase de Candida Antarctica
Tipo B Imobilizada em Quitosana com a Novozym 435 na
etanólise do ácido oléico na temperatura de 30
o
C, razão molar
ácido:álcool 1:1 e sem adição de água
...........................................................................................................
74
FIGURA 4.14 Comparação do comportamento da Novozym 435 na reação de
etanólise do ácido oléico com a etanólise do óleo de coco residual
na temperatura de 30
o
C, razão molar ácido:álcool 1:1 e sem
adição de água ..................................................................................
75
FIGURA 4.15 Estabilidade operacional da Novozym 435 e da Lipase de Candida
Antarctica Tipo B Imobilizada em Quitosana na reação de
etanólise do óleo de coco residual na temperatura de 30
o
C, razão
molar ácido:álcool 1:1 e sem adição de água
...........................................................................................................
76
FIGURA 4.16 Diagrama de Pareto indicando o efeito dos valores estimados para
as variáveis independentes para o Planejamento fatorial 2
3
da
reação de alcoólise enzimática do óleo de algodão residual .....
78
FIGURA 4.17 Valores previstos pelo modelo versus valores experimentais
obtidos pelo pelo planejamento experimental fatorial 2
3
com
triplicata do ponto central para a reação de alcoólise enzimática do
óleo de algodão ..........................................................................
80
FIGURA 4.18 Superfície de resposta para a conversão em função da temperatura
e razão molar óleo:álcool para alcoólise enzimática de óleo de
algodão utilizando Novozymes 435 como catalisador .
81
FIGURA 4.19 Superfície de resposta para a conversão em função da temperatura
e do tempo reacional para a alcoólise enzimática de óleo de
algodão utilizando Novozymes 435 como catalisador ......
82
LISTA DE TABELAS
TABELA 2.1 Comparação das propriedades físico-químicas .............................. 17
TABELA 2.2 Distribuição espacial das principais fontes de oleaginosas pelas
regiões do Brasil ..............................................................................
21
TABELA 2.3 Comparação entre a catálise química e a catálise enzimática para
produção de biodiesel ......................................................................
31
TABELA 2.4 Classificação das enzimas de acordo com IUBMB ........................ 35
TABELA 3.1 Valores reais das variáveis independentes para o Planejamento
Fatorial 2
3
utilizado para otimizar as condições da esterificação
enzimática do ácido oléico utilizando uma lípase do tipo B de
Candida antarctica comercial como catalisador ............................
51
TABELA 3.2 Valores reais das variáveis independentes para o Planejamento
Fatorial 2
3
utilizado para otimizar as condições da etanólise
enzimática do óleo de algodão residual utilizando uma lípase do
tipo B de Candida antarctica comefcialcomo catalisador ..............
51
TABELA 4.1 Caracterização físico-química das matérias-primas lipídicas
utilizadas nas reações de alcoólise enzimática ................................
56
TABELA 4.2 Percentuais de ácidos graxos para o ácido oléico ........................... 57
TABELA 4.3 Percentuais de ácidos graxos para o óleo de coco residual ............. 58
TABELA 4.4 Percentuais de ácidos graxos para o óleo de algodão residual ........ 59
TABELA 4.5 Resultados do Planejamento Fatorial 2
3
com triplicata do ponto
central tendo como variável resposta a conversão obtida na
esterificação enzimática do ácido oléico utilizando uma lipase
comercial de Candida antarctica tipo B (Novozym 435) ...............
61
TABELA 4.6 Estimativa dos efeitos principais e suas interações na conversão
do ácido oléico a ésteres etílicos .....................................................
63
TABELA 4.7 Anova para a reação de alcoólise enzimática do ácido oléico
utilizando Novozym 435 como catalisador .....................................
64
LISTA DE TABELAS
TABELA 4.8 Conversões obtidas na alcoólise enzimática do óleo de algodão
residual de baixa acidez livre utilizando uma lipase comercial de
Candida antarctica tipo B (Novozym 435) ...................................
77
TABELA 4.9 Estimativa dos efeitos principais e suas interações na conversão
do óleo de algodão a ésteres etílicos ..............................................
79
TABELA 4.10 ANOVA para a reação de alcoólise enzimática do óleo de
algodão utilizando Novozym 435 como catalisador ......................
80
TABELA 4.11 Caracterização físico-química dos ésteres etílicos ........................ 83
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO ................................................................................................
12
2
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................
16
2.1
Contexto Histórico ............................................................................................
16
2.2
Matérias-primas ............................................................................................... 19
2.3
Métodos de obtenção de biodiesel ................................................................... 23
2.3.1 Microemulsificação ................................................................................ 24
2.3.2 Pirólise .................................................................................................... 24
2.3.3 Esterificação ............................................................................................ 25
2.3.4 Transesterificação ................................................................................... 27
2.4
Catálise enzimática ........................................................................................... 32
2.4.1 Lipase ...................................................................................................... 33
2.4.2 Enzimas imobilizadas ............................................................................. 37
2.5
Considerações finais ......................................................................................... 38
3
MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................ 40
3.1
Substratos e Catalisador .................................................................................. 40
3.2
Determinação da Atividade Hidrolítica das Enzimas Imobilizadas ............ 41
3.3
Caracterização Físico-Química da Matéria-Prima e do Biodiesel ............... 41
3.3.1 Índice de Acidez ..................................................................................... 42
3.3.2 Densidade ................................................................................................ 43
3.3.3 Teor de Umidade .................................................................................... 43
3.3.4 Índice de Iodo ......................................................................................... 44
3.3.5 Glicerina Livre, Combinada e Total ....................................................... 45
3.4
Caracterização Cromatográfica da Matéria-Prima ...................................... 47
3.5 Alcoólise Enzimática do Ácido Oléico e dos Óleos Vegetais Residuais
Utilizando Lipase como Catalisador ...............................................................
49
3.6
Cálculo da Conversão em Ésteres Etílicos ..................................................... 52
3.7
Recuperação e Regeneração do Biocatalisador ............................................. 53
3.8
Neutralização dos Ésteres Etílicos Obtidos .................................................... 53
4
RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................... 55
4.1
Caracterização Físico-Química da Matéria-Prima ....................................... 55
4.2
Caracterização Cromatográfica da Matéria-Prima ...................................... 56
4.3 Alcoólise Enzimática do Ácido Oléico Utilizando Lipase Comercial de
Candida Antarctica Tipo B (Novozym 435) como Catalisador .....................
60
4.3.1 Efeito da Temperatura ............................................................................ 66
4.3.2 Efeito da Razão Molar Ácido:Álcool ..................................................... 68
4.3.3 Efeito da Concentração de Água ............................................................ 70
4.4 Alcoólise Enzimática do Ácido Oléico Utilizando Lipase de Candida
Antarctica Tipo B Imobilizada em Quitosana como Catalisador .................
74
4.5 Alcoólise Enzimática do Óleo de Coco Residual Utilizando Novozym 435
como Catalisador ..............................................................................................
75
4.6
Ciclos de Atividade ........................................................................................... 76
4.7 Alcoólise Enzimática do Óleo de Algodão Residual Utilizando Novozym
435 como Catalisador .......................................................................................
77
4.8
Caracterização dos Ésteres Etílicos ................................................................ 82
4.9
Conclusões Parciais .......................................................................................... 83
5
CONCLUSÕES ................................................................................................ 85
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 87
ANEXO ...................................................................................................................... 95
Capítulo 1 – Introdução Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
12
1. INTRODUÇÃO
Diante das atuais perspectivas ambientais, o homem precisa se mobilizar em busca de
garantir um planeta habitável para as próximas gerações. Além disso, a grande maioria da
energia que a humanidade consome atualmente para os mais diversos fins advém do petróleo,
gás natural e carvão, mas essas fontes são esgotáveis e poluentes, e o preço para sua aquisição
aumenta a cada dia. Por isso, surge na comunidade científica e na população em geral, a
necessidade de desenvolver combustíveis alternativos, renováveis, menos poluentes e a um
preço razoável. Nesse contexto, nasce o biodiesel, um combustível ambientalmente correto,
substituto do diesel de petróleo, que pode ser produzido a partir de fontes renováveis como
óleos vegetais, gorduras animais e óleos utilizados para fritura de alimentos, resultando em
uma fonte permanente de geração de energia (Demirbas, 2007; Ramos et al., 2003).
Quimicamente, ele é definido como um derivado mono-alquil éster de ácidos graxos
derivados de lipídeos de ocorrência natural e uma das maneiras pela qual pode ser produzido,
juntamente com a glicerina, é através da reação de alcoólise de triacilgliceróis (ou
triglicerídeos) com álcoois de cadeia curta, na presença de um catalisador ácido, básico ou
enzimático (Al-Zuhair, 2005; Demirbas, 2007; Ramos et al., 2003; Rodrigues et al., 2007;
Vieira et al., 2006).
O biodiesel nasceu basicamente como uma solução para a crise internacional do
petróleo, mas também e, principalmente, em virtude dos problemas ambientais que o nosso
planeta enfrenta na atualidade. Os benefícios ambientais que esse novo combustível pode
trazer são imensos, tais como a redução de até 78% das emissões de gás carbônico, que é
absorvido pela fotossíntese das próprias oleaginosas, redução de 90% das emissões de
fumaças e de 98% de enxofre na atmosfera (Lin et al, 2007).
Com essas características, o biodiesel se tornou um produto de grande interesse entre
leigos e cientistas, sendo fonte de inúmeras pesquisas e desenvolvido em vários países do
mundo, inclusive no Brasil, detentor da primeira patente mundial de produção industrial de
biodiesel e que deve aproveitar a experiência obtida com o Programa Nacional do Álcool
(PROALCOOL) para facilitar a introdução desse biocombustível na matriz energética
brasileira e alcançar os benefícios esperados, sobretudo a geração de emprego e renda, pois o
Capítulo 1 – Introdução Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
13
biodiesel é capaz de melhorar não só as condições ambientais, mas também a situação sócio-
econômica de regiões menos favorecidas. O nosso país tem todas as condições de se tornar
um grande produtor de biodiesel, com a sua imensa extensão territorial e diversidade de
clima, que o torna uma potência na produção de biomassa para fins energéticos. A mamona, o
dendê, a soja, entre outras, e, mais recentemente, os resíduos industriais e residenciais, podem
ser abundantes fontes de energia e inclusão social.
O biodiesel vem para substituir o óleo diesel mineral e é essa a motivação econômica
para produção desse bioproduto no nosso país, uma vez que o diesel é o derivado do petróleo
mais consumido no Brasil e que uma fração crescente desse produto vem sendo importada
anualmente (Ramos et al., 2003). Destaque-se que o Brasil importa cerca de 40 milhões de
barris de óleo diesel, por ano, o que representa uma despesa em nosso balanço de pagamentos
de pelo menos 1,2 bilhões de dólares (Holanda, 2004).
Uma outra característica desse biocombustível que deve ser ressaltada, é que ele pode
ser usado em qualquer motor do ciclo diesel, com pouca ou nenhuma necessidade de
adaptação, o que não acontece com o uso direto dos óleos vegetais como combustíveis, pois,
devido a sua alta viscosidade, baixa volatilidade e combustão incompleta, alguns problemas
foram detectados, tais como: (a) ocorrência de excessivos depósitos de carbono no motor; (b)
a obstrução nos filtros de óleo e bicos injetores; (c) a diluição parcial do combustível no
lubrificante; (d) o comprometimento da durabilidade do motor; e (e) um aumento
considerável em custos de manutenção (Akoh et al., 2007; Fukuda et al., 2001; Ramos et al.,
2003; Vieira et al., 2006; Yagiz et al., 2007).
Apesar de todos os benefícios que estão atrelados ao biodiesel, a sua produção
enfrenta problemas, principalmente quanto ao custo da matéria-prima quando se utiliza óleo
refinado. Sendo assim, o uso de óleos residuais tem se mostrado interessante para produção de
biodiesel, uma vez que é uma matéria-prima mais barata, disposta incorretamente no meio
ambiente, usada normalmente para produção de sabão, massa de vidraceiro e ração para
animais e que não deve ser reutilizada por causar sérios danos à saúde humana. Somente o
Japão contribui com cerca de 500.000 toneladas de óleo residual por ano, contribuindo com o
aumento dos problemas ambientais se um efetivo sistema de coleta e reciclagem não for
implantado. Já a China, por exemplo, produz mais de 20 mil toneladas de óleo de fritura
anualmente, mas já há um sistema de coleta visando à produção de biodiesel (Canakci, 2007;
Capítulo 1 – Introdução Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
14
Encinar et al., 2007; Samukawa et al., 2000; Wang et al., 2007). Um levantamento primário
da oferta de óleos residuais de fritura, suscetíveis a serem coletados (produção > 100
Kg/mês), revela um valor da oferta brasileira superior a 30.000 toneladas anuais (Holanda,
2004).
Dados reportados na literatura comprovam a viabilidade técnica da utilização de
resíduos industriais e residenciais para produção de biodiesel. Vários autores mostram que os
motores que funcionaram com o biodiesel obtido de óleo de fritura apresentaram um melhor
desempenho e a sua queima emite menos CO
2
, materiais particulados e gases do efeito estufa
(Kulkarni et al., 2006; Lebedevas e Vaicekauskas, 2006; Lin et al., 2007). Além disso, o
processo de purificação do biodiesel feito a partir de matérias-primas residuais ácidas é mais
fácil, pois o subproduto da reação é água (Lucena, 2008).
Dentre os processos de produção de biodiesel, a alcoólise alcalina com metanol é o
processo mais usado comercialmente. Entretanto, apesar do baixo custo dos catalisadores
químicos homogêneos, essa rota de produção apresenta algumas desvantagens como a não
recuperação e reutilização do catalisador, produção de sabão, difícil recuperação do glicerol,
um grande gasto energético e a permanência da dependência do petróleo ao se utilizar
metanol (Al-Zuhair, 2007; Al-Zuhair et al., 2006; Iso et al., 2001; Wang et al, 2006).
Nesse sentido, como o biodiesel precisa ser de alta pureza para ser usado como
combustível nos motores de combustão interna, a etanólise enzimática apresenta-se como uma
rota de produção promissora por possibilitar a obtenção de um produto mais puro, a fácil
recuperação do glicerol, a não produção de sabão, um menor gasto energético, a fácil
recuperação e reutilização do biocatalisador e a utilização de etanol como álcool
transesterificante, um produto também obtido de uma fonte renovável, menos tóxico do que o
metanol e com grande disponibilidade no Brasil, desde que se tornou um dos maiores
produtores mundiais. Além disso, o uso de enzimas como catalisador da reação de alcoólise
viabiliza o uso de matérias-primas com baixo valor agregado (elevado teor de ácidos graxos
livres), pois a transesterificação alcalina exige que o óleo vegetal seja isento de umidade e de
ácidos graxos livres (não podendo exceder 1% FFA
1
), uma vez que a base pode reagir com os
ácidos graxos, formando sabão e água, o que dificulta a separação e purificação do biodiesel
(Dossat et al., 1999; Lucena, 2008; Shieh et al., 2003).
1
Ácidos graxos livres
Capítulo 1 – Introdução Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
15
Todavia, a biotransformação ainda não é comercialmente competitiva com a catálise
convencional em virtude do alto preço das enzimas e da sua inativação por contaminação pelo
óleo, pelo álcool ou pelos subprodutos formados durante a reação (Isso et al., 2001; Meher et
al., 2006; Ranganathan et al., 2007; Royon et al., 2007). Sendo assim, essa dissertação visa
estudar a produção enzimática de biodiesel utilizando, primeiramente, ácido oléico comercial
e etanol para avaliar o comportamento da lipase na esterificação de substratos ácidos e as
variáveis que influenciam no processo. A importância de se utilizar primeiramente o ácido
oléico comercial é que, além desse ácido ser o mais comumente encontrado nos óleos
residuais, ao partir de uma matéria-prima pura, diminui-se a probabilidade de inativação da
enzima por contaminantes do óleo residual, e avalia-se apenas a influência das variáveis
escolhidas, buscando otimizar o processo a fim de estabelecer as características para
aplicações industriais.
Conhecendo-se as melhores condições de esterificação do ácido oléico, avaliou-se o
comportamento da lipase frente a óleos residuais e a sua estabilidade operacional após várias
reações consecutivas. Objetivou-se também comparar o comportamento da lipase em meios
com características físico-químicas distintas.
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
16
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Este capítulo tem a finalidade de levantar o estado da arte inserido no contexto deste
projeto e visa identificar as lacunas que devem ser preenchidas com esse trabalho. Ele é
dividido em cinco tópicos nos quais, inicialmente, procura-se contextualizar o biodiesel,
seguindo com uma descrição das matérias-primas e dos métodos de obtenção desse
biocombustível, dando ênfase a alcoólise enzimática, objeto de estudo dessa dissertação.
2.1. Contexto Histórico
Historicamente, durante a escassez do petróleo, os óleos vegetais e seus derivados
foram usados como combustível alternativo ao diesel do petróleo. O primeiro registro do uso
de óleos vegetais como combustível líquido na combustão interna de motores data de 1900
quando Rudolf Diesel usou óleo de amendoim. Entretanto, devido ao baixo custo e alta
eficiência, o petróleo tornou-se a fonte de energia dominante e o diesel do petróleo foi então
produzido para motores a diesel. Apesar disso, sendo o petróleo uma fonte finita, surge na
comunidade científica a necessidade de desenvolver energias alternativas. Assim, nos anos 30
e 40, os óleos vegetais passaram a ser usados diretamente nos motores a diesel em situações
de emergência (Akoh et al., 2007; Ma et al., 1999; Pousa et al., 2007). No entanto, com essa
prática, observou-se que a durabilidade do motor era comprometida devido a alta viscosidade,
baixa volatilidade e combustão incompleta dos óleos vegetais in natura.
Sendo assim, iniciaram-se as primeiras transformações químicas nos óleos vegetais, a
fim de torná-lo menos viscoso e mais eficiente. A pirólise foi o primeiro método de
transformação utilizado, seguido da transesterificação e esterificação (Pousa et al., 2007), mas
a primeira patente mundial de produção industrial de biodiesel por transesterificação surgiu na
década de 80, no Brasil, de autoria do engenheiro químico Expedito José de Sá Parente (Olga,
2005).
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
17
A descoberta do biodiesel por Expedito Parente se deu em 1977 quando ele observou
uma vagem de ingá, cheia de óleo, onde ele visualizou uns grãos ligados, fomentando a
molécula do biodiesel, com os ésteres de ácidos graxos. A partir daí, ele iniciou as pesquisas
com óleo de algodão e metanol. Após a síntese, ele verificou que a viscosidade e as
características aparentes se assemelhavam às do óleo diesel mineral e então testou o seu
combustível num motor velho emprestado por um amigo, surpreendendo-se com o bom
funcionamento do motor que não funcionava nem com o petrodiesel (Olga, 2005). A Tabela
2.1 mostra uma comparação das características do óleo diesel mineral com as características
do biodiesel.
Tabela 2.1: Comparação das propriedades físico-químicas
Propriedade Óleo Diesel Biodiesel
Calor de combustão (MJ/Kg) 45,2 40,5
Viscosidade (cS a 40
o
C) 2,98 6,17
Enxofre (%) 0,15 < 0,01
Ponto de inflamabilidade (
o
C) 82 124
Número de cetano 49,2 59,7
Ponto de névoa (
o
C) -14 -2
Ponto de orvalho (
o
C) -21 -10
Fonte: HOLANDA, 2004.
Diante dessa motivação, o engenheiro parte em busca de parcerias e em 1980 patenteia
sua metodologia de produção de biodiesel por transesterificação (Olga, 2005). No entanto, o
governo brasileiro não deu muita importância à descoberta do pesquisador, mesmo depois de
testes bem sucedidos feitos nos carros da Companhia Energética do Ceará e em um avião
militar brasileiro. Com a falta de interesse e de investimento do governo, a patente torna-se de
domínio público e o biodiesel passa a ser explorado em outras partes do planeta.
Na época da descoberta de Parente, o governo brasileiro preocupava-se apenas com o
Programa Nacional do Álcool – PROALCOOL, implementado na década de 70 com o
objetivo de abastecer com etanol, de forma extensiva, veículos movidos normalmente a
gasolina (Holanda, 2004). No entanto, segundo o próprio Expedito, o álcool é um combustível
solitário, só para veículos de passeio. Não é coletivo, não serve para caminhão, ônibus, trem,
para produção de energia elétrica... Já o biodiesel, como sucedâneo do diesel mineral, é um
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
18
combustível coletivo, muito mais plural. Dessa forma, o álcool não diminui nossa
dependência do petróleo.
O PROALCOOL surgiu por uma necessidade de mercado. Na época o açúcar estava
muito barato, e os usineiros precisavam de alternativas. Então o programa do álcool não
nasceu pela necessidade energética (Olga, 2005). O biodiesel, entretanto, ao invés de
concentrador de riquezas, é um combustível distribuidor de riquezas.
Diante dessas constatações a respeito do PROALCOOL, das turbulências no mercado
internacional do petróleo e das preocupações ambientais, o governo brasileiro cria em 2002 o
Programa Nacional do Biodiesel, PROBIODIESEL, que tem como principal objetivo
promover o desenvolvimento de tecnologias de produção e avaliar a viabilidade e a
competitividade técnica, sócio-ambiental e econômica do biodiesel para os mercados interno e
externo, bem como de sua produção e distribuição espacial nas diferentes regiões do país
(Moreira et al., 2006; Ramos et al., 2003). Esse programa é resultado de estudos feitos por
comissões interministeriais em parceria com universidades e centros de pesquisa,
considerando a etanólise de óleos vegetais como a principal rota de produção de biodiesel, em
virtude da grande capacidade de produção de etanol pelo Brasil (Pousa et al., 2007).
Em 2004, é lançado o Programa Nacional de Produção e Uso de Biodiesel (PNPB),
cujo principal objetivo era a implementação de forma sustentável, tanto técnica, como
economicamente, da produção e uso do biodiesel, com enfoque na inclusão social e no
desenvolvimento regional, via geração de emprego e renda (Suarez et al., 2006). Esse
programa propõe a introdução de biocombustíveis derivados de óleos e gorduras na matriz
energética brasileira através da adição de 2% de biodiesel (B2) ao diesel consumido no Brasil
até 2008 e dentro de 15 anos as perspectivas são de que essa proporção passe para 20% de
biodiesel e 80% de diesel (B20), o que, em termos ambientais, resultará em uma redução
significativa no padrão de emissões de materiais particulados, óxidos de enxofre e gases que
contribuem para o efeito estufa. Sendo assim, sua difusão, em longo prazo, proporcionará
maiores expectativas de vida à população e, como conseqüência, um declínio nos gastos com
saúde pública, possibilitando um redirecionamento de verbas para outros setores, como
educação e previdência. Cabe aqui ainda ressaltar que a adição de biodiesel ao petrodiesel, em
termos gerais, melhora as características do combustível fóssil, pois possibilita a redução dos
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
19
níveis de ruído e melhora a eficiência da combustão pelo aumento do número de cetano
(Moreira et al., 2006; Ramos et al., 2003).
Para garantir o cumprimento dessas metas, o governo federal incentiva a produção de
biodiesel através do fornecimento de um selo social para os produtores que adquirem a
matéria-prima em cooperativas. Esse selo, além de garantir isenções fiscais, melhora as
condições de financiamento em bancos públicos (Pousa et al., 2007).
Além do selo social, para estimular o mercado de biocombustíveis antes da
obrigatoriedade de seu uso, o governo idealizou leilões de biodiesel, sob responsabilidade da
Agência Nacional de Petróleo e Gás Natural, ANP, onde a PETROBRAS assegura a compra
do volume necessário de Biodiesel para o B2 das empresas com o selo social. Houve cinco
leilões entre 2005 e 2006 (Pousa et al., 2007).
2.2. Matérias – Primas
A matéria-prima escolhida para a produção de biodiesel varia muito de acordo com a
região. Qualquer lipídeo de origem animal ou vegetal deve ser considerado como adequado
para produção de biodiesel, dependendo da disponibilidade, custo, propriedades de
armazenamento e do desempenho como combustível. A escolha da matéria-prima pode sofrer
também influência do governo que fornece incentivos fiscais para produção a partir de uma
determinada matéria-prima em detrimento de outras. O Brasil, por exemplo, apesar de ser o
segundo maior produtor mundial de soja, incentiva a produção de biodiesel de óleo de
mamona, devido o mercado para o óleo de soja já ser bem estabelecido, enquanto o
aproveitamento do óleo de mamona para o mercado de biodiesel poderá facilitar a geração de
renda nas regiões mais pobres do país, onde a soja não pode ser cultivada (Knothe et al,
2006).
O uso de óleos vegetais e animais para produção de biodiesel também é interessante
por se tratar de um composto renovável e por seu uso sustentado não provocar danos ao meio
ambiente, contribuindo assim para o sucesso do protocolo de Kyoto. Recentes levantamentos
demonstram que apenas 2,2% da energia consumida no mundo é proveniente de fontes
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
20
renováveis, o que evidencia um extraordinário potencial para exploração de outras fontes.
Considerando-se apenas a biomassa proveniente de atividades agroindustriais, calcula-se que
o potencial combustível desse material seja equivalente a, aproximadamente, 6.587 milhões
de litros de petróleo ao ano (Ramos et al., 2003).
Os óleos vegetais são substâncias hidrofóbicas, obtidas pela prensagem ou por
extração das sementes de oleaginosas, constituídos, principalmente, por triglicerídeos com
pequenas quantidades de mono e diglicerídeos, além de ácidos graxos livres, fosfolipídeos,
esteróis, água e outras impurezas que afetam a reação de transesterificação quando se usa
catalisador básico ou ácido, dificultando a separação do glicerol (co- produto). Eles são
líquidos a temperatura ambiente, altamente viscosos, com baixa volatilidade, caráter
poliinsaturado e combustão incompleta, o que inviabiliza o seu uso direto nos motores
(Demirbas, 2007; Felizardo et al., 2006; Ma et al., 1999; Ramos et al., 2003).
O Brasil, um país de grande biodiversidade, é considerado um paraíso para a produção
de biomassa para fins alimentares, químicos e energéticos. Estudos divulgados pelo National
Biodiesel Board encarregado da implementação do biodiesel nos Estados Unidos afirmam
categoricamente que o Brasil tem condições de liderar a produção mundial de biodiesel,
promovendo a substituição de, pelo menos, 60% do óleo diesel consumido no mundo
(Holanda, 2004).
O aproveitamento energético dos óleos vegetais como combustível, além dos
benefícios ambientais já comprovados, pode favorecer lugares menos favorecidos com o
aumento da oferta de empregos, culminado com a valorização do campo e do trabalhador
rural. A região semi-árida do Brasil, por exemplo, que abrange quase todos os estados do
Nordeste e o norte de Minas Gerais, são regiões bastante castigadas pelas secas e com um
grande número de pessoas vivendo na linha da pobreza. Nessa região, as culturas energéticas
podem se basear em lavoura de sequeiro, isto é, sem irrigação. É o caso da mamona e do
algodão, que podem conviver com regime pluviométrico do semi-árido. Portanto, a grande e
forte motivação para um programa de biodiesel no Nordeste reside na possibilidade de
erradicar ou diminuir a miséria do campo por meio de assentamentos familiares (Holanda,
2004). A Tabela 2.2 mostra as principais oleaginosas cultivadas nas cinco regiões brasileiras.
Acredita-se que as regiões mais carentes do Brasil poderão vir a ser grandes
produtoras de biodiesel. A demanda mundial por combustíveis de origem renovável será
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
21
crescente, e o Brasil tem potencial para ser um grande exportador mundial, principalmente no
contexto atual de mudanças climáticas (Holanda, 2004).
Tabela 2.2: Distribuição espacial das principais fontes de oleaginosas pelas regiões do Brasil
CENTRO-OESTE NORDESTE NORTE SUDESTE SUL
ALGODÃO X X X X
BABAÇU X X
COCO X
COLZA X X
DENDE X X
GIRASSOL X X X
MAMONA X X X
SOJA X X X X X
Fonte: RAMOS, et al., 2003.
Uma outra matéria-prima que pode ser utilizada para produção de biodiesel são as
gorduras animais, mas ainda não há muitos estudos com esse substrato e os métodos de
produção a partir dessas substâncias são diferentes dos usados com óleo vegetal devido às
gorduras possuírem propriedades químicas diferentes (são sólidos a temperatura ambiente e
possuem uma quantidade maior de ácidos graxos saturados) (Ma et al., 1999). Essa matéria-
prima é geralmente mais barata que os óleos refinados porque, ao invés de um produto
primário, representam um subproduto da agroindústria animal, e porque a demanda por este
produto é menor do que a maioria dos óleos vegetais mais comuns. Além do elevado teor de
ácidos graxos saturados, elas possuem ponto de fusão relativamente alto, uma propriedade
que, a baixas temperaturas, pode levar a precipitação e a um baixo desempenho do motor. Do
lado positivo, o biodiesel derivado de gorduras animais, devido ao seu alto teor de ésteres de
ácidos graxos saturados, geralmente apresenta número de cetano superior ao observado em
biodiesel de óleo vegetal (Knothe et al, 2006).
Até aqui, conclui-se que o biodiesel é totalmente benéfico, preservando o meio
ambiente e contribuindo com o desenvolvimento econômico e social de regiões carentes do
planeta. Apesar disso, há frentes que são contra o desenvolvimento desse biocombustível,
alegando que ele compete com a produção de alimentos, que deve ser prioritária. Para se ter
uma idéia, segundo uma matéria constante no site do jornal nacional, o preço do óleo de soja
aumentou para o consumidor final, mesmo o Brasil sendo o segundo maior produtor desse
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
22
grão em todo o mundo. Uma das justificativas dadas na reportagem é que o óleo de soja tem
sido usado para produção de biodiesel.
Contradições aparte, o biodiesel enfrenta uma grande barreira a sua comercialização: o
custo da matéria-prima quando se usa óleo refinado. O biodiesel produzido a partir de óleos
vegetais de grau alimentício não apresenta viabilidade econômica em relação ao petrodiesel,
mesmo usando o mais barato dos óleos, uma vez que é essa matéria-prima que representa
cerca de 70 a 85% do custo total de produção (Bonetti et al., 2007; Knothe et al., 2006).
Daí o grande número de pesquisas com óleos usados em frituras industriais e
residenciais, uma matéria-prima mais barata, cuja produção é crescente em todo o mundo e
que é, normalmente, disposta indiscriminadamente no meio ambiente, como nos esgotos das
cidades, contaminado águas, ou então, integram a cadeia alimentar quando são vendidos como
complemento de ração animal, tornando-se assim a causa de muitos problemas de saúde
humana, uma vez que, durante a fritura, alguns componentes nocivos são formados. (Costa
Neto et al., 2000; Felizardo et al., 2006; Kulkarni et al., 2006).
Devido ao grande número de estabelecimentos comerciais que fazem uso de óleos e
gorduras, fica difícil fazer um levantamento preciso da disponibilidade desse resíduo em
grandes centros urbanos. Muitos países desenvolvidos têm estabelecido políticas que
penalizam a disposição de óleo residual em esgotos. No Japão, por exemplo, 500.000
toneladas de óleo residual são descartadas anualmente. Entretanto, em algumas cidades já há
um programa de coleta desses óleos para transformá-los em biodiesel e usá-lo no transporte
público (Costa Neto et al., 2000; Felizardo et al., 2006; Kulkarni et al., 2006, Shimada et al.,
2002).
Vários autores reportam a viabilidade técnica e ambiental da utilização de óleo usado
para produção de biodiesel. Kulkarni et al. (2006), publicaram que os motores que
funcionaram com o biodiesel obtido de óleo de fritura apresentaram um melhor desempenho e
a sua queima emite menos CO
2
, materiais particulados e gases do efeito estufa. Segundo
Costa Neto et al. (2000), a significativa redução de fumaça, obtida em teste com biodiesel de
óleo usado, demonstrou que vale a pena reutilizar o óleo descartado de frituras para produção
desse biocombustível, fornecendo um destino mais adequado para esse poluente. No entanto,
identificou-se também a necessidade de um eficiente sistema de coleta de óleos usados para
que a substituição do óleo diesel mineral por biodiesel de óleo residual alcance o patamar
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
23
desejado, o que em termos gerais, será de grande contribuição para o meio ambiente (Utlu et
al., 2007; Yagiz et al., 2007).
No estudo da produção de biodiesel a partir de óleos residuais, verificou-se que os
óleos apresentavam uma composição variada de ácidos graxos livres, dos quais 40%
correspondiam ao ácido oléico. Dessa forma o ácido oléico é um dos ácidos carboxílicos que
ocorre em grandes quantidades na maioria dos lipídeos, sendo, portanto, responsável por
grande parte da acidez livre em matérias residuais (Lucena, 2008).
Devido as transformações químicas e físicas pelas quais os óleos passam durante a
fritura, é necessário uma modificação das tecnologias existentes para produção de um
biodiesel de qualidade aceitável. Os ácidos graxos livres não são transformados em biodiesel
pela alcoólise alcalina, o método mais convencional. Por isso, matérias-primas ácidas
requerem processamento distinto do empregado em óleos e gorduras refinadas. A catálise
ácida foi examinada, mas temperaturas muito altas, elevado excesso estequiométrico de álcool
e longos tempos de reação foram necessários (Al-Zuhair et al., 2007; Knothe et al, 2006). Já a
catálise enzimática apresenta-se como uma alternativa promissora para a alcoólise de
matérias-primas com alto teor de ácidos graxos livres (Akoh et al., 2007).
2.3. Métodos de Obtenção de Biodiesel
Em virtude da inviabilidade do uso direto de óleos vegetais nos motores de injeção
direta e indireta, movidos a diesel, vários estudos têm sido conduzidos para desenvolver
derivados de óleos vegetais, cujas propriedades e desempenho se aproximem do óleo diesel
mineral.
Dentre os principais métodos de transformação de óleos vegetais, destacam-se a
microemulsificação, a pirólise, a esterificação e a transesterificação.
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
24
2.3.1. Microemulsificação
Uma microemulsão é definida como uma dispersão isotrópica, termodinamicamente
estável, de óleo, água, surfactante e geralmente uma molécula pequena anfifílica, denominada
cosurfactante (Fukuda et al., 2001).
Apesar das microemulsões apresentarem boas características, verificou-se que em
longo prazo provocam a decomposição de carbono no motor, combustão incompleta e
aumento da viscosidade dos óleos lubrificantes (Urioste, 2004).
2.3.2. Pirólise
A pirólise, ou craqueamento térmico, é um processo onde ocorre uma ruptura da
estrutura molecular original de um determinado composto pela ação do calor, na ausência de
ar ou oxigênio, a temperaturas superiores a 450
o
C, geralmente auxiliado por um catalisador,
de modo a gerar moléculas menores. Catalisadores típicos para serem empregados na pirólise
são o óxido de silício – SiO
2
e o óxido de alumínio – Al
2
O
3
(Holanda, 2004; Ma et al., 1999).
O equipamento para pirólise ou craqueamento térmico é caro e os produtos resultantes
desse processo são de difícil caracterização devido ao grande número de reações que ocorrem
e devido ao grande número de produtos que são formados, tais como alcanos, alcenos,
alcadienos, ácidos carboxílicos e aromáticos, dependendo da fonte do óleo vegetal
decomposto. Contudo, apesar dos óleos vegetais pirolisados apresentarem concentrações
satisfatórias de enxofre, água, sedimentos e cobre, são inaceitáveis os níveis de cinzas,
resíduos de carbono e o ponto de ignição alcançado. Embora o produto da pirólise seja
quimicamente semelhante ao diesel mineral, a remoção do oxigênio durante o processo
térmico elimina qualquer benefício ambiental do produto e geralmente produz um
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
25
combustível mais próximo da gasolina que do diesel (Al-Zuhair et al., 2007; Fukuda et al.,
2001; Holanda, 2004; Ma et al., 1999; Ranganathan et al., 2007; Urioste, 2004).
2.3.3. Esterificação
Outro método para produção de biodiesel é através da reação de esterificação, em que
um ácido graxo reage com um álcool, a elevadas temperaturas, e é auxiliada por um
catalisador ácido, geralmente ácido sulfúrico, fornecendo, além dos ésteres alquílicos, água
como subproduto. Esse processo de obtenção de biodiesel é, normalmente, muito utilizado
industrialmente como uma etapa de pré-tratamento para matérias-primas de elevada acidez
livre, geralmente óleos residuais, efluentes graxos e matérias-primas com elevado teor de
ácidos graxos na sua composição, como por exemplo, óleo de babaçu (Marchetti et al., 2007).
No entanto, quimicamente, a reação de esterificação exige elevadas concentrações de
álcool para se alcançar conversões significativas. Vários pesquisadores do processo informam
que a mínima razão molar de álcool/ácido graxo necessária deve ser de pelo menos 9:1, ou
seja, um excesso estequiométrico de 800%, uma vez que a relação estequiométrica entre o
ácido graxo e o álcool é de 1:1. Esse problema deve-se principalmente pela água formada ao
longo da reação, pois desativa o catalisador (H
+
) presente no meio, favorecendo a reação
inversa de hidrolise. Entretanto, essa reação de esterificação também pode ser catalisada
enzimaticamente. Dados da literatura comprovam a viabilidade do uso de lipases na
esterificação de matérias-primas de elevada acidez livre em proporções estequiométricas e em
condições brandas de temperatura (Kulkarni et al., 2006). A seguir, a Figura 2.1 mostra o
mecanismo da esterificação enzimática.
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
26
Figura 2.1 – Mecanismo da esterificação enzimática com etanol.
Inicialmente ocorre uma adição nucleofílica para formar o complexo enzima-substrato
(ES). O nucleófilo é o oxigênio da hidroxila da enzima que ataca o carbono da carbonila do
ácido graxo, e o par de elétrons do grupamento amino da enzima captura o hidrogênio da
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
27
hidroxila. Em seguida, o par de elétrons do oxigênio do ácido graxo no complexo enzima-
substrato captura o hidrogênio do grupamento amino, liberando uma molécula de água (grupo
abandonador) e formando um composto intermediário enzima acetilada (E-Ac). Esse
composto intermediário sofre então o ataque do átomo de oxigênio do álcool que é adicionado
ao átomo de carbono da carbonila do composto intermediário, e o par de elétrons do
nitrogênio captura o hidrogênio da hidroxila do álcool, formando o composto enzima
acetilada-álcool (E-AcA). Finalmente, o próton é transferido do ácido conjugado da amina
para o átomo de oxigênio do complexo, liberando o éster alquílico e reconstituindo a enzima
(Al-Zuhair et al., 2007).
2.3.4. Transesterificação
A reação de transesterificação só acontece na presença de um catalisador, que pode ser
ácido (esterificação), básico ou enzimático. A alcoólise alcalina, cujo catalisador é,
geralmente, hidróxido de sódio ou de potássio, é o processo mais usado industrialmente,
produzindo, além do produto de interesse (ésteres alquilícos), subprodutos tais como glicerol
(também conhecido como glicerina), água e sabão (Salis et al., 2005)
Figura 2.2 – Reação de transesterificação, onde R representa a cadeia carbônica dos ácidos graxos e R’
a cadeia carbônica do álcool reagente.
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
28
Essa reação ocorre em etapas, tendo mono e diglicerídeos como produtos
intermediários (Felizardo et al., 2006; Marchetti et al., 2007; Saad, 2005). A Figura 2.3, a
seguir, mostra o mecanismo da transesterificação enzimática com etanol.
Fi
gura 2.3 – Mecanismo da transesterificação enzimática com etanol.
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
29
Comparando as Figura 2.1 e 2.3, o mecanismo é basicamente o mesmo, sendo a
principal diferença o substrato e os produtos intermediários produzidos. Na transesterificação,
o substrato é um triglicerídeo (óleo vegetal de baixa acidez livre) e ao invés de água, os sub-
produtos formados são glicerol, diglicerídeos e monoglicerídeos.
Os álcoois preferencialmente usados nesse tipo de reação são álcoois de cadeia curta
tais como o metanol, etanol, propanol, butanol ou álcool amílico. Os álcoois mais utilizados
são o metanol e o etanol, principalmente pelo seu baixo custo, suas propriedades físico-
químicas (menor cadeia carbônica) e grande disponibilidade na Europa, Japão e Estados
Unidos (Lu et al., 2007; Ma et al., 1999; Marchetti et al., 2007; Urioste, 2004). Devido à
elevada hidrofilicidade do metanol, ao se utilizar esse álcool, as reações enzimáticas são
efetuadas em meio à solvente orgânico. Outra desvantagem do metanol é que quando usado
em excesso pode inativar a enzima (Al-Zuhair et al., 2006).
No Brasil, o etanol tem força natural desde que o país se tornou um dos maiores
produtores mundiais, com uma tecnologia de produção bem estabelecida, grande capacidade
industrial, com plantas instaladas em todo o país e devido ao fato de o etanol ser obtido de um
recurso renovável (Faccio, 2004).
Apesar de o etanol ser menos reativo do que o metanol, ele tem a vantagem de ser
menos tóxico e de evitar a adição de solvente orgânico em reações enzimáticas, o que
viabiliza o processo de obtenção de biodiesel com redução de custos com solventes e com
consumo de energia (Urioste, 2004). Além disso, ao se usar o etanol de origem vegetal, a
emissão de dióxido de carbono decorrente da combustão do biodiesel é reabsorvida na íntegra
pela fotossíntese, durante o crescimento das próximas safras das biomassas das quais se
produz o álcool e o óleo, ou seja, o etanol é mais ambientalmente correto do que o metanol
(Akoh et al., 2007).
Apesar dos altos rendimentos conseguidos em um curto espaço de tempo quando se
realiza uma transesterificação química, o alto gasto energético com as elevadas temperaturas e
as dificuldades de recuperação do catalisador e dos subprodutos são as principais
desvantagens da rota química convencional (Lu et al., 2007; Shimada et al., 1999).
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
30
De acordo com a Figura 2.2, para que a reação de transesterificação ocorra
estequiometricamente, são necessários 3 moles de álcool para cada mol de triglicerídeo. O
rendimento dessa reação depende de diversos fatores, tais como:
• A razão molar entre o óleo e o álcool, pois como a reação de transesterificação é
reversível, geralmente ela é feita com excesso de álcool para favorecer a formação dos
ésteres alquílicos (Ma et al., 1999; Marchetti et al., 2007; Saad, 2005; Urioste, 2004).
Na catálise enzimática, no entanto, alguns autores alcançaram boas conversões na
proporção estequiométrica, uma vez que o excesso de álcool pode provocar a
inativação da enzima (Kose et al., 2002, Oliveira et al., 2004; Samukawa et al., 2000);
• A temperatura também é outro fator importante que varia em função dos tipos de óleo
e do catalisador. A metanólise alcalina, por exemplo, ocorre entre 20-35
o
C (Urioste,
2004). Em relação a catálise enzimática, dependendo da fonte da enzima e do suporte
na qual ela foi imobilizada, temperaturas elevadas podem desnatura-la.
• O tipo de catalisador. Os catalisadores possíveis são os ácidos (H
2
SO
4
, HCl, H
3
PO
4
),
as bases (KOH, NaOH) ou as enzimas (lipases). A catálise alcalina é muito mais
rápida do que a ácida, contudo, quando se utilizam óleos residuais com elevado teor de
água e de ácidos graxos livres, a catálise ácida é mais indicada (esterificação) (Ma et
al., 1999; Urioste, 2004);
• A concentração de ácidos graxos livres e de água nos óleos quando a reação é
catalisada por catalisador básico (NaOH). O conteúdo de água e de ácidos graxos
livres nos reagentes deve ser baixo, pois a reação inversa de hidrólise pode ser
favorecida e podem ser formados sabões no processo, o que aumenta a viscosidade
final do produto, dificulta a separação do glicerol e diminui o rendimento em ésteres
(Fukuda et al., 2001; Ma et al., 1999; Marchetti et al., 2007; Urioste, 2004);
Como já mencionado anteriormente, a reação de alcoólise pode ser conduzida por
vários tipos de catalisadores e, dependendo do catalisador escolhido, há vantagens e
desvantagens, e no que se refere ao uso de óleos residuais de elevada acidez livre,
catalisadores alcalinos não são indicados, pois esses ácidos neutralizam a ação catalítica e
favorecem a formação de sabão, diminuindo o rendimento da reação. Esse comportamento
dos catalisadores alcalinos frente a matérias-primas ácidas é confirmado no trabalho de Malta
et al. (2007). Segundo os resultados apresentados por esse autor, em nenhum momento o
produto da reação, éster etílico, foi obtido quando da utilização de hidróxido de sódio, pois a
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
31
base, em todas as concentrações testadas, foi consumida na sua totalidade pelo excesso de
acidez. Entretanto, ao se utilizar lipases como catalisadores, obtiveram-se níveis de conversão
de até 82%.
A produção de biodiesel por biotransformação, ou catálise enzimática, tem sido alvo
de muitos estudos nos últimos anos pela possibilidade concreta de recuperação e reutilização
do catalisador ao usar enzima imobilizada, por permitir a recuperação simples do glicerol, por
eliminar os problemas de índice de acidez com a total conversão dos ácidos graxos livres
presentes no glicerídeo (eliminando a etapa de pré-tratamento numa catálise convencional),
pelo uso de condições brandas no processo e pela tendência de obtenção de elevados
rendimentos em meios constituídos de óleo e álcool em proporções estequiométricas,
comportamento este não observado na rota química (Akoh et al., 2007; Marchetti et al., 2007;
Vieira et al., 2006; Silva et al., 2004). Entretanto, o custo de produção desse catalisador é
significativamente maior do que um catalisador químico (Felizardo et al., 2006). A Tabela 2.3
mostra uma comparação entre a catálise química a catálise enzimática.
Tabela 2.3: Comparação entre a catálise química e a catálise enzimática para produção de biodiesel
Catálise Química Catálise Enzimática
Temperatura de reação (
o
C)
60 - 70 30 – 40
Ácidos graxos livres no óleo
não refinado
Produtos saponificados Ésteres
Água na matéria-prima
Interferência na reação Interferência na reação
Rendimento em ésteres
alquílicos
Alto Alto
Recuperação do glicerol
Difícil Fácil
Purificação de ésteres
Lavagens consecutivas Nenhuma
Reutilização do catalisador Nenhuma (quando catálise
homogênea)
Fácil (quando
imobilizado)
Fonte: URIOSTE, D. 2004.
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
32
2.4. Catálise Enzimática
Catálise enzimática ou biotransformação refere-se a modificações específicas ou
interconversões na estrutura química de uma substância, realizadas por enzimas presentes nas
células ou na forma isolada (Dalla-Vecchia et al., 2004).
A aplicação de biocatalisadores na indústria é objeto de muitas investigações, devido à
alta atividade catalítica em comparação com os catalisadores convencionais, a sua alta
especificidade e ao fato de atuarem com alta eficiência em condições reacionais bastante
suaves (Dalla-Vecchia et al., 2004).
O interesse industrial por tecnologias enzimáticas vem aumentando gradativamente,
principalmente, nas áreas de engenharia de proteínas e enzimologia em meios não
convencionais, as quais ampliaram consideravelmente o potencial de aplicação das enzimas
como catalisadores em processos industriais. Entre os processos de maior interesse estão as
reações de hidrólise, síntese e transesterificação de lipídeos por meio das lipases. As razões do
enorme potencial biotecnológico dessa enzima incluem fatos relacionados com: i) sua alta
estabilidade em solventes orgânicos; ii) não requerem a presença de co-fatores; iii) possuem
uma larga especificidade pelo substrato e, iv) exibem uma alta enantiosseletividade (Carvalho
et al., 2003; Castro et al., 2004).
Embora, atualmente, as aplicações industriais de lipases estejam concentradas nas
indústrias de detergentes, novas aplicações vêm se estabelecendo nos mais diversos campos,
tais como indústria farmacêutica, química fina, cosméticos, oleoquímica, couros, polpa de
celulose e papel, tratamento de resíduos industriais e mais recentemente na produção de
combustiveis. Alguns autores já afirmam que no futuro as lípases serão os catalisadores
escolhidos para produção de biodiesel (Akoh et al., 2007). As lipases vêm, deste modo,
conquistando uma faixa crescente do mercado de enzimas industriais (Castro et al., 2004).
No que se refere à produção de combustíveis, um biocombustível pode ser obtido a
partir de óleos e gorduras através de modificações químicas dos ácidos graxos (hidrogenação),
pela reversão da ligação éster (hidrólise) e reorganização dos ácidos graxos na cadeia
principal do triglicerídeo (transesterificação) (Castro et al., 2004).
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
33
Sem levar em consideração os outros processos existentes, como hidrogenação e
fracionamento, pode-se afirmar que as limitações para obtenção desses produtos estão
associadas aos tipos de catalisadores químicos empregados, que são pouco versáteis e
requerem altas temperaturas para atingir razoável velocidade de reação. Além disso,
possuindo baixa especificidade, geralmente fornecem produtos de composição química mista
ou contaminada, que requerem uma etapa posterior de purificação, aumentando os custos de
produção (Castro et al., 2004).
Nesse sentido, o enfoque biotecnológico apresenta-se com uma alternativa promissora
que atende aos apelos atuais da Química Verde, reduzindo o impacto ambiental pela
minimização dos resíduos gerados nos processos químicos convencionais, fornecendo
maiores rendimentos, obtendo produtos biodegradáveis com menor consumo de energia
(Castro et al., 2004; Silva et al., 2004).
Os óleos e gorduras são matérias-primas versáteis para aplicação da biotransformação,
sendo inúmeros os processos implementados em escala comercial. A escolha do tipo de
biocatalisador é efetuada entre os microrganismos vivos íntegros ou outros materiais
biológicos como RNA, anticorpos ou enzimas isoladas ou contidas em células. O uso de
enzimas isoladas é preferível, quando existem limitações com relação a permeabilidade do
substrato na membrana da célula, ou quando ocorrem reações secundárias indesejáveis
(Castro et al., 2004).
2.4.1. Lipase
As enzimas são substâncias biodegradáveis, que tornam os processos de produção
industrial mais eficientes e, geralmente, menos dispendiosos, proporcionado obtenção de
produtos de qualidade superior. Elas são catalisadores biológicos, desde a síntese de
intricados compostos até a quebra de complexas moléculas. Como catalisadores, elas
permanecem intactas ao final da reação, quando imobilizadas e quando não são desnaturadas
por algum fator. As enzimas são altamente específicas (o que evita reações paralelas
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
34
indesejáveis) e, sendo proteínas, são 100% biodegradáveis, o que as torna ambientalmente
inofensivas.
No início da utilização de enzimas em processos industriais, elas tinham pouca
utilidade porque se acreditava que somente o meio aquoso era propício para manter a
conformação estrutural cataliticamente ativa. Entretanto, sabe-se atualmente que muitas
enzimas (ou complexos enzimáticos) são cataliticamente ativas em ambientes hidrofóbicos,
com eficiência similar àquela encontrada em soluções aquosas, ou em certos casos até
superior. Acredita-se que as enzimas sejam cataliticamente ativas em meio orgânico porque
permanecem na sua forma original, e não se desdobram em meio não-aquoso. Apesar disso, as
enzimas necessitam de uma pequena quantidade de água para reter sua conformação
tridimensional ativa, mesmo quando estão ligadas covalentemente a um suporte. A água
contribui para integridade estrutural, polaridade do sítio ativo e estabilidade da proteína e
pode limitar a solubilidade de substratos hidrofóbicos em torno da enzima.
Atualmente, mais de 3000 diferentes enzimas tem sido identificada e muitas isoladas
em sua forma pura. Várias tem sido obtidas na forma cristalina e a seqüência de aminoácidos,
bem como a estrutura tridimensional determinadas através de cristalografia de raios-X e
RMN-2D (Dalla-Vecchia et al., 2004).
A nomenclatura das enzimas é feita baseada no substrato sobre o qual atuam,
acrescentando o sufixo ase. Por exemplo, as lipases são enzimas que atuam sobre os lipídeos.
A União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB) divide as enzimas em
seis grandes classes (Tabela 2.4), e cada uma em subclasses de acordo com o tipo de reação
que as mesmas catalisam (Saad, 2005).
De acordo com a Tabela 2.4, as lipases (triglicerol acil-hidrolases, EC 3.1.1.3) são
classificadas como hidrolases e atuam sobre a ligação éster presentes em acilgliceróis,
liberando ácidos graxos e glicerol, constituindo uma classe especial de estereases. A
diferenciação entre uma lipase e uma esterease (EC. 3.1.1.1) está no fato de que a primeira
catalisa reações de substratos insolúveis em água, enquanto que uma esterease age em
substratos solúveis (Cruz Junior et al., 2007; Linko et al., 1998).
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
35
Tabela 2.4 - Classificação das enzimas de acordo com a IUBMB
Número Classe Tipo de reação catalisada Subclasse
1 Oxidoredutases Reações de oxidação e redução de
ligações do tipo C-H, C-C, e C=C
Hidrogenases, oxidases,
peroxidases, etc.
2 Transferases Transferência de grupos aldeídico,
cetônico, acila, fosforila ou metila
Transaldolases,
transcetolases, etc
3 Hidrolases Hidrólise de ésteres, amidas, lactonas,
lactamas, epóxidos, nitrilas, anidridos
e glicosídeos
Esterases, lipases,
peptidases, fosfatases,
etc.
4 Liases Adição-eliminação de grupos a dupla
ligação ou formação de duplas
ligações por remoção de grupos
Descarboxilases,
cetoácidoliases,
hidroliases.
5 Isomerases Transferência de grupos dentro da
molécula para produzir isômeros
Racemases, epimerases,
etc.
6 Ligases Formação e clivagem de ligações C-C,
C-S, C-O e C-N e ésteres de fosfato
Sintetases
Fonte: SAAD, E.B. 2005.
Entretanto, a diferenciação entre lipases e estereases ainda não está completamente
definida. Em 1958, Sarda e Desnuelle propuseram definir as lipases a partir de sua
característica cinética, que é a propriedade de ativação na presença de substratos insolúveis
em água e emulsionados, ou seja, na presença de uma interface lipídeo/água. Segundo estes
autores, as lipases seriam ativadas na presença de ésteres emulsionados, enquanto as
estereases não apresentariam esta ativação, exercendo sua função hidrolítica sobre substratos
solúveis em água (Dalla-Vecchia et al., 2004).
As lipases são comumente encontradas na natureza em tecidos animais, vegetais e
microbianos, sendo produzida, preferencialmente, por fermentação usando várias espécies de
microrganismos, tais como os fungos Aspergillus mucor, Rhizopus penicillium, Geotrichum
sp, por leveduras de Tulopis sp e Candida sp e bactérias como Pseudomonas sp,
Achromobacter sp e Staphylococcus sp. Em função do baixo rendimento do processo
fermentativo, as lipases microbianas tinham também um custo bem mais elevado quando
comparado com outras hidrolases, como proteases e carboxilases. Entretanto, os recentes
avanços registrados na tecnologia do DNA têm permitido aos fabricantes de enzimas
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
36
colocarem no mercado lipases microbianas com atividade bem elevada, a um custo bem mais
acessível. Atualmente, lipases microbianas são produzidas por diversas indústrias, como
Novozymes, Amano, Gist Brocades, entre outras. Uma publicação recente sobre a
disponibilidade comercial de lipases listou enzimas de 34 diferentes fontes, incluindo 18 a
partir de fungos e 7 de bactérias (Castro et al., 2004; Dalla-Vecchia et al., 2004).
O sítio catalítico é formado pela tríade catalítica Ser-His-Asp/Glu, que se repete em
todas as estruturas e é frequentemente protegido na molécula por uma “tampa” hidrofóbica ou
“lid” que ao interagir com a interface lipídeo/água sofre uma mudança conformacional,
expondo o sítio ativo. A presença da tampa “tampa” na estrutura da enzima e a propriedade de
ativação interfacial passaram a ser fatores determinantes para a caracterização das lipases.
Estudos de raio-X realizados por Uppenberg et al.(1994) com lipase de Cândida antarctica
revelou a existência de uma “tampa” similar recobrindo a tríade catalítica Ser-His-Asp (Petkar
et al., 2006; Uppenberg et al., 1994).
Mais recentemente, entretanto, observou-se que a presença da “tampa” não está
necessariamente correlacionada com a ativação interfacial, sendo que as lipases de
Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia glumae e Cândida antarctica B, que apresentam
“tampa” em suas estruturas, não sofrem ativação interfacial. Por outro lado, as cutinases,
enzimas consideradas lípases “verdadeiras”, não apresentam a “tampa” e não precisam da
interface para exercer a atividade hidrolítica (Dalla-Vecchia et al., 2004). Esta observação
sugere que a presença de uma tampa dominante e a ativação interfacial não são critérios
adequados para classificar uma enzima como lipase. Portanto, a definição atual é bastante
simples: uma lipase é uma carboxiesterase que catalisa a hidrólise de acilglicerol de cadeia
longa (Castro et al., 2004).
As lipases são muito utilizadas em síntese orgânica devido a sua grande
disponibilidade e baixo custo. Além disso não requerem cofatores, atuam em uma faixa de pH
relativamente grande, são muito estáveis nesse meio, apresentam especificidade,
regiosseletividade, quimiosseletividade e enatiosseletividade. Possuem habilidade de catalisar
reações de esterificações, interesterificações, aminólise e tiotransesterificação (Dalla-Vecchia
et al., 2004; Tinge et al., 2006).
As reações lipolíticas ocorrem na interface água-lipídeo podendo, em alguns casos,
impedir que as cinéticas das reações enzimáticas sejam descritas pelas equações de Michaelis-
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
37
Menten, que só são válidas se a reação catalítica ocorrer em fase homogênea. A técnica de
camada única tem sido usada extensivamente e, mais recentemente, a tecnologia gota-óleo foi
proposta para estabelecimento da cinética da lipase, que é monitorada pela análise automática
do perfil de uma gota de óleo suspensa em água; a redução na tensão superficial entre óleo e
água causada pela hidrólise da lipase é medida em função do tempo (Castro et al., 2004).
O estudo cinético da reação de alcoólise de óleos vegetais catalisada por lípase ainda é
limitado na literatura, mas os resultados desses estudos são importantes para o projeto de
reatores adequados e eficientes e para o controle e otimização do processo e dos efeitos das
mudanças nas condições operacionais. A maioria dos estudos cinéticos constantes na
literatura propõe um modelo Ping-Pong bi-bi com inibição competitiva pelo álcool
(considerando álcoois de cadeia curta) (Al-Zuhair et al., 2006).
CHULALAKSANANUKUL et al. (1993) estudaram o mecanismo cinético da reação
de esterificação catalisada por lipase de Mucor miehei imobilizada em resina aniônica
(Lipozyme IM) tendo o ácido oléico e etanol como substratos e hexano como solvente. Os
autores propuseram também o mecanismo Ping-Pong bi-bi, com inibição por excesso de
etanol (Faccio, 2004).
2.4.2. Enzimas Imobilizadas
Em reações químicas e bioquímicas, o uso de enzimas puras pode ser dispendioso e
seu descarte após o uso é economicamente inviável. Além disso, as enzimas estão sujeitas a
inativação por fatores químicos, físicos ou biológicos, podendo ocorrer quando estocadas ou
durante o uso. Para que a catálise seja eficiente em um determinado processo, há necessidade
de protegê-la da interação com o solvente, meio no qual são realizadas algumas reações, pois
o mesmo poderia provocar a inativação, impossibilitando a catálise da reação. Frente a este
problema, novas técnicas de imobilização têm sido desenvolvidas para fornecer a estabilidade
das enzimas e facilitar sua recuperação e reutilização (Cruz Junior et al., 2007).
O principal interesse em imobilizar uma enzima é obter um biocatalisador com
atividade e estabilidade que não sejam afetadas durante o processo, em comparação com sua
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
38
forma livre. Idealmente, a enzima imobilizada deverá exibir uma atividade catalítica superior.
Além disso, não devem ocorrer alterações estruturais, bem como modificações no sítio ativo.
A imobilização pode inibir ou aumentar a atividade e estabilidade da enzima, porém não
existe uma regra que prediga a manutenção destes parâmetros após o processo de
imobilização (Dalla-Vecchia et al., 2004).
A imobilização pode ocorrer através da adsorção ou ligação da enzima em um material
insolúvel, pelo uso de uma reagente multifuncional através de ligações cruzadas,
confinamento em matrizes formadas por géis poliméricos ou encapsulação através de uma
membrana polimérica (Dalla-Vecchia et al., 2004).
Para ser efetivo na imobilização, o suporte deve deixar a enzima acessível aos
substratos, manter sua atividade por um longo período e permitir que o sistema
(suporte/enzima) seja regenerado ao final do processo, sem que ocorram perdas na atividade
enzimática (Dalla-Vecchia et al., 2004).
Uma outra vantagem de se imobilizar enzimas é a possibilidade de reutilizá-la ao final
do processo, o que, em termos de produção de biodiesel, é interessante porque pode reduzir os
custos da produção com aquisição da enzima, uma vez que ela pode ser recuperada e
reutilizada e pode ser imobilizada em suportes baratos como a quitosana, por exemplo (Salis
et al., 2005).
2.5. Considerações Finais
De acordo com a literatura, a biotransformação enzimática de óleo vegetal residual,
objeto de interesse dessa dissertação, apresenta, além de todas as vantagens já mencionadas
anteriormente, o diferencial da matéria-prima não necessitar de um pré-tratamento, que
consiste em utilizar primeiro um catalisador ácido para converter os ácidos graxos livres em
seus respectivos ésteres e diminuir o nível desses ácidos no óleo, e depois realizar uma
transesterificação alcalina (Kulkarni et al., 2006).
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
39
Embora os processos de alcoólise enzimática para obtenção de biodiesel ainda não
sejam comercialmente desenvolvidos, novos resultados têm sido reportados em artigos e
patentes. O aspecto comum desses estudos consiste na otimização das condições de reação
(solvente, temperatura, pH, enzima, entre outros), a fim de estabelecer as características para
aplicações industriais. Contudo, tanto o rendimento, como o tempo de reação e o custo do
biocatalisador ainda são desfavoráveis se comparados com o sistema de reação por catálise
básica (Castro et al., 2004).
Por tudo o que foi exposto nessa revisão bibliográfica, o presente trabalho visa estudar
a produção enzimática de biodiesel a partir de óleo residual e etanol, verificando a influência
das variáveis de processo e a cinética de reação, buscando a otimização e a redução de custos
na obtenção de um produto de alto valor agregado.
Capítulo 3 – Materiais e Métodos Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
40
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Este capítulo mostra os reagentes e o procedimento experimental empregado no estudo
da alcoólise enzimática do ácido oléico e do óleo vegetal residual, bem como a metodologia
de caracterização da matéria-prima e de análise das amostras de ésteres etílicos (Biodiesel).
3.1. Substratos e Catalisador
Como o objetivo deste trabalho foi a obtenção de um biocombustível proveniente de
uma matéria-prima residual e, como geralmente esses resíduos possuem um elevado índice de
acidez livre, estudou-se primeiramente a influência das variáveis de processo da etanólise
enzimática do ácido oléico, e para confirmar a viabilidade do uso de lipases nesse tipo de
reação, realizaram-se alguns experimentos com dois óleos residuais de diferentes índices de
acidez.
Portanto, três tipos de material lipídico foram utilizados para a reação de alcoólise
enzimática visando à obtenção de ésteres etílicos. São eles: ácido oléico comercial para
síntese (VETEC), óleo de coco residual resultante do processo de destilação do óleo da
empresa DUCÔCO e óleo de algodão residual resultante do processo de fritura de castanhas
da empresa IRACEMA. Álcool etílico comercial (VETEC, 99,8% de pureza) também foi
utilizado como substrato em todos os experimentos.
Como catalisador, utilizou-se uma lipase comercial imobilizada de Candida antarctica
tipo B (Novozym 435), gentilmente cedida pela Novozyme do Brasil (Araucária – PR), cuja
atividade hidrolítica era de 491,98 U/g. Também usou-se como catalisador um derivado
produzido pelo Grupo de Pesquisa e Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos
(GPBIO) do Departamento de Engenharia Química da Universidade Federal do Ceará. Esse
derivado consiste em uma lipase de Candida antarctica tipo B (CALB) imobilizada em
quitosana, ativada com glicidol, etilenodiamina e glutaraldeído, cujo excesso de umidade foi
retirado por secagem com hexano na presença 3% de acido butírico. As condições de
Capítulo 3 – Materiais e Métodos Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
41
imobilização, ativação e secagem desse derivado foram as condições otimizadas por Silva (
2007). Foram imobilizadas 6 mg de proteína / g de suporte, apresentando uma atividade
hidrolitica de 369,36 U/g.
3.2.Determinação da Atividade Hidrolítica das Enzimas Imobilizadas
A determinação da atividade hidrolítica da enzima foi descrita por Silva (2007).
Segundo o autor, a atividade lipásica pode ser quantificada pela hidrólise do
paranitrofenilbutirato (pNPB) em 2-propanol a 25 ºC com adição de 0,01g de lipase. Para esta
reação, um volume de 29mL de tampão fosfato de sódio 100 mM, pH 8,0, foi adicionado a
1,0 mL de solução de pNPB 15 mM em 2-propanol num reator encamisado, provido de
agitação, sendo a reação iniciada pela adição da enzima. A variação da absorbância a um
comprimento de onda de 410 nm foi monitorado por 7,5 minutos, retirando-se, para isso,
aproximadamente 2 mL do sobrenadante a cada 1,5 minutos sendo lido imediatamente no
espectrofotômetro. Uma unidade de atividade (U) foi definida como a quantidade de enzima
necessária para hidrolisar 1 mmol de pNPB por minuto, e as atividades foram expressas em
U/g.
3.3.Caracterização Físico-Química da Matéria-Prima e do Biodiesel
Os ésteres obtidos a partir da alcoólise de uma matéria-prima lipídica só podem ser
considerados como biodiesel se atenderem a algumas exigências, ou seja, se estiverem dentro
das especificações regulamentadas pela Agência Nacional de Petróleo (ANP). Para verificar
se o produto obtido estava dentro dessas especificações, foram empregadas várias
metodologias analíticas descritas pela American Oil Chemists Society (A.O.C.S.) e pela
American Society for Testing and Materials (ASTM). A seguir, descrevem-se as análises
realizadas na caracterização da matéria-prima e dos ésteres etílicos obtidos por síntese
enzimática.
Capítulo 3 – Materiais e Métodos Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
42
3.3.1. Índice de Acidez
O índice de acidez revela o estado de conservação do óleo e corresponde ao número de
miligramas de hidróxido de potássio (KOH) necessário para neutralizar os ácidos graxos
livres de um grama de gordura (em mg KOH/g). A decomposição dos glicerídeos é acelerada
por aquecimento e pela luz, e a rancidez é quase sempre acompanhada pela formação de ácido
graxo livre. Óleos com elevada acidez livre são impróprios para o consumo humano e para
sua utilização como combustível, uma vez que a acidez livre tem ação corrosiva sobre os
componentes metálicos do motor. (Dantas, 2006)
Os métodos de análise do índice de acidez e da porcentagem de ácidos graxos livres
empregados nessa dissertação foram os métodos Cd 3d-63 e Ca 5a-40, respectivamente, que
são descritos pela American Oil Chemists Society (A.O.C.S.).
Para o cálculo do índice de acidez, inicialmente neutralizou-se o solvente (álcool
etílico comercial) com uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) 0,25 N, utilizando uma
solução de fenolftaleína 1% em álcool como indicador. Em seguida, mediu-se cerca de 1 g da
amostra a ser analisada em um erlenmeyer de 250 mL, adicionaram-se 50 mL de etanol
neutralizado e 2 ou 3 gotas de fenolftaleína, titulando em seguida com a solução de NaOH
0,25 N, até que uma coloração levemente rósea persistisse por 15 segundos. Para amostras
cujo índice de acidez era muito baixo, utilizou-se uma solução de NaOH 0,1 N.
Feito esse procedimento e anotado a massa da amostra analisada e o volume de NaOH
gasto na titulação, fizeram-se os cálculos de acordo com as Equações 3.1 e 3.2.
M
NFV
gmgKOHIA
11,56
)/(
×××
=
(3.1)
M
NFV
AG
2,28
(%)
×××
=
(3.2)
Capítulo 3 – Materiais e Métodos Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
43
onde
I
A é o índice de acidez; V é o volume gasto de NaOH na titulação; F é o fator da
solução de NaOH (sempre próximo de 1);
N é a normalidade da solução de NaOH (mol/L);
M
é a massa da amostra utilizada e
AG
é a porcentagem de ácidos graxos livres, expressa
como ácido oléico, em óleos comuns, brutos e refinados.
3.3.2. Densidade
A densidade relativa a 20
o
C das amostras foi determinada segundo a norma ASTM D-
4052, utilizando-se um densímetro digital da marca Anton Paar, modelo DMA 4500. Após a
calibração do equipamento com água destilada, mediu-se 5 mL de amostra e preencheu-se a
célula do densímetro para fazer a determinação da densidade. A leitura foi realizada
diretamente no visor do equipamento a 20
o
C em g/cm
3
.
3.3.3. Teor de Umidade
A quantidade de água presente nas amostras de substratos e ésteres etílicos foi medida
segundo o método ASTM D-1744, utilizando um titulador Karl-Fischer da marca Metrohm,
modelo 795 KTF Titrino, com capacidade de detectar umidade na ordem de ppm com
precisão de ±0,03%. O procedimento consistiu, primeiramente, em calibrar a solução Karl-
Fischer com água destilada para determinação do fator de solução. Adicionou-se, em seguida,
aproximadamente 1 g da amostra a ser analisada, e após um determinado período de tempo, o
teor de umidade é lido no software Vesuv datalogger 1999.
Capítulo 3 – Materiais e Métodos Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
44
3.3.4. Índice de Iodo
O índice de iodo é o número de miligramas de iodo absorvidos por 100 g de gordura e
reflete o grau de insaturação da amostra analisada. Os resultados obtidos por esse método
dependem de fatores tais como: tempo de contato, solução utilizada na determinação e o
excesso de iodo presente na solução (Lucena, 2008).
Para análise das amostras constantes nessa dissertação, utilizou-se o método Cd 1-25
sugerido pela American Oil Chemists Society (A.O.C.S.). O procedimento consistiu em pesar
de 0,2 g a 1,0 g da amostra em erlenmeyers de 250 mL de boca esmerilhada, adicionando-se
em seguida 15 mL de tetracloreto de carbono e 25 mL de solução de Wijs (solução comercial
de iodo em ácido acético glacial e tetracloreto de carbono). Deixou-se essa mistura reagir ao
abrigo da luz e a temperatura ambiente por 1 hora. Decorrido esse período de tempo,
adicionaram-se 20 mL de solução de iodeto de potássio e 150 mL de água destilada, titulando-
se em seguida com solução de tiossulfato de sódio 0,1 N até o aparecimento de uma coloração
levemente amarela, quando então adicionaram-se 2 mL de solução indicadora de amido e
continuou-se a titulação com tiossulfato de sódio até o desaparecimento da coloração azul.
Para o cálculo do índice de iodo, utilizou-se a Equação 3.3:
M
FVV
II
TB
××−
=
27,1)(
(3.3)
sendo
T
V o volume gasto na titulação com tiossulfato de sódio 0,1 N;
B
V é o volume gasto na
titulação do branco;
F é o fator da solução de tiossulfato de sódio e
M
é a massa da amostra
em gramas.
Capítulo 3 – Materiais e Métodos Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
45
3.3.5. Glicerina Livre, Combinada e Total
A glicerina, ou glicerol, é um subproduto resultante da reação de alcoólise de
triglicerídeos. É feita uma distinção de dois tipos de glicerina: a glicerina livre e a glicerina
combinada. A glicerina livre é o glicerol propriamente dito, um triálcool resultante da quebra
da molécula de triglicerídeo e da combinação com o álcool transesterificante. A glicerina
combinada, por sua vez, pode-se dizer que é o próprio triglicerídeo, ou seja, no óleo, antes da
reação, há 100% de glicerina combinada e 0% de glicerina livre, pois se tem somente
triglicerídeo e não se tem nada de glicerol. A medida que a reação prossegue e a molécula de
triglicéris vai sendo quebrada, formando os ésteres lineares e o glicerol, a quantidade de
glicerina combinada (triglicerídeo) diminui e a quantidade de glicerina livre (glicerol)
aumenta. Portanto, a conversão da reação é medida em termos da diminuição da glicerina
combinada ou da formação de glicerol.
A determinação da glicerina nas amostras de óleo e biodiesel seguiu o método do
periodato de sódio de acordo com as normas NTB A-0104 e NTB A-0204, descritas por
Menzel (2004). Esse método também tem sido utilizado por outros autores (Oliveira
et al.,
2004). Durante o processo de análise, a amostra contendo glicerina (livre e/ou combinada) foi
saponificada, liberando glicerina da sua forma de éster. Em seguida a glicerina foi separada da
parte graxa, por extração com água acidulada. A glicerina foi dosada na parte aquosa ácida.
Quando a amostra saponificada foi a amostra bruta, a glicerina dosada é a glicerina total.
O procedimento consistiu em medir cerca de 3 g da amostra (óleo e/ou biodiesel)
diretamente num funil de separação tarado e seco. Adicionaram-se, em seguida, 20 mL de
água destilada e 0,5 mL de ácido sulfúrico (H
2
SO
4
) 1:4 v/v, agitando-se manual e
vigorosamente. Feito isso, esperou-se a separação de fases, recolhendo a fase aquosa inferior
em um erlenemeyer de 250 mL para dosagem da glicerina livre. Pesou-se essa fase e à metade
dela adicionaram-se 50 mL de solução de periodato de sódio 5,5 g/L, 4 g de bicarbonato de
sódio e 1 a 2 g de iodeto de potássio, titulando-se em seguida com solução de arsenito de
sódio 0,1 N até o desaparecimento da coloração amarela. A porcentagem de glicerina livre foi
calculada segundo a Equação 3.4.
Capítulo 3 – Materiais e Métodos Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
46
A fase superior, para análise da glicerina combinada, foi transferida para um balão de
fundo chato com o auxilio de 20 mL de água destilada e 5 mL de álcool etílico. Ao balão foi
adicionado 3 mL de hidróxido de sódio 50% e essa mistura foi levada para aquecimento sob
refluxo, até que a coloração ficasse translúcida. Esfriou-se o balão e o seu conteúdo foi
transferido para um balão volumétrico de 250 mL completando o volume com água. Do
conteúdo do balão, transferiu-se uma alíquota de 50 mL para um funil de separação de 250
mL, adicionando-se em seguida 10 mL de tolueno p.a., duas gotas de indicador de azul de
bromofenol 0,1 % e 2 mL de ácido sulfúrico 1:4 v/v, agitando até que a coloração mudasse de
azul para amarelo. Deixou-se separar as camadas, recolhendo a fase aquosa inferior em um
erlenmeyer de 250 mL e adicionaram-se 50mL de solução de periodado de sódio 5,5 g/L, 4 g
de bicarbonato de sódio e 1 a 2 g de iodeto de potássio, titulando-se em seguida com solução
de arsenito de sódio 0,1 N até a mudança da coloração azul para amarela. As porcentagens de
glicerina combinada e total foram calculadas segundo as Equações 3.5 e 3.6, respectivamente.
alíquota
totalb
Mm
MTVV
GL
×
×××−
=
1,0)(
(%)
1
(3.4)
Am
TVV
GC
b
×
××−
=
25)(
(%)
2
(3.5)
Am
TVV
GT
b
×
××−
=
25)(
(%)
3
(3.6)
sendo
GL porcentagem de glicerina livre; GC é a porcentagem de glicerina combinada; GT
é a porcentagem de glicerina total; m é a massa da amostra de óleo e/ou biodiesel;
b
V é o
volume do branco;
1
V
,
2
V
e
3
V são os volumes gastos nas titulações;
T
é o título da solução
de arsenito;
total
M é a massa total da fase aquosa utilizada na análise da glicerina livre;
alíquota
M é a metade da massa total e A corresponde aos 50 mL transferidos do balão
volumétrico para o funil de separação na dosagem da glicerina combinada e total.
Capítulo 3 – Materiais e Métodos Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
47
3.4. Caracterização Cromatográfica da Matéria-Prima
A composição química em ácidos graxos do ácido oléico e dos óleos vegetais
residuais foi determinada fazendo-se a transesterificação da matéria-prima com metanol, e
identificando-se quali-quatitativamente, por cromatografia gasosa, os ésteres metílicos
purificados resultantes do processo.
O equipamento utilizado foi um cromatógrafo a gás da marca Thermo Focus GC
acoplado a um espectômetro de massa, com uma coluna adsorvedora Column Capillary RTX-
5MS. As dimensões da coluna eram 15 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e
0,25 µm de espessura do filme líquido. O fluxo da coluna foi de 0,5 mL/min, a temperatura do
detector foi de 200
o
C, a temperatura do injetor foi de 250
o
C e a temperatura do forno iniciou
em 50
o
C, mantendo-se nessa temperatura por 2 minutos quando passou a aumentar 4
o
C/min
até atingir 250
o
C. O gás de arraste foi gás hélio e o volume de amostra injetado foi de 1 µL.
Para realização da reação de transesterificação dos substratos, adotou-se o
procedimento descrito por Silva (2005), com algumas modificações. Mediu-se 1 g de ácido
oléico/óleo vegetal em um balão de fundo chato. Adicionaram-se 25 mL do reagente de
saponificação, agitou-se vigorosamente e colocou-se para aquecer, sob refluxo, por 30
minutos. Depois esfriou-se o balão e adicionaram-se 25 mL do reagente de esterificação,
agitando-se vigorosamente e colocado-se para aquecer, sob refluxo, por mais 30 minutos.
Passado esse tempo, esfriou-se o balão e transferiu-se o seu conteúdo para um funil de
separação com o auxílio de 25 mL de éter de petróleo. Observou-se a formação de 3 fases.
Descartaram-se as duas fases inferiores e à fase superior adicionaram-se 20 mL de solução
saturada de cloreto de sódio. Dessa vez observou-se a formação de duas fases. Descartou-se a
fase inferior e transferiu-se a fase superior (ésteres etílicos) para um becker com sulfato de
sódio (para retirada de resquícios de água). Filtrou-se o sulfato de sódio, recolhendo a solução
em outro becker. Deixou-se evaporar, a temperatura ambiente, de um dia para o outro, e só
então a solução resultante foi injetada no cromatógrafo.
Capítulo 3 – Materiais e Métodos Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
48
Reagentes:
• Reagente de saponificação – solução de KOH 0,5 mol/L em etanol anidro;
• Reagente de esterificação – 3,30 g de NH
4
Cl + 100 mL de etanol anidro + 3 mL de
H
2
SO
4
concentrado;
• Solução salina – solução aquosa de NaCl 30%;
• Éter de petróleo
Após obtido os percentuais de ácidos graxos presentes nas amostras, a massa molar
média do ácido oléico e dos óleos vegetais foi calculado de acordo com as Equações 3.7 e 3.8,
respectivamente.
×
=
∑
100
)(
AGiAGi
ácido
WPM
PMM
(3.7)
×
×=
∑
100
)(
3
AGiAGi
óleo
WPM
PMM
(3.8)
sendo
ácido
PMM a massa molar média do ácido oléico;
óleo
PMM é a massa molar média do
óleo vegetal;
AGi
PM é a massa molar do ácido graxo e
AGi
W é a porcentagem de ácido graxo
presente na amostra analisada.
Capítulo 3 – Materiais e Métodos Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
49
3.5. Alcoólise Enzimática do Ácido Oléico e dos Óleos Vegetais Residuais Utilizando
Lipase como Catalisador
A matéria-prima lipídica utilizada em todos os experimentos não passou por nenhum
tratamento prévio, apenas por uma simples filtração para retirada de materiais particulados
quando da utilização dos óleos residuais.
Os experimentos foram realizados em erlenmeyers de 250 mL fechados com tampa de
vidro. A quantidade de ácido/óleo foi mantida fixa em 10 g em todos os experimentos, bem
como a quantidade de lipase foi fixada em 5% p/p, baseada na massa de ácido/óleo medida.
As quantidades de etanol foram pré-estabelecidas pelo planejamento de experimentos. O
intervalo de estudo das variáveis procurou abranger a maioria dos estudos constantes na
literatura referentes a reação de alcoólise enzimática de óleos vegetais.
Depois de calculada as quantidades de álcool, os erlenmeyers, contendo os substratos
e o catalisador, foram colocados em um agitador rotativo, com controle digital de temperatura
e agitação (incubadora TE - 420), à 200 rpm.
Decorrido o tempo de reação, também definido por um planejamento experimental
fatorial, as amostras foram filtradas (para recuperação e posterior reutilização da enzima) e
colocadas em um funil de separação para separação das fases (decantação da água quando da
utilização do ácido oléico e do óleo de coco e decantação da glicerina quando da utilização do
óleo de algodão). A fase superior, rica em ésteres etílicos, foi separada e analisada. Na Figura
3.1 está representado o fluxograma do procedimento experimental.
Capítulo 3 – Materiais e Métodos Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
50
Figura 3.1 – Fluxograma do procedimento experimental para a reação de alcoólise enzimática do ácido oléico e
do óleo vegetal residual
As variáveis escolhidas para serem estudadas variaram de acordo com a matéria-prima
de partida. Quando da utilização do ácido oléico, estudou-se a influência da razão molar
ácido:álcool, da temperatura do sistema reacional e da concentração de água, para um tempo
reacional de 8 horas. Quando a matéria-prima de partida foi o óleo de algodão, as variáveis
escolhidas foram a razão molar óleo:álcool, a temperatura e o tempo reacional, pois como se
trata de uma reação de transesterificação, uma vez que o óleo de algodão apresentou um baixo
índice de acidez, a literatura indica elevados tempos de reação. Para verificar o efeito das
variáveis sobre a conversão da reação, bem como encontrar as condições que maximizassem a
síntese de ésteres, um planejamento experimental fatorial com 2 níveis e 3 variáveis, foi
realizado. As Tabelas 3.1 e 3.2 mostram os intervalos de estudo das variáveis. Esses
intervalos foram definidos de modo a abranger a maioria dos estudos constantes na literatura.
Agitador (200 rpm)
com controle de
temperatura
Filtração
Separação das
fases
Fase superior
(ésteres etílicos)
Determinação da
conversão
Descarte da fase
inferior (mono, di e
triglicerídeos, glicerol,
agua e impurezas)
Ácido / Óleo +
Etanol + Enzima
Capítulo 3 – Materiais e Métodos Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
51
Tabela 3.1 - Valores reais das variáveis independentes para o Planejamento Fatorial 2
3
utilizado para otimizar as
condições da esterificação enzimática do ácido oléico utilizando uma lípase do tipo B de Candida antarctica
comercial como catalisador.
Variável Intervalo de estudo
Razão molar ácido:etanol [R] 1:1-1:6
Temperatura [TR](
o
C) 30-50
Concentração de água [W] (% p/p) 0 - 20
Tabela 3.2 - Valores reais das variáveis independentes para o Planejamento Fatorial 2
3
utilizado para otimizar as
condições da etanólise enzimática do óleo de algodão residual utilizando uma lípase do tipo B de Candida
antarctica comercial como catalisador.
Variável Intervalo de estudo
Razão molar óleo:etanol [R] 1:3-1:9
Temperatura [TR](
o
C) 30-50
Tempo [TO](h) 24-72
Vale ressaltar que os experimentos foram realizados randomicamente e com triplicata
do ponto central. Os dados experimentais foram analisados com o
software Statistica 6.0.
Devido ao elevado índice de acidez do óleo de coco residual, escolheu-se a melhor
condição experimental obtida com o ácido oléico para realizar uma reação com esse óleo e
confirmar a viabilidade do uso de lipases nesse tipo de reação.
Os experimentos realizados com a lípase imobilizada em quitosana também ocorreram
nas melhores condições obtidas tanto na alcoólise do ácido oléico quanto do óleo de coco para
se verificar a potencialidade do uso deste derivado preparado com um suporte de baixo custo.
Capítulo 3 – Materiais e Métodos Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
52
3.6. Cálculo da Conversão em Ésteres Etílicos
Quando a matéria-prima de partida foi o ácido oléico e o óleo residual ácido, a
conversão foi calculada acompanhando a redução do índice de acidez de acordo com a
Equação 3.9. Isso pode ser feito porque à medida que os ésteres vão sendo formados, a
quantidade de ácidos graxos livres diminui e, portanto, o índice de acidez decresce. Segundo
Lucena (2008), essa metodologia consegue prever bem a conversão em ésteres, obtendo-se
valores bem próximos quando comparados aos dados obtidos com a cromatografia gasosa.
100(%)
0
0
×
−
=
IA
IAIA
X
F
(3.9)
sendo
0
IA o índice de acidez do ácido/óleo e
F
IA é o índice de acidez do biodiesel.
Entretanto, quando a matéria-prima de partida foi o óleo de algodão residual, cujo
índice de acidez estava dentro do limite necessário para se realizar uma trensesterificação
alcalina, a conversão foi calculada acompanhando a redução da glicerina combinada pelo
método do periodato de sódio na determinação da glicerina, descrito no item 3.3.5 (Oliveira
et
al
., 2004).
100
R
(%) ×
=
GO
GL
X
(3.10)
sendo
RGL a glicerina liberada durante a reação e GO é a glicerina combinada do óleo antes
da reação.
Capítulo 3 – Materiais e Métodos Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
53
3.7. Recuperação e Regeneração do Biocatalisador
Após a reação, o biocatalisador foi filtrado a vácuo, recolhendo-se o biodiesel num
Kitassato e a lipase retida em um funil de porcelana com papel de filtro. O biocatalisador foi
então lavado três vezes com hexano p.a. e secado a vácuo, sendo reutilizado em seguida para
verificar a perda de atividade na reação de alcoólise do material lipídico.
3.8. Neutralização dos Ésteres Etílicos Obtidos
Depois de obtidos os ésteres etílicos com a catálise enzimática, observou-se que o
índice de acidez não estava dentro do limite estabelecido pela Agência Nacional de Petróleo
(ANP). Na tentativa de deixar a mistura de ésteres dentro da especificação no que se refere ao
índice de acidez, fez-se uma neutralização com uma amostra de glicerina resultante do
processo de transesterificação alcalina. Para tanto, segundo Souza (2008), dividiu-se o índice
de acidez do biodiesel por 50,6 para obter o valor em meq/g. A esse resultado acrescentou-se
15% e o valor final correspondeu a 1 g de biodiesel. Partindo-se da quantidade de biodiesel
que se queria neutralizar, por uma regra de três simples calculou-se a quantidade de biodiesel
a ser neutralizada em meq/g. Em seguida, calculou-se a alcalinidade livre da fase glicerina,
em meq/g, e esse valor corresponde a 1 g de glicerina. Como já se sabe a quantidade de
biodiesel, em meq/g, que se quer neutralizar, por uma regra de três simples calculou-se a
quantidade, em gramas, de glicerina correspondente a quantidade de biodiesel a ser
neutralizada. Misturou-se, então, o biodiesel com a glicerina, deixando sob agitação e
aquecimento até atingir a temperatura 120
o
C, permanecendo nessa temperatura por 30
minutos. Em seguida, colocou-se a mistura para decantação da glicerina, analisando a acidez
da fase superior que corresponde aos ésteres neutralizados.
Para análise da alcalinidade livre da fase glicerina, mediu-se cerca de 2 g da amostra e
misturou-se com 25 mL de álcool etílico neutralizado com hidróxido de sódio 0,25 N,
utilizando uma solução de fenolftaleína 1% em álcool como indicador. Em seguida, titulou-se
Capítulo 3 – Materiais e Métodos Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
54
a mistura com ácido clorídrico 0,1 N e calculou-se a alcalinidade livre de acordo com a
equação a seguir.
()
M
NFVV
gmeqKOHAL
B
××−
=
1
)/(
3.11)
onde AL é a alcalinidade livre;
1
V é o volume gasto de HCl na titulação;
B
V é o volume
gasto com o branco; F é o fator da solução de HCl (sempre próximo de 1);
N é a
normalidade da solução de HCl (mol/L) e
M
é a massa da amostra utilizada.
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
55
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Este capítulo apresenta os resultados obtidos na caracterização e na reação de alcoólise
enzimática dos três substratos descritos no capítulo de materiais e métodos, bem como as
caracterizações dos ésteres etílicos obtidos após a reação. Mostra também as discussões
desses resultados na tentativa de explicá-los.
Para um melhor entendimento, o capítulo foi dividido em 9 tópicos, iniciando pela
caracterização físico-química e cromatográfica da matéria-prima, que objetivou um melhor
conhecimento do material com o qual se trabalhou e um melhor entendimento de alguns
resultados. Depois, mostra-se o resultado da reação de alcoólise enzimática do ácido oléico
utilizando a Novozym 435 como catalisador, analisando a influência da temperatura, da razão
molar entre os substratos e da concentração de água presente no meio. Em seguida, tem-se o
resultado da mesma reação agora utilizando uma lipase do tipo B de Candida antarctica
(CALB) imobilizada em quitosana, para verificar a potencialidade do uso de um derivado
produzido pelo Grupo de Pesquisas em Processos Biotecnológicos (GPBIO) do Departamento
de Engenharia Química da UFC. Como o propósito dessa dissertação é verificar a viabilidade
do uso de lipase na esterificação de óleos residuais, o tópico seguinte mostra o resultado da
etanólise do óleo de coco residual ácido e o estudo de ciclos das duas lipases. Para comparar o
comportamento da lipase em dois meios distintos, o último tópico apresenta o resultado do
planejamento experimental fatorial realizado com um óleo residual de baixa acidez livre. Por
fim, o último tópico desse capítulo mostra a caracterização físico-química dos ésteres etílicos
obtidos.
4.1. Caracterização Físico-Química da Matéria-Prima
A Tabela 4.1 mostra o resultado da caracterização físico-química das matérias-primas
lipídicas utilizadas neste trabalho.
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
56
Como pode ser observado na Tabela 4.1, o ácido oléico e o óleo de coco residual
possuem um elevado índice de acidez, o que inviabiliza o seu uso em reações de alcoólise
com catalisador básico. Entretanto, o óleo de algodão apresentou um baixo índice de acidez.
Tabela 4.1- Caracterização físico-química das matérias-primas lipídicas utilizadas nas reações de alcoólise
enzimática.
PROPRIEDADES Ácido oléico Óleo de coco
residual
Óleo de algodão
residual
Índice de acidez (mg KOH/g) 191,62 195,08 1,79
Densidade a 20
o
C (Kg/cm
3
) 893,4 917,36 918,74
Índice de iodo (g/100g) 92,50 7,21 105,08
Teor de umidade (%) 0,07 0,25 0,07
Glicerina livre (%) ND 0,03 0,068
Glicerina total (%) ND 3,17 8,408
Observa-se também que o ácido oléico e o óleo de algodão residual apresentaram um
elevado índice de iodo, indicando a forte presença de compostos insaturados (ácido
palmitoléico, ácido linoléico e ácido oléico), que é confirmada pela análise cromatográfica,
descrita no tópico 4.2. A presença de insaturações não é recomendada porque ligações duplas
e triplas são extremamente reativas e fazem tanto o óleo quanto o biodiesel resultante
apresentarem uma baixa resistência à oxidação e uma maior tendência em formar depósitos de
“goma” nos motores (Araújo et al, 2007; Lucena, 2008). Já o óleo de coco residual apresentou
um índice de iodo bem menor, o que sugere a baixa presença de compostos insaturados,
confirmada também pela análise cromatográfica.
4.2. Caracterização Cromatográfica da Matéria-Prima
Nas Tabelas 4.2, 4.3 e 4.4 estão listados os percentuais de ácidos graxos obtidos por
cromatografia gasosa para o ácido oléico e para os óleos vegetais residuais.
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
57
Com base na composição química (Tabela 4.2), a massa molar média do ácido oléico é
282,47 g/mol.
Tabela 4.2 - Percentuais de ácidos graxos para o ácido oléico.
Ácido Graxo Composição (%)
Ácido miristico (C14:0) 0,850
Ácido palmitoleico (C16:1) 2,020
Ácido palmítico (C16:0) 2,550
Ácido oléico cis (C18:1) 94,40
A Figura 4.1 mostra o cromatograma do ácido oléico. Observa-se um pico bem
definido para o ácido oléico, com tempo de retenção de 12,2 minutos. Entretanto, outros picos
foram detectados, registrando a presença de outros ácidos graxos, em menor quantidade,
indicando que a acidez constante na Tabela 4.1 não é referente apenas ao ácido oléico.
Figura 4.1- Cromatograma do ácido oléico.
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
58
Tabela 4.3 - Percentuais de ácidos graxos para o óleo de coco residual.
Ácido Graxo Composição (%)
Ácido caprílico (C8:0) 2,640
Ácido cáprico (C10:0) 3,740
Ácido láurico (C12:0) 51,62
Ácido miristico (C14:0) 22,40
Ácido palmítico (C16:0) 10,04
Ácido linoleico (C18:2) 0,510
Ácido oléico cis (C18:1) 0,650
Ácido oléico trans (C18:1) 5,500
Ácido esteárico (C18:0) 2,870
Com base na composição química e considerando que o óleo de coco residual, devido
ao elevado índice de acidez, é constituído majoritariamente por ácidos graxos livres e não por
triglicerídeos, a massa molar média desse óleo é 217,60 g/mol.
A Figura 4.2 mostra o cromatograma do óleo de coco residual com os picos mais
representativos e os seus respectivos tempos de retenção. O pico mais intenso, cujo tempo de
retenção é 21,32 minutos, refere-se ao ácido láurico (ácido dodecanóico), presente em maior
quantidade na amostra de óleo.
Figura 4.2 - Cromatograma do óleo de coco residual.
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
59
Tabela 4.4 - Percentuais de ácidos graxos para o óleo de algodão residual.
Ácido Graxo Composição (%)
Ácido miristico (C14:0) 0,48
Ácido palmitoleico (C16:1) 0,22
Ácido palmítico (C16:0) 21,40
Ácido linoleico (C18:2) 47,45
Ácido oléico cis (C18:1) 22,81
Ácido oléico trans (C18:1) 4,66
Ácido esteárico (C18:0) 2,98
Com base na Tabela 4.4, a massa molar média do óleo de algodão residual é 827,01
g/mol.
A Figura 4.3 mostra o cromatograma do óleo de algodão residual com os picos mais
representativos e os seus respectivos tempos de retenção. O pico mais intenso, cujo tempo de
retenção é 11,99 minutos, refere-se ao ácido linoléico, presente em maior quantidade na
amostra de óleo.
Figura 4.3 - Cromatograma do óleo de algodão residual.
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
60
4.3. Alcoólise Enzimática do Ácido Oléico Utilizando Lipase Comercial de Candida
Antarctica Tipo B (Novozym 435) como Catalisador
Os resultados obtidos no planejamento experimental fatorial para a esterificação
enzimática do ácido oléico comercial utilizando lipase comercial como catalisador são
apresentados na Tabela 4.5. O tempo de reação foi mantido fixo em oito horas para todos os
experimentos, uma vez que, em ensaios preliminares, observaram-se maiores conversões em
ésteres nesse tempo, o que foi confirmado posteriormente ao se estudar a cinética de reação
(subtópicos 4.3.1, 4.3.2 e 4.3.3).
Baseado nesses valores, o erro experimental foi de, aproximadamente 0,68 %,
mostrando uma boa reprodutibilidade dos experimentos. Observando a Tabela 4.5, pode-se
ver que a maior conversão de biodiesel foi de 88,36 % nas condições de menor temperatura
(30
o
C), maior razão molar ácido:álcool (1:6) e menor concentração de água (W = 0%).
Entretanto, como será explicado posteriormente, a temperatura e a concentração de água
adicionada ao meio reacional tiveram um efeito não significativo e negativo, respectivamente,
na conversão em ésteres e, apesar do efeito positivo da razão molar, não foi necessário um
excesso estequiométrico para obter conversões razoáveis.
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
61
Tabela 4.5 – Resultados do Planejamento Fatorial 2
3
com triplicata do ponto central tendo como variável
resposta a conversão obtida após 8 horas de esterificação enzimática do ácido oléico utilizando uma lipase
comercial de Candida antarctica tipo B (Novozym 435).
Experimento
Razão molar
R
Temperatura
T (
o
C)
Concentração
de água
W (% p/p)
Conversão (%)
1 1 : 1 30 0
87,31 ± 0,68
2 1 : 6 30 0
88,36 ± 0,68
3 1 : 1 30 20
78,30 ± 0,68
4 1 : 6 30 20
86,80 ± 0,68
5 1 : 1 50 0
86,34 ± 0,68
6 1 : 6 50 0
87,90 ± 0,68
7 1 : 1 50 20
75,30 ± 0,68
8 1 : 6 50 20
82,70 ± 0,68
9 (c) 1 : 3,5 40 10
86,95 ± 0,68
10 (c) 1 : 3,5 40 10
85,04 ± 0,68
11(c) 1 : 3,5 40 10
85,73 ± 0,68
A partir dos dados da Tabela 4.5, fez-se a análise estatística utilizando o software
Statistica 6.0. Através do Diagrama de Pareto, mostrado na Figura 4.4, pode-se observar que a
variável concentração de água e razão molar entre os reagentes cruzam a linha de nível de
significância de 95 %. Portanto, a razão molar ácido:álcool e a concentração de água tiveram
efeito estatisticamente significativo na conversão em ésteres, dentro do intervalo estudado
para cada variável.
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
62
-,756692
-1,12955
-1,53166
-2,57714
5,399196
7,307375
-10,341
5
p=,05
Efeitos estimados (valores absolutos)
1com2
1com2com3
2com3
(2)Temperatura
1com3
(1)Razão molar
(3)Concentração de água
Figura 4.4 – Diagrama de Pareto indicando o efeito dos valores estimados para as variáveis estudadas no
planejamento experimental 2
3
com triplicata do ponto central da esterificação enzimática do ácido oléico.
A Tabela 4.6 mostra a estimativa dos efeitos do planejamento experimental realizado.
Pode-se observar que os valores de p obtidos para os fatores analisados são menores que 0,05,
exceto para a temperatura e para as interações entre a temperatura e a razão molar entre os
reagentes, entre temperatura e concentração de água e para interação entre as três variáveis.
Logo, confirma-se que o único parâmetro sem efeito significativo dentro das faixas
experimentais estudadas foi a temperatura.
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
63
Tabela 4.6 – Estimativa dos efeitos principais e suas interações na conversão do ácido oléico a ésteres etílicos.
Fatores Efeitos Desvio padrão p
Média
84,47727 0,291615 0,000012
TR (
o
C)
-1,76250 0,683898 0,123323
R
4,99750
0,683898
0,018217
W (%)
-7,07250
0,683898
0,009221
TR * R
-0,51750
0,683898
0,528226
TR*W
-1,04750
0,683898
0,265286
R*W
3,69250
0,683898
0,032634
TR*R*W
-0,77250
0,683898
0,375917
TR – Temperatura; R – Razão molar entre reagentes; W – Concentração de água
Uma outra observação importante que se pode fazer da Tabela 4.6 é que a
concentração de água apresentou um menor efeito, indicando ser ela a variável mais
significativa no processo. Além disso, o efeito dessa variável foi negativo, o que já era
esperado uma vez que o excesso de água favorece a reação de hidrólise do éster, diminuindo a
conversão no equilíbrio.
Sendo assim, a partir da análise da regressão linear dos resultados obtidos, foi possível
obter um modelo polinomial para descrever a conversão em éster etílico, dentro dos intervalos
das variáveis estudadas. A Equação 4.1 mostra o modelo de primeira ordem para as variáveis,
considerando todos os coeficientes de regressão.
0013,00563,00058,00193,0
2425,07975,00832,0
4257,3
)00155,0()13565,0()00017,0()0051,0(
)6189,0()0570,0()0536,0(2440,89(%)
±±±
±±±
±
×××−××+×±+××+
×
−
×
+
×
−=
WRTRWRWTRRTR
WRTRConversão
(4.1)
sendo TR a temperatura de reação, R a razão molar entre os reagentes e W a concentração de
água adicionada a mistura reacional.
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
64
A Tabela 4.7 mostra a análise da variância (ANOVA) para a variável resposta
(conversão) da reação de alcoólise enzimática do ácido oléico utilizando lipase Novozym 435
como catalisador.
Tabela 4.7 – Anova para a reação de alcoólise enzimática do ácido oléico utilizando Novozym 435 como
catalisador.
Fonte de Variação
Soma
Quadrática
SQ
Graus de
Liberdade
d.f.
Média
Quadrática
MQ
F
Regressão
195,82
8 24,47 26,16
Erro
1,8709
2 0,9354
Total SS
197,69
10
R
2
= 0,9479; F
8;2;0,05
=19,37
A partir da Tabela 4.7 observa-se que o coeficiente de determinação (R
2
), obtido pela
regressão é 0,94. Por essa mesma Tabela 4.7, pode-se realizar o teste F para confirmar o
ajuste do modelo obtido. Segundo Rodrigues (2005), para que os parâmetros do modelo
tenham significância estatística, o valor de F da regressão deve ser maior que o valor de F
tabelado. Comparando o valor de F da regressão com o tabelado (F
tabelado
=19,37), verifica-se
uma regressão significativa. Portanto, os dados experimentais são bem representados pelo
modelo ajustado, ou seja, o modelo obtido para as variáveis significativas pode ser utilizado
para predizer a conversão em éster, dentro do intervalo estudado. Essa conclusão também é
confirmada pela Figura 4.5, que apresenta a comparação entre os valores observados
experimentalmente e aqueles preditos pelo modelo ajustado. Observa-se, pela análise dessa
Figura 4.5, pouca dispersão dos pontos que estão próximos a reta representativa, o que
comprova o bom ajuste do modelo.
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
65
74 76 78 80 82 84 86 88 90
74
76
78
80
82
84
86
88
90
Valores preditos
Valores observados
Figura 4.5 – Valores preditos pelo modelo versus valores experimentais da conversão em ésteres etílicos obtidos
pelo planejamento experimental 2
3
com triplicata do ponto central da esterificação enzimática do ácido oléico.
A Figura 4.6 representa a superfície de resposta para a conversão em ésteres em função
da razão molar e da concentração de água adicionada ao meio. Por ela, observa-se que o
aumento da concentração de água diminui a conversão enquanto o aumento da concentração
de álcool a favorece. Entretanto, o ganho de conversão com o aumento da proporção entre os
reagentes é muito pouco, o que indica a não necessidade de um excesso estequiométrico.
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
66
88
86
84
82
80
78
76
74
Figura 4.6 – Superfície de resposta representando a conversão em função da razão molar entre os reagentes e
concentração de água adicionada ao meio.
Os tópicos seguintes apresentam uma discussão individualizada dos efeitos das
variáveis estudadas.
4.3.1.
Efeito da Temperatura (TR)
As Figuras 4.7 e 4.8 mostram a influência da temperatura na cinética da reação de
esterificação do ácido oléico com etanol utilizando lipase Novozyme 435 como catalisador.
A literatura indica que a temperatura ótima da lipase é abaixo de 70
o
C (Faccio, 2004).
Segundo Gao et al (2006), ao estudarem a imobilização de lipase em resina macroporosa e
sua aplicação na síntese de biodiesel em meios quase anidros, concluíram que a temperatura
ótima de reação de uma lipase imobilizada foi 40
o
C. Acima desse valor a taxa de conversão
de biodiesel diminui rapidamente até a provável desativação da enzima.
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
67
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Conversão (%)
Tempo (min)
30
o
C
50
o
C
Figura 4.7- Influência da temperatura na esterificação enzimática do ácido oléico com etanol utilizando
Novozym 435 como catalisador na razão molar 1:1 e concentração de água W=0%.
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Conversão (%)
Tempo (min)
30
o
C
50
o
C
Figura 4.8- Influência da temperatura na esterificação enzimática do ácido oléico com etanol utilizando
Novozym 435 como catalisador na razão molar 1:6 e concentração de água W=0%.
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
68
Neste trabalho, a temperatura não influenciou a conversão, dentro do intervalo
estudado, o que pode ser observado nas Figuras 4.7 e 4.8, que mostram a cinética da reação na
menor concentração de água (W = 0%) e nas razões molares 1:1 e 1:6, respectivamente. Por
elas percebe-se que, apesar de um ligeiro favorecimento da conversão nos primeiros minutos
de reação com o aumento da temperatura,
a conversão no equilíbrio é muito similar para
ambas as temperaturas, e a velocidade de reação, especialmente quando se usa razão molar
ácido:álcool 1:1, é praticamente a mesma, atingindo o equilíbrio quase ao mesmo tempo. Pela
Figura 4.7 observa-se que para ambas as temperaturas uma conversão acima de 80% é
atingida com 60 minutos de reação. Já pela Figura 4.8, uma conversão acima de 80% é
conseguida com a temperatura de 50
o
C somente após 120 minutos de reação. Portanto, não é
necessário um auto gasto energético com o aumento da temperatura, uma vez que é possível
obter uma boa conversão numa temperatura próxima a ambiente (30
o
C) e a uma velocidade
praticamente igual a da temperatura de 50
o
C.
4.3.2.
Efeito da Razão Molar Ácido:Álcool (R)
As Figuras 4.9 e 4.10 mostram o efeito da razão molar na esterificação enzimática do
ácido oléico com etanol utilizando Novozyme 435 como catalisador.
Apesar do efeito positivo apresentado pela variável razão molar ácido:álcool, observa-
se pelas Figuras 4.9 e 4.10 que nos primeiros minutos de reação o aumento de R torna a
reação mais lenta e embora as conversões no equilíbrio sejam maiores na condição de maior
razão molar, os valores são muito próximos, indicando a não necessidade de um excesso
estequiométrico, tornando o processo enzimático, nesse aspecto, mais vantajoso do que a
catálise química convencional.
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
69
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Conversão (%)
Tempo (min)
[1:1]
[1:6]
[1:12]
Figura 4.9- Influência da razão molar ácido:álcool na esterificação enzimática do ácido oléico com etanol
utilizando Novozym 435 como catalisador na temperatura de 30
o
C e na menor concentração de água (W = 0%).
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Conversão (%)
Tempo (min)
[1:1]
[1:6]
[1:12]
Figura 4.10- Influência da razão molar ácido:álcool na esterifcação enzimática do ácido oléico com etanol
utilizando Novozym 435 como catalisador na temperatura de 50
o
C e na menor concentração de água (W = 0%)
Esses resultados estão de acordo com o que vem sendo reportado na literatura.
Trubiano et al (2007), ao estudarem a influência das condições operacionais e das limitações
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
70
da transferência de massa externa na síntese de ésteres de ácidos graxos utilizando uma lipase
de Candida antarctica, verificaram o mesmo efeito para a razão molar. Esses autores
estudaram várias razões molares e verificaram que a medida que a quantidade de álcool
aumentava, a conversão em ésteres progredia mais lentamente e a conversão no equilíbrio
aumentava. Nesse estudo eles verificaram a existência de uma razão molar máxima na qual
acima desse valor a taxa inicial de reação começava a diminuir, o que sugere a existência de
uma razão molar ótima.
Wang et al (2007), ao estudarem a produção enzimática de biodiesel a partir de óleos
residuais ácidos, também observaram que uma quantidade excessiva de álcool diminui a
velocidade inicial de reação e tem um efeito negativo na lipase. Em comum acordo com
vários autores, esse comportamento da lipase frente ao excesso estequiométrico de álcool
pode ser explicado por efeitos inibitórios, uma vez que, devido a elevada polaridade de
álcoois de cadeia curta como o etanol, por exemplo, ao entrar em contato com a enzima o
álcool pode ficar adsorvido no suporte no qual a enzima foi imobilizada, formando uma
camada limite aquosa em torno do biocatalisador, deixando o sítio ativo da enzima
inacessível.
4.3.3.
Efeito da Concentração de Água (W)
De acordo com a Figura 4.4, o aumento da concentração de água no meio reacional
teve um efeito negativo na conversão em ésteres dentro do intervalo estudado, ou seja, no
equilíbrio, à medida que a quantidade de água aumentou a conversão de biodiesel diminuiu.
Esse efeito também é observado claramente na Figura 4.11, que mostra a cinética da reação de
esterificação do ácido oléico com etanol utilizando Novozym 435 como catalisador na
temperatura de 30
o
C e na razão molar ácido:álcool de 1:1.
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
71
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Conversão (%)
Tempo (min)
W = 0%
W = 20%
Figura 4.11- Influência da concentração de água na esterificação enzimática do ácido oléico com etanol
utilizando Novozym 435 como catalisador na temperatura de 30
o
C e na menor razão molar (R = 1:1)
Sabe-se que as lipases necessitam de uma certa quantidade de água para manter a sua
conformação tridimensional ativa, mesmo quando a enzima está covalentemente ligada a um
suporte, uma vez que a água interage com os grupos hidrofílicos localizados na superfície da
enzima levando a conformação aberta da lipase. Entretanto, existe uma concentração mínima
de água em meios quase anidros na qual acima desse valor a taxa de conversão decresce
significativamente, facilitando a hidrólise do éster (Gao et al, 2006; Trubiano et al, 2007;
Yahya, et al, 1998).
De acordo com os resultados obtidos por Foresti et al (2007), em reações de
esterificação e hidrólise, a quantidade de água afeta a conversão de equilíbrio assim como a
distribuição dos produtos no meio. Particularmente para esterificações, à medida que a
concentração de água aumenta, a conversão no equilíbrio diminui, o que pode ser resultado da
água agindo como substrato na reação inversa de hidrólise.
Entretanto, observando a Figura 4.11, percebe-se um ligeiro favorecimento da
conversão, nos primeiros minutos de reação, com o aumento da concentração de água
presente no meio. Esse comportamento também foi observado por Foresti et al (2007) e por
Foresti et al (2008), que explicaram que a adição de elevadas quantidades de água à mistura
de substratos promoveu a formação de duas fases líquidas, aumentando significativamente o
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
72
rendimento em ésteres etílicos em condições distantes do equilíbrio. Isso acontece porque o
sistema líquido bifásico formado logo no início da reação com a adição da água faz com que a
água produzida pela reação de esterificação seja extraída para fase aquosa, tornado a fase
orgânica rica em éster, pois devido a sua alta hidrofobicidade, eles permanecem nessa fase.
No caso de reações feitas em sistemas com W = 0%, as baixas conversões medidas no início
da reação foram conseqüência de ambas hidratação insuficiente do biocatalisador e um
contínuo aumento da quantidade de água dentro da fase reagente. No início, toda a água
produzida permanece em uma única fase, favorecendo a hidrólise do éster, mas a medida que
a quantidade de água aumenta, ocorre uma ruptura de fase, fazendo com que toda a água
acumulada migre para a fase aquosa, reduzindo a taxa de reação inversa e favorecendo a
síntese de éster. Por isso a conversão no equilíbrio na condição de menor quantidade de água
foi maior.
Portanto, o ponto chave para explicar o aumento da taxa inicial de conversão com a
elevação da quantidade de água é a formação de um sistema líquido bifásico logo no início.
Se a água adicionada ao sistema reacional for alta o suficiente para a formação de duas fases
líquidas, a conversão medida nos primeiros minutos de reação aumenta, pois o sistema
bifásico promove a migração da água formada durante a reação da fase orgânica para a fase
aquosa, tornado a fase orgânica rica em éster.
A Figura 4.12 mostra a influência do aumento da quantidade de álcool na maior
concentração de água. Por ela percebe-se que quando se aumenta a quantidade de água
juntamente com a quantidade de álcool, a conversão no equilíbrio é maior.
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
73
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Conversão (%)
Tempo (min)
Razão molar ácido:álcool (1:1)
Razão molar ácido:álcool (1:6)
Figura 4.12- Influência do aumento da concentração de álcool com o aumento da concentração de água na
esterificação enzimática do ácido oléico com etanol utilizando Novozym 435 como catalisador na temperatura de
30
o
C.
O fato do aumento da quantidade de água ser menos prejudicial à reação de
esterificação com o aumento da quantidade de álcool pode ser explicado pelo fato de que na
proporção estequiométrica a água presente no meio é mais significativa do que a concentração
de álcool, favorecendo a reação inversa de hidrólise do éster. Já com um excesso de álcool
presente no meio, a água fica solubilizada com o álcool e por isso, além da conversão no
equilíbrio ser maior, a velocidade de reação é menor, pois não há a formação do sistema
bifásico logo no inicio. Entretanto, é importante salientar que o aumento na concentração de
álcool e água não permitiu uma melhora na conversão, já que a maior conversão no equilíbrio
(87 %) foi obtida na condição de menor concentração de água e menor razão molar entre
substratos.
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
74
4.4. Alcoólise Enzimática do Ácido Oléico Utilizando Lipase de Candida antarctica Tipo
B Imobilizada em Quitosana como Catalisador
A Figura 4.13 mostra a comparação dos resultados obtidos na reação de esterificação
do ácido oléico com etanol utilizando o derivado de quitosana e a Novozym 435, como
catalisador. De acordo com esta Figura, observa-se que a conversão no equilíbrio é
praticamente a mesma. Entretanto, a velocidade de reação no início é menor quando se
utilizou o derivado de quitosana como catalisador.
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Conversão (%)
Tempo (min)
comercial
quitosana
Figura 4.13 - Comparação do comportamento da Lipase de Candida Antarctica Tipo B Imobilizada em
Quitosana com a Novozym 435 na etanólise do ácido oléico na temperatura de 30
o
C, razão molar ácido:álcool
1:1 e sem adição de água.
Esta observação pode ser explicada por dois motivos. Primeiramente, a quantidade de
enzima imobilizada por grama de suporte para o derivado de quitosana é menor do que para a
Novozym 435, ou seja, a carga do derivado de quitosana é menor, tornando a velocidade de
reação mais lenta. Uma outra explicação possível é o problema difusional causado pela
ativação do derivado com glutaraldeído. Segundo Foresti et al (2007), as baixas conversões
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
75
obtidas com os derivados tratados com glutaraldeído podem ser explicadas pelo fato do acesso
ao sítio ativo da lipase ter ficado bloqueado pela ligação química estabelecida entre a lipase e
a quitosana ativada durante o processo de imobilização, que pode ter envolvido aminoácidos
do sítio ativo, provocando restrições estéricas, ou mudanças conformacionais impróprias,
levando a uma redução da atividade enzimática.
4.5. Alcoólise Enzimática do Óleo de Coco Residual Utilizando Novozym 435 como
Catalisador
A Figura 4.14 mostra uma comparação do comportamento da Novozym 435 na reação
de esterificação do ácido oléico e do óleo de coco residual ácido.
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Conversão (%)
Tempo (min)
ácido oléico
óleo de coco residual
Figura 4.14- Comparação do comportamento da Novozym 435 na reação de etanólise do ácido oléico com a
etanólise do óleo de coco residual na temperatura de 30
o
C, razão molar ácido:álcool 1:1 e sem adição de água.
Essa comparação foi realizada para observar se o óleo residual não desnaturava a
enzima, e como se pode observar pela Figura 4.14, a Novozym 435 comportou-se de maneira
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
76
semelhante na reação de esterificação do óleo de coco residual com etanol, provando a
potencialidade do uso dessa lipase para obtenção de ésteres a partir de matérias-primas ácidas.
4.6.Ciclos de Atividade
A Figura 4.15 mostra as conversões obtidas após 11 reações de etanólise do óleo de
coco residual utilizando a mesma amostra de enzima, tanto para a Novozym 435 como para o
derivado de quitosana. Ambas as lipases foram apenas lavadas com hexano e secadas a vácuo
antes da reutilização.
0123456789101112
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Conversão (%)
Ciclos
Novozyme 435
Derivado de quitosana
Figura 4.15- Estabilidade operacional da Novozym 435 e da Lipase de Candida Antarctica Tipo B Imobilizada
em Quitosana na reação de etanólise do óleo de coco residual na temperatura de 30
o
C, razão molar ácido:álcool
1:1 e sem adição de água.
Os resultados mostram a estabilidade das lipases, comprovando a viabilidade da
catálise enzimática para produção de biodiesel a partir de substratos de elevada acidez livre,
uma vez que o alto custo da enzima é um dos fatores mais importantes na catálise enzimática,
restringindo a produção industrial de biodiesel por essa rota alternativa. Esses resultados
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
77
também estão de acordo com o que outros autores observaram. Wang et al (2007),
verificaram a manutenção da atividade da Novozyme 435 após dez ciclos consecutivos.
4.7. Alcoólise Enzimática do Óleo de Algodão Residual Utilizando Novozym 435 como
Catalisador
Os resultados obtidos no planejamento de experimentos encontram-se na Tabela 4.8.
Baseado nesses valores, o erro experimental foi de aproximadamente 2,19%, mostrando uma
boa reprodutibilidade dos experimentos. Observando a Tabela 4.7, pode-se ver que a maior
conversão de biodiesel foi de 82,66 % em 72 horas de reação nas condições de menor
temperatura (30
o
C) e na menor razão molar álcool:óleo (3:1).
Tabela 4.8 – Conversões obtidas na alcoólise enzimática do óleo de algodão residual de baixa acidez livre
utilizando uma lipase comercial de Candida antarctica tipo B (Novozym 435).
Experimento Razão Molar
R
Temperatura
T R(
o
C)
Tempo
TO (h)
Conversão
(%)
1 1:3 30,0 24
45,00 ± 2,19
2 1:3 50,0 24
79,00 ± 2,19
3 1:9 30,0 24
41,70 ± 2,19
4 1:9 50,0 24
31,79 ± 2,19
5 1:3 30,0 72
82,66 ± 2,19
6 1:3 50,0 72
76,19 ± 2,19
7 1:9 30,0 72
73,89 ± 2,19
8 1:9 50,0 72
50,35 ± 2,19
9 (c) 1:6 40,0 48
68,87 ± 2,19
10 (c) 1:6 40,0 48
64,51 ± 2,19
11 (c) 1:6 40,0 48
62,88 ± 2,19
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
78
A partir dos dados da Tabela 4.8, fez-se a análise estatística utilizando o software
Statistica 6.0. Através do Diagrama de Pareto, mostrado na Figura 4.16, podemos observar que
a variável razão molar, tempo reacional e as interações entre razão e temperatura e entre
temperatura e tempo cruzam a linha de nível de significância de 95 %. Portanto, razão molar
álcool:óleo e o tempo reacional, bem como as interações entre a temperatura e o tempo e entre
razão molar e temperatura tiveram efeito estatisticamente significativo na conversão em
ésteres. Apesar de não significativa, a temperatura teve um efeito negativo, indicando que esta
enzima tem um comportamento ótimo em condições brandas de temperatura. A razão molar
também apresentou um efeito negativo, apontando para uma possível inativação enzimática
pelo excesso de álcool. Já o tempo reacional apresentou um efeito positivo, o que leva a
conclusão de que quanto maior o tempo de reação maior a conversão.
-,701019
1,882805
3,178269
-6,40627
-7,22097
-10,0795
10,13636
p=,05
Efeitos estimados (valores absolutos)
(2)temperatura
1com3
1com2com3
2com3
1com2
(1)Razão
(3)Tempo
Figura 4.16- Diagrama de Pareto indicando o efeito dos valores estimados para as variáveis independentes para
o Planejamento fatorial 2
3
da reação de alcoólise enzimática do óleo de algodão residual.
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
79
Nesse momento já se pode observar que, apesar de um tempo bem maior ser
necessário para se alcançar boas conversões com o óleo de algodão, os efeitos das variáveis
estudadas foram semelhantes aos efeitos dos fatores analisados no planejamento experimental
com o ácido oléico. A Tabela 4.9 mostra a estimativa dos efeitos do planejamento
experimental realizado com o óleo de algodão. Pode-se observar que os valores de p obtidos
para os fatores analisados são menores que 0,05, exceto para a temperatura e para a interação
entre razão molar e tempo e para a interação entre as três variáveis. Logo, confirma-se que o
único parâmetro sem efeito significativo dentro das faixas experimentais estudadas foi a
temperatura.
Tabela 4.9 – Estimativa dos efeitos principais e suas interações na conversão do óleo de algodão a ésteres
etílicos
.
Fatores Efeitos Desvio padrão p
Média 61,51 0,90 0,000214
R -21,28 2,11 0,009700
TR (
o
C)
-1,48 2,11 0,555875
TO (h) 21,40 2,11 0,009593
TR * R -15,24 2,11 0,018644
R*TO
3,975 2,11 0,200430
TR*TO -13,52 2,11 0,023510
TR*R*TO
6,71 2,11 0,086365
TR – Temperatura; R – Razão molar entre reagentes; TO – Tempo
Considerando os coeficientes de regressão linear obtidos, intervalo de confiança de
95% e quatro casas decimais, foi possível escrever o modelo matemático de primeira ordem
correspondente a variável resposta (conversão) de acordo com a Equação 4.3.
0014,00098,00604,00786,0
4055,05278,02440,3
7548,21
)0047,0()0561,0()1588,0()4778,0(
)5256,2()1450,4()2383,14(4573,96(%)
±±±±
±±±
±
×××+××−××−××−
×
+
×
+
×
+−=
TORTRTOTRTORTRR
TOTRRConversão
(4.3)
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
80
sendo TR a temperatura de reação, R a razão molar entre os reagentes e TO o tempo
reacional.
O ajuste do modelo escolhido pode ser confirmado pela Figura 4.17, que mostra a
comparação entre os valores reais e aqueles obtidos pelo modelo, observando-se uma
aglomeração dos pontos próximo a reta representativa.
30 40 50 60 70 80 90
30
40
50
60
70
80
90
Valores preditos
Valores observados
Figura 4.17 – Valores previstos pelo modelo versus valores experimentais obtidos pelo pelo planejamento
experimental fatorial 2
3
com triplicata do ponto central para a reação de alcoólise enzimática do óleo de algodão.
Tabela 4.10 – ANOVA para a reação de alcoólise enzimática do óleo de algodão utilizando Novozym 435 como
catalisador.
Fonte de Variação
Soma
Quadrática
SQ
Graus de
Liberdade
d.f.
Média
Quadrática
MQ
F
Regressão
2839,143 8 354,89 39,83
Erro
17,829 2 8,91
Total SS
2856,972 10
R
2
= 0,97246; F
8;2;0,05
=19,37
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
81
Pela Tabela 4.10 (ANOVA), que mostra a análise de variância e o teste F, novamente
confirma-se que o modelo escolhido representa os dados experimentais, uma vez que o valor
de F da regressão foi maior que o valor de F tabelado (19,37).
A seguir, analisou-se a superfície de resposta, Figura 4.18, para se avaliar o efeito da
razão molar óleo:álcool na conversão da reação. Por ela, percebe-se que os melhores
resultados foram conseguidos nas condições de menor razão molar, o que está de acordo com
o que vem sendo reportado na literatura (Kose et al., 2002; Oliveira et al., 2004). Isso
acontece porque, provavelmente, o excesso de álcool provoca inativação da enzima.
80
70
60
50
40
Figura 4.18- Superfície de resposta para a conversão em função da temperatura e razão molar óleo:álcool para
alcoólise enzimática de óleo de algodão utilizando Novozymes 435 como catalisador.
Segundo Chen e Wu (2003), ao estudarem métodos de regeneração da atividade de
uma lipase de Candida antarctica, que fora inativada pelo excesso de álcool durante a reação
de alcoólise de óleo de soja, essa inativação pode ser explicada pela imiscibilidade entre
triglicerídeos e álcoois de cadeia curta (metanol e etanol). Além disso, o suporte no qual a
enzima foi imobilizada pode ter adsorvido compostos polares como o etanol, o que, em
elevadas concentrações desse álcool, promove a formação de uma camada estagnada desse
reagente em torno da partícula de enzima imobilizada, impedindo a entrada de triglicerídeo ao
sítio ativo da enzima.
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
82
A Figura 4.19 mostra o efeito do tempo reacional na conversão da reação. Por ela
percebe-se que as maiores conversões ocorreram nos maiores tempos e nas menores
temperaturas, o que era esperado, uma vez que quanto mais tempo os reagentes
permaneceram em contato, maior foi a conversão. No entanto, o tempo necessário para se
obter boas conversões ainda foi alto se comparado com a catálise química e com a
esterificação de substratos de elevada acidez livre.
80
70
60
50
40
Figura 4.19- Superfície de resposta para a conversão em função da temperatura e do tempo reacional para a
alcoólise enzimática de óleo de algodão utilizando Novozymes 435 como catalisador.
4.8.Caracterização dos Ésteres Etílicos
Como o interesse dessa dissertação foi a obtenção de ésteres etílicos a partir de uma
matéria-prima residual, e diante dos bons resultados conseguidos com a esterificação do óleo
de coco residual ácido utilizando o derivado de quitosana, a Tabela 4.11 apresenta a
caracterização dos ésteres produzidos pela reação de alcoólise do óleo de coco utilizando uma
lípase de Cândida antarctica tipo B imobilizada em quitosana como catalisador, na condição
de menor temperatura (30
o
C), menor razão molar óleo:álcool (1:1) e sem adição de água.
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
83
Tabela 4.11- Caracterização físico-química dos ésteres etílicos.
PROPRIEDADES Ésteres etílicos Limite ANP
Índice de acidez (mg KOH/g) 25,40 0,50
Densidade a 20
o
C (Kg/m
3
) 879,96 850-900
Índice de iodo (g/100g) 6,74 **
Teor de umidade (%) 0,05 0,05
Glicerina livre (%) 0,015 0,02
Glicerina total (%) 0,204 0,25
**Vide anexo A
Comparando a caracterização dos ésteres etílicos obtidos com os limites permitidos
pela resolução 7 da Agência Nacional de Petróleo (ANP), percebe-se que o único parâmetro
que não ficou dentro da especificação foi o índice de acidez. Entretanto, após submeter a
mistura de ésteres etílicos a uma neutralização com a glicerina resultante do processo de
produção de biodiesel por transesterificação com catalisador básico, o índice de acidez
reduziu para 0,76 mg KOH/g, ficando muito próximo do limite exigido pela ANP.
4.9.Conclusões Parciais
Tendo por base os resultados apresentados e discutidos nesse capítulo, uma conclusão
que se pode chegar é que a utilização da lípase de Cândida antarctica tipo B imobilizada para
produção de biodiesel é mais viável quando da utilização de substratos ácidos, uma vez que os
melhores resultados foram conseguidos com matérias-primas desse tipo e com uma taxa de
reação comparável a esterificação com catalisador ácido.
Segundo Lucena (2008), uma conversão em torno de 87 % em éster metílico a partir
da metanólise de ácido oléico comercial com ácido sulfúrico foi conseguida com 60 minutos
de reação, a uma temperatura de 90
o
C, razão molar ácido:álcool de 1:3 e com adsorção da
água formada durante o processo. Já com os ensaios sem adsorção de água, uma conversão
máxima de 88,18 % em éster metílico foi atingida a uma temperatura de 110
o
C e razão molar
entre reagentes de 1:9. Enquanto isso, os resultados dessa dissertação mostram que a
Capítulo 4 – Resultados e discussões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
84
esterificação enzimática do ácido oléico comercial com etanol forneceu uma conversão de
87,3 % com 60 minutos de reação, a uma temperatura de 30
o
C, na proporção estequiométrica
e sem adsorção de água.
Capítulo 5 – Conclusões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
85
5. CONCLUSÕES
Esse trabalho teve como objetivo verificar a potencialidade do uso de lipase
imobilizada, especialmente uma lipase imobilizada pelo Grupo de Pesquisa em Processos
Biotecnológicos (GPBIO) do Departamento de Engenharia Química da UFC, na reação de
modificação de óleos vegetais residuais, verificando a influência das variáveis do processo e a
cinética de reação, bem como uma comparação do comportamento da lipase em dois óleos
com características físico-químicas diferentes.
De acordo com o estudo realizado, algumas conclusões podem ser apresentadas,
dependendo do catalisador e do substrato utilizado.
Os resultados dessa dissertação demonstraram que ambos os biocatalisadores
utilizados apresentaram boa eficiência na esterificação de matérias-primas ácidas, com a
enzima imobilizada em um suporte de quitosana pelo GPBIO apresentando atividade
comparável a lipase comercial.
O emprego do planejamento experimental fatorial mostrou-se eficiente no estudo das
variáveis que influenciam a conversão da reação. Nos dois planejamentos empregados, os
efeitos das variáveis foram praticamente os mesmos, com exceção de um tempo de reação
maior quando da utilização do óleo de algodão, cuja principal diferença em relação aos outros
substratos foi o seu baixo índice de acidez livre. Esse resultado nos levou a concluir que é
mais viável o emprego de lipase para produção de biodiesel quando se utiliza resíduos
gordurosos com altos teores de ácidos graxos livres.
Os resultados dos planejamentos e da cinética de reação encontrados nessa dissertação
demonstram que, dentro do intervalo estudado, a temperatura, a razão molar entre os
substratos e a concentração de água adicionada ao meio tiveram um efeito negativo na
conversão em ésteres.
As condições amenas exigidas pela catálise enzimática tornam essa rota alternativa
promissora, apesar dos custos da aquisição do biocatalisador ainda serem elevados.
Entretanto, diante dos bons resultados obtidos com o derivado de quitosana, os insumos com a
produção do catalisador podem diminuir, uma vez que a quitosana é um suporte barato.
Capítulo 5 – Conclusões Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
86
Os resultados dos planejamentos possibilitaram a proposta de um modelo empírico
que demonstrou uma boa concordância com os dados experimentais, obtendo-se, em 8 horas
de reação, uma conversão máxima de 88,36% para a esterificação do ácido oléico e, em 72
horas de reação, 82,66% de conversão para a transesterificação do óleo de algodão residual.
A avaliação do número de ciclos em que a enzima imobilizada poderia ser utilizada
sem perda considerável de atividade foi realizada, concluindo que a enzima pode ser
reutilizada por no mínimo 10 vezes após o primeiro uso, o que não acontece com os
catalisadores químicos convencionais que, sendo homogêneos, não são separados ao final do
processo.
Sendo assim, os resultados dessa dissertação indicam a possibilidade do uso de lipases
em reações de alcoólise de óleos vegetais residuais ácidos objetivando a produção de
biodiesel, tornando possível o uso de matérias-primas de baixo valor agregado, contribuindo,
dessa forma, para redução da poluição ambiental, tanto por produzir um combustível
ambientalmente correto como por dar um destino mais nobre a um produto sem serventia e
que é despejado no meio ambiente indiscriminadamente.
Referências Bibliográficas Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
87
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Anexos Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
95
ANEXO
Resolução ANP N° 7, de 19.3.2008 - DOU 20.3.2008
REGULAMENTO TÉCNICO Nº 7/2008 (Especificação do Biodiesel-B100).
MÉTODO
CARACTERÍSTICA UNIDADE LIMITE
ABNT
NBR
ASTM
D
EN/ISO
Aspecto - LII (1) - - -
Massa específica a 20º C kg/m
3
850-900
7148
14065
1298
4052
EN ISO
3675 - EN
ISO 12185
Viscosidade Cinemática a 40ºC mm
2
/s 3,0-6,0 10441 445 EN ISO
3104
Teor de Água, máx. (2) mg/kg 500 - 6304 EN ISO
12937
Contaminação Total, máx. mg/kg 24 - - EN ISO
12662
Ponto de fulgor, mín. (3) ºC 100,0 14598
93
-
EN ISO
3679
Teor de éster, mín % massa 96,5 15342
(4) (5)
- EN 14103
Resíduo de carbono (6) % massa 0,050 - 4530 -
Cinzas sulfatadas, máx. % massa 0,020 6294 874 EN ISO
3987
Enxofre total, máx. mg/kg 50
-
-
5453
-
EN ISO
20846
EN ISO
20884
Sódio + Potássio, máx. mg/kg 5
15554
15555
15553
15556
-
EN 14108
EN 14109
EN 14538
Cálcio + Magnésio, máx. mg/kg 5
15553
15556
-
EN 14538
Fósforo, máx. mg/kg 10 15553 4951 EN 14107
Corrosividade ao cobre, 3h a 50
ºC, máx.
- 1 14359 130 EN ISO
2160
Anexos Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
96
Número de Cetano (7) - Anotar -
613
6890
(8)
EN ISO
5165
Ponto de entupimento de filtro a
frio, máx.
ºC 19 (9) 14747 6371 EN 116
Índice de acidez, máx. mg KOH/g 0,50
14448
-
664
-
-
EN 14104
(10)
Glicerol livre, máx. % massa 0,02 15341
(5)
-
-
6584
(10)
-
-
EN 14105
(10)
EN 14106
(10)
Glicerol total, máx. % massa 0,25 15344
(5)
-
6584
(10)
-
-
EN 14105
(10)
Mono, di, triacilglicerol (7) % massa Anotar 15342
(5)
15344
(5)
6584
(10)
-
-
EN 14105
(10)
Metanol ou Etanol, máx. % massa 0,20 15343 - EN 14110
Índice de Iodo (7) g/100g Anotar - - EN 14111
Estabilidade à oxidação a 110ºC,
mín.(2)
h 6 - - EN 14112
(10)
Nota:
(1) LII – Límpido e isento de impurezas com anotação da temperatura de ensaio.
(2) O limite indicado deve ser atendido na certificação do biodiesel pelo produtor ou
importador.
(3) Quando a análise de ponto de fulgor resultar em valor superior a 130ºC, fica dispensada a
análise de teor de metanol ou etanol.
(4) O método ABNT NBR 15342 poderá ser utilizado para amostra oriunda de gordura
animal.
Anexos Costa Filho, E.H.
Estudo da Produção Enzimática de Biodiesel Utilizando Óleo Residual e Etanol
97
(5) Para biodiesel oriundo de duas ou mais matérias-primas distintas das quais uma consiste
de óleo de mamona:
a) teor de ésteres, mono-, diacilgliceróis: método ABNT NBR 15342;
b) glicerol livre: método ABNT NBR 15341;
c) glicerol total, triacilgliceróis: método ABNT NBR 15344;
d) metanol e/ou etanol: método ABNT NBR 15343.
(6) O resíduo deve ser avaliado em 100% da amostra.
(7) Estas características devem ser analisadas em conjunto com as demais constantes da tabela
de especificação a cada trimestre civil. Os resultados devem ser enviados pelo produtor de
biodiesel à ANP, tomando uma amostra do biodiesel comercializado no trimestre e, em caso
de neste período haver mudança de tipo de matéria-prima, o produtor deverá analisar número
de amostras correspondente ao número de tipos de matérias-primas utilizadas.
(8) Poderá ser utilizado como método alternativo o método ASTM D6890 para número de
cetano.
(9) O limite máximo de 19ºC é válido para as regiões Sul, Sudeste, Centro-Oeste e Bahia,
devendo ser anotado para as demais regiões. O biodiesel poderá ser entregue com
temperaturas superiores ao limite supramencionado, caso haja acordo entre as partes
envolvidas. Os métodos de análise indicados não podem ser empregados para biodiesel
oriundo apenas de mamona.
(10) Os métodos referenciados demandam validação para as matérias-primas não previstas no
método e rota de produção etílica.
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