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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE GENÉTICA E BIOQUÍMICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA
DEPENDÊNCIA TÉRMICA DOS EFEITOS
DE GLICEROL E SORBITOL A 1 M
SOBRE A ESTABILIZAÇÃO E DESESTABILIZAÇÃO
IN VITRO DE ERITRÓCITOS HUMANOS POR ETANOL
Estudante: Francislene Glória de Freitas Reis
Orientador: Professor Dr. Nilson Penha-Silva
UBERLÂNDIA, MG
2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE GENÉTICA E BIOQUÍMICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA
DEPENDÊNCIA TÉRMICA DOS EFEITOS
DE GLICEROL E SORBITOL A 1 M
SOBRE A ESTABILIZAÇÃO E DESESTABILIZAÇÃO
IN VITRO DE ERITRÓCITOS HUMANOS POR ETANOL
Estudante: Francislene Glória de Freitas Reis
Orientador: Professor Dr. Nilson Penha-Silva
Tese apresentada à Universidade
Federal de Uberlândia como parte
dos requisitos para obtenção do
Título de Doutor em Genética e
Bioquímica (Área de Bioquímica)
UBERLÂNDIA, MG
2007
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
R375d
Reis, Francislene Glória de Freitas, 1976-
Dependência térmica dos efeitos de glicerol e sorbitol a 1 M sobre a
estabilização e desestabilização de eritrócitos humanos por etanol /
Francislene Glória de Freitas Reis - 2007.
74 f.: il.
Orientador: Nilson Penha-Silva.
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Uberlândia, Programa de
Pós-Graduação em Genética e Bioquímica.
Inclui bibliografia.
1. Células - Membranas - Teses. 2. Eritrócitos - Teses. I. Penha-Silva,
Nilson. II. Universidade Federal de Uberlândia. Programa de Pós-
Graduação em Genética e Bioquímica. II. Título.
CDU: 576.314
Elaborado pelo Sistema de Bibliotecas da UFU / Setor de Catalogação e Classificação
Palavras-chaves: Caotrópicos, eritrócitos, estabilidade de membranas, etanol,
osmólitos
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE GENÉTICA E BIOQUÍMICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA
DEPENDÊNCIA TÉRMICA DOS EFEITOS
DE GLICEROL E SORBITOL A 1 M
SOBRE A ESTABILIZAÇÃO E DESESTABILIZAÇÃO
IN VITRO DE ERITRÓCITOS HUMANOS POR ETANOL
ESTUDANTE: Francislene Glória de Freitas Reis
COMISSÃO EXAMINADORA:
Presidente: Professor Dr. Nilson Penha-Silva (Orientador)
Examinador: Professor Dr. Adriano O. Andrade (UFU)
Examinador: Professor Dr. Marcelo Emílio Beletti (UFU)
Examinador: Professor Dr. Marcelo Matos Santoro (UFMG)
Examinador: Professora Dra. Maria Goreti de Almeida Oliveira (UFV)
DATA DE DEFESA: 28/02/2007
As sugestões da comissão examinadora e as normas da PGGB para o formato da
tese foram contempladas.
Professor Dr. Nilson Penha-Silva
(Orientador)
iv
“O rio atinge os seus objetivos porque aprendeu a
contornar os obstáculos”.
(Autor desconhecido)
“Já que você tem que pensar de qualquer forma,
pense grande”.
(Donald Trump)
v
DEDICATÓRIA
A Deus,
por ter traçado um caminho maravilhoso para mim, onde passei e continuo
passando por medos, decepções, erros, frustrações, enganos, sustos, tristezas,
desânimo, mas, também, por uma imensidão de felicidades, amizades, amores,
realizações... Enfim, sem passar por todos esses lugares, eu não seria a pessoa
que nós conhecemos hoje.
Aos meus pais,
Luzia e Edson, meu sincero e eterno agradecimento, pois sem vocês eu não teria
conseguido alcançar os meus objetivos. Obrigado pelo amor, carinho, confiança,
dedicação e ajuda a mim destinados desde o meu nascimento.
Ao meu marido Marcelo,
A quem tenho que agradecer muito pela paciência, companheirismo e pelo filho
que temos, o qual nos traz e continuará promovendo muitas alegrias. A você: o
meu sincero amor e carinho.
Ao meu filho Marcus Vinícius,
Por ter me inspirado a dar início e término a mais uma etapa na minha formação
acadêmica.
vi
AGRADECIMENTOS
A minha amiga Cynthia Barbosa Firmino, pelo companheirismo e conselhos
em todos os momentos vividos na pós-graduação, incluindo o oferecimento de
condições para a realização dos experimentos do Doutorado.
Ao meu estimado professor e orientador Dr. Nilson Penha-Silva, pela
orientação e acolhimento em seu laboratório. Ficam aqui registrados os meus
sinceros agradecimentos a essa pessoa que tive possibilidades de conhecer
melhor, durante estes 4 anos de Doutorado, fazendo aumentar ainda mais a
minha admiração e respeito a sua pessoa.
Aos professores e funcionários do Instituto de Genética e Bioquímica e de
Ciências Biológicas pela colaboração na minha formação profissional e na
realização deste trabalho.
Aos professores Dra. Amélia Hamaguchi, Dra. Maria Inês Homsi-
Brandeburgo e Dr. Foued Salmén Espíndola, pela contribuição em minha
formação acadêmica, o que muito enriquece a minha experiência profissional.
À Escola Técnica de Análises Clínicas da UFU, pela ajuda na realização
dos experimentos deste trabalho.
Aos meus amigos e colegas do Laboratório de Enzimologia: Cleine Chagas
da Cunha Arvelos, Juliana Carla da Costa Huss, Letícia Ramos de Arvelos, Lubia
Cristina Fonseca, Luiz Fernando Gouvêa-e-Silva, Mariana Vaini de Freitas, Mário
da Silva Garrote Filho, Natássia Caroline Resende Corrêa, Rita de Cássia
Mascarenhas Netto, Tatiana Maria Theodoro de Souza, pelos auxílios durante a
execução deste trabalho e pela convivência enriquecedora.
Aos funcionários do Instituto de Genética e Bioquímica, em especial
Gerson Fraissat Mamede Filho, Cleuber Honorato Pereira, Maria Aparecida Vilela,
Maria Marlene Macedo, Sebastiana Abadia Inácio, Sirle de Souza e Vilmar
Mendes Goulart; vocês de pouquinho em pouquinho sempre me ajudaram a fazer
grandes feitos.
E também ao programa de pós-graduação em Genética e Bioquímica da
UFU, que me aceitou como estudante e tornou possível a conclusão e defesa
deste trabalho.
vii
ABREVIATURAS
A
1
Absorvância antes da transição de desnaturação dos eritrócitos
A
2
Absorvância depois da transição de desnaturação dos eritrócitos
D
Desnaturante (etanol)
D
50
Concentração de etanol que produz 50% de hemólise
D
50R
Concentração de etanol que produz 50% de lise do estado R dos eritrócitos
D
50T
Concentração de etanol que produz 50% de lise do estado T dos eritrócitos
dD Amplitude da concentração do desnaturante na transição de desnaturação
Estado R Estado expandido dos eritrócitos
Estado T Estado compactado dos eritrócitos
FOE Fragilidade osmótica dos eritrócitos (estabilidade contra choque hipotônico)
H
50
Concentração de NaCl que produz 50% de hemólise
P
D
Profundidade da linha sigmoidal de desestabilização (hemólise do estado T)
P
S
Profundidade da linha sigmoidal de estabilização (formação do estado T)
S
50
Concentração de etanol que produz 50% de estabilização
Salina Solução de NaCl a 0,9 g.dL
-1
SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) na presença do agente desnaturante
duodecil-sulfato de sódio (SDS)
T Temperatura absoluta, dada em Kelvin
T
m
Temperatura de meia transição da desnaturação térmica
viii
ÍNDICE
Página
Introdução..................................................................................................................................... 01
Capítulo 1 (Revisão da literatura): Os eritrócitos como modelo de estudo da estabilidade
de membranas..............................................................................................................................
04
Composição e estrutura das membranas biológicas........................................................ 05
Importância da estabilidade de membranas biológicas.................................................... 07
Os eritrócitos como modelo de estudo de membranas..................................................... 08
Efeito de osmólitos sobre a estabilidade de membranas................................................. 10
Efeito do etanol sobre a estabilidade de eritrócitos.......................................................... 12
Efeito de osmólitos e da temperatura sobre a estabilidade de eritrócitos......................... 14
Considerações finais......................................................................................................... 16
Capítulo 2 (Trabalho experimental): Dependência térmica dos efeitos de glicerol e
sorbitol a 1 M sobre a estabilização e desestabilização in vitro de eritrócitos humanos
por etanol......................................................................................................................................
19
Resumo............................................................................................................................. 20
Abstract............................................................................................................................. 22
Introdução......................................................................................................................... 24
Material e métodos............................................................................................................ 26
Resultados......................................................................................................................... 29
Discussão.......................................................................................................................... 47
Conclusões........................................................................................................................ 56
Referências bibliográficas........................................................................................................... 57
1
INTRODUÇÃO
2
Cromossomas, proteínas e membranas são complexos organizacionais
biológicos, que devem conciliar estabilidade com funcionalidade, para manterem
os organismos vivos ativos em ambientes de composição química flutuante e
sujeitos a oscilações físicas decorrentes do ambiente ou do próprio metabolismo.
Extremos de temperatura, pH, tonicidade e concentrações elevadas de
solutos caotrópicos representam ameaças constantes ao equilíbrio entre a
estabilidade e a funcionalidade dos complexos biológicos.
As células tentam combater essas ameaças, renovando seus complexos
biológicos, mas também controlando a temperatura, o pH, a tonicidade e a ação
deletéria de solutos caotrópicos.
Os organismos vivos podem combater a ação deletéria de solutos
caotrópicos usando solutos orgânicos de baixo peso molecular, genericamente
designados como osmólitos por causa de sua ação estar associada a um
aumento da pressão osmótica do meio.
Há algum tempo o Laboratório de Enzimologia da Universidade Federal de
Uberlândia têm estudado a ação de osmólitos em enzimas e, mais recentemente,
passou também a estudar o comportamento de eritrócitos humanos frente à ação
de osmólitos de ocorrência natural.
O estudo do comportamento dos eritrócitos tem por objetivo entender o
efeito dos osmólitos sobre uma membrana biológica e sem dúvida sobre a própria
célula da qual a membrana é um dos componentes.
As membranas biológicas desempenham inúmeras funções e qualquer
alteração comprometedora de sua estabilidade e funcionalidade também afetará a
estabilidade e a funcionalidade da célula e, conseqüentemente, do organismo,
pois as membranas não são meras barreiras de definição de organelas, células e
tecidos, mas agentes reguladores do transporte e da comunicação (transdução de
sinais) entre diferentes ambientes do organismo.
Os eritrócitos humanos constituem um modelo barato e de fácil obtenção
para estudo do comportamento de outras células dos organismos vivos.
O Laboratório de Enzimologia padronizou um método de estudo da
dependência da hemólise de eritrócitos humanos com a concentração de etanol,
em meio isotônico com o sangue. A ocorrência de hemólise é monitorada pela
3
absorvância em 540 nm (A
540
), associada à liberação de hemoglobina no
processo de lise dos eritrócitos.
A dependência de A
540
com a concentração de etanol define três transições
seqüenciais de naturezas sigmoidais, que podem ser estatisticamente ajustadas
por regressão não-linear. A primeira transição, dada por uma sigmóide crescente,
representa a transição de hemólise ou desnaturação dos estados dos eritrócitos
designados como equinócitos dos tipo I e II, predominantes em baixas
concentrações de etanol. A segunda transição, dada por uma sigmóide
decrescente, representa uma transição de estabilização dos eritrócitos, dada pela
conversão dos equinócitos dos tipos I e II em equinócitos do tipo III ou esferócitos,
predominantes em concentrações mais elevadas de etanol. A terceira transição,
dada também por uma sigmóide crescente, representa a transição de
desnaturação dos esferócitos pelo aumento da concentração de etanol.
Neste trabalho nós nos ocupamos da caracterização da segunda e terceira
transições sigmoidais apresentadas pelos eritrócitos humanos. Essas transições
representam respectivamente a formação e a desnaturação dos esferócitos pelo
etanol. As transições foram estudadas na presença de glicerol ou sorbitol, ambos
a 1 mol.L
-1
, no intervalo térmico entre 27 e 47 °C.
Os resultados e seus significados são apresentados e discutidos (Capítulo
2), após a contextualização do problema no âmbito da literatura científica da área
(Capítulo 1).
4
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
OS ERITRÓCITOS COMO MODELO DE ESTUDO
DA ESTABILIDADE DE MEMBRANAS
5
COMPOSIÇÃO E ESTRUTURA DAS MEMBRANAS BIOLÓGICAS
As membranas biológicas são complexos organizacionais biológicos
compostos de lipídeos, proteínas e carboidratos [DANIELLI e DAVSON, 1935]. Os
principais lipídeos encontrados nas membranas dos mamíferos são fosfolipídeos,
glicoesfingolipídeos e colesterol [MURRAY e GRANNER, 2002]. A proporção
entre lipídeos e proteínas varia conforme as funções mais específicas da
membrana [STORRY, 2004].
Para se obter informações sobre a composição e estrutura das membranas
biológicas, os pesquisadores usam várias abordagens bioquímicas, como o SDS-
PAGE e a aplicação de enzimas específicas, dentre outras. Além disso, também
são usadas técnicas morfológicas, dentre as quais se incluem a microscopia ótica
e a microscopia eletrônica, que pode ser acompanhada de fratura por
congelamento [MURRAY e GRANNER, 2002].
De todas as células humanas, os eritrócitos estão entre as mais estudadas.
Há um amplo conhecimento das proteínas de membrana dessas células. Muitas
dessas proteínas são transportadores de solutos [Storry, 2004]. Suas proteínas
mais estudadas são a proteína da banda 3, a glicoforina, a espectrina e a
gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase. Seus lipídeos mais abundantes são
fosfatidilcolina (25%), fosfatidiletanolanina (22%), fosfatidilserina (10%),
esfigomielina (18%) e colesterol (25%), como descrito na literatura [MURRAY,
2002].
O modelo que melhor retrata a estrutura das membranas biológicas é
aquele proposto por Singer e Nicolson [1972], conhecido por modelo do mosaico
fluido. Neste modelo, os lipídeos das membranas estão unidos entre si e
distribuídos em duas camadas. A porção hidrofílica da monocamada interna fica
exposta para o interior da célula, enquanto a porção hidrofílica da monocamada
externa fica exposta para o exterior da célula, de tal forma que as porções
hidrofóbicas de cada monocamada da membrana ficam em contato no interior da
bicamada. Há proteínas anfipáticas que se distribuem ao longo desta bicamada
lipídica. As proteínas e os lipídeos que constituem a membrana interagem por
meio de interações de van der Waals. Essas forças são de natureza mais fraca do
6
que as ligações covalentes, o que é importante na determinação da consistência
fluídica da membrana [MURRAY e GRANNER, 2002].
A fluidez de uma membrana é dependente da temperatura do meio, mas
também de seu teor de esteróis e de ácidos graxos saturados e insaturados
[CRIBIER, MORROT e ZACHOWSKI, 1993; SINGER e NICHOLSON, 1972].
Os ácidos graxos saturados presentes nos fosfolipídios de membrana
formam uma malha altamente alinhada, que permite o estabelecimento de um
maior número de interações de van der Waals em relação aos ácidos graxos
insaturados cis-configurados, naturalmente presentes em nossas membranas.
Assim, um maior teor em ácidos graxos saturados aumenta a rigidez, ou seja,
diminui a fluidez de uma membrana, enquanto um maior teor em ácidos graxos
insaturados cis-configurados diminui a rigidez ou aumenta a fluidez da membrana
[MURRAY e GRANNER, 2002].
A alteração da fluidez da membrana por meio da quantidade de esteróis é
explicada pela presença do núcleo rígido do anel esteróide, o qual diminui a
liberdade de rotação das ligações carbono-carbono. Isso resulta na diminuição da
fluidez da membrana [MURRAY e GRANNER, 2002].
A elevação da temperatura aumenta a fluidez da membrana, pois o
aumento da agitação térmica promove uma transição de um estado mais
ordenado, semelhante a um gel, para um estado mais desordenado, semelhante
a um líquido. É por isso que a transição de estado físico de uma membrana é
chamada de fusão de membrana e a temperatura intermediária no processo de
fusão de membrana é chamada de temperatura de fusão (T
m
). Quanto maior é o
teor em ácidos graxos saturados e maior é o tamanho de suas cadeias, maior é o
valor de T
m
da membrana [CAMPBELL, 2000; MURRAY e GRANNER, 2002;
NELSON e COX, 2000; VIEIRA, GAZZINELLI e MARES-GUIA, 1996].
A estabilidade de uma membrana é uma medida de sua capacidade em
manter sua estrutura, o que exige a resistência contra os agentes promotores de
desnaturação, como o calor e solutos. Níveis mais elevados em ácidos graxos
saturados e colesterol aumentam, portanto, a estabilidade da membrana contra a
desnaturação pelo calor e por solutos caotrópicos. Entretanto, a fluidez de uma
membrana é primordial para a manutenção das funções de uma célula
metabolicamente ativa. Assim, uma membrana deve equilibrar estabilidade e
7
fluidez para manter a célula ativa. Isso exige a interação com o ambiente
extracelular, que está em constante modificação, por meio de processos como o
transporte de substâncias através da membrana e a recepção e transdução de
sinais [MURRAY e GRANNER, 2002].
IMPORTÂNCIA DA ESTABILIDADE DAS MEMBRANAS BIOLÓGICAS
As membranas biológicas apresentam a função primária de delimitar
espaços biológicos, como células e organelas. Nesses espaços pode ser
realizado um melhor controle sobre o fluxo de vários elementos, como água,
eletrólitos e solutos orgânicos. Com isso, é possível criar micro-ambientes
propícios para a realização de reações químicas ou processos que dependem da
alteração desse micro-ambiente, como é o caso da regulação de vários genes
[MURRAY e GRANNER, 2002]. Desse modo, alterações que comprometem a
estabilidade de membranas afetarão o funcionamento celular, o que poderá ser
bastante prejudicial para o organismo.
Outro aspecto que retrata a importância da estabilidade de membranas é o
grande interesse dos biotecnologistas em preservar a integridade física e
funcional de materiais biológicos naturais, como grãos de pólen, óvulos,
espermatozóides, embriões, tecidos e células, particularmente de elementos
figurados do sangue. A estabilidade de membranas também é muito importante
na utilização biotecnológica de lipossomos, que são vesículas criadas
artificialmente a partir de uma bicamada lipídica, em processos como o transporte
de fármacos no interior do organismo [SCOTT, LECAK e ACKER, 2005; STOREY
et al., 1996].
Destes materiais biológicos, os eritrócitos biopreservados atendem à
demanda clínica de pacientes com anemia, hemorragia e baixa produção de
elementos sanguíneos pela medula óssea [BAKALTCHEVA, ODEYALE e
SPARGO, 1996; BOGNER et al., 2002; DE LOECKER et al., 1993; Eroglu et al.,
2000; MOECKEL et al., 2002; PELLERIN-MENDES et al., 1997; WAGNER et al.,
2002]. Nesse sentido, o uso de osmólitos naturais aparece como alternativa viável
de biopreservação, distintamente da criopreservação, por não promover efeitos
8
deletérios nos complexos organizacionais biológicos [SCOTT, LECAK e ACKER,
2005; STOREY et al., 1996].
OS ERITRÓCITOS COMO MODELO DE ESTUDO DE MEMBRANAS
Os eritrócitos ou células vermelhas do sangue (RBC) são utilizadas em
muitos estudos relacionados à composição e ao comportamento de membrana,
contribuindo assim, com informações para estimar o comportamento de outras
membranas celulares. Além disso, qualquer alteração da membrana das RBC,
seja em sua composição ou estabilidade, serve de ferramenta diagnóstica para
uma série de doenças e para estudos de comportamentos celulares mediante
ganho de idade, exercícios físicos e dieta [FIRMINO, 2007; GOUVÊA-e-SILVA,
2006; MARIGLIANO et al., 1999; MARRA et al., 1996; MAZZANTI et al., 2002;
SRINIVASAN e KEMPAIAH, 2006]
Um método de baixo custo e eficácia para estudar a estabilidade de
membranas de eritrócitos é o teste de fragilidade osmótica dos eritrócitos (FOE).
A FOE pode ser definida como a resistência de eritrócitos à hemólise por
hipotonicidade. Ela é determinada pelo uso de soluções tamponadas de NaCl em
água destilada em concentrações decrescentes de 0,9 a 0% [JAIN, 1986, apud
Elias et al., 2004). Em meio hipotônico, os eritrócitos aumentam de volume até
atingir um volume crítico de hemólise. A partir desse ponto há um rompimento da
membrana [JAIN, 1973, apud ELIAS et al., 2004]. Nesse tipo de estudo é
conveniente fazer um monitoramento da lise de eritrócitos mediante a leitura de
absorbância da hemoglobina em um espectrofotômetro com comprimento de
onda ajustado em 540 nm [MOECKEL et al., 2002; NELSON e COX, 2000].
Desse modo, podemos determinar a concentração de cloreto de sódio que causa
50% de hemólise (H
50
).
Os eritrócitos de diferentes espécies animais podem-se comportar de
modos diferentes [JAIN, 1986, apud ELIAS et al., 2004]. Segundo Saunders e
Aldrich [2001], a fragilidade osmótica de animais ectotérmicos e endotérmicos é
distinta. Os eritrócitos dos animais ectotérmicos são mais resistentes.
9
Há diferenças na concentração de sal que determina a estabilidade normal
do eritrócito em animais sadios de diferentes espécies [ELIAS et al., 2004].
Essas diferenças na estabilidade dos eritrócitos são devidas a vários
fatores de natureza intrínseca ou extrínseca. Os fatores intrínsecos compreendem
forma, volume, tamanho e tipo do eritrócito, quantidade de hemoglobina,
composição química e viscoelasticidade de sua membrana [PERK et al., 1964,
apud ELIAS et al., 2004).
Ao que parece, as células menores apresentam menor capacidade de
expansão e atingem o volume hemolítico crítico mais precocemente. Alterações
na composição da membrana celular afetam o formato da célula em pacientes
humanos, reduzindo a FOE [WEED e REED, 1966, apud ELIAS et al., 2004;
TELEN e KAUFMAN, 1999]. O tempo de vida da célula também é muito
importante, já que os eritrócitos velhos, que correspondem a 30% da população
eritrocitária, são mais frágeis do que os eritrócitos jovens [PERK et al., 1964, apud
ELIAS et al., 2004).
Os fatores extrínsecos responsáveis pela redução da FOE compreendem
variações fisiológicas, como as pós-prandiais, e também variações patológicas,
que incluem a presença de hematozoários, uremia, cirrose, processos auto-
imunes, dentre outros [JAIN, 1973, apud ELIAS et al., 2004; MAKINDE e
BOBADE, 1994].
Os fatores intrínsecos e extrínsecos podem estar intimamente relacionados
de modo a provocar alterações na FOE. Por exemplo, em indivíduos com
doenças associadas a alterações metabólicas, como insuficiência renal [SASAKI,
1977, apud ELIAS et al., 2004] e doença hepática [OYABU et al., 1982], ocorre
uma modificação na proporção de fosfolipídeos e de colesterol na membrana
eritrocitária.
A membrana celular de eritrócitos maduros também pode sofrer alterações
em sua composição lipídica de acordo com as alterações dos lipídios circulantes
[DIMOPOULLOS e BEDELL, 1962, apud ELIAS et al., 2004; TELEN e KAUFMAN,
1999]. Os eritrócitos maduros não são capazes de sintetizar lipídeos, pois
desprovidos da atividade de enzimas lipogênicas como a acetil CoA carboxilase
[PITTMAN e MARTIN, 1966, apud ELIAS et al., 2004; TELEN e KAUFMAN,
1999].
10
EFEITO DE OSMÓLITOS SOBRE A ESTABILIDADE DE MEMBRANAS
As membranas biológicas e outros complexos organizacionais biológicos,
como proteínas, cromossomos, células e tecidos, devem manter a sua estrutura
organizacional íntegra para que continuem funcionais. Para tal, os organismos
desenvolveram mecanismos para combaterem os fatores desestabilizadores,
como extremos de pH, temperatura, pressão, tonicidade e/ou de solutos
caotrópicos.
Há vários mecanismos que permitem a um organismo tolerar condições de
estresse, como a incorporação de diferentes tipos de ácidos graxos na membrana
plasmática, além da produção de solutos orgânicos não-iônicos de pequena
massa molecular, denominados osmólitos [BOROWITZA e BROWN, 1974;
BOWLUS e SOMERO, 1979; NIKOLOPOULOS e MANETAS, 1991; POLLARD e
WYN JONES, 1979; YANCEY, 1985]. Os osmólitos formam soluções miscíveis
com as moléculas do solvente (água) em torno do complexo biológico [BAIER e
MCCLEMENTS, 2003; BAIER, DECKER e MCCLEMENTS, 2004] e atuam,
portanto, como co-solventes.
Os osmólitos de ocorrência natural compreendem três classes principais:
álcoois polidroxílicos (como o glicerol e o sorbitol), aminoácidos e derivados
(como a glicina, a metilglicina, a dimetilglicina e a trimetilglicina) e combinação de
uréia e metilaminas [SOMERO, 1986, apud PFEIL et al., 1998; YANCEY et al.,
1982]. Há também os açúcares, como a sacarose e a trehalose, dentre outros
[YANCEY et al., 1982].
Os osmólitos também podem ser classificados, de acordo com seus efeitos
sobre a atividade de proteínas, em solutos compatíveis e solutos não-
compatíveis. Os solutos compatíveis são aqueles que não perturbam a atividade
da proteína em temperatura próxima à ambiente [FIELDS et al., 1977, apud PFEIL
et al., 1998), como glicina, sacarose, glicerol e sorbitol, mesmo estando em altas
concentrações [YANCEY et al., 1982]. Já os solutos não-compatíveis, como a
uréia e os aminoácidos básicos livres, são aqueles que perturbam a atividade da
proteína.
O acúmulo de osmólitos é uma estratégia imprescindível para a
sobrevivência de vários seres vivos. É o que acontece, por exemplo, em alguns
11
peixes marinhos, como tubarões e arraias. A concentração de sal no corpo
desses animais é inferior àquela do meio em que vivem. Para evitar problemas
osmóticos, eles retêm uréia. Entretanto, níveis elevados de uréia podem provocar
a desestabilização de proteínas. Para neutralizar os efeitos deletérios da uréia,
esses animais marinhos produzem óxido de trimetilamina (TMAO), que é um
osmólito [YANCEY et al., 1982].
A origem da estabilização de membranas biológicas por osmólitos, ou
osmoestabilização de membranas biológicas, é uma questão ainda controversa,
mas que deve estar fundamentada em um mecanismo chamado de efeito
solvofóbico [TIMASHEFF e ARAKAWA, 1989] ou osmofóbico [BOLEN e
BASKAKOV, 2001], originalmente usado para explicar a estabilização de
proteínas por aqueles co-solventes [BERNARDINO NETO, 2006; FINOTTI, 2006;
FIRMINO, 2007; GOUVÊA-E-SILVA, 2006].
O efeito solvofóbico ou osmofóbico é caracterizado pela maior afinidade
pela água do que pela mistura osmólito-água dos grupos apolares [GEKKO e
TIMASHEFF, 1981a; GEKKO e TIMASHEFF, 1981b] e do esqueleto peptídico
[LIU e BOLEN, 1995] da proteína, partes da proteína que ficam mais expostas ao
solvente no estado desnaturado. Assim, o osmólito é preferencialmente excluído
da camada de hidratação da proteína.
As moléculas de água da camada de hidratação possuem menor
mobilidade e são altamente organizadas. Como a superfície de exposição ao
solvente de uma proteína no estado desnaturado é maior do que no estado
nativo, isso significa que a camada de hidratação que se forma ao redor de uma
proteína do estado desnaturado é maior do que aquela do estado nativo.
A formação da camada de hidratação envolve um aumento de energia
livre. Como o estado desnaturado possui uma camada de hidratação mais
extensa do que o estado nativo, isso significa que há uma maior quantidade de
energia livre associada ao estado desnaturado do que ao estado nativo. Como os
estados nativo e desnaturado estão em equilíbrio, o fato de o estado desnaturado
possuir maior quantidade de energia livre promove o deslocamento desse
equilíbrio em direção ao estado nativo, que passa a ser favorecido. Isso significa
que o estado nativo está sendo estabilizado relativamente ao estado desnaturado.
12
O efeito osmofóbico também deve estar associado a outros fatores, como a
exclusão espacial do osmólito e alterações na constante dielétrica e na
viscosidade da solução [FIELDS, 2001; QU, BOLEN e BOLEN, 1998; SAUNDERS
et al., 2000; TAYLOR et al., 1995; WANG e BOLEN, 1997; WANG, ROBERTSON
e BOLEN, 1995; YANCEY, 2001]. Os co-solventes neutros podem modular as
forças de atração e repulsão entre as proteínas [BAIER et al., 2004;
MCCLEMENTS, 2002; RECORD et al., 1998; TIMASHEFF, 1993] e a freqüência
de colisões entre as moléculas da proteína, por aumento na viscosidade do meio
[KULMYRZAEV, BRYANT e MCCLEMENTS, 2000; KULMYRZAEV,
CANCALLIERE e MCCLEMENTS, 2000].
EFEITO DO ETANOL SOBRE A ESTABILIDADE DE ERITRÓCITOS
A ação do etanol sobre as membranas de diferentes células do organismo
pode ser estudada in vitro a partir do estudo do comportamento dos eritrócitos na
presença de etanol.
A administração de etanol in vivo aumentaria a fluidez da membrana
[SEEMAN, 1972, apud YAMADA et al., 1999; BURGEN e METCALFE, 1970,
apud YAMADA et al., 1999), o que resultaria em redução da velocidade de
hemólise do eritrócito (BURGEN e METCALFE, 1970, apud YAMADA et al.,
1999].
Entretanto, o etanol é um agente caotrópico que promove a desnaturação
de diversas proteínas, inclusive daquelas encontradas na membrana de eritrócitos
humanos. Ele leva à abertura de poros por onde ocorre saída de hemoglobina
[ZAVODNIK, PILETSKAIA e STEPURO, 1994].
O etanol pode induzir a geração de diferentes estados conformacionais em
eritrócitos, os quais podem ser classificados em equinócitos dos estados I (EI), II
(EII) e III (EIII) e estomatócitos (S). Cada um desses estados se caracteriza por
modificações específicas na forma do eritrócito. Assim, em EI, os eritrócitos são
discóides com contorno irregular, enquanto que em EII essas mesmas células
estão achatadas e com espículas. Já em EIII, tais células são esféricas
13
(esferócitos) com espículas, ao passo que em S essas células têm a forma de
feijão [BESSIS et al., 1972; YAMADA et al., 1999].
Somente as conformações EI e EII dos eritrócitos possuem a membrana
mais fluídica e a velocidade de hemólise reduzida [YAMADA et al., 1999].
Isso significa que, dependendo das condições, o etanol pode estabilizar ou
desestabilizar os eritrócitos, o que repercute sobre a taxa de hemólise.
Entre 0 e 45 mL.dL
-1
de etanol, na presença de NaCl a 0,9 g.dL
-1
, os
eritrócitos humanos sofrem uma transição de hemólise com ponto intermediário
(D
50R
) em 14,28 mL.dL
-1
de etanol, uma transição de estabilização com ponto
intermediário (S
50T
) em 26,49 mL.dL
-1
de etanol, e uma segunda transição de
hemólise com ponto intermediário (D
50T
) em 34,76 mL.dL
-1
de etanol [Gouvêa-e-
Silva, 2006]. Essas transições foram ilustradas na Figura 1.1 (página 17).
Observações por microscopia de luz mostraram que antes da primeira
transição de hemólise, em 2,0 mL de etanol por dL de solução salina, os
eritrócitos existiam em um estado expandido e com e sem espículas, que foi
designado como estado R por analogia com o estado R das proteínas. Este
estado com certeza representa os equinócitos dos estados I e II [BESSIS et al.,
1972; YAMADA et al., 1999]. Mas antes da segunda transição de hemólise, em 32
mL de etanol por dL
-1
de solução salina, os eritrócitos estavam presentes em um
estado contraído ou apertado, que foi designado como estado T por analogia com
o estado T das proteínas [GOUVÊA-e-SILVA, 2006]. Este estado T com certeza
representa os equinócitos do estado III ou esferócitos [BESSIS et al., 1972;
YAMADA et al., 1999]. A Figura 1.2 (página 18) mostra um modelo ilustrativo dos
efeitos do etanol sobre as transições de estados morfológicos dos eritrócitos.
Assim, a transição de hemólise descrita em 14,28 mL de etanol por dL de
salina deve representar a transição de desnaturação do estado R, enquanto as
transições de estabilização e de hemólise descritas em 26,49 e em 34,76 mL de
etanol por dL de salina devem representam respectivamente as transições de
estabilização (geração do estado T) e de desnaturação do estado T dos eritrócitos
[GOUVÊA-e-SILVA, 2006].
O etanol, portanto, apresenta efeitos antagônicos sobre a membrana de
eritrócitos, um efeito caotrópico e um efeito estabilizador.
14
Em meio aquoso, o etanol compete com a água pela formação de ligações
de hidrogênio com lipídeos e proteínas da superfície da membrana. Como ele é
capaz de formar ligações de van der Waals com grupos apolares, tanto de
proteínas quanto dos lipídeos de membrana, ele pode contribuir para a remoção
de água da superfície da membrana, o que induziria alterações na conformação
das proteínas e da própria membrana. A desnaturação do estado R do eritrócito
pelo etanol é fundamentada na ação caotrópica desse solvente [GOUVÊA-e-
SILVA, 2006].
Por outro lado, o efeito estabilizador do etanol fundamenta-se em sua ação
como um osmólito. A incubação de eritrócitos em etanol a 26,49 mL de etanol por
dL de salina gera uma situação onde predomina a ação estabilizadora sobre a
ação caotrópica, mas com um aumento da concentração de etanol além de 34,76
mL de etanol por dL de salina, o próprio aumento na pressão osmótica se
encarrega de promover desnaturação do estado T dos eritrócitos [GOUVÊA-e-
SILVA, 2006].
EFEITO DE OSMÓLITOS E DA TEMPERATURA SOBRE A ESTABILIDADE DE
ERITRÓCITOS
Cada tipo de célula possui uma resistência intrínseca ao calor, o que
possibilita o seu uso para estabilização de alimentos, tratamento de câncer,
separação de linhagens celulares, dentre outras aplicações. A resistência celular
ao calor pode ser reduzida por fatores físicos, como pressão elevada e radiação
ionizante, e também por fatores químicos, como solventes orgânicos [WEBER e
BONT, 1996], anestésicos anfifílicos [YATVIN et al., 1982], detergentes, ácidos
graxos, agentes desnaturantes [ALEXANDROV, 1985, apud IVANOV, 2002] e
altos níveis de cálcio no meio extracelular [STEGE et al., 1993].
As bactérias termofílicas possuem uma elevada resistência térmica devida
ao elevado teor de ácidos graxos de cadeia longa e saturada nos seus lipídeos de
membrana [RUSSELL e FUKUNAGA, 1990]. Essa composição lipídica da
membrana celular pode ser modificada durante o desenvolvimento do organismo,
conforme as condições do meio [YATVIN et al., 1986; LADHA et al., 1993;
15
SPECTOR e BURNS, 1987], no sentido de conferir à membrana a composição
necessária para conciliar estabilidade e funcionalidade.
A temperatura também afeta as ações caotrópica e estabilizante de có-
solventes.
O aumento da temperatura diminui o ponto da meia transição de hemólise
(D
50
) de eritrócitos pelo etanol, o que significa que o calor e o etanol apresentam
um sinergismo de ação caotrópica sobre eritrócitos [BERNARDINO NETO, 2006;
FINOTTI, 2006].
Embora, na presença de salina e a 37 °C, entre 0 e 1,5 mol.L
-1
, o sorbitol
não promova lise de eritrócitos humanos, a 1 mol.L
-1
ele também potencializa a
ação caotrópica do etanol. Esse sinergismo de ação caotrópica entre o sorbitol e
o etanol ocorre na faixa de temperatura de 27 a 47 °C, mas declina com o
aumento da temperatura até desaparecer em torno de 68,6 °C, quando o sorbitol
passa a combater a ação desnaturante promovida pelo etanol e pelo calor
[BERNARDINO NETO, 2006].
Na presença de salina e a 37 °C, entre 0 e 2,8 mol.L
-1
, o glicerol não
promove lise de eritrócitos humanos, mas a 1 mol.L
-1
ele também potencializa a
ação caotrópica do etanol, entre 24,7 e 45,9 °C, mas além desses limites de
temperatura ele neutraliza a ação hemolítica promovida pela combinação da ação
do etanol com o frio ou calor [FINOTTI, 2006].
Essa ação estabilizadora do glicerol a baixas temperaturas justifica sua
utilização na criopreservação de eritrócitos [BAKALTCHEVA, ODEYALE e
SPARGO, 1996; BOGNER et al., 2002; DE LOECKER et al., 1993; EROGLU et
al., 2000; MOECKEL et al., 2002; PELLERIN-MENDES et al., 1997; WAGNER et
al., 2002]. A 4,35 mol.L
-1
, o glicerol permite a criopreservação a -80 °C de
eritrócitos humanos por períodos de até 10 anos [KRIJNEN, KUIVENHOVEN e
WIT, 1968; ROWE, EYSTER e KELLNER, 1968; WALKER, 1996], sem prejuízo
de sua estabilidade [WAGNER et al., 2002].
A ação estabilizadora do sorbitol e do glicerol a temperaturas mais
elevadas pode ser uma manifestação na membrana como um todo da ação mais
específica daqueles osmólitos sobre proteínas. Tanto o glicerol quanto o sorbitol
são capazes de aumentar o valor de T
m
das proteínas, ou sejam, eles elevam a
quantidade de calor necessária para levar as proteínas ao ponto de meia-
16
desnaturação pelo calor [BAIER e MCCLEMENTS, 2003; BAIER, DECKER, e
MCCLEMENTS, 2004].
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A estabilidade da membrana de eritrócitos pode ser afetada por fatores
como a alimentação, a lipogênese, a temperatura, o pH e a concentração de
solutos caotrópicos e osmólitos. Um caotrópico, como o etanol apresenta uma
ação dualística sobre uma membrana, podendo promover lise ou estabilização,
conforme sua concentração e a ação combinada de outros fatores. Os osmólitos
também apresentam uma ação dualística sobre as membranas de eritrócitos,
podendo promover estabilização e desestabilização de sua estrutura, conforme
sua concentração e a interferência de outros fatores.
17
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
D
50T
S
50T
% Hemólise
% (v/v) Etanol
D
50R
A
B
Figura 1.1. Dependência da percentagem de hemólise com a concentração de etanol em
solução salina fisiológica a 37 °C. O gráfico A representa a lise induzida por etanol do
estado morfológico R dos eritrócitos. Esta transição é caracterizada pela concentração de
etanol que promove 50% de hemólise (D
50R
) nos eritrócitos do estado R. O gráfico B
representa a geração induzida por etanol do estado estabilizado T dos eritrócitos,
caracterizada pelo ponto de meia-transição (S
50T
), e seguida pela lise induzida por etanol
do estado estabilizado T, caracterizada pelo seu ponto de meia-transição transição (D
50T
)
[GOUVÊA-e-SILVA, 2006].
18
Adição de etanol
•
•
A
A
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1
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)
)
3
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(
(
D
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5
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T
T
)
)
Eritrócitos lisados
Figura 1.2. Modelo ilustrativo das ações do etanol sobre eritrócitos em solução salina. Os
eritrócitos existiriam em estado morfológico expandido (R) ou condensado (T). Cada
estado morfológico representaria um conjunto de diferentes formas. Baixas concentrações
de etanol promoveriam lise do estado R (rota 1). Concentrações intermediárias de etanol
promoveriam um deslocamento do estado R dos eritrócitos para o estado T (rota 2), por
aumento na pressão osmótica. Altas concentrações de etanol promoveriam lise do estado T
(rota 3) [BERNARDINO NETO, 2006; FINOTTI, 2006].
19
CAPÍTULO 2
PARTE EXPERIMENTAL
DEPENDÊNCIA TÉRMICA DOS EFEITOS
DE GLICEROL E SORBITOL A 1 M
SOBRE A ESTABILIZAÇÃO E DESESTABILIZAÇÃO
IN VITRO DE ERITRÓCITOS HUMANOS POR ETANOL
20
RESUMO
DEPENDÊNCIA TÉRMICA DOS EFEITOS DE GLICEROL E SORBITOL A 1 M
SOBRE A ESTABILIZAÇÃO E DESESTABILIZAÇÃO IN VITRO DE
ERITRÓCITOS HUMANOS POR ETANOL
Eritrócitos incubados em soluções salinas com concentrações crescentes
de etanol sofrem alterações morfológicas e físico-químicas. Em solução salina de
etanol a 2% os eritrócitos estão presentes em um estado morfológico expandido
(R) e são designados como equinócitos. Entre 12,52 e 16,10% de etanol em
solução salina, os eritrócitos do estado R sofrem uma transição sigmoidal de lise,
com um ponto de meia-transição de lise (D
50R
) em 14,28% de etanol. Mas entre
24,67 e 28,37%, os eritrócitos apresentam uma transição de estabilização, com
um ponto de meia transição de estabilização (S
50
) em 26,49% de etanol. Em
solução salina de etanol a 32%, eritrócitos íntegros, em meio a alguns eritrócitos
lisados, estão presentes em um estado morfológico contraído (T) e são
designados como esferócitos. Em 28,37% de etanol começa uma transição
sigmoidal de lise do estado T dos eritrócitos, com um ponto de meia transição
(D
50T
) em 34,76% de etanol. A transição de estabilização seguida da
desestabilização dos eritrócitos pelo etanol forma um “buraco” na curva de
hemólise em função da concentração de etanol. O presente trabalho teve por
objetivo estudar o efeito de dois osmólitos, o glicerol e o sorbitol, ambos a 1
mol.L-1, sobre a dependência térmica da estabilização e desestabilização de
eritrócitos pelo etanol em solução salina fisiológica. A transição de estabilização
foi caracterizada pelo ponto de meia-transição (S
50
) e pela profundidade da
sigmóide de estabilização (P
S
) dos eritrócitos, que constitui uma estimativa da
população de eritrócitos estabilizados. A transição de lise do estado estabilizado
(T) foi caracterizada pelo ponto de meia-transição (D
50T
) e pela profundidade da
sigmóide de desestabilização (P
D
) dos eritrócitos, que constitui uma estimativa da
população de eritrócitos lisados. Os valores de S
50
apresentaram declínios
lineares estatisticamente significantes com o aumento da temperatura tanto em
salina pura quanto em solução salina de glicerol ou sorbitol; além disso, as retas
21
de dependência térmica de S
50
apresentaram valores de S
50
mais baixos em
salina com glicerol ou sorbitol do que em salina pura. Isso deve significar que o
efeito de estabilização dos eritrócitos tem uma origem osmótica, pois tanto o
aumento da temperatura quanto a incorporação de glicerol ou sorbitol aumentam
a pressão osmótica do meio. Embora os valores de P
S
não tenham sido
significantemente afetados pelo aumento da temperatura, a presença do glicerol
ou do sorbitol produziu uma dependência térmica significante em P
S.
Em
temperaturas mais baixas a presença de glicerol ou sorbitol diminui
significantemente a população de eritrócitos estabilizados, mas com o aumento da
temperatura há um aumento da população de eritrócitos estabilizados. Isso
sugere que o efeito estabilizador do etanol sobre os eritrócitos não tenha
exclusivamente uma origem osmótica, mas esteja relacionado com uma interação
direta com a malha lipídica da membrana. Os valores de D
50T
apresentaram uma
dependência negativa estatisticamente significante com o aumento da
temperatura, tanto em salina pura quanto em salina de glicerol ou sorbitol. Como
os valores de D
50T
das retas de dependência térmica foram menores na presença
de glicerol e de sorbitol do que de salina pura, isso indica que a lise do estado T
dos eritrócitos teria uma origem osmolar. Os valores de P
D
apresentaram
dependências positivas significantes tanto em salina pura quanto em salina de
glicerol e sorbitol. Os baixos valores de P
D
observados em salina de glicerol ou
sorbitol às temperaturas mais baixas do intervalo térmico considerado são
devidos à pequena população de eritrócitos estabilizados nessas condições. Em
suma, glicerol e sorbitol a 1 mol.L
-1
em solução salina fisiológica e o aumento na
temperatura aumentam a pressão osmótica do meio e agem em sinergismo com o
etanol tanto na formação quanto na lise do estado T dos eritrócitos.
Palavras-chave: caotrópicos, eritrócitos, estabilidade de membranas, etanol,
osmólitos.
22
ABSTRACT
THERMAL DEPENDENCE OF THE EFFECTS OF 1 M GLYCEROL AND
SORBITOL ON THE IN VITRO STABILIZATION AND DESTABILIZATION OF
HUMAN ERYTHROCYTES BY ETHANOL
Incubation of erythrocytes in saline solutions with increasing concentrations
of ethanol produces morphological and physicochemical alterations. In saline
solution of 2% ethanol, erythrocytes are present in an expanded morphological
state (R) and are designated as echinocytes. Between 12.52 and 16.10% ethanol
in saline solution, the R state erythrocytes suffer a sigmoidal lysis transition, with a
half-transition point (D
50R
) at 14.28% ethanol. But between 24.67 and 28.37%,
erythrocytes present a stabilization transition with a half-transition point (S
50
) at
26.49% ethanol. In saline solution of 32% ethanol, integer erythrocytes are
present, among lysed cells, in a contracted morphological state (T) and are
designated as espherocytes. At 28.37% ethanol begins a sigmoidal lysis transition
of the T state of the erythrocytes, with a half-transition point (D
50T
) at 34.76%
ethanol. The stabilization transition followed but the destabilization transition by
ethanol forms a “hole” or “pocket” in the lysis curve of erythrocytes by ethanol. The
present work had the aim to study the effect of two osmolytes, glycerol and
sorbitol, both at 1 mol.L
-1
, on the thermal dependence of the stabilization and
destabilization of erythrocytes by ethanol in physiological saline solution. The
stabilization transition was characterized by the half-transition point (S
50
) and by
the deepness of the stabilization sigmoid (P
S
) of the erythrocytes, which
constitutes an estimative of the stabilized population of erythrocytes. The lysis
transition of the stabilized state (T) was characterized by the half-transition point
(D
50T
) and by the deepness of the destabilization sigmoid (P
D
) of the erythrocytes,
which constitute an estimative of the lysed population of erythrocytes. The S
50
values presented statistically significant linear declines with the temperature
increase in pure saline as in saline solution of glycerol and sorbitol; on the other
side, the thermal dependence lines of S
50
presented lower S
50
values in saline
solutions of glycerol or sorbitol than in a pure saline solution. This shall mean that
23
the stabilization effect of the erythrocytes has an osmotic origin, since the
temperature increase as the incorporation of glycerol or sorbitol to the solution
increased the osmotic pressure of the medium. Although the P
S
values were not
significantly changed by the temperature increase, the presence of glycerol and
sorbitol produced significant thermal dependences for P
S.
At the lower
temperatures of the interval the presence of glycerol or sorbitol decreased
significantly the population of stabilized erythrocytes, but with the temperature
increase there is an increase in the population of stabilized erythrocytes. This
suggests that the stabilizing effect of ethanol doesn’t have exclusively an osmotic
origin, but also an action based on a direct interaction with the lipid bilayer of the
membrane. The D
50T
values presented a negative and statistically significant
dependence with the temperature increase in the pure saline solution as well in
the saline solution of glycerol or sorbitol. Since the D
50T
values of the thermal
dependencies lines were smaller in the presence of glycerol and sorbitol than they
were in the pure saline solution, this indicates that the lysis of the T state of the
erythrocytes would have an osmolar origin. The P
D
values presented positive and
significant dependencies in pure saline solution as well as in saline solutions of
glycerol and sorbitol. The smaller values of P
D
observed in saline solutions of
glycerol and sorbitol at the lower temperatures of the thermal interval we
considered are due to the smaller population of erythrocytes that were stabilized
under those conditions. In summary, 1 mol.L
-1
glycerol or sorbitol in physiologic
saline solution and the temperature increase produce increments in the osmotic
pressure of the medium and act in synergism with ethanol in the formation and in
the lysis of the T state of the erythrocytes.
Key words: chaotropics, erythrocytes, ethanol, membrane stability, osmolytes.
24
INTRODUÇÃO
Os eritrócitos constituem um modelo conveniente para estudo da
estabilidade de membranas biológicas, devido a sua fácil obtenção e a sua
capacidade de liberar, quando lisados, a proteína hemoglobina, que pode ser
espectrofotometricamente monitorada em 540 nm.
A estabilidade de membrana do eritrócito é em si uma questão muito
importante no diagnóstico, caracterização e monitoração de hemoglobinopatias,
bem como na preservação de células sanguíneas para fins terapêuticos
[BAKALTCHEVA, ODEYALE e SPARGO, 1996; BOGNER et al., 2002; DE
LOECKER et al., 1993; EROGLU et al., 2000; KRIJNEN, KUIVENHOVEN e WIT,
1968; MOECKEL et al., 2002; PELLERIN-MENDES et al., 1997; ROWE, EYSTER
e KELLNER, 1968; WAGNER et al., 2002; WALKER, 1996].
Dentre os vários fatores que podem afetar a estabilidade da membrana dos
eritrócitos estão a temperatura, o pH, a tonicidade e a concentração de solutos
caotrópicos, como o etanol, e estabilizantes, como os osmólitos.
Os osmólitos são solutos capazes de estabilizar complexos biológicos
como cromossomas, proteínas e membranas. Sua ação estabilizadora está
relacionada com o aumento da pressão osmótica do meio, razão pela qual eles
receberam a designação de osmólitos.
O etanol é um soluto caotrópico, capaz de desnaturar proteínas e danificar
a membrana do eritrócito, produzindo hemólise, mas também capaz de aumentar
a pressão osmótica, levando a uma estabilização de proteínas [USHA et al., 2006]
e de membranas.
Os eritrócitos normalmente têm um formato discóide em solução isotônica
com o sangue, mas na presença de etanol eles são encontrados na forma de
disco, muitas vezes com espículas (equinócitos) e de esferas (esferócitos)
[BESSIS, 1972; YAMADA et al., 1999], estruturas que diferem na velocidade de
hemólise [YAMADA et al., 1999].
A uma baixa concentração de etanol (2,0 mL de etanol por dL
de salina), os
eritrócitos apresentam um maior diâmetro e espículas laterais. O aumento na
concentração, além de 12,52 mL de etanol por dL de salina, determina uma
25
transição sigmoidal crescente em A
540
, com um ponto de meia-transição a uma
concentração de etanol de 14,28 mL.dL
-1
. Essa transição foi atribuída à transição
de lise dos equinócitos, que constituiriam um estado relaxado ou R dos eritrócitos
[GOUVÊA-e-SILVA, 2006].
Acima de 16,10 mL de etanol por dL de salina, os eritrócitos encontram-se
completamente hemolisados, mas em 32,0 mL.dL
-1
eritrócitos íntegros são vistos,
porém com um menor diâmetro, junto de eritrócitos completamente lisados. Entre
24,67 e 28,37 mL.dL
-1
, há um declínio sigmoidal de A
540
, com um ponto de meia-
transição a uma concentração de etanol de 26,49 mL.dL
-1
. Essa transição foi
atribuída à transição de formação dos esferócitos, que constituiriam um estado
apertado ou T dos eritrócitos. A formação desse estado T dos eritrócitos seria
devida ao efeito do etanol como osmólito [GOUVÊA-e-SILVA, 2006].
Entretanto, acima de 28,37 mL.dL
-1
, os eritrócitos sofrem uma transição de
hemólise, com um ponto de meia-transição em 34,76 mL.dL
-1
. Essa transição foi
atribuída à lise do estado T dos eritrócitos, decorrente da elevação da pressão
osmótica além de um nível crítico estabilizante em sinergismo com a ação
caotrópica do etanol [GOUVÊA-e-SILVA, 2006].
Os efeitos do glicerol e sorbitol, que são osmólitos não-caotrópicos, sobre a
primeira transição de lise dos eritrócitos, foram estudados por este laboratório
[BERNARDINO NETO, 2006; FINOTTI, 2006].
Neste trabalho, nós nos propusemos a estudar os efeitos do glicerol e do
sorbitol sobre a transição de estabilização ou formação do estado T dos eritrócitos
pelo etanol e sobre a transição de lise desse estado T no intervalo térmico entre
27 e 47 °C.
26
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta das amostras de sangue
Este estudo foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
(CEP) da Universidade Federal de Uberlândia e pelos doadores voluntários
recrutados, todos de aparência saudável, não fumantes, sem uso de medicação e
não consumidores de bebidas alcoólicas.
Foram coletados 3 mL de sangue em seringas heparinizadas da veia
antecubital de voluntários humanos masculinos (n=12, 20-28 anos), após jejum
noturno de 8 a 12 horas.
Dependência da estabilidade dos eritrócitos humanos com a concentração
de etanol
A estabilidade dos eritrócitos foi analisada em soluções com 12 a 60 mL de
etanol por dL de salina (NaCl a 0,9 g.dL
-1
). A cada unidade de uma série
duplicada de frascos de evacuados, foi adicionado1 mL da solução teste. Após
pré-incubação a 27, 32, 37, 42 ou 47 °C, foram adicionados 25 μL de sangue em
cada tubo. Após homogeneização e incubação em cada temperatura, os frascos
foram centrifugados a 600xg por 10 minutos e os sobrenadantes foram analisados
quanto à absorção espectrofotométrica da luz visível de 540 nm (A
540
) de
comprimento de onda, com uso de um espectrofotômetro Micronal B442 (São
Paulo, SP, Brasil), usando como branco uma solução de NaCl a 0,9 g.dL
-1
.
Dependência da estabilidade dos eritrócitos humanos com a concentração
de etanol na presença de glicerol
A uma série de baterias de tubos evacuados contendo 1 mL de solução de
etanol com concentrações variáveis entre 12 e 50 mL de etanol por dL de salina
(NaCl a 0,9 g.dL
-1
) com glicerol a 1 mol.L
-1
, pré-incubadas a 27, 32, 37, 42 ou 47
°C, por 10 minutos, eram adicionadas alíquotas de 25 µL de sangue em cada
tubo. Após homogeneização, os tubos foram incubados por 30 minutos em cada
temperatura e depois centrifugados por 10 minutos a 600xg. Durante as
27
incubações os tubos permaneceram fechados. As absorvâncias dos
sobrenadantes foram lidas em 540 nm usando como branco uma solução de
glicerol a 1 mol.L
-1
em NaCl a 0,9 g.dL
-1
.
Dependência da estabilidade dos eritrócitos humanos com a concentração
de etanol na presença de sorbitol
A uma série de baterias de tubos evacuados contendo 1 mL de solução de
etanol com concentrações variáveis entre 12 e 48 mL de etanol por dL de solução
salina (NaCl a 0,9 g.dL
-1
) com sorbitol a 1 mol.L
-1
, pré-incubadas a 27, 32, 37, 42
ou 47 °C, por 10 minutos, foram adicionadas alíquotas de 25 µL de sangue em
cada tubo. Após homogeneização, os tubos foram incubados por 30 minutos em
cada temperatura e depois centrifugados por 10 minutos a 600xg. Durante as
incubações os tubos permaneceram fechados. As absorvâncias dos
sobrenadantes foram lidas em 540 nm usando como branco uma solução de
sorbitol a 1 mol.L
-1
em salina.
Determinação das curvas de transição de estabilização
Os valores de A
540
eram inicialmente locados contra as respectivas
concentrações de etanol para definição das regiões onde houve transição de
estabilização, caracterizada por diminuição dos valores de absorvância com o
aumento da concentração de etanol. Os pontos da transição de estabilização
foram analisados por regressão não linear com base na forma decrescente da
equação de Boltzmann:
2
)/dC-S(C
21
nm 540
A
e1
A-A
A
50
+
=
(2.1),
em que A e A representam os valores máximo e mínimo de A
1 2 540
, C é a
concentração de etanol, S
50
representa a concentração do etanol que causa 50%
de estabilização e dC é a amplitude da variação da concentração de etanol na
transição sigmoidal entre A e A
1 2
. A curva e os parâmetros intrínsecos da
regressão somente eram aceitos quando os valores de P eram menores do que
0,05.
28
A profundidade da curva de estabilização (P
S
) foi obtida pela diferença
entre A e A para cada ajuste.
1 2
Determinação das curvas de transição de hemólise do estado T dos
eritrócitos
Os valores de A
540
eram inicialmente locados contra as respectivas
concentrações de etanol para definição das regiões onde houve transição de
hemólise, caracterizada por aumento dos valores de absorvância com o aumento
da concentração de etanol. Os pontos da transição de hemólise foram analisados
por regressão não-linear com base na forma crescente da equação de Boltzmann:
)/dCD- (C
21
nm 540
50
e1
AA
A
=
(2.2),
em que A e A representam os valores mínimo e máximo de A
1 2 540
, D é a
concentração de etanol, D
50
representa a concentração do etanol que causa 50%
de hemólise e dD é a amplitude da variação da concentração de etanol na
transição sigmoidal entre A e A
1 2
. A curva e os parâmetros intrínsecos da
regressão somente eram aceitos quando os valores de P eram menores do que
0,05.
A profundidade da curva de lise ou desestabilização dos eritrócitos (P
D
) foi
feita pela diferença entre A e A para cada ajuste.
1 2
Edição e comparação estatística dos dados experimentais
A edição e avaliação estatística dos dados foram realizadas com o software
OriginPro 7.5 (Microcal, Northampton, Massachusetts, USA). As curvas obtidas
foram consideradas estatisticamente aceitáveis somente quando P foi menor que
0,05. A comparação dos dados foi realizada por análise de variância simples
(anova) ou por análise de variância pelo teste de Tukey, com P<0,05 indicando
diferença significante entre as médias.
29
RESULTADOS
Os efeitos da incubação de eritrócitos humanos com etanol em solução
salina pura, solução salina de glicerol e solução salina de sorbitol foram
estudados a 27, 32, 37, 42 e 47 °C na faixa de concentração de etanol designada
como “buraco de estabilização” do etanol. A Figura 2.1 mostra, apenas a título de
ilustração, o resultado de um experimento típico sobre o comportamento dos
eritrócitos no “buraco de estabilização” do etanol em solução salina de sorbitol.
Nessa faixa de concentração de etanol há uma transição de estabilização seguida
de uma transição de desnaturação. Ambas as transições foram ajustadas a linhas
de regressão sigmoidal, como está mostrado na Figura 2.1. A sigmóide
decrescente, à esquerda, representa a transição de estabilização dos eritrócitos.
A sigmóide crescente, à direita, representa a transição de lise do estado
estabilizado T dos eritrócitos.
A transição de estabilização por etanol foi caracterizada em solução salina
pura (Figura 2.2) e em solução salina de glicerol (Figura 2.3) e de sorbitol
(Figura 2.4), ambos a 1 mol.L
-1
, a 27, 32, 37, 42 e 47 °C.
A transição de lise do estado T foi caracterizada também em solução salina
pura (Figura 2.5) e em solução salina de glicerol (Figura 2.6) e sorbitol (Figura
2.7), ambos a 1 mol.L
-1
, a 27, 32, 37, 42 e 47 °C.
As Figuras 2.2 a 2.7 apresentam sigmóides que representam o
comportamento geral de todos os pontos experimentais, embora para cada
experimento individual tenha sido feito um ajuste independente. Os ajustes
individuais permitiram a determinação do ponto intermediário da transição, S
50
para a estabilização e D
50T
para a desestabilização. Todos os ajustes individuais
aceitos para análise foram estatisticamente significantes (P<0,05), tanto para o
efeito de estabilização quanto para o efeito de desestabilização (ou lise do estado
estabilizado) dos eritrócitos.
Os valores de S
50
nas diferentes temperaturas e solventes estudados estão
mostrados na Tabela 2.1. Os padrões de dependência térmica dos valores de S
50
em todos os solventes foram apresentados na Figura 2.8.
30
Os valores de D
50T
e seus padrões de dependência térmica em cada
composição do solvente estão mostrados na Tabela 2.2 e na Figura 2.9,
respectivamente.
Os ajustes individuais representados pelas Figuras 2.2 a 2.7 também
foram utilizados para determinação dos valores da profundidade das curvas
individuais de estabilização (Figuras 2.2 a 2.4) e da profundidade das curvas
individuais de desestabilização (Figuras 2.5 a 2.7).
Os valores obtidos para a profundidade da curva de estabilização (P
S
) dos
eritrócitos e os padrões de dependência térmica de P
S
nos diferentes solventes
foram mostrados na Tabela 2.3 e na Figura 2.10, respectivamente.
Os valores obtidos para a profundidade da curva de desestabilização (P
D
)
dos eritrócitos e os padrões de dependência térmica de P
D
nos solventes
estudados foram mostrados na Tabela 2.4 e na Figura 2.11, respectivamente.
Nas Figuras 2.8 a 2.11, as dependências térmicas dos valores de S
50
,
D
50T
, P
S
e P
D
, respectivamente, nos três solventes utilizados (salina, salina com
glicerol e salina com sorbitol) foram mostradas duas a duas. Assim, cada uma
dessas figuras apresenta três gráficos, um para a comparação entre salina e
salina com glicerol (A), um segundo para comparação entre salina com glicerol e
salina com sorbitol (B) e um terceiro para comparação entre salina e salina com
sorbitol (C). Nessas figuras cada linha de regressão da dependência térmica
aparece entre as curvas que delimitam seus intervalos de 95% de confiança. Isso
permite ao leitor ter uma idéia a respeito da ocorrência de diferença significante
entre as dependências térmicas nos solventes considerados dois a dois.
A Tabela 2.5 sumariza a ocorrência de significância entre as retas de
regressão para a dependência térmica dos parâmetros analisados (S
50
, D
50T
, P
S
e
P
D
) para cada combinação dos solventes dois a dois (salina versus glicerol, salina
com glicerol versus salina com sorbitol e salina versus sorbitol).
31
Figura 2.1. Efeito da concentração de etanol em solução salina de sorbitol a 1
mol.L
-1
sobre a lise de eritrócitos humanos. Temperatura = 47 °C. A dependência
apresenta um formato semelhante a um buraco ou uma curva de Gauss invertida.
O etanol apresentou um efeito de estabilização (■), dado por uma sigmóide
decrescente (mostrada em vermelho, à esquerda), seguido de um efeito de
desestabilização (●), dado por uma sigmóide crescente (mostrada em azul, à
direita).
32
10 15 20 25 30 35 40
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
27 °C
Etanol (mL.dL
-1
)
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
32 °C
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
37 °C
Absorvância em 540 nm
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
42 °C
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
47 °C
Figura 2.2. Efeito da temperatura (entre 27 e 47°C) sobre a transição de
estabilização de eritrócitos humanos por etanol em solução salina fisiológica pura.
Os dados de diferentes experimentos foram ajustados por uma única sigmóide em
cada temperatura apenas a título de ilustração.
33
12 16 20 24 28 32 36
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
27 °C
Etanol (mL.dL
-1
)
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
32 °C
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
37 °C
Absorvância em 540 nm
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
42 °C
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
47 °C
Figura 2.3. Efeito da temperatura (entre 27 e 47 °C) sobre a transição de
estabilização de eritrócitos humanos por etanol em solução salina fisiológica com
glicerol a 1 mol.L
-1
. Os dados de diferentes experimentos foram ajustados por
uma única sigmóide em cada temperatura apenas a título de ilustração.
34
12 16 20 24 28 32
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
27 °C
Etanol (mL.dL
-1
)
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
32 °C
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
37 °C
Absorvância em 540 nm
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
42 °C
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
47 °C
Figura 2.4. Efeito da temperatura (entre 27 e 47 °C) sobre a transição de
estabilização de eritrócitos humanos por etanol em solução salina fisiológica com
sorbitol a 1 mol.L
-1
. Os dados de diferentes experimentos foram ajustados por
uma única sigmóide em cada temperatura apenas a título de ilustração.
35
20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
27 °C
Etanol (mL.dL
-1
)
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
32 °C
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
37 °C
Absorvância em 540 nm
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
42 °C
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
47 °C
Figura 2.5. Efeito da temperatura (entre 27 e 47°C) sobre a transição de
desestabilização de eritrócitos humanos por etanol em solução salina fisiológica
pura. Os dados de diferentes experimentos foram ajustados por uma única
sigmóide em cada temperatura apenas a título de ilustração.
36
16 20 24 28 32 36 40 44 48 52
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
27 °C
Etanol (mL.dL
-1
)
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
37 °C
32 °C
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Absorvância em 540 nm
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
42 °C
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
47 °C
Figura 2.6. Efeito da temperatura (entre 27 e 47 °C) sobre a transição de
desestabilização de eritrócitos humanos por etanol em solução salina fisiológica
com glicerol a 1 mol.L
-1
. Os dados de diferentes experimentos foram ajustados por
uma única sigmóide em cada temperatura apenas a título de ilustração.
37
16 20 24 28 32 36 40 44 48
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
27 °C
Etanol (mL.dL
-1
)
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
32 °C
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
37 °C
Absorvância em 540 nm
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
42 °C
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
47 °C
Figura 2.7. Efeito da temperatura (entre 27 e 47 °C) sobre a transição de
desestabilização de eritrócitos humanos por etanol em solução salina fisiológica
com sorbitol a 1 mol.L
-1
. Os dados de diferentes experimentos foram ajustados
por uma única sigmóide em cada temperatura apenas a título de ilustração.
38
Tabela 2.1. Efeito da temperatura e da composição do solvente sobre o ponto de
meia transição de estabilização (S
50
) do estado T de eritrócitos humanos pelo
etanol, dado em mL de etanol por dL de solução salina fisiológica. A quantidade
de amostras em cada situação aparece entre parênteses.
Solvente 27 °C 32 °C 37 °C 42 °C 47 ° C P
Solução salina pura 35,82±0,19
(6)
30,84± 0,56
(6)
26,66± 0,44
(6)
23,56± 0,39
(6)
18,51± 0,96
(6)
*
Solução salina
com glicerol a 1 mol.L
-1
32,49± 1,42
(6)
29,47± 0,77
(6)
26,39± 0,31
(6)
22,30± 0,54
(10)
18,71± 1,08
(6)
*
Solução salina
com sorbitol a 1 mol.L
-1
25,54±4,42
(6)
30,74±1,37
(4)
24,21±0,49
(6)
16,33±0,33
(6)
14,26±0,38
(6)
*
P
b,c a b,c a,b,c b,c
*P<0,05 indicando diferença estatisticamente significante entre as temperaturas (anova).
a
P<0,05 indicando diferença estatisticamente significante entre salina e salina com glicerol (teste de Tukey).
b
P<0,05 indicando diferença estatisticamente significante entre salina e salina com sorbitol (teste de Tukey).
c
P<0,05 indicando diferença estatisticamente significante entre salina com glicerol e salina com sorbitol (teste de Tukey).
39
Figura 2.8. Comparação das retas de regressão da dependência térmica da
meia-transição de estabilização (S
50
) de eritrócitos humanos. Em solução salina
pura: Y = 58,1 - 0,838 X; N = 30; R = -0,994; P<0,0001. Em solução salina com
glicerol a 1 mol.L
-1
: Y = 51,6 - 0,696 X; N = 34; R = -0,984; P<0,0001. Em solução
salina com sorbitol a 1 mol.L
-1
: Y = 47,9 - 0,704 X; N = 28; R= -0,821; P<0,0001.
As linhas contínuas centrais constituem as retas de regressão, as quais aparecem
entre curvas pontilhadas que delimitam seus respectivos intervalos de 95% de
confiança.
40
Tabela 2.2. Efeito da temperatura e da composição do solvente sobre o ponto de
meia transição de lise ou desestabilização (D
50T
) de eritrócitos humanos pelo
etanol, dado em mL de etanol por dL de solução salina fisiológica. A quantidade
de amostras em cada situação aparece entre parênteses.
Solvente 27 °C 32 °C 37° C 42 °C 47 °C P
Solução salina pura 45,11±0,71
(6)
41,88±4,23
(6)
35,77±4,63
(6)
33,24±2,77
(6)
28,93±2,31
(6)
*
Solução salina com glicerol
a 1 mol.L
-1
36,26±0,28
(4)
34,12±0,51
(6)
31,39±2,66
(4)
25,37±1,16
(10)
28,06±2,87
(6)
*
Solução salina com sorbitol
a 1 mol.L
-1
42,28±1,78
(6)
33,06±2,69
(4)
29,83±0,74
(6)
27,38±1,59
(6)
24,55±1,76
(6)
*
P
a,b,c a,b b a,b b
*P<0,05 indicando diferença estatisticamente significante entre as temperaturas (anova).
a
P<0,05 indicando diferença estatisticamente significante entre salina e salina com glicerol (teste de Tukey).
b
P<0,05 indicando diferença estatisticamente significante entre salina e salina com sorbitol (teste de Tukey).
c
P<0,05 indicando diferença estatisticamente significante entre salina com glicerol e salina com sorbitol (teste de Tukey).
41
Figura 2.9. Comparação das retas de regressão da dependência térmica da
meia-transição de desestabilização (D
50T
) de eritrócitos humanos. Em solução
salina fisiológica pura: Y = 67,3 - 0,820 X; N = 30; R = -0,886; P < 0,0001). Em
solução salina com glicerol a 1 mol.L
-1
: Y = 50,4 - 0,533 X; N = 30; R = - 0,814; P
< 0,0001. Em salina com sorbitol a 1 mol.L
-1
: Y = 62,7 - 0,841 X; N = 28; R = -
0,930; P < 0,0001. As linhas contínuas centrais constituem as retas de regressão,
as quais se encontram entre curvas pontilhadas que delimitam seus respectivos
intervalos de 95% de confiança.
42
Tabela 2.3. Efeito da temperatura e da composição do solvente sobre a
profundidade da curva de transição de estabilização (P
S
) ou formação do estado T
de eritrócitos humanos pelo etanol, dada em variação de densidade óptica (ΔOD).
A quantidade de amostras em cada situação aparece entre parênteses.
Solvente 27 32 37 42 47 P
Solução salina pura 0,500±0,0329
(6)
0,553±0,0949
(6)
0,523±0,0783
(6)
0,614±0,0594
(6)
0,502±0,0379
(6)
Solução salina com glicerol a 1
mol.L
-1
0,157±0,0311
(6)
0,199±0,0622
(6)
0,161±0,0486
(6)
0,281±0,126
(10)
0,381±0,141
(6)
*
Solução salina com sorbitol a 1
mol.L
-1
0,0856±0,0463
(6)
0,291±0,3047
(4)
0,308±0,0728
(6)
0,442±0,0609
(6)
0,585±0,0950
(6)
*
P
a,b,c a a,b,c a,b,c c
*P<0,05 indicando diferença estatisticamente significante entre as temperaturas (anova).
a
P<0,05 indicando diferença estatisticamente significante entre salina e salina com glicerol (teste de Tukey).
b
P<0,05 indicando diferença estatisticamente significante entre salina e salina com sorbitol (teste de Tukey).
c
P<0,05 indicando diferença estatisticamente significante entre salina com glicerol e salina com sorbitol (teste de Tukey).
43
Figura 2.10. Comparação das retas de regressão da dependência térmica das
profundidades das curvas de estabilização (P
S
) de eritrócitos humanos. Em
solução salina fisiológica pura: Y = 0,490 + 0,0013 X; N = 30; R = 0,126; P =
0,507. Em solução salina com glicerol a 1 mol.L
-1
: Y = -0,155 + 0,0105 X; N = 34;
R = 0,591; P < 0,001. Em salina com sorbitol a 1 mol.L
-1
: Y = -0,531 + 0,0235 X; N
= 28; R = 0,813; P < 0,0001. As linhas contínuas centrais constituem as retas de
regressão, as quais se encontram entre curvas pontilhadas que delimitam seus
respectivos intervalos de 95% de confiança.
44
Tabela 2.4. Efeito da temperatura e da composição do solvente sobre a
profundidade da curva de transição de lise ou desestabilização (P
D
) do estado T
de eritrócitos humanos pelo etanol, dada em variação de densidade óptica (ΔOD).
A quantidade de amostras em cada situação aparece entre parênteses.
Solvente 27 °C 32 °C 37 °C 42 °C 47 °C P
Solução salina pura 0,415±0,0578
(6)
0,459±0,101
(6)
0,536±0,132
(6)
0,681±0,0552
(6)
0,595±0,119
(6)
*
Solução salina com glicerol
a 1 mol.L
-1
0,0923±0,0265
(10)
0,179±0,0413
(6)
0,200±0,0749
(4)
0,417± 0,112
(8)
0,413±0,137
(6)
*
Solução salina com sorbitol
a 1 mol.L
-1
0,0279±0,0127
(6)
0,0921±0,0560
(4)
0,189±0,0372
(6)
0,405±0,162
(6)
0,488±0,110
(6)
*
P
a,b,c a a,b,c a,b,c c
*P<0,05 indicando diferença estatisticamente significante entre as temperaturas (anova).
a
P<0,05 indicando diferença estatisticamente significante entre salina e salina com glicerol (teste de Tukey).
b
P<0,05 indicando diferença estatisticamente significante entre salina e salina com sorbitol (teste de Tukey).
c
P<0,05 indicando diferença estatisticamente significante entre salina com glicerol e salina com sorbitol (teste de Tukey).
45
Figura 2.11. Comparação das retas de regressão da dependência térmica das
profundidades das curvas de desestabilização (P
D
) de eritrócitos humanos. Em
solução salina fisiológica pura: Y = 0,106 + 0,0116 X; N = 30; R = 0,630; P =
0,000190. Em solução salina com glicerol a 1 mol.L
-1
: Y = -0,399 + 0,0180 X; N =
28; R = 0,787; P < 0,0001. Em solução salina com sorbitol a 1 mol.L
-1
: Y = -0,663
+ 0,0245 X; N = 28; R = 0,883; P < 0,0001. As linhas contínuas centrais
constituem as retas de regressão, as quais aparecem entre curvas pontilhadas
que delimitam seus respectivos intervalos de 95% de confiança.
46
Tabela 2.5. Ocorrência de diferença significante entre as retas de regressão para
a dependência térmica dos parâmetros analisados*.
Parâmetro Salina x glicerol Glicerol x sorbitol Salina x sorbitol
S
50
S S S
D
50T
S S S
P
S
S S S
P
D
S S S
*S indicando ocorrência de diferença estatisticamente significante (P<0,05) entre retas de dependência
térmica.
47
DISCUSSÃO
O “buraco de estabilização” do etanol
A dependência entre a taxa de hemólise, dada pela absorvância em 540
nm, e a concentração de etanol (Figura 2.1) tem uma aparência de poço ou
buraco e foi designada na literatura como “buraco de estabilização” do etanol
[BERNARDINO NETO, 2006; FINOTTI, 2006; GOUVÊA-e-SILVA, 2006].
Neste trabalho, procuramos estudar o efeito da temperatura e de dois
diferentes osmólitos sobre aquele “buraco de estabilização” do etanol.
Para dirigir melhor a análise de nossos resultados, vamos considerar
separadamente os efeitos da temperatura e de cada um dos osmólitos, para
então, construirmos uma análise de natureza mais global.
Efeito da temperatura sobre a transição de estabilização dos eritrócitos por
etanol em solução salina
A transição de estabilização dos eritrócitos pelo etanol, que está mostrada
ilustrativamente pela linha da esquerda (em vermelho) da Figura 2.1, foi
determinada em 27, 32, 37, 42 e 47 °C, em solução salina fisiológica pura (Figura
2.2). Foi usada uma única escala para cada gráfico do painel, com o objetivo de
propiciar uma melhor visualização do efeito da temperatura sobre a transição.
O aumento da temperatura promove uma migração da curva para a
esquerda (Figura 2.2), de tal forma que o ponto de meia-transição de
estabilização (S
50
) estaria diminuindo com o aumento da temperatura. Antes de
tentar analisar o significado dessa diminuição de S
50
é necessário nos
certificarmos se este efeito está estatisticamente fundamentado. Na Tabela 2.1
podemos ver que há diferenças estatisticamente significantes entre os valores
médios de S
50
de cada uma das temperaturas consideradas. De fato, há uma
dependência linear negativa e significante entre S
50
e a temperatura (Figura 2.8).
Esse padrão de dependência é concordante com aquele descrito por GOUVÊA-e-
SILVA [2006].
De posse da informação de que o aumento da temperatura promove uma
diminuição estatisticamente significante no valor de S
50
, passamos a analisar o
significado dessa tendência.
48
Por se tratar de um efeito de estabilização, a diminuição de S
50
pelo
aumento da temperatura não se deve à exacerbação do efeito caotrópico do
etanol pelo aumento da temperatura. Entretanto, o aumento da temperatura
diminui o valor de D
50
do que seria o estado R dos eritrócitos [Bernardino Neto,
2006; Finotti, 2006], o que significa que o calor está agindo em sinergismo com o
etanol na promoção da lise do estado R dos eritrócitos, pois o calor, assim como o
etanol, também é um agente caotrópico [FONSECA et al., 2006; NEURATH et al.,
1944; SCHELLMAN, 2002; TANFORD, 1970], capaz de promover mesmo in vivo
a ocorrência de hemólise [LEPOCK et al., 1989].
Se o aumento na temperatura e o etanol promovem hemólise pela
alteração das propriedades tanto de lipídeos quanto de proteínas da membrana
[BETZ et al., 2007; CHI e WU, 1991; SVETINA et al., 2004; VERTESSY e STECK,
1989; ZAVODNIK, PILETSKAIA e STEPURO, 1994], a que se deveria a
diminuição de S
50
pela temperatura? A explicação para esse efeito estabilizador
poderia residir na ação do etanol como um osmólito, de tal maneira que a causa
da estabilização seria a pressão osmótica imposta pelo etanol (GOUVÊA-e-
SILVA, 2006).
A pressão osmótica (Π) é dada pela equação:
Π = MRT (2.3),
onde M é a concentração molar dos solutos, R é a constante universal dos gases
(1,984 cal.K
-1
.mol
-1
) e T é a temperatura absoluta, dada em Kelvin.
Assim, a elevação na temperatura promoveria um aumento na pressão
osmótica e uma estabilização dos eritrócitos a uma menor concentração de etanol
do que ocorre em temperaturas mais baixas.
Um aumento na pressão osmótica por etanol foi apresentado como a causa
da estabilização de proteínas por esse soluto [USHA et al., 2006]. Essa
estabilização do eritrócito estaria associada à estabilização tanto de proteínas
quanto da própria malha lipídica da membrana.
O aumento da temperatura e o próprio etanol não estão deixando de agir
como caotrópicos, mas concomitantemente eles ajudam a estabilizar o estado T
dos eritrócitos pelo aumento na pressão osmótica. Na faixa de concentração em
torno de S
50
, o resultado líquido dessa ação dualística e antagônica do etanol é a
estabilização do eritrócito.
49
A profundidade do efeito de estabilização (P
S
) é uma medida da quantidade
de eritrócitos que sofreu estabilização (Figura 2.2). A comparação estatística
entre os valores de profundidade da estabilização em solução salina (Tabela 2.3)
revelou que as diferenças não são estatisticamente significantes. Por outro lado,
também não houve dependência significante (P = 0,507) entre os valores de P
S
e
a temperatura (Figura 2.10). Isto significa que o aumento da temperatura não
afetou a quantidade de eritrócitos que foram estabilizados pelo aumento na
concentração do etanol em solução salina.
Efeito da temperatura sobre a transição de estabilização dos eritrócitos por
etanol em solução salina de glicerol
O glicerol é um osmólito da classe dos álcoois polidroxílicos, muito utilizado
em estudos de osmoestabilização de eritrócitos [BAKALTCHEVA, ODEYALE e
SPARGO, 1996; BERNARDINO NETO, 2006; DE LOECKER et al., 1993;
PELLERIN-MENDES et al., 1997; WAGNER et al., 2002].
Na presença de glicerol a 1 mol.L
-1
em solução salina, o aumento da
temperatura também promove uma migração da curva para a esquerda (Figura
2.3), de tal forma que o ponto de meia-transição de estabilização (S
50
) também
estaria diminuindo com o aumento da temperatura. A diminuição de S
50
com o
aumento na temperatura também foi estatisticamente significante na presença de
glicerol a 1 mol.L
-1
como foi na ausência deste osmólito (Tabela 2.1). Um corolário
útil para sustentação dessa afirmação é a significância estatística da reta de
regressão linear obtida para a dependência entre S
50
e a temperatura (Figura
2.8).
A diminuição em S
50
também é coerente com a natureza osmolar do efeito
de estabilização pelo etanol.
Uma comparação dos valores de profundidade da estabilização pelo etanol
(em solução salina de glicerol) entre as diferentes temperaturas revela que o
aumento da temperatura altera significantemente os valores de P
S
(Tabela 2.3).
De fato, P
S
aumenta de forma significante com o aumento da temperatura (Figura
2.10). Isso significa que, na presença de glicerol a 1 mol.L
-1
, o aumento da
temperatura aumenta a quantidade de eritrócitos que está sofrendo estabilização
pelo etanol.
50
Efeito da temperatura sobre a transição de estabilização dos eritrócitos por
etanol em solução salina de sorbitol
O sorbitol, assim como o glicerol, é também um osmólito da classe dos
álcoois polidroxílicos muito estudado para estabilização de eritrócitos
[BAKALTCHEVA, ODEYALE e SPARGO, 1996; DE LOECKER et al., 1993;
FINOTTI, 2006; PELLERIN-MENDES et al., 1997; WAGNER et al., 2002].
Na presença de solução salina de sorbitol a 1 mol.L
-1
, também houve
mudança (Figura 2.3), estatisticamente significante (Tabela 2.1), do ponto de
meia-transição de estabilização (S
50
) com o aumento da temperatura. Realmente,
os valores de S
50
apresentaram uma dependência negativa significante com o
aumento da temperatura na presença de sorbitol, dentro do intervalo térmico
considerado (Figura 2.8).
Como o sorbitol é um co-solvente que estabiliza complexos biológicos pelo
aumento da osmolaridade do meio, ele vai agir de modo sinérgico com o etanol e
a temperatura, promovendo um aumento na pressão osmótica. Esta observação
reforça a idéia de que o efeito estabilizador tem uma origem osmótica.
O aumento da temperatura altera significantemente a profundidade da
estabilização (Tabela 2.3). De fato, os valores de P
S
aumentaram
significantemente com o aumento da temperatura (Figura 2.10). Isso mostra que,
na presença de sorbitol a 1 mol.L
-1
, o aumento da temperatura aumenta a
quantidade de eritrócitos que está sofrendo estabilização pelo etanol.
Efeito de osmólitos sobre a dependência térmica da transição de
estabilização dos eritrócitos por etanol em solução salina
Tanto em solução salina pura quanto em solução salina de glicerol ou de
sorbitol o aumento da temperatura promoveu diminuição estatisticamente
significante em S
50
(Figura 2.8).
Mas será que a incorporação de glicerol ou sorbitol promoveu alterações
significantes em S
50
?
Essa pergunta pode ser respondida pela comparação entre os valores de
S
50
obtidos na presença de cada um dos solventes (Tabela 2.1). Houve diferença
estatisticamente significante nos valores de S
50
obtidos em solução salina em
relação aos valores obtidos em solução salina de sorbitol em todas as
51
temperaturas utilizadas, exceto a 32 °C. Esse mesmo padrão de significância
também foi encontrado entre os valores de S
50
obtidos em solução salina de
sorbitol em relação àqueles obtidos em solução salina de glicerol. Mas os valores
de S
50
em solução salina foram significantemente diferentes dos valores obtidos
em solução salina de glicerol apenas a 32 e 42 °C (Tabela 2.1).
Esse padrão não-homogêneo no comportamento dos solventes utilizados
pode ser mais bem caracterizado pela análise da influência do solvente na
dependência térmica de S
50
. A Figura 2.8 mostra as comparações possíveis da
dependência térmica de S
50
nos três solventes utilizados. As diferenças entre as
linhas de dependência térmica entre os solventes foram estatisticamente
significantes (Tabela 2.5).
Se a origem do efeito estabilizador do etanol é osmótica e a incorporação
do osmólito aumenta a pressão osmótica do meio, com certeza a incorporação de
glicerol ou sorbitol deveria promover estabilização dos eritrócitos. De fato, esta
estabilização pode ser inferida pelo abaixamento significante (Tabela 2.5) da linha
de dependência térmica de S
50
tanto na presença de glicerol quanto de sorbitol
em relação à solução salina pura (Figura 2.8).
A influência do solvente pode manifestar-se não somente no ponto de
meia-transição de estabilização (S
50
), mas também na profundidade dessa
transição (P
S
).
Houve diferença significante entre os valores de P
S
nos três solventes,
analisados dois a dois, a 27, 37 e 42 °C (Tabela 2.3). Os valores de P
S
aumentaram significantemente com o aumento da temperatura na presença de
solução salina de glicerol e de sorbitol, mas não de solução salina pura (Figura
2.10). Porém houve significância estatística nas diferenças entre os padrões de
dependência térmica de P
S
nos diferentes solventes (Tabela 2.5). Isso significa
que a incorporação de glicerol ou sorbitol à solução salina altera a população de
eritrócitos que é estabilizada pelo etanol (estado T). Nas temperaturas inferiores
do intervalo térmico considerado, a incorporação de glicerol ou sorbitol diminuiu
bastante a população de eritrócitos estabilizados. Entretanto, com o aumento na
temperatura aumenta também a população de eritrócitos estabilizados (Figura
2.10).
52
O efeito estabilizante do etanol sobre eritrócitos não deve ter uma natureza
puramente osmótica, mas deve também estar relacionado com uma ação direta
sobre a membrana. A capacidade do etanol em preservar constante a população
de eritrócitos no estado T dentro da faixa térmica utilizada (Figura 2.10) estaria
também associada a sua capacidade de interagir diretamente com a malha
lipídica da membrana. O etanol é capaz de aumentar a fluidez da membrana do
eritrócito [YAMADA et al., 1999]. A incorporação de glicerol ou sorbitol a
temperaturas mais baixas está prejudicando essa ação do etanol sobre o estado
T dos eritrócitos, pois os valores de P
S
diminuem com a diminuição da
temperatura e aumentam com o aumento da temperatura pela ação daqueles
solutos (Figura 2.10).
Efeito da temperatura sobre a transição de desestabilização do estado T dos
eritrócitos por etanol em solução salina
A transição de lise dos eritrócitos pelo etanol em solução salina, que está
mostrada ilustrativamente pela linha da direita (em azul) da Figura 2.1, foi
determinada em 27, 32, 37, 42 e 47 °C (Figura 2.5). Foi usada uma única escala
para cada gráfico do painel, a fim de permitir uma melhor visualização do efeito da
temperatura sobre a transição.
O aumento da temperatura promove um deslocamento da curva para a
esquerda (Figura 2.5), de tal forma que o ponto de meia-transição de hemólise
(D
50T
) estaria diminuindo com o aumento da temperatura. De fato, há diferenças
estatisticamente significantes entre os valores de D
50T
obtidos às diferentes
temperaturas consideradas (Tabela 2.2). Além disso, os valores de D
50T
apresentaram uma dependência negativa significante com o aumento da
temperatura (Figura 2.9).
Por se tratar de um efeito de desestabilização, a diminuição de D
50T
com o
aumento da temperatura deve-se à exacerbação do efeito caotrópico do etanol.
Com o aumento na temperatura, há necessidade de uma menor concentração de
etanol para promover 50% de lise dos eritrócitos, o que significa que o calor está
agindo em sinergismo com o etanol na promoção da lise do estado T dos
eritrócitos.
53
Entretanto, como o valor de D
50
do estado T a 37 °C (Tabela 2.2), 35,77
mL de etanol por dL de solução salina (Tabela 2.2), é muito maior do que o valor
de D
50
reportado para o estado R dos eritrócitos, 14,28 mL de etanol por dL de
solução salina [GOUVÊA-e-SILVA, 2006], a lise do estado T dos eritrócitos está
também associada à ação do etanol como um osmólito. Existe um valor crítico de
osmolaridade além do qual o etanol passa a estimular a lise em detrimento da
estabilização do eritrócito.
A profundidade da curva de desestabilização (P
D
) ou lise do estado T é
uma medida da quantidade de eritrócitos que está sofrendo a transição de lise. Os
valores de P
D
foram significantemente diferentes nas temperaturas utilizadas
(Tabela 2.4). O aumento significante de P
D
com o aumento na temperatura
(Figura 2.11) é uma evidência da origem osmótica da transição de lise do estado
T dos eritrócitos pelo etanol em solução salina.
Efeito da temperatura sobre a transição de desestabilização do estado T dos
eritrócitos por etanol em solução salina de glicerol
Na presença de solução salina de glicerol a 1 mol.L
-1
, o aumento da
temperatura também promove uma migração da curva para a esquerda (Figura
2.6), de tal forma que o ponto de meia-transição de desestabilização (D
50
) do
estado T dos eritrócitos também estaria diminuindo com o aumento da
temperatura. De fato, houve diferença estatisticamente significante nos valores de
D
50T
obtidos nas diferentes temperaturas utilizadas (Tabela 2.2). Os valores de
D
50T
diminuíram significantemente com o aumento na temperatura (Figura 2.9), o
que sugere uma natureza osmolar para a desestabilização do estado T dos
eritrócitos pelo etanol.
Os valores de profundidade da desestabilização (P
D
) pelo etanol (em
solução salina de glicerol) foram significantemente alterados pela temperatura
(Tabela 2.3), de tal modo que P
D
aumenta com o aumento da temperatura
(Figura 2.10). Isso mostra que, na presença de glicerol a 1 mol.L
-1
, o aumento da
temperatura aumenta a quantidade de eritrócitos que está sofrendo
desestabilização pelo etanol.
54
Efeito da temperatura sobre a transição de desestabilização do estado T dos
eritrócitos por etanol em solução salina de sorbitol
Em solução salina de sorbitol a 1 mol.L
-1
, também houve mudança (Figura
2.7), estatisticamente significante (Tabela 2.2), do ponto de meia-transição de
desestabilização (D
50T
) com as mudanças na temperatura. Os valores de D
50T
diminuíram significantemente com o aumento da temperatura na presença de
sorbitol, dentro do intervalo térmico considerado (Figura 2.8), o que suporta a
idéia de que o efeito desestabilizador tenha uma origem osmótica.
A mudança na temperatura também altera significantemente a
profundidade da curva de desestabilização (Tabela 2.3). Houve aumento
significante nos valores de P
D
(Figura 2.10), o que mostra que, na presença de
sorbitol a 1 mol.L
-1
, o aumento da temperatura aumenta a quantidade de
eritrócitos que está sofrendo lise pelo etanol.
Efeito de osmólitos sobre a dependência térmica da transição de
desestabilização do estado T dos eritrócitos por etanol em solução salina
O aumento da temperatura promoveu diminuição estatisticamente
significante em D
50T
tanto em solução salina pura quanto em solução salina de
glicerol ou de sorbitol (Figura 2.9).
Mas será que houve diferenças significantes de D
50T
entre os solventes?
Houve diferença significante nos valores de D
50T
entre os três solventes
somente a 27 °C. A 32 e 42 °C houve diferença significante entre salina e salina
com glicerol e entre salina e salina com sorbitol, mas não entre salina com glicerol
e salina com sorbitol. A 37 °C a diferença foi significante apenas entre a solução
salina e a solução salina de sorbitol (Tabela 2.2).
Entretanto, a forma mais apropriada de lidar com a questão é pela análise
do padrão de dependência térmica entre os solventes (Figura 2.9). Uma
comparação entre as linhas de regressão de D
50T
em função da temperatura
mostrou a existência de significância entre todos os três solventes quando
comparados dois a dois (Tabela 2.5).
Os menores valores de D
50
na reta de dependência térmica de D
50T
(Figura
2.9) observados na presença de glicerol e sorbitol significam que esses osmólitos
estão potencializando a lise osmótica do estado T dos eritrócitos. Lise osmótica
55
de eritrócitos pode ocorrer por ação do próprio glicerol e do sorbitol [ARAKAWA et
al., 1977; EBER et al., 1992] e é considerada dependente da fluidez lipídica da
membrana [ARAKI e RIFKINDI, 1981]. Como o etanol e o calor alteram a fluidez
de membrana, o valor de D
50
do estado T é resultante do conjunto de ações
dualísticas e antagônicas tanto do etanol e do calor quanto dos próprios
osmólitos.
Em relação à profundidade da desestabilização (P
D
), houve diferença
significante entre os valores de P
D
nos três solventes, analisados dois a dois, a
27, 37 e 42 °C (Tabela 2.4). A 32 °C, a diferença foi significante apenas entre
salina e glicerol. Mas a 47 °C, a diferença foi significante entre salina e sorbitol
(Tabela 2.4).
Também aqui a forma mais apropriada de lidar com a questão é pela
comparação da dependência térmica de P
D
(Figura 2.11). Em todos os solventes,
os valores de P
D
aumentaram significantemente com o aumento da temperatura
(Figura 2.11). Além disso, as retas de dependência térmica de P
D
também foram
diferentes entre os diferentes solventes quando comparadas duas a duas (Tabela
2.5). Como os valores de P
D
foram sempre menores na presença de glicerol ou
sorbitol, isso deve significar que esses osmólitos estariam diminuindo a população
de eritrócitos do estado T que sofre lise pelo etanol no intervalo térmico
considerado (Figura 2.11).
Em suma, glicerol ou sorbitol a 1 mol.L
-1
em solução salina fisiológica, o
aumento na concentração de etanol e na temperatura agem em sinergismo,
aumentando a pressão osmótica do meio até um valor crítico, onde a formação do
estado T dos eritrócitos é favorecida, mas além desse valor crítico, um aumento
na pressão osmótica por qualquer um daqueles agentes (glicerol, sorbitol, etanol
ou calor) promove a lise do estado T dos eritrócitos.
56
CONCLUSÕES
Os valores de S
50
apresentaram declínios lineares significantes com o
aumento na temperatura tanto em salina pura quanto em solução salina de
glicerol ou sorbitol; além disso, as retas de dependência térmica de S
50
apresentaram valores de S
50
mais baixos em salina com glicerol ou sorbitol do
que em salina pura. Isso deve significar que o efeito de estabilização dos
eritrócitos tem uma origem osmótica, pois tanto o aumento da temperatura quanto
a incorporação de glicerol ou sorbitol aumentam a pressão osmótica do meio.
Embora P
S
não tenha sido significantemente afetado pela temperatura, a
presença do glicerol ou do sorbitol produziu uma dependência térmica significante
em P
S.
Em temperaturas mais baixas a presença de glicerol ou sorbitol diminuiu a
população de eritrócitos estabilizados, mas o aumento da temperatura elevou a
população de eritrócitos estabilizados. Isso sugere que o efeito estabilizador do
etanol sobre os eritrócitos não tenha exclusivamente uma origem osmótica, mas
esteja relacionado com uma interação direta com a malha lipídica da membrana.
Os valores de D
50T
apresentaram uma dependência negativa com o
aumento da temperatura, tanto em salina pura quanto em salina de glicerol ou
sorbitol. Como os valores de D
50T
das retas de dependência térmica foram
menores na presença de glicerol e de sorbitol do que de salina pura, isso indica
que a lise do estado T dos eritrócitos teria uma origem osmolar.
Os valores de P
D
apresentaram dependências positivas significantes tanto
em salina pura quanto em salina de glicerol e sorbitol. Os baixos valores de P
D
observados em salina de glicerol ou sorbitol às temperaturas mais baixas do
intervalo térmico considerado são devidos à pequena população de eritrócitos
estabilizados nessas condições.
Em suma, glicerol ou sorbitol a 1 mol.L
-1
em solução salina fisiológica e o
aumento na temperatura aumentam a pressão osmótica do meio e agem em
sinergismo com o etanol tanto na formação quanto na lise do estado T dos
eritrócitos.
57
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
58
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