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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
Estudo do papel de galectina-1 na infecção experimental por
Toxoplasma gondii
NATALIA SAKURA KOYAMA
Ribeirão Preto-SP
2008
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NATALIA SAKURA KOYAMA
Estudo do papel de galectina-1 na infecção experimental por
Toxoplasma gondii
Tese apresentada a Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
para obtenção de título de Doutor em Ciências
Área de Concentração: Imunologia Básica e
Aplicada
Orientação: Prof. Dr. Marcelo Dias Baruffi
Ribeirão Preto-SP
2008
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIALMENTE
DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU
ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A
FONTE.
Koyama, Natalia Sakura
Estudo do papel de galectina-1 na infecção experimental por Toxoplasma
gondii/ Ribeirão Preto, 2008.
109p. : il. ; 30 cm.
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto/USP Área de Concentração: Imunologia Básica e Aplicada
Orientador: Marcelo Dias Baruffi.
1.Galectina-1, 2.Toxoplasma gondii, 3.Infecção oral, 4.Resposta imune
FOLHA DE APROVAÇÃO
Autor: Natalia Sakura Koyama
Título: Estudo do papel de galectina-1 na infecção experimental por Toxoplasma
gondii
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
para obtenção do título de Doutor.
Área de concentração: Imunologia Básica e
Aplicada.
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof. Dr. _____________________________________________________________
Instituição: Assinatura:
Prof. Dr. _____________________________________________________________
Instituição: Assinatura:
Prof. Dr. _____________________________________________________________
Instituição: Assinatura:
Prof. Dr. _____________________________________________________________
Instituição: Assinatura:
Prof. Dr. _____________________________________________________________
Instituição: Assinatura:
DEDICATÓRIA
À minha família e ao meu querido amigo e
namorado Chester, pelo grande incentivo dado
nos momentos difíceis, encorajando-me para
superar os desafios, e pela paciência.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Dr. Marcelo Dias Baruffi, pela oportunidade de
desenvolver meu projeto de doutorado. Agradeço a confiança, a amizade e os valiosos
ensinamentos, que de maneira tão generosa compartilha com os alunos, sendo um
exemplo de entusiasmo pela pesquisa. Obrigada por colaborar nesse importante passo
da minha formação.
À Profa. Dra Maria Cristina Roque Barreira, que me recebeu em seu laboratório de
maneira acolhedora e cedeu toda a infra-estrutura para o desenvolvimento do presente
trabalho.
Ao Dr. Emerson S. Bernardes, cuja valiosa co-orientação teve importância
fundamental no desenvolvimento e direcionamento deste trabalho. Agradeço a
dedicação, a disponibilidade e a participação ativa em todas as etapas, desde as
discussões científicas até a realização dos experimentos.
À Profa. Dra. Neide Maria Silva, por todo o auxílio e disponibilidade, pelo interesse
manifestado pelo estudo, pelas discussões científicas e pelas valiosas sugestões para o
direcionamento deste trabalho.
À pós-graduanda Marise Lopes Fermino, companheira de bancada, por sempre estar
disposta a me auxiliar nos experimentos e pela extrema dedicação e companheirismo.
Agradeço também as palavras amigas me animaram nos momentos de maiores
dificuldades.
À funcionária Vani Maria Alves Correia, pelo auxílio inestimável no preparo do
material histológico, pelos ensinamentos e principalmente pela amizade, sempre com
uma palavra amiga reconfortante. Terei sempre a lembrança dos vários momentos
agradáveis enquanto preparávamos os materiais para inclusão.
À funcionária Marlise Bonetti A. Montes, pelo excelente auxílio técnico e pela
colaboração nos experimentos. Agradeço principalmente a amizade sincera em todos
esses anos de convivência, sempre com um ombro amigo nos momentos de
dificuldades, e pelos momentos de descontração dentro e fora do laboratório.
À equipe do laboratório Ângela, Camillo, Daniel, Helder, Lilian, Juliana, Thalita e
Willian agradeço a cada um de vocês por toda ajuda nos experimentos de forma
direta ou indireta, pela paciência e, principalmente, pela amizade. Foi muito bom
conviver com todos vocês, dentro e fora do laboratório ao longo desses anos, que
tornaram essa minha caminhada mais divertida e agradável.
Aos funcionários Marcella Daruge Grando e Rubens Eduardo da Silva, pelo
auxílio no manuseio de animais de experimentação, pelo apoio nos experimentos,
pela manutenção da organização e limpeza do laboratório e pelo bom humor, que
tornaram o dia-a-dia mais alegre.
À equipe do laboratório da Profa. Dra. Maria Regina Torqueti, Danyelle, Michele,
Mirian pela amizade e pelos momentos agradáveis que tivemos. Agradeço
especialmente a Mirian por ter auxiliado na correção da minha tese e por ter se
tornado uma amiga nessa fase final do meu doutorado.
À Profa. Dra. Cristina Ribeiro de B. Cardoso, pela amizade sincera e
companheirismo em todos esses anos de convivência. Sou grata pelas inúmeras
conversas científicas e por estar presente em todos os momentos que eu mais precisei,
sempre me encorajando nas ocasiões mais difíceis. Mas, também sou grata pelos
muitos momentos de descontração e alegria que tivemos. Pessoas como você são
raras. Obrigada por tudo!
A todos os colegas do laboratório de Glicobiologia que sempre me receberam bem
em seu laboratório e foram solícitos. Agradeço em especial à funcionária Sandra M.
O. Thomaz e aos pós-graduandos Luciana Ruas, Leandro, Fernanda e Nerry pelo
auxílio no dia-a-dia, estando sempre prontos a ajudar, e pelo convívio agradável.
Aos funcionários da FCFRP Reinaldo F. Batista, Ronaldo de Araújo, Fabiana
Rossetto de Morais e Zita Maria de O. Gregório, e aos funcionários da FMRP
Ednelson A. Mazzotto, Sávio Hedley F. Miranda, Patrícia E. Vendruscolo, Érica
Vendruscolo, Maria Inês A. Castania, Walter M. Turato, Rosângela C. P.
Mesquita. Agradeço a todos vocês que contribuíram de alguma forma para a
realização deste trabalho, com a assistência técnica e o convívio agradável.
À Ana Cristine S. Ferreira, secretária da pós-graduação, pela dedicação, pelo
carinho e por toda ajuda nas “papeladas” prestada nesses anos todos.
Aos docentes da pós-graduação em Imunologia Básica e Aplicada, pela minha sólida
formação científica e acadêmica.
À Profa. Dra. Lusânia M. A. Greggi e a toda equipe de seu laboratório pela força
dada nessa fase final e pelo ótimo convívio.
À CAPES pela bolsa concedida.
A todos aqueles que me ajudaram de alguma forma.
"Se olharmos o tempo suficiente para o
escuro, acabamos sempre por ver aí alguma
coisa." William Butler Yeats
i
RESUMO
KOYAMA, N. S. Estudo do papel de galectina-1 na infecção experimental por
Toxoplasma gondii. 2008. 109 f. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008.
Toxoplasma gondii é um parasita intracelular adquirido por meio da ingestão de cistos
teciduais ou presentes em alimentos contaminados com fezes de gatos. A infecção oral
de camundongos C57BL/6 com cistos de T. gondii causa ileíte associada a uma resposta
Th1 exacerbada. Galectina-1, uma proteína ligante de β-galactosídeos, apresenta papel
imunomodulador em diversos modelos de doenças inflamatórias e auto-imunes.
Entretanto, o papel de galectina-1 durante a infecção parasitária ainda não foi
determinado. Portanto, o objetivo deste trabalho foi estudar o papel de galectina-1 na
resistência do hospedeiro contra a infecção por T. gondii e na patogênese da ileíte
induzida por este parasita. A primeira estratégia utilizada foi o tratamento de
camundongos infectados por T. gondii com galectina-1. Para tal, camundongos
C57BL/6 foram infectados com 100 cistos da cepa ME-49 pela via oral e tratados com
PBS ou galectina-1 (50 µg/animal) nos dias 0, 2, 4, 6 e 8 após a infecção. A taxa de
mortalidade e a perda de peso foram significantemente menores em camundongos
tratados com galectina-1 em relação aos não tratados. Ainda, a carga parasitária no
cérebro de camundongos tratados com galectina-1 também foi menor. No dia 7 após a
infecção, a análise histopatológica do intestino delgado mostra que o tratamento de
camundongos infectados por T. gondii com galectina-1 induziu uma redução
significante na inflamação intestinal. Além disso, camundongos tratados com galectina-
1 infectados apresentaram uma redução nos níveis no IFN-γ e TNF-α no soro e aumento
na expressão de IL-10 e TGF-β no baço no 7º dia após infecção em relação ao
camundongo controle não tratado. Além disso, a infecção por T. gondii provocou uma
diminuição da expressão da galectina-1 no intestino delgado dos animais. Esses
resultados sugerem que o efeito protetor induzido por galectina-1 pode estar relacionado
com a redução das citocinas inflamatórias IFN-γ e TNF-α e aumento das citocinas
reguladoras IL-10 e TGF-β. Outra estratégia para avaliar o papel de galectina-1 durante
a infecção por T. gondii foi o uso de camundongos geneticamente deficientes de
galectina-1 (Gal-1
-/-
). A ausência de galectina-1 endógena também protegeu os animais,
ii
pois camundongos Gal-1
-/-
apresentaram maior taxa de sobrevivência em relação aos
selvagens C57BL/6 (Gal-1
+/+
). Apesar de ambos os camundongos apresentarem
patologia intestinal similar, os animais Gal-1
-/-
infectados apresentaram maiores níveis
de IL-10 e menores de IFN-γ no intestino delgado em relação aos selvagens.
Comparado aos camundongos Gal-1
+/+
, os animais Gal-1
-/-
infectados apresentam menor
número de células dendríticas, T CD4 ativadas, NK e NKT no linfonodo mesentérico.
Ainda, camundongos deficientes de galectina-1 também apresentaram níveis séricos de
IFN-γ e IL-12 menores em relação aos selvagens. Em conjunto, esses dados sugerem a
função benéfica tanto da ausência de galectina-1 endógena como a administração de
galectina-1 exógena na resistência a infecção por T. gondii pode estar associada à
montagem de uma resposta inflamatória menos intensa em nível local e sistêmico.
Portanto, este estudo abre novas perspectivas para a compreensão da função de
galectina-1, endógena e exógena, na indução da homeostase imunológica frente a
processos infecciosos.
Palavras chave: galectina-1, Toxoplasma gondii, infecção oral, resposta imune
iii
ABSTRACT
KOYAMA, N. S. Study of the role of galectin-1 in the experimental infection with
Toxoplasma gondii. 2008. 109 f. Thesis (Doctoral) – Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008.
Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite acquired by oral ingestion of
tissue cysts or foods contaminated with cat feces. Oral infection of C57BL/6 mice with
T. gondii cysts induces acute lethal ileitis associated with a strong Th1 adaptive immune
response. The therapeutic role of galectin-1, a β-galactoside-binding protein, in various
autoimmune and inflammatory experimental diseases has been associated with its anti-
inflammatory properties. However, the function of galectin-1 during a parasitic
infection has never been assessed. The aim of this work was to evaluate the role of
galectin-1 in host defense against T. gondii infection and in the pathogenesis of parasite
induced ileitis. The first strategy used was to examine the effect of treating T. gondii
infected mice with galectin-1. To accomplish this, C57BL/6 mice were infected with
100 cists of ME-49 strain by oral route and treated with PBS or galectin-1 (50
µg/animal) on days 0, 2, 4, 6 and 8 post infection. In this study, the rate of mortality and
weight loss was significantly lower in galectin-1 treated mice than untreated mice
during infection. The parasite burden in brains from galectin-1 treated mice was
reduced. At day 7 post infection, histological examination indicated that treatment of T.
gondii infected mice with galectin-1 resulted in a significant reduction in inflammation
of the small intestine. In addition, infected mice treated with galectin-1 presented a
marked reduction in IFN-γ and TNF-α serum levels and an augmentation of IL-10 and
TGF-β expression in the spleen at 7 days post infection when compared to control mice.
These results suggest that the observed reduction in mortality during acute phase of
infection in galectin-1 treated mice may due to the down regulation of inflammatory
cytokines IFN-γ and TNF-α and augmentation of regulatory cytokines IL-10 and TGF-
β. Interestingly, the T. gondii infection provoked a reduction of galectin-1 expression in
the small intestine of the animals. Another strategy to study the role of galectin-1 during
T. gondii infection was through the utilization of galectin-1 deficient mice (Gal-1
-/-
).
The absence of endogenous galectin-1 also protected mice, since Gal-1
-/-
infected mice
presented prolonged survival than C57BL/6 WT mice (Gal-1
+/+
). Despite similar
iv
intestinal pathology, Gal-1
-/-
presented higher IL-10 levels and lower IFN-γ levels in
small intestine in relation to Gal-1
+/+
infected mice. Compared to WT mice, Gal-1
-/-
infected mice had lower cell numbers of dendritic cells, activated CD4 T cells, NK and
NKT cells in mesenteric lymph nodes. Furthermore, Gal-1
-/-
infected mice also
presented reduced serum IFN-γ and IL-12 levels compared to Gal-1
+/+
mice. The data
identify the beneficial role of both absence galectin-1 and the administration of
exogenous galectin-1 in resistance to T. gondii. Taken together, our results suggest that
intracellular functions of endogenous galectin-1 may not be the same as those exerted
by exogenous administrated galectin-1 during a parasitic infection. However, exogenous
or endogenous galectin-1 could play an important role in the homeostasis of the immune
response during toxoplasmosis. Finally, this study provides new clues concerning the
role of galectin-1 in the induction of homeostasis during parasitic infection.
Keywords: galectin-1, Toxoplasma gondii, oral infection, immune response.
v
LISTAS DE ABREVIATURAS
AIDS - Síndrome da imunodeficiência adquirida
AP-1 – “activator protein-1”
APC - célula apresentadora de antígeno
β-ME - 2β-mercaptoetanol;
BSA - albumina bovina sérica
C2GnT- core 2β-1,6 N-acetil glicosaminiltransferase
CD - “cluster differentiation”
CDR- domínio de reconhecimento de carboidrato
CCL2- “chemokine ligand” 2 (“monocyte chemoattractant protein 1”)
Con-A - concanavalina A
DO - densidade óptica
DTH - hipersensibilidade do tipo tardia
DTT - Ditiotreitol
EAE- encefalomielite auto-imune experimental
ECL- quimioluminescência aumentada
ELISA- “Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay” (ensaio imunoenzimático)
ERK - “extracellular signal-related kinase”
FACs - citometria de fluxo
FITC - Isocianato de fluoresceína
FOXP3 – “forkhead box P3”
gal-1 - galectina-1
Gal-1
+/+
- camundongos C57BL/6 selvagens
Gal-1
-/-
- camundongo geneticamente deficiente do gene da galectina-1
vi
GalNAc - N-acetil galactosamina
GlcNAc - N-acetil glicosamina
HE - hematoxilina e eosina
IDO - “Indoleamine 2,3 dioxygenase”
IELs - linfócitos intra-epiteliais
IFN-γ - interferon-γ
IGTP - GTPase induzível por IFN-γ
IL - interleucina
iNOS - Óxido nítrico sintetase induzível
IRG - família de GTPase relacionadas com a imunidade
lacNAc - N-acetil lactosamina
LPS- lipopolissacarídeo
MLN- linfonodo mesentérico
MyD88 – “myeloid differentiation factor 88”
NFAT - fator nuclear de células T ativadas
NK- células matadoras naturais
NO - óxido nítrico
PE - Ficoeritrina
PBMC- células mononucleares do sangue periférico
PLC - fosfolipase C
PMN- polimorfonuclear
SCID - imunodeficiência grave combinada
SNC - sistema nervoso central
SBF - soro bovino fetal
SPF - condições livres de germes patogênicos específicos
vii
SDS-PAGE - eletroforese em gel de poliacrilamida em duodecil sulfato de sódio
STag- antígeno solúvel de taquizoíta de T. gondii
STAT - Transdutor de sinal e ativador de transcrição
TCRαβ- cadeia αβ do receptor de células T
TGF-β - Fator de crescimento tumoral β
Th- células T “helper”
TLR- receptores do tipo toll
TNF-α - fator de necrose tumoral-α
WT- Wild type, tipo selvagem
viii
LISTAS DE FIGURAS
Figura 1.
Curva de sobrevivência de camundongos C57BL/6 tratados
ou não com galectina-1, durante a infecção por T.
gondii..................................................................................
41
Figura 2.
Alterações histopatológicas no intestino delgado de
camundongos C57BL/6 controles e tratados com galectina-1
infectados por T. gondii..........................................................
43
Figura 3.
Parasitismo tecidual no intestino delgado e no SNC de
camundongos C57BL/6 controles e tratados com galectina-1
aos 7 dias de infecção com 100 cistos de T.
gondii.....................................................................................
44
Figura 4.
Níveis séricos de IFN-
γ
, TNF-
α
e IL-12/23 p40 de
camundongos C57BL/6 infectados com T. gondii tratados ou
não com galectina-1........................................................
46
Figura 5.
Expressão relativa de TNF-
α
, IFN-γ, IL-12/23 p40 e IL-4 no
linfonodo mesentérico de camundongos controles e tratados
com galectina-1 infectados com T. gondii..............................
47
Figura 6.
Expressão relativa de TGF-
β
e IL-10 no baço de
camundongos C57BL/6 controles e tratados com galectina-1
infectados com T. gondii........................................................
48
Figura 7.
Imunodetecção de galectina-1 em extrato total de intestino
de camundongos C57BL/6 selvagens infectados ou não com
T. gondii..................................................................................
49
Figura 8.
Curva de sobrevivência de camundongos deficientes ou não
do gene da galectina-1, durante a infecção por T. gondii.......
51
Figura 9.
Alterações histopatológicas no fígado de camundongos
selvagens e Gal-1
-/-
aos 7 dias de infecção por T. gondii..
53
Figura 10.
Alterações histopatológicas no pulmão de camundongos
selvagens e Gal-1
-/-
infectados por T. gondii.......................
54
Figura 11.
Alterações histopatológicas no SNC de camundongos
selvagens e Gal-1
-/-
aos 30 dias de infecção por T. gondii....
56
ix
Figura 12.
Parasitismo no SNC e no pulmão de camundongos aos 15 e
30 dias de infecção com Toxoplasma gondii.........................
57
Figura 13.
Análise comparativa dos níveis séricos de IFN-
γ
e IL-12/23
p40 de camundongos selvagens e Gal-1
-/-
infectados por T.
gondii......................................................................................
58
Figura 14.
Expressão relativa de IFN-
γ
e IL-12/23 p40 no baço de
camundongos selvagens e Gal-1
-/-
infectados por T. gondii.
60
Figura 15.
Porcentagem de células T CD8
, CD4
e CD4
CD25
no
baço de camundongos selvagens e Gal-1
-/-
infectados por T.
gondii.......................................................................................
61
Figura 16.
Porcentagem de células T CD4
CD25
Foxp3
no baço de
camundongos selvagens e Gal-1
-/-
infectados por T. gondii.
63
Figura 17.
Determinação das porcentagens de células CD19
e F4/80
+
no baço de camundongos selvagens e Gal-1
-/-
, infectados por
T. gondii.........................................................................
64
Figura 18.
Dosagem de IL-10 no intestino de camundongos selvagens e
Gal-1
-/-
infectados por T. gondii.............................................
65
Figura 19.
Dosagem de IL-12/23 p40 e IFN-γ no intestino de
camundongos destituídos ou não do gene da galectina-1 e
infectados por T. gondii.......................................................
67
Figura 20.
Comparação dos níveis séricos de IFN-γ e IL-12 de
camundongos selvagens (Gal-1
+/+
)
e Gal-1
-/-
infectados por
T. gondii..................................................................................
68
Figura 21.
Detecção de células T CD4
e CD8
no linfonodo
mesentérico de camundongos selvagens e Gal-1
-/-
infectados
por T. gondii.............................................................................
69
Figura 22.
Detecção de células CD11c
, CD11c
CD8
α
, NK, NKT e
F480
+
, no linfonodo mesentérico de camundongos selvagens
(Gal-1
+/+
)
e Gal-1
-/-
infectados por T. gondii...........................
70
Figura 23.
Análise da taxa de morte celular no linfonodo mesentérico
de camundongos deficientes ou não para o gene da
galectina-1 infectados por T. gondii.......................................
72
x
Figura 24.
Comparação das alterações histopatológicas no intestino
delgado de camundongos Gal-1
+/+
e Gal-1
-/-
infectados por T.
gondii.....................................................................................
73
Figura 25.
Parasitismo no intestino delgado de camundongos aos 7 dias
de infecção com Toxoplasma gondii.......................................
74
Figura 26.
Parasitismo no SNC e nos órgãos periféricos de
camundongos aos 7 dias de infecção com Toxoplasma
gondii....................................................................................
75
Figura 27.
Produção de IFN-γ, IL-10 e IL-4 por células T CD4 de
camundongos selvagens e Gal-1
-/-
não infectados e ativadas
in vitro....................................................................................
77
Figura 28.
Produção de IFN-γ, IL-10 e IL-4 por células T CD4 de
camundongos selvagens e Gal-1
-/-
não infectados polarizadas
para o padrão Th1, Th2 e Th17.............................................
78
xi
SUMÁRIO
RESUMO ..................................................................................................................................................... I
ABSTRACT ............................................................................................................................................... III
LISTAS DE ABREVIATURAS ................................................................................................................. V
LISTAS DE FIGURAS ........................................................................................................................... VIII
SUMÁRIO ................................................................................................................................................. XI
INTRODUÇÃO............................................................................................................................................ 1
OBJETIVO ................................................................................................................................................. 21
METODOLOGIA ...................................................................................................................................... 22
RESULTADOS .......................................................................................................................................... 40
DISCUSSÃO .............................................................................................................................................. 79
CONCLUSÕES .......................................................................................................................................... 92
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................................... 94
ANEXO .................................................................................................................................................... 110
________________________________________________________________________Introdução
1
INTRODUÇÃO
Toxoplasma gondii
Toxoplasma gondii é um protozoário que infecta a maioria das células nucleadas
de aves e mamíferos, tendo sido descrito simultaneamente em 1908 por Nicolle e
Manceaux na África do Norte e por Splendore no Brasil. A designação desta espécie
originou-se do nome do roedor norte africano Ctenodactylus gondi do qual este parasito
foi isolado. O nome do gênero é derivado do grego toxon, que significa arco, em
referência ao formato do protozoário.
Toxoplasma é um protozoário pertencente ao filo Apicomplexa, que consiste
principalmente de parasitos intracelulares obrigatórios, dentre eles o Plasmodium
causador da malária; estes protozoários são caracterizados pela presença de um
complexo apical composto por um anel de microtubulos de ancoragem através do qual
as organelas secretórias, micronema e roptrias, liberam seu conteúdo (DUBREMETZ et
al., 1998). As roptrias contêm moléculas-chave que são utilizadas pelo parasito no
processo de invasão celular e subversão de funções do hospedeiro (BOOTHROYD;
DUBREMETZ, 2008).
Em humanos, a infecção por T. gondii é uma das infecções parasitárias mais
comuns, sendo que cerca de um terço da população mundial já entrou em contato com
este parasita. Nos Estados Unidos e no Reino Unido estima-se que 9 a 40% das pessoas
estejam infectadas (JONES et al., 2007; JOYNSON, 1992; DUBEY; BEATTIE 1988).
Na América Central e do Sul calcula-se que a infecção atinja de 50 a 80% das grávidas
(ROSSO et al., 2008; HUNG et al., 2007). No Brasil cerca de 70% das gestantes são
sorologicamente positivas para T. gondii (SPALDING et al., 2005), sendo essa variação
correlacionada com os hábitos alimentares e de higiene da população.
________________________________________________________________________Introdução
2
T. gondii pode ser transmitido através da via oral-fecal, carnivorismo (isto é,
ingestão de carne contendo cistos) ou congenitamente. Os humanos tornam-se
infectados através da ingestão de cistos presentes em carne crua ou mal passada,
principalmente bovina ou suína, ou ingestão de oocistos em alimentos ou água
contaminados com fezes de gatos (DUBEY; BEATTIE, 1988; BAHIA-OLIVEIRA et
al., 2003).
Toxoplasmose em humanos: patogênese
A toxoplasmose é geralmente assintomática em indivíduos imunocompetentes e
progride para um estado crônico sem maiores complicações. Em cerca de 10% dos
casos a infecção aguda é acompanhada de linfoadenopatia febril e linfomonocitose
(FELDMAN, 1968; MONTOYA; LISENFELD, 2004). O estágio latente do parasito
pode persistir por toda a vida em um hospedeiro de forma clinicamente inaparente ou
latente. Entretanto, nos Estados Unidos cerca de 2% dos indivíduos imunocompetentes
infectados com T. gondii desenvolvem a toxoplasmose ocular, geralmente coriorretinite
(inflamação da camada interna do olho) (HOLLAND, 2003), cujas lesões podem levar a
perda progressiva da visão. No Brasil, essa incidência é maior, acometendo de 8 a 17%
dos indivíduos infectados (SILVEIRA et al., 2001; JONES et al, 2006).
Por outro lado, a toxoplasmose pode causar patologia grave e ser letal em
indivíduos imunossuprimidos ou em neonatos infectados congenitamente. Em
indivíduos imunocomprometidos, por exemplo, pela Síndrome da Imunodeficiência
Adquirida (AIDS), ou aqueles sob terapia imunossupressora, o parasito que está na sua
forma latente no sistema nervoso central (SNC) pode se reativar resultando em
encefalite toxoplásmica, lesões necróticas no SNC ou coriorretinite (AMBROISE-
THOMAS; PELLOUX, 1993; LUFT; REMINGTON, 1992). A encefalite toxoplásmica
________________________________________________________________________Introdução
3
pode apresentar os sintomas de cefaléia, alterações psicomotoras e comportamentais,
convulsões, paralisia de nervos cranianos e ataxia (MONTOYA; LISENFELD, 2004).
A toxoplasmose congênita ocorre apenas quando a mãe torna-se infectada
durante a gestação. A infecção materna adquirida antes da gestação tem baixo ou
nenhum risco ao feto (VOGEL et al., 1996). Em algumas regiões do Brasil, a
prevalência de toxoplasmose congênita é 1 em cada 3000 nascimentos (NETO et al,
2000). Estudos mostram que o risco da infecção congênita é menor quando a infecção
materna ocorre no primeiro trimestre (10 a 15%) e maior quando essa infecção acontece
durante o terceiro trimestre (60-90%) (DUNN et al., 1999). Por outro lado, se a infecção
congênita ocorre durante o primeiro trimestre, ela pode resultar em seqüelas mais graves
e até em aborto (DESMONTS; COUVREUR, 1974; HOLLIMAN, 1995). Na infecção
congênita, o feto é infectado por taquizoítas transmitidos através da placenta,
desenvolvendo a toxoplasmose disseminada que geralmente é fatal ou produz lesões no
SNC (AMBROISE-THOMAS; PELLOUX, 1993; FERREIRA; BORGES, 2002).
Dentre as manifestações clínicas temos hidrocefalia, convulsões, calcificação
intracerebral, coriorretinite, estrabismo, cegueira, epilepsia, retardo mental e anemia
(DESMONTS; COUVREUR, 1974; MONTOYA; LIESENFELD, 2004). Destas
manifestações, a seqüela mais comum é a toxoplasmose ocular que acomete cerca de
70-90% dos pacientes (DESMONTS; COUVREUR, 1974). Recentemente, foi descrito
que as crianças do Brasil com toxoplasmose ocular congênita apresentam
sintomatologia mais grave em relação às da Europa, apresentando lesões maiores e
maior freqüência de múltiplas lesões (GILBERT et al., 2008).
________________________________________________________________________Introdução
4
Subtipos de T .gondii
T. gondii podem ser classificados em três linhagens clonais principais chamadas
I, II e III, que apresentam baixa diversidade genética entre si (apenas 1% de divergência
entre essas linhagens) que são encontrados na Europa, África, Ásia e América do Norte.
A linhagem tipo I, a qual pertence a cepa RH, é caracterizada por sua alta virulência em
camundongos. Essa linhagem parece estar mais freqüentemente associada à
toxoplasmose ocular (MAUBON et al., 2008). As linhagens tipo II e III são
significantemente menos virulentas que a tipo I em camundongos, apresentando a
persistência na forma de cistos. A tipo II, a qual pertence a cepa ME49, é a linhagem
encontrada mais comumente em animais e humanos cronicamente infectados na Europa
e na América do Norte. Ainda, esta linhagem é encontrada em pacientes com AIDS e na
toxoplasmose congênita (BOOTHROIYD ; GRIGG, 2002). A linhagem clonal tipo III
está mais confinada em animais e é menos freqüente que a tipo II na Europa e na
América do Norte. Esta linhagem é considerada avirulenta em camundongos, embora
morte do animal em algumas semanas ou meses após o inoculo, associada ao
comprometimento neuronal (LEHMANN et al., 2006).
Por outro lado, o estudo de espécimes obtidas nas Américas Central e do Sul, na
Ásia e na África demonstrou que nessas regiões existem linhagens ou exóticas ou
atípicas, apresentam polimorfismos que não são típicos das linhagens clonais
(LEHMANN et al., 2006).
Ciclo de vida
Durante seu ciclo de vida, T. gondii se apresenta em três estágios infecciosos —
taquizoíta (do grego tachys = rápido; em grupos ou clones), forma que apresenta uma
rápida proliferação na célula hospedeira; bradizoíta (do grego brady = lento; em cistos
________________________________________________________________________Introdução
5
teciduais), forma que se encontra dentro de cistos sob replicação lenta em resposta ao
estresse imposto pelo sistema imunitário do hospedeiro; e esporozoíto, forma infectante
oriunda de processo de reprodução sexuada do parasito (DUBEY, 1998).
O ciclo de vida deste parasito apresenta duas fases (heteroxeno), uma fase
assexuada, que ocorre tanto em hospedeiros intermediários como em definitivos, e outra
sexuada, que é exclusiva de hospedeiros definitivos, os felídeos domésticos e selvagens
(BLACK; BOOTHROYD, 2000; DUBEY, 2007). O ciclo sexual ou entero-epitelial
ocorre exclusivamente nos enterócitos intestinais de muitos membros da família
Felidae. Após a ingestão de cistos teciduais, os parasitos invadem os enterócitos, onde
sofrem várias divisões e se diferenciam em microgametócitos e macrogametócitos. Os
gametócitos se fundem e formam os zigotos ou oocistos, que são eliminados junto com
as fezes. No meio ambiente, os oocistos sofrem esporulação (torna-se infectivos),
produzindo os esporozoítos, que são altamente resistentes e podem persistir por vários
meses ou anos no ambiente. Depois da ingestão desses esporozoítos por um hospedeiro
intermediário, estes se diferenciam nas formas replicativas taquizoítas que estabelecem
e mantêm a infecção aguda (COPPENS; JOINER, 2001). Durante a infecção aguda,
pode ocorrer a transmissão congênita para o feto. As formas taquizoítas invadem
ativamente células do hospedeiro, tanto hematopoiéticas quanto não-hematopoiéticas e
se replicam nos vacúolos parasitóforos (SIBLEY, 1993). A maioria deles é eliminada
pela resposta imune e os remanescentes se diferenciam em bradizoítas, de replicação
lenta, formando cistos que aparecem entre os dias 10 e 14 após a infecção de animais de
experimentação. A formação de cistos representa a fase crônica do ciclo assexuado e
esses são particularmente evidentes no sistema nervoso central e no tecido muscular
onde podem permanecer pelo resto de vida do hospedeiro (BLACK; BOOTHROYD,
________________________________________________________________________Introdução
6
2000). Quando felídeos ingerem carne contendo cistos, reinicia-se o ciclo entero-
epitelial, fechando o ciclo.
Resposta imunológica contra T. gondii
Após a contaminação com T. gondii, a rápida multiplicação dos taquizoítas nos
tecidos de hospedeiro imunocompetente é controlada através do desenvolvimento de
resposta imune celular adequada.
Diversos estudos de toxoplasmose em modelo animal demonstraram que a
resistência a essa doença é dependente das citocinas interferon-γ (IFN-γ) e interleucina-
12 (IL-12) (SUZUKI et al., 1988; GAZZINELLI et al., 1994; SCHARTON-KERSTEN
et al., 1997b). A IL-12, que é composta pelas subunidades p40 e p35, tem sido descrita
como fundamental para a indução da produção de IFN-γ (GAZZINELLI et al., 1994).
Na ausência do gene de IL-12p40 ou de transdutores de sinal Tyk2 ou STAT4
(Transdutor de sinal e ativador de transcrição 4) associados ao receptor de IL-12, a
produção de IFN-γ é gravemente prejudicada, resultando na susceptibilidade à infecção
aguda por T. gondii (CAI et al., 2000; SHAW et al., 2003). A fonte primária de IL-12
durante a infecção são as células dendríticas (REIS E SOUZA et al., 1997), as quais são
essenciais para a produção dessa citocina, pois a depleção dessas células aboliu a
produção de IL-12 e aumentou a susceptibilidade dos animais à infecção por T. gondii
(LIU et al., 2006). Por outro lado, tem se demonstrado que células dendríticas são um
meio de disseminação de T. gondii no hospedeiro, como um cavalo de Tróia
(LAMBERT et al., 2006).
O reconhecimento de T. gondii é dependente de receptores do tipo toll (TLR),
que são receptores que reconhecem padrões moleculares conservados em patógenos,
pois camundongos geneticamente deficientes de MyD88 (SCANGA et al., 2002;
________________________________________________________________________Introdução
7
DEBIERRE-GROCKIEGO et al., 2007) e de TLR11 (YAROVINSKY et al., 2005)
apresentam resistência prejudicada à infecção por T. gondii, com menor produção de IL-
12 e IFN-γ. Células dendríticas convencionais e plasmocitóides de camundongos
MyD88
-/-
ou TLR11
-/-
estimuladas com antígeno solúvel de taquizoíta de T. gondii
(STag) produziram baixos níveis de IL-12 p40, IL-6 e Fator de Necrose Tumoral Alfa
(TNF-α) (SCANGA et al., 2002; YAROVINSKY et al., 2005; PEPPER et al., 2008).
Trabalhos in vitro demonstraram que IL-12 induz a produção de IFN-γ por
células matadoras naturais (NK) (SHER et al., 1993; GAZZINELLI et al., 1993;
HUNTER et al., 1994). Por sua vez, IFN-γ e TNF-α ativam a atividade microbicida de
macrófagos (GAZZINELLI et al., 1993). Esse processo também foi demonstrado in
vivo através de camundongos SCID, animais com imunodeficiência combinada grave,
os quais produzem altos níveis de IFN-γ e IL-12 após a infecção por T. gondii, mesmo
na deficiência de células T e B (HUNTER et al., 1994). Ainda, a administração de IL-12
recombinante prolongou a sobrevivência desses animais e tal efeito foi abolido pela
depleção de células NK ou IFN-γ (GAZZINELLI et al., 1993).
Mecanismos de eliminação do parasito
É sabido que a resistência contra diversos parasitos induzida por IFN-γ ocorre
principalmente via o fator de transcrição STAT-1 (GIL et al, 2001; COLLAZO et al.,
2001; GAVRILESCU et al., 2004). Dentre os genes regulados por IFN-γ via STAT-1,
quatro são de particular importância para a resistência a T. gondii: o que codifica a
iNOS (Óxido Nítrico Sintetase induzível), os que codificam as proteínas Irgm1 (LRG-
47) e Irgm3 (IGTP - GTPase induzível por IFN-γ) e a que codifica a indoleamina
dioxygenase (IDO) (TAYLOR et al., 2004).
________________________________________________________________________Introdução
8
A enzima iNOS catalisa a formação de óxido nítrico a partir de L-arginina. A
expressão de iNOS em macrófagos requer a ativação combinada por IFN-γ e TNF-α ou
lipopolissacarídeo (LPS). O mecanismo preciso do efeito microbicida de NO ainda não
está claro. Embora o NO seja a principal via usada por macrófagos no controle da
proliferação de T. gondii, estudos de infecção de camundongos deficientes de iNOS
mostrou que a enzima tem um papel limitado durante a fase aguda da infecção, mas
evidente durante a fase crônica. Camundongos deficientes de iNOS infectados com T.
gondii por via oral apresentam uma menor inflamação no intestino delgado e maior
sobrevivência em relação a camundongos selvagens na fase aguda (KHAN et al., 1997).
Entretanto, durante a infecção crônica os camundongos deficientes de iNOS sucumbem
com maior carga parasitária e inflamação no cérebro (KHAN et al., 1997; SCHARTON-
KERSTEN et al., 1997a).
Outro grupo de mediadores da resistência a patógenos induzidas por IFN-γ
pertencem à família IRG (família de GTPase relacionadas com a imunidade) ou p47
GTPase. Dentre os membros das proteínas IRG que apresentam papel preponderante na
resistência contra T. gondii, podemos citar Irgm3 (IGTP), Irgm1 (LRG-47) e Irgd (IRG-
47) (TAYLOR et al., 2007; TAYLOR et al., 2000; COLLAZO et al. 2001).
Camundongos deficientes de Irgm1 e Irgm3 morrem durante a fase aguda da infecção
por T. gondii, com mortalidade similar à observada em camundongos deficientes de
IFN-γ (TAYLOR et al., 2000; COLLAZO et al. 2001). Nesses camundongos não há
supressão da replicação de taquizoítas nas células do peritônio, apesar da produção
normal de IL-12, IFN-γ e NO (TAYLOR et al., 2000).
Diversas evidências sugerem que as proteínas IRG apresentam a capacidade de
restringir o crescimento de parasitos em células do hospedeiro, por exemplo, Irgm1 e
Irgm3 controlam a proliferação de T. gondii em macrófagos (BUTCHER et al., 2005) e
________________________________________________________________________Introdução
9
Irgm3 controla o crescimento parasito em astrócitos (HALONEN et al., 2001;
MARTENS et al., 2005).
Por fim, outro mecanismo de controle da replicação de T. gondii induzido por
IFN-γ é através da indução da enzima indoleamina dioxygenase (IDO). Esta enzima
cataboliza a quebra do anel aromático do triptofano em quinurenina, resultando na
depleção de triptofano, sendo este um aminoácido essencial para o parasito
(PFEFFERKORN, 1984). Após a infecção de camundongos com T. gondii, observa-se a
redução da concentração de triptofano nos órgãos, mas em animais deficientes de IFN-γ
essa redução não é observada e parece estar correlacionada com o aumento da carga
parasitária nesses animais (SILVA et al., 2002; FUJIGAKI et al., 2002).
Papel da imunidade adaptativa na infecção por T. gondii
Durante a fase crônica da toxoplasmose, a sobrevivência de camundongos à
infecção depende da imunidade adaptativa, principalmente de células T CD8 e uma
resposta do padrão Th1 (SUZUKI; REMINGTON, 1988, 1990; KHAN et al., 1999). A
neutralização tanto de IFN-γ ou TNF-α durante essa fase resulta na reativação da
toxoplasmose e no desenvolvimento de encefalite toxoplásmica, caracterizado por
várias áreas de inflamação aguda focal e infiltrado inflamatório nas meninges e
parênquima cerebral (SUZUKI et al., 1989; 1990). O mesmo é observado quando há
depleção concomitante de células T CD8 e CD4 (GAZZINELLI et al., 1992). Estudos
com camundongos deficientes de perforina e camundongos deficientes de β2
microglobulina, que não possuem linfócitos T CD8 periféricos, demonstraram que
células T CD8 induzem resistência à infecção principalmente através da produção de
IFN-γ, em detrimento de sua atividade citolítica (DENKERS et al., 1997; DENKERS;
GAZZINELLI, 1998). Nesse contexto, foi demonstrado recentemente que células CD8
________________________________________________________________________Introdução
10
específicas para o peptídeo HF10, derivado do processamento do antígeno
imunodominante GRA6, são críticas para a imunidade protetora contra a infecção
experimental por T. gondii (BLANCHARD et al., 2008).
A principal fonte de IFN-γ no cérebro são células T que se infiltram após a
infecção (SCHLUTER et al., 1995; WANG et al., 2004; DENKERS et al. 1997). Além
dos linfócitos T, as células microgliais (macrófagos no cérebro) são as principais
produtoras dessa citocina no cérebro de camundongos infectados (SUZUKI et al.,
2005).
Células T CD4 são importantes na indução de resistência à infecção por T.
gondii, porém em certas condições podem exacerbar a doença. O papel
imunopatogênico de células T CD4 foi demonstrado através de modelo de infecção de
T. gondii por via oral, no qual se observou destruição do intestino delgado mediado por
este subtipo celular (LIESENFELD et al., 1996). Nesse trabalho observou-se que
camundongos C57BL/6 são susceptíveis, enquanto que Balb/c são resistentes à infecção
oral por T. gondii, sendo que essa susceptibilidade está associada à necrose dos vilos do
íleo mediada por células T CD4 e IFN-γ (LIESENFELD et al., 1996). Linfócitos
isolados da lâmina própria do intestino delgado de camundongos susceptíveis
expressaram níveis aumentados de IFN-γ e TNF-α e a depleção destas citocinas através
de anticorpos reduziu a necrose intestinal (LIESENFELD et al., 1999). As citocinas IL-
12 e IL-18 também estão associadas com o desenvolvimento da necrose intestinal, uma
vez que camundongos geneticamente deficientes dessas citocinas não apresentaram
necrose intestinal (VOSSENKÄMPER et al., 2004).
________________________________________________________________________Introdução
11
Regulação da resposta imunológica
Diversos trabalhos têm demonstrado a importância de mecanismos reguladores
no controle de processos inflamatórios que resultam em dano tecidual como a ileíte.
Dentre os mecanismos reguladores, podemos citar as citocinas IL-10, TGF-β e IL-27
(SUZUKI et al., 2000; ROERS et al., 2004; MENNECHET et al., 2004; VILLARINO
et al., 2003).
A citocina IL-10 previne o desenvolvimento da ileíte em camundongos Balb/c
infectados por T. gondii por via oral. Animais Balb/c deficientes de IL-10 apresentaram
patologia intestinal mediada por uma resposta Th1 similar à observada em
camundongos C57BL/6 (SUZUKI et al., 2000). Também foi demonstrado que IL-10
tem um papel na regulação negativa de IFN-γ sistêmico em camundongos C57BL/6
infectados por Toxoplasma por via intraperitoneal (GAZZINELLI et al., 1996).
Consistente com o papel supressor de IL-10 sobre a resposta Th1, camundongos
deficientes de IL-10 apresentam elevados níveis de IL-12 e conseqüente resposta de
IFN-γ e TNF-α aumentada, levando à inflamação hepática e necrose tecidual
(GAZZINELLI et al., 1996).
A citocina IL-10 tem ação inibitória das funções de células apresentadoras de
antígenos (APC), afetando a atividade coestimulatória e a resposta de citocinas de
células dendríticas e macrófagos (MOORE et al., 2001; COOPER et al., 2008). Esta
citocina é produzida por linfócitos Th2, células Tr1, células T reguladoras (SUFFIA et
al., 2006), células B (MUN et al., 2003), macrófagos (BLISS et al., 2000; KATAKURA
et al., 2004) e células dendríticas (MOORE et al., 2001).
Vale ressaltar que células T CD4 apresentam papel crítico na indução da
mortalidade de camundongos deficientes de IL-10 infectados por T. gondii. Dessa
forma, a mortalidade desses camundongos foi prevenida por tratamentos para reduzir a
________________________________________________________________________Introdução
12
magnitude da resposta de células T CD4, através de uso de anticorpos anti-CD4
(GAZZINELLI et al., 1996) ou bloqueio das moléculas coestimulatórias CD28/CD80 e
CD40/CD40L (VILLEGAS et al., 2000). Interessantemente, células T CD4 parecem ser
a fonte mais relevante de IL-10 durante a toxoplasmose, uma vez que a deleção do gene
de IL-10 nessas células foi suficiente para conferir susceptibilidade à infecção oral por
T. gondii (ROERS et al., 2004).
Recentemente, foi descrito que as principais células produtoras de IL-10 são
células Th1 convencionais (Tbet
+
) e não as T reguladoras. A marcação simultânea de
células T CD4 e de citocinas IFN-γ e IL-10 demonstrou que uma fração significante de
células produtoras de IFN-γ também produzem IL-10, sendo raras as células produtoras
apenas de IL-10. É interessante notar que células Th1 produtoras de IL-10 apresentam
função efetora, isto é, tem a capacidade de induzir a atividade microbicida de
macrófagos (JANKOVIC et al., 2007). A produção de IL-10 foi observada em células
Th1 ativadas, mas não naquelas em repouso, sugerindo que o desenvolvimento de
células Th1 produtoras de IL-10 pode estar correlacionado com a extensão da ativação
Th1. Desta forma, células Th1 que produzem tanto IL-10 como IFN-γ atuariam tanto na
eliminação do patógeno quanto na supressão da patologia resultante do processo
inflamatório (COOPER et al., 2008).
Podemos destacar também TGF-β como uma citocina chave associada à
regulação da imunopatologia intestinal mediada por T. gondii. A produção de TGF-β
por linfócitos intra-epiteliais (IELs) tem sido descrita como crítica na regulação de
linfócitos da lâmina própria e da resposta Th1 no intestino (BUZONI-GATEL et al.,
2001). Trabalhos demonstraram que a transferência adotiva de IELs CD8αβ
+
TCRαβ
+
do 7º dia de infecção por T. gondii para camundongo “naive” preveniu o
desenvolvimento da ileíte e a mortalidade desses animais após o desafio por infecção
________________________________________________________________________Introdução
13
oral (MENNECHET et al., 2004). TGF-β produzida por IELs modula as respostas pró-
inflamatórias dos linfócitos da lâmina própria através da inibição da transcrição de
mediadores pro-inflamatórios, tais como IFN-γ, IL-15, iNOS e TNF-α no intestino, via
ativação de Smad 2 e 3 (MENNECHET et al., 2004).
Estudos recentes têm demonstrado que IL-27 e IL-6 são importantes reguladores
de células T produtoras de IL-10 (AWASTHI et al., 2007; STUMHOFER et al., 2007).
IL-27 é uma citocina heterodimérica produzida principalmente por células da imunidade
inata e tem papel na inibição de respostas Th1, Th2 e Th17 em vários modelos de
infecção e de doenças auto-imunes (KASTELEIN et al., 2007). A presença de IL-27 na
cultura de células T inibe a produção de citocinas pró-inflamatórias e aumenta a
produção de IL-10 por células TCD4 e CD8 via STAT1 e STAT3 (AWASTHI et al.,
2007; STUMHOFER et al., 2006; 2007). A importância de IL-27 na diferenciação de
células T produtoras de IL-10 “in vivo” foi observada através de camundongo
geneticamente deficiente do receptor de IL-27 infectado por T. gondii, nos quais são
ausentes células Th1 IL-10
+
IFN-γ
+
(STUMHOFER et al., 2007). Consistente com a
importância de IL-27 na produção de IL-10, camundongo deficiente do receptor de IL-
27 desenvolve inflamação letal mediada por células T CD4 após infecção por T. gondii
(VILLARINO et al., 2003). Além disso, esse camundongo também desenvolve
encefalite toxoplásmica mediada por células Th17. Então, IL-27 também atua como
supressora de resposta Th17 contra antígenos do parasito durante a infecção por T.
gondii (STUMHOFER et al., 2007).
Galectina-1
A galectina-1 pertence a uma família evolutivamente conservada de proteínas
ligantes de carboidratos (lectinas) encontrada em mamíferos, atualmente com 15
________________________________________________________________________Introdução
14
membros (RABINOVICH et al., 2007). As galectinas apresentam afinidade por β-
galactosídeos e possuem seqüências conservadas nos seus domínios de reconhecimento
de carboidrato (CDR) (BARONDES et al., 1994a; DUNPHY et al., 2002, LEFFLER et
al., 2004). Baseado na sua estrutura, galectinas podem ser classificadas em três grupos:
prototípica, com repetição em “tandem” ou quimérica. As galectinas prototípicas são
aquelas que possuem apenas um CDR, que podem formar homodímeros tornando-se
funcionalmente bivalentes, e são representadas pelas galectinas -1, -2, -5, -7, -10, -13, -
14 e -15. As galectinas com repetições em “tandem” possuem dois CDR não idênticos
ligados por uma seqüência ligante curta (galectinas -4, -6, -8, -9, e -12). A galectina
quimérica apresenta um domínio não lectínico ligado ao CDR representada por um
único membro, a galectina-3 (LEFFLER et al., 2004).
Galectinas são proteínas solúveis, não possuem peptídeo sinal, estão confinadas
a compartimentos citosólicos e são liberadas para o meio extracelular através de um
mecanismo secretório não convencional (COOPER; BARONDES, 1990; SATO et al.,
1993; SEELENMEYER et al., 2005). Depois de liberadas para o meio extracelular,
galectinas podem se ligar a β-galactosídeos presentes nos múltiplos glicoconjugados
encontrados na superfície celular e na matrix extracelular como a laminina e a
fibronectina (VARKI
et al., 1999; COOPER; BARONDES et al., 1999). A maioria das
galectinas se ligam preferencialmente a glicoconjugados contendo β-galactosídeos que
consistem de unidades de N-acetil lactosamina (Galβ1-3GlcNAc ou Galβ1-4GlcNAc;
lacNAc), na forma de dissacarídeo ou como unidades repetitivas na cadeia poli N-acetil
lactosamina em N-glicanas ou O-glicanas (PATNAIK et al., 2006; HIRABAYASHI et
al., 2002). Embora todos os membros das galectinas reconheçam β-galactosídeos, cada
galectina tem uma especificidade única para oligossacarídeos mais complexos que
________________________________________________________________________Introdução
15
resulta nas ligações de diferentes glicoconjugados com conseqüente função diferente
dessas lectinas (PATNAIK et al., 2006; PACLICK et al., 2008).
O gene da galectina-1 é denominado Lgals-1 (“beta-galactoside-binding
protein”) e está localizado na região q12-q13.1 do cromossomo humano e na região E
do cromossomo 15 de camundongos (BALDINI et al., 1993). A galectina-1,
anteriormente chamada de lectina L14, contém 134 aminoácidos, massa molecular de
aproximadamente 14kDa, possui caráter ácido. Esses monômeros associam-se de modo
reversível formando homodímeros com constante de dissociação de 7µM (CHO;
CUMMINGS, 1995) e cada monômero possui um domínio de reconhecimento de
carboidrato (CDR) (BARONDES et al., 1994b). Análise de estruturas cristais de
galectina-1 ligadas a glicanas (DIAS-BARUFFI et al., 2002; LÓPEZ-LUCENDO et al.,
2004), estudos de ligação dessa lectina com neoglicoproteínas imobilizadas
(STOWELL et al., 2004) e glicoconjugados de superfície celular (PATNAIK et al,
2006), mostram que galectina-1 reconhece resíduos de galactose terminal e que esta
ligação proteína-carboidrato pode ser interferência de glicanas de diferentes
complexidades estruturais e ser sensível a condições oxidantes. A expressão da
galectina-1 foi observada em células epiteliais do timo (BAUM et al., 1995a), células T
primadas com antígeno (BLASER et al., 1998), macrófagos ativados (RABINOVICH et
al., 1996), células B ativadas (ZUNIGA et al., 2001b), células endoteliais (LA et al.,
2003), células endoteliais do cólon (THIJSSEN; HULSMANS; GRIFFIOEN, 2008),
células do estroma e de órgãos linfóides murinos e humanos, como o timo e linfonodo.
(CHIARIOTTI et al., 1999; RABINOVICH et al., 2002, STILLMAN et al, 2006).
Observou-se que células endoteliais, na presença de TNF-α, secretam mais galectina-1
que as não estimuladas com essa citocina (BAUM et al., 1995b) e lisado de células
dendríticas maduras continham mais galectina-1 que o lisado de células dendríticas
________________________________________________________________________Introdução
16
imaturas (PEREIRA et al., 2005). Ainda, a expressão de galectina-1 em certos tipos de
câncer está relacionada com a progressão do tumor (LIU; RABINOVICH, 2005;
DEMETTER et al., 2008).
Além da presença dessa lectina no citoplasma, galectina-1 também foi detectada
no núcleo (VYAKARNAM et al., 1998). Diversas evidências indicam que galectina-1
juntamente com galectina-3 estão envolvidas no “splicing” de pré-mRNA, uma vez que
extrato nuclear depletado de ambas galectinas perderam a capacidade de realizar
“splicing” e a adição de galectina-1 ou galectina-3 recombinante foi capaz de restaurar
essa atividade (PARK et al., 2001; VYAKARNAM et al., 1997).
Foram descritos alguns receptores de galectina-1 em células T, incluindo CD2,
CD3, CD43, CD45, CD29 e CD7 (PACE et al., 1999; 2000; ROBERTS et al., 2003;
STILLMAN et al., 2006; HERNANDEZ et al., 2006), fato evidenciado pela
redistribuição dessas glicoproteínas em microdomínios específicos após a incubação
com galectina-1. Entretanto, o possível envolvimento de CD45 na indução de apoptose
por galectina-1 ainda é controverso (WALZEL et al., 1999, NGUYEN et al., 2001;
FAJKA-BOJA et al., 2002), provavelmente devido à diferenças na glicosilação
específica dessas glicoproteínas, que é um fator determinante que afeta a resposta de
células T à galectina-1. Nessa linha, células T CD45 sem a enzima core 2β-1,6 N acetil
glicosaminiltransferase (C2GnT), uma estrutura responsável para criar ramificações em
O-glicanas das glicoproteínas de linfócitos T, são resistentes a morte induzida por
galectina-1 (NGUYEN et al., 2001; GALVAN et al., 2000). Ainda, demonstrou-se que
a susceptibilidade a essa lectina pode ser regulado negativamente pela ST6Gal I
sialiltransferase que seletivamente modifica N-glicanas em CD45 para reduzir a ligação
de galectina-1 nessas células e a conseqüente sinalização via CD45 (AMANO et al.,
2003). Portanto, capacidade de galectina-1 de se ligar à célula é determinada pelo
________________________________________________________________________Introdução
17
repertório de glicoproteínas expresso na superfície celular e a atividade de
glicosiltransferases específicas.
A ligação de galectina-1 a células T inicia uma variedade de eventos de
transdução de sinal, tais como ZAP-70 e ERK-2, fosforilação da tirosina de fosfolipase
Cγ-1 (PCγ-1), influxo de cálcio, ativação de fatores de transcrição como AP-1 e NFAT e
redução da proteína anti-apoptótica Bcl-2, importante para fisiologia e sobrevivência de
célula T (VESPA et al., 1999; RABINOVICH et al., 2000a; WAZEL et al., 2002; ION
et al., 2005; ELOLA et al., 2005). Estudos têm demonstrado que galectina-1 antagoniza
sinalização do receptor de células T (TCR) durante a ativação destas células, inibindo a
produção de IL-2 e sua proliferação (CHUNG et al., 2000). Trabalhos têm demonstrado
que galectina-1 inibe a secreção de citocinas pró-inflamatórias tais como TNF-α e IFN-
γ por células T ativadas sem induzir a apoptose (RABINOVICH et al., 1999a). Também
foi demonstrado que essa lectina induz a produção de IL-10 em células mononucleares
do sangue periférico (PBMC) e em linfócitos T na presença ou não de anti-CD3 (VAN
DER LEIJ et al., 2004; 2007; STOWELL et al., 2008b)
.
Diversos trabalhos também mostram a participação de galectina-1 na resposta
imune inata e no processo inflamatório. Neste contexto, foi mostrado que essa lectina
inibe o edema, o extravasamento de neutrófilos e a desgranulação de mastócitos
(RABINOVICH et al., 2000b), sendo a migração de neutrófilos na peritonite murina
também inibida por galectina-1 através da inibição da adesão de neutrófilos ao endotélio
(LA et al., 2003, COOPER et al, 2008). Por outro lado, essa lectina é capaz de
promover a ativação da NADPH-oxidase, levando à explosão respiratória em
neutrófilos in vitro (ALMKVIST et al., 2002). Ainda, galectina-1 induz a expressão de
fosfatidilserina em neutrófilos humanos, sem promover apoptose, e favorece o
________________________________________________________________________Introdução
18
reconhecimento fagocítico desses leucócitos por macrófagos (DIAS-BARUFFI, et al.,
2003; STOWELL et al., 2007).
Galectina-1 inibe a liberação do ácido araquidônico (RABINOVICH et al.,
2000b), a produção de NO e a expressão de NO sintetase induzível (iNOS) em
macrófagos estimulados com LPS (CORREA et al., 2003). Trabalhos relatam que
monócitos humanos tratados com essa lectina apresentam redução da fagocitose via
FcγRI e inibição da expressão de MHCII, com conseqüente redução da apresentação de
antígenos a células T (BARRIONUEVO et al, 2007). Além disso, foi evidenciado que
essa lectina bloqueia a produção de IL-12 em células infectadas por Trypanosoma cruzi
(ZUNIGA et al., 2001a). Por outro lado, galectina-1 aumenta a secreção de citocinas
pró-inflamatórias em células dendríticas e a migração dessas células através da matriz
extracelular (FULCHER et al., 2006).
Galectina-1 também apresenta papel antiinflamatório in vivo. Em modelo animal
de encefalite auto-imune (OFFNER et al., 1990) e artrite reumatóide, a administração de
galectina-1 aboliu a resposta auto-imune, sendo que neste último o efeito terapêutico foi
acompanhado por mudança de resposta de citocinas para o padrão Th2 (RABINOVICH
et al., 1999b). Recentemente, foi corroborado que essa mudança de resposta para o
padrão Th2 está relacionada à morte de células Th1, mas não de células Th2, induzida
por galectina-1, sendo esta susceptibilidade associada ao padrão de glicosilação da
superfície dessas células (TOSCANO et al., 2007). A redução na produção de IFN-γ
também foi observada em modelo de hepatite induzida por concanavalina A (con-A)
(SANTUCCI et al., 2000), uveíte auto-imune experimental (TOSCANO et al., 2006) e
reação do enxerto contra hospedeiro (BAUM et al. 2003) em camundongos tratados
com galectina-1, além de menor inflamação na colite experimental em camundongos
tratados com essa lectina (SANTUCCI et al., 2003). Portanto, esses dados sugerem que
________________________________________________________________________Introdução
19
esta lectina exerce importante papel imunorregulador (TOSCANO et al., 2007), sendo
essa modulação da resposta imune relacionada ao efeito benéfico do uso de galectina-1
no tratamento de diversas doenças auto-imunes/ inflamatórias experimentais
(TOSCANO et al., 2006).
Nesse contexto, recentemente foi demonstrado que células T reguladoras
expressam constitutivamente galectina-1 e que essa lectina exerce papel na função
supressora dessas células, uma vez que células T reguladoras humanas (CD4
+
CD25
+
)
não foram capazes de inibir a proliferação de células T CD4
+
CD25
-
in vitro na presença
de anticorpo anti-galectina-1. Esses dados foram confirmados com células CD4
+
CD25
+
provenientes de camundongos deficientes de galectina-1, as quais apresentaram menor
atividade supressora sobre células CD4
+
CD25
-
em comparação a células de
camundongos selvagens (GARIN et al., 2007).
Na literatura existem diversas evidências que galectina-1 e galectina-3 podem
apresentar funções biológicas antagônicas (RABINOVICH et al., 2007). Assim, foi
demonstrado que a galectina-1 apresenta um caráter antiinflamatório e a galectina-3 é
geralmente pró-inflamatória (RABINOVICH et al., 2007). Nessa linha, recentemente
foi demonstrado que camundongos deficientes de galectina-3 exibiram uma resposta
inflamatória deficiente no intestino, fígado e sistema nervoso central durante a fase
aguda da infecção por Toxoplasma gondii, com maior carga parasitária cerebral.
Contraditoriamente, esses camundongos apresentaram uma resposta Th1 exacerbada
(BERNARDES et al., 2006).
Camundongos geneticamente deficientes de galectina-1 (Gal-1
-/-
) foram
produzidos há mais de uma década (POIRIER; ROBERTSON, 1993) e os estudos
iniciais indicaram falta de fenótipo nesses animais (POIRIER; ROBERTSON, 1993;
COLNOT et al., 1998). Entretanto, estudos mais recentes têm mostrado que, na
________________________________________________________________________Introdução
20
ausência de galectina-1, camundongos apresentam redução da sensibilidade térmica
(MCGRAW et al., 2005), na fusão de fibras musculares e na regeneração muscular
(GEORGIADIS et al., 2007). No contexto de processos inflamatórios, camundongos
Gal-1
-/-
apresentam maior inflamação na medula espinal em modelo de encefalomielite
auto-imune experimental (EAE) (TOSCANO et al., 2007) e maior resposta de
hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) (NORLING et al., 2008). Ainda, consistente
com o papel imunorregulador de galectina-1, esta lectina tem um papel relevante na
manutenção da tolerância materno-fetal (BLOIS et al., 2007) e animais (Gal-1
-/-
)
produzem mais IFN-γ e IL-17 durante a doença auto-imune experimental (TOSCANO
et al., 2007).
Neste contexto, baseado no fato de que galectina-1 é importante na função
supressora de células T reguladoras e que camundongos geneticamente deficientes dessa
lectina produzem mais citocinas pró-inflamatórias durante doença auto-imune,
pretendeu-se avaliar o papel de galectina-1 na relação parasito-hospedeiro em modelo
de infecção por T. gondii.
__________________________________________________________________________Objetivo
21
OBJETIVOS
Avaliar o papel de galectina-1 na modulação da resposta imune em modelo
experimental de toxoplasmose utilizando camundongos selvagens (Gal-1
+/+
) e
geneticamente deficientes de galectina-1 (Gal-1
-/-
) e camundongos tratados com
galectina-1. Mais detalhadamente, pretendeu-se:
1. Estudar a progressão da toxoplasmose nesses animais por meio de análises de
mortalidade, histopatologia e carga parasitária;
2. Avaliar o perfil de citocinas no soro e/ou órgãos de camundongos infectados por
T. gondii;
3. Analisar o perfil de leucócitos presentes no baço e no linfonodo mesentérico de
camundongos infectados por T. gondii.
_______________________________________________________________________Metodologia
22
METODOLOGIA
Soluções e reagentes
I.Solução de PBS - Foi preparada utilizando cloreto de sódio (NaCl) 0,14 mM, cloreto de
potássio (KCl) 2,7 mM, fosfato de potássio monobásico (KH
2
PO
4
) 0,88mM e
fosfato de sódio dibásico (Na
2
HPO
4
) 6,4 mM (todos obtidos da Merck & Co. Inc.,
Whitehouse Station, NJ, EUA), dissolvidos em água deionizada destilada, ajustado o
pH para 7,0 e mantida a 4
o
C.
II.Meio de cultura (RPMI-1640) – As culturas de células foram mantidas em meio de
cultura RPMI-1640 (Gibco BRL, Life Technologies, Gaithersburg, MD, EUA),
suplementado como descrito a seguir. Para o preparo do meio, o conteúdo de cada
frasco foi reconstituído em 1 litro de água deionizada em MILLI-Q (Millipore
Corp., Bedford, MA, USA), e foram adicionados 10 mM de HEPES (N-
2hidroxietilpiperazina, N-2 ácido etanosulfônico) (Gibco BRL) e 2,2 g de
bicarbonato de sódio (Merck). O pH da solução foi ajustado para 7,4. O meio usado
nas culturas de células foi suplementado com 5% de soro bovino fetal (Cultilab,
Campinas, SP) previamente inativado por incubação a 56ºC por 10 minutos. Foram
adicionados 5 x 10
-5
M de 2-mercaptoetanol, 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de
penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina, aminoácidos não essenciais e piruvato de
sódio, todos provenientes do Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Essa solução
completa foi esterilizada com membrana de poro 0,22 mm (Millipore Corp.) e
mantida a 4
°
C até o momento de ser utilizada.
III.Tampão de lise - Foram misturadas nove partes de uma solução de cloreto de amônio
0,16M (Merck) e uma parte de solução de Tris 0,17M. A solução foi esterilizada em
membrana de poro 0,22 µm e mantida a 4°C. Esta solução foi utilizada para lisar
_______________________________________________________________________Metodologia
23
hemácias das amostras de macrófagos e células do baço antes de iniciar as culturas
propriamente ditas.
Animais de experimentação
Foram utilizados camundongos da linhagem C57BL/6 selvagens (Gal-1
+/+
) ou
geneticamente deficientes do gene da galectina-1 Lgals-1 (Gal-1
-/-
), com 6 a 8 semanas.
Os animais foram fornecidos pelo biotério de animais isogênicos da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FCFRP-USP)
e mantidos em condições livres de germes patogênicos específicos (SPF) no biotério de
animais de experimentação da FCFRP-USP. Os camundongos C57BL/6 Gal-1
-/-
foram
obtidos a partir de 20 procedimentos de retrocruzamento de animais C57BL/6 selvagens
com camundongos 129SV Gal-1
-/-
. Os animais C57BL/6 Gal-1
-/-
foram cedidos pelo Dr.
Richard D. Cummings, do Departamento de Bioquímica, da Faculdade de Medicina da
Universidade de Emory, Atlanta, EUA. O trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética
no Uso de Animais do Campus de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (CEUA
– Protocolo N° 07.1.784.53.0).
Obtenção e purificação da Galectina-1 Recombinante Humana Dimérica
Galectina-1 (CHO & CUMMINGS, 1995) foi obtida de cultura de
bactérias (E. coli cepa M-15) transformadas com plasmídio PQU-50 contendo o gene
completo da galectina-1. A bactéria citada foi cedida pelo Prof. Dr. Richard Cummings,
do Departamento de Bioquímica, da Faculdade de Medicina da Universidade de Emory,
Atlanta, EUA. As bactérias foram cultivadas em meio LB Broth Base (Invitrogen,
Carlsbad, CA, EUA) com ampicilina (50 µg/mL) (USB Corporation, EUA) sob agitação
em incubadora a 37°C. Após crescimento bacteriano, foi adicionado a cultura isopropil
_______________________________________________________________________Metodologia
24
β-D-tiogalacto-piranozídeo (IPTG, Promega Corporation, WI, EUA), para a indução da
expressão de galectina-1 pelas bactérias. O cultivo foi mantido sob agitação em
incubadora por mais 4 horas. Após este período de incubação, a suspensão bacteriana
foi centrifugada a 5000 g por 20 minutos a 4°C. Finalmente, o sobrenadante foi
desprezado e o pellet foi armazenado a -70°C por no máximo 2 semanas.
O pellet bacteriano descongelado foi ressuspendido em tampão de lise [8mL de
PBS estéril; 14mMde β-mercaptoetanol (2-ME, Merck); 14 tablete de inibidores de
protease sem EDTA (Roche Applied Science, Mannheim, Germany); 1 mg de lisozima
(Roche Applied Science); 100 µg de RNAse tipo 3A (Sigma-Aldrich); 100 µg de
DNAse tipo IV (Sigma-Aldrich)].
O pellet foi incubado por 30 minutos no tampão de lise a 4°C e posteriormente
sonicado. O lisado bacteriano foi centrifugado a 10.000 g por 45 minutos a 4° C. Em
seguida, o sobrenadante foi submetido à cromatografia de afinidade em coluna de
agarose-lactos (Sigma-Aldrich). O material não-ligante foi eluído com tampão de
equilíbrio (PBS, adicionado de 14mM de 2-ME pH 7,4). O material ligante à coluna foi
eluído com tampão de eluição (PBS, 14mM de 2-ME, 100mM de lactose, pH 7,4). Esse
procedimento cromatográfico foi monitorizado por leitura de densidade ótipca (DO) em
280 nm em espectrofotômetro (UV mini 1240, Shimadzu). Os valores de DO obtidos
foram convertidos para concetração (mg /mL) utilizando o coeficiente de extinção
molar (1,17) desta molécula e o fator de diluição (FD) pela seguinte fórmula:
Concentração de galectina-1 [mg/mL] = 1,17 × FD × DO (280mM)
Uma vez que galectina é uma proteína produzida uma bactéria gram-negativa,
que possui LPS (lipolissacarídeo) na composição sua parede celular, essa lectina foi
_______________________________________________________________________Metodologia
25
submetida à cromatografia de afinidade em coluna contendo Polimixina B acoplada à
agarose (Detoxi-Gel Endotoxin Removing Gel, Pierce, IL, USA).
A galectina-1 purificada, obtida da cromatografia em agarose-lactose, foi
aplicada a coluna de gel de agarose-polimixina-B e a galectina-1 livre de LPS foi eluída
utilizando tampão de eluição livre de endotoxinas. Então, as alíquotas de galectina-1
livre de LPS foram mantidas em tampão de eluição a -70° C até o momento do uso, com
a finalidade de preservar a atividade lectínica dessa proteína.
A quantidade de LPS nas amostras de galectina-1 foi determinada utilizando o
kit QCL-1000 (Cromogenic Limulus Amebocyte Lysate Assay, Cambrex Company,
MD, USA), e foi menor que 0,1 unidade de endotoxina (EU)/µg de proteína.
Para os ensaios, estas alíquotas foram submetidas ao processo de cromatografia
de exclusão molecular em coluna PD10 (Sephadex-G25M, Pharmacia LKB, Uppsala,
Suécia) para a retirada da lactose e de 2-ME. A galectina-1 foi eluída com PBS livre de
endotoxinas e as concentrações de galectina-1 nas alíquotas foram determinadas como
descrito acima.
Infecção de camundongos por Toxoplasma gondii (cepa ME-49)
Cultivo do parasito Toxoplasma gondii
A cepa ME-49, de baixa virulência, cistogênica (LUNDE et al., 1983) tem sido
mantida em laboratório através de sucessivas infecções em animais C57BL/6. Os
animais receberam 20 cistos (por via oral) e, após 30 dias, o cérebro dos animais foi
removido, macerado, e os cistos purificados através da separação em gradiente de
Dextran MW 167.000 (Sigma-Aldrich). Resumidamente, cada cérebro foi
homogeneizado em 4 mL de PBS e ao macerado resultante foram adicionados 4 mL de
dextran (25%) e a mistura homogeneizada. Após o processo de centrifugação a 800 g
_______________________________________________________________________Metodologia
26
por 22 minutos a 4°C, a fase superior resultante, contendo grande parte de tecido
cerebral, foi removida e o precipitado ressuspenso em 4 mL de PBS. Essa suspensão foi
centrifugada a 500 g por 10 minutos, sendo o sobrenadante descartado e o sedimento
ressuspenso em 1 mL de PBS. Finalmente, os cistos foram contados em câmara de
Neubauer, estando prontos para serem administrados aos animais selvagens (Gal-1
+/+
) e
Gal-1
-/-
da linhagem C57BL/6.
Infecção de camundongos por Toxoplasma gondii (cepa ME-49)
Camundongos machos Gal-1
+/+
ou Gal-1
–/–
de 6 a 8 semanas de idade, foram
infectados com 20 ou 100 (50 µL) cistos por via oral. Além disso, camundongos
selvagens C57BL/6 foram tratados com PBS ou galectina-1 (50 µg/animal – 100 µL),
por via intraperitoneal, nos dias 0, 2, 4, 6 e 8 de infecção. A dose foi baseada em valores
já descritos, conforme Santucci et al (2003).
Inicialmente, camundongos machos Gal-1
+/+
, Gal-1
–/–
e C57BL/6 (controle) ou
tratados galectina-1 (gal-1) foram infectados com 100 cistos por via oral para a
avaliação da mortalidade e da fase aguda da toxoplasmose. Posteriormente,
camundongos machos Gal-1
+/+
, Gal-1
–/–
foram infectados com 20 cistos para avaliação
da fase crônica da toxoplasmose. Nos dias 7, 15 e 30 de infecção com 20 cistos, os
animais foram eutanasiados para retirada de sangue para dosagem de citocinas. As
amostras de tecido do cérebro, fígado, baço e pulmão, também foram coletadas de cada
animal, para avaliação do parasitismo cerebral e do infiltrado inflamatório. Além disso,
baços foram retirados para fenotipagem de células através de citometria de fluxo.
Nos dias 3 e 7 de infecção com 100 cistos, os camundongos foram eutanasiados
para obtenção de soro e de segmentos do íleo e dos linfonodos mesentéricos (MLN),
além dos órgãos citados acima. Segmentos do intestino delgado foram colhidos, lavados
_______________________________________________________________________Metodologia
27
e imersos em solução de formaldeído a 4% para análise histopatológica, como descrita
abaixo. Os segmentos intestinais do íleo destinados à dosagem de citocinas foram
lavados e imersos em solução PBS suplementado com coquetel de inibidor de proteases
(Roche Applied Science). Em seguida, esses segmentos foram homogeneizados com
triturador de tecidos, as amostras foram centrifugadas (5000 rpm) e os sobrenadantes
armazenados a -80°C até o momento do uso. Os linfonodos mesentéricos foram
retirados para fenotipagem de células.
Analise histopatológica
Para avaliação das lesões patológicas nos diferentes órgãos dos animais
infectados, fragmentos de cérebro, pulmão, fígado, baço e intestino delgado foram
coletados nos dias 3, 7, 15 e 30 de infecção e fixados com formaldeído a 4%
(tamponado em tampão fosfato 0,1 M). Após a fixação por 24 horas, os fragmentos
foram desidratados em concentrações crescentes de álcool e xilol e inclusos em blocos
de parafina e cortes de 5µm de espessura dos tecidos foram obtidos com o auxílio de um
micrótomo. Os cortes foram dispostos em lâminas, incubados em xilol para retirar o
excesso de parafina e hidratados com concentrações decrescentes de álcoois (do
absoluto ao álcool 70%). Os cortes reidratados foram corados com hematoxilina e
eosina (HE) e desidratados com concentrações crescentes de álcool (70% a absoluto),
imersos em xilol e montadas com lamínula de vidro com Permount (Electron
Microscopy Science, Fort Washington, USA).
A análise das lesões patológicas foi feita em toda a extensão do intestino
delgado, e as lesões inflamatórias foram graduadas de acordo com a presença e extensão
de infiltrados inflamatórios na lâmina própria e submucosa, alargamento das
vilosidades, aumento na espessura destas e início de necrose. As alterações
_______________________________________________________________________Metodologia
28
histopatológicas foram verificadas em 40 campos microscópicos de cada secção tecidual
no fígado, baço, pulmão e em secções sagitais de cada hemisfério cerebral no sistema
nervoso central (SNC) (aumento de 400×). No fígado e pulmão, foram avaliados focos
inflamatórios e de necrose, quando presentes, e infiltrados inflamatórios nos septos
alveolares, respectivamente. No SNC foi analisada a presença de células inflamatórias
espalhadas pelo parênquima e nas meninges; manguito perivascular e infiltrados
inflamatórios focais (nódulos gliais). A análise foi feita em pelo menos 5 animais de
cada grupo.
As imagens dos cortes de imunohistoquímica e histopatologia foram capturados
utilizando-se a câmera digital Nikon DXM 1200 (Nikon Instruments Inc, NY, USA)
acoplada ao microscópio Nikon Eclipse E800 (Nikon Instruments Inc.).
Análise do parasitismo tecidual por imunohistoquímica
Para a quantificação do parasitismo tecidual nos diferentes órgãos dos animais
infectados, cortes histológicos parafinados de tecido do SNC, pulmão, fígado, baço e
intestino delgado foram utilizados. As lâminas foram incubadas em xilol para retirar o
excesso de parafina e hidratadas com concentrações decrescentes de álcoois (do
absoluto ao álcool 70%). Em seguida, a peroxidase endógena do tecido foi bloqueada
através da incubação dos cortes com água oxigenada a 3%, por 30 minutos.
Posteriormente, as lâminas foram lavadas por três vezes em PBS e foi realizado o
resgate antigênico em tampão citrato 0,01 M, pH 6.0 por 7 minutos em forno
microondas em potência máxima. Em seguida, as lâminas foram lavadas por três vezes
com PBS e incubadas com PBS BSA 1% (Sigma-Aldrich) por 30 minutos para se obter
o bloqueio das ligações inespecíficas. Os cortes foram finalmente incubados com
anticorpo primário que consistiu em soro de coelho anti-cepa ME-49 de Toxoplasma em
_______________________________________________________________________Metodologia
29
câmara úmida, a 4ºC por 12-16 horas. Após esse período, o anticorpo secundário e em
seguida a Streptavidina foram adicionados ambos da Dako Cytomation LSAB
®
(Dako
North America, CA, USA) e incubados por 30 minutos cada, a temperatura ambiente.
Procedeu-se a revelação da reação utilizando-se o cromógeno diaminobenzidina (DAB)
(Zymed Laboratories Inc., CA, USA). As reações foram interrompidas com água
destilada, as lâminas contra-coradas com Hematoxilina de Mayer por 1 minuto e, então,
montadas com Entelan (Merck).
A análise do parasitismo tecidual foi realizada através da contagem do número
de vacúolos parasitóforos em toda a extensão do intestino delgado e em 40 campos
microscópicos no fígado, pulmão e baço. No SNC foi feita a contagem de vacúolos
parasitóforos e estruturas como cisto (parasitismo total) em secções sagitais de um
hemisfério cerebral (aumento de 400×).
Imunodetecção de galectina-1 no extrato total de intestino delgado de
camundongos C57BL/6 selvagens infectados ou não com T. gondii
As amostras de intestino delgado de camundongos selvagens (n=5) infectados ou
não com 100 cistos foram extraídas ao 7° dia de infecção e as amostra de cada grupo
foram maceradas juntas em nitrogênio líquido na presença de tampão de amostra (62.5
mM Tris pH 6.8, 2% (p/v) SDS, 5% (v/v) glicerol, 0.10 mM SERVA blue, 0.25 mM
EDTA, e 0.9% β-mercaptoetanol). Os extratos intestinais foram centrifugados por 10
min a 10000 g e, os sobrenadantes de cada preparação foram submetidos à determinação
da concentração protéica total com o uso do kit “BCA Protein Assay Kit” (Pierce
Biotechnology, Inc. USA). Como controles foram utilizadas amostras de intestino de
camundongos C57BL/6 Gal-1
-/-
. Finalmente, as amostras de cada sobrenadante foram
submetidas à SDS-PAGE, em concentração equivalente a 100 µg de proteína e em
condições redutoras. A corrida eletroforética foi realizada em minigel de poliacrilamida
_______________________________________________________________________Metodologia
30
com concentração de 12,5% utilizando tampão convencional de corrida, contendo Tris-
Glicina e 0,1% SDS (Sigma Chemical). As proteínas foram, então, eletrotransferidas do
gel para membrana de nitrocelulose (0,22 µm; Hybond – Amersham Biosciences,
Alemanha) por 1,5h a 25V (300-400mA) em tampão Tris-Glicina contendo 10%
metanol. A eficiência da eletrotransferência foi avaliada pela coloração das membranas
com o corante Ponceau S para proteínas. A etapa de bloqueio foi realizada pela
incubação das membranas com solução de PBS contendo 5% de leite bovino desnatado,
por 12-14 horas sob branda agitação. Seqüencialmente, a membrana foi incubada com
0,25 µg/mL de anticorpo policlonal de coelho anti-Gal-1 humana, purificado por
afinidade, diluído em PBS contendo BSA 1%, por 1,5 hora a temperatura ambiente. Em
seguida, a membrana foi submetida a três lavagens com PBS/Tween 20 0,05% por 10
minutos cada, sobre agitação. Após as etapas de lavagens, incubou-se a membrana com
40 ng/mL de IgG de cabra anti-IgG de coelho conjugada com peroxidade (HRPO:
Horseradish Peroxidase Conjugated - Jackson ImmunoReseach- USA) por uma hora.
Três etapas de lavagens foram repetidas. A imunorreatividade para Gal-1 foi detectada
usando o kit ECL Western Blot (Amersham) e filme fotográfico (Hyperfilm™ ECL™ –
Amersham). Finalmente, foi feita uma análise comparativa do nível de detecção de
galectina-1 na diferentes amostras por densitometria com o uso do programa “DigDoc-
Alphaease” (versão 3.2 – Alpha-Immunotech) e os resultados foram expressos em
valores de densidade integrada.
Dosagem de citocinas por ELISA
A quantificação de citocinas foi realizada por ensaio imunoenzimático (ELISA)
utilizando OptEIATM SET:Mouse (BD Biosciences, San Diego, CA, EUA), segundo as
intruções do fabricante. Foram submetidos à detecção de citocinas os sobrenadantes de
_______________________________________________________________________Metodologia
31
culturas de células T CD4, os sobrenadantes dos lisados intestinais e soro proveniente de
animais Gal-1
+/+
e Gal-1
–/–
e daqueles tratados ou não com galetina-1 infectados por T.
gondii. Brevemente, placas de 96 poços para ELISA (Corning Costar Europe
Badhoevedorp, The Netherlands) foram recobertas com 50 µL/poço com anticorpo anti-
citocinas (IFN-γ, IL-12p40, TNF-α , IL-10 ou IL-4) diluído (1/250) em tampão
carbonato 0,06M, pH 9,5 e incubadas por 12-16 horas a 4°C. Posteriormente, a placa foi
lavada com PBS contendo 0,05% de Tween 20 (PBS-T) (Sigma-Aldrich) e, incubada
por 2 horas a temperatura ambiente, com uma solução de bloqueio (PBS acrescido de
10% soro bovino fetal). Após esse período, aos poços foram adicionados, em duplicada,
IFN-γ, IL-12p40, TNF-α, IL-10 ou IL-4 recombinante para obtenção de uma curva
padrão (iniciada em 1000 pg/mL) ou as amostras, seguindo-se incubação à temperatura
ambiente por 2 horas. Após lavagens, o anticorpo biotinilado (1/500) específico para a
citocina testada mais a avidina conjugada a peroxidase (1/250) foram adicionados e
incubados por 1 hora. Após nova etapa de lavagens, foi acrescentada a solução
reveladora constituída de tetrametilbenzidina (TMB, Sigma-Aldrich). A reação foi
bloqueada após 20 minutos com ácido sulfúrico 2 N e a leitura realizada a 450 nm em
leitor de microplacas (Power Wave x – BIO-TEK INSTRUMENTS, Inc, USA). A
concentração das diferentes citocinas nos soros, sobrenadantes das culturas de células ou
do lisado intestinal foi determinada com referência à curva padrão obtida com as
diferentes diluições da citocina recombinante. A sensibilidade do ELISA foi de 15,6;
31,25; 15,6; 62,5 e 31,25 pg/mL para TNF-α, IL-10, IL-12p40, IFN-γ e IL-4,
respectivamente.
_______________________________________________________________________Metodologia
32
Separação e cultivo da sub-população de células T CD4 do baço
Neste ensaio foram utilizados leucócitos do baço de camundongos Gal-1
+/+
e
Gal-1
-/-
não infectados para purificação de células CD4
+
utilizando-se CD4 MACS
MultiSort beads, como descrito previamente (FISSON et al., 2003). As células do baço
de camundongos foram obtidas homogeneizando-se o baço em PBS com auxílio de
duas pinças, de forma a se obter a separação do estroma conjuntivo e a liberação de
células na solução. A células foram lavadas em PBS gelado acrescido de 0,5% de BSA
mais 3mM de EDTA, incubadas com microbeads conjugadas a anticorpos anti-CD4 (3
µl por 10
7
células) e, submetidas à purificação em coluna Mini Macs, de acordo com as
recomendações do fabricante (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA).
As células CD4 purificadas foram lavadas 2 vezes em solução PBS por
centrifugação a 250 g a 4°C por 10 minutos e ressuspensas em PBS em meio RPMI
suplementado com 5% de soro bovino fetal a uma concentração de 1 × 10
6
células/mL.
A suspensão celular foi distribuída em placas de 48 poços (400 µL por poço), e
incubada por 5 dias em câmara úmida contendo 5% de CO
2
,
foram estimuladas de
diferentes maneiras: com meio de cultura somente, com concanavalina A (con-A,
Sigma-Aldrich) a 2 µg/mL ou anti-CD3 (BD-Biosciences) aderidas a placas em
diferentes concentrações (0,125 a 2 µg/mL) em PBS mais anti-CD28 (BD-Biosciences)
a 1 µg/mL. Os sobrenadantes foram então colhidos, centrifugados (250 g por 10
minutos) e filtrados em membrana de poro 0,22 µm e estocados a 4°C até o uso (para
dosagem de citocinas).
Diferenciação de células T CD4 em condições polarizadoras Th1, Th2 ou Th17
As células T CD4, purificadas como no item anterior, na concentração de 1 × 10
6
células/mL foram cultivadas em placas de 48 poços por 5 dias na presença de anti-CD3
_______________________________________________________________________Metodologia
33
e anti-CD28 e IL-2 (50 U/mL; R&D Systems), nas condições polarizadoras: Th1, IL-12
(2 ng/mL; BD Biosciences) mais anticorpo anti-IL-4 (100 ng/mL; BD Biosciences);
Th2, IL-4 (5 ng/mL; BD Biosciences) mais anti-IL-12 (2 µg/mL; BD Biosciences); e
Th17, TGF-β (3 ng/mL; R&D Systems), IL-23 (20 ng/mL; R&D Systems), IL-6 (20
ng/mL; R&D Systems), anti-IFN-γ (1 µg/mL; BD Biosciences) mais anti-IL-4 (1
µg/mL; BD Biosciences). No 3º dia de cultivo de leucócitos nas condições
polarizadoras Th1 e Th2, foram adicionadas aos poços IL-2 mais anti-IL-4 e IL-2, anti-
IL-12 mais anti-IFN-γ, respectivamente. Além disso, foi adicionada IL-2 nas culturas
com condições polarizadoras Th17 nos dia 2 e 4 de cultivo. Após 5 dias de cultura os
sobrenadantes foram colhidos para posterior dosagem de citocinas.
Fenotipagem de células do baço e do linfonodo mesentérico
A análise fenotípica das células foi realizada por citometria de fluxo (FACs)
(KULLIGAN et al., 1991). Células provenientes do baço ou do linfonodo mesentérico
de animais Gal-1
+/+
e Gal-1
–/–
infectados por T. gondii, foram submetidas à análise de
marcadores de superfície CD3, CD8, CD4, CD25, CD44, CD19, CD11c, NK1.1 e F4/80
(BD Biosciences) por citometria de fluxo, nos diferentes dias de infecção. Para tal, as
células obtidas na concentração 1 × 10
6
células/mL foram ressuspensas em PBS-BSA a
1% e a elas adicionados os diferentes anticorpos monoclonais específicos conjugado a
FITC ou PE. Após a incubação por 30 minutos a 4°C, as células foram lavadas 2 vezes
com PBS-BS, sendo centrifugadas a 250 g por 10 minutos e posteriormente fixadas
com PBS contendo 1% de formol a 37%. As preparações celulares foram adquiridas no
aparelho FACsCalibur (Bencton Dickinson Immunocytometry Systems, BDIS, San
Jose, CA, EUA) e analisadas utilizando o programa FACs Diva (Bencton Dickinson
Immunocytometry Systems).
_______________________________________________________________________Metodologia
34
Avaliação da exposição de fosfatidilserina nas superfícies de células do linfonodo
mesentérico
As células obtidas do linfonodo mesentérico de camundongos infectados foram
avaliadas quanto exposição de fosfatidilserina na superfície celular. Para tal, leucócitos
foram lavados com tampão de ligação pH 7,4 (HEPES 10mM, NaCl 150 mM, KCl 5 mM,
MgCl
2
1 mM, CaCl
2
1,8mM), centrigados a 300 g por 5 minutos. As células foram
incubadas com 300µL de anexina V conjugada a FITC (Apoptest-FITC, DakoCytomation,
Golstrup, Denmark) na diluição 1:300 em tampão de ligação por 20 minutos, protegidas da
luz a 4°C. Posteriormente, foram adicionados às células 100 µL de tampão de ligação e 5
µL de iodeto de propídeo (250 µg/mL). As amostras foram analisadas por citometria de
fluxo.
Quantificação da carga parasitária
O pulmão e o cérebro de camundongos Gal-1
+/+
, Gal-1
–/–
e aqueles tratados ou
não com galectina-1 infectados por T. gondii, foram retirados em diferentes dias de
infecção para análise da carga parasitária através do PCR em tempo real. Os tecidos
foram submetidos à extração de DNA utilizando-se o kit Wizard® SV Genomic DNA
Purification System (Promega), segundo orientação do fabricante. Ao final, o DNA foi
eluído em 500 µL de água livre de nucleases (Gibco BRL) e mantido à -20°C até o
momento do uso. Para controle positivo da reação, utilizou-se uma concentração de 10
5
e 10
7
parasitos e um pulmão ou cérebro de camundongo não-infectado somado a 10
5
parasitos. O pulmão ou cérebro de um animal não infectado foi utilizado como padrão
negativo da reação.
_______________________________________________________________________Metodologia
35
Extração de DNA de T. gondii para construção da curva padrão
Dez camundongos Balb/c foram infectados, intraperitonealmente, com a cepa
RH de T.gondii e, após dois dias de inoculo, foram sacrificados. O líquido peritoneal foi
retirado utilizando salina estéril (0,9% de NaCl). O exsudato foi tratado com tampão de
lise, centrifugado e filtrado em filtros de 3 µm (Millipore Co.) obtendo-se parasitos
purificados. Posteriormente, os parasitos foram centrifugados duas vezes a 2500 g por
10 minutos e depois diluídos a uma concentração de 1 × 10
7
e 1 × 10
5
parasitos/mL. O
material foi armazenado a -20°C até a realização do experimento.
Construção das curvas padrão
A curva padrão de T. gondii para as reações de PCR em tempo real foi gerada a
partir da extração de DNA de tecido pulmonar ou cerebral ao qual foram adicionados 1
× 10
5
taquizoítas de T. gondii. A mistura foi diluída para uma concentração final de 100
ng de DNA total. As concentrações da curva variaram de 0,1 a 1000 parasitos, em
diluições seriadas em base 10 para uma quantificação absoluta do parasito.
PCR em tempo real para determinação da carga parasitária
As reações de PCR em tempo real utilizadas para a quantificação de carga
parasitária de T. gondii foram preparadas utilizando-se o SYBR Green PCR Master Mix
(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) contendo 3 mM de MgCl
2
, 200 µM de
dATP, dCTP e dGTP, 400 µM de dUTP, 1,25 unidades de AmpliTaq GoldR DNA
polimerase e 0,5 unidades de AmpEraseR uracil-N-glicosilase (UNG). Para a
amplificação foram utilizados 10 µL de Sybr, 10 µL de DNA das amostras (50 ng), 0,5
µL de primer sense e 0,5 µL de primer antisense. As sequências do primer para a
_______________________________________________________________________Metodologia
36
identificação do parasito foram: gene B1 (amplicon 50 pb) “Forward”: 5'-
TTCAAGCAGCGTATTGTCGA-3' e “Reverse”:5'-CATGAACGGATGCAGTTCCT –
3´. Para o controle endógeno usou-se uma seqüência de β-actina (amplicon 100 pb)
“Forward”: 5'- CCTAAGGCCAACCGTGAAAA -3' e “Reverse”: 5'-
GAGGCATACAGGGACAGCACA-3'. Os parâmetros de ciclagem termal foram feitos
de acordo com as instruções do fabricante. A mistura foi incubada a 50°C por 2
minutos, seguida de 10 minutos a 95°C, para ativar a enzima AmpliTaq Gold.
Seguiram-se 40 ciclos de incubação a 95°C por 15 segundos e a 60°C por 1 minuto.
Cada amostra foi testada em duplicata e todas as quantificações foram normalizadas em
relação ao controle endógeno (β-actina). O gráfico foi gerado pelo “Data Analysis and
Technical Graphics Origin 6.0”, Microcal Software.
Extração de RNA
A extração do RNA total foi realizada utilizando as recomendações do
fabricante do reagente Trizol LS (Invitrogen). O RNA total foi extraído com
clorofórmio (Merck). Após incubação de 3 minutos em temperatura ambiente, as
amostras foram centrifugadas a 12.000 g por 15 minutos, sendo o sobrenadante
transferido para outro tubo. O RNA foi precipitado com 500 µL de álcool isopropílico
(Sigma-Aldrich) e, decorridos 10 minutos de incubação em temperatura ambiente, as
amostras foram novamente centrifugadas. O pellet de RNA foi lavado com 1,0 mL de
etanol 75%, seguida de uma centrifugação a 7.500 g por 5 minutos. O sobrenadante foi
desprezado e o RNA ressuspenso em água livre de DNAse e RNAse (Gibco BRL).
Transcrição reversa
_______________________________________________________________________Metodologia
37
O RNA total foi convertido em cDNA por transcrição reversa. Inicialmente, 4
µg de RNA e 20 pmol de Oligo dT (Invitrogen), foram incubados previamente a 70°C
por 5 minutos, e em seguida, a 4°C por mais 5 minutos. Decorrido esse tempo, foram
adicionados às amostras uma mistura contendo 0,5 mM de dATP, dCTP, dGTP e dTTP
(100mM dNTP Set, PCR Grade, Invitrogen), 20 unidades de inibidor de RNAse
(RNaseOut Ribonuclease Inhibitor, Invitrogen), 1 µL de transcriptase reversa (ImProm-
II Reverse Transcriptase, Promega Corporation), 3 mM de MgCl
2
e 4 µL de tampão da
reação. A reação de transcrição reversa foi feita segundo instruções do fabricante. A
mistura foi incubada por 5 minutos a 25°C, seguida de 60 minutos a 42°C e 15 minutos
a 70°C. As amostras foram então tratadas com 10 µg de RNAse (Gibco BRL), por 30
minutos a 37ºC.
Detecção de mRNA para citocinas por reações de PCR em tempo real
A expressão do mRNA para citocinas IL-10, TGF-β, IL-12p40 e IFN-γ foi
pesquisada em baços de camundongos Gal-1
+/+
, Gal-1
–/–
e daqueles tratados ou não com
galectina-1 infectados por T. gondii através de reações de PCR em tempo real. As reações
de PCR em tempo real foram preparadas em volume final de 25 µL, contendo 20 ng de
DNA ou 2 µL de cDNA, 5 pmol de cada primer e 12,5 µL de SYBR Green PCR Master
Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Foi utilizado o Sistema de PCR em
tempo real da Applied Biosystems 7500 para detectar e quantificar a amplificação dos
produtos específicos com SYBR Green. Os parâmetros de ciclagem termal foram
utilizados de acordo com as instruções do fabricante. A mistura foi incubada a 50°C por 2
minutos, seguida de 10 minutos a 95°C, para ativar a enzima AmpliTaq Gold. Seguiram-se
40 ciclos de incubação a 95°C por 15 segundos e a 60°C por 1 minuto. Cada amostra foi
ensaiada em duplicata e todas as quantificações foram normalizadas em relação a um
_______________________________________________________________________Metodologia
38
controle endógeno (β-actina). Expressão relativa foi calculada pelo método de comparação
dos valores de CT (limiar de detecção), através da fómula 2
-∆∆ct
.
Primers utilizados nas reações de PCR em tempo real
As seqüências de RNA mensageiro para as citocinas foram retiradas do banco
de dados do website NCBI. Todos os primers foram desenhados com o programa Primer
Express (v2.0, Applied Biosystems). Todos os pares de “primers” que foram utlilizados
(Erviergas, São Paulo, SP, Brasil) constituem-se de 20 pares de bases, possuem
temperatura de melting de 58°C e amplificam fragmentos de cerca de 100 pares de bases.
A Tabela 1 abaixo resume as seqüências dos primers específicos.
Tabela 1. Seqüência de nucleotídeos dos primers utilizados para análise de PCR em
tempo real e genotipagem.
Gene
Primer*
Seqüência (5’ – 3’)
β-actina
S
AS
AGCTGCGTTTTACACCCTTT
AAGCCATGCCAATGTTGTCT
IFN-γ
S
AS
TGCCATCGGCTGACCTAGAG
TCTCAGAGCTAGGCCGCAG
IL-12p40
S
AS
AACCATCTCCTGGTTTGCCA
CGGGAGTCCAGTCCACCTC
IL-10
S
AS
TGACTGGCATGAGGATCAGC
AGTCCGCAGCTCTAGGAGCA
TGF-
β
1
S
AS
GACTCTCCACCTGCAAGACCA
GGGACTGGCGAGCCTTAGTT
IL-4
S
AS
GTCTCTCGTCACTGACGGCA
CGTGGATATGGCTCCTGGTAC
TNF-
α
S
AS
GACGTGGAACTGGCAGAAGAG
GCCACAAGCAGGAATGAGAAG
*S, primer sense; AS, primer anti-sense
_______________________________________________________________________Metodologia
39
Análise estatística dos resultados
Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (DP) ou média ±
erro padrão da média (EPM). A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste de
Mann-Whitney para comparação de duas amostras independentes ou a análise de
variância (ANOVA) e o teste de Bonferroni para determinar as diferenças entre distintos
grupos experimentais. O método Kaplan-Meier foi utilizado para comparar as taxas de
sobrevivência dos grupos estudados. As curvas de sobrevivência foram comparadas
usando os testes log-rank e qui-quadrado que geram um valor de p bi-caudal, para testar
a hipótese nula de que não há diferença entre todos os grupos de animais. Todas as
análises foram realizadas no programa estatístico Graph Pad PRISM 4.0 (Graph Pad,
USA).
_________________________________________________________________________Discussão
40
RESULTADOS
Parte 1: Estudo da interferência do tratamento de camundongos com galectina-1
exógena na evolução da toxoplasmose experimental
No sentido de analisar a importância de galectina-1 na modulação da infecção
por T. gondii, camundongos C57BL/6 machos foram tratados com galectina-1 exógena
(50µg por animal) ou PBS e infectados com 100 cistos da cepa ME-49 T. gondii por via
oral para avaliação da mortalidade. O tratamento foi realizado do dia 0 ao 8º de infecção
por T. gondii, em dias alternados, e a mortalidade avaliada.
Os camundongos controles (não tratados) apresentaram uma mortalidade de
58,3%, entre os dias 8 e 12, durante a fase aguda da infecção. Por outro lado, o
tratamento de camundongos com galectina-1 promoveu resistência a T. gondii, com
100% de sobrevivência no 30º dia de infecção contra 41,7% de camundongos controles
(Figura 1A). Portanto, galectina-1 protegeu os animais contra a mortalidade causada
pela infecção por T. gondii durante a fase aguda.
O peso dos animais também foi avaliado nos diferentes dias de infecção. Em
relação aos camundongos tratados com galectina-1, os camundongos controles
apresentaram significantemente maior perda de peso no 8º dia de infecção (p < 0,05),
dia em que foi observado o início da morte desses animais (Figuras 1A e 1B). Essa
perda de peso foi ainda maior entre os dias 9º e 20º de infecção nos camundongos
controles (p < 0,001), o que não foi observado nos camundongos tratados com
galectina-1, que apresentaram valores de peso similares ao do 8º dia de infecção.
Devido à diferença na taxa de mortalidade entre os camundongos tratados ou não
com galectina-1, a histologia do intestino delgado desses camundongos foi avaliada aos
7 dias de infecção oral com 100 cistos da cepa ME-49 de T. gondii. O intestino delgado
_________________________________________________________________________Discussão
41
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42
dos animais controles apresentou segmentos com infiltrado inflamatório,
predominantemente constituído por células mononucleadas, na lâmina própria e
submucosa (Figura 2A). Alguns infiltrados inflamatórios foram intensos e em grandes
extensões. Em algumas áreas o comprimento das vilosidades apresentava-se reduzido e a
espessura destas aumentada. Além disso, observou-se uma perda focal das células
epiteliais superficiais em alguns locais, indicando os estágios mais precoces de necrose
intestinal (Figura 2A). Em contrapartida, os animais tratados com galectina-1
apresentaram lesões intestinais menos graves no mesmo período de infecção quando
comparados com animais controles. Nesse contexto, os intestinos dos animais tratados
com essa lectina apresentaram menor infiltrado inflamatório na lamina própria e na
submucosa e vilosidades mais conservadas (Figura 2B) e uma acentuada redução no
índice de inflamação do intestino delgado em relação aos animais controles (Figura 2C).
Ao avaliarmos o nível de parasitismo no intestino delgado por
imunohistoquímica, com auxílio de um anticorpo policlonal anti T-gondii, observamos
que no 7º dia de infecção há uma maior carga parasitária nos camundongos não tratados
com galectina-1 (Figura 3A). O mesmo foi verificado no cérebro de camundongos não
tratados com essa lectina (Figura 3B) por meio da técnica de PCR em tempo real para o
gene B1 de T. gondii. Esses resultados mostram que os camundongos tratados com
galectina-1 são mais resistentes à infecção oral por T. gondii, pois apresentaram taxas
significantemente inferiores de parasitismo (intestinal e cerebral), mortalidade e lesão
intestinal em comparação aos camundongos controles.
Baseado no fato de que a imunopatologia intestinal observada em camundongos
C57BL/6 infectados oralmente por T. gondii é mediada por uma resposta inflamatória do
padrão Th1 (LIESENFELD et al., 1996, 1999) e que o tratamento de várias doenças
auto-imunes experimentais com galectina-1 reduz os níveis de IFN-γ (TOSCANO et al.,
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45
2006), foi dosado as concentrações de IL-12/23p40, TNF-α e IFN-γ no soro de
camundongos tratados ou não com galectina-1. Observamos que o tratamento com
galectina-1 reduziu significantemente (p < 0,05) os níveis séricos de IFN-γ e TNF-α em
relação aos camundongos controle no 7º dia de infecção (Figura 4A e B). Entretanto,
não foi observada diferença significativa nos níveis de IL-12/23 p40 no soro desses
camundongos (Figura 4C).
Ao avaliar expressão de mensagem de citocinas no linfonodo drenante do
intestino, linfonodo mesentérico, verificamos que a expressão relativa das citocinas pró-
inflamatórias TNF-α e IFN-γ também estavam reduzidas nos linfonodos de
camundongos tratados em relação à expressão dos animais controles aos 7 dias de
infecção (Figura 5 A e B). Ainda, no linfonodo mensetérico, a expressão de IL-12/23
p40 também estava reduzida nos animais tratados com galectina-1 (Figura 5C).
Uma vez que os níveis de citocinas pró-inflamatórias estavam reduzidos no soro
e no linfonodo mesentérico de camundongos tratados com galectina-1, dosou-se a
citocina IL-10, porém esta não foi detectada no soro (dados não mostrados). Por outro
lado, camundongos tratados com galectina-1 apresentaram aumento significativo na
expressão de TGF-β e IL-10 no baço aos 7 dias de infecção (Figura 6 A e B). Além
disso, os linfonodos mesentéricos de animais tratados também apresentaram expressão
de IL-4 significantemente maior em relação aos não tratados no mesmo período de
infecção (Figura 5D). Curiosamente, a infecção de camundongos C57BL/6 selvagens
com 100 cistos de T. gondii provocou uma redução na imunodetecção de galectina-1 no
intestino delgado aos 7 dias de infecção em comparação aos animais selvagens não
infectados (Figura 7). Como esperado, não foi detectada galectina-1 em amostras de
intestino de animais Gal-1
-/-
(Figura 7). Esse conjunto de resultados sugerem que o
tratamento de animais selvagens com galectina-1 exógena auxilia na resistência contra a
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50
infecção por T. gondii e, provavelmente, pode compensar a redução da galectina-1 no
intestino de animais infectados.
Parte 2: Avaliação da importância da galectina-1 endógena na evolução da
toxoplasmose experimental
Outra estratégia para tentarmos compreender o papel de galectina-1 na
modulação da infecção por T. gondii, foi através da utilização de camundongos
geneticamente deficientes dessa lectina (Gal-1
-/-
) como modelo de estudo dessa
infecção. Para isto, animais selvagens Gal-1
+/+
e Gal-1
-/-
foram infectados com T. gondii
por via oral e a mortalidade avaliada.
Os resultados demonstraram que camundongos Gal-1
-/-
machos, quando
infectados com 100 cistos da cepa ME-49 por via oral, apresentaram uma maior
resistência a T. gondii, com 40% de sobrevivência no 45º dia de infecção contra 20% de
camundongos selvagens (Figura 8). Vale ressaltar que a maioria dos camundongos
selvagens morreu na fase aguda da infecção, com 80% de mortalidade no 11º dia de
infecção contra 20% dos camundongos Gal-1
-/-
no mesmo período. Portanto, na
ausência de galectina-1 endógena há um retardo da mortalidade dos camundongos
infectados por T. gondii, os quais morrem mais na fase crônica da infecção.
Para investigar o papel de galectina-1 durante a fase crônica da infecção,
camundongos Gal-1
-/-
e selvagens foram infectados com 20 cistos e os tecidos hepático,
pulmonar e cerebral foram submetidos à análise histopatológica. O fígado dos
camundongos selvagens e Gal-1
-/-
infectados com 20 cistos da cepa ME-49 de T. gondii,
apresentou lesões aos 7 dias de infecção, que foram caracterizadas por focos de
infiltrados inflamatórios, constituídos principalmente por células mononucleadas.
Ambas as linhagens de camundongos apresentaram lesões de intensidade similar. Além
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52
disso, a maioria dos animais selvagens apresentou focos de necrose no fígado, por outro
lado, focos de necrose não foram freqüentes nos órgãos de animais Gal-1
-/-
(Figura 9A e
B). As lesões hepáticas se apresentaram em menor intensidade aos 15 dias de infecção
em ambas as linhagens de camundongos e foram raramente vistas aos 30 dias de
infecção (dados não mostrados).
Lesões pulmonares foram observadas em camundongos selvagens e Gal-1
-/-
aos 7
dias de infecção com 20 cistos de T. gondii e se caracterizaram pela presença de
infiltrados inflamatórios nos septos alveolares, constituídos por células mononucleadas,
levando a uma pneumonia intersticial. Estas lesões persistiram em ambas as linhagens
aos 15 dias (Figura 10 A e B) e diminuíram em intensidade aos 30 dias de infecção com
o parasito (dados não mostrados). Entretanto, os animais Gal-1
-/-
apresentaram lesões
pulmonares levemente menos intensas aos 7 e 15 dias de infecção quanto comparados
com os animais selvagens infectados (Figura 10 A e B).
Aos 7 dias não foram verificadas alterações inflamatórias relevantes no SNC em
animais selvagens e Gal-1
-/-
infectados com 20 cistos de T. gondii (dados não mostados).
Aos 15 dias de infecção alguns focos inflamatórios foram observados no parênquima
desses animais (dados não mostrados). Entretanto, aos 30 dias de infecção, ambas as
linhagens de camundongos apresentaram lesões inflamatórias graves neste órgão. As
lesões foram caracterizadas por manguitos perivasculares, infiltrados de células
inflamatórias mononucleadas espalhadas pelo parênquima e alguns infiltrados
organizados como focos, os nódulos gliais (Figura 11 A e B). Foram observadas também
células inflamatórias nas meninges. E ambas as linhagens de camundongos
apresentaram alterações inflamatórias no SNC com intensidade similar aos 30 dias de
infecção (Figura 11 A e B). Além disso, a análise por microscopia de luz dos cortes
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54
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55
cerebrais corados com HE indicaram a presença de cistos nas duas linhagens de
camundongos (Figura 11 A e B).
Posteriormente, o cérebro desses camundongos foi avaliado nos dias 7, 15 e 30
de infecção quanto ao nível de parasitismo por imunohistoquímica com auxílio de
anticorpo policlonal anti-T. gondii (Figura 12A). Verificamos que não havia a formação
de cistos característicos no SNC de camundongos selvagens e Gal-1
-/-
no 7º dia de
infecção (dados não mostrados). Aos 15 e 30 dias de infecção, foi detectada a presença
do parasita em ambos os grupos, porém não foi observada diferença no número de
formas de T. gondii entre as diferentes linhagens de camundongos (Figura 12B). Ao
avaliar o pulmão de camundongos selvagens e do 15º e 30º de infecção com 20 cistos de
T. gondii, também não foi observada diferença significativa no número de parasitas entre
os camundongos (Figura 12C). O baço e o fígado também foram examinados nesse
mesmo período de infecção, porém formas de T. gondii não foram encontrados (dados
não mostrados).
A infecção por T. gondii é controlada por uma resposta do padrão Th1
(GAZZINELLI et al., 1994; SCHARTON-KERSTEN et al., 1997b). Portanto,
avaliamos os níveis de citocinas IFN-γ e IL-12 no soro de camundongos selvagens e
Gal-1
-/-
nos diferentes dias de infecção com 20 cistos de T. gondii.
Nossos resultados mostraram que há altos níveis séricos IFN-γ no soro dos
camundongos selvagens no 7º dia de infecção, entretanto os níveis de IFN-γ detectado
no soro de camundongos Gal-1
-/-
foram aproximadamente a metade do observado nos
selvagens (Figura 13A). Apesar dos níveis inferiores de IFN-γ no soro de camundongos
Gal-1
-/-
no 7º de infecção, nos dias 15 e 30 de infecção a concentração dessa citocina foi
similar as do camundongo selvagem (Figura. 13A). Além disso, a expressão relativa de
IFN-γ também estava reduzida no baço de animais Gal-1
-/-
em relação aos selvagens no
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58
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7 dia de infecção (p < 0,05) (Figura 14A). Os níveis séricos de IL-12/23 p40 também
estavam significantemente menores (p < 0,01) nos animais Gal-1
-/-
em relação aos
selvagens, no 7º dia de infecção (Figura 13B). Entretanto, nesse mesmo período, não foi
observada diferença na expressão relativa de IL-12/23 p40 nos baços dos camundongos
das duas linhagens (Figura 14B). Nos dias 15 e 30 de infecção, foram detectadas
concentrações séricas de IL-12/23 p40 equivalentes entre os grupos (Figura 13B).
Portanto, nossos dados sugerem que há uma menor produção de citocinas do padrão Th1
no início da infecção em animais Gal-1
-/-
.
Uma vez que o soro e o baço de camundongos, infectados com 20 cistos,
apresentaram menores concentrações de citocinas pró-inflamatórias (Figuras 13 e 14),
avaliamos também o perfil de células T CD8
+
, CD4
+
e células T ativadas CD4
+
CD25
+
nos baços de camundongos durante a infecção por T. gondii com 20 cistos da cepa ME-
49. Observamos que não houve diferença na porcentagem de células T CD8
+
e CD4
+
de
camundongos selvagens e Gal-1
-/-
durante a infecção (Figura 15A e B). No 30º dia de
infecção, há um aumento significante na porcentagem de células CD4
+
tanto em baços
de camundongos selvagens como Gal-1
-/-
em relação ao 7º e 15º dia de infecção (Figura
15B).
Com relação às células ativadas CD4
+
CD25
+
, observou-se porcentagem
significativamente menor nas células no baço de camundongos Gal-1
-/-
em relação à dos
selvagens no 15º dia de infecção por este parasito (Figura 15C). No 7º dia de infecção as
porcentagens desse tipo celular dos baços de ambos os grupos foram similares e
observamos um aumento desse tipo celular no 15º de infecção de camundongos
selvagens e Gal-1
-/-
. No 30º de infecção, há uma redução na porcentagem de células
CD4
+
CD25
+
em camundongos selvagens, enquanto que nos camundongos Gal-1
-/-
essa
porcentagem foi mantida em relação à porcentagem obtida no 15º dia de infecção
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(Figura 15C). Vale ressaltar que não houve diferença significativa na porcentagem de
células T reguladoras (CD4
+
CD25
+
Foxp3
+
) no baço entre os grupos no 7° dia de
infecção (Figura 16).
Foram analisadas também as subpopulações de células B e de macrófagos nos
baços dos camundongos infectados por T. gondii (Figura 17 A e B). Observou-se alta
porcentagem de células B (CD19
+
) no 7º dia de infecção e uma redução da porcentagem
nos dias 15º e 30º, porém não foi observada diferença nas porcentagens dessas células
entre os grupos selvagens e Gal-1
-/-
(Figura 17A). Em relação à cinética de macrófagos
(F4/80
+
) durante a infecção, observou-se um aumento na porcentagem desses fagócitos
no 15º dia em relação ao 7° dia, com posterior redução no 30º dia de infecção (Figura
17B). Também não foi detectada diferença entre os grupos de animais.
Para analisar o papel de galectina-1 endógena durante a fase aguda da infecção,
camundongos Gal-1
-/-
e selvagens foram infectados com 100 cistos por via oral. Uma
das citocinas importantes na regulação da resposta imune durante diversos tipos de
infecções é IL-10. No intestino de animais Gal-1
-/-
e selvagens a citocina IL-10 foi mais
intensamente detectada apenas no intestino de animais no 3º e 7º dia de infecção,
respectivamente (Figura 18). Entretanto, essa citocina não foi detectada em soros de
camundongos infectados de ambos os grupos (dados não mostrados).
É sabido que camundongos C57BL/6 apresentam alta taxa de mortalidade
quando infectados com 100 cistos da cepa ME-49 por via oral associada à necrose do
íleo mediada por células T CD4 e pela citocina IFN-γ (LIESENFELD et al. 1996). Uma
vez que camundongos Gal-1
-/-
são mais resistentes à mortalidade em relação a
camundongos selvagens (Figura 8), foi investigado o nível da citocina IFN-γ no lisado
intestinal desses camundongos infectados com 100 cistos. No 3º dia de infecção, os
níveis de IFN-γ no íleo foram similares em ambos os grupos de camundongos (Figura
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19A). Entretanto, no 7º de infecção, os camundongos Gal-1
-/-
apresentaram menores
níveis de IFN-γ no intestino delgado em relação aos animais selvagens (Figura 19A).
Em concordância com os níveis de IFN-γ no intestino delgado de camundongos Gal-1
-/-
,
estes também apresentaram menores níveis dessa citocina no soro no 7º dia de infecção
em relação aos selvagens (Figura 20A).
Por outro lado, não houve diferença nos níveis de IL-12/23 p40 no intestino de
camundongos Gal-1
-/-
e selvagens nos dias 3 e 7 de infecção (Figura 19B), embora os
níveis séricos de IL-12 estavam reduzidos significantemente nos camundongos Gal-1
-/-
no 7º dia de infecção (Figura 20B). Como já citado, camundongos Gal-1
-/-
apresentaram
maior nível de IL-10 no intestino delgado no 3º dia de infecção em relação ao selvagem
os quais apresentaram aumento no nível de IL-10 apenas no 7º dia de infecção (Figura
18). Esses dados mostram que camundongos Gal-1
-/-
apresentam maior nível de IL-10
no 3º dia de infecção e menores níveis de IFN-γ, uma citocina pró-inflamatória, no íleo e
no soro no 7º dia de infecção em relação ao selvagem.
Avaliou-se também a porcentagem de células T CD4 e T CD8 no linfonodo
mesentérico de camundongos selvagens e geneticamente deficientes de galectina-1
infectados com 100 cistos de T. gondii. Os linfonodos mesentéricos de animais Gal-1
-/-
apresentaram porcentagens de células T CD4 e CD8 significantemente menores que os
de animais selvagens no 3 e 7º dia de infecção (Figura 21A e B). O número de células T
CD4 ativadas, CD25
+
ou CD44
+
,
no linfonodo mesentérico também estavam
significantemente menores em camundongos Gal-1
-/-
em relação aos camundongos
selvagens (Figura 21C e D). Ainda, o número de células dendríticas CD11c
+
e
CD11c
+
CD8α
+
e células NK também estavam reduzidos no linfonodo de camundongos
Gal-1
-/-
no 7º dia de infecção (Figura 22A, B e C). Ainda, foi avaliada a apoptose em
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células do linfonodo mesentérico dos dois grupos de camundongos. Observamos que
nesse órgão as taxas de apoptose e necrose não foram elevadas e não houve diferença na
porcentagem de células apoptóticas (Anexina V
+
/PI
-
) (Figura 23A) ou necróticas
(Anexina V
+
/PI
+
) (Figura 23B) no linfonodo de animais selvagens e Gal-1
-/-
.
A análise histopatológica realizada no intestino delgado de camundongos
infectados com 100 cistos de T. gondii revelou que nos intestinos de animais selvagens e
Gal-1
-/-
apresentava alguns segmentos com intenso infiltrado inflamatório na lamina
própria e na submucosa no 7º dia de infecção (Figura 24A e B). Além disso, observou-se
uma perda focal das células epiteliais superficiais das extremidades das vilosidades em
alguns locais, indicando os estágios mais precoces de necrose intestinal em ambos os
camundongos (Figura 24A e B).
Uma vez que os dois grupos apresentaram inflamação similar no intestino
(Figura 24C), a avaliação da carga parasitária nesse órgão de camundongos infectados
com 100 cistos foi realizada no 7º dia de infecção. O número de parasitas foi similar no
intestino delgado de animais selvagens e Gal-1
-/-
(Figura 25B). Ainda, foi avaliado o
parasitismo tecidual no SNC e nos órgãos periféricos baço, fígado e pulmão dos dois
grupos de camundongos. Observou-se que o número de parasitas estava aumentado no
pulmão de camundongos selvagens em relação aos Gal-1
-/-
aos 7 dias de infecção
(Figura 26A). Entretanto, não foi observada diferença no parasistimo tecidual nos outros
órgãos no mesmo período (Figura 26 B-D).
Dados da literatura mostram que células de baço derivadas de animais deficientes
para o gene da galectina-1, produzem elevados níveis de citocinas do padrão Th1
(TOSCANO et al., 2007). Portanto, com a finalidade de se avaliar o “status”
imunológico dos animais Gal-1
-/-
utilizados nesse trabalho, foi investigada a produção de
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IFN-γ, IL-10 e IL-4 por células de T CD4 de camundongos selvagens e Gal-1
-/-
não
infectados. Detectou-se que células provenientes de camundongos Gal-1
-/-
produzem
altos níveis de IFN-γ em relação ao selvagem, quando estimulados com baixas
concentrações de anti-CD3. Entretanto essa diferença não é observada quando essas
células foram ativadas com altas concentrações de anti-CD3 (Figura 27A). Além de
produzirem mais IFN-γ, células T CD4 também produzem maiores concentrações de IL-
10 e IL-4 (Figura 27B e C).
Quando as células foram diferenciadas para Th1 ou Th2 não foi observada
diferença na produção de IFN-γ ou IL-4, respectivamente (Figura 28A e C). Entretanto,
diferença significativa foi observada entre células diferenciada Th2 ou Th17 quando se
dosou IL-10 no sobrenandante. Células provenientes do camundongo geneticamente
deficiente de galectina-1 produziram mais IL-10 em relação ao selvagem no protocolo
de diferenciação para o padrão Th2 ou Th17 (Figura 28B).
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79
DISCUSSÃO
Parte 1: Os camundongos tratados com galectina-1 exógena são mais resistentes à
infecção por T. gondii
Nossos resultados demonstraram o efeito protetor do tratamento de
camundongos C57BL/6 infectados por T. gondii com galectina-1 exógena, uma vez que
100% dos animais tratados sobreviveram a esta infecção. Esse efeito benéfico foi
acompanhado com menor inflamação no intestino delgado, menores níveis séricos de
citocinas pró-inflamatórias e com uma drástica redução do parasitismo intestinal e
cerebral. Além disso, foi detectado maior quantidade de mRNA para citocinas
reguladoras nas células do baço dos animais tratados em relação aos não tratados com
galectina-1. Portanto, esta lectina parece proteger os camundongos da resposta
inflamatória intestinal letal induzida por T. gondii em camundongos C57BL/6.
Camundongos C57BL/6 infectados por T. gondii são susceptíveis ao
desenvolvimento de ileíte mediada por células T CD4
+
da lamina própria intestinal e por
citocinas do padrão Th1 (LIESENFELD et al., 1996, 1999). O tratamento com
galectina-1 reduziu a expressão de IFN-γ e TNF-α em camundongos infectados com T.
gondii em relação aos camundongos não tratados (Figuras 4 e 5). Em concordância com
nossos resultados, a administração de galectina-1 exógena também suprimiu a resposta
inflamatória Th1 em modelos experimentais de artrite induzida por colágeno
(RABINOVICH et al, 1999b), hepatite induzida por Con-A (SANTUCCI et al, 2000),
colite induzida por hapteno (SANTUCCI et al, 2003) e uveíte auto-imune (TOSCANO
et al., 2006). Ainda, no modelo de diabetes auto-imune, o tratamento com células
dendríticas expressando galectina-1 transgênica induziu aumento de células T CD4
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80
produtoras de IL-4 e diminuição de células T CD4 positivas para IFN-γ no linfonodo
drenante (PERONE et al., 2006). Nesse contexto, demonstramos que os linfonodos
mesentéricos de animais infectados e tratados com galectina-1 apresentaram redução do
nível de expressão de mensagem para IFN-γ e elevação do nível de mensagem IL-4
(Figura 6B e Figura 7) em comparação com os animais não tratados. Em alguns desses
modelos, a redução da resposta Th1 estava associada com aumento de apoptose de
células T ativadas mediada por galectina-1 (SANTUCCI et al., 2003; TOSCANO et al.,
2006). Recentemente, foi demonstrado que células Th1 e Th17, mas não Th2,
expressam um padrão de glicanas na superfície celular crítico para indução de morte
celular induzido por galectina-1 (TOSCANO et al., 2007). Contudo, nosso trabalho
anterior demonstrou que galectina-1 não induz apoptose em células T humanas ativadas
(STOWELL et al., 2007). Esta diferença de resultados pode estar relacionada com
diferentes condições de cultivo celular e diferentes metodologias de avaliação de
apoptose. Por exemplo, existem indícios que a indução de apoptose e da expressão de
fosfatidilserina em células T ativadas seria um artefato da ação de DTT, um agente
redutor utilizado juntamente com galectina-1 (STOWELL et al., 2007).
Diversos trabalhos têm demonstrado a importância de citocinas reguladoras na
prevenção de dano tecidual resultante de resposta de células T a patógenos (COUPER et
al, 2008; LI; FLAVELL, 2008). No contexto da infecção oral por T. gondii, IL-10 tem
um papel essencial na regulação da patologia intestinal (SUZUKI et al., 2000). No
estudo atual, foi demonstrado que o tratamento com galectina-1 promoveu um aumento
da expressão relativa da mensagem para IL-10 no baço de camundongos infectados por
T. gondii (Figura 6B).
A IL-10 regula as funções de muitas células do sistema imunológico, tais como
macrófagos, células dendríticas e células T, por meio da inibição de expressão
_________________________________________________________________________Discussão
81
moléculas coestimulatórias e produção de citocinas pró-inflamatórias por APCs e
supressão da proliferação e da produção das citocinas IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-5 e TNF-α
por células T CD4 (COUPER et al, 2008; LI; FLAVELL, 2008). Além disso, IL-10
aumenta a diferenciação de células T CD4 reguladoras produtoras de IL-10 (Tr1) in
vitro (GROUX et al, 1997).
O uso de galectina-1 exógena em camundongo com uveíte induziu a produção
de IL-10 por células do linfonodo drenante (TOSCANO et al., 2006). A exposição
direta de linfócitos T CD4 ou monócitos a galectina-1 induz a produção de IL-10 in
vitro, sendo que os monócitos e as células mononucleares do sangue periférico (PBMC)
foram os principais produtores dessa citocina (VAN DER LEIJ, et al, 2007). Outro
mecanismo da regulação induzida por galectina-1 é através da indução da geração de
células dendríticas tolerogênicas produtoras de IL-10 que induz a expansão de células T
reguladoras in vivo, importantes na tolerância materno-fetal (BLOIS et al., 2007).
Ainda, galectina-1 é expressa em células T reguladoras e é necessária para a sua função
supressora (GARÍN et al., 2007). Esses resultados indicam que a propriedade
antiinflamatória da galectina-1 está mais relacionada à indução da produção de IL-10 do
que com a capacidade de modular a viabilidade de células T, como sugerido por Stowell
e cols. (2008b).
Evidências recentes demonstraram que células T CD4 são as principais
produtoras de IL-10 durante a infecção por T. gondii, pois a depleção da expressão de
IL-10 apenas em células T tornou os camundongos susceptíveis ao desenvolvimento de
patologia intestinal letal após desafio com o parasito (ROERS et al., 2004). Consistente
com a propriedade reguladora de IL-10, um trabalho recente demonstrou que células T
CD4 produtoras de IFN-γ (células Th1) são as principais produtoras de IL-10 durante a
infecção por T. gondii (JANKOVICK et al., 2007), sugerindo que IL-10 está sendo
_________________________________________________________________________Discussão
82
produzida para contrabalancear a elevada produção de IFN-γ, inibindo dessa forma o
desenvolvimento da patologia durante a infecção por T. gondii (O’GARRA; VIEIRA,
2007). Nesse contexto, demonstrou-se que a galectina-1 exogéna promoveu aumento de
mensagem para IL-10 no baço e redução tanto dos níveis séricos como de mensagem
para IFN-γ no linfonodo mesentérico de animais infectados (Figuras 4 a 6).
Em adição a IL-10, TGF-β tem um papel crítico no controle da ileíte induzida
pela infecção oral com T. gondii (BUZONI-GATEL et al., 2001; MENNECHET et al.
2004). O tratamento com galectina-1 induziu aumento da expressão de TGF-β por
células dos linfonodos (TOSCANO et al., 2006). Ainda, restabeleceu a expressão de
TGF-β1 e de STAT3 fosforilado em fêmeas grávidas que sofreram indução de estresse
(BLOIS et al., 2007). De modo interessante, a galectina-1 exógena também foi capaz de
induzir a expressão de TGF-β no baço de camundongos infectados por T. gondii (Figura
6A), além de promover a redução da expressão de citocinas pró-inflamatórias (Figuras 4
e 5). Em concordância com os nossos achados, foi demonstrado no modelo de colite
induzida por hapteno, que o tratamento de camundongos com galectina-1 protegeu
contra o desenvolvimento de colite e este efeito benéfico estava associado com a
redução dos níveis de citocinas pró-inflamatórias como IFN-γ, IL-12, TNF-α e IL-1,
tanto do soro como no intestino (SANTUCCI et al., 2003). Portanto, com base em
dados da literatura e em nossos resultados sugerimos que o mecanismo protetor da
galectina-1 exógena na toxoplasmose experimental pode estar associado à indução de
expressão de IL-10 e de TGF-β e a redução da produção de citocinas pró-inflamatórias.
Além desses mecanismos reguladores, galectina-1 pode modular a migração
celular. Estudos têm demonstrado que galectina-1 inibe a migração de neutrófilos para a
cavidade peritoneal in vivo (LA et al., 2003; GIL et al., 2006) e de neutrófilos na
inflamação induzida por fosfolipase A2 (RABINOVICH et al., 2000b), portanto, é
_________________________________________________________________________Discussão
83
possível que essa lectina também iniba a migração de neutrófilos para o intestino. É
sabido que neutrófilo é o primeiro subtipo celular recrutado num processo infeccioso ou
inflamatório. A depleção de neutrófilos em camundongos na fase inicial da infecção
com T gondii, por via intraperitoneal, tornou-os muito susceptíveis, o que não foi
observado quando a remoção dessas células foi realizada numa fase mais tardia (BLISS
et al., 2001). Durante a infecção oral com T. gondii, camundongos MyD88
-/-
apresentaram um atraso na migração de neutrófilos para o intestino delgado e
sucumbem à infecção e isto pode estar associado a persistência do parasita
(SUKHUMAVASI et al., 2008). Neutrófilos têm sido descritos como sendo importantes
na ativação e na indução da produção de IL-12 e TNF-α por células dendríticas do baço
(BENNOUNA et al., 2003). Apesar de não ter sido feita a análise do número de
neutrófilos no intestino dos animais, foi demonstrado uma redução nos níveis de
mensagem para TNF-α e IL-12 no linfonodo mesentérico de animais infectados e
tratados com galectina-1 em comparação com os animais controle (Figura 5A e C).
Ainda nessa linha, foi demonstrado que galectina-1 pode inibir o rolamento, a adesão e
a migração de outro tipo de leucócito como as células T (HE; BAUM, 2006; NORLING
et al., 2008) além de promover a indução de apoptose em células T ativadas (CD25
+
,
Fas
+
, FasL
+
) presentes na mucosa intestinal no modelo de colite experimental
(SANTUCCI et al., 2003).
Nossos achados mostram que camundongos tratados com galectina-1
apresentaram um melhor controle do parasitismo no cérebro e no intestino delgado,
além de uma menor inflamação intestinal.
Diversas evidências na literatuta ilustram o papel preponderante de IFN-γ na
resistência a infecção por T. gondii. Essa citocina participa no controle da replicação do
parasito por meio da indução da produção de NO (óxido nítrico) e proteínas IRG
_________________________________________________________________________Discussão
84
(GTPases relacionadas com imunidade) (TAYLOR et al, 2004; 2007). Macrófagos
infectados tratados com galectina-1 apresentam aumento na replicação de Trypanosoma
cruzi associado com a regulação negativa da produção de IL-12 e NO (ZUNIGA et al.,
2001), através da repressão da expressão de óxido nítrico sintetase induzível (iNOS) e
da ativação da via metabólica de L-arginase (CORREA et al., 2003). Contudo, no
trabalho em tela, os camundongos infectados com T gondii e tratados com galectina-1
foram capazes de controlar a disseminação desse agente infeccioso, apresentando menor
quantidade de parasitos no cérebro em relação aos camundongos controles infectados,
não tratados com essa lectina (Figura 3).
Considerando que a galectina-1 pode ligar-se a vários tipos celulares incluindo
macrófagos, células epiteliais, dendríticas, endotélio, neutrófilos, enterócitos do
duodeno e íleo (DIAS-BARUFFI et al., 2003; KUWABARA et al., 2003; LA et al.,
2003; GIL et al., 2006; HE; BAUM, 2006; NORLING et al., 2008), estudos deverão ser
realizados no sentido identificar os tipos celulares e seus ligantes envolvidos na ação
protetora da galectina-1 na toxoplasmose experimental.
De modo interessante, a infecção por T gondii promoveu uma inibição na
expressão de galectina-1 endógena no intestino delgado de camundongos C57BL/6 em
relação aos animais não infectados (Figura 7). Considerando que a galectina-1 é um
alvo importante para metaloprotease 2 (DEAN & OVERALL, 2007) e que células
infectadas com T. gondii expressam nívies elevados dessa protease (BUACHE et al.,
2007), sugerimos que a redução da expressão dessa lectina no intestino de animais
infectados pode estar associada ao aumento da expressão de metaloprotease 2.
Entretanto, uma investigação mais aprofundada deverá ser realizada para o melhor
entendimento desse fenômeno. Com base nesse conjunto de resultados, sugerimos que a
galectina-1 exógena pode compensar a redução da expressão da forma endógena dessa
_________________________________________________________________________Discussão
85
lectina na infecção por T gondii, favorecendo o ajuste funcional da resposta
imunológica para defesa contra esse parasita e auxiliando na manutenção da homeostase
intestinal de animais infectados.
Parte 2: Camundongos deficientes para o gene da galectina-1 são menos
susceptíveis a infecção experimental por T. gondii
Com base em dados da literatura e nos resultados da parte I desse trabalho foi
elaborada a seguinte hipótese: animais deficientes para o gene da galectina-1 poderiam
ser menos resistentes a infecção por T. gondii. Entretanto, a ausência de galectina-1
endógena protegeu os camundongos contra a infecção por T. gondii. Os camundongos
Gal-1
-/-
apresentaram maior sobrevivência, com menores níveis de citocinas pró-
inflamatórias IL-12 e IFN-γ tanto no soro como no sítio de infecção e menor número de
células no linfonodo mesentérico em relação aos camundongos selvagens. Além disso, a
inflamação intestinal e a carga parasitária foram semelhantes entre os dois grupos apesar
de um aparente maior comprometimento pulmonar e hepático dos animais selvagens em
relação aos Gal-1
-/-
.
Em contraste aos nossos resultados obtidos da infecção experimental com T.
gondii, foi demonstrado que galectina-1 endógena regula negativamente resposta Th1,
pois células T CD4
+
de camundongos Gal-1
-/-
ativadas produziram mais IFN-γ em
relação às células dos selvagens in vitro (TOSCANO et al., 2007). No modelo de
doença encefalomielite auto-imune, os camundongos Gal-1
-/-
desenvolvem doença mais
exacerbada em relação ao camundongo selvagem. Ainda, a estimulação ex vivo de
células provenientes do baço desses camundongos demonstrou que aquelas provenientes
de camundongos Gal-1
-/-
apresentaram maior proliferação e maior produção de IL-17 e
_________________________________________________________________________Discussão
86
IFN-γ, embora não apresentassem diferença na produção de IL-5 nem de IL-10
(TOSCANO et al., 2007). Apesar da aparente contradição entre achados da infecção
experimental do nosso trabalho com dados da literatura, foi demonstrado que células do
baço de animais Gal-1
-/-
quando submetidas à estimulação in vitro produziram maiores
níveis de IFN-γ em comparação com células de animais selvagens (Figura 27A) com
descrito por TOSCANO e cols. (2007).
Células T CD4 “naive” de camundongos Gal-1
-/-
(da linhagem 129) produziram
mais IFN-γ in vitro em relação às células Gal-1
+/+
quando estimuladas com altas
concentrações de anti-CD3 e CD28 (TOSCANO et al., 2007). Nossos resultados foram
similares quando células T CD4 “naive” foram estimuladas com baixas concentrações
de anti-CD3. Entretanto, essa diferença de produção de IFN-γ entre células Gal-1
-/-
e
selvagens não foi observada quando foi utilizada maiores concentrações de anti-CD3
como estímulo (Figura 27A). Baseados nisso, nossos resultados sugerem que células T
CD4 Gal-1
-/-
precisam de baixos níveis de estímulo para a produção de elevadas
concentrações de IFN-γ. Essa diferença de limiar de ativação pode estar relacionada
com o uso de diferentes linhagens de animais no trabalho referido (129Sv) e no presente
trabalho C57BL/6, obtido de 20 gerações de retrocruzamento de camundongos 129SV
Gal-1
-/-
com os da linhagem C57BL/6. De forma interessante, a susceptibilidade ao
desenvolvimento da ileíte durante infecção oral por T. gondii está associada a linhagem
do camundongo, animais C57BL6/129 não apresentam ileíte característica de C57BL/6
após o desafio oral com T. gondii e isto está relacionada com menor concentração de IL-
12 p70 no soro de camundongos C57BL6/129 em relação aos C57BL/6 (KHAN et al.,
2006).
Entretanto, diferente do esperado, camundongos Gal-1
-/-
infectados por T. gondii
apresentam menores níveis de IFN-γ séricos (sistêmicos) em relação a camundongos
_________________________________________________________________________Discussão
87
selvagens ao 7° dia de infecção (Figura 13A). Numa infecção sistêmica existem várias
células que podem regular a produção de citocinas do padrão Th1, como células
dendríticas tolerogênicas, células T reguladoras, Th3, Tr1, células T CD8 supressoras.
Recentemente foi demonstrado que a galectina-1 é importante para a função supressora
de células T reguladoras, sendo que as células T reguladoras provenientes de
camundongos Gal-1
-/-
perderam a capacidade de suprimir a proliferação de células T
(GARIN et al., 2007). Nos baços de camundongos Gal-1
-/-
e Gal-1
+/+
infectados não
houve diferença significativa da porcentagem de células T reguladoras
(CD4
+
CD25
+
Foxp3
+
) no 7º dia de infecção (Figura 16). Entretanto, a função supressora
dessas células não foi avaliada em nosso estudo. Por outro lado, foi demonstrado que na
infecção por T. gondii célula T reguladora não é o principal subtipo celular produtor de
IL-10, pois a depleção de células CD25
+
com anticorpos em camundongos não afetou a
sobrevivência desses animais à infecção. Nesse trabalho, foi demonstrado que o
principal subtipo celular produtor de IL-10 são células Th1 (Tbet
+
Foxp3
-
) (JANKOVIC
et al., 2007). Em concordância, nossos resultados in vitro demonstram que células T
CD4 “naive” de camundongos quando ativadas com anti-CD3 e/ou diferenciadas para o
padrão Th1, produzem tanto IFN-γ quanto IL-10 (Figuras 27 e 28). Além disso, as
células CD4 de camundongos Gal-1
-/-
produziram mais IL-10 e IL-4 em relação às
células do selvagem após a ativação (Figura 27 B e C) como demonstrado por Toscano
e cols., (2007). Contudo, essa diferença na produção de IL-10 entre células T CD4 de
camundongos Gal-1
-/-
e selvagens não foi observada quando foram diferenciadas para o
padrão Th1 (Figura 28B). Entretanto, células diferenciadas para um perfil Th2 ou Th17,
produzem mais IL-10 em relação às células do selvagem (Figura 28B). Na infecção
experimental por T. gondii, foi observado que intestinos de camundongos Gal-1
-/-
apresentam maiores concentrações de IL-10 no 3º dia de infecção, enquanto que esse
_________________________________________________________________________Discussão
88
aumento no intestino de camundongos selvagens é verificado apenas no 7º dia de
infecção (Figura 18). Embora não tenham sido detectados níveis séricos de IL-10 de
camundongos infectados com 20 ou 100 cistos, é possível inferir que essa produção
precoce de IL-10 regule a produção de IFN-γ no intestino.
Apesar dos camundongos Gal-1
-/-
apresentarem níveis de IFN-γ menores no
intestino e no soro, esses camundongos apresentaram uma inflamação intestinal similar
ao do selvagem (Figura 24). Porém, outros trabalhos mostram camundongos Gal-1
-/-
apresentam maior infiltrado inflamatório na medula espinal em relação aos selvagens no
modelo de EAE (TOSCANO et al., 2007) e maior resposta de hipersensibilidade do tipo
tardia (DTH) (NORLING et al., 2008). Em animais Gal-1
-/-
também foi observada a
maior adesão de neutrófilos a parede dos vasos sanguíneos com maior emigração, etapa
importante para um processo inflamatório (COOPER; NORLING; PERRETI, 2008).
Além disso, foi demosntrado que galectina-1 endógena pode regular o “homming’ de
linfócitos para os sítios de inflamação (NORLING et al., 2008).
No entanto, vale ressaltar que, no presente trabalho, os camundongos Gal-1
-/-
apresentam menor número de células dendríticas CD11c
+
e CD11c
+
CD8α
+
no linfonodo
mesentérico (Figura 22A e B). A redução de células dendríticas também foi observada
no linfonodo mesentérico de camundongos deficientes em TLR9, associada à menor
produção de IFN-γ por células T CD4 da lâmina própria (MINNS et al., 2006). Essa
redução do número dessas células apresentadoras de antígenos pode estar relacionada
com menores níveis de IFN-γ no intestino, porque poderia haver menor ativação de
células T CD4 no linfonodo mesentérico e conseqüente redução da migração dessas
células para o intestino delgado, com menor produção de IFN-γ local. Em concordância
com essa hipótese, camundongos Gal-1
-/-
também apresentaram menor número de
_________________________________________________________________________Discussão
89
células T ativadas CD4
+
CD25
+
e CD4
+
CD44
+
no linfonodo mesentérico em relação ao
selvagem no 7° dia de infecção (Figura 21 C e D).
Outro resultado relevante foi o menor número de células NK e NKT no
linfonodo mesentérico de camundongos Gal-1
-/-
infectados (Figura 22 C e D). Isso pode
indicar que essas células migraram mais para o intestino, mas as células presentes na
lamina própria intestinal de camundongos selvagens e Gal-1
-/-
não foram avaliadas no
presente trabalho. Mas se houve migração maior dessas células para o intestino, era de
se esperar maior inflamação intestinal em relação ao selvagem e conseqüentemente
maior mortalidade, fato que não foi observado no presente trabalho. Células NK têm
sido associadas como um dos mediadores da imunopatologia intestinal induzida por T.
gondii, sua depleção protegeu os camundongos contra o desenvolvimento da ileíte
(KHAN et al., 2006). Ainda, camundongos deficientes de células NKT também
desenvolveram menor lesão intestinal, apresentam menor expressão de IFN-γ no íleo
após a infecção por T. gondii (RONET et al., 2005).
Apesar dos camundongos Gal-1
-/-
apresentarem uma inflamação intestinal
similar a dos camundongos selvagens, a ausência de galectina-1 endógena protegeu os
animais contra a infecção por T. gondii. Vale ressaltar que os camundongos selvagens
apresentaram lesões hepáticas e pulmonares levemente maiores em relação ao
camundongo Gal-1
-/-
(dados não mostrados). Então, é possível que esses camundongos
selvagens tenham sucumbido à infecção por T. gondii pela conjunção de inflamações
hepática, pulmonar e intestinal, havendo uma inflamação sistêmica. Ainda nessa linha,
foi demonstrado um maior número de parasitas no pulmão dos animais selvagens em
comparação os camundongos Gal-1
-/-
(Figura 26A).
O conjunto de resultados do nosso trabalho sugere que tanto administração de
galectina-1 exógena como a ausência da galectina-1 endógena, favorece a resistência de
_________________________________________________________________________Discussão
90
camundongos à infecção por T. gondii. Nessa linha, foi descrito que as galectinas
podem apresentar funções antagônicas em função de sua localização no espaço intra ou
extracelular (LIU et al., 2002). Tanto a deficiência de galectina-3 como o tratamento de
camundongos com essa lectina protege os animais do desenvolvimento da asma, através
da indução de uma resposta do padrão Th1 (ZUBERI et al., 2004; LÓPEZ et al., 2006).
Uma possível explicação para a maior resistência dos animais Gal-1
-/-
seria a
existência de maior número de linfócitos reguladores CD8αα IEL e de linfócitos CD8
convencionais numa proporção adequada e favorecedora de uma maior resistência a
infecção experimental por T. gondii, uma vez que esses animais apresentaram maior
taxa de sobrevivência (Figura 8).
Recentemente foi demonstrado que a galectina-1 endógena favorece a seleção
negativa CD8 convencionais, por outro lado essa lectina promove o desenvolvimento de
células CD8αα reguladoras intestinais (LIU et al., 2008). De modo interessante, animais
Gal-1
-/-
apresentam maior quantidade de IEL CD8αα reguladoras no intestino que os
selvagens (LIU et al., 2008). Ainda, a transferência de IELs reguladoras para
camundongos C57BL/6 infectados oralmente com T. gondii os protegeu do
desenvolvimento da ileíte letal (MENNECHET et al., 2004). Com base nestes dados da
literatura e no conjunto de dados deste trabalho sugerimos que os animais Gal-1
-/-
são
mais resistentes à infecção por T. gondii por apresentarem, por exemplo, no intestino
um microambiente que contenha uma proporção de células CD8:CD8αα adequada para
a montagem de uma resposta protetora contra T. gondii. Esta hipótese pode ainda ser
reforçada pelo fato de que células CD8 são críticas para o desenvolvimento de
imunidade protetora a esse parasita (BLANCHARD et al., 2008). Ainda nesse contexto,
a ausência da galectina-1 endógena pode favorecer a quantidade e a migração de células
CD8 convencionais e CD8αα para o intestino uma vez que essa lectina pode modular a
_________________________________________________________________________Discussão
91
migração in vivo tanto de neutrófilos como de linfócitos para sítios inflamatórios (LA et
al., 2003; NORLING et al., 2008; LIU et al., 2008).
Finalmente, nossos dados abrem novas perspectivas de melhor compreensão
da função de galectina-1 na indução da homeostase imunológica frente a desafios
infecciosos e /ou inflamatórios.
________________________________________________________________________Conclusões
92
CONCLUSÕES
1. O tratamento de camundongos C57BL/6 infectados por T. gondii com galectina-
1 exógena protegeu os animais contra essa infecção, uma vez que este
procedimento induziu os seguintes eventos nesses animais:
• Manutenção da taxa da sobrevida em 100%;
• Redução do parasitismo no intestino delgado e no sistema nervoso
central;
• Diminuição da intensidade da resposta inflamatória no intestino delgado
de camundongos;
• Redução dos níveis séricos de IFN-γ e TNF-α;
• Redução de mensagem para citocinas pró-inflamatórias (IFN-γ, TNF-α e
IL-12) e aumento de mRNA para IL-4 nos linfonodos mesentéricos;
• Aumento da expressão de mRNA das citocinas regulatoras (IL-10 e
TGF-β) nos baços;
2. A ausência de galectina-1 endógena também protegeu os camundongos contra
infecção por T. gondii, pois a evolução da toxoplasmose nesses animais foi
acompanhada pelos seguintes eventos:
• Aumento da taxa da sobrevida;
• Menor número de cistos no pulmão aos 7 dias de infecção;
• Redução dos níveis séricos de IFN-γ e IL-12;
• Menor quantidade de mRNA para IFN-γ no intestino delgado e no baço;
• Redução do número de células dendríticas no linfonodo mesentérico;
• Redução de número de células T ativadas, NK e NKT no linfonodo
mesentérico;
________________________________________________________________________Conclusões
93
• Aumento dos níveis de IL-10 no intestino no início da infecção;
_______________________________________________________________________Referências
94
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___________________________________________________________________________Anexo
110
ANEXO
___________________________________________________________________________Anexo
111
GALECTIN-1 SUPPRESSES INFECTION-STIMULATED ILEITIS IN C57BL/6
MICE INFECTED BY TOXOPLASMA GONDII
Short title: Galectin-1 in Toxoplasma infection
Natalia S. Koyama
1
, Marise L. Fermino
2
, Neide M. Silva
3
, Richard D. Cummings
4
,
Sean R. Stowell
4
; Emerson S. Bernardes
2
, Maria C. Roque-Barreira
2
, Marcelo Dias-
Baruffi
1,5
.
1
Departamento de Bioquímica e Imunologia; Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil.
2
Departamento de Biologia Celular e Molecular, Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil.
3
Instituto de Ciências Biomédicas. Universidade Federal de Uberlândia, Campus
Umuarama, Uberlândia, MG, Brazil
4
Department of biochemistry, School of Medicine, Emory University, Atlanta, GA,
USA.
5
Departamento de Análises Clínicas, Toxocológicas e Bromatológicas, Faculdade de
Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto,
SP, Brazil.
Fundings
This work was supported by grants from Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) to M.D.B. (480775/04-4) and Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São
Paulo to M.C.R.B. N.S.K. received scholarship from Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES).
Corresponding author:
Prof. Dr. Marcelo Dias Baruffi
Departamento de Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo,
Av. do Café s/n, Monte Alegre, 14040-903
Ribeirão Preto-SP, Brazil.
Email: [email protected]
Acknowledgements:
___________________________________________________________________________Anexo
112
We thank Vani MA Correa, Marlise BA Montes and Rubens E da Silva for excellent
technical assistance.
ABSTRACT
Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite acquired by oral ingestion of
tissue cysts. Oral infection of C57BL/6 mice with T. gondii cysts induces acute lethal
ileitis associated with a strong Th1 response. Galectin-1, a lactose-binding protein, has
potential anti-inflammatory effects in various models of autoimmune and inflammatory
experimental diseases. However, the function of galectin-1 during parasitic infection has
never been assessed. The objective of this work was to evaluate the effects of galectin-1
treatment on mice infected orally with T. gondii. C57BL/6 mice were infected with 100
___________________________________________________________________________Anexo
113
cists of ME-49 strain by oral route and treated with PBS or galectin-1 (50 µg/animal) on
days 0, 2, 4, 6 and 8 of infection. In this study, the rate of mortality and parasite burden
was significantly lower in galectin-1 treated than untreated mice. At day 7 post
infection, histological examination of small intestine indicated that treatment of T.
gondii infected mice with galectin-1, induced reduction on small intestine inflammation.
In addition, galectin-1 treated mice infected by T. gondii presented a marked reduction
in IFN-γ and TNF-α serum levels and an augmentation on IL-10 and TGF-β expression
in spleen at 7 day post infection in relation to untreated mice. These results suggest that
the observed reduction in mortality during acute phase of infection in galectin-1 treated
mice may due to the down regulation of inflammatory cytokines IFN-γ and TNF-α and
augmentation of regulatory cytokines IL-10 and TGF-β.
INTRODUCTION
Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate
intracellular parasite that infects many warm blood animals. Numerous studies have
demonstrated that IFN-γ is the primary mediator of protective immunity against T.
gondii. However, overproduction of pro-inflammatory cytokines can be detrimental to
the host, as clearly demonstrated by the increased mortality of IL-10 deficient mice
(Suzuki et al., 2000; Gazzinelli et al., 1996). The excessive Th1 response also induces
intestinal pathology in C57BL/6 infected by oral route with T. gondii cysts, which is
characterized by an extensive necrosis of the ileal villi (Liesenfeld et al., 1996)
___________________________________________________________________________Anexo
114
associated with an increased production of IFN-γ and TNF-α by CD4
+
T cells from the
lamina propria (Mennechet 2002, Liesenfeld et al., 1999).
Galectin-1 (gal-1) belongs to lectin family carbohydrate-binding proteins, which
is expressed in almost all tissues and different cell types (Rabinovich et al, 2002). This
endogenous lectin presents immunoregulatory effects through diverse mechanisms such
as down-regulation of IFN-γ (Rabinovich et al, 1999), apoptosis of T cells (Perillo et
al., 1995), affects activation of T cell (Chung et al., 2000), inhibit neutrophil trans-
endothelial migration (La et al., 2003; Cooper et al., 2008), induces IL-10 production on
monocytes (van der Leij et al., 2007) and is important for immunossupressive function
of regulatory T cell (Garín et al., 2007).
In this regard, it has been demonstrated that administration of galectin-1
suppresses T cell –mediated autoimmune experimental diseases including experimental
autoimmune encephalomyelitis (Offner et al., 1990), collagen-induced arthritis
(Rabinovich et al., 1999), and con-A induced hepatitis (Santucci et al., 2000) and
hapten- induced colitis (Santucci et al., 2003) in rodents. However, the role of galectin-1
was not assessed during parasite infection in mice, on which an overwhelming Th1
response can be harmful for the host, but is necessary for parasite replication control.
In this work, we have evaluated the role of galectin-1 treatment during acute
infection with T. gondii in C57BL/6 mice. Our findings suggest that galectin-1 play a
role in protecting the host against a lethal ileits induced by T. gondii.
MATERIAL AND METHODS
Animals. Male C57BL/6 mice (wild type; WT) were bred and housed under approved
conditions at the Animal Research Facilities of Faculdade de Ciências Farmacêuticas de
Ribeirão Preto-USP (Ribeirão Preto, Brazil). The Ethics Committee on Animal
___________________________________________________________________________Anexo
115
Research of the University of São Paulo approved all procedures performed in the
studies described herein.
Parasites. The low virulent ME-49 strain of T. gondii was maintained by intraperitoneal
inoculation of the C57BL/6 mice with brain homogenate. For experiments, 6 to 8-wk-
old male mice were infected orally with 100 cysts by intragastric gavage, which had
been prepared from brains of chronically infected C57BL/6 mice. After infection, mice
were weighed and mortality was recorded daily. All experiments were performed with
4-6 mice/group.
Treatment of mice with recombinant galectin-1. The expression and purification of
recombinant form of human Gal-1 was prepared as described previously (Dias-Baruffi
et al., 2003). Mice were injected i.p. with PBS or 50 µg of recombinant galectin-1 on
days 0, 2, 4, 6 and 8 after infection with ME-49. The dose of galectin-1 has been
described previously (Santucci et al., 2003).
Histopathology. For histological analysis, the small intestine was removed from each
mouse (n=5/group) and cut into four pieces, each piece was rolled on itself to make a
“Swiss roll”. Then, the small intestines were fixed immediately in 4% buffered formalin
overnight, embedded in paraffin, sectioned and stained with hematoxilin and eosin
(HE). All length of the small intestine was examined for histological changes. Sections
of the small intestine from 5 animals per group were evaluated in a blinded fashion and
an average score of the lesions throughout the whole section was assigned based on the
presence and extent of infiltrating cells in the lamina propria and submucosa, thickening
of intestinal villi and superficial necrosis. The histopathological alterations were
___________________________________________________________________________Anexo
116
evaluated on 40 microscopic fields from each small intestine tissue sections at 400×
magnification in a microscope (Olympus Co., Tokyo, Japan). The analyses were done in
5 animals per group.
Parasite burden. Lung and brain tissues from T. gondii infected animals were collected
at day 7 pi for analysis of parasite load. DNA was extracted from tissues using the
Wizard® SV Genomic DNA Purification kit (System, Promega, USA) according to the
manufacturer's protocol. The standards for the PCR reactions were generated using 50
mg of lung or brain normal tissue, to which 10
5
T. gondii were added. The standard 10-
fold dilutions ranged from 0.01 to 1000 parasite equivalents per 50 ng of total DNA,
and a standard curve was generated from these dilutions to determine the parasite load
of DNA from tissue samples. Non-infected murine tissue (lung or brain) was used as
negative control. The results were expressed as T. gondii tachyzoite-equivalents per µg
DNA. PCR amplification and analysis were achieved using an ABI Prism 7500
sequence detector (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). All the reactions were
performed with SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) using a 20 µL volume
in each reaction, which contained 50 ng of template DNA, 5 pmol of each primer, and
10 µL of SYBR Green. Each sample was tested in duplicate and all quantifications were
normalized to an endogenous control (β-actin). The primers used for PCR amplification
targeting the repetitive 35-fold repetitive sequence of the T. gondii B1 gene, which is
found in all known parasite strains (Burg et al.1989), and β-actin gene were designed
using the Primer Express® software v2.0 (Applied Biosystems) and specifically amplify
a 50 pb and 100 pb fragment, respectively. The sequences for primers are: B1 - forward
- 5’- TTCAAGCAGCGTATTGTCGA-3'; reverse - 5’-
CATGAACGGATGCAGTTCCT- 3’ and
β-actin - forward - 5'-
___________________________________________________________________________Anexo
117
CCTAAGGCCAACCGTGAAAA -3'; reverse 5'- GAGGCATACAGGGACAGCACA-
3'.
Serum levels of cytokines. Mice were bled at 7 days after infection and the
concentrations of IFN-γ and IL-12 p40 in their sera were measured by ELISA with a
commercially available kit, according to the manufacture’s instructions (OptEIA set) kit
obtained from BD Biosciences.
RNA extraction, cDNA preparation, and real-time RT-PCR for detection of
cytokines IL-10, TGF-β
ββ
β, . Tissue samples from spleen were kept frozen (-70ºC) until
mRNA extraction. Briefly, total RNA was extracted from spleen using Trizol reagent,
cDNA prepared, amplified, and quantified using primers. Levels of PCR product were
normalized to housekeeping gene (β-actin). Cytokine data are presented as the mean.
Statistical analysis. Groups were compared using Prism Statistical Software’s unpaired
t test. Finally, the log rank test and Kaplan-Mayer curves were used to compare the
survival rates between the study groups. A p value less than 0,05 was considered
statistically significant.
RESULTS
The treatment with galectin-1 protects mice from acute infection with T. gondii. To
access the immunoregulatory role of galectin-1 during T. gondii infection, mice were
infected orally with 100 cysts of ME-49 strain and were treated i.p. with either
recombinant galectin-1 or saline solution on days 0, 2, 4, 6 and 8 of infection and their
survival compared. 58,3% of the control mice died from the 8º to 12º day of infection,
whereas 100% galectin-1 treated mice survived throughout the 30d duration of the
___________________________________________________________________________Anexo
118
experiment (Fig 1A). Additionally, infected control mice had a significantly higher
weight loss at day 8 (p < 0,05) compared with galectin-1 treated mice (Fig. 1B), this day
coincided with that mice began to die.
Galectin-1 treated mice display less severe tissue damage during T. gondii infection.
Mice were evaluated for evidence of mucosal inflammation during the acute phase of
infection. Histological examination of the small intestine from infected mice revealed
that control mice presented infiltration of inflammatory cells, constituted mainly by
mononucleated cells, on lamina propria and submucosa. Some intestinal segments had
severe and extensive inflammatory infiltrate in the lamina propria and thickening of
intestinal villi. Furthermore, we observed some areas with focal loss of epithelial cells,
indicating the early stages of intestinal necrosis. Histological scorings of small intestine
sections from galectin-1 treated mice revealed a significant (p< 0,005) reduction in
inflammation in the same period (Fig 2) when compared to control mice. Parasite
burden was assessed using real-time quantitative PCR. Control mice had higher parasite
burden in the brain compared to galectin-1 treated mice at day 7 post infection (p =
0,0003) (Fig. 3). The results demonstrate that galectin-1 treated mice are more resistant
to oral infection with T. gondii showing less pathological lesions on small intestine and
lower parasite burden in brain than control mice.
Galectin-1 treated mice show reduced IFN-
γ
serum levels during T. gondii infection. To
determine whether the increased pathology in the intestines of orally infected mice was
caused by an enhanced inflammation, the levels of pro-inflammatory (IFN-γ, TNF-α
and IL-12) and anti-inflammatory (IL-10 and TGF-β) cytokines levels in the serum
were assessed on day 7 post infection (Fig. 4). The treatment with galectin-1 reduced
significantly (p < 0,05) the IFN-γ serum levels in relation to control mice. However,
___________________________________________________________________________Anexo
119
there is no difference on IL-12 levels and IL-10 and TGF-β levels were not detected in
the serum.
Galectin-1 treated mice show augmented expression of IL-10 and TGF-
β
in spleen,
during T. gondii infection. The IL-10 and TGF-β RNAm expression in spleens were
quantified by Real Time PCR, galectin-1 treated mice presented significantly (p < 0,05)
higher expression of IL-10 and TGF-β at day 7 post infection in relation to PBS treated
mice (Fig. 5).
DISCUSSION
Our results show that the treatment with galectin-1 protects mice from oral T.
gondii infection. The beneficial effects of galectin-1 in mice were related to prolong
survival associated with lower weight loss, intestinal pathology and parasite burden.
Furthermore, galectin-1 treated mice show reduced levels of the inflammatory cytokines
IFN-γ and IL-12. This reduced inflammatory response protected C57BL/6 mice from
the lethal hyper immune response elicited by T. gondii.
T. gondii infected C57BL/6 mice are prone to intestinal pathology mediated by
CD4
+
T cells and type 1 cytokines (Liesenfeld et al., 1996, 1999). Galectin-1 treatment
down-regulated serum IFN-γ levels in T. gondii infected mice compared to control
mice. In accordance with this results, therapeutic administration of galectin-1 also
suppressed Th1 inflammatory response in experimental models of collagen-induced
arthritis (Rabinovich et al, 1999), Con-A induced hepatitis (Santucci et al, 2000),
hapten-induced colitis (Santucci et al, 2003) and autoimmune uveitis (Toscano et al.,
2006). Moreover, in autoimmune diabetes model, the treatment with dendritic cells
expressing transgenic galectin-1 induced increased percentage of CD4 T cell positive
for IL-4 and reduced of IFN-γ secreting CD4 T cell in draining lymph node (Perone et
___________________________________________________________________________Anexo
120
al., 2006). In some of these models, it was reported an association between reduction of
Th1 response and increased levels of activated T cells apoptosis mediated by galectin-1
(Toscano et al., 2006). Recently, was demonstrated that Th1 and Th17 cell, but not Th2,
express a pattern of cell surface glycan critical for gal-1 induced cell death (Toscano et
al., 2007). Nevertheless our previous work demonstrated that galectin-1 failed to induce
apoptosis in activated human T cells (Stowell et al, 2008). This difference could be due
different methodology conditions.
Many evidences argue that regulatory cytokines are essential to prevent
collateral tissue damage as a result of excessive T cell responses to pathogens (Couper
et al, 2008, Li & Flavell 2008). In context of T. gondii infection, IL-10 plays an
important role for regulating intestinal immunopathology induced by oral infection
(Suzuki et al., 2000). In the present study we demonstrated that gal-1 treatment induces
the IL-10 expression in spleen from mice infected with T. gondii. IL-10 regulates many
cell types such as macrophages, dendritic cells and T cell. This cytokine inhibits
costimulatory molecule expression and production of proinflammatory cytokines by
antigen presenting cell and limits T cell proliferation and production of IL-2, IFN-γ, IL-
4, IL-5 and TNF-α by CD4 T cells (Couper et al, 2008, Li & Flavell 2008).
Furthermore, IL-10 enhances the differentiation of an antigen-driven IL-10 producing
CD4
+
regulatory T (Tr1) cells in vitro (Groux et al, 1997).
Galectin-1 treatment of mice with experimental autoimmune uveitis induces IL-
10 production by draining lymph node cells (Toscano et al., 2006). The direct exposure
of activated CD4 T lymphocytes or monocytes to galectin-1 induced IL-10 production
in vitro, but monocytes were the strongest IL-10 producers (van der Leij, et al, 2007).
Another mechanism of regulation induced by galectin-1 is through promotion of the
generation of tolerogenic dendritic cells that induces the expansion of IL-10 secreting
___________________________________________________________________________Anexo
121
regulatory T cells in vivo, which was demonstrated in a fetal maternal tolerance (Blois
et al., 2007). Moreover, galectin-1 is over-expressed in regulatory T cells and is
important for the effector immunosuppression activity (Garín et al., 2007). These results
suggest that the anti-inflammatory property of gal-1 is more related to induction of IL-
10 production than affecting T cell viability.
Recent evidence demonstrated that CD4 T cell are the major producers of IL-10,
since the abrogation of IL-10 expression in T cell renders mice susceptible to
development of colitis and severe immunopathology upon infection with T. gondii
(Roers et al., 2004). Consistent with regulatory property of IL-10, a recent study have
demonstrated that Th1 cells are the major producer of IL-10 in T. gondii infection,
which is important for inhibition of the development of immunopathology (Jankovick et
al., 2007).
In addition to IL-10, TGF-β has been shown to play a critical role in controlling
the ileitis induced by oral T. gondii infection (Buzoni-Gatel et al., 2001; Mennechet et
al. 2002). Galectin-1 treatment induced augmented TGF-β expression on spleen from
infected mice at 7 day post infection. The treatment with this lectin also induced TGF-β
production by lymph node cells (Toscano et al., 2006). Galectin-1 restored the TGF-β1
expression ofand phosphorylated STAT3 on pregnant females after stress induction
(Blois et al., 2007).
Diverse evidence has been accumulated regarding the IFN-γ essential role on
resistance to T. gondii infection. This cytokine mediates control of parasite replication
trough induction of production of NO (Nitric Oxide) and IRG (Immunity-Related
GTPases) proteins (Taylor et al, 2004 and 2007). Infected macrophages treated with
Galectin-1 show increased Trypanosoma cruzi replication associated with a down-
regulation of NO and IL-12 production (Zuniga et al., 2001). Gal-1 suppresses NO
___________________________________________________________________________Anexo
122
production by inhibition of inducible nitric oxide syntase (iNOS) expression and
activation of L-arginase (Correa et al., 2003). In the present work, galectin-1 treated
mice are able to control parasite growth, since presented reduced parasite numbers in
the brain in relation to untreated infected mice.
The data from the present study show that the treatment of T. gondii infected
mice with galectin-1 protects mice from the lethal ileitis.
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___________________________________________________________________________Anexo
126
FIGURE LEGENDS
Figure 1. Galectin-1 treated mice survive longer than control mice during T. gondii
infection. Mice were orally infected with 100 cysts of ME-49 strain by gavage. Mice
were treated i.p. with 50µg of galectin-1 (gal-1 - open circles) or PBS (control - closed
circles) on days 0, 2, 4, 6 and 10 of infection. The animals were monitored for survival
(A) and weight loss (B) at different days of infection. Results are represented as
percents. The difference in survival between control (n=12) and gal-1 treated mice
(n=13) is significant (p = 0,0002). Differences in body weights of groups were
significant (*p < 0,05; **p <0,001) from day 8 onward.
Figure 2. Histological changes in the ileum of galectin-1 treated and control mice
following peroral infection with T. gondii infection. Mice were infected with 100
cysts of ME-49 strain by gavage and histological studies were performed on their small
intestine at 7 days after infection. The animals were treated with vehicle (A) or with
galectin-1 (B – 50 µg/animal) as described on material and methods. Hematoxylin and
eosin stain and magnification: 200×. The score of inflammation (C) were significantly
reduced in galectin-1 treated mice compared to control mice (* p = 0,0043). The values
are mean ± SD of inflammation score from 5 animals per group.
Figure 3.
Parasite burden in the brain of T. gondii-infected control and gal-1 treated
mice.
Control and gal-1 treated mice were challenged orally with 100 cyts of T. gondii.
At day 7 postinfection, brain and lung from both groups of mice (five mice per group)
were colleted and the level of parasite load was determined by quantitative real
-time PCR
of the
T. gondii B1 gene. Parasite burden was significantly higher in brain from control
mice compared to galectin
-1 treated mice (* p = 0.028). Values are mean number ± SEM
of parasites per microgram of tissue.
___________________________________________________________________________Anexo
127
Figure 5. Relative expression of TGF-β
ββ
β and IL-10 in control and galectin-1 treated
mice infected with T. gondii. Spleen was harvested from PBS or galectin-1 treated mice on
day 7 postinfection with 100 cysts of T. gondii. The expression of citokines measured by
Real time PCR Statistics were performed using Student’s t-test. Significant differences are
denoted by an asterisk (*) p < 0,05.
Figure 4. Serum IL-12, IFN-γ
γγ
γ and TNF-α
αα
α levels in control and galectin-1 treated mice
infected with T. gondii. Sera were harvested on day 7 postinfection with 100 cysts of
strain ME-49. Cytokines were measured by ELISA. Statistics were performed using
Student’s t-test. Significant differences are denoted by an asterisk (*) p < 0,05.
___________________________________________________________________________Anexo
128
Figure 1- Koyama et al
___________________________________________________________________________Anexo
129
Figure 2- Koyama et al
___________________________________________________________________________Anexo
130
Figure 3- Koyama et al
___________________________________________________________________________Anexo
131
Figure 4- Koyama et al
___________________________________________________________________________Anexo
132
Figure 5 - Koyama et al
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