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CATÁLOGO DE TRANSCRITOS E PROTEÍNAS DE
GLÂNDULAS SALIVARES DO CARRAPATO Rhipicephalus
(Boophilus) microplus: CLONAGEM de cDNAs E
DESCRIÇÃO DE ANTÍGENOS PARA IMUNOTRIAGEM E
VACINAÇÃO
LUCINDA GIAMPIETRO BRANDÃO
Tese apresentada à Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto, da Universidade de São
Paulo, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Doutor em Ciências.
RIBEIRÃO PRETO
2007
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CATÁLOGO DE TRANSCRITOS E PROTEÍNAS DE
GLÂNDULAS SALIVARES DO CARRAPATO Rhipicephalus
(Boophilus) microplus: CLONAGEM de cDNAs E
DESCRIÇÃO DE ANTÍGENOS PARA IMUNOTRIAGEM E
VACINAÇÃO
LUCINDA GIAMPIETRO BRANDÃO
Tese apresentada à Faculdade de
Odontologia de Ribeirão Preto, da
Universidade de São Paulo, como parte dos
requisitos para obtenção do título de Doutor
em Ciências.
Orientadora: Prof
a
Dr
a
Isabel Kinney
Ferreira de Miranda Santos
RIBEIRÃO PRETO
2007
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Brandão, Lucinda Giampietro
Catálogo de transcritos e proteínas de glândulas salivares do carrapato
Rhipicephalus (Boophilus) microplus: clonagem de cDNAs e descrição
de antígenos para imunotriagem e vacina
ção
/
Lucinda Giampietro Brandão – Ribeirão Preto, 2007.
Tese. (Doutorado) - -Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto –
Universidade de São Paulo – FMRP - USP
DADOS CURRICULARES
LUCINDA GIAMPIETRO BRANDÃO
Nascimento
16 de julho de 1972
Birigui – S.P.
Filiação
Osvaldino Brandão e
Rosa Maria Pereira Giampietro Brandão
1994 - 1998
Curso de Graduação em Farmácia com
Habilitação em Bioquímica – Universidade
Estadual de Londrina – UEL
2000 - 2002
Curso de Pós-Graduação em Imunologia
Básica e Aplicada: Bioagentes Patogênicos –
nível de Mestrado – na Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto – Universidade
de São Paulo – FMRP - USP
2003
Curso de Pós-Graduação em Imunologia
Básica e Aplicada: Bioagentes Patogênicos –
nível de Doutorado – na Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto – Universidade
de São Paulo – FMRP - USP
Resumo
Resumo
A saliva de artrópodes hematófagos facilita seu acesso ao sangue do hospedeiro e
às respostas imune e inflamatória elicitada por suas picadas e pela própria saliva. O
carrapato do boi possui um ciclo longo de alimentação no hospedeiro que dura 21
dias, durantes os quais o carrapato libera até 250 mL de saliva. O hospedeiro
desenvolve resposta imune específica ao carrapato, indicando que os componentes
salivares podem ser antígenos úteis para controle imunobiológico desse parasita. O
objetivo desse trabalho é identificar genes das glândulas salivares do carrapato do
boi que codifiquem para antígenos úteis para vacina. Expressed sequence tags
(ESTs) de 3 bibliotecas de cDNA de glândulas salivares (fêmeas com 3-4 dias de
alimentação, ninfas e machos em alimentação) do carrapato R. Boophilus microplus
foram analisadas. As ESTs foram automaticamente cortadas de iniciadores e
seqüências do vetor, agrupadas e comparadas com banco de dados usando
programas escritos em Visual Basic 6.0 (Microsoft). Peptídeo sinal, indicativo de
secreção, foram detectados com Signal P 3.0 Server. As buscas foram feitas nos
bancos de dados NR – proteína (NCBI), GO, KOG, P-fam, SMART, rRNA (NCBI) e
MIT-PLA (NCBI) e outros bancos de dados como ACARI and BMNT. As 3487 ESTs
produziram 1644 contigs e vários dele foram diferencialmente expressos nos
diferentes estágios do carrapato. Pelo menos 200 contigs contém peptídeo sinal
indicando que os produtos codificados são secretados na saliva e no hospedeiro. Os
genes de interesse para vacina são os que codificam para inibidores de trombina,
metaloproteases, lipocalinas ligantes de histamina e serotonina, inibidores de
agregação plaquetária e cimentos que são ricos em glicina, tirosina e ou serina,
peptídeos antimicrobianos, proteínas envolvidas em adesão celular, proteínas
ligantes de imunoglobulinas, proteínas ligantes de eritrócitos, ente outros. As
seqüências completas dos cDNAs desses transcritos foram clonadas por um
processo em massa e serão triadas usando DNA plasmidial como sistema de
entrega de antígeno. Eles serão testados pela capacidade de induzir reação
cutânea de hipersensibilidade tardia, que é a leitura imunológica correlacionada com
a resistência a carrapatos.
Abstract
Abstract
Catalog of the transcripts and proteins from the salivary gland of the tick
Rhipichephalus Boophilus microplus: cDNAs cloning and description of
antigens for immuno screening and vaccination
Saliva from hematophagous arthropods facilitates their access to the host’s blood
and counters immune and inflammatory responses elicited by their bites and by
saliva itself. The cattle tick is a long-feeder and its life cycle on the host lasts 21 days,
during which it can deliver up to 250 ml of saliva. Hosts develop specific immune
responses against ticks indicating that salivary components may constitute useful
antigens for immunobiological control of this parasite. The aim of this work is to
identify genes from salivary glands of the cattle tick that code for useful antigens.
Expressed sequence tags from three salivary gland cDNA libraries (feeding nymphs
and from male and female adults fed on for 3-4 days) from R. Boophilus microplus
were analyzed. ESTs were automatically trimmed of primer and vector sequences,
clusterized and compared with databases using programs written in Visual Basic 6.0
(Microsoft). Signal peptides indicative of secretion were detected with the Signal P
3.0 Server. BLAST searches were done to dababase as NR – protein (NCBI), GO,
KOG, P-fam, SMART, rRNA (NCBI) and MIT-PLA (NCBI) and custom databases
ACARI and BMNT. The 3487 ESTs generated 1644 contigs and several were
differentially expressed in different developmental stages of the tick. At least 200
contigs contain a signal peptide indicating that the encoded products are secreted in
saliva and into the host. Genes of interest for vaccines are those coding for: protease
and thrombin inhibitors; metalloproteases; histamine or serotonin-binding lipocalins;
inhibitors of platelet aggregation or tick cements that are glycine-, tyrosine- and/or
serine-rich; antimicrobial peptides; proteins involved in cellular attachment;
immunoglobulin-binding proteins; erythrocyte-binding proteins, among other genes of
interest. The full length cDNAs of these transcripts were cloned with a high
throughput approach and will be screened using plasmid DNA as an antigen-delivery
system. They will be tested for their capacity to induce cutaneous delayed-type
hypersensitivity reactions, which are the immunological readout that correlates with
resistance against ticks.
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 -
Resposta imune elicitada por inoculação intradérmica
com DNAs plasmideais purificados contendo GIs
expressando proteínas individuais de saliva de
artrópodes hematófagos.
TABELA 2 -
Características gerais dos contigs.
TABELA 3 -
Características gerais dos contigs quando comparados
com o banco de dados NR.
TABELA 4 -
Características gerais dos contigs quando comparados
com o banco de dados ACARI.
TABELA 5 -
Características gerais dos contigs quando comparados
com o banco de dados GO.
TABELA 6 -
Características gerais dos contigs quando comparados
com o banco de dados SMART.
TABELA 7 -
Características gerais dos contigs quando comparados
com o banco de dados KOG.
TABELA 8 -
Características gerais dos contigs quando comparados
com o banco de dados BMNT e expressão diferencial
entre as bibliotecas.
TABELA 9 - Melhor match dos contigs comuns entre macho e ninfa
com os bancos de dados NR e ACARI.
TABELA 10 - Melhor match dos contigs comuns entre fêmea e ninfa
com os bancos de dados NR e ACARI.
TABELA 11 - Melhor match dos contigs comuns entre fêmea e
macho com os bancos de dados NR e ACARI.
TABELA 12 - Melhor match dos contigs comuns entre fêmea, macho
e ninfa com os bancos de dados NR e ACARI.
TABELA 13 - Melhor match dos contigs exclusivos de ninfa que
possuem mais de uma seqüência com os bancos de
dados NR e ACARI.
TABELA 14 - Melhor match dos contigs exclusivos de macho que
possuem mais de uma seqüência com os bancos de
dados NR e ACARI.
TABELA 15 - Melhor match dos contigs exclusivos de fêmea que
possuem mais de uma seqüência com os bancos de
dados NR e ACARI.
TABELA 16 -
Características gerais do contigs da seleção preliminar.
TABELA 17 - Características gerais do contigs selecionados para
clonagem vacinal: número de seqüências por contig,
melhor match com NR e ACARI e os respectivos
valores de E.
TABELA 18 -
Características gerais do contigs selecionados para
clonagem vacinal: número de seqüências por contig,
melhor match com NR e ACARI e os respectivos
valores de E.
TABELA 19 - Características gerais do contigs selecionados para
clonagem vacinal: número de seqüências por contig,
melhor match com SMART, PFAM e BMNT e os
respectivos valores de E.
TABELA 20 -
Características gerais do contigs selecionados para
clonagem vacinal: número de seqüências por contig,
melhor match com KOG, os respectivos valores de E e
número de seqüências distribuídas pelas bibliotecas de
fêmea, macho e ninfa.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 -
Esquema representativo da amplificação dos genes por
PCR para clonagem em vetor VR2001 TOPO TA.
109
FIGURA 2 -
Representação esquemática do vetor de clonagem de DNA
VR2001 TOPO TA.
109
FIGURA 3 -
Número de contigs com diferentes números de seqüências
presentes na biblioteca de fêmea.
109
FIGURA 4 -
Número de contigs com diferentes números de seqüências
presentes na biblioteca de macho.
109
FIGURA 5 -
Número de contigs com diferentes números de seqüências
presentes na biblioteca de ninfa.
111
FIGURA 6 -
Número de contigs com diferentes números de seqüências
presentes nas bibliotecas agrupadas.
111
FIGURA 7 -
Número de contigs da biblioteca de fêmea com os
diferentes resíduos.
115
FIGURA 8 - Número de contigs da biblioteca de macho com os
diferentes resíduos.
119
FIGURA 9 - Número de contigs da biblioteca de ninfa com os diferentes
resíduos.
122
FIGURA 10 -
Número de contigs das bibliotecas combinadas com os
diferentes resíduos.
124
FIGURA 11 -
Número de contigs da biblioteca de fêmeas que
apresentaram similaridades com seqüências depositadas
em diferentes banco de dados.
126
FIGURA 12 -
Número de contigs da biblioteca de macho que
apresentaram similaridades com seqüências depositadas
em diferentes bancos de dados.
128
FIGURA 13 -
Número de contigs da biblioteca de ninfas que
apresentaram similaridades com seqüências depositadas
em diferentes banco de dados.
131
FIGURA 14 -
Número de contigs das bibliotecas combinadas que
apresentaram similaridades com seqüências depositadas
em diferentes banco de dados.
FIGURA 15 -
Número de contigs da biblioteca de fêmea distribuídos de
acordo com a função molecular do banco de dados GO.
FIGURA 16 -
Número de contigs da biblioteca de macho distribuídos de
acordo com a função molecular do banco de dados GO.
FIGURA 17 -
Número de contigs da biblioteca de ninfas distribuídos de
acordo com a função molecular do banco de dados GO.
FIGURA 18 -
Número de contigs das bibliotecas combinadas distribuídos
de acordo com a função molecular do banco de dados GO.
FIGURA 19 -
Número de contigs total e por biblioteca.
FIGURA 20 -
Número de contigs exclusivos para cada biblioteca.
FIGURA 21 -
Número de contigs em comum nas diferentes bibliotecas.
FIGURA 22 -
Número de contigs com peptídeo sinal com diferentes
números de seqüências.
FIGURA 23 -
Número de contigs com peptídeo sinal que apresentaram
similaridades com seqüências depositadas em diferentes
bancos de dados.
FIGURA 24 -
Número de contigs com peptídeo sinal distribuídos de
acordo com a função molecular do banco de dados GO.
FIGURA 25 -
Número de contigs com peptídeo sinal presentes em cada
biblioteca.
FIGURA 26 -
Número de contigs com peptídeo sinal presentes em
comum nas diferentes bibliotecas.
FIGURA 27 -
Número de contigs com peptídeo sinal presentes
exclusivamente em cada biblioteca.
FIGURA 28 -
Representação esquemática da presença de domínio
ZnMc_salivary_gland_MPs na seqüência protéica de
Rm_97M.
FIGURA 29 -
Representação esquemática da presença de domínio SCP
na seqüência protéica de Rm_1341N.
FIGURA 30 -
Representação esquemática da presença de domínio ML
na seqüência protéica de Rm_607F.
FIGURA 31 -
Representação esquemática da presença de domínios
Kunitz na seqüência protéica de Rm_141N.
FIGURA 32 -
Representação esquemática da presença de domínio
Kunitz na seqüência protéica de Rm_315M.
FIGURA 33 -
Representação esquemática da presença de domínios
Kunitz na seqüência protéica de Rm_1214N.
FIGURA 34 -
Representação esquemática da presença de domínios
Kunitz na seqüência protéica de RM_1418N.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 1
1.1 Breve Histórico
1.2 O Carrapato
1.2.1 Morfologia Geral
1.2.2 Sistemática e Identificação
1.2.3 Ixodidae 7
1.2.4 R. (Boophilus) microplus: Biologia, Importância Veterinária e
Controle
9
1.3 Interface Parasita - Hospedeiro 11
1.4 Alternativas de Controle: Vacinas Anti – carrapato 14
1.5 Descoberta de Genes e Genômica Funcional de Parasitas 18
1.6 Uso de Transcriptomas para Descrever Salivomas (Conjunto de
Proteínas Presentes no Extrato de Glândula Salivar ou saliva) de
Artrópodes Hematófagos
22
1.7 Clonagem rápida de Genes de Interesse (GIs) a Partir de
Transcriptomas, Imunologia Reversa para Triagem de Antígenos e
Vacinas de DNA em Bovinos.
23
2 OBJETIVOS 35
2.1 Objetivos gerais 53
2.2 Objetivos específicos 54
3 MATERIAL E MÉTODOS 76
3.1 Obtenção de Carrapatos e Dissecação de Glândulas Salivares 96
3.2 Extração de RNAm
3.3 Quantificação de RNAm
3.4 Construção de Biblioteca de cDNA
3.5 Empacotamento do cDNA Ligado ao Vetor
3.6 Titulação dos Fagos Recombinantes Empacotados
3.7 Determinação do Percentual de Clones Recombinantes
3.8 Amplificação das Bibliotecas para Estocar e PCR para Produção
de Fragmentos Moldes para Reação de Sequenciamento
3.9 Purificação dos Produtos de PCR e Reação de Sequenciamento
para Validação das Bibliotecas
3.10 Nomenclatura das Seqüências
3.11 Tratamento Bioinformático das Seqüências Nucleotídicas
3.12 Seleção dos Clones para Serem Usados na Triagem de DTH
nos Bovinos
3.13 Limpeza dos Produtos de Reação de Polimerase em Cadeia dos
Genes Pré-selecionados para Clonagem
3.14 Reanálise dos Clones para Desenho de Iniciadores para
Amplificação de Genes Selecionados para Clonagem
3.15 Amplificação dos Genes por PCR para Clonagem em Vetor
VR2001 TOPO TA
3.16 Clonagem dos Produtos de PCR dos Genes em Vetor VR 2001
TOPO TA
3.17 Seleção de Recombinantes Positivos
3.18 Extração de DNA Plasmidial para Triagem de Clones -
GenElute™ HP Endotoxin-Free Plasmid Megaprep Kit (Sigma)
4 RESULTADOS
4.1 Plotagem dos Resultados de Bioinformática em Planilha
4.2 Perfil Geral das Bibliotecas
4.3 Expressão Diferencial de Genes entre Fêmea, Macho e Ninfa.
4.4 Seleção Preliminar de Contigs
4.5 Contigs Selecionados
4.6 Análise dos clones escolhidos para serem imunotriados por
imunologia reversa
4.6.1 Contig 85
4.6.2 Contig 81
4.6.3 Contig 89
4.6.4 Contig 126
4.6.5 Contig 1275
4.6.6 Contig 1250
4.6.7 Contig 138
4.6.8 Contig 1563
4.6.9 Contig 1402
4.6.10 Contig 1411
4.6.11 Contig 176
4.6.12 Contig 206
4.6.13 Contig 211
4.6.14 Contig 867
4.6.15 Contig 330
4.6.16 Contig 387
4.6.17 Contig 97
4.6.18 Contig 1341
4.6.19 Contig 607
4.6.20 Contig 141
4.6.21 Contig 315
4.6.22 Contig 1214
4.6.23 Contig 1418
4.6.24 Contig 12
4.6.25 Contig 13
4.6.26 Contig 41
4.6.27 Contig 103
4.6.28 Contig 124
4.6.29 Contig 21
4.6.30 Contig 22
4.6.31 Contig 51
4.6.32 Contig 53
4.6.33 Contig 70
4.6.34 Contig 76
4.6.35 Contig 73
4.6.36 Contig 109
4.6.37 Contig 98
4.6.38 Contig 110
4.6.39 Contig 93
4.6.40 Contig 106
4.6.41 Contig 79
5 DISCUSSÃO
6 CONCLUSÕES
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1 Introdução
Introdução
19
Introdução
20
Introdução
21
1 - INTRODUÇÃO
1.1 - Breve Histórico
Fósseis de Parasitiformes, em particular de carrapatos, são muito raros e
relativamente recentes. Apenas quatro descrições de fósseis de carrapatos foram
publicadas: a de um macho, que não tem como ser diferenciado de
Dermacentor
reticulatus
4
, que foi encontrado no canal auditivo externo de um rinoceronte peludo,
Tichorhius antiquitatis
, do Plioceno
105,132
, a de
Ixodes succineus
encontrado em
âmbar Báltico (35-40 milhões de anos atrás)
132
; a de
Ixodes tertiarius
, encontrado em
depósitos da época do Oligoceno (cerca de 30 milhões de anos atrás) no estado de
Wyoming (EUA)
107
e um macho de
Amblyomma
, altamente parecido com
Amblyomma testudinis
, encontrado em âmbar Dominicano cerca de 30 milhões de
anos atrás
69
. Oliver
86
sugere, contudo, que os carrapatos possam ter originado no
período Devoniano (350-400 milhões de anos atrás).
Registros históricos ocorreram bem mais tarde sendo que uma figura em uma
tumba egípcia, datada de 1.500 A.C., representando um animal semelhante à hiena
com três protuberâncias no pavilhão auricular interno, é o registro mais antigo da
presença do carrapato
5
. Sua primeira denominação foi Cynorhaestea, citada por
Homero por volta de 800 A.C. Em 355 A.C., Aristóteles, em sua
Historia Animalium,
referiu-se aos carrapatos, acreditando que sua origem fosse o capim
4
.
Na Antiga Grécia era chamado de Croton, por ser semelhante às sementes
de mamona, e, pela mesma razão, foi denominado Ricinus na Antiga Roma. No ano
77, o carrapato foi citado como hematófago por Plínio em sua
Historia Naturalis
. A
designação genérica Boophilus do grego "amigo do boi", foi introduzida por Curtice,
em 1891, sendo o
Boophilus microplus
a única, das 5 espécies conhecidas,
reconhecida como presente no Brasil
92
. Mas em 2005 foi sugerida a mudança para
Rhipicephalus
(Boophilus)
microplus
. Então, a partir de agora está sendo usada
essa nova nomenclatura.
O
R.
(Boophilus)
microplus
é originário da Ásia, notadamente da Índia e da
ilha de Java. Em função das expedições exploradoras registradas na história, com a
movimentação de animais e mercadorias, ocorreu a sua expansão e introdução na
maioria das regiões tropicais e subtropicais: Austrália, México, América Central,
Introdução
22
América do Sul e África, tendo se estabelecido dentro dos climas demarcados pelos
paralelos 32° ao Norte e 32º ao Sul, com alguns focos no 35º ao Sul
84
.
1.2 - O Carrapato
1.2.1 - Morfologia Geral
Os aracnídeos parasitas e conhecidos como carrapatos estão relacionados
com a o filo Arthropoda, classe Aracnida, subclasse Acari, ordem Parasitiforme e
subordem Ixodida. São os únicos entre os acarianos a possuir o corpo de tamanho
grande (2-30mm). Caracterizam-se por não apresentarem segmentação corporal e
possuírem três pares de pernas quando larvas e quatro quando ninfas e adultos, por
não apresentarem antenas, serem hematófagos obrigatórios, pelo menos em
alguma fase do ciclo vital, por possuírem hipostômio com dentes recorrentes e por
possuírem uma agregação altamente especializada de estruturas sensoriais no tarso
I (órgão de Haller).
1.2.2 - Sistemática e Identificação
Os Ixodidas são cosmopolitas, e no Brasil, encontram-se amplamente
dispersos. São parasitas do homem e de animais domésticos e silvestres, de
produção zootécnica, de guarda e/ou companhia, além de envolvimento como
vetores de agentes de doenças para seus respectivos hospedeiros. No mundo são
aceitas três famílias: Ixodidae, Argasidae e Nuttallielidae, sendo que essa última não
tem representantes assinalados no Brasil.
1.2.3 - Ixodidae
Há registros da ocorrência de 6 gêneros de Ixodidae no Brasil. São eles:
Amblyomma, Anocentor, Aponomma, Haemaphysalis, Ixodes e Rhipicephalus
, já
que o
Boophilus
atualmente faz parte do
Rhipicephalus
. A diferenciação desses
gêneros por características morfológicas é relativamente simples.
1.2.4 - R. (Boophilus) microplus: Biologia, Importância Veterinária e
Controle
Introdução
23
Espécie de ampla distribuição geográfica no mundo e introduzida no Brasil
provavelmente ainda no período da colonização, com a importação de bovinos
provenientes das Ilhas dos Açores. É parasito preferencial de bovinos, sendo, por
isso, considerado como
monoxeno
, pelo que recebeu a designação de “carrapato
do boi”. Entretanto, já foi demonstrado que se fixa, alimenta-se e completa o ciclo
vital em outros hospedeiros, o que permite que seja considerado também como
heteroxeno
.
As formas adquiridas durante o ciclo de vida são: larvas (neolarvas e
metalarvas), ninfas (neoninfas e metaninfas), machos (neandros e gonandros) e
fêmeas (neóginas, partenóginas, teleóginas e quenóginas).
Nos hospedeiros, a preferência de fixação desses carrapatos varia com a
espécie. Nos bovinos, localiza-se preferencialmente nas regiões de face interna do
ouvido externo, períneo, úbere ou escroto, face interna das coxas, barbela e região
hipogástrica.
O
R.
(Boophilus)
microplus
foi incriminado como vetor de
Babesia bovis
e
Babesia
bigemina
, esporozoários agentes da babesiose bovina. Participa como um
dos vetores de
Anaplasma marginale
e
Anaplasma centrale
. Parasita os animais em
grandes colônias, permanecendo todo o ciclo vital sobre o hospedeiro e provocando
anemia microcítica, discrasia sanguínea e edemaciação, favorecendo o
estabelecimento de outros patógenos com alta morbidade.
O controle de carrapatos tem sido centrado no uso de acaricidas que levam
ao desenvolvimento de carrapatos cada vez mais resistentes. Embora, a maioria dos
trabalhos publicados relate a resistência de
R.
(Boophilus)
ssp
a acaricidas, também
tem sido demonstrado que carrapatos de multi-hospedeiros também desenvolvem
resistência a eles. Dessa forma, há uma contínua necessidade de desenvolvimento
de novos acaricidas, porém cada dia há mais evidências de que o uso de acaricidas
não é justificado se observamos o custo benefício. O fator resistência associado
com a conseqüente presença de resíduos químicos nos produtos animais de
consumo e ainda com a contaminação do ambiente por esses resíduos, resultou em
busca de novas alternativas para o controle da infestação dos animais por
carrapatos
41
. Vale ainda lembrar a desvalorização do couro animal por causas das
cicatrizes resultantes das infestações. Sendo assim, umas das alternativas de
Introdução
24
controle é o desenvolvimento de vacinas anti-carrapato, que é um dos principais
objetivos dessa tese.
1.3 - Interface Parasita - Hospedeiro
Durante sua refeição de sangue no hospedeiro, o carrapato precisa lidar com
vários aspectos da homeostasia do hospedeiro que ocorre em resposta à agressão
tais como imunidade específica e inata, inflamação e coagulação, que são todos
processos que interferem na hematofagia. O parasita usa o complexo farmacológico
de sua saliva tanto para facilitar o acesso ao sangue quanto para escapar das
defesas do hospedeiro
21,73,93
. A saliva pode conter moléculas imunossupressoras,
ligantes de histamina e de imunoglobulinas, inibidoras do sistema complemento, de
trombina e de agregação plaquetária, inativadoras da bradicinina e anafilotoxina,
vasodilatadoras e outras. O repertório salivar varia de acordo com a espécie de
carrapato, sendo complementar ao repertório homeostático do hospedeiro natural
93
.
A glândula salivar é o órgão osmorregulador do parasita e durante a hematofagia
excreta grandes quantidades de componentes parasitários no hospedeiro
104
.
Certas espécies hospedeiras contornam a evasão do parasita e montam
defesas que anulam a saliva e terminam por interromper a refeição e expulsar o
carrapato. Esse desfecho é refletido por meio de diminuição no ingurgitamento, na
ovipostura e na taxa de eclosão de ovos
134,135
. Os dados acumulados na literatura
sugerem que as respostas eficazes envolvem anticorpos, padrão de linfócitos T
específicos tipo Th1 e DTH cutânea com participação de basófilos
11,15,17,18,31,33,70,116
,
mas os mecanismos efetores de fato ainda não foram satisfatoriamente elucidados
de modo a orientar o desenvolvimento de vacinas. Alguns outros trabalhos também
confirmam que em bovinos esses componentes imunes são mediadores de
resistência
11
.
1.4 - Alternativas de Controle: Vacinas Anti – carrapato
Conforme já descrito no item 1.2 há cada vez mais a necessidade de buscar
formas alternativas de controle do carrapato, como por exemplo, desenvolvimento
de vacinas anti-carrapato.
A demonstração de que a resistência a carrapatos poderia ser transmitida por
soro de animais infestados imunes
116
levou vários laboratórios a tentar desenvolver
Introdução
25
vacinas.
Entre as estratégias empregadas para buscar antígenos, há a do antígeno
oculto
119
, ou seja, aquele que não foi exposto ao hospedeiro durante uma infestação
natural e que por isso não deve ter gerado mecanismos de escape do parasita por
pressão seletiva, podendo, portanto, gerar mecanismos imunes efetores mais
eficientes. Atualmente existem duas vacinas no mercado baseadas nesse conceito,
TICK-GARD
136
(australiana) e GAVAC
97
(cubana). Ambas utilizam o antígeno Bm86,
uma glicoproteína de
B. microplus.
No caso dessas vacinas, os anticorpos ligam-se
à superfície de células intestinais causando lise e interferindo na nutrição do
parasita
27
e ocorre, de fato, redução da infestação e da capacidade reprodutiva dos
carrapatos. A eficácia dessas vacinas é, porém, muito variável e pouco duradoura
76
.
Esse nível de desempenho torna indispensável o uso combinado de acaricidas com
reforços da vacina, dificultando o manejo da mesma. Esse é um dos aspectos
negativos do antígeno oculto, pois não há exposição freqüente do hospedeiro ao
antígeno, como acontece com antígenos salivares, e na falta de melhores
adjuvantes e/ou sistemas de entrega de antígenos, é difícil preservar a imunidade.
Um parasita revestido da complexidade apresentada pelo carrapato
dificilmente será controlado por vacina contendo apenas um antígeno alvo da
resposta imune. O desenvolvimento de vacinas "multi-valentes" baseadas em vários
antígenos é uma estratégia que vem sendo testada para doenças como a malária
109
e tuberculose
3
. Uma característica importante de vacinas multi-valentes é a indução
de níveis múltiplos de imunidade, o que facilita a solução de problemas associados à
restrição genética de resposta imune, diversidade genética dos antígenos
108
e
mecanismos de escape do parasita, tal como a redundância de moléculas já
descrita. Apesar de sua eficácia ser aquém do necessário, as vacinas comerciais
existentes reforçam a idéia de que a imunoprofilaxia é uma maneira eficiente de se
fazer o controle da infestação por carrapatos. Existem vários outros antígenos
candidatos potenciais ou sob avaliação para controlar espécies diversas de
carrapatos, mas esses antígenos não foram identificados por meio de abordagens
genômicas ou leituras imunobiológicas de alto desempenho. Entre os antígenos já
testados quanto ao impacto sobre infestações, nenhum apresenta eficácia
compatível com as exigências da produção animal e/ou da saúde pública. Um outro
fato que deve ser destacado com base nos conhecimentos de que vacinas
monovalentes candidatas estão sendo testadas e não têm demonstrado um bom
Introdução
26
resultado de proteção. Sendo assim, o uso de vacinas monovalentes seria uma
estratégia interessante na tentativa de atingir e bloquear alguns pontos da resposta
do hospedeiro contra o carrapato. Com essa sugestão se faz necessária a criaç
ão
de um grande repertório de antígenos candidatos o que vem de encontro com um
dos objetivos do presente projeto que visou construir um banco de genes que
permitiu a seleção de vários antígenos a serem testados.
1.5 - Descoberta de Genes e Genômica Funcional de Parasitas
Atualmente as vacinas feitas de subunidades são preferidas em relação
àquelas feitas a partir de organismos inteiros devido a exigências relativas à
segurança, à facilidade de produção de proteínas recombinantes e às imposições da
própria resposta imune diante de uma complexidade de antígenos. Já nos referimos
ao requisito para níveis múltiplos de imunidade, alcançado por vacinas que, mesmo
sendo de subunidades, são multicomponentes. Essa tendência criou uma demanda
para a descoberta rápida de novos antígenos. Novas informações sobre a biologia
do parasitismo, imprescindíveis para eleger os melhores antígenos, podem ser
obtidas rapidamente a partir da análise de
Expressed Sequence Tags
(ESTs) com
ferramentas de bioinformática, permitindo descobrir genes úteis não somente para
desenvolvimento de vacinas mas para emprego em outras tecnologias de controle.
Elas têm tido sucesso na identificação de genes e de antígenos novos de parasitas
como
Plasmodium
30,46,60
,
Schistosoma
mansoni
102
,
Onchocerca
114
e, de relevância
para esse projeto, em vetores como
Lutzomia
longipalpis
22
,
Phlebotomus
papatasi
120
,
Anopheles. gambiae
29,54
,
Anopheles stephensi
122
,
Aedes aegypti
121
,
Anopheles darlingi
19
e o piolho
Pediculus humanus
91
.
Já existem vários trabalhos publicados sobre transcriptomas de
carrapatos
2,26,40,44,53,68,81,94,99,123
. Uma análise de 1942 ESTs foi usada para estudar a
expressão gênica em larvas e adultos de
Amblyomma americanum
53
. Essa
abordagem também foi empregada para estudar 234 ESTs de
R.
(Boophilus)
microplus
26
, dos quais duas eram possivelmente envolvidas em resistência a
acaricidas. Um estudo do genoma funcional da glândula salivar do carrapato vetor
da doença de Lyme,
Ixodes scapularis
123
, gerou 735 ESTs e revelou 383 novos
genes daquele parasita. Seqüências completas foram obtidas para 87 clones com
similaridade com inibidores de proteases, metaloproteinases, domínios ligantes de
Introdução
27
histamina e vários peptídeos de função desconhecida com resíduos conservados de
cisteína. Existe ainda ESTs de
Dermacentor andersoni
no
National Center for
Biotechnology Information
(NCBI), obtidas a partir de estudo da expressão gênica
em machos alimentados na presença de fêmeas
2
; no
The Institute for Genomic
Research
(TIGR), no final de 2003, foram depositadas cerca de 18.422 ESTs para
R. appendiculatus
, e esse número não mudou desde então; na mesma base de
dados existiam 3992 ESTs depositadas para
A. variegatum
, e esse número também
continua o mesmo. O
Ixodes scapularis
possui 87190 depositadas no banco de
dados de ESTs da TIGR. No que concerne à espécie contemplada por esse projeto,
R.
(Boophilus)
microplus
, foram depositadas 20417 ESTs derivadas de um
pool
de
RNAs extraídos de carrapatos, em julho de 2004 pela TIGR. Essas ESTs formavam
cerca de 8540 contigs. A estratégia do
Agricultural Research Service
do
United
States Department of Agriculture
(ARS - USDA) e do TIGR para gerar as ESTS foi
fazer um
pool
de RNAm de vários tecidos e estágios do
R.
(Boophilus)
microplus
,
tanto em condições normais quanto de estresse
81
. Apesar da estratégia aplicada ter
por objetivo cobrir todo o transcriptoma do ciclo biológico, ainda excluiu a expressão
de genes pertinentes às fases do ciclo do parasita e de tecidos relevantes que não
foram incluídos no
pool
como ninfas durante hematofagia, machos durante a
hematofagia, glândula salivar de fêmea no início da hematofagia, hemócitos de
fêmeas em hematofagia e órgão de Gené
14
de fêmeas teleóginas, entre outros. No
presente momento existem na TIGR 42512 ESTs formando um total de 9403
contigs.
Dessa forma, a construção das bibliotecas nesse projeto complementa as
informações geradas pelo grupo americano.
1.6 - Uso de Transcriptomas para Descrever Salivomas (Conjunto de Proteínas
Presentes no Extrato de Glândula Salivar ou saliva) de Artrópodes
Hematófagos
Ribeiro e Valenzuela
123
desenvolveram uma estratégia muito útil para
descrever o salivoma de numerosos artrópodes hematófagos que prescinde da
execução de eletroforese bi-dimensional e espectrometria de massa.
Resumidamente, os componentes da saliva ou glândula salivar do artrópode de
Introdução
28
interesse são separados por massa molecular em um gel de acrilamida e
transferidos para uma membrana de PVDF. As bandas são recortadas e as misturas
de proteínas ali contidas são seqüenciadas por degradação de Edman. Cada
posição contém um ou mais aminoácidos e um programa de busca, similar ao
programa BLOCKS
51
compara todas as possibilidades de seqüências de
aminoácidos contra as três possibilidades (
frames
) positivas de tradução de cada
EST no banco de seqüências da respectiva glândula salivar. Por meio dessa
estratégia
39,122,123
várias proteínas salivares vêm sendo descritas e também
avaliadas quanto ao seu potencial antigênico e protetor
120
, com a vantagem de
identificar rapidamente o(s) clone(s) de cDNA correspondente(s) já disponível(is) e
arranjado(s) em placa e que contém(êm) a(s) seqüência(s) inteira(s),
unidirecional(is) devido à estratégia para construção das bibliotecas (vide Material e
Métodos).
1.7 - Clonagem rápida de Genes de Interesse (GIs) a Partir de Transcriptomas,
Imunologia Reversa para Triagem de Antígenos e Vacinas de DNA em Bovinos.
O advento de tecnologias para o estudo de transcriptomas em larga escala
criou uma demanda para um processo de clonagem em larga escala dos GIs para
executar estudos diversos, inclusive de imunogenicidade com vacinas de DNA. Com
isso em vista, Valenzuela desenvolveu vetor plasmidial proprietário que combina as
facilidades da clonagem rápida do vetor TOPO TA (Invitrogen) dependente de
topoisomerase com as vantagens do vetor VR 2001 para imunização com DNA
(VICAL), cujo plasmídeo possui um gene de resistência a canamicina, um promotor
forte oriundo do citomegalovírus humano para promover expressão otimizada do GI
e um peptídeo sinal do ativador de tecido para plasminogênio para promover a
secreção do GI pelas células transformadas do recipiente do plasmídeo. O vetor é
conhecido como VR 2001 - TOPO TA
85
.
Essa última característica do vetor vacinal é importante porque, no caso da
interface carrapato-hospedeiro, existe inúmeras evidências de que tanto a
imunidade mediada por anticorpos quanto a imunidade celular caracterizada por
reações cutâneas tardias (DTH) dependentes de basófilos e eosinófilos medeiam à
resistência ao parasita
11,15,17,18,31,33,70,116
. Esses mecanismos, por sua vez,
Introdução
29
dependem de linfócitos TCD4+ que reconheçam antígenos exógenos processados e
apresentados no contexto de MHC classe II, daí a importância da construção vacinal
conter o peptídeo sinal.
GIs de diversos artrópodes hematófagos foram clonados no vetor descrito
acima foram testados quanto à capacidade de induzir reações de DTH quando
entregues sob a forma de DNA plasmidial inoculado intradermicamente. O
reconhecimento de GIs por anticorpos é estabelecido por meio de
western blot
do
salivoma conforme descrito no item 1.6. É importante ressaltar que os plasmídeos
foram testados em hospedeiros já imunes. Essa estratégia é chamada de
imunologia reversa porque será o hospedeiro imune que indicará quais os GIs que
induzem o padrão de resposta desejado. Evita a necessidade de imunizar animais
com os GIs para verificar, somente então, o padrão de resposta imune
85
.
A Tabela 1 contém um resumo dos resultados de Valenzuela J.G.
(comunicação pessoal) obtidos com GIs de 4 espécies de artrópodes hematófagos,
inclusive uma espécie de carrapato. Como se pode verificar, cerca de 25-30% dos
GIs testados induziram reações de hipersensibilidade cutânea tardia. Cerca de 50%
dos GIs de flebotomíneos induziram anticorpos, mas não houve sobreposição
desses dois tipos de resposta para cerca de metade dos GIs que induzem resposta
imune. Em outras palavras, nem todo GI que induz DTH também induz anticorpos e
vice-versa. Esses resultados reforçam a necessidade de triar os GIs quanto a sua
capacidade de induzir DTH, que é um dos componentes da resposta imune
protetora.
Em relação às experiências em bovinos com o sistema de entrega de
antígeno por meio de vacinas de DNA, existem numerosos relatos empregando
diferentes antígenos, promotores e vias e sistemas de inoculação. De modo geral,
todos os esforços nesse sentido indicam que é possível induzir respostas imunes
em bovinos inoculados com DNA e, dependendo do(s) antígeno(s) candidatos
codificados pelos plasmídeos vacinais, até obter proteção contra várias doenças
8
.
TABELA 1 -
Resposta imune elicitada por inoculação intradérmica com DNAs
plasmideais purificados contendo GIs expressando proteínas individuais de saliva de
artrópodes hematófagos.
Introdução
30
Vetor Hospedeiro testados Resposta de DTH/
Número de GIs testados (%)
Lutzomia longipalpis Camundongos singenéicos (2 cepas) e hamsters
9/30 (~30%)*
Phebotomus papatasi Camundongos suiços
5/21 (~25%)*
Phebotomus argentipes Camundongos suiços
6/24 (~25%)*
Ixodes scapularis Cobaias
8/32 (~25%)
* GIs de flebotomíneos cujos produtos geraram anticorpos em animais imunizados: ~50%.
2 Objetivos
Objetivos
31
2 - OBJETIVOS
2.1 - Objetivos gerais
• Aumentar a oferta e a qualidade de carne, leite e couros por meio da
diminuição de perdas causadas pelo carrapato e da eliminação de resíduos de
carrapaticidas;
• Gerar conhecimento sobre a biologia da interação carrapato/hospedeiro;
• Desenvolver vacina anti-carrapato.
2.2 - Objetivos específicos
• Construir bibliotecas de cDNA de glândulas salivares de ninfas e de fêmeas
menores que 4mm de R. (Boophilus) microplus em alimentação em hospedeiros
bovinos;
• Executar o sequenciamento em massa dessas bibliotecas e de outra já disponível
(de machos), com meta mínima de 1500 ESTs por biblioteca;
• Assinalar função biológica putativa aos ESTs por meio de bioinformática,
identificar genes mais ou menos expressos nas diferentes situações do
parasitismo e identificar genes de interesse a constituírem antígenos candidatos;
• Empregar esses transcriptomas para caracterizar o proteoma das glândulas
salivares R. (Boophilus) microplus;
• Obter a seqüência completa dos genes de interesse com vistas à clonagem e
expressão de antígenos recombinantes;
• Clonar os GIs em vetor plasmidial proprietário, dependente de topoisomerase
para clonagem rápida e contendo promotor forte e peptídeo sinal (VR 2001 -
TOPO TA
85
);
• Preparar os clones vacinais para verificar a imunogenicidade de GIs em bovinos
infestados por meio respostas de hipersensibilidade cutânea tardia.
3 Material e Métodos
Material e Métodos
33
3 - MATERIAL E MÉTODOS
3.1 - Obtenção de Carrapatos e Dissecação de Glândulas Salivares
Os carrapatos utilizados no projeto são originados da propriedade da região
Nordeste do estado de São Paulo. Os carrapatos estavam parasitando bovinos da
raça holandesa preto e branca puro de origem (susceptíveis). Foram coletadas 200
ninfas alimentadas, 100 fêmeas ingurgitadas menores que 4mm e 62 fêmeas
completamente ingurgitadas. As ninfas e fêmeas de tamanho menor que 4 mm
tiveram seus pares de glândula salivares dissecadas sob lupa em PBS, num
intervalo máximo de até 4 horas após a remoção. Todos os órgãos foram
armazenados em RNA Later (Ambion) durante dissecação seguindo resfriamento a
4
o
C, -20
o
C, transporte em gelo até a Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
(USP) e por fim mantidos em freezer -80
o
C. Os materiais utilizados para dissecação
eram livres de RNAses. RNaseZAP
TM
(Ambion) foi utilizado para limpeza das
superfícies e todos os cuidados foram tomados, como esterilização úmida e seca,
para eliminar as ribonucleases dos materiais utilizados para dissecação dos órgãos.
3.2 - Extração de RNAm
As glândulas salivares de ninfas, de fêmeas menores que 4mm e os órgãos
de Gene de fêmeas completamente ingurgitadas tiveram seu RNAm extraídos com o
Kit Micro-Fast Track
TM
2.0 (Invitrogen) que permite isolar o RNA poli A
+
(RNAm
poliadenilado) dos RNAr e RNAt em 2-3 horas. Para tal procedimento os órgãos
armazenados foram sedimentados por centrifugação 5000 x g por 5 minutos
removendo assim todo RNA Later. O sedimento foi ressuspenso e lisado com adição
de 1ml de tampão de lise do kit contendo detergente (SDS) e proteína degradante
de RNA (RNase). O material lisado foi passado de 2-10 vezes através de seringa
plástica (1cc) contendo agulha (18G) até a perda de viscosidade do lisado. O
mesmo foi incubado à 45
o
C durante 15-20 minutos para solubilização do material. A
concentração de NaCl do lisado foi ajustada para uma concentração final de 0,5M
através da adição de 63
µ
l de NaCl 5M para cada 1ml de lisado e o mesmo foi
homogeneizado através da utilização de seringa (1cc) com agulha (18G) para
eliminação de qualquer DNA que possa ter restado. Dessa forma, um preparado de
Material e Métodos
34
RNAm bem translúcido foi obtido, vertido sobre resina de oligo (dT) celulose e
deixado em repouso durante 2 minutos para intumescimento, seguindo agitação leve
do tubo durante 1 hora em agitador com pouca velocidade para facilitar a aderência
do RNAm à oligo(dT) celulose. A oligo(dT) celulose foi sedimentada por
centrifugação a 4000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente, o sobrenadante
descartado e o sedimento ressuspenso em 1,3 ml de tampão de ligação do kit para
processo de lavagem. A resina ressuspensa foi centrifugada a 4000 x g durante 5
minutos a temperatura ambiente e o sobrenadante descartado. Esse passo foi
repetido mais 2 vezes até a obtenção de um sobrenadante não turvo. A resina foi
ressuspensa em 0,3mL de tampão de ligação, vertida dentro de uma coluna de
rotação (spin-column), acoplada dentro de um tubo de polipropileno de 1,5mL, e
esse conjunto foi centrifugado a 4000 x g durante 10 segundos a temperatura
ambiente. Esse procedimento foi repetido até que todo oligo(dT) celulose fosse
transferido para a coluna. A coluna foi removida do tubo e o filtrado foi descartado.
Ao recolocar a coluna de volta ao tubo adicionou-se à mesma 500
µ
l de tampão de
ligação e procedeu-se centrifugação a 4000 x g durante 10 segundos a temperatura
ambiente. A adição de tampão de ligação/centrifugação repetida mais 2 vezes. À
oligo(dT) celulose com RNAm ligado foi adicionado 200
µ
L tampão de lavagem
contendo baixa concentração de sal para eliminação de RNAr e de SDS seguindo
centrifugação a 4000 x g por 10 segundos a temperatura ambiente. Esse passo foi
ser repetido mais uma vez. A coluna foi então acoplada a um tubo novo e a ela
foram adicionado 100
µ
l de tampão de eluição seguindo centrifugação a 4000 x g por
10 segundos à temperatura ambiente. Esse passo foi repetido. Foi realizada uma
centrifugação 4000 x g por mais 1 minuto. A coluna foi removida do tubo contendo o
eluato com RNAm que foi precipitado através da adição de 10
µ
l de carreador
glicogênio (2mg/ml), 30
µ
l de acetato de sódio (2M) e 200
µ
l de etanol absoluto
(100%) seguindo armazenagem a -80
o
C. Para uso o RNAm foi descongelado e
centrifugado a 16000 x g durante 15 minutos a 4oC. A centrifugação foi repetida
para remover traços de etanol. O tubo foi deixado à temperatura ambiente por pelo
menos 1 hora para secagem total. O sedimento de RNAm foi ressuspenso com 10
µ
l
de tampão de eluição e armazenado em freezer -80
o
C até utilização.
Material e Métodos
35
3.3 - Quantificação de RNAm
A quantificação do RNAm foi realizada através da diluição de 1
µ
L de RNAm
extraído em 399
µ
L de H
2
O ultra-pura e leitura desse material em espectrofotômetro
em comprimento de onda 260nm. As concentrações de RNAm mensageiros foram
fornecidas automaticamente pelo equipamento com base na diluição (400) e fator de
correção do RNAm (40).
3.4 - Construção de Biblioteca de cDNA
As bibliotecas de cDNA foram construídas através do uso do Kit SMART
TM
cDNA Library Construction (Clontech) que permite a produção de bibliotecas e alta
qualidade com cDNA de seqüência completa a partir de nanogramas de RNA poli
A+. Assim, cerca de 50ng de RNAm, das diferentes extrações, serviram como molde
na transcrição reversa (RT) com produção de cDNA de fita simples através da
utilização de iniciadores que permitem a transcrição completa do RNAm. Nesse
passo foram adicionados dentro de tubo de polipropileno o RNAm a ser
experimentado, oligonucleotídeo SMART IV e iniciador CDS III/3para PCR seguindo
incubação à 72
o
C por 2 minutos e depois em gelo por mais 2 minutos. Em seguida
foi adicionado tampão First Strand, DTT (20mM), dNTPs (10mM), transcriptase
reversa PowerScriptTM seguindo incubação à 42
o
C em Banho-maria por uma hora e
depois incubação em gelo para por fim à reação de síntese da fita simples.
Após esse passo uma reação de polimerase em cadeia (Long Distance PCR)
produziu fitas duplas de cDNA. Para isso foram adicionados em tubo de
polipropileno o cDNA de fita simples, tampão Advantage2 para PCR, dNTPs,
iniciador 5’ para PCR, iniciador CDS III/3para PCR, uma mistura de Polimerase
Advantage 2 e água destilada q.s.p.100
µ
l. O tubo foi colocado em termociclador pré-
aquecido à 95
o
C. A temperatura de desnaturação foi de 95
o
C, de anelamento e de
extensão 68
o
C, com número variado de ciclos até que se determinou o menor
número de ciclos capazes de amplificar o cDNA evitando assim amplificações
inespecíficas. Uma alíquota de 5
µ
l dessa amplificação foi analisada em gel de
agarose 1% corado com brometo de etídio e as duplas fitas de cDNA apareceram
como um borrão de 0,1 - 4 kb no gel com algumas bandas brilhantes
correspondentes aos RNAm mais abundantes no material que estava sendo
experimentado. As fitas duplas de cDNA produzidas foram então tratadas com
Material e Métodos
36
proteinase K (inativação de DNA polimerase) através de incubação com a mesma à
45
o
C durante 20 minutos.
Ao final do tratamento com proteinase K as duplas fitas de cDNA foram
purificadas através do uso do Kit MicroconR Centrifugal Filter Devices YM 100
(Millipore) -100.000 NMWL (Nominal Molecular Weight Limit), que concentra e
dessaliniza de 10-500
µ
l de soluções macromoleculares através de centrifugação. A
membrana de celulose do filtro é de amicon sendo de baixa ligação, anisotrópica e
hidrofílica, ou seja, membrana de alto desempenho para
concentração/dessalinização do material a ser experimentado, assim como para
troca de tampão, remoção de iniciadores, proteinase K e polimerase, entre outros.
Assim, o filtro acoplado a um tubo de polipropileno de 1,5mL foi inicialmente
hidratado com 500
µ
L de H
2
O ulta-pura seguindo centrifugação 10.000 x g durante 1
minuto à temperatura ambiente. O filtrado foi descartado. Ao volume de 52
µ
L da
amostra contendo o cDNA de dupla fita foi adicionado cerca de 450
µ
L H
2
O ulta-pura
e o volume total foi dispensado ao filtro acoplado a um tubo polipropileno de 1,5mL.
Procedeu-se centrifugação a 600 x g cerca de 13 minutos à temperatura de 25
o
C,
sem deixar secar a membrana. Procedeu-se uma lavagem do material através da
adição de 500
µ
L de H
2
O ulta-pura seguindo centrifugação 600 x g durante 13
minutos. O filtro contendo certo volume foi acoplado a um tubo novo de cabeça para
baixo e centrifugado durante 3 minutos à 25
o
C com velocidade máxima durante 5
segundos e então por mais 1 minuto a 1200 x g. O material coletado foi armazenado
em freezer -20
o
C até utilização.
Após purificação descrita foi digerido 79
µ
L das duplas fitas de cDNA
presentes no tubo com enzimas SfiI A/B na presença de tampão de digestão e BSA
por 2 horas à 50
o
C. Esse material foi diretamente fracionado (não pode ser
congelado em hipótese alguma) por tamanho através da passagem por coluna
cromatográfica Chroma Spin-1000 que foi previamente agitada, deixada à
temperatura ambiente e lavada com tampão de coluna a fim de equilibrá-la para o
fracionamento. Depois de atingido o equilíbrio de gotejamento da coluna (1 gota a
cada 40 - 60 segundos) foi dispensada na mesma 100
µ
l da mistura de cDNA dupla
fita digerida com SfiI. O tubo contendo a mistura descrita foi lavado com 100
µ
l de
tampão de coluna e esse material foi dispensado sobre a Chroma Spin-1000. Um
Material e Métodos
37
volume de 600
µ
l de tampão de coluna foi dispensado sobre a mesma e as gotas
foram imediatamente coletadas em 16 diferentes tubos de polipropileno de 1,5ml.
Uma alíquota de 4
µ
l de cada um desses tubos foi analisada através de eletroforese
em gel de agarose 1% (150V por 10 minutos) após coloração com brometo de etídio
para determinação dos tamanhos das frações. Diferentes grupos de frações foram
formados. Dessa forma, foram reunidas no mesmo tubo cerca de 3-4 frações. Os
cDNAs das glândulas salivares de fêmeas de tamanho menor que 4mm foram
reunidos de 7-10 (large) e de 11-12 (medium) enquanto os cDNAs dos órgãos de
Gené de fêmeas completamente ingurgitadas foram reunidos de 8-11 (large) e 12-13
(medium). As frações de fragmentos grandes (Large ou I) e médios (Medium ou II)
purificadas através da utilização do Kit MicroconR Centrifugal Filter Devices YM 100
(Millipore) -100.000 NMWL (Nominal Molecular Weight Limit) previamente descrito e
um total de 4-7
µ
l de cDNA dupla fita foi recuperado. Apenas as frações I (Laje) dos
três cDNAs obtidos foram separadamente incubadas à 16
o
C por 12-16 horas com os
braços do vetor
λ
TriplEx2 (500ng/
µ
l), previamente digeridos com SfiI A/B e
defosforilados, na presença de T4 DNA ligase, tampão de ligação e ATP (10mM),
permitindo assim a ligação dos cDNA de fita dupla entre os braços do mesmo.
Dessa forma, os fragmentos de dupla fita de cDNA ligados ao vetor estão em uma
única direção de leitura. De uma forma geral, todos os clones isolados da biblioteca
construída com SMART terão a seqüência completa correspondente à região 5não
traduzida (UTR) de cada um dos RNAm, desde que o RNA inicial tenha sua
integridade garantida durante o de extração. Cada reação de ligação dos fragmentos
grandes com o vetor foi ser empacotada.
3.5 - Empacotamento do cDNA Ligado ao Vetor
O Kit Gigapack® III Gold Packaging Extract (Stratagene) possui extrato de
empacotamento que permite empacotar, com alta eficiência (2x109 pfu/
µ
g), os DNA
λ
TriplEx2 (lambda) recombinantes e foi especialmente projetado para construção de
bibliotecas de cDNA. O extrato e empacotamento possui restrição negativa (HsdR
–
McrA
–
McrBC
–
McrF
–
Mrr
–
) o que permite tanto a otimização do empacotamento
quanto a representatividade da biblioteca. Um volume de 4
µ
L de DNA dos diferentes
fagos recombinantes foi adicionado a um em tubo de polipropileno de 1,5mL
contendo o extrato de empacotamento armazenado a -80
o
C. A mistura foi incubada
Material e Métodos
38
à temperatura ambiente (22
o
C) por duas horas e 500
µ
l de tampão SM, composto de
NaCl, MgSO
4
, tris-HCl, foram adicionados a cada tubo de empacotamento seguindo
adição de 20
µ
l de clorofórmio. O tubo foi levemente homogeneizado e centrifugado
brevemente para sedimentação de restos celulares. O sobrenadante contendo os
DNA
λ
TriplEx2 (lambda) recombinantes empacotados (fagos) foram titulados.
3.6 - Titulação dos Fagos Recombinantes Empacotados
As bibliotecas foram tituladas para se ter uma estimativa do número de fagos
e clones independentes na mesma. Para isso foi realizado protocolo descrito no
manual do Kit SMART
TM
cDNA Library Construction (Clontech) onde a linhagem de
E. coli XL-1 Blue presente em estoque (-80
o
C) em meio de cultura com tetraciclina e
glicerol (25%) foi semeada em placa contendo meio de cultura LB/tetraciclina por 12-
16 horas à 37
o
C. Os fagos recombinantes foram diluídos na proporção de 1:10 e
1:20 com tampão SM. Alíquotas individuais de 2, 4 e 8
µ
L desse material diluído
foram individualmente misturadas a 600
µ
L culturas bacterianas da linhagem de E.
coli XL-1 Blue previamente cultivada em 25ml de meio de cultura LB enriquecido
com MgSO
4
(1M) e maltose (20%), sem a presença do antibiótico que poderá
impedir a infecção das bactérias pelos fagos, cultivada sob agitação de 140-200rpm
à 37
o
C durante 4-6 12-16 horas, até obter DO600 (densidade óptica com leitura em
comprimento de onda de 600nm) máxima de 1-2. As presenças de maltose e MgSO
4
permitem uma melhor adsorção dos fagos às bactérias, aumentando o potencial de
transdução das bactérias pelos fagos. As bactérias foram sedimentadas por
centrifugação de 5000rpm por 5 minutos. O sedimento foi gentilmente ressuspenso
com solução 10mM de MgSO
4
estéril até DO600= 0,5. As diferentes misturas de
bactéria e fago recombinantes foram incubadas à 37
o
C durante 15 minutos para
permitir adsorção dos fagos à superfície bacteriana. Por fim essa mistura foi
adicionada a 7mL de meio de cultura LB ágar semi-sólido contendo 10mM de
MgSO
4
previamente aquecido a 45
o
C. Esse material foi vertido sobre placas, pré-
aquecida à 37
o
C, de ágar LB/10mM MgSO
4
para formar uma espécie de tapete. As
placas foram incubadas inicialmente a temperatura ambiente cerca de 10 minutos
para permitir a solidificação e resfriamento do ágar semi-sólido, seguindo incubação
à 37
o
C por 6-18 horas com formação das placas de lise que foram contadas. O
Material e Métodos
39
número de placas de lise formadas foram colocadas na seguinte fórmula para
obtenção dos títulos dos fagos (pfu/mL) de cada biblioteca:
pfu/mL = número de placas x fator de diluição x 103
µ
L/mL
µ
L (fago plaqueado diluído)
Um número de 96 placas de lise por biblioteca foram coletadas e eluídas em
placas de formato 96 contendo 100
µ
l de tampão de diluição de fago (tampão SM).
As placas foram incubadas à temperatura ambiente sob agitação lenta.
3.7 - Determinação do Percentual de Clones Recombinantes
Foram utilizados 3
µ
l de cada eluato de fago recombinante para PCR. A cada
poço foi adicionado, além do DNA molde do fago, iniciadores forward (Pt2F1) e
reverse (Pt2R1), dNTPs (dGTP, dCTP, dATP e dTTP), MgCl2, enzima Taq DNA
PolimerasePlatinum High-Fidelity (Invitrogen) tampão da Taq Hi-Fi e H2O ultra-pura
para um volume final de 25
µ
l. A amplificação foi realizada utilizando um ciclo com
temperatura de desnaturação de 94
o
C, anelamento de 49
o
C e extensão de 72
o
C em
33 ciclos. Importante nesse passo de PCR é o passo de aquecimento inicial das
placas por 75
o
C por 2 minutos e 94
o
C por mais dois minutos, para que haja
liberação dos DNAs recombinantes pelos fagos. Ao final da reação 5
µ
de cada um
dos produtos de PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1 % para
análise dos perfis de migração. Houve mais de 95% de aproveitamento de cada
placa.
3.8 - Amplificação das Bibliotecas para Estocar e PCR para Produção de
Fragmentos Moldes para Reação de Sequenciamento
Para amplificação das bibliotecas construídas foram adicionados 12mL de
meio SM em 20 placas de cultura preparadas para conter placas de lise confluentes.
Essas placas foram incubadas à 4
o
C de 16-18 horas e depois agitação em placas de
agitação por no mínimo 1 hora a temperatura ambiente. Todo o material eluído foi
homogeneizado em um único frasco estéril e em seguida aliquotados em tubos de
polipropileno de 50mL contendo 10mL de clorofórmio. Cada tubo foi agitado em
vortex por 2 minutos seguindo centrifugação a 5000 x rpm durante 20 minutos. O
Material e Métodos
40
sobrenadante foi separado do sedimento de resto celular. Uma parte do material foi
aliquotado em crio tubos e armazenado em freezer -80
o
C após a adição de DMSO
para concentração final de 7%. O material restante foi armazenado a 4
o
C.
3.9 - Purificação dos Produtos de PCR e Reação de Sequenciamento para
Validação das Bibliotecas
A purificação foi realizada através do uso de Montage® PCR
µ
96 Plate
(Millipore) que é um filtro para purificação em formato de 96 poços, que permite a
purificação de pequenos volumes de reações de PCR (20-100
µ
l) fornecendo cerca
de 20
µ
l do produto purificado com uso de vácuo, ideal para esse tipo de produção
em massa. Para utilização do Montage® PCR
µ
96 Plate o volume da reação de PCR
foi ser ajustado para 100µL com H2O ultra-pura e o material transferido para a placa
de 96 poços do Montage® PCR
µ
96 Plate que foi colocado em um manifold (suporte)
de vácuo (MultiScreen384 Vacuum Manifold – Millipore) a 20 inches Hg durante 7-12
minutos, até que os poços estejam secos. As amostras foram eluídas da membrana
de filtração com H2O ultra-pura para volume final de 20
µ
l através de agitação
intensa durantes 10-15 minutos. Os produtos de PCR purificados foram submetidos
à eletroforese em gel de agarose 1% para se estimar as concentrações dos DNAs.
Os produtos de PCR foram submetidos à sequenciamento utilizando-se o kit
Big Dye (Applied BioSystems). A reação de sequenciamento se resume em utilizar
cada produto de PCR na presença de dNTPs marcadas cada qual com uma cor:
ATP (verde), dCTP (azul), dGTP (preto) e dTTP (vermelho), polimerase, iniciador
forward (Pt2F3) e tampão O ciclo da reação de sequenciamento foi 96
o
C por 10
segundos para desnaturação, 50
o
C por 20 segundos para anelamento e 60
o
C
durante 4 minutos para extensão. O ciclo foi repetido por 40 vezes. Os produtos da
reação de sequenciamento foram purificados por MultiScreen® Separations System
(Millipore) para eliminação de dye terminators antes da eletroforese de
sequenciamento através da passagem por SephadexT® G50 Superfine (Amersham
Pharmacia Biotech) (96 Well Sephadex Processing - Millipore). Para isso placas de
96 poços MultiScreen HV foram preenchidas com o SephadexT® G50 Superfine
com o auxílio de um carregador de coluna (Column Loader) de 45
µ
l. Cada um dos
poços das placas de 96 contendo a resina foi intumescida com 300
µ
L de água ultra-
Material e Métodos
41
pura. A cada adição de 100
µ
L, incubou-se durante 5 minutos à temperatura
ambiente. Procedeu-se centrifugação a 2500 x rpm por 5 minutos para retiradas do
excesso de água. As amostras para purificação foram dispensadas no centro de
cada poço contendo a resina e a placa HV foi colocada sobre placa de 96 poços
compatível com o seqüenciador a ser utilizado. Procedeu-se centrifugação a 2500 x
rpm por 5 minutos e as amostras foram secas speed-vac de placas durante 1 hora
em velocidade média. A cada poço foi então adicionado 10
µ
L de formamida. O
material foi desnaturado a 95
o
C por 2 minutos em termociclador. Os produtos foram
submetidos à sequenciamento em sistema de capilar ABI PRISM® 3700 DNA
Analyzer (Applied BioSystems).
3.10 - Nomenclatura das Seqüências
Para que as ESTs geradas em massa pelo sequenciamento sejam úteis para
posterior localização dos GIs, foi utilizada uma nomenclatura para nomear cada um
dos clones presentes nas placas de 96 poços. A biblioteca de macho foi identificada
como GSMM (glândula salivar de macho medium), a de fêmea GSFL<4 (glândula
salivar de fêmea large menor do que 4 mm) e a de ninfa GSNL (glândula salivar de
ninfa large). Sendo assim, um clone da biblioteca de macho, por exemplo, teve
como identificação GSMM13_A02, onde 13 é o número da placa e A02 o número do
poço. Algumas seqüência são identificadas com o número 1 ou 2 na frente do nome,
quando a placa foi resequenciada. A letra F no final do nome se refere a forward.
3.11 - Tratamento Bioinformático das Seqüências Nucleotídicas
O sequenciamento em massa das bibliotecas forneceu um total de 1500
ESTs por biblioteca. Esses dados brutos foram extraídos do seqüenciador e
submetidos a processamento utilizando programas escritos em Visual Basic 6.0 –VB
(Microsoft Corp,Remond, WA, USA)
95
pelo Dr. José Marcos Chaves Ribeiro do
National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) - National Institutes of
Health (NIH) e cedidos gentilmente por ele para o grupo de pesquisa em carrapatos
da FMRP-USP. O programa permite que a avaliação do conteúdo dos bancos de
ESTs seja heurístico e que o pesquisador faça um trabalho verdadeiramente
prospectivo dos ESTs. O produto dos programas tem essas características porque
organiza a informação, inclusive a de similaridades, numa única planilha de Excel,
Material e Métodos
42
de visualização, acesso e leitura e manipulação fáceis e com hiper-links para as
bases de dados e de literatura científica (PubMed). Evita, assim que o pesquisador
tenha que ter conhecimento prévio do conteúdo do banco de ESTs ou faça
conjecturas sobre este para iniciar suas buscas.
Inicialmente as seqüências passaram por um processo de limpeza e controle
de qualidade. As seqüências aprovadas foram então agrupadas em contigs. Cada
contig, quando formado de mais de uma seqüência, teve as seqüências organizadas
resultando em uma seqüência consenso por contig. Cada uma das seqüências
consenso formada foi então submetidas a busca por similaridade nos bancos de
dados NR (non redundant) de proteínas do GenBank do NCBI (Non-Redundant do
National Center for Biotechnology Information), GO (Gene Ontology -
http://www.geneontology.org/), Pfam (Protein families database of alignments HMMs
- http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)
10
, SMART(Simple Modular Archtecture
Research Tool - http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)
106
, KOG (EuKaryotic
Orthologus Groups - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/new/), que é umas versão
eucariótica do COG (Cluster of Orthologous Groups), Mit-pla (Mitochondrial and
Plasmid) e RRNA composto por rRNA. Ao final das buscas por similaridades, nos
bancos de dados descritos, os resultados fornecidos foram organizados em tabelas
em formato de planilha do Excel. Essas seqüências foram então submetidas ao
SignalP 3.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)
82
para predição da
presença de peptídeo sinal.
Todos os procedimentos descritos nesse item foram realizados para as 3
bibliotecas separadamente gerando as tabelas de análises de glândula salivar de
ninfa large (GSNL), de glândula salivar de fêmea menor que 4 milímetros large
(GSF<4L) e de glândula salivar de macho medium (GSMM). Para que uma visão
geral dessas bibliotecas fosse fornecida, os dados brutos das 3 foram agrupados e
processados em conjunto gerando a planilha RMall, em Excel. Ao final dos
processamentos já descritos, os resultados foram processados para responder à
pergunta: quais genes são diferencialmente expressos entre as bibliotecas? Para
isso os resultados obtidos até então foram submetidos a processamento por um
outro programa. Esse programa gerou uma tabela contendo informação de quantos
membros do contig foram originadas de cada uma das diferentes bibliotecas.
Material e Métodos
43
3.12 - Seleção dos Clones para Serem Usados na Triagem de DTH nos Bovinos
Uma análise geral das bibliotecas acima orientou a escolhas dos genes a
serem clonados no vetor vacinal VR2001 TOPO TA. Os clones de interesse foram
escolhidos seguindo os seguintes requisitos: possuir peptídeo sinal (característica
de proteínas secretadas) e/ou ter expressão abundante, isto é, estar sendo
amplamente expresso nas bibliotecas e ter vários clones na biblioteca
representando o mesmo cDNA e/ou ter função biológica putativa que indique ser um
bom alvo para um controle imunobiológico.
Sendo assim foram selecionados 192 seqüências de 108 diferentes contigs,
onde cada contig selecionado foi representado com 1 a 6 clones, sejam esses da
biblioteca de macho, ninfa ou fêmea. Estes clones foram amplificados e levados
para os Estados Unidos para realização de Estágio Sanduíche.
Experimentos Realizados na Vector Molecular Biology Unit (VMBU) -
Laboratory of Malaria and Vector Research (LMVR) - National Institute of
Allergy and Infectious Diseases (NIAID) - National Institutes of Health (NIH)
Sob Supervisão do Dr. Jesus G. Valenzuela
3.13 - Limpeza dos Produtos de Reação de Polimerase em Cadeia dos Genes
Pré-selecionados para Clonagem
Para limpeza dos produtos de PCR foi realizado utilizando placas Edge
BioSystems - ExcelaPure 96-well UF Plate P/N com água ultra-pura e filtragem à
vácuo. Algumas das amostras foram ressuspensa e foram submetidas à eletroforese
em gel de agarose para análise dos seus perfis de migração e concentração.
3.14 - Reanálise dos Clones para Desenho de Iniciadores para Amplificação de
Genes Selecionados para Clonagem
Todos os clones foram reanalisados in silico e um total de 45 cDNAs foram
selecionados para serem clonados em vetor VR2001 TOPO TA.
Os iniciadores forward foram desenhados tendo como referência a seqüência
de nucleotídeos do clone escolhido para ser o DNA molde na reação de
amplificação, para produzir o produto de PCR a ser clonado.
Material e Métodos
44
3.15 - Amplificação dos Genes por PCR para Clonagem em Vetor VR2001
TOPO TA
Cada uma das reações foi realizada usando Supermix (Invitrogen), DNA
molde, iniciador forward e iniciador reverse. O ciclo para realização do PCR foi 75
o
C
por 3 minutos, 94
o
C por 2 minutos seguindo de 22 repetições de 94
o
C durante 1
minuto, anelamento a 49
o
C durante 1 minuto e extensão 72
o
C durante 1 minuto e 20
segundos. Os produtos de PCR foram analisados quanto ao seu perfil de migração
eletroforética em gel de agarose 1,2%. Foram produzidos 45 produtos de PCR de
diferentes clones selecionados. Uma visão geral desse passo está plotada na
Figura1.
Material e Métodos
45
FIGURA 1 - Esquema representativo da amplificação dos genes por PCR para
clonagem em vetor VR2001 TOPO TA.
Em
(A)
está representado o DNA molde resultante do PCR utilizando os iniciados
Pt2F1 e Pt2R1. A dupla fita de DNA do PCR tinha a presença da seqüência dos
iniciadores descritos, além da presença de seqüência nucleotídica codificadora de
peptídeo sinal e cauda poli A. Esse DNA molde, já limpo, serviu de molde para a
reação de PCR mostrada em
(B).
Para essa amplificação foram utilizados o iniciador
forward específico e o reverse CDS III / 3’ PCR. O produto desse PCR
(C)
é uma
dupla fita de DNA sem a presença da seqüência nucleotídica que codifica o peptídeo
sinal, mas com a presença da cauda poli A.
5´
5´
3´
3´
5´
5´
3´
3´
INICIADOR CDS III / 3´ PCR
INICIADOR
ESPECÍFICO
Cauda poli A
5´
5´
3´
3´
Região codificadora
de peptídeo sinal
Cauda poli A
SEQÜÊNCIA DO
INICIADOR Pt2F1
SEQÜÊNCIA DO
INICIADOR Pt2R1
5´
5´
3´
3´
Cauda poli A
Produto de PCR sem região
codificadora de peptídeo sinal
iniciador
forward
específico e
iniciador
reverse
CDS III/3´ PCR
A
B
C
Região codificadora
de peptídeo sinal
Material e Métodos
46
3.16 - Clonagem dos Produtos de PCR dos Genes em Vetor VR 2001 TOPO TA
Para reação de ligação foram utilizados PCR não limpo, solução salina
(tampão), água ultra-pura e vetor VR 2001 TOPO TA (Figura2). Células TOP 10
(Invitrogen) foram transformadas com essa ligação, incubadas em meio SOC e a
solução plaqueadas em placas de LB com canamicina com concentração final de
30µg/ml, para permitir crescimento de colônias isoladas, e para isto a placa foi
mantida em incubadora a 37
o
C de 14-16 horas.
FIGURA 2 - Representação esquemática do vetor de clonagem de DNA VR2001
TOPO TA
(A)
O vetor VR 2001 TOPO TA para clonagem em massa contém a seqüência que
codifica o peptídeo sinal do ativador de plasminogênio tecidual (TPA) para garantir
que a proteína seja secretada. Esse vetor também contém o promotor de
citomegalovírus (CMV) para expressão em células de mamíferos e o gene
resistência à canamicina. Duas topoisomerases flanqueiam o sítio de clonagem
(destacado como sítio de clonagem “TOPO”) para facilitar a clonagem nesse vetor.
(B)
Seqüência detalhada do sítio de clonagem TOPO indicando os aminoácidos do
peptídeo sinal TPA que precede o sítio de clonagem e os dois únicos sítios BamHI
que flaqueiam o sítio de clonagem
85
.
Material e Métodos
47
3.17 - Seleção de Recombinantes Positivos
Os recombinantes positivos foram selecionados por PCR de colônia. Os
clones positivos foram então utilizados para reação de sequenciamento em
Sequence Analyzer - Beckman Coulter sequenciar as amostras.
As seqüências forma analisadas e 1 clone de cada uma das 45 diferentes
cDNAs foram armazenados.
Os 45 clones tiveram seu DNA plasmidial extraído com uso do kit MiniPrep
(Promega) conforme descrição do fabricante.
Cada um dos plasmídeos extraídos, foram submetidos a digestão com a
enzima de restrição BamHI para confirmar a presença do inserto.
O DNA plasmidial foi utilizado como molde para reação de sequenciamento e
as seqüências foram analisadas gerando a seqüência consenso completa de cada
um dos contigs de interesse.
3.18 Extração de DNA Plasmidial para Triagem de Clones - GenElute™ HP
Endotoxin-Free Plasmid Megaprep Kit (Sigma)
Para extração de DNA plasmidial dos diferentes clones construídos foi
utilizado o kit GenElute™ HP Endotoxin-Free Plasmid Megaprep Kit (Sigma) que
elimina a presença de endotoxina (LPS – lipopolissacarídeos) na preparação
(
≤
0.1EU/µg). O procedimento foi realizado com base no descrito pelo fabricante.
Todo os DNAs plasmideais produzidos no item anterior foram concentrados
por meio de Amicon Centricon Plus-20 PL 100 – 1000.000 NMWL( Millipore).
Cada um dos plasmídeos extraídos, conforme descrito no itemXXX, foram
submetidos a digestão com a enzima de restrição BamHI para confirmar a presença
do inserto.
4 Resultados
Resultados
49
4 - RESULTADOS
4.1 - Plotagem dos Resultados de Bioinformática em Planilha
Para exemplificar como é o aspecto da planilha na qual estão plotados os
resultados das análises bioinformática, foi necessário dividi-la em pequenas tabelas
como apresentado abaixo. A amostragem retirada para essa exemplificação teve
origem da análise que contém as 3 bibliotecas juntas, a RMall (macho, fêmea e
ninfa). O conteúdo de cada tabela aparece descrito ao longo do texto. As colunas
das tabelas aparecem nomeadas em inglês, já que os programas usados para
processar os dados e gerar os resultados, foram desenvolvidos nos Estados Unidos.
Dessa forma, foram mantidas as características gerais e originais no formato em que
os resultados são apresentados. Como descrito em material e métodos, a maioria
das células é provida de hyperlinks ligados ou não a páginas da internet, que ao
serem clicados mostram o conteúdo (resultado) presente na célula.
Na Tabela 2 encontram-se as características gerais de cada contig, mais
especificamente da seqüência consenso. A coluna assembled contig contém a
seqüência de nucleotídeos consenso formada, na length está demonstrado o
número de nucleotídeos que formam a consenso, assim como em percent N está o
percentual de N (nucleotídeos que não foram determinados ser A, T, C ou G). Em
percent AT pode-se saber o percentual de nucleotídeos AT presentes na seqüência
consenso, enquanto em PA at determina-se o número do nucleotídeo no qual se
inicia a cauda poli A (quando presente). A coluna reverse possui N em todas as
células, já que para as bibliotecas do presente trabalho só foi utilizado o iniciador
forward e não (N) o reverse. A célula assembler output contém o alinhamento dos
clones das diferentes bibliotecas que foram agrupados por similaridade.
Ainda na Tabela 2, na coluna contig number aparece apenas a numeração
dos contigs para facilitar as análises. Em fasta file estão as seqüências de
nucleotídeos de todos os clones, em formato fasta. Number of sequences relata o
número de seqüências de nucleotídeos que formaram o contig enquanto na coluna
name of larger sequence aparece a denominação da maior seqüência presente no
contig. O número do nucleotídeo onde se inicia a cauda poli A está demonstrado na
coluna poly A at. A coluna cluster auxilia a numeração dos contigs para facilitara a
observação das análises.
Resultados
50
TABELA 2 -
Características gerais dos contigs.
Assembled contig Length Percent N Percent AT PA at Reverse?
Assembler
output
RMall-contig_104 536 0.7 48.3 N Contig-104
RMall-contig_139 273 0.4 49.1 254 N Contig-139
RMall-contig_146 438 . 52.1 419 N Contig-146
RMall-contig_170 428 0.5 51.4 409 N Contig-170
RMall-contig_241 664 0.2 44.3 N Contig-241
RMall-contig_251 799 0.3 46.6 780 N Contig-251
continuação da Tabela 2:
Contig
number
Fasta file
Number of
sequences
Name of larger
sequence
PolyA at Cluster
104 Contig104 11 GSNL03_D07_.b_058 464 Cluster 104
139 Contig139 6 GSMM16F_E02_.b_007 231 Cluster 139
146 Contig146 5 GSNL01F_C05_.b_034 274 Cluster 146
170 Contig170 4 GSNL12_E02_.b_007 399 Cluster 170
241 Contig241 2 GSNL18F_A09_.b_065 Cluster 241
251 Contig251 2 1GSNL13F_A02_.b_005 434 Cluster 251
Na Tabela 3 encontram-se as características gerais dos contigs quando
comparados com o banco de dados NR. Na coluna em average result aparece a
indicação de qual tipo de domínio a seqüência apresentou quando submetida ao
Signal P 3.0 Server (cyt = domínio citoplasmático, ind= domínio indeterminado, sig =
domínio de peptídeo sinal e anch = domínio âncora) . Nas colunas signal, anchor,
cytoplasm e no orf relata o valor obtido pela análise da seqüência no Signal P Server
indicativa do domínio detectado. Em best match to NR protein database estão
apresentados os melhores matches que a seqüência consenso obteve quando
submetida a uma busca no banco de dados de proteína não redundante. A coluna E
value descreve os valores de E (nível de significância) desse melhor match e
fornece acesso ao NCBI quando o computador possui rede de internet. Na coluna
match aparece descrito o número do gi da seqüência que demonstrou melhor match
com a seqüência consenso.
Ainda na Tabela 3, na coluna extent match aparece o
número de aminoácidos
que alinharam entre a seqüência submetida e a do banco de dados que revelou
melhor match. A length of best match apresenta o número de aminoácidos da
seqüência do banco de dados que revelou melhor match com a seqüência de
aminoácidos da seqüência consenso, enquanto % identity relata o percentual de
identidade nesse match. O first residue of match é o número do primeiro aminoácido
da seqüência do banco de dados que deu match com a seqüência consenso,
Resultados
51
enquanto first residue of sequence é o número do primeiro nucleotídeo da seqüência
consenso que deu match com a proteína do banco de dados. Na coluna number of
segments relata o número de blocos de match entre a seqüência consenso e a do
banco de dados. A orientation of assembled output descreve se match aconteceu na
direção forward (+1, +2 ou +3) ou na reverse (-1, -2 e -3). A coluna species
demonstra o gênero e a espécie do organismo que deu origem à proteína presente
no banco de dados de melhor match.
TABELA 3 -
Características gerais dos contigs quando comparados com o banco de
dados NR.
Average
Result
Signal Anchor Cytoplas No orf Best match to NR protein database E value Match
Cyt 0 0 2 0 ribosomal protein L28 2E-044 gi|67083849
Ind 0 0 0 0 ribosomal protein S19 2E-022 gi|67084003
Cyt 0 0 3 0 ribosomal protein S25 9E-051 gi|67083895
Cyt 0 0 5 0 ribosomal protein L44e 6E-041 gi|70909943
Cyt 0 0 1 0 ribosomal protein S8 2E-094 gi|67083817
Cyt 0 0 1 0 ribosomal protein S3e 4E-092 gi|70909551
continuação da Tabela 3:
Extent
of
match
Length
of best
match
%
identity
% Match
length
First
residue
of match
First
residue of
sequence
Number of
segments
Orientation
of assembled
output
111 141 79 79 31 52 2 FOR
59 150 91 39 87 31 1 FOR
108 111 96 97 4 69 1 FOR
70 104 85 67 35 28 2 FOR
181 209 95 87 1 7 2 FOR
118 241 88 49 5 13 3 FOR
Na Tabela 4 apresentam-se as características gerais dos contigs quando
comparados com o banco de dados ACARI. Em best match to ACARI database
estão apresentados os melhores matches que a seqüência consenso obteve quando
submetida a uma busca no banco de dados ácaros. E value descreve os valores de
E do melhor match. Na coluna match aparece descrito o gi da seqüência que
demonstrou melhor match com a seqüência consenso e em extent match aparece o
número de aminoácidos que alinharam entre a seqüência submetida e a do banco
de dados que revelou melhor match. A length of best match apresenta o número de
aminoácidos da seqüência do banco de dados que revelou melhor match com a
seqüência de aminoácidos da seqüência consenso.
Resultados
52
Na coluna % identity relata o percentual de identidade match. O first residue
of match é o número do primeiro aminoácido da seqüência do banco de dados que
deu match com a seqüência consenso, enquanto first residue of sequence é o
número do primeiro nucleotídeo da seqüência consenso que deu match com a
proteína do banco de dados. A coluna number of segments relata o número de
blocos de match entre a seqüência consenso e a do banco de dados. A orientation
of assembled output descreve se match aconteceu na direção forward (+1, +2 ou +3)
ou na reverse (-1, -2 e -3). A coluna species demonstra o gênero e a espécie do
organismo que deu origem à proteína presente no banco de dados com a qual
ocorreu o melhor match.
TABELA 4 -
Características gerais dos contigs quando comparados com o banco de
dados ACARI.
Best match to ACARI database E value Match Extent of match
Length of best
match
ribosomal protein L28 3E-047 gi|67083849 111 141
ribosomal protein S19 1E-025 gi|67083989 59 150
ribosomal protein S25 1E-053 gi|67083895 108 111
ribosomal protein L44 1E-038 gi|51011508 78 105
ribosomal protein S8 2E-097 gi|67083817 181 209
continuação da Tabela 4:
% identity
% Match
length
First residue
of match
First residue
of sequence
Number of
segments
Orientation of
assembled output
79 79 31 52 2 FOR
91 39 87 31 1 FOR
96 97 4 69 1 FOR
89 74 28 28 2 FOR
95 87 1 7 2 FOR
As características gerais dos contigs que foram comparados com o banco de
dados GO estão apresentadas na Tabela 5. Em best match to GO database estão
apresentados os melhores matches que a seqüência consenso obteve quando
submetida à busca no banco de dados de domínios protéicos GO.
E value descreve os valores de E do melhor match no banco de dados GO.
Na coluna all descriptors há a descrição da função putativa da seqüência do contig.
A classificação da função aparece descrita da mais específica, passando pela
intermediária (second parent) e atingindo a mais geral (parent). GO# lista o número
Resultados
53
de identificação da seqüência do banco de dados GO com a qual a seqüência
consenso obteve o melhor match. A coluna E value of functional GO descreve os
valores de E do melhor match no banco de dados de função molecular do GO.
TABELA 5 -
Características gerais dos contigs quando comparados com o banco de
dados GO.
Best match to GO database
RNA binding - structural constituent of ribosome - protein biosynthesis - cytosolic large ribosomal subunit
(sensu Eukarya)
RNA binding - structural constituent of ribosome - protein biosynthesis - hemocyte development - cytosolic
small ribosomal subunit (sensu Eukarya)
positive regulation of growth rate
protein biosynthesis - cytosolic large ribosomal subunit (sensu Eukarya) - structural constituent of
ribosome
Larval development (sensu Nematoda) - growth - physiological process - reproduction
RNA binding - structural constituent of ribosome - protein biosynthesis - cytosolic small ribosomal subunit
(sensu Eukarya)
continuação da Tabela 5:
E value All descriptors Parent
3E-22 RNA binding||nucleic acid binding||binding binding
2E-13 RNA binding||nucleic acid binding||binding binding
9E-40 structural constituent of ribosome||structural molecule activity structural molecule activity
5E-40 structural constituent of ribosome||structural molecule activity structural molecule activity
2E-65 structural constituent of ribosome||structural molecule activity structural molecule activity
1E-92 RNA binding||nucleic acid binding||binding binding
continuação da Tabela 5:
Second parent GO #
E value of
functional GO
nucleic acid binding GO:0003723 3.00E-22
nucleic acid binding GO:0003723 2E-13
structural constituent of ribosome GO:0003735 8.00E-23
structural constituent of ribosome GO:0003735 5.00E-40
structural constituent of ribosome GO:0003735 4.00E-62
nucleic acid binding GO:0003723 1.00E-92
Na Tabela 6, as características gerais dos contigs que foram comparados
com o banco de dados SMART aparecem distribuídas nas colunas. Em best match
to SMART database estão apresentados os melhores matches que a seqüência
consenso obteve quando submetida a busca nesse banco de dados, em E value
estão valores de E do melhor match no banco de dados SMART. Em best match to
PFAM database estão apresentados os melhores matches que a seqüência
consenso obteve quando submetida a busca nesse banco de dados. Na segunda
coluna E value estão os valores de E do melhor match no banco de dados PFAM.
Resultados
54
TABELA 6 -
Características gerais dos contigs quando comparados com o banco de
dados SMART.
Best match to
SMART database
E value
Best match to PFAM
database
E value
Ribosomal_L28e 2E-017
HTH_DTXR 7E-005 Ribosomal_S19e 8E-020
HTH_DTXR 0.013 Ribosomal_S25 2E-044
Ribosomal_L44 3E-026
Ribosomal_S8e 9E-047
KH 5E-004 Ribosomal_S3_C 2E-014
As características gerais dos contigs que foram comparados com o banco de
dados KOG estão plotadas na Tabela 7. Na coluna best match to KOG database
estão apresentados os melhores matches que a seqüência consenso obteve quando
submetida à busca nesse banco de dados. Já E value lista os valores de E do
melhor match no banco de dados KOG. General class descreve sucintamente a
provável função da seqüência do respectivo contig.
TABELA 7 -
Características gerais dos contigs quando comparados com o banco de
dados KOG.
Best match to KOG database E value General class
60S ribosomal protein L28 4E-018 Translation, ribosomal structure and biogenesis
40S ribosomal protein S19 2E-017 Translation, ribosomal structure and biogenesis
40S ribosomal protein S25 1E-043 Translation, ribosomal structure and biogenesis
60S ribosomal protein L44 2E-036 Translation, ribosomal structure and biogenesis
40S ribosomal protein S8 1E-079 Translation, ribosomal structure and biogenesis
40S ribosomal protein S3 1E-057 Translation, ribosomal structure and biogenesis
Os contigs analisados em questão, quando submetidos ao banco de dados
MIT-PLA e RRNA não mostraram homologia com os respectivos bancos. Dessa
forma a tabela foi omitida, mas a estrutura de demonstração dos resultados segue a
mesmo perfil do descrito para NR.
Em cada uma das colunas da Tabela 8 estão apresentadas as características
dos contigs quando submetidos ao banco de dados BMNT. A estrutura de
demonstração dos resultados segue a mesmo perfil do descrito para NR. A Tabela 8
ainda demonstra, em cada uma das colunas, características dos contigs quando
submetidos ao banco de dados BMNT. A estrutura de demonstração dos resultados
Resultados
55
segue a mesmo perfil do descrito para NR. A coluna cluster lista os números dos
contigs, enquanto as colunas GSF4, GSM e GSN relatam o número de clones de
fêmea e/ou macho e/ou ninfa presentes no respectivo contig (expressão diferencial).
Os contigs analisados em questão, quando submetidos ao banco de dados MIT-PLA
e RRNA não mostraram homologia com os respectivos bancos. Dessa forma a
tabela foi omitida, mas a estrutura de demonstração dos resultados segue a mesmo
perfil do descrito para NR.
Em cada uma das colunas da Tabela 8 estão apresentadas as características
dos contigs quando submetidos ao banco de dados BMNT. A estrutura de
demonstração dos resultados segue o mesmo perfil do descrito para NR. A coluna
cluster lista os números dos contigs, enquanto as colunas GSF4, GSM e GSN
relatam o número de clones oriundos de fêmea e/ou macho e/ou ninfa presentes no
respectivo contig (expressão diferencial).
TABELA 8 -
Características gerais dos contigs quando comparados com o banco de
dados BMNT e expressão diferencial entre as bibliotecas.
Best match to BMNT database E value Match
Extent
of match
Length
of best
match
%
identity
%
Match
length
EST776135 BEA Boophilus micro 0.0 gi|49567354 465 484 99 96
EST767495 BEA Boophilus micro 0.0 gi|49558714 397 405 98 98
EST775975 BEA Boophilus micro 0.0 gi|49567194 657 663 99 99
continuação da Tabela 8:
First
residue
of match
First residue of
sequence
Number of
segments
Orientation of
assembled
output
Cluster GSF4 GSM GSN
21 50 1 FOR 104 0 10 1
139 0 6 0
1 14 1 FOR 146 1 1 3
170 0 1 3
1 8 1 FOR 241 1 0 1
251 1 0 1
Resultados
56
4.2 - Perfil Geral das Bibliotecas
Os resultados do processamento dos dados das bibliotecas de fêmea, macho
e ninfa foram analisados individualmente, bem como numa combinação das três
bibliotecas. Os resultados das análises foram plotados em gráficos e fornecem um
perfil geral da seqüência consenso de cada um dos contigs presentes nas diferentes
bibliotecas.
A partir de 1440 seqüências iniciais, respectivamente, 1152, 993 e 1134
foram mantidas após serem processadas pelo programa Stripper e formaram,
respectivamente, 533, 368 e 664 contigs, nas bibliotecas de fêmea, macho e ninfa.
Para a combinação das 3 bibliotecas, as 3279 seqüências geraram 1644 contigs.
O número de contigs contendo as diferentes quantidades de seqüências, das
bibliotecas de fêmea, macho, ninfa e da biblioteca combinada, aparecem plotados
nas Figuras 3, 4, 5 e 6, respectivamente.
0
5
10
15
500
505
510
515
1-5 6-10 11-15 16-20 21-25 26-30
36-40
206-210
Nùmero de Contigs
Número de Sequências
FIGURA 3 - Número de contigs com diferentes números de seqüências
presentes na biblioteca de fêmea.
O gráfico representa o número de seqüências
distribuídas nos 533 contigs.
Resultados
57
0
5
10
15
330
335
340
345
1-5 6-10 11-15 16-20 36-40
Nùmero de Contigs
Número de Sequências
FIGURA 4 - Número de contigs com diferentes números de seqüências
presentes na biblioteca de macho.
O gráfico representa o número de seqüências
distribuídas nos 368 contigs.
0
5
10
15
470
475
480
485
1-5
6-10
11-15
16-20
Nùmero de Contigs
Número de Sequências
21-25
81-85
FIGURA 5 - Número de contigs com diferentes números de seqüências
presentes na biblioteca de ninfa.
O gráfico representa o número de seqüências
distribuídas nos 664 contigs.
Resultados
58
1-10 11-20 21-30
Nùmero de Contigs
31-40 41-50
0
10
20
30
1590
1600
1610
51-60 61-70 351-360
Número de Sequências
FIGURA 6 - Número de contigs com diferentes números de seqüências
presentes nas bibliotecas agrupadas.
O gráfico representa o número de
seqüências distribuídas nos 1644 contigs.
Todas as bibliotecas tiveram a seqüência consenso de cada contig submetida
a uma análise para buscar resíduos âncora, citoplasmático ou peptídeo sinal. Os
resultados das análises aparecem demonstrados nas Figuras 7 (fêmea), 8 (macho),
9 (ninfa) e 10 (combinação das três).
Resultados
59
0
100
200
300
indeterminado
citoplasmático
peptídeo
sinal
âncora
Número de Contigs
Resíduo
FIGURA 7 - Número de contigs da biblioteca de fêmea com os diferentes
resíduos.
0
50
100
150
200
indeterminado citoplasmático
peptídeo
sinal
âncora
Número de Contigs
Resíduo
FIGURA 8 - Número de contigs da biblioteca de macho com os diferentes
resíduos.
Resultados
60
0
50
100
150
200
250
indeterminado citoplasmático
peptídeo
sinal
âncora
Número de Contigs
Resíduo
FIGURA 9 - Número de contigs da biblioteca de ninfa com os diferentes
resíduos.
0
200
400
600
800
1000
indeterminado
citoplasmático
peptídeo
sinal
âncora
Número de Contigs
Resíduo
FIGURA 10 - Número de contigs das bibliotecas combinadas com os diferentes
resíduos.
Nas Figuras 11, 12, 13 e 14, estão apresentados os números de contigs das
bibliotecas de fêmea, macho, ninfa e a combinada, respectivamente, que tiveram
Resultados
61
match com seqüências depositadas nos bancos de dados NR, PFAM, KOG, GO,
ACARI, SMART, MIT-PLA e RRNA. Na Figura 14 também está apresentado o
resultado da busca no banco de BMNT (ESTs R. (Boophilus) microplus TIGR).
0
100
200
300
400
500
NR P FAM K O G GO SM ARTAC A RI M IT-P LA R RN A
Número de Contigs
Banco de Dados
FIGURA 11 - Número de contigs da biblioteca de fêmeas que apresentaram
similaridades com seqüências depositadas em diferentes banco de dados.
0
100
200
300
NR PFAM KOG GO SMARTACARI MIT-PLA RRNA
Número de Contigs
Banco de Dados
FIGURA 12 - Número de contigs da biblioteca de macho que apresentaram
similaridades com seqüências depositadas em diferentes bancos de dados.
Resultados
62
0
100
200
300
400
500
NR PFAM KOG GO SMARTACARI MIT-PLA RRNA
Número de Contigs
Banco de Dados
FIGURA 13 - Número de contigs da biblioteca de ninfas que apresentaram
similaridades com seqüências depositadas em diferentes banco de dados.
N R PF A M
KO G
G O SM AR T
AC A R I M IT
PLA
R R NA
Número de Contigs
Ban c o de D ados
0
250
500
750
100 0
125 0
150 0
BM N T
FIGURA 14 - Número de contigs das bibliotecas combinadas que apresentaram
similaridades com seqüências depositadas em diferentes banco de dados.
Resultados
63
As funções moleculares gerais de cada contig, preditas após comparação no
banco de dados GO, estão apresentadas nas Figuras 15, 16, 17 e 18, para fêmea,
macho, ninfa e combinada, respectivamente.
0
10
20
30
40
50
li
g
a
ç
ã
o
c
a
talí
t
ica
tra
n
sporte
m
o
léc
u
la e
s
t
r
utural
d
e
sc
o
n
h
e
c
i
d
a
t
ra
n
s
d
u
çã
o
d
e
s
i
n
a
l
r
e
g
ul
a
d
o
r
d
e
t
ra
n
s
cri
ç
ã
o
obso
l
et
a
f
a
tor
d
e
tr
a
d
u
ç
ã
o
motora
regulad
o
r de e
n
zima
Número de Contigs
Função Molecular
(G ene Ontology)
FIGURA 15 - Número de contigs da biblioteca de fêmea distribuídos de acordo
com a função molecular do banco de dados GO.
Resultados
64
0
10
20
30
40
50
l
i
g
aç
ão
ca
t
alí
t
ica
transporte
m
olécula estrutural
des
c
onh
ec
id
a
t
r
a
ns
duç
ão
d
e
s
i
na
l
regulador de transcrição
obs
o
leta
r
e
gul
a
do
r
d
e
tr
a
duç
ão
r
eg
u
lad
o
r de
en
z
ima
Número de Contigs
Função Molecular
(Gene Ontology)
FIGURA 16 - Número de contigs da biblioteca de macho distribuídos de acordo
com a função molecular do banco de dados GO.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
lig
a
ç
ã
o
c
a
talít
i
ca
transporte
m
o
lé
c
u
la
es
t
ru
t
ur
al
d
e
s
c
onhe
c
id
a
transdução de
si
n
al
re
g
u
lad
o
r
d
e
t
ra
n
scriç
ã
o
ob
s
ol
e
ta
reg
u
la
d
or
de
tra
d
u
ç
ão
reg
u
lador de enzima
Número de Contigs
Função Molecular
(G ene Ontology)
FIGURA 17 - Número de contigs da biblioteca de ninfas distribuídos de acordo
com a função molecular do banco de dados GO.
Resultados
65
0
50
100
150
lig
a
ção
catal
ítica
tran
sporte
mol
é
cula estr
u
tural
de
sco
nhec
id
a
transdução de sinal
reg
ulad
or d
e transcri
ç
ão
ob
sol
eta
f
a
tor de tradu
çã
o
mo
t
o
ra
reg
ul
ador de
en
zima
Número de Contigs
Função Molecular
(Gene Ontology)
FIGURA 18 - Número de contigs das bibliotecas combinadas distribuídos de
acordo com a função molecular do banco de dados GO.
4.3 - Expressão Diferencial de Genes entre Fêmea, Macho e Ninfa.
Dentre os 1644 contigs formados em RMall, resultantes do agrupamentos das
seqüências das bibliotecas de ninfa, fêmea e macho, 684 possuem pelo menos 1
seqüência de ninfa, 620 possuem pelo menos 1 seqüência de fêmea e 528 pelo
menos 1 seqüência de macho como pode ser observado na Figura 19.
Dentre as 684 de ninfas, 560 são exclusivas das mesmas. Das 124 restantes,
64 aparecem também de macho, 27 e na biblioteca de fêmea e 35 aparecem nas 3
bibliotecas. Dos 620 contigs que possuem seqüências de fêmea, 531 estão
presentes só na biblioteca de fêmea. Das 89 restantes 27 aparecem também na
biblioteca de ninfa, 27 na de macho e 35 aparecem nas 3 bibliotecas. Por fim, dos
528 contigs que possuem pelo menos 1 seqüência de macho. 402 estão presentes
só na biblioteca de macho. Das 126 restantes 27 aparecem também na biblioteca de
fêmeas, 64 na de ninfa e 35 aparecem nas 3 bibliotecas. Na Figura 20 estão
Resultados
66
apresentados os números de contigs que são exclusivos de cada biblioteca,
enquanto na Figura 21 estão os dados que são comuns entre as bibliotecas.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
Número de Contigs
RMall ninfa
fêmea
macho
Biblioteca
FIGURA 19 - Número de contigs total e por biblioteca
0
100
200
300
400
500
600
ninfa fêmea macho
Número de Contigs
Biblioteca
FIGURA 20 - Número de contigs exclusivos para cada biblioteca
Resultados
67
0
10
20
30
40
50
60
70
ninfa
macho
ninfa
fêmea
macho
fêmea
ninfa
macho
fêmea
Número de Contigs
Biblioteca
FIGURA 21 - Número de contigs em comum nas diferentes bibliotecas
Como descrito em material e métodos, o foco deste projeto, na escolha de
antígenos vacinais, são as proteínas secretadas pelo carrapato, já que de alguma
forma essas estariam modulando a resposta imune e/ou a hemostasia do
hospedeiro. Sendo assim, dos 1644 contigs totais resultantes da combinação das
três bibliotecas, os 200 contigs que possuem peptídeo sinal, previamente
apresentados na Figura 10, foram analisados mais detalhadamente.
Os 200 contigs contêm um total de 772 seqüências. A distribuição dessas
seqüências pelos contigs está apresentada na Figura 22.
Resultados
68
1-5 6-10 11-15
Nùmero de Contigs
16-20 21-25
0
5
10
15
165
170
26-30
31-35
40-45
Número de Sequências
56-60
FIGURA 22 - Número de contigs com peptídeo sinal com diferentes números
de seqüências.
O gráfico representa o número de seqüências distribuídas nos 200
contigs.
Na Figura 23 estão apresentados os números de contigs que contêm peptídeo
sinal e que possuem match com seqüências depositadas nos bancos de dados NR,
PFAM, KOG, ACARI, GO, SMART e BMNT, ou não como no caso dos bancos MIT-
PLA e RRNA.
Resultados
69
NR PFAM
KOG
GO SMART
ACARI
MIT
PLA
RRNA
Número de Contigs
Banco de Dados
0
50
100
150
200
BMNT
FIGURA 23 - Número de contigs com peptídeo sinal que apresentaram
similaridades com seqüências depositadas em diferentes bancos de dados.
O número de contigs, contendo peptídeo sinal, com match em GO (função
molecular), está apresentado na Figura 24.
0
5
10
15
20
25
30
35
li
g
ação
ca
t
alítica
tr
an
s
po
r
te
mo
lé
cu
la
es
tr
utural
desconhe
c
ida
tr
an
sd
uç
ã
o de si
n
al
r
e
gu
l
ad
o
r d
e
transcr
i
ção
obsoleta
re
g
u
lad
o
r
de
e
n
zim
a
Número de Contigs
Função Molecular
(Gene Ontology)
FIGURA 24 - Número de contigs com peptídeo sinal distribuídos de acordo
com a função molecular do banco de dados GO.
Resultados
70
Os 200 contigs foram também analisados relação à expressão diferencial de
genes pelas bibliotecas de fêmea, macho e ninfa como apresentado na Figura 25.
0
20
40
60
80
100
120
140
Número de Contigs
ninfa
fêmea
macho
Biblioteca
FIGURA 25 - Número de contigs com peptídeo sinal presentes em cada
biblioteca.
Dentre 122 contigs da biblioteca de ninfa, 93 na de macho e 54 na de fêmea,
alguns deles são comuns entre ninfa e macho (31) ou entre ninfa e fêmea (8) ou
entre macho e fêmea (4) ou entre os três (14) com apresentado na Figura 26.
0
5
10
15
20
25
30
35
ninfa
macho
ninfa
fêmea
macho
fêmea
ninfa
macho
fêmea
Número de Contigs
Biblioteca
FIGURA 26 - Número de contigs com peptídeo sinal presentes em comum nas
diferentes bibliotecas
Resultados
71
Os contigs que aparecem em mais de uma das bibliotecas, descritos acima,
foram submetidos à busca por matches nos bancos de dados NR e ACARI e os
resultados das buscas estão apresentados nas Tabelas 9, 10, 11 e 12.
TABELA 9 -
Melhor match dos contigs comuns entre macho e ninfa com os bancos
de dados NR e ACARI.
N
o
Contig
N
o
Seqs
Macho
N
o
Seqs
Ninfa
Melhor Match com NR Melhor Match com ACARI
325 1 1 hypothetical protein cgd4_1300
304 1 1 Rho guanine nucleotide exchange fac
330 1 1 microplusin preprotein
microplusin preprotein
354 1 1 hypothetical protein AN2480.2
305 1 1 putative Na+/K+-ATPase alpha subunit
346 1 1 putative secreted protein
putative secreted protein
289 1 1 Hypothetical protein CBG15126
putative salivary protein containing
347 1 1 minus agglutinin
putative cement protein RIM36
107 1 1 salivary gland-associated protein 64P
salivary gland-associated protein 64P
206 1 2 Riddle 4
Chymotrypsin-elastase inhibitor
171 1 2 PREDICTED: similar to Hnrpa0 protei
putative salivary secreted protein of
173 1 3 pherophorin-dz1 protein
unknown
153 1 4 salivary gland-associated protein 64P
salivary gland-associated protein 64P
154 1 4 putative secreted tyrosine rich saliv
putative secreted tyrosine rich saliv
71 1 5 OSJNBa0061G20.11
36/38 kDa immunodominant saliva prote
85 1 6 PREDICTED: similar to Splicing fact
93 1 8 salivary gland-associated protein 64P
salivary gland-associated protein 64P
205 2 1 super cysteine rich protein; SCRP
putative cement protein
200 2 1 salivary gland-associated protein 64P
salivary gland-associated protein 64P
131 2 2 putative cement protein RIM36
putative cement protein RIM36
175 2 2 salivary gland-associated protein 64P
salivary gland-associated protein 64P
102 2 9 putative secreted salivary protein
putative secreted salivary protein
90 2 12 cell wall protein GP2
136 3 3 Hypothetical protein T20B6.3
putative cement protein RIM36
124 3 4 putative cement protein RIM36
putative cement protein RIM36
106 4 4 salivary gland-associated protein 64P
salivary gland-associated protein 64P
138 5 1 putative 8.9 kDa secreted protein
putative 8.9 kDa secreted p
103 5 6 20/24 kDa immunodominant saliva prote
20/24 kDa immunodominant saliva prote
42 6 6 pherophorin-dz1 protein
unknown
22 12 9 plus agglutinin
putative cement protein RIM36
79 15 3 plus agglutinin
putative cement protein
Resultados
72
TABELA 10 -
Melhor match dos contigs comuns entre fêmea e ninfa com os bancos
de dados NR e ACARI.
N
o
Contig
N
o
Seqs
Fêmea
N
o
Seqs
Ninfa
Melhor Match com NR Melhor Match com ACARI
240 1 1 VP1 capsid protein
254 1 1 putative salivary secreted peptide
putative salivary secreted peptide
269 1 1 PREDICTED: similar to cytoplasmicn
273 1 1 pherophorin-dz1 protein
putative salivary protein containing
272 1 1 PREDICTED: similar to
cyclophilin A
120 1 4 putative membrane protein
NPL-2
51 1 11 plus agglutinin
extracellularmatrix-like protein
141 4 1 hypothetical protein
hypothetical protein
TABELA 11 -
Melhor match dos contigs comuns entre fêmea e macho com os
bancos de dados NR e ACARI.
N
o
Contig
N
o
Seqs
Fêmea
N
o
Seqs.
Macho
Melhor Match com NR Melhor Match com ACARI
258 1 1 Heterogeneous nuclear ribonucleo
NPL-2
256 1 1 PREDICTED: similar to Heterogeneous
putative cement protein
243 1 1 Protein of unknown function DUF6
66 14 15 IucA/IucC
TABELA 12 -
Melhor match dos contigs comuns entre fêmea, macho e ninfa com os
bancos de dados NR e ACARI.
N
o
Contig
N
o
Seqs
Fêmea
N
o
Seqs
Macho
N
o
Seqs
Ninfa
Melhor Match com NR Melhor Match com ACARI
23 1 1 5 ENSANGP00000014102
extracellularmatrix-like protein
110 1 3 3 flagelliform silk protein
salivary gland-associated protein 64P
70 1 10 5 basic proline-rich protein
unknown
73 1 10 12 flagelliform silk protein
extracellularmatrix-like protein
12 1 20 24 PREDICTED: similar to keratin 1
putative cement protein RIM36
13 1 35 24 Lor protein
unknown
152 2 1 2 Hypothetical protein T20B6.3
putative salivary protein containing
109 2 2 4 major ampullate spidroin
salivary gland-associated protein 64P
76 2 5 11 plus agglutinin
extracellularmatrix-like protein
53 2 10 12 flagelliform silk protein-1
extracellularmatrix-like protein
41 2 10 19 pherophorin-dz1 protein
unknown
21 2 14 10 flagelliform silk protein
extracellularmatrix-like protein
98 3 4 3 GH24939p
unknown
23 1 1 5 ENSANGP00000014102
extracellularmatrix-like protein
Resultados
73
Na Figura 27 está apresentado o número de contigs que estão presentes
exclusivamente nas bibliotecas de fêmea ou macho ou ninfa.
0
20
40
60
80
ninfa fêmeamacho
Número de Contigs
Biblioteca
FIGURA 27 - Número de contigs com peptídeo sinal presentes exclusivamente
em cada biblioteca.
De um total de 70 contigs com expressão exclusiva na biblioteca de fêmea, 58
são formados por seqüências únicas. Os outros contigs possuem pelo menos 2 ou
mais seqüências. A Tabela 13 apresenta o melhor match que cada contig, com mais
de uma seqüência, apresentou em busca no banco de dados NR e ACARI.
TABELA 13 -
Melhor match dos contigs exclusivos de ninfa que possuem mais de
uma seqüência com os bancos de dados NR e ACARI.
N
o
Contig
N
o
Seqs
Ninfa
Melhor Match com NR Melhor Match com ACARI
397 2 PREDICTED: similar to Zinc finger p
374 2 Hypothetical protein C55A1.15
387 2 conserved hypothetical protein ixodegrin-2A RGD containing protein
382 2 unknown putative secreted protein
207 2 putative membrane protein
365 2 RNA-binding protein, RRM domain putative cement protein
377 2 hydroxyproline-rich glycoprotein DZ-H
211 3 PREDICTED: similar to G2/mitotic-sp calreticulin
94 3 salivary gland-associated protein 64P salivary gland-associated protein 64P
52 3 minus agglutinin extracellularmatrix-like protein
210 3 ENSANGP00000000743 hypothetical protein
140 6 proline-rich protein - mouse (fragment) putative secreted protease inhibitor
Resultados
74
De um total de 45 contigs com expressão exclusiva na biblioteca de macho 31
são formados por seqüências únicas. Os outros contigs possuem pelo menos 2 ou
mais seqüências. A Tabela 14 apresenta o melhor match que cada contig, com mais
de uma seqüência, apresentou em busca no banco de dados NR e ACARI.
TABELA 14 -
Melhor match dos contigs exclusivos de macho que possuem mais de
uma seqüência com os bancos de dados NR e ACARI.
N
o
Contig
N
o
Seqs
Macho
Melhor Match com NR Melhor Match com ACARI
321 2 olfactory receptor
341 2 polysaccharide lyase, family 8
279 2 GL metallothionein
334 2 hypothetical protein hypothetical protein
315 2 ENSANGP00000022061 putative secreted salivary protein I
310 2 Gly receptor
194 3 PREDICTED: similar to pleckstrin ho
169 4 YCR592
176 4 hypothetical protein hypothetical protein
137 6 putative membrane protein putative cement protein RIM36
125 7 putative membrane protein putative cement protein RIM36
97 12 salivary gland metalloprotease salivary gland metalloprotease
89 15 immunoglobulin G binding protein C unnamed protein product
81 16 immunoglobulin G binding protein B unnamed protein product
De um total de 30 contigs com expressão exclusiva na biblioteca de fêmea, 26
são formados por seqüências únicas. Os outros contigs possuem pelo menos 2 ou
mais seqüências. A Tabela 15 apresenta o melhor match que cada contig, com mais
de uma seqüência, apresentou em busca no banco de dados NR e ACARI.
TABELA 15 -
Melhor match dos contigs exclusivos de fêmea que possuem mais de
uma seqüência com os bancos de dados NR e ACARI.
N
o
Contig
N
o
Seqs
Fêmea
Melhor Match com NR Melhor Match com ACARI
229 2 microplusin preprotein-like microplusin preprotein-like
262 2 similar to Plasmodium falciparum
236 2 hypothetical protein Afu1g09070 putative secreted histamine binding protein
126 4
Resultados
75
4.4 - Seleção Preliminar de Contigs
Dentre os 1644 contigs, 200 possuem seqüência com peptídeo sinal predito. Na
Tabela 16 estão apresentados os 108 contigs selecionados inicialmente para serem
clonados. Algumas de suas características, como número de seqüências por contig,
presença de peptídeo sinal, melhor similaridade com banco de dados de proteínas
NR e ACARI, com os respectivos valores de E, estão também apresentados na
Tabela.
TABELA 16 –
Características gerais do contigs da seleção preliminar.
Assembled contig
N. of
Seqs
Average
Result
Best match to NR protein database E value Best match to ACARI database E value
RMall_1119 1 Cyt conserved hypothetical protein 3.1
RMall_994 1 Ind 26kDa protease 3E-016 salivary secreted serine protease 3E-018
RMall_1257 1 Ind Carboxypeptidase, vitellogenic-like 0.002 putative secreted carboxype 2E-005
RMall_1325 1 Ind Cuticle protein 14 isoform a 6E-021 Cuticle protein 10.9 (Ir-ACP10.9 1E-012
RMall_1636 1 Ind defender against cell death 1 5E-051 defender against cell death 1 4E-054
RMall_594 1 Ind GA18281-PA 4E-056 cathepsin L-like tick cysteine protei 0.002
RMall_730 1 Ind glutathione S-transferase 6E-065 glutathione S-transferase 7E-068
RMall_1426 1 Ind hypothetical protein 0.32 HL35 antigen U 0.083
RMall_1514 1 Ind hypothetical protein 9E-078
RMall_1198 1 Ind hypothetical protein CaO19_13035 0.003 BTSP-9 1E-005
RMall_595 1 Ind hypothetical protein CND05180 3.2
RMall-contig_1071 1 Ind hypothetical protein PF11_0233 0.059 putative secreted protein 8E-005
RMall-contig_1572 1 Ind lacunin 0.35 putative secreted protein 6E-004
RMall-contig_1367 1 Ind multiple coagulation factor deficienc 5E-026 multiple coagulation factor deficienc 4E-029
RMall-contig_1480 1 Ind OSJNBa0072D08.4 0.005 putative secreted protein 0.062
RMall-contig_1242 1 Ind PREDICTED: similar to Ankyrin repea 8.8 putative secreted salivary protein 0.013
RMall-contig_466 1 Ind PREDICTED: similar to CG18815-PA, i 2E-043
RMall-contig_1218 1 Ind
PREDICTED: similar to
ENSANGP000000
8E-027 putative salivary protein 0.017
RMall-contig_1587 1 Ind PREDICTED: similar to GA12600-PA 2E-048
RMall-contig_807 1 Ind putative cell adhesion protein Sym32 3E-012
RMall-contig_1507 1 Ind putative secreted protein 7E-023 putative secreted protein 6E-026
RMall-contig_1593 1 Ind salivary gland metalloprotease 2E-041 salivary gland metalloprotease 1E-044
RMall-contig_713 1 Ind super cysteine rich protein; SCRP 4E-010
RMall-contig_885 1 Ind tetraspanin-like protein 3E-096 tetraspanin-like protein 2E-099
RMall-contig_509 1 Ind thrombospondin 0.37 salivary gland metalloprotease 0.059
RMall-contig_1144 1 Ind TPA: collagen, type VI, alpha 3 8E-008 thrombin inhibitor 9E-008
RMall-contig_1140 1 Ind unknown 0.015 unknown 2E-005
RMall-contig_1015 1 Ind von Willebrand factor 3E-006 von Willebrand factor 3E-009
RMall-contig_281 2 Ind Hypothetical protein CBG19173 3E-012 Chymotrypsin-elastase inhibitor 8E-007
RMall-contig_264 2 Ind KOG3882-like protein 6E-013 KOG3882-like protein 4E-016
RMall-contig_375 2 Ind novel protein similar to vertebrate 0.003
RMall-contig_148 4 Ind PREDICTED: similar to expressed seq 7E-008
RMall-contig_1519 1 SIG alpha-N-acetyl-galactosaminidase 2E-021
RMall-contig_1597 1 SIG antimicrobial peptide 1E-014 antimicrobial peptide 1E-017
RMall-contig_1149 1 SIG BcDNA.GH06717 3E-023
RMall-contig_494 1 SIG cathepsin L-like cysteine proteinase 3E-065 cathepsin L-like cysteine proteinase 2E-068
Resultados
76
Assembled contig
N. of
Seqs
Average
Result
Best match to NR protein database E value Best match to ACARI database E value
RMall-contig_115 1 SIG Coagulation factor IX 4E-013 salivary secreted serine protease 1E-014
RMall-contig_1397 1 SIG conserved hypothetical protein 8E-039 conserved hypothetical protein 8E-042
RMall-contig_870 1 SIG EG:100G10.5 7E-035
RMall-contig_1290 1 SIG hypothetical protein 4E-004 hypothetical protein 4E-007
RMall-contig_1308 1 SIG lipocalin-like protein 0.86 lipocalin-like protein 7E-004
RMall-contig_867 1 SIG PREDICTED: similar to G2/mitotic-sp 9E-005 secreted protein 0.017
RMall-contig_1315 1 SIG PREDICTED: similar to Growth hormon 6E-015
RMall-contig_1376 1 SIG PREDICTED: similar to matrilin 2 pr 0.059 putative 9.4 kDa secreted p 1E-004
RMall-contig_1271 1 SIG PREDICTED: similar to ovochymase 2 9E-014 midgut serine proteinase-2 5E-013
RMall-contig_1213 1 SIG
PREDICTED: similar to RIKEN cDNA
C2
4E-010
RMall-contig_1563 1 SIG putative 8.9 kDa secreted protein 6E-006 putative 8.9 kDa secreted p 5E-009
RMall-contig_1250 1 SIG putative salivary HBP family member 0.001 putative salivary HBP family member 9E-007
RMall-contig_1212 1 SIG putative salivary secreted peptide 2E-005 putative salivary secreted peptide 2E-008
RMall-contig_1402 1 SIG putative salivary secreted peptide 3E-009 putative salivary secreted peptide 4E-012
RMall-contig_1411 1 SIG putative salivary secreted peptide 9E-009 putative salivary secreted peptide 1E-011
RMall-contig_1214 1 SIG putative secreted protein 5E-026 putative secreted protein 4E-029
RMall-contig_1341 1 SIG putative secreted salivary protein 3E-031 putative secreted salivary protein 3E-034
RMall-contig_1541 1 SIG putative secreted salivary protein 0.057 putative secreted salivary protein 5E-005
RMall-contig_1458 1 SIG salivary gland metalloprotease 2E-047 salivary gland metalloprotease 2E-050
RMall-contig_1508 1 SIG salivary selenoprotein M precursor 5E-034 salivary selenoprotein M precursor 4E-037
RMall-contig_1275 1 SIG serotonin and histamine binding prote 2E-008 serotonin and histamine binding 2E-011
RMall-contig_1312 1 SIG super cysteine rich protein; SCRP 2E-046
RMall-contig_1418 1 SIG thrombin inhibitor 1E-031 thrombin inhibitor 1E-034
RMall-contig_902 1 SIG unnamed protein product 8E-007
RMall-contig_607 1 SIG unnamed protein product 0.010 putative salivary protein 2E-005
RMall-contig_998 1 SIG unnamed protein product 1E-178
Chain A, Crystal Structure Of The
Major H
0.001
RMall-contig_1108 1 SIG von Willebrand factor 2E-006 von Willebrand factor 2E-009
RMall-contig_806 1 SIG von Willebrand factor 1E-007 von Willebrand factor 1E-010
RMall-contig_1607 1 SIG von Willebrand factor 3E-008 von Willebrand factor 3E-011
RMall-contig_387 2 SIG conserved hypothetical protein 0.10 ixodegrin-2A RGD containing protein 2E-004
RMall-contig_315 2 SIG ENSANGP00000022061 0.040 putative secreted salivary protein 1E-004
RMall-contig_330 2 SIG microplusin preprotein 8E-018 microplusin preprotein 9E-021
RMall-contig_262 2 SIG microplusin preprotein-like 7E-006 microplusin preprotein-like 7E-009
RMall-contig_272 2 SIG PREDICTED: similar to Peptidyl-prol 2E-076 cyclophilin A 3E-076
RMall-contig_210 3 SIG ENSANGP00000000743 3E-004 hypothetical protein 3E-004
RMall-contig_211 3 SIG PREDICTED: similar to G2/mitotic-sp 0.003 calreticulin 0.003
RMall-contig_185 3 SIG PUTATIVE GLYCINE-RICH PROTEIN 0.15
RMall-contig_206 3 SIG Riddle 4 1E-012 Chymotrypsin-elastase inhibitor 4E-010
RMall-contig_176 4 SIG hypothetical protein 0.60 hypothetical protein 7E-004
RMall-contig_126 4 SIG hypothetical protein Afu1g09070 0.28 putative secreted histamine binding p 0.002
RMall-contig_169 4 SIG YCR592 0.036
RMall-contig_141 5 SIG hypothetical protein 5E-008 hypothetical protein 5E-011
RMall-contig_154 5 SIG putative secreted tyrosine rich saliv 1E-012 putative secreted tyrosine rich saliv 1E-015
RMall-contig_140 6 SIG proline-rich protein - mouse (fragment) 1E-010 putative secreted protease inhibitor 7E-009
RMall-contig_138 6 SIG putative 8.9 kDa secreted protein 0.021 putative 8.9 kDa secreted p 2E-005
RMall-contig_23 7 SIG ENSANGP00000014102 2E-010 extracellularmatrix-like protein 1E-007
RMall-contig_110 7 SIG flagelliform silk protein 2E-014 salivary gland-associated protein 64P 8E-015
RMall-contig_85 7 SIG PREDICTED: similar to Splicing fact 0.043
RMall-contig_124 7 SIG putative cement protein RIM36 3E-042 putative cement protein RIM36 2E-045
RMall-contig_125 7 SIG putative membrane protein 1E-020 putative cement protein RIM36 3E-010
RMall-contig_109 8 SIG major ampullate spidroin 9E-017 salivary gland-associated protein 64P 3E-013
RMall-contig_106 8 SIG salivary gland-associated protein 64P 1E-029 salivary gland-associated protein 64P 7E-033
RMall-contig_93 9 SIG salivary gland-associated protein 64P 3E-045 salivary gland-associated protein 64P 2E-048
RMall-contig_98 10 SIG GH24939p 4E-020 unknown 1E-013
RMall-contig_103 11 SIG
20/24 kDa immunodominant saliva
prote
8E-058
20/24 kDa immunodominant saliva
protein
7E-061
RMall-contig_102 11 SIG putative secreted salivary protein 3E-035 putative secreted salivary protein 2E-038
RMall-contig_42 12 SIG pherophorin-dz1 protein 1E-058 unknown 2E-059
RMall-contig_51 12 SIG plus agglutinin 1E-009 extracellularmatrix-like protein 3E-009
Resultados
77
Assembled contig
N. of
Seqs
Average
Result
Best match to NR protein database E value Best match to ACARI database E value
RMall-contig_97 12 SIG salivary gland metalloprotease 8E-025 salivary gland metalloprotease 7E-028
RMall-contig_90 14 SIG cell wall protein GP2 0.009
RMall-contig_89 15 SIG immunoglobulin G binding protein C 9E-084 unnamed protein product 8E-087
RMall-contig_70 16 SIG basic proline-rich protein 3E-022 unknown 7E-009
RMall-contig_81 16 SIG immunoglobulin G binding protein B 3E-081 unnamed protein product 2E-084
RMall-contig_79 18 SIG Hypothetical protein F12A10.1 1E-009 putative cement protein 2E-007
RMall-contig_76 18 SIG plus agglutinin 9E-023 extracellularmatrix-like protein 1E-011
RMall-contig_22 21 SIG plus agglutinin 4E-017 putative cement protein RIM36 2E-010
RMall-contig_73 23 SIG flagelliform silk protein 6E-024 extracellularmatrix-like protein 1E-013
RMall-contig_53 24 SIG flagelliform silk protein-1 5E-019 extracellularmatrix-like protein 3E-010
RMall-contig_21 26 SIG flagelliform silk protein 2E-019 extracellularmatrix-like protein 7E-009
RMall-contig_66 29 SIG IucA/IucC 0.70
RMall-contig_41 31 SIG pherophorin-dz1 protein 3E-048 unknown 3E-049
RMall-contig_12 45 SIG PREDICTED: similar to keratin 1; Ke 5E-023 putative cement protein RIM36 1E-019
RMall-contig_13 60 SIG Lor protein 2E-028 unknown 2E-020
4.5 - Contigs Selecionados
Na Tabela 17 está demonstrada a lista dos 45 contigs que tiveram seu cDNA
clonado em vetor vacinal. Algumas de suas características como número de
seqüências por contig, presença de peptídeo sinal, melhor similaridade com banco
de dados de proteínas NR e ACARI, valore de E, estão também apresentados na
Tabela.
TABELA 17 -
Características gerais do contigs selecionados para clonagem vacinal:
número de seqüências por contig, melhor match com NR e ACARI e os respectivos
valores de E.
Assembled contig
Number of
sequences
Average
Result
Best match to NR protein database E value Best match to ACARI database E value
RMall-contig_12 45 SIG PREDICTED: similar to keratin 1; Ke 5E-023 putative cement protein RIM36 1E-019
RMall-contig_13 60 SIG Lor protein 2E-028 unknown 2E-020
RMall-contig_21 26 SIG flagelliform silk protein 2E-019 extracellularmatrix-like protein 7E-009
RMall-contig_22 21 SIG plus agglutinin 4E-017 putative cement protein RIM36 2E-010
RMall-contig_41 31 SIG pherophorin-dz1 protein 3E-048 unknown 3E-049
RMall-contig_51 12 SIG plus agglutinin 1E-009 extracellularmatrix-like protein 3E-009
RMall-contig_53 24 SIG flagelliform silk protein-1 5E-019 extracellularmatrix-like protein 3E-010
RMall-contig_66 29 SIG IucA/IucC 0.70
RMall-contig_70 16 SIG basic proline-rich protein 3E-022 unknown 7E-009
Resultados
78
Assembled contig
Number of
sequences
Average
Result
Best match to NR protein database E value Best match to ACARI database E value
RMall-contig_73 23 SIG flagelliform silk protein 6E-024 extracellularmatrix-like protein 1E-013
RMall-contig_76 18 SIG plus agglutinin 9E-023 extracellularmatrix-like protein 1E-011
RMall-contig_79 18 SIG Hypothetical protein F12A10.1 1E-009 putative cement protein 2E-007
RMall-contig_81 16 SIG immunoglobulin G binding protein B 3E-081 unnamed protein product 2E-084
RMall-contig_85 7 SIG PREDICTED: similar to Splicing fact 0.043
RMall-contig_89 15 SIG immunoglobulin G binding protein C 9E-084 unnamed protein product 8E-087
RMall-contig_90 14 SIG cell wall protein GP2 0.009
RMall-contig_93 9 SIG salivary gland-associated protein 64P 3E-045 salivary gland-associated protein 64P 2E-048
RMall-contig_97 12 SIG salivary gland metalloprotease 8E-025 salivary gland metalloprotease 7E-028
RMall-contig_98 10 SIG GH24939p 4E-020 unknown 1E-013
RMall-contig_103 11 SIG 20/24 kDa immunodominant saliva prote 8E-058 20/24 kDa immunodominant saliva prote 7E-061
RMall-contig_106 8 SIG salivary gland-associated protein 64P 1E-029 salivary gland-associated protein 64P 7E-033
RMall-contig_109 8 SIG major ampullate spidroin 9E-017 salivary gland-associated protein 64P 3E-013
RMall-contig_110 7 SIG flagelliform silk protein 2E-014 salivary gland-associated protein 64P 8E-015
RMall-contig_124 7 SIG putative cement protein RIM36 3E-042 putative cement protein RIM36 2E-045
RMall-contig_126 4 SIG hypothetical protein Afu1g09070 0.28 putative secreted histamine binding p 0.002
RMall-contig_138 6 SIG putative 8.9 kDa secreted protein 0.021 putative 8.9 kDa secreted p 2E-005
RMall-contig_141 5 SIG hypothetical protein 5E-008 hypothetical protein 5E-011
RMall-contig_176 4 SIG hypothetical protein 0.60 hypothetical protein 7E-004
RMall-contig_185 3 SIG PUTATIVE GLYCINE-RICH PROTEIN 0.15
RMall-contig_206 3 SIG Riddle 4 1E-012 Chymotrypsin-elastase inhibitor 4E-010
RMall-contig_211 3 SIG PREDICTED: similar to G2/mitotic-sp 0.003 calreticulin 0.003
RMall-contig_315 2 SIG ENSANGP00000022061 0.040 putative secreted salivary protein 1E-004
RMall-contig_330 2 SIG microplusin preprotein 8E-018 microplusin preprotein 9E-021
RMall-contig_387 2 SIG conserved hypothetical protein 0.10 ixodegrin-2A RGD containing protein 2E-004
RMall-contig_607 1 SIG unnamed protein product 0.010 putative salivary protein 2E-005
RMall-contig_867 1 SIG PREDICTED: similar to G2/mitotic-sp 9E-005 secreted protein 0.017
RMall-contig_1108 1 SIG von Willebrand factor 2E-006 von Willebrand factor 2E-009
RMall-contig_1214 1 SIG putative secreted protein 5E-026 putative secreted protein 4E-029
RMall-contig_1250 1 SIG putative salivary HBP family member 0.001 putative salivary HBP family member 9E-007
RMall-contig_1275 1 SIG serotonin and histamine binding prote 2E-008 serotonin and histamine bin 2E-011
RMall-contig_1341 1 SIG putative secreted salivary protein 3E-031 putative secreted salivary protein 3E-034
RMall-contig_1402 1 SIG putative salivary secreted peptide 3E-009 putative salivary secreted peptide 4E-012
RMall-contig_1411 1 SIG putative salivary secreted peptide I 9E-009 putative salivary secreted peptide 1E-011
RMall-contig_1418 1 SIG thrombin inhibitor 1E-031 thrombin inhibitor 1E-034
RMall-contig_1563 1 SIG putative 8.9 kDa secreted protein 6E-006 putative 8.9 kDa secreted p 5E-009
A Tabela 18 é a continuação da caracterização dos contigs selecionados para
clonagem vacinal em comparação com o GO.
Resultados
79
TABELA 18 -
Características gerais do contigs selecionados para clonagem vacinal:
número de seqüências por contig, melhor match com NR e ACARI e os respectivos
valores de E.
Assembled contig
Number of
sequences
Average
Result
Best match to GO database E value
RMall-contig_12 45 SIG cornified envelope - structural constituent of epidermis - internal side of plasma membrane 8E-24
RMall-contig_13 60 SIG cornified envelope - structural constituent of epidermis - internal side of plasma membrane 6E-30
RMall-contig_21 26 SIG myogenesis - regulation of actin filament polymerization - stress fiber formation 2E-14
RMall-contig_22 21 SIG cell proliferation - extracellular space 1E-12
RMall-contig_41 31 SIG cornified envelope - structural constituent of epidermis - internal side of plasma membrane 8E-30
RMall-contig_51 12 SIG cell proliferation - extracellular space 2E-08
RMall-contig_53 24 SIG myogenesis - regulation of actin filament polymerization - stress fiber formation 2E-14
RMall-contig_66 29 SIG
RMall-contig_70 16 SIG extracellular space 2E-15
RMall-contig_73 23 SIG cornified envelope - structural constituent of epidermis – internal side of plasma membrane 2E-13
RMall-contig_76 18 SIG cell proliferation - extracellular space 2E-15
RMall-contig_79 18 SIG chromatin - nucleus - mRNA-nucleus export - mRNA localization, intracellular - omega speckle 6E-07
RMall-contig_81 16 SIG
RMall-contig_85 7 SIG pre-mRNA splicing factor activity - RNA splicing – nucleus - mRNA processing 0.004
Assembled contig
Number of
sequences
Average
Result
Best match to GO database E value
RMall-contig_89 15 SIG
RMall-contig_90 14 SIG eggshell formation (sensu Insecta) - pole plasm assembly - pole plasm RNA localization 0.0007
RMall-contig_93 9 SIG biological_process unknown 2E-17
RMall-contig_97 12 SIG
integrin binding - integrin-mediated signaling pathway - negative regulation of cell proliferation -
metallopeptidase activity
0.004
RMall-contig_98 10 SIG RNA binding - ribonucleoprotein complex 2E-15
RMall-contig_103 11 SIG positive regulation of growth rate - locomotory behavior 3E-11
RMall-contig_106 8 SIG biological_process unknown - cellular_component unknown 1E-20
RMall-contig_109 8 SIG structural constituent of cytoskeleton - epidermis development - intermediate filament 1E-12
RMall-contig_110 7 SIG keratin filament 2E-12
RMall-contig_124 7 SIG
negative regulation of transcription from Pol II promoter - transcription cofactor activity - nucleus - cytoplasm -
mating behavior - courtship behavior - circadian rhythm - eclosion rhythm - regulation of circadian sleep/wake
cycle, sleep - male courtship behavior (sensu Insecta), song production - locomotor rhythm - behavioral
response to cocaine
3E-09
RMall-contig_126 4 SIG
RMall-contig_138 6 SIG
RMall-contig_141 5 SIG mechanosensory behavior - response to mechanical stimulus - extracellular 0.0004
RMall-contig_176 4 SIG
RMall-contig_185 3 SIG
RMall-contig_206 3 SIG mesoderm development 3E-09
RMall-contig_211 3 SIG cilium - axoneme - protein binding - visual perception - eye photoreceptor cell development 0.014
RMall-contig_315 2 SIG
RMall-contig_330 2 SIG
RMall-contig_387 2 SIG extracellular space - molecular_function unknown - circadian rhythm 0.02
RMall-contig_607 1 SIG extracellular space 0.002
RMall-contig_867 1 SIG nucleocytoplasmic transporter activity - mRNA catabolism, nonsense-mediated - nucleus - cytoplasm 0.005
RMall-contig_1108 1 SIG blood coagulation - hemostasis 0.008
RMall-contig_1214 1 SIG embryonic development (sensu Animalia)- larval development (sensu Nematoda) -growth locomotory behavior 2E-18
RMall-contig_1250 1 SIG
RMall-contig_1275 1 SIG
RMall-contig_1341 1 SIG extracellular 1E-22
RMall-contig_1402 1 SIG
Golgi apparatus - glycosphingolipid biosynthesis - glycoprotein biosynthesis -
galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase activity - proteoglycan biosynthesis - N-
acetyllactosamine beta-1,3-glucuronosyltransferase activity - asioloorosomucoid beta-1,3-
glucuronosyltransferase activity - galactosyl beta-1,3 N-acetylgalactosamine beta-1,3-glucuronosyltransferase
activity
4E-06
RMall-contig_1411 1 SIG
RMall-contig_1418 1 SIG basement membrane 4E-26
RMall-contig_1563 1 SIG transcription factor activity - neurogenesis 0.017
Resultados
80
Na Tabela 19 estão apresentadas outras características dos contigs
selecionados com relação ao banco de dados SMART, Pfam e BMNT.
TABELA 19 -
Características gerais do contigs selecionados para clonagem vacinal:
número de seqüências por contig, melhor match com SMART, PFAM e BMNT e os
respectivos valores de E.
Assembled contig
Number of
sequences
Average
Result
Best match to
SMART
database
E value
Best match to
PFAM database
E value Best match to BMNT database E value
RMall-contig_12 45 SIG PRP 3E-004 Extensin_2 1E-011 EST7726 BEA Boophilus micro 0.0
RMall-contig_13 60 SIG PRP 1E-004 Extensin_2 2E-013 EST7726 BEA Boophilus micro 0.0
RMall-contig_21 26 SIG TSP1 0.068 Drf_FH1 1E-009 EST7735 BEA Boophilus micro 1E-173
RMall-contig_22 21 SIG DM6 0.027 Drf_FH1 3E-009 EST7735 BEA Boophilus micro 5E-097
RMall-contig_41 31 SIG DM6 0.001 Extensin_2 1E-022
RMall-contig_51 12 SIG TSP1 0.019 IER 2E-005 EST7735 BEA Boophilus micro 6E-044
RMall-contig_53 24 SIG TSP1 0.026 Drf_FH1 5E-008 EST7735 BEA Boophilus micro 1E-161
RMall-contig_66 29 SIG RIO 0.015 PNTB 0.056
RMall-contig_70 16 SIG Atrophin-1 9E-012 EST7735 BEA Boophilus micro 0.0
RMall-contig_73 23 SIG CBF 0.024 Drf_FH1 3E-011
RMall-contig_76 18 SIG DUF1421 3E-009 EST7735 BEA Boophilus micro 0.0
RMall-contig_79 18 SIG PRP 2E-006 GRP 8E-006
RMall-contig_81 16 SIG DM8 0.038 Pox_G7 0.034 EST7757 BEA Boophilus micro 0.0
RMall-contig_85 7 SIG APC_basic 0.012 EST7772 BEA Boophilus micro 0.0
RMall-contig_89 15 SIG ILWEQ 0.038 PMG 0.056 EST7665 BEA Boophilus micro 0.0
RMall-contig_90 14 SIG DUF605 0.005 EST7774 BEA Boophilus micro 0.0
RMall-contig_93 9 SIG PRP 2E-005 GRP 5E-011 EST7687 BEA Boophilus micro 0.0
RMall-contig_97 12 SIG ACR 0.018 Reprolysin 0.035
RMall-contig_98 10 SIG PRP 0.010 Drf_FH1 9E-011
RMall-contig_103 11 SIG TOPEUc 0.044 MCPVI 1E-004 EST7649 BEA Boophilus micro 0.0
RMall-contig_106 8 SIG PRP 8E-006 Drf_FH1 4E-011 EST7766 BEA Boophilus micro 0.0
RMall-contig_109 8 SIG PRP 2E-005 Drf_FH1 4E-010
RMall-contig_110 7 SIG PRP 0.001 DUF1517 1E-006
RMall-contig_124 7 SIG Gag_spuma 3E-004 EST7702 BEA Boophilus micro 0.0
RMall-contig_126 4 SIG
RMall-contig_138 6 SIG Protamine_P1 0.045 EST7618 BEA Boophilus micro 0.0
RMall-contig_141 5 SIG KU 7E-010 Kunitz_BPTI 2E-008
RMall-contig_176 4 SIG
RMall-contig_185 3 SIG PHD 0.076
RMall-contig_206 3 SIG TNFR 0.019 TIL 7E-014
RMall-contig_211 3 SIG PSN 0.002 YMF19 1E-004
RMall-contig_315 2 SIG KU 2E-004 Kunitz_BPTI 0.015 EST7685 BEA Boophilus micro 0.0
RMall-contig_330 2 SIG
RMall-contig_387 2 SIG DISIN 0.036 Atrophin-1 0.088
RMall-contig_607 1 SIG ML 3E-006 E1_DerP2_DerF2 4E-005 EST7665 BEA Boophilus micro 0.0
RMall-contig_867 1 SIG MADS 0.041 DUF1168 0.003
RMall-contig_1108 1 SIG PSN 0.012 TIL 0.004
RMall-contig_1214 1 SIG KU 6E-009 Kunitz_BPTI 2E-006
RMall-contig_1250 1 SIG
RMall-contig_1275 1 SIG His_binding 9E-011
RMall-contig_1341 1 SIG SCP 7E-028 SCP 2E-020 EST7680 BEA Boophilus micro 0.0
RMall-contig_1402 1 SIG DUF1459 0.002
RMall-contig_1411 1 SIG TLC 0.098 DUF1459 0.005
RMall-contig_1418 1 SIG KU 4E-020 Kunitz_BPTI 8E-018 EST7730 BEA Boophilus micro 0.0
RMall-contig_1563 1 SIG VWC 2E-004 Branch_AA_trans 0.014
Resultados
81
Em relação a busca em KOG, os 45 contigs apresentaram as características
apresentadas na Tabela 20. Nessa Tabela ainda estão plotados o números de
seqüências das diferentes bibliotecas presentes em cada um dos contigs.
TABELA 20 -
Características gerais do contigs selecionados para clonagem vacinal:
número de seqüências por contig, melhor match com KOG, os respectivos valores
de E e número de seqüências distribuídas pelas bibliotecas de fêmea, macho e
ninfa.
Assembled contig
Number
of sequences
Average
Result
Best match to KOG database E value
GSFL
4
GSMM GSNL
RMall-contig_12 45 SIG WASP-interacting protein VRP1/WIP, contains WH2 domain 4E-011 1 20 24
RMall-contig_13 60 SIG Wiskott Aldrich syndrome proteins 7E-012 1 35 24
RMall-contig_21 26 SIG WASP-interacting protein VRP1/WIP, contains WH2 domain 2E-012 2 14 10
RMall-contig_22 21 SIG Actin regulatory protein (Wiskott-Aldrich syndrome protein) 2E-010 0 12 9
RMall-contig_41 31 SIG Actin regulatory protein (Wiskott-Aldrich syndrome protein) 3E-024 2 10 19
RMall-contig_51 12 SIG Actin regulatory protein (Wiskott-Aldrich syndrome protein) 1E-008 1 0 11
RMall-contig_53 24 SIG WASP-interacting protein VRP1/WIP, contains WH2 domain 6E-014 2 10 12
RMall-contig_66 29 SIG 14 15 0
RMall-contig_70 16 SIG Actin regulatory protein (Wiskott-Aldrich syndrome protein) 4E-015 1 10 5
RMall-contig_73 23 SIG Actin regulatory protein (Wiskott-Aldrich syndrome protein) 7E-014 1 10 12
RMall-contig_76 18 SIG WASP-interacting protein VRP1/WIP, contains WH2 domain 2E-014 2 5 11
RMall-contig_79 18 SIG Uncharacterized conserved glycine-rich protein 2E-005 0 15 3
RMall-contig_81 16 SIG Predicted pyridoxal-dependent decarboxylase 0.090 0 16 0
RMall-contig_85 7 SIG RNA binding protein RBM12/SWAN 0.011 0 1 6
RMall-contig_89 15 SIG Netrin transmembrane receptor unc-5 0.050 0 15 0
RMall-contig_90 14 SIG Transcription factor Caudal, contains HOX domain 0.002 0 2 12
RMall-contig_93 9 SIG
RNA polymerase II C-terminal domain-binding protein RA4,
contains RPR and RRM domains
6E-011 0 1 8
RMall-contig_97 12 SIG Disintegrin metalloproteinases with thrombospondin repeats 9E-007 0 12 0
RMall-contig_98 10 SIG Wiskott Aldrich syndrome proteins 2E-012 3 4 3
RMall-contig_103 11 SIG Uncharacterized conserved low complexity protein 1E-005 0 5 6
RMall-contig_106 8 SIG Dosage compensation complex, subunit MLE 1E-013 0 4 4
RMall-contig_109 8 SIG Actin regulatory protein (Wiskott-Aldrich syndrome protein) 6E-012 2 2 4
RMall-contig_110 7 SIG Dosage compensation complex, subunit MLE 1E-009 1 3 3
RMall-contig_124 7 SIG mRNA cleavage factor I subunit/CPSF subunit 3E-004 0 3 4
RMall-contig_126 4 SIG 4 0 0
RMall-contig_138 6 SIG 0 5 1
RMall-contig_141 5 SIG Serine proteinase inhibitor (KU family) 6E-008 4 0 1
RMall-contig_176 4 SIG Ubiquitin fusion degradation protein-2 0.089 0 4 0
RMall-contig_185 3 SIG 3 0 0
RMall-contig_206 3 SIG Proteins containing Ca2+-binding EGF-like domains 2E-007 0 1 2
RMall-contig_211 3 SIG CBF1-interacting corepressor CIR and related proteins 0.009 0 0 3
RMall-contig_315 2 SIG Serine proteinase inhibitor (KU family) 0.013 0 2 0
RMall-contig_330 2 SIG 0 1 1
RMall-contig_387 2 SIG 0 0 2
RMall-contig_607 1 SIG Major epididymal secretory protein HE1 0.005 1 0 0
RMall-contig_867 1 SIG Chromatin assembly factor-I 0.001 0 1 0
RMall-contig_1108 1 SIG 0 1 0
RMall-contig_1214 1 SIG Serine proteinase inhibitor (KU family) 2E-008 0 0 1
RMall-contig_1250 1 SIG 0 0 1
RMall-contig_1275 1 SIG 0 0 1
RMall-contig_1341 1 SIG Defense-related protein containing SCP domain 1E-021 0 0 1
RMall-contig_1402 1 SIG 0 0 1
RMall-contig_1411 1 SIG SWAP mRNA splicing regulator 0.017 0 0 1
RMall-contig_1418 1 SIG Serine proteinase inhibitor (KU family) 8E-017 0 0 1
RMall-contig_1563 1 SIG Mismatch repair ATPase MSH4 (MutS family) 0.047 0 0 1
Resultados
82
4.6 - Análise dos clones escolhidos para serem imunotriados por imunologia
reversa.
4.6.1 - Contig 85
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 85 (Rm_85N). O contig é composto
por 7 seqüências que contém um gene de aproximadamente 612-pb codificando
uma proteína de 11.7-kDa, com uma seqüência sinal de 22-aa (AYG-GP), com um pI
de 4.2 e uma carga de -9.1 em pH 7. Dos 7 clones, 1 está presente na biblioteca de
macho e 6 estão presentes na biblioteca de ninfa. Dos 113-aa, 9 foram
caracterizados com caráter fortemente básico, 18 com caráter fortemente ácido, 30
com caráter hidrofóbico e 25 com caráter polar. A execução do Blast X
não
revelou
homologia.
4.6.2 - Contig 81
R. (Boophilus) microplus proteína de macho 81 (Rm_81M). O contig é
composto de 16 seqüências que contém um gene de aproximadamente 648-pb
codificando uma proteína parcial de 18.1-kDa, com uma seqüência sinal de 16-aa
(GGG-ET), com um pI de 9.1 e uma carga de 8.6 em pH 7. Os 16 clones estão
presentes na biblioteca de macho. Dos 160-aa, 22 foram caracterizados com caráter
fortemente básico, 14 com caráter fortemente ácido, 44 com caráter hidrofóbico e 46
com caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com seqüência de
outros carrapatos como com a proteína B ligante de imunoglobulina G de R.
appendiculatus
128
com 80% de identidade e valor de E de 4e-79, com a proteína B
ligante de imunoglobulina G de R. haemaphysaloides haemaphysaloides com 80%
de identidade e valor de E de 6e-66, com a proteína C ligante de imunoglobulina G
de R. appendiculatus
128
com 46% de identidade e valor de E de 2e-41 e coma
proteína putativa ligante de imunoglobulina de I. scapularis
87
com 25% de identidade
e valor de E de 1e-6, entre outros.
4.6.3 - Contig 89
R. (Boophilus) microplus proteína de macho 89 (Rm_89M). O contig é
composto de 15 seqüências que contém um gene de aproximadamente 637-pb
Resultados
83
codificando uma proteína parcial de 17.3-kDa, com uma seqüência sinal de 20-aa
(AQG-TV), com um pI de 9,1 e uma carga de 8.6 em pH 7. Os 15 clones estão
presentes na biblioteca de macho. Dos 152-aa, 22 foram caracterizados com caráter
fortemente básico, 14 com caráter fortemente ácido, 51 com caráter hidrofóbico e 41
com caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com seqüência de
outros carrapatos como com a proteína C ligante de imunoglobulina G de R.
appendiculatus
128
com 84% de identidade e valor de E de 1e-83, com a proteína B
ligante de imunoglobulina G de R. appendiculatus
128
com 46% de identidade e valor
de E de 1e-40, com a proteína B ligante de imunoglobulina G de R.
haemaphysaloides haemaphysaloides com 48% de identidade e valor de E de 6e-35
e com a proteína putativa ligante de imunoglobulina de I. scapularis
87
com 27% de
identidade e valor de E de 2e-8, entre outros
4.6.4 - Contig 126
R. (Boophilus) microplus proteína de fêmea 126 (Rm_126F). O contig é
composto por 4 seqüências que contém um gene de aproximadamente 821-pb
codificando uma proteína de 23.1-kDa, com uma seqüência sinal de 18-aa (VAS-
LD), um pI de 8.5 e uma carga de 5.2 em pH 7. Os 4 clones estão presentes na
biblioteca de fêmea. Dos 202-aa, 25 foram caracterizados com caráter fortemente
básico, 20 com caráter fortemente ácido, 69 com caráter hidrofóbico e 68 com
caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com seqüência de outros
carrapatos como com a proteína putativa ligante de serotonina e histamina de R.
haemaphysaloides haemaphysaloides com 63% de identidade e valor de E de 3e-
74, com a proteína putativa secretada ligante de histamina de I. scapularis com 25%
de identidade e valor de E de 1e-4, com o peptídeo putativo secretado de glândula
salivar de I. scapularis com 25% de identidade e valor de E de 2e-4.
4.6.5 - Contig 1275
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 1275 (Rm_1275N). O contig é
composto por 1 seqüência que contém um gene de aproximadamente 755-pb
codificando uma proteína de 21.9-kDa, com uma seqüência sinal de 22-aa (CHA-
QK), um pI de 9.6 e uma carga de 15.7 em pH 7. Esse clone está presente na
biblioteca de ninfa. Dos 188-aa, 30 foram caracterizados com caráter fortemente
Resultados
84
básico, 15 com caráter fortemente ácido, 64 com caráter hidrofóbico e 52 com
caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com seqüências de outros
carrapatos, como com a proteína de ligação a histamina e a serotonina de
Dermacentor reticulatus fêmea ligante de histamina (FS-HBP2) / proteína 2
específica
101
com 36% de identidade e valor de E de 5e-327 e com o precursor da
proteína 2 específica de fêmea ligante de histamina 2 de R. appendiculatus
88
com
31% de identidade e valor de E de 1e-13, entre outros.
4.6.6 - Contig 1250
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 1250 (Rm_1250N). O contig é
composto por 1 seqüência que contém um gene de aproximadamente 756-pb
codificando uma proteína de 22.8-kDa, com uma seqüência sinal de 19-aa (SLSe-
N), um pI de 5.2 e uma carga de -4 em pH 7. Esse clone está presente na biblioteca
de ninfa. Dos 200-aa, 20 foram caracterizados com caráter fortemente básico, 24
com caráter fortemente ácido, 59 com caráter hidrofóbico e 73 com caráter polar. A
execução do Blast X revelou homologia com seqüências de outros carrapatos como
com a proteína putativa salivar membro da família HBP de I. scapularis com 25% de
identidade e valor de E de 3e-9, com proteína putativa secretada de I. scapularisom
26% de identidade e valor de E de 1e-7, com a proteína truncada ligante de
histamina de I. pacificus com 23% de identidade e valor de E de 1e-4, com proteína
ligante de histamina de I. scapularis com 25% de identidade e valor de E de 6e-4,
com a proteína salivar ligante de histamina de I. scapularis com 24% de identidade e
valor de E de 7e-4 e com a proteína ligante de histamina I. scapularis
28
com 23% de
identidade e valor de E de 7e-4, entre outros.
4.6.7 - Contig 138
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 138 (Rm_138N). O contig é
composto por 6 seqüências que contém um gene de aproximadamente 546-pb
codificando uma proteína de 10-kDa, com uma seqüência sinal de 17-aa (CFG-DV),
um pI de 5.1 e uma carga de -4.7 em pH 7. Das 6 clones, 5 estão presentes na
biblioteca de macho e 1 na de ninfa. Dos 92-aa, 6 foram caracterizados com caráter
fortemente básico, 11 com caráter fortemente ácido, 25 com caráter hidrofóbico e 33
com caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com seqüência de
Resultados
85
outros carrapatos, como com a proteína putativa secretada de 8.9 kDa de I.
scapularis com 33% de identidade e valor de E de 6e-6, com a proteína putativa
secretada salivar de I. scapularis com 36% de identidade e valor de E de 2e-4, coma
proteína putativa salivar de I. scapularis com 36% de identidade e valor de E de 2e-
4, com a proteína putativa salivar secretada I. scapularis com 32% de identidade e
valor de E de 6e-4, com a proteína putativa secretada salivar de I. scapularis com
32% de identidade e valor de E de 6e-4 e com o peptídeo putativo secretado salivar
de 9.41kDa de I. pacificus com 26% de identidade e valor de E de 0.015, entre
outros.
4.6.8 - Contig 1563
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 1563 (Rm_1563N). O contig é
composto por 1 seqüência que contém um gene de aproximadamente 794-pb
codificando uma proteína de 9.8-kDa, com uma seqüência sinal de 19/20-aa (GHC-
WT), um pI de 6.1 e uma carga de -1.9 em pH 7. Esse clone está presente na
biblioteca de ninfa. Dos 87-aa, 7 foram caracterizados com caráter fortemente
básico, 9 com caráter fortemente ácido, 21 com caráter hidrofóbico e 30 com caráter
polar. A pesquisa se similaridades na base de dados NR com a ferramenta Blast X
revelou homologia com seqüências de outro carrapato como com a proteína putativa
secretada de 8.9 kDa de I. scapularis com 34% de identidade e valor de E de 8e-16,
com a proteína putativa salivar secretada de I. scapularis com 34% de identidade e
valor de E de 8e-16 e com o peptídeo putativo secretado de glândula salivar de I.
scapularis com 27% de identidade e valor de E de 3e-5, entre outros.
4.6.9 - Contig 1402
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 1402 (Rm_1402N). O contig possui
1 seqüência que contém um gene de aproximadamente 397-pb codificando uma
proteína de 3.6-kDa, com uma seqüência sinal de 21-aa (TVA-KP), um pI de 9.1 e
uma carga de 2.2 em pH 7. Esse clone está presente na biblioteca de ninfa. Dos 28-
aa, 2 foram caracterizados com caráter fortemente básico, 5 com caráter hidrofóbico
e 12 com caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com seqüências
de outros carrapatos como peptídeo putativo salivar secretado de I. pacificus com
55% de identidade e valor de E de 1e-8 e com proteína putativa salivar secretada
Resultados
86
rica em tirosina I. scapularis com 55% de identidade e valor de E de 2e-8, entre
outros.
4.6.10 - Contig 1411
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 1411 (Rm_1411N). O contig é
composto por 1 seqüência que contém um gene de aproximadamente 429-pb
codificando uma proteína de 3.6-kDa, com uma seqüência sinal de 21-aa (TVA-KP),
um pI de 9.1 e uma carga de 2.2 em pH 7. Esse clone está presente na biblioteca de
ninfa. Dos 28-aa, 2 foram caracterizados com caráter fortemente básico, 4 com
caráter hidrofóbico e 13 com caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia
com seqüências de outros carrapatos como com o peptídeo putativo salivar
secretado de Ixodes pacificus com 55% de identidade e valor de E de 1e-8 e com
proteína putativa salivar secretada rica em tirosina de I. scapularis com 55% de
identidade e valor de E de 2e-8, entre outros.
4.6.11 - Contig 176
R. (Boophilus) microplus proteína de macho 176 (Rm_176M). De um total de
4 seqüências contém um gene de 463-pb codificando uma proteína de 11-kDa, com
uma seqüência sinal de 27-aa (AEA-RK), um pI de 8 e uma carga de 2.1 em pH 7.
As 4 seqüências aparecem na biblioteca de macho. Dos 97-aa foram caracterizados
23 com caráter fortemente básico, 21 com caráter fortemente ácido, 9 com caráter
hidrofóbico e 23 com caráter polar. Em A execução do Blast X revelou homologia
com a proteína W09G12.7 de Caenorhabditis elegans / proteína hipotética
W09G12.7 de Caenorhabditis elegans
25
com 28% de identidade e valor de E de
0.31. Dentre os carrapatos apresentou homologia com a proteína hipotética de
Haemaphysalis longicornis
79
com 56% de identidade e valor de E de 0,68.
4.6.12 - Contig 206
R. (Boophilus) microplus proteína de macho 206 (Rm_206M). O contig é
composto por 3 seqüências que contém um gene de aproximadamente 662-pb
codificando uma proteína de 20.8-kDa, com uma seqüência sinal de 23-aa (TSA-
RR), um pI de 8.2 e uma carga de 9.5 em pH 7. Dos 3 clones 1 está presente na
biblioteca de macho e 2 na de ninfa. Dos 181-aa, 23 foram caracterizados com
Resultados
87
caráter fortemente básico, 13 com caráter fortemente ácido, 46 com caráter
hidrofóbico e 73 com caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com a
proteína predita similar a isoforma 1 de Y69H2.3a de Tribolium castaneum com 34%
de identidade e valor de E de 4e-19. Dentre os carrapatos apresentou homologia
com a proteína ixodidina inibidora de quimotripsina e elastase de R. (Boophilus)
microplus
35
com 48% de identidade e valor de E de 5e-7, entre outros.
4.6.13 - Contig 211
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 211 (Rm_211N). O contig é
composto por 3 seqüências que contém um gene de aproximadamente 504-pb
codificando uma proteína de 14.7-kDa, com uma seqüência sinal de 22-aa (LKA-
WA), um pI de 10.4 e uma carga de 23.6 em pH 7. Os 3 clones estão presentes na
biblioteca de ninfa. Dos 126-aa, 34 foram caracterizados com caráter fortemente
básico, 11 com caráter fortemente ácido, 33 com caráter hidrofóbico e 28 com
caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com a proteína predita
hipotética de Rattus norvegicus com 45% de identidade e valor de E de 5e-7, entre
outros.
4.6.14 - Contig 867
R. (Boophilus) microplus proteína de macho 867 (Rm_867M). O contig é
composto por 1 seqüência que contém um gene de aproximadamente 734-pb
codificando uma proteína de 15.1-kDa, com uma seqüência sinal de 22-aa (LKA-
WA), um pI de 10.5 e uma carga de 22.9 em pH 7. Esse clone está presente na
biblioteca de macho. Dos 129-aa, 34 foram caracterizados com caráter fortemente
básico, 11 com caráter fortemente ácido, 37 com caráter hidrofóbico e 35 com
caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com a proteína RUNX1 de
Homo sapiens
112
com 28% de identidade e valor de E de 8e-5 e com a proteína 3
ligante de eritrócito de Plasmodium yoelii yoelii
59
com 48% de identidade e valor de
E de 4e-4, entre outros.
Resultados
88
4.6.15 - Contig 330
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 330 (Rm_330N). O contig é
composto por 2 seqüências que contém um gene de aproximadamente 500-pb
codificando uma proteína de 13.2-kDa, com uma seqüência sinal de 20-aa (SSA-
HH), um pI de 9.2 e uma carga de 7.9 em pH 7. Dentre os clones, 1 está presente
na biblioteca de macho e 1 na de ninfa. Dos 107-aa, 13 foram caracterizados com
caráter fortemente básico, 6 com caráter fortemente ácido, 37 com caráter
hidrofóbico e 35 com caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com a
pré-proteína microplusina de Boophilus microplus
34
com 49% de identidade e valor
de E de 2e-17, com a proteína hebreaina de Amblyomma hebraeum
67
com 45% de
identidade e valor de E de 3e-16 e com a proteína anti-microbiana do tipo
microplusin de Argas monolakensis com 25% de identidade e valor de E de 0.019,
entre outros.
4.6.16 - Contig 387
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 387 (Rm_387N). O contig é
composto de 2 seqüências que contém um gene de aproximadamente 587-pb
codificando uma proteína de 14.2-kDa, com uma seqüência sinal de 21-aa (TNA-
AV), um pI de 4 e uma carga de -17.4 em pH 7. Os 2 clones estão presentes na
biblioteca de fêmea. Dos 133-aa, 10 foram caracterizados com caráter fortemente
básico, 27 com caráter fortemente ácido, 27 com caráter hidrofóbico e 43 com
caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com seqüência de outro
carrapato como com a proteína ixodegrina-2A que contém RGD de I. scapularis com
27% de identidade e valor de E de 0.051.
4.6.17 - Contig 97
R. (Boophilus) microplus proteína de macho 97 (Rm_97M). O contig é
composto por 12 seqüências que contém um gene parcial de aproximadamente 643-
pb codificando uma proteína parcial de 18.3-kDa, sem a presença de uma seqüência
sinal, com um pI de 5.6 e uma carga de -6.2 em pH 7. Os 12 clones estão presentes
na biblioteca de macho. Dos 162-aa, 18 foram caracterizados com caráter
fortemente básico, 25 com caráter fortemente ácido, 39 com caráter hidrofóbico e 44
com caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com seqüência de
Resultados
89
outros carrapatos como a metaloprotease de Haemaphysalis longicornis com 42%
de identidade e valor de E de 2e-30, com a metaloproteinase de R.
haemaphysaloides com 42% de identidade e valor de E de 5e-28, com a
metaloprotease de Argas monolakensis com 36% de identidade e valor de E de 6e-
26, com a metaloprotease de glândula salivar de Boophilus microplus com 39% de
identidade e valor de E de 6e-24, com a metaloprotease salivar truncada de I.
pacificus com 34% de identidade e valor de E de 1e-18, com a proteína hipotética de
Ixodes ricinus
72
com 34% de identidade e valor de E de 6e-18, com a
metaloprotease truncada secretada de I. scapularis com 32% de identidade e valor
de E de 8e-18 e com a metaloprotease 1 de I. scapularis
37
/ metaloprotease de
glândula salivar de I. scapularis
37
com 31% de identidade e valor de E de 3e-17,
entre outros.
O contig ainda apresentou um domínio ZnMc_salivary_gland_MPs truncado
como apresentado na Figura 28, com valor de E de 2e-23.
2e-23
FIGURA 28 - Representação esquemática da presença de domínio
ZnMc_salivary_gland_MPs na seqüência protéica de Rm_97M.
4.6.18 - Contig 1341
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 1341 (Rm_1341N). O contig é
composto por 1 seqüência que contém um gene de aproximadamente 731-pb
codificando uma proteína de 21.7-kDa, com uma seqüência sinal de 17-aa (VLS-
YQ), um pI de 10.3 e uma carga de 19.6 em pH 7. Esse clone está presente na
biblioteca de ninfa. Dos 184-aa, 34 foram caracterizados com caráter fortemente
básico, 16 com caráter fortemente ácido, 38 com caráter hidrofóbico e 52 com
caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com a proteína predita
similar a CG16995-PA de Tribolium castaneum com 48% de identidade e valor de E
de 2e-34, proteína relacionada a SCP Bombyx mori com 42% de identidade e valor
de E de 2e-34. Dentre os carrapatos, revelou homologia com proteína putativa
Resultados
90
salivar secretada I. scapularis com 50% de identidade e valor de E de 5e-34, entre
outros.
O contig ainda apresentou um domínio SCP como apresentado na Figura 29,
com valor de E de 5e-23.
5e-23
FIGURA 29 - Representação esquemática da presença de domínio SCP na
seqüência protéica de Rm_1341N.
4.6.19 - Contig 607
R. (Boophilus) microplus proteína de fêmea 607 (Rm_607F). O contig é
composto de 1 seqüência que contém um gene de aproximadamente 815-pb
codificando uma proteína de 14.7-kDa, com uma seqüência sinal de 19-aa (CGA-
QQ), um pI de 5.3 e uma carga de -2.1 em pH 7. Esse clone está presente na
biblioteca de fêmea. Dos 134-aa, 14 foram caracterizados com caráter fortemente
básico, 16 com caráter fortemente ácido, 43 com caráter hidrofóbico e 44 com
caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com seqüência de outro
carrapato como à proteína putativa salivar de I. scapularis com 23% de identidade e
valor de E de 2e-4, entre outros.
O contig ainda apresentou um domínio ML como apresentado na Figura 30,
com valor de E de 0,001.
0,001
FIGURA 30 - Representação esquemática da presença de domínio ML na
seqüência protéica de Rm_607F.
Resultados
91
4.6.20 - Contig 141
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 141 (Rm_141N). O contig é
composto de 5 seqüências que contém um gene de aproximadamente 535-pb
codificando uma proteína de 17-kDa, com uma seqüência sinal de 18-aa (GTF-RW),
um pI de 9.1 e uma carga de 11.3 em pH 7. Dos 5 clones, 4 estão presentes na
biblioteca de fêmea e 1 na de ninfa. Dos 142-aa, 24 foram caracterizados com
caráter fortemente básico, 13 com caráter fortemente ácido, 30 com caráter
hidrofóbico e 53 com caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com
seqüência da proteína hipotética de Haemaphysalis longicornis
79
com 38% de
identidade e valor de E de 3e-15. Também revelou homologia com a proteína que
contém domínios Kunitz do inibidor de tripsina pancreática bovina de Danio rerio
com 35% de identidade e valor de E de 2e-9, entre outros.
O contig ainda apresentou dois domínios Kunitz como apresentado na Figura
31, com valores de E de 0,0001 e 0,006.
0,0001 0,006
FIGURA 31 - Representação esquemática da presença de domínios Kunitz na
seqüência protéica de Rm_141N.
4.6.21 - Contig 315
R. (Boophilus) microplus proteína de macho 315 (Rm_315M). O contig é
composto por 2 seqüências que contém um gene de aproximadamente 812-pb
codificando uma proteína de 22.6-kDa, com uma seqüência sinal de 18-aa (CAA-
TS), um pI de 8.3 e uma carga de 7.6 em pH 7. Os 2 clones estão presentes na
biblioteca de macho. Dos 194-aa, 25 foram caracterizados com caráter fortemente
básico, 17 com caráter fortemente ácido, 35 com caráter hidrofóbico e 86 com
caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com a proteína
ENSANGP00000022061 de A. gambiae str. PEST/ ENSANGP00000022061 A.
gambiae str. PEST com 35% de identidade e valor de E de 8e-15. Dentre os
Resultados
92
carrapatos apresentou homologia com a proteína putativa secretada salivar de I.
scapularis com 26% de identidade e valor de E de 4e-8 e com a proteína KUN-4 de
I. pacificus com 26% de identidade e valor de E de 3e-7, entre outros.
O contig ainda apresentou um domínio Kunitz como apresentado na Figura
32, com valor de E de 0,00006.
0,00006.
FIGURA 32 - Representação esquemática da presença de domínio Kunitz na
seqüência protéica de Rm_315M.
4.6.22 - Contig 1214
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 1214 (Rm_1214N). O contig é
composto de 1 seqüência que contém um gene de aproximadamente 1027-pb
codificando uma proteína de 25.3-kDa, com uma seqüência sinal de 20-aa (VHG-
FQ), um pI de 8.9 e uma carga de 18.4 em pH 7. Esse clone está presente na
biblioteca de ninfa. Dos 224-aa, 30 foram caracterizados com caráter fortemente
básico, 12 com caráter fortemente ácido, 59 com caráter hidrofóbico e 78 com
caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com a proteína putativa
secretada de R. (Boophilus) microplus com 35% de identidade e valor de E de 7e-
26, com a proteína hipotética CBG05636 de Caenorhabditis briggsae 30% de
identidade e valor de E de 1e-18 e com a lacunina de Manduca sexta
80
com 29% de
identidade e valor de E de 1e-18, entre outros.
O contig ainda apresentou um dois domínios Kunitz como apresentado na
Figura 33, com valores de E de 0,001 e 0,007.
0,001 0,007
FIGURA 33 - Representação esquemática da presença de domínios Kunitz na
seqüência protéica de Rm_1214N.
Resultados
93
4.6.23 - Contig 1418
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 1418 (Rm_1418N). O contig é
composto por 1 seqüência que contém um gene de aproximadamente 856-pb
codificando uma proteína de 22.5-kDa, com uma seqüência sinal de 20-aa (AVG-
RR), um pI de 8.4 e uma carga de 8.7 em pH 7. Esse clone está presente na
biblioteca de ninfa. Dos 194-aa, 24 foram caracterizados com caráter fortemente
básico, 15 com caráter fortemente ácido, 39 com caráter hidrofóbico e 84 com
caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com proteínas de outro
carrapato como com o inibidor de trombina de Amblyomma hebraeum
66
com 48% de
identidade e valor de E de 2e-31. Outras homologias foram com a proteína
GA17283-PA de Drosophila pseudoobscura
96
com 35% de identidade e valor de E
de 3e-28, com o precursor do inibidor de protease do tipo Kunitz de Ancylostoma
caninum com 34% de identidade e valor de E de 5e-28, com a proteína
trombospondina de Haemonchus contortus
111
com 34% de identidade e valor de E
de 9e-28 e com proteína CG33103-PB predita que por predição é similar a isoforma
B1 da papilina de Apis mellifera com 35% de identidade e valor de E de 3e-27, entre
outros.
O contig ainda apresentou dois domínios Kunitz como apresentado na Figura
34, onde o primeiro domínio apresentou um valor de E de 4e-12 e o segundo 1e-11.
4e-12 1e-11
FIGURA 34 - Representação esquemática da presença de domínios Kunitz na
seqüência protéica de RM_1418N.
Resultados
94
Todos os contigs descritos a seguir são todos representantes de proteína
ricas em glicina.
4.6.24 - Contig 12
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 12 (Rm_12N). O contig é formado
de 45 seqüências e contém uma ORF de aproximadamente 1491-pb codificando
uma proteína de 42-kDa, com uma seqüência sinal de 20-aa (VFA-NW), um pI de
9.7 e uma carga de 12 em pH 7. Dentre esses clones, um está presente na
biblioteca de fêmea, vinte na de macho e vinte e quatro na de ninfa. Dos 412-aa,
foram caracterizados 21 com caráter fortemente básico, 9 com caráter fortemente
ácido, 89 com caráter hidrofóbico e 155 com caráter polar. A execução do Blast X
revelou homologia com a proteína loricrina de Mus musculus
140
com 32% de
identidade e valor de E de 1e-22, entre outros. Dentre os carrapatos a maior
homologia foi com proteína putativa de cimento RIM36 de R. appendiculatus
12
com
34% de identidade e valor de E de 8e-16.
4.6.25 - Contig 13
R. (Boophilus) microplus proteína de macho 13 (Rm_13M). O contig é
formado por 60 seqüências e contém uma ORF de aproximadamente 1527-pb
codificando uma proteína de 44.2-kDa, com uma seqüência sinal de 20-aa (VFA-
SW), um pI de 9.8 e uma carga de 14 em pH 7. Dentre os clones 1 está presente na
biblioteca de fêmea, 35 na de macho e 24 na de ninfa. Dos 438-aa foram
caracterizados 22 com caráter fortemente básico, 8 com caráter fortemente ácido, 98
com caráter hidrofóbico e 159 com caráter polar. A execução do Blast X revelou
homologia com a proteína loricrina de Mus musculus
77
com 34% de identidade e
valor de E de 2e-28, entre outros. Dentre os carrapatos a maior homologia foi uma
proteína R. haemaphysaloides haemaphysaloides
141
com 30% de identidade e valor
de E de 1e-17.
Resultados
95
4.6.26 - Contig 41
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 41 (Rm_41N). O contig possui 31
seqüências e contém uma ORF de aproximadamente 1172-pb codificando uma
proteína de 28.9-kDa, com uma seqüência sinal de 20-aa (GQA-YW), um pI de 9.5 e
uma carga de 6.9 em pH 7. Dentre os clones, 2 estão presentes na biblioteca de
fêmea, 10 na de macho e 19 na de ninfa. Dos 304-aa, 8 foram caracterizados com
caráter fortemente básico, 1 com caráter fortemente ácido, 84 com caráter
hidrofóbico e 77 com caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com
uma proteína de R. haemaphysaloides haemaphysaloides
141
com 41% de identidade
e valor de E de 2e-48. Podemos ainda destacar homologai com a proteína
shematrina-4 de Pinctada fucata
139
com 43% de identidade e valor de E de 7e-41,
entre outros.
4.6.27 - Contig 103
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 103 (Rm_103N). O contig é
formado por 11 seqüências e contém uma ORF de aproximadamente 697-pb
codificando uma proteína de 18.7-kDa, com uma seqüência sinal de 19-aa (GSA-
YL), um pI de 8.5 e uma carga de 2 em pH 7. Dentre os clones 5 estão presentes na
biblioteca de macho e 6 na de ninfa. Dos 179-aa, 9 foram caracterizados com
caráter fortemente básico, 8 com caráter fortemente ácido, 60 com caráter
hidrofóbico e 32 com caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com a
proteína da saliva de 20/24 kDa imunodominante de R. appendiculatus com 63% de
identidade e valor de E de 1e-57, com a proteína putativa de cimento RIM36 de R.
appendiculatus
12
com 40% de identidade e valor de E de 2e-17, entre outros.
4.6.28 - Contig 124
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 124 (Rm_124N). O contig é
formado por 7 seqüências e contém um gene de 739-pb codificando uma proteína
de 19.4-kDa, com uma seqüência sinal de 19-aa (TFA-GI), um pI de 5 e uma carga
de -4.6 em pH 7. Dentre os clones, 3 estão presentes na biblioteca de macho e 4 na
de ninfa. Dos 186-aa, 6 foram caracterizados com caráter fortemente básico, 11 com
caráter fortemente ácido, 64 com caráter hidrofóbico e 45 com caráter polar. A
execução do Blast X revelou homologia com a proteína putativa de cimento RIM36
Resultados
96
de R. appendiculatus
12
com 56% de identidade e valor de E de 5e-42 e com proteína
de saliva imunodominante de 36/38 kDa de R. appendiculatus com 48% de
identidade e valor de E de 2e-10, entre outros.
4.6.29 - Contig 21
R. (Boophilus) microplus proteína de macho 21 (Rm_21M). O contig é
formado por 26 seqüências e contém uma ORF de aproximadamente 852-pb
codificando uma proteína de 18.9-kDa, com uma seqüência sinal de 18-aa (AHG-
SK), um pI de 10.1 e uma carga de 7 em pH 7. Dentre os 26 clones, 2 estão
presentes na biblioteca de fêmea, 14 na de macho e 10 na de ninfa. Dos 205-aa
foram caracterizados 9 com caráter fortemente básico, 2 com caráter fortemente
ácido, 76 com caráter hidrofóbico e 43 com caráter polar. A execução do Blast X
revelou homologia com a proteína flageliforme da seda de Nephila
madagascariensis
50
com 39% de identidade e valor de E de 7e-19 e a proteína
flageliforme da seda de Nephila clavipes
49
com 37% de identidade e valor de E de
1e-17. Dentre os carrapatos, a maior homologia foi com um antígeno do tipo cimento
de Haemaphysalis longicornis
48
com 35% de identidade e valor de E de 9e-12.
4.6.30 - Contig 22
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 22 (Rm_22N). O contig é formado
por 21 seqüências e contém uma ORF de aproximadamente 851-pb codificando
uma proteína de 19-kDa, com uma seqüência sinal de 18-aa (AHA-VS), um pI de
10.1 e uma carga de 7 em pH 7. Dentre os 21 clones, 12 estão presentes na
biblioteca de macho e 9 na de ninfa. Dos 205-aa foram caracterizados 9 com caráter
fortemente básico, 2 com caráter fortemente ácido, 75 com caráter hidrofóbico e 44
com caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com a proteína
flageliforme da seda de Nephila madagascariensis
50
com 40% de identidade e valor
de E de 9e-17, entre outros. Dentre os carrapatos, a maior homologia foi com um
antígeno do tipo cimento de Haemaphysalis longicornis
48
com 35% de identidade e
valor de E de 6e-10.
Resultados
97
4.6.31 - Contig 51
R. (Boophilus) microplus proteína de fêmea 51 (Rm_51F). O contig possui 12
seqüências e contém uma ORF de aproximadamente 898-pb codificando uma
proteína de 20-kDa, com uma seqüência sinal de 18-aa (AYA-TS), um pI de 10.1 e
uma carga de 7.1 em pH 7. Dentre os 12 clones, 1 está presente na biblioteca de
fêmea e 11 na de ninfa. Dos 217-aa foram caracterizados 9 com caráter fortemente
básico, 2 com caráter fortemente ácido, 77 com caráter hidrofóbico e 50 com caráter
polar. A execução do Blast X revelou homologia com a proteína 1 flageliforme da
seda de Araneus ventricosus, com 34% de identidade e valor de E de 6e-19, com a
proteína flageliforme da seda de Nephila clavipes
49
com 39% de identidade e valor
de E de 6e-19 e com a proteína flageliforme da seda de Nephila madagascariensis
50
com 36% de identidade e valor de E de 2e-18,
4.6.32 - Contig 53
R. (Boophilus) microplus proteína de macho 53 (Rm_53M). O contig é
formado de 24 seqüências e contém uma ORF de aproximadamente 886-pb
codificando uma proteína de 20.1-kDa, com uma seqüência sinal de 18-aa (AYA-
TS), um pI de 10 e uma carga de 6.1 em pH 7. Dentre os 24 clones, 2 estão
presentes na biblioteca de fêmea, 10 de macho e 12 na de ninfa. Dos 217-aa, 9
foram caracterizados com caráter fortemente básico, 3 com caráter fortemente
ácido, 77 com caráter hidrofóbico e 49 com caráter polar. A execução do Blast X
revelou homologia com a proteína-1 flageliforme da seda de Araneus ventricosus,
com 34% de identidade e valor de E de 8e-19, com a proteína flageliforme da seda
de Nephila clavipes
49
com 38% de identidade e valor de E de 4e-18 e com a
proteína flageliforme da seda de Nephila madagascariensis
50
com 38% de
identidade e valor de E de 9e-18, entre outros. Dentre os carrapatos, a maior
homologia foi com antígeno do tipo cimento de Haemaphysalis longicornis
48
com
37% de identidade e valor de E de 5e-14.
4.6.33 - Contig 70
R. (Boophilus) microplus proteína de macho 70 (Rm_70M). O contig é
formado de 16 seqüências e contém uma ORF de aproximadamente 871-pb
codificando uma proteína de 19.1-kDa, com uma seqüência sinal de 18-aa (AYA-
Resultados
98
GT), um pI de 10 e uma carga de 6.9 em pH 7. Dentre os 16 clones, 1 está presente
na biblioteca de fêmea, 10 na de macho e 5 na de ninfa. Dos 210-aa, 9 foram
caracterizados com caráter fortemente básico, 2 com caráter fortemente ácido, 78
com caráter hidrofóbico e 39 com caráter polar. A execução do Blast X revelou
homologia com a proteína flageliforme da seda de Nephila clavipes
49
com 41% de
identidade e valor de E de 3e-22, com a proteína flageliforme da seda de Nephila
clavipes
50
com 41% de identidade e valor de E de 4e-22, com a proteína
flageliforme da seda de Nephila madagascariensis
50
com 40% de identidade e valor
de E de 8e-22, entre outros. Dentre os carrapatos, a maior homologia foi com o
antígeno do tipo cimento de Haemaphysalis longicornis
48
com 40% de identidade e
valor de E de 1e-13.
4.6.34 - Contig 76
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 76 (Rm_76N). O contig é formado
por 18 seqüências e contém uma ORF de aproximadamente 869-pb codificando
uma proteína de 8.9-kDa, com uma seqüência sinal de 18-aa (AHG-SK), um pI de
11 e uma carga de 3 em pH 7. Dentre os 18 clones, 2 estão presentes na biblioteca
de fêmea, 5 na de macho e 11 na de ninfa. Dos 101-aa, 4 foram caracterizados com
caráter fortemente básico, 1 com caráter fortemente ácido, 39 com caráter
hidrofóbico e 19 com caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com a
proteína flageliforme da seda de Nephila clavipes
50
com 43% de identidade e valor
de E de 3e-19 e com a proteína flageliforme da seda de Nephila clavipes
49
com 38%
de identidade e valor de E de 1e-17, entre outros. Dentre os carrapato, a maior
homologia foi com antígeno do tipo cimento de Haemaphysalis longicornis
48
com
35% de identidade e valor de E de 2e-11.
4.6.35 - Contig 73
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 73 (Rm_73N). O contig é formado
23 seqüências e contém uma ORF de aproximadamente 804-pb codificando uma
proteína de 18.4-kDa, com uma seqüência sinal de 18-aa (SHG-AP), um pI de 9.7 e
uma carga de 5 em pH 7. Dentre os 23 clones, 1 está presente na biblioteca de
fêmea, 10 na de macho e 12 na de ninfa. Dos 197-aa, 8 foram caracterizados com
caráter fortemente básico, 3 com caráter fortemente ácido, 55 com caráter
Resultados
99
hidrofóbico e 56 com caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com a
proteína flageliforme da seda de Nephila madagascariensis
50
com 37% de
identidade e valor de E de 2e-23 e com a proteína flageliforme da seda de Nephila
clavipes
49
40% de identidade e valor de E de 2e-21, entre outros. Dentre os
carrapatos, a maior homologia foi com antígeno do tipo cimento de Haemaphysalis
longicornis
48
com 38% de identidade e valor de E de 9e-13.
4.6.36 - Contig 109
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 109 (Rm_109N). O contig é
formado por 8 seqüências e contém uma ORF de aproximadamente 852-pb
codificando uma proteína de 18.8-kDa, com uma seqüência sinal de 18-aa (SLG-
AP), um pI de 9.8 e uma carga de 6.1 em pH 7. Dentre os 8 clones, 2 estão
presentes na biblioteca de fêmea, 2 de macho e 4 na de ninfa. Dos 200-aa, 10 foram
caracterizados com caráter fortemente básico, 4 com caráter fortemente ácido, 53
com caráter hidrofóbico e 59 com caráter polar. A execução do Blast X revelou
homologia com a proteína espidroína major ampullate de Agelenopsis aperta
115
com
37% de identidade e valor de E de 1e-16, entre outros. Dentre os carrapatos a maior
homologia foi com o antígeno de cimento de Haemaphysalis longicornis
48
com 34%
de identidade e valor de E de 4e-15.
4.6.37 - Contig 98
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 98 (Rm_98N). O contig é formado
por 10 seqüências e contém uma ORF de aproximadamente 851-pb codificando
uma proteína de 19-kDa, com uma seqüência sinal de 18-aa (AYG-AA), um pI de 9.6
e uma carga de 5 em pH 7. Dentre os 10 clones, 3 estão presentes na biblioteca de
fêmea, 4 de macho e 3 na de ninfa. Dos 200-aa, 9 foram caracterizados com caráter
fortemente básico, 4 com caráter fortemente ácido, 53 com caráter hidrofóbico e 61
com caráter polar. A execução do Blast X revelou homologia com a proteína
GH24939p de Drosophila melanogaster com 40% de identidade e valor de E de 5e-
20 e com a proteína flageliforme da seda de Argiope trifasciata
43
com 38%% de
identidade e valor de E de 2e-18. Dentre os carrapatos, a maior homologia foi com
antígeno do tipo cimento de Haemaphysalis longicornis
48
com 40% de identidade e
valor de E de 1e-17, entre outros.
Resultados
100
4.6.38 - Contig 110
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 110 (Rm_110N). O contig é
formado por 7 seqüências e contém uma ORF de aproximadamente 797-pb
codificando uma proteína de 18.1-kDa, com uma seqüência sinal de 18-aa (VYA-
AP), um pI de 9.5 e uma carga de 3.9 em pH 7. Dentre os 7 clones, 1 está presente
na biblioteca de fêmea, 3 na de macho e 3 na de ninfa. Dos 189-aa, 8 foram
caracterizados com caráter fortemente básico, 4 com caráter fortemente ácido, 52
com caráter hidrofóbico e 56 com caráter polar. A execução do Blast X revelou
homologia com antígeno do tipo cimento de Haemaphysalis longicornis
48
com 39%
de identidade e valor de E de 9e-19, com antígeno do tipo cimento de
Haemaphysalis longicornis
48
com 40% de identidade e valor de E de 3e-15 e com a
proteína flageliforme da seda de Argiope trifasciata
43
com 40% de identidade e valor
de E de 1e-14, entre outros.
4.6.39 - Contig 93
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 93 (Rm_93N). O contig é formado
por 9 seqüências e contém uma ORF de aproximadamente 887-pb codificando uma
proteína de 15.7-kDa, com uma seqüência sinal de 18-aa (TSA-TR), um pI de 9 e
uma carga de 4.4 em pH 7. Dentre os 9 clones, 1 está presente na biblioteca de
macho e 8 na de ninfa. Dos 160-aa, 8 foram caracterizados com caráter fortemente
básico, 4 com caráter fortemente ácido, 22 com caráter hidrofóbico e 55 com caráter
polar. A execução do Blast X revelou homologia com a proteína 64P associada à
glândula salivar de R. appendiculatus
117
com 64% de identidade e valor de E de 3e-
45, com a proteína da casca do ovo rica em glicina e tirosina de Opisthorchis
viverrini
98
com 52% de identidade e valor de E de 4e-28, com a proteína shematrina-
4 de Pinctada fucata
139
com 51% de identidade e valor de E de 1e-26 e com
proteína putativa salivar que contém repetições GYG de I. scapularis com 58% de
identidade e valor de E de 1e-19, entre outros.
4.6.40 - Contig 106
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 106 (Rm_106N). O contig é
formado por 8 seqüências e contém uma ORF de aproximadamente 863-pb
codificando uma proteína de 19.5-kDa, com uma seqüência sinal de 16-aa (ALA-
Resultados
101
SE), um pI de 9.4 e uma carga de 5.4 em pH 7. Dentre os 8 clones, 4 estão
presentes na biblioteca de macho e 4 na de ninfa. Dos 205-aa, 8 foram
caracterizados com caráter fortemente básico, 3 com caráter fortemente ácido, 49
com caráter hidrofóbico e 63 com caráter polar. A execução do Blast X revelou
homologia com a proteína 64P associada à glândula salivar de R. appendiculatus
117
com 49% de identidade e valor de E de 1e-29, com a proteína shematrina-4 de
Pinctada fucata
139
com 42% de identidade e valor de E de 6e-29 e com a proteína
da casca do ovo rica em glicina e tirosina de Opisthorchis viverrini
98
com 52% de
identidade e valor de E de 3e-27, entre outros.
4.6.41 - Contig 79
R. (Boophilus) microplus proteína de ninfa 79 (Rm_79N). O contig é formado
por 18 seqüências e contém uma ORF de aproximadamente 413-pb codificando
uma proteína de 9.2-kDa, com uma seqüência sinal de 19-aa (AMA-SS), um pI de
9.2 e uma carga de 2.4 em pH 7. Dentre esses clones, 15 estão na biblioteca de
macho e 3 na de ninfa. Dos 86-aa, 3 foram caracterizados com caráter fortemente
básico, 1 com caráter fortemente ácido, 15 com caráter hidrofóbico e 35 com caráter
polar. A execução do Blast X revelou homologia com a proteína cuticular de
Tachypleus tridentatus
57
com 63% de identidade e valor de E de 4e-9 e com a
queratina 10 de Rattus norvegicus
52
com 40% de identidade e valor de E de 3e-06,
entre outros. Dentre os carrapatos, a maior homologia foi com proteína putativa do
cimento de I. scapularis
45
com 42% de identidade e valor de E de 2e-04 e com a
proteína 64P associada à glândula salivar de R. appendiculatus
117
com 41% de
identidade e valor de E de 4e-04.
5 Discussão
Discussão
103
5 - DISCUSSÃO
Esta tese teve por objetivo obter um grande painel de antígenos de
carrapatos por meio de análises dos genes expressos por um tecido fundamental na
interface hospedeiro-parasito, a glândula salivar do carrapato. Para tal, tecidos de
três formas de desenvolvimento foram estudados, as glândulas de ninfas, de
machos e de fêmeas obtidas durante o processo de hematofagia. A fim de manter a
expressão relativa dos genes desses tecidos e ao mesmo tempo evitar gastos com
sequenciamento de genes de expressão muito abundante, bibliotecas de cDNA
semi-normalizadas, unidirecionais e com o gene completo foram construídas. Os
genes expressos por esses tecidos foram seqüenciados parcialmente (ESTs) e as
ESTs obtidas analisadas por meio de programa de bioinformática que permitiu
identificar os genes cujos produtos são secretados com maior ou menor abundância,
além da função biológica putativa. Segundo os critérios de seleção empregados pelo
projeto, 45 destes genes foram clonados em vetor que permite clonagem TA. Além
disso, outras características importantes do vetor permitem que o cDNA clonado
seja expresso em altas concentrações e seja secretado, mimetizando a maneira com
que as proteínas são expressas e secretadas pelas glândulas salivares do carrapato
e, também, permitindo que a via exógena de processamento e apresentação de
antígenos vacinais pelas células fagocíticas do hospedeiro seja tomada. Essa via
leva à apresentação de antígenos em moléculas MHC de Classe II e vai permitir a
sensibilização e expansão dos linfócitos CD4
+
que induzam os mecanismos efetores
adequados para controlar a infestação. Assim, obtivemos um grande repertório de
genes, cujos produtos são potencialmente úteis para serem empregados como
antígenos em vacinas.
O perfil geral dos contigs formados após combinação das três bibliotecas
(Figuras 6, 10, 14 e 18) apresenta uma baixa redundância entre as seqüências visto
que dos 1644 contigs, 1328 são formados de seqüências únicas. É importante
lembrar que o número de seqüências total que formam os 1644 contigs é de 3487,
logo, 38% são seqüências únicas. Em outras palavras, as bibliotecas possuem um
amplo perfil de diferentes seqüências, o que automaticamente resulta e um grande
painel de antígenos.
Discussão
104
Dentre os contigs formados, os que possuem resíduos com características de
peptídeos sinal (200 contigs), foram objeto de estudo detalhado, já que são estes os
antígenos que estariam sendo secretados pelo carrapato e controlando as respostas
imunes e hemostáticas do hospedeiro, logo, possíveis candidatos a antígenos
vacinais. Isso vem de encontro com os resultados de busca no GO, onde as
seqüências secretadas dos 200 contigs mostraram função molecular putativa de
ligação (31 contigs), molécula estrutural (30 contigs) e catalítica (14), entre outras.
Esse resultado está de acordo com as principais funções desempenhadas pelas
proteínas secretadas das glândulas salivares dos carrapatos. A atividade de ligação
às proteínas, ácidos nucléicos, carboidratos e íons, e a de molécula estrutural como
a de constituinte do exoesqueleto e epiderme, que incluem principalmente as
proteínas chamadas de “cimento”. Em relação à atividade catalítica, como de
transferase, estão algumas proteínas ainda não caracterizadas.
Entre os resultados demonstrados por meio das análises das bibliotecas em
conjunto (RMall) foi interessante observar que o perfil de expressão gênica é
bastante diferente entre esses três tecidos. Dentre os 1644 contigs, 34% são
exclusivos de ninfas, 32% de fêmea e 25% de macho (Figura 20), que é um
resultado interessante do ponto de vista de perfil de expressão nas diferentes fases
de vida do carrapato, como também nas diferenças entre macho e fêmea. Essa
grande diversidade de genes expressos pode ser uma explicação de como o
carrapato consegue modular tão bem a resposta do hospedeiro, tornando ainda
mais intrigante e desafiadora, o desenvolvimento de uma vacina para o controle ou
diminuição da infestação pelo R. (boophilus) microplus. Assim, buscar do que há de
comum entre macho, fêmea e ninfa, pode ser um bom começo.
O número de genes expressos em comum entre machos e ninfas (64 contigs)
é bem maior do que o apresentado entre macho e fêmeas (27 contigs) e entre ninfas
e fêmeas (27 contigs) como apresentado na Figura 21. Esse estudo pôde
demonstrar que o perfil de fêmeas contém aqueles genes mais relacionados com as
funções anti-hemostáticas, o dos machos, com as funções de escape da resposta
imune e o de ninfas, uma fase de transição para adultos, contém aqueles que
manipulariam tanto as respostas imune quanto hemostática do hospedeiro,
tendendo, porém, mais para o perfil do macho do que da fêmea. Algumas hipóteses
podem ser levantadas. Entre elas, temos que a maioria das ninfas utilizadas neste
Discussão
105
trabalho e coletadas randomicamente estariam comprometidas a serem adultos
machos. Outra possibilidade seria a de que, como a fêmea adulta está preparando-
se para o acasalamento e a postura de ovos, como descrito em trabalhos anteriores,
essa teria um auxílio do macho durante o repasto sanguíneo e dedicar-se-ia mais a
adquirir sangue. Assim o perfil de expressão gênica do macho seria mais voltado a
burlar a resposta do hospedeiro e o da fêmea seria o de aumentar a capacidade de
sugar o sangue e expressar genes que auxiliariam no acasalamento e manutenção
dos ovos até sua queda do hospedeiro. As ninfas estariam num estado pré-
acasalamento, e como já dito, podendo ser muitas delas machos, teriam um perfil de
expressão gênica mais de macho para poder burlar a resposta do hospedeiro sem
auxílio adicional. Como em relação à fêmea sugam pouco sangue, seu perfil anti-
hemostático é semelhante ao do macho.
Sendo assim, analisando mais especificamente os contigs, foi dado enfoque
aos 200 contigs preditos secretados, dentre os quais 65%, 47% e 27% são
exclusivos de ninfa, fêmea e macho, respectivamente (Figura 25). Existem alguns
contigs que são comuns apenas entre duas bibliotecas e existem aqueles que são
comuns às três: 4 contigs para fêmea e macho, 8 contigs para fêmea e ninfa, 31
contigs para macho e ninfa e 31 contigs presentes nas três bibliotecas(Figura 26).
Um outro dado interessante que vale a pena ressaltar é a taxa de novidade
dos resultados apresentados em comparação com as ESTs da TIGER. Os
resultados desse trabalho apresentam cerca de 50% de novidade em relação ao que
já está disponível nesse banco de dados. Pode ser maior se levarmos em
consideração que os resultados da presente tese são baseados em bibliotecas
construídas de glândulas salivares, isto é, são órgão específicos, enquanto os dados
apresentados pela TIGER são de um pool de tecidos de carrapatos em diversas
situações biológicas, mas que não incluem algumas daquelas de nosso projeto.
Dessa forma, as escolhas dos genes para serem re-clonados em vetor para
triagem e serem testados como vacina vêem de encontro com a necessidade de
burlar os sistemas homeostáticos do hospedeiro, principalmente o sistema
hemostático e imune, já que automaticamente todos os outros sistemas
dependentes ou ligados a esse serão atingidos em cascata.
O controle do sistema hemostático do hospedeiro é essencial para o sucesso
da alimentação do carrapato. Dessa forma, inibidores eficientes são parte crucial de
Discussão
106
sua estratégia de alimentação. Os carrapatos possuem muitos inibidores de
coagulação sanguínea e de agregação plaquetária. Inibidores de hemostasia têm
sido extensivamente estudados, especialmente os de carrapatos moles. Já foram
descritos inibidores de enzimas de coagulação central do sangue, Fator Xa e
trombina e inibidores de agregação plaquetária
42,58,71,74,83,124,130
. Nesse trabalho
identificamos um homólogo de inibidor de trombina de Amblyomma hebraeum, o
Rm_1418N, de ninfas do carrapato R. Boophilus microplus. O contig Rm_1418N
madura possui dois segmentos homólogos à BPTI da família Kunitz de inibidores de
serina proteases
24,100
. Cada segmento contém um domínio Kunitz que é comum em
outros inibidores de coagulação produzidos por carrapatos. Estes dois domínios são
muito similares entre si e entre outras proteínas. Por homologia interna da seqüência
temos um indicativo de que Rm_1418N é uma proteína com dois domínios.
Até 2004 todos os anticoagulantes de carrapatos conhecidos eram originados
de saliva até que foi descrito um inibidor de trombina (Amblin) isolado e
caracterizado a partir da hemolinfa de fêmeas do carrapato Amblyomma hebraeum
66
e com o qual nosso contig revelou homologia com nível de significância de 2e-31 e
48% de identidade. Na seqüência protéica do contig 1418 podemos observar as 2
regiões Kunitz-like que aparecem entre as regiões de ligação que está sublinhada.
Podemos ainda observar as 18 cisteínas presentes nos dois domínios. As cisteínas
são característicos dos inibidores de trombina já descritos, como Boophilin do
carrapato R. boophilus microplus (12 cisteínas)
55
e Amblina (14 cisteínas) de
Amblyomma hebraeum
66
, além de Ixolaris (10 cisteínas) que é um inibidor de
coagulação da via do fator tecidual oriundo do Ixodes scapularis
38
. Também são
característicos do inibidor tripsina pancreática bovina
24,100
. O motivo pelo qual existe
essa diferença entre o número de resíduos de cisteínas entre os inibidores de
trombina descritos e, principalmente, entre Rm_1418N e Boophilin, na está descrito,
mas pode ser devido as diferentes seqüências de aminoácidos, visto que o melhor
match entre Rm_1418N foi com a proteína da hemolinfa de A. hebraeum e não com
a proteína de R. (Boophilus) microplus. Pode-se sugerir que Rm_1418N seria um
inibidor de trombina ainda não descrito e depositado nos bancos de dados, sendo
assim uma forma alternativa de inibidor de trombina usado para poder burlar o
sistema imune do hospedeiro.
Discussão
107
A estrutura de BPTI formando complexo com tripsina já foi determinada e
demonstrou que as características estruturais da mesma são importantes para o
reconhecimento e inibição da protease
24,100
. Na BPTI há duas alças que são muito
importantes para o reconhecimento do sítio ativo da protease: a primeira alça é
formada de pelos resíduos TGPKARII e a segunda por VYGGCR
24,100,138
. A
identidade é bastante alta entre Rm_1418N, Amblin e BPTI, mas sabe-se que BPTI
inibe trispina, que Amblin inibe trombina. O produto da RM_1418N ainda não foi
testado. Isso implica ressaltar que diferenças sutis na seqüência de aminoácidos
das alças de reconhecimento podem contribuir para as diferentes especificidades e,
portanto, funções. Já que a trombina mostra pouca afinidade pela maioria dos
inibidores com domínios Kunitz parecidos com BPTI
138
, uma questão pode ser
levantada: como a Amblina, entre outros inibidores de trombina, estaria fazendo
interação com a trombina? Dessa forma há muito trabalho ainda para ser feito para
que possamos descrever a função e mecanismo de interação de Rm_1418N,
proteína com domínio Kunitz similar a BPTI.
Assim como Rm_1418N, o RM_1214N apresentou dois domínios Kunitz. O
alinhamento entre essas seqüências evidenciou que o padrão de resíduos de
cisteína está mantido, sendo responsável pela formação das pontes de dissulfeto e,
por fim, da estrutura característica do domínio: enovelamentos alfa e beta.
Rm_1214N apresentou um total de 22 resíduos de cisteínas, 4 resíduos a mais do
que Rm_1418N. Sendo assim, por predição comparativa o Rm_1214N poderia ser
incluído na família de proteínas que possuem domínio Kunitz. No entanto, para
determinar a função de tal proteína, que pode ter atividade de inibidor de serina
protease característico das proteínas contendo tal domínio, muitos estudos ainda
são necessários, tendo em vista o grande número de possibilidades funcionais das
proteínas que fazem parte desta família. Ainda sobre Rm_1214N tem-se que apesar
do nível de 35% de identidade com uma proteína secretada putativa de R. Boophilus
microplus, chamada de penthaplus e descrita como um novo transcrito de glândula
salivar que codifica cinco domínios Kunitz, a Rm_1214N só apresenta dois domínios
Kunitz. Além disso, apresentou homologia com a proteína lacunin da traça/mariposa
Manduca sexta na região de domínio Kunitz
80
. Esta proteína foi caracterizada como
sendo uma proteína grande de matriz extracelular (mais de 3000 aminoácidos)
contendo domínios múltiplos e apresentando 10 domínios Kunitz distribuídos entre
Discussão
108
estes diferentes domínios. Rm_1214 alinhou-se com lacunin na região de presença
de um dos domínios Kunitz da mesma, o que se apresenta entre os resíduos 2000 a
2600. O mesmo aconteceu com a proteína papilin de Drosophila
65
que também é um
a proteína que possui vários domínios em sua seqüência, incluindo domínios Kunitz
(dados não mostrados).
Rm_315M revelou presença de domínio Kunitz e 35% de identidade com
ENSANGP00000022061 de Anopheles gambiae str. PEST. Essa seqüência de
anófeles ainda está sujeita às revisões, mas, ao que tudo indica, possui vários multi-
domínios e entre eles 10 domínios Kunitz. Rm_315M se alinhou com o penúltimo
dos domínios Kunitz descritos acima. Dentre os carrapatos, a homologia mais
próxima (valor de E de 4e-08) ocorreu com a proteína salivar secretada putativa de I.
scapularis, que também apresenta domínio Kunitz. Este alinhamento apresentou
26% de identidade.
Rm_1411N e Rm_1402N são proteínas ricas em tirosina e o alinhamento
entre as duas demonstrou (Figura 31) que apesar de estarem em contigs diferentes
elas são muito similares quanto à seqüência de aminoácidos. Tanto Rm_1411N
quanto Rm_1402N revelaram similaridade com peptídeo putativo salivar secretado
de I. pacificus com 55% de identidade e valor de E de 1e-8 e com proteína putativa
salivar secretada rica em tirosina de I. scapularis com 55% de identidade e valor de
E de 2e-8, entre outros. O que diferencia as duas é basicamente uma inserção de 2
grupos de aminoácidos em Rm_1411N, um de 6 e um de 3.
Vale a pena lembrar que a histamina é um mediador inflamatório produzido
por mastócitos e basófilos, desempenhando um papel importante na imunidade inata
e adquirida da pele
32
. A histamina é potencialmente lesiva a ectoparasitas
16,63,133
.
Dessa forma, alguns parasitas que sugam sangue secretam anti-histamínicos no
local da alimentação, suprimindo a inflamação e facilitando a alimentação
131
. O
carrapato R. appendiculatus que se alimenta principalmente em gado, produz pelo
menos três diferentes proteínas ligantes de histamina (HBPs).
Por outro lado, a serotonina é um neurotransmissor importante no sistema
nervoso central e está implicado na patofisiologia de várias desordens
neurológicas
101
. A serotonina também funciona como um importante mediador na
inflamação, com função similar à da histamina
6
. Sua atividade é especialmente
importante em roedores, onde é produzi da e secretada pelos mastócitos teciduais.
Discussão
109
Em outras espécies é primariamente secretada pelas plaquetas e dessa forma está
relacionada com a sensibilidade por contato e modulação da agregação
plaquetária
7
.
A proteína ligante de serotonina e histamina (SHBP) de D. reticulatus, um
novo membro da família Histamine-binding protein (HBP), foi a primeira lipocalina
descrita como contendo dois sítios de ligação de alta afinidade. Dessa forma, o nível
de 36% de identidade existente entre Rm_1275N e SHBP, de 31% demonstrado
com HBP de R. appendiculatus e o fato da maioria destas identidades se apresentar
nas regiões de
β
fita e
α
hélice, nos permite predizer que Rm_1275N seria mais um
novo membro da família HBP, mas com atividade de ligação também a serotonina.
Carrapatos que se alimentam em bovinos, como R. appendiculatus, secretam
lipocalinas ligantes de histamina, mas não de serotonina, enquanto que, carrapatos
que se alimentam em roedores, como D. reticulatus, produzem uma proteína
homóloga ligante à ambas as aminas biogênicas, representando um exemplo da
adaptação do parasita contra as estratégias de defesa de seus hospedeiros.
Roedores não são bons hospedeiros para nenhum dos estágios de R.
appendiculatus, o que difere de D. reticulatus. Porém apesar de relatos de que a
fixação do carrapato R. (Boophilus) microplus no hospedeiro seria afetado pela
atividade da histamina, mas não pela serotonina
62
, tanto a histamina quanto a
serotonina afetam a alimentação de D. andersoni in vitro
89
. Com efeito, por meio das
homologias apresentadas pelo Rm_1275N com proteína ligante de histamina e,
também, de serotonina, além do relato da clonagem molecular e expressão
funcional de um receptor de serotonina do R. (Boophilus) microplus
23
, temos nesse
trabalho evidência da importância da serotonina com mediador na hemostasia de
bovinos. Sendo assim, podemos estar descrevendo pela primeira vez uma proteína
com atividade dupla de ligação à serotonina e à histamina no carrapato de gado R.
(Boophilus) microplus.
Rm_126F revelou homologia com algumas proteínas como a proteína
putativa ligante de histamina e serotonina de Rhipicephalus haemaphysaloides
haemaphysaloides (não caracterizada) com valor de E de 3e-74 e 63% de
identidade. Também mostrou homologia com proteínas de Ixodes scapularis como
proteína secretada putativa ligante de histamina e peptídeo secretado putativo de
glândula salivar.
Discussão
110
Rm_1250N demonstrou homologia de seqüência protéica com proteínas
ligantes de histamina dos carrapatos I. scapularis e I. pacificus. Essas proteínas
ainda não foram caracterizadas funcionalmente, mas somente por meio da
homologia com outras HBP de R. appendiculatus
88
presentes no banco de dados
NR/NCBI e da análise da presença de motivos ligantes de histamina por meio de
busca no banco de dados Prosite
28
.
A similaridade de Rm_867N com de seqüência da proteína 3 ligante de
eritrócito de Plasmodium yoelii yaoelli
59
com 48% de identidade, de certa forma
sugere a possibilidade de que assim como a proteína do agente da malária, o
carrapato esteja produzindo uma proteína ligante de hemácias. Já Rm_211N
apresentou identidade de 45 % com a PREDICTED: hypothetical protein de Rattus
norvegicusI. Apesar das similaridades com diferentes proteínas, quando são
alinhadas (Rm_867N e Rm_211N) elas apresentam grande similaridade de
seqüência de aminoácido, só que Rm_867N possui uma inserção de 71
aminoácidos logo antes da cauda poli A (região C terminal). Seriam novamente duas
proteína com atividades semelhantes mas, com seqüências diferentes, ouse riam
duas proteínas semelhantes na seqüência mas com funções completamente
diferentes? Mais uma pergunta que só poderá ser respondida com mais
experimentos.
Variabilina, disagregina e savignigrina, inibidores de agregação plaquetária
que têm como alvo o receptor de fibrinogênio (GPIIb/IIIa, integrina
α
IIb
β
3) foram
descritos, respectivamente, no carrapato duro (hard) Dermacentor variabilis
129
e nos
carrapatos moles (soft) Ornithodoros moubata
61
e O. savigny
74
. A savignygrin
pertence à família Kunitz-BPTI e apresenta o motivo de reconhecimento RGD na
alça de ligação ao substrato do enovelamento Kunitz
74
. A variabilina, por sua vez,
possui um motivo RGD na sua porção C-terminal que não é flanqueada por
cisteínas
129
. Prováveis antagonistas de agregação oriundos de I. pacificus possuem
motivos RGD flanqueados por cisteínas e foram chamados de ixodegrinas, existindo
homólogos em I. scapularis
40
. Porém estas ixodegrinas, apesar de serem
relacionadas com variabilina, possuem cisteínas flaqueadoras. Sendo assim, apesar
de Rm_387N revelar homologia com a proteína ixodegrina que possui domínio RGD
do carrapato I. scapularis, ela não possui domínio RGD, dificultando sua inclusão
Discussão
111
como homólogo funcional de ixodegrinas, mesmo apresentando 11 resíduos de
cisteínas e 27% de identidade.
Rm_330N revelou 49% de identidade com a pré-proteína microplusina da
hemolinfa de R. (Boophilus) microplus
34
e 45% com hebreaina da hemolinfa de A.
hebraeum
67
. Essas proteínas podem ser designadas como sendo peptídeos
antimicrobianos ricos em cisteína. O alinhamento das três proteínas revelou que os
seis resíduos de cisteína são totalmente conservados nas três seqüências. Até
2003, quando se deu o depósito da seqüência da microplusina no banco de dados
NR/NCBI esta não apresentava similaridade com nenhuma proteína conhecida.
Logo a seguir, em 2004, a hebreaina foi depositada e agora Rm_330N parece fazer
parte deste grupo de proteínas. Uma característica comum entre hebreaina,
microplusina e Rm_330N é a presença de resíduos de histidina na porção C
terminal. Esses resíduos chamam a atenção devido à possibilidade de serem
importantes na mediação da atividade antimicrobiana
67
já que a hebreaina
recombinante, com e sem resíduos de histidina, foram testadas em relação à
atividade antimicrobiana, sendo que a hebreaina com histidina revelou uma
atividade antimicrobiana bem mais forte do que a hebreaina mutante. Um próximo
passo seria testar a atividade antimicrobiana de Rm_330N para descartar ou
confirmar esta hipótese. Outros autores mostraram que a expressão do gene da
microplusina também foi positiva, e de mesma intensidade, em corpo gorduroso,
hemócitos, ovários e intestino do carrapato R. Boophilus microplus
34
. Mais uma vez
percebe-se que uma proteína do presente projeto possui similaridade com uma
proteína de R. (Boophilus) microplus, no caso a microplusina e que a identidade
entre elas é de 45%, como já descrito. Dessa forma, sugere-se que existem uma
diferença entre ambas, talvez a finalidade seja que o carrapato tenha uma maior
possibilidade de burlar o sistema de defesa do hospedeiro, tendo variáveis da
mesma proteína com mesma função e seqüências diferentes.
Rm_206M apresentou homologia com uma proteína predita, mas ainda não
caracterizada, a Y69H2.3a isoform 1 oriunda do Tribolium castaneum (besouro),
apresentando 34% de identidade. Quando comparado com seqüências de
carrapatos, a Rm_206 apresentou homologia com a ixodidina de Boophilus
microplus, um inibidor de quimotripsina e elastase, com identidade de 48%
35
.
Ixodidina faz parte da família dos peptídeos antimicrobianos (AMPs) ricos em
Discussão
112
cisteína e com atividade inibitória sobre as proteases quimotripsina e elastase. O
alinhamento entre as seqüências de aminoácidos de Rm_206M, ixodidina e de
inibidor de quimotripsina e elastase (C/E1) do helminto parasitário Ascaris suum
56
,
que é uma proteína já caracterizada, revelou que há uma conservação relativa nos
resíduos cisteínas. Já foi proposto que proteínas que apresentem a mesma
localização de resíduos de cisteína, também apresentariam pontes de dissulfeto
similares
9,13,90
. Sendo assim, a comparação entre as seqüências sugere que
Rm_206M possua o mesmo padrão de pontes de dissulfeto postulado para ixodinina
e C/E1. Extrapolar a atividade funcional seria interessante, mesmo levando em
conta que as AMPs são comumente peptídeos pequenos de 10kDa e que a
RM_206M madura se apresentaria em torno de 20kDa, já que além da razoável
homologia e alta identidade com um inibidor de elastase/quimotripsina e presença
de resíduos relativamente conservados de cisteínas, que são indicativos de pontes
de dissulfeto similares, foi detectado 33% de identidade com um domínio TIL
(domínio rico em resíduos de cisteína do tipo inibidor de tripsina) quando submetida
a busca no banco de dados PFAM. Dessa forma, esta seria a descrição de uma
nova proteína com atividade antimicrobiana putativa, sendo a quinta de R. Boophilus
microplus
34-36
, mas com características de tamanho molecular diferente com um
número total de 26 resíduos de cisteína. Com tantos resíduos de cisteína, Rm_206M
poderia também apresentar uma estrutura molecular de função ainda não
caracterizada.
Rm_176M revelou alinhamento com proteína não caracterizada de
Caenorhabditis elegans, a W09G12.7, com 26% de identidade. Dentre os carrapatos
a melhor homologia foi com uma proteína hipotética de Haemaphysalis longicornis
79
com valor de E de 0.68, mas com 56% de identidade. Este alto valor de identidade
resultou de um alinhamento entre apenas 23 resíduos de aminoácidos de cada
seqüência no qual as 6 cisteínas presentes foram alinhadas de maneira perfeita.
Entre as seqüências com as quais Rm_141N revelou homologia, temos uma
proteína hipotética do carrapato Haemaphysalis longicornis
79
, havendo identidade de
38%. Esta proteína possui um único domínio Kunitz. Uma outra proteína que foi
homóloga a Rm_141N foi a proteína denominada domínios inibidores de tripsina
pancreática de Danio rerio (peixe) com identidade de 35%. Essa proteína, por sua
vez, possui 3 domínios Kunitz. O alinhamento entre Rm_141N, que possui 10
Discussão
113
resíduos de cisteína e dois domínios Kunitz, e as respectivas proteínas
mencionadas foram nas regiões deste domínio. A presença do domínio foi
confirmada pelos bancos de dados CDD, SMART, PFAM e KOG, sugerindo que
Rm_141N possui um inibidor de serina protease.
Rm_138N apresentou homologia (valor de E de 6e-06 a 6e-04) e identidade
(32% a 36%) muito similar com 5 proteínas putativas secretadas oriundas de I.
scapularis, entre elas uma proteína de 8.9kDa. Rm_138N não revelou nenhum
domínio característico em pesquisa nos bancos de dados especializados. Uma
característica apresentada em comum com uma das proteínas homólogas é seu
tamanho predito, de aproximadamente 9.9kDa (proteína madura).
A forma truncada madura de Rm_97M oi alinhada com algumas
metaloproteases. Essas enzimas são na maioria das vezes zinco-dependentes e a
maioria delas, chamadas de zincinas, possuem um seqüência consenso curta,
HExxH, com as duas histidinas agindo como ligantes do zinco catalítico e o ácido
glutâmico como base geral. Uma subclasse das zincinas é caracterizada por um
motivo alongado no C-terminal, HExxHxxGxxH/D, com uma glicina adicional
rigorosamente conservada e com uma terceira histidina ou aspartato ligante de
zinco. Uma análise detalhada de Rm_97M revela que ela possui o domínio catalítico
de ligação ao zinco similar ao da família das reprolisinas (HELGHNLGxxHD), com
exceção de duas substituições conservadas (G
→
A e L
→
T). Algumas
metaloproteases contêm o motivo de ligação do zinco HExxHxxGxxH e uma
metionina localizada distalmente (normalmente 25 resíduos distantes da primeira H
do domínio de ligação ao zinco). Devido a essa metionina conservada e ao motivo
de ligação ao zinco, essa família é também conhecida como a das metizicinas.
Rm_97M possui o domínio de ligação ao zinco das metizicinas e uma metionina a
36 resíduos de distância do domínio inicial de ligação ao zinco, 11 resíduos a mais
do que o encontrado no clã MB.
Para estudar o carrapato I. ricinus foi construída uma biblioteca de cDNA de
glândula salivar para identificar os genes diferencialmente expressos entre
carrapatos fêmeas alimentados durante 5 dias e carrapatos fêmeas não
alimentados. Dentre os genes diferencialmente expressos foi descrito um com
homologia com valor de E e percentual de identidade significante com uma
metaloprotease zinco dependente de veneno de cobra
72
. Rm_97M revelou 34% de
Discussão
114
identidade e valor de E de 6
e-18
com a seqüência descrita neste trabalho, assim
como com outras metaloproteases de artrópodes. Sendo assim, sugere-se a
inclusão de Rm_97M nessa família já que ela possui características desse grupo.
Além disso, mesmo que exista baixa homologia de seqüência, todas as seqüências
com as quais ela teve homologia possuem o motivo curto ou longo do sítio de
ligação com o zinco.
As metaloproteases de veneno de cobra são organizadas em 4 classes de P-I
a PIV. A P-I possui domínio protease e seqüências pré e pro metaloprotease, a P-II,
similar a PI, mas com adição de domínio RGD (arginina, glicina e ácido aspártico),
característico de desintegrina, flanqueado por cisteínas que forma uma alça para
projetar o motivo RGD e inibir a ligação de fibrinogênio (FNG) a integrinas, P-III, com
adição de um grande domínio de 11 cisteínas e P-IV, que não possui atividade
proteolítica e parece funcionar como componente de matriz extracelular.
Rm_97M possui domínio rico em cisteína (9 cisteínas) logo após o sítio ativo,
mas não possui a trinca RGD característica das desintegrinas. Os resíduos de
cisteína não seguem nem os padrões das desintegrinas nem o da classe P-III.
Sendo assim, a função deste domínio rico em cisteína não é conhecida, mas pode
ser uma plataforma que facilita a ligação para proteínas de matriz extracelular, como
proposto para outras metaloproteases. Desta forma, a ligação da metaloprotease do
carrapato à matriz do hospedeiro poderia aumentar sua eficiência em manter a
cavidade de repasto e o foco hemorrágico do hospedeiro.
Com bases nos relatos de Francischetti et al. (2003)
37
e comparando Rm_97M
com as seqüências descritas em seu trabalho, sugere-se que mesmo não possuindo
trinca RGD, ela poderia atuar sobre fibrinogênio e ter atividade gelatinase, como
descrito para algumas metaloproteases de veneno de cobra e de aranha. Sendo
assim, com a atividade fibrinolítica de clivagem de fibrinogênio, não haveria
formação de coágulo de fibrina. Com esta atividade antifibrinogênio e antifibrina,
similar às proteases hemorrágicas de veneno de cobra, teríamos uma atividade anti-
hemostática presente na saliva do carrapato. Vale a pena destacar que o trabalho
de Francischetti et al. (2003) descreve o primeiro relato de atividade fibrinogenolítica
de saliva de artrópode hematófago.
O clone Rm_81M, após pesquisa no banco de dados não redundante do
NCBI (NR), apresentou grande similaridade com proteína B ligante de IgG de R.
Discussão
115
appendiculatus com 80% de identidade e valor de E de 4
e-79
enquanto Rm_89M
apresentou similaridade com a proteína C ligante de IgG do mesmo carrapato com
84% de identidade e valor de E de 1
e-83
e com a do R. haemaphysaloides
haemaphysaloides (80% de identidade e valor de E de 1
e-66
). Sabe-se que a
imunoglobulina G (IgG) do hospedeiro é capaz de atravessar a parede do intestino e
atingir a hemocele de carrapatos fêmeas adultas do carrapato africano R.
appendiculatus quando se alimentam em cobaias. Além disto, como IgGs também
são encontradas na saliva dos mesmos carrapatos fêmeas e tendem a aumentar em
estágios tardios de alimentação, foi proposto que este seria um mecanismo de
escape da atividade de anticorpos do hospedeiro e de eliminar proteínas não
próprias através da glândula salivar. Para que isto aconteça sugeriu-se que poderia
haver a participação de proteínas ligantes de IgG que são encontradas na hemolinfa
(78 e > 100 kDa) e no extrato de glândula salivar (23 e 57 kDa) de carrapatos
fêmeas no sexto dia de alimentação, indicando que existe uma cooperação entre
ambas para o sucesso da remoção de proteínas estranhas como a Ig do hospedeiro
durante alimentação. Este mecanismo poderia então, fazer parte do sistema de
defesa do carrapato
125
.
Mais tarde descreveu-se a presença de proteínas ligantes de IgG em extratos
de glândulas salivares de carrapatos ixodídeos R. appendiculatus, Amblyomma
variegatum e Ixodes hexagonus, não alimentados, sendo que o tamanho das
proteínas seria diferente nas 3 espécies. Foi também descrita a presença de duas
proteínas ligantes de IgG na hemolinfa de carrapatos fêmeas e machos de R.
appendiculatus e uma de 78 kDa foi detectada quando os carrapatos foram
alimentados por 6 dias. Embora não haja diferença no perfil proteínas ligantes de
IgG derivadas de extratos de glândulas salivares de carrapatos machos e fêmeas de
R. appendiculatus, duas outras formas foram detectadas em carrapatos machos
após serem alimentados por 6 dias
126
.
Há 3 proteínas ligante de IgGs descritas como as mais abundantes, que são
IGBP-MA (29 kDa), IGBP-MB (25 kDa) e IGBP-MC (21 kDa) e foram isoladas a partir
de carrapatos machos R. appendiculatus parcialmente alimentados. As IGBP são
antigenicamente distintas e são expressas especificamente em machos R.
appendiculatus em alimentação na presença ou ausência de fêmeas. Parecem ser
glicoproteínas, pois possuem sítios de glicosilação preditos. Ainda segundo este
Discussão
116
trabalho, IGBP-MC se liga a IgG de cobaia e também a IgG humana e bovina,
enquanto IGBP-MA e possivelmente IGBP-MB, somente se ligaria a IgG da
cobaia
127
. Em 1998, Wang et al., caracterizaram as 3 proteínas ligantes de Ig
específicas de machos de R. appendiculatus IGBP -MA, -MB e –MC, já descritas.
Análises das seqüências revelaram que -MB e –MC são proteínas relacionadas que
diferem no fato de –MC ter uma seqüência sinal, indicando ser esta uma proteína
secretada. Os resultados ainda indicam que a presença de –MC (secretada) na
glândula salivar do macho interfere na alimentação da fêmea, já que na ausência de
auxílio do macho, a fêmea tem dificuldade de se alimentar, aumentando o tempo de
repasto sanguíneo, enquanto –MB parece não ter o mesmo efeito. Sendo assim, foi
sugerido que por meio da expressão de –MC que o macho facilita alimentação de
sua fêmea, que então ingurgita e faz a postura dos ovos, o que irá diretamente
interferir na perpetuação da espécie
128
. Estudos com biblioteca de cDNA de
carrapatos machos Ixodes scapularis que estão se acasalando e alimentando, e
subtraindo os genes comuns entre fêmeas alimentadas, resultaram em 7 cDNAs
únicos, entre eles um com similaridade a IGBP-MC de R. appendiculatus. Por RT-
PCR foi confirmado que este gene é realmente expresso em macho, mas não em
fêmeas
87
.
Quando os artrópodes hematófagos se alimentam, algumas das
imunoglobulinas oriundas do hospedeiro não são digeridas, mas sim atravessam a
parede do intestino e vão para o corpo do artrópode
103
. Os estudos com carrapatos
africanos, R. appendiculatus, revelaram que estas Igs são também transportadas da
cavidade do corpo do carrapato de volta para as glândulas salivares e por isso elas
são excretadas de volta ao hospedeiro, pela saliva do carrapato, mantendo sua
atividade ligante de anticorpos
125
. A família de proteínas ligantes de Ig produzidas na
hemolinfa e nas glândulas salivares foi descrita em várias espécies de carrapatos
ixodídeos
126
. Esses dados indicam que proteínas ligantes de Ig agiriam como um
sistema de defesa contra Ig ingeridas.
Outro fato que sustenta a possibilidade dessas proteínas ligantes de Ig serem
parte de um sistema de defesa é o que há trabalhos demonstrando que algumas Igs
do hospedeiro podem ultrapassar o trato digestivo e se ligar aos ovários de fêmeas
do carrapato Dermacentor variabilis em alimentação
1
. Sendo assim, o carrapato
estaria protegendo seus ovários de lesões mediadas por anticorpos.
Discussão
117
Apesar dos primeiros trabalhos de 1994 terem descrito a presença de
proteínas ligantes de Igs em fêmeas, podemos notar que mais tarde os trabalhos
descrevem a presença apenas em machos, o que vem de encontro com os
resultados apresentados na presente tese, onde todos os 31 clones descritos que
fazem parte do Rm_81M e Rm_89M, são originados das bibliotecas de machos
alimentados em bovinos Bos indicus (holandês preto e branco). A observação inicial
feita em fêmeas pode ter tido origem num artefato derivado do fato de que elas
sugariam tanto a saliva do hospedeiro quanto as proteínas da saliva dos machos
que estão alimentando-se na mesma cavidade hemorrágica que elas. Com base nos
resultados dos trabalhos descritos, Rm_81M e Rm_89M possuem alto percentual de
identidade entre as seqüências protéicas IGBP-MC e –MB, respectivamente, e
permitindo a predição funcional desses clones como sendo proteínas ligantes de
imunoglobulinas.
Todas as seqüências que serão discutidas nos próximos parágrafos
revelaram não ter nenhum domínio após busca no CDD. Esses clones foram
reunidos em um grande grupo onde todas as seqüências protéicas apresentam
muitos resíduos do aminoácido glicina. Serão, então, chamadas de proteínas ricas
em glicina. O padrão de distribuição das glicinas nas seqüências é, contudo, muito
variável, além dos contigs serem também ricas em outros resíduos de aminoácidos
principalmente serina, leucina, tirosina e prolina, conforme o contig estudado.
Conforme o contig há também presença de motivo Gly-Gly-X, duplas de glicinas
seguidas de diferentes aminoácidos. Esses fatos poderiam explicar os mais variados
tipos de alinhamentos com as mais diversas seqüências presentes no banco de
dados não redundante do NCBI, após busca utilizando Blast X. Dessa forma, todas
as seqüências que serão discutidas agora pertencem a grupo especial de clones
com proteínas muito ricas em glicina, mas que fazem parte de contigs diferentes.
Situação similar ocorre com as proteínas das sedas das aranhas, que pertencem à
mesma classe taxonômica dos carrapatos e cujas sedas são igualmente ricas em
glicinas, mas onde os motivos diferentes assinalam módulos estruturais distintos e,
portanto, tarefas específicas para proteínas com resíduos similares. Com efeito,
dentro do grupo encontramos vários contigs apresentando similaridades com
proteínas de sedas de aranhas e temos os subgrupos formados por clones muito
Discussão
118
parecidos, mas ainda assim presentes em contigs diferentes conforme observado
nos resultados apresentados.
Um subgrupo interessante é o formado por clones Rm_21M, Rm_22M,
Rm_51F, Rm_53M, Rm_70M e Rm_76N. Existe uma semelhança muito grande
entre as seqüências protéicas dos clones. O alinhamento entre estas seqüências
demonstra que há 98 aminoácidos idênticos entre as seqüências, ou seja, em torno
de 70%. Dessa forma, tem-se um subgrupo de proteínas que, apesar de muito
semelhantes, foram localizados em contigs diferentes. Neste subgrupo será incluída
Rm_73N e Rm_109, não por serem muito similares às seqüências já citadas, mas
sim por também demonstrarem alinhamento com proteínas de aranha e com o
antígeno do tipo cimento Haemaphysalys longicornis
48
. Todas essas seqüências
apresentam muitos resíduos de serina, aminoácido abundante nas proteínas de
seda. A busca no banco de dados não redundante do NCBI os clones Rm_21M,
Rm_22M, Rm_70M e Rm_76N revelara similaridade principalmente com seqüência
de proteínas da seda flageliforme das aranhas Nephila madagascariensis
50
e
Nephila clavipes
49
, enquanto os clones Rm_51F e Rm_53M, apesar da grande
similaridade com os clones anteriores, revelaram em primeiro lugar similaridade com
a proteína em forma de flagelo da seda da aranha Araneus ventricosus e depois
com as outras, provavelmente pela inserção das seqüências PALSG e SGS/SDS.
Essas mesmas seqüências apresentaram menor similaridade com uma proteína to
tipo cimento do carrapato Haemaphysalys longicornis
48
, como já citado.
Rm_73N apesar de apresentar similaridade com as proteínas das aranhas N.
madagascariensis e N. clavipes, destoa das seqüências desse subgrupo, como
pode ser visualizado na Fig.XXX, e demonstra similaridade com proteína to tipo
cimento de Haemaphysalys longicornis
48
. Ainda vale ressaltar que Rm_73N é
seqüência que apresenta melhor similaridade com as seqüências de aranha Nephila
já citadas.
Já Rm_109N também é similar a uma proteína produzida pelas glândulas
abdominais de outra aranha, a major ampullate spidroin de Agenelopsis aperta
115
e
à proteína do tipo cimento da Haemaphysalys longicornis
48
. É muito interessante
observar os vários alinhamentos das proteínas de R.(Boophilus) microplus com as
proteínas das aranhas, visto que como engenheiras as aranhas ultrapassam de
longe qualquer outra criatura. A seda dragline (reboque), que essas acrobatas
Discussão
119
providas de oito pernas usam para montar suas teias, dando com ela saltos mais
ousados que aqueles do bungee jumping, é extraordinariamente forte. Corresponde
a um cabo não mais espesso do que uma mangueira de jardim que pudesse
suportar um jato Boeing 737 sem quebrar. Ainda a chamada seda flageliforme usada
nas redes em espiral é suficientemente elástica para esticar até 200% de seu
comprimento. Com sete diferentes tipos de seda, muitas aranhas tecem artesanatos
complexos e elásticos. A seda dragline é também chamada de seda major ampullate
porque é produzida nas glândulas major ampullate
49
. As fibras da seda de aranha
em geral são de interesse para pesquisa por causa da alta elasticidade e força
tênsil. Estas propriedades conferem uma resistência (energia absorvida antes da
ruptura por unidade de massa) especial a seda da aranha
115
.
Apesar dessas propriedades tênsil e elásticas, proteínas de seda possuem
uma outra característica de enorme relevância para o presente estudo e que é a sua
capacidade de mimetizar a matriz extracelular de tecidos de vertebrados superiores.
Com efeito, muitas sedas de aranhas e de lepidópteras estão sendo empregadas
em engenharia de tecidos como andaimes para sustentar o crescimento e adesão
de vários tipos de células humanas
20
. Esse fato levanta a hipótese de que as
proteínas homólogas de carrapatos são empregadas pelo parasita para subverter a
adesão de células do hospedeiro, direcionado-as para uma falsa matriz o que as
torna atraentes como antígenos.
Um outro clone inserido nesse grupo é o Rm_98N, que possui similaridade
com as seqüências de Rm_73N e Rm_109N. O seu melhor alinhamento é com uma
proteína de Drosophila melanogaster não caracterizada, mas também se alinhou
com uma proteína flageliforme da aranha Argiope trifasciata
43
e também com a
proteína do tipo cimento de Haemaphysalys longicornis
48
.
Muitos artrópodes fazem seda: aranhas, lepidópteras como o bicho-da-seda e
algumas abelhas
50
. As proteínas apresentam repetições de motivos de aminoácidos
e o mesmo foi observado nas proteínas apresentadas neste trabalho. Alguns
pesquisadores pensam que esta cadeia de hélices do tipo mola seria o segredo da
resistência e elasticidade da seda, e que a regularidade poderia ajudar o fluido
protéico se auto-arranjar em fibras conforme ele vai saindo das glândulas produtoras
de seda
50
. Da mesma forma, a proteínas descritas em nosso subgrupo apresentam
Discussão
120
repetições, sugerindo termos umas proteínas resistentes e elásticas sendo
codificadas por nossos clones.
Sendo a seda crucial para aranhas, não só com a finalidade de capturar
insetos e dessa forma, ser importante na alimentação, como barreira de proteção e
como abrigo para os ovos. Com todos estes papéis biológicos, diferentes sedas
parecem ter propriedades mecânicas que correspondem a suas diferentes
funções
49,50
. Transportando para a realidade dos carrapatos, as proteínas descritas
podem ter importantes papéis como para alimentação do carrapato, já que com suas
características putativas de flexibilidade e resistência no cone de cimento, facilitaria
sua interação e permanência no hospedeiro. Poderia estar também servindo como
uma barreira de proteção impedindo que ele se solte facilmente do hospedeiro o que
facilitaria o acasalamento.
Todas as proteínas descritas, incluindo agora Rm_110N também foram
alinhadas com a proteína do tipo cimento de Haemaphysalys longicornis
48
. As
proteínas descritas neste trabalho possuem características comuns com proteínas
de cimento que auxiliam seus carrapatos na sua fixação no hospedeiro durante o
repasto sanguíneo, sendo proteínas que fazem parte do cone de cimento. Uma
observação mais detalhada dos alinhamentos com valores mais significativos (valor
de E e %identidade) com proteínas de outros organismos, sugere-se que tais
produtos gênicos correspondem novas proteínas ainda não descritas que fazem
parte do cone de cimento. Assim como as aranhas possuem várias proteínas com
características diferentes, mas cada qual importante para a formação teia de seda,
resta agora uma melhor definição das características e funções individuais dos
clones descritos. Vale lembrar, no entanto, que as proteínas produzidas por
glândulas salivares dos carrapatos e secretadas no hospedeiro bovino, e que
incluem as proteínas ricas em glicina, normalmente induzem repostas imunes.
Sendo assim temos uma gama de candidatos a antígenos vacinas serem testados.
Rm_12N e Rm_13M apresentaram resultados de alinhamento no Blast X com
as mesmas proteínas. Desta forma, ambos os clones foram alinhados e
demonstraram realmente uma similaridade muito grande entre si, onde Rm_13M
possui quatro regiões com inserções de aminoácidos: VGNGFGS, GLGS, GS e
ERSP. A similaridade com a proteína loricrina humana sugere que sejam mais dois
clones ricos em glicina, mas com algumas características individuais. A loricrina é o
Discussão
121
principal componente protéico do envelope celular cornificado das células de
epiderme diferenciada de mamífero (extrato córneo)
140
. Em resumo é uma proteína
estrutural. Apesar da similaridade há diferenças que podem ser essenciais para uma
descrição funcional dos clones Rm_12N e Rm_13M. Desta forma, uma melhor
caracterização funcional se faz necessária. De todo modo, as similaridades
encontradas permitem lançar a hipótese de que os produtos desses clones
funcionam como um subversor das atividades fisiológicas da pele, o órgão alvo do
parasita.
O clone Rm_93N é sem dúvida muito similar com a proteína 64P associada à
glândula salivar de R. appendiculatus
117
, com valor de E de 3e-45 e 64% de
identidade. Em segundo lugar no alinhamento aparece uma proteína, também rica
em glicina e tirosina de casca de ovo de Opisthorchis viverrini
98
, com valor de E de
4e-28 e 52% de identidade, seguida da proteína shemantrin 4, componente da
concha da ostra da pérola, Pinctada fucata
139
, com valor de E de 1e-26 e 51% de
identidade, sendo seguida de uma proteína de outro carrapato, a proteína salivar
putativa de I. scapularis que contém repetições GYG. Todas estas proteínas
apresentam repetições contendo os aminoácidos glicina (G, Gly) e tirosina (Y, Tyr).
A trinca de repetição GYG aparece 13 vezes na seqüência sendo que 12 delas
seguidas. O alinhamento entre Rm_106N e Rm_93N é interessante de ser
observado já que ambas demonstram similaridade com proteína 64P Rhipicephalus
appendiculatus
117
, mas Rm_106N apresenta um valor de E de 1e-29 com 49% de
similaridade. As similaridades com Opisthorchis viverrini
98
e com Pinctada fucata
139
também ocorrem. Rm_106N também é uma proteína com repetições de glicina e
tirosina tendo 11 trincas GYG, sendo 6 destas em seqüência. A proteína 64P é
considerada um antígeno exposto do carrapato R. appendiculatus e foi usado como
vacina (uma forma truncada para expor epítopos ocultos) para controle de
carrapatos. Este antígeno foi descrito como apresentando reação cruzada com
antígenos ocultos do intestino. Após imunização de hospedeiros, infestações com
carrapatos induziram uma resposta inflamatória cutânea e o aumento do título de
anticorpos, enquanto que carrapatos ingurgitados morreram após lesão intestinal
117
.
Por meio desse resultado Trimnell et al.
117
sugeriram que o uso deste antígeno
numa vacina seria uma estratégia auto-sustentável para o controle de ectoparasitas
devido ao reforço natural conferido pelas infestações. Assim, nossos clones podem
Discussão
122
representar novas possibilidades de uso de proteínas secretadas como antígenos
vacinais que, como o trabalho citado demonstrou, poderia ser na forma truncada. No
caso da proteína rica em GY da casca do ovo do parasita de fígado Opisthorchis
viverrini
98
ela foi descrita como sendo reconhecida por animais infectados e sugeriu-
se o uso como antígeno de teste diagnóstico. Em outras palavras: esta proteína
induz resposta imune, o que reforça a sugestão do uso de Rm_106N e Rm_93N
como antígenos vacinais.
Apesar do valor de E ser de 4e-9, Rm_79N possui 63% de identidade com
uma proteína cuticular de Tachypleus tridentatus
57
, que é descrita como sendo
proteína do exoesqueleto. Rm_79N pode ser considerada uma proteína secretada
no local da picada e fazendo parte do cone de cimento, com base nos alinhamentos
com proteínas de cimento de carrapatos.
Rm_124N mostrou similaridade com a proteína putativa de cimento de RIM
36 (Rhipicephalus immunodominant molecule of 36kDa) de Rhipicephalus
appendiculatus
12
, com valores de 56% de identidade e 5e-42 de valor de E. Além da
riqueza em resíduos de glicina (28), a proteína é rica em resíduos de prolina (27,)
serina (11) e leucina (22), assim como o é a proteína RIM 36. Estes aminoácidos
são proeminentes no conteúdo geral previamente determinado para substâncias do
cimento de carrapatos R.(Boophilus) microplus. Com bases nos resultados
apresentados sugere-se a inclusão de Rm_124N no grupo das proteínas que fazem
parte da formação do cone de cimento do carrapato Boophilus microplus. A
presença de peptídeo sinal e de domínio rico em glicina é consistente com o papel
das proteínas de matriz extracelular. Um grande conteúdo de glicina é uma
característica de proteínas de matriz extracelular de vertebrados, incluindo queratina
e colágeno, devido à capacidade da glicina se adaptar a uma grande quantidade de
conformações de cadeia. Algumas trincas de aminoácidos contendo glicina são
típicas de colágenos de vertebrados e invertebrados
64,75,110
. Foi sugerido que
componentes do cimento do carrapato poderiam estar mimetizando componentes da
pele de vertebrados a fim de usar as enzimas derivadas do hospedeiro durante o
processo de endurecimento, já que este é um processo ainda não caracterizado.
Uma proteína de glândula salivar do tipo das de matriz extracelular foi descrita em
Haemaphysalis longicornis contendo as repetições GXX remanescentes daquelas
presentes em colágenos
78
. O cone de cimento é primariamente proteináceo, mas
Discussão
123
também contém alguns carboidratos e lipídios. Para determinarmos se Rm_124N
contém tais características são necessários mais alguns dados complementares.
Sugere-se que Rim 36 é uma molécula imunodominante em gado Bos indicus
12
apesar de pesquisadores terem relatado em 1968 que proteínas do cimento de R.
Boophilus microplus não seriam capazes de induzir resposta imune detectável no
hospedeiro
113
. Desta forma a resposta imune gerada pode ser em conseqüência do
fato de que Bos indicus, que se desenvolveu na Ásia e entrou na África nos últimos
milhares de anos
47
, seria um hospedeiro recente para as espécies de carrapatos
africanos como Rhipicephalus appendiculatus. Tendo em vista que atualmente o
carrapato Boophilus faz parte do gênero Rhipicephalus e com base nos dados
apresentados, sugere-se que Rm_124N seria uma proteína que faria parte do cone
de cimento podendo ser um importante antígeno na indução de resposta imune no
hospedeiro.
O clone Rm_41N e RH50 uma proteína desconhecida de Rhipicephalus
haemaphysaloides haemaphysaloides
141
resultaram em um alinhamento com valor
de E de 2e-48 e 41% de identidade, muito próximo do valor de alinhamento entre o
clone e a proteína shemantrin-4 de Pinctada fucata com valor de E de 7e-41 e
identidade de 43%. A proteína madura possui 38% de glicina (G-Gly), 14% de
leucina (L-Leu) e 13% de serina (S-Ser), mas não possui resíduo de cisteína. Uma
característica notável da seqüência é a presença de domínios contendo repetições
de aminoácidos. Vinte e quatro cópias do dipeptídeo GL, associado com glicina (9),
tirosina (4), serina (4), leucina (4), metionina (2) e valina (1), na posição 3 da trinca
de aminoácidos (GLX). RM_41N é rica em G, L e S, que são proeminentes no
conteúdo geral de aminoácido previamente determinado para a substância cimento
do carrapato R. Boophilus microplus (KEMP 1982). Segundo Zhou et al.
141
em seu
trabalho de caracterização de RH50 de Rhipicephalus haemaphysaloides, existe um
aumento na expressão de RH50 na glândulas salivares após repasto sanguíneo.
Essas proteínas expressas diferencialmente em glândulas salivares de carrapatos
são da maior importância para sobrevivência do carrapato e modulam imunidade
inata e adquirida. Já que proteínas salivares especificamente expressas durante o
repasto sanguíneo de carrapatos podem ter um papel de modulação da resposta
imune do hospedeiro e transmissão de patógenos, foi sugerido se isolar genes supra
regulados nas glândulas salivares para desenvolvimento de vacinas
137
. Diferente de
Formatado: Fonte: Itálico
Discussão
124
muitas estratégias existentes, já é postulado que antígenos de glândula salivar de
carrapatos são associados com eventos que regulam a fixação do carrapato na pele
do hospedeiro, captura do sangue, e transmissão de patógenos, por esta razão, a
glândula salivar do carrapato é considerada como fonte de antígenos vacinais para
carrapato
118
. Com base nos dados descritos, Rm_41N pode ser um potencial
candidato na modulação de resposta imune no hospedeiro bovino.
A proteína imunodominante da saliva (20/24kDa) de Rhipicephalus
appendiculatus (não caracterizada) quando alinhada com Rm_103N mostra
identidade de 63% com valor de E de 1e-57. Rm_103N possui 29 resíduos de glicina
33 de prolina, 11 de leucina e 5 de serina. Com base nos resultados apresentados
podemos descrevê-la com uma proteína putativa presente no cone de cimento.
De uma forma geral, a função das proteínas ricas em glicinas caracterizadas
em carrapatos é sempre atribuída à função de cimentos, mas como as bibliotecas da
presente tese demonstram, essa classificação se torna muito superficial tendo em
vista a gama de diferentes seqüências de proteínas relatadas e que foram
destinadas a dezenas de diferentes contigs . Isto se torna ainda mais relevante
quando a maior parte dos alinhamentos, com valores mais significativos, ocorre com
proteínas de seda da aranha, por exemplo. Maiores estudos são necessários para
realmente caracterizarmos tais proteínas. Talvez a grande quantidade de diferentes
proteínas ricas em glicina secretadas no bovino poderia formar redes (teias) que de
alguma formam impediriam a chegada de células do sistema imune no local do
repasto sanguíneo ou capturariam as hemácias que contêm a hemoglobina
essencial para a nutrição da fêmea, entre outras atividades já sugeridas durante a
discussão dos dados. Burlar a atividade destas proteínas seria uma forma de induzir
proteção contra o carrapato R. Boophilus microplus.
6 Conclusões
Conclusões
126
Conclusões
206
6 - CONCLUSÕES
De acordo com a metodologia utilizada e os objetivos da tese, e ainda com os
resultados e discussão apresentados, pode-se concluir que:
•
As bibliotecas de cDNA construídas de glândulas salivares de machos, de ninfas
e de fêmeas menores que 4mm de R Boophilus microplus em alimentação em
hospedeiros bovinos são representativas do repertório gênico expresso nesses
tecidos e refletem a abundância relativa de cada RNA mensageiro;
•
A meta de 1500 ESTs por biblioteca para sequenciamento em massa dessas
bibliotecas revelou ser suficiente para aproximar-se do esgotamento da taxa de
novidade das ESTs;
•
As ferramentas de bioinformática empregadas são heurísticas e, em havendo
genes similares depositadas nas bases de dados, permitiram assinalar função
biológica putativa rapidamente a todos os ESTs e identificar genes mais ou
menos expressos nas diferentes situações do parasitismo estudadas. Também
permitiram implementar os critérios para identificar genes de interesse a
constituírem antígenos candidatos;
•
As bibliotecas construídas possuem a seqüência completa e unidirecional dos
genes de interesse facilitando a clonagem e expressão futura de antígenos
recombinantes;
•
O sistema de clonagem de GIs no vetor plasmidial proprietário VR 2001 TOPO
TA para triagem de antígenos por imunologia reversa revelou ser útil para
clonagens rápidas de genes completos; contudo, o sistema de entrega de
antígenos para hospedeiros bovinos sob a forma de DNA não foi eficiente para
elicitar reações de hipersensibilidade cutânea tardia (DTH) visíveis a olho nu.
•
O sistema de imunotriagem dos GIs clonados em vetor plasmidial proprietário VR
2001 TOPO TA e entregues sob a forma de DNA deverá empregar a verificação
histológica do infiltrado celular a fim de constatar a elicitação de DTH; caso não
seja bem sucedido os GIs deverão ser triados na forma de proteínas
recombinantes.
Formatado: Fonte: Negrito
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