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DA ATIVAÇÃO DE NEUTRÓFILOS PELA LECTINA MNCF DECORREM TRANSCRIÇÃO GÊNICA
E SECREÇÃO DE MEDIADORES SUSTENTADAS EM AMBIENTE ANTI-INFLAMATÓRIO
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto para obtenção do título de Doutor em
Ciências, área de concentração Imunologia Básica e Aplicada
Aluna: Karina Alves de Toledo
Orientadora: Maria Cristina Roque Barreira
Co-orientadora: Lise Halbwachs-Mecarelli
RIIBEIRÃO PRETO
2007
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THESE DE DOCTORAT DE
L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE
Spécialité
Immunologie
Présentée par
Mlle. Karina Alves de Toledo
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR de les UNIVERSITÉS de SÃO PAULO et PIERRE ET MARIE CURIE
Sujet de la thèse :
L'activation des neutrophiles par le MNCF a pour conséquence la transcription des
gènes et la secrétion de cytokines, et cela même dans des conditions anti-inflammatoires
Soutenue le 21-decembre-2007
Devant le jury composé de :
Mme. ROQUE-BARREIRA Maria Cristina Directeur de thèse
Mme. MECARELLI Lise Halbwachs Directeur de thèse
Mme. MORENO Andréa Novais Rappoteur
Mme. BISSON Gabriela Silva Rapporteur
M. LESAVRE Philippe Examinateur
M. DONADI Eduardo Antonio Examinateur
2
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Dedico...
... a Deus por toda força que me destes durante esta longa caminhada.
Ofereço...
... ao meu marido Carlos, a quem eu não conseguiria, nem que a mim fossem dadas
muitas páginas, expressar por inteiro todo o meu carinho, amor e gratidão. Esta tese
também é sua.
3
Agradecimentos
Às Dras. Maria Cristina Roque Barreira e Lise Halbwachs-Mecarelli pela pronta acolhida em
seus respectivos laboratórios e por todos os ensinamentos que muito contribuiram para a
minha formação.
Aos professores Drs. Marcelo Dias Baruffi, Maria Célia Jamur e Constance Oliver pela
disponibilidade em me atender sempre que necessário. Acrescento ainda a este time o Dr.
Philippe Lesavre e as Dras. Gabriela Pereira Bisson, Andréa Novais Moreno e Veronique
Witko-Sarsat que, todos juntos, tanto contribuiram para o desenvolvimento deste trabalho.
Às queridas secretárias Ana Cristine, Rosângela e Silvia (CPG) que moram no meu coração.
Às técnicas Patrícia E. Vendruscolo, Sandra Maria de Oliveira Thomaz e Érica Vendruscolo
pela preciosa ajuda e competente apoio técnico.
Às queridas amigas Camilinha, Luciana Ruas, Aline, Cláudia Polli, Vânia e Dani Carlos por
toda a amizade, lealdade e profissionalismo, além é claro dos infinitos momentos de alegria
juntas.
Ao amiguinho Trança por estar sempre disponível e ser sempre solícito a solucionar nossas
intermináveis dúvidas.
Às “copines” Agnès, Soumeya, Chehrazade, Dikra, Magali, Sandra, Julie e Sandra pelos
ótimos momentos que passamos juntas e por toda a paciência que tiveram comigo.
À Inês e Lúcia, pela amizade, respeito e todo o carinho com o qual tanto nos ajudam em
nossos trabalhos.
Aos colegas de laboratório, cada um tem sua parcela particular de ajuda neste trabalho.
À FAPESP, CAPES e FAEPA pelo auxílio financeiro para realização deste trabalho.
Enfim, a todos aqueles que de forma direta ou indireta estiveram presentes nesta etapa da
minha vida.
4
ÍNDICE
INTRODUÇÃO................................................................................................................16
Resposta inflamatória aguda..............................................................................................16
Desgranulação neutrofílica.................................................................................................21
Morte celular.......................................................................................................................29
Glicocorticóides e inflamação............................................................................................34
MNCF.................................................................................................................................36
OBJETIVOS.....................................................................................................................38
MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................................39
Obtenção da lectina MNCF................................................................................................39
PARTE I
Separação de neutrófilos.....................................................................................................40
Biotinilação da lectina MNCF............................................................................................41
Interação de MNCF-biotinilado e neutrófilos pré-tratados ou não com dexametasona....41
Migração de neutrófilos in vitro.........................................................................................42
Atividade mieloperoxidase (MPO)....................................................................................43
Expressão de CD62L..........................................................................................................43
Avaliação dos filamentos de F-actina................................................................................44
Western blot para NF-kB p50............................................................................................45
Real Time PCR para citocinas e quimiocinas....................................................................46
Quantificação de CXCL8...................................................................................................48
5
PARTE II
Purificação de neutrófilos humanos do sangue periférico.................................................50
Apoptose em neutrófilos incubados com MNCF...............................................................50
Estudo da desgranulação neutrofílica através da expressão de CD11b, CD35,
CD63 e CD66.....................................................................................................................51
Análise de fosforilação de proteínas tirosino-quinase e p38 MAP quinase......................52
RESULTADOS.................................................................................................................54
PARTE I
MNCF interage na superfície de neutrófilos pré-tratados ou não com dexametasona......54
Migração neutrofílica in vitro, induzida por MNCF, não inibida por dexametasona........55
MNCF regula a expressão de CD62L em neutrófilos humanos........................................57
Efeito de MNCF sobre o aumento de expressão de F-actina e a polarização
de neutrófilos pré-tratados, ou não, com dexametasona ...................................................59
Pré-tratamento com dexametasona não inibe a translocação do fator de
transcrição NF-kB induzido por MNCF...........................................................................64
MNCF ativa a expressão gênica de TNF-alpha, IL-1beta, CCL4 e CXCL8
por neutrófilos humanos estimulados pela lectina MNCF, mesmo quando
pré-tratados com dexametasona.........................................................................................66
Neutrófilos pré-tratados com dexametasona sob o estímulo de MNCF
secretam CXCL8 ..............................................................................................................67
PARTE II
Efeito anti-apoptótico de MNCF sobre neutrófilos humanos............................................69
6
MNCF induz desgranulação neutrofílica...........................................................................72
MNCF induz fosforilação de tirosino-quinases e p38 MAPK em neutrófilos..................75
Avaliação das possíveis vias de sinalização envolvidas na desgranulação
induzida por MNCF............................................................................................................77
DISCUSSÃO.....................................................................................................................79
CONCLUSÕES.................................................................................................................91
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................92
7
ABREVIATURAS
7AAD 7-amino-actinomycin D
AP-1 Fator de transcrição AP-1
Apaf-1 Apoptosis-activating factor 1
BCA Bicinchoninic acid
BPI Bactericidal/permeability-increasing protein
C5a Componente 5a do sistema complemento
CRD Carbohydrate recognition domain
DAB 3,3'-Diaminobenzidine
DX Dexametasona
EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid
ERK Extracellular signal-regulated kinase
FAAD Fas-associated death domain
Fas Receptor de morte celular (CD95 ou APO-1)
FasL Ligante do receptor de morte celular
FITC Fluorescein isothiocyanate
GM-CSF Granulocyte macrophage colony-stimulating factor
GR Glucocorticoid receptor
HBSS Hank's buffered saline solution
hCAP-18 Human cathelicidin antimicrobial protein
HPA Hypothalamic-pituitary-adrenal
IgY Imunoglobulina de galinha
JAM Junctional adhesion molecule
LAMP Lysosome-associated membrane protein
LTB4 Leucotrieno B4
MAPK Mitogen-activated protein kinase
MIF Mean intensity fluorescence
MNCF Macrophage-derived neutrophil chemotatic factor
MPO Mieloperoxidase
NF-κB Nuclear factor-κB
8
NGAL Neutrophil gelatinase-associated lipocalin
P388-D1 Linhagem celular de macrófagos de camundongos
p38 MAPK Proteína p38 MAP
PAF Platelet-activating factor
PBS Phosphated-buffered saline
PCR Polymerase Chain Reaction
PD98059 2'-amino-3'-methoxyflavone (inibidor de ERK MAPK)
PE Phycoeritrine
PECAM-1 Platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31)
PKC Protein kinase C
PMA Phorbol myristate acetate
PP2 4-amino-5-(4-chlorophenyl)-7-(t-butyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine
(inibidor de Src)
PSGL-1 P-selectin glycoprotein ligand-1
RBL-2H3 Linhagem celular de mastócitos de rato
RPMI Meio de cultura
SB203580 (4-(4-Fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-
imidazole) (inibidor de p38 MAPK)
SDS Sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
Src Família de proteínas tirosino-quinase (Fgr, Hck, Lyn)
SYBR Synergy Brands
Syk Proteína tirosino-quinase
TMB 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine
UNG Uracil-N-glicosilase
9
RESUMO
O acúmulo focal de leucócitos, próprio da inflamação, é desencadeado por uma ampla
gama de mediadores, de origens variadas. A migração das células ocorre em múltiplas etapas
coordenadas e pode ser inibido por glicocorticóide, que exerce efeitos reguladores negativos
–sobre a síntese/ou liberação de moléculas pró-inflamatórias e de adesão– e positivos –sobre
a expressão de anexina-1, proteína de ação anti-inflamatória. Temos estudado o efeito indutor
de migração de neutrófilos exercido por MNCF (macrophage derived neutrophil chemotactic
factor), que é uma lectina ligante de galactosídeos, dotada da propriedade de recrutar
neutrófilos mesmo em condição anti-inflamatória, gerada pelo tratamento com dexametasona.
Essa atividade peculiar pode ter repercussões relevantes no desenho de estratégias
terapêuticas para frear a inflamação quando ela causa lesão tissular. Isso justifica o especial
interesse na compreensão dos mecanismos de ação de MNCF sobre neutrófilos humanos.
Nesse contexto, demonstramos anteriormente que a interação de MNCF com componentes da
matriz extracelular pode contribuir para que a ação desse agente supere o efeito
antinflamatório da dexametasona (Toledo et al 2007). Neste trabalho, nosso objetivo é
identificar as respostas de ativação dos neutrófilos determinadas por MNCF, de maneira a
identificar diferenças entre essas respostas e as desencadeadas por atraentes cujas ações
sejam sensíveis ao efeito anti-inflamatório da dexametasona. Ensaios in vitro demonstraram
que MNCF, a partir de ligação à superfície celular, induz a migração de neutrófilos humanos,
tanto normais como pré-incubados com dexametasona. Ao atuar sobre neutrófilos normais,
MNCF induziu respostas qualitativamente muito similares às induzidas por outro atraente,
quais sejam: (a) fosforilação de tirosino-quinases e de p38 MAP; (b) shedding de L-selectina;
(c) desgranulação de grânulos secundários e vesículas secretórias, mas não de grânulos
azurofílicos; (d) resistência à apoptose espontânea; (e) translocação nuclear do fator de
transcrição NF-kB; (f) transcrição gênica e secreção de citocinas e quimiocinas pró-
inflamatórias; (g) polarização celular. Os neutrófilos estimulados com MNCF – em
10
comparação aos estimulados com outro atraente (CXCL-8) – polarizaram mais tardiamente e
apresentaram níveis superiores de transcrição de genes de mediadores inflamatórios. Quando
neutrófilos pré-tratados com dexametasona foram estimulados, os níveis de transcrição
gênica de mediadores inflamatórios foram mantidos frente a MNCF e inibidos frente a
CXCL8. Dentre os mediadores que tiveram o gene transcrito em níveis altos inclui-se a
própria CXCL8, cuja expressão protéica foi também avaliada. Neutrófilos –pré-tratados ou
não com dexametasona– estimulados com MNCF secretaram altos níveis de CXCL-8 no
sobrenadante. Já, frente a outros estímulos, neutrófilos pré-tratados com dexametasona
tiveram a secreção de CXCL8 fortemente inibida. Nossos resultados indicam que os
mecanismos envolvidos no fato da inflamação aguda desencadeada por MNCF ser resistente
ao efeito de glicocorticóide incluam a capacidade dessa lectina de induzir altos níveis de
produção de mediadores inflamatórios, manifesta mesmo em neutrófilos pré-tratados com
dexametasona. Nosso estudo está em consonância com os avanços feitos nos últimos dez
anos no campo de investigações sobre neutrófilos, que atribuem a essas células funções mais
complexas do que a ingestão e eliminação de microorganismos, com destaque para a sua
capacidade de transcrever genes e expressar produtos que estão intimamente ligados às
respostas inflamatória e imunitária.
Palavras chave: MNCF, migração de neutrófilos, dexametasona, transcrição gênica, secreção
de citocinas
11
TITRE: L'activation des neutrophiles par le MNCF a pour conséquence la
transcription des gènes et la secrétion de cytokines, et cela même dans des conditions
anti-inflammatoires
RÉSUMÉ
Le recrutement des leucocytes dans les sites inflammatoires est déclenché par des
médiateurs d'origines diverses. Il comprend plusieurs étapes coordonnées, susceptibles d'être
inhibées par des glucocorticoïdes. Ces derniers diminuent la synthèse et/ou la sécrétion de
molécules pro-inflammatoires ou de molécules d'adhérence et augmentent l'expression de
l'annexine-1, une protéine anti-inflammatoire. Nous avons étudié le MNCF (Facteur
Chimioattractant pour les Neutrophiles et dérivé des Macrophages), une lectine liant le D-
galactose et capable de recruter les neutrophiles, y compris dans les conditions anti-
inflammatoires représentées par le traitement par la déxamethasone. Cette propriété
particulière pourrait inspirer le montage de nouvelles thérapeutiques anti-inflammatoires et
justifie que l’on s’intéresse particulièrement à la compréhension du mécanisme d’action du
MNCF sur les neutrophiles humains. C’est dans ce contexte que nous avons démontré que
l’interaction du MNCF avec des composants de la matrice extracellulaire permet à ce facteur
de surmonter les effets anti-inflammatoires de la déxamethasone (Toledo et al. 2007). Le but
de cette recherche était de caractériser l’activation des neutrophiles humains par le MNCF, en
la comparant à celle déclenchée par d’autres agonistes, après traitement par la
déxamethasone.
Des tests in vitro ont montré que le MNCF se lie à la surface des neutrophiles et
provoque la migration de ces cellules, qu’elles soient ou non pré-traitées par la
dexamethasone. Les effets du MNCF étaient très semblables à ceux d’autres agonistes du
12
neutrophiles, à savoir : (a) l’inhibition de l’apoptose spontanée ; (b) le relarguage de CD62L ;
(c) la phosphorylation de tyrosine-kinases et de la p38MAPkinase ; (e) la dégranulation des
vésicules de sécrétion et des granules spécifiques mais pas des granules azurophiles ; (f) la
translocation du facteur de transcription NF-κB et (g) la transcription des gènes et la
secrétion de cytokines pro-inflammatoires et de chimiokines. Cependant, les effets du
MNCF étaient spécifiques et non dus à des agonistes des neutrophiles contaminants, comme
le LPS, le TNF-α ou des chimiokines. En effet, ces effets du MNCF n’étaient pas modifiés
par la déplétion en LPS sur detoxigel, ni par le récepteur soluble du TNF, ethanercept et ils
persistaient après pré-traitement des neutrophiles par la dexamethasone, ce qui supprimait les
effets de chimiokines comme CXCL8. Enfin, la pré-activation des neutrophiles par le LPS
n’était pas nécessaire pour que soient observés les effets du MNCF, qui se distinguaient en
cela des effets de la galectine 3. Nos résultats indiquent que l’inflammation aïgue induite par
le MNCF in vivo, même chez les animaux traités avec de la dexamethasone, s’explique par la
capacité de ce facteur à produite des taux élevés de médiateurs pro-inflammatoires par un
mécanisme insensible aux glucocorticoïdes. Nos données sont en accord avec différentes
études rapportées ces derniers dix ans, qui montrent que l’action des neutrophiles ne se limite
pas à l’élimination des microbes mais comprend la transcription de gènes et une participation
active aux réponses inflammatoire et immunitaire.
Mots clés: MNCF, migration des neutrophiles, déxamethasone, transcription des gènes,
secrétion de cytokines
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TITLE: Neutrophil activation by MNCF lectin results in gene transcription and
secretion of cytokines, even in anti-inflammatory conditions
ABSTRACT
Leukocytes are accumulated, in the inflammatory process, because to action of the
wide array of stimuli. This event envolved several and coodenated steps whose inhibited by
glucocoticoids, such as dexamethasone. Dexamethasone affects human neutrophils in
different ways. It shows negative effects (on synthesis and secretion of pro-inflammatory
mediators) and positive effects (for example, on annexin I). Among the inducers of leukocyte
migration, MNCF, a galactose-binding lectin, has been described as an agonist and
chemoattractant for neutrophils, both in vivo and in vitro. MNCF shows as peculiar activity
the migration of neutrophils resistant to dexamethasone actions which awakes great interest
in undertanding the mechanism of action on polymorphonuclears by this lectin. Our first step
was study human MNCF-stimulated neutrophils pre-incubated with dexamethasone. In these
conditions, MNCF, in the absence of F-actin polymerization: (a) protects neutrophils from
spontaneous apoptosis, (b) induces tyrosine and p38 MAP quinases phosphorylation, (c)
induces CD62L shedding, (d) degranulates secretory vesicles and secundary granules, but not
azurophilic granules, in the dependent manner of tyrosine and MAP quinases and Src family,
(e) translocates the transcription factor NF-kB and, (f) induces transcription and secretion of
pro-inflammatory cytokines and chemokines. In parallel, human neutrophils pre-incubated
with dexamethasone and stimulated with MNCF did not show CD62L shedding and F-actin
polarization, but the in vitro migration was maintained. Besides, we already observe
translocation of NF-kB from cytoplasm to nucleous which it activates the genic transcription
14
and secretion of inflammatory mediators, such as CXCL8. The results, showed here,
strengthens previous results, demonstranting that MNCF as a agonist to neutrophils, beyond
increase the half life them. Although,
dexamethasone modifies some effects of MNCF on neutrophis, this glucocorticoid does not
inhibit the cellular response to the studied lectin. Thus, the maintenance of inflammatory
mediators, dependents to NF-kB, during the inflammatory process, could explain, even
parcialy, the break in the resitance to glucocorticoids actions by MNCF in the neutrophil
migration.
Keywords: MNCF, neutrophil migration, dexamethasone, genic transcription, secretion of
cytokines
15
INTRODUÇÃO
RESPOSTA INFLAMATÓRIA AGUDA
As respostas inflamatórias são operacionalmente caracterizadas por dor, rubor, calor e
edema no sítio de infecção, refletindo três tipos de mudanças nos vasos sanguíneos locais. A
primeira é o aumento do diâmetro vascular, levando a um aumento no fluxo sanguíneo,
especialmente nos pequenos vasos sanguíneos locais. A segunda mudança é que as células
endoteliais, que formam os vasos sanguíneos, são ativadas para expressar moléculas de
adesão que promovem a interação com leucócitos circulantes. A combinação da taxa do fluxo
sanguíneo diminuída e da expressão das moléculas de adesão permite aos leucócitos aderirem
ao endotélio e migrarem em direção aos tecidos perivasculares, em um processo denominado
extravasamento. Todas essas mudanças são produzidas, em grande parte, pela atividade de
fatores quimiotáticos liberados pelos macrófagos ativados presentes no tecido inflamado
(Deuel et al., 1981; Doherty et al., 1987; Brandes et al., 1991; Worthen et al., 1992). No
ínicio de um processo inflamatório, as primeiras células atraídas ao local são os neutrófilos,
seguidos pelos monócitos, que se diferenciam em macrófagos nos tecidos. Nas etapas
posteriores, outros leucócitos, como eosinófilos e linfócitos, chegam ao foco inflamatório
(Kay, 1970; Bienenstock et al., 1986). A terceira maior mudança nos vasos sanguíneos locais
é o aumento da permeabilidade vascular. Em vez de permanecerem firmemente próximas
entre si, as células endoteliais que limitam a parede dos pequenos vasos sanguíneos se
separam, permitindo a saída de fluido e proteínas do sangue, que se acumulam. De tais
eventos decorrem o edema, a dor e o rubor localizados, que correspondem à clássica tríade de
manifestações da inflamação.
16
Os neutrófilos, como já mencionado, constituem a primeira população celular que
atravessa as paredes dos vasos em direção ao sítio inflamatório. A migração de neutrófilos é
finamente regulada, ocorre através de uma sequência de ativação de proteínas adesivas e de
seus ligantes, expresso nos neutrófilos e nas células endoteliais (Lawrence & Springer, 1991;
Von Andrian et al., 1991; Konstantopoulos & Mcintire, 1996), como esquematizado de
maneira resumina na figura 1.
Figura 1. Recrutamento de neutrófilos é dissecável em passos distintos envolvendo
interações seqüenciais de diferentes famílias de moléculas de adesão em leucócitos e
células endoteliais. O rolling envolve interações entre membros da família das selectinas (L-,
P- e E-selectina) e seus respectivos ligantes que apresentam o resíduo Lewis
x
. A ativação de
integrinas da família β2 e moléculas de adesão da família das imunoglobulinas (ICAMs) por
uma variedade de estímulos proporciona firme adesão do neutrófilos ao endotélio inflamado,
evento que irá proporcionar a transmigração celular, por muitas vezes citada como diapedese.
A molécula PECAM-1 presente tanto na superfície de neutrófilos como células endoteliais
possue papel primordial neste processo.
17
A participação de interações do tipo proteína-carboidrato na resposta inflamatória
começou a ser evidenciada no início da década de 1980, por Stoolman & Rosen (1983). Tais
interações, reversíveis, determinam ligações de baixa afinidade, que fazem o leucócito rolar,
em velocidade menor do que a do fluxo sanguíneo, ao longo da superfície do endotélio
vascular, adjacente ao local de inflamação. As selectinas, glicoproteínas transmembrânicas
expressas no endotélio vascular - P-selectina, E-selectina - e nos leucócitos - L-selectina -
medeiam esse fenômeno, ao reconhecerem açúcares ligantes cognatos, geralmente
imobilizados em estruturas do tipo mucina. O neutrófilo expressa L-selectina
constitutivamente, molécula que interage com oligossacarídeos do tipo mucina (Varki, 1997),
induzidos por mediadores inflamatórios (Spertini et al., 1991). A L-selectina é desprendida
da superfície celular por clivagem proteolítica (shedding), 5 a 10 minutos após a ativação do
neutrófilo (Kishimoto et al., 1989; Griffin et al., 1990; Smith et al., 1991; Bazil &
Strominger, 1994), mecanismo que, aparentemente, limita o recrutamento dessas células
durante processos inflamatórios (Hafezi-Moghadam et al., 2001). As selecinas-P e -E são
expressas em resposta a estímulos inflamatórios apropriados. Segundos após o estímulo do
endotélio, a P-selectina, constitutivamente sintetizada e estocada nos corpúsculos de Weibel-
Palade, é transportada para a superfície do endotélio e rapidamente distribuída na membrana.
A P-selectina interage com uma sialoglicoproteína (P-selectin glycoprotein ligand-1, PSGL-
1) (Moore et al., 1992), uniformemente distribuída em neutrófilos quiescentes. Na presença
de estímulos inflamatórios, a ligação da P-selectina é acompanhada por uma rápida
distribuição de PSGL-1 no uropódio dos neutrófilos ativados e pode sinalizar a transição do
rolling para a fase de captura dessas células (Bruehl et al., 1997). A expressão da P-selectina
é de curta duração, e a adesão tem continuidade pela E-selectina, molécula que também se
liga a sialoglicoproteínas da superfície do neutrófilo (revisto por Wagner & Roth, 2000).
18
O sinal que dispara a etapa seguinte do processo de migração é oriundo das selectinas
ativadas. Os domínios citoplasmáticos, das selectinas-L e PSGL-1 ativadas estão implicados
em mecanismos de transdução de sinais, que levam a ativação das integrinas nos neutrófilos
(Simon et al., 1995, 1999; Macever & Cummings, 1997; Williams & Solomkin, 1999). Dessa
forma, as selectinas promovem transição ordenada do processo de adesão, induzindo a
expressão temporal e sequencialmente adequada das integrinas. As integrinas são
glicoproteínas transmembrânicas heterodiméricas, expressas na superfíce de leucócitos como
heterodímeros de CD11/CD18. Estabelecem interações do tipo proteína-proteína, com seus
ligantes expressos na superfície das células endoteliais, que correspondam a moléculas da
superfamília das imunoglobulinas - ICAM-1 e ICAM-2. Essas interações determinam a
adesão firme do leucócito ao endotélio (revisto por Wagner & Roth, 2000).
Nessa etapa da cascata de adesão, além dos sinais induzidos pelas selectinas ativadas,
moléculas atraentes de leucócitos passam a atuar. O endotélio dos microvasos, em condições
de inflamação, produz atraentes, como o fator ativador de plaquetas (PAF), leucotrieno B4
(LTB4) e várias quimiocinas. Esses atraentes são imobilizados por ligação a proteoglicanos,
na superfície luminal das células endoteliais (revisto por Witko-Sarsat et al., 2000). Dentre as
quimiocinas, a interleucina-8 (CXCL-8) é considerada o principal atraente de neutrófilos,
uma vez que sua neutralização por anticorpos monoclonais inibe o recrutamento de
neutrófilos para o sítio de inflamação (Folkesson et al., 1995; Matsumoto et al., 1997; Sekido
et al., 1993). A CXCL8 é derivada do tecido e internalizada pelas células endoteliais das
vênulas pós-capilares. Através de vesículas de plasmalema, CXCL-8 é transportada
abluminalmente até a superfície dessas células, onde se associa aos microvilos e é
apresentada aos leucócitos aderidos (Middleton et al., 1997). De uma maneira geral, as
moléculas atraentes induzem a translocação e a ativação de CD11/CD18, do pool de
19
estocagem intracelular, para a superfície do leucócito. A expressão de integrinas na superfície
celular é aumentada três a dez vezes, minutos após o estímulo por mediadores inflamatórios
como TNF-α, C5a, LTB4, fMLP e quimiocinas (Huber et al., 1991; Sengelov, 1996;
Borregaard & Cowland, 1997). As próprias moléculas de integrinas estão envolvidas em
eventos de sinalização intracelulares, uma vez que suas caudas citoplasmáticas constituem
sítios para fosforilação e atuam na ligação a proteínas do citoesqueleto (Alpin et al., 1998).
Os neutrófilos integram os sinais induzidos simultaneamente pelo engajamento de integrinas
e pelas citocinas inflamatórias ou atraentes, de maneira a ativar uma série de eventos
intracelulares que resultam no spreading celular e na sua locomoção (revisto por Witko-
Sarsat et al., 2000). Os neutrófilos adquirem morfologia polarizada, o que permite que se
locomovam vetorialmente para o tecido perivascular (Snyderman & Goetzl, 1981; Clark &
Brudgge, 1995; Lauffenburger & Howitz, 1996), num processo de transmigração.
A transmigração de neutrófilos ocorre em etapas que são coordenadas tanto por
moléculas de adesão, como por mediadores solúveis derivados do microambiente local
(Bruyninckx et al., 2001). Esse processo envolve interações homotípicas estabelecidas por
CD31 (PECAM-1) que é uma molécula de adesão de expressão constitutiva, membro da
superfamília das imunoglobulinas. Moléculas de CD31 têm distribuição juncional em células
endoteliais e são também expressas na superfície do leucócito, o que viabiliza a interação
homotípica e a passagem do leucócito pela junção endotelial (revisto por Bianchi et al.,
1997). Recentemente, demonstrou-se que CD31 desencadeia sinalização intracelular em
neutrófilos, regulando a “rede” de actina, o que afeta, em última instância, a forma das
células que migram através da junção entre duas células endoteliais (Dimitrijevic et al.,
2002). CD31 promove a migração haptotática dos leucócitos, entendendo-se tal fenômeno
20
como a migração ao longo de um gradiente de moléculas atraentes ligadas a um substrato
fixo (Muller et al., 1993; Vaporcyan et al., 1993; Muller, 1995). Além de CD31, atribuiu-se à
molécula de adesão juncional (JAM - membro da superfamília das imunoglobulinas),
concentrada seletivamente nas junções inter-endoteliais, um papel no processo de
transmigração de leucócitos em modelos murinos (Martin-Padura et al., 1998).
Vencida a barreira endotelial, o leucócito passa a se mover em direção ao gradiente de
atraente, estabelecido no espaço sub-endotelial. O atraente pode dirigir o movimento do
leucócito, ainda localizado na junção endotelial, desde que se difunda, a partir do sub-
endotélio, e estabeleça um gradiente juncional (Zocchi et al., 1996). A migração dos
neutrófilos através da matriz extracelular é mediada pelas integrinas β2, conjuntamente com
β1 e β3, α6β1, α5β1 e αvβ3, receptores para laminina, fibronectina e vitronectina. Essas
moléculas, que se encontram estocadas nos grânulos dos neutrófilos, durante a transmigração,
sob o estímulo de atraentes, são rapidamente expressas na membrana plasmática (Bohnsack
et al., 1995; Hendey et al., 1996; Loike et al., 1999; Roussel & Gingras, 1997). A locomoção
leucocitária requer a formação contínua de novos contatos adesivos na região frontal da
célula, enquanto a região posterior desliga-se do substrato adesivo (Lauffenburger &
Horwitz, 1996).
DESGRANULAÇÃO NEUTROFÍLICA
Leucócitos polimorfonucleares (neutrófilos) exercem papel crucial na primeira linha
de defesa contra bactérias, fungos e protozoários invasores. A resposta inflamatória mediada,
como já mencionado, é processo em múltiplas etapas, envolvendo a adesão inicial dos
21
neutrófilos circulantes ao endotélio vascular ativado, o subsequente extravasamento e
migração de neutrófilos para o sítio inflamatório e, por último, a eliminação do
microorganismo estranho, através de fagocitose, geração de metabólitos reativos do oxigênio
e liberação de substâncias microbicidas. Muitas dessas etapas são dependentes da
mobilização de grânulos citoplasmáticos e vesículas secretórias. Os vários subtipos de
grânulos contidos nos neutrófilos constituem um importante reservatório não somente de
proteínas antimicrobianas, proteases e componentes do burst oxidativo - mas também de uma
ampla gama de receptores de membrana para moléculas de adesão - expressas na matriz
extracelular do endotélio - e de mediadores inflamatórios solúveis, como demonstra a Tabela
1. A mobilização controlada dessas organelas citoplasmáticas é que permite a transformação
dos neutrófilos de células circulantes passivas em potentes efetoras da imunidade inata. Além
disso, a exocitose regulada dos grânulos dos neutrófilos faz com que o arsenal de proteínas
citotóxicas neles contido seja liberado de maneira direcionada, evitando na maioria das vezes,
dano maior para o hospedeiro (revisto por Faurschou e Borregard, 2003).
22
Tabela 1. Constituintes dos grânulos neutrofílicos
Classe de
constituintes
Exemplo Compartimento
Enzimas microbicidas
Hidrolases ácidas
Proteinases neutras
Peptídeos antimicrobianos
Receptores
Receptores de adesão
Moléculas efetoras
Proteínas citoplasmáticas
Mieloperoxidase
Lisozima
Fosfolipase A2
Catepsinas
β-glucoronidase
N-acetil-β-glucosaminidase
Fosfatases
Serprocidinas (elastase, proteinase-3,
catepsina-G, azurocidina (CAP-37))
Gelatinase
Colagenase
Defensinas
Lactoferrina
Catelicidinas
Transmembrana (CR1 ou CD35, TNF-
R, fMLP-R, IL8-R)
Linkados a GPI (Fcγ-RIII, uPAR,
CD14)
CR3 (CD11b), CR4 (CD11c)
Componentes da NADPH oxidase
(gp91-phox, p22-phox)
iNOS
Fgr (tirosino quinase da família Src)
Hck (tirosino quinase da família Src)
Grânulos azurofílicos
Grânulos azurofílicos e específicos
Grânulos específicos
Grânulos azurofílicos
Grânulos azurofílicos
Grânulos específicos
Grânulos específicos
Grânulos azurofílicos
Grânulos específicos
Grânulos específicos
Grânulos específicos e/ou vesívulas secretórias
Grânulos específicos e/ou vesívulas secretórias
Grânulos específicos e/ou vesívulas secretórias
Grânulos específicos e/ou vesívulas secretórias
Grânulos azurofílicos
Grânulos específicos
Grânulos azurofílicos
23
Grânulos azurofílicos
Os grânulos azurofílicos são empacotados com proteínas hidrolases ácidas e
antimicrobianas e, por muitos anos, foram vistos como lisossomos primários. Como os
lisossomos, os grânulos azurofílicos contêm granulofisina (CD63) em sua membrana (Cham
et al., 1994). No entanto, diferentemente dos lisossomos, eles não expressam LAMP-1 e
LAMP-2 (lysosome-associated membrane protein) (Cieutat et al., 1998) e nem o receptor
manose-6 fosfato, essenciais para as enzimas lisossomais (Dahms et al., 1989; Michaelson et
al., 1992; Nauseef et al., 1992). Consequentemente, os grânulos azurofílicos são melhor
vistos como grânulos secretórios regulados e não como lisossomos especializados (Cieutat et
al., 1998). Ao lado de CD63, as seguintes proteínas de membrana foram identificadas nos
grânulos azurofílicos: CD68 (Saito et al., 1991), presenilina (Mirinics et al., 2002),
estomatina (Feuk-Lagerstedt et al., 2002) e ATP-ase H+ do tipo vacular (Nanda eta l., 1996).
Os grânulos azurofílicos são muito heterogêneos, em tamanho e forma. Já foram
descritas várias subpopulações que diferem quanto a características físicas, citoquímicas e
morfológicas (Bainton et al., 1971; Parmley et al., 1987; Rice et al., 1987; Egesten et al.,
1994). Com base na ordem de formação durante a mielopoiese, os grânulos azurofílicos
podem ser divididos em dois grupos principais: os pobres em defensina, formados no início
do estágio promielocítico e os ricos em defensina, formados na transição
promielocítico/mielócito (Arnljots et al., 1998).
Os grânulos azurofílicos sofrem exocitose limitada em resposta à estimulação
(Sengelov et al., 1993; Faurshou et al., 2002) e contribuem primariamente para a morte e
degradação de microorganismos fagocitados, localizados no interior dos fagolisossomos
(Joiner et al., 1989).
24
Grânulos peroxidase-negativos
Grânulos peroxidase-negativos podem ser específicos (ou secundários) e de gelatinase
(ou terciários) (Kjeldsen et al., 1992). Grânulos específicos e de gelatinase diferem
significativamente entre si quanto ao conteúdo protéico e propriedades secretórias. Grânulos
específicos são grandes e ricos em substâncias antibióticas, o mesmo não acontecendo com
os pequenos grânulos de gelatinase. Por outro lado, os grânulos de gelatinase são mais
facilmente exocitados do que os específicos (Sengelov et al., 1995). Essas características
refletem a importância dos grânulos de gelatinase como um reservatório de enzimas que
degradam a matriz extracelular e de receptores de membrana, implicados no extravasamento
e diapedese dos neutrófilos. Os grânulos específicos participam de atividades antimicrobianas
dos neutrófilos, através da mobilização de um arsenal de substâncias antimicrobianas tanto
para os fagossomos quanto para o exterior celular (Joiner et al., 1989; Jesaitis et al., 1990;
Mollinedo et al., 1997).
Vesículas secretórias
São vesículas endocíticas (Borregard et al., 1987) que estocam receptores associados
à membrana, necessários para que ocorram as primeiras fases da resposta inflamatória
mediada por neutrófilos. A mobilização das vesículas secretórias ocorre em resposta a uma
ampla variedade de estímulos inflamatórios (Sengelov et al., 1993a e 1993b). Essas vesículas
são ricas em β2-integrina CD11b/CD18 (Mac-1, CR3) (Sengelov et al., 1993b), receptor de
complemento 1 (CR1) (Sengelov et al., 1994), receptores para peptídeos bacterianos
formilados (formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP)-receptors) (Sengelov et al.,
1994b), receptor ácido de LPS CD14 (Detmers et al., 1995), receptor FcγIII CD16 (Detmers
25
et al., 1995) e metaloprotease leucolisina (Kang et al., 2001). Em seguida a exocitose, as
substâncias que estavam contidas nos grânulos são incorporadas à membrana plasmática. A
decorrente mudança de superfície celular permite ao neutrófilo estabelecer firme contato com
o endotélio vascular ativado.
Importância da desgranulação na resposta inflamatória aguda mediada por
neutrófilos
Os compartimentos intracelulares mobilizáveis dos neutrófilos diferem quanto à
hierarquia exocítica. Vesículas secretórias têm maior capacidade de liberação extracelular,
seguida pelos grânulos de gelatinase, grânulos específicos e azurofílicos (Sengelov et al.,
1993 e 1995). Assim, in vitro, o estímulo com concentrações nanomolares de mediadores
inflamatórios, como fMLP, leva a uma rápida e quase completa descarga das vesículas
secretórias, sem afetar significativamente a liberação dos diversos grânulos (Sengelov et al.,
1993c). A estimulação mais intensa com um agonista como PMA, induz ampla liberação dos
grânulos de gelatinase, moderada liberação dos grânulos específicos e baixa exocitose dos
grânulos azurofílicos (Kjeldsen et al., 1992; Faurschou et al., 2002). Hierarquia semelhante
de exocitose tem sido demonstrada na migração de neutrófilos in vivo (Sengelov et al., 1995),
podendo ser reproduzidas pela elevação gradual nos níveis de Ca
+2
intracelular (Sengelov et
al., 1993). Vários estímulos são capazes de induzir aumento na concentração citosólica do
Ca
+2
, incluindo ativação de L-selectina, CD11b/CD18 e o receptor de fMLP (Laudanna et al.,
1994; Ng-Sikorski et al., 1991). As vias de sinalização envolvidas no processo de
desgranulação neutrofílica são complexas e foram, até o momento, apenas parcialmente
mapeadas e resumidamente esquematizada na Figura 2.
26
Figura 2. Mecanismos de transdução de sinal por receptores que ativam a
degranulação. A figura ilustra as principais vias de sinalização transmembrânicas ativadas
por receptores expressos em fagócitos e implicadas no processo de degranulação celular.
Resumidamente, o recrutamento de neutrófilos para o foco inflamatório ocorre num
intervalo de minutos a horas e constitui um evento essencial na resposta aguda do hospedeiro
contra patógenos invasores. Esse recrutamento envolve uma série de eventos de exocitose
regulados, que mudam gradualmente o estado funcional do neutrófilo. A interação neutrófilo-
endotélio ativa a mobilização das vesículas secretórias (Borregaard et al., 1994), mobilização
esta que enriquece a superfície dos neutrófilos com β2-integrina CD11b/CD18 e é
acompanhada pelo shedding de L-selectina (Sengelov et al., 1993; Borregaard et al., 1994). β
2-integrinas translocadas interagem com moléculas de adesão endoteliais da família ICAM,
mediando adesão firme e iniciando a transmigração neutrofílica (Carlos e Harlan, 1994).
27
PIC PI3K
DAG
PKC
PLD
PKC
PTKs
Ras
Proteínas Rho
(Cdc42, Rac, Rho)
MAPK
Transcrição gênica
JNK/SAPK e p38MAPK
Rearranjo do citoesqueleto
degranulação degranulação
degranulação
Integrinas L-selectina Receptores Fc citocinas
Receptores
Acoplados
A proteína G
Membrana plasmática
PIC PI3K
DAG
PKC
PLD
PKC
PTKs
Ras
Proteínas Rho
(Cdc42, Rac, Rho)
MAPK
Transcrição gênica
JNK/SAPK e p38MAPK
Rearranjo do citoesqueleto
degranulação degranulação
degranulação
Integrinas L-selectina Receptores Fc citocinas
Receptores
Acoplados
A proteína G
Membrana plasmática
A exocitose dos grânulos de gelatinase libera metaloproteases colagenolíticas, as
quais desempenham papel significante na degradação da membrana basal vascular durante o
extravasamento de neutrófilos (Delclaux et al., 1996). Na seqüência do processo de migração
através do tecido intersticial, grânulos específicos e azurofílicos são parcialmente exocitados
(Sengelov et al., 1995), mobilizando receptores para componentes da matriz extracelular
(Singer et al., 1989), bem como enzimas que degradam a matriz, incluindo colagenase e
serina proteases, que facilitam a migração.
Frente à agressão bacteriana, o neutrófilo ativa seus sistemas antimicrobianos,
dependentes ou não de oxigênio, pela liberação dos grânulos azurofílicos e específicos para o
fagossomo ou para o exterior celular (Joiner et al., 1989). A diversidade funcional das
substâncias contidas nos grânulos permite ao neutrófilos atacar a bactéria por diferentes vias.
Alguns constituintes dos grânulos - como defensinas (Wimley et al., 1994), BPI (Ooi et al.,
1987), hCAP-18 (Turner et al., 1998), lactoferrina (Chapple et al., 1998), lisosima (Tanida et
al., 1992) - exercem atividade antimicrobiana através da ruptura da membrana bacteriana.
Outras - como NGAL (Goetz et al., 2002), lactoferrina (Oram e Reiter, 1968) Nramp-1
(Jabado et al., 2000) - interferem nas vias metabólicas dependentes de ferro. Outras ainda -
como citocromo b558 e MPO (Klebanoff, 1999) - participam da geração de espécies tóxicas
do oxigênio. Uma característica interessante dos constituintes granulares, como defensinas,
azurocidina e hCAP-18, é a capacidade de induzir quimiotaxia de células T CD4+ e CD8+
(Yang et al., 2000a e 2000b; Chertov et al., 1996), que amplifica a resposta inflamatória e
estabelece um elo entre os mecanismos da imunidade inata e adaptativa.
28
MORTE CELULAR
A morte celular, definida como perda irreversível da estrutura e funções vitais da
célula, ocorre por dois processos morfologicamente distintos: necrose e apoptose.
A necrose se caracteriza pela perda da integridade da membrana plasmática. Diferentes
agressões, como isquemia, hipoxia, hipertermia, irradiação e metabólitos tóxicos, podem levar
à perda abrupta da integridade da membrana plasmática (citólise) e à alteração de seus
gradientes eletroquímicos. A liberação dos constituintes intracelulares para o meio extracelular
estimula a resposta inflamatória e amplia a lesão tecidual.
A apoptose é processo ativo cuja marca registrada é a autodigestão controlada dos
constituintes celulares, decorrente da ativação de proteases endógenas; tem sido comparada,
metaforicamente, a um "suicídio celular". A ativação dessas proteases compromete a
integridade do citoesqueleto, provocando um verdadeiro colapso da estrutura celular. Em
resposta à contração do volume citoplasmático, a membrana celular forma bolhas e altera o
posicionamento de seus lipídios constituintes. Em células quiescentes, a distribuição de
fosfatidilserina se faz primariamente no folheto interno da membrana plasmática. No processo
de apoptose a fosfatidilserina é exposta no folheto externo da membrana. O novo
posicionamento da fosfatidilserina serve como sinalizador para que células fagocíticas das
proximidades englobem os fragmentos celulares e completem o processo de degradação.
Durante a apoptose ocorrem alterações características no núcleo celular, atribuídas à ativação
de endonucleases que degradam o DNA. Como resultado, o núcleo torna-se picnótico e a
cromatina se condensa nas porções adjacentes à membrana nuclear. Finalmente, o núcleo entra
em colapso e se fragmenta. Simultaneamente, as bolhas que se formam no citoplasma separam
a célula em fragmentos circundados por membrana, contendo partes do núcleo e organelas
29
intactas (corpos apoptóticos). Como já salientado, o processo de degradação dos restos
celulares são fagocitados pelos macrófagos teciduais ou células adjacentes (revisto por
Thompson, 1999 e Kerr et al., 1972) é completado.
A apoptose pode ser deflagrada por estímulos externos através de receptores
específicos na superfície celular, chamados receptores da morte, ou por estímulos internos de
estresse intracelular, tais como lesão do DNA e perturbações no ciclo celular ou nas vias
metabólicas (Figura 3). As proteases que são ativadas por esses eventos são as caspases,
fundamentais no processo de morte celular (revisto por Thompson, 1999 e Kerr et al., 972).
As caspases estão presentes no citosol sob a forma de pró-enzimas inativas, tornando-se ativas
após clivagem proteolítica nos resíduos do ácido aspártico (Thompson, 1999). Pelo menos 14
membros dessa família já foram identificados nos mamíferos e estão envolvidos no processo
de inflamação e apoptose. Uma vez ativada, a maioria das caspases é capaz de catalizar a
ativação de outros membros da família, resultando em amplificação da cascata proteolítica.
Alguns membros, tais como a caspase-8, ocupam posição proximal na cascata proteolítica e
agem como reguladores e iniciadores. Outros, como a caspase-3, são mais distais e agem
como efetores da fragmentação celular (Patel e Gores, 1998) (Figura 3). Contrariamente às
proteases armazenadas nos lisossomos ou ativadas no citosol pelo cálcio, que atuam sobre um
espectro amplo de substratos inespecíficos, as caspases têm substratos bem restritos, o que
lhes assegura seletividade e especificidade no processo de proteólise. Tais substratos incluem
proteínas envolvidas no reparo de danos e na replicação do DNA, no ciclo celular, na
sinalização de transdução e na manutenção da integridade da estrutura celular. O ataque a
todos esses alvos impede o reparo; toda a estrutura do citoesqueleto e do núcleo se rompe e há
desestruturação da célula (Kerr et al., 1972; Thompson, 1999).
30
A apoptose pode ser ativada através de receptores de morte, presente na superfície
celular e ativada em resposta ao acoplamento de ligantes específicos. A maioria desses
receptores da morte é membro da superfamília de receptores para o fator de necrose tumoral
(TNF-α) caracterizada por apresentar um domínio extracelular rico em cisteína e um domínio
citoplasmático, chamado domínio da morte (ou death domain), essencial para transdução
intracelular do sinal de morte. Dentre tais receptores, o mais estudado e melhor caracterizado é
o receptor Fas (CD95 ou APO-1) (Figura 3) (Faubion e Gores, 1999; Kerr et al., 1972).
Quando o ligante Fas se acopla ao receptor Fas, as moléculas individuais do receptor
se trimerizam formando agregados de cadeias da morte. Um vez agregadas, as cadeias da
morte se ligam a uma proteína adaptadora, presente no citosol, chamada cadeia da morte
associada ao Fas ("Fas-associated death domain", FADD). A ligação desse complexo à pro-
caspase-8 resulta na ativação dessa enzima, por clivagem proteolítica. A caspase-8 pode então,
diretamente ou pela via mitocondrial, ativar a caspase-3 (caspase efetora) (Figura 3).
31
Figura 3. Vias implicadas no processo de apoptose celular.
Além dos receptores de morte, a apoptose pode também ser ativada por sinais de
estresse intracelular que resultem em disfunção mitocondrial, tais como lesão do DNA (via
gene p53), alterações nas vias metabólicas (aumento do cálcio intracelular, redução do pH,
estresse oxidativo), drogas, toxinas ou privação dos fatores de crescimento. Na presença de
sinais de estresse intracelular ocorre a translocação de proteínas pró-apoptóticas (Bax, Bid,
etc) do citosol para a mitocôndria. Essas proteínas fazem parte da família de proteínas Bcl-2
cujos membros exercem importante função reguladora da apoptose (Figura 3). A translocação
das proteínas pró-apoptóticas para a mitocôndria resulta na liberação de citocromo-c, presente
entre as membranas mitocondriais externa e interna, para o citosol. Ali o citocromo-c forma
um complexo com o fator ativador da apoptose 1 ("apoptosis-activacting factor 1, apaf-1"),
levando à ativação da caspase-9 que, por sua vez, ativa caspases efetoras. Portanto, a ativação
das caspases pode ser desencadeada via receptores de morte ou via disfunção mitocondrial,
com liberação do citocromo-c (revisto por Thompson, 1999 e Kerr et al., 1972).
Apoptose na resolução da inflamação
A apoptose de neutrófilos e sua subseqüente ingestão por macrófagos é o principal
mecanismo para a eliminação de neutrófilos que tenham sido recrutados para o sítio
inflamatório, promovendo assim a resolução da inflamação (Cox et al, 1995; Savill, 1997). A
apoptose constitutiva de neutrófilos senescentes envolve a cascata proteolítica das caspases –
caspases, calpainas e o proteassoma – que ativam quinases; por exemplo, capase-3 ativa
PKCd (Pongracz et al, 1999). Mediadores inflamatórios, como LPS ou GM-CSF, retardam a
apoptose de neutrófilos por causar: (i) estabilidade mitocondrial; (ii) redução da atividade de
caspase-3 (Watson et al, 1999); (iii) diminuição da expressão do gene Bax, um membro pró-
apoptótico da família Bcl-2 (Dibbert et al, 1999). Por outro lado, citocinas anti-inflamatórias,
32
como IL-10, aceleram a apoptose de neutrófilos ativados por LPS (Cox, 1996). O
extravasamento e a apoptose de neutrófilos inflamatórios ocorrem normalmente em
camundongos que são deficientes em Fas e Fas-ligante, demonstrando que a apoptose
mediada pela interação Fas-FasL não é essencial para regular a meia vida de neutrófilos na
resposta inflamatória aguda (Fecho and Cohen, 1998).
Macrófagos podem ativar a apoptose de neutrófilos através do reconhecimento de
FasL na superfície dessas células, ou através da liberação extracelular de FasL na forma
solúvel (Brown and Savill, 1999). A fagocitose de neutrófilos apoptóticos por macrófagos
envolve o complexo avb3 CD36-integrina que interage com um ligante, ainda não
identificado, na superfície de neutrófilos apoptóticos (Savill et al, 1992). Macrófagos
estimulados com partículas de glucanas digeríveis deixam de reconhecer o sistema avb3, mas
passam a reconhecer fosfatidilserina exposta na superfície de células apoptóticas. CD36
parece agir como um cofator, necessário tanto para o sistema avb3 como para o
reconhecimendo de fosfatidilserina (Fadok et al, 1998a). CD14 participa da fagocitose de
linfócitos apoptóticos, mas não de neutrófilos apoptóticos. Finalmente, a fagocitose de
neutrófilos apoptóticos inibe ativamente a produção de IL-1β, CXCL8, IL-10, GM-CSF,
TNF-α, leucotrieno C4 e tromboxano B2 por macrófagos humanos (Fadok et al, 1998b). A
supressão da produção de mediadores inflamatórios é importante para a etapa de resolução
da inflamação aguda
33
GLICOCORTICÓIDES E INFLAMAÇÃO
Glicocorticóides são comumente utilizados no tratamento de uma ampla gama de
doenças inflamatórias agudas, incluindo artrite reumatóide, asma e vasculite. No entanto, os
mecanismos pelos quais os glicocorticóides exercem suas ações imunosupressoras e anti-
inflamatórias não estão completamente esclarecidos. Há evidências de que agem através de
várias vias em múltiplas células-alvo, tecidos e órgãos para iniciar seus efeitos pleiotrópicos.
É importante ressaltar que os glicocorticóides desempenham papéis fisiológicos e
farmacológicos através da ativação do eixo adrenal hipotalâmico pituitário (HPA;
hypothalamic-pituitary-adrenal) (Munck et al., 1984). Muitas das ações dos glicocorticóides
sobre células são mediadas pela interação com receptores específicos de glicocorticóides
intracelulares do tipo II. Esses receptores estão distribuídos em diferentes tecidos, mantendo
habitualmente uma expressão da ordem de 0.03-3 x 10
5
moléculas por célula. O receptor de
glicocorticóide do tipo II humano é membro da superfamília de receptor esteróide, com motif
zinc-finger característico para interação com DNA. Duas variantes alternativas resultam do
splicing de um único gene (Hollenberg et al., 1985), dando origem à forma α do receptor,
constituída de 777 aminoácidos, e à forma β do receptor, uma proteína de 742 aminoácidos.
A forma β do receptor é incapaz de se ligar ao corticóide, embora tenha capacidade de se
ligar ao DNA. A expressão da forma β do receptor em muitas células e tecidos motiva a
especulação de que ele possa funcionar como um inibidor endógeno de ação dos
glicocorticóides (Bamberger, et al., 1995). Receptores de glicocorticóides são expressos em
monócitos, macrófagos, granulócitos, e todas subpopulações de linfócitos (Schlaghecke et al.,
1994).
34
Os glicorcorticóides exercem poderosos efeitos sobre funções dos neutrófilos,
particularmente as relacionadas com sensibilização e ativação. Muitos estudos do efeito dos
glicocorticóides têm sido realizados in vitro, usando altas doses de esteróide sintético, como
dexametasona. Efeitos similares aos exercidos in vitro pelos glicocorticóides são
reproduzidos in vivo pelo cortisol liberado. A literatura descreve muitos efeitos dos
glicocorticóides sobre neutrófilos, tais como: inibição da interação com outras células
(Petroni et al., 1988); diminuição na expressão de moléculas de adesão, principalmente,
CD11/CD18 e L-selectina (Burton et al., 1995; Filep et al., 1997; Yossef et al., 1995);
inibição da liberação de mediadores, como quimiocinas (Wertheim et al., 1993), citocinas
(Mianki et al. 1996; Pang et al. 1997), radicais livres (Direnzo et al. 1994; Tsuji & Shioya,
1994; Fukushima et al. 1990) e enzimas proteolíticas (Direnzo et al. 1994; Llewellyn-Jones et
al. 1994). Os glicocorticóides inibem ainda atividades dos neutrófilos, como bactericida (Abe
et al. 1996; Roilides et al. 1993), migratória (Llewellyn-Jones et al. 1994; Salak et al. 1993;
Hirasawa et al. 1992) e de desgranulação (Joseph et al. 1995; Schleimer et al. 1989).
Há exemplos de proteínas neutrofílicas sendo positivamente reguladas pelos
glicocorticóides. A expressão do receptor para interleucina-1 é elevada por ação de
esteróides, um efeito contra-balanceado pela diminuição na produção do ligante IL-1. Sugere-
se que esta contra-regulação dos níveis de receptor e ligante promova um controle endógeno
da resposta imune pelos glicocorticóides (Munck et al., 1992). Várias outras proteínas são
também positivamente reguladas pelos glicocorticóides. A expressão da proteína endógena
anti-inflamatória anexina-1, também conhecida como lipocortina-1, tem sido descrita como
induzida por glicocorticóides em neutrófilos murinos (Perretti & Flower 1996).
35
MNCF
Cunha & Ferreira (1986), demonstraram que monocamadas de macrófagos
peritoneais de ratos, ao serem estimuladas com LPS, liberam no sobrenadante um fator que
induz migração seletiva de neutrófilos, in vitro e in vivo. A peculiaridade dessa atividade -
manifestar-se mesmo em animais-teste pré-tratados com glicocorticóide - sugeria que a
molécula responsável fosse diferente dos atraentes conhecidos. Os autores denominaram-na
MNCF - "macrophage derived chemotactic factor".
Os trabalhos de purificação do MNCF, realizado pelo grupo de pesquisa liderado pela
Profa. Dra. Maria Cristina Roque-Barreira, iniciaram-se quando algumas moléculas
mediadoras da imunidade natural vinham sendo identificadas como lectinas endógenas,
motivando o ensaio de adsorção do sobrenadante de macrófagos em resinas com açúcar
acoplado. Constatou-se adsorção seletiva da atividade MNCF em D-galactose imobilizada,
sugerindo que a molécula correspondesse a lectina ligante desse açúcar. A cromatografia de
afinidade em coluna de açúcar propiciou método de isolamento do MNCF, eluído com
solução do açúcar específico. A preparação obtida passou a ser utilizada nos estudos
subseqüentes (Dias-Baruffi et al.,1993; Dias-Baruffi et al.,1995a). O CRD da molécula de
MNCF é responsável por sua capacidade de recrutar neutrófilos, já que a presença de D-
galactose inibe seletivamente a atividade exercida in vivo e in vitro (Dias-Baruffi, et al.,
1993; Dias-Baruffi, et al., 1995b). MNCF induz a movimentação dos neutrófilos por
mecanismo haptotático, por ligar-se a laminina da matriz extracelular e a glicanas da
superfície de neutrófilos (Dias-Baruffi, et al., 1995b; Dias-Baruffi, et al., 1999).
MNCF induz migração de neutrófilos em ratos e camundongos; em ambos a atividade
é resistente a glicocorticóides. A migração neutrofílica é inibida por Toxina pertussis,
36
sugerindo que a sua ligação a glicanas de superfície induza sinalização via receptores
acoplados a proteína G.
MNCF tem abrangente atividade como mediador do processo inflamatório, já que,
além de atuar diretamente sobre neutrófilos, liga-se a glicanas de moléculas IgE da superfície
de mastócitos, promovendo desgranulação celular e ampliando, dessa forma, o recrumento de
neutrófilos para o foco inflamatório (Moreno et al., 2003). Mais ainda, a produção e a
secreção de MNCF por macrófagos são seguidas de sua ligação a glicanas da superfície
dessas mesmas células (Bernardes 2000, dissertação de mestrado). MNCF é armazenado em
macrófagos residentes de ratos e a ativação celular mobiliza-o para a superfície, seguindo-se
liberação para o meio externo. Macrófagos estimulados sintetizam MNCF de novo (Moreno,
2002 tese de Doutorado). Recentemente, MNCF foi também detectado por anticorpos IgY,
produzidos em nosso laboratório, em mastócitos da linhagem RBL-2H3 (comunicação
pessoal).
No que se refere à especificidade fina de reconhecimento de carboidratos, MNCF
liga-se não somente a β-galactose (Galβ4Glic), mas também - e com maior afinidade - a
glicanas contendo alfa-galactose terminal (Galα3Galβ4GlicNAc) (Dissertação de mestrado
de Bernardes,E.S., 2000), reproduzindo a especificidade descrita por alguns autores para
galectina-3 (Sato & Hughes, 1994).
37
OBJETIVOS
Nossos objetivos nesse estudo foram:
1. ampliar a caracterização da lectina MNCF quanto aos eventos de ativação celular
induzidos em neutrófilos humanos;
2. identificar mecanismos de ação peculiares de MNCF e que justifiquem sua
resistência ao efeito anti-inflamatório de glicocorticóides; e,
3. avaliar possíveis vias de sinalização pelas quais MNCF exerça seu papel de indutor
de migração neutrofílica.
38
MATERIAIS E MÉTODOS
Projeto analisado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do HCRP e da FMRP-
USP (no. Processo 9618/2004)
Obtenção da lectina MNCF
MNCF foi produzido em condições assépticas, de acordo com metodologia descrita
por Toledo et. al., 2007. Macrófagos da linhagem P388-D1 adaptados ao meio livre de soro,
Macrophage-SFM (Gibco BRL, Life Technologies, Inc, Grand Island, USA) foram
estimulados na presença de LPS (10 µg/ml; Sigma, St Louis, MO, USA) diluído em meio
RPMI (RPMI-1640; Gibco), à 37ºC, em ar atmosférico umidecido acrescido de CO
2
5%, por
um período de 40 minutos. Ao final deste período, a solução contendo LPS foi descartada e
as células cuidadosamente lavadas por três vezes com RPMI e novamente incubadas por 24
horas em RPMI na ausência de LPS. Em seguida, os sobrenadantes foram reunidos e
submetidos à centrifugação (2000 xg, 5 minutos, 4ºC) e a posterior concentração em sistema
de Amicon (membranas YM-10; Amicon division, WR, Grace e Co., Beverey, MA, USA).
Essas preparações foram submetidas à cromatografia de afinidade em coluna de agarose-
melibiose (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA). Após a remoção do material não
adsorvido, através de lavagem com PBS (pH 7.4), a fração adsorvida foi eluída com D-
galactose 0.4M (Sigma), seguindo-se ultradiafiltração em Sistema Amicon. Algumas
preparações foram adicionalmente cromatografadas em coluna de Detoxi-Gel
TM
Endotoxin
Removing Gel (Pierce) para eliminação de contaminação por LPS. Foram realizadas a leitura
39
de absorbância em 280 nm e dosagem protéica pelo método de BCA (Sigma), para estimar a
concentração protéica de cada preparação. O controle de qualidade das preparações de
MNCF foi realizado através de ensaio de atividade biológica in vivo e análise eletroforética
em SDS-PAGE (Dias-Baruffi 1995, Toledo et. al. 2007).
PARTE I
Separação de neutrófilos
Para realização de ensaios in vitro, neutrófilos humanos do sangue periférico foram isolados
utilizando Mono-Poly Resolving Medium (Flow Laboratories, Rockville, MD, USA),
conforme instruções do fabricante. Foram coletados 20 ml de sangue, de voluntários sadios,
em seringa heparinizada (20 UL/ml; Liquemine, Produtos Roche Químicos e Farmacêuticos
S.A., Rio de Janeiro, RJ, Brasil). Amostras de 5 ml foram cuidadosamente colocadas sobre 4
ml de meio de separação. As amostras foram centrifugadas a 400 x g, durante 50 minutos, à
25º C. O plasma e o anel de mononucleares foram desprezados e o anel de neutrófilos foi
lavado com 50 ml de RPMI a 500 xg por 10 minutos, por duas vezes. O sedimento de células
foi ressuspendido em 1 ml de meio RPMI. Contagem global de células foi realizada em
câmara de Neubauer (Neubauer Improved Bright-Line, Loptik Labor, Germany), partindo da
suspensão diluída 20 vezes em solução de Turk (20ml ácido acético glacial, 0.5g azul de
metileno e água para 1L). A preparação de neutrófilos foi analisada quanto à viabilidade,
através do método de exclusão por azul de Tripan, e pureza por análise de tamanho e
granulosidade através de citometria de fluxo em FacSort (Becton Dickinson
Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA), cujos foram tratados pelos programas Cell
Quest e WinMDI (Newton et al, 1998).
40
Biotinilação da lectina MNCF
Amostras de 1 mg de MNCF foram submetidas à marcação com sulfo- NHS- LC- biotina
(sulfosuccinimidil-6-(biotinamida) hexanoato) (Pierce). Para tanto, a cada amostra, diluída
em 500 µl de bicarbonato de sódio 50 mM (pH 8.5) e adicionou-se um volume de 37 µl de
biotina 1 mg/ml, diluída em água oxigenada. Após 2 horas de incubação em gelo, as amostras
foram diafiltradas contra PBS, utilizando-se sistema Centricom (Amicon
Division) e
estocada à -20°C.
Interação de MNCF-biotinilado e neutrófilos pré-tratados ou não com dexametasona
Citometria de fluxo
Neutrófilos humanos (10
6
) foram pré-tratados ou não por 60 min à 37
o
C com dexametasona
(25µM ou 10 µg/ml) (Merck, Darmstadt, Germany). Após lavagens por centrifugação (500
xg, 10 min, 4
o
C) os neutrófilos foram fixados com paraformaldeído 4% por 20 min, à
temperatura ambiente. As células foram novamente lavadas e tratadas por 5 minutos com
solução de glicina 0.1M, para então serem incubadas com MNCF biotinilado (10 µ
g/amostra), por 30 minutos, à temperatura ambiente. Após duas lavagens com PBS, as células
foram incubadas com estreptoavidina conjugada a fluoresceína (1:1000) (Sigma), por 30
minutos à temperatura ambiente. Após duas lavagens com PBS o sobrenadante foi descartado
e o pellet foi ressuspenso para 300 µl de PBS para análise por citometria de fluxo em
FACsort.
41
Microscopia de Fluorescência
Neutrófilos humanos (10
5
) aderidos a lamínulas tratadas com solução 2% de Biobond (EM
Sciences, Fort Washington, PA) foram processados como descrito no item anterior. Após
incubação com estreptoavidina-FITC, as células passaram por 10 lavagens, de 5 min cada,
com PBS e, por último lavagem rápida em água ultrapura (Barnsted Thermol, Dubuque,
OWA, USA). As lamílulas foram montadas em Fluormount G (EM Sciences). O material foi
analisado em microscópio de fluorescência Eclipse 800 (Nikon Eclipse 800, Nikon USA,
Melville, NY). As imagens foram adquiridas com o auxílio da câmara digital Nikon DXM
1200 (Nikon).
Migração de neutrófilos in vitro
Utilizou-se sistema Transwell (Corning Costar Corporation, Cambridge, MA) de 24 poços
com membrana de policarbonato com poros de 5 µm. A cada um dos poços adicionaram-se
as amostras ensaiadas contidas em 600 µl de meio de cultura RPMI. As amostram foram:
MNCF (10 µg/ml), fMLP (10
-7
M; Sigma) e CXCL8 (50 ng/ml; R&D Systems , Minneapolis,
MN). Poços contendo apenas meio correspondiam ao controle negativo. Suspensões de
neutrófilos humanos (10
6
) pré-tratados com dexametasona (25µM) por 60 minutos, ou apenas
RPMI, foram adicionados às peças de inserção do sistema. Após 1 hora de incubação à 37
o
C,
as células emigrantes foram coletadas e centrifugadas por 10 minutos a 500 xg. O número de
neutrófilos contidos em cada poço foi estimado pela quantificação de mieloperoxidase.
42
Atividade mieloperoxidase (MPO)
Triton X-100 1% (Sigma) e tetrametilbenzidina (TMB) (Pierce) foram adicionados às
amostras contendo neutrófilos emigrantes. Reação colorimétrica foi paralisada pela adição de
ácido sulfúrico 2N após 10 minutos e a leitura colorimétrica realizada a 450 nm em leitor de
microplacas (Power Wavex – BIO-TEK INSTRUMENTS, INC). O número de neutrófilos
contido nas amostras foi inferido utilizando-se a regressão linear de curva padrão gerada pela
leitura de absorbância proporcionada por número conhecido de neutrófilos (0.05-1.0 x 10
5
neutrófilos/ml)
Expressão de CD62L
Neutrófilos humanos (10
6
) tratados ou não com dexametasona (25µM), foram incubados com
PMA (10 ng/ml; Sigma), CXCL8 (25 ng/ml) ou MNCF (10 µg/ml), diluídos em RPMI, por
períodos de 5-120 minutos, à 37ºC. As células foram lavadas, por centrifugação, com RPMI e
ressuspendidas em 200 µl desse meio para reação com anticorpo monoclonal murino anti-
CD62L humano conjugado a FITC (Caltag Laboratories South San Francisco, CA). Como
controle de isotipo foi utilizada IgG1 murina de especificidade irrelevante. Decorridos 30
minutos de incubação, à 4ºC, com os anticorpos (10 µg/ml) as células foram lavadas e
ressuspensas em parafolmaldeído 2% para análise por FACsort.
43
Avaliação dos filamentos de F-actina
Citometria de fluxo
Neutrófilos humanos (10
6
) pré-tratados ou não com dexametasona (25µM), foram incubados
por diferentes períodos de tempo (1-60 min), com fMLP (10
-7
M), CXCL8 (50ng/ml) ou
MNCF (10 µg/ml) à 37ºC. As células foram então fixadas com paraformaldeído 4% por 20
min à temperatura ambiente. Após lavagem por centrifugação (10 min, 500 xg, 4
o
C) as
células foram permeabilizadas com Triton X-100, 0.3% (v/v), por 10 min e novamente
lavadas por centrifugação. Tratamento com glicina 0.1M foi realizado por 5 min à
temperatura ambiente. Após nova centrifugação para lavagem das células, estas foram
incubadas por 45 min à temperatura ambiente com Faloidina-Alexa 488 (1:500) (Molecular
Probes, Eugene, OR). Ao término do período de incubação, as células foram lavadas por
centrifugação e analisadas por citometria de fluxo.
Microscopia de fluorescência
Neutrófilos humanos (10
5
) aderidos por 20 min, à 37ºC, a lamínulas tratadas com Biobond 2,
foram processados como descrito em item anterior. Os filamentos de F-actina foram
revelados pela incubação das células com Faloidina-Alexa 488 (1:300) (Molecular Probes)
por 45 min. Seguiram-se 10 lavagens com PBS por 5 min cada e uma última lavagem, rápida,
com água ultrapura. As lâminas foram montadas em Fluoromount G (EM Sciences) e
analisadas em microscópio de fluorescência Eclipse E800 (Nikon). As imagens foram
adquiridas com o auxílio da câmara digital Nikon DXM 1200 (Nikon).
44
Western blot para NF-kBp50
A subunidade p50 do complexo NFκB foi detectado por Western blot, usando-se anticorpo
específico. Neutrófilos humanos (10
6
) pré-tratados, ou não, com dexametasona (25µM;
60min) e estimulados com CXCL8 (50ng/ml) ou MNCF (10µg/ml), por 2 horas à 37ºC. A
partir do sedimento de células estimuladas foram obtidos extratos protéicos da membrana, do
citoplasma e do núcleo preparados por fracionamento subcelular por Triton X-114 (JW
Goding - 1996 - Academic Press). Os extratos foram diluídos em tampão de amostra redutor
(10 mM Tris/HCl (pH 6.8)/1% (w/v) SDS/25% (v/v) glycerol/0.1 mM 2-
mercaptoethanol/0.03% (w/v) Bromophenol Blue), fervidos e submetidos à SDS-PAGE em
gel contendo 10% de acrilamida. Após separação eletroforética, o material foi
eletrotransferido para membrana de nitrocelulose (Millipore, Bedford, MA, U.S.A.). A
membrana foi incubada com solução PBS-BSA1%-Tween20 0,05% (tampão de bloqueio),
por 60minutos, à temperatura ambiente e incubada com anticorpo primário de cabra anti-NF-
κBp50 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), diluído em tampão de bloqueio
(1/200), por 16 horas, à 4°C. Seguiram-se lavagens das membranas e nova incubação com
anticorpo secundário de macaco anti-IgG de cabra conjugado à peroxidase (Santa Cruz
Biotechnology), diluído em tampão de bloqueio (1/200), por 60 min à temperatura ambiente.
Finalmente, a reação foi revelada usando-se solução de DAB (3,3’-diaminobenzidine liquid
substrate system tetrahydrochloride; Sigma).
45
Real-Time PCR para citocinas e quimiocinas
Neutrófilos humanos (10
6
células), pré-tratados ou não com dexametasona (25µM; 1h, 37ºC)
foram estimulados por 6 horas à 37ºC com MNCF (10 µg/ml), CXCL8 (50 ng/ml) ou fMLP
(10
-7
M) na presença de soro fetal bovino (5%), em ar atmosférico umidecido e 5% de CO
2
.
Ao final da incubação, as células foram coletadas e lavadas por centrifugação (500 xg, 10min,
4ºC) em PBS. O sedimento foi ressuspenso em 500 µl de Trizol (Invitrogen life
Technologies) para extração de ácidos nucléicos.
Extração de ácidos nucléicos
A extração de RNA total dos neutrófilos foi feita em Trizol, segundo recomendações do
fabricante. Brevemente, as amostras foram mantidas por 5 min em 500 µl de Trizol,
adicionando-se em seguida 100 µL de clorofórmio (Merk, Darmstadt, Germany). Após
incubação de 3 minutos à temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas a 12.000 xg
por 15 minutos. O sobrenadante foi transferido para outro tubo e o RNA nele contido foi
precipitado com 250 µL de álcool isopropílico (Sigma). Decorridos 10 minutos de incubação
à temperatura ambiente, as amostras foram novamente centrifugadas. O sedimento foi lavado
com 500 µl de etanol 75% e centrifugado a 7.500 xg por 5 minutos. Após descarte do
sobrenadante o sedimento, contendo o RNA foi ressuspenso em água livre de DNAse e
RNAse (Gibco).
46
Transcrição reversa
O RNA total foi convertido em cDNA por transcrição reversa, sendo cada reação preparada
em um volume final de 20 µL. Inicialmente, 1 µg de RNA e 20 pmol de Oligo dT (Invitrogen
life Technologies, Carlsbad, CA, USA), foram incubados à 70°C por 5 minutos e, em
seguida, mantidos em gelo por mais 5 minutos. Adicionou-se às amostras uma mistura
contendo 0.5 mM de dATP, dCTP, dGTP e dTTP (100mM dNTP Set, PCR Grade,
Invitrogen), 20 unidades de inibidor de RNAse (RNaseOut Ribonuclease Inhibitor,
Invitrogen life Technologies), 1 µL de transcriptase reversa (ImProm-II Reverse
Transcriptase, Promega Corporation, Madison, WI, USA), 3 mM de MgCl
2
e 4 µL de tampão
da reação. A mistura foi incubada por 5 minutos à 25°C, seguida de 60 minutos à 42°C e 15
minutos à 70°C. As amostras foram então tratadas com 10 µg de RNAse (Gibco), por 30
minutos à 37ºC e submetidas à reação de PCR em Tempo Real.
PCR em Tempo Real
As reações de PCR em Tempo Real foram preparadas em volume final de 25 µL, contendo 2
µL de cDNA, 5 pmol de cada primer e 12,5 µL de SYBR Green PCR Master Mix (Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA), contendo 3 mM de MgCl2, 200 µM de dATP, dCTP e
dGTP, 400 µM de dUTP, 1,25 unidades de AmpliTaq GoldR DNA polimerase e 0,5 unidades
de AmpEraseR uracil-N-glicosilase (UNG). Foi utilizado o Sistema de PCR em tempo real da
Applied Biosystems 7300 para detectar e quantificar a amplificação do DNA na presença de
SYBR Green. Os parâmetros de ciclagem termal foram feitos de acordo com as instruções
do fabricante. A mistura foi incubada a 50°C por 2 minutos, seguida de 10 minutos a 95°C,
47
para ativar a enzima AmpliTaq Gold. Seguiram-se 40 ciclos de incubação a 95°C por 15
segundos e a 60°C por 1 minuto. Todas as quantificações foram normalizadas em relação a
um controle endógeno (β-actina).
Primers utilizados na reação de PCR em Tempo Real
As seqüências de RNA mensageiro para as citocinas e quimiocinas foram retiradas do banco
de dados Website NCBI. Todos os primers foram desenhados com o programa Primer
Express (v 2.0, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Os 6 pares de primers
(Erviergas, São Paulo, SP, Brasil) eram constituídos de 20 pares de bases, possuiam
temperatura de melting de 58°C e amplificavam fragmentos de cerca de 100 pares de bases.
A Tabela 2 resume as seqüências dos primers específicos.
Quantificação de CXCL8
Neutrófilos humanos (5 x 10
5
) foram incubados ou não com dexametasona (25µM), diluída
em RPMI, por 60 minutos, à temperatura ambiente. Após incubação, as células foram lavadas
com RPMI por centrifugação (500 xg, 4
o
C) por 10 minutos e adicionadas a poços individuais
de uma placa de cultura com 24 poços. Os estímulos, LPS (5 µg/ml), fMLP (10
-7
M) ou
MNCF (10 µg/ml), foram diluídos em RPMI acrescido de 5% de soro fetal bovino e
adicionados aos neutrófilos. As células foram incubadas em estufa umidecida e 5% de CO
2
,
por 12 horas. No final do período de incubação, o sobrenadante da cultura foi removido e
centrifugado por 10 min, 500x g a 4
o
C. Os sobrenadantes foram coletados e estocados à –
20
o
C até o momento de uso. A detecção de CXCL8 nos sobrenandantes coletados foi feita
48
por método de ELISA, utilizando-se OPTEIA
TM
Human CXCL8 ELISA Kit II (BD
Biosciences, San Diego, CA, USA) de acordo com as recomendações do fabricante.
Tabela 2 – Seqüência dos primers específicos
Primer Sequence (5' 3')
TNF-α
Forward: GCAGAGGACCAGCTAAGAGGG
Reverse: GGAAGAGAACCTGCCTGGC
IL1-β
Forward: CAAGGCACAACAGGCTGCT
Reverse: CATTTCACTGGCGAGCTCAG
CXCL8
Forward: AAACCACCGGAAGGAACCA
Reverse: GCACCTTCACACAGAGCTGC
CXCL10
Forward: AACCGTACGCTGTACCTGCAT
Reverse: CACGTGGACAAAATTGGCTTG
CCL4
Forward: GCGTGACTGTCCTGTCTCTCC
Reverse: AAGAAAAGCAGCAGGCGGT
β-actin
Forward: AAGGATTCCTATGTGGGCGA
Reverse: TCCATGTCGTCCCAGTTGGT
49
PARTE II
Purificação de neutrófilos humanos do sangue periférico
Neutrófilos humanos do sangue periférico foram isolados à temperatura ambiente, utilizando
Polymorphprep (AXIS-SHIELD PoC AS, Oslo, Norway) conforme instruções do fabricante.
Para tanto, amostras de 21 ml de sangue, obtidas de voluntários sadios do "Etablissement
Français du Sang", em tubos BD Vacutainer, adicionados com EDTA, foram centrifugadas
por 20 minutos a 900 rpm. O sobrenadante, contendo plasma e plaquetas, foi novamente
centrifugado por 10 minutos, a 2400 rpm. O plasma, depletado de plaquetas, foi recolocado
sobre as hemáceas e, após homogeneização, as amostras foram cuidadosamente colocadas
sobre 3.5 ml de Polymorphprep (Axis-Shield Poc. AS, Norton MA, USA), e centrifugadas a
2000rpm, durante 45 minutos. O plasma e o anel de mononucleares foram descartados e o
anel de neutrófilos coletado. Após lavagem com 50 ml de PBS (Gibco) a 1500 rpm por 10
minutos, as hemáceas que contaminavam a preparação foram lisadas com solução NaCl
0.2%, por 1 minuto, e igual volume de NaCl 1.6%. Após nova lavagem, o sedimento de
neutrófilos foi ressuspenso em 3 ml de PBS. Contagem global de células foi realizada em
câmara de Neubauer, partindo da suspensão diluída 20 vezes em solução de Turk. A
viabilidade dos neutrófilos foi verificada através do método de exclusão por azul de Tripan.
Apoptose em neutrófilos incubados com MNCF
Neutrófilos (10
6
), diluídos em RPMI, acrescido de soro fetal bovino 10%, foram incubados
com MNCF (0,0005-50 µg/ml) ou somente com meio, por 16 horas, à 37°C ou à 4°C. Para
50
detecção de neutrófilos em processo apoptose ou de necrose utilizaram-se as marcações com
7AAD conjugado a PE e Annexin-V conjugada a FITC, por 15 minutos, à temperatura
ambiente, de acordo com recomendações do fabricante (Euromedex, Souffel Weyersheim,
France). As células foram, imediatamente, submetidas à leitura por citometria de fluxo e
posterior análise usando o programa Cell Quest. Em alguns ensaios, neutrófilos foram pré-
tratados com etanercept 1µg/ml (um receptor solúvel de TNF-α).
Avaliação da desgranulação neutrofílica através da expressão de CD11b, CD35, CD63 e
CD66
Um total de 10
6
neutrófilos, diluídos em 500 µl de HBSS
++
, foram pré-incubados ou
não com diferentes inibidores de tirosino-quinases e, posteriormente, estimulados por rhTNF-
α (20ng/ml), rhCXCL8 (50ng/ml) ou MNCF 10µg/ml) por diferentes intervalos de tempo, à
37ºC, em tubos ependorfs revestidos com BSA 1%. A reação foi paralisada com 1 ml de
HBSS
++
gelado e as células foram centrifugadas por 10 minutos a 1400 rpm, à 4°C. O
sedimento de células foi ressuspenso e incubados por 45 min, à 4ºC, com anticorpos
específicos ou isotipo controle, conjugados a FITC ou PE (BD Biosciences), diluídos em
PBS-BSA1%, azida sódica 0.1%. As células foram lavadas com PBS-Azida 0.1% e fixadas
em solução Fix-FACs (PBS-Azida 0.1%-formaldeído 1%), até o momento de leitura por
citometria de fluxo.
51
Análise de fosforilação de proteínas tirosino-quinase e p38 MAP quinase
Neutrófilos (2x10
6
), diluídos em 500 µl de HBSS
++
foram estimulados em tubos ependorfs
revestidos com BSA 1% por 20 minutos a 37°C, com MNCF 10µg/ml, rhCXCL8 50ng/ml ou
rhTNF-α 20ng/ml. A reação foi paralisada com 1 ml de HBSS
++
gelado e as células foram
centrifugadas rapidamente (10-20 segundos) em alta rotação (5000 rpm). As amostras foram
ressuspendidas em 30 µl de tampão de amostra aquecido contendo SDS (0.1 M Tris, pH 6,8,
4% SDS, 1.8 mM glicerol, 1.5 mM 2-ME, 4 mM ortovanadato, 40 kallikrein inhibitory units
(KIU)/ml aprotinina, 8 mM leupeptina, 80 ug/ml quimostatina, 4 mM phenylmethanesulfonyl
fluoride) e imediatamente fervidas por 10 minutos. Para análise de fosforilação de proteínas
tirosino-quinases totais, as amostras foram aplicadas em gel de poliacrilamida gradiente 7-
15% e submetidas à migração eletroforética durante uma noite, à 4°C. Para análise de p38
MAPK fosforilada, as amostras foram aplicadas em gel de poliacrilamida 10% e submetidas
à migração eletroforética por 2 horas à temperatura ambiente. Ao final da eletroforese,
procedeu-se a eletro transferência das proteínas para membrana de nitrocelulose (Hybond-
ECL), feita em tampão de Western Blot contendo 24mM Tris, 190 mM Glicina e 20% etanol,
durante 3 horas, à 4°C. A membrana foi saturada com tampão TBS (25mM Tris, 120mM
NaCl, 500mM KCl) acrescido de-Tween 0.1%-BSA 5% (tirosino-quinase) ou TBS acrescido
de Tween 0.1%-leite desnatado 5% (p38MAPK), denominados tampão de saturação, durante
1 hora a temperatura ambiente para posterior incubação com anticorpo monoclonal de
camundongo anti-phosphotyrosine-PY20-HRP(1/1000) ou policlonal de coelho anti-
phosphop38MAPK (1/1000), diluídos em tampão de saturação, durante 16 horas, à 4°C. As
membranas foram lavadas em TBS-Tween 0.1% e incubadas com anticorpo secundário anti-
IgG de coelho conjugado à peroxidase para análise de p38MAPK durante 1 hora a
52
temperatura ambiente. A reação de ambas quinases foi revelada por Western Blot Luminol
Reagent em filme Kodak. A revelação de p38MAPK total foi feita pela reação com anticorpo
policlonal de coelho anti-p38MAPK após remoção dos anticorpos primário e secundário
utilizados para detecção de phosphop38MAPK. A incubação durou 3 horas, à 55°C, e foi
feita na presença de tampão de stripping contendo 62.5M Tris 0.5M pH 6.8, 2% SDS,
100mM beta-mercaptoetanol. Para a análise quantitativa foi utilizado o software NIH Image
1.63.
Análise estatística
A análise estatística foi feita pelo teste de Student-Newman-Keuls, através da utilização do
programa INSTAT (INSTAT software, GrafhPad, San Diego, CA).
53
RESULTADOS
PARTE I
MNCF interage na superfície de neutrófilos pré-tratados ou não com dexametasona
O reconhecimento por MNCF de ligantes na superfície de neutrófilos humanos, foi
avaliado por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência utilizando-se MNCF
biotinilado, cuja ligação foi revelada pelo conjugado estreptoavidina-FITC. Como controles
negativos foram utilizados neutrófilos pré-tratados, ou não, com dexametasona incubados
apenas com estreptavidina-FITC. A exposição de neutrófilos à lectina MNCF biotinilada
aumentou a intensidade média de fluorescência (MIF), indicando ligação da lectina à
superfície celular (figura 4A). Análise por microscopia de fluorescência confirma a
ocorrência dessa interação e mostra a distribuição homogênea do MNCF ligado à superfície
dos neutrófilos (figura 4B).
Análises similares foram realizadas utilizando neutrófilos pré-tratados com
dexametasona. Os ensaios demonstram que o pré-tratamento das células não interferiu na
ligação de MNCF (figura 4A). Por citometria de fluxo, a intensidade média de fluorescência
teve seu valor aumentado, indicando a ligação de MNCF à superfície celular. Da mesma
maneira, a distribuição de MNCF ligado à superfície celular continuou homogênea em
neutrófilos pré-tratados com dexametasona (figura 4B).
54
Figura 4. Dexametasona não interfere na ligação de MNCF à superfície de neutrófilos
humanos. Neutrófilos pré-tratados ou não com dexametasona (25 µM DX) foram incubados
com MNCF-biotina (10 µg; histograma vazio) ou somente meio (controle; histograma cheio).
A ligação revelada com estreptoavidina conjugada à FITC foi analisada por citometria de
fluxo (A) e microscopia de fluorescência (B).
Migração neutrofílica in vitro, induzida por MNCF, não inibida por dexametasona
Neutrófilos humanos, pré-tratados ou não com dexametasona, foram submetidos a
estímulo com diferentes atraentes: FMLP (10
-7
M), CXCL8 (50 ng/ml) e MNCF (10 µg/ml),
em sistema Transwell. A quantidade de neutrófilos que migraram foi estimada determinando-
se a concentração de mieloperoxidase no poço inferior, após a lise das células nele contidas.
55
Controle MNCF MNCF+DX
FITC DIC
A
B
Não pré-tratados DX Tratados DX
Controle MNCF MNCF+DX
FITC DIC
Controle MNCF MNCF+DX
FITC DIC
A
B
Não pré-tratados DX Tratados DX
Todos os estímulos utilizados induziram migração dos neutrófilos que não haviam sido pré-
tratados com dexametasona (figura 5). MNCF e CXCL8 tiveram atividades quimiotáticas
similares proporcionando a migração de 38 e 55 x 10
4
neutrófilos, respectivamente, enquanto
fMLP determinou a migração de 80 x 10
4
neutrófilos.
O pré-tratamento com dexametasona, por si só, não afetou o comportamento de
neutrófilos não estimulados (meio). Entretanto, ele inibiu drasticamente a migração induzida
por FMLP (figura 5). Migrações determinadas por MNCF e por CXCL8 não foram alteradas
pelo pré-tratamento com dexametasona (figura 5).
Figura 5. Migração in vitro de neutrófilos, induzida por MNCF, é resistente ao pré-
tratamento com dexametasona. O ensaio foi realizado em sistema Transwell. Os poços
continham os estímulos ensaiados e nos insertos foram aplicados 10
6
neutrófilos pré-tratados
com dexametasona (25 µM). Os estímulos utilizados foram MNCF (10 µg/ml), CXCL8 (50
ng/ml) ou fMLP (10
-7
M), tendo apenas meio como controle negativo. O número de
neutrófilos que migraram para os poços foi estimado pela determinação da concentração de
mieloperoxidase após 1h de estímulo. O resultado é expresso como número de neutrófilos
emigrantes.
56
meio FMLP CXCL8 MNCF
0
20
40
60
80
100
Neutrófilos x 104
Estímulos
semDX
comDX
MNCF regula a expressão de CD62L em neutrófilos humanos
A expressão de L-selectina (CD62L) foi monitorada na superfície de neutrófilos
submetidos a estímulo com PMA (10 ng/ml), MNCF (10 µg/ml) ou CXCL8 (25 ng/ml).
Como demonstra a figura 6A, todos os estímulos analisados provocaram decréscimo na
intensidade de fluorescência referente à molécula CD62L, indicando a ocorrência de
shedding de L-selectina. Frente ao estímulo com MNCF ou PMA, o shedding foi mais
eficiente; ocorreu a partir de 5 minutos de estímulo. Já CXCL8 só determinou shedding de
CD62L, partir de 15 minutos de estímulo (figura 6A). Aos 60 minutos, os decréscimos de
expressão de CD62L eram similares entre neutrófilos submetidos aos diferentes estímulos.
Neutrófilos pré-tratados com dexametasona (25µM) também foram monitorados
quanto à expressão de CD62L. Foi constatado, inicialmente, que o pré-tratamento das células
com dexametasona, isoladamente, não altera a expressão de CD62L (dados não mostrados).
O estímulo dos neutrófilos pré-tratados com dexametasona com PMA ou CXCL8 provocou
queda da expressão de superfície de CD62L, refletindo a ocorrência de shedding eficiente
desta molécula. (figura 6B). No entanto, o estímulo com MNCF não provocou queda da
expressão de CD62L, no decorrer de 60 minutos de monitoramento, fato indicativo de não ter
ocorrido shedding (figura 6B). A extensão do período de observação para 120 minutos
mostrou diminuição da intensidade de fluorescência para CD62L, sugerindo que apenas
tardiamente MNCF induziria shedding de L-selectina de neutrófilos pré-tratados com
dexametasona.
57
Figura 6. O pré-tratamento de neutrófilos com dexametasona inibe o shedding de
CD62L induzido por MNCF. Neutrófilos humanos, pré-tratados (B) ou não (A) com
dexametasona (25 µM) e estimulados por diferentes períodos de tempo (0-120 min) com
MNCF (10 µg/ml), CXCL8 (50 ng/ml) e PMA (10 ng/ml) tiveram a expressão de CD62L na
superfície celular analisada por citometria de fluxo. O resultado é representativo de três
ensaios independentes.
0 20 40 60 80 100 120
0,0
0,5
1,0
1,5
variação na expressão de CD62L
em relação ao controle
Tempo (minutos)
controle
MNCF
PMA
CXCL8
A
B
58
0 10 20 30 40 50 60
0,0
0,5
1,0
1,5
variação na expressão de CD62L
em relação ao controle
tempo (minutos)
controle
MNCF
PMA
CXCL8
Efeito de MNCF sobre o aumento de expressão de F-actina e a polarização de
neutrófilos pré-tratados, ou não, com dexametasona
Efeito de MNCF sobre neutrófilos não pré-tratados com dexametasona: indução de
polarização celular, não associada ao aumento de expressão de F-actina
Neutrófilos estimulados por CXCL8, fMLP ou MNCF foram analisados por
citometria de fluxo, quanto ao grau de expressão de F-actina.
Reproduzindo dados da literatura, os estímulos controles de CXCL8 e fMLP
induziram rápido (1 min) aumento da expressão de F-actina, evidenciada pela marcação com
faloidina. Esse rápido aumento do conteúdo de F-actina foi seguido de queda gradual,
completada em 10-20 min. (figura 7A). Os dados gerados por microscopia de fluorescência
demonstram que esses mesmos estímulos provocam polarização dos filamentos de F-actina e
formação de ruffles na superfície dos neutrófilos. (figura 8).
O estímulo de neutrófilos com MNCF evidenciou algumas peculiaridades.
Intrigantemente, as análises por citometria de fluxo demonstram que MNCF não aumenta a
expressão de F-actina, que se mantém em níveis similares ou inferiores aos detectados nas
células controles (não estimuladas), durante todo o período de 60 minutos de monitoramento,
sugerindo que MNCF não tivesse determinado polimerização de F-actina (figura 7A). A
despeito desse fato, a microscopia de fluorescência evidenciou que MNCF induziu suaves
ondulações na superfície dos neutrófilos (ruffles), visíveis após 1min de estímulo (dados não
mostrados). Já a polarização das células e a reorganização dos filamentos de F-actina só
aconteceram tardiamente, aos 60 minutos de estímulo, como mostra a figura 8.
59
Nossos dados sugerem que, na ausência de dexametasona, MNCF induza a
polarização tardia e dos filamentos de F-actina de neutrófilos sem, contudo, determinar o
esperado aumento de expressão de F-actina, como fazem os estímulos controles.
Interferência de dexametasona na expressão de F-actina e polarização de neutrófilos
estimulados por quimioatraentes
Neutrófilos pré-tratados com dexametasona e estimulados com MNCF (10 µg/ml),
CXCL8 (50 ng/ml) e fMLP (10
-7
M) foram avaliados quanto ao conteúdo e organização dos
filamentos de F-actina. Análise por citometria de fluxo mostrou que o pré-tratamento de
neutrófilos humanos com dexametasona proporcionou diminuição nos níveis de expressão de
F-actina, conforme evidencia a diferença da intensidade média de fluorescência
proporcionada pelas células pré-tratadas (DX) e não pré-tratadas (controle) com
dexametasona, na ausência de estímulo (figura 7B).
Sob estímulo de CXCL8, MNCF ou fMLP ocorreu rápido (1min) aumento no
conteúdo de F-actina (figura 7B), quando comparado ao conteúdo de F-actina mensurado em
neutrófilos pré-tratados com dexametasona e não estimulados. Entretanto, a expressão de F-
actina induzida pelos diferentes estímulos em neutrófilos pré-tratados com dexametasona
sempre esteve aquém dos níveis basais verificados em neutrófilos não tratados com
dexametasona e não estimulados (controle). No decorrer do tempo, verificou-se, nas células
estimuladas, diminuição gradual do conteúdo de F-actina (figura 7B). Os estímulos com
MNCF, CXCL8 ou fMLP proporcionaram resultados similares entre si, desenhando um perfil
de aumento e queda dos níveis de F-actina semelhante aos proporcionados por CXCL8 ou
60
fMLP em neutrófilos não tratados com dexametasona (figura 7A). Diferiram, entretanto, da
curva determinada por MNCF nas células não tratadas (figura 7A).
A microscopia de fluorescência revelou que neutrófilos pré-tratados com
dexametasona e estimulados com CXCL8 ou MNCF não reorganizaram os filamentos de F-
actina mesmo no intervalo de 1min (figura 9), correspondente ao ponto máximo de
expressão de F-actina observado por citometria de fluxo (figura 7B). Assim, o aumento
relativo do conteúdo de F-actina, proporcionado em condições anti-inflamatórias em resposta
aos estímulos com MNCF ou CXCL8 não foi acompanhado da polarização desses filamentos
(figura 9).
61
Figura 7. MNCF não induz aumento de expressão de F-actina em neutrófilos. A
expressão de F-actina foi monitorada em neutrófilos humanos pré-tratados (B), ou não (A)
com dexametasona e estimulados por CXCL8 (50 ng/ml), fMLP (10
-7
M) ou MNCF (10 µ
g/ml) por diferentes períodos de tempo A expressão de F-actina foi avaliada por citometria de
fluxo, através da reação com Faloidina conjugada à Alexa-Fluor 488. Os resultados são
expressos como Média da Intensidade de Fluorescência (MIF). O resultado é representativo
de três ensaios independentes.
B
A
0 10 20 30 40 50 60
100
200
300
400
500
600
700
Tempo (minutos)
MIF (média da intensidade de fluorescência)
(Tempo (minutos))
controle
fMLP
CXCL8
MNCF
62
0 10 20 30 40 50 60
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
MIF (média da intensidade de fluorescência)
Tempo (minutos)
DX
fMLP
CXCL8
MNCF
controle
Contro
D
Figura 8. Polarização dos filamentos de F-actina induzida pela lectina MNCF em
neutrófilos. Neutrófilos humanos, aderidos a lamínulas tratadas com Biobond 2%, foram
estimulados por CXCL8 (50 ng/ml), fMLP (10
-7
M) ou MNCF (10 µg/ml) por diferentes
períodos à 37
o
C. Neutrófilos não estimulados foram utilizados como controles. A polarização
dos filamentos de F-actina foi observada por microscopia de fluorescência através de reação
com Faloidina conjugada à Alexa-Fluor 488. As imagens são representativas de três ensaios
independentes.
63
Controle fMLP 15min
CXCL8 15min MNCF 60min
Controle fMLP 15min
CXCL8 15min MNCF 60min
Figura 9. Pré-tratamento com dexametasona inibe a polarização de filamentos de F-
actina em neutrófilos. Neutrófilos humanos, pré-tratados com dexametasona (25 µM),
foram aderidos a lamínulas e estimulados com CXCL8 (50 ng/ml) ou MNCF (10 µg/ml).
Preparações de neutrófilos também foram incubadas com dexametasona (DX) ou apenas
meio (controle). A polarização dos filamentos de F-actina foi observada por microscopia de
fluorescência através de reação com Faloidina conjugada à Alexa-Fluor 488. As imagens são
representativas de três ensaios independentes.
64
Controle DX
CXCL8 1min MNCF 1min
Controle DX
CXCL8 1min MNCF 1min
Pré-tratamento com dexametasona não inibe a translocação do fator de transcrição NF-
kB induzido por MNCF
Neutrófilos humanos (2x10
6
), pré-tratados ou não com dexametasona (60 min; 25 µM), e
estimulados com MNCF (10 µg/ml) tiveram a localização nuclear de NF-κB p50 monitorada
(figura 10). Nos extratos nucleares obtidos de células não estimuladas (controles), NF-κB
não foi detectado por anticorpos específicos, resultado que permaneceu negativo em extratos
que foram obtidos de neutrófilos pré-tratados com dexametasona. Nos extratos nucleares de
neutrófilos pré-tratados ou não com dexametasona e estímulados com MNCF, a subunidade
p50 de NF-κB foi imunomarcada (figura 10). Esse resultado indica que MNCF induz a
translocação de NF-κB para o núcleo do neutrófilo, independentemente do pré-tratamento da
célula com dexametasona.
Figura 10. MNCF induz a translocação de NF-kB para o núcleo de neutrófilos pré-
tratados, ou não, com dexametasona. Neutrófilos humanos pré-tratados, ou não, com
dexametasona (25 µM; 60 minutos), foram estimulados com MNCF (10 µg/ml) por 2 horas, à
37
o
C. A translocação de NF-kB p50 foi avaliada por Western blot de extrato nuclear,
utilizando-se anticorpo policlonal anti-NFkB p50. A revelação foi feita com anticorpo
conjugado à peroxidase. O resultado mostrado é representativo de três ensaios independentes.
NF-kB p50
CXCL8
Controle
MNCF
D
D
D
65
MNCF ativa a expressão gênica de TNFα, IL-1β, CCL4 e CXCL8 por neutrófilos
humanos, mesmo quando prétratados com dexameasona.
A transcrição dos genes das citocinas TNF-α e IL-1β e das quimiocinas CCL4 e
CXCL8 foi avaliada por PCR quantitativo em tempo real em neutrófilos humanos pré-
tratados, ou não, com dexametasona e posteriormente estimulados com MNCF, CXCL8 ou
fMLP (figura 11). O estímulo dos atraentes foi eficaz na indução da transcrição gênica de
todas as citocinas e quimiocinas testadas. Além disso, o potente efeito estimulatório da
lectina MNCF sobre neutrófilos foi, mais uma vez, demonstrado. MNCF, comparado aos
controles positivos (CXCL8 e fMLP), foi capaz de induzir transcrição gênica 10 vezes maior
para o gene de TNF-α e CXCL8 e 20 vezes maior para os genes de IL-1β e CCL4 (figura
11).
O pré-tratamento com dexametasona, por si só, não ativou a transcrição de nenhum
dos genes testados. No entanto a expressão de mRNA foi totalmente inibida em neutrófilos
pré-tratados com dexametasona e subseqüentemente estimulados com CXCL8 ou fMLP para
todos genes testados (figura 11). Por outro lado, o estímulo com a lectina MNCF sobrepôs os
efeitos inibitórios de dexametasona. A transcrição gênica induzida por MNCF para os genes
de TNF-α, IL-1 e CXCL8 foi apenas parcialmente inibida pelo glicocorticóide, mas ainda
assim foi 3, 60 e 30 vezes maior, respectivamente, do que a verificada no controle negativo
(neutrófilos não estimulados e pré-tratados com dexametasona). A transcrição gênica para
CCL4 induzida por MNCF não sofreu nenhuma inibição pelo tratamento com dexametasona
(figura 11), enquanto a transcrição para TNF-α induzida por MNCF foi a mais afetada pela
dexametasona.
66
Figura 11. Transcrição gênica de mediadores inflamatórios induzida por MNCF em
neutrófilos humanos pré-tratados, ou não, com dexametasona. Neutrófilos humanos pré-
tratados, ou não, com dexametasona (25 µM; 60 minutos), foram estimulados com CXCL8
(50 ng/ml), fMLP (10
-7
M) ou MNCF (10 µg/ml). As células foram submetidas à extração de
RNA total, que foi convertido em cDNA. Os níveis de expressão foram quantificados por
PCR em tempo real. Os painéis mostram a expressão dos mediadores TNF-α, IL1β, CXCL8 e
CCL4.
Neutrófilos pré-tratados com dexametasona sob estímulo de MNCF secretam CXCL8.
O sobrenadante de cultura de neutrófilos estimulados por MNCF durante 12 horas foi
avaliado quanto ao conteúdo de CXCL8. O sobrenadante de células que não haviam sido
meio MNCF CXCL8 fMLP
0
5
10
15
20
250
300
350
400
IL-1 beta (expressão relativa)
semDX
comDX
meio MNCF CXCL8 fMLP
0
10
20
30
40
150
200
250
300
CXCL8 (expressão relativa)
semDX
comDX
meio MNCF CXCL8 fMLP
0
5
10
15
300
350
400
CCL4 (expressão relativa)
semDX
comDX
meio MNCF CXCL8 fMLP
0,0
0,1
0,2
2,2
2,4
2,6
TNF-alpha (expressão relativa)
semDX
comDX
67
tratadas com dexametasona continha níveis de CXCL8 equivalentes aos induzidos pelos
estímulos controles, LPS e fMLP (figura 12).
O pré-tratamento de neutrófilos com dexametasona reduziu a secreção da quimiocina
CXCL8 induzida pelos estímulos de LPS e fMLP aos níveis detectados em células não
estimuladas (meio). Já o estímulo com MNCF determinou níveis altos de produção de
CXCL8, próximos aos proporcionados por neutrófilos não tratados com dexametasona
(figura 12). Esse resultado sugere que, mesmo em condições anti-inflamatórias, MNCF
induza secreção CXCL8, quimiocina sabidamente atraente de neutrófilos. A produção de
CXCL8 induzida por MNCF pode constituir-se em alça de amplificação da atividade de
recrutamento de neutrófilos para o foco inflamatório.
Figura 12. Secreção de CXCL8 por neutrófilos pré-tratados ou não com dexametasona
e estimulados por MNCF. Neutrófilos, pré-tratados ou não com dexametasona (60 min; 25
µM), foram estimulados com MNCF (10 µg/ml), LPS (5 µg/ml), fMLP (10
-7
M). A incubação
apenas com meio proporcionou o controle negativo do ensaio. A quantificação de CXCL8
contido no sobrenadante de cultura foi determinada por ELISA Os resultados estão expressos
como pg/ml +/- SD de amostras ensaiadas em triplicata.
68
meio LPS fMLP MNCF
0
50
100
150
200
250
300
CXCL8 (pg/ml)
sem DX
com DX
PARTE II
Efeito anti-apoptótico de MNCF sobre neutrófilos humanos
Neutrófilos humanos foram incubados durante 20 horas, à 4ºC (controle negativo) ou à
37ºC, na ausência ou na presença da lectina MNCF, em diferentes concentrações (0-50 µ
g/ml). Ao final do período de incubação, as células foram coletadas e incubadas com
Anexina-V, marcador de apoptose e 7AAD, marcador de necrose. Os resultados, ilustrados
na figura 13, mostram que MNCF inibiu significativamente a apoptose espontânea de
neutrófilos humanos. A concentração de MNCF que causou maior inibição da apoptose foi a
de 0,5 µg/ml. As demais concentrações foram menos efetivas e determinaram aumento da
ocorrência de necrose. É importante ressaltar que resultados similares entre si foram obtidos
utilizando-se preparações de MNCF submetidas, ou não, a adsorção em resina de Detoxi-gel
(figura 14A), ligante de LPS.
Os efeitos anti-apoptóticos de MNCF foram comparados ao efeitos da citocina TNF-α
(figura 14B). Neutrófilos, incubados por 20 horas com TNF-α, tiveram a apoptose
espontânea diminuída em nível similar ao determinado por MNCF. O efeito anti-apoptótico
de TNF-α sobre neutrófilos humanos foi revertido pela co-incubação das células com
etanercept, um receptor solúvel de TNF-α. A co-incubação de neutrófilos com etanercept não
interferiu na inibição da apoptose espontânea determinada por MNCF (figura 14B).
O experimento ilustrado no painel A demonstra que o efeito inibitório exercido por
MNCF não é atribuível à contaminação das preparações com LPS. Já o ensaio ilustrado no
painel B demonstra que graus similares de inibição da apoptose são determinados por MNCF
69
e TNF-α, mas que apenas o efeito de TNF-α é revertido pela co-incubação dos neutrófilos
com o receptor solúvel, específico para essa citocina.
Figura 13. A apoptose espontânea de neutrófilos é inibida por MNCF. Neutrófilos
humanos (10
6
) foram incubados à 37ºC com MNCF em diferentes concentrações (0-50
µg/ml) durante 20 horas. As células foram analisadas, por citometria de fluxo, quanto a
ligação de Anexina-V (marcador de apoptose) e 7AAD (marcador de necrose). Neutrófilos
mantidos à 4
o
C, durante o mesmo período de 20h, constituíram o controle negativo de
apoptose e necrose. O resultado é expresso como porcentagem de células positivas para
anexinaV e 7AAD e é representativo de três ensaios independentes.
70
4oC 37oC 0,0005 0,005 0,05 0,5 5 50
0
10
20
30
40
50
60
70
apoptose
necrose
MNCF (µg/ml)
% neutrófilos
AnexinaV+/7AAD+
Figura 14. Caracterização do efeito anti-apoptótico de MNCF sobre neutrófilos
humanos, comparado ao efeito de TNF-a. Neutrófilos (10
6
) foram incubados à 37ºC,
durante 20 horas, com preparações de MNCF (0.5 µg/ml) previamente adsorvidas
(dtxMNCF) ou não à resina de Detoxi-gel (A). Realizaram-se ensaios comparativos entre
MNCF e TNF-a (B); tais preparações foram acrescidas de etanercept, um receptor solúvel de
TNF-a. Os neutrófilos foram analisados, por citometria de fluxo, quanto a ligação de
Anexina-V (marcador de apoptose) e 7AAD (marcador de necrose). Neutrófilos mantidos à
4ºC, durante o mesmo período de 20h, constituíram o controle negativo de apoptose e
necrose. O resultado é expresso em porcentagem de células positivas para anexinaV, e
representa a média dos valores obtidos em 3 ensaios independentes.
A
B
4oC 37oC MNCF dtxMNCF
0
10
20
30
40
50
60
70
% neutrófilos anexinaV
+
4oC 37oC - etanercept - etanercept
0
10
20
30
40
50
60
70
TNF MNCF
% neutrófilos anexinaV
+
71
MNCF induz desgranulação neutrofílica
O monitoramento do processo de desgranulação neutrofílica foi feito por citometria
de fluxo, utilizando-se anticorpos específicos para CD11b, CD66, CD35 e CD63. Os
neutrófilos foram estimulados com MNCF (0.1-10 µg/ml), à 37ºC, por período de 30
minutos. As citocinas TNF-α e CXCL8 foram utilizadas como controles positivos; ambas
induziram aumento na expressão de CD11b, determinando cinéticas de ativação distintas: a
expressão máxima de CD11b foi detectada aos 5 minutos de estímulo com CXCL8, e aos 20
minutos de estímulo com TNF-α (figura 15).
A incubação de neutrófilos humanos com MNCF (10 µg/ml) induziu aumento na
expressão de todos marcadores estudados, com exceção de CD63 (figura 15A). O estímulo
dos neutrófilos com diferentes concentrações de MNCF, mostra que a expressão de CD11b é
dose dependente e que 10 µg/ml de MNCF induz alta expressão do marcador (figura 15B).
Em relação à cinética de expressão de CD11b proporcionada por MNCF (10 µg/ml) foi
observado aumento discreto e gradual da expressão de CD11b nos primeiros 20 minutos de
estímulo. Decorridos 30 minutos, o efeito de MNCF é máximo sobre a expressão de CD11b
(figura 15C). A cinética de expressão de CD11b determinada por MNCF é próxima à
determinada por TNF-α, enquanto CXCL8 aumentou mais rapidamente a expressão do
marcador, que já era máxima aos 10 minutos de estímulo.
O efeito de MNCF (10 µg/ml) sobre a expressão de CD11b aos 30 minutos de
estímulo foi comparado ao efeito de TNF-α na condição de presença ou ausência de
etanercept. Etanercetp reverteu o aumento de expressão de CD11b induzido por TNF-α e
não teve qualquer efeito sobre a ação de MNCF (figura 16A).
72
Figura 15. Efeito de MNCF sobre a expressão de marcadores associados ao processo de
desgranulação de neutrófilos. A expressão de diferentes marcadores de superfície
relacionados ao processo de desgranulação (CD11b, CD66, CD35, CD63) foi avaliada por
citometria de fluxo em neutrófilos (10
6
) estimulados com MNCF (10µg/ml) (painel A). A
expressão de CD11b foi analisada a partir do estímulo com diferentes concentrações de
MNCF (painel B). A cinética da expressão de CD11b estimulada por MNCF (10 µg/ml) foi
comparada às cinéticas determinadas por CXCL8 e TNF-α. Dos dados obtidos por
citometria, a média de intensidade de fluorescência (MIF) foi plotada nos gráficos A, B, C.
Os resultados ilustrados representam a média de três ensaios independentes.
CD11b CD66 CD35 CD63
0
50
100
150
200
250
300
350
Hanks
MNCF
MIF
Hanks TNF 0,1 1 5 10
0
50
100
150
200
MNCF (ug/ml)
MIF (CD11b)
0 5 10 15 20 25 30
0
100
200
300
TNF
CXCL8
MNCF
tempo (min)
MIF (CD11b)
A
B
C
73
Preparações de MNCF pré-adsorvidas, ou não, em resina de Detoxi-gel exerceram
efeitos semelhantes sobre a expressão de CD11b em neutrófilos, enquanto preparações de
MNCF desnaturadas por fervura não aumentaram a expressão de CD11b na superfície de
neutrófilos (figura 16B). LPS aumentou, apenas discretamente, a expressão de CD11b
(figura 16B).
Figura 16. Desgranulação de neutrófilos, induzida por MNCF, manifesta por aumento
de expressão de CD11b. Neutrófilos (10
6
) foram estimulados por MNCF e analisados
quanto a expressão de CD11b. MNCF (10 µg/ml) e TNF (20 ng/ml) foram respectivamente
acrescidos, ou não, de etanercept (1 µg/ml) (A). Neutrófilos também foram incubados com
preparações de MNCF adsorvidas em Detoxi-gel ou desnaturadas por fervura. LPS (10 µ
g/ml) também foi ensaiado como estímulo de desgranulação celular. A expressão de CD11b
foi avaliada por citometria de fluxo e expressa como Média da Intensidade de Fluorescência
(MIF). Os gráficos apresentados são representativos de três ensaios independentes.
A
B
Hanks LPS MNCF dtxMNCF MNCF fervido
0
50
100
150
200
MIF (CD11b)
Hanks - etanercept - etanercept
0
25
50
75
100
125
150
175
TNF MNCF
MIF (CD11b)
74
MNCF induz fosforilação de tirosino-quinases e p38 MAPK em neutrófilos
A fosforilação de proteínas tirosino-quinases, em neutrófilos estimulados pela lectina
MNCF foi estudada através de Western Blot, revelado com anticorpo PY20 conjugado a
peroxidase (HRP) (figura 17). A revelação de proteínas com resíduos de tirosina fosforilados
em neutrófilos não estimulados proporcionou o controle basal (CTR) para análises
comparativas. Como controle positivo, foi utilizado TNF-α (20 ng/ml), que induziu
fosforilação dos resíduos de tirosina em proteínas de massa molecular aparente de 125 e 70
kDa. MNCF (10 µg/ml) induziu fosforilação dos resíduos de tirosina em proteínas com
massa molecular aparente de 70 kDa (figura 17).
Avaliou-se a cinética de fosforilação de p38 MAP quinase induzida por MNCF, TNF-
α e CXCL8 (figura 18). Observou-se que MNCF foi capaz de induzir fosforilação de
p38MAPK, determinando uma cinética de ativação de p38MAPK muito similar à
proporcionada por TNF-α. A fosforilação de p38MAPK já ocorria aos 5 minutos de estímulo
com MNCF, atingindo um máximo após 10 minutos (figura 18). Decorridos 20 minutos de
estimulação houve diminuição discreta na quantidade de p38MAPK fosforilada. Já a
fosforilação de p38MAPK induzida por CXCL8 foi detectada apenas no perído de 5 minutos
pós-estimulação; não houve detecção de p38MAPK em sua forma fosforilada decorridos 10 e
20 minutos de estímulo (figura 18).
75
Figura 17. Fosforilação induzida por MNCF de resíduos de tirosina em proteínas de
neutrófilos. Neutrófilos (2x10
6
) foram estimulados por MNCF (10 µg/ml) ou TNF (20
ng/ml) durante 30 minutos, a 37°C. O sedimento de neutrófilos ressuspenso em tampão de
amostra redutor foi aplicado em gel de acrilamida, gradiente 7-15%. A fosforilação total foi
avaliada através de Western Blot utilizando-se o anticorpo antiPY20 conjugado a peroxidase
e revelação por quimioluminescência. MM= mistura de marcadores de massa molecular
conhecida, CTR= controle, proporcionado por neutrófilos não estimulados.
76
Figura 18. Fosforilação de p38MAP quinase por MNCF. Neutrófilos (2x10
6
células)
foram estimulados com TNF (20 ng/ml), MNCF (10 µg/ml) ou CXCL8 (50 ng/ml), por até
20 minutos, a 37°C. O sedimento celular, solubilizado em tampão de amostra redutor foi
aplicado em gel de acrilamida 10%. As formas fosforilada (phospho p38) e total de p38
MAPK (total p38) foram reveladas por anticorpos monoclonais específicos. O controle
corresponde ao material obtido de neutrófilos não estímulados.
Avaliação das possíveis vias de sinalização envolvidas na desgranulação induzida por
MNCF
Foram avaliadas as vias de sinalização possivelmente envolvidas na desgranulação
neutrofílica induzida pela lectina MNCF. Para tanto, utilizaram-se inibidores específicos de
tirosino-quinases (genisteína), de proteínas da família Src (PP2), de proteína PKC
(staurosporina) e de inibidores das MAP quinases p38 e ERK (SB203580 e PD98059) na
avaliação da expressão de CD11b na superfície de neutrófilos estimulados com MNCF. Com
exceção de staurosporina, todos os inibidores utilizados determinaram inibição, em diferentes
graus, do aumento da expressão de CD11b estimulada por MNCF (figura 19). Esse resultado
77
5
10
20
5
10
20
5
10
20
controle
TNF MNCF CXCL8
phospho p38
total p38
5
10
20
5
10
20
5
10
20
controle
TNF MNCF CXCL8
phospho p38
total p38
sugere que as vias de sinalização ativadas por MNCF incluem tirosino-quinases bem como
MAP quinases. Nesta análise, a tirosino quinase PKC não faria parte do conjunto de
moléculas que sinalizam a ativação de neutrófilos mediada por MNCF.
Figura 19. Avaliação de possíveis vias de sinalização envolvidas no processo de
degranulação de neutrófilos induzida por MNCF. Neutrófilos (10
6
) foram estimulados
com MNCF (10 µg/ml) e analisados, por citometria de fluxo, quanto a expressão de CD11b.
O estímulo foi aplicado em células pré-tratadas com inibidores, indicados na figura, de vias
de sinalização envolvidas na desgranulação de neutrófilos. A expressão de CD11b foi
avaliada por citometria de fluxo e expressa como Média da Intensidade de Fluorescência
(MIF). O gráfico apresentado é resultado da média de três ensaios independentes, sendo *
para P < 0,05, ** para P<0.01 e *** para P<0.001 comparado a neutrófilos estimulados com
MNCF, na ausência de inibidores. NS, não significativo.
78
Hanks - genisteina PP2 PD98059 SB203580 staurosporina
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
MNCF
MIF (CD11b)
***
*
**
***
NS
Hanks - genisteina PP2 PD98059 SB203580 staurosporina
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
MNCF
MIF (CD11b)
***
*
**
***
NS
DISCUSSÃO
O mediador inflamatório MNCF (Macrophage-derived Neutrophil
Chemotactic Factor) é uma lectina atraente de neutrófilos, ligante de galactosídeos, liberada
no sobrenadante de monocamadas de macrófagos peritoneais (rato e camundongos) e
macrófagos da linhagem P388-D1 estimulados com LPS (Dias-Baruffi et al, 1995 e Toledo et
al, 2007). A atividade de recrutar neutrófilos desta lectina é peculiar pelo fato de manifestar-
se mesmo em animais pré-tratados com dexametasona (Dias-Baruffi et al, 1995). Neste
trabalho, através de ensaios realizados in vitro com neutrófilos humanos, identificamos que a
indução de produção persistente de CXCL8, mantida em células pré-tratadas com
dexametasona é um dos eventos que distingue MNCF de outros atraentes. Caracterizamos
ainda o processo de desgranulação de neutrófilos induzido por MNCF e avaliamos as vias de
sinalização implicadas nesse evento.
Moreno et al. (2003) descreveram a existência de um glicoligante para MNCF,
na superfície de neutrófilos humanos. Trata-se de um receptor acoplado a proteína G, uma
vez que o tratamento com Toxina pertussis inibiu a migração de neutrófilos induzida pela
lectina. Receptores em neutrófilos podem ter a sua expressão e funcionalidade modificadas
por glicocorticídes. Por exemplo, a expressão dos receptores da citocina IL1 e de Fcγ do tipo
I em neutrófilos é regulada por dexametasona (revisado por Goulding, 1998). Outro estudo
sugere que glicocorticóides possam interferir na interação de receptor da superfície do
neutrófilo com seu agonista (Filep et al. 1997). Nossos resultados demonstram que o pré-
tratamento de neutrófilos humanos com dexametasona não inibe, e nem mesmo interfere, na
ligação de MNCF à superfície de neutrófilos, evento este que desencadeia a ativação
neutrofílica e culmina com a transmigração celular (Moreno et al. 2003).
79
Comparamos atividades exercidas por MNCF sobre neutrófilos com as
exercidas por atraentes conhecidos – fMLP e CXCL8. Na presença de dexametasona, os
resultados proporcionados variaram de acordo com o atraente testado. O peptídeo fMLP teve
sua atividade indutora de migração inibida, resultado coincidente com o relatado por Burnett
et al. (1994), mas que diverge de outros estudos (Sasagawa et al. 2000; Lomas et al. 1991). Já
a quimiocina CXCL8 e a lectina MNCF não tiveram sua atividade atraente inibida pelo pré-
tratamento dos neutrófilos com dexametasona. Comportamento semelhante já foi descrito
para LTB4 e PAF (Psychoyos et al. 1989; Kurihara et al. 1989; Sasagawa et al. 2000), mas o
mecanismo que o determina ainda é desconhecido. Sasagawa et al. (2000) sugerem que a
ação inibitória de glicocorticóides envolva mecanismo relacionado à inibição da secreção da
quimiocina CXCL8. Nossos resultados demonstram que neutrófilos estimulados com MNCF
produzem CXCL8, produção esta que é mantida em neutrófilos pré-tratados com
dexametasona.
Observamos que o pré-tratamento de neutrófilos com dexametasona não
alterou o shedding de L-selectina provocado pelos estímulos PMA ou CXCL8, manifesto
desde 5 minutos após o estímulo. Já o estímulo com MNCF de neutrófilos pré-tratados com
dexametasona resultou em manutenção dos níveis de CD62L, no decorrer de 60 minutos, ou
seja, em ausência de shedding de L-selectina. Baseando-se em dados de Filep et al (1997)
poder-se-ia supor que a ausência de shedding frente ao estímulo com MNCF estaria
relacionada à ausência de interação dessa lectina com o seu respectivo receptor. No entanto,
este trabalho demonstra claramente que o pré-tratamento de neutrófilos com dexametasona
não interfere na ligação da lectina ao seu receptor. Assim, outras alternativas devem ser
cogitadas. Por exemplo, visto que a ação proteolítica da enzima sheddase depende de uma
estrutura tri-dimensional apropriada de CD62L, próxima à membrana plasmática (Zouki et al.
80
2000), é válido especular que o pré-tratamento com dexametasona interfira na conformação
estrutural de CD62L, fazendo com que o processo de shedding induzido por MNCF seja
inibido.
O fato do processo de migração induzido por MNCF se completar a despeito
da ausência de shedding de CD62L não é coerente com a idéia clássica de que o shedding
seja um pré-requisito para a diapedese de neutrófilos. Tal exigência tem sido contestada por
diversos autores. Estudos in vivo e in vitro usando inibidores de protease que bloqueiam a
clivagem de CD62L têm gerado resultados conflitantes. O inibidor KD-IX-73-4 reduz a
velocidade do rolling de neutrófilos e aumenta o acúmulo desse tipo celular sobre ligantes
imobilizados, em condições de fluxo (Walcheck et al. 1996). Já o inibidor de
metaloproteinase, Ro 31-9790, bloqueia a clivagem de CD62L, sem alterar a habilidade dos
neutrófilos de aderir, rolar e transmigrar (Allport et al. 1997). Em camundongos que
expressam CD62L modificadas, por gene targeting, resistente à clivagem proteolítica, há
aumento do afluxo de neutrófilos para sítio inflamatório (Venturi et al. 2003). Assim, há
dados da literatura que dão suporte à nossa observação de que a manutenção da expressão de
CD62L, em condições anti-inflamatórias, não é impeditiva para a ocorrência da migração de
neutrófilos.
Os processos de polimerização e polarização dos filamentos de F-actina foram
estudados em neutrófilos estimulados por MNCF antes do pré-tratamento, ou não, com
dexametasona. MNCF induz a polarização, ainda que tardia, dos neutrófilos, sem, contudo
aumentar o conteúdo de F-actina na célula. Os fenômenos tardios induzidos por MNCF
remetem às ações de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α, que induzem migração de
neutrófilos por mecanismo indireto (Faccioli et al. 1990). TNF-α induz mudanças
81
morfológicas em neutrófilos, associadas porém à queda no conteúdo de F-actina (Kutsuna et
al. 2004). Dada a importância da polarização dos filamentos de F-actina em direção à região
frontal das células para que elas se movam, sugerimos que a migração neutrofílica induzida
por MNCF envolva mudanças morfológicas e reorganização da F-actina; mas não
obrigatoriamente a polimerização dos filamentos de F-actina.
Diversos trabalhos mostram o papel regulatório dos glicocorticóides sobre os
filamentos de actina (Miki et al. 2000; Clark et al. 2005). Demonstramos que o pré-
tratamento com dexametasona diminui o conteúdo de F-actina em neutrófilos. Tomando
como referência esse conteúdo diminuído de F-actina de neutrófilos pré-tratados com
dexametasona, é possível constatar uma recuperação parcial do conteúdo de F-actina em
resposta ao estímulo com CXCL8, fMLP e MNCF, sem que nenhuma alteração morfológica
visível fosse visualizada.
O processo de polarização dos filamentos de F-actina envolve a participação
orquestrada de diversas proteínas e receptores. Receptores de quimioatraentes, integrinas e
outras moléculas de adesão, proteínas do citoesqueleto e moléculas regulatórias intracelulares
mudam sua localização celular durante o processo de polarização. Um sistema complexo de
moléculas de transdução de sinal, incluindo tirosino-quinases, lipídeo quinases, mensageiros
secundários, como cálcio ou cAMP e membros da família Rho das pequenas GTPases estão
envolvidos no processo regulatório do rearranjo do citoesqueleto durante a polarização e a
migração do leucócito (revisto por Sanchez-Madrid e del Pozo, 1999). Além disso, outras
proteínas pertencentes a rede de microfilamentos podem ser responsáveis pela locomoção
celular, como talina, tubulina e paxilina (revisto por Sanchez-Madrid e del Pozo, 1999), mas
elas não foram avaliadas em nosso estudo. Assim, investigação adicional é necessária para
verificar se dexametasona inibe a locomoção celular através da inibição da polarização dos
82
filamentos de F-actina e, ainda, se o estímulo com MNCF não se associa ao rearranjo da rede
de citoesqueleto celular, ou rearranje outros filamentos diferentes de F-actina. A
complexidade do processo de migração celular, que envolve diversas cascatas de sinalização
e diferentes tipos celulares, reforça a necessidade de que se ampliem os estudos em torno da
lectina MNCF e suas ações peculiar sobre a ativação e migração de neutrófilos.
Nossas observações sugerem claramente que neutrófilos humanos após
tratamento com dexametasona continuam sendo células responsivas ao estímulo da lectina
MNCF. Com o intuito de ampliarmos essa caracterização, analisamos ainda a transcrição
gênica de citocinas (TNF-α e IL1β) e quimiocinas (CXCL8 e CCL2) pró-inflamatórias.
Demonstramos, pela primeira vez, que MNCF é uma lectina indutora de altos níveis de
mRNA para moléculas pró-inflamatórias, efeito que é independente do pré-tratamento das
células com dexametasona. Esses resultados se revestem de especial importância se levarmos
em consideração as fortes evidências, existentes na literatura, de que o efeito anti-
inflamatório dos glicocorticóides seja atribuído à inibição da transcrição de genes de
proteínas pró-inflamatórias. Esses genes correspondem aos de numerosas citocinas
(interleucinas 1-6, 11, 13, TNF-alpha e GM-CSF), quimiocinas (CXCL8, CCL5, CCL3,
CCL2, CCL11) e moléculas de adesão (revito por Cosio et al. 20005). Isso significa que a
lectina MNCF seja um agente indutor de migração de neutrófilos resistente aos efeitos de
dexametasona e que um dos mecanismos dessa resistência esteja associado a sua propriedade
de manter a transcrição gênica de mediadores inflamatórios, a despeito dos efeitos inibitórios
exercidos pelo glicocorticóide. Os mecanismos propostos de repressão da transcrição gênica
mediada pelos glicocorticóides são (a) interação proteína-proteína entre GR ativado e fatores
de transcrição como AP-1 (Jonat et al. 1990) e NF-kB (Ray e Prefontaine, 1994), (b) inibição
83
da translocação nuclear das subunidades de NF-kB (Ohtsuka et al. 1996) e, (c) bloqueio da
interação de NF-kB com o próprio DNA (Scheinman et al. 1994).
Dentre os mediadores inflamatórios que tiveram sua transcrição gênica
aumentada pela lectina MNCF merece destaque CXCL8. Esta quimiocina está implicada na
rápida amplificação da resposta inflamatória aguda, através do recrutamento de neutrófilos e
da prevenção de apoptose dessas células. Dada a sua importância no processo inflamatório,
foi feita a quantificação da proteína CXCL8. MNCF, diferentemente de LPS e fMLP, induz
secreção de CXCL8 por neutrófilos pré-tratados ou não com dexametasona, fato coerente
com o resultado proporcionado pela análise de transcrição gênica e que pode justificar o
efeito indutor de migração de neutrófilos pré-tratados com dexametasona exercido por
MNCF.
CXCL8 é uma quimiocina encontrada estocada intracelularmente em
neutrófilos. A sub-localização de CXCL8 ainda não foi definida com exatidão, mas acredita-
se que ela esteja presente em grânulos neutrofílicos não clássicos (Pellmé et al. 2006).
Baseados na importância do processo de desgranulação neutrofílica durante o processo
inflamatório (Borregaard et al., 1994; Sengelov et al., 1993) e da existência de citocinas e
quimiocinas estocadas em seu citoplasma (Lloyd e Oppenheim, 1992; Bronchud et al. 1987;
Caspar et al. 1993; Cassatella, 1995; Bliss et al. 1999; Kasama et al. 1993 e 1994; Rudack et
al. 2004), seguimos nosso estudo avaliando o papel de MNCF na desgranulação de
neutrófilos, avaliada em paralelo com o efeito sobre a apoptose espontânea de neutrófilos.
Demonstramos que a lectina MNCF em baixas concentrações (0.5 µg/ml)
diminui a taxa apoptótica espontânea de neutrófilos e não ativa o processo de desgranulação
neutrofílica. Para que ocorra aumento de expressão nos marcadores de desgranulação
84
neutrofílica são necessárias concentrações maiores (10 µg/ml) dessa lectina. Porém, nessas
condições, observa-se maior frequência de neutrófilos necróticos. Assim, a concentração
ótima de MNCF varia para diferentes efeitos biológicos, como a proteção à apoptose
espontânea de neutrófilos ou a desgranulação celular. Esse comportamento da lectina MNCF
levou à formulação de várias hipóteses.
Primeiramente, a modulação da apoptose apresentada por MNCF poderia estar
intimamente relacionada com o estado de ativação induzido pela lectina. O TNF-α é uma
citocina que também modula a apoptose espontânea de neutrófilos de maneira dependente da
dose utilizada; os autores dessa observação sugerem que a diminuição da meia vida dos
neutrófilos relacione-se ao estado de ativação celular, induzido pela citocina. Em altas
concentrações, TNF-α ativa o burst respiratório e CD11b/CD18, concomitantemente com as
vias pró-apoptóticas. Já em baixas concentrações, TNF-alpha exerce efeito anti-apoptótico
(van den Berg et al. 2001).
Os diferentes efeitos exercidos por MNCF em diferentes doses poderiam ser
atribuíveis à presença de contaminantes em nossas preparações de MNCF. Há semelhanças
entre os efeitos de MNCF e de outros mediadores sobre neutrófilos. A cinética de
desgranulação neutrofílica induzida por MNCF é semelhante à determinada por TNF-α,
citocina implicada no extravasamento de neutrófilos e no recrumento dos mesmos para o sítio
inflamatório (Canetti et. al., 2001 e 2003, Gosset et. al., 1984, Xing et. al., 1994, Bombini et.
al., 2004). TNF-α, diferentemente de fMLP ou LTB4, ativa neutrófilos tardiamente,
induzindo, dentre outras respostas, aumento na expressão de CD11b e CD15 via p38 MAPK
(Berger et. al., 2002, Suzuki et. al. 2001). Cecílio e colaboradores (1997) postularam que a
citocina TNF-alpha murina fosse a responsável pela atividade quimiotática de neutrófilos
85
resistente à dexametasona em camundongos, hipótese fundamentada em ensaios de
quimiotaxia feitos na presença de anticorpos anti-TNF-α murino. Cabe resssaltar que a
citocina TNF-α apresenta sítio lectínico, específico para açúcares contentdo
diacetilquitobiose (Lucas et al. 1994). Como descrito acima, TNF-α possui atividade anti-
apoptótica sobre neutrófilos (van den Berg et al. 2001), além de induzir desgranulação
neutrofílica aumentando a expressão de moléculas de adesão como CD11b e CD15 (Berger et
al. 2002; Suzuki et al. 2001). Já havíamos demonstrado anteriormente que preparações de
MNCF murinas são desprovidas de TNF-α (Toledo et al. 2007) e novas evidências desse fato
foram geradas no presente trabalho. Às preparações de MNCF foi adicionada a droga
ethanercept, um receptor solúvel de TNF-α, capaz de bloquear as atividades anti-apoptóticas
e indutoras de desgranulação neutrofílica induzidas pela citocina. Nestas condições, as
atividades de MNCF não foram inibidas, afastando, mais uma vez, a possibilidade de que
TNF-α seja o responsável pelas atividades da lectina MNCF.
O processo de obtenção de MNCF envolve o estímulo de macrófagos em
cultura com LPS. Há indicações na literatura de que LPS é contaminante comum de amostras
biológicas, não sendo eliminado facilmente por processos convencionais de cromatografia
(Wicks et al. 1995; Issekutz 1983). Por essa razão, avaliou-se a atividade das preparações de
MNCF após processo de adsorção de LPS em resinas com polimixina B imobilizada (Detoxi-
gel) ou após fervura por 10 minutos, processo de desnaturação protéica ao qual LPS é
resistente. O processo de desnaturação protéica inibiu as atividades da amostra, enquanto que
a adsorção à coluna de Detoxi-gel não afetou os efeitos exercidos pela amostra. Os resultados
obtidos não eliminam a possibilidade de contaminação das preparações de MNCF com LPS,
mas sugerem fortemente que a mobilização de grânulos induzida por MNCF não corresponda
86
a processo que exige o priming de neutrófilos, como ocorre com galectina-3 (Karlsson et. al.,
1998, Almkvist et. al., 2001).
Galectina-3 é uma lectina ligante de β-galactosídeos que atua sobre a
fisiologia de neutrófilos induzindo agregação celular (Timoshenko et. al., 2003), adesão a
laminina (Kuabara & Liu, 1996) e o extravasamento em resposta a infecção (Sato et. al.,
2002). A ação de galectina-3 sobre neutrófilos, ocorre após o priming celular através da
incubação com LPS ou citocalasina B. O priming é indispensável porque o receptor de
galectina-3, CD66b, encontra-se no interior dos grânulos de gelatinase (Karlsson et. al., 1998,
Almkvist et. al., 2001, Feuk-Lagerstedt et. al., 1999, Yamaoka et. al., 1995, Sengelov et. al.,
1995). A comparação entre galectina-3 e MNCF, no que tange aos aspectos supracitados,
torna válido supôr que o receptor para MNCF esteja constitutivamente expresso na superfície
de neutrófilos humanos.
Finalmente, investigamos a possibilidade que MNCF interaja com neutrófilos
humanos através de diferentes receptores, fosforilando assim diversas proteínas envolvidas
nesta cascata de sinalização. Para tanto, avaliou-se a interferência exercida por diferentes
inibidores da cascata de sinalização sobre a desgranulação neutrofílica induzida por MNCF.
Há um aumento da fosforilação de proteínas, nos resíduos de tirosina, em resposta a
diferentes agonistas de desgranulação, como agentes quimiotáticos e quimiocinas, ligantes de
receptores Fc, citocinas, microcristais inflamatórios e PMA (phorbol myristate acetate) (Yan
et al. 1996; Huang et al. 1988 e 1990; Gómez-Cambronero et al. 1989, 1991 e 1992; Berkow
& Dodson 1990; McColl et al. 1991; Connely et al. 1991; Ohta et al. 1992; gaudry et al.
1993; Richard et al. 1994a e 1994b; Dusi et al. 1994a e 1994b; Liang et al. 1995). Estudos
com inibidores de tirosino-quinases indicaram que a mobilização das vesículas secretórias
87
requer fosforilação de tirosina (Naccache et al. 1994). MNCF, a exemplo de outros agonistas
de neutrófilos, induz fosforilação dos resíduos de tirosina. Além disso, genisteina (um
inibidor de tirosino-quinases) inibe de maneira significativa a desgranulação induzida por
MNCF. As proteínas fosforiladas por MNCF têm massa molecular aparente de 70 kDa,
sugerindo fortemente a quinase Syk, juntamente com a família Src (Fgr, Hck e Lyn) estejam
envolvidas na transdução de sinal pelos receptores sete transmembrânicos (Gaudry et al.
1995; Ptasznik et al. 1995 e 1996), β2-integrinas (Berto net al. 1994; Yan et al. 1995), FcγRs
(Hamada et al. 1993; Kiener et al. 1993) e outros estímulos (Corey et al. 1994; Welch et al.
1997). No atual estado da investigação, só é possível afirmar que a família Src esteja
envolvida no processo de desgranulação induzido por MNCF, já que PP2 inibiu o aumento de
CD11b na superfície de neutrófilos estimulados pela lectina.
A desgranulação de neutrófilos induzida por MNCF foi avaliada sob a
influência de outros inibidores, como a staurosporina, um inibidor de PKC. PKC, juntamente
com Ca2+ citosólico livre é ativado por agonistas de receptores, como PMA, um poderoso
indutor de desgranulação. A despeito de fortes sugestões de participação de PKC no processo
de desgranulação neutrofílica, o inibidor staurosporina não afetou o aumento de expressão de
CD11b na superfície de neutrófilos estimulados por MNCF. Esse resultado torna improvável
que o receptor de MNCF, na superfície de neutrófilos, ative vias em que PKC esteja
implicada.
A cascata de MAP quinase é descrita por participar de múltiplas funções
neutrofílicas como desgranulação, locomoção, proliferação, diferenciação e sobrevivência
(Lewis et. al., 1998). Peptídeos quimiotáticos (Grinstein & Furuya 1992; Torres et al. 1993),
quimiocinas (Knall et al. 1996), L-selectina (Waddell et al. 1995), citocinas (Gomez-
88
Cambronero et al. 1993; Rafiee et al. 1995) ativam esta via em neutrófilos, ficando
demonstrado agora que MNCF faz o mesmo. MNCF induz fosforilação máxima de
p38MAPK de maneira tempo-dependente, exercendo sua atividade máxima após 10 minutos
de estímulo, de maneira semelhante a TNF-alpha. A cinética de fosforilação de p38MAPK
proporcionada por MNCF, diferiu da atribuída a CXCL8 quanto ao aumento na expressão de
CD11b. Além disso, SB203580 e PD98059, inibidores de p38 e ERK MAPK,
respectivamente, inibiram de maneira significativa a desgranulação induzida por MNCF.
O conjunto de resultados apresentados constitui uma primeira demonstração
de que MNCF induz atividades anti-apoptótica e indutora de desgranulação em neutrófilos. A
caracterização desses eventos, ainda que parcial, fornece informações importantes sobre essa
lectina, resumidas a seguir. MNCF induz desgranulação de grânulos específicos e de
gelatinase e das vesículas secretórias, não afetando os grânulos azurofílicos. Esse processo de
desgranulação é independente do priming de neutrófilos por LPS e da presença da citocina
TNF-alpha. Dentre as vias de sinalização ativadas por MNCF durante o processo de
desgranulação estão as tirosino-quinases, proteínas da família Src e as MAP quinases, p38 e
ERK.
A respeito da migração neutrofílica induzida por MNCF em condições anti-
inflamatórias, grandes avanços também foram feitos e e podem ser, resumidamente,
avaliados na tabela 3. Nossos resultados complementam observação prévias de Toledo et al.
2007, onde foi demonstrada a importância de glicoproteínas da matriz extracelular (laminina
e fibronectina) na resistência à ação de dexametasona, tanto na adesão quanto na haptotaxia
induzidas por MNCF. Demonstramos, neste trabalho, que o glicocorticóide dexametasona,
embora modifique alguns efeitos de MNCF sobre neutrófilos humanos, não impede sua ação
ativadora sobre tal tipo celular. Neutrófilos humanos que tiveram contato com dexametasona
89
e foram estimulados por MNCF são células que, embora não apresentem shedding de CD62L
e polarização de F-actina, mantém capacidade migratória. Secundariamente, após
translocamento nuclear de NF-kB p50, são ativadas vias de transcrição gênica e secreção de
mediadores inflamatórios, como CXCL8.
Finalmente, sugerimos que MNCF não seja o único mediador envolvido na
migração neutrofílica resistente à ação de glicocorticóides. Embora maiores estudos sejam
necessários, demonstramos que nessa condição anti-inflamatória, MNCF lança mão de uma
indução persistente da secreção de diversos outros mediadores pró-inflamatórios. A
disponibilidade destes mediadores no sítio inflamatório poderá, então, complementar a ação
inflamatória da lectina MNCF tanto sobre neutrófilos quanto outros tipos celulares
envolvidos no processo inflamatório, auxiliando assim na quebra de resistência aos
glicocorticóides.
Tabela 3. Análise comparativa das atividades desencadeadas pelos agonistas MNCF e
CXCL8 sobre neutrófilos pré-tratados ou não com dexametasona (DX).
___________________________________________________________________________
Atividades avaliadas MNCF CXCL8
sem DX com DX sem DX com DX
___________________________________________________________________________
Migração neutrofílica sim sim sim sim
Shedding L-selectina sim não sim sim
Aumento na expressão não sim sim sim
de F-actina
Polarização celular sim não sim não
Translocamento de NF-κB sim sim sim sim
Transcrição gênica sim sim sim não
Secreção de CXC8 sim sim - -
90
CONCLUSÕES
MNCF foi caracterizado como uma lectina agonista de neutrófilos humanos que atua
sobre os seguintes parâmetros: (i) diminuição na taxa espontânea de apoptose, (ii)
desgranulação de vesículas secretórias e grânulos secundários dependente da participação de
tirosino e MAP quinases, além de membros da família Src, (iii) shedding de CD62L, (iv)
translocação de NF-κB, (v) transcrição gênica de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias e,
(vi) secreção de CXCL8.
Além disso, a manutenção de transcrição gênica e secreção de mediadores pró-
inflamatórios, sob condições anti-inflamatórias, corresponde a um possível mecanismo pelo
qual MNCF recruta neutrófilos de maneira resistente à ação de glicocorticóides.
91
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Abe S, Ohnishi M, Nohmi T, Katoh M. et al. (1996) A glucocorticoid antagonist,
mifepristone, affects anticandida activity of murine neutrophils in the presence of
prednisolone-treated mice in-vivo. FEMS Immunol Med. Microbiol v. 13: 311-316
Allport JR, Ding HT, Ager A, Steeber DA. et al. (1997) L-selectin shedding does not regulate
human neutrophil attachment, rolling or transmigration across human vascular endothelium
in vitro. J. Immunol. v. 158: 4365-4372
Almkvist J, Faldt J, Dahlgren C, Leffer H, Karlsson A. (2001) Lipopolysaccharide-induced
gelatinase granule mobilization primes neutrophils for activation by galectin-3 and
formylmethionyl-Leu-Phe. Infect Immun. v. 69(2):832-7
Alpin AE, Howe S, Alahari SK, Juliano R.L. (1998) Signal transduction and signal
modulation by cell adhesion receptors: The role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell
adhesion molecules, and selectins. Pharmacol. Rev., v. 50: 197-263
Arnljots K, Sorensen O, Lollike K, Borregaard N. (1998) Timing, targeting and sorting of
azurophil granule proteins in human myeloid cells. Leukemia, v. 12: 1789–1795
Bainton DF, Ullyot JL, Farquhar MG. (1971) The development of neutrophilic
polymorphonuclear leukocytes in human bone marrow. J. Exp. Med., v. 134: 907–934
Bamberger CM, Bamberger AM, de Castro M, Chrousos GP. (1995) Glucocorticoid receptor
beta, a potential indogenous inhibitor of glucocorticoid action in humans. J. Clin. Invest., v.
95: 2435-2441
Bargatze RF, Kurk S, Butcher EC, Jutila MA. (1994) Neutrophils roll on adherent
neutrophils bound to cytokine-induced endothelial cells via L-selectin on the rolling cells.
J.Exp.Med., v.180:1785-1792
Bazil, V. & Strominger, JL. (1994) Metalloprotease and serine protease are involved in
cleavage of CD43, CD44 and CD16 from stimulated human granulocytes. J. Immunol., v.
152: 1314-1322
Berger M, Budhu S, Lu E,Li Y, Loike D. et al. (2002) Different G(i)-coupled chemoattractant
receptors signal qualitatively different functions in human neutrophils. J Leukoc Biol, v. 71:
798-806
Berkow RL, Dodson RW. (1990) Tyrosine specific protein phosphorylation during activation
of human neutrophils. Blood, v. 75: 2445-2452
Bernardes, ES. (2000) “Reconhecimento de alfa-glicanas pela lectina MNCF. Identificação
de proteína cognata ao MNCF no soro fetal bovino” Rib. Preto (Dissertação de Mestrado,
FMRP-USP)
92
Berton G, Fumagalli L, Laudanna C, Sorio C. Beta2 integrin-dependent protein tyrosine
phosphorylation and activation of the FGR protein tyrosine quinase in human neutrophils. J
Cell Biol, v. 126: 1111-1121
Bianchi E, Bender JR, Blasi F, Pardi R. (1997) Through and beyond the wall: late steps in
leucocyte transendothelial migration. Immunol. Today, v. 18, p. 586-591
Bienenstock J, Befus AD, Denburg JA. (1986) Mast cell heterogeneity: basic questions and
clinical implications. In: Befus AD, Beinenstock J, Denburg JA. Mast Cell Diferentiation and
Heterogeneity. Raven Press, Inc., New York, p. 379-402
Bliss SK, Marshall AJ, Zhang Y, Denkers EY. (1999) Human polymorphonuclear leukocytes
produce IL-12, TNF-alpha, and the chemokines macrophage-inflammatory protein-1 alpha
and -1 beta in response to Toxoplasma gondii antigens. J Immunol., v. 162: 7369-7375
Bohnsack JF, Chang J, Zhou X, Yednock TA. (1995) Mechanisms of beta 1 integrin-
dependent adherence of granulocytic HL60 to fibronectin. J. Leukoc. Biol., v. 57: 592-599
Bombini G, Canetti R, Rocha FA, Cunha FQ. (2004) Tumour necrosis factor-alpha mediates
neutrophil migration to the knee synovial cavity during immune inflammation. Eur j
Pharmacol., v. 496: 197-204
Borregaard N. & Cowland JB. (1997) Granules of the human neutrophilic
polymorphonuclear leukocyte. Blood, v. 89: 3503-3521
Borregaard N, Kjeldsen L, Sengelov H, Diamond MS et al. (1994) Changes in subcellular
localization and surface expression of L-selectin, alkaline phosphatase, and Mac-1 in human
neutrophils during stimulation with inflammatory mediators. J. Leukocyte Biol, v. 56: 80–87
Borregaard N, Miller LJ, Springer TA. (1987) Chemoattractant-regulated mobilization of a
novel intracellular compartment in human neutrophils. Science, v. 237: 1204–1206
Brandes ME, Mai UE, Ohura K, Wahi SM. (1991) Type I transforming growth factor-beta
receptors on neutrophils mediate chemotaxis to transforming growth factor-beta. J.Immunol,
v. 147: 1600-1606
Bronchud MH, Scarffe JH, Thatcher N, Crowther D et al. (1987) Phase I/II study of
recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in patients receiving intensive
chemotherapy for small cell lung cancer. Br J Cancer, v. 56: 809-813
Brown SB, and Savill J (1999). Phagocytosis triggers macrophage release of Fas ligand and
induces apoptosis of bystander leukocytes. J Immunol., v. 162:480–485
Bruehl RE, Moore KL, Lorant DE, Borregaard N et al. (1997) Leukocyte activation induces
surface redistribution of P-selectin glycoprotein ligand-1. J. Leukoc. Biol., v. 61: 489-499
93
Bruyninckx WJ, Comerford KM, Lawrence DW, Colgan SP. (2001) Phosphoinositide 3-
quinase modulation of beta-3-integrin represents an endogenous “braking” mechanism during
neutrophil transmatriz migration. Blood, v. 97: 3251-3258
Burnett D, Adams DH, Martin TJ, Liu Q et al. (1994) Inhibitionby FK506 of formyl peptide-
induced neutrophil activation and associated protein synthesis. Biochem. Pharmacol. v. 48:
1081-1088
Burton JL, Kehrli ME, Kapil S, Horst RL. (1995) Regulation of L-selectin and CD18 on
bovine neutrophil by glucocorticoids – effects of cortisol and dexamethasone. J. Leukoc.
Biol. v. 57: 317-325
Canetti C, Silva JS, Ferreira SH, Cunha FQ. (2001). Tumor necrosis factor-alpha and
leukotriene B(4) mediate the neutrophil migration in immune inflammation. Br J Pharmacol,
v. 134: 1619-1628
Carlos TM and Harlan JM (1994) Leukocyte–endothelial adhesion molecules. Blood, v. 84:
2068–2101
Caspar CB, Seger RA, Buger J, Gmur J. (1993) Effective stimulation of donors for
granulocyte transfusion with recombinant methionyl granulocyte colony-stimulating factor.
Blood, v. 81: 2866-2871
Cassatella MA. (1995) The production of cytokines by polymorphonuclear neutrophils.
Immunol Today, v. 16: 21-26
Cecilio CA, Costa EH, Ulcelli EH, Chaves CAA et al. (1997) The neutrophil migration
induced by tumor necrosis alpha in mice is unaffected by glucocorticoids. Mediators of
inflammation, v. 6: 46-52
Cham BP, Gerrard JM and Bainton DF. (1994) Granulophysin is located in the membrane of
azurophilic granules in human neutrophils and mobilizes to the plasma membrane following
cell stimulation. Am. J. Pathol., v. 144: 1369–1380
Chapple DS, Mason DJ, Joannou CL, Odell EW et al. (1998) Structure–function relationship
of antibacterial synthetic peptides homologous to a helical surface region on human
lactoferrin against Escherichia coli serotype O111. Infect. Immun., v. 66: 2434–2440
Chertov O, Michiel DF, Xu L, Wang JM et al. (1996) Identification of defensin-1, defensin-
2, and CAP37/azurocidin as T-cell chemoattractant proteins released from interleukin-8-
stimulated neutrophils. J. Biol. Chem., v. 271: 2935–2940
Cieutat AM, Lobel P, August JT, Kjeldsen L. et al. (1998) Azurophilic granules of human
neutrophilic leukocytes are deficient in lysosome-associated membrane proteins but retain the
mannose 6-phosphate recognition marker. Blood, v. 91: 1044–1058
94
Clark AF, Brotchie D, Read AT, Hellberg P et al. (2005) Dexamethasone alters F-actin
architecture and promotes cross-linked actin network formation in human trabecular
meshwork tissue. Cell Motil Cytoskeleton, v. 60(2): 83-95
Clark EA, Brugge JS. (1995) Integrins and signal transduction pathways: the road taken.
Science, v. 268: 233-239
Conelly PA, Farrell CA, Merenda JM, Conklyn MJ, Showell HJ. (1991) Tyrosine
phosphorylation is an early signaling event common to Fc receptor croslinking in human
neutrophils and rat basophilic leukemia cells (RBL 2H3). Biochem Biophys Res Commun, v.
177: 192-201
Corey SJ, Burkhardt AL, Bolen JB, Geahlen RK et al. (1994) Granulocyte colony-stimuling
factor receptor signaling involves the formantion of a three-component comlex with Lyn and
Syk protein-tyrosine quinases. Proc Natl Acad Sci USA, v. 91: 4683-4687
Cosio BG, Torrego A, Adcok IM. (2005) Molecular mechanisms of glucocorticoids.
Arch Bronconeumol., v. 41(1):34-41
Cox G, Crossley J, and Xing Z (1995). Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils
contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo. Am J Resp Cell Mol
Biol., v. 12:232–237
Cox G (1996). (IL-10) enhances resolution of pulmonary inflammation in vivo by promoting
apoptosis of neutrophils. American Journal of Physiology, v. 271:L566–L571.
Cunha FQ, Ferreira SH. (1986) The release of a neutrophil chemotactic factor from peritoneal
macrophages by endotoxin: inhibition by glucocorticoids.
Eur J Pharmacol., v. 23;129(1-2):65-76
Dahms NM, Lobel P and Kornfeld S. (1989) Mannose 6-phosphate receptors and lysosomal
enzyme targeting. J. Biol. Chem., v. 264: 12115–12118
Delclaux C, Delacourt C, D’Ortho MP, Boyer V. et al. (1996) Role of gelatinase B and
elastase in human polymorphonuclear neutrophil migration across basement membrane. Am.
J. Respir. Cell Mol. Biol., v. 14: 288–295
Detmers PA, Zhou D, Powell D, Lichenstein H. (1995) Endotoxin receptors (CD14) are
found with CD16 (Fc gamma RIII) in an intracellular compartment of neutrophils that
contains alkaline phosphatase. J. Immunol., v. 155: 2085–2095
Deuel TF, Senior RM, Chang D, Griffin GL. et al. (1981) Platelet factor 4 is chemotactic for
neutrophils and monocytes. Proc. Natl. Acd. Sci. USA, v. 78: 4584-4587
Dias-Baruffi M, Cunha FQ, Ferreira SH, Roque-Barreira MC. (1993) Macrophage released
neutrophil chemotactic factor (MNCF) induces PMN-neutrophil migration through lectin-like
activity. Agents actions., v.38: C54
95
Dias-Baruffi M, Roque-Barreira MC, Cunha FQ, Ferreira SH. (1995) Biological
characterization of a homogeneous fration of purified macrophage-derived-neutrophil-
chemotactic-factor. Mediators inflammation., v. 4: 55-57
Dias-Baruffi M, Roque-Barreira MC, Cunha FQ, Ferreira SH. (1995) Isolation and partial
chemical characterization of macrophage-derived-neutrophil-chemotactic-factor. Mediators
inflammation., v. 4: 52-54
Dias-Baruffi M. (1999) Novos aspectos da caracterização da lectina de origem macrofágica,
MNCF: Produção por linhagem de macrófagos de camundongo, analogia com proteínas
conhecidas e ligação à superfície de neutrófilos e à laminina. Rib. Preto (Tese-Doutorado,
FMRP-USP)
Dibbert B, Weber M, Nikolaizik WH, Vogt P. et al. (1999). Cytokine-mediated Bax
deficiency and consequent delayed neutrophil apoptosis: A general mechanism to accumulate
effector cells in inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A, 96:13330–13335
Dimitrijevic I, Axelsson L, Andersson T. (2002) The adhesion receptor CD31 can be primed
to rapidly adjust the neutrophil cytoskeleton. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 292: 1092-
1097
Direnzo M, Pasqui AL, Chiarion C, Carducci A, Auteri A. (1994) The in vitro effect of 2
glucocorticoids on some lymplhomonocyte and neutrophil functions. Int. J. Immunother. v.
10: 103-112
Doherty DE, Haslett C, Tonnesen MG, Henson PM. (1987) Human monocyyte adherence: a
primary effect of chemotactic factors on the monocyte to stimulate adherence to human
endothelium. J.Immunol, v. 138: 1762-1771
Drost EM. & MacNee W. (2002) Potential role of IL-8, platetet-activating factor and TNF-
alpha in the sequestration of neutrophils in the lung: effects on neutrophil deformability,
adhesion receptor expression, and chemotaxis. J. Immunol. v. 32:393-403
Dusi S, Donini M, Rossi F. (1994a) Tyrosine phosphorylation and activation of NADPH
oxidase in human neutrophils: a possible role for MAP quinases and for a 75 kDa protein.
Biochem J, v. 304: 243-250
Dusi S, Donini M, Della Bianca V, Rossi F. (1994b) Tyrosine phosphorylation of
phospholipase Cgamma2 is involved in the activation of phosphoinositide hydrolysis by Fc
receptors in human neutrophils. Biochem Biophys Res Commun, v. 201: 1100-1108
Egesten J, Breton-Gorius J, Guichard U, Gullberg, Olsson I. (1994) The heterogeneity of
azurophil granules in neutrophil promyelocytes: immunogold localization of
myeloperoxidase, cathepsin G, elastase, proteinase 3, and bactericidal/permeability
increasing protein. Blood, v. 83: 2985–2994
96
Faccioli LH, Souza GE, Cunha FQ, Poole S, Ferreira SH. (1990). Recombinant interleukin-1
and tumor necrosis factor induce neutrophl migration “in vivo” by indirect mechanisms.
Agents Actions, v. 30(3-4): 344-349
Fadok VA, Warner ML, Bratton DL, and Henson PM (1998a). CD36 is required for
phagocytosis of apoptotic cells by human macrophages that use either a phosphatidylserine
receptor or the vitronectin receptor (alpha v beta 3). J Immunol., v. 161:6250–6257
Fadok VA, Bratton DL, Konowal A, Freed PW. et al.(1998b). Macrophages that have
ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through
autocrine/paracrine mechanisms involving TGF-beta, PGE2, and PAF. J Clin Invest., v.
101:890–898
Fassbender K, Kaptur S, Becker P, Groschel J et al. (1999) Inverse association between
endogenous glucocorticoid secretion and S-selectin (CD62L) expression in trauma patients.
Life Sci. v. 65 (23):2471-2480
Faubion WA, Gores GJ. (1999) Death receptors in liver biology and pathobiology.
Hepatology, v.29:1-4
Faurschou M, Sorensen OE, Johnsen AH, Askaa J and Borregaard N. (2002) Defensin-rich
granules of human neutrophils: characterization of secretory properties. Biochim. Biophys.
Acta, v. 1591: 29–35
Faurschou M & Borregaard N. (2003) Neutrophil granules and secretory vesicles in
inflammation. Microbes and Infection, v.5: 1317-1327
Fecho K, and Cohen PL (1998). Fas ligand (gld)- and Fas (lpr)-deficient mice do not show
alterations in the extravasation or apoptosis of inflammatory neutrophils. J Leukocyte Biol v.
64:373–383.
Feuk-Lagerstedt E, Jordan ET, Leffler H, Dahlgren C, Karlsson A. (1999) Identification of
CD66a and CD66b as the major galectin-3 receptor candidates in human neutrophils. J
Immunol., v. 163(10): 5592-5598
Feuk-Lagerstedt E, Samuelsson M, Mosgoeller W, Movitz C et al. (2002) The presence of
stomatin in detergent-insoluble domains of neutrophil granule membranes. J. Leukocyte Biol.,
v. 72: 970–977
Filep JG, Dela-Landre A, Payette Y, Foldes-Filep E (1997) Glucocorticoid receptor regulates
expression of L-selectin and CD11/CD18 on human neutrophils. Circulation. v. 96: 295-301
Folkeson HG, Matthay MA, Hebert CA, Broaddus VC (1995) Acid aspiration-induced lung
injury in rabbits mediated by interleukin-8-dependent mechanisms. J. Clin. Invest., v. 96:
107-116
97
Ford-Hutchinson AW, Bray MA, Doig MV, Shipley ME, Smith MJH. (1980) Leukotriene B,
a potent chemokinetic and aggregating substance released from polymorphonuclear
leukocytes. Nature. v. 286: 264-265
Fukushima K, Ando M, Ito K, Suga M, Araki S. (1990) Stimulus and cumulative dose-
dependent inhibition of O
2-
production by polymorphonuclear leukocytes of patients
receiving corticosteroids. J. Clin. Lab. Immunol., v. 33: 117-123
Gaudry M, Roberge CJ, de Medicis R, Lussier A et al. (1993) Crystal induced neutrophil
activation : III. Inflammatory microcrystals induce a distinct pattern of tyrosine
phosphorylation in human neutrophilsl. J Clin Invest v. 91 : 1649-1655
Gaudry M, Gilbert C, Barabe F, Poubelle PE, Naccache PH. (1995) Activation of Lyn is a
common element of the stimulation of human neutrophils by soluble and particulate stimuli.
Blood, v. 86 : 3567-3574
Goetz DH, Holmes MA, Borregaard N, Bluhm ME et al. (2002) The neutrophil lipocalin
NGAL is a bacteriostatic agent that interferes with siderophore-mediated iron acquisition.
Mol. Cell , v.10:1033–1043
Gomez-Cambronero J, Colasanto JM, Huang CK, Sha’afi RI. (1993) Direct stimulation by
tyrosine phosphorylation of microtubule-associated protein (MAP) kinse activity by
granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in human neutrophils. Biochem J, v. 291 :
211-217
Gomez-Cambronero J, Huang CK, Bonak VA et al. (1989) Tyrosine phosphorylation in
human neutrophil. Biochem Biophys Res Commun, v. 162 : 1478-1485
Gomez-Cambronero J, Wang E, Johnson G, Huang CK, Sha’afi RI (1991) Platelet activating
factor induces tyrorise phosphorylation in human neutrophils. J Biol Chem, v. 266 : 6240-
6245
Gomez-Cambronero J, Huang CK, Gomez-Cambronero TM, Water-man WH et al. (1992)
Granulocyte macrophage colony stimulating factor induced protein phosphorylation of
microtubule associated protein quinase in human neutrophils. Proc Natl Acad Sci USA, v.
89 : 7551-7555
Gosset P, Tonnel AB, Joseph M, Prin L et al. (1984) Secretion of a chemotactic factor for
neutrophils and eosinophils by alveolar macrophages from asthmatic patients. J Allergy Clin
Immunol, v. 74: 827-834
Goulding NJ, Euzger HS, Butt SK, Perretti M. (1998) Novel pathways for glucocorticoid
effects on neutrophils in chronic inflammation. Inflamm Res. Suppl v.3:S158-165
Griffin JD, Spertini O, Ernst J, Belvin MP et al. (1990) Granulocyte-macrophage colony-
stimulated factor and other cytokines regulate surface expression of the leukocyte adhesion
molecule-1 on human neutrophils, monocytes, and their precursors. J. Immunol., v. 145: 576-
584
98
Grinstein S, Furuya W. (1992) Chemoattractant-induced tyrosine phosphorylation and
activation of microtubule-associated protein quinase in human neutrophils. J Biol Chem, v.
267: 18122-18125
Hafezi-Moghadam A, Thomas KL, Prorock AJ, Huo Y, Ley K. (2001) L-selectin shedding
regulates leukocyte recruitment. J. Exp. Med., v. 193 (7): 863-872
Hamada F, Aoki M, Akiyama T, Toyoshima K. (1993) Association of immunoglobulin G Fc
receptor II with Src-like protein quinase Fgr in neutrophils. Proc Natl Acad Sci USA, v. 90:
6305-6309
Hendey B, Lawson M, Marcantonio EE, Maxfield FR. (1996) Intracellular calcium and
calcineurin regulate neutrophil motility on vitronectin through a recector identified by
antibodies to av and b3. Blood, v. 87: 2083-2048
Hickey MJ, Forster M, Mitchell D, Kaur J et al. (2000) L-selectin facilitates emigration and
extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.
J.Immunol. v.165:7164-7170
Hirasawa N, Watanabe M, Mue S, Watanabe K et al. (1992) Induction of neutrophil
infiltration by rat chemotactic cytokine (CINC) and its inhibition dexamethasone in rats.
Inflammation, v. 16: 187-196
Hollenberg SM, Weinberger MC, Ong ES, Cerelli G et al. (1985) Primary structure and
expression of a functional human glucocorticoid receptor cDNA. Nature, v. 315: 635-641
Howard TH and Meyer WH. (1984).Chemotactic peptide modulation of actin assembly and
locomotion in neutrophils. J Cell Biol., v.98: 1265-1271
Huang CK, Laramee GR, Casnellie JE. (1975) Chemotactic factor-induced tyrosine
phosphorylation of membrane-associated proteins in rabbit peritoneal neutrophils. Biochem
Biophys Res Commun, v. 151: 794-801
Huang CK, Bonak V, Laramee GR, Canellie JE. (1990) Protein tyrosine phosphorylation in
rabbit peritoneal neutrophils. Biochem J, v. 269: 431-436
Huber AR, Kunkel SL, Todd RF, Weiss JS (1991) Regulation of transendothelial neutrophil
migration by endogenous interleukin-8. Science, v. 254: 99-102
Issekutz AC (2003) Removal of gram negative endotoxin from solution by affinity
chromatography. J Immunol Meth, v. 61: 275-281
Jabado N, Jankowski A, Dougaparsad S, Picard V et al. (2000) Natural resistance to
intracellular infections: natural resistance-associated macrophage protein 1 (Nramp1)
functions as a pH-dependent manganese transporter at the phagosomal membrane. J. Exp.
Med., v. 192: 1237–1248
99
Jesaitis AJ, Buescher ES, Harrison D, Quinn MT et al. (1990) Ultrastructural localization of
cytochrome b in the membranes of resting and phagocytosing human granulocytes. J. Clin.
Invest., v. 85: 821–835
Joiner KA, Ganz T, Albert J and Rotrosen D The opsonizing ligand on Salmonella
typhimurium influences incorporation of specific, but not azurophil, granule constituents into
neutrophil phagosomes. J. Cell Biol., v. 109: 2771–2782
Jonat C, Rahmsdorf HJ, Park KK, Cato AC et al. (1990) Antitumor promotion and
antiinflammation: down-modulation of AP-1 (Fos/Jun) activity by glucocorticoid hormone.
Cell., v. 62(6):1189-204
Joseph BZ, Beam R, Martin RJ, Borish L (1995) Prednisone inhibits leukocyte granule
secretion into the asthmatic airway. Int. J. Immunopathol. Phamacol, v. 8: 23-30
Kang T, Yi J, Guo A, Wang X et al. Subcellular distribution and cytokine- and chemokine-
regulated secretion of leukolysin/MT6-MMP/MMP-25 in neutrophils. J. Biol. Chem., v. 276:
21960–21968
Karlsson A, Follin P, Leffler H, Dahlgren C. (1998). Galectin-3 activates the NADPH-
oxidase in exudate but not peripheral blood neutrophils. Blood, v.91: 3430-3438
Kasama T, Strieter RM, Standiford TJ, Burdick MD, Kunkel SL. (1993) Expression and
regulation of human neutrophil-derived macrophage inflammatory protein 1 alpha. J Exp
Med, v. 178: 63-72
Kasama T, Strieter RM, Lukacs NW, Burdick MD, Kunkel SL. (1994) Regulation of
neutrophil-derived chemokine expression by IL-10. J Immunol., v. 152: 3559-3569
Kay AB. (1970) Studies on eosinophils leucocyte migration. I. Eosinophils and Neutrophils
accumulation following Antigen-Antibody reactins in Guinea-Pig Skin. Clin. Exp. Immunol,
v. 6:75-86
Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR. (1972) Apoptosis. A basic biological phenomenon with
wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer., v. 26 (4):239-357
Kiener PA, Rankin BM, Burkhardt AL, Schieven GL et al. (1993) Cross-linking of Fcgamma
receptor I (FcgammaRI) and receptor II (FcgammaRII) on monocytic cells activates a signal
transduction pathway common to both Fc receptors that involves the stimulation of p72 Syk
protein tyrosine quinase. J Biol Chem, v. 268: 24442-24448
Kishimoto TK, Jutila MA, Berg EL, Butcher EC. (1989) Neutrophil Mac-1 and Mel-14
adhesion proteins inversely regulated by chemotactic factors. Science, v. 245:1238-1241
Kjeldsen L, Bjerrum OW, Askaa J and Borregaard N (1992) Subcellular localization and
release of human neutrophil gelatinase, confirming the existence of separate gelatinase-
containing granules. Biochem. J, v. 287: 603–610
100
Klebanoff SL (1999) Myeloperoxidase. Proc. Assoc. Am. Physicians, v. 111: 383–389
Knall C, Young S, Nick JA, Buhl AM et al. (1996) Interleukin-8 regulation of the
Ras/Raf/mitogen activated protein quinase pathway in human neutrophils. J Biol Chem, v.
271: 2832-2838
Konstantopoulos K. and Mcintire LV. (1996) Effects of fluid dynamics on vascular cell
adhesion. J. Clin. Invest., v. 98: 2661-2665
Kurihara K, Wardlaw AJ, Moqbel R, Kay AB. (1989) Inhibition of platelet-activating factor
(PAF)-induced chemotaxis and PAF binding to human eosinophils and neutrophils by the
specific ginkgolide-de-rived PAF antagonist. BN 52021. J. Allergy Clin. Immunol. v. 83: 83-
90
Kutsuna H, Kenichi S, Kamata N, Kato T et al. (2004). Actin reorganization and
morphological changes in human neutrophils stimulated by TNF, FM-CSF, and G-CSF: the
role of MAP quinases. Am J Physiol Cell Physiol, v. 286: 55-64
Laudanna C, Constantin G, Baron P, Scarpini E (1994) Sulfatides trigger increase of
cytosolic free calcium and enhanced expression of tumor necrosis factor-alpha and
interleukin-8 mRNA in human neutrophils. Evidence for a role of L-selectin as a signaling
molecule. J. Biol. Chem, v. 269: 4021–4026
Lauffenburger DA. and Horwitz AF. (1996) Cell migration: A physically integrated
molecular process. Cell., v. 84: 359-369
Lawrence MB. and Springer TA. (1991) Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow
rates: Distinction and prerequisite for adhesion through integrins. Cell, v. 65: 859-873
Lewis TS, Shapiro PS, Ahn NG. (1998). Signal transduction through MAP quinase cascades.
Adv Cancer Res, v. 74: 49-139
Ley K, Gachtgens P, Fennie M, Singer S et al. (1991) Lectin-like cell adhesion molecule 1
mediates leukocyte rolling in mesenteric venules in vivo. Blood, v 77:2553-2555
Liang L, Huang CK. (1995) Tyrosine phosphorylation induced by cross-linking of Fcgamma
receptor type II in human neutrophils. Biochem J, v. 306: 489-495
Llewellyn-Jones CG, Hill SL, Stockley RA. (1994) Effects of fluticasone propionate on
neutrophil chemotaxis, superoxide, superoxide generation, and extracellular proteolytic
activity in-vitro. Thorax v. 49: 207-212
Lloyd AR, Oppenheim JJ. (1992) Poly´s lament: the neglected role of the polymorphonuclear
neutrophil in the afferent lim of the immune response. Immunol Today, v. 13: 169-172
Loike JD, Cao L, Budhu S, Marcantonio EE et al. (1999) Differential regulation of beta 1
integrins by chemoattractants regulates neutrophil migration through fibrin. J. Cell Biol., v.
144: 1047-1056
101
Lomas DA, Ip M, Chamba A, Stockley RA. (1991) The effect of in vitro and in vivo
dexamethasone on human neutrophil function. Agents Actions, v. 33: 279-285
Lucas R, Magez S, Leys R, Fransen L et al. (1994) Mapping the lectin-like activity of tumour
necrosis factor. Science, v. 263: 814-817
McColl SR, DiPersio JF, Caon AC, Ho P, Naccache PH. (1991) Involvement of tyrosine
quinases in the activation of human peripheral blood neutrophils by granulocyte-macrophage
colony-stimulating factor. Blood, v. 78: 1842-1852
Macever RP. And Cummings RD. (1997) Role of PSGL-1 binding to selectins in leukocyte
recruitment. J. Clin. Invest., v. 100: 485-492
Martin-Padura I, Lostaglio S, Shneemann M, Williams L et al. (1988) Junctional adhesion
molecule, a novel member of the ikmmunoglobulin superfamily that distributes at
intercellular junctions and modulates monocyte transmigration. J. Cell Biol., v. 142: 117-127
Matsumoto T, Yokoi K, Mukaida N, Harada A et al. (1997) Pivotal role of interleukin-8 in
the acute respiratory distress syndrome and cerebral reperfusion injury. J. Leukoc. Biol., v.
62: 581-587
Mianki S, Hamasaki Y, Yamamoto S, Miyazaki S. (1996) Inhibition by dexamethasone of
the lipopolysaccharide-induced increase in IL-6 messenger-RNA abundancec and IL-6
production in human polymorphonuclear leukocytes. Int. Immunopathol. Pharmacol. v. 18:
339-346
Michaelson D, Rayner J, Couto M and Ganz T (1992) Cationic defensins arise from charge-
neutralized propeptides: a mechanism for avoiding leukocyte autocytotoxicity?. J. Leukocyte
Biol., v.51: 634–639
Middleton J, Neil S, Wintle J, Clark-Lewis I et al. (1997) Transcytosis and surface
presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell, v. 91: 385-395
Miki H, Mio T, Nagai S, Hoshino Y et al. (2000) Glucocorticoid-induced contractility and F-
actin content of human lung fibroblasts in three-dimensional culture. Am J Physiol Lung Cell
Mol Physiol., v. 278(1): L13-L18
Mirinics ZK, Calafat J, Udby L, Lovelock J et al. (2002) Identification of the presenilins in
hematopoietic cells with localization of presenilin 1 to neutrophil and platelet granules.
Blood Cells Mol. Dis., v. 28: 28–38
Mollinedo F, Nakajima M, Llorens A, Barbosa E et al. Major co-localization of the
extracellular-matriz degradative enzymes heparanase and gelatinase in tertiary granules of
human neutrophils. Biochem. J, v. 327: 917–923
Moore KL, Stults NL, Diaz S, Smith DL et al. (1992) Identification of a specific glycoprotein
ligand for P-selectin (CD62) on myeloid cells. J. Cell Biol., v. 118: 445-456
102
Moreno AN. (2002) A Lectina MNCF: cinética da localização em macrófagos, papel na
atividade de neutrófilos e mastócitos e mimetização de seu efeito pela lectina vegetal KM
+
.
Rib. Preto (Tese-Doutorado, FMRP-USP)
Moreno AN, Jamur MC, Oliver C, Roque-Barreira MC. (2003) Mast cell degranulation
induced by lectins: effect on neutrophil recruitment. Int Arch Allergy Immunol. v.132: 221-30
Munck A, Guyre PM, Holbrook NJ. (1984) Physiological functions of glucocorticoids in
stress and their relation to pharmacological actions. Endocr. Rev., v. 5: 25-44
Munck A, Naray Fejes-Toth A. (1992) The ups and downs of glucocorticoid physiology.
Permissive and suppressive effects revisited. Mol. Cell Endocrinol, v. 90: C1-C4
Muller WA, Weigl SA, Deng X, Philips DM. (1993) PECAM-1 is required for
transendothelial migration of leukocytes. J. Exp. Med., v. 178: 449-460
Muller, W.A. (1995) The role of PECAM-1 (CD31) in leukocyte emigration: studies in vitro
and in vivo. J. Leukoc. Biol., v. 57: 523-528
Naccache PH, Jean N, Liao NW, Bator JM et al. (1994) Regulation of stimulated integrin
surface expression in human neutrophils by tyrosine phosphorylation. Blood, v. 84: 616-624
Nanda A, Brumell JH, Nordstrom T, Kjeldsen L et al. Activation of proton pumping in
human neutrophils occurs by exocytosis of vesicles bearing vacuolar-type H
+
-ATPases. J.
Biol. Chem., v. 271:15963–15970
Nauseef WM, McCormick S and Yi H (1992) Roles of heme insertion and the mannose-6-
phosphate receptor in processing of the human myeloid lysosomal enzyme, myeloperoxidase.
Blood, v. 80: 2622–2633
Ng-Sikorski J, Andersson R, Patarroyo M and Andersson T (1991) Calcium signaling
capacity of the CD11b/CD18 integrin on human neutrophils. Exp. Cell Res., v.195: 504–508
Newton RA, and Hogg N. (1998). The human S100 protein MRP-14 is a novel activator of
the β2integrin Mac-1 on neutrophil. J. Immunol., v. 160:1427-1435
Ohta S, Inazu T, Taniguchi T, Nakagawara G, Yamamura H. (1992) Protein-tyrosine
phosphorylation induced by concanavalin A and N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine in
human neutrophils. Eur J Biochem, v. 206: 895-900
Ohtsuka T, Kaziro Y, Satoh T. (1996) Analysis of the T-cell activation signaling pathway
mediated by tyrosine quinases, protein quinase C, and Ras protein, which is modulated by
intracellular cyclic AMP. Biochim Biophys Acta, v. 1310(2) 223-232
Ooi CE, Weiss J, Elsbach P, Frangione B and Mannion B (1987) A 25-kDa NH
2
-terminal
fragment carries all the antibacterial activities of the human neutrophil 60-kDa
bactericidal/permeability-increasing protein. J. Biol. Chem., v. 262:14891–14894
103
Oram JD and Reiter B (1968) Inhibition of bacteria by lactoferrin and other iron-chelating
agents. Biochim. Biophys. Acta, v.170: 351–365
Palmblad J, Malmsten CL, Uden AM, Radmark O et al. (1981) Leukotriene B4 is a potent
stereospecific stimulator of neutrophil chemotaxis and adherence. Blood. v. 58: 658-661
Pang G, Ortega M, Ren ZG, Reeves G, Clancy R. (1997) Autocrine modulation of IL-8
production by sputum neutrophils in chronic bronchial sepsis. Am. J. Respir. Crit. Care Med.
v. 155: 726-731
Parmley RT, Rice WG, Kinkade KM, Gilbert C and Barton JC (1987) Peroxidase-containing
microgranules in human neutrophils: physical, morphological, cytochemical, and secretory
properties. Blood, v. 70: 1630–1638
Patel T, Gores GJ. Apoptosis in liver transplantation: a mechanism contributing to immune
modulation, preservation injury, neoplasia, and viral disease. Liver Transplant Surg, v. 4:42-
50
Perretti M, Flower RJ. (1996) Measurement of lipocortin 1 levels in murine peripheral blood
leukocytes by flow cytometry ; modulation by glucocorticoids and inflammation. Br. J.
Phamacol. v. 118: 605-610
Peschon JJ, Slack JL, Reddy P, Stocking KL et al. (1998) An essential role for ectodomain
shedding in mammalian development. Science, v. 282: 1281-1284
Petroni KC, Shen L, Guyre PM. (1988) Modulation of human polymorphonuclear leukocyte
IgG Fc-receptors and Fc-receptor-mediated functions by IFN-gamma and glucocoticoids. J.
Immunol. v.140: 3467-3472
Pongracz J, Webb P, Wang KQ, Deacon E et al. (1999). Spontaneous neutrophil apoptosis
involves caspase 3-mediated activation of protein quinase C-delta. J Biol Chem, v.
274:37329–37334
Psychoyos S, Uziel-Fusi S, Bhagwat S, Morrissey MM. (1989) Influence of standard and
novel LTB4 analogs on human neutrophil chemotaxis by multiwell cap assay. J. Immunol.
Methods v. 124: 189-196
Preece G, Murphy G, Ager A. (1996) Metalloproteinase-mediated regulation of L-selectin
levels on leucocytes. J.Biol.Chem. v. 271: 11634-11640
Ptasznik A, traynor-Kaplan A, Bokoch GM. (1995) G protein-coupled chemoattractant
receptors regulate Lyn tyrosine quinase: Src adapter protein signaling complexes. J Biol
Chem, v. 270: 19969-19973
Ptasznik A, Prossnitz ER, Yoshikawa D et al. (1996) A tyrosine quinase signling pathway
accounts for the majority of phosphatidylinositol 3, 4, 5-triphosphate formation in
chemoattractant stimulated human neutrophils. J Biol. Chem, v. 271: 25204-25207
104
Rafiee P, Lee JK, Leung CC, Raffin TA. (1995) TNF alpha induces tyrosine phosphorylation
of mitogen activated protein quinase in adherent human neutrophils. J Immunol, v. 154:
4785-4792
Ray A, Prefontaine KE. (1994) Physical association and functional antagonism between the
p65 subunit of transcription factor NF-kappa B and the glucocorticoid receptor.
Proc Natl Acad Sci U S A., v. 91(2):752-6
Rice WG, Ganz T, Kinkade JM, Selsted ME et al. (1987) Defensin-rich dense granules of
human neutrophils. Blood, v.70: 757–765
Richard S, Shaw AS, Showell HJ, Connelly PA (1994a) The role of individual Fcgamma
receptors in aggregated IgG-stimulated protein tyrosine phosphorylation in the human
neutrophil. Biochem Biophys Res Commun, v. 199: 653-661
Richard S, Farrell CA, Shaw AS, Showell HJ, Connelly PA (1994b) C5a as a model for
chemotactic factor stimulated tyrosine phosphorylation in the human neutrophil. J Immunol.,
v. 152: 2479-2487
Roilides E, Uhlig K, Venzon D, Pizzo PA, Walsh TJ. (1993) Prevention of corticosteroid-
induced suppression of human polymorphonuclear leukocyte-induced damage of aspegillus-
fumigatus hyphae by granulocyte-colony-stimulating factor and gamma-interferon. Infect.
Immun, v. 61: 4870-4877
Roussel E. and Gingras MC. (1997) Transendothelial migration induces rapid expression on
neutrophils of granule-release VLA6 used for tissue infiltration. J. Leukoc. Biol., v. 62: 356-
362
Rudack C, Jorg S, Sachse F. (2004) Biologically active neutrophil chemokine pattern in
tonsillitis. Clin Exp Immunol., v. 135: 511-518
Saito N, Pulford KA, Breton-Gorius J, Masse JM et al. (1991) Ultrastructural localization of
the CD68 macrophage-associated antigen in human blood neutrophils and monocytes. Am. J.
Pathol., v. 139: 1053–1059
Salak JL, McGlone JJ, Lyte M. (1993) Effects of in-vitro adrenocorticotropic hormone,
cortisol and human recombinant interleukin-2 on porcine neutrophil migration and luminol-
dependent chemiluminescence. Vet. Immunol. Immunopathol v. 39: 327-337
Sanchez-Madrid F, del Pozo MA. (1999) Leukocyte polarization in cell migration and
immune interactions. EMBO J., v. 18(3):501-511
Sato S, Hughes RC. (1994) Regulation of secretion and surface expression of Mac-2, a
galactoside-binding protein of macrophages.J Biol Chem., v. 269(6):4424-30
Savill J (1997). Apoptosis in resolution of inflammation. J Leukoc Biol , v.61:375–380
105
Savill J, Hogg N, Ren Y, and Haslett C (1992). Thrombospondin cooperates with CD36 and
the VnR in macrophage recognition of neutrophils undergoing apoptosis. J Clin Invest ,
v.90:1513–1520
Sasagawa Y, Sakuma S, Higashi Y, Sasakawa T, Amaya T, Goto T. (2000) FK506 supresses
neutrophil cheattractant production by peripheral blood mononuclear cells. Eur.J. Pharmacol.
v. 403: 281-288
Sheinman SJ, Reid R, Coulson R, Jones DB, Ford SM (1994) Transepithelial phosphate
transport in rabbit proximal tubular cells adapted to phosphate deprivation.
Am J Physiol., v. 266:C1609-1618
Schlaghecke R, Beuscher D, Kornely E, Specker C. (1994) Effects of glucocorticoids in
rheumatoid arthritis. Diminished glucocorticoid receptors do not result in glucocorticoid
resistance. Arthritis Rheum., v. 37: 1127-1131
Sham RL, Phatak PD, Ihne TP, Abboud CN (1993).Packman CH. Signal pathway regulation
of interleukin-8-induced actin polymerization in neutrophils. Blood, v; 82: 2546-2551
Sekido N, Mukaida N, Harada A, Nakanishi I et al. (1993) Prevention of lung reperfusion
injury in rabbits by a monoclonal antibody against interleukin-8. Nature, v. 365: 654-657
Sengelov H, Kjeldsen L and Borregaard N. (1993) Control of exocytosis in early neutrophil
activation. J. Immunol., v.150:1535–1543
Sengelov H, Kjeldsen L, Diamond MS, Springer TA and Borregaard N (1993) Subcellular
localization and dynamics of Mac-1 (alpha m beta 2) in human neutrophils. J. Clin. Invest., v.
92: 1467–1476
Sengelov H, Kjeldsen L, Diamond MS, Springer TA and Borregaard N (1993) Subcellular
localization and dynamics of Mac-1 (alpha and beta 2) in human neutrophils. J. Clin. Invest.,
v. 92: 1467–1476.
Sengelov H, Kjeldsen L, Kroeze W, Berger M and Borregaard N (1994) Secretory vesicles
are the intracellular reservoir of complement receptor 1 in human neutrophils. J. Immunol., v.
153: 804–810
Sengelov H, Boulay F, Kjeldsen L and Borregaard N (1994) Subcellular localization and
translocation of the receptor for N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine in human
neutrophils. Biochem. J, v.. 299: 473–479.
Sengelov H, Follin P, Kjeldsen L, Lollike K et al. (1995) Mobilization of granules and
secretory vesicles during in vivo exudation of human neutrophils. J. Immunol, v. 154: 4157–
4165.
Sengelov, H. (1996) Secretory vesicles of human neutrophils. Eur. J. Haematol., v. 57: 6-24
106
Simon SI, Burns AR, Taylor AD, Gopalan PK et al. (1995) L-selectin (CD62L) cross-linking
signals neutrophil adhesive functions via the Mac-1 (CD11b/CD18) beta2-integrin. J.
Immunol., v. 155: 1502-1514
Singer II, Scott S, Kawka DW and Kazazis DM (1989) Adhesomes: specific granules
containing receptors for laminin, C3bi/fibrinogen, fibronectin, and vitronectin in human
polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Cell Biol, v.109: 3169–3182
Smith CW, Kishimoto TK, Abbass O, Hughes et al. (1991) Chemotactic factors regulated
lectin adhesion molecule-1 (LECAM-1) dependent neutrophil adhesion to cytokine-
stimulated endothelial cells in vitro. J. Clin. Invest., v. 87: 609-618
Smolen JE, Petersen TK, Koch C, O'Keefe SJ et al. (2000) L-selectin signaling of neutrophil
adhesion and degranulation involves p38 mitogen-activated protein quinase. J.Biol.Chem., v.
275:15876-15884
Snyderman R. and Goetzl EJ. (1981) Molecular and cellular mechanisms of leukocyte
chemotaxis. Science, v. 213: 830-837
Spertini O, Luscinskas FW, Munro JM, Griffin JD et al (1991) Leukocyte adhesion
molecule-1 (LAM-1, L-selectin) interacts with an inducible endothelial cell ligand to support
leukocyte adhesion. J. Immunol., v. 147: 2565-2573
Stoolman LM and Rosen SD (1983) Possible role for cell-surface carbohydrate-binding
molecules in lymphocyte recirculation. J. Cell Biol., v. 96: 722-729
Strausbaugh HJ, Rosen SD. (2001) A potential role for annexin 1 as a physiologic mediator
of glucocorticoid-induced L-selectin shedding from myeloid cells. J. Immunol., v. 166: 6294-
6300
Suzuki K, Hino M, Kutsuna H, Hato F et al (2001) Selective activation of p38 mitogen-
activated protein quinase cascade in human neutrophils stimulated by IL-1beta J Immunol.,
v.167(10):5940-7
Tsuji C, Shioya S. (1994) In-vivo effect of methylprednisolone on lipopolysaccharide-
induced superoxide production by pulmonary and circulating blood neutrophils in rats. Circ.
Shock. v. 42: 128-134
Tanida N, Ohno N, Adachi Y, Matsuura M et al. (1992) Modification of
immunopharmacological activities of synthetic monosaccharide lipid A analogue, GLA60, by
lysozyme. J. Biochem., v. 112: 616–623
Thomas E, Leroux JL, Blotman F, Descomps B, Chavis C. (1995) Enhancement of
leukotriene A4 biosynthesis in neutrophils from patients with rheumatoid arthritis after a
single glucocorticoid dose. Biochemical Pharmacology, v.49: 243-248
Thompson CB. (1999) Apoptosis. In: Paul WE, editor. Fundamental immunology. 4. ed.
Philadelphia: Lippincott-Raven; p.813-29
107
Timoshenko AV, Gorudko IV, Maslakova OV, Andre S et al (2003) Analysis of selected
blood and immune cell responses to carbohydrate-dependent surface binding of proto- and
chimera-type galectins.Mol Cell Biochem., v. 250(1-2):139-49
Toledo KA, Bernardes ES, Baruffi MD, Roque-Barreira MC. (2007) Neutrophil haptotaxis
induced by mouse MNCF: interactions with extracellular matriz glycoproteins probably
contribute to overcoming the anti-inflammatory action of dexamethasone. Inflammation
Research., v. 56 (9): 368-376.
Torres M, Hall FL, O’Neil K. (1993) Stimulation of human neutrophils with formyl-
methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two
distinct mitogen-activated protein quinases. J Immunol., v. 150: 1563-1577
Turner J, Cho Y, Dinh NN, Waring AJ and Lehrer RI (1998) Activities of LL-37, a cathelin-
associated antimicrobial peptide of human neutrophils. Antimicrob. Agents Chemother, v. 42:
2206–2214
van den Berg JM, Weyer S, Woening JJ, Roos D, Kerijpers TW. (2001) Divergent effects of
tumor necrosis factor-alpha on apoptosis of human neutrophils. J Leukocyte Biology, v. 69:
467-473
Vaporciyan AA. (1993) Involvement of platelet-endothelial cell adhesion molecule-I in
neutrophil recruitment in vivo. Science, v. 262: 1580-1582
Varki A. (1997) Selectin ligands: Will the real ones please stand up? J. Clin. Invest., v. 99:
158-162
Venturi GM, Tu L, Kadono T, Khan AI et al. (2003) Leukocyte migration is regulated by L-
selectin endoproteolytic release.Immunity, v.19(5):713-24
Von Andrian UH, Chambers JD, McEvoy LM, Bargatze RF et al (1991) Two-step model of
leukocyte-endothelial cell interaction in inflammation: Distinct roles for LECAM-1 and the
leukocyte beta2-integrins in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 88: 7538-7542
Wadell TK, Fialkow L, Chan CK, kishimoto TK, Downey GP. (1995) Sinaling functions of
L-selectin: enhancement of tyrosine phosphorylation and activation of MAP quinase. J Biol
Chem, v. 270: 15403-15411
Wagner JG. and Roth RA. (2000) Neutrophil migration mechanisms, with emphasis on the
pulmonary vasculature. Pharmacol. Rev., v. 52: 349-374
Walcheck B, Kahn J, Ficher JM, Wang BB et al. (1996) Neutrophil rolling altered by
inhibition of L-selectin shedding in vitro.Nature, v. 380(6576):720-3
Watson RW, O’Neill A, Brannigen AE, Coffey R et al. (1999). Regulation of Fas antibody
induced neutrophil apoptosis is both caspase and mitochondrial dependent. FEBS Letters, v.
453:67–71.
108
Welch H, maridonneau-Parini I. (1997) Hck is activated by opsonized zymosan and A23187
in distinct subcellular fractions of human granulocytes. J Biol Chem, v. 272: 102-109
Wertheim WA, Kunker SL, Standiford TJ, Burdick MD et al. (1993) Regulation of
neutrophil-derived IL-8-the role of prostaglandin-E2 dexamethasone and IL-4. J. Immunol.,
v.151: 2166-2175
Wicks IP, Howell ML, Hancock T, Kohsaka H et al. (1995) Bacterial lipopysaccharide
copurifies with plasmid DNA: implications for animal models and human gene therapy. Hum
Gene Ther, v. 6(3): 317-323
Williams MA and Solomkin JS. (1999) Integrin-mediated signaling in human neutrophil
functioning. J. Leukoc. Biol., v. 65: 725-736
Wimley WC, Selsted ME and White SH (1994) Interactions between human defensins and
lipid bilayers: evidence for formation of multimeric pores. Protein Sci, v. 3:1362–1373
Witko-Sarsat V, Rieu P, Descamps-Latscha B, Lesavre P, Halbwachs-Mecarelli L. (2000)
Biology of disease. Neutrophils: molecules, functions and pathophysiological aspects. Lab.
Invest., v. 80: 617-653
Worthen GS, Avdi N, Vukajlovich S, Tobias PS. (1992) Neutrophil adherence induced by
lipopolysaccharide in vitro. Role of plasma component interaction with lipopolysaccharide.
J. Clin. Invest, v. 90: 2526-2535
Xing Z, Jodana M, Kirpalani H, Driscoll KE et al. (1994) Cytokine expression by neutrophils
and macrophages in vivo: endotoxin induces tumor necrosis factor-alpha, macrophage
inflammatory protein-2, interleukin-1 beta, and interleukin-6 but not RANTES or
transforming growth factor-beta 1 mRNA expression in acute lung inflammation. Am J
Respir Cell Mol Biol, v.10: 148-153
Yamaoka A, Kuwabara I, Frigeri LG, Liu FT (1995) A human lectin, galectin-3 (epsilon
bp/Mac-2), stimulates superoxide production by neutrophils.J Immunol., v.154(7):3479-87
Yan SR, Fumagalli L, Berton G. (1996) Activation of SRC family quinases in human
neutrophils: evidence that p58C FGR and p53/56 LYN redistributed toa Triton X 100
insoluble cytoskeletal fraction, also enriched in the caveolar protein caveolin, display an
enhanced quinase activity. FEBS Lett, v. 380: 198-203
Yan SR, Huang M, Berton G. (1997) Activation of p58 c-fgr and p53/56 lyn in adherent
human neutrophils: evidence for a role of divalent cations in regulating neutrophil adhesion
and protein tyrosine quinase activities. J Inflammation, v. 45: 297-311
Yang D, Chen Q, Chertov O and Oppenheim JJ (2000) Human neutrophil defensins
selectively chemoattract naive T and immature dendritic cells. J. Leukocyte Biol, v.68: 9–14
Yang D, Chen Q, Schmidt AP, Anderson GM et al. (2000) LL-37, the neutrophil granule-
and epithelial cell-derived cathelicidin, utilizes formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) as a
109
receptor to chemoattract human peripheral blood neutrophils, monocytes, and T cells. J. Exp.
Med, v.192: 1069–1074.
Youssef P, Roberts-Thomson P, Ahern M, Smith M. (1995) Pulse methylprednisolone in
rheumatoid-arthritis - effects on peripheral-blood and synovial-fluid neutrophil surface
phenotype J. Rheumatol. v .22: 2065-2071
Zocchi MR, Ferrero E, Leone BE, Rovere P et al. (1996) CD31/PECAM-1-driven
chemokine-independent transmigration of human T lymphocytes. Eur. J. Immunol., v. 26:
759-767
Zouki C, Quellet S, Filep JG (2000) The anti-inflammatory peptides, antiflammins, regulate
the expression of adhesion molecules on human leukocytes and prevent neutrophil adhesion
to endothelial cells.FASEB J., v.14(3):572-80
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111
FICHA CATALOGRÁFICA
Toledo, Karina Alves
Da ativação de neutrófilos pela lectina MNCF decorrem
transcrição gênica e secreção de mediadores sustetadas em
ambiente anti-inflamatório. Ribeirão Preto, 2007.
106 p.: il.; 30 cm
Tese de doutorado em co-tutela, apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração:
Imunologia Básica e Aplicada.
Orientadora: Roque-Barreira, Maria Cristina
Co-orientadora: Halbwachs-Mecarelli, Lise
MNCF, 2. ativação neutrofílica, 3. glicocorticóides
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