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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E
APLICADA
Construção de uma vacina de DNA múltipla
contendo dois antígenos micobacterianos
(Ag85A+Hsp65) e avaliação da proteção
contra tuberculose experimental
Juliana Issa Hori
RIBEIRÃO PRETO
2007
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Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E
APLICADA
Construção de uma vacina de DNA múltipla
contendo dois antígenos micobacterianos
(Ag85A+Hsp65) e avaliação da proteção
contra tuberculose experimental
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de
São Paulo para obtenção do Título de Mestre em
Ciências Área de concentração: Imunologia
Básica e Aplicada.
Orientador: Prof. Dr. Célio Lopes Silva
RIBEIRÃO PRETO
2007
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central do Campus Administrativo de Ribeirão Preto / USP
Hori, Juliana Issa
Construção de uma vacina de DNA múltipla contendo dois antígenos micobacterianos
(Ag85A+Hsp65) e avaliação da proteção contra tuberculose
experimental. Ribeirão Preto,
2007.
137 p. : il.; 28cm
Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP.
Área de Concentração: Imunologia Básica e Aplicada.
Orientador: Dr. Célio Lopes Silva.
1. Tuberculose 2. Vacina de DNA 3. Hsp65 4. Ag85A.
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Daisaku Ikeda.
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DEDICATÓRIA
Aos meus pais Julio e Naza pelo apoio e incentivo incondicional. Pelo
exemplo de vida e dedicação, por todo amor e carinho...
Obrigada por tudo.. Amo vocês!
Á toda minha família, em especial aos meus tios
Abrahão, Kazu, Luís e tias Rosa, Maria, Cida e Má....
Aos primos Cris, Jú e Wander...
Ao meu querido Bruno por todo amor, carinho, amizade e
companherismo. Pelas conversas, risadas e momentos inesquecíveis... também
pela imprescindível ajuda com a elaboração da capa desse trabalho.
Obrigada.... Eu te amo!!!
vi
AGRADECIMENTOS
Ao meu professor e orientador Dr. Célio Lopes Silva, pela oportunidade de trabalhar
em seu laboratório, pela confiança deposiatada em mim e em meu trabalho, pelos
ensinamentos e pela grande contribuição em minha formação profissional. Muito obrigada!!!
À professora Dr
a
. Arlete Aparecida Martins Coelho-Castelo, pela co-orientação nesse
trabalho, pelas valiosas sugestões e discussões que contribuíram sem dúvida para o
enriquecimento desse trabalho. Obrigada por sua disponibilidade e atenção!
À professora Dr
a
. Vânia Luiza Deperon Bonato pela colaboração durante o
desenvolvimento desse trabalho.
Aos professores Dr. Marcelo Brocchi e Dr. Luis Carlos de Souza Ferreira, pela
participação no julgamento desse trabalho, pelas excelentes sugestões e contribuições na
elaboração final dessa dissertação.
À professora Dr
a
. Simone Gusmão Ramos, por toda avaliação dos cortes histológicos.
À técnica Elaine Medeiros Floriano, por sua simpatia e disponibilidade na
elaboração dos cortes histológicos.
À Dr
a
. Kris Huygen e Dr
a
. Marta Romano, pela disponibilização de todo o material
relacionado ao Ag85A.
À professora Dr
a
. Ana Paula Ulian Araújo, por todas as sugestões e recomendações.
Ao professor Dr. João Santana da Silva, por toda sua dedicação ao Programa de Pós-
Graduação em Imunologia Básica e Aplicada e inflexível preocupação com nossa formação
acadêmico-profissional.
À todos os docentes do Programa, pela contribuição em minha formação.
À querida secretária Ana Cristine, pelo exemplo de competência nos serviços
prestados à pós-graduação, por todo carinho e ajuda em todos os momentos que precisei.
Ao professor Dr. Dario Simões Zamboni, pelo apoio ‘emocional’ nessa fase final de
elaboração da dissertação, pelos conselhos e pela oportunidade me dada nessa nova fase que
se iniciará em minha vida!
Ao Dr. Carlos Rodrigo Zarate-Bladés, pela importante participação nesse trabalho,
por todas suas sugestões, críticas e correções.
À Izaíra Tincane Brandão (Iza!) e Ana Paula Masson (Aninha!), nossa mãezona e
nossa mãezinha do laboratório, pelo apoio técnico nos experimentos realizados, pela
amizade e ensinamentos. Obrigada!
Às minhas queridas e companheiras, Bauxita, Lú, Marininha, Paty, Tati e Wendy, pela
grande amizade, companherismo, conselhos e consolos! Obrigada pela ajuda com os
vii
experimentos (mesmo nas madrugadas!), pelas risadas, brincadeiras, enfim, pelos momentos
inesquecíveis vividos durante esses três anos!
À todos do laboratório que contribuíram de maneira direta ou indireta nesse
trabalho, pela convivência diária, por todo apoio e principalmente pela amizade: Ana Paula
(Pat), Ana Flávia, Beraba, Cássia, Deison (marmota!), Denise, Eduardo, Galetti, Julio,
Marina, Pry, Ricardo, Rodrigo, Rogério, Rubinho, Sandra, Sheila, Thiago, Zé Eduardo e
Willian.
Ao pessoal do Núcleo de Pesquisas em Tuberculose (NPT): Ana, Carlos, Helena,
Vanessa e em especial ao Rogério pelo auxílio na impressão final dessa dissertação, pelos
socorros com os computadores e pela amizade.
Ao WalterMiguel Turato pela ajuda indispensável nos experimentos de Citometria de
Fluxo e pelos ótimos momentos de gargalhadas!
Aos meus eternos amigos de Birigui: Josie, Jonas, Aline, André e Fer, que mesmo de
tão longe, sempre me incentivaram e torceram por mim. Obrigada pela fiel amizade durante
todos esses anos. Adoro muito todos vocês!!!
Aos meus amigos do Laboratório de Biologia Molecular da UFSCar, por todos os
ensinamentos durante a minha iniciação científica, que sem dúvida alguma foram muito
importantes para a minha atual formação: ao professor Dr. Flávio Henrique Silva, que
sempre confiou em mim e pelo grande incentivo ao meu crescimento acadêmico. Aos queridos
Andréa, César, Dani, Elisete, Kelly, Maria Teresa, Marilena, Pat, Reis, Vivi, Wilson e
principalmente à Déia, minha amiga e companheira de todas as horas! Muito obrigada por
tudo!!!
Aos novos companheiros de laboratório, pela recepção, amizade e apoio nessa minha
‘transição’! Ao Joni, Tati, Marcelo, Giu, Grace e Eulalia. Obrigada!!!
À todos os amigos do Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e
Aplicada, em especial ao Antônio, Claudia, Carla, Ellen, Fabi, Silvinha e Vivi, por todos os
momentos compartilhados.
Ao professor e filósofo Dr. Daisaku Ikeda, por todas as orientações e ensinamentos
proporcionados.
À todos da ‘família Soka’, que são realmente uma família para mim, que sempre
poderei contar!
À FAEPA, pelos auxílios concedidos para a divulgação do presente trabalho em
eventos científicos.
À FAPESP, pelo auxílio financeiro essencial para o desenvolvimento desse trabalho.
viii
SUMÁRIO
Abreviaturas
xiii
Resumo
xix
Abstract
xxi
1- Introdução
1
1.1- Tuberculose 2
1.2- Resposta imune na tuberculose 3
1.3- Desenvolvimento de vacinas contra TB 10
1.4- Desenvolvimento da vacina DNA-Hsp65 15
2- Objetivos
20
2.1- Objetivo Geral 21
2.2- Objetivos Específicos 21
3- Material e Métodos
22
3.1- Primeira estratégia de construção da vacina múltipla 23
3.1.1- Amplificação do gene Ag85A 23
3.1.2- Clivagem e purificação do plasmídeo pVAX-Hsp65 24
3.1.3- Defosforilação do plasmídeo pVAX-Hsp65 linearizado e
clonagem do inserto Ag85A
24
3.1.4- Preparação de bactérias E.coli DH5α CaCl
2
competentes
25
3.1.5- Transformação das bactérias por choque térmico 25
3.1.6-Quantificação e avaliação da integridade dos plasmídeos
purificados
26
3.2- Segunda estratégia de construção da vacina múltipla 27
3.2.1- Amplificação do gene Ag85A 27
3.2.2- Clivagem e purificação do plasmídeo pVAX-Hsp65 28
3.2.3- Preparação do plasmídeo pVAX-Hsp65 para clonagem do
inserto Ag85A
28
3.2.4- Transformação das bactérias por choque térmico e
identificação dos novos clones recombinantes
29
3.2.5- Quantificação e avaliação da integridade dos plasmídeos
purificados
29
3.2.6- Construção do plasmídeo pVAX-Ag85A 30
3.3- Ensaio de transfecção de macrófagos J774 30
3.4- Extração do RNA total das células e realização de RT-PCR 31
3.5- Análise de western-blot 33
ix
3.6- Animais 34
3.7- Extração e purificação das construções de DNA 34
3.8- Quantificação e avaliação da integridade dos plasmídeos purificados 35
3.9- Obtenção das proteínas recombinantes: rHsp65 e rAg85A 36
3.10- Quantificação dos níveis de endotoxinas 37
3.11- Grupos experimentais e Imunizações 38
3.12- Obtenção do lisado de M. tuberculosis (Mtb) 39
3.13- Processamento do baço para cultura de células 40
3.14- Cultura de células para dosagem de citocinas 40
3.15- Cultura de células para linfoproliferação 40
3.16- Ensaio Imunoenzimático-ELISA para dosagem de anticorpos 41
3.17- Ensaio Imunoenzimático- ELISA para dosagem de citocinas 42
3.18- Preparo do inóculo de M. tuberculosis 43
3.19- Desafio dos animais com M. tuberculosis 44
3.20- Avaliação dos pulmões dos animais desafiados 44
3.21- Coleta, digestão e obtenção de células do pulmão 45
3.22- Ensaio imunoenzimático ELISA para dosagem de citocinas no
homogenato de pulmão
46
3.23- Marcação de células para Citometria de Fluxo 46
3.24- Ensaio Imunoenzimático ELISA para dosagem de anticorpos 47
3.25- Determinação do número de unidades formadoras de colônia (UFC) 47
3.26- Análise histológica 48
3.27- Análise estatística 48
3.28- Delineamento experimental 48
4- Resultados
51
4.1- Primeira estratégia de construção da vacina múltipla 52
4.2- Identificação dos clones recombinantes 55
4.3- Nova estratégia de construção da vacina múltipla 57
4.4- Identificação dos novos clones recombinantes 60
4.5- Detecção do mRNA do gene Ag85A em macrófagos de linhagem
J774
63
4.6- Detecção da proteína Ag85A por western-blot 65
4.7- Análise das vacinas gênicas purificadas 67
4.8- Obtenção da proteína Hsp65 recombinante (rHsp65) 69
4.9- Quantificação de endotoxina bacteriana 71
4.10- Ensaios de Imunogenicidade 72
x
4.10.1- Resposta imune humoral anti-Hsp65 e anti-Ag85A 72
4.10.2- Detecção de citocinas em sobrenadante de cultura de células
do baço
76
4.10.3- Resposta Linfoproliferativa após imunização 82
4.11- Ensaios de Proteção 84
4.11.1- Resposta imune humoral anti-Hsp65 e anti-Ag85A nos
animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis
84
4.11.2- Análise da produção de citocinas no homogenato do pulmão
de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis
88
4.11.3- Avaliação fenotípica das células presentes nos pulmões de
animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis
91
4.11.4- Avaliação das unidades formadoras de colônia (UFC) 95
4.11.5- Avaliação histopatológica do pulmão 97
5- Discussão
103
6- Conclusões
124
7- Referências Bibliográficas
126
7.1- Artigos Científicos 127
7.2- Livros, teses e dissertações 137
xi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1- Resultado da reação de amplificação do gene Ag85A, avaliado por
gradiente em PCR
53
Figura 2- Resultado da clivagem do plasmídeo pVAX-Hsp65 54
Figura 3- Resultado do PCR de colônia 56
Figura 4- Resultado da nova reação de amplificação do gene Ag85A, avaliado
por gradiente em PCR
58
Figura 5- Resultado das clivagens dos plasmídeos pVAX1 e pVAX-Hsp65
digeridos com BamHI e HindIII
59
Figura 6- Resultado da reação de PCR de colônia 61
Figura 7- Análise de restrição dos plasmídeos recombinantes 62
Figura 8- Avaliação do RNA total e detecção do mRNA de Ag85A 64
Figura 9- Detecção da proteína Ag85A por meio de western blot 66
Figura 10- Perfil eletroforético dos DNAs plasmídeais purificados 68
Figura 11- Expressão e purificação da proteína recombinante Hsp65 70
Figura 12- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65 74
Figura 13- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Ag85A 75
Figura 14- Detecção de IL-12 em sobrenadante de cultura de células do baço
dos animais imunizados
78
Figura 15- Detecção de IFN-γ em sobrenadante de cultura de células do baço
dos animais imunizados
79
Figura 16- Detecção de IFN-γ em sobrenadante de cultura de células do baço
dos animais imunizados
80
Figura 17- Detecção de IL-10 em sobrenadante de cultura de células do baço
dos animais imunizados
81
Figura 18- Resposta linfoproliferativa dos animais imunizados 83
Figura 19- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65
nos animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis
86
Figura 20- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Ag85A
nos animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis
87
Figura 21- Detecção de citocinas em homogenato de pulmão de animais
imunizados e desafiados com M. tuberculosis
89
Figura 22- Detecção de citocinas em homogenato de pulmão de animais
imunizados e desafiados com M. tuberculosis
90
Figura 23- Análise da porcentagem de células pulmonares expressando o
marcador CD3
+
nos animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis
92
Figura 24-
Análise da porcentagem de linfócitos T, expressando os marcadores CD4
+
e
CD8
+
no pulmão de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis
93
xii
Figura 25- Análise da porcentagem de linfócitos T CD4
+
e T CD8
+
expressando
os marcadores CD44
hi
e CD62L
lo
no pulmão de animais imunizados e desafiados
com M. tuberculosis
94
Figura 26- Número de UFC no pulmão de animais imunizados e desafiados com
M. tuberculosis
96
Figura 27- Cortes histológicos dos pulmões de animais imunizados e
desafiados com M. tuberculosis (aumento 40X)
99
Figura 28- Cortes histológicos dos pulmões de animais imunizados e
desafiados com M. tuberculosis (aumento 200X)
101
xiii
_________________________________________________________________Abreviaturas
xiv
ABREVIATURAS
Ag85: Antígeno 85
AIDS: Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
APC: Célula Apresentadora de Antígeno
BAAR: Bacilo Álcool-Ácido Resistente
BALT: Tecido Linfóide Associado ao Brônquio
BCG: Bacilo de Calmette-Guérin
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool
BSA: Albumina Sérica Bovina
cDNA: DNA Complementar
CFP: Proteínas de Filtrado de Cultura
CIAP: Calf Intestinal Alkaline Phosphatase
CMV: Citomegalovírus
ConA: Concanavalina A
CpG: Dinucleotídeos Citosina-Guanina
CR: Receptor de Complemento
CTL: Célula T citotóxica
Cy: CyChrome
DAB: 3,3’-Diaminobenzidine
DC-SIGN: Dendritic Cell-Specific ICAM-3 Grabbing Non-integrin
DEPC: Diethylpyrocarbonate
DMT: Dimicolato de Trealose
DNA: Ácido Desoxiribonucléico
dNTPs: Dideoxinucleotídeos Fosfato
_________________________________________________________________Abreviaturas
xv
DO: Densidade Óptica
DTT: Dithiothreitol
EDTA: Ethylene Diamine Tetracetic Acid
ELISA: Ensaio Immunoenzimático de Adsorção
ESAT-6: 6-kDa Early Secreated Antigen Target
FACs: Análise de Citometria de Fluxo
Fcγ
γγ
γR: Receptor para a porção constante de IgG
FITC: Isotiocianato de Fluoresceína
FSC: Forward Scartter
HBHA: Heparin-Binding Hemagglutinin
HE: Hematoxilina-Eosina
HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana
HLA: Antígeno Leucocitário Humano
HSP65: Proteína de Choque Térmico de 65 kDa
ICAM: Molécula de Adesão Intercelular 1
IFN-γ
γγ
γ: Interferon-gama
Ig: Imunoglobulina
IL: Interleucina
iNOS: Óxido Nítrico Sintase induzida
IPTG: Isopropiltio-β-D-Galactosídeo
KatG: Gene que codifica para a enzima Catalase-Peroxidase
LAL: Lisado de amebócito de Limulus sp
LAM: Liporabinomanana
LB: Luria Bertania
_________________________________________________________________Abreviaturas
xvi
LPS: Lipopolissacarídeo
MCP-1: Monocyte Chemoattractant Protein-1
MDR: Multi-Droga Resistente
MHC: Complexo Principal de Histocompatibilidade
MIP-2: Macrophage Inflammatory Protein-2
MOPS: 3 -(N-Morpholino) propanesulfonic acid
MSC: Sítio de Múltipla Clonagem
Mtb: Mycobacterium tuberculosis
MTP-64: M. tuberculosis secreted proteins
MVA: Vírus da vaccinia Ankara modificado
NCBI: Nacional Center for Biotechnology Information
NI: Não Imunizado e Não Infectado
NK: Natural Killer
NO: Óxido Nítrico
NPT: Núcleo de Pesquisas em Tuberculose
OMS: Organização Mundial de Saúde
OPD: Orto-phenilene-diamina
ORF: Fase Aberta de Leitura
PAMP: Padrão Molecular Associado ao Patógeno
PBS: Salina Tamponada com Fosfato
PCR: Reação em Cadeia da Polimerase
PE: Ficoeritrina
PMSF: Phenylmethylsulphonyl Fluoride
PPD: Derivado Protéico Purificado
_________________________________________________________________Abreviaturas
xvii
PRR: Receptor de Reconhecimento Padrão
PstA1: Phosphate Transport System Permease Protein A-1
RANTES: Regulated upon activation normal T cell expressed and secreted
RD1: Region of Difference 1
RNA: Ácido Ribonucléico
RNIs: Intermediários Reativos do Nitrogênio
ROIs: Intermediários Reativos do Oxigênio
RpoB: Beta Subunit of RNA Polymerase
SBF: Soro Bovino Fetal
SBPT: Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisiologia
SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis
SPF: Livre de Patógenos Específicos
SSC: Side Scartter
TB: Tuberculose
TCR: Receptor da Célula T
TGF: Fator de Crescimento Tumoral
Th1: Célula T auxiliar tipo 1
Th2: Célula T auxiliar tipo 2
ThyA: Thymidylate Synthase
TLR: Receptor do Tipo Toll
TM: Temperatura de Melting
TNF: Fator de Necrose Tumoral
tPA: Human Tissue Plasminogen Activator
Treg: Célula T reguladora
_________________________________________________________________Abreviaturas
xviii
UFC: Unidades Formadoras de Colônia
XDR: Extremamente Resistente
WHO: World Health Organization
ZN: Ziehl-Neelsen
xix
_____________________________________________________________________Resumo
xx
RESUMO
Mais de 100 anos após sua descoberta, a tuberculose (TB) ainda é considerada uma
das maiores causas de mortalidade em todo o mundo. A única vacina atualmente licenciada
para uso na profilaxia da TB é o BCG, porém esta tem mostrado uma eficácia variável de 0 a
80%. Portanto, estratégias para o desenvolvimento de novas vacinas tem sido alvo de intensa
investigação. A vacina DNA-Hsp65, desenvolvida pelo nosso grupo, tem demonstrado não só
atividade preventiva como terapêutica contra a doença já estabelecida. No entanto, uma
vacina baseada em um único antígeno poderia não proteger efetivamente toda a população
humana. Assim, no intuito de otimizar essa vacina, o objetivo desse trabalho foi construir uma
vacina múltipla de DNA, contendo dois antígenos micobacterianos: a Hsp65 e o Ag85A, e
avaliar a sua eficácia protetora em modelo de TB experimental. Após a construção e
caracterização da vacina múltipla DNA-Ag85A/Hsp65, os experimentos em modelo murino
foram desencadeados. Camundongos Balb/c foram imunizados com 4 doses quinzenais de
100 µg de DNA e 15 dias após a última imunização, os animais foram mortos para realização
dos ensaios de imunogenicidade, ou então desafiados com 10
5
bacilos H37Rv e mortos após
30 dias para realização dos ensaios de proteção. Os dados de imunogenicidade não mostraram
uma boa indução de resposta. Entretanto, nos ensaios de proteção, os animais vacinados com
DNA-Ag85A/Hsp65 apresentaram ativação de linfócitos B de memória, aumento no
recrutamento de linfócitos TCD4
+
e CD8
+
efetores e TCD8
+
de memória, produção de IL-12 e
IFN-γ e diminuição de IL-4. Além disso, houve produção de IL-10, importante citocina
antiinflamatória. Esse perfil de resposta gerado contribuiu para a redução do número de UFCs
nos pulmões e também para uma maior preservação do parênquima pulmonar após infecção
por Mtb se comparados com os animais controles. Assim, essa vacina apresentou-se como
uma alternativa promissora para o uso na profilaxia contra TB experimental.
xxi
____________________________________________________________________Abstract
xxii
ABSTRACT
More than 100 years after tuberculosis (TB) discovery, TB is still a main cause of
mortality worldwide. The only vaccine currently accepted for TB prophylaxis is BCG,
however, its effectiveness varies from 0 to 80%. Therefore, development of new vaccines
strategies has been an issue of intense investigation. Our group developed the DNA-Hsp65
vaccine which has shown a preventive and therapeutical activity against the established
illness. Nevertheless, a vaccine based only on one antigen could possibly not be able to
protect effectively the human population. Therefore, in attempt to optimize our vaccine, this
study objective was the construction of a multiple DNA vaccine with two mycobacterial
antigens: Hsp65 and Ag85A, and the evaluation of its protective effectiveness in experimental
TB. After the multiple vaccine DNA-Ag85A/Hsp65 construction and characterization, the
experiments in murine model had been initiated. Balb/c mice had been immunized with 4
doses of DNA (100 µg) with 2 weeks interval and 15 days after the last immunization, the
animals had been killed for the immunogenicity assays, or they were challenged with 10
5
H37Rv bacilli and killed after 30 days for the protection assays. The immunogenicity data did
not show a strong induction of immune response. However, the protection assays
demonstrated that DNA-Ag85A/Hsp65 vaccinated animals presented an activation of memory
B lymphocytes, an increased mobilization of TCD4
+
and TCD8
+
effector and TCD8
+
memory
lymphocytes, a production of IL-12 and IFN-γ and a reduction of IL-4. Moreover, these
animals produced IL-10, an important antiinflammatory cytokine. Also, we consider that this
overall response contributed for a CFU reduction in lungs and for a better preservation of
pulmonary parenchyma after Mtb infection when compared with the control animals. So, this
vaccine was presented as a promising alternative for the use in the prophylaxis against
experimental TB.
1
__________________________________________________________________Introduçâo
2
1 INTRODUÇÃO
1.1 Tuberculose
Cento e vinte e cinco anos se passaram desde a descoberta por Robert Koch do agente
etiológico da tuberculose (TB), Mycobacterium tuberculosis (Mtb), denominado também
como bacilo de Koch. Esse único microorganismo continua sendo um dos maiores causadores
de morte no mundo atual (Andersen, 2001) (Kaufmann, 2006).
Dados epidemiológicos mostram que a TB provocou a morte de mais de 1 bilhão de
pessoas ao longo da estória e acredita-se que 32% da população mundial esteja infectada com
o bacilo. É estimado que nos próximos 20 anos, haverá mais 1 bilhão de pessoas infectadas,
com 36 milhões de óbitos (WHO, 2002). Segundo a Organização Mundial da Saúde (Content
et al.), em 2003 foram reportados pelos 199 países participantes do Programa de Controle de
Tuberculose Mundial, 8,8 milhões de novos casos de TB. Neste contexto, o Brasil ocupa o 15
o
lugar em um ranking de 22 países que, juntos, somam 80% dos casos dessa patologia no
mundo todo (SBPT, 2004) (WHO, 2004).
A TB sempre esteve presente em países não desenvolvidos ou em desenvolvimento,
no entanto, essa última década foi marcada por uma reemergência global da doença,
relacionada principalmente a co-infecção com o vírus da imunodeficiência humana (HIV,
Human Immunodeficiency Virus) que causa a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
(AIDS, Acquired Immunodeficiency Syndrome) (Nunn et al., 2005). Aliado a esse fato, a
ineficiência dos sistemas de saúde, as condições de desnutrição e pobreza em determinadas
regiões, a dificuldade de adesão aos extensos esquemas terapêuticos, que levam a seleção e
surgimento de cepas de Mtb multi-drogas resistentes (MDR) (Espinal, 2003) e, mais
recentemente, das cepas extremamente resistentes (XDR) (Raviglione, 2006), são fatores que
contribuíram de forma decisiva para o aumento da incidência da tuberculose (Bloom and
__________________________________________________________________Introduçâo
3
Murray, 1992) (Meacci et al., 2005).
Apesar das estatísticas mostrarem que grande parte da população mundial já entrou em
contato com o Mtb, apenas uma parcela relativamente pequena desses indivíduos (5 a 10%),
desenvolvem a TB ativa. Noventa por cento das pessoas infectadas apresentam uma forma
latente e assintomática da doença, o que não descarta a possibilidade de uma reativação da
infecção em algum momento da vida, decorrente de um quadro de imunossupressão,
desnutrição ou exposição aos bacilos MDR e XDR (Boom et al., 2003) (Rook et al., 2005a)
(Flynn and Chan, 2005).
A profilaxia da TB é realizada pela administração da vacina BCG (Bacilo de
Calmette-Guérin) em recém-nascidos. A vacina BCG foi desenvolvida pelos pesquisadores
Albert Calmétte e Camille Guérin, em 1921, sendo gerada a partir de uma cepa virulenta de
Mycobacterium bovis que foi atenuada através da realização de vários subcultivos in vitro do
bacilo (Bloom and Jacobs, 1989) (Bannon, 1999) (Chung and Biggers, 2001). No Brasil essa
vacina tem se mostrado eficaz na proteção contra a tuberculose infantil. Mas não mostra
atividade protetora em indivíduos adultos (Barreto et al., 2006).
Até o momento, e apesar das cepas MDR e XDR, o tratamento de pacientes portadores
de TB é realizado por meio de quimioterapia, que combina o uso de diferentes antibióticos e
tem duração de no mínimo seis meses (Zhu et al., 2005).
1.2 Resposta imune na tuberculose
M. tuberculosis é um patógeno intracelular obrigatório, aeróbio e apresenta uma
parede celular peculiar composta por diferentes lipídeos, como: complexo de ácidos
micólicos, arabinogalactano e peptidoglicano associados à liporabinomanana (LAM) (Chan et
al., 1991) (Flynn and Chan, 2005).
__________________________________________________________________Introduçâo
4
A transmissão do Mtb acontece pela via respiratória através da inalação de partículas,
contendo a bactéria, que são expelidas em forma de aerosol por indivíduos com a doença ativa
(Riley et al., 1995). Embora possa ocorrer em outras partes do corpo humano (ossos, rins,
pleura, intestino, cérebro, etc), a tuberculose pulmonar é a forma mais comum da doença
(Flynn and Chan, 2001).
A infecção normalmente se inicia na superfície da mucosa pulmonar quando os
bacilos inalados encontram os macrófagos alveolares. O estabelecimento da infecção depende
de fatores como o número e a virulência dos bacilos inalados, características genéticas e a
condição imunológica do indivíduo exposto (Dannenberg, 1993).
A resposta imune desencadeada contra a TB é bastante complexa, e, muitos
componentes do sistema imune estão envolvidos tanto na proteção, quanto na imunopatologia
da doença.
O sucesso do estabelecimento da infecção no pulmão depende da interação do
patógeno com as células hospedeiras, usualmente os macrófagos alveolares. Essa interação
ocorre por meio dos padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs, Pathogen
Associated Molecular Pattern), expressos na superfície do bacilo, com os receptores de
reconhecimento padrão (PRRs, Pattern Recognition Receptors) expressos nas superfície das
células, tais como o CD14, os receptores do sistema complemento (CR1, CR3 e CR4), os
receptores de manose e os receptores do tipo ‘Toll’ (TLRs, Toll Like Receptors), como Toll 2
e Toll 4 (Kaufmann, 2003) (Drennan et al., 2004) (Ernst, 1998) (Means et al., 1999). Além
desses receptores, o receptor para a porção constante de IgG (FcγR) também reconhece o
complexo anticorpo-micobactéria (Ernst, 1998).
O bacilo também pode interagir com outras células do hospedeiro como as células
dendríticas. Essa interação ocorre via um receptor tipo lectina presente na superfície dessas
__________________________________________________________________Introduçâo
5
células, o DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific ICAM-3 Grabbing Non-integrin) ou CD209.
Esse receptor interage com a lipoarabinomanana (LAM) de M. tuberculosis desencadeando
efeitos antiinflamatórios, porém se essa propriedade é benéfica ou não para o bacilo, ainda é
controversa (Herrmann and Lagrange, 2005).
As interações iniciais entre o bacilo e as células do sistema imune desencadeiam a
liberação de uma cascata de moléculas inflamatórias, incluindo citocinas e quimiocinas, que
além de participarem no recrutamento celular também terão papel fundamental no
estabelecimento da resposta imune contra o bacilo.
Inicialmente, ocorre a migração de neutrófilos para o sítio da infecção, seguidos de
monócitos que se diferenciam em macrófagos e de precursores de células dendríticas (Flynn
and Chan, 2001) (Kaufmann, 2003). Dentre estas células, os macrófagos são descritos como
essenciais na indução da resposta imune contra TB, pelo fato de serem as células que contêm
os bacilos e também por exercerem funções microbicidas. Além disso, os macrófagos atuam
como células apresentadoras de antígenos e podem ativar a resposta imune adaptativa (Flynn
and Ernst, 2000) (Flynn, 2004).
A resposta dos macrófagos, decorrente da presença dos bacilos fagocitados, induz a
produção de TNF-α e IL-12 (Flynn and Ernst, 2000). A citocina IL-12 participa do processo
de ativação das células NK (Natural Killer), induzindo-as a produzirem IFN-γ, a qual
juntamente com o TNF-α, ativa as funções microbicidas dos macrófagos, como: (1) fusão do
lisossoma ao fagossoma e liberação de enzimas com potencial lítico, (2) produção de
intermediários reativos do oxigênio (ROIs, Reactive Oxigen Intermediary), tóxicos para os
bacilos, (3) produção de intermediários reativos do nitrogênio (RNIs, Reactive Nitrogen
Reactive) e (4) apoptose da célula infectada (Chan et al., 1995) (Hingley-Wilson et al., 2003)
(Fairbairn, 2004). Além disso, os bacilos submetidos às condições variadas de estresse no
__________________________________________________________________Introduçâo
6
interior dos macrófagos, como sua própria entrada na célula do hospedeiro, liberam altas
concentrações de proteínas de choque térmico, ou Hsps (Heat Shock Protein), as quais podem
induzir a liberação de IL-1β, IL-6 e GM-CSF e quimiocinas como MCP-1, MIP-2 e RANTES
pelas células T (Srivastava, 2002) (Reimann and Schirmbeck, 2004).
Entretanto, os bacilos são altamente adaptados ao homem e ao infectá-lo são capazes
de escapar dos mecanismos iniciais de defesa desencadeados pelo hospedeiro. Algumas
dessas estratégias de escape estão relacionadas ao metabolismo oxidativo dos macrófagos. A
interação preferencial via receptores como o CR3, por exemplo, impede o “burst” oxidativo,
diminuindo a produção de ROIs e evitando a ação tóxica dos mesmos sob M. tuberculosis
(Wright and Silverstein, 1983). Além disso, enzimas como a catalase e superóxido dismutase
produzidas pelas micobactérias são capazes de degradar espécies reativas do oxigênio
(Roberts and Hirst, 1996) (Cole et al., 1998). O bacilo da TB também é capaz de sobreviver
no interior de macrófagos evitando o seu processamento por impedir a fusão do fagossoma ao
lisossoma, mecanismo este mediado por lipídeos (Russell, 1995) (Turner and Dockrell, 1996).
Deste modo, a ativação inicial dos macrófagos decorrente da captura dos bacilos, na
maioria das vezes, é insuficiente para eliminá-los, dado os mecanismos de evasão já
comentados. Assim, o controle da infecção requer também a ativação da resposta imune
celular específica, principalmente dos linfócitos T (Clemens and Horwitz, 1995) (Flynn,
2004) (Flynn and Chan, 2005).
Os trabalhos realizados por North e colaboradores (1974), mostrando que
camundongos isentos de linfócitos T eram mais suscetíveis à TB experimental e os estudos de
Lefford e colaboradores (1975), comprovando que células T poderiam transferir imunidade,
representaram um marco inicial na tentativa de se caracterizar as várias funções das
subpopulações de linfócitos T na TB (North, 1974) (Lefford, 1975).
__________________________________________________________________Introduçâo
7
A importância de linfócitos T CD4
+
na imunidade contra TB humana foi evidenciada
em pacientes infectados por HIV, onde a depleção dessas células foi correlacionada com a
maior susceptibilidade a essa doença (Lai et al., 1997). Sua importância na resposta protetora
está relacionada ao desenvolvimento da resposta de perfil Th1, ou seja, desenvolvida num
microambiente em que prevalecem as citocinas como IFN-γ e IL-12. O IFN-γ é de
fundamental importância na resposta contra M. tuberculosis e é produzido por células T
CD4
+
, T CD8
+
e NK (Fenton et al., 1997). Pacientes que apresentam deficiências nos
receptores para o IFN-γ são mais susceptíveis às infecções micobacterianas (Jouanguy et al.,
1997). Um dos principais papéis atribuídos ao IFN-γ e outras citocinas do padrão Th1 na
resposta do hospedeiro contra TB consiste no recrutamento e ativação de macrófagos. Vários
pesquisadores mostraram que o IFN-γ é uma das principais citocinas associadas à resposta
protetora durante a infecção por micobactérias (Cooper et al., 1993) (Flynn et al., 1993)
(Yang and Mitsuyama, 1997). Por outro lado, Fonseca e colaboradores (2007), evidenciaram
que altos níveis de IFN-γ não estavam relacionados à proteção contra TB experimental.
Dessa forma, células T CD4
+
produtoras de IFN-γ seriam capazes de ativar
macrófagos que, conseqüentemente, atuariam na destruição dos bacilos ou, pelo menos na
inibição da multiplicação de bactérias remanescentes. Além das células CD4
+
e macrófagos,
um importante papel na resposta protetora contra TB também tem sido atribuído às células T
CD8
+
citotóxicas. A maioria dessas células medeia a lise de células infectadas por meio da
formação de poros por perforina e pela ação das moléculas efetoras, granulisinas e granzimas
(Silva et al., 2001). Tem sido descrito ainda, que células T CD8
+
de camundongos infectados
produzem IFN-γ em resposta ao reconhecimento de antígenos de Mtb apresentados por
células dendríticas ou macrófagos (Serbina and Flynn, 1999) (Silva et al., 1996). Além disso,
a cultura de linfócitos provenientes de pulmão de animais infectados na presença de células
__________________________________________________________________Introduçâo
8
dendríticas também infectadas é capaz de gerar células T CD8
+
que reconhecem e lisam
macrófagos infectados por M. tuberculosis (Serbina et al., 2000). Esses dados mostram que
células T CD8
+
, restritas ao reconhecimento de antígenos associados às moléculas de classe I
do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), também participam do controle da TB
(Bonato et al., 1998) (Silva et al., 2001).
Células T ‘não convencionais’ também podem estar envolvidas na resposta para
eliminação do bacilo. Estas células incluem os linfócitos Tγδ, específicos para fosfoantígenos
micobacterianos, células NKT que reconhecem antígenos não protéicos apresentados pelas
moléculas CD1 ou até mesmo, células T reguladoras (Treg) controlando o desenvolvimento
da doença. As células Tγδ secretam diferentes citocinas como IL-17 e IFN-γ e podem exercer
atividade citotóxica contra macrófagos infectados reduzindo a viabilidade de bacilos extra ou
intracelulares (Tsukaguchi et al., 1995) (Boom, 1999) (Dieli et al., 2001) (Lockhart et al.,
2006). Embora alguns trabalhos tenham mostrado que há um aumento na população de
células Tγδ em pacientes com TB (Ito et al., 1992) (Ueta et al., 1994), outros grupos
mostraram quem não há variação nessa população celular (Barnes et al., 1992) (Li et al.,
1996). Com relação às células NKT, não existe um consenso sobre o seu papel durante a
infecção por Mtb. Foi observarda uma falha na formação de granuloma em camundongos
deficientes dessas células (Apostolou et al., 1999). Também foi descrito que a ativação de
células NKT com seu ligante natural, a α-galactosilceramidase, protege camundongos contra
TB (Chackerian et al., 2002). Por outro lado, outros pesquisadores mostraram que não há
diferença entre camundongos deficientes de células NKT e selvagens após desafio com cepa
virulenta de M. bovis (Kawakami et al., 2002). Da mesma forma, a depleção dessas células
em camundongos infectados com Mtb não ocasionou diferença no número de UFC (Unidades
Formadoras de Colônia) no pulmão desses animais (Junqueira-Kipnis et al., 2003). O papel
__________________________________________________________________Introduçâo
9
das células T reguladoras na TB ainda é um pouco desconhecido. Embora elas sejam
importantes para o controle de uma resposta imune exacerbada, no caso da TB elas parecem
impedir o clearence de Mtb nos indivíduos infectados (Kursar et al., 2007). Experimentos do
nosso grupo mostraram que as células T reguladoras podem ser um fator envolvido na
susceptibilidade à TB experimental: camundongos com maior freqüência de células T
reguladoras no sítio da infecção apresentam um menor influxo de células T efetoras e,
consequentemente, menor capacidade de controlar o crescimento do bacilo (Paula, 2007).
A contribuição das células B CD19
+
na TB também permanece controversa.
Camundongos deficientes de células B apresentaram aumento no número de UFC após
desafio com M. tuberculosis em relação aos camundongos selvagens (Vordermeier et al.,
1996). Entretanto, Johnson e colaboradores (1997) não observaram diferenças na UFC do
pulmão de camundongos selvagens e deficientes de células B 45 dias após desafio com
aerosol contendo baixo número de bacilos (Johnson et al., 1997). Por outro lado, Bosio e
colaboradores (2000) mostraram que linfócitos B possuem um papel protetor durante as fases
mais iniciais da infecção. Neste trabalho, camundongos deficientes de células B apresentaram
aumento do comprometimento pulmonar e disseminação da bactéria quando comparados aos
camundongos selvagens (Bosio et al., 2000). Uma das dificuldades de se estabelecer o
verdadeiro papel das células B contra a infecção por Mtb, são as disparidades das condições
experimentais, o que dificulta o estabelecimento de uma correlação precisa.
Os bacilos da TB, que persistem no hospedeiro, normalmente permanecem dentro dos
macrófagos, que se localizam em uma estrutura celular complexa conhecida como granuloma.
Estas estruturas, claramente evidenciadas na reação inflamatória crônica, são capazes de
limitar o crescimento da micobactéria e prevenir a disseminação da infecção para outros
órgãos (Nau et al., 1997) (Bean et al., 1999). Estes granulomas constituem-se de uma área
__________________________________________________________________Introduçâo
10
central de necrose circundada por macrófagos infectados. Linfócitos T CD4
+
e T CD8
+
,
distribuem-se mais perifericamente, ao redor dos macrófagos. Além disso, ocorre também um
influxo de linfócitos B na periferia do granuloma. Na maioria das vezes, os macrófagos
fundem-se formando as células gigantes, ou células de Langhans (Kaufmann, 2003) (Boom et
al., 2003) (Cosma et al., 2004). No entanto, a formação granulomatosa muitas vezes não é
capaz de eliminar completamente o bacilo, mantendo-o apenas isolado. Em indivíduos
imunossuprimidos, onde o equilíbrio entre o sistema imune do hospedeiro e o patógeno é
quebrado, ocorre a reativação e, muitas vezes, a disseminação da infecção (Rivas-Santiago et
al., 2005) (Wallis, 2007).
De forma geral, a compreensão dos mecanismos envolvidos na resposta imune
protetora ou patológica é essencial para a identificação de marcadores imunológicos que
possam ser correlacionados à proteção, susceptibilidade e progressão da doença, assim como
para o desenvolvimento racional de vacinas e novos recursos terapêuticos contra a TB.
1.3 Desenvolvimento de vacinas contra a TB
Desde a introdução do conceito de vacinação pelo médico inglês Edward Jenner, há
mais de 200 anos, esta se tornou a medida mais eficiente e menos dispendiosa de evitar
doenças infecciosas. As vacinas têm como objetivo fundamental a imunização prévia do
indivíduo, de modo que este possa responder rápido e eficientemente quando em contato com
o agente infeccioso, evitando assim, o desenvolvimento da doença.
Como descrito anteriormente, o BCG é a única vacina atualmente licenciada para o
uso na profilaxia da TB. Ela é produzida a partir de cepas atenuadas de M. bovis e estima-se
que mais de 2,5 bilhões de pessoas já tenham sido vacinadas com a mesma (Martin, 2005).
Essa vacina, administrada em dose única, apresenta uma série de vantagens, tais como: 1)
__________________________________________________________________Introduçâo
11
pode ser administrada ao nascimento; 2) apresenta estabilidade ao calor na forma de vacina
viva liofilizada e 3) é uma vacina cuja produção requer baixo custo (O'Donnell, 1997). Além
disso, o BCG protege contra as formas mais graves de TB durante a infância, TB
extrapulmonar e meningite, e também contra a hanseníase (Martin, 2005).
Embora venha sendo amplamente utilizada, a eficácia do BCG permanece
controversa. Estudos epidemiológicos mostraram que o nível de proteção alcançado, em
diferentes populações, pode variar de 0 a 80% (Andersen and Doherty, 2005) (Rook et al.,
2005b). Essa variabilidade está associada a vários fatores como: o contato prévio com
micobactérias ambientais, principalmente nas regiões tropicais; o fato do BCG ser produzido
por laboratórios de diferentes países, os quais empregam diferentes cepas do bacilo; além do
fato dessa vacina estar sendo mantida em cultura há muitos anos, o que acarretou a perda de
segmentos gênicos que poderiam ser imunogênicos (Enserink, 2001) (Brandt et al., 2002)
(von Reyn and Vuola, 2002) (Britton and Palendira, 2003) (Martin, 2005). Além disso, a
vacina BCG pode interferir no teste de sensibilidade para detecção da doença (PPD, Purified
Protein Derivative) e não apresenta proteção adicional com a administração de reforços (Hess
and Kaufmann, 1999) (Britton and Palendira, 2003) (Monteiro-Maia et al., 2006).
No que concerne à segurança do BCG, existe uma preocupação crescente com o uso
de organismos vivos em indivíduos imunocomprometidos, fato especialmente agravante se
considerarmos que no caso da TB, a co-infecção pelo HIV tem se tornado cada vez mais
comum (Grange et al., 1983) (Perronne, 1994) (Kaufmann and Schaible, 2003).
Por todos os motivos acima expostos, a procura por uma alternativa de imunização
mais segura e eficaz para a TB tem levado muitos pesquisadores a investirem no
desenvolvimento de novas vacinas.
As primeiras tentativas para o desenvolvimento de uma vacina contra TB envolviam o
__________________________________________________________________Introduçâo
12
uso de microorganismos vivos (Smith, 1985). Essa estratégia de imunização é uma alternativa
interessante, pois induz uma resposta imunológica celular e humoral, que pode ser de longa
duração e, além disso, não necessitam de adição de adjuvante uma vez que os próprios
componentes da bactéria possuem este papel. No entanto, esse tipo de vacina pode oferecer
alguns riscos, como a reversão de virulência ou a possível indução de patologia mediante
situações de imunossupressão (Frey, 2006).
A disponibilidade da seqüência genômica de M. tuberculosis (Cole et al., 1998) deu
um impulso importante na investigação de antígenos imunogênicos e/ou imunodominantes
com potencial para o desenvolvimento de novas vacinas. A partir desses estudos, outras
estratégias de imunizações foram propostas como, por exemplo, o uso de BCG recombinante.
Neste caso, são inseridos, na micobactéria, genes que passam a expressar determinadas
proteínas. Essas proteínas podem ser citocinas inflamatórias, como a IL-12, antígenos
imunodominantes de Mtb, ou ambos (Martin, 2005) (Reed and Lobet, 2005) (Rook et al.,
2005b). Entre as várias cepas de BCG recombinante encontram-se: o rBCG30, que expressa o
antígeno 85B (Ag85B) de Mtb; o BCG RD1, uma cepa de BCG na qual foram inseridos genes
do complexo RD1 de Mtb e o BCG ∆ure-Hly que expressa a proteína listeriolisina de Listeria
monocytogenes e é deficiente da enzima urease (Horwitz and Harth, 2003) (Pym et al., 2003)
(Grode et al., 2005).
Outro tipo de vacina atualmente em desenvolvimento, são as vacinas de subunidades,
as quais consistem no uso de um ou mais componentes da micobactéria como elementos da
parede do bacilo ou moléculas secretadas como proteínas, carboidratos, lipoglicoproteínas e
glicolipídeos (Reed and Lobet, 2005) (Fonseca et al., 2007). Apesar de serem consideradas
seguras, essas vacinas exigem alto custo de produção e também se mostram pouco
imunogênicas (Sable et al., 2007). Uma alternativa para minimizar o problema da baixa
__________________________________________________________________Introduçâo
13
imunogenicidade seria a utilização de adjuvantes. Porém, há uma grande dificuldade de se
atingir a resposta imune adequada sem a indução de persistentes processos inflamatórios, uma
vez que é comum observar ulceração após a vacinação com a maioria dos adjuvantes
conhecidos (Bomford, 1998).
Na última década, os avanços na tecnologia do DNA recombinante para o
desenvolvimento de novas vacinas, permitiram a introdução de novas estratégias para a
obtenção e produção de antígenos, assim como foram otimizadas novas maneiras de se
administrar e apresentar esses antígenos para as células do sistema imune. Estas estratégias
abriram caminho para inovações, particularmente no contexto do desenvolvimento de vacinas
mais seguras, eficazes e polivalentes (Wolff et al., 1990) (Gurunathan et al., 2000). Dentre
essas estão as vacinas de DNA ou vacinas gênicas (Spier, 1996).
As vacinas de DNA são métodos potentes para a geração de uma forte resposta
humoral e celular (Huygen, 1998) (Gurunathan et al., 2000) (Silva, 2004). Essas vacinas são
constituídas de plasmídeos bacterianos contendo um promotor viral que controla a expressão
do gene de interesse dentro de uma célula eucariótica, levando à transcrição do mRNA no
núcleo e a tradução da proteína no citoplasma (Donnelly et al., 2005). Quando o DNA é
administrado, o organismo passa a produzir o antígeno por meios próprios, sem os efeitos
indesejáveis da introdução de um agente infeccioso patogênico ou de vacinas contendo
subunidades protéicas e adjuvantes (Spier, 1996). Dessa forma, o indivíduo vacinado é capaz
de induzir uma resposta imune celular e humoral específica, bem como memória imunológica.
Além disso, as vacinas de DNA mimetizam os efeitos das vacinas vivas por possibilitarem a
geração de antígenos endógenos e, consequentemente, a ativação de linfócitos T CD8
+
.
Adicionamente, também são adjuvantes por conter em sua estrutura seqüências de
nucleotídeos CpGs (citosina-fosfato-guanina) não metilados, que difere do padrão dos
__________________________________________________________________Introduçâo
14
eucariotos. Os motifs CpGs, têm capacidade imunoestimulatória ativando receptores TLR 9 e
TLR 3, dando inicio a resposta imune inata, com um direcionamento para uma padrão Th1
(Krieg, 2002).
Por fim, as vacinas de DNA oferecem também, a possibilidade da combinação de
antígenos de um mesmo ou de diferentes patógenos, gerando as chamadas vacinas multi-
genes ou multivalentes (Gurunathan et al., 2000), permitindo imunizar simultaneamente
contra diferentes enfermidades. Recentemente, vários estudos descreveram as vantagens da
“co-entrega” de antígenos em uma proteína híbrida na imunização contra doenças infecciosas
complexas, como a malária e a leishmaniose (Li et al., 1999) (Zadeh-Vakili et al., 2004).
A vacinação com DNA pode ser feita em várias espécies animais, por diversas vias e
esquemas. Além da injeção intramuscular, que é a via mais utilizada, as vacinas gênicas
também podem ser administradas por via intranasal na forma de aerosol, por via oral ou por
via intradérmica através do bombardeamento de micropartículas de ouro cobertas com o
material genético (Pertmer et al., 1995). O custo de produção das vacinas gênicas em larga
escala é significativamente menor do que o custo de produção das vacinas protéicas
recombinantes, peptídeos sintéticos e outras. O controle de qualidade é mais fácil, e a
comercialização não necessita de uma rede de refrigeração, uma vez que estas vacinas são
estáveis à temperatura ambiente. Estes fatores facilitam o transporte, a distribuição e o
estabelecimento de amplos programas de imunizações em regiões de difícil acesso.
Os mecanismos envolvidos na ativação da resposta imune humoral e celular, pelas
vacinas de DNA plasmideais, ainda não foram completamente elucidados. Alguns autores
propõem que a indução da resposta imune possa ter início após a transfecção de uma célula
somática, não apresentadora de antígeno profissional, enquanto outros autores têm
demonstrado a importância de células CD11b
+
ou CD11c
+
da medula óssea na indução da
__________________________________________________________________Introduçâo
15
resposta imune (Gurunathan et al., 2000). De qualquer modo, antígenos produzidos no
citoplasma da célula hospedeira são processados por várias enzimas, e os fragmentos
resultantes apresentados na superfície celular juntamente com moléculas de classe I do MHC
para linfócitos T CD8
+
. Por outro lado, parte dos antígenos produzidos pelos miócitos ou
APCs são secretados sem sofrerem processamento, podendo estimular tanto linfócitos B a
produzirem anticorpos específicos, como serem endocitados por outras APCs e estimularem
linfócitos T CD4
+
(Liu, 2003). Recentemente, foi demonstrado pelo nosso grupo, que células
B podem capturar o DNA plasmideal in vivo, sugerindo que essas células também possam
participar do processo de apresentação de antígeno em modelos de vacinas de DNA (Coelho-
Castelo et al., 2003).
As vacinas de DNA continuam a ser testadas em uma série de modelos de infecção
experimental em camundongos (Manickan et al., 1995), cobaias (de Paula et al., 2007) e
também em primatas não humanos (Barouch et al., 2000), além de ensaios de fase clínica I e
II (Wang et al., 1998) (Gilbert et al., 2003).
Na tentativa de contribuir na busca de alternativas profiláticas e terapêuticas para a
TB, o Núcleo de Pesquisas em Tuberculose (NPT) da FMRP-USP vêm desenvolvendo uma
vacina de DNA contra a TB experimental, baseada no gene que codifica para a proteína de
choque térmico de 65 kDa (Hsp65) de Mycobacterium leprae.
1.4 Desenvolvimento da vacina DNA-Hsp65
As proteínas de choque térmico ou chaperoninas são moléculas altamente conservadas
entre as espécies e desempenham papel importante no dobramento e translocação de proteínas
e montagem de complexos protéicos. A síntese de Hsps aumenta nas situações de estresse
como um mecanismo de proteção celular (Lindquist and Craig, 1988).
__________________________________________________________________Introduçâo
16
As Hsps são potentes ativadoras do sistema imune inato e adaptativo, podendo
desempenhar um importante papel no mecanismo de ação de vacinas, por estarem envolvidas
com os efeitos imunogênicos ou com a modulação dos mesmos (Srivastava et al., 1994)
(Multhoff, 2006). Três distintos papéis das Hsps na atuação como vacinas foram descritos: 1)
Hsps microbianas como antígenos imunodominantes; 2) Hsps como adjuvantes e 3) Hsps
como chaperoninas ou carreadoras de peptídeos imunodominantes, facilitando a geração da
resposta imune peptídeo-específica (Reimann and Schirmbeck, 2004).
No início da década de 90, Silva e colaboradores (1992) utilizaram pela primeira vez a
Hsp65 de M. leprae como antígeno para o desenvolvimento de vacinas contra a TB (Silva et
al., 1992). Estudos envolvendo a transferência adotiva de células transfectadas (macrófagos,
tanto derivados de linhagem celular como de medula óssea) expressando o antígeno Hsp65
induziram proteção contra desafio com cepa virulenta de Mtb H37Rv, em modelo
experimental (Silva et al., 1994). Posteriormente, foi demonstrado que plasmídeos contendo o
gene hsp65 também protegeram camundongos contra subseqüente desafio com Mtb (Lowrie
et al., 1994) (Tascon et al., 1996). Quando administrada por via intramuscular em
camundongos desafiados com M. tuberculosis ou previamente infectados com os bacilos por
via endovenosa, a vacina DNA-Hsp65 apresentou efeito profilático e terapêutico,
respectivamente (Lowrie et al., 1997) (Lowrie et al., 1999) (Bonato et al., 2004). Esses efeitos
benéficos da vacina foram associados à participação de células T CD4
+
e T CD8
+
produtoras
de IFN-γ e produtos citotóxicos, característicos do perfil Th1 de resposta (Silva et al., 1996)
(Bonato et al., 1998) (Lowrie and Silva, 2000).
O NPT vem se preocupando cada vez mais com a otimização dessa vacina, tanto na
redução da dose (Lima et al., 2003), modo e rota de administração (Rosada, 2006) (Souza,
2006) (Gonçalves, 2006), como na sua biodistribuição (Coelho-Castelo et al., 2006) e
__________________________________________________________________Introduçâo
17
segurança (Lima, 2006), na tentativa de garantir sua efetividade no uso clínico.
No entanto, uma vacina baseada em um único antígeno micobacteriano poderia não
proteger efetivamente toda a população humana, uma vez que há uma grande diversidade de
HLA populacional. Assim, uma vacina composta de mais de um antígeno imunodominate,
poderia melhorar a proteção alcançada pela vacina DNA-Hsp65, além de assegurar uma
ampla cobertura de uma população geneticamente heterogênea.
Diversos estudos têm sido realizados no sentido de identificar novos antígenos e
epitopos imunodominantes de M. tuberculosis, candidatos ao desenvolvimento de novas
vacinas contra a TB (Mustafa, 2002). Proteínas secretadas, presentes no filtrado de cultura
(CFP, Culture Filtrate Protein) de Mtb têm sido o foco desses estudos, pelo fato desses
antígenos serem considerados imunodominates por estimularem uma forte resposta imune
celular e humoral (Andersen, 1997). Dentre alguns desses antígenos, estão o ESAT-6 (Early
Secretory Antigenic Target of 6 kDa) (Lalvani et al., 1998), PstA1, ThyA, RpoB (Cho et al.,
2000) (Bivas-Benita et al., 2004) e também aqueles pertencentes ao complexo Ag85 (Wiker et
al., 1992).
O complexo antígeno 85 (Ag85) consiste de três proteínas: Ag85A, Ag85B e Ag85C,
com peso molecular entre 30-32kDa, que são codificadas por três genes parálogos localizados
em diferentes regiões do genoma da micobactéria (Content et al., 1991). Juntas, essas
proteínas constituem a maior porção das proteínas secretadas por M. tuberculosis e M. bovis
(Wiker et al., 1992). Embora presente em grande quantidade nos filtrados de cultura, essas
proteínas também podem ser encontradas em associação com a superfície da bactéria (Schou
et al., 1985) (Wiker et al., 1992).
As proteínas do complexo Ag85 possuem atividade enzimática de micolil transferases,
requerida para a biogênese do ‘fator corda’, também conhecido como Dimicolato de Trealose
__________________________________________________________________Introduçâo
18
(DMT), importante para a manutenção da integridade da parede celular micobacteriana
(Belisle et al., 1997). Em adição a sua importância na biosíntese da parede celular, o
complexo Ag85 também pode estimular a captura da micobactéria por macrófagos humanos
através da interação dessas proteínas com a fibronectina presente na matrix extracelular. Esta
interação resulta em um aumento da fagocitose do bacilo mediada pelos receptores do
complemento presentes nos macrófagos do hospedeiro (Abou-Zeid et al., 1988).
Diversos estudos vêm demonstrando a importância dessas proteínas como promissoras
candidatas ao desenvolvimento de vacinas contra a TB. Em um desses estudos foi
demonstrado que a vacinação com DNA plasmideal codificando para o Ag85B estimulou
forte resposta humoral e celular, além de conferir proteção significativa em camundongos
C57BL/6 desafiados com a cepa virulenta de Mtb H37Rv (Kamath et al., 1999). Langermans
e colaboradores (2005) descreveram que a imunização de camundongos e também de
primatas não humanos com a proteína de fusão ESAT-6/Ag85B em adjuvante conferiu
proteção contra TB (Langermans et al., 2005).
Estudos mostrando a disrupção dos genes que codificam para os três componentes do
complexo Ag85 de M. tuberculosis sugerem que o Ag85A pode ser o componente essencial
para a sobrevivência da bactéria dentro dos macrófagos (Jackson et al., 1999) (Armitige et al.,
2000). Assim, atenção especial tem sido dada a essa proteína.
O Ag85A induz uma forte proliferação de células T e produção de IFN-γ na maioria
dos indivíduos infectados com M. tuberculosis ou M. leprae (Launois et al., 1994). Além
disso, em modelo experimental, a vacina de DNA codificando para o Ag85A foi efetiva tanto
nas primeiras semanas após o desafio com Mtb, como em uma fase mais tardia da infecção,
observada pela diminuição das UFCs no pulmão dos animais (Tanghe et al., 1999).
Recentemente, a vacina MVA-85A que utiliza como vetor o vírus vaccinia Ankara
__________________________________________________________________Introduçâo
19
recombinante, modificado pela adição do gene que codifica o Ag85A, iniciou testes clínicos
de fase I (McShane et al., 2004). Utilizando essa vacina como reforço da primeira imunização
com BCG, os autores demonstraram indução de proteção contra TB em camundongos, além
de níveis significativos de células CD4
+
e CD8
+
antígeno-específicas em relação aos animais
somente imunizados com MVA-85A (Goonetilleke et al., 2003).
Como descrito anteriormente, o NPT, vem realizando diversos estudos com a vacina
gênica DNA-Hsp65, de forma a otimizar o seu uso e o seu desenvolvimento tecnológico. A
vacinação baseada em DNA abre a possibilidade de combinar epitopos de diferentes proteínas
em uma única vacina, aprimorando a sua utilização (Suhrbier, 1997) (An and Sette, 1999).
Nesse sentido, a construção de uma vacina múltipla, contendo o gene que codifica para a
proteína de choque térmico Hsp65 de M. leprae, e o gene que codifica para o Ag85A de M.
tuberculosis se faz muito interessante, pois poderia possibilitar sua utilização em populações
humanas geneticamente heterogêneas uma vez que múltiplos epitopos contidos em uma única
vacina, poderiam assegurar uma maior cobertura dos diversos tipos de HLA dessas
populações.
20
___________________________________________________________________Objetivos
21
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral:
Este trabalho tem como objetivo principal a construção de uma vacina múltipla de
DNA, baseada na fusão entre dois antígenos imunogênicos: a Hsp65 de M. leprae e o Ag85A
de M. tuberculosis, e a avaliação da sua eficácia protetora em modelo de tuberculose
experimental murina.
2.2 Objetivos Específicos:
• Construção e caracterização da vacina múltipla de DNA através de ensaios
moleculares e ensaios in vitro.
• Avaliação da imunogenicidade da vacina múltipla em relação às vacinas de DNA
codificando os antígenos individualmente (DNA-Ag85A e DNA-Hsp65), através da produção
de anticorpos específicos, proliferação celular e dosagem de citocinas do baço dos animais
imunizados.
• Avaliação da eficácia protetora da vacina múltipla de DNA em relação às vacinas
DNA-Ag85A e DNA-Hsp65, através da produção de citocinas no pulmão, do grau de
diferenciação das células pulmonares, contagem das unidades formadoras de colônias (UFCs)
e da análise histológica dos pulmões dos animais imunizados e desafiados com M.
tuberculosis.
22
___________________________________________________________ Material e Métodos
23
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Primeira estratégia de construção da vacina múltipla
3.1.1- Amplificação do gene Ag85A
O gene Ag85A de M. tuberculosis foi obtido por amplificação a partir do plasmídeo
pV1ns-tPA (gentilmente cedido pela Dra Kris Huygen do Instituto Pasteur, Bélgica), através
da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Aproximadamente 20 ng de DNA
plasmideal foi incubado com os oligonucleotídeos Ag85F e Ag85R (10 pmol/µL), que
hibridizam com o gene Ag85A, deoxinucleotídeos (dNTPs) a 10 mM, tampão da enzima (KCl
a 500 mM; Tris-HCL a 200 mM, pH 8,4; MgCl
2
a 1,5 mM) e 1 U da enzima Platinum Taq
DNA polimerase (Invitrogen, USA) em um volume final de 50 µL. O material foi amplificado
em termociclador PTC 200 (MJ Research, INC), com incubação inicial a 94°C por 5 min,
seguido de 34 ciclos de 94°C, 1 min; um gradiente de temperatura de anelamento variando de
57-68°C por 40 s e 72°C para extensão final do fragmento por 1 min e 30 s.
Os oligonucleotídeos empregados foram desenhados de forma a conter em suas
extremidades um sítio para a enzima de restrição AflII (sublinhado), para posterior clonagem
no vetor de expressão pVAX-Hsp65. As seqüências dos oligonucleotídeos foram as seguintes:
Forward (Ag85F): 5´- AACTTAAGACCATGGATGCAAT - 3´
Reverse (Ag85R): 5´- AACTTAAGGTATGCTGCGGCGC - 3´
Após a reação, foram retiradas alíquotas para análise em gel de agarose 1% (Gibco-
BRL, USA), para verificar em qual temperatura de anelamento ocorreu a amplificação do
gene, a quantificação do mesmo e se o produto apresentava uma única banda com o tamanho
esperado.
O produto de PCR amplificado foi então purificado com o uso do Kit “Wizard SV Gel
and PCR Clean-up System” (Promega, USA) e digerido com 10 U da enzima AflII
___________________________________________________________ Material e Métodos
24
(Fermentas, Canada) e seu respectivo tampão (Tris-HCl a 50 mM, pH 7,5; MgCl
2
a 10 mM;
NaCl a 100 mM e BSA 0,1 mg/mL) em um volume final de 20 µL, a 37°C por 14 h.
3.1.2- Clivagem e purificação do plasmídeo pVAX-Hsp65
A vacina múltipla foi construída a partir da vacina original DNA-Hsp65 (já existente
no nosso laboratório). Essa vacina foi construída mediante a clonagem do gene hsp65 no vetor
de expressão eucariótico pVAX1 (Invitrogen, USA). O vetor pVAX1 foi especialmente
desenhado para o uso no desenvolvimento de vacinas de DNA, ele possui o gene de
resistência ao antibiótico canamicina para seleção em E. coli ao invés do gene de resistência
ao antibiótico ampicilina, devido a esse último ter sido reportado causar uma resposta alérgica
em alguns indivíduos. Além disso, a ampicilina é um antibiótico de uso corrente, sendo o seu
gene não recomendado para uso em humanos (Romano et al., 1997) (Medrala et al., 2003).
A enzima de restrição utilizada para a linearização do plasmídeo pVAX-Hsp65 foi a
AflII (Fermentas, Canada), a mesma empregada para clivagem do inserto Ag85A, para que
dessa forma pudesse ser realizada a clonagem devido às extremidades serem compatíveis.
Cerca de 10 µg de DNA plasmideal foi incubado a 37ºC com 10 U de AflII (Fermentas,
Canada) e seu tampão, em um volume final de 40 µL, durante 14 h para total digestão.
A análise da reação de clivagem foi feita através de eletroforese em gel de agarose 1%
e a banda correspondente ao vetor, foi purificada em coluna pelo Kit “Wizard SV Gel and
PCR Clean-up System” (Promega, USA), de acordo com as recomendações do fabricante.
3.1.3– Defosforilação do plasmídeo pVAX-Hsp65 linearizado e clonagem do
inserto Ag85A
A defosforilação do vetor foi feita com a enzima Calf Intestinal Alkaline Phosphatase
– CIAP (Invitrogen, USA). Para isso, foram adicionados à reação de clivagem, Tris-HCl a
___________________________________________________________ Material e Métodos
25
200 mM, pH 8,0; MgCl
2
a 100 mM e 1 U da enzima em uma reação final de 80 µL, incubada
por 30 min a 37ºC e inativada por 15 min a 65ºC. Seguiu-se a defosforilação, o isolamento do
vetor em gel de agarose 1% com o auxílio do Kit “Wizard SV Gel and PCR Clean-up
System” (Promega, USA).
A clonagem do inserto Ag85A no plasmídeo defosforilado foi realizada com o auxílio
da enzima T4 DNA Ligase (Invitrogen, USA). A reação de ligação foi feita em um volume
total de 10 µL, utilizando-se 1 U da enzima, e deixada a 4ºC, por 14 h.
3.1.4– Preparação de bactérias E.coli DH5α
αα
α CaCl
2
competentes
As bactérias foram quimicamente preparadas segundo Sambrook et al., (1989). A
partir de uma colônia da bactéria E.coli DH5α, foi feita uma cultura por 16 h, sob agitação a
200 rpm a 37°C, em meio Luria Bertani (LB) líquido (Difco, USA) sem antibiótico.
Posteriormente, o inóculo foi diluído 1:50 e mantido a 200 rpm e a 37°C até atingir a
densidade óptica (DO) de aproximadamente 0,5 – 0,6 a 660 nm.
A cultura foi resfriada e centrifugada a 4000 g, por 7 min a 4°C, o precipitado,
ressuspendido com 1/3 do volume original com CaCl
2
a 0,1 M gelado e mantido no gelo por
mais 20 min. Após esse período, a cultura foi centrifugada novamente e o precipitado
ressuspendido em CaCl
2
a 0,1 M contendo 50% de glicerol. As alíquotas foram separadas,
imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -70°C.
3.1.5– Transformação das bactérias por choque térmico
Um volume de 5 µL da reação de ligação foi adicionado às bactérias competentes as
quais foram incubadas no gelo por 10 min. Após esse período foi dado o choque térmico
colocando as bactérias a 42°C por 90 s e logo em seguida a 0°C por 1 min. Foram adicionados
à reação, 800 µL de meio de cultura LB líquido (Difco, USA) e a mesma foi incubada a 37°C
___________________________________________________________ Material e Métodos
26
por cerca de 1 h. Após esse período, foi retirada uma alíquota de 200 µL das bactérias que
foram semeadas em meio seletivo LB ágar (Sigma, Germany) com o antibiótico canamicina
(100 µg/mL) e as culturas foram incubadas a 37°C por 16 h.
A partir das colônias formadas na placa, foi realizado um teste para identificação das
colônias recombinantes, utilizando a técnica de PCR de colônia. Aproximadamente 10 ng de
DNA plasmideal foi incubado com os oligonucleotídeos Ag85F e Ag85R (10 pmol/µL);
deoxinucleotídeos (dNTPs) a 1,25 mM; tampão da enzima (KCl a 500 mM; Tris-HCL a 200
mM, pH 8,4; MgCl
2
a 1,5 mM) e 0,1 U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen, USA) em um
volume final de 20 µL. O material foi amplificado em termociclador PTC 200 (MJ Research,
INC), com incubação inicial a 96ºC por 2 min; 39 ciclos de 94ºC, 15 s; 55ºC, 15 s, seguido de
polimerização final a 72ºC por 40 s.
As colônias com resultado positivo foram cultivadas em meio líquido LB, com
canamicina (100 µg/mL), durante 16 h e utilizadas para uma minipreparação plasmideal
utilizando o Kit de extração “Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System”
(Promega, USA) para a extração dos DNAs plasmideais e posterior identificação dos clones
recombinantes.
3.1.6– Quantificação e avaliação da integridade dos plasmídeos purificados
Após a purificação dos clones recombinantes, foi realizada a quantificação desses
plasmídeos por espectrofotometria nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm utilizando o
aparelho GeneQuant II
TM
(Amershan, BioSciences, Sweden).
A avaliação da positividade dos plasmídeos recombinantes quanto à presença do gene
Ag85A foi feita através do sequênciamento das amostras utilizando o oligonucleotídeo T7
Promoter, (5´-TAATACGACTCACTATAGGG – 3´), e o oligonucleotídeo Ag85fim, (5´-
CCAAGACGCCTACAACGC–3´) como primers. O sequênciamento foi realizado em
___________________________________________________________ Material e Métodos
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sequênciador automático ABI 377 (Perkin Elmer, USA), seguindo o método de Sanger et al.,
(1987), em colaboração com a professora Dra Maria Helena de Souza Goldman do Centro de
Sequênciamento e Análise de Expressão Gênica, FFCLRP-USP (Sanger et al., 1977).
A partir da sequência obtida, foi feito um alinhamento com o banco de dados do
NCBI, Nacional Center for Biotechnology Information disponível no endereço eletrônico:
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast.cgi, com o auxílio da ferramenta BLAST, para a
confirmação da presença do gene Ag85A na construção.
3.2- Segunda estratégia de construção da vacina múltipla
3.2.1- Amplificação do gene Ag85A
Uma segunda estratégia de construção da vacina múltipla foi elaborada uma vez que o
sequênciamento dos clones recombinantes obtidos na primeira tentativa revelou que a ORF
(Open Reading Frame) da proteína de fusão havia sido perdida.
O gene que codifica para Ag85A foi novamente amplificado por PCR a partir do
plasmídeo pV1ns-tPA como descrito no ítem 3.1.1, porém utilizando-se os novos
oligonucleotídeos desenhados: Ag85ecorVfw: 5´- CCGGATATCACCATGGATGCAATG –
3´ e Ag85ecorVrev: 5´- GGATATCGGTATGCTGCGGCGC – 3´. Utilizou-se o mesmo ciclo
de amplificação alterando-se somente o gradiente de temperatura de anelamento que variou de
53-64°C.
Os novos oligonucleotídeos empregados foram desenhados de forma a conter em suas
extremidades um sítio para a enzima de restrição EcoRV (sublinhado), que deixa as
extremidades abruptas e um nucleotídeo a mais, a guanina, no ‘oligo’ reverse (em destaque).
Após a reação, foram retiradas alíquotas para análise em gel de agarose 1%, para
verificar em qual temperatura de anelamento ocorreu a amplificação do gene, a quantificação
do mesmo e se o produto apresentava uma única banda com o tamanho esperado.
___________________________________________________________ Material e Métodos
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O produto de PCR amplificado foi então purificado com o uso do Kit “Wizard SV Gel
and PCR Clean-up System” (Promega, USA) e digerido com 10 U da enzima EcoRV
(Invitrogen, USA) em um volume final de 50 µL, a 37°C por 14 h.
3.2.2- Clivagem e purificação do plasmídeo pVAX-Hsp65
As enzimas de restrição utilizadas para a linearização do vetor foram HindIII e BamHI
(Invitrogen, USA), que deixam as extremidades coesivas. A reação foi deixada a 37°C por 14
h e a análise da clivagem foi feita através de eletroforese em gel de agarose 1%. A banda
correspondente ao vetor foi isolada do gel e purificada em coluna pelo Kit “Wizard SV Gel
and PCR Clean-up System” (Promega, USA), de acordo com as recomendações do fabricante.
3.2.3- Preparação do plasmídeo pVAX-Hsp65 para clonagem do inserto Ag85A
Após a clivagem do vetor, as extremidades coesivas foram preenchidas com
deoxinucleotídeos fosfato (dNTPs) pela atividade do fragmento Klenow da Polimerase I
(Gibco-BRL, USA).
O tratamento com Klenow consistiu de incubação do plasmídeo em Tris-HCl a 0,5
mM, pH 7,5; MgCl
2
a 5 mM; DTT a 10 mM; 0,5 mg/ml BSA; dNTPs a 40 µM e 10 U da
enzima por 30 min a 37ºC e 15 min a 70ºC para inativação da mesma. O DNA tratado foi
então purificado com o Kit “Wizard SV Gel and PCR Clean-up System” e defosforilado com
a enzima Calf Intestinal Alkaline Phosphatase – CIAP (Invitrogen, USA) como descrito no
item 3.1.3.
A clonagem do inserto Ag85A no vetor defosforilado foi realizada com o auxílio da
enzima T4 DNA Ligase (Invitrogen, USA) e a reação de ligação foi feita em um volume final
de 10 µL, utilizando-se 1 U da enzima e deixada a 4ºC, por 14 h.
___________________________________________________________ Material e Métodos
29
3.2.4- Transformação das bactérias por choque térmico e identificação dos novos
clones recombinantes
Um volume de 5 µL da reação de ligação foi utilizado para transformar células de E.
coli DH5-α CaCl
2
competentes, como descrito no item 3.1.5. As bactérias foram semeadas em
meio LB ágar (Sigma, Germany) contendo o antibiótico canamicina (100 µg/mL) e deixadas a
37°C por 16 h.
A partir das colônias formadas na placa, foi realizado PCR para a identificação das
colônias recombinantes. A reação de PCR foi idêntica a descrita no item 3.1.5 alterando-se
somente os primers utilizados: Ag85EcorVfw e Ag85EcorVrev (10 pmol/µL).
As colônias com resultado positivo foram cultivadas em meio líquido LB (Difco,
USA), com canamicina (100 µg/mL), durante 16 h e utilizadas para uma minipreparação
plasmideal utilizando o Kit de extração “Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification
System” (Promega, USA) para a extração dos prováveis clones recombinantes.
3.2.5 – Quantificação e avaliação da integridade dos plasmídeos purificados
A quantificação dos clones recombinantes foi realizada por espectrofotometria à 260 e
280 nm utilizando o aparelho GeneQuant II
TM
(Amershan, BioSciences, Sweden) e a
confirmação desses recombinantes foi feita por análise de restrição com a enzima PmeI
(Fermentas, USA) a qual flanqueia o cassete Ag85A+Hsp65. Cerca de 200 ng dos plasmídeos
foram incubados com 1 U da enzima em um volume final de 20 µL a 37ºC por 14 h. Em
seguida, os produtos da digestão de cada amostra foram submetidos a eletroforese em gel de
agarose 1% e a corrida foi realizada a 75 V por 1 h. O padrão 1 Kb Plus DNA Ladder (Gibco-
BRL, USA) foi utilizado como marcador de peso molecular; o gel foi corado com 0,5 mg/mL
de brometo de etídio (Gibco-BRL, USA) e a visualização das bandas foi feita em luz
ultravioleta no aparelho Image Master VDS (Pharmacia Biotech, USA).
___________________________________________________________ Material e Métodos
30
Em seguida foi realizado o sequênciamento desses plasmídeos, utilizando os
oligonucleotídeos: T7 Promoter, (5´-TAATACGACTCACTATAGGG–3´), Ag85meio, (5´-
CGTCAAGCCCACCG-3´) e Ag85fim, (5´-CCAAGACGCCTACAACGC-3´) para verificar
a integridade da junção Ag85A – Hsp65. O sequênciamento foi realizado em colaboração
com a professora Dra Mayana Zatz do Centro de Estudos do Genoma Humano, ICB-USP.
Após o sequênciamento, foi feito um alinhamento das seqüências obtidas com o banco
de dados do NCBI, como citado anteriormente (item 3.1.6).
3.2.6- Construção do plasmídeo pVAX-Ag85A
Para a construção do plasmídeo pVAX-Ag85A, o inserto Ag85A, obtido por
amplificação (item 3.2.1) foi clonado no vetor pVAX1 (Invitrogen, USA), o qual foi
previamente linearizado com as enzimas HindIII e BamHI (Invitrogen, USA). Esse vetor foi
preparado da mesma maneira que o vetor pVAX-Hsp65 (item 3.2.3) para que pudesse ser
realizada a clonagem. A caracterização desse plasmídeo foi realizada através de análise de
restrição, PCR e sequênciamento, assim como realizado para a vacina múltipla.
3.3- Ensaio de transfecção de macrófagos J774
Macrófagos da linhagem J774 foram cultivados em placas de cultura de 6 poços
(Corning, USA) em meio RPMI 1640 (Sigma, Germany), suplementado com 10% de soro
bovino fetal - SBF (Gibco-BRL, USA), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 mg/mL) e
gentamicina (10 mg/mL) (Gibco-BRL, USA), 50 mM de 2 mercaptoetanol (ME) (Sigma,
Germany) e 200 mM de L-glutamina até atingirem a confluência de aproximadamente 50%.
Para cada transfecção, diluiu-se 10 µL de Lipofectina (Invitrogen, USA) em 100 µL
de meio Opti-MEM
(Invitrogen, USA) e incubou-se a temperatura ambiente por cerca de 40
min. Em seguida, foram adicionados aproximadamente 2 µg de DNA, previamente diluído em
___________________________________________________________ Material e Métodos
31
100 µL de Opti-MEM
(Invitrogen, USA). A mistura foi incubada por mais 10 min a
temperatura ambiente e então adicionados 800 µL de meio RPMI 1640 (Sigma, Germany)
incompleto. A solução foi adicionada às células e deixada por cerca de 10 h. Após esse
período, o meio contendo o DNA foi substituído por RPMI 1640 (Sigma, Germany) completo
e as células foram incubadas a 37°C a 5% de CO
2
por 72 h.
3.4- Extração do RNA total das células e realização de RT-PCR
A extração do RNA total das células transfectadas foi realizada utilizando-se 1 mL do
reagente Trizol (Invitrogen, USA) para cada poço contendo as células. Em seguida as
amostras foram homogeneizadas, transferidas para um tubo de 1,5 mL e incubadas por 5 min
a temperatura ambiente, para completa dissociação dos complexos de nucleoproteínas. Após
esse período, adicionou-se 200 µL de clorofórmio e o material foi agitado vigorosamente por
30 s e mantido a temperatura ambiente por 3 min. Posteriormente as amostras foram
centrifugadas a 10.500 g por 15 min a 4°C e a fase aquosa (sobrenadante) foi cuidadosamente
retirada e transferida para um novo tubo. O RNA foi precipitado com 500 mL de isopropanol
e armazenado por aproximadamente 15 h a -20°C. Em seguida as amostras foram novamente
centrifugadas a 10.500 g por 15 min a 4°C e o precipitado foi ressuspendido em 50 µL de
água DEPC (Dietil Pirocarbonato) (Sigma, Germany). O RNA total de cada amostra foi
quantificado por espectrofotometria a 260 nm utilizando o aparelho GeneQuant II
TM
(Amershan, BioSciences, Sweden).
Após a quantificação, foi feito um gel de agarose 1,5% desnaturante, para visualização
da integridade dos RNAs obtidos. A preparação do gel foi realizada acrecentando-se 30 mL
de formaldeído 37% e 33 mL de tampão de migração MOPS 5X (MOPS a 0,5 M; acetato de
sódio a 50 mM; EDTA a 0,5 mM, pH 8,0) a 87 mL de agarose fundida em água Mili-Q
estéril. As amostras (cerca de 1 µg) foram diluídas em tampão MOPS 1X, formaldeído 20%,
___________________________________________________________ Material e Métodos
32
formamida 50% e brometo de etídio (200 µg/mL) e incubadas a 65°C por 15 min. Após esse
período, foi acrescentado tampão da amostra 1X (glicerol 50%; EDTA a 10 mM, pH 8,0;
bromofenol blue 0,25% e xylene cyanol FF 0,25%) e aplicado no gel. A corrida foi realizada a
80 V por cerca de 1,3 h e a visualização das bandas foi feita em luz ultravioleta no aparelho
Image Master VDS (Pharmacia Biotech, USA).
O RNA total obtido, foi então tratado com a enzima Amplification grade DNAse I
(Gibco-BRL, USA) para completa degradação de DNA, eliminando assim a possibilidade de
contaminação com o DNA genômico ou plasmídeal. Para o tratamento de 1 µg de RNA total
adicionou-se 1 U da enzima e seu respectivo tampão (Tris-HCl a 20 mM, pH 8,4; KCl a 50
mM e MgCl
2
a 2 mM) em um volume final de 10 µL. A reação foi mantida por 15 min a 25°C
e inativada com a adição de EDTA a 25 mM seguido de 15 min de incubação a 65°C. Para o
controle desse processo, uma alíquota de cada amostra foi submetida à reação de PCR.
Após o tratamento com DNAse, as amostras foram preparadas para a síntese do cDNA
fita simples. Para tanto, foram adicionados oligo-dT (500 mg/mL) (Gibco-BRL, USA) e
dNTPs (10 mM) e incubou-se por 10 min a 70°C. Em seguida, adicionou-se o tampão da
enzima (Tris-HCl a 50 mM, pH 8,4; KCl a 75 mM), MgCl
2
a 3 mM e DTT a 0,02 mM. A
amostra foi equilibrada por 2 min a 42°C e em seguida adicionou-se 20 U da enzima
SuperScript II (Gibco-BRL, USA) durante 50 min a 42°C. A reação foi inativada pela
incubação por 15 min a 70°C. Em seguida, realizou-se uma reação de PCR para confirmação
do cDNA específico para a proteína Ag85A.
Para verificar a qualidade do cDNA obtido, realizou-se também PCR com oligos da -
actina como controle. Para cada reação adicionou-se dNTPs a 10 mM; Tris-HCl a 20 mM, pH
8,4; KCl a 50 mM; MgCl
2
a 1,5 mM; oligonucleotídeos -actina-1 (5´-
TGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3´) e -actina-2 (5’-CTCTTTGATGTCACGCACGATTT-
3’) a 10 pmol/µL e 2,5 U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen, USA) em um volume final de
___________________________________________________________ Material e Métodos
33
50 µL. A reação foi incubada em termociclador PTC-200 (MJ Research, INC), com incubação
inicial de 95°C por 3 min, 35 ciclos de 94°C por 45 s, 60°C por 45 s, 72°C por 90 s e uma
extensão final de 72°C por 10 min. Todas as reações de PCR obtidas foram analisadas através
de eletroforese gel de agarose 1%.
3.5- Análise de Western blot
Após 72 h de transfecção, foi coletado o sobrenadante dos macrófagos e à
monocamada de células restantes foi adicionado tampão de lise: NaCl a 150 mM; Tris a 50
mM, pH 8,0; IgePal CA-630 1% (Sigma, Germany), 50 mM de PMSF (Gibco-BRL, USA), e
deixado por cerca de 30 min no gelo. O lisado foi então centrifugado a 10.000 g, por 10 min a
4°C e o sobrenadante coletado.
Uma alíquota de 20 µL de cada amostra foi utilizada para análise de eletroforese em
gel de poliacrilamida 10% SDS-PAGE. As proteínas separadas no gel foram transferidas para
uma membrana de nitrocelulose através do aparelho mini trans-blot® (BioRad, USA) por 1,3
h a 100 V em tampão de transferência: Metanol 20%; Tris 6%; Glicina 0,3%.
A membrana foi bloqueada com soro albumina bovina (BSA) 2% e Tween-20 0,05%
em PBS 1X por 2 h a temperatura ambiente, e marcada com o anticorpo monoclonal contra a
proteína Ag85A (TD 17-4, gentilmente cedido pela Dra Kris Huygen) em uma diluição de
1:500 em PBS 1X contendo 2% de BSA e 0,05% de Tween-20, por 18 h a 4°C. Após esse
período, a membrana foi extensivamente lavada com PBS 1X contendo 0,5% de Tween-20 e
incubada com anticorpo anti-IgG conjugado com peroxidade em uma diluição de 1:5000, por
1 h a temperatura ambiente. A membrana foi revelada utilizando o Kit de revelação “DAB
Substrate Kit for peroxidase” (Vector, U.K).
___________________________________________________________ Material e Métodos
34
3.6- Animais
Foram utilizados camundongos BALB/c, SPF (Specific Patogen Free), fêmeas, com 6
a 8 semanas de idade, provenientes do Biotério de Animais Isogênicos da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto-USP. Os animais foram mantidos em isoladores de
animais, com temperatura, umidade, fluxo de ar e ciclo de luz claro/escuro controlado, com
livre acesso a água e ração. Os animais infectados com Mycobacterium tuberculosis foram
mantidos em isoladores de animais, em laboratório de nível III de biossegurança, nas mesmas
condições descritas acima.
3.7- Extração e purificação das construções de DNA
Os plasmídeos pVAX1 (vetor), pVAX-Hsp65 (DNA-Hsp65), pVAX-Ag85A (DNA-
Ag85A) e pVAX-Ag85A/Hsp65 (DNA-Ag85A/Hsp65) foram purificados por cromatografia
de troca iônica, utilizando-se o “kit” comercial Qiagen Giga Plasmid Purification, EndoFree
(Qiagen, USA.).
Inicialmente foi realizada a cultura de bactérias E. coli DH5-α, transformadas com
cada plasmídeo em questão, em meio LB ágar (Sigma, Germany) juntamente com o
antibiótico canamicina (Cilinon
) na concentração de 100 µg/mL, por 16 h a 37ºC. Após esse
período, escolheu-se uma colônia, a qual foi inoculada em 5 mL de meio LB líquido (Gibco
BRL) contendo canamicina (100 µg/mL) e incubada durante 8 h, 250 rpm a 37°C (Incubador
shaker series 25, New Brunswick, USA). A seguir, essa cultura foi diluída 1/500 em 2,5 L de
LB líquido, contendo canamicina (100 µg/mL), e incubada novamente a 37ºC sob agitação
(250 rpm) durante 16 h. Após a incubação, o material foi centrifugado a 6800 g por 15 min a
4ºC. O sobrenadante foi desprezado e cerca de 7 gramas do precipitado foi ressuspenso em
125 mL de tampão P1 (Tris-HCl a 50 mM pH 8,0; EDTA a 10 mM e RNAse 100 µg/ml). Em
seguida foram adicionados 125 mL de tampão P2 (NaOH a 200 mM; SDS1%) e esperou-se 5
___________________________________________________________ Material e Métodos
35
min para a completa lise da parede bacteriana. Logo após, adicionou-se 125 mL do tampão P3
(acetato de potássio a 3,0 M pH 5,5) e o material foi filtrado e mantido no gelo por 30 min
após adição de tampão para remoção de endotoxinas (Qiagen, USA).
O filtrado foi aplicado em uma coluna de troca iônica (Qiagen, USA) previamente
equilibrada com tampão QBT (NaCl a 750 mM; MOPS a 50 mM pH 7,0; etanol 15% e Triton
X-100 0,15%). Após a aplicação do filtrado, a resina foi lavada com 600 mL de tampão QC
(NaCl a 1 M; MOPS a 50 mM pH 7,0; etanol 15%) e o DNA plasmideal foi eluído com 30
mL de tampão QN (NaCl a 1,25 M; MOPS a 50 mM pH 7,0; etanol 15%). O DNA eluído foi
precipitado com isopropanol e centrifugado a 28600 g por 45 min a 4°C. Finalmente o
sedimento foi ressuspenso em cerca de 1 mL de água estéril livre de endotoxinas (Qiagen,
USA).
3.8- Quantificação e avaliação da integridade dos plasmídeos purificados
Após a purificação dos diferentes plasmídeos correspondentes a cada uma das
construções, foi realizada a quantificação e a avaliação da integridade dos produtos
purificados. A quantificação dos plasmídeos se fez por espectrofotometria nos comprimentos
de onda de 260 a 280 nm utilizando-se o aparelho GeneQuant II
TM
(Amershan-Pharmacia,
BioSciences, USA).
A caracterização dos plasmídeos pVAX1 (Invitrogen, USA) e DNA-Hsp65 foram
feitas utilizando-se a enzima de restrição BamHI (Invitrogen, USA), enquanto que a
caracterização dos plasmídeos DNA-Ag85A e DNA-Ag85A/Hsp65 foram realizadas com a
enzima PmeI (Fermentas, Canada). Aproximadamente 1 µg dos plasmídeos foram incubados
a 37°C por 16 h com as respectivas enzimas (1 U/µg) e seus tampões.
Em seguida, os produtos da digestão de cada amostra, bem como os plasmídeos não
digeridos, foram submetidos a eletroforese em gel de agarose 1%. As amostras foram
___________________________________________________________ Material e Métodos
36
ressuspensas em tampão de eletroforese 1 X (0,25% azul de bromofenol; 40% de sacarose em
água) e o material submetido a eletroforese em tampão TAE (Tris-acetato a 40 mM; EDTA a
1 mM pH 8,3). O padrão 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA) foi utilizado como
marcador de peso molecular; o gel foi corado com 0,5 mg/mL de brometo de etídio (Gibco-
BRL, USA) e a visualização das bandas foi feita em luz ultravioleta no aparelho Image
Master VDS (Pharmacia Biotech, USA).
Todas os DNAs purificados foram certificados quanto a presença de endotoxinas
(LPS) pelo teste de LAL (Limulus Amebocyte Lysate) (Kit QCL-1000 – Quantitative
Cromogenie – Bio Whittaker – CAMBREX Company), conforme descrito adiante.
3.9- Obtenção das proteínas recombinantes: rHsp65 e rAg85A
Bactérias E. coli ER2566 transformadas com o plasmídeo pET28a (Novagen, UK)
contendo o gene hsp65 foram cultivadas em 2,5 L de meio LB líquido (Gibco-BRL, USA)
contendo canamicina na concentração de 100 µg/mL e 300 mM do indutor IPTG
(Isopropylthio--D-Galactoside, Gibco BRL) a 37°C sob agitação a 250 rpm por 18 h. Após
incubação, as células foram coletadas por centrifugação a 5000 g por 15 min em centrífuga
J2HS (Beckman, rotor JS-7.5), ressuspensas em 20 mL de tampão fosfato e lisadas em
homogeneizador. Após centrifugação a 20600 g por 20 min, o sobrenadante foi descartado e o
sedimento ressuspenso em 30 mL de tampão fosfato contendo Uréia a 5 M e agitado por 1 h.
A suspensão foi então centrifugada a 20600 g por mais 20 min e o sobrenadante coletado e
submetido à cromatografia de afinidade utilizando-se a coluna HiTrap Chelating HP
(Amersham Pharmacia, USA), conforme o protocolo especificado pelo fornecedor. A amostra
de proteína foi eluida da coluna por concentrações crescentes de imidazol. Após eluição a
proteína foi dializada contra PBS 1X durante 16 h a 4°C.
___________________________________________________________ Material e Métodos
37
Para a quantificação da proteína Hsp65 recombinante utilizou-se Coomassie® Protein
Assay Reagent (Pierce, USA) e para a quantificação de endotoxinas o teste de LAL. A
proteína recombinante rAg85A de Mycobacterium tuberculosis, foi adquirida da empresa
Lionex (Germany, Braunschweig) e também foi certificada quanto a presença de endotoxinas
pelo teste de LAL.
3.10- Quantificação do nível de endotoxinas
A determinação da presença de endotoxinas bacterianas nas vacinas gênicas, bem
como nas proteínas purificadas, foi realizada através do teste cromogênico do lisado de
amebócito de Limulus polyphemus (LAL), que é um teste quantitativo para avaliação de
endotoxinas de bactérias gram-negativas utilizando o “QCL-100 LAL kit” (Cambrex).
Primeiramente, a endotoxina foi reconstituída através da adição de 1 mL de água fornecida
pelo próprio kit seguido de agitação vigorosa e homogeneização em vórtex por 15 min.
Utilizando-se uma seringa de 10 mL, foi reconstituído o substrato cromogênico com a adição
de 6,5 mL de água do kit. O frasco foi protegido da luz e posteriormente incubado em placa
de 96 poços, a 37ºC até o momento do uso. A seguir, o LAL foi reconstituído pela adição de
1,4 mL de água com auxílio de uma seringa. Uma vez com os reagentes reconstituídos,
retirou-se a placa da estufa e preparou-se a curva padrão através de diluições sucessivas da
endotoxina partindo de uma concentração 1 Unidade de Endotoxina por mL (UE/mL) até 0,1
UE/mL. Posteriormente as amostras foram depositadas na placa, adicionados 50 µL do LAL e
incubada a 37ºC por 10 min.
Com auxílio de uma micropipeta, foram depositados 100 L do substrato cromogênico
em todos os poços (amostras e curva), seguidos de homogeneização e incubação a 37ºC por 6
min. Posteriormente foram acrescentados 100 L de uma solução de ácido acético 25% para
interrupção da reação. Finalmente foi feita a determinação das densidades ópticas (D.O.) em
___________________________________________________________ Material e Métodos
38
espectrofotômetro a 405 nm. Os resultados foram determinados correlacionando a curva
padrão com a diluição das amostras, levando em consideração a absorbância e a concentração
de endotoxina para esse ponto de cada uma das amostras, em relação à curva padrão. A
fórmula aplicada para calcular a quantidade de LPS por micrograma de DNA foi:
UE/mL X diluição
UE/µg DNA =
________________________
amostra µg/mL
Consideraram-se amostras livres de endotoxina, aquelas que apresentaram valores
menores a 0,1 UE/µg DNA, de acordo com a farmacopéia americana e européia.
3.11- Grupos experimentais e Imunizações
Os grupos experimentais foram constituidos de camundongos inoculados com as
seguintes preparações:
• Solução Salina (controle)
• pVAX1 (vetor vazio, controle)
• DNA-Hsp65 (pVAX-Hsp65)
• DNA-Ag85A (pVAX-Ag85A)
• DNA-Ag85A/Hsp65 (pVAX-Ag85A/Hsp65, vacina múltipla)
• DNA-Ag85A+Hsp65 (pVAX-Ag85A e pVAX-Hsp65)
• BCG (controle de padrão positivo)
Os animais receberam 4 doses de 100 µg de DNA plasmideal purificado administrado
em solução salina (NaCl a 0,9%, Equiplex) contendo 25% de sacarose por injeção
intramuscular, em um volume total de 100 µL/dose, sendo administrado 50 µL em cada
músculo quadríceps, direito e esquerdo, seguindo procedimentos de anti-sepsia. As injeções
foram aplicadas com intervalos quinzenais, totalizando 400 µg de DNA. As preparações
utilizadas para a imunização do grupo DNA-Ag85A+Hsp65, foram feitas utilizando 50 µg de
___________________________________________________________ Material e Métodos
39
cada DNA plasmideal (DNA-Ag85A e DNA-Hsp65) também administrado em solução salina
contendo 25% de sacarose.
As imunizações com BCG foram feitas em uma única dose com a inoculação de 10
5
bacilos da cepa Morreau (gentilmente cedido pelo Departamento de Vacinas do Hospital das
Clínicas de Ribeirão Preto) por via subcutânea, 30 dias antes do desafio com Mtb. Como
grupo controle os animais foram injetados com vetor pVAX1 ou com salina.
Quinze dias após a última imunização, os animais foram sacrificados para coleta dos
baços e realização dos ensaios de imunogenicidade ou então 30 dias após a última imunização
os animais foram desafiados com 10
5
bacilos Mycobacterium tuberculosis da cepa H37Rv
(ATCC 27294) por via intratraqueal e sacrificados 30 dias após o desafio para coleta dos
pulmões e avaliação da proteção conferida contra a doença.
3.12– Obtenção do lisado de M. tuberculosis (Mtb)
Para a preparação do lisado de Mtb, foi utilizada uma alíquota de M. tuberculosis da
cepa H37RV (ATCC 27294) congelada a –70ºC (com viabilidade superior a 85%).
Cerca de 200 µl dessa alíquota foram distribuídos em 10 mL de meio Middlebrook
7H9 (Difco Laboratories, USA) enriquecido com Middlebrook ADC
TM
(BD Biosciences,
USA), e incubado por 7 dias a 37ºC. A suspensão de micobactérias obtida foi centrifugada a
2465 g por 20 min e o sedimento ressuspenso em 1 mL de PBS estéril e agitado
vigorosamente por 2 a 3 min em tubo contendo pérolas de vidro, até adquirir aspecto
homogêneo. Após serem homogeneizadas, as micobactérias foram mortas a 80ºC por 2 h,
lisadas em homogeneizador de alta pressão, com aproximadamente 3 pulsos de 15 min cada, e
filtradas em filtro 0,22 µm (Corning, USA).
A quantificação e certificação quanto a presença de endotoxinas foram realizadas
como descrito para a proteína rHsp65 (item 3.9).
___________________________________________________________ Material e Métodos
40
3.13– Processamento do baço para cultura de células
Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e o baço foi coletado em 2
mL de meio RPMI-1640 incompleto (Sigma, Germany) e mantido em gelo. Em câmara de
fluxo laminar os baços foram divulssionados para a obtenção das células que foram contadas
em câmara de Neubauer e diluídas em meio RPMI (Sigma, Germany) suplementado com 10%
de Soro Fetal Bovino (Gibco BRL, USA), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (10
mg/mL), gentamicina (100 µg/mL), L-glutamina (200mM) (Gibco BRL, USA) e 2-
Mercaptoetanol (5.10
-5
M) (Sigma, Germany) para uma concentração final de 5x10
6
células/mL.
3.14-Cultura de células para dosagens de citocinas
Para dosagens de citocinas, 1 mL da suspensão celular obtida no item anterior foi
distribuída em placas de 24 poços (Costar) para posterior estímulo in vitro com meio (RPMI),
rHsp65 (20 µg/mL), rAg85A (20 µg/mL), lisado de Mtb (10 µg/mL) ou mitógeno
concanavalina A (conA) (40 µg/mL). Após 48 horas de cultura, os sobrenadantes foram
coletados e armazenados a – 20ºC para posterior dosagem de citocinas por ELISA.
3.15- Cultura de células para linfoproliferação
Para o desenvolvimento do protocolo de linfoproliferação, 100 µL/poço da suspensão
celular (5 x 10
5
células) obtida no item 3.13 foram distribuídas em placas de 96 poços (Costar)
para posterior estímulo in vitro com meio (RPMI), rHsp65 (2 µg/mL), rAg85A (2 µg/mL) ou
conA (4 µg/mL). A cultura de células foi pulsada com 50 µL por poço partindo de uma
solução a 10 µCi/mL de timidina [
3
H] em RPMI-completo 16 h antes de completar o tempo
total de incubação de 72 h, a 37
o
C em estufa a 5% CO
2
.
___________________________________________________________ Material e Métodos
41
3.16- Ensaio Imunoenzimático ELISA para dosagem de anticorpos
A resposta imune humoral foi avaliada através da produção de anticorpos específicos
anti-Hsp65 e anti-Ag85A dos subtipos IgG1 e IgG2a, por ELISA nas amostras de soro pré-
imunes e soros coletados através do plexo-retro orbital, duas semanas após a última
imunização. Placas de 96 poços de poliestireno (Maxisorp Nunc-Immuno Plates, USA) foram
sensibilizadas com 100 µL/poço da solução de proteína rHsp65 ou rAg85A diluídas em
tampão de ligação (Na
2
HPO
4
a 0,1M, pH 9,0) em uma concentração final de 5 µg/mL. As
placas foram incubadas a 4ºC por 16 h e posteriormente lavadas com PBS 1X contendo
0,05% de Tween 20 e bloqueadas com 200 µL/poço de uma solução de gelatina 1% (Synth –
Lote: 58681) com 0,05% de Tween 20. Após incubação por 1 h, a 37ºC, as placas foram
novamente lavadas e adicionou-se 100 µL/poço dos soros, diluídos 1:10, 1:100, 1:500 e
1:1000, em solução de gelatina/Tween 20 (0,05%). As placas foram incubadas por 2 h a 37ºC,
e após lavagem das mesmas, foi realizada incubação por 1 h, a 37ºC, com anticorpo
monoclonal anti-IgG1 ou anti-IgG2a conjugados com biotina (PharMingen, USA),
adicionando-se 100 µL/poço do anticorpo diluído em solução de gelatina/Tween 20 (0,05%)
em uma concentração final de 0,5 µg/mL. Após procedimento de lavagem, foi adicionada 100
µL/poço da solução de avidina biotina peroxidase StrepAB kitTM (Dako, USA) sendo
incubada por 30 min a temperatura ambiente. As placas foram reveladas pela adição da
solução de OPD (Sigma, Germany) e a reação foi interrompida pela adição de 50 µL/poço de
ácido sulfúrico 16%. A leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro de placa
(µQuant Bio-Tek Instruments Inc.) a 490 nm. Todos os anticorpos utilizados foram adquiridos
da PharMingen e utilizados de acordo com as instruções do fabricante.
3.17- Ensaio Imunoenzimático ELISA para dosagem de citocinas
___________________________________________________________ Material e Métodos
42
A produção de citocinas em sobrenadante de cultura foi avaliada quanto à produção de
IFN-γ, IL-12 e IL-10 por ELISA. Placas de 96 poços de poliestireno (Maxisorp Nunc-
Immuno Plates, USA) foram sensibilizadas com 100 µL da solução de anticorpo monoclonal
purificado específico para a citocina de interesse (PharMingen, USA - citados na tabela
abaixo), diluídos em tampão de ligação (Na
2
HPO
4
a 0,1 M, pH 9,0) em uma concentração
final de 1 µg/mL. As placas foram incubadas a 4ºC por 16 h. Após sucessivas lavagens com
solução PBS 1X contendo 0,05% de Tween 20 (Vetec), as placas foram incubadas com 200
µL/poço da solução de bloqueio, constituída de PBS 1X contendo 10% de soro bovino fetal –
SBF (Gibco BRL, USA) durante 1 h, a temperatura ambiente. As placas foram novamente
lavadas e as amostras foram adicionadas, 100 µL/poço juntamente com a curva padrão da
citocina recombinante, diluída em PBS/SBF 10%/Tween 20 a 0,05%, e incubadas por 16 h a
4°C. Após lavagem, foi feita incubação por 1 h, a temperatura ambiente, com anticorpo
monoclonal conjugado com biotina específico para a citocina de interesse (PharMingen,
USA), adicionando-se 100 µL/poço do anticorpo diluído em PBS/SBF 10%/Tween 20 a
0,05% em uma concentração final de 0,5 µg/mL. Após lavagem, adicionou-se 100 µL/poço de
solução de avidina biotina peroxidase StrepAB kitTM (Dako, USA) sendo incubada por 30
min a temperatura ambiente. As placas foram reveladas pela adição da solução de OPD
(Sigma, Germany) após novo procedimento de lavagem. A reação foi interrompida pela
adição de 50 µL/poço de ácido sulfúrico 16% (Merck). A leitura da absorbância foi realizada
em espectrofotômetro de placa (mQuant Bio-Tek Instruments Inc.) a 490 nm. A determinação
das concentrações das citocinas foi feita por interpolação dos resultados de absorbância
obtidos nas amostras em relação aos da curva padrão. Todos os anticorpos e citocinas
recombinantes foram adquiridos da PharMingen e utilizados de acordo com as instruções do
fabricante.
___________________________________________________________ Material e Métodos
43
3.18- Preparo do inóculo de M. tuberculosis
A suspensão de M. tuberculosis, linhagem H37Rv (ATCC 27294) foi obtida a partir de
uma alíquota congelada a -70º C, na qual foi observada viabilidade superior a 85%. O volume
total da alíquota (1 mL) foi semeado em 2,5 mL de meio Middlebrook 7H9 (Difco, USA). A
cultura foi incubada por 7 dias, a 37º C. Após este período, a cultura foi centrifugada a 2465 g
por 20 min, o sedimento foi ressuspenso em 1 mL de solução salina estéril e em seguida
transferido para tubo contendo pérolas de vidro. Essa suspensão foi agitada em vórtex (Ika
Works Inc., USA) por 2 a 3 min até adquirir aspecto homogêneo. Adicionou-se salina estéril a
esta suspensão até que a mesma atingisse a turbidez equivalente à Escala de Mc Farland n
o
1,
o que equivale a uma concentração de 1x10
7
bacilos/mL (Atlas, 1993). Para o preparo do
inóculo de infecção, diluiu-se a suspensão com turbidez equivalente à escala numa proporção
de dez vezes, obtendo-se assim uma suspensão com a concentração de 1x10
6
bacilos/mL. A
viabilidade da cultura foi verificada, de acordo com a metodologia descrita por McDonough
& Kress (1995), incubando-se por 10 min a 37ºC cerca de 100 µL desta suspensão de
bactérias com 100 µL de diacetato de fluoresceína a 2 µg/mL (Acros Organics, USA) e 100
µL de brometo de etídio a 10 µg/mL (Sigma, Germany) (McDonough et al., 1993). A seguir,
a suspensão de micobactérias foi observada em microscópio de fluorescência modelo
Aristoplan (Leitz Wetzlar, Germany). As bactérias viáveis apresentam coloração verde
Anticorpo Purificado Anticorpo Biotinilado
IFN-γ
Clone: R4-6A2
Isotipo: IgG1 de rato
Clone: XGM1.2
Isotipo: IgG1 de rato
IL-12/p70
Clone: 9A5
Isotipo: IgG2b de rato
Clone: C17.8
Isotipo: IgG2a de rato
IL-10
Clone: JES5-2A5
Isotipo: IgG1 de rato
Clone: SXC-1
Isotipo: IgM de rato
___________________________________________________________ Material e Métodos
44
enquanto as bactérias mortas coram-se com a solução de brometo, apresentando-se com uma
coloração avermelhada. Outros controles realizados foram: coloração de Ziehl-Neelsen;
contagem de bacilos presentes por mililitro de inóculo por meio da semeadura de várias
diluições do mesmo, em meio 7H11 e a semeadura da cultura original em ágar-sangue. Todos
os procedimentos de cultura da micobactéria, preparo do inóculo e desafio dos animais foram
realizados em laboratório de biossegurança nível III.
3.19- Desafio dos animais com M. tuberculosis
Cada animal foi desafiado com 100 µL da suspensão contendo 1x10
5
bacilos de M.
tuberculosis H37Rv por via intratraqueal, 30 dias após a última imunização. Para esse
procedimento, os animais foram previamente anestesiados com uma solução de
tribromoetanol (Acros Organics, USA) a 2,5% em solução salina, por via intraperitoneal.
Após a anestesia, realizou-se o procedimento cirúrgico para exposição da traquéia e
inoculação da bactéria. Como controle experimental, foi acrescentado um grupo que recebeu
solução salina por via intratraqueal ao invéz do desafio com a bactéria.
3.20- Avaliação do pulmão dos animais desafiados
Trinta dias após o desafio, os animais foram sacrificados e os pulmões coletados e
colocados em placas de Petri estéreis contendo 2 mL de meio RPMI-1640 Incompleto (Gibco
BRL, USA). Os pulmões foram pesados e tiveram seus lóbulos separados para os diversos
procedimentos experimentais: o lóbulo superior direito foi colocado em um tubo contendo 10
mL de formol tamponado para posterior processamento e análise histológica; os lóbulos
superior e inferior esquerdos foram coletados em tubos contendo 2 mL de meio RPMI-1640
incompleto e armazenados a –20ºC para posterior detecção de citocinas; os lóbulos médio e
inferior direitos foram coletados em placas de petri de 22 mm de diâmetro (Corning) para
___________________________________________________________ Material e Métodos
45
obtenção de células para análise de citometria de fluxo (FACs) e determinação do número de
unidades formadoras de colônias (UFC).
3.21- Coleta, digestão e obtenção de células do pulmão
Os lóbulos destinados aos ensaios de UFC e citometria de fluxo, foram pesados,
cortados em pequenos fragmentos e transferidos para um tubo de fundo cônico (Falcon) de 50
mL contendo 15 mL da solução de digestão estéril. Essa solução foi preparada em meio de
cultura RPMI-1640 incompleto contendo 0,5 µg/mL de Liberase (Liberase Blendzymez –
Roche, IN) e 25 U/mL de Desoxiribonuclease I (Gibco BRL, USA). Após a adição da solução
de digestão, os tubos foram incubados a 37ºC, sob agitação constante, durante 30 min. Após a
digestão, as células foram dispersas com auxílio de uma seringa de 10 mL e centrifugadas a
1050 g por 10 min, a 4ºC. O sedimento foi ressuspenso em 1 mL de RPMI-1640 incompleto.
Uma alíquota de 100 µL dessa suspensão foi retirada para o protocolo de UFC e o restante foi
novamente centrifugado e o sedimento ressuspenso em 5 mL de meio RPMI-1640 contendo
10% de SBF para inibir a atividade da enzima liberase. As células presentes foram separadas
do restante da matriz digerida utilizando-se organza estéril, seguida de lavagem da malha com
mais 10 mL de meio RPMI-1640 completo. As células obtidas foram centrifugadas a 1050 g,
por 10 min, a 4ºC, ressuspensas em 1 mL de meio RPMI-1640 completo e contadas em
câmara de Neubauer. A concentração final foi acertada para 1x10
7
células/mL. Essas células
foram utilizadas para avaliação da expressão de marcadores de superfície por citometria de
fluxo.
3.22- Ensaio imunoenzimático ELISA para dosagem de citocinas no homogenato de
pulmão
___________________________________________________________ Material e Métodos
46
Para a determinação das citocinas produzidas no pulmão após o desafio com Mtb, o
órgão foi extraído, pesado, triturado e, após centrifugação e coleta do sobrenadante, esse foi
empregado nos ensaios de ELISA. Foram avaliadas a produção de IFN-γ, IL-12, IL-10 e IL-4.
O protocolo do ensaio de ELISA foi realizado como descrito no item 3.17, com a
utilização dos mesmos clones dos anticorpos monoclonais purificados e biotinilados anti-
IL12/p40, anti-IL10, anti-IFN-γ. Os clones utilizados para IL-4 foram: anticorpo purificado
clone: 11B11 e anticorpo biotinilado clone: BVD6-24G2.
3.23- Marcação das células para citometria de fluxo
As populações de células do pulmão de animais imunizados e desafiados foram
caracterizadas pela expressão de marcadores de superfície utilizando anticorpos monoclonais
específicos conjugados a fluorocromos.
As células obtidas após a digestão do pulmão foram distribuídas em tubos de
poliestireno, 1x10
6
células em 100µL por tubo, e incubadas durante 30 min, a 4ºC, com
anticorpo anti-CD16/CD32 (Fc Block
TM
- PharMingen), na concentração de 0,5 µg/10
6
células. Esta incubação visa minimizar as ligações inespecíficas. Posteriormente, essas células
foram incubadas com os respectivos anticorpos monoclonais de interesse, de acordo com a
tabela abaixo (0,5 – 0,75 µg de anticorpo/1x10
6
células) durante 30 min, a 4ºC, no escuro.
Após o tempo de incubação as células foram lavadas com 2 mL de PBS 1X contendo 2% de
SBF, centrifugadas a 1050 g, por 10 min a 4ºC e ressuspensas em 300 µL de PBS 1X
contendo 1% de formol (Nuclear) para a fixação das células. As preparações celulares foram
adquiridas no aparelho FACSort
TM
(Becton & Dickinson, USA). Foram adquiridas 10.000
células por tubo, analisadas através do programa Cell Quest, de acordo com parâmetros de
tamanho (FSC), granularidade (SSC) e intensidade de fluorescência dos anticorpos marcados
com ficoeritrina (PE), isotiocianato de fluoresceína (FITC) e CyChrome (Cy).
___________________________________________________________ Material e Métodos
47
Inicialmente, foi determinada a população de linfócitos, baseada nos parâmetros FSC e
SSC, para detecção das porcentagens de linfócitos T (CD4
+
e CD8
+
) e linfócitos B (CD19
+
).
A expressão de CD44
hi
e CD62L
lo
foi analisada nas populações de linfócitos CD4
+
ou CD8
+
.
Todos os anticorpos foram adquiridos da PharMingen e utilizados de acordo com as instruções
do fabricante.
Marcação Tubo
FITC PE CY
1 Isotipo controle IgG2a de
rato
Isotipo controle IgG2a de
rato
Isotipo controle IgG2b de
rato
2 CD4 CD8
3 CD62L CD44 CD4
4 CD62L CD44 CD8
5 CD3 CD19
3.24- Ensaio Imunoenzimático ELISA para dosagem de anticorpos
A dosagem de anticorpos no soro dos animais imunizados e desafiados foi realizada
como descrito no item 3.16.
3.25- Determinação do número de unidades formadoras de colônia (UFC)
A partir da alíquota de 100 µL do pulmão digerido (item 3.21), foram feitas diluições
em PBS 1X de 10, 100, 1000 e 10000 vezes. As diluições (100 µL) foram semeadas em meio
sólido 7H11 (meio 7H9 acrescido de ágar bacteriológico (Difco, USA)). Foram adicionados
100 µL de cada diluição sobre as placas, as quais foram vedadas e incubadas a 37ºC por 30
dias. Após o período de incubação, as colônias de micobactérias foram contadas com auxílio
de lupa (Leica Microsystems). O número de colônias foi corrigido de acordo com as diluições
e o peso dos pulmões e expresso em Log
10
do número de UFC por grama de pulmão.
___________________________________________________________ Material e Métodos
48
3.26– Análise histológica
Para a análise histológica do pulmão dos animais desafiados, imunizados ou não, o
lóbulo superior direito do pulmão de cada animal foi coletado e fixado em formol tamponado
com fosfato. Posteriormente o material foi processado pela técnica Elaine Medeiros Floriano,
no laboratório coordenado pela Drª. Simone Gusmão Ramos, no Departamento de Patologia
da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Foram realizados os cortes histológicos (5 µm) e
as lâminas obtidas foram coradas com Hematoxilina e Eosina (HE). Também foi realizada
uma coloração por Ziehl-Neelsen (ZN), específica para Bacilos Álcool-Ácido Resistentes
(BAAR) para a detecção de M. tuberculosis. As lâminas foram analisadas por microscopia
óptica em conjunto com a patologista Drª. Simone Gusmão Ramos.
3.27- Análise estatística
Para realização da análise estatística, utilizou-se o programa Prism 4.0, e foi
empregado o teste t de Student não-pareado para comparar os dados entre os diferentes grupos
experimentais. Foram considerados significativos os resultados cujas diferenças apresentaram
p<0,05.
3.28- Delineamento experimental
Os seguintes delineamentos experimentais foram utilizados no decorrer desse
trabalho:
___________________________________________________________ Material e Métodos
49
• Construção da vacina de DNA múltipla
• Ensaios de imunogenicidade
Primeira
Imunização
Dias
0 15 30 45
60
Segunda
imunização
Terceira
imunização
Quarta
imunização
Coleta do
soro pré-
imune
Coleta do
soro pós-
imune
Sacrifício dos
animais e coleta
do baço
Imunização
Ag85A
Clivagem com
enzimas de restrição
Ag85A
PCR
Clonagem
Vacina múltipla
Hsp65
Ag85A
- Linfoproliferação
- ELISA (citocinas
e anticorpos)
Ag85A
pVAX-Hsp65 linearizado
Plasmídeo contendo Ag85A
___________________________________________________________ Material e Métodos
50
• Ensaios de proteção
Primeira
imunização
Dias
0 15 30 45 75 105
Segunda
imunização
Terceira
imunização
Quarta
imunização
Desafio com
Mtb
Coleta do
soro pré-
imune
Imunização
do grupo
BCG
Coleta do
soro após
desafio
Sacrifício
dos animais
e coleta dos
pulmões
-
ELISA (citocinas e
anticorpos)
- FACs
- UFC
- Histologia
51
__________________________________________________________________Result
ados
52
4 RESULTADOS
4.1- Primeira estratégia de construção da vacina múltipla
Para a obtenção do gene Ag85A do plasmídeo pV1ns-tPA foi realizado um PCR em
gradiente, com temperaturas de anelamento variando entre 57 a 66°C. Essas temperaturas
foram escolhidas de acordo com as temperaturas de melting (TM) especificadas pelos
primers.
O produto de amplificação do gene Ag85A observado em gel de agarose revelou uma
banda única de aproximadamente 0,9 Kb correspondente ao tamanho esperado do gene. Esse
produto de PCR amplificou em uma TM entre 57°C e 58,8°C (Figura 1).
Para avaliar a integridade dos vetores pVAX1 e pVAX-Hsp65 para a posterior
clonagem do gene Ag85A, foram realizadas digestões enzimáticas e análises eletroforéticas
para checagem do mapa de restrição desses vetores. A reação de clivagem do plasmídeo
pVAX1 mostrou uma banda de 3,0 Kb, correspondente ao tamanho esperado. Já a digestão do
plasmídeo pVAX-Hsp65 revelou a presença de uma banda de aproximadamente 6,0 Kb. Esse
tamanho era o esperado, uma vez que o gene para a Hsp65 clonado no vetor pVAX1 possui
3,0 Kb e o vetor vazio, 3,0 Kb. Já o plasmídeo não digerido apresentou um padrão de bandas
típico de plasmídeos não linearizados, onde se observa duas bandas, que correspondem às
formas mais espiraladas e menos espiraladas do vetor (Figura 2).
__________________________________________________________________Result
ados
53
Figura 1- Resultado da reação de amplificação do gene Ag85A, avaliado por
gradiente de temperatura em PCR. As amostras foram submetidas a eletroforese em gel de
agarose 1%, e as bandas visualizadas por coloração com brometo de etídio. A pista L
constitui o marcador de peso molecular em kilobase – 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen,
USA); As pistas 1 a 8 correspondem ao produto de amplificação do plasmídeo pV1Jns-tPA,
utilizado como molde para amplificação do gene Ag85A em diferentes TMs (57; 57,3; 58;
58,8; 60,1; 61,8; 63,6; 65,5; 66°C), N: controle negativo. Kb: kilobases. O número circulado
destaca a amostra escolhida para posterior purificação.
L 1 2 3 4 5 6 7 8 N
1,0 Kb
0,9 Kb
__________________________________________________________________Result
ados
54
Figura 2- Resultado da clivagem do plasmídeo pVAX-Hsp65. As amostas foram
submetidas a eletroforese em gel de agarose 1%, sendo as bandas reveladas pela coloração
com brometo de etídio. A pista L: corresponde ao padrão de peso molecular, 1 Kb Plus DNA
Ladder (Invitrogen, USA); a pista 1, indica o vetor pVAX1 (vazio) não digerido; a 2, o vetor
pVAX1 (vazio) linearizado com AflII, com o tamanho de 3,0 Kb, a pista 3, mostra o
plasmídeo pVAX-Hsp65 não digerido e a pista 4, pVAX-Hsp65 linearizado com AflII, com o
tamanho de 6,0 Kb.
3,0 Kb
6,0 Kb
L 1 2 3 4
__________________________________________________________________Result
ados
55
4.2- Identificação dos clones recombinantes
Uma das caracterizações realizadas para a identificação dos clones recombinantes foi
através de PCR de colônia, utilizando-se oligonucleotídeos específicos para o gene de
interesse. A análise das colônias recombinantes resultantes da ligação do gene Ag85A ao vetor
pVAX1 (Invitrogen, USA) revelou a presença de três clones positivos (Figura 3A), enquanto
que a análise da ligação do gene Ag85A no plasmídeo pVAX-Hsp65 revelou somente um
clone positivo (Figura 3B). Todas as bandas apresentaram um tamanho aproximado de 0,9
Kb, coincidente com o tamanho do gene Ag85A.
A confirmação dos quatro clones recombinantes obtidos foi realizada por meio de
sequênciamento desses plasmídeos. Dos três clones pVAX-Ag85A positivos, somente um
possuía o gene Ag85A inserido de forma correta. Em relação ao clone pVAX-Ag85A/Hsp65,
o sequenciamento revelou a inserção correta do inserto porém, ao se analisar a seqüência
completa do gene Ag85A e a junção com o gene hsp65, foi verificado que a proteína de fusão
havia saído de sua fase aberta de leitura.
Diante disso, foi decidido descartar todos os clones obtidos e foi elaborada uma nova
estratégia para a construção das vacinas DNA-Ag85A e DNA-Ag85A/Hsp65.
__________________________________________________________________Result
ados
56
Figura 3- Resultado do PCR de colônia. Eletroforese em gel de agarose 1%. Em A:
análise da reação de ligação do gene Ag85A com o vetor pVAX1, L: padrão de peso
molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); pistas: 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9 e 11
plasmídeos não recombinantes; pistas: 5, 6 e 10, plasmídeos pVAX-Ag85A recombinantes,
N: controle negativo. Em B: análise da reação de ligação do gene Ag85A com o plasmídeo
pVAX-Hsp65, L: padrão de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA);
pistas: 1, 2, 3, 4, 5 e 7, plasmídeos não recombinantes; pista: 6 plasmídeo pVAX-
Ag85A/Hsp65 recombinante; N: controle negativo.
0,9 Kb
1,0 Kb
A
L 1 2 3 4
5 6 7 8 9 10 11 N
B
L 1 2 3 4 5 6 7 N
1,0 Kb
0,9 Kb
__________________________________________________________________Result
ados
57
4.3- Nova estratégia de construção da vacina múltipla
Os produtos da nova reação de amplificação do gene Ag85A, observados por
eletroforese em gel de agarose 1% revelaram uma banda de aproximadamente 0,9 Kb
correspondente ao gene Ag85A. A reação de PCR foi realizada com um gradiente de
temperatura de anelamento variando entre 53 a 60°C. Em todas as temperaturas ocorreu
amplificação, porém, nas TMs mais baixas as bandas foram mais evidentes (Figura 4).
A análise da clivagem do plasmídeo pVAX-Hsp65 revelou uma banda de 6,0 Kb
(como o esperado), e a clivagem do vetor pVAX1 ‘vazio’, sem o gene hsp65, mostrou uma
banda de 3,0 Kb (Figura 5).
__________________________________________________________________Result
ados
58
Figura 4- Resultado da nova reação de amplificação do gene Ag85A, avaliado por
gradiente em PCR. Após a realização do PCR, as amostras foram separadas por eletroforese
em gel de agarose 1%, utilizando brometo etídio para visualização das bandas. L: marcador de
peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); pistas: 1 a 7, pV1J.ns-tPA
utilizado como molde para amplificação do gene Ag85A em diferentes TMs (53-60°C); N:
controle negativo. O círculo destaca a amostra escolhida para purificação.
L 1 2
3 4 5 6 7 N
1,0
Kb
0,9
Kb
__________________________________________________________________Result
ados
59
Figura 5- Resultado das clivagens dos plasmídeos pVAX1 e pVAX-Hsp65
digeridos com BamHI e HindIII. As amostas foram submetidas a gel de agarose 1%, sendo
as bandas reveladas pela coloração com brometo de etídio. L: padrão de peso molecular 1 Kb
Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); pista 1: vetor pVAX1 não digerido; pista 2: vetor
pVAX1 digerido; pista 3: pVAX-Hsp65 não digerido e pista 4: pVAX-Hsp65 digerido.
6,0 Kb
3,0 Kb
L 1 2 3 4
__________________________________________________________________Result
ados
60
4.4- Identificação dos novos clones recombinantes
A análise da reação de PCR por eletroforese em gel de agarose 1% revelou a presença
de um único clone pVAX-Ag85A positivo (Figura 6A) e quatro possíveis clones pVAX-
Ag85A/Hsp65 (Figura 6B). Em todos ocorreu a amplificação de uma banda de tamanho
aproximado de 0,9 Kb, equivalente ao tamanho do gene Ag85A.
O gene Ag85A e o cassete Ag85A-Hsp65, possui um sítio para a enzima PmeI
flanqueando as suas extremidades (Figura 7A), o que possibilitou a realização de uma análise
de restrição, para confirmar a presença dos insertos dentro dos vetores. A clivagem do
plasmídeo pVAX-Ag85A revelou a presença de uma banda de 1,0 Kb, correspondente ao
gene Ag85A e uma segunda banda de 3,0 Kb correspondente ao vetor pVAX1 (canaleta 5). Já
a digestão do plasmídeo pVAX-Ag85A/Hsp65 resultou no aparecimento de uma banda com
tamanho aproximado de 4,0 Kb e outra de 3,0 Kb (canaletas 1, 2, 3 e 4), a primeira
correspondendo a fusão dos genes Ag85A (1,0 Kb) e hsp65 (3,0 Kb), e a segunda,
correspondente ao vetor pVAX1 (3,0 Kb) na ausência dos genes (Figura 7B).
A caracterização final foi realizada através do sequênciamento dos plasmídeos. A
análise das seqüências mostrou que um dos clones pVAX-Ag85A/Hsp65 (clone 1), apesar de
possuir o gene Ag85A, este havia se inserido na posição contrária, fato considerado normal,
uma vez que tanto o inserto quanto o vetor possuíam extremidades abruptas, podendo,
portanto ser clonado ou na posição 5´→ 3´ ou na 3´→ 5´. Esse clone foi então eliminado.
Os três clones recombinantes restantes mostraram estar inseridos na direção correta de
acordo com o software Multalin (www.prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html) e o
alinhamento com o banco de dados do NCBI mostrou uma similaridade acima de 93% desses
plasmídeos com o gene Ag85A.
__________________________________________________________________Result
ados
61
Figura 6- Resultado da reação de PCR de colônia. As amostas foram submetidas a
gel de agarose 1%, sendo as bandas reveladas pela coloração com brometo de etídio. Em A:
perfil plasmideal dos clones recombinantes provenientes da reação de ligação do gene Ag85A
com o vetor pVAX1, L: padrão de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA);
pistas: 1 – 7, plasmídeos não recombinantes; pista: 8 plasmídeo pVAX-Ag85A recombinante.
Em B: perfil plasmideal dos clones recombinantes provenientes da reação de ligação do gene
Ag85A com o plasmídeo pVAX-Hsp65, L: padrão de peso molecular 1Kb Plus DNA Ladder
(Invitrogen, USA); pistas: 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, e 11, plasmídeos não recombinantes; pistas: 1, 5,
6 e 12 plasmídeos pVAX-Ag85A/Hsp65 recombinantes; N: controle negativo.
A
L 1 2 3 4 5 6 7 8
1,0 Kb
0,9 Kb
L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
N
1,0 Kb
B
__________________________________________________________________Result
ados
62
Figura 7- Análise de restrição dos plasmídeos recombinantes. As amostas foram
submetidas a gel de agarose 1%, sendo as bandas reveladas pela coloração com brometo de
etídio. Em A, esquema do cassete Ag85A+Hsp65 flanqueado pela enzima PmeI. Em B, perfil
eletroforético dos plasmídeos recombinantes após digestão com a enzima PmeI. L: padrão de
peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); pista 1: pVAX-Ag85A/Hsp65
(clone 1) digerido; pista 2: pVAX-Ag85A/Hsp65 (clone 5) digerido; pista 3: pVAX-
Ag85A/Hsp65 (clone 6) digerido; pista 4: pVAX-Ag85A/Hsp65 (clone 12) digerido; pista 5:
pVAX-Ag85A digerido.
PmeI
PmeI
3´
5´
Ag85A
A
Hsp65
1,0 Kb
3,0 Kb
A
B
L 1 2
3 4 5
1,0 Kb
4,0 Kb
3,0 Kb
__________________________________________________________________Result
ados
63
4.5- Detecção do mRNA do gene Ag85A em macrófagos de linhagem J774
Após a análise das seqüências dos três clones recombinantes pVAX-Ag85A/Hsp65
obtidos não apontarem nenhuma diferença entre eles, optamos pela realização de um ensaio
de RT-PCR para verificar qual deles produziria a mensagem para a proteína Ag85A para que
dessa forma, pudesse ser escolhido o clone da vacina múltipla a ser utilizado nos ensaios
posteriores.
Macrófagos de linhagem J774 foram transfectados com os três diferente clones (clone
5, clone 6 e clone 12) por 72 h. Após esse período, o RNA total foi extraído e analisado
quanto a sua integridade através da detecção dos RNAs ribossômicos 28S e 18S (Figura 8A).
A análise detectou o mRNA para a proteína Ag85A somente no clone número 6 (Figura 8B).
Esse resultado comprova que a célula foi eficientemente transfectada e que o DNA
recombinante está sendo transcrito. Uma vez que o gene Ag85A está em fase com o gene
hsp65, a produção da proteína de fusão deve ocorrer normalmente. Isso fica evidente na figura
9.
__________________________________________________________________Result
ados
64
Figura 8- Avaliação do RNA total e detecção do mRNA de Ag85A. Macrófagos
J774 foram transfectados com os três clones recombinantes pVAX-Ag85A/Hsp65 por 72 h. O
RNA total foi extraído e avaliado por meio de eletroforese em gel de agarose 1%. Em A:
avaliação da integridade do mRNA, mostrando as duas bandas, 28S e 18S. Em B: mensagem
para o gene Ag85A, onde Ag85A (RT-) mostra o controle negativo da reação após tratamento
com a enzima DNAse; β actina (RT+) mostra o controle positivo da reação com oligos para a
β actina e Ag85A (RT+) mostra o PCR específico com oligos para Ag85A (descrito em
material e métodos, item 3.4).
28 S
18S
clone 5 clone 6
clone
12
Ag85A (RT-)
β
ββ
β
actina (RT+)
Ag85A (RT+)
A
B
0,4 Kb
0,9 Kb
__________________________________________________________________Result
ados
65
4.6- Detecção da proteína Ag85A por western blot
Para verificar se o mRNA para o gene Ag85A estava sendo corretamente traduzido em
proteína, foi feita uma análise de western blot, a qual revelou uma banda de aproximadamente
100 kDa, correspondente ao tamanho da proteína de fusão, sendo 32 kDa da proteína Ag85A
somados a 65 kDa da proteína Hsp65 (Figura 9). Através dessa análise comprovou-se que
além da transcrição do gene quimérico, estava ocorrendo também a tradução da proteína
recombinante.
A partir desses resultados, foi escolhido o clone número 6 para realização dos ensaios
posteriores deste trabalho.
__________________________________________________________________Result
ados
66
Figura 9- Detecção da proteína Ag85A por meio de western blot. Macrófagos J774
foram transfectados com os três clones recombinantes pVAX-Ag85A/Hsp65 por 72 h. Após
esse período, as células foram lisadas e tiveram seus sobrenadantes e lisados coletados. As
proteínas foram separadas por meio de eletroforese em gel SDS-PAGE 10% e,
posteriormente, transferidas para membrana de nitrocelulose. A revelação das bandas foi
realizada usando o kit “DAB Substrate Kit for peroxidase” com o anticorpo específico anti-
Ag85A (TD-17-4). L: padrão de peso molecular BenchMark Pré-Stained Protein Ladder
(Invitrogen, USA); pista 1: sobrenadante de células não transfectadas; pista 2: sobrenadante
de células transfectadas com o clone 5; pista 3: sobrenadante de células transfectadas com o
clone 6; pista 4: sobrenadante de células transfectadas com o clone 12; pista 5: lisado de
células não transfectadas; pista 6: lisado de células transfectadas com o clone 5; pista 7: lisado
de células transfectadas com o clone 6 e pista 8: lisado de células transfectadas com o clone
12.
121,3
kDa
L 1
2 3 4 5 6 7 8
68,8
kDa
__________________________________________________________________Result
ados
67
4.7- Análise das vacinas gênicas purificadas
Antes de se iniciar os protocolos de imunizações, todos os DNAs foram purificados
por cromatografia de troca iônica, e verificados quanto a sua integridade.
Amostras da vacina DNA-Hsp65 e do vetor pVAX1 foram digeridas com a enzima
BamHI (Invitrogen, USA), a qual lineariza os plasmídeos. A digestão do vetor pVAX1 vazio
revelou uma banda com tamanho aproximado de 3,0 Kb (pista 2) enquanto que a digestão da
vacina DNA-Hsp65 revelou uma banda de aproximadamente 6,0 Kb (pista 4), sendo 3,0 Kb
do vetor somados a 3,0 Kb do gene hsp65. A presença da formação de diversas bandas
observadas no DNA não digerido (pistas 1 e 3) é característica de DNA super-enovelado, fato
que não ocorre nos DNAs linearizados. É importante ressaltar também que não se observou
contaminação dos plasmídeos com DNA nem RNA genômicos (Figura 10A).
A mesma caracterização foi realizada com as vacinas DNA-Ag85A e DNA-
Ag85A/Hsp65, porém, utilizando-se a enzima PmeI (Fermentas, Canada). Essa enzima
flanqueia tanto o gene Ag85A quanto o cassete Ag85A/Hsp65.
A clivagem da vacina DNA-Ag85A revelou a presença de uma banda de 1,0 Kb
correspondente ao gene Ag85A e outra banda de 3,0 Kb correspondente ao vetor pVAX1
(pista 1). Já a digestão da vacina múltipla DNA-Ag85A/Hsp65 resultou no aparecimento de
uma banda com tamanho aproximado de 4,0 Kb e outra de 3,0 Kb (pista 2), a primeira
correspondendo a fusão dos genes Ag85A (1,0 Kb) + hsp65 (3,0 Kb), e a segunda banda (3,0
Kb), correspondente ao vetor pVAX1 na ausência dos genes (Figura 10B).
__________________________________________________________________Result
ados
68
Figura 10- Perfil eletroforético dos DNAs plasmídeais purificados. As amostas
foram submetidas a eletroforese em gel de agarose 1%, sendo as bandas reveladas pela
coloração com brometo de etídio. Os plasmídeos foram purificados com kit comercial
Qiagen
TM
(Gibco BRL, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Em A, pVAX1 e
DNA-Hsp65 digeridos ou não com a enzima BamHI (Invitrogen, USA). L: padrão de peso
molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); pista 1: pVAX1 não digerido; pista 2:
pVAX1 digerido; pista 3: DNA-Hsp65 não digerido e pista 4: DNA-Hsp65 digerido. Em B,
DNA-Ag85A e DNA-Ag85A/Hsp65 digeridos ou não com a enzima PmeI (Fermentas,
Canada). L: padrão de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); pista 1:
DNA-Ag85A digerido; pista 2: DNA-Ag85A/Hsp65 digerido.
3,0
Kb
3,0 Kb
6,0 Kb
L 1 2 3 4
A
4,0
Kb
L 1 2
1,0
Kb
B
__________________________________________________________________Result
ados
69
4.8- Obtenção da proteína Hsp65 recombinante (rHsp65)
A proteína rHsp65, utilizada em nossos ensaios, foi obtida através de expressão em
sistema procariótico, como descrito em material e métodos (item 3.9). A figura 11 mostra a
expressão da proteína rHsp65 em gel de poliacrilamida SDS/PAGE 10% onde pudemos
verificar o aparecimento de uma banda de expressão na altura de 65 kDa, no extrato de
bactérias induzidas com IPTG, quando comparada com o extrato de bactérias não induzidas
(Figura 11).
A purificação da proteína rHsp65 do extrato bruto foi realizada em cromatografia de
afinidade em resina Hi-Trap Chelating HP e a pureza da proteína pôde ser visualizada em gel
de poliacrilamida SDS/PAGE 10% (Figura 11) onde se observa banda única cujo perfil
eletroforético corresponde à proteína rHsp65. Essa proteína foi utilizada nos ensaios
moleculares, descritos abaixo. Além disso, os resultados sugerem que a proteína expressa foi
purificada por coluna de afinidade, com eliminação de outras proteínas contaminantes que
poderiam interferir com os próximos experimentos.
__________________________________________________________________Result
ados
70
Figura 11- Expressão e purificação da proteína recombinante Hsp65. Eletroforese
em gel de poliacrilamida 10% em condições desnaturantes mostrando a expressão da proteína
rHsp65 induzida pela adição de 300 mM de IPTG em bactérias ER2566 crescidas a 37°C, por
16 h e a purificação da rHsp65 realizada em coluna de afinidade (Amershan-Pharmacia). L:
padrão de peso molecular BenchMark Pré-Stained Protein Ladder (Invitrogen, USA); pista 1:
extrato de bactérias não induzidas; pista 2: extrato de bactérias induzidas com IPTG por 16 h;
pista 3: rHsp65 purificada. As bandas protéicas foram visualizadas pela coloração com
Coomassie Blue.
L 1 2 3
65 kDa
__________________________________________________________________Result
ados
71
4.9- Quantificação de endotoxina bacteriana
Com a finalidade de avaliar a quantidade de endotoxina contaminante presente nas
construções vacinais e nas proteínas recombinantes, foi utilizado o teste Limulus Ameboyte
Lysate (LAL), onde foram obtidos índices de endotoxina menores que 0,1 UE/µg de DNA,
portanto aceitáveis para testes in vivo, como recomendado pela farmacopéia americana e
européia (Tabela 1).
Tabela 1. Quantificação de endotoxina pelo teste LAL.
UE/µ
µµ
µg: Unidades de endotoxina por micrograma de amostra
Amostra
UE/µ
µµ
µg de DNA
Solução salina < 0,0001
Solução sacarose < 0,0001
pVAX1 < 0,0001
DNA-Hsp65 < 0,0001
DNA-Ag85A < 0,0001
DNA-Ag85A/Hsp65 < 0,0001
__________________________________________________________________Result
ados
72
4.10- Ensaios de imunogenicidade
O protocolo de imunização utilizado nos experimentos de imunogenicidade foi o
seguinte: quatro imunizações com 100 µg de cada DNA com um intervalo de 15 dias entre
cada dose. Após 15 dias da última imunização, os animais foram sacrificados e avaliados em
relação a diversos parâmetros como: produção de anticorpos anti-Hsp65 e anti-Ag85A,
produção de citocinas e resposta linfoproliferativa.
4.10.1- Resposta imune humoral anti-Hsp65 e anti-Ag85A
A resposta imune humoral foi avaliada por meio da técnica de ELISA, onde se
analisou a produção de anticorpos IgG específicos, anti-Hsp65 e anti-Ag85A, dos subtipos
IgG1 e IgG2a. Como controles negativo foram utilizados amostras de soro de animais pré-
imunizados e injetados com salina. A dosagem de anticorpos específicos foi realizada em
amostras obtidas duas semanas após a última imunização com: DNA-Hsp65, DNA-Ag85A,
DNA-Ag85A/Hsp65 e DNA-Ag85A+Hsp65.
A análise da produção de anticorpos 15 dias após a última imunização com a vacina
DNA-Hsp65, apresentou produção de anticorpos específicos tanto IgG1 como IgG2a (Figura
12), porém com uma tendência à polarização da resposta para o padrão Th1, visto que a razão
IgG1/IgG2a entre esses dois subtipos foi em média de 0,6.
Com relação a produção de anticorpos específicos anti-Ag85A (Figura 13), foi
observado um aumento significativo de anticorpos do subtipo IgG2a no soro dos animais
imunizados com DNA-Ag85A. Esses animais também apresentaram a produção de anticorpos
do subtipo IgG1, quando comparados com os animais imunizados apenas com salina. Porém,
assim como na imunização com DNA-Hsp65, a razão IgG1/IgG2a foi em média de 0,6
sugerindo assim a prevalência de um padrão de resposta do tipo Th1 nesses animais.
__________________________________________________________________Result
ados
73
A vacinação dos animais com DNA-Ag85A+Hsp65 revelou resultados interessantes
quanto à produção de anticorpos. Na figura 12, pôde-se observar um aumento na detecção de
anticorpos anti-Hsp65 apenas do subtipo IgG2a apesar de não ter sido significativo, enquanto
que ao observarmos a produção de anticorpos anti-Ag85A nesses mesmos animais (Figura
13), vemos um aumento expressivo tanto de IgG1 quanto de IgG2a, inclusive com um leve
aumento desse último subtipo quando comparado com a produção pelos animais imunizados
somente com DNA-Ag85A.
De forma inesperada, os animais imunizados com a vacina contendo os antígenos
fusionados (DNA-Ag85A/Hsp65), não apresentaram anticorpos anti-Hsp65 ou anti-Ag85A
(Figuras 12 e 13).
__________________________________________________________________Result
ados
74
Figura 12- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65.
Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com intervalos de 2 semanas
com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções. O grupo controle recebeu salina.
Os níveis de anticorpos foram detectados por ELISA no soro dos animais (diluído 10 vezes)
antes do início das imunizações (pré imune) e duas semanas após a última imunização (pós
imune). Os resultados representam a média de 2 experimentos independentes. ** p<0,0001, *
p<0,001 em relação ao grupo controle e aos animais pré imunizados.
__________________________________________________________________Result
ados
75
Figura 13- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-
Ag85A. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com intervalos de 2
semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções. O grupo controle
recebeu salina. Os níveis de anticorpos foram detectados por ELISA no soro dos animais
(diluído 10 vezes) antes do início das imunizações (pré imune) e duas semanas após a última
imunização (pós imune). Os resultados representam a média de 2 experimentos
independentes. ** p<0,001, * p<0,05 em relação ao grupo controle e aos animais pré
imunizados.
__________________________________________________________________Result
ados
76
4.10.2- Detecção de citocinas em sobrenadante de cultura de células do baço
Após a avaliação da produção de anticorpos foi determinado o perfil de citocinas
produzidas pelas células do baço de animais imunizados mediante estímulo com o lisado de
Mtb obtido por sonicação (antígenos totais). Para tanto foram analisadas as citocinas IL-12,
IFN-γ e IL-10 com o intuito de conhecer o perfil da resposta imune celular induzida após a
vacinação com as diferentes construções e mediante o estímulo com diferentes antígenos
micobacterianos. Adicionalmente avaliou-se também a produção da citocina IFN-γ, na
presença de estímulo específico com rHsp65 e rAg85A.
Em relação a IL-12, pôde-se concluir que todas as construções induziram as células do
baço a produzirem essa citocina mediante estímulo com o lisado de Mtb, inclusive os animais
controle, injetados apenas com salina (Figura 14).
Após a avaliação da produção de IL-12, passamos a avaliar os níveis de IFN-γ nas
células do baço após estímulo com o lisado de Mtb. A produção dessa citocina nessas células
mostrou diferença significativa somente nos animais imunizados com DNA-Ag85A, apesar de
ter ocorrido também, um aumento na sua produção pelas células dos animais imunizados com
ambas as vacinas (DNA-Ag85A+Hsp65) (Figura 15).
Quando as células foram estimuladas especificamente com a proteína rHsp65,
observamos um aumento na produção de IFN-γ naquelas provenientes de animais imunizados
com DNA-Hsp65 e com DNA-Ag85A+Hsp65, o mesmo foi observado na cultura estimulada
com a proteína rAg85A a qual mostrou produção significativa de IFN-γ nos animais
imunizados com a construção DNA-Ag85A e com DNA-Ag85A+Hsp65 (Figura 16), porém
em ambas as culturas celulares os níveis detectados da citocina foram mais baixos quando
comparados com os mesmos animais estimulados com Mtb (Figura 15). A imunização com a
vacina múltipla de DNA (DNA-Ag85A/Hsp65) não induziu níveis estatísticamente
significativos de IFN-γ nas células dos animais em nenhum dos casos.
__________________________________________________________________Result
ados
77
Para ter uma idéia mais precisa do perfil de resposta imune apresentada pelos animais
após as imunizações com as diferentes construções, foi dosada também a citocina IL-10 em
cultura de células de baço, a qual é importante na regulação da inflamação.
A análise em conjunto da detecção de IL-10, mostrou que houve uma pequena
diminuição nos níveis dessa citocina nas células dos animais imunizados se comparados com
os animais do grupo controle, mas essa diminuição só foi significativa para o grupo vacinado
com a vacina múltipla DNA-Ag85A/Hsp65 (Figura 17).
__________________________________________________________________Result
ados
78
ConA
Salina
DNA-Hsp65
DNA-Ag85A
DNA-Ag85A/Hsp65
DNA-A
g
85A+Hsp65
0
250
500
750
1000
1250
IL-12 pg/mL
S
al
i
na
DNA-Hsp65
DNA-Ag85A
DNA-Ag85A/Hsp65
DNA-Ag85A+Hsp65
0
1000
2000
IL-12 pg/mL
Figura 14- Detecção de IL-12 em sobrenadante de cultura de células do baço
dos animais imunizados. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular
com 100 g das diferentes construções gênicas em 4 doses com intervalos de 2 semanas. O
grupo controle recebeu solução salina. Duas semanas após a última imunização, os animais
foram sacrificados e as células do baço foram estimuladas com meio (RPMI), 20 g/mL do
lisado de Mtb ou 40 µg/mL de ConA. Após 48 h, os sobrenadantes das culturas foram
coletados para detecção de citocinas por ELISA. Os resultados são expressos em média ±
desvio padrão da concentração da citocina em pg/mL e representam a média de 2
experimentos independentes.
Meio
Mtb
__________________________________________________________________Result
ados
79
ConA
Sal
i
na
DNA
-
Hsp65
DNA-Ag85
A
DNA-Ag85
A
/Hsp65
D
N
A-Ag85A+Hsp65
0
10000
20000
30000
IFN-
γ
γ
γ
γ
pg/mL
Sa
l
ina
DNA
-
H
s
p65
D
NA-Ag8
5
A
DNA-Ag8
5
A/Hsp65
DNA
-Ag8
5A+Hs
p65
0
500
1000
1500
2000
*
IFN-
γ
γ
γ
γ
pg/mL
Figura 15- Detecção de IFN-γ
γγ
γ em sobrenadante em cultura de células do baço dos
animais imunizados. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com
100 g das diferentes construções gênicas em 4 doses com intervalos de 2 semanas. O grupo
controle recebeu solução salina. Duas semanas após a última imunização, os animais foram
sacrificados e as células do baço foram estimuladas com: meio (RPMI), 20 g/mL do lisado
de Mtb ou 40 µg/mL de ConA. Após 48 h, os sobrenadantes das culturas foram coletados para
detecção de citocinas por ELISA. Os resultados são expressos em média ± desvio padrão da
concentração da citocina em pg/mL e representam a média de 2 experimentos independentes.
* p<0,05 em relação ao grupo controle.
Meio
Mtb
__________________________________________________________________Result
ados
80
rHsp65
S
ali
n
a
D
NA
-
Hs
p
6
5
D
NA-Ag
8
5A
D
NA-Ag85
A
/H
s
p6
5
DNA-Ag85A+Hsp6
5
0
100
200
300
400
500
600
700
800
*
*
IFN-
γ
γ
γ
γ
(pg/mL)
ConA
S
al
i
n
a
DNA-H
sp
65
DNA-Ag85A
D
NA
-Ag
85A/
Hsp65
DNA-Ag85A+Hsp65
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
IFN-
γ
γ
γ
γ
(pg/mL)
rAg85A
Salina
DNA-Hsp65
DNA-Ag85
A
DNA-Ag85A/Hsp65
DNA-Ag85A+
Hsp65
0
100
200
*
*
IFN-
γ
γ
γ
γ
(pg/mL)
Figura 16- Detecção de IFN-γ
γγ
γ em sobrenadante de cultura de células do baço de
animais imunizados. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com
100 g das diferentes construções em 4 doses com intervalos de 2 semanas. O grupo controle
recebeu solução salina. Duas semanas após a última imunização, os animais foram
sacrificados e as células do baço foram estimuladas com 40 g/mL conA, 20 g/mL rHsp65
(gráfico acima) e 20 µg/mL rAg85A (gráfico abaixo). Após 48 h, os sobrenadantes das
culturas foram coletados para detecção de citocinas por ELISA. Os resultados são expressos
em média ± desvio padrão da concentração da citocina em pg/mL e representam a média de 2
experimentos independentes. * p<0,05 em relação ao grupo controle.
__________________________________________________________________Result
ados
81
ConA
Salina
DNA-
Hsp
6
5
DNA-Ag
8
5A
DNA-
Ag8
5A/
Hs
p6
5
DNA-
Ag8
5A
+Hsp6
5
0
1000
2000
3000
IL-10 (pg/mL)
Salina
DN
A-Hs
p
6
5
DNA-A
g
85A
D
NA
-
Ag8
5
A/
Hs
p
65
DN
A
-Ag85A
+
Hsp65
0
100
200
300
400
*
IL-10 (pg/mL)
Figura 17- Detecção de IL-10 em sobrenadante de cultura de células do baço dos
animais imunizados. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com
100 g das diferentes construções gênicas em 4 doses com intervalos de 2 semanas. O grupo
controle recebeu solução salina. Duas semanas após a última imunização, os animais foram
sacrificados e as células do baço foram estimuladas com: meio (RPMI), 20 g/mL do lisado
de Mtb ou 40 µg/mL de ConA. Após 48 h, os sobrenadantes das culturas foram coletados para
detecção de citocinas por ELISA. Os resultados são expressos em média ± desvio padrão da
concentração da citocina em pg/mL e representam a média de 2 experimentos independentes.
* p<0,05 em relação ao grupo controle.
Meio
Mtb
__________________________________________________________________Result
ados
82
4.10.3- Resposta linfoproliferativa após imunização
A análise da resposta linfoproliferativa das células do baço dos animais imunizados, e
posteriormente estimuladas com rHsp65 e rAg85A demonstra que somente as células dos
animais do grupo imunizado com a vacina múltipla (DNA-Ag85A/Hsp65) não proliferaram
frente ao estímulo com a proteína rHsp65. Por outro lado, no caso do estímulo com a proteína
rAg85A, os animais vacinados com DNA-Ag85A mostraram uma linfoproliferação
específica. Já o grupo DNA-Ag85A+Hsp65 mostrou perfil de proliferação semelhante,
independente do estímulo, ou seja: rHsp65 ou rAg85 (Figura 18).
__________________________________________________________________Result
ados
83
Salin
a
DNA-Hsp65
DNA-
A
g8
5A
D
N
A-
A
g
85A
/Hs
p
65
DNA-A
g
85A
+
Hsp65
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
**
**
*
# #
#
meio
rHsp65
rAg85A
c.p.m
Figura 18- Resposta linfoproliferativa de animais imunizados. Camundongos
BALB/c foram imunizados por via intramuscular com 100 g das diferentes construções
gênicas em 4 doses com intervalos de 2 semanas. O grupo controle recebeu solução salina.
Duas semanas após a última imunização, os animais foram sacrificados e as células do baço
(5 x 10
5
células) foram estimuladas com meio (RPMI), 2 g/mL de rHsp65 ou 2 µg/mL de
rAg85A e a cultura de células foi pulsada com 50 µL por poço de timidina tritiada em RPMI -
Completo 16 h antes de completar o tempo de incubação de 72 h a 37
o
C em estufa 5% CO
2
.
c.p.m: contagem por minuto. Os resultados representam a média de 2 experimentos
independentes. * p<0,05; ** p<0,005 em relação às células estimuladas com rHsp65 do grupo
controle, # p<0,05; ## p<0,005 em relação às células estimuladas com rAg85A do grupo
controle.
__________________________________________________________________Result
ados
84
4.11- Ensaios de proteção
Após trinta dias da última imunização, os diferentes grupos (descritos em material e
métodos e delineamento experimental) foram desafiados com a cepa virulenta de M.
tuberculosis H37Rv e trinta dias após o desafio foram sacrificados. O pulmão foi removido
para avaliação de diversos parâmetros como o número de unidades formadoras de colônia
(UFC), detecção de citocinas, avaliação fenotípica das células presentes nos pulmões e análise
histopatológica.
Devido ao grupo DNA-Ag85A+Hsp65 ter sido inserido posteriormente e ao curto
período de tempo para a realização de todos os experimentos, não há dados, referentes a esse
grupo, da produção de citocinas e FACs, mas somente da produção de anticorpos e ensaio de
UFC, o qual julgamos ser o mais relevante para o objetivo deste trabalho.
4.11.1- Resposta imune humoral anti-Hsp65 e anti-Ag85A nos animais
imunizados e infectados
Também foi analisado o perfil de anticorpos apresentado pelos animais imunizados e
infectados com Mtb.
Com relação aos animais vacinados com DNA-Hsp65, observamos que os níveis de
imunoglobulinas anti-Hsp65 do subtipo IgG2a, se mantiveram iguais mesmo após a infecção.
Entretanto, houve um pequeno aumento nos níveis de IgG1 nesses animais se comparados
com os níveis produzidos quando eles foram somente imunizados (Figuras 12 e 19),
sugerindo, nesse caso, uma mudança para um padrão misto de resposta após a infecção, com
uma razão IgG1/IgG2a de aproximadamente 1.
Um resultado interessante foi o demonstrado tanto pelos animais vacinados com
DNA-Ag85A/Hsp65 (vacina múltipla), quanto pelos vacinados com DNA-Ag85A+Hsp65
que apresentaram uma produção significativa de anticorpos anti-Hsp65 tanto do subtipo
__________________________________________________________________Result
ados
85
IgG2a quanto de IgG1 após a infecção, fato que não foi observado nesses animais quando
foram somente imunizados (Figuras 12 e 19). A vacina múltipla, assim como a vacina DNA-
Hsp65, apresentou um padrão misto de resposta, já a vacina contendo os dois antígenos
mostrou uma tendência ao padrão Th1, com uma razão IgG1/IgG2a de cerca de 0,4.
Com relação ao grupo DNA-Ag85A os níveis de anticorpos específicos se mantiveram
os mesmos. Já os animais vacinados com DNA-Ag85A+Hsp65, mostraram uma ligeira
redução nos níveis de IgG2a após a infecção (Figuras 13 e 20).
A vacinação com BCG induziu somente anticorpos anti-Hsp65 e anti-Ag85A do
subtipo IgG1, sugerindo uma tendência ao padrão Th2 (Figuras 19 e 20).
__________________________________________________________________Result
ados
86
Figura 19- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65
nos animais vacinados e desafiados com M. tuberculosis. Camundongos BALB/c foram
vacinados por via intramuscular com intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA
das diferentes construções vacinais. O grupo BCG recebeu 10
5
bacilos por via subcutânea e o
grupo controle recebeu solução salina. 30 dias após a ultima imunização os animais foram
desafiados com cerca de 10
5
bacilos H37Rv. Os níveis de anticorpos foram detectados por
ELISA no soro dos animais (diluído 10 vezes) 30 dias após o desafio. Os resultados
representam a média de 2 experimentos independentes. ***p< 0,0001, ** p<0,01, * p<0,05
em relação ao grupo controle.
__________________________________________________________________Result
ados
87
Figura 20- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Ag85A,
nos animais vacinados e desafiados com M. tuberculosis. Camundongos BALB/c foram
imunizados por via intramuscular com intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de
DNA das diferentes construções vacinais. O grupo BCG recebeu 10
5
bacilos por via
subcutânea e o grupo controle recebeu solução salina. 30 dias após a ultima imunização os
animais foram desafiados com cerca de 10
5
bacilos H37Rv. Os níveis de anticorpos foram
detectados por ELISA no soro dos animais (diluído 10 vezes) 30 dias após o desafio. Os
resultados representam a média de 2 experimentos independentes.** p<0,005, * p<0,05 em
relação ao grupo controle.
__________________________________________________________________Result
ados
88
4.11.2- Análise da produção de citocinas no homogenato do pulmão de animais
imunizados e desafiados com M. tuberculosis
As citocinas analisadas foram: IL-12, IFN-γ, IL-10 e IL-4.
Não houve produção, estatísticamente significativa, da citocina IL-12 entre os
diferentes grupos imunizados e posteriormente infectados com M. tuberculosis. Já os animais
imunizados com a vacina BCG tiveram uma produção menor se comparado com o grupo
controle, o qual foi injetado somente solução salina (Figura 21A).
Com relação à produção de IFN-γ, observamos o mesmo perfil detectado para a
citocina IL-12, onde todos os grupos apresentaram uma produção da citocina, porém sem
diferenças significativas entre eles. Podemos observar também que a baixa produção de IL-12
nos animais vacinados com BCG corrobora com os baixos níveis de IFN-γ detectados para
esses mesmos animais (Figura 21B).
A despeito da IL-10, os resultados obtidos mostraram que as diferentes construções
vacinais também induziram a produção dessa citocina no pulmão, porém sem diferença
estatística entre os diversos grupos experimentais (Figura 22A). Enquanto que a análise da
produção de IL-4 mostrou uma menor produção pelos animais vacinados com DNA-Hsp65,
DNA-Ag85A e DNA-Ag85A/Hsp65 se comparados com os animais injetados com solução
salina (Figura 22B).
__________________________________________________________________Result
ados
89
Figura 21- Detecção de citocinas em homogenato de pulmão de animais
imunizados e desafiados com Mtb. Camundongos BALB/c foram imunizados por via
intramuscular com intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes
construções. O grupo BCG recebeu 10
5
bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu
solução salina. 30 dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de
10
5
bacilos H37Rv e 30 dias após o desafio os animais foram sacrificados e dosou-se as
citocinas no homogenato dos pulmões por ELISA. Em A: análise da produção de IL-12. Em
B: análise da produção de IFN-γ. Os resultados expressam a média ± desvio padrão da
concentração de citocina em pg/mL e representam a média de 2 experimentos independentes.
* p<0,05 em relação ao grupo controle.
A
B
__________________________________________________________________Result
ados
90
Figura 22- Detecção de citocinas em homogenato de pulmão de animais
imunizados e desafiados com Mtb. Camundongos BALB/c foram imunizados por via
intramuscular com intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes
construções. O grupo BCG recebeu 10
5
bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu
solução salina. 30 dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de
10
5
bacilos H37Rv e 30 dias após o desafio os animais foram sacrificados e dosou-se as
citocinas no homogenato dos pulmões por ELISA. Em A: análise da produção de IL-10. Em
B: análise da produção de IL-4. Os resultados expressam a média ± desvio padrão da
concentração de citocina em pg/mL e representam a média de 2 experimentos independentes.
* p<0,05; ** p< 0,0005 em relação ao grupo controle.
A
B
__________________________________________________________________Result
ados
91
4.11.3- Avaliação fenotípica das células presentes nos pulmões de animais
imunizados e desafiados com M. tuberculosis
Visando conhecer o efeito das diferentes construções vacinais nas células dos animais,
foi realizada a técnica de citometria de fluxo para avaliar o perfil fenotípico das células
presentes nos pulmões dos animais infectados.
Primeiramente foi avaliada a expressão da molécula CD3
+
, a qual se mostrou elevada
em todos os grupos vacinados (Figura 23).
O próximo passo foi analisar os marcadores CD4
+
e CD8
+
nesses linfócitos, os quais
também apresentaram um aumento nos animais vacinados com as diferentes construções de
DNA se comparados com o grupo controle, o qual foi injetado somente solução salina e
posteriormente infectados (Figuras 24). Já com relação ao grupo BCG, observamos um
aumento significativo somente de células T CD4
+
(Figura 24).
Do mesmo modo, foi avaliada a geração de células T CD4
+
e T CD8
+
de memória
efetora, ou seja, expressando os marcadores CD44
hi
e CD62L
lo
. A análise da figura 25
evidencia um aumento no número de células T CD4
+
CD44
hi
CD62L
lo
somente nos animais
imunizados com BCG e um aumento de células T CD8
+
CD44
hi
CD62L
lo
em todos os grupos
vacinados.
__________________________________________________________________Result
ados
92
Figura 23- Análise da porcentagem de células pulmonares expressando o
marcador CD3
+
. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com
intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções vacinais.
O grupo BCG recebeu 10
5
bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu solução
salina. 30 dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de 10
5
bacilos H37Rv e 30 dias após o desafio os animais foram sacrificados e analisou-se expressão
de marcadores de superfície nas células do pulmão por citometria de fluxo. Os resultados
representam a média de 2 experimentos independentes. * p< 0,05; ** p< 0,001 em relação ao
grupo controle.
__________________________________________________________________Result
ados
93
Figura 24- Análise da porcentagem de linfócitos T, expressando os marcadores
CD4
+
e CD8
+
no pulmão de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis.
Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com intervalos de 2 semanas
com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções vacinais. O grupo BCG recebeu
10
5
bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu solução salina. 30 dias após a
ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de 10
5
bacilos H37Rv e 30 dias
após o desafio os animais foram sacrificados e analisou-se expressão de marcadores de
superfície nas células do pulmão por citometria de fluxo. Em A: Linfócitos T CD4
+
. Em B:
Linfócitos T CD8
+
. Os resultados representam a média de 2 experimentos independentes. * p<
0,05; ** p< 0,001 em relação ao grupo controle.
A
B
__________________________________________________________________Result
ados
94
Figura 25- Análise da porcentagem de linfócitos T CD4
+
e T CD8
+
expressando os
marcadores CD44
hi
e CD62L
lo
no pulmão de animais imunizados e desafiados com M.
tuberculosis. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com intervalos
de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções vacinais. O grupo
BCG recebeu 10
5
bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu solução salina. 30
dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de 10
5
bacilos H37Rv e
30 dias após o desafio os animais foram sacrificados e analisou-se expressão de marcadores
de superfície nas células do pulmão por citometria de fluxo. Em A: Linfócitos T
CD4
+
CD44
hi
CD62L
lo
. Em B: Linfócitos T CD8
+
CD44
hi
CD62L
lo
. Os resultados representam a
média de 2 experimentos independentes. * p< 0,05; ** p< 0,005 em relação ao grupo
controle.
A
B
__________________________________________________________________Result
ados
95
4.11.4- Avaliação das Unidades Formadoras de Colônias (UFC)
Trinta dias após o desafio, os animais foram sacrificados e os bacilos presentes nos
pulmões foram contados por meio do ensaio de UFC.
Como pôde ser observado na figura 26, todas as construções vacinais foram capazes
de reduzir de forma significativa o número de bactérias no pulmão de animais previamente
vacinados e posteriormente infectados, quando comparados com os animais injetados somente
com solução salina.
Um resultado interessante foi o observado para os animais imunizados com a vacina
múltipla (DNA-Ag85A/Hsp65), que reduziram a carga bacilar em cerca de 0,9 log
10
nos
ensaios de proteção, enquanto eles não apresentaram dados promissores na imunogenicidade.
__________________________________________________________________Result
ados
96
Figura 26- Número de UFC no pulmão de animais vacinados e desafiados com M.
tuberculosis. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com intervalos
de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções vacinais. O grupo
BCG recebeu 10
5
bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu solução salina. 30
dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de 10
5
bacilos H37Rv e
30 dias após o desafio os animais foram sacrificados, o pulmão coletado e homogeneizados.
As amostras foram diluídas 100 vezes e cultivadas em meio 7H11. Após 28 dias de cultura, o
número de UFC foi analisado. N.I: animal não imunizado e não infectado. Os resultados são
expressos em Log
10
do número de UFC por grama de pulmão total e representam a média de 2
experimentos independentes. * p<0.05; ** p<0,005; *** p<0,0001 em relação ao grupo
controle.
__________________________________________________________________Result
ados
97
4.11.5- Avaliação histopatológica do pulmão
Os cortes histológicos dos diferentes grupos foram avaliados quanto ao
comprometimento pulmonar e a presença de bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR).
O grupo N.I (não imunizado e não infectado) corresponde ao parênquima pulmonar
natural. Nesses cortes observamos que os alvéolos estão preservados, garantindo a função
respiratória desse tecido e que áreas ao redor dos brônquios (peribronquial) ou vasos
(perivascular) não apresentam infiltrados inflamatórios. Os grupos infectados que receberam
solução salina ou somente o vetor nas imunizações, apresentaram um comprometimento de
cerca de 60 a 70% do parênquima pulmonar, com um intenso infiltrado inflamatório difuso,
caracterizado pela presença de macrófagos xantomatosos, linfócitos e alguns neutrófilos. Foi
observado também hiperplasia do tecido linfóide associado ao brônquio (BALT, Bronchus-
Associated Lymphoid Tissue) e um pouco de edema nesses pulmões. Já nos grupos
imunizados com as diferentes construções gênicas, constatamos um menor
comprometimento pulmonar, com áreas bem preservadas do pulmão. Além disso, o
infiltrado celular nesses grupos apresenta-se mais focalizado, com formações
granulomatosas, sugerindo uma tentativa de contenção da infecção. Também foi
observado uma hiperplasia do BALT nesses animais, sugerindo que houve uma
estimulação linfocítaria para o local da infecção. Essa hiperplasia foi mais acentuada nos
animais imunizados com a vacina DNA-Ag85A/Hsp65. O grupo imunizado com BCG
também apresentou um parênquima pulmonar mais preservado com pequeno infitrado
peribronquiolar e congestão mínima do tecido quando comparado com os grupos controles
(Figuras 27 e 28).
__________________________________________________________________Result
ados
98
A análise das lâminas coradas pelo método de Ziehl-Neelsen, as quais mostram a
presença de bacilos Mtb nos pulmões, confirmaram os resultados obtidos no ensaio de
UFC (dados não mostrados).
__________________________________________________________________Result
ados
99
Figura 27- Cortes histológicos dos pulmões de animais imunizados e
desafiados com Mtb. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com
intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções vacinais.
O grupo BCG recebeu 10
5
bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu solução
salina. 30 dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de 10
5
bacilos H37Rv e 30 dias após o desafio os animais foram sacrificados e os pulmões coletados
para a análise histopatológica. Os cortes foram corados por hematoxilina e eosina e
observados em microscópio óptico em um aumento de 40X.
__________________________________________________________________Result
ados
100
__________________________________________________________________Result
ados
101
Figura 28- Cortes histológicos dos pulmões de animais imunizados e
desafiados com Mtb. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com
intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções vacinais.
O grupo BCG recebeu 10
5
bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu solução
salina. 30 dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de 10
5
bacilos H37Rv e 30 dias após o desafio os animais foram sacrificados e os pulmões coletados
para a análise histopatológica. Os cortes foram corados por hematoxilina e eosina e
observados em microscópio óptico em um aumento de 200X.
__________________________________________________________________Result
ados
102
103
___________________________________________________________________Discussão
104
5 DISCUSSÃO
Nas últimas décadas, os avanços na tecnologia para a pesquisa e desenvolvimento de
vacinas permitiram a introdução de novas estratégias para a obtenção e produção de
antígenos. Essas estratégias abriram caminhos para inovações, particularmente no contexto do
desenvolvimento de vacinas mais seguras, eficazes e polivalentes.
No caso da TB, a variabilidade na proteção conferida pela vacina BCG, têm levado
muitos pesquisadores a busca de novos fármacos e vacinas que realmente combatam a
epidemia existente atualmente.
Entre as vacinas candidatas à profilaxia e terapia da TB, destaca-se a vacina de DNA
que codifica para a proteína Hsp65, desenvolvida por Silva e colaboradores (1992). Como
citado anteriormente na introdução, essa vacina destacou-se como importante ferramenta na
indução de proteção contra a infecção por M. tuberculosis em modelo experimental murino
(Bonato et al., 1998) (Silva, 1999) (Lowrie, 1999) (Lima et al., 2003) e vêm sendo alvo de
diversos estudos com o intuito de otimizá-la de modo a garantir o seu uso clínico (Gonçalves,
2006) (Souza, 2006) (Rosada, 2006) (Coelho-Castelo et al., 2006).
Nesse sentido, a proposta deste trabalho foi construir uma vacina múltipla de DNA,
contendo mais de um antígeno imunogênico, utilizando um vetor plasmideal liberado para uso
clínico, o pVAX1, e avaliar o papel dessas construções na eficácia da resposta protetora
contra TB se comparada com a vacina DNA-Hsp65 já existente.
A clonagem de genes em vetores de expressão é um processo delicado, pois é
necessário considerar vários parâmetros importantes para a transcrição e tradução do mesmo.
Em geral os vetores comerciais dispõem dessas seqüências na sua forma correta para
favorecer a expressão do antígeno. No nosso caso, para montagem de um sistema de
expressão contendo dois antígenos tivemos que usar mais de uma estratégia para se obter
sucesso. Na primeira estratégia elaborada para a construção dessa vacina, o oligonucleotídeo
___________________________________________________________________Discussão
105
forward, utilizado para a amplificação do gene Ag85A, foi desenhado de maneira a conter na
sua extremidade 5´, duas bases de adenina para servir como sítio de ancoragem para a enzima
AflII e dessa forma facilitar a clivagem do produto de PCR. Com relação ao oligonucleotídeo
reverse, tomou-se o cuidado para que fosse retirada a seqüência de terminação do gene (códon
stop), para que ocorresse a fusão em fase com o gene hsp65. Além disso, esse oligo também
continha o sítio para a enzima AflII e seu respectivo sítio de ancoragem, e uma seqüência
codificadora para três aminoácidos espaçadores: alanina, alanina e tirosina (AAY). Estudos
demonstram que a adição de seqüências espaçadoras adequadas, flanqueando epítopos, pode
facilitar o processamento do peptídeo pelo proteassoma, resultando também em um aumento
de células T citotóxicas (CTLs) específicas (Del Val et al., 1991) (Velders et al., 2001). A
seleção desses aminoácidos como espaçadores, foi baseada no fato de o proteassoma clivar
preferencialmente resíduos de aminoácidos básicos e hidrofóbicos (Beekman et al., 2000).
Velders e colaboradores (2001), evidenciaram que a vacinação de camundongos com DNA
contendo essa seqüência espaçadora flanqueando determinados epítopos, foi mais efetiva na
indução de imunidade anti-tumor HPV16, do que a vacinação com o DNA na ausência de tais
seqüências. Em adição, nesse mesmo trabalho, o grupo demonstrou um aumento do
processamento e apresentação de epítopos restritos ao HLA-A2, portanto, sendo também
relevante para a indução de uma resposta imune em humanos.
A escolha da enzima AflII para a linearização do plasmídeo pVAX-Hsp65 também foi
importante pois ele possuía um sítio único de clivagem para essa enzima, o que possibilitou a
sua linearização sem que o gene hsp65 fosse digerido. Além disso, esse sítio de clonagem
estava upstream da seqüência de hsp65, próximo ao promotor do CMV (citomegalovirus), o
que permitiu que o gene Ag85A fosse clonado na posição 5’em relação ao gene hsp65.
A vacina múltipla de DNA foi estrategicamente construída de maneira a conter logo
após o promotor CMV, a seqüência KOZAK, uma seqüência consenso que permite a ligação
___________________________________________________________________Discussão
106
do mRNA ao ribossomo, possibilitando que o mesmo possa buscar o ATG inicial de forma
correta e portanto inicie a tradução protéica (Lewin, 2001). Precedendo o gene Ag85A, está
presente também, uma seqüência sinal eucariótica: o human tissue plasminogen activator ou
tPA, importante para a secreção da proteína de fusão. Baldwin e colaboradores (1999)
demonstraram que a imunização de camundongos com a vacina de DNA que codificava para
a proteína Ag85A na forma secretada, ou seja, contendo o sinal tPA, foi mais eficaz do que a
vacina de DNA que codificava para a forma não secretada, observado pela produção de altos
títulos de anticorpos anti-Ag85A específicos, linfoproliferação e resposta CTLs Ag85A
específicos (Baldwin et al., 1999). Além disso, foi demonstrado também, que a forma
secretada foi capaz de conferir uma proteção mais duradoura contra a cepa altamente
virulenta, CSU37 de M. tuberculosis se comparado com os animais imunizados com a forma
não secretada.
Após o sequênciamento dos clones recombinantes descritos acima, verificamos que o
gene hsp65 clonado no vetor pVAX1, não se iniciava diretamente no códon de iniciação
ATG, mas sim em 11 nucleotídeos upstream a esse códon. Como o gene Ag85A foi clonado a
5´do gene hsp65, a fase aberta de leitura da primeira proteína não conhecidiu com a da
segunda, portanto uma nova estratégia foi elaborada.
Para a nova amplificação do gene Ag85A, o oligonucleotídeo forward foi desenhado
de forma a conter o sítio de reconhecimento da enzima EcoRV e um sítio de ancoragem
(CCG) na extremidade 5´. Essa enzima foi escolhida, pois cliva deixando as extremidades
abruptas ou “cegas”. Já o oligonucleotídeo reverse continha o sítio para a enzima EcoRV e o
nucleotídeo guanina (G) como sítio de ancoragem. A inserção de somente um nucleotídeo
para a ancoragem da enzima, foi devido ao TM do oligo estar muito alto uma vez que havia
uma grande quantidade de seqüências GC na parte final do gene Ag85A. Logo em seguida ao
sítio para a enzima EcoRV, foi adicionado também mais uma guanina, para que o gene Ag85A
___________________________________________________________________Discussão
107
entrasse em fase com o gene hsp65. A guanina foi o único nucleotídeo que após análise in
silico, não criou nenhum códon de terminação em nenhuma das 3 fases aberta de leitura da
proteína.
A presença de um sítio de múltipla clonagem (MCS, Multiple Cloning Site) localizado
imediatamente após o promotor CMV e anteriormente à seqüência que codificava para o gene
hsp65, possibilitou a elaboração da estratégia de clivagem desse vetor para a inserção do gene
Ag85A. Nessa nova construção, o vetor foi digerido com as enzimas HindIII e BamHI, para
que fosse retirada uma pequena seqüência presente no próprio vetor que separaria um gene do
outro. Porém essas enzimas clivam deixando as extremidades coesivas e, portanto
incompatíveis com as extremidades abruptas do inserto. A clonagem do gene Ag85A só foi
possível após o preenchimento das extremidades do vetor com deoxinucleotídeos fosfato pela
atividade do fragmento Klenow da DNA Polimerase I. Esse fragmento é resultado da
clivagem proteolítica da enzima DNA Polimerase I e é muito utilizado em reações de síntese
de DNA in vitro, por conter as atividades de polimerase e exonucleolítica de revisão 5´→3´
(Voet, 2002).
A transformação da reação de ligação do gene Ag85A no plasmídeo pVAX-Hsp65,
resultou na formação de poucas colônias nas placas (média de duas a cinco colônias), o que
indica uma alta eficiência da reação de defosforilação realizada no vetor. A identificação de
plasmídeos recombinantes contendo ambas as extremidades abruptas é relativamente
trabalhosa, pois na maioria das vezes, há o surgimento de muitos falsos recombinantes, uma
vez que, os vetores podem voltar a se ligarem neles próprios. A enzima Calf Intestinal
Alkaline Phosphatase (CIAP), é uma das fosfatases alcalinas que podem ser utilizadas na
remoção do fosfato 5´ terminal evitando assim a recircularização do DNA plasmideal
(Sambrook, 1989).
___________________________________________________________________Discussão
108
Após a etapa de construção da vacina múltipla, foi necessário analisar a presença e a
funcionalidade do gene Ag85A. O parâmetro utilizado para apontar a presença desse gene foi
por meio de análise de restrição. Com relação à funcionalidade do gene, foi avaliada a
produção de mRNA para Ag85A, como também a detecção da própria proteína de fusão em
macrófagos de linhagem J774. Essas análises nos mostraram indiretamente que células
apresentadoras de antígenos foram capazes de transcrever e traduzir a proteína de fusão, como
observado no western blot (Figura 9), garantindo que a vacinação fosse realizada com uma
construção plasmideal adequada.
Uma das principais preocupações com relação à imunização com vacinas de DNA,
devido ao seu modo de produção, é a contaminação por LPS. O LPS é uma endotoxina
produzida por bactérias gram-negativas que pode “alterar” a imunogenicidade da vacina
atuando como um adjuvante, pois é capaz de imunomodular APCs, promovendo a sua
maturação, aumento na expressão de moléculas co-estimunlatórias e liberação de citocinas
que direcionam a resposta imune para um perfil Th1 (Hawkins et al., 2003). Dessa forma,
todas as construções vacinais foram testadas para excluir a presença de tal contaminação. Essa
análise demonstrou a pureza de todos os DNAs obtidos, os quais foram considerados
aceitáveis para testes in vivo de acordo com a Farmacopéia Européia que preconiza que o
limite de contaminação por endotoxina não ultrapasse 5 UE/Kg peso corpóreo/hora.
Após as construções gênicas terem sido certificadas iniciou-se os processos de
imunizações e avaliação da resposta imune induzida por cada vacina de DNA.
Primeiramente avaliou-se a resposta imune humoral desencadeada por essas
construções. A avaliação da produção de anticorpos específicos representa um importante
indicador da transcrição correta do gene contido na vacina de DNA, bem como do tipo de
resposta celular gerada. Uma vez que IgG1 (Th2) e IgG2a (Th1) podem ser considerados
marcadores do padrão de resposta imune gerada, a razão IgG1/IgG2a pode ajudar a definir o
___________________________________________________________________Discussão
109
fenótipo de células T induzidas pela vacinação (Coffman et al., 1988). Portanto, podemos
inferir que apesar de a imunização com DNA-Hsp65 ter gerado ambos os subtipos de
anticorpos (Figura 12), ela tendeu à uma polarização de uma resposta para o padrão Th1, visto
que a razão IgG1/IgG2a entre esses dois subtipos foi em média de 0,6.
A vacinação dos animais com DNA-Ag85A+Hsp65 revelou resultados interessantes
quanto à produção de anticorpos. Interessantemente, mesmo os animais tendo sido
imunizados com a mesma quantidade de DNA de ambos os antígenos (50 µg de cada), houve
somente um aumento de anticorpos para o Ag85A (Figuras 12 e 13). Isso pode ter ocorrido
devido à ‘competição antigênica’ a qual estaria priorizando a resposta para um dos antígenos.
Morris e colaboradores (2000) mostraram em seu trabalho que a imunização com uma
combinação de antígenos contra TB, induziu uma limitada competição antigênica, também
observada por Corbel e colaboradores (1994) (Morris et al., 2000) (Corbel, 1994). Essa
competição poderia estar ocorrendo provavelmente, devido a uma maior secreção da proteína
Ag85A em relação a proteína Hsp65, uma vez que a sua construção foi feita de forma a conter
a seqüência sinal eucariótica Human Tissue Plasminogen Activator ou tPA (descrito em
material e métodos), dita como facilitadora para a secreção de proteínas pelas células do
hospedeiro (Li et al., 1999) (Baldwin et al., 1999). Montgomery e colaboradores (1997)
reportaram que a transfecção de uma determinada linhagem celular com uma vacina de DNA
codificando para o Ag85A fusionada com a seqüência tPA, apresentava uma maior expressão
da proteína quando comparada com células transfectadas com a vacina de DNA codificando o
gene Ag85A sozinho (Montgomery et al., 1997). Li e colaboradores (1999), também relataram
um aumento na expressão dos antígenos micobacterianos: MTP-64, KatG, ESAT-6 e HBHA,
quando estes estavam fusionados a seqüência tPA (Li et al., 1999). Assim, acreditamos que
no caso dos animais imunizados com a preparação contendo tanto DNA-Ag85A como DNA-
Hsp65 (DNA-Ag85A+Hsp65), houve uma prevalência na produção da proteína Ag85A e
___________________________________________________________________Discussão
110
assim um aumento na produção de anticorpos específicos para essa proteína e não para a
proteína Hsp65. Os animais imunizados com a vacina contendo os antígenos fusionados
(DNA-Ag85A/Hsp65), não apresentaram anticorpos anti-Hsp65 ou anti-Ag85A, como
observado nas figuras 12 e 13. Para explicarmos esse fato, poderíamos postular algumas
hipóteses. Primeira, devido ao tamanho da proteína de fusão, essa não estaria sendo expressa
em quantidades suficientes para gerar uma resposta imune humoral de mesma intensidade da
gerada pelas construções individuais. Segunda, na expressão da proteína fusionada poderiam
ocorrer mudanças conformacionais que resultariam na perda do seu reconhecimento pelos
anticorpos anti-Hsp65 e anti-Ag85A devido à inacessibilidade dos epítopos para os quais
esses anticorpos são específicos e que estão presentes nas proteínas nativas. Essa não detecção
de imunoglobulinas não necessariamente significa que esses animais não estejam produzindo
outros tipos de anticorpos específicos para outros epítopos presentes somente na proteína de
fusão e que, portanto, não estamos conseguindo detectá-los, pois as proteínas utilizadas na
sensibilização desses ensaios foram as proteínas nativas.
Embora a produção de anticorpos não seja um fator preponderante no controle da
resposta imune contra tuberculose, não podemos descartar totalmente sua participação na
imunidade protetora. Vordermeier e colaboradores (1996) demonstraram que a infecção de
camundongos deficientes de células B com uma cepa virulenta de Mtb levou a um aumento na
carga bacilar nos pulmões desses animais quando comparados aos animais normais
(Vordermeier et al., 1996). Algumas das funções sugeridas às células B seria a de célula
apresentadora de antígenos (APCs), as quais estariam capturando antígenos através de seus
receptores de imunoglobulinas, processando-os e apresentando-os para as células T (Ozaki
and Berzofsky, 1987) ou expressando o antígeno, após captura do DNA plasmideal (Coelho-
Castelo et al., 2003). Além disso, esses epítopos apresentados via MHC de classe II, poderiam
direcionar a resposta das células T contra o determinado patógeno (Watts and Lanzavecchia,
___________________________________________________________________Discussão
111
1993) (Simitsek et al., 1995). Uma outra função para os anticorpos seria a de neutralizar
componentes solúveis da micobactéria como, por exemplo, as lipoarabinomananas (LAM), as
quais foram descritas como supressoras da resposta mediada por células T in vitro (Moreno et
al., 1989). Além disso, anticorpos opsonizantes poderiam facilitar a captura do bacilo e assim
impedir a disseminação da infecção.
Após a avaliação da resposta imune humoral, foi determinado o perfil de citocinas
produzidas pelas células do baço mediante estímulo com o lisado de Mtb, o qual contém tanto
a Hsp65 quanto o Ag85A.
A produção de IL-12 induzida por todas as construções vacinais, inclusive nos animais
controle, (Figura 14), sugere que isto tenha ocorrido devido a ação de certos componentes da
parede micobacteriana e, portanto, presentes no lisado de Mtb, como por exemplo, a
lipoarabinomanana (LAM), que pode interagir com receptores de reconhecimento padrão
presentes nas APCs levando à ativação dessas células e conseqüente produção dessa citocina
(Park and Scott, 2001). Esse tipo de ativação corresponderia a ativação da resposta imune
inata do animal. A IL-12 representa uma importante ligação entre a imunidade inata e a
adquirida, sendo produzida durante as reações imunes inatas iniciais contra microorganismos
intracelulares e estimulando as respostas da imunidade adquirida que protegem o hospedeiro
contra esses microorganismos (Flynn and Ernst, 2000).
A respeito dos níveis de IFN-γ detectados no sobrenadante de cultura de células de
baço após estímulo com o lisado de Mtb, observou-se que somente os animais imunizados
com DNA-Ag85A apresentaram níveis significativos de produção dessa citocina, apesar de
ter ocorrido também um pequeno aumento na sua produção pelos animais imunizados com
ambas as vacinas: DNA-Ag85A+Hsp65 (Figura 15). Como citado anteriromente, a proteína
Ag85A é uma das principais proteínas secretadas por M. tuberculosis, junto com Ag85B e
Ag85C, essas proteínas constituem cerca de 20 a 30% de todas as proteínas presentes no
___________________________________________________________________Discussão
112
filtrado de cultura de Mtb (Wiker et al., 1992). Portanto, esse aumento na produção de IFN-γ
observado nos animais imunizados com DNA-Ag85A e com DNA-Ag85A+Hsp65, pode estar
relacionado com a imunogenicidade da proteína Ag85A, como já discutido.
Adicionalmente foi avaliada a produção de IFN-γ pelas células do baço de animais
imunizados, mediante estímulo específico com a proteína rHsp65 e rAg85A. Como já era
esperado, os níveis detectados da citocina nas culturas foram mais baixos quando comparados
com os mesmos animais estimulados com o lisado de Mtb (Figura 15 e 16). Por outro lado,
observamos que a produção de IFN-γ pelas células dos animais do grupo DNA-
Ag85A+Hsp65, estimulados com rHsp65, mostraram uma produção bastante sensível da
citocina, se comparados com o mesmo grupo quando estímulado com rAg85A. Esse dado
interessante parece contradizer nossa hipótese da imunodominância do Ag85A. Porém é
bastante razoável supor que tal imunodominância se mostre mais aparente numa resposta
imune humoral do que em uma resposta imune celular. Nesse sentido, podemos observar que
a imunização apenas com a vacina contendo um único antígeno foi específica a esse antígeno
(Figura 16).
Resultado surpreendente foi observado com o grupo imunizado com a vacina múltipla
de DNA (DNA-Ag85A/Hsp65) que não induziu níveis significativos de IFN-γ nos animais em
nenhum dos casos. Os dados obtidos por essa construção são interessantes e merecem maiores
avaliações. Baseado apenas nesse resultado de citocina não temos condições de levantar
hipóteses plausíveis.
A detecção de IFN-γ nos sobrenadantes das culturas de células dos animais
imunizados com DNA-Hsp65, DNA-Ag85A e com a preparação contendo as duas
construções (DNA-Ag85A+Hsp65), sugere que essas imunizações poderiam estar levando a
ativação de uma resposta imune com diferenciação de linfócitos T produtores desta citocina,
ou seja, do padrão Th1. O IFN-γ é responsável pela ativação de mecanismos microbicidas de
___________________________________________________________________Discussão
113
macrófagos, estimula a expressão de moléculas de MHC de classe I e II e de moléculas
coestimulatórias na superfície de células apresentadoras de antígeno e promove a troca de
isotipo de imunoglobulinas para anticopos opsonizantes, como por exemplo, IgG2a em
camundongo (Boehm et al., 1997), o que condiz com os resultados de produção de anticorpos
desse subtipo nesses mesmos animais (Figuras 12 e 13). Dessa forma, as vacinas DNA-
Hsp65, DNA-Ag85A e DNA-Ag85A+Hsp65 podem ser efetivas para o controle da
tuberculose, uma vez que induziram um padrão de resposta considerado protetor contra TB.
Para ter uma idéia mais precisa do perfil de resposta imune apresentada pelos animais
após as imunizações com as diferentes construções, dosamos também a citocina IL-10 a qual
é importante na regulação da inflamação. Foi observado que somente os animais imunizados
com a vacina múltipla apresentaram uma diminuição significativa dessa citocina.
Em conjunto, as análises dos resultados referentes à imunogenicidade mostram que as
construções vacinais: DNA-Hsp65, DNA-Ag85A e DNA-Ag85A+Hsp65 estimularam a
diferenciação de linfócitos T naives em linfócitos T efetores específicos de padrão Th1, como
observado pela proliferação antígeno específica (Figura 18) e pela elevada produção de
anticorpos do subtipo IgG2a e produção de IFN-γ (Figuras 12, 13 e 16) por esses animais.
Considerando que a micobactéria é um patógeno intracelular, é importante que uma
vacina desencadeie uma resposta com a participação de células T CD8
+
citotóxicas e
produção de citocinas como IFN-γ que atuarão na ativação das APCs, para a produção de
espécies reativas de oxigênio e lise de células infectadas, culminando assim com a eliminação
do bacilo. O papel do IFN-γ na imunidade contra micobactéria foi primeiramente
demonstrado através da observação de que camundongos geneticamente deficientes na
produção dessa citocina eram extremamente susceptíveis à infecção por Mtb (Cooper et al.,
1993) (Flynn et al., 1993). Além disso, estudos recentes mostram que humanos com mutações
genéticas nos genes relacionados à produção de IFN-γ, têm uma maior predisposição a TB ou
___________________________________________________________________Discussão
114
a doenças bacterianas (Casanova and Abel, 2002). A maioria das vacinas que não induzem
bons níveis de IFN-γ antígeno-específicos não induz imunidade efetiva em modelos animais
(Agger and Andersen, 2001). Portanto, relacionando os dados obtidos em nossos ensaios, é
possível estabelecer um quadro de resposta imunológica que comprova a eficácia das
vacinações, visto que a imunidade protetora contra tuberculose é baseada na geração de
células Th1 CD4
+
(Flynn and Chan, 2001). Uma vez ativadas, essas células T CD4
+
produtoras de IFN-γ passarão a expressar o fenótipo de ativação CD44
hi
e CD62L
lo
e poderão
migrar para os sítios de infecção em resposta ao patógeno.
Apesar de a imunização com as vacinas codificando os antígenos individualmente ter
mostrado uma boa indução de resposta, o mesmo não ocorreu quando os animais foram
imunizados com a vacina múltipla. Porém sua eficácia pôde ser avaliada em modelo de
prevenção ou profilaxia, como descrito abaixo.
Após a análise da resposta imune humoral e celular desencadeada pelas diferentes
construções, foi feita uma investigação da resposta imune protetora gerada por essas vacinas,
mediante desafio com a cepa virulenta de Mtb: H37Rv.
Nesse sentido, o primeiro parâmetro avaliado foi a produção de anticorpos específicos
pelos animais previamente vacinados e posteriormente infectados. Com relação aos animais
vacinados com DNA-Hsp65, observamos que os níveis de imunoglobulinas anti-Hsp65 do
subtipo IgG2a, se mantiveram os mesmos após a infecção, enquanto que houve um pequeno
aumento nos níveis de IgG1 se comparados com os níveis produzidos pelos animais somente
imunizados (Figuras 12 e 19), sugerindo, nesse caso, uma mudança para um padrão misto de
resposta após a infecção, com uma razão IgG1/IgG2a de aproximadamente 1. Um resultado
interessante foi o demonstrado tanto pelos animais vacinados com DNA-Ag85A/Hsp65
(vacina múltipla), quanto pelos vacinados com DNA-Ag85A+Hsp65 que apresentaram uma
produção significativa de anticorpos anti-Hsp65 tanto do subtipo IgG2a quanto de IgG1, fato
___________________________________________________________________Discussão
115
que não foi observado nesses animais quando foram somente imunizados (Figuras 12 e 19). A
vacina múltipla, assim como a vacina DNA-Hsp65, apresentou um padrão misto de resposta,
já a vacina contendo os dois antígenos mostrou uma tendência ao padrão Th1, com uma razão
IgG1/IgG2a de cerca de 0,4. A produção de anticorpos por esses grupos sugere que o bacilo
poderia estar funcionando como um reforço na produção dos mesmos, comprovando que a
vacinação foi eficiente, gerando células B e T de memórias específicas para antígenos da
micobactéria. Com relação ao grupo DNA-Ag85A os níveis de anticorpos específicos se
mantiveram os mesmos, após a infecção. Porém os animais vacinados com DNA-
Ag85A+Hsp65 tiveram uma diminuição nos níveis de IgG2a anti-Ag85A (Figura 20) se
comparados com os níveis detectados antes da infecção (Figura 13). Talvez essa diminuição
possa estar relacionada com o aumento nesses mesmos animais de IgG2a anti-Hsp65 (Figura
19). Como discutido acima, no caso desses animais pode estar ocorrendo uma competição
antigênica, onde após a imunização houve uma priorização da resposta para o antígeno
Ag85A, contudo após a infecção com o Mtb essa resposta pode ter priorizado o antígeno
Hsp65, uma vez que essa é uma proteína de choque térmico produzida em grandes
quantidades pelo bacilo M. tuberculosis (Lee and Horwitz, 1995), principalmente após as
condições de estresse estabelecidas pelas células do hospedeiro após a infecção pelo
microorganismo (Silva, 1999).
O desenvolvimento de uma vacina eficiente contra a TB deve ser embasado no bom
entendimento da relação patógeno-hospedeiro, nesse sentido, a avaliação do local onde se
estabelece a infecção é essencial. Assim, a análise em conjunto dos resultados obtidos
referentes aos ensaios de proteção como a dosagem de citocinas nos pulmões, a caracterização
das células presentes no local da infecção, a contagem de UFCs, bem como a análise
histopatológica, representam parâmetros importantes na caracterização do efeito profilático de
uma vacina contra TB.
___________________________________________________________________Discussão
1
16
Em nosso modelo, foi observado que as citocinas IL-12 e IFN-γ estavam presentes nos
pulmões, porém sem diferença significativa entre os grupos. Somente o grupo BCG mostrou
uma diminuição nos níveis das mesmas citocinas quando comparados com os grupos
controles ou mesmo com os grupos vacinados com as construções gênicas (Figura 21) e um
aumento de IL-10 (Figura 22). A detecção de citocinas após processos vacinais e desafio, é
extremamente conflitante, uma vez que a própria infecção interfere com a produção detectada.
Assim, o fato das construções vacinais não mostrarem diferença com relação a produção de
IL-12 ou IFN- γ, não exclui nem minimiza a importância das mesmas. Outros parâmetros
desse trabalho devem ser levados em consideração para verificação da eficácia das vacinas.
Apesar da importância da citocina IFN-γ na proteção contra TB, ela não pode estar em
níveis muito altos no local da infecção, pois pode gerar uma inflamação exacerbada e
conseqüente dano tecidual, portanto, a não detecção de níveis maiores de IFN-γ nos grupos
imunizados com as vacinas de DNA em relação ao grupo controle pode ser considerado um
bom resultado. Dados recentes do nosso grupo mostram que animais imunizados com CFP
(Proteínas do Filtrado de Cultura de Mtb) mais a seqüência imunoestimulatória CpG 1826,
que induziram altos níveis de IFN-γ nos pulmões dos animais infectados, não foram protetoras
e também foi observado a existência de áreas de necrose nos pulmões desses animais
(Fonseca et al., 2007). Além disso, segundo Florido e colaboradores (2005) o excesso de IFN-
γ pode levar a apoptose de clones de linfócitos T CD4
+
responsivos a micobactérias (Florido
et al., 2005). Nesse sentido, parece que a magnitude ou o “tamanho” da resposta Th1,
considerando-se a produção de IFN-γ, não pode ser considerada como parâmetro único
associado com proteção na TB.
Em relação à produção da citocina IL-10, os resultados obtidos demonstraram que as
diferentes construções vacinais também induziram a produção dessa citocina no pulmão,
porém sem diferença significativa entre os grupos experimentais (Figura 22A). Em função das
___________________________________________________________________Discussão
117
atividades biológicas da IL-10, é importante que haja uma concentração adequada dessa
citocina no local da infecção para impedir uma resposta imune exacerbada que gere danos ao
parênquima pulmonar. A citocina IL-10 é produzida principalmente pelas células T e
macrófagos, e regula negativamente a ação dos macrófagos e down-regula a resposta
inflamatória (Moore et al., 1993). O papel da IL-10 na infecção por M. tuberculosis continua
controverso, em estudos para identificação dos fatores que causam necrose em granulomas,
Ehlers e colaboradores (2001) descreveram que a ausência de IL-10 acelerou a formação de
focos de necrose nos granulomas, provavelmente em função do aumento na produção de IFN-
γ (Ehlers and Daffe, 1998). Por outro lado, a regulação negativa da resposta imune celular
pode ser prejudicial para a eliminação do bacilo. Camundongos geneticamente deficientes de
IL-10 apresentaram aumento da imunidade contra a micobactéria, embora o melhor controle
sobre a replicação dos bacilos não estivesse associado ao aumento da produção de IFN-γ
(Murray and Young, 1999). Além disso, camundongos transgênicos que expressavam níveis
aumentados de IL-10 apresentaram reativação da doença (Turner et al., 2002).
Para uma avaliação mais precisa do perfil de resposta imune apresentada pelos
animais imunizados com as diferentes construções vacinais, foi dosada também citocina IL-4,
um dos principais estímulos para o desenvolvimento de células Th2 a partir de células T CD4
naive. A análise dos níveis de IL-4 mostrou uma diminuição da produção pelos animais
vacinados com DNA-Hsp65, DNA-Ag85A e DNA-Ag85A/Hsp65 se comparados com os
animais injetados com salina (Figura 22B). Essa diminuição de IL-4 sugere que as vacinações
com as diferentes construções, de certa forma, modularam a resposta imune desses animais
para um perfil Th1, mesmo não havendo uma produção exacerbada de IFN-γ.
Segundo Rook e colaboradores (2004, 2005a, 2005b), as populações dos países em
desenvolvimento já possuem naturalmente uma tendência a um perfil Th2, devido à exposição
a parasitas, como os helmintos, e também a micobactérias ambientais, levando a produção de
___________________________________________________________________Discussão
118
IL-4 pelo hospedeiro, e o mesmo aconteceria com os animais de experimentação (Rook et al.,
2004) (Rook et al., 2005b) (Rook et al., 2005a). Assim, quando o indivíduo é infectado pela
micobactéria, ocorre o desenvolvimento de uma resposta inflamatória predominantemente
Th1, porém é uma resposta Th1 “corrompida”, segundo Rook (2005b), devido a presença de
citocinas Th2, pois mesmo que essa resposta tenha uma elevada amplitude, a presença de IL-4
pode inibir os mecanismos microbicidas dos macrófagos, diminuindo, por exemplo, a
expressão da enzima óxido-nítrico sintase (iNOS), induzindo a toxicidade do TNF-α o que
poderia explicar a progressão da doença devido a necrose e fibrose.
Portanto, pode ser observado nos grupos imunizados com DNA-Hsp65, DNA-Ag85A
e DNA-Ag85A/Hsp65, a presença de uma resposta Th1, ressaltada principalmente pela
diminuição dos níveis de IL-4. Dessa forma, uma vacina que consiga modular essa resposta
predominantemente Th2, deixando agir a resposta Th1, seria muito interessante
principalmente para a população dos países em desenvolvimento.
Além do perfil de citocinas induzido pelas diferentes vacinações, foi avaliado também
o perfil fenotípico das células presentes nos pulmões dos animais infectados. Com relação aos
marcadores CD4
+
e CD8
+
, pôde-se observar que essas células estavam ligeiramente
aumentadas nos animais que foram imunizados com as construções de DNA se comparados
com os animais controles. Com excessão do grupo BCG, no qual houve um aumento somente
de células CD4
+
(Figuras 24). Porém esse aumento no número de células T CD4
+
nos grupos
imunizados não se correlaciona com os dados obtidos na produção de IFN-γ, onde não houve
diferença significativa na produção dessa citocina quando comparada com os grupos controles
(Figura 21B). Durante a infecção, muitas células migram para o parênquima pulmonar, onde
ocorre a formação de granulomas, que são formados principalmente por células T CD4
+
e
CD8
+
, bem como células B, que circundam os macrófagos contendo Mtb (Ottenhoff et al.,
1998) (Kaufmann, 2003) (Flynn, 2004). Vários modelos experimentais utilizando linhagens
___________________________________________________________________Discussão
119
de animais deficientes para CD4
+
(Caruso et al., 1999), eliminando-se as células CD4
+
pelo
uso de anticorpos monoclonais (Scanga et al., 2000) e utilizando animais deficientes de
células T CD8
+
ou de MCH de classe I (Orme et al., 1992) (Sousa et al., 2000) mostraram
uma maior susceptibilidade desses animais a infecção. Por isso a importância da participação
dessas células no local da infecção. Além disso, vale a pena relembrar que células T CD4
+
ativadas, presentes no pulmão, são importantes fontes de IFN-γ, a qual irá ativar os
mecanismos microbicidas dos macrófagos que por sua vez poderá eliminar o bacilo contido
no seu interior. Já as células T CD8
+
, por sua vez, também são importantes na resposta contra
o bacilo, principalmente devido a sua atividade citotóxica (Stenger and Modlin, 2002) e
produção de IFN- (Serbina et al., 2000). Estudos têm sugerido que o bacilo dentro do
fagossoma possa ter acesso ao citoplasma sendo, então, apresentados aos linfócitos T CD8
+
via MHC de classe I (Mazzaccaro et al., 1996). Segundo Grotzke e colaboradores (2005), em
humanos e camundongos infectados é possível isolar grande quantidade de células T CD8
+
específicas para o Mtb indicando que essas células são estimuladas pelo bacilo
constantemente (Grotzke and Lewinsohn, 2005).
Do mesmo modo, foi avaliada a geração de células T CD4
+
e CD8
+
de memória
efetora, ou seja, expressando os marcadores CD44
hi
e CD62L
lo
. A análise da figura 25 mostra
que não há uma diferença expressiva no número de células T CD4
+
expressando esses
marcadores nos animais vacinados com as construções, somente nos imunizados com BCG, o
mesmo não acontece com as células T CD8
+
efetoras, onde o número entre todos os animais
vacinados é aumentado. A avaliação das subpopulações que expressam o marcador CD44
hi
nas células T CD4
+
e CD8
+
foi importante, pois nos mostrou a indução de células T efetoras,
sugerindo que as construções vacinais foram eficientes em ativar tais células, e esse fenótipo
ativado pode induzir proteção. Tal proteção é evidenciada em nossos ensaios pela recuperação
de colônias e pela análise histológica pulmonar nos diferentes modelos.
___________________________________________________________________Discussão
120
Com relação a recuperação de unidades formadoras de colônias nos pulmões dos
animais infectados observou-se que todas as construções foram capazes de reduzir de forma
significativa o número de bactérias no pulmão quando comparadas com os animais injetados
somente com salina (Figura 26). Porém a redução geral apresentada pelos diferentes grupos
de cerca de 0,85 log
10
não foi maior do que a observada para o grupo imunizado com BCG, o
qual apresentou uma redução de 1.7 log
10
. Mesmo assim, esses resultados foram considerados
promissores, uma vez que BCG já é descrito ter uma maior efetividade na proteção a TB, em
comparação com vacinas de DNA, em modelos murinos (Baldwin et al., 1999) (Li et al.,
1999). Um outro fator que devemos levar em consideração, é que em nosso modelo, a
infecção se dá por via intratraqueal e não por aerosol, dessa forma a carga bacilar que atinge o
pulmão é elevada, cerca de 10
5
bacilos, comparada com cerca de 200 a 300 bacilos na
infecção por aerosol, portanto uma redução de cerca de 0.8 log
10
é bastante relevante. Além
disso, no modelo de infecção intratraqueal os bacilos atingem diretamente os pulmões e no
caso de aerosol, os mesmos podem atingir também o trato gastrintestinal (Rook et al., 2005b).
Um resultado interessante foi o observado para os animais imunizados com a vacina múltipla
(DNA-Ag85A/Hsp65), os quais reduziram a carga bacilar em cerca de 0,9 log
10
na proteção,
enquanto eles não apresentaram dados promissores na imunogenicidade. Isso reforça mais
uma vez nossa hipótese de que essa vacina é funcional, porém não conseguimos detectar a sua
eficácia por não possuirmos ferramentas adequadas para a realização dos ensaios in vitro.
Outro parâmetro de grande importância analisado nesse trabalho foi a análise
histopatológica do pulmão dos animais infectados. Essa análise é essencial para avaliar a
eficácia de novas vacinas uma vez que a resposta inflamatória induzida pelas estratégias
vacinais propostas, pode levar a uma redução não só das UFCs, mas também deve ser capaz
de não comprometer o parênquima pulmonar. Nesse sentido, constatamos que a análise dos
cortes histológicos apresentados pelos animais imunizados com as vacinas de DNA
___________________________________________________________________Discussão
121
apresentaram um menor comprometimento do parêquima, o que correlacionou com os dados
de redução da UFC nesses mesmos grupos. Além disso, houve uma tendência de focalizar o
processo de infecção com formação de granulomas (Figuras 27 e 28).
A análise em conjunto dos resultados referentes à proteção demonstra que as
vacinações com as diferentes construções de DNA conseguiram induzir uma resposta imune
nos animais que foram infectados com Mtb, com ativação de linfócitos B de memória,
evidenciado pela detecção de anticorpos específicos no soro, mesmo passados 30 dias da
infecção; além disso, houve também um aumento no recrutamento de linfócitos T CD4
+
e T
CD8
+
efetores e T CD8
+
de memória (Figuras 24 e 25) os quais são extremamente
importantes para a eliminação do bacilo intracelular devido a sua atividade citolítica. Com
relação às citocinas produzidas, podemos dizer que as imunizações levaram a um balanço na
resposta, com uma produção não muito elevada de IL-12 e IFN-γ, porém diminuição de IL-4,
o que é importante, se considerarmos que os animais já têm uma predisposição a um padrão
Th2 e que esta citocina pode contribuir na formação de necrose e dano tecidual. Além de IL-
12 e IFN-γ, também houve produção de IL-10, importante citocina, responsável por down-
regular a resposta inflamatória. Esse perfil de resposta gerado contribuiu para a redução, em
todos os grupos vacinados, no log
10
de UFC nos pulmões dos animais e também para uma
maior preservação do parênquima pulmonar após infecção por Mtb, como observado pelos
cortes hitologicos.
Uma nova vacina contra a TB precisa exercer um efeito modulador sobre o sistema
imune e não simplesmente polarizar a resposta para o perfil Th1. Sabe-se que a infecção pela
micobactéria por si só é capaz de induzir uma forte reposta de padrão Th1 no início da
doença, com posterior resposta mista quando a patologia se torna crônica. No entanto, como
discutido anteriormente, nos países em desenvolvimento, o perfil inicial de resposta à TB é
tanto Th2 como Th1 devido ao contato prévio com parasitas. Portanto, uma estratégia de
___________________________________________________________________Discussão
122
imunização contra TB deve ser capaz de modular a resposta imune de forma adequada a fim
de intervir eficientemente em ambos os cenários (Rook et al., 2005b) (Rook et al., 2005a).
A despeito da vacina múltipla, contendo os dois antígenos fusionados, não induzir
uma boa resposta quando observamos a sua imunogenicidade, ela foi eficaz em induzir uma
resposta protetora, levando a uma redução de 0,9 log
10
de UFC nos pulmões dos animais
infectados. Essa vacina apresentou o mesmo perfil de resposta das vacinas anteriormente
descritas, com produção balanceada de citocinas e aumento de células T CD4
+
e T CD8
+
e
também CD8
+
de memória.
Apesar de não possuirmos os dados de citocinas e FACs para a vacina contendo os
dois antígenos separados (DNA-Ag85A+Hsp65), ela também reduziu o log
10
de UFC nos
pulmões dos animais infectados, quando comparada com os animais infectados e não
imunizados (grupo salina). Acreditamos que o perfil de resposta induzida seja o mesmo
observado para as vacinas DNA-Hsp65 e DNA-Ag85A individuais. A proteção conferida pela
vacina DNA-Hsp65+Ag85A, semelhante a induzida pela vacinação com os antígenos
individuais, sugere que essa estratégia de imunização pode ser uma alternativa a mais, uma
vez que teríamos em uma mesma preparação dois antígenos diferentes e assim uma maior
cobertura da população, devido a diversidade de HLAs existentes. O mesmo vale para a
vacina múltipla, a qual contém os dois antígenos, porém fusionados. Essa estratégia parece ser
a mais adequada uma vez que essa proteína de fusão pode estar fornecendo mais epitopos
imunogênicos para o sistema imune, por ser gerada uma nova proteína com uma nova
conformação. Além disso, devemos levar em consideração o fato de que nesse tipo de
imunização é introduzido apenas um plasmídeo com os genes ao invés de dois, diminuindo
assim os custos de produção e a quantidade de material genético inserido nos seres humanos.
123
__________________________________________________________________Conclusões
124
6 CONCLUSÕES
Os resultados apresentados neste trabalho nos permitem concluir que:
1) A vacina múltipla DNA-Ag85A/Hsp65 foi corretamente construída, como
evidenciado pelas análises de caracterização.
2) Camundongos imunizados com a vacina múltipla, assim como aqueles imunizados
com as contruções individuais (administradas isoladamente ou em conjunto) foram protegidos
de forma similar contra a infecção por M. tuberculosis.
3) Considerando que a vacina múltipla codifica para dois antígenos distintos e que os
níveis de IL-4 foram menores nos animais desse grupo, esta construção representa uma nova
alternativa para o desenvolvimento de uma vacina anti-TB.
125
!
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!
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_____________________________________________________Referências Bibliográficas
126
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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