( PDF ) Biodistribuição das microesferas de PLGA (co-polímero derivado dos ácidos lático e glicólico) carreando o plasmídeo pcDNA3-Hsp65, e determinação do tráfego intracelular dessa formulação e do ...

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

Biodistribuição das microesferas

de PLGA

(co-polímero derivado dos ácidos lático e glicólico)

carreando o plasmídeo pcDNA

-Hsp65, e determinação do tráfego

intracelular dessa formulação e do plasmídeo: influência

na indução da resposta imune

ANA PAULA FÁVARO TROMBONE

RIBEIRÃO PRETO

2006

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ANA PAULA FÁVARO TROMBONE

Biodistribuição das microesferas

de PLGA

(co-polímero derivado dos ácidos lático e glicólico)

carreando o plasmídeo pcDNA

-Hsp65, e determinação do tráfego

intracelular dessa formulação e do plasmídeo: influência

na indução da resposta imune

Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto da Universidade de São Paulo para a obtenção do

título de Doutor em Ciências – Área de Concentração:

Imunologia Básica e Aplicada

Orientadora: Profa. Dra. Arlete A.M. Coelho-Castelo

Co-orientador: Prof. Dr. Célio Lopes Silva

Ribeirão Preto

2006

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Trabalho realizado no Laboratório de Vacinas Gênicas, Departamento de Bioquímica

e Imunologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São

Paulo, com auxílio financeiro da FAPESP (01/14516-1).

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE

TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA

FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca Central do Campus

Administrativo de Ribeirão Preto / USP

Trombone, Ana Paula Fávaro

Biodistribuição das microesferas de PLGA (co-polímero derivado dos

ácidos lático e glicólico) carreando o plasmídeo pcDNA

-Hsp65, e

determinação do tráfego intracelular dessa formulação e do plasmídeo:

influência na indução da resposta imune.

Ribeirão Preto, 2006.

128 pp. 28cm

Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto/USP – Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada.

Orientadora: Prof. Dra. Arlete A.M. Coelho-Castelo

Co-orientador: Célio Lopes Silva

1. DNA plasmideal 2. Microesferas de PLGA

3. Tráfego intracelular 4. Endo-lisossomos

“Renda-se, como eu me rendi. Mergulhe no que você não

conhece como eu mergulhei. Não se preocupe em entender,

viver ultrapassa qualquer entendimento.”

Clarice Lispector

DEDICATÓRIA

Aos meus pais Nelson (in memorian) e Neusa...

Ao meu marido Gustavo...

Ao meu irmão Silvio, à minha cunhada Gislaine, aos meus sobrinhos Henrique

e Beatriz...

A toda a minha amada família...

…simplesmente obrigada por tudo!

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. Arlete A.M. Coelho-Castelo, pela sua competência, dedicação à pesquisa,

pela valiosa contribuição para minha formação científica, mas principalmente pela sua

confiança e amizade;

Ao Prof. Dr. Célio Lopes Silva, pelo apoio, espírito científico e por disponibilizar toda a

estrutura do seu laboratório para a realização dos experimentos;

À Profa. Dra. Vânia Luiza Deperon Bonato Martins, pela contribuição intelectual durante a

realização deste trabalho e pelo carinho;

Aos Profs. Dr. Benedito Antonio Lopes da Fonseca (FMRP-USP), Marcelo Damario

Gomes (FMRP-USP), Dr. Maurício Martins Rodrigues (UNIFESP) e Dra Verônica Porto

Carreiro de Vasconcellos Coelho (Instituto do Coração-FMUSP) pela atenção dispensada,

comentários e sugestões na correção da proforma desta dissertação, e pela participação na

banca;

Às Profas. Dra. Constance Oliver (FMRP-USP) e Maria Célia Jamur (FMRP-USP) pelo

auxílio em diversos experimentos;

À Izaíra Tincani Brandão, Ana Paula Masson, Patríca V.P. Palma e Márcia S.Z. Graeff,

pelo auxílio técnico;

A todos os colegas de laboratório: Alexandra, Aninha, Ana Olívia, Cássia, Carlos Rodrigo,

Carolina, Daniele, Deison, Denise, Eduardo, Fábio, Giovana, Iza, José Maciel, Luis

Henrique, Juliana, Júlio César, Karla, Luciana, Marina, Marininha, Patrícia, Pryscilla,

Rogério, Rubens, Sandra, Sheila, Tatiana, Thiago, Wendy e Willian, pela amizade e

companheirismo;

À minha grande amiga Janaína;e à minha companheira Denisinha;

Aos docentes da área de pós-graduação em Imunologia Básica e Aplicada, pela

competência com que mantêm o curso de pós-graduação;

Aos colegas da administração do Centro de Pesquisa em Tuberculose (CPT): Ana,

Ademir, Carlos, Fabiana, Helena, Marcos, Melissa e Rogério pelos serviços prestados que

foram essenciais para este trabalho;

Às secretárias Ana Cristine e Rosângela pelo exemplo de competência e dedicação à

pós-graduação e pela amizade com que acolhe todos os alunos

Ao Ronaldo, pelos serviços prestados e seu pelo seu ótimo humor;

Aos funcionários do Biotério: Júlio, Cris, Rubinho, Sávio, Edinelson, cuja contribuição é

imprescindível para a realização de nossos estudos;

A todos os funcionários do Departamento de Bioquímica e Imunologia, que direta ou

indiretamente contribuem para o bom andamento do nosso dia a dia;

À FAPESP,CNPq, FAEPA e Rede TB pelo apoio financeiro durante a realização do

projeto de pesquisa e à FAPESP pela concessão da bolsa de doutorado (processo

01/14516-1).

...Muito obrigada a todos!

ABREVIATURAS

Abreviaturas

- AIDS: Acquired Immunodeficiency Syndrome – Síndrome da Imunodeficiência

Adquirida

- A/O: emulsão água em óleo

- A/O/A: emulsão água em óleo em água

- BCG: Bacilo Calmette Guérin

- BiP: binding protein

- BSA: albumina sérica bovina

- CpG: dinucleotídeos citosina-guanina

- DAPI: 4´, 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride

- DIC: differential interference contrast

- DNA: ácido desoxiribonucléico

- DMT: dimicolato de trealose

- GM-CSF: fator estimulador de colônias de granulócitos e monócitos

- GRP78: glucose-regulated protein – 78kDa

- Hsp65: proteína de choque térmico de 65 kDa do Mycobacterium leprae

- IFN-γ: interferon gama

- KLH: Keyhole limpet haemocyanin

- IL: interleucina

- J774: macrófagos de linhagem tumoral originários de camundongos Balb/c

- LAMP: lysosome-associated membrane proteins

- MHC: Complexo Principal de Histocompatibilidade

- PBS: Salina Tamponada com Fosfato

- pcDNA

: DNA plasmideal utilizado como vetor da vacina de DNA

- pcDNA

-Hsp65: DNA plasmideal contendo o gene da hsp65 utilizado como vacina

de DNA

- PCR: reação em cadeia da polimerase

Abreviaturas

iii

- PLGA: co-polímero derivado dos ácidos lático e glicólico

- PPD: purified protein derivative

- SBF: soro bovino fetal

- TLR: receptor do Tipo Toll

- TNF: fator de necrose tumoral

- WHO: Organização Mundial da Saúde

RESUMO

Resumo

Os dados apresentados neste trabalho demonstraram que as microesferas,

utilizadas como veiculo para imunização com DNA-Hsp65/DMT, foram amplamente

distribuídas pelo organismo após a administração intramuscular. Essas partículas,

em geral, foram capturadas por células apresentadoras de antígenos, como

macrófagos e células dendríticas através de fagocitose. Além disso, os resultados

demonstraram que as células dos linfonodos drenantes provenientes de animais que

receberam a formulação contendo DNA-Hsp65/DMT apresentaram aumento

significativo na expressão de moléculas superficiais CD80, CD86 e MHC de classe

II, quando comparadas com as formulações controle (vetor/DMT e vazia). Em

relação ao tráfego intracelular, as microesferas permaneceram nos endossomos

tardios e/ou lisossomos por até 15 dias, sugerindo que essas construções foram

hidrolisadas nessas vesículas para liberação do DNA, não ocorrendo assim escape

da formulação para o compartimento citoplasmático.

Por outro lado, os resultados apresentados sobre o tráfego intracelular do DNA

plasmideal demonstraram que o DNA (DNA-Hsp65) foi capturado por células

dendríticas e macrófagos da linhagem J774 pelos processos de macropinocitose e

endocitose mediada por clatrina, respectivamente. Após a captura, o DNA

plasmideal localizou-se nos endossomos tardios e/ou lisossomos sendo capaz de

inibir a acidificação das mesmas, provavelmente como mecanismo de escape da

degradação enzimática. Além disso, não houve co-localizaçao do DNA com Rab5 e

Lamp I, sugerindo que a inibição da acidificação pode ter interferido com o

recrutamento desses marcadores. Adicionalmente, a alteração da acidificação

dessas vesículas inibiu a apresentação do antígeno KLH pela via de classe II,

quando as células foram previamente tratadas com DNA plasmideal, porém, não

alterou o recrutamento de MyD88 para as vesículas. A cinética do tráfego intracelular

do DNA nu sugere que o DNA plasmideal permaneça em vesículas até alcançar a

Resumo

região perinuclear. Assim sendo, os resultados apresentados neste trabalho sobre a

biodistribuição e tráfego intracelular das microesferas, e, principalmente, do DNA

plasmideal, trazem novas contribuições para os esclarecimentos dos mecanismos de

ativação celular em vacinas de DNA. Além disso, abrem perspectivas para o uso de

DNA no controle de células do sistema imune e terapia gênica.

vii

ABSTRACT

Abstract

viii

In this study we demonstrated that microspheres, used as vehicle to DNA-

Hsp65/DMT immunization, were widespread in several organs after intramuscular

administration. In general, these particles were captured through phagocytosis

mediated by antigen presenting cells, such as macrophages and dendritc cells.

Besides, our results demonstrated that draining lymph node cells derived from mice

that received the DNA-Hsp65/DMT-containing formulation presented a significant

increase in the expression of cell surface molecules CD80, CD86 and class II MHC

versus that of the control formulations (vector/DMT and empty). Regarding the

intracellular traffic, we observed that the microspheres remained in the late

endosomes and/or lysosomes until 15 days after the uptake, suggesting that these

constructions were hydrolysed in these vesicles. Accordingly, we can draw the

conclusion that the

DNA was released without the escape of the formulation to the

cytoplasmatic compartment.

In another way, the data concerning the cell traffic of plamideal DNA (DNA-

Hsp65) demonstrated that their capture by dendritic cells and J774 macrophage cell

line was performed by macropinocytosis and clatrin-mediated endocytosis,

respectively. After the uptake, the plamidial DNA was found in the late endosomes

and/or lysosomes and remained in these vesicles avoid their acidification. This

phenomenon might be a novel mechanism of escape from enzymatic degradation.

Despite this result, the plasmid was not co localized with the usual

endosome/lysosome markers Rab5 and Lamp I suggesting that the recruitment of

these markers is dependent on pH-conditions. In addition our results showed that this

modified pH impaired the antigen specific presentation mediated by class II MHC

pathway in that antigen presenting cells previously treated with the plasmid DNA

pointing out that mechanisms could be due the lysosomotropic role of DNA.

However, in this case, the recruitment of MyD88 was not altered. The kinetic of the

Abstract

intracellular traffic of naked plasmidial DNA suggests that the plasmid remains in

vesicles until reaches the perinuclear region.

Taken together, the data presented regarding biodistribution and intracellular

traffic of microspheres or mainly of naked plasmideal DNA described novel and

interesting phenomenon that can elucidate the cellular mechanisms involved in T cell

activation in DNA vaccines. Most importantly, our data open perspectives for the

potential use of the DNA in immune cell control and gene therapy.

ÍNDICE

ABREVIATURAS..........................................................................................................i

RESUMO.....................................................................................................................iv

ABSTRACT................................................................................................................vii

1. INTRODUÇÃO.........................................................................................................1

2. OBJETIVOS...........................................................................................................17

3. MATERIAIS E MÉTODOS.....................................................................................19

3.1. PLASMÍDEOS: OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO..................................................

3.1.1. Obtenção dos plasmídeos recombinates pcDNA

-Hsp65 e pcDNA

....................

3.1.2. Quantificação dos plasmídeos purificados.............................................................

3.1.3. Avaliação da integridade dos plasmídeos

.........................................................21

3.2. MICROESFERAS: ENCAPSULAMENTO DOS PLASMÍDEOS E CARACTERIZAÇÃO

DAS PARTÍCULAS..............................................................................................................

3.2.1. Encapsulamento dos plasmídeos pcDNA

-Hsp65 e pcDNA

juntamente com

dimicolato de trealose (DMT) em microesferas poliméricas biodegradáveis...................

3.2.2. Avaliação da eficiência do encapsulamento dos plasmídeos pcDNA

-Hsp65 e

pcDNA

...................................................................................................................24

3.2.3. Determinação do diâmetro das microesferas.........................................................

3.3. MICROESFERAS: EXPERIMENTOS IN VIVO - BIODISTRIBUIÇÃO E CÉLULAS

ENVOLVIDAS NO PROCESSO DE CAPTURA..................................................................

3.3.1. Imunização dos camundongos com microesferas de PLGA fluorescentes para o

ensaio de biodistribuição

..........................................................................................25

3.3.2. Avaliação da biodistribuição das microesferas de PLGA

fluorescentes

...........................................................................................................26

3.3.3. Imunização dos camundongos com microesferas de PLGA fluorescentes para

caracterizar os tipos celulares envolvidos na captura......................................................

3.3.4. Caracterização dos tipos celulares envolvidos na captura da microesfera e

avaliação da expressão de moléculas de superfície........................................................

3.4. MICROESFERAS: FAGOCITOSE E TRÁFEGO INTRACELULAR IN

VITRO

.......................................................................................................................28

3.4.1. Microscopia de fluorescência

..........................................................................28

3.4.2. Microscopia eletrônica de transmissão

.............................................................29

3.5. DNA PLASMIDEAL (DNA NU): CAPTURA E TRÁFEGO INTRACELULAR IN

VITRO

.......................................................................................................................30

3.5.1. Marcação do DNA plasmideal para os ensaios de microscopia

..........................30

3.5.2. Captura e tráfego intracelular do DNA plasmideal utilizando células J774,

macrófagos peritoneais ou células dendríticas

...........................................................31

3.5.2.1. Células J774 e macrófagos peritoneais...........................................................

3.5.2.2. Células dendríticas derivadas do baço.............................................................

3.6. CAPTURA DO DNA PLASMIDEAL POR CÉLULAS KNOCKOUT DE

TLR9

.........................................................................................................................35

3.7. DNA PLASMIDEAL (DNA NU): ENSAIO DE APRESENTAÇÃO DE ANTÍGENO E

ATIVAÇÃO DE TLR9 E MyD88

...................................................................................37

3.7.1. Influência do tratamento com DNA plasmideal na apresentação de antígeno

......37

3.7.1.1. Obtenção dos linfócitos T CD4 e das células apresentadoras de antígenos

(macrófagos peritoneais)...............................................................................................

3.7.1.2. Ensaio de proliferação celular..........................................................................

3.7.2. Recrutamento da molécula MyD88 após o tratamento com DNA plasmideal........

4. RESULTADOS.......................................................................................................39

4.1. OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS PLASMÍDEOS pcDNA

-Hsp65 E

pcDNA

.....................................................................................................................40

4.2. PREPARO E CARACTERIZAÇÃO DAS MICROESFERAS POLIMÉRICAS

BIODEGRADÁVEIS CONTENDO OS PLASMÍDEOS pcDNA

-Hsp65 OU pcDNA

JUNTAMENTE COM DMT

..........................................................................................40

4.3. AVALIAÇÃO DA BIODISTRIBUIÇÃO DAS MICROESFERAS DE PLGA

FLUORESCENTES

....................................................................................................46

4.4. CARACTERIZAÇÃO DOS TIPOS CELULARES ENVOLVIDOS NA CAPTURA DA

MICROESFERA E AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE MOLÉCULAS DE

SUPERFÍCIE

.............................................................................................................50

4.5. MICROESFERAS: FAGOCITOSE E TRÁFEGO INTRACELULAR IN VITRO

...........50

4.6. DNA PLASMIDEAL (DNA NU): CAPTURA E TRÁFEGO INTRACELULAR IN VITRO –

INIBIÇÃO DA ACIDIFICAÇÃO DAS VESÍCULAS LISOSSOMAIS

..................................61

4.7. DNA PLASMIDEAL (DNA NU): CAPTURA POR CÉLULAS KNOCKOUT DE TLR9...

4.8. DNA PLASMIDEAL (DNA NU): ENSAIO DE APRESENTAÇÃO DE

ANTÍGENO

................................................................................................................78

4.9. RECRUTAMENTO DE MyD88, RAB5, LAMP 1 E BiP/GRP78 EM VESÍCULAS QUE

CAPTURARAM O DNA PLASMIDEAL

...........................................................................81

5. DISCUSSÃO..........................................................................................................91

6. CONCLUSÕES....................................................................................................108

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................111

8. ANEXO.................................................................................................................127

ANEXO 1. MAPA DO PLASMÍDEO pcDNA

(INVITROGEN)...............................128

ANEXO 2. ARTIGO...............................................................................................129

1. INTRODUÇÃO

Introdução

VACINAS DE DNA

Vacinas baseadas em DNA plasmideais têm se destacado pela sua capacidade

de gerar uma resposta imune similar às vacinas utilizando organismos vivos

atenuados ou organismos vivos recombinantes, porém sem os riscos associados

com o uso desses agentes infecciosos. Este tipo de vacina é composta por

moléculas de DNA de dupla fita circulares de origem bacteriana que contêm o gene

codificando a proteína de interesse, além de outros elementos importantes, tais

como a presença de um gene de resistência a antibióticos e origem de replicação

bacteriano; um forte promotor gênico eucariótico; e uma seqüência de poliadenilação

para finalização da expressão (GURUNATHAN et al., 2000; HAN et al., 2002;

SRIVASTAVA & LIU, 2003).

Anteriormente, acreditava-se que o DNA plasmideal, também denominado de

DNA nu, já que não possui nenhum revestimento de proteção, não poderia ser

capturado in vivo e transportado para o núcleo, local no qual seria transcrito. Porém,

em 1990, WOLFF e colaboradores demonstraram pela primeira vez, que a

administração por via intramuscular de um DNA plasmideal contendo genes para

determinado polipeptídeo, induzia a expressão dessa proteína em células

musculares. Este estudo forneceu a base para o conceito de que o uso de DNA

procariótico in vivo poderia resultar na expressão direta da proteína na célula-alvo.

Esta estratégia de vacinação, além de evitar muitos problemas associados às

vacinas vivas, tais como, reversão de virulência, instabilidade térmica e contra-

indicação para indivíduos imunodeprimidos, destaca-se pela possibilidade de

processamento e apresentação de antígeno por ambas as moléculas de MHC (Major

Histocompatibility Complex) de classe I e classe II, ativando assim, células T

citotóxicas (CD8) e células T auxiliares (CD4), respectivamente (HAN et al., 2002).

Resumidamente, este processo ocorre da seguinte forma: no caso da apresentação

Introdução

via MHC de classe I, o DNA plasmideal é capturado e transportado para o núcleo da

célula apresentadora de antígeno, onde será transcrito em mRNA, e, em seguida,

traduzido em proteína no citosol. Após a síntese protéica, os antígenos expressos

endogenamente serão degradados em peptídeos pelo proteassoma e, em seguida,

transportados para o retículo endoplasmático, onde serão associados a moléculas

do MHC de classe I. A apresentação deste complexo (peptídeo-MHC de classe I) na

superfície das células apresentadoras de antígenos poderá ativar os linfócitos T

CD8. Por outro lado, parte dos antígenos produzidos pelas células hospedeiras

serão secretados para o meio exterior das mesmas, sem sofrerem processamento,

onde poderão tanto estimular linfócitos B a produzirem anticorpos específicos, como

serem endocitados por outras células apresentadoras de antígenos e apresentados

via MHC de classe II, estimulando assim linfócitos T CD4. Desta forma, a vacinação

com DNA plasmideal poderá estimular linfócitos B, linfócitos T citotóxicos (CD8) e

linfócitos T auxiliares (CD4), proporcionando assim uma resposta imune humoral e

celular (GURUNATHAN et al., 2000; LIU, 2003; DONNELLY et al., 2005).

Cabe ressaltar que no caso da vacinação com DNA plasmideal, alguns

mecanismos são sugeridos em relação à transfecção da célula alvo. Alguns autores

propõem que a indução da resposta imune possa ter início após a transfecção direta

de células somáticas (miócitos, queratinócitos, ou qualquer célula que não expresse

a molécula MHC de classe II), porém, embora essas células sejam capazes de

capturar o DNA plasmideal e produzir a proteína em questão, as células musculares

usualmente não possuem moléculas co-estimulatórias necessárias para a ativação

dos linfócitos. Alternativamente, o DNA plasmideal pode transfectar diretamente as

células apresentadoras de antígenos profissionais e assim induzir uma resposta

imune adequada, ou ainda, pode ocorrer o mecanismo conhecido como cross-

priming, no qual célula somática e/ou célula apresentadora de antígeno transfectada

Introdução

com o DNA plasmideal produzem o antígeno protéico, e este é capturado por uma

célula apresentadora de antígeno que ativará linfócitos T citotóxicos (GURUNATHAN

et al., 2000; LIU, 2003). Além disso, recentemente foi demonstrado que células B

podem capturar o DNA plasmideal in vivo, sugerindo que essas células também

possam participar do processo de apresentação de antígeno em modelos de vacinas

de DNA (COELHO-CASTELO et al., 2003).

Além de estimular uma resposta imune humoral e celular, e de fornecer

informações genéticas necessárias para que o organismo produza o antígeno por

meios próprios, sem os efeitos indesejáveis da introdução de um agente infeccioso

ou de vacinas contendo subunidades protéicas e adjuvantes, as vacinas de DNA

possuem outras vantagens, tais como: oferecem a possibilidade de combinar

antígenos de um mesmo ou de diferentes patógenos ou mesmo a co-administração

com imunomoduladores; são fáceis de se produzir; possuem baixo custo e

apresentam uma boa estabilidade (HAN et al., 2002). Adicionalmente, as vacinas de

DNA carregam em si a função adjuvante mediada pelos motivos CpG, uma vez que

esses motivos interagem com Toll-like receptor (TLR) 9, iniciando assim a cascata

de sinalização intracelular via proteína adaptadora MyD88, que contribuirá para a

ativação celular. Apesar das vantagens das vacinas de DNA, é importante ressaltar

que algumas questões são levantadas em relação à segurança dessas vacinas,

dentre elas, a possibilidade de integração do DNA plasmideal com o genoma do

hospedeiro, podendo assim interferir na ativação de oncogenes ou na inativação de

genes supressores de tumor (

DONNELLY

et al.,

2003; KLINMAN

et al., 1997). Embora

estudos realizados em nosso laboratório demonstraram que a vacina DNA-Hsp65

não se integra no genoma (COELHO-CASTELO et al., 2006); as moléculas de DNA

podem persistir por longo tempo na célula eucariótica, o que levaria a geração de

grandes quantidades da proteína recombinante podendo resultar em tolerância.

Introdução

Além disso, há a preocupação de que as vacinas de DNA possam levar ao

desenvolvimento de anticorpos anti-DNA e induzir doenças autoimunes, como por

exemplo, lupus eritomatoso sistêmico e artrite reumatóide (GILKESON

et al.,

1995

Mesmo com as possíveis desvantagens acima citadas, as vacinas de DNA têm

sido utilizadas, em modelos animais, para uma ampla variedade de doenças, dentre

elas, HIV, câncer, alergia, doenças auto-imunes e tuberculose (SILVA et al., 1994;

TASCON et al., 1996; TARACHA et al., 2003; LEE et al., 2004; PAVLENKO et al.,

2004). Neste último caso, especificamente, é de interesse do nosso grupo de

pesquisa (Centro de Pesquisa em Tuberculose – FMRP), desenvolver uma vacina

eficaz para uso clínico. Isto se deve ao fato de que a tuberculose, infecção causada

por Mycobacterium tuberculosis, ainda é um problema de saúde pública mundial,

desde que atualmente entre dois a três milhões de pessoas morrem por ano e

estima-se que entre oito a dez milhões de novos casos surgem anualmente (WHO

2005; ROOK et al., 2005). A re-emergência da tuberculose na década de 80 pode

ser atribuída a fatores como: (i) epidemia de AIDS; (ii) o declínio nas condições de

vida de parcela considerável da população mundial; (iii) o declínio dos recursos

destinados às ações de controle da doença nos países desenvolvidos e em

desenvolvimento; (iv) problemas gerais de ordem política e organizacional,

enfrentados pelos sistemas públicos de saúde em todo o mundo; (v) o crescimento

dos fluxos migratórios; (vi) os problemas ligados à dificuldade de adesão de parcela

dos pacientes aos esquemas terapêuticos que atualmente ainda exigem um tempo

relativamente longo e com efeitos adversos consideráveis; e (vii) o surgimento de

cepas de micobactérias resistentes a um ou mais fármacos utilizados na

quimioterapia da doença (BRUDNEY & DOBKIN, 1991; BLOOM & MURRAY, 1992;

MEACCI & KRUSE, 2005).

Introdução

VACINA DE DNA CONTRA TUBERCULOSE

Para o desenvolvimento racional de vacinas contra a tuberculose, é consenso

que haja uma caracterização da relação entre o agente infeccioso e o sistema imune

do hospedeiro. Atualmente, sabe-se que o M. tuberculosis, após ser inalado,

interage inicialmente com macrófagos alveolares e células dendríticas presentes nas

vias aéreas (FLYNN & CHAN, 2005). No caso dos macrófagos alveolares, que são o

habitat preferencial do bacilo, esta interação ocorre através de diversos receptores,

tais como, receptores para a porção Fc de imunoglobulinas, receptores do sistema

complemento, receptor de manose, proteínas surfactantes, CD14 (ERNST,

1998) e

Toll-like receptor (TLR) do tipo 2 e 4 (MEANS et al., 1999). Tem sido proposto que

esta interação pode determinar o destino do M. tuberculosis, visto que, interações

com receptores para imunoglobulinas e TLRs estimulam os mecanismos de defesa

do hospedeiro, enquanto que interações com receptores do sistema complemento

promovem a sobrevivência do bacilo (KAUFMANN, 2001). Após a captura, o M.

tuberculosis pode ser degradado no interior dos lisossomos dos macrófagos, ou

alternativamente, escapar da degradação por inibir a fusão do fagolisossomo

(ARMSTRONG & HART, 1975; RUSSELL et al., 1996; FERRARI et al., 1999)

permanecendo assim no fagossomo precoce onde tem acesso aos íons Ferro, que

são essenciais para a sua sobrevivência intracelular (SCHAIBLE et al., 1999;

LOUNIS et al., 2001).

Devido a este mecanismo de inibição do fagolisosso, a ativação dos

macrófagos pelos bacilos, na maioria das vezes, é insuficiente para eliminá-los.

Desta forma, o controle da infecção requer a ativação da resposta imune celular,

caracterizada pela presença de linfócitos T auxiliares (CD4) e linfócitos T citotóxicos

(CD8). A importância dos linfócitos T CD4 na imunidade contra a tuberculose foi

comprovada em vários modelos experimentais utilizando linhagens de animais

Introdução

deficientes dessas células, que demonstraram o seu envolvimento desde a fase

aguda até a fase crônica da infecção (CARUSO et al., 1999; SCANGA et al., 2000;

SAUNDERS et al., 2002). Sua relevância na resposta protetora está diretamente

relacionada ao desenvolvimento de uma resposta do tipo Th1, ou seja, desenvolvida

em um microambiente em que prevalecem as citocinas IFN-γ, IL-12, IL-2 e TNF-α

(BARNES et al., 1993; COPPER et al., 1993). Em adição, vários pesquisadores

demonstraram que o IFN-γ é uma das principais citocinas associadas à resposta

protetora durante a infecção por micobactérias (FLYNN et al., 1993; BONATO et al.,

1998), sendo que, células T CD4 produtoras de IFN-γ seriam capazes de ativar

macrófagos, levando à destruição dos bacilos. Também tem sido descrito que

linfócitos T CD8 de camundongos infectados são capazes de produzir IFN-γ em

resposta ao reconhecimento de antígenos de M. tuberculosis apresentados por

macrófagos ou células dendríticas (SERBINA & FLYNN, 1999). Além disso, os

linfócitos T citotóxicos podem lisar as células alvo via a ação conjunta das perforinas

e granulisinas ou pela via Fas/FasL (STENGER et al., 1998; SILVA et al., 2001;

GROTZKE & LEWINSOHN et al., 2005).

Conforme citado acima, o controle da infecção é baseado numa resposta do

tipo Th1, e a citocina IL-12 tem papel fundamental neste direcionamento da resposta

imune, uma vez que, a produção desta citocina é induzida após a fagocitose do

bacilo pelos macrófagos ou por células dendríticas, direcionando assim a resposta

imune para um perfil do tipo Th1, com produção de IFN-γ (HENDERSON et al.,

1997; LADEL et al., 1997; SANO et al., 1999). Outra citocina que merece destaque é

o TNF-α, pois estudos sugerem que esta citocina tem papel fundamental na

formação e manutenção do granuloma em humanos e camundongos (NAU et al.,

1997; FLYNN & CHAN, 2005). Por outro lado, o TNF-α também contribui

Introdução

significativamente para o desenvolvimento da imunopatologia da tuberculose. Um

ponto importante, quando se trata do desenvolvimento de vacina para tuberculose, é

alcançar uma resposta imune protetora de maneira que não cause lesão tecidual

exacerbada.

Atualmente, a única vacina utilizada contra tuberculose é a Mycobacterium

bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), uma vacina viva baseada em Mycobacterium

bovis atenuado, introduzida para uso humano em 1921. Porém, estudos realizados

em diferentes populações têm demonstrado que esta vacina não proporciona uma

proteção consistente contra essa doença (proteção varia de 0% a 80%),

particularmente contra a tuberculose pulmonar adulta (FINE, 1995). Além disso, a

vacinação com BCG possui outras desvantagens, tais como, indivíduos vacinados

com BCG apresentam uma resposta de hipersensibilidade do tipo tardia ao teste

PPD (LOWRIE et al., 1995; LOWRIE et al., 1997a), não podendo assim, distinguir se

o mesmo foi exposto ao M. tuberculosis; em relação à segurança, existe uma

preocupação crescente quanto ao uso de organismos vivos em indivíduos

imunocomprometidos, fato especialmente agravante se considerarmos que, no caso

da tuberculose, a co-infecção pelo HIV tem se tornado cada vez mais comum.

Diante disso, inúmeras pesquisas visando desenvolver novas vacinas, as quais

incluem o uso de antígenos recombinantes, peptídeos sintéticos e DNA plasmideal,

têm sido realizadas em modelos animais. Progresso considerável tem sido

observado com vacinas de DNA plasmideal clonados com genes para antígenos de

M. tuberculosis, dos quais destacam-se os antígenos ESAT 6, Ag 85 e Hsp65

(LOZES et al., 1997; LOWRIE et al., 1997b; BONATO et al., 1998; DENIS et al.,

1998; KAMATH et al., 1999).

Estudos desenvolvidos no Centro de Pesquisa em Tuberculose da FMRP-USP

têm confirmado que a vacinação com DNA plasmideal é efetiva, ou seja, resultados

Introdução

experimentais demonstraram que a vacinação, por via intramuscular, com DNA

plasmideal codificando a Hsp65 de M. leprae (DNA-Hsp65) é capaz de proteger

camundongos Balb/c contra subseqüente desafio com a linhagem virulenta H37Rv

de M. tuberculosis (LOWRIE et al., 1994; TASCON et al., 1994). Esta proteção foi

atribuída principalmente à linfócitos T antígeno específicos, produtores de IFN-γ,

com atividade citotóxica, e perfil característico de resposta imune do tipo Th1

(BONATO et al., 1998; SILVA & LOWRIE, 2000). Além disso, estudos adicionais,

utilizando camundongos infectados com M. tuberculosis e posteriormente tratados

com a vacina DNA-Hsp65, demonstraram um declínio significativo no número de

bactérias no pulmão e no baço, com predomínio de uma resposta imune de padrão

Th1. Desta forma, a vacinação com DNA-Hsp65 também foi efetiva quando utilizada

como terapia contra a tuberculose (LOWRIE et al., 1999).

Apesar dos excelentes resultados obtidos nos experimentos de proteção e

terapia, no mínimo três doses de quantidades elevadas do DNA-Hsp65 (100

µg/dose) são necessárias para alcançá-los. Assim, alternativamente a vacina de

DNA plasmideal (DNA nu), outras abordagens vacinais têm sido desenvolvidas pelo

nosso grupo de pesquisa. Além disso, o interesse em novas abordagens deve-se ao

fato de que, apesar da vacina de DNA ter se mostrado eficiente em induzir uma

resposta imune protetora em vários modelos animais de doenças infecciosas ou não

(ULMER et al., 1993; GURUNATHAN et al., 2000), quando testada em ensaios

clínicos humanos, em geral, os resultados não foram promissores (O'HAGAN et al.,

2004), provavelmente devido à dose e a falta de conhecimento do tráfego

intracelular do DNA plasmideal.

Desta forma, a fim de melhorar a eficiência da vacina de DNA nu, estratégias

utilizando sistemas carreadores têm sido empregadas com o intuito de proteger o

DNA plasmideal de nucleases responsáveis pela sua degradação, melhorar o

Introdução

processo de transfecção de células apresentadoras de antígenos, já que essas

células são essenciais para promover uma resposta imune mediada por células T

(MANICKAN et al., 1997; TIMARES et al., 1998), e conseqüentemente reduzir a

quantidade de DNA e o número de doses administradas.

VACINAS DE DNA ENCAPSULADAS

Dentre os sistemas carreadores utilizados atualmente, destaca-se o

encapsulamento do DNA em microesferas compostas de polímeros de ácido lático e

glicólico [PLGA: (poli(D,L-lático-co-glicólico)]. Essas microesferas de PLGA possuem

as vantagens de serem biodegradáveis e biocompatíveis, já que uma vez

degradadas, liberam o ácido lático e ácido glicólico, os quais são substratos inócuos

ao organismo, sendo metabolizados via o ciclo do ácido cítrico (PANYAM &

LABHASETWAR, 2003). Além disso, esses polímeros já são utilizados para fins

cirúrgicos na composição de fios de sutura e de implantes, sendo assim, este

material já está bem caracterizado e aprovado para uso em humanos (HANAFUSA

et al., 1995; MATSUSUE et al., 1995; MOONEY et al., 1997; EISELT et al., 1998).

Em adição, este sistema apresenta grande aplicabilidade no campo da imunização

uma vez que ele pode ser projetado para liberar quantidades do plasmídeo de forma

contínua ou pulsátil (ELDRIDGE et al., 1991; JIANG et al., 2005). Além disso, outras

vantagens são oferecidas pela utilização das microesferas de PLGA, dentre elas: (i)

proteção do plasmídeo encapsulado possibilitando uma redução na quantidade

utilizada; (ii) interação com células do sistema fagocitário mononuclear; (iii) facilidade

de administração; (iv) estabilidade, uma vez que as microesferas são armazenadas

sob a forma de um pó liofilizado que pode ser reconstituído imediatamente antes da

administração; (v) possibilidade de inclusão de diferentes antígenos e/ou adjuvantes

Introdução

em uma única formulação; e (vi) a produção de vacinas de dose única (HANES et

al., 1995; WAECKERLE-MEN & GROETTRUP, 2005). Cabe ressaltar que o

tamanho das partículas (1 µm a 10 µm) desempenha um papel fundamental na

propriedade adjuvante das microesferas, pois favorece a captura por células

apresentadoras de antígenos e conseqüentemente seu transporte para os

linfonodos, representando assim uma estratégia importante para desencadear uma

resposta imune mediada por linfócitos T (JILEK et al., 2005).

Em adição às vantagens acima descritas, estudos têm comprovado que a

administração de microesferas contendo DNA plasmideal estimula uma resposta

imune específica ao antígeno em questão (CHEN et al., 1998; HEDLEY et al.,1998;

JONES et al., 1997; CAI et al., 2005). Corroborando com esses resultados, estudos

realizados no Centro de Pesquisa em Tuberculose, utilizando-se microesferas de

PLGA contendo DNA-Hsp65 e o adjuvante dimicolato de trealose (DMT), têm

demonstrado que este tipo de vacinação é capaz de gerar eficiente resposta imune

humoral (IgG2a) e celular (altos níveis de IFN-γ), além de conferir proteção aos

camundongos Balb/c contra subseqüente desafio com a linhagem virulenta H37Rv

de M. tuberculosis (LIMA et al., 2003). Esta abordagem, comparada ao DNA nu

(DNA-Hsp65), forneceu vantagens como a redução no número de doses e na

quantidade de DNA-Hsp65 administrada por via intramuscular, ou seja, com as

microesferas contendo DNA-Hsp65/DMT a vacinação consistiu em uma única dose

de 30 µg de DNA-Hsp65, enquanto que no caso do DNA nu foram administradas

três doses de 100 µg de DNA plasmideal. Em adição a estas estratégias, destaca-se

o uso das microesferas como sistema de prime-boost para a prevenção da

tuberculose (RUBERTI et al., 2004). Esta abordagem vacinal baseia-se na utilização

de uma formulação contendo dois diferentes tipos de microesferas de PLGA, ou

Introdução

seja, microesferas de PLGA 50:50 (liberação rápida) contendo DNA-Hsp65/DMT

(priming) e microesferas de PLGA 75:25 (liberação lenta) contendo a proteína

recombinante Hsp65 (boost). Esta estratégia foi promissora, pois resultou em uma

resposta imune prolongada, quando comparado com as microesferas contendo

apenas DNA-Hsp65/DMT, com altos níveis de anticorpos específicos para Hsp65 e

produção de IFN-γ que persistiram por até 90 dias após a imunização.

TRÁFEGO INTRACELULAR

Apesar do progresso das vacinas de DNA plasmideal (com ou sem

carreadores) em relação à imunogenicidade e proteção, o tráfego intracelular e a

biodistribuição do DNA plasmideal nu ou encapsulado em microesferas é um

processo ainda pouco explorado. Investigações sobre o itinerário intracelular do DNA

plasmideal têm sido abordadas em estudos utilizando DNA adsorvido em polímeros

ou lipídeos catiônicos, ou encapsulados em nanoesferas de PLGA (PANYAM &

LABHASETWAR, 2003; JILEK et al., 2005; LECHARDEUR et al., 2005). Alguns

estudos sugerem que polímeros ou lipídeos catiônicos são internalizados por

endocitose mediada por clatrina (CLARK & HERSH, 1999), entretanto, o tamanho,

bem como a composição, podem influenciar no mecanismo de internalização. Desta

forma, lipídeos catiônicos com diâmetro acima de 500 nm são preferencialmente

internalizados por endocitose independente de clatrina ou via receptor, enquanto

que partículas menores (< 200 nm) podem ser internalizadas por endocitose

dependente de clatrina (SIMOES et al., 1999). No caso do DNA plasmideal

encapsulado em polímeros de PLGA a internalização ocorre via fagocitose, para

microesferas com diâmetro de 1 a 10 µm, e através de pinocitose ou endocitose

Introdução

dependente de clatrina, para nanopartículas em torno de 70 nm (PANYAM &

LABHASETWAR, 2003; JILEK et al., 2005).

Após a captura, o próximo passo é a liberação do plasmídeo para o

compartimento citoplasmático, e isto ocorre provavelmente através da ruptura ou da

desestabilização da membrana dos endossomos ou lisossomos. De fato, estudos

sugerem que o complexo DNA plasmideal/lipídeos catiônicos sofre fusão com a

membrana dessas organelas permitindo o escape do DNA para o citosol (ZELPHATI

& SZOKA, 1996a; ZELPHATI & SZOKA, 1996b; MUI et al., 2000). No caso dos

polímeros catiônicos, o mecanismo sugerido é “escape mediado por esponja de

prótons” (“proton sponge-mediated escape”). Esta teoria baseia-se no fato de que

as membranas endossomais/lisossomais possuem bombas de prótons V-ATPase

que transportam prótons para o interior das organelas resultando na sua acidificação

(GRABE & OSTER, 2001). Desta forma, a presença de polímeros ionizáveis no

endossomo acarreta o influxo de prótons seguido de íons cloreto e água, aumentado

assim, a pressão osmótica e o tamanho da organela, e conseqüentemente levando à

ruptura da membrana permitindo o escape do DNA plasmideal para o citoplasma

(KLEMM et al., 1998; SONAWANE et al., 2003). A seguir, uma vez o DNA

plasmideal livre no citoplasma, este poderá se difundir através do poro nuclear e

alcançar o núcleo, local no qual será transcrito.

Sobre o tráfego do DNA nu, sem sistemas carreadores, estudos têm

demonstrado que a captura do DNA plasmideal por células musculares ocorre por

endocitose mediada por caveolina (WOLFF et al., 1992; BUDKER et al., 2000).

Alternativamente, BASNER-TSCHAKARJAN et al. (2004) demonstraram que em

queratinócitos, o processo de captura ocorre por macropinocitose. Apesar de

atualmente o tráfego intracelular do DNA nu ser um processo ainda pouco

conhecido, tem sido proposto que após a captura, o DNA segue para o

Introdução

compartimento endossomal, e neste ponto ele poderá escapar para o citoplasma ou

seguir em direção aos lisossomos. Nos lisossomos, o DNA plasmideal poderá ser

degradado, ou alternativamente poderá escapar para o citoplasma, semelhante ao

que provavelmente acontece nos endossomos, porém, cabe ressaltar que esses

mecanismos ainda não estão esclarecidos. Uma vez no citosol, o DNA seguirá em

direção ao núcleo para ser transcrito (WATTIAUX et al., 2000; LECHARDEUR &

LUKACS, 2002; WIETHOFF & MIDDAUGH, 2003; LECHARDEUR et al., 2005).

Na tentativa de esclarecer o tráfego intracelular, vários marcadores específicos

têm sido utilizados, principalmente no tráfego endo-lisossomal (Esquema 1). Dentre

eles destacam-se as proteínas Rab, as quais são responsáveis pela regulação do

transporte entre as organelas, sendo então distribuídas em distintos compartimentos

celulares, tais como, endossomos precoces (Rab5), endosomos tardios (Rab7) e

complexo de Golgi (Rab 11) (ZERIAL & McBRIDE, 2001). Outro marcador

comumente utilizado é a proteína de membrana associada ao lisossomo (LAMP) que

está presente nas membranas dos endossomos tardios e lisossomos (PILLAY et al.,

2002).

Em relação à biodistribuição do DNA plasmideal, estudos realizados em nosso

laboratório demonstraram que quinze dias após a administração por via

intramuscular, mensagem para Hsp65 foi detectada no músculo e fígado, para a

vacinação com DNA nu (DNA-Hsp65) (COELHO-CASTELO et al., 2006), ao passo

que para microesferas contendo DNA-Hsp65/DMT a mensagem foi detectada no

músculo, fígado, linfonodo drenante e baço (LIMA et al., 2003). Além disso, estudos

adicionais utilizando DNA nu demonstraram a presença de mensagem para Hsp65

em outros órgãos, quando diferentes períodos foram analisados, ou seja, dois e sete

dias após a imunização, resultados positivos foram obtidos para linfonodo drenante,

medula óssea e baço, enquanto que para o timo a mensagem foi detectada somente

Introdução

no período de dois dias após a imunização (COELHO-CASTELO et al., 2006).

Quanto as microesferas, não há dados sobre a sua biodistribuição, e apesar de

estudos demonstrarem que células apresentadoras de antígenos são as

responsáveis pela sua captura in vitro e in vivo, sendo que neste último caso quando

administradas por via intraperitoneal e intradérmica (WALTER et al., 2001;

NEWMAN et al., 2002), o destino das partículas e até mesmo as células

responsáveis pela captura, após a administração intramuscular, ainda não foi

esclarecido.

Diante dos dados apresentados pelo Centro de Pesquisa em Tuberculose -

FMRP sobre a eficiência da vacina de DNA-Hsp65 (encapsulado ou não) contra

tuberculose, o esclarecimento da biodistribuição e tráfego intracelular das

microesferas contendo DNA-Hsp65/DMT, adicionado ao entendimento do tráfego

intracelular do DNA nu (DNA-Hsp65), são informações importantes para o

desenvolvimento de novos plasmídeos e/ou carreadores, que por sua vez, poderão

refletir no uso de pequenas doses de DNA, sendo importantes para os testes pré-

clínicos já iniciados pelo nosso grupo de pesquisa, além do que, o entendimento

destes mecanismos pode colaborar com o desenvolvimento de sistemas mais

eficientes de veiculação de vacinas, bem como esclarecer os mecanismos

envolvidos na ativação e/ou manutenção da resposta imune.

Introdução

2. OBJETIVOS

Objetivos

Os objetivos do presente trabalho são:

- Determinar a biodistribuição in vivo das microesferas de PLGA [Poli (D,L-

lático-co-glicólico)] contendo DNA-Hsp65/DMT;

- Identificar in vivo, os tipos celulares envolvidos na captura das microesferas,

após imunização intramuscular;

- Esclarecer o tráfego intracelular in vitro das microesferas de PLGA contendo

DNA-Hsp65/DMT e do DNA nu (DNA-Hsp65), utilizando microscopia de

fluorescência e microscopia confocal.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais e Métodos

3.1. PLASMÍDEOS: OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO

3.1.1. Obtenção dos plasmídeos recombinates pcDNA

-Hsp65 e pcDNA

Os plasmídeos pcDNA

-Hsp65 e pcDNA

(vetor) foram purificados por

cromatografia de troca iônica, utilizando-se Endofree Plasmid Giga Kit

(QIAGEN

Inc., Valencia, CA, USA). Para a realização desse protocolo, uma colônia de

bactérias Echerichia coli DH5α™ transformada com o plasmídeo recombinante

pcDNA

-Hsp65 ou plasmídeo pcDNA

foi retirada de uma placa recém preparada

contendo meio LB Agar (SIGMA, Germany) e ampicilina (Cilinon

) na concentração

de 100 µg/ml. Esta colônia foi inoculada em 5,0 ml de caldo LB BROTH BASE

(GIBCO BRL, Scotland) com ampicilina (100 µg/ml) e incubada durante 8 horas a

C sob agitação vigorosa (250 rpm) em incubadora com agitação (Incubador

shaker series 25, New Brunswick, Edison, New Jersey, USA). A cultura inicial foi

diluída 1/500 em 2,5 litros de caldo LB BROTH BASE, contendo ampicilina (100

µg/ml), e incubada a 37°C sob agitação (250 rpm) durante 16 horas. Após incubação

o material foi centrifugado a 5.500 rpm por 15 minutos a 4°C e o sedimento

ressuspendido em 125 ml de tampão P1 (Tris-HCl 50 mM pH 8,0; EDTA 10 mM e

RNAse 100 µg/ml). Em seguida foram adicionados 125 ml de tampão P2 (NaOH 200

mM; SDS1%) e após 5 minutos adicionou-se 125 ml do tampão P3 (acetato de

potássio 3,0 M pH 5,5). O material foi filtrado, adicionado ao tampão ER (para

remoção do LPS – composição não revelada pelo fabricante) e mantido no gelo por

30 minutos. O filtrado foi aplicado à resina da QIAGEN

previamente equilibrada

com tampão QBT (NaCl 750 mM; MOPS 50 mM pH 7,0; etanol 15% e Triton X-100

0,15 %). Após a aplicação do filtrado, a resina foi lavada com 600 ml de tampão QC

Materiais e Métodos

(NaCl 1,0 M; MOPS 50 mM pH 7,0; etanol 15 %) e o DNA plasmideal foi eluído com

30 ml de tampão QF (NaCl 1,25 M; MOPS 50 mM pH 7,0; etanol 15 %). O DNA

eluído foi precipitado em 52,5 ml de isopropanol e em seguida centrifugado a 14000

rpm por 45 minutos a 4°C e o sedimento ressuspendido em 0,5 - 1,0 ml de água.

3.1.2. Quantificação dos plasmídeos purificados

A quantificação dos plasmídeos pcDNA

-Hsp65 e pcDNA

foi realizada por

espectrofotometria nos comprimentos de onda de 260 nm e 280 nm utilizando o

aparelho Gene Quant II

(Pharmacia Biotech, Cambridge - England).

3.1.3. Avaliação da integridade dos plasmídeos

A presença do inserto da Hsp65 no plasmídeo pcDNA

-Hsp65 foi verificada

utilizando as enzimas de restrição BamH I (Invitrogen, life technologies) e Not I

(Invitrogen, life technologies). Um micrograma do plasmídeo pcDNA

-Hsp65 foi

incubado com BamH I (1 unidade/µg de DNA) e Not I (1 unidade/µg de DNA) a 37

por 3 horas. Para o vetor pcDNA

utilizou-se apenas a enzima de restrição BamH I.

Em seguida os produtos da digestão de cada amostra, e também os plasmídeos não

digeridos, foram submetidos a eletroforese em gel de agarose (Sigma-Aldrich,

Germany) a 1%. As amostras foram ressuspendidas em tampão de eletroforese 6

vezes concentrado (0,25 % azul de bromofenol; 40 % de sucrose em água) e o

material submetido a eletroforese em tampão TAE (Tris-acetato 40 mM; EDTA 1 mM

pH 8,3). A corrida foi realizada a 76 V por 1 hora utilizando o aparelho da Life

Tecnologies Inc., Modelo 250 (BRL). O padrão de 1Kb DNA Ladder (Invitrogen, life

technologies) foi utilizado como marcador de peso molecular. O gel foi corado com

Materiais e Métodos

0,5 µg/ml de brometo de etídio (Gibco BRL) e a visualização das bandas foi feita em

luz ultravioleta no ImageMaster VDS (Pharmacia Biotech).

3.2. MICROESFERAS: ENCAPSULAMENTO DOS PLASMÍDEOS E

CARACTERIZAÇÃO DAS PARTÍCULAS

3.2.1. Encapsulamento dos plasmídeos pcDNA

-Hsp65 e pcDNA

juntamente com

dimicolato de trealose (DMT) em microesferas poliméricas biodegradáveis

As microesferas de PLGA [50:50 Poli (D,L-lático-co-glicólico)] foram obtidas

pelo método da emulsão múltipla e evaporação do solvente. Para isso, a fase

aquosa (300 µL) contendo pcDNA

-Hsp65 ou pcDNA

(5,0 mg) foi emulsionada, sob

forte agitação (11000 rpm), em uma solução de 30 ml de cloreto de metileno

contendo 400 mg de PLGA 50:50 (Resomer RG 505, Boehringer Ingelheim), 6,6 mg

de coumarina - 6 [marcador fluorescente verde (λ

:505 nm) - Sigma Aldrich] e 500

µL de DMT (1 mg/ml; SIGMA ALDRICH - USA), utilizando o homogeneizador

Ultraturrax T 25 (IKA – Labortechnik, Germany) para obtenção de uma emulsão

primária água/óleo (A/O). Esta emulsão foi vertida na fase aquosa externa (100 ml),

contendo 3% de álcool poli vinílico (Mowiol 40-88, Aldrich Chemicals) como

tensoativo, e homogeneizada, para assim formar a emulsão água/óleo/água (A/O/A).

O solvente orgânico foi eliminado por evaporação à temperatura ambiente sob

agitação (800 rpm) com o auxílio do homogeneizador RW20N (IKA – Labortechnik,

Germany) por 6 horas (Esquema 2). As microesferas foram coletadas por

centrifugação a 14000 rpm por 10 minutos a 4°C, lavadas três vezes com água

Materiais e Métodos

estéril, liofilizadas por 12 horas e armazenadas a 4°C. Todo esse processo foi

realizado de forma asséptica, utilizando fluxo laminar e material estéril.

Cabe ressaltar que para os ensaios de biodistribuição das microesferas foi

adicionado 6,6 mg de coumarina - 6 na formulação, conforme descrito acima, porém

para os ensaios de tráfego intracelular, utilizou-se 60 µg deste mesmo marcador.

3.2.2. Avaliação da eficiência do encapsulamento dos plasmídeos pcDNA

-Hsp65

e pcDNA

A taxa de encapsulamento dos plasmídeos foi determinada conforme descrito

por BARMAN et al.(2000). Aproximadamente 10 mg de microesferas foram pesadas

e ressuspendidas em 200 µL de TE (10mM Tris-HCl pH=8,0, 1 mM EDTA). Em

seguida 500 µL de clorofórmio foram adicionados à suspensão para solubilizar as

microesferas. As amostras foram homogeneizadas durante 1 hora à temperatura

ambiente, utilizando um rotator orbital (HYBAID, Maxi Hybridisation), e centrifugadas

a 14000 rpm, por 5 minutos, a 4°C. O sobrenadante contendo o DNA extraído das

microesferas foi diluído apropriadamente e a quantidade de DNA foi determinada

conforme a seguinte equação:

DNA (µg/mg microesferas) = Absorbância

λ=260nm

x fator de diluição)/ (ε*w*b),

onde ε = 50

-1

(coeficiente de extinção), w = peso das microesferas em mg, b =

caminho óptico (1 cm).

Materiais e Métodos

3.2.3. Determinação do diâmetro das microesferas

O diâmetro das partículas foi determinado por difratometria laser utilizando o

aparelho SALD-2101 (SHIMADZU), e os resultados foram apresentados na forma de

mediana.

3.3. MICROESFERAS: EXPERIMENTOS IN VIVO - BIODISTRIBUIÇÃO E

CÉLULAS ENVOLVIDAS NO PROCESSO DE CAPTURA

3.3.1. Imunização dos camundongos com microesferas de PLGA fluorescentes

para o ensaio de biodistribuição

Camundongos BALB/c machos, com aproximadamente 25 dias, foram

imunizados, por via intramuscular, com uma dose de microesferas contendo 30 µg

de DNA (DNA-Hsp65/DMT). As microesferas (30 µg DNA/animal) foram

ressuspendidas em PBS estéril e as injeções aplicadas nos músculos quadríceps

das patas traseiras, sendo o volume injetado de 50 µL/músculo. Os animais foram

sacrificados nos tempos de 24 horas, 7 dias, 15 dias, 30 dias, 60 dias e 120 dias

após a imunização, e os seguintes órgãos foram retirados: os linfonodos drenantes,

medula óssea, timo, pulmão, baço, rim, fígado e testículos. Os cinco primeiros

grupos (24 horas – 60 dias) foram compostos por cinco camundongos, enquanto que

o último grupo (120 dias) foi composto por três camundongos. Como controle do

experimento foi utilizado um animal imunizado com a formulação contendo DNA-

Hsp65 sem coumarina.

Materiais e Métodos

3.3.2. Avaliação da biodistribuição das microesferas de PLGA fluorescentes

Para o ensaio de biodistribuição as células foram obtidas conforme descrito

abaixo:

- Pulmão: o órgão foi coletado e cortado em fragmentos. Para liberar as células

do tecido a amostra foi agitada (200 rpm, 37

C) por 20 minutos em uma solução de

digestão [15 ml de RPMI incompleto + 1,25 µL de liberase (Roche)]. Em seguida, a

amostra foi centrifugada (1500 rpm, 5 min, à 4

C) e o precipitado ressuspenso em 5

ml de RPMI completo. Este material foi peneirado e tratado com uma solução de lise

para hemácias (1,54 g NH4Cl + 0,41 g Tris para 200 ml de água, pH=7,65). Para

desfazer possíveis aglomerados a suspensão celular foi tratada com DNAse 0,025%

(DN-25 - Sigma). Para avaliar a presença de microesferas fluorescentes, as células

obtidas (aproximadamente 1 x 10

células) foram ressuspendidas em 300 µL de PBS

contendo 1% de formaldeído e analisadas no citômetro de fluxo (canal FL1). Foram

adquiridos 100.000 eventos por amostra.

- Fígado e testículos: os órgãos foram coletados e cortados em fragmentos.

Para liberar as células dos tecidos as amostras foram agitadas (200 rpm, 37

C) por

20 minutos em uma solução de digestão contendo 10,8 mg de colagenase IV

(Sigma-Aldrich, USA), 22 mg piruvato (Vetec) e 3 mM de cloreto de cálcio. As etapas

seguintes foram realizadas conforme descrito acima (pulmão).

- Rim: o órgão foi coletado e cortado em fragmentos. Para liberar as células do

tecido a amostra foi agitada (200 rpm, 37

C) por 20 minutos em uma solução de

digestão contendo 10,8 mg de colagenase IV (Sigma-Aldrich, USA), 30 mg tripsina

(Difco) e 3 mM de cloreto de cálcio. As etapas seguintes foram realizadas conforme

descrito acima (pulmão).

Materiais e Métodos

- Baço, timo e linfonodo: após a obtenção dos órgãos, os mesmos foram

divulsionados em meio RPMI incompleto para a obtenção de células totais. Após a

lise de hemácias (exceto para o linfonodo) utilizando-se o tampão de lise (1,54 g

NH4Cl + 0,41 g Tris para 200 ml de água, pH=7,65) as células foram lavadas com

PBS e centrifugadas por 5 minutos a 1500 rpm. Células do timo e linfonodo foram

também tratadas com DNAse 0,025% (DN-25 Sigma). Aproximadamente 1x 10

células foram ressuspensas em 300 µL de PBS contendo 1% de formaldeído e

analisadas no citômetro de fluxo (canal FL1). Foram adquiridos 100.000 eventos por

amostra.

- Medula óssea: o fêmur foi lavado com RPMI incompleto, com o auxílio de uma

seringa. Em seguida as células foram centrifugadas a 5000 rpm por 5 minutos a 4°C

e o sedimento foi ressuspendido em 1 ml de PBS. Aproximadamente 1x 10

células

foram ressuspensas em 300 µL de PBS contendo 1% de formaldeído e analisadas

no citômetro de fluxo (canal FL1). Foram adquiridos 100.000 eventos por amostra.

3.3.3. Imunização dos camundongos com microesferas de PLGA fluorescentes

para caracterizar os tipos celulares envolvidos na captura

Camundongos BALB/c machos foram imunizados conforme descrito no item

3.3.1 com as microesferas fluorescentes contendo pcDNA

-Hsp65/DMT,

pcDNA

/DMT (30 µg DNA/animal) ou formulação vazia (apenas o polímero, sem

DNA plasmideal e DMT). Os animais foram sacrificados após 7 dias e os linfonodos

drenantes foram coletados. Cada grupo foi composto por cinco camundongos. Como

controle do experimento foi utilizado um grupo de animais (5 animais) que

receberam 50 µL de PBS/músculo.

Materiais e Métodos

3.3.4. Caracterização dos tipos celulares envolvidos na captura da microesfera e

avaliação da expressão de moléculas de superfície

Os linfonodos drenantes (pool de cinco animais) foram coletados e

divulsionados em RPMI incompleto para a obtenção de células totais. As células

foram lavadas com PBS e centrifugadas por 5 minutos a 1500 rpm. Em seguida

foram ressuspensas em 600 µL de PBS e incubadas por 45 minutos a 4

C na

presença do anticorpo anti-CD16/CD32 (Fc Block - 2.4G2 PharMingen, San Diego,

CA). Posteriormente, as suspensões celulares (aproximadamente 1x 10

células por

tubo) foram incubadas, durante 30 minutos a 4

C, com diferentes anticorpos: anti-

CD80, anti-CD86, anti-CD11b, anti-CD11c ou anti-IA

conjugados com ficoeritrina

(PE). Em seguida as amostras foram lavadas em PBS contendo 2% de soro fetal

bovino e o pellet ressupendido em 300 µL de PBS contendo 1% de paraformaldeído

e analisadas por citometria de fluxo. Foram adquiridos 100.000 eventos por amostra.

Como controles foram utilizados anticorpos não relacionados apropriados. Todos os

anticorpos foram adquiridos da PharMingen e usados de acordo com as instruções

do fabricante. A presença das moléculas de superfície foi analisada no canal FL2 e a

presença da microesfera no canal FL1.

3.4. MICROESFERAS: FAGOCITOSE E TRÁFEGO INTRACELULAR IN VITRO

3.4.1. Microscopia de fluorescência

Células J774 ou macrófagos peritoneais (2x10

macrófagos/lamínula, obtidos

através da lavagem da cavidade peritoneal com 4 ml de PBS estéril gelado), foram

incubados durante vários períodos (2 dias, 8 dias e 10 dias) a 37

C, em meio RPMI

completo, com 2x10

microesferas fluorescentes contendo

DNA

-Hsp65/DMT. Em

Materiais e Métodos

seguida, as lamínulas foram lavadas em PBS estéril e incubadas em RPMI completo

com o marcador de vesículas acídicas, LysoTraker Red DND-99 (Molecular Probes,

Eugene Oregon, USA), durante 30 minutos a 37

C. Após esse período, as lamínulas

foram lavadas novamente com PBS estéril e colocadas em uma lâmina de vidro e

analisadas em microscópio de fluorescência (NIKON Eclipse E800, NIKON

Instruments Inc., Melville, NY). Paralelamente, macrófagos peritoneais foram

incubados com microesferas fluorescentes durante 24 horas, e após esse período,

as células foram lavadas com PBS e fixadas com paraformaldeído 2% durante 15

minutos. A lâmina foi montada com Fluormont G (EMScience) e analisada em

microscópio confocal (LEICA DM IRE2).

3.4.2. Microscopia eletrônica de transmissão

Macrófagos peritoneais (1x10

macrófagos/poço, obtidos através da lavagem

da cavidade peritoneal com 4 ml de PBS estéril gelado), foram incubados em placas

de 6 poços durante vários períodos (2 dias, 8 dias,10 dias e 15 dias) a 37

C, em

meio RPMI completo, com 1x10

microesferas fluorescentes contendo DNA-

Hsp65/DMT. Em seguida, as células foram lavadas com PBS e fixadas por 2 horas

em uma solução de cacodilato 0,1M (pH=7,4) contendo 2% de glutaraldeído e 2% de

paraformadeído. A seguir, as células foram novamente fixadas, durante 1 hora, em

outra solução de cacodilato 0,1M (pH=7,4) contendo 2% de ósmio. Nas próximas

etapas as células passaram pelos seguintes tratamentos: (1) foram lavadas com

água Milli Q, seguidas de contraste em bloco com 0,5% de solução aquosa de

acetato de uranila; (2) desidratadas em álcool; (3) retiradas da placa utilizando óxido

de propileno; (4) colocadas em eppendorff e centrifugadas em alta rotação durante 5

minutos; (5) lavadas, duas vezes, com óxido de propileno; (6) e embebidas em

Materiais e Métodos

resina utilizando a cápsula de Beem. A seguir as grades foram cortadas e analisadas

em microscópio eletrônico de transmissão (Philips).

3.5. DNA PLASMIDEAL (DNA NU): CAPTURA E TRÁFEGO INTRACELULAR IN

VITRO

3.5.1. Marcação do DNA plasmideal para os ensaios de microscopia

O DNA plasmideal (pcDNA

-Hsp65 ou pcDNA

) foi marcado com fluorocromo

Alexa 488 (verde) ou Alexa 594 (vermelho), utilizando-se o sistema ULYSIS

(Molecular Probes, Eugene Oregon, USA), com algumas modificações. Esse sistema

de marcação utiliza um método químico denominado de Universal Linkage System

(ULS) que permite a ligação estável do fluorocromo na porção N

da base guanina.

Foram utilizados 8 µg a 10 µg de plasmídeo por marcação. O DNA plasmideal a ser

marcado foi ressuspendido em 19 µL do tampão de marcação e denaturado a 95°C

durante 5 minutos. As amostras foram colocadas em gelo para a adição de 1 µL do

reagente ULS (contendo o fluorocromo) e mais 3,5 µL do tampão de marcação. A

reação foi incubada a 80°C por 15 minutos. O DNA plasmideal foi purificado do

excesso do reagente ULS através da precipitação com isopropanol (overnight, -

C). Em seguida, foi ressuspendido em água estéril e armazenado a -20°C até o

momento de uso.

Materiais e Métodos

3.5.2. Captura e tráfego intracelular do DNA plasmideal utilizando células J774,

macrófagos peritoneais ou células dendríticas

Com o objetivo de esclarecer os mecanismos de captura e o tráfego intracelular

do DNA plasmideal alguns marcadores de compartimentos específicos foram

utilizados, dentre eles, Transferrina conjugada com Alexa 594 (marcador de

endossomos precoces), LysoTraker Red ou Dextran conjugado com Texas Red

(marcadores de endossomos tardios/lisossomos), DAPI (marcador de DNA nuclear),

Rab5 (marcador de endossomo precose), LAMP 1 (proteína de membrana presente

nos endossomos tardios/lisossomos) e BiP/GRP78 (marcador de retículo

endoplasmático).

3.5.2.1. Células J774 e macrófagos peritoneais

Para estes ensaios macrófagos da linhagem J774 (2x10

células/poço) ou

macrófagos peritoneais (2x10

células/poço, obtidos através da lavagem da

cavidade peritoneal com 4 ml de PBS estéril gelado) foram incubados em câmaras

de cultura (Lab-Tek Chamber Slide, Nalge Nunc International) com meio RPMI

completo (sem vermelho de fenol) durante 12 a 24 horas a 37

C. Em seguida, as

células foram submetidas a vários tratamentos conforme descrito abaixo:

- Transferrina conjugada com Alexa Fluor 594 (Molecular Probes, Eugene

Oregon, USA): as células foram tratadas simultaneamente com 4 µg do DNA

plasmideal marcado com Alexa Fluor 488 (item 3.5.1) e 14 µg/ml de transferrina

durante 30 minutos a 37

C. Por outro lado, para o tempo de incubação de 15

minutos com o DNA, adicionou-se primeiramente a transferrina e após 15 minutos

adicionou-se o DNA por mais 15 minutos, completando assim o tempo de 30 minutos

Materiais e Métodos

do marcador (transferrina). Após esse período, as células foram lavadas com PBS

estéril e fixadas com paraformaldeído 2% durante 15 minutos. As lâminas foram

montadas com Fluormont G (EMScience) e analisadas em microscópio confocal

(LEICA DM IRE2).

- LysoTracker Red DND-99 (Molecular Probes, Eugene Oregon, USA): as

células foram tratadas com 4 µg do DNA plasmideal marcado com Alexa Fluor 488

(item 3.5.1) durante vários períodos (24 horas a 120 horas) a 37°C. Trinta minutos

antes de completar o tempo do tratamento adicionou-se o marcador de vesículas

acídicas, LysoTraker Red (160 nM). Após esse período, as células foram lavadas

com PBS estéril e fixadas com paraformaldeído 2% durante 15 minutos. As lâminas

foram montadas com Fluormont G (EMScience) e analisadas em microscópio

confocal (LEICA DM IRE2). É importante ressaltar que a fluorescência do reagente

LysoTracker Red está diretamente associada com o pH das vesículas, ou seja,

somente vesículas acídicas como os endossomos tardios e os lisossomos são alvos

deste marcador (Esquema 1).

- DAPI (Molecular Probes, Eugene Oregon, USA): as células foram tratadas

com DNA marcado com Alexa Fluor 488 e LysoTracker Red, conforme acima

mencionado, e nos últimos 20 minutos do tratamento, adicionou-se o marcador de

DNA nuclear (DAPI, 0.6mM).

- Cloroquina (Sigma-Aldrich, USA): as células foram tratadas simultaneamente

com 4 µg do DNA plasmideal marcado com Alexa Fluor 488 (item 3.5.1) e 10 µM de

cloroquina durante 4 horas a 37

C. Quando necessário, o marcador de vesículas

acídicas, LysoTraker Red DND-99 (160 nM), foi adicionado nos últimos 30 minutos

de incubação. Após esse período, as células foram lavadas com PBS estéril e

fixadas com paraformaldeído 2% durante 15 minutos. As lâminas foram montadas

Materiais e Métodos

com Fluormont G (EMScience) e analisadas em microscópio confocal (LEICA DM

IRE2). Cabe ressaltar que a cloroquina é uma substância lisossomotrópica que inibe

a acidificação endo-lisosssomal, além de causar a permeabilização das membranas

dessas vesículas.

- Dextran conjugado com Texas Red (10.000 MW, neutro – Molecular Probes,

Eugene Oregon, USA): as células foram tratadas simultaneamente com 4 ug do DNA

plasmideal marcado com Alexa Fluor 488 (item 3.5.1) e 10 ug/ml de dextran durante

24 horas a 37

C. Após esse período, as células foram lavadas com PBS estéril e

fixadas com paraformaldeído 2% durante 15 minutos. As lâminas foram montadas

com Fluormont G (EMScience) e analisadas em microscópio confocal (LEICA DM

IRE2). Paralelamente, células foram incubadas com dextran (10 µg/ml) por 24 horas

a 37

C, sendo que nos últimos 30 minutos o marcador LysoTraker Green (1 µM -

Molecular Probes, Eugene Oregon, USA) foi adicionado. Em seguida, as lamínulas

foram lavadas com PBS estéril e colocadas em uma lâmina de vidro e analisadas em

microscópio de fluorescência (NIKON Eclipse E800, NIKON Instruments Inc.,

Melville, NY).

- Rab5 (BD Transduction Laboratories): as células foram tratadas com 4 µg do

DNA plasmideal marcado com Alexa Fluor 488 (item 3.5.1) durante vários períodos

(5 minutos, 15 minutos e 19 horas) a 37°C. Após esse tratamento, as células foram

lavadas com PBS estéril e fixadas com paraformaldeído 4% durante 15 minutos. As

etapas seguintes foram realizadas da seguinte forma: (1) as células foram incubadas

por 5 minutos com glicina 0,1M; (2) as células foram bloqueadas com IgG (IgG de

asno, 20 µg em BSA 3%) durante uma hora; (3) a seguir as células foram incubadas

por uma hora, à temperatura ambiente, com o anticorpo primário anti-Rab5 (IgG de

camundongo, 10 µg em saponina 0,01% preparada em BSA 1%); (4) adicionou-se o

Materiais e Métodos

anticorpo secundário anti-IgG de camundongo marcado com Texas Red durante

uma hora à temperatura ambiente (diluído 1: 250 em BSA 1%, Santa Cruz

Biotechnology, Inc.). Entre cada etapa (1-4) as células foram lavadas cinco vezes

com PBS. A seguir as lâminas foram montadas com Fluormont G (EMScience) e

analisadas em microscópio confocal (LEICA DM IRE2).

- LAMP 1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.): as células foram tratadas com 4 µg

do DNA plasmideal marcado com Alexa Fluor 488 (item 3.5.1) durante 24 horas a

37°C. Após esse tratamento, as células foram lavadas com PBS estéril e fixadas

com paraformaldeído 4% durante 15 minutos. As etapas seguintes foram realizadas

conforme descrito para o Rab5, alterando-se apenas os anticorpos utilizados, ou

seja, anticorpo primário anti-LAMP 1 (IgG de cabra, 7 µg em saponina 0,01%

preparada em BSA 1%), e anticorpo secundário anti-IgG de cabra marcado com

Alexa 594 (diluído 1: 250 em BSA 1%, Molecular Probes, Eugene Oregon, USA.).

- BiP/GRP78 (BD Transduction Laboratories): as células foram tratadas com 4

µg do DNA plasmideal marcado com Alexa Fluor 488 (item 3.5.1) durante 24 horas e

19 horas a 37°C. Após esse tratamento, as células foram lavadas com PBS estéril e

fixadas com paraformaldeído 4% durante 15 minutos. As etapas seguintes foram

realizadas conforme descrito para o Rab5, alterando-se apenas os anticorpos

utilizados, ou seja, anticorpo primário anti-BiP/GRP78 (IgG de cabra, 7 µg em

saponina 0,01% preparada em BSA 1%), e anticorpo secundário anti-IgG de cabra

marcado com Alexa 594 (diluído 1: 250 em BSA 1%, Molecular Probes, Eugene

Oregon, USA.).

Materiais e Métodos

3.5.2.2. Células dendríticas derivadas do baço

Paralelamente estudos de captura e tráfego foram realizados utilizando células

dendríticas derivadas do baço de camundongo Balb/c conforme descrito por WEST

et al. (1999). Essas células foram obtidas da seguinte forma: após a remoção das

células do baço, as mesmas foram distribuídas em placas de baixa aderência, e

mantidas durante 14 dias em meio RPMI suplementado com 10% de soro bovino

fetal, 100 mM de piruvato de sódio, 10 mM de aminoácidos não essenciais, 10 mg/ml

de canamicina, 200 mM de glutamina, 10 mM de β-mercaptoetanol, 10 ng/ml GM-

CSF (PeproTech EC Ltd, GB) e 1 ng/ml de TGF-β (R & D Systems Europe, Ltd.;

citocina utilizada para manutenção das células dendríticas em cultura). Cabe

ressaltar que este meio foi trocado a cada dois dias. Após este período a expressão

de moléculas de superfície foi avaliada por citometria de fluxo, sendo 99% das

células foram positivas para as moléculas CD11c, MHC de classe II e DEC205. A

cultura foi negativa para células B e células T.

Após a diferenciação, as células dendríticas foram tratadas com 4 µg do DNA

plasmideal marcado com Alexa Fluor 488 (item 3.10) durante 1 hora a 37°C. Trinta

minutos antes de completar o tempo do tratamento adicionou-se o marcador de

vesículas acídicas, LysoTraker Red (160 nM). Após esse período, as células foram

lavadas com PBS e analisadas em microscópio vital (LEICA 570).

3.6. CAPTURA DO DNA PLASMIDEAL POR CÉLULAS KNOCKOUT DE TLR9

Células dendríticas proveniente da medula óssea de camundongos deficientes

(knockout) do receptor TLR9 foram obtidas da seguinte forma: após a retirada do

Materiais e Métodos

tecido adjacente, os ossos foram partidos em ambiente estéril, sendo a medula

óssea lavada com PBS utilizando uma seringa com agulha 13 x 4,5 mm. As células

recém colhidas da medula óssea foram lavadas em PBS e centrifugadas a 1500 rpm

por 10 minutos. Em seguida foram incubadas com tampão de lise de hemácias,

novamente lavadas e centrifugadas a 1500 rpm por 10 minutos, diluídas em RPMI-

1640 suplementado (10% de SBF, 2 mM de glutamina, 50 UI de penicilina e 50

mg/ml de estreptomicina) e distribuídas em placas de 24 poços (2,5 x 10

) na

presença das citocinas GM-CSF (20 ng/ml, R&D systems) e IL-4 (10 ng, R&D

systems).O tempo de cultura foi de seis dias, sendo o meio trocado de 3 em 3 dias.

A seguir, as células dendríticas foram removidas e transferidas (2 x 10

células/poço)

para as câmaras de cultura (Lab-Tek Chamber Slide, Nalge Nunc International) e,

incubadas em meio RPMI completo (sem vermelho de fenol) durante 2 horas a 37

Feito isso, as células foram incubadas com 4 µg DNA plasmideal marcado com

Alexa Fluor 594 durante uma hora. Após esse período, as células foram lavadas com

PBS estéril e fixadas com paraformaldeído 2% durante 15 minutos. As lâminas foram

montadas com Fluormont G (EMScience) e analisadas em microscópio confocal

(LEICA DM IRE2).

Materiais e Métodos

3.7. DNA PLASMIDEAL (DNA NU): ENSAIO DE APRESENTAÇÃO DE ANTÍGENO

E RECRUTAMENTO DE MyD88

3.7.1. Influência do tratamento com DNA plasmideal na apresentação de antígeno

3.7.1.1. Obtenção dos linfócitos T CD4 e das células apresentadoras de

antígenos (macrófagos peritoneais)

Camundongos BALB/c machos foram imunizados, por via subcutânea, com 50

µg de KLH (Keyhole limpet haemocyanin, Sigma-Aldrich, Germany) em 50 µL de

adjuvante completo de Freund (50 µg de KLH em cada coxim plantar; Sigma-Aldrich,

Germany). Após sete dias, outra dose de 50 µg de KLH em 50 µL de adjuvante

incompleto de Freund (Sigma-Aldrich, Germany) foi administrada (dose total: 200 µg

de KLH). A seguir, sete dias após a última imunização, linfócitos T CD4 provenientes

dos linfonodos poplíteos foram purificados utilizando MicroBeads CD4 - L3T4

(Miltenyi Biotec GmbH, Germany). Como células apresentadoras de antígenos foram

utilizados macrófagos peritoneais de camundongos Balb/c não imunizados, obtidos

através da lavagem da cavidade peritoneal com 4 ml de PBS estéril gelado. Para o

experimento de apresentação de antígeno, macrófagos peritoneais (5x10

células)

foram pré-incubados com 20 µg de pcDNA

-Hsp65 por vários períodos (0 horas, 24

horas, 48 horas ou 72 horas), e em seguida foram tratados com KLH por mais 24

horas.

3.7.1.2. Ensaio de proliferação celular

Após o tratamento com KLH, os macrófagos peritoneais (5x10

células) foram

fixados com paraformaldeído 1% durante quinze minutos. A seguir, após a lavagem

Materiais e Métodos

com PBS estéril, 5x10

células T CD4 (purificadas dos linfonodos dos animais

imunizados com KLH) foram adicionadas e a cultura foi mantida em RPMI 1640

suplementado (10% de SBF, 2 mM de glutamina, 50 UI de penicilina e 50 mg/ml de

estreptomicina) durante 72 horas. Para avaliar a proliferação dos linfócitos, 16

horas antes de completar o tempo total de incubação (72 horas) foi adicionado 0,5

µCi de 3H-timidina em RPMI 1640 suplementado. Após o período de 72 horas, as

células foram coletadas em filtros e a radiotividade foi quantificada no aparelho de

cintilação (Beckman, Germany). Os resultados foram expressos em CPM (3H-

contagem por minuto). Este ensaio foi realizado em triplicata, e como controle

positivo os linfócitos T CD4 foram estimulados com Concanavalina A (ConA - 40

µg/ml, Sigma, USA).

3.7.2. Recrutamento da molécula MyD88 após o tratamento com DNA plasmideal

Para visualizar o recrutamento da molécula MyD88, após o tratamento com

DNA plasmideal, foi utilizada a linhagem de célula Raw-MyD88GFP (gentilmente

cedidas pelo Dr. Hermann Wagner - Institute of Medical Microbiology, Immunology

and Hygiene, Munich, Germany). Esta linhagem foi gerada através da tranfecção

estável com o plasmídeo pEF-MyD88-GFP (GFP: green fluorescent protein)

(AHMAD-NEJAD et al., 2002). Assim, para este experimento, as células Raw-

MyD88GFP foram tratadas com DNA plasmideal marcado com Alexa Fluor 594

(vermelho) durante 24 horas, e em seguida, as lamínulas foram lavadas com PBS

estéril e colocadas em uma lâmina de vidro e analisadas em microscópio de

fluorescência microscopia confocal (LEICA DM IRE2).

4. RESULTADOS

Resultados

4.1. OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS PLASMÍDEOS pcDNA

-HSP65 E

pcDNA

Os plasmídeos pcDNA

-Hsp65 (DNA-Hsp65) e pcDNA

, obtidos através do kit

comercial QIAGEN (item 3.1.1), foram utilizados nas formulações das microesferas

de PLGA e nos experimentos de tráfego intracelular do DNA plasmideal (DNA nu).

Antes de iniciar os experimentos, a integridade dos plasmídeos foi verificada

utilizando as enzimas de restrição BamH I e Not I. A análise de eletroforese em gel

de agarose 1% mostrou que a digestão do pcDNA

-Hsp65 produziu 2 bandas, uma

de 5,4 kb representando o vetor (pcDNA

), e a outra de 3,3 kb, representando o

inserto da Hsp65 (Figura 1, pista 5). Por outro lado, o pcDNA

digerido (BamH I),

mostrou perfil eletroforético correspondente ao tamanho do vetor, com uma banda

de 5,4 kb (Figura 1, pista 3).

4.2. PREPARO E CARACTERIZAÇÃO DAS MICROESFERAS POLIMÉRICAS

BIODEGRADÁVEIS CONTENDO OS PLASMÍDEOS pcDNA

-HSP65 OU pcDNA

JUNTAMENTE COM DMT

As microesferas de PLGA foram obtidas pelo método de emulsão múltipla e

evaporação do solvente orgânico. A eficiência do encapsulamento dos plasmídeos

pcDNA

-Hsp65 e pcDNA

, nas formulações com 6,6 mg de coumarina-6, foi de

49,9% (6,24 µg de DNA/mg de microesferas) e 24% (3,0 µg de DNA/mg de

microesferas), respectivamente. Para a formulação com 60 µg de coumarina-6 a

eficiência do encapsulamento para o plasmídeo pcDNA

-Hsp65 foi de 52,8% (6,6 µg

de DNA/mg de microesferas) e para a formulação sem coumarina-6 foi de 34,4%

(4,3 µg de DNA/mg de microesferas). Para todas as formulações acima

Resultados

mencionadas o DMT (0,5 mg/formulação) foi adicionado na fase orgânica da

emulsão água/óleo/água durante o processo de encapsulamento.

Em relação ao diâmetro das microesferas, os lotes de formulações não

apresentam diâmetro uniforme, mas são caracterizados por uma distribuição

Gaussiana conforme ilustrado nas Figuras 2 – 4. Esses dados confirmam que o

método utilizado na obtenção das microesferas originou partículas com um perfil de

distribuição de diâmetro inferior a 10 µm (Tabela I), o qual é considerado adequado

para a fagocitose por células apresentadoras de antígenos.

Tabela I. Diâmetro das microesferas de PLGA 50:50 [Poli (D,L-lático-co-glicólico)]:

obtido por difratometria laser.

Microesferas

Diâmetro das partículas (mediana - µm)

pcDNA

-Hsp65 (6,6 mg coumarina-6)

3,9

pcDNA

(6,6 mg coumarina-6) 4,4

pcDNA

-Hsp65 (60 µg coumarina-6)

4,6

pcDNA

-Hsp65 (sem marcador fluorescente) 3,9

Vazia (6,6 mg coumarina-6) 5,6

Resultados

4.3. AVALIAÇÃO DA BIODISTRIBUIÇÃO DAS MICROESFERAS DE PLGA

FLUORESCENTES

Para avaliar a biodistribuição das microesferas, camundongos BALB/c foram

imunizados com microesferas fluorescentes (6,6 mg de coumarina-6) contendo DNA-

Hsp65/DMT. Os animais foram sacrificados nos tempos de 24 horas, 7 dias, 15 dias,

30 dias, 60 dias e 120 dias após a imunização, e os seguintes órgãos foram

coletados: linfonodos drenantes, medula óssea, timo, pulmão, baço, rim, fígado e

testículos. A biodistribuição nesses órgãos foi determinada por citometria de fluxo

(canal FL1-fluorescência verde).

Como pode ser observado na Tabelas II e III, as microesferas estão presentes

em todos os órgãos analisados após 24 horas, 7 dias e 15 dias, apesar de haver

variações entre os animais. Após 30 dias, 60 dias e 120 dias, a maioria dos órgãos

analisados continuaram positivos, com exceção do fígado e do rim, para o tempo de

30 dias, linfonodo, baço e pulmão, para o tempo de 60 dias, e rim, para o tempo de

120 dias. Cabe ressaltar que 100.000 células foram adquiridas por amostra, portanto

a porcentagem de células positivas para microesfera (coumarina-6) é pequena

quando comparada com o número total de células, sendo que a menor porcentagem

de células positivas foi obtida no timo (0,002% de células positivas/tempo 15 dias -

Figura 5) e a maior porcentagem nos linfonodos (9,3% de células positivas/tempo 15

dias - Figura 5).

Resultados

Tabela II. Número de animais com resultados positivos para cada órgão

24h 7d 15d 30d 60d 120d

LN 4/5 5/5 2/5 4/5 0/5 2/3

MO 3/5 1/5 2/5 1/5 2/5 2/3

Baço 5/5 3/5 2/5 2/5 0/5 1/3

Timo 3/5 2/5 1/5 3/5 4/5 2/3

Pulmão 4/5 5/5 5/5 3/5 0/5 2/3

Rim 4/5 3/5 3/5 0/5 5/5 0/3

Fígado 5/5 2/5 3/5 0/5 5/5 2/3

Testículos 2/5 4/5 5/5 2/5 5/5 2/3

Camundongos BALB/c machos foram imunizados com as microesferas fluorescentes

contendo pcDNA

-Hsp65/DMT (30 µg DNA/animal) conforme descrito no item 3.3.1. Os

animais foram sacrificados nos tempos de 24 horas, 7 dias, 15 dias, 30 dias, 60 dias e 120

dias após a imunização e os órgãos foram coletados e processados. As células foram

analisadas no citômetro de fluxo (100.000 eventos por amostra). Cada grupo foi composto

por três ou cinco camundongos. Os valores apresentados na tabela indicam o número de

animais positivos para cada órgão sob o número total de animais analisados. LN: linfonodos;

MO: medula óssea.

Resultados

Tabela III. Número de células positivas para coumarina-6 nos diferentes órgãos

analisados

LN MO Baço Timo Pulmão Rim Fígado Testículos

24 h

813 32 19 0 71 286 13 0

7540 0 22 37 0 0 587 0

0 0 673 160 309 56 314 0

1758 88 74 5 186 143 603 2

4994 56 54 0 315 420 445 488

148 283 17 0 72 0 0 32

1598 0 9 6 1192 3244 2323 6072

1226 0 97 4 1634 2372 1878 0

329 0 0 0 465 0 0 167

3693 0 0 0 319 407 0 217

15d

0 0 0 0 436 0 0 82

0 31 0 2 682 82 2841 79

0 0 16 0 1064 341 0 633

12888 297 4 0 89 68 100 251

5707 0 0 0 481 0 425 251

30d

0 0 50 0 0 0 0 0

9029 0 0 14 1264 0 0 0

726 0 0 0 369 0 0 0

196 58 32 16 0 0 0 75

135 0 0 35 125 0 0 11

60d

0 0 0 0 0 2587 1725 547

0 131 0 737 0 1971 2443 333

0 0 0 593 0 1943 6380 436

0 333 0 1054 0 974 448 804

0 0 0 1833 0 1783 5530 566

120

940 154 0 216 0 0 20 0

0 50 0 0 1385 0 214 42

548 0 52 1106 3089 0 0 31

Camundongos BALB/c machos foram imunizados com as microesferas fluorescentes contendo pcDNA

-Hsp65/DMT (30 µg

DNA/animal) conforme descrito no item 3.3.1. Os animais foram sacrificados nos tempos de 24 horas, 7 dias, 15 dias, 30 dias e

120 dias após a imunização e os órgãos foram coletados e processados. As células foram analisadas no citômetro de fluxo

(100.000 eventos por amostra). Cada grupo foi composto por três ou cinco camundongos. LN: linfonodos; MO: medula óssea.

Resultados

4.4. CARACTERIZAÇÃO DOS TIPOS CELULARES ENVOLVIDOS NA CAPTURA

DA MICROESFERA E AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE MOLÉCULAS DE

SUPERFÍCIE

Para avaliar as células envolvidas na captura das microesferas verificou-se a

expressão das moléculas CD11b e CD11c. Adicionalmente, outras moléculas de

superfície presentes nessas células (CD80, CD86 e IA

) foram analisadas para

caracterizar o perfil de ativação. Para isto, camundongos BALB/c foram imunizados

com três tipos de microesferas fluorescentes, diferindo apenas no material

encapsulado (pcDNA

-Hsp65/DMT, pcDNA

/DMT ou vazia). Como pode ser

observado na Figura 6, macrófagos e células dendríticas estão envolvidos na

captura das microesferas, uma vez que células positivas para coumarina-6

apresentaram CD11b e CD11c como marcadores de superfície. Além disso, a

expressão das moléculas co-estimulatórias (CD80 e CD86) e de classe II (IA

) estão

aumentadas nas células dos linfonodos (pool de cinco animais) de animais

imunizados com microesfera fluorescentes contendo pcDNA

-Hsp65/DMT.

4.5. MICROESFERAS: FAGOCITOSE E TRÁFEGO INTRACELULAR IN VITRO

Estudos iniciais do tráfego intracelular das microesferas fluorescentes contendo

pcDNA

-Hsp65/DMT foram realizados utilizando células J774. Para isso, essas

células foram incubadas com as microesferas e a visualização dos endossomos

tardios e lisossomos foi realizada utilizando o marcador LysoTraker Red (item 3.4.1).

Como pode ser observado na Figura 7, utilizando microscopia de fluorescência, as

microesferas foram fagocitadas pelas células J774 e após 48 horas, observou-se

colocalização nos endossomos tardios e lisossomos (coloração amarela). Porém,

devido ao baixo número de microesferas fagocitadas (uma ou duas, em vários

Resultados

campos analisados - Figura 7), tornou-se difícil dar continuidade aos experimentos.

Desta forma, na tentativa de melhorar a quantidade de microesferas fagocitadas,

optou-se trocar as células J774 por macrófagos peritoneais provenientes de

camundongos Balb/c. Como demonstrado na Figura 8, várias microesferas foram

fagocitadas após 24 horas de tratamento, assim, os próximos experimentos foram

realizados utilizando macrófagos peritoneais.

Dando continuidade aos experimentos de tráfego intracelular, os macrófagos

foram incubados com as microesferas, durante 2 dias, 8 dias e 10 dias, e a

visualização dos endossomos tardios e lisossomos foi realizada utilizando o

marcador LysoTraker Red (item 3.4.1). Como pode ser observado nas Figuras 9, 10

e 11, as microesferas foram fagocitadas pelos macrófagos e houve colocalização

nos endossomos tardios e lisossomos (coloração amarela) em todos os tempos

analisados. Além disso, durante esses períodos de análise, houve perda ou

diminuição da fluorescência de algumas partículas (Figuras 9C, 10B e 11B),

provavelmente devido ao processo de hidrólise das microesferas. Porém estas

partículas ainda continuam nas vesículas, quando observadas em DIC (differential

interference contrast) (Setas, Figuras 9D, 10E e 11E). A Figura 12 demonstra o

controle do experimento, no qual os macrófagos foram mantidos apenas em RPMI-C

com 10 % de soro bovino fetal. A permanência das microesferas em vesículas foi

confirmada por microscopia eletrônica de transmissão, conforme demonstrado nas

Figuras 13 e 14, e em todos os tempos analisados (2 dias, 8 dias, 10 dias e 15 dias)

as microesferas estavam presentes nas vesículas.

Resultados

4.6. DNA PLASMIDEAL (DNA NU): CAPTURA E TRÁFEGO INTRACELULAR IN

VITRO – INIBIÇÃO DA ACIDIFICAÇÃO DAS VESÍCULAS LISOSSOMAIS

Na tentativa de esclarecer os mecanismos de captura e o tráfego intracelular do

DNA plasmideal alguns marcadores de compartimentos específicos foram utilizados,

dentre eles, Transferrina conjugada com Alexa 594 (marcador de endossomos

precoces) e LysoTracker Red ou Dextran conjugado com Texas Red (marcadores de

endossomos tardios/lisossomos). Desta forma, o DNA plasmideal marcado com

Alexa 488 (conforme descrito no item 3.5.1) foi incubado com as células (J774,

macrófagos peritoneais ou células dendríticas) por determinados períodos e um dos

marcadores acima mencionados foi adicionado à cultura.

Como pode ser observado na Figura 15, utilizando microscopia confocal, após

15 minutos, o DNA plasmideal foi endocitado pelas células J774 e colocalizado com

a Transferrina. Porém, após trinta minutos de incubação não houve colocalização

(Figura 16), indicando assim que o DNA foi transferido para outra vesícula. Desta

forma, na tentativa de elucidar o caminho do DNA utilizou-se um outro marcador, o

LysoTracker Red. Este reagente possui fluorescência vermelha em vesículas

acídicas, tais como endossomos tardios/lisossomos. Assim, células J774 foram

incubadas com DNA marcado com Alexa 488 e a visualização dos endossomos

tardios e lisossomos foram realizadas utilizando este marcador. Como demonstrado

nas Figuras 17 a 21, utilizando microscopia confocal, o DNA plasmideal foi

endocitado pelas células J774, porém não houve colocalização (Figuras 17C - 21C)

com as vesículas acídicas em todos os tempos analisados (24 horas – 120 horas).

Resultados similares foram obtidos utilizando macrófagos peritoneais (tempos de 24

horas e 72 horas - Figura 22). Além disso, quando as células J774 foram incubadas

com o vetor pcDNA

marcado com Alexa 488 durante 24 horas, seguido da adição

Resultados

do LysoTracker Red, também não houve colocalização com endossomos

tardios/lisossomos (Figura 23)

Cabe ressaltar que em todos os experimentos

realizados, um controle do reagente LysoTracker foi realizado incubando as células

com este marcador, e conforme representado na Figura 24, todas as células

apresentaram fluorescência, demonstrando assim que o reagente utilizado estava

em perfeita condição. Adicionalmente, com o intuito de eliminar a possibilidade de

que a inibição da acidificação observada anteriormente (Figuras 17 -23) fosse

decorrente da interferência entre os fluorocromos (vermelho e verde), o DNA

plasmideal sem marcação foi incubado com LysoTracker Green, e os resultados não

foram alterados (Figura 24E e 24F).

Para confirmar esses resultados, DNA marcado com Alexa 488 foi incubado

com Dextran conjugado com Texas Red (marcador de lisossomos, citado

anteriormente). Conforme demonstrado na Figura 25, houve colocalização do DNA

com o marcador Dextran após 24 horas. Desde que, nossos resultados

demonstraram que o DNA plasmideal não está colocalizado com LysoTracker Red,

mas está colocalizado com Dextran, estes resultados sugerem que o DNA, presente

em vesículas lisossomais, inibe a acidificação dos endossomos tardios/lisossomos

por um mecanismo ainda desconhecido. Esta hipótese foi confirmada com a

colocalização do Dextran com LysoTracker Green (Figura 26), pois, neste caso, o pH

das vesículas não foi alterado. Com o intuito de verificar se a alteração do pH não

influencia no perfil de distribuição do DNA, o mesmo foi incubado com cloroquina,

uma substância que impede a acidificação das vesículas. Conforme demonstrado na

Figura 27, não houve alteração na distribuição do DNA plasmideal. A ação da

cloroquina foi confirmada, pois, após incubação de 24 horas, não houve marcação

com LysoTracker Red (Figura 27C).

Resultados

Os resultados apresentados anteriormente, em relação à incubação do DNA

plasmideal com as células J774 em diversos períodos (Figuras 17 a 21), também

demonstraram que, após 96 horas e 120 horas (Figuras 20 e 21), o DNA plasmideal

está localizado ao redor do núcleo, o que sugere que, após a captura, o DNA

permanece em vesículas até chegar a região perinuclear, sugerindo assim, que o

DNA plasmideal não escapa do compartimento endo-lisossomal para o citoplasma.

Paralelamente, foram realizados experimentos com células dendríticas

derivadas do baço. Estes experimentos demonstraram que o DNA plasmideal foi

capturado por prolongamentos da membrana plasmática (Figura 28, seta 1),

sugerindo que a macropinocitose é o mecanismo envolvido na captura do DNA pelas

células dendríticas. Além disso, alguns sinais de colocalização com endossomos

tardios/lisossomos foram detectados quando o DNA marcado com Alexa 488 foi

incubado por 1 hora com as células dendríticas, seguido da adição de marcador

LysoTracker Red. Entretanto, muitas vesículas com DNA plasmideal não

apresentaram colocalização, sugerindo que, como nos macrófagos (J774 e

peritoneais), o DNA plasmideal pode inibir a acidificação dos endossomos

tardios/lisossomos (Figura 28).

Resultados

4.7. DNA PLASMIDEAL (DNA NU): CAPTURA POR CÉLULAS KNOCKOUT DE

TLR9

Nossos resultados demonstraram que células dendriticas provenientes de

animais knockout do receptor TLR9 é capaz de capturar o DNA plasmideal, portanto

a deficiência deste receptor não influencia neste processo (Figura 29).

4.8. DNA PLASMIDEAL (DNA NU): ENSAIO DE APRESENTAÇÃO DE ANTÍGENO

Como nossos resultados sugerem que o DNA plasmideal inibe a acidificação

dos endossomos tardios/lisossomos, o próximo passo foi verificar se esta alteração

poderia prejudicar a apresentação de antígeno, já que estes compartimentos estão

envolvidos no processo de apresentação de antígeno via MHC de classe II. Para

isto, experimentos de apresentação de antígeno utilizando KLH (antígeno exógeno –

apresentação via MHC de classe II) e células T CD4 específicas, conforme descrito

no item 3.6.1, foram realizados. Os resultados demonstraram que o tratamento com

DNA plasmideal interfere na apresentação do antígeno KLH, pois quando o DNA foi

adicionado na cultura nos tempos de 24 horas, 48 horas ou 72 horas antes do

tratamento com KLH, ou simultaneamente ao KLH (tempo zero), a proliferação dos

linfócitos T CD4 específicos diminuiu significativamente, quando comparado com as

células que receberam apenas KLH (Figura 30).

Resultados

4.9. RECRUTAMENTO DE MyD88, RAB5, LAMP 1 E BiP/GRP78 EM

VESÍCULAS QUE CAPTURARAM O DNA PLASMIDEAL

A inibição da acidificação da vesícula contendo o DNA plasmideal poderia

interferir no recrutamento da molécula sinalizadora MyD88, já que esta via é ativada

através da interação dos motivos CpGs, presentes no DNA plasmideal, com o

receptor TLR9. Nossos resultados demonstraram que a não acidificação lisossomal

pelo DNA plasmideal não prejudica o recrutamento da molécula MyD88, pois,

conforme demonstrado na Figura 31, as células Raw-MyD88GFP apresentaram

pontos de colocalização com DNA plasmideal (marcado com Alexa 594 - vermelho),

indicando assim a molécula MyD88 foi recrutada para as vesículas contendo o DNA

(CpG). Por outro lado, quando avaliamos o recrutamento do Rab5 (marcador de

endossomo precoce) para a vesícula endocítica contendo DNA, não observamos

colocalização, sugerindo que após a captura, o DNA plasmideal encontra-se em uma

vesícula deficiente desta molécula e que talvez o DNA possa interferir direta ou

indiretamente no recrutamento do Rab5 (Figuras 32 e 33). A presença do Rab5

também foi avaliada em um período maior (19 horas, Figura 34), pois a principio,

cogitou-se a possibilidade de que o DNA permaneceria em vesículas precoces

durante todo o seu trajeto, já que anteriormente não houve colocalização com o

LysoTracker Red. Porém, com estes resultados do Rab5 e com a colocalização com

o Dextran (Figura 25) esta hipótese foi descartada. Avaliamos também o

recrutamento de LAMP 1 (molécula presente nos lisossomos), e não observamos

colocalização com o plasmideo (Figura 35), apesar de nossos resultados

demonstrarem que o DNA está presente nos lisossomos (Figura 25). Este resultado

sugere que provavelmente a inibição da acidificação possa interferir direta ou

indiretamente no recrutamento do LAMP 1. Adicionalmente, investigamos a co-

Resultados

marcação do BiP/GRP78 presente no retículo endoplasmático com o DNA

plasmideal e não observamos colocalização, sugerindo que após o processo de

endocitose o DNA fique restrito a vesículas endossomais/lisossomais (Figuras 36 e

37).

Resultados

Tabela IV. Resumo dos resultados de colocalização entre DNA e compartimentos

intracelulares, e molécula MyD88.

Colocalização

DNA versus Positiva (+) ou negativa (-)

Transferrina +

Rab5 -

LysoTracker Red

Dextran +

LAMP 1 -

BiP/GRP78 -

MyD88 +

5. DISCUSSÃO

Discussão

Os dados apresentados neste trabalho demonstraram que as microesferas,

usadas como veiculo para imunização com DNA plasmideal, foram amplamente

distribuídas após a administração intramuscular, como já observado anteriormente

para o DNA nu (COELHO-CASTELO et al., 2006). As microesferas, em geral, foram

capturadas por células apresentadoras de antígenos, como macrófagos e células

dendríticas através de fagocitose. Em relação ao tráfego intracelular, as

microesferas permanecem nos endossomos tardios e/ou lisossomos por até 15 dias,

sugerindo que essas construções sejam hidrolisadas nessas vesículas para

liberação do DNA. Por outro lado, no caso do DNA nu, ao atingir essas vesículas ele

é capaz de alterar o pH das mesmas, impedindo a sua acidificação, provavelmente

como mecanismo de escape da degradação enzimática. Este fato, possivelmente

permite que o DNA alcance a região perinuclear ainda nas vesículas endo-

lisossomais. Em relação à captura do DNA, os resultados demonstraram que esta

ocorre por endocitose dependente de clatrina ou macropinocitose, dependendo da

célula em questão, mas parece envolver um mecanismo distinto de maturação de

vesículas uma vez que não recruta Rab5 e LAMP 1 (Figuras 32 - 35), ficando restrito

a essas vesículas, e não apresentando colocalização com BiP/GRP78 (Figuras 36 e

37). Interessantemente, a não acidificação dos endossomos tardios/lisossomos,

devido à presença do DNA, teve conseqüência direta na apresentação de antígenos

pela via de classe II, porém não interferiu no recrutamento de MyD88. Esse último

resultado pode explicar a sinalização mediada pelo DNA bacteriano em células

eucarióticas, mesmo com vesículas não acídicas. Cabe ressaltar que os dados

apresentados sobre o tráfego do DNA plasmideal forneceram a primeira avaliação

completa do comportamento de um DNA plasmideal bacteriano em células

eucarióticas, e trouxeram achados muito importantes para desenvolvimento de

Discussão

novas vacinas e terapias. Esses resultados com DNA nu abriram novas perspectivas

para a utilização do DNA plasmideal, em função da dose. Assim altas doses agiriam

como imunoestimulantes e baixas doses poderiam controlar o desenvolvimento de

uma resposta imune exacerbada, ou não adequada. Essa hipótese está em depósito

de patente no INPI (número 2005.1.2414.17.8) e estudos a este respeito estão em

andamento.

Os estudos desenvolvidos por nosso grupo (Centro de Pesquisa em

Tuberculose – FMRP) têm demonstrado que a vacina de DNA plasmideal nu

codificando a Hsp65 de M. leprae (DNA-Hsp65), ou ainda utilizando sistemas

carreadores como as microesferas de PLGA (DNA-Hsp65/DMT), são capazes de

gerar imunidade protetora contra tuberculose (SILVA, 1999; TASCON et al., 1996;

LOWRIE et al., 1999; SILVA & LOWRIE; 2000; LIMA et al., 2003). Entretanto,

adicionalmente a caracterização da resposta imune protetora, outros aspectos sobre

as vacinas de DNA são considerados relevantes para o entendimento deste tipo de

abordagem vacinal, tais como, o tráfego intracelular e a biodistribuição.

No que diz respeito as microesferas de PLGA, vários estudos têm demonstrado

sua eficiência como sistema de liberação sustentada de diversos agentes (DNA

plasmideal, proteínas, peptídeos e compostos de baixo peso molecular), além da

sua capacidade em gerar uma resposta imune adequada contra o antígeno

encapsulado (MEN et al., 1995; MCKEEVER et al., 2002; LIMA et al., 2003). Neste

trabalho optamos pelo encapsulamento do DNA-Hsp65 juntamente com o dimicolato

de trealose (DMT), um componente da parede celular da micobactéria utilizado neste

caso como imunoestimulante (KOIKE et al., 1998), em virtude de dados prévios do

nosso laboratório (LIMA et al., 2003) que demonstraram que animais imunizados

com microesferas contendo DNA-Hsp65 (30 µg de DNA/animal) apresentavam

Discussão

produção de IFN-γ. No entanto, não se observou desenvolvimento de resposta

humoral e proteção contra a infecção, após o desafio com M. tuberculosis. Por outro

lado, com a adição do DMT na formulação, verificou-se altos níveis de anticorpos

(IgG2a) e de IFN-γ, e uma proteção significativa foi alcançada. Diante desses dados

a formulação de microesferas contendo DNA-Hsp65 e o adjuvante DMT foi utilizada

em nossos ensaios de biodistribuição e tráfego intracelular, uma vez que este

sistema carreador parece ser eficiente. Cabe ressaltar que com a utilização dessa

formulação a quantidade de DNA utilizada (30 µg - dose única) foi reduzida em dez

vezes, quando comparado com a vacinação com DNA nu (300 µg - três doses de

100 µg), o que justifica a análise da mesma.

Em relação à biodistribuição do DNA plasmideal encapsulado em microesferas

de PLGA, alguns estudos demonstraram que após a administração por via

intramuscular ou subcutânea, a mensagem para o DNA plasmideal estava presente

preferencialmente nos sítios de injeção (no músculo por 60 dias e na pele por 120

dias - LUNSFORD et al., 2000). Paralelamente, nosso grupo demonstrou que a

mensagem para Hsp65, após a administração intramuscular de microesferas

contendo DNA-Hsp65/DMT, foi detectada no músculo, fígado, linfonodo drenante e

baço, somente quinze dias após a imunização, e não em períodos superiores (LIMA

et al., 2003; e dados não mostrados). Apesar de ambos os estudos demonstrarem a

permanência da mensagem para o antígeno em questão em diferentes órgãos, a

biodistribuição das microesferas in vivo, após a administração intramuscular, não foi

relatada até o momento. O esclarecimento da biodistribuição é um dos pontos

importantes no que diz respeito a biosegurança, já que a vacina DNA-Hsp65 está em

fase pré-clínica e tem como meta alcançar os ensaios clínicos, e, além disso, os

dados sobre o tempo de permanência dessas partículas contribuem para o

Discussão

delineamento racional desse tipo de sistema de liberação, uma vez que podemos

alterar o tempo de degradação baseado na composição do polímero.

Desta forma, para determinar a biodistribuição, um corante lipofílico

fluorescente (coumarina-6) foi incorporado a matriz das microesferas de PLGA. A

coumarina-6 possui a característica importante de não se dissociar do polímero,

tornando possível sua utilização como marcador fluorescente das microesferas

(DESAI et al., 1997), sem fornecer dados falsos positivos. Assim, nossos resultados

demonstraram (Tabela II e III) que a presença da microesfera foi observada em

todos os órgãos analisados, nos tempos de 24 horas, 7 dias e 15 dias , sendo que

no linfonodo drenante o número de células positivas foi consideravelmente maior

(Figura 5). Nos tempos de 30 e 60 dias, a maioria dos órgãos continuou positiva,

exceto rim e fígado para o tempo de 30 dias, linfonodo, baço e pulmão, para o tempo

de 60 dias. Apesar da biodistribuição das microesferas ter sido analisada 120 dias

após a administração, somente o rim apresentou resultado negativo. Estes dados

também mostraram que a quantidade de microesferas em um determinado órgão

varia de um animal para outro, e isto provavelmente seja devido a variabilidade do

sistema envolvendo variação dos animais e da inoculação, o que também explica o

fato de que nem todos os animais apresentaram positividade para os tecidos

analisados (Tabela II).

Os resultados positivos obtidos após 120 dias não eram esperados, pois a

análise histológica do sítio de inóculo demonstrou que em 30 dias após a

administração das microesferas não há depósito dessas partículas (LIMA et al.

2003), ou seja, considerando que parte das microesferas permanece no local de

administração, neste período o polímero já deveria ter sido degradado. Isso nos

remete a hipótese de que após 120 dias provavelmente o polímero tenha sido

Discussão

hidrolisado e incorporado ao organismo na forma de ácido lático e glicólico, e que a

fluorescência observada neste período possa ser devida à permanência do corante

ainda não metabolizado. Em relação ao tempo de 60 dias esta possibilidade também

pode ser aplicada, porém como há variações entre os órgãos, não podemos

descartar a permanência de algumas microesferas intactas. A caracterização

realizada por LIMA et al. (2003) foi realizada através de imuhistoquímica, enquanto

que neste trabalho foi analisada por citometria de fluxo, com aquisição de 100.000

células, usando assim um método mais sensível no que diz respeito ao número de

células analisadas.

Por outro lado, os resultados apresentados sobre a biodistribuição demonstram

a presença de microesferas no linfonodo drenante e baço após 24 horas, sendo que

a presença das microesferas no linfonodo, 7 dias após a administração, foi bastante

homogênea (Tabela II). Esses dados são interessantes, pois nos permite

estabelecer uma cinética da presença dessas microesferas nos órgãos linfóides

secundários, após a imunização intramuscular e, isso pode favorecer o

estabelecimento de protocolos vacinais usando esse sistema de liberação. Além

disso, esses resultados demonstram que as microesferas foram transportadas do

sítio de inóculo para os diferentes órgãos, provavelmente através da migração de

células apresentadoras de antígenos que fagocitaram as microesferas, ou

alternativamente, ao transporte direto das microesferas livres para o sistema linfático

ou circulatório alcançando assim outros sítios, onde serão fagocitadas por células

apresentadoras de antígenos (LUNSFORD et al., 2000).

De fato, nossos resultados demonstraram que macrófagos e células dendríticas

(marcadores CD11b

e CD11c

, respectivamente) foram os responsáveis pela

captura das microesferas em todas as formulações analisadas (Figura 6). Além

Discussão

disso, a ativação celular foi observada, no grupo imunizado com microesferas

contendo DNA-Hsp65/DMT, através do aumento da expressão de moléculas co-

estimulatórias (CD80 e CD86) e moléculas de MHC de classe II. Por outro lado, nos

grupo imunizados com microesferas vazias ou contendo pcDNA

/DMT, a expressão

dessas moléculas (CD80, CD86 e IA

) foi significativamente menor, quando

comparada com o grupo imunizado com DNA-Hsp65/DMT (Figura 6). Esses

resultados sugerem que a modulação positiva observada para as moléculas co-

estimulatórias e de classe II é decorrente da presença do gene Hsp65 e não devido

ao simples processo de captura, à presença de motivos CpG ou do adjuvante DMT.

É possível que após a administração das formulações contendo o gene da Hsp65,

as proteínas Hsp65 recém sintetizadas possam estimular as células apresentadoras

de antígenos via receptore(s) presentes na superfície destas células. Cabe ressaltar

que este fato não foi comprovado ainda para a hsp65, mas estudos anteriores já tem

relatado a capacidade de outras Hsps (gp96, Hsp70) em aumentar a expressão de

moléculas co-estimulatórias e de classe II (BASU et al., 2000;

SINGH-JASUJA et al.,

2000), provavelmente através da ligação com receptores, tais como Toll like

receptors 2 e 4 (BINDER et al., 2004). Adicionalmente, esses resultados

demonstraram também que a quantidade de células CD11c

foi maior no grupo

imunizado com microesferas contendo DNA-Hsp65/DMT, provavelmente devido ao

fato de que, com a ativação celular, houve migração de mais células para os

linfonodos.

Este direcionamento da captura por células apresentadoras de antígeno é

possível devido ao diâmetro das partículas, que está entre 1 µm e 10 µm (Figuras 2 -

4), permitindo que as microesferas sejam capturadas principalmente por essa

subpopulação. Nossos resultados também corroboram com estudos anteriores que

Discussão

demonstram que após a imunização intraperitonial ou intradérmica, com

microesferas fluorescentes, macrófagos e células dendríticas, respectivamente,

foram as principais células envolvidas na captura dessas partículas (NEWMAN et.

al., 2002). Porém, cabe ressaltar a importância da via de administração, pois em

nosso estudo ambos os tipos celulares estão envolvidos na captura das

microesferas. A transfecção dessas células apresentadoras de antígenos é de

extrema importância, pois trabalhos demonstram que peptídeos antigênicos

envolvidos na estimulação de linfócitos T citotóxico após vacinação com DNA, são

apresentados no contexto de MHC classe I por células derivadas da medula óssea e

não pelo miócitos transfectados (DOE et. al., 1996; AKBARI et. al., 1999). Embora

nossos resultados nos mostrem uma ampla biodistribuição das microesferas, não

podemos afirmar que a expressão da Hsp65 esteja ocorrendo nesses órgãos, uma

vez que não fomos capazes de detectar a mensagem por RT-PCR (dados não

mostrados).

Em adição aos estudos de biodistribuição, foram realizados ensaios sobre o

tráfego intracelular das microesferas. O primeiro passo desse trajeto inicia-se com a

captura das partículas, e neste ponto, o tamanho das microesferas (1 µm - 10 µm)

determina que o processo envolvido seja a fagocitose, e isto já está bem

estabelecido na literatura. Porém, as etapas seguintes ainda são fases obscuras no

tráfego dessas partículas. Com o intuito de contribuir com o esclarecimento do

destino intracelular das microesferas nós utilizamos um marcador de vesículas

acídicas (LysoTracker Red), e os resultados demonstraram que tanto na linhagem

de células J774, quanto nos macrófagos peritoneais, as microesferas estão

localizadas nos endossomos tardios e/ou lisossomos em todos os períodos

analisados. Apesar de ambos os macrófagos capturarem as partículas, os

Discussão

macrófagos peritoneais demonstraram maior capacidade fagocítica, portanto, a

maior parte dos ensaios foi realizada com essas células. Paralelamente, em todos os

tempos analisados (2 dias, 8 dias e 10 dias) observou-se a diminuição ou perda da

fluorescência de algumas partículas (Figuras 3C, 4B e 5B), porém, as mesmas ainda

continuaram nas vesículas, quando observadas em DIC (differential interference

contrast) (Setas, Figuras 3D, 4E e 5E). Uma possível explicação para a perda da

fluorescência é o processo de hidrólise das microesferas, e com isso, provavelmente

houve uma diminuição do marcador coumarina-6. Cabe ressaltar que para a

biodistribuição in vivo das microesferas a quantidade do marcador foi de 6,6 mg,

enquanto que para a microscopia utilizou-se 60 µg, diferença esta explicada pela

sensibilidade das técnicas utilizadas. Assim sendo, a diferença observada entre a

presença da coumarina-6 aos 120 dias após a administração das microesferas, nos

ensaios de biodistribuição, e a perda ou diminuição da mesma, nos ensaios do

tráfego intracelular, pode ser devida à quantidade do marcador utilizada. Um outro

aspecto a ser considerado é a influencia da hidrólise das microesferas no marcador

Lysotracker. Uma vez que este marcador é específico para vesículas acídicas e o

processo de degradação das microesferas pode tornar o meio acido devido à

liberação dos ácidos lático e glicólico, um resultado falso positivo poderia ser

cogitado. Porém, conforme observado em todos os tempos analisados, poucos

sinais de degradação foram observados na microscopia de fluorescência, sugerindo

que a degradação in vitro das microesferas é muito lenta. Assim, devido a essa

velocidade de hidrólise o pH das vesículas provavelmente não foi alterado,

principalmente no menor período de incubação (24 horas). Além disso, os resultados

da microscopia eletrônica não demonstraram sinais relevantes de degradação em

Discussão

100

todos os tempos avaliados, desta forma, podemos sugerir que as microesferas estão

localizadas nos endossomos tardios e/ou lisossomos (Figuras 13 e 14).

Diante desses resultados, sugerimos que há possibilidade das microesferas

serem degradas pelo processo de hidrólise ainda no endossomo tardio e/ou

lisossomos, pois, mesmo após 10 dias, as partículas permanecem nessas organelas

(Figura 11). PANYAM et al. (2002) demonstraram que nanopartículas de PLGA

marcadas com coumarina-6 são capazes de escaparem dos compartimentos

endossomo-lissossomo para o citoplasma 10 minutos após a administração. A

alteração da carga superficial da partícula, devido à mudança do pH nas vesículas

[endossomo precoce (pH= 7,4) - carga negativa; endossomo-lisossomo (pH= 4,0-

5,0) – carga positiva; citoplasma (pH= 7,4) - carga negativa], é proposto como o

mecanismo responsável pelo escape das nanopartículas. Ou seja, com o pH acídico

nos endossomos-lisossomos, a carga superficial das partículas altera de aniônica

para catiônica, resultando em uma interação local com a membrana dessas

vesículas permitindo o escape para o citoplasma.

Ainda não está claro como as microesferas alcançam o citoplasma (JILEK et

al., 2005), porém diante dos resultados obtidos, acreditamos que as microesferas,

diferente das nanopartículas, não escapam para o citoplasma tão facilmente, uma

vez que não observamos a presença de partículas fluorescentes no citoplasma das

células, mas sim, a permanência das mesmas nos endossomos tardios e/ou

lisossomos por até 10 dias (Figura11). Estes resultados foram confirmados por

microscopia eletrônica, já que em todos os tempos analisados as microesferas

permaneceram em vesículas. Em relação à permanência das microesferas nos

endossomos tardios e/ou lisossomos (ambos são vesículas acídicas, portanto são

alvos do marcador LysoTracker) uma questão importante a ser considerada é a

Discussão

101

presença do DMT na formulação utilizada. Estudos sugerem que o DMT, em

micobactérias, é um dos fatores que contribuem para a inibição da fusão entre o

fagossomo e o lisossomo (SPARGO et al., 1991; CROWE et al., 1994). Desta forma,

o DMT contido nas microesferas pode ser liberado no interior do fagossomo

impedindo assim a fusão com o lisossomo. Com isso, a provável localização das

microesferas seria nos fagossomos tardios, aqui denominado de endossomo tardio,

e esta localização é favorável à manutenção do DNA encapsulado, uma vez que

acredita-se que o DNA plasmideal possa ser degrado nos lisossomas, o que parece

não ocorrer diante dos resultados observados e que serão discutidos mais adiante.

Assim, diante de todos os dados apresentados, parece inviável que partículas

grandes como as microesferas possam escapar das vesículas endocíticas através

da interação com a membrana. Provavelmente, o DNA plasmideal encapsulado nas

microesferas escape para o citoplasma durante o processo de hidrólise das

mesmas, justificando assim, as respostas imunes celulares e humorais observadas

após a administração desta formulação (LIMA et al., 2003). Além disso, talvez

semelhante as nanopartículas, as microesferas possam adquirir carga superficial

catiônica em meio acídico, já que ambas as formulações são de PLGA, e isto possa

acarretar na desestabilização das membranas dos endossomos tardios, favorecendo

o escape do DNA, mas não da microesfera. Além disso, utilizamos uma formulação

de microesferas de diferentes tamanhos (Figuras 2 – 4), desse modo é possível que

as partículas menores liberem mais facilmente o DNA plasmideal para o citoplasma

do que as maiores. Estudos adicionais, nesse caso, são necessários para esclarecer

tal fato. Esses dados são relevantes no que concerne a indução da resposta imune.

Assim, parece que as partículas menores podem ser mais rápidas e eficientes na

indução da resposta, uma vez que podem favorecer a liberação do DNA mais

Discussão

102

rapidamente quando comparado com as partículas maiores. Isso traz conseqüências

diretas no design de formulações de PLGA para indução de resposta imune usando

doses ainda menores do que a utilizada por LIMA et al. (2003).

Paralelamente aos ensaios do tráfego intracelular da microesfera, foram

realizados estudos sobre o tráfego intracelular do DNA plasmideal nu (DNA-Hsp65).

No caso do DNA, semelhante as microesferas, as etapas envolvidas desde a

internalização até a transcrição ainda não foram totalmente esclarecidas. Para que o

DNA plasmideal seja transcrito, várias barreiras devem ser vencidas, tais como, a

membrana plasmática, os compartimentos endo-lisossomais, a mobilidade no

citoplasma e finalmente a membrana nuclear (WIETHOFF & MIDDAUGH, 2003;

LECHARDEUR, et al., 2005). Desta forma, o DNA deve ser primeiramente

capturado, e este processo, como os outros envolvidos no tráfego do plasmídeo, é

pouco conhecido. WOLFF et al. (1992) apresentaram pela primeira vez resultados

demonstrando que o DNA plasmideal foi capturado pelas células musculares por

endocitose via caveolina, alternativamente, outro estudo demonstrou que a

macropinocitose é responsável pela internalização de DNA plasmideal em

queratinócitos (BASNER-TSCHAKARJAN et. al., 2004). Nossos resultados mostram

que dois diferentes mecanismos estão envolvidos na captura do plasmídeo,

dependendo do tipo celular avaliado. Similar ao descrito em queratinócitos, nas

células dendríticas a captura do plasmídeo ocorre via macropinocitose (Figura 28).

Por outro lado, em macrófagos da linhagem J774 a endocitose ocorre via

transferrina, e desde que esta via está relacionada com sulcos revestidos com

clatrina (CONNER & SCHMID, 2003), podemos então concluir que em células J774

a endocitose é mediada por clatrina (Figura 15). Interessantemente, este mecanismo

Discussão

103

foi recentemente descrito na captura de CpG em células dendríticas (LATZ et al.,

2004).

Seguindo o tráfego do DNA em células J774, após a captura, nossos resultados

demonstraram que o DNA plasmideal está localizado nos endossomos tardios e

lisossomos (Figura 25). Além disso, foi observado que o DNA permanece em

vesículas até alcançar a região perinuclear, sugerindo assim que o plasmídeo não

escapa para o compartimento citoplasmático. Como anteriormente cogitado, o

escape do DNA para o citoplasma tem sido proposto em sistemas carreadores como

lipídeos e polímeros catiônicos. Nesses casos, a carga superficial está diretamente

relacionada com escape do material adsorvido, seja promovendo interação ou

desestabilização das membranas endo-lisossomais. Diferente dos carreadores

catiônicos, o DNA plasmideal possui carga negativa semelhante à membrana endo-

lisossomal, e essas cargas similares, podem resultar em baixa associação entre

DNA e membrana, dificultando assim o escape do plasmídeo para o compartimento

citoplasmático. Além disso, considerando que o citoplasma é composto por uma

rede de filamentos, por microtubulos, organelas e elevadas concentrações de

proteínas (LUBY-PHELPS, 2000) resultando em um congestionamento molecular, a

difusão de macromoléculas, como o DNA, pode ser limitada. Desse modo, a

permanência do DNA em vesículas talvez favoreça sua movimentação pelo

citoplasma. Entretanto, não podemos excluir a participação de outros mecanismos

nesse tráfego, sendo necessários estudos adicionais para determinar a relevância

biológica do DNA permanecer em vesículas.

A priori, a permanência em vesículas acídicas poderia ser considerada um

aspecto negativo para a molécula de DNA, que nessa situação costuma alterar sua

conformação, o que poderia comprometer seriamente a produção de antígeno e

Discussão

104

conseqüentemente a indução da resposta imune. Porém, nossos dados

demonstraram que o DNA plasmideal inibe a acidificação dos endossomos

tardios/lisossomos, um mecanismo inesperado e até o momento desconhecido.

Podemos especular alguma alteração na bomba de prótons, mas como a molécula

de DNA plasmideal induz tal fenômeno é completamente desconhecido.

Considerando que o DNA possa ser degradado nos lisossomos, conforme sugerido

por alguns estudos (WATTIAUX et al., 2000), e que esta degradação pode ser

parcialmente inibida por inativação das enzimas lisossomais, devido à alteração do

pH acídico dos lisossomos (LECHARDEUR et al., 1999; CIFTCI & LEVY, 2001),

então, podemos sugerir que a inibição da acidificação dos lisossomos pode evitar a

degradação do DNA plasmideal. Quando avaliamos este fenômeno nas células

dendríticas, observamos a presença de dois padrões, ou seja, alguns pontos não

colocalizaram com os endossomos tardios/lisossomos e outros colocalizaram com

essas organelas. No primeiro caso pode-se afirmar que, semelhante ao observado

nos macrófagos, o DNA plasmideal inibiu a acidificação dessas vesículas,

demonstrando assim que esta alteração ocorre em diferentes tipos celulares. Por

outro lado, no segundo caso, os sinais de colocalização podem ser devido à

característica peculiar dessas células que possuem um alto nível de reciclagem e

maturação das vesículas endossomais, não permitindo que o DNA atue sobre

algumas vesículas recém sintetizadas, resultando, assim, na colocalização com o

DNA plasmideal. Em adição a esses resultados, demonstramos que a inibição da

acidificação do pH, pelo tratamento com a cloroquina, não alterou nem a captura e

nem a distribuição do DNA, sugerindo que a captura do plasmídeo pode ocorrer em

células com vesículas alcalinas e permanecer nas mesmas. Como a inibição da

acidificação dessas vesículas é um mecanismo novo, ainda não discutido, pode-se

Discussão

105

pensar em um fenômeno mais amplo, utilizado em infecções bacterianas

intracelulares, e também como mecanismo de escape. Esses resultados abrem

perspectivas para estudos evolutivos que permitirão esclarecer o mecanismo

bioquímico e a relevância do mesmo em infecções bacterianas ou virais.

Uma vez que a captura do DNA ocorre por macropinocitose ou endocitose,

dependendo da célula em questão e, que quando em vesículas, o DNA foi capaz de

inibir a acidificação das mesmas, optamos por avaliar se este fato poderia ter

conseqüência no recrutamento de marcadores lisossomais como o LAMP 1. A não

colocalização com LAMP 1 sugere que essa alteração pode interferir nesse

recrutamento (Figura 35). Além disso, o não recrutamento de Rab5 para as

vesículas endossomais precoces, juntamente com a ausência de LAMP 1 pode

indicar uma nova rota de captura, uma vez que vários estudos destacam a presença

dessas moléculas durante o tráfego endo-lisossomal (AHMAD-NEJAD et al., 2002;

ZERIAL & McBRIDE, 2001; PILLAY et al., 2002). Por outro lado, a inibição da

acidificação não alterou o recrutamento da molécula MyD88 (Figura 31).

Curiosamente, nossos resultados diferem dos apresentados por AHMAD-NEJAD et

al. (2002) que demonstraram que a acidificação das vesículas endossomais é um

pré-requisito para o recrutamento de MyD88. Talvez tal divergência seja decorrente

do estímulo utilizado, já que a maioria dos estudos utilizam os motivos CpG, e neste

trabalho usamos o DNA plasmideal. Cabe ressaltar que a não colocalização com

BiP/GRP78 (Figuras 36 e 37) sugere que o DNA, uma vez em vesículas, não se

funde com outras vesículas recém formadas do retículo endoplasmático.

Adicionalmente, nossos resultados também demonstraram que o processo de

captura é independente do receptor TLR9 (Figura 29), uma vez que células de

animais knockout deste receptor também endocitam DNA, separando, desta

Discussão

106

maneira, a sinalização do processo de captura. Porém, uma vez capturado, a

sinalização do DNA é dependente de TLR9/MyD88. Provavelmente a captura do

DNA não está relacionada com este receptor, uma vez que o TLR9 não é um

receptor de superfície, pelo contrário, está presente no retículo endoplasmático

(LATZ et al., 2004).

Ainda em relação à inibição da acidificação, nosso próximo passo foi avaliar o

efeito deste fenômeno na apresentação antigênica, e os resultados obtidos

demonstraram que a apresentação do antígeno KLH (apresentado via MHC de

classe II) foi prejudicada após o tratamento com o DNA plasmideal (Figura 30).

Sabe-se que enzimas proteolíticas, como as catepsinas, presentes nas vesículas

endossomais, são responsáveis pela degradação de antígenos protéicos e que esta

atividade é dependente de pH ácido. Essas enzimas são responsáveis pela clivagem

da cadeia invariante das moléculas de MHC de classe II, e esta é uma das etapas

fundamentais para a apresentação de antígenos por esta via (ABBAS & LICHTMAN,

2003). Como nossos resultados demonstraram que o DNA plasmideal inibe a

acidificação dos lisossomos, e que, conforme acima mencionado, as enzimas

proteolíticas são importantes na apresentação via MHC de classe II e que sua

atividade é dependente de pH ácido, então, a inativação dessas enzimas, devido à

alteração do pH, é um possível mecanismo envolvido na alteração da apresentação

de antígeno. Esse interessante fenômeno, aparentemente paradoxal, pode ser

utilizado, por outro lado, não no estímulo da resposta imune, mas sim, no controle da

resposta imune adaptativa (considerando a ativação de células TCD4). Desse modo,

a hipótese levantada para tais resultados é que altas doses de DNA plasmideal

podem ser imunoestimulantes, enquanto que baixas doses podem resultar em efeito

oposto, como controle da inflamação, podendo ser usado no tratamento de doenças

Discussão

107

auto-imunes. Essa visão abre novas abordagens para o uso do DNA procariótico

(depósito de patente no INPI, número 2005.1.2414.17.8).

Cabe ressaltar que recentemente ACCAPEZZATO et al. (2005) demonstraram

que o tratamento com cloroquina, um agente lisossomotrópico, que inibe a

acidificação das vesículas endossomais (conforme mencionado anteriormente),

melhora a apresentação cruzada de antígenos solúveis em células dendríticas. Este

fenômeno foi justificado provavelmente devido ao fato que com o uso da cloroquina

e conseqüentemente, a inibição da acidificação, a degradação do antígeno solúvel é

reduzida, favorecendo o seu escape para o citoplasma, aumentando assim a

ativação de células TCD8. Com base nos resultados apresentados neste trabalho, o

DNA plasmideal pode ser considerado um agente lisossomotrópico como a

cloroquina, mas se ele favorece a apresentação cruzada de antígenos solúveis

ainda é um ponto a ser esclarecido, já que tal possibilidade não foi avaliada. A

interferência da inibição da acidificação com o tratamento com DNA plasmideal foi

avaliada apenas no contexto de apresentação de antígeno para células TCD4.

Em conjunto, todos os resultados apresentados sobre a biodistribuição e

tráfego intracelular das microesferas, juntamente com o tráfego do DNA plasmideal,

contribuem para o entendimento dos processos envolvidos na geração de resposta

imune em terapia gênica, e sugerem novos mecanismos envolvidos na interação

microesferas e DNA plasmideal com o sistema biológico. Conseqüentemente, esses

dados podem também contribuir para o delineamento de sistemas vacinais mais

eficientes, abrindo perspectivas de novas abordagens para o DNA plasmideal.

108

6. CONCLUSÕES

Conclusões

109

Com os dados apresentados neste trabalho podemos concluir que:

- a biodistribuição das microesferas de PLGA contendo DNA-Hsp65/DMT é

ampla, alcançando todos os órgãos analisados, e, além disso, esta formulação

permanece na maioria dos órgãos por pelo menos 30 dias;

- células dendríticas e macrófagos peritoneais, presentes nos linfonodos

drenantes, são os responsáveis pela captura das microesferas, após sua

administração por via intramuscular, em adição, células provenientes de animais que

receberam a formulação contendo DNA-Hsp65/DMT apresentaram aumento

significativo na expressão de moléculas superficiais CD80, CD86 e MHC de classe

II, quando comparadas com as formulações controle (vetor/DMT, vazia);

- as microesferas de PLGA contendo DNA-Hsp65/DMT, são fagocitadas in vitro

por macrófagos peritoneais e permanecem nos endossomos tardios e lisossomos,

onde são hidrolisadas, não ocorrendo escape para o compartimento citoplasmático;

- o DNA plasmideal (DNA-Hsp65) é capturado por células dendríticas e

macrófagos da linhagem J774 pelos processos de macropinocitose e endocitose

mediada por clatrina, respectivamente; e independente de TLR9;

- após a captura, o DNA plasmideal localiza-se nos endossomos tardios e

lisossomos induzindo a inibição da acidificação desses compartimentos;

- o DNA plasmideal permanece em vesículas até alcançar a região perinuclear,

ou seja, o plasmídeo não escapa para o compartimento citoplasmático;

- a inibição da acidificação dos endossomos tardios e lisossomos, mediada pelo

DNA interfere na apresentação de antígeno;

- o DNA plasmideal recruta a molécula MyD88, portanto a alteração do pH das

vesículas endo-lisossomais não influencia na ativação dessa cascata de sinalização.

Conclusões

110

Por outro lado, LAMP 1 e Rab5 não são recrutadas para as vesículas contendo

DNA.

111

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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127

8. ANEXO

Anexo

128

Anexo 1. Mapa do plasmídeo pcDNA

(Invitrogen)

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