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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA E FARMACOLOGIA
Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas
KELLY ISHIDA
ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville
SOBRE LEVEDURAS DE ISOLADOS CLÍNICOS
MARINGÁ
2006
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KELLY ISHIDA
ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville
SOBRE LEVEDURAS DE ISOLADOS CLÍNICOS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas
da Universidade Estadual de Maringá –
Área de Concentração Produtos Naturais e
Síntéticos Biologicamente Ativos, como
parte dos requisitos para a obtenção do
título de MESTRE EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS.
Orientador: Prof. Dr. Celso Vataru Nakamura
Co-orientador: Prof.
Dr. Benedito Prado Dias Filho
MARINGÁ
2006
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3
Aos meus pais, Amélia e Rubens, aos
meus avós, Setsuko e Miyajiro e ao
meu irmão Frank, pelo apoio e
incentivo constante.
4
AGRADECIMENTOS
“Uma andorinha não faz o verão”
(ditado popular)
Meu sincero agradecimento ao Prof. Dr. Celso Vataru Nakamura, pela sua amizade,
compreensão, paciência, confiança depositada em mim, admirável orientação e
engrandecimento profissional proporcionado nestes seis anos de convivência durante a minha
iniciação científica e o mestrado.
Ao Prof. Dr. Benedito Prado Dias Filho pela amizade e co-orientação desde a
iniciação científica.
À Profa. Dra. Tânia Ueda-Nakamura pelo apoio, amizade, sugestões e incentivos para
este trabalho.
Ao Prof. Dr. João Carlos Palazzo de Mello pelo suporte oferecido no Laboratório de
Farmacognosia do DFF/UEM.
À Profa. Dra. Sueli Fumie Yamada-Ogatta, da Universidade Estadual de Londrina,
pelo apoio e sugestões para este trabalho.
À Profa. Dra. Terezinha Inês Estilavet Svidzinski pelos ensinamentos em micologia
clínica e contribuições técnicas para a realização deste trabalho.
Ao Dr. Heinrich Luftmann do Instituto de Química Orgânica da Universidade de
Müster, Alemanha, pela obtenção do espectro de massas e suporte na interpretação deste.
Aos amigos queridos do laboratório: Denise de Oliveira Scoaris, Ivens Camargo Filho,
Raíssa Bocchi Pedroso, Marie Eliza Zamberlam, Thelma Onozatto, Érika Ravazzi Franco
Ramos, Heloísa Bressan Gonçalves, Cecília Valente Rodrigues Truite, Michelle Vendrametto,
Jean Colocite, Simone Evellyn Daniel Hernandes, Eliane Harue Endo e Andrea Mayumi
5
Koroishi, obrigada pela valorosa amizade, convivência e apoio durante o desenvolvimento
deste trabalho.
Aos meus colegas do Laboratório: Rosana Ferreira Carli, Marcio Guilhermetti,
Adriana Rosseti, Maria Aparecida Manzotti, Marinete Martinez Vicentim, Prisciliana
Carvalho, Zelita Rodrigues Souza, Nilza Bittencourtti, Adriana Santos, Paula Galdino
Carvalho, Jéssica Bertol, Karin Pelizzaro Rocha, Vanessa Ido, Amanda Bortolucci, Miriam
Ueda Yamaguchi, Rafael Yamamoto, e Simone Foss, pela boa convivência.
Aos colegas, Rita de Cássia Rampazzo, Fernando Bizerra e Paulo Roberto Ceridorio
Corrêa pelo apoio técnico na identificação molecular das amostras clínicas.
À Ana Cristina Isler pelo trabalho e companhia durante a coleta e extração das cascas
de Stryphnodendron adstringens.
Às amigas, Viviane Maraes de Aguiar, Andréia Martins Favarin, Gláucia Squizatto,
Andréia Naomi Ochiai Sekikawa, Andréa Tieko Kinoshita, Cristina Yoshie Ywazaki e
Fabiana Margonato pela amizade e convivência.
Em especial, agradeço ao Rafael de Leon Carvalho pelo amor, amizade,
companheirismo, cumplicidade e constante apoio neste momento da minha vida.
Às instituições financiadoras: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas desta Universidade, pelos
auxílios concendidos para a realização deste trabalho..
Principalmente aos meus pais e aos meus avós, que desde de criança me incentivaram.
Meus sinceros agradecimentos pela pessoa que sou e pelo meu sucesso.
A todos que participaram deste trabalho, direta ou indiretamente, para que pudesse ser
realizado.
A Deus, que sempre guiou meus passos, mostrando-me a o caminho a ser seguido.
6
“A mente que se abre a uma nova idéia
jamais voltará ao seu tamanho original."
(Albert Einstein)
7
RESUMO
Em recursos naturais, principalmente plantas, têm se buscado moléculas bioativas que
podem se tornar uma alternativa para o desenvolvimento de novos agentes antifúngicos com
menos efeitos colaterais, amplo espectro de ação e menor custo. Assim, o objetivo deste
trabalho foi verificar o efeito do extrato bruto, frações e subfrações de Stryphnodendron
adstringens (Mart.) Coville, popularmente conhecido como “barbatimão”, sobre leveduras
isoladas de fluido vaginal. Amostras de fluido vaginal foram coletadas de 506 pacientes
ambulatoriais, sendo que 103 apresentaram cultura positiva para leveduras (20,35%). Dentre
essas, 96/103 (93,2%) foram identificadas como Candida albicans, 6 como C. não albicans (1
C. parapsilosis, 1 C. tropicalis e 4 Candida sp.) e uma amostra como não pertencente ao
gênero Candida. Todas as amostras foram susceptíveis aos poliênicos, e somente 7,76 %
resistentes ou susceptível dose dependente ao fluconazol. A maioria das amostras produziram
protease ácida (99%), fosfolipase (83%) e hemolisina (91,3%). A aderência de leveduras em
células Vero foi variada, sendo que 67,9% das amostras apresentaram aderência de 50 a
150%, e a maioria possuem características hidrofílicas. As amostras foram susceptíveis aos
extratos de S. adstringens em concentrações superiores a 7,8 µg/mL mostrando somente
atividade fungistática. A subfração F2.4 do “barbatimão” inibiu a formação do tubo
germinativo em concentrações ≥15,75 µg/mL, e um aumento significativo de brotamentos
(188,34%) foi observado em leveduras tratadas com 125 µg/mL. A inibição da aderência de
leveduras em células e superfície abiótica foi dose dependente. A subfração F2.4 reduziu a
hidrofobicidade de superfície celular. Através da metodologia empregada nesse estudo, não
foi possível detectar a inibição da atividade de enzimas extracelulares de Candida spp.
Interações da subfração F2.4 com anfotericina B, fluconazol e nistatina não foram sinérgicas.
Através da microscopia óptica e de varredura pôde-se observar a inibição na formação de
pseudohifas e efeito aglutinante da subfração F2.4. Irregularidades na parede celular de
8
leveduras tratadas com a subfração F2.4 também foram visualizadas, e a microscopia
eletrônica de transmissão evidenciou o efeito sobre a parede celular. Adicionalmente, a
estimulação macrofágica foi verificada quando as leveduras eram previamente tratadas com
7,8 µg/mL da subfração F2.4 por 2 h, observando um aumento de 28% em relação ao
controle. A citotoxicidade dos extratos do “barbatimão” foi observada sobre células Vero e
macrófagos com CC
50
acima de 100 µg/mL. Por outro lado, para hemácias e larvas de
Artemia salina a CC
50
e DL
50
foram superiores a 1000 µg/mL, exceto para a subfração F2.4
com DL
50
de 100 µg/mL. Provavelmente a atividade antifúngica da subfração F2.4 observada
neste trabalho se atribui às proantocianidinas poliméricas triidroxilados no anel B e presença
de ácido gálico na sua estrutura, com estimativa de peso molecular médio de 2.000 Da.
Palavras-chave: Antifúngicos, “Barbatimão”, Candida sp., Leveduras,
Stryphnodendron adstringens
9
ABSTRACT
In natural products, mainly plants, have searched bioactivies compounds which can
become an alternative for development of news antifungal agents with fewer side effects, a
greater spectrum of action and low cost. So, the aim of this study was verify the effect of
crude extract, fractions, and sub-fractions otained from Stryphnodendron adstringens (Mart.)
Coville, known as “barbatimão”, on yeasts isolated from vaginal fluid. Of 506 vaginal fluid
samples, 103 had positive culture on dextrose Sabouraud ágar (20.35%). Ninety and six
samples were identified as Candida albicans and, six C. non- albicans (1 C. parapsilosis, 1 C.
tropicalis and 4 Candida sp). One no concern genus Candida. All yeasts were susceptible to
polyenes and, just 7.76% were resistants or dose dependent susceptible. The most of yeast
produced acid protease (99%), phospholipase (83%) and hemolysin (91.3%). Adherence on
Vero cells was varied, being 67.9% with 50 to 150 yeasts/100 cells, and the most had
hydrophilics characteristics. The extracts of S. adstringens showed antifungal activity in
concentration above 7.8 µg/mL, however just fungistatic action. The sub-fraction F2.4
inhibited the germinative tube formation in concentrations ≥15.75 µg/mL and significative
increase of buddings (188.34%) was observed in yeasts treated with 125 µg/mL. Adherence
inhibition of yeast on cell and abiotic surface was dependent dose. The sub-fraction F2.4
reduced the cellular surface hydrophobicity. In this study was not possible verify the
inhibition of extracellular enzymes activities. Combinations of sub-fraction F2.4 with
amphotericin B, nystatin or fluconazole were not synergic. Through optic and scanning
eletronic microscopy can be observed the inhibition in pseudohyphal formation and
agglutinant effect of sub-fraction F2.4. Irregularity on cell wall of yeasts treated was observed
and transmission eletronic microscopy showed evidence of the effect of “barbatimão” on
yeast wall cell. Additionaly, the macrophage stimulation was verify when the yeasts were
10
treated previously with 7.8 µg/mL of sub-fraction F2.4 by 2 h, observing increase of 28%
compared with control group. Cytotoxicity effect of extracts obtained from “barbatimão” was
observed on Vero and macrophages cells with CC
50
above 100 µg/mL. On the other hand, for
blood red cell and Artemia salina grub the CC
50
and DL
50
were >1,000 µg/mL, except for sub-
fraction F2.4, which DL
50
was 100 µg/mL. Probably the antifungal activity of sub-fraction
F2.4 is attributed the polymers proanthocyanidins tri-hydroxylated in ring B and presence of
gallic acid linked in structure of polymer, with median molecular weight of 2,000 Da.
Key-Words: Antifungal, “Barbatimão”, Candida sp., Stryphnodendron adstringens,
Yeast
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville, São Jerônimo da Serra, Paraná,
Brasil. A: Planta; B:Caule; C: Folha.-----------------------------------------------------------------28
Figura 2: Esquema de diluição dos antifúngicos em estudo (anfotericina B, fluconazol,
nistatina, subfração F2.4 do “barbatimão”) para a combinação de diferentes concentrações. X
é a concentração inibitória mínima.--------------------------------------------------------------------57
Figura 3: Freqüência de leveduras isoladas de fluido vaginal em meio ágar Sabouraud
dextrose.---------------------------------------------------------------------------------------------------65
Figura 4: Aderência de Candida albicans isoladas de fluido vaginal sobre monocamada de
células Vero. A: 0,04 levedura/célula Vero. B: 3,86 levedura/célula Vero. Barra = 20 µm.--74
Figura 5: Correlações significativas entre fatores de virulência de Candida spp. e
susceptibilidade aos agentes antifúngicos, com nível de significância de 0,05. A: Correlação
positiva de hemolisina com protease e fosfolipase; B: correlação negativa de CSH com
enzimas extracelulares e aderência em células Vero; C: correlação positiva entre
susceptibilidade a fluconazol e anfotericina B com atividade hemolítica.-----------------------76
Figura 6: Espectro de
13
C RMN MAS no estado sólido da subfração F2.4 de
Stryphnodendron adstringens. (a) C-4 de unidades de prodelfinidina e prorobinetinidina; (b)
metoxila de ácido carboxílico; (c) C-3 de unidade terminal de flavan-3-ol; (d) C-3 de
unidades de prorobinetinidina (configuração 2,3-trans); (e) C-2 de unidades de prodelfinidina
(configuração 2,3-cis); (f) C-2 de unidades de prodelfinidina e prorobinetinidina
(configuração 2,3-trans); (g) C-4a de unidades de prodelfinidina (configuração 2,3-cis); (h)
12
C-2’ e C-6’ do anel B não substituído de prodelfinidina; (i) C-2” do ácido gálico; (j) C-1’ e C-
4’ de unidades de prodelfinidina e prorobinetinidina; (k) C-4” do ácido gálico; (l) C-3’ e C-5’
do anel B de prodelfinidina; (m) carbonos hidroxilados do anel A; (n e o) carboxila de ácidos
carboxílicos.-----------------------------------------------------------------------------------------------81
Figura 7: Polímero de proantocianidina que pode compor a subfração F2.4 de
Stryphodendron adstringens, sugerido através da análise do espectro de massas e de
13
C
RMN.------------------------------------------------------------------------------------------------------82
Figura 8: Média das concentrações inibitória mínima das frações F1, F2 e F3 (A) e
subfrações F2.2, F2.3 e F2.4 (B) de Stryphnodendron adstringens sobre leveduras de isolados
clínicos. Amostragem n=103 para frações e n=38 para as subfrações. A: * diferença
significativa em relação a fração F1 (p<0,001). B: * diferença significativa em relação a
F2/F2.4 (p<0,001). Resultados expressos em média ± erro padrão da média.-------------------87
Figura 9: Inibição da formação do tubo germinativo de Candida albicans pela subfração F2.4
de Stryphnodendron adstringens na concentração de15,75 µg/mL. A: Controle; B: 15,75
µg/mL da subfração F2.4. Aumento de 400X.-------------------------------------------------------90
Figura 10: Efeito da subfração F2.4 de Stryphnodendron adstringens sobre o brotamento de
Candida albicans isolada de fluido vaginal. A: Controle, B: 125 µg/mL subfração F2.4, C:
3,12 µg/mL nistatina. Aumento de 400X.-------------------------------------------------------------92
Figura 11: Efeito da subfração F2.4 de Stryphnodendron adstringens sobre brotamentos de
Candida albicans isolada de fluido vaginal. Concentrações das drogas em µg/mL. *Diferença
significativa com o grupo controle (p<0,001, test t-student).--------------------------------------92
13
Figura 12: Efeito da subfração F2.4 de Stryphnodendron adstringens nas concentrações de
7,8 e 125 µg/mL na aderência de leveduras de isolados clínicos, em monocamada de células
Vero (A) e em superfície abiótica (B). Amostras padrões: Candida albicans ATCC 10231,
Candida parapsilosis ATCC 22019. Amostras de isolados clínicos: Candida sp (02), C.
albicans (111, 235 e 352), C. parapsilosis (144) e C. tropicalis (299). Controle; 7,8
µg/mL; 125 µg/mL.-----------------------------------------------------------------------------------95
Figura 13: Inibição de aderência de Candida albicans ATCC 10231 em células Vero (A, B e
C) e em superfície abiótica (D, E, F) tratadas previamente com a subfração F2.4 de
Stryphnodendron adstringens por 24 h a 37 ºC. A e D: Controle; B e E: 7,8 µg/mL; C e F:
125 µg/mL. Aumento de 400X.------------------------------------------------------------------------96
Figura 14: Hidrofobicidade de superfície celular de amostras de leveduras do gênero
Candida tratadas por 24 h com a subfração F2.4 de Stryphnodendron adstringens nas
concentrações de 7,8 e 125 µg/mL, sendo Candida albicans ATCC 10231, Candida
parapsilosis ATCC 22019 e 6 isolados clínicos: Candida albicans (111, 235 e 352), Candida
parapsilosis (144), Candida tropicalis (299) e Candida sp ()2). Controle; 7,8 µg/mL; 125
µg/mL.-----------------------------------------------------------------------------------------------------98
Figura 15: Microscopia eletrônica de transmissão (A, B e C) e de varredura (D, E e F) de
Candida albicans tratada com subfração F2.4 de Stryphnodendron adstringens por 48 h a 37
ºC. A e D: Controle; B e C: 125 µg/mL, E e F: 31,25 µg/mL. Barras=1µm.------------------101
Figure 16: Microscopia eletrônica de transmissão de Candida albicans tratada com subfração
F2.4 de Stryphnodendron adstringens. A: Controle; B: 3,12 µg/mL de nistatina; C e D: 31,25
µg/mL da subfração F2.4; E e F: 125 µg/mL da subfração F2.4. Barras = 1 µm.-------------102
14
Figura 17: Estímulo da resposta macrofágica pela subfração F2.4 de Strypnhodendron
adstringens sobre leveduras tratadas previamente com 7,8 µg/mL por 2 h a 37 ºC.----------106
Figura 18: Estímulo da resposta macrofágica pela subfração F2.4 de Stryphnodendron
adstringens sobre Candida albicans previamente tratadas com 7,8 µg/mL. A e B: Coloração
de Giemsa; C e D: Microscopia eletrônica de varredura; E e F: Microscopia eletrônica de
transmissão. A, C e E: Controle; B, D e F: 7,8 µg/mL. Barras = 5 µm.------------------------107
Figura 19: Microscopia óptica do processo de internalização de Candida albicans pelos
macrófagos J774G8. As leveduras foram tratadas previamente com subfração F2.4 de
Stryphnodendron adstringens na concentração de 7,8 µg/mL por 2 h, e posteriormente
submetido à interação com macrófagos por 1 h a 37 ºC. A: Macrófago com leveduras
internalizadas; B – F: Etapas do processo de internalização de leveduras pelos macrófagos. B:
Levedura aderida à membrana de macrófago; C: Invaginação de membrana com a levedura;
D: Extensão da invaginação de membrana envolvendo a levedura; E: Completo envolvimento
da levedura pela membrana; F: Levedura internalizada. Aumento de 1000X.-----------------108
15
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Seqüência dos oligonucleotídeos iniciadores para reações de amplificação em
cadeia pela polimerase.----------------------------------------------------------------------------------42
Tabela 2: Composição química do meio mínimo utilizado na preparação de meios de cultura
para avaliar a produção de enzimas extracelulares (protease ácida, fosfolipase e hemolisina).
A concentração dos constituintes está expressa em g/L.--------------------------------------------51
Tabela 3: Identificação das leveduras isoladas de fluido vaginal através do método
micológico padrão e pela reação em cadeia da polimerase.----------------------------------------65
Tabela 4: Concentração inibitória mínima em µg/mL de antifúngicos sobre leveduras de
isolados clínicos e perfil de sensibilidade e resistência.--------------------------------------------68
Tabela 5: Caracterização de 103 leveduras isoladas de fluido vaginal quanto à produção de
enzimas extracelulares (protease ácida, fosfolipase e hemolisina), hidrofobicidade de
superfície celular e aderência em células Vero.------------------------------------------------------75
Tabela 6: Rendimento das frações e subfrações obtidas a partir de 100 g do pó da casca do
caule do Stryphnodendron adstringens, após extração com acetona:água (7:3), partição com
acetato de etila e eluição em coluna contendo Sephadex LH-20.----------------------------------77
Tabela 7: Atividade antifúngica de extratos de Stryphnodendron adstringens sobre Candida
spp. Concentração inibitória mínima (CIM) em µg/mL. -------------------------------------------88
Tabela 8: Inibição da aderência de Candida spp. em células Vero e superfície abiótica
(vidro), tratadas por 24 h a 37 ºC com subfração F2.4 nas concentrações de 7,8 e 125 µg/mL. -
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------96
16
Tabela 9: Concentração citotóxica de 50% (CC
50
) e dose letal de 50% (DL
50
) em µg/mL e
índice de seletividade (IS) das frações F1, F2 and F3 e subfração F2.4 de Stryphnodendron
adstringens sobre células de mamíferos (Vero, Macrófagos J774G8 e hemácias de carneiro) e
larvas de Artemia salina. ------------------------------------------------------------------------------111
17
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1: Processo de extração das cascas de Stryphnodendron adstringens e partição
do extrato bruto com acetato de etila. A coluna de Sephadex LH-20 foi eluída em solventes de
diferentes proporções volumétricas a uma seqüência de etanol 50%, etanol 70%, etanol 90% e
acetona 70%, obtendo as respectivas subfrações: F2.1, F2.2, F2.3 e F2.4.-----------------------45
18
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
δ
Deslocamento químico
13
C RMN Ressonância magnética nuclear de carbono 13
AH Atividade hemolítica
ASD Ágar Sabouraud dextrose
BEC Célula epitelial bucal
CC
50
Concentração citotóxica de 50%
CFI Concentração fracional inibitória
CFM Concentração fungicida mínima
CI
50
Concentração inibitória de 50%
CIM Concentração inibitória mínima
CIM
50
Concentração inibitória mínima de 50%
CIM
90
Concentração inibitória mínima de 90%
CSH Hidrofobicidade de superfície celular
CVV Candidíase vulvovaginal
CVVR Candidíase vulvovaginal recorrente
DL
50
Dose letal de 50%
DMSO Dimetilsulfóxido
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
ES-MS Espectrometria de massas por eletrospray
HIV Vírus da imunodeficiência adquirida
HMB Hexametilbenzeno
IH Índice de hidrofobicidade
IS Índice de seletividade
19
MET Microscopia eletrônica de transmissão
MEV Microscopia eletrônica de varredura
MOPS Ácido-3-N- morfolinopropanesulfônico
PCR Reação em cadeia da polimerase
PMN Polimorfonuclear
R Resistente
rpm Rotação por minuto
S Sensível
SDD Susceptibilidade dose dependente
SDS Dodecil sulfato de sódio
SFB Soro fetal bovino
UFC Unidade formadora de colônia
YNB Base nitrogenada para levedura
20
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 23
1.1 Plantas medicinais 23
1.2 Fitoterápicos como alternativa para o tratamento de infecções fúngicas 24
1.3 Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville 25
1.3.1 Atividades farmacológicas e toxicológicas de Stryphnodendron ............................................................ 25
1.3.2 Fitoquímica e relação com a atividade biológica..................................................................................... 27
1.4 Candidíases 29
1.4.1 Fatores de virulência................................................................................................................................ 29
1.4.2 Candíase vulvovaginal............................................................................................................................. 30
1.4.3 Fármacos empregados na terapêutica das infecções fúngicas.................................................................. 31
1.4.4 Resistência aos azóis................................................................................................................................32
1.4.5 Diagnóstico das infecções fúngicas ......................................................................................................... 34
2 OBJETIVOS 36
2.1 Objetivos gerais 36
2.2 Objetivos específicos 36
3 MATERIAIS E MÉTODOS 38
3.1 Amostras em estudo 38
3.1.1 Coleta das amostras de fluido vaginal ..................................................................................................... 38
3.1.2 Isolamento de leveduras e estocagem...................................................................................................... 38
3.2 Identificação das amostras 39
3.2.1 Métodos clássicos de identificação.......................................................................................................... 39
3.2.2 Identificação das leveduras isoladas através da técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ..... 40
3.3 Material vegetal 43
3.3.1 Coleta.......................................................................................................................................................43
3.3.2 Processo extrativo.................................................................................................................................... 43
3.3.3 Fracionamento ......................................................................................................................................... 43
3.3.4 Caracterização química da subfração F2.4 de Stryphnodendron adstringens.......................................... 44
3.4. Teste de susceptibilidade in vitro aos agentes antifúngicos 46
3.4.1 Soluções estoques dos antifúngicos......................................................................................................... 46
3.4.2 Determinação da concentração inibitória mínima ...................................................................................46
3.5 Perfil dos fatores de virulência das leveduras isoladas de fluido vaginal 47
3.5.1 Aderência em células de linhagem contínua............................................................................................47
3.5.2 Hidrofobicidade de superfície celular...................................................................................................... 48
3.5.3 Determinação de enzimas extracelulares................................................................................................. 49
21
3.6 Avaliação da atividade antifúngica de Stryphnodendron adstringens sobre leveduras
de isolados clínicos 52
3.6.1 Teste de susceptibilidade in vitro do extrato bruto, frações e subfrações................................................52
3.6.2 Efeito da subfração F2.4 sobre as enzimas extracelulares (protease ácida, fosfolipase e hemolisina) .... 53
3.6.3 Efeito da subfração F2.4 sobre a hidrofobicidade de superfície celular (CSH) .......................................53
3.6.4 Ensaio de inibição da aderência das leveduras em células de linhagem contínua e em superfície abiótica
pela subfração F2.4........................................................................................................................................... 54
3.6.5 Efeito da subfração F2.4 sobre a formação do tubo germinativo.............................................................54
3.6.6 Efeito da subfração F2.4 sobre o processo de divisão leveduriforme...................................................... 55
3.7 Combinação de drogas 55
3.8 Efeito da subfração F2.4 de Stryphnodendron adstringens sobre o processo de
internalização de leveduras por Macrófagos 58
3.9 Microscopia óptica 59
3.10 Avaliação das alterações ultraestruturais 59
3.10.1 Microscopia eletrônica de transmissão..................................................................................................59
3.10.2 Microscopia eletrônica de varredura...................................................................................................... 60
3.11 Estudo do efeito tóxico do “barbatimão” 60
3.11.1 Efeito sobre a viabilidade das larvas da Artemia salina ........................................................................ 60
3.11.2 Efeito citotóxico dos extratos do “barbatimão” sobre células VERO e MACRÓFAGO J774G8 ......... 60
3.11.3 Estudo do efeito hemolítico e hemaglutinante dos extratos do “barbatimão”........................................ 61
3.12 Análise Estatística 62
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 63
4.1 Distribuição e caracterização das leveduras 63
4.2 Perfil de susceptibilidade aos agentes antifúngicos 66
4.3 Perfil dos fatores de virulência das leveduras isoladas de fluido vaginal 69
4.3.1 Aderência em células VERO...................................................................................................................69
4.3.2 Hidrofobicidade de superfície celular...................................................................................................... 70
4.3.3 Produção de enzimas extracelulares ........................................................................................................ 71
4.3.4 Correlação entre fatores de virulência e antifúngicos.............................................................................. 72
4.4 Estudo Fitoquímico 77
4.4.1 Rendimento dos extratos obtidos das cascas do caule do Stryphnodendron adstringens ........................ 77
4.4.2 Caracterização química da subfração F2.4 de Stryphnodendron adstringens.......................................... 78
4.5 Atividade antifúngica de Stryphnodendron adstringens 83
4.5.1 Combinações de drogas antifúngicas....................................................................................................... 89
4.5.2 Investigação do modo de ação da subfração F2.4 de Stryphnodendron adstringens sobre Candida spp.89
4.5.2.1 Efeito sobre a formação do tubo germinativo ............................................................................. 89
4.5.2.2. Efeito sobre o processo de divisão celular................................................................................. 91
4.5.2.3 Inibição da aderência de leveduras em células Vero e superfície abiótica................................. 93
4.5.2.4 Efeito sobre a hidrofobicidade de superfície celular...................................................................97
4.5.2.5 Avaliação das alterações ultraestruturais................................................................................... 99
4.5.2.6 Efeito sobre a atividade das enzimas extracelulares (protease ácida, fosfolipase e hemolisina)
............................................................................................................................................................... 103
22
4.6 Efeito estimulante da subfração F2.4 de Stryphnodendron adstringens sobre a
fagocitose de Candida albicans 104
4.7 Toxicidade das frações e subfração F2.4 de Stryphnodendron adstringens 109
5 CONCLUSÕES 112
6 REFERÊNCIAS 114
23
1 Introdução
1.1 Plantas medicinais
Nas últimas décadas, o uso de plantas medicinais pela população mundial tem crescido
de forma significativa. Cerca de 80% da população mundial fez uso de algum tipo de erva na
busca de alívio de alguma sintomatologia dolorosa ou desagradável e, desse total, pelo menos
30% deu-se por indicação médica. As plantas medicinais têm se constituído um dos recursos
terapêuticos empregados por uma parcela significativa da população brasileira, seja na
manutenção ou na recuperação da saúde. A produção de fitoterápicos representa uma
perspectiva importante para o desenvolvimento do setor industrial, devendo-se para isto levar
em consideração o potencial da biodiversidade existente. Nosso país possui cerca de 120.000
espécies vegetais das quais menos de 1 % foram estudadas (MARTINS et al., 1994).
As plantas têm sido comumente utilizadas na medicina popular, porém poucos estudos
têm sido realizados para comprovar a atividade farmacológica. Trabalhos recentes têm
demonstrado que alguns extratos de plantas medicinais possuem diferentes atividades
biológicas. O óleo essencial da alfavaca (Ocimum gratissimum L.) apresentou ter atividade
antibacteriana contra bactérias Gram positivas (Sthalylococcus aureus) e Gram negativas
(Pseudomonas aeruginosa) (NAKAMURA et al., 1999). Plantas da família Mimosaceae
como Albizia anthelmintica Brong. possuem atividade anti-helmíntica contra Haemonchus
contortus e Heligmosomoides polygyrus (GITHIORI et al., 2003), e o extrato bruto de Parkia
biglobosa (Jacq.) G.Don é capaz de neutralizar veneno de cobra de duas espécies (Naja
nigricollis e Echis ocellatus) (ASUZU; HARVEY, 2003). Deste modo, muitas pesquisas estão
sendo realizadas no sentido de ampliar o conhecimento farmacológico, para posterior
aplicação clínica.
24
1.2 Fitoterápicos como alternativa para o tratamento de infecções
fúngicas
Atualmente há uma grande preocupação com o tratamento de infecções fúngicas.
Têm-se verificado um aumento no aparecimento de amostras fúngicas resistentes aos agentes
antifúngicos largamente utilizados na terapêutica. Além disso, as drogas disponíveis para o
tratamento de infecções fúngicas são altamente tóxicas. Algumas espécies fúngicas estão
tomando espaço no arsenal das infecções oportunistas, dentre elas destacam-se Aspergillus e
Fusarium, que têm causado infecções sistêmicas, principalmente em pacientes
imunocomprometidos (GELFAND, 1997).
Conseqüentemente, a necessidade pela busca de novos agentes antifúngicos tem se
tornado grande no decorrer desses últimos anos. Uma alternativa para isso é a busca de
moléculas bioativas em produtos naturais, especialmente plantas medicinais popularmente
utilizadas, na tentativa de descobrir agentes antifúngicos com menos efeitos colaterais,
espectro de ação ampliado e com efetiva ação fungicida (MESA ARANGO et al., 2004).
Muitos pesquisadores têm relatado atividade antifúngica de plantas medicinais.
Nakamura et al. (2004) mostraram atividade fungicida do óleo essencial de Ocimum
gratissium L. sobre quatro espécies de Candida. Mincoff et al. (2005) verificaram a atividade
antifúngica de um peptídio de 30 kDa isolado de Sorghum bicolor L. contra Candida
albicans. Alicina e ajoeno, isoladas de Allium sativum L., eucalipitol (1,8 cianol) de
Eucalyptus globulus Labill. e zeamatina de Zea mays L., são substâncias ativas contra
diferentes gêneros de fungos, que podem compreender: Candida, Malassezia, Cryptococcus,
Aspergillus e dermatófitos. Assim, moléculas isoladas de produtos naturais com potencial
antifúngico podem contribuir para a indústria farmacêutica no desenvolvimento de fármacos e
para a produção de novas formulações, com menos efeitos colaterias, amplo espectro de ação
e menor custo (MESA ARANGO et al., 2004).
25
1.3 Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville
Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville, família Leguminosae, com sinonímia de
Stryphnodendron barbatimao Mart., é conhecido popularmente como barbatimão, barba-de-
timam, Yba-timõ, casca-de-virgindade (ou da mocidade) e chorãozinho roxo.
O “barbatimão” é uma árvore, de caule e ramos tortuosos, revestidos de pouca
folhagem; casca rugosa; folhas bipinadas; com folíolos ovados, pequenos, às vezes glabros.
As flores são avermelhadas ou quase brancas, pequenas, dispostas em espigas cilíndricas,
axilares, densas. O fruto é uma vagem séssil, grossa, carnosa, linear-oblonga, comprida em
torno de 10 cm (CORRÊA, 1984). As cascas apresentam em pedaços de formas e tamanhos
variados. A casca proveniente do tronco mostra-se curvada, no sentido transversal, medindo
em geral 12 mm de espessura. As cascas dos ramos apresentam-se enroladas no mesmo
sentido medindo em média 4 mm de espessura. A superfície externa é de cor pardo-
esverdeada e com placas esbranquiçadas quando recoberta por liquens. Pode ser rugosa e
profundamente escavada em todos os sentidos. Sua superfície interna é de cor pardo-
avermelhada viva a pardo-brancacenta, às vezes enrugada transversalmente e estriada
longitudinalmente, devido à presença de grandes feixes de fibras (OLIVEIRA et al., 1998)
(Figura 1).
A parte da planta utilizada popularmente é a casca, rica em taninos, na qual o extrato
bruto é preparado na forma de infusão ou decocção.
1.3.1 Atividades farmacológicas e toxicológicas de Stryphnodendron
Recentes trabalhos mostraram a atividade antimicrobiana de frações e subfrações
semipurificadas das cascas de S. adstringens. Endo et al. (2000) e Holetz et al. (2002, 2005)
mostraram o efeito inibitório do extrato bruto e subfrações semipurificadas da casca de S.
adstringens sobre Herpetomonas samuelpessoai. Em 2002, Herzog-Soares et al. (2002)
observaram a atividade antiproliferativa do extrato bruto de S. adstringens sobre
26
Trypanosoma cruzi, agente causador da doença de Chagas, enquanto Luize et al. (2005)
verificaram o efeito anti-protozoário do extrato bruto sobre Leishmania (L.) amazonensis e
Trypanosoma cruzi, na concentração de 100 µg/mL. Maza et al. (2003) observaram alterações
na ultraestrutura de formas promastigostas de L. amazonensis na presença de extratos de S.
adstringens. Nas concentrações iguais ou inferiores a 500 µg do extrato bruto de S.
adstringens, observou-se atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus e
Pseudomonas aeruginosa (AUDI et al., 2004). Já S. polyphyllum e S. obovatum apresentaram
efeito antibacteriano contra S. aureus, nas concentrações de 125 e 250 µg/mL,
respectivamente (LOPES et al., 2005).
Atividade antiinflamatória de S. adstringens foi estudada por Panizza et al. (1988), e
atividade antiulcerogênica por Audi et al. (1999) e Martins et al. (2002). Bersani-Amado et al.
(1996) verificaram o efeito analgésico e antiinflamatório do extrato aquoso de S. adstringens.
O efeito de extratos obtidos de cascas de espécies de Strypnhodendron sobre o
processo de cicatrização de ferimentos foram avaliados por Panizza et al. (1988) (S.
adstringens) e Lopes et al. (2005) (S. polyphyllum e S. obovatum), observando uma ótima
atividade cicatrizante.
Também foi avaliada a atividade moluscicida contra Biomphalaria glabrata,
verificando que o extrato alcóolico da casca de S. adstringens e S. polyphyllum em 50 ppm,
apresenta mortalidade de 60% e 70% , respectivamente (BEZERRA et al., 2002).
Rebecca et al. (2002) mostraram que a admistração de doses em tempo prolongado do
extrato aquoso de S. adstringens resulta efeitos tóxicos a ratos Wistar. Eles também
determinaram a toxicidade aguda, na qual a DL
50
foi observada na dose de 2.699 mg/kg.
Além disso, esse extrato também interferiu no metabolismo energético hepático (REBECCA
et al., 2003).
27
1.3.2 Fitoquímica e relação com a atividade biológica
As cascas de Stryphnodendron adstringens contêm pelo menos 8% de taninos totais,
constituídos principalmente por taninos condensados (FARMACOPÉIA, 2003). Os taninos
condensados de S. adstringens são constituídos por unidades de prodelfinidina, que podem ser
galocatequina e/ou epigalocatequina, que contém grupos orto-hidroxilas no anel B (SANTOS
et al., 2002). Mello et al. (1996a, 1996b, 1999) também identificaram flavan-3-ols,
prodelfinidinas, e prorobinetinidinas de S. adstringens.
Santos et al. (2002) compararam o teor de taninos e compostos fenólicos em duas
espécies de Stryphnodendron. Adicionalmente, observaram pequenas quantidades de
monômeros, dímeros e trímeros em extrato bruto extraído com acetona:água (7:3, v/v).
Também verificaram que ocorrem diferenças no grau de polimerização para os extratos das
plantas entre S. adstringens e S. polyphyllum. De acordo com esses autores, o grau de
polimerização é um fator importante para a atividade biológica dos taninos.
Toledo et al. (2002) detectaram a presença de taninos condensados de alto peso
molecular (oligômeros e polímeros) em subfrações da fração acetato de etila, obtidas em
coluna de Sephadex LH-20. Holetz et al. (2005) sugeriram que a elevada atividade anti-
protozoário dos polímeros se deve a estereoquímica, devido a presença de vários grupamentos
hidroxilas, que assumem diferentes conformações espaciais, e podem interagir com proteínas
do metabolismo de H. samuelpessoai, inibindo o crescimento do protozoário.
Para o controle de qualidade dos extratos de S. adstringens, pode-se utilizar padrões de
taninos condensandos monoméricos, como galocatequina, epigalocatequina, 4´-O-
metilgalocatequina, 4´-O-metilgalocatequina(4α→8)-4’-O-metilgalocatequina (AUDI et al.,
2004)
28
Figura 1: Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville, São Jerônimo da Serra, Paraná,
Brasil. A: Planta; B:Caule; C: Folha.
B
A
C
C
29
1.4 Candidíases
Os agentes etiológicos de candidíases são leveduras do gênero Candida, que
geralmente se multiplicam por meio de brotamentos. Esse gênero é constituído por mais de
cem espécies que podem viver em diversos ecossistemas. As leveduras estão distribuídas
universalmente colonizando homens e animais, sobretudo o tegumento e mucosas digestivas,
genital e respiratória. Até 80% dos indivíduos podem exibir colonização nesses locais na
ausência de doença. Sobrevivem ainda no solo, na água, nos vegetais, nos alimentos e em
diversos ambientes (CANNON; CHAFFIN, 1999). O espectro das candidíases inclui desde
infecções superficiais, transitórias, facilmente tratáveis, até as formas invasivas com
comprometimento sistêmico. E nesse caso são potencialmente fatais e apresentam pouca
probabilidade de sucesso terapêutico (HAZEN, 1995).
Nos últimos anos, infecções hospitalares por leveduras têm sido freqüentes. Embora as
bactérias ainda sejam os agentes etiológicos mais comumente isolados, as leveduras ocupam o
quarto lugar entre os agentes de infecções hospitalares, as quais estão associadas à elevada
taxa de mortalidade e morbidade (REAGAN et al., 1995; VAZQUEZ et al., 1997; HUANG et
al., 1998).
1.4.1 Fatores de virulência
Alguns fatores de virulência são importantes para que os microrganismos se
estabeleçam no tecido e causem infecção. Mecanismos de aderência são essenciais para o
sucesso da colonização de microrganismos no corpo humano, e é considerado um passo
importante para a colonização sobre o tecido, e conseqüentemente uma etapa relevante para a
patogênese de muitas doenças infecciosas. Muitos pesquisadores relatam que a
hidrofobicidade de superfície celular está relacionada com o de aderência em superfícies
30
abióticas e não abióticas (HAZEN et al.; 1991; ENER; DOUGLAS, 1992). A habilidade de
Candida sp. persistir no local colonizado e causar infecção tem sido atribuída à capacidade
dessas leveduras em crescer em extremas condições fisiológicas, bem como pH e nutrientes.
Além disso, produções de enzimas extracelulares (proteases ácidas como a aspartil proteinase,
lipases, fosfolipases e hemolisinas), dimorfismo (células unicelulares e pseudohifas) e a
habilidade de variar fenotipicamente contribuem para o processo infeccioso (CALDERONE;
FONZI, 2001). Esses fatores de virulência têm contribuído no estabelecimento de infecções
por microrganismos e principalmente estão relacionados com o processo invasivo
(BARRETT-BEE et al., 1985, IBRAHIM et al., 1995; FEKETE-FORGÁCS et al., 2000;
GHANNOUM, 2000; SINGLETON et al., 2004).
1.4.2 Candíase vulvovaginal
A candidíase vulvovaginal (CVV), também conhecida como monilíase vaginal, é a
segunda causa mais comum de infecção vaginal (SALVATORE, 1980).Esta infeção é
caracterizada por prurido, ardor, dispauremia, e eliminação de um corrimento esbranquiçado.
Com freqüência, a vulva e a vagina encontram-se edemaciadas e hiperemiadas. As lesões
podem estender-se pelo períneo, região perianal e inguinal. Não é uma doença de transmissão
exclusivamente sexual. Existem fatores que predispõe ao aparecimento da infecção: diabetes
melitus, gravidez, uso de anticoncepcionais orais, antibióticos, corticóides,
imunossupressores, obesidade, radioterapia, transplantes, infecção por HIV, dentre outros.
Estima-se que aproximadamente 75% das mulheres já tiveram pelo menos um episódio de
CVV durante a sua vida. Uma porcentagem significativa delas pode ter episódios
subseqüentes de CVV, e 5% podem desenvolver candidíase vulvovaginal recorrente (CVVR),
que é caracterizada por três ou mais episódios de CVV durante um ano (KENT, 1991;
SOBEL, 1998).
31
Cerca de 90% dos casos de CVV são atribuídos a C. albicans. Outras espécies desse
gênero ou, eventualmente, de outros gêneros completariam a relação dos agentes etiológicos,
destacando-se Candida glabrata e C. tropicalis (SOBEL, 1996). Entretanto infecções
atribuídas às espécies de Candida não-albicans estão sendo mais freqüentes na maioria das
candidíases (PARAZZINI et al., 2000; RIBEIRO et al, 2000; BAUTERS et al., 2002;
CONSOLARO et al., 2004).
1.4.3 Fármacos empregados na terapêutica das infecções fúngicas
As principais classes de antifúngicos compreendem os poliênicos, os azóis,
tiocarbamatos, alilaminas, derivados morfolínicos, 5-fluorocitosina, a griseofulvina, entre
outros (McGINNIS; RINALDI, 1996). No entanto, o tratamento da candidíase é geralmente
baseado em dois grupos de drogas: os azóis e agentes poliênicos (REEF et al., 1995; SOBEL,
1999).
Os poliênicos, representados por nistatina e anfotericina B são antifúngicos
empregados no tratamento das candidíases. Anfotericina B é um dos fármacos de escolha na
maioria das doenças fúngicas humanas. Sua ação é fungicida, sendo indicada em infecções
sistêmicas com administração por infusão endovenosa. Porém o seu uso tem sido limitado
devido ao seu alto grau de toxicidade. Enquanto que a nistatina é utilizada topicamente, pois é
demasiadamente tóxica (McGINNIS; RINALDI, 1996).
A utilização de agentes antifúngicos azólicos foi uma das alternativas encontradas para
tratar infecções fúngicas tanto superficiais quanto sistêmicas, diminuindo a agressividade dos
poliênicos. Os azóis mais comuns são o cetoconazol e o miconazol, e os mais recentes são
fluconazol, itraconazol, voriconazol e posoconazol. Os azóis atuam na via biosintética do
ergosterol, inibindo enzimas dessa via, principalmente a 14-α lanosterol dimetilase. Com a
freqüente utilização desses agentes antifúngicos, tem se verificado um crescente aumento na
32
resistência a essas drogas, especialmente ao fluconazol (IWATA, 1992). Foram relatados
vários casos de resistência em pacientes com fungemia, principalmente as espécies de
Candida não albicans, 75% dos isolados de C. krusei, 35% de C. glabrata e 10-15% de C.
tropicalis e C. lusitaniae. Entretanto a resistência a anfotericina B ocorre em pequenas
proporções (ELLIS, 2002; KRCMERY; BARNES, 2002).
Antifúngicos mais recentes da classe das equinocandinas (caspofungina,
anidulafungina, micafungina) também têm sido utilizados em infecções fúngicas sistêmicas
por Candida sp. e Aspergillus sp. São substâncias produzidas pelos fungos Aspergillus
nidulans, Aspergillus syndowi e Zalerion arboricola, que atuam sobre o crescimento de
fungos inativando a enzima 1,3-β-D-glucana sintetase, responsável pela síntese de parede
celular (STONE et al., 2002; ODDS et al., 2003). Por causa desse mecanismo de ação das
equinocandinas, essas foram apelidadas de penicilina antifúngica.
Além de novas substâncias antifúngicas estarem sendo estudadas, novas
especialidades farmacêuticas vêm sendo produzidas para melhorar a farmacocinética e
diminuir a toxicidade do fármaco. Uma das formulações lipídicas é a anfotericina B
(Ambisome
®
- Anfotericina B lipossomal) (RINGDEN, 1991), que na sua formulação clássica
apresenta estreito índice terapêutico.
1.4.4 Resistência aos azóis
Os agentes azólicos são rotineiramente utilizados no tratamento de micoses e
profilaxias em pacientes imunocomprometidos. Entretanto, resistência de Candida spp. a esta
classe de droga continua aumentando em resposta à larga aplicação na terapêutica. Silva et al.
(1998) mostraram alta freqüência de leveduras, isoladas de orofaríngea de pacientes HIV
positivo, resistentes aos derivados azólicos, incluindo o fluconazol (66,1% dos isolados).
Porém em pacientes imunocompentes a ocorrência de leveduras do gênero Candida
33
resistentes aos azóis estão sendo isoladas com maior freqüência (PELLETIER et al., 2002;
SOBEL et al., 2003).
São vários os mecanismos moleculares de resistência de Candida sp. aos azóis, que
incluem redução do influxo de droga para o interior da célula leveduriforme, modificação ou
degradação da droga no interior da célula, modificação da via biosintética do ergosterol, e
aumento de escoamento de droga da célula através de bombas de efluxo. Alguns genes estão
envolvidos no mecanismo de resistência. Muitas alterações genéticas têm sido identificadas, e
estão associadas com o gene ERG11 de C. albicans, que codifica a lanosterol dimetilase,
incluindo mutações em ponto no gene, aumento da expressão e amplificação do gene.
Expressões aumentadas do gene ERG3, que codifica C-5-esterol desaturase, reduzem a
susceptibilidade aos azóis. Outros genes que codificam enzimas que participam da via
biosintética do ergosterol também estão relacionados com a resistência aos azóis. Alguns
estudos relatam a dependência de expressão do gene ERG3 e ERG11, ou seja, há um aumento
da expressão do gene ERG3, quando a deleção do gene ERG11 é observada, e vice-versa.
Além disso, aumento da expressão de genes que codificam bombas de efluxo tem sido
amplamente observado em leveduras resistentes ao azóis. Duas famílias de transportadores
estão relacionadas ao processo de efluxo de droga: ABC e MTS, sendo os genes mais comuns,
CDR e MDR1, respectivamente (WHITE et al., 1998).
Além dos mecanismos moleculares de resistência, também existem os celulares, que
podem compreender em resistência intrínsica à droga, seleção natural de estirpes resistentes,
expressão de gene transitório para resistência (resistência epigenética) e alteração no tipo
celular. Um outro aspecto relevante é a atividade fungistática da maioria dos antifúngicos e a
administração prolongada, permitindo a seleção de mutantes (WHITE et al., 1998).
A resistência aos agentes azólicos também está relacionada com a produção de
enzimas extracelulares, como as proteinases ácidas e fosfolipases (FEKETE-FORGÁCS et al.,
34
2000; WU et al., 2000). Nesses microrganismos também foi observado o aumento de
patogenicidade. Além disso, o aumento da produção de aspartil proteinase ácida está
correlacionado com o aumento da expressão do gene que codifica a bomba de efluxo
resistente a multidrogas (MDR1). Adicionalmente, isolados com virulência diminuída exibem
também uma expressão diminuída do gene CDR (GRAYBILL et al., 1998).
1.4.5 Diagnóstico das infecções fúngicas
O diagnóstico de CVV é freqüentemente baseado na história clínica do paciente e no
exame físico, sem evidência em testes laboratoriais (FERRIS et al., 1996). Métodos
convencionais para a identificação de espécies de Candida são baseados nas características
morfológicas e fisiológicas (KURTZMAN; FELL, 1998), cuja técnica é trabalhosa e demanda
muito tempo.
Atualmente, existem diversos testes comerciais para identificação presuntiva de
espécies de Candida e susceptibilidade aos agentes antifúngicos. Meio cromogênico, como
CHROMagar Candida
, permite rápida triagem na identificação de leveduras a partir de uma
simples cultura sobre o meio (HOUANG et al.,1997). Adicionalmente, testes como o
Candifast
(International Microbio, França) são utilizados para identificar e avaliar a
susceptibilidade aos agentes antifúngicos.
Novas pesquisas têm sido realizadas com base no método de análise do DNA para a
identificação de espécies de Candida (ARANCIA et al., 1997; MORACE et al., 1997;
KURZAI et al., 1999; AHMAD et al., 2002; LOEFFLER et al., 2000; MAAROUFI et al.,
2003; WHITE et al., 2003). Métodos baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR)
estão sendo utilizados, com sucesso, no diagnóstico de candidíases (MORACE et al., 1997;
AHMAD et al., 2002; WHITE et al., 2003).
35
É importante ressaltar que muitas espécies Candida não albicans têm sido menos
susceptíveis aos agentes antifúngicos (COLLIN et al., 1999), e a utilização prolongada e
repetida desses antifúngicos tem contribuído para a resistência de Candida sp. Assim, há
necessidade de diagnóstico da infecção, a identificação da espécie fúngica e determinação da
susceptibilidade aos antifúngicos existentes, para obtenção do sucesso terapêutico.
36
2 Objetivos
2.1 Objetivos gerais
2.1.1 Avaliar a atividade antifúngica de extratos das cascas de Stryphnodendron
adstringens (Mart.) Coville sobre leveduras isoladas de fluido vaginal.
2.1.2 Contribuir para a pesquisa no desenvolvimento de um fármaco com atividade
antifúngica.
2.2 Objetivos específicos
2.2.1 Isolar leveduras de fluido vaginal de pacientes ambulatoriais;
2.2.2 Identificar as amostras de leveduras isoladas através do método bioquímico
clássico e pela técnica da reação em cadeia da polimerase;
2.2.3 Investigar a susceptibilidade das amostras isoladas aos agentes antifúngicos
(anfotericina B, fluconazol e nistatina) usualmente empregados no tratamento de infecções
fúngicas;
2.2.4 Caracterizar o perfil de virulência das amostras de leveduras quanto à capacidade
aderente em células de linhagem contínua, hidrofobicidade de superfície celular e produção de
enzimas extracelulares (protease ácida, fosfolipase e hemolisina);
2.2.5 Obter extrato bruto, frações e subfrações das cascas de S. adstringens;
2.2.6 Verificar a atividade antifúngica dos extratos brutos, frações e subfrações
extraídas das cascas de S. adstringens sobre as leveduras isoladas;
2.2.7 Caracterizar quimicamente a subfração F2.4 de S. adstringens;
37
2.2.8 Avaliar o efeito da subfração F2.4 do “barbatimão” sobre a atividade das
enzimas extracelulares, hidrofobicidade de superfície celular, aderência em células e
superfície abiótica, formação do tubo germinativo e brotamento;
2.2.9 Avaliar a combinação de drogas entre subfração F2.4 com anfotericina B,
fluconazol ou nistatina;
2.2.10 Avaliar o efeito da subfração F2.4 sobre o processo de internalização de
leveduras pelos macrófagos J774G8;
2.2.11 Avaliar as alterações ultraestruturais de C. albicans tratada com a subfração
F2.4 através de microscopia eletrônica de transmissão e de varredura;
2.2.12 Avaliar o efeito tóxico dos extratos do “barbatimão”.
38
3 Materiais e métodos
3.1 Amostras em estudo
3.1.1 Coleta das amostras de fluido vaginal
As amostras de fluido vaginal foram coletadas de pacientes ambulatoriais
encaminhadas ao Laboratório de Análises Clínicas Carlos Chagas da cidade de
Maringá/Paraná para exame ginecológico de rotina. As amostras de fluido vaginal foram
obtidas utilizando-se um swab, diluídas em solução salina 0,9% estéril entre o período de
setembro de 2002 e março de 2003. Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em
Pesquisas Envolvendo Humanos da Universidade Estadual de Maringá com registro sob nº
026/2002.
3.1.2 Isolamento de leveduras e estocagem
As amostras de fluido vaginal foram analisadas microscopicamente quanto a presença
e ausência de leveduras através do exame à fresco e da coloração de Gram. Também foram
realizadas culturas da fluido vaginal em ágar sabouraud dextrose (ASD) acrescida de
cloranfenicol a 50 mg/mL (Sigma Chemical Co) através de estrias descontínuas e incubadas a
37 ºC por 48 a 72 h em condições aeróbias (MURRAY et al., 1995). Cada isolado obtido foi
mantido em água destilada estéril a 24-28 ºC (MARCO et al., 1998).
39
3.2.1 Métodos clássicos de identificação
A caracterização das leveduras isoladas foi realizada através das técnicas
recomendadas por Larone (1995) e Kurtzman e Fell (1998). As mesmas foram reativadas em
meios de cultivo e transferidas para o meio seletivo diferencial para leveduras CHROMágar
Candida
®
(Probac do Brasil). Cada tipo de colônia isolada foi submetido às seguintes provas:
3.2.1.1 Tubo germinativo (Efeito Reynolds Braude): As amostras de levedura com
cultivo de 24 a 48 h a 37 ºC foram inoculadas em tubos de ensaio contendo 0,5 mL de soro
humano. Estas foram incubadas a 37 ºC por até 3 h, e as leituras foram realizadas de hora em
hora com o objetivo de constatar a formação do tubo germinativo.
3.2.1.2 Clamidoconídio: Foram realizados microcultivos sobre lâmina contendo ágar
fubá acrescido de Tween 80 a 1%. As amostras foram incubadas a 25 ºC, por até 96 h e as
leituras efetuadas diariamente.
3.2.1.3 Auxanograma de fontes de Carbono: Foi avaliada a capacidade de
assimilação dos seguintes açucares: glicose, inositol, sacarose, lactose, dulcitol, xilose,
rafinose, celobiose, melibiose, trealose, ramnose e maltose. Para este teste foi utilizado o meio
de cultura ágar YNB (base nitrogenada para levedura), na qual uma suspensão de leveduras de
cada isolado foi semeada por toda a superfície, e então inserido os discos de papel
impregnados com solução desses açúcares a uma distância de 3 centímetros entre eles. As
placas de Petri foram incubadas em estufa a 37 ºC por 48 h para verificar o crescimento
leveduriforme em torno de cada disco de papel.
3.2.1.4 Zimograma: Neste teste foi avaliada a capacidade de fermentação dos
seguintes açúcares: glicose, lactose, maltose e sacarose. Esses açúcares foram adicionados em
caldo YNB em tubos contendo tubos de Durhan. As amostras de leveduras foram inoculadas
nesse meio e incubadas a 37 ºC por 48 h. A presença de gás no tubo de Durhan indica a
capacidade fermentadora da levedura.
40
3.2.2 Identificação das leveduras isoladas através da técnica da Reação
em Cadeia da Polimerase (PCR)
A identificação molecular das leveduras através de PCR foi realizada como descrito
por Milde et al. (2000) e Ahmad et al. (2002).
3.2.2.1 Extração de DNA
O DNA genômico foi extraído pelo método descrito em Jain (2001), com algumas
modificações. Os isolados clínicos foram cultivados em 3 mL de caldo Sabouraud a 37 ºC por
24 h. As células foram centrifugadas a 13.000 rpm e lavadas com 1,5 mL de água destilada
estéril. O sedimento foi ressuspendido em 500 µL de tampão de lise TENTS (10mM Tris HCl
pH 8,0 contendo 2% v/v Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl e 1 mM EDTA) e 2 pérolas
de vidro (2 mm). Em seguida foram adicionados 400 µl de fenol saturado e a suspensão foi
homogeneizada em vórtex por 3 min. A fase aquosa foi removida após centrifugação da
mistura a 13.000 rpm por 5 min e transferida para novo tubo e desproteinizada com fenol-
clorofórmio-álcool isoamílico (25:24:1,v/v). O DNA presente na fase aquosa foi precipitado
com etanol absoluto por 2 h, lavado com etanol 70% (v/v) seco e ressuspendido com 50 µL de
água deionizada estéril. O DNA foi tratado com 1µL RNAse A (1 mg/mL) a 37 ºC por 1 h e
as concentrações foram estimadas por eletroforese em gel de agarose como descrito por
Sambrook e Russel (2001).
3.2.2.2 Seminested PCR (snPCR)
Para a identificação dos isolados de Candida sp. foram utilizados os seguintes
iniciadores: oligonucleotídeo direto universal, CTSF, oligonucleotídeo reverso CTSR, capazes
de amplificar o final da extermidade 3' do DNA ribossomal (rDNA) 5.8 S a extremidade 5'
inicial do rDNA 28 S e a região espaçadora interna. Para realização do segundo ciclo de
amplificação foram utilizados oligonucleotídeos espécie-específicos que derivam da região
ITS2 de C. albicans (CADET), C. parapsilosis (CPDET), C. tropicalis (CTDET) e C.
glabrata (CGDET), (Tabela 1) (AHMAD et al., 2002).
41
3.2.2.3 Amplificação do gene CHS 1 (quitina sintetase) (chs 1 – PCR)
Durante a realização da técnica de seminested PCR, as amostras identificadas
presuntivamente como C. glabrata foram confirmadas, utilizando oligonucleotídeos
iniciadores complementares a uma seqüência do gene que codifica quitina sintetase,
denominados GLAB 1 e GLAB2 (Tabela 1) descrito por Milde et al. (2000).
3.2.2.4 Amplificação do DNA
A reação de amplificação de DNA foi realizada em tubos de 0,2 mL, com volume total
de 20 µL contendo 1X tampão para PCR (200 mM Tris HCl pH 8,4, 500 mM KCl, MgCl 2
mM), 1 U Taq DNA polimerase, 5 pmol dos iniciadores, 1 µL do DNA extraído da cultura
(cerca de 10 ng) , 0,1 mM de desoxirribonucleotídeos trifosfatos.
No primeiro ciclo de amplificação do snPCR foram utilizados os oligonucleotídeos
iniciadores universais CTSF e CTSR nas seguintes condições: 1 ciclo de desnaturação a 94 ºC
por 3 min, seguidos de 30 ciclos a 94 ºC por 1 min, hibridação a 60 ºC por 30 segundos,
extensão a 72 ºC por 1 min e finalmente um ciclo a 72 ºC por 10 min.
Após o primeiro ciclo de amplificação 1 µL do produto (cerca de 10 ng) foi utilizado
como substrato para o segundo ciclo de amplificação utilizando a combinação do iniciador
reverso universal (CTSR) e um oligonucleotídeo espécie-específico. A reação de amplificação
foi realizada nas mesmas condições anteriores.
Para chs 1-PCR foram utilizadas as seguintes condições: 35 ciclos a 94 ºC por 30
segundos, hibridação a 60 ºC por 60 segundos, extensão a 72 ºC por 30 segundos.
3.2.2.5 Eletroforese em gel de agarose
A migração eletroforética do DNA em gel de agarose foi realizada em sistema de gel
submerso em tampão TBE (89 mM Tris base; 89 mM ácido bórico; 2 mM EDTA; pH 8,3). O
gel, em diferentes concentrações (0,8 a 2,5%) foi preparado em TBE. As amostras e um
padrão de peso molecular (100 pb Ladder - Invitrogen) foram aplicados em tampão de
42
amostra para DNA 1X (Ficoll 400 2,5%; Azul de bromofenol 0,025%; Xileno cianol FF
0,025%). O sistema foi submetido a uma diferença de potencial (70 a 100 V) com amperagem
constante.
As moléculas de DNA foram visualizadas após coloração do gel com brometo de
etídeo (0,5 µg/mL) por 30 minutos e observação em comprimento de onda a 260 nm.
Tabela 1: Seqüência dos oligonucleotídeos iniciadores para reações de amplificação em
cadeia pela polimerase.
Oligonucleotídeo
Seqüência 5’ → 3’
CTSF TCGCATCGAT GAAGAACGCAGC
CTSR TCTTTTCCTCCGCTTAT TGATATGC
CADET ATTGCTTGCGGCGGTAACGTCC
CPDET TCTTTTCCTCCGCTTAT TGATATGC
CGDET TAGGTTTTACCAAC TCGGTGTT
CTDET ATTTTGCTAGTGGCC
GLAB 1 GTGCAGATATGTCGCTATTACCTTTGG
GLAB 2 CGACTGGTTGACGATAATCAGAGGAGATGGG
43
3.3 Material vegetal
3.3.1 Coleta
Cascas do caule de Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville foram coletadas na
cidade de São Jerônimo da Serra, estado do Paraná/Brasil (23º 47’ 7,8”S, 50º 45’ 23,5” L, 926
m de altitude) em novembro de 2004. Um exemplar foi depositado no Herbário do
Departamento de Biologia da Universidade Estadual de Maringá sob nº 11.386. As cascas da
planta foram cortadas em pedaços menores e secas à temperatura ambiente. Posteriormente ao
processo de secagem, as cascas foram moídas em moinho de martelos e submetidas ao
processo extrativo.
3.3.2 Processo extrativo
O fluxograma 1 resume o processo extrativo e o de fracionamento.
Cem gramas do pó das cascas do “barbatimão” foram extraídos com 1 L de uma
mistura de acetona e água (7:3, v/v) por turbólise durante 15 min, maceração por 30 min e
posteriormente turbólise por 5 min. O extrato obtido foi filtrado, concentrado em evaporador
rotatório sob pressão reduzida e logo após liofilizado. O pó resultante foi denominado de
extrato bruto (F1).
3.3.3 Fracionamento
Trinta gramas do extrato bruto de “barbatimão” (F1) foram solubilizados em 300 mL
de água destilada e particionados com 300 mL de acetato de etila (Synth) (12 vezes), obtendo
as frações aquosa (F2) e acetato de etila (F3).
44
O extrato bruto F1 e as frações F2 e F3 foram submetidos ao teste antifúngico
proposto neste trabalho, com o objetivo de determinar a fração que apresenta a melhor
atividade antifúngica, para prosseguir no fracionamento.
Assim, 2 g da fração F2 foi cromatografada em coluna de Sephadex LH-20 (h=17 cm;
φ=2,5 cm, Pharmacia), utilizando os seguintes solventes orgânicos em proporção volumétrica:
etanol 50%, etanol 70%, etanol 90%, acetona: água (7:3), obtendo subfrações dos respectivos
solventes, que foram denominadas de F2.1, F2.2, F2.3 e F2.4. Posteriormente, essas
subfrações foram submetidas ao teste antifúngico.
3.3.4 Caracterização química da subfração F2.4 de Stryphnodendron
adstringens
A subfração F2.4 foi analisada por espectrometria de massas ES-MS empregando-se o
aparelho Quattro LCZ (Micromass Manchester, UK) com alça nanospray. O espectro de
massas da subfração foi realizado pelo Dr. Heinrich Luftmann do Instituto de Química
Orgânica da Universidade de Münster, Alemanha.
O espectro de RMN
13
C MAS no estado sólido foi realizada no espectrômetro de
RMN Varian, modelo Mercury plus BB 300 MHz, com probe de sólidos CPMAS de 7 mm e
rotor de nitrito de silício de 7 mm com tampa Kel-F, em uma rotação de 5 kHz, pulso a 33,9º
de 4,9 µs e 10 s de intervalo entre as seqüências de pulso (5.120 repetições) em uma
freqüência de 75 MHz. A referência externa utilizada foi hexametilbenzeno (HMB) com sinal
de metila em 17,3 ppm. Este procedimento foi realizado no Departamento de Química da
Universidade Estadual de Maringá.
45
Fluxograma 1: Processo de extração das cascas de Stryphnodendron adstringens e partição
do extrato bruto com acetato de etila. A coluna de Sephadex LH-20 foi eluída em proporções
volumétricas a uma seqüência de etanol 50%, etanol 70%, etanol 90% e acetona 70%,
obtendo as respectivas subfrações: F2.1, F2.2, F2.3 e F2.4.
Turbólise 15 min
Maceração 30 min
Turbólise 5 min
Fração Bruta (F1)
30 g + 300mL água destilada
+
300mL acetato de etila
F3
F2
F2.1 F2.2 F2.3 F2.4
2g
100 g pó das cascas do “barbatimão” + 1 L acetona:água (7:3, v/v)
Coluna Se
p
hadex LH-20
46
3.4. Teste de susceptibilidade in vitro aos agentes antifúngicos
3.4.1 Soluções estoques dos antifúngicos
Soluções estoques de anfotericina B (FUNGIZON
®
- Bristol-Myers Squibb),
fluconazol (Pfizer, São Paulo, Brasil) e nistatina (Sigma Chemical Co, USA) foram
preparados em 10% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO) e meio RPMI 1640 (Sigma) em
concentrações de 500 µg/mL, 5.000 µg/mL e 1000 µg/mL, respectivamente. Essas soluções
foram filtradas através de uma membrana de 0,22 µm de porosidade (Millipore), aliquotadas
em tubos para microcentrifugação e armazenadas a -20 ºC.
3.4.2 Determinação da concentração inibitória mínima
Todas as amostras de leveduras isoladas foram submetidas ao teste de susceptibilidade
aos antifúngicos poliênicos (anfotericina e nistatina) e ao fluconazol. A determinação da
concentração inibitória mínima (CIM) foi realizada através da técnica de microdiluição em
caldo preconizado pelo “National Comittee for Clinical Laboratory Standards”, documento
M27-A2 (NCCLS, 2002). Leveduras crescidas em ASD por 48 h foram padronizadas de
acordo com a turbidez da escala 0,5 Mc Farland (1-5 x 10
6
UFC/mL), diluídas 1:50 em
solução salina 0,9% e posteriormente 1:20 em meio RPMI 1640 com tampão MOPS 0,165 M
(ácido 3-N-morfolinopropanesulfônico), pH 7,0, obtendo concentração de 1-5 x 10
3
UFC/mL.
Em microplacas de 96 poços, foi distribuído um volume de 100 µL de meio RPMI 1640 com
tampão MOPS 0,165 M em cada poço. Posteriormente, 100 µL dos antifúngicos foram
aliquotados no primeiro poço da microplaca, e as diluições seriadas das drogas foram
realizadas para obter concentrações finais de 50 a 0,04 µg/mL para anfotericina B, 100 a 0,09
µg/mL para nistatina, e 128 a 0,25 µg/mL para fluconazol. Um volume de 100 µL da
suspensão de leveduras padronizadas (1-5 x 10
3
UFC/mL) foi dispensado nos poços para obter
47
uma concentração fúngica final de 0,5-2,5 x 10
3
UFC/mL. As microplacas foram incubadas
em estufa a 37 °C por 48 h em uma câmara umedecida.
Candida albicans ATCC 10231 e Candida parapsilosis ATCC 22019 (FIOCRUZ, Rio
de Janeiro, Brasil) foram utilizadas como amostras padrões. Poços sem a droga e outro
somente como meio RPMI 1640 foram utilizados como controle positivo de crescimento
leveduriforme e de esterilidade do meio, respectivamente.
A determinação da concentração inibitória mínima dos agentes poliênicos foi obtida
através da observação da ausência de crescimento na menor concentração da droga capaz de
inibir o crescimento microbiano in vitro. Para o fluconazol foi determinada a concentração
que inibe o crescimento leveduriforme em 50% (CIM
50
) e em 90% (CIM
90
) através da
densidade ótica em comprimento de onda de 492 nm (PELLETIER et al., 2002).
3.5 Perfil dos fatores de virulência das leveduras isoladas de fluido
vaginal
A caracterização dos fatores de virulência foi realizada com todas as amostras de
leveduras isoladas de fluido vaginal. Os fatores de virulência avaliados foram: aderência em
células de linhagem contínua, produção de enzimas extracelulares (protease ácida, fosfolipase
e hemolisina) e hidrofobicidade de superfície celular.
3.5.1 Aderência em células de linhagem contínua
Manutenção das células VERO: Células de rim de macaco verde (Vero) foram
cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB - Gibco), 50
µg/mL de penicilina e 50 µg/mL de estreptomicina a 37
o
C em estufa úmida com tensão de
5% de CO
2
em garrafas de plástico com tampas de rosca com dispositivo para a entrada de
CO
2
. As células eram observadas em microscópio invertido diariamente. Para a manutenção
48
das células Vero, estas eram repicadas de 3 a 4 dias com tripsina (Gibco) à 37
o
C por um
tempo em torno de 2 min e meio DMEM.
O Ensaio: Primeiramente, uma monocamada confluente de células foi obtida para
ensaio de aderência. A monocamada foi submetida ao processo de tripsinização e padronizada
para que 2 x 10
5
células fossem distribuídas em cada poço da microplaca de 24 poços
contendo lamínulas redondas. A microplaca foi incubada por 24 h a 37 ºC e tensão de CO
2
a
5% para obtenção de uma monocamada.
Leveduras isoladas foram ativadas em meio caldo sabouraud por 24 h a 37 ºC.
Posteriormente, as amostras foram lavadas em PBS 0,01 M pH 7,2 estéril, padronizadas a 1 x
10
6
UFC/mL, e uma alíquota de 500 µL foi dispensada em cada poço. A microplaca foi
incubada a 37 ºC por 1 h em 5% de CO
2
. As lamínulas foram fixadas em solução de Bouim
overnight e coradas pelo Giemsa (diluição 1:20, v/v). O esfregaço foi desidratado em uma
seqüência de acetona pura, mistura de acetona e xileno (nas proporções de 7:3, 5:5, 3:7) e
xileno puro por 10 s para cada solvente. As lamínulas foram montadas em lâminas utilizando
entellan (Merck). A contagem de leveduras aderidas em pelo menos 200 células Vero foi
realizada (DOROCKA-BOBKOWSKA et al., 2003).
3.5.2 Hidrofobicidade de superfície celular
Amostras de isolados clínicos foram ativadas em caldo sabouraud por 24 h a 37 ºC,
centrifugados a 4000 rpm por 10 min, lavadas em PBS 0,05M pH 7,4 estéril, e ressuspendidas
no mesmo tampão. A absorbância da suspensão de leveduras foi determinada em
espectrofotômetro em comprimento de onda de 660 nm. Posteriormente, as amostras de
leveduras foram tratadas com xileno (2,5:1; v/v), agitadas por 2 min e deixadas em repouso
por 20 min. A absorbância da fase aquosa foi determinada, e o índice de hidrofobicidade (IH)
foi calculado, através da seguinte fórmula:
49
IH: (A
amostra
– A
tratado
) x 100 / A
amostra
;
Na qual a A
amostra
é absorbância da suspensão de levedura e A
tratado
é a absorbância da
fase aquosa obtida após tratamento com xileno (TEIXEIRA et al., 1993).
3.5.3 Determinação de enzimas extracelulares
O meio base utilizado para esses experimentos foi o meio mínimo, cuja composição
está descrito em detalhes na Tabela 2 (PONTECORVO et al., 1953).
3.5.3.1 Determinação da atividade de protease ácida
As amostras de leveduras foram previamente ativadas em meio de indução (meio
mínimo suplementado com 0,6% de caseína de leite) por 24 h a 37 ºC. Após o período de
incubação o número de células foi determinado através de contagem direta utilizando-se uma
câmara hemocitométrica (Improved Neubauer Chamber), e uma suspensão leveduriforme de
1,0 x 10
6
UFC/mL foi preparada. Foram tranferidos 10 µL da suspensão de leveduras sobre
placas de Petri contendo meio mínimo pH 4,0 suplementado com caseína de leite na
concentração final de 0,6%. O inóculo foi dispensado em orifícios de aproximadamente 3 mm
de diâmetro perfurados no ágar. Amostra de Candida albicans ATCC 10231 foi utilizada
como controle positivo para produção de protease ácida extracelular.
Para a observação do crescimento celular e da atividade proteolítica extracelular, as
placas foram incubadas a 37 ºC por um tempo máximo de 72 h. As amostras que
apresentaram um halo de degradação ao redor da colônia após o período incubado foram
consideradas positivas para produção de proteases. A atividade proteolítica foi estimada pela
razão entre o diâmetro da zona de degradação ao redor da colônia e o diâmetro da colônia,
como descrito por Ruchel et al. (1982).
50
3.5.3.2 Determinação da atividade de fosfolipase
As amostras foram ativadas por 24 h a 37 ºC em meio caldo Sabouraud e uma
suspensão levedurifome de 1,0 x 10
6
UFC/mL foi preparada. Foram aliquotadas 5 µL da
suspensão sobre a superfície de ágar ovo (meio mínimo pH 4,5 suplementado com emulsão de
gema de ovo na concentração final de 4% (v/v), NaCl 20 g/L e CaCl
2 .
2 H
2
0 1 g/L). Amostra
de Candida albicans ATCC 10231 foi utilizada como controle positivo para a produção de
fosfolipase extracelular.
Para a observação do crescimento celular e atividade de fosfolipase extracelular, as
placas foram incubadas a 37 ºC por 96 h. As amostras que apresentaram um halo de
precipitação ao redor da colônia após o período de incubação foram consideradas positivas
para atividade de fosfolipase. A atividade de fosfolipase foi estimada pela razão entre o
diâmetro da zona de precipitação ao redor da colônia e o diâmetro da colônia, como descrito
por Samaranayake et al. (1984).
3.5.3.3 Determinação da atividade hemolítica
As amostras foram ativadas por 24 h a 37 ºC em meio caldo Sabouraud e uma
suspensão leveduriforme de 1,0 x 10
6
UFC/mL foi padronizada. Um volume de 10 µL da
suspensão foi aliquotada sobre a superfície de ágar sangue 7% (v/v) (meio mínimo pH 4,5
suplementado com sangue de carneiro).
Para a observação do crescimento celular e da atividade hemolítica dos isolados
clínicos, as placas de Petri foram incubadas a 37 ºC por 96 h com tensão de CO
2
a 5%. As
amostras que apresentaram um halo de degradação translúcido ao redor da colônia foram
consideradas β-hemolíticos (hemólise semelhante ao controle positivo) e as que apresentaram
um halo esverdeado foi considerado α-hemolítico (LUO et al., 2001). A atividade hemolítica
pelas leveduras foi estimada pela razão entre o diâmetro da zona de hemólise ao redor da
colônia e o diâmetro da colônia.
51
Candida parapsilosis ATCC 22019 e Aeromonas hydrophila ATCC 7966 foram
utilizadas como amostras padrões, apresentando atividade hemolítica negativa e positiva,
respectivamente.
Tabela 2: Composição química do meio mínimo utilizado na preparação de meios de cultura
para avaliar a produção de enzimas extracelulares (protease ácida, fosfolipase e hemolisina).
A concentração dos constituintes está expressa em g/L (PONTECORVO et al., 1953).
Componentes g/L
NaNO
3
6,0
KH
2
PO
4
1,5
KCl 0,5
MgSO
4
.7H
2
O 0,5
FeSO
4
0,01
ZnSO
4
0,01
Glicose 10,0
Agar 15,0
52
3.6 Avaliação da atividade antifúngica de Stryphnodendron
adstringens sobre leveduras de isolados clínicos
3.6.1 Teste de susceptibilidade in vitro do extrato bruto, frações e
subfrações
3.6.1.1 Soluções estoque da droga
O pó do extrato bruto, frações e subfrações foram diluídos em meio RPMI 1640 para
obtenção de uma solução a 10 mg/mL, filtrados em membrana com 0,22 µm de porosidade,
aliquotadas e armazenados a -20 ºC.
3.6.1.2 Determinação da concentração inibitória mínima
Todas as leveduras isoladas foram submetidas ao teste de susceptibilidade às frações
F1, F2 e F3. Posteriormente, representantes de cada espécie isolada foram submetidas às
subfrações da fração F2 (F2.1 a F2.4). A metodologia de análise da atividade antifúngica do
extrato bruto, frações e subfrações do “barbatimão” foi a mesma utilizada para determinar a
CIM dos agentes antifúngicos, porém utilizando concentrações de 0,24 a 1000 µg/mL. Em
cada teste foram utilizadas as amostras de C. albicans ATCC 10231 e nistatina para controle
de qualidade.
3.6.1.3 Determinação da concentração fungicida mínima
Após a determinação da concentração inibitória mínima da droga, uma alíquota das
concentrações inibitórias foi semeada na superfície de ASD, incubadas a 37 ºC por 48 h. A
concentração fungicida mínima (CFM) foi obtida através da observação da menor
concentração da droga onde não houve crescimento de colônias.
Para avaliar o efeito da subfração F2.4 sobre alguns fatores de virulência, amostras de
Candida albicans e Candida não albicans foram selecionadas
53
3.6.2 Efeito da subfração F2.4 sobre as enzimas extracelulares (protease
ácida, fosfolipase e hemolisina)
Vinte amostras de leveduras foram selecionadas e ativadas em caldo sabouraud por 24
h a 37 ºC. Uma suspensão fúngica de 1 x 10
6
UFC/mL foi submetida ao tratamento
antifúngico com uma concentração de 7,8 e 125 µg/mL da subfração F2.4 do “barbatimão”
previamente diluída em meio RPMI 1640. Uma alíquota de 10 µL dessa suspensão foi
dispensada sobre a superfície do ágar meio mínimo suplementado com 0,6% de caseína do
leite, e 7% de sangue de carneiro, e 5 µL sobre o ágar meio mínimo suplementado com 4% de
gema de ovo, para avaliar respectivamente, a ação da subfração F2.4 sobre a protease ácida,
hemolisina e fosfolipase (procedimentos descritos anteriormente). Adicionalmente, amostras
cultivadas em concentração subinibitória por 24 h a 37 ºC foram submetidas a este ensaio.
3.6.3 Efeito da subfração F2.4 sobre a hidrofobicidade de superfície
celular (CSH)
Oito amostras de leveduras foram ativadas em caldo sabouraud por 24 h a 37 ºC, e
uma suspensão fúngica de 1 x 10
6
UFC/mL foi submetida ao tratamento com subfração F2.4
do “barbatimão” nas concentrações de 7,8 e 125 µg/mL em meio RPMI 1640, incubadas a 37
ºC por 24 h. As leveduras controle e as tratadas foram centrifugadas a 4000 rpm por 10 min,
lavadas em PBS 0,05M pH 7,4 e ressuspendidas no mesmo tampão. O ensaio foi realizado
como previamente descrito, sendo amostras controle e tratadas comparadas, e a porcentagem
de redução/aumento do IH foi calculada.
54
3.6.4 Ensaio de inibição da aderência das leveduras em células de
linhagem contínua e em superfície abiótica pela subfração F2.4
Uma monocamada confluente de células Vero foi previamente preparada para este
ensaio. A monocamada foi submetida ao processo de tripsinização e padronizada para que 2 x
10
5
células fossem distribuídas em cada poço da microplaca de 24 poços contendo lamínulas
redondas. A microplaca foi incubada por 24 h a 37 ºC e tensão de CO
2
a 5% para obtenção de
uma monocamada.
Leveduras isoladas foram tratadas com subfração F2.4 nas concentrações de 7,8 e 125
µg/mL diluídas em meio RPMI 1640 por 24 h a 37 ºC. Posteriormente, as amostras controle e
tratadas com a droga foram lavadas em PBS 0,01 M pH 7,2 e padronizadas a 1 x 10
6
UFC/mL, e uma alíquota de 500 µL foi dispensada em microplacas com poços contendo a
monocamada de célula Vero, e em microplacas contendo somente lamínulas de vidro. As
microplacas foram incubadas a 37 ºC por 1 h em 5% de CO
2
. As lamínulas foram fixadas em
Bouim overnight e coradas pelo Giemsa (diluição 1:20). O esfregaço foi desidratado em uma
seqüência de acetona pura, mistura de acetona e xileno (7:3, 5:5, 3:7) e xileno puro por 10 s
para cada solvente. As lamínulas foram montadas em lâminas utilizando o entellan.
A contagem de leveduras aderidas em pelo menos 200 células Vero foi realizada. Para
a contagem de aderência em lamínulas de vidro, pelo menos 20 campos foram analisados e a
porcentagem de redução da aderência foi calculada .
3.6.5 Efeito da subfração F2.4 sobre a formação do tubo germinativo
Uma suspensão de leveduras de isolados clínicos foi padronizada de acordo com a
escala 0,5 de Mc Farland (1-5 x 10
6
UFC/mL). Cem microlitros de meio RPMI 1640 foram
distribuídos nos poços de microplacas de 96 poços, e diluições seriadas da subfração F2.4 do
“barbatimão” foi realizada obtendo concentrações de 0,97 a 1000 µg/mL. Em seguida, 10 µl
55
da suspensão fúngica foi dispensada em cada poço. O efeito da subfração F2.4 sobre a
formação do tubo germinativo foi analisado em microscópico óptico invertido após 2 h de
incubação a 37 ºC. Foi considerado como inibição do tubo germinativo, a ausência ou tubos
germinativos com até 2 vezes o tamanho da levedura original. Nistatina nas concentrações de
0,05 a 50 µg/mL foi utilizada como droga padrão (MINCOFF et al., 2005).
3.6.6 Efeito da subfração F2.4 sobre o processo de divisão leveduriforme
Uma amostra de Candida albicans isolada de fluido vaginal foi escolhida para o
ensaio. A amostra foi ativada em meio caldo sabouraud por 24 h a 37 ºC e uma suspensão
leveduriforme de 1,0 x 10
6
UFC/mL foi padronizada em solução salina 0,9% (p/v) estéril.
Duzentos microlitros da suspensão foram dispensadas em tubo de ensaio com diferentes
concentrações da subfração F2.4 do “barbatimão” (7,8, 31,25 e 125 µg/mL) diluídos em meio
RPMI 1640, e o volume final obtido foi de 20 mL. Após a incubação dos tubos de ensaio a 37
ºC por 48 h, foram centrifugados a 4000 rpm por 10 min, e as leveduras sedimentadas foram
ressuspendidas. Coloração negativa da amostra tratada com diferentes concentrações da
subfração F2.4 e controle negativo foi realizada na proporção de 1:1 (amostra:tinta nanquim).
O esfregaço foi observado em microscópio óptico e a diferenciação de levedura com
brotamento foi realizada em pelo menos 300 leveduras (NAKAMURA et al., 2004).
3.7 Combinação de drogas
Para a realização de combinações da subfração F2.4 do “barbatimão” com anfotericina
B, fluconazol ou nistatina, uma amostra de Candida albicans isolada de fluido vaginal foi
escolhida para o ensaio. A amostra foi ativada em meio caldo Sabouraud por 24 h a 37 ºC e
uma suspensão leveduriforme de 1-5 x 10
4
UFC/mL foi padronizada em solução salina 0,9%
56
(p/v) estéril. Volume de 100 µL de meio RPMI 1640 foi distribuído em microplaca de 96
poços. Diluições seriadas da droga A foram realizadas na direção do número 12 para o 2 da
microplaca de 96 poços, e posteriormente a outra droga B foi diluída na direção da letra A
para o G (Figura 2). Em cada poço foi dispensado 5 µL de uma suspensão de leveduras a 1-5
x 10
4
UFC/ml. A microplaca foi incubada a 37 ºC por 48 h em uma câmara úmida. Após a
incubação, a leitura foi feita visualmente e espectrofotometricamente a um comprimento de
onda de 492 nm para o cálculo da concentração inibitória de 90%. O índice da concentração
fracional inibitória (índice CFI) das combinações das drogas foi determinado para avaliar a
interação das drogas (ELIOPOULOS; MOELLERING JR, 1996).
Cálculo do índice CFI:
Índice CFI = CFI A + CFI B = (A)/CIM (A) + (B)/CIM (B)
Na qual CFI A= Concentração inibitória fracional da droga A; CFI B= Concentração
inibitória fracional da droga B; (A)= concentração da droga A; (B)= concentração da droga B;
(CIM A)= concentração inibitória mínima da droga A; (CIM B)= concentração inibitória
mínima da droga B.
Com esse método, o sinergismo é definido como um CFI≤ 0,5, adição com CFI=1,
indiferença como CFI=CFI(A) ou CFI (B) e o antagonismo quando CFI for ≥ 4.
57
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
8x
B
4x
C
2x
D
X
E
0,5x
F
0,25x
G
0,125x
H
0
0 0,015x 0,031x 0,062x 0,125x 0,25x 0,5x x 2x 4x 8x 16x
Figura 2: Esquema de diluição dos antifúngicos em estudo (anfotericina B, fluconazol,
nistatina, subfração F2.4 do “barbatimão”) para a combinação de diferentes concentrações. X
é a concentração inibitória mínima.
58
3.8 Efeito da subfração F2.4 de Stryphnodendron adstringens sobre
o processo de internalização de leveduras por Macrófagos
Manutenção dos Macrófagos J774G8: Linhagem de células contínuas de
macrófagos J774G8 foi cultivada em meio RPMI 1640 pH 7,4 suplementado com SFB a 37
ºC, com tensão de CO
2
a 5% em câmara úmida. O meio de cultura era trocado diariamente e
os repiques eram feitos a cada 3 dias.
O Ensaio: Uma monocamada de macrófagos foi obtida para que uma suspensão de
células a 5 x 10
5
células/mL fosse preparada e distribuída em poços da microplaca de 24
poços contendo lamínulas de vidro. A microplaca foi incubada a 37 ºC, com tensão de CO
2
a
5% em câmara úmida para formação de uma monocamada.
Candida albicans de isolado clínico, na concentração de 1 x 10
6
UFC/mL, foi
submetida a presença da subfração F2.4 nas concentrações de 7,8 µg/mL por 2 h a 37 ºC. As
leveduras foram lavadas com PBS 0,01M pH 7,2 e a suspensão de leveduras foram
padronizadas a 1 x 10
6
UFC/mL. Um volume de 500 µL foi dispensado na monocamada de
macrófagos previamente preparada. A interação levedura-macrófago foi realizada por 1 h a 37
ºC com tensão de CO
2
a 5%. As lamínulas redondas foram lavadas com PBS 0,01M pH 7,2,
fixadas com Bouim overnight e coradas pelo Giemsa (diluído 1:20, v/v). O esfregaço foi
desidratado em uma seqüência de acetona pura, mistura de acetona e xileno (7:3, 5:5, 3:7) e
xileno puro por 10 s para cada solvente. As lamínulas foram montadas em lâminas utilizando
o entellan.
Leveduras internalizadas pelos macrófagos foram contadas e o cálculo do índice de
internalização foi realizado através da fórmula:
Índice de internalização= nº macrófagos infectados X nº de leveduras por macrófago
59
3.9 Microscopia óptica
Para avaliar e documentar o efeito da subfração F2.4 do “barbatimão” sobre leveduras
de isolados clínicos, as imagens obtidas de cada experimento foram capturadas em
microscópio óptico Motic BA 300 com câmara fotográfica acoplada. O programa utilizado
para a captura de imagens foi o Motic Image Plus 2.0.
3.10 Avaliação das alterações ultraestruturais
Leveduras previamente tratadas com 7,8 µg/mL da subfração F2.4 do “barbatimão”
foram submetidas a presença de uma monocamada de macrófagos por 1 h a 37 ºC. As células
leveduriformes de Candida albicans foram cultivadas na presença 7,8, 31,25 e 125 µg/mL da
subfração F 2.4 e 3,12 µg/mL de nistatina por 24 h a 37 ºC. Posteriormente, as amostras
obtidas da interação macrófago-levedura e leveduras tratadas com a subfração F2.4 foram
coletadas por centrifugação a 3.000 g por 10 min e fixadas em glutaraldeído 2,5 % em tampão
cacodilato 0,1 M.
Assim, essas amostras foram preparadas para a microscopia eletrônica de transmissão
e de varredura, como segue os métodos descritos abaixo.
3.10.1 Microscopia eletrônica de transmissão
Após a fixação, as células foram lavadas em tampão cacodilato 0,1 M e pH 7,2,
contrastada em tetróxido de ósmio 1%, contendo ferrocianeto de potássio 0,8% e CaCl
2
durante 40 min, desidratadas em concentrações crescentes de acetona (15, 30, 50, 70, 80, 90,
95, 100% e acetona ultra seco) durante 15 min e incluídas em epon. Cortes ultrafinos obtidos
em um ultramicrótomo foram coletados em grades de cobre com 400 mesh, contrastado com
acetato de uranila e citrato de chumbo e observadas em um microscópio eletrônico ZEISS
EM-900.
60
3.10.2 Microscopia eletrônica de varredura
As amostras fixadas foram lavadas no tampão cacodilato 0,1 M e aderidas em chips
com poli-L-lisina. Em seguida foram desidratadas em concentrações crescentes de etanol a
15, 30, 50, 70, 80, 90, 95, 100% e etanol ultraseco durante 15 min em cada um. As amostras
foram submetidas ao ponto crítico, metalizadas com ouro e observadas em microscópio
eletrônico de varredura SHIMADZU SS-550.
3.11 Estudo do efeito tóxico do “barbatimão”
3.11.1 Efeito sobre a viabilidade das larvas da Artemia salina
Para a eclosão dos ovos de A. salina, foi utilizado sal marinho (20 g/L) diluído em
água destilada com luz incidente e calor por até 3 dias até a eclosão dos ovos. Após a eclosão,
10 larvas foram separadas para cada grupo (controle negativo e diferentes concentrações dos
extratos do barbatimão – 1, 10, 100 e 1000 µg/mL) (PIMENTEL MONTANHER et al.,
2002). As larvas foram submetidas às mesmas condições ambientais por 24 h para posterior
contagem de sobreviventes. O experimento foi realizado em triplicata em três momentos
distintos, e o número de sobreviventes em cada concentração foi contado.
3.11.2 Efeito citotóxico dos extratos do “barbatimão” sobre células
VERO e MACRÓFAGO J774G8
Através de uma monocamada confluente de células Vero e macrófagos, essas foram
ressuspendidas e padronizadas a 2,5 x 10
5
células/mL. Cem microlitros da suspensão de célula
(2,5 x 10
4
células) foram inoculadas em placas de 96 poços, incubadas em estufa úmida a 37
o
C com tensão de 5% de CO
2
por 24 h. Posteriormente, o meio de cultura de cada poço foi
retirado e então adicionadas 100 µl de várias concentrações (1 a 1000 µg/mL) das frações F1,
61
F2, F3 e da subfração F2.4 do “barbatimão”. No ensaio, poços somente com o meio de cultura
foram considerados como branco da amostra, e poços com células como controle. Após 48 h
de incubação a 37 ºC e 5% CO
2
, foi verificada a citotoxicidade dos extratos através do método
colorimétrico da sulforrodamina B como descrito por Lin et al. (1999).
3.11.2.1 Método colorimétrico da Sulforrodamina B (LIN et al., 1999)
Após a incubação necessária para o ensaio de citotoxicidade, foi retirado o meio de
cultura dos poços da microplaca de 96 poços, e a monocamada de células foi fixada com 50
µL/poço de ácido tricloroacético a 10% (p/v) por 1 h a 4 ºC. As células foram lavadas 4 vezes
em água corrente. Após a secagem do material fixado, 50 µL de sulforrodamina B 0,4% (p/v
em 1% de ácido acético aquoso) foi dispensado em cada poço, incubado por 30 min a 4 ºC e
protegido da luz. O excesso de sulforrodamina B foi retirado do poço lavando 4 vezes com
ácido acético a 1%, e posteriormente, 150 µL de tampão Tris-base 10 mM foi dispensado e
agitado até a dissolução do complexo formado sulforrodamina B-proteína. A absorbância das
amostras foi determinada através de um espectrofotômetro em comprimento de onda de 530
nm (Bio-Tek
®
).
3.11.3 Estudo do efeito hemolítico e hemaglutinante dos extratos do
“barbatimão”
Uma suspensão de hemácias de carneiro a 4% (v/v, em solução de glicose a 5%
estéril) foi submetida à presença de diferentes concentrações das frações (F1, F2 e F3) e
subfração F2.4 do “barbatimão” (0, 1 a 1000 µg/mL). Após um período de incubação de 2 h
em banho maria a 37 ºC, os tubos de ensaio foram centrifugados a 3.000 rpm por 10 min e o
sobrenadante foi utilizado no doseamento de hemoglobina em espectrofotômetro a 540 nm
para verificar o efeito hemolítico da droga. O efeito aglutinante foi verificado visualmente. O
resultado foi expresso em porcentagem de hemólise e o resultado para o efeito hemaglutinante
62
foi expresso qualitativamente. Suspensão de hemácias de carneiro a 4% tratada com Triton
X114 foi considerada como controle positivo para a atividade hemolítica, enquanto que
suspensão de hemácias foi considerada como o branco da amostra.
O cálculo para determinar a atividade hemolítica (AH) dos extratos do “barbatimão” é:
AH (%) = 100 - [(AP - AS)/(AP - AC)]x100
Sendo, AP=absobância do controle positivo, AS= absorbância da amostra teste, AC=
absorbância do branco (LEE et al.; 1999, LI et al., 2002).
Para os ensaios de citoxicicidade, foi calculada a concentração citotóxica de 50 %
(CC
50
) e para A. salina, dose letal de 50% (DL
50
). Posteriormente foi calculado o índice de
seletividade (IS) dos extratos, baseando-se na relação de CC
50
ou DL
50
com a média das CIMs
(HERREROS et al., 2001).
3.12 Análise Estatística
Todas as análises estatísticas deste estudo foram realizadas através do software
Statistica 6.0 (Statsoft, Inc., Oklahoma city, Okla, USA). Os testes utilizados incluem teste
Mcnemar, Pearson, t-Student, Anova one-way (teste de Tukey e Dunnett), e o intervalo de
confiança considerado foi de 95%.
63
4 Resultados e Discussão
4.1 Distribuição e caracterização das leveduras
Foram utilizadas no presente trabalho, amostras de fluido vaginal de mulheres entre 13
e 80 anos, sendo a maioria apresentando idade de 20 a 50 anos, sintomáticas e assintomáticas,
sem histórico prévio associadas à imunodeficiência. De um total de 506 pacientes, 20,35%
(103/506) apresentaram culturas positivas para leveduras (Figura 3). Os exames a fresco e a
bacterioscopia após coloração de Gram de fluido vaginal confirmaram a presença de
leveduras em 81 (16%) amostras com cultura positiva em ASD, concordando em 78,6% na
positividade do resultado. Esses dados de prevalência de leveduras em fluido vaginal de
pacientes sintomáticas e assintomáticas foram consistentes com dados previamente publicados
(ECKERT et al., 1998; GIRALDO et al., 2000; CONSOLARO et al. 2004).
As amostras de leveduras isoladas foram identificadas através de dois métodos:
método micológico padrão e reação em cadeia da polimerase (PCR). O método padrão
identificou Candida albicans em 83,5% (86/103) e C. não-albicans em 16,5% (17/103). Pelo
seminested PCR, C. albicans foi identificada em 96 amostras (93,2%), e não-albicans em 6
(6,8%), sendo uma C. parapsilosis, uma C. tropicalis e 4 isolados foram identificados como
Candida sp. Um isolado foi caracterizado como não pertencente ao gênero Candida (Tabela
3).
Vaginites causadas por Candida spp. permanecem um problema comum em pacientes
imunocompetentes e mulheres saudáveis. Pesquisadores têm mostrado que a espécie
predominante é C. albicans em cerca de 90% dos casos de CVV sintomática, e poucos casos
podem ser causados por outras espécies, principalmente C. glabrata. No entanto, estudos
mostram uma pequena evidência de que esteja ocorrendo um aumento significativo de CVVR
e esporádica causadas por espécies não-albicans (SOBEL; CHAIM, 1997, SOBEL, 1998).
64
A análise comparativa entre os dois métodos de identificação utilizados neste estudo
foi realizada através do teste Mcnemar, verificando uma diferença significativa entre eles
(p<0,05). Identificação das espécies pelo método de snPCR foi concordante com o método
micológico padrão em 83 isolados (80,6%). Candida albicans foi identificada em 93,2% das
amostras por snPCR e 83,5% pelo método micológico padrão, mostrando que amostras
identificadas pelo micológico padrão como espécies não-albicans foi identificada como C.
albicans pelo método molecular. Apesar da facilidade em se identificar C. albicans através da
morfologia, muitas delas possuem fenótipos muito distintos, na morfologia e metabolismo
celular (LAN et al., 2002). Por outro lado, através da tecnologia da amplificação de gene por
PCR, pode-se detectar leveduras do gênero Candida através de seqüência gênica conservada e
específica. No seminested PCR, foi utilizado iniciadores que amplificam as regiões 5.8S, 28S
do DNA ribossomal e a região interespaçadora ITS2, mostrando ser um método específico e
sensível para a detecção de Candida spp. (AHMAD et al., 2002).
65
Cultura
positiva
20,35%
Cultura
negativa
79,65%
Figura 3: Freqüência de leveduras isoladas de fluido vaginal em meio ágar Sabouraud
dextrose.
Tabela 3: Identificação das leveduras isoladas de fluido vaginal através do método
micológico padrão e pela reação em cadeia da polimerase.
Nº de leveduras isoladas pelo: Leveduras
snPCR Método padrão
%
Concordância
Candida sp 4 1 0
C. albicans
96 86 89,6
C. krusei
0 1 0
C. parapsilosis
1 2 50,0
S. cerevisae
0 2 0
C. glabrata
0 6 0
C. tropicalis
1 2 0
C. lusitaneae
0 1 0
C. stellatoidea
0 2 0
Não Candida 1 0 0
66
4.2 Perfil de susceptibilidade aos agentes antifúngicos
O perfil de susceptibilidade das amostras de isolados clínicos aos antifúngicos pode
ser resumido na Tabela 4. A concentração inibitória mínina de anfotericina B, fluconazol e
nistatina foram determinados, e aproximadamente 43,7% (45/103) dos isolados foram
susceptíveis a uma CIM para anfotericina B de 0,19 µg/mL, 73,8% (76/103) dos isolados com
CIM de 6,25 µg/mL para nistatina. Cem porcento das amostras apresentaram sensibilidade ao
fluconazol com CIM
50
< 8 µg/mL, sendo que 79,2 (84/106) apresentaram CIM
50
menores que
0,25 µg/mL. No entanto, analisando os resultados da CIM
90,
3,88 % das amostras foram
consideradas como resistentes ao fluconazol, 3,88 % suscepível dose dependente e 92,24 %
sensíveis ao fluconazol, ressaltando que 54,4 % (56/103) das amostras apresentaram-se
sensíveis em concentração igual ou menor a 0,25 µg/mL para o fluconazol. Apesar da
amostragem pequena de C. não-albicans, não houve diferença significativa no perfil de
sensibilidade aos antifúngicos testados entre espécies de C. albicans e não-albicans.
As concentrações inibitórias mínimas dos antifúngicos poliênicos e fluconazol
apresentaram perfil de susceptibilidade semelhante ao descrito por Mcginnis e Rinald (1996).
É sugerido que quando uma amostra fúngica apresentar uma CIM ≥ 1 µg/mL, para
anfotericina B, a mesma é considerada resistente (FORBES et al., 1998). Assim todas
amostras testadas foram determinadas como sensíveis a anfotericina B. Ribeiro et al. (2000)
utilizando o mesmo ensaio de susceptibilidade, mostraram que amostras isoladas de fluido
vaginal no estado de Espírito Santo, Brasil eram sensíveis a anfotericina B. A resistência à
anfotericina B parece ser espécie dependente que podem emergir durante o tratamento
antifúngico. Essas incluem espécies de C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis e C.
lusitaniae (ELLIS, 2002). A ocorrência de resistência à anfotericina B e à nistatina em
amostras de isolados clínicos é baixa, e freqüentemente ocorre pela diminuição ou
modificação da molécula alvo – ergosterol, diminuindo a afinidade pelos poliênicos.
67
Geralmente, um isolado resistente a um poliênico também é resistente a outros (WHITE et al.,
1998).
Embora haja uma considerável evidência de resistência a agentes azólicos em
candidíase oral por espécies de Candida, poucos estudos sobre a susceptibilidade de isolados
vaginais aos azóis responsáveis por candidíase vulvovaginal têm sido relatado (Sobel et al.,
2003). Tem sido observado que a resistência ao fluconazol em isolados vaginais ocorre com
uma freqüência semelhante ao encontrado neste trabalho (RIBEIRO et al., 2000, SOBEL et
al., 2003). Porém, Batters et al. (2002) mostraram que 21,1 % dos isolados vaginais de
pacientes que freqüentam clínica ginecológica foram resistentes ao fluconazol. Resistência a
drogas antifúngicas de Candida spp. continua a aumentar em resposta a grande utilização de
drogas na profilaxia e tratamento de pacientes imunossuprimidos (SILVA et al., 1998,
PFALLER et al., 2000).
Esses resultados mostram que as leveduras isoladas na cidade de Maringá, Paraná,
Brasil são sensíveis aos antifúngicos mais utilizados na terapêutica da candidíase
vulvovaginal.
68
Tabela 4: Concentração inibitória mínima em µg/mL de antifúngicos sobre leveduras de isolados clínicos, e perfil
de sensibilidade e resistência.
CIM ( µg/mL) Susceptibilidade (%) Antifúngico
Candida
albicans
Candida
parapsilosis
Candida
tropicalis
Candida
sp
não -
Candida
S SDD R
Anfotericina B 0,04-0,39 0,09 0,39 0,19-0,39 0,19 100 - 0
Nistatina 3,12-12,50 3,12 6,25 3,12-6,25 3,12 - - -
Fluconazol
CIM
50
<0,25-8 0,25 0,25 0,25-2 0,25 100 0 0
Fluconazol
CIM
90
<0,25-128 0,25 0,25 0,25-8 0,25 92,24 3,88 3,88
S: susceptível; SDD: susceptibilidade dose dependente; R: resistente.
-: não classificado
69
4.3 Perfil dos fatores de virulência das leveduras isoladas de fluido
vaginal
Candidíasis é uma infecção comum em várias locais do corpo humano, dentre elas o
trato genital. Embora essa infecção ocorra com maior freqüência em pacientes com uma
predisposição, ou seja, com algum desequilíbrio metabólico e/ou imunocomprometimento, a
espécie predominantemente responsável é a C. albicans, e muitos fatores de virulência podem
ser expressas, contribuindo para a patogênese. Dentre esses fatores de virulência estão o
processo de aderência no tecido, produção de enzimas extracelulares, hidrofobicidade de
superfície celular, dentre outros (CALDERONE; FONZI, 2001).
4.3.1 Aderência em células VERO
O mecanismo de adesão é a primeira etapa para a colonização, e a expressão de
moléculas e a influência das células hospedeiras podem ser importantes na transição de
leveduras comensais para patogênicas, com a subsequente invasão tecidual e disseminação
(SENET, 1998). O reconhecimento celular através de biomoléculas denominadas adesinas
(Alsp, Als5p, Hwp1p, Int1p, Mnt1p) presentes na superfície de C. albicans promovem a
aderência em células hospedeiras. Outras moléculas de característica protéica se ligam a
muitas proteínas da matriz extracelular de um tecido, possibilitando que o microrganismo
permaneça em contato com o hospedeiro (CALDERONE; FONZI, 2001).
Neste trabalho foi avaliada a capacidade dos isolados clínicos de leveduras do gênero
Candida em aderir em uma monocamada de células de mamífero. A capacidade aderente em
células Vero variou dentre as amostras de Candida spp., de 0,04 a 3,86 levedura/célula Vero.
A maioria das amostras, cerca de 70%, apresentou aderência entre 0,50 e 1,50 levedura/célula
Vero. As condições ambientais foram padronizadas para todas as amostras, podendo indicar
que a variabilidade genética é o maior fator que possa estar diferindo-as na aderência em
células Vero. Não foi observada diferença significativa na adesão entre amostra de C.
70
albicans e C. não-albicans (p<0,05) (Tabela 5 e Figura 4). Resultados de aderência de
leveduras de isolados clínicos sobre células de mamíferos podem variar segundo dados
experimentais realizados por outros pesquisadores. Vidotto et al. (2003) verificaram que
amostras de C. albicans e C. dubliniensis estão bem adaptadas na capacidade de aderir em
células de origem bucal e vaginal, não apresentando diferença significativa na aderência
dessas duas espécies em células vaginais, com adesão entre 0,70 e 0,90 levedura/célula Vero.
Considerando a variabilidade genética dos microrganismos, fatores fenotípicos e ambientais,
bem como, pH, temperatura, nutrientes, tempo de incubação, condições de aerobiose e tipo
celular, podem interferir no processo de adesão (PIRES et al., 2001).
4.3.2 Hidrofobicidade de superfície celular
De acordo com Hazen et al. (2000) leveduras com índice de hidrofobicidade <10% é
classificado como células hidrofílicas, enquanto que leveduras com índice >90%,
hidrofóbicas. Dos isolados obtidos, 46,2% (49/103) tiveram IH<10%, e apenas 6 tiveram IH
alta: C. parapsilosis (85,3%), C. tropicalis (72,3%), e 4 isolados de C. albicans (81-95%).
Hidrofobicidade de superfície celular de C. albicans e C. não albicans não tiveram diferença
significativa (p<0,05) (Tabela 05). Desta maneira, a maioria das leveduras estudadas são
células hidrofílicas.
Interações hidrofóbicas podem ter um papel importante na aderência de
microrganismos sobre uma grande variedade de superfície, tanto em superfície abiótica
quanto celular, principamente em fagócitos e outras células de mamíferos. Existem vários
métodos para estudar a hidrofobicidade de superfície celular de microganismos
(ROSENBERG, 1981; TEIXEIRA et al., 1993; HAZEN et al., 2000; GALLARDO-
MORENO et al., 2003), sendo a metodologia empregada neste trabalho baseada na afinidade
celular por hidrocarboneto insolúvel (TEIXEIRA et al., 1993). Muitos fatores podem
71
interferir na determinação da hidrofobicidade de superfície celular; metodologia utilizada,
meio de cultura para a ativação das amostras, temperatura, tempo de crescimento, condições
de aerobiose e a genética do microganismo (HAZEN et al., 1986; MOZES; ROUXHET,
1987; HAZEN, 1989); dificultando assim em determinar um valor absoluto de
hidrofobicidade. Entretanto uma boa estimativa das propriedades hidrofóbicas do envelope
celular pode ser realizada.
4.3.3 Produção de enzimas extracelulares
Segundo Luo et al. (2001) microrganismos que degradam hemácias produzem um halo
translúcido em torno da colônia idêntico a beta-hemólise da amostra controle Aeromonas
hydrophyla beta-hemolítico e um halo verde escuro para a alfa-hemólise. Depois de 96 h de
incubação 37 ºC em 5% CO
2
, o número de amostras com beta-hemólise aumentou de 8,7%
(9/103) para 91,3% (94/103). A atividade hemolítica das amostras variou entre 1 a 4,3 mm de
beta-hemólise. Entretanto isolados de C. não albicans produziram um halo de degradação
menor que C. albicans, estatisticamente significativo com p< 0,05 (Tabela 05). Luo et al.
(2001) verificaram que diferentes espécies de Candida expressavam variáveis perfis de
hemólise, e amostras de C. parapsilosis não produziram nenhum halo de hemólise. No
entanto Bonassoli et al. (2005) mostraram que amostras de C. parapsilosis possuíam perfil de
hemólise variado. A função de hemolisinas como fator de virulência e facilitador na
disseminação de leveduras não está bem estabelecido (BONASSOLI et al., 2005). Isto pode
estar relacionado com pouco estudo a respeito da expressão e função de atividade hemolítica
por leveduras do gênero Candida, quando comparado aos estudos envolvendo fosfolipases e
aspartil proteinases.
Muitas enzimas de degradação têm aumentado a virulência e contribuido no processo
invasivo de Candidíases. As enzimas extracelulares; proteases ácidas (aspartil proteinase-
SAP) e fosfolipases; têm sido associadas à virulência e patogênese de infecções por Candida
72
spp. (CALDERONE; FONZI, 2001). Na Tabela 05, pode-se observar que 99% (102/103) das
amostras de leveduras isoladas produziram protease ácida, com atividade proteolítica entre 2,5
e 11,5 mm. Para a produção de fosfolipase foi verificada a produção em 83% (88/103) das
amostras, com halo de preciptação de 1 a 2,6 mm. A atividade das enzimas protease ácida e
fosfolipase não foi diferente entre amostras de C. albicans e C. não albicans (p<0,05).
Muitos autores têm mostrado que isolados produtores de altas quantidades de
fosfolipases e proteases são capazes de infectar e invadir o tecido com maior facilidade
àqueles que produzem menos, confirmando a função dessas enzimas no processo da patogenia
(IBRAHIM et al., 1995; DE BERNARDIS et al., 1999; CALDERONE; FONZI, 2001).
Ghannoum (2000) verificou que a estirpe com gene knockout para a enzima fosfolipase FLB1
produz menos enzima, e foi considerada menos virulenta que a estirpe selvagem, confirmando
a participação dessa enzima na infecção e mortalidade por Candida sp.
4.3.4 Correlação entre fatores de virulência e antifúngicos
A produção de enzimas extracelulares correlacionou-se positivamente entre si, ou seja,
amostra que produz grande quantidade de protease ácida, também produz fosfolipase e
hemolisina (Figura 5-A). Sugita et al (2002) também verificaram que o genótipo A de C.
albicans produzia mais proteinase e fosfolipase do que os genótipos B e C. A relação dessas
duas enzimas não está bem discutida, mas vários autores propõem que leveduras com alta
produção de proteinase e fosfolipase possuem uma invasibilidade tecidual mais efetiva
(IBRAHIM et al., 1995; FEKETE-FORGÁCS et al., 2000; GHANNOUM, 2000).
Diversos trabalhos têm relacionado a hidrofobicidade de superfície celular à aderência
de leveduras às células hospedeiras (HAZEN et al., 1991; ENER; DOUGLAS, 1992;
PANAGODA et al., 2001). No entanto, outros relatam que a CSH não é um dos fatores
predominantes envolvidos na aderência, e que o efeito da CSH sobre a aderência é isolado
73
dependente (HAZEN, 1989), ou também que possa estar envolvido na coadesão de levedura
em células epiteliais (KENNEDY; SANDIN, 1988; KENNEDY et al., 1988). Neste trabalho,
pode-se verificar que a hidrofobicidade de superfície celular correlacionou negativamente
com todos os fatores de virulência, incluindo a aderência em células Vero, revelando que
leveduras hidrofóbicas produzem menos enzimas extracelulares e aderem menos que as
leveduras hidrofílicas (Figura 5-B). Provavelmente a hidrofobicidade de superfície celular não
seja o principal mecanismo responsável pelo processo de adesão dos isolados em células
Vero.
Adicionalmente, o perfil de susceptibilidade ao fluconazol e nistatina correlacionou-se
positivamente com a produção de hemolisina, mostrando que amostras que respondiam ao
fluconazol e nistatina com CIM alta, produziam um halo de hemólise maior (Figura 5-C).
Poucos estudos têm correlacionado a susceptibilidade aos antifúngicos com a atividade
hemolítica de leveduras. Ibrahim et al. (1995) verificaram que amostras isoladas de sangue
produziam mais SAPs, fosfolipases e outros fatores de virulência que isolados comensais.
Dessa maneira, essa correlação pode estar relacionada a grande capacidade de amostras
menos sensíveis a drogas se disseminarem pelo sistema sanguíneo do hospedeiro.
Neste estudo não foram verificadas uma correlação positiva estatisticamente
significativa entre susceptibilidade aos antifúngicos e produção de proteases ácidas e
fosfolipases. Resultados semelhantes foram observados por De Bernardis et. al. (1999). Por
outro lado, muitos trabalhos têm correlacionado o aumento da produção de proteinases e
fosfolipases com resistência ao fluconazol (FEKETE-FORGÁCS et al., 2000) e com o
aumento da expressão de genes de resistência como MDR1 (WU et al., 2000).
Esses fatores de virulência: (1) produção de proteases ácidas, fosfolipases,
hemolisinas, (2) processo de adesão através de reconhecimento de receptores por moléculas
74
na superfície do microrganismo, (3) formação de pseudohifas, podem ser considerados como
alvos para ação de novos agentes antifúngicos.
Figura 4: Aderência de Candida albicans isoladas de fluido vaginal sobre monocamada de
células Vero. A: 0,04 levedura/célula Vero. B: 3,86 levedura/célula Vero. Barra = 20 µm.
A
B
75
Tabela 5: Caracterização de 103 leveduras isoladas de fluido vaginal quanto à produção de enzimas extracelulares (protease ácida,
fosfolipase e hemolisina), hidrofobicidade de superfície celular e aderência em células Vero.
Fatores de
Virulência
Mínimo
Máximo Média
Intervalo de
dados
Freqüência
(%)
C. albicans
X±DPM
não C. albicans
X±DPM
Aderência
(levedura/célula Vero)
0,04 3,86 1,10 0,50 – 1,50 67,90 1,10 ± 0,06 0,91 ± 0,16
Hidrofobicidade de
superfície celular (%)
0,0 95,25 22,27 0-10 46,23 21,19 ± 2,33 40,37± 13,19
Protease ácida (mm)
0,0 11,5 8,51 9-11 45,27 6,35 ± 1,14 8,54 ± 0,22
Fosfolipase (mm)
0,0 2,61 1,51 1,5-2,5 72,64 1,53 ± 0,07 1,08 ± 0,36
Hemolisina (mm)
0,0 4,27 2,2 2-3 50,00 2,23 ± 0,09* 1,19 ± 0,58*
X: Média; DPM: Desvio Padrão da Média.
*Estatisticamente diferente com p<0,05 (teste t-Student).
76
Protease
Fosfoli
p
ase
01234
Hemolisina (mm)
0
2
4
6
8
10
12
Aderência
Protease
Fosfoli
p
ase
0 20406080100
CSH (%)
0,04
0,98
1,94
2,91
3,86
Fluconazol
Nistatina
01234
Hemolisina (mm)
0,25
16,00
32,00
128,00
Figura 5: Correlações significativas entre fatores de virulência de Candida spp. e
susceptibilidade aos agentes antifúngicos, com nível de significância de 0,05. A: Correlação
positiva de hemolisina com protease e fosfolipase; B: correlação negativa de CSH com enzimas
extracelulares e aderência em células Vero; C: correlação positiva entre susceptibilidade a
fluconazol e anfotericina B com atividade hemolítica.
A B
C
77
4.4 Estudo Fitoquímico
4.4.1 Rendimento dos extratos obtidos das cascas do caule do
Stryphnodendron adstringens
A partir de 100 g do pó da casca do caule de Stryphnodendron adstringens (Mart.)
Coville, foram obtidos 36 g de extrato bruto (F1). Para a realização da partição líquido-líquido
com acetato de etila:água (1:1) foram utilizados 30 g da F1, obtendo-se 23,3 g de fase aquosa
(fração F2), e 5,5 g da fase acetato de etila (fração F3). Posteriormente, 2 g da fração F2 foram
submetidos a uma coluna de Sephadex LH-20, obtendo-se 4 subfrações: F2.1 (0,38 g), F2.2 (0,59
g), F2.3 (0,03 g) e F2.4 (1,08 g) (Tabela 6).
Tabela 6: Rendimento das frações e subfrações obtidas a partir de 100 g do pó da casca
de Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville, após extração com acetona:água (7:3), partição
com acetato de etila e eluição em coluna contendo Sephadex LH-20.
Rendimento (%)
Frações
F1 36
F2 28
F3 6,6
Subfrações
F2.1 5,32
F2.2 8,26
F2.3 0,42
F2.4 15,12
78
4.4.2 Caracterização química da subfração F2.4 de Stryphnodendron
adstringens
Através da espectrometria de massas por eletrospray (EM-ES), foi caracterizada uma
substância do tipo polimérica com peso molecular médio de 2000 Da. Aparece uma série de picos
com intervalo de unidades de 152 Da, correspondendo à fórmula molecular de C
7
H
4
O
4
provavelmente do ácido gálico, que deve compor o polímero. Análise elementar foi realizada,
observando que a substância contém 51,49% de carbono, 4,64% de hidrogênio e ausência de
nitrogênio. Dessa maneira, pode-se afirmar que a substância é composta por sistema aromático.
A Figura 6 mostra o espectro de
13
C RMN MAS, no estado sólido, da subfração F2.4 do
“barbatimão”. A análise do espectro de
13
C RMN está baseada em Newman e Porter (1992) e em
Czochanska et al. (1979). Esta análise deve ser realizada dividindo-se o espectro em duas grandes
regiões. Os deslocamentos químicos entre 30 a 90 ppm correspondem ao anel da região A, e entre
90 e 160 ppm anel da região B.
Sinais a
δ
56 ppm corresponde ao grupo metoxila (NEWMAN; PORTER, 1992), podendo
ser em C-4’ de unidades de proantocianidina ou C-4’’ do ácido gálico (MELLO et al., 1996a).
Em
δ
170 e 177 ppm correspondem ao grupo carboxila de ácido carboxílico (NEWMAN;
PORTER, 1992; LORENZ et al., 2004) podendo ser atribuídos à molécula de ácido gálico. Em
δ
122 e 140 ppm corresponde ao C-1” e C-4” do ácido gálico, respectivamente (MELLO, 1995).
Uma banda larga centrada em
δ
40 ppm corresponde ao C-4 de unidades de procianidina e
prodelfinidina (KOUPAI-ABYAZANI et al., 1993a) ou de prorobinetinidina (FOO et al., 2000)
com deslocamento químico em
δ
36 ppm. Importante frisar que em extratos de S. adstringens já
foram isoladas e identificadas diversas substâncias do tipo 5-deóxi-proantocianidinas,
denominadas de prorobinetinidinas (MELLO et al., 1996b, TOLEDO, 2002).
79
Sinais em
δ
65-66 ppm correspondem ao C-3 da unidade terminal de flavan-3-ol
(CZOCHANSKA et al., 1979) e em
δ
72-73 ppm ao C-3 das unidades de procianidina e
prodelfinidina na extensão do polímero (KOUPAI-ABYAZANI; BOHM, 1993b; FOO et al.,
2000).
A configuração relativa das unidades que compõem o polímero que constitui a subfração
F2.4 pode apresentar unidades com configuração 2,3-cis ou com 2,3-trans. O pico em
δ
72 ppm
corresponde ao C-3 de unidades prorobinetinidina com configuração relativa do tipo 2,3-trans,
em
δ
75 ppm corresponde ao C-2 de unidades com configuração do tipo 2,3-cis de unidades de
prodelfinidina (KOUPAI-ABYAZANI et al., 1993a; KOUPAI-ABYAZANI; BOHM, 1993b;
MELLO, 1995), e em
δ
82 ppm corresponde ao C-2 de procianidinas e prodelfinidinas
(KOUPAI-ABYAZANI; BOHM, 1993b) e prorobinetinidinas (MELLO, 1995) com configuração
2,3-trans. Já, sinais entre
δ
101 e 102 ppm correspondem ao C-4a de 2,3-cis de procianidinas e
prodelfinidinas (KOUPAI-ABYAZANI et al., 1993a), como pode ser observado no espectro
(Figura 6).
Deslocamento químico em
δ
110 ppm confirma a presença de unidades de prodelfinidinas
na subfração F2.4, e ausência de procianidinas. Segundo Koupai-Abyazani et al. (1993a) este
sinal corresponde ao C-2’ e C-6’ de prodelfinidinas, e Mello, em 1995 confirma a ausência de
substituição desses carbonos no anel B, confirmando dessa forma, a triidroxilação neste anel. De
acordo com Koupai-Abyazani et al. (1993a), sinal com deslocamento químico entre
δ
102 e 107
ppm indica a presença de hidroxilas no anel B em C-3’, C-4’ e C-5’; e picos em
δ
114 a 118 ppm,
a presença de dihidroxilas no anel B.
Carbonos quaternários da estrutura química do polímero de proantocianidina estão
indicados em deslocamento químico de
δ
135, 148 e 158 ppm. Em
δ
135 ppm corresponde aos
80
C-1’ e C-4’ de unidades de prodelfinidina e prorobinetinidina (MELLO, 1995). Sinais em
δ
148
ppm correspondem ao C-3’ e C-5’ do anel B de prodelfinidinas (KOUPAI-ABYAZANI; BOHM,
1993b; MELLO, 1995); e em
δ
158 ppm corresponde aos carbonos hidroxilados do anel A
(MELLO, 1995) que podem corresponder os carbonos C-5, C-7 e C-8q (FOO et al., 2000). Esses
dados são confirmados pelos dados espectrais obtidos de
13
C RMN
, com deslocamentos
químicos próximos a
δ
103, 131, 144 e 155 ppm que indicam sinais de carbonos não protonados
(NEWMAN; PORTER, 1992).
Segundo Newman e Porter (1992), pico em
δ
105 ppm indica C-4a e C-8 em ligações do
tipo 4→8, e talvez uma pequena contribuição de C-6 em ligações 4→6. Aparentemente, um sinal
neste deslocamento químico não pode ser observado no espectro de
13
C RMN (Figura 6).
A subfração F2.4 é constituída por unidades de flavan-3-óis, sugerindo que o polímero
seja composto por 6 monômeros de proantocianidinas, além da presença de uma ou mais
unidades de ácido gálico. As unidades formadoras do polímero possuem a configuração relativa
dos tipos 2,3-cis e 2,3-trans, com presença ou ausência de hidroxila no C-5 e sempre com
hidroxilação no anel B do tipo pirogalol, caracterizando unidades de prodelfinidina e
prorobinetidinina. Grupos metoxilas em C-4’ de unidades de proantocianidinas podem estar
presentes no polímero, ou mesmo na(s) unidade(s) de ácido gálico, confirmada pela análise dos
espectros de massas e de
13
C RMN. As ligações entre os monômeros do tipo 4→8 e 4→6 não
pôde ser definidas pelo espectro de
13
C RMN e nem como do tipo α- ou β-, por não ter sido
realizado a análise de dicroísmo circular. Deste modo, baseado em Mello et al. (1996a, 1996b,
1999) sugerimos na figura 7, a estrutura química do polímero de peso molecular de 2114 Da que
pode compor a subfração F2.4 do “barbatimão”.
81
Figura 6: Espectro de
13
C RMN MAS no estado sólido da subfração F2.4 de Stryphnodendron adstringens. (a) C-4 de unidades de
prodelfinidina e prorobinetinidina; (b) metoxila de ácido carboxílico; (c) C-3 de unidade terminal de flavan-3-ol; (d) C-3 de unidades
de prorobinetinidina (configuração 2,3-trans); (e) C-2 de unidades de prodelfinidina (configuração 2,3-cis); (f) C-2 de unidades de
prodelfinidina e prorobinetinidina (configuração 2,3-trans); (g) C-4a de unidades de prodelfinidina (configuração 2,3-cis); (h) C-2’ e
C-6’ do anel B não substituído de prodelfinidina; (i) C-2” do ácido gálico; (j) C-1’ e C-4’ de unidades de prodelfinidina e
prorobinetinidina; (k) C-4” do ácido gálico; (l) C-3’ e C-5’ do anel B de prodelfinidina; (m) carbonos hidroxilados do anel A; (n e o)
carboxila de ácidos carboxílicos.
d
c
b
a
e
g
f
i
Região A
Região B
h
j
m
l
k
n
o
O
OH
HO
OR
2
OH
OH
R
1
A
B
C
2
3
4
5
6
7
8
1'
2'
3'
4'
5'
6'
82
OH
OH
OH
O
HO
HO
OH
OH
O
O
OH
HO
O
OH
HO
OH
OH
OH
HO
OH
G: Galoila
OH
O
OH
CH
3
OH
OH
OH
OH
OH
OH
O
OG
HO
OH
O
OG
HO
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
4
5
4
8
4'
4
8
4
4
8
8
3
3
6
Figura 7: Polímero de proantocianidina que pode compor a subfração F2.4 de
Stryphodendron adstringens, sugerido através da análise do espectro de massas e de
13
C RMN.
83
4.5 Atividade antifúngica de Stryphnodendron adstringens
A Figura 8 e a Tabela 7 mostram o efeito de S. adstringens quanto à atividade antifúngica
sobre as leveduras isoladas de fluido vaginal. Essa atividade foi caracterizada através da
determinação da concentração inibitória mínima. Primeiramente, todas as amostras de isolado
clínico foram submetidas ao teste de susceptibilidade in vitro das frações (F1, F2 e F3). Por
apresentar melhor atividade antifúngica, a fração F2 foi escolhida para prosseguir no processo de
purificação. A Figura 6A mostra que somente a fração F3 foi significativamente diferente à
fração F1 (p<0,001), havendo uma diminuição na atividade antifúngica dessa fração. A fração F2
foi capaz de inibir o crescimento leveduriforme entre as concentrações de 0,97 a 7,8 µg/mL,
enquanto a fração F1 apresentou atividade antifúngica entre 0,48 a 31,25 µg/mL.
A partir da fração F2 foi obtido 4 subfrações: F2.1, F2.2, F2.3 e F2.4. A subfração F2.1
foi considerada de baixa atividade antifúngica, uma vez que esta não inibiu o crescimento
leveduriforme em concentrações ≤1000 µg/mL. No entanto, as subfrações F2.2, F2.3 e F2.4
apresentaram uma boa atividade (Figura 6B), sendo a F2.4 a mais ativa com relação às outras
duas (p<0,001). Porém, a subfração F2.4 não foi estatisticamente mais ativa que a fração F2.
Para avaliar a atividade fungicida, as concentrações que inibiram o crescimento de
leveduras foram semeadas em meio sólido (ASD). Para todas as frações e subfrações testadas, a
concentração fungicida mínima (CFM) mostrou-se alta, 16 a 128 vezes maior que a CIM, sendo
mais de 60% das amostras com CFM ≥ 1000 µg/mL. Assim, os extratos obtidos do “barbatimão”
possuem somente atividade fungistática.
Em relação à atividade da subfração F2.4 com os antifúngicos testados neste estudo,
pode-se observar que a anfotericina B e fluconazol são mais eficazes que a subfração F2.4
84
(p<0,05 e p<0,0001, respectivamente). Por outro lado, a atividade antifúngica da nistatina não se
mostrou mais ativa que a subfração F2.4 (p>0,05). É necessário ressaltar que, amostras
determinadas como resistentes ao fluconazol (CIM
90
≥ 64 µg/mL) ou susceptíveis dose
dependente (16 µg/mL ≤ CIM
90
≤ 32 µg/mL) possuem uma boa sensibilidade à subfração F2.4,
com CIM entre 7,8 a 15,75 µg/mL e 1,9 a 7,8 µg/mL, respectivamente. Apesar da sua atividade
fungistática, assim como os agentes azólicos, os extratos do “barbatimão” apresentam uma
relevante ação antifúngica.
Nas últimas décadas têm se observado um número aumentado de infecções causadas por
fungos em decorrência da resistência farmacológica em várias espécies. Em recursos naturais,
como as plantas medicinais, têm sido objetos de estudo para atividade contra fungos
leveduriformes e filamentosos (MESA ARANGO, 2004; FENNER et al., 2005). Moléculas como
eugenol constituinte químico majoritário do óleo essencial de Ocimum gratissimum L.
(NAKAMURA et al., 2004), e peptídeos isolados de Zea mays e Sorghum bicolor (STEVENS et
al., 2002; MINCOFF et al., 2005) são exemplos de moléculas com uma boa atividade antifúngica
contra Candida spp.
Com freqüência, os taninos têm se mostrado uma classe de moléculas com muitas
atividades farmacológicas, dentre elas a antimicrobiana. Panizzi et al. (2002) verificaram que a
fração III de Rubus ulmifolius; composta por taninos; e o isolado ácido gálico, possuem atividade
inibitória contra C. albicans, porém inativo contra Aspergillus niger. Sanches et al. (2005)
verificaram que as subfrações de S. obovatum obtidas da fração acetato de etila possuem uma
atividade antifúngica moderada (62,25-125 µg/mL) contra Candida spp. E essa atividade
antifúngica foi atribuida à presença de taninos condensados e ácido gálico. Holetz et al. (2005)
mostraram atividade antiprotozoário do extrato bruto e das subfrações de S. adstringens, inibindo
o crescimento do tripanosomatídeo, além de levar a alterações ultraestruturais na mitocôndria e
85
complexo de Golgi e diminuir a atividade da enzima citocromo c succinato redutase. Outros
estudos também têm verificado a ação dos taninos sobre enzimas de microrganismos (FIELD;
LETTINGA, 1992). Esses autores sugerem que a ação antimicrobiana esteja atribuída aos taninos
condensados.
Sanches et al. (2005) verificaram que os monômeros e dímeros de prodelfinidina isolados
do extrato de S. obovatum não apresentaram atividade antifúngica em concentrações inferiores a
1000 µg/mL. No entanto as subfrações constituídas de compostos de alto peso molecular
apresentaram uma atividade entre 62,5 e 125 µg/mL. Santos et al. (2002) mostraram que os
extratos de Stryphnodendron spp. são constituídos por taninos com alto grau de polimerização,
afirmando que essa característica deve ser um fator importante para a atividade biológica. Tem
sido verificado que o aumento do grau de polimerização, aumenta progressivamente o grau de
reatividade dos taninos Isto ocorre devido a ligações de hidrogênio com os resíduos de
aminoácidos (FIELD; LETTINGA, 1992).
Esquenazi et al. (2002) verificaram que extratos e frações de Cocos nucifera possuíam
atividade antiviral e antibacteriana, mas não inibiram o crescimento de fungos (C. albicans, C.
neoformans e F. pedrosoi). Também se pode observar que as frações eram compostas por
polímeros de proantocianidinas do tipo B, com unidades de epicatequina na extensão e
epicatequina ou catequina como unidade terminal do polímero, sugerindo que esse polímero,
diidroxilado no anel B, seria responsável pela alta atividade antibacteriana. Estudos anteriores
têm mostrado que o número de grupos hidroxilas no anel B das unidades monoméricas de
proantocianidinas interfere no nível de inibição de crescimento de certos microrganismos,
verificando que proantocianidinas triidroxilados no anel B possuem maior ação antimicrobiana
(SCALBERT, 1991).
86
Existem várias hipóteses para explicar a atividade antimicrobiana dos taninos: 1) inibição
de enzimas de fungos e bactérias ou complexação com substratos dessas enzimas; 2) ação sobre
as membranas celulares dos microrganismos, modificando o seu metabolismo, 3) complexação
com os íons metálicos (SCALBERT, 1991; SANTOS; MELLO, 2003). Segundo Haslam (1996),
além disso, também pode ser considerada a habilidade dos taninos de se complexarem a outras
macromoléculas, incluindo proteínas e polissacarídeos.
O alto grau de polimerização e hidroxilação dos taninos condensados presentes na
subfração F2.4 parecem ser fatores revelantes para a atividade antifúngica contra Candida spp.
Pode-se sugerir que a atividade antifúngica dos extratos de S. adstringens se deve a presença de
proantocianidinas poliméricas constituídas por unidades de prodelfinidinas e moléculas de ácido
gálico, de peso molecular médio de 2.000 Da.
87
F1 F2 F
3
0
5
10
15
*
Concentração
µ
g/mL
F2.2 2
,3
F2.4 F2
0
10
20
30
Concentração
µ
g/mL
*
*
Figura 8: Média das concentrações inibitória mínima das frações F1, F2 e F3 (A) e subfrações
F2.2, F2.3 e F2.4 (B) de Stryphnodendron adstringens sobre leveduras de isolados clínicos.
Amostragem n=103 para frações e n=38 para as subfrações. A: * diferença significativa em
relação a fração F1 (p<0,001). B: * diferença significativa em relação a F2/F2.4 (p<0,001).
Resultados expressos em média ± erro padrão da média.
A
B
88
Tabela 7: Atividade antifúngica de extratos de Stryphnodendron adstringens sobre Candida spp.
Concentração inibitória mínima (CIM) em µg/mL.
Extratos Intervalo CIM Freqüência CIM (%) Média CIM± EPM
Frações
F1 0,48 – 31,25 3,9 (52) 4,84 ± 0,39
F2 0,97 – 7,8 3,9 (41) 4,74±0,22
F3 0,97 – 31,25 7,8 (38) 11,32 ± 0,75*
Sub-frações
F2.1 > 1000 >1000 (100) -
F2.2 1,9-62,5 15,75 (24) 20,38 ± 3,32**
F2.3 0,9-31,25 15,75 (45) 16,46 ± 2,03**
F2.4 0,9-7,8 7,8 (47) 7,2 ± 0,92
* diferença significativa em comparação com F1 (p<0.001). ** diferença significativa em
comparação com F2 (p<0.001).
89
4.5.1 Combinações de drogas antifúngicas
A combinação entre a subfração F2.4 e anfotericina B e subfração F2.4 e nistatina, foi
caracterizada como uma interação indiferente, sendo o índice CFI semelhante às concentrações
fracionais de cada droga. Somente uma combinação antifúngica mostrou ser aditiva, com um
CFI=1 para as concentrações de 1,9 µg/mL para subfração F2.4 e 1,5 µg/mL para nistatina. O
mesmo ocorreu para combinação entre subfração F2.4 e anfotericina B, com concentrações de 1,9
e 0,9 µg/mL, respectivamente.
A combinação entre subfração F2.4 e fluconazol não mostrou efeito positivo. Foi
observado uma indiferença no resultado obtido, com índice CFI muito semelhante a CFI da
subfração F2.4.
Esses resultados demonstram que a combinação da subfração F2.4 com os antifúngicos
poliênicos (anfotericina B e nistatina) e fluconazol não apresentou uma interação positiva das
drogas.
4.5.2 Investigação do modo de ação da subfração F2.4 de Stryphnodendron
adstringens sobre Candida spp.
4.5.2.1 Efeito sobre a formação do tubo germinativo
Leveduras expostas por 2 h a 37 ºC a diferentes concentrações da subfração F2.4 em meio
RPMI 1640 foram visualizadas em microscópio óptico invertido. Foi verificado que em
concentrações ≥15 µg/mL da subfração F2.4 houve inibição da formação de tubos germinativos
nas células leveduriformes (Figura 9). A concentração mínima de nistatina que inibiu a formação
do tubo germinativo foi de 6,25 µg/mL. A formação do tubo germinativo e conseqüente formação
de pseudohifa é um fator de virulência de C. albicans e uma caracterísitica para a invasibilidade
90
no tecido infectado. Muitos antifúngicos como a nistatina visto neste trabalho; o fluconazol
(HAZEN et al., 2000) e substâncias provenientes de produtos naturais (MINCOFF et al., 2005)
são capazes de inibir este processo.
Figura 9: Inibição da formação do tubo germinativo de Candida albicans pela subfração F2.4 de
Stryphnodendron adstringens na concentração de 15,75 µg/mL. A: Controle; B: 15,75 µg/mL da
subfração F2.4. Aumento de 400X.
A
B
91
4.5.2.2. Efeito sobre o processo de divisão celular
Após o tratamento de C. albicans em concentrações da subfração F2.4 do
“barbatimão”(7,8, 31,25 e 125 µg/mL) por 48 h a 37 ºC, foi verificado um aumento na quantidade
de células leveduriformes com brotamento (Figura 10). Somente a concentração de 125 µg/mL
apresentou um aumento de brotamentos significativo em relação as leveduras não tratadas com a
droga (188,34%) (Figura 11). Apesar do aumento de leveduras com brotamentos, observou-se
que o seu crescimento era inibido em pelo menos 1,5 Log
10.
No entanto, a maioria dos agentes
antifúngicos possui a propriedade de inibir o crescimento leveduriforme por inibir a formação de
brotamento, caracterizada pela diminuição do número de células com brotamento (HAZEN et al.,
2000; NAKAMURA et al., 2004).
92
Figura 10: Efeito da subfração F2.4 de Stryphnodendron adstringens sobre o brotamento de
Candida albicans isolada de fluido vaginal. A: Controle, B: 125 µg/mL subfração F2.4, C: 3,12
µg/mL nistatina. Aumento de 400X.
22,02
19,29
29,22
28,02
63,55
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Controle Nistatina
3,12
7,8 31,25 125
% Brotamento
Figura 11: Efeito da subfração F2.4 de Stryphnodendron adstringens sobre brotamentos de
Candida albicans isolada de fluido vaginal. Concentrações das drogas em µg/mL. *Diferença
significativa com o grupo controle (p<0,001).
*
A
B
C
93
4.5.2.3 Inibição da aderência de leveduras em células Vero e superfície abiótica
Leveduras isoladas de fluido vaginal tratadas com subfração F2.4 nas concentrações de
7,8 e 125 µg/mL por 24 h, tiveram dificuldade em aderir em monocamada de células Vero e
superfície abiótica (vidro) (Figura 12A e 12B, respectivamente). Também se observou que a
inibição da aderência em ambos os materiais foram doses dependentes (Figura 13 e Tabela 8).
Diferença na aderência de leveduras em células Vero ou superfície abiótica nas concentrações de
7,8 e 125 µg/mL em comparação com o grupo não tratado foi estatisticamente significativa para
algumas amostras estudadas (p<0,05), ressaltando para a amostra de C. albicans ATCC 10231
(p<0,001). Além disso, também foi observada uma correlação positiva significativa (p<0,05) na
aderência de leveduras em células Vero e em lamínula de vidro, mostrando que as amostras que
possuem uma boa aderência em células Vero, também possuem em vidro.
Os efeitos dos antifúngicos sobre a aderência de leveduras em células epiteliais bucais
(BECs) tem sido estudada através de diferentes modos: (a) pré-incubação dos isolados com a
droga; (2) pré-tratamento das BECs com a droga; (c) tratamento durante a fase de aderência, (d)
tratamento após o processo de adesão (DOROCKA-BOBKOWSKA, et al., 2003). Muitos
estudos têm indicado que a pré-exposição da levedura ao antifúngico tem reduzido a adesão.
Ellepola e Samaranayake (1998a, 1998b) verificaram uma redução significativa da aderência de
Candida spp. em BECs e superfície de acrílico pela ação de diversos antifúngicos como
anfotericina B, nistatina, cetoconazol, fluconazol e 5-fluotocitosina. Esta redução da aderência de
leveduras em células epiteliais humanas por agentes antimicóticos também foi verificada por
outros pesquisadores (ZEPELIN et al., 2002; DOROCKA-BOBKOWSKA et al., 2003).
Além dos estudos relacionados aos antifúngicos utilizados na terapêutica, plantas
medicinais também estão sendo alvo para a atividade antiaderente. Polaquini et al. (2006)
94
verificaram que extrato aquoso de Azadirachta indica A. Juss inibe a aderência de C. albicans em
resina composta. Foo et al. (2000) demostraram que proantocianidinas da fração acetato de etila
de Vaccimium macrocarpum Ait. na concentração de 75 µg/mL exibe uma potente atividade
antiaderente de Escherichia coli fímbria-P, sugerindo que as proantocianidinas podem ser
benéficas para a prevenção de infecções urinárias causadas por esta espécie bacteriana.
Existem várias adesinas na superfície de Candida spp. que se interagem com os ligantes
de membrana celular do hospedeiro, que podem ser proteínas e carboidratos (CALDERONE;
FONZI, 2001). Considerando a capacidade dos taninos em se complexarem as proteínas,
favorecido pelo alto grau de hidroxilação, sugere-se que os taninos poderiam interferir na
exposição dessas adesinas, e como consequência, inibir a interação com os receptores ligantes
presentes na célula hospedeira. A mesma situação poderia estar ocorrendo sobre a fomação do
tubo germinativo e a hidrofobicidade de superfície celular.
95
0
20
40
60
80
100
C. albicans C.
parapsilosis
2 111 144 235 299 352
Índice de adesão (%)
0
20
40
60
80
100
C. albicans C.
parapsilosis
2 111 144 235 299 352
Índice de adesão (%)
Figura 12: Efeito da subfração F2.4 de Stryphnodendron adstringens nas concentrações de 7,8 e
125 µg/mL na aderência de leveduras de isolados clínicos, em monocamada de células Vero (A)
e em superfície abiótica (B). Amostras padrões: Candida albicans ATCC 10231, Candida
parapsilosis ATCC 22019. Amostras de isolados clínicos: Candida sp (02), C. albicans (111, 235
e 352), C. parapsilosis (144) e C. tropicalis (299). Controle; 7,8 µg/mL; 125 µg/mL.
B
A
96
Tabela 8: Inibição da aderência de Candida spp. em células Vero e superfície abiótica (vidro),
tratadas por 24 h a 37 ºC com subfração F2.4 nas concentrações de 7,8 e 125 µg/mL.
Inibição da aderência (%)
Concentração F2.4 (µg/mL) Vero Superfície abiótica
7,8 44,99 ± 18,99 53,48 ± 18,06
125 53,84 ± 28,48 73,17 ± 18,00
Figura 13: Inibição de aderência de Candida albicans ATCC 10231 em células Vero (A, B e C)
e em superfície abiótica (D, E, F) tratadas previamente com a subfração F2.4 de Stryphnodendron
adstringens por 24 h a 37 ºC. A e D: Controle; B e E: 7,8 µg/mL; C e F: 125 µg/mL. Aumento
de 400X.
A
D
B
E
C
F
97
4.5.2.4 Efeito sobre a hidrofobicidade de superfície celular
A Figura 14 mostra que a subfração F2.4 interfere na hidrofobicidade de superfície
celular, observando uma redução dessa hidrofobicidade após tratamento da levedura com 125
µg/mL. Estudos têm demostrado que alguns antifúngicos alteram a hidrofobicidade de superfície
celular de leveduras. A exposição de C. albicans a nistatina e cetoconazol reduz a CSH, porém o
fluconazol e 5-fluorocitisina não afetaram significativamente a CSH (ELLEPOLA;
SAMARANAYAKE, 1998a). Hazen et al. (2000) verificaram que o fluconazol reduz a CSH de
C. albicans, mas não altera o perfil de hidrofobicidade/hidrofilicidade das amostras.
Hazen e Hazen (1992) têm mostrado que a hidrofobicidade de superfície celular de C.
albicans está correlacionada com a concentração de fibrilas no exterior da parede celular, e que a
hidrofobicidade é uma reflexão das propriedades físico-química da parede celular. As mudanças
em nível de parede celular causadas pelas drogas antifúngicas não somente reduz a habilidade de
Candida spp. em aderir às células de mamíferos e superfície abiótica, bem como suprime o
crescimento leveduriforme e formação de pseudohifas (ELLEPOLA; SAMARANAYAKE,
1998a; 1998b).
98
-20
0
20
40
60
80
100
C. albicans C.
parapsilosis
2111144 235 299 352
IH (%)
Figura 14: Hidrofobicidade de superfície celular de amostras de leveduras do gênero Candida
tratadas por 24 h com a subfração F2.4 de Stryphnodendron adstringens nas concentrações de 7,8
e 125 µg/mL, sendo Candida albicans ATCC 10231, Candida parapsilosis ATCC 22019 e 6
isolados clínicos: Candida albicans (111, 235 e 352), Candida parapsilosis (144), Candida
tropicalis (299) e Candida sp (02). Controle; 7,8 µg/mL; 125 µg/mL.
99
4.5.2.5 Avaliação das alterações ultraestruturais
Após o tratamento das leveduras com diferentes concentrações da subfração F2.4 do
“barbatimão” por 48 h a 37 ºC, pôde-se observar através das imagens obtidas da microscopia
eletrônica de varredura (MEV) e de transmissão (MET), alterações na estrutura de células
leveduriformes. A inibição da formação de pseudohifa em concentração igual ou superior a 7,8
µg/mL foi observada na MEV e microscopia ótica comum, quando comparada com o grupo que
não recebeu tratamento com a subfração F2.4. Adicionalmente, o efeito aglutinante da subfração
F2.4 em leveduras foi evidenciado na MEV (Figura 15-E e F), que poderia ser causado por
deposições da subfração F2.4 na superfície celular (Figura 15-B e E). Alteração na morfologia
das células leveduriformes pôde ser observada, sendo caracterizada por irregularidades na parede
celular (Figura 15-B,C e F).
A Figura 16-A mostra a ultraestrutura de parede celular e membrana citoplasmática de C.
albicans não tratada. A parede celular se apresenta homogênea e delimitada, com a membrana em
contato íntimo. Por outro lado, células tratadas com diferentes concentrações da subfração F2.4
provoca uma perda da integridade da parede celular (Figura 16-C e E), observando a ausência de
homogeneidade na densidade eletrônica quando comparado com o grupo controle. As Figuras 16-
D e F mostram células leveduriformes completamente deformadas em decorrência da
desorganização na parede celular. Também é possível observar uma alteração na membrana
citoplasmática e uma separação da parede celular.
A nistatina, um agente poliênico, que atua diretamente sobre o ergosterol de membrana
plasmática, se liga fortemente formando um canal que permite a saída de K
+
e Mg
+2
para o
exterior da célula, e em concentrações subinibitórias reduz a hidrofobicidade de parede celular e
aderência em células epiteliais. Além disso, alterações ultraestruturais de Candida spp. são bem
100
caracterizadas em nível de membrana citoplasmática pela descontinuidade e invaginação (Figura
16-B). Agentes azólicos, por exemplo, sertoconazol e miconazol, atuam principalmente inibindo
a síntese de ergosterol, levando a alteração na permeabilidade do plasmalema que,
conseqüentemente leva a modificações na célula. Estas são caracterizadas por uma alteração no
plasmalema, em organelas citoplasmáticas, como aumento mitocondrial, acúmulo de vesículas, e
mudança na morfologia celular (NOLLIN; BORGERS, 1974; GARRO et al., 1989).
Muitos trabalhos também têm demonstrado a ação antifúngica de extratos de produtos
naturais sobre a ultraestrutura de diversas espécies de Candida. Nakamura et al. (2004)
verificaram que o óleo essencial de Ocimum gratissimum provoca alteração na parede celular e
em algumas organelas citoplasmáticas. Sionov et al. (2005) e Zhang et al. (2006) verificaram que
substâncias isoladas da esponja de Sysidea herbacea e da planta Tribulus terretris L.,
respectivamente, alteravam a membrana celular de C. albicans.
Estudos recentes têm demostrado a ação antimicrobiana de extratos de S. adstringens
sobre protozoários. Maza et al. (2003) verificaram que a subfração F2.5 obtida da fração aquosa
do “barbatimão” causa alterações ultraestruturais em promastigotas de Leshmania amazonensis,
como a presença de protozoários com dois flagelos, dois núcleos, sugerindo a interferência do
extrato sobre a divisão celular, além de apresentar membrana concêntrica no citoplasma
característico de processo autofágico. Holetz et al. (2005) mostraram que em Herpetomonas
samuelpessoai tratado com CI
50
do extrato bruto do “barbatimão” houve um aumento na
mitocôndria com número maior de cristas e evidente vesiculação no complexo de Golgi. Também
foi observada uma diminuição da atividade da enzima citocromo c succinato redutase, um típico
marcador mitocondrial, conferindo a sua ação no metabolismo energético celular.
101
Figura 15: Microscopia eletrônica de transmissão (A, B e C) e de varredura (D, E e F) de
Candida albicans tratada com subfração F2.4 de Stryphnodendron adstringens por 48 h a 37 ºC.
A e D: Controle; B e C: 125 µg/mL, E e F: 31,25 µg/mL. Barras=1µm.
A
B
D
C
E
F
E
102
Figure 16: Microscopia eletrônica de transmissão de Candida albicans tratada com subfração
F2.4 de Stryphnodendron adstringens. A: Controle; B: 3,12 µg/mL de nistatina; C e D: 31,25
µg/mL da subfração F2.4; E e F: 125 µg/mL da subfração F2.4. Barras = 1 µm.
A
B
E
D
F
C
103
4.5.2.6 Efeito sobre a atividade das enzimas extracelulares (protease ácida, fosfolipase e
hemolisina)
Não foi ovservado nenhum efeito da subfração F2.4 sobre a atividade das enzimas
extracelulares liberadas pelas leveduras, através da metodologia empregada neste estudo.
Considerando as propriedades fitoquímicas da subfração, os taninos poderiam ser complexados
pelos constituintes protéicos do meio de cultura, dificultando a detecção de uma possível inibição
da atividade de enzimas extracelulares.
A inibição de microganismos por compostos tânicos se deve a ligações de hidrogênio com
proteínas vitais, como as enzimas. Estudos anteriores têm verificado que os taninos são potentes
inibidores de enzimas como pectinase, amilase, celulose, peroxidase e lipase, dentre outras.
Também foi verificado que taninos de peso molecular elevado são geralmente mais ativos quando
comparado com os monômeros, sendo os taninos oligoméricos os inibidores de microganismos
mais ativos (FIELD; LETTINGA, 1992).
104
4.6 Efeito estimulante da subfração F2.4 de Stryphnodendron
adstringens sobre a fagocitose de Candida albicans
Candida albicans tratada previamente com 7,8 µg/mL da subfração F2.4 do “barbatimão”
por 2 h sofreu um processo de internalização mais intenso pelos macrófagos que as leveduras
controle. Foi observado um aumento na internalização de aproximadamente 28% para as
leveduras tratadas (Figura 17). Através de micrografias de microscopia óptica, microscopia
eletrônica de varredura e transmissão, o processo de internalização de leveduras pôde ser
observado (Figura 18), ressaltando para o número maior de leveduras internalizadas quando estas
eram previamente tratadas com a subfração F2.4. Na Figura 19 pôde-se verificar as etapas da
internalização de leveduras pelos macrófagos, desde a aderência na membrana do macrófago à
formação do fagossomo (Figura 19 B-F). Hazen et al. (2000) verificaram que C.albicans tratadas
previamente com 0,75 X CIM de fluconazol por 26 h estimula a fagocitose de leveduras por
PMN. Outro fator importante é que este tratamento com a droga pode facilitar a morte da
levedura pelos fagócitos, observando que leveduras hidrofóbicas resistem mais à morte por
fagocitose que as hidrofílicas. Os autores sugeriram que esta ação estimulatória do fluconazol à
fagocitose está relacionada às alterações observadas na parede celular e membrana de C.
albicans.
Trabalhos têm demonstrado que a hidrofobicidade de parede celular é determinada pelas
características moleculares da parede celular, que se correlaciona com a formação do tubo
germinativo, adesão a células epiteliais e proteínas de matriz extracelular, organização de fibrilas
da superfície da parede celular, e relacionada com o processo de fagocitose. Outros demonstram
que a redução da hidrofobicidade de superfície celular é um fator importante para o aumento da
fagocitose de microrganismo pelos leucócitos, e que agentes antifúngicos que diminuem a
105
hidrofobicidade pode ser capaz de reduzir a virulência e patogenicidade (ELLEPOLA;
SAMARANAYAKE, 1998a; HAZEN et al., 2000).
Schepetkin e Quinn (2006) relataram que polissacarídeos obtidos de plantas possuem
potencial efeito imunomodulador sobre macrófagos. Os polissacarídeos se ligam a receptores de
superfície e induz uma resposta em macrófagos, estimulando a produção de
citocinas/quimiotáticos, intermediários oxigênio reativo e estímulo da proliferação celular.
Pesquisadores têm demostrados que polifenóis de plantas possuem atividade
imunomodulatória. Resveratrol, um natural polifenol de uvas, estimula a fagocitose em pró-
monócitos de C. albicans a baixas concentrações (1-10 µM) (BERTELLI et al., 1999). Também
foi verificado que proantocianidinas de semente de uva estimulam proliferação de linfócitos,
citotoxicidade de células NK, proporção CD4+/CD8+ e produção de IL-2 e IFN-γ (ZHANG et
al., 2005). Rohrbach et al. (1992) descreveram a atividade imunomodulante dos taninos
condensados sobre macrófago alveolar, provavelmente por estimular a fluido de fatores
quimiotáticos e produção de intermediários oxigênio reativo. Adicionalmente, os macrófagos
podem ser estimulados a liberar ácido araquidônico, que é metabolizado a eucosanóides e
leucotrienos, mediando a resposta inflamatória.
106
55,4
43,3
0
10
20
30
40
50
60
70
Controle 7,8
índice de internalização
Figura 17: Estímulo da resposta macrofágica pela subfração F2.4 de Strypnhodendron
adstringens sobre leveduras tratadas previamente com 7,8 µg/mL por 2 h a 37 ºC.
107
Figura 18: Estímulo da resposta macrofágica pela subfração F2.4 de Stryphnodendron
adstringens sobre Candida albicans previamente tratadas com 7,8 µg/mL. A e B: Coloração de
Giemsa, C e D: Microscopia eletrônica de varredura, E e F: Microscopia eletrônica de
transmissão. A, C e E: Controle, B, D e F: 7,8 µg/mL. Barras = 5 µm.
D
A
B
C
F
E
108
Figura 19: Microscopia óptica do processo de internalização de Candida albicans pelos
macrófagos J774G8. As leveduras foram tratadas previamente com subfração F2.4 de
Stryphnodendron adstringens na concentração de 7,8 µg/mL por 2 h, e posteriormente
submetido à interação com macrófagos por 1 h a 37 ºC. A: Macrófago com leveduras
internalizadas; B – F: Etapas do processo de internalização de leveduras pelos macrófagos.
B: Levedura aderida à membrana de macrófago; C: Invaginação de membrana com a
levedura; D: Extensão da invaginação de membrana envolvendo a levedura; E: Completo
envolvimento da levedura pela membrana; F: Levedura internalizada. Aumento de 1000X.
A
B C
D E
F
109
4.7 Toxicidade das frações e subfração F2.4 de Stryphnodendron
adstringens
Na Tabela 9 está resumido o efeito dos extratos obtidos das cascas de S. adstringens sobre
diferentes modelos de toxicidade. Foi verificado o efeito citotóxico sobre células nucleadas (Vero
e Macrófago J774G8), efeito membranolítico sobre hemácias de carneiro e o efeito tóxico sobre
larvas de Artemia salina. Também foi calculado o índice de seletividade (IS) dos extratos,
baseando-se na relação CC
50
ou DL
50
com a média das CIMs.
As frações F1, F2, F3 e subfração F2.4 não possuem atividade hemolítica (AH < 1%) em
concentrações menores ou iguais a 1000 µg/mL. Entretanto hemaglutinação foi observada em
concentrações acima de 500 µg/mL. Foi verificado que na presença de concentrações acima de
100 µg/mL de extratos de “barbatimão”, houve uma diminuição significativa no número de
sobreviventes (p<0,05) de A. salina. No entanto, as concentrações testadas não foram capazes de
levar a morte de 50% da população, exceto a subfração F2.4, com DL
50
de 100 µg/mL. As
concentrações citotóxicas de 50% (CC
50
) em células Vero foram maiores que 100 µg/mL para
todas as frações e subfração F2.4. No entanto, para os Macrófagos J774G8, a CC
50
foi de 70
µg/mL para a fração F1, e para a fração F2, F3 e subfração F2.4 foram maiores que 100 µg/mL
(Tabela 9).
É importante ressaltar que uma das principais características que um antimicrobiano deve
apresentar é a capacidade de atuar seletivamente sobre o microrganismo, sem causar danos ao
hospedeiro. Drogas que atuam sobre estruturas ou funções microbianas inexistentes em células de
mamíferos geralmente têm maior toxicidade seletiva.
Neste estudo foi verificada a toxicidade in vitro dos extratos do “barbatimão”, mostrando
que os mesmos apresentaram moderada citotoxicidade sobre as células nucleadas utilizadas, e
110
uma baixa toxicidade sobre larvas de A. salina e hemácias de carneiro. Dessa maneira, observou-
se uma boa toxicidade seletiva sobre as células e larvas de A. salina (Tabela 9). Esta ação seletiva
se deve a capacidade da droga em estudo de interferir sobre a homeostase de parede celular de C.
albicans, que possui uma estrutura peculiar de fungos leveduriformes. Isto pode ser reforçado
pela baixa atividade membranolítica dos extratos em hemácias de carneiro. Diferentemente, isto
ocorre com agentes poliênicos, apesar de sua seletividade e eficácia no tratamento de infecções
fúngicas, possui alta toxicidade, mostrando também ser altamente hemolítica (LUIZE et al.,
2005).
Sousa et al. (2003) sugeriram que o extrato das cascas de S. adstringens não possui
genotoxicidade sobre células somáticas e germinativas de Drosophila melanogaster. Estudos de
toxicidade aguda e efeitos sobre os parâmetros bioquímicos em ratos Wistar após um tempo
prolongado de tratamento com extrato aquoso de S. adstringens foram realizados por Rebecca et
al. (2002). O valor de DL
50
do extrato foi de 2.699 mg/kg, e efeitos tóxicos foram observados
após a adminstração do extrato por 30 dias, verificando o aumento do peso do rato, involução do
timo e aumento do nível de glicose e aspartil aminotransferase no plasma do rato. Além disso,
esse extrato também interferiu no metabolismo energético hepático (REBECCA et al., 2003).
Diante deste trabalho, pode-se verificar que os extratos de S. adstringens possuem grande
potencial como agente antifúngico para o tratamento de Candidíasis. Para o desenvolvimento e
comercialização de um novo medicamento, estudos toxicológicos e de eficácia terapêutica (pré-
clínicos e clínicos) são requeridos para que o medicamento possa ser aprovado pelo órgão de
fiscalização do país (BRASIL, 2004). Em razão desta atividade antifúngica e outras atividades
farmacológicas já verificadas, e toxicidade relativamente baixa, subsídeos às pesquisas e à
produção de um fitoterápico poderiam ser incentivados.
111
Tabela 9: Concentração citotóxica de 50% (CC
50
) e dose letal de 50% (DL
50
) em µg/mL e índice
de seletividade (IS) das frações F1, F2 and F3 e subfração F2.4 de Stryphnodendron adstringens
sobre células de mamíferos (Vero, Macrófagos J774G8 e hemácias de carneiro) e larvas de
Artemia salina.
Vero Macrófagos Hemácias
Artemia salina
Extratos
CC
50
IS CC
50
IS CC
50
IS DL
50
IS
F1 150 31 70 14,5 >1000 >206,6 >1000 >206,6
F2 125 26,4 150 31,6 >1000 >211 >1000 >211
F3 160 14,1 160 14,1 >1000 >82,3 >1000 >82,3
F2.4 165 22,9 100 13,9 >1000 >138,9 100 13,9
112
5 Conclusões
• Foram isoladas 103 leveduras de fluido vaginal de pacientes ambulatoriais, identificadas
como Candida albicans em 80,6% e 93,2% pelo método micológico padrão e seminested
PCR, respectivamente.
• Todos os isolados clínicos foram susceptíveis aos agentes poliênicos (anfotericina B e
nistatina), e 92,24 % foram sensíveis ao fluconazol.
• A maioria das amostras produz proteases ácida (99%), fosfolipases (83%) e hemolisinas
(91,3%), e são células hidrofílicas. As leveduras possuem grande variabilidade na
capacidade aderente em células Vero.
• Correlações significativas entre os fatores de virulência e susceptibilidade a agentes
antifúngicos foram verificadas: (1) Correlação positiva entre a produção de enzimas
extracelulares; (2) Correlação positiva entre produção de hemolisina e susceptibilidade a
nistatina e fluconazol; (3) Correlação negativa entre CSH e aderência em células Vero, e
produção de proteases ácida e fosfolipases.
• O extratos bruto, fração F2 e subfração F2.4 do “barbatimão” inibem o crescimento
leveduriforme em concentrações superiores a 7,8 µg/mL, caracterizando em uma ação
fungistática.
• A subfração F2.4 do “barbatimão” inibe a formação do tubo germinativo de Candida
albicans, a aderência de Candida spp. em células Vero e superfície de vidro. Também
reduz a hidrofobicidade de superfície celular de leveduras. Observou-se um aumento no
número de brotamentos em leveduras tratadas com a subfração F2.4, mesmo inibindo o
crescimento.
113
• Através de micrografia ótica, eletrônica de transmissão e de varredura pôde-se observar
que a subfração F2.4 provoca um efeito aglutinante, alteração na parede celular de
Candida albicans, caracterizada por irregularidades na superfície da parede e menor
eletrodensidade.
• A subfração F2.4 pode estimular a resposta macrofágica de leveduras previamente
tratadas em concentração de 7,8 µg/mL por 2 h.
• A subfração F2.4 não inibiu a atividade de enzimas extracelulares, como protease ácida,
fosfolipases e hemolisinas. E as combinações com agentes antifúngicos (anfotericina,
nistatina e fluconazol) não foram sinérgicas.
• Os extratos do “barbatimão” apresentaram baixa citotoxicidade sobre células de linhagem
contínua, Vero e Macrófagos, com CC
50
maior que 100 µg/mL. Sobre hemácias de
carneiro e larvas de Artemia salina, a CC
50
e DL
50
foram maiores que 1000 µg/mL,
exceto para a F2.4 com DL
50
de 100 µg/mL. Desta maneira, os extratos do “barbatimão”
possuem um bom índice de seletividade.
• A subfração F2.4 pode ser constituída por unidades de flavan-3-óis, composto de 6
unidades de proantocianidinas com ácido gálico ligado a sua estrutura. As unidades
formadoras do polímero possuem a configuração relativa dos tipos 2,3-cis e 2,3-trans,
com presença ou ausência de hidroxila no C-5 e sempre com hidroxilação no anel B do
tipo pirogalol, caracterizando unidades de prodelfinidina e prorobinetidinina. Grupos
metoxilas em C-4’ de flavan-3-ol ou em ácido gálico pode existir. O polímero que pode
compor a subfração F2.4 do “barbatimão” pode ter peso molecular de 2114 Da.
114
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