( PDF ) Aspectos químicos envolvidos nas interações de citrus com fitopatógenos

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

“ASPECTOS QUÍMICOS ENVOLVIDOS NAS INTERAÇÕES

DE Citrus COM FITOPATÓGENOS”

Rodrigo Facchini Magnani*

Tese apresentada como parte dos

requisitos para obtenção do título de

DOUTOR EM CIÊNCIAS, área de

concentração: QUÍMICA ORGÂNICA.

Orientador: Prof. Dr. Edson Rodrigues Filho

* bolsista CNPq

São Carlos - SP

2007

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Livros Grátis

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Milhares de livros grátis para download.

Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da

Biblioteca Comunitária/UFSCar

M196aq

Magnani, Rodrigo Facchini.

Aspectos químicos envolvidos nas interações de Citrus

com fitopatógenos / Rodrigo Facchini Magnani. -- São

Carlos : UFSCar, 2008.

145 f.

Tese (Doutorado) -- Universidade Federal de São Carlos,

2007.

1. Microrganismos fitopatogênicos. 2. Fungos

fitopatogênicos. 3. Interação planta-microrganismos. 4.

Espectrometria de massas. 5. Citrus. 6. Cromatografia

líquida. I. Título.

CDD: 547 (20

)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

Centro de Ciências Exatas e de Tecnolorzia

Departamento de Quimica

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Curso de Doutorado

Assinaturas dos membros da banca examinadora que avaliaram e

aprovaram a defesa de tese de doutorado do candidato Rodrigo Facchini

Magnani realizado em 10 de agosto de 2007:

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pro1\Dr.~~d~on'~d~gUeS Filho

Prof. Dr. Luit-Álberto Beraldo de Moraes

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Profa. Dra. R-;;-:a\..vincenzi de Oliveira

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Prof. Df. Paulo'Sérgio Pereira

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Aos meus pais que sempre me apoiaram e me

incentivaram em todos os momentos.

DEDICO

“Organismos não se adaptam simplesmente

a condições autônomas, previamente existentes;

eles criam, destroem, modificam e transformam internamente

aspectos do mundo exterior por suas próprias atividades vitais.

Nem organismo, nem ambiente é um sistema fechado;

cada um é aberto para o outro.”

Richard C. Lewontin et al., 1984

Morre lentamente...

"Morre lentamente, quem não troca de idéias, não troca de discurso, evita as

próprias contradições.

Morre lentamente, quem vira escravo do hábito, repetindo todos os dias o mesmo

trajeto e as mesmas compras no supermercado. Quem não troca de marca, não

arrisca vestir uma cor nova, não dá papo para quem não conhece.

Morre lentamente, quem faz da TV o seu gurú e seu parceiro diário. (Como pode 14

polegadas ocupar tanto espaço em uma vida?).

Morre lentamente, quem evita uma paixão, quem prefere o "preto no branco" e os

"pingos nos is" a um turbilhão de emoções indomáveis, justamente as que resgatam

brilho nos olhos, sorrisos e soluços, coração aos tropeços, sentimentos.

Morre lentamente, quem não vira a mesa quando está infeliz no trabalho, no

casamento, na família, nas amizades, quem não arrisca o certo pelo incerto atrás de

um sonho, quem não se permite, uma vez na vida, fugir dos conselhos sensatos.

Morre lentamente, quem não viaja, quem não lê, quem não ouve música, quem não

vê o sol nascer ou se pôr, quem não acha graça de si mesmo.

Morre lentamente, quem destrói seu amor próprio, quem não se deixa ajudar. Morre

lentamente, quem passa os dias queixando-se da má sorte ou da chuva incessante,

desistindo de um projeto antes de iniciá-lo, não perguntando sobre um assunto que

desconhece e não respondendo quando lhe indagam o que sabe.

Evitemos a morte em suaves prestações, lembrando sempre que estar vivo exige um

esforço bem maior do que simplesmente respirar!"

Pablo Neruda

AGRADECIMENTOS

A Deus;

Ao Prof. Dr. Edson Rodrigues Filho - UFSCar, São Carlos - pela amizade,

orientação, ensinamentos e constantes incentivos;

Ao Prof. Dr. Sérgio Florentino Pascholati – ESALQ/USP - pela colaboração e

disponibilização do seu laboratório para o aprendizado dos ensaios biológicos;

Ao pesquisador Dr. Nelson Arno Wulff – FUNDECITRUS, Araraquara – pelas

amostras de plantas, análises e discussões sobre microrganismos fitopatogênicos de

citros;

Ao doutorando MSc. Leonardo Toffano do laboratório de Fitopatologia da

ESALQ/USP pela realização dos ensaios biológicos com o microrganismo

Guignardia citricarpa.

Aos professores do Laboratório de Produtos Naturais - UFSCar: Prof. Dr. João

Batista Fernandes, Prof

. Dra. Maria Fátima das Graças Fernandes da Silva e ao

Prof. Dr. Paulo César Vieira, pela amizade e ensinamentos na graduação e pós-

graduação;

Aos demais professores do Departamento de Química da UFSCar;

Aos amigos do Laboratório de Produtos Naturais – UFSCar e em especial aos

alunos do Laboratório de Espectrometria de Massas – UFSCar;

Aos “companheiros” Gezimar Donizetti de Souza e Joel Alvim Junior pela grande

amizade e cumplicidade em várias decisões profissionais;

As pesquisadoras Dr. Adélia Cristina Pessoa Araújo e Dr. Danusa Leal Telles e

aos grandes amigos que fiz durante os sete meses em que trabalhei no Laboratório

de Resíduo de Agortóxicos e Bebidas Alcoólicas do Instituto de Tecnologia de

Pernambuco – LabTox – ITEP;

Gostaria de agradecer especialmente ao pesquisador José Raimundo Filho, a

Secretária Vera Lúcia Andrade e Silva e ao Técnico Manoel Vieira Silva do

LabTox por ter tido a oportunidade de conhecêlos e terem despertado em mim o

respeito pela cultura nordestina e pela inteligência natural que o nordestino possui;

Aos amigos do laboratório de bioequivalência e equivalência farmacêutica da

Unidade de Farmacologia e Gastroenterologia da Universidade São Francisco –

UNIFAG – USF. Em especial aos pesquisadores Dr. Fábio Alessandro Proença

Barros (Cebolinha) e Dr. Eduardo César Meurer pela amizade e o grande

aprendizado sobre espectrometria de massas;

Aos amigos dos Laboratórios de Síntese Orgânica, de RMN, de Inorgânica e aos

demais laboratórios do Departamento de Química da UFSCar pelas contribuições na

execução deste trabalho e amizade;

A todos os amigos da turma de 96, e do Departamento de Química;

Ao corpo técnico do Departamento de Química - UFSCar: Ademir, Sr. Antônio (in

memorian), Doraí, Luciana, Paulo e Valdir;

Ao Programa de Pós-Graduação em Química;

Aos meus pais Vanderley e Rosa Maria, à minha irmã Patrícia e aos meus avós

Zaira, José (in memorian), Irma e Alcides pelos constantes incentivos, apoio e

compreensão que me permitem buscar as realizações dos meus sonhos;

A minha família por todo o apoio;

A Daniela, minha companheira, pelo carinho e compreensão que foram

fundamentais em todos esses anos de convivência;

Por fim, ao bom e velho Blues.

vii

SUMÁRIO

1 Introdução 1

1.1 Metabólitos Secundários de Espécies do Gênero Citrus

(RUTACEAE) 1

1.2 Interações Entre Plantas e Microrganismos 4

1.3 Processos de Reconhecimento na Resistência de Plantas à

Doenças 7

1.4 Possibilidades de indução de defesas: Resistência Sistêmica

Adquirida (SAR)

1.5 Fitoalexinas 14

1.6 Algumas Patogenias de Citrus 16

1.6.1 Pinta Preta 16

1.6.2 Cancro Cítrico 17

1.6.3 Mancha Marrom de Alternária 18

1.6.4 Morte Súbita dos Citros 19

1.6.5 Clorose Variegada dos Citros ou Amarelinho 20

1.6.6 Greening 21

2 Objetivos 25

2.1 Objetivo Geral 25

2.2 Objetivos Específicos 25

3 Procedimento Experimental 27

3.1 Materiais 27

3.2 Equipamentos Utilizados 28

3.3 Metodologias de Análise dos Metabólitos Secundários Presentes

Em Citrus Através de HPLC/UV-MS 31

3.3.1 Coletas dos Materiais Botânicos 31

3.3.2 Metodologia de Análise dos Compostos Polares Presentes Nas

Folhas do Enxerto 31

3.3.2.1 Extração e Pré-purificação dos Compostos Polares Presentes

nas Folhas do Enxerto 31

3.3.2.2 Condições Cromatográficas Utilizadas Durante a Análise dos

Compostos Polares Presentes no Extrato de Folhas de Citrus 32

3.3.3 Metodologia de Análise dos Compostos de Polaridade

Intermediária Presentes Nas Folhas do Enxerto 33

3.3.3.1 Extração e Pré-purificação dos Compostos de Polaridade

Intermediária Presentes nas Folhas do Enxerto 33

3.3.3.2 Condições Cromatográficas Utilizadas Durante A Análise dos

Compostos de Polaridade Intermediária Presentes no Extrato de

Folhas de Citrus 34

3.3.4 Aplicação da Metodologia de Análise dos Compostos Polares

Presentes em Citrus em Plantas Com Sintomas da Doença

Morte Súbita dos Citros (MSC) 36

3.3.4.1 Coletas dos Materiais Botânicos de Plantas Sadias e Com

Sintomas de MSC 36

3.3.4.2 Extração, Pré-purificação e Condições Cromatográficas

Utilizadas na Análise dos Compostos Polares Presentes nas

Cascas do Tronco do Enxerto 37

viii

3.3.4.3 Novas Condições Desenvolvidas Para a Análise dos Compostos

Polares Presentes nas Cascas do Tronco do Enxerto 37

3.4 Isolamento e Identificação dos Metabólitos Secundários de

Alternaria alternata

3.4.1 Obtenção do Microrganismo Isolado Alternaria alternata 36

3.4.2 Cultivo de A. alternata em milho 39

3.4.3 Extração dos Metabólitos Secundários de A. alternata 40

3.4.4 Isolamento dos Metabólitos Secundários de A. alternata 41

3.4.5 Desenvolvimento da Análise Via HPLC-UV Para a Construção

da Curva de Produção do Alternariol e Alternariol Monometil Éter 44

3.4.5.1 Cultivo de A. alternata em Milho Visando a Produção dos

Metabólitos Secundários 44

3.4.5.2 Condições Cromatográficas (HPLC-UV) 44

3.4.5.3 Construção das Curvas de Calibração de AME e AOH 45

3.4.5.4 Extração e Pré-Purificação dos Metabólitos Secundários de A.

alternata Visando a Construção da Curva de Produção de AME

e AOH 45

3.4.6 Quantificação de Alternariol e Alternariol Monometil Éter No

Flavedo e No Albedo de Tangerinas (Citrus reticulata) Com

Sintomas de Mancha Marrom de Alternaria 46

3.4.6.1 Material Vegetal 46

3.4.6.2 Solução de Padrões e Curvas Analíticas 47

3.4.6.3 Extração e Preparo de Amostra 47

3.4.6.4 Otimização dos Parâmetros Utilizados No LC-MS/MS 48

3.4.6.5 Limite de Detecção e Limite de Quantificação 49

3.4.6.6 Especificidade, Linearidade e Precisão 50

3.4.6.7 Recuperação 50

3.5

Aplicação das Metodologias de TLC, PCR, HPLC-DAD e HPLC-

MS/MS Na Avaliação da Diferença de Metabolismo Encontrada

Em Plantas Com Sintomas de Greening

3.5.1 Coletas dos Materiais Botânicos 52

3.5.2 Extração dos Compostos Polares Presentes nas Folhas do

Enxerto Com Sintomas de Greening 52

3.5.3 Condições Utilizadas Durante as Análises dos Extratos de

Plantas com Sintomas de Greening por TLC 53

3.5.4 Condições Utilizadas Durante as Análises dos Extratos de

Plantas com Sintomas de Greening por HPLC-DAD 53

3.5.5 Condições Utilizadas Durante as Análises dos Extratos de

Plantas com Sintomas de Greening por HPLC-MS/MS 54

3.6 Realização dos Ensaios de Inibição de Guignardia citricarpa, in

vitro, Pelo Método de Germinação de Esporos Em Placa de

Poliestireno 57

3.6.1 Compostos Utilizados No Ensaio de Inibição de Guignardia

citricarpa, in vitro 59

4 Resultados e Discussões 63

4.1 Resultados Obtidos Para a Metodologia de Análise Por

HPLC/UV/MS dos Metabólitos Secundários Presentes em Citrus 63

4.1.1 Extração e Pré-purificação dos Compostos Polares Presentes

nas Folhas do Enxerto 63

4.1.2 Resultados Obtidos Durante a Extração e Pré-purificação dos

Compostos de Polaridade Intermediária Presentes nas Folhas

de Citros 66

4.1.3

Resultados Obtidos Durante as Análises dos Compostos Polares

Presentes nas Cascas do Tronco do Enxerto de C. sinensis

sobre C. limonea

4.1.3.1 Resultados das Novas Condições Desenvolvidas Para a Análise

dos Compostos Polares Presentes nas Cascas do Tronco do

Enxerto 74

4.2 Resultados Obtidos do Isolamento e Identificação dos

Metabólitos Secundários de A. alternata 77

4.2.1 Determinação Estrutural da Micotoxina Alternariol Monometil

Éter 78

4.2.2 Determinação Estrutural da Micotoxina Alternariol 84

4.2.3 Determinação Estrutural da Molécula Ácido Tenuazônio 91

4.3 Construção da Curva de Produção das Micotoxinas AOH e AME

Pelo Microrganismo Alternaria alternata Cultivado em Milho 97

4.3.1 Resultados Obtidos Para a Metodologia de Extração e Análise

das Micotoxinas AOH e AME de A. alternata por HPLC-UV 97

4.3.2 Resultados Obtidos Na Construção das Curvas de Calibração

dos Metabólitos Secundários de A. alternata por HPLC-UV 98

4.3.3 Curvas de Produção dos Metabólitos Secundários de A.

alternata por HPLC-UV 99

4.4

Quantificação de Alternariol e Alternariol Monometil Éter No

Flavedo e No Albedo de Tangerinas (Citrus reticulata) Com

Sintomas de Mancha Marrom de Alternaria

102

4.4.1

Desenvolvimento do Método e Especificidade

102

4.4.2

Sensibilidade, Linearidade, Precisão e Exatidão do Método

106

4.5

Aplicação das Metodologias de TLC, PCR, HPLC-DAD e HPLC-

MS/MS Na Avaliação da Diferença de Metabolismo Encontrada

Em Plantas Com Sintomas de Greening

113

4.6 Resultados Obtidos Durante A Realização dos Ensaios de

Inibição de Guignardia citricarpa, in vitro, Pelo Método de

Germinação de Esporos Em Placa de Poliestireno

126

5 Considerações Finais 131

6 Referências Bibliográficas 135

PRINCIPAIS ABREVIAÇÕES

AS - Ácido Salicílico

AME - Alternariol Monometil Éter

AOH - Alternariol

BA - Ácido Benzóico

BDA - Batata Dextrose Ágar

CVC - Clorose Variegada dos Citros

DAD - Diodo Array Detector

DP - Desvio Padrão

DPR - Desvio Padrão Relativo

ES -

Electrospray

HBL - Huanglongbing

HPLC - High Performance Liquid Chromatografy

HSQC -

Heteronuclear Single Quantum Conerence

L/h - Litros por Hora

MMA - Mancha Marrom de Alternaria

MSC - Morte Súbita dos Citros

MS/MS - Espectrometria de Massas seqüencial

m/z

- Relação massa/carga

n.d. - Não Detectado

NOE -

Nuclear overhouser effect

ODS - Octadecilsilano

PCR - Reação em Cadeia da Polimerase

PR - Proteínas Relacionadas à Patogênese

R - Gene de Resistência

RF - Fator de Retenção

RMN

C - Ressonância Magnética Nuclear de Carbono – 13

RMN

H - Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio – 1

rpm - Rotações por Minuto

SAR - Resistência Sistêmica Adquirida

SPE - Extração em Fase Sólida

S/R - Relação Sinal Ruído

SRM - Selected Reaction Monitoring

TLC - Cromatografia em Camada Delgada

TMV - Vírus do Mosaico do Fumo

u.m.a. - Unidades de Massa Atômica

UV - Ultra Violeta

PRINCIPAIS SÍMBOLOS

h - Altura

Å - Ângstron

cm - Centímetro

- Coeficiente de Determinação

j -

Constante de Acoplamento

- Daltons

- Deslocamento Químico em Partes Por Milhão

d - Diâmetro

- Dubleto

eV - Eletrovoltz

ºC - Grau Celsius

[M-H]

- Ion Pseudo-Molecular Desprotonado

[M+H]

- Ion Pseudo-Molecular Protonado

Kg - Kilograma

MHz - Megahertz

µm - Micrômetro

mg - Miligramas

mm - Milímetro

- Singleto

- Tripleto

V - Voltz

xii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Eluição gradiente utilizada durante a análise dos extratos

polares das folhas de citros. 30

Tabela 2 Eluição gradiente utilizada durante a análise dos extratos de

polaridade intermediária das folhas de citros. 32

Tabela 3 Eluição gradiente utilizada durante as análises de plantas com

sintomas de MSC. 35

Tabela 4 Rampa cromatográfica utilizada durante as análises de plantas

com sintomas de Greening. 50

Tabela 5 Eluição gradiente utilizada durante as análises de plantas com

sintomas de greening. 52

Tabela 6 Compostos que foram utilizados no ensaio de inibição dos

apressórios de G. citricarpa. 56

Tabela 7 Amostras que foram analisadas pelo experimento de SRM. 70

Tabela 8 Dados de RMN utilizados para a determinação estrutural do

ácido tenuazônio. 88

Tabela 9 Representação das médias das áreas obtidas e estimativa das

concentrações das micotoxinas avaliadas durante os dias de

cultivo. 96

Tabela 10 Resultados referentes a linearidade, limites de quantificação e

detecção propostos para o método (os valores estão

representados como a média ± DPR, n = 3).

105

Tabela 11 Experimento de precisão (repetibilidade e precisão

intermediária) utilizando o flavedo como matriz. 106

Tabela 12 Experimento de precisão (repetibilidade e precisão

intermediária) utilizando o albedo como matriz. 106

Tabela 13 Valores obtidos para o experimento de recuperação utilizando

tanto flavedo quanto o albedo como matrizes. (n = 5). 107

Tabela 14 Aplicação do método validado nas análises de tangerinas com e

sem sintomas de mancha marrom de alternaria (n = 3). 108

Tabela 15 Resultados obtidos através das técnicas, TLC, PCR, HPLC-UV

e HPLC-MS/MS para plantas sadias e com sintomas de

greening. 118

Tabela 16 Resultados obtidos durante o Ensaio 1 a de germinação dos

esporos de G. citricarpa. 124

Tabela 17 Resultados obtidos durante o Ensaio 1 b de germinação dos

esporos de G. citricarpa. 124

Tabela 18 Resultados obtidos durante o ensaio 2 a de germinação dos

esporos de G. citricarpa. 126

Tabela 19 Resultados obtidos durante o ensaio 2 a de germinação dos

esporos de G. citricarpa. 126

xiii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Estruturas moleculares de metabólitos encontrados em

espécies de Citrus. 03

Figura 2 Microrganismos capazes de causar doenças em plantas e

comparação das suas dimensões com uma célula vegetal

típica (adaptado de AGRIOS, 1997). 06

Figura 3 Representação diagramática da interação do fitopatógeno

Nectria haematococca e células de ervilha Pisum sativum.

Referência à capacidade de patógenos promoverem a

detoxificação de fitoalexinas produzidas pelo hospedeiro

(adaptado de VANETTEN et al, 1989). 08

Figura 4 Estruturas moleculares de substâncias com propriedades

ativadoras de SAR. 13

Figura 5 Estruturas moleculares das fitoalexinas a- xantiletina, b-

seselina, c- umbeliferona e d- scoparona. 15

Figura 6 Frutos com sintomas de pinta preta. 16

Figura 7 Folha e frutos com sintomas de cancro. 17

Figura 8 Fruto e folhas de tangerina com sintomas de mancha

marrom de alternaria. 18

Figura 9 orta enxerto e planta com sintomas de mancha morte

súbita dos citros. 19

Figura 10 Folha e frutos com sintomas de amarelinho. 20

Figura 11 Folhas frutos e ramos com sintomas de greening. Psilídeo

Diaphorina citri, vetor da doença nas Américas. 21

Figura 12 Estruturas moleculares do Ácido Gentísico (AG) e da

Orbicularina. 23

Figura 13 Extração e pré-purificação dos compostos polares. 32

Figura 14 Extração e pré-purificação dos compostos de polaridade

intermediária. 34

Figura 15 Região da copa onde foi realizada enxertia de C. sinensis

(laranja pêra) sobre C. limonea (limão cravo) apresentando

sintoma de MSC no cavalo do enxerto. 36

Figura 16 Extração e pré-purificação dos metabólitos secundários de

A. alternata. 46

Figura 17 Extração e pré-purificação das micotoxinas AOH e AME de

A. alternata. 48

Figura 18

Estrutura molecular do Ácido 2-O-

-4C1-glucopiranosídeo

(Orbicularina).

Figura 19 Extração dos compostos presentes em folhas da enxertia

de C. sienensis sobre C. limonea com sintomas de

Greening. 53

Figura 20 Desenvolvimento do ensaio de inibição de G. citricarpa, in

vitro, pelo método de germinação de esporos em placa de

poliestireno. 58

Figura 21 Estruturas moleculares dos compostos utilizados no ensaio

1 de inibição dos apressórios de G. citricarpa. 61

Figura 22 Estruturas moleculares dos compostos utilizados no ensaio

2 de inibição dos apressórios de G. citricarpa. 62

xiv

Figura 23 Espectro obtido do experimento de íons fragmento de [M-

= 609 com energia de colisão de 13 eV. 65

Figura 24 Propostas de fragmentação para a rutina e hesperidina. 65

Figura 25 Espectro obtido do experimento de íons fragmento de [M-

= 403 (40 eV), [M-H]

= 373 (45 eV) e [M-H]

= 373 (25

eV). 69

Figura 26 Propostas de fragmentação para a nobiletina, tangeretina e

aurentina. 70

Figura 27 Cromatogramas obtidos da análise da casca da copa (C.

sinensis) e da casca do cavalo (C. limonea) de uma planta

com sintomas de MSC. 71

Figura 28 Espectro de íons fragmento de [M-H]

= 593 do extrato da

copa (C. sinensis) do enxerto de uma planta com sintomas

aparentes de MSC. 73

Figura 29 Perfil das áreas obtidas através dos experimentos de SRM

(transição de quantificação 593 > 353) das amostras de

laranjeiras sadias, sadias coletadas ao lado de plantas

doentes e plantas doentes. 76

Figura 30 Estrutura química do Alternariol (AOH), Alternariol

monometil éter (AME) e Ácido tenuazônio. 77

Figura 31 Correlações de NOESY para o Alternariol monometil éter. 78

Figura 32 Experimento de RMN

H do Alternariol Monometil Éter. 79

Figura 33 Ampliação do espectro de RMN

H do Alternariol Monometil

Éter na região de 4,0 – 2,5 ppm. 80

Figura 34 Ampliação do espectro de RMN

H do Alternariol Monometil

Éter na região de 7,4 – 6,0 ppm. 81

Figura 35 Experimento de RMN NOESY do Alternariol Monometil

Éter. 82

Figura 36 Espectro de massas ES

de íons fragmento com 40 eV do

Alternariol Monometil Éter. 83

Figura 37 Experimento de RMN

H do Alternariol. 85

Figura 38 Ampliação do espectro de RMN

H do Alternariol na região

de 7,2 – 6,3 ppm. 86

Figura 39 Ampliação do espectro de RMN

H do Alternariol na região

de 3,8 – 0,8 ppm. 87

Figura 40 Experimento de HSQC do Alternariol. 88

Figura 41 Espectro de massas FS do Alternariol. 89

Figura 42 Espectro de massas de íons fragmento com 30 eV do

Alternariol. 90

Figura 43 Estrutura molecular do ácido tenuazônio. 92

Figura 44 Experimento de RMN

H do Ácido Tenuazônio. 93

Figura 45 Experimento de RMN

H do Ácido Tenuazônio. 94

Figura 46 Experimento de RMN

C do Ácido Tenuazônio. 95

Figura 47 Experimento de espectrometria de massas full scan

electrospray no modo positivo e no modo negativo do Ácido

Tenuazônio. 100

Figura 48 Curva de produção do metabólito AME. 100

Figura 49 Curva de produção do metabólito AOH. 100

Figura 50 Espectro de íons fragmento (segunda geração) obtido por

CID-MS/MS; A) alternariol (25 eV); B) alternariol monometil

éter (35 eV). Os íons marcados representam as transições

escolhidas para o esperimento de SRM (• → ο).

104

Figura 51 Propostas de fragmentação dos alternariois; A) Perda do

grupo metila (15 Da) na forma de radical; B) Perda de uma

molécula de CO (28 Da); C) Formação dos íons fragmento

m/z 215 e m/z 213 para o alternariol. Esta fragmentação

aparentemente não é observada para o alternariol monometil

éter. 105

Figura 52 Cromatogramas dos experimentos de SRM obtidos durante a

quantificação no flavedo por HPLC-MS/MS: A) e B) Ausentes

de micotoxinas (branco); C) e D) Concentrações próximas ao

limite de quantificação; E) e F) Maior concentração da curva

analítica. Os números 1 e 2 referem-se ao alternariol e

alternariol monometil éter respectivamente. 107

Figura 53 Experimento com extratos do albedo dos frutos de

C.sinensis (laranja pêra) em placa de TLC revelada em

lâmpada de UV a 360 nm. 114

Figura 54 Experimento de PCR. 115

Figura 55 Espectro de íons fragmento da molécula ácido gentísico. 118

Figura 56 Espectro de íons fragmento da molécula ácido salicílico. 118

Figura 57 Propostas de fragmentação e transições monitoradas no

experimento de SRM para as moléculas ácido gentísico,

orbicularina, ácido salicílico e ácido salicílico glicosilado

(ácido β-O-D glucosilsalicilico).

119

Figura 58 Cromatogramas obtidos durante os experimentos de SRM

de plantas com sintomas de greening e de plantas sadias. 120

Figura 59 Gráficos de barras apresentando o perfil de áreas

encontradas através do experimento de LC-MS/MS quando

a molécula orbicularina estava sendo monitorada. 124

Figura 60 Gráfico dos ensaios de inibição de G. citricarpa relativo ao

Ensaio 1a. 128

Figura 61 Gráfico dos ensaios de inibição de G. citricarpa relativo ao

Ensaio 1b. 128

Figura 62 Gráfico dos ensaios de inibição de G. citricarpa relativo ao

Ensaio 2a. 130

Figura 63 Gráfico dos ensaios de inibição de G. citricarpa relativo ao

Ensaio 2b. 130

xvi

LISTA DE FLUXOGRAMAS

Fluxograma 1 Extratos obtidos de A. alternata cultivada em milho. 40

Fluxograma 2 Isolamento dos metabólitos secundários de A.

alternata. 42

Fluxograma 2.1 Continuação do Fluxograma 2 para o isolamento dos

metabólitos secundários de A. alternata. 43

LISTA DE CROMATOGRAMAS

Cromatograma 1 Cromatograma obtido durante o desenvolvimento do

método para os compostos polares utilizando a

coluna Shimadzu CLC-phenil (333 nm). 64

Cromatograma 2 Cromatograma obtido anteriormente durante o

desenvolvimento do método para os compostos de

polaridade intermediária utilizando a coluna

Shimadzu CLC-phenil (333 nm). 67

Cromatograma 3 Experimento de Full Scan dos compostos de

polaridade intermediária presentes nas amostras de

folhas de Citrus. 68

Cromatograma 4 Cromatograma de íons totais (TIC) obtido durante a

análise de HPLC-UV-MS da copa (C. sinensis) de

uma planta com aparentes de MSC. 73

Cromatograma 5 Cromatograma de SRM obtido do extrato da copa de

uma planta com sintomas de MSC. 75

Cromatograma 6 Cromatograma obtido da análise do extrato realizado

com 30 dias de cultivo. 98

Cromatograma 7 Cromatograma obtido de uma planta sadia. 116

Cromatograma 8 Cromatograma obtido de uma planta com sintoma de

greening. 116

xvii

Resumo

“ASPECTOS QUÍMICOS ENVOLVIDOS NAS INTERAÇÕES DE Citrus COM

FITOPATÓGENOS” – Este trabalho descreve o desenvolvimento de metodologias

de análise para metabólitos polares e de polaridade intermediária presentes em

laranjeiras provenientes da enxertia de Citrus sinensis sobre Citrus limonea usando

HPLC-DAD-MS/MS. Através deste método, foram detectados flavonóides

glicosilados e polimetoxilados. O método também foi aplicado na análise de plantas

com sintomas da doença Morte Súbita dos Citros (MSC). Neste mesmo contexto

foram analisadas plantas sadias e com sintomas da doença Greening com o objetivo

de monitorar moléculas derivadas do ácido benzóico como o ácido gentísico,

orbicularina, ácido salicílico e ácido salicílico glicosilado (ácido β-O-D

glucosilsalicilico). Um outro estudo realizado neste trabalho tratou do isolamento e

identificação das micotoxinas alternariol (AOH) e alternariol monometil éter (AME),

além do ácido tenuazônio, produzidas in vitro pelo microrganismo fitopatogênico de

citros Alternaria alternata. A produção destas micotoxinas foi monitorada através de

HPLC-DAD ao longo de trinta dias de cultivo do microrganismo com a finalidade de

construir uma curva de produção destas moléculas. Validou-se também um método

usando HPLC-MS/MS para quantificar as micotoxinas AOH e AME nas cascas de

tangerina (albedo e flavedo) com sintomas de mancha marrom de alternaria (MMA),

onde encontrou-se 17.4 ± 1.0 µg/kg de AOH e 3.5 ± 0.2 µg/kg de AME no flavedo de

tangerina. Por fim, foram realizados ensaios de inibição do fungo fitopatogênico de

citros Guignardia citricarpa, causador da doença pinta preta, através do método de

germinação de esporos em placa de poliestireno. As substâncias que apresentaram

praticamente 100% de inibição foram dois derivados do ácido benzóico, o ácido

3,4,5-trimetoxibenzóico e o ácido 3,4-dimetoxibenzóico, e os flavonóides glicosilados

naringina e rutina. Essas quatro substâncias, na concentração de 500 µg/mL, foram

capazes de inibir por completo a germinação dos esporos de G. citricarpa.

xviii

Abstract

“CHEMICAL ASPECTS RELATED TO THE INTERACTION BETWEEN Citrus

PLANTS AND PHYTOPATOGENIC FUNGI” – This present thesis describes the

development of analytical methodologies involving the HPLC-PDA-MS/MS coupling

to verify the production of both polar and non-polar metabolites in orange trees

produced by grafting Citrus sinensis onto Citrus limonea. By the use of such kind of

method, it was possible to verify the production of both polymethoxy and glycosyl

flavonoids. This method was then applied to plants with symptoms of two different

diseases, Citrus Sudden Death (MSC) and Greening. Regarding this last disease, the

methodologies were focused on detection of some analogous of benzoic acid like

gentisic acid, orbicularin, salicylic acid and glycosyl salicylic acid. Another part of this

work was focused on isolation and characterization of Alternariol (AOL) and

Alternariol Monomethyl Ether (AME), mycotoxins produced in vitro by a

phytopathogenic strain of Alternaria alternata and the molecule tenuazoic acid.

These mycotoxins were also monitored using HPLC-DAD for 30 days in an attempt to

find out a possible profile of their production. In addition, an analytical method

involving HPLC-MS/MS was developed, validated and applied to quantify the

amounts of AOL and AME in different parts of tangerines (i.e., on flavedo and on

albedo tissues) with and without symptoms of Alternaria Brown Spot disease. The

levels of such substances were about 17.4 ± 1.0 µg/kg of AOH and 3.5 ± 0.2 µg/kg of

AME on flavedo. Some inhibition tests against Guinardia citricarpa, related to Black

Spot disease, were also done with some isolated compounds. Five of these

compounds showed to have 100% of inhibition in this test at concentration of 500

µg/mL: benzoic acid, 3,4,5-trimethoxibenzoic acid, 3,4-dimethoxibenzoic acid, and

the glycosyl flavonoids naringin and rutin.

1 - INTRODUÇÃO

1.1 – Metabólitos Secundários de Espécies do Gênero Citrus

(RUTACEAE)

A ordem Rutales é constituída pelas famílias Rutaceae, Cneoraceae,

Simaroubaceae (elevado à família Surianaceae e Kirkiaceae), Meliaceae e

Burseraceae (ENGLER, 1931). A família Rutaceae constitui o maior grupo

dentro da ordem Rutales e caracteriza-se por uma grande diversidade de

metabólitos secundários não comuns nas demais famílias da ordem,

representados por alcalóides derivados do ácido antranílico, cumarinas e

limonóides (WATERMAN, 1983). Alguns gêneros desta família são cultivados

no Brasil, entre eles Clausena, Citrus e Murraya.

Os flavonóides, contidos na casca de limão, vêm sendo estudados

desde 1936, quando Szent-Gyorgy extraiu a “citrina”, uma mistura de

flavonóides de limão, que é considerada como vitamina. Desde então, vários

estudos estão sendo conduzidos a respeito dos flavonóides. Os flavonóides da

casca de limão são caracterizados pela presença de quatro grupos de

flavonóides: flavonas-O-glicosiladas, flavonas-C-glicosiladas, flavonols e

flavanonas. O primeiro grupo é muito comum em frutos, onde são encontrados

na casca de limão luteolina-7-rutinosideo e diosmetina-7-rutinosideo

(diosmina). Flavonóides-C-glicosilados são largamente distribuídos em plantas

superiores. Foram encontradas quatro flavonas-di-C-glicosilados em casca de

limão: 6,8-di-C-glucosil-luteonina; 6,8-di-C-glucosil-apigenina; 6,8-di-C-glucosil-

chrisoeriol; 6,8-di-C-glucosil-diosmetina. O grupo flavonol contido na casca de

limão é caracterizado pela presença de rutina (quercetina-3-O-rutinosideo)

(Figura 1a) e três compostos polimetoxilados: 3,5,7,4’-tetrahidroxi-6,8,3’-

trimetoxi-flavona (limocitrol) (Figura 1b); 3,5,7,4’-tetrahidroxi-,8,3’-dimetoxi-

flavona (limocitrina); 3,5,7,3’-tetrahidroxi-6,8,4’-trimetoxi-flavona (isolimocitrol).

Flavonas polimetoxiladas estão presentes especialmente no gênero Citrus e

estão localizadas no flavedo. O próximo grupo é o das flavanonas. Esses

compostos têm muita importância para o gênero Citrus, por causa do seu uso

em quimiotaxonômia e, também, devido à sua relação com o paladar. Os

compostos presentes na casca de limão constituem três glicosídeos:

hesperitina-7-rutinosideo (hesperidina), naringenina-7-rutinosideo e eriodictiol-

7-rutinosideo (eriocitrina). Vários outros grupos de polifenóis estão também

presentes na casca de limão. Alguns deles estão relatados como ácidos

fenólicos e fenilpropanóides (cumarinas e glicosídeos fenilpropanóicos) (BALDI

et. al., 1995).

Limonóides também representam um grupo de substâncias

quimicamente relatadas, como nortriterpenóides encontrados em Rutaceae e

Meliaceae. Trinta e seis limonóides não glicosilados e 17 limonóides

glicosilados foram isolados de Citrus e de seus híbridos, como obacunona

glicosídeo (Figura 1c) e nomilina glicosídeo (Figura 1d), isolados da casca de

Citrus tangerina (Tanaka) Tseng da Índia. Limonóides não glicosilados e seus

glicosídeos têm sido relatados como anticarcinogênicos em animais de

laboratório e ativos contra insetos (TIAN & DING, 2000).

Outras duas classes de substâncias relatadas na espécie Citrus são os

alcalóides acridônicos e as cumarinas. WU et. al. (1983) reportaram os

alcalóides grandisinina (Figura 1e), grandisina-I (Figura 1f) e gerandisina-II

(Figura 1g) e as cumarinas 5-metoxiseselina (Figura 1h), xantiletina (Figura

1i), xantoxiletina e clausarina (Figura 1j) presentes nos frutos de Citrus grandis

Osb. F. hakunikuyu Hayata, planta utilizada na medicina popular japonesa

como expectorante, no tratamento de edemas e dores abdominais.

Como descrito acima, o gênero Citrus tem em suas várias espécies uma

diversidade muito grande de substâncias em sua composição química.

Várias também são as doenças que esse gênero possui sendo

provocadas por microrganismos. Muitas das classes dos metabólitos

secundários produzidos por Citrus, além de terem outras funções, também

atuam na defesa destas plantas contra os invasores que tentam infectar seus

hospedeiros. Outras moléculas são produzidas especificamente para este

propósito. E dessa forma se inicia uma verdadeira batalha travada pela

sobrevivência entre o patógeno (microrganismo) e o hospedeiro (Citrus).

OOO

OMe

OOO

h- 5-metoxiseselina

i- Xantiletina

j- Clausarina

NHO

OMe Me

OHO

NMeO

OMe Me

OHO

NMeO

OH Me

OMe

OHO

e- Grandisinina

f- Grandisina-I

g- Grandisina-II

OCH

b- Limocitrol

COOH

c- Obacunona glicosídeo

d- Nomilina glicosídeo

a- Rutina

COOH

OAc

Figura 1. Estruturas moleculares de metabólitos encontrados em espécies de

Citrus.

1.2 - Interações Entre Plantas e Microrganismos

Os microrganismos exibem diferentes tipos de associações ou

interações com as plantas, onde algumas podem ser observadas até mesmo a

níveis macroscópicos. Algumas das associações são neutras, outras são

benéficas, outras, ainda, são prejudiciais. Nas associações que se baseiam no

neutralismo, os dois organismos se desenvolvem sem qualquer efeito

recíproco, pois são dotados de exigências de crescimento completamente

diferentes (PELCZAR, et al., 1981; AGRIOS, 1997).

O mutualismo é um exemplo de uma relação simbiótica, na qual cada

organismo recebe benefícios da associação. O modo pelo qual se manifesta

esse benefício é variado. Um tipo de mutualismo envolve a troca de nutrientes

entre duas espécies, como por exemplo, a interação de certas algas com

fungos, formando os liquens. O fungo obtém substâncias de valor nutricional,

tais como a glicose e álcoóis poliídricos das algas, enquanto estas se

beneficiam pelas propriedades das paredes celulares do fungo associado,

capazes de reter água. O fenômeno do comensalismo se refere a uma relação

entre organismos, na qual um dos componentes recebe benefícios,

permanecendo o outro sem ser afetado (PELCZAR, et al., 1981).

Por outro lado, as associações antagonistas ocorrem quando um

organismo atinge de modo adverso o ambiente do outro. Tais organismos

antagonistas podem apresentar grande importância prática, já que eles

produzem com freqüência antibióticos ou outras substâncias inibidoras que

afetam os processos normais de crescimento ou de sobrevivência de outros

organismos. A segunda relação negativa entre duas populações se manifesta

quando ambas são adversamente afetadas com respeito à sobrevivência ao

crescimento, onde o espaço e os nutrientes são limitados, e é denominada de

competição. O parasitismo é definido como uma relação entre organismos na

qual um vive sobre ou dentro do outro (de uma espécie diferente) e às custas

desse organismo hospedeiro, sendo este último prejudicado no processo. A

quarta relação negativa é a predação caracterizada quando ocorre a morte e a

ingestão de um organismo de uma espécie por outros (PELCZAR, et al., 1981;

AGRIOS, 1988).

Milhares de microrganismos se encontram em associações com as

plantas (Figura 2). As três maiores categorias de organismos causadores de

doenças nas plantas são os fungos, os procariontes (bactéria, micoplasma) e

os vírus. Os nematóides também causam várias doenças em plantas. Existem

também doenças de plantas causadas por parasitas de plantas superiores e

protozoários (JACKSON & TAYLOR, 1996; AGRIOS, 1988).

Figura 2. Microrganismos capazes de causar doenças em plantas e

comparação das suas dimensões com uma célula vegetal típica (adaptado de

AGRIOS, 1997).

1.3 - Processos de Reconhecimento na Resistência de Plantas

à Doenças

O reconhecimento sobre as bases genética e bioquímica da

resistência de plantas aumentou consideravelmente desde a virada do século

XX, quando melhoristas de plantas primeiramente reconheceram que a

resistência era, freqüentemente, controlada por genes mendelianos. A

demonstração de que as plantas têm centros de origem geográfica e que co-

evoluíram com seus patógenos foi uma descoberta fundamental para os

melhoristas, levando ao uso de híbridos interespecíficos entre culturas e seus

parentes selvagens, como fonte de germoplasma resistente. Até 1992, no

entanto, nenhum gene de resistência (R) havia sido clonado e caracterizado no

nível molecular. Desde então, diversos genes R de diferentes espécies têm

sido clonados (CAI et al., 1997; DE WIT, 1995; JOHAL & BRIGGS, 1992;

JONES et al., 1996; LEONARDS-SCHIPPERS et al., 1992; MILLIGAN et al.,

1998).

A gama de fitopatógenos que infectam plantas é enorme e cada um

tem o seu próprio modo de patogenicidade. Apesar do grande potencial de

patógenos, a resistência (falta de suscetibilidade) é a regra e a susceptibilidade

é a exceção. Por que um patógeno é capaz de causar doença em uma planta,

e não em outra (fenômeno conhecido como resistência de planta não-

hospedeira), permanece como uma importante questão a ser respondida em

patologia de plantas.

Durante as interações planta-patógeno, os contactos iniciais servem

como um ponto de partida identificável, a partir do qual uma cascata de

eventos começa a acontecer do lado do patógeno e do lado da planta. Sinais

são trocados, novos genes expressos, novas proteínas sintetizadas, e

modificações estruturais e bioquímicas são elaboradas. Estes fenômenos

podem ser bem exemplificados através do mecanismo de defesa da planta de

ervilha Pisum sativum através da produção da fitoalexina pisatina, como

resposta a infecção do fungo Nectria haematococca e, ainda, através do

contra-ataque desse microrganismo frente à degradação da pisatina pela

enzima pisatina demetilase, tornando a fitoalexina não tóxica a ele (Figura 3)

(PASCHOLATI et al., 1998).

Figura 3. Representação diagramática da interação do fitopatógeno Nectria

haematococca e células de ervilha Pisum sativum. Referência à capacidade de

patógenos promoverem a detoxificação de fitoalexinas produzidas pelo

hospedeiro (adaptado de VANETTEN et al, 1989).

Esse potencial químico-enzimático que os microrganismos possuem

pode ser utilizado para se estudar as possíveis biotransformações que um

determinado microrganismo pode realizar frente a um composto utilizado como

substrato. Vários trabalhos desse gênero vêm sendo realizados, como

biotransformações de diterpenos labdanos na tentativa de se obter compostos

análogos da forskolina, que possui dentre outras atividades a de inibir a

metástase de células cancerosas (GARCIA-GRANADOS et al., 1995; GARCIA-

GRANADOS et al., 1997).

De uma outra forma, é possível utilizar essas reações para se estudar

um determinado patossitema visando à elucidação dos mecanismos de

patogenicidade, bem como toda a relação planta microrganismo. Esse tipo de

estudo pode ser realizado efetuando-se biotransformações com compostos e

fungos isolados da mesma planta e de regiões distintas como raízes, sistema

vascular, caule, folhas, frutos, cascas, etc.

Uma diferença chave entre plantas resistentes e suscetíveis está no

tempo de reconhecimento do patógeno invasor e na rápida e efetiva ativação

dos mecanismos de defesa do hospedeiro. Uma planta resistente é capaz de

rapidamente desencadear uma ampla variedade de respostas de defesa que

detêm a colonização pelo patógeno. Em contraste, a planta suscetível exibe

respostas muito mais débeis e lentas, que não conseguem restringir o

crescimento ou disseminação do patógeno. Como resultado, uma planta

suscetível sofre sérios danos ou é, até mesmo, morta pela infecção do

patógeno. A ativação de respostas de defesa nas plantas é iniciada pelo

reconhecimento, por parte do hospedeiro, de sinais (moléculas) codificados

pelo patógeno chamados de eliciadores (ex.: proteínas microbianas, pequenos

peptídeos, oligossacarídeos, etc.). A interação de eliciadores do patógeno com

receptores do hospedeiro (muitos dos quais podem ser codificados por genes

R), provavelmente, ativa uma cascata de sinais de transdução que pode

envolver fosforilação, fluxo de íons, espécies de oxigênio ativo, e outros

eventos sinalizadores. A seguir, a ativação transcricional e/ou pós-

transcricional de fatores de transcrição, eventualmente, leva à indução de

genes de defesa da planta. Além de eliciar respostas primárias de defesa,

sinais do patógeno podem ser amplificados através da geração de sinais

secundários da planta, tais como moléculas de ácido salicílico (DURNER et al.,

1997). Tanto eliciadores primários do patógeno, como sinais secundários

endógenos, podem ativar uma série de genes de defesa na planta, cujos

produtos incluem glutatione-S-transferase (GST), peroxidases, proteínas da

parede celular, inibidores de proteinase, enzimas hidrolíticas (quinases e β-1,3-

glucanases), outras proteínas relacionadas à protogenese (proteínas-RP) e

enzimas que biossintetizam fitoalexinas, tais como fenilalanina amônia-liase

(PAL), e chalcona sintase (HAMMOND-KOSACK & JONES, 1996). As

proteínas-RP são proteínas abundantes codificadas pelo hospedeiro e

induzidas pelos patógenos. Muitas delas possuem atividade antimicrobiana ‘in

vitro’ ou quando são superexpressas em plantas transgênicas (JACH et al.,

1995).

Em um nível macroscópico, respostas de defesa induzidas são

freqüentemente manifestadas, em parte, como uma resposta de

hipersensibilidade, a qual se caracteriza por lesões necróticas como resultado

de morte celular do hospedeiro localizada no sítio de infecção (GOODMAN &

NOVACKY, 1994). A ocorrência da morte de células de plantas durante a

resposta de hipersensibilidade pode desempenhar um papel na prevenção do

crescimento e disseminação do patógeno para os tecidos sadios (DANGL et

al., 1996; GREENBERG, 1996). A base bioquímica e molecular da

desintegração e conseqüente morte celular é complexa e ainda pouco

caracterizada.

1.4 - Possibilidades de indução de defesas: Resistência

Sistêmica Adquirida (SAR)

Resistência Sistêmica Adquirida (SAR) foi descrita pela primeira vez

por CHESTER, 1933, o qual revisou 201 estudos que tratavam sobre a questão

da imunidade fisiológica adquirida em plantas e levantou a hipótese de que as

plantas teriam um sistema imunológico similar ao dos mamíferos. ROSS, 1961

foi o primeiro a caracterizar em detalhes a ocorrência de SAR. Ele estudou

esse fenômeno em plantas de fumo (Nicotiana tabacum L.) que exibem lesões

locais quando infectadas pelo vírus do mosaico do fumo (TMV). ROSS, 1961

demonstrou que as lesões locais que ocorrem após a inoculação desafiante

com TMV foram restringidas por inoculação prévia com o mesmo vírus. Essa

restrição não foi somente efetiva contra TMV, mas também contra outros

patógenos, incluindo vírus, bactérias e fungos.

Desde os experimentos de ROSS, 1961, o conhecimento dos eventos

bioquímicos que levam ao estabelecimento de SAR não progrediu

substancialmente até que WHITE, 1979 demonstrou que o ácido salicílico (AS)

e certos derivados do ácido benzóico (BA) podiam induzir SAR. Em 1982,

descobriu-se que a acumulação de um grupo de proteínas extracelulares

denominadas proteínas relacionadas à patogênese (PR) era correlacionada

com a ocorrência de SAR (VAN LOON & ANTONIW, 1982).

O conhecimento sobre os mecanismos que governam SAR ainda é

bastante incipiente, apesar do formidável progresso proporcionado pela adoção

de técnicas modernas de biologia molecular, genética e bioquímica. De acordo

com diversos trabalhos, três etapas importantes no mecanismo de ativação de

SAR podem ser identificadas: iniciação, transmissão de sinais e expressão

gênica (MORAES, 1998).

A cascata de eventos que levam até SAR é iniciada após a formação

de lesões necróticas, tanto em interações incompatíveis como em interações

compatíveis (KUC, 1982). O mecanismo de iniciação de SAR, a partir de

plantas que sobrevivem à infecção por microrganismos virulentos (interações

compatíveis), é ainda pouco conhecido. Esse conhecimento poderá ser

alcançado através da monitoração, por parte das plantas, do balanço de

metabólicos e de níveis energéticos, sendo que desvios de um padrão normal

poderiam significar a presença de parasitas (DELANEY, 1997). Esse modelo

parece plausível, uma vez que o balanço de determinados metabólitos e níveis

energéticos das plantas são normalmente desviados para o consumo de

patógenos.

Uma das questões mais importantes, que tem desafiado a pesquisa

em SAR, é como os tecidos da planta distantes do local da infecção, adquirem

maior resistência. Ao contrário dos animais, as plantas não possuem um

sistema circulatório para transportar grandes quantidades de compostos de

defesa contra patógenos. As plantas utilizam moléculas transmissoras de

sinais, as quais, mesmo em concentrações baixas, podem ativar mecanismos

de resistência em células não diretamente invadidas por patógenos. A fim de

ser um sinal em SAR, uma molécula deve ser sintetizada pela planta; aumentar

a concentração sistematicamente após o ataque de patógenos; mover-se

através da planta; induzir fitoalexinas e proteínas relacionadas à defesa; e

aumentar a resistência contra patógenos. Diversas moléculas têm sido

postuladas como sinais potenciais para ativar SAR, desde que ROSS (1961)

levantou, pela primeira vez, a hipótese sobre a existência desta, porém

nenhuma recebeu maior atenção que o ácido salicílico (SA) (Figura 4), um

produto do metabolismo dos fenilpropanóides.

Para ser considerado um ativador SAR, um produto químico deve

possuir três características: primeiro, o composto ou seus metabólitos não

devem exibir atividade direta; segundo, ele deve induzir resistência contra o

mesmo espectro de patógenos que SAR ativada biologicamente; e terceiro, ele

deve induzir a expressão dos mesmos genes marcadores, conforme SAR

ativada por patógenos (KESSMANN et. al., 1994).

Até o momento o SA é a única substância derivada de plantas que foi

demonstrada ser um indutor de SAR. Posteriormente, um análogo funcional de

SA, ácido 2,6 dicloroisonicolínico (INA) (Figura 4) foi o primeiro composto

sintético a ativar SAR. Entretanto tanto SA como INA são fitotóxicos para a

maioria das plantas cultivadas e, portanto, não possuem potencial para ser

usados comercialmente como protetores de plantas. Recentemente, outro

análogo de SA, benzotiazole (BTH), benzo-(1,2,3)-thiadiazole-7-ácido

carbotiotico S-metil éster (Figura 4), foi demonstrado ser um potente ativador

de SAR e possibilita a proteção em condições de campo contra um amplo

espectro de doenças em diversas espécies de plantas [MORAES, 1998;

GORLACH et. al., 1996; MAUCH-MANI & MÉTRAUX, 1998]. O BTH é até o

momento o único indutor de SAR liberado para o uso comercial (MORAES,

1998).

OOH

ClCl

INA

BTH

Figura 4.

Estruturas moleculares de substâncias com propriedades ativadoras

de SAR.

1.5 - Fitoalexinas

Fitoalexinas são substâncias tóxicas produzidas em quantidades

apreciáveis, por plantas, como resultado de estímulos provocados por vários

tipos de microrganismos fitopatogênicos através de perturbações químicas e

mecânicas (AGRIOS, 1988).

Desde que Muller e Börger propuseram hipóteses a respeito das

fitoalexinas (MULLER & BÖRGER, 1940) elas continuaram a fascinar

fitopatologistas no que diz respeito a determinar as bases envolvidas na

resistência de plantas. A maioria dos trabalhos iniciais envolvendo fitoalexinas

reportava sobre substâncias antimicrobianas produzidas de novo pela planta

quando inoculadas por fungos (BAILEY & MANSFIELD, 1982). Desde aquele

tempo, maior atenção foi dada aos processos de eliciação das fitoalexinas e a

natureza dos eliciadores. Técnicas de biologia molecular também foram

desenvolvidas, visando estabelecer o papel que as fitoalexinas representam

para a resistência de plantas.

Nas últimas décadas tem crescido o interesse pelo estudo das

fitoalexinas. Este estudo é realizado, na maioria das vezes, utilizando-se

células e tecidos de plantas cultivados in vitro. Uma grande variedade de

eliciadores têm sido reportada na literatura, entre microrganismos (SEITZ,

1979; HARBORNE, 1995; WEITING, 1996; ZOOK, 1998) e substâncias

químicas tais como cerebrosidas (KOGA, 1998), quitina (LIU, 1995; SERADGE,

1995), ácidos orgânicos (SHARAN, 1998; LIU, 1995), etc. Dentre as

fitoalexinas induzidas nesses trabalhos, encontram-se representantes fenólicos

(SEITZ, 1979; LIU, 1995), flavonóides (WEITING, 1996; SERADGE, 1995),

alcalóides (SEITZ, 1979; ZOOK, 1998), cumarinas (SHARAN, 1998), etc.

O acúmulo de compostos antifúngicos, mais especificamente nos tecidos

de citros, tem sido reportado em vários experimentos. Cumarinas como a

xantiletina (KHAN, 1985) (Figura 5a) e seselina (VERNENGHI, 1987) (Figura

), foram acumuladas no tronco e nas raízes de citros quando estes foram

infectados com Phytophthora spp. ISMAIL et al. 1978, constataram um

incremento na síntese da umbeliferona (7-hidroxicumarina) (Figura 5c) quando

grapefruit estava infectada por microrganismos. Afek e Sztejnberg (AFEK &

SZTEJNBERG, 1988) isolaram a cumarina scoparona (6,7-dimetoxicumarina)

(Figura 5d) da copa de citros quando seguido da inoculação de P. citrophthora.

O acúmulo dessa fitoalexina foi induzido no fruto, folhas, e ramos de Satsuma

mandarim através da infecção com Diaporthe citri (Faw.). Scoparona foi isolada

também da casca dos frutos de citros quando estes estavam infectados com

Guignardia citricarpa Kiely, fitopatógeno causador da doença pinta-preta dos

citros (DE LANGE, 1976) e, ainda, das cascas quando estas foram irradiadas

com radiação gama (RIOV, 1971). Este composto não foi encontrado em

cascas de frutos quando não eram irradiados e nem em frutos não infectados

com G. cítricarpa. Bem-Yehoshua et al. (BEM-YEHOSHUA, 1987 E 1988)

isolou várias substâncias antifúngicas de frutas de pomelo, algumas delas eram

derivados de cumarinas. Bem-Yehoshua et al. (BEM-YEHOSHUA, 1991)

também detectou scoparona em várias frutas de citros seguido de iluminação

UV. Entretanto, BAUDOIN & ECKERT (1985) não encontraram acumulação

significante de compostos antifúngicos em tecidos feridos de limão inoculados

com Geotrichum candidum Link ex Pers.

OOO

OHO O

a- xantiletina

b- seselina

c- umbeliferona

d- scoparona

Figura 5.

Estruturas moleculares das fitoalexinas a- xantiletina, b- seselina, c-

umbeliferona e d- scoparona.

1.6 - Algumas Patogenias de Citrus

1.6.1 - Pinta Preta

Figura 6: Frutos com sintomas de pinta preta: a – mancha preta, b – mancha

sardenta, c – mancha virulenta (Fonte: Fundecitrus).

“Pinta Preta” é uma doença que afeta plantas cítricas em vários países

da África (Moçambique, Zimbábue, África do Sul), Ásia (China, Coréia, Hong-

Kong, Filipinas, Taiwan, Japão), Oceânia (Austrália) e América do Sul

(Argentina, Peru, Uruguai e Brasil) (KIELY, 1949; KOTZÉ, 1981; GARRÁN,

1996). Dentre estes países, as maiores perdas têm sido registradas na África

do Sul, Japão, Argentina e, principalmente no Brasil.

A pinta preta dos citros é uma doença causada pelo fungo Guignardia

citricarpa, que afeta todas as variedades de laranjas doces, limões verdadeiros,

tangerinas e híbridos e é disseminada por meio de mudas, restos de material

vegetal, água da chuva e vento. O principal sintoma são lesões nos frutos, que

causam a sua depreciação no mercado pela perda do interesse na

comercialização desse fruto in natura. Ainda, as lesões impedem a exportação

dos frutos, tanto pela aparência quanto pela possibilidade de contaminação das

plantações dos países importadores onde a doença pinta preta não ocorre.

Três são os tipos de manchas produzidas durante o desenvolvimento da

doença: “mancha preta” ou “mancha dura”, “mancha sardenta” e “mancha

virulenta”. Esses sintomas são bem definidos e ocorrem em diferentes

estágios, dependendo do avanço, da estação do ano e da maturidade dos

frutos (BRODRICK & RABIE, 1970).

A doença não provoca alterações de sabor no fruto, que pode ser

comercializado para a indústria de suco. Porém, em ataques severos, a pinta

preta causa a queda acentuada dos frutos.

1.6.2 - Cancro Cítrico

Figura 7: Folha e frutos com sintomas de cancro cítrico (Fonte: Fundecitrus).

A bactéria causadora do cancro cítrico Xanthomonas axonopodis pv. citri

foi introduzida no Brasil em 1952, na região de Presidente Prudente (SP).

Algumas das conseqüências da doença são queda das folhas e dos frutos e

diminuição na produção.

O cancro cítrico ataca todas as variedades de citros, mas algumas delas

são mais resistentes à doença. As lesões que provoca podem ter variações nas

suas características, podendo ser confundidas com outras doenças e pragas.

O primeiro sintoma visível é o aparecimento de pequenas lesões

salientes, que surgem nos dois lados das folhas, sem deformá-las. As lesões

aparecem na cor amarela e logo se tornam marrons. Nos frutos a doença se

manifesta pelo surgimento de pequenas manchas amarelas que aos poucos

vão crescendo e tornando-se marrons. As manchas são salientes, parecidas

com verrugas, de cor marrom no centro. Nos ramos as lesões também são

salientes, na forma de crostas de cor parda (FUNDECITRUS, 2007).

1.6.3 - Mancha Marrom de Alternária

Figura 8:

Fruto e folhas de tangerina com sintomas de mancha marrom de

alternaria (Fonte: Fundecitrus).

A mancha marrom de alternaria é causada por um fungo (Alternaria

alternata f. sp. citri), que ataca os tecidos da planta, principalmente os mais

jovens. É só no tecido morto de folhas e ramos que o fungo sobrevive e se

reproduz, até mesmo em folhas em decomposição no solo. No fruto, isso não

acontece.

A diferença entre este fungo que ocorre nas tangerinas e os da mesma

espécie que atacam as folhas de limão “Cravo” e limão rugoso é a produção de

uma toxina, que é específica, de acordo com a variedade das plantas afetadas.

A doença se caracteriza por manchas necróticas (tecido morto) de cor

marrom-escuro rodeadas de um halo amarelo, nas folhas, ramos e frutos. As

conseqüências mais graves e que causam prejuízos aos produtores são a

queda de folhas e frutos, além da seca dos ramos. Em pomares do Estado de

São Paulo, observou-se a presença de um líquido de consistência viscosa

sobre as lesões, o que ainda não foi descrito nos casos observados em outros

países (FUNDECITRUS, 2007).

1.6.4 - Morte Súbita dos Citros

Figura 9: Porta enxerto e planta com sintomas de mancha morte súbita dos

citros (Fonte: Fundecitrus).

A morte súbita dos citros (MSC) foi identificada pela primeira vez em

2001, no município de Comendador Gomes (MG). Pesquisadores observaram

que as folhas perdiam o brilho e as plantas morriam em poucas semanas. Por

esse motivo, foi batizada de morte súbita.

A MSC se espalhou por outros municípios e chegou à região norte de

São Paulo. Só foi identificada em variedades enxertadas sobre limão ‘Cravo’.

Pesquisas mostram que os vasos do floema, que levam os produtos gerados

na fotossíntese para toda a planta, inclusive a raiz, ficam bloqueados. Sem

alimento, a árvore morre.

A disseminação da MSC e a forma de distribuição nos talhões afetados,

além de outros fatores, indicam semelhanças com a tristeza dos citros.

Suspeita-se que a doença seja causada por um vírus, provavelmente

transmitido pelo pulgão preto, Toxoptera citricarpa, o mesmo vetor da tristeza

dos citros, doença que atacou a citricultura na década de 40.

Os sintomas mais característicos da MSC são: amarelecimento da parte

interna da casca do porta-enxerto, ausência de radicelas e perda de brilho das

folhas. Outros sintomas podem ou não ocorrer, como seca de ponteiros,

desfolha, falta de brotações e morte repentina da planta com os frutos ainda

aderidos (FUNDECITRUS, 2007).

1.6.5 - Clorose Variegada dos Citros ou Amarelinho

Figura10:

Folha e frutos com sintomas de amarelinho (Fonte: Fundecitrus).

A Clorose Variegada dos Citros (CVC) ou Amarelinho foi identificada

oficialmente no Brasil em 1987 em pomares do Triângulo Mineiro e do Norte e

Noroeste do Estado de São Paulo. Embora essas sejam as regiões mais

afetadas até hoje, ela já está presente em quase todas as áreas citrícolas do

país.

A CVC é causada pela bactéria Xylella fastidiosa que, restrita ao xilema

da planta, provoca o entupimento dos vasos. A produção do pomar afetado

pela doença cai rapidamente, seus frutos vão ficando duros e amadurecem

precocemente. A bactéria é transmitida e disseminada nos pomares por insetos

vetores.

Os primeiros sintomas são vistos nas folhas, passam posteriormente

para os frutos e acabam afetando toda a planta. Quanto mais nova a planta,

maior a chance de ser infectada. Uma folha com sintomas de CVC mostra na

face superior pontuações circulares de cor amarela. Na face inferior, apresenta

lesões de cor palha, às vezes necrosadas. Com o agravamento da doença, os

frutos ficam queimados pelo sol, com tamanho reduzido, endurecidos e com

maturação precoce. Nesse estágio, são imprestáveis para o comércio

(FUNDECITRUS, 2007).

1.6.6 - Greening

Figura 11: a – folha, b - fruto e c – ramos com sintomas de greening. d:

psilídeo Diaphorina citri, vetor da doença nas Américas (Fonte: Fundecitrus).

O “greening”, também chamado de “huanglongbing” (HBL), é uma

doença de difícil controle, provavelmente originária da China, e hoje afetando

seriamente a produção de citros na Ásia e na África. A primeira observação do

“greening” nos pomares brasileiros foi em março de 2004. Um grupo de

pesquisadores brasileiros e franceses iniciou os estudos para a identificação da

doença (FUNDECITRUS, 2007).

O agente causal da doença é uma bactéria pleomórfica, gram-negativa e

limitada ao floema. Antes da constatação no Brasil, existiam duas formas de

bactérias causadoras do “greening”: Candidatus liberibacter africanus,

associada à forma africana da doença, sensível a temperaturas elevadas,

sendo seu ótimo entre 20 e 25 ºC, e Candidatus liberibacter asiaticus,

associada à forma asiática, tolerante a temperaturas mais elevadas (25 a 32

ºC). Essas bactérias afetam o floema, impedem o fluxo normal da seiva,

provocam a redução do tamanho e deformação dos frutos e definhamento da

árvore. A distribuição das bactérias na planta é bastante irregular (ROSSETTI,

2001). A transmissão das formas africana e asiática ocorre por vetores, que

são duas espécies de psilídeos: Trioza erytreae, que ocorre na África; e

Diaphorina citri, que é encontrada na Ásia, África e também nas Américas.

O “greening” diagnosticado em São Paulo é atribuído majoritariamente a

uma nova bactéria, denominada Candidatus liberibacter americanus, embora a

ocorrência de Candidatus liberibacter asiaticus também tenha sido detectada

(TEIXEIRA et. al., 2005

a,b).

No Estado de São Paulo acredita-se que a doença seja transmitida pelo

psilídeo D. citri, comum nos pomares brasileiros e na planta ornamental

conhecida como falsa murta (Murraya paniculata). A bactéria Candidatus

liberibacter americanus também foi detectada nesta Rutaceae ornamental

(LOPES et al., 2005). Não existe nenhuma variedade de copa ou porta-enxerto

de citros resistente a doença (FUNDECITRUS, 2007).

Nas décadas de 60 e 70, a Cromatografia em Camada Delgada (TLC) foi

empregada com sucesso na indexação e diagnose do “greening” em plantas

cítricas (SCHWARZ, 1968; VAN VUUREN & da GRAÇA, 1977), devido à

ocorrência de um composto fenólico glicosilado, identificado como um éster de

glicose do ácido gentísico nas plantas doentes (FELDMAN & HANKS, 1969). A

forma aglicona do marcador, o ácido gentísico (AG) (Figura 12), é um

composto fenólico encontrado em diversas plantas, cuja quantidade aumenta

consideravelmente nos tecidos cítricos afetados pelo “greening” (VAN

LELYVELD et al., 1988; HOOKER et al., 1993). Entretanto, a quantidade deste

composto não está correlacionada à tolerância ou suscetibilidade ao “greening”

(VAN LELYVELD et al., 1988). EL-MOUSALLAMY et al. (2000) também

identificaram um derivado glicosilado de ácido gentísico (ácido 2,5-

dihidroxibenzóico 2-O-

-glicopiranose, também chamado de Orbicularina)

(Figura 12) em Cotoneaster orbicularis, enquanto KOVÁCS et al. (2004)

encontraram o derivado glicosilado do ácido gentísico em vinho branco. Por

sua vez, SCHWARZ & VAN VUUREN (1970) observaram estreita correlação

na presença do marcador fenólico como indexador de HBL em laranjas doces,

mandarinas e tangelos. Entretanto, pouca correlação em limões e grapefruits.

AG Orbicularina

Figura 12.

Estruturas moleculares do Ácido Gentísico (AG) e da Orbicularina.

VAN VUUREN & da GRAÇA (1977) compararam variações na forma de

extração, concentração do extrato aquoso e separação cromatográfica e

determinaram que a extração sem concentração, com posterior resolução em

butanol saturado com água, representa a forma mais reprodutível e eficaz para

ser empregada como método de diagnóstico para o “greening”, detectando

inclusive plantas assintomáticas como positivas para “greening”. MELLO et al.

(1974) observaram a ocorrência de um marcador fluorescente de mesmo Rf,

identificado como o marcador do “greening”, em plantas doentes de etiologia

desconhecida e em plantas com Tristeza no Brasil. HOOKER et al. (1993)

detectaram AG em citros infectadas com CTV, embora em concentração

estatisticamente menor que em plantas com “greening”. FELDMANN & HANKS

(1969) identificaram o ácido gentísico glicosilado também em plantas com

“stubborn”, “dieback” e “stem pitting” (CTV), embora a natureza do agente

causal destas doenças possa ser questionada devido ao desconhecimento do

patógeno quando da realização do estudo. Por sua vez, SCHWARZ não

constatou a ocorrência do marcador violeta-fluorescente em plantas com

TRISTEZA (SCHWARZ, 1968). A diagnose do greening através da PCR vem

sendo efetuada rotineiramente no laboratório de Diagnose de Doenças e

Pragas do Fundecitus. A comparação destes resultados com a diagnose

experimental do greening via TLC vem apresentando resultados promissores

(WULFF, N.A., comunicação pessoal).

Vários estudos reportam que compostos fenólicos presentes em

espécies vegetais, exibem papel importante na resistência de plantas a pragas

e doenças. Quanto maior for o teor desses compostos, melhor é a resistência

(LEGE et al., 1995; FERNÁNDEZ et al., 1996). Também se deve mencionar

que glicosídeos de ácido gentísico foram identificados como derivados de ácido

salicílico, um composto conhecido por ser sintetizado em diversas plantas

durante as respostas de defesa (EL-MOUSALLAMY et al., 2000). Ademais, o

estudo da distribuição do ácido gentísico e da forma glicosilada fornece

subsídios para aumentar a compreensão da relação patógeno-hospedeiro

nesta interação. LELYVELD & VAN VUUREN (1988a) mostraram que a

atividade da enzima peroxidase é maior em plantas sadias quando comparadas

com plantas afetadas pelo “greening”. O ácido gentísico, que é encontrado em

maiores quantidades em plantas doentes, é um inibidor da atividade desta

enzima (LELYVELD & VAN VUUREN, 1988b).

Estudando a distribuição deste marcador fenólico (ácido gentísico e o

ácido gentísico glicosilado) em plantas cítricas infectadas pelo “greening”

pretende-se diagnosticar a ocorrência de plantas com “greening” através de

TLC. O desenvolvimento de ferramentas de diagnose mais rápidas, eficazes e

de baixo custo, pode facilitar estudos de distribuição espacial da doença,

transmissão do agente causal e diagnose para fins de erradicação. Entretanto,

diversos estudos são necessários.

A disponibilidade de ferramentas analíticas de alta sensibilidade e

precisão pode ser empregada para validar os resultados obtidos através de

TLC, bem como permitir a caracterização do marcador. Embora o fenol

glicosilado marcador tenha sido quimicamente caracterizado (FELDMAN &

HANKS, 1969), é necessário confirmar sua natureza neste estudo através de

técnicas modernas como o HPLC (EL-MOUSSALAMY et al., 2000), visando

identificar de forma inequívoca todas as plantas com “greening”.

2 – Objetivos

2.1 - Objetivo Geral

Nas áreas de biologia e química de microrganismos, principalmente de

produtos naturais, os trabalhos visando entender e manipular as interações de

plantas com sua microbiota associada vem adquirindo cada vez mais atenção e

importância. Neste contexto as fitopatogenias são responsáveis por grandes

prejuízos anuais na agricultura, principalmente no que se remete a

comercialização de Citrus, uma vez que o Brasil é o maior produtor mundial de

frutas cítricas e consequentemente acometido por diversas doenças em seus

laranjais. Dessa forma, fazem-se necessários estudos que tragam uma melhor

compreensão das interações envolvidas entre as plantas da espécie Citrus com

os seus respectivos fitopatógenos. Sendo assim, o objetivo geral deste trabalho

é o de desenvolver ferramentas analíticas que nos possibilite estudar as

patogenias de Citrus tanto do ponto de vista da planta quando do

microrganismo, proporcionando assim, diagnósticos mais precisos e a busca

de inibidores mais eficazes no combate ao desenvolvimento dessas doenças.

2.2 - Objetivos Específicos

Os objetivos específicos dos trabalhos descritos nessa tese, que

forneceram os casos exemplares aplicados nas discussões gerais, para se

entender o objetivo exposto acima (

2.1), foram os seguintes:

2.2.1 - Coletar materiais vegetais de Citrus em suas várias partes (casca dos

frutos, folhas, ramos e casca do tronco) e estudar a composição química

das mesmas;

2.2.2 - Desenvolver metodos analíticos via HPLC-UV-MS e HPLC-MS/MS

como ferramentas para o estudo do perfil químico dos materiais vegetais

de Citrus sadios e com sintomas de doenças;

2.2.3 - Analisar os metabólitos secundários envolvidos na interação entre

espécies de Citrus frente a fungos fitopatogênicos;

2.2.4 - Isolar e identificar os metabólitos secundários provenientes dos

microrganismos fitopatogênicos de Citrus quando desenvolvidos em

meios de cultivo artificial.

2.2.5 –

Quantificar os metabólitos secundários (micotoxinas) dos

microrganismos fitopatogênicos quando desenvolvidos em seus

hospedeiros (Citrus) para avaliar o acúmulo destas moléculas na planta.

3 - Procedimento Experimental

3.1 – Materiais

a) Suporte para cromatografia:

- Sílica gel 230-400 mesh (Sílica Flash), para cromatografia em coluna;

- Sílica gel 70-230 mesh (Sílica comum), para cromatografia em coluna;

- Sílica 60 H Mesh para cromatografia em coluna;

- Sílica gel 60 PF

254

, para cromatografia em camada delgada preparativa

(CCDP).

b) Eluentes para cromatografia:

- Foram utilizados solventes comerciais, destilados no DQ-UFSCar;

- Foram utilizados solventes PA da Merck, Synth, Vetex, Reagen e outros;

- Solventes de grau cromatográfico Merck, Aldrich;

-Solventes grau HPLC JT Baker

c) Solventes utilizados para a obtenção dos espectros de RMN:

- Solventes deuterados da Merck e Aldrich 98-99,9 %

d) Substâncias utilizadas para o isolamento e cultivo dos

microrganismos:

- Álcool 70%

- Hipoclorito de sódio 11%

- Dextrose – Mallinckrodt

- Agar bacteriológico – DIFCO, Henrifarma

- Batata inglesa

- Milho de canjica Ioki



e) Papel de filtro:

- JProlab, JP40 Quantitativo ∅ = 12.5 cm

- INLAB tipo 10, porosidade 3,0 µm

f) Cartucho de extração em fase sólida:

- Supelco LC-18/3 mL

- Aminopropil SPE cartridge Varian, 3 mL / 500 mg

g) Colunas Cromatográficas:

- Shimadzu CLC-phenil (25 cm x 4.6 mm)

- Alltech, Inertisil 250 x 4.6 mm, 5 µm, Deerfield, IL)

3.2. Equipamentos Utilizados

a) Espectrômetro de massas:

- MICROMASS Quattro LC

- Waters Quattro Premier™ T-Wave™

b) HPLC:

- Waters Alliance 2795

- HPLC-DAD Shimadzu: controladora SCL-10Avp, bombas LC-10AD e LC-

10ADvp, autoinjetor SIL-10ADvp, detector SPD-M10Avp PDA e degaseificador

DGU-14A.

c) Espectrômetro de RMN:

- Brüker ARX – 200

- Brüker DRX – 400

d) Evaporadores Rotativos:

- Evaporador Rotativo TECNAL (TE 120)

- Rotavapor Büchi 461 – water bath (EL 131)

e) Estufa de secagem e esterilização:

- FANEN – 315 SE

f) Balança analítica:

- Mettler P163

g) Câmara de fluxo laminar:

- Veco VL FS – 12M

h) Estufa incubadora:

- FANEM 347 CD

i) Autoclave vertical:

- Phoenix AV 75

j) Banho de ultra-som:

- Branson 1510, Danbury, CT)

k) Turvo Vap:

- TurboVap II, Zymark

l) Moinho de facas:

- TECNAL Turratec



3.3 - Metodologias de Análise dos Metabólitos Secundários

Presentes Em Citrus Através de HPLC/UV-MS

Esse tópico relata o desenvolvimento de um método de análise dos

compostos presentes no enxerto de citros utilizando a técnica de HPLC/UV-

MS. O objetivo de desenvolver estas metodologias visa analisar, com

pequenas quantidades de material vegetal, substâncias polares e de polaridade

intermediária presentes nas folhas de plantas cítricas.

3.3.1 - Coletas dos Materiais Botânicos

As folhas de citros, provenientes da enxertia de Citrus sinensis e Citrus

limonea, utilizadas no desenvolvimento desse trabalho foram coletadas em

uma plantação de propriedade da Fazenda Jamaica que se encontra localizada

na Rodovia Eng. Thales de L. Peixoto Jr. Km 272 Sul (entre Ribeirão Preto e

São Carlos). Essa coleta foi realizada no dia 03 de novembro de 2005.

3.3.2 - Metodologia de Análise dos Compostos Polares

Presentes Nas Folhas do Enxerto

3.3.2.1 - Extração e Pré-purificação dos Compostos Polares

Presentes nas Folhas do Enxerto

As folhas de citros depois de coletadas foram lavadas em água corrente

para a remoção de alguns resíduos do ambiente. Em seguida, foram colocadas

para desidratação em estufa circular com temperatura controlada de 45

overnight. O material seco foi moído em moinho de facas (TECNAL Turratec



)

até a total pulverização.

A uma massa de 200 mg das folhas secas e moídas adicionou-se 10,0

mL de H

O:CH

CN (7:3 v/v).

Essa suspensão foi submetida a banho de ultra-som por um período de

15 min e filtrada em funil analítico com o auxílio de papel de filtro (INLAB tipo

10, porosidade 3,0 µm). Ao extrato filtrado adicionou-se 5,0 mL de CHCl

A pré-purificação consistiu em centrifugar as duas fases formadas por 5

minutos com o intuito de otimizar a separação. Em seguida, descartou-se a

fase orgânica e obteve-se uma alíquota de 1,0 mL da fase aquosa.

Uma alíquota de 20,0 µL dessa solução foi analisada por HPLC-UV.

Todo esse procedimento está ilustrado na Figura 13 representada

abaixo.

Figura 13. Extração e pré-purificação dos compostos polares.

3.3.2.2 - Condições Cromatográficas Utilizadas Durante a

Análise dos Compostos Polares Presentes no Extrato de

Folhas de Citrus

Todas as análises cromatográficas foram realizadas em um HPLC-DAD

Shimadzu equipado com uma controladora SCL-10Avp, bombas LC-10AD e

LC-10ADvp, autoinjetor SIL-10ADvp, detector SPD-M10Avp PDA e

degaseificador DGU-14A, utilizando coluna Shimadzu CLC-phenil (25 cm x 4.6

mm).

As análises foram realizadas no modo reverso de eluição utilizando

CN:MeOH 1:1 acidificado com 1% de ácido fórmico como sistema B e H

acidificado com 1% de ác. fórmico como sistema A. A eluição foi realizada no

modo gradiente de eluição como está representado na Tabela 1 onde foi

aplicado uma vazão de 0,7 mL/min e o volume de injeção foi de 25 µL. A faixa

de monitoramento no DAD foi de 200 – 370 nm, porém todas as análises foram

monitoradas a 333 nm.

Tabela 1. Eluição gradiente utilizada durante a análise dos extratos polares das

folhas de citros.

T (min) CH

CN:MeOH 1:1 1%

ác. fórmico (%)

O 1% ác. fórmico

(%)

1 10 90

15 15 85

20 18 82

25 18 82

30 20 80

40 40 60

45 100 0

50 100 0

3.3.3 - Metodologia de Análise dos Compostos de Polaridade

Intermediária Presentes Nas Folhas do Enxerto

3.3.3.1 - Extração e Pré-purificação dos Compostos de

Polaridade Intermediária Presentes nas Folhas do Enxerto

As mesmas folhas desidratadas e moídas utilizadas no desenvolvimento

de análise dos compostos polares foram utilizadas no desenvolvimento de

análise dos compostos de polaridade intermediária.

A uma massa de 200 mg das folhas secas e moídas adicionou-se 10,0

mL de Acetonitrila.

Essa suspensão foi submetida a banho de ultra-som por um período de

15 min e filtrada em funil analítico com o auxílio de papel de filtro (INLAB tipo

10, porosidade 3,0 µm). Do filtrado obtido, uma alíquota de 5,0 mL foi

adicionada a 25 mL de água Milli-Q.

A pré-purificação foi realizada ativando-se, previamente, um cartucho de

extração em fase sólida (Supelco LC-18/3 mL) com 5,0 mL de acetonitrila e

condicionando-o com 5,0 mL de água Milli-Q. Em seguida, no cartucho de EFS

foi aplicada a solução do extrato preparada anteriormente. O eluído obtido foi

descartado. As substâncias adsorvidas ao cartucho de SPE foram, então,

eluídas com 3,0 mL de THF.

Uma alíquota de 20,0 µL dessa solução foi analisada por HPLC-UV.

Todo esse procedimento está ilustrado na Figura 14 representada

abaixo.

Figura 14. Extração e pré-purificação dos compostos de polaridade

intermediária.

3.3.3.2 - Condições Cromatográficas Utilizadas Durante A

Análise dos Compostos de Polaridade Intermediária Presentes

no Extrato de Folhas de Citrus

Todas as análises cromatográficas foram realizadas em um

equipamento HPLC-DAD com a mesma configuração descrita anteriormente,

para as análises dos compostos polares.

As análises também foram realizadas no modo reverso de eluição

utilizando CH

CN:MeOH 1:1 v/v acidificado com 1% de ácido fórmico como

sistema B e H

O acidificado com 1% de ác. fórmico como sistema A. A eluição

foi realizada no modo gradiente como está representado na Tabela 2 onde foi

aplicado uma vazão de 0,8 mL/min e o volume de injeção foi de 25 µL. A faixa

de monitoramento no DAD foi de 200 – 370 nm, porém todas as análises foram

monitoradas a 333 nm.

Tabela 2. Eluição gradiente utilizada durante a análise dos extratos de

polaridade intermediária das folhas de citros.

T (min) CH

CN:MeOH 1:1 1%

ác. fórmico (%)

O 1% ác. fórmico

(%)

1 50 50

18 50 50

20 100 0

30 100 0

3.3.4 - Aplicação da Metodologia de Análise dos Compostos

Polares Presentes em Citrus em Plantas Com Sintomas da

Doença Morte Súbita dos Citros (MSC)

Nesta etapa do trabalho, utilizou-se nas cascas do tronco do enxerto de

C. sinensis (laranja pêra) sobre C. limonea (limão cravo) a metodologia

previamente desenvolvida para analisar os compostos polares presentes nas

folhas de citros (Itens 3.3.2 e 3.3.3). O intuito deste experimento foi avaliar a

diferença no metabolismo secundário tanto da copa (laranja pêra) quanto do

cavalo (limão cravo) de plantas sadias e de plantas doentes. O sintoma que

evidencia uma planta doente é a presença de coloração amarelada apenas no

cavalo do enxerto, enquanto que na copa não se evidencia qualquer mudança

aparente na coloração (Figura 15).

Figura 15.

Região da copa onde foi realizada enxertia de C. sinensis (laranja

pêra) sobre C. limonea (limão cravo) apresentando sintoma de MSC no cavalo

do enxerto.

3.3.4.1 - Coletas dos Materiais Botânicos de Plantas Sadias e

Com Sintomas de MSC

Todos os materiais vegetais utilizados nesse trabalho, provenientes da

enxertia de Citrus sinensis sobre Citrus limonea, foram cedidos pelo

FUNDECITRUS – Fundo de Defesa da Citricultura. As plantas, tanto com

sintomas quanto sem sintomas da doença MSC, foram coletadas pelos

técnicos do FUNDECITRUS em fazendas da região de Comendador Gomes e

Citrus limonea

(Cavalo)

Citrus sinensis

(Copa)

Coloração

Amarelada

Frutal e as discusões de sintomatologia foram realizadas com o pesquisador

Dr. Nelson Arno Wulff.

3.3.4.2 - Extração, Pré-purificação e Condições

Cromatográficas Utilizadas na Análise dos Compostos Polares

Presentes nas Cascas do Tronco do Enxerto

Em um primeiro momento, tanto a extração quanto a pré-purificação dos

compostos polares presentes nas cascas do tronco do enxerto de citros foram

as mesmas realizadas anteriormente descritas no tópico 3.3.2.1 (Página 31)

para as folhas do enxerto. As condições cromatográficas também foram as

mesmas realizadas anteriormente para a análise dos compostos polares

presentes nas folhas do enxerto, como descritas no tópico 3.3.2.2 (Página 32).

Porém, em um segundo momento, houve a necessidade de realizar a

adaptação do método anteriormente desenvolvido para uma nova coluna

cromatográfica, devido à constatação de que a coluna cromatográfica

Shimadzu CLC-phenil (250 mm x 4,6 mm) que estava sendo utilizada havia

perdido a sua eficiência.

3.3.4.3 Novas Condições Desenvolvidas Para a Análise dos

Compostos Polares Presentes nas Cascas do Tronco do

Enxerto

A extração e a pré-purificação dos compostos polares presentes nas

cascas do tronco do enxerto de citros continuaram sendo as mesmas descritas

no tópico

3.3.2.1 (Página 31).

O equipamento utilizado durante as análises consistiu de um HPLC

(Waters Alliance 2795, Manchester, UK) acoplado a um espectrômetro de

massas com analisador duplo quadrupolar (Waters Quattro Premier

T-

Wave

, Manchester, UK). Para a otimização dos parâmetros cromatográficos,

bem como as sintonias realizadas no espectrômetro de massas, foi utilizada

uma coluna analítica ODS (Alltech, Inertisil 250 x 4,6 mm, 5 µm, Deerfield, IL)

onde foram injetados 15 µL do extrato da copa de uma planta com sintomas de

MSC realizado de acordo com o tópico 3.3.2.1 (Página 31). Para o ajuste da

sintonia utilizou-se uma vazão de 0.9 mL/min da fase móvel isocrática

metanol:água 1:1 v/v, ambas acidificadas com 1% de ácido fórmico, onde a

entrada da amostra no espectrômetro de massas foi ajustada com o auxílio de

um splitter para a proporção de 2:1 (descarte:MS). As amostras foram

ionizadas utilizando uma fonte de electrospray (ES) operando no modo

negativo onde a temperatura do bloco da fonte estava ajustada com a

temperatura de 100

C e a temperatura do probe ajustada em 300

C. O fluxo

do gás de secagem bem como os parâmetros de ionização do capilar, cone e

extrator foram ajustados utilizando infusão direta na fonte de ES. Os fluxos de

nitrogênio do nebulizador e do gás de desolvatação foram ajustados em 20 e

500 L/h. A voltagem do capilar foi mantida em 3.00 kV durante todo o

experimento. Para o monitoramento do composto com íon pseudo-molecular

[M-H]

= 593 nos extratos foram realizados experimentos de SRM (selected

reaction monitoring), onde a transição 593 → 353 foi a que apresentou maior

sensibilidade mantendo a voltagem do cone em 60 V e a energia de colisão em

35 eV. Ainda, para o monitoramento do composto em questão a transição 593

→ 473 também foi monitorada com a função de transição de confirmação, onde

esta apresentou maior sensibilidade mantendo a voltagem do cone em 60 V e a

energia de colisão em 30 eV. Os parâmetro de dwell-time e inter-scan delay

também foram otimizados visando obter maior sensibilidade para o analito. Os

valores que implicaram em melhor sensibilidade foram registrados através dos

valores 0.1 e 0.01, respectivamente. A pressão do gás de colisão (argônio) foi

mantida em 3.76.e

-3

mbar durante todos os experimentos.

Durante o monitoramento do íon pseudo-molecular [M-H]

= 593 utilizou-

se eluição no modo gradiente com um tempo de análise de 16 min (Tabela 3).

Todos os outros parâmetros utilizados foram os mesmo aplicados no

desenvolvimento descrito acima.

Tabela 3. Eluição gradiente utilizada durante as análises de plantas com

sintomas de MSC.

T (min) MeOH 1% ác. fórmico

(%)

O 1% ác. fórmico

(%)

0.00 30 70

10.0 75 25

11.0 100 0

16.0 100 0

3.4 - Isolamento e Identificação dos Metabólitos Secundários

de Alternaria alternata

3.4.1 - Obtenção do Microrganismo Isolado Alternaria alternata

O fungo fitopatogênico Alternaria alternata f. sp. citri isolado dos frutos

de tangerina contendo sintomas da doença mancha marrom de alternaria nos

foi cedido pelo Dr. Eduardo Feichtenberger, pesquisador da Unidade de

Pesquisa e Desenvolvimento de Sorocaba APTA Regional/SAA. Esta linhagem

se mantinha cultivada em placa de Petri contendo meio sólido BDA – “batata,

dextrose e ágar”.

3.4.2 - Cultivo de A. alternata em milho

O fungo A. alternata foi cultivado em milho de canjica com umidade de

50% v/m. O milho de canjica da marca Ioki



foi dividido em 31 Erlenmeyers de

500 mL de modo a conter 100g de milho em cada frasco somando um total de

3,1 Kg de meio de cultivo. Em seguida adicionou-se 50 mL de H

O destilada

(50 % de umidade). Outros 3 Erlenmeyers foram preparados da mesma

maneira para servirem de testemunha (branco).

Os frascos contendo o meio foram esterilizados em autoclave por 20

minutos sob temperatura de 120

C e pressão de 1 atm. Em seguida, em

capela de fluxo laminar, com o auxílio de uma lâmina e alça de platina,

pequenas quantidades da cultura de A. alternata foram retiradas da placa de

Petri e inoculadas aos meios anteriormente preparados.

O fungo foi mantido em cultivo por um período de 30 dias a 25

3.4.3 - Extração dos Metabólitos Secundários de A. alternata

Os extratos dos metabólitos secundários de A. alternata cultivado em

milho foram obtidos utilizando EtOH, CH

e MeOH. Os extratos foram

realizados tanto do meio sólido intacto (grãos de milho inteiros) quanto do meio

sólido moído em moinho (TECNAL Turratec



Fluxograma 1 a seguir apresenta os extratos obtidos tanto para o

branco quanto para o meio cultivado, bem como o tempo de extração:

Fluxograma 1.

Extratos obtidos de A. alternata cultivada em milho.

Alternaria alternata f. sp. citri

3,1 Kg de milho de canjica

200 mL de Etanol 24 h

43 g

200 mL de Etanol meio moído 24 h

28 g

200 mL de CH

meio moído 5 dias

(08/07/04 até 13/07/04)

200 mL de CH

meio moído 6 dias

(13/07/04 até 19/07/04)

200 mL de MeOH meio moído 13 dias

(22/07/04 até 10/08/04) 8,5 g

Unidos 47 g

3.4.4 - Isolamento dos Metabólitos Secundários de A. alternata

Iniciou-se o isolamento dos metabólitos secundários de A. alternata

cultivado em milho em grande escala. O primeiro extrato a ser fracionado foi o

extrato EtOH do meio intacto (sem moer) como ilustrado no Fluxograma 2 à

seguir.

Fluxograma 2. Isolamento dos metabólitos secundários de A. alternata.

Aa_EtOH_9:1_10_9

68,4403 mg

Aa_EtOH_9:1_10_9C

16,70 mg

1 ... ... 13

Aa_EtOH_9:1_10_9A

18,40 mg

Aa_EtOH_9:1_10_9B

2,80 mg

Alternaria alternata f. sp. citri

Extrato EtOH (42,27 g)

meio milho

Hexano 100% 2,0 L

(0,7484 g)

Hex: CH

1:1 2,0 L

(0,2350 g)

100% 3,0 L

(1,8240 g)

:MeOH 9:1 4,0 L

(1,5595 g)

:MeOH 1:1 2,0 L

(13,5542 g)

MeOH 100% 2,0 L

(8,6859 g)

Aa_EtOH_9:1_11 e Aa_EtOH_9:1_12

1,3270 g

Aa_EtOH_9:1_10

280,0 mg

1 ... ... 15

Aa_EtOH_9:1_10_9B_A

15,60 mg

Aa_EtOH_9:1_10_9C_B

14,80 mg

a: Coluna cromatográfica de dimensões h x d = 32,0 x 5,5 cm empacotada com 269,4 g de

sílica comum

b: Coluna cromatográfica de dimensões h x d = 43,5 x 5,0 cm empacotada com 191,0 g de

sílica Flash. Eluição gradiente utilizando proporções de Hexano, CH

e MeOH, em

seguida misturas de CH

e MeOH e por final MeOH.

c: Coluna cromatográfica de dimensões h x d = 38,0 x 3,4 cm empacotada com 62,8 g de sílica

Flash. Eluição gradiente utilizando CH

proporções de CH

e MeOH e por final

MeOH.

d: Cromatografia em camada delgada preparativa de dimensões h x d = 20,0 x 20,0 cm com

camada de 1 mm de sílica. Eluição utilizando CH

:MeOH 93:7.

e: Cromatografia em camada delgada preparativa de dimensões h x d = 20,0 x 20,0 cm com

camada de 1 mm de sílica. Eluição utilizando CH

:MeOH 93:7.

Fluxograma 2.1. Continuação do Fluxograma 2 para o isolamento dos

metabólitos secundários de A. alternata.

Aa_EtOH_9:1_11 e Aa_EtOH_9:1_12

1,3270 g

Aa_EtOH_9:1_11_13 e Aa_EtOH_9:1_11_14

45,9 mg

Aa_EtOH_9:1_11_3

41,7 mg

Aa_EtOH_9:1_11_5

alícota de 45,0 mg

1 ...

12,9 mg

4,20 mg

3,80 mg

14,1 mg

1,10 mg

2,60 mg

8,20 mg

1,60 mg

4,10 mg

Aa_EtOH_9:1_11_13_1

36,2 mg

... 7

13_1B

0.40 mg

13_1A

1,20 mg

13_1C

30,3 mg

3DE

12,3 mg

Aa_EtOH_9:1_11_3DE_A

2,20 mg

Aa_EtOH_9:1_11_3DE_B

5,80 mg

f: Coluna cromatográfica de dimensões h x d = 40,0 x 3,0 cm empacotada com 76,7 g de sílica

Flash. Eluição gradiente utilizando proporções de CH

e MeOH e por final MeOH.

g: Cromatografia em camada delgada preparativa de dimensões h x d = 20,0 x 20,0 cm com

camada de 1 mm de sílica. Eluição utilizando CH

:MeOH 94:6.

h: Cromatografia em camada delgada preparativa de dimensões h x d = 20,0 x 20,0 cm com

camada de 1 mm de sílica. Eluição utilizando CH

:MeOH 94:6.

i: Cromatografia em camada delgada preparativa de dimensões h x d = 20,0 x 20,0 cm com

camada de 1 mm de sílica. Eluição utilizando CH

:MeOH 93:7.

j: Coluna cromatográfica de dimensões h x d = 72,0 x 2,40 cm empacotada com Sephadex LH

20. Eluição isocrática utilizando MeOH.

K: Cromatografia em camada delgada preparativa de dimensões h x d = 20,0 x 20,0 cm com

camada de 1 mm de sílica. Eluição utilizando CH

:MeOH 90:10.

3.4.5 - Desenvolvimento da Análise Via HPLC-UV Para a

Construção da Curva de Produção do Alternariol e Alternariol

Monometil Éter

Neste tópico está relatado o desenvolvimento de análise via HPLC-UV

para a construção da curva de produção das micotoxinas alternariol (AOH) e

alternariol monometil éter (AME). Essas micotoxinas foram detectadas nos

extratos de A. alternata cultivado em milho, como relatado anteriormente.

3.4.5.1 - Cultivo de A. alternata em Milho Visando a Produção

dos Metabólitos Secundários

O fungo A. alternata foi cultivado em milho de canjica com umidade de

50% v/m, como descrito no tópico 3.4.2 (Página 39) Algumas modificações

foram efetuadas com o intuito de reduzir a quantidade do meio de cultivo e

otimizar a extração dos metabólitos a serem analisados. Num total de 30

erlenmeyers de 100 mL foram adicionados 20 g de milho de canjica moída em

cada frasco.

3.4.5.2 - Condições Cromatográficas (HPLC-UV)

Todas as análises cromatográficas foram realizadas em um HPLC-UV

Shimadzu equipado com uma controladora SCL-10Avp, bombas LC-10AD e

LC-10ADvp, autoinjetor SIL-10ADvp, detector SPD-M10Avp PDA e

degaseificador DGU-14A. utilizando coluna PHENOMENEX PHENOSPHERE

ODS (250 x 4,6 mm, 5 µm, 80 Å). As análises foram realizadas no modo reverso

de eluição, utilizando CH

CN:MeOH 1:1 v/v acidificado com 1% de ác. fórmico

como sistema B e H

O acidificado com 1% de ác. fórmico como sistema A. A

eluição foi realizada no modo isocrático com 70% de B por 20 minutos. Todas

as análises foram monitoradas a 340 nm.

3.4.5.3 - Construção das Curvas de Calibração de AME e AOH

Para a realização das curvas de produção das duas micotoxinas

encontradas em A. alternata construiu-se curvas de calibração externa em

MeOH para cada uma delas. Para tanto, utilizou-se concentrações de 2 a 1000

µg/mL para o composto AME e concentrações de 10 a 5200µg/mL para o

composto AOH.

3.4.5.4 - Extração e Pré-Purificação dos Metabólitos

Secundários de A. alternata Visando a Construção da Curva de

Produção de AME e AOH

Na segunda etapa deste trabalho, as micotoxinas AME e AOH foram

utilizadas como padrões para o monitoramento da produção das mesmas

durante o metabolismo de A. alternata ao longo de 30 dias. Para o

desenvolvimento dessa etapa realizou-se o cultivo do microrganismo em escala

reduzida utilizando 30 frascos de Erlenmeyer de 100 mL contendo 20 g de

milho tipo canjica (Ioki



) com 50 % de umidade (m/v) cada. Entre os intervalos

de 5 dias foram realizadas extrações dos metabólitos secundários de A.

alternata. Essas extrações foram realizadas em triplicata (três frascos do meio

de cultivo) adicionando-se 40 mL de EtOH em cada frasco e filtrando a

suspensão em funil de Büchner com papel de filtro (INLAB tipo 10, porosidade

3,0 µm). Esse procedimento foi repetido por três vezes para cada frasco

obtendo-se um volume total de 120 mL.

A pré-purificação foi realizada condicionando, previamente, um cartucho

de extração em fase sólida (Supelco LC-18/3 mL) com 10 mL de EtOH. Em

seguida, o cartucho de SPE foi eluído com 50,0 mL da solução do extrato

realizado anteriormente. O eluído obtido foi analisado via HPLC injetando-se 10

µL. As substâncias interferentes retidas no cartucho de SPE foram, então,

eluídas com 5,0 mL de CH

CN e descartadas.

Todo esse procedimento está ilustrado na Figura 16 representada

abaixo.

Figura 16.

Extração e pré-purificação dos metabólitos secundários de A.

alternata.

3.4.6 – Quantificação de Alternariol e Alternariol Monometil Éter

No Flavedo e No Albedo de Tangerinas (Citrus reticulata) Com

Sintomas de Mancha Marrom de Alternaria

Todos os dados referentes a este item estão apresentados no trabalho

publicado de MAGNANI et. al. 2007.

3.4.6.1 – Material Vegetal

As tangerinas utilizadas neste experimento (Citrus reticulata), com e sem

sintomas da doença mancha marrom de alternaria, foram coletadas na cidade

de Aguaí localizada no centro do estado de São Paulo no mês de abril de 2004.

Frutos saudáveis também foram coletados em um supermercado na cidade do

Recife, capital do estado de Pernambuco, região onde a doença aqui estudada

ainda não foi encontrada. As tangerinas utilizadas durante este experimento

foram manualmente descascadas com o auxílio de uma faca de forma a

separar o albedo do flavedo. Esses dois materiais foram desidratados em

estufa sob temperatura de 45

C durante três dias e em seguida esse material

foi moído em moinho de facas (TECNAL Turratec



) até a forma de pó.

3.4.6.2 – Solução de Padrões e Curvas Analíticas

Foram preparadas em metanol (JT Baker, grau HPLC, Ecatepec,

Mexico) soluções estoque para o AOH e para o AME na concentração de 100

µg/mL. As soluções de trabalho foram preparadas nas concentrações de 0,1;

0,2; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 ng/mL (ppt) através da diluição da solução estoque.

Alíquotas de 1 mL das soluções de trabalho foram adicionadas a 9 mL de

acetonitrila (JT Baker, grau HPLC, Ecatepec, Mexico) onde estas soluções

foram adicionadas a 200 mg do flavedo desidratado e moído. Em seguida foi

realizado o procedimento descrito no item 3.4.6.3. O mesmo procedimento foi

realizado para o albedo.

As curvas de calibração foram obtidas em replicatas de seis. O intervalo

dinâmico utilizado foi de 0,5 a 20 µg/kg em todas as análises. As curvas de

calibração foram obtidas usando um fator de peso de 1/X plotando a

concentração (µg/kg) no eixo x e a área obtida pela integração da banda

produzida pelo experimento de SRM no eixo y.

3.4.6.3 – Extração e Preparo de Amostra

O procedimento utilizado para a extração e preparo de amostra foi

realizado como uma adaptação do trabalho de LAU et. al., 2003. Tanto o

flavedo quanto o albedo (200 mg) foram extraídos com 10 mL de acetonitrila

(JT Baker, grau HPLC, Ecatepec, Mexico) contendo 1% de ácido acético (JT

Baker, Ecatepec, Mexico). Esta suspensão foi mantida em banho de ultra-som

(Branson 1510, Danbury, CT) durante 5 min e em seguida filtrada. Tanto o

papel de filtro (JProlab, JP40 Quantitativo ∅ = 12.5 cm, São José dos Pinhais,

Brasil) quanto o funil analítico utilizados no procedimento de filtração foram em

seguida lavados três vezes com 2 mL do mesmo solvente de extração. Logo

após, o solvente foi evaporado sob fluxo contínuo de nitrogênio (TurboVap II,

Zymark, Hessen, Germany) com temperatura controlada de 58

C e o resíduo

foi reconstituído com 1.5 mL de acetato de etila (JT Baker, HPLC grade,

Ecatepec, Mexico).

O preparo da amostra constituiu de clean-up aplicando o extrato

reconstituído em acetato de etila em cartucho de SPE contendo fase

estacionária aminopropil (Varian, 3 mL/500 mg, Palo Alto, Ca) previamente

condicionado com 6 mL de diclorometano (JT Baker, grau HPLC, Ecatepec,

Mexico). Em seguida, o cartucho foi lavado com 2 mL de acetona (JT Baker,

grau HPLC, Ecatepec, Mexico) e com 2 mL de acetonirila. Para a eluição dos

alternarióis foram utilizados 4 mL de acetonitrila com 1% de ácido acético. Em

seguida esta fração foi concentrada sob fluxo de nitrogênio e reconstituída em

1 mL de acetonitrila : água 4:1. Todos os solventes utilizados tanto na extração

quanto no preparo da amostra foram de grau HPLC.

Todo este procedimento está ilustrado na Figura 17.

Figura 17. Extração e pré-purificação das micotoxinas AOH e AME de A.

alternata.

3.4.6.4 – Otimização dos Parâmetros Utilizados No LC-MS/MS

O equipamento utilizado durante as análises consistiu de um HPLC

(Waters Alliance 2795, Manchester, UK) acoplado a um espectrômetro de

massas com analisador duplo quadrupolar (Waters Quattro Premier

T-

Wave

, Manchester, UK). Para a otimização dos parâmetros cromatográficos

bem como as sintonias realizadas no espectrômetro de massas foi utilizada

uma coluna analítica ODS (Alltech, Inertisil 250 x 4,6 mm, 5 µm, Deerfield, IL)

onde foram injetados 15 µL das soluções de AOH e AME nas concentrações

de 100 ng/mL. Para isso, utilizou-se uma vazão de 0.95 mL/min da fase móvel

isocrática metanol:água 4:1 onde a entrada da amostra no espectrômetro de

massas foi ajustada com o auxílio de um splitter para a proporção de 2:1

(descarte:MS). As amostras foram ionizadas utilizando uma fonte de

electrospray (ES) operando no modo negativo onde a temperatura do bloco da

fonte estava ajustada com a temperatura de 100

C e a temperatura do probe

ajustada em 300

C. O fluxo do gás de secagem bem como os parâmetros de

ionização do capilar, cone e extrator foram ajustados utilizando infusão direta

na fonte de ES. Os fluxos de nitrogênio do nebulizador e do gás de

desolvatação foram ajustados em 20 e 500 L/h. A voltagem do capilar foi

mantida em 3.0 kV durante todo o experimento. Para os experimentos de SRM

(selected reaction monitoring) foram selecionadas duas transições para cada

analito: Para o AOH foi selecionada a transição 257 → 213 para ser utilizada

como transição de quantificação e a transição 257 → 215 para ser utilizada

como transição de confirmação, mantendo o cone a 25 V e a energia de colisão

em 25 eV; para o AME foi selecionada a transição 271 → 256 para ser utilizada

como transição de quantificação e a transição 271 → 228 para ser utilizada

como transição de confirmação, mantendo o cone a 35 V e a energia de colisão

em 30 eV. O parâmetro de dwell-time também foram otimizados visando obter

maior sensibilidade para os analitos. Dessa forma, variou-se o dwell-time de

0.1 até 0.8 s (com acréscimo de 0.1 por análise) e o inter-scan delay de 0.005

até 0.05 s (com acréscimo de 0.005 por análise). Os valores que implicaram

em melhor sensibilidade foram registrados através dos valores 0.3 e 0.01

respectivamente. A pressão do gás de colisão (argônio) foi mantido em 5.70.e

-3

durante todos os experimentos.

3.4.6.5 – Limite de Detecção e Limite de Quantificação

Os limites de detecção (LD) foram definidos de acordo com a menor

concentração dos analitos que apresentaram em suas análises uma relação

sinal-ruído (S/R) igual a três. Os limites de quantificação (LQ) foram definidos

como a menor concentração em que a relação-ruído fosse igual a dez. Estes

dois parâmetros em questão foram considerados adequados desde que a área

da banda cromatográfica pudesse ser medida com precisão e exatidão

aceitáveis.

3.4.6.6 – Especificidade, Linearidade e Precisão

A especificidade das análises foi atingida devido à utilização das

transições específicas de cada composto utilizando o experimento SRM. A

linearidade foi avaliada através do coeficiente de determinação das curvas

analíticas (r

). E a precisão foi avaliada através do desvio padrão relativo

calculado durante as análises tanto intra-dia quanto inter-dia.

3.4.6.7 – Recuperação

A exatidão do método foi determinada utilizando as recuperações. Para

tanto, o cálculo da recuperação foi realizado comparando os pontos da curva

de calibração em matriz com os mesmos pontos da curva de calibração em

metanol.

3.5 - Aplicação das Metodologias de TLC, PCR, HPLC-DAD e

HPLC-MS/MS Na Avaliação da Diferença de Metabolismo

Encontrada Em Plantas Com Sintomas de Greening

Nessa etapa do trabalho, realizaram-se as análises por HPLC-DAD e

HPLC-MS/MS das amostras analisadas anteriormente pelos pesquisadores do

FUNDECITRUS utilizando TLC e PCR para a constatação da doença Greening

em citros.

Nas décadas de 60 e 70, a TLC foi empregada com sucesso na

indexação e diagnose do Greening em plantas cítricas, devido à ocorrência de

um composto fenólico glicosilado, identificado como um glicosídeo do ácido

gentísico chamado orbicularina (Figura 18) nas plantas doentes (SCHWARZ,

1968; VAN VUUREN, 1977; FELDMAN, 1969). Essa constatação, até hoje, é

avaliada com o surgimento de uma mancha azulada com Rf 0,3 quando

extratos aquosos das folhas do enxerto são analisados com fase móvel n-

Butanol saturado com água em TLC contendo sílica como fase estacionária e

revelada em lâmpada de UV no comprimento de onda de 360 nm.

O diagnóstico da doença apenas por TLC é bastante subjetivo, uma vez

que esse método analítico é pouco sensível e a concentração de Orbicularina

nas plantas doentes é bastante baixa.

Dessa forma, a análise de plantas de citros para diagnose de Greening

por métodos analíticos mais sensíveis se torna necessário. Assim, esse tópico

relata o desenvolvimento das metodologias de análise dos compostos

presentes no enxerto de citros com sintoma da doença Greening utilizando

HPLC-DAD e HPLC-MS/MS.

OOH

Orbicularina

Figura 18.

Estrutura molecular do Ácido 2-O-

-4C1-glucopiranosídeo

(Orbicularina).

3.5.1 - Coletas dos Materiais Botânicos

Todos os materiais vegetais utilizados nesse trabalho, provenientes da

enxertia de Citrus sinensis sobre Citrus limonea, foram cedidos pelo

FUNDECITRUS – Fundo de Defesa da Citricultura. As plantas, tanto com

sintomas quanto sem sintomas da doença Greening, foram coletadas pelos

técnicos do FUNDECITRUS em fazendas da região de Araraquara e

certificadas pelo pesquisador Dr. Nelson Arno Wulff.

3.5.2 - Extração dos Compostos Polares Presentes nas Folhas

do Enxerto Com Sintomas de Greening

A uma massa de 100 mg das folhas frescas e trituradas adicionou-se

200 µL de H

Essa suspensão foi mantida sob agitação por um período de 2 horas e

filtrada em funil analítico com o auxílio de papel de filtro (INLAB tipo 10,

porosidade 3,0 µm).

Dos 100 µL de extrato aquoso obtido, alíquotas de 20 µL foram

analisadas por TLC, HPLC-DAD e através de HPLC-MS/MS.

Todo esse procedimento está ilustrado na Figura 19 representada

abaixo.

Figura 19.

Extração dos compostos presentes em folhas da enxertia de C.

sienensis sobre C. limonea com sintomas de Greening.

3.5.3 - Condições Utilizadas Durante as Análises dos Extratos

de Plantas com Sintomas de Greening por TLC

As análises utilizando placas de TLC foram realizadas no Departamento

Científico do Fundecitrus. Estas análises foram realizadas aplicando-se 20 µL

do extrato de plantas com sintomas de greening em placas comerciais de TLC.

Em seguida o extrato aplicado era eluído com uma solução de água saturada

com n-butanol. Esta placa era em seguida mantida na capela até que todo o

resíduo do eluente fosse evaporado. Logo após, a placa era revelada sob

lâmpada de UV com comprimento de onda de 360 nm.

3.5.4 - Condições Utilizadas Durante as Análises dos Extratos

de Plantas com Sintomas de Greening por HPLC-DAD

Para o ajuste das condições utilizadas nas análises efetuadas através do

equipamento HPLC-DAD foram utilizados extratos de plantas com sintomas de

greening. Estes extratos foram realizados de acordo com o procedimento

descrito anteriormente no tópico 3.5.2 (Página 52).

O equipamento utilizado durante as análises consistiu de um HPLC-UV

Shimadzu equipado com uma controladora SCL-10Avp, bombas LC-10AD e

LC-10ADvp, autoinjetor SIL-10ADvp, detector SPD-M10Avp DAD e

degaseificador DGU-14A utilizando coluna PHENOMENEX PHENOSPHERE

ODS (250 x 4,6 mm, 5 µm, 80 Å). As análises foram realizadas no modo reverso

de eluição utilizando MeOH acidificado com 1% de ác. fórmico como sistema B

e H

O acidificado com 1% de ác. fórmico como sistema A. A eluição foi

realizada no modo gradiente iniciando-se a análise com 13% da fase B até

atingir 40% em 40 minutos, em seguida aumentou-se a proporção da fase B

até 100% até 45 minutos, onde esta proporção foi mantida isocraticamente até

50 minutos. Os dados referentes à rampa cromatográfica estão ilustrados na

Tabela 4. A vazão da fase móvel foi mantida em 0,7 mL/min e o volume de

injeção de todas as amostras foi de 20 µL. O detector de varredura de diodos

foi ajustado para monitorar o intervalo de comprimento de ondas de 220 até

370 nm, porém, os cromatogramas de todas as amostras foram monitorados

em um comprimento de onda selecionado de 330 nm.

Tabela 4. Condições cromatográficas por eluição gradiente utilizada durante as

análises de plantas com sintomas de Greening.

T (min) MeOH 1% ác.fórmico

(%)

O 1% ác. fórmico

(%)

0.0 13 87

40 40 60

45 100 0

50 100 0

3.5.5 - Condições Utilizadas Durante as Análises dos Extratos

de Plantas com Sintomas de Greening por HPLC-MS/MS

O equipamento utilizado durante as análises consistiu de um HPLC

(Waters Alliance 2795, Manchester, UK) acoplado a um espectrômetro de

massas com analisador duplo quadrupolar (Waters Quattro Premier

T-

Wave

, Manchester, UK). Para a otimização dos parâmetros cromatográficos

bem como as sintonias realizadas no espectrômetro de massas foi utilizada

uma coluna analítica ODS (Alltech, Inertisil 250 x 4.6 mm, 5 µm, Deerfield, IL)

onde foram injetados 15 uL das soluções de ácido gentísico (AG) e ácido

salicílico (AS), ambos nas concentrações de 100 ng/mL. Tanto o AG quanto o

AS foram diluídos até a concentração de 100 ng/mL a partir de soluções

estoque de 100 µg/mL preparadas em metanol grau HPLC. Para o ajuste da

sintonia utilizou-se uma vazão de 0.9 mL/min da fase móvel isocrática

metanol:água 5:95 v/v, ambas acidificadas com 1% de ácido fórmico, onde a

entrada da amostra no espectrômetro de massas foi ajustada com o auxílio de

um divisor de vazão para a proporção de 2:1 (descarte:MS). As amostras foram

ionizadas utilizando uma fonte de electrospray (ES) operando no modo

negativo onde a temperatura do bloco da fonte estava ajustada com a

temperatura de 100

C e a temperatura do probe ajustada em 320

C. O fluxo

do gás de secagem bem como os parâmetros de ionização do capilar, cone e

extrator foram ajustados utilizando infusão direta na fonte de ES. Os fluxos de

nitrogênio do nebulizador e do gás de desolvatação foram ajustados em 50 e

600 L/h. A voltagem do capilar foi mantida em 3.15 kV durante todo o

experimento. Para o monitoramento do AG nos extratos foram realizados

experimentos de SRM (selected reaction monitoring), onde a transição 153 →

109 foi a que apresentou maior sensibilidade mantendo a voltagem do cone em

30 V e a energia de colisão em 15 eV. Ainda, para o monitoramento do AS a

transição 137 → 93 foi a que apresentou maior sensibilidade mantendo a

voltagem do cone em 25 V e a energia de colisão em 15 eV. Os parâmetro de

dwell-time e inter-scan delay também foram otimizados visando obter maior

sensibilidade para os analitos. Os valores que implicaram em melhor

sensibilidade para os dois analitos foram registrados através dos valores 0.1 e

0.01 respectivamente. A pressão do gás de colisão (argônio) foi mantida em

3.60.e

-3

mbar durante todos os experimentos.

Ainda, com a intenção de monitorar os glicosídeos do AG (orbicularina)

e do AS (ácido β-O-D glucosilsalicilico) nos extratos de plantas com sintomas

de greening algumas análises foram realizadas na tentativa de ajustar a

sintonia do equipamento para a detecção destes compostos. Porém estes

ajustes não foram realizados utilizando padrões destas substâncias, mas sim

utilizando o próprio extrato de uma planta com sintomas da doença greening.

Para realizar as sintonias necessárias foram utilizadas, como parâmetro inicial,

as mesmas condições anteriormente ajustadas para os padrões AG e AS.

Dessa forma, foram somadas as massas encontradas para o as moléculas

desprotonadas AG ([M-H]

= 153) e AS ([M-H]

= 137) a massa que

representasse como substituinte uma molécula de glicose (162 u.m.a.). Ou

seja, para a orbicularina monitorou-se o íon [M-H-H+glicose]

= 315 e para o

ácido β-O-D glucosilsalicilico monitorou-se o íon [M-H-H+glicose]

= 299.

Assim, para o monitoramento da orbicularina nos extratos foram

realizados experimentos de SRM, onde a transição 315 → 153 foi selecionada

para ser utilizada como transição de quantificação e a transição 315 → 109

para ser utilizada como transição de confirmação, ambas mantendo-se o cone

em 50 V e a energia de colisão em 30 eV. E para o monitoramento do ácido β-

O-D glucosilsalicilico foram selecionadas as transições 299 → 137 mantendo-

se o cone em 30 V e a energia de colisão em 15 eV para ser utilizada como

transição de quantificação, e a transição 299 → 93 para ser utilizada como

transição de confirmação mantendo-se o cone em 30 V e a energia de colisão

em 35 eV.

Durante as análises das moléculas AG e AS e supostamente das

moléculas orbicularina e ácido β-O-D glucosilsalicilico utilizou-se eluição no

modo gradiente com um tempo de análise de 25 min (Tabela 5). Todos os

outros parâmetros utilizados foram os mesmo aplicados no desenvolvimento

descrito acima.

Tabela 5. Eluição gradiente utilizada durante as análises de plantas com

sintomas de greening.

T (min) MeOH 1% ác.fórmico

(%)

O 1% ác. fórmico

(%)

0.0 5 95

15 100 0

25 100 0

3.6 - Realização dos Ensaios de Inibição de Guignardia

citricarpa, in vitro, Pelo Método de Germinação de Esporos Em

Placa de Poliestireno

Para a obtenção dos esporos de G. citricarpa, o fungo foi crescido sobre

folhas (cortadas com um vazador metálico com 2 cm de diâmetro) de Citrus, os

quais foram autoclavados em água destilada por 20 minutos e colocados em

placa de Petri (h X φ = 12 X 90 mm) com meio agar-água (1,5%), sendo 5

fragmentos por placa. Em pontos próximos ao fragmento de folha, foram

colocados discos de micélio (colônias com 20 dias de crescimeto em BDA)

(Figura 20 – a). Ao final de 14 dias observou-se, com a ajuda de Lupa, a

presença de uma matriz gelatinosa no ostíolo do picnídio (Figura 20 – b). Essa

matriz gelatinosa foi coletada, sob Lupa (aumento de 200 x), com auxílio de um

alfinete entomológico, sendo em seguida, essa massa utilizada para o preparo

das suspensões de conídios (1 x 10

conídios mL

-1

) (Figura 20 – c),

quantificados em câmara de Newbauer. Os picnidiósporos foram obtidos de

uma massa gelatinosa presente no ostíolo dos picnídios, de acordo com

MCONIE, 1964 & 1967 & BLANCO, 1999. A viabilidade dos picnidiósporos foi

observada em lâminas de poliestireno, em microscópio ótico (aumento de 400

x) e confirmada a partir da germinação dos mesmos, em H

O (destilada

esterilizada), após 12 h de inoculação em câmara de crescimento a 25

C e

fotoperíodo intercalando 12 h de luz e 12 h de escuro.

Para a produção das lâminas de poliestireno, obteve-se uma solução de

poliestireno, através da dissolução de uma placa de petri de poliestireno (h X φ

=12 X 90 mm) moída em 100,0 mL de acetato de amila. Em seguida,

mergulhou-se um número desejado de lâminas de vidro nessa solução de

poliestireno e deixou-se secar por um período de 6 horas em capela, obtendo-

se, assim, um filme de poliestireno nas lâminas de vidro. A lâmina de vidro

coberta pelo filme de poliestireno teve a função de mimetizar a superfície

hidrofóbica das folhas de Citrus.

Montou-se o experimento de forma a tomar uma placa de petri de vidro

(h X φ =12 X 90 mm), forrando-se o seu fundo com papel de filtro circular e

adicionando-se uma lâmina de vidro sem o filme de poliestireno sobre este

papel de filtro. Sobre esta lâmina, sobrepôs-se, em forma de cruz, uma outra

lâmina de vidro contendo o filme de poliestireno, umedecendo, em seguida, o

papel de filtro com água destilada (Figura 20 – d) (LEITE & NICHOLSON,

1992).

O experimento foi conduzido adicionando-se 40 µL da suspensão de

esporos mais 40 µL da solução do composto a ser testado sobre a lâmina de

vidro coberta com o filme de poliestireno. As placas de Petri contendo o

experimento foram seladas com plástico transparente e incubadas em câmara

de crescimento à temperatura de 26

C e luz fluorescente constante por 12 h.

Com o auxílio de um microscópio ótico foi possível observar a

germinação dos conídios, nos períodos de 12, 18 e 24 horas do início do

experimento. Foram considerados como germinados os conídios com tubos

germinativos maiores do que o comprimento do próprio picnidiósporo (

Figura

20 – e, f

) (GLIENKE, 1995). Se não houvesse germinação dos conídios, dentro

do período de 24 horas, o composto testado poderia ser considerado como um

agente fungitóxico.

Figura 20

. Desenvolvimento do ensaio de inibição de G. citricarpa, in vitro, pelo

método de germinação de esporos em placa de poliestireno.

a ) Cultivo sobre folhas

de laranjeira

b ) Coleta dos esporos com o

auxílio de lupa e alfinete

c ) Suspensão de esporos

12 h

16 h

400 X

10-15

dias

d ) Ensaio em placa

de poliestireno

e )f )

3.6.1 - Compostos Utilizados No Ensaio de Inibição de

Guignardia citricarpa, in vitro

Os compostos que foram testados frente à inibição dos apressórios de

G. citricarpa, bem como a concentração utilizada de cada um deles, estão

representados na Tabela 6 e Figuras 21 e 22. As substâncias ácido 3,4,5-

trimetoxibenzóico, ácido 3,4-dimetoxibenzóico, ácido 3,5-dinitrobenzóico, ácido

salicílico, ácido gentísico, flavona, naringina, rutina e hesperidina utilizadas no

ENSAIO 1 foram todas obtidas comercialmente. Já as substâncias xantiletina,

seselina, suberosina, crenulatina, tamatina, limonianina e 5-Hidroxinoracrinicina

utilizadas no ENSAIO 2 foram obtidas a partir do fracionamento cromatográfico

do porta-enxerto de C. sinensis sobre C. limonia, realizado no Laboratório de

Produtos Naturais do DQ-UFSCar onde este experimento está descrito com

detalhes no capítulo 1 da tese do pesquisador Alan Bezerra Ribeiro (RIBEIRO,

2006). A substância alternariol monometil éter foi obtida como metabólito

secundário do microrganismo fitopatogênico Alternaria alternata e o ácido

clorogênico foi obtido de plantas de Coffea arábica, estas duas substâncias

foram isoladas e identificadas no Laboratório de Espectrometria de Massas e

no Laboratório de Microbiologia Micromolecular do DQ-UFSCar.

Todos os compostos foram diluídos em 1 mL de H

O (tubos eppendorf

de 1 mL) e mantidos em banho maria sob a temperatura controlada de 45

por um período de 20 minutos, até a total solubilização.

Ainda, com o intuito de testar outros solventes para à solubilização das

substâncias empregadas nesse ensaio biológico, foram testados o solvente

DMSO (dimetilsulfóxido) e a mistura de DMSO:H

O 1:1.

Tabela 6. Compostos que foram utilizados no ensaio de inibição dos

apressórios de G. citricarpa.

ENSAIO 1

Substância

Fonte

Concentração

Estrutura

Molecular

(Figura 10)

Ácido 3,4,5-trimetoxibenzóico

Sigma

500 µg/mL

Ácido 3,4-dimetoxibenzóico

Sigma

500 µg/mL

Ácido 3,5-dinitrobenzóico

Sigma

500 µg/mL

Ácido Salicílico

Synth

500 µg/mL

Ácido Gentísico

Sigma

500 µg/mL

Ácido Clorogênico

Sigma

500 µg/mL

Flavona

Sigma

500 µg/mL

Naringina

Sigma

500 µg/mL

Rutina

Sigma

500 µg/mL

Hesperidina

Sigma

500 µg/mL

Alternariol Monometil Éter

Isolado de Alternaria alternata

no laboratório

500 µg/mL

Água

40,0 µL

ENSAIO 2

Substância

Fonte

Concentração

Estrutura

Molecular

(Figura 11)

Xantiletina