Download PDF
ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
GILMARA SILVA DE MELO SANTANA
ESTUDO DA FENOTIPAGEM DE QUATRO ENZIMAS METABOLIZADORAS DE
FÁRMACOS EM UMA AMOSTRA DA POPULAÇÃO DO ESTADO DO CEARÁ
FORTALEZA
2004
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
ii
GILMARA SILVA DE MELO SANTANA
ESTUDO DA FENOTIPAGEM DE QUATRO ENZIMAS
METABOLIZADORAS DE FÁRMACOS EM UMA AMOSTRA DA POPULAÇÃO
DO ESTADO DO CEARÁ
Tese submetida à Coordenação do Programa de
Pós-Graduação em Farmacologia, do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal
do Ceará, como requisito parcial para obtenção do
título de Doutor em Farmacologia.
Orientador: Prof. Dra. Maria Elisabete Amaral de
Moraes
FORTALEZA
2004
ads:
iii
GILMARA SILVA DE MELO SANTANA
ESTUDO DA FENOTIPAGEM DE QUATRO ENZIMAS
METABOLIZADORAS DE FÁRMACOS EM UMA AMOSTRA DA POPULAÇÃO
DO ESTADO DO CEARÁ
Tese submetida à Coordenação do Programa de Pós-
Graduação em Farmacologia, do Departamento de
Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina
da Universidade Federal do Ceará, como requisito
parcial para obtenção do título de Doutor em
Farmacologia.
Aprovada em 30 de Janeiro de 2004
BANCA EXAMINADORA
____________________________________________
Profa. Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará - UFC
____________________________________________
Prof. Dr. Gilberto de Nucci
Universidade de São Paulo - USP
____________________________________________
Prof. Dr. François Germain Noel
Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ
____________________________________________
Profa. Dra. Gisela Costa Camarão
Universidade Federal do Ceará - UFC
____________________________________________
Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes
Universidade Federal do Ceará - UFC
iv
A Deus, meu Senhor, por haver me criado,
ter me dado à oportunidade de aprender
aquilo que hoje sei e lembrar-me a cada dia
que ainda preciso ser uma pessoa melhor
v
Ao meu marido Samuel por estar sempre ao
meu lado e dividir comigo alegrias e
tristezas. Perdão meu amor, pelas ausências,
que tão carinhosamente suportastes durante
todos estes anos.
vi
Ao meu filho Felipe. Tua existência me
ensinou a reavaliar muito dos meus valores.
Amo-te Filho
vii
Aos meus pais Eliane e Toni por acreditarem
em mim e nunca se negarem a segurar as
pontas para nos ajudar. Amo muito vocês
viii
A Tita, Dinho e Beca meus queridos irmãos.
ix
Aos verdadeiros Amigos que passaram e
permanecem em minha vida.
x
AGRADECIMENTOS
À Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes, minha orientadora, pelos sete anos de
convivência, onde pude compartilhar de seus conhecimentos científicos e de sua amizade.
Tenha sempre certeza de que a senhora contribuiu muito para que eu chegasse aonde cheguei.
Ao Dr Manoel Odorico de Moraes por acreditar no meu potencial, pelo exemplo,
incentivo constante e pela doação de seus conhecimentos.
Ao Dr Fernando Antônio Frota Bezerra por sua inestimável ajuda na avaliação clínica
dos nossos voluntários, bem como pelo respeito e amizade.
Ao Professor Dr Gilberto De Nucci por compartilhar suas idéias e despertar em mim o
interesse pela fenotipagem de nossos voluntários. Serei sempre uma admiradora tanto dos
seus conhecimentos científicos como da sua simplicidade como ser humano.
À Profa. Dra. Geanne Mattos de Andrade Cunha pelo apoio na validação das
metodologias analíticas.
À Maria Tereza Rocha pelo carinho e incentivo durante todo a minha pós-graduação.
Aos amigos Francisco Evanir Gonçalves de Lima O e Adriano Nunes Cunha do
laboratório analítico por dividir comigo seus conhecimentos práticos e teóricos no manuseio
do HPLC.
Ao Dr René Fumeaux do Centro de Pesquisa da Nestlé (Lausanne – Suíça) que
gentilmente nos cedeu o padrão do AFMU, sem o qual nossa etapa analítica não poderia
acontecer.
Aos amigos estudantes da Unidade de Farmacologia Clínica: Luciana Bessa, Raquel,
Suellen, Demétrius, Ismael, Giovanni, Ismênia, Marne, Fabrine e Aline pela amizade e
carinho que construímos durante todo este período. Vocês moram no meu coração.
xi
Aos amigos da Pós-Graduação e a todos que fazem o Departamento de Fisiologia e
Farmacologia da Faculdade de Medicina da UFC.
Aos amigos da Igreja Cristã Evangélica Betel pelo carinho e apoio.
Aos voluntários da cafeína e demais voluntários da Unidade de Farmacologia Clínica,
sem os quais seria impossível realizar esta pesquisa.
Aos membros da banca examinadora que gentilmente aceitaram contribuir com nosso
trabalho, mesmo durante suas férias.
Ao Instituto Claude Bernard, à Fundação Cearense de Amparo à Pesquisa (FUNCAP)
e ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pelo apoio financeiro.
xii
EPÍGRAFE
Senhor! Oxalá que me abençoes muito e me alargues as fronteiras; que
seja comigo a tua mão e me preserves do mal; de modo que não me
sobrevenha mal algum!
I Crônicas 4:9, 10.
xiii
ÍNDICE
AGRADECIMENTOS...........................................................................................................................X
EPÍGRAFE..........................................................................................................................................XII
ÍNDICE ...............................................................................................................................................XIII
LISTA DE TABELAS...................................................................................................................... XVII
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................................XIX
RESUMO.........................................................................................................................................XXIII
ABSTRACT...................................................................................................................................... XXV
INTRODUÇÃO.......................................................................................................................................2
1 METABOLISMO DOS FÁRMACOS.........................................................................................3
1.1 REAÇÕES FASE I .......................................................................................................................... 4
1.1.1 Oxidação...........................................................................................................................5
1.1.1.1 Famílias do Citocromo P450 .......................................................................................................6
1.1.2 Hidrólise............................................................................................................................8
1.1.3 Redução.............................................................................................................................9
1.2 REAÇÕES DA FASE II ...................................................................................................................9
1.2.1 Glicuronidação..................................................................................................................9
1.2.2 Acetilação........................................................................................................................10
1.2.3 Metilação.........................................................................................................................11
2 FARMACOGENÉTICA.............................................................................................................11
2.1 POLIMORFISMO.......................................................................................................................... 12
2.1.1 Polimorfismo de Acetilação ............................................................................................14
2.1.2 Polimorfismo de Oxidação..............................................................................................15
2.1.3 Polimorfismo na Hidrólise do Álcool..............................................................................18
2.2 MODELOS HEREDITÁRIOS.......................................................................................................... 19
2.3 CONSEQÜÊNCIAS FARMACOLÓGICAS......................................................................................... 20
2.3.1 Conseqüências Farmacodinâmicas.................................................................................21
2.3.2 Conseqüências Farmacocinéticas...................................................................................22
2.4 VARIAÇÕES ÉTNICAS................................................................................................................. 23
2.5 IMPACTO DA FARMACOGENÉTICA NO DESENVOLVIMENTO DE FÁRMACOS .................................23
2.6 TÉCNICAS USADAS PARA AVALIAÇÃO DA FARMACOGENÉTICA .................................................. 25
2.7 MEDICAMENTOS USADOS COMO FERRAMENTA FARMACOLÓGICA – “PROBE”............................ 26
3 CAFEÍNA.....................................................................................................................................27
3.1 FARMACOLOGIA ........................................................................................................................27
3.2 FARMACOLOGIA CLÍNICA.......................................................................................................... 27
xiv
3.2.1 Farmacocinética..............................................................................................................28
3.2.2 Metabolismo....................................................................................................................29
3.3 TOXICOLOGIA............................................................................................................................ 31
3.4 REAÇÕES ADVERSAS .................................................................................................................31
3.4.1 Efeitos Potencialmente Danosos à Vida..........................................................................31
3.4.2 Overdose Aguda..............................................................................................................32
3.4.3 Efeitos Adversos, Severos ou Irreversíveis......................................................................32
3.4.4 Efeitos Adversos Sintomáticos.........................................................................................32
3.5 CAFEÍNA COMO FÁRMACO “PROBE”...........................................................................................32
4 JUSTIFICATIVA........................................................................................................................33
OBJETIVOS..........................................................................................................................................36
1 GERAIS: ......................................................................................................................................36
2 EPECÍFICOS...............................................................................................................................36
MATERIAL...........................................................................................................................................38
1 ETAPA CLÍNICA.......................................................................................................................38
2 ETAPA ANALÍTICA..................................................................................................................39
3 ANÁLISE ESTATÍSTICA..........................................................................................................42
METODOLOGIA .................................................................................................................................43
1 ETAPA CLÍNICA – PROTOCOLO EXPERIMENTAL........................................................43
1.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO ..................................................................................................... 43
1.2 SELEÇÃO DOS VOLUNTÁRIOS .................................................................................................... 43
1.3 EXAMES LABORATORIAIS.......................................................................................................... 43
1.3.1 Valores de referência dos exames laboratoriais.............................................................44
1.4 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO ........................................................................................................... 44
1.5 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO .......................................................................................................... 44
1.6 CRITÉRIOS PARA RETIRADA DO ESTUDO .................................................................................... 45
1.7 INTERNAMENTO......................................................................................................................... 45
1.7.1 Horários de jejum e de Alimentação:..............................................................................46
1.8 POSOLOGIA:............................................................................................................................... 46
1.9 COLETA DE SANGUE .................................................................................................................. 46
1.10 COLETA DE URINA................................................................................................................ 46
1.11 EFEITOS ADVERSOS............................................................................................................... 47
1.11.1 Definições de efeitos adversos quanto à intensidade......................................................47
1.11.2 Relacionamento suposto com a droga experimental.......................................................47
1.12 ASPECTOS ÉTICOS .................................................................................................................48
1.12.1 Comitê de Ética...............................................................................................................48
1.12.2 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.................................................................48
xv
1.12.3 Confidencialidade...........................................................................................................49
2 ETAPA ANALÍTICA – DETERMINAÇÃO ANALÍTICA DOS METABÓLITOS.............50
2.1 DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO PARA QUANTIFICAÇÃO DOS METABÓLITOS .......... 50
2.1.1 Preparação de soluções padrão e reagentes...................................................................50
2.1.2 Preparação das amostras da curva de calibração..........................................................51
2.1.3 Extração das amostras de urina......................................................................................52
2.1.4 Recuperação....................................................................................................................52
2.1.5 Condições Cromatográficas............................................................................................53
2.1.6 Precisão e Acurácia........................................................................................................53
2.2 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DAS ENZIMAS CYP1A2, NAT2, CYP2A6 E XO...................... 54
2.3 AVALIAÇÃO DO FENÓTIPO DAS ENZIMAS CYP1A2, NAT2, CYP2A6 E XO.............................. 54
2.4 CLASSIFICAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DOS VOLUNTÁRIOS .............................................. 54
3 ETAPA ANALÍTICA – DETERMINAÇÃO E ANÁLISE DOS PARÂMETROS
FARMACOCINÉTICOS....................................................................................................................................
55
3.1 DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO PARA QUANTIFICAÇÃO DA CAFEÍNA .................... 55
3.1.1 Preparação de soluções padrão e reagentes...................................................................55
3.1.2 Preparação das amostras da curva de calibração..........................................................56
3.1.3 Extração das amostras de plasma...................................................................................56
3.1.4 Recuperação....................................................................................................................57
3.1.5 Condições Cromatográficas............................................................................................57
3.1.6 Precisão e Acurácia........................................................................................................58
3.2 PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS DETERMINADOS.................................................................. 58
4 COMPARAÇÃO COM OUTRO ESTUDO FARMACOCINÉTICO....................................59
4.1 ESCOLHA DO FÁRMACO ............................................................................................................. 59
4.2 METODOLOGIA DE COMPARAÇÃO.............................................................................................. 59
5 ANÁLISE ESTATÍSTICA..........................................................................................................60
RESULTADOS......................................................................................................................................62
1 DADOS CLÍNICOS ....................................................................................................................62
1.1 AVALIAÇÃO CLÍNICA................................................................................................................. 62
1.1.1 Exame Cardiológico........................................................................................................62
1.1.2 Eventos Adversos.............................................................................................................62
1.1.3 Exames de Patologia Clínica..........................................................................................63
2 DETERMINAÇÃO ANALÍTICA DOS METABÓLITOS......................................................66
2.1 MÉTODO ANALÍTICO ................................................................................................................. 66
2.1.1 Desenvolvimento e validação do método analítico para quantificação dos metabólitos da
cafeína (1U – 1-metilúrico; 17U – 1,7-dimetilúrico; 1X – metilxantina; 17X – 1,7-dimetilxantina e AFMU
– 5-acetilamino-6-formilamino-3metiluracil)..............................................................................................
66
xvi
2.2 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DAS ENZIMAS CYP1A2, NAT2, CYP2A6 E XO...................... 71
2.3 AVALIAÇÃO DOS FENÓTIPOS DAS ENZIMAS ESTUDADAS ............................................................ 72
2.3.1 CYP1A2...........................................................................................................................72
2.3.2 CYP2A6...........................................................................................................................74
2.3.3 NAT2 ...............................................................................................................................76
2.3.4 XO ...................................................................................................................................78
2.4 CLASSIFICAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DOS VOLUNTÁRIOS .............................................. 80
3 DETERMINAÇÃO E ANÁLISE DOS PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS.............81
3.1 MÉTODO ANALÍTICO ................................................................................................................. 81
3.1.1 Desenvolvimento e validação do método analítico para quantificação da cafeína no
plasma.
81
3.2 DETERMINAÇÃO E COMPARAÇÃO DOS PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS DOS GRUPOS DE
VOLUNTÁRIOS SELECIONADOS
........................................................................................................................... 83
3.2.1 Comparação dos parâmetros farmacocinéticos para a enzima CYP1A2 .......................83
3.2.2 Comparação dos parâmetros farmacocinéticos para a enzima NAT2............................85
3.2.3 Comparação dos parâmetros farmacocinéticos para a enzima XO................................88
3.2.4 Comparação dos parâmetros farmacocinéticos para a enzima CYP2A6 .......................90
4 COMPARAÇÃO COM OUTRO ESTUDO FARMACOCINÉTICO....................................92
4.1 AVALIAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO DE FREQÜÊNCIA DAS ASC DO PROPRANOLOL........................... 92
DISCUSSÃO..........................................................................................................................................95
CONCLUSÕES ...................................................................................................................................103
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..............................................................................................105
GLOSSÁRIO.......................................................................................................................................121
ANEXO 1 - VALORES DE REFERÊNCIA DOS EXAMES LABORATORIAIS. ......................124
ANEXO 2 - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO.................................126
ANEXO 3 - VALORES INDIVIDUAIS DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA...................................128
ANEXO 4 - ABREVIATURAS DOS PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS........................131
ANEXO 5 - DADOS FARMACOCINÉTICOS DOS VOLUNTÁRIOS ........................................132
ANEXO 6 – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA...................................................................164
ANEXO 7 – OUTRAS PUBLICAÇÕES NO PERÍODO DO DOUTORADO...............................165
xvii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Material utilizado na etapa clínica (incluindo: seleção, internamento e coleta de
amostras de urina de 80 voluntários)................................................................................38
Tabela 2 – Medicamento administrado na etapa clínica...........................................................39
Tabela 3- Equipamentos utilizados na etapa clínica.................................................................39
Tabela 4- Material utilizado na etapa analítica.........................................................................40
Tabela 5- Equipamentos utilizados na etapa analítica..............................................................40
Tabela 6 - Componentes do HPLC Shimadzu.........................................................................41
Tabela 7 - Padrões utilizados na etapa analítica.......................................................................41
Tabela 8 - Reagentes utilizados na etapa analítica. ..................................................................42
Tabela 9 - Amostras biológicas utilizadas para quantificação analítica...................................42
Tabela 10. Médias, desvio padrão e medianas dos parâmetros hematológicos dos voluntários
selecionados para o estudo de biodisponibilidade da cafeína, valores correspondentes à
avaliação realizada antes do internamento dos voluntários (pré-estudo). ........................63
Tabela 11. Médias, desvio padrão e medianas dos parâmetros de função hepática dos
voluntários selecionados para o estudo de biodisponibilidade da cafeína, valores
correspondentes à avaliação realizada antes do internamento dos voluntários (pré-
estudo). .............................................................................................................................64
Tabela 12- Médias, desvio padrão e medianas dos parâmetros de função renal dos voluntários
selecionados para o estudo de biodisponibilidade da cafeína, valores correspondentes à
avaliação realizada antes do internamento dos voluntários (pré-estudo). ........................65
Tabela 13- Médias, desvio padrão e medianas dos parâmetros de função metabólica dos
voluntários selecionados para o estudo de biodisponibilidade da cafeína, valores
correspondentes à avaliação realizada antes do internamento dos voluntários (pré-
estudo). .............................................................................................................................65
Tabela 14 - Parâmetros relativos à curva de calibração do método analítico para quantificação
do 1U em urina por HPLC na faixa de concentração de 0,5 a 16μg/mL. ........................68
Tabela 15 - Parâmetros relativos à curva de calibração do método analítico para quantificação
do AFMU em urina por HPLC na faixa de concentração de 2 a 32μg/mL......................
68
Tabela 16- Parâmetros relativos à curva de calibração do método analítico para quantificação
do 1X em urina por HPLC na faixa de concentração de 2 a 32μg/mL. ...........................
69
xviii
Tabela 17. Parâmetros relativos à curva de calibração do método analítico para quantificação
do 17U em urina por HPLC na faixa de concentração de 2 a 32μg/mL. .........................70
Tabela 18 -Parâmetros relativos à curva de calibração do método analítico para quantificação
do 17X em urina por HPLC na faixa de concentração de 2 a 32μg/mL. .........................70
Tabela 19 – Média e Desvio padrão das atividades das enzimas CYP1A2 e CYP2A6 dos 79
voluntários. .......................................................................................................................71
Tabela 20 – Média e Desvio padrão das atividades das enzimas NAT2 e Xantina Oxidase dos
79 voluntários. ..................................................................................................................72
Tabela 21 - Relação dos voluntários classificados em cada grupo, de acordo com a atividade
enzimática.........................................................................................................................80
Tabela 22 - Parâmetros relativos à curva de calibração do método analítico para quantificação
da cafeína no plasma humano por HPLC na faixa de concentração de 0,5 e 8μg/mL.....82
Tabela 23 - Comparação dos parâmetros farmacocinéticos, da cafeína, entre os grupos
CYP1A2-MA e CYP1A2-ME. Os valores estão expressos como média e desvio padrão
(n= 8) ................................................................................................................................84
Tabela 24 - Comparação dos parâmetros farmacocinéticos, da cafeína, entre os grupos NAT2-
MA e NAT2-ME. Os valores estão expressos como média e desvio padrão (n= 8)........87
Tabela 25 - Comparação dos parâmetros farmacocinéticos, da cafeína, entre os grupos XO-
MA e XO-ME. Os valores estão expressos como média e desvio padrão (n= 8) ............89
Tabela 26 - Comparação dos parâmetros farmacocinéticos, da cafeína, entre os grupos
CYP2A6-MA e CYP2A6-ME. Os valores estão expressos como média e desvio padrão
(n= 8) ................................................................................................................................91
Tabela 27- Valores de referência para a Análise Hematológica ............................................124
Tabela 28 - Valores de referência para função hepática.........................................................124
Tabela 29 - Valores de referência para função hepática.........................................................125
Tabela 30 – Valores de referencia para função Renal............................................................125
Tabela 31 - Valores individuais de atividade das enzimas CYP1A2, NAT2, XO e CYP2A6
dos 79 voluntários avaliados, a partir das razões entre os metabólitos da cafeína
avaliados (AFMU, 1U, 1X, 17U, 17X). CYP1A2 = (AFMU + 1X + 1U)/ 17U; CYP2A6
= 17U / (AFMU + 1X + 1U + 17X + 17U); NAT2 = AFMU/ (AFMU + 1X + 1U) e XO
= 1U/ (1X + 1U). ............................................................................................................
128
xix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Estrutura bioquímica da família de enzimas do citocromo P450; onde as helix estão
representadas em vermelho e o grupo heme em verde. Fonte:
www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/proLig/ pdbEntries/1pha/index.gif......................................7
Figura 2. Via metabólica de desmetilação da cafeína, mostrando a retirada do radical metil nas
posições 1, 3 e 7 que formarão a teobromina (37X), paraxantina (17X) e teofilina (13X),
respectivamente ................................................................................................................30
Figura 3. Vias de cascata metabólica da cafeína, mostrando as principais enzimas envolvidas
no metabolismo e os principais metabólitos.....................................................................
30
Figura 4 - Cromatograma da urina repicada com os metabólitos: AFMU, 1U, 1X, 17U, 17X; e
o padrão interno: Teobromina, após a extração com clorofórmio e isopropanol (4:1),
mostrando o grau de separação entre as substâncias analisadas.......................................66
Figura 5 - Curva de calibração do método analítico para a quantificação de 1U em urina por
HPLC na faixa de concentração entre 0,5 e 16μg/mL......................................................67
Figura 6 - Curva de calibração do método analítico para a quantificação de AFMU em urina
por HPLC na faixa de concentração entre 2 e 32μg/mL. .................................................68
Figura 7 - Curva de calibração do método analítico para a quantificação de 1X em urina por
HPLC na faixa de concentração entre 2 e 32μg/mL.........................................................69
Figura 8 - Curva de calibração do método analítico para a quantificação de 17U em urina por
HPLC na faixa de concentração entre 2 e 32μg/mL.........................................................
69
Figura 9 - Curva de calibração do método analítico para a quantificação de 17X em urina por
HPLC na faixa de concentração entre 2 e 32μg/mL.........................................................
70
Figura 10 - Histograma dos valores de atividade da enzima CYP1A2 de 79 voluntários. A
curva indica a distribuição normal esperada.....................................................................73
Figura 11 - Gráfico da análise pelo teste Quantil-Quantil (Q-Q) dos valores de atividade da
enzima CYP1A2 de 79 voluntários. A linha verde representa a distribuição normal e os
pontos vermelhos representam os dados experimentais...................................................73
Figura 12 - Gráfico da análise pelo teste Q-Q dos valores de atividade da enzima CYP1A2 de
79 voluntários. Este gráfico representa o grau de dispersão dos dados experimentais em
relação à distribuição normal............................................................................................74
Figura 13- Histograma dos valores de atividade da enzima CYP2A6 de 81 voluntários A
curva indica a distribuição normal esperada.....................................................................75
xx
Figura 14 - Gráfico da análise pelo teste Quantil-Quantil (Q-Q) dos valores de atividade da
enzima CYP1A2 de 79 voluntários. A linha verde representa a distribuição normal e os
pontos vermelhos representam os dados experimentais...................................................75
Figura 15 - Gráfico da análise pelo teste Q-Q dos valores de atividade da enzima CYP1A2 de
79 voluntários. Este gráfico representa o grau de dispersão dos dados experimentais em
relação à distribuição normal............................................................................................76
Figura 16 - Histograma dos valores de atividade da enzima NAT2 de oitenta e um voluntários.
A curva indica a distribuição normal esperada.................................................................77
Figura 17 - Gráfico da análise pelo teste Quantil-Quantil (Q-Q) dos valores de atividade da
enzima NAT2 de 79 voluntários. A linha verde representa a distribuição normal e os
pontos vermelhos representam os dados experimentais...................................................
77
Figura 18 - Gráfico da análise pelo teste Quantil-Quantil (Q-Q) dos valores de atividade da
enzima NAT2 de 79 voluntários. Este gráfico representa o grau de dispersão dos dados
experimentais em relação à distribuição normal. .............................................................78
Figura 19 - Histograma dos valores de atividade da enzima XO de oitenta e um voluntários. A
curva indica a distribuição normal esperada.....................................................................78
Figura 20 - Gráfico da análise pelo teste Quantil-Quantil (Q-Q) dos valores de atividade da
enzima XO de 79 voluntários. A linha verde representa a distribuição normal e os pontos
vermelhos representam os dados experimentais...............................................................79
Figura 21 - Gráfico da análise pelo teste Q-Q dos valores de atividade da enzima XO de 79
voluntários. Este gráfico representa o grau de dispersão dos dados experimentais em
relação à distribuição normal............................................................................................
79
Figura 22 - Cromatograma referente à amostra de plasma branco, de voluntários sadios,
repicado com cafeína e o padrão interno: Teobromina, após a extração com clorofórmio
e isopropranol (4:1), mostrando o grau de separação entre as substâncias analisadas.....
81
Figura 23 - Curva de calibração do método analítico para a quantificação de cafeína no
plasma humano por HPLC na faixa de concentração entre 0,5 e 8μg/mL.......................82
Figura 24 - Curvas de concentrações plasmáticas (μg/mL) versus tempo (h) após a
administração de um comprimido de cafeína 200mg, comparando os voluntários do
grupo CYP1A2-MA e CYP1A2-ME (n = 8 em cada grupo). ..........................................85
Figura 25 - Curvas de concentrações plasmáticas (ng/mL) versus tempo (h) após a
administração de um comprimido de cafeína 200mg, comparando os voluntários do
grupo NAT2-MA e NAT2-ME (n = 8 em cada grupo)....................................................87
xxi
Figura 26 - Curvas de concentrações plasmáticas (ng/mL) versus tempo (h) após a
administração de um comprimido de cafeína 200mg, comparando os voluntários do
grupo XO-MA e XO-ME (n = 8 em cada grupo).............................................................89
Figura 27 - Curvas de concentrações plasmáticas (ng/mL) versus tempo (h) após a
administração de um comprimido de cafeína 200mg, comparando os voluntários do
grupo CYP2A6-MA e CYP2A6-ME (n = 8 em cada grupo). ..........................................92
Figura 28 – Histograma da distribuição de freqüência das ASC
0-t
de 48 voluntários após a
administração de um comprimido de 40mg de propranolol. A curva demonstra a
distribuição normal esperada............................................................................................
92
Figura 29 - Gráfico da análise pelo teste Quantil- Quantil (Q-Q) dos valores de ASC do
Propranolol de 48 voluntários, após uma dose única de 40mg. A linha verde representa a
distribuição normal e os pontos vermelhos representam os valores individuais de ASC.93
Figura 30 - Gráfico da análise pelo teste Quantil-Quantil (Q-Q) dos valores de ASC do
Propranolol de 48 voluntários, aos uma dose única de 40mg. Este gráfico representa o
grau de dispersão dos dados experimentais em relação à distribuição normal. ...............93
xxii
Resumo
xxiii
RESUMO
ESTUDO DA FENOTIPAGEM DE QUATRO ENZIMAS METABOLIZADORAS DE
FÁRMACOS EM UMA AMOSTRA DA POPULAÇÃO DO ESTADO DO CEARÁ.
Gilmara Silva de Melo Santana
Orientadora: Profa. Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia do Departamento de
Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará para
obtenção do título de Doutor em Farmacologia.
Janeiro/2004
A caracterização do fenótipo acetilador e oxidativo das atividades das enzimas
metabolizadoras é de fundamental relevância para avaliação da resposta farmacológica aos
vários agentes terapêuticos. Os estudos de fenotipagem e genotipagem têm como finalidade
detectar e mensurar polimorfismos nestas enzimas. O estudo teve como objetivo determinar o
perfil fenotípico da atividade metabolizadora das enzimas CYP1A2, CYP2A6, XO e NAT2
em uma amostra de oitenta voluntários saudáveis da população do estado do Ceará, utilizando
a cafeína como fármaco “probe”. Os voluntários foram avaliados através de consulta médica
para confirmação do estado de higidez; as funções metabólicas, hepática e renal foram
avaliadas através de exames laboratoriais hematológicos e bioquímicos. O protocolo clínico
consistiu de um internamento onde os voluntários receberam um comprimido de 200mg de
cafeína e coletas de sangue e urina. As amostras de sangue seguiram os seguintes intervalos a
partir da administração: 0; 0:05; 0:15; 0:25; 0:35; 0:45; 1:00; 1:15; 1:30; 2; 4; 6; 8; 12 e 24
horas. A urina foi colhida em seu volume total durante as 10 horas após a administração, o
volume urinário total foi quantificado e uma alíquota foi armazenada para determinação dos
metabólitos. O protocolo analítico consistiu de dosagem por HPLC das concentrações
plasmáticas de cafeína e das concentrações urinárias dos cinco principais metabólitos da
cafeína: 1U – ácido 1-metilúrico; 17U – ácido 1,7-dimetilúrico; 1X – metilxantina; 17X – 1,7-
dimetilxantina e AFMU – 5-acetilamino-6-formilamino-3-metiluracil. A partir das
concentrações molares urinárias dos metabólitos foram determinadas as atividades das
enzimas: CYP1A2 = (AFMU + 1X + 1U)/ 17U; CYP2A6 = 17U / (AFMU + 1X + 1U + 17X
+ 17U); NAT2 = AFMU/ (AFMU + 1X + 1U) e XO = 1U/ (1X + 1U). Os valores das
atividades enzimáticas foram submetidos a análise por estatística descritiva (histograma) não
apresentando distribuição normal. Foram identificados pelo menos três fenótipos
metabolizadores para as enzimas CYP1A2, NAT2 e XO. Com base na atividade de cada
enzima os voluntários foram divididos em dez grupos organizados categoricamente. Os
voluntários dos grupos de maior e menor atividade enzimática foram escolhidos para
determinação dos parâmetros farmacocinéticos (ASC; t1/2; ke; Vd/Kg; CL). A comparação
destes parâmetros (teste “t” de Student) entre os dois grupos apresentou diferenças
significantes (p<0,05). Nossos resultados sugerem a existência de polimorfismo nas enzimas
estudadas de acordo com a heterogeneidade das atividades enzimáticas na amostra da
população de voluntários saudáveis do estado do Ceará.
xxiv
Abstract
xxv
ABSTRACT
A POPULATION PHENOTYPING STUDY OF FOUR DRUG-METABOLIZING
ENZYMES IN CEARÁ – BRAZIL.
Gilmara Silva de Melo Santana
Orientadora: Maria Elisabete Amaral de Moraes
Thesis presented for the degree of Doctor in Pharmacology by the Department of
Pharmacology and Physiology of the Federal University of Ceará
Characterization of acetylator and oxidative metabolizers phenotypes is of clinical
relevance, as it has been shown that the pharmacological response of several therapeutic
agents. The studies of phenotypage and genotipage have as purpose to detect and to mensurar
polimorfismos in these enzymes. In this study, we assessed in vivo activities of CYP1A2,
CYP2A6, Xantine Oxidase (XO) and NAT2 in sample of 82 volunteers (40 men and 42
women) from Ceará – Brazil using caffeine as probe. The volunteers were free from
significant cardiac, hepatic, renal, pulmonary, gastrointestinal and hematological disease, as
assessed by physical investigation, ECG and hematological and biochemical tests. The study
was open, the volunteers were hospitalized, having already had a normal evening meal, and
after an overnight fast they received a single 200 mg dose of caffeine tablet. Blood samples
were collected in regular interview ( 0; 5min; 15min; 25min; 35min; 45min; 1h; 1,25h; 1,5h;
2h; 4h; 6h; 8h; 12h and 24 hour) after the administration of caffeine. Urine was harvested in
its total volume during the 10 hours after the administration of caffeine, the total urinário
volume was quantified and an aliquot one was stored for determination of the metabólitos.
The caffeine was determined in human plasma and the metabolites were determined in human
urinary by HPLC using teobromina as an internal standard. The metabolites assessed were:
1U – 1-methyluric acid; 17U – 1, 7-dimethyluric acid; 1X – 1-methylxantine; 17X – 1, 7-1-
dimethylxantine e AFMU – 5-acetylamino-6-formylamino-3methyluracil. The following
molar ratios were calculated as an index for CYP1A2 activity [(AFMU + 1X + 1U)/ 17U];
CYP2A6 activity [17U / (AFMU + 1X + 1U + 17X + 17U)]; NAT2 activity [AFMU/ (AFMU
+ 1X + 1U)] and Xanthine Oxidase activity [1U/ (1X + 1U)]. The enzymatic activities were
plotted in histogram. The frequency distributions of the CYP1A2, CYP2A6, XO and NAT2
were not normally distributed, showing three phenotypes. Afterwards the volunteers were
classified by enzymatic activities in ten groups, and the lowest and highest metabolizers
groups were chosen to determine the following pharmacokinetic parameters: AUC
0-24
, t
1/2
, ke,
CL and Vd/Kg. The comparison of these parameters (test “t” de Student) between these two
groups it showed significant differences (p<0.05). Our findings may suggest that the
heterogeneous population assessed (health volunteers from Ceará - Brazil) has shown
polymorphism in the enzymatic activities of the CYP1A2, NAT2, XO and CYP2A6
Introdução
2
INTRODUÇÃO
Os seres humanos são diariamente expostos a uma grande variedade de compostos
estranhos denominados xenobióticos. Algumas destas substâncias são inócuas, mas a grande
maioria delas é capaz de promover respostas biológicas devido a suas propriedades químicas,
sendo então denominados fármacos. A interação entre um fármaco e o organismo é
didaticamente dividida em dois processos a farmacodinâmica que compõe a ação do fármaco
sobre o organismo e a farmacocinética que contempla a ação do organismo sobre a droga. Os
processos farmacocinéticos controlam a absorção, distribuição, biotransformação e a excreção
dos fármacos e deste modo são importantes no delineamento dos esquemas terapêuticos.
As propriedades farmacocinéticas dos fármacos são influenciadas por fatores ligados à
formulação e ao indivíduo. Dentre os fatores ligados ao indivíduo destacam-se os
componentes genéticos, étnicos, ambientais e dietéticos. A literatura médica é rica em
exemplos de fármacos que apresentam farmacocinética alterada em resposta a fatores étnicos.
Estas variações envolvem a biodisponibilidade da substância, a distribuição tecidual, a
eliminação e principalmente o metabolismo. Dentre estas as que envolvem o metabolismo
parecem ser as mais importantes, tendo em vista que o metabolismo lança mão de inúmeras
proteínas e enzimas distintas envolvidas nos processos de reconhecimento, recaptação,
distribuição e eliminação das drogas. Com base nestes conceitos é fácil entender como o
polimorfismo genético entre diferentes grupos étnicos pode influenciar fortemente nas
propriedades farmacocinéticas de um composto terapêutico.(WOOD; ZHOU, 1991;
FRACKIEWICZ, SHIOVITZ and JHEE, 2002).
O processo de eliminação de um fármaco do organismo se desenvolve por duas vias
principais: a biotransformação e a excreção. A biotransformação pode ser afetada pela dose
administrada, interações com outros fármacos e principalmente a integridade da função
hepática. O mecanismo de excreção renal é de fundamental importância para garantir que a
atividade biológica cesse, principalmente em se tratando de substâncias de pequeno peso
molecular e acentuada ionização no pH fisiológico. A grande maioria dos fármacos necessita
ser ionizada para que seja eliminada com maior eficácia.
3
1 METABOLISMO DOS FÁRMACOS
O termo metabolismo pode ser definido como o conjunto de reações químicas para a
biotransformação de substâncias endógenas e exógenas (RITSHEL, 1982). De uma forma
geral é o fígado o principal sítio metabólico de fármacos, no entanto, existem outros órgãos
que têm uma atividade considerável como metabolizadores tais como: o trato gastrintestinal,
os pulmões, a pele e os rins (CORREIRA; CASTAGNOLI, 1984).
Ao serem absorvidos no trato gastrintestinal para a corrente sangüínea, os fármacos
são inicialmente transportados, pela circulação porta hepática, para o fígado, onde uma fração
significante é captada e metabolizada pelos hepatócitos ou ainda pelas células de Kupffer.
Este fenômeno de extração ou eliminação de um fármaco da corrente sangüínea durante sua
passagem inicial pela mucosa intestinal e pelo fígado se denomina metabolismo de primeira
passagem. (BENET; KROETZ et al., 1996).
As reações metabólicas têm como função principal fornecer energia para manutenção
e funcionamento do corpo. Essas reações estão divididas em três grandes grupos: as reações
de anabolismo, que realizam biossíntese de moléculas complexas a partir de substâncias mais
simples; as reações de catabolismo, que simplificam estruturas químicas pela sua
decomposição e as reações de conversão ou biotransformação de compostos xenobióticos em
substâncias mais polares para que estas possam ser eliminadas mais facilmente (RITSCHEL,
1982).
O catabolismo tem uma importância relevante no metabolismo dos fármacos uma vez
que exerce grande influência na duração do efeito farmacológico produzido por um
determinado medicamento, bem como na produção de metabólitos, que de modo geral têm
uma atividade menor que o fármaco original, podendo inclusive ser inativo (detoxificação).
Eventualmente, ocorre o fenômeno inverso, onde a biotransformação forma um
metabólito farmacologicamente mais ativo. Nestes casos a substância original é chamada de
precursor inativo ou pró-fármaco. Em suma, os metabólitos de um fármaco podem ter uma
ação farmacológica diferente da ação do composto original, esta ação não necessariamente
constitui um efeito terapêutico, mas também efeitos tóxicos como: mutagenicidade,
4
teratogenicidade e carcinogenicidade (CORREIRA; CASTAGNOLI, 1984; BENET
KROETZ et al, 1996).
As pró-drogas são compostos farmacologicamente inativos destinados a aumentar a
quantidade da forma ativa que atinge o seu local de ação. As pró-drogas inativas são
convertidas rapidamente em metabólitos com atividade biológica, geralmente por hidrólise de
uma ligação éster ou amida (GOODMAN & GILMAN, 10ª ed).
No processo de biotransformação, grande parte das moléculas orgânicas com atividade
farmacológica são substâncias lipofílicas, podendo ou não ser ionizadas ou são ionizadas de
modo parcial em pH fisiológico. Tais características possibilitam uma forte ligação com as
proteínas plasmáticas, dificultando sua filtração glomerular, além do que substâncias de
natureza lipofílica são facilmente reabsorvidas nos túbulos renais. Desta forma, se a
inativação dos fármacos dependesse apenas da excreção renal a grande maioria deles teria um
tempo de atividade bastante prolongado (GOLDSTEIN; ARONOW and KALMAN, 1974).
O metabolismo dos fármacos pode ocorrer por reações químicas espontâneas ou
catalisadas por enzimas celulares específicas. Estas enzimas estão localizadas no retículo
endoplasmático, nas mitocôndrias, ou na membrana plasmática nuclear (BENET; KROETZ et
al., 1996).
Em geral as reações de biotransformação de fármacos são classificadas como reações
de funcionalização da Fase I e reações biossintéticas da Fase II. Os sistemas enzimáticos
envolvidos nas reações da fase I localizam-se no retículo endoplasmático, assim como vários
sistemas enzimáticos de conjugação da fase II ficam no citoplasma ou ainda nos microssomas.
Geralmente, os fármacos biotransformados por uma reação da fase I do retículo
endoplasmático são conjugados na fração citosólica da mesma célula.
1.1 Reações Fase I
Esta fase é responsável pela funcionalização dos xenobióticos, nela ocorre introdução
ou exposição de um grupo funcional ao fármaco, este grupo funcional é relativamente reativo,
5
originando um composto mais polar e, portanto, mais suscetível à excreção. (IYER; SINZ,
1999).
Estas reações estão divididas em oxidação (microssomal, mitocondrial e em outras
organelas), redução e as reações hidrolíticas. De uma forma geral o grupo introduzido se
constituirá um grupo de ataque para o sistema de conjugação da fase II. Se não forem
rapidamente excretados na urina os produtos das reações de biotransformação da fase I podem
interagir com compostos endógenos para formar conjugados altamente hidrossolúveis.
(GOODMAN & GILMAN, 10ª ed.).
Essa fase pode aumentar, diminuir ou manter inalterada a atividade farmacológica,
mas em geral ocorre perda de atividade farmacológica. Em raros casos o metabolismo está
associado a uma alteração da atividade farmacológica (GOODMAN & GILMAN, 10ª ed.).
As principais enzimas da fase I de biotransformação são as isoenzimas das famílias do
citocromo P450 e as isoformas da flavina monooxigenase (IYER; SINZ, 1999).
1.1.1 Oxidação
As reações de oxidação da fase I podem ser microssomais, onde pode haver acréscimo
de um átomo de oxigênio ao substrato ou ainda uma oxidação primária para reestruturação
molecular com perda de uma porção da molécula original (CORREIRA; CASTAGNOLI,
1984).
A oxidação mitocondrial é catalisada pelas enzimas monoaminoxidase e
deaminoxidase; que têm a função de desaminar oxidativamente várias aminas naturais assim
como uma série de fármacos. Os produtos de reação são alquil aril aldeídos que são oxidados
por outras enzimas até ácidos carboxílicos. A monoaminoxidase é uma enzima encontrada
especialmente no fígado, no rim, no intestino e no tecido nervoso. Seus substratos incluem a
feniletilamina, a tiramina, as catecolaminas e os derivados do triptofano. A deaminoxidase
transforma as aminas em aldeídos na presença de oxigênio. Entre os seus substratos se
encontram a histamina e as polimetilendiaminas (BENET; KROETZ et al., 1996).
6
Existem ainda as oxidações de metais que têm importância na farmacologia incluindo
a conversão do arsênio da forma trivalente a pentavalente e o ferro da forma ferrosa a férrica.
Os sulfúricos são oxidados a sulfatos e os compostos disulfídricos a ésteres do ácido sulfúrico
ou ácidos sulfônicos. Os produtos oxidados são menos tóxicos e são excretados rapidamente
(CORREIRA; CASTAGNOLI, 1984).
As enzimas da família da xantina oxidase apresentam como cofator o molibdênio e um
grupamento Fe
2
S
2
; elas são responsáveis pela hidroxilação oxidativa de vários compostos
aromáticos heterocíclicos e aldeídos nas reações que envolvem a quebra de uma ligação C-H.
A xantina oxidase é uma importante fonte de radicais livres derivados de oxigênio e está
também implicada no metabolismo de drogas como a 6-mercaptopurina. Sabe-se que ela
catalisa a 8-hidroxilação da metilxantina in vitro e in vivo. (KISKER, SCHINDELIN and
REES, 1998).
As biotransformações oxidantes que são catalisadas pelas monooxigenases do
citocromo P450 incluem: a hidroxilação da cadeia aromática bilateral; N-desalquilação, O-
desalquilação, S-desalquilação; N-oxidação; Sulfoxidação; N-hidroxilação; desalogenização e
dessulfuração. (WILKINSON, 2001).
1.1.1.1 Famílias do Citocromo P450
A família de enzimas do citocromo P450 é o principal catalisador das reações de
biotransformação dos fármacos. As enzimas do citocromo P450 (designadas pela sigla CYP)
são proteínas da membrana que contém o grupamento heme e estão localizadas no retículo
endoplasmático liso de inúmeros tecidos.
As enzimas do citocromo P450 são hemoproteínas que ativam o oxigênio molecular
para o metabolismo oxidativo de uma grande variedade de constituintes químicos orgânicos e
lipofílicos. Nas células eucariontes as P450 existem como hemoproteínas ligadas às
membranas, cada uma contendo aproximadamente 500 aminoácidos e tendo o ferro-
porfirínico como grupo prostético. Apresentam uma molécula de cisteína localizada próxima
à terminação carboxi da proteína, fornecendo um grupo tiol que é essencial para o ferro heme
7
já que altera a densidade eletrolítica do anel porfirínico, determinando um centro eletrolítico
para ativação do oxigênio molecular. (HASLER, ESTABROOK et al., 1999).
Figura 1 – Estrutura bioquímica da família de enzimas do citocromo P450; onde as helix estão
representadas em vermelho e o grupo heme em verde. Fonte: www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/proLig/
pdbEntries/1pha/index.gif
As reações oxidantes catalisadas pelo sistema de monooxigenases microssômicas
necessitam da hemoproteína no citocromo P450, da NADPH citocromo redutase, do NADPH
e do oxigênio molecular. A primeira etapa consiste da reação do substrato xenobiótico com a
forma oxidada do citocromo P450 (Fe
+3
) para formar um complexo enzima-substrato. Em
seguida a citocromo P450 redutase recebe um elétron do NADPH (que reduz o complexo
oxidativo citocromo P450-xenobiótico). Em seguida o complexo citocromo P450 reduzido
(Fe
+2
) reage com o oxigênio molecular e com um outro elétron do NADPH que foi doado
através da mesma flavoproteína redutase para deste modo formar uma espécie de oxigênio
ativado. Nas etapas finais um átomo de oxigênio é liberado como água e o outro é transferido
para o substrato. Após a liberação do substrato oxidado a enzima citocromo P450 oxidada é
regenerada. (WILKINSON, 2001).
A expressão celular das P450 é regulada por fatores de transcrição os quais tornam-se
ativados durante a exposição a vários agentes químicos. A capacidade de uma substância
química para servir como indutor de transcrição está, geralmente, ligada a uma família do
CYP 450, deste modo os hidrocarbonetos aromáticos, por exemplo, induzirão um tipo de
P450 diferente daquela que os barbitúricos são capazes de induzir. (HASLER, ESTABROOK
et al., 1999).
8
Foram identificadas cerca de 12 famílias de genes do citocromo P450 no homem e em
muitos casos observa-se a presença de vários tipos de enzimas do P450 na mesma célula. O
sistema de classificação padrão da família multigênica do citocromo P450 baseia-se na
semelhança da seqüência de proteínas individuais. Para que as enzimas sejam consideradas da
mesma família devem possuir mais de 40% de aminoácidos semelhantes. Uma família
divide-se em subfamílias, e as enzimas são classificadas em diferentes subfamílias quando
apresentam uma semelhança de seqüência inferior a 60% (WILKINSON, 2001; HASLER,
ESTABROOK et al., 1999).
Dentre as 12 famílias conhecidas, as famílias 1, 2 e 3 do citocromo P450 (CYP1,
CYP2 e CYP3) codificam as enzimas metabolizadoras da maioria dos fármacos e as demais
famílias estão envolvidas na biotransformação de compostos endógenos como os esteróides e
os ácidos graxos.
1.1.2 Hidrólise
No retículo endoplasmático do fígado, do intestino e de outros tecidos humanos foram
identificadas inúmeras estearases e amidases inespecíficas. As reações de hidrólise de ésteres
e amidas expõem grupos álcoois ou aminas que serão substratos adequados para as reações de
conjugação da fase II. (WILKINSON, 2001).
A epóxido hidrolase microssômica pode ser encontrada no retículo endoplasmático de
praticamente todos os tecidos e em geral é considerada uma enzima de desintoxicação, pois
hidrolisa os aneróxidos produzidos pelas reações de oxidação do citocromo P450 que são
altamente reativos; estes anaeróxidos são hidrolisados a metabólitos inativos e hidrossolúveis
(WILKINSON, 2001).
As proteases e peptidases se distribuem nos tecidos e participam da biotransformação
dos fármacos polipeptídicos. A oferta dessas drogas através de membranas biológicas requer a
inibição das enzimas ou a indisponibilidade de seus substratos (WILKINSON, 2001).
As enzimas hidrolíticas conhecidas como estearases e amidases se encontram no
plasma sanguíneo, fígado, rim e outros tecidos. Fármacos como a procainamida, lidocaína e
9
indometacina têm suas amidas hidrolisadas. Já a procaína, succinilcolina, ácido
acetilsalicílico, clofibrato e o metilfenidato são substratos farmacológicos de estearases.
(GOLDSTEIN, ARONOW and KALMAN, 1974; RITSCHEL, 1982).
1.1.3 Redução
As reduções metabólicas dos fármacos, estão presentes no metabolismo do prontosil,
tartrazina, nitrobenzeno, cloranfenicol, metirapona, metadona e do naloxone (GOLDSTEIN,
ARONOW and KALMAN, 1974; RITSCHEL, 1982).
1.2 Reações da Fase II
Nesta fase ocorrem reações de conjugação entre o fármaco ou o seu metabólito
produzido na fase I (BENET; KROETZ et al., 1996; CORREIRA; CASTAGNOLI, 1984;
GOLDSTEIN, ARONOW and KALMAN, 1974; RITSCHEL, 1982), onde o fármaco é ligado
com o ácido glicurônico, sulfato, glutationa, aminoácidos ou acetato. O conjugado, resultante
dessa ligação é, geralmente, farmacologicamente inativo, com lipossolubilidade inferior à do
precursor e altamente polar, o que determina uma rápida excreção renal, biliar ou fecal.
Dentre essas reações temos a glicuronidação, a acetilação, a sulfatação e a metilação.
Alguns fármacos são metabolizados quase completamente por uma via, entretanto, a
grande maioria dos fármacos sofre a ação de diversas vias metabólicas. Nesses casos, a
porcentagem ou a quantidade metabolizada por diferentes vias podem variar individualmente
e, segundo as espécies (WEBER, 1986).
As principais enzimas envolvidas nas reações de fase II são a glutation-S-transferase,
sulfotransferases, Uridina difosfato glucuronil transferases (UDP-glucuronil transferases), N-
acetiltransferases e as metiltransferases (IYER; SINZ, 1999).
1.2.1 Glicuronidação
10
A glicuronidação ocorre quando o ácido glicurônico se liga aos fenóis, álcoois, aminas
aromáticas e ácidos carboxílicos formando seus correspondentes glicuronídicos. As UDP-
glucuronil transferases são as enzimas responsáveis por estas reações e podem ser encontradas
no fígado e em outros tecidos. (GOLDSTEIN; CASTAGNOLI, 1974; RITSCHEL, 1982).
A glicuronidação é a reação quantitativamente mais importante na fase II. A UDP-
glicuronil transferase catalisa a transferência de uma molécula de ácido glicurônico ativada
para álcoois aromáticos e alifáticos, ácidos carboxílicos, aminas e grupos sulfidrilas livres de
compostos exógenos para formarem conjugados O-, N- e S-glicuronato (WILKINSON,
2001).
1.2.2 Acetilação
A acetilação constitui-se uma reação de conjugação onde a acetilcoenzima age como
doadora de um grupo acetil. A coenzima A, por meio de seu grupo sulfidrila livre, reage com
a forma ativa de um ácido carboxílico formando o derivado acetil-CoA; e em seguida o grupo
acetil é transferido para um receptor apropriado (como uma amina aromática). As enzimas
responsáveis são as N-acetiltransferases hepáticas e da mucosa gastrintestinal (citosol). No
fígado encontram-se células reticuloendoteliais que acetilam as hidrazinas, arilaminas,
sulfonamidas. Ao contrário do que ocorre com a maioria dos fármacos, os metabólitos
acetilados são menos hidrossolúveis que os fármacos originais e esta característica prolonga o
seu tempo de eliminação (RITSCHEL, 1982 e WILKINSON, 2001).
A acetilação ocorre por meio de um mecanismo de “ping-pong”, onde o substrato
oscila entre a forma livre e a acetilada. Nesta reação existem dois substratos e dois produtos.
Inicialmente, ocorre a transferência de um grupo acetil, vindo da acetil-CoA, para a enzima
N-acetiltransferase (NAT) para formar um intermediário enzima-acetil (Ac-NAT) unido por
ligação covalente (reação 1). Na segunda fase a acetilação do substrato é efetivada com a
regeneração da enzima livre (reação 2) (MEYER, ZANGER et al., 1990 e WEBER, 1986).
(reação 1) Ac-CoA + NAT Î CoA + Ac-NAT
(reação 2) Ac-NAT + Substrato Î Ac-substrato + NAT
11
1.2.3 Metilação
A metilação ocorre por uma via onde a S-adenosilmetionina age como doador de
grupo metila para formar os derivados N-metil, O-metil (ou metox) e S-metil. As reações de
metilação são catalisadas por diversas transmetilases que se encontram no citosol e seus
substratos incluem as catecolaminas, o fenol, as aminas e a histamina. Geralmente a metilação
ocorre na posição meta (GOLDSTEIN, 1974; RITSCHEL, 1982).
A metilação e a conjugação com os aminoácidos glicina, glutamina e taurina são
reações menos comuns quando se trata de metabolismo de fármacos, no entanto, representa
uma importante etapa do metabolismo de compostos endógenos (WILKINSON, 2001).
2 FARMACOGENÉTICA
Embora se tenha reconhecido durante anos que as diferenças genéticas dos indivíduos
podem modificar suas respostas às drogas, somente durante as duas últimas décadas estudos
sistemáticos foram feitos para avaliar a importância dos caracteres genéticos na eficácia do
fármaco e em suas reações adversas. O estudo científico da variabilidade individual
geneticamente determinada no metabolismo do fármaco e das reações não usuais é chamado
Farmacogenética.
Os chamados distúrbios farmacogenéticos constituem variações na resposta de um
determinado fármaco causado por erros inatos no seu metabolismo enzimático, esses erros
podem envolver tanto as modificações na seqüência genética que irá gerar a enzima (como no
caso das enzimas do sistema do citocromo P450 (CYP P450)) ou ainda na quantidade destas
enzimas (como no caso dos polimorfismos das N-acetiltransferases).
As alterações genéticas encontradas nas diferentes populações exercem importante
influência sobre o metabolismo e a resposta clínica dos fármacos. As diferentes respostas
clínicas encontradas entre determinadas populações podem ser resultado de modificações no
metabolismo ou de fatores geneticamente relacionados. A observação acerca da variação e
descontinuidade no efeito produzido por alguns compostos constitui um ponto de partida da
farmacogenética.
12
Fatores farmacogenéticos podem ser detectados por pesquisa na população, efetuando-
se medidas farmacológicas em vários indivíduos, a fim de determinar se as respostas
coletadas seguem uma distribuição unimodal, bimodal ou multimodal. A distribuição normal,
ou unimodal ocorre quando a população estudada possui características homogêneas. A
bimodalidade sugere a possibilidade de existência de duas subpopulações distintas, indicando
a existência de diferenças genéticas entre os dois grupos. No caso da multimodalidade, reflete
a possibilidade de existência de mais de duas subpopulações distintas.
Quando se trata de metabolismo de um determinado fármaco; a ocorrência de
distribuições não normais sejam elas bimodais ou multimodais pode identificar a existência de
polimorfismo na seqüência genética que determina a enzima metabolizadora. O polimorfismo
é definido como uma característica monogênica ou mendeliana que se expressa na população
em pelo menos dois fenótipos, onde nenhum deles tem freqüência inferior a 1% (LARES-
ASSEFF; TRUJILLO-JIMÉNEZ, 2001).
2.1 Polimorfismo
O polimorfismo denota uma herança, característica, que é controlada por um lócus
gênico com 2 alelos. Tal alteração está presente em cerca de 1% da população. Esta incidência
pode aumentar quando se trata de um grupo com mutações espontâneas. O polimorfismo
genético vem se desenvolvendo durante a evolução, podendo ocorrer como resultados de
processos variados como as mutações pontuais, conversões gênicas, deleções e inserções
(NEBERT et al., 1997 e GULLSTÉN, 2000).
O conhecimento do polimorfismo genético, envolvendo o metabolismo de fármacos,
de uma forma geral, pode ajudar a desvendar graves problemas clínicos, tais como a ausência
de respostas terapêuticas, efeitos adversos e toxicidade medicamentosa. O perfil metabólico
da administração desses medicamentos tem revelado muitos casos de polimorfismo na
população.
Conforme Weinshilboum (1984, apud SPILKER, 1991, p.662) estudos utilizando
eletroforese protéica demonstraram que aproximadamente 25% de todas as enzimas humanas
13
estudadas são polimórficas. Deste modo, há um enorme potencial teórico no estudo da
influência das diferenças genéticas no metabolismo de medicamentos, bem como no aumento
da incidência ou da severidade das reações adversas. Alguns polimorfismos genéticos
representam um importante impacto sobre funções orgânicas essenciais, podendo muitas
vezes constituir fatores de risco como no caso do aumento da predisposição ao
desenvolvimento de cânceres. Outros polimorfismos podem funcionar, por exemplo, ainda
como mecanismos de defesa contra malária e tuberculose (LARES-ASSEFF; TRUJILLO-
JIMÉNEZ, 2001).
As primeiras evidências com respeito à base genética do polimorfismo no
metabolismo surgiram a partir do estudo do metabolismo da isoniazida em humanos, onde
Mitchell e colaboradores em 1958 mostraram que as variações na inativação da isoniazida
poderiam estar sob controle genético. Mais tarde estudos posteriores demonstraram que a
distribuição das freqüências de ocorrência das formas acetilada e inalterada de isoniazida na
urina e no plasma apresentavam características de uma distribuição bimodal (MITCHELL,
RIEMENSNIDER et al., 1958; NERI, 1993).
O Polimorfismo na hidroxilação da debrisoquina tem sido associado com diferenças
pessoais. Os investigadores relatam que hidroxiladores lentos tem alta vitalidade, são menos
alerta, mais eficientes e apresentam falta de iniciativa. Os autores especulam que debrisoquina
hidroxilase ainda está envolvida no metabolismo de substâncias endógenas, importantes para
a função do SNC. A atividade da monoaminoxidase plaquetária também tem sido associada
com peculiaridades individuais.
O conhecimento da predisposição genética para toxicidade a um medicamento
permitirá que os médicos possam evitar muitas reações adversas em pacientes geneticamente
susceptíveis. Isto já tem ocorrido em alguns pacientes que receberam suxametônio durante a
cirurgia, cuja determinação pré-operatória da atividade plasmática da colinesterase foi
satisfatória; outros, ainda através da determinação in vitro da susceptibilidade
farmacogenética para toxicidade aos metabólicos dos medicamentos.
Os polimorfismos são detectados através da observação das diferenças entre
indivíduos ou populações quanto à função enzimática (fenótipo) e da avaliação do gene que
codifica a enzima (genótipo). Nos estudos de fenotipagem in vivo, geralmente um fármaco
14
“probe” é administrado aos voluntários e o metabolismo do fármaco é avaliado pela
determinação da razão entre as concentrações do fármaco mãe e dos metabólitos encontrados
no sangue ou na urina. Alternativamente, se as amostras de tecido estiverem disponíveis a
fenotipagem pode incluir a determinação da atividade da enzima microssomal para substratos
específicos, detecção de níveis da enzima do citocromo P450 por métodos imunológicos, pela
mensuração dos níveis do RNAm que codifica as CYPs através do método de hibridização de
vários ácidos nucléicos ou pelo uso da transcriptase reversa acoplada à reação de polimerase
(RT-PCR). Nos estudos de genotipagem as mutações nos genes são usualmente detectadas
com reações de polimerase (PCR) (HASLER, ESTABROOK et al., 1999).
Em alguns casos, no entanto, variações genéticas estão sendo identificadas e a elas não
se tem associado nenhuma significância funcional, destacando assim a importância de
estabelecer uma ligação entre a variação genética e as possíveis variações fenotípicas.
(HASLER, ESTABROOK et al., 1999)
2.1.1 Polimorfismo de Acetilação
O polimorfismo da N-acetilação é uma das variações genéticas mais comuns na
biotransformação de fármacos e compostos químicos em geral. Este polimorfismo é
determinado pelas enzimas da família das N-acetiltransferases presentes no fígado e no
coração. Deste modo, o polimorfismo da N-acetilação está envolvido nos efeitos terapêuticos
e reações adversas de diversos fármacos que possuem aminas em sua composição. (BLUM,
DEMIERRE et al., 1991; LARES-ASSEFF; TRUJILLO-JIMÉNEZ, 2001)
Do ponto de vista genético, a explicação das referidas diferenças no metabolismo por
acetilação de alguns fármacos está na ocorrência de três genótipos para esta reação: os
acetiladores lentos são homozigotos recessivos (rr), enquanto os acetiladores rápidos são
homozigotos (RR) ou heterozigotos (Rr). O polimorfismo genético é controlado por dois
genes alélicos autossômicos com um lócus único identificado por R (rápidos) e r (lentos).
(CLARK, 1985; EVANS, MANLEY and MCKUSICK, 1960; HERBERT; WEBER, 1986;
JENNE, 1960; MEYER, ZANGER et al., 1990; NERI, 1993; SUNAHARA, URANO and
AGAMA, 1961).
15
Estudos têm demonstrado que a velocidade de acetilação é intensamente influenciada
pela raça e pouco sofre influência do sexo e da idade. Os acetiladores rápidos predominam
entre os esquimós e japoneses, enquanto os acetiladores lentos apresentam uma freqüência
maior e
ntre os caucasianos do norte da África, escandinavos e judeus. (LARES-ASSEFF;
TRUJILLO-JIMÉNEZ, 2001)
O conhecimento do polimorfismo genético da enzima N-acetiltransferase 2 (NAT2)
constitui uma importante ferramenta na prática clínica; já que a alta incidência do fenótipo de
acetiladores lentos determina uma redução significante na velocidade de eliminação de
aminas e hidrazinas aumentando assim o tempo de exposição do corpo aos agentes químicos,
podendo constituir um dos fatores responsáveis pela toxicidade destes fármacos. Os
acetiladores lentos apresentam um maior risco de desenvolvimento de câncer de bexiga,
enquanto os acetiladores rápidos apresentam um maior risco de desenvolvimento de câncer
coloretal, além do que nos acetiladores rápidos não raramente observa-se ineficácia da
terapêutica com tuberculostáticos e anti-hipertensivos (BLUM, DEMIERRE et al., 1991;
LARES-ASSEFF; TRUJILLO-JIMÉNEZ, 2001 e MA, WOO and McLEOD, 2002).
A atividade da expressão de NAT2 pode ser determinada pela fenotipagem de
indivíduos usando os chamados fármacos “probe” como substratos, a fim de explorar a
capacidade metabólica de sistemas enzimáticos. Dentre outros fármacos como a sulfatetazina,
hidralazina, procainamida e isoniazida; a cafeína é amplamente utilizada como “probe” para
determinar o fenótipo acetilador (EVANS, MANLEY and MCKUSICK, 1960; LADERO,
ANDRES at al, 1993; MINERS, BIRKETT 1996 e LARES-ASSEFF; TRUJILLO-JIMÉNEZ,
2001).
Em termos gerais, a bimodalidade do metabolismo pela acetilação nos seres humanos
é comum para um número considerável de fármacos (BRATTON; MARSHALL, 1939;
CHAPRON, KRAMER and MERCIK, 1980; EVANS, 1989).
2.1.2 Polimorfismo de Oxidação
16
O polimorfismo do metabolismo de fármacos divide a população em pelo menos dois
fenótipos: os metabolizadores insuficientes (MI) ou lentos e os metabolizadores extensos
(ME) ou rápidos; denotando uma distribuição de freqüência de característica bimodal
(MEYER, 1994 e HASLER, ESTABROOK et al., 1999).
Polimorfismos têm sido detectados em diversas enzimas metabolizadoras de fármacos,
incluindo as enzimas do citocromo P450 (CYP). As enzimas do CYP que apresentam
polimorfismo genotípico e / ou fenotípico descritos incluem: CYPs 1A1, 1A2, 2A6, 2C9,
2C19, 2D6, 2E1 e 3A4. Dentre estes, os que estão mais bem caracterizados são o
polimorfismo da debrisoquina 4-hidroxilase (CYP2D6) e da S-mefenitoína hidroxilase
(CYP2C19) (KUPFER, ROBERTS, et al., 1981; KUPFER; PREISING, 1984; LARES-
ASSEFF; TRUJILLO-JIMÉNEZ, 2001; WILKINSON, 2001).
A CYP2D6 tem sido associada com o metabolismo de mais de 50 fármacos utilizados
na terapêutica. Vários estudos, realizados com a população européia e caucasiana, têm
demonstrado que a capacidade do fármaco “probe” de metabolizar a conversão da
debrisoquina em 4-hidroxidebrisoquina apresenta uma distribuição bimodal. Sabe-se que a
enzima responsável é a CYP2D6, caracterizando desta forma um polimorfismo na enzima
(MEYER, 1994 e FROMM, KROEMER and EICHELBAUM, 1997).
Os estudos de fenotipagem da enzima CYP2D6, em caucasianos, têm mostrado
consistentemente que 5 a 10% da população são metabolizadores insuficientes (MI),
apresentando índices elevados da razão entre o fármaco “probe” e seu metabólito. No oriental
apenas 1 % da população apresenta este fenótipo (MI). Estudos na população africana têm
demonstrado uma variabilidade maior na prevalência de MI, que se estende de 0 a 19%. Esta
variação pode ser explicada pela heterogeneidade étnica existente no continente africano
(MEYER, 1994; BERTILSSON, DAHL, 1996; KROEMER and EICHELBAUM, 1997 e
MASIMIREMBWA; HASLER, ESTABROOK et al., 1999).
Muitos carcinógenos são metabolizados pelas enzimas CYP1A1 e CYP1A2. Estes
substratos são principalmente hidrocarbonetos aromáticos, como por exemplo, benzopireno,
dimetilbenzantraceno e p-nitrocrisene. Quatro alelos polimórficos de CYP1A1: CYP1A1*2A,
CYP1A1*2B, CYP1A1*3, CYP1A1*4 já foram identificados. A freqüência de ocorrência
destes alelos em diferentes populações é variável sendo de 2,7 a 5,1% em caucasianos; 10 a
17
15% em japoneses; 13,6 a 25,5% em africanos e 2,7 a 22% em afro-americanos. Algumas
variantes de genótipo da CYP1A1 têm sido identificadas como fator de risco para a
ocorrência de câncer de pulmão, especialmente quando estão acompanhadas pelo efeito
sinérgico do p53 mutado (WORMHOUDT, COMMANDEUR and VERMEULEN, 1999 e
GULLSTÉN, 2000).
Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos são os principais substratos da CYP1A2. A
cafeína é outro importante substrato e a sua desmetilação é usada para avaliar a atividade da
enzima (CYP1A2) in vivo. Estudos anteriores demonstraram que a CYP1A2 é induzida pelo
cigarro e pelo omeprazol. Outros estudos têm demonstrado a existência de variações
interindividuais, cujas bases genéticas ainda não estão bem elucidadas (NEBERT,
PETERSEN and PUGA, 1991; SWANSON; BRADFIELD, 1993; TANG; KALOW, 1996;
ZEVIN; BENOWITZ, 1999).
Estudos in vitro com microssomos do fígado humano e estudos de fenotipagem in vivo
têm demonstrado uma clara variação interindividual quanto à atividade da enzima CYP2A6.
Nos estudos iniciais de fenotipagem da CYP2A6 a cumarina foi utilizada como “probe”,
sendo substituída posteriormente pela nicotina, que apresentou bons resultados (RAUTIO,
KRAUL et al., 1992; CHOLERTON, IDLE et al., 1992; PELKONEN; RAUNIO, 1995;
NUNOYA, YOKOI et al., 1996; NUNOYA, YOKOI et al., 1999; NAKAJIMA,
YAMAMOTO et al., 1996a; NAKAJIMA, YAMAMOTO et al., 1996b; SHIMADA,
YAMAZAKI and GUENGERICH, 1996; NAKAJIMA, YAMAGISHI et al., 2000).
A subfamília CYP2C contém três enzimas polimórficas: CYP2C8, CYP2C9 e
CYP2C19. A enzima CYP2C9 está envolvida no metabolismo do S-warfarina, fenitoína,
tolbutamida. Algumas drogas antiinflamatórias não esteroidais também são substratos dessa
enzima, como por exemplo, o diclofenaco, piroxicam, tenoxicam, ibuprofeno e o ácido
acetilsalicílico. A variabilidade individual no metabolismo da tolbutamina e da fenitoína tem
sido observada em estudos clínicos; onde têm sido relatados dois alelos variantes (CYP2C9*2
e CYP2C9*3). A freqüência de ocorrência dos genótipos alterados é de 6 a 19% em
caucasianos, 0 a 2,6% em orientais e 0,5 a 1% em afro-americanos. (WORMHOUDT,
COMMANDEUR and VERMEULEN, 1999 e HIRVONEN, 1999)
18
A CYP2C19, também conhecida como mefenitoína 4-hidroxilase, metaboliza várias
drogas como a S-mefenitoína, omeprazol, diazepam, imipramina e propranolol, dentre outros.
Os principais alelos variantes são CYP2C19*2, CYP2C19*3 e CYP2C19*4. Vários estudos
têm mostrado claramente a ocorrência dos fenótipos de MI e de Metabolizadores extensos
(ME) para a atividade desta enzima. Além da variabilidade interindividual ocorre uma
variabilidade inter-étnica. A freqüência de MI em caucasianos é de 2,5 a 6%; 18 a 23% em
japoneses e 15 a 17% em chineses (MEYER; ZANGER, 1997; GARCIA-BARCELO, CLOW
et al., 1999; INGELMAN-SUNDBERG, 1999; WORMHOUDT, COMMANDEUR and
VERMEULEN, 1999 e ITOH, INOUE et al., 2000).
2.1.3 Polimorfismo na Hidrólise do Álcool
A eliminação do álcool parece estar sob o controle genético, embora a natureza dos
fatores envolvidos ainda não esteja totalmente esclarecida. As enzimas hepáticas álcool
desidrogenase e aldeído desidrogenase são as responsáveis pela oxidação do etanol; sendo a
álcool desidrogenase responsável pela oxidação de aproximadamente 90% do álcool no corpo.
Sua estrutura é controlada por três lócus de genes autossômicos, ADH1, ADH2 e ADH3.
Tanto o ADH1 quanto o ADH3 estão ativos durante a vida fetal, enquanto o ADH2 é
responsável pela atividade da álcool desidrogenase em adultos. (SMITH, HOPKINSON and
HARRIS, 1971; KHANNA; ISRAEL, 1980)
Já se tem conhecimento de pelo menos duas formas da álcool desidrogenase, a
chamada atípica e a usual, que são distinguidas entre si pela atividade catalítica, pH ótimo e
por parâmetros farmacocinéticos. A forma atípica tem maior atividade oxidante do álcool e
está polimorficamente distribuída na população. Além disso, há diferenças inter-étnicas na
freqüência dessas formas; os japoneses e chineses têm uma freqüência muito maior do alelo
atípico (85 a 90%) que os caucasianos (5%) (WATBURG, PAPENBERG and AEBI, 1965;
EDWARDS; EVANS, 1967; WATBURG; SCHÜRCH, 1968; SMITH, HOPKINSON and
HARRIS, 1971).
Sabe-se que os orientais são mais sensíveis aos efeitos adversos do álcool; esta
característica parece estar correlacionada com o aumento das concentrações do acetaldeído
em indivíduos suscetíveis. A habilidade para metabolizar o acetaldeído é também
19
polimorficamente distribuída nas populações com diferenças inter-étnicas na freqüência da
atividade enzimática. Em cerca de 50% dos japoneses e chineses a atividade da isoenzima
aldeído desidrogenase (ALDH
2
) está ausente. Como esta enzima é praticamente responsável
pela oxidação do acetaldeído, tal ausência resulta num aumento das concentrações do
acetaldeído tornando os indivíduos mais suscetíveis aos efeitos do álcool (MIZOI, IJIRI et al.,
1979; HARADA, AGARWAL and GOEDDE, 1980; TENG, JEHAM and KIE-INJO, 1979;
TENG, 1981).
2.2 Modelos Hereditários
Em 1986, WEBER demonstrou que as diferenças hereditárias nos mecanismos de
acetilação estavam associadas com alterações na estrutura e na quantidade da enzima
acetiladora (WEBER, 1986).
Estudos farmacocinéticos com a N-acetiltransferase hepática parcialmente purificada
sugeriram que, com relação aos dois fenótipos (acetiladores rápidos e lentos) ocorre uma
variabilidade na quantidade da enzima, enquanto que a afinidade da enzima pelo substrato não
varia. Sua atividade catalítica final é cerca de 100 vezes superior nos acetiladores rápidos
(HERBERT; WEBER, 1986; MEYER, ZANGER et al., 1990).
A literatura retrata quatro modelos que explicam as diferenças hereditárias na
acetilação para substratos monomórficos e polimórficos
No Modelo I os acetiladores lentos e rápidos têm N-acetiltransferase com
especificação catalítica idêntica para substratos polimórficos, mas os acetiladores rápidos têm
uma maior quantidade de enzima que os acetiladores lentos.
No Modelo II os dois fenótipos se diferenciam quanto às estruturas das N-acetiltransferase
hepática e estas possuem diferentes atividades catalíticas em substratos polimórficos. De
acordo com este modelo o fígado de ambos os acetiladores têm a mesma quantidade N-
acetiltransferase monomórfica diferenciada.
20
No Modelo III os acetiladores lentos e rápidos têm uma espécie de N-acetiltransferase que
catalisa substratos polimórficos e monomórficos. No caso dos lentos eles apresentam outra N-
acetiltransferase monomórfica que acetila os substratos monomórficos mais intensamente que
os polimórficos.
No Modelo IV os diferentes fenótipos apresentam diferentes isoenzimas da N-
acetiltransferase, as quais são estruturalmente diferenciadas.
2.3 Conseqüências Farmacológicas
O conhecimento da bimodalidade no fenótipo das reações de acetilação dos fármacos
numa determinada população compõe uma importante informação para o estabelecimento de
esquemas terapêuticos, já que as reações de toxicidade, conhecidamente, estão intimamente
associadas com o fenótipo acetilador. Observou-se que os acetiladores rápidos apresentam
uma maior incidência de hepatite, diabetes e câncer induzidos por aminas carcinogênicas
como β-naftilamina e 2-aminofluoreno, que são polimorficamente acetiladas em humanos
(GLOWINSKI, RADTKE and WEBER, 1978).
O polimorfismo no gene da N-Acetiltransferase 2 vem sendo associado, na literatura,
com vários efeitos tóxicos induzidos por drogas, bem como câncer em vários tecidos
(FRETLAND, LEFF, DOLL and HEIN 2001).
Sabe-se que alguns fármacos necessitam de doses mais altas para obter efeitos
terapêuticos, no caso dos metabolizados por acetilação tal característica se deve a um aumento
na velocidade de acetilação. Indivíduos acetiladores lentos apresentam uma maior incidência
de Lupus Eritematoso Sistêmico induzido por doses convencionais de hidralazina e
procainamida. Semelhantemente, pacientes acetiladores lentos tratados com doses
convencionais de isoniazida apresentaram uma maior incidência de polineuropatia
(INGILMAN-SUNDBERG, 2001).
A variabilidade genética no metabolismo e na resposta terapêutica de um fármaco é
extensa; a concentração plasmática do fármaco pode variar mais de mil vezes entre dois
indivíduos de mesmo peso e que receberam a mesma dose do medicamento. As causas desta
21
variação podem ser de origem genética, fisiopatológica e ambiental (INGILMAN-
SUNDBERG, 2001).
2.3.1 Conseqüências Farmacodinâmicas
A alta incidência de hipertensão na população chinesa tem sido associada com a
existência de polimorfismos no gene que codifica a enzima conversora de angiotensina (ECA)
ou ainda na atividade plasmática desta enzima. Entretanto, a correlação entre esses fatores
ainda não esteja totalmente esclarecida. As propriedades farmacocinéticas dos inibidores da
ECA tem sido bem estudadas e revela que a diferença entre a população chinesa e os
caucasianos é pequena, porém significante (JENG, HARN et al, 1997; FRACKIEWICZ,
SHIOVITZ and JHEE, 2002).
Com relação ao propranolol, diferenças na farmacodinâmica e na farmacocinética têm
sido observadas entre asiáticos e caucasianos, bem como entre africanos e caucasianos.
Estudos anteriores demonstraram que os chineses são mais sensíveis aos efeitos do
propranolol que os caucasianos. Estes resultados podem ser explicados, em parte, devido
ocorrência de concentrações plasmáticas do propranolol livre mais elevadas na população
chinesa (ZHOU, KOSHAKJI et al, 1989; ZHOU, SHAY et al, 1993).
Vários estudos indicam que os asiáticos apresentam altas concentrações plasmáticas
do haloperidol e baixas concentrações de seu metabólito quando comparados com os
caucasianos que receberam doses semelhantes do haloperidol, como a CYP2D6 está
envolvida no metabolismo do haloperidol. Esta variabilidade étnica tem sido associada com
os diferentes alelos reportados para o gene da CYP2D6. Uma mutação específica no alelo
CYP2D6*10 causa uma diminuição significante da atividade da CYP2D6; logo indivíduos
com o alelo *10 apresentam uma concentração de fármaco no estado de equilíbrio bastante
elevada. Tais alelos ocorrem e cerca de 50 a 70% da população asiática, contra apenas 2% dos
caucasianos (POTKIN, SHEN et al., 1984; JANN, CHANG et al., 1989; CHANG, JANN et
al., 1991; LLERENA, DAHL et al., 1992; ZHANG-WONG, BEISER et al., 1998).
22
2.3.2 Conseqüências Farmacocinéticas
A nifedipina é um agente anti-hipertensivo antagonista dos canais de cálcio que atua
reduzindo a resistência vascular coronariana e aumentando o fluxo sangüíneo coronariano
através da diminuição do influxo de cálcio. Seus parâmetros farmacocinéticos apresentam
uma significante diferenciação em populações de raças distintas. O impacto da raça na
farmacocinética da nifedipina tem sido bem explorado comparando os parâmetros observados
numa população do sul da Ásia com os caucasianos. Vários estudos indicam que a área sob a
curva (ASC) da nifedipina é significantemente maior nos indivíduos do sul da Ásia do que em
caucasianos (AHSAN, RENWICK et al., 1991; AHSAN, RENWICK et al., 1993; RASHID,
MARTIN et al., 1995; FRACKIEWICZ, SHIOVITZ and JHEE, 2002).
Inúmeros fármacos com atividade depressora sob o sistema nervoso central são
metabolizados pela CYP3A4 e exibem uma variabilidade étnica nos seus valores
farmacocinéticos. Usando como exemplo o ansiolítico alprazolam, os asiáticos apresentam
vários parâmetros farmacocinéticos diferenciados com relação aos caucasianos: Cmax
elevado, ASC estendida, clearance reduzido e meia vida (t
1/2
) aumentada. Esses resultados
sugerem que doses menores de alprazolam serão necessárias para que os asiáticos apresentem
efeitos farmacológicos semelhantes (LIN, LAUE et al., 1988).
Várias outras diferenças tem sido observadas quando comparados os parâmetros
farmacocinéticos dos asiáticos e dos caucasianos: a nicotina apresenta um clearance elevado
nos hispânicos e nos caucasianos em relação aos asiáticos; a teofilina apresenta uma meia
vida mais extensa em crianças asmáticas não asiáticas; o clearance da morfina é
significantemente maior em chineses do que em caucasianos e esta diferença tem sido
atribuída a altas taxas de glicuronidação existentes nos chineses (KOYSOOKO, TUCHINDA
et al., 1987; AHLSTROM, ALVERO et al., 1999; BENOWITZ, PEREZ-STABLE et al.,
2000).
Estudos preliminares indicam que as mulheres negras apresentam níveis plasmáticos
do metabólito N-desmetiltamoxifeno elevados em comparação com as brancas, entretanto, as
duas populações apresentam níveis plasmáticos do tamoxifeno semelhantes. A presença do
23
metabólito N-desmetiltamoxifeno está associada com o aumento no número de cânceres de
mama (FLAWS, LIM et al., 2000).
O sildenafil, inibidor de fosfodiesterase empregado no tratamento da disfunção erétil,
exibe uma biodisponibilidade aumentada nos homens mexicanos quando comparados com os
caucasianos. Os mexicanos apresentam valores de Cmax e ASC quase duas vezes mais altos
que os caucasianos; sugerindo que os mexicanos apresentam uma capacidade de metabolizar
o sildenafil bastante reduzida quando comparados com os caucasianos (FLORES-
MURRIETA, CASTAÑEDA-HERNANDEZ et al., 2000).
2.4 Variações Étnicas
O campo da farmacogenética apresenta interfaces com a área das diferenças étnicas na
metabolização de medicamentos. Algumas dessas diferenças genéticas na população
(relacionadas ao metabolismo de medicamentos) são altamente correlacionadas com a raça.
Várias populações já tiveram seus fenótipos acetiladores determinados com a
quantificação da sulfametazina livre e acetilada. Em 1993, Sardas e colaboradores
fenotiparam uma população de iranianos e observaram que a freqüência do fenótipo acetilador
lento em iranianos era semelhante às populações árabes, mas era maior que a freqüência
observada nos europeus (SARDAS, LAHIJANY et al., 1993).
A distribuição dos fenótipos acetiladores lentos e rápidos varia claramente de acordo
com o grupo étnico e a origem geográfica da população estudada.
2.5 Impacto da farmacogenética no desenvolvimento de fármacos
Os avanços nos estudos de farmacogenética estão rapidamente influenciando a
indústria farmacêutica, pois ela permite identificar se os indivíduos são metabolicamente
diferenciados, através da identificação de polimorfismos genéticos que potencialmente
alterem a concentração do fármaco e sua resposta. Enquanto os achados da farmacogenética
permitem respostas individualizadas, a farmacogenômica é um termo genérico usado para
descrever a aplicação comercial da tecnologia genômica no desenvolvimento de fármacos e
24
terapias. A farmacogenômica, através da biologia molecular e ferramentas genéticas, avalia o
mapeamento genômico, analisa populações, hereditariedade familiar e os fatores genéticos
envolvidos na resposta dos fármacos (COOPER, 1998; REGALDO, 1999; KURTH, 2000).
O conhecimento da farmacogenética tem se tornado um atrativo para a prática médica
à medida que oferece subsídios para desenvolvimento de terapias mais eficientes e
apropriadas e com menor probabilidade de eventos adversos. Algumas falhas na eficácia
podem ser resultados dos parâmetros farmacocinéticos, deste modo a farmacogenética pode
ser usada para analisar, de modo mais eficiente, os dados obtidos nos ensaios clínicos. Além
disso, os dados farmacogenéticos permitem ainda a avaliação da eficácia relativa do fármaco
em populações específicas. Este fenômeno já tem sido descrito em pacientes com Alzheimer
que mostraram uma variação na resposta à terapia anticolinérgica que foi identificada como
dependente da presença ou não do alelo APOE4 (POIRIER, 1999; RASTOGI, 2003).
A tecnologia farmacogenética possui aplicabilidade clínica à medida que a classe
médica toma conhecimento dessas características, podendo assim observar uma prescrição
apropriada para seus pacientes, que esteja de acordo com as suas características
farmacogenéticas. Informações detalhadas acerca da eficácia do processo de metabolização de
um fármaco podem também ajudar o médico durante a decisão farmacoterapêutica, tanto na
escolha do medicamento quanto do regime posológico a ser usado, resultando numa redução
na ocorrência de eventos adversos, aumento da adesão e redução de custos (NORTON, 2001;
FRACKIEWICZ, SHIOVITZ and JHEE, 2002).
Diante das informações que a farmacogenética vem trazendo para a farmacoterapia,
algumas características tem sido introduzidas aos estudos fase I de desenvolvimento de novos
fármacos, uma vez que esses estudos quando realizados com substâncias que sejam
metabolizadas por enzimas que conhecidamente apresentem polimorfismo devem ser
desenvolvidos de forma estratificada a fim de que os parâmetros farmacocinéticos sejam
avaliados de acordo com o fenótipo metabolizador dos indivíduos. Indivíduos que apresentem
genótipo potencialmente não seguro devem ser intencionalmente excluídos do ensaio para não
aumentarem, desnecessariamente, as chances de eventos adversos (KURTH, 2000;
FRACKIEWICZ, SHIOVITZ and JHEE, 2002).
25
Nos estudos de Fase II e III a farmacogenética deve identificar subpopulações,
incluindo os grupos raciais e étnicos com risco potencial de eventos adversos. Os desenhos
dos ensaios clínicos atuais ainda não adotam como rotina o estudo farmacogenético, e desta
forma podem estar contribuindo com a identificação inadequada de eventos adversos raros,
porém sérios (KURTH, 2000).
2.6 Técnicas usadas para avaliação da farmacogenética
As duas principais técnicas usadas no screening para polimorfismos em indivíduos são
a genotipagem e a fenotipagem. A genotipagem envolve a identificação de mutações
genéticas (polimorfismos) que determinem uma alteração no metabolismo de uma droga
específica. O genótipo não é influenciado pelos fatores ambientais e permanece o mesmo em
toda a vida do indivíduo, desta forma ele pode ser usado para identificar se o fator é genético
ou ambiental (BERTILSSON, DAHL et al., 1991; BRONSEN, SINDRUP et al., 1993; LIN;
POLAND, 1995; JEFFERSON; GREIST, 1996; RASTOGI, 2003).
A genotipagem é segura e relativamente não invasiva, podendo ser facilmente
desenvolvida em amostras de tecido como o sangue. Entretanto, as técnicas de mensuração
usadas na genotipagem incluem não apenas o uso da reação de cadeia de polimerases (PCR),
mas também as ligações com oligonucleotídeos, DNA chips, dentre outras técnicas que se
tornam em geral mais complexas (FRACKIEWICZ, SHIOVITZ and JHEE, 2002).
A atividade da enzima pode ser medida pela avaliação do fenótipo metabolizador
através da fenotipagem. Esta requer a administração de um fármaco “probe” que é usado para
mensurar os parâmetros farmacocinéticos. Os dados obtidos são usados para classificar os
indivíduos em grupos, quanto à sua capacidade de metabolizar o fármaco administrado. Os
indivíduos capazes de metabolizar eficientemente um fármaco são chamados de
metabolizadores extensos (EMs) ou rápidos. Indivíduos que apresentam deficiência no
metabolismo são chamados metabolizadores insuficientes (MI) ou lentos. Outro grupo de
indivíduos são aqueles capazes de realizar uma metabolização ultra-rápida e estes são
chamados de metabolizadores ultra-rápidos (UMs). As técnicas de fenotipagem são capazes
de investigar interações droga a droga, ou ainda falhas no processo geral de metabolização do
26
fármaco (KROEMER; EICHELBAUM, 1995; LINDER, PROUGH and VALDES, 1997;
NORTON, 2001; FRACKIEWICZ, SHIOVITZ and JHEE, 2002).
2.7 Medicamentos usados como ferramenta farmacológica – “probe”
Dentre as metodologias de fenotipagem o uso de fármacos “probe” como ferramenta
farmacológica para avaliar possíveis alterações no fenótipo de enzimas metabolizadoras de
fármacos, vem sendo cada vez mais presente.
Um fármaco “probe” pode ser definido como um fármaco cujas vias metabólicas
(enzimas e produtos) são conhecidas e desta forma permite a avaliação quantitativa da
atividade das enzimas envolvidas na sua metabolização através da quantificação dos produtos
formados. Esta metodologia vem sendo usada para identificar diferenças genéticas no
metabolismo de medicamentos em humanos.
A antipirina é um dos medicamentos mais usados como modelo de estudo. Outros
exemplos são o acetaminofeno, a cafeína, a fenacetina e a teofilina.
Tais fármacos são altamente metabolizados, podendo interagir com o medicamento
que está sendo avaliado indicando um aumento no metabolismo. Esta monitorização é
realizada através da concentração plasmática e urinária do medicamento e de seus
metabólitos.
A meia vida curta da antipirina pode ser justificada pela indução enzimática
microsomal, causada pelo medicamento teste. A inibição das enzimas é mais complexa e
difícil de ser testada, já que pode ser causada por muitos processos, inclusive conjugação.
A cafeína vem sendo utilizada como fármaco “probe” para fenotipagem de várias
enzimas metabolizadoras de xenobióticos. A cafeína apresenta vantagens quando comparada a
outros fármacos probe, já que é uma substância de uso relativamente comum, fazendo parte
da composição não apenas de medicamentos mas também de bebidas, sendo relativamente
segura e desta forma permitindo que os protocolos de estudo de fenotipagem sejam menos
invasivos e com menores probabilidades de efeitos adversos. Além disso, ela é
27
completamente absorvida, tem uma boa distribuição pelos líquidos corporais, tem baixa
ligação com as proteínas plasmáticas, o seu metabolismo é completamente hepático, apresenta
uma meia vida de eliminação curta e sua excreção renal na forma inalterada é negligenciável
(KRUL; HAGEMAN, 1998).
3 CAFEÍNA
3.1 Farmacologia
Dentre os inúmeros mecanismos de ação que foram propostos para as metilxantinas,
os principais são a inibição da fosfodiesterase e a alteração da translocação intracelular de
cálcio. Entretanto, as concentrações necessárias para produzir tais efeitos estão fora da faixa
que usualmente apresenta atividade farmacológica in vivo. Mas recentemente foi demonstrada
sua atividade como antagonista dos receptores de adenosina em concentrações
farmacologicamente relevantes. Esta atividade tem servido para explicar os efeitos
estimulantes sobre o SNC, diuréticos, metabólicos e os efeitos cardíacos das metilxantinas.
Tem sido sugerido que o aumento da força de contração diafragmática, produzido pelas
metilxantinas, é um fator contribuinte na atividade antiasmática (BOUSHEY, 2003).
3.2 Farmacologia Clínica
Os efeitos relacionados com a administração de doses únicas de cafeína entre 300 e
600mg incluem a estimulação do sistema nervoso central, aumento da pressão arterial,
aumento do débito cardíaco, aumento das secreções gástricas de ácido e pepsinas,
relaxamento muscular incluindo broncodilatação, diureses, aumento de ácidos graxos livres e
estimulação de catecolaminas pela medula adrenal (BOUSHEY, 2003).
A ingestão crônica de cafeína parece promover tolerância para os efeitos
cardiovasculares, renais, efeitos sobre o sistema nervoso central e também efeitos
metabólicos.
28
3.2.1 Farmacocinética
O método mais apropriado para a determinação da cafeína em fluidos biológicos é a
cromatografia líquida de alta performance (HPLC) com fase reversa e detecção por
ultravioleta. Este processo permite a separação da cafeína de outras xantinas e uratos
interferentes para melhor quantificação do fármaco em uma amostra de 0,1mL.
(FOENANDER, BIRKETT et al, 1980)
A cafeína apresenta uma biodisponibilidade oral de aproximadamente 95%, com seu
pico de concentração plasmática ocorrendo entre 5 e 90 minutos após a administração a
voluntários em jejum. Não há evidências de metabolismo pré-sistêmico. A eliminação ocorre,
quase que completamente através do metabolismo hepático em adultos, enquanto que em
neonatos a eliminação é praticamente renal e de forma inalterada. (BONATI, LATINI et al.,
1982)
Em adultos ocorre uma acentuada variabilidade individual na taxa de eliminação de
cafeína, (o clearance médio é 1,6mL.min
-1
.mg
-1
, variando de 0,35 a 4,5mL.min
-1
kg
-1
). Não há
evidências de uma cinética dose dependente. A meia-vida de eliminação plasmática é em
média 4,9 horas com uma variação de 1,9 a 12,2 horas. A cafeína é distribuída em todos os
fluidos corporais e apresenta um volume de distribuição aparente de 0,55L.kg
-1
. Sua ligação
média com as proteínas plasmáticas é de 35%. Relatos indicam que a razão entre as
concentrações de cafeína na saliva versus plasma é de aproximadamente 0,74 (BONATI,
LANITE et al., 1982 e NEWTON, BROUGHTON et al., 1981).
Como a cafeína é metabolizada pelas enzimas oxidativas do fígado, todos os
compostos que conhecidamente alteram a atividade desse sistema de enzimas podem
influenciar o seu clearance. Na verdade, a eliminação da cafeína é aumentada em fumantes e é
inibida pela cimetidina, dissulfiran e os contraceptivos orais. A meia-vida da cafeína é
prolongada durante a gravidez. O volume aparente de distribuição da cafeína está aumentado
em neonatos.
Embora o perfil farmacocinético da cafeína seja similar em adultos, jovens e idosos, a
taxa de eliminação em neonatos é extremamente lenta e o volume aparente de distribuição,
29
bem como a taxa de eliminação, estão aumentados em neonatos prematuros (BLANCHARD;
SAWERS, 1983).
3.2.2 Metabolismo
O metabolismo da cafeína é complexo e apresenta diferenças significantes entre as
espécies, bem como entre os indivíduos em diferentes situações clínicas.
No homem já foram identificados 30 diferentes metabólitos da cafeína. Inicialmente
ela sofre três desmetilações oxidativas nas posições 1, 3 e 7 para formar teobromina (37X),
paraxantina (17X) e teofilina (13X), respectivamente, as quais são dependentes da CYP1A2,
conforme descrito na figura 1. Todos estes produtos desmetilados são detectáveis no plasma
após administração da cafeína. Com base nos dados do clearance basal, as frações do produto
desmetilado encontradas no plasma são 84% de paraxantina, 12% de teobromina e 4% da
teofilina(KRUL; HAGEMAN, 1998).
Após a formação da paraxantina a cafeína é metabolizada por três reações: 1ª) uma
hidroxilação na posição 8, que é catalisada por uma enzima do citocromo P450 a CYP2A6,
para formar o ácido 1,7-dimetilúrico (17U); 2ª) uma desmetilação na posição 7, que é
catalisada por uma enzima do citocromo P450 a CYP1A2, para formar o 1-metilxantina (1X);
3ª) a formação do 5-acetilamino-6-formilamino-3-metiluracil (AFMU) que é catalisada pela
N-acetiltransferase (NAT) (KRUL; HAGEMAN, 1998).
30
N
N
N
N
CH
3
O
O
CH
3
CH
3
1
3
7
137X
CYP1A2
N
N
N
N
CH
3
O
O
CH
3
H
N
N
N
N
H
O
O
CH
3
CH
3
CYP1A2
N
N
N
N
CH
3
O
O
H
CH
3
Teobromine (37X)
Paraxantina (17X)
Teofilina (13X)
CYP1A2
Figura 2. Via metabólica de desmetilação da cafeína, mostrando a retirada do radical metil nas
posições 1, 3 e 7 que formarão a teobromina (37X), paraxantina (17X) e teofilina (13X), respectivamente
Parte da metilxantina formada na segunda reação é metabolizada a ácido 1-metilúrico
(1U) e esta reação é catalisada pela enzima xantina oxidase (XO).
Figura 3. Vias de cascata metabólica da cafeína, mostrando as principais enzimas envolvidas no
metabolismo e os principais metabólitos
A razão molar dos diferentes metabólitos da cafeína tem sido usada para obter o
fenótipo metabólico das enzimas CYP1A2, CYP2A6, NAT2 e XO. Estas enzimas estão
31
envolvidas na ativação e detoxificação de vários compostos xenobióticos incluindo agentes
carcinógenos (KRUL; HAGEMAN, 1998).
A atividade destas enzimas é geneticamente determinada mas fatores ambientais como
a dieta, o consumo de álcool ou fumo e a prática de exercícios parecem modificar a atividade
das enzimas de metabolização (KRUL; HAGEMAN, 1998).
3.3 Toxicologia
Dados disponíveis sugerem que a cafeína não é mutagênica. A exposição crônica de
altas doses de cafeína não aumenta a incidência de tumores em animais de laboratório, no
entanto, dados de estudos epidemiológicos sugerem uma relação entre o uso crônico de
bebidas contendo cafeína e um aumento na incidência de câncer no ovário, pâncreas e bexiga.
Altas doses de cafeína têm demonstrado atividade teratogênica em animais de
laboratório, mas estudos epidemiológicos sugerem que o consumo de cafeína pela mulher
grávida não aumenta o risco de nascimento de bebês de baixo peso, prematuros ou de
malformações congênitas.
3.4 Reações Adversas
3.4.1 Efeitos Potencialmente Danosos à Vida
Mortes devido ao uso de cafeína têm sido relacionadas a overdoses. A gravidade dos
efeitos adversos é relacionada com a dose e os sintomas são consistentes com os dados
farmacológicos, conhecidos da cafeína. Estes incluem dor epigástrica, vômito, diurese,
taquicardia e estimulação do SNC (agitação, tremores e convulsões). Estudos sugerem que a
toxicidade ocorra em adultos com doses maiores que 1g e a toxidade severa nas doses entre
2g e 5g. Entretanto, uma menor toxicidade tem sido observada diante de concentração
plasmática de 84mg.L-1.
32
3.4.2 Overdose Aguda
Overdose, pelo uso acidental da cafeína, tem levado à morte de crianças e adultos.
Danos clínicos têm sido reportados com a overdose pelo uso do café, sendo os sintomas
típicos: a diurese, taquicardia e estimulação do SNC (tremores e convulsões). Acidose
metabólica, cetose e hiperglicemia têm sido relatadas em pacientes em overdose por cafeína;
cetonúria tem sido relatada em crianças que ingerem grandes quantidades de cafeína.
Pacientes em overdose por cafeína têm apresentado concentrações plasmáticas extremamente
altas de epinefrina e norepinefrina. A dose letal de cafeína em adultos parece ser entre 5 e
10g, e a concentração plasmática que tem determinado admissão hospitalar é a de 150mg/L-1,
em overdose fatal.
3.4.3 Efeitos Adversos, Severos ou Irreversíveis.
A ingestão crônica de mais de 500mg de cafeína por dia está relacionada ao
cafeinismo, uma síndrome de grau leve e irregular, apresentando febre, insônia, anorexia,
ansiedade e irritabilidade. Usualmente esta síndrome tem sido confundida com ansiedade
neurótica.
3.4.4 Efeitos Adversos Sintomáticos
Efeitos adversos comuns ao uso da cafeína estão relacionados com o sistema
gastrintestinal (náusea), e do sistema nervoso central – SNC (insônia, tremores). Quando
ocorre a interrupção do consumo crônico de cafeína pode ocorrer cefaléia severa.
3.5 Cafeína como fármaco “probe”
O metabolismo da cafeína envolve várias vias de biotransformação. As enzimas
responsáveis pela formação dos metabólitos da cafeína já estão bem identificadas. Sabe-se
que a CYP1A2 catalisa as três reações de desmetilação que ocorrem em cerca de 90% da
cafeína metabolizada in vivo; suas isoformas contribuem significantemente para o
metabolismo formando os três principais produtos: a paraxantina, a teobromina e a teofilina.
33
As isoformas do CYP também estão envolvidas na formação de metabólitos secundários,
onde a CYP3A4 catalisa a 8-hidroxilação da cafeína. (MINERS; BIRKETT, 1996)
Além das CYP a N-acetiltransferase 2 (NAT2) e a xantina oxidase também
contribuem para a formação dos metabólitos secundários. A excreção urinária do AFMU é
dependente da atividade da NAT2. A razão entre as concentrações de 1-metilxantina e 1-
metilúrico é determinada pela xantina oxidase (XO). Estudos da atividade da NAT2 e da XO
em diversas populações têm sido realizados utilizando a cafeína como fármaco “probe” e os
resultados encontrados são semelhantes aos realizados com a isoniazida e outros fármacos
“probe” (KALOW, 1991 e TANG; KALOW, 1991).
O conhecimento da enzimologia do metabolismo da cafeína tem fornecido base para a
sua utilização como fármaco “probe” para enzimas metabolizadoras de vários xenobióticos in
vivo e in vitro. (MINERS; BIRKETT, 1996)
4 JUSTIFICATIVA
O uso dos medicamentos no Brasil está baseado em dados farmacocinéticos gerados
em outras populações, sabe-se porém que a etnia tem sido caracterizada como um fator
diferencial dos parâmetros farmacocinéticos nas diferentes populações.
Tendo em vista que o conhecimento das características farmacogenéticas da população
brasileira é de suma importância para a melhor definição dos esquemas terapêuticos
estabelecidos em nosso país, faz-se necessário o desenvolvimento de projetos que tenham
como objetivo fenotipar a nossa população quanto às principais vias de metabolização dos
fármacos.
Sabe-se que as reações de acetilação são parte significante do metabolismo de diversos
fármacos usados na prática clínica, incluindo os tuberculostáticos (isoniazida e rifampicina), o
anticonvulsivante clonazepam, o vasodilatador periférico hidralazina, a dapsona (usada no
tratamento da hanseníase), o antiarrítmico procainamida, os antimicrobianos sulfametazina e
sulfasalazina., dentre outros.
34
A determinação da existência de modalidades diferenciadas de fenótipos acetiladores
pode trazer implicações clínicas e conseqüentemente possíveis modificações nos esquemas
terapêuticos destas drogas, já que os acetiladores lentos têm uma maior tendência a apresentar
efeitos tóxicos e os acetiladores rápidos, não raramente, necessita de maiores doses, fato este
que no caso dos tuberculostáticos, por exemplo, poderia justificar a ineficácia observada em
alguns esquemas terapêuticos utilizados no Brasil.
Baseado no fato de que a atividade das enzimas hepáticas tem importante
conseqüência terapêutica e pode variar de acordo com o grupo étnico; recomenda-se a
execução de estudos de fenotipagem e genotipagem a fim de detectar e mensurar
polimorfismos nestas enzimas. (FRACKIEWICZ, SHIOVITZ and JHEE, 2002)
Até o momento não se tem registro de dados acerca da caracterização do fenótipo
acetilador na população brasileira.
35
Objetivos
36
OBJETIVOS
1 GERAIS:
Caracterizar o fenótipo metabolizador da cafeína, em uma amostra da população de
voluntários saudáveis da Unidade de Farmacologia Clínica.
2 EPECÍFICOS
Quantificar os metabólitos AFMU, 1U, 1X, 17U e 17X em amostras de urina.
Avaliar se as atividades das enzimas CYP1A2, CYP2D6, NAT2 e Xantina Oxidase
apresentam uma distribuição normal.
Classificar os voluntários quanto ao padrão metabólico.
Avaliar a quantificação plasmática da cafeína.
Determinar o perfil farmacocinético dos voluntários com menor e maior atividade
enzimática.
Comparar os parâmetros farmacocinéticos dos grupos de voluntários classificados
como de maior e menor atividade enzimática.
Comparar os resultados obtidos com outro estudo farmacocinético de um fármaco
metabolizado pela enzima CYP1A2.
37
Material e Métodos
38
MATERIAL
1 ETAPA CLÍNICA
A etapa clínica do estudo, constou de uma fase de seleção dos voluntários (para
garantir a higidez) e de um internamento onde os voluntários tomaram um comprimido de
200mg de cafeína. O material utilizado durante esta etapa encontra-se descrito nas tabelas 1, 2
e 3.
Tabela 1- Material utilizado na etapa clínica (incluindo: seleção, internamento e coleta de
amostras de urina de 80 voluntários)
.
MATERIAL UTILIZADO PARA COLETA FABRICANTE
Agulhas descartáveis 25x8 BD – USA
Agulhas 21G x 1 Vacutainer BD – USA
Álcool 70% HUWC-UFC
Algodão Johnson and Johnson – USA
Coletores de fezes Fornecido pelo Laboratório Louis Pasteur
Coletores de urina Fornecido pelo Laboratório Louis Pasteur
Garrafas plásticas de 1000mL
Pipetas ajustáveis (100µL, 200µL, 1000µL) Gilson Pipetman, França
Ponteiras plásticas para pipetas (capacidade
5-200µL)
Unilab, Brasil
Ponteiras plásticas para pipetas (capacidade
200-1000µL)
Unilab, Brasil
Seringas descartáveis de 10mL BD – USA
Suporte para conexão da agulha BD – USA
Tubos Vacutainer BD – USA
Tubos plásticos para armazenar plasma
(tipo “corning”)
Corning Costar Corporation– Canadá
39
Tabela 2 – Medicamento administrado na etapa clínica.
DESCRIÇÃO FABRICANTE LOTE VALIDADE
Cafeína Leader® 1E1401 03/05
Tabela 3- Equipamentos utilizados na etapa clínica.
APARELHOS FABRICANTE
Termômetro thermo flat Becton Dickinson Ind. Cirúrgicas Ltda –
Brasil
Esfignomanômetro Tycos 7050-14 Tycos –USA
Estetoscópio Lytmman – USA
Eletrocardiógrafo Dixtal – Brasil
Balança Balmak- Brasil
Centrífuga Eppendorf
Freezer horizontal –20ºC Eletrolux-Brasil
2 ETAPA ANALÍTICA
A etapa analítica do estudo; constou de uma fase de determinação analítica dos
metabólitos da cafeína na urina dos voluntários (para quantificação da atividade das enzimas
CYP1A2, CYP2A6, NAT2 e XO) e uma fase de determinação analítica da cafeína no plasma
dos voluntários (para determinar os parâmetros farmacocinéticos).
O material utilizado durante esta etapa encontra-se descrito nas tabelas 4, 5, 6, 7, 8 e 9.
40
Tabela 4- Material utilizado na etapa analítica.
DESCRIÇÃO PRODUTOR/PAÍS
Pipetas ajustáveis (100µL, 200µL, 1000µL) Gilson Pipetman, França
Ponteiras plásticas para pipetas (capacidade
5-200µL)
Unilab, Brasil
Ponteiras plásticas para pipetas (capacidade
200-1000µL)
Unilab, Brasil
Tubos de ensaio 120 x 11 mm Unilab, Brasil
Tubos Eppendorf (2mL)
Tabela 5- Equipamentos utilizados na etapa analítica.
EQUIPAMENTO MARCA/ MODELO
HPLC Shimadzu
Deionizador TKA / DI 800
Purificador de água – Rios Millipore / Rios 05
Purificador de água – Milli-Q Millipore / MILLI-Q GRADIENTE
Agitador de Tubos Phoenix / AP-56
Balança Analítica Mettler Toledo / AB204-S
Secador de Amostras – Dry Block Techne – DB3
Centrífuga Jouan/ M23i
Pipeta (Q64453A) Gilson / P1000
Pipeta (Q65273A) Gilson / P200
Pipeta (Q63359A) Gilson / P20
Gerador 170 KVA Leon Himer / 170KVA
Medidor de pH Hanna instruments, Portugal
Balança analítica Ohaus co. Florham Park Switzerland
Vortex mixer Fisher Vortex Genie 2 Fisher Scientific Laboratory Equipment, USA
41
Tabela 6 - Componentes do HPLC Shimadzu
COMPONENTE MODELO
Controladora SCL-10A VP
Bomba LC 10ADVP
Misturador FCV-10ALVP
Degaseificador DGU-14A
Autoinjetor SIL-10ADVP
Forno Guarda Coluna CTO-10AVP
Detector PDA SPD-M 10A VP
Shimpack C-18/ CLC-ODS (M)
Coluna analítica
Dimensões: 250mm x 4.6 mm; 5μm de
diâmetro de partícula
Tabela 7 - Padrões utilizados na etapa analítica.
SUBSTÂNCIA MARCA LOTE PROPÓSITO
Cafeína Sigma 22K1257 Analito
1,7-Dimethyluric acid Sigma 61K2519 Analito
1-Methylxanthine Sigma 61K4076 Analito
1,7-Dimethylxanthine Sigma 90K4059 Analito
1-Methyluric acid Sigma 129H2511 Analito
AFMU Nestlé Research Não disponível Analito
Teobromina Sigma 71K2541 Padrão interno
42
Tabela 8 - Reagentes utilizados na etapa analítica.
DESCRIÇÃO
Acetonitrila grau HPLC (100%)
Tetrahidrofurano para HPLC
Ácido Acético Glacial (PA)
Acetato de Etila PA
Dietilformamida - Sigma
Sulfato de Amônio – Carlo Erba
Hidróxido de Sódio – Carlo Erba
Clorofórmio HPLC
Isopropranol HPLC
Água purificada usando Milli-Q
Tabela 9 - Amostras biológicas utilizadas para quantificação analítica.
DESCRIÇÃO
Plasma humano normal (antes e depois da administração de cafeína 200mg)
Urina (antes da administração de cafeína 200mg e das 10 horas após a administração
3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os programas utilizados para as análises estatísticas do estudo foram:
Microsoft Excel 97 (Microsoft Corporation, Rermond, WA, USA)
GraphPad Prism versão 3.00 (GraphPad software, Inc.San Diego, CA, USA)
SPSS 10.0 for Windows
43
METODOLOGIA
1 ETAPA CLÍNICA – PROTOCOLO EXPERIMENTAL
1.1 Delineamento do Estudo
A pesquisa consistiu de um estudo aberto 82 voluntários sadios, adultos (quarenta
homens e quarenta e duas mulheres, não grávidas). Os voluntários qualificados para participar
do estudo foram internados por um período de aproximadamente 12 horas, quando receberam
um comprimido de 200mg de cafeína seguido por um copo de água de 200mL.
1.2 Seleção dos Voluntários
Foram selecionados 82 voluntários saudáveis por meio de consulta médica,
Eletrocardiograma (ECG) e exames laboratoriais.
Uma vez confirmada a higidez, os voluntários foram submetidos a uma entrevista livre
para a avaliação das condições emocionais para participar da investigação, antes do início do
estudo. Após isso, os voluntários foram esclarecidos de todas as dúvidas restantes, e os que
concordaram, assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo 2) para
participação no estudo.
1.3 Exames Laboratoriais
Os seguintes exames laboratoriais foram realizados nos períodos pré-estudo (período
de avaliação para seleção de voluntários saudáveis).
Análise Hematológica: Hemoglobina, Hematócrito, Contagem total e diferencial de
leucócitos, Contagem de plaquetas e Velocidade de Hemossedimentação (VHS).
44
Análise bioquímica: Creatinina, Bilirrubina Total, Proteína Total, Albumina, Glicose
em jejum, Fosfatase alcalina, Aspartato-amino-transferase (AST), Alanina-amino-transferase
(ALT), Colesterol total, Triglicérides, Ácido úrico e Gama GT.
Sumário de urina: Densidade, pH, Proteínas e Microscopia
1.3.1 Valores de referência dos exames laboratoriais
Os valores utilizados como referência para os exames laboratoriais (ANEXO 1) foram
fornecidos pelo laboratório de patologia clínica responsável por estas análises (Laboratório
Louis Pasteur).
1.4 Critérios de Inclusão
Os seguintes critérios foram satisfeitos para que os voluntários participassem do
estudo.
• Idade entre 18 e 50 anos.
• Índice de massa corpórea de 19 a 30;
• Submetidos a uma história clínica e exame físico, ECG e exames laboratoriais
complementares e considerados saudáveis
• Concordou livremente e assinou o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, após
todos os elementos essenciais do protocolo terem sido esclarecidos, antes de qualquer
procedimento.
1.5 Critérios de exclusão
Os critérios de exclusão adotados foram:
• Resultados dos exames laboratoriais complementares fora dos valores considerados
normais (±10%), a menos que fossem considerados clinicamente irrelevantes;
45
• Fez uso de medicação regular com conhecida atividade sobre o metabolismo da cafeína,
dentro das 2 semanas que antecederam o inicio deste estudo, ou fez uso de qualquer
medicação com um período inferior a sete meias vidas do início deste estudo;
• Fumante;
• Fazia uso de Contraceptivos orais;
• Foi internado por qualquer motivo até 4 semanas antes do início deste estudo;
• História de abuso de álcool ou drogas, ou ingeriu bebidas alcoólicas nas 48 horas que
antecedem o período de internação para iniciar o estudo;
• História de doença hepática, renal, epiléptica; tem história ou teve infarto do miocárdio,
angina e/ou insuficiência cardíaca;
• O voluntário apresentava hipersensibilidade conhecida à cafeína ou a qualquer xantina;
• O voluntário tinha qualquer condição que o impedia de participar do estudo pelo
julgamento do investigador.
1.6 Critérios para retirada do estudo
As seguintes condições foram consideradas como critérios de retirada do estudo:
O voluntário não deseja continuar no estudo, por razões outras que a ocorrência de
eventos adversos do fármaco teste; por ex. indisponibilidade, intolerância aos procedimentos
do estudo, efeitos adversos do fármaco, testes laboratoriais anormais julgados de relevância
clínica, doença intercorrente requerendo medicação.
1.7 Internamento
Os voluntários foram orientados para se apresentarem para internamento, na Unidade
de Farmacologia Clínica – UNIFAC – da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do
Ceará, aproximadamente às 6:30 horas na manhã do ensaio e permaneceram na UNIFAC até
12 horas após a administração da medicação, retornando no dia seguinte para a coleta de
24horas após a medicação.
46
1.7.1 Horários de jejum e de Alimentação:
Os voluntários foram orientados a permanecerem em jejum a partir das 23:00 horas da
noite anterior ao ensaio e até 02:00 horas após a ingestão da medicação, quando uma refeição
será servida. Em seguida foram oferecidos almoço, lanche e jantar. Líquidos foram permitidos
ad libitum após a refeição inicial realizada 2 horas após a administração da cafeína.
1.8 Posologia:
Os voluntários receberam um comprimido contendo 200mg de Cafeína por via oral em
dose única, com um copo de água (200 mL).
1.9 Coleta de Sangue
As coletas de sangue para determinação das concentrações plasmáticas de cafeína
foram obtidas, com "butterfly" (escalpe) ou cateter venoso heparinizado introduzido em veia
superficial do antebraço do voluntário, imediatamente antes da administração de uma das
preparações de cafeína e nos seguintes intervalos a partir da administração: 0; 0:05; 0:15;
0:25; 0:35; 0:45; 1:00; 1:15; 1:30; 2; 4; 6; 8; 12 e 24 horas.
A cada intervalo foram coletados 9mL de sangue e colocados em tubos vacutainer de
vidro contendo 30μL de heparina. Em seguida foram centrifugadas a 3.000 rpm, na
temperatura de 8ºC, durante 12 minutos, o plasma foi separado e colocado em dois tubos. Em
seguida, os tubos foram devidamente armazenados em freezer, numa temperatura de –20ºC,
até sua análise.
1.10 Coleta de Urina
Os voluntários foram orientados a esvaziar a bexiga antes da administração da cafeína,
quando foi armazenada uma alíquota de urina de 3mL (usada como controle).
47
A urina total foi armazenada durante as dez horas que sucederam a administração da
cafeína. Ao final do período de coleta, cada voluntário teve o seu volume total de urina
medido. A urina total foi homogeneizada e desta retirou-se uma alíquota de 5mL para
posterior determinação dos metabólitos.
1.11 Efeitos adversos
Foi solicitado aos voluntários que relatassem qualquer evento adverso e a sua data de
ocorrência, para que fosse acompanhado clínica e laboratorialmente até que os parâmetros
alterados voltassem ao normal. Foi também solicitada a informação se houve ou não a
necessidade de medicação adicional. As perguntas realizadas para saber se os voluntários
tiveram algum evento adverso foram limitadas a perguntas gerais, tais como: Como vai você?
1.11.1 Definições de efeitos adversos quanto à intensidade
Leve: Experiência adversa facilmente tolerada
Moderada: Experiência adversa desagradável o bastante para interferir na atividade
cotidiana.
Severa: Experiência adversa que impossibilita a realização da atividade cotidiana
normal.
1.11.2 Relacionamento suposto com a droga experimental
Sem relação: A experiência adversa definitivamente não está relacionada à droga em
estudo.
Desconhecida: Há outras causas mais prováveis e não há suspeitas de que a droga seja
a causa.
Possível: Não foi demonstrado um relacionamento de causa e efeito direto entre a
droga e a experiência adversa, porém, há uma possibilidade razoável de que a droga esteja
envolvida.
Provável: Há um relacionamento direto de causa e efeito entre a experiência e a droga
em estudo.
48
1.12 Aspectos éticos
1.12.1 Comitê de Ética
O projeto de pesquisa, com o protocolo experimental e o termo de consentimento,
foram submetidos ao Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade
Federal do Ceará, credenciado pelo CONEP - Conselho Nacional de Saúde/MS.
O Estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque (1964) e as revisões
de Tóquio (1975), Veneza (1983), Hong Kong (1989), Somerset Oeste (1996) e Edimburgo
(2000), assim como as regulamentações locais (Resoluções 196/96 e 251/97 do CNS-MS,
bem como Resolução 84/02 de medicamentos genéricos da ANVISA).
1.12.2 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
O “termo de consentimento livre e esclarecido” é uma tradução brasileira originária do
termo francês consentement livre et éclairé. Esta forma é utilizada nas resoluções da
Comissão Nacional de Saúde (CNS – MS), órgão que regula a ética na pesquisa em seres
humanos no Brasil.
Segundo a Declaração do Congresso Nacional de Bioética (SIBI), realizado em junho
de 2000, o art. 11º, dedicado aos temas da pesquisa e experimentação, relata que “os sujeitos
das experimentações deverão dar seu consentimento livre e esclarecido e plenamente
informado”.
O termo de consentimento livre e esclarecido é uma condição indispensável na
pesquisa com seres humanos. Trata-se de uma decisão voluntária, verbal ou escrita, realizada
por uma pessoa autônoma e capaz, selecionada após um processo informativo, para a
experimentação consciente dos seus riscos, benefícios e possíveis conseqüências.
A prática do termo do consentimento livre e esclarecido contribui no exercício da ética
dignificando e engrandecendo tanto o voluntário quanto o investigador da pesquisa.
49
Todos os voluntários selecionados para o estudo receberam explanação sobre a
natureza e os objetivos. Foi enfatizado que o trabalho teria a finalidade de pesquisa e que o
voluntário não poderia esperar qualquer efeito terapêutico. O voluntário também tinha
conhecimento da sua liberdade para se retirar a qualquer momento do estudo sem que isto lhe
cause qualquer prejuízo no seu atendimento junto à Unidade de Farmacologia Clínica ou ao
Hospital Universitário Walter Cantídio da Universidade Federal do Ceará. Foi solicitado a
cada voluntário que, caso concordasse com o protocolo de estudo, assinasse o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido para a participação do estudo (anexo 2).
1.12.3 Confidencialidade
Os resultados da avaliação médica, o eletrocardiograma e os exames laboratoriais
foram registrados em folha individual de cada voluntário. Todas as informações obtidas
durante o estudo, referente ao estado de saúde dos voluntários ficaram disponíveis aos
médicos do Hospital Universitário Walter Cantídio da Universidade Federal do Ceará. Uma
cópia dos exames laboratoriais, realizados no período pré e pós-estudo, foi fornecida ao
voluntário, quando solicitada.
50
2 ETAPA ANALÍTICA – DETERMINAÇÃO ANALÍTICA DOS METABÓLITOS
2.1 Desenvolvimento do método analítico para quantificação dos metabólitos
Os metabólitos escolhidos para quantificação foram: AFMU – 5-acetilamino-6-
formilamino-3-metiluracil; 1U – 1-metilúrico; 17U – 1,7-dimetilúrico; 1X – metilxantina;
17X – 1,7-dimetilxantina.
A literatura apresenta diversos métodos para quantificação dessas substâncias em urina
de voluntários saudáveis e pacientes por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE - no
decorrer do nosso texto estaremos utilizando a sigla HPLC que tem sido aceita
internacionalmente) (KRUL,C e HAGEMAN, G;1998; BENDRISS, E, 2000 e BAUD-
CAMUS, F.,2001. CAUBET, M. 2002).
O método utilizado em nosso trabalho consistiu de uma adaptação do método descrito
por KRUL,C e HAGEMAN, G;1998; utilizando teobromina como padrão interno.
2.1.1 Preparação de soluções padrão e reagentes
A fase móvel utilizada foi composta por uma mistura de duas soluções. A solução A
(acetonitrila, tetrahidrofurano, ácido acético e água). Que foi preparada em um balão
volumétrico (com capacidade para 1000mL) onde foram adicionados 44mL de acetonitrila,
2,5mL de tetrahidrofurano, 1mL de ácido acético e completado o volume com água Mille-Q.
A solução obtida foi cuidadosamente homogeneizada, sendo todo o processo de preparação
realizado dentro de uma capela. A Solução B era composta apenas de acetonitrila.
A solução estoque de AFMU foi prepara na concentração de 1mg/mL, diluída em uma
solução de dimetilformamida e acetato de etila (1:20 v/v).
A solução estoque de teobromina foi preparada na concentração de 2mg/mL em fase
móvel, com fácil dissolução.
51
As soluções estoque de 1X e 1U foram preparadas na concentração de 2,5mg/mL,
diluídas em fase móvel. As soluções de 1X e 1U necessitaram da adição de 0,05mL e 0,1mL
de NaOH - 1N, em cada 1mL de fase móvel, para facilitar a dissolução.
A solução estoque de 17U foi preparada na concentração de 2mg/mL em fase móvel, e
necessitou da adição de 0,08mL de NaOH - 1N, em cada 1mL de fase móvel, para facilitar a
dissolução.
A solução estoque de 17X foi preparada na concentração de 2,5mg/mL em fase móvel,
com fácil dissolução.
Para fins de validação do método, os cincos metabólitos foram agrupados numa
solução denominada pool de metabólitos. A solução pool mãe foi preparada numa
concentração de 100μg/mL, onde todos os metabólitos estavam na mesma concentração. Esta
solução pool mãe foi alicotada e estocada a –70ºC, para garantir a estabilidade. A solução
pool mãe de metabólitos (100μg/mL em fase móvel) foi diluída nas concentrações de 1; 2; 4;
8; 16 e 32μg/mL.
As soluções utilizadas no processo de extração foram: uma solução de clorofórmio e
álcool isopropílico (4:1 v/v) para extração e uma solução de ácido acético 0,05% para
ressuspensão.
2.1.2 Preparação das amostras da curva de calibração
Os padrões de calibração foram preparados na matriz biológica (urina); quando uma
amostra de urina branca, devidamente estocada (-20ºC) foi descongelada.
Os padrões de curva de calibração foram preparados contaminando a urina branca com
a solução pool mãe dos metabólitos nas seguintes concentrações: 1; 2; 4; 8; 16 e 32μg/mL.
Uma concentração fixa de padrão interno (teobromina 10μg/mL) foi adicionada a todos as
amostras de urina contaminada, antes da extração.
52
2.1.3 Extração das amostras de urina
Os procedimentos utilizados na extração das amostras de urina dos voluntários e das
amostras de urina contaminadas com metabólitos (solução pool mãe) para realização da curva
de calibração foram os mesmos.
Todas as amostras de urina foram descongeladas até temperatura ambiente. O processo
de extração consistiu das seguintes etapas:
• Separar num tubo de ensaio tipo Falcon uma alíquota de 200μL de urina;
• Adicionar 200μL de Teobromina a 10μg/mL;
• Adicionar 120mg de Sulfato de amônio;
• Misturar em vortex, por 30 segundos;
• Adicionar 6mL da solução de extração (Clorofórmio: Álcool isopropílico – 4:1 v/v);
• Centrifugar a 1000g por 10 minutos;
• Remover a fase aquosa cuidadosamente (camada superior);
• Colocar a fase orgânica num tubo de ensaio de vidro; e
• Secar completamente com vapor de Nitrogênio, no dry-bloc, numa temperatura de
37ºC;
• Ressuspender com 1mL de ácido acético a 0,05%.
A solução final foi colocada (cerca de 400μL) em “microvials” que posteriormente
foram lacrados e acondicionados na bandeja do injetor automático (SIL-10ADVP). Alíquotas
de 20μL foram injetadas automaticamente no sistema de cromatografia líquida.
Todas as etapas de extração das amostras foram realizadas numa capela de fluxo
laminar vertical, para evitar exposição às soluções de reagentes tóxicos e voláteis.
2.1.4 Recuperação
Preliminarmente, a recuperação dos metabólitos e do padrão interno foi avaliada,
comparando uma amostra de urina contaminada com os padrões e, posteriormente, submetida
ao processo de extração, anteriormente descrito, com uma amostra dos padrões não submetida
ao processo de extração. A recuperação foi expressa como percentagem.
53
Os testes de recuperação foram realizados em três concentrações distintas, uma baixa
uma média e uma alta e cada uma delas em duplicata.
2.1.5 Condições Cromatográficas
Um aparelho de cromatografia líquida de alta performance (no decorrer do nosso texto
estaremos utilizando a sigla HPLC que tem sido empregado internacionalmente) da marca
Shimadzu, com bomba, misturador, degaseificador, auto-injetor, forno para guarda de coluna
analítica, coluna analítica Shinpack C-18/ CLC-ODS (M) – 250mm x 4,6(mm) e detector
ultravioleta foi utilizado.
A pressão máxima do sistema foi estabelecida em 250kgf. A coluna operou a uma
temperatura de 35ºC. A temperatura do auto-injetor foi de 4ºC e o volume de injeção foi de
20μL.
A fase móvel foi dividida em A (tetrahidrofurano, ácido acético e água; 5:1:996 v/v) e
B (acetonitrila). As corridas analíticas desenvolveram-se num gradiente binário entre as fases
A e B na seguinte proporção: de 0 a 20 minutos 99% de A e 1% de B; de 21 a 28 minutos
67% de A e 33% de B; de 29 a 40 minutos 99% de A e 1% de B.
O fluxo foi de 1mL/min, o tempo total de corrida foi de vinte minutos. A fase móvel
na coluna foi injetada e monitorizada pelo detector ultravioleta no comprimento de onda
273nm.
2.1.6 Precisão e Acurácia
A precisão e a acurácia foram calculadas para amostras de calibração. Os
experimentos da curva de calibração foram feitos em duplicata.
54
2.2 Determinação da atividade das enzimas CYP1A2, NAT2, CYP2A6 e XO
A atividade enzimática, ou fenótipo da enzima, pode ser determinada pela avaliação
das concentrações urinárias de seus substratos e produtos metabólicos, desta forma trabalhos
como o de BENDRISS em 2000 demonstram que a razão molar das taxas de metabólitos
servem como forma de mensuração da atividade enzimática.
Os principais metabólitos urinários da cafeína que têm sido usados para determinar a
atividade metabólica das enzimas CYP1A2, CYP2A6 e XO são: 17U (Ácido 1,7-
Dimetilúrico), 17X (1,7-Dimetilxantina ou paraxantina), 1U (Ácido 1-Metilúrico), 1X (1-
Metilxantina), AFMU (5-Acetilamino-6-formilamino-3-metiluracil). (BENDRISS, 2000)
De acordo com BAUD-CAMUS, 2001 e colaboradores o fenótipo da enzima N-
acetiltransferase 2 (NAT2) pode ser determinado pela razão: [AFMU] / [AFMU + 1X + 1U].
Para as demais enzimas as razões serão: [AFMU + 1X + 1U] / 17U para CYP1A2;
17U / [AFMU + 1X + 1U + 17X + 17U] para CYP2A6 e 1U / [1X + 1U] para XO.
2.3 Avaliação do Fenótipo das enzimas CYP1A2, NAT2, CYP2A6 e XO
A avaliação dos fenótipos das enzimas estudadas foi realizada por estatística descritiva
com representação gráfica por de histograma, Normal Q-Q Plot e Detrended Normal Q-Q
Plot; os quais indicam a tendência de normalidade ou não da distribuição dos valores obtidos
para a atividade enzimática.
2.4 Classificação da atividade enzimática dos voluntários
Posteriormente à determinação da atividade enzimática e constatação ou não de
tendência a normalidade nas distribuições destes valores; os voluntários foram categorizados
em grupos de oito classificados na origem crescente de atividade para cada uma das enzimas.
Os voluntários classificados nos grupos extremos (maior e menor atividade
enzimática) foram escolhidos para posterior determinação dos parâmetros farmacocinéticos.
55
Os voluntários com menor atividade enzimática foram classificados no grupo ME e
receberam a seguinte codificação: CYP1A2-ME (para os oitos voluntários com menor
atividade enzimática da CYP1A2), NAT2-ME (para os oitos voluntários com menor atividade
enzimática da NAT2), CYP2A6-ME (para os oitos voluntários com menor atividade
enzimática da CYP2A6) e XO-ME (para os oitos voluntários com menor atividade enzimática
da XO).
Os voluntários com maior atividade enzimática foram classificados no grupo MA e
receberam a seguinte codificação: CYP1A2-MA (para os oitos voluntários com maior
atividade enzimática da CYP1A2), NAT2-MA (para os oitos voluntários com maior atividade
enzimática da NAT2), CYP2A6-MA (para os oitos voluntários com maior atividade
enzimática da CYP2A6) e XO-MA (para os oitos voluntários com maior r atividade
enzimática da XO).
3 ETAPA ANALÍTICA – DETERMINAÇÃO E ANÁLISE DOS PARÂMETROS
FARMACOCINÉTICOS
3.1 Desenvolvimento do método analítico para quantificação da cafeína
A literatura apresenta diversos métodos para quantificação da cafeína em plasma de
voluntários saudáveis e pacientes por HPLC (NEWTON, L.1981; BONATI, M. 1982;
BLANCHARD, J. 1983; BENDRISS, E, 2000 e KAMIMORI, G.H.2001).
Em nosso trabalho, utilizamos o método descrito para determinação dos metabólitos,
com alguma adaptações, constituindo-se um método simples e adequado para a quantificação
da cafeína em plasma humano por HPLC, utilizando a teobromina como padrão interno.
3.1.1 Preparação de soluções padrão e reagentes
As soluções preparadas foram diluídas numa solução de diluição, semelhante à fase
móvel, composta por uma mistura de acetonitrila, tetrahidrofurano, ácido acético e água na
56
proporção 100:2,5:1:896,5 v/v. Em um balão volumétrico (com capacidade para 100mL) foi
adicionado 10mL de acetonitrila, 250μL de tetrahidrofurano, 100μL de ácido acético e
completado o volume com água Mille-Q. A solução obtida foi cuidadosamente
homogeneizada, sendo todo o processo de preparação realizado dentro de uma capela.
A solução estoque de cafeína foi prepara na concentração de 2mg/mL, diluída na
solução de diluição.
A solução estoque de teobromina foi preparada na concentração de 1mg/mL diluída na
solução de diluição.
As soluções utilizadas no processo de extração foram: uma solução de dietiléter e
diclorometano (70:30 v/v) para extração e uma solução de diluição para ressuspensão.
3.1.2 Preparação das amostras da curva de calibração
Os padrões de calibração foram preparados na matriz biológica (plasma); quando uma
amostra de plasma branco, devidamente estocada (-20ºC) foi descongelada.
Os padrões de curva de calibração foram preparados contaminando o plasma branco
com a solução de cafeína nas seguintes concentrações: 0,5; 1; 2; 4; 8 e 16μg/mL. Uma
concentração fixa de padrão interno (teobromina 5μg/mL) foi adicionada a todos as amostras
de plasma contaminado, antes da extração
3.1.3 Extração das amostras de plasma
Os procedimentos utilizados na extração das amostras de plasma dos voluntários e das
amostras de plasma contaminadas com cafeína para realização da curva de calibração foram
os mesmos.
Todas as amostras de plasma foram descongeladas até temperatura ambiente. O
processo de extração consistiu das seguintes etapas:
• Separar num tubo de ensaio tipo Falcon uma alíquota de 500μL de plasma;
57
• Adicionar 500μL de Teobromina a 5μg/mL;
• Adicionar 4mL da solução de extração (Dietiléter:Diclorometano – 70:30 v/v);
• Centrifugar a 3000rpm por 15 minutos, na temperatura de 25ºC;
• Remover a fase aquosa cuidadosamente (camada superior);
• Colocar a fase orgânica num tubo de ensaio de vidro;
• Secar completamente com vapor de Nitrogênio, no dry-bloc, numa temperatura de
30ºC;
• Ressuspender com 400μL da solução de diluição.
A solução final foi colocada em “microvials” que posteriormente foram lacrados e
acondicionados na bandeja do injetor automático (SIL-10ADVP). Alíquotas de 20μL foram
injetadas automaticamente no sistema de cromatografia líquida.
Todas as etapas de extração das amostras foram realizadas numa capela de fluxo
laminar vertical, para evitar exposição às soluções de reagentes tóxicos e voláteis.
3.1.4 Recuperação
Preliminarmente, a recuperação da cafeína e da teobromina (do padrão interno) foi
avaliada comparando uma amostra de plasma contaminada com o padrão de cafeína e
posteriormente submetida ao processo de extração descrito no item 3.1.3, com uma amostra
do padrão de cafeína não submetida ao processo de extração. A recuperação foi expressa
como percentagem.
Os testes de recuperação foram realizados em três concentrações distintas, uma baixa
uma média e uma alta e cada uma delas em duplicata.
3.1.5 Condições Cromatográficas
Um HPLC Shimadzu, com bomba, misturador, degaseificador, auto-injetor, forno para
guarda de coluna analítica, coluna analítica Shinpack C-18/ CLC-ODS (M) – 250mm x
4,6mm) e detector ultra-violeta foi utilizado.
58
A pressão máxima do sistema foi estabelecida em 250kgf. A coluna operou a uma
temperatura de 35ºC. A temperatura do auto-injetor foi de 4ºC e o volume de injeção foi de
20μL.
A fase móvel foi dividida em A (tetrahidrofurano, ácido acético e água; 5:1:996 v/v) e
B (acetonitrila). As corridas analíticas desenvolveram-se num gradiente binário entre as fases
A e B na seguinte proporção: de 0 a 10 minutos 82% de A e 18% de B; de 10 15 minutos 60%
de A e 40% de B; de 15 a 20 minutos 82% de A e 18% de B.
O fluxo foi de 1mL/min, o tempo total de corrida foi de vinte minutos. A fase móvel
na coluna foi injetada e monitorizada pelo detector ultravioleta no comprimento de onda
273nm.
3.1.6 Precisão e Acurácia
A precisão e a acurácia foram calculadas para amostras de calibração. Os
experimentos da curva de calibração foram feitos em duplicata.
3.2 Parâmetros farmacocinéticos determinados
Os parâmetros farmacocinéticos calculados em nosso protocolo foram:
ASC
0-24
: área sob a curva de concentração plasmática do fármaco versus tempo;
do tempo 0 (zero) ao tempo 24h (vinte e quatro), calculada pelo método trapezoidal.
ASC
[0-∝]
ou ASC
[0-inf]
: área sob a curva de concentração plasmática do fármaco
versus tempo; do tempo 0 (zero) ao tempo infinito, calculada pelo método trapezoidal; onde
ASC
[0-inf]
= ASC
0-24
+ Ct 24/ λz
Cmax: Pico de concentração máxima do fármaco, obtido diretamente dos dados;
Tmax: Tempo para atingir o Cmax
t
1/2
: Meia-vida de eliminação
CL: Clearance sistêmico
ke: Constante de eliminação terminal
59
Vd/kg: Volume de distribuição por kilograma.
4 COMPARAÇÃO COM OUTRO ESTUDO FARMACOCINÉTICO
4.1 Escolha do fármaco
Para efeito de comparação de nossos dados com outros estudos farmacocinéticos,
escolhemos como fármaco alvo o propranolol que é conhecidamente um substrato da enzima
CYP1A2.
4.2 Metodologia de comparação
Analisamos os dados experimentais do estudo farmacocinético de uma formulação de
propranolol 40mg administrada a quarenta e oito voluntários saudáveis a fim de comparar
com os nossos resultados. A comparação se deu através da análise da distribuição de
freqüência das ASC dos voluntários e da estatística descritiva desses valores, para posterior
identificação de seu padrão (normal ou não).
60
5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os valores de atividade enzimática para CYP1A2, CYP2A6, NAT2 e XO foram
analisados pelo histograma e os gráficos Quantil-Quantil; através do programa SPSS for
Windows (versão 10).
A concentração máxima (Cmax) foi calculada através da observação nos dados de
concentração plasmática identificando o maior valor.
O tempo para atingir o Cmax (Tmax) foi observado diretamente dos dados e sua
análise feita pela mediana.
A constante de eliminação terminal (ke) de primeira ordem foi estimada por regressão
linear dos pontos da fase de eliminação numa plotagem log-linear. A análise foi feita através
de média e desvio padrão.
A meia-vida (t
1/2
) foi calculada pela regressão da concentração semilogarítmica versus
tempo. A análise foi feita através de média e desvio padrão.
A análise das áreas sob a curva (ASC
0-24
e ASC
0-∞
) foi realizada pela média e desvio
padrão.
Todos os parâmetros farmacocinéticos dos grupos de voluntários MA e ME de cada
enzima avaliada foram comparados pelo teste paramétrico t-Student e pelo teste não
paramétrico Wilcoxon, através do programa SPSS for Windows (versão 10).
61
Resultados
62
RESULTADOS
Nossos resultados estão divididos em três grupos, dados clínicos, determinação
analítica dos metabólitos e determinação e análise dos parâmetros farmacocinéticos.
1 DADOS CLÍNICOS
1.1 Avaliação Clínica
Foram avaliados 82 indivíduos, 40 do sexo feminino e 42 do sexo masculino, com
idade variando de 18 a 47 anos, idade média de 25 (±6,43) anos e mediana em 22 anos. O
índice de massa corpórea na consulta inicial, variou de 18,86 – 29,76 kg/m
2
com valor da
média 22,86 (±2,93) kg/m
2
e mediana 22,46 kg/m
2
.
Na avaliação inicial as médias das pressões sistólica e diastólica foram respectivamente:
112 (± 12,03) mmHg e 72 (± 9,22) mmHg. Quanto à freqüência de pulso a média foi 73 (±
8,10) batimentos por minuto (bpm).
1.1.1 Exame Cardiológico
O ECG convencional de todos os voluntários, realizado na avaliação inicial, foi
considerado normal ou anormal sem significado clínico.
1.1.2 Eventos Adversos
Os comprimidos de cafeína foram bem tolerados pelos voluntários. Um voluntário
relatou mal estar gástrico, de leve intensidade, no dia do internamento. Outro voluntário
apresentou um episódio de hipertensão no mesmo dia, fazendo uso de medicação
concomitante (captopril 25mg), este evento adverso não foi considerado pelos pesquisadores
associado à ingestão de cafeína.
63
1.1.3 Exames de Patologia Clínica
Os resultados dos exames hematológicos e bioquímicos realizados na avaliação inicial
dos voluntários confirmaram o estado de higidez. Todos foram considerados normais ou com
anormalidades sem significância clínica. Os parâmetros hematológicos foram descritos sob a
forma de média, desvio padrão e mediana e estão apresentados na tabela 10. Os valores de
referência estão descritos na tabela 26 (anexo I).
Tabela 10. Médias, desvio padrão e medianas dos parâmetros hematológicos dos voluntários
selecionados para o estudo de biodisponibilidade da cafeína, valores correspondentes à avaliação realizada
antes do internamento dos voluntários (pré-estudo).
DADOS HEMATOLÓGICOS – HOMENS (N = 40)
PARÂMETROS MÉDIA SD MEDIANA
Hemoglobina 15,07 0,83 15,25
Hematócrito 44,5 2,32 44,65
Plaquetas 246,24 49,75 249
Leucócitos totais 6,9 1,6 6,65
Bastões 1 0 1
Segmentados 53,92 12 54
Eosinófilos 5,12 2,47 5
Basófilos 0,52 0,51 1
Linfócitos 30,31 9,6 30
Monócitos 7,69 1,42 8
DADOS HEMATOLÓGICOS – MULHERES (N = 42)
PARÂMETROS MÉDIA SD MEDIANA
Hemoglobina 12,77 0,85 12,75
Hematócrito 38,26 2,58 38,25
Plaquetas 257,60 54,23 244,5
Leucócitos totais 7,04 1,61 6,75
Bastões 1 0 1
Segmentados 58,26 8,03 59
Eosinófilos 4,4 2,38 4
Basófilos 0,49 0,51 0
Linfócitos 28,35 80,03 29
Monócitos 7,05 1,72 6
Os parâmetros bioquímicos foram divididos em três grupos: parâmetros de função
hepática, renal e metabólica e os valores encontrados estão representados nas tabelas 02, 03 e
64
04 respectivamente como média, desvio padrão e mediana. Os valores de referência estão
descritos nas tabelas 27, 28e 29 (anexoI).
Tabela 11. Médias, desvio padrão e medianas dos parâmetros de função hepática dos voluntários
selecionados para o estudo de biodisponibilidade da cafeína, valores correspondentes à avaliação realizada
antes do internamento dos voluntários (pré-estudo).
PARÂMETROS DE FUNÇÃO HEPÁTICA – HOMENS (N = 40)
PARÂMETROS MÉDIA SD MEDIANA
TGO (AST) 21,64 5,16 21
TGP (ALT) 21,37 7,9 19,95
Gama GT 22,64 11,31 20
Fosfatase Alcalina 171,83 45,03 180
Proteína Total 7,24 0,33 7,28
Bilirrubina 0,8 0,28 0,7
PARÂMETROS DE FUNÇÃO HEPÁTICA – MULHERES (N = 42)
PARÂMETROS MÉDIA SD MEDIANA
TGO (AST) 17,82 4,08 17
TGP (ALT) 16,76 8,76 15
Gama GT 16,56 8,49 16
Fosfatase Alcalina 153,97 36,89 149
Proteína Total 7,10 0,33 7,1
Bilirrubina 0,6 0,22 0,54
65
Tabela 12- Médias, desvio padrão e medianas dos parâmetros de função renal dos voluntários
selecionados para o estudo de biodisponibilidade da cafeína, valores correspondentes à avaliação realizada
antes do internamento dos voluntários (pré-estudo).
PARÂMETROS DE FUNÇÃO RENAL – HOMENS (N = 40)
PARÂMETROS MÉDIA SD MEDIANA
Creatinina 0,86 0,14 0,9
Clearance de Creatinina 135,19 34,02 127,67
PARÂMETROS DE FUNÇÃO RENAL – MULHERES (N = 42)
PARÂMETROS MÉDIA SD MEDIANA
Creatinina 0,63 0,11 0,6
Clearance de Creatinina 149,77 34,46 148,97
Tabela 13- Médias, desvio padrão e medianas dos parâmetros de função metabólica dos
voluntários selecionados para o estudo de biodisponibilidade da cafeína, valores correspondentes à
avaliação realizada antes do internamento dos voluntários (pré-estudo).
PARÂMETROS DE FUNÇÃO METABÓLICA – HOMENS (N = 40)
PARÂMETROS MÉDIA SD MEDIANA
Glicose 87,36 6,44 87
Ácido Úrico 5,28 0,91 5,4
Colesterol Total 164,45 31,73 163
Triglicérides 100,24 47,88 93
PARÂMETROS DE FUNÇÃO METABÓLICA – MULHERES (N = 42)
PARÂMETROS MÉDIA SD MEDIANA
Glicose 85,70 7,12 85
Ácido Úrico 3,89 0,84 3,85
Colesterol Total 167,33 29,26 159,5
Triglicérides 80,75 31,68 68,5
66
2 DETERMINAÇÃO ANALÍTICA DOS METABÓLITOS
2.1 Método Analítico
2.1.1 Desenvolvimento e validação do método analítico para quantificação dos
metabólitos da cafeína (1U – 1-metilúrico; 17U – 1,7-dimetilúrico; 1X –
metilxantina; 17X – 1,7-dimetilxantina e AFMU – 5-acetilamino-6-formilamino-
3metiluracil).
O método desenvolvido mostrou-se específico para os cincos metabólitos (1U, 17U,
1X, 17X e AFMU) e o padrão interno (teobromina), obtendo-se boa separação destes
compostos entre si, bem como dos componentes da urina. Os tempos de retenção encontrados
foram: AFMU – 4,488; 1U – 5,698; 1X – 6,909; 17U – 12,610; 17X – 14,140 e Teobromina –
9,144 minutos. A figura abaixo apresenta o gráfico dos picos dos cinco metabólitos e do
padrão interno em urina repicada, demonstrando uma separação adequada entre os picos das
substâncias avaliadas.
Minutes
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
mAU
0 20 40 60 80
mAU
0
20
40
60
80
4.488 390944 AFMU
5.698 639419 1U
6.185 2009
6.909 531454 1X
9.153 879492 TEOBROMINA
12.616 390106 17U
14.140 455632 17X
1: 273 nm, 8 nm
CC Pool 060203
CC Pool Padrões 03
Retention Time
Area
Name
Figura 4 - Cromatograma da urina repicada com os metabólitos: AFMU, 1U, 1X, 17U, 17X; e o
padrão interno: Teobromina, após a extração com clorofórmio e isopropanol (4:1), mostrando o grau de
separação entre as substâncias analisadas.
67
A recuperação média da extração foi de 55,31% para AFMU; 86,96% para 1U;
79,24% para 1X; 62,41% para 17U e 75,61% para 17X.
O método escolhido foi linear nas concentrações testadas de 0,5; 1; 2; 4, 8 e 16μg/mL
para a quantificação do metabólito 1U, e permitindo linearidade até 16μg/mL com um
coeficiente de correlação (r) maior que 0,95 para 1U (r
= 0,98870). A figura 5 apresenta a
curva de calibração do metabólito 1U e a tabela 14 apresentam os parâmetros relativos à
equação da curva de calibração.
Para os demais metabólitos (AFMU, 1X, 17U e 17X) o método escolhido foi linear
nas concentrações testadas de 2, 4, 8, 16 e 32μg/mL e permitindo linearidade até 32μg/mL
com um coeficiente de correlação (r) maior que 0,95 para todos os metabólitos sendo estes:
AFMU (r
= 0,99858), 1X (r
= 0,99854, 17U) (r
= 0,99916) e 17X (r
= 0,99822). As figuras 6,
7, 8 e 9 apresentam as curvas de calibração dos metabólitos e as tabelas 15, 16, 17 e 18
representam os parâmetros relativos às suas equações das curvas de calibração.
Curva calibração 1U
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 5 10 15 20
Concentração (ug/mL)
Razão 1U/PI
Figura 5 - Curva de calibração do método analítico para a quantificação de 1U em urina por
HPLC na faixa de concentração entre 0,5 e 16μg/mL
68
Tabela 14 - Parâmetros relativos à curva de calibração do método analítico para quantificação do
1U em urina por HPLC na faixa de concentração de 0,5 a 16μg/mL.
PARÂMETRO VALOR
Inclinação (a) 0,0679
Intercepto (b) 0,1292
Coeficiente de Correlação (r) 0,98870
Curva de Calibração AFMU
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 5 10 15 20 25 30 35
Concentração AFMU (ug/mL)
Razão AFMU/P
I
Figura 6 - Curva de calibração do método analítico para a quantificação de AFMU em urina por
HPLC na faixa de concentração entre 2 e 32μg/mL.
Tabela 15 - Parâmetros relativos à curva de calibração do método analítico para quantificação do
AFMU em urina por HPLC na faixa de concentração de 2 a 32μg/mL.
PARÂMETRO VALOR
Inclinação (a) 0,0210
Intercepto (b) 0,0589
Coeficiente de Correlação (r) 0,99858
69
Curva de Calibração 1X
0
0,5
1
1,5
2
0 5 10 15 20 25 30 35
Concentração 1X (ug/mL)
Razão 1X/PI
Figura 7 - Curva de calibração do método analítico para a quantificação de 1X em urina por
HPLC na faixa de concentração entre 2 e 32μg/mL.
Tabela 16- Parâmetros relativos à curva de calibração do método analítico para quantificação do
1X em urina por HPLC na faixa de concentração de 2 a 32μg/mL.
PARÂMETRO VALOR
Inclinação (a) 0,0466
Intercepto (b) 0,0723
Coeficiente de Correlação (r) 0,99854
Curva de Calibração 17U
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 5 10 15 20 25 30 35
Concentração 17U (ug/mL)
Razão 17U/PI
Figura 8 - Curva de calibração do método analítico para a quantificação de 17U em urina por
HPLC na faixa de concentração entre 2 e 32μg/mL.
70
Tabela 17. Parâmetros relativos à curva de calibração do método analítico para quantificação do
17U em urina por HPLC na faixa de concentração de 2 a 32μg/mL.
PARÂMETRO VALOR
Inclinação (a) 0,0325
Intercepto (b) 0,0094
Coeficiente de Correlação (r) 0,99916
Curva de Calibração 17X
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 5 10 15 20 25 30 35
Concentração 17X (ug/mL)
Razão 17X/PI
Figura 9 - Curva de calibração do método analítico para a quantificação de 17X em urina por
HPLC na faixa de concentração entre 2 e 32μg/mL.
Tabela 18 -Parâmetros relativos à curva de calibração do método analítico para quantificação do
17X em urina por HPLC na faixa de concentração de 2 a 32μg/mL.
PARÂMETRO VALOR
Inclinação (a) 0,0412
Intercepto (b) 0,0354
Coeficiente de Correlação (r) 0,99822
A precisão média foi de 1,66% para AFMU; 1,01% para 1U; 0,55% para 1X; 0,25%
para 17U e 0,20% para 17X. A exatidão média foi de 100,59% para o AFMU; 99,92% para
1U; 98,92% para 1X; 99,27% para 17U e 98,88% para 17X. Por definição, o coeficiente de
71
variação (CV) para a precisão não pode exceder 15% para cada concentração analisada
(tolerância de até 20% da concentração do limite de quantificação). Em se tratando da
acurácia, o CV deve estar dentro de 15% do valor atual em relação à média das amostras de
cada concentração (tolerância até 20% da concentração do limite de quantificação). O limite
de quantificação do método foi de 2μg/mL para os cincos metabólitos. O menor limite de
detecção foi 1μg/mL.
2.2 Determinação da atividade das enzimas CYP1A2, NAT2, CYP2A6 e XO.
Embora tenham sido quantificadas as concentrações urinárias dos cinco metabólitos
nos 80 voluntários, um deles (VOL 60) foi considerado “outline” e não foi incluído da
quantificação das atividades enzimáticas, totalizando apenas 79 voluntários.
A atividade das enzimas foi determinada através das seguintes razões: CYP1A2 =
(AFMU + 1X + 1U)/ 17U; CYP2A6 = 17U / (AFMU + 1X + 1U + 17X + 17U); NAT2 =
AFMU/ (AFMU + 1X + 1U) e XO = 1U/ (1X + 1U). As concentrações dos metabólitos foram
expressas em suas concentrações molares (g/L). As tabelas 19 e 20 apresentam os valores da
estatística descritiva das atividades das enzimas CYP1A2; CYP2A6; NAT2 e XO.
Tabela 19 – Média e Desvio padrão das atividades das enzimas CYP1A2 e CYP2A6 dos 79
voluntários.
VOLUNTÁRIO CYP1A2 CYP2A6
Média 1,5366 0,2540
Desvio Padrão (SD) 0,7656 0,0641
Mediana 1,3942 0,2551
Variancia 0,586 0,0041
Intervalo de confiança 95% 0,1693 – 3,2425 0,0142 – 0,5223
Valor Mínimo 0,4258 0,0611
Valor Máximo 3,9525 0,4806
Coeficiente Skewness 1,032 0,548
Coeficiente Kurtosis 0,970 2,070
72
Tabela 20 – Média e Desvio padrão das atividades das enzimas NAT2 e Xantina Oxidase dos 79
voluntários.
VOLUNTÁRIO NAT2 XANTINA OXIDASE
Média 1,1073 0,2337
Desvio Padrão (SD) 1,2310 0,1140
Mediana 0,6613 0,2142
Variancia 1,515 0,0130
Intervalo de confiança 95% 0,2722 – 2,4868 0,0252 – 0,4926
Valor Mínimo 0,0065 0,0476
Valor Máximo 6,5261 0,5777
Coeficiente Skewness 1,896 0,912
Coeficiente Kurtosis 4,416 0,607
A estatística descritiva dos valores de atividade enzimática para CYP1A2, NAT2, XO
e CYP2A6 indicou que eles não correspondem a uma distribuição normal, já que seus
coeficientes de Skewness (coeficiente de assimetria) Kurtosis (coeficiente de achatamento)
foram diferentes de zero; no entanto, os valores de atividade da NAT2 foram os que melhor
caracterizaram esta não normalidade.
2.3 Avaliação dos fenótipos das enzimas estudadas
A avaliação dos fenótipos das enzimas estudadas foi realizada através de estatística
descritiva com representação gráfica por de histograma, Normal Q-Q Plot e Detrended
Normal Q-Q Plot; os quais indicam a tendência de normalidade ou não da distribuição dos
valores obtidos para a atividade enzimática.
2.3.1 CYP1A2
A distribuição de freqüência dos valores encontrados para a atividade da enzima
CYP1A2 demonstrou uma distribuição não normal, com tendência a triimodalidade.
73
A figura 10 representa o histograma da distribuição de freqüência dos valores de
atividade da enzima CYP1A2 de oitenta e um voluntários avaliados.
CYP1A2
4,00
3,75
3,50
3,25
3,00
2,75
2,50
2,25
2,00
1,75
1,50
1,25
1,00
,75
,50
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Std. Dev = ,77
Mean = 1,54
N = 81,00
Figura 10 - Histograma dos valores de atividade da enzima CYP1A2 de 79 voluntários. A curva
indica a distribuição normal esperada.
As figuras 11 e 12 representam os gráficos quantil-quantil dos valores de atividade da
enzima CYP1A2 de setenta e nove voluntários avaliados.
Normal Q-Q Plot of CYP1A2
Observed Value
543210-1
Expected Normal Value
4
3
2
1
0
-1
Figura 11 - Gráfico da análise pelo teste Quantil-Quantil (Q-Q) dos valores de atividade da
enzima CYP1A2 de 79 voluntários. A linha verde representa a distribuição normal e os pontos vermelhos
representam os dados experimentais.
Nº de Voluntários
ATIVIDADE CYP1A2
74
O gráfico de Normal Q-Q Plot mostrou a existência de dois pontos de quebra (0,75 e
2,5) na distribuição dos valores experimentais de atividade enzimática, estes ponto podem ser
usados como divisor entre os fenótipos metabolizadores, dividindo os voluntários em três
grupos: os metabolizadores insuficientes (12,66%), os metabolizadores intermediários
(75,95%) e os metabolizadores extensos (11,39%).
Detrended Normal Q-Q Plot of CYP1A2
Observed Value
4,03,53,02,52,01,51,0,50,0
Deviation from Normal
,8
,6
,4
,2
0,0
-,2
-,4
Figura 12 - Gráfico da análise pelo teste Q-Q dos valores de atividade da enzima CYP1A2 de 79
voluntários. Este gráfico representa o grau de dispersão dos dados experimentais em relação à
distribuição normal.
2.3.2 CYP2A6
Embora os testes de normalidade tenham indicado que a distribuição de freqüência
para a atividade enzimática da CYP2A6 seja não normal, os gráficos apresentados não
apresentaram tendência a bimodalidade.
A figura 13 representa o histograma e da distribuição de freqüência dos valores de
atividade da enzima CYP2A6 de oitenta e um voluntários avaliados.
75
CYP2A6
,475
,450
,425
,400
,375
,350
,325
,300
,275
,250
,225
,200
,175
,150
,125
,100
,075
,050
20
10
0
Std. Dev = ,06
Mean = ,254
N = 81,00
Figura 13- Histograma dos valores de atividade da enzima CYP2A6 de 81 voluntários A curva
indica a distribuição normal esperada.
As figuras 14 e 15 representam os gráficos quantil-quantil dos valores de atividade da
enzima CYP1A2 de setenta e nove voluntários avaliados. Embora a estatística descritiva tenha
mostrado a não normalidade dos dados, a representação gráfica não demonstra claramente os
pontos de quebra, dificultando a avaliação da heterogeneidade da distribuição.
Normal Q-Q Plot of CYP2A6
Observed Value
,5,4,3,2,10,0
Expected Normal Value
,5
,4
,3
,2
,1
0,0
Figura 14 - Gráfico da análise pelo teste Quantil-Quantil (Q-Q) dos valores de atividade da
enzima CYP1A2 de 79 voluntários. A linha verde representa a distribuição normal e os pontos vermelhos
representam os dados experimentais.
Nº de Voluntários
ATIVIDADE CYP2A6
76
Detrended Normal Q-Q Plot of CYP2A6
Observed Value
,5,4,3,2,10,0
Deviation from Normal
,08
,06
,04
,02
0,00
-,02
-,04
Figura 15 - Gráfico da análise pelo teste Q-Q dos valores de atividade da enzima CYP1A2 de 79
voluntários. Este gráfico representa o grau de dispersão dos dados experimentais em relação à
distribuição normal.
2.3.3 NAT2
A distribuição de freqüência dos valores encontrados para a atividade da enzima
NAT2 demonstrou uma distribuição não normal, com tendência a trimodalidade.
A figura 16 representa o histograma da distribuição de freqüência dos valores de
atividade da enzima NAT2 dos oitenta e um voluntários avaliados. Os voluntários foram
classificados como acetiladores lentos, intermediários e rápidos, de acordo com o valor da
atividade enzimática. Aqueles que apresentaram atividade inferior a 0,25 (n = 21) foram
classificados como acetiladores lentos e aqueles com atividade entre 0,25 e 2,5 (n = 48) foram
classificados como acetiladores intermediários, enquanto os que apresentaram atividade
enzimática superior a 2,5 (n = 10) foram classificados como acetiladores rápidos. A
percentagem de acetiladores lentos foi de 46,83% e de acetiladores rápidos foi de 53,16%.
77
NAT
6,50
6,00
5,50
5,00
4,50
4,00
3,50
3,00
2,50
2,00
1,50
1,00
,50
0,00
30
20
10
0
Std. Dev = 1,23
Mean = 1,11
N = 81,00
Figura 16 - Histograma dos valores de atividade da enzima NAT2 de oitenta e um voluntários. A
curva indica a distribuição normal esperada.
As figuras 17 e 18 representam os gráficos quantil-quantil dos valores de atividade da
enzima NAT2 de setenta e nove voluntários avaliados.
Normal Q-Q Plot of NAT
Observed Value
86420-2
Expected Normal Value
5
4
3
2
1
0
-1
-2
Figura 17 - Gráfico da análise pelo teste Quantil-Quantil (Q-Q) dos valores de atividade da
enzima NAT2 de 79 voluntários. A linha verde representa a distribuição normal e os pontos vermelhos
representam os dados experimentais.
Nº de Voluntários
ATIVIDADE NAT2
78
Detrended Normal Q-Q Plot of NAT
Observed Value
76543210-1
Deviation from Normal
2,5
2,0
1,5
1,0
,5
0,0
-,5
-1,0
Figura 18 - Gráfico da análise pelo teste Quantil-Quantil (Q-Q) dos valores de atividade da
enzima NAT2 de 79 voluntários. Este gráfico representa o grau de dispersão dos dados experimentais em
relação à distribuição normal.
2.3.4 XO
A distribuição de freqüência dos valores encontrados para a atividade da enzima XO
não apresentou tendência a bimodalidade. A figura 19 representa o histograma da distribuição
de freqüência dos valores de atividade da enzima XO dos setenta e nove voluntários
avaliados.
XO
,550
,500
,450
,400
,350
,300
,250
,200
,150
,100
,050
12
10
8
6
4
2
0
Std. Dev = ,11
Mean = ,234
N = 81,00
Figura 19 - Histograma dos valores de atividade da enzima XO de oitenta e um voluntários. A
curva indica a distribuição normal esperada.
Nº de Voluntários
ATIVIDADE XO
79
As figuras 20 e 21 representam os gráficos quantil-quantil dos valores de atividade da
enzima NAT2 de setenta e nove voluntários avaliados.
Normal Q-Q Plot of XO
Observed Value
,6,5,4,3,2,10,0-,1
Expected Normal Value
,6
,5
,4
,3
,2
,1
0,0
-,1
Figura 20 - Gráfico da análise pelo teste Quantil-Quantil (Q-Q) dos valores de atividade da
enzima XO de 79 voluntários. A linha verde representa a distribuição normal e os pontos vermelhos
representam os dados experimentais.
Detrended Normal Q-Q Plot of XO
Observed Value
,6,5,4,3,2,10,0
Deviation from Normal
,10
,08
,06
,04
,02
0,00
-,02
-,04
Figura 21 - Gráfico da análise pelo teste Q-Q dos valores de atividade da enzima XO de 79
voluntários. Este gráfico representa o grau de dispersão dos dados experimentais em relação à
distribuição normal.
80
O gráfico de Normal Q-Q Plot mostrou a existência de dois pontos de quebra (0,35 e
0,38) na distribuição dos valores experimentais de atividade enzimática, este ponto pode ser
usado como divisor entre os fenótipos metabolizadores. Deste modo classificamos os
voluntários como metabolizadores insuficientes (83,54%), metabolizadores intermediários
(3,8%) e metabolizadores extensos (12,66%).
2.4 Classificação da atividade enzimática dos voluntários
Os voluntários classificados no grupo CYP1A2-ME correspondem aos oito
voluntários que apresentaram menor atividade para a enzima CYP1A2; os classificados no
grupo CYP1A2-MA correspondem aos oito com maior atividade para a enzima CYP1A2.
Classificação semelhante foi estabelecida para as outras enzimas: CYP2A6-ME = são os oito
com menor atividade da CYP2A6; CYP2A6-MA = são os oito com maior atividade da
CYP2A6; NAT2-ME = são os oito com menor atividade da NAT2; NAT2-MA = são os oito
com maior atividade da NAT2; XO-ME = são os oito com menor atividade da XO; XO-MA =
são os oito com maior atividade da XO.
A tabela 11 apresenta a relação de voluntários classificados em cada grupo que foram
escolhidos para determinação dos parâmetros farmacocinéticos.
Tabela 21 - Relação dos voluntários classificados em cada grupo, de acordo com a atividade
enzimática.
ENZIMA CLASSIFICAÇÃO VOLUNTÁRIOS
CYP1A2-ME 36, 39, 55, 61, 65, 75, 79 e 81
CYP1A2
CYP1A2-MA 17, 24, 34, 38, 50, 53, 64 e 72
NAT2-ME 03, 04, 05, 18, 37, 48, 71, 76
NAT2
NAT2-MA 17, 32, 34, 39, 50, 51, 53 e 58
XO-ME 03, 04, 32, 34, 56, 64, 68 e 71
XO
XO-MA 29, 36, 39, 51, 58, 61, 72 e 81
CYP2A6-ME 17, 24, 34, 50, 53, 56, 58 e 72
CYP2A6
CYP2A6-MA 03, 36, 61, 65, 68, 75, 79 e 81
81
3 DETERMINAÇÃO E ANÁLISE DOS PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS
3.1 Método Analítico
3.1.1 Desenvolvimento e validação do método analítico para quantificação da cafeína
no plasma.
O método desenvolvido mostrou-se específico para a cafeína e para o padrão interno
(teobromina), obtendo-se boa separação destes compostos entre si, bem como dos
componentes do plasma. A cafeína apresentou o tempo de retenção 5,106 min e a teobromina
3,530 min.
A figura 22 apresenta os picos da cafeína e do padrão interno em plasma repicado,
demonstrando uma separação adequada entre os picos das substâncias avaliadas. A
recuperação média da extração da cafeína foi de 97,11%.
Mi n u t e s
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
mAU
0 10 20 30 40 50 60
mAU
0
10
20
30
40
50
60
2.844 3077
3.106 4775
3.530 76105 Teobromina
5.106 423904 Cafeína
1: 273 nm, 8 nm
C C Plasma 290403
Curva Calibração Plasma 4 04-Rep1
Retention Time
Area
Name
Figura 22 - Cromatograma referente à amostra de plasma branco, de voluntários sadios, repicado
com cafeína e o padrão interno: Teobromina, após a extração com clorofórmio e isopropranol (4:1),
mostrando o grau de separação entre as substâncias analisadas.
O método escolhido foi linear nas concentrações testadas de 1, 2, 4, 8 e 16μg/mL para
a quantificação da cafeína, e permitindo linearidade até 16μg/mL com um coeficiente de
82
correlação (r) maior que 0,95 (r
= 0,99782). O limite de quantificação do método foi de
0,5μg/mL. A figura 20 apresenta a curva de calibração da cafeína e a tabela 12 representa os
parâmetros relativos à equação da curva de calibração.
A precisão variou entre 1,23 e 3,26%. A exatidão variou entre 99,97 e 112,14%.
Curva de Calibração CAFEÍNA
0
1
2
3
4
5
0246810
Concentração Cafeína (ug/mL)
Razão Cafeína/PI
Figura 23 - Curva de calibração do método analítico para a quantificação de cafeína no plasma
humano por HPLC na faixa de concentração entre 0,5 e 8μg/mL.
Tabela 22 - Parâmetros relativos à curva de calibração do método analítico para quantificação da
cafeína no plasma humano por HPLC na faixa de concentração de 0,5 e 8μg/mL.
PARÂMETRO VALOR
Inclinação (a) 0,49266
Intercepto (b) 0,0595
Coeficiente de Correlação (r) 0,99782
83
3.2 Determinação e comparação dos parâmetros farmacocinéticos dos grupos de
voluntários selecionados
Os parâmetros farmacocinéticos calculados foram: área sob a curva de concentração
plasmática versus tempo de zero a vinte e quatro horas (ASC
0-24
); concentração máxima
(Cmax); tempo para atingir a concentração máxima (Tmax); constante de eliminação (ke);
Meia vida de eliminação (t
1/2
); Clearance sistêmico (CL) e o volume de distribuição por quilo
(Vd/kg).
Foram calculados os parâmetros farmacocinéticos dos voluntários descritos na tabela
11 e comparados os valores encontrados no grupo MA e no grupo ME, a fim de identificar se
houve diferença estatística entre os grupos. A diferença foi avaliada pelo teste t Student e pelo
teste de Wilcoxon.
3.2.1 Comparação dos parâmetros farmacocinéticos para a enzima CYP1A2
A tabela 23 traz os valores dos parâmetros farmacocinéticos da cafeína, comparando
os grupos CYP1A2-MA e CYP1A2-ME e identificando o valor do p para o teste t de Student.
A análise estatística pelo teste não paramétrico de Wilcoxon não demonstrou diferença
estatística entre os valores dos parâmetros farmacocinéticos do grupo CYP1A2-MA e
CYP1A2-ME.
As médias dos valores de ASC para os grupos CYP1A2-MA e CYP1A2-ME foram
42,976 (± 17,533) μg.h/mL e 52,433 (± 24,139) μg.h/mL respectivamente, a análise estatística
pelo teste t Student mostrou uma significância de p<0,001.
As médias dos valores de ke para os grupos CYP1A2-MA e CYP1A2-ME foram
0,175 (±0,085) h.
-1
e 0,117 (±0,047) h.
-1
respectivamente, a análise estatística pelo teste t
Student mostrou uma significância de p<0,001.
84
As médias (desvio padrão) dos valores de t
1/2
para os grupos CYP1A2-MA e
CYP1A2-ME foram 6,6 horas (±7,26) e 6,6 horas (±3,34) respectivamente, a análise
estatística pelo teste t Student mostrou uma significância de p<0,05.
As médias dos valores de Cmax para os grupos CYP1A2-MA e CYP1A2-ME foram
5,465 (±1,041) μg/mL e 6,012 (±1,768) ) μg/mL respectivamente, a análise estatística pelo
teste t Student mostrou uma significância de p<0,001.
As médias dos valores de Tmax para os grupos CYP1A2-MA e CYP1A2-ME foram
0,58 (±0,19) horas e 1,250 (±0,502) horas respectivamente, a análise estatística pelo teste t
Student mostrou uma significância de p<0,001.
As médias dos valores de CL para os grupos CYP1A2-MA e CYP1A2-ME foram
481,019 (±219,67) mL/h e 373,105 (±190,430) mL/h respectivamente, a análise estatística
pelo teste t Student mostrou uma significância de p<0,001.
As médias dos valores de Vd/kg para os grupos CYP1A2-MA e CYP1A2-ME foram
0,043 (±0,011) L/kg e 0,046 (±0,005) L/kg respectivamente, a análise estatística pelo teste t
Student mostrou uma significância de p<0,001.
Tabela 23 - Comparação dos parâmetros farmacocinéticos, da cafeína, entre os grupos CYP1A2-
MA e CYP1A2-ME. Os valores estão expressos como média e desvio padrão (n= 8)
MAIORES MENORES
PARÂMETRO
MÉDIA SD MÉDIA SD
SIGNIFICÂNCIA
ASC
(0-24h)
(μg.h/mL)
42,9760 17,533 56,433 24,139 p<0,001
ke (h.
-1
) 0,17550 0,085 0,117 0,047 p<0,001
t
½
(h) 6,600 7,260 6,987 3,336 p<0,05
Cmax
(μg/mL)
5,465 1,041 6,012 1,768 p<0,001
Tmax (h) 0,580 0,191 1,250 0,502 p<0,001
CL
(mL/h) 481,019 219,667 373,105 190,430 p<0,001
Vd/kg (L/kg) 0,043 0,011 0,046 0,005 p<0,001
85
A Figura 24 apresenta o gráfico das curvas de concentrações plasmáticas (μg/mL)
versus tempo (h) após a administração de um comprimido de cafeína 200mg, dos grupos
CYP1A2-MA e CYP1A2-ME (n = 8 em cada grupo) de voluntários.
ASC - CYP1A2
0 10 20 30
0.0
2.5
5.0
7.5
CYP1A2-MA
CYP1A2-ME
Tempo (h)
Concentração Plasmática
(ug/mL)
Figura 24 - Curvas de concentrações plasmáticas (μg/mL) versus tempo (h) após a administração
de um comprimido de cafeína 200mg, comparando os voluntários do grupo CYP1A2-MA e CYP1A2-ME
(n = 8 em cada grupo).
3.2.2 Comparação dos parâmetros farmacocinéticos para a enzima NAT2
A tabela 24 traz os valores dos parâmetros farmacocinéticos da cafeína, comparando
os grupos NAT2-MA e NAT2-ME e identificando o valor do p para o teste t Student.
A análise estatística pelo teste não paramétrico de Wilcoxon não demonstrou diferença
estatística entre os valores dos parâmetros farmacocinéticos do grupo NAT2-MA e NAT2-
ME.
As médias dos valores de ASC para os grupos NAT2-MA e NAT2-ME foram 63,033
(±35,563) μg.h/mL e 58,613 (±13,583) μg.h/mL respectivamente, a análise estatística pelo
teste t Student mostrou uma significância de p<0,002.
86
As médias dos valores de ke para os grupos NAT2-MA e NAT2-ME foram 0,131
(±0,75) h
-1
e 0,117 (±0,031) h
-1
respectivamente, a análise estatística pelo teste t Student
mostrou uma significância de p<0,002.
As médias dos valores de t
1/2
para os grupos NAT2-MA e NAT2-ME foram 7,161
horas (±4,218) e 6,358 horas (±1,858) respectivamente, a análise estatística pelo teste t
Student mostrou uma significância de p<0,002.
As médias dos valores de Cmax para os grupos NAT2-MA e NAT2-ME foram 7,085
(±1,349) μg/mL e 6,411 (±0,993) μg/mL respectivamente, a análise estatística pelo teste t
Student mostrou uma significância de p<0,001.
As médias dos valores de Tmax para os grupos NAT2-MA e NAT2-ME foram 0,895
(±0,504) horas e 1,250 (±0,424) horas respectivamente, a análise estatística pelo teste t
Student mostrou uma significância de p<0,002.
As médias dos valores de CL para os grupos NAT2-MA e NAT2-ME foram 352,993
(±190,287) mL/h e 314,156 (±80,617) mL/h respectivamente, a análise estatística pelo teste t
Student mostrou uma significância de p<0,001.
As médias dos valores de Vd/kg para os grupos NAT2-MA e NAT2-ME foram 0,042
(±0,006) L/kg e 0,047 (±0,008) L/kg respectivamente, a análise estatística pelo teste t Student
mostrou uma significância de p<0,001.
87
Tabela 24 - Comparação dos parâmetros farmacocinéticos, da cafeína, entre os grupos NAT2-MA
e NAT2-ME. Os valores estão expressos como média e desvio padrão (n= 8)
MAIORES MENORES
PARÂMETRO
MÉDIA SD MÉDIA SD
SIGNIFICÂNCIA
ASC
(0-24h)
(μg.h/mL)
63,033 35,563 58,613 13,583 p<0,002
ke (h.
-1
) 0,131 0,075 0,117 0,031 p<0,002
t
½
(h) 7,161 4,218 6,358 1,858 p<0,002
Cmax
(μg/mL)
7,085 1,349 6,411 0,993 p<0,001
Tmax (h) 0,895 0,504 1,250 0,424 p<0,002
CL
(mL/h) 352,993 190,287 314,156 80,617 p<0,001
Vd/kg (L/kg) 0,042 0,006 0,047 0,008 p<0,001
A Figura 25 apresenta o gráfico das curvas de concentrações plasmáticas (ng/mL)
versus tempo (h) após a administração de um comprimido de cafeína 200mg, dos grupos
NAT2-MA e NAT2-ME (n = 8 em cada grupo) de voluntários.
ASC - NAT2
0 10 20 30
0.0
2.5
5.0
7.5
NAT2-MA
NAT2-ME
Tempo (h)
Concentração Plasmática
(ug/mL)
Figura 25 - Curvas de concentrações plasmáticas (ng/mL) versus tempo (h) após a administração
de um comprimido de cafeína 200mg, comparando os voluntários do grupo NAT2-MA e NAT2-ME (n = 8
em cada grupo).
88
3.2.3 Comparação dos parâmetros farmacocinéticos para a enzima XO
A tabela 25 traz os valores dos parâmetros farmacocinéticos da cafeína, comparando
os grupos XO-MA e XO-ME e identificando o valor do p (teste t Student).
A análise estatística pelo teste não paramétrico de Wilcoxon não demonstrou diferença
estatística entre os valores dos parâmetros farmacocinéticos do grupo XO-MA e XO-ME.
As médias dos valores de ASC para os grupos XO-MA e XO-ME foram 60,680
(±34,69) μg.h/mL e 56,31 (±22,58) μg.h/mL respectivamente, a análise estatística pelo teste t
Student mostrou uma significância de p<0,002.
As médias dos valores de ke para os grupos XO-MA e XO-ME foram 0,111 (±0,047)
h.
-1
e 0,129 (±0,058) h.
-1
respectivamente, a análise estatística pelo teste t Student mostrou
uma significância de p<0,001.
As médias dos valores de t
1/2
para os grupos XO-MA e XO-ME E foram 7,473 (±3,72)
h e 6,409 (±2,81) h respectivamente, a análise estatística pelo teste t Student mostrou uma
significância de p<0,001.
As médias dos valores de Cmax para os grupos XO-MA e XO-ME foram 6,302
(±1,912) μg/mL e 5,765 (±1,469) μg/mL respectivamente, a análise estatística pelo teste t
Student mostrou uma significância de p<0,001.
As médias dos valores de Tmax para os grupos XO-MA e XO-ME foram 1,250
(±0,526) horas e 0,875 (±0,516) horas respectivamente, a análise estatística pelo teste t
Student mostrou uma significância de p<0,001.
As médias dos valores de CL para os grupos XO-MA e XO-ME foram 372,262
(±213,873) mL/h e 362,080 (±170,255) ) mL/h respectivamente, a análise estatística pelo teste
t Student mostrou uma significância de p<0,002.
89
As médias dos valores de Vd/kg para os grupos XO-MA e XO-ME foram 0,048
(±0,004) ) L/kg e 0,042 (±0,005) ) L/kg respectivamente, a análise estatística pelo teste t
Student mostrou uma significância de p<0,001.
Tabela 25 - Comparação dos parâmetros farmacocinéticos, da cafeína, entre os grupos XO-MA e
XO-ME. Os valores estão expressos como média e desvio padrão (n= 8)
MAIORES MENORES
PARÂMETRO
MÉDIA SD MÉDIA SD
SIGNIFICÂNCIA
ASC
(0-24h)
(μg.h/mL)
60,680 34,688 56,310 22,582 p<0,002
ke (h.
-1
) 0,111 0,047 0.129 0,058 p<0,001
t
½
(h) 7,473 3,720 6,409 2,809 p<0,001
Cmax
(μg/mL)
6,302 1,912 5,765 1,468 p<0,001
Tmax (h) 1,250 0,526 0,875 0,516 p<0,001
CL
(mL/h) 372,262 213,873 362,080 170,255 p<0,002
Vd/kg (L/kg) 0,048 0,004 0,042 0,005 p<0,001
A Figura 26 apresenta o gráfico das curvas de concentrações plasmáticas (ng/mL)
versus tempo (h) após a administração de um comprimido de cafeína 200mg, dos grupos XO-
MA e XO-ME (n = 8) de voluntários.
ASC - XO
0 10 20 30
0.0
2.5
5.0
7.5
XO-MA
XO-ME
Tempo
Concentração Plasmática
(ug/mL)
Figura 26 - Curvas de concentrações plasmáticas (ng/mL) versus tempo (h) após a administração
de um comprimido de cafeína 200mg, comparando os voluntários do grupo XO-MA e XO-ME (n = 8 em
cada grupo).
90
3.2.4 Comparação dos parâmetros farmacocinéticos para a enzima CYP2A6
A tabela 26 traz os valores dos parâmetros farmacocinéticos da cafeína, comparando
os grupos CYP2A6-MA e CYP2A6-ME e identificando o valor do “p” para teste t Student.
A análise estatística pelo teste não paramétrico de Wilcoxon só demonstrou diferença
entre os valores dos grupos estudados para o parâmetro Tmax (com p<0,05); os demais
parâmetros farmacocinéticos do grupo CYP2A6-MA e CYP2A6-ME não apresentaram
diferença estatística.
As médias dos valores de ASC para os grupos CYP2A6-MA e CYP2A6-ME foram
61,554 (±21,513) μg.h/mL e 44,491 (±16,861) μg.h/mL respectivamente, a análise estatística
pelo teste t Student mostrou uma significância de p<0,001.
As médias dos valores de ke para os grupos CYP2A6-MA e CYP2A6-ME foram
0,099 (±0,039) h.
-1
e 0,148 (±0,078) ) h.
-1
respectivamente, a análise estatística pelo teste t
Student mostrou uma significância de p<0,002.
As médias dos valores de t
1/2
para os grupos CYP2A6-MA e CYP2A6-ME foram
7,957 (±3,133) horas e 7,329 (±7,004) horas respectivamente, a análise estatística pelo teste t
Student mostrou uma significância de p<0,05.
As médias dos valores de Cmax para os grupos CYP2A6-MA e CYP2A6-ME foram
5,757 (±1,398) μg/mL e 5,666 (±1,160) μg/mL respectivamente, a análise estatística pelo
teste t Student mostrou uma significância de p<0,001.
As médias dos valores de Tmax para os grupos CYP2A6-MA e CYP2A6-ME foram
1,215 (±0,472) horas e 0,574 (±0,191) horas respectivamente, a análise estatística pelo teste t
Student mostrou uma significância de p<0,001.
As médias dos valores de CL para os grupos CYP2A6-MA e CYP2A6-ME foram
365,127 (±196,577) mL/h e 451,710 (±210,761) mL/h respectivamente, a análise estatística
pelo teste t Student mostrou uma significância de p<0,001.
91
As médias dos valores de Vd/Kg para os grupos CYP2A6-MA e CYP2A6-ME foram
0,0467 (±0,005) L/kg e 0,046 (±0,010) ) L/kg respectivamente, a análise estatística pelo teste t
Student mostrou uma significância de p<0,001.
Tabela 26 - Comparação dos parâmetros farmacocinéticos, da cafeína, entre os grupos CYP2A6-
MA e CYP2A6-ME. Os valores estão expressos como média e desvio padrão (n= 8)
MAIORES MENORES
PARÂMETRO
MÉDIA SD MÉDIA SD
SIGNIFICÂNCIA
ASC
(0-24h)
(μg.h/mL)
61,554 21,513 44,491 16,861 p<0,001
ke (h.
-1
) 0,099 0,039 0,148 0,078 p<0,002
t
½
(h) 7,957 3,133 7,329 7,004 p<0,05
Cmax
(μg/mL)
5,757 1,398 5,666 1,160 p<0,001
Tmax (h) 1,215 0,472 0,574 0,191 p<0,001
CL
(mL/h) 365,127 196,577 451,710 210,761 p<0,001
Vd/kg (L/kg) 0,046 0,005 0,046 0,010 p<0,001
A Figura 27 apresenta o gráfico das curvas de concentrações plasmáticas (ng/mL)
versus tempo (h) após a administração de um comprimido de cafeína 200mg, dos grupos
CYP1A2-MA e CYP1A2-ME (n = 8) de voluntários.
ASC - CYP2A6
0 10 20 30
0.0
2.5
5.0
7.5
CYP2A6-MA
CYP2A6-ME
Tempo (h)
Concentração Plasmática
(ug/mL)
92
Figura 27 - Curvas de concentrações plasmáticas (ng/mL) versus tempo (h) após a administração
de um comprimido de cafeína 200mg, comparando os voluntários do grupo CYP2A6-MA e CYP2A6-ME
(n = 8 em cada grupo).
4 COMPARAÇÃO COM OUTRO ESTUDO FARMACOCINÉTICO
4.1 Avaliação da distribuição de freqüência das ASC do Propranolol
Resolvemos avaliar a distribuição de freqüência das ASC de quarenta e oito
voluntários que tomaram um comprimido de 40mg de propranolol (fármaco metabolizado
pela CYP1A2). Os dados mostraram que as ASC, semelhantemente aos dados experimentais,
não compunham uma distribuição normal. Observamos que tanto o histograma (figura 28)
quanto os gráficos Quantil-Quantil (figuras 29 e 30) confirmaram esta não normalidade.
AUC
750,0
700,0
650,0
600,0
550,0
500,0
450,0
400,0
350,0
300,0
250,0
200,0
150,0
100,0
50,0
10
8
6
4
2
0
Std. Dev = 138,13
Mean = 206,1
N = 49,00
Figura 28 – Histograma da distribuição de freqüência das ASC
0-t
de 48 voluntários após a
administração de um comprimido de 40mg de propranolol. A curva demonstra a distribuição normal
esperada.
93
Normal Q-Q Plot of AUC
Observed Value
8006004002000-200
Expected Normal Value
600
500
400
300
200
100
0
-100
-200
Figura 29 - Gráfico da análise pelo teste Quantil- Quantil (Q-Q) dos valores de ASC do
Propranolol de 48 voluntários, após uma dose única de 40mg. A linha verde representa a distribuição
normal e os pontos vermelhos representam os valores individuais de ASC.
Detrended Normal Q-Q Plot of AUC
Observed Value
8006004002000
Deviation from Normal
300
200
100
0
-100
Figura 30 - Gráfico da análise pelo teste Quantil-Quantil (Q-Q) dos valores de ASC do
Propranolol de 48 voluntários, aos uma dose única de 40mg. Este gráfico representa o grau de dispersão
dos dados experimentais em relação à distribuição normal.
94
Discussão
95
DISCUSSÃO
Sabe-se que o metabolismo dos fármacos tem uma importância fundamental quando se
avalia a atividade de um medicamento sobre o organismo humano. Desta forma tanto os
efeitos terapêuticos quanto os potenciais efeitos tóxicos podem ser alterados de acordo com a
atividade metabólica. Quando um novo composto é introduzido na terapêutica o seu
comportamento metabólico é avaliado para determinação dos esquemas terapêuticos; no
entanto as variações genéticas entre os indivíduos da população brasileira não são levadas em
conta durante o planejamento e a produção das formulações que serão usadas em nosso país.
Os dados farmacocinéticos e metabólicos que caracterizam um composto farmacêutico
são usualmente derivados de pesquisa clínica em poucas populações. Grande parte da
pesquisa de desenvolvimento dos novos fármacos é realizada em indivíduos caucasianos (ou
ainda brancos de origem européia) e nos japoneses. Está cada vez mais claro que a
variabilidade inter-étnica deve ser levada em consideração quando da escolha de um
tratamento farmacológico e, principalmente, da dose a ser utilizada (RENWICK, 1996). Sabe-
se que existem diferenças inter-étnicas no metabolismo de xenobióticos e este fato tem sido
associado com as variações existentes no desenvolvimento de respostas tóxicas entre as
populações (KALOW, 1991 e RENWICK, 1996).
As variações no metabolismo dos xenobióticos podem ser originadas a partir da
constituição genética do indivíduo ou ainda de suas práticas culturais tais como a dieta, o
consumo de álcool, poluição urbana, uso de cigarro e terapias farmacológicas anteriores. Estes
fatores não genéticos, poderão promover uma variabilidade inter-étnica ou ainda mascarar
uma real alteração genética (RENWICK, 1996).
A literatura relata a existência de dois tipos de variabilidade étnica na atividade das
enzimas metabólicas: o primeiro consiste de diferenças na incidência de metabolizadores
lentos para uma determinada enzima em diferentes populações; e o segundo consiste numa
diferença na media e no desvio padrão entre as taxas de metabolismo e /ou eliminação
(RENWICK, 1996). Em nosso estudo procuramos avaliar os dois aspectos: inicialmente
observamos a incidência de metabolizadores lentos e rápidos para as enzimas CYP1A2,
CYP2A6, NAT2 e XO através do estudo das distribuições de freqüência de atividade
96
enzimática; em seguida, categorizamos nossos voluntários em grupos de padrão metabólico
diferentes e comparamos a média e o desvio padrão dos principais parâmetros
farmacocinéticos para confirmar as diferenças entre os grupos.
Como não tínhamos conhecimento de relatos científicos acerca do perfil fenotípico da
população do estado do Ceará quanto à atividade das enzimas metabólicas, procuramos em
nosso estudo avaliar voluntários sadios que nos permitissem em uma primeira análise, ou
análise piloto, caracterizar a população saudável através da estatística descritiva identificando
se estes voluntários apresentariam um padrão metabólico homogêneo, caracterizado por uma
distribuição normal ou não.
Nossos voluntários foram selecionados com uma criteriosa avaliação clínica e
laboratorial que veio confirmar seu estado de higidez, evitando possíveis interferências de
patologias individuais (principalmente as hepáticas e renais) na determinação da atividade
enzimática desses voluntários. Foram inicialmente recrutados 85 voluntários, dos quais 80
concluíram a etapa clínica, possibilitando a avaliação completa dos seus resultados.
Durante a etapa clínica, todos os voluntários toleraram bem o comprimido de cafeína
de 200mg administrado. O único evento adverso relatado com possível associação com a
administração da cafeína foi um “mal estar gástrico” que pode ser justificado pelos efeitos
adversos da cafeína descritos na literatura, que incluem sintomas gastrintestinais (COLTON et
al., 1974 e CURATOLO; ROBERTSON, 1983). Nossos resultados corroboram com a
literatura quando relatam as vantagens clínicas da utilização da cafeína como fármaco
“probe”, pois já é um fármaco de uso relativamente comum e apresenta riscos menores de
eventos adversos (MINERS; BIRKETT, 1996).
Outro fator que vem confirmar as vantagens do uso da cafeína é o fato de que ela
possibilita, através da administração de um único fármaco, determinar o fenótipo de quatro
diferentes enzimas metabólicas, envolvidas nas reações de acetilação e oxidação dos
processos de biotransformação de xenobióticos que são largamente utilizados na prática
médica (CAMPBELL et al., 1987 e BUTLER et al., 1992).
A metodologia utilizada em nosso estudo para quantificação dos metabólitos na urina,
consistiu de uma modificação do método inicialmente descrito por Grant em 1984 e
97
posteriormente adaptado por outros pesquisadores (KRUL; HAGEMAN, 1998; BENDRISS
et al., 2000; BAUD-CAMUS et al., 2001; CAUBET et al., 2002). Esta metodologia
possibilitou a quantificação de cinco metabólitos da cafeína, bem como da teobromina (que
foi utilizada como padrão interno).
Nossa metodologia mostrou-se robusta, tendo em vista as soluções dos metabólitos
permaneceram estáveis durante toda a etapa analítica, apresentando coeficientes de variação
compatíveis com os valores exigidos pela resolução 84 de medicamentos genéricos da
ANVISA (BRASIL, 2002).
Quanto à sensibilidade o método apresentou limites de quantificação compatíveis com
a metodologia descrita por outros pesquisadores para dosagem dos principais metabólitos da
cafeína. Brendriss em 2000 descreveu linearidade entre 0,5 e 17,5μ/mL para a curva de
calibração do metabólito 1U; nosso resultados apresentaram uma linearidade entre 0,5e
16μ/mL. Para os demais metabólitos (AFMU, 1X, 17U e 17X) nossa linearidade permaneceu
na faixa entre 2 e 32μ/mL, enquanto a literatura relata uma faixa mais ampla (1 a 50μ/mL); no
entanto não houve prejuízo para as análises, tendo em vista que os valores experimentais
encontraram-se dentro dos limites da curva de calibração (BRENDRISS et al., 2000; BAUD-
CAMUS et al., 2001).
Quanto à especificidade, nossos resultados, semelhantemente aos demais trabalhos,
demonstraram que o método foi específico, permitindo uma suficiente separação entre os
analitos de modo que numa só corrida analítica todos fossem quantificados sem interferências
de outras substâncias presentes na matriz biológica estudada. A linearidade das curvas de
calibração foi confirmada pelos valores de R que foram superior a 0,98.
Em nosso estudo avaliamos o perfil fenotípico de 79 voluntários saudáveis entre 18 e
47 anos, de ambos os sexos, da cidade da Fortaleza, Ceará. O fenótipo acetilador avaliado foi
o da enzima NAT2; os fenótipos de oxidação avaliados foram os das enzimas CYP1A2 e
CYP2A6; além destes avaliamos também o fenótipo da enzima XO.
A atividade metabólica das enzimas foi determinada pela razão das concentrações
molares dos principais metabólitos da cafeína, como descrito por KRUL, 1998; Baud-Camus,
2001e Caubet, 2001. O perfil metabólico da amostra da população saudável do estado do
98
Ceará foi determinado pela análise da estatística descritiva com os testes de normalidade, já
que a literatura relata que a avaliação de suas distribuições de freqüência permite que através
da caracterização da normalidade ou não da distribuição, a população estudada seja
classificada como homogênea ou heterogênea para a atividade desta enzima (NERI, 1993;
BENDRISS et al., 2000; BAUD-CAMUS et al., 2001; CAUBET et al., 2002 e
SARUWATARI et al, 2002).
Muitas são as variações metabólicas interpopulacionais relatadas, elas abrangem tanto
as reações de fase I (principalmente as de oxidação) quanto às reações de fase II
(principalmente as de acetilação). Dentre as enzimas oxidativas o sistema microssomal do
CYP450 está envolvido em muitas dessas reações polimórficas.
O estudo do fenômeno da bimodalidade nas reações metabólicas em geral (sejam de
oxidação ou acetilação) veio de certa forma facilitar a detecção de possíveis alterações
genéticas (polimórficas) nessas enzimas metabolizadoras (NERI, 1993).
Dentro da análise da estatística descritiva, todas as enzimas avaliadas apresentaram
coeficientes de Skewnesse Kurtosis diferentes de zero, caracterizando uma distribuição não
normal; esses resultados foram confirmados pela representação gráfica do histograma e do
Normal Q-Q Plot e do Detrended Normal Q-Q Plot que demonstraram a diferença entre os
valores experimentais e os valores esperados para uma distribuição normal.
Nossos resultados, expressos no Q-Q Plot para a atividade da enzima NAT2,
apresentaram dois pontos de quebra, indicando que a população avaliada é heterogênea e
sugerindo a existência de três fenótipos: acetiladores lentos - 26,58%, acetiladores
intermediários - 60,76% e de acetiladores rápidos - 12,66%. Nossos resultados corroboram
com os achados publicados por CASTAÑEDA-HERNÁNDEZ em 1995., para a população
mexicana, que também apresentaram três fenótipos acetiladores, porém com proporções
diferentes (CASTAÑEDA-HERNÁNDEZ et al.,1995).
Variações quanto às reações de acetilação já foram relatadas em indivíduos
provenientes de vários paises mediterrâneos, onde o fenótipo de acetiladores lentos
predomina; ou ainda de indivíduos de origem japonesa, onde o fenótipo predominante é o
acetilador rápido.
99
O polimorfismo genético da acetilação tem sido estudado em varias populações, estes
trabalhos procuraram comparar a incidência dos fenótipos acetiladores em grupos de diversas
origens étnicas e geográficas. Até o momento não se tinha conhecimento de estudos que
caracterizassem as freqüências fenotípicas na população brasileira.A caracterização adequada
do fenótipo acetilador é clinicamente relevante, tendo em vista a resposta farmacológica de
vários agentes terapêuticos, o risco de exposição a compostos tóxicos presentes no ambiente
urbano (oriundos principalmente do lixo químico das indústrias) que são biotransformados
por acetilação, e a incidência de certas doenças relacionadas com a capacidade que o
indivíduo apresenta de acetilar estes compostos (EVANS, 1989; CHAPRON et al., 1980).
A análise da estatística descritiva para a enzima CYP1A2 mostrou que a distribuição
de freqüência apresentou um ponto de quebra (que representa uma interrupção nos dados
plotados) no valor de 2,5; desta forma dividimos os voluntários em dois grupos, os que
apresentaram a atividade enzimática inferior a 2,5 e os que apresentaram valores superiores a
2,5. Os valore percentuais de cada grupo foram de 88,61% para os menores que 2,5
classificados como metabolizadores insuficientes; e 11,39% para os maiores que 2,5
classificados como metabolizadores extensos.
A enzima CYP1A2 possui um importante papel no metabolismo de fármacos muito
utilizados na clínica (como o propranolol, a teofilina, a imipramina, etc), de substâncias pró-
carcinógenas (como as aminas aromáticas e heterocíclicas) e ainda compostos endógenos
como a melatoína. A existência de polimorfismos nesta enzima ainda não está totalmente
confirmada, nossos resultados apresentam uma distribuição de freqüência não normal,
indicando uma heterogeneidade na população estudada, com pelo menos três fenótipos; os
metabolizadores insuficientes (12,66%), os metabolizadores intermediários (75,95%) e
metabolizadores extensos (11,39%). A literatura relata que indivíduos com metabolismo
extenso para CYP1A2 apresenta um maior risco de desenvolvimento de câncer coloretal e de
bexiga quando expostos a arilaminas ou aminas heterocíclicas presentes nos alimentos de
nossa dieta (KRUL, 1998; SARUWATARI, 2002).
A estatística descritiva para a atividade da enzima CYP2A6 mostrou parâmetros de
uma distribuição não normal, no entanto os gráficos de histograma e Q-Q-plot não indicam
sinais de bimodalidade, bem como o último não apresentou claramente os pontos de quebra.
100
Diante disso não foi possível classificar os voluntários com atividade enzimática baixa ou
alta.
Trabalhos anteriores descrevem polimorfismo na enzima CYP2A6, com a presença de
três alelos diferentes. Deficiências na atividade da CYP2A6 tem sido levantadas como
justificativa para redução na incidência de doenças pulmonares causadas por fatores
ambientais (principalmente o tabaco) (OSCARSON, 2001).
A análise da enzima Xantina Oxidase mostrou que a distribuição de freqüência
apresenta dois pontos de quebra nos valores de 0,35 e 0,38; desta forma os voluntários foram
divididos em metabolizadores insuficientes (83,54% - com atividade enzimática inferior a
0,35), metabolizadores intermediários (3,8% - com atividade enzimática maior que 0,35 e
menor que 0,38) e metabolizadores extensos (12,66% - com atividade enzimática superior a
0,38). A literatura não descreve as conseqüências de um fenótipo metabolizador insuficiente
ou extenso para a enzima Xantina Oxidase, sendo necessários outros estudos clínicos
(GULLSTEN, 2000).
Nossa metodologia analítica para determinação da cafeína plasmática consistiu de uma
modificação da metodologia descrita por Krul e Hageman em 1998. A metodologia de
quantificação plasmática da cafeína mostrou-se robusta, sensível (com limite de quantificação
linear de 1μg/mL) e específica (pois permitiu a separação entre a cafeína e a teobromina).
A quantificação da cafeína permitiu a determinação dos parâmetros farmacocinéticos e
a comparação desses parâmetros entre os voluntários dos grupos MA e ME para cada enzima.
A análise estatística pelo teste t mostrou diferença entre todos os parâmetros farmacocinéticos
dos grupos MA e ME para todas as enzimas, no entanto a análise pelo teste de Wilcoxon não
paramétrico, não demonstrou diferença estatística. Considerando que os grupos estudados
podem ser considerados homogêneos, pois contemplam voluntários com o comportamento
metabólico semelhante, consideramos os valores do teste paramétrico.
Ao avaliar a estatística descritiva de uma amostra de 48 voluntários que tomaram um
comprimido de 40mg de propranolol (fármaco metabolizado pela enzima CYP1A2),
observamos que os valores de ASC compõem uma distribuição não normal, com coeficientes
101
de Skewness e Kurtosis diferentes de zero. Sugerindo assim a existência de um padrão
metabólico bimodal.
A Unidade de Farmacologia Clínica vem a cerca de onze anos contribuindo para a
formação de profissionais capacitados para o desenvolvimento de ensaios clínicos e
juntamente com outros pesquisadores do Departamento de Fisiologia e Farmacologia tem
apresentado um significante número de publicações nessa área; com o nosso trabalho de
avaliação do perfil fenotípico de uma amostra da população do ceará, tivemos a oportunidade
de concretizar o início de uma nova linha de pesquisa dentro deste departamento. A
farmacogenética tem sido, nos últimos anos alvo de crescente número de projetos de pesquisa,
e a cada dia torna-se mais aplicável clinicamente, tendo em vista que seus conceitos e achados
podem contribuir para a elaboração de protocolos terapêuticos mais adequados às
características metabólicas de nossa população.
102
Conclusões
103
CONCLUSÕES
Nossos resultados indicam que as atividades das enzimas CYP1A2, CYP2A6, NAT2 e
XO apresentam uma heterogeneidade nas suas distribuições de freqüências, sugerindo que
estas enzimas apresentem polimorfismos na população cearense.
A avaliação dos perfis fenotípicos das enzimas CYP1A2, NAT2 e Xantina Oxidase
demonstrou uma trimodalidade na distribuição de freqüência, indicando a existência de, pelo
menos, três fenótipos para cada enzima.
A metodologia utilizada em nosso trabalho permitiu a implementação da linha de
pesquisa “Farmacogenética” na Unidade de Farmacologia Clínica”, sendo de grande
importância no desenvolvimento de ensaios clínicos.
104
Referências Bibliográficas
105
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AHLSTROM, H.; ALVERO, J.; ALVERO, R.; ESPOS, R.; FAJUTRAO, L.; HERRERA, J;
KJELLMAN, B.; KUBISTA, J.; LEVISTE, C.; MEYER, P.; OLDAEUS, G.;
SIRICURURAT, A.; VICHYANOND, P; WETTRELL, G.; WONG, E.; LAXMYR, L.;
NYBERG, L.; OLSSON, H.; WEIBULL, E.; ROSENBORG, J. Pharmacokinetics of
bambuterol during oral administration to asthmatic children. Brazilian Journal of Clinical
Pharmacology, v.48; p. 299–308; 1999.
AHSAN, C.H.; RENWICK, A.G.; MACKLIN, B.; CHALLENOR, V.F.; WALLER, D.G.
GEORGE, C.F.; Ethnic differences in the pharmacokinetics of oral nifedipina. Brazilian
Journal of Clinical Pharmacology, v.31; p. 399–403, 1991.
AHSAN, C.H.; RENWICK, A.G.; WALLER, D.G.; CHALLENOR, V.F.; GEORGE, C.F;
AMANULLAH, M. The influence of dose and ethnic origins on the pharmacokinetics of
nifedipina. Clinical Pharmacology and Therapeutic, v.54; p. 329–338, 1993.
BAUD-CAMUS, F.; MARQUET, P.; SOURSAC, M.; DAVRINCHE, C.; FARINOTTI, R.
Determination of N-acetylation phenotype using caffeine as a metabolic probe and high-
performance liquid chromatography with either ultraviolet detection or electrospray mass
spectrometry. Journal of Chromatography B, v. 760; p. 55-63, 2001.
BEM-HAMIDA, MAN, W.K.; McNEIL, N.; SPENCER, J. Histamine, xanthine oxidase
generated oxygen-derived free radicals and Helicobacter pylori in gastroduodenal
inflammation and ulceration. Inflammation Research, v.47; p.193-199; 1998
BENDRISS, E.; MARKOGLOU, N.; WAINER, I.W. Liquid chromatography method for the
simultaneous determination of caffeine and fourteen caffeine metabolites in urine. Journal of
Chromatography B, v. 746; p. 331-338; 2000.
BENET, L.Z.; KROETZ, D.L.; SHEINER, L.B. Pharmacokinetics: The dynamics of drug
absorption, distribution and elimination. In: HARDMAN,J.G et. Al (Ed) Goodman and
106
Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics. 9
th
ed. New York: McGraw Hill,
1996. chapt.1, p 3-27.
BENOWITZ, N.L.; PEREZ-STABLE, E.J.; HERRERA, B.; JACOB, P 3rd. Ethnic
differences in nicotine metabolism: evidence for lower CYP2A6 activity in Chinese
Americans compared to Hispanics or whites. Clinical Pharmacology and Therapeutics,
v.67; p. 113; 2000.
BERTILSSON, L.; DAHL, M.; EDQQVIST, B.; et al. Genetic regulation of the disposition of
psychotropic drugs. In: MELTZER, H.Y.; NEROSZZI, D. Current Practice and future
Developments in the pharmacotherapy of Mental Disorders. 1
st
ed. Amsterdam: Elsevier
Science Publishers, p. 73 – 80, 1991.
BERTILSSON, L.; DAHL, M.J. Polymorphic drug oxidation: relevance to the treatment of
psychiatric disorders. CNS Drugs, v.5; p.200 – 223; 1996.
BLANCHARD, J. and SAWERS, S. J. A. Comparative Pharmacokinetics of Caffeine in
young and Elderly Men. Journal of Pharmacokinetics and Biopharmaceutics, v.11. n.2. p
109-126. 1983.
BLUM, M.; DEMIERRE, A.; GRANT, D.M.; HEIM, M. and MEYER, U.A. Molecular
mechanism of slow acetylation of drugs and carcinogens in humans. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the USA. v.88; p. 5237 – 5241; June 1991.
BONATI, M.; LATINI, R.; GALLETTI, F.; YOUNG, J.F.; TOGNONI, G. and
GARATTINE, S. Caffeine disposition after oral doses. Clinical Pharmacology and
Therapeutics, v. 32. p. 98-106. 1982.
BOUSHEY, H.A. Drogas utilizadas da Asma. Em: KATZUNG, B.G.; Farmacologia Básica
e Clínica, 8ª ed. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan S.A, 2003. Cap. 20, p. 296-298.
BRASIL. Resolução da diretoria colegiada da ANVISA (RDC) Nº 84, de 19 de março de
2002. Estabelece regulamento técnico para medicamento genérico. Diário oficial da
República Federativa do Brasil, Poder executivo, Brasília, DF, 20 mar. 2002. Seção 1, p.42.
107
BRATTON, C.A; MARSHALL, E.K.; A New Coupling Component For Sulfanilamide
DeterminaTION. Journal of Biology Chemic; v. 128; p. 537 – 550; 1939
BRONSEN, K.; SINDRUP, S.H.; SKJELBO, E.; NIELSEN, K.K.; GRAM, L.F. Role of
genetic polymorphism in psychopharmacology, an update. Psychopharmacology Series,
v.10; p. 199 – 211, 1993.
BUTLER, M.A.; LANG, N.P.; YOUNG, J.F.; CAPORASO, N.E.; VINEIS, P.; HAYES,
R.B.; TEITEL, C.H.; MASSENGILL, J.P.; LAWSEN, M.F.; KADLUBAR, F.F.
Determination of CYP1A2 and NAT2 phenotypes in human populations by analysis of
caffeine urinary metabolites. Pharmacogenetics, v.2; p. 116 – 127, 1992.
CAMPBELL, M.E.; GRANT, D.M.; INABA, T.; KALOW, W. Biotransformation of caffeine,
paraxanthine, theophylline by polycyclic aromatic hydrocarbon-inducible cytochromes -450
in human liver microsomes. Drug Metabolism Disposition, v.15; p. 237 – 249, 1987.
CASTAÑEDA-HERNÁNDEZ, G.; FALCÓN-NERI, A; HERRERA-ABARCA, A.;
HERRERA, J.E.; FLORES-MURRIETA, F.J.; Determination of three acetylator phenotypes
in a Mexican population using sulfamethazine metabolic ratio. American Journal of
Therapeutics, v. 2, p. 57 – 60, 1995.
CAUBET, M,; ELBAST,W.; DUBUC, M.; BRAZIER,J. Analysis of urinary caffeine
metabolites by HPLC-DAD: the use of metabolic ratios to assess CYP1A2 enzyme activity.
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v. 27. p. 261-270, 2002.
CHANG, W.H.; JANN, M.W.; HWU, H.G.; CHEN, T.Y.; LIN, S.K.; WANG, J.M.;
ERESHEFSKY, L.; SAKLAD, S.R.; RICHARDS, A.L.; LAM, Y.W. Ethnic comparison of
haloperidol and reduced haloperidol plasma levels: Taiwan Chinese versus American non-
Chinese. Journal of Formosan Medical Association, v.90; p. 572 – 578, 1991.
CHAPRON, J.D.; KRAMER, A. P.; MERCIK, S.B. Kinetic Discrimination of three
sulfamethazine acetylation phenotype. Clinical Pharmacology and Therapeutic, v.27; p.
104 – 113, 1980.
108
CHOLERTON, S.; IDLE, M.E.; VAS, A.; GONZALEZ, F.J.; IDLE, J.R. Comparasion of a
novel thin-layer chromatographic-fluorescence detection method with a spectrofluorometric
method for the determination of 7-hidroxycoumarin in human urine. Journal of
Chromatography, v.575; p. 325 – 330, 1992.
CLARK, W.J.; Genetically determined variability in acetylation and implications:
Therapeutic implications Drugs, v.29; p. 342–375, 1985.
COLTON, T.; GOSSELIN, R.E.; SMITH, R.P. The tolerance of coffee drinkers to caffeine.
Clinical Pharmacology and Therapeutics, v.9; p. 770 – 775, 1974.
COOPER, D. What is Pharmacogenetics? Pharmacogenetics in Patient Care Conference
by American Association Clinical Chemistry, Nov 6, 1998.
CORREIRA A. y CASTAGNOLI, N. Farmacocinética II: Biotransformacion de Fármacos.
Farmacologia Básica y Clínica. Em: Katzung G.B. El Manual Moderno. Primera ed. p.37-
46; 1984.
CURATOLO, P.W.; ROBERTSON, D. The health consequences of caffeine. Annals of
Internal Medicine, v.98; p. 641 – 653, 1983.
DAY, R.O.; MINERS, J.O.; BIRKETT, D.J.; GRAHAM, G.G. and WHITEHEAD, A.;
Relationship between plasma oxipurinol concentrations and xanthine oxidase activity in
volunteers dosed with allopurinol. British Journal of Clinical Pharmacology,v. 26; p.429 –
434, 1988.
EDWARDS, J.A.; EVANS, D.A.P. Ethanol metabolism in subjects possessing typical and
atypical liver alcohol dehydrogenase. Clinical Pharmacology and Therapeutics, v.8; p. 824
– 829, 1967.
EVANS, D.A.; MANLEY, K.L. y MCKUSICK, V.A. Genetic Control of isoniazid
metabolism in man. British Medical Journal, v. 2; p. 485 – 491, 1960.
109
EVANS, D.A.P.: N-acetyltransferase. Pharmacology and Therapeutic, v.42; p. 157 – 234,
1989.
FLAWS, J.; LIM, C.; LUO, J.; BUSH, T. Racial differences in tamoxifen metabolism.
Annals of Epidemiology, v.10; p. 463 – 464, 2000.
FLORES-MURRIETA, F.J.; CASTAÑEDA-HERNANDEZ, G.; GRANADOS-SOTO, V.;
HERRERA, J.E. Increased bioavailability of sildenafil in Mexican men. The Journal of the
American Medical Association, v.283; p. 1825 – 1826, 2000.
FOENANDER, T; BIRKETT, D.J.; MINERS, J.O.; WING, L.M.H. The simultaneous
determination of theophyline, theobromine and caffeine by high performance liquid
chromatography. Clinical Biochemistry, v. 13. p. 132 – 134, 1980.
FRACKIEWICZ, E.J.; SHIOVITZ, T. O.; JHEE, S.S. Ethnicity indrug development and
therapeutics. London, 2002. 135p. 1ª Ed. Editora Greenwich Medical media Ltd.
FRETLAND, A.J.; LEFF, M.A.; DOLL, M.A; HEIN, D.W. Functional characterization of
human N-acetyltransferase 2 (NAT2) single nucleotide polymorphisms, Pharmacogenetics;
v.11(3); p.207-15, 2001.
FROMM, M.F.; KROEMER, H.K.; EICHELBAUM, M. Impact of P450 genetic
polymorphism on the first-pass extraction of cardiovascular and neuroactive drugs. Advanced
Drug Delivery, v.27; p. 171 – 199, 1997.
GARCIA-BARCELO, M.; CLOW, L.Y.; KUM CHIU, H.F.; WING, Y.K.; SHING LEE,
D.T.; LAM, K.L.; WAYE, M.M.. Frequencies of defective CYP2C19 alleles in a Hong Kong
Chinese population. Clinical Chemistry, v.45; p. 2273 – 2274, 1999.
GLOWINSKI, I.B; RADTKE, H.E.; WEBER, W.W.; Genetic Variation in N-acetylation of
Carcinogenic Arylamines by Human and Rabbit. Molecular Pharmacology, v. 14; p. 940 –
949, 1978.
110
GOLDSTEIN, A.; ARONOW, L.; KALMAN, M.S. Metabolismo de los fármacos.
Farmacologia. Segunda ed. Limusa, 1974. p. 267-358.
GULLSTÉN, H. Acesso ao documento primário: Significance of polymorphisms in
CYP2A6 gene. 2000. 83p. Academic Dissertation, Department of Pharmacology and
Toxicology, University of Oulu; December 2000.
HARADA, S.; AGARWAL, D.P.; GOEDDE, H.W. Electrophoretic and biochemical studies
of human aldehyde dehydrogenase isozymes in various tissue. Life Sciences, v.26; p. 1773 –
1780, 1980.
HASLER, J.A.; ESTABROOK, R.; MURRAY, M.; PIKULEVA, I.; WANERMAN, M.;
CAPDEVILA, J.; HOLLA, V.; HELVIG, C.; FALCK, J.R.; FARREL, G.; KAMINSKY,
L.S.; SPIVACK, S.D.; BOITIER, E.; BEAUNE, P. Human cytochromes P450. Molecular
Aspects of Medicine, v. 20. p. 1 – 137, 1999.
HERBERT, H.A. y WEBER, W.W. N-acetylation Pharmacogenetics. Drug Metabolism and
Disposition, v. 4; p. 382 – 385, 1986.
HIRVONEN, A. Polymorphisms of Xenobiotic-Metabolizing Enzymes and Susceptibility to
cancer. Environmental Health Perspectives; v.107; p. 37 – 47; 1999
INGELMAN-SUNDBERG, M. Duplication, multiduplication and amplification of genes
encoding drug-metabolizing enzymes. Evolutionary, toxicological, and clinical
pharmacological aspects. Drug Metabolism Reviews, v.31; p. 449 – 459, 1999.
INGILMAN-SUNDBERG, M. Pharmacogenetics: an opportunity for a safer and more
efficient pharmacotherapy. Journal of Internal Medicine, v. 250; p. 186 – 200, 2001.
ITOH, K.; INOUE, K.; NAKAO, H.; YANAGIWARA, S.; TADA, H.; SUZUKI, T.
Polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism based determination of
two major genetic defects responsible for a phenotypic polymorphism of cytochrome P450
(CYP)2C19 in the Japanese population. Annais Biochem, v.284; p. 160 – 162, 2000.
111
IYER, K.R.; SINZ, M.W. Characterization of phase I and phase II hepatic drug metabolism
activities un a panel of human liver preparations. Chemico-Biological International, v. 118.
p. 151 – 169, 1999.
JANN, M.W.; CHANG, W.H.; DAVIS, C.M.; CHEN, T.Y.; DENG, H.C.; LUNG, F.W;
ERESHEFSKY, L.; SAKLAD, S.R.; RICHARDS, A.L. Haloperidol and reduced haloperidol
plasma levels in Chinese vs. non-Chinese psychiatric patients. Psychiatry Research, v.30; p.
45 – 52, 1989.
JEFFERSON, J.W.; GREIST, J.H. Brussels sprouts and psychopharmacology (understanding
the cytochrome P-450 enzyme system). In: JEFFERSON, J.W.; GREIST, J.H.; eds. Annual
of Drug Therapy, v.3; Philadelphia, PA: WB Saunders; p. 2 – 22, 1996.
JENG, J.R.; HARN, H.G.; JENG, C.Y.; YUEH, K.C.; SHIEH, S.M. Angiotensin I converting
enzyme gene polymorphism in Chinese patients with hypertension. American Journal of
Hypertension, v.10; p. 558 – 561, 1997.
JENNE, J.W.: Studies of human patterns of isoniazid metabolism using na intravenous fall-off
technique with a chemical method. American Review of Respiratory Disease, v. 81, n.1, p.
1 – 8, 1960.
KALOW, W. Interethnic variation in drug metabolism. Trends in Pharmacology Sciences,
v.12, n.03; p. 102 – 107, 1991.
KAMIMORI, G.H.; KARYEKAR, C.S.; OTTERSTETTER, R.; COX, D.S.; BALKIN, T.J.;
BELENKY, G.L.; EDDINGTON, N.D. The rate of absorption and relative bioavailability of
caffeine administered in chewing gum versus capsules to normal healthy volunteers.
International Journal of Pharmaceutics, v. 234. i. 1-2,2. p. 159-167, March 2002.
KHANNA, J.M.; ISRAEL, Y. Ethanol metabolism. International Review of Physiology,
v.21; p. 275 – 315, 1980.
KISKER, C.; SCHINDELIN, H. and REES, D.C. Molybdenumcofator-containing enzymes:
structure and mechanism. Annual Review of Biochemistry, v.66; p.233 – 267, 1998.
112
KOYSOOKO, R.; TUCHINDA, M.; HABANANADA, S.; PINTHONG, T.;
WATTANAPERMPOOL, J.; GEADSOMNUIG, S. Pharmacokinetics of oral theophylline in
Thai asthmatic children. Asian Pacific Journal of Allergy & Immunology, v.5; p. 179 –
185, 1987.
KROEMER, H.K.; EICHELBAUM, M. “It’s the genes stupid”. Molecular basis and clinical
consequence of genetic cytochrome P450 2D6 polymorphism. Life Science, v.56; p. 2285 –
2299; 1995;
KRUL,C e HAGEMAN, G. Analysis of urinary caffeine metabolites to assess
biotransformation enzyme activities by reversed-phase high-performance liquid
chromatography. Journal of Chromatography B, v. 709; p. 27 – 34, 1998.
KUPFER, A.; PREISING, R. Pharmacogenetic of mephenytoin: a new drug hydroxylation
polymorphism in man. European Journal of Clinical Pharmacology, v. 26; p. 153 – 159,
1984.
KUPFER, A.; ROBERTS, R.K.; SCHENKER, S.; BRANCH, R.A. Stereoselective
metabolism of mephenytoin in man. The Journal of Pharmacology and Experimental
Therapeutics, v. 218; p. 193 – 199, 1981.
KURTH, J.H. Pharmacogenomics: future promise of a tool for identifying patients at risk.
Drug Information Journal, v.34; p. 223 – 227, 2000.
LADERO, J.M.; ANDRES, M.P.; BANARES, A.; FERNANDEZ, B.; HÉRNANDEZ, C.;
BETINEZ, J.;Acetylator polymorphism in rheumatoid artritis. European Journal of Clinical
Pharmacology, v.45(3); p. 279 – 281, 1993.
LARES-ASSEFF, I..; TRUJILLO-JIMÉNEZ, F. La Farmacogenética y su importância en la
clínica. Gaceta Médica de México, v. 137. n. 3. p. 227 – 236, 2001.
113
LIN, K.M.; LAUE, J.K.; SMITH, R.; PHILIPS, P.; ANTAL, E.; POLAND, R.E. Comparison
of alprazolam plasma levels in normal Asian and Cascasian male volunteers.
Psychopharmacology, v.96; p. 365 – 369, 1988.
LIN, K.M.; POLAND, R.E. Ethnicity, culture, and psychopharmacology. In BLOOM, F.E.;
KUPFER, D.I.. Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress. New York,
NY: Raven Press, 1995.
LINDER, M.W.; PROUGH, R.A.; VALDES, R. Pharmacogenetics: a laboratory tool for
optimizing therapeutic efficiency. Clinical Chemistry, v.43. n.2; p. 254 – 266, 1997.
LLERENA, A.; DAHL, M.L.; EKVIST, B.; BERTILSSON, L. Haloperidol disposition is
dependent on the debrisoquina hydroxylation phenotype: increased plasma levels of the
reduced metabolite in poor metabolizers. Therapeutic Drug
Monitoring, v.14; p. 261 – 264, 1992.
MA, M.K.; WOO, M.H. and McLEOD, H.L. Genetic basis of drug metabolism. American
Journal of Health-System Pharmacy, v.59, n.21, Nov 1; p. 2061 – 2069, 2002.
MARY H.H. ENSOM; THOMAS K.H. CHANG and PAYAL PATEL. Pharmacogenétics,
the therapeutic drug monitoring of the future? Clinical pharmacokinetic, 40 (11); 783-802,
2001.
MASIMIREMBWA, C.M.; HASLER, J.A. Genetic polymorphism of drug metabolizing
enzymes in African populations: Implication for the use of neuroleptics and antidepressants.
Brain Research Bulletin, v.44; p.561 – 571, 1997.
MEYER, U.A.; ZANGER, M.U.; GRANT, D. y BLUM, M. Genetic polymorphisms of Drug
metabolism. Progress in Liver Diseases, v. 9, p. 307 – 323, 1990.
MEYER, U.A.; ZANGER, M.U. Molecular mechanisms of genetic polymorphisms of drug
metabolism. Annual Review Pharmacology and Toxicology, v.37; p. 269 – 296, 1997.
114
MEYER, U.A. The molecular basis of genetic polymorphism of drug metabolism. Journal of
Pharmacology, v.46; p. 409 – 415, 1994.
MINERS, J.O.; BIRKETT, D.J. The use of caffeine as a metabolic probe for human drug
metabolizing enzymes. General Pharmacology: The Vascular System, v. 27; n. 2; p. 245 –
249, 1996.
MIZOI, Y.; IJIRI, I.; TATSUNO, Y.; KIJIMA, T.; FUJIWA, S.; HISHIDA, J.A. Relationship
between facial flushing and blood acetaldehyde levels after alcohol intake. Pharmacology
biochemistry and Behavior, v.10, n.2, p. 303 – 311, 1979.
MITCHELL, R.S.; RIEMENSNIDER, D.K.; HARSCH, J.R.; BEL, J.C. New information on
the clinical implications of individual variations in the metabolic handling of antituberculous
drugs particularly isoniazid. In: 17
th
Conference Chemotherapy Tuberculosis, 1958,
Washington D.C. US. Veterans Adm. Amy Navy, Annals of the 17
th
Conference
Chemotherapy Tuberculosis, p. 77 – 85, 1958.
NAKAJIMA, M.; YAMAMOTO, T.; NUNOYA, K.I.; YOKOI, T.; NAGASHIMA, K.;
INOUE, K.; FUNAE, Y.; SHIMADA, N.; KAMATAKI, T.; KUROIWA, Y. Characterization
of CYP2A6 involved in 3’-hydroxylation of cotinine in human liver microsomes. Journal of
Pharmacology Experimental and Therapeutics, v. 277; p. 1010 – 1015, 1996a
NAKAJIMA, M.; YAMAMOTO, T.; NUNOYA, K.I.; YOKOI, T.; NAGASHIMA, K.;
INOUE, K.; FUNAE, Y.; SHIMADA, N.; KAMATAKI, T.; KUROIWA, Y. Role of human
cytochrome P4502A6 in C-oxidation of nicotine. Drug Metabolism and Disposition; v. 24;
p. 1212 – 1217; 1996b
NAKAJIMA, M.; YAMAGISHI, S; YAMAMOTO, H.; YAMAMOTO, T.; KUROIWA, Y.;
YOKOI, T. Deficient cotinine formation from nicotine is attributed to the whole deletion of
the CYP2A6 gene in humans. Clinical Pharmacology & Therapeutics, v.67, n.01, p. 57-69,
2000.
115
NEBERT, D.W.; PETERSEN, D.D; PUGA, S.A. Human AH locus polymorphism and
cancer: Inducibility of CYP1A1 and other genes by combustion products and dioxin.
Pharmacogenetics, v.1, p. 68 – 78, 1991.
NEBERT, D.W. Polymorphism in drug-metabolizing enzymes: what is their clinical
relevance and why do they exist? American Journal of Human Genetics, v. 60, p. 265 –
271, 1997.
NERI, M.A.F. Acesso ao documento primário: Caracterización Fenotípica de Acetiladores
Lentos y Rápidos em uma População mexicana. 1993. 75f. Tesis que para obtener el título de
química farnaceutica bióloga; Universidad nacional Autônoma de México, Cuautitlán, Edo.
Do México, 1993.
NEWTON, R.; BROUGHTON, L.J.; LIND, M.J.; MORRISON, P.J.; ROGERS, H.J. AND
BRADBROOK, I.D. Plasma and salivary pharmacokinetics of caffeine in man. European
Journal of Clinical Pharmacology, v.21. p. 45-52, 1981.
NORTON, R.M. Pharmacogenomics and individualized drug therapy. In: Medscape
Pharmacotherapy, 2001. <http://www.medscape.com/medscape/pharmacology/journal/2001
/mp7520.nort/mp7520.nort.html>. Accessed May 4; 2001
NUNOYA, K.I.; YOKOI, T.; KIMURA, K.; KODAMA, T.; FUNAYAMA, M.; INOUE, K.;
NAGASHIMA, K.; FUNAE, Y.; SHIMADA, N.; GREEN, C.; KAMATAKI, T. (+)-Cis-3,5-
dimethyl-2-(3-pyridyl) thiazolidin-4-one hydrochloride (SM-12502) as a novel substrate for
cytochrome P450 2A6 in human liver microsomes. Journal of Pharmacology Experimental
and Therapeutics, v.277; p. 768 – 774, 1996.
NUNOYA, K.I.; YOKOI, T.; TAKAHASHI, Y.; KIMURA, K.; KINOSHITA, M.;
KAMATAKI, T. Homologous unequal cross-over within the human CYP2A gene cluster as a
mechanism for the deletion of the entire CYP2A6 gene associated with the poor metabolizer
phenotype. Journal of Biochemistry, v. 126; p. 402 – 407, 1999.
116
OSCARSON, M.; Genetic polymorphisms in the cytochrome P450 2A6 (CYP2A6) gene:
implications for interindividual differences in nicotine metabolism. Drug Metabolism and
Disposition; v. 29 (2); p. 91 -95; 2001
PELKONEN, O.; RAUNIO, H.; Individual expression of carcinogen-metabolizing enzymes:
cytochrome P4502A. Journal of Occupational Environmental Medicine, v.37, n.1, p. 19 –
24, 1995.
PENA, S. D. J.; PARRA, F. C.; AMADO, R. C.; et al. Color and genomic ancestry in
Brazilians. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of
America, EUA, v. 100, p. 177-182, 2003.
POIRIER, J. Apolipoprotein E4, cholinergic integrity and the pharmacogenetics of
Alzheimer’s disease. Journal Psychiatry Neuroscience, v.24, n.2, p. 147 – 153, 1999.
POTKIN, S.G.; SHEN, Y.; PARDES, H.; PHELPS, B.H.; ZHOU, D.; SHU, L.; KORPI, E.;
WYATT, R.J. Haloperidol concentrations elevated in Chinese patients. Psychiatry Research,
v.12, p.167 – 172, 1984.
RASHID, T.J.; MARTIN, U.; CLARKE, H.; WALLER, D.G.; RENWICK, A.G.; GEORGE,
C.F. Factors affecting the absolute bioavailability of nifedipina. Brazilian Journal of
Clinical Pharmacology, v.40, p. 51 – 58, 1995.
RASTOGI, M. An Overview of Pharmacogenomics. 1999 – 2000; American
Pharmaceutical Association Policy Committee Reports.. http: //
www.aphanet.org
/govt/policycomm2000/pharmacobackground.html?clkd=iwm. Accessed Nov 11, 2003
RAUTIO, A.; KRAUL, H.; KOJO, A.; SALMELA, E.; PELKONEN, O. Interindividual
variability of coumarin 7-hidroxylation in healthy individuals. Pharmacogenetics, v.2, p. 227
– 233, 1992.
REGALDO, A. Inventing the pharmacogenome business. American Journal Health-System
Pharmacy, v.56, p. 40 – 50, 1999.
117
RENWICK, A.G. Inter-ethnic differences in xenobiotic metabolism. Environmental
Toxicology and pharmacology, v.2, p. 165 – 170, 1996.
RITSHEL, W.A. Handbook of Basic Pharmacokinetics. Drug Intelligence Publication, In
Hamilton IL, 1982, p 1-15 and 133-157.
SARDAS, S.; LAHIJANY, B.; COK, I.; KARAKAYA, A.E. N-acetylation phenotyping with
sulfamethazine in an Iranian population. Pharmacogenetics, v.3(3), p. 131-134, 1993
SARUWATARI, J.; NAKAAWA, K.; SHINDO, J.; TAJIRI, TAKAHIRO, T.; FUJIEDA, M.;
YAMAZAKI, H.; KAMATAKI, T.; ISHIZAKI, T. A population phenotyping studyof three
drug-metabolizing enzymes in Kyushu, Japan, with use of the caffeine test. Clinical
Pharmacology and Therapeutics, v.72, n.2, p.200-208, 2002.
SHIMADA, T.; YAMAZAKI, H.; GUENGERICH, F.P. Ethnic-related differences in
coumarin 7-hydroxylation activities catalyzed by cytochrome P2402A6 in liver microsome of
Japanese and Caucasian populations. Xenobiotica, v.23, p.395 – 403, 1996.
SMITH, M.; HOPKINSON, D.D.; HARRIS, H. Developmental changes and polymorphism
in human alcohol dehydrogenase. Annals of Human Genetics, v.34, p. 251 – 271, 1971.
SPILKER, B. Special Patient Populations in: Guide to Clinical Trials. Pennsylvania:
Lippincott Williams & Wilkins; 1991; p. 658 – 672
SUNAHARA, S.; URANO. M.; y AGAMA, W.: Genetical and Geographic Studies on
isoniazid inactivation. Science, v. 134, p. 1530 – 1531, 1961.
SWANSON, H.I.; BRADFIELD, C.A. The AH receptor: genetics, structure and function.
Pharmacogenetic, v. 3, p.213 – 230, 1993.
TANAKA, E. Clinical importance of non-genetic and genetic cytochrome P450 function tests
in liver disease. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics, v. 23, p.161-170, 1998.
118
TANG, B.K.; KALOW, W. Assays for CYP1A2 by testing in vivo metabolism of caffeine in
humans. Methods in Enzymology, v.272, p. 124 – 131, 1996.
TENG, Y.S.; JEHAM, S.; KIE-INJO, L.E. Human alcohol dehydrogenase ADH2 and ADH3
polymorphisms in ethnic Chinese and Indians of west Malaysia. Human Genetics, v.53, p. 87
– 90, 1979.
TENG, Y.S. Human live aldehyde dehydrogenase in Chinese and Asiatic Indians: gene
deletions and its possible implications in alcohol metabolism. Biochemical Genetics, v.19,
p.107 – 114, 1981.
WATBURG, J.P.V.; PAPENBERG, J.; AEBI, H. Atypical human alcohol dehydrogenase.
Canadian Journal of Biochemistry, v.43, p.889 – 898, 1965.
WATBURG, J.P.V.; SCHÜRCH, P.M. Atypical human liver alcohol dehydrogenase. Annals
of the New York Academy of Science, v.151, p.936 – 946, 1968.
WEBER, W.W. The Molecular Basis Hereditary Acetylation Polymorphisms - Commentary.
Drug Metabolism and Disposition, v. 14, n.04, p. 377 – 381, 1986.
WILKINSON, G.R. Pharmacokinetics: The dynamics of drug absorption, distribution and
elimination. In: Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics 10
th
ed. New York: McGraw Hill: HARDMAN,J.G et all (Ed); 2001. chapt.1, p 3-29.
WOOD, A.J.J.; ZHOU, H.H. Ethnic differences in drug disposition and responsiveness.
Clinical Pharmacokinetics, v.20, n.5, p. 350 – 373, 1991.
WORMHOUDT, L.W.; COMMANDEUR, J.N.M.; VERMEULEN, N.P.E. Genetic
polymorphism of human N-acetyltransferase, citochrome P450, glutathione-S-transferase, and
epoxide hydrolase enzymes: relevance to xenobiotic metabolism and toxicity. Critical
Reviews in Toxicology, v.29, n.01, p. 59 – 124, 1999.
ZEVIN, S.; BENOWITZ, N.L. Drug interactions with tobacco somoking. An update. Clinical
Pharmacokinetic, v. 36, n.06, p. 425 – 438, 1999.
119
ZHANG-WONG, J.; BEISER, M.; ZIPURSKY, R.B.; BEAN, G.; An investigation of ethnic
and gender differences in the pharmacodynamics of haloperidol. Psychiatry Research, v.81,
p. 333 – 339, 1998.
ZHOU, H.H.; KOSHAKJI, R.P.; SILBERSTEIN, D.J.; WILKINSON, G.R.; WOOD, A.J.;
Altered sensitivity to the clearance of propranolol in men of Chinese descent as compared to
American whites. New England Journal of Medicine, v.320, p. 565 – 570, 1989.
ZHOU, H.H.; SHAY, S.D.; WOOD, A.J.. Contribution of differences in plasma binding of
propranolol to ethnic differences in sensitivity. Comparison between Chinese and
CASCasians. Chinese Medicine Journal, v.106, p. 898 – 902, 1993.
120
Glossário
121
GLOSSÁRIO
POLIMORFISMO: Alteração genética presente em cerca de 1% da população. Pode
ser produzida por mutações pontuais, conversões gênicas, deleções ou inserções.
FÁRMACO “PROBE”: Também chamado de fármaco de sondagem. Corresponde a
um fármaco utilizado como ferramenta farmacológica para avaliação do fenótipo de uma
enzima metabolizadora.
ESTUDO FASE I: é estabelecida a segurança do fármaco em função da dose, num
pequeno grupo de voluntários sadios (caso haja expectativa de que o fármaco tenha uma
toxicidade significativa, tal como ocorre geralmente na terapia de câncer e da AIDS, são
utilizados na fase I voluntários portadores da doença e não voluntários normais).
ESTUDO FASE II: a medicação é administrada pela primeira vez em pacientes com a
doença-alvo para determinar sua eficácia onde um pequeno grupo de pacientes (10-200) é
estudado de modo detalhado.
ESTUDO FASE III: a droga é avaliada em um número maior de pacientes (por vezes
milhares deles) para estabelecer melhor sua segurança e eficácia. São de difícil planejamento
e caros devido ao grande número de pacientes envolvidos.
ESTUDO FASE IV: tem início após obter-se a aprovação para a comercialização do
fármaco, constitui o monitoramento do fármaco em condições de uso em um grande número
de pacientes.
ESTUDO ABERTO: tanto o pesquisador responsável como o sujeito da pesquisa são
informados e têm conhecimento sobre a medicação que será administrada.
IMC: Índice de Massa Corpórea (IMC): é a razão do peso (kg) pela altura (m
2
) ao
quadrado. É o melhor indicador de obesidade, pois enfatiza a adiposidade relativa dos
indivíduos e minimiza os efeitos da altura. O valor ideal é de 20 – 27 kg/m
2
segundo Ministry
122
of National Health and Welfare, Canadá, entretanto, a National Academy of Sciences enfatiza
que o IMC aumenta com a idade, de 19 – 24 para adultos jovens e de 24 – 29 para acima de
65 anos.
PADRÃO INTERNO: substância que apresenta semelhanças com a droga em questão,
fórmula estrutural e tempo de retenção na determinação analítica. Deve apresentar
concentração conhecida, pois funcionará como um controle de qualidade do funcionamento
do aparelho que irá quantificar o princípio ativo e/ou seus metabólitos.
123
Anexos
124
ANEXO 1 - Valores de Referência dos Exames laboratoriais.
Tabela 27- Valores de referência para a Análise Hematológica
DADOS HEMATOLÓGICOS – VALORES DE REFERÊNCIA
PARÂMETROS HOMENS MULHERES
Hemoglobina (g/dL) 13,5-18 11,5-16,4
Hematócrito (%) 40-54 36-47
Plaquetas (10
3
/mm
3
) 150 a 450
Leucócitos totais (/mm
3
) 5-10
Contagem Diferencial
Bastões 1-3
Segmentados 40-75
Eosinófilos 1-6
Basófilos 0-1
Linfócitos 20-45
Monócitos 2-10
Tabela 28 - Valores de referência para função hepática
PARÂMETROS DE FUNÇÃO HEPÁTICA
PARÂMETROS HOMENS MULHERES
TGO Até 38 Até 32
TGP Até 41 Até 31
Gama GT 8 - 61 5 - 36
Fosfatase Alcalina Até 270
Proteína Total 6,3 – 8,2
Bilirrubina 0,32 – 1,1
125
Tabela 29 - Valores de referência para função hepática
PARÂMETROS DE FUNÇÃO RENAL
PARÂMETROS HOMENS MULHERES
Creatinina (mg/dL) 0,7 – 1,2 0,5 – 0,9
Clearance de Creatinina - -
Tabela 30 – Valores de referencia para função Renal
PARÂMETROS DE FUNÇÃO METABÓLICA
PARÂMETROS HOMENS MULHERES
Glicose 70 - 110
Ácido Úrico 3,4 – 7,0 2,4 – 5,7
Colesterol Total Até 239
Triglicérides Até 200
126
ANEXO 2 - Termo de consentimento livre e esclarecido
“Avaliação do perfil fenotípico de uma população de voluntários saudáveis”
Você está sendo convidado a participar de um projeto de pesquisa. Sua participação é
importante, porém, você não deve participar contra a sua vontade. Leia atentamente as informações
abaixo e faça qualquer pergunta que desejar, para que todos procedimentos desta pesquisa sejam
esclarecidas.
O abaixo-assinado, Nome, idade, RG nº, declara que é de livre e espontânea vontade que está
participando como voluntário do projeto de pesquisa supracitado, de responsabilidade dos
pesquisadores Ma. Elisabete Amaral de Moraes e Gilmara Silva de Melo Santana da Unidade de
Farmacologia Clínica do HUWC- UFC.
O abaixo-assinado está ciente que:
i - O objetivo da pesquisa é avaliar o fenótipo de metabolização da cafeína em 200
voluntários saudáveis, da população do Ceará.
ii - Durante o estudo, você será internado nas instalações da Unidade de Farmacologia Clínica,
por um período de aproximadamente 13 horas.
iii - O voluntário tomará um comprimido de 200mg de cafeína com um copo d’água de 200mL
e permanecerá na Unidade para coleta de plasma nas próximas 12 horas. Serão coletadas amostras de
sangue de 6 ml (cada) com butterfly (scalpe) ou catéter venoso heparinizado durante o internamento.
iv – Nas 10 horas que sucederem à administração da cafeína, toda a sua urina deverá ser
armazenada em recipiente específico, para posterior análise.
iv - A participação neste estudo não tem objetivo de lhe submeter a um tratamento terapêutico.
v - A administração oral de cafeína, de maneira continuada, pode causar efeitos colaterais
como perda do sono, dor de estômago, náusea e vômitos. Entretanto, o aparecimento de efeitos
indesejáveis, após administração de dose única da cafeína, tem menor probabilidade de aparecer. Além
dos efeitos citados, a administração de qualquer medicamento pode causar reações imprevisíveis.
vi - Se você faz uso de álcool diariamente, não poderá participar neste estudo. Em caso de
qualquer dúvida, por favor pergunte, que você será esclarecido pelos responsáveis da pesquisa.
vii. Será submetido antes da primeira e após a segunda internação aos seguintes exames
laboratoriais: de sangue (hemograma, creatinina sérica e clearance de creatinina, bilirrubina, proteína
total, albumina, glicemia, fosfatase alcalina, SGOT, SGTP, colesterol total, triglicérides, ácido úrico,
γGT, sumário de urina e do coração (eletrocardiograma). Esses exames tem a finalidade de ajudar ao
médico na decisão de incluí-lo ou não neste tipo de pesquisa. Uma cópia dos exames será fornecida
para você no final do estudo, conforme solicitação.
127
viii - Obteve todas as informações necessárias para poder decidir conscientemente sobre a
participação no referido ensaio clínico.
xi - Tem a liberdade de desistir ou interromper a participação neste estudo no momento em
que desejar, sem necessidade de qualquer explicação e sem que isto venha interferir no seu
atendimento médico desta Instituição.
xii - A interrupção não causará prejuízo ao seu atendimento, cuidado e tratamento pela equipe
da Unidade de Farmacologia Clínica.
xiii - Os resultados obtidos durante este ensaio serão mantidos em sigilo, e a Unidade de
Farmacologia Clínica não o(a) identificará por ocasião da exposição e/ou publicação dos mesmos.
xiv - Caso surja alguma intercorrência, deverá procurar o serviço de ambulatório médico do
Hospital Universitário Walter Cantídio da UFC e solicitar que o mesmo contate os médicos
responsáveis pelo ensaio clínico, nos telefones abaixo.
xv - A Unidade de Farmacologia Clínica o(a) manterá informado(a) e prestará qualquer tipo de
esclarecimento em relação ao progresso da pesquisa, conforme solicitação do voluntário.
xvi - Poderá contatar a Secretaria da Comissão de Ética (fone: 288-8338) para apresentar
recursos ou reclamações em relação ao ensaio clínico.
xvi - De acordo com valores previamente estabelecidos, os voluntários serão ressarcidos das
despesas e tempo despendidos na realização do supracitado estudo clínico
xvii - É condição indispensável, para participação no ensaio clínico, que esteja em boa saúde
e, portanto, não esteja no momento sob tratamento médico ou fazendo uso de quaisquer drogas ou
medicações.
xviii - É condição indispensável para participação no ensaio clínico que não esteja grávida,
comprovado pela sorologia (Beta-HCG).
Fortaleza,
____________________________________________
Assinatura do voluntário
Maria Elisabete Amaral de Moraes – Fone: 288-8346
Gilmara Silva de Melo Santana – Fone 292.8268
Unidade de Farmacologia Clínica - 288-8250
128
ANEXO 3 - Valores Individuais de Atividade Enzimática
Tabela 31 - Valores individuais de atividade das enzimas CYP1A2, NAT2, XO e CYP2A6 dos 79
voluntários avaliados, a partir das razões entre os metabólitos da cafeína avaliados (AFMU, 1U, 1X, 17U,
17X). CYP1A2 = (AFMU + 1X + 1U)/ 17U; CYP2A6 = 17U / (AFMU + 1X + 1U + 17X + 17U); NAT2 =
AFMU/ (AFMU + 1X + 1U) e XO = 1U/ (1X + 1U).
VOLUNTÁRIO CYP1A2 NAT2 XO CYP2A6
01 MMA 1,6812 0,1571 0,0947 0,2179
03 TMA 1,4728 0,0219 0,0841 0,3038
04 MPE 1,8235 0,0964 0,1369 0,2460
05 AOD 1,5400 0,0065 0,2197 0,2182
06 ASS 1,6476 0,1870 0,1242 0,2236
07 FMA 1,2493 0,2038 0,1456 0,3274
08 CVSO 2,1346 2,3149 0,1634 0,1955
09 ARAP 0,8466 1,5844 0,2568 0,2226
10 MHPA 1,0059 1,6091 0,2466 0,2696
11 MZCM 1,0375 0,4248 0,4144 0,2609
12 SRO 2,1164 1,7673 0,2142 0,2047
13 TRS 1,1506 1,1932 0,2295 0,2857
14 TRL 1,9792 1,2705 0,1779 0,2342
16 FAMA 0,6815 3,0027 0,2844 0,2941
17 WM 3,2333 3,1451 0,3742 0,1566
18 GBP 1,2097 0,0985 0,1453 0,2601
19 AV 0,8601 0,7345 0,1194 0,2071
20 DCA 1,5054 1,4602 0,1679 0,2300
21 ASO 1,3002 0,2795 0,2837 0,2751
22 VSM 2,2206 1,4658 0,2551 0,2088
23 DSC 1,2764 0,7345 0,1006 0,2627
24 EQA 2,9719 0,7345 0,2778 0,1250
25 SVN 1,2373 0,1140 0,2211 0,2423
26 RFL 2,1496 1,4338 0,3064 0,2389
129
VOLUNTÁRIO CYP1A2 NAT2 XO CYP2A6
27 FAAA 1,1819 0,3044 0,2966 0,2913
28 JGR 1,3874 1,4114 0,2532 0,2984
29 CEBP 2,0364 0,1262 0,4308 0,2398
30 FABR 2,1990 2,1632 0,1760 0,2571
31 FGR 1,4674 0,4231 0,0927 0,2661
32 FSM 3,9525 4,2238 0,0807 0,1982
33 CLSG 1,8939 1,2134 0,1503 0,2572
34 ALFV 3,0083 2,2855 0,1237 0,1791
35 MCL 1,7615 0,1198 0,1810 0,2308
36 MRSP 0,7183 0,3514 0,3808 0,3936
37 MOM 1,5401 0,0438 0,1793 0,2685
38 MFH 2,5726 1,6275 0,1825 0,1831
39 FAK 0,4988 3,8769 0,5374 0,2804
40 SDDF 1,9019 0,9602 0,1079 0,2685
43 IMB 1,4568 0,1300 0,1703 0,3085
44 VPT 3,0362 2,1538 0,2118 0,2030
45 MGS 0,9051 1,0758 0,3521 0,2051
46 APRS 1,7959 2,8220 0,3353 0,2112
47 MFG 0,8262 0,4015 0,2616 0,3038
48 BAC 1,1733 0,0101 0,1734 0,3199
49 FHSA 1,1868 0,2916 0,1565 0,2229
50 RTL 2,8091 2,5674 0,2965 0,1716
51 KQS 1,1292 6,5261 0,5777 0,2706
52 RFA 1,3377 0,6613 0,1732 0,2403
53 FWPC 3,4099 3,3992 0,3090 0,1736
54 LNL 0,7900 0,3966 0,2011 0,2074
55 JBR 0,6395 0,4434 0,1281 0,2860
56 FEOM 1,8169 0,1165 0,1190 0,1813
57 GVA 0,4263 0,7725 0,2650 0,2654
130
VOLUNTÁRIO CYP1A2 NAT2 XO CYP2A6
58 OLMN 1,1820 3,2699 0,4836 0,1824
59 RMA 1,8707 0,5669 0,3536 0,2305
61 JIOBR 0,7605 1,6253 0,3814 0,3531
62 AVM 0,9936 0,2610 0,2939 0,2714
63 MCLS 1,8907 0,1824 0,1962 0,2055
64 JFSJ 2,1609 1,0306 0,1124 0,2007
65 PDOC 0,5570 0,2024 0,2979 0,3619
66 MCR 2,0895 0,1892 0,2084 0,2741
67 FGSF 1,1760 1,9751 0,3864 0,3006
68 RFP 0,9111 0,2948 0,0476 0,3453
70 JILF 1,0813 0,1346 0,2252 0,2486
71 JSDL 1,6477 0,0353 0,1058 0,2233
72 FRSC 3,6136 0,1703 0,4690 0,1780
73 SAA 0,7916 0,4390 0,2958 0,3442
74 MLOM 2,1840 1,0362 0,1409 0,2391
75 IOV 0,5890 0,5337 0,2298 0,4806
76 MLSC 1,2388 0,0546 0,1575 0,2978
77 SMLC 1,8073 1,6042 0,0890 0,2551
78 FMFP 1,5132 1,4606 0,1213 0,2669
79 AAS 0,4258 0,2742 0,2913 0,4045
80 CGRF 1,2026 0,3998 0,3064 0,2652
81 FCAA 0,6131 0,8548 0,5103 0,4011
82 ALAA 0,6565 0,6279 0,2076 0,2883
83 ALBT 0,9888 0,2517 0,2093 0,2164
84 GCS 1,6224 4,5546 0,2391 0,2831
85 FMNC 1,3942 0,3706 0,2746 0,2491
Média 1,5366 1,1073 2337 0,2540
Desvio Padrão (SD) 0,7656 1,2310 0,1140 0,0641
131
ANEXO 4 - Abreviaturas dos Parâmetros Farmacocinéticos
ASC: Área sob a Curva da Concentração Plasmática versus Tempo, relaciona-se com a
quantidade ou a extensão de absorção do fármaco pode ser calculado pelo método trapezoidal e
expresso em unidades de concentração vezes tempo.
ASC
0-t
: Área sob a Curva do Tempo Zero ao Tempo T, relaciona-se com a quantidade do
fármaco absorvida do tempo zero ao tempo t, onde t é a última coleta determinada experimentalmente
(no caso do nosso estudo o t é igual a 24 horas).
ASC
0-inf
: Área sob a Curva do Tempo Zero ao infinito, corresponde à ASC 0-t somada à
extrapolação para o tempo infinito.
ASC
0-inf/0-t
: Relação entre a área sob a curva do tempo zero ao infinito e a área sob a curva do
tempo zero ao tempo t. Não deve ser inferior a 0,8.
Cmax: Concentração Máxima Atingida no Plasma, concentração mais elevada do fármaco
atingida na circulação sangüínea após administração de um fármaco. Relaciona-se a intensidade da
resposta farmacológica. O Cmax ideal deve estar dentro da janela terapêutica.
Tmax: Tempo necessário para atingir a concentração máxima no plasma, é obtido através da
observação direta.
ke: Constante de Eliminação, representa a soma de todas as taxas constantes para remoção do
fármaco do corpo.
t
½
: Meia Vida de Eliminação do fármaco, representa o tempo em que a concentração do
fármaco no plasma é reduzida a metade. Calcula-se através do logaritmo neperiano (ln) de 2 (ln2=
0,693) dividido pela constante de elimifação. t1/2 = ln2/K.
CL: Clearance
Vd: Volume de Distribuição
Vd/kg: Volume de Distribuição por kilograma
132
ANEXO 5 - Dados Farmacocinéticos dos Voluntários
DADOS DO VOL 03 TMA
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
61,08927
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
65,11312
AUC
0-inf/ 0-t
0,938202
ke (h-1) 0,11409
t
1/2
(h) 6,07546
Cmax (μg/mL)
6,138233
Tmax (h) 1,25
CL (mL/h) 291,7999
Vd (L) 2,557636
Vd (L/kg) 0,044097
AUC Vol 03 TMA
0,0
1, 0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
012345678910111213141516171819202122232425262728
Tempo (h)
133
DADOS DO VOL 04 MPE
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
57,95221
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
60,34453
AUC
0-inf/ 0-t
0,960356
ke (h-1) 0,135542
t
1/2
(h) 5,113884
Cmax (μg/mL)
6,117939
Tmax (h) 2
CL (mL/h) 314,8587
Vd (L) 2,322957
Vd (L/kg) 0,045548
AUC Vol 04 MPE
0,0
1, 0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425262728
Tempo (h)
134
DADOS DO VOL 05 AOD
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
40,92853
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
45,93662
AUC
0-inf/ 0-t
0,890978
ke (h-1) 0,096682
t
1/2
(h) 7,169324
Cmax (μg/mL)
4,827809
Tmax (h) 1
CL (mL/h) 413,6134
Vd (L) 4,278065
Vd (L/kg) 0,060682
AUC Vol 05 AOD
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
135
DADOS DO VOL 08 CVSO
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
84,24397
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
111,4294
AUC
0-inf/ 0-t
0,75603
ke (h-1) 0,067515
t
1/2
(h) 10,26659
Cmax (μg/mL)
7,629544
Tmax (h) 1
CL (mL/h) 170,5115
Vd (L) 2,525542
Vd (L/kg) 0,051542
A
UC Vol 08 CVSO
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425262728
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
136
DADOS DO VOL 17 WM
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
a b
ASC
0-t
(μg.h/mL)
32,64512
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
32,64512 32,64512
AUC
0-inf/ 0-t
1 32,64512
ke (h-1) 0,191761 142,4936
t
1/2
(h) 3,614647 0,249926
Cmax (μg/mL)
5,910315 2,773413
Tmax (h) 0,41666 5,910315
CL (mL/h) 582,0165
Vd (L) 2,328758
Vd (L/kg) 0,038176
AUC Vol 17 WM
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
012345678910111213141516171819202122232425262728
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
137
DADOS DO VOL 18 GBP
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
60,67608
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
66,5068
AUC
0-inf/ 0-t
0,912329
ke (h-1) 0,101305
t
1/2
(h) 6,842203
Cmax (μg/mL)
7,426964
Tmax (h) 0,58333
CL (mL/h) 285,6851
Vd (L) 2,820058
Vd (L/kg) 0,043722
AUC Vol 18 GBP
0,0
1, 0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425262728
Tempo (h)
138
DADOS DO VOL 24 EQA
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
72,39613
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
143,9079
AUC
0-inf/ 0-t
0,503073
ke (h-1) 0,029064
t
1/2
(h) 23,84883
Cmax (μg/mL)
5,099056
Tmax (h) 0,41666
CL (mL/h) 132,0289
Vd (L) 4,542665
Vd (L/kg) 0,064435
A
UC Vol 24 EQA
0,0
1, 0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
012345678910111213141516171819202122232425262728
Tempo (h)
139
DADOS DO VOL 29 CEBP
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
43,88231
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
45,96628
AUC
0-inf/ 0-t
0,954663
ke (h-1) 0,131374
t
1/2
(h) 5,276152
Cmax (μg/mL)
4,57738
Tmax (h) 1,25
CL (mL/h) 413,3465
Vd (L) 3,146343
Vd (L/kg) 0,047672
AUC Vol 29 CEBP
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425262728
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
140
DADOS DO VOL 32 FSM
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
101,9515
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
124,1751
AUC
0-inf/ 0-t
0,82103
ke (h-1) 0,072426
t
1/2
(h) 9,570425
Cmax (μg/mL)
8,6494
Tmax (h) 1
CL (mL/h) 153,0097
Vd (L) 2,112637
Vd (L/kg) 0,038412
AUC Vol 32 FSM
0,0
1, 0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10 ,0
012345678910111213141516171819202122232425262728
Tempo (h)
141
DADOS DO VOL 34 ALFV
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
62,94605
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
74,53242
AUC
0-inf/ 0-t
0,844546
ke (h-1) 0,079533
t
1/2
(h) 8,715224
Cmax (μg/mL)
6,32519
Tmax (h) 0,58
CL (mL/h) 254,9226
Vd (L) 3,205247
Vd (L/kg) 0,048935
A
UC Vol 34 ALFV
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425262728
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
142
DADOS DO VOL 36 MRSP
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
79,10014
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
93,46623
AUC
0-inf/ 0-t
0,846296
ke (h-1) 0,079838
t
1/2
(h) 8,681952
Cmax (μg/mL)
6,62741
Tmax (h) 2,00
CL (mL/h) 203,282
Vd (L) 2,54619
Vd (L/kg) 0,046294
A
UC Vol 36 MRSP
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
143
DADOS DO VOL 37 MOM
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
59,84348
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
65,66551
AUC
0-inf/ 0-t
0,911338
ke (h-1) 0,104875
t
1/2
(h) 6,609283
Cmax (μg/mL)
6,77970
Tmax (h) 1,00
CL (mL/h) 289,3452
Vd (L) 2,758958
Vd (L/kg) 0,057478
A
UC Vol 37 MOM
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425262728
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
144
DADOS DO VOL 38 MFH
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
42,21231
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
42,32712
AUC
0-inf/ 0-t
0,997288
ke (h-1) 0,241709
t
1/2
(h) 2,867694
Cmax (μg/mL)
6,52341
Tmax (h) 1,00
CL (mL/h) 448,8848
Vd (L) 1,857129
Vd (L/kg) 0,036414
A
UC Vol 38 MFH
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
012345678910111213141516171819202122232425262728
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
145
DADOS DO VOL 39 FAK
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
47,98774
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
50,12265
AUC
0-inf/ 0-t
0,957406
ke (h-1) 0,137198
t
1/2
(h) 5,052156
Cmax (μg/mL)
8,6494
Tmax (h) 1
CL (mL/h) 379,0701
Vd (L) 2,762936
Vd (L/kg) 0,050235
AUC Vol 39 FAK
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
012345678910111213141516171819202122232425262728
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
146
DADOS DO VOL 48 BAC
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
85,37976
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
107,4498
AUC
0-inf/ 0-t
0,794601
ke (h-1) 0,06846
t
1/2
(h) 10,12484
Cmax (μg/mL)
7,24612
Tmax (h) 1,25
CL (mL/h) 176,8267
Vd (L) 2,582918
Vd (L/kg) 0,047832
AUC Vol 48 BAC
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425262728
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
147
DADOS DO VOL 50 RTL
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
50,79198
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
52,91857
AUC
0-inf/ 0-t
0,959814
ke (h-1) 0,132078
t
1/2
(h) 5,248005
Cmax (μg/mL)
6,64775
Tmax (h) 0,58
CL (mL/h) 359,0422
Vd (L) 2,718406
Vd (L/kg) 0,042146
A
UC Vol 50 RTL
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
012345678910111213141516171819202122232425262728
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
148
DADOS DO VOL 51 KQS
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
131,3076
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
200,7324
AUC
0-inf/ 0-t
0,654143
ke (h-1) 0,044433
t
1/2
(h) 15,59978
Cmax (μg/mL)
7,94075
Tmax (h) 2,00
CL (mL/h) 94,65337
Vd (L) 2,130243
Vd (L/kg) 0,042183
A
UC Vol 51 KQS
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
149
DADOS DO VOL 53 FWPC
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
29,49955
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
29,56414
AUC
0-inf/ 0-t
0,997815
ke (h-1) 0,234447
t
1/2
(h) 2,95652
Cmax (μg/mL)
4,92485
Tmax (h) 0,58
CL (mL/h) 642,6704
Vd (L) 2,741218
Vd (L/kg) 0,031875
A
UC Vol 53 FWPC
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
150
DADOS DO VOL 54 LNL
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
49,28279
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
55,05751
AUC
0-inf/ 0-t
0,895115
ke (h-1) 0,093514
t
1/2
(h) 7,412217
Cmax (μg/mL)
4,15458
Tmax (h) 2,00
CL (mL/h) 345,0937
Vd (L) 3,690284
Vd (L/kg) 0,052718
AUC Vol 54 LNL
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
012345678910111213141516171819202122232425262728
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
151
DADOS DO VOL 55 JBR
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
32,09896
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
32,36121
AUC
0-inf/ 0-t
0,991896
ke (h-1) 0,186898
t
1/2
(h) 3,708683
Cmax (μg/mL)
4,99910
Tmax (h) 0,58
CL (mL/h) 587,1226
Vd (L) 3,141399
Vd (L/kg) 0,041885
A
UC Vol 55 JBR
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
152
DADOS DO VOL 56 FEOM
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
35,44213
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
36,0781
AUC
0-inf/ 0-t
0,982372
ke (h-1) 0,162386
t
1/2
(h) 4,268512
Cmax (μg/mL)
4,31762
Tmax (h) 0,6
CL (mL/h) 526,6352
Vd (L) 3,243105
Vd (L/kg) 0,047002
AUC Vol 56 FEOM
0,0
0,5
1, 0
1, 5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0 15,0 16,0 17,0 18,0 19,0 20,
0
21,0 22,
0
23,
0
24,
0
25,
0
26,
0
27,
0
28,
0
Tempo (h)
153
DADOS DO VOL 58 OLMN
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
47,13348
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
52,99023
AUC
0-inf/ 0-t
0,889475
ke (h-1) 0,09405
t
1/2
(h) 7,369956
Cmax (μg/mL)
7,62954
Tmax (h) 1,0
CL (mL/h) 358,5567
Vd (L) 3,812389
Vd (L/kg) 0,042836
A
UC Vol 58 OLMN
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
012345678910111213141516171819202122232425262728
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
154
DADOS DO VOL 61 FIOBR
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
31,5373
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
33,68335
AUC
0-inf/ 0-t
0,936288
ke (h-1) 0,113878
t
1/2
(h) 6,08674
Cmax (μg/mL)
3,38529
Tmax (h) 1,3
CL (mL/h) 564,0769
Vd (L) 4,953333
Vd (L/kg) 0,055037
A
UC Vol 61 FIOBR
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425262728
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
155
DADOS DO VOL 64 JFSJ
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
28,2452
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
28,32532
AUC
0-inf/ 0-t
0,997171
ke (h-1) 0,236179
t
1/2
(h) 2,934835
Cmax (μg/mL)
3,81574
Tmax (h) 0,6
CL (mL/h) 670,7779
Vd (L) 2,840122
Vd (L/kg) 0,034218
AUC Vol 64 JFSJ
0,0
0,5
1, 0
1, 5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 0 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8
Tempo (h)
156
DADOS DO VOL 65 PDOC
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
30,65953
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
31,11834
AUC
0-inf/ 0-t
0,985256
ke (h-1) 0,174975
t
1/2
(h) 3,961409
Cmax (μg/mL)
4,32440
Tmax (h) 1,50
CL (mL/h) 610,5724
Vd (L) 3,489485
Vd (L/kg) 0,045259
A
UC Vol 65 PDOC
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
0123456789101112131415161718192021222324252627282930
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
157
DADOS DO VOL 68 RFP
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
59,97303
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
76,28489
AUC
0-inf/ 0-t
0,786172
ke (h-1) 0,066326
t
1/2
(h) 10,45063
Cmax (μg/mL)
5,47100
Tmax (h) 0,75
CL (mL/h) 249,0664
Vd (L) 3,75519
Vd (L/kg) 0,043163
A
UC Vol 68 RFP
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021222324252627282930
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
158
DADOS DO VOL 71 JSDL
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
42,87896
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
43,62072
AUC
0-inf/ 0-t
0,982995
ke (h-1) 0,167372
t
1/2
(h) 4,141351
Cmax (μg/mL)
5,28675
Tmax (h) 1,50
CL (mL/h) 435,5729
Vd (L) 2,60242
Vd (L/kg) 0,036397
AUC Vol 71 JSDL
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
159
DADOS DO VOL 72 FRSC
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
25,07234
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
25,07234
AUC
0-inf/ 0-t
1
ke (h-1) 0,200642
t
1/2
(h) 3,454648
Cmax (μg/mL)
4,47465
Tmax (h) 0,42
CL (mL/h) 757,8072
Vd (L) 3,776914
Vd (L/kg) 0,049436
A
UC Vol 72 FRSC
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
0123456789101112131415161718192021222324252627282930
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
160
DADOS DO VOL 75 IOV
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
89,0205
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
129,8051
AUC
0-inf/ 0-t
0,685801
ke (h-1) 0,049727
t
1/2
(h) 13,93901
Cmax (μg/mL)
5,47520
Tmax (h) 1,25
CL (mL/h) 146,3733
Vd (L) 2,943528
Vd (L/kg) 0,038731
AUC Vol 75 IOV
0,0
1, 0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
012345678910111213141516171819202122232425262728
Tempo (h)
161
DADOS DO VOL 76 MLSC
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
60,1584
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
62,18433
AUC
0-inf/ 0-t
0,967421
ke (h-1) 0,144844
t
1/2
(h) 4,785468
Cmax (μg/mL)
7,46328
Tmax (h) 1,50
CL (mL/h) 305,5432
Vd (L) 2,109462
Vd (L/kg) 0,042359
AUC Vol 76 MLSC
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
012345678910111213141516171819202122232425262728
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
162
DADOS DO VOL 79 AAS
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
61,63699
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
66,19447
AUC
0-inf/ 0-t
0,93115
ke (h-1) 0,111784
t
1/2
(h) 6,200766
Cmax (μg/mL)
7,49870
Tmax (h) 0,42
CL (mL/h) 287,0331
Vd (L) 2,567744
Vd (L/kg) 0,044656
A
UC Vol 79 AAS
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
163
DADOS DO VOL 81 FCAA
PARÃMETROS FARMACOCINÉTICOS
ASC
0-t
(μg.h/mL)
79,41919
ASC
0-inf
(μg.h /mL)
91,65127
AUC
0-inf/ 0-t
0,866537
ke (h-1) 0,083902
t
1/2
(h) 8,261389
Cmax (μg/mL)
7,13538
Tmax (h) 1,25
CL (mL/h) 207,3076
Vd (L) 2,470829
Vd (L/kg) 0,047516
A
UC Vol 81 FCAA
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0123456789101112131415161718192021222324252627282930
Tempo (h)
Concentração (ug/mL)
164
ANEXO 6 – Aprovação do Comitê de ética.
165
ANEXO 7 – outras publicações no período do doutorado.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo