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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
Departamento de Fisiologia e Farmacologia
Avaliação da Hipertermoterapia Associada ao Paclitaxel,
5-Fluorouracil e 5-Fluorouracil mais Ácido Folínico no
Tumor de Walker 256 Implantado em Estômagos de Rato
Paulo Ferdinando de Melo Oliveira
Fortaleza-Ceará
2003
ads:
i
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
Departamento de Fisiologia e Farmacologia
Avaliação da Hipertermoterapia Associada ao Paclitaxel,
5-Fluorouracil e 5-Fluorouracil mais Ácido Folínico no
Tumor de Walker 256 Implantado em Estômagos de Rato
Paulo Ferdinando de Melo Oliveira
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Farmacologia do Departamento de Fisiologia
e Farmacologia da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal do Ceará para obtenção do
título de Doutor
Orientador:
Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho
Fortaleza-Ceará
2003
O49a Oliveira, Paulo Ferdinando de Melo
Avaliação da hipertermoterapia associada ao paclitaxel, 5-
fluorouracil e 5-fluorouracil mais ácido folínico no tumor de
Walker 256 implantado em estômagos de rato / Paulo Ferdi-
nando de Melo Oliveira. – Fortaleza, 2003.
234 f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho.
Tese (Doutorado). Universidade Federal do Ceará.
Faculdade de Medicina.
1. Hipertermia induzida. 2. Quimioterapia. 3. Carcinoma 256
de Walker. 4. Modelos animais. 5. Neoplasias gástricas. 6. Lin-
foma de pequenas células. I. Moraes Filho, Odorico (Orient.) II.
Título.
CDD 616.994.33
ads:
ii
Avaliação da Hipertermoterapia Associada ao Paclitaxel,
5-Fluorouracil e 5-Fluorouracil mais Ácido Folínico no
Tumor de Walker 256 Implantado em Estômagos de Rato
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia
do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para a obtenção do Título
de Doutor em Farmacologia.
Data da Aprovação: 09 de Outubro de 2003
Banca Examinadora:
________________________________________
Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho
(Orientador)
________________________________________
Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro
(co-Orientador)
________________________________________
Prof. Dr. Lusmar Veras Rodrigues
________________________________________
Prof. Dr. Francisco Valdeci de Almeida Ferreira
________________________________________
Prof. Dr. Paulo Roberto Leitão de Vasconcelos
iii
Aos meus pais
Maria Núbia (in memoriam)
e
Manoel do Nascimento
Por tudo que fizeram por mim
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter me dado forças e saúde a fim de conseguir terminar
este trabalho.
Ao Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho, meu orientador, e
antes de tudo colega e amigo, o meu mais sincero agradecimento, por todo este
período de boa convivência e proficiente orientação, que me enriqueceu e que
levarei sempre presente na minha formação.
Ao Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro, meu mais sincero
agradecimento não só pela co-orientação, mas por sempre dispor de seu labora-
tório quando necessitei além de ser uma honra tê-lo em nossa banca.
Ao Prof. Dr. Lusmar Veras Rodrigues que, gentilmente aceitou
participar desta banca, muito nos honra, nossos melhores agradecimentos.
Ao Prof. Dr. Francisco Valdeci de Almeida Ferreira pela gentile-
za em realizar os experimentos imunohistoquímicos deste trabalho, nossos agra-
decimentos. Muito nos honra tê-lo como integrante de nossa banca.
Ao Prof. Dr. Paulo Roberto Leitão de Vasconcelos por de bom
grado aceitar a participação nesta banca, em muito nos honra.
À minha esposa Cristina e aos meus filhos Felipe, André e Mi-
khael. Aqui não só os agradeço, mas também os reverencio, além de lhes pedir
as mais sinceras desculpas por todo este período de ausência e falta que causei a
toda a família devido à atenção dispensada a este trabalho.
A Profa. Dra. Cláudia do Ó Pessoa a quem sempre recorremos pa-
ra ajuda em nosso trabalho e que sempre se dispôs solícita, nosso especial agra-
decimento.
v
Ao Prof. Paulo Roberto Carvalho de Almeida que não mediu es-
forços e dedicação no estudo minucioso das 400 lâminas deste trabalho, sempre
com a mesma paciência, polidez e sabedoria. Realmente me faltam palavras para
expressar o meu mais sincero agradecimento. A minha profunda admiração à
sua pessoa.
À Profa. Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes e ao Dr. Fer-
nando Antônio Frota Bezerra por me terem aceitado na Unidade de Farmaco-
logia Clínica interinamente enquanto realizava este trabalho.
À Dra. Ana Paula Negreiros Nunes Alves pela disponibilidade e
presteza ao realizar a imunohistoquímica dos experimentos de nosso trabalho,
nossos agradecimentos.
À Dra. Miren Maite Uribe Arregi pela solicitude, polidez e pres-
teza ao nos fornecer os dados estatísticos do Instituto do Câncer do Ceará, nosso
apreço e agradecimento.
Ao Instituto do Câncer do Ceará, na pessoa de seu Diretor, o
Prof. Dr. Sérgio Ferreira Juaçaba, por nos ter fornecido as drogas deste expe-
rimento, a fim de que pudéssemos executá-lo, nosso sincero agradecimento.
Aos estudantes de medicina Daniel Magalhães Pereira, Patrícia
Macedo e Rafael Oliveira e Rafael Cardoso que mantiveram o tumor de Wal-
ker in vivo, sem o qual não poderíamos executar este trabalho.
À Profa. Dra. Sílvia Maria de Freitas pelos relevantes serviços
estatísticos prestados a este trabalho, sem os quais seria impossível conclui-lo,
nossos sinceros agradecimentos.
Aos Drs. Felipe dos Santos Dias Soares, Gabriel dos Santos Dias
Soares, Daniel Mota Moura Fé e Renata Gomes Picciani que, na primeira
vi
fase deste trabalho (até então estudantes de medicina), muito contribuíram para a
realização do mesmo, nossa eterna gratidão.
Aos estudantes de medicina Germana Lopes do Nascimento,
Germara Lopes do Nascimento, Litchia Lemna Pinheiro e Márcia Degobi
Sousa por suas inestimáveis contribuições a este trabalho, nossos agradecimen-
tos.
A todos os Docentes do Departamento de Fisiologia e Farmacolo-
gia da UFC que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste
trabalho, nossa imensa gratidão.
Ao Sr. Aronay Salmon da Cruz Lobato e à Sra. Maria do Perpé-
tuo Socorro Negreiros Oliveira, funcionários do Serviço de Quimioterapia do
Instituto do Câncer do Ceará que, sempre solícitos e educados, nos atendiam e
nos forneciam as drogas que necessitávamos para a execução deste trabalho. O
mínimo que posso dizer é muitíssimo obrigado.
A todos os funcionários e técnicos do Laboratório de Oncologia
Experimental e da Unidade de Farmacologia Clínica, em especial às secretárias
Fábia Beserra Lima e Flávia Martins Aguiar, bem como à secretária do Cur-
so de Pós-Graduação em Farmacologia, Sílvia Maria Azevedo Lima, as quais,
quando necessitei de seus préstimos, sempre me atenderam com enorme aten-
ção.
Ao colega e amigo Prof. Rômulo Augusto Feio Farias que nunca
mediu esforços para nos ajudar em nossos experimentos, notadamente nos estu-
dos citogenéticos que, juntamente com o estudante de biologia Bruno Coelho
Cavalcante, muito contribuíram neste trabalho, nosso agradecimento.
vii
À Dra. Maria Artemiza Portela de Almeida Cardoso, veterinária,
e ao Sr. Bento Francisco de Oliveira, não só pela dedicação ao Biotério do De-
partamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC, mas também pela ajuda ines-
timável e presteza em nos fornecer os animais, sem os quais seria impossível
realizar este trabalho, nosso respeito e gratidão.
Ao Sr. Francisco José Oliveira de Queiroz pelo suporte técnico-
fotográfico que nos foi prestado a fim de que as imagens fotográficas deste tra-
balho saíssem a contento, nosso agradecimento.
À Sra. Silvana França dos Santos pelo preparo e execução das
mais de 400 lâminas analisadas neste trabalho. Sua ajuda foi primordial, nossos
sinceros agradecimentos.
Ao Prof. Dr. Lúcio Flávio Gonzaga da Silva, colega de graduação
e pós-graduação, tanto no Mestrado como no Doutorado, por seu grande caráter,
meu agradecimento por ter partilhado de seu convívio.
Ao amigo Dr. Fernando Xavier do Nascimento que, ao comparti-
lharmos das cirurgias, nos favoreceu e nos deu oportunidade para melhorar meu
suporte financeiro e “agüentar o barco” até aqui, nossos sinceros agradecimen-
tos.
Ao Prof. Dr. Carlos Maurício de Castro Costa por ter me permi-
tido “invadir” seu gabinete e usufruir de seu funcionário e equipamentos (com-
putador e impressora).
Ao Sr. Sílvio Alves Costa por seu dedicado e prestimoso trabalho
de digitação desta tese, nosso pleno agradecimento.
viii
“Combati o bom combate,
terminei a minha carreira,
guardei a fé”
(Paulo, 2Tm-7)
ix
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS................................................................................ xv
LISTA DE TABELAS................................................................................ xxii
LISTA DE ABREVIAÇÕES..................................................................... xxiii
RESUMO.................................................................................................... xxviii
ABSTRACT................................................................................................ xxix
INTRODUÇÃO............................................................................................ 1
1. Relevância do Trabalho........................................................................... 1
2. Generalidades sobre Câncer Gástrico.................................................... 3
2.1. Epidemiologia..................................................................................... 3
2.1.1. Estatística do Câncer................................................................. 3
2.2. Etiopatogenia....................................................................................... 5
2.2.1. Helicobacter pylori................................................................... 5
2.2.2. Fatores Genéticos do Câncer Gástrico...................................... 9
2.2.2.1. Genes Supressores Tumorais e Moleculares de Ade-
são Celular no Câncer Gástrico.................................. 11
2.2.3. Fatores Ambientais................................................................... 14
3. Classificação do Câncer Gástrico........................................................... 16
3.1. Patologia.............................................................................................. 19
3.2. Sintomatologia.................................................................................... 19
4. Tratamento................................................................................................ 20
5. Modelo Experimental............................................................................... 22
5.1. Generalidades...................................................................................... 22
5.2. O Carcinossarcoma 256 de Walker..................................................... 23
5.3. Características Histopatológicas do Tumor......................................... 24
5.4. Transplantabilidade do Tumor............................................................ 25
5.5. Características Gerais do Consumo Energético dos Tumores Sólidos 26
x
6. Hipertermia............................................................................................... 27
6.1. Histórico.............................................................................................. 27
6.2. Fatores Básicos da Morte Celular por Hipertermia............................ 28
6.2.1. Efeito Citotóxico da Hipertermia............................................. 28
6.2.2. Morte Celular por Hipertermia em Diferentes Fases do Ciclo
Celular......................................................................................
29
6.2.3. Termotolerância como um Antagonismo de Morte Celular
por Hipertermia........................................................................
30
6.3. Fatores Especiais da Hipertermia in vivo............................................ 30
6.3.1. Indução de Alterações no Fluxo Sangüíneo e Microambiente
Tumorais por Hipertermia >42ºC............................................. 30
6.3.2. A Hipertermia “Moderada” Aumenta o Fluxo Sangüíneo
Tumoral.................................................................................... 32
6.4. Efeito Sinérgico da Hipertermia e Radiação....................................... 33
6.4.1. Radiossensibilização Térmica.................................................. 33
6.4.2. Seqüência Radiação-Calor........................................................ 34
6.5. Interação entre Hipertermia e Drogas................................................. 35
6.5.1. Quimiossensibilização Térmica................................................ 35
6.5.2. Diferentes Modos de Interação Droga-Calor........................... 35
6.5.3. Seqüência Droga-Calor............................................................ 37
6.5.4. Farmacocinética das Drogas Aplicadas Sincronicamente à
Hipertermia............................................................................... 38
6.6. Efetores Celulares da Hipertermia...................................................... 39
6.6.1. Membrana Celular e Citoesqueleto.......................................... 39
6.6.2. Proteínas Celulares e Ácidos Nucléicos................................... 40
6.6.3. Proteínas do Choque Térmico (HSP)....................................... 42
6.7. Características da Morte Celular por Hipertermia.............................. 42
xi
6.7.1. Diferentes Tipos de Morte Celular........................................... 42
6.7.2. Apoptose Induzida por Hipertermia......................................... 43
6.8. Mudanças na Imunoresposta Celular Induzida por Hipertermia......... 45
6.8.1. Efeitos pré-Clínicos do Calor sobre Linfócitos e Tumores
Experimentais........................................................................... 45
6.8.2. Mudanças Imunológicas em Pacientes com Câncer Tratados
com Hipertermia de Corpo Inteiro (WBH).............................. 46
6.9. Modulação de Resistência à Droga por Hipertermia........................... 49
6.9.1. Reversão de Resistência à Droga Induzida por Hipertermia.... 49
6.9.2. Termotolerância está Freqüentemente Associada com Resis-
tência à Droga........................................................................... 49
6.9.3. O Papel da Hipertermia é Reverter ou Induzir a Resistência
às Drogas.................................................................................. 50
7. Drogas Utilizadas em Associação com a Hipertermia.......................... 51
7.1. Paclitaxel (Taxol®)............................................................................. 51
7.2. 5-FU (5-Fluorouracil).......................................................................... 52
7.3. Ácido Folínico (Leucovorin®)............................................................ 53
8. Progressão Tumoral................................................................................. 55
OBJETIVOS................................................................................................. 59
1. Gerais..................................................................................................... 59
2. Específicos............................................................................................. 59
MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................ 61
1. Drogas e Reagentes................................................................................... 61
2. Paclitaxel (Taxol®)................................................................................... 62
2.1. Química............................................................................................... 62
2.2. Mecanismo de Ação............................................................................ 62
xii
2.3. Farmacoclínica e Farmacocinética...................................................... 63
2.4. Dosagem e Programação..................................................................... 63
2.4.1. Quando administrado para o tratamento do câncer de ovário
epitelial.....................................................................................
63
2.4.2. Quando administrado em animais (ratos)................................. 64
3. 5-Fluorouracil (5-FU)............................................................................... 64
3.1. Química............................................................................................... 64
3.2. Mecanismo de Ação............................................................................ 64
3.3. Farmacoclínica e Farmacocinética...................................................... 65
3.4. Dosagem e Programação..................................................................... 66
3.4.1. Quando administrado para o tratamento do câncer de cólon
Duke C......................................................................................
66
3.4.2. Quando administrado para o tratamento do câncer cervical
recorrente..................................................................................
66
3.4.3. Quando administrado em animais (ratos)................................. 66
4. Ácido Folínico (Leucovorin®) (fator citrovorum).................................. 66
4.1. Química............................................................................................... 66
4.2. Mecanismo de Ação............................................................................ 67
4.3. Farmacoclínica e Farmacocinética...................................................... 68
4.4. Dosagem e Programação..................................................................... 68
4.4.1. Quando administrado em seres humanos.................................. 68
4.4.2. Quando administrado em animais (ratos)................................. 68
4.5. Indicações de Uso do Ácido Folínico (Leucovorin®)........................ 69
5. Material Cirúrgico................................................................................... 70
6. Vidraria..................................................................................................... 70
7. Materiais Diversos.................................................................................... 70
8. Equipamentos........................................................................................... 71
9. Animais...................................................................................................... 72
xiii
10. Anestesia.................................................................................................. 72
11. Tumor...................................................................................................... 72
12. Preparação do Inóculo e Repicagem.................................................... 73
13. Implante do Tumor no Estômago......................................................... 73
14. Grupos de Tratamento........................................................................... 75
15. Técnica Hipertérmica............................................................................. 77
16. Técnica Quimioterápica......................................................................... 77
17. Estudos Morfológicos............................................................................. 78
18. Lavagem e Esterilização do Material................................................... 78
19. Técnica Citogenética para Tumor de Walker 256 Ascítico................ 78
19.1. Lâmina (previamente gelada em H
2
O destilada)............................... 79
19.2. Adaptações........................................................................................ 80
20. Contagem de Cromossomos.................................................................. 80
21. Documentação Fotográfica.................................................................... 80
22. Análise Estatística.................................................................................. 80
22.1. Taxol®, 5-FU e Leucovorin®........................................................... 80
22.2. Leucovorin® apenas.......................................................................... 81
RESULTADOS............................................................................................. 82
1. Paclitaxel (Taxol®)................................................................................... 82
1.1. Experimentais...................................................................................... 82
1.2. Histopatológicos.................................................................................. 87
1.3. Imunohistoquímicos............................................................................ 93
2. 5-Fluorouracil (5-FU)............................................................................... 94
2.1. Experimentais...................................................................................... 94
2.2. Histopatológicos.................................................................................. 98
2.3. Imunohistoquímicos............................................................................ 102
xiv
3. Ácido Folínico (Leucovorin®) (LEU)..................................................... 103
3.1. Experimentais...................................................................................... 103
3.2. Histopatológicos.................................................................................. 112
4. Progressão Tumoral................................................................................. 125
DISCUSSÃO................................................................................................. 133
1. Paclitaxel (Taxol®)................................................................................... 133
2. 5-Fluorouracil (5-FU)............................................................................... 140
3. Ácido Folínico (Leucovorin®) (LEU)..................................................... 142
4. Progressão Tumoral................................................................................. 150
CONCLUSÕES............................................................................................ 158
1. Paclitaxel (Taxol®)................................................................................... 158
2. 5-Fluorouracil (5-FU)............................................................................... 158
3. Ácido Folínico (Leucovorin®) (LEU)..................................................... 158
4. Progressão Tumoral................................................................................. 158
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA............................................................. 159
ANEXOS....................................................................................................... 203
xv
LISTA DE FIGURAS
Figura A
Estrutura química do Paclitaxel (Taxol®)................................. 62
Figura B
Estrutura química do 5-Fluorouracil.......................................... 64
Figura C
Estrutura Química do Ácido Folínico (Leucovorin®)............... 67
Figura D
Metabolismo do 5-Fluorouracil + Ácido Folínico..................... 69
Figura E
Inoculação e Manutenção do carcinossarcoma de Walker 256. 74
Figura 1
Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para todos os grupos
(Controle e Taxol)...................................................................... 83
Figura 2
Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para todos os grupos,
exceto Controle e Taxol no 3
o
dia.............................................. 84
Figura 3
Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Taxol
no 3
o
dia e Taxol no 3
o
dia + HT no 3
o
dia................................ 84
Figura 4
Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Taxol
no 7
o
dia e Taxol no 7
o
dia + HT no 7
o
dia................................ 85
Figura 5
Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Taxol
no 10
o
dia e Taxol no 10
o
dia + HT no 10
o
dia..........................
85
Figura 6
Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Taxol
no 3
o
dia e Taxol no 7
o
dia.........................................................
86
Figura 7
Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Taxol
no 3
o
dia e Taxol no 10
o
dia + HT no 10
o
dia............................
86
Figura 8
Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Taxol
no 3
o
dia e Taxol no 7
o
dia + HT no 7
o
dia................................
87
Figura 9
Muscular da mucosa separa nitidamente o tumor da mucosa.
Tratamento com Taxol + HT no 3
o
dia (HE) 200X...................
88
Figura 10
Tumor infiltra a musculatura com células fusiformes (sarco-
ma). Tratamento com Taxol no 10
o
dia (HE) 200X...................
88
xvi
Figura 11
Tumor em toda a espessura da parede gástrica, áreas de necrose
na mucosa. Tratamento com Taxol + HT no 3
o
dia (HE) 40X......
89
Figura 12
Tumor com extensas áreas de necrose e hemorragia. Trata-
mento com Taxol + HT no 10
o
dia (HE) 200X.......................... 89
Figura 13
Tumor na submucosa, vaso hiperemiado, com linfócitos cir-
cundantes. Tratamento com Taxol (HE) 200X.......................... 90
Figura 14
Tumor invade o pâncreas, entremeando-se aos ácinos. Trata-
mento com Taxol no 3
o
dia (HE) 200X..................................... 90
Figura 15
Tumor infiltra o tecido adiposo com células poligonais (epite-
lióide). Tratamento com Taxol + HT (HE) 100X.....................
91
Figura 16
Tumor apresentando corpos apoptóticos (seta). Tratamento
com Taxol + HT no 3
o
dia (HE) 400X.......................................
91
Figura 17
Ninhos de células tumorais (setas) em meio à extensa hemor-
ragia. Tratamento com Taxol + HT no 3
o
dia (HE) 200X.........
92
Figura 18
Tumor em pequenos agrupamentos (setas) em meio à extensa
hemorragia. Tratamento com Taxol + HT no 10
o
dia (HE) 100X.
92
Figura 19
Tumor 100% vimentina positiva. Tratamento com Taxol +
HT no 3
o
dia. IHQ: vimentina....................................................
93
Figura 20
Tumor 100% queratina negativa. Tratamento com Taxol.
IHQ: queratina...........................................................................
93
Figura 21
Tumor 40% vimentina positiva. Tratamento com Taxol + HT
no 3
o
dia. IHQ: vimentina..........................................................
94
Figura 22
Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para todos os grupos
(Controle e QT5FU)...................................................................
96
Figura 23
Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Con-
trole e QT5FU no 3
o
dia.............................................................
96
Figura 24
Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Con-
trole e QT5FU + HT no 7
o
dia...................................................
97
xvii
Figura 25
Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Con-
trole e QT5FU no 10
o
dia........................................................... 97
Figura 26
Tumor com necrose coagulativa extensa. Contornos celulares
e nucleares preservados. Tratamento com 5-FU no 3
o
dia (HE)
100X........................................................................................... 98
Figura 27
Tumor entre as glândulas da mucosa (setas), destruindo-as.
Tratamento com 5-FU no 3
o
dia (HE) 400X.............................. 99
Figura 28
Tumor com células poligonais (epitelióides). Presença de cé-
lulas fusiformes (mesenquimais) Tratamento com 5-FU no 7
o
dia (HE) 200X............................................................................ 99
Figura 29
Tumor com extensa necrose. Há lise tumoral. Tratamento com
5-FU no 7
o
dia (HE) 100X.........................................................
100
Figura 30
Tumor infiltrando o pâncreas. Há pouca necrose. Tratamento
com 5-FU no 7
o
dia (HE) 200X.................................................
100
Figura 31
Hemorragia intratumoral. Tratamento com 5-FU + HT no 10
o
dia (HE) 100X............................................................................ 101
Figura 32
Tumor com hemorragia à esq. Muscular da mucosa ao meio.
Edema representa a mucosite focal à dir. Tratamento com 5-
FU no 10
o
dia (HE) 200X.......................................................... 101
Figura 33
Tumor 100% vimentina positiva em toda sua extensão, exceto
mucosa. Tratamento com 5-FU. IHQ: vimentina......................
102
Figura 34
Tumor 100% queratina negativa, com controle queratina posi-
tiva à dir. Tratamento com 5-FU no 7
o
dia. IHQ: queratina....
102
Figura 35
Tumor 100% vimentina positiva. Presença de célula de Lan-
gerhans (vimentina +) (seta). Tratamento com 5-FU no 7
o
dia.
IHQ: vimentina.......................................................................... 103
Figura 36
Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para todos os grupos
(Controle, 5FU+LEU e 5FU+LEU+HT)................................... 104
xviii
Figura 37
Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Con-
trole e (5FU) + (LEU) no 7
o
dia................................................. 105
Figura 38
Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Con-
trole e (5FU) + (LEU) no 10
o
dia...............................................
105
Figura 39
Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Con-
trole e (5FU+LEU) + HT no 3
o
dia............................................
106
Figura 40
Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Con-
trole e (5FU+LEU) + HT no 7
o
dia............................................
106
Figura 41
Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Con-
trole e (5FU+LEU) + HT no 10
o
dia..........................................
107
Figura 42
Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos (5FU)
+ (LEU) no 3
o
dia e (5FU+LEU) + HT no 3
o
dia......................
108
Figura 43
Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos (5FU)
+ (LEU) no 7
o
dia e (5FU+LEU) + HT no 7
o
dia......................
109
Figura 44
Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos (5FU)
+ (LEU) no 10
o
dia e (5FU+LEU) + HT no 10
o
dia.................. 110
Figura 45
Valores observados e valores médios da temperatura dos ani-
mais ao longo do tempo (min.) em cada grupo experimental.... 111
Figura 46
Tumor com necrose da mucosa e submucosa (setas). Trata-
mento com 5FU + LEU associado à HT no 3
o
dia (HE) 40X.... 112
Figura 47
Tumor com necrose intensa. Tratamento com 5FU + LEU as-
sociado à HT no 3
o
dia (HE) 100X............................................ 113
Figura 48
Tumor residual com reação inflamatória. Necrose na submu-
cosa. Tratamento com 5FU + LEU associado à HT no 3
o
dia
(resposta parcial) (HE) 100X..................................................... 113
Figura 49
Tumor invadindo a mucosa, submucosa e muscular, se esten-
dendo até a JEG. Tratamento com 5FU + LEU associado à
HT no 3
o
dia (não houve resposta) (HE) 40X............................ 114
xix
Figura 50
Necrose na mucosa, submucosa e muscular. Tratamento com
5FU + LEU associado à HT no 3
o
dia (HE) 100X..................... 114
Figura 51
Tumor não visualizado. Necrose da muscular própria e da
submucosa. Tratamento com 5FU + LEU associado à HT no
3
o
dia (resposta completa) (HE) 100X....................................... 115
Figura 52
Vaso repleto de êmbolos tumorais (seta). Tratamento com
5FU + LEU associado à HT no 3
o
dia (HE) 200X..................... 116
Figura 53
Tumor invadindo a submucosa (extensa necrose liquefativa),
muscular e serosa. Tratamento com 5FU + LEU associado à
HT no 3
o
dia (HE) 40X.............................................................. 116
Figura 54
Tumor invadindo essencialmente a musculatura e o tecido
adiposo. Tratamento com 5FU + LEU associado à HT no 3
o
dia (HE) 100X............................................................................ 117
Figura 55
Tumor com intensa necrose. Tratamento com 5FU + LEU as-
sociado à HT no 7
o
dia (HE) 200X............................................ 117
Figura 56
Células tumorais no espaço porta e na luz da veia porta. Visão
ducto biliar (seta). Tratamento com 5FU + LEU associado à
HT no 7
o
dia (HE) 200X............................................................ 118
Figura 57
Êmbolos tumorais em vasos na submucosa (seta). Tratamento
com 5FU + LEU associado à HT no 7
o
dia (HE) 200X............. 118
Figura 58
Reação inflamatória fibrosante da submucosa. Tratamento
com 5FU + LEU associado à HT no 7
o
dia (HE) 40X............... 119
Figura 59
Exudato inflamatório com predomínio de linfócitos. Trata-
mento com 5FU + LEU associado à HT no 7
o
dia (HE) 100X.. 119
Figura 60
Presença de macrófagos (setas) e linfócitos. Tratamento com
5FU + LEU associado à HT no 7
o
dia (resposta completa)
(HE) 200X.................................................................................. 120
xx
Figura 61
Necrose mínima da mucosa. Tratamento com 5FU + LEU as-
sociado à HT no 10
o
dia (HE) 200X.......................................... 120
Figura 62
Tumor com bastante hemorragia. Tratamento com 5FU +
LEU no 10
o
dia (HE) 100X........................................................
121
Figura 63
Presença de tumor na junção esôfago-gástrica. Tratamento
com 5FU + LEU no 10
o
dia (HE) 40X......................................
121
Figura 64
Junção esôfago-gástrica normal. Tratamento com 5FU + LEU
associado à HT no 10
o
dia (resposta completa) (HE) 40X........
122
Figura 65
Veia (seta) com êmbolos tumorais. Tratamento com 5FU +
LEU associado à HT no 10
o
dia (HE) 200X..............................
123
Figura 66
Tumor em todas as camadas. Veia com êmbolos na submuco-
sa (seta). Tratamento com 5FU + LEU associado à HT no 10
o
dia (HE) 40X.............................................................................. 123
Figura 67
Êmbolo tumoral em veia da submucosa (seta). Tratamento
com 5FU + LEU associado à HT no 10
o
dia (HE) 200X........... 124
Figura 68
Infiltrado tumoral perineural (setas). Tratamento com 5FU +
LEU associado à HT no 10
o
dia (HE) 100X..............................
124
Figura 69
Tumor original mostra-se como neoplasia indiferenciada......... 125
Figura 70
Tumor original apresenta células indiferenciadas e pleomórficas.
126
Figura 71
Tumor original mostra-se como neoplasia de alto grau mitóti-
co (setas)....................................................................................
126
Figura 72
Tumor original apresenta células com picnose (setas).............. 127
Figura 73
Tumor original apresenta células apoptóticas (setas)................ 127
Figura 74
Tumor original apresenta células pleomórficas entre glândulas 128
Figura 75
Tumor original apresenta células pleomórficas e três mitoses
atípicas (setas)............................................................................ 128
Figura 76
Tumor original apresenta células de aspecto epitelióide e duas
mitoses atípicas (setas)............................................................... 129
xxi
Figura 77
Tumor original apresenta células indiferenciadas entre glândulas
129
Figura 78
Tumor sob tratamento com 5-FU no 10
o
dia apresenta invasão
da mucosa, além de edema (mucosite focal)............................. 130
Figura 79
Tumor sob tratamento com 5-FU no 3
o
dia apresenta invasão
da mucosa gástrica, destruindo-a............................................... 130
Figura 80
Tumor sob tratamento com Taxol® + HT no 3
o
dia apresenta
invasão pancreática, além de células pleomórficas nos ácinos.. 131
Figura 81
Cariótipo normal de rato (fibroblastos) com 42 cromossomos.. 132
Figura 82
Cariótipo de célula tumoral (Walker 256) com 37 cromossomos.
132
xxii
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Tabela I
Testes para a igualdade das curvas estimadas de Kaplan-
Meier entre os grupos.................................................................
82
Tabela II
Testes para a igualdade das curvas estimadas de Kaplan-
Meier entre os grupos, exceto Controle e Taxol no 3
o
dia.........
83
Tabela III
Testes para a igualdade das curvas estimadas de Kaplan-
Meier entre os grupos.................................................................
95
Tabela IV
Teste Log-Rank para a igualdade das curvas estimadas de
Kaplan-Meier do Grupo Controle versus os demais grupos
individualmente.......................................................................... 95
Tabela V
Teste Log-Rank para a igualdade das curvas estimadas de
Kaplan-Meier do Grupo Controle versus os demais grupos
individualmente.......................................................................... 104
Tabela VI
Teste Log-Rank para a igualdade das curvas estimadas de
Kaplan-Meier do Grupo (5FU) + (LEU) no 3
o
dia versus os
demais grupos individualmente................................................. 107
Tabela VII
Teste Log-Rank para a igualdade das curvas estimadas de
Kaplan-Meier do Grupo (5FU) + (LEU) no 7
o
dia versus os
demais grupos individualmente................................................. 108
Tabela VIII
Teste Log-Rank para a igualdade das curvas estimadas de
Kaplan-Meier do Grupo (5FU) + (LEU) no 10
o
dia versus os
demais grupos individualmente................................................. 109
Tabela IX
Teste Log-Rank para a igualdade das curvas estimadas de
Kaplan-Meier do Grupo (5FU+LEU) + HT no 3
o
dia versus os
demais grupos individualmente................................................. 110
Quadro I
Teste de Tukey para a comparação das médias (
5%
= 1,16)....
111
xxiii
LISTA DE ABREVIAÇÕES
1p - Braço curto do cromossomo 1
1q - Braço longo do cromossomo 1
5,10-CH
2
H
4
PteGlu - 5,10-metilenotetrahidrofolato
5-FdUMP - 5-fluorodesoxiuridina monofosfato
5-FdUTP - 5-fluorodesoxiuridina trifosfato
5-FU - 5-Fluorouracil
7q - Braço longo do cromossomo 7
ABC - Complexo avidina-biotina-peroxidase
AJCC - Comitê Americano Contra o Câncer
APC -
Gene supressor do câncer gástrico (adenomatous polyposis coli)
atm - Atmosfera
ATP - Adenosina trifosfato
Balb - Raça de camundongos
bcl-2 - Oncogene relacionado à proliferação celular no câncer
bpm - Batimentos por minuto
cagA - Citotoxina gene A
CCNU - Cloro-etil-ciclohexil-nitrosuréia
CD44 - Molécula de adesão celular
CDK - Quinases dependentes de ciclina
c-erg-2 - Gene relacionado ao câncer gástrico
=CH– - Unidade de carbono-único do grupo metenil
–CH
2
– - Unidade de carbono-único do grupo metileno
–CH
3
- Unidade de carbono-único do grupo metil
CHO - Células ovarianas de hamsters Chineses (Chinese ham-
ster ovary cells)
–CHO - Unidade de carbono-único do grupo formil
xxiv
c-ki-ras - Gene relacionado ao câncer gástrico
Cl
- Cloro iônico
c-met - Gene relacionado ao câncer gástrico
c-myc - Gene relacionado ao câncer
CSF - Fator estimulador de colônia (colony stimulating factor)
D, t e T - Variáveis Dose térmica/tempo/Temperatura
D7S95 - Locus do braço longo do cromossomo 7
DCC -
Gene supressor do câncer de cólon (deleted colorectal cancer)
DFF - Departamento de Fisiologia e Farmacologia
DHFU - Dihidrofluorouracil
DNA - Ácido desoxirribonucléico
dTMP - Desoxitimidina monofosfato
dUMP - Desoxiuridina monofosfato
e.g. - Por exemplo (exempla gratia)
EGF -
Fator de crescimento epidérmico (epidermal growth factor)
EGFr - Receptor de fator de crescimento epidérmico (epidermal
growth factor receptor)
FdUDP - Fluorodesoxiuridina difosfato
FdUMP - Fluorodesoxiuridina monofosfato
FdUrD - Fluorodesoxiuridina
FGF-
-
Fator de crescimento de fibroblastos (fibroblast growth factor
)
FH
2
- Dihidrofolato
FH
4
- Tetrahidrofolato
FRNA - Ácido ribonucléico incorporado ao 5-FU
FUDP - Fluorouracil difosfato
FUMP - Fluorouracil monofosfato
FUTP - Fluorouracil trifosfato
gl - Graus de liberdade
xxv
Gy - Unidade de medida de irradiação ionizante (gray)
H&E - Hematoxilina-Eosina
H. pylori
-
Helicobacter pylori
H
+
- Hidrogênio iônico
H
1
e H
2
- Tipos de bloqueadores histamínicos
H
4
PteGlu
1
- Tetrahidrofolato
HCO
3
- Bicarbonato iônico
HeLa - Célula de colo de útero
HGF -
Fator de crescimento de hepatócitos (hepatocyte growth factor)
HIF - Fator induzido por hipóxia (hypoxia-inducible factor)
HSF - Fator de choque térmico (heat shock factor)
HSP - Proteína de choque térmico (heat shock protein)
HT - Hipertermia
i.m. - Intramuscular
i.p. - Intraperitoneal
i.v. - Intravenosa
IARC - International Agency for Research on Cancer
IFN-
- Interferon gama
IGF-I -
Fator de crescimento tipo insulina I (insulin-like growth factor I)
IGF-II -
Fator de crescimento tipo insulina II (insulin-like growth factor II)
IHM - Imunohistoquímica
IL-1
-
Interleucina 1
IL-10 - Interleucina 10
IL-2 - Interleucina 2
IL-6 - Interleucina 6
IL-8 - Interleucina 8
INCA - Instituto Nacional do Câncer
JEG - Junção esôfago-gástrica (cárdia)
xxvi
JRSGC - Japanese Research Society for Gastric Cancer
kcal/mol - Unidade de medida de calorias (kilocaloria por mol)
kDa - Unidade de medida de peso molecular (kilodalton)
KGF - Fator de crescimento de queratinócitos
KM - Teste estatístico Kaplan-Meier
k-sam - Gene relacionado ao câncer gástrico
L-31 - Lectina ligadora de lactosídeo de 31-kd
LDH - Lactato dehidrogenase
LOE - Laboratório de Oncologia Experimental da UFC
M, S, G1 e G2 - Fases do ciclo celular
MCF-7 - Tipo de adenocarcinoma mamário
MDR - Multidroga-resistência
MFDU - Monofosfato de desoxiuridilato
MFTM - Monofosfato de timidilato
mL - Mililitro
MS - Ministério da Saúde
MTX - Metotrexato
Na
+
- Sódio iônico
NK - Tipo de linfócito (natural killer)
nm23 - Gene supressor de metástase
ºC - Grau centígrado (Celsius)
P388 - Tipo de célula leucêmica
P450 - Tipo de enzima hepática
p53 - Gene supressor do câncer gástrico
PABA - Ácido para-aminobenzóico
PDGF-
-
Fator de crescimento derivado de plaquetas (platelet
derived growth factor )
xxvii
PET - Tomografia por emissão de pósitrons (positron emission
tomography)
pH - Potencial hidrogênio-iônico
PPHC - Perfusão peritoneal hipertérmica contínua
Pr - Probabilidade
PVC - Policloreto de vinila
PVPI - Polivinilpirrolidona
R - Constante da Dose térmica
RAT - Razão de aumento térmico
RNA - Ácido ribonucléico
RV - Razão de verossimilhança
S
ˆ
(t), j, t
j
, d
j
e n
j
- Variáveis do teste Kaplan-Meier
SC(m
2
) - Superfície corporal em metros quadrados
SCID - Raça de camundongos
SPM - Sarcomas de partes moles
T4 - Linfócito T4
T8 - Linfócito T8
TGF-
-
Fator de crescimento transformante (transforming
growth factor
)
TGF-D
-
Fator de crescimento transformante D (transforming
growth factor
D)
TNM - Classificação Tumor/Linfonodo/Metástase
TS - Timidilato-sintase
UFC - Universidade Federal do Ceará
UICC - União Internacional Contra o Câncer
v.o. - Via oral
vacA - Citotoxina A vacuolada
WBH - Hipertermia de corpo inteiro (whole-body hyperthermia)
xxviii
RESUMO
Avaliação da hipertermoterapia associada ao paclitaxel, 5-fluorouracil e 5-fluorouracil mais
ácido folínico no tumor de Walker 256 implantado em estômagos de rato. Paulo Ferdinando de
Melo Oliveira. Orientador: Manoel Odorico de Moraes Filho. Departamento de Fisiologia e Farmaco-
logia, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará.
Introdução: As drogas quimioterápicas convencionais não têm obtido sucesso no tratamento do cân-
cer gástrico. O paclitaxel (Taxol) mostrou ser efetivo no tratamento dos cânceres de ovário, mama e
pulmão. O 5-fluorouracil (5-FU) tem apresentado resultados promissores no tratamento do câncer de
cólon. O ácido folínico (Leucovorin®) potencializa a citotoxicidade do 5-fluorouracil. Estudos desen-
volvidos no Japão, Estados Unidos e Europa vêm sugerindo o uso de quimioterapia associada à hiper-
termia no controle da doença localmente avançada. Objetivos: Avaliar a influência do paclitaxel, 5-
fluorouracil e 5-fluorouracil mais ácido folínico, isolados e associados à hipertermia, na sobrevida de
ratos com tumor de Walker 256 implantados no estômago, e observar o comportamento do tumor de
Walker 256 original implantado em estômagos de rato sem tratamento e submetidos aos tratamentos
quimioterápicos propostos, associados à hipertermia. Métodos: Implantou-se o tumor de Walker 256
na mucosa gástrica de rato no 3
o
, 7
o
, e 10
o
dias de inoculação do tumor. Os animais foram tratados
com paclitaxel, 5-fluorouracil e 5-fluorouracil mais ácido folínico, isolados e associados à hipertermia.
Foram administrados paclitaxel na dose de 25 mg/m
2
, 5-fluorouracil na dose de 130 mg/m
2
e ácido
folínico na dose de 7 mg/m
2
. A Hipertermia de Corpo Inteiro foi iniciada 2 horas após a administração
dos quimioterápicos, tendo duração de 1 hora. Resultados: Os animais inoculados com tumor apresen-
taram uma sobrevida de 13,25 0,53. Os animais tratados com Paclitaxel isolado apresentaram sobre-
vida de 28,61 0,82, 20,92 1,77 e 20,07 0,60 no 3
o
, 7
o
e 10
o
dias, respectivamente, e aqueles trata-
dos com Paclitaxel + hipertermia apresentaram sobrevida de 19,17 1,20, 22,54 1,47 e 17,92 1,06
nos mesmos períodos. Os animais tratados com 5-fluorouracil isolado apresentaram sobrevida de
16,16 0,52, 15,57 0,57 e 17,94 0,46 no 3
o
, 7
o
e 10
o
dias, respectivamente, e aqueles tratados com
5-fluorouracil + hipertermia apresentaram sobrevida de 14,45 0,36, 16,36 0,81 e 18,37 1,86 nos
mesmos períodos. Os animais tratados com 5-fluorouracil + ácido folínico apresentaram sobrevida de
14,89 0,71, 16,56 0,91 e 16,11 0,67 no 3
o
, 7
o
e 10
o
dias, respectivamente, e aqueles tratados com
5-fluorouracil + ácido folínico + hipertermia apresentaram sobrevida de 17,60 1,22, 15,42 0,31 e
15,45 0,39 nos mesmos períodos. Conclusões: O tumor experimental de Walker 256 é um tumor de
pequenas células. A hipertermia associada à quimioterapia, com paclitaxel, 5-fluorouracil, 5-
fluorouracil mais ácido folínico como tratamento do tumor de Walker experimental implantado nos
estômagos de rato Wistar, não melhorou a sobrevida.
Palavras-Chave: hipertermia, quimioterapia, hipertermoterapia, tumor gástrico experimental, tumor
de Walker, tumor de pequenas células.
xxix
ABSTRACT
Evaluation of the hyperthermotherapy associated with paclitaxel, 5-fluorouracil and 5-
fluorouracil plus folinic acid on the Walker 256 tumor implanted in rat stomachs. Paulo Fer-
dinando de Melo Oliveira. Supervisor: Manoel Odorico de Moraes Filho. Department of Physiol-
ogy and Pharmacology, Faculty of Medicine, Federal University of Ceará.
Introduction: The conventional chemotherapy drugs have not obtained success on the treatment
of gastric cancer. The paclitaxel (Taxol) showed to be effective on treating lung, breast and
ovarian cancer. The 5-fluorouracil (5-FU) has shown promising results on the treatment of colon
cancer. The folinic acid (Leucovorin®) reinforces the 5-FU cytotoxicity. Studies developed in
Japan, United States and Europe suggest the use of chemotherapy associated with hyperthermia
on the control of locally advanced disease. Objectives: Evaluate the influence of paclitaxel, 5-
fluorouracil and 5-fluorouracil plus folinic acid, isolated and associated with hyperthermia, on the
survival of rats with Walker 256 tumor implanted on their stomach, and observe the behavior of
the original Walker 256 tumor implanted in the stomach of rats with no treatment and with the
proposed chemotherapy treatments associated with hyperthermia. Methods: The Walker 256 tu-
mor was implanted on the mucous layer of the rat stomach on the 3rd, 7th and 10th day after in-
oculation. The animals were treated with paclitaxel, 5-fluorouracil and 5-fluorourcil plus folinic
acid isolated and associated with hyperthermia. Paclitaxel 25 mg/m
2
, 5-fluorouracil 130 mg/m
2
and folinic acid 7 mg/m
2
were used. The Whole-Body Hyperthermia was initiated 2 hours after
the administration of the chemotherapic drugs, with 1 hour of duration. Results: The animals in-
oculated with tumor showed a survival of 13.25 0.53. The animals treated with Paclitaxel iso-
lated showed a survival of 28.61 0.82, 20.92 1.77 and 20.07 0.60 in the 3
rd
, 7
th
and 10
th
days,
respectively, and those treated with Paclitaxel + hyperthermia showed a survival of 19.17 1.20,
22.54 1.47 and 17.92 1.06 in the same periods. The animals treated with 5-fluorouracil iso-
lated showed a survival of 16.16 0.52, 15.57 0.57 and 17.94 0.46 in the 3
rd
, 7
th
and 10
th
days,
respectively, and those treated with 5-fluorouracil + hyperthermia showed a survival of 14.45
0.36, 16.36 0.81 and 18.37 1.86 in the same periods. The animals treated with 5-fluorouracil +
folinic acid showed a survival of 14.89 0.71, 16.56 0.91 and 16.11 0.67 in the 3
rd
, 7
th
and
10
th
days, respectively, and those treated with 5-fluorouracil + folinic acid + hyperthermia showed
a survival of 17.60 1.22, 15.42 0.31 and 15.45 0.39 in the same periods. Conclusions: The
Walker 256 is a small cell tumor. The hyperthermia associated with chemotherapy using pacli-
taxel, 5-fluorouracil and 5-fluorouracil plus folinic acid as treatment of Walker experimental tu-
mor implanted in Wistar rat stomachs do not improved the survival.
Key-words: hyperthermia, chemotherapy, hyperthermotherapy, experimental gastric tumor,
Walker tumor, small cells tumor.
1
INTRODUÇÃO
1. Relevância do Trabalho
O câncer gástrico é a mais freqüente das neoplasias malignas do
aparelho digestivo, de tal maneira que se configura como um grave problema de
saúde pública em dimensões nacionais, e porque não dizer, até mesmo em certos
países, tais como Japão, Chile, Finlândia e Islândia, sendo sua incidência menor
nas Filipinas, Honduras e Estados Unidos. No Japão, corresponde a 40% de to-
das as neoplasias malignas, e nos Estados Unidos a apenas 5% (Muraro & Man-
tovani, 2000).
Sua taxa de mortalidade é de 45 casos por 100 mil habitantes no
Japão, e de apenas 8 casos nos Estados Unidos (Muraro & Mantovani, 2000).
No Brasil, as estimativas para a taxa bruta de mortalidade foram de 12 casos por
100 mil habitantes (International Agency for Research of Cancer – IARC,
2000). O tumor é mais freqüente no homem, na proporção de 2 para 1 (Muraro
& Mantovani, 2000).
Nos anos 80, a incidência de câncer gástrico em Fortaleza era de
46,8 por 100 mil habitantes nos homens e 20,1 nas mulheres (Juaçaba et al.,
1984). Em 2002, a estimativa para o Ceará e Fortaleza foi de 11,88/100 mil para
homens e 5,14/100 mil para mulheres (Brasil, 2002).
Há muito tem-se observado este declínio na incidência mundial. O
Japão e o Chile, que nos anos 70 apresentavam uma incidência de 70-80 casos
por 100 mil habitantes (Crumb et al., 1970), hoje apresentam uma taxa bem me-
nor de mortalidade (IARC, 2000). Nos Estados Unidos, a taxa de incidência, que
era de 10/100 mil habitantes/ano, hoje está em torno de 8/100 mil. Esta diminui-
ção na incidência é atribuída à refrigeração dos alimentos, à diminuição do uso
do sal e ao menor consumo de alimentos defumados.
2
O Ceará, comparado aos demais Estados brasileiros, ainda apresen-
ta índice de mortalidade elevado, haja vista que a taxa bruta, para homens, no
Ceará e Fortaleza, que é de 7,03/100 mil, está acima da taxa da região nordeste,
que é de 3,97/100 mil (Brasil, 2002).
O que é preocupante é a expectativa de vida destes pacientes que
apresentam-se sem nenhum incremento nos últimos 20 anos. Além disso, a qua-
lidade de vida desses pacientes torna-se bastante comprometida pela presença de
síndromes dolorosas como conseqüência do processo patológico.
Aproximadamente 50% dos pacientes com câncer gástrico têm na
dor aguda o sintoma primário. Outras vezes, a dor aguda surge após o diagnósti-
co ou se acentua com a confirmação deste, associando-se de forma desvantajosa
a quadro depressivo, que advém com a confirmação da doença (Bonica, 1990).
Como a doença se apresenta e acomete em grande parte a popula-
ção de baixa renda, notadamente no interior do nosso Estado, o agricultor, prin-
cipal fonte de renda de sua família, após o acometimento da doença, se vê inca-
paz de novamente trabalhar, daí advindo uma depressão ainda maior, a qual re-
percute sobremaneira na sua sobrevida.
Esses dados permitem configurar o câncer de estômago no Ceará
como um grave problema de saúde pública. Encontra-se, portanto, diante de uma
realidade que precisa ser enfrentada nos seus mais variados aspectos. Assim,
procura-se desenvolver um trabalho que, na medida do possível, forneça subsí-
dios para uma aplicabilidade imediata de novas condutas terapêuticas que possi-
bilitem a perspectiva de minimizar essa grave realidade. Embasados numa ex-
tensa revisão bibliográfica, e na experiência de várias pesquisas, tais como S-
pratt em tumores de pâncreas (Spratt et al., 1980), Sugarbaker no uso da quimio-
terapia intraperitoneal de maneira científica (Sugarbaker et al., 1985) e Fujimoto
na análise da ação antitumoral da hipertermoquimioterapia com mitomicina C e
completa destruição das células neoplásicas no líquido peritoneal e no peritônio
3
(Fujimoto et al., 1988), decide-se estudar a viabilidade da implementação da hi-
pertermoterapia associada às terapêuticas quimioterápicas convencionais em
tumores experimentais implantados em estômagos de rato. Embora muitas dro-
gas já tenham demonstrado sinergismo com a hipertermoterapia, tais como mi-
tomicina C (Fujimoto et al., 1988), agentes alcalinos como fosfamida e ifosfa-
mida, além dos compostos platinum (Oliveira, 1997; Hildebrandt et al., 2002), a
técnica da hipertermia associada à quimioterapia ainda necessita de um estudo
mais aprofundado no seu detalhamento técnico, inclusive, numa visão histopato-
lógica, através do desenvolvimento de um modelo experimental cujas condições
permitam uma posterior adaptação para o emprego imediato em seres humanos.
2. Generalidades sobre Câncer Gástrico
2.1. Epidemiologia
2.1.1. Estatística do Câncer
O Instituto Nacional do Câncer (INCA) do Ministério da Saúde
(MS) estima para o ano de 2002, em todo o Brasil, a ocorrência de 337.535 no-
vos casos de câncer e 122.600 óbitos devidos à doença. Desse total, 165.895
(49,1%) casos e 66.060 (53,9%) óbitos serão para o sexo masculino e 171.640
(50,9%) casos e 56.540 (46,1%) óbitos para o sexo feminino. Estima-se que o
principal câncer a acometer a população brasileira será o câncer de pele não-
melanoma (62.190 casos – 18,4%), seguido pelas neoplasias malignas da mama
feminina (36.090 casos – 10,7%), câncer de próstata (25.600 casos – 7,6%), de
pulmão (21.425 casos – 6,3%) e de estômago (20.420 casos – 6,0%) (Brasil,
2002).
A análise por sexo demonstra que as maiores taxas de incidência
entre os homens serão devido ao câncer de pele não-melanoma (36,57/100 mil),
próstata (29,76/100 mil), pulmão (17,45/100 mil) e estômago (16,14/100 mil),
4
enquanto que entre as mulheres, destacam-se as neoplasias malignas da mama
(40,66/100 mil), câncer de pele não-melanoma (34,56/100 mil), colo do útero
(19,82/100 mil), cólon e reto (11,04/100 mil) e estômago (7,38/100 mil) (Brasil,
2002).
As maiores taxas de mortalidade por câncer no Brasil em 2002, ten-
do em vista a localização primária, serão de 12,99/100 mil para o câncer de
pulmão, primeira causa de morte nos homens, seguido de 9,14/100 mil para o
câncer de próstata e 8,47/100 mil para o de estômago. Estima-se que o câncer de
mama feminino (10,25/100 mil) será a primeira causa de morte nas mulheres,
seguido pelo câncer de pulmão (5,29/100 mil), cólon e reto (4,59/100 mil), colo
do útero (4,49/100 mil) e estômago (4,24/100 mil) (Brasil, 2002).
De maneira semelhante, a incidência de novos casos de câncer gás-
trico em mulheres no Brasil está como a quinta causa, assim como na estimativa
de óbito.
Já no Estado do Ceará para 2002, a análise por sexo mostra que a
taxa de incidência de novos casos de câncer gástrico entre os homens é de
11,88/100 mil, enquanto que entre as mulheres é de 5,13/100 mil. Já a taxa bruta
de mortalidade entre os homens é de 7,03/100 mil, e entre as mulheres é de
4,04/100 mil (Brasil, 2002).
Portanto, se observa que a incidência de novos casos de câncer gás-
trico no Ceará em homens está como a terceira causa, ao passo que a estimativa
de óbito é a segunda, só sendo superada pelo câncer de próstata. Já no tocante às
mulheres, a incidência de novos casos é a quarta causa, enquanto que a estimati-
va de óbito é a segunda, somente sendo superada pelo câncer de mama (Brasil,
2002).
5
2.2. Etiopatogenia
Os fatores hereditários têm sido muito valorizados na sua etiopato-
genia. Assim, sua incidência é 3-4 vezes maior entre os membros de uma mesma
família. Napoleão Bonaparte, seu pai, um irmão e duas irmãs morreram de cân-
cer gástrico. É também mais freqüente em pessoas do grupo sangüíneo A (Ya-
magata & Hisamichi, 1979a).
Quanto aos fatores preponderantes, os raciais têm sido relatados
como importantes. A incidência é maior na raça amarela (Japão), assim como
em negros do que em brancos nos Estados Unidos. Os fatores ambientais tam-
bém têm sido mencionados na etiopatogenia da moléstia. Trabalhadores rurais e
de minas de carvão, fumantes e populações que ingerem alimentação de alto ris-
co têm sido mais acometidos por este tipo de neoplasia. É considerado de alto
risco a ingestão de muito amido e de poucos vegetais e frutas frescas, assim co-
mo a alimentação rica em carbohidratos e/ou pobre em micronutrientes, além da
ingestão de pouca quantidade de proteínas. Outros fatores dietéticos importantes
na gênese do câncer gástrico são: ingestão de alimentos defumados, peixes desi-
dratados por sal e conservas de modo geral (Yamagata & Hisamichi, 1979b).
O consumo de carnes e peixes desidratados por processos de salga-
mento com nitrato e nitrito, respectivamente, também é apontado como favore-
cedor da neoplasia. Esses aspectos constituem hoje a chamada “Teoria da Nitro-
samina”, pois essas substâncias nitrogenadas, na presença de hipo ou acloridria
(que permitem a formação bacteriana), são substâncias mutagênicas, teratogêni-
cas e carcinogênicas atuando sobre a síntese de DNA e aumentando a chance de
mutação (Green et al., 1988; Ichiyoshi et al., 1990; Rosen, 1997).
2.2.1. Helicobacter pylori
O Helicobacter pylori, uma bactéria gram negativa e microaerófila,
tem sido implicada como um possível agente promotor no desenvolvimento do
6
carcinoma gástrico. Esta associação está baseada no aumento da incidência da
infecção por H. pylori na China, onde há uma alta taxa de câncer gástrico, e nu-
ma elevada incidência de infecção em pacientes com câncer gástrico nos Esta-
dos Unidos (Staley, 1995).
Outro estudo analisa os dados de 13 pacientes e mostra uma associ-
ação significativa entre a soropositividade para H. pylori e os coeficientes de
incidência e mortalidade para câncer gástrico (Forman et al., 1993).
O H. pylori tem sido apontado como um provável fator etiológico
na gênese do carcinoma gástrico, e definido por algumas entidades como um
verdadeiro carcinogênico (Siegel et al., 1976).
Alguns autores assinalam o papel do H. pylori no desenvolvimento
da gastrite crônica (Tso et al., 1987; Tatsuta et al., 1993). Outros identificam o
H. pylori como um fator de risco pela sua associação com lesões pré-neoplásicas
gástricas (Tso et al., 1987), com o adenocarcinoma (Taki & Kuwabara, 1981) e
com o tipo bem diferenciado do adenocarcinoma precoce (Dixon et al., 1996).
Haveria também um progressivo aumento de risco com a coexistência de H. p-
ylori associado à gastrite crônica atrófica antral (Tatsuta et al., 1993).
Os dados epidemiológicos descritos acima correspondem a um tipo
de carcinoma gástrico, e provavelmente o mais comum, o adenocarcinoma intes-
tinal de Láuren (Iwanaga et al., 1975).
O outro tipo, chamado de adenocarcinoma difuso, não mostra estas
associações, e parece sofrer menos influências ambientais. Todavia, outros auto-
res já consideram que o H. pylori esteja associado com ambos os tipos intestinal
e difuso de câncer gástrico. Estudos epidemiológicos indicam que o H. pylori
esteja relacionado com o câncer distal e não com o gástrico proximal (Cheung &
Delcore, 2001).
Há uma forte ligação entre a infecção por H. pylori e o câncer gás-
trico em muitos países, tais como o Japão (Miwa et al., 2002). Estudos estimam
7
que a infecção por H. pylori contribui com um risco acima de 60% para o câncer
gástrico em uma dada população (Fendrick et al., 1999).
Por outro lado, a prevalência da infecção por H. pylori é alta em
alguns países, incluindo Índia e Bangladesh, todavia, as taxas de câncer gástrico
são baixas (Miwa et al., 2002). Na África, a infecção por H. pylori também é
comum, mas o câncer gástrico é relativamente incomum (Cheung & Delcore,
2001). Alguns relatos sumarizam que estudos epidemiológicos feitos na África
sugerem que a infecção por H. pylori nem sempre está diretamente correlacio-
nada com o risco para doença gastrintestinal, tal como úlcera péptica e câncer
gástrico (Miwa et al., 2002).
Dentre as várias citotoxinas ou proteínas citotóxicas derivadas do
H. pylori, a citotoxina gene A (cagA) e a citotoxina A vacuolada (vacA) são re-
conhecidas como fatores virulentos importantes para danos de células epiteliais
da mucosa gástrica (Atherton et al., 1997; Slater et al., 1999). Múltiplos estudos
têm demonstrado que a variedade cagA positiva está associada com altos níveis
de inflamação gástrica (Crabtree, 1996). Um estudo internacional identificou
uma forte associação entre o status cagA e os níveis de pepsinogênio, os quais
são marcadores de atrofia gástrica (Webb et al. 1999). Mais especificamente,
uma variedade bacteriana com o gene vacA de seqüência de sinal tipo s1 e de
seqüência do meio do gene tipo m1 é provavelmente mais virulenta, sendo fre-
qüentemente detectada em pacientes com úlcera péptica (De Gusmão et al.,
2000) ou câncer gástrico (Miehlke et al., 2000).
Estudos clínicos isolados com H. pylori no Japão têm demonstrado
possuir tanto cagA quanto vacA, assim como genes com vacA genótipo s1/m1
têm sido associados com apresentação de doença mais severa (Ito et al., 1997;
Maeda et al., 1998). Semelhante ao Japão, muitos estudos clínicos com varieda-
des de H. pylori em pacientes na Coréia são cagA positivos associados a vacA
genótipo s1/m1 (Kim et al., 1999). Um relato oriundo da Índia sugere que a
8
maioria de seus casos isolados é de seqüência de sinal tipo s1 e de seqüência do
meio do gene tipo m1, embora em torno de 35% fossem do subtipo m2 (Mukho-
paghyay et al., 2000). Em Taiwan, as variedades vacA s1a/m2 são significati-
vamente mais freqüentes que s1a/m1 (Wang et al., 1998; Lin et al., 2000). Há
aproximadamente 80% de variantes bacterianas de H. pylori na Ásia que possu-
em o subtipo s1c (Van Doorn et al., 1999). Estas diferenças no genótipo vacA
devem resultar num mais baixo risco de câncer gástrico, a despeito da alta pre-
valência de infecção por H. pylori em alguns países.
Variações no rigor das gastrites têm sido explicadas pela existência
de linhagens mais agressivas de H. pylori portadores dos genes cagA e vacA. De
acordo com este conceito, linhagens cagA e vacA positivas induzem ao maior
recrutamento de neutrófilos pelo aumento da produção da citocina inflamatória,
interleucina-8 (IL-8), e pelas células epiteliais gástricas. Os portadores dessas
linhagens teriam maior propensão ao desenvolvimento de úlcera péptica em uns,
e linfoma MALT, ou carcinoma gástrico, em outros, enquanto que aqueles com
gene vacA e cagA negativos permaneceriam apenas com gastrite (Mattos &
Goldenzon Filho, 1996).
9
2.2.2. Fatores Genéticos do Câncer Gástrico
CÂNCER DO TIPO
MAL DIFERENCIADO
C
ÉLULA
N
ORMAL
CÂNCER DO TIPO
BEM DIFERENCIADO
Instabilidade
Genética
Instabilidade
Genética
M
ETAPLASIA
I
NTESTINAL
Expressão (cripto)
Deleção gênica 2,2 kb
Mutação na p53
Mutação K-ras
Mutação APC
A
DENOMA
Mutação p53 e perda alélica
Expressão de 6,0 kb em c-met
Perda de hererozigose
em APC e p53
c-met 6,0 kb
Perda gênica de bcl-2
C
ÂNCER
P
RECOCE
Perda de caderina
Perda de heterozigose em 1q
Expressão de TGF-
Receptor de TGF-
alterado
Transcrição anormal de CD44
Perda de 18q
Perda de heterozigose em 1q
Receptor de TGF-
alterado
Transcrição anormal de CD44
C
ÂNCER
A
VANÇADO
Perda de heterozigose em 7q
Amplificação de K-sam e c-met
Redução em nm23
Perda de heterozigose em 7q
Amplificação de c-erb-2
Redução em nm23
M
ETÁSTASE
Fonte: “As duas vias genéticas do câncer gástrico (bem e mal diferenciados)”.
Adaptado por Tahara (1995a)
Dentre os vários oncogenes implicados no desenvolvimento e pro-
gressão do câncer gástrico um dos mais importantes é o c-met, o qual codifica o
receptor para o fator de crescimento de hepatócitos (HGF). Este gene está fre-
qüentemente amplificado no câncer gástrico, principalmente nas formas avança-
das, e em especial nos carcinomas cirróticos, ocorrendo boa correlação entre a
10
presença da amplificação, o estágio clínico, a presença de metástases e o prog-
nóstico. A amplificação deste gene é rara em outros cânceres gastrintestinais,
tais como os esofagianos e colo-retais (Tahara, 1995a).
Estudos recentes mostram que a interação entre células tumorais
que expressam quantidades aumentadas de c-met e HGF, produzidos por células
estromais ativadas, esta envolvida na morfogênese e progressão do câncer gás-
trico. Isto é, as células estromais ativadas por fatores de crescimento tumoral ou
interleucina-1 (IL-1) secretam HGF, que por sua vez promove o crescimento
das células tumorais. Naqueles clones celulares que mantêm a expressão de E-
caderina e -catenina, as células tumorais se organizarão em forma tubular, re-
sultando assim em adenocarcinoma bem diferenciado. Nos clones com redução
ou perda da expressão de E-caderina
ou -catenina, o HGF promove uma dis-
persão das células tumorais, levando assim a um adenocarcinoma pouco dife-
renciado, ou carcinoma cirrótico. Isto sugere que o HGF regula a adesão celular
no câncer gástrico por meio das caderinas e cateninas (Tahara et al., 1996).
Outros oncogenes relacionados com o câncer gástrico são: o gene k-
sam, o qual codifica o receptor para fator de crescimento de queratinócitos
(KGF), amplificado em cânceres pouco diferenciados e cirróticos; o gene c-erb-
2, amplificado nas formas bem diferenciadas e relacionado à presença de metás-
tases hepáticas; e o gene c-ki-ras
, mutado em alguns casos de câncer bem dife-
renciado (Tahara, 1995a; Tahara et al., 1996).
Além dos oncogenes, os cânceres gástricos podem expressar uma
grande variedade de fatores de crescimento, hormônios intestinais e citocinas,
tais como o fator de crescimento de transformação (TGF-), o fator de cres-
cimento epidérmico (EGF), cripto e anfirregulina
, encontrados em todos os tipos
de câncer gástrico. Outros fatores de crescimento, tais como TGF-D, fator de
crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento tipo insulina
(IGF-II) e fator de crescimento de fibroblastos (FGF-), apresentam freqüen-
11
temente expressão aumentada nos tipos pouco diferenciado e cirrótico (Tahara et
al., 1996).
2.2.2.1. Genes Supressores Tumorais e Moleculares de Adesão
Celular no Câncer Gástrico
O câncer gástrico mostra freqüentemente inativação de múltiplos
genes supressores, incluindo p53, APC e DCC. A perda de alelo e as mutações,
levando à inativação do gene supressor tumoral p53, são encontradas em mais
de 60% de todos os tumores gástricos, independente do tipo histológico, assim
como em 30% dos adenomas e em 10% das metaplasias intestinais. O gene p53
parece ser o principal alvo de mutações associadas com carcinógenos da dieta.
Alguns estudos mostram que a inativação de p53 é importante tanto para a car-
cinogênese quanto para a progressão tumoral dos cânceres gástricos. O espectro
de mutações encontrado no câncer gástrico é diferente daquele encontrado nos
cânceres esofagianos e colo-retais, indicando que os carcinógenos devem ser
diferentes (Nishisho et al., 1991; Nakatsuru et al., 1992). A perda de alelos e a
mutação do gene APC são freqüentemente associadas com adenocarcinoma bem
diferenciado. Mutação missense é dominante no câncer gástrico, enquanto muta-
ção non-sense ocorre no câncer colo-retal. Além disso, o gene APC está somati-
camente mutado em 25% dos adenomas gástricos e em 10% nos pólipos hiper-
plásticos (Tahara, 1995b). O gene supressor tumoral relacionado ao câncer gás-
trico é o APC (adenomatous polyposis coli). As mutações deste gene e a perda
de alelo são encontradas em mais de 50% dos adenocarcinomas bem diferencia-
dos e em 30% dos carcinomas com células em anel de sinete. Este gene não está
relacionado com adenocarcinomas pouco diferenciados.
Os tipos de mutação p53 e APC são bastante variáveis (Poremba et
al., 1995; Tahara et al., 1996).
12
A avaliação da expressão do p53 também pode ter um valor prediti-
vo na sensibilidade do câncer à quimioterapia. Um estudo mostrou que células
de adenocarcinomas gástricos e esofagianos, com boa resposta à quimioterapia,
exibem uma expressão aumentada da proteína p53 selvagem (não-mutada) após
o uso de drogas. Este aumento é necessário para o controle do crescimento do
câncer pela indução de apoptose. As células dos cânceres resistentes à quimiote-
rapia podem expressar ou não a proteína p53 mutada (Nabeya et al., 1995; Ha-
mada et al., 1996).
Moléculas que regulam a adesão celular, tais como E-caderina
, P-
caderina e -catenina, também podem funcionar como proteínas supressoras
tumorais. A expressão destas moléculas está significativamente diminuída nos
tipos pouco diferenciados e no câncer gástrico cirrótico, apoiando a teoria de
que a expressão reduzida de caderinas e cateninas esteja envolvida no desenvol-
vimento e invasão destes tipos de câncer gástrico (Tahara et al., 1996).
Também se observa perda de heterozigose dos genes DCC
e bcl-2
nos cânceres bem diferenciados. O cromossomo 1 parece conter genes supresso-
res tumorais, pois a perda de heterozigose de 1p (braço curto do cromossomo 1)
ocorre nos cânceres pouco diferenciados, e a de 1q (braço longo do cromossomo
1) nos bem diferenciados (Tahara, 1995a).
As ciclinas, as quinases dependentes de ciclina (CDK) e seus inibi-
dores regulam o crescimento, a diferenciação e a morte celular. Anormalidades
nestes reguladores do ciclo celular estão implicadas na patogênese de cânceres
gastrintestinais.
A maioria dos tecidos de carcinoma gástrico apresenta uma expres-
são aumentada de ciclina E
e de CDK, porém, quando o gene da ciclina E está
amplificado, existe um risco maior de metástases. Alterações semelhantes são
encontradas nos carcinomas colo-retais (Tahara, 1995b; Tahara et al., 1996).
13
As mutações somáticas nas seqüências de DNA, caracterizadas co-
mo microssatélites, são conseqüência de erros de replicação do DNA, decorren-
tes da instabilidade genética.
As alterações de microssatélites ocorrem em grande número de
cânceres gástricos, principalmente nos adenocarcinomas pouco diferenciados.
Estas alterações são mais freqüentes nos tumores múltiplos, indicando assim que
estas devem desempenhar um papel mais importante nestes casos do que nos
tumores solitários. Erros de replicação em várias seqüências de DNA ocorrem
em inúmeros cânceres primários múltiplos, sugerindo assim que mutações em
genes reparados tenham sido originadas em células germinativas (Tahara,
1995a; Nakashima et al., 1995; Tahara et al., 1996).
Além dos erros de replicação, a redução dos telômeros pode levar à
instabilidade cromossômica, à ativação da telomerase e, conseqüentemente, ao
câncer. A presença da telomerase parece ser crítica para a carcinogênese, ocor-
rendo precocemente, pois é necessária para a imortalidade celular, característica
das células neoplásicas. Observa-se redução de telômeros na metaplasia intesti-
nal, o que pode levar à instabilidade cromossômica e rearranjos, com implicação
no desenvolvimento do câncer e adenocarcinoma gástrico. A maioria das células
tumorais primárias e metastáticas exibe a atividade da enzima telomerase, en-
quanto que a mucosa gástrica normal é sempre telomerase negativa (Tahara,
1995b; Tahara et al., 1996).
Alterações em múltiplos genes e fatores celulares facilitam o de-
senvolvimento de metástases no câncer gástrico. Em geral, as formas bem dife-
renciadas mostram metástases hepáticas e as pouco diferenciadas, disseminação
peritoneal.
A molécula de adesão celular CD44 é importante para a interação
célula-célula. A expressão de formas variantes de CD44 é encontrada em vários
tipos de câncer, sendo identificada em todos os tecidos de câncer gástrico e em
14
suas metástases. O padrão de variantes de CD44 difere nos tipos de câncer gás-
trico, sugerindo assim que existem diferentes vias genéticas atuando.
O gene nm23
é um candidato a gene supressor de metástases, ocor-
rendo perda de heterozigose em 8% dos casos de câncer gástrico.
A expressão da lectina ligadora de lactosídeo de 31-kd (L-31) está
geralmente aumentada em tumores de cânceres gástricos bem diferenciados, su-
gerindo assim sua relação com estas metástases.
A invasão e disseminação peritoneal nos tipos indiferenciados pare-
ce necessitar não apenas das alterações nas moléculas de adesão celular, mas
também da perda de heterozigose do braço longo do cromossomo 7 (no locus
D7S95 de 7q). É possível que este locus contenha um gene supressor tumoral
importante para a progressão do câncer gástrico (Tahara, 1995a; Tahara et al.,
1996).
2.2.3. Fatores Ambientais
Desde a década de 1960 tem-se dado grande atenção ao papel da
dieta na gênese do câncer. Assim é que alterações ocorridas na incidência dos
cânceres de estômago, cólon, reto, bexiga, ovário e endométrio parecem ter sido
influenciadas por modificações nos padrões alimentares (Doll, 1992). Os nitra-
tos, presentes em muitos vegetais e na água potável, quando usados em altas do-
ses como conservantes podem provocar câncer de estômago (Tannenbaum et al.,
1979), bem como o sal e alimentos salgados (Tuyns, 1988).
Um grande interesse se concentra no papel da dieta que poderia
fornecer uma explicação plausível para as diferenças existentes entre países. Ar-
roz, frituras, produtos de grãos e condimentos picantes são vinculados às origens
do câncer gástrico. Vale ressaltar que um alto consumo de vegetais e frutas ricas
em vitamina C atuaria como protetor gástrico contra o câncer. Os compostos
nitrosaminas e nitrosamidas possuem capacidade carcinogênica. Os nitritos po-
15
dem estar agregados quando utilizados como preservativos à dieta, especialmen-
te de alimentos defumados, produtos de salsicharia, inclusive salsichas defuma-
das tipo Frankfurt (Castro & Arcuri, 1999).
O carcinoma gástrico está acompanhado, em 85-90% dos casos, de
hipocloridria, tendo sido demonstrado que esta pode preceder o câncer gástrico
por muitos anos. Postula-se que um pH intragástrico alto promova o crescimento
de bactérias que reduzem os nitratos da dieta a nitritos e, por conseguinte, serão
convertidas as aminas da dieta, na presença destes nitritos, nos compostos carci-
nogênicos N-nitroso (Hall et al., 1986).
Embora não esteja claro que a dieta seja agente causal do câncer
gástrico, tem sido demonstrado que sua alta incidência está correlacionada com
alta ingesta de sal e alto consumo de conservantes, alimentos salgados, condi-
mentos picantes, alimentos defumados e peixes, ou seja, alimentos que conte-
nham uma alta concentração de sal, nitratos e nitritos, e que podem agir como
irritantes gástricos. Os hidrocarbonatos aromáticos policíclicos nestes alimentos
podem ser carcinogênicos, e ambos os nitratos e nitritos podem ser convertidos
nos conhecidos carcinogênicos ativos: as nitrosaminas. O sal tem sido implicado
no desenvolvimento da gastrite atrófica crônica, pode aumentar a mutagenicida-
de de alimentos nitrosaminados e pode agir como um co-carcinógeno. Hoje em
dia, com a disponibilidade de uso comum de alimentos refrigerados, pode-se
reduzir a exposição a estes carcinógenos, tendo assim a refrigeração desempe-
nhado papel importante no declínio da incidência do câncer gástrico no mundo
(Cheung & Delcore, 2001).
Outros fatores dietéticos conhecidos aumentam o risco de câncer
gástrico, incluindo baixo teor de gordura, baixo consumo de proteínas e baixo
consumo de vitaminas A e C. Muitos estudos sugerem que dietas ricas em vege-
tais não cozidos, frutas frescas, fibras e vitaminas A e C estão associadas com
um baixo risco de desenvolvimento da doença. O ácido ascórbico e o -caroteno
16
encontrados em frutas frescas e vegetais agem como anti-oxidantes. Além do
mais, o ácido ascórbico pode prevenir a conversão de nitratos em N-nitrosami-
nas. O consumo de água contendo altas concentrações de nitratos ou H. pylori
tem sido mostrado como sendo um fator de risco para o câncer gástrico (Cheung
& Delcore, 2001).
Embora o tabagismo por cigarro tenha sido relatado como tendo
alto risco para câncer gástrico, o consumo de álcool não parece aumentar este
risco (Cheung & Delcore, 2001).
O risco de câncer gástrico está aumentado em pacientes com gastri-
te crônica associada à anemia perniciosa, embora este risco também pareça ter
sido demonstrado no passado. A anemia perniciosa é caracterizada por uma atro-
fia mucosa fúndica, perda de células parietais e células principais, hipocloridria
e hipergastrinemia. Isto ocorre em 3% da população idosa >60 anos. Para indi-
víduos nos quais anemia perniciosa tenha estado presente por mais de 5 anos, o
risco de câncer gástrico é duas vezes maior do que em indivíduos controles da
mesma idade. A Doença de Menetrier (gastrite hipertrófica gigante) está tam-
bém associada a um alto risco de câncer gástrico. Outras condições associadas a
alto risco incluem radiação de exposição prévia, ingestão de afla-toxina, antece-
dentes familiares, pessoas do grupo sangüíneo A (risco relativo: 1,2 comparado
com grupo sangüíneo O), certos tipos de ocupações profissionais e vírus Epstein
Barr (Cheung & Delcore, 2001). Os pólipos gástricos adenomatosos são mais
passíveis de degeneração maligna (Hope et al., 1998; Muraro, 2000) e a polipo-
se gástrica difusa tem alto potencial de malignização (Muraro, 2000).
3. Classificação do Câncer Gástrico
Em 1988, a União Internacional Contra o Câncer (UICC) e o Comi-
tê Americano Contra o Câncer (AJCC) propuseram a classificação TNM, onde:
17
T = Tumor Primário, dividindo-se em:
T
x
– Tumor primário que não pode ser avaliado;
T
0
– Tumor primário não evidenciado;
T
is
– Carcinoma in situ (tumor intraperitoneal sem
invasão de lâmina própria);
T
1
– Tumor invadindo a lâmina própria ou submucosa;
T
2
– Tumor invadindo a muscular própria ou submucosa;
T
3
– Tumor penetrando na serosa (peritônio visceral), mas
sem invasão de estruturas adjacentes;
T
4
– Tumor invadindo estruturas adjacentes.
N = Linfonodos Regionais, dividindo-se em:
N
x
– Linfonodo regional que não pode ser avaliado;
N
0
– Linfonodo regional sem metástases;
N
1
– 1-6 linfonodos regionais com metástases;
N
2
– 7-15 linfonodos regionais com metástases;
N
3
– >15 linfonodos regionais com metástases.
M = Metástases à Distância, dividindo-se em:
M
x
– Metástase à distância que não pode ser avaliada;
M
0
– Metástase à distância inexistente;
M
1
– Metástase à distância.
R = Resultado Cirúrgico, dividindo-se em:
R
0
– Tumor não residente;
R
1
– Tumor residente microscópico;
R
2
– Tumor residente macroscópico.
18
A classificação TNM se baseia em grau de penetração do tumor (T),
disseminação ganglionar (N) e presença ou não de metástases (M) (Cheung &
Delcore, 2001).
A Sociedade Japonesa para a Pesquisa do Câncer Gástrico, durante
o I Congresso Mundial de Câncer Gástrico, em Kyoto, em 1995, classificou os
linfonodos regionais de tal forma que o câncer gástrico poderia acomodar 16
grupos de coletores linfáticos. Estes seriam: os da arcada marginal das curvatu-
ras do estômago (N
1
), aqueles situados a mais de 3 cm da parede gástrica, como
os próximos dos pedículos hepáticos e lienais (N
2
) e aqueles ainda mais distan-
tes (N
3
). Estes últimos compreendem os coletores ao longo das artérias mesenté-
rica, cólica e aórtica (Japanese Research Society for Gastric Cancer – JRSGC,
1995; Muraro & Mantovani, 2000).
Sistema de Estadiamento Cirúrgico Japonês (JRSGC, 1995)
S
0
– Sem invasão da serosa;
S
1
– Suspeita de invasão da serosa;
S
2
– Invasão da serosa definida;
S
3
– Invasão de órgãos adjacentes.
N
1
– Linfonodos perigástricos comprometidos;
N
2
– Linfonodos comprometidos ao redor das artérias gástrica esquer-
da, hepática comum e esplênica, e tronco celíaco;
N
3
– Linfonodos comprometidos no ligamento hépato-duodenal, face
posterior do pâncreas e raiz do mesentério;
N
4
– Linfonodos comprometidos na cadeia para-aórtica e cólico média
P
0
– Sem metástases peritoneais;
P
1
– Metástases peritoneais adjacentes;
P
2
– Algumas metástases espalhadas pelo peritônio;
P
3
– Muitas metástases espalhadas pelo peritônio.
H
0
– Sem metástases hepáticas;
H
1
– Metástases hepáticas limitadas a um lobo;
H
2
– Algumas metástases hepáticas bilaterais;
H
3
– Numerosas metástases bilaterais.
19
3.1. Patologia
O câncer gástrico tem a seguinte distribuição topográfica: 40% dis-
tal (antro e piloro), 25% corporal e 35% proximal (fundo e cárdia).
Nos últimos 15 anos, tem sido observado um aumento na incidência
de tumores proximais, o que tem repercussão direta no prognóstico do paciente.
Os tumores proximais apresentam maiores índices de aneuploidia e comprome-
timento lifonodal.
Classificação Histopatológica de Láuren
I
NTESTINAL
Tumor diferenciado, com tendência à formação de glându-
las, tipicamente de áreas de metaplasia intestinal.
D
IFUSO
Exibe pouca coesão das células e tende a extender-se pela
submucosa e metastizar precocemente (Hospital das Clíni-
cas de Porto Alegre, 1997).
O tipo de neoplasia gástrica mais freqüente é o adenocarcinoma,
responsável por quase 95% de todos os tumores incidentes no estômago. Em
seguida, temos os linfomas com 3%, e os leiomiossarcomas com 2%. Outros
tumores como os carcinóides e os espinocelulares também podem ocorrer, em-
bora com certa raridade (Muir & Harvey, 1997).
3.2. Sintomatologia
Em muitos pacientes, o início da doença é caracterizado por des-
conforto epigástico, evidenciado por síndrome hipostêmica, com plenitude gás-
trica pós-prandial, além de eructações e flatulência. Náuseas e vômitos também
podem estar presentes com a evolução da neoplasia.
20
A hemorragia digestiva alta, em alguns casos, pode ser a primeira
manifestação da doença. Pode ser através da hematêmese e melena, vindo em
decorrência a anemia e em seguida o emagrecimento, que costuma ser o sintoma
mais encontrado. A perda de peso vai se pronunciando a ponto de deixar o doen-
te com astenia e adinamia. Na fase mais avançada da neoplasia, o doente apre-
senta-se caquético e muitas vezes com massa palpável localizada no cárdia, além
de sintomas de obstrução, principalmente disfagia (Muraro, 2000).
4. Tratamento
O tratamento do câncer gástrico é cirúrgico. Na maioria das vezes,
precedido de preparo pré-operatório adequado, onde se deve avaliar, caso neces-
sário, a melhora das condições gerais do paciente. A cirurgia radical é aquela
que oferece possibilidade de cura, ainda assim, é limitada pela extensão da do-
ença na parede gástrica e pelo comprometimento dos linfonodos (Grey et al.,
1986). Atualmente, considerando a maior morbi-mortalidade da gastrectomia
total em relação à gastrectomia subtotal, a ressecção de todo o estômago é reser-
vada apenas para os tumores de corpo e de fundo gástricos. Para os tumores de
antro, utiliza-se mais freqüentemente a ressecção subtotal. No caso de tumores
de fundo, deve-se ressecar um segmento do esôfago distal (Muraro, 2000).
A cirurgia curativa esta contra-indicada em pacientes cuja ocorrên-
cia de seja <
60%, pois esta envolve uma larga excisão do tumor, com margem
de 5 cm e ressecção de linfonodos a 3 cm do mesmo (ressecção D
1
). Para tumo-
res dos 2/3 distais, a gastrectomia parcial pode ser suficiente, mas, se mais pro-
ximal, a gastrectomia total pode ser necessária. A remoção de linfonodos distan-
tes (ressecção D
2
) parece melhorar a sobrevida entre os Japoneses, mas não entre
os Europeus.
21
A paliação é freqüentemente necessária para resolver a obstrução,
minorar a dor e cessar a hemorragia, e envolve judicioso uso de drogas, cirurgia
e radioterapia.
A sobrevida de cinco anos é menor que 10%, mas muito melhor
para o carcinoma gástrico precoce que está confinado à mucosa e submucosa
(Hope et al., 1998).
Em pacientes portadores de tumor avançado, com metástases à dis-
tância ou carcinomatose peritoneal, o tratamento cirúrgico tem finalidade apenas
paliativa. Estes são pacientes com prognóstico bastante restrito, cuja sobrevida
média sem tratamento é de aproximadamente quatro meses. A estes pacientes,
portanto, devem ser oferecidas outras alternativas terapêuticas com o intuito de
prolongar e melhorar sua qualidade de vida.
Em função da indisponibilidade de novas opções terapêuticas para o
tratamento do câncer gástrico, a cirurgia, como mencionado acima, continua
sendo o tratamento preferencial para este tipo de neoplasia, sendo aquele que
oferece maiores possibilidades de cura. Ao longo do tempo, desde a descrição
das gastrectomias por Billroth nos meados do século XIX, procedimentos radi-
cais tais como a gastrectomia, a epiplectomia e o esvaziamento das cadeias regi-
onais, têm se mostrado eficientes nos casos iniciais, principalmente na experiên-
cia Japonesa (Noguchi et al., 1989).
A abordagem exclusivamente cirúrgica do câncer gástrico prevale-
ceu por quase um século. Somente em 1984, no estudo da Mayo Clinic, foi de-
monstrado um aumento do controle local com o uso de radioterapia e 5-fluoura-
cil (5-FU) pós-cirurgia (Moertel et al., 1984).
Embora o câncer de estômago seja considerado uma neoplasia até
certo ponto sensível à quimioterapia, os esquemas terapêuticos atuais têm limi-
tada aplicabilidade e respostas insuficientes. Portanto, a quimioterapia tem se
mostrado ineficaz na tentativa de aumentar a sobrevida dos portadores desse tipo
22
de tumor, possivelmente devido à sua resistência às drogas antineoplásicas
(Hermans et al., 1993).
A radioterapia como método opcional de tratamento do tumor gás-
trico foi introduzida por Takasuda em 1978. As demais terapêuticas acima cita-
das mostraram-se também ineficientes em aumentar a sobrevida de pacientes
portadores dessas neoplasias gástricas quando usadas isoladamente ou associa-
das à cirurgia (Hallissey et al., 1994). O emprego da radioterapia adjuvante à
cirurgia associado à quimioterapia tem apresentado resultados encorajadores. Há
também estudos em andamento da combinação de radioterapia associada à poli-
quimioterapia com 5-FU, adriamicina e mitomicina C (Dubois, 1997).
5. Modelo Experimental
5.1. Generalidades
Um dos principais obstáculos enfrentados pelos pesquisadores que
vêm tentando estudar os efeitos dessa associação terapêutica em tumores gástri-
cos é a disponibilidade de um modelo experimental adequado. O desenvolvi-
mento de tumores experimentais gástricos a partir de carcinógenos químicos tem
se mostrado pouco prático em função da demora e do crescimento errático des-
tas neoplasias (Ray et al., 1961; Bragheto, 1984). Outros modelos descritos na
literatura não reproduzem a biologia do tumor gástrico, pois são implantados na
camada serosa (Ackerman, 1970). Assim, para se estabelecer experimentalmente
a eficácia de novos fármacos e esquemas terapêuticos, necessitar-se-ia de um
modelo animal com elevado índice de pega, que facilitasse o manuseio nos tes-
tes laboratoriais e que apresentasse um comportamento biológico semelhante ao
do tumor gástrico espontâneo. O carcinossarcoma 256 de Walker, descrito por
Earle em 1935, por suas características, parece ser o ideal para os objetivos pro-
postos. Trata-se de um tumor bem caracterizado, facilmente mantido em labora-
23
tório, de crescimento rápido e uniforme, que raramente apresenta regressão es-
pontânea, sendo de comprovada eficácia em testes laboratoriais (Moraes Filho,
1981). Baseados nestas características, desenvolveu-se um modelo experimental
de tumor gástrico (Oliveira et al., 1995) que foi utilizado nestes experimentos.
5.2. O Carcinossarcoma 256 de Walker
O tumor original foi descoberto em 1928 quando George Walker,
em seu laboratório na Escola de Medicina da Universidade Johns Hopkins, ob-
servou uma massa tumoral situada na glândula mamária de uma rata albina pre-
nha, a qual, segundo descrição própria, regredia durante o período de lactação e
logo após voltava a recrudescer. A histopatologia revelou um adenocarcinoma, e
sua transplantabilidade foi comprovada pelo próprio Walker com um índice de
aproximadamente 56% de pega em 16 ratos albinos (Earle, 1935).
Walker & Earle, em 1935, descreveram macroscopicamente a neo-
plasia como uma massa tumoral aproximadamente do tamanho de uma noz, lo-
calizada na região abdominal esquerda, aparentemente originada da mama, de
tecido firme, granular, róseo acinzentado, com pequenos focos de necrose e
pouco estroma.
Microscopicamente, mostrou-se como estrutura tipicamente carci-
nomatosa, com estroma constituído de tecido conjuntivo frouxo, às vezes inva-
dido por epitélio glandular. As células principais apresentaram forma poligonal
ou arredondada, com núcleos volumosos, arredondados ou ovalados.
Na segunda geração, desorganizou-se a estrutura glandular e as cé-
lulas epiteliais, embora conservando as mesmas peculiaridades do tumor origi-
nal, cujas células achavam-se rodeadas de fibras e células do estroma. Estas úl-
timas apresentavam dois tipos diversos: um de tamanho pequeno, alongado e
com núcleo densamente corado, e outro bem mais volumoso, alongado e com
núcleo fracamente corado (Earle, 1935).
24
Após sucessivos transplantes, a neoplasia apresentou variações
morfológicas (Earle, 1935; Schrek & Avery, 1937; Talalay et al., 1952; Stewart
et al., 1959; Fisher & Fisher, 1964). O tumor foi então caracterizado nas formas
carcinomatosa, sarcomatosa e mista, e carcinossarcomatosa.
5.3. Características Histopatológicas do Tumor
Em uma revisão geral dos trabalhos publicados sobre o tema, Ste-
wart e cols. (1959) e Fisher & Fisher (1961) descreveram três tipos de células do
tumor de Walker. Uma célula característica da variante carcinomatosa apresen-
tando forma poligonal ou arredondada, núcleo volumoso, esferóide ou ovóide e
membrana nuclear de contorno nítido com grânulos de cromatina condensados
em sua periferia e nucléolo proeminente. A célula de padrão sarcomatoso é ge-
ralmente fusiforme e suas características são semelhantes as dos fibroblastos ne-
oplásicos. Um terceiro tipo, indiferenciada, pequena e densamente corada, apre-
senta forma arredondada, poligonal ou alongada, com citoplasma escasso e nú-
cleo de cromatina grumosa, intensamente corado, ocorrendo isoladamente ou em
grupos, e encontrada freqüentemente entre as células de padrão carcinomatoso.
Iwana de Mattos & Franco (1971), pesquisando ratos Wistar inocu-
lados por via intramuscular com o carcinossarcoma 256 de Walker, chamaram a
atenção para a freqüência com que observaram matástase nos rins, supra-renais,
coração e gânglios linfáticos. Em outro trabalho, Iwana de Mattos e cols. (1980)
constataram envolvimento tumoral do tipo infiltrativo nos rins (53%), baço
(50%), pulmões (46,5%), fígado (45%) supra-renais (10,3%), medula óssea
(44,8%), sangue circulante (55,2%), e ocasionalmente no coração (5%) e língua
(1,6%).
25
5.4. Transplantabilidade do Tumor
O tumor de Walker pode ser perpetuado através das mais variadas
técnicas. Walker realizou pela primeira vez o transplante usando fragmentos do
tecido tumoral. Posteriormente, Earle (1935), Schrek (1935) e Agostino (1968)
inocularam suspensões de células tumorais, obtidas da forma sólida do tumor,
por via intramuscular, e conseguiram o desenvolvimento tumoral no local da
inoculação. Outras formas de transplante, tais como a inoculação de células tu-
morais mantidas em cultura in vitro (Earle, 1935; Leighton et al., 1967) ou a i-
noculação de suspensão de células da forma ascítica do tumor (Agostino, 1968),
também podem ser usadas. As diversas vias utilizadas para a inoculação se mos-
traram eficazes: subcutânea (Earle, 1935; Schrek, 1935; Talalay et al., 1952; Fi-
sher & Fisher, 1961; Fonteles et al., 1966; Jensen & Muntzing, 1970), intramus-
cular (Earle, 1935; Schrek, 1935; Talalay et al., 1952; Iwana de Mattos & Fran-
co, 1971; Sampaio & Oliveira, 1975; Fonteles et al., 1978; Moraes Filho et al.,
1980), intraperitoneal (Agostino, 1968; Iwana de Mattos & Franco, 1971), intra-
pleural (Iwana de Mattos & Franco, 1971) e sangüínea (Talalay et al., 1952;
Agostino et al., 1961; Fisher & Fisher, 1965). Após estudo dos diferentes locais
de inoculação intramuscular, Iwana de Mattos & Franco (1971) concluíram que
o músculo da coxa era o local ideal para o transplante do tumor devido à sua me-
lhor vascularizacão e ao crescimento uniforme e simétrico do tumor.
O uso do carcinossarcoma 256 de Walker como modelo experimen-
tal para estudo da biologia tumoral despertou o interesse de vários pesquisadores
para o esclarecimento de suas peculiaridades. Schrek (1935) verificou que o
crescimento tumoral e o tempo decorrido entre a sua inoculação e o aparecimen-
to do tumor estavam diretamente proporcionais ao número de células injetadas
por via intramuscular.
26
O sexo também pode influenciar o crescimento tumoral. Caldarola e
cols. (1968) citaram em seu trabalho que o tumor se desenvolvia melhor em ra-
tos machos do que em fêmeas, relacionando o fato à influência hormonal.
Embora tenha sido constatado o bom desenvolvimento do tumor em
várias linhagens de ratos (Earle, 1935; Talalay et al., 1952; Fisher & Fisher,
1961), Jensen & Muntzing (1970) relataram um melhor crescimento em animais
da linhagem Sprague-Dawley do que nos da linhagem Wistar. Em contrapartida,
observações feitas por Fonteles e cols. (1979) e Moraes Filho e cols. (1980)
mostraram que o índice de pega em ratos Wistar inoculados por via intramuscu-
lar com 10
6
células era de 100%.
Constitui-se também significante o fator idade em relação ao cres-
cimento tumoral, que é mais lento em animais muito jovens ou muito idosos
(Katona, 1972). Oliveira Filho e cols. (1997) obtiveram excelentes resultados
com animais inoculados entre 70 e 80 dias de nascido.
Baseados nos estudos exaustivos da biologia do tumor de Walker, e
principalmente nos achados anteriormente descritos por Bröyn (1974), levou-se
a inferir que o tumor de Walker também poderia ser inoculado, através da muco-
sa gástrica, na junção esôfago-gástrica, corpo do estômago e pequena curvatura,
o que permitiu o desenvolvimento do modelo de tumor gástrico usado nesse tra-
balho (Oliveira et al., 1995).
5.5. Características Gerais do Consumo Energético dos Tumores Sólidos
Devido à necessidade de geração de energia por parte dos tumores sóli-
dos, o catabolismo da glicose aumenta, enquanto que a síntese de glicose dimi-
nui. Há maior consumo de glicose na superfície de tumores sólidos, com níveis
elevados de hexoquinase e níveis reduzidos de glicose-6-fosfatase (utilização em
PET – tomografia por emissão de pósitrons). O alto grau de glicólise no tumor é
feito, em geral, por meio de metabolismo aeróbico. No núcleo dos tumores sóli-
27
dos, onde há áreas de hipóxia, ocorre glicólise anaeróbica, com produção de al-
tas taxas de ácido lático, advindas da transformação de piruvato pela enzima
LDH, a qual se encontra elevada no sangue de pacientes oncológicos. Há hipóte-
ses de que fatores de transcrição como c-myc e HIF-I (fator induzido por hipó-
xia) ligam-se ao promotor do gene LHD-A, aumentando assim a síntese de iso-
enzimas LDH-específicas, as quais ativam a glicólise anaeróbica. As fosfatases
também apresentam-se elevadas por estarem envolvidas na síntese de glicogê-
nio, além de participarem da sinalização celular, desfosforilando proteínas en-
volvidas na regulação do ciclo celular. Como no câncer não existe um fenótipo
universal, nem todos os tumores apresentam as mesmas alterações enzimáticas,
estas não podem ser consideradas exclusivas da condição neoplásica, já que in-
tensa atividade metabólica pode ocorre em infecções e no pós-trauma (Castro,
2005).
6. Hipertermia
6.1. Histórico
A elevação de apenas alguns graus na temperatura tecidual pode
trazer profundas alterações no funcionamento da célula e do organismo como
um todo. O conhecimento sobre o aquecimento de tumores é tão antigo quanto
os textos escritos sobre medicina. Assim, nos papiros cirúrgicos de Edwin Smith
que remontam há mais de 5.000 anos, e que se encontram, provavelmente, entre
os primeiros escritos médicos, faz-se a descrição de uma paciente com um tumor
de mama tratada com o calor (Overgaard, 1985). Semelhantes procedimentos
têm sido relatados em muitos outros registros históricos. Entretanto, os primei-
ros ensinamentos práticos sobre o uso da hipertermia só foram realmente inicia-
dos por Hipócrates, o qual recomendava a seus discípulos o uso desse tipo de
tratamento para os tumores malignos (Seegenschmiedt & Vernon, 1995).
28
Posteriormente, esse tipo de terapêutica caiu no desuso. Somente no
final do século XIX o fato foi redescoberto quando observou-se que pacientes
portadores de tumores malignos que tinham febre ocasionada por infecções bac-
terianas às vezes apresentavam diminuição do tamanho do tumor e ocasional-
mente até regressão total. Baseado nessas observações, Coley-Nauts e cols.
(1953) deliberadamente induziram febre em pacientes portadores de neoplasias
malignas, usando toxinas bacterianas pirogênicas, e observaram algumas respos-
tas parciais (Coley-Nauts et al., 1953).
Mais recentemente, Crile (1963) apontou novos rumos para o mo-
derno estudo quantitativo dos efeitos da hipertermia no câncer. Posteriormente,
outros investigadores vêm relatando resultados encorajadores sobre o uso de no-
vas técnicas de indução de hipertermia no tratamento de pacientes portadores de
diversos tipos de neoplasias (Hill & Hunt, 1987; Oleson et al., 1988; Fujimura,
1990; Fujimoto & Takahashi, 1992; Sugarbaker, 1995).
6.2. Fatores Básicos da Morte Celular por Hipertermia
6.2.1. Efeito Citotóxico da Hipertermia
Quando uma cultura de células cresce exponencialmente (e.g., célu-
las ovarianas de hamsters chineses (CHO)) e são expostas a uma temperatura
entre 41 e 47ºC, uma curva dose-efeito pode ser definida pelo planejamento da
taxa de morte celular contra a duração da hipertermia. A curva de sobrevida cor-
respondente mostra um típico limiar, o qual reflete os dois passos do processo de
morte celular. Isto é marcado por uma interrupção do crescimento linear no iní-
cio da exposição ao calor, que é seguido pela morte celular exponencial. Uma
observação fundamental é que a capacidade para induzir morte celular a tempe-
raturas <42-43ºC (abaixo de um certo ponto de interrupção (breakpoint)) é acen-
tuadamente menor que acima de 43ºC. Portanto, uma definição comum de dose
térmica (D) obtida a partir de uma exposição num determinado tempo (t) a uma
29
determinada temperatura (T) é de D = tR
T = 43
, com R = 2 para temperaturas
>
43ºC e R = 4 para temperaturas <43ºC, ou, nos casos de variação de T, uma
somação de fração da dose e duração (t + T).
A dose térmica requerida para induzir morte celular hipertérmica
varia de acordo com o fator 10 entre diferentes tipos de linhagem celular. Con-
tudo, há uma variação particular da dose térmica na curva de sobrevida desde o
início da fase exponencial. A dose de energia térmica requerida para induzir
morte celular exponencial está intimamente relacionada àquela que é requerida
para a desnaturação de proteínas celulares, sendo a quantidade in vitro de 140
kcal/mol, assim como em tumores experimentais. Isto leva à hipótese de que o
efeito citotóxico da hipertermia esta principalmente baseado na desnaturação de
proteínas membranares e citoplasmáticas, embora a correspondência de relação
não tenha sido elaborada para fenômenos sensíveis à radiação e/ou a drogas ci-
tostáticas (Westra & Dewey, 1971; Dewey et al., 1977a; Gerner, 1985; Sapareto,
1987).
6.2.2. Morte Celular por Hipertermia em Diferentes Fases do Ciclo
Celular
Culturas de células sincronizadas exibem variação em sua suscepti-
bilidade ao calor de acordo com sua fase no ciclo celular. Em geral, a mais alta
sensibilidade ao calor pode ser observada durante a fase mitótica. O exame mi-
croscópico das células na fase M sujeitas à hipertermia mostrou dano em seu
aparelho mitótico, levando a uma ineficiente mitose e conseqüente poliploidia.
As células na fase S são também sensíveis à hipertermia, onde danos cromosso-
mais são observados. As células nas fases S e M sofrem “um lento modo de
morte celular” após a hipertermia, enquanto que aquelas expostas ao calor du-
rante a fase G1 são relativamente resistentes e não mostram nenhum dano mi-
croscópico. As células durante a fase G1 podem seguir “um rápido modo de
30
morte celular” imediatamente após a hipertermia. Estas variações existem entre
as diferentes fases do ciclo celular indicando a possível diversidade de meca-
nismos moleculares de morte celular que se segue à hipertermia (Westra & De-
wey, 1971; Coss et al., 1982; Vidair & Dewey, 1988).
6.2.3. Termotolerância como um Antagonismo de Morte Celular
por Hipertermia
Células malignas expostas a temperaturas <43ºC, ou resfriadas a
37ºC, entre dois tratamentos de choque térmico >43ºC, mostram um prejuízo na
sua susceptibilidade citotóxica induzida pelo calor, o qual resulta no aplanamen-
to de inativação da curva. Este fenômeno de termotolerância é essencialmente
reversível, e de origem multifatorial, não sendo herdado em cultura de células. É
um fenômeno parcialmente baseado na indução de proteínas de choque térmico
(HSP) e outros processos de adaptação pós-transição (e.g., ciclo celular, parada
na fase G2 do ciclo, mudanças no metabolismo celular). A capacidade para ex-
pressar tolerância térmica deve ser atenuada sob algumas condições ambientais
(e.g., redução inesperada do pH intracelular) e pode também ocorrer junto com
alguma forma adquirida, ou herdada, de resistência à droga (Chin et al., 1990;
Wachsberger et al., 1997).
6.3. Fatores Especiais da Hipertermia in vivo
6.3.1. Indução de Alterações no Fluxo Sangüíneo e Microambiente
Tumorais por Hipertermia >42ºC
O microambiente de tumores malignos é caracterizado pela redução
do fluxo sangüíneo e pela densidade dos vasos que favorecem a hipóxia, a aci-
dose e a necessidade energética. A hipertermia em temperaturas >42ºC, além de
seus efeitos citotóxicos, tem demonstrado diminuir o fluxo sangüíneo tumoral
em estudos fundamentais realizados nas décadas de 1970 e 1980, prejudicando
31
assim o oxigênio e o suprimento de nutrientes e induzindo a acidose. A dose
térmica necessária para alterar o suprimento sangüíneo tumoral varia entre tu-
mores individuais e seus diferentes tipos. Isto parece, na maioria das vezes, de-
pender da percentagem de vasos responsivos que têm mantido sua capacidade de
regulação térmica. Além do mais, o dano induzido pelo calor na vascularização
tumoral pode ocorrer em temperaturas que podem alterar, mas não danificar, a
vascularização do tecido normal. Em alguns casos, mudanças de microcircula-
ção induzidas pela hipertermia foram relatadas como irreversíveis, e em outros,
colapsos da circulação foram evidenciados mesmo após o término da exposição
ao calor. Extraordinário, a considerável não homogeneidade do suprimento san-
güíneo dentro do mesmo tumor persiste após tratamento com temperatura
>42ºC. As mudanças morfológicas associadas com hipertermia incluem edema
endotelial, mudança do fluido plasmático intestinal, microtrombose devido à
ativação da homeostase, e mudanças da viscosidade de membranas celulares do
sangue. Todos estes fatores também promovem a redução do oxigênio e do su-
primento de nutrientes, tanto quanto a acidose intratumoral (Von Ardenne &
Reitnauer, 1982; Folkman, 1990).
Os efeitos da hipertermia isolada ou em combinação com outros
agentes in vivo têm sido estudados em roedores, grandes animais e humanos.
Muitas variáveis podem influenciar os efeitos da hipertermia in vivo (Urano et
al., 1980). O mais importante, a circulação sangüínea, que é um mecanismo para
o transporte de calor, afeta a temperatura do corpo, produzindo assim o aqueci-
mento nos tecidos por alguns meios (Jain & Ward-Hartley, 1984). A quantidade
e a dependência do fluxo sangüíneo da temperatura influenciam intrinsecamente
na distribuição de nutrientes às células e no status metabólico e no pH (Streffer,
1985).
Os vasos do tumor assemelham-se a capilares porosos e a sinusói-
des venosos sem a musculatura vascular lisa, a qual permite vasoatividade nor-
32
mal, tal como indução térmica da vasodilatação (Reinhold & Endrich, 1986). A
estase do fluxo sangüíneo e a destruição vascular podem ocorrer na microcircu-
lação do tumor sob condições que somente produzam mudanças reativas rever-
síveis em tecidos normais, criando assim uma das mais importantes e racionais
vantagens de efeitos diferenciais da hipertermia entre tumores e tecidos normais.
Áreas de baixa perfusão sangüínea tumoral podem atingir, preferencialmente,
temperaturas mais elevadas do que em tecidos normais, aumentando assim os
efeitos diferenciais do calor.
6.3.2. A Hipertermia “Moderada” Aumenta o Fluxo Sangüíneo
Tumoral
Ao contrário dos estudos mais recentes sobre mudanças microambi-
entais em tumores tratados com hipertermia “convencional” (>42ºC), a hiper-
termia “moderada” (<42ºC), que é muito mais fácil de ser aplicada in vivo e ofe-
rece uma melhor comparação para situações clínicas, tem demonstrado melhorar
o fluxo sangüíneo tumoral e desta maneira satisfazer a necessidade de oxigênio.
Deste modo, isto pode aumentar a efetividade da radioterapia (que é mais efetiva
em tumores com mais alto suprimento de oxigênio) assim como da quimiotera-
pia (cuja distribuição pode ser favorecida pelo aumento do fluxo sangüíneo tu-
moral). Além disso, esta hipótese daria uma boa explanação para a correlação de
dose térmica e resultado clínico, como foi observado em ensaios clínicos sobre
hipertermia local/regional, onde as temperaturas intratumorais não excediam
42ºC durante a maior parte do tempo de tratamento. Contudo, a situação em pa-
cientes com câncer parece ser muito mais complexa do que em sistemas experi-
mentais, e o comportamento da vascularização tumoral, sob condições hipertér-
micas, pode também depender do método de aplicação da hipertermia, contanto
que a efetividade clínica de certas aplicações hipertérmicas seja realmente base-
ada no insucesso da vascularização tumoral, o que pode ser útil no futuro tendo
33
em vista combinar este efeito com outros agentes anti-angiogênicos (alguns dos
quais têm sido recentemente introduzidos dentro da terapia anticâncer).
Se na visão de outros investigadores a hipertermia age por incre-
mento do suprimento sangüíneo tumoral, uma possível conseqüência seria com-
binar a hipertermia com drogas antineoplásicas ( radiação) em tumores com
baixo suprimento sangüíneo que não foram tratados adequadamente por modali-
dades convencionais de tratamento e sofreram recorrência do tumor (e.g., recor-
rência local de câncer cervical pré-irradiado, recorrência de câncer retal ou reci-
diva de câncer mamário). Ainda há um número mínimo de incertezas acerca do
efeito da hipertermia sobre o fluxo sangüíneo tumoral e, portanto, mais investi-
gações se fazem necessárias nesta área (Vaupel et al., 1989; Folkman, 1990; I-
wata et al., 1996; Song et al., 1997).
6.4. Efeito Sinérgico da Hipertermia e Radiação
6.4.1. Radiossensibilização Térmica
Uma das mais importantes observações em estudos in vitro sobre a
ação do calor foi que a hipertermia e a radiação agem em sinergia. Este siner-
gismo induz a um aumento na morte celular mesmo em baixas temperaturas.
Isto ocorre de maneira mais pronunciada na fase S, onde as células são usual-
mente resistentes à radiação isolada. A extensão da radiossensibilização térmica
pode ser quantificada pelo quociente da fração de sobrevida de células tratadas
com radiação isolada e aquelas tratadas com radiação associada ao calor (razão
de aumento térmico (RAT)) (Westra & Dewey, 1971; Kim et al., 1976; Schlag
& Lucke-Huhle, 1976; Dewey et al., 1977b; Dewhirst et al., 1980; Dewey,
1994).
34
6.4.2. Seqüência Radiação-Calor
A extensão do sinergismo entre calor e radiação depende da tempe-
ratura aplicada, do intervalo de tempo entre calor e radiação, e da seqüência do
tratamento. Isto é mais distinto quando ambas as modalidades são aplicadas de
maneira sincronizada. In vitro, um efeito supra-aditivo de calor e radiação pode
ocorrer por 8 horas (ou período de tempo mais longo) quando células CHO são
tratadas numa temperatura >43ºC antes da radiação. Usando uma seqüência in-
versa, um efeito similar é freqüentemente observado por um curto período de
tempo (2-4 horas), mas este efeito também é visto em temperaturas <42ºC. Um
efeito sinérgico de calor e radiação também pode ser observado em células ter-
motolerantes quando uma dose isolada de radiação de 2-4 Gy é aplicada; mas
este efeito pode ser alterado dependendo do tipo de célula e do seu grau de tole-
rância. Células sob hipóxia, assim como células com suprimento de nutrientes
deficiente e/ou pH ácido, têm demonstrado reagir muito sensivelmente ao trata-
mento combinado de calor e radiação (Westra & Dewey, 1971; Kim et al., 1976;
Dewey et al., 1977a; Mills & Meyn, 1983; Streffer et al., 1984; Dewey, 1994).
Aplicações sincronizadas de calor e radiação não são ainda possí-
veis na prática clínica, mesmo que os respectivos aparelhos já tenham sido dese-
nhados e estejam sob avaliação. Uma vez que instruções claras sobre uma ótima
seqüência radiação-calor não podem ser derivadas a partir de dados experimen-
tais, a recomendação geral e a prática diária atuais são devido a estas razões, on-
de calor e radiação têm que ser aplicados dentro de um pequeno espaço de tem-
po. Alguns investigadores preferem um intervalo de tempo de 2-4 horas entre
radiação e calor para aumentar a razão terapêutica. Outras aplicações de calor
antes da irradiação podem ser vantajosas devido à prevenção da estase vascular,
mas com possibilidade de promover radioresistência. Outro aspecto importante é
que algumas frações de radioterapia antes do primeiro curso de hipertermia po-
dem ser benéficas por razões radiobiológicas. Contudo, todas estas estratégias
35
não estão comprovadas por dados clínicos, e pelo menos a ótima seqüência radi-
ação-calor na clínica hipertérmica carece de clarividência (Hildebrandt et al.,
2002).
6.5. Interação entre Hipertermia e Drogas
6.5.1. Quimiossensibilização Térmica
Análoga à radiossensibilização térmica, a hipertermia também au-
menta a citotoxicidade de vários agentes antineoplásicos (quimiossensibilização
térmica). Aplicações adicionais de drogas quimioterápicas específicas têm de-
monstrado aumentar a inibição do crescimento de clones genéticos celulares em
elevadas temperaturas, tanto in vitro como in vivo. A extensão da quimiossensi-
bilização térmica das drogas também pode ser expressa pela RAT, que basica-
mente é a razão de sobrevida da célula exposta a elevadas temperaturas a uma
temperatura normal para um certo nível de droga. Isto representa principalmente
os fatores farmacodinâmicos da interação droga-calor (e.g., mudanças da cinéti-
ca do modo primário de ação da droga), mas, além da atenção, deve-se enfatizar
a farmacocinética clínica e a modulação de para-efeitos. Em hipertermia, intera-
ções adicionais entre drogas e altas temperaturas têm sido descritas. Por exem-
plo, como algumas drogas perdem sua estabilidade química em altas temperatu-
ras, ou como tornam-se prejudiciais em contato com o vidro ou plástico. Isto
também tem que ser considerado, uma vez que solventes ou aditivos podem in-
teragir com o calor e então induzir tanto termotolerância como termossensibili-
zação (Hahn, 1982; Bull, 1984; Dahl, 1988).
6.5.2. Diferentes Modos de Interação Droga-Calor
A interação do calor com drogas quimioterápicas tem sido classifi-
cada por termos como aditivo ou superaditivo (aumento linear com o aumento
da temperatura), limiar de comportamento (pouco ou nenhum aumento da cito-
36
toxicidade em baixas temperaturas, ou acentuado aumento com distinto limiar
de temperatura) ou “independente” (Hahn, 1982; Bull, 1984).
É geralmente aceito que muitos agentes alcalinos (e.g., ciclofosfa-
mida e ifosfamida) e compostos platinum aumentam linearmente seus efeitos
citotóxicos quando temperaturas são elevadas a partir de 37ºC até acima de
40,5ºC. A doxorubicina, ao contrário, possui um limiar de temperatura, enquanto
que muitos antimetabólitos (e.g., 5-fluorouracil), assim como os alcalóides da
vinca e taxanos, não mostram dependência à hipertermia. Além disso, um de-
terminado grupo de drogas (chamadas termossensíveis) age no caminho citotó-
xico somente em elevadas temperaturas. Algumas drogas bem conhecidas, como
é o caso do anestésico local lidocaína, ou do antifúngico anfotericina B, têm
demonstrado agir como drogas termossensíveis (Bull, 1984; Dahl, 1988; Issels,
1999).
Revisões de dados publicados na literatura sobre a interação droga-
calor fazem voltar a atenção para discussões controversas sobre os achados do
modo de interação de várias drogas e o calor, principalmente porque dados sobre
a quimiossensibilização térmica freqüentemente referem-se a estudos in vitro
nos quais a temperatura >43ºC foi a utilizada e, portanto, não podem ser utiliza-
dos na hipertermia clínica. Além disso, tumores experimentais variam em sua
susceptibilidade a certos agentes citostáticos (tanto em temperatura ambiente a
37ºC, quanto em elevadas temperaturas). Além do mais, é fato conhecido que
drogas mais efetivas em temperaturas normais não têm necessariamente alta ca-
pacidade de sensibilização em temperaturas mais altas. Indo mais além, a exten-
são da quimiossensibilização térmica de uma droga em um dado sistema expe-
rimental varia entre diferentes modos de administração e dosagem. É interessan-
te notar que certos modos de aquecimento podem promover termotolerância
e/ou resistência à droga, e que mais aspectos farmacocinéticos não podem ser
simulados em modelos experimentais. Pelo menos, a perda de demonstração da
37
quimiossensibilização térmica pode ser devido a um inadequado intervalo entre
a administração da droga e a exposição ao calor para vários agentes (Hahn,
1982; Dahl, 1988; Urano et al., 1999).
6.5.3. Seqüência Droga-Calor
Dados disponíveis na literatura sugerem que a quimiossensibilidade
térmica pode ter melhor rendimento pela administração sincronizada dentro de
um pequeno intervalo de tempo para muitas drogas, mas deve haver algumas
exceções. As oxacefalosporinas, ciclofosfamida e ifosfamida, por exemplo, so-
frem um extensivo metabolismo hepático e, portanto, devem ser aplicadas algu-
mas horas antes da hipertermia. Ao contrário, resultados clínicos favoráveis têm
também sido alcançados por aplicação da hipertermia regional em conjugação
com ifosfamida dentro de um pequeno intervalo de tempo (Issels et al., 1990;
Wiedemann et al., 1993; Urano et al., 1999). Outro exemplo é o antimetabólito
gemcitabina, onde o tempo de intervalo de 24 horas entre a aplicação da droga e
o calor foi o necessário para atingir um efeito sinérgico in vitro em um modelo
em ratos. A correlação com dados clínicos ainda não foi concluída (Van Bree et
al., 1999). Por outro lado, mostrou-se que aplicações simultâneas de etoposide e
calor levam a uma diminuição da atividade citostática in vitro, enquanto que a-
plicações desta droga levam a resultados satisfatórios quando feitas em combi-
nação com outros agentes em hipertermia regional ou de corpo inteiro (Wiede-
mann et al., 1996; Hildebrandt et al., 2001). Em conclusão, além dos estudos
farmacológicos, será necessário otimizar a aplicação de agentes citostáticos em
conjugação com diferentes abordagens de hipertermia na prática clínica. A con-
tinuação de pesquisas pré-clínicas pode apresentar contratempo com relação a
importantes fatores acerca da interação droga-calor, mas será útil na avaliação
de novas drogas para a quimioterapia hipertérmica.
38
6.5.4. Farmacocinética das Drogas Aplicadas Sincronicamente à
Hipertermia
A quimiossensibilização térmica reflete preferencialmente aspectos
farmacodinâmicos de ação da droga durante a hipertermia, apesar de não consi-
derar mudanças complexas na farmacocinética da droga sob condições hiper-
térmicas. Infelizmente, os dados disponíveis na literatura sobre as bases da tera-
pia citostática sob condições hipertérmicas ainda são muito pouco entendidos.
No geral, espera-se que mudanças no suprimento sangüíneo do tumor ocorram, e
que estas afetem a distribuição das drogas citostáticas nos tecidos neoplásicos.
Presume-se também que mudanças no fluido e balanço eletrolíticos, assim como
mudanças de pH, possam resultar em mudanças da solubilidade e volume de dis-
tribuição das drogas. A hipercloridria gástrica e/ou fluido de seqüestro gastrin-
testinal pode representar fontes adicionais de problemas de distribuição, mas,
pelo menos, as drogas antineoplásicas serão principalmente administradas por
via intravenosa durante a hipertermia. Ao menos os metabolismos hepático e
renal e a excreção podem mostrar mudanças relevantes sob várias modalidades
de tratamento hipertérmico (Vanakoski & Seppälä, 1998).
Num estudo clínico de fase I sobre WBH, uma leve diminuição na
eliminação renal de carboplatina foi detectada, o que levou a se supor que isto
deveria ser a razão para um aumento na nefrotoxicidade da carboplatina enquan-
to combinada à hipertermia (Robins et al., 1993; Gerke et al., 2000).
Em outras investigações com carboplatina e estudos farmacológicos
com WBH, a ocorrência de nefrotoxicidade foi principalmente devido ao uso de
uma hemodiálise extracorpórea (sistema para induzir WBH), um método que
pensou-se produzir uma relevante taxa de nefrotoxicidade por si só (Wiedemann
et al., 1994; Gerke et al., 2000).
39
Em hipertermia regional da pélvis, uma tendência na direção a um
mais alto clearance peritoneal, pós-aplicação de carboplatina, foi detectada em
pacientes com câncer de ovário (Formenti et al., 1996).
Contudo, somente muito poucos estudos em farmacologia clínica
com drogas sob condições de hipertermia têm sido publicados. Os dados suge-
rem que pelo menos uma mais duradoura exposição sistêmica ao calor, de maio-
res partes do corpo (e.g., em WBH), pode influenciar especialmente na farmaco-
cinética de drogas citotóxicas administradas sincronicamente com a hipertermia
devido a mudanças na circulação do órgão (e.g. do fígado ou rim), na taxa de
metabolismo dependente da temperatura, ou na mudança do fluido. Em geral, a
interação droga-calor em pacientes com câncer parece ser muito mais dependen-
te de fatores ambientais (e.g., suprimento sangüíneo, equilíbrio do fluido, ou va-
lor do pH) do que daqueles com radiação e calor. Como esses fatores usualmen-
te não podem ser simulados por experimentos pré-clínicos de maneira convin-
cente, dados correspondentes sobre a interação droga-calor e quimiossensibili-
zação térmica devem ser interpretados com grande cautela. Além do mais, pes-
quisas no âmbito de ensaios clínicos são ainda necessárias.
6.6. Efetores Celulares da Hipertermia
6.6.1. Membrana Celular e Citoesqueleto
A hipertermia afeta a fluidez e estabilidade das membranas celula-
res e impede a função de transporte de proteínas transmembrana e a de recepto-
res de superfície celular in vitro. Um aumento da fluidez das membranas celula-
res foi observado em células termossensíveis, mas não em células termotoleran-
tes. Isto sugere que as alterações de membrana representam um importante alvo
na morte celular hipertérmica (Stevenson et al., 1981; Calderwood & Hahn,
1983). Estas observações dão lugar a numerosos relatos sobre mudanças no po-
tencial de membrana, elevação do sódio intracelular e conteúdo de cálcio, assim
40
como elevação do efluxo de potássio sob hipertermia. Contudo, nenhum destes
fenômenos parece estar correlacionado com a taxa de morte celular in vitro,
mesmo que um único fenômeno possa assumir um efeito da hipertermia sobre o
transporte de íons transmembrana (Na
+
/H
+
, HCO
3
/Cl
ATP-transporte, respec-
tivamente) e o pH intracelular a partir destes dados (Calderwood & Hahn, 1983;
Vidair & Dewey, 1986; Song et al., 1993; Liu et al., 1996).
Além do mais, a hipertermia tem demonstrado induzir várias mu-
danças de organização cito-esquelética (e.g., forma da célula, aparelho mitótico,
membranas intraplasmáticas tais como as do retículo endoplasmático e dos li-
sossomos), mas, novamente, não foi encontrada correlação clara entre estas mu-
danças e a termossensibilidade de várias linhagens celulares (Von Ardene et al.,
1969; Overgaard, 1976; Hahn, 1982; Coss et al., 1982). Neste contexto, o esfa-
celamento da membrana de células em cultura expostas ao calor foi descrito
primeiro, e foi notado que as células que exibem este fenômeno sofreram morte
celular após uma única dose de calor (Borrelli et al., 1986).
A partir dos mais recentes pontos de vista, o esfacelamento mem-
branar não representa um dano primário da membrana celular, mas é um típico
fator de morte celular programada (apoptose). Até hoje, vários autores têm de-
monstrado que a hipertermia é capaz de induzir apoptose tanto in vitro quanto
em animais experimentais.
6.6.2. Proteínas Celulares e Ácidos Nucléicos
A síntese intracelular de novo e a polimerização de moléculas de
RNA e DNA durante a síntese de proteínas estão diminuídas in vitro em tempe-
raturas entre 42 e 45ºC de maneira dose-dependente. Ao passo que o RNA e a
síntese de proteínas se recuperam rapidamente após o término da exposição ao
calor, a síntese de DNA é inibida por um longo período (Henle & Leeper, 1979;
Hahn, 1982; Streffer, 1988).
41
O choque térmico leva a uma agregação de desnaturação de proteí-
nas na matriz nuclear. Isto ocorre principalmente devido à insolubilidade das
proteínas celulares após seu desdobramento, acarretando assim um aumento da
concentração de proteínas nucleares. Recentemente, elevadas ligações de afini-
dade e redistribuição em direção a estruturas nucleares têm sido descritas para
mais de 100 diferentes proteínas celulares, incluindo as HSP.
O aumento da quantidade de proteínas nucleares pelo aquecimento
consecutivo afeta diversas funções moleculares (inclusive a síntese e o reparo do
DNA) quando uma certa dose térmica é excedida. Esta dose limite é diversa en-
tre distintas linhas celulares. As células HeLa, que entram na fase S do ciclo ce-
lular em 41,5ºC, a despeito de um prejuízo das enzimas nucleares, sofrem con-
seqüente morte na fase M após conclusão da síntese de DNA. Sob outros meios,
as células CHO, que exibem um acentuado prejuízo de replicação do DNA nas
mesmas condições experimentais retidas em G1, tornam-se termotolerantes.
Tanto o caráter limiar quanto a susceptibilidade distinta ao calor entre diferentes
linhagens celulares podem ser melhor explicados pelas diferenças na recupera-
ção a partir do choque térmico, e não pela extensão do dano celular intrínseco
induzido pelo calor (Higashikubo et al., 1993; Roti Roti et al., 1998).
Na década de 1960, supunha-se que a hipertermia agia de maneira
semelhante à radiação por induzir dano direto ao DNA e quebra da dupla hélice.
Mais tarde, tornou-se evidente que o calor não era capaz de causar severo dano
intrínseco ao DNA, mas, ao invés de impedir o reparo do DNA induzido pela
radiação, o dano celular é subtotal e, portanto, ajuda na fragmentação do DNA
induzida pela radiação. A partir dos recentes pontos de vista, isto pode ser cau-
sado pela inibição de enzimas reparadoras do DNA dependentes da temperatura.
De fato, tem sido demonstrada pela hipertermia a inibição da DNA-polimerase
e da DNA-polimerase (Hildebrandt et al., 2002).
42
6.6.3. Proteínas do Choque Térmico (HSP)
Enquanto a síntese de muitas proteínas celulares está prejudicada
sob condições hipertérmicas, o mesmo não pode ser dito sobre as HSP. Elas re-
presentam um grupo heterogêneo de proteínas chaperones (Beviláqua, 1999),
consistindo de pelo menos cinco subgrupos com massa molecular e variando
parcialmente sua função biológica. Estão usualmente divididas dentro das pe-
quenas HSP (massa molecular <40 kDa) e as famílias HSP60, HSP70, HSP90 e
HSP100. Todas as famílias HSP distribuem suas funções chaperones, isto é, elas
ligam-se não seletivamente à proteína hidrofóbica e as seqüências são liberadas
por desnaturação. Então, elas impedem a interação irreversível com proteínas
vizinhas (e.g., na matriz nuclear), o que resulta em perda de função. Contudo,
expressão elevada de funções chaperones das HSP não são restritas a elevadas
temperaturas. Elas podem também ser observadas sob várias condições de s-
tress, e algumas HSP realizam funções semelhantes durante a síntese de proteí-
nas regulares, contanto que alguns aminoácidos não tenham ainda desenvolvido
estruturas complexas. A síntese de HSP pode ser induzida dentro de minutos por
ativação do assim chamado “fator de choque térmico” (HSF). Esse fator liga-se
rapidamente e ativa a região promotora de vários genes do choque térmico após
trimerização, em particular aquela envolvida na síntese de HSP70. Hoje supõe-
se que pelo menos as famílias HSP27 e HSP70 representam “as proteínas da so-
brevida geral”, as quais são capazes de defender as células contra uma variedade
de estímulos potencialmente letais (pró-apoptóticos) (Morimoto, 1993; Agashe
& Hartl, 2000).
6.7. Características da Morte Celular por Hipertermia
6.7.1. Diferentes Tipos de Morte Celular
Hoje parece estar provado que as propriedades antineoplásicas das
drogas e radiação são principalmente baseadas nas suas capacidades (no cami-
43
nho direto ou indireto) de induzir tanto apoptose (sinônimo de programação)
quanto necrose (morte celular). Enquanto que a necrose é marcada por um dano
celular patológico passivo
, seguido por uma resposta inflamatória originada a
partir do tecido circunjacente, a apoptose representa um controle geneticamente
programado; uma morte ativa
programada. Isto pode ser ativado por dano celu-
lar, ou fisiologicamente, pela presente contribuição para manter a homeostase
tecidual, assim como prevenir severo dano celular, o que pode levar a sustentar
uma infecção viral ou câncer. Na visão de outros autores, o excesso de apoptose
pode levar a prejuízo no desenvolvimento celular e à doença degenerativa em
um dado tecido ou organismo. Vale ressaltar ainda que muitos estímulos que
ativam a apoptose são também capazes de induzir necrose em exposições pro-
longadas ao calor e intensas (White, 1996).
Na apoptose, o estímulo potencial letal semelhante a drogas citotó-
xicas, radiação, viroses ou inativação celular, ativa a cascata de proteases cisteí-
na-específica; são as chamadas “caspases” em diferentes caminhos. Cada uma
destas sinalizações pode ser estimulada na mitocôndria. A regulação da progra-
mação da apoptose é controlada através da exposição de um número de genes
com ativação (e.g., família de genes bax) ou inibição (e.g., gene da família bcl,
p53) de propriedades. Como as alterações genéticas destes genes foram encon-
tradas no intuito de contribuir para as transformações malignas e progressão de
várias doenças malignas sólidas e hematológicas, pesquisas básicas sobre apop-
tose foram estimuladas durante as últimas décadas (White, 1996; Neubauer et
al., 1996; Jaattelã, 1999).
6.7.2. Apoptose Induzida por Hipertermia
A hipertermia é suficientemente capaz de induzir tanto necrose co-
mo apoptose in vitro de maneira temperatura-dependente (Harmon et al., 1990).
A susceptibilidade da cultura de células à apoptose poderia ser demonstrada em
44
um número particular de experimentos usando linhas celulares hematológicas
(Harmon et al., 1990; Gabai et al., 1995). Yonezawa e cols. (1996), em estudos
usando várias linhagens celulares de osteossarcoma e tecidos de partes moles,
relataram explicitamente que a apoptose poderia ser somente induzida por aque-
cimento acima de 43ºC em uma cultura isolada de histiociotoma fibroso malig-
no. Parece que pelo menos alguns tipos de células exibem susceptibilidade dife-
rente à apoptose induzida pelo calor. Acima de uma distinta temperatura, é mui-
to mais provável induzir necrose.
Considerando experimentos in vivo, um significante retardo do
crescimento do tumor devido à apoptose foi observado em um xenotransplante
de carcinoma de cólon ward, mas não em fibrossarcoma exposto por longo perí-
odo de tempo à moderada hipertermia. Além do mais, análises de tecidos hospe-
deiros revelam a ocorrência de apoptose em vários tecidos linfáticos (especial-
mente timo). Taxas de apoptose moderadamente aumentadas foram também es-
tabelecidas dentro do intestino delgado, o mesmo não ocorrendo em nenhum
outro órgão (Sakaguchi et al., 1995; Yonezawa et al., 1996).
Num empreendimento conjunto, a apoptose parece representar um
importante efetor de ação do calor. De qualquer modo, o que deve ser levado em
consideração aqui é que muitos dos dados pré-clínicos referem-se a temperaturas
mais elevadas do que aquelas que possam ser efetivamente aplicadas em trata-
mentos hipertérmicos de pacientes com câncer. Como a hipertermia é sempre
aplicada em combinação com radiação e/ou drogas antineoplásicas na prática
clínica, é concebível que pelo menos um efeito pró-apopotótico aditivo possa
tornar-se relevante no âmbito das estratégias multimodais. Além do mais, isto
deve servir de suporte para adicionais mudanças vasculares, nutricionais e imu-
nológicas (Hildebrandt et al., 2002).
45
6.8. Mudanças na Imunoresposta Celular Induzida por Hipertermia
6.8.1. Efeitos pré-Clínicos do Calor sobre Linfócitos e Tumores
Experimentais
O termo hipertermia tem que ser claramente distinto do termo febre.
Enquanto que o primeiro refere-se à indução artificial de calor, quer seja externa
ou interna, localizada ou sistêmica, o segundo diz respeito a um fenômeno pato-
fisiológico internamente induzido, o qual pode ser causado por anormalidades
do cérebro ou agentes tóxicos (e.g., pirógenos: viroses, toxinas bacterianas, dro-
gas, colapso tecidual, proteínas estranhas), os quais afetam os centros termore-
guladores no hipotálamo e levam a um aumento sistêmico na temperatura do
corpo (Seegenschmiedt & Vernon, 1995).
Uma aparente reação imunológica provocou vários estudos in vitro
sobre o efeito do calor sobre linfócitos humanos desde o início da década de
1980, principalmente focalizando funções imunológicas de linfócitos não migra-
tórios (Amaning & Olszewski, 1994).
Neste contexto, muitos investigadores têm observado prejuízo da
função dos linfócitos após aplicação não fisiológica em altas temperaturas
(>42ºC) in vitro, e especialmente os linfócitos NK têm demonstrado reagir mais
sensivelmente ao calor. A partir de recentes pontos de vista, constatou-se ser
muito difícil se chegar a uma conclusão por comparação destes estudos, uma vez
que diferentes testes e cálculos foram utilizados para mensurar a atividade lítica
das células NK, algumas vezes sem considerar a quantidade total de linfócitos
NK. Contudo, Shen e cols. (1994) demonstraram, de maneira persuasiva, que a
função das células NK está aumentada em temperaturas em torno de 40ºC, mas
prejudicada em temperaturas acima de 42ºC. Mais recentemente, achados refe-
rindo-se a temperaturas in vitro <41ºC revelaram um aumento na proliferação
das células NK, as quais foram acompanhadas com resposta ao choque térmico
tão bem quanto à secreção de selectina. A relevância clínica destes achados
46
permanece clara (Azocar et al., 1982; Kappel et al., 1991; Shen et al., 1994; Di
et al., 1997).
A influência do calor sobre a resposta imune celular manifesta-se a
partir de recentes estudos animais feitos por Burd e cols. (1998). Aqui, um retar-
do de crescimento de um xenotransplante em câncer de mama de camundongos
SCID e Balb foi observado após longo período de tempo de exposição sob mo-
derada hipertermia. As doses térmicas aqui aplicadas foram muito baixas para
induzir mudanças em algum tecido hospedeiro, mas, em um determinado sítio
do tumor, o acúmulo de linfócitos hospedeiros e de células NK adotivamente
transferidas foram responsáveis por uma acentuada taxa de células tumorais em
apoptose, observada em ambos os modelos animais pós-hipertermia. Este efeito
foi inibido por seletivo bloqueio da função das células NK. Portanto, as células
NK medeiam a lise celular e podem representar um importante mecanismo cito-
tóxico induzido por moderada hipertermia (Burd et al., 1998).
6.8.2. Mudanças Imunológicas em Pacientes com Câncer Tratados
com Hipertermia de Corpo Inteiro (WBH)
Muitos dados publicados na literatura sobre mudanças imunológi-
cas em seres humanos expostos a aquecimento sistêmico referem-se a investiga-
ções de subpopulações de linfócitos e/ou citocinas no soro de pessoas saudáveis
cuja temperatura corporal central foi moderadamente elevada de 39ºC para
39,5ºC em banho-maria (Downing et al., 1988; Kappel et al., 1991; Kappel et
al., 1998). Existem também relatos sobre mudanças imunológicas em pacientes
após um derrame cerebral decorrente do calor (Hammami et al., 1998). Além
disso, poucas publicações estão disponíveis sobre mudanças em exposição ao
calor por pequeno período de tempo em níveis de citocina no soro de pacientes
tratados tanto por calor de radiação como por WBH extracorporal a 42ºC (Ro-
bins et al., 1995).
47
No tocante à subpopulação de linfócitos, foi observada uma signifi-
cante redução na quantidade de células T4, e na razão T4/T8, tanto em pessoas
saudáveis como em pessoas que sofreram moderada hipertermia em banho-
maria, assim como em pacientes que sofreram derrame cerebral a partir do a-
quecimento. Por outro lado, as células T8 e NK foram elevadas significativa-
mente, resultando então em um leve aumento da quantidade de linfócitos totais,
a despeito da diminuição das supracitadas células T4 (Downing & Taylor, 1987;
Kappel et al., 1998). Como recentemente demonstrado, uma diminuição de célu-
las T4 também ocorreu em pacientes tratados com WBH, mas uma redução de
células T8 não foi detectada neste contexto (Ahlers et al., 1998; Hegewisch-
Becker et al., 1998).
Mudanças na resposta imune celular observadas em indivíduos ex-
postos a aquecimento sistêmico são relativamente inespecíficas e podem ser in-
terpretadas como parte de uma resposta geral ao stress fisiológico maior, cuja
presença reflete-se claramente pela significante elevação da freqüência e débito
cardíacos em pacientes submetidos a WBH (Faithfull et al., 1984; Kerner et al.,
1999). Mudanças semelhantes, incluindo uma elevação das células NK, também
podem ser induzidas pela infusão de adrenalina ou por exercício físico modera-
do, enquanto que exercício físico mais pesado pode implicar em prejuízo da ati-
vidade dessas células (Hoffman-Goetz & Pedersen, 1994; Kappel et al., 1998).
Moderados níveis de catecolaminas no plasma resultam na estimu-
lação da função das células NK, enquanto que prejuízo na atividade dessas célu-
las foi encontrado na presença de altos níveis de catecolaminas. Numa maneira
de ver, as catecolaminas podem exercer sua influência sobre os linfócitos san-
güíneos por uma estimulação direta, e noutro aspecto, através da inervação sim-
pática dos tecidos linfáticos (Benschop et al., 1997; Maes et al., 1999).
Investigações de níveis de citocinas no soro em pacientes que sofre-
ram WBH têm sido realizadas por Robins e cols. (1995). Estes autores relataram
48
alterações em pacientes tratados com WBH, compreendendo uma elevação das
interleucinas anti-inflamatórias IL-6 e IL-10, enquanto que a IL-2 e o interferon
gama (IFN-) permaneceram inalterados. Estes achados foram recentemente
confirmados por outros autores, notadamente por Hildebrandt e cols. (2002).
Extraordinário, ambas as mudanças nos níveis de citocinas em pacientes subme-
tidos a WBH, assim como aquelas em subpopulações de linfócitos, reverteram
espontaneamente. Além disso, um aumento de citocinas anti-inflamatórias pode
também ser induzido por stress fisiológico em modelos animais, algumas vezes
chegando mesmo a induzir diminuição de níveis séricos de IL-2 e IFN- (Robins
et al., 1995; Ahlers et al., 1999; Iwakabe et al., 1998).
A WBH induz a liberação endógena de citocinas mielo-estimulató-
rias que agem para compensar a mielosupressão induzida pelas drogas e pela
radiação (D’Oleire et al., 1993; Neta & Oppenheim, 1991; Shen et al. 1991).
Estes sinais endógenos estimulam a produção de TNF, além de estimularem ou-
tras citocinas inflamatórias: interleucinas IL-1, IL-6, IL-8, fator estimulador de
colônia (CSF), interferon (IFN), fator de crescimento de transformação (TGF-
). Além disso, o TNF intrinsecamente estimula a produção de citocinas mielo-
estimulatórias (Neta et al., 1992).
Com relação aos fatos mencionados acima, a WBH e outras formas
de exposição sistêmica ao calor >41ºC têm demonstrado induzir severas altera-
ções na circulação de linfócitos sangüíneos, resultando mais na supressão do que
na estimulação do sistema imune. Contudo, futuras pesquisas revelarão se estes
achados apenas representam parafenômenos, ou se há uma conexão entre mu-
danças nos linfócitos sangüíneos e aumento na migração de linfócitos e a ativi-
dade das células NK no sítio tumoral, como foi demonstrado em tumores expe-
rimentais (Hildebrandt et al., 2002).
49
6.9. Modulação de Resistência à Droga por Hipertermia
6.9.1. Reversão de Resistência à Droga Induzida por Hipertermia
Resistência à droga representa a maior causa de falha do tratamento
em doenças malignas humanas e pode ser induzida por diferentes mecanismos,
dos quais, o pleiótropo “multidroga-resistência” (MDR), mediado pela glicopro-
teína transmembrana p170 e fluxo de bomba, tem ganho particular interesse
(Hegewisch-Becker, 1996; Filipts et al., 1996). Dados pré-clínicos sugerem que
a hipertermia é um fenômeno com possibilidade de superar vários modos de re-
sistência à droga, o que tem sido particularmente demostrado pelos derivados
platinum (e.g., cisplatina). A cisplatina supera a resistência através da hiperter-
mia de maneira exemplar, pois suas causas são multifatoriais (e.g., mudanças na
condutividade transmembrana, atividade da sódio-potássio ATPase, metabolis-
mo da glutationa, reparo do DNA). Portanto, isto possibilita investigar o efeito
da hipertermia sobre a resistência às drogas em diferentes níveis celulares (mas é
interessante notar que o fenótipo MDR não está envolvido na resistência à cis-
platina). Contudo, o que se deve ter em mente aqui é que temperaturas em doses
térmicas foram significativamente maiores nestes estudos in vitro do que naque-
les que usualmente se tem atingido na prática clínica (Hettinga et al., 1997). Ao
contrário, o curso de pacientes individuais previamente refratários aos compos-
tos platinum, os quais responderam à terapia pós-adição da hipertermia, é forte-
mente oposto à reversão de resistência à droga induzida pela hipertermia (Hilde-
brandt et al., 1998).
6.9.2. Termotolerância está Freqüentemente Associada com Resis-
tência à Droga
Uma moderada exposição ao calor tem demonstrado induzir expres-
são de HSP em cultura de células, e níveis elevados de HSP70 intracelular têm
mostrado estar associado com termotolerância. Ao contrário, a transfecção de
50
HSP70 para dentro de culturas de fibroblastos resultou em uma pronunciada di-
minuição de termossensibilidade, com semelhantes achados obtidos por outros
membros da família HSP. A termotolerância pode estar associada com diferen-
tes formas de resistência à droga (e.g., MDR), e a hipertermia tem mostrado in-
duzir várias formas de resistência à droga, incluindo MDR ou a inativação da
enzima topoisomerase II dependente de calor. A ocorrência de um calor induzí-
vel e de simultânea resistência ao calor e a drogas (termotolerância + MDR) têm
ocorrido sob certas condições (Lindquist & Craig, 1988; Li et al., 1990; Chin et
al., 1990; Ciocca et al., 1993; Kampinga, 1995; Oh et al., 1997).
6.9.3. O Papel da Hipertermia é Reverter ou Induzir a Resistência
às Drogas
Parece curioso que a hipertermia tenha sido mostrada com dupla
finalidade: reverter ou induzir resistência a drogas in vitro. A reversão da resis-
tência tem sido particularmente demonstrada para compostos platinum em tem-
peraturas >42ºC, enquanto que a indução desta (isolada ou em conjunto com
termotolerância e acúmulo de HSP) pode aparecer quando baixas temperaturas
são aplicadas. A despeito destas observações pré-clínicas, um efeito favorável de
diferentes abordagens da hipertermia sobre a sensibilidade das drogas tem sido
relatado no âmbito de ensaios clínicos. Aqui, pacientes quimiossensíveis, princi-
palmente, mas também aqueles com doenças refratárias (e.g., tumores de células
germinativas e sarcomas), foram sucessivamente tratados com hipertermia adi-
cional para um dado esquema quimioterápico (Wiedemann et al., 1996; Rietbro-
ek et al., 1997; Wessalowski et al., 1998; Hildebrandt et al., 2001).
Além do mais, há um estudo disponível na literatura no qual espé-
cimes de tumor oriundo de pacientes participando em ensaios clínicos com hi-
pertermia foram investigados, com relatos para a modulação de resistência à
droga ao nível molecular. Aqui, foi excluída uma indução de resistência à droga
51
(MDR) por hipertermia regional da pélvis em conjunto com radioterapia e qui-
mioterapia (Stein et al., 1999). Em conclusão, dados disponíveis na literatura
sobre hipertermia e resistência à droga sugerem o efeito positivo (reversão da
resistência) e o excesso de desvantagens (indução de resistência) na prática clí-
nica. Contudo, o que se deve ter em mente aqui é que a resistência à droga pode-
ria ser induzida por hipertermia como princípio, particularmente em temperatura
moderada (Hildebrandt et al., 2002).
7. Drogas Utilizadas em Associação com a Hipertermia
7.1. Paclitaxel (Taxol®)
A administração de agentes citotóxicos tem sido terapia corriqueira
em doenças neoplásicas notadamente confinada à cavidade peritoneal (Dedrick
et al., 1978; Markman et al., 1992; Markman, 1993). É grande o interesse e o
uso do Paclitaxel (Taxol®), e se tem obtido bons resultados em pacientes com
câncer de ovário refratário ao tratamento com derivados platinum (McGuire et
al., 1989, 1993). Por outro lado, tem-se demonstrado, em estudos experimentais,
bons resultados com derivados platinum, no caso, específico com tumores de
Walker 256 implantados nos estômagos de rato. O uso da carboplatina isolada e
associada à hipertermia mostrou bons resultados (Oliveira, 1997).
A interação da hipertermia e Paclitaxel (Taxol®) em estudos in vi-
tro em câncer de mama humano e em adenocarcinoma MCF-7 mostrou que a
hipertermia pode diminuir, ou parar, a progressão de células tratadas com pacli-
taxel através da fase S e dentro do G2/M (Leal et al., 1999).
Paclitaxel (Taxol®) usado em duas diferentes doses intraperitoneais
associado à hipertermia a 43ºC, em adenocarcinoma murino mamário, demons-
trou alta efetividade (Cividalli et al., 2000).
52
Nem a vincristina (Rose et al., 1979; Mizuno et al., 1980) nem a
vimblastina (Giovanella et al., 1970; Neumann et al., 1985) têm demonstrado
que o calor aumenta a citotoxicidade, tanto in vitro como in vivo, em hipertermia
de corpo inteiro (WBH) a temperaturas de 41,5 a 42ºC. Como nos casos de uso
clínico dos alcalóides da vinca, a interação de etoposide, taxol e calor não tem
sido suficientemente testada para descrever suas atividades com hipertermia in
vitro ou in vivo, embora estudos preliminares in vitro sugiram que o taxol, quan-
do administrado concomitantemente com o calor, não é interativo em variações
relevantes de temperatura em WBH (Sakaguchi et al., 1993a, 1993b).
É neste contexto que se propõe verificar o taxol experimentalmente
sobre o carcinossarcoma 256 de Walker, implantado em estômagos de rato, sob
condições de hipertermia peritoneal contínua de corpo inteiro.
7.2. 5-FU (5-Fluorouracil)
Dentre os agentes quimioterápicos existentes, o 5-FU é aquele usa-
do por excelência, tanto isolado como associado ao tratamento adjuvante do
câncer colo-retal (Barone et al., 1979; Santos & Santos, 1997), sendo também
aquele mais extensamente usado nos cânceres gástrico e de cólon, e largamente
usado em combinação com outras drogas no tratamento do câncer de mama
(Ansfield et al., 1971).
A combinação de 1 hora de hipertermia a 42ºC com adriamicina,
vincristina ou 5-FU resultou em efeito sinérgico contra células leucêmicas P388
(Adwankar & Chitnis, 1984).
O 5-FU é de inestimável valor no tratamento do câncer de cólon
(Ansfield et al., 1962; Curreri et al., 1958). Em mais de 2000 casos, o 5-FU ofe-
receu uma resposta de 21% (Carter & Friedman, 1974).
O fluorouracil, em metástases por câncer de cólon, mostrou boa
resposta isoladamente (22%) e em associação com metil-CCNU e vincristina
53
(37%) (Falkson & Falkson, 1976). Moertel e cols. (1975), em estudo controlado
e randomizado com 80 pacientes portadores de carcinoma colo-retal avançado,
usaram o 5-FU isolado e em combinação com metil-1,3-cis(2-cloretil)-1-nitro-
soura e vincristina, e observaram que o grau de toxicidade da combinação era
comparável ao 5-FU isolado. Em 10 semanas de tratamento, eles observaram
ainda que com esta associação de três drogas a taxa de resposta objetiva foi de
43,5% quando comparada com a do 5-FU isolado, que foi de apenas 19,5%
(Moertel et al., 1975).
A combinação da infusão de 5-FU via artéria hepática comum asso-
ciada à radioterapia em metástases hepáticas por carcinoma de cólon, apesar de
controversa, mostrou somente uma boa paliação em muitos casos (Barone et al.,
1979).
Estudos feitos em leucemia humana da linhagem T linfoblástica
onde se usou 5-FU associado à hipertermia mostraram sinergismo sobre os efei-
tos citotóxicos nesta linhagem (Mini et al., 1986). Experimentos feitos in vitro
com células leucêmicas P388 expostas à hipertermia associada à adriamicina,
vincristina ou 5-FU resultaram em sinergismo de ação com conseqüente morte
celular (Adwankar & Chitnis, 1984).
Dispõe-se, portanto, verificar o 5-FU experimentalmente sobre o
carcinossarcoma 256 de Walker, um tumor sólido, implantado em estômagos de
rato, ora isolado ou sob condições de hipertermia peritoneal contínua de corpo
inteiro.
7.3. Ácido Folínico (Leucovorin®)
O ácido folínico (Leucovorin®), um conhecido modulador dos efei-
tos do 5-FU, aumenta, tanto in vitro como in vivo, a citotoxidade do 5-FU em
muitos, mas não em todos, os tipos de câncer, de uma maneira, concentração e
tempo dependente (Ullman et al., 1978). Diversos estudos pré-clínicos sugerem
54
que é importante administrar o leucovorin antes, ou pelo menos concomitante-
mente, à fluoropirimidina para permitir o metabolismo do leucovorin ao 5,10-
CH
2
FH
4
poliglutamatos, que são mais efetivos em promover formação de com-
plexos ternários (Houghton et al., 1986; Cao et al., 1996).
Projetos pilotos em desenvolvimento no Japão e Estados Unidos
vêm sugerindo o emprego de outros tipos de terapêutica associando a quimiote-
rapia e hipertermia à cirurgia no controle da doença localmente avançada (Fuji-
moto et al., 1990). O aumento dos efeitos citotóxicos de muitos antibióticos an-
tineoplásicos, alcalóides e agentes alquilantes devido o aumento de temperatura
tem sido observado em sistemas in vivo e in vitro (Bull, 1984). Até o presente
momento, somente informações incompletas estão disponíveis na literatura a
respeito da interação de temperaturas elevadas e antimetabólitos citotóxicos de
células tumorais (Herman et al., 1981; Giovanella et al., 1970). Raras informa-
ções experimentais têm sido relatadas envolvendo interação do 5-FU e hiperter-
mia (Mizuno et al., 1980; Rose et al., 1979). A hipertermoterapia isolada não se
mostrou eficaz no tratamento do tumor de Walker implantado em estômago de
rato. Já sua associação à quimioterapia com carboplatina apresentou bons resul-
tados (Oliveira, 1997). O uso clínico do 5-FU associado ao calor pode ser rele-
vante, especialmente para o tratamento de pacientes com tumores sólidos sensí-
veis a esta droga (Costanzzi et al., 1979).
Tenciona-se, assim, verificar o leucovorin associado ao 5-FU expe-
rimentalmente sobre o carcinossarcoma 256 de Walker, um tumor sólido, im-
plantado em estômagos de rato, ora isoladamente ora sob condições de hiper-
termia peritoneal contínua de corpo inteiro.
55
8. Progressão Tumoral
Em estudos com carcinógenos em animais experimentais, têm-se
confirmado que pelo menos dois passos – iniciação e promoção – são requeridos
para produzir tumores (Friedewald & Rous, 1944). O primeiro passo (iniciação)
acredita-se envolver a conversão do interior de uma célula normal em uma célu-
la latente de tumor. O segundo passo (promoção) parece ser um evento no qual
as células latentes tumorais estimulam-se a se dividir (Heidelberger, 1977; Isa-
acs et al., 1982; Farber, 1984; Berenblum, 1985). Juntamente com estas mudan-
ças iniciais, estas anormalidades e divisões celulares excessivas, são gerados no-
vos fenótipos (Nowell, 1976) e as células que sofrem seleção clonal são afetadas
(Steel, 1984). Algumas células agressivas e transformadas continuam no terceiro
passo, o qual leva à invasão e metástase (Nicolson, 1984). Tudo isto sustenta o
conceito de que a promoção é também um processo de múltiplos estágios, os
quais levam à progressão.
Certas características biomorfológicas do estágio de progressão fo-
ram delineadas a partir de estudos em neoplasias experimentais e humanas du-
rante a carcinogênese, a saber:
a) Invertibilidade;
b) Alterações discerníveis no genoma celular, moleculares e morfo-
lógicas;
c) Desenvolvimento de instabilidade cariotípica;
d) Crescimento de células no estágio de progressão, sensíveis a fa-
tores ambientais durante a fase precoce deste estágio;
e) Agente “progressor”, o qual age para induzir a transição de célu-
las no estágio de promoção àquele de progressão;
f) Indução espontânea (fortuita) ao estágio de progressão a partir do
estágio de promoção.
56
A invertibilidade deste estágio é enfatizada pela demonstrável alte-
ração no genoma celular (e.g., translocação cromossomal) (Wolman, 1983), de-
leção cromossomal (Sato et al., 1991), amplificação gênica (Tlsty, 1996) e ou-
tras alterações estruturais do DNA (Malins et al., 1996) que são encontradas
dentro deste estágio. Tais mudanças genômicas claramente distinguem o estágio
de progressão (irreversível) do estágio de promoção (reversível) que o precede
(Balaban et al., 1986; Aldaz et al., 1987; Sargent et al., 1989). Embora as célu-
las no estágio de progressão não estejam completamente dependentes da presen-
ça continuada do agente promotor para sua existência, os agentes promotores e
outros fatores ambientais podem aumentar o crescimento e a expressão genética
de células no estágio de progressão. E como o crescimento da neoplasia conti-
nua, e desenvolve instabilidade cariotípica, a resposta a fatores ambientais pode
ser alterada ou mesmo perdida (Noble, 1977; Welch & Tomasovic, 1985).
As populações de células malignas são caracterizadas por uma ins-
tabilidade genética, a qual leva à geração espontânea de variadas formas, sur-
gindo assim diferentes fenótipos e propriedades genotípicas (Goldie & Coldman,
1985). Tais alterações genéticas incluem mutações, deleções, amplificações gê-
nicas e translocações, dentre outras (Bellamy et al., 1990).
A demonstração experimental do estágio de progressão é um tanto
mais complexa do que a iniciação e a promoção. Em sistemas experimentais, o
mais efetivo desenvolvimento de neoplasia implica na administração continuada
do agente promotor, mesmo que a aplicação do agente progressor tenha cessado.
Isto deve ser esperado, pois as células em estágio precoce de progressão respon-
dem ao agente promotor, e assim continuam a responder proliferativamente.
Desta maneira, o agente promotor produz um aumento nas lesões neoplásicas
iniciais em sistemas experimentais.
O estágio de progressão usualmente se desenvolve a partir de célu-
las no estágio de promoção, mas pode também desenvolver-se diretamente a
57
partir de células normais como resultado da administração relativamente alta de
doses citotóxicas de agentes carcinogênicos completos, capazes de induzir inici-
ação e progressão. Além disso, a incorporação de informação genética dentro do
genoma tais como viroses oncogênicas, material genético de transfecção estável,
ou alterações cromossômicas espontâneas, pode realçar a transição dentro do
estágio de progressão. Como tem sido assinalado, mudanças cariotípicas são
comuns se não onipresentes em células neoplásicas no estágio de progressão
(Harris, 1991). Alguns estudos têm enfatizado o aumento da amplificação gênica
em células neoplásicas (Sager et al., 1985; Mäkelä & Alitalo, 1986; Tlsty et al.,
1993). Tlsty et al. (1989) demonstraram que a taxa espontânea da amplificação
gênica, em um número de linhagem celular neoplásica, foi quase 100 vezes a
taxa mensurada em células não neoplásicas. O impacto dos últimos achados de
mutações microssatélites é suavizado pela demonstração de que a freqüência de
suas mutações em tecidos normais é da ordem de 1-5x10
-2
, enquanto que a vari-
ação em seqüências minissatélites pode ser tão alta quanto 10
-1
em tecidos hu-
manos normais (Simpson, 1997).
Enquanto muitas, mas nem todas, mutações em proto-oncogenes
podem ser vistas em muitas lesões precoces, as mutações no gene supressor p53
em uma variedade de situações, tanto em animais quanto em humanos, estão
prontas para se identificar durante o estágio de progressão (Tamura et al., 1991;
Donghi et al., 1993; Navone et al., 1993; Tanaka et al., 1993). O estágio de pro-
gressão tem como função não somente envolver a instabilidade cariotípica, mas
também selecionar as células que mais convêm para sua agressiva replicação e
continuado crescimento. Mecanismos associados com a instabilidade cariotípica
são numerosos e incluem a interrupção do aparelho mitótico, alterações na fun-
ção telomere (Ledbetter, 1992; Blackburn, 1994), inibição da função da topo-
isomerase (Cortés et al., 1993), hipometilação de DNA (Smith, 1998), recombi-
nação genética e de DNA (Chorazy, 1985; Murnane, 1990; Sengstag, 1994),
58
amplificação gênica (Tlsty et al., 1993), conversão gênica (Taghian & Nicko-
loff, 1997) e transposição gênica (Cheng & Loeb, 1993). Por causa de seu papel
único como “guardião do genoma”, as anormalidades no gene supressor p53 po-
dem também contribuir para o envolvimento na instabilidade cariotípica (Sood
et al., 1997).
59
OBJETIVOS
1. Gerais
1) Avaliar a sobrevida de ratos portadores de tumores experimentais
(carcinossarcomas de Walker 256) implantados em seus estôma-
gos submetidos à hipertermia associada à quimioterapia com Pa-
clitaxel (Taxol®), 5-FU (Fluorouracil) e 5-FU + ácido folínico
(Leucovorin®);
2) Analisar, através de estudos histopatológicos (H&E) e imunohis-
toquímica (IHM), o comportamento dos tumores experimentais
(carcinossarcomas de Walker 256) implantados em estômagos de
ratos com ou sem tratamento quimioterápico (Paclitaxel, 5-FU e
5-FU + ácido folínico) associado ou não à hipertermia.
2. Específicos
1) Avaliar a sobrevida de ratos portadores de tumores experimentais
(carcinossarcomas de Walker 256) implantados em seus estôma-
gos e submetidos à hipertermia associada à quimioterapia com
Paclitaxel (Taxol®);
2) Avaliar a sobrevida de ratos portadores de tumores experimentais
(carcinossarcomas de Walker 256) implantados em seus estôma-
gos e submetidos à hipertermia associada à quimioterapia com 5-
FU (Fluorouracil);
3) Avaliar a sobrevida de ratos portadores de tumores experimentais
(carcinossarcomas de Walker 256) implantados em seus estôma-
gos e submetidos à hipertermia associada à quimioterapia com 5-
FU + ácido folínico (Leucovorin®);
60
4) Analisar, através de estudos histopatológicos (H&E), o compor-
tamento dos tumores experimentais (carcinossarcomas de Walker
256) implantados em estômagos de ratos com ou sem tratamento
quimioterápico (Paclitaxel, 5-FU e 5-FU + ácido folínico) asso-
ciado ou não à hipertermia;
5) Analisar, através de estudos imunohistoquímicos (IHM), o com-
portamento dos tumores experimentais (carcinossarcomas de
Walker 256) implantados em estômagos de ratos com ou sem tra-
tamento quimioterápico (Paclitaxel, 5-FU e 5-FU + ácido folíni-
co) associado ou não à hipertermia;
6) Analisar, por técnica citogenética, o cariótipo do tumor carcinos-
sarcoma de Walker 256, para o estudo da progressão tumoral.
61
MATERIAIS E MÉTODOS
1. Drogas e Reagentes
Paclitaxel (Bristol-Myers Squibb, Brasil): frasco-ampola de 5 mL
com 30 mg.
5-Fluorouracil (ICN Farmacêutica Ltda., Brasil): frasco-ampola de
10 mL com 250 mg.
Ácido Folínico (Biosintética, Brasil): frasco-ampola de pó liofiliza-
do injetável com 54 mg
de folinato cálcico, equivalendo a 50 mg de ácido folínico.
Ketalar (Aché, Brasil): cloridrato de cetamina (frasco-ampola de 10
mL com 50 mg/mL).
Rompun (Bayer, Brasil): cloridrato de xilazina (frasco-ampola de
10 mL com 2 mg/mL).
Cloranfenicol (Prodotti, Brasil): succinato de cloranfenicol (frasco-
ampola com 1 g).
Solução de Ringer-Lactato (Gaspar Viana, Brasil): frasco de 500
mL com 3 g de cloreto de sódio, 0,15 g de cloreto de potássio, 0,10 g de cloreto
de Cálcio 2(H
2
O) e 1,55 g lactato de sódio.
Telebrix hystero (Guerbet, Brasil): toxitalamato de meglumina +
polividona (frasco-ampola de 20 ml com 5 g de iodo).
Anticorpos monoclonais (Laboratório Dako, EUA): anti-vimentina
e anti-queratina.
Formalina em pastilhas (Tayuyna, São Paulo): 0,475 g de parafor-
maldeído.
Povidine (Tecnofarma, Brasil): polivinilpirrolidona (PVPI) a 10%.
Éter dietílico (Hoechst, Brasil).
62
2. Paclitaxel (Taxol®)
2.1. Química
O paclitaxel tem uma estrutura química complexa, consistindo de
um sistema de 15 anéis taxanos associados e um éster preso ao carbono da ca-
deia na posição 13. Sua estrutura química é mostrada na figura abaixo.
Figura A. Estrutura química do Paclitaxel (Taxol®)
2.2. Mecanismo de Ação
O paclitaxel é um extrato oriundo da casca do teixo ocidental (Ta-
xus brevifolia). Ele mostrou ter atividade antitumoral primeiramente na década
de 1960. Acredita-se que a cadeia éster ligada ao carbono 13 é essencial para
esta atividade. Ele liga-se covalentemente, de preferência, à subunidade da
tubulina (Rao et al., 1992) e estabiliza os microtúbulos intracelulares. Estudos
anteriores demonstraram que os locais de ligação do paclitaxel são diferentes
daqueles da colchicina e dos alcalinóides da vinca (Kumar, 1981). O efeito esta-
bilizador ocorre sobre os microtúbulos in vitro em concentrações tão baixas
63
quanto 0,05 mol/L. Ao nível celular, a exposição ao paclitaxel induz à forma-
ção anormal do fuso, o qual, provavelmente, leva ao efeito citotóxico.
2.3. Farmacoclínica e Farmacocinética
O paclitaxel é muito pouco solúvel em solução aquosa. Portanto,
requer Cremophor EL e álcool desidratado USP como solventes. Mesmo em
Cremophor EL, pode ainda estar presente precipitado, necessitando assim do
uso de um filtro na linha intravenosa. Durante uma infusão intravenosa contínua
de 3 a 6 horas em doses padrão, tem-se atingido concentrações plasmáticas de
1,3 a 13,0 mol. Acima de 95% de paclitaxel circulante está ligado às proteínas
plasmáticas. A eliminação do paclitaxel, seguindo uma cinética não linear com
sobretudo uma meia-vida de eliminação, estende-se entre 5 e 52 horas após 24
horas de infusão. Caso a cisplatina seja administrada imediatamente anterior ao
paclitaxel, em regime de combinação, a meia-vida de eliminação é prolongada.
Enquanto que o exato mecanismo para o clearance do paclitaxel não está com-
pletamente elucidado, o mecanismo hepático pela enzima P450 e a excreção bi-
liar são importantes. Estudos em animais têm demonstrado que mais de 42% de
uma dose injetada é eliminada como metabólito e como substância inalterada
pela bile.
2.4. Dosagem e Programação
2.4.1. Quando administrado para o tratamento do câncer de ovário
epitelial
- Regime de 3 horas:
175 a 250 mg/m
2
de paclitaxel durante 3 horas por 3 semanas.
- Regime de 24 horas:
135 a 175 mg/m
2
de paclitaxel durante 24 horas por 3 semanas.
64
- Regime de 96 horas:
120 a 140 mg/m
2
de paclitaxel durante 96 horas por 3 semanas.
2.4.2. Quando administrado em animais (ratos)
25 mg/m
2
de paclitaxel i.p.
Obs.) Para se calcular a área corporal do animal (rato), utiliza-se a
fórmula SC(m
2
) = 0,01672 h(cm) P(Kg) , onde h é a altura
mas no rato utiliza-se o comprimento desprezando-se a cauda
(Wernicke, 1949).
3. 5-Fluorouracil (5-FU)
3.1. Química
O 5-FU é uma fluoropirimidina, cujo nome químico é 5-fluoro-
2,4(1H,3H) pirimidina dione. Ele é sensível à luz e pode precipitar-se em tempe-
ratura ambiente. Sua estrutura química é mostrada na figura abaixo.
Figura B. Estrutura química do 5-Fluorouracil
3.2. Mecanismo de Ação
Em 1957, Heidelberger sintetizou 5-FU com a intenção de desen-
volver um novo agente citotóxico. As bases teóricas para este desenvolvimento
originaram-se de observações onde células tumorais utilizavam uracil mais efi-
cientemente que as células normais da mucosa intestinal. O 5-FU permanece
65
inativo até ser convertido pelo tecido-alvo em um de seus muitos metabólitos
citotóxicos. Enquanto que o exato mecanismo de ação do 5-FU permanece inde-
terminado, este se apresenta como inibidor da timidilato-sintase (TS) por ativa-
ção do metabólito 5-FdUMP (5-fluorodesoxiuridina monofosfato) e como redu-
tor do folato, levando assim à formação de um complexo ternário inativo, o que
pode ser aumentado pela co-administração de ácido folínico. A inibição da TS
leva à inibição da síntese de DNA através da depleção do pool de timidina. A
seqüência dependente da interação 5-FU e metotrexato (MTX) está bem estabe-
lecida. O MTX e o 5-FU são sinérgicos ao máximo quando o MTX é adminis-
trado 24 horas antes do 5-FU, inibindo assim a produção dos precursores nor-
mais da purina. Como um mecanismo alternativo de ação, o FUTP (fluorouracil
trifosfato) incorpora-se ao RNA, com subseqüente prejuízo de sua função. A
incorporação do 5-FdUTP (5-fluorodesoxiuridina trifosfato) ao DNA como um
precursor fraudulento da timidina pode induzir à quebra de uma única hélice e
produzir assim efeitos citotóxicos.
3.3. Farmacoclínica e Farmacocinética
O 5-FU é usualmente administrado intravenosamente. A biodispo-
nibilidade seguida à administração oral é altamente variável por causa de uma
absorção inconsistente a partir do trato gastrintestinal e do metabolismo de pri-
meira passagem, onde o fígado inativa compostos. A injeção intravenosa típica
de 10 a 15 mg/kg resulta no pico de concentração plasmática de 0,1 a 1,0 mM. É
incerto se o 5-FU é removido mediante duas ou três fases de eliminação. Menos
de 10% dele está ligado a proteínas do soro. Sua meia-vida é pequena (6 a 20
min.) devido a seu rápido metabolismo pelo fígado e por outros tecidos. Mais de
80% dele é metabolizado em DHFU (dihidrofluorouracil), que por sua vez é me-
tabolizado e excretado na urina. Aproximadamente 15% do 5-FU administrado é
excretado inalterado na urina. A detoxicação hepática do 5-FU permite a admi-
66
nistração, pela veia-porta, em altas doses, para o tratamento de metástases hepá-
ticas com toxicidade sistêmica mínima.
3.4. Dosagem e Programação
3.4.1. Quando administrado para o tratamento do câncer de cólon
Duke C
Após ressecção cirúrgica com margens livres (T
1-4
N
0
M
0
), devem
ser submetidos a tratamento adjuvante por 6 ciclos:
- D1 a D5
450 mg/m2 de 5-FU i.v. em bolo
- Semanalmente por 48 semanas a partir do 28
o
dia após o 1
o
ciclo:
450 mg/m2 de 5-FU i.v. em bolo
- A cada 2 semanas, iniciando concomitante ao 5-FU semanal:
50 mg de Levamisole v.o. a cada 8 horas por 3 dias
3.4.2. Quando administrado para o tratamento do câncer cervical
recorrente
- Dose usual:
750 a 1000 mg/m
2
/dia de 5-FU durante 4 ou 5 dias em infusão i.v.
contínua. Este curso é repetido no intervalo de 28 dias.
3.4.3. Quando administrado em animais (ratos)
130 mg/m
2
de 5-FU i.p.
4. Ácido Folínico (Leucovorin®) (fator citrovorum)
4.1. Química
O ácido folínico (ácido pteroilglutâmico) consiste de anel pteridina,
ácido para-aminobenzóico (PABA) e ácido glutâmico.
67
Figura C. Estrutura Química do Ácido Folínico (Leucovorin®)
Os folatos também podem conter: (1) hidrógenos extra nas posições
7 e 8 (dihidrofolato) ou 5, 6, 7 e 8 (tetrahidrofolato); (2) unidades de carbono-
único tais como o grupo metil (–CH
3
) em N
5
, o grupo formil (–CHO) em N
5
ou
N
10
, um grupo metileno (–CH
2
–) ou um metenil (=CH–) entre N
5
e N
10
; (3) resí-
duos adicionais de ácido glutâmico ligados à porção -carboxil do glutamato.
4.2. Mecanismo de Ação
Os folatos são essenciais para a síntese de DNA por serem co-
fatores na síntese das purinas e pirimidinas. Também são necessários para as
reações envolvidas no metabolismo dos amino-ácidos. Em todas as reações, os
poliglutamatos são consideravelmente mais ativos que os monoglutamatos. Para
que haja atividade, o folato deve estar na forma tetrahidro, sendo assim mantido
pela enzima dihidrofolato-redutase. Esta enzima reduz o ácido folínico da dieta
em tetrahidrofolato (FH
4
) numa reação de duas etapas, assim como o dihidrofo-
lato (FH
2
) produzido a partir do FH
4
durante a síntese de timidilato. Os antago-
nistas do folato atuam através da inibição da dihidrofolato-redutase.
A nova síntese de purinas requer duas reações de transferência de
um carbono folato-dependente para a inserção de átomos de carbono nas posi-
ções 2 e 8.
68
Os folatos são particularmente importantes para a conversão do
monofosfato de desoxiuridilato (MFDU) em monofosfato de timidilato
(MFTM), que é catalisado pela enzima timilidato-sintase (TS). Está é uma rea-
ção de metilação na qual um folato atua como doador de –CH
3
. Ao contrário das
outras reações folato-dependentes, durante esta reação, o FH
4
é oxidado em FH
2
,
devendo portanto ser reduzido antes que possa atuar novamente. A reação da TS
limita a velocidade de síntese de DNA nos mamíferos.
4.3. Farmacoclínica e Farmacocinética
O ácido folínico é geralmente administrado por via oral, mas há
preparações disponíveis para uso parenteral. No intestino, ele é transportado a-
través da mucosa inalterada. Os folatos são captados pelas células do fígado e
medula óssea por transporte ativo, havendo mecanismos transportadores distin-
tos para o ácido folínico e para os folatos reduzidos e metotrexato. A captação
do folato reduzido mediada pelo transporte é consideravelmente mais eficaz que
aquela do ácido folínico. No interior das células, o ácido folínico é reduzido e
metilado, ou formilado, antes de ser convertido pela poliglutamato-sintase na
forma poliglutamato mediante a adição seqüencial de 2 a 5 porções de glutama-
to. O ácido folínico (um ácido tetrahidrofólico sintético) é convertido de forma
muito mais rápida na forma poliglutamato.
4.4. Dosagem e Programação
4.4.1. Quando administrado em seres humanos
- Dose semanal:
20 mg/m
2
i.v. em bolo (para 425 mg/m
2
no reto, i.v. em bolo no
homem).
4.4.2. Quando administrado em animais (ratos)
- Dose única (no rato):
7 mg/m
2
de ácido folínico i.p. (para 130 mg/m
2
de 5-FU)
Obs.) Há uma relação de compensação de agentes anticancerosos
em diferentes animais com sua toxicidade (Freireich et al.,
1966).
69
4.5. Indicações de Uso do Ácido Folínico (Leucovorin®)
Existem indicações de uso do ácido folínico como uma nova tera-
pêutica auxiliar ao 5-FU na potencialização de sua ação em inibir a síntese de
DNA. O 5-FU bloqueia a enzima TS, que normalmente converte o ácido desoxi-
uridílico em ácido timidílico (um passo essencial na pirimidina), daí ocorrendo a
síntese do DNA. O 5-FU também bloqueia a síntese do RNA por substituição
pelo uracil. O ácido folínico aumenta o pool de folato e estabiliza o complexo
ternário formado entre 5-FdUMP e TS, reduzindo então a atividade desta enzi-
ma. Dessa maneira, a TS desempenha papel importante na progressão a partir de
G1 para dentro da Fase S. O ácido folínico potencializa o efeito do 5-FU sobre a
síntese de DNA aumentando assim as taxas de reposta clínica em pacientes com
câncer colo-retal de 10% com apenas 5-FU para 35% com 5-FU associado ao
ácido folínico (Leucovorin®) (Guillou, 1996).
Figura D. Metabolismo do 5-Fluorouracil + Ácido Folínico
Timidina
fosforilase
Pirimidina
fosforibosil
transferase
Timidilato sintase
Metiltetrahidrofolato
Dihidrofolato
Tetrahidrofolato
ÁCIDO
FOLÍNICO
Dihidrofolato
redutase
70
5. Material Cirúrgico
Tesoura Mayo-Stille de 14 cm (Medlight, Brasil).
Tesoura Metzenbaum de 14 cm (Medlight, Brasil).
Pinça dente de rato de 14 cm (Medlight, Brasil).
Pinça Adison-Brown de 12 cm (Medlight, Brasil).
Pinça de dissecção de 12 cm (Medlight, Brasil).
Pinça Kelly de 14 cm (Medlight, Brasil).
Pinça mosquito de 10 e 12 cm (Medlight, Brasil).
Pinça Crille de 16 cm (Medlight, Brasil).
Porta-Agulha Derf de 12 cm (Medlight, Brasil).
Caixa cirúrgica de 20 x 10 x 8 cm (Medlight, Brasil).
Afastador Desmares de 6,5 cm (Martin).
Lâminas de bisturi n
o
10, 11 e 15 (Kramer, Brasil).
Fios cirúrgicos de mononylon 4-0 e 5-0 (Ethicon, Brasil).
Agulha fenestrada (projetada especificamente para este experimen-
to) de 40 x 12 cm, com 3 e 5 fenestras, e com a ponta romba em
sua extremidade.
6. Vidraria
Becher de 100 mL (Pyrex, Brasil).
Becher de 500 mL (Pyrex, Brasil).
Proveta graduada de 1000 mL (Pyrex, Brasil).
Erlenmeyer de 25 e 100 mL (Pyrex, Brasil).
7. Materiais Diversos
Seringas descartáveis de 1, 3 e 5 mL (BD, Brasil).
Agulhas descartáveis de 13 x 4,5 cm e de 25 x 7 cm (BD, Brasil).
71
Equipo de soro (Sondaplast, Brasil).
Equipo para bomba de infusão enteral/parenteral (B. Braun, Brasil).
Escalpes N
o
19 ou 21 (Venescalp, Brasil).
Luvas cirúrgicas N
o
7,5 e 8 (Lengruber, Brasil).
Luvas de procedimento (Blowtex, EUA).
Filmes para Raio-X (Kodak, Brasil).
Filmes de 35 mm para fotos eme papel Fujifilm ASA 200.
Filmes de 35 mm para fotos em papel Kodak Gold ASA 100.
Filmes de 35 mm para slides Ektachrome ASA 100.
Serpentina de polietileno de 0,5 cm de diâmetro interno e com 8
voltas de 7,5 cm de diâmetro externo.
8. Equipamentos
Banho-Maria modelo 100 (FANEM, Brasil).
Bomba de infusão (B. Braun, Brasil).
Termômetro digital Thermometer MT-520 Mimipa-APPA
Termômetro clínico de 35 a 42ºC (BD, Brasil).
Balança para animais com tara de 0 a 2000 g (Mettler P3, EUA).
Balança de precisão modelo ID-1500 (Filizola, Brasil).
Aparelho de Raio-X Diagnost 92/500 mA (Philips, Holanda).
Microscópio (Nikon, Japão).
Câmera fotográfica monoreflex SLR de 35 mm (Nikon, Japão).
Câmera fotográfica monoreflex SLR de 35 mm (Canon, Japão).
Micrótomo.
Estufa de esterilização.
Autoclave.
Hemocitômetro (Herka, Alemanha).
Agitador magnético.
72
Mesa cirúrgica (confeccionada de madeira compensada, revestida de
laminado plástico) de 34,5 x 29,5 x 21,5 cm, contendo, na superfície superior, um
recipiente de poliestireno para conservar melhor o calor repassado para o animal. A
mesa foi desenvolvida especialmente para o emprego na hipertermia em ratos, e a
sua altura, a mesma do banho-maria, evita a perda de calor pela solução de perfusão
após o seu aquecimento. Sua superfície superior permite angulações para facilitar a
drenagem da solução infundida na cavidade peritoneal.
9. Animais
Foram utilizados ratos Wistar machos, com 8 a 12 semanas de vida,
pesando entre 160 e 300 g, provenientes do Biotério Central da Universidade Fede-
ral do Ceará (UFC). Os animais foram então divididos aleatoriamente em grupos de
6 a 12 ratos para inoculação do tumor de Walker 256 e abrigados a 24ºC em ciclos
luz/escuro de 12 horas, com alimento (ração Fri-Ribe Ratos) e água ad libitum, no
Biotério do Laboratório de Cirurgia Experimental do Departamento de Cirurgia da
UFC.
10. Anestesia
Para os transplantes de manutenção do tumor e implantes no estôma-
go, foi utilizada anestesia com éter dietílico, administrado através de uma câmara
anestésica de PVC. Nos experimentos de hipertermia, os animais foram anestesia-
dos através de uma associação entre a cetamina (90 mg/kg) e a xilazina (10 mg/kg),
administradas simultaneamente por via i.p.
11. Tumor
Foi utilizado o carcinossarcoma 256 de Walker, obtido do Laboratório
de Fisiologia Metabólica (Prof. Rui Curi) do Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, o qual vem sendo mantido no Laboratório de Oncolo-
73
gia Experimental do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC, através
de implantes i.m. sucessivos a cada 7 dias.
12. Preparação do Inóculo e Repicagem
Após 7 a 8 dias de evolução, o tumor é retirado do animal doador e
colocado em uma placa de Petri contendo 8 mL de Ringer-Lactato e 2 mL de clo-
ranfenicol (100 mg/mL). Em seguida, transfere-se o tecido sem focos necróticos
para outra placa de Petri contendo também Ringer-Lactato e cloranfenicol na mes-
ma concentração, onde então este é triturado em pequenos fragmentos de aproxi-
madamente 2 mm
3
, e aí permanece incubado por 5 min. Os fragmentos são então
colocados no homogeneizador de Potter, ou agitador magnético, e macerados na
mesma solução anteriormente mencionada, sendo o homogenato inoculado por via
i.m. na coxa direita do animal (1 mL contendo cerca de 10
6
células). Uma suspen-
são de células preparadas com a mesma metodologia foi também utilizada para o
implante do tumor no estômago.
13. Implante do Tumor no Estômago
Os ratos, mantidos em jejum por 12 horas com água ad libitum, foram
anestesiados por via inalatória com éter dietílico. Após antisepsia da parede abdo-
minal do animal com povidine (polivinilpirrolidona), foi realizada uma incisão me-
diana, com elevação de 5 cm do estômago para fora da incisão. Um catéter de 2
mm de diâmetro foi então introduzido através da boca, orofaringe e esôfago, che-
gando até o estômago (Figura E). Através deste tubo, foi injetado 1 mL da suspen-
são do inóculo tumoral em 2 sítios gástricos: 0,5 mL da suspensão na grande curva-
tura e 0,5 mL na pequena curvatura. Foi então realizado o pinçamento (clampeadu-
ra) gástrico com uma pinça hemostática concomitantemente à introdução da sus-
pensão do tumor nos sítios previamente referidos (Figura E). A sutura da parede foi
executada com fio mononylon 4-0. Desde o pós-operatório imediato, os animais
ficaram sob dieta ad libitum, tanto para água como para alimentos sólidos.
74
Figura E. Inoculação e Manutenção do carcinossarcoma de Walker 256
75
14. Grupos de Tratamento
Para o estabelecimento da metodologia do implante do tumor no
estômago, e para a avaliação da efetividade do tratamento com a quimioterapia
isolada, hipertermia associada à quimioterapia ou um imunomodulador + quimi-
oterapia isolada ou em associação com a hipertermia, os animais foram dividi-
dos em 3 grupos de 6 sub-grupos cada, de acordo com a droga utilizada (Ta-
xol®, 5-FU e 5-FU + Leucovorin), tendo os 3 grupos o mesmo Grupo Controle,
conforme pode ser visto abaixo. Todos os animais foram observados diariamen-
te até o dia de sua morte espontânea ou por sacrifício no 90
o
dia pós-implante.
Grupo Controle: 12 animais inoculados com o tumor para avaliação
do índice de pega e da sobrevida.
Grupo 1 Taxol® (Paclitaxel)
:
Sub-Grupo TAX-1: 07 animais submetidos à quimioterapia isolada
3 dias após o implante do tumor;
Sub-Grupo TAX-2: 06 animais submetidos à quimioterapia + hiper-
termia 3 dias após o implante do tumor;
Sub-Grupo TAX-3: 10 animais submetidos à quimioterapia isolada
7 dias após o implante do tumor;
Sub-Grupo TAX-4: 07 animais submetidos à quimioterapia + hiper-
termia 7 dias após o implante do tumor;
Sub-Grupo TAX-5: 09 animais submetidos à quimioterapia isolada
10 dias após o implante do tumor;
Sub-Grupo TAX-6: 09 animais submetidos à quimioterapia + hiper-
termia 10 dias após o implante do tumor.
76
Grupo 2 5-FU (5-Fluorouracil)
:
Sub-Grupo 5FU-1: 09 animais submetidos à quimioterapia isolada 3
dias após o implante do tumor;
Sub-Grupo 5FU-2: 11 animais submetidos à quimioterapia + hiper-
termia 3 dias após o implante do tumor;
Sub-Grupo 5FU-3: 07 animais submetidos à quimioterapia isolada 7
dias após o implante do tumor;
Sub-Grupo 5FU-4: 10 animais submetidos à quimioterapia + hiper-
termia 7 dias após o implante do tumor;
Sub-Grupo 5FU-5: 06 animais submetidos à quimioterapia isolada
10 dias após o implante do tumor;
Sub-Grupo 5FU-6: 08 animais submetidos à quimioterapia + hiper-
termia 10 dias após o implante do tumor.
Grupo 3 5-FU + Leucovorin® (5-Fluorouracil + Ácido Folínico)
:
Sub-Grupo 5FL-1: 09 animais submetidos à quimioterapia isolada 3
dias após o implante do tumor;
Sub-Grupo 5FL-2: 10 animais submetidos à quimioterapia + hiper-
termia 3 dias após o implante do tumor;
Sub-Grupo 5FL-3: 09 animais submetidos à quimioterapia isolada 7
dias após o implante do tumor;
Sub-Grupo 5FL-4: 12 animais submetidos à quimioterapia + hiper-
termia 7 dias após o implante do tumor;
Sub-Grupo 5FL-5: 09 animais submetidos à quimioterapia isolada
10 dias após o implante do tumor;
Sub-Grupo 5FL-6: 11 animais submetidos à quimioterapia + hiper-
termia 10 dias após o implante do tumor.
77
15. Técnica Hipertérmica
A hipertermia de corpo inteiro utilizada nesses experimentos foi
obtida através de uma perfusão peritoneal, por um período de 1 hora, de uma
solução de Ringer-Lactato previamente aquecida em banho-maria, denominada
de perfusão peritoneal hipertérmica contínua (PPHC). Inicialmente, a solução
foi impulsionada, por bomba de fluxo contínuo, através de um equipo de polieti-
leno conectado a uma serpentina, que por sua vez foi mantida dentro de um ba-
nho-maria a 49ºC. Daí, a solução caminhava através de outro tubo de polietileno
conectado a um escalpe N
o
19 ou 21, introduzido no quadrante inferior esquerdo
do abdome do animal (fossa ilíaca esquerda). A bomba foi programada para um
fluxo de infusão de 8,3 mL/min. O animal foi mantido na posição de Trende-
lemburg, numa angulação de 6º, sendo a drenagem realizada pela gravidade a-
través de uma agulha fenestrada de 40 x 12 cm, de ponta romba, introduzida por
meio de um guia no quadrante superior direito do abdome (hipocôndrio direito)
e conectada a um tubo de polietileno. A temperatura do animal foi mensurada
durante todo o experimento através de termômetros colocados na cavidade peri-
toneal e no reto. O animal foi contido e mantido sob anestesia dentro de um re-
cipiente de poliestireno aberto na parte superior.
16. Técnica Quimioterápica
A quimioterapia foi realizada usando-se 3 diferentes drogas: 1) Pa-
clitaxel (Taxol®), em dose única de 25 mg/m
2
, por via i.p., 2 horas antes de ini-
ciar a hipertermia; 2) 5-FU (5-Fluorouracil), em dose única de 130 mg/m
2
, por
via i.p., 2 horas antes de iniciar a hipertermia; e 3) Ácido Folínico (Leucovo-
rin®), em dose única de 7 mg/m
2
, por via i.p., 15 min. antes de iniciar a quimio-
terapia com 5-FU.
78
17. Estudos Morfológicos
As preparações tanto em H&E como em IHM foram oportunamente
estudadas pelo pesquisador bem como pelo patologista. Todos os animais mor-
tos espontaneamente ou sacrificados foram submetidos a detalhado estudo ne-
croscópico, e análises macro e microscópicas. Fragmentos do tumor dos animais
foram fixados em formol a 10%, incluídos em parafina, cortados em micrótomo
na espessura de 4 a 6 e corados pela técnica da Hematoxilina-Eosina (H&E).
As preparações de imunohistoquímica foram realizadas através da técnica imu-
noenzimática, cuja reação utiliza o complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC),
como descrito por Hsu e cols. (1981).
18. Lavagem e Esterilização do Material
O material cirúrgico foi lavado em água destilada e esterilizado em
autoclave a 110ºC por 2 horas a 2 atm. A vidraria foi lavada com água destilada
e esterilizada em estufa a 110ºC por 2 horas.
19. Técnica Citogenética para Tumor de Walker 256 Ascítico
1) Em rato Wistar com tumor ascítico de Walker 256 implantado há
10 dias, introduz-se 1 mL de colchicina no abdome e aguarda-se
por 2 horas;
2) Aspira-se 5 mL de ascite hemática, transfere-se para um tubo fal-
con e centrifuga-se por 9 minutos a 1000 rpm (velocidade 2);
3) Despreza-se o sobrenadante, restando as células e 0,5 mL de
meio;
4) Com uma pipeta Pasteur, homogeniza-se o pellet em pequenos
volumes, lentamente;
79
5) Recolhe-se o material total com a pipeta e adiciona-se 5 mL de
hipotônica KCl no tubo falcon, previamente aquecida a 37ºC;
6) Goteja-se o material na hipotônica, homogeneizando lentamente
(retira-se do fundo pelas paredes e aplica-se no fundo novamente
com bastante cuidado);
7) Leva-se ao banho-maria por 25 minutos. Neste intervalo, homo-
geneizar 2 a 3 vezes. Adiciona-se 0,5 mL de fixador. Lisar hemá-
cias e parar hipotônica;
8) Centrifuga-se por 9 minutos a 1000 rpm (velocidade 2). Despre-
za-se o sobrenadante, restando 0,5 mL de meio. Homogeneizar
pelas paredes;
9) Recolhe-se todo o material na pipeta e acrescenta-se 5 mL de fi-
xador no tubo;
10) Goteja-se o material no fixador e homogeneiza-o novamente;
11) Centrifuga-se por 9 minutos a 1000 rpm (velocidade 2). Repete-
se todo o procedimento (9-11 minutos) por mais 2 vezes;
12) Na última centrifugação, deixa-se 1 mL com o pellet;
19.1. Lâmina
(previamente gelada em H
2
O destilada)
13) Segura-se a lâmina com uma pinça e goteja-se o material a a-
proximadamente 30 cm;
14) Deixa-se a lâmina secar inclinada. Cora-se com giemsa por 4-5
minutos. Deixa-se secar, depois de lavada com H
2
O destilada;
15) Caso ainda haja citoplasma, prepara-se novo fixador (2:1 – me-
tanol : ácido acético) e faz-se mais uma lavagem.
80
19.2. Adaptações
Hipotônica = 1 KCl 0,075 M : 1 citrato de sódio 0,4%.
Fixador = 2,5 metanol : 1 ácido acético.
Lavagem com fixador: no mínimo 8 vezes.
20. Contagem de Cromossomos
A contagem de cromossomos foi realizada pela análise visual quan-
titativa.
21. Documentação Fotográfica
As microfotografias foram obtidas através de equipamento fotográ-
fico Nikon acoplado a microscópio óptico comum Nikon com aumentos de 100
e 400x. As demais fotos em papel foram obtidas com câmeras fotográficas mo-
noreflex Canon e Nikon, munidas de objetivas de 35 a 105 e 35 a 70 mm, res-
pectivamente.
22. Análise Estatística
22.1. Paclitaxel
(Taxol®), 5-FU (5-Fluorouracil) e Ácido Folínico
(Leucovorin®)
O teste Kaplan-Meier (KM) é um estimador não-paramétrico utili-
zado para a estimação da curva de sobrevivência,
S
ˆ
(t) =
Π
j:t
j
<t
j
j
n
d
1
81
até a ocorrência de algum evento de interesse (morte, por exemplo), onde d
j
é o
número de indivíduos que apresentaram o evento ou foram censurados no tempo
t
j
, n
j
é o número de indivíduos em risco e
S
ˆ
(t) é a probabilidade de que o tempo
de ocorrência de um evento seja maior do que um tempo t, P[T>t], t>
0 (Soares
& Colosimo, 1995).
A variável
S
ˆ
(t) descreve a probabilidade estimada de que um indi-
víduo sobreviva até o tempo t ou mais. A censura é a observação parcial da res-
posta. Para este estudo, foram considerados censurados os dados que apresenta-
ram tempo de sobrevivência >90 dias.
Para comparar as curvas de sobrevivência entre os grupos de trata-
mento, foram utilizados os testes Log-Rank (Mantel, 1966), Wilcoxon e Razão
de Verossimilhança (Cox & Oakes, 1984).
As medidas de mediana para a variável tempo (dias) foram calcula-
das por
interpolação utilizando-se as informações das estimativas da sobrevivência.
22.2. Ácido Folínico
(Leucovorin®) + 5-FU (5-Fluorouracil)
A metodologia estatística utilizada para a análise do estudo longitu-
dinal da temperatura dos ratos foi baseada nos modelos para medidas repetidas
no tempo (Singer & Andrade, 1986). Esta modelagem adotada é equivalente à
de parcelas subdivididas (ou split-plot), sendo que nesta situação, o tempo (min)
é o fator considerado na sub-parcela. Tal abordagem é também conhecida como
parcela subdividida no tempo (Montgomery, 1991).
A análise é feita da forma usual através da Análise de Variância,
sendo que, para a sub-parcela (tempo), e na interação Tempo versus Tratamento,
são utilizadas, em algumas situações, uma correção para os graus de liberdade
desses efeitos e do resíduo 2. As correções utilizadas foram baseadas no teste F-
Conservativo (Singer & Andrade, 1986). Para os testes de comparação de mé-
dias a posteriori, foi utilizado o teste de Tukey (Winer, 1971).
82
RESULTADOS
1. Paclitaxel (Taxol®)
1.1. Resultados Experimentais
O Grupo Controle, constituído por doze (12) animais sem tratamen-
to, obteve uma sobrevida média igual a 13,25 0,53.
Todos os Grupos Experimentais Taxol, isolados ou associados à
hipertermia (HT) no 3
o
, 7
o
e 10
o
dias, mostraram diferença estatisticamente sig-
nificante (p < 0,0001 – Teste Log-Rank) quando comparados ao Grupo Controle
(Tabela I).
Tabela I. Testes para a igualdade das curvas estimadas de Kaplan-Meier
entre os grupos
Teste Qui-Quadrado g. l. Pr > Qui-Quadrado
Log-Rank 75,5954 6 < ,0001
Wilcoxon 77,7887 6 < ,0001
-2Log (RV) 33,5838 6 < ,0001
g.l. = graus de liberdade; Pr = probabilidade; RV = Razão de verossimilhança
Para a curva de sobrevivência de Kaplan-Meier, todos os Grupos
Experimentais mostraram maior probabilidade de sobrevida que o Grupo Con-
trole, com especial destaque para os grupos no 3
o
dia com Taxol isolado e Taxol
associado à hipertermia. Os grupos no 7
o
dia mostraram que a probabilidade de
sobrevida relativa ao tratamento com Taxol associado à hipertermia superou o
Taxol isolado. Os grupos no 10
o
dia mostraram que a probabilidade de sobrevida
relativa ao tratamento com Taxol associado à hipertermia foi ligeiramente maior
que o Taxol isolado (Figura 1).
83
Figura 1. Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para todos os grupos
(Controle e Taxol)
Todos os Grupos Experimentais, exceto Controle e Taxol no 3
o
dia,
isolados ou associados à hipertermia no 3
o
, 7
o
e 10
o
dias, não mostraram diferen-
ça estatisticamente significante (p < 0,4402 – Teste Log-Rank) quando compa-
rados entre si (Tabela II).
Tabela II. Testes para a igualdade das curvas estimadas de Kaplan-Meier
entre os grupos, exceto Controle e Taxol no 3
o
dia
Teste Qui-Quadrado g. l. Pr > Qui-Quadrado
Log-Rank 3,7549 4 < ,4402
Wilcoxon 4,2795 4 < ,3695
-2Log (RV) 5,7659 4 < ,2173
g.l. = graus de liberdade; Pr = probabilidade; RV = Razão de verossimilhança
Para a curva de sobrevivência de Kaplan-Meier, excetuando-se os
grupos Controle e Taxol no 3
o
dia, observa-se que os grupos nos 3
o
e 7
o
dias
com Taxol associado à hipertermia mostraram uma probabilidade de sobrevida
de 50% (Figura 2).
84
Figura 2. Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para todos os grupos,
exceto Controle e Taxol no 3
o
dia
O Grupo Experimental Taxol isolado no 3
o
dia, em relação ao grupo
associado à hipertermia no 3
o
dia, não mostrou diferença estatisticamente signi-
ficante (Figura 3).
Figura 3. Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Taxol no
3
o
dia e Taxol no 3
o
dia + HT no 3
o
dia
85
O Grupo Experimental Taxol isolado no 7
o
dia, em relação ao grupo
associado à hipertermia no 7
o
dia, mostrou diferença estatisticamente significan-
te (p < 0,01 – Teste Log-Rank) (Figura 4).
Figura 4. Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Taxol no
7
o
dia e Taxol no 7
o
dia + HT no 7
o
dia
O Grupo Experimental Taxol isolado no 10
o
dia, em relação ao gru-
po associado à hipertermia no 10
o
dia, não mostrou diferença estatisticamente
significante (Figura 5).
Figura 5. Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Taxol no
10
o
dia e Taxol no 10
o
dia + HT no 10
o
dia
86
O Grupo Experimental Taxol isolado no 3
o
dia, em relação ao grupo
isolado no 7
o
dia, mostrou diferença estatisticamente significante (p < 0,001 –
Teste Log-Rank) (Figura 6).
Figura 6. Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Taxol no
3
o
dia e Taxol no 7
o
dia
O Grupo Experimental Taxol isolado no 3
o
dia, em relação ao grupo
associado à hipertermia no 10
o
dia, mostrou diferença estatisticamente signifi-
cante (p < 0,01 – Teste Log-Rank) (Figura 7).
Figura 7. Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Taxol no
3
o
dia e Taxol no 10
o
dia + HT no 10
o
dia
87
O Grupo Experimental Taxol isolado no 3
o
dia, em relação ao grupo
associado à hipertermia no 7
o
dia, não mostrou diferença estatisticamente signi-
ficante (Figura 8).
Figura 8. Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Taxol no
3
o
dia e Taxol no 7
o
dia + HT no 7
o
dia
O Grupo Experimental Taxol isolado no 3
o
dia, em relação ao grupo
isolado no 10
o
dia, não mostrou diferença estatisticamente significante.
1.2. Exames Histopatológicos (H&E)
O tumor de Walker 256, em sua fase evolutiva inicial de 3 dias, está
presente na submucosa dos animais experimentais, com células poligonais dis-
postas em mosaico, não atingindo a mucosa, e estando separada desta pela mus-
cular da mucosa (Figura 9). Nesta fase, o tumor foi submetido a tratamento com
Taxol associado à hipertermia.
88
Figura 9. Muscular da mucosa separa nitidamente o tumor da mucosa.
Tratamento com Taxol + HT no 3
o
dia (HE) 200X
O carcinossarcoma 256 de Walker, em sua fase evolutiva avançada
de 10 dias, infiltra a musculatura com células fusiformes, sugerindo assim, dife-
renciação sarcomatosa. Nesta fase, utilizou-se o Taxol isoladamente e as células
tumorais estavam bem preservadas, não sendo observada hemorragia (Figura
10).
Figura 10. Tumor infiltra a musculatura com células fusiformes (sarcoma).
Tratamento com Taxol no 10
o
dia (HE) 200X
89
Em fase evolutiva inicial de 3 dias, o tumor evidencia-se em toda a
espessura da parede gástrica, inclusive na mucosa, onde observam-se áreas de
necrose (Figura 11). Em fase evolutiva avançada de 10 dias, o tumor foi subme-
tido a tratamento com Taxol associado à hipertermia. O tumor encontra-se com
extensas áreas de necrose e hemorragia (Figura 12).
Figura 11. Tumor em toda a espessura da parede gástrica, áreas de necrose
na mucosa. Tratamento com Taxol + HT no 3
o
dia (HE) 40X
Figura 12. Tumor com extensas áreas de necrose e hemorragia. Tratamento
com Taxol + HT no 10
o
dia (HE) 200X
90
Tumor na submucosa, em torno de vaso hiperemiado, com linfóci-
tos circundantes (Figura 13).
Figura 13. Tumor na submucosa, vaso hiperemiado, com linfócitos circun-
dantes. Tratamento com Taxol (HE) 200X
O tumor invade o pâncreas, entremeando-se aos ácinos pancreáticos
(Figura 14) e infiltra o tecido adiposo com células poligonais e aspecto de tumor
epitelióide (Figura 15).
Figura 14. Tumor invade o pâncreas, entremeando-se aos ácinos. Trata-
mento com Taxol no 3
o
dia (HE) 200X
91
Figura 15. Tumor infiltra o tecido adiposo com células poligonais (epiteliói-
de). Tratamento com Taxol + HT (HE) 100X
Após tratamento combinado de Taxol com hipertermia, o tumor
apresentou corpos apoptóticos (Figura 16).
Figura 16. Tumor apresentando corpos apoptóticos (seta). Tratamento com
Taxol + HT no 3
o
dia (HE) 400X
92
Nos casos com sobrevida de 108 dias (n = 2) submetidos a trata-
mento com Taxol associado à hipertermia, evidenciaram-se ninhos de células
tumorais em meio à extensa hemorragia (Figura 17).
Figura 17. Ninhos de células tumorais (setas) em meio à extensa hemorragi-
a. Tratamento com Taxol + HT no 3
o
dia (HE) 200X
Em fase evolutiva avançada de 10 dias, o carcinossarcoma 256 de
Walker submetido a tratamento com Taxol associado à hipertermia, apresenta res-
posta terapêutica parcial, com sobrevida de 1 ano, 3 meses e 5 dias. O tumor apre-
senta-se em pequenos agrupamentos em meio à extensa hemorragia (Figura 18).
Figura 18. Tumor em pequenos agrupamentos (setas) em meio à extensa
hemorragia. Tratamento com Taxol + HT no 10
o
dia (HE) 100X
93
1.3. Exames Imunohistoquímicos (IHM)
O tumor de Walker 256 utilizado neste trabalho apresenta-se essen-
cialmente sarcomatoso, uma vez que, à luz da imunohistoquímica, pelo método
ABC, a grande maioria dos casos apresenta 100% de células vimentinas positi-
vas (Figura 19), assim como 100% de células queratinas negativas (Figura 20).
Figura 19. Tumor 100% vimentina positiva. Tratamento com Taxol + HT
no 3
o
dia. IHQ: vimentina
Figura 20. Tumor 100% queratina negativa. Tratamento com Taxol. IHQ:
queratina
94
Quando o carcinossarcoma de Walker 256 foi submetido ao trata-
mento com Taxol associado à hipertermia, a expressão sarcomatosa continha
vimentina positiva em 100% das células da maioria dos grupos. Já em outros
grupos, esta expressão se atenua e a marcação vimentina positiva é de apenas
40% (Figura 21).
Figura 21. Tumor 40% vimentina positiva. Tratamento com Taxol + HT no
3
o
dia. IHQ: vimentina
2. 5-Fluorouracil (5-FU)
2.1. Resultados Experimentais
O Grupo Controle, constituído por doze (12) animais sem tratamen-
to, obteve uma sobrevida média igual a 13,25 0,53.
Os resultados dos testes apresentados na Tabela III foram unânimes
ao mostrarem que, para um nível de significância p < 0,01, pelo menos um dos
grupos de tratamento apresentou uma estimativa diferente para a curva estimada
de Kaplan-Meier.
95
Tabela III. Testes para a igualdade das curvas estimadas de Kaplan-Meier
entre o grupos
Teste Qui-Quadrado g. l. Pr > Qui-Quadrado
Log-Rank 52,7220 6 < ,0001
Wilcoxon 49,7220 6 < ,0001
-2Log (RV) 56,5731 6 < ,0001
g.l. = graus de liberdade; Pr = probabilidade; RV = Razão de verossimilhança
Utilizando-se o teste Log-Rank para comparar o Grupo Controle
com os demais Grupos Experimentais, concluiu-se que os grupos QT5FU no 3
o
e 10
o
dias e QT5FU associado à hipertermia no 7
o
e 10
o
dias mostraram diferen-
ça estatisticamente significante (p < 0,002 e p < 0,003, respectivamente). Já os
grupos QT5FU associado à hipertermia no 3
o
dia e QT5FU no 7
o
dia não mos-
traram diferença estatisticamente significante em relação ao Grupo Controle pe-
lo mesmo teste (p < 0,12 e p < 0,14, respectivamente).
Tabela IV. Teste Log-Rank para a igualdade das curvas estimadas de Ka-
plan-Meier do Grupo Controle versus os demais grupos indivi-
dualmente
Tratamento Qui-Quadrado g. l. Pr > Qui-Quadrado
QT5FU
3 dias
09,4159 1 0,0022 (ns)
QT5FU
3 dias
+ HT
3 dias
02,4132 1 0,1203 (ns)
QT5FU
7 dias
03,9967 1 0,1456 (ns)
QT5FU
7 dias
+ HT
7 dias
09,2752 1 0,0023 (ns)
QT5FU
10 dias
26,0059 1 < ,0001 (ns)
QT5FU
10 dias
+ HT
10 dias
08,6714 1 0,0032 (ns)
g.l. = graus de liberdade; Pr = probabilidade; ns = não significativo
96
Para a curva de sobrevivência de Kaplan-Meier, os grupos QT5FU
no 3
o
e 10
o
dias mostraram maior probabilidade de sobrevida em relação ao
Grupo Controle, enquanto que apenas o grupo QT5FU associado à hipertermia
no 7
o
dia mostrou pequena probabilidade de sobrevida em relação ao Grupo
Controle (Figura 22).
Figura 22. Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para todos os grupos
(Controle e QT5FU)
Para a curva de sobrevivência de Kaplan-Meier, o grupo QT5FU no
3
o
dia mostrou pequena probabilidade de sobrevida (25%) em relação ao Grupo
Controle (Figura 23).
Figura 23. Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Contro-
le e QT5FU no 3
o
dia
97
Figura 24. Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Contro-
le e QT5FU + HT no 7
o
dia
Figura 25. Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Contro-
le e QT5FU no 10
o
dia
Utilizando-se o teste Log-Rank para comparar o grupo QT5FU no
3
o
dia com o grupo QT5FU associado à hipertermia no 3
o
dia, concluiu-se que a
curva de Kaplan-Meier dos dois grupos é significativamente diferente (p =
0,0113) uma da outra.
98
Utilizando-se o teste Log-Rank para comparar o grupo QT5FU no
7
o
dia com o grupo QT5FU associado à hipertermia no 7
o
dia, concluiu-se que a
curva de Kaplan-Meier dos dois grupos não é significativamente diferente (p =
0,3753) uma da outra.
Utilizando-se o teste Log-Rank para comparar o grupo QT5FU no
10
o
dia com o grupo QT5FU associado à hipertermia no 10
o
dia, concluiu-se que
a curva de Kaplan-Meier dos dois grupos é significativamente diferente (p =
0,0026) uma da outra.
2.2. Exames Histopatológicos (H&E)
O carcinossarcoma de Walker 256, em sua fase evolutiva inicial de
3 dias, apresentou uma extensa área de necrose coagulativa, onde se preservam
os contornos das células e dos núcleos, não ocorrendo lise celular. Nesta fase, o
tumor foi submetido a tratamento com 5-FU isolado (Figura 26), e as células
preservaram sua forma.
Figura 26.
Tumor com necrose coagulativa extensa. Contornos celulares e nu-
cleares preservados. Tratamento com 5-FU no 3
o
dia (HE) 100X
99
Nesta mesma fase evolutiva inicial de 3 dias, as células do tumor de
Walker 256 entremeiam-se às glândulas na mucosa gástrica, destruindo-as. Nes-
ta fase, o tumor foi tratado com 5-FU isolado (Figura 27).
Figura 27. Tumor entre as glândulas da mucosa (setas), destruindo-as. Tra-
tamento com 5-FU no 3
o
dia (HE) 400X
Em fase evolutiva intermediária de 7 dias, o tumor de Walker 256
manifesta-se com células poligonais tipicamente epitelióides, além de células
fusiformes tipicamente sarcomatosas (Figura 28). Nesta fase, o tratamento foi à
base de 5-FU isolado.
Figura 28.
Tumor com células poligonais (epitelióides). Presença de células fusi-
formes (mesenquimais) Tratamento com 5-FU no 7
o
dia (HE) 200X
100
O tumor em estudo, quando tratado com 5-FU isolado, aos 7 dias de
evolução, apresenta-se com extensa área de necrose (Figura 29).
Figura 29. Tumor com extensa necrose. Há lise tumoral. Tratamento com
5-FU no 7
o
dia (HE) 100X
O tumor em sua fase evolutiva de 7 dias, ao ser tratado com 5-FU
isolado, apresenta-se infiltrando o pâncreas e com pequena área de necrose (Fi-
gura 30).
Figura 30. Tumor infiltrando o pâncreas. Há pouca necrose. Tratamento
com 5-FU no 7
o
dia (HE) 200X
101
O tumor de Walker 256, na sua fase evolutiva avançada de 10 dias,
apresenta bastante hemorragia intratumoral ao ser tratado com 5-FU associado à
hipertermia (Figura 31).
Figura 31. Hemorragia intratumoral. Tratamento com 5-FU + HT no 10
o
dia (HE) 100X
Observa-se ainda que o carcinossarcoma de Walker 256, na sua fase
evolutiva avançada de 10 dias, sob tratamento com 5-FU isolado, evidencia bas-
tante tecido tumoral, com considerável hemorragia e acentuado edema (áreas
esbranquiçadas), correspondendo ao que se denomina mucosite focal (Figura
32).
Figura 32.
Tumor com hemorragia à esq. Muscular da mucosa ao meio. Edema repre-
senta a mucosite focal à dir. Tratamento com 5-FU no 10
o
dia (HE) 200X
102
2.3. Exames Imunohistoquímicos (IHM)
O tumor de Walker 256 utilizado neste trabalho mostrou ser essen-
cialmente sarcomatoso, uma vez que, à luz da imunohistoquímica pelo método
ABC, apresenta-se em 100% das células vimentina positivas (Figura 33), assim
como, nas queratinas negativas (Figura 34).
Figura 33. Tumor 100% vimentina positiva em toda sua extensão, exceto
mucosa. Tratamento com 5-FU no 7
o
dia. IHQ: vimentina
Figura 34. Tumor 100% queratina negativa, com controle queratina positi-
va à dir. Tratamento com 5-FU no 7
o
dia. IHQ: queratina
103
Os estudos imunohistoquímicos do tumor de Walker 256 implanta-
do nos estômagos de rato, neste trabalho, revelaram ser o tumor essencialmente
sarcomatoso, com 100% de positividade para a vimentina. Todavia, no epitélio
que apresenta vimentina negativa, há uma célula vimentina positiva isolada – a
chamada célula de Langherans – que são células intra-epiteliais apresentadoras
de antígenos (Figura 35).
Figura 35.
Tumor 100% vimentina positiva. Presença de célula de Langherans (vi-
mentina +) (seta). Tratamento com 5-FU no 7
o
dia. IHQ: vimentina
3. Ácido Folínico (Leucovorin®) (LEU)
3.1. Resultados Experimentais
Os resultados dos testes Log-Rank e Wilcoxon apresentados na Ta-
bela V mostraram que, para um nível de significância p < 0,01, pelo menos um
dos Grupos Experimentais apresenta uma estimativa diferente para a curva de
Kaplan-Meier. Resultado este também observado pela análise da Figura 36.
104
Tabela V. Teste Log-Rank para a igualdade das curvas estimadas de Ka-
plan-Meier do Grupo Controle versus os demais grupos individu-
almente
Tratamento Qui-Quadrado g. l. Pr > Qui-Quadrado
(5FU)
3 dias
+ (LEU)
3 dias
03,5334 1 0,0601 (ns)
(5FU)
7 dias
+ (LEU)
7 dias
07,5747 1 0,0059 (*)*
(5FU)
10 dias
+ (LEU)
10 dias
08,1178 1 0,0044 (*)*
(5FU+LEU)
3 dias
+ HT
3 dias
10,8085 1 0,0010 (*)*
(5FU+LEU)
7 dias
+ HT
7 dias
06,1031 1 0,0135 (**)
(5FU+LEU)
10 dias
+ HT
10 dias
10,3414 1 0,0013 (*)*
g.l. = graus de liberdade; Pr = probabilidade; ns = não significativo; * = significativo a 1%; **
= significativo a 5%
Figura 36. Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para todos os grupos
(Controle, 5FU+LEU e 5FU+LEU+HT)
105
Figura 37. Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Contro-
le e (5FU) + (LEU) no 7
o
dia
Figura 38. Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Contro-
le e (5FU) + (LEU) no 10
o
dia
106
Figura 39. Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Contro-
le e (5FU+LEU) + HT no 3
o
dia
Figura 40. Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Contro-
le e (5FU+LEU) + HT no 7
o
dia
107
Figura 41. Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos Contro-
le e (5FU+LEU) + HT no 10
o
dia
Tabela VI. Teste Log-Rank para a igualdade das curvas estimadas de Ka-
plan-Meier do Grupo (5FU) + (LEU) no 3
o
dia versus os demais
grupos individualmente
Tratamento Qui-Quadrado g. l. Pr > Qui-Quadrado
(5FU)
7 dias
+ (LEU)
7 dias
1,6182 1 0,2033 (ns)*
(5FU)
10 dias
+ (LEU)
10 dias
1,6050 1 0,2052 (ns)*
(5FU+LEU)
3 dias
+ HT
3 dias
3,7114 1 0,0540 (*)**
(5FU+LEU)
7 dias
+ HT
7 dias
0,2294 1 0,6320 (ns)*
(5FU+LEU)
10 dias
+ HT
10 dias
2,7380 1 0,0980 (ns)*
g.l. = graus de liberdade; Pr = probabilidade; ns = não significativo; * = significativo a 5%
108
Figura 42. Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos (5FU) +
(LEU) no 3
o
dia e (5FU+LEU) + HT no 3
o
dia
Tabela VII. Teste Log-Rank para a igualdade das curvas estimadas de Ka-
plan-Meier do Grupo (5FU) + (LEU) no 7
o
dia versus os demais
grupos individualmente
Tratamento Qui-Quadrado g. l. Pr > Qui-Quadrado
(5FU)
10 dias
+ (LEU)
10 dias
0,0775 1 0,7807 (ns)
(5FU+LEU)
3 dias
+ HT
3 dias
0,5080 1 0,4760 (ns)
(5FU+LEU)
7 dias
+ HT
7 dias
2,6033 1 0,1066 (ns)
(5FU+LEU)
10 dias
+ HT
10 dias
0,0319 1 0,8582 (ns)
g.l. = graus de liberdade; Pr = probabilidade; ns = não significativo
109
Figura 43. Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos (5FU) +
(LEU) no 7
o
dia e (5FU+LEU) + HT no 7
o
dia
Tabela VIII. Teste Log-Rank para a igualdade das curvas estimadas de
Kaplan-Meier do Grupo (5FU) + (LEU) no 10
o
dia versus os
demais grupos individualmente
Tratamento Qui-Quadrado g. l. Pr > Qui-Quadrado
(5FU+LEU)
3 dias
+ HT
3 dias
1,0457 1 0,3065 (ns)
(5FU+LEU)
7 dias
+ HT
7 dias
1,3162 1 0,2513 (ns)
(5FU+LEU)
10 dias
+ HT
10 dias
0,1339 1 0,7144 (ns)
g.l. = graus de liberdade; Pr = probabilidade; ns = não significativo
110
Figura 44. Estimativas das curvas de Kaplan-Meier para os grupos (5FU) +
(LEU) no 10
o
dia e (5FU+LEU) + HT no 10
o
dia
Tabela IX. Teste Log-Rank para a igualdade das curvas estimadas de Ka-
plan-Meier do Grupo (5FU+LEU) + HT no 3
o
dia versus os de-
mais grupos individualmente
Tratamento Qui-Quadrado g. l. Pr > Qui-Quadrado
(5FU+LEU)
7 dias
+ HT
7 dias
3,4870 1 0,0619 (ns)
(5FU+LEU)
10 dias
+ HT
10 dias
0,0050 1 0,9435 (ns)
g.l. = graus de liberdade; Pr = probabilidade; ns = não significativo
As médias no tempo 0 (quando se inicia o tratamento com hiper-
termia) não diferem tanto para os grupos 5FU associado à HT quanto para os
grupos 5FU + LEU associado à HT. Em todos os outros tempos (20, 30, 40, 50 e
60 minutos), as médias de temperatura dos grupos 5FU associado à HT supera-
ram as dos grupos 5FU + LEU associado à HT (Quadro 1).
111
Quadro 1. Teste de Tukey para a comparação das médias (
5%
= 1,16)
Tempo
(min.)
Tratamento
Média
(n = 25)
Desvio-
padrão
Comparação*
0
5FU+HT
(5FU+LEU) +HT
36,70
37,22
0,49
0,69
a b
a b
20
5FU+HT
(5FU+LEU) +HT
38,59
37,76
1,06
1,68
a b
b
30
5FU+HT
(5FU+LEU) +HT
39,02
37,80
1,36
1,96
a b
b
40
5FU+HT
(5FU+LEU) +HT
39,25
37,73
1,47
2,01
a b
b
50
5FU+HT
(5FU+LEU) +HT
39,23
37,78
1,57
1,75
a b
b
60
5FU+HT
(5FU+LEU) +HT
39,19
37,75
1,50
1,79
a b
b
*Médias com letras iguais não diferem estatisticamente
As curvas observadas na Figura 45 mostram nitidamente que os
grupos tratados com 5FU associado à HT mantêm uma média de temperatura
maior que os grupos tratados com 5FU + LEU associado à HT.
32
34
36
38
40
42
44
0 102030405060
Tempo (min)
Temperatura
5FU+HT (5FU+LEU)+HT
5FU+HT Média (5FU+LEU)+HT Média
112
Figura 45. Valores observados e valores médios da temperatura dos ani-
mais ao longo do tempo (min.) em cada grupo experimental
A plotagem das temperaturas nos tempos 20, 30, 40, 50 e 60, refe-
rente à Figura 45 acima, foi construída segundo a experimentação mostrada nos
Anexos 1 e 2.
3.2. Exames Histopatológicos (H&E)
O tumor de Walker 256 implantado no estômago de rato engloba
todas as camadas, inclusive a mucosa, onde se observa área de necrose. Há tam-
bém presença de intensa necrose na submucosa objeto do tratamento com 5FU +
LEU associado à HT sobre o tumor na sua fase evolutiva inicial de 3 dias (Figu-
ras 46 e 47).
Figura 46. Tumor com necrose da mucosa e submucosa (setas). Tratamento
com 5FU + LEU associado à HT no 3
o
dia (HE) 40X
113
Figura 47. Tumor com necrose intensa. Tratamento com 5FU + LEU asso-
ciado à HT no 3
o
dia (HE) 100X
Em outro animal, observa-se tumor residual com reação inflamató-
ria e área de necrose na submucosa, quando o animal foi submetido a tratamento
com 5FU + LEU associado à HT em tumor em fase evolutiva inicial de 3 dias
(Figura 48).
Figura 48.
Tumor residual com reação inflamatória. Necrose na submucosa. Tratamento
com 5FU + LEU associado à HT no 3
o
dia (resposta parcial) (HE) 100X
114
Pode-se observar bem a junção esôfago-gástrica (JEG) e o tumor inva-
dindo a mucosa, submucosa e muscular gástricas, mesmo sob tratamento com 5FU +
LEU associado à HT em tumor em fase evolutiva inicial de 3 dias (Figura 49).
Figura 49.
Tumor invadindo a mucosa, submucosa e muscular, se estendendo até a JEG. Trata-
mento com 5FU + LEU associado à HT no 3
o
dia (não houve resposta) (HE) 40X
Num animal com tumor em fase evolutiva inicial de 3 dias, o trata-
mento com 5FU + LEU associado à HT obteve como resposta necrose da muco-
sa, submucosa e muscular (Figura 50).
Figura 50.
Necrose na mucosa, submucosa e muscular. Tratamento com 5FU +
LEU associado à HT no 3
o
dia (HE) 100X
115
Em situação semelhante à anterior, outro animal com tumor em fase
evolutiva inicial de 3 dias, submetido a tratamento com 5FU + LEU associado à
HT, exibe necrose da muscular própria e da submucosa (Figura 51).
Figura 51.
Tumor não visualizado. Necrose da muscular própria e da submucosa. Tratamento
com 5FU + LEU associado à HT no 3
o
dia (resposta completa) (HE) 100X
Observa-se ainda uma situação inusitada, haja vista que o tumor de
Walker 256, em fase evolutiva inicial de 3 dias e implantado em estômago de
rato, manifesta-se com vaso repleto de êmbolos tumorais, a despeito do trata-
mento com 5FU + LEU associado à HT (Figura 52).
116
Figura 52. Vaso repleto de êmbolos tumorais (seta). Tratamento com 5FU +
LEU associado à HT no 3
o
dia (HE) 200X
Tem-se também observado tumor em fase evolutiva inicial de 3 dias
invadindo a submucosa (extensa necrose liquefativa), muscular e serosa, resul-
tado do tratamento com 5FU + LEU associado à HT (Figura 53).
Figura 53.
Tumor invadindo a submucosa (extensa necrose liquefativa), muscular e
serosa. Tratamento com 5FU + LEU associado à HT no 3
o
dia (HE) 40X
117
Observa-se ainda que o tumor de Walker 256, em sua fase evolutiva
inicial de 3 dias, invade a gordura e o músculo, mesmo com o tratamento de
5FU + LEU associado à HT (Figura 54).
Figura 54.
Tumor invadindo essencialmente a musculatura e o tecido adiposo.
Tratamento com 5FU + LEU associado à HT no 3
o
dia (HE) 100X
Evidencia-se intensa necrose do tumor, em fase evolutiva interme-
diária de 7 dias, sob tratamento com 5FU + LEU associado à HT (Figura 55).
Figura 55. Tumor com intensa necrose. Tratamento com 5FU + LEU asso-
ciado à HT no 7
o
dia (HE) 200X
118
Percebe-se claramente fígado com células tumorais no espaço porta.
Há também células tumorais na luz da veia porta. Tendo-se, inclusive, a visão do
ducto biliar (Figura 56).
Figura 56.
Células tumorais no espaço porta e na luz da veia porta. Visão ducto biliar
(seta). Tratamento com 5FU + LEU associado à HT no 7
o
dia (HE) 200X
Já se havia visto êmbolos tumorais em vasos com o tumor em fase
evolutiva inicial de 3 dias, agora vêem-se êmbolos tumorais em vasos na sub-
mucosa com o tumor em fase evolutiva intermediária de 7 dias (Figura 57).
Figura 57. Êmbolos tumorais em vasos na submucosa (seta). Tratamento
com 5FU + LEU associado à HT no 7
o
dia (HE) 200X
119
Evidencia-se também reação inflamatória fibrosante na submucosa
com o tumor em fase evolutiva intermediária de 7 dias sob tratamento com 5FU
+ LEU associado à HT (Figura 58).
Figura 58. Reação inflamatória fibrosante da submucosa. Tratamento com
5FU + LEU associado à HT no 7
o
dia (HE) 40X
No mesmo Grupo Experimental, evidencia-se linfócitos e exudato
inflamatório com predomínio de linfócitos (cicatrização do conjuntivo) em tu-
mor em fase evolutiva intermediária de 7 dias sob tratamento com 5FU + LEU
associado à HT (Figura 59).
Figura 59. Exudato inflamatório com predomínio de linfócitos. Tratamento
com 5FU + LEU associado à HT no 7
o
dia (HE) 100X
120
Ainda no mesmo Grupo Experimental, há presença de macrófagos
(pigmentos acastanhados) e linfócitos que falam a favor de inflamação crônica
que evolui para cicatrização do conjuntivo em tumor em fase evolutiva interme-
diária de 7 dias sob tratamento com 5FU + LEU associado à HT (Figura 60).
Figura 60.
Presença de macrófagos (setas) e linfócitos. Tratamento com 5FU +
LEU associado à HT no 7
o
dia (resposta completa) (HE) 200X
Um animal com sobrevida de 95 dias apresentou área de necrose
mínima em tumor em fase evolutiva avançada de 10 dias sob tratamento com
5FU + LEU associado à HT (Figura 61).
Figura 61. Necrose mínima da mucosa. Tratamento com 5FU + LEU asso-
ciado à HT no 10
o
dia (HE) 200X
121
Tumor em fase evolutiva avançada de 10 dias sob tratamento com
5FU + LEU apresenta intensa hemorragia (Figura 62).
Figura 62. Tumor com bastante hemorragia. Tratamento com 5FU + LEU
no 10
o
dia (HE) 100X
Tumor em fase evolutiva avançada de 10 dias acomete, inclusive, a
junção esôfago-gástrica, a despeito do tratamento com 5FU + LEU (Figura 63).
Figura 63. Presença de tumor na junção esôfago-gástrica. Tratamento com
5FU + LEU no 10
o
dia (HE) 40X
122
Tumor em fase evolutiva avançada de 10 dias sob tratamento com
5-FU + LEU associado à HT não mais se evidencia na junção esôfago-gástrica,
claramente normal após 95 dias de sobrevida (Figura 64).
Figura 64. Junção esôfago-gástrica normal. Tratamento com 5FU + LEU
associado à HT no 10
o
dia (resposta completa) (HE) 40X
Tumor em fase evolutiva avançada de 10 dias sob tratamento com
5FU + LEU associado à HT evidencia capilar com células tumorais ao seu redor.
Ao meio, observa-se artéria normal e veia cheia de êmbolos tumorais e com
manguito perivascular de células tumorais ao seu redor (Figura 65).
123
Figura 65. Veia (seta) com êmbolos tumorais. Tratamento com 5FU + LEU
associado à HT no 10
o
dia (HE) 200X
Num animal em fase evolutiva avançada de 10 dias sob tratamento
com 5FU + LEU associado à HT evidencia-se tumor nas camadas mucosa, mus-
cular da mucosa, submucosa e muscular, além de veia com êmbolos na submu-
cosa (Figura 66).
Figura 66.
Tumor em todas as camadas. Veia com êmbolos na submucosa (seta).
Tratamento com 5FU + LEU associado à HT no 10
o
dia (HE) 40X
124
Numa visão mais nítida desse mesmo animal, observa-se grande
quantidade de êmbolos tumorais na veia da submucosa (Figura 67).
Figura 67. Êmbolo tumoral em veia da submucosa (seta). Tratamento com
5FU + LEU associado à HT no 10
o
dia (HE) 200X
Em outro animal com tumor em fase evolutiva avançada de 10 dias
sob tratamento com 5FU + LEU associado à HT denota-se nitidamente intenso
infiltrado tumoral perineural (Figura 68).
Figura 68. Infiltrado tumoral perineural (setas). Tratamento com 5FU +
LEU associado à HT no 10
o
dia (HE) 100X
125
4. Progressão Tumoral
O carcinossarcoma de Walker 256, após o 7
o
dia da implantação em
estômagos de rato Wistar e sem tratamento, mostra-se como neoplasia indife-
renciada, com células tumorais entre as glândulas, citoplasma claro e mal deli-
mitado, núcleos volumosos de cromatina frouxa (vesiculosos) e nucléolo denso
com halo mais claro ao seu redor (Figura 69).
Figura 69. Tumor original mostra-se como neoplasia indiferenciada
Apresenta células indiferenciadas e pleomórficas (anisocitose e ani-
socariose), com grande relação núcleo-citoplasma (Figura 70).
126
Figura 70. Tumor original apresenta células indiferenciadas e pleomórficas
Mostra-se como neoplasia de alto grau mitótico, observando-se três
mitoses atípicas no campo (Figura 71).
Figura 71.
Tumor original mostra-se como neoplasia de alto grau mitótico (setas)
Apresenta picnose de poucas células, o que demonstra a necrose
natural (Figura 72).
127
Figura 72. Tumor original apresenta células com picnose (setas)
Apresenta células em apoptose (Figura 73).
Figura 73. Tumor original apresenta células apoptóticas (setas)
Apresenta células pleomórficas, que se imiscuem entre as glându-
las, indiferenciadas e com núcleos hipercromáticos (Figura 74).
128
Figura 74. Tumor original apresenta células pleomórficas entre glândulas
Apresenta células pleomórficas e três mitoses atípicas (Figura 75).
Figura 75. Tumor original apresenta células pleomórficas e três mitoses a-
típicas (setas)
Apresenta células de aspecto geral epitelióide, porém, com duas
mitoses atípicas (Figura 76).
129
Figura 76. Tumor original apresenta células de aspecto epitelióide e duas
mitoses atípicas (setas)
Apresenta células indiferenciadas que se imiscuem entre as glându-
las (invasividade), de maneira generalizada (Figura 77).
Figura 77.
Tumor original apresenta células indiferenciadas entre glândulas
130
O tumor de Walker 256, originalmente implantado em estômagos
de rato Wistar, mesmo sob tratamento com Fluorouracil (5-FU) na sua fase evo-
lutiva avançada de 10 dias:
Apresenta invasão da mucosa, de forma bastante intensa, onde se
evidencia edema (mucosite focal) (Figura 78).
Figura 78. Tumor sob tratamento com 5-FU no 10
o
dia apresenta invasão
da mucosa, além de edema (mucosite focal)
Apresenta invasão da mucosa gástrica, destruindo-a (Figura 79).
Figura 79. Tumor sob tratamento com 5-FU no 3
o
dia apresenta invasão da
mucosa gástrica, destruindo-a
131
O tumor de Walker 256, originalmente implantado em estômagos
de ratos Wistar, sob tratamento com Paclitaxel (Taxol®) associado à hipertermia
na sua fase evolutiva inicial de 3 dias, invade o pâncreas, apresentando células
pleomórficas entre os ácinos (Figura 80).
Figura 80. Tumor sob tratamento com Taxol® + HT no 3
o
dia apresenta
invasão pancreática, além de células pleomórficas nos ácinos
Como podemos ver na figura abaixo, o cariótipo normal de um rato,
neste caso proveniente de células fibroblásticas, possui 42 cromossomos.
132
Figura 81. Cariótipo normal de rato (fibroblastos) com 42 cromossomos
Fonte: “Tumour Progression: in vitro and in vivo investigations of “spontaneously” trans-
formed rat cell lines”. Manoel Odorico de Moraes (Tese de Doutorado).
Pode-se observar que o cariótipo do tumor de Walker 256, neste
experimento, apresenta, no mínimo, alteração autossômica, o que denota altera-
ção no número de cromossomos, pois, em várias observações (n = 10), manifes-
tou-se diminuição do número de cromossomos, alguns com 36, 37, outros com
38 ou 39 cromossomos (Figura 82). A contagem de cromossomos foi realizada
pela análise visual quantitativa
Figura 82. Cariótipo de célula tumoral (Walker 256) com 37 cromossomos
133
DISCUSSÃO
1. Tratamento com Paclitaxel (Taxol®)
Os Grupos Experimentais Taxol, isolados ou associados à hiperter-
mia nos 3
o
, 7
o
e 10
o
dias, apresentam curvas de sobrevivência mais elevadas,
com significância estatística (p < 0,0001 – Teste Log-Rank) em relação ao Gru-
po Controle.
Quando se compara o grupo de 3 dias com Taxol isolado com aque-
le associado à hipertermia neste mesmo período, constata-se que não houve sig-
nificância estatística entre eles. O mesmo ocorrendo ao se comparar o grupo de
10 dias com Taxol isolado com aquele associado à hipertermia neste mesmo pe-
ríodo. Todavia, quando se compara o grupo de 7 dias com Paclitaxel (Taxol®)
isolado com aquele associado à hipertermia, neste mesmo período, constata-se
que houve significância estatística (p < 0,01 – Teste Log-Rank) entre eles.
Como se pode inferir, a droga isolada Taxol tem similarmente o
mesmo efeito que aquela associada à hipertermia quando o tumor está na fase
inicial de 3 dias e quando em sua fase avançada de 10 dias. O mesmo já não po-
de ser dito quando o tumor encontra-se em sua fase intermediária de 7 dias, pois,
neste momento, a associação Taxol e hipertermia mostrou ser melhor que o Ta-
xol isolado (p < 0,01 – Teste Log-Rank).
Neste trabalho, utiliza-se o Taxol duas horas antes do tratamento
hipertérmico, com tempo suficiente para o mesmo iniciar sua ação. Já é sabido
que o mecanismo de ação do Taxol está em estabilizar os microtúbulos durante a
mitose, por mudar a dinâmica de equilíbrio em direção à reunião de microtúbu-
los (Schiff et al., 1979; Schiff & Horwitz, 1980; Manfredi & Horwitz, 1984;
Wallin et al., 1986). Já a hipertermia mild (41 a 42ºC), por sua vez, resulta na
desorganização do sistema de microtúbulos (Knox et al., 1991). A hipertermia
usada neste trabalho é a do tipo mild, cuja média de temperatura é de 41,8ºC
134
(Robins et al., 1993; Oliveira, 1997). Ora, se o Taxol atua sobre os microtúbu-
los, e a hipertermia também, não se pode esperar portanto um sinergismo efeti-
vo, uma vez que, no momento em que a hipertermia inicia sua ação, o Taxol já
teria atuado sobre os microtúbulos, não podendo assim a hipertermia ter sua a-
ção efetiva e esperada. Outra hipótese seria quando a hipertermia passasse a agir
sobre os microtúbulos, estes já estariam estabilizados pela ação do Taxol, e nes-
tas circunstâncias, a hipertermia não os reconheceria como tal, daí, não teria a
ação efetiva e esperada, uma vez que apresentaria mínima ação de sinergismo
sobre o tumor na sua fase intermediária de 7 dias, onde a hipertermia associada
ao Taxol mostrou significância estatística (p < 0,01 – Teste Log-Rank).
Tem-se demonstrado a ação do Taxol sobre o tumor carcinossarco-
ma de Walker 256 em inibir e determinar mudanças e locomoção, um efeito que
pode estar relacionado à invasividade e ao potencial metastático do tumor (Kel-
ler & Zimmermann, 1986).
A ação do Taxol associado à hipertermia em adenocarcinoma hu-
mano de mama MCF-7 in vitro demonstrou que a hipertermia inibiu a citotoxi-
cidade do Taxol relacionada com os efeitos sobre o ciclo celular, ou seja, a hi-
pertermia pode retardar, ou parar, a progressão de células tratadas com Taxol,
através e fora da fase S dentro de G2/M (Leal et al., 1999).
Os resultados obtidos em todos os estudos executados em adeno-
carcinoma mamário murino, onde foi utilizada hipertermia associada à quimiote-
rapia com Taxol e epirrubicina, puderam demonstrar que a combinação Taxol e
hipertermia é altamente efetiva, com um superaditivo efeito usando 45 mg/kg de
Taxol quando comparado a 30 mg/kg. Um superaditivo efeito foi obtido combi-
nando Taxol na dose de 45 mg/kg e epirrubicina 9 mg/kg associado à hiperter-
mia. Não obstante, os resultados finais sugeriram que é possível usar Taxol as-
sociado à hipertermia como protocolo para resposta de tumor local, enquanto
135
epirrubicina poderia ser acrescentado no sentido de se atingir um melhor contro-
le sistêmico (Cividalli et al., 2000).
Neste contexto, utiliza-se o tumor carcinossarcoma de Walker 256,
implantado não simplesmente na musculatura esquelética, como se manifesta
histopatologicamente sua predileção, mas também satisfatoriamente em muscu-
latura glandular, como no caso em discussão, mais precisamente nos estômagos
de rato Wistar. Sob condições de hipertermia associada à quimioterapia, neste
caso o Taxol, ou simplesmente com Taxol isolado, obteve-se resposta terapêuti-
ca satisfatória (parcial) do tumor em sua fase inicial de 3 dias e no estágio avan-
çado de 10 dias com o uso isolado do Taxol. Já o tumor implantado no estôma-
go, em seu estágio intermediário de 7 dias, responde satisfatoriamente melhor à
associação quimioterápica de Taxol e hipertermia do que simplesmente ao uso
de Taxol isolado.
Como se pode ver, há divergências de tratamento em experimentos
in vitro e in vivo, e para uma elucidação completa e satisfatória, ter-se-ia um
bom conhecimento da fisiologia do tumor, da sua microcirculação, do pH, e a
hipoxia que poderia influenciar na interação entre a hipertermia e as diferentes
drogas.
Portanto, torna-se difícil determinar se a hipertermia e/ou drogas
citotóxicas, frente à morte celular, são fatores independentes, ou se estes refor-
çam a resposta tumoral.
Numa série de dois ratos com 108 dias de sobrevida (estatistica-
mente censurados), os quais apresentavam o tumor em ninhos (Figura 17) como
resposta terapêutica parcial ao tratamento quimioterápico com Taxol associado à
hipertermia em tumor em fase evolutiva inicial de 3 dias. Observa-se ainda bas-
tante hemorragia em função da hipertermia.
Tem-se observado que o tumor ora invade a gordura (tecido adipo-
so), e as células aí presentes são poligonais, tomando aspecto de tumor epiteliói-
136
de. Refere-se aqui a células submetidas a tratamento quimioterápico com Taxol
associado à hipertermia em tumor em fase evolutiva inicial de 3 dias
(Figura 15).
Não se observa, no entanto, hemorragia em função da hipertermia.
Observa-se nesta fase evolutiva inicial de 3 dias que o tumor sub-
metido ao tratamento quimioterápico com Taxol associado à hipertermia apre-
senta corpos apoptóticos (Figura 16).
Evidencia-se tumor na submucosa, com células circunjacentes ao
vaso (Figura 13) e linfócitos próximos ao vaso, o que denota reação imunológi-
ca. Os linfócitos T citolíticos fornecem efetiva imunidade anti-tumoral in vivo,
como demonstrado por estudos de transplante de tumor experimental. De fato,
os linfócitos T citolíticos medeiam a rejeição de tumores transplantados, sendo
este apenas um exemplo de imunidade anti-tumoral específica in vivo (Abbas et
al., 1994).
No caso aqui em discussão, além da reação imunológica, há tam-
bém reação inflamatória (Figura 13).
Numa série de quatro ratos com 1 ano, 3 meses e 5 dias (estatisti-
camente censurados), onde, ao serem sacrificados, eis que três deles não mais
apresentaram o tumor após tratamento quimioterápico com Taxol associado à
hipertermia, demonstrando assim resposta terapêutica completa (cura), ou seja,
completamente curados, uma vez que todos os tumores inoculados nos estôma-
gos de rato se implantam (Fonteles et al., 1979; Moraes Filho et al., 1980). Em
contrapartida, apenas um dos ratos apresentou resposta terapêutica parcial, ape-
sar da sobrevida de 1 ano, 3 meses e 5 dias, com tumor em pequenos agrupa-
mentos em meio à extensa hemorragia (Figura 18). Hemorragia esta que é quase
uma constante quando se faz o tratamento com hipertermia. É bem verdade que
neste caso o tumor encontra-se em fase avançada de 10 dias, estatisticamente
censurado, com mais de 1 ano de sobrevida e com células tumorais em fase su-
cessiva de degeneração, provavelmente apresentando necrose e/ou apoptose.
137
Em série de ratos submetidos a tratamento quimioterápico com Ta-
xol associado à hipertermia em tumor em fase evolutiva inicial de 3 dias, o
mesmo se implanta nitidamente na submucosa, aqui preservando a mucosa, a
qual se apresenta claramente separada da submucosa pela muscular da mucosa
(Figura 19). As células tumorais são do tipo poligonal (carcinoma), mas, à luz da
imunohistoquímica, resultaram vimentina positiva (sarcoma e/ou tumor de pe-
quenas células) (Alves et al., 2002).
O tumor de Walker 256 implantado em estômagos de ratos em suas
várias etapas de evolução nos 3
o
, 7
o
e 10
o
dias sofreu variação morfológica para
a variante sarcomatosa de pequenas células, o que está bem caracterizado ao e-
xame de imunohistoquímico pelo método ABC e pode ser melhor evidenciado
através das Figuras 33 e 35. Isto também foi observado por outros pesquisadores
(Alves et al., 2002).
Um grupo de ratos submetidos a tratamento quimioterápico com
Taxol associado à hipertermia apresentou extensas áreas de necrose decorrentes
da quimioterapia e da hipertermia, e extensas áreas de hemorragia decorrentes
da hipertermia apenas, uma vez que, com o tratamento somente quimioterápico,
não se observa hemorragia (Figura 12).
O tumor carcinossarcoma de Walker 256 mostra, na sua grande
maioria, tropismo muscular e preservação da mucosa gástrica. Não obstante, po-
de-se observar que o tumor se apropria de toda a espessura da parede gástrica,
inclusive com áreas de necrose na mucosa, decorrentes do tumor e/ou do trata-
mento quimioterápico com Taxol associado à hipertermia em tumor em fase e-
volutiva inicial de 3 dias (Figura 11).
Em série experimental submetida a tratamento quimioterápico com
Taxol isolado em tumor em fase evolutiva avançada de 10 dias, observa-se infil-
tração na submucosa e na muscular, até atingir a serosa, com presença de células
138
fusiformes (sarcoma e/ou tumor de pequenas células) e ausência de sangramento
(Figura 10).
O tumor carcinossarcoma de Walker 256 tem alta virulência e a so-
brevida sem tratamento tem sido baixa (13,25 0,53) quando inocula-se 1 ml
em estômagos de rato com 1 milhão (10
6
) de células. Todavia, sob tratamento
quimioterápico com Taxol associado à hipertermia em tumor em fase evolutiva
inicial de 3 dias, não ocorre metástase à distância, mas sim, invasão pancreática
por contigüidade, onde o tumor entremeia-se entre ácinos (Figura 14).
Em algumas séries experimentais, o tumor submetido a tratamento
quimioterápico com Taxol® associado à hipertermia se apresenta epitelióide,
mesmo que a imunohistoquímica seja vimentina positiva, invade o tecido adipo-
so, o que demonstra a agressividade do tumor, notadamente em tumores de pe-
quenas células, como neste caso, e apresenta poucas áreas necróticas, mas exibe
a presença de corpos apoptóticos (Figura 16).
Na sua maioria, o tumor de Walker 256 acomete completamente a
submucosa e a muscular, atingindo inclusive a serosa, às vezes preservando a
mucosa (Figura 19). Evidencia-se então como sarcoma, ou mesmo como tumor
de pequenas células, uma vez que apresenta vimentina positiva em 100% das
células.
Os experimentos, na sua quase totalidade, quando da realização do
tratamento quimioterápico com Taxol, isolado ou associado à hipertermia, mani-
festaram expressão sarcomatosa plena ou tumor de pequenas células (vimentina
positiva em 100%). Não obstante, em alguns grupos, a associação Taxol e hiper-
termia atenuou a expressão sarcomatosa, marcando a vimentina em apenas 40%
das células (Figura 21), o que pode ser devido a um possível efeito da hiperter-
mia sobre receptores antigênicos do tumor, alterando-os ou destruindo-os em
algumas células de alguns grupos estudados, pois, ao se realizar o tratamento
139
quimioterápico deste tumores apenas com Taxol, esta atenuação da vimentina
não se manifesta.
Atualmente, já está bem estabelecido que a morte de células nor-
mais e/ou tumorais por apoptose é uma grande resposta à praticamente todas as
modalidades de terapia do câncer, incluindo radioterapia, quimioterapia, imuno-
terapia, hipertermoterapia, ablação hormonal, fotodinamicoterapia, e mais recen-
temente, geneterapia (Stephens & Meyn, 2001). Neste trabalho, demonstra-se
tanto a ação do quimioterápico (Paclitaxel (Taxol®)), como da hipertermia, evi-
denciando bem a apoptose, pois denotam-se corpos apoptóticos (Figura 16).
A morfologia in vivo da apoptose é sempre a mesma, independente
de espécie, célula ou tipo de tecido, ou se ocorre em tecido normal ou se tumo-
ral. O seu aparecimento não é influenciado por causa, que inclui a apoptose as-
sociada a processos fisiológicos ou condições patológicas, e responde a modali-
dades terapêuticas incluindo drogas, radiação ionizante, hipertermia e terapia
gênica. Os corpos apoptóticos espontâneos ou induzidos por radiação são histo-
logicamente os mesmos em todos os tecidos normais, tendo-se estudado inclusi-
ve glândulas serosas, timo, intestino e glândula mamária. Quanto aos tumores, a
preocupação é o conhecimento de sua morfologia, sendo a apoptose induzida a
mesma em carcinomas, linfomas e sarcomas em humanos e animais (Stephens &
Meyn, 2001).
Dessa maneira, tem-se evidenciado que o Taxol também é citotóxi-
co sobre células de carcinoma gástrico não-cíclicas em fase G
0
/G
1
e pode induzir
morte celular apoptótica (Chang et al., 1996) em tumor humano. No entanto,
também evidenciou-se apoptose em tumor experimental em fase evolutiva inici-
al de 3 dias implantado no estômago de rato sob efeito do Taxol associado à hi-
pertermia (Figura 16). O que leva-se a acreditar que o Taxol, como agente qui-
mioterápico, é capaz de levar à apoptose, assim como o sinergismo quimioterá-
pico (Taxol®) associado à hipertermia também leva à apoptose.
140
2. Tratamento com 5-Fluorouracil (5-FU)
O tumor de Walker 256, implantado em estômagos de rato Wistar,
em sua fase evolutiva inicial de 3 dias e sob tratamento quimioterápico com 5-
FU somente, causa necrose extensa do tecido, mas de maneira coagulativa, ou
seja, uma necrose isquêmica, onde as células necrosadas apresentam, além de
alterações nucleares, citoplasma com aspecto de substância coagulada (Pereira,
1994), preservando, portanto, sua forma e arquitetura, onde as células e seus nú-
cleos se mostram como sombras (Figura 26).
Numa fase precoce de implante do tumor com apenas 3 dias de evo-
lução, as células tumorais entremeiam-se às glândulas na mucosa gástrica, des-
truindo-as (Figura 27), mostrando assim o poder de virulência e invasividade do
carcinossarcoma de Walker 256.
O tumor de Walker 256, implantado em estômagos de rato Wistar,
em sua fase evolutiva intermediária de 7 dias e sob tratamento quimioterápico
com 5-FU somente, mostra-se, ao exame histopatológico por HE, como células
poligonais (epiteliais) ou fusiformes (mesenquimais), fazendo com que se pense
tratar-se de um carcinossarcoma. No entanto, ao exame imunohistoquímico, re-
velou tratar-se de um sarcoma e/ou tumor de pequenas células, uma vez que fora
100% positivo para vimentina (Figura 33) e 100% negativo para queratina (Fi-
gura 34).
Este tumor apresenta ainda extensa área de necrose, onde a lise ce-
lular é de pronto evidente (Figura 29) e encontram-se poucas células, diferente-
mente da necrose coagulativa (Figura 26), o que demonstra uma melhor ação do
quimioterápico nesta fase evolutiva, embora estes resultados não tenham mos-
trado significância estatística quando se compara quimioterapia associada à hi-
pertermia com quimioterapia isolada.
O mesmo tumor também se comporta de maneira agressiva e inva-
siva, vez que já infiltra o pâncreas, apesar da pouca necrose. No entanto, tal ação
141
não é considerada como uma metástase, mas sim como uma infiltração por con-
tigüidade, pois o pâncreas é um órgão contíguo ao estômago, local onde o tumor
foi originalmente implantado (Figura 30).
Ao se estudar o carcinossarcoma de Walker 256, em sua fase evolu-
tiva intermediária de 7 dias, eis que, sob tratamento quimioterápico com 5-FU
somente, e ao exame imunohistoquímico, este mostra-se 100% vimentina positi-
va e 100% queratina negativa. Porém, na mucosa, que é vimentina negativa, há
algumas células dendríticas denominadas células de Langherans, as quais se
mostram vimentina positiva (Figura 35). Estas células são também conhecidas
como células apresentadoras de antígenos.
O tumor de Walker 256, implantado em estômagos de rato Wistar,
em sua fase evolutiva avançada de 10 dias e sob tratamento quimioterápico com
5-FU, apresenta considerável hemorragia em seu interior, o que é muito mais
devido ao efeito da hipertermia do que ao da quimioterapia (Figura 31).
Este tumor mostra massa tumoral elevada, a muscular da mucosa ao
meio, ao lado da mucosa, e como para-efeito do quimioterápico (5-FU), há mu-
cosite focal, decorrente do 5-FU, evidenciada na forma de edema e áreas es-
branquiçadas (Figura 32). Além disso, há também presença de hemorragia, ca-
racterística esta não exclusiva da hipertermia, pois aqui trata-se de tratamento
com quimioterapia somente e no entanto ocorreu hemorragia.
O mesmo tumor, apesar de mostrar-se ora com características carci-
nomatosas (células poligonais), ora sarcomatosas (células fusiformes), ao ser
submetido à imunohistoquímica, revela ser na verdade um sarcoma e/ou tumor
de pequenas células, uma vez que a coloração para vimentina resultou 100% po-
sitiva (Figura 33), resultado este confirmado pela coloração para
queratina, que
foi 100% negativa (Figura 34).
Numa abordagem estatística, temos que o tumor de Walker 256 em
sua fase evolutiva inicial de 3 dias sob tratamento
quimioterápico com 5-FU isola-
142
do quando comparado ao 5-FU associado à hipertermia, demonstra ser estatistica-
mente
significante (p = 0,01), uma vez que ao se observar a curva de Kaplan-Meier
(Figura 22) tem-se a nítida compreensão de que o tratamento isolado com 5-FU no
3
o
dia foi mais efetivo que o 5-FU associado à hipertermia, de tal maneira, se pode
afirmar que o
5-FU associado à hipertermia, neste estágio evolutivo inicial de 3
dias
, não foi sinérgico.
Com relação ao tumor de Walker
256 em sua fase evolutiva interme-
diária de 7 dias
sob tratamento quimioterápico com 5-FU isolado quando compa-
rado ao 5-FU associado à hipertermia, demonstra não haver significância estatística
entre eles (Figura 22), o que denota a ineficiência do tratamento quimioterápico
isolado, assim como da quimioterapia associada à hipertermia, diante, portanto,
da agressividade tumoral,
uma vez que se está diante de um tumor de pequenas
células de alto grau de virulência
(100% vimentina positiva) (Pinheiro et al., 2000;
Alves et al., 2002). No entanto,
apesar de não haver significância estatística, este
grupo é o único
em que a quimioterapia com 5-FU isolado mostra ligeira melhora
na sobrevida quando comparado
ao 5-FU associado à hipertermia (Figura 22).
Já o tumor de Walker 256 em sua fase evolutiva avançada de 10
dias
sob tratamento quimioterápico com 5-FU isolado quando comparado com 5-
FU associado à hipertermia, demonstra ter alta significância estatística (p =
0,0026), com curvas de Kaplan-Meier bem diferenciadas umas das outras, eviden-
ciando assim que o 5-FU
e a hipertermia não foram sinérgicos e que o 5-FU isolado
foi mais efetivo (Figura 22), mesmo estando o tumor em fase evolutiva avançada.
3. Tratamento com Ácido Folínico (Leucovorin®) (LEU)
Ao se fazer o estudo comparativo dos tratamentos 5FU + LEU iso-
lado versus 5FU + LEU associado à HT, em tumores em fase evolutiva inicial
de 3 dias, observa-se diferença estatisticamente significativa (p < 0,05) entre e-
143
les, mostrando assim que a hipertermia associada à quimioterapia coadjuvante
pelo ácido folínico é efetiva (Tabela VI; Figura 42).
Entretanto, quando se fez o estudo comparativo desses mesmos tra-
tamentos em tumores em fases evolutivas intermediária (7 dias) e avançada (10
dias), eis que não houve nenhuma significância estatística entre eles, mostrando
assim que não ocorreu sinergismo entre hipertermia e quimioterapia induzida
pelo ácido folínico (Tabelas VII e VIII; Figuras 43 e 44).
Ao se submeter 50 animais (ratos Wistar) à combinação de trata-
mento quimioterápico com hipertermia, sendo 25 deles sob efeito de 5FU e os
outros 25 sob efeito de 5FU + LEU, e com suas respectivas temperaturas aferi-
das em seis tempos diferentes (0, 20, 30, 40, 50, e 60 min.), tem-se que a com-
pensação das médias de temperatura diferiu nas várias combinações de tempo
versus tratamento, exceto no tempo basal (zero) (Teste de Turkey,
5%
= 1,16)
(Quadro 1).
Era de se esperar que o 5FU + LEU fosse mais efetivo e melhorasse
a sobrevivência ou a efetividade do 5FU, e daí melhorasse também o sinergismo
(LEU modulando) com a hipertermia, o que não ocorreu. O que se constatou, na
verdade, foi que a hipertermia como um todo em nada melhorou a sobrevivência
quando comparada à quimioterapia isolada. Adicionalmente, o Leucovorin®
veio induzir uma maior termotolerância, haja vista que 9 dos 25 animais sujeitos
ao 5FU + LEU associado à HT manifestaram-se com diminuição da temperatura
inicial, ou permanência da mesma, a despeito de se acrescentar calor em todo o
experimento durante uma hora.
Existem duas explicações possíveis para esta situação: a primeira
no sentido da associação de 5FU com Leucovorin® favorecer a termotolerância
por induzir a expressão das proteínas do choque térmico (HSP); e a segunda no
sentido do Leucovorin® não ter melhorado o efeito do 5FU na presença da
hi-
144
pertermia e ter agido no sentido de aumentar a resistência do tumor à droga, sendo
por esta razão que o efeito na sobrevida não foi efetivo.
Esperava-se que as médias de temperatura ao longo do tempo
(min.) dos animais submetidos ao 5FU + LEU associado à HT fossem superiores
aos valores do 5FU associado à hipertermia (Figura 45). Para surpresa do obser-
vador, eis que os resultados foram exatamente o oposto: as médias de temperatu-
ra dos animais ao longo do tempo (min.) foram sempre superiores para todos os
tempos (20, 30, 40, 50 e 60 min.), exceto o basal (zero). No estudo de medidas
repetidas de tempo, obteve-se a conformação gráfica (Figura 45). Por ser o tem-
po uma variável contínua, pode-se garantir que em todos os tempos o gráfico
demostra bem a realidade.
O carcinossarcoma de Walker 256, quando implantado em estôma-
gos de rato por inoculação via mucosa gástrica, tinha como característica, na
maioria da vezes, preservar a mucosa e invadir as outras camadas, e ocasional-
mente, invadir também a própria mucosa (Oliveira, 1997). Porém, tem-se obser-
vado nestes experimentos ser quase uma constante o fato do tumor ser mais in-
vasivo e não preservar a mucosa, acometendo assim todas as camadas, daí o
porquê do 5FU + LEU associado à HT atuar sobre a mucosa, determinado assim
necrose na mesma e na submucosa (Figura 46 – vide setas).
Observa-se que mesmo o tumor estando numa fase evolutiva inicial
de 3 dias, este já se manifesta difusamente, disseminando-se assim para a sub-
mucosa, e que, apesar da efetividade do 5FU + LEU associado à HT determinar
uma intensa necrose sobre o tumor, não há uma efetividade satisfatória, pois o
grau de envolvimento tumoral é bastante considerável, superando assim a ação
terapêutica do 5FU + LEU associado à HT. Aqui sabe-se que houve significân-
cia estatística (p < 0,05) (Tabela VI; Figura 42), mas como estamos diante de
tumor de pequenas células, onde sua virulência e agressividade são considera-
velmente manifestas, daí porquê, mesmo que o tratamento seja efetivo, como
145
demonstra o tumor com intensa necrose (Figura 47), não é suficiente para uma
boa resposta na taxa de sobrevida, ou seja, para uma resposta terapêutica com-
pleta (cura) e não apenas uma resposta terapêutica parcial.
Em alguns animais experimentais há progressão tumoral sem res-
posta ao tratamento, e noutros há cura total. Mas neste caso, ocorre apenas res-
posta terapêutica parcial, uma vez que o tumor em fase evolutiva inicial de 3
dias, sob tratamento com 5FU + LEU associado à HT, apresenta-se como tumor
residual com reação inflamatória, além de necrose na submucosa (Figura 48).
Há situações em que o tumor de Walker 256 invade a mucosa,
submucosa e muscular, além da junção esôfago-gástrica (JEG), não “respeitan-
do” nada. Diga-se de passagem, o tumor não fora originalmente implantado na
JEG, o mesmo ascendeu até chegar a esta posição, e neste caso, não respondeu a
nenhum efeito do tratamento com 5FU + LEU associado à HT em tumor em fase
evolutiva inicial de 3 dias (Figura 49).
Há outras situações, possivelmente face à boa resposta imunológica
do animal, da efetividade do tratamento com 5FU + LEU associado à HT, e da
fase evolutiva inicial (3 dias) do tumor, que fazem com que se consiga boa res-
posta terapêutica, ou mesmo resposta terapêutica completa (cura) no animal por
parte do tratamento (Figuras 50 e 51).
Dia após dia, tem-se observado que o tumor de Walker 256 mostra-
se cada vez mais agressivo e invasivo, uma vez que o tumor, mesmo em fase
evolutiva inicial de 3 dias, já se apresenta com êmbolos, daí porque não há efeti-
va, nem resposta terapêutica alguma, uma vez que neste caso o animal estava
sob tratamento com 5FU + LEU associado à HT (Figura 52).
Isto vem explicar porque nenhum tratamento é efetivo, porque a
sobrevida dos animais é tão precoce, e porque não ocorre metástase do tumor,
pois, antes mesmo da metástase ocorrer, o animal vai a óbito, o que demonstra
146
ser o tumor de pequenas células, dado seu comportamento, invasividade, alto
grau de agressividade e alta taxa de proliferação (Figura 71 – vide setas).
Semelhante a estes êmbolos tumorais em fase evolutiva tumoral tão
precoce, só encontra-se uma maior barreira para o sucesso dos xenotransplantes:
a rejeição hiperaguda, a qual se refere à ligação de anticorpos humanos prefor-
mados às células endoteliais do doador. O que resulta na ativação do comple-
mento, lise celular e eventual trombose vascular (Geller et al., 1998).
Em animal com tumor em fase evolutiva inicial de 3 dias, o mesmo
invade a submucosa, muscular e serosa, e sob tratamento com 5FU + LEU asso-
ciado à HT, este é efetivo sobre a submucosa, ocasionando assim extensa necro-
se liquefativa, mas não o é sobre a muscular e a serosa (Figura 53).
O tumor de Walker 256 implantado em estômago de rato manifesta-
se mais que agressivo, invadindo a musculatura e o tecido adiposo, mesmo em
fase evolutiva inicial de 3 dias e sob tratamento com 5FU + LEU associado à
HT, não obtendo, neste caso, resposta terapêutica alguma (Figura 54).
O tumor de Walker 256 implantado em estômago de rato com tu-
mor em fase evolutiva intermediária de 7 dias e sob tratamento com 5FU + LEU
associado à HT, manifesta-se na forma de intensa necrose e com resposta tera-
pêutica parcial (Figura 55). Aqui, mesmo dado à agressividade do tumor de pe-
quenas células, há resposta terapêutica parcial.
Já se havia demonstrado anteriormente (Oliveira, 1997), em um de-
terminado grupo de animais, que ao se inocular 100 mil (10
5
) células do tumor
de Walker estes animais se mantiveram vivos por 40,2 4,5 dias. Um dos ani-
mais deste grupo apresentou invasão do fígado (provavelmente por contiguidade
no peritônio), além de ascite hemorrágica (Oliveira, 1997).
Nos experimentos deste trabalho, cuja quantidade de células tumo-
rais inoculadas foi sempre igual a 1 milhão (10
6
), o tumor em fase evolutiva in-
termediária de 7 dias e sob tratamento com 5FU + LEU associado à HT apresen-
147
ta-se no fígado com células tumorais no espaço porta, na luz da veia porta e in-
vadindo os sinusóides hepáticos (Figura 56), mostrando assim a agressividade
do tumor de pequenas células, não exibindo nenhuma resposta terapêutica posi-
tiva.
Em animal experimental com tumor em fase evolutiva intermediária
de 7 dias e sob tratamento com 5FU + LEU associado à HT, mostra êmbolos
tumorais em vasos na submucosa, não possibilitando o menor grau de sobrevida
para o animal (Figura 57).
Por outro lado, em um grupo experimental com tumor em fase evo-
lutiva intermediária de 7 dias, sob tratamento com 5FU + LEU associado à HT,
ocorre fibrose na submucosa (Figura 58), com predomínio de linfócitos, o que
fala a favor de cicatrização e conseqüente cura total. No entanto, estes casos são
raros (Figuras 58 e 59).
Neste mesmo grupo experimental, encontra-se, em outro animal,
presença de macrófagos (pigmentos acastanhados) e linfócitos, o que aponta pa-
ra inflamação crônica (Figura 60). O tumor foi sendo destruído e a inflamação
foi se instalando, com conseqüente aparecimento de exudato inflamatório e cica-
trização no conjuntivo, resultando em cura total (Figura 60). Um bom exemplo
do tratamento quimioterápico com 5FU + LEU associado à HT.
Em rato Wistar com tumor implantado no estômago em fase evolu-
tiva avançada de 10 dias e sob tratamento com 5FU + LEU isolado, observa-se
bastante hemorragia. Isto demonstra que a hemorragia não é resposta exclusiva
apenas da hipertermia, e pode ocorrer também em quimioterapia isolada (Figura
62), mesmo com tumor em fase evolutiva avançada de 10 dias.
Em outro animal com tumor em fase evolutiva avançada de 10 dias
e sob tratamento com 5FU + LEU associado à HT, nota-se um infiltrado tumoral
perineural (Figura 68), o que corresponderia, do ponto de vista clínico, à mani-
festação dolorosa. Aqui, mais uma vez, vem demonstrar a agressividade do tu-
148
mor de pequenas células ao se infiltrar, comprometendo assim a região perineu-
ral.
Outro animal experimental, com tumor em fase evolutiva avançada
de 10 dias e sob tratamento com 5FU + LEU associado à HT, mostra necrose
mínima da mucosa. Esta necrose exígua demonstra a eficácia do tratamento, o
que possibilitou ao animal uma sobrevida de 95 dias. Este animal foi estatisti-
camente censurado, uma vez que se estabeleceu 90 dias como o ponto de coorte,
e a partir daí, todos os animais que sobrevivessem estariam curados ou com res-
posta terapêutica parcial, o que fora aqui constatado, ou seja, houve necrose mí-
nima, mas não houve cura e sim resposta terapêutica parcial; o que comprova
que mesmo sendo tumor de pequenas células, portanto agressivo e invasivo, não
se pode desistir do tratamento; observe-se que neste caso específico houve res-
posta terapêutica satisfatória (parcial) em tumor em fase evolutiva avançada de
10 dias.
Em outro rato com tumor em fase evolutiva avançada de 10 dias e
sob tratamento com 5FU + LEU associado à HT, evidencia-se tumor invadindo
todas as camadas, atingindo inclusive a JEG, devido à natureza de sua agressivi-
dade e invasividade (Figura 63). Vale salientar que neste experimento o tumor
não fora originalmente implantado na JEG, como o fora em trabalho anterior
(Oliveira, 1997).
Em outro animal com tumor em fase evolutiva avançada de 10 dias
e sob tratamento com 5FU + LEU associado à HT, obteve-se cura total (resposta
terapêutica completa), pois o rato apresentava sobrevida de 95 dias (estatistica-
mente censurado) e podia-se notar as estruturas todas normais, incluindo a JEG
(Figura 64).
Denota-se ainda, em tumor em fase evolutiva avançada de 10 dias e
sob tratamento com 5FU + LEU associado à HT, capilar preenchido por êmbo-
los tumorais e células tumorais ao seu redor, veia cheia de êmbolos e com man-
149
guito perivascular de células tumorais ao seu redor, com apenas artéria normal
(Figura 65).
Tem-se observado êmbolos tumorais em veia de animais com tumor
em fase evolutiva inicial de 3 dias (Figura 52). Também notam-se os mesmos
êmbolos tumorais em animais com tumor em fase evolutiva intermediária de 7
dias (Figura 57), além de células tumorais na luz da veia porta (Figura 56).
Todos esses achados vêem a caracterizar o alto grau de agressivida-
de e invasividade do tumor de Walker 256. No entanto, o tumor também se ma-
nifesta com êmbolos tumorais em veia da submucosa em animais com tumor em
fase evolutiva avançada de 10 dias sob tratamento com 5FU + LEU associado à
HT, demonstrando assim a ineficiência do tratamento, na sua grande maioria,
neste experimento (Figuras 66 e 67). Devido não à essência do tratamento de per
se, mas primordialmente à agressividade e invasividade do tumor de pequenas
células (tumor de Walker 256), que neste trabalho apresenta invasividade san-
güínea, sem metástase, ou seja, sem passar para a matriz intersticial, desde a fase
mais avançada de 10 dias, passando pela de 7 dias.
O Leucovorin® serviu para modular este estudo em dois sentidos: o
primeiro, em manifestar invasividade tumoral intravasos desde sua fase evoluti-
va inicial até a mais avançada, uma vez que isto ainda não havia sido manifesto
nem com o uso do Taxol® nem com o uso do 5FU isolados; e o segundo, em
induzir termotolerância (Figura 45), o que explicaria a resistência aumentada do
tumor ao 5FU, o que não ocorre quando se associa 5FU + LEU em tumores de
cólon humano (Zaniboni et al., 1993; Wolmark et al., 1993), onde houve uma
boa resposta de imunomodulação do Leucovorin® em relação ao 5FU, melho-
rando assim a sobrevida.
Este experimento, no qual usamos 5FU + LEU associado à HT, nos
orienta ainda no sentido de não mais se fazer hipertermia associada à quimiote-
rapia com 5FU onde haja imunomodulação com Leucovorin®, mesmo em tumo-
150
res quimiossensíveis ao 5FU, pois o efeito hipertérmico neste trabalho fora rebo-
te, ou seja, o contrário do esperado.
4. Progressão Tumoral
Tinha-se como norma prática na preparação do inóculo e repicagem
do tumor de Walker 256, disponibilizá-lo no 10
o
ao 12
o
dia de evolução. No en-
tanto, o tumor nesta fase apresenta-se bastante necrosado, pouco se aproveitando
do mesmo (Oliveira, 1997). Com a repicagem freqüente e constante, o tumor foi
se tornando cada vez mais agressivo em necrose, a ponto de se ter que disponibi-
lizá-lo em um período de tempo mais curto, com o fito de viabilidade tumoral –
de tumor vivo – com capacidade experimental. Sendo assim, utilizou-se o tumor
aos 7 (sete) dias de evolução, por ser este o melhor dia de viabilidade tumoral e
por seu tempo hábil, pois, aos 6 (seis) dias, o tumor ainda não apresenta boa via-
bilidade, e aos 8 (oito) dias, o mesmo já começa a apresentar necrose.
Esta precocidade de uso do tumor em fase mais curta de tempo tem
tornado o mesmo cada vez mais agressivo, pois, se antes o carcinossarcoma 256
de Walker, ao ser implantado em estômagos de rato Wistar, atravessava a muco-
sa e se implantava na muscular e, na grande maioria das vezes, preservava a mu-
cosa (Oliveira, 1997), agora, com o uso do tumor de Walker 256 no estágio de 3
dias desde o seu inóculo nos animais de manutenção, este tem se manifestado
bastante agressivo, acometendo inclusive a mucosa, mesmo sob tratamento (Fi-
gura 11).
Tem-se ciência de que o tumor de Walker 256 com o qual se traba-
lha no Laboratório de Oncologia Experimental (LOE) do Departamento de Fisi-
ologia e Farmacologia (DFF) da Universidade Federal do Ceará (UFC), até en-
tão considerado como um carcinossarcoma, trata-se na verdade de um tumor de
pequenas células, por excelência, uma vez que, ao ser submetido à histopatolo-
151
gia clássica (H&E), apresentava células poligonais características de carcinoma,
grande atividade mitótica, células indiferenciadas e grande pleomorfismo, e ao
ser submetido à imunohistoquímica (IHM), apresentava vimentina positiva em
100% dos casos, o que se leva a concluir tratar-se de um tumor de pequenas cé-
lulas em essência. Tal constatação deste trabalho foi também alcançada por ou-
tros pesquisadores do LOE, tais como Pinheiro et al. (2000) e Alves et al.
(2002), os quais concluíram que o tumor de Walker/LOE sofrera variação mor-
fológica para a variante sarcomatosa de pequenas células isoladas e indiferenci-
adas.
O tumor de Walker 256 tem apresentado alta capacidade prolifera-
tiva, uma vez que, ao ser implantado como tumor original na mucosa gástrica,
em fase evolutiva inicial de 3 (três) dias, evidencia apenas um broto tumoral na
mucosa (Bröyn, 1974). Todavia, tem-se observado que o tumor de Walker 256
apresenta, já nesta fase evolutiva inicial (3 dias), embolia tumoral, mesmo es-
tando o tumor sob potente tratamento, neste caso, quimioterapia com 5-Fluoro-
uracil mais um imunomodulador – ácido folínico (Leucovorin®), associados à
hipertermia. Sendo assim, o tumor, ao exibir êmbolos em fase tão inicial de evo-
lução (3 dias), fala a favor de elevada agressividade, fazendo com que seja difí-
cil uma terapêutica efetiva para esta situação (Figura 52).
Também objeto de observação deste trabalho, constata-se êmbolos
tumorais em vasos na submucosa quando o tumor de Walker 256 encontra-se em
sua fase evolutiva intermediária de 7 (sete) dias, fase esta bem mais proliferati-
va. Mesmo assim, êmbolos tumorais nesta fase evolutiva, haja vista ser a fase na
qual o tumor vence a membrana basal, já se manifestam na forma de êmbolos
intravasos, vez que o tumor está sob tratamento quimioterápico reforçado com
5FU + LEU associados à HT (Figura 57).
O que não dizer do tumor de Walker 256 em sua fase evolutiva a-
vançada de 10 (dez) dias, vez que nas fases inicial (3 dias) e intermediária (7
152
dias) o tumor já se manifestava na forma de êmbolos dentro de vasos, sob trata-
mento quimioterápico com 5FU + LEU associados à HT, pois, na fase evolutiva
avançada de 10 dias, os vasos se encontram cheios de êmbolos tumorais e man-
guito perivascular de células tumorais ao seu redor (Figura 65). Nesta situação, o
tumor de Walker 256 também está sob tratamento reforçado (5FU + LEU asso-
ciados à HT); não obstante, sem a efetividade esperada, pois, se este tratamento
não respondeu satisfatoriamente com o tumor em sua fase evolutiva inicial de 3
dias, onde já havia a presença de êmbolos tumorais dentro dos vasos, o que dizer
do tumor em sua fase evolutiva avançada de 10 dias, onde já há maior quantida-
de de êmbolos. Desta forma, pouco se pode esperar de quaisquer tratamentos em
vista de um tumor tão agressivo quanto este.
Foi constatado em trabalho recente (Oliveira, 1997) que o tumor de
Walker 256, implantado em estômagos de rato Wistar com 1 milhão (10
6
) de
células em todos os casos, não apresenta metástases à distância, apesar de êmbo-
los tumorais tão precocemente evidenciados. No entanto, foi observada invasi-
vidade por contiguidade no fígado (Oliveira, 1997) e pâncreas (Figuras 14 e 80).
O tumor de Walker 256, embora apresente precoce invasividade e
elevada agressividade, não apresenta tumores secundários ou metástases. Este
fato poderia ser explicado por possíveis alterações na expressão de moléculas de
adesão, o que impediria a migração de células tumorais para a fixação em molé-
culas do órgão-alvo, e conseqüente extravasamento, para que assim seja possível
a formação de metástases.
Os cânceres crescem por infiltração progressiva, invasão e destrui-
ção do tecido circunjacente. Em geral, são pouco demarcados do tecido normal
circundante, e lhes falta um plano de clivagem bem definido (Robbins et al.,
1991).
A maioria dos cânceres é obviamente invasiva, e se pode esperar,
por exemplo, invasão da parede do cólon ou do útero, ou projeção através da
153
superfície da pele (nódulo da irmã Josefa). Eles não reconhecem os limites ana-
tômicos e normais e, com freqüência, expandem-se através dos linfáticos, dos
vasos sangüíneos, e dos espaços perivasculares (Robbins et al., 1991).
Neste trabalho, pôde-se constatar que o tumor experimental expan-
diu-se para os vasos sangüíneos nas diferentes fases de sua evolução (inicial (3
dias), intermediária (7 dias) e avançada (10 dias)) (Figuras 52, 57 e 65), além
também de expandir-se em infiltrado perineural (Figura 68), o que vem confir-
mar a natureza invasiva e agressiva do mesmo.
As artérias são muito mais resistentes a invasões do que as veias ou
os canais linfáticos. Esta resistência é atribuída convencionalmente à espessura
das paredes arteriais, porém, pode ser atribuída também ao conteúdo em elastina
dessas paredes, assim como, ao fato de elaborarem inibidores da protease (Rob-
bins et al., 1991).
Portanto, constata-se com evidência que o tumor experimental em
fase evolutiva avançada de 10 dias sob reforçado tratamento quimioterápico
(5FU + LEU associados à HT) mostra capilar com células tumorais ao seu der-
redor e veia cheia de êmbolos, e denotam-se ainda artéria ao meio e artéria com-
pletamente normal (Figura 65), demonstrando assim que as artérias são menos
susceptíveis a invasões.
Vários estudos têm demonstrado uma clara correlação entre o nível
de expressão de E-caderinas e invasividade, além de fornecerem evidências de
que as mesmas devem agir como uma proteína supressora da invasão. Contudo,
o papel das E-caderinas na invasividade deve ser restrito à invasão inicial em si
mesma. A liberação de células tumorais a partir do tumor primário e a formação
de metástases exigem atividades celulares adicionais, tal como: ações proteolíti-
cas, interações adesivas das células tumorais com a membrana basal e eventos
de locomoção celular. A este respeito, deve-se observar que linhagens celulares
derivadas de tumor têm sido isoladas e que estas mostram uma perda completa
154
da expressão de E-caderina, apesar de não metastizarem in vivo (Herrenknecht,
1996).
O reduzido nível, ou ausência, de E-caderinas em tumores desdife-
renciados pode ser provocado por diversas maneiras. Por exemplo, vários tumo-
res estão associados com deleção alélica ou perda de heterozigose sobre o cro-
mossomo 16, onde as E-caderinas estão localizadas (16q22), resultando numa
regulação baixa de sua expressão (Herrenknecht, 1996).
Acredita-se, portanto, que o tumor experimental de Walker 256,
devido a sua invasividade para os vasos, provavelmente possa apresentar altera-
ção (diminuição) na expressão ou na atividade das E-caderinas.
A perda de expressão, ou aumentada expressão, de algumas integri-
nas específicas pode ser vista em alguns tipos de células neoplásicas específicas,
levando assim a uma invasividade aumentada e/ou a propriedades metastáticas
(Rosales et al., 1995).
Em alguns casos, tem sido relatado que a progressão tumoral, em
fase mais benigna para fase mais maligna, está associada com perda de expres-
são de subunidades específicas de integrinas (Hart, 1996).
Em geral, um rato possui 42 cromossomos normais (Figura 81). A
quantidade encontrada no tumor experimental de Walker 256 deste estudo foi
inferior, variando entre 36 e 39 cromossomos. O que possibilita dizer que se es-
tá, no mínimo, diante de uma alteração autossômica (Figura 82).
Na maioria das desordens autossômicas recessivas, o principal de-
feito bioquímico refere-se a alguns aspectos do metabolismo do DNA, ou estru-
tura cromossomal, especialmente reparo do DNA. A perda da capacidade das
células em reparar o dano ao DNA em pacientes com Xeroderma pigmentosum é
bem conhecida. Através de estudos de mutações nesta doença, pôde-se encontrar
e caracterizar 14 ou mais genes envolvidos na reparação de nucleotídeos (Ho-
eijmakers, 1994). Outras doenças autossômicas recessivas que estejam associa-
155
das a uma aumentada incidência de neoplasias podem exibir anormalidades ge-
néticas relacionadas a defeitos na manutenção ou reparo da estrutura genômica.
Estas incluem: síndrome de Bloom, anemia de Fanconi e ataxia telangiectasia
(Hanawalt & Sarasin, 1986), as quais estão associadas à instabilidade cromos-
sômica.
Alguns investigadores têm relatado aberrações numéricas e estrutu-
rais em cromossomos celulares, intestinais e outros (Gardner et al., 1982; Takai
et al., 1986).
A morfologia de fibroblastos da pele que crescem em cultura de
células a partir de pacientes com polipose familiar, ou síndrome de Gardner, e-
xibem mudanças indicativas de que tais células são anormais e mais parecidas
com células em processo de transformação neoplásica in vitro (Antecol & Mu-
kherjee, 1982). Assim sendo, alterações em um único gene (APC) podem levar
ao desenvolvimento de neoplasia numa variedade de tecidos, originando assim a
polipose familiar.
Uma aberração numérica autossômica foi constatada no tumor ex-
perimental de Walker 256 deste estudo (Figura 82). Espera-se que num futuro
próximo possa-se detectar tais aberrações com o intuito de melhor caracterizar o
tumor e até dizer com clarividência o porquê dele apenas invadir e não metastizar.
Neste experimento, detectou-se apenas alteração autossômica (Fi-
gura 82) do tumor de Walker 256. Num futuro próximo, onde se possa fazer es-
tudos mais detalhados envolvendo alterações cromossômicas estruturais, quiçá
seja-se capaz de descrever, por exemplo, transformações cromossômicas ou
mesmo alteração de fatores de crescimento.
Sabe-se ser grande o número de subtipos histológicos que fazem
parte dos sarcomas de partes moles (SPM), e várias alterações moleculares rela-
tivas às translocações em diferentes cromossomos e em genes distintos já foram
determinadas.
156
A superexpressão de fatores de crescimento e de receptores de fato-
res de crescimento tem sido relatada (EGF, EGFr, TGF-, PDGF-) (Kohlber-
ger et al., 1995). O aumento da expressão do fator de crescimento de cadeia de-
rivado de plaquetas mostrou-se relacionado à presença de tumores de alto grau e
a um elevado índice de antígeno de proliferação nuclear, sugerindo que PDGF-
deva ser um importante mediador da proliferação celular nos SPM. Demonstrou-
se também que fatores de crescimento tipo insulina (IGF-1 e IGF-2) encontram-
se superexpressos em 50% das vezes, sugerindo assim a existência de mecanis-
mos regulatórios autócrinos e parácrinos envolvidos no crescimento desses tu-
mores (Kohlberger et al., 1995).
Quando se trata de câncer de pulmão em humanos, o carcinoma
neuroendócrino de pequenas células, em 78% das vezes, apresentou-se em topo-
grafia central. O alargamento do mediastino pelas metástases linfonodais é fre-
qüente (Younes, 1997; Shields, 2001; Pearson, 2002).
Ainda se tratando de câncer de pulmão em humanos, os carcinomas
de pequenas células apresentam o pior prognóstico quando comparados aos car-
cinomas de não-pequenas células. São tumores de tratamento químio- e radiote-
rápicos. Indica-se a cirurgia apenas quando se apresentam como nódulos perifé-
ricos únicos e quando os exames de estadiamento demonstram que não há dis-
seminação linfática ou metástase à distância (Younes, 1997; Shields, 2001; Pe-
arson, 2002).
Já o tumor de pequenas células tipo tumor de Walker 256 utilizado
neste trabalho, mostra-se bastante agressivo e, mesmo sem exibir metástases à
distância, evidencia invasividade e alterações qualitativas nas mitoses, além de
alterações inclusive no número de cromossomos; o tumor mostra-se com instabi-
lidade genética, a qual bem evidencia uma progressão de baixo controle em sua
evolução. Daí porque se faz vaticinar ser de difícil manuseio terapêutico.
157
Com todas estas observações feitas, e frente a todas as dificuldades
apresentadas no manuseio do tumor, o mesmo enseja a que se façam muitas e
maiores análises em trabalhos futuros, no intuito de melhor conhecer este tumor,
haja vista que o esforço de reconhecê-lo como um tumor de pequenas células e
as investigações no âmbito da quimioterapia com Paclitaxel (Taxol®), 5-
Fluorouracil (5-FU) e Ácido Folínico (Leucovorin®), isolados ou associados à
hipertermia, foram apenas um ensaio, não obstante, novos ensaios virão com
certeza.
158
CONCLUSÕES
1. Tratamento com Paclitaxel (Taxol®)
Com relação ao tumor de Walker 256 implantado em estômagos de
rato Wistar, concluiu-se que:
O tratamento com Paclitaxel isolado foi mais significante do que o
Paclitaxel associado à hipertermia.
2. Tratamento com 5-Fluorouracil (5-FU)
Com relação ao tumor de Walker 256 implantado em estômagos de
rato Wistar, concluiu-se que:
O tratamento com 5-FU isolado foi mais significante do que o 5-FU
associado à hipertermia.
3. Tratamento com Ácido Folínico (Leucovorin®)
Com relação ao tumor de Walker 256 implantado em estômagos de
rato Wistar, concluiu-se que:
Os tratamentos com 5-FU + LEU isolados e 5-FU + LEU associa-
dos à hipertermia não obtiveram significância.
4. Progressão Tumoral
Com relação ao tumor de Walker 256 implantado nos estômagos de
rato Wistar, concluiu-se que:
1) Em todas as fazes evolutivas (inicial – 3 dias, intermediária –
7 dias e avançada – 10 dias) o tumor apresentou invasividade e
agressividade, mas sem metástase.
2) O tumor de Walker 25 tem comportamento semelhante a tumo-
res de pequenas células indiferenciadas.
159
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203
ANEXOS
Anexo 1. Temperaturas medidas em ratos tratados com 5-FU associado à
hipertermia
Temperatura (ºC)
Rato n
o
0 min (t
0
) 20 min 30 min 40 min 50 min 60 min
01 36 39,8 40,2 40,2 40,2 40,2
02 36 37,3 37,5 37,9 38 38,5
03 35,8 37,5 37,5 37,5 37,5 37,5
04 36,2 39,5 41,3 42 42 42
05 37,5 39,7 39,7 39,8 40,6 39,7
06 37,1 39,8 40,8 41 40,9 40,2
07 36,9 37,9 38,2 38,2 38 38
08 36,5 39,2 40 41,2 40 40
09 36,4 38,5 39,2 39 40 40,1
10 36,4 39,1 38,7 39,4 39 39,9
11 36,1 40,3 41,3 42 41,9 42
12 36,5 38 37,9 38,7 38,2 39,1
13 37 39,5 40,3 40 40,2 40,8
14 36,7 38 37,5 38,3 38,8 39
15 37,2 37,5 37,5 39 38,4 38,1
16 37,3 37,8 37,5 37,9 37,6 37,2
17 37,5 39,5 40 39 39 39
18 36,9 38,9 38 37,5 37 37
19 37 38 38,2 38,4 38,7 38,7
20 36,5 38,1 37,8 38,2 37,9 38
21 36,9 37 37,5 37,5 37 36,8
22 37 37,2 40,2 40,4 40,6 40,7
23 37 39,8 40,1 40 40,2 39,8
24 37 39,9 40,7 41,2 41,4 40,4
25 36 37 38 37 37 37
204
Anexo 2. Temperaturas medidas em ratos tratados com 5-FU + LEU asso-
ciado à hipertermia
Temperatura (ºC)
Rato n
o
0 min (t
0
) 20 min 30 min 40 min 50 min 60 min
01 37 37 36 36 35,8 35,3
02 37 38 38 39 38,5 39
03 38 36 35,7 37 37 37,2
04 38 39 38,6 39,2 38,1 38,2
05 37 35,8 35 35 35 35
06 36,5 36,5 35,5 36 36,5 35
07 37 38,8 39,8 40,5 40,6 39,7
08 38 39,8 41 41 39,5 40,5
09 38,9 40,9 39,8 39,8 39,4 39,5
10 38 37,7 37,1 37 37,8 38,1
11 37 39,5 39,4 39 39,5 39,5
12 37 39,8 40,1 39,5 39,5 40,1
13 39 38,7 39,4 39,2 39,7 39,5
14 37,5 37,5 37 36,5 36,5 37
15 37,2 36,8 36,9 36,8 36,8 37
16 36,8 37 36,6 36,5 36,5 36,5
17 36,3 40,5 41,7 40,7 40,7 39
18 38 37 37,5 36,7 36,7 37
19 37,2 35 34 34 35 35
20 36,5 36 36 35,7 37 37
21 37 38 38,3 35 36 37
22 37,3 36,2 37,2 38 37,5 38
23 36,2 36,2 36,3 36,3 36,2 36,5
24 38 40,2 38,5 38,3 38,3 36,2
25 37 36 39,5 40,5 40,5 40,9
