ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
ESTUDO DOS EFEITOS DA INIBIÇÃO CRÔNICA
DO ÓXIDO NÍTRICO NA REPRODUÇÃO
DE RATOS MACHOS
Adriana da Rocha Tomé
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Farmacologia do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal do Ceará como requisito para obtenção do título
De Doutor em Farmacologia
Orientador: Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao
Fortaleza
2002
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
4
Esta tese foi submetida como parte dos requisitos necessários à obtenção do
grau de Doutora em Farmacologia, outorgado pela Universidade Federal
do Ceará, e encontra-se à disposição dos injteressados na Biblioteca
Setorial desta instituição.
Defesa Formal aprovada em
Adriana da Rocha Tomé
Banca Examinadora:
Professor Dr. Viela Satyanarayana Rao
Orientador
Professor Dr. Manasses Claudino Fonteles
Co-orientador
Professor Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro
Professor Dr. Vicente José de Figueiredo Freitas
(UECE)
Professor Dr. Marcus Raimundo Vale
ads:
5
T618e Tomé, Adriana da Rocha
Estudo dos efeitos da inibição crônica do óxido
nítrico na reprodução de ratos machos / Adriana da Rocha
Tomé. – Fortaleza, 2002.
113f.: il.
Orientador: Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao
Tese (Doutorado). Universidade Federal do Ceará.
Curso de Pós-Graduação em Farmacologia.
1. Óxido nítrico – processo reprodutivo.
I. Título
CDD 591.16
6
ÍNDICE
RESUMO 4
ABSTRACT 6
1. Revisão de Literatura 8
1.1 Histórico 8
1.2 Biosíntese do NO 11
1.3 Transporte de NO e Mecanismo de Ação Biológico 16
1.4 Inibidores da NO sintetase 19
1.5 O Papel do NO na Reprodução 24
1.6 O Papel do NO na Reprodução Feminina 25
1.6.1 Função Ovariana 25
1.6.2 Função do Oviduto 25
1.6.3 Função Uterina e Vaginal 26
1.7 O Papel do NO na Reprodução Masculina 28
1.7.1 Óxido Nítrico e Regulação da Ereção Peniana 28
1.7.2 Óxido Nítrico e Função Testicular 35
1.7.3 Óxido Nítrico e Motilidade Espermática 37
1.7.4 Óxido Nítrico e Espermatogênese 37
1.7.5 Controle Hormonal da Espermatogênese 40
1.7.6 Óxido Nítrico e Esteroidogênese 40
1.7.7 Óxido Nítrico e Comportamento Sexual 44
2 - OBJETIVOS 46
2.1 - OBJETIVO GERAL 46
2.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS 46
3 - MATERIAIS E MÉTODOS 47
3.1 – Materiais 47
3.1.1 - Animais
47
3.1.2 – Drogas e Reagentes 47
3.1.3 - Aparelhos e Materiais 47
3.2 – Métodos 49
3.2.1 - Descida Testicular 49
3.2.2 - Emissão Seminal Induzida pela Pilocarpina 49
3.2.2.1 – Dosagem de Nitrito/Nitrato 51
3.2.3 – Inibição Crônica da Óxido Nítrico Sintetase (NOS) 51
3.2.3.1 – Medição da Pressão Arterial 52
3.2.3.2 – Comportamento Sexual 53
3.2.3.2.1 - Ooforectomia 53
3.2.3.3 - Fertilidade 54
3.2.3.4 – Pesos Corporais e Pesos Relativo dos Órgãos 54
3.2.3.5 – Histologia Testicular 55
3.2.3.5.1 - Microscopia Óptica 55
3.2.3.5.2 - Microscopia Eletrônica 55
3.2.3.5 – Morfologia e Concentração Espermática 56
3.2.3.6 - Dosagem de Testosterona Plasmática 57
7
3.2.3.7 – Análise Estatística 57
4 – RESULTADOS 58
4.1 - Descida Testicular 58
4.2 – Emissão Seminal 59
4.2.1 – Emissão seminal induzida por pilocarpina 59
4.2.2 – Efeito da atropina e do L-NAME na emissão seminal induzida pela
pilocarpina
60
4.2.3 – Reversão pela L-arginina e nitroprussiato de sódio da emissão seminal
induzida pela pilocarpina
61
4.2.4 – Dosagem de nitrito/nitrato 62
4.3 – Inibição crônica da óxido nítrico sintetase 63
4.3.1 – Medição da pressão arterial 63
4.3.2 – Efeito da inibição crônica da NOS no comportamento sexual de ratos
machos
64
4.3.3.- Efeito da inibição crônica da NOS na fertilidade de ratos machos 67
4.3.4.- Peso corporal e peso relativo do epidídimo, próstata e vesícula
seminal.
68
4.3.5. – Histologia Testicular 70
4.3.5.1. – Microscopia Óptica 70
4.3.5.2.- Microscopia Eletrônica 72
4.3.6 -Morfologia e Concentração Espermática 75
4.3.7.- Dosagem de Testosterona Plasmática 79
5. DISCUSSÃO 80
6. CONCLUSÕES 95
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 96
8
RESUMO
O óxido nítrico (NO), derivado da L-arginina pela óxido nítrico
sintetase (NOS), a qual existe em várias isoformas, é considerado um importante
mensageiro molecular em vários órgãos incluindo o trato genital masculino. Este
estudo analisou o possível efeito do L-NAME (N
G
-nitro-L-arginina metil éster),
um inibidor não seletivo de NOS sobre a descida testicular, emissão seminal
induzida por colinérgico, função testicular, comportamento sexual e fertilidade
em ratos Wistar machos. O tratamento de ratos machos de 20 dias de idade com
L-NAME na dose de 20mg/kg/dia por 10 dias consecutivos promoveu um
significativo retardo na descida testicular comparado ao controle que recebeu
salina. Este efeito do L-NAME foi bloqueado em animais pré-tratados com L-
arginina (600mg/kg, s.c.), um substrato para a biossíntese de NO, sugerindo que
o NO exerce um papel modulador na descida testicular. Em ratos machos
adultos, a pilocarpina (0,75 e 3,0 mg/kg, i.p.), droga colinérgica, induziu a
emissão seminal de maneira dose-dependente. A emissão seminal em resposta a
pilocarpina ( 3,0 mg/kg) foi diminuída em animais atropinizados sugerindo um
efeito colinérgico. L-NAME tembém inibiu a emissão seminal induzida por
pilocarpina e este efeito foi revertido por L-arginina (600mg/kg, s.c.) ou pela
administração conjunta de nitroprussiato de sódio (0,5mg/kg, s.c.). Além disto, a
análise urinária de nitrato/nitrito demonstrou marcada alteração em concordância
com o tratamento. Estes resultados sugerem que o NO participa na
neurotransmissão inibitória responsável pela emissão seminal em ratos
estimulados com pilocarpina. Em experimentos realizados para verificar os
efeitos da inibição crônica de NOS sobre o comportamento copulatório, o
tratamento de ratos com L-NAME (40mg/kg/dia) durante um período de um
ciclo completo de espermatogênese uma influência inibitória sobre o
comportamento sexual foi evidenciada por um aumento na latência da primeira
monta e intromissão e marcada inibição da frequência de intromissão e ejulação.
A inibição crônica de NOS também demonstrou alteração na função testicular
refletida pela diminuição nos níveis séricos de testosterona, contagem de
9
espermatozóides e anormalidades espermáticas. O número de fêmeas grávidas,
de machos que receberam tratamento crônico com L-NAME, foi reduzido
resultando em 75% de inibição da fertilidade. O efeito de L-NAME sobre a
fertilidade masculina pode dever-se a inibição da NOS periférica e central
promovendo inibição da secreção local de androgênios e/ou gonadotrofinas. Os
resultados mostram evidências que o NO regula de maneira importante o
processo reprodutivo masculino tais como descida testicular, comportamento
sexual e fertilidade.
10
ABSTRACT
Nitric Oxide (NO) derived from L-arginine by the nitric oxide synthase
(NOS) which is expressed by various isoforms, is considered to be na important
messenger molecule in several organ systems including the male genital tract.
This study analysed the possible effects of L-NAME (N
G
-nitro-L-arginine methyl
ester), a nonselective NOS inhibitor on testicilar descent; cholinergic stimulation-
induced seminal emission; testicular function; sexual behaviour; and on fertility
of male Wistar rats. Treatment of 20 days old male rats with L-NAME at
20mg/kg/day for 10 consecutive days caused a significant delay in the testes
descent compared to controls that receives only normal saline. This effect of L-
NAME was fully reversed in animals pretreated with L-arginine (600mg/kg,
s.c.), a substrate for NO biosynthesis, suggesting stimulant drug pilocarpine (0.75
– 3.0 mg/kg, i.p.) induced a dose-related seminal emission. The seminal emission
response to 3.0mg/kg of pilocarpine was greatly diminished in atropinized
animals, suggesting a cholinomimetic effect. L-NAME, also inhibited the
pilocarpine-induced seminal emission which could be reversed by L-arginine
(600mg/kg, s.c.). Further, urine analysis for nitrate/nitrite metabolites showed
marked alterations in accordance to the drug treatments. These results suggest
that NO mediates the inhibitory neurotransmission responsible for seminal
emission in pilocarpine stimulated rats. In experiments carried out to verify the
effects of chonic NOS inhibition on copulatory behavior, treatment of rats with
L-NAME (40mg/kg/day) for a period of one complete spermatogenic cycle
caused an inhibitory influence on sexual behavior as evidenced by a increase in
the first mount and intromission latencies and marked inhibitions of the
intromission and ejaculation frequencies. Chronic NOS inhibition further
evidenced impaired testicular function, reflected by decreases in serum levels of
testosterone, epididymal sperm counts and sperm abnormalities. The number of
females impregnated with males that received chronic L-NAME treatment was
highly reduced, resulting in 75% inhibition of fertility. The adverse influence of
11
L-NAME on male infertility could be due to NOS inhibition at both peripheral
and central sites causing inhibition of local androgen and/or gonadotropin
secretions. These results provide evidence that NO importantly regulates male
reproductive processes such as testicular descent, sexual behavior and fertility.
1
1. Revisão de Literatura
1.1 Histórico
Em 1916, Mitchell et al., observaram que o óxido de nitrogênio era
produzido em mamíferos. Essa observação foi confirmada posteriormente por
Tannenbaum et al. (1928). O óxido nítrico é extremamente lábil, sua meia-vida
no organismo é de 5-10 segundos e depois é convertida, na presença de água e
oxigênio, em nitratos e nitritos. Apesar dos seres humanos excretarem nitratos, os
cientistas sempre acharam que este era derivado apenas da dieta. Em 1956,
Magge and Barnes do conselho de pesquisas médicas de Surrey, Inglaterra,
relataram que o organismo humano converte nitratos de alimentos curados em
nitrosaminas carcinogênicas. Em 1981, Steven Tannenbaum e seus colaboradores
no Instituto de Tecnologia de Massachusetts (MIT), observaram que seres
humanos e ratos alimentados com dieta contendo níveis baixos de nitratos
continuavam a excretar quantidades substanciais de nitratos, concluindo que a
dieta não era a única fonte de nitratos. Tannenbaum encontrou uma pista valiosa
em um de seus pacientes. O mesmo excretava níveis muito altos de nitratos no
período em que se encontrava com uma diarréia infecciosa. O processo
inflamatório associado com a diarréia era aparentemente responsável pela
formação de nitrato. Em um trabalho posterior, Tannenbaum observou, que
injeções de endotoxina bacteriana incrementava em muito a excreção de nitratos
em ratos. A fonte precisa da formação de nitrato foi descoberta por Michael
Marletta da Universidade de Michigan, quando da orientação de seu aluno
2
Dennis Stueher da Universidade de Utah. Marletta foi aluno de Tannenbaum no
MIT e continuava intrigado a respeito do papel do sistema imunológico na
formação de nitrato. Marletta descobriu que uma cepa de camundongos com
deficiência de macrófagos induzida geneticamente excretava quantidades muito
baixas de nitratos e estabeleceu uma relação entre a presença de macrófagos e a
excreção de nitratos. Estudando macrófagos em cultura, descreveu a relação entre
a adição de endotoxina bacteriana e interferon gama com a produção de nitrato
pelos macrófagos constatando que, através da manipulação do meio de cultura na
ausência de L-arginina, os macrófagos perdiam a habilidade de produzir nitratos.
John Hibbs et al. (1987) trabalhando independentemente demonstrou, que
macrófagos só conseguiam destruir células tumorais em cultura na presença de
arginina e que a mesma era convertida em nitrato e citrulina. A partir desta
descoberta ele considerou, que o óxido nítrico era produzido por uma enzima
presente no macrófago, que se utilizava de L-arginina como substrato e
produzindo citrulina, sendo o primeiro pesquisador a sintetizar um análogo da L-
arginina para bloquear esta enzima. O derivado metilado da L-arginina foi capaz
de inibir a capacidade dos macrófagos de gerar óxido nítrico e assim destruir
células tumorais, fungos e bactérias.
Numa série de investigações não-relacionadas, pesquisadores
identificaram o óxido nítrico como uma mólecula mensageira intracelular.
Existem duas etapas deste aspecto da história do óxido nítrico. A primeira etapa
diz respeito ao detalhamento de como neurotransmissores dilatam vasos
sanguíneos e a segunda é concernente ao estudo de drogas dilatadoras
3
coronarianas utilizadas no tratamento sintomático da angina. Furchgott, um
farmacologista cardiovascular trabalhando no Medical Center Downstate no
Brooklyn em Nova York, USA e Zawadski (1980), forneceram evidências que o
relaxamento de anéis vasculares induzido pela acetilcolina era mediado por um
fator relaxante derivado do endotélio (FRDE). Inúmeros investigadores,
incluindo o próprio Furchgott e Ignarro, da Universidade da Califórnia, tentaram
isolar sem sucesso o fator relaxante derivado do endotélio, no entanto,
demontraram que o mesmo aumenta os níveis intracelulares de GMPc no
músculo liso vascular. Neste meio tempo, investigadores como Ferid Murad, na
Universidade da Virgínia, estavam tentando entender os mecanismos da eficácia
da nitroglicerina no tratamento de ataques cardíacos. Em 1977, Murad e seus
colaboradores então na Universidade de Stanford descobriram, que a
nitroglicerina e outros nitratos orgânicos são pró-drogas, que se tornam ativas
quando convertidas metabolicamente a óxido nítrico e que os mesmos relaxavam
os vasos aumentando os níveis de GMPc (Katsuki et al, 1977). Em 1986, tanto
Furchgott como Ignarro especularam, que o óxido nítrico ou uma molécula
quimicamente relacionada, eram o fator de relaxamento derivado do endotélio.
Independentemente, Palmer et al. (1987) e Ignarro et al. (1987), forneceram
evidências que o FRDE era o óxido nítrico (NO). Um ano depois, Palmer et al.
(1988) publicaram que o NO era sintetizado no endotélio a partir da L-arginina,
formando no processo, a citrulina.
Garthwaite et al. (1988), trabalhando no Royal College of London,
encontraram evidências para a presença e síntese de NO no cérebro. Estes
4
achados foram confirmados por David Bredt e Solomon Snyder (1989) no Johns
Hospkin Hospital de Baltimore, Maryland, USA, que localizaram as regiões onde
a óxido nítrico sintetase neuronal se expressava e caracterizara o óxido nítrico
como um neurotransmissor central e periférico, do tipo não adrenérgico não
colinérgico (NANC), em fibras neuronais no trato intestinal e genitourinário, que
passaram a se denominar fibras nitrérgicas.
Durante o período de 1989 até hoje, foram realizadas inúmeras pesquisas
sobre a biologia e função do NO com mais de 10.000 publicações neste campo
por ano e em 1992 o óxido nítrico foi nomeado como “Molécula do Ano” por
parte dos editores da revista Science. A descoberta desta molécula como um
neurotransmissor, mensageiro celular e efetor da resposta imune celular
revolucionou vários campos da medicina, principalmente nas áreas de fisiologia,
patologia, farmacologia básica e clínica, neurologia, imunologia e reprodução.
1.2 Biosíntese do NO
O NO é um radical livre gasoso inorgânico formado pela óxido nítrico
sintetase (NOS), numa reação que combina oxigênio molecular com o nitrogênio
terminal do aminoácido L-arginina, liberando L-citrulina. A NOS requer não
somente esses substratos , mas também outras co-enzimas/cofatores como a
flavina adenina dinucleotídeo (FAD), a nicotinamida fosfato de adenina
dinucleotídeo (NADPH), tetrahidrobiopterina (THB
4
) e calmodulina (Bredt &
Snyder, 1994; Palmer et al., 1988b; Moncada et al., 1989; Moncada, 1992)
5
(Figura 1).
L-arginina + O
2
+ NADPH
Citrulina + NO + NADP
A NOS existe em três isoformas. A NOS cerebral (NOSb) ou neuronal
(NOSn NOS1) e endotelial NOS (NOSc ou NOS3), também referida como NOS
constitutiva (NOSc), são responsáveis pela liberação basal de NO, sendo ambas
cálcio/calmodulina dependente para sua ativação (Griffith & Stuehr, 1995;
Snyder, 1995). A atividade dessas duas diferentes isoformas de NOS podem ser
reguladas por hormônios sexuais (Weiner et al., 1994).
NOS
FAD
FMN
Biopterina
Figura 1.Síntese do NO. No painel (a) é mostrado um esquema geral comsubstratos,
enzima, cofatores e principais produtos da via L-arginina-NO. Um esquema das
reações de oxidação mostrando as estruturas químicas primárias é mostrado no painel
(b). Os inibidores da NOS agem como falso substrato, substituindo a L-arginina no
processo.
b
a
6
Uma terceira isoforma é a forma cálcio-independente (NOSi ou NOS2),
que é expressa somente em resposta a citocinas inflamatórias ou
lipopolissacarídeos (LPS) (Nussler & Billiar, 1993; Morris & Billiar, 1994).As
três isoformas da NOS são produtos de genes separados, entretanto com
homologia de 50 a 60% dos aminoácidos (Nethan & Xie, 1994).
Entretanto, as três isoformas presumivelmente funcionam como um
homodímero durante a ativação, compartilhando de domínio carboxi-terminal
redutase homólogo a citocromo P-450 redutase e um domínio amino terminal
oxigenase contendo um grupo heme prostético, que são ligados ao meio da
proteína por um domínio ligador de calmodulina (Dinerman et al., 1993; Abu-
Soud et al., 1994; Sessa, 1994; Su et al., 1995).
O domínio redutase das três isoformas de NOS contém tetraidrobiopterina
(THB), que é requerida para a geração eficiente de NO e necessário para manter
uma conformação estável para o transporte de elétrons, provavelmente por
promover uma homodimerização (Klatt et al., 1995; Tzeng et al., 1995; Ghosh et
al., 1996) (Figura 2).
7
Figura 2. Isoformas da Óxido Nítrico Sintetase (NOS)
Aumentos da concentração intracelular de cálcio disparam uma cascata de
eventos levando a ativação de NOSc e síntese de NO. O cálcio intracelular se liga
a calmodulina para formar o complexo cálcio-calmodulina e regular a ligação de
calmodulina ao domínio trava (“latch domain”), que permite a transferência de
elétrons do NADPH via grupos de flavinas, através do domínio redutase de um
sítio ativo contendo heme, facilitando a conversão de O
2
e L-arginina para NO e
L-citrulina (Abu- Soud et al., 1994; Su et al., 1995; Siddhanta et al., 1996).
Em contraste com NOSc, a NOSi não requer um aumento intracelular de
cálcio (Cho et al., 1992). Quelantes de cálcio têm mostrado serem redutores da
atividade de NOSc; contudo, com vistas a atividade de NOSi , o papel do cálcio
permanece pouco claro. Gellar et al. (1993), afirmam que quelantes de cálcio
significativamente reduziram a atividade NOSi, enquanto Charles et al. (1993),
afirmam que a atividade NOSi não é influenciada pelos quelantes de cálcio.
Excluindo o cálcio, diversos outros fatores podem regular a atividade da
8
NOS. Mecanismos pré e pós traducionais e transcricionais têm demonstrado
serem reguladores da expressão de todas as isoformas de NOS (Kelly et al.,
1996). Embora a NOSi seja citosólica, a NOSc possui sítio de miristilação,
capacitando-a de se ligar a membrana celular (Busconi & Michel, 1993). A
fosforilação da NOSc pela proteína quinase C e A está associada com o
desligamento da enzima da membrana celular e perda de atividade (Bredt et al.,
1992; Michel et al., 1993). Existem também, sítios potenciais de fosforilação na
NOSi (Geller et al., 1993); contudo, não tem sido demonstrado um significado
funcional para estes sítios.
A associação aparente das três isoenzimas NOS com o endotélio (NOSe),
neurônios (NOSn) e com necessidade de indução (NOSi) é uma simplificação
didática de apresentação das mesmas. Por exemplo, a NOSe é localizada não
apenas nas células endoteliais vasculares mas também em plaquetas (Radomski
et al., 1990) e em certas populações neuronais no cérebro (Dinerman et al.,
1994), enquanto a NOSn foi encontrada no epitélio bronquiolar e na traquéia
(Kobzik et al., 1993), e também no músculo esquelético (Kobzik et al., 1994).
Além do mais, algumas diferenças tem sido identificadas entre NOSi obtidas de
diferentes tecidos dentro de uma mesma espécie animal (Mohaupt et al., 1994).
Ademais, a NOSe (constitutiva) pode ser induzida em certas circustâncias como
durante exercitação crônica (Sessa et al., 1994) ou durante a gravidez, quando
tanto NOSe quanto a NOSi são induzidas (Weiner et al., 1994), enquanto em
alguns tecidos a NOSi é expressa constitutivamente, como no epitélio bronquial
humano (Kobzik et al., 1993), no rim de rato (Mohaupt et al., 1994) e em
9
alguns tecidos fetais (Baylis et al., 1994).
A L-arginina é o único doador fisiológico de nitrogênio e substrato
essencial para a determinação da taxa de geração de NO. A arginina é sintetizada
a partir da citrulina por ação da argininosuccinato sintetase (Morris & Billiar,
1994; Nussler et al., 1994). O transporte da arginina para dentro da célula é fator
limitante da atividade NOS (Sax et al., 1988).
Inibidores competitivos da arginina como o N
G
- nitro-L-arginina metil
éster (L-NAME) ou o N-monometil-L-arginina (L-NMMA) promovem a
diminuição da atividade enzimática da NOS (Bogle et al., 1992). Assim, a síntese
e transporte da arginina representam alvos potenciais para experimentação e
manipulação da síntese de NO celular (Rosselli et al., 1998).
Tem-se demonstrado que a NOS é geradora de peróxido de hidrogênio,
superóxido, bem como de NO (Heinzel et al., 1992). Superóxidos (
.
O
2
-
) gerados
em baixas concentrações de L-arginina reagem com o NO, resultando em
aumento da geração de peroxinitrito (ONOO
-
) e consequente toxicidade celular.
Essas reações são bloqueadas por inibidores de NOS como o L-NAME (Xia et
al., 1996).
1.3 Transporte de NO e Mecanismo de Ação Biológico
Inicialmente, acreditava-se que o NO alcançava seu alvo intracelular
através da livre difusão pela membrana da célula. Contudo, devido a sua
curtíssima meia-vida (< 30 s) e sua alta reatividade com o O
2
-
, ferro heme e não-
10
heme, o conceito de difusão passiva do NO foi difícil de ser aceito. Devido a
reação do NO com os grupos tiol (-SH) de proteínas, esta molécula pode formar
compostos S-nitrosil estáveis e biologicamente ativos (Stamler et al, 1992). De
fato, tem-se demonstrado que o NO circula na forma de albumina S-nitrosilada e
possui atividades biológicas idênticas as do NO in vitro e in vivo (Keaney et al.,
1993). Desde que os compostos ferro-nitrosil são associados com ligantes de tiol,
a formação do ferro-dinitrosil cisteína tem sido sugerido como uma segunda via
para o transporte de NO (Mulsch et al., 1993).
Atualmente, o NO é tido como mediador de múltiplos efeitos biológicos,
embora inicialmente tenha-se acreditado, que os efeitos do NO fossem mediados
somente via ativação da guanilato ciclase e consequentemente, da 3’, 5’-
guanosina monofosfato cíclico (GMPc). O GMPc atua como mediador no
relaxamento, inibidor do crescimento de célula muscular lisa vascular e na
prevenção da agregação plaquetária e aderência de neutrófilos às células
endoteliais (Murad, 1994).
Contudo, estudos recentes sugerem que o NO pode, também, induzir seus
efeitos biológicos por vias GMPc independentes. Sendo o NO paramagnético,
esta molécula possui alta capacidade de formação de complexo nitroso de alta
afinidade com vários complexos metálicos (Lancaster et al., 1992). Além disso,
liga-se aos grupos tiol (-SH) da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
(GADPH), e via este mecanismo o NO diminui a atividade glicolítica associada
ao infarto do miocárdio, falhas na reperfusão e neurotoxicidade, além da inibição
da respiração mitocondrial (Moncada et al.,1991). Outro mecanismo
11
relevante pode incluir a S-nitrosilação dos tiois, formação de nitrotirosina e
ligação do NO ao heme protéico da cadeia respiratória (McDonald & Moss,
1993; Mohr et al., 1996).
O NO apresenta ação inibidora da atividade de GADPH através de
ligação covalente ao NAD ou ao NADH. Esta molécula também pode agir como
um radical livre seqüestrador e inativar radicais superóxido (
.
O
2
-
), prevenindo a
toxicidade celular (Cook & Tsao, 1993). Contudo, sob condições apropriadas, a
reação do NO com o
.
O
2
-
pode resultar na geração de peroxinitrito (ONOO
-
), um
potente oxidante celular (Beckman et al., 1990; Beckman & Crow, 1993). O
peroxidonitrito se decompõe para formar o radical hidroxil reativo HOONO.
Peroxinitrito e seus metabólitos são capazes de induzir citotoxicidade por
peroxidação lipídica, nitrosilação de várias moléculas de tirosina quinase, que
regulam o funcionamento da enzima e sua via de transdução de sinal e
promovem, também, inativação de canais de Na
+
.
Juntos, estes achados sugerem que a ação do NO numa célula depende de
sua concentração, estado redox celular e abundância de metais, proteínas tiol e
tióis de baixo peso molecular (glutationa), bem como outros alvos nucleofílicos
(Davies et al., 1995).
Do ponto de vista biológico, as reações químicas mais importantes do NO
são aquelas com o oxigênio em sua várias formas “redox” e com metais de
transição. A reação do NO com O
2
forma dióxido nítrico (NO
2
) , o qual dimeriza
para formar N
2
O
4
. Este último sofre uma dismutação espontânea em solução
aquosa a um pH de 7.4 para gerar os produtos finais estáveis nitrito (NO
2
-
) e
12
nitrato (NO
3
-
) (Moncada et al., 1991; Lewis e Deen, 1994). Na presença de
tecidos biológicos a meia vida do NO é de 3-5s (Moncada, 1991; Ignarro et al.,
1993). Numerosas interações químicas com oxigênio, ânion superóxido e outros
radicais derivados do oxigênio e oxihemoproteínas (Ignarro et al., 1993). No
entanto, o NO gerado no organismo é convertido quase que completamente a
nitrato, uma vez que nitritos reagem com a oxihemoglobina (Ignarro, 1993)
segundo a seguinte reação:
2Fe
2+
+ O
2
+ 3NO
2
-
+ 2H
+
⇔ 2Fe
3+
+ 3NO
3
-
+H
2
O.
A estimativa quantitativa de NO
2
-
e NO
3
-
em amostras biológicas aquosas
é usada como uma medida indireta do NO produzido endogenamente (Archer,
1993; Schulz et al., 1999).
1.4 Inibidores da NO sintetase
Desde a descoberta da via arginina/NO, a utilização de inibidores da NOS
tem demonstrado ser uma importante ferramenta no estudo da fisiologia,
farmacologia e até mesmo fisiopatologia dos diversos agravos que envolvem esta
enzima (Pinto, 1999).
Vários compostos foram descritos como capazes de inibir a síntese de NO,
atuando por diferentes mecanismos como antagonismo pelo sítio catalítico da
enzima (análogos da L-arginina) ( Hibbs et al., 1987; Moore et al., 1990),
antagonismo da calmodulina (Bredt & Snyder, 1990; Win et al., 1996) e
antagonistas que agem no sítio de ligação da flavina-adenina-dinucleotídeo
13
(Stuehr et al., 1991).
Antes da descoberta do NO com um mediador biológico, demonstrou-se
que um análogo da arginina a N
ω
-monometil-L-arginina preveniu a citotoxidade
de macrófagos contra células tumorais (Hibbs et al., 1990). Subsequentemente,
demonstrou-se que este composto é um inibidor competitivo da formação de NO
na vasculatura e em outros sítios (Moncada et al., 1989). Muitos outros análogos
da L-arginina são hoje conhecidos por agirem como inibidores competitivos
(algumas vezes irreversivelmente) tanto das isoformas constitutivas como
induzidas. Todas as isoformas de NOS podem ser inibidas, em graus variáveis,
por análogos da L-arginina substituídos no grupamento guanidino (Mayer e
Andrew, 1998; Boucher et al., 1999). Alguns análogos da L-arginina exibem
certa seletividade por determinada isoforma, geralmente sobre as isoformas
constitutivas. A N
ω
-ciclopropil-L-arginina, por exemplo, inibe com maior
potência a NOSn em relação a NOSi in vitro (Lambert et al., 1992), enquanto que
o N
ω
-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) apresenta seletividade sobre a
NOSe após hidrólise. Já o N
ω
-amino-L-arginina não é seletivo para nenhuma das
isoformas ( Gross et al., 1990; Gross et al., 1991; Lambert et al.,1991; Lambert et
al., 1992; Furfine et al., 1993). Os mecanismos de inibição da NOS induzida por
estes compostos variam, porém todos envolvem a ocupação do sítio ligante para
o substrato.
Além dos análogos da L-arginina, vários compostos heterocíclicos como o
7-nitroindazol (7-NI) também são capazes de inibir a NOS (Moore et al., 1993;
Mayer e Andrew, 1998; Boucher et al., 1999). Ao contrário de outros
14
inibidores seletivos de NOSn, a base para sua seletividade envolve uma captação
diferencial deste inibidor pelos neurônios em comparação ao endótelio. Este
composto apresenta efeitos cardiovasculares discretos in vivo, apesar de ser um
potente inibidor da atividade da NOS em homogenados de células endoteliais
(Babbedge et al., 1993; Moore et al., 1993; Wolff et al., 1994).
Aminoácidos que compartilham com a arginina a porção guanilínica,
também possuem a capacidade de inibir a NOS. Entre estes merecem destaque o
N
G
-N
G
- dimetil-L-arginina (L-ADMA), o N-monometil-L-arginina (L-NMMA) e
o N
G
-N’
G
- dimetil-L-arginina (L-SDMA), que são naturalmente encontrados nos
organismos vivos (Vallance et al. 1992). O ADMA e SDMA são encontrados
livres no citosol celular. Provavelmente esses aminoácidos são frutos do
“turnover” de proteínas, porém podem ser captados a partir do meio extracelular
através do transporte de L-arginina (Bogle et al., 1995). O papel destes
aminoácidos como inibidores naturais da NOS foi melhor caracterizado com a
descoberta de uma enzima capaz de metabolizá-los à citrulina, a dimetil-amino-
hidrolase (DDAH), o que possibilitou especular sobre a possibilidade de se
modular a atividade da NOS a partir da concentração desses aminoácidos pela
DDAH (McAlister et al., 1996; McAlister & Vallance, 1998).
Outro composto foi sugerido como inibidor natural da NOS. Trata-se de
um peptídeo de 89 aminácidos, a proteína inibitória da NOSn (PIN). A proteína
humana apresenta alta homologia com a de rato (100%), sugerindo, assim,
participar de funções altamente conservadas ao longo da evolução. Seqüência de
ligação com essas moléculas só foi observada na isoforma neuronal da NOS.
15
Nesta enzima, o provável mecanismo de inibição repousa sobre a capacidade da
PIN em evitar a dimerização da NOSn, entretanto, de modo diferente do
observado com o 7-nitro-imidazol (7-NI) (Jaffrey & Snyder, 1997).
Dentre os compostos sugeridos como inibidores da NOS, o N-imioetil-L-
ornitina (L-NIO), um substituto imidazólico da ornitina, projeta-se pela
capacidade de inibir irreversivelmente esta enzima, com potência cinco vezes
superior à observada entre os compostos (Moncada et al., 1991).
Outro inibidor da NOS que merece ser diferenciado é a aminoguanidina
por possuir uma seletividade pela NOSi (Misko et al., 1993; Wolff & Lubeskie,
1993; Matson et al., 1998). Esse composto possui um coeficiente de inibição para
a isoenzima induzida 32 a 52 vezes inferior aos obtidos para produzir alterações
pressóricas agudas em ratos (Corbett et al., 1992). Um resumo dos principais
inibidores da seletividade relativa e estrutura química primária é demonstrada na
tabela 1.
Mais recentemente foi possível avaliar melhor a função das isoformas nos
organismos graças ao desenvolvimento de animais destituídos geneticamente
dessas enzimas. Já foram desenvolvidos animais transgênicos (knock-out) para as
três isoenzimas (Sheseley et al., 1996; Huang et al., 1995; Laubach et al., 1995).
16
Tabela 1. Principais inibidores das isoenzimas sintetases de óxido nítrico
Composto Abreviação Estrutura Química Potência Inibitória Fonte
N
ω
-
monometil-
L-arginina
L-NMMA
NOSe=NOSn >NOSi
Endógena
*
e
Síntese
Artificial
N
ω
-nitro-
Larginina
L-NA
NOSn=NOSe>>NOSi
Síntese
Artificial
N
ω
-nitro-L-
arginina
metil éster
L-NAME
**
NOSe>NOSn=NOSi Síntese
Artificial
N
ω
-amino-L-
arginina
L-NAA
NOSn=NOSe>NOSi
Síntese
Artificial
7-
nitroindazol
7-NI
***
NOSn>>NOSe=iNOs
Síntese
Artificial
N-
δ
iminoetil-L-
ornitina
L-NIO
NOSi>NOSe=NOSn
Síntese
Artificial
Aminogua-
nidina
NOSi>NOSe=NOSn
Síntese
Artificial
Peptídeo
Inibidor
Neuronal
PIN Específico para NOSn Endógena
N
ω
- N
ω
-
dimetil-L-
arginina
L-ADMA NOSe>>NOSn>NOSi Endógena
*
N
ω
- N
ω’
-
dimetil-L-
arginina
L-SDMA NOSe>>NOSn>NOSi Endógena
*
*
Produzida por vários tecidos, incluindo endotélio e encontrada no plasma e
urina de seres humanos (Kakimoto e Akazawa, 1970; Vallance et al., 1992;
Fickling et al., 1993; Kimoto et al., 1995).
**
In vivo após hidrólise o L-NAME tem maior especificidade pela isoforma
endotelial.
***
In vivo o 7-NI é captado seletivamente por neurônios, in vitro a potência de
inibição é semelhante para as três isoformas.
17
1.5 O Papel do NO na Reprodução
Atualmente, sabe-se que o NO é produzido em diferentes células,
incluindo células musculares, mesangiais, neurônios, plaquetas, hepatócitos,
macrófagos, fibroblastos e células epiteliais. O NO regula o tônus das células
musculares, a agregação e adesão plaquetárias, o crescimento celular, a apoptose,
a neurotransmissão, lesão celular, bem como as respostas imunes induzidas por
infecções. Devido ao fato desses processos estarem associados à biologia,
fisiologia e fisiopatologia de diversos processos reprodutivos é provável, que o
NO desempenhe papel importante na reprodução. Na última década, o NO foi
reconhecido como molécula reguladora importante da biologia e fisiologia do
sistema reprodutivo (Rosselli et al, 1998).(Figura 3).
Figura 3. Papel do óxido nítrico na fisiologia do trato reprodutivo masculino e feminino.
Adaptado de Rosselli et al, 1998.
ÓXIDO NÍTRICO
Placenta
(Pré-eclâmpsia)
Remodelamento tecidual
Esteroidogênese
Função do Oviduto
Comportamento
Sexual
Gravidez
Parto
Ovulação
Foliculogênese
Infertilidade
Espermatogenêse
Motilidade
Espermática
Ereção Peniana
18
1.6 O Papel do NO na Reprodução Feminina
1.6.1 Função Ovariana
O papel do NO como regulador da função ovariana foi evidenciado a
partir da observação de que a síntese de NO aumenta com o desenvolvimento
folicular. Durante o desenvolvimento folicular e a ovulação, foi observado a
correlação do aumento dos níveis de NO e estrógeno (Rosselli et al, 1994a).
Shukovski & Tsafriri (1994) demonstraram, que a administração
intraperitoneal ou via região peri-ovariana de inibidores da óxido nítrico sintetase
(NOS), inibiu a ovulação em ratas, fornecendo evidências de que o NO participa
do processo ovulatório.
Bonello et al. (1996), constataram através de avaliação da interferência no
fluxo sanguíneo para o ovário, que o NO participante do processo ovulatório não
seja de origem endotelial, mas gerado localmente por células ovarianas bem
como pela vasculatura ovariana, regulando a ovulação.
1.6.2 Função do Oviduto
A contração induzida por endotelina no oviduto teve sua intensidade
diminuída pela administração de L-NAME, um inibidor da NOS evidenciando a
participação do NO na fisiologia e regulação da função do oviduto (Rosselli et
al., 1994b). Em 1997, Ekerhovd et al., constataram a ação do NO como mediador
da atividade contrátil em anéis isolados de trompa de Fallopio humana.
19
O oviduto tem papel funcional crítico, sendo o local de fertilização e
princípio do desenvolvimento embrionário. É possível que o NO tenha
importante participação nesses processos. A liberação basal de NO pode
promover a motilidade espermática e proteger o óvulo, bem como o
espermatozóide dos danos causados pela ação do radicais livres (Rosselli et al.,
1994b).
Contrário a situação fisiológica, a NOS no oviduto pode aumentar sobre
certas condições patológicas, como infecções ou endometrioses, que
eventualmente levam a diminuição da fertilidade através do efeito deletério e/ou
tóxico no espermatozóide, bem como no óvulo (Rosselli et al., 1998).
1.6.3 Função Uterina e Vaginal
O NO regula a contratilidade das células musculares lisas e a contração
espontânea, bem como a distensão do útero durante a gravidez, tendo portanto
ação reguladora de processos biológicos e fisiopatológicos do útero, tornando-se
alvo de intensas investigações (Azuma et al., 1995; Dong & Yallamplalli, 1996).
Os vasos e neurônios uterinos expressam NOS, a qual modula, através do
NO, o efeito contrátil de múltiplos fatores vasoativos locais e sistêmicos
(Magness et al., 1996; Veille et al., 1996). Além de ter sido demonstrada a
presença de NOS na parede dos vasos e neurônios, a presença desta sintetase foi
encontrada no epitélio glandular, em células do estroma endometrial, células
musculares lisas e mastócitos miometriais, sugerindo que o NO tem papel local
20
importante no controle geral da função uterina (Telfer et al., 1995).
Buhimschi et al. (1996), demonstraram que a cérvix de ratas expressa as
três isoformas de NOS, a NOS induzida (NOSi), a neural (NOSn) e a endotelial
(NOSc). Além disso, constataram que durante a gestação e no pré-parto os níveis
de NOSi aumentam na cérvix e diminuem no útero. Com a administração de L-
NAME, um inibidor da NOS, esses autores observaram um prolongamento do
trabalho de parto.
Durante a gestação e o parto ocorrem mudanças hormonais e de seus
receptores, que podem regular a atividade da NOS cervical. Ali et al (1997),
evidenciaram que modificações da atividade da NOS cervical e uterina era
progesterona dependente.
A atividade de NOS foi demonstrada na vagina. Chartterjee et al (1996),
encontraram NOSc ativa no tecido epitelial escamoso e nas células musculares
lisas da vagina. A maior atividade dessa NOS foi demonstrada no estro e no pró-
estro.
21
1.7 O Papel do NO na Reprodução Masculina
1.7.1 Óxido Nítrico e Regulação da Ereção Peniana
Em 1990, Ignarro et al. demonstraram pela primeira vez, que a
estimulação elétrica de tiras isoladas de corpo cavernoso de coelho, promovia a
formação endógena de NO. Baseado nestas observações, eles postularam que a
ereção peniana é mediada pelo NO gerado em resposta a neurotransmissão não-
adrenérgica-não-colinérgica (NANC). Subsequentemente, Holmquist et al
(1991), forneceram evidências, que in vivo, a ativação da via arginina/NO induz
ereção peniana em coelhos.
Após esses achados, a regulação endógena do NO e o mecanismo pelo
qual ele regula a ereção peniana foi motivo de intensas investigações. Burnett et
al (1992), localizaram atividade de NOS em neurônios penianos de ratos
inervando o corpo cavernoso e plexo neural na camada adventícia de artérias
peniana, sugerindo que o NO é mediador da função peniana (Figura 4).
22
L-arginina + O
2
NO + L-Citrulina
Ca
2+
EP
PGE
1
Nervo Parassimpático
NO
Nítrico
Nervos NANC
Célula Endotelial
Célula do Músculo Liso
do Corpo Cavernoso
PIV
Forscolina
AC
G
s
Ach
+
GTP
NO
GC
+
cGMP
+
PDE
5
GMP
+
Sildenafil
PQG
+
Ca
2+
Ca
2+
ATP
cAMP
PQA
Relaxamento
Contração
NA
Receptor
adrenérgico
Inibidores da NOS
(p.ex., L-NAME)
Inibidores da NOS
(p.ex., L-NAME)
(ereção)
(flacidez)
+
AMP
PD
3,4
+
Papaverina
Figura 4. Mecanismos de regulação do tônus da musculatura lisa do corpo
cavernoso e ereção peniana e modulação farmacológica. PGE
1
= prostaglandina E
1
;
PIV= peptídeo intestinal vasoativo; PDE= fosfodiesterases; PQG e PQA= proteína
quinase G e proteína quinase A. Adaptado de Bivalacqua et al., 2000.
23
Em 1992, Burnett et al., constataram a abundante presença de NOSc no
endotélio da vasculatura peniana e no endotélio sinusoidal do corpo cavernoso.
Morande et al. (1995), demonstraram atividade de NOS em células pineal.
Através de técnicas de imunohistoquímica e histoquímica Burnett et al.
(1995), demonstraram a localização da NOS no trato genital de ratos machos.
Estes autores demonstraram uma maior densidade da enzima na cauda do
epidídimo e no canal deferente e uma menor densidade desta nos testículos,
cabeça e corpo do epidídimo, vesícula seminal e glândula coagulatória. A medida
da atividade enzimática da NOS através da análise da taxa de converção da L-
arginina [H
3
] em L-citrulina [H
3
] e NO revelou, que os padrões funcionais são
coerentes com a distribuição da NOS ao longo do trato genital. As maiores taxas
de atividade enzimática sendo localizadas, portanto, na cauda epididimária e no
canal deferente.
A NOS neuronal parece ter papel decisivo como mediador da ereção
peniana (Burnett et al, 1996). Em humanos, a atividade NOS foi localizada de
forma discreta em neurônios do plexo pélvico, em nervos do corpo cavernoso,
incluindo as terminações de tecido erétil do corpo cavernoso, feixes neurais do
dorso do pênis e plexos neurais da adventícia de artérias do corpo cavernoso
(Burnett et al, 1993).
Em humanos, a atividade NOS foi identificada em discretos locais
neuronais, incluindo plexo pélvico, nervos cavernosos e suas terminações, que se
encontram dentro do tecido erétil, ramos do nervo dorsal peniano e nervo na
24
adventícia das artérias profundas (Burnett et al., 1993).
Foi demonstrado, que o neurônio pré-ganglionar que se estende da coluna
vertebral ao pênis contem NOS (Vanhatalo & Soinila, 1995). Esses achados
sugerem, que o NO afeta a ereção peniana em vários níveis neuronais (Vanhatalo
et al., 1996). Adicionalmente, a injeção direta do L-NAME no núcleo
paraventricular, mas não no núcleo caudal, no septo medial, área pré-optica e a
área CA1 do hipocampo inibe a ereção peniana induzida por apomorfina e
ocitocina. Esses achados sugerem que ações do NO no cérebro e distal dos
nervos periféricos, podem influenciar a ereção peniana (Melis et al., 1994a).
Em camundongos desprovidos de NOSn, a NOSc tem-se mostrado
mediadora da ereção peniana dependente de NO (Burnett et al., 1996). Juntos,
esses achados sugerem, que tanto a NOSn como a NOSc são capazes de regular a
ereção peniana. Como o NO age como mediador da ereção peniana, fatores
reguladores da NOSn ou NOSc podem diferencialmente interferir na ereção
peniana (Rosselli et al., 1998).
A NOS neuronal do corpo cavernoso do pênis do rato foi clonado por
Magee et al. (1996). O NOSc presente no pênis difere do NOSn cerebral pela
presença de 102 nucleotídeos. O RNAm é expresso no pênis uretra, próstata e
músculo esquelético do rato, coexistindo com a NOSn cerebelar no plexo pélvico
e bexiga e é, também, detectável no cerebelo.
As características da NOSn sugerem, que esta pode ser regulada
diferentemente da NOSn cerebelar. Em adição a NOSc e NOSn, a NOSi é
expressada nas células do músculo liso do corpo cavernoso do pênis
25
(Garban et al., 1997). Recentemente foi feita a clonagem da NOSi peniana de
ratos e de humanos e os estudos demonstraram vários aminoácidos diferentes,
quando comparado a sua isoforma análoga no tecido não peniano (Garban et al.,
1997).
Como a disfunção erétil está associada com a atividade reduzida de NOSn
e também a redução da complacência da célula muscular lisa peniana (Regazzi
et al., 1996; Carrier et al., 1997), a clonagem dessa isoforma pode abrir o
caminho para possível gerenciamento da disfunção da ereção peniana.
De fato, a indução local de NOSi injetando-se uma mistura de indutores
corrigiu a disfunção peniana observada em ratos senescentes (Garban et al.,
1997).
Várias linhas de evidências sugerem, que a via NO-GMPc é responsável
pela mediação da ereção peniana em resposta a administração do ácido N-metil-
D-aspártico (Melis et al., 1994b), acetilcolina (Champion et al., 1997), ocitocina
(Melis et al., 1994a), apomorfina (melis et al., 1994a), cocaína (Chan et al.,
1996), andrógenos de maneira geral (Person et al., 1996), testosterona (Zvara et
al., 1995), dehidrotestosterona (Lugg et al., 1995), estimulação elétrica
(Holmquisst et al., 1991) e dopamina (Melis et al., 1996).
Em contraste, a ereção peniana induzida pelo peptídeo intestinal vasoativo
e adrenomoduladores não foi revertida pelo L-NAME, um inibidor da NO
sintetase, sugerindo que uma via independente de NO também participa da
ereção peniana (Hayashida et al., 1996; Champion et al., 1997).
Juntos, esses achados reafirmam a importância e possível uso de
26
ativadores e potenciadores da via arginina-NO-guanilato ciclase como agentes
terapêuticos na disfunção erétil. Devido aos vastos efeitos locais do NO no pênis
e como esta molécula é muito lábil e de meia vida curta, a aplicação
farmacológica da substância ativa no órgão em questão, pode ser efetiva em altas
concentrações sem causar efeitos colaterais. A linsidomina (SIN-1), um doador
de NO, tem sido usado com sucesso para corrigir desordens de ereção peniana
em homens (Stief et al., 1992).
A regulação da ereção peniana por andrógenos e pela pituitária e seu
relacionamento com a atividade de NOS é de interesse fisiológico especial. A
deficiência de andrógenos como a testosterona, tem sido desde muito tempo
associada a impotência e disfunções da ereção peniana (Garban et al., 1995;
Penson et al., 1996) De fato, a castração resulta em significantiva diminuição da
atividade NOSc e NOSc no pênis e reduz a ereção peniana induzida por
estimulação elétrica em 70% (Lugg et al., 1996; Penson et al., 1996). A
administração da droga antiandrogênica, flutamina, a ratos não castrados, reduziu
a atividade das enzimas NOSc e NOSn e também, a ereção peniana. Em ratos
castrados a resposta erétil foi abolida completamente, entretanto a atividade NOS
não estava diminuída abaixo dos valores observados em ratos castrados.
A administração de estrógeno a ratos castrados, assim como a
hipofisectomia ou tratamento com antagonistas de GnRH em ratos intactos
diminuiu a resposta erétil em níveis abaixo dos valores de animais castrados
controle. Além disso, em ratos hipofisectomizados a atividade NOS peniana
encontra-se abaixo dos níveis encontrados em animais castrados. Estes dados
27
sugerem, que a ereção peniana em ratos é completamente dependente de
andrógenos, provavelmente devido a sua ação na manutenção da atividade NOS
(Penson et al., 1996).
A disfunção erétil ocorre em patologias como o diabetes tipo I e II,
acompanhada de hipogonadismo, bem como uma diminuição significativa da
quantidade e atividade de NOSn no pênis (Vernet et al., 1995; Rehman et al.,
1997). É possível, que a administração de andrógenos ou doadores de NO a ratos
diabéticos pode ser terapeuticamente importante para melhorar a atividade NOS e
consequentemente a ereção peniana. A tensão de oxigênio é regulador da síntese
de NO, e baixa pressão de oxigênio inibe a atividade NOS no corpo cavernoso
(Kim et al., 1993). Da mesma forma, o tabagismo leva a uma considerável
diminuição da atividade NOS, com diminuição da quantidade de NOSn, que não
é refletida na redução da resposta a estímulos elétricos (Xia et al., 1997). Esse
fato pode ser atribuído a uma síntese compensatória de NO por outras isoformas
de NOS. Na verdade, a atividade NOSc em ratos expostos ao cigarro não foi
afetada (Xia et al., 1997), foi demonstrado que a NOSc induziu ereção peniana
em camundongos com deficiência de NOSn (Burnett et al., 1996). A função erétil
encontra-se diminuída em ratos velhos e senescentes. Comparando-se a ratos
jovens, houve uma diminuição da atividade de NOS, bem como de fibras
musculares contendo NOS em ratos velhos (Garban et al., 1995; Carrier et al.,
1997).
Embora o mecanismo erétil permaneca intacto com o avançar da idade em
ratos, as respostas estimulatória central e periférica estão diminuídas e há
28
também, a redução do número de fibras contendo NOS, que podem contribuir
para essas observações.
Portanto, o NO tem papel decisivo na regulação da ereção peniana e a
aplicação local de doadores de NO bem como terapia gênica podem tornar-se
alternativas clínicas no tratamento da disfunção erétil (Rosselli et al., 1998).
1.7.2 Óxido Nítrico e Função Testicular
Ehrem et al.(1994), demonstraram pela primeira vez, a presença de baixos
níveis de atividade de NOSc no testículo e altos níveis nos outros órgãos do trato
urogenital masculino (uretra, bexiga, canal deferente, próstata e vesícula seminal)
(Figura 5).
Figura 5. Anatomia do Trato Reprodutivo Masculino de Rato
O papel do NO no testículo foi evidenciado pelo fato desse órgão
apresentar três categorias de enzimas importantes para a síntese do mesmo.
29
Milstien et al. (1996) constataram a presença da GTP-ciclohidrolase I, a enzima
inicial para a síntese de THB
4
. A argininosuccinato sintetase e liase, enzimas
responsáveis pela geração de L-arginina, foram detectadas em abundância no
testículo (Yu et al., 1995). Ewing & Maines (1995), confirmaram a existência da
isoenzima heme oxigenase HO-1 e HO-2, que clivam a heme molécula para
produzir NOS.
Para avaliar a relevância fisiológica da atividade de NOS no testículo, a
distribuição da mesma foi caracterizada em várias células. Células de Leydig, de
Sertoli e endoteliais de testículo humano, demonstraram possuir NOSc ativa
(Davidoff et al., 1995; Zini et al., 1996).
Em 1997, Davidoff et al. demonstraram a co-localização do GMPc nas
células de Leydig, o que sugere que as células testiculares são equipadas com a
via NO-GMPc, podendo participar de forma importante na regulação das funções
testiculares como espermatogênese e esteroidogênese.
A NOSc está presente nas células de Sertoli e Leydig em todos os
estágios da espermatogênese, porém foi constatado que a NOSc ativa está
correlacionada a processos degenerativos e à apoptose celular (Zini et al., 1996).
O NO atua no testículo como um regulador do fluxo sanguíneo, da
permeabilidade celular e na função contrátil das miofibrilas, regulando assim, a
síntese e transporte de esteróides (Adams et al., 1994; Davidhoff et al., 1995).
Wang et al (1997) identificaram uma variação testicular da NOSn. O papel do
NO como regulador da esteróidogênese no testículo e os fatores autócrino-
parácrino na regulação desse processo tem sido alvo de constantes
30
investigação, sendo um dos objetivos de nosso trabalho.
1.7.3 Óxido Nítrico e Motilidade Espermática
O NO regula a motilidade espermática (Hellstrom et al., 1994). Em
condições fisiológicas, pequenas quantidades de NO são geradas neutralizando
radicais livres que inibem a motilidade espermática. Já em estados patológicos, a
excessiva produção de NO contribui para a formação de peroxinitrito, um ânion
altamente tóxico, que reduz a motilidade espermática (Rosselli et al., 1995).
Além do NO, a L-arginina, o substrato para a NOS influencia a
viabilidade espermática. Em homens com anormalidades espermáticas, os níveis
de arginina estavam mais baixos, quando comparados aos encontrados em
indivíduos normais (Szabo et al., 1996).
1.7.4 Óxido Nítrico e Espermatogênese
A espermatogênese é um complexo processo de divisão e diferenciação
celular que conduz a formação do espermatozóide (SPTZ) (McDonald & Pineda,
1989), enquanto mantém o número de espermatogônias (Courot et al, 1970;
Ortavant et al, 1977). A liberação do SPTZ é um evento que culmina numa série
de outros eventos, que tiveram início na vida fetal (Setchell, 1982).
As células espermáticas são oriundas a partir das células germinativas
primordiais, que migram do saco vitelínico para a gônada indiferenciada, onde
estas células, por um mecanismo de diferenciação que se inicia na puberdade,
vão formar as espermatogônias e determinar a espermatogênese (Garner &
31
Hafez, 1982). Segundo Farris (1971), a origem da espermatogênese em ratos
ocorre em torno de 50 a 60 dias de vida.
Para que ocorra a multiplicação e manutenção de uma numerosa
quantidade de espermatogônias, nesse processo está envolvida uma série de
divisões mitóticas de uma espermatogônia denominada Tipo A1, para células
mais diferenciadas, denominadas A2, A3, In, B1 e B2 (Amann & Schanbacher,
1983).
A espermatogênese pode ser dividida em fases distintas, que são
espermatocitogênese e espermiogênese. A espermatocitogênese é uma fase
proliferativa, onde as células germinativas são multiplicadas por uma série de
divisões mitóticas seguida de divisões meióticas, ou seja, de espermatogônia a
espermátide (McDonald & Pineda, 1989) (Figura 6).
A espermiogênese é uma fase diferenciativa, onde o núcleo e o citoplasma
sofrem mudanças para formar o espermatozóide (McDonald & Pineda, 1989).
Segundo Ortovant (1977), nesta fase, a espermátide sofre uma metamorfose para
se transformar, posteriormente, em espermatozóide.
O NO éum radical livre ativo e um importante mensageiro intracelular.
Foram descritos efeiotos de doadores de NO, como o nitroprussiato de sódio no
espermatozóide. O nitroprussiato de sódio estimula a hiperativação e a síntese de
prostaglandinas e de leucotrienos em espermatozóide de camundongos ( Herrero
et al. 1994; Herrero et al., 1995) e aumenta a motilidade e a peroxidação lipídica
em espermatozóides humanos (Hellstrom et al., 1994).
Zamir et al. (1995), observaram que o nitroprussiato de sódio estimula
32
a formação de GMPc e a reação acrossômica em espermatozóides bovinos.
Entretanto, Herrero et al. (1996), demonstraram que houve redução da
fertilização in vitro, quando espermatozóides de camundongos foram incubados
com L-NAME, sugerindo a participação do NO nafisiologia dos mesmos. Em
1997, Herrero et al., evidenciaram a presença de NOS em espermatozóides de
camundongos e efirmaram, que os espermatozóides de mamíferos tem habilidade
potencial para sintetizar NO, sugerindo um papel do NO endógeno da função
espermática.
Figura 6- Espermatogênese no rato. Os efeitos da testosterona e FSH na progressão das
células espermatogênicas são mostrados (setas) no esquema acima. O FSH age
p
redominantemente para dar suporte à diferenciação das espermatogônias previnindo a
degeneração prematura das mesmas e das espermátides, além de promover a divisão
meiótica dos espermatócitos na fase de paquíteno, dando origem a espermátides
arredondadas. O principal efeito da testosterona é de facilitar a progressão de espermátides
arredondadas (nos estágios VII-VIII do ciclo espermatogênico) em espermátides em
alongamento, talvez mantendo a ligação física das células “ attachment” às células de
33
1.7.5 Controle Hormonal da Espermatogênese
Segundo Austin (1983), o início da espermatogênese durante a puberdade
requer tanto FSH como LH. A ação do LH é indireta, através da estimulação da
produção de testosterona pelas células de Leydig, pois altos níveis de
testosterona são requisitados para a espermatogênese.
O requerimento hormonal para iniciar a espermatogênese em animais
imaturas difere do requerido para a manutenção da espermatogênese em animais
hipofisectomizados (Kaltenbach & Dunn, 1987). Steinberger (1974), propôs que
a mitose da espermatogônia e o estágio inicial da meiose são hormônio
independente e que a redução final da meiose requer testosterona, enquanto que a
diferenciação morfológica final de espermátide em SPTZ requer FSH e talvez
testosterona.
Segundo Reeves (1987), o LH e o FSH são liberados de forma tônica e
basal. Os níveis tônicos são responsáveis pelo controle da liberação através do
feedback (-) das gônadas.
1.7.6 Óxido Nítrico e Esteroidogênese
Rettori et al.(1994) demonstraram evidências diretas da participação do
NO como regulador da síntese do hormônio liberador do hormônio luteinizante
(LHRH). Em 1979, Ojeda et al. demonstraram, que a PGE
2
estimula a liberação
de LHRH tanto “in vitro” quanto “in vivo”. Rettori et al.(1992) evidenciaram a
34
participação do NO indutor da liberação e síntese de PGE
2
do hipotálamo. Estes
fatos sugerem que o NO deve ativar enzimas como a cicloxigenase, responsável
pela conversão de ácido araquidônico em prostanóides.
A norepinefrina é tida como indutor da liberação de LHRH via α
1
-
adrenoreceptores. A síntese de LHRH induzida pela norepinefrina é
acompanhada por aumento da concentração de PGE
2
, porém o uso de inibidores
da NOS (L-NAME) ou seqüestradores de NO (p.ex., hemoglobina), bloqueiam o
efeito da norepinefrina sobre a síntese de LHRH. Esses achados tornam evidente
a participação da PGE
2
, modulada positivamente pelo NO como mediadora da
síntese de LHRH induzida por norepinefrina (Rettori et al., 1992; McCann &
Rettori, 1996
a).
Outro agente promotor de liberação do LHRH do hipotálamo é o ácido
glutâmico, que também induz liberação de norepinefrina no cérebro (Navarro et
al., 1994). Inibidores da NOS como o L-NMMA bem como a hemoglobina (um
sequestrador de NO) são inibidores da liberação de LHRH induzida pelo ácido
glutâmico (Rettori et al., 1994).
O NO gerado a partir de neurônios geradores de NO induz a liberação de
LHRH (Bonavera et al., 1993).
A ocitocina pode induzir comportamento de monta via liberação de LHRH
induzida por NO (Rettori et al., 1997). Esses autores demonstraram que a
ocitocina estimulou a liberação de LHRH, PGE
2
e NO quando da ausência de L-
NMMA, enquanto que na presença deste inibidor de NOS a estimulação não
ocorreu. Além desses achados esse grupo de pesquisadores constatou, que o
35
NO gerado a partir da estimulação pela ocitocina libera LHRH bem como inibe
a liberação de ocitocina através de um feedback (-).
A liberação de LHRH é pulsátil e não constante. Estudos demonstraram a
participação de ácido ϒ-aminobutírico (GABA) como regulador desse fenômeno.
Inibidores da NOS como o L-NMMA e hemoglobina previnem o efeito inibitório
do GABA, sugerindo que esse efeito seja mediado pelo NO (Rosselli et al.,
1998).
A importância fisiológica desse processo é que o LHRH estimula a
glândula pituitária com subsequente liberação de gonadotrofinas, que por sua
vez ativam as gônadas para produzir os esteróides sexuais. Nas fêmeas, o LHRH
induz ovulação e luteinização das células precursoras do corpo lúteo, enquanto
que em machos induz a espermatogênese. Portanto, o LHRH age não somente na
regulação gonadal, mas também na secreção de esteróides tanto em machos
quanto em fêmeas (McCann, 1982; Jenner & Conn, 1994).
A atividade NOS tem sido demonstrada em células de Leydig e Sertoli do
testículo (Davidoff et al., 1997). Essas células são importantes reguladoras da
síntese de testosterona. Desta forma é provável que o NO também regule a
síntese de testosterona.
Estudos evidenciaram, que o NO participa da síntese de testosterona como
um regulador negativo da mesma (Adams et al., 1992; Welch et al., 1995).
Adams et al. (1993) demonstraram que a supressão de testosterona
induzida pelo álcool foi revertida na presença de L-NAME, sugerindo que o
etanol induz seu efeito via geração de NO. A administração de L-NAME
36
aumentou a concentração de testosterona plasmática em ratos, sugerindo que o
NO é um regulador negativo da síntese de testosterona. Adams et al. (1996),
demonstraram que o L-NAME aboliu a supressão induzida por morfina e a
liberação da síntese de testosterona induzida por HCG, indicando que esse efeito
ocorre diretamente no testículo e não é dependente da secreção de LH. Devido ao
fato do NO e do L-NAME não aumentarem o efeito da morfina nem do
naltrexone (um antagonista dos opióides), respectivamente, é possível que o NO
e os opióides suprimam a liberação de testosterona por mecanismos diferentes.
Com o intuito de mostrar o mecanismo pelo qual o NO suprime a
liberação de testosterona, Welch et al. (1995) demonstraram que a liberação da
síntese de testosterona induzida por HCG em cultura de células de Leydig
aumentou nos tratamentos com L-NMMA e L-NAME e esse aumento foi
acompanhado pela diminuição intracelular de GMPc. Esses achados sugerem que
o NO medeia seus efeitos via GMPc.
A administração in vivo de vasodilatadores como a hidralazina e
nicardipina (não geradores de NO), inibiram a liberação basal de testosterona,
bem como a liberação induzida por L-NAME, sugerindo um envolvimento
vascular, porém de forma especulativa (Adams et al., 1994).
A esteroidogênese nas células de Leydig é controlada por hormônios do
eixo hipotalâmico hipofisário, bem como por diversos outros fatores produzidos
no testículo que atuam de modo autócrino e/ou parácrino (Saez,
1994).Investigações recentes focam fatores central e periférico como mediadores
da ação inibitória na produção de andrógeno e na função celular controlada
37
por andrógeno. Exemplo disso, os peptídios opióides endógenos são importantes
moléculas mensageiras envolvidas no controle parácrino da função testicular,
especialmente nas mudanças na esteroidogênese testicular (Akinbami et al.,
1994; Kostic et al., 1997). Kostic et al. (1998), indicaram um possível papel do
NO com regulador decrescente da produção de andrógenos. Entretanto, não está
claro o que esse achado representa para a ativação da via do NO testicular. Esses
autores concluíram, que há controvérsias sobre a ação direta do NO sobre as
células de Leydig, ou se haveria uma ação indireta através da produção local de
outras moléculas sinalizadoras.
1.7.7 Óxido Nítrico e Comportamento Sexual
Estímulos sexualmente relevantes elicitam uma complexa cascata de
parâmetros genital e somatomotor, que são facilitados por hormônios esteróides.
Uma grande quantidade de evidências experimentais, principalmente conduzidas
em ratos de laboratório, demonstraram que o comportamento sexual masculino
está sob controle de neurotransmissores específicos (Larsson & Ahlenius, 1999).
Um dos agentes que desempenham papel central neste processo é a
dopamina (DA), tendo em vista que as drogas dopaminérgicas desde muito
tempo são sabidamente facilitadoras do comportamento sexual masculino
(Bitran & Hull, 1987; Melis & Argiolas, 1994). O estímulo proveniente de uma
fêmea receptiva leva à liberação de dopamina em pelo menos três sistemas
integrados. Atividade somatomotora promovida pelo sistema nigroestriatal;
numerosos tipos de motivação provenientes do sistema mesolímbico; e a
38
área pré-óptica medial (MPOA) apontam para a motivação especificamente em
direção a alvos sexuais, aumentando a eficiência e taxa copulatória e
coordenando os reflexos genitais. A presença prévia de testosterona é permissiva
para liberação de DA na MPOA, tanto em condições basais quanto em resposta a
fêmea. Uma das maneiras pelas quais a testosterona pode aumentar a liberação de
DA é através da regulação crescente de NOS, o que por sua vez aumenta a
liberação de DA. Além disso, a liberação de LH, esteróide dependente, tanto em
ratos machos como fêmeas é dependente de receptores de glutamato do tipo
NMDA, de NO e de GPMc (Pu et al., 1996).
Micro-injeções de uma alta dose de inibidor de NOS na MPOA inibiu a
habilidade dos machos de copularem (Moses, 1999). A aplicação de diálise
reversa de L-arginina na MPOA aumentou a taxa de cobertura, enquanto a diálise
reversa de inibidores da síntese do NO diminuíram a taxa de monta (Sato et al.,
1998). Portanto, o NO é um importante mediador de liberação de DA na MPOA
tanto em condições basais como em situações sexuais e isto pode facilitar a
copulação.
Hull et al.(1994), demonstraram que o pré-tratamento com L-NAME
diminuiu o número de intromissões e ejaculações, além de inibir os reflexos
copulatórios não relacionados á cópula (ex-cópula), tais como antero reflaxo do
pênis e ereção. No entanto, estes autores observaram haver um aumento da
emissão seminal, o qual foi relacionado a uma estimulação nervosa simpática.
Isto se deve ao fato do NO manter um tônus inibitório basal em muitas funções
simpáticas (Lewis et al., 1991); Benson et al., 1988; Harada et al., 1993;
39
Togashi et al., 1992; Iadecola et al., 1993).
2 - OBJETIVOS
2.1 - OBJETIVO GERAL
- Avaliar a participação do óxido nítrico nos eventos reprodutivos de
ratos machos.
2.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Verificar o efeito da inibição crônica da óxido nítrico sintetase, com a finalidade de
avaliar a participação do óxido nítrico sobre o eixo hipotalâmico-hipofisário-
gonadal, descida testicular e esteróidogênese.
- Avaliar os efeitos da inibição crônica da óxido nítrico sintetase (NOS) sobre a
morfologia espermática, fertilidade e comportamento sexual de ratos machos.
40
3 - MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 – Materiais
3.1.1 - Animais
Foram utilizados ratos machos Wystar (Rattus norvegicus) imaturos, com
idade de 20 dias e ratos Wystar adultos de ambos os sexos, com variação de peso
para machos de 200 a 300g e para fêmeas de 150 a 180g, provenientes do
biotério do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal
do Ceará. Os animais foram mantidos em ciclo de 12/12 horas de
claridade/escuridão, recebendo água e ração padrão (Purina) ad libitum.
3.1.2 – Drogas e Reagentes
- Acetato de uranila a 2% (Merck, Alemanha)
- Ácido periódico de Schiff (Merck, Alemanha)
- Álcool etílico – etanol (Reagen)
- Cadmium (Sigma, EUA)
- Eosina (Merck, Alemanha)
- Epon 812 ( Sigma, EUA)
- 17β-estradiol (Sigma, EUA)
- Éter etílico (Reagen)
- Formol 10% (LabSynth, Brasil)
- Glutaraldeído a 2,5% (Merck, Alemanha)
- Hematoxilina (Merck, Alemanha)
- Kit para dosagem de testosterona (DPC, EUA)
- L-arginina (Sigma, EUA)
- L-nitro- arginina metil éster (Sigma, EUA)
- L-nitro-arginina (Sigma, EUA)
41
- Nitroprussiato de sódio (Sigma, EUA)
- Óleo mineral
- Papanicolaou (Reagen)
- Parafina
- Pilocarpina (Sigma, EUA)
- Solução fisiológica (NaCL 0.9%)
- Sulfato de atropina (Sigma, EUA)
- Tampão cacodilato 0,1M pH 7,2
- Tampão de Cloreto de amônia 75mM, pH 9,6
- Tampão fosfato 0,2M pH 7,2
3.1.3 - Aparelhos e Materiais
- Aparelho de radioimunoensaio, Gamma C12 (DPC, EUA)
- Autoclave (Fabbe-103)
- Balança Analítica (Marte AL-200)
- Balança para pesagem de animais (Filizola ID-1500)
- Caixas para animais de laboratório 25x25x20 cm e 40x40x20 cm
- Câmara hematimétrica (Câmara de Neubauer) (Wschreck Hofheim,
Alemanha)
- Capilares venosos de vidro (Perfecta)
- Centrífuga (Faben-215)
- Cronômetros (Technos Quartz-965)
- Espectrofotômetro (Beckman DU 640B)
- Estantes para Tubos de Ensaio (Interlab)
- Fios de sutura seda 4-0 (Brasmedica)
- Fisiógrafo Narco DMP4 (Bio-System, EUA)
- Transdutor Stathon, P23.
- Freezer –75
º
C
- Freezer Doméstico (Brastemp FF-260)
- Lâminas e lamínulas (Interlab)
42
- Material fotográfico para microscopia eletrônica (Kodak, Alemanha)
- Medidor de pH (Analion PM-608)
- Microscópio eletrônico Modelo10 ( Carl Zeiss, Alemanha)
- Microscópio óptico acoplado a câmara fotográfica, modelo Nikon10
(Nikon, Japão)
- Pipeta para contagem de leucócitos (Interlab)
- Ponteiras plásticas 200 e 1000µl (Oxford)
- Seringas de volumes variados (Unaplic)
- Sondas de polietileno PE50 e PE70 (Brasmedica)
- Tubos de ensaio (Interlab)
3.2 – Métodos
3.2.1 - Descida Testicular
No intuito de verificar o participação do NO na descida testicular, o efeito
de um inibidor da NOS foi avaliado sobre a duração do período da descida dos
testículos em ratos imaturos.
Ratos machos Wistar imaturos (20 dias de vida) foram divididos em 03
grupos de 12 animais e tratados com veículo (salina 0,9%, 10ml/kg/dia, v.o), L-
NAME (20 mg/kg v.o.) ou L-NAME (20mg/kg v.o) + L-arginina (600mg/kg
i.p.), duas vezes ao dia, por um período de 10 dias.
Durante o tratamento foram feitas observações diárias da descida
testicular, onde o parâmetro adotado para a confirmação da descida testicular
completa, consistiu da observação da presença dos dois testículos na bolsa
escrotal.
3.2.2 - Emissão Seminal Induzida pela Pilocarpina
Drogas colinérgicas como a pilocarpina têm demonstrado induzir a
43
resposta de emissão seminal, porém os mecanismos não são claros. Um possível
papel do NO foi investigado utilizando-se um inibidor de NOS na emissão
seminal induzida por pilocarpina.
Ratos Wystar pesando entre 200 e 300g foram mantidos individualmente
em caixas de metal (25 x 25 x 30 cm) e com um espelho obliquamente
posicionado, que permitiu a observação do processo de emissão seminal. A
escolha dos animais foi feita de forma aleatória e os experimentos foram
conduzidos entre as 9:00 e 14:00 horas. Cada animal foi utilizado somente uma
vez e colado para ambientação na caixa de metal por um período de 30 minutos
antes da aplicação das drogas. A emissão seminal na forma de gotas foi contada
através de observação direta durante um período de 60 minutos subsequentes a
aplicação da pilocarpina e quando necessário utilizou-se o microscópio óptico
para confirmação do exame. Nossos experimentos preliminares mostraram, que a
maioria das emissões ocorreram entre o período de 15 a 45 minutos após
estimulação com a pilocarpina. As drogas utilizadas nos pré-tratamentos foram
administradas 15 minutos antes da aplicação da pilocarpina. Os resultados foram
expressos em gotas de sêmen durante o período de 60 minutos.
Foram constituídos grupos tratados com pilocarpina (0,75, 1,5 e 3,0
mg/kg, i.p.) para avaliação de dose resposta desta droga na emissão seminal,
onde observou-se o melhor resultado na dose de 3 mg/kg de pilocarpina.
Posteriormente, animais foram pré-tratados com atropina na dose de 5 e
10mg/kg, s.c., seguido de tratamento com pilocarpina (3mg/kg, i.p.). Um outro
tratamento foi feito utilizando-se o L-NAME nas doses de 5, 10 e 20 mg/kg,s.c.,
15 minutos antes da administração da pilocarpina (3mg/kg, i.p.). Foram criados
grupos experimentais para avaliar os efeitos da co-administração de L-arginina
(600mg/kg, s.c.) ou nitroprussiato de sódio (0,5mg/kg, s.c.) com L-NAME
(5mg/kg, s.c.) na resposta da emissão seminal induzida por pilocarpina (3mg/kg,
i.p.).
44
3.2.2.1 – Dosagem de Nitrito/Nitrato
Amostras de urina dos grupos experimentais citados no item 3.2.2 foram
coletadas por meio de estimulação manual e colocadas em tubos resfriados em
gelo durante o período da coleta, que levou de 30 a 60 minutos. Em seguida, o
material foi centrifugado a 800g por 10 minutos.
As amostras foram congeladas a –75
º
C até serem analisadas. Os níveis
urinários de NO
3
-
/NO2
-
foram medidos após redução do NO
3
–
para NO
2
-
pelo
cadmium e as amostras analisadas com base na reação de Greiss (GREISS &
BEMERKUNGEN, 1879). Em síntese, 1ml de urina (1:10, v/v) centrifugada foi
adicionada a 0,25ml de tampão cloreto de amônia (75mM, pH 9,6). Esta solução
foi introduzida numa seringa especial de 3ml contendo 1g de cadmium em pó
pré-tratado com 3ml de 0.1N HCl e 3ml de cloreto de amônia (75mM, pH 9,6).
Depois de 5 minutos, sendo feita agitação constante, para viabilizar a redução do
NO
3
–
para NO
2
-
pela ação do cadmium, a amostra foi ejetada da seringa e
analisada em seu conteúdo de nitrito pela reação de Greiss em 540 nm. A curva
padrão foi construída tanto para NO
3
–
aspirado da seringa com cadmium, quanto
para NO
2
-
utilizando nitrato e nitrito de sódio, respectivamente. Em ambos os
experimentos, obteve-se 100% de redução de NO
3
–
para NO
2
-
até a concentração
de 10mM de NO
3
–
. Os resultados foram expressos em NO
3
-
/NO
2
-
(µM).
3.2.3 – Inibição Crônica da Óxido Nítrico Sintetase (NOS)
O objetivo maior desse estudo foi estabelecer o papel do NO no
comportamento sexual , na função testicular e na fertilidade de ratos machos.
Ratos machos Wystar (200 - 300g) de fertilidade comprovada, foram divididos
em grupos de 06 animais, e tratados com veículo (salina 0.9%, 10ml/kg/dia, v.o.)
ou N
ω
-nitro-L-arginina-metil éster (L-NAME, 40mg/kg/dia, v.o.) por um período
56 dias, equivalente a duração do ciclo espermatogênico em ratos.
Após 56 dias
de tratamento, 06 animais de cada grupo foram submetidos a testes de
45
comportamento sexual, utilizando-se fêmeas ooforectomizadas, sendo
posteriormente sacrificados para coleta de testículos e epidídimos, que foram
utilizados para análise de morfologia espermática, avaliação do quadro
histológico e processados para análise em microscopia eletrônica. Os animais
restantes foram submetidos a teste de fertilidade acasalados com fêmeas de
fertilidade comprovada.
3.2.3.1 – Medição da Pressão Arterial
Com o intuito de avaliar a eficiência dos inibidores da NOS, ao final dos
tratamentos foram feitas medições de pressão arterial. Para tal, um total de 12
animais (06 animais do grupo controle e 06 do grupo tratado), foram anestesiados
com uretano numa combinação da via peritoneal (300mg/kg) e endovenosa
(700mg/kg).
Após a anestesia, os tecidos subcutâneo e muscular foram divulsionados e
a artéria carótida comum esquerda dissecada e canulada com cânula de
polietileno. Os mesmos procedimentos foram realizados para canular a veia
jugular esquerda.
Após a preparação cirúrgica, os animais foram imediatamente instalados
no sistema composto de fisiógrafo acoplado a um transdutor de pressão,
conectado à cânula arterial e a uma bomba de infusão contínua, sendo esta,
conectada à cânula jugular. Tão logo o animal fora instalado no sistema,
inclinava-se o registro da pressão arterial (PA controle), até que esse se
estabilizasse, o que transcorria em torno de 15-20 minutos. A partir daí o
fisiógrafo registrou os dados de pressão arterial durante 15 minutos. A pressão
arterial média foi calculada tomando-se como base a equação:
PAM = PS + 2PD
3
46
3.2.3.2 – Comportamento Sexual
Os grupos de animais citados no item 3.2.3, ao final dos tratamentos,
foram submetidos a avaliação quanto ao efeito da inibição crônica da NOS no
comportamento sexual, utilizando-se grupos de 10 fêmeas Wistar adultas (150-
180g) ooforectomizadas. Dez dias após o procedimento cirúrgico as fêmeas
foram tratados com 17β-estradiol (20µg/kg s.c.) e progesterona, administrada em
duas doses, sendo a primeira 72 e a segunda 8 horas antes de serem colocadas
com os machos em teste na proporção de 1:1 (macho/fêmea).
A latência e freqüência de monta e intromissão foram avaliadas através de
observação visual. A ocorrência de monta foi considerada, quando os machos
apresentavam comportamento de cortejo às fêmeas, que caracterizou-se por
perseguição, seguida da monta propriamente dita e agarramento na região do
flanco e demonstração de rápidos e sucessivos movimentos de cópula.
A intromissão foi possível de ser diferenciada da monta pelo movimento
característico de cópula mais acentuado e demorado, onde à desmonta pôde-se
observar, que no caso de ter havido ejaculação os machos apresentaram um
comportamento de inatividade por um período de 5-10 minutos.
Para confirmar a ocorrência da ejaculação realizaram-se lavados vaginais
para detectar a presença dos espermatozóides, além de observar-se a presença do
tampão mucoso na região vulvar das fêmeas. Os animais foram observados por
um período de 30 minutos.
3.2.3.2.1 - Ooforectomia
Dez fêmeas foram submetidas a um regime de dieta zero, com livre acesso
a água nas 12 horas antecedentes a cirurgia. Os animais foram anestesiados em
câmara de vidro com éter, sendo em seguida imobilizados e colocadas em
decúbito ventral.
O ato cirúrgico consistiu em uma única incisão na região abdominal, mais
precisamente 0,1cm abaixo do umbigo, com uma extensão de
47
aproximadamente 1,0 a 1,5cm. A retirada dos ovários foi viabilizada através de
um corte próximo a porção distal dos cornos uterinos. O seguimento uterino
cortado, foi suturado com fio “cat-gut” e a pele, posteriormente suturada com fio
de algodão. Dez dias após a cirurgia os animais encontravam-se aptos a serem
utilizados no experimento.
3.2.3.3 - Fertilidade
O segundo grupo de animais citados no item 3.2.3, foram submetidos a
teste de fertilidade. Esse parâmetro foi avaliado através da colocação dos
referidos machos com fêmeas de fertilidade comprovada, apresentando ciclos
estrais regulares, onde após detecção do estágio de pró-estro as mesmas eram
colocadas junto aos machos na proporção de 1:1 (macho/fêmea), durante toda a
noite.
Na manhã do dia seguinte, foram realizados lavados vaginais e quando da
presença de espermatozóides, considerou-se a partir daí o primeiro dia da
gestação. No vigésimo dia da gestação as fêmeas foram sacrificadas em câmara
com éter, realizando-se então, a contagem, medição e pesagem dos fetos, além da
contagem das reabsorções e de fetos com teratogênese.
3.2.3.4 – Pesos Corporais e Pesos Relativo dos Órgãos
Dos grupos de animais citados no ítem 3.2.3, submetido ao sacrifício para
retirada de testículos e epidídimos, foram coletadoa também as próstatas e
vesículas seminais. Esses animais tiveram aferição de seus pesos corporais no
início e ao final do tratamento. Tomando-se como referência o peso corporal
final, foram feitas aferições dos pesos relativos do epidídimo, da próstata e da
vesícula seminal.
48
3.2.3.5 – Histologia Testicular
3.2.3.5.1 - Microscopia Óptica
Após realização dos testes de comportamento e fertilidade, os animais
foram sacrificados e os testículos imediatamente retirados e pesados sendo um
deles fixado em formaldeído a 10% e o outro, reservado para a avaliação em
microscopia eletrônica. Fragmentos deste órgão foram incluídos em parafina e
feitos cortes de 5µm de espessura corados pela hematoxilina-eosina (HE) para
análise histológica.
Mudanças histológicas associadas ao tratamento com L-NAME tiveram
como parâmetros a integridade da estrutura do tecido, tamanho do lúmen dos
túbulos seminíferos, aspecto do epitélio e presença ou ausência dos estágios da
espermatogênese.
A mensuração do diâmetro e área dos túbulos seminíferos foi feita
utilizando-se uma lâmina micrométrica 1/0.01 (Carl Zeiss) e a ocular do tipo
Kellner x 10 (Nikon). Um número mínimo de 10 túbulos foi aleatoriamente
selecionado para determinar a média de diâmetro de cada fragmento analisado.
Para a avaliação do efeito do tratamento sobre as células da linhagem
espermatogênica, procedeu-se a contagem das espermatogônias e espermátides
em 50 túbulos entre os estágios VI a VIII do ciclo espermatogênico, segundo a
classificação de Leblond & Clermont (1952).
3.2.3.5.2 - Microscopia Eletrônica
Após sacrifício e retirada dos testículos, com auxílio de bisturi, foram
cortados pequenos fragmentos e fixados em glutaraldeído a 2,5% e fosfato
tamponado (pH 7,4) a temperatura de 40°C. Em seguida os fragmentos foram
recortados em blocos de 1mm
3
e submetidos a sucessivas lavagens com tampão
fosfato (3 lavagens, 10 minutos cada) e deixados no mesmo durante a noite.
Após a retirada do fixador, os fragmentos foram submetidos a tratamento pelo
49
ósmio (após-fixação), em solução de tetróxido de ósmio a 1% e tampão fosfato a
0,1M (pH 7,3) por duas horas a 4°C. O material foi em seguida desidratado em
concentrações crescentes de acetona e incluído em Epon. Foram então
realizados cortes de 0.6µm com navalha de diamante em ultra-micrótomo,
montados em grades de 200 “Mesh”, duplamente corados com acetato de uranila
e citrato de chumbo, examinados e fotografados em microscópio eletrônico (Carl
Zeiss, modelo 10).
Foi avaliada, qualitativamente, a morfologia das espermatogônias, células
de Sertoli, de Leydig e demais células da linhagem espermatogenética. Os
parâmetros para avaliação constaram da observação da morfologia e integridade
da membrana plasmática, do núcleo, de estruturas juncionais, de desmossomas e
de organelas citoplasmáticas.
3.2.3.5.3 – Morfologia e Concentração Espermática
Os epidídimos foram removidos e a porção caudal, pesada e cortada em
pequenos fragmentos com lâmina de bisturi, sendo em seguida homogeneizada
em 20ml de salina 0,9%. Deste homogeneizado retirou-se uma gota e procedeu-
se ao esfregaço sobre lâmina de vidro. O material foi posto para secagem em
meio ambiente, fixado em formol tamponado a 10% e corado pela técnica de
Papanicolau.
As anormalidades espermáticas foram avaliadas através de microscopia
óptica, quanto a morfologia de cabeça e cauda dos espermatozóides. Dentre as
patologias de cabeça foi considerada a ocorrência de cabeças isoladas, estreita na
base e as que não possuíam a forma de gancho. Quanto as patologias de cauda,
foi considerada a ocorrência de caudas dobradas, enroladas e fragmentadas. Para
a avaliação foram contados 200 espermatozóides.
O restante do homogeneizado epipidimário foi diluído na proporção de
1:20, utilizando-se uma pipeta para contagem de leucócitos. A concentração
espermática foi avaliada em câmara hemocitométrica de Neubauer e os
resultados expressos em 10
4
/mm
3
.
50
3.2.3.6 - Dosagem de Testosterona Plasmática
Amostras de sangue dos grupos controle e tratado foram coletadas através
da compressão do plexo vascular do globo ocular, utilizando-se tubos de
microhematócrito não heparinizados. Após a coleta as amostras foram
centrifugadas para obtenção do plasma e submetidas a avaliação quanto a
concentração de testosterona por radioimunoensaio.
3.2.3.7 – Análise Estatística
Os dados foram expressados em média ± erro padrão da média (e.p.m.) e
analisados através de análise de variância ou alternativamente pelo teste de
Kruskal-Wallis , sempre que os dados não alcançavam uma distribuição normal.
As diferenças entre grupos foram testadas pelos testes t-Sudent ou através do
teste Mann-Whitney. As proporções foram analisadas através do teste de Qui-
quadrado ou alternativamente pelo teste de Fischer. As diferenças foram
consideradas significativas ao nível de 5% (p < 0,05).
51
4 - RESULTADOS
4.1 - Descida Testicular
O grupo tratado com o L-NAME (20mg/kg/dia, v.o.) apresentou um
retardamento altamente significativo no processo de descida testicular, quando
comparado ao grupo controle. Quando utilizamos a associação de L-NAME
(20mg/kg/dia, v.o.) + L-arginina (600mg/kg/dia, i.p.), houve uma reversão ao
nível do controle (Figura 7).
0
10
20
30
40
50
Descida Testicular (Dias de Vida)
Controle L-NAME L-NAME
+
L-ARGININA
*
Figura 7. Efeito do L-NAME (20 mg/Kg/dia; v.o. durante 10 dias) no tempo de
descida testicular em ratos imaturos (a partir dos 20 dias de vida) e reversão do
retardo da descida testicular pela adiministração de L-arginina (600 mg/Kg/dia;
i.p. durante 10 dias). * p< 0,05, teste t de Student bicaudal não pareado versus
controle. ** p< 0,05, teste t de Student bicaudal não pareado versus L-NAME.
**
52
4.2 – Emissão Seminal
4.2.1 – Emissão seminal induzida por pilocarpina
A resposta ejaculatória obtida através do tratamento com a pilocarpina
(0,75, 1,5 e 3 mg/kg/dia) está demonstrada na figura 8. A injeção intraperitoneal
(i.p.) da referida droga causou uma ejaculação dose-dependente nos ratos, tendo-
se obtido o efeito máximo na dose de 3 mg/kg. O número de gotas de sêmen
observado nas respectivas doses de pilocarpina durante o período de 60 minutos,
foi da ordem de 0,88 ± 0,30, 2,00 ± 0,35 e 8,25 ± 1,20 gotas. A dose de 3 mg/kg
de pilocarpina foi utilizada para estudar a participação do NO na emissão
seminal.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Número de gotas de sêmen / 60min
0,75 1,5 3,0
Figura 8. Emissão seminal induzida pela pilocarpina (0,75, 1,5 e 3 mg/Kg; i.p.).
O número de gotas de sêmen foram registrados por 60 minutos. Cada coluna
representa a médias de 8-10 animais e as barras verticais expressam o erro
padrão da média. *p< 0,001 comparado com animais grupo de animais tratados
com 0,75 e com 1,5 mg/Kg.
*
Pilocar
p
ina
53
4.2.2 – Efeito da atropina e do L-NAME na emissão seminal
induzida pela pilocarpina
A figura 9 ilustra a emissão seminal induzida pela pilocarpina (3mg/kg,
i.p.) e o efeito do pré-tratamento com a atropina (5 e 10mg/kg, s.c.) e com o L-
NAME (5, 10 e 20mg/kg, v.o.) sobre a mesma. A atropina bloqueou a resposta a
pilocarpina de forma significante na dose de 5mg/kg, enquanto que a dose de
10mg/kg promoveu um bloqueio quase completo da resposta ejaculatória. De
forma dose-independente, o L-NAME (5, 10 e 20mg/kg, s.c.), também diminuiu
a emissão seminal induzida pela pilocarpina.
0
2
4
6
8
10
Gotas de sêmen / 60 min
Pilo 5 10 5 10 20
Atropina (mg/kg) L-NAME (mg/kg)
Figura 9. Emissão seminal induzida por pilocarpina (3 mg/Kg; i.p) em animais
pré-tratados por via subcutânea com veículo (salina; 1 ml/Kg) , atropina (5 e 10
mg/Kg) ou L-NAME (5, 10 e 20 mg/Kg). As colunas e barras verticais
expressam a média ± erro padrão da média de pelo menos seis animais. *
p<0,001 comparado com controle, ANOVA one-way seguido de teste de
Student Newman-Keuls para comparações múltiplas. ** p< 0,001 comparado
com dose de 5 mg/Kg. ANOVA one-way seguido de teste de Student Newman-
Keuls para comparações múltiplas
*
**
*
*
*
54
4.2.3 – Reversão pela L-arginina e nitroprussiato de sódio da emissão
seminal induzida pela pilocarpina
A figura 10 mostra o efeito inibitório do L-NAME na emissão seminal
induzida pela pilocarpina em ratos e sua reversão pela L-arginina e pelo
nitroprussiato de sódio. O pré-tratamento com o L-NAME (5mg/kg, s.c.) causou
uma diminuição altamente significativa da emissão seminal induzida pela
pilocarpina (3mg/kg, i.p.). O efeito do L-NAME foi significativamente revertido
pela concomitante administração da L-arginina (600mg/kg, s.c.) e pelo
nitroprussiato de sódio (0,5mg/kg, s.c.).
0
2
4
6
8
10
Gotas de sêmen/60min.
PILO L-NAME L-NAME L-NAME
+ +
L-Arginina SNP
*
**
**
Figura 10. Efeito da L-arginina e nitroprussiato de sódio na emissão seminal
induzida por pilocarpina (3 mg/Kg; i.p). Os animais foram pré-tratados com salina
(1 ml/Kg; s.c), atropina (5 e 10 mg/Kg; s.c), L-NAME (5 mg/Kg; s.c), L-NAME e
L-arginina (5 e 600 mg/Kg; s.c, respectivamente) ou L-NAME e nitroprussiato de
sódio (5 e 0,5 mg/Kg; s.c, respectivamente) 15 minutos antes da administração de
pilocarpina. *p< 0,001 comparado com animais tratados com salina. ** p <0,05,
comparado com animais tratados com L-NAME.
55
4.2.4 – Dosagem de nitrito/nitrato
Os níveis de nitrito/nitrato em ratos normais (grupo controle) e em ratos
tratados somente com pilocarpina ou na combinação de L-NAME ou de
nitroprussiato de sódio mais
L-NAME estão representados na figura 11.
Comparado ao grupo controle (285,5 ± 45,6µM), os animais tratados com
pilocarpina (3mg/kg, i.p.) apresentaram um aumento significativo na
concentração urinária de NO
3
/NO
2
–
(496,7 ± 58,0µM). O pré-tratamento com L-
NAME (5mg/kg, s.c.) aboliu completamente o aumento dos níveis de NO
3
/NO
2
–
induzidos pela pilocarpina . Essa resposta do L-NAME sobre o efeito da
pilocarpina foi bloqueada, quando realizou-se a administração concomitante de
nitroprussiato de sódio (0,5mg/kg, s.c.).
0
100
200
300
400
500
600
Concentração Urinária NO
3
/NO
2
(
µ
M).
Normal Pilocarpina L-NAME L-NAME
+
SNP
Figura 11. Níveis urinários de NO
3
-
/NO
2
-
em ratos controle (normal) e em
ratos tratados com pilocarpina (3 mg/Kg; i.p), L-NAME ( 5 mg/Kg; s.c) ou
em animais pré-tratados com L-NAME e nitroprussiato de sódio (5 e 0,5
mg/Kg; s.c) 15 minutos antes da administração de pilocarpina. Cada coluna
representa a média de seis animais e as barras verticais expressam o erro
padrão da média. *p< 0,001 comparado com grupo de animais controle.
**p< 0,05 comparado com animais tratados apenas com pilocarpina.
*
**
56
4.3 – Inibição crônica da óxido nítrico sintetase
4.3.1 – Medição da pressão arterial
Com a finalidade de avaliar a eficácia do tratamento crônico com o L-
NAME (40mg/kg /dia, v.o.), inibidor da NOS, objetivando-se a inibição da
síntese do NO, foram realizadas aferições das pressões arteriais dos grupos
controle e tratado. A figura 12 demonstra, que após oito semanas de tratamento
com o referido inibidor, houve um aumento significativo (p<0,05) da pressão
arterial dos animais tratados, quando comparados ao grupo controle, que
manteve-se normotenso (126,2 ± 8,70 mmHg e 163,7 ± 5,26 mmHg, grupo
controle e tratado, respectivamente).
0
40
80
120
160
200
Pressão Arterial Média (mmHg)
Controle L-NAME
*
Figura 12 – Pressão arterial média de ratos Wistar normotensos tratados com L-
NAME (40 mg/Kg/dia, v.o por 56 dias comparado com ratos Wistar
normotensos controle. Cada coluna representa a média de dez animais e as barras
verticais expressam o erro padrão da média. *p< 0,001, teste t de Student não
pareado bicaudal comparado com grupo de animais controle.
57
4.3.2 – Efeito da inibição crônica da NOS no comportamento
sexual de ratos machos
Ao avaliarmos os efeitos da inibição crônica da NOS utilizando o L-
NAME (40mg/kg, v.o.) no comportamento de cobertura de ratos machos,
observamos que a latência de monta e intromissão, observamos um aumento
significativo (p<0,05) desse parâmetro, quando comparamos os grupos controle e
tratado. A frequência de monta, bem como a frequência de intromissão,
diminuíram significativamente (p<0,05), quando comparamos os grupos controle
e tratado. Os resultados estão demonstrados nas figuras 13 e 14. Não foram
constatadas ejaculações em nenhum dos animais tratados com L-NAME.
Entretanto, todos os animais do grupo controle (tratados com salina), ejacularam
(p<0,001).
58
0
4
8
12
16
20
Latência de Monta (min
)
0
4
8
12
16
20
24
Latência de Intromissão (min)
0
5
10
15
20
25
30
Latência de Ejaculação (min)
a
b
c
Figura 13. Efeito do tratamento crônico com L-NAME (40 mg/Kg/dia, v.o durante 56
dias) na latência de monta (a), intromissão (b) e ejaculação (c) de ratos. Os animais
foram observados por 30 minutos na presença de fêmeas tratadas com 17-β-estradiol e
progesterona (para aumentar receptividade) em gaiola única na proporção de 1:1. Cada
coluna representa a média de dez animais e as barras verticais expressam o erro padrão
da média. *p< 0,001, teste t de Student não pareado bicaudal comparado com grupo de
animais controle tratados com salina (1 ml/Kg; v.o durante 56 dias).
Salina L
-
NAME
Salina
L
-
NAME
Salina L
-
NAME
*
*
*
59
0
5
10
15
20
25
30
Frequência de Monta
0
5
10
15
20
25
30
Frequência de Intromissão
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
Frequência de ejaculação
Salina L
-
NAME
Salina L
-
NAME
Salina L
-
NAME
*
*
Figura 14. Efeito do tratamento crônico com L-NAME (40 mg/Kg/dia, v.o
durante 56 dias) na frequência de monta (a), intromissão (b) e ejaculação (c) de
ratos. Os animais foram observados por 30 minutos na presença de fêmeas
tratadas com 17-β-estradiol e progesterona (para aumentar receptividade) em
gaiola única na proporção de 1:1. Cada coluna representa a média de dez animais
e as barras verticais expressam o erro padrão da média. *p< 0,001, teste t de
Student não pareado bicaudal comparado com grupo de animais controle tratados
com salina
(
1 ml/K
g;
v.o durante 56 dias
)
.
*
60
4.3.3.- Efeito da inibição crônica da NOS na fertilidade de ratos
machos
Quando os animais tratados com L-NAME (40mg/kg, v.o.) foram
submetidos ao acasalamento com a fêmeas de fertilidade comprovada, somente 8
das 10 fêmeas apresentaram o tampão gelatinoso vaginal (“vaginal plug”),
enquanto todos os animais pertencentes ao grupo controle demonstraram a
ocorrência do mesmo. Ao contrário do grupo controle, as fêmeas acasaladas com
machos tratados com L-NAME (40mg/kg, v. o
.), apresentaram alto índice de
morte e/ou reabsorção fetal, bem como a ocorrência de dois casos de fetos
teratogênicos (Figura 15). Foram observados somente 22 fetos vivos no grupo
tratado contra 103 fetos vivos do grupo controle. O peso fetal foi maior no grupo
tratado em ao grupo controle (Tabela 2).
Tabela 2 - Efeito da inibição da NOS na fertilidade de ratos machos tratados com L-
NAME
Grupos
No.de ratas com
tampão vaginal
No.de ratas com
fetos vivos
No. De fetos
vivos
No. de fetos
por rata prenhe
Peso fetal
Média ± EPM
Controle (10) 10 10 103
10.30±0.6 3.017±0.050
L-NAME (10)
(40 mg/kg, v.o.)
8 2 22
11.00±0.0 3.920±0.130*
*p<0,05 vs. Controle (n) número de animais.
61
4.3.4.- Peso corporal e peso relativo do epidídimo, próstata e
vesícula seminal.
Não houve diferença entre os grupos controle e tratado com relação aos
pesos corporais. Epidídimos, próstatas e vesículas seminais, também não
demonstraram diferenças quanto ao parâmetro peso, quando comparamos os
grupos controle e tratado (Figura 16).
Figura 15. Efeito teratogênico observado em fetos de fêmeas que foram
acasaladas com machos tratados com L-NAME (40 mg/Kg/dia; v.o durante
56 dias) (a) contrastado com feto normal (b) e com útero contendo pontos
de reabsorção (c). Para maiores detalhes ver texto.
a b c
62
0
50
100
150
200
250
300
350
Peso corpóreo (g)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Peso dos Órgãos (g/100g)
Seqüência1
Seqüência2
Süêi4
Controle L-NAME
Dia 0 8ªSem Dia 0 8ªSem
Vês. Seminal
Controle
Tratado
Epidídimo
Dia 0 8ª Sem Dia 0 8
ª
Sem
Testículo
Dia 0 8ª Sem
a
b
Figura 16. Peso corporal (a) e relativo de órgãos genitais masculinos (b) de
animais tratados cronicamente com L-NAME (40 mg/Kg/dia, v.o durante 56
dias). * p< 0,001 comparado com controle antes do ínicio do tratamento com
L-NAME.
*
63
4.3.5. – Histologia Testicular
4.3.5.1. – Microscopia Óptica
Embora os cortes histológicos dos testículos de animais tratados
com L-NAME (40mg/kg, v. o.) não tenham apresentado diferenças
quanto aos efeitos da droga nos estágios do ciclo espermatogênico,
houve uma redução focal do número de espermatogônias e
espermatócitos na porção periférica do parênquima testicular. A
porção central do parênquima não apresentou lesões histológicas por
efeito do tratamento (Figura 17). Observamos uma discreta diminuição
do número das células de Leydig de 14,4
± 1,53 para 12,4 ± 1,52,
quando comparamos grupos controle e tratado.
64
Figura 17 - Achados histológicos no testículo de animais tratados com salina
0.9% (10ml/kg/dia, v.o.) ou L-NAME (40 mg/Kg/dia, v.o) durante 56 dias. No
painel a é mostrado a porção periférica de tecidos de animais controle e no painel
b a porção periférica de animais tratados com L-NAME. As setas em b e em d
(cortes de animais tratados) indicam que há um comprometimento do epitélio dos
túbulos seminíferos, com diminuição das espermatogônias e espermatócitos. Em
c é mostrado um corte de porção central do parênquima testicular de animais
controle e em d a mesma porção em animais tratados. Coloração pelo HE,
aumento de 40 x.
A B
C D
65
4.3.5.2.- Microscopia Eletrônica
A microscopia eletrônica revelou alterações das membranas celular e
nuclear, onde observamos enrugamento das mesmas nas células de Leydig e
Sertoli (Figura 18 b e d). Vacúolos citoplasmáticos, indicativo de processos
degenerativos, também estão presentes nesses tipos celulares, porém de forma
mais evidentes nas células de Leydig. Dentre as organelas citoplasmáticas,
observamos um comprometimento da integridade mitocondrial, como rareamento
das cristas mitocondriais das células de Leydig (Figura 18 b). As
espermatogônias não apresentaram alterações estruturais, porém detectamos
deformidade na estrutura do capuz acrossomático das espermátides com
acentuada alteração da membrana do mesmo (Figura 19 b).
66
A B
C D
Figura 18. Microscopia eletrônica de transmissão com aumento de 12.000 x de células de Leydig de
animais controle (
a) e de animais tratados com L-NAME na dose de 40 mg/Kg, v.o durante 56 dias
(
b). As setas azul, vermelho e verde, respectivamente, indicam presença de vácuolos, rareamento
das cristas mitocondriais e enrugamento da membrana do nucléolo. Os painéis (
c) e (d) representam
células de Sertoli de animais tratados com salina ou com L-NAME no mesmo protocolo descrito
acima demonstrando nos pontos evidenciados por setas a presença de mitocôndrias com rareamento
de cristas.
67
68
4.3.6 -Morfologia e Concentração Espermática
O tratamento com o L-NAME demonstrou um efeito deletério sobre a
espermatogênese, considerando-se que os espermatozóides coletado da porção
caudal do epidídimo, ao serem analisados, apresentaram uma concentração
diminuída de 13.70 ± 1,28 x10
4
células/mm
3
para 5,70 ± 1,06 x10
4
células/mm
3
(p<0,001), quando comparado ao grupo controle após oito semanas de
tratamento (Figura 20).
A B
Figura 19. Microscopia eletrônica de transmissão com aumento de 31.500 x de espermátides de
animais controle (
a) e em (b) animais tratados com L-NAME (40 mg/Kg/dia, v.o durante 56 dias)
onde foi possível evidenciar a completa deformidade da estrutura do capuz acrossomático com
enrugamento e descontinuidade da membrana.
69
0
4
8
12
16
20
Concentração espermática
(mm3)
Quanto a morfologia dos espermatozóides, observou-se que após 56 dias de
tratamento com o L-NAME houve um aumento das patologias de cabeça, tanto no
grupo controle, quanto no tratado, porém somente no último este se deu de forma
significativa. Dentre as patologias de cabeça foram consideradas as formas isoladas,
estreita na base e as que não apresentavam a forma de gancho (Figura 21
b). As
anomalias de cauda também foram evidenciadas com aumento de caudas dobradas e
fortemente dobradas sem no entanto serem estatisticamente significativas (Figura 21
c e
d). Os valores de anomalias encontradas nos animais tratados com salina foram 1,66 ±
0,33 antes do início do tratamento e 2,12
± 0,22 após oito semanas de tratamento com
salina, enquanto que nos ratos do grupo L-NAME o número de anomalias de cabeça foi
de 2,35
± 0,16 antes do início do tratamento e 6,30 ± 0,28 (p<0,05 vs. controle) após
56 dias de administração da droga (Figura 22).
Dia 0 8ª Semana
Controle L-NAME Controle L-NAME
Figura 20. Efeito do tratamento crônico com L-NAME(40mg/kg/dia, v.o.,
durante 56 dias) na concentração espermática. O material foi coletado da
cauda do epidídimo. *p<0,001, teste t de Studant não pareado comparado
com controle tratado com salina.
*
70
A B
C D
Figura 21. Fotos de microscopia óptica (Papanicolau, com aumento de 100x) mostrando
anormalidades espermáticas. No painel (
a) é mostrado um espermatozóide normal de animais
controle e em (
b) uma cabeça isolada, uma ocorrência comum nos animais tratados
cronicamente com L-NAME. Os painéis (
c) e (d) mostram espermatozóides com caudas
dobrada e fortemente dobrada, respectivamente.
71
0
1
2
3
4
5
6
7
Patologias de Cabeça de STZs (10
4
/mm
3
)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
Patologia de Cauda (10
4
/mm
3
)
Controle L-NAME
Dia 0 8ªSem Dia 0 8ªSem
Controle L-NAME
Dia 0 8ªSem Dia 0 8ªSem
Figura 22. Anormalidades de cabeça (a) e cauda (b) de
espermatozóides de animais controle e tratados cronicamente com L-
NAME (40mg/kg/dia, v.o., durante 56dias). O material coletado do
epidídimo foi diluído na proporção de 1:20, retirando-se uma gota para
esfregaço em lâmina de vidro, que posteriormente foi corada pelo
Papanicolau. Foram contados 200 espermatozóides.*p<0,05 comparado
controle e tratado.
*
a
b
72
4.3.7.- Dosagem de Testosterona Plasmática
Com o intuito de avaliar os efeitos da inibição crônica da óxido nítrico
sintetase, utilizando L-NAME (40mg/kg/dia, v.o., durante 56 dias), sobre o eixo
hipotalâmico- hipofisário- gonadal e subsequênte liberação de gonatodrofinas e
síntese de andrógenos, ao final do tratamento, coletamos amostras de sangue, que
foram submetidas a centrifugação para separação do soro e posterior dosagem da
testosterona sérica através de técnica de radioimunoensaio. A dosagem revelou
uma diminuição significativa dos níveis de testosterona entre os animais do
grupos controle e tratado ( 2,08 ± 0,37 e 0,48 ± 0,07, respectivamente) (Figura
23).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Testosterona Plasmática (ng/ml)
Controle L-NAME
*
Figura 23. Efeito da inibição crônica da óxido nítrico sintetase nos níveis de
testosterona sérica. Os animais foram tratados com L-NAME (40 mg/kg/dia, v.o.,
durante 56 dias). p< 0,001 comparando o grupo controle ao tratado.
73
6. DISCUSSÃO
Este estudo foi delineado para investigar os efeitos do N
G
-nitro-L-arginina
metil éster (L-NAME), um inibidor não seletivo da NOS em ratos, utilizando
diferentes sistemas experimentais com o intuito de avaliar o papel do NO como
regulador da função reprodutiva.
O sistema reprodutivo masculino produz e armazena os gametas
masculinos. Os gametas masculinos ou espermatozóides são produzidos no
testículo e estocados no epidídimo. O pênis têm a função de proporciona o
mecanismo a entrega, enquanto as glândulas acessórias contém várias secreções,
que ajudam no transporte dos espermatozóides.
O controle endócrino da descida testicular em mamíferos é pouco
conhecido. No cérebro, o NO ativa a liberação de LHRH, que alcança a pituitária
e ativa a liberação de gonadotrofina (Rettori et al., 1993). Observações
experimentais e clínicas indicam, que a descida testicular é um evento mediado
por andrógenos diretamente regulado por gonadotrofinas hipofisárias (Rajfer &
Welsh, 1977). Acredita-se que a descida testicular seja um processo bifásico,
migrando primeiramente, das proximidades do polo inferior do rim para o
hipogástrio (descida intra-abdominal) e uma segunda fase, migrando através do
canal inguinal para o escroto (descida ínguino-escrotal) (Hutson, 1985). O
metabólito androgênico ativo em ambas as fases parece ser a dihidrotestosterona,
que é sintetizada pelos testículos e deve estar presente em altas concentrações
74
locais para ser efetivo (Spencer et al., 1993; Lin et al., 2001). Tem sido feita a
hipótese, de que a descida testicular ocorra como resultado da secreção de
descendina um testículo normal e sua secreção resulte em crescimento seletivo de
células do gubernáculo. O desenvolvimento do gubernáculo resulta em
masculinização dos elementos do canal inguinal. No início da descida testicular,
o processo patente migra para o canal inguinal, gerando uma pressão intra-
abdominal sobre o gubernáculo, que por sua vez exerce ação sobre os testículos
para descerem ao canal inguinal. A descida dos testículos para dentro e através
do canal inguinal é uma etapa intermediária entre a pressão intra-abdominal
transmitida pelo processo vaginal a regressão do gubernáculo induzida por
andrógenos. É possível que andrógenos sob controle do eixo hipotalâmico-
hipofisário preservado de fetos altere as propriedades viscoelásticas do
gubernáculo, criando uma pressão intra-abdominal, que empurra os testículos
para dentro do saco escrotal (Levy & Husmann, 1995).
Neste estudo, o papel do NO na descida testicular foi verificado tratando-
se ratos machos com 20 dias de idade com L-NAME ( 20 mg/kg/dia) por um
período de 10 dias. Esta dose de L-NAME fora capaz de mostrar ser a causa da
inibição de NOS cerebral (Faria et al., 1997). O tratamento com L-NAME causou
um retardo significativo na descida testicular comparado ao controle tratado com
salina. Além disso, o efeito causado pelo L-NAME foi completamente revertido
pela L-arginina, um substrato para a biossíntese do NO, sugerindo que o NO tem
função de modulação na referida descida testicular. Embora o mecanismo preciso
da sua participação na descida testicular não tenha sido esclarecido neste
75
estudo, esta é a primeira verificação mostrando claramente, evidências de que o
tratamento de ratos machos imaturos com inibidor de NOS afeta a maturação
sexual (puberdade) avaliada através da medida do período de tempo transcorrido
para a descida testicular, demonstrando a participação do NO na descida
testicular.
É bastante conhecido que, o comportamento sexual em ratos machos é
regulado por vários sistemas neurotransmissores (Bitran & Hull, 1987). A
acetilcolina (Ach) é um neurotransmissor participante no comportamento sexual
e drogas colinérgicas como a fisostigmina e a pilocarpina induzem ejaculação em
ratos, que pode ser bloqueada por atropina (Stief et al., 1989; Zarrindast et al.,
1994), indicando que este efeito é mediado por um mecanismo colinérgico
central. Demonstrou-se, que a administração de baixas doses de agonistas
dopaminérgicos, como a apomorfina e lisurida, induzem ereção peniana e
facilitam a emissão seminal em ratos, efeitos estes, que podem ser antagonizados
pela sulpirida, um antagonista dopaminérgico (Benassi-Benelli et al., 1979;
Zarrindast et al., 1994). Esses achados indicam uma possível interação entre
neurônios dopaminérgicos e colinérgicos centrais para indução da ejaculação,
emissão seminal ou ambas, porém com mecanismos subjacentes obscuros.
Devido a vasta distribuição de fibras NOS ao longo dos neurônios eferentes
parassimpáticos, é razoável conjecturar, que o NO liberado durante a estimulação
colinérgica pode mediar a neurotransmissão inibitória responsável pela emissão
seminal. Drogas colinérgicas como a pilocarpina, podem estimular a emissão
seminal através de um mecanismo, possivelmente envolvendo NO, agindo
76
em sítios centrais e periféricos. O presente estudo verificou a hipótese de que a
via L-arginina/óxido nítrico participe da resposta estimulatória da pilocarpina na
emissão seminal. Os resultados mostram que a pilocarpina, um agonista
colinérgico, pode estimular a emissão seminal em ratos, a qual pode ser
antagonizada completamente pela atropina, um antagonista muscarínico não
seletivo, indicando a participação de um mecanismo colinérgico. Esta observação
é consistente com os achados prévios de Zarrindast et al. (1994). A estimulação
da emissão seminal induzida por pilocarpina foi inibida pelo L-NAME, um
inibidor não seletivo da NOS (Moncada et al., 1991), indicando a participação do
NO na mediação do seu efeito. Além disso, o efeito inibitório do L-NAME na
emissão seminal induzida por pilocarpina pode ser efetivamente revertido em
animais tratados com excesso de substrato de L-arginina ou com nitroprussiato
de sódio, um doador putativo de NO. O possível comprometimento do sistema L-
arginina/óxido nítrico na ação da pilocarpina é sugerido anteriormente pelo
aumento dos níveis de nitrito/nitrato ( NO
3
-
/NO
2
-
) urinário, produtos da oxidação
do NO, e sua inibição por ação do L-NAME, um inibidor não seletivo da NOS.
O NO provavelmente medeia a neurotransmissão inibitória responsável
pela emissão seminal induzida por pilocarpina em ratos agindo em sítios
nervosos centrais e periféricos. Sugere-se que a ereção peniana e a emissão
seminal sejam mediadas por dois mecanismos distintos e a área hipotalâmica pré-
óptica medial (MPOA), parece ser o provável local de integração de mecanismos
reflexos medulares. A MPOA participa da modulação da motivação sexual (Hull
et al., 1997), e estudos recentes confirmaram a existência de neurônios
77
contendo NOS na MPOA, no núcleo parassimpático do rato e no gânglio pélvico
principal, que fornece eferentes pós-ganglionares para os órgãos urogenitais (
Vizzard et al., 1994; Hamilton et al., 1995; Persson et al., 1998). Na MPOA,
efeitos mediados por receptores dopaminérgicos do tipo D
1 e D2, foram sugeridos
ser antagonistas entre si e ter diferentes limiares de ativação. Por exemplo,
enquanto baixos níveis de estimulação dopaminérgica sobre receptores D
1
modulam positivamente a ereção controlada pelo sistema parassimpático, a
estimulação em níveis mais altos dos receptores D
2, modulam positivamente a
emissão seminal controlada pelo sistema nervoso simpático, explicando assim, a
progressão da ereção para o mecanismo ejaculatório (Hull et al., 1992). A
quinelorana, um agonista de receptores dopaminérgicos ministrados
sistemicamente ou diretamente na MPOA, foi sugerida como inibidora da ereção
peniana, porém com ação facilitatória da emissão seminal (Bazzett et al., 1991).
Um efeito facilitatório da estimulação muscarínica no comportamento sexual
requer a participação de testosterona (Renata Marquez e Velasquez Montezuma,
1997). A testosterona é responsável pela regulação crescente da síntese de NO na
MPOA e de facilitar a liberação de dopamina nesta área em ratos normais, mas
não em animais castrados (Hull et al., 1997). Esses achados sugerem, que há a
possibilidade de a pilocarpina facilitar a emissão seminal através da aceleração
da liberação de dopamina mediada por NO na MPOA. Todavia, estudos
adicionais são requeridos para indentificar a natureza precisa da interação entre
neurônios colinérgicos e dopaminérgicos na MPOA para a indução da emissão
seminal.
78
O NO funciona como um agente neurotransmissor não adrenérgico não
colinérgico (NANC) no trato urogenital (Burnett et al., 1995). Tem sido proposto
por exemplo, que o NO quer seja liberado pelos neurônios NANC, ou formado
no endotélio ou no músculo liso, estimula a formação de GMPc no músculo liso
do corpo cavernoso, que por sua vez relaxa a musculatura e permite ao sangue
fluir para o corpo cavernoso causando a ereção (Holmquist et al., 1992). A
emissão seminal e a ejaculação, são tidas como primariamente mediadas por
catecolaminas (Benson et al., 1988). Contudo, os efeitos andrenégicos, que
regulam o processo ejaculatório, podem ser modulados por NO, assim como por
estimulação colinérgica. Devido a demonstração por técnicas
imunohistoquímicas da presença de abundantes fibras neuronais NOS positivas
na parte terminal do canal deferente e no ducto ejaculatório, o NO possivelmente
atuando através de neurotransmissão inibitória, possa mediar a passagem do
fluido seminal. Foram demonstrados receptores muscarínicos no pênis e na
musculatura lisa do pênis e da uretral do rato (Godec & Bates, 1984). A emissão
do sêmen na uretra depende da inervação simpática, que condiciona a contração
da musculatura lisa do canal deferente, da vesícula seminal e da próstata
(Bruschini et al., 1977; McConnell et al., 1979). Nervos parassimpáticos também
estimulam a secreção da vesícula seminal e da próstata (de Groat & Booth,
1980). Parece que a pilocarpina através da estimulação de receptores
muscarínicos pode ativar a síntese de NO do endotélio do vasos bem como dos
nervos NANC. Além disso, pode haver um sinergismo com o NO na modulação
da atividade secretória e do tônus muscular dos órgãos genitais.
79
O principal objetivo deste estudo foi analisar os efeitos da inibição crônica
da síntese de óxido nítrico no comportamento sexual e na fertilidade de ratos
machos adultos. Os resultados demonstraram que a administração oral de L-
NAME (40 mg/kg/dia durante um ciclo espermatogênico completo) exerce um
efeito inibitório no comportamento sexual masculino, bloqueia a
espermatogênese, aumentando o número de alterações morfológicas nos
espermatozóides e diminui a fertilidade em ratos. Esta dose de L-NAME foi
escolhida com base em dados da literatura (Yallampalli & Garfield, 1993; Hull et
al., 1994). As alterações induzidas com a dose que utilizamos consistem no
aumento da latência da primeira monta e da intromissão e a marcada inibição da
frequência de intromissão e de ejaculação. Essas observações são consistentes
com o efeito inibitório estabelecido do L-NAME sobre o relaxamento dos corpos
cavernosos, levando a disfunção erétil (Ignarro, 1992; Burnett et al., 1992; Hull
et al., 1994) e sobre a emissão seminal e ejaculação induzida por estimulação
colinérgica (Tomé et al., 1999). Esse impedimento parece refletir primariamente
a inibição da função erétil, embora este parâmetro não tenha sido avaliado no
presente experimento. O mecanismo molecular da ereção peniana envolve o
relaxamento da musculatura lisa (arteriolar e trabecular), que é na verdade uma
mudança no tônus contrátil através da reposição do estado pré-contrátil
(adrenégico) acompanhado por diminuição do Ca
2+
e/ou pela diminuição da
sensibilidade do maquinário contrátil ao Ca
2+
. A redução na concentração do
Ca
2+
citosólico é promovida pelo AMPc, GMPc ou por ativação dos canais de
potássio com hiperpolarização, que previne a abertura dos canais de cálcio
80
voltagem dependentes. A guanilato ciclase, que cataliza a conversão da
guanosina trifosfato para GMPc é ativada pelo NO (Snyder, 1992). O GMPc
ativa a proteínoquinase G, que através de múltiplas fosforilações facilita o
seqüestro do cálcio e reduz a entrada do mesmo para a célula (De Tejada, 2002).
Assim, a inibição da síntese de NO pelo L-NAME pode adversamente afetar a
ereção peniana e acentuar a influência do tônus contrátil adrenérgico levando a
uma disfunção erétil. Além disso, foi comunicado recentemente, que o L-NAME
induz deficiência somática motora (Araki et al., 2001), que pode também
contribuir para dificultar a monta e a intromissão. A taxa de cobertura deve ser
relacionada à motivação sexual, enquanto a frequência é reconhecida como
parâmetro útil da potencialidade erétil masculina ou de sensibilidade peniana
(Miesel et al., 1994). A reduzida receptividade de fêmeas aos machos também
pode afetar a taxa de cobertura. A receptibilidade das ratas foi demonstrada antes
do teste de comportamento sexual e apenas animais receptivos foram utilizados
para o mesmo.
O testículo tem duas funções; síntese de hormônios esteroidais e
espermatogênese. Esses processos ocorrem em estruturas anatomicamente
distintas. A função endócrina é desempenhada por células embutidas entre os
túbulos seminíferos, enquanto a espermatogênese, processo de produção de
espermatozóides, ocorre dentro dos túbulos. Em resposta a estimulação do
hormônio luteinizante (LH), proveniente da adeno hipófise, as células de Leydig
presentes no testículo são responsáveis pela produção de testosterona.
Uma das mais críticas influências que a inibição de NOS pode ter no
81
sistema reprodutivo é a indução da diminuição da secreção de testosterona. A
administração diária de 40 mg/Kg de L-NAME durante oito semanas causou uma
diminuição significativa da concentração sérica de testosterona nos animais
utilizados nesse estudo. Foi demonstrado, que a remoção de testosterona induzida
pela destruição das células de Leydig, interrompe o processo espermatogênico
(Sharpe et al., 1990). Esta influência parece ser focalizada no estágio VII do
epitélio seminífero, que ocorre imediatamente antes da espermiogênese e afeta
principalmente o espermatócito I, na etapa de paquíteno, a espermátide
arredondada e a espermátide em alongamento. Uma marcada degeneração dos
dois primeiros tipos celulares poderia resultar em um declínio do número de
espermatozóides e a desintegração do último tipo celular poderia potencialmente
estar associado a problemas no desenvolvimento de estruturas especializadas do
espermatozóide, como o acrossoma ou a cauda. Curiosamente, em nosso estudo,
observamos tanto uma diminuição do número de espermatozóides como aumento
de anormalidades morfológicas após o tratamento com L-NAME e a microscopia
eletrônica revelou defeitos acrossômicos. A atividade secretória normal do
epitélio epididimário e de outros órgãos sexuais acessórios depende do nível
plasmático de andrógenos, os quais estão sob controle do FSH e o LH (Mann &
Ludwak-Mann, 1981). Durante o trânsito normal através do epidídimo, o
espermatozóide desenvolve gradualmente a capacidade para fertilizar o óvulo sob
a influência de suprimento androgênico proveniente dos testículos (Ogebin-Crist
& Jahad, 1978; Moore & Bedford, 1979). A discreta ruptura do epitélio
observada na periferia dos túbulos seminíferos de ratos machos tratados com
82
L-NAME, pode ser uma consequência da diminuição do fluxo sanguíneo para os
testículos, devido ao fato da inibição crônica da NOS induzir hipertensão e
reduzir o fluxo plasmático renal e a taxa de filtração glomerular (Gabbai, 2001).
Uma segunda consequência da diminuição dos níveis de testosterona
poderia ser uma influência adversa sobre o comportamento sexual. A presença de
testosterona é necessária para a liberação de dopamina na MPOA durante
condições basais e após estímulo sexual. Os níveis de dopamina nesta área reflete
ativação motora primária, além de aspectos de motivação de comportamento de
cópula (Damasma et al., 1992), que é influenciado pelo sistema mesolímbico
(Everitt et al., 1989). Uma maneira pela qual a testosterona pode promover
liberação de dopamina é através da regulação crescente de NOS, que por sua
vez, por ação do NO, aumenta a liberação de dopamina (Hull et al., 1997).
Microinjeções de inibidores de NOS na MPOA inibe a habilidade de machos
vírgens de copularem (Moses & Hull, 1999). Além do mais, a administração de
L-arginina por meio de microdiálise reversa na MPOA aumenta a taxa de
cobertura (Sato et al., 1998). Assim, parece que o bloqueio parcial da secreção de
testosterona acompanha as mudanças induzidas pelo L-NAME na taxa de
cobertura e na frequência de intromissão. Contudo, os dados publicados a
respeito dos níveis de testosterona in vitro e in vivo em resposta a tratamento com
doadores de NO e inibidores da NO sintetase, sobre os níveis de testosterona são
confusos. Nesses estudos, ratos machos tratados com doadores de NO ou com
inibidores da NOS mostraram um aumento significativo da testosterona sérica, e
do fluido intersticial, bem como um aumento quando os animais foram
83
tratados com inibidores de NOS em estudo feito com fatias testiculares in vitro.
Enquanto Adams et al.(1994) comunicavam efeito não significativo do doador de
NO dinitrato de isosorbide sobre a esteroidogênese testicular, Del Punta et al.
(1996) demonstraram um efeito inibitório de doadores de NO neste processo. A
razão para esta discrepância entre esses e os nossos resultados pode
provavelmente ser atribuída ao tipo de doador de NO/ou inibidor de NOS
utilizado e/ou a dosagem utilizada. A dose de L-NAME utilizada em nossos
protocolos experimentais não acarretou qualquer alteração no peso corporal ou
no peso relativo dos testículos, vesícula seminal e próstata.
Diversos estudos sugerem que as células testiculares são bem equipadas
com a via NO-GMPc, que pode participar na regulação da função testicular,
como a espermatogênese e esteroidogênese (Davidhoff et al., 1995; Zini et al.,
1996; Tatsumi et al., 1997; Wang et al., 1997). A esteroidogênese nas células de
Leydig há muito tempo tem sido reconhecida como estando sob o controle do
eixo hipotalâmico-hipofisário-testicular. Burnett et al. (1995) demonstraram a
capacidade do testículo em sintetizar NO através de vários tipos celulares.
Técnicas de imunohistoquímica e avaliação de RNAm estabeleceram, que a
NOSi é expressaconstitutivamente nas células de Leydig e de maneira específica
nas células de Sertoli, nas células peritubulares e nas células espermatogênicas de
testículos normais (O’Bryan et al., 2000), sugerindo um novo papel para a NOSi
na regulação autócrina ou parácrina da vasculatura testicular, na esteroidogênese
nas células de Leydig e na espermatogênese. Outras células produtoras de NO,
principalmente as células endoteliais, mastócitos e macrófagos são
84
observadas numa associação íntima com as células de Leydig e foram descritas
como moduladoras da biossíntese de testosterona (Hutson, 1992; Burnett et al.,
1995). Tornou-se difícil neste estudo, precisar se o L-NAME diminuiu a
produção de testosterona por efeito direto no testículo ou se através da inibição
da liberação de LHRH e LH. Alguns estudos têm demonstrado, que o L-NAME
inibe a liberação de LHRH e de LH (Rettori et al., 1993; Pinilla et al., 1999), que
são necessários para a estimulação das células de Leydig para produção de
andrógenos (Soez, 1994). A habilidade dos ratos tratados com L-NAME em
acasalar foi mantida apesar do baixo nível sérico de testosterona, que foi
suficiente para o comportamento de cobertura normal, porém foi insuficiente
para a manutenção da capacidade fertilizante do espermatozoide epididimário.
O papel do NO na modulação do processo reprodutivo em fêmeas tem
sido estudado com maior intensidade. Por exemplo, o papel do NO no processo
de ovulação, implantação e gestação foi bem estabelecido (Rosselli et al., 1998;
Dixit & Parvizi, 2001). Biswas et al. (1998) demonstraram, que a inibição da
NOS pelo L-NAME acarreta um retardo no crescimento embrionário e falha no
processo de implantação, o que pode ser atenuado pelo nitroprussiato de sódio ou
por outro doador de NO. A redução crônica da produção de NO pelo L-NAME
no terço final da gestação (entre os dias 13 e 20 na dose de 0,1 a 6 mg/ml na água
de beber, que resulta em aproximadamente em 6 a 60 mg/dia) demonstrou a
indução de uma redução significativa do crescimento intrauterino dos fetos, além
de processo necrótico hemorrágico em ratas (Diket et al., 1994). Este efeito do L-
NAME foi previnido pela co-administração do nitroprussiato de sódio,
85
sugerindo que o desenvolvimento fetal é mediado pelo NO. Por outro lado,
poucos estudos foram direcionados no intuito de conhecer o efeito da inibição do
NO na reprodução de ratos machos. O efeito sobre os parâmetros reprodutivos
em animais normalmente começa com o reconhecimento do surgimento de por
exemplo diminuição da produção espermática, impotência e infertilidade. O
efeito da L-arginina, o substrato para a síntese de NO, sobre a função reprodutiva
de ratos machos tem sido recentemente examinado. Os resultados mostraram que
o tratamento com L-arginina (200mg/kg/dia , v.o. por um período de 7 dias
consecutivos), efetiva e reversivelmente inibiu a fertilidade em ratos machos
(Ratnassoriya & Dharmasiri, 2001), indicando que a produção elevada de NO
pode ser em detrimento da fertilidade masculina. Contudo, não existem estudos
que tenham avaliado os efeitos de inibidores da NOS na fertilidade masculina.
A influencia adversa do L-NAME na função testicular, na contagem
espermática epididimária e nas anormalidades observadas neste estudo indicam
fortemente, que este é capaz de diminuir a fertilidade de machos mamíferos.
Portanto, foram analisados os efeitos da inibição da NOS na fertilidade de ratos
machos adultos. A administração diária de L-NAME (40mg/kg/dia, i.p., durante
um ciclo espermatogênico) resultou no impedimento da fertilidade. O L-NAME
suprimiu significativamente a fertilidade tanto quando foi feita a mensuração do
número de implantações quanto de gestação, quando comparado ao grupo
controle tratado com salina, o que é indicativo de algum tipo de interrupção da
função espermática como o transporte do espermatozóide na fêmea, capacitação,
reação acrossômica penetração na zona pelúcida ou fusão do espermatozóide
86
com o óvulo (Wassarman, 1987). Com vistas a isso, tem sido mostrado que a
inibição da NOS durante a capacitação espermática impede a fertilidade “in
vitro” e a reação acrossômica espontânea em camundongos (Herrero et al., 1997).
O número de fêmeas acasaladas com machos receberam tratamento com L-
NAME foi altamente reduzido, resultando numa inibição de 75% da fertilidade.
O efeito inibitório do L-NAME em ratos machos pode ser atribuído a inibição da
NOS, que suprime a integridade funcional testicular e/ou epididimária,
possivelmente inibindo a secreção de andrógeno local e/ou de gonadotrofina. A
privação de andrógeno, não somente suprime a espermatogênese, levando a uma
baixa concentração espermática, mas também altera o meio epididimário, que
torna-se inadequado à maturação e sobrevivência do espermatozóide (Setty,
1979; Rao & Mathur, 1988; Rao & Shah, 1988). A concentração e morfologia
espermática no epidídimo foi, entretanto, adversamente afetada após a
administração do L-NAME. Uma concentração inadequada de espermatozóides
não pode penetrar o muco cervical, levando a uma falha na fertilização do óvulo.
O presente estudo demonstrou, que a inibição da NOS pode impedir a fertilização
em ratos devido a interferência nos níveis de andrógenos testiculares.
O estudo através da microscopia ótica e eletrônica demonstrou alterações
morfológicas. Dentre as alterações encontradas na avaliação através da
microscopia eletrônica, o rareamento das cristas mitocondriais presentes nas
células de Leydig pode estar relaciona as alterações da concentração sérica da
testosterona, tendo em vista que o metabolismo do colesterol tem etapa
mitocondrial. Além disso, o comprometimento da integridade mitocondrial
87
afeta a cadeia respiratória celular podendo corroborar para a geração de espécies
reativas de oxigênio podendo acarretar citotoxicidade. Uma grande quantidade de
vacúolos, estruturas compatíveis com processo degenerativo celular, foi
encontrana na porção periférica do parênquima testicular, quando da avaliação
através de microscopia ótica e mais detalhadamente nas células de Leydig e
Sertoli, através da microscopia eletrônica.
Em síntese, os resultados obtidos neste estudo oferecem evidências, de
que o NO age como um importante mediador dos processos reprodutivos
masculinos tais como descida testicular, comportamento sexual e fertilidade.
Estudos futuros podem corroborar na avaliação do uso de moduladores da síntese
de NO para o tratamento de desordens reprodutivas específicas tais como
impotência e infertilidade masculina.
88
6. CONCLUSÕES
6.1 O óxido tem papel modulatório na descida testicular
6.2 O óxido nítrico medeia a neurotransmissão inibitória responsável pela
estimulação colinérgica associada a emissão seminal
6.3 A inibição da óxido nítrico sintetase durante um ciclo espermatogênico
suprimiu a função testicular resultando na diminuição da secreção de
andrógenos e comprometeu a espermatogênese.
6.4 A inibição da óxido nítrico sintetase prejudicou a fertilização em ratos
machos, fato este, atribuído principalmente as disfunções testiculares.
Os dados obtidos sugerem, que o óxido nítrico é uma molécula
mensageira importante nos processos reprodutivos de machos. Desta
forma, moduladores da óxido nítrico sintetase podem ser vistos como
ferramentas potenciais para o tratamento da impotência e da infertilidade
masculina.
89
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABU-SOUD, H. M.; FELDMAN, P. L. et al. Electron transfer in nitric oxide
syntheses: characterization of L-arginina analogs that block heme iron reduction.
J. Biol. Chem., v. 269, p. 32318-32326, 1994.
ADAMS, ML., MEYER, ER., SEWING, BN., CICERO, TJ. 1994. Effects of
nitric oxide related agents on rat testicular function. J. Pharmacol. Exp. Ther.
269: 230-237.
ALI, M.; BUHIMISCHI, I. et al. Changes in expression of nitric oxide synthase
isoforms in rat uterus and cervix during pregnancy and parturition. Mol. Hum.
Reprod., v. 3, p. 995-1003, 1997.
ARAKI, T., MIZUTANI, H., MATSUBARA, M., IMAI, Y., MIZUGAKI, M.,
ITOYAMA, Y. 2001. Nitric oxide synthase inhibitors cause motor déficits in
mice. Eur, Neuropsychopharmacol. 11: 125-133.
AZUMA, H.; OBAYASHI, S. et al. Role of endothelium in human uterine
arteries during normal menstrual cycle. Br. J. Pharmacol., v. 114, p. 902-908,
1995.
BAZZETT, TJ., EATON, RC., THOMPSON, JT., MARKOWSKI, VP.,
LUMELY, LA., HULL, EM. 1991. Dose-dependent D2 effects on genital
reflexes after MPOA injections of quinelorane and apomorphne. Life Sci. 48:
2309-2315.
BECKMAN, J.S.; BECKMAN, T. W. et al. Apparent hydroxyl radical
production of peroxynitrite: implications for endothelial injury from nitric oxide
and superoxide. Proc. Natl. Acad. Sci., v. 87, p. 1620-1624, 1990.
BECKMAN, J.S; CROW, J. P. Pathological implications of nitric oxide,
superoxide and peroxynitrite formation. Biochem. Soc. Trans., v. 21, p. 330-334,
1993.
BENASSI-BENELLI, A., FERRARI, F., PELLEGRINI QUARRANTOTTI, B.
1979. Penile erection induced by apomorphine and N-n-propyl-norapomorphine
in rats. Arch. Int. Pharmacodyn. 242: 241-247.
BENSON, GS. 1988. Male sexual function: erection, emission, reproduction.
90
Raven Press, New York, pp. 1121-1139.
BISWAS, S., KABIR, SN., PAL, AK. 1998. The role of nitric oxide in the
process of implantation in rats. J. Reprod. Fert. 114: 157-161.
BITRAN, D., HULL, M. 1987. Pharmacological analysis of male rat sexual
behavior. Neurosci. Biobehav. Rev. 11: 365-389.
BOGLE, R.G. et al. Indduction of N
G
Monomethyl-L-arginine (L-NNMA) uptake
by human endothelial cells and activated murine macrophages: a possible
mechanism for differential inhibition of nitric oxide biosynthesis. Am. J.
Physiol., v. 269, p. C750-C752, 1995.
BOGLE, R.G.; BAYDOUN, A. R. et al. L-Arginine transport is incresed in
macrophages generating nitric oxide. Biochem. J., v. 284, p.15-18, 1992.
BONELLO, N.; MCKIE, K. et al. Inhibition of nitric oxide effects on
interleukin-1 beta-enhanced ovulation rate, steroid hormone and ovarian
leukocyte distribution at ovulation in rat. Biol. Reprod., v. 54, p. 436-445, 1996.
BREDT, D.; SNYDER, S. H.Isolation of nitric oxide synthase, a calmodulin-
requireing enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci., v. 8, p. 682-685, 1990.
BREDT, D.; SNYDER, S. H. Nitric oxide: a physiology messenger molecule.
Annu. Ver. Biochem., v. 63, p. 175-195, 1994.
BREDT, D.S.; FERRIS, C. D. et al. Nitric oxide synthase regulatory sites.
Phosphorylation by cyclic AMP-dependent protein kinase, protein kinase C and
calcium/calmodulin protein kinase, identification of flavin and calmodulin
binding sites. J. Biol. Chem., v. 267, p. 10976-10981, 1992.
BRUSCHINI, H., SCHMIDT, RA., TANAGHO, EA. 1977. Studies on
neurophysiology of vas deferens. Invest. Urol. 15: 112-116.
BUHIMISCHI, I.; ALI, M. et al. Differential regulation of nitric oxide in rat
uterus and cervix during pregnancy and labor. Hum. Reprod., v. 11, p. 1755-
1766, 1996.
BURNETT, A. L.; LOWENSTEIN, C. J. et al. Nitric oxide: a physiological
mediator of penile erection. Science, v. 257, p. 410-413, 1992.
BURNETT, A. L.; NELSON, R. J. et al. Nitric oxide-dependent penile erection
in mice lacking nitric oxide synthase. Mol. Med., v. 2, p. 288-290, 1996.
91
BURNETT, A. L.; RICKER, D. D. et al. Localization of nitric oxide synthase in
the reproductive organs of male rat. Biol. Reprod., v. 52, p. 1-7, 1995.
BURNETT, A. L.; TILLMAN, S. I. et al. Immunohistochemical localization of
nitric oxide synthase in anatomic innervation of the human penis. J. Urol., v.150,
p. 73-76, 1993.
BUSCONI, L.; MICHEL, T. Endothelial nitric oxide synthase: N-terminal
myristoylation determines subcellular localization. J. Biol. Chem, v. 268, p.
8410-8413, 1993.
CARRIER, S.; NAGARAJU, P. et al. Age decrease nitric oxide synthase-
containing nerve fibres in the rat. J. Urol., v. 157, p. 1088-1092, 1997.
CHAMPION, H.C.; WANG, R. et al. Adrenomedullin induces penile erection in
the cat. Eur. J. Pharmacol., v. 319, p.71-75, 1997.
CHANG, J. Y.; HUANG, C. L. et al. Nitric oxide as a mediator of cocaine-
induced penile erection in rat. Br. J. Pharmacol., v. 118, p. 155-161, 1996.
CHARLES, I.G.; PALMER, R. M. J. et al. Cloning, characterization and
expression of a cDNA encoding na inducible nitric oxide synthase from the
human chondrocyte. Proc. Natl. Acad. Sci., v. 90, p. 11419-11423, 1993.
CHATTERJEE, S.; GANDULA, P. R. et al. Immunocytochemical localization of
nitric oxide-II in reproductive organs of female rats during the oestrous cycle.
Histochem., v. 28, p. 715-723, 1996.
CHO, H. J.; XIE, Q. et al. Calmodulin is a subunit of nitric oxide synthase from
macrophages. J. Exp. Med., v. 176, p. 599-604, 1992.
COOK, J. P.; TSAO, P. S. Cytoprotective effects of nitric oxide. Cieculation, v.
88, p. 2451-2454, 1993.
CORBETT, J. A. et al. Aminoguanidine a novel inhibitor of nitric oxide
formation prevents diabetic vascular disfunction. Diabetes, v. 41, p. 552-556,
1992.
DAMASMA, G.; PFAUS, J. G. et al. Sexual behavior increases dopamine
transmission in the nucleus accumbence and striatum of male rats: comparison
with novelty and locomotion. Behav. Neurosci., v. 106, p. 181-191, 1992.
DAVIDOFF, M. S.; MIDDENDORFF, R. et al. Nitric oxide synthase (NOS-
92
1) in Leydig cells of human testis. Arch. Histol. Cytol., v. 58, p.17-30, 1995.
DAVIES, M. G.; FULTON, G. J. et al. Clinical biology of nitric oxide. Br. J.
Surg., v. 82, p. 1598-1610, 1995.
DE GROAT, W. C.; BOOTH, A. M. Physiology of male sexual function. Ann.
Intern. Med., v. 92, p. 329-340, 1980.
DEL PUNTA, K.; CHARREAU, E. H. et al. Nitric oxide inhibits Leydig cell
steroidogenesis. 137: 5337-5343, 1996.
DIKET, AL., PIERCE, MR., MUNSHI, UK., VOELKER, CA., SANDRA
ELOBY-CHILDRESS, BS., GREENBERG, SS. 1994. Nitric oxide inhibition
causes intrauterine growth retardation and hind-limb disruptions in rats. Am. J.
Obstet. Gynecol. 171: 1243-1250.
DINERMAN, J. L.; LOWENSTEIN, L. J. et al. Molecular mechanisms of nitric
oxide regulation: potential relevance to cardiovascular disease. Circ. Res., v. 73,
p. 217-222, 1993.
DONG, Y. L.; YALLAMPALLI, C. Interaction between nitric oxide and
prostaglandin E2 pathways in pregnant rat uteri. Am. J. Physiol., v. 270, p. E471-
E476, 1996.
EKERHOVD, E. BRAENNTROEM, M. et al. Evidenc for nitric oxide medieted
contractile activity in isolated strips of human Fallopian tube. Hum. Reprod., v.
12, p. 301-305, 1997.
EVERITT, BJ., CADOR, M., et al. Interactions between the amygdala and
ventral stiatum in stimulus-reward associations: studies using a second-order
schedule of sexual reinforcement. Neuroscience. 30: 63-75, 1989.
FARIA, MS., MUSCARÁ, MN.et al. Acute inhibition of nitric oxide synthesis
induces anxiolysis in the plus maze test. Eur. J. Pharmacol. 323: 37-43. 1997
FURCHGOTT, R.F. Introduction to EDRF research. J. Cardiovasc. Pharmacol.
v.22, [suppl 7], p. 51-2, 1993.
GABBAI, FB. Effects of nitric oxide synthase blockers on renal function.
Nephrol. Dial. Transplant. v.16, [Suppl 1], p.10-13, 2001.
GARBAN, H.; MARQUEZ, D. et al. Restoration of normal adult penile erection
response in aged rats by-long term treatment with androgens. Biol. Reprod.,
93
v. 53, 1365-1372, 1995.
GARBAN, H.; MARQUEZ, D. et al. Cloning of rat and human inducible penile
nitric oxide synthase: aplication for gene therapy of erectile dysfunction. Biol.
Reprod. , v. 56, p. 954-963, 1997.
GARTHWAITE, J.; CHARLES, S. L. et al. Endothelium-derived relaxing factor
release on activation of NMDA receptor suggests role as intracellular messenger
in the brain. Nature, v. 336, p. 385-388, 1988.
GELLER, D. A.; LOWENSTEIN, C. J. et al. Molecular clonig and expression of
inducible nitric oxide synthase from human hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci.,
v. 90, p. 3491-3495, 1993.
GODEC, CJ., BATES, H. 1984. Cholinergic receptors in corpora cavernosa.
Urology. 24: 31-33.
GRIFFITH, O. W.; STUEHR, D. J. Nitric oxide synthese properties and catalytic
mechanism. Annu. Ver. Physiol., v. 57, p. 707-736, 1995.
GROSH, D. A.; ABU-SOUD, H.M. et al. Domain of macrophage NO synthase
have divergent roles in forming and stabilizing the active dimeric enzyme.
Biochemistry, v. 35, p. 1444-1449, 1996.
HAMILTON, MO., PAPKA, RE., O’DONOGHUE, DL., VAIDYA, AM.,
WILLIAMS, SJ., POFF, CR., MCCNEILL, DL. 1995. Spinal projection neurons
to the laterodorsal pontine tegmental nucleus: relationship to preganglionic
neurons and nitric oxide synthase. J. Comp. Neurol. 355: 1-8.
HAYSHIDA, H.; OKAMURA, T. et al. Neurogenic nitric oxide mediates
relaxation of canine corpus cavernosum. J. Urol., v.155, p. 1122-1127, 1996.
HEINZEL, B.; JOHN, M. et al. Ca2+/calmodulin-dependent formation of
hydrogen peroxide by brain nitric oxide synthase. Biochem. J., v. 281, p. 627-
630, 1992.
HERRERO, MB., GOIN, JC., BOQUET, M., CANTEROS, MG., FRANCHI,
AM., MARTINEZ, SP., POLAK, JM., VIGGIANO, JM., GIMENO, MAF.
1997. The nitric oxide synthase of mouse spermatozoa. FEBS Letters. 411: 39-
42.
HIBBS, J. B.; TAINTOV, R. R. et al. Macrophage cytotoxicity: role for L-
94
arginine deaminase and imino nitrogen oxidation to nitrite. Science, v. 235, p.
473-476, 1987.
HOLMQUIST, F.; STIEF, C. G. et al. Effects of the nitric oxide synthase
inhibitor NG-nitro-L-arginine on erectile response to cavernous nerve stimulation
in rabbit. Acta Physiol. Scand., v. 143, p. 299-304, 1991.
HOLMQUIST, F.; STIEF, C.G. et al. Effect of the nitric oxide synthese inhibitor
NG-nitro-L-arginine on erectile response to cavernous nerve stimulation in
rabbit. Acta Physiol. Scand., v. 143, p. 299-304, 1991.
HUANG, P. L. et al. Hypertension in mice lacking the gene for the endothelial
nitric oxide synthase. Nature, v. 377, p. 239-242, 1995.
HULL, EM., DU, J., LORRAIN, DS., MATUSZEWICH, L. 1997. Testosterone,
preoptic dopamine, and copulation in male rats. Brain. Res. Bull. 44: 327-333.
HULL, EM., EATON, RC., MARKOWSKI, VP., MOSES, J., LUMELY, LA.,
LOUCKS, JA. 1992. Opposite influnce of medial preoptic D
1
and D
2
receptors on
genital reflexes: implications for copulation. Life. Sci. 51: 1705-1713.
HULL, EM., LUMLEY, LA., MATUSZEWICH, L., DOMINGUEZ, J.,
MOSES, J. LORRAIN, DS. 1994. The roles of nitric oxide in sexual function of
male rats. Neuropharmacology. 33: 1499-1504.
HUTSON, JM. 1985. A biphasic model for the hormonal control of testicular
descent. Lancet. 24: 419-421.
HUTSON, JM. 1992. Development of interdigitations between Leydig cells and
macrophages. Cell. Tiss. Res.267: 385-389.
IGNARRO, L. J.; BUGA, G. M. et al. Endothelium-derived relating factor
produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proc. Natl. Acad. Sci.,
v. 84, p. 9265-9269, 1987.
IGNARRO, L. J.; BUSH, P. A. et al. Nitric oxide and cyclic GPM formation
upon electrical fiel stimulation cause relaxation of corpus cavernosum smooth
muscle. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 170, p. 843-850, 1990.
Ignarro, LJ. 1992. Nitric oxide as the physiological mediator of penile erection. J.
NIH Res. 4: 59-62.
JAFFREY, R. S.; SNYDER, S. H. PIN- an associated protein inhibitior of
95
neuronal oxide synthase. Science, v. 274, p. 774-777, 1996.
KEANEY, J.F.; SIMON, D. I. et al. NO forms an adduct with serum albumin that
has endothelium-derives relaxing factor like properties. J. Clin. Invest., v. 91, p.
1582-1589, 1993.
KELLY, R. A., BALLIGAND, J. L. et al. Nitric oxid and cardiac function. Circ.
Res., v. 79, p. 363-380, 1996.
KIM, N.; VARDI, Y. et al. Oxygen tension regulates the nitric oxide pathway.
Physiological role in penile erection. J. Clin. Invest., v. 91, p. 437-442, 1993.
KLATT, P.; SCHMIDT, K. et al. Structural analysis of porcine brain nitric oxide
synthase reveals a role for tetrahydrobiopterin and L-arginine in the formation of
sds-resistant dimer. EMBO J., v. 14, p. 3687-3695, 1995.
LANCASTER, J. R.; LANGREHR, J. M. et al. EPR detection of heme iron-
containing protein nitrosylation by nitric oxide during rejection of rat heart
allograft. J. Biol. Chem., v. 267, p. 10994-10998, 1992.
LARSSON, K., AHLENIUS, S. 1999. Brain and sexual behaviour. Ann. NY.
Acad. Sci. 877: 292-308.
LEVY, JB., HUSMANN, DA.1995. The hormonal control of testicular descent.
J. Androl. 16: 459-463.
LIM, HN., HUGHES, IA., HAWKINS, JR.2001. Clinical and molecular
evidence for the role of androges and WT1 in testis descent. Mol. Cel.
Endocrinol. 185: 43-50.
LUGG, J. A.; RAJFER, J. et al. Dihydrotestosterone is active androgen in the
maintenance of nitric oxide-mediated penile erection in the rat. Endocrinology, v.
136, p.1495-1501, 1995.
MAGGE, T.; FUENTES, A. M. et al. Cloning a novel neuronal nitric oxide
synthase expressed in penis and lower urinary tract. Biochem. Biophys. Res.
Commun., v. 226, p. 145-151, 1996.
MAGNESS, R. R.; ROSENFELD, C. R. et al. Endothelial vasodilator production
by uterine and systemic arteries. Effects of AngII on PGI2 and NO in pregnancy.
Am. J. Physiol., v. 270, p. H1914-H1923, 1996.
MANN, T., LUTWACK-MANN, C. 1981. Male reproductive function and
96
semen. In, Theures and Trends in Psychology, Structure and Investigative
Urology, T. Kaun (Ed), pp140-149, Springer, New York.
MATTSON, D. L. et al. Inducible nitric oxide synthase and blood pressure.
Hypertension, v. 31, p. 15-20, 1998.
MCALISTER, R.J. et al. Regulation of nitric oxide synthase by dimethyl-
arginine dimethylaminohydrolase. Br. J. Pharmacol., v. 119, p. 1533-1540, 1996.
MCALISTER, R.J.; VALLANCE, P. Endogenous inhibition of nitric oxide
synthase. How important are they? Exp. Neprol., v. 6, p. 195-199, 1998.
McConnell, J., Benson, GS., Wood, J. 1979. Autonomic innervationof the
mammalian penis: a histochemical and physiological study. J. Neurol. Transm.
45: 227-238.
MCDONALD, L. J.; MOSS, J. Stimulation by nitric oxide of an NDA linkage to
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Proc. Natl. Acad. Sci., v. 90, p.
6238-6241, 1993.
MEISEL, RL., O’HANLON, JK., SACHS, BD. 1994. The Physiology of male
sexual behaviour. In: Knobil, E., Neill, J. (Eds), the Physiology of Reproduction.
Raven Press, New York, pp.3-105.
MELIS, M. R. ; STANCAMPIANO, R. et al. Nitric oxide synthase inhibitors
prevent N-methyl-D-aspartic acid-induced penile erection and yawing in male
rat. Neuronsci. Lett., v. 179, p. 9-12, 1994 a.
MELIS, M. R.; STANCAMPIANO, R. et al. Prevention by NG-nitro-L-arginine
methyl ester of apomorphine and oxytocin-induced penile erection and yawning:
site of action in the brain. Pharmacol. Biochem. Behav., v. 48, p. 799-804,
1994b.
MELIS, M. R.; SUCCU, S. et al. Dopamine agonist increase nitric oxide
production in the paraventricular nucleus of the hypothalamus: correlation with
penile erection and yawing. Eur. J. Neurosci., v. 10, p. 2056-2063, 1996.
MICHEL, T.; LI, G. K. et al. Phospholylation and subcellular translocation of
endothelial nitric oxide synthase. Proc. Natl. Acad. Sci., v. 90, p. 6252-6256,
1993.
MICHELL, H. H.; SHONLE, J.S. et al. The origin of the nitrites in urine. J. Biol.
97
Chem., v. 24, p. 461-490, 1916.
MISKO, T. P. et al. Selective inhibition of inducible nitric oxide synthase by
aminoguanidine. Eur. J. Pharmacol., v. 233, p. 119-125, 1993.
MOHR, S.; STAMLER, J. S. et al. Post translational modification of
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase by S-nitrosylation and subsequent
NADH attachment. J. Biol. Chem., v. 271, p. 4209-4214, 1996.
MONCADA, S., PALMER, RM., HIGGS, EA. 1991. Nitric oxide: physiology,
pathophysiology and pharmacology. Pharmac . Rev. 43: 109-142.
MONCADA, S.; PALMER, R. M. J. et al. Nitric oxide physiology,
pathophysiology and pharmacology. Pharmacol. Ver., v. 43, p. 109-142., 1991.
MOORE, HDM., BEDFORD, JM. 1979. The differential absorptive activity of
epithelial cells of the rat epididymis before and after castration. Anat. Rec. 103:
313-315.
MOORE, P. K. et al. L-NG-nitroarginine (L-NOARG), a novel L-arginine
reservible inhibition of endothelium-dependent vasodilation in vitro. Br. J.
Pharmacol., v. 99, p. 408-412, 1990.
MORONDE, E.; MIDDENDORFF, R. et al.The effect of NO-donors and rat
pineal cells: stimulation of cGMP-independent inhibition of melatonin synthesis.
J. Neuroendocrinol, v.7, p. 202-214, 1995.
MORRIS, S. M.; BILLIAR, T. R. New insights into the regulation of inducible
nitric oxide synthesis. Am. J. Physiol., v. 266, p. E829- E839, 1994.
MULSCH, A.; MORDVINTCEV, P.I. et al. Formation and release of dinitrosyl
iron complexes by endothelial cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 196,
p. 1303-1308, 1993.
MURAD, F. Regulation of cytosolic guanylyl cyclase by nitric oxide: the NO-
cyclic GMP signal transduction system. Adv. Pharmacol., v. 26, p. 19-33, 1994.
MURRAD(1977)
NATHAN, A. K.; XIE, Q. W. Regulation of biosynthesis of nitric oxide. J. Biol.
Chem, v. 269, p.13275-13278, 1994.
NUSSLER, A. K.; BILLIAR, T. R. et al. Conduction of nitric oxide synthase and
arginosuccinate synthase in a murine macrophage cell line. Implications for
98
regulation of nitric oxide production. J. Biol. Chem., v. 269, p. 1257-1261, 1994.
NUSSLER, A. K.; BILLIAR, T. R. Inflammation, immunoregulation and
inducible nitric oxide synthase. J. Leukocyte Biol., v. 54, p. 171-178, 1993.
O’BRYAN, MK., SCHLATT, S., GERDPRASERT, O., PHILLIPS, DJ., DE
KRETSER, DM., HEDGER, MP. 2000. Inducible nitric oxide synthase in the rat
testis: evidence for potential roles in both normal function and inflammation-
mediated infertility. Biol. Reprod. 63: 1285-1293.
ORGEBIN-CHRIST, MC., JAHAD, N. 1978. The maturation of rabbit
epididymis spermatozoa in organ culture: inhibition by antiandrogens and
inhibitors of ribonucleic acid and protein synthesis. Endocrinology. 103: 46-49.
PALMER, R. M. J.; ASHTON, D. S. et al. Vascular endothelial cells synthesize
nitric oxide from L-arginina. Nature, v. 33, p. 664-668, 1988.
PALMER, R. M. J.; FERRIGE, A. G. et al. Nitric oxide release accounts for the
biological activity of endothelium-derived relaxation factor. Nature, v. 327, p.
524-526, 1987.
PENSON, D. F.; NG, C. et al. Androgen and pituitary control penile nitric oxide
synthase and erectile function in rat. Biol. Reprod., v.55, p.567-574, 1996.
PERSSON, K., ALM, P., UVELIUS, B., ANDERSSON, KE. 1998. Nitrergic
and cholinergic innervation of the rat lower urinary tract after pelvic
ganglionectamy. Am. J. Physiol. 274: R389-R397.
PINILLA, L., TENA-SEMPERE, M., GONZALEZ, D., ANGUILAR, E. 1999.
The role of nitric oxide in the control of basal and LHRH-stimulated LH
secretion. J. Endocrinol. Invest. 22: 340-348.
PINTO, A. R. Papel da óxido nítrico sintetase e cicloxigenase 1 e 2 no escape
vascular sistêmico em ratos normotensos. Tese de Mestrado. Dep. de Fisiologia e
Farmacologia, UFC, Brasil, 1999.
RAJFER, J., WALSH, PC. 1977. Hormonal regulation of testicular descent:
experimental and clinical observations. J. Urol. 118: 985-990.
RAO, MV., MATHUR, N. 1988. Estrogen-induced effects on mouse testis and
epididymal spermatozoa. Exp. Clin. Endocrinol. 92: 231-234.
RAO, MV., SHAH, KD. 1988. Endocrine approach to male fertilitycontrol
99
by steroid hormone combination in rat Rattus norvegicus L. Ind. J. Exp. Biol. 36:
775-779.
RATNASOORIYA, WD., DHARMASIRI, MG. 2001. L-arginine, the substrate
of nitric oxide synthase, inhibits fertility of male rats. Asian J. Androl. 3: 97-103.
REGAZZI, E.; CHINELLATO, A. et al. Characterization of in vitro relaxant
mechanism in erectile tissue from rabbits of different ages. Urol. Res., v. 24, p.
317-322, 1996.
RETTORI, V., BELOVA, N., DEES, WL., NYBERG, CL., GIMERO, M.,
MCCAUN, SM. 1993. Role of nitric oxide in the control of leutinizing hormone-
releasing hormone release in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 10130-
10134.
RIEMAN, R.K.; BUSCHER, C. et al. Increases expression of nitric oxide
synthase in the myometrium ofpregnant rat uterus. Am. J. Physiol., v. 272, p.
E1008-E1015, 1997.
ROSELLI, M., KELLER, PJ., DUBEY, RK. 1998. Role of nitric oxide in the
biology, physiology and pathophysiology of reproduction. Human Reproduction
Update. 4: 3-24.
ROSELLI, M.; KELLER, P.J. et al. Role of nitric oxide in the biology,
physiology and pathophysiology of reproduction. Human Reproduction Update,
v. 4, p. 3-24, 1998.
ROSELLI, M.; IMTHURN, B. et al. Circulating nitrite/nitrate increse with
follicular development: indirect evidence for estradiol medieted release.
Biochem. Biolphys. Res. Cmmun., v. 202, p. 1543-1552, 1994 a.
ROSELLI, M.; IMTHURN, B. et al. Endogenous nitric oxide modulates
endothelin-1 induced contraction in bovine oviduct. Biochem. Biophys.
Commun., v. 201, p. 143-148, 1994b.
SATO, Y., HORITA, H., KUROHATA, T., ADACHI, H., TSUKAMOTO, T.
1998. Effect of nitric oxide level in the medial preoptic area on male copulatory
behaviour in rats. Am. J. Physiol. 274: R243-R247.
SAX, H. C.; HASSELGREN, P. O. et al. Amino acid uptake in isolated liver:
effect of trauma and sepsis. J. Surg. Res., v. 45, p. 50-55, 1988.
100
SESSA, W. C. The nitric oxide synthase family of proteins. J. Vasc. Res., v.31,
p. 131-143, 1994.
SETTY, BS. 1979. Regulation of epididymal function and sperm maturation-
endocrine approachto fertility control in male. Endocrinology. 74: 100-117.
SHARPE, RM., MADDOCKS, S., KERR, JB. 1990. Cell-cell interactions in the
control of spermatogenesis as studied using Leydig cell destruction and
testosterone replacement. Am. J. Anat. 188: 3-20.
SHESELEY, E. G. et al. Eleveted blood pressure in mice lacking endothelial
nitric oxide synthase. Proc. Natl. Acad. Sci., v. 90, p. 13176-13181, 1996.
SIDDHANTA, U.; WU, C. et al. Heme iron reduction and catalysis by a nitric
oxide synthase heterodimer containing one reduction and two oxygenase
domains. J.Biol. Chem., v. 271, p.7309-7312, 1994.
SNYDER, S. H. Nitric oxide: NO endothelial NO. Nature, v. 377, p. 196-197,
1995.
SNYDER, S. H.; BREDT, D. (1989)
SOEZ, JM. 1994. Leydig cells: endocrine, paracrine and autocrine regulation.
Endocr. Rev. 15: 574-626.
SPENCER, JR., VAUGHAN EDJR., IMPERATO-MCGINLEY, J. 1993.
Studies of the hormonal control of postnatal testicular descent in the rat. J. Urol.
149: 618-623.
STIEF, C., BENARD, F., BOSCH, R., ABOSEIF, S., NUNES, L., LUE, TF.,
TANAGHO, EA. 1989. Acetylcholine as a possible neurotransmitter in penile
erection. J. Urol. 141: 1444-1448.
STIEF, C.G.; HOLMQUIST, F. et al. Preliminary results with the nitric oxide
donor linsidomine chlorhydrate in the treatment of human erectile dysfunction. J.
Urol., v. 148, p. 1437-1440, 1992.
STUEHR, D. J. et al. Inhibition of macrophage and andothelial cell nitric oxide
synthase by diphenykeneidonium and its analogs. FASEB J., v. 5, p. 98-103,
1991.
SU, Z.; BLAZING, M. A. et al. The calmodulin-nitric oxide synthase interaction:
critical role of calmodulin latch domain in enzyme activation. J.Biol. Chem.,
101
v. 270, p. 29117-29122, 1995.
TANNENBAUM, S. R., Moran
TANNENBAUM, S. R.; FETT, D. et al. Nitrite and nitrate are formed by
endogenoous synthesis in the human intestine. Science, v. 200, p.1487-1489,
1928.
TATSUMI, N., FIJISAWA, M., KANZAKI, M. et al. 1997. Nitric oxide
production by cultured rat Leydig cells. Endocrinology. 138: 994-998.
TELFER, J.; LYALL, F. et al. Identification of nitric oxide synthase in human
uterus. Hum. Reprod., v.10, p. 19-23, 1995.
TOMÉ, AR., DA SILVA, JCR., SOUZA, AAA., MATTOS, JPV., VALE, MR.,
RAO, VSN. 1999. Possible involvement of nitric oxide in pilocarpine induced
seminal emission in rats. Gen. Pharmacol. 33: 479-485.
TZENG, E.; BILLIAR, T. R. et al. Expression of human inducible nitric oxide
synthase in a tetrahydrobiopterin (H4B)-deficient cell line: H4B promotes
assembly of enzime subunits into an active dimer. Proc. Natl. Acad. Sci.,v.92,
p.11771-11775, 1995.
VALLANCE, P. et al. Accumulation of na endogenous inhibitor of nitric oxide
synthase in cronic renal failure. Lancet, v.339, p. 572-575, 1992.
VANHATALO, S.; KLINGE, E. et al. Nitric oxide-synthesizing neurons
originating at several different levels innervate rat penis. Neuroscience, v.75, p.
891-899, 1996.
VANHATALO, S.; SOINILA, S. Direct nitric oxide-containing innervation from
rat spinal cord to the penis. Neurosci. Lett., v. 199, p. 45-48, 1995.
VEILLE, J. C.; LI, P. et al. Effects of estrogen on nitric oxide biosynthesis and
vasorelaxant activity in sheep uterine and renal arteries in vitro. Am. J. Obstet.
Gynecol., v.174, p. 1043-1049, 1996.
VERNET, D.; CAI, L. et al. Reduction of penile nitric oxide synthase in diabetes
BB/WORdp (type I) and BBZ/WORdp (TypeII) rats with erectile dysfunction.
Endocrinology, v. 136, p. 5709-5717, 1995.
VIZZARD, MA., ERDMAN, SL., FORSTERMANN, U., DE GROAT, WC.
1994. Differential distribution of nitric oxide synthase in neural pathways to
102
the urogenital organs. Brain. Res. 646: 279-291.
WANG, Y., GOLIGORSKY, MS., LIN, M ET AL. 1997. A novel, testis specific
mRNA transcript encoding an NH2 terminal truncated nitric oxide synthase. J.
Biol. Chem. 272: 11392-11401.
WASSARMAN, PM. 1987. The biology and chemistry of fertilization. Science.
235: 553-560.
WEINER, C. P. ; LIZASOAIN, I. et al. Induction of calcium-dependent nitric
oxide synthases by Sex hormones. Proc. Natl. Acad. Sci., v. 19, p. 5212-5216,
1994.
WELCH, C.; WATSON, M. E. et al. Evidence to suggest nitric oxide is a
interstitial regulator of Leydig cell steroidogenesis. Metabolism, v. 44, p. 234-
238, 1995.
WIN, N. H. H. et al. A new and potent calmodulin antagonist, HF-2035, which
inhibits vascular relaxation induced by nitric oxide synthase. Eu. J. Pharmacol.,
v. 229, p. 119-126, 1996.
WOLFF, D. J.; LUBESKIE, A. Aminoguanidine is an isoform-selective,
mechanism-based inactivation of nitric oxide synthase. Arch. Biochem. Biophys.,
v. 316, p. 290-301, 1995.
XIA, Y.; DAWSON, T. M. et al. Nitric oxide synthase generates superoxide and
nitric oxide in arginine-depleted cells leading to peroxynitrite-mediated cellulr
injury. Proc. Natl. Acad. Sci., v. 93, p. 6770-6774, 1996.
YALLAMPALLI, C., GARFIELD, RE., BYAM-SHMITH, M. 1993. Nitric
oxide inhibits uterine contractility during pregnancy but not during delivery.
Endocrinology. 133: 1899-1902.
ZARRINDAST, MR., MAMANPUSH, SM., RASHIDY-POUR, A. 1994.
Morphine inhibits dopaminergic and cholinergic induced ejaculation in rats. Gen.
Parmacol. 25: 803-808.
ZINI, A., O’BRYAN, MK., MAGID, MS., SCHLEGEL, PN. 1996.
Immunohistochemical localization of endothelial nitric oxide synthase in human
testis, epididymis and vas deferens suggests a possible role for nitric oxide in
spermatogenesis, sperm maturation, and programmed cell death. Biol.
103
Reprod. 55: 935-941.
ZVARA, P.; SIOUFI, R. et al Nitric oxide mediated penile erection is a
testosterone dependent event: a rat erection model. Int. J. Impotence Res., v. 7, p.
209-219, 1995.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
