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FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
Estudo do potencial antiinflamatório do óleo-resina da
Copaifera langsdorffii
Desf. (COPAÍBA) e de seu
constituinte diterpênico Ácido Kaurenóico nos modelos
experimentais de inflamação intestinal
LAURA ANDRÉA FARIAS PAIVA
FORTALEZA-CEARÁ
2004
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II
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
Estudo do potencial antiinflamatório do óleo-resina da
Copaifera langsdorffii
Desf. (COPAÍBA) e de seu
constituinte diterpênico Ácido Kaurenóico nos modelos
experimentais de inflamação intestinal
LAURA ANDRÉA FARIAS PAIVA
Tese apresentada ao Departamento de Fisiologia e
Farmacologia da Faculdade de Medicina, Universidade Federal
do Ceará, como pré–requisito para obtenção do título de
Doutor em Farmacologia
Orientador: Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao
FORTALEZA-CEARÁ
2004
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III
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
Esta tese foi submetida como parte dos requisitos necessários à
obtenção do grau de Doutor em Farmacologia, outorgado pela
Universidade Federal do Ceará, e encontra-se à disposição dos
interessados na Biblioteca Setorial da referida Universidade.
A citação de qualquer trecho desta tese é permitida, desde que seja
feita de acordo com as normas da ética científica.
______________________
Laura Andréa Farias Paiva
Data da Defesa: 26-11-2004
Banca Examinadora:
____________________________
Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao
____________________________
Prof. Dr. Aldo Ângelo Moreira Lima
____________________________
Profa. Dr. Nylane Maria Nunes de Alencar
____________________________
Profa. Dra. Fernanda Regina de Castro Almeida
________________________
Profa. Dra. Salete Maria da Rocha Sipriano Brito
IV
SAGA DA AMAZÔNIA
Era uma vez na Amazônia a mais bonita floresta
mata verde, céu azul, a mais imensa floresta
no fundo d`água as Iaras, caboclo lendas e mágoas
e os rios puxando as águas...
...aqui termina essa história para gente de valor
pra gente que tem memória, muita crença, muito amor
pra defender o que ainda resta, sem rodeio, sem aresta
era uma vez uma floresta na Linha do Equador...
Vital Farias
V
A Deus, que dá sentido a tudo.
Ao Professor Vietla Satyanarayana Rao, que na convivência de
todos estes anos soube tudo sobre mim e mesmo assim
continuou meu amigo.
Aos meus pais José Bonifácio de Paiva (
in memoriam
) e Maria
do Socorro Farias Piava, aos quais devo tudo que sou.
Aos meus irmãos Joana, Boni e Francisco e sobrinhos, fontes
de amor, apoio e compreensão.
Ao Maurício que muitas vezes me tirou dessa jornada e me
ensinou a viver o agora.
AGRADECIMENTOS
VI
Ao professor Dr. Vietla Satyanarayana Rao, meu
orientador, por seus ensinamentos, dedicação, competência
científica, paciência e apoio em todos os momentos.
Ao professor Edilberto Silveira, do Departamento de
Química Orgânica e Inorgânica desta Universidade, pelo
fornecimento do material, objeto de estudo deste trabalho, o
óleo-resina da
Copaifera langsdorffii
e do Ácido Kaurenóico.
A amiga Adriana da Rocha Tomé, pela colaboração nos
trabalhos de análise histológica.
As amigas Adriana Rolim, Luilma e Regilane pela
companhia e ajudas nas intermináveis doasagens de “malon,
mielo e catalase” e pela amizade e força em todos os
momentos.
As amigas Arlândia e Flávia pela colaboração neste trabalho.
Aos bolsistas de iniciação científica e amigos, pois afinal
“a culpa sempre é do bolsista”.
À todos os funcionários do Departamento de Fisiologia e
Farmacologia.
Ao CNPq pelo auxílio financeiro
VII
SUMÁRIO
Lista de tabelas............................................................................... X
Lista de figuras............................................................................... XI
Lista de quadros.............................................................................. XIV
RESUMO.......................................................................................... XV
ABSTRACT....................................................................................... XVI
1. INTRODUÇÃO 01
1.1. Caminhos da fitoterapia 02
1.2. A flora brasileira 06
1.3. Riqueza ameaçada 12
1.4. Gênero
Copaifera
e o óleo de copaíba 19
1.5. Histórico e aplicações do óleo de copaíba 26
1.6. Compostos detectados no gênero
Copaifera
38
1.7. Atividade farmacológica do gênero
Copaifera
42
1.8. Doenças Inflamatórias Intestinais (DII) 47
1.8.1. Doença de Crohn 48
1.8.2. Colite ulcerativa 49
1.8.3. Espécies reativas de oxigênio e as DIIS 51
1.8.4. Antioxidantes derivados de plantas 54
1.9. Isquemia 56
1.10. Permeabilidade intestinal 58
1.11. Cicatrização 59
2. OBJETIVOS 63
2.1. Objetivo geral 64
2.2. Objetivos específicos 64
3. MATERIAL 65
3.1. Animais 66
3.2. Drogas, reagentes e corantes 66
3.3. Equipamentos 68
3.4. Material botânico 68
VIII
4. MÉTODOS 70
4.1 Análise fitoquímica do óleo-resina da
Copaífera langsdorffii
Desf. 71
4.1.1. Estudo espectrométrico de RMN 71
4.1.2. Estudo cromatográfico 71
4.1.3. Estudo da fração volátil 71
4.1.4. Identificação do Ácido Kaurenóico 71
4.1.5. Isolamento do Ácido Kaurenóico 71
4.2. Colite ulcerativa induzida por ácido acético em ratos (MASCOLO
et al
., 1995)
72
4.3. Colite ulcerativa induzida por TNB (ácido trinitrobenzeno sulfônico)
em ratos MORRIS
et al.,
1989
74
4.4. Injúria intestinal induzido por iskemia-reperfusão em ratos.
( KIMURA
et al
., 1998)
75
4.5. Inflamação intestinal induzido por indometacina em ratos. (RUH
et
al
., 1998)
76
4.6. Aumento na permeabilidade induzido por indometacina (LANGE &
DELBRO, 1995)
77
4.7. Atividade cicatrizante 78
4.7.1. Ferida aberta (MORTON & MALON, 1972) 78
4.7.2. Ferida por incisão (UDUPA
et al.,
1994) 79
4.8. Ensaio para atividade da enzima Mieloperoxidase (MPO)
KRAWISZ
et al.,
1984
80
4.9. Ensaio para dosagem de Malonaldeido (MDA) (UCHIYAMA &
MIARA, 1978)
82
4.10. Dosagem do nitrito (CHEN
et al
., 2000) 83
4.11. Dosagem de catalase (BEERS & SIZER, 1952) 84
4.12. Determinação dos grupos sulfidrílicos não protéicos SH-NP
(Glutationa) (BOYD
et al
., 1979)
85
4.13. Avaliação histopatológica 86
4.14. Análises estatísticas 87
5. RESULTADOS 88
5.1. Análise fitoquímica do óleo-resina da
Copaífera langsdorffii
Desf. 89
IX
5.2. Colite ulcerativa induzida por ácido acético em ratos 94
5.3. Colite ulcerativa induzida por TNB (ácido trinitrobenzeno
sulfônico) em ratos
106
5.4. Injúria intestinal induzido por isquemia-reperfusão em ratos. 112
5.5. Toxicidade intestinal induzida por indometacina em ratos. 119
5.6. Permeabilidade intestinal com azul de Evans em camundongos 124
5.7. Atividade cicatrizante 126
5.7.1. Ferida aberta 126
5.7.2. Ferida por incisão 126
6. DISCUSSÃO 130
7. CONCLUSÃO 145
8. BIBLIOGRAFIA 147
9. PUBLICAÇÕES 184
X
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Espécies que já sofreram biopirataria 14
Tabela 2 – Indicações etnofarmacológicas dos óleos de copaíba
encontradas na literatura
32
Tabela 3 – Efeito do óleo resina da
Copaifera langsdoffii
e ácido
kaurenóico na avaliação induzida por ácido acético em ratos
95
Tabela 4 – Efeito do óleo resina da
Copaifera langsdoffii
na avaliação de
escore e peso úmido em modelo de colite ulcerativa induzida por TNB em
ratos
107
Tabela 5 – Efeito do óleo resina da
Copaifera langsdoffii
e ácido
kaurenóico na avaliação da permeabilidade intestinal no modelo de azul
de Evans em camundongos
125
XI
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Ilustração medieval mostrando o manjericão, que tinha efeito
principal de purificar o sangue conforme afirma o Tacuinum Sanitatis, de
Viena
04
Figura 2 – Página de título da História Naturalis Brasiliae de Willem Piso
e MacGrave (Amsterdam, 1648), obra que, precedida pela História
Plantarum Novae Hispaniae de Francisco Hernandez constitui-se em
valiosa informação sobre história natural, medicina, observações
meteorológicas, usos e costumes do novo continente
07
Figura 3 – Mostra o mapeamento das regiões onde espécies do gênero
Copaifera
foram encontradas
21
Figura 4 – Cromatograma típico de óleos de copaiba 39
Figura 5 – Numeração e estereoquímica normal dos esqueletos
diterpênicos: caurano, clerodano e labdano. Sistema decalìnico
representado pelos anéis A e B
42
Figura 6 – Foto da
Copaifera langsdorffii
Desf. (Leguminosae) 69
Figura 7 – Efeito da administração retal e oral do óleo-resina da
Copaíba sobre a atividade da mieloperoxidase, 24 horas após a indução
da colite com ácido acético em ratos
97
Figura 8 – Efeito da administração retal e oral do Ácido Kaurenóico
sobre a atividade da mieloperoxidase, 24 horas após a indução da colite
com ácido acético em ratos
98
Figura 9 – Efeito da administração retal e oral do óleo-resina da
Copaíba sobre a dosagem de malonaldeído, 24 horas após a indução da
colite com ácido acético em ratos
99
Figura 10 – Efeito da administração retal e oral do Ácido Kaurenóico
sobre a dosa
g
em de malonaldeído, 24 horas após a indu
ç
ão da colite com
ácido acético em ratos
100
Figura 11 – Efeito da administração retal e oral do óleo-resina da
Copaíba sobre a dosagem do nitrito, 24 horas após a indução da colite
com ácido acético em ratos
101
XII
Figura 12 – Efeito da administração retal e oral do óleo-resina da
Copaíba sobre a dosagem de catalase, 24 horas após a indução da colite
com ácido acético em ratos
102
Figura 13 – Efeito do óleo-resina da Copaíba na colite induzida por
ácido acético
103
Figura 14 – Efeito do Ácido Kaurenóico na colite induzida por ácido
acético
104
Figura 15 – Foto mostrando a lesão causada no cólon no modelo de
colite induzida por ácido acético
105
Figura 16 – Efeito da administração retal e oral do óleo-resina da
Copaíba sobre a atividade da mieloperoxidase, 2, 24 e 48 horas após a
indução da colite com TNB em ratos
108
Figura 17 – Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba
sobre a dosagem de malonaldeído, 2, 24 e 48 horas após a indução da
colite com TNB em ratos
109
Figura 18 – Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba
sobre a dosagem de catalase, 2, 24 e 48 horas após a indução da colite
com TNB em ratos
110
Figura 19 – Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba, 2,
24 e 48 horas após a indução da colite com TNB em ratos
111
Figura 20 – Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba
sobre a atividade da mieloperoxidase, 24, 12 e 2 horas antes da indução
da iskemia-reperfusão em intestino de ratos
113
Figura 21 – Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba
sobre a dosagem de malonaldeído, 24, 12 e 2 horas antes da indução da
iskemia-reperfusão em intestino de ratos
114
Figura 22 – Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba
sobre a dosagem do nitrito, 24, 12 e 2 horas antes da indução da
iskemia-reperfusão em intestino de ratos
115
XIII
Figura 23 – Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba
sobre a dosagem de catalase, 24, 12 e 2 horas antes da indução da
iskemia-reperfusão em intestino de ratos
116
Figura 24 – Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba
sobre a diminuição de grupos sulfidrílicos não-protéicos (SH-NP) na
iskemia-reperfusão em intestino de ratos
117
Figura 25 – Efeito da administração oral o óleo-resina da Copaíba
iskemia-reperfusão em intestino de ratos
118
Figura 26 – Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba
sobre a atividade da mieloperoxidase, 12 e 2 horas antes da indução da
toxicidade intestinal com indometacina em ratos
120
Figura 27 – Efeito da administração oral do Ácido Kaurenóico sobre a
atividade da mieloperoxidase, 12 e 2 horas antes da indução da
toxicidade intestinal com indometacina em ratos
121
Figura 28 – Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba
sobre a dosagem do nitrito, 12 e 2 horas antes da indução da toxicidade
intestinal com indometacina em intestinos ratos
122
Figura 29 – Efeito da administração oral do Ácido Kaurenóico sobre a
dosa
g
em do nitrito, 12 e 2 horas antes da indu
ç
ão da toxicidade intestinal
com indometacina em intestinos ratos
123
Figura 30 – Efeito do óleo-resina da
Copaifera langsdoffii
(ORCL) na
contração da pele no modelo de ferida aberta
127
Figura 31 – Efeito do óleo-resina da
Copaifera langsdoffii
(ORCL) na
contração da pele no modelo de ferida aberta
128
Figura 31 – Foto de animais que foram submetidos ao modelo de ferida
aberta por incisão
129
XIV
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 – Estrutura química de constituintes isolados do óleo-resina da
Copaifera langsdorffii
92
Quadro 2 – Constituintes químicos identificados no óleo essencial do
óleo-resina da
Copaifera langsdorffii
93
XV
RESUMO
ESTUDO DO POTENCIAL ANTIINFLAMATÓRIO DO ÓLEO-RESINA DA
Copaifera
langsdorffii
DESF. (COPAÍBA) E DE SEU CONSTITUINTE DITERPÊNICO ÁCIDO
KAURENÓICO NOS MODELOS EXPERIMENTAIS DE INFLAMAÇÃO INTESTINAL.
Laura
Andréa Farias Paiva, esta tese foi submetida como requisito necessário á obtenção do grau de Doutor no
Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza,
Ceará, Brasil. Orientador: Vietla Satyanarayana Rao.
O óleo-resina da Copaifera langsdorffii (Leguminaceae) é utilizado popularmente no
tratamento de processos inflamatórios e na cicatrização de feridas e úlceras. Estudos
prévios estabeleceram as propriedades gastroprotetora e antiinflamatória em modelos
animais. O presente estudo avaliou o potencial antiinflamatório do óleo-resina da Copaifera
langsdorffii (ORCL) e de seu constituinte diterpênico, ácido kaurenóico (AK) nos modelos
experimentais de colite induzida por ácido acético (UC-AA), por ácido trinitrobenzênico
sulfônico (UC-TNBS), e ainda, indometacina e isquemia-reperfusão induzindo inflamação
intestinal (II-IND e II-I/R). E também, o potencial de cicatrização de feridas foi avaliado
em ratos com feridas abertas e com incisão. Ratos foram pré-tratados via oral (15 e 2
horas antes) ou retal 2 horas após a indução da colite, com ORCL (200 e 400mg/Kg), AK
(50 e 100mg/Kg) ou veículo (1mL, 2% Tween 80 ou 1mL, 2% DMSO). A colite foi induzida
pela aplicação de 2mL de ácido acético 4% (v/v) ou TNBS (0,25 mL com 20mg) e 24 ou 72
horas depois, os danos na mucosa do cólon foram avaliados, medidos os níveis de
mieloperoxidase e malonaldeído. No modelo de (CU-AA), houve uma importante redução
no escore da lesão e peso úmido nos animais tratados com as substâncias teste, quando
comparado ao controle veículo. Os efeitos foram confirmados na bioquímica pela
significante redução da atividade da mieloperoxidase (MDA), o marcador da infiltração de
neutrófilos e pela marcada diminuição nos níveis de malonaldeído, um indicador da
lipoperoxidação. Além de o ácido acético aumentar os níveis de nitrito e da enzima catalase
no cólon, onde o tratamento com ORCL diminuiu significativamente. A análise microscópica
revelou uma diminuição da infiltração de células inflamatórias e do edema da submucosa,
nos segmentos do cólon tratados com ORCL ou AK. De maneira similar, no modelo de UC-
TNBS, houve uma redução do escore da lesão e peso úmido do cólon de animais pré-
tratados com ORCL (400mg/Kg, v.o. ou retal) 2, 24 e 48 horas após a injeção intracolônica
de TNBS. A atividade da MPO, mas não MDA e catalase foram significativamente afetados
pelo pré-tratamento com ORCL. As observações histológicas indicam uma proteção parcial
do ORCL, como UC-TNBS é um modelo crônico, talvez houvesse necessidade de uma
terapia mais prolongada. No modelo de II-I/R, quarenta e cinco minutos de isquemia
seguida de uma hora de reperfusão da artéria mesentérica superior causou significante
aumento nos níveis de MPO, catalase, MDA e nitrito, com uma significante diminuição dos
grupos sulfidrílicos não-protéicos (NP-SH/GSH) indicando um estresse oxidativo. Estes
valores foram sigificamente revertido pelo pré-tratamento via oral com ORCL (200 e
400mg/Kg), sugerindo que ORCL anula o estresse oxidativo. Animais pré-tratados com
ORCL (200 e 400mg/Kg, v.o.) ou AK (100mg/Kg, v.o.), 12 e 2 horas antes da
administração de 20mg/Kg de indometacina causando toxicidade intestinal, foi capaz de
ser evidenciado pela diminuição nos níveis de MPO e nitrito. Diferente da indometacina,
ORCL mas não AK falharam em induzir o aumento signifativo na permeabilidade intestinal.
Este efeito do ORCL foi similar ao inibidor seletivo de COX-2, rofecoxibe. Estas observações
sugerem que ORCL é isento de toxicidade intestinal diferente da toxicidade intestinal dos
inibidores clássicos não seletivos da COX. Além disso, ORCL promove cicatrização de
feridas aberta ou com incisão em ratos evidenciada pela contração e tensão da pele. Os
dados indicam um potencial antiinflamatório do óleo-resina da copaíba e do seu diterpeno
ácido kaurenóico, possivelmente mediado pelos mecanismos antioxidantes e anti-
lipoperoxidativo.
XVI
ABSTRACT
STUDIES ON THE ANTI-INFLAMMATORY POTENTIAL OF COPAIBA OIL-RESIN FROM
COPAIFERA LANGSDORFFII
AND
ITS DITERPENE CONSTITUENT KAURENOIC ACID IN
EXPERIMENTAL MODELS OF INTESTINAL INFLAMMATION.
Laura Andréa Farias Paiva, thesis
submitted in partial fulfillment for the award of Degree in Doctor of Philosophy in Pharmacology, Post Graduate
Department of Physiology and Pharmacology, Faculty of Medicine, Federal University of Ceará, Fortaleza, CE,
Brazil. Advisor: Vietla Satyanarayana Rao.
Copaiba oil-resin from
Copaifera langsdorffii
(Leguminaceae) is a reputed traditional
remedy for the treatment of inflammatory conditions and to promote healing of ulcers and
wounds. Previous studies established its anti-inflammatory and gastroprotective properties
through animal experimentation. The present study extended these earlier studies to
analyse the intestinal anti-inflammatory potential of oil-resin
Copaifera langsdorffii
(ORCL)
and its diterpene constituent, kaurenoic acid (KA) in rat models of ulcerative colitis induced
by acetic acid (AA-UC), and trinitribenzene sulfonic acid (TNBS-UC), and in indomethacin -
and ischemia-reperfusion-induced intestinal inflammation (IND-II and I/R-II). Further, its
wound healing potential was evaluated in rats on open and incision wounds. Rats were
pretreated orally (15 hrs and 2 hrs before) or rectally 2 hrs before the induction of colitis
with ORCL (200 and 400 mg/kg), KA (50 and 100 mg/kg) or vehicle (1 ml, 2% Tween 80
or 1 ml, 2% DMSO). Colitis was induced by intracolonic instillation of a 2 ml of 4% (v/v)
acetic acid solution or TNBS (0.25 ml of 20 mg) and 24 hrs or 72 hrs latter, the colonic
mucosa was analysed for the severity of macroscopic colonic damage, the myeloperoxidase
and the malondialdehyde levels. In AA-UC model, a marked reduction in Gross damage
score and in wet weight/length ratio of colonic tissue were evident in animals pretreated
orally or rectally with test substances, as compared to vehicle alone-treated controls. This
effect was confirmed biochemically by a significant reduction in colonic myeloperoxidase
(MPO) activity, the marker of neutrophilic infiltration and by a marked decrease in
malondialdehyde (MDA) level, an indicator of lipoperoxidation. Besides, AA elevated
increase in the levels of nitrite and catalase activity in colon tissue was also significantly
decreased by ORCL treatment. Furthermore, microscopical examination revealed the
diminution of inflammatory cell infiltration, and the submucosal edema in colon segments
of rats pretreated with ORCL or KA. In a similar manner, in TNBS-UC, a marked reduction
in Gross damage score and in wet weight/length ratio of colonic tissue was evident by
ORCL pretreatment (400 mg/kg, p.o. or intra-rectal) at 2, 24 and 48 hrs after intracolonic
injection of TNBS. MPO activity but not the MDA and catalase levels were significantly
affected by ORCL treatment. Histological observations also indicated only a partial
protection by ORCL, suggesting that TNBS-UC being a chronic model, a more prolonged
therapy may be needed. In the model of I/R-II, five forty minute of ischemia followed by
one hour reperfusion of superior mesenteric artery caused significant elevations of MPO,
catalase, MDA and nitrite levels with a significant decrease in non-protein sulfhydryls (NP-
SH/ GSH) indicating an oxidative stress. These changes were significantly reversed by oral
pretreatment with ORCL (200 and 400 mg/kg), suggesting that ORCL obliterates oxidative
stress. Pretreatment of animals with ORCL (200 and 400 mg/kg, p.o.) or KA (100 mg/kg,
p.o.), 12 and 2 hrs before the administration of 20 mg/kg indomethacin mitigated the
intestinal toxicity as evidenced by decreases in tissue levels of MPO and nitrite. Unlike
indomethacin, ORCL but not KA at either dose failed to induce a significant increase in
intestinal permeability. This effect of ORCL simulated that of a selective COX-2 inhibitor,
rofecoxib. These observations suggest that ORCL is devoid of intestinal toxicity unlike the
classical non-selective COX inhibitors. Also, ORCL promoted wound healing in rats on
experimental open or incision wounds as evidenced by an early wound contraction and
increased wound tensile strength. The data indicate a significant anti-inflammatory
potential of copaiba oil-resin and its diterpenoid, kaurenoic acid possibly mediated through
an antioxidant/anti-lipoperoxidative mechanism(s).
1. INTRODUÇÃO
2
1. INTRODUÇÃO
1.1. Caminhos da Fitoterapia
As origens da Fitoterapia, assim como da Medicina, recuam até a mais
remota Antiguidade. Relatos e tradições imemoriais – dos egípcios aos chineses ou
dos gregos aos fenícios – já fazem menção às propriedades curativas das plantas,
um poder que, ao longo dos séculos, independentemente do maior ou menor grau
de civilização atingido por esses povos, esteve sempre associado ao sobrenatural
e ao sagrado. A cura pelas plantas, na origem, repousa na crença de que a
natureza é um grande reservatório de qualidades mágicas ou milagrosas, à espera
de serem descobertas e utilizadas pelos homens; e essa crença reflete a convicção
de que a capacidade de curar é um dom concedido pelos deuses a alguns mortais
(NATURA, 2002).
O fato é que, para as civilizações da Antiguidade, a doença era concebida
como castigo divino e, portanto, devia ser tratada por sacerdotes – guardiões dos
segredos da cura, elos de ligação entre a divindade e os mortais. Mas,
impregnados ou não de aura sobrenatural, existem muitos registros do uso de
medicamentos fitoterápicos pelos antigos. A natureza não só fornecia alimento,
mas era o “laboratório” no qual podiam ser encontradas as substâncias para todos
os fins. Ainda que conhecessem muito superficialmente as características e
propriedade das plantas, nossos antepassados as usavam em larga escala, com
base na experiência empírica, observando, talvez, o uso que os animais
instintivamente faziam delas.
Os egípcios estão entre os povos que mais colaboraram para sistematizar
informações sobre práticas de cura a partir de plantas e resinas, sempre com
grande apelo às suas implicações religiosas. Acreditavam que cada órgão do corpo
era protegido por um deus e, assim, ao primeiro sinal de distúrbio, eram feitas
oferendas à divindade correspondente. E igualmente se notabilizaram no preparo
3
de medicamentos – como ficou registrado no Papiro de Ébers (cerca de 1.500
a.C.) – indicado para diversos males, sempre associados a rituais religiosos.
Entre os egípcios, já há registros não só do uso analgésico do ópio, como
também da utilização de fungos com propriedades antibióticas. Além disso, por
acreditarem na continuidade da vida em outras dimensões, também
desenvolveram muitas substâncias e técnicas especiais para conservação de
cadáveres. Admite-se que a antiga tradição egípcia na manipulação desses
produtos teria dado origem à própria palavra “química”, derivada de “kemi”, nome
pelo qual o Egito era conhecido na Antiguidade, e que significa “terra vermelha”.
Outras civilizações, como a indiana e a chinesa, a grega e a romana,
também deixaram extensas obras sobre o uso de plantas medicinais, de que é
exemplo o livro indiano Sushruta-Samhita, com um inventário de 700 espécies. Já
os chineses são responsáveis pela introdução do conceito de saúde como
equilíbrio entre corpo e mente.
Na bíblia, já adentrando a cultura que nos é familiar, há várias citações de
medicamentos de origem vegetal: a mandrágora, os bálsamos, as gomas e
algumas essências. Da mesma forma, o Talmud – compilação das interpretações e
comentários da lei oral judaica – descreve grande número de substâncias
vegetais.
Mas é só com Hipócrates (460-370 a.C.) que vem a ser formulada, pela
primeira vez, uma teoria que atribui causas naturais às doenças, por oposição às
concepções divinas ou sobrenaturais. “Nenhuma doença é mais humana ou mais
divina que as outras. Todas as doenças têm uma causa natural”, afirma ele em A
Doença Sagrada. Considerado o “pai” da medicina no Ocidente, Hipócrates
começou a liberar as práticas médicas de sua “aura” sagrada de origem, vindo a
influenciar várias escolas filosóficas e científicas, com seguidores do peso de um
Claudius Galenus (cerca de 130 a.C.).
4
FIGURA 1 – Ilustração medieval mostrando o manjericão, que tinha efeito
principal de purificar o sangue conforme afirma o Tacuinum Sanitatis, de Viena.
5
Com o fim do Império Romano, a medicina então praticada entrou em
decadência, fazendo renascer, sob a ótica do cristianismo, a concepção sagrada
do corpo, da saúde e da doença. Ao longo da Idade Média, os conhecimentos
científicos foram relegados a um plano inferior, chegando a ser considerados
práticas satânicas e feitiçaria, sujeitos aos santos tribunais da Inquisição. A
simples utilização de medicamentos contrapunha-se à fé cristã, de acordo com
uma lógica peculiar: se a doença, a peste e a dor provinham de Deus, caberia
então a Ele, e só a Ele, providenciar a cura. Por isso, os padres, recomendavam
aos fiéis que, em caso de doença, recorressem aos santos, já que a cada um era
atribuído a responsabilidade de encaminhar um tipo particular de cura.
Enquanto no Ocidente Medieval a Medina científica evoluía muito precária e
lentamente, no mundo árabe, tornado herdeiro do patrimônio médico das
civilizações antigas, essa e outras ciências conheceram um desenvolvimento
notável. Preservando a tradição clássica de judeus, gregos e romanos, os árabes
foram os responsáveis por avanços significativos nos campos da química e da
farmácia. Aos árabes é atribuída, por exemplo, a separação entre ciência médica e
ciência farmacêutica; foi em Bagdá que surgiu, no século VIII, aquela que foi
considerada a primeira farmácia da história. Muitas das inovações da técnica
farmacêutica, de aparelhos e métodos, foram introduzidas pelos árabes. Exemplo
célebre dessa contribuição são os tradicionais potes de farmácia, de faiança,
adotados em todo o mundo nos séculos seguintes.
O conhecimento árabe começou a ser difundido na Península Ibérica já a
partir do século IX, quando da invasão mulçumana, e teve grande impulso a partir
do século XV, principalmente através dos judeus, então considerados os maiores
detentores do saber médico árabe e greco-romano. Conhecedores das
propriedades curativas das plantas, bem como de experiências alquímicas, os
judeus também desempenharam importante papel no campo da medicina.
A profunda estagnação que o conhecimento médico havia experimentado
na Europa medieval só foi interrompida no Renascimento e no período das
6
grandes navegações. Além dos fatores internos, que levaram à redescoberta da
antiga sabedoria greco-latina, o contato com novas terras e culturas, no Mundo
Novo, na África e na Ásia, foi um convite ao experimentalismo e às descobertas
científicas.
Sem contar todo o impacto sócio-cultural, filosófico e econômico o Novo
Mundo apresentou ao europeu uma biodiversidade jamais imaginada até então e,
rapidamente, novas plantas, drogas e terapias foram-se somando ao arsenal
médico europeu. Estudiosos passaram a se dedicar ao potencial da exuberante
flora medicinal das terras descobertas, descrevendo suas características e
propriedades. É o caso de Garcia da Orta, médico e naturalista português, que
partiu para Índia em 1953, para se dedicar ao estudo das ervas da região –
experiência de anos, da qual resultou sua obra máxima,
Colóquios dos simples e
drogas e coisas medicinais da Índia
, verdadeira enciclopédia médico-botânica.
Graças a essa e outra iniciativas, similares, as planta rapidamente tiveram
grande aceitação na farmacologia européia, estimulando outros médicos e
naturalistas a estudá-las, cada vez em maior profundidade.
1.2. A Flora Brasileira
Durante o século XVI, o Brasil não chegou a ser alvo de estudos de nenhum
médico ou naturalista como Garcia da Orta, mas um bom trabalho de identificação
e descrição da exuberante natureza brasileira foi inicialmente realizado, com
critério, por jesuítas como Nóbrega e Anchieta. Observando a natureza e a forma
como os indígenas preparavam alimentos e remédios, os padres repassavam
informações à Metrópole e mesmo a outros colégios jesuíticos espalhados pelo
império português, colaborando para divulgar os segredos da flora brasileira.
Foram, assim, os primeiros responsáveis pela difusão dos conhecimentos da
farmacologia indígena pelo mundo.
7
FIGURA 2 – Página de título da Historia Naturalis Brasiliae de Willem Piso
e MacGrave (Amsterdam, 1648), obra que, precedida pela Historia Plantarum
Novae Hispaniae de Francisco Hernandez constitui-se em valiosa informação sobre
história natural, medicina, observações meteorológicas, usos e costumes do novo
continente.
8
Mas não era só o interesse meramente especulativo que levava os jesuítas
a estudar o poder curativo das plantas. Junto aos colégios, eles mantinham, entre
oficinas, forjas e demais instalações voltadas à subsistência, boticas bem
equipadas para atender aos enfermos – e essas boticas deram origem a muitos
hospitais, como a Santa Casa de Misericórdia do Rio de Janeiro.
Em matéria de medicamentos, a preferência era pelos consagrados
produtos europeus, boa parte dos quais, no entanto, sequer conseguia chegar
intacta à Colônia, deteriorando-se na difícil e longa viagem. A necessidade, então,
fez que grande parte do arsenal terapêutico das boticas dos jesuítas fosse sendo
formado a partir de plantas medicinais indígenas.
Assim, muitos conhecimentos do Velho e do Novo Mundo iriam se
amalgamar no Brasil-colônia, no que se refere ao uso de plantas medicinais e
práticas de cura. A técnica, por exemplo, desenvolvida pelos portugueses, de
utilizar a aguardente de cana para concentrar o poder curativo de certas ervas, foi
reconhecida e utilizada pelos indígenas. No sentido inverso, práticas adotadas por
pajés, como o uso do fogo e de brasas diretamente no corpo, para curar algumas
moléstias, acabaram sendo aceitas e aplicadas pelos europeus.
Caminhos e
Fronteiras
, do historiador Sérgio Buarque de Holanda, descreve esta e muitas
outras formas como a cultura paulista se desenvolveu, a partir do convívio entre o
elemento europeu e o índio.
Dessa mistura de culturas, hábitos e crenças, nasceu um tipo de medicina
particular no Brasil-colônia. Para além da área de influência dos colégios jesuítas,
os boticários e ervanários eram clandestinos, uma vez que apenas em 1960, por
determinação das Ordenações Filipinas, seriam autorizados a funcionar como
casas comerciais. Mas em face da escassez de cientistas e médicos, muitos dos
chamados “empíricos” (curandeiros, raizeiros, pajés, parteiras e barbeiros)
assumiam a missão de tratar doentes. Essas práticas foram objeto de análise dos
primeiros naturalistas, que se dedicaram ao estudo sistemático da flora brasileira,
9
como os holandeses Piso e MacGrave, que vieram ao Brasil com Maurício de
Nassau, entre 1648 e 1650.
Apesar da existência, desde o início, de estudos de caráter científico –
incipientes, é verdade -, a prática médica pouco avançou no Brasil até o início do
século XIX, quando a chegada da Corte portuguesa impôs várias transformações à
Colônia, a fim de criar uma infraestrutura econômica e cultural compatível com a
presença da Família real. Em 1808, dom João VI decretou a abertura dos portos
brasileiros às nações amigas de Portugal, pondo fim ao pacto colonial; instalou
ministérios, implantou Juntas de Comércio, Agricultura e Navegação; abriu a
Biblioteca e a Imprensa Régia, assim como várias escolas, além de promover o
intercâmbio com artistas e cientistas. Ainda em 1808, foram criados os estudos
médicos no Hospital Militar da Bahia, em Salvador, dando início ao ensino oficial
de Medicina, com ênfase em anatomia e cirurgia. No ano seguinte, foi fundada a
Faculdade de Medicina no Rio de Janeiro, composta por várias cadeiras como
Química, Matéria Médica e Farmácia.
Nessa época, destaca-se a figura de Freire Allemão, um dos poucos
estudiosos da flora brasileira egressos da Faculdade Médica do Rio de Janeiro.
Nascido na então capital do Império, Freire Allemão, filho de camponeses, logo
depois de se formar, em 1833, especializou-se em Paris e, de volta, passou a
lecionar botânica e zoologia na escola em que se formou. Tratou pessoalmente de
dom Pedro II, sendo então nomeado médico da Imperial Comarca e, mais tarde,
diretor do Museu Nacional. Dedicou parte de sua vida ao estudo das plantas,
especialmente no Ceará, onde colheu mais de 20 mil amostras.
O reduzido incentivo dado à pesquisa não representava, porém, que a
Corte portuguesa deixasse de se interessar pelo potencial da natureza brasileira.
Mas esses estudos seriam realizados principalmente por estrangeiros – médicos
botânicos e naturalistas vindo sobretudo da França, da Inglaterra e da Alemanha.
Cientistas como Martius, Spix, Saint Hilaire, Eschwege, Derby, Goeldi ou Peckolt, e
muitos outros, vieram ao Brasil em diferentes épocas e viajaram por todo o nosso
10
território. Alguns deles – é o caso de Martius – Dedicaram suas vidas a estudar
especificamente a flora brasileira e produziram considerável obra sobre suas
características, com entusiásticas análises das plantas de uso medicinal.
Enquanto estudiosos estrangeiros louvavam a diversidade e a enorme gama
de aplicações da rica flora do Brasil, na Europa, durante o século XIX,
desenvolviam-se paralelamente estudos farmacêuticos que buscavam a síntese
orgânica, a fim de contrariar a tese predominante, segundo a qual os compostos
orgânicos só podiam ser fabricados por organismos vivos. Em 1828, o alemão
Friedrich Wrohler conseguiu a síntese da uréia, a partir de uma substância
inorgânica, o cianato de amônio. A partir daí, diversas outras descobertas
científicas começavam a mudar o perfil da industria farmacêutica, que se
sofisticaria cada vez mais, juntamente com a indústria química, transformando
completamente o perfil da prática médica.
No Brasil a transição para a era dos medicamentos industrializados foi
lenta, especialmente nas áreas menos urbanizadas do país. Nas grandes cidades,
em particular no Rio de Janeiro, a industrialização da atividade farmacêutica era
mais visível. Entre a segunda metade do século XIX e início do século XX, muitas
das tradicionais boticas e farmácias transformaram-se em pequenos e médios
laboratórios, onde conviviam as tradicionais práticas de manipulação com a
produção em larga escala de tônicos, ungüentos, xaropes e produtos de
“toucador”, cujas propriedades eram divulgadas, em singulares campanhas, em
revistas e jornais, mas principalmente através dos famosos
almanacks
de
farmácia. Muitas das fórmulas utilizadas na produção desses remédios guardavam
ainda princípios fitoterápicos ou de origem animal, mas alguns deles já eram
resultado da introdução de elementos sintéticos.
Foi nessa altura - final da Primeira Grande Guerra (1914-1918) - que o
mundo enfrentou mais uma difícil luta contra um inimigo poderoso: a gripe
espanhola. Considerada a primeira pandemia do mundo moderno, a
influenza
11
atingiu dimensões globais em seis meses, causando a morte de 25 milhões de
pessoas, em menos de dois anos entre 1918 e 1919.
Diante dos poucos recursos para combatê-la, a violência da gripe
estimulou a atividade farmacêutica nos países mais industrializados, levando a
um vigoroso crescimento e internacionalização, processo que passou a envolver
investimentos cada vez maiores em pesquisa. A dimensão que a indústria
farmacêutica atingiu no pós-guerra pode ser avaliada pelo fato de que a
Alemanha, como parte das obrigações de guerra devidas aos Estados Unidos,
teve de entregar a marca "Aspirina", medicamento desenvolvido pelo laboratório
Bayer em 1897, que representava um dos maiores valores econômicos atingido
por um remédio em toda a história.
A grande revolução da indústria farmacêutica, porém viria cerca de uma
década depois. Em 1929, Alexander Fleming divulgava a descoberta daquela que
seriar considerada a "droga do século" - a penicilina. A prova de fogo do poder
do antibiótico foi a Segunda Guerra Mundial (1939-1945), quando graças à
penicilina foi possível preservar a vida de milhares de soldados.
A partir daí, mais e mais investimentos em pesquisa e tecnologia
intensificaram o desenvolvimento da biotecnologia e da indústria farmacêutica. A
sofisticação não apenas dos medicamentos, mas principalmente dos recursos de
diagnóstico e de intervenção cirúrgica, foi transformando por completo a prática
médica nas grandes cidades. O hospital, antes destinado basicamente a pobres e
indigentes, assumiu posição central na prestação de serviços à saúde, agrupando
as diversas especialidades médicas e todo o equipamento e infra-estrutura
necessários.
O ensino de Medicina, por sua vez, acompanhou a enorme evolução
tecnológica, tanto em relação ao diagnóstico quanto às técnicas de tratamento,
caminhando para a especialização cada vez mais acentuada. De um lado esse
panorama ampliou as possibilidades de cura aumentando significativamente a
12
perspectiva de vida de boa parte da humanidade; de outro, a alta sofisticação da
Medicina acabou por excluir a parte restante numerosa, sem recursos financeiros
para desfrutar dos benefícios tecnológicos daí advindos.
Além da questão do difícil acesso à moderna Medicina ocidental, outro
debate veio à tona nas últimas décadas do século XX. Em grande medida, a
tecnologia "desumanizou" a prática médica: o corpo humano passou a ser visto
como uma máquina, e a doença, como o mau funcionamento de um mecanismo
biológico. E quando o tratamento da parte defeituosa compromete - o que não é
raro - outras partes, estas também são tratadas isoladamente, sem relação com o
conjunto.
Na medida em que se começou a questionar essa visão, novamente voltaram
ao debate, tanto nacional como internacional, antigos valores e práticas médicas.
Entre elas, ganharam novo impulso não só a medicina chinesa, cujo princípio
fundamental é que a saúde depende do equilíbrio entre mente e corpo, mas
também a Homeopatia e, principalmente, a Fitoterapia. Inserida numa visão
compreensiva e abrangente, baseada na manutenção da saúde, enquanto princípio
que se situa acima e além do combate à doença, a Fitoterapia volta revigorada e
avalizada cientificamente como uma alternativa viável, inclusive economicamente,
para o tratamento de distúrbios orgânicos, antes que estes se transformem em
problemas mais sérios (NATURA, 2002).
1.3. Riqueza Ameaçada
Muitos anos antes das caravelas portuguesas fincarem suas âncoras por
aqui, o Brasil estava longe de ser um paraíso tropical inabitado. Bem no coração da
Amazônia, em Mato Grosso, onde hoje convivem 14 tribos indígenas no Parque
Nacional do Xingu, havia uma civilização com avançado conhecimento de
engenharia. As evidências arqueológicas, reveladas em setembro de 2003,
mostraram vestígios de praças, ruas e pontes construídas por uma sociedade com
cerca de cinco mil habitantes. Durante pelo menos 250 anos, esses povos resistiram
13
a toda sorte de ameaças, de malária e febre amarela a picadas de cobra e plantas
venenosas. Para se curar, usavam infusões de ervas e poções feitas pelos pajés
com ingredientes quase sempre secretos. Só 350 mil índios, ou 0,2% da população
brasileira, resistiram às armas de fogo, ao domínio dos colonizadores e às doenças
européias (MENCONI, 2003).
A população nativa diminuiu, mas a pilhagem das riquezas naturais
brasileiras já dura 500 anos; Os colonizadores europeus que saqueavam as
colônias deram lugar aos piratas disfarçados de turistas, pesquisadores ou
missionários. Seu objetivo continua o mesmo; apropriar-se das riquezas da maior
biodiversidade do mundo, úteis na produção de alimentos, remédios e cosméticos.
A grilagem evoluiu a reboque da indústria farmacêutica e da biotecnologia. Um
quarto dos atuais medicamentos industrializados é derivado de plantas, o que
representa um mercado mundial de US$ 14 bilhões ao ano, sendo US$124 milhões
só no Brasil (MENCONI, 2003).
O País amarga um prejuízo diário de US$ 16 milhões com a biopirataria,
segundo o Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renováveis (Ibama). Há casos emblemáticos como o pau-brasil, a seringueira ou a
fruta do bibiri, registrada pelo laboratório canadense Biolink, apesar de usada há
gerações como anticoncepcional pelos índios uapixanas, de Rondônia. Uma
empresa japonesa deixou mais evidente essa vulnerabilidade ao registrar como
seus os nomes de frutas nacionais típicas como cupuaçu e acerola. O caso mais
famoso, porém, é o do professor da faculdade de medicina de Ribeirão Preto,
Sérgio Ferreira, que descobriu no veneno da jararaca uma substância capaz de
controlar a pressão arterial. Sem dinheiro para tocar as pesquisas, ele aceitou
uma parceria com o laboratório americano Bristol-Myers Squibb. Em troca de
recursos, a empresa registrou a patente do princípio ativo Captopril, um mercado
que gera US$ 2,5 milhões ao ano em royalties, e o Brasil também tem que pagar
(MENCONI, 2003).
14
Não há páreo no mundo para a riqueza das florestas, pradarias e savanas
brasileiras, que abrigam duas em cada cinco espécies de plantas e animais do
planeta. Aqui vivem 55 espécies de primatas, dois quintos das aves e um décimo
dos anflbios e mamíferos do mundo. O grande dilema da exploração dos recursos
naturais é o desconhecimento. A ciência já esquadrinhou quase 1,8 milhão de
espécies de um total que pode variar entre cinco e 30 milhões. Por isso, a
biopirataria muitas vezes passa despercebida. Na maioria dos casos, ela é reflexo
da falta de fiscalização, de controle e de uma legislação que proteja a propriedade
genética das espécies nativas (VER TABELA 1) (MENCONI, 2003).
TABELA 1 – Espécies que já sofreram biopirataria:
ACEROLA
Malpighia glabra
Linn
Rica em vitamina C, a fruta foi patenteada pela empresa
j
aponesa Asahi Foods, que também re
g
istrou como sua
propriedade o nome açaí. A bola da vez é o camu-camu, fruta
avermelhada de
g
osto azedo campeã em vitamina C, que está
na mira dos japoneses.
ANDIROBA
Carapa guianensis
Aubi
Usada pelos povos da Amazônia como repelente de insetos,
contra febre e como cicatrizante. A Rocher Yves Ve
g
etale
re
g
istrou nos Estados Unidos, Europa e Japão a patente sobre a
produção de cosméticos ou remédios que usem o seu extrato.
AYAHUASCA
Banisteriopsis caapi
Cipó alucinó
g
eno usado há quatro séculos em cerimônias
reli
g
iosas de tribos indí
g
enas e em rituais do Santo Daime. Foi
patenteada pela empresa americana Internacional Plant
Medicine Corp.
BIBIRI
Ocotea rodiei
De sua semente é extraída a rupununina, substância patenteada
pela In
g
laterra para ser usada como anticoncepcional. O
laboratório canadense Biolink re
g
istrou seu princípio ativo,
empregado em medicamentos para Aids.
COPAÍBA
Copaifera sp
É
considerado o antibiótico das matas. Tem propriedades
expectorantes, desinfetantes e estimulantes. A empresa
Technico-flor S/A re
g
istrou patente mundial sobre
cosméticos ou alimentos que utilizem a planta.
15
CUPUAÇU
Theobroma
grandiflorum
Considerada uma fruta exótica da Amazônia, ela foi patenteada
pela Asahi Foods, que produz o cupulate, chocolate de cupua
ç
u.
A empresa britânica The Body Shop patenteou o extrato da fruta
para produção de cosméticos.
CURARE
Mistura de ervas guardada em sigilo pelos índios e usada na
ponta da flecha como veneno para imobilizar a presa. Foi
patenteada pelos EUA na década de 40 e é usado na produ
ç
ão
de relaxantes musculares e anestésicos cirúrgico.
FÓSSEIS
O fóssil rara de uma planta de 130 milhões de anos foi
anunciado na Suécia como uma
rande descoberta. Só não se
revelou que ele foi levado ile
g
almente da Chapada do Araripe,
no Ceará.
JARARACA
Bothrops jararaca
Pesquisador brasileiro descobriu no veneno da cobra uma
substância para controlar a hipertensão. O laboratório Bristol
Myers-Squibb financiou a pesquisa e re
g
istrou o princípio ativo
contra pressão alta, um mercado de US$ 2,5 bilhões. O Brasil
paga royaltes, como o resto do mundo.
JARARACA ILHÔA
Bothrops insularis
A cobra, que só existe na ilha da Queimada Grande, no litoral
Sul de São Paulo, é considerada exótica e desperta interesse em
colecionadores do mundo todo pela sua beleza e pelo poder de
seu veneno, muito mais letal do que o das outras espécies de
jararaca. Há dois anos, alguns exemplares da serpente foram
encontrados à venda num mercado de animais em Amsterdam.
MOGNO
Swietenia macrophylla
Em 40 anos de explora
ç
ão, foram extraídos 2,5 milhões de
árvores, avaliado em US$ 4 bilhões. Dois ter
ç
os da madeira
mais valiosa do País vão para EUA e Inglaterra, nem todos pelo
caminho da legalidade.
PAU-BRASIL
Caesalpinia echinata
lam
Os portu
g
ueses surrupiaram dos índios o se
g
redo da extra
ç
ão
do pi
g
mento vermelho. Sobraram poucos exemplares para
contar a história da árvore que deu nome ao Brasil.
PAU-ROSA
Desde a década de 30, seu óleo é usado como fixador de aroma
nos EUA, Bélgica, França, Reino Unido e Alemanha. É a matéria-
16
Aniba roseadora
prima do perfume Chanel n°5 e corre risco de extinção.
QUEBRA-PEDRA
Phyllantus niruri
Linn
Usada pelos índios para tratar problemas hepáticos e renais, foi
patenteada por uma empresa americana para fabrica
ç
ão de
medicamento para hepatite B.
SAPO
Epipedobetes tricolor
O sapo que vive nas árvores da Amazônia possui uma toxina
análgésica 200 vezes mais potente do que a morfina. O
laboratório americano Abbott sintetizou a substância e vende a
droga.
SERINGEIRA
Hevea brasiliensis
Em 1876, o in
g
lês Henry Wickham plantou sementes de
serin
g
ueira em colônias britânicas na Malásia, que se tornou
grande exportador e desbancou o Brasil, que passou a importar
borracha.
FONTE: Revista ISTO É, 24 de setembro de 2003 n° 1773.
O carro-chefe da exploração predatória é a madeira tropical mais nobre e
valiosa do mundo, o mogno. Batizada de ouro verde por seu alto valor comercial,
ela é vendida a US$ 1,4 mil por tora. Entre 1971 e 2001 foram extraídos 2,5
milhões de árvores. Dois terços seguiram para os EUA e a Inglaterra (MENCONI,
2003).
O atual governo prepara um banco de dados com o nome científico e
popular das várias espécies nativas. Disponível na internet, ele poderia coibir,
iniciativas como a da empresa japonesa Asahi Foods, que abocanhou as marcas
cupuaçu e acerola. Não adianta nem reclamar direitos na Justiça porque a
maracutaia esconde uma briga de gigantes. Os países ricos relutam em
reconhecer o conhecimento tradicional de povos nativos como propriedade
intelectual. Em compensação, defendem as patentes sobre genes e princípios
ativos encontrados na natureza. Na prática, vale quem for mais rápido no gatilho
em registrar marcas e patentes no Exterior (MENCONI, 2003).
Nossos recursos genéticos são subutilizados, em geral amarram a pesquisa
nacional e abrem brechas para interesses menos legítimos. É impossível sobrevoar
17
a floresta e reconhecer do alto quais plantas têm efeito terapêutico. 0 único jeito
de aprofundar o conhecimento científico é se aproximar das populações
tradicionais, que quase nunca são remuneradas. A ministra do Meio Ambiente,
Marina Silva, autora do primeiro projeto de lei de combate à biopirataria, há oito
anos engavetado no Congresso, promete enviar um projeto de lei para substituir
a atual medida provisória que rege o setor, no qual propõe penas para a
biogrilagem. "A legislação é essencial, mas a conscientização da sociedade é
fundamental para impedir esse crime duplo, que rouba nossas riquezas e impede
nosso desenvolvimento", diz Marina (MENCONI, 2003).
Pela legislação atual, biopirataria não é crime. Por isso, os 29 americanos,
holandeses, suíços e alemães presos nos últimos dez anos pela Polícia Federal
somente no Amazonas foram enquadrados na lei que trata do transporte ilegal
de animais e plantas e, logo depois, liberados sob pagamento de fiança.
Sabendo da facilidade, os biopiratas estão mais ousados e sofisticados. A PF e o
Ibama já apreenderam com falsos turistas mapas detalhados da Amazônia
elaborados por satélites americanos, aparelhagem para medir a acidez da água e
substâncias que adormecem animais embalados para "exportação" (MENCONI,
2003).
Para combater tanta sofisticação, a PF criou a divisão de repressão aos
crimes ambientais, que coordenará o trabalho em delegacias especializadas.
"Este é o setor mais sofisticado do crime organizado e para combatê-lo temos
que conhecer o assunto", avisa o delegado e biólogo Jorge Pontes. A PF deu o
nome do maior pirata da história - Drake - a uma operação em 11 Estados para
tentar impedir o tráfico de animais e a saída de material genético pelas
fronteiras. A dobradinha biopirataria e tráfico de animais é a terceira maior
atividade ilícita do mundo, perdendo só para o tráfico de drogas e de armas
(MENCONI, 2003).
Os índios também entraram na briga. Desde fevereiro, o Instituto
Indígena Brasileiro da Propriedade Intelectual registra, os conhecimentos
18
tradicionais dos pajés. Integrado por advogados e sociólogos índios e pajés, o
instituto vai tentar o reconhecimento internacional pela Organização Mundial de
Propriedade Intelectual. "Nosso saber deve ser respeitado para que as
comunidades indígenas se beneficiem de tradições seculares", defende Marcos
Terena, um dos criadores do instituto (MENCONI, 2003).
Campanhas de conscientização e a repressão policial são fundamentais;
mas não suficientes. Até porque o biopirata conta com muitas saídas e com a
fragilidade dos acordos internacionais ainda não regulamentados. A solução
definitiva apontada pela Associação Brasileira de Empresas de Biotecnologia e a
aprovação de uma legislação para regulamentar à bioprospecção, a pesquisa
científica e o intercâmbio de material genético entre cientistas de outros países.
"Os pesquisadores brasileiros ou estrangeiros terão que se submeter a contratos
meticulosos para que o Brasil possa se beneficiar da sua biodiversidade",
argumenta Antônio Paes de Carvalho, presidente da associação (MENCONI, 2003).
O interesse dos estrangeiros é tanto que há 20 anos uma indústria suíça
controla a Pentapharm, um dos mais importantes serpentários do País, localizado
em Uberlândia, Minas Gerais. Ali se criam em cativeiro as cobras jararacuçus, uma
espécie do grupo das jararacas. Toda a produção de veneno segue para a Suíça,
que o transforma num medicamento anticoagulante. Para espanto dos desavisados,
o negócio é legal e tem permissão de todos os órgãos governamentais para
exportar o veneno das cobras tupiniquins (MENCONI, 2003).
Enquanto a solução não vem, Francisco José Abreu Matos, da Universidade
Federal do Ceará, registrou 700 espécies de plantas conhecidas por suas
propriedades medicinais. Ele avaliou a toxicidade e a eficácia terapêutica de 70
espécies e reuniu os dados no livro
Farmácia viva,
com isso, garante Matos, é
possível baratear o custo dos medicamentos. "Há uma grande dificuldade para as
plantas brasileiras se tornarem fonte de renda e as pesquisas acabam entregando o
ouro ao bandido", acrescenta (MENCONI, 2003).
19
1.4. Gênero Copaifera e o óleo de Copaíba
Os trabalhos realizados sobre o gênero
Copaifera
L. estão, em sua maioria,
relacionados com o óleo que é exudado do tronco destas árvores, o óleo de
copaíba, facilmente encontrado na região tropical da América Latina. Desde os
primeiros anos de descobrimento do Brasil, o óleo de copaíba vem sendo indicado
para diversos fins, farmacológicos ou não.
A nomenclatura botânica segue, como norma, os nomes mais antigos dados
às plantas. Em alguns casos, entretanto, são feitas exceções frente à utilização
corrente de outros nomes. Uma destas exceções está nas leguminosas, cujo nome
mais antigo é Faba, mas Fabaceae Lindley dá lugar a Leguminosae Juss, na
nomenclatura desta que é uma das mais importantes famílias botânicas. A
classificação mais moderna da família Leguminosae a divide em três subfamílias:
Caesalpinoideae, Mimosoideae e Papilionoideae (ou Faboideae) (JUDD,
et al.,
1999). Por esta classificação, que segue o sistema de Engler, o gênero
Copaifera
L. pertence à família Leguminosae Juss., sub-família Caesalpinoideae Kunth.
Segundo outro sistema de classificação, o de Cronquist, o gênero Copaifera L.
Pertence à família Caesalpiniaceae R.Br. A classificação apenas como Fabaceae
também é encontrada em alguns livros (HARBONE
et al.,
1971; LEWIS & ELVIN-
LEWIS, 1977).
Muitos botânicos e cronistas que estiveram nas índias Ocidentais e na
América no início da colonização descreveram espécies do gênero
Copaifera.
Em
1628
,
MarcGrave e Piso descreveram os aspectos morfológicos da planta,
empregando o termo "Copaíba" sem designar espécies (PISO & MARCGRAVE,
1625). Mais tarde verificou-se, através dos caracteres descritos pelos dois
cronistas, que a espécie estudada foi a
Copaifera martii
(DWYER, 1951)
.
JACQUIN,
1760,
descreveu em detalhes a primeira
Copaifera como Copaiva
officinalis
Jacq. mas, como não possuía o fruto, baseou sua descrição nos
aspectos do fruto da espécie estudada por MarcGrave e Piso. Somente dois anos
20
depois, o cientista sueco Carl von Linneu descreveu corretamente a
Copaifera
officinalis
(LINNAEUS, 1762), assumindo a descrição oficial do gênero
Copaifera
L.
HAYNE,
1825,
publicou uma monografia com oito novas espécies de
Copaifera
que, apesar de um pouco confusa em vista do conhecimento atual,
constituiu o mais importante tratado de descrição do gênero e serviu como base
para estudos como o de Bentham, na Flora Brasiliensis, realizado durante a
expedição com o naturalista VON MARTIUS, 1870.
Os trabalhos mais recentes de descrição de novas espécies foram realizados
por Harms e Ducke, este último com contribuições de extremo valor sobre as
espécies da Região Amazônica (DUCKE, 1932; DUCKE, 1949) e do estado do
Ceará (DUCKE, 1967),
e por Dwyer, que realizou um levantamento das espécies
americanas (DWYER, 1945; DWYER, 1954).
As copaíbas são árvores nativas da região tropical da América Latina e
também da África Ocidental. Na América Latina são encontradas espécies na
região que se estende da México ao norte da Argentina (VON MARTIUS, 1870;
BURKART, 1943; DWYER, 1951; DWYER, 1954; ALENCAR, 1982).
Segundo a última edição do lNDEX KEWENSIS, 1996, o gênero
Copaifera
possui 72 espécies, sendo que dezesseis destas só são encontradas no Brasil
(DWYER, 1951)
.
Popularmente conhecidas como copaibeiras ou pau d'óleo, as copaíbas são
encontradas facilmente nas Regiões Amazônica e
Centro-oeste do Brasil. Entre as
espécies mais abundantes, destacam-se:
C officinalis
L. (norte do Amazonas,
Roraima, Colômbia, Venezuela e San Salvador) (ANDRADE JR.
et al.,
2000),
C.
guianensis
Desf. (Guianas), C.
reticulata
Ducke, C.
multijuga
Hayne (Amazônia),
C.
confertiflora
Bth (Piauí), C.
langsdorffii
Desf. (Brasil, Argentina e Paraguai), C.
coriacea
Mart. (Bahia), C.
cearensis
Huber ex Ducke (Ceará) (PIO CORRÊA, 1931;
21
WOOD,
et al.,
1940; MORS & RIZZINI, 1966; SOUZA & ABREU, 1977; PERROT,
1994).
No Brasil, a espécie C.
langsdorffii
Desf.
é particularmente importante por
estar distribuída em quase todo o território nacional (da Amazônia a Santa
Catarina, no Nordeste e Centro-oeste) e por possuir quatro diferentes variedades:
C.
langsdorffii
var. grandifolia, grandiflora, laxa e glabra (LEITE, 1993). A espécie
usada nos nossos experimentos foi a C.
langsdorffii
Desf.
FIGURA 3 - Mostra o mapeamento das regiões onde espécies do gênero
Copaifera
foram encontradas.
As copaibeiras são árvores de crescimento lento, alcançam de 25 a 40
metros de altura, podendo viver até 400 anos. O tronco é áspero, de coloração
escura, medindo de 0,4 a 4 metros de diâmetro. As folhas são alternadas,
pecioladas e penuladas. Os frutos contêm uma semente ovóide envolvida por um
arilo abundante e colorido. As flores são pequenas, apétalas, hermafroditas e
arranjadas em panículos axilares (JACQUIN, 1760; PIO CORRÊA, 1931;
SILVA,
et al.,
1977; ALENCAR, 1982; VAN DEN BERG, 1982; BAILLON,
1886).
22
A floração e frutificação das copaíbas ocorrem a partir dos 5 anos de idade,
em plantios. A floração ocorre entre outubro e julho e a frutificação entre junho e
outubro, com variações dentro destes intervalos, dependendo da região e clima,
com ausência de florescimento anual, em algumas regiões (SANTOS, 1979;
CARVALHO, 1994).
Nectíferas, algumas espécies, como a
Copaifera langsdorffii,
são polinizadas
no período diurno, de 8:00 às 16:00 horas, com grande participação de
Trigona sp
e
Apis mellifera
(CRESTANA & KAGEYAMA, 1989), tendo sido encontrados grãos
de pólen provenientes de
Copaifera
em amostras de mel do estado do Ceará
(BARTH, 1971).
À época da frutificação, as copaíbas são visitadas no período diurno por
aves, as quais são as maiores responsáveis pela dispersão de suas sementes,
como o tucanuçu
(Ramphastos toco),
a galha-do-campo
(Cyanocorax cristatellus)
e
o sabiá, que engolem o arilo e regurgitam a semente (CARVALHO, 1994). No
período noturno, as copaíbas são ponto de encontro de diversos mamíferos, como
os macacos mono-carvoeiros
(Cebus apella nigritus
) (DI BIRETTI
et al.,
2000),
observados no Parque Nacional de Iguazu, na Argentina, e que utilizam sua copa
como ponto de descanso noturno, como pequenos roedores que apreciam os
frutos e são atraídos pelo cheiro de cumarina presente nas sementes maduras e,
por último, os silvícolas, no norte do país, que apreciam a carne destes pequenos
roedores e utilizam as copaíbas como local de espera de caça.
A biologia das sementes de C.
langsdorffìi
foi estudada por diversos
pesquisadores que abordaram desde sua morfologia e anatomia (CRESTANA &
BELTRATI, 1988), passando pela sua conservação (EIRA,
et al.,
1992) e
maturação (BARBOSA,
et al.,
1992), até germinação (BORGES & BORGES, 1979).
Sua identificação botânica é difícil, sendo realizada, na maioria das vezes,
segundo características das flores, como: pubenescência das sépalas,
23
comprimento dos anteros e a condição glaborosa ou não do pistilo (DWYER,
1951). As características dos frutos são igualmente importantes, mas estes são
dificilmente encontrados em coleções botânicas.
A designação correta para o óleo de copaíba é a de óleo-resina, por ser um
exudato constituído por ácidos resinosos e compostos voláteis (BRUNETON,
1987). Também é chamado, erroneamente, de bálsamo de copaíba (FIGUEIREDO,
1935; BRUNETON, 1993), apesar de não ser um bálsamo verdadeiro, por não
conter derivados do ácido benzóico ou cinâmico (DWYER, 1951; PIO CORREA,
1931; ROBBERS
et al.,
1996).
O óleo de copaíba é encontrado em canais secretores localizados em todas
as partes da árvore. Estes canais são formados pela dilatação de espaços
intercelulares (mcatos) que se intercomunicam no meristema, chamadas de canais
esquizógenos (OLIVEIRA, 1905). O caráter mais saliente deste aparelho secretor
está no tronco, onde os canais longitudinais, distribuídos em faixas concêntricas,
nas camadas de crescimento demarcadas pelo parênquima terminal, reúnem-se
com um traçado irregular, em camadas lenhosas, muitas vezes sem se
comunicarem (OLIVEIRA, 1905; ALENCAR, 1982). Segundo alguns autores, o óleo
é produto da desintoxicação do organismo vegetal e funciona como defesa da
planta contra animais, fungos e bactérias (ALENCAR, 1982).
São vários os métodos relatados para a retirada do óleo de copaíba.
Antigamente, obtinha-se o óleo através de cortes a machado no tronco, o que
inutilizava a árvore (LE CONTE, 1927). A incisão em V, colocando-se abaixo vasos
apropriados para receber o óleo, à semelhança da extração de borracha
(OLIVEIRA, 1905; MATTA, 1913), e o chamado método do arrocho, que consiste
em selar o tronco, abaixo das incisões, com embiras e cipós e coletar o óleo da
árvore até o seu esgotamento, provocando sua morte, são métodos há muito
tempo abandonados (OLIVEIRA, 1905). A retirada por meio de bomba de sucção
também é descrita (SILVA, 1923), porém pouco difundida.
24
A única prática de coleta não agressiva é aquela realizada através de uma
incisão a cerca de 1 metro de altura do tronco (LE COINTE, 1927; ALENCAR,
1952). Terminada a coleta, o orifício é vedado com argila para impedir a
infestação da árvore por fungos ou cupins. A argila pode ser facilmente retirada,
permitindo que se façam outras coletas no mesmo tronco (PERROT, 1943),
obtendo-se quantidade de óleo igual ou mesmo superior a da primeira retirada
(ALENCAR, 1952). Nesta primeira extração a quantidade de óleo obtido varia
bastante. Alguns cronistas descreveram que uma única árvore pode gerar até 40
ou 50 litros de óleo por ano (PISO, 1625; MATTA, 1913; GRIEVE, 1994), apesar
de nem todas as espécies serem capazes de produzir essa quantidade (PIO
CORREA, 1931).
O interesse na madeira de determinadas espécies de
Copaifera
também é
grande. Sua superfície é lisa, lustrosa, durável, de alta resistência a ataque de
xilófagos e baixa permeabilidade, própria para fabricação de peças torneadas e de
marcenaria em gera (CARVALHO, 1942)l. A árvore também é utilizada na
fabricação de carvão (LOUREIRO, 1979) e pelas indústrias de construção civil e
naval (SOUZA, 1977; CARVALHO, 1994).
O interesse pela madeira e a utilidade do óleo de copaíba fez com que o
governo imperial regulasse a derrubada das copaibeiras através de um ato
expedido em 1818, segundo o qual as árvores só poderiam ser derrubadas por
conta do estado, vendidas com 20% de lucro para a produção de mastros e
vergas de navio (CESAR, 1956).
Apesar deste ato, as árvores continuaram a ser derrubadas até os dias
atuais; com a sua extração não racional. O interesse na madeira e os
desmatamentos crescentes na Região Amazônica acabaram transformando o óleo
de copaíba em subproduto da indústria madeireira. Sua fonte nos mercados
municipais de Manaus e Belém, varia de acordo com a situação das estradas
que levam os caminhões com madeira por toda parte. No estado de Rondônia, é
comum encontrar mulheres e filhos de madeireiros ao longo da estrada que liga
25
Porto Velho a Ariquemes e Ji-Paraná, vendendo óleo de copaíba em baldes de
plástico. Hoje em dia, a maior parte do óleo é obtida através do processo de
extração total, com a derrubada da árvore (VEIGA JR & PINTO, 2002).
O óleo de copaíba é um líquido transparente cuja coloração varia do
amarelo ao marrom. Para utilização farmacológica, os óleos mais escuros e
viscosos (DUCKE, 1939) são os preferidos (RODRIGUES, 1894; SILVA, 1911;
MATTA,1913; SILVA, 1923; PENNA, 1946; SILVA, 1951; RODRIGUES, 1989).
Somente na espécie
C. langsdorffii,
o óleo de copaíba apresenta-se vermelho,
semelhante ao sangue de dragão (
Croton sp.
),
recebendo a denominação popular
de copaíba vermelha (MEDEIROS
et al.,
1985; MATTOS FILHO
et al.,
1993).
Segundo LAWRENCE, 1980, as espécies botânicas mais freqüentemente
utilizadas na produção de óleo são:
C.
reticulata
(70%),
C. guianensis
(10%),
C.
multijuga
(5%) e
C. officinalis
(5%).
Dentro de determinada espécie produtora também ocorrem variações quali
e quantitativas (VEIGA JR., 1997). Algumas árvores praticamente não exudam
óleo ou o fazem em quantidades muito pequenas para coleta (o que os mateiros
chamam de “árvores macho”) (GÂNDAVO, 1576). A quantidade de resina pode ser
influenciada (aumentada) por fatores como o aumento de luminosidade e a
diminuição de nitrogênio no solo (LANGENHEIM, 1990). Nos estudos realizados
com
C.
multijuga,
com retiradas periódicas de óleo de copaíba, foram obtidas
maiores quantidades de óleo na estação chuvosa em árvores localizadas em
terreno argiloso (ALENCAR, 1982).
Um dos aspectos interessantes da copaíba é o procedimento da retirada do
óleo utilizado pelos indígenas e ainda observado no interior do Brasil. Muitos
destes procedimentos são consideradas místicos pela ciência de hoje, embora
tenham sido adquiridos pelos indígenas através da experimentação empírica
durante milhares de anos. Vários cronistas, que estiveram na América Latina em
regiões tão diferentes como a bacia amazônica e do Prata e o Nordeste brasileiro,
26
relatam a utilização das mesmas técnicas por índios separados por milhares de
quilômetros (VEIGA JR & PINTO, 2002).
Segundo o Príncipe MAXIMILIANO, 1958, que esteve na região do Espírito
Santo no início do século XIX, "...é
crença geral que a incisão deva ser feita em
lua cheia e o óleo colhido no quarto minguante...”
.
João Ferreira Rosa, em seu
Tratado Único da CONSTITUIÇÃO PESTILENCIAL, de 1694, relatava:
"Neste pau,
nas noites de lua cheia, quando os frutos estão maduros, se faz golpe até a
medula,..., correr óleo em grande quantidade”.
Ainda hoje os mesmos procedimentos são seguidos pelos silvícolas, alguns
deles, com muito misticismo. Afirmam que quando o machado atinge o cerne, a
árvore dá um longo suspiro e o óleo começa a correr (CESAR, 1956). Para a
retirada do óleo, segundo estes, a árvore não deve ser olhada diretamente (para a
copa), sob pena da árvore secar e o óleo voltar para a terra. A ascendência do
óleo da terra é comumente relatada por mateiros do norte do país, embora não
encontrada na literatura. Segundo alguns deles, sob a influência da lua cheia de
agosto, o óleo sobe da terra para a árvore e esta é a época mais indicada para a
retirada do óleo. Vários relatos confirmam este período de coleta (ROSA, 1694;
LANGGAARD, 1872; GRIEVE, 1994).
1.5. Histórico e aplicações do Óleo de Copaíba
A origem do nome copaíba parece vir do tupi: cupayba, a árvore de
depósito, ou que tem jazido, em alusão clara ao óleo que guarda em seu interior
(O TUPI NA GEOGRAFIA NACIONAL, 1928). Chamado de copaíva (PECKOLT,
1942) ou copahu (LÉRY, 1578) pelos indígenas [do tupi: Kupa’iwa (LÉRY, 1578) e
Kupa’ü (GRANDE ENCICLOPEDIA LARRROUSSE CULTURAL, 1998),
respectivamente, e cupay, na Argentina e no Paraguai (guarani) (VON MARTIUS,
1854), o óleo de copaíba e suas propriedades medicinais eram bastante difundidos
entre os índios latino-americanos à época que aqui chegaram os primeiros
exploradores europeus no século XVI. Este conhecimento, tudo indica, veio da
27
observação do comportamento de certos animais que, quando feridos,
esfregavam-se nos troncos das copaibeiras para cicatrizarem suas feridas
(CARDIM, 1998; SALVADOR, 1975), como observou o holandês Gaspar Barléu
(BARLÉU, 1974; SALVADOR, 1975):
“...Vêem-se estas plantas esfoladas pelo atrito dos animais,
que, procuram instintivamente este remédio da natureza...”
As propriedades do óleo tão apreciado pelos índios, que o usam
principalmente como cicatrizante e antiinflamatório, fizeram com que a copaíba
fosse uma das primeiras espécies a serem descritas pelos cronistas portugueses
(MARC GRAVE, 1942; PISO, 1957; CARRARA & MEIRELLES, 1996).
A primeira citação sobre o óleo talvez tenha sido em uma carta de Petrus
Martius ao Papa Leão X, publicada em Estrasburgo, em 1534, em que a droga
utilizada pelos índios era chamada de "Copei" (DWYER, 1951).
Uma publicação da mesma época do padre Jesuíta José Acosta, "De Natura
Novi Orbis", foi traduzida do latim para o francês em 1606. Na tradução
portuguesa de José Maffeu, intitulada "História Natural e Moral das índias",
encontra-se o seguinte texto (ACOSTA, 1792):
“... o bálsamo é celebrado com razão por seu excelente odor e
muito maior efeito para curar feridas, e outros diversos
remédios para enfermidades, que nele se experimentam...
...nos tempos antigos os Índios apreciavam em muito o
bálsamo, com ele os índios curavam suas feridas e que delas
aprenderão os espanhóis...”
O jesuíta José de Anchieta, em sua longa carta ao Padre Geral, datada
de São Vicente, em fins de 1560, comenta as utilidades do óleo de copaíba
(RODRIGUES, 1934):
28
"...exala um cheiro muito farte porém suavíssimo e é ótimo para
curar feridas, de tal maneira que em pouco tempo nem mesmo
sinal fica das cicatrizes.”
A descoberta da terapêutica indígena permitiu que os primeiros médicos
que trabalharam no Brasil contornassem parcialmente a escassez dos remédios
empregados na Europa, cujo suprimento a Colônia era intermitente. As práticas
indígenas eram tão difundidas, que os viajantes sempre se abasteciam destes
medicamentos, "comprovadamente eficientes", antes de excursões por regiões
pouco conhecidas (CARRARA & MEIRELLES, 1996).
As utilidades farmacológicas do óleo de copaíba também foram citadas em
1576, por Pero Magalhães Gandavo, um dos primeiros cronistas da História
Brasileira (GANDAVO, 1576; VOGT & LEMOS, 1982).
As citações mais remotas da aceitação desta farmacopéia indígena na
América pelos europeus datam de 1587, quando Gabriel Soares de Sousa (c.1540-
c.1592), no seu "Tratado Descritivo do Brasil", registrou a utilização do óleo de
copaíba e chamou os produtos medicinais utilizados pelos índios de "as árvores e
ervas da virtude” (CARRARA & MEIRELLES, 1996).
Todos os mais importantes cronistas que estiveram no Brasil relataram as
propriedades dos óleos de copaíba. Ainda no século XVI, Jean de LERY, em 1578,
e os padres Fernão CARDIM, em 1584, Francisco SOARES, em 1594 e Simão
TRAVAÇOS, em 1596, citam o óleo como um excelente cicatrizante (CUNHA,
1998).
No século XVII, vários outros viajantes relatam as propriedades deste óleo,
como RODRIGUES, em 1607, SILVEIRA, em 1624, e MORÃO, em 1677, ano em
que o óleo de copaíba foi inserido na farmacopéia britânica (LEITE, 1998).
29
São muitas as denominações que o óleo das copaibeiras recebe nas
diversas regiões da América Latina onde é utilizado. Na Região Amazônica, o uso
do óleo de copaíba é tão extenso, que a copaíba destaca-se como a planta
medicinal mais utilizada e conhecida pela população (MING, 1995). O óleo pode
ser encontrado em mercados populares e é conhecido por diferentes
denominações, como: Copahyba, Copaibarana (RODRIGUES, 1989), Copaúba,
Copaibo, Copal, Maram, Marimari e Bálsamo dos Jesuítas (DUCKE, 1939).
Fora da Região Amazônica a espécie mais comum é a
Copaifera langsdorffii
,
conhecida por diversos nomes nas várias regiões onde é encontrada, a saber:
óleo-de-copaíba (RJ, SP, ES), óleo-pardo, óleo-vermelho (BA, RJ, SP), bálsamo,
caobi, copaíba, capaúba (MS), coopaíba (MG), copaí, copaibeira, copaibeira-de-
minas, capaúba (SP), copaíba-preta, copaíba-de-várzea, copaíba-vermelha, óleo-
amarelo, óleo-capaíba (BA, MG), copaúva, cupaúva, cupiúva, cupiuba, oleiro, óleo
(MG, PR), pau-óleo (PR), pau-óleo-de-copaíba, pau-óleo-do-sertão (BA), pau-
d'óleo, podoi (PI, CE), e copaibeira nos demais estados do sul do país (BRAGA,
1960).
Na Venezuela, o óleo de copaíba é o aceite de palo, cabimba, cabima,
aceite de zaraza ou bálsamo de copaiba e na França, o huile de copahu, baume de
copahu ou huile rouge de copayer (FONSECA, 1927).
A confusão de nomes é bastante grande mesmo dentro de um só estado. A
Copaifera martii
, por exemplo, é conhecida no Pará corno copaiba ou copaíba
jutaí, em Óbidos, jutaí pororoca, em Montalegre e copaibarana, em Santarém
(FONSECA, 1927). Jutaí e copaibarana também são nomes populares de outras
duas leguminosas:
Hymenea courbaril
e
Macrolobium microcalix
(SILVA
et al.,
1977), respectivamente. Copaibuçu (ou, copaíba grande) é um nome atribuído a
Ficus gameleira (Moraceae) (CUNHA, 1998), pela semelhança da copa das duas
árvores quando encontradas em regiões abertas (HOENE, 1941).
30
Não só os nomes, mas também os óleos de copaibeiras são confundidos
com óleos de árvores de outros gêneros da família Leguminosae. A confusão mais
comum ocorre com os óleos do gênero
Eperua
. Apesar de mais resinosos e de
coloração diferente, esverdeado, os óleos exudados das espécies
E. oleifera
e
F.
purpurea
são conhecidos popularmente com nomes correlatos aos da copaíba,
como copaíba-jacaré (MORS & RIZZINI, 1966) e copaibarana, respectivamente
(DUCKE, 1932). O óleo da espécie
E. falcata
(GRENAND & MORETTI, 1987)
também é utilizado na medicina popular de modo análogo ao da copaíba (FLEURY,
1997), como cicatrizante, antifúngico e bactericida (GRENAND & MORETTI, 1987).
As utilizações da medicina popular para o óleo de copaíba são muitas (PIO
CORRÊA, 1931; FIGUEIREDO, 1935; FREISE, 1937; DEUSSEN, 1939; ROSSELLS,
1977; RODRIGUES & MACHADO, 1977; GUILLEN, 1977; ALENCAR, 1982) e
indicam uma grande variedade de propriedades farmacológicas. As principais
atividades relatadas foram de antiinflamatório das vias superiores e inferiores e
cicatrizante. A TABELA 2 apresenta algumas das utilizações populares dos óleos
de copaíba.
Devido ao grande número de indicações medicinais, o óleo de copaíba já foi
considerado a verdadeira panacéia (ROSA, 1964), mas a sua utilização e,
principalmente, sua prescrição médica diminuiu muito nas últimas décadas. À
época do seu descobrimento pela terapêutica ocidental, algumas de suas
principais propriedades foram deixadas de lado em função de sua grande
atividade contra alguns males para os quais não havia medicação eficiente, como
a blenorragia e a gonorréia. No século XVIII, a experiência secular já então
limitava as indicações e o produto fez-se quase um específico para as vias
urinárias. Assim o empregaram F. Hoffmann (1660-1742), W. Cullen (1710-1790)
e J. Hunter (1748-1793) e Trousseau (1801-1867) (ROSA, 1964).
A descoberta neste século de agentes terapêuticos sintéticos mais
eficientes, como a penicilina (GOODMAN & GILMAN, 1945), diminuiu bastante sua
utilização.
31
Para outras indicações, como as propriedades cicatrizantes, para o qual o
óleo de copaíba foi muitas vezes descrito, é pequena a utilização nos dias de hoje.
Nos últimos anos, entretanto, o retorno à terapêutica natural trouxe de volta os
fitoterápicos para as farmácias de todo o país, mas o conhecimento de sua
utilização e suas aplicações se perderam, ou aparecem bastante confusos nas
centenas de publicações que não apresentam mais que duas ou três propriedades
farmacológicas já bastante conhecidas.
Algumas das propriedades hoje esquecidas são descritas por pesquisadores
que estudaram sua utilização junto aos silvícolas. Um exemplo é a descrição de
BERTONI, em 1927, que passou vários anos estudando os costumes dos índios
guaranis no Paraguai:
"É evidente a ação do óleo de copaíba C. langsdo ii, no
tratamento do reumatismo! Utiliza-se nas desinterias, em
casos mais graves, onde a ipeca não resolvia. Em especial
nos casos mais graves, com retite gangrenosa (...) Era a
essa resina que apelavam quando não queriam que as
e idas deixassem nenhuma cicatriz.”
rff
f r
Convivendo com os tapuias, ROSA, 1694, foi um dos cronistas que melhor
descreveu as utilizações do óleo de copaíba e a forma como deveria ser aplicado.
As aplicações a quente e em compressas em partes externas só são encontradas
em relatos mais antigos e hoje abandonadas da terapêutica. Rosa cita ainda a
utilização do óleo em massagens na cabeça para curar paralisias, dores de cabeça
e convulsões.
O chá das cascas e sementes da
Copaifera
também é indicado para
diversos males, especialmente na Venezuela e Colômbia, onde são utilizados como
anti-hemorroidal e purgativo (FONSECA, 1939; BARROS, 1982; MATOS, 1997) e
32
na Amazônia Brasileira é indicado no tratamento de moléstias pulmonares e asma
(CARVALHO, 1994).
Na África Ocidental (Camarões) encontra-se apenas uma utilização
medicinal para um óleo de copaíba específico,
Copaifera religiosa
, indicado no
tratamento da sífilis e blenorragia (MALLART-GUIMERA, 1969).
TABELA 2 - Indicações etnofarmacológicas dos óleos de copaíba encontradas na
literatura:
PROPRIEDADE
FARMACOLÓGICA
REFERÊNCIA
Vias Urinárias
- Antiblenorrágico
- Antiinflamatório
- Antigonorréico
- Antisséptico
- Cistite
- Estimulante
- Incontinência urinária
- Sífilis
BRUNETON, 1993; OLIVEIRA, 1905; CESAR, 1956; PECKOLT,
1942; BRAGA, 1960; FONSECA, 1927; DUCHESNE, 1836;
FREISE, 1933; MATOS, 1997.
FERREIRA, 1980; VIEIRA, 1992.
OLIVEIRA, 1905; SILVA, 1911; GOODMAN & GILMAN, 1945;
FONSECA, 1939.
BRUNETON, 1987; OLIVEIRA, 1905; GOODMAN & GILMAN,
1945.
WOOD,
et al.,
1940; BRUNETON, 1987; CESAR, 1956;
BOMPARD, 1964; FREISE, 1933.
WOOD,
et al.,
1940; GRIEVE, 1994; PECKOLT, 1942;
DUCHESNE, 1836.
RODRIGUES, 1894; CRUZ, 1965.
LEWIS, 1977; RODRIGUES, 1894.
Vias Respiratórias
33
- Antiasmático
- Bronquite
- Expectorante
- Inflamações de
garganta
- Hemoptise
- Pneumonia
- Sinusite
BARROS, 1982.
WOOD,
et al.,
1940; BRUNETON, 1993; CESAR, 1956;
RODRIGUES, 1894; CRUZ, 1965; FREISE, 1933; BARROS, 1982.
OLIVEIRA, 1905.
FERREIRA, 1980; VIEIRA, 1992; FIGUEIREDO, 1979.
FERREIRA, 1980.
RIBEIRO, 1971.
FERREIRA, 1980.
Outros
- Afrodisíaco
- Antitetânico
(principalmente em
recém-nascidos)
- Antitetânico (contra o
bacilo do tétano e nas
convulsões)
- Anti-reumático
- Antiherpético
- Anticancerígeno
- Antitumoral (tumores
de próstata)
- Leishmaniose
- Leucorréia
- Contra paralisia
- Dores de cabeça
- Picada de cobra
RIBEIRO, 1971.
CESAR, 1956; FONSECA, 1927; FREISE, 1933; TEIXEIRA, 1923.
SILVA, 1911; RODRIGUES, 1894; VIEIRA, 1992.
BRAGA, 1960; BERTONI, 1927; MATOS, 1997; RIBEIRO, 1971.
VIEIRA, 1992.
RODRIGUES, 1989; FIGUEIREDO, 1979.
HARTWELL, 1967.
GRENAND & MORETTI, 1987.
CESAR, 1956; CRUZ, 1965.
RIBEIRO, 1971.
RIBEIRO, 1971.
ROSA, 1694; BARLEU, 1974.
34
Em artigo recente, Fleury reviu as utilizações medicinais do óleo de copaíba
na região da Guiana Francesa, onde é utilizada contra psoríase, leishmaniose e
como cicatrizante e antiinflamatório (FLEURY, 1997).
A disseminação da indústria de produtos naturais em todo o mundo e no
Brasil, nos últimos anos, levou à comercialização extensiva do óleo de copaíba
pelos laboratórios farmacêuticos. Das pequenas cidades do interior da Amazônia,
os óleos de copaíba são transportados para as cidades de Manaus e Belém, de
onde são exportados para a Europa e América do Norte ou enviados para a região
sudeste para serem vendidos pelas farmácias que comercializam produtos
naturais. Os óleos podem ser encontrados nas farmácias de todo o país em
diversas apresentações. As mais comuns são em cápsulas ou envasados em
pequenos frascos de 30 mL.
No norte do Brasil, o caboclo faz amplo uso do óleo de copaíba. Ele o utiliza
como produto medicinal e também como combustível na iluminação pública. As
grandes distâncias, que devem ser vencidas na selva para encontrar as copaíbas,
em geral 0,2-0,3 árvores por hectare, fazem com que a mistura do óleo de
copaíba com outros óleos se torne uma prática comum. Os mateiros muitas vezes
armazenam na mesmo recipiente os óleos de todas as copaibeiras que encontram,
sem se preocuparem se provêm de árvores da mesma espécie botânica. Também
os misturam com bálsamo de gurjum e com óleos de espécies de
Calophyllum
,
que possuem densidade e aroma semelhantes (FREISE, 1937).
Também é comum a adulteração do óleo de copaíba com produto de menor
valor agregado, com o objetivo de diluir o óleo. Estas adulterações já eram descritas
desde o começo do século tanto na Europa, onde o óleo, exportado, era
misturado com óleo de madeira e colofane (PIO CORRÊA, 1931), como no Brasil,
onde publicações alemãs ensinavam como e onde comprar óleos de boa qualidade
em cidades da Amazônia (FREISE,1937; GILDEHEISTER & HOFFMAN, 1935). Hoje
em dia ainda é comum que intermediários na comercialização do óleo de copaíba
o misturem com água, óleo diesel e banha animal (LEITE, 1997). Essas
35
adulterações devem ainda ser somadas àquelas praticadas pelos laboratórios
farmacêuticos, que utilizam óleos vegetais comestíveis como a soja e o milho para
a diluição. Só recentemente uma metodologia para detectar estas adulterações foi
desenvolvida (VEIGA JR.
et al.,
1997).
A exportação dos óleos de copaíba para a Europa foi registrada desde o
final do século XVIII, ocupando o segundo lugar nas exportações brasileiras de
drogas medicinais (SIMONSEN, 1944; ARRUDA, 1980). Naquela época era comum
que comunidades indígenas inteiras, da grande área que se estende desde a
Região Amazônica até os estados de Maranhão e Mato Grosso, se ocupassem da
extração do óleo (CARRARA & MEIRELLES, 1996).
Os franceses foram os que mais se dedicaram ao estudo e exploração do
óleo de copaíba no passado. No período que antecedeu a primeira grande guerra,
Hamburgo, na Alemanha, era o principal centro de importação do óleo de copaíba
do Brasil e o distribuía para a Europa (cerca de 50 ton./ano), sendo a França
responsável pelo consumo de mais de 6 ton./ano (PERROT, 1458). No período de
pós-guerra, entretanto, foi quando se alcançou o maior valor global de exportação
do óleo, obtendo-se a máximo de 225 toneladas, no ano de 1918 (FONSECA,
1927).
Com os dados que dispomos, nos períodos de 1796 a 1807, de 1839 a
1870 (CARRARA & MEIRELLES, 1996), de 1901 a 1934 (FONSECA, 1927) e de
1962 a 1996 (COMÉRCIO EXTERIOR DO BRASIL, 1962-1996; GILBERT, 1995;
ANUÁRIO ESTATÍSTICO DO BRASIL, 1996), podemos observar que as grandes
oscilações na quantidade de óleo exportadas continuam até os nossos dias, com o
volume variando de 101 a 59 toneladas de óleo nos anos de 1994 e 1996,
respectivamente. Essa oscilação e a pequena quantidade de óleo de copaíba
consumida no mercado interno dificultam a organização de cooperativas
extrativistas nos estados do norte do país e, conseqüentemente, a sobrevivência
das comunidades que têm na exploração do óleo sua fonte de subsistência.
36
Outros períodos de grande volume de exportação foram nos anos de 1925
e 1953 (CARRARA & MEIRELLES, 1996).
Nas últimas três décadas, o destino das exportações brasileiras de óleo de
copaíba esteve dividido entre a França, a Alemanha, a Inglaterra e os Estados
Unidos, este último o principal importador, alcançando 20,8 toneladas no ano de
1973. Os últimos dados disponíveis datam de 1996. A partir de 1997, o óleo de
copaíba, por apresentar pequeno volume no montante de produtos exportados,
deixou de possuir estatística própria e passou a constar no volume de produtos
minoritários dos anuários do IBGE. Segundo estes últimos dados, a Alemanha foi o
país que mais importou o óleo de copaíba, superando os Estados Unidos e França
(COMÉRCIO EXTERIOR DO BRASIL, 1962-1996).
Na indústria de perfumes, o óleo de copaíba é uma matéria-prima
importante por ser um excelente fixador, com notas frescas e acres que combinam
muito bem com as tradicionais notas florais (SIMONETTI, 1991).
O óleo de copaíba é utilizado também nas indústrias de cosméticos
(FLEURY, 1997), por suas propriedades emolientes, como bactericida e
antiinflamatório, na manufatura de sabonetes, cremes e espumas de banho,
xampus (DEL NUNZIO, 1985), cremes condicionadores (DEL CASTILHO, 1993),
loções hidratantes (DEL CASTILHO, 1993) e capilares, para amaciar o cabelo
(SOUZA & ABREU, 1977).
Na indústria de vernizes (SIMONETTI, 1991), o óleo de copaíba é utilizado
na formulação como secativo (WAKAO, 1978), substituindo o óleo de linhaça. Na
pintura com porcelana, o óleo atua como solvente para as tintas em pó mas como
seca rapidamente (2 a 3 dias) deve ser utilizado em conjunto com outros óleos
para que a pintura demore mais para secar (WAKAO, 1978). Já na pintura em
tela, o óleo é utilizado como "amolecedor" de vernizes de pinturas antigas,
procedimento que pode gerar diluição também da camada de tinta, prejudicando
a pintura (CESAR, 1956; MASSCHELEIN-KLEINER, 1995). A utilização do óleo de
37
copaíba na indústria de fotografia, coma acelerador, também é citada na
literatura.
Os óleos de copaíba, por serem muito ricos em hidrocarbonetos
isoprenóides, podem ser convertidos, na presença de zeólitas, em misturas de
substâncias poliaromáticas (STASHENKO,
et al.,
1995). Por ser uma fonte rica e
renovável de hidrocarbonetos, o uso do óleo de copaíba como combustível
ecologicamente limpo tem sido extensamente avaliado. Calvin (MAUGH, 1979;
CALVIN, 1980; CALVIN, 1982; CALVIN, 1987) e SIERRA (1983) descreveram as
potencialidades do óleo como combustível, utilizado diretamente em mistura com
óleo diesel numa proporção de 9 litros de óleo diesel para 1 litro de copaíba. Há
também indicações na literatura da utilização do óleo de copaíba como aditivo
para butadieno na confecção de borracha sintética (TILLOTSON, 1945) e como
inibidor de corrosão de aço em solução salina (FRANCESHINI, 2002). O óleo tem
sido utilizado também como fonte de substrato quiral na síntese de biomarcadores
de sedimentos e resíduos de petróleo (IMAMURA, 1992).
Devido à grande quantidade de aplicações, muitos estudos se detiveram na
avaliação do potencial de produção dos óleos de copaíba. Alencar realizou estudos
silviculturais de regeneração natural das árvores (ALENCAR, 1984), germinação
(ALENCAR, 1981) e produção de óleos (ALENCAR, 1982). Em espécies de
C.
multijuga
, observou que a espécie apresenta alta percentagem de germinação
(87,5%) e que a produção de óleo-resina, a qual alcançou 7 litros por ano em
uma das árvores, é ideal para a comercialização com fins medicinais. Para
finalidades energéticas, entretanto, seria necessário o estabelecimento de
plantações com sementes de árvores-mãe, ou seja, espécimes que apresentassem
uma maior produção do óleo (ALENCAR, 1982). Estudos populacionais e de
germinação também foram realizados em espécies de
C. langsdorffii
(OLIVEIRA,
1995),
C. publifora
(RAMIREZ & ARROYO, 1990).
38
A casca da copaíba também encontra aplicações na tintura caseira, de onde
se retira um corante amarelo, mediante cocção, utilizado para colorir fios de
algodão (MIRANDOLA & MIRANDOLA, 1991).
1.6. Compostos Detectados no Gênero Copaifera
Os estudos mais antigos acerca do óleo de copaíba datam do início do
século XIX. Schweitzer, em 1829, foi o primeiro a descrever a solidificação do óleo
de copaíba em uma substância que cristalizava após longo tempo em repouso. A
esta substância deu o nome de ácido copaívico. Flückiger observou um depósito
similar no óleo de
Copaifera officinalis,
em Trinidad (WOOD
et al.,
1940).
FEHLING, em 1841, obteve um depósito cristalino diferente de uma copaíba do
Pará, a que ele deu o nome de ácido oxycopaívico, de fórmula molecular C
20
H
28
0
3
,
STRAUSS (WOOD
et al.,
1940), em 1865, isolou outro ácido cristalino, de fórmula
C
22
H
34
O
4
, a que ele chamou de ácido meta-copaívico, com fusão entre 205°C e
206°C. Já no século XX, Tschirch encontrou os dois ácidos acima descritos,
misturados a outros, não cristalizados (WOOD
et al.,
1940). Keto, seu
colaborador, descobriu outros dois ácidos no óleo de copaíba do Pará, a que
chamou de ácido paracopaívico, de fórmula C
20
H
32
O
3
,
de ponto de fusão entre
142°C e 145°C; e ácido homoparacopaívico, de fórmula C
18
H
28
O
3
, fundindo entre
111°C e 112°C (WOOD
et al.,
1940).
O único destes ácidos que encontra similar nos diterpenos
isolados e identificados após o advento das técnicas espectroscópicas parece
ser o ácido paracopaívico. Delle Monache (DELLE MONACHE,
et al.,
1970), 70
anos depois de Keto, isolou o ácido ent-11-hidróxi-labda-8(17), 13-dieno-15-óico
do óleo de
Copaifera multijuga,
endêmico na Região Amazônica, que possui a
mesma fórmula molecular e a mesma faixa de ponto de fusão.
Após o trabalho realizado por TSCHIRCH & KETO, 1901, DEUSSEN em
1912, GILDEHEISTER, em 1931, FREISE, em 1437 e GOTTLIEB & IACHAM, em
1945, realizaram estudos de densidade, solubilidade, índices de acidez e
39
saponificação de óleos de copaíba de diferentes espécies, assim como da
essência, separada por arraste a vapor.
A composição química dos óleos de copaíba encontra-se definida em vários
trabalhos, onde foram utilizadas técnicas mais antigas, bem como metodologias
modernas de isolamento e identificação, tais como cromatografia líquida de alta
eficiência (HPLC) (BRAGA, 1995), cromatografia com fluido supercrítico com
detector de infravermelho (SFC-FT-IR) (MORIN
et al.,
1989) e cromatografia
gasosa acoplada à espectrometria de massas com colunas cromatográficas de fase
estacionária quiral (β-ciclodextrina permetilada) (TAKEOKA
et al.,
1990).
Constatou-se serem os óleos constituídos por misturas de sesquiterpenos,
predominantes na maioria deles, e de diterpenos (VEIGA JR.,
et al.,
1995).
A FIGURA 4 ilustra um cromatograma típico de óleo de copaíba, obtido
através de cromatografia gasosa de alta resolução, com coluna de baixa
polaridade. Neste cromatograma, sesquiterpenos (eluídos entre 8 e 13 minutos) e
diterpenos (eluídos entre 20 e 26 minutos) são observados nas duas regiões de
eluição.
FIGURA 4 – Cromatograma típico de óleos de copaíba.
PINTO
et al.,
adaptaram a metodologia originalmente desenvolvida por
MCCARTHY & DUTHIE, 1962, utilizando coluna cromatográfica de sílica
impregnada com KOH para a separação de ácidos carboxílicos em biolipídios (que
40
foi depois modificada por RAMIJAK & ARPINO, 1977, para separação de
ácidos de alfaltos). Esta adaptação foi utilizada na separação dos
componentes do óleo de copaíba por classes de substâncias em: hidrocarbonetos,
álcoois e ácidos carboxílicos, de acordo com o solvente utilizado para eluição da
coluna (BRAGA
et al.,
2000).
A maioria dos estudos realizada com óleo de copaíba visou sua aplicação
comercial na indústria de perfumes e cosméticos. A fração responsável pelo aroma
do óleo de copaíba corresponde à dos sesquiterpenos. Estes compostos foram
exaustivamente estudados e, hoje, o valor de concentrados de sesquiterpenos de
Copaifera
chega a ser 600 vezes maior do que o do óleo bruto. Os sesquiterpenos
são geralmente identificados por cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR)
através da comparação de seus índices de kóvats (VEIGA JR
et al.,
1997). Óleos
comerciais, obtidos de várias regiões da Brasil, foram analisados por CGAR,
espectrometria de massas, mostrando uma grande quantidade sesquiterpenos
(mais de 40) e diterpenos, provavelmente fruto de misturas de óleos de diversas
espécies do gênero (VEIGA JR
et al.,
1997). Alguns estudos citam o óleo
essencial, obtido através da destilação direta, à pressão reduzida ou por arraste
de vapor do óleo-resina, como o verdadeiro óleo de copaíba. VEIGA JR & PINTO,
2002 estudaram os óleos obtidos por diversas técnicas de destilação dos óleos de
Copaifera multijuga
e analisaram a composição da resina e da fração
sesquiterpênica, verificando degradações provenientes do processo de destilação.
Alguns compostos encontrados em óleos de copaíba apresentam aromas
marcantes, sendo utilizados pela indústria de perfumes, como o α-humuleno
(HARBONE & BAXTER, 1983), cariofileno (MERCK INDEX, 11° ed.), α e β-selineno
e β-bisaboleno (DUKE). Entre os sesquiterpenos que foram encontrados em óleos
de copaíba, α-copaeno, β-cariofileno, β-bisaboleno, α e β-selineno, α-humuleno e
δ e γ-cadineno foram descritos em grande parte dos óleos estudados.
Alguns autores (LANGENHEIM,
et al.,
1990) relacionam a variação na
composição dos óleos em função de fatores bióticos externos, tais como a injúria
41
provocada por insetos ou fungos (LANGENHEIM, 1990). Um exemplo seria a
produção de β-cariofileno, que é particularmente efetivo contra lepidópteros, e de
seu óxido, que atua diretamente na inibição de fungos. As variações na
composição sesquiterpênica dos óleos, porém, são muito grandes, descritas
durante a maturação, ocorrendo sazonalmente em uma árvore, numa mesma
espécie e entre espécies (LANGENHEIM,
et al.,
1990). A presença de α-copaeno
ou α-ilangeno nos óleos de copaíba, usualmente detectada através de
cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR), só pode ser confirmada
utilizando-se a injeção realizada diretamente na coluna (On-Column), nas análises
por CGAR, uma vez que os dois compostos sofrem isomerização durante a
vaporização no injetor. A presença das duas séries de estereoisômeros entre
sesquiterpenos de óleos de copaíba é relatada na literatura (TAKEOKA,
et al.,
1990) para o α-copaeno, como 99% dextrógiro (+) e 1% levógiro (-). A presença
majoritária do isômero (+) é importante, pois somente o (+)-α-copaeno é efetivo
na atração da mosca de fruta do Mediterrâneo, uma praga que ataca frutas e
flores na Europa (TAKEOKA,
et al.,
1990).
Apesar da extensa literatura sobre óleos de copaíba, poucas referências
discriminam a espécie de Copaifera que está sendo estudada. Somente 5 espécies
têm sua composição química descrita na literatura. Muitos artigos não definem o
local da coleta do óleo e outros citam locais onde a espécie não é endêmica. As
espécies de
Copaifera
estudadas com identificação botânica, de acordo com sua
localização, são:
C. multijuga
Hayne, abundante na região Amazônica,
C.
langsdorffii
Desf., encontrada na região do cerrado, no nordeste, centro-oeste e
sudeste brasileiro,
C. cearensis
Huber ex Ducke, nordeste brasileiro e
C. officinalis
L. e
C. reticulata
Ducke encontradas ao norte da Amazônia ocidental na região
que se estendo até a Venezuela (DWYER, 1951).
Os 28 diterpenos, descritos nos óleos de copaíba estudados, pertencem aos
esqueletos caurano (ácidos cauranóico e caurenóico – FIGURA 5), labdano e
clerodano. Em estudo realizado com diversos óleos de copaíba provenientes de
várias regiões do Brasil, o ácido copálico foi o único encontrado em todos os óleos
42
analisados (VEIGA JR & PINTO, 1997). Por esta razão, este diterpeno ácido
pode ser usado como biomarcador de óleos de copaíba (VEIGA JR & PINTO,
1997).
CAURANO CLERODANO LABDANO
FIGURA 5 – Numeração e estereoquímica normal dos esqueletos diterpênicos:
caurano, clerodano e labdano. Sistema decalínico representado pelos anéis A e B.
Estudos fitoquímicos foram também realizados com as sementes de
Copaifera salikounda
Heck, uma espécie do sul da África Ocidental (FICALHO, 1929),
sendo detectadas cumarinas. Em estudos mais recentes realizados com o óleo das
sementes de uma espécie de
Copaífera
brasileira foram encontrados cumarinas
(0,15%) e os ácidos palmítico (24,9%), oléico (35,3%), linoléico (35,7%),
araquidínico (1,1%) e beênico (3,0%) (CRAVEIRO
et al.,
1978). Estudos realizados
com óleos de sementes de
C.
langsdorffii
mostraram a presença da cumarina
umbeliferona (CRAVEIRO
et al.,
1978) e de oligossacarídeos xiloglucânicos (MORS
& MONTEIRO, 1959; BUCKERIDGE,
et al.,
1992) com rendimento de 40% do peso
seco da semente e alto peso molecular (2.000.000) (FRANCO
et al.,
1996).
Aminoácidos não protéicos, como o N-metil-
trans
-4-hidroxi-L prolina, foram
encontrados como cerca de 2-3% do peso seco das folhas das espécies
C.
langsdorffii, C. multijuga, C. pubiflora, C. venezuelana
e
C. offlicinalis
(LANGENHEIM,
et al.,
1987)
.
43
1.7. Atividades Farmacológicas do Gênero Copaifera
O Food and Drug Administration (FDA), órgão de regulamentação de
drogas e alimentos do governo americano, aprovou o óleo de copaíba em 1972
(FCC, 1972). Testes de irritação e sensibilização do óleo de copaíba foram
realizados com 25 voluntários, não se observando estes tipos de reação
(KLIGMAN, 1966).
Entre as propriedades medicinais dos óleos de copaíba, a mais estudada foi
a antiinflamatória. ZANINI
et al.,
1988, estudaram a atividade antiinflamatória do
óleo em ratos utilizando diversos modelos, como inibição de edema induzido por
carragenina, inibição de formação de granuloma “Cotton-pellet” e aumento de
permeabilidade vascular. Seus resultados indicam que o óleo possui atividade
antiinflamatória e baixa toxidez (DL
50
3.79 mL/kg). Apesar dos efeitos adversos
por altas doses do óleo (irritação gastro-intestinal, diarréia, sialorréia e depressão
do sistema nervoso central), seu uso é plenamente justificado na medicina
popular. O estudo feito por ZANINI
et al.,
1988, foi realizado com óleo comercial,
sem identificação botânica da espécie que o produziu.
FERNANDES,
et al.,
1992, estudaram o efeito analgésico e antiinflamatório
dos óleos de
Copaifera cearensis,
comparado-os com os da indometacina e com o
de alguns derivados isolados de óleos de copaíba como o ácido copálico, o éster
metílico do ácido solidago e bisabolol. Os resultados do estudo indicam que o óleo
possui atividades antiinflamatória e analgésica maiores que aquela dos três
compostos estudados isoladamente, porém menores que da indometacina
(FERNANDES,
et al.,
1992).
Estudos recentes realizados com diversos óleos de copaíba comerciais
(VEIGA JR.,
et al.,
2001) de
Copaifera multijuga
mostram que a fração que contém
hidrocarbonetos tem maior atividade antiinflamatória do que as frações de álcoois
sesquiterpênicos e ácidos diterpênicos.
44
Óleos de copaíba comerciais mostraram atividades de proteção contra a
penetração de cercárias de
Schistosoma mansoni
(GILBERT,
et al.,
1972), e como
cercaricida (MAHAJAN & FERREIRA, 1971; MAHAJAN,
et al.,
1972), piscicida
(MAHAJAN,
et al.,
1972) e repelente de insetos (LACEY,
et al.,
1981; JONES,
et
al.,
1983). Atividades antimicrobiana e antibacteriana também são relatadas na
literatura (MARUSSELLA & SICURELLA, 1960; ABDULLIM, 1962; OPDYKE, 1976;
LIMA,
et al.,
1995; CASCON,
et al.,
2000; MIRANDA,
et al.,
2000).
Estudos de absorção na pele de camundongos, entretanto, mostraram que
a absorção percutânea do óleo de copaíba é muito lenta, por volta de noventa e
dois minutos (MEYER, 1959).
A atividade anti-tumoral de óleos de
Copaifera langsdorffii
foi observada
contra carcinoma IMC, em camundongos (OHSAKI,
et al.,
1994). O fracionamento
guiado por bioensaio mostrou que os diterpenos colavenol e o ácido hardwíckico
apresentam potente atividade anti-tumoral, sem, contudo, apresentarem
citotoxicidade contra as mesmas células (OHSAKI,
et al.,
1994). Para os óleos de
C. multijuga
a atividade anti-tumoral vem sendo estudada
in vivo
e
in vitro
, sendo
observada esta atividade também para o óleo desta espécie. Nestes estudos, o
óleo de
C. multijuga
tem inibido o crescimento tumoral (melanoma murino
B16F10) através da redução da formação de nódulos de metástase no tecido
pulmonar. Experimentos de viabilidade celular, realizados
in vitro
com este mesmo
óleo, mostram uma significativa redução no número de células de melanoma
viáveis. O óleo de
Copaifera multijuga
mostrou-se também tóxico e com potente
atividade antitumoral tempo e dose dependente em ensaios contra células de
mastocitoma murino P815 (LIMA,
et al.,
2000).
A atividade gastroprotetora do óleo de
Copaifera langsdorffii
foi avaliada em
lesões gástricas induzidas por etanol e indometacina. Ratos pré-tratados com o
óleo desta copaíba foram protegidos em doses a partir de 400mg/kg. Os
resultados obtidos sugerem que a ação deste óleo se deve a diminuição de acidez
gástrica, provavelmente através da promoção da secreção de muco gástrico e
45
bicarbonato, como foi demonstrado em pesquisa no Laboratório de Produtos
Naturais do Departamento de Farmacologia da Universidade Federal do Ceará
(PAIVA,
et al.,
1998).
As propriedades cicatrizantes de feridas e úlceras, uma das principais
indicações dos óleos de copaíba, foram estudadas em óleos comerciais por BRITO,
et al.,
1998, 1999, e nos óleos de
Copaifera langsdorffii
, por PAIVA
et al.,
2002.
Nos estudos de Brito, realizados em modelo de ferida aberta, os ratos que
receberam óleo de copaíba na região dorsal apresentaram aumento de tecido de
granulação e do número de vasos sanguíneos, porém, diminuição da
quantidade de fibras colágenas (BRITO,
et al.,
1998, 1999).
Nos experimentos realizados por PAIVA
et al.,
2002, o óleo mostrou-se
bastante ativo nos ratos em modelos de ferida aberta, resistência à tensão e
úlcera crônica de estômago, produzida por ácido acético.
Uma das áreas em que se vem pesquisando intensamente a utilização do
óleo de copaíba atualmente é a odontológica (PINHEIRO, 1993; BOMBONATTI&
SCARANELO, 1996; COSTA,
et al.,
1996). BANDEIRA, 1998, estudou a composição
do óleo essencial, separado da resina do óleo de
Copaifera multijuga
e sua
compatibilidade biológica em molares de rato, associados ao hidróxido de cálcio
como veículo e as atividades bactericida e bacteriostática das duas frações frente
ao óleo bruto. Os resultados de biocompatibilidade, obtidos com hidróxido de
cálcio misturado ao óleo essencial do óleo de
Copaifera multijuga
, mostraram um
melhor desempenho histopatológico que aquele com o hidróxido de cálcio
misturado ao óleo de copaíba e ao polietilenoglicol, utilizado tradicionalmente. Os
estudos de atividade antibacteriana mostraram maiores atividades bactericida e
bacteriostática do óleo de
Copaifera multijuga
, frente a
Streptococcus mutans
,
enquanto o óleo essencial apresentou melhor ação bactericida e a resina
apresentou-se apenas bacteriostática.
46
Propriedades anti-oxidantes são descritas para o extrato metanólico das
cascas de
C. reticulata
. Testado quanto à redução de radicais livres, indicadores
de dano ao DNA, o extrato metanólico mostrou-se bastante ativo, apresentando
CI
50
3µg/ml, menor que a padrão utilizada, catequina (CI
50
5µg/ml)
(DESMARCHELIER,
et al.,
1997). O potencial anti-oxidante reativo total deste
extrato também foi analisado quanto à redução de radicais livres em ensaios de
quimioluminescência, mostrando uma atividade de 7500 µM, em valores relativos
ao padrão, Trolox (DESMARCHELIER,
et al.,
1997).
Estudos
in vitro
e
in vivo
com a
Copaifera multijuga
Hayne e suas frações
mostraram uma atividade anticancerígena (LIMA
et al.,
2003).
Vários dos compostos já isolados ou detectados nos óleos de copaíba já
tiveram propriedades farmacológicas, descritas na literatura. Entre os
sesquiterpenos, algumas propriedades como antiúlcera (YAMAHARA, 1992),
antiviral (DENYER,
et al.,
1992) e antirinovírus (DENYER,
et al.,
1992) são
descritas para o ar-curcumeno e o β-bisaboleno, este último também descrito
como abortivo (PEI-GEN & NAI-GONG, 1991). O bisabolol é conhecido por conferir
propriedades antiinflamatória e analgésica à camomila (Matricaria chamomilla)
(ZCKOVIC,
et al.,
1994), o β-elemeno é descrito coma anticâncer (cérvico)
(LEEWENBERG, 1987) e cariofileno e δ-cadineno como anti-cariogênico, sendo
este último também bactericida (CMI 8OOµg/ml) (KUBO & MUROI, 1993).
Entre estes, entretanto, os que foram mais estudados e se mostraram
ativos num maior número de ensaios foram o cariofileno e seu óxido. O cariofileno
é descrito na literatura como: anti-edêmico (SHIMIZU
et al.,
1990), fagorrepelente
(KEELER & TU, 1991), antiinflamatório (CI=100µM) (SHIMIZU
et al.,
1990),
antitumoral (ZHENG
et al.,
1992), bactericida (KANG
et al.,
1992), insetífugo
(JACOBSON, 1990) e antialérgico (TANAKA
et al.,
1996). Algumas destas
atividades são também conferidas ao óxido (SHIMIZU
et al.,
1990; KEELER & TU,
1991; ZHENG
et al.,
1992), além de inseticida (BERTTARINI & BORGONOVI,
1991).
47
O ácido kaurenóico é descrito na literatura como tripanossomicida (ALVES,
et al.,
1995), atividade conferida também a óleos de copaíba que não contêm este
diterpeno (YAMAHARA, 1992). Estudos realizados com ácido kaurenóico isolado de
Copaifera langsdorffii
mostram também atividade relaxante do músculo liso, sobre
contrações uterinas induzidas (ALENCAR CUNHA, et al., 2003).
O ácido kaurenóico e seus derivados foram capazes de inibir a atividade da
Na-K-ATPase (NATTAYA, 2003). Um grande número de diterpenos tem mostrado
capacidade de modular o processo inflamatório inibindo a atividade do fator
nuclear kappaB (NF-kappaB) (CASTRILLO
et al.,
2001).
Apesar da extensa literatura que trata dos óleos de copaíba, poucos são os
artigos onde é encontrada a identificação botânica da espécie estudada. Os
estudos de atividade biológica confirmam a sabedoria popular e o conhecimento
adquirido dos índios pelos portugueses já no início da colonização. Poucos deles,
porém, conseguem identificar os princípios ativos apesar de sugerirem que
compostos fortemente ativos estão presentes.
Tudo isso indica que apesar de toda a pesquisa já realizada, os óleos de
copaíba são potencialmente importantes como fonte de princípios ativos em
farmacologia, portanto, resolvemos utilizar o óleo de copaíba bruto e o seu
constituinte isolado, o ácido kaurenóico, nos modelos de colite ulcerativa e
isquemia-reperfusão e cicatrização, na busca de substâncias capazes de interferir
nas injúrias causadas por estes importantes modelos experimentais.
1.8. Doenças Inflamatórias Intestinais (DII)
As doenças inflamatórias intestinais (DII), termo que compreende,
principalmente, doença de Crohn e colite ulcerativa, são um problema de saúde
pública em muitos países. A incidência de DII varia dentro de regiões diferentes.
Por exemplo: na Ásia e na América do Sul as taxas de incidência da colite
48
ulcerativa e da doença de Crohn são de 0,5 e 0,08 por 100.000 habitantes,
respectivamente. Já nos EUA a incidência é de 11 por 100.000 habitantes para
colite ulcerativa e 7 para 100.000 habitantes para doença de Crohn (DAMIÃO &
HABR-GAMA, 1993).
A idade de início da doença está entre os 15 e os 30 anos, tendo um
segundo pico entre os 60 e os 80 anos. Não há predominância de sexo, mas uma
possível associação com certas síndromes genéticas. Suas etiologias permanecem
mal definidas (STEIDLER
et al.,
2000).
Sugere-se que as DII decorram de anormalidades imunológicas celulares,
ou seja, da reatividade anormal dos linfócitos T da mucosa gastrointestinal a uma
microflora normal não patogênica, porém a patogênese permanece desconhecida
(MATSUMOTO,
et al.,
2001).
As DII caracterizam-se por inflamação intestinal crônica não infecciosa e
manifestam-se clinicamente por diarréia, dor abdominal, perda ponderal e
náuseas. A mortalidade é baixa e geralmente acontece nos primeiros anos da
doença. Isto ocorre quando há alterações nutricionais, podendo causar
desidratação e anemia, que aumentam a morbidade gerada pelas crises de
diarréia (STEIDLER
et al.,
2000). Nas doenças de longa duração a mortalidade
está associada ao risco de câncer de cólon.
1.8.1. DOENÇA DE CROHN
A
Doença de Crohn
caracteriza-se por um envolvimento transmural e
descontínuo dos intestinos, podendo atingir todo o tubo digestivo. Sua incidência
nas últimas décadas vem aumentando. É mais comum na raça branca, iniciando-
se mais freqüentemente entre os 20 e os 30 anos. Tem um componente genético
hereditário importante e prevalência maior em indivíduos HLA-2 +, bem como nos
HLA-B27+ quando associada à espondilite anquilosante. A etiologia é
desconhecida, conquanto se estudem, além das causas imunes, possíveis causas
49
infecciosas. Observa-se, com freqüência, piora ou início da doença de Crohn
associada a crises emocionais. A apresentação clínica da doença varia de acordo
com a extensão, a intensidade e as complicações presentes. Acomete, com maior
freqüência, o íleo terminal e o cólon, iniciando-se tipicamente com crises de
diarréia, febre, dor abdominal e emagrecimento. Na evolução, podem surgir
complicações locais, nutricionais e sistêmicas. A doença se agrava e as crises
tornam-se mais freqüentes, gerando comprometimento do estado geral e piora da
qualidade de vida do indivíduo (MAGALHÃES, 1993).
1.8.2. COLITE ULCERATIVA
A
colite ulcerativa
consiste em uma inflamação idiopática que envolve a
mucosa do cólon e do reto, resultando em friabilidade difusa e erosões com
sangramento. Pode, em 40 a 50% dos pacientes, ser limitada ao reto ou ao
retossigmóide. Em 30 a 40% dos doentes vai além do sigmóide, não atingindo o
cólon em toda a sua extensão e numa minoria, não mais do que 20%, atinge todo
o cólon. Os principais sintomas são: diarréia, enterorragia, tenesmo, eliminação de
muco e dor abdominal tipo cólica. A doença é caracterizada por períodos de
recidiva sintomática e remissões e os sintomas, em geral, permanecem por
semanas e até meses. Além disso, há intensa correlação da gravidade com a
extensão da doença. Existem manifestações extra-intestinais em
aproximadamente 25% dos doentes, incluindo o eritema nodoso, a epiesclerite e a
artrite não deformante oligoarticular, entre outras (MAGALHÃES, 1993; PEAKMAN
& VERGANI, 1999).
Nos últimos anos, uma das doenças mais estudadas tem sido a colite
ulcerativa. Tal interesse deriva de suas variadas formas de apresentação, do
crescente número de diagnósticos nos últimos anos, da importante
morbimortalidade e de seu elevado custo social (HOULI & NETTO, 1984;
TEIXEIRA,
et al.,
1988; HAY & HAY,1992; HODGSON, 1994). O marcado aumento
no risco de câncer colorretal, chegando em alguns estudos a uma incidência
cumulativa em 35 anos de até 25 % em pacientes com pancolite
(BROSTRÖM
et
50
al.,
1987; EKBOM
et al.,
1990; LENNARD-JONES
et al.,
1990; PINCZOWSKI
et al.,
1994) e o grau de incapacidade que a doença pode trazer
(FERGUSON
et al.,
1994) reforçam a relevância do assunto e a necessidade crescente da investigação
nesta área.
O tratamento da colite ulcerativa encontra-se restrito pela sua patogênese
obscura e pelo limitado entendimento dos eventos imunoinflamatórios que a
desencadeiam. Até o momento, a intervenção terapêutica concentra-se,
principalmente, no combate às conseqüências da amplificação das cascatas
imunológicas e inflamatórias e às repercussões sistêmicas destas. O
entendimento, ainda que incompleto, destes mecanismos tem proporcionado o
desenvolvimento de linhas de pesquisa. Desta maneira, além dos tratamentos já
consagrados avalia-se a utilização de imunomoduladores, inativadores de radicais
livres, inibidores da síntese de leucotrienos e de inibidores do recrutamento de
neutrófilos entre outros (BRYNSKOV, 1993; BERSTEIN & SHANAHAN, 1994; VAN
HOGEZAND, 1994).
Modelos mais elaborados de pesquisa apresentam inúmeras dificuldades
seja na operacionalização, possibilidade de vieses, dificuldade de extensão de suas
conclusões ou pelo custo e tempo de realização. Neste contexto, os modelos
experimentais de indução de colite, guardadas as suas limitações, podem servir
como alternativas viáveis para estudar sua etiopatogenia ou mesmo seu manejo
terapêutico (FUCHS & WANNMACHER, 1998). Existem vários modelos de indução
da colite (ácido acético, ácido trinitrobenzenosulfônico, carragenam/sulfato
dextram, imunocomplexos, indometacina, tamarin, HLA-B27) (MACPHERSON &
PFEIFFER, 1978; MORRIS
et al.,
1989; FEDORAK
et al.,
1990; FABIA
et al.,
1992;
YAMADA
et al.,
1992; STENSON, 1994; WARREN & WATKINS, 1994; TANNAHILL
et al.,
1995; ZAHAVI
et al.,
1995).
As opções terapêuticas disponíveis para o tratamento das doenças
inflamatórias intestinais, doença de Crohn e colite ulcerativa promovem remissão
das crises, mas não a cura da doença. Entre as mais conhecidas estão
51
sulfasalazina, o ácido 5-aminosalicílico (5-ASA), os corticosteróides e os agentes
imunossupressores e imunorreguladores (azatioprina, mercaptopurina,
methotrexate e ciclosporina). Muitos estudos estão sendo realizados em busca de
novos tratamentos, entre eles: citocinas e anticitocinas (IL-1, IL-2, IL-10, IL-11,
IL-12, UL-18), interferon—alfa e gama (IFN-α e IFN-γ), supressores do TNF-α
(talidomida, extrato polifenol de chá verde), vitamina D, antioxidantes,
antibióticos, nicotina e óleo de peixe (BIONDO-SIMÕES
et al.,
2003)
1.8.3. ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO E AS DIIS
A DII é caracterizada pelo desenvolvimento de uma inflamação intestinal
resultante da liberação local de mediadores inflamatórios (citocinas, eicosanóides)
e de espécies reativas de oxigênio que levam ao aumento da permeabilidade
vascular, recrutamento de células inflamatórias e finalmente dando origem a
ulceração da mucosa (GRISHAM, 1994; STENSON, 1990).
O intestino delgado e cólon contêm uma grande variedade de enzimas
capazes de gerar significativas quantidades de espécies reativas de oxigênio,
incluindo a xantina oxidase, aldeído oxidase, prostaglandina sintase, lipoxigenase
e uma variedade de amino oxidases como a monoamino oxidase e diamino
oxidase. A fonte mais significativa destes radicais no intestino, com inflamação
crônica, são os leucócitos fagocitários (ex. neutrófilos, eosinófilos, monócitos e
macrófagos) – é bem conhecido que episódios ativos de DII idiopática são
caracterizados pelo extravasamento e infiltração de um grande número de
leucócitos no interstício. Este aumento do infiltrado inflamatório é acompanhado
pela injúria da mucosa incluindo aumento da permeabilidade vascular,
rompimento da matrix extracelular, edema, dano às células epiteliais e ulceração.
Desde que a função primária das células fagocitárias é destruir microorganismos
invasores, estas células possuem a habilidade de sintetizar e liberar grandes
quantidades de radicais livres oxigenados. Embora não seja claro se estas células
iniciam ou exacerbam a injúria intestinal, há boa evidência para sugerir que a
inibição farmacológica ou imunológica de suas funções fagocitárias e de liberação
52
de mediadores atenuam a injúria e a disfunção associada à DII experimental ou
humana (WALLACE,
et al.,
1989; LAUREN,
et al.,
1990; HARRIS,
et al.,
1992).
Estudos utilizando detecção por quimioluminescência mostram elevada
concentração de radicais livres oxigenados produzidos pelo cólon de animais com
colite experimental e em pacientes com inflamação intestinal ativa
(KESHAVARZIAN,
et al.,
1992a; SIMMONDS,
et al.,
1992). OSHITANI,
et al.,
(1993) utilizando localização histoquímica demonstraram que células endoteliais
vasculares e monócitos de pacientes, com colite ulcerativa, produzem altas
concentrações de ânion superóxido.
Em adição, os níveis de alguns antioxidantes estão diminuídos no cólon
humano (GRISHAM,
et al
., 1990; MULDER,
et al
., 1991) e a maior parte da
atividade enzimática da mucosa está associada com as células epiteliais do cólon,
cujo interstício é essencialmente isento de significativa defesa enzimática contra
estes radicais livres. Os radicais e oxidantes produzidos pelos leucócitos
fagocitários, no intestino com inflamação crônica, podem facilmente abater o
tecido, resultando em modificações oxidativas de vários alvos biológicos.
AHNFELT-RONNE
et al
., (1990) encontraram que biópsias de cólon, de
pacientes com DII ativa, apresentam níveis elevados de produtos da peroxidação
lipídica. BUFFINGTON & DOE (1995) demonstraram que as defesas antioxidantes
da mucosa estavam depletadas em amostras de biópsia de intestino inflamado de
pacientes com DII, sugerindo que tal deficiência pode comprometer severamente
a mucosa inflamada aos efeitos deletérios dos radicais livres oxigenados.
Várias linhas de evidências demonstram o efeito benéfico da suplementação
antioxidante no intestino inflamado. Em modelos animais de colite, alguns
benefícios terapêuticos foram observados com superóxido dismutase, catalase e
α-tocoferol (KESHAVARZIAN
et al.,
1990; KESHAVARZIAN
et al.,
1992b;
BLUMENSTEIN
et al.,
1994).
53
Em adição, o intestino inflamado cronicamente é conhecido por produzir
altos níveis de óxido nítrico (MIDDLETON,
et al.,
1993). Embora as fontes desta
geração de óxido não tenham sido claramente identificadas, existem crescentes
evidências sugerindo que leucócitos fagocitários, assim como células epiteliais
intestinais, possam ser dois fortes candidatos. As citocinas, como o Fator de
Necrose Tumoral, Interferon-γ e interleucina-1β estão elevadas no intestino e/ou
cólon com inflamação crônica (SARTOR, 1994). Reunido ao fato que essas
citocinas sejam indutoras da NO sintase em macrófagos, neutrófilos e células
endoteliais (MONCADA & HIGGS, 1993) não é difícil de imaginar um cenário onde
a inflamação induz a produção de óxido nítrico. Estudos mostram que a
administração de certos inibidores da NO sintase atenuam a injúria tecidual e a
inflamação em diferentes modelos de DII, sugerindo que o óxido nítrico possa
exercer um papel direto ou indireto na promoção da inflamação e disfunção
intestinal, sendo possível que a inibição do óxido nítrico possa proteger o intestino
pela promoção da vasoconstricção, desse modo limitando a chegada de células e
mediadores inflamatórios para o tecido (DAVID
et al.,
1997).
Uma variedade de mecanismos antioxidantes está envolvido para combater
um potencial ameaçador dos radicais livres sobre as estruturas biológicas vitais ao
organismo (HALLIWELL, 1990; HALLIWELL &GUTTERIDGE, 1990; STOCKER &
FREI, 1991).
Frente à produção fisiológica, mas potencialmente perigosa, de radicais
livres oxigenados, o organismo dispõe de defesas enzimáticas específicas. Estas
enzimas, presentes no local de produção dos radicais livres, mantêm os mesmos
em concentrações muito baixas (SIMON
et al.,
1997).
A Catalase (HALLIWELL, 1988) está localizada no interior dos peroxisomas
(organelas celulares que desempenham um papel importante na desintoxicação de
diversos produtos), sua função é de catalisar a dismutação do peróxido de
hidrogênio em água e em oxigênio molecular.
54
A Glutationa Peroxidase é uma enzima citosólica e intramitocondrial sendo o
mecanismo para remoção do peróxido de hidrogênio mais importante que a
catalase. A glutationa peroxidase, a única enzima humana conhecida que contém
selênio em seu grupo prostético (selenometionina, um componente do centro
ativo), catalisa a reação de peróxido de hidrogênio e glutation reduzido, formando
água e glutation oxidado (GRIEB, 1992). Este sistema limita igualmente a
propagação de radicais livres, ao reduzir os hidroperóxidos (ROOH) instáveis em
ácidos graxos hidroxilados (ROH).
A cooperação de vários elementos dos sistemas antioxidantes e sua
importância em proteger o organismo contra oxidações patogênicas ainda estão
longe de serem elucidadas. O homem continua a pesquisa para elucidação deste
sistema na busca de um composto antioxidante que apresente além de uma
esperada atividade catalítica, a habilidade de penetração nas células, baixa
toxicidade e baixo custo.
1.8.4. ANTIOXIDANTES DERIVADOS DE PLANTAS
Uma grande variedade de plantas medicinais e de seus princípios ativos
apresentam atividade antioxidante.
O alho (
Allium sativum
) atenua o dano cerebral induzido pela isquemia
cerebral em ratos (NUMAGAMI
et al.,
1996), protege contra a hepatoxicidade
induzida por acetaminofeno (WANG
et al.,
1996), assim como seu princípio ativo
“allicin”, que previne a peroxidação lipídica de homogenato hepático
in vitro
(PRASAD
et al.,
1995).
O ginseng (
Panax ginseng
) planta medicinal chinesa utilizada
tradicionalmente para aumentar a resistência física e combater o estresse e a
fadiga também apresenta atividade antioxidante (GILLIS, 1997), sendo capaz de
sequestrar radicais hidroxila e prevenir a peroxidação lipídica (ZHANG
et al.,
1996).
55
No México, assim como nos países da América Central o consumo de
pimenta (
Capsicum annum
) é tradicional a centena de anos e esta é importante
fonte de beta-caroteno e vitamina A, os quais possuem propriedade antioxidante
(GONZAEZ DE MEJIA
et al.,
1998).
O “Silymarin”, uma mistura de flavonolignanas da planta medicinal
Silybum
marianum
, é utilizada no tratamento de suporte de doenças hepáticas devido ao
seu efeito hepatoprotetor, que é considerado envolver efeito antioxidante e
estabilizador de membrana (SKOTTOVA & KREIMAN, 1998), além de promover
gastroproteção no modelo de injúria gástrica induzida por isquemia-reperfusão
(ALARCÓN DE LA LASTRA
et al.,
1995).
O guaraná (
Paullinia cupana
) apresenta atividade antioxidante em inibir a
peroxidação lipídica (MATTEI
et al.,
1998).
O extrato de
Polygonum multiflorum
e uma fração contendo antraquinonas
produzem proteção dose dependente contra a injúria miocárdia induzida pela
isquemia-reperfusão em ratos (YIM
et al.,
1998).
“Rubiadin”, uma dihidroxiantraquinona isolada do extrato alcoólico de
Rubia
cardifolia
possui potente propriedade antioxidante. Previne a peroxidação lipídica e
sua propriedade antioxidante é melhor que a do EDTA, Tris, manitol e vitamina E
(TRIPATHI
et al.,
1997).
O EGb761 (Tebonin
®
, Byk Química e Farmacêutica) é um extrato
pradonizado das folhas de
Gingko biloba
sendo um potente antagonista da
produção de radicais livres e da peroxidação das membranas celulares. O suporte
bioquímico destas atividades pode ser os glicosídeos gikgoflavonas e as
proantocianidinas. A proteção das membranas celulares explica claramente os
efeitos obtidos sobre o vasoespasmo arterial e sobre a reatividade metabólica dos
56
tecidos isquêmicos (GARDÉS-ALBERT
et al.,
1990; GUILLON
et al.,
1986;
PINCEMAIL & DEBY, 1986).
1.9. Isquemia
Durante o episódio da isquemia, ou seja, quando existe oferta insuficiente
de oxigênio, o rendimento da cadeia respiratória mitocondrial é baixo. Em
anaerobiose, duas moléculas de ATP são produzidas a partir de uma molécula de
glicose, contra 36 em aerobiose. A hipóxia persistente induz uma crise energética
na bomba Na-K-ATPase da membrana, com entrada de sódio e cálcio na célula, o
que aumenta a pressão osmótica e o edema intracelular. O cálcio intracelular ativa
a fosfolipase A
2
(com aumento nas taxas de ácidos graxos livres), enzima esta que
converte a xantina-desidrogenase em xantina-oxidase, fonte de ânion superóxido.
Paralelamente, o metabolismo de ADP em anaerobiose se realiza até a síntese de
AMP, de adenosina, de inosina e de hipoxantina (BULKLEY, 1987).
Todas estas pertubações celulares são reversíveis, no entanto, no momento
da reperfusão, as células isquêmicas são submetidas a um “estresse oxidativo”
que irá acelerar sua destruição (BULKLEY, 1987).
Durante a reperfusão, a produção de radicais livres na zona isquêmica é
intensa e os sistemas de proteção estão deprimidos (diminuição das taxas de
SOD, catalase e glutationa peroxidase) (BULKLEY, 1987).
A superprodução de radicais durante a reperfusão pode ocorrer devido a
ativação dos neutrófilos polimorfonucleares acumulados na zona isquêmica
(acelerando o consumo de oxigênio e ativando a NADPH-oxidase da membrana), o
que origina uma produção e difusão extracelular de radicais livres; por reação dos
produtos do metabolismo anaeróbio, ou seja, hipoxantina e xantina oxidase, os
quais, em presença do oxigênio, formam a xantina e o ânion superóxido, o qual
reage com óxido nítrico para formar peroxinitrito; por transformação do ácido
aracdônico acumulado durante a fase isquêmica, originando a síntese de
57
endoperóxidos e a produção de radicais livres (BULKLEY, 1987; SAMDAMI
et al.,
1997).
Os radicais livres formados durante a reperfusão (O
2
e H
2
O
2
transformados
em OH) reagem com as membranas celulares fosfolipídicas (resultando em
alterações na fluidez, aumento da permeabilidade e perda da integridade da
membrana), proteínas e ácidos nucléicos, provocando a desorganização estrutural
e funcional da célula e sua morte. Eles atuam sobre os ácidos graxos livres
acumulados durante a fase isquêmica e podem desviar a cascata do ácido
araquidônico em direção à via metabólica vaso-constrictora e pró-agregante do
tromboxano A
2
. Estes radicais são agentes quimioatrativos para as plaquetas
(adesão e agregação) e os neutrófilos polimorfonucleares, os quais ativam a
aderência ao endotélio e somam sua própria produção de radicais (BULKLEY,
1987).
Os radicais livres oriundos da isquemia tissular contribuem ao agravamento
desta, seja exercendo seus efeitos negativos diretamente (oxidação de lipídios,
proteínas,ácidos nucleicos) ou induzindo um colapso microcirculatório por ação
sobre o endotélio vascular, plaquetas e neutrófilos (diminuição das taxas de
prostaciclina e aumento das taxas de tromboxano A
2
), tais reações originam o
fenômeno de não-reperfusão que se observa durante os reimplantes cirúrgicos
(BULKLEY, 1987).
Estudos experimentais têm demonstrado que radicais livres de oxigênio e
peroxidação lipídica exercem importante papel na patogênese da lesão gástrica
aguda induzida pela isquemia-reperfusão. O sistema xantina oxidase tem sido
proposto como fonte primária destes radicais, seguido pelos neutrófilos. A
estimulação do metabolismo oxidativo neutrofílico resulta na liberação de grandes
quantidades de O
2
, H
2
O
2
e H
+
. Em adição, neutrófilos secretam a enzima
mieloperoxidase no meio extracelular, onde esta catalisa a oxidação de CL
-
pelo
H
2
O
2
para produzir o potente oxidante citotóxico ácido hipocloroso (HOCL) e N-
Cloraminas (ALARCÓN DE LA LASTRA
et al.,
1995).
58
A glutationa, um antioxidante encontrado em altas concentrações no fígado
(KAPLOWITZ
et al.,
1985), neutraliza vários tipos de radicais, diretamente ou em
associação com a glutationa peroxidase. Estudos prévios mostram que a
glutationa é consumida durante a isquemia de reperfusão, indicando geração de
radicais livres (STEIN
et al.,
1991). Porém a relação entre as alterações neste
sistema e a fase isquemia-reperfusão não foi totalmente elucidade (ERDEN &
BOR, 1984; BORREGAARD
et al.,
1987).
Durante o período de reperfusão após a isquemia, a suspensão parcial ou
completa do fluxo sanguíneo ocorre em vários leitos vasculares. Tem sido sugerido
que o fenômeno de não refluxo na reperfusão da isquemia hepática resulta de
ligação microvascular de capilares ou sinusóides com leucócitos e plaquetas
agregadas. O ânion superóxido também pode contribuir para este fenômeno (KOO
et al.,
1991).
A prevenção da geração de espécies reativas de oxigênio, principalmente
de ânions superóxido que durante a fase de reperfusão reagem com óxido nítrico
para formar peroxinitrito (SAMDANI
et al.,
1997), pela utilização de estratégias
que neutralizem estes ânions ou que inibam seletivamente a óxido nítrico sintase
promovem proteção contra o desenvolvimento de injúria do órgão (DALKARA &
MOSKOWITZ, 1997)
1.10. Permeabilidade Intestinal
A mucosa gastrointestinal executa duas importantes tarefas, cada uma tem
suprema importância para o organismo. Primeiro, a mucosa participa na digestão,
absorção e ingestão de nutrientes, água e eletrólitos; segundo é constituída de
uma eficiente barreira que impede a entrada de componentes químicos
potencialmente tóxicos, exemplo: agentes tóxicos, imunogênico ou carcinogênico
que são barrados na parede intestinal. As junções firmes que unem as células
59
epiteliais são de fundamental importância para manter a integridade da barreira
(POWELL, 1981; HOLLANDER, 1992). Alguns estudos sugerem que estas junções
são de fato, dinâmicas e podem ser reguladas por vários fatores intraluminais que
têm relação fisiológica ou patológica (MADARA, 1988; MADARA, 1990;
PAPPENHEIMER
et al.,
1994). Todavia, a importância nutricional por via
paracelular de absorção é controversa (SOERGAEL, 1993; MADARA, 1994), e é
mais aceito que moléculas potencialmente nocivas penetrem a lâmina própria do
intestino através desta via controlável (SADOWSKI & MEDDINGS, 1993). Em
algumas situações de intestino inflamado, a permeabilidade das junções firmes
está marcadamente aumentada, até mesmo quando o epitélio apresenta-se
morfologicamente aderente (MADARA, 1990). O aumento primário da
permeabilidade macromolecular, é um fator controverso na etiologia das Doenças
Inflamatórias Intestinais (DII) (PEETERS
et al.,
1994). Clinicamente, o grau de
inflamação intestinal (e resposta ao tratamento) pode ser monitorado pela
permeabilidade de moléculas teste que servem como marcador para o transporte
paracelular (HOLLANDER, 1992; PEETERS
et al.,
1994)
1.11. Cicatrização
Os eventos da fase inicial da cicatrização de feridas são desencadeados
quando vasos sangüíneos são rompidos, resultando em hemorragia onde há
rompimento da barreira epidermal da pele e dano às estruturas subjacentes. A
hemorragia tem que ser estancada para que o restante do processo de cicatrização
prossiga; isso ocorre através da formação de um coágulo que tampona os vasos
danificados. O coágulo consiste de uma rede de fibrina com plaquetas agregadas e
embutidas no interstício, que aprisiona células vermelhas que se transformam em
outro componente do tampão de coágulo (GRINNELL, 1984).
Além de contribuir para a hemostasia, a fibrina também possui um
componente primário da matriz provisional, que se forma na ferida durante o
período inicial de cicatrização. Ela fica recoberta com fibronectina a partir dos
derivados do soro e plaquetas agregadas. Fibronectinas são uma classe de
60
glicoproteínas que facilitam a fixação de células migratórias na rede de fibrina,
sendo um componente extremamente importante tanto para a matriz primária
como para a derme madura (HYNES, 1986). Durante a fase inicial da cicatrização, a
fibronectina auxilia na adesão celular e modula a migração de vários tipos de células
para a ferida (GRINNELL, 1984). Em adição, a rede de fibrina-fibronectina adere
várias citocinas liberadas no momento da injúria, servindo como um reservatório
desses fatores para os futuros estágios da cicatrização (WYSOCKI & GRINNELL,
1990).
Tanto a trombina quanto a fibrina têm efeitos sobre mecanismos adicionais
da cicatrização. A trombina estimula a permeabilidade vascular observada após a
lesão e também facilita a migração extravascular de células inflamatórias (ESMON,
1993). A fibrina pode também atuar na epitelização e na angiogênese. Ela age
como um andaime para a migração de células mesenquimais e inflamatórias
(TANAKA & SLTEISHI, 1993).
A agregação plaquetária ocorre quando estas são expostas ao colágeno
extravascular (SANTARO, 1986). Essa agregação leva à liberação de citocinas de
grânulos alfa do citoplasma de células plaquetárias. Estas citocinas incluem PDGF,
TGF-β, TGF-α, bFGF, PDEGF e PDECGF. Algumas dessas citocinas têm um efeito
direto na fase inicial do processo de cicatrização e outras têm um papel crucial nos
aspectos tardios da cicatrização, por sua ligação com a rede de fibrina
(LAWRENCE, 1998).
O dano tecidual no sítio da injúria estimula a resposta inflamatória que se
inicia rapidamente após a ferida ser criada. A resposta inflamatória aciona eventos
que têm implicações com todo o processo de cicatrização. Na cicatrização normal,
as mudanças que ocorrem no tecido com o tempo são extremamente
reproduzíveis. Após a hemostase ter sido completada, células inflamatórias
migram para ferida com a predominância inicial de neutrófilos. Em 48 a 72 horas
61
macrófagos começam a superar o número de neutrófilos, e há uma quantidade de
macrófagos que permanece na ferida por vários dias. É crítico que macrófagos, e
não neutrófilos, sejam essenciais para cicatrização normal. Após 5 a 7 dias,
poucas células inflamatórias permanecem na ferida com cicatrização normal, e os
fibroblastos tornam-se o tipo de célula predominante (LAWRENCE, 1998).
Recentemente, os neutrófilos têm sido reconhecidos como produtores de
citocinas pró-inflamatórias que funcionam como um dos primeiros sinais para a
ativação dos fibroblastos locais e queratinócitos, apesar de ter-lhe sido
inicialmente atribuído apenas um papel na defesa fagocítica (HUBNER &
GRISELDI, 1996). O número de neutrófilos aumenta entre 24 a 48 horas depois
de ocorrida a lesão. Na ausência de contaminação substancial, a infiltração de
neutrófilos cessa após vários dias e seu número decai rapidamente. Além disso,
depois de alguns dias os neutrófilos presos no coágulo são perdidos junto com a
crosta que se desprende, sendo que aqueles remanescentes dentro dos tecidos
viáveis se transformam em senescentes e são fagocitados pelos macrófagos
teciduais (NEWMAN, HENSON & HENSON, 1982).
Quando monócitos migram dos capilares para o espaço extravascular
transformam-se em macrófagos, em um processo mediado por fatores do soro
(NEWMAN, HENSON & HENSON, 1982) e fibronectina (WRIGHT & MEYER, 1985).
A maneira exata como eles se diferenciam é baseada num estímulo do tecido para
o qual ele é recrutado (KESHAR & STEIN, 1992). Fatores quimiotáticos estão
envolvidos na estimulação da migração de macrófagos para a área da ferida
(SNYDERMAN & FUDMAN, 1980). Os fatores específicos que estimulam a migração
de macrófagos, que incluem fragmentos de colágeno, fragmentos de fibronectina
e elastina, têm derivados da matriz lesionada, como também componentes do
complemento.
Monócitos aderem ao endotélio dos vasos sanguíneos e migram para
tecido de uma maneira similar aos neutrófilos. Uma vez no espaço extravascular
liga-se a proteínas da matriz extracelular, através de receptores para integrinas
62
(DOHERTY
et al,
1987). Eles então expressam fator 1 de estimulação de colônia,
que contribui para sua sobrevivência. Uma vez na matriz provisional, os
macrófagos são ativados através da estimulação pela interleucina 2 (IL-2) e
interferon sigma (INF-sigma), derivados de linfócitos T, como também por
estímulo viral ou bacteriano (ADAMS & HAMILTON, 1984). PDGF pode também
estimular a ativação de macrófagos (TZENG
et al,
1985).
Os macrófagos são muito importantes na cicatrização normal de feridas.
Macrófagos fagocitam bactéria e tecido morto e, também, secretam colagenase e
elastases que quebram a matriz danificada (WERB, BANDA & JONES, 1980).
Também secretam um inibidor tecidual de metaloproteinase, sugerindo sua
habilidade para regular firmemente a quebra de tecido e a remodelação
(STRICKLIN
et al,
1993). Os macrófagos são a fonte primária de citocinas que
estimula a proliferação de fibroblastos, a produção de colágeno e outros processos
de cicatrização. Macrófagos também produzem prostaglandinas, metabólitos do
oxigênio e carragenina, que são reguladores adicionais para a resposta da
cicatrização. O TGF-β regula a sua própria produção por macrófagos de forma
autócrina. Estimula também os macrófagos a secretarem várias outras citocinas,
incluindo FGF, PDGF, TNF-α, e IL-1 (LAWRENCE, 1998).
Material estranho ou bactérias podem mudar o cenário da cicatrização
normal para um quadro de inflamação crônica. Apesar das fases agudas da
inflamação serem necessárias a persistência da inflamação pode ser deletéria para
o hospedeiro. Após a morte, neutrófilos liberam enzimas proteolíticas destrutivas e
radicais livres do oxigênio os quais lesam o tecido. Os produtos advindos da
clivagem do complemento junto aos produtos intermediários do metabolismo dos
radicais peróxidos derivados de neutrófilos contribuem para a formação de
complexos citotóxicos de ataque a membranas que perpetuam a destruição
tecidual. Essa injúria, mediada por neutrófilos, pode contribuir para o dano
tecidual progressivo decorrente de queimaduras e reperfusão, após períodos de
isquemia contribuindo com problemas observados como resultado de inflamação
crônica induzida por corpos estranhos persistentes e infecção crônica (LAWRENCE,
1998).
63
2.OBJETIVOS
64
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
As Doenças Inflamatórias Intestinais (DIIs) são um problema de saúde
pública em muitos países. Suas etiologias permanecem mal definidas. Nos Estados
Unidos a incidência de colite ulcerativa é de 11 para cada 100.000 habitantes e de
Doença de Crohn de 7 para cada 100.000 habitantes. Drogas de primeira escolha
como os corticosteróides manifestam seus efeitos colaterais com o uso
prolongado, frequentemente tem o aparecimento de hipertensão arterial, diabetes
e osteoporose. Uma vez que o óleo-resina da Copaíba (ORCL) é utilizado
popularmente como antiinflamatório e na cicatrização de feridas e úlceras,
resolvemos avaliar o potencial antiinflamatório do óleo-resina da
Copaifera
langsdorffii
Desf (ORCL) e do seu constituinte Ácido Kaurenóico (AK) em modelos
animais representativos de DIIs em humanos, a fim de possibilitar a utilização
terapêutica de um fitoterápico com controle e qualidade na saúde primária.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Avaliar o potencial da ação inibitório do ORCL nos modelos experimentais de
colite ulcerativa induzida por ácido acético, TNB e indometacina, e no modelo de
isquemia-reperfusão intestinal.
•Esclarecer o envolvimento de fatores defensores (glutationa), enzimas (catalase,
mieloperoxidase) e substâncias envolvidas no processo de injúria (nitrito,
malonaldeído).
• Analisar de forma macroscópica e microscópica as lesões.
• Avaliar a atividade cicatrizante do ORCL e AK nos modelos experimentais de
feridas abertas e por incisão.
65
3.MATERIAL
66
3. MATERIAL
3.1. ANIMAIS
Todos os animais utilizados nos experimentos foram provenientes do
Biotério Central da Universidade Federal do Ceará (UFC), e mantidos no
Laboratório setorial em caixa de propileno a 26 ± 2°C, em ciclo claro-escuro de
12h, tendo acesso livre à água e ração Purina.
• Ratos albinos, Rattus
norvegicus,
variedade Wistar, adultos, de ambos os
sexos e pesando 150-300g.
• Camundongos albinos,
Mus musculus
, variedade Swiss-webster, adultos, de
ambos os sexos e pesando 20-30g.
3.2. DROGAS, REAGENTES E CORANTES
Ácido Etilenodiaminotetraacético Sal Dissódico (EDTA)
PROANALYSI
N-Acetilcisteina
Fluimucil®-EUROFARMA
Ácido 5,5'-Ditio-bis-2-nitrobenzóico - DTNB SIGMA
Ácido acético glacial P.A. SYNTH
Ácido fosfórico SIGMA
Ácido tiobarbitúrico SIGMA
Ácido tricloroacético P.A. SIGMA
Ácido trinitrobenzeno sulfônico SIGMA
Albumina Bovina Sérica - BSA REAGEN
Álcool etílico absoluto P.A. QUIMEX
Azul de Evans REAGEN, BRASIL
Brometo de hexadeciltrimetilamônio -HTAB SIGMA
Cetamina
Ketalar®-PARKE DAVIS
Citrato de sódio – C
6
H
5
Na
3
O
7
.2H
2
O REAGEN
67
Cloreto de potássio SYNTH
Cloreto de sódio CINÉTICA
CuSO
4
.5H
2
O QUIMEX
Dimetilsulfóxido - DMSO VETEC
Éter etílico comercial PRO ANALYSIS
Folin Ciocaltean QEEL
Formaldeido REAGEN
Formamida SIGMA
Glicose VETEC
Glutation reduzido SIGMA
Hematoxilina e Eosina
NEWPROV®
Hidrocloreto de ο-diasidine
SIGMA
Hidróxido de sódio REAGEN
Indometacina SIGMA
Malonaldeído SIGMA
Mieloperoxidase SIGMA
Na
2
CO
3
VETEC
Naphthylenediamina SIGMA
n-butanol LAFAN
Nitrogênio líquido WHITE MARTINS
Parafina SYNTH
PBS
Peróxido de hidrogênio VETEC; KONIG, ARG.
Sulfanilamida SIGMA
Tampão tris SIGMA
TNB SIGMA
Tween 80 RIEDEL, ALEMANHA
Xilasina ROMPON, BAYER
68
3.3. EQUIPAMENTOS
Agitador de tubos-VORTEX PHOENIX AP56
Agitador - Aquecedor FANEN 258
Balança analítica MARTE AL 200
Balança para animais FILIZOLA
Banho Maria QUIMIS
Centrífuga refrigerada CIENTEC CT 5500 DR
Elisa PACKARD SPECTRA COUNT
Espectrofotômetro BAYER-RA 50 / BECKMAN DU640B
Freezer -75ºC LEGACI SYSTEM
Lavadora ultrasônica UNIQUE USC 700
Microscópio NIKON
pHmetro ALALION-PM 608
Pipetas automáticas JENCONS
3.4. MATERIAL BOTÂNICO
A
Copaifera langsdorffiti
Desf. e seu óleo-resina foram coletados na
localidade de Barreiro Grande, Crato-CE, identificada pela equipe do Professor
Afrânio G. Fernandes do Departamento de Biologia da Universidade Federal do
Ceará. Amostras testemunhas das espécies medicinais encontram-se depositadas
no Herbário Prisco Bezerra desta Universidade, estando a exsicata da
Copaifera
langsdorffii
Desf., registrada sob o número 24.461 (FIGURA 6). O óleo-resina
obtido do caule da planta foi analisado no Departamento de Química Orgânica e
Inorgânica, pela equipe do professor Edilberto R. Silveira.
69
FIGURA 6- Foto da
Copaifera langsdorffii
Desf. (Leguminosae)
Local da coleta: localidade de Barreiro Grande, Crato-CE
Exsicata: 24.461
Depositada: Herbário Prisco Bezerra-UFC
70
4.MÉTODOS
71
4. MÉTODOS
4.1. ANÁLISE FITOQUÍMICA DO ÓLEO-RESINA DA
Copaifera
langsdorffii
Desf.
O estudo químico foi realizado no Departamento de Química Orgânica e
Inorgânica da Universidade Federal do Ceará, pela equipe do Prof. Dr. Edilberto R.
Silveira.
4.1.1. Estudo espectrométrico de RMN
O ORCL foi analisado por espectrometria da Ressonância Magnética Nuclear
de Hidrogênio (RMN
1
H) e Ressonância Magnética Nuclear de Carbono (RMN
13
C).
4.1.2. Estudo cromatográfico
Foi realizada a cromatografia do óleo-resina sobre gel de sílica.
4.1.3. Estudo da fração volátil
Do óleo-resina, 36,8g foram submetidos a extração da fração volátil por
hidrodestilação, fornecendo 2,7g (7,3%) de óleo essencial de coloração amarela-
clara.
Os constituintes do óleo essencial, foram identificados por interpretação do
cromatograma, índice de kovats e comparação visual dos espectros de massa com
padrões da literatura (ADAMS, 1989)
4.1.4. Identificação do Ácido Kaurenóico
A identificação do ácido Kaurenóico foi efetuada a partir de métodos
espectrométricos (IV, EM e RMN).
4.1.5. Isolamento do Ácido Kaurenóico
Tratamentos cromatográficos sucessivos da fração ácida em sílica gel e
eluição com aumento gradual de polaridade da fase móvel.
72
4.2. Colite ulcerativa induzida por ácido acético em ratos (MASCOLO
et
al.,
1995)
Embora o modelo de colite induzida por ácido acético seja claramente
tóxico, é provável que a resposta inflamatória resultante seja devida ao produto
do influxo de conteúdo luminal para a lâmina própria decorrente da destruição das
células epiteliais com perda da barreira epitelial entre as células imunológicas da
lâmina própria e os antígenos do lúmen. E, apesar de diferente daquele que se
encontra na colite ulcerativa, onde o evento iniciador é uma ativação das células
imunológicas da lâmina própria que levam a um dano das células epiteliais, ambas
as situações mostram uma surpreendente semelhança quando se examina o
padrão do metabolismo do ácido araquidônico. Nas duas situações, tanto os
produtos da lipoxigenase como da cicloxigenase são igualmente dependentes da
infiltração dos neutrófilos, seja na colite ulcerativa ou na mediada por ácido
acético (FABIA
et al.,
1992; YAMADA
et al.,
1992; FABIA
et al.,
1993). Como a
colite induzida é precoce e aguda é possível sua utilização no estudo desta fase da
doença a fim de investigar qual ou quais componentes da doença inflamatória
intestinal são produtos de um componente inflamatório agudo bem como avaliar a
eficácia farmacológica de novas drogas nesta fase da doença.
Ratos Wistar (150-200 g), machos, em jejum de 36 horas, n=6 animais
dividido em 11 grupos: 1. Controle não tratado; 2. Controle veículo (2% de tween
80); 3. Controle veículo AK (3% de DMSO); 4. ORCL (200mg/kg); 5. ORCL
(400mg/kg); 6. AK(50mg/kg); 7. AK(100mg/kg), foram tratados por via oral 24 e
2h antes da administração de ácido acético (2mL via retal, 4%); 8. ORCL
(200mg/kg); 9. ORCL (400mg/kg); 10. AK(50mg/kg); 11. AK(100mg/kg), foram
tratados por via retal 24 e 2h antes da administração de ácido acético (2mL via
retal, 4%). Os animais foram anestesiados com éter e o ácido acético foi instilado
no cólon, a 8cm do ânus do animal por meio de uma sonda. 24h após a
administração do ácido acético os animais foram sacrificados por deslocamento
cervical para a retirada de 8cm do cólon a partir do ânus e desprezados 3cm
73
proximais. Os 5cm do cólon foram abertos longitudinalmente, limpos com solução
salina (0,9% NaCl) e avaliados macroscopicamente para aferição de escores, de
acordo com WALLACE
et al.,
1989, (0=aparência normal; 1=hiperemia focal sem
úlcera; 3=ulceração com inflamação, único local; 4=dois ou mais sítios com
discreta ulceração e inflamação; 5=sítios maiores de injúria e inflamação com
extensão de 1-2cm ao longo do comprimento do cólon; 6-10= o escore aumenta
de 1 por cada cm adicional de dano ou injúria, além de 2cm). Foi avaliado
também o peso úmido do tecido. Após pesagem, 300mg de tecido foram
separadas para dosagem de mieloperoxidase, 200mg para dosagem de
malonaldeído, nitrito e catalase, e com tecido restante realizado análise
histológica.
74
4.3. Colite ulcerativa induzida por TNB (ácido trinitrobenzeno sulfônico)
em ratos MORRIS
et al.,
1989.
A colite induzida por TNB é um modelo experimental bastante utilizado para
se fazer o “screening” de drogas com ação nas doenças inflamatórias intestinais
humanas (WALLACE, 1988; YOSHIKAWA
et al.,
1997; CHEN
et al.,
1999) onde os
mediadores inflamatórios mais comuns são as espécies reativas de oxigênio,
aminas vasoativas e os eicosanóides que têm um importante papel (SEO
et al.,
1995; LOGUERCIO
et al.,
1996; CARTY
et al.,
2000).
Ratos Wistar (150-200 g), machos, em jejum de 60 horas, receberam água
glicosada 0,5%, n=6 animais divididos em 4 grupos: 1. Controle não tratado; 2.
Controle veículo TNB (2% de tween 80); 3. ORCL (400mg/kg); foram tratados por
via oral, 2, 24 e 48h após a indução da colite; 4. ORCL (400mg/kg); foram
tratados por via retal, 2, 24 e 48h após a indução da colite. A inflamação do cólon
foi induzida após uma leve anestesia com éter, com uma única administração
intracolônica de 0,25 mL de etanol 50% contendo 20 mg de TNB. A solução foi
administrada através de um cateter (0,3 mm de diâmetro) introduzido a 8 cm do
ânus. Setenta e duas horas após a indução da colite, os animais foram sacrificados
por deslocamento cervical para a retirada de 8cm do cólon a partir do ânus (cólon
distal) e desprezados 3cm proximais. Os 5cm do cólon foram abertos
longitudinalmente, limpo com solução salina (0,9% NaCl) e avaliado
macroscopicamente para aferição de escores (WALLACE
et al.,
1989),
(0=aparência normal; 1=hiperemia focal sem úlcera; 3=ulceração com
inflamação, único local; 4=dois ou mais sítios com discreta ulceração e
inflamação; 5=sítios maiores de injúria e inflamação com extensão de 1-2cm ao
longo do comprimento do cólon; 6-10=o escore aumenta de 1 por cada cm
adicional de dano ou injúria, além de 2cm). Foi avaliado também o peso úmido do
tecido. Após pesagem, 300mg de tecido foram separadas para dosagem de
mieloperoxidase, 200mg para dosagem de malonaldeído e catalase e com o tecido
restante realizado a análise histológica.
75
4.4.
Injuria intestinal induzida por isquemia-reperfusão em ratos.
(KIMURA
et al.,
1998)
O intestino delgado é altamente sensível a injúria causada pela isquemia-
reperfusão (I/R), que é clinicamente associada com alta morbidade e mortalidade.
A I/R envolve uma complexa resposta inflamatória, que inclui ativação do sistema
complemento, agregação dos neutrófilos polimorfonucleares (PMNs), e produz um
aumento no número de radicais livres derivados do oxigênio, os quais são
responsáveis por danos teciduais. (GRISHAM
et al.,
1986; SIMPSON
et al.,
1993;
SCHWARZ
et al.,
1999; BALOGH
et al.,
2002). Os eventos moleculares que
ocorrem com a injúria causada pela I/R incluem perda de aminoácidos, proteínas
transportadoras de membrana, enzima citocromo e ácido nucléicos, induzindo a
lesão da mucosa, diminuição da função intestinal e aumento da permeabilidade de
bactérias e endotoxinas, levando a uma resposta inflamatória sistêmica
(HALLIWELL
et al.,
2000).
Ratos Wistar (150-200 g), machos, em jejum de 36 horas, n=6 animais
dividido em 6 grupos: 1. Controle não tratado; 2. Controle veículo (2% de tween
80); 3. ORCL (200mg/kg); 4. ORCL (400mg/kg); 5. AK(50mg/kg); 6.
AK(100mg/kg); foram tratados por via oral, 24, 12 e 2 horas antes da indução da
isquemia. Os animais foram anestesiados com cetamina (100mg/kg) e xilasina
(35mg/kg) (0,05mL/animal, i.m.), foi então realizada laparotomia, clampeada a
artéria mesentérica superior por 45min, após este tempo foi retirado o clampe e
liberado a reperfusão por uma hora. Os animais foram sacrificados por
deslocamento cervical. Foi retirado o intestino delgado, separado o íleo e lavado
em salina gelada, 300mg de tecido para dosagem de mieloperoxidase, 200mg
para dosagem do malonaldeído, 400mg para dosagem de catalase e nitrito,
500mg para dosagem da glutationa e com tecido restante realizado a análise
histológica.
76
4.5. Inflamação intestinal induzido por indometacina em ratos. (RUH
et
al.,
1998)
A indometacina é um dos mais efetivos DAINES utilizados na clínica para o
tratamento das doenças reumáticas e artrite, porque tem ação analgésica,
antipirética e antiinflamatória. Estas ações são mediadas pela completa inibição da
atividade da e PG H sintase (VANE 1971; KULMACZ & LANDS, 1985). Contudo, os
efeitos da indometacina causam danos à mucosa gastrointestinal (GARCIA
RODRIGUES & JICK, 1994; HAWKEY, 1996). Na mucosa gástrica a injúria induzida
pela indometacina é mediada pela peroxidação lipídica e radicais livres que
causam danos e destroem as células da membrana (NAITO
et al.,
1998; TANAKA
et al.,
1996).
Ratos Wistar (150-200 g), machos, em jejum de 36 horas, n=6 animais,
dividido em 5 grupos: 1. Controle não tratado; 2. Controle veículo (2% de tween
80); 3. ORCL (200mg/kg); 4. ORCL (400mg/kg); 5. AK(100mg/kg); foram tratados
por via oral, 12 e 2 horas antes do tratamento com indometacina (20mg/kg,
s.c.). Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical 12 horas após a
administração da indometacina, foi então realizada laparotomia, retirado o
intestino delgado, lavado em salina gelada, 300mg de tecido foi separada para
dosagem de mieloperoxidase, 400mg para dosagem de nitrito.
77
4.6. Aumento na permeabilidade induzido por indometacina
(LANGE & DELBRO, 1995)
LANGE
et al.,
1994, demonstraram que um método rápido de determinar a
permeabilidade paracelular no intestino é instilando um marcador intralumial.
Como substância teste ele utilizou o corante, azul de Evans (AE).
Camundongos Swiss machos (32-35g) tratados com ORCL (200 e
400mg/Kg, v.o., 2 horas antes) ou AK (50 e 100mg/Kg, v.o., 2 horas antes) ou
indometacina (20mg/Kg, v.o., 6 horas antes) ou rofecoxib (5mg/Kg, v.o., 6 horas
antes) foram anestesiados com uma solução contendo cloridrato de xilasina
(35mg/Kg) e cetamina (100mg/Kg) no volume de 0,05mL/animal (i.m.). Através
de laparotomia foram isoladas 6 alças intestinais de 5cm cada, sendo a primeira a
7cm de distância da cárdia. Em cada alça foi injetado 0,1mL de solução de azul de
Evans (3% em PBS). Uma hora depois os animais foram sacrificados por
deslocamento cervical e as alças foram dissecadas e abertas longitudinalmente
para a retirada do seu conteúdo interno. Estas foram então lavadas em beckers
consecutivos, por um minuto em cada um dos beckers contendo 6mM de
acetilcisteína em PBS. A parte medial de cada alça foi removida (15mm),
enxugada gentilmente em papel de filtro, pesada e encubada com 3mL de
formamida a 50°C por 24h. A quantidade de corante eluido foi estimada em
espectrofotômetro em cumprimento de onda de 612nm.
78
4.7. Atividade cicatrizante
O óleo-resina da
Copaifera langsdorffii
(ORCL) é utilizado popularmente na
cicatrizaçãod e feridas e úlceras, portanto, resolvemos avaliar esta atividade.
O processo de reparação de tecido humano combina mecanismos de
reparação e regeneração tecidual. Na reparação tecidual uma cicatriz é gerada,
formando um remendo no sítio da lesão, muitas vezes associada à perda de
função. Regeneração tecidual, ao contrário, envolve a recriação do tecido na
forma em que ele existia antes da injúria, com pequena ou nenhuma perda de
função. O equilíbrio entre reparo e regeneração em resposta à injúria é
ligeiramente diferente em cada tipo de tecido. Apesar de alguns componentes do
processo de cicatrização possuírem mecanismos regenerativos, a pele é um
exemplo de tecido no qual a resposta à injúria é predominantemente reparativa
(LAWRENCE, 1998).
Devido à liberação diferenciada de cada uma das citocinas envolvidas neste
processo é possível dividí-lo em fase inicial, intermediária, tardia e final. Cada fase
caracteriza-se por eventos biológicos específicos. A fase inicial da cicatrização
envolve inflamação e estabelecimento da hemostasia. A fase intermediária
caracteriza-se primariamente por proliferação e migração de células
mesenquimais, epitelização e angiogênese. Os eventos centrais da fase tardia da
cicatrização incluem a síntese de colágeno e outras proteínas de matriz e a
contração da ferida. Remodelação da ferida predomina na fase final de
cicatrização (LAWRENCE, 1998).
4.7.1. Ferida aberta (MORTON & MALON, 1972)
Três grupos de ratos contendo seis animais por grupo foram depilados e
então anestesiados para retirada de 2cm
2
de pele. Os animais foram mantidos em
gaiolas separadas. A contração da pele foi calculada pela redução de área
descoberta por pele. As mudanças no tamanho de área da lesão foram medidas
79
por planimetria em mm
2
num plástico transparente. O ORCL (100µL na
concentração de 2 e 4%) ou o veículo (100µL com 4% de tween 80 em salina)
foram aplicados topicamente, todos os dias por um período de 21 dias. A
contração da pele foi expressa em percentagem de redução da área original.
4.7.2. Ferida por incisão (UDUPA
et al.,
1994)
Três grupos de seis animais cada foram depilados, anestesiados e feitos
uma incisão linear, esta foi suturada com fio de nylon a cada um centímetro e os
animais foram mantidos em gaiolas individuais. A sutura foi removida um dia
antes do tecido ser submetido à tensão. Os animais receberam tratamento tópico
com veículo (100µL com 4% de tween 80 em salina) ou ORCL (100µL na
concentração de 2 e 4%) duas vezes ao dia (10.00 a.m. e 6.00 p.m.) e foram
sacrificados após 5, 7 ou 12 dias da cirurgia. A pele contendo a incisão foi retirada
ei exercida uma tensão (g) de acordo com NAGI & ZINGG (1971) e expresso em
g/cm.
80
4.8. Ensaio para atividade da enzima Mieloperoxidase (MPO)
(KRAWISZ
et al.,
1984)
A mieloperoxidase (MPO, peróxido de hidrogênio oxidoredutase) é uma
enzima amplamente distribuída no organismo e suas fontes fundamentais são os
leucócitos (neutrófilos, monócitose os macrófagos) apesar de ter sido isolada de
muitos fluidos biológicos (saliva, líquido sinovial e sêmen, entre outros) (YAN,
et
al.,
1992; EDWARDS
et al.,
1988; WOLFF
et al.,
1992). E também em diferentes
tecidos (coração, rins, pele, fígado e placenta) (KARGER,
et al.,
1994; JOHNSON,
et al.,
1987; BRADLEY,
et al.,
1982; KOMATSU,
et al.,
1992; JOSEPH
et al.,
1993).
No entanto, a fonte mais comum são os neutrófilos, onde a enzima se encontra
localizada a nível lisossomal. Constituindo de 2-5% do conteúdo de proteínas
destas células (MARQUEZ
et al.,
1990).
O sistema MPO-peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)-ferro tem sido um sistema
bem estudado (KETTLE
et al.,
1992; KETTLE & WINTERBOURN, 1994). A reação
da MPO com o H
2
O
2
proveniente das células fagocitarias ativadas por partículas
estranhas, formam um complexo enzima-substrato com uma forte capacidade
oxidativa. Este complexo se combina com o ferro, geralmente cloroso, que se
oxida para formar o ácido hipocloroso (HOCL). O ácido hipocloroso é um potente
agente oxidativo que contribui com o mecanismo de defesa contra os agentes
infecciosos, mas também pode atuar sobre as células do hospedeiro. O HOCL
pode causar muitos danos em enfermidades inflamatórias (KETTLE &
WINTERBOURN, 1994).
O aumento da atividade da MPO é relatado em vários processos patológicos
e está associado com o aumento do estresse oxidativo, como no caso das
enfermidades infecciosas, inflamatórias e isquemia-reperfusão. Nestes casos se
demonstrou um aumento significativo da atividade da mieloperoxidase, em
proporção direta ao número de neutrófilos infiltrados no tecido, portanto, se pode
utilizar sua atividade como índice de migração leucocitária e de estresse oxidativo
(SIMPSON & FANTONE, 1988; KOMATSU,
et al.,
1992; NALINI
et al.,
1993;
81
WILSON
et al.,
1993; PERALTA
et al.,
1993; JUNGER et al., 1993; OVER
et al.,
1993; VENGE, 1994)
Amostras do cólon (300 mg) foram imediatamente congeladas em
nitrogênio líquido e homogeneizadas em uma solução de brometo de
haxadeciltrimetilamônio 0,5 % (HTAB) em tampão fosfato 50 mM (HTAB, pH 6, 1
mL por 50 mg de tecido). O homogenato foi submetido a três ciclos de
congelamento, 5 min (-70
o
C) e descongelamento (água a 37
o
C). As amostras
foram então centrifugadas (4000 rpm, 15 min, 4
o
C) para remover o material
insolúvel. A MPO contida no sobrenadante (0,1 mL) foi analisada
espectrofotometricamente após a adição de 2,9 mL de tampão fosfato (50 mM, pH
6) contendo 0,167 mg/mL de hidrocloreto de
ο
-dianisidine e 0,0005 % de
peróxido de hidrogênio. As cinéticas de mudanças na absorbância a 470 nm foram
medidas no tempo 0 e 5min.
82
4.9. Ensaio para dosagem de Malonaldeído (MDA) (UCHIYAMA &
MIHARA, 1978)
Os radicais livres de oxigênio podem provocar distúrbios nos sistemas
biológicos por afetarem uma variedade de seus constituintes moleculares (lipídios,
proteínas, carboidratos e DNA). Resíduos de ácidos graxos poliinsaturados nas
proteínas apresentam uma estrutura química que os torna alvo particularmente
vulneráveis para a oxidação pelos radicais livres (peroxidação de lipídios). A
peroxidação de lipídios é iniciada se um radical ingressa a fase lipídica e apresenta
significante reatividade para retirar um átomo de hidrogênio para um grupamento
(-CH
2
) do ácido graxo. Radicais hidroxila mas não ânions superóxido são capazes
de promover peroxidação de lipídios. A presença de íons metálicos como o ferro,
parece ser essencial para a iniciação da peroxidação de lipídios. Peróxidos lipídicos
são instáveis, e tendem a se decompor rapidamente para formarem produtos
secundários. Esses produtos secundários incluem alcanos como etano e pentano
(que são detectáveis por cromatografia gasosa) e aldeídos como malonaldeído
(que são detectáveis pela reação com o ácido tiobarbitúrico). Esses produtos são
“per si”, tóxicos e podem ser responsáveis por muitos efeitos deletérios da
peroxidação de lipídios.
Duzentos miligramas do cólon foram tomados e homogeneizados com uma
solução gelada de KCL 1,15% (homogenato a 10%). Quinhentos microlitros do
homogenato foram transferidos para um tubo de ensaio e adicionados 3mL de
H
3
PO
4
1%, pH=2, e 1mL de ácido tiobarbitúrico 0,6%. Esta mistura foi fervida em
banho-maria por 45min, a seguir resfriada em água gelada, adicionados 4mL de
n-butanol, agitado em vortex por 1 min e centrifugado a 1200 rpm por 15 min. A
fase butanólica foi tomada para leitura em espectrofotômetro a 520 e 535nm. A
diferença das absorbâncias obtidas nas duas leituras foi utilizada para calcular o
malonaldeído, baseada no coeficiente de extinção molar de 13.700M/cm.
83
4.10. Dosagem do nitrito (CHEN
et al.,
2000)
A liberação excessiva de intermediários reativos de oxigênio pelos
neutrófilos está implicada no mecanismo fisiopatológico de uma variedade de
condições inflamatórias, agudas e crônicas, como por exemplo, sepse bacteriana,
síndrome da angústia respiratória no adulto, doenças intestinais, doenças
reumáticas e vasculite de diferentes etiologias (MALY & SHURER-MALY, 1995)
A concentração do nitrito foi medida tendo com indicador a produção de NO
de acordo com a reação de Griess. Foram misturados 100µL do sobrenadante a
um mesmo volume do reagente de Griess (1% sulfanilamida em 5% de ácido
fosfórico e 0.1% naphthylethylenediamina em água); a absorbância foi medida à
560nm e determinado em ELISA.
84
4.11. Dosagem de Catalase (BEERS & SIZER, 1952)
A catalase (HALLIWELL, 1988) está localizada no interior dos peroxisomas
(organelas celulares que desempenham um papel importante na desintoxicação de
diversos produtos), sua função é de catalisar a dismutação do peroxido de
hidrogênio em água e oxigênio molecular.
Foi misturado em cubeta de quartzo 980µL do meio [90mL (100µL de H
2
O
2
em 100mL de H
2
O milli-Q q.s.p.) + 5mL tampão TRIS (HCL 1M EDTA 5mM pH=8)
+ 4mL de H
2
O milli-Q] para a reação com 20µL do homogenato. O sobrenadante
do homogenato foi lido durante 6min em espectrofotômetro a 230nm em UV,
zerado com H
2
O destilada.
Concentração de proteínas totais (Método de Lowry)
Foram preparados tubos de ensaio, contendo 750µL de H
2
O, 5µL da amostra,
500µL do reagente C [24mL do reagente A (Na
2
CO
3
2% em NaOH 0,1N) para 1mL
do reagente B (0,5% de CuSO
4
.5H
2
O em 1% de citrato de sódio
C
6
H
5
Na
3
O
7
.2H
2
O), agitar], repouso por 10min, 50µL do reagente D (1mL do
reativo Follin para 1mL de H
2
O destilada), repouso por 30min, após, agitado e lido
em espectrofotômetro a 750nm em onda visível, zerado com H
2
O destilada. O
padrão tinha 50µL de BSA (albumina bovina sérica).
85
4.12. Determinação dos grupos sulfidrílicos não protéicos SH-NP
(Glutationa) (BOYD
et al.,
1979)
A mucosa usualmente contém altas concentrações de glutation reduzido
(GSH), o principal componente do estoque endógeno de grupos sulfidrílicos não-
protéicos (SH-NP) (BOYD et al., 1979). De acordo com estudos prévios foi
demonstrado que radicais livres citotóxicos e níveis baixos de compostos
sulfidrílicos estão associados com danos teciduais gástricos (MILLER et al., 1985;
PARMAR et al., 1988)
Quinhentos miligramas do íleo foram homogeneizados em 5mL de EDTANa
2
a 0,02M gelado. A 4mL do homogenato foi adicionado 3,2mL de água destilada
mais 0,8mL de ácido tricloroacético a 50%, agitados e filtrados. Foram retirados
2mL do filtrado e adicionados 4mL de tampão tris 0,4M (pH8,9) e 0,1mL de DTNB
à 0.01M. A absorbância foi determinada dentro de 5min a 412nm. Um branco foi
feito sem homogenato. A concentração de SH-NP foi calculada através da equação
da reta de regressão obtida de uma curva de calibração de Glutationa reduzido
(GHS) e expressa em µg de SH-NP/500mg de tecido.
86
4.13. Avaliação Histopatológica
Para verificação das alterações teciduais microscópicas do cólon foram
realizados cortes histológicos de todos os grupos tratados. O tecido foi fixado em
formaldeído tamponado 10 % e incluídos em parafina, os cortes foram obtidos
através de micrótomo, corados em lâmina com hematoxilina-eosina e examinados
a microscopia ótica. Dentre os critérios utilizados para histologicamente acessar o
dano tecidual foi incluído a infiltração de neutrófilos polimorfonucleares e
macrófagos, hemorragia, edema e necrose. Para quantificação da infiltração de
neutrófilos polimorfonucleares e macrófagos, as células foram contadas de acordo
com o método de NYGARD
et al.,
(1994).
87
4.14. Análises Estatísticas
Os resultados foram expressos em média ± E.P.M. Para comparação
múltipla de dados paramétricos foi utilizada a análise de variância (ANOVA) uma
via, seguida doteste de Student-newman-Keuls e para dados não paramétricos o
teste empregado foi o de Kruskal-Wallis seguido do pós-teste de Dunn (KRUSKAL
& WALLIS, 1952).
Em todas as análises estatísticas, considerou-se o nível crítico para rejeição
da hipótese de nulidade menor que 0.05 (p<0.05). Os asteriscos (*p<0.05;
**p<0.01 e ***p<0.001) serviram para caracterizar o grau de significância
estatístico (SNEDECOR, 1963).
88
5.RESULTADOS
89
5. RESULTADOS
5.1. ANÁLISE FITOQUÍMICA DO ÓLEO-RESINA DA
Copaifera
langsdorffii
Desf.
O oleo-resina foi analisado por espectrometria da Ressonância Magnética
Nuclear de Hidrogênio (RMN
1
H) e Ressonância Magnética Nuclear de Carbono
(RMN
13
C), onde foi identificado, além de uma fração sesquiterpênica, uma
mistura de dois diterpenos, um furânico e outro caurênico, como constituintes
majoritários.
A cromatografia sobre gel de sílica do óleo-resina permitiu a obtenção de
duas frações (QUADRO 1):
● POLAR: o tratamento cromatográfico possibilitou o isolamento e
identificação dos ácidos poliáltico (1) e caurenóico (2) e dos seus ésteres metílicos
(3 e 4).
● APOLAR: apresentou uma mistura de terpenos identificados como
caurenal (5), sesquiterpênico oxigenado (6), diterpenico furãnico (7) e caurenol
(8).
A análise por CG-EM do óleo essencial forneceu um cromatograma, cujos
constituintes principais identificados estão no QUADRO 2.
A identificação do ácido caurenóico foi efetuada a partir de métodos
espectrométricos (IV, EM e RMN).
O espectro na região do IV foi obtido em Espectrômetro Perkin Elmer,
modelo FT-IR Espectrum 1000 da central analítica do Departamento de Química
Orgânica e Inorgânica utilizando pastilhas de KBr para análise das amostras
sólidas e filmes para os óleos. O espectro de massa foi obtido em espectrômetro
de massa Hewlett-Packard, modelo HP - 5971A, acoplado a cromatógrafo de gás-
líquido, modelo HP - 5890A série II (CGL-EM), provido de coluna capilar DB-5
(dimetilpolisiloxano) com 30,0 m de comprimento; 0,25 mm de diâmetro interno e
filme de 0,1 m, utilizando um gradiente de aumento de temperatura do injetor
de 35-180°C/4°C/min e 180 a 280°C/20°C/min. Para substâncias sólidas utilizou-
se espectrômetro de massa VG Auto Spec da Fisious Instruments, modelo M,
90
operando em impacto eletrônico de 70eV, do Laboratório de Produtos Naturais da
Universidade Federal do Ceará.
Os espectros de RMN
1
H e RMN
13
C unidimensionais e bidimensionais foram
obtidos à temperatura ambiente, em espectrômetros Bruker Avance DRX-500
operando na frequência de hidrogênio a 500 MHz e na frequência do carbono a
125 MHz utilizando sonda dual de 5 mm, para experimentos unidimensionais
1
H e
13
C e bidimensionais de correlação homonuclear
1
H,
1
H-COSY e NOESY e
correlação heteronuclear HETCOR e COLOC. Para experimentos bidimensionais de
correlação homonuclear com detecção inversa
1
H,
1
H-COSY e NOESY, de
correlação heteronuclear HMQC e HMBC e com gradiente GS-COSY, GS-HMQC e
GS-HMBC, utilizou-se sonda inversa multinuclear de 5 mm com z-gradiente e
unidade de gradiente de 10 A, pertencentes ao Centro Nordestino de Aplicação e
Uso da Ressonância Magnética Nuclear (Cenauremn) da Universidade Federal do
Ceará.
Os experimentos unidimensionais de RMN
13
C foram efetuados sob
desacoplamento total de hidrogênios. Quantidades variadas de amostras foram
dissolvidas em 0,5 mL de CDCl
3
e acondicionadas em tubos de RMN de 5mm. Os
deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão (ppm) e foram
referenciados para RMN
1
H pelo pico do hidrogênio pertencente a fração de
clorofórmio não deuterada (δ 7,24) e para RMN
13
C pelo pico central do tripleto a
δ 77,0 do clorofórmio deuterado. O padrão de hidrogenação dos carbonos em
RMN
13
C foi determinado a partir da utilização da técnica DEPT (Distortionless
Enhancement by Polarization Transfer) variando o ângulo de nutação (θ) de 45°,
90° e ou 135°.
Os pontos de fusão foram determinados em aparelho de
microdeterminação Mettler provido de placa aquecedora modelo FP-52 e unidade
de controle FP-5.
Utilizou-se Polarímetro digital Perkin-Elmer 341 para obtenção da rotação
ótica e rotação específica.
Isolamento do ácido Kaurenóico: 103,8 g do óleo de copaíba foram
submetidos à extração da fração volátil, fornecendo 17,4 g, (10,2 %) de óleo
essencial e 88,4 g (85,2%) de resina. A resina resultante foi dividida em fração
91
ácida e fração neutra a partir de reação ácido-base com hidróxido de amônio,
obtendo-se 19,2 g (21,8 %) de fração neutra e 66,8 g (75%) de fração ácida.
Tratamentos cromatográficos sucessivos da fração ácida em sílica gel e
eluição com aumento gradual de polaridade da fase móvel permitiram o
isolamento de 1,5 g (4,4%) de um sólido incolor, de ponto de fusão 176,1-
176,2°C, solúvel em clorofórmio,
[
]
°25
D
α
= -81°, cuja análise espectrométrica
possibilitou a identificação deste composto como o de ácido caur-16-en-19-óico,
obtido com hexano: acetato de etila 5%.
Dados Físicos:
12
CO
2
H
H
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
13
14
15
16
17
18
19
20
Ácido
ent-
Caur-16-en-19-óico
70
FM = C
20
H
30
O
2
PM = 302
Ponto de Fusão = 176,1-176,2°C
Aspecto = Cristais incolores
Solubilidade = Clorofórmio
[α] = -81°
Espectrometria de RMN
1
H (500 MHz, CDCl
3
): (deslocamento químico em δ,
multiplicidade, Integração e constante de acoplamento): 0,81(td; 1H; J=13,3; 4,
0); 0,96 (sl; 3H); 1,00 (td; 1H; 13,5; 4,3); 1,05(m;1H); 1,06 (m; 1H); 1,14 (dd;
1H; 11,2; 4,9); 1,23 (sl; 3H); 1,41(m;1H); 1,42(m;1H); 1,47 (m; 1H); 1,54(m;
1H); 1,60 (m; 2H); 1,62(m; 1H); 1,84(m; 2H); 1,88(m; 2H); 1,98(dd; 1H; 12,8;
1,61); 2,04 (m; 2H); 2,15 (dm; 1H; 14,4); 2,62 (sl; 1H); 4,72 (s; 1H); 4,78 (s;
1H); 11,98 (bl; 1H);
Espectrometria de RMN
13
C (125 MHz, CDCl
3
): (deslocamento químico em
δ): 40,8; 19,1; 37,8; 43,8; 57,2; 21,9; 41,3; 44,3; 55,2; 39,7; 18,5; 33,1; 43,9;
39,7; 49,0; 155,8; 103,0; 29,0;184,6; 15,6.
92
QUADRO 1 – Estrutura química de constituintes isolados do óleo-resina da
Copaifera langsdorffii.
123
4
56
7
8
93
QUADRO 2 – Constituintes químicos identificados no óleo essencial do óleo-
resina da
Copaifera langsdorffii.
COMPOSTO IK TEOR (%)
β-elemeno 1392 4.43
α-cis-bergamoteno 1396 4.56
β-cariofileno 1415 6.08
γ-elemeno 1431 2.20
α-trans-bergamoteno 1439 2.53
β-farneseno 1444 1.03
γ-muroleno 1471 1.24
ar-curcumeno 1483 4.63
β-selineno 1487 0.60
γ-cadineno 1504 0.54
β-bisaboleno 1507 0.82
δ-cadineno 1522 1.11
Óxido de cariofileno 1570 54.20
(8β, 13β) Kaur-16-eno 1921 0.72
TOTAL - 84.69
94
5.2. COLITE ULCERATIVA INDUZIDA POR ÁCIDO ACÉTICO EM
RATOS
Os resultados referentes ao efeito do tratamento do óleo resina da
Copaifera langsdorffii
(ORCL) e do ácido kaurenóico (AK) sobre as lesões
intestinais induzidas por ácido acético em ratos podem ser vistos na TABELA 3 e
FIGURAS 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9.
Na TABELA 3 o grupo controle não tratado apresentou um escore 0 e peso
úmido de 68,87 ± 3,88. Uma única administração de 2mL de ácido acético 4%
revelou um escore de lesão no controle veículo do ORCL de 8,80 ± 0,37 e peso
úmido de 174,44 ± 18,79 e no controle veículo do AK um escore de lesão de 8,67
± 0,33 e peso úmido de 166,76 ± 12,63 este aumento foi significativo quando
comparado ao controle não tratado (p<0,001).
O pré-tratamento 24 e 2h antes do ácido acético com ORCL 200 e
400mg/Kg via oral foi capaz de reduzir o escore da lesão (5,80 ± 0,49 e 5,40 ±
0,24, respectivamente) e de forma significativa reduzir o peso úmido (108,72 ±
14,67 e 125,72 ± 4,48, respectivamente, p<0,05).
O pré-tratamento 24 e 2h antes do ácido acético com ORCL 200 e
400mg/Kg via retal foi capaz de reduzir de forma significativa o escore da lesão
(3,60 ± 0,24, p<0,05 e 2,50 ± 0,57, p<0,01 respectivamente), chegando a um
percentual de redução de 72% no ORCL 400 e também foi capaz de reduzir de
forma significativa o peso úmido (123,08 ± 13,64 e 127,17 ± 7,04,
respectivamente, p<0,05).
O pré-tratamento 24 e 2h antes do ácido acético com AK 50 e 100 via oral
foi capaz de reduzir o escore da lesão, sendo esta redução significativa nos
animais tratados com AK 100 (5,50 ± 0,67 e 5,00 ± 0,45, p<0,05,
respectivamente) e também reduzir o peso úmido (110,10 ± 8,85 e 113,33 ±
12,12, respectivamente).
O pré-tratamento 24 e 2h antes do ácido acético com AK 50 e 100 via retal
foi capaz de reduzir o escore da lesão, sendo esta redução significativa nos
animais tratados com AK 100 (5,28 ± 0,92 e 4,17 ± 0,75, p<0,05
respectivamente), chegando a um percentual de redução de 52% e também foi
95
capaz de reduzir o peso úmido, sendo o resultado significativo nos animais
tratados com AK 100 (116,87 ± 20,17 e 101,24 ± 3,28, p<0,01, respectivamente).
TABELA 3 – Efeito do óleo resina da
Copaifera langsdorffii
e ácido kaurenóico na
avaliação de escore e peso úmido em modelo de colite ulcerativa induzida por
ácido acético em ratos.
GRUPOS
ESCORE
Avaliação
Macroscópica
Média ± E.P.M.
a
PESO ÚMIDO
(mg/cm)
Média ± E.P.M.
b
Controle não tratado
0
68,87 ± 3,88
Controle AA
(Veículo ORCL–2% de tween
80)
Controle AA
(Veículo AK–3% de DMSO)
8,80 ± 0,37#
8,67 ± 0,33#
174,44 ± 18,79#
166,76 ± 12,63#
VIA ORAL
AA + ORCL 200mg/kg
5,80 ± 0,49 (34%) 108,72 ± 14,67* (38%)
AA + ORCL 400mg/kg
5,40 ± 0,24 (38%) 125,72 ± 4,48* (28%)
AA + AK 50mg/kg
5,50 ± 0,67 (36%) 110,10 ± 8,85 (34%)
AA + AK 100mg/kg
5,00 ± 0,45* (42%) 113,33 ± 12,12 (32%)
VIA RETAL
AA + ORCL 200mg/kg
3,60 ± 0,24* (59%)
123,08 ± 13,64* (29%)
AA + ORCL 400mg/kg
2,50 ± 0,57** (72%)
127,17 ± 7,04* (27%)
AA + AK 50mg/kg 5,28 ± 0,92 (39%) 116,87 ± 20,17 (30%)
AA + AK 100mg/kg 4,17 ± 0,75* (52%) 101,24 ± 3,28** (39%)
AA=ácido acético, ORCL=óleo-resina da
Copaifera langsdorffii
e AK=ácido kaurenóico.
Os valores entre parênteses representam o percentual de redução.
# Controle AA vs Controle não tratado p<0,001.
a
Mann-Whitney’s U-test,
* p < 0.05, ** p < 0.01, vs controle AA.
b
Student Newman-Keul´s test, * p < 0.05, ** p < 0.01, vs controle AA.
96
Na FIGURA 7 observa-se que 24h após a administração de 2mL ácido
acético 4%, via retal, o pré-tratamento via oral e retal de ORCL 200 e 400, foi
capaz de reduzir de forma significativa (p<0.001) a atividade da enzima
mieloperoxidase. Uma marcada diminuição na FIGURA 8 foi notada 24h após a
administração de 2mL ácido acético 4%, via retal, o pré-tratamento via oral e retal
do AK 50 e 100, foi capaz de reduzir de forma significativa (p<0.001) a atividade
da enzima mieloperoxidase.
Na FIGURA 9 também ocorreram significativas mudanças na dosagem de
malonaldeído, observa-se que 24h após a administração de 2mL ácido acético 4%,
via retal, o pré-tratamento via oral e retal de ORCL 200 e 400, foi capaz de reduzir
de forma significativa (p<0.001) a dosagem de malonaldeído. Na FIGURA 10 o
pré-tratamento via oral e retal de AK 50 e 100, foi capaz de reduzir de forma
significativa (p<0.001) a dosagem de malonaldeído.
A FIGURA 11 mostra que 24h após a administração de 2mL ácido acético
4%, via retal, o pré-tratamento via retal de ORCL 200 e 400, foi capaz de reduzir
de forma significativa (p<0.001) a concentração de nitrito.
Na FIGURA 12 observa-se que 24h após a administração de 2mL ácido
acético 4%, via retal, o pré-tratamento via retal de ORCL 200, foi capaz de reduzir
de forma significativa (p<0.001) a concentração de catalase no cólon.
A FIGURA 13 mostra o resultado da investigação histopatológica do
intestino, tratados com veículo e ORCL 200, onde é observada uma atenuação das
desordens associadas ao grupo sem tratamento, como também na FIGURA 14,
onde AK 100 foi capaz de atenuar os danos causados pelo ácido acético.
A FIGURA 15 mostra a lesão macroscópica causada no cólon no modelo
de colite induzida por ácido acético.
97
FIG 7. Efeito da administração retal e oral do óleo-resina da Copaíba sobre a
atividade da mieloperoxidase, 24 horas após a indução da colite com ácido acético
em ratos.
0
2
4
6
8
10
12
14
Atividade da MPO (U/g de tecido)
a
b
b b
b
Controle Controle ORCL200 ORCL400 ORCL200 ORCL400
não tratado AA
ORAL
RETAL
Efeito da administração retal e oral do óleo-resina da Copaíba (200 e 400 mg/kg)
sobre a atividade da mieloperoxidase no cólon, 24 horas após a administração de
ácido acético em ratos. A atividade da mieloperoxidase no cólon (U/g de tecido)
foi quantificada na ausência de tratamento (controle não tratado), através do pré-
tratamento com veículo (Controle AA; 0.5 mL de 2% Tween 80 retal ou oral),
óleo-resina da Copaíba 200 mg/kg (ORCL 200) e 400 mg/kg (ORCL 400). Os
dados foram expressos como MÉDIA ± EPM de 6 ratos.
a
p < 0.001 vs controle não
tratado;
b
p < 0.001 vs controle AA.
98
FIG 8. Efeito da administração retal e oral do Ácido Kaurenóico sobre a atividade
da mieloperoxidase, 24 horas após a indução da colite com ácido acético em
ratos.
0
2
4
6
8
10
12
14
Atividade da MPO (U/g de tecido)
a
b
b b b
Controle Controle AK 50 AK 100 AK 50 AK 100
não tratado AA
ORAL
RETAL
Efeito da administração retal e oral do Ácido Kaurenóico (50 e 100 mg/kg) sobre a
atividade da mieloperoxidase no cólon, 24 horas após a administração de ácido
acético em ratos. A atividade da mieloperoxidase no cólon (U/g de tecido) foi
quantificada na ausência de tratamento (controle não tratado), através do pré-
tratamento com veículo (Controle AA; 0.5 mL de DMSO 3% retal ou oral), Ácido
Kaurenóico 50 mg/kg (AK 50) e 100 mg/kg (AK 100). Os dados foram expressos
como MÉDIA ± EPM de 6 ratos.
a
p < 0.001 vs controle não tratado;
b
p < 0.001 vs
controle AA.
99
FIG 9. Efeito da administração retal e oral do óleo-resina da Copaíba sobre a
dosagem de malonaldeído, 24 horas após a indução da colite com ácido acético
em ratos.
0
10
20
30
40
50
60
70
MDA (mmol/g de tecido)
a
b
b
b b
ORAL
RETAL
Controle Controle ORCL200 ORCL400 ORCL 200 ORCL400
não tratado AA
Efeito da administração retal e oral do óleo-resina da Copaíba (200 e 400 mg/kg)
sobre os níveis de malonaldeído no cólon, 24 horas após a administração de ácido
acético em ratos. Os níveis de malonaldeído no cólon (mmol/g de tecido) foram
quantificados na ausência de tratamento (controle não tratado), através do pré-
tratamento com veículo (Controle AA; 0.5 mL de 2% Tween 80 retal ou oral),
óleo-resina da Copaíba 200 mg/kg (ORCL 200) e 400 mg/kg (ORCL 400). Os
dados foram expressos como MÉDIA ± EPM de 6 ratos.
a
p < 0.001 vs controle não
tratado;
b
p < 0.01 vs controle AA.
100
FIG 10. Efeito da administração retal e oral do Ácido Kaurenóico sobre a
dosagem do malonaldeído, 24 horas após a indução da colite com ácido acético
em ratos.
0
10
20
30
40
50
60
70
MDA (mmol/g de tecido)
a
b
b
b b
Controle Controle AK 50 AK 100 AK 50 AK 100
não tratado AA
ORAL
RETAL
Efeito da administração retal e oral do Ácido Kaurenóico (50 e 100 mg/kg) sobre
os níveis de malonaldeído no cólon, 24 horas após a administração de ácido
acético em ratos. Os níveis de malonaldeído no cólon (mmol/g de tecido) foram
quantificados na ausência de tratamento (controle não tratado), através do pré-
tratamento com veículo (Controle AA; 0.5 mL de DMSO 3% retal ou oral), Ácido
Kaurenóico 50 mg/kg (AK 50) e 100 mg/kg (AK 100). Os dados foram expressos
como MÉDIA ± EPM de 6 ratos.
a
p < 0.001 vs controle não tratado;
b
p < 0.01 vs
controle AA.
101
FIG 11. Efeito da administração retal do óleo-resina da Copaíba sobre a dosagem
do nitrito, 24 horas após a indução da colite com ácido acético em ratos.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
NaNO
2
(
µ
M)/10mg de tecido
a
b
b
Controle Controle ORCL200 ORCL400
não tratado AA
RETAL
Efeito da administração retal do óleo-resina da Copaíba (200 e 400 mg/kg) sobre
a dosagem de nitrito no cólon, 24 horas após a administração de ácido acético em
ratos. A concentração de nitrito no cólon (µM/10mg de tecido) foi quantificada na
ausência de tratamento (controle não tratado), através do pré-tratamento com
veículo (Controle AA; 0.5 mL de 2% Tween 80 retal), óleo-resina da Copaíba 200
mg/kg (ORCL 200) e 400 mg/kg (ORCL 400). Os dados foram expressos como
MÉDIA ± EPM de 6 ratos.
a
p < 0.001 vs controle não tratado;
b
p < 0.001 vs
controle AA.
102
FIG 12. Efeito da administração retal do óleo-resina da Copaíba sobre a dosagem
de catalase, 24 horas após a indução da colite com ácido acético em ratos.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Atividade da
Catalase (mM/min/
µ
g de proteína)
a
b
Controle Controle ORCL200 ORCL400
não tratado AA
RETAL
Efeito da administração retal do óleo-resina da Copaíba (200 e 400 mg/kg) sobre
a dosagem de catalase no cólon, 24 horas após a administração de ácido acético
(AA) em ratos. A concentração de catalase no cólon (mM/min/µg de proteína) foi
quantificada na ausência de tratamento (controle não tratado), através do pré-
tratamento com veículo (Controle AA; 0.5 mL de 2% Tween 80 retal), óleo-resina
da Copaíba 200 mg/kg (ORCL 200) e 400 mg/kg (ORCL 400). Os dados foram
expressos como MÉDIA ± EPM de 6 ratos.
a
P < 0.001 vs controle não tratado;
b
P <
0.001 vs controle AA.
103
FIG 13. Efeito do óleo-resina da Copaíba na colite induzida por ácido acético.
s
e
CONTROLE VEÍCULO CONTROLE ÁCIDO ACÉTICO
ORCL 200mg/Kg
Efeito do óleo-resina da Copaíba na colite induzida por ácido acético em ratos.
Quando comparado ao controle veículo, a análise histológica do cólon dos ratos
tratados com ácido acético mostra uma desorganização do epitélio (e), edema na
submucosa (s) com uma inflamação difusa, infiltração de leucócitos e foco de
necrose (flecha). Secção do cólon tratado, via retal, com óleo-resina da Copaíba
(200 mg/kg) mostra uma atenuação da desordem morfológica e redução da
infiltração de células inflamatórias e edema associada à administração do ácido
acético (H & E X 40).
104
FIG 14. Efeito do Ácido Kaurenóico na colite induzida por ácido acético.
e
CONTROLE VEÍCULO CONTROLE ÁCIDO ACÉTICO
ÁCIDO KAURENÓICO 100mg/Kg
Efeito do Ácido Kaurenóico na colite induzida por ácido acético em ratos. Quando
comparado ao controle veículo, a análise histológica do cólon dos ratos tratados
com ácido acético mostra uma desorganização do epitélio (e), edema na
submucosa (s) com uma inflamação difusa, infiltração de leucócitos e foco de
necrose (flecha). Secção do cólon tratado, via retal, com Ácido Kaurenóico (100
mg/kg) mostra uma atenuação da desordem morfológica e redução da infiltração
de células inflamatórias e edema associada à administração do ácido acético (H &
E X 40)
105
FIG 15. Foto mostrando a lesão causada no cólon no modelo de colite induzida
por ácido acético.
CONT. VEÍCULO – CONT ÁC. ACÉTICO – ORCL 200mg/Kg
106
5.3. COLITE ULCERATIVA INDUZIDA POR TNB (ÁCIDO
TRINITROBENZENO SULFÔNICO) EM RATOS
Os resultados da avaliação do efeito do tratamento do óleo resina da
Copaifera langsdorffii
(ORCL) sobre as lesões intestinais induzidas por TNB em
ratos podem ser vistos na TABELA 4 e FIGURAS 16, 17, 18 e 19.
Na TABELA 4 o grupo controle não tratado apresentou um escore 0 e peso
úmido de 171,16 ± 4,24. Uma única administração intracolônica de 0,25 mL de
etanol 50% contendo 20 mg de TNB revelou um escore de lesão no controle
veículo do ORCL de 9,00 ± 0,84 e peso úmido de 284,37 ± 16,70 este aumento foi
significativo quando comparado ao controle não tratado (p<0,001).
O Tratamento por via oral (ORCL 400) e retal (ORCL 400), 2, 24 e 48h após
a indução da colite com TNB foi capaz de reduzir o escore da lesão (1,83 ± 0,83 e
3,40 ± 1,22, respectivamente, p<0,001 e p<0,01) e também de forma significativa
reduzir o peso úmido quando tratado via oral com ORCL 400 (157,40 ± 4,58,
p<0,01).
Na FIGURA 16 observa-se que 72h após a indução da colite com TNB via
retal, o tratamento via oral e retal de ORCL 400, foi capaz de reduzir de forma
significativa (p<0,05 e p<0,001, respectivamente) a atividade da enzima
mieloperoxidase.
A FIGURA 17 mostra o resultado do tratamento via oral de ORCL 400, 72h
após a indução da colite com TNB via retal, demonstrando que o ORCL 400 não
foi capaz de alterar de forma significativa a concentração do malonaldeído.
Também na FIGURA 18 observa-se que 72h após a indução da colite com TNB
via retal, o tratamento via oral de ORCL 400, não foi capaz de alterar de forma
significativa a concentração de catalase no cólon.
Os intestinos dos animais foram avaliados através de um estudo
histopatológico que pode ser observado na FIGURA 19, onde o tratamento com
ORCL 400 eliminou, parcialmente, os danos causados pelo TNB.
107
TABELA 4 – Efeito do óleo resina da
Copaifera langsdorffii
na avaliação de escore
e peso úmido em modelo de colite ulcerativa induzida por TNB em ratos.
GRUPOS ESCORE
Média ± E.P.M.
a
PESO ÚMIDO (mg/cm)
Média ± E.P.M.
b
Controle não tratado
0
171,16 ± 4,24
Controle TNB
(Veículo ORCL – 2% de tween
80)
9,00 ± 0,84*
284,37 ± 16,70*
VIA ORAL
TNB + ORCL400mg/kg
1,83 ± 0,83***(80%) 157,40 ± 4,58** (45%)
VIA RETAL
TNB + ORCL400mg/kg
3,40 ± 1,22** (62%)
210,88 ± 24,45 (26%)
TNB=ácido trinitrobenzeno sulfônico, ORCL=óleo-resina da
Copaifera langsdorffii
.
Os valores entre parênteses representam o percentual de redução.
a
Mann-Whitney’s U-test,
** p < 0.01, *** p < 0.001, vs controle TNB.
b
Student Newman-Keul´s test, * p < 0.05, ** p < 0.01, vs controle TNB.
108
FIG 16. Efeito da administração retal e oral do óleo-resina da Copaíba sobre a
atividade da mieloperoxidase, 2, 24 e 48 horas após a indução da colite com TNB
em ratos.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
Atividade da MPO (U/g de tecido)
a
b
Controle Controle ORCL400 ORCL400
não tratado TNB
c
ORAL
RETAL
Efeito da administração retal e oral do óleo-resina da Copaíba (400 mg/kg) sobre
a atividade da mieloperoxidase no cólon, 72 horas após a administração de TNB
em ratos. A atividade da mieloperoxidase no cólon (U/g de tecido) foi quantificada
na ausência de tratamento (controle não tratado), através do pré-tratamento com
veículo (Controle TNB; 0.5 mL de 2% Tween 80 retal), óleo-resina da Copaíba 400
mg/kg (ORCL 400). Os dados foram expressos como MÉDIA ± EPM de 6 ratos.
a
p
< 0.001 vs controle não tratado;
b
p < 0.05 vs controle TNB;
c
p < 0.001 vs controle
TNB.
109
FIG 17. Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba sobre a dosagem
de malonaldeído, 2, 24 e 48 horas após a indução da colite com TNB em ratos.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
MDA (mmol/g de tecido)
Controle Controle ORCL400 ORCL400
não tratado TNB
RETAL ORAL
Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba (400 mg/kg) sobre os
níveis de malonaldeído no cólon, 72 horas após a administração de TNB em ratos.
Os níveis de malonaldeído no cólon (mmol/g de tecido) foram quantificados na
ausência de tratamento (controle não tratado), através do pré-tratamento com
veículo (Controle TNB; 0.5 mL de 2% Tween 80 retal), óleo-resina da Copaíba 400
mg/kg (ORCL 400). Os dados foram expressos como MÉDIA ± EPM de 6 ratos.
Dados não significativos.
110
FIG 18. Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba sobre a dosagem
de catalase, 2, 24 e 48 horas após a indução da colite com TNB em ratos.
650
660
670
680
690
700
710
720
Concentração de
Catalase (mM/min/
µ
g de proteína)
Controle Controle ORCL400 ORCL400
não tratado TNB
RETAL ORAL
Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba (200 e 400 mg/kg) sobre a
dosagem de catalase no cólon, 72 horas após a administração de TNB em ratos. A
concentração de catalase no cólon (mM/min/µg de proteína) foi quantificada na
ausência de tratamento (controle não tratado), através do pré-tratamento com
veículo (Controle TNB; 0.5 mL de 2% Tween 80 oral), óleo-resina da Copaíba 200
mg/kg (ORCL 200) e 400 mg/kg (ORCL 400). Os dados foram expressos como
MÉDIA ± EPM de 6 ratos. Dados não significativos.
111
FIG 19. Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba 2, 24 e 48 horas
após a indução da colite com TNB em ratos.
CONTROLE VEÍCULO CONTROLE TNB
ORCL 400mg/Kg
Efeito do óleo-resina da Copaíba na colite induzida por TNB em ratos. Quando
comparado ao controle veículo, a análise histológica do cólon dos ratos tratados
com TNB mostra uma desorganização do epitélio, edema na submucosa com uma
inflamação difusa, infiltração de leucócitos. Secção do cólon tratado, via oral, com
óleo-resina da Copaíba (400 mg/kg) mostra uma atenuação da desordem
morfológica e redução da infiltração de células inflamatórias e edema associada à
administração do TNB (Ácido Tinitrobenzóico) (H & E X 40).
112
5.4.
INJURIA INTESTINAL INDUZIDA POR ISQUEMIA-REPERFUSÃO EM
RATOS.
O efeito do tratamento óleo resina da
Copaifera langsdorffii
(ORCL) 24, 12
e 2 horas antes da indução da isquemia-reperfusão sobre as injurias intestinal em
ratos podem ser vistos nas FIGURAS 20, 21, 22, 23, 24 e 25.
O pré-tratamento via oral de ORCL 400, foi capaz de reduzir de forma
significativa (p<0,05) a atividade da enzima mieloperoxidase no modelo de
isquemia-reperfusão (FIGURA 20).
Na FIGURA 21 observa-se que o pré-tratamento via oral de ORCL 200 e
400, foi capaz de diminuir de forma significativa (p<0,001) a concentração do
malonaldeído no modelo de isquemia-reperfusão.
O efeito do pré-tratamento via oral de ORCL 200 e 400, pode ser obervado
na FIGURA 22, onde foi capaz de diminuir de forma significativa (p<0,01 e
p<0,05, respectivamente) a concentração de nitrito no tecido.
Na FIGURA 23 observa-se que mesmo com a indução da isquemia-
reperfusão, o pré-tratamento via oral de ORCL 200 e 400, foi capaz de diminuir de
forma significativa (p<0,001) a concentração de catalase no intestino.
Na FIGURA 24 observa-se que após a indução da isquemia-reperfusão, o
pré-tratamento via oral de ORCL 200 e 400 foi capaz de aumentar de forma
significativa (p<0,001) a concentração de grupos sulfidrílicos não-protéicos (SH-
NP) no intestino.
Os intestinos dos animais foram avaliados através de um estudo
histopatológico que pode ser observado na FIGURA 25, onde o tratamento com
ORCL 200, parcialmente, as injúrias causadas no modelo de isquemia-reperfusão.
113
FIG 20. Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba sobre a atividade
da mieloperoxidase, 24, 12 e 2 horas antes da indução da isquemia-reperfusão em
intestino de ratos.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
Atividade da MPO (U/g de tecido)
a
b
Controle Controle ORCL200 ORCL400
não tratado Isquemia-reperfusão
ORAL
Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba (200 e 400 mg/kg) sobre a
atividade da mieloperoxidase, após 45min de isquemia e uma hora de reperfusão
em intestino de ratos. A atividade da mieloperoxidase no intestino (U/g de tecido)
foi quantificada na ausência de tratamento (controle não tratado), através do pré-
tratamento com veículo (Controle isquemia-reperfusão; 0.5 mL de 2% Tween 80
via oral), óleo-resina da Copaíba 200 mg/kg (ORCL 200) e 400 mg/kg (ORCL 400).
Os dados foram expressos como MÉDIA ± EPM de 6 ratos.
a
p < 0.001 vs controle
não tratado;
b
p < 0.05 vs controle isquemia-reperfusão.
114
FIG 21. Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba sobre a dosagem
de malonaldeído, 24, 12 e 2 horas antes da indução da isquemia-reperfusão em
intestino de ratos.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
MDA diferença da absorbancia
a
b
b
Controle Controle ORCL200 ORCL400
não tratado Isquemia-reperfusão
ORAL
Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba (200 e 400 mg/kg) sobre
os níveis de malonaldeído, 24, 12 e 2 horas antes da indução da isquemia-
reperfusão em intestino de ratos. Os níveis de malonaldeído no intestino (mmol/g
de tecido) foram quantificados na ausência de tratamento (controle não tratado),
através do pré-tratamento com veículo (Controle isquemia-reperfusão; 0.5 mL de
2% Tween 80 oral), óleo-resina da Copaíba 200 mg/kg (ORCL 200) e 400 mg/kg
(ORCL 400). Os dados foram expressos como MÉDIA ± EPM de 6 ratos.
a
p < 0.001
vs controle não tratado;
b
p < 0.001 vs controle isquemia-reperfusão.
115
FIG 22. Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba sobre a dosagem
do nitrito, 24, 12 e 2 horas antes da indução da isquemia-reperfusão em intestino
de ratos.
0
5
10
15
20
25
NaNO
2
(
M)/10mg de tecido
a
c
b
Controle Controle ORCL200 ORCL400
não tratado Isquemia-reperfusão
ORAL
Efeito da administração retal do óleo-resina da Copaíba (200 e 400 mg/kg) sobre
a dosagem de nitrito, 24, 12 e 2 horas antes da indução da isquemia-reperfusão
em intestino de ratos. A concentração de nitrito no intestino (µM/10mg de tecido)
foi quantificada na ausência de tratamento (controle não tratado), através do pré-
tratamento com veículo (Controle isquemia-reperfusão; 0.5 mL de 2% Tween 80
oral), óleo-resina da Copaíba 200 mg/kg (ORCL 200) e 400 mg/kg (ORCL 400). Os
dados foram expressos como MÉDIA ± EPM de 6 ratos.
a
p < 0.001 vs controle não
tratado;
b
p < 0.01 vs controle isquemia-reperfusão;
c
p < 0.05 vs controle
isquemia-reperfusão.
116
FIG 23. Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba sobre a dosagem
de catalase, 24, 12 e 2 horas antes da indução da isquemia-reperfusão em
intestino de ratos.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Concentração de
Catalase (mM/min/
µ
g de proteína)
a
b
b
Controle Controle ORCL200 ORCL400
não tratado Isquemia-reperfusão
ORAL
Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba (200 e 400 mg/kg) sobre a
dosagem de catalase, 24, 12 e 2 horas antes da indução da isquemia-reperfusão
em intestino de ratos. A concentração de catalase no intestino (mM/min/µg de
proteína) foi quantificada na ausência de tratamento (controle não tratado),
através do pré-tratamento com veículo (Controle isquemia-reperfusão; 0.5 mL de
2% Tween 80 oral), óleo-resina da Copaíba 200 mg/kg (ORCL 200) e 400 mg/kg
(ORCL 400). Os dados foram expressos como MÉDIA ± EPM de 6 ratos.
a
p< 0.001
vs controle não tratado;
b
p< 0.001 vs controle isquemia-reperfusão.
117
FIG 24. Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba sobre a
diminuição de grupos sulfidrílicos não-protéicos (SH-NP) na isquemia-reperfusão
em intestino de ratos.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
µ
g de GSH/500mg de tecido
b
b
a
Controle Controle ORCL200 ORCL400
não tratado Isquemia-reperfusão
ORAL
Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba (200 e 400 mg/kg) sobre a
diminuição de grupos sulfidrílicos não protéicos (SH-NP) na isquemia-reperfusão
em intestino de ratos. A concentração de grupos sulfidrílicos não protéicos (SH-
NP) no intestino (µg de GSH/500mg de tecido) foi quantificada na ausência de
tratamento (controle não tratado), através do pré-tratamento com veículo
(Controle isquemia-reperfusão; 0.5 mL de 2% Tween 80 oral), óleo-resina da
Copaíba 200 mg/kg (ORCL 200) e 400 mg/kg (ORCL 400). Os dados foram
expressos como MÉDIA ± EPM de 6 ratos.
a
p < 0.001 vs controle não tratado;
b
p <
0.001 vs controle isquemia-reperfusão.
118
FIG 25. Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba sobre a isquemia-
reperfusão em intestino de ratos.
CONTROLE VEÍCULO CONT. ISQUEMIA-REPERFUSÃO
ORCL 400
Efeito do óleo-resina da copaíba no modelo de isquemia-reperfusão em ratos.
Quando comparado ao controle veículo, a análise histológica do cólon dos ratos
submetidos a 45min de isquemia e uma hora de reperfusão mostra uma
congestão com exsudato inflamatório e perda da integridade epitelial. Secção do
cólon tratado, via oral, com óleo-resina da Copaíba (ORCL 200mg/kg) mostram
população caliciforme preservada, moderado exsudato inflamatório e discreta
destruição epitelial (H & E X 40).
119
5.5. TOXICIDADE INTESTINAL INDUZIDA POR
INDOMETACINA EM RATOS.
O efeito do tratamento óleo resina da
Copaifera langsdorffii
(ORCL) e Ácido
Kaurenóico (AK) 12 e 2 horas antes da indução da toxicidade intestinal com
indometacina podem ser vistos nas FIGURAS 26, 27, 28 e 29.
O pré-tratamento via oral de ORCL 200, 400 e AK 100, foi capaz de reduzir
de forma significativa (p<0,001) a atividade da enzima mieloperoxidase no modelo
de toxicidade intestinal com indometacina (FIGURA 26 e 27).
O efeito do pré-tratamento via oral de ORCL 200, 400 e AK 100, pode ser
observado na FIGURA 28 e 29, onde foram capaz de diminuir de forma
significativa (p<0,001) a concentração de nitrito no tecido.
120
FIG 26. Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba sobre a atividade
da mieloperoxidase, 12 e 2 horas antes da indução da toxicidade intestinal com
indometacina em ratos.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Atividade da MPO (U/g de tecido)
a
b
b
Controle Controle ORCL200 ORCL400
não tratado Indometacina
ORAL
Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba (200 e 400 mg/kg) sobre a
atividade da mieloperoxidase, 12 e 2 horas antes da indução da toxicidade
intestinal com indometacina em ratos. A atividade da mieloperoxidase no intestino
(U/g de tecido) foi quantificada na ausência de tratamento (controle não tratado),
através do pré-tratamento com veículo (Controle indometacina; 0.5 mL de 2%
Tween 80 via oral), óleo-resina da Copaíba 200 mg/kg (ORCL 200) e 400 mg/kg
(ORCL 400). Os dados foram expressos como MÉDIA ± EPM de 6 ratos.
a
p < 0.001
vs controle não tratado;
b
p < 0.001 vs controle indometacina.
121
FIG 27. Efeito da administração oral do ácido kaurenóico sobre a atividade da
mieloperoxidase, 12 e 2 horas antes da indução da toxicidade intestinal com
indometacina em ratos.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Atividade da MPO (U/g de tecido)
a
b
Controle Controle AK 100
não tratado Indometacina
ORAL
Efeito da administração oral do ácido kaurenóico (100 mg/kg) sobre a atividade da
mieloperoxidase, 12 e 2 horas antes da indução da toxicidade intestinal com
indometacina em ratos. A atividade da mieloperoxidase no intestino (U/g de
tecido) foi quantificada na ausência de tratamento (controle não tratado), através
do pré-tratamento com veículo (Controle indometacina; 0.5 mL de 2% Tween 80
via oral), ácido kaurenóico 100mg/kg (AK 100). Os dados foram expressos como
MÉDIA ± EPM de 6 ratos.
a
p < 0.001 vs controle não tratado;
b
p < 0.001 vs
controle indometacina.
122
FIG 28. Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba sobre a dosagem
do nitrito, 12 e 2 horas antes da indução da toxicidade intestinal com
indometacina em intestino de ratos.
0
5
10
15
20
25
30
35
NaNO
2
( M)/10mg de tecido
a
b
b
Controle Controle ORCL200 ORCL400
não tratado Indometacina
ORAL
Efeito da administração oral do óleo-resina da Copaíba (200 e 400 mg/kg) sobre a
dosagem de nitrito, 12 e 2 horas antes da indução da toxicidade intestinal com
indometacina em intestino de ratos. A concentração de nitrito no intestino
(µM/10mg de tecido) foi quantificada na ausência de tratamento (controle não
tratado), através do pré-tratamento com veículo (Controle indometacina; 0.5 mL
de 2% Tween 80 oral), óleo-resina da Copaíba 200 mg/kg (ORCL 200) e 400
mg/kg (ORCL 400). Os dados foram expressos como MÉDIA ± EPM de 6 ratos.
a
p
< 0.001 vs controle não tratado;
b
p < 0.001 vs controle indometacina.
123
FIG 29. Efeito da administração oral do Ácido Kaurenóico sobre a dosagem do
nitrito, 12 e 2 horas antes da indução da toxicidade intestinal com indometacina
em intestino de ratos.
0
5
10
15
20
25
30
35
NaNO2 (
µ
M)/10mg de tecido
a
b
Controle Controle AK 100
não tratado Indometacina
ORAL
Efeito da administração oral do ácido kaurenóico (100 mg/kg) sobre a dosagem de
nitrito, 12 e 2 horas antes da indução da toxicidade intestinal com indometacina
em intestino de ratos. A concentração de nitrito no intestino (µM/10mg de tecido)
foi quantificada na ausência de tratamento (controle não tratado), através do pré-
tratamento com veículo (Controle indometacina; 0.5 mL de 2% Tween 80 oral),
ácido kaurenóico 100mg/kg (AK 100). Os dados foram expressos como MÉDIA ±
EPM de 6 ratos.
a
p < 0.001 vs controle não tratado;
b
p < 0.001 vs controle
indometacina.
124
5.6.
PERMEABILIDADE INTESTINAL COM AZUL DE EVANS EM
CAMUNDONGOS.
O efeito do pré-tratamento óleo resina da
Copaifera langsdorffii
(ORCL) e
Ácido Kaurenóico (AK) na permeabilidade intestinal com azul de Evans pode ser
vistos nas TABELA 5.
O grupo pré-tratado com indometacina foi capaz de aumentar de forma
significativa (p<0,01) (104,26 ± 9,19), a permeabilidade intestinal, quando
comparado ao controle não tratado (50,53 ± 3,50).
O rofecoxib não alterou de forma significativa (58,17 ± 3,96) a
permeabilidade intestinal, quando comparado ao controle não tratado (50,53 ±
3,50), porém quando administrado juntamente com a indometacina (183,82 ±
17,08) (p<0,001) foi capaz de potencializar a permeabilidade exercida pela
indometacina sozinha (104,26 ± 9,19).
Os grupos pré-tratados com ORCL 200 e 400 não foram capazes de alterar
de forma significativa (47,74 ± 3,70; 59,92 ± 4,64, respectivamente) a
permeabilidade intestinal, quando comparado ao controle não tratado (50,53 ±
3,50). Quando ORCL 200 e 400 foram administradas juntamente com
indometacina o grupo do ORCL 400 (168,22 ± 18,16) (p<0,001) foi capaz de
potencializar a permeabilidade exercida pelo grupo da indometacina (104,26 ±
9,19).
AK 50, mas não o AK 100, foi capaz de aumentar de forma significativa
(200,55 ± 13,05) a permeabilidade intestinal, quando comparado ao controle não
tratado (50,53 ± 3,50).
125
TABELA 5 – Efeito do óleo resina da
Copaifera langsdorffii
e ácido kaurenóico na
avaliação da permeabilidade intestinal no modelo de azul de Evans em
camundongos.
GRUPOS
Tratamento (v.o.)
N Concentração de azul de Evans (g)/g
de tecido x 10
-5
Média ± E.P.M.
Controle não tratado
6
50,53 ± 3,50
Indometacina (20mg/Kg)
7 104,26 ± 9,19**
a
Rofecoxib (5mg/Kg)
6 58,17 ± 3,96**
b
Rofecoxib (5) + INDO (20)
6 183,82 ± 17,08***
b
***
c
ORCL (200mg/Kg)
6 47,74 ± 3,70***
b
ORCL (200) + INDO (20)
7 144,32 ± 14,20*
b
*
c
ORCL (400mg/Kg)
4 59,92 ± 4,64*
b
ORCL (400) + INDO (20)
5 168,22 ± 18,19***
b
***
c
AK (50mg/Kg)
6 200,55 ± 13,05***
b
AK (50) + INDO (20)
6 161,76 ± 17,18***
b
***
c
AK (100mg/Kg)
5 116,68 ± 12,12
(ns)
AK (100) + INDO (20)
7 86,58 ± 6,84
(ns)
ORCL=óleo-resina da
Copaifera langsdorffii
e AK=ácido kaurenóico.
Student Newman-Keul´s test, * p < 0.05, ** p < 0.01, ***p<0.001; quando comparado ao
controle não tratado (a); quando comparado a indometacina (b); quando comparado ao
tratamento sem indometacina (c); (ns) não significativo.
Tratamento com indometacina e/ou rofecoxib foi realizado 6h antes da cirurgia, quando
administrado em associação foi dado um intervalo de 30 minutos entre estes, Os tratamentos com
ORCL e AK foram administrados 2h antes da cirurgia e quando administrados em associação com a
indometacina, 30 minutos antes desta.
126
5.7. ATIVIDADE CICATRIZANTE
5.7.1.Ferida aberta
Como podemos ver na FIGURA 30 os animais tratados com veículo
tiveram contração de 51,29% ± 9,54% dos 2cm originais até o nono dia e o
percentual dos animais tratados com ORCL (2% e 4%) foi da ordem de 72,10% ±
7,37% e 84,05 ± 2,37%, respectivamente. O progresso na contração foi o mesmo
nos dias seguintes 12, 15, 18 e 21.
5.7.2.Ferida por incisão
Os resultados da aplicação tópica de ORCL na incisão linear pode ser
observado na FIGURA 31 . O grupo tratado com ORCL 4% mostrou um aumento
significante (99%) no 5º dia da exposição a tensão (cont. veículo 33,95 ±
7,44g/cm e ORCL 2% 51,97 ± 9,13g/cm e ORCL 4% 71,48 ± 5,77g/cm).
A FIGURA 32 mostra uma foto de animais que foram submetidos ao
modelo de ferida aberta por incisão.
127
FIG 30. Efeito do óleo-resina da
Copaifera langsdorffi
(ORCL) na contração da
pele no modelo de ferida aberta.
0
20
40
60
80
100
120
3 6 9 12 15 18 21
DIAS
% DE CONTRAÇÃO DA PEL
E
CONT VEÍCULO
ORCL 2%
ORCL 4%
*
Efeito do óleo-resina da Copaifera
langsdorffi
(ORCL) na contração da pele da
ferida aberta. ORCL ou o veículo foram aplicados topicamente todos os dias,
durante vinte e um dias. Os dados foram expressos como MÉDIA ± EPM de 6
ratos. *p < 0.05 vs controle veículo.
128
FIG 31. Efeito do óleo-resina da
Copaifera langsdorffi
(ORCL) na contração da
pele no modelo de ferida por incisão.
,0
0
50
100
150
200
250
DIAS
TENSÃO (g/cm)
CONT VEÍCULO
ORCL 2%
ORCL 4%
*
5 7 12
Efeito do óleo-resina da
Copaifera langsdorffi
(ORCL) na resistência a tensão.
ORCL ou o veículo foram aplicados topicamente todos os dias, durante doze dias.
Os dados foram expressos como MÉDIA ± EPM de 6 ratos. *p < 0.05 vs controle
veículo.
129
FIG 32. Foto de animais que foram submetidos ao modelo de ferida por incisão.
CONT VEÍCULO - ORCL 2% - ORCL 4%
130
6.DISCUSSÃO
131
6.DISCUSSÃO
Óleo-resina da
Copaifera langsdorffii
(ORCL) e Ácido Kaurenóico (AK) no
modelo de colite induzida por ácido acético (AA) e TNBS.
O óleo de copaíba destaca-se dentre as substâncias medicinais de uso
popular, sendo frequentemente utilizado como antiinflamatório ou cicatrizante
(VIARA, L. S. Fitoterapia da Amazônia. São Paulo: EAC, 1992). A forma de
utilização pode ser tópica, vaginal, oral, dentre outras. Experimentalmente,
Fernades
Et al
., 1992, verificaram o efeito antiinflamatório do óleo de copaíba,
inibindo o edema de pata induzido pela carragenina em ratos e Paiva
Et al
., 2000,
demonstraram em ratos, seu efeito gastroprotetor contra lesões gástricas
induzidas por estresse, indometacina e etanol. Entretanto, apesar do óleo de
copaíba ser amplamente utilizado pouco se conhece a respeito do seu efeito no
trato intestinal. Portanto, neste estudo primeiro verificamos a eficácia do óleo-
resina de copaíba em modelos animais de inflamação intestinal induzidos por
ácido acético, TNBS, isquemia-reperfusão e indometacina. Segundo verificamos o
efeito deste óleo na contração da pele em modelos de ferida aberta e incisão, na
tentativa de validar o uso popular do óleo-resina de copaíba na cicatrização de
feridas.
A Doença inflamatória intestinal (DII), que compreende colite ulcerativa e
doença de Crohn, é uma condição crônica que afeta principalmente à parte distal
do intestino e apresenta períodos alternados de inflamação e remissão dos
sintomas. Normalmente a fisiologia do intestino é um balanço entre a ativação e
controle da resposta imune. Atualmente não está claro se a resposta imune causa
a colite ulcerativa e a doença Crohn, muitas teorias existem, mas não explicam
adequadamente esta patologia. Uma outra teoria descreve que o aumento da
permeabilidade da mucosa está associado a pacientes com doenças inflamatórias
intestinais. A mais plausível teoria é que as DIIs alteram o funcionamento do
sistema imune causando uma proliferação anormal de citocinas, antígenos,
linfócitos e anticorpos. Indiferente ao mecanismo exato, o sistema imune é
132
ativado e ocorre o dano na mucosa na DII. Ambos, colite ulcerativa e doença de
Crohn, são condições inflamatórias crônicas, a primeira afeta o cólon e a ultima
mais comumente afeta o intestino delgado, podendo se estender ao cólon.
Caracteristicamente a mucosa na colite ulcerativa progride para ulceração com
pseudopólipos. Em ambas as doenças há um aumento de adnocarcinomas no
cólon. A etiologia da DII permanece desconhecida e o tratamento farmacológico é
carente de opções (SANDS, 2000), portanto, a procura por novas linhas de terapia
é pertinente. O maior objetivo do presente estudo é averiguar se ORCL e seu
constituinte AK têm um efeito no estágio inicial da colite induzida por AA e TNBS.
O óleo-resina da
Copaifera langsdorffii
e seu constituinte diterpênico ácido
kaurenóico têm mostrado ser antiinflamatório, nossa hipótese é que eles exerçam
sua atividade abrandando os danos provocados pelo AA ou TNBS e detenham a
progressão da reação inflamatória.
Nos anos recentes têm surgido significativos avanços sobre o curso da
doença, patogênese, e opções terapêuticas para colite ulcerativa. É evidente que o
avanço na busca da elucidação da DII oferecerá ao clínico novas perspectivas no
cuidado e acompanhamento dos pacientes. No presente estudo, nós mostramos
que ORCL e AK previnem lesões teciduais em ratos, no modelo de colite induzida
por ácido acético e TNBS, observado por seus efeitos em alterações
macroscópicas, histológicas e bioquímicas. A colite induzida por ácido acético é um
dos modelos experimentais mais utilizados para avaliar substâncias nesta condição
(MACPHERSON & PFEIFFER, 1978; SHARON & STENSON, 1985; NOA
et al.,
2000)
onde mediadores inflamatórios como espécie reativa de oxigênio, aminas
vasoativas e eicosanóides desempenham um papel proeminente (SEO
et al.,
1995;
LOGUERCIO
et al.,
1996; CARTY
et al.,
2000).
Estudos anteriores indicam que radicais livres derivados de oxigênio como,
superóxido (O
2
-
), óxido nítrico (NO) e radical hidroxila (OH), têm um papel nos
danos teciduais que ocorrem na DII. O intestino produz enzimas capazes de gerar
radicais livres (PARKS, 1989). Tem sido colocado que na colite ulcerativa,
episódios passageiros de isquemia com subseqüente reperfusão produzem níveis
133
altos de radicais livres (GRISHAM & GRANGER, 1988). Este processo inicia uma
cascata de eventos que leva ao recrutamento e ativação de leucócitos, resultando
em ulceração da mucosa. Existem baixos níveis de antioxidantes endógenos na
mucosa do cólon. O resultado de um estresse oxidativo pode facilmente sobrepor
as defesas endógenas que regulam a produção de espécies reativas de oxigênio
(ROS) (BLAU
et al.,
1999). Estas espécies são citotóxicas, induzindo
lipoperoxidação e outro estresse oxidativo por destruir proteínas, lipídeos e ácidos
nucléicos, causando uma deficiência celular, lesão, e eventualmente morte. Há
evidências consistentes que na biópsia de pacientes com colite ulcerativa, os
danos causados pelas espécies reativas de oxigênio são promovidos pelo aumento
na lipoperoxidação (GRISHAM, 1994). Foi sugerido que o desequilíbrio no
mecanismo da DII, entre pró-oxidantes e antioxidantes, pode ser controlado por
um tratamento antioxidante. Alguns agentes como N-acetilcisteina, sulfasalazina,
L-glutamina, flavonóides etc., que são destruidores de radicais livres foram
efetivos em prevenir colite experimental induzida por ácido acético e TNBS
(AUROMA
et al.,
1987; KAYA
et al.,
1999; NOSÁLÒVÁ
et al.,
2000; SÁNCHEZ DE
MEDINA
et al.,
2002).
Em nossos estudos, ORCL e AK demonstraram diminuir vários parâmetros
da inflamação no cólon, como o escore da lesão e peso úmido do intestino,
dependendo da dose e via de administração. O peso úmido do tecido inflamado é
considerado um indicador confiável e sensível da severidade e extensão de
resposta inflamatória (RACHMILEWITZ
et al.,
1989). As substâncias teste foram
capazes de reduzir significativamente o peso úmido e o escore da lesão,
comparado ao controle que recebeu o veículo. Em alguns modelos, a dose mais
alta não foi muito efetiva e as razões para este achado são difíceis de explicar.
Provavelmente estas substâncias podem funcionar com limitada capacidade
antioxidante.
Também, ORCL e AK foram eficazes em reduzir os sinais histológicos de
inflamação como, infiltração de leucócitos, edema e dano de tecido. Os neutrófilos
desempenham um papel crucial na produção de ânion superóxido gerando uma
134
cascata de várias espécies reativas com formação de radical hidroxila e água
oxigenada que contribuem significativamente para a necrose de tecido e
deficiência orgânica (BAKER & CAMPBELL, 1991; SALIM, 1992; GRISHAM, 1994).
Nossos resultados mostram que ambos, ORCL e AK podem reduzir a atividade de
MPO associada com a colite induzida por ácido acético. MPO é uma enzima
lançada por estímulos inflamatórios através da ativação de grânulos de
armazenamento no neutrófilo e que catalisa a formação de várias espécies
reativas (KETTLE, 1997). Uma redução na atividade desta enzima pode ser
interpretada como uma manifestação da atividade antiinflamatória (VELJACA
et
al.,
1995). O aumento na atividade da MPO pode ser correlacionado positivamente
com o aumento em níveis de MDA indicando um aumento em lipoperoxidação no
grupo controle do ácido acético. Além da inibição da mieloperoxidase, eles
também suprimiram o nível aumentado de malonaldeído associado com colite
induzida por ácido acético. O aumento da lipoperoxidação que acontece no tecido
do cólon pode iniciar um ciclo maligno que gera cada vez mais metabólitos
reativos, exaurindo os antioxidantes celulares, vitamina C e E em última instância
favorecem o desenvolvimento conseqüente de inflamação e ulceração adicional. É
então razoável assumir que os tratamentos melhoram o estresse oxidativo que
ocorrem animais com colite porque as substâncias teste podem reduzir o nível de
MDA, um bom indicador de lipoperoxidação (OHAKWA
et al.,
1979) e atividade de
MPO, um marcador de leucócitos polimorfonucleares (BRADLEY
et al.,
1982). Em
adição, eles eficazmente reduziram os sinais histológicos de inflamação como
infiltração de leucócitos, edema e dano tecidual. A atividade oxidativa de radicais
livres é uma causa importante de lesão tecidual na inflamação (KRUIDENEIR e
VERSPAGET, 1998). Neutrófilos desempenham um papel crucial nesta
consideração por produzir ânions superóxido e uma cascata de várias espécies
reativas que leva a uma produção de radical hidroxila e água oxigenada (BAKER &
CAMPBELL, 1991; SALIM, 1992). Os efeitos antiinflamatórios dos grupos cauranos
e diterpenos têm estado recentemente descritos e parecem prejudicar a
sinalização inflamatória por inibição de fatores nucleares como NF-kappaB. Como
o ácido kaurenóico suprimiu a severidade da colite induzida por ácido acético, nós
presumimos que inibiu a atividade do NF-kB que regula a transcrição de várias
135
citocinas inflamatórias (TAK & FIRESTEIN, 2001). Os efeitos antiinflamatórios
desta substância no modelo animal de colite pareceu consistente com observações
antigas que demonstram sua habilidade em inibir o edema de pata induzido por
carragenina em ratos (FERNANDES
et al.,
1992).
A colite induzida por TNBS também é um modelo experimental comumente
utilizado para o estudo de novas drogas com atividade nas doenças inflamatórias
intestinais (WALLACE, 1988; YOSHIAKWA
et al.,
1997; CHEN
et al.,
1999) em que
mediadores inflamatórios como espécies reativas de oxigênio, aminas vasoativas e
eicosanoides desempenham um papel proeminente (SEO
et al.,
1995; LOGUERCIO
et al.,
1996; CARTY
et al.,
2000). O TNBS modelo de colite é caracterizado por
uma resposta inflamatória aguda intensa imediata com necrose da mucosa
seguida por uma fase prolongada de cicatrização das lesões da mucosa e
progressão para uma resposta tipo crônico (NEURATH
et al.,
2000). Neste modelo
de colite, os efeitos terapêuticos sobre as lesões da mucosa e úlcera de drogas
conhecidas como potentes antiinflamatórios, dexametasona ou metilpredinisolona,
têm sido difíceis de demonstrar (FRIES
et al.,
1998). Em nossas experiências com
ratos, a fase aguda de colite de TNBS está associada significativamente ao
aumento de MPO e MDA, mas realçado com níveis baixos de catalase, indicando
um agudo estresse oxidativo. O ORCL mostrou eficácia neste modelo experimental
de colite. ORCL significativamente reduziu o peso úmido e escore da lesão,
comparados com o controle que recebeu o veículo. É interessante mencionar que
a infiltração de neutrófilos está associada à atividade da MPO, e esta foi, mais
uma vez, alterada pelo tratamento com ORCL assim como o dano tecidual e
edema, observados nas análises histológicas. Isto presumivelmente reflete uma
outra contribuição para o dano tecidual e edema por outras células inflamatórias,
especialmente macrófagos e linfócitos. Neutrófilos desempenha um papel crucial
no desenvolvimento de danos teciduais, como foi demonstrado em muitos
modelos de lesão gástrica e intestinal (GRISHAM
et al.,
1990; KVIETZ
et al.,
1990;
MATSUMOTO
et al.,
1993) por produzir superóxido e uma cascata de várias
espécies reativas que levam a uma formação de radical hidroxila e água oxigenada
(BAKER e CAMPBELL, 1991; SALIM, 1992).Os efeitos benéficos de ORCL nas
136
lesões teciduais que ocorrem na colite não podem ser, necessariamente, devido à
diminuição da atividade da MPO ou reabastecimento de glutationa. Porém, estes
efeitos do ORCL podem contribuir para uma diminuição nas lesões teciduais como
foi observado com outras substâncias como silimarim e n-acetilcisteina
(NOSALÒVA
et al.,
2000; CRUZ
et al.,
2001). Como os neutrófilos desempenham
um papel crucial no desenvolvimento da inflamação intestinal (GRISHAM, 1994),
nós sugerimos que o efeito benéfico de ORCL na colite induzida por TNBS é
devido a sua capacidade em diminuir a infiltração de neutrófilos no cólon.
ORCL e Isquemia/Reperfusão
O intestino delgado é altamente sensível aos danos causados pela
isquemia/reperfusão (I/R). A isquemia aguda mesentérica é uma emergência
vascular que pode exigir um primeiro diagnóstico e intervenção adequada para
restabelecer o fluxo de sangue mesentérico, para prevenir a necrose do intestino e
morte do paciente (OLDENBERG
et al.,
2004). O pronto atendimento é essencial
para melhorar o resultado clínico. A isquemia/reperfusão ativa uma resposta
inflamatória complexa que inclui, ativação do sistema complemento, agregação e
migração de neutrófilos polimorfonucleares, e aumenta o número de vários
derivados de oxigênio, radicais livres, que são responsáveis pelo dano tecidual
(SCHWARZ
et al.,
1999; BALOGH
et al.,
2002). Um modelo animal de oclusão
passageira da artéria mesentérica superior foi usada neste estudo para verificar o
efeito de potencial benéfico de ORCL na lesão tecidual causada pela I/R . Os
danos intestinais observados foram, hiperemia e níveis elevados de MPO, MDA,
catalase, e nitrito com uma redução nos níveis de glutationa. Estas alterações
foram notadamente inibidas pelo pré-tratamento com ORCL administrado por via
oral nas doses de 200 e 400 mg/kg. Os estudos anteriores demonstraram a
eficácia de vários extratos de plantas que possuem atividades antioxidante e
antiinflamatória como
Ginkgo biloba
e
Artemisia vulgaris
em minimizar as lesões
intestinais associadas a I/R (TIGNO & GUILA, 2000; PEHLIVAN
et al.,
2002).
A
perfusão microvascular que ocorre após a isquemia é associada com infiltração de
células inflamatórias, aumentando a interação leucócito-célula-endotelial e
137
lançando mediadores inflamatórios (CHEN
et al.,
2000; BRAUN
et al.,
2002).
Ocorre aderência de neutrófilos ativados ao endotélio microvascular secretando a
enzima MPO e favorecendo a formação de ROS com subseqüente dano tecidual
(WELBOURN
et al.,
1991; KETTLE
et al.,
1997; CARDEN e GRANGER, 2000).
Radicais livres de oxigênio iniciam a lipoperoxidação danificando proteínas que
podem responder pela necrose celular associada com a reperfusão (ZIMMERMAN
& GRANGER, 1992). Foi demonstrado que durante a reperfusão, o oxigênio
molecular reage com xantina oxidase e hipoxantina para produzir radicais livres de
oxigênio (GRANGER, 1986).
Neste estudo, ORCL na dose mais alta reduziu a MPO, um marcador
bioquímico da infiltração de neutrófilo no tecido lesionado e assim protegeu o
tecido do estresse oxidativo associado a I/R. A atividade da catalase foi
aumentada nos tecidos homogenados no grupo controle I/R quando comparado
ao controle veículo. A catalase é uma enzima protetora extensamente distribuída,
que catalisa a degradação de H
2
O
2
, um forte agente oxidante biológico
(FOREMAN & TORRES, 2001) e níveis aumentados de catalase estão associados as
lesões teciduais que ocorrem no modelo de I/R podendo representar um sistema
biológico contra reações oxidantes deste tecido. Uma observação semelhante foi
feita por Esposito
et al.
(2003) em polpas dentais inflamadas em humano. Estes
autores acharam um aumento da atividade da catalase em polpa dental inflamada
quando comparado ao tecido saudável. De maneira interessante, o pré-tratamento
com ORCL mostrou valores significativamente mais baixos de catalase e MDA
quando comparados ao grupo tratado com veículo. Dado que o nível de produção
de H
2
O
2
é alto em área intestinal (HALLIWELL
et al.,
2000), ORCL com suas
propriedades antioxidante e anti-lipoperoxidativa podem ter eficazmente
modulado a catalase e MDA para níveis muito mais baixos que os valores basais.
Os níveis de glutationa (GSH) no intestino de ratos submetidos a I/R foi
significativamente mais baixo que o grupo tratado com veículo, e o pré-tratamento
com ORCL significativamente alterou isto. Em um estudo prévio, nós observamos
que ORCL no modelo de úlcera gástrica induzida por etanol, promove uma
138
depleção de GSH na mucosa, oferecendo gastroproteção (Paiva
et al.,
1998). A
GSH é um agente protetor extremamente importante e diretamente extermina
radicais livres (KIDD, 1997). Além da inibição da mieloperoxidase, ORCL reverteu
a diminuição nos níveis de glutationa associada a I/R. A GSH é um do mais
abundante antioxidantes intracelular e que desempenha um papel essencial em
proteger células dos danos oxidativos (YU, 1994). A água oxigenada formada por
peroxidação lipídica é decomposta pela glutationa peroxidase, usando dois moles
de glutationa por mol de água oxigenada metabolizada. A glutationa oxidada deixa
a célula mais prontamente do que a forma reduzida, deste modo facilita a sua
depleção (HOGEBERG
et al.,
1975). É então, razoável assumir que o tratamento
com ORCL melhorou o equilíbrio oxidativo do cólon em animais com colite, porque
reduziu a atividade da mieloperoxidase, um marcador do acúmulo de leucócitos
polimorfonucleares (BRADLEY
et al.,
1982) e aumentou os níveis teciduais de
antioxidante, a glutationa. Desde que ORCL modulou a depleção de GSH, nós
assumimos que este é dotado de propriedade antioxidante.
A produção de óxido nítrico (NO) pelo óxido nítrico sintase induzida (NOSi)
foi mostrado que está associada às lesões intestinais induzidas por I/R (TURNAGE
et al.,
1995). Foi demonstrado que inibidores seletivos de NOSi podem atenuar a
hemodinâmica e desarranjo microcirculatório resultante da I/R intestinal (CHEN
et
al.,
2000; NAITO
et al.,
2004). A inibição significativa de ORCL no aumento de
nitrito associado a I/R sugere que um excesso de NO, produzido por NOSi, pode
ter contribuído para a iniciação/amplificação das lesões inflamatórias intestinais
pelos vários mecanismos inclusive, danos oxidativos e nitroativos como também o
aumento de citocinas inflamatórias.
Recentemente, o fator nuclear kppaB ( NF-kB) foi implicado no dano
intestinal induzido por I/R (CHEN & WANG, 2004; NICHOLS, 2004). A via de
produção do NF-kB é cíclica na resposta inflamatória regulando a expressão de
citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas e enzimas induzíveis e deste modo
desempenha um papel maior nas desordens inflamatórias agudas e crônicas como
também na resolução de inflamação (BARNES
et al.,
1997; LAWRENCE
et al.,
139
2001; GHOSH & KARIN, 2002). CHEN
et al.
(2003) estudaram o papel do NF-kB
na inflamação aguda que ocorre na I/R intestinal pela separação seletiva de IkB
kinase (IKK)-
B
, a subunidade catalítica de IKK que é essencial para ativação de
NF-kB. A separação de IKK-
B
em enterócitos preveniu a resposta inflamatória
sistêmica que, caso contrário, normalmente culmina em síndrome de deficiência
orgânica de órgão múltiplo. Porém, a remoção de IKK-
B
também resultou em
severa apoptose na reperfusão da mucosa intestinal. Estes resultados de CHEN
et
al.
(2003) refletem a função dúbia do sistema de NF-kB, que é responsável por
ambas, a proteção do tecido e inflamação sistêmica, e ressalta a precaução que
deve ser tomada em usar inibidores de NF-kB e IKK.
Existem trabalhos mostrando várias substâncias derivadas de plantas que
contenham diterpenos apresentando atividade capazes de inibir a ativação do NF-
kB e assim inibir a cascata inflamatória (CASTRILLO
et al.,
2001). Um papel
essencial da microbiota intestinal é o de facilitar respostas inflamatórias agudas
(SOUZA
et al.,
2004). Estes autores demonstram que em animais livre de
microorganismos, o dano intestinal era bem menor quando comparados a animais
normais submetidos a I/R intestinal. O ácido presente no ORCL é um diterpeno
kaurenóico que tem propriedade bactericida e também é capaz de inibir a ativação
de NF-kB (WILKENS
et al.,
2002; GIANG
et al.,
2003). Estes possíveis efeitos do
ORCL podem ter favorecido no controle efetivo das lesões inflamatórias intestinal
nos grupos de animais tratados com ORCL no modelo de isquemia/reperfusão.
Óleo-resina de Copaiba no modelo de toxicidade intestinal induzida por
indometacina.
A permeabilidade no intestino delgado é freqüentemente alterada em
pacientes com doença de Crohn e pode desempenhar um papel patogênico (FRIES
et al.,
1999). A inibição de COX estimula os nervos entéricos que afetam
motilidade, secreção alcalina e permeabilidade no duodeno de rato (NYLANDER
et
al.,
2001). O uso prolongado ou de altas doses de inibidores não-seletivos de COX
(indometacina, naproxeno, piroxicam, sulindac, diclofenaco) ou inibidores seletivos
140
de COX-2 (rofecoxibe, celecoxibe, etodolaco, nimesulkda, parecoxibe e
etoricoxibe) podem causar danos gastrointestinais (SIGTHORSSON
et al.,
2002).
Inibidores seletivos de COX-1, dex-ketoprofene não induz nenhum dano ao trato
gastrointestinal, mas o não-seletivo induz complicações gastrintestinais e COX-2
seletivo aumentou os riscos de trombose e efeitos adversos cardíacos.
Os antiinflamatórios não-esteroidais em geral causam erosões agudas e
induzem úlceras crônicas que resultam em hospitalizações e morte por causa de
hemorragia e perfuração. Ambos, indometacina e rofecoxibe parecem produzir
efeitos adversos indesejáveis no intestino. Lesões induzidas por indometacina são
mais severas, ela induz mucositis, alterações morfológicas, aumenta a
permeabilidade da mucosa e uma resposta pró-inflamatória. A administração de
indometacina aumenta permeabilidade intestinal em ratos e induz patologias
inflamatórias no intestino delgado (STEWART
et al.,
1980) e este representa um
modelo para doença do Crohn (COLPAERT
et al.,
2001). Indometacina (1-(4-
clorobenzol)-5-metoxi-2-metil-1H-indole-3-ácido acético) é um inibitor não seletivo
de COX e inibe a formação de prostanóides. Em adição aumenta a síntese de
leucotrieno, outros mecanismos possíveis foram propostos para a indução de
inflamação de intestino. Entre os mecanismos sugeridos estão (1) a fosforilação
oxidativa levando a diminuição da capacidade de reserva de ATP celular
(SOMASUNDARAM
et al.,
1995); (2) inibição da atividade de desaturação que leva
a um desequilíbrio composição ácida gordurosa relativa entre saturada vs.
poliinsaturada da membrana da célula epitelial (COOPER, 1977); (3) ação
detergente na borda de escova, alterando as propriedades da camada de muco
(GULLIKSON
et al.,
1982); e (4) deposição de fibrina intra-vascular (ANTHONY
et
al.,
1996) juntamente com vasoconstricção esplânica (FIEGEN
et al.,
1981)
levando a uma isquemia local. O aumento de macrófagos produtores de TNF tem
sido divulgado em condições de aumento da permeabilidade intestinal em colite
experimental (TATEISHI
et al.,
1997) e a terapia com anti-TNF também foi eficaz
em suprimir a toxicidade intestinal induzida por indometacina (COLPAERT
et al.,
2001). Isto sugere que a indometacina exerce sua ação na permeabilidade
intestinal via um mecanismo TNF dependente. A permeabilidade intestinal
141
aumentada (síndrome de intestino frouxo) não acontece só com o uso de NSAIDs
como a indometacina, mas também em alergias a alimentos, uso de antibióticos,
excessos de bebida alcoólica, infecções parasitárias, na aids, asma e artrite.
Neste estudo, nós resolvemos investigar os efeitos de ORCL e AK em
comparação com o inibidor seletivo COX-2, rofecoxibe no modelo de
permeabilidade induzida por indometacina no intestino delgado de camundongos.
Os resultados obtidos mostram que indometacina e AK aumentam a
permeabilidade quando comparada com o grupo que recebeu apenas o corante
azul de Evans. O efeito observado da indometacina na permeabilidade intestinal é
consistente com estudos anteriores (COLPAERT
et al.,
2001). Em contraste,
ambos, ORCL e rofecoxibe quando administrados isolados, demonstraram uma
diminuição na permeabilidade. Porém, estas substâncias em combinação com
indometacina produziram um aumento maior ainda da permeabilidade intestinal.
Estas observações são consistentes com trabalhos anteriores (LAUDANNO
et al.,
2002; SIGTHORSSON
et al.,
2002) foi demonstrado uma resposta inflamatória
exagerada com necrose e lesões erosivas gastrointestinais quando drogas
seletivas de COX-1 ou não seletivas são combinadas com agentes seletivos COX-2.
A inibição de COX-2, desde que o COX-1 é ativado, existirá um aumento na
expressão de COX-2 favorecendo a regeneração de PGE, que é citoprotetora. A
inibição das duas, COX-1 e COX-2, induzem lesões (LAUDANNO
et al.,
2002;
TANAKA
et al.,
2002). Quando COX-1 e COX-2 são inibidas não existe nenhuma
expressão de COX-2 e isto pode causar danos teciduais (TANAKA
et al.,
2002).
ORCL
Na medicina tradicional ORCL é extensamente empregado para tratar
feridas e úlceras (PIO CORRÊA, 1984). O óleo-resina da Copaíba está
comercialmente disponível para uso oral ou para aplicação tópica e seu efeito
antimicrobiano foi previamente descrito. Apesar do seu uso popular, não existia
nenhum dado publicado sobre sua capacidade de cicatrização de feridas. Então o
presente estudo examinou se ORCL pode promover a cicatrização de feridas em
142
experimentos cutâneos. A cicatrização de feridas envolve três diferentes fases:
inflamação, formação de tecido de granulação, e formação de matriz e
remodelamento (CLARK, 1985).
A fase inflamatória acontece logo depois do ferimento ocorrer e dura mais
ou menos 5 dias, durante este período existe a produção de mucopolissacarídeos
e precursores de proteína solúveis de colágeno, acontece então a formação de
tecido de granulação, com proliferação de fibroblastos e a formação de poucos
vasos sangüíneos que definha ao redor do sétimo dia depois do início do
ferimento. Neste estudo, a aplicação tópica de ORCL, em uma concentração de
4%, significativamente aumentou a contração da ferida no no dia. A contração do
ferimento na fase rápida (7-9 dias) é mais relevante para ser estudada do que as
fases mais velhas (depois de 12 dias), pois o percentual de contração do
ferimento após este período quase cessou (CROSS
et al.,
1995). Foi sugerido que
o fator comum na contração de feridas é a atividade de fibroblastos
(microfibroblastos), estes são encontrados no tecido de granulação de cicatrização
de feridas (GABBIANI
et al.,
1971). Vários fitoconstituintes presentes no ORCL,
como diterpenos, e ou a presença de algum fator de crescimento desconhecido,
como fator de crescimento de transformação, promova a formação de colágeno
(MUSTOE
et al.,
1987) e poderia ter contribuído para contração primária da ferida.
Um aspecto importante da cicatrização de ferida depois da incisão cirúrgica
pode ser a geração de resistência à tensão, que pode medir a propriedade de
cicatrização do tecido. Depois da remoção de sutura no quinto dia, a força medida
reflete a formação do colágeno novo (NAGI & ZINGG, 1971). O tratamento com
ORCL (4%) aumentou a resistência à tensão no quinto dia de cicatrização
indicando significativamente que ORCL pode acelerar a cicatrização do ferimento.
A deiscência da ferida normalmente acontece dentro dos primeiros sete dias
depois de cirurgia. Deste modo, um aumento na primeira fase de resistência à
tensão notada no modelo de incisão pode levar a uma redução em complicações
na cicatrização da ferida.
143
Muitos fatores gerais e locais como infecção, destruição de proteína,
doença (uremia, icterícia), drogas citotoxicas e antimetabólicas, deficiência de
vitamina C e zinco, etc. podem influenciar negativamente no acúmulo de colágeno
e/ou ganho de força mecânica (BURNS
et al.,
2003). O reparo do tecido de
embriões é rápido, eficiente e perfeito e não deixa uma cicatriz, uma habilidade
que é perdida como resultado do desenvolvimento. Uma diferença chave na
cicatrização entre o embrião e o adulto que pode explicar porque no embrião se
cura perfeitamente e no adulto deixa cicatrizes, é a presença de uma resposta
inflamatória local no adulto, o que não ocorre no embrião. Estudos na cicatrização
de ratos PU.1 nulo, que é geneticamente incapazes de criar uma resposta
inflamatória, mostra que a inflamação realmente pode ser, em parte, responsável
pela cicatrização, e estudos genéticos de inflamação em larvas zebrafish (Danio
rerio) sugerem que a identificação das rotas genéticas modulando o recrutamento
de células inflamatórias pode ser o modo de melhorar a cicatrização no adulto
(REDD
et al.,
2004). Em homem e animais domésticos, cicatrização na pele depois
de trauma, cirurgia, queimadura ou dano de esporte é um problema médico
grande, freqüentemente resultando em estética adversa, perda de função,
restrição de movimento de tecido e/ou crescimento de efeitos psicológicos
adversos. Os tratamentos atuais são empíricos, incertos e impossíveis de predizer:
não existe nenhuma droga de prescrição para a prevenção ou tratamento da
cicatrização. Os ferimentos de pele em embriões se curam perfeitamente sem
cicatrizes comparando com a cicatriz de adulto. Fibroblastos da cavidade oral
expressam um fenótipo que é responsável pela falta de tecido de cicatrização
depois da lesão, uma característica não associada com fibroblastos da pele
(LALANI
et al.,
1998). FERGUSON & O 'AKNE (2004) investigaram as diferenças
celulares e moleculares entre a não cicatrização do embrião e a formação de
cicatriz no adulto, as diferenças importantes incluem a resposta inflamatória, que
em ferimentos de embrião consiste em números mais baixos de com menos
células inflamatórias diferenciadas. Este, junto com níveis altos de moléculas
morfogenética envolvidas em crescimento de pele, significando que o perfil de
fator de crescimento na cicatrização de um ferimento de um embrião é muito
diferente daquele em um ferimento de adulto. Deste modo, ferimentos de embrião
144
se curam sem uma cicatriz, tem níveis baixo de TGFbeta1 e TGFbeta2, níveis
baixos de fator de crescimento derivados de plaquetas e níveis altos de TGFbeta3.
Isto significa que a cicatrização pode não ser mais uma conseqüência inevitável do
ferimento ou cirurgia e que uma abordagem completamente nova agora é possível
para a prevenção da cicatriz em humanos. A cicatriz depois da lesão pode
acontecer em muitos tecidos além da pele. Deste modo, as drogas que melhoram
as cicatrizes podiam ter benefícios difundido e previnir complicações em vários
tecidos, por exemplo, prevenção de cegueira depois de cicatriz devido a lesão no
olho, facilitação de reconexões neuronal no sistema nervoso central e periférico,
restituição de intestino normal e função reprodutiva prevenindo adesões depois de
lesões no sistema gastrintestinal ou reprodutivo, e restauração da função
locomotora prevenindo cicatrizes em tendões e ligamentos. Experimentalmente,
cicatrização em feridas de ratos, pudo imitar o perfil do embrião livre de cicatriz,
por exemplo, neutralizando PDGF, neutralizando TGFbeta1 e TGFbeta2 ou
adicionando TGFbeta3 exógeno (FERGUSON & O'AKNE, 2004). Estas experiências
resultam em ferimento livre de cicatriz no adulto. Tais experiências permitem a
identificação de objetivos terapêuticos para desenvolver moléculas farmacêuticas
inovadoras, que notadamente melhorem ou completamente previnam a
cicatrização. Nossas experiências indicam que ORCL minimiza a formação de
cicatriz, porém, precisa ser investigado se TGFbeta3 está envolvido no efeito de
cicatrizaçõa de ORCL.
Nas doses testadas ORCL (200 e 400 mg/kg) e AK (50 e 100 mg/kg) não
manifestaram sinais de toxicidade ou anormalidade de comportamento. Então, nós
consideramos que as doses empregadas são seguras e livres de toxicidade.
Porém, ORCL em uma dose relativamente mais alta (1.6 g/kg) pode induzir
diarréia, mas nenhuma outra mudança comportamental e foi administrado via oral
ORCL e AK em doses até 5 g/kg e 3 g/kg, respectivamente, sendo incapaz de
produzir qualquer anormalidade em ratos (observações inéditas). Os dados
presentes sugerem que ORCL e ou seu componente podem prevenir inflamação
intestinal experimental e que este efeito protetor pode pelo menos em parte
envolver um mecanismo antioxidante que merece uma avaliação adicional para
145
sua utilização terapêutica na prevenção e tratamento de doença de intestino
inflamatória não específica.
146
7.CONCLUSÃO
7.CONCLUSÃO
147
ORCL previne danos teciduais no modelo de colite induzido por ácido acético como
foi verificado através de seus efeitos em alterações macroscópicas, histológicas e
bioquímicas e da mesma maneira foi eficiente na colite induzida por TNBS em
ratos.
Os tratamentos com ORCL e AK tem um impacto benéfico no estresse oxidativo
com uma significante atividade antiinflamatória, em colite experimental induzida
por ácido acético e TNBS em ratos.
As investigações prévias e presentes sugerem que ORCL possua um potencial
antiinflamatório destituído de efeitos colaterais gástricos e intestinais.
ORCL atenua significativamente a lesão intestinal induzida por I/R em rato através
da oclusão da artéria mesentérica superior.
ORCL é capaz de prevenir a lesão intestinal induzida por indometacina em ratos.
Diferentemente de indometacina e AK, ORCL não aumenta permeabilidade
intestinal, mas em combinação com indometacina ele causa um significante
aumento até certo ponto semelhante ao rofecoxibe.
ORCL acelera a cicatrização de feridas experimentais em pele de ratos. Não só
apressa a contração do ferimento, mas também, realça a resistência a tensão da
ferida. Estes resultados confirmam o uso benéfico de ORCL na medicina
tradicional sul-americana.
148
8.BIBLIOGRAFIA
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