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Universidade de São Paulo
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Programa de Pós-Graduação em Genética
Análise da expressão gênica promíscua no timo de
camundongos NOD (non obese diabetic) durante a
emergência do Diabetes melitus tipo 1
Thaís Arouca Fornari
Ribeirão Preto
2008
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Universidade de São Paulo
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Programa de Pós-Graduação em Genética
Análise da expressão gênica promíscua no timo de
camundongos NOD (non obese diabetic) durante a
emergência do Diabetes melitus tipo 1
Thaís Arouca Fornari
DISSERTAÇÃO APRESENTADA AO PROGRAMA DE
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA DA FACULDADE
DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO PARA
OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM
CIÊNCIAS, ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: GENÉTICA
ORIENTADOR: PROF. DR. GERALDO A. S. PASSOS
Ribeirão Preto
2008
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FORNARI, THAÍS A.
ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA PROMÍSCUA NO TIMO DE
CAMUNDONGOS NOD (NON OBESE DIABETIC) DURANTE A EMERGÊNCIA
DO DIABETES MELITUS TIPO 1
RIBEIRÃO PRETO, 2008
154p.il 30 cm
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA À FACULDADE DE
MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO, USP, ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM
GENÉTICA
ORIENTADOR: PASSOS, GERALDO A.S.
Apoio e Suporte Financeiro
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Imunogenética Molecular,
localizado no Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto (FMRP) – USP com apoio financeiro das seguintes entidades e
instituições:
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) por
meio da bolsa de mestrado Processo 05/57231 - 8 e Auxílio à Pesquisa
Processo 06/54788 – 4
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq)
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – FMRP – USP
Dedico esse trabalho
Com muito carinho
aos meus queridos pais, Rosane e Francisco, e ao meu irmão
Guilherme, pela certeza de nunca terem me desamparado e
estado ao mesmo tempo longe fisicamente e mais presentes do
que nunca em minha vida. Não existem palavras no universo
capazes de exprimir o que vocês representam em minha vida!
Obrigada pelo apoio incondicional, pelo incentivo e pelas
infinitas orações.
AMO MUITO VOCÊS!!!!!
“O valor das coisas não está no
tempo em que elas duram,
mas na intensidade com que
acontecem. Por isso existem momentos
inesquecíveis, coisas inexplicáveis e
pessoas incomparáveis.”
Fernando Pessoa
Agradecimentos
Agradeço especialmente ao meu orientador, Prof. Dr. Geraldo Aleixo da Silva
Passos, por seu exemplo de profissionalismo, seriedade, dedicação e
comprometimento com aquilo que faz. Agradeço pela confiança que me foi dada,
pela paciência e pelo incentivo diário durante minha pós-graduação, me
estimulando a superar as dificuldades, o que se tornou imprescindível para o meu
crescimento profissional e pessoal. Obrigada Geraldo!
Aos colegas e amigos do laboratório de Citogenética e Mutagênese, pelo carinho
e disponibilidade em ajudar todas as vezes que precisei, especialmente à Patricia
e Ana Paula, pelo auxílio dado em algumas técnicas e à professora Elza Tieme
Sakamoto-Hojo por ter permitido e proporcionado condições para o
desenvolvimento destas.
Aos docentes, pós-graduandos e funcionários da área de Pós-Graduação do
Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto pela
agradável convivência e amizade. Em especial, agradeço às secretárias Susie
Nalon e Maria Aparecida pelo carinho, dedicação, amizade, disponibilidade e
empenho ao longo desses anos.
Ao Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto por
proporcionar condições para a realização deste trabalho.
Agradeço à Profa. Dra. Maria José Alves da Rocha do Departamento de
Morfologia, Estomatologia e Fisiologia da Faculdade de Odontologia de Ribeirão
Preto, bem como dos seus alunos que contribuiram com a confecção de lâminas
histológicas.
Agradeço ao Prof. Dr. Klaus Hartfelder do Departamento de Biologia Celular e
Molecular e Bioagentes Patogênicos da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
pela disponibilidade e auxílio prestado durante os experimentos utilizando
microscopia confocal.
Aos amigos e colegas de trabalho (de todas as épocas) do Grupo de
Imunogenética Molecular do Departamento de Genética da FMRP-USP
especialmente: Cristina, Claudia, Márcia, Danielle, Paula, Vanessa, Adriane,
Janaína, Guilherme, Monique, Ana Maria, Diane, Paula Sandrin e Ana Lúcia.
Agradeço pela convivência, pelo companheirismo e por tudo que aprendi com
vocês durante esses anos. Muito obrigada!
À FAPESP pelo apoio técnico e financeiro de suma importância para o
desenvolvimento desse projeto.
Finalmente, agradeço a todos os amigos, da vida acadêmica e pessoal, e aos
profissionais que de alguma forma me auxiliaram ao longo desse trabalho
proporcionando conhecimento, apoio e carinho. Obrigada a todos!
“Sempre é preciso saber quando uma
etapa chega ao final
Se insistirmos em permanecer nela
mais do que o tempo necessário,
perdemos a alegria e o sentido das
outras etapas que precisamos viver.
Encerrando ciclos, fechando portas,
terminando capítulos. Não importa o
nome que damos, o que importa é
deixar no passado os momentos da
vida que já se acabaram.”
Fernando Pessoa
SUMÁRIO
RESUMO ................................................................................................................ii
ABSTRACT............................................................................................................iv
1. INTRODUÇÃO....................................................................................................2
1.1 O papel do timo no desenvolvimento das células T e na indução da
tolerância imunológica.........................................................................................2
1.1.1 Ontogenia do timo...................................................................................2
1.1.2 Estrutura do timo.....................................................................................4
1.1.3 Migração das células precursoras linfóides para o timo..........................7
1.1.4 Maturação dos timócitos em células T....................................................8
1.1.5 Indução da Tolerância Imunológica ......................................................11
1.2 Expressão Gênica Promíscua no timo.........................................................13
1.3 Autoimunidade e doenças autoimunes........................................................18
1.4 A importância dos camundongos NOD na pesquisa do diabetes tipo 1......21
1.5 Análise do transcriptoma.............................................................................23
1.5.1 Conceito de transcriptoma....................................................................23
1.5.2 Métodos de análise do transcriptoma ...................................................24
2. HIPÓTESE DO TRABALHO .............................................................................29
3. OBJETIVOS......................................................................................................31
4. MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................33
4.1 Linhagem de camundongos NOD ...............................................................33
4.2 Avaliação da glicemia..................................................................................33
4.3 Definição de controle e teste.......................................................................33
4.4 Cultura de timo adulto (ATOC)....................................................................34
4.5 Inibição seletiva do transcrito do gene Aire com RNA interferente (RNAi)..34
4.5.1 Monitoramento da transfecção e determinação da seqüência de RNAi
anti-Aire..........................................................................................................34
4.5.2 Inibição seletiva do transcrito do gene Aire em cultura de timo adulto
(ATOC)...........................................................................................................36
4.6 Avaliação de apoptose e necrose em ATOC por citometria de fluxo...........37
4.7 Separação do estroma tímico......................................................................37
4.8 Extração de RNA total.................................................................................38
4.9 Quantificação de RNA total .........................................................................39
4.10 Avaliação da integridade do RNA total por eletroforese em gel de agarose ..39
4.10.1 Preparação do gel...............................................................................39
4.10.2 Preparação das amostras de RNA......................................................40
4.11 Reações de transcrição reversa seguida de PCR (RT- PCR)...................40
4.12 Preparação das lâminas de cDNA microarrays.........................................42
4.12.1 Biblioteca de cDNAs murinos..............................................................42
4.12.2 Amplificação de cDNA para a confecção de microarrays ...................42
4.12.3 Purificação dos produtos de PCR.......................................................43
4.12.4 Confecção das lâminas de microarrays ..............................................44
4.12.5 Delineamento das hibridações em microarrays ..................................44
4.12.6 Marcação de sondas de cDNA com o fluorocromo Cy3/Cy5 ..............46
4.12.7 Hibridação das sondas de cDNA com os microarrays........................51
4.13 Aquisição de imagens de microarrays.......................................................51
4.14 Quantificação e normalização dos dados de microarrays .........................52
4.15 Nomenclatura dos genes...........................................................................57
4.16 Análise da expressão gênica promíscua no timo ......................................57
4.17 Análise das regiões cromossômicas de susceptibilidade ao DM-1 ...........58
5. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL.................................................................61
6. RESULTADOS..................................................................................................63
6.1 Emergência de diabetes mellitus (DM-1) em camundongos NOD ..............63
6.2 Avaliação da integridade das amostras de RNA .........................................65
6.3 Avaliação da expressão do gene Aire e de TRAs no estroma tímico..........66
6.4 Avaliação de apoptose e necrose em ATOC...............................................69
6.5 Determinação da seqüência e concentração de RNAi anti-Aire para ensaio
em ATOC...........................................................................................................70
6.6 Análise da inibição do transcrito do gene Aire utilizando RNA interferente.74
6.7 Análise dos genes diferencialmente expressos por agrupamento hierárquico
e da significância estatística do padrão de expressão ......................................75
6.8 Determinação da expressão gênica promíscua (PGE) no timo...................82
6.9 Análise das regiões cromossômicas de susceptibilidade ao DM-1 .............96
7. DISCUSSÃO...................................................................................................100
7.1 Emergência de diabetes mellitus (DM-1) em camundongos NOD ............100
7.2 Expressão do gene Aire e de TRAs no estroma tímico.............................100
7.3 Avaliação da inibição do transcrito do gene Aire com RNA interferente....104
7.4 Expressão gênica promiscua no timo........................................................106
7.5 Regiões cromossômicas de susceptibilidade ao diabetes tipo 1...............108
8. CONCLUSÕES...............................................................................................111
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................113
ANEXOS.............................................................................................................129
Anexo I................................................................................................................130
Anexo II...............................................................................................................132
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Desenvolvimento do microambiente epitelial do timo..........................................4
Figura 2. Esquema representativo da estrutura do timo e de todos os seus componentes
celulares...............................................................................................................................5
Figura 3. Estrutura e função do timo...................................................................................9
Figura 4. Representação de diversos tecidos e órgãos parenquimais no timo.................14
Figura 5. Tolerância central e periférica defectivas nos camundongos NOD...................22
Figura 6. Ilustração dos métodos de marcação de sondas complexas de cDNA para
microarrays..................................................................... ...............................................26
Figura 7. Esquema dos principais tipos de delineamento experimental para
microarrays........................................................................................................................45
Figura 8. Preparação da fita simples de cDNA incorporada com amino alil.................... 47
Figura 9. Preparação do cDNA marcado com CyDye......................................................48
Figura 10. Pipeline utilizado na análise de dados de microarrays em lâminas de vidro..54
Figura 11. Ilustração da análise da significância estatística utilizando SAM....................56
Figura 12. Ideograma representativo................................................................................58
Figura 13. Freqüência de camundongos NOD pré-autoimunes e autoimunes.................64
Figura 14. Integridade das amostras de RNA total...........................................................65
Figura 15. Avaliação da expressão dos genes: Actb, Cd3e, Aire e Col II no estroma
tímico..................................................................................................................................67
Figura 16. Avaliação da expressão dos genes: Gad67, Ia-2, Ins-1 e Ins-2 no estroma
tímico.................................................................................................................................68
Figura 17. Avaliação da viabilidade em ATOC por citometria de fluxo.............................69
Figura 18. Avaliação da inibição do transcrito do gene Aire utilizando as sequências de
RNAi anti- Aire...................................................................................................................71
Figura 19. Seqüência do RNAi anti-Aire que promoveu melhor inibição do transcrito do
gene Aire em cultura ATOC...............................................................................................71
Figura 20. Avaliação da transfecção dos timos em cultura com microscopia de
fluorescência confocal........................................................................................................73
Figura 21. Avaliação da expressão do gene Aire em amostras de estroma tímico em
cultura ATOC.....................................................................................................................74
Figura 22. Comparação dos perfis de expressão gênica entre camundongos NOD pré-
autoimunes e autoimunes em estroma de timos recém removidos...................................77
Figura 23. Comparação dos perfis de expressão gênica entre camundongos NOD pré-
autoimunes e autoimunes em estroma de timos em cultura ATOC..................................78
Figura 24. Comparação dos perfis de expressão gênica em camundongos NOD pré-
autoimunes em estroma tímico tratado com RNAi Aire, RNAi controle e não tratado
(controle)............................................................................................................................79
Figura 25. Comparação dos perfis de expressão gênica em camundongos NOD pré-
autoimunes em estroma tímico tratado com RNAi Aire e não tratado (controle)...............80
Figura 26. Comparação dos perfis de expressão gênica em camundongos NOD pré-
autoimunes em estroma tímico tratado com RNAi Aire e com RNAi controle...................81
Figura 27. Gráfico ilustrativo do SymAtlas........................................................................82
Figura 28. Representação da expressão gênica específica de tecidos em timos recém
removidos de camundongos NOD pré-autoimunes e autoimunes....................................84
Figura 29. Representação da expressão gênica específica de tecidos em timos em
cultura ATOC de camundongos NOD pré-autoimunes e autoimunes...............................85
Figura 30. Representação da expressão gênica específica de tecidos em timos em
cultura ATOC tratados com RNAi Aire, RNAi controle e não tratados (controle) de
camundongos NOD pré-autoimunes..................................................................................86
Figura 31. Representação da expressão gênica específica de tecidos em timos em
cultura ATOC tratados com RNAi Aire e não tratados (controle) de camundongos NOD
pré-autoimunes..................................................................................................................87
Figura 32. Representação da expressão gênica específica de tecidos em timos em
cultura ATOC tratados com RNAi Aire e tratados com RNAi controle de camundongos
NOD pré-autoimunes.........................................................................................................88
Figura 33. Representação da expressão gênica de antígenos relacionados a tecidos para
glândulas/pâncreas em timos recém removidos de camundongos NOD pré-autoimunes e
autoimunes.........................................................................................................................90
Figura 34. Representação da expressão gênica de antígenos relacionados a tecidos para
glândulas/pâncreas em timos em cultura ATOC de camundongos NOD pré-autoimunes e
autoimunes.........................................................................................................................91
Figura 35. Representação da expressão gênica de antígenos relacionados a tecidos para
glândulas/pâncreas em timos em cultura ATOC tratados com RNAi Aire, RNAi controle e
não tratados (controle) de camundongos NOD pré-autoimunes.......................................92
Figura 36. Representação da expressão gênica de antígenos relacionados a tecidos para
glândulas/pâncreas em timos em cultura ATOC tratados com RNAi Aire e não tratados
(controle) de camundongos NOD pré-autoimunes............................................................93
Figura 37. Representação da expressão gênica de antígenos relacionados a tecidos para
glândulas/pâncreas em timos em cultura ATOC tratados com RNAi Aire e tratados com
RNAi controle de camundongos NOD pré-autoimunes.....................................................94
Figura 38. Imagem típica de hibridização de microarray com sondas fluorescentes (Cy3 e
Cy5)..................................................................................................................................131
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela I. Primers utilizados nas reações de PCR, suas respectivas temperaturas de
anelamento e seqüências sense e antisense....................................................................41
Tabela II. Genes diferencialmente expressos (109) de acordo com o programa SAM em
amostras de estroma de timos recém removidos de camundongos NOD pré-autoimunes e
autoimunes.......................................................................................................................133
Tabela III. Genes diferencialmente expressos (89) de acordo com o programa SAM em
amostras de estroma de timos em cultura ATOC de camundongos NOD pré-autoimunes
e autoimunes....................................................................................................................136
Tabela IV. Genes diferencialmente expressos (122) de acordo com o programa SAM em
amostras de estroma de timos em cultura ATOC de camundongos NOD pré-autoimunes
tratados com RNAi Aire e com RNAi controle e não tratados
(controle)..........................................................................................................................139
Tabela V. Genes diferencialmente expressos (53) de acordo com o programa SAM em
amostras de estroma de timos em cultura ATOC de camundongos NOD pré-autoimunes
tratados com RNAi Aire e não tratados (controle) ......................................................143
Tabela VI. Genes diferencialmente expressos (370) de acordo com o programa SAM em
amostras de estroma de timos em cultura ATOC de camundongos NOD pré-autoimunes
tratados com RNAi Aire e com RNAi controle..................................................................145
Tabela VII. Genes que codificam antígenos específicos para pâncreas em timo de
camundongos NOD............................................................................................................95
Tabela VIII. Genes diferencialmente expressos em estroma de timos recém removidos e
em cultura ATOC de camundongos NOD pré-autoimunes com representatividade da PGE
localizados em regiões coincidentes com idds conhecidas...............................................97
Tabela IX. Genes diferencialmente expressos em estroma de timos em cultura ATOC de
camundongos NOD pré-autoimunes após tratamento com RNA interferente com
representatividade da PGE localizados em regiões coincidentes com idds
conhecidas.........................................................................................................................98
Resumo
Resumo
ii
RESUMO
A tolerância imunológica é a propriedade essencial do sistema imune que
controla as reações patológicas contra antígenos do próprio. O timo é visto como
o principal órgão envolvido com a indução de tolerância aos antígenos próprios
que são expressos pelas células tímicas (tolerância central), enquanto que a
indução de tolerância aos antígenos relacionados a outros tecidos (TRAs) tem
sido atribuída aos mecanismos de tolerância extratímica (tolerância periférica).
Entretanto, a evidência da expressão de TRAs de órgãos e tecidos
parenquimais no timo pelas células medulares epiteliais (mTECs) de
camundongos e de humanos a qual foi referida como “expressão gênica
promíscua” (PGE) reforçou a concepção de tolerância central de TRAs. O controle
molecular dessa expressão tem sido atribuído ao gene Aire (Auto immune
regulator) que é um regulador de transcrição.
No presente estudo, procurou-se retratar a expressão gênica promíscua no
timo de camundongos NOD (Non Obese Diabetic) por meio da análise da
expressão gênica em grande escala, ou seja, descrevendo seu transcriptoma
usando a tecnologia de cDNA microarrays.
Para a análise dos dados utilizamos programas de bioinformática
dedicados a microarrays bem como dados de bancos para a caracterização da
PGE e susceptibilidade genética ao diabetes melitus do tipo 1 (DM-1).
Três conjuntos de resultados puderam ser evidenciados. No primeiro
conjunto observou-se a ocorrência da PGE de antígenos tecidos/órgãos
parenquimatosos (TRAs) em timos recém removidos e em in vitro em cultura
ATOC de camundogos NOD pré-autoimunes e autoimunes (diabéticos). O
segundo conjunto de resultados consistiu na análise do efeito da inativação do
transcrito de gene Aire na expressão gênica do timo de camundongos NOD in
vitro em cultura ATOC. Finalmente, no último conjunto de dados, demonstrou-se
que certos genes de TRAs com expressão promíscua, se encontram em regiões
cromossômicas de susceptibilidade ao DM - 1 (idds). Como três deles (Il-4, Cd4 e
Cdk4) são diretamente relacionados com a patogenia do DM-1 em camundongos
foi possível estabelecer um paralelo entre PGE e susceptibilidade genética.
Abstract
Abstract
iv
Analysis of the promiscuous gene expression in the thymus of NOD (non
obese diabetic) mice during onset of type 1 diabetes mellitus.
ABSTRACT
Immunologic tolerance is an essential property of the immune system,
which controls immune reactions directed against the body self components. The
thymus is seen as the main organ involved with the tolerance induction to self
antigens, which are expressed by the thymic cells (central tolerance), while the
tolerance induction to the diverse other peripheral tissues and organs is attributed
to extra thymic mechanisms (peripheral tolerance).
Nevertheless, the evidence for the expression of peripheral tissue related
antigens (TRAs) in the thymus by the medullary thymic epithelial cells (mTECs) of
mice and humans, which have been termed to as promiscuous gene expression
(PGE), has contributed to the concept of central tolerance to TRAs.
The molecular control of such gene expression has been attributed to the
Aire (autoimmune regulator) gene, which plays a role as a transcriptional
regulator.
In the present study, we searched to picture PGE in the thymus of NOD
(non obese diabetic) mice by means of high throughput gene expression,
analyzing the transcriptome by the cDNA microarray method. To analyzing data
we used bioinformatics programs dedicated to microarrays and specialized data
banks to characterize PGE and genetic susceptibility to type 1 diabetes mellitus
(DM-1).
Studying pre and autoimmune NOD mice, we evidentiate three sets of
results. In the first set, it was observed the occurrence of PGE of parenchymal
tissue/organs antigens (TRAs) in fresh thymuses and in thymuses cultured in vitro
in adult thymus organ cultures (ATOC).
The second set of results consisted in the analysis of the effect of in vitro
(ATOC) Aire gene silencing on PGE.
Finally, in the third data set, we demonstrated that certain promiscuously
expressed genes are positioned in DM-1 genetic susceptibility chromosomal
regions (idds). As three of such genes (IL4, Cd4 and Cdk4) are directly associated
to the DM-1 pathogenesis in mice, it was possible to establishing a parallel
between PGE in the thymus and genetic susceptibility to this autoimmune disease.
Introdução
Introdução
2
1. INTRODUÇÃO
1.1 O papel do timo no desenvolvimento das células T e na indução da
tolerância imunológica
1.1.1 Ontogenia do timo
O timo deriva de invaginações do ectoderma no pescoço e tórax do
embrião em desenvolvimento que formam estruturas chamadas de arcos
branquiais (Abbas & Lichtman, 2005).
A origem do desenvolvimento do epitélio do timo tem sido debatida por
décadas. Inicialmente, Cordier & Haumont (1980) sugeriram que o compartimento
epitelial do timo seria derivado da ectoderme (córtex) e da endoderme (medula).
A hipótese de “origem dual” baseia-se na formação de um rudimento tímico
de natureza reticuloepitelial e outro de origem endo-ectodérmica derivadas da
terceira bolsa faríngeana e fenda branquial. O retículo do epitélio medular tímico é
de origem endodérmica, enquanto que o retículo do epitélio cortical tímico é de
origem ectodérmica. Nesta bolsa se formam tubos de células epiteliais que vão
crescendo em forma de cordões para baixo até o tórax. Os cordões perdem a
comunicação com sua origem e se transformam na medula do timo. Durante sua
migração, decorrente de sua aderência ao pericárdio visceral, o rudimento tímico
é invadido por vasos sanguíneos que serão os portadores dos precursores de
timócitos, células dendríticas, macrófagos e mastócitos. As células reticulares
epiteliais emitem prolongamentos e formam os septos, corpúsculos de Hassal e
as áreas onde vão ser ocupadas pelos linfócitos T em maturação no córtex.
Posteriormente, inicia-se a tração pelo pericárdio, que leva o timo até sua posição
anatômica no mediastino anterior na maioria dos animais, sendo que o timo se
mantém no extramediastino cervical nas aves e branquial nos peixes (van Ewijk et
al., 2000; Gray et al., 2005).
Embora num primeiro momento estudos digam que o timo tenha se
derivado das células epiteliais de ambas as origens endodérmica e ectodérmica,
experimentos em aves e camundongos, via transplante ectópico, tem
demonstrado conclusivamente que as células epiteliais tímicas são
exclusivamente de origem endodérmica, deste modo, refutando o modelo de
“origem dual” de ontogenia epitelial tímica e aceitando um novo modelo de
Introdução
3
“origem única” (Anderson & Jenkinson, 2001; Blackburn & Manley, 2004; Barthlott
et al., 2006; Zhang et al., 2007).
Recentemente, análises clonais utilizando embriões com 12 dias de
desenvolvimento (Rossi et al., 2006) e experimentos com mapeamentos indicando
um progenitor comum para as células corticais e medulares (Bleul et al., 2006), têm
conclusivamente mostrado que somente um folheto germinativo contribui para o
compartimento epitelial tímico e esse folheto seria a endoderme. Contudo, não se
pode excluir sinais de indução e/ou sobrevivência de outro folheto germinativo
(Manley et al., 2003; Gordon et al., 2004; Boehm & Bleul, 2006).
Em camundongos, o timo surge como estruturas bilaterais da terceira bolsa
faringeana no intestino primário embrionário (Manley, 2000; Gordon et al., 2001) e
são colonizados por progenitores hematopoéticos por volta do 11.5 dia do
desenvolvimento embrionário (Itoi et al., 2001). O primeiro marcador descrito para
essa região foi o Foxn1, necessário para o desenvolvimento de células epiteliais
tímicas funcionais, para a formação do timo e, portanto, para a formação da
diversidade do repertório de células T auto-tolerantes (Nehls et al., 1996; Boehm
et al., 2003; Bleul et al., 2006).
Recentemente surgiram evidências da presença de um segundo timo em
algumas linhagens de camundongos, chamado cervical, que se desenvolve após
o nascimento e tendo o mesmo tamanho de um linfonodo. As células epiteliais no
timo cervical também expressam Foxn1, indicando sua relação com o
compartimento epitelial do timo toráxico (Dooley et al., 2006; Terszowski et al.,
2006). Essa descoberta pode mudar todo nosso conhecimento a cerca deste
órgão, porém muitos estudos ainda deverão ser realizados a fim de se chegar a
conclusões definitivas.
A involução alométrica do timo inicia-se pouco antes do nascimento e a
involução absoluta ocorre na puberdade, entretanto o timo adulto continua a receber
células precursoras, vindas da medula óssea e a lançar células colonizadoras das
áreas T periféricas (Bodey et al., 1997). Esse fenômeno é conhecido e
frequentemente associado à idade, sendo caracterizado pela substituição do estroma
tímico por tecido adiposo (Montecino-Rodriquez et al., 2005).
Introdução
4
1.1.2 Estrutura do timo
O timo é um órgão linfóide primário em que os precursores de células T
derivados da medula óssea se submetem a um processo complexo de maturação
no contexto do microambiente tímico, representado por células não linfóides e
linfóides e por componentes da matriz extracelular (ECM) (Villa-Verde et al.,
1995). É formado por dois lobos (direito e esquerdo), sendo ambos divididos em
múltiplos lóbulos por septos fibrosos. Anatomicamente, cada lóbulo é dividido em
uma região subcapsular, um córtex, que contém uma densa coleção de linfócitos
T em maturação e uma medula, com uma população mais esparsa de linfócitos
(tecido conjuntivo frouxo e células reticulares epiteliais), e onde ocorrem os
processos finais de maturação dos linfócitos T (Abbas & Lichtman, 2005; Boehm
& Bleul, 2006) (Figura 1).
Figura 1. Desenvolvimento do microambiente epitelial do timo. A) Capacidade de desenvolvimento
das células TEC progenitoras. Á esquerda estão indicadas as quatro bolsas faringeanas (i-iv); a
origem comum da paratireóide (amarelo) e do timo (azul) está situada na terceira bolsa faringeal.
À direita, as células supridas com o gene funcional Foxn1 apresentam timopoiese normal. Ao
centro, um modelo para a diferenciação das células epiteliais do timo. Se existe ou não
progenitoras epiteliais bipotentes para células medulares (MEP) e/ou corticais (CEP) não é sabido.
B) Estrutura de um timo adulto encapsulado e dividido pelos septos mesenquimais em lóbulos
individuais. CMJ = junção córtico-medular (cortico-medullary junction) (Extraído e modificado de
Boehm & Bleul, 2006)
Timo embrionário
Rudimento cístico após nascimento
Córtex
Medula
Cápsula
Zona subcapsular
Desenvolvimento da unidade tímica epitelial
Septo
TECs
Timo embrionário
Rudimento cístico após nascimento
Córtex
MedulaMedula
Cápsula
Zona subcapsular
Desenvolvimento da unidade tímica epitelial
SeptoSepto
TECs
Introdução
5
O córtex proporciona um microambiente necessário para a seleção positiva
dos timócitos imaturos enquanto que a medula é responsável pela seleção
negativa das células T auto-reativas. Os progenitores linfóides entram no timo
adulto pela junção córtico-medular e então migram para a região subcapsular
antes, porém, retornando pelo córtex em direção a medula (Anderson &
Jenkinson, 2001).
Cada um destes compartimentos forma um microambiente estromal
especializado que é crucial para controlar a maturação das células T. Este
estroma é composto essencialmente de células epiteliais corticais (cTECs) e
medulares (mTECs), fibroblastos reticulares, células dendríticas e macrófagos
derivados da medula óssea, além de estruturas conhecidas como corpúsculos de
Hassal, localizados especificamente na medula tímica e composto de espirais
compactas de células epiteliais remanescentes de células em degeneração
(Figura 2).O timo tem um suprimento vascular abundante e vasos linfáticos
eferentes que drenam para os linfonodos do mediastino (van Ewijk W, 1991; Gray
et al., 2002; Abbas & Lichtman 2005).
Figura 2. Esquema representativo da estrutura do timo e de todos os seus componentes
celulares. (Extraído e modificado de Human Embriology -
http://www.embryology.ch/anglais/qblood/lymphat03.html).
Introdução
6
A manutenção do microambiente tímico requer interações recíprocas entre
timócitos e células estromais, denominadas de “cross talk” tímico (van Ewijk et al.,
1994; van Ewijk et al., 2000; Germeraard et al., 2003; Gray et al., 2006).
A interação dos precursores de timócitos com o microambiente estromal
permite o comprometimento desses com as linhagens celulares T e
essencialmente elimina ou permite a supressão de células auto-reativas (Boehm
& Bleul, 2006; Anderson et al., 2007).
As células epiteliais tímicas são os componentes celulares principais do
microambiente tímico, e influenciam diferentes aspectos da diferenciação dos
timócitos, vias de interações célula-célula e das secreções de fatores solúveis,
tais como os hormônios tímicos timulina (thymulin), timopoetina (thymopoietin) e
timosina- α1 (thymosin-α1) (Savino, 2006).
Dados recentes mostram que o hormônio do crescimento (GH) modula
pleiotropicamente funções tímicas como, por exemplo, aumenta a proliferação de
timócitos e de células epiteliais tímicas (Savino, 2007).
Um complexo linfoepitelial localizado corticalmente no timo, as células
“nurse” tímicas (TNC), são estruturas multicelulares linfoepiteliais formadas por
uma célula epitelial tímica (TEC) que abriga 20-200 timócitos, carregando
primeiramente o fenótipo duplo-positivo CD4/CD8, embora timócitos imaturos
duplo negativos, bem como, células maduras simples positivas também possam
ser encontradas. TNCs criam provavelmente um microambiente especial para a
diferenciação e/ou proliferação dos timócitos, com timócitos sendo expostos aos
antígenos do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e aos hormônios
tímicos. Tal diferenciação ocorre em paralelo com a migração da célula dentro e
fora do complexo (Savino, 2006).
O mesênquima tímico, derivado da crista neural, também pode ser capaz
de influenciar diretamente o desenvolvimento dos precursores de células T CD4
-
8
-
por apresentação de fatores de crescimento solúveis sobre componentes da
matriz extracelular (ECM). Além de influenciar o desenvolvimento das células
epiteliais tímicas imaturas, e assim ter um papel direto no estabelecimento do
microambiente tímico (Jenkinson et al., 2003).
Introdução
7
1.1.3 Migração das células precursoras linfóides para o timo
Durante o desenvolvimento fetal, ocorre a geração de todas as células
sanguíneas, chamada de hematopoese, ocorre inicialmente em ilhotas
sanguíneas do saco vitelino e do mesênquima para-aórtico e depois no fígado
fetal que gera precursores de células T de origem mesodérmica, e no baço. Essa
função é assumida de modo gradual pela medula óssea, principalmente dos
ossos chatos, de forma que, ao atingir a puberdade, a hematopoese ocorre
principalmente no esterno, nas vértebras, nos ilíacos e nas costelas. A
proliferação e o desenvolvimento de células precursoras na medula óssea são
estimulados pelas citocinas, produzidas principalmente pelas células do estroma e
macrófagos da medula óssea (Abbas & Lichtman 2005).
Os precursores de células T, ou células imaturas da linhagem de células T,
derivados da medula óssea entram no timo na junção cortico-medular, e então
migram à região subcapsular da glândula através dos vasos sanguíneos. O
desenvolvimento começa no córtex e, conforme os timócitos vão evoluindo eles
migram para a medula tímica, de forma que esta contém principalmente células T
maduras. Desta por sua vez, deixam o timo e entram no sangue e nos tecidos
linfóides periféricos. As quimiocinas são uma grande família de citocinas
estruturalmente homólogas que regulam a migração de linfócitos e outros
leucócitos através dos tecidos linfóides periféricos (Blackburn & Manley, 2004;
Abbas & Lichtman 2005).
As células do microambiente tímico produzem dois grupos de moléculas,
as quimiocinas, incluindo Cxcl12 (Chemokine C-X-C motif ligand 12), a qual
preferencialmente atrai timócitos imaturos CD4
-
CD8
-
e CD4
+
CD8
+
, e Ccl21
(Chemokine C-C ligand 21), que exerce quimioatração para timócitos simples
positivos maduros, e as proteínas da matriz extracelular, visto que os timócitos em
desenvolvimento expressam os receptores correspondentes. Além disso, embora
as quimiocinas e a matriz extracelular possam dirigir a migração dos timócitos por
si mesmo, uma função combinada para estas moléculas parece contribuir para os
padrões de migração resultantes dos timócitos em seus vários estágios de
diferenciação (Savino et al., 2003; Savino et al., 2006).
Introdução
8
1.1.4 Maturação dos timócitos em células T
O processo de maturação dos linfócitos consiste numa complexa
seqüência de eventos biológicos, compreendendo a proliferação das linhagens
celulares precursoras, a expressão diferencial de proteínas de membrana,
rearranjos gênicos do receptor de antígeno, a seleção do repertório de linfócitos
maduros, e conseqüente morte celular programada dos linfócitos não
selecionados e finalmente a migração celular. Durante cada um desses estágios,
as células sofrem significativas mudanças celulares e genéticas (Abbas &
Lichtman, 2005).
A maturação inicial caracteriza-se por um aumento da produção de todas
as células sanguineas na medula óssea e por uma alta atividade mitótica,
estimulada principalmente pela interleucina 7 (IL-7) que é produzida pelas células
do estroma da medula óssea e do timo e pelos ligantes Notch (Harman et al.,
2005; Zamisch et al., 2005). A atividade proliferativa cessa depois que os genes
para os receptores de antígeno são expressos. Tais genes surgem por um
processo de recombinação somática gerando diversidade do repertório dos
linfócitos após junção de segmentos gênicos diferentes.
A interação entre células estromais e linfóides dentro do microambiente
tímico é um fator crítico para formar a correta especificidade antigênica do
repertório de células T, assim como para capacitá-lo a responder à apresentação
de antígenos estranhos pelas moléculas de MHC e não responder a antígenos
próprios (Barthlott et al., 2006).
Os timócitos imaturos corticais recém-chegados ao timo contêm os genes
de TRs na configuração germinativa e, portanto, ainda não expressam o TCR,
CD3, as cadeias ζ e os co-receptores CD4 e CD8. Essas células são chamadas
de timócitos duplo-negativos (DN) e se submetem à múltiplos ciclos de
proliferação e de progresso ao estágio duplo-negativo CD4
-
CD8
-
(DN),
aproximadamente 5% do total de timócitos, com discretos passos de maturação
distinguidos pela expressão de marcadores de superfície celular CD44
high
CD25
-
(DN1), CD44
high
CD25
+
(DN2), CD44
low
CD25
+
(DN3), e CD44
low
CD25
-
(DN4). As
proteínas do complexo recombinase (Rag-1 e Rag-2) são expressas pela primeira
vez nesse estágio, e os rearranjos V(D)J se iniciam. Durante a transição da fase
DN para duplo-positiva CD4
+
CD8
+
(DP), aproximadamente 85% dos timócitos se
redistribuem à região cortical (Ramialison et al., 2002). O rearranjo dos genes da
Introdução
9
cadeia α e a expressão do heterodímero TCR αβ ocorrem na população
CD4
+
CD8
+
, exatamente antes ou durante a migração dos timócitos do córtex para
a medula (Figura 3).
Figura 3. Estrutura e função do timo. Dividido em duas regiões, córtex e medula, povoados por
diferentes subtipos celulares epiteliais tímicos (TECs). Nos adultos, os precursores de células T
entram no timo pela junção cortico-medular, e começam então um programa altamente complexo
de diferenciação, o qual está ligado à migração através do estroma tímico. Os subtipos diferentes
de timócitos são encontrados conseqüentemente em regiões espacialmente restritas do timo. O
córtex tímico foi separado em quatro regiões: Região 1, junção cortico-medular, local de entrada
dos precursores de células T; Região 2, células diferenciadas em DN2 as quais se submetem a
expansão clonal proliferativa; Região 3, inicia-se os rearranjos V(D)J dos genes TRs em células no
estágio DN3; Região 4, transição de DN para o estado de DP (CD4+CD8+). Células DP migram do
córtex para a medula tímica, onde se diferenciam em simples positivas (SP CD4+ ou CD8+). A
seleção positiva ocorre no córtex entre as TECs corticais (cTECs), e a seleção negativa ocorre
principalmente na medula, entre as TECs medulares (mTECs) e células dendríticas (DCs). Células
SP que completaram o programa de diferenciação saem da medula tímica em direção a periferia.
[Extraído e modificado de Blackburn & Manley, 2004].
Introdução
10
A recombinação V(D)J dos receptores de células T é um evento molecular
essencial na maturação destas células. É um processo de recombinação sítio
específica da molécula de DNA que só ocorre nos estágios inicias de
desenvolvimento dos linfócitos T e B. A geração de grande diversidade nas
regiões variáveis do receptor de antígeno de linfócitos T é crucial para que os
organismos possam reconhecer e responder contra, virtualmente, todo e qualquer
antígeno estranho.
Cada locus TCR consiste de segmentos gênicos de regiões variáveis (V),
joinig (J) e constante (C), e para as cadeias β e δ incluem segmentos gênicos de
diversidade (D). De modo geral, o rearranjo dos segmentos gênicos, ocorre através
da ligação de um segmento J a um dos segmentos D, formando uma união D-J,
posteriormente um dos segmentos gênicos V se liga ao segmento D-J unidos. Toda
seqüência de DNA interveniente aos segmentos gênicos que se ligaram passam por
um processo de deleção (Paul, 1993). Os segmentos gênicos rearranjados são
transcritos em um RNA primário, que se torna um RNA maduro após o seu
processamento. O rearranjo D-J e V-DJ ocorre entre os segmentos gênicos da
cadeia β e δ de TCR; entre os segmentos gênicos da cadeia α e γ onde não há
segmentos D, ocorre apenas o rearranjo V-J (Abbas & Lichtman, 2005).
As primeiras células que expressam os TCRs estão no córtex tímico, e essa
expressão é baixa em comparação com a célula T madura. Em virtude da expressão
de seus complexos TCR completos, as células duplo-positivas podem responder ao
antígeno e ficam sujeitas à seleção positiva e negativa. A maioria das células DP, as
quais constituem cerca de 80% daquela população, morre por negligência porque
não reconhecem moléculas disponíveis de MHC expressas por células estromais
tímicas (Abbas & Lichtman, 2005; Savino, 2006).
As células que passam com sucesso pelos processos de seleção
amadurecem em células T CD4+ ou CD8+ e são chamadas de timócitos simples
positivos (SP), e compreendem aproximadamente 10% dos timócitos no timo
(Ramialison et al., 2002). Assim, os estágios de maturação das células T podem ser
rapidamente distinguidos pela análise da expressão das moléculas CD4 e CD8. Essa
maturação fenotípica é acompanhada da maturação funcional (Abbas & Lichtman,
2005).
Finalmente, os timócitos maduros com positividade única (células T CD4 e
CD8 restritas ao MHC) entram na medula do timo e deixam esse órgão pelos
Introdução
11
vasos sanguíneos para colonizar os tecidos linfóides periféricos (Haks et al.,
1998). Apenas 15% dos timócitos que vivem no timo nesta fase vão formar a
maioria do repertório de células T periféricas (Savino, 2006).
1.1.5 Indução da Tolerância Imunológica
A tolerância imunológica aos antígenos próprios envolve processos de
seleção negativa e positiva de linfócitos T que se desenvolvem no timo, fenômeno
também chamado de “educação tímica dos linfócitos T” (Abbas & Lichtman, 2005).
Células T imaturas provenientes da medula óssea passam pelo processo
de maturação intratímica constituído pelos estágios de duplo-negativas (CD4
-
CD8
-
), duplo-positivas (CD4
+
CD8
+
) e simples positivas (CD4
+
ou CD8
+
). Durante
estes estágios ocorre também a recombinação V(D)J dos TCRα/β. A tolerância
imunológica, por sua vez, depende de interações entre TCR dos timócitos e o
complexo peptídeo MHC próprio das células estromais tímicas (Anderson et al.,
2006).
A seleção positiva é o processo na qual os timócitos DP (no córtex) que
apresentam TCR completo na superfície, se ligam com baixa avidez (fracamente)
ao complexo peptídeo MHC próprio e são estimulados a sobreviver. Os timócitos
cujos receptores não reconhecem as moléculas de MHC próprias morrem por
apoptose. Isso assegura que as células T maduras sejam restritas ao MHC
próprio. Na seleção positiva também há restrição de moléculas de classe I ou de
classe II do MHC com os subtipos de linfócitos T, assegurando que as células T
CD8+ citotóxicas sejam específicas a peptídeos expostos pelas moléculas de
MHC de classe I, enquanto que as células T CD4+ auxiliares ligam-se às
moléculas de MHC de classe II associadas ao peptídeo (Abbas & Lichtman, 2005;
Anderson et al., 2006). As moléculas CD4 e CD8 funcionam como co-receptores
do TCR durante a seleção positiva e reconhecem as moléculas de MHC enquanto
que o complexo TCR reconhece o complexo peptídeo MHC. Os sinais liberados
pelo complexo TCR e os co-receptores funcionam simultaneamente no sentido de
promover a sobrevivência dos timócitos (Abbas & Lichtman, 2005).
Em contraste, a seleção negativa é a eliminação por apoptose dos
timócitos cujos TCRs ligam-se com avidez (fortemente) ao antígeno próprio
apresentado pela molécula de MHC própria de células dendríticas ou de mTECs.
A avidez do reconhecimento do antígeno depende da afinidade do TCR e da
Introdução
12
concentração do peptídeo que a célula T reconhece. Este processo elimina
células T em desenvolvimento que são fortemente auto-reativas contra antígenos
próprios ubíquos, que são os antígenos próprios expressos pelas mTECs,
antígenos relacionados a tecidos (TRAs) (Abbas & Lichtman, 2005).
Existe uma distinção no papel das células TECs. As células corticais não
só auxiliam na atração dos precursores linfóides do sangue para o timo como
também controlam a diferenciação dos timócitos ao estágio em que eles
expressam em sua superfície o receptor de células T αβ completo.
Consequentemente, os peptídeos próprios e as moléculas do complexo de
histocompatibilidade (MHC) encontram afinidade suficiente nessas células sendo
assim selecionadas positivamente. Posteriormente, os timócitos se movem para a
medula. As mTECs apresentam moléculas MHC que expressam peptídeos que
representam muitos tecidos do parênquima. Os timócitos que apresentarem alta
afinidade pelos complexos serão negativamente selecionados ou deletados
(Holländer, 2007).
De fato, todos os grupos de células apresentadoras de antígenos (APCs),
assim como as corticais tímicas (cTECs), medulares tímicas (mTECs), células
dendríticas (DCs) e macrófagos tem suas funções na apresentação de grupos de
peptídeos próprios, e especialização nas suas habilidades para suportar as
seleções positiva e negativa, contribuindo para a diversidade do quadro de
antígenos próprios no timo (Klein & Kyewski, 2000a; Kyewski & Derbinski, 2004;
Anderson et al., 2006).
O processo de seleção e a maturação do repertório de células T são de
grande importância, pois induzem a tolerância dessas células ao que é próprio. A
aquisição dessa tolerância é dependente da interação entre receptor de célula T
(TCR - Tcell receptor) e ligantes peptídeos-MHC próprios. Logo a diversidade de
antígenos próprios acessível a esse repertório no timo é quem vai determinar a
extensão e especificidade dessas células (Klein & Kyewski, 2000b).
Introdução
13
1.2 Expressão Gênica Promíscua no timo
A discriminação do próprio/não-próprio é uma propriedade essencial do
sistema imune que dirige uma variedade de mecanismos efetores contra agentes
patogênicos enquanto ignora os constituintes próprios do organismo. Somente
quando a tolerância ao próprio está finalmente balanceada é que a integridade do
corpo é garantida (Kyewski & Derbinski, 2004).
A tolerância imunológica é a propriedade essencial do sistema imune que
controla as reações patológicas contra antígenos do próprio. O timo é visto como
o principal órgão envolvido com a indução de tolerância aos antígenos próprios
que são expressos pelas células tímicas (tolerância central), enquanto que a
indução de tolerância aos antígenos relacionados a outros tecidos (TRAs) tem
sido atribuída aos mecanismos de tolerância extratímica (tolerância periférica).
A evidência da expressão de TRAs de órgãos e tecidos parenquimais no
timo de camundongos e de humanos foi referida como “expressão gênica
promíscua” (PGE) (Jolicoeur et al., 1994; Sospedra et al.,1998; Derbinski et al.,
2001; Gotter et al., 2004; Kyewski & Derbinski, 2004), o que reforçou a concepção
de tolerância central de antígenos tecidos específicos.
Entretanto, a descrição do fenômeno da expressão promíscua de genes de
TRAs pelas células tímicas medulares epiteliais (mTECs), que expressam
moléculas que normalmente caracterizam outros tecidos (Figura 4), iniciou uma
nova fase na pesquisa em imunogenética que se ocupa da reavaliação das bases
moleculares da tolerância central das células T na prevenção da autoimunidade
(Kyewski & Derbinski, 2004).
Introdução
14
Figura 4. Representação de diversos tecidos e órgãos parenquimais no timo murino é garantida
pela expressão dos antígenos tecido específicos (TRAs) pelas células epiteliais (TECs), fenômeno
chamado expressão gênica promíscua (Extraído e modificado de Kyewski & Derbinski, 2004).
Atualmente, é reconhecido que ao invés de seletivo, este tipo de expressão
é o mais amplo possível, com diversa ontologia e podendo envolver até 10% de
todos os genes do camundongo e, muito provavelmente do homem (Kyewski &
Derbinski, 2004).
Ao contrário do que se assume, as mTECs não formam um esqueleto
estático, mas de maneira similar ao epitélio estratificado da pele ou dos intestinos,
têm um “turnover” com meia-vida de 3 a 4 semanas (Booth et al. , 2000; Alonso et
al., 2003; Boehm et al., 2003). Isto torna as mTECs um compartimento tímico
altamente dinâmico, e que apesar disso, o espectro dos antígenos próprios
expressos não se altera segundo o que observa Kyewski e Derbinski (2004). Os
timócitos que entram na medula do timo sempre encontrarão um espectro
completo de “genes promíscuos” apesar da geração contínua de mTECs.
Intestino
Placenta
Próstata
Músculo esquelético
Útero
Bexiga
Embrião
Olho
Tecido Gorduroso
Vesícula biliar
Oócito/zigoto
Paratireóide
Cérebro
Fígado
Outros
Epiderme
Tireóide
Glândula mamária
Rim
Leucócitos
Coração
Língua
Estômago
Testículos
Glândula salivar
Pâncreas
Pulmão
Eritrócitos
Cordão umbilical
Medula óssea
Endotélio
Ameloblastos
Placenta
Próstata
Músculo esquelético
Útero
Bexiga
Embrião
Olho
Tecido Gorduroso
Vesícula biliar
Oócito / zigoto
Paratireóide
Intestino
Placenta
Próstata
Músculo esquelético
Útero
Bexiga
Embrião
Olho
Tecido Gorduroso
Vesícula biliar
Oócito/zigoto
Paratireóide
Cérebro
Fígado
Outros
Epiderme
Tireóide
Glândula mamária
Rim
Leucócitos
Coração
Língua
Estômago
Testículos
Glândula salivar
Pâncreas
Pulmão
Eritrócitos
Cordão umbilical
Medula óssea
Endotélio
Ameloblastos
Placenta
Próstata
Músculo esquelético
Útero
Bexiga
Embrião
Olho
Tecido Gorduroso
Vesícula biliar
Oócito / zigoto
Paratireóide
Placenta
Próstata
Músculo esquelético
Útero
Bexiga
Embrião
Olho
Tecido Gorduroso
Vesícula biliar
Oócito / zigoto
Paratireóide
Introdução
15
O controle molecular da expressão gênica promíscua no timo também deve
ser investigado. O gene Aire (Autoimmune regulator) que é um regulador da
transcrição (Pitkänen et al., 2003) controla a expressão de um conjunto de genes
de TRAs em mTECs, com uma tendência a genes que cuja expressão é
preferencial de células diferenciadas (Anderson et al., 2002 e 2005; Derbinski et
al., 2005; Derbinski & Kyewski, 2005; Barthlott et al. 2006; Kont et al., 2008).
Mesmo assim, os genes que são controlados por Aire são altamente
diversos com relação à estrutura e função, o que dificulta conclusões sobre seu
modo de ação detalhado. Dados recentes indicaram que Aire contém domínios de
ligação com DNA (Kumar et al., 2001), mas controla a transcrição de maneira
independente da posição de promotores.
O gene Aire codifica uma proteína de 552 aminoácidos expressa
principalmente no timo, e em menor extensão nos linfonodos, além de ter sido
encontrado em alguns outros tecidos (Zuklys et al., 2000; Halonen et al., 2001;
Adamson et al., 2004).
O sequenciamento genômico comparativo indica que a organização gênica
é altamente conservada em humanos e camundongos sendo caracterizada por 14
éxons distantes 13kb do DNA genômico, por uma região promotora TATA box
associada a sitios CpG e por um elemento controlador localizado upstream do
primeiro éxon. Os genes Aire de ambos são altamente homólogos e as
respectivas proteínas contém estruturas peculiares similares (Blechschmidt et al.,
1999).
Uma parte dos transcritos de TRAs, porém parecem ser independentes da
expressão de Aire (Derbinski et al., 2005; Kuroda et al., 2005), e este gene
também regula positiva e negativamente a transcrição de uma gama de genes
nas TECs, que não codificam para TRAs. O significado deste controle no timo foi
observado em estudos com animais Aire-knockout, onde a ausência desse gene
promove o aparecimento de auto-anticorpos, especialmente para o olho e o
estômago (Devoss et al., 2006; Gavanescu et al., 2007), sendo suficiente para
causar autoimunidade. Em outro estudo, análises de camundongos Aire
-
/
-
mostram que a expressão de algumas TRAs é reduzida ou ausente em células
mTECS deficientes de Aire e a seleção negativa dos timócitos é prejudicada
(Liston et al., 2004a).
Introdução
16
Entretanto, a significância destes achados para a compreensão com
precisão da ação de Aire in vivo ainda não está clara. É preciso que haja
evidências diretas de co-regulação dos genes de TRAs (expressão promíscua)
devido à seqüências consenso em suas regiões de promotores/enhancers, nas
quais atuaria a proteína Aire ou mesmo outros complexos reguladores da
transcrição (Kyewski & Derbinski, 2004).
Um estudo recente mostrou que as TRAs seguem o padrão de expressão
do gene Aire durante o desenvolvimento normal do timo e sua involução. Uma
baixa expressão do gene começa a ser detectada por volta do dia 13,5 do
desenvolvimento embrionário e aumenta significativamente no dia 15,5. A maior
taxa de expressão do gene acontece no 11º após o nascimento e gradualmente
decresce (Kont et al., 2008).
O Grupo de Imunogenética Molecular da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto vem trabalhando com culturas de timo fetal (FTOC, Fetal Thymus
Organ Culture) e adulto (ATOC, Adult Thymus Organ Culture) procurando
compreender melhor a ação do gene Aire in vitro.
Os estudos sobre expressão gênica no timo, incluindo expressão
promíscua, normalmente são planejados para utilizar amostras frescas,
recentemente coletadas por cirurgia, o que deve refletir a situação in vivo em
curto prazo.
Entretanto, as culturas do órgão in vitro que são baseadas no uso de timo
fetal (FTOC) ou de timo adulto (ATOC) apresentam grandes vantagens pois
preservam a arquitetura e a constituição celular originais do timo in vivo (DeLuca
et al., 1995).
Nosso grupo de pesquisa aliou este recurso com a tecnologia dos cDNA
microarrays e conseguiu demonstrar que ocorre maturação de células T por meio
da detecção da recombinação V(D)J de receptores de células T (TRVB8.1) e
modulação da expressão gênica em FTOCs numa escala de transcriptoma
evidenciando a participação de genes essenciais implicados no desenvolvimento
do timo (Cardoso et al., 2006).
Outro trabalho empregando cDNA microarrays na tentativa de observar a
ocorrência de expressão promíscua em FTOCs de camundongos Balb-c foi
realizado pelo mesmo grupo. Comparando o tempo de gestação e a duração das
culturas, foi possível determinar a época da emergência da indução de genes de
Introdução
17
TRAs os quais representaram 57 diferentes órgãos parenquimais e 7 órgãos
linfóides. Mostrou-se pela primeira vez que FTOC também reproduz a expressão
gênica promíscua (Sousa Cardoso et al., 2006).
Como estas observações foram realizadas no timo da linhagem Balb-c que
não apresenta, pelo que se sabe, doenças auto imunes, o presente trabalho
procurou mensurar a expressão gênica promíscua em linhagens autoimunes na
tentativa de apontar genes de TRAs que uma vez desregulados poderão
ocasionar falha na tolerância central.
Neste trabalho aprofundaram-se as análises sobre expressão gênica
promíscua no timo da linhagem isogênica autoimune NOD (Non Obese Diabetic)
procurando apontar genes cujo descontrole nos níveis de expressão poderão
estar implicados na manifestação de autoimunidade. O timo desta linhagem foi
estudado in vivo e em cultura (ATOC) para a observação das variações da
expressão gênica promíscua por meio da tecnologia dos cDNA microarrays. O
timo em cultura ATOC também serviu de sistema modelo para a inibição do
transcrito do gene Aire sobre a expressão promíscua de genes de TRAs por meio
da técnica de RNA interferente (RNAi).
O fenômeno do RNAi foi primeiramente observado no final da década de
1980, representando atualmente uma técnica potente no silenciamento da
expressão de genes por meio da degradação de seu RNA mensageiro (Caplen et
al., 2004; Leung et al., 2005; Shankar et al., 2005). O processo envolve diversas
etapas, do qual fazem parte a clivagem de um RNA dupla-fita em porções
menores de 21-28 nucleotídeos por uma enzima RNase-III denominada Dicer. As
fitas simples de RNAi geradas pela degradação, são incorporadas a um complexo
multiprotéico chamado RISC (RNA-inducing silencing complex), que serve como
base para o reconhecimento do RNA mensageiro (RNAm) complementar alvo,
que por sua vez é degradado por uma enzima Slicer do complexo, uma proteína
posteriormente reconhecida e denominada Argonauta-2. O RNAi exibe uma
eficácia de longo alcance, pelo fato de estar protegido pelo complexo RISC,
sendo então preservado facilitando assim a degradação de RNAs mensageiros
em subseqüentes reações endonucleolíticas.
Diversos pequenos tipos de RNAs dupla-fita artificiais têm sido inseridos
em uma grande variedade de células e organismos diferentes, sendo, portanto a
técnica de RNAi amplamente utilizada como um método para o silenciamento de
Introdução
18
genes específicos. Assim, essa tecnologia apresenta um vasto potencial como
ferramenta para determinar funções de genes, e como forma de terapia para
patologias caracterizadas por expressão aberrante de proteínas celulares, como
doenças infecciosas, desordens genéticas, neoplasias e disfunções imunológicas.
1.3 Autoimunidade e doenças autoimunes
A possibilidade de que o sistema imune de um indivíduo possa reagir
contra antígenos autólogos e causar dano tecidual foi apreciada por imunologistas
desde quando a especificidade do sistema imune para antígenos estranhos foi
reconhecida. Hoje sabe-se que os eventos-chave no desenvolvimento de
autoimunidade são o reconhecimento de antígenos próprios por linfócitos auto-
reativos, a ativação destas células para proliferarem e se diferenciarem em
células efetoras e os seus produtos (Abbas & Lichtman, 2005).
As doenças autoimunes são condições patológicas em que o sistema
imune age sobre si mesmo e causa sérios danos teciduais através de
mecanismos ainda desconhecidos (Kamradt & Mitchison, 2001; Tarner &
Fathman, 2001). Essas doenças surgem a partir da interação de três
componentes: genético, ambiental e regulatório que resultam numa falha na auto-
tolerância (Fathman et al., 2005; Jiang et al., 2005). Tal falha na tolerância central
impediria a expressão gênica promíscua de genes TRAs que se encontrariam
desregulados em tal situação.
Desordens autoimunes comuns em humanos como diabetes mellitus tipo 1
(DM-1), artrite reumatóide e lúpus eritrematoso sistêmico refletem a combinação
de muitos fatores genéticos suportados por resultados de doenças autoimunes
em modelos animais (Jiang et al., 2005).
O uso da terapia gênica no combate de doenças autoimunes em humanos
tem sido estudado e pode ser uma área promissora da pesquisa no tratamento
dessas doenças. A inserção de um DNA em células hospedeiras poderia procurar
corrigir um dos três efeitos: defeito genético dado por um gene defectivo ou
ausente; inserção de genes que codificam moléculas anti-inflamatórias, como
citocinas (Il-4, Il-10 ou TGF-β) ou ainda interferência com processos de
sinalização envolvendo reações autoimunes, como sinalização por TCR ou vias
de co-estimulação ou apoptose (Tarner & Fathman, 2001).
Introdução
19
O alto percentual de doenças em pares discordantes de gêmeos
monozogóticos demonstram o papel central dos fatores ambientais na etiologia
das doenças autoimunes. Estudos em modelos animais têm mostrado claramente
que infecções podem dar início a doenças autoimunes (Bach, 2005). Associações
entre viroses e o desenvolvimento do diabetes tipo 1 têm sido feitas. As viroses
são consideradas fatores ambientais de risco porque induzem fortes respostas
imunes e podem infectar o pâncreas e as células β (Gianani & Sarvetnick, 1996;
Filippi & von Herrath, 2005; von Herrath et al., 2007).
O diabetes melitus é uma doença metabólica multi sistêmica decorrente do
comprometimento da produção de insulina resultante da destruição das células β.
Vários mecanismos podem contribuir para a destruição dessas células incluindo
reações mediadas por linfócitos CD4
+
reativos. Inicialmente ocorre necrose celular
e infiltração linfocitária (CD4
+
e CD8
+
) gerando lesões conhecidas como insulite.
O camundongo NOD (Non Obese Diabetic), modelo para estudo da doença,
desenvolve insulite espontânea também mediada por linfócitos T, seguida por
diabetes manifesto (Abbas & Lichtman, 2005).
Como em humanos, o progresso da doença em camundongos NOD é
definida em pelo menos dois estágios. No primeiro deles, a infiltração das ilhotas
do pâncreas pelas células T auto-reativas começa depois dos 4 meses de idade e
torna-se progressivamente mais extensa mas, poupa ainda uma parte das células
β produtoras de insulina. Esse estado pré-diabético pode persistir por meses
(anos em pacientes), o ataque autoimune se mantém sob controle e relativamente
não destrutivo. No segundo estágio, tipicamente entre 15 a 25 semanas de idade,
eventos desconhecidos provocam insulite que progride para a destruição das
células β (Castaño & Eisenbarth, 1990; Serreze & Leiter, 1994).
O diabetes tipo 1 tem influência genética e ambiental no seu
desenvolvimento. O diabetes autoimune em NOD apresenta muitas
características genéticas e patofisiológicas com o diabetes humano. Em ambas as
espécies, os genes do MHC e outros não-MHC contribuem para a
susceptibilidade da doença. Cerca de 20 regiões não-MHC conhecidas como idd
(insulin dependent diabetes) têm sido associadas ao risco da doença em
camundongos NOD (Maier & Wicker, 2005).
Essas regiões de susceptibilidade podem afetar a habilidade da deleção
clonal de células T precursoras auto-reativas no timo (Liston et al., 2004b), a
Introdução
20
habilidade de apresentar auto-antígenos e selecionar células T auto-reativas
(Stratmann et al., 2003), a tolerância periférica e a atividade das células T ou
moléculas com potencial regulatório (Salomon et al., 2000; Kreuwel et al., 2001)
ou a agressividade da lesão (Lyons et al., 2000a).
Uma das estratégias para localizar um gene de grande efeito na
susceptibilidade a um distúrbio baseia-se no conceito de ligação genética. Esse
conceito refere-se ao fato de que dois loci gênicos situados muito próximos num
mesmo cromossomo tendem a ser herdados juntos (ligados). Desse modo, se um
determinado marcador genético, cuja localização já é conhecida, for sempre
herdado junto com a doença pelos membros afetados de uma mesma família,
muito provavelmente o gene da doença terá sua localização nas vizinhanças
desse marcador (Aune et al.; 2004). Estudos de linkage no genoma total
demonstra que múltiplas doenças auto-imunes exibem loci de susceptibilidade
comum (Wanstrat & Wakeland, 2001). Uma alternativa para o estudo de genes
envolvidos em doenças complexas, cujo modo de transmissão não é conhecido,
são os estudos de associação. A associação com o marcador investigado ocorre
quando o gene ou o locus em desequilíbrio de ligação com o marcador estão
envolvidos na patofisiologia da doença. A maior vantagem dos estudos de
associação é que eles podem detectar genes com efeitos modestos (Michelon &
Vallada, 2004). Estudos de expressão dos loci de susceptibilidade que foram
identificados por linkage são raros, até o momento. Nosso grupo recentemente
publicou um artigo associando a tecnologia dos cDNA microarrays com dados de
linkage, na investigação de genes diferencialmente expressos de células B
(CD19
+
) em pacientes com lúpus eritrematoso sistêmico (SLE) (Trevisan et al.;
2006). Esse estudo sugeriu que regiões cromossomais previamente identificadas
como loci de susceptibilidade ao SLE são de fato transcritos por células B de
pacientes. Até o momento não foi realizada essa associação com diabetes
mellitus do tipo 1.
Estudos de linkage em camundongos têm sido confirmados por estratégias
congênitas em diabetes tipo 1 e outras doenças autoimunes. Muitas regiões
inicialmente encontradas apresentam-se como sítios de muitos genes de
susceptibilidade, como por exemplo, o sinal de linkage no cromossomo 3 de
camundongos cuja dissecção resultou na descoberta de 4 loci de susceptibilidade
(Podolin et al., 1997; Lyons et al., 2000b; Penha-Gonçalves et al., 2003).
Introdução
21
A caracterização do perfil de expressão gênica pode identificar milhares de
genes expressos que podem ter sua transcrição regulada por padrões que
identificam uma doença. Assim, a investigação de novos genes potencialmente
envolvidos com a determinação da doença pode ser conduzida de modo mais
rápido e amplo.
1.4 A importância dos camundongos NOD na pesquisa do diabetes tipo 1
A linhagem NOD (Non Obese Diabetic) é um importante modelo para
estudo da emergência do diabetes mellitus do tipo 1 (DM-1). Desde seu
aparecimento ocorrido há mais de 20 anos, estudos com esta linhagem têm
proporcionado muitas idéias e resultados sobre a complexidade dos processos
envolvidos com doenças autoimunes. Os camundongos NOD representam um
excelente modelo de doença autoimune sendo muito úteis para dissecar os
mecanismos de tolerância, pois desenvolvem espontaneamente diabetes
autoimune muito similar ao diabetes autoimune do tipo 1 humana, incluindo a
presença de autoanticorpos pâncreas específicos, células T CD4+ e CD8+
autoreativas e sintenia de grupos de ligação (linkage) com regiões de
cromossomos humanos (Atkinson & Leiter, 1999; Anderson & Bluestone, 2005).
Experimentalmente, uma tolerância central defectiva têm sido implicada em
pelo menos parte do processo patológico em camundongos NOD (Anderson &
Bluestone, 2005) e essa falha parece ser causada por defeito intrínseco no
processo de apoptose nos timócitos de NOD durante a seleção negativa
(Kishimoto & Sprent, 2001; Liston et al., 2004b; Zucchelli et al., 2005) (Figura 5).
Introdução
22
Figura 5. Tolerância central e periférica defectivas nos camundongos NOD. A figura ilustra
defeitos em vários processos tolerogênicos que podem ser responsáveis pelo desenvolvimento do
diabetes em camundongos NOD. (Extraído e modificado de Anderson & Bluestone, 2005).
C
E
N
T
R
A
L
P
E
R
I
F
É
R
I
C
O
Células NK
Linfonodo
Pancreático
Anticorpos
maternos
Resistência
à apoptose
Células T
ativadas
Apoptose defeituosa nos timócitos
Defeitos intrínsecos dos timócitos
Produção de células T regulatórias alterada
Timo
Ativação
homeostática
Célula T ilhota específica
Insulina, Gad,
Hsp60, outros
Apoptose das
células β
Decréscimo de Il-4
Th1 > Th2
Células NK
Sítio de
ativação?
Células T reg
Célula APC
com Ag de
pâncreas
Primeiras ilhotas
específicas
C
E
N
T
R
A
L
P
E
R
I
F
É
R
I
C
O
Células NK
Linfonodo
Pancreático
Anticorpos
maternos
Resistência
à apoptose
Células T
ativadas
Apoptose defeituosa nos timócitos
Defeitos intrínsecos dos timócitos
Produção de células T regulatórias alterada
TimoTimo
Ativação
homeostática
Célula T ilhota específica
Insulina, Gad,
Hsp60, outros
Apoptose das
células β
Decréscimo de Il-4
Th1 > Th2
Células NK
Sítio de
ativação?
Células T reg
Célula APC
com Ag de
pâncreas
Primeiras ilhotas
específicas
Introdução
23
Além do camundongo NOD outro roedor, o rato BB (BioBreeding) também
é usado como modelo para estudo do diabetes tipo 1. A razão pela preferência
por modelos animais é devido ao fato de eles terem um genoma definido, terem
mais reagentes monoclonais para a análise dos componentes do sistema imune
além de menor custo. Além do mais, os resultados encontrados em NOD podem
ser extrapolados para humanos (Atkinson & Leiter, 1999).
O camundongo NOD surgiu a partir da linhagem do camundongo Suíço
(Swiss) durante um experimento de seleção no Japão em que cruzamentos entre
irmãos foram mantidos para que uma linhagem toda desenvolvesse catarata.
Porém, além de não apresentarem catarata, os camundongos tiveram seu índice
glicêmico alterado e linhagens susceptíveis a não susceptíveis a doenças
autoimunes foram selecionadas (Makino et al., 1980; Atkinson & Leiter, 1999).
A incidência do diabetes espontâneo em NOD é de 60% a 80% em fêmeas
e de 20% a 30% em machos. Essa incidência da doença aumenta quando o
camundongo é mantido em ambiente relativamente livre de patógenos e decresce
dramaticamente em condições normais de manutenção (Singh & Rabinovitch,
1993; Bowman et al., 1994). O início do diabetes ocorre entre 12 a 14 semanas
de idade em fêmeas e um pouco depois em machos. Estudos histológicos
mostram que os infiltrados celulares são notados nas ilhotas até
aproximadamente 3 a 4 semanas de idade quando os animais começam a
demonstrar a peri-insulite (Anderson & Bluestone, 2005).
O camundongo NOD também está propenso a desenvolver outras
síndromes autoimunes como: sialite (Hu et al., 1992), tiroidite autoimune (Many et
al., 1996), polineuropatia periferal autoimune (Salomon et al., 2001) e prostatite
(em machos).
1.5 Análise do transcriptoma
1.5.1 Conceito de transcriptoma
Em analogia ao termo genoma o qual se refere ao conjunto de genes de
uma determinada espécie, criou-se o termo transcriptoma para se referir ao
conjunto de RNAs, ou seja, os transcritos de uma célula num dado momento de
seu ciclo. Como são os RNAm os responsáveis pela codificação da síntese de
proteínas e, portanto, os mais importantes no estudo da expressão do genoma,
Introdução
24
geralmente entende-se que o transcriptoma é o conjunto dos RNAm. Mas é
oportuno lembrar que tanto os RNAs transportadores (RNAt) e os RNAs
ribossômicos (RNAr) devem ser incluídos no conceito do transcriptoma apesar de
não serem codificadores de proteínas.
Recentemente foram incluídos os microRNAs no conceito de transcriptoma
por representarem uma classe distinta de RNAs que controlam a expressão gênica
ao nível da síntese e/ou degradação dos RNAm (Sevignani et al., 2006).
Durante todo o processo de diferenciação celular e tecidual, um conjunto
diversificado de proteínas é mobilizado como resultado da expressão diferencial
dos respectivos genes. Portanto, pode-se dizer que durante o desenvolvimento o
primeiro ponto de controle molecular é a expressão gênica ao nível do conjunto
de RNAm, definido como transcriptoma. Sabe-se hoje que o transcriptoma das
células e tecidos é reflexo da razão entre a biossíntese de RNAm (transcrição) e
sua degradação, muitas vezes causada pelos microRNAs (Sevignani et al., 2006).
Além disso, o transcriptoma é variável entre os diferentes tipos de células,
tecidos e órgãos de um dado indivíduo, sendo que as próprias condições
fisiológicas normais, como as diferentes fases do ciclo celular, ou patológica,
como por exemplo, infecções ou neoplasias, influenciam no chamado perfil do
transcriptoma (Passos et al., 2000).
A comparação da expressão gênica por mensuração dos níveis de RNAm de
células em condições normais e patológicas está resultando em diagnósticos por
“fingerprints” o que poderá ajudar a identificar disfunções moleculares com maior
precisão, para uma posterior intervenção terapêutica (Xiang & Chen, 2000).
1.5.2 Métodos de análise do transcriptoma
Cópias de RNAm na forma de DNA (DNA complementar ou simplesmente
cDNA) clonadas em vetores plasmidiais de E.coli e o sequenciamento a partir da
extremidade 3´-OH, perfazendo 0,3 a1,5 kb, confere ao que chamamos de
“Expressed Sequence Tags” (ESTs) ou em português, Etiqueta de Seqüência
Expressa. As ESTs proporcionaram um avanço significativo na decifração do
genoma funcional humano, de camundongos e outros organismos.
Mais recentemente o Brasil deu uma contribuição importante no
sequenciamento de cDNAs pela tecnologia das seqüências ORESTES (Open-
Reading Frame ETSs) (Dias Neto et al., 2000). Tais seqüências correspondem a
Introdução
25
porções mais internas em direção à extremidade 5´dos RNAm, o que fez os
pesquisadores conhecerem mais sobre a estrutura do transcriptoma humano.
Um grande progresso tem ocorrido nos últimos anos na caracterização de
clones de cDNA de humanos, camundongos e outros organismos-modelo. Os
clones de cDNA e suas seqüências formam a base para a técnica de arranjos em
membranas de alta densidade (microarrays) para a análise de expressão gênica
em grande escala (Duggan et al., 1999; Lipshutz et al., 1999).
Várias técnicas para a análise do transcriptoma analisando expressão de
mRNA estão disponíveis atualmente como SAGE (análise em série da expressão
gênica, do inglês Serial Analysis of Gene Expression) (Ye et al., 2002). Entretanto,
estes métodos possuem desvantagens, quando o objetivo é analisar expressão
em grande escala. Porém, o problema apresentado por estas técnicas pode ser
solucionado por meio da tecnologia de microarrays (Jordan, 1998; Passos et al.,
2000; van Hal et al., 2000; Sakamoto-Hojo et al., 2003).
A tecnologia dos cDNA microarrays mostrou ser uma ferramenta poderosa e
muito difundida nos estudos de expressão gênica com aplicações no estudo de
vários organismos tanto em situações normais como patológicas (Whitney & Becker,
2001) além de expressar centenas de genes simultaneamente e fornecer assinaturas
moleculares das atividades celulares nos estudos de doenças multigênicas como é o
caso das doenças autoimunes (Fathman et al., 2005) . Aliando-se a disponibilidade
das bibliotecas de cDNA com a robótica de alta precisão na deposição de pequenas
amostras em superfícies sólidas, tornou-se possível a preparação dos arrays
(arranjos) de clones de cDNA, produtos de PCR (reação de polimerização em
cadeia) e oligonucleotídeos em membranas de nylon ou em lâminas de vidro
(Passos et al., 2000).
Pelo conhecimento do perfil de expressão gênica, é possível responder
importantes questões, tais como, quantos genes e quais suas intensidades de
expressão estão envolvidos num determinado processo biológico. Além disso,
reflete o perfil transcricional de milhares de genes em resposta a um estímulo
farmacológico ou a uma resposta imune entre outros (Kurella et al., 2001).
As sondas utilizadas nas hibridações com os microarrays (sondas de cDNA
derivadas das amostras de RNA em estudo) podem ser marcadas com
radioatividade (
33
P) quando utiliza-se como plataforma membranas de nylon ou
com fluorocromos (Cy3 e Cy5) quando utiliza-se lâminas de vidro (Figura 6).
Introdução
26
Como definiu Jordan (1998), as seqüências de cDNA fixadas no microarray
são chamadas de alvo e o RNA extraído das células (cDNAs marcados) chamado de
sonda. E neste trabalho, seguiremos esta definição, mas sabemos que vários
laboratórios definem as seqüências depositadas no array como sondas.
Figura 6. Ilustração dos métodos de marcação de sondas complexas de cDNA para microarrays.
A) Método fluorescente usando Cy3 e Cy5 e lâmina de vidro e B) Método radioativo usando
33
P e
membranas de náilon. (Extraído e modificado do livro Mutagênese Ambiental: Sakamoto-Hojo et
al., 2003).
Introdução
27
O presente trabalho representa um esforço no sentido de esclarecer se a
expressão gênica promíscua no timo de uma linhagem isogênica de
camundongos, a qual também é autoimune e reproduz o diabetes mellitus do tipo
1 (DM-1), ou seja , a linhagem NOD, pode ser associada com o fenômeno da
autoimunidade.
Hipótese do Trabalho
Hipótese do Trabalho
29
2. HIPÓTESE DO TRABALHO
1) A linhagem de camundongos NOD (Non Obese Diabetic), que reproduz
diabetes melitus do tipo 1, apresenta expressão descontrolada de
antígenos relacionados a tecidos (TRAs) em células epiteliais do timo
(expressão gênica promíscua) durante a transição do estado pré-
autoimune para o estado autoimune .
2) A expressão gênica promíscua de TRAs no timo inclui genes de
susceptibilidade ao diabetes melitus do tipo 1.
3) Dada a preservação das propriedades morfofisiológicas do timo adulto
em cultura (ATOC), o fenômeno da expressão gênica promíscua (PGE)
também poderá ser reproduzido neste sistema modelo.
4) A expressão do gene Aire (Auto immune regulator) em células epiteliais
do timo poderá ser associada à expressão de um conjunto TRAs.
Objetivos
Objetivos
31
3. OBJETIVOS
Objetivo amplo: Comparar a expressão gênica promíscua de TRAs no timo de
camundongos NOD (pré-autoimunes vs autoimunes) e avaliar o efeito da
inativação do transcrito do gene Aire neste tipo de expressão.
Objetivos específicos:
1) Avaliar a expressão gênica diferencial de TRAs (expressão gênica
promíscua) no estroma do timo da linhagem isogênica NOD (non obese
diabetic) durante a transição do estado pré-autoimune Æ autoimune
usando a tecnologia dos cDNA microarrays.
2) Avaliar e comparar os níveis de expressão do gene Aire no estroma do
timo de camundongos NOD usando a técnica de RT-PCR.
3) Avaliar quais genes têm seu padrão de expressão alterado após a
inativação do transcrito do gene Aire usando o sistema de RNA
interferente in vitro em cultura de timo (ATOC) dos camundongos NOD.
Material e Métodos
Material e Métodos
33
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Linhagem de camundongos NOD
A linhagem NOD (Non Obese Diabetic) foi adquirida junto ao biotério da
Universidade Estadual de Campinas (CEMIB UNICAMP). Os animais foram
transferidos para nosso Laboratório no Departamento de Genética da Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto, USP em mini isoladores “Alesco” sob condições
“SPF” (Single Patogen Free) devidamente autoclavados e isentos de impurezas
com entrada de ar filtrado, e foram mantidos sob as mesmas condições, incluindo
os mini isoladores, em câmara isoladora “Alesco” também com entrada de ar
filtrado (filtro de 0,45 µ) e a temperatura constante de 25
o
C, ciclo de iluminação de
12 horas, com maravalha, água e ração ad libitum previamente autoclavadas.
Um preparado polivitamínico suplementar Glicopan pet (Vetnil, São Paulo,
Brasil) previamente filtrado e estéril foi fornecido juntamente com a água para
compensar as perdas ocorridas durante a autoclavagem da ração.
4.2 Avaliação da glicemia
Para a análise da glicemia foi utilizado o aparelho Accu Check – Active Kit
(Roche Diagnóstica Brasil LTDA, São Paulo, Brasil). A leitura do valor glicêmico é
dada por meio da aplicação de uma gota de sangue (2 µL) no papel reativo o qual
é em seguida inserido no leitor óptico. O resultado é expresso em concentração
de glicose em mg/dL. Animais cujos valores de glicemia excederam a 250 mg/dL
foram considerados diabéticos.
4.3 Definição de controle e teste
O presente trabalho pretende avaliar a modulação da expressão gênica
que ocorre durante a transição do estado pré-autoimune Æ autoimune, ou seja,
transição animal sadio Æ animal diabético. Portanto, foram considerados como
controle os animais sadios ou pré-diabéticos que apresentaram índice glicêmico <
250 mg/dL e teste aqueles que apresentaram índice glicêmico ≥ 250 mg/dL e
desenvolveram, portanto, diabetes (estado autoimune).
Material e Métodos
34
4.4 Cultura de timo adulto (ATOC)
Animais da linhagem NOD adultos foram sacrificados por anestesia
profunda com éter e os timos foram imediatamente removidos intactos e
transferidos para filtros de policarbonato Millipore 0,45 µ sobre um bloco de “grids”
de plástico (Upjohn, Kalamazoo, MI) e mantidos em placas de cultura (24 wells)
contendo 2,0 mL de meio Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium HEPES
modification (DMEM) e Nutrient Mixture F-10 HAM (HAM F-10) (Sigma-Aldrich
TM
),
adicionados de 20% de soro fetal bovino (GIBCO
®
), estreptomicina (100 µg/mL),
penicilina (250 U/mL), gentamicina (10 µg/mL) e bicarbonato de sódio (1,2 g/L).
As culturas ATOC foram mantidas a 37
o
C em estufa com atmosfera com 5% de
CO
2
(Whalen et al., 1999) num período entre 20 a 24 horas de cultura.
Posteriormente, foi feita a separação das células tímicas para a obtenção das
células epiteliais tímicas (TECs) e em seguida a extração de RNA total. O
procedimento foi feito tanto para as amostras controle (pré-autoimunes) quanto
para as amostras testes (autoimunes).
4.5 Inibição seletiva do transcrito do gene Aire com RNA interferente (RNAi)
4.5.1 Monitoramento da transfecção e determinação da seqüência de RNAi anti-Aire
O ensaio de inibição do transcrito do gene Aire em timos de animais pré-
autoimunes em cultura ATOC foi realizado usando o TriFECTa™ - Dicer-
Substrate RNAi kit da IDT - Integrated DNA Tecnologies (Coralville, IA, USA) com
seqüências de RNA interferente. O kit inclui três seqüências diferentes de RNAi
anti-Aire, as quais devem ser previamente testadas buscando a melhor eficiência
de inibição do transcrito no modelo de estudo. Além das seqüências anti-Aire,
outras três seqüências estavam incluídas no kit: 1) RNA irrelevante marcado com
Cy3 usado para medir a eficiência de transfecção (microscopia de fluorescência
confocal), 2) uma seqüência duplex de RNAi irrelevante (controle negativo), o qual
não é capaz de alterar a expressão gênica nas células em estudo e 3) um
controle positivo, constituído de uma seqüência de RNAi anti-Hprt (Hypoxanthine
guanine phosphoribosyl transferase), um gene constitutivo, utilizada para avaliar
se o processo de transfecção e o sistema modelo são adequados para inibição
com RNAi.
Material e Métodos
35
O método escolhido para a transfecção dos timos em cultura foi o de
lipofecção utilizando o Hiperfect Transfection Reagent ® da Qiagen (Hilden,
Alemanha) seguindo as instruções do fabricante.
Para se determinar qual o melhor duplex para o inibição do transcrito do
gene Aire realizou-se um experimento piloto utilizando as três seqüências anti-
Aire e as demais seqüências controle que foram testadas nas concentrações de
10, 50 e 100 nM. Finalmente amostras de cDNA oriundas dos timos tratados com
estes RNAs foram submetidas a reações de PCR (método de RT-PCR) para a
escolha da melhor seqüência.
As reações de RT-PCR do experimento piloto para a seleção da seqüência
de RNAi anti-Aire a ser adotada foram feitas a partir de 2 µg de cada amostra de
RNA que foram convertidas a cDNA utilizando a enzima SuperScript II
®
(Invitrogen). Retirou-se 5 µL do produto da reação e a amplificação foi feita em
diluições sucessivas (1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 e 1:128) em cada reação
de RT-PCR semiquantitativa. Foram usados os seguintes pares de primers nas
seqüências sense e antisense respectivamente: Aire (5’
CATCCTGGATTTCTGGAGGA 3’ e 5’ GCTCTTTGAGGCCAGAGTTG 3’) e
Hprt (5’ GCTTGCTGGTGAAAAGGACCTCTCGAAG 3’ e
5’ CCCTGAAGTACTCATTATAGTCAAGGGCAT 3’). Um volume final de 25 µl de
uma reação típica de RT-PCR, contendo 200µM de dNTP, 1,5 mM de MgCl
2
, 50
mM KCl, 10 mMTris-HCl (pH 8,4 a 25°C), 10 µM de cada primer e 2 U de Taq
DNA polimerase, foi submetida a ciclagem térmica. Trinta e cinco ciclos foram
realizados, cada um com três passos. Para o gene Aire foi desnaturação: 94°C,
30 segundos; anelamento: 57°C, 30 segundos; extensão: 72°C, 30 segundos e
para o gene Hprt foi desnaturação: 94°C, 30 segundos; anelamento: 60°C, 30
segundos; extensão: 72°C, 30 segundos. Os produtos da amplificação foram
submetidos a uma eletroforese em gel de agarose 1,5 % em paralelo ao lado de
um marcador de peso molecular de 50 pb (Promega, EUA).
Para a determinação da concentração bem como da eficiência da
transfecção fez-se uso da microscopia de fluorescência confocal onde a
seqüência duplex selecionada foi testada em diferentes concentrações: 10nM,
50nM e 100 nM.
A avaliação da transfecção dos timos utilizando microscopia de
fluorescência confocal foi realizada no Departamento de Biologia Celular e
Material e Métodos
36
Molecular e Bioagentes Patogênicos da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
sob a supervisão do Prof. Dr. Klaus Hartfelder e foi feita após a confecção de
lâminas contendo cortes histológicos dos timos transfectados com a seqüência de
um RNAi marcada com Cy3.
Os timos foram extraídos e submetidos em cultura ATOC conforme
descrito no item 4.5.2 e após 24 horas foram imersos em Tissue Freezing Medium
(TBS
TM
– Triangle Biomedical Sciences) e congelados até serem cortados num
criostato (Microtome Cryostat HM 505E) no Departamento de Morfologia,
Estomatologia e Fisiologia - FORP. Os cortes foram feitos com espessura de 20
µm e em seguida as lâminas foram confeccionadas. Posteriormente foram
analisados em um software (Leica TCS – SP2) de microscopia de fluorescência
confocal que por sua vez permitiu uma série de outros cortes longitudinais de
menor espessura, tornando possível assim a vizualização da fluorescência no
tecido e consequentemente a eficiência da transfecção.
4.5.2 Inibição seletiva do transcrito do gene Aire em cultura de timo adulto (ATOC)
A cultura ATOC foi montada numa placa de 24 wells contendo 2,0 mL de
meio Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium HEPES modification (DMEM) e
Nutrient Mixture F-10 HAM (HAM F-10) (Sigma-Aldrich
TM
), adicionados de 20% de
soro fetal bovino, estreptomicina (100 µg/mL), penicilina (250 U/mL), gentamicina
(10 µg/mL) e bicarbonato de sódio (1,2 g/L). A placa foi mantida na estufa a 37°C
durante a preparação do RNAi. O RNAi foi diluído em 20 µL de meio Minimum
Essential Medium Eagle Alpha Modification (α-MEM) sem soro. Para cada timo
em cultura foi feita uma diluição individual. Para a concentração determinada
(50nM) foram utilizados 6µL do RNAi escolhido (seqüência 1). Adicionou-se 1 µL
de Hiperfect Transfection Reagent ao RNAi diluído e após homogeneização
incubou-se a reação por 10 minutos em temperatura ambiente permitindo a
formação dos complexos de transfecção RNAi-Lipofectamina. Após a incubação,
os complexos foram adicionados ao meio de cultura da placa e a cultura foi
mantida a 37
o
C em estufa com atmosfera com 5% de CO
2
(Whalen et al., 1999)
por 24 horas.
Foram utilizados 3 controles: 1) timo sem RNAi contendo apenas o meio de
cultura (controle); 2) timo em presença de um RNAi irrelevante (controle
Material e Métodos
37
negativo), sem a capacidade de silenciamento; 3) timo em presença de um RNAi
anti-Hprt (controle positivo) para monitorar a funcionalidade do experimento de
silenciamento. Foram utilizados 3 timos em cada condição controle, bem como
para a condição do experimental RNAi anti-Aire.
4.6 Avaliação de apoptose e necrose em ATOC por citometria de fluxo
Os timos removidos dos animais NOD pré-autoimunes após submetidos à
cultura in vitro ATOC em placas de 24 wells por 24 horas foram transferidos para
outra placa contendo 1 mL de colagenase II, 100U/mL de meio de cultura
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium HEPES modification (DMEM) (Sigma-
Aldrich
TM
) por 30 minutos. Após esse tempo, os timos foram então macerados em
uma rede de nylon com o auxílio de um embolo de seringa, e as suspensões de
células foram então quantificadas por meio do aparelho Coulter. A quantidade de
1x10
6
células foi utilizada para o ensaio em cada tubo. Posteriormente as células
foram lavadas em 3 mL de PBS 1X, e o botão de células foi obtido após
centrifugação a 400xg, por 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado, e a
seguir foram adicionados 100µL/tubo de tampão de Annexin Binding Buffer diluído
1:10 em PBS, e 1µL de cada marcador, anexina V e iodeto de propídeo (PI)
provenientes do ApoScreen
TM
Annexin V-FITC KIT (Birmengham, AL35260 USA).
As amostras foram incubadas por 15 minutos à temperatura ambiente e
posteriormente foi adicionado 50µL de PBS para leitura no citômetro. Foram
utilizados 2 timos para cada um dos tempos verificados ( 0 e 24 horas).
4.7 Separação do estroma tímico
Adaptou-se o protocolo descrito por Gray et al. (2002). O procedimento de
separação de estroma tímico, o qual é formado pelas células corticais e pelas
medulares (TECs) inicia-se após a retirada dos timos recém removidos e em
cultura ATOC de animais pré-autoimunes e autoimunes. Nesse protocolo deve-se
utilizar um pool de timos usando-se de 2 a 3 timos por amostra. O mesmo foi feito
para os timos em cultura ATOC no experimento de inibição do transcrito do gene
Aire utilizando RNAi. Os timos foram fragmentados em pequenos blocos de 3
mm
3
e colocados em um becker contendo 40 mL de meio Dulbecco’s Modified
Eagle’s Medium HEPES modification (DMEM) e Nutrient Mixture F-10 HAM (HAM
F-10) (Sigma-Aldrich
TM
). Os fragmentos foram agitados num agitador magnético
Material e Métodos
38
por 30 minutos a 4ºC. Isto permite que os timócitos se desloquem do estroma
migrando para o meio de cultura. Decorridos os 30 minutos, os fragmentos de
estroma foram removidos com auxílio de pinça e colocados num tubo Falcon de
15 mL juntamente com 10 mL de EDTA 5 mM. Procurando remover o meio que
ainda se encontrava nos tecidos centrifugou-se a 2000xg a temperatura ambiente
por 5 minutos. Os fragmentos foram removidos e transferidos para um tubo
Eppendorf de 1,5 mL e iniciou-se a extração de RNA total.
4.8 Extração de RNA total
A fim de prevenir da contaminação por ribonucleases durante a extração e
manuseio dos RNAs, toda a vidraria, tubos plásticos, espátulas e pinças utilizadas
foram previamente autoclavados.Todo o procedimento foi realizado usando luvas
de látex sem talco e descartáveis.
As amostras de RNA total foram extraídas do estroma de timos recém
removidos e de culturas ATOC tanto de animais pré-autoimunes quanto de
autoimunes bem como as amostras provenientes do experimento de inibição do
transcrito do gene Aire. Para tal, utilizou-se o Trizol ® Reagent (Invitrogen).
Após a obtenção do estroma tímico, este foi rompido até a separação das
células TECs e estas foram suspensas em 200 µL de solução salina 0,9% estéril
e em seguida foi adicionado 1 mL de Trizol. O material foi homogeneizado com o
auxílio de um micro homogeneizador do tipo Potter e posteriormente com um
pipetador procurou-se dissociar os fragmentos do tecido ainda restantes. As
amostras foram deixadas em repouso durante 5 minutos a temperatura ambiente
promovendo a dissociação nucleoproteica. Em seguida, foram adicionados 200 µL
de clorofórmio, seguindo-se por agitação em Vórtex durante 15 segundos e
posterior repouso por mais 3 minutos a temperatura ambiente. Após esse período,
as amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 12000xg a 4°C, recolhendo-se
a fase aquosa sobrenadante e transferindo-a para um novo tubo.
Para a precipitação do RNA total foram adicionados ao sobrenadante 3
volumes de isopropanol gelado e a mistura deixada a -20°C por pelo menos 18
horas.
O RNA total foi coletado por centrifugação a frio (7500xg por 5 minutos) e o
precipitado foi lavado duas vezes com 1000 µL de etanol 70 % também a frio. O
Material e Métodos
39
excesso de etanol foi removido do precipitado de RNA por evaporação em tubo
aberto tomando cuidado para não ressecar as amostras. Finalmente as amostras
de RNA foram dissolvidas em 13 µL de água Milli-Q estéril.
O grau de pureza das preparações de RNA total foi calculado por medidas
espectrofotométricas (Genequant – Amersham Pharmacia Biotech) calculando as
razões entre as absorbâncias; A
260
/A
280
~ 2,0 indicando que a preparação estava
livre de proteínas e A
220
/A
260
~ 0,7 livre de fenol. A integridade das preparações foi
avaliada por meio de eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com brometo
de etídeo seguindo protocolo convencional.
4.9 Quantificação de RNA total
O precipitado de RNA total era dissolvido em 13 µl de água Milli-Q
previamente tratada com DEPC (Dietil Pirocarbonato). A solução de RNA era
então diluída 100X e submetida a dosagens em espectrofotômetro usando luz
ultravioleta (Genequant – Amersham Pharmacia Biotech). As dosagens tiveram
como base a seguinte estimativa: 1U de A
260
= 40 µg RNA/mL.
4.10 Avaliação da integridade do RNA total por eletroforese em gel de
agarose
4.10.1 Preparação do gel
A qualidade das preparações de RNA foi avaliada por meio de eletroforese
em gel de agarose sob condições denaturantes. Um volume total de 35 mL de
agarose fundida em água Milli-Q autoclavada (1,5% de agarose) foi misturado a
10 mL de formaldeído 37% e 11 mL de tampão de migração MOPS 5X
concentrado (20,6g de MOPS dissolvidos em 800 mL de acetato de sódio 50mM,
pH 7,0 ajustado com NaOH 2N e adicionados 10 mL de EDTA 0,5M pH 8,0;
volume final ajustado para 1000 mL). O gel foi solidificado em suporte de acrílico
que inicialmente foi tratado com NaOH 0,5 M por 10 minutos, assim como a cuba
e o pente para a eliminação de RNAase sendo posteriormente lavados com água
Milli-Q autoclavada.
Material e Métodos
40
4.10.2 Preparação das amostras de RNA
Durante o tempo de solidificação do gel, as amostras de RNA foram
desnaturadas na seguinte mistura: 4,5 µL de solução de RNA (2 µg RNA); 2 µL de
tampão MOPS 5X; 3,5 µL de formaldeído 37% (Merck, Alemanha) e 10 µL de
formamida. A mistura foi então incubada por 15 minutos a 65°C. Após esse
tempo, o tubo foi colocado imediatamente no gelo. Adicionou-se 1 µL de brometo
de etídeo diluído 1:10 (solução estoque 10mg/mL) e 2 µL de dye loading solution
(1/10 do volume). Após eletroforese a 80V durante 90 minutos as bandas de
RNAr 28 S, 18 S e 5 S foram visualizadas em transluminador UV e fotografadas
com câmera digital.
4.11 Reações de transcrição reversa seguida de PCR (RT- PCR)
Reações de transcrição reversa foram realizadas com 2 µg de RNA total, 1
µL de oligo (dT) e 1 µL de DNTP mix 10nM em um volume final de 20 µL,
segundo instruções do fabricante. As amostras permaneceram a 65°C durante 5
minutos e depois foram colocadas imediatamente no gelo e foi dado um spin para
que se evitasse a evaporação da amostra após a abertura do tubo. Em seguida,
acrescentou-se 4 µL de buffer 5x first-strand, 2 µL de dTT e 1 µL de RNAsin e
deixou-se por 2 minutos a 42°C. Adicionou-se 1 µL de enzima Superscript II
RNase H Reverse Transcriptase (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) e a
reação permaneceu a 42°C por 50 minutos, e depois a 70°C por 15 minutos.
As soluções de cDNAs foram assim diluídas: 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32,
1:64, 1:128 e 1:256 e misturadas ao mix e a primers específicos de PCR
compondo um volume final de 25 µl contendo: 200µM de dNTP, 1,5 mM de MgCl
2
,
50 mM KCl, 10 mMTris-HCl (pH 8,4 a 25°C), 10 µM de cada primer e 2 U de Taq
DNA polimerase.
As reações de PCR foram realizadas num aparelho Master Cycler
Gradiente (Eppendorf) e preparadas em um volume final de 25 µL de uma reação
típica de PCR. O protocolo de ciclagem térmica para amplificação foi: 1 x 94°C
durante 5 minutos; 30 x : desnaturação a 94°C, 30 segundos; anelamento
temperatura de acordo com o primer (Tabela I), 30 segundos; extensão a 72°C,
30 segundos. Após os ciclos as reações permaneceram a 72° por 10 minutos e
em seguida por mais 10 minutos a 4°C. A duração do programa foi de 3 horas e
Material e Métodos
41
15 minutos. Os primers utilizados foram definidos utilizando-se o programa
Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) observando as
respectivas localizações em exons diferentes.
As soluções de cDNAs provenientes do experimento de inibição do
transcrito do gene Aire foram diluídas (1:1 a 1:2048) e as reações de PCR foram
realizadas sob as mesmas condições do experimento descrito no item 5.5.1.
Tabela I. Primers utilizados nas reações de PCR, suas respectivas temperaturas de anelamento e
seqüências sense e antisense.
Gene Tm Primer Sense Primer Antisense
Aire 57°C 5’ CATCCTGGATTTCTGGAGGA 3’ 5’ GCTCTTTGAGGCCAGAGTTG 3’
Actb 60°C 5’ ATGGATGACGATATCGCT 3’ 5’ ATGAGGTAGTCTGTCAGG 3’
CD3e 57°C 5’ GATGCGGTGGAACACTTTCT 3’ 5’ ACTGTCCTCGACTTCCGAGA 3’
Col II 57°C 5’ GCCAAGACCTGAAACTCTGC 3’ 5’ GCCATAGCTGAAGTGGAAGC 3’
Gad67 61ºC 5’ TGCAACCTCCTCGAACGCGG 3’ 5’ CCAGGATCTGCTCCAGAGAC 3’
Ia-2 60°C 5’ AGACAGGGCTCCAGATTTTGC 3 5’ GCATGGTCATAGGGTAGGAAG 3’
Ins-1 60°C 5’ CAGCCCTTAGTGACCAGC 3’ 5’ TCTCCAGCTGGTAGAGGG 3’
Ins-2 61°C 5’ CAGCCCTAAGTGATCCGC 3’ 5’ TCTCCAGCTGGTAGAGGG 3’
Para a análise dos produtos gênicos amplificados, uma alíquota de 10 µL
da reação de PCR foi misturada com 2 µL de loading buffer e separados por
eletroforese em gel de agarose 1,5% contendo também brometo de etídio. A
corrida eletroforética procedeu-se a 80 V durante 90 minutos. Como marcador de
pesos moleculares utilizou-se o DNA do fago ∅X174 digerido com Hae III. As
bandas foram visualizadas por iluminação UV de um transiluminador e o gel
fotografado usando uma câmera digital.
Material e Métodos
42
4.12 Preparação das lâminas de cDNA microarrays
4.12.1 Biblioteca de cDNAs murinos
Nosso laboratório mantém uma biblioteca de cDNA murino (Biblioteca MTB
IMAGE), com cerca de 9.000 clones de timo provenientes do “IMAGE Consortium”
(http://image.llnl.gov/). São clones com seqüências “expressed sequence tags”
(EST), cujos tamanhos moleculares variam de 500 a 1.500 pb, e está totalmente
caracterizada, cujos clones estão seqüenciados e catalogados. Os clones estão
identificados com seus respectivos “accession numbers” (Acc) no GenBank,
Clone ID, o nome do gene e a posição de cada clone nas placas de 384 poços em
planilhas do programa Excel® Microsoft. Conservamos esta biblioteca em E. coli
em placas de microtitulação (384 poços) a -80°C (material gentilmente cedido
pela Dra. Catherine Nguyen, do INSERM-TAGC ERM 206, Marseille, França).
4.12.2 Amplificação de cDNA para a confecção de microarrays
Os clones de E. coli da biblioteca de cDNA IMAGE murina, repicados em
placas de 384 poços contendo meio de cultura 2X LB + ampicilina foram
incubados durante 16 horas, na proporção de 5 µL da cultura original diluídos em
45 µL de meio de cultura 2X LB (volume final em cada poço: 50 µL). A seguir uma
alíquota de 8µL da cultura foi transferida para outra placa de 384 poços, contendo
72 µL de água deionizada estéril, e esta placa incubada a 95
o
C por 10 minutos
para lise das células. Após centrifugação a 4000xg por 5 minutos foi retirado 10µL
do sobrenadante e adicionado a 40µL de um mix para PCR contendo tampão da
reação de PCR (10X), solução de dNTP (2mM), primers com seqüências
consenso aos três vetores presentes na biblioteca (10µM), primer LBP 1S
(5´TGTGGATTGTGAGCGGATAA3´) e primer 1AS
(5´GGGTTGAATTAGCGGAACG3´), Taq polimerase (5U/µL) e água deionizada
estéril q.s.p 50 µL. O programa para amplificação dos insertos teve como base o
descrito por Menossi et al., (2000): 5 minutos a 94°C, seguidos de 30 ciclos (94°C,
por 30 segundos; 55°C por 30 segundos, 72°C por 2 minutos), seguida por uma
extensão final de 7 minutos a 72°C e 5 minutos a 4 °C. Foi realizada em um
aparelho termociclador “Mastercycler Gradient” (Eppendorf), em placas de PCR
seladas com adesivo laminado para evitar evaporação.
Material e Métodos
43
Cerca de 2 amplificações PCR de cada clone foram realizadas, sempre
totalizando 50µL de volume.
A avaliação da qualidade dos produtos amplificados pela PCR foi feita em
gel de agarose 1%, em tampão TAE 1X (Tris-acetato 0,04 M, EDTA 0,001 M)
contendo brometo de etídio (10mg/mL) a 80V, durante 15 minutos. A visualização
das bandas foi realizada utilizando transluminador U.V. e fotografados em câmera
digital.
4.12.3 Purificação dos produtos de PCR
Para obtenção de uma eficiente fixação dos insertos de cDNA amplificados
tanto nas membranas de náilon ou nas lâminas de vidro é necessária a remoção
de nucleotídeos não incorporados e primers da reação de PCR (Hegde et al.,
2000). Utilizamos a purificação dos produtos de PCR por precipitação com etanol.
Os produtos de PCR (50 µL) foram transferidos para placas de cultivo com
fundo em “U” e foram adicionados 10 µL de acetato de sódio 3M pH 4,8 em cada
poço de uma placa de 96 poços. Em seguida, os produtos das duas PCR foram
agrupados, totalizando 100 µL, que foram transferidos para esta mesma placa.
Após a adição de 100 µL de etanol absoluto, as placas foram incubadas por 16
horas (overnight) a –20
o
C. Após este tempo, as placas foram centrifugadas a
4000xg por 60 minutos a 2-8°C. O sobrenadante foi desprezado e o pellet foi
ressuspenso em 100 µL de etanol 70%. As placas foram novamente centrifugadas
a 4000xg por 30 minutos a 2-8°C. O sobrenadante foi novamente desprezado e a
placa secou à temperatura ambiente overnight. Após a placa seca, o pellet foi
ressuspenso em 50 µL de água deionizada autoclavada.
Uma alíquota de 5 µL destes produtos foi aplicada em gel de agarose 1%
contendo brometo de etídeo, visualizado em transluminador U.V. e fotografado
em câmera digital para avaliar a qualidade dos produtos amplificados.
As placas foram secas em forno a 42°C e adicionou-se 27 µL de solução
de espotagem (DMSO 50% - dimetil sulfóxido) por poço da placa. Em seguida,
estas placas foram levadas ao freezer – 20°C e os produtos foram congelados e
descongelados por 3 vezes para uma melhor dissolução do DNA concentrado.
Posteriormente, os clones foram passados para as placas do robô, e estocadas a
4°C até a deposição dos produtos de PCR em lâminas de vidro.
Material e Métodos
44
4.12.4 Confecção das lâminas de microarrays
Amostras de produtos de PCR dos clones de cDNA já purificados foram
preparadas para deposição em lâminas de vidro adicionando-se mesmo volume
(1:1) de reagente D (GE Health Care) e transferidas para microplacas de 384
poços (Genetix). Utilizando um robô Array Spotter Generation III (Amersham
Biosciences), as amostras foram depositadas por um conjunto de canetas que
deposita um volume de 0,9 nL da amostra baseada na ação de capilaridade em
superfície de lâminas de vidro (PN UltraGaps 40015 Corning, USA) completando
2 x 4.500 pontos / lâmina (cada lâmina é então composta por 4.500 seqüências
de cDNA diferentes depositadas em duplicata perfazendo 9.000 pontos). Após a
deposição de cada conjunto de amostras, as canetas são lavadas
automaticamente em uma estação de lavagem que utiliza sucessivamente água
purificada (18 megohm/cm), etanol absoluto (Merck), solução 0,2 M de KOH e
água novamente. As canetas foram secas com nitrogênio 5.0 analítico antes das
próximas amostras serem carregadas. A câmara de deposição das amostras em
lâminas do robô Array Spotter Generation III possui temperatura e umidade
controladas. A umidade relativa de deposição das amostras deve estar em torno
de 55% e a temperatura em torno de 25°C. Além disso, a sala em que se
encontra o robô é mantida com ar limpo (sala limpa classe 10.000).
Após a deposição e secagem de todas as amostras nas lâminas, o DNA foi
fixado por cross-linking por meio de irradiação ultravioleta a 500 mJ de energia
(Hoefer UV Crosslinker).
4.12.5 Delineamento das hibridações em microarrays
Uma escolha chave em um projeto que envolve a tecnologia de microarray
é utilizar comparações que podem ser diretas ou indiretas, isto é, estabelecer
comparações dentro ou entre as lâminas. Existem três principais tipos de
delineamento: 1) inversão de corantes (dye-swap), 2) experimentos em volta
(looping) e 3) RNA de referência (Figura 7). Mas, não existe um delineamento
experimental ideal para todas as situações, ou seja, diferentes desenhos
experimentais são necessários para contextos experimentais diferentes. Qualquer
que seja o tipo de desenho utilizado será requerido o mesmo número de
hibridações, e a decisão sobre o tipo de delineamento deve considerar a pergunta
do trabalho.
Material e Métodos
45
Figura 7. Esquema dos principais tipos de delineamento experimental para microarrays. A, B e C-
amostras controle; A’,B’ e C’- amostras teste; R – pool de RNA de referência.
O pool de RNA é a amostra de referência mais utilizada atualmente. Nos
experimentos com microarrays do presente trabalho adotou-se a estratégia do
RNA de referência ao invés do dye-swap, pois para realizar os experimentos com
troca de corantes seria necessário marcar a mesma amostra de RNA com os dois
corantes (Cy3 e Cy5). Porém, tal abordagem passa a ser inviável, pois a
quantidade de RNA seria insuficiente para a repetição das hibridações.
O pool de RNA de referência neste caso foi uma mistura “equimolar” de
RNA total de timos de camundongos C57BL/6 adultos cujas amostras foram
extraídas exatamente nas mesmas condições das experimentais.
O uso de RNA de referência passou a ser uma abordagem bastante
adequada eliminando assim a necessidade de repetir as marcações de uma
mesma amostra com dois corantes (dye-swap) e, conseqüentemente evitando as
diferenças de incorporação. As amostras de timo de NOD foram marcadas com o
corante Cy3 e um RNA de referência (timo de C57BL/6) com Cy5.
Material e Métodos
46
As hibridações com cDNAs oriundos de RNA referência são importantes
para os cálculos de normalização, pois reflete a estimativa da quantidade de
material depositado em cada ponto do microarray (alvo).
4.12.6 Marcação de sondas de cDNA com o fluorocromo Cy3/Cy5
Amostras de RNA (cDNA) foram marcadas utilizando o Kit Cyscribe Post-
Labelling (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) segundo as instruções do
fabricante. As reações envolvem a preparação do cDNA em dois passos. No
primeiro passo ocorre a síntese da primeira fita de cDNA com a incorporação de
nucleotídeos amino-alil dUTP modificados, com posterior degradação da cadeia
de RNAm e purificação do cDNA para remoção de nucleotídeos livres e
oligômeros (Figura 8). No segundo passo, o cDNA é marcado com formas
reativas de ésteres NHS Cy3 que se ligam aos nucleotídeos modificados e após
um processo de purificação do cDNA marcado com CyDye com colunas de
purificação CyScribe GFX para eliminação de Cy3 Dye não incorporado as
sondas estão prontas para hibridação (Figura 9).
Material e Métodos
47
Figura 8. Preparação da fita simples de cDNA incorporada com amino alil usando os reagentes do
kit “CyScribe Post Labelling” (GE Healthcare) (Extraído e modificado do manual de instruções do
kit).
RNA total
Anelamento dos RNAs mensageiros
Oligo(dT) primer
random nonamers
Nucleotídeos,AA-dUTP,
Tampão da reação, enzima
(transcriptase reversa)
Anelamento das fitas simples dos
cDNAs incorporadas com amino alil
(AA-dUTP) com RNA
Neutralização (2 M HEPES)
Fita simples dos cDNAs
incorporadas com amino alil livre
de nucleotídeos e oligômeros
Purificação com
colunas CyScribe GFX
Anelamento
Síntese dos
cDNAs
Degradação dos RNAs
mensageiros
Purificação dos cDNAs
Fita simples de cDNAs marcadas
e incorporadas com amino alil
Tratamento alcalino (2,5 M NaOH)
Material e Métodos
48
Figura 9. Preparação do cDNA marcado com CyDye utilizando os reagentes do kit “CyScribe Post
Labelling” (GE Healthcare) (Extraído e modificado do manual de instruções do kit).
cDNAs incorporados com CyDye e
CyDye não incorporado
Colunas de purificação
CyScribe GFX
Fita simples de cDNAs marcadas e
incorporada com amino alil
Acoplamento dos cDNAs
com CyDye-NHS ester
Purificação dos cDNAs
marcados com CyDye
CyDye-NHS ester
Hidroxilamida
cDNAs marcados com CyDye
purificado
Hibridação com os microarrays
Material e Métodos
49
Preparação da primeira fita de cDNA por incorporação de AAdUTP
Em um tubo Eppendorf de 1,5 µL imerso em gelo picado foram adicionados
10 µg de RNA total, 1 µL de primers randômicos, 3 µL de oligo (dT) e 0,5 µL de
controle denominado “spike mix” para o Universal ScoreCard em um volume total
de 11 µL (Proporção de 2 µL de spike mix para cada 1 µg de RNA marcado). A
reação foi cuidadosamente montada e incubada a 70°C por 5 minutos, sendo
posteriormente resfriada a 4°C durante 5 minutos. A extensão da cadeia de cDNA
foi realizada utilizando 4 µL de tampão 5X CyScript , 2 µL de DDT 0,1 M, 1µL de
nucleotídeo “mix”, 1µL de AA-dUTP (a quantidade de um tubo contendo AA-dUTP
liofilizado foi ressuspenso em 30 µL de água livre de nucleases e mantido a -20°C
por no máximo 30 dias), 1 µL de transcriptase reversa CyScript, em um volume
final de reação de 20 µL. A reação foi incubada a 42°C por 90 minutos.
Procedemos à degradação do RNAm adicionando 2 µL de NaOH 2.5 M com
incubação a 37°C durante 15 minutos, posteriormente foi adicionado 20 µL de
HEPES 2M.
a) Purificação do cDNA com colunas de purificação CyScribe GFX
Para cada amostra de cDNA com volume entre 20 a 100 µL foram
adicionados 500µL de solução “capture buffer” em uma coluna de purificação GFX
colocada dentro de um tubo coletor. O produto de cDNA marcado com aminoalil
não purificado foi adicionado à coluna e misturado 5 vezes. A centrifugação foi
feita a 13800xg por 30 segundos. A coluna foi retirada e o líquido contido no tubo
coletor foi descartado. A coluna foi novamente colocada no tubo coletor e foram
adicionados 600µL de etanol 80%. A centrifugação foi feita a 13800xg por 30
segundos. A coluna foi retirada e o líquido contido no tubo coletor foi descartado.
Esta lavagem foi repetida mais duas vezes. Uma nova centrifugação foi feita a
13800xg por 10 segundos para retirada do excesso de etanol 80% da amostra. O
tubo coletor foi descartado e a coluna contendo o cDNA foi colocada em um tubo
de 1,5 µL. Foi adicionada a coluna 60 µL de bicarbonato de sódio 0,1 M pH 9,0 e
incubado durante 5 minutos. O material foi centrifugado a 13800xg por 1 minuto.
Material e Métodos
50
b)Incorporação de Cy3 e Cy5
A amostra de cDNA marcada com aminoalil purificado foi adicionada a um
tubo com a alíquota de CyDye NHS éster e ressuspendida várias vezes. O
material foi centrifugado a 13800xg por 1 minuto e incubado, no escuro, durante 1
hora. Posteriormente, foi adicionado 15 µL de hidroxilamina 4M seguida de
incubação no escuro, durante 15 minutos a temperatura ambiente.
c) Purificação do cDNA marcado com CyDye com colunas de purificação
CyScribe GFX
Para cada amostra de cDNA com volume entre 20 a 100 µL foram
adicionados 500 µL de solução “capture buffer” em uma coluna de purificação
GFX colocada dentro de um tubo coletor. O produto de cDNA marcado com
CyDye não purificado foi adicionado à coluna e misturado 5 vezes. A
centrifugação foi feita a 13800xg por 30 segundos. A coluna foi retirada e o líquido
contido no tubo coletor foi descartado. A coluna foi novamente colocada no tubo
coletor e foram adicionados 600 µL da solução “wash buffer”. A centrifugação foi
feita a 13800xg por 30 segundos. A coluna foi retirada e o líquido contido no tubo
coletor foi descartado. Esta lavagem foi repetida mais duas vezes. Uma nova
centrifugação foi feita a 13800xg por 10 segundos para retirada do excesso da
solução “wash buffer” da amostra. O tubo coletor foi descartado e a coluna
contendo o cDNA foi colocada em um tubo de 1,5 µL. Foi adicionado a coluna 60
µL da solução “elution buffer” pré-aquecido à 65°C e incubado durante 5 minutos.
O material foi centrifugado a 13800xg por 1 minuto.
d) Quantificação do CyDye incorporado no cDNA
Após a purificação foi feita a monitoração de incorporação dos
fluorocromos por meio de leitura em espectofotômetro (Ultrospec 2100, GE
Healthcare Bio-Sciences) em comprimento de onda a 550 nm para Cy3 e 650 nm
para o Cy5 usando cubetas de quartzo e amostras diluídas 100X.
Para hibridações com os dois fluorocromos foram adicionados os cDNA
marcado com Cy3 e Cy5 em um tubo de microcentrífuga protegido da luz. A
solução de cDNA foi evaporada em um aparelho “Speed Vacum”. A seguir o
cDNA foi dissolvido em 6 µL de água livre de nuclease e denaturado a 95°C por 2
Material e Métodos
51
minutos. A solução foi imediatamente resfriada no gelo por 30 segundos. A essa
reação adicionou-se 1,5 µL de A
80
(1mg/mL) e incubou-se a 75 °C por 45 minutos,
estando assim pronta para o processo de hibridação.
4.12.7 Hibridação das sondas de cDNA com os microarrays
As lâminas de microarrays foram hibridadas utilizando um processador
automático de lâminas, Lucidea Automated Slide Processor – ASP (Amersham
Biosciences) que permite a hibridação e lavagens de lâminas em câmaras
independentemente controladas (12 lâminas por vez). Este aparelho inclui um
software que automatiza a injeção de amostras líquidas e soluções de lavagens
ou ar dentro das câmaras e possui parâmetros de controle de temperatura e
velocidade de injeção e circulação destas soluções no interior das mesmas.
As sondas de cDNA marcadas com Cy3 e Cy5 foram hibridadas por 15
horas a 42°C. As condições de lavagens foram: 1XSSC/0,2%SDS (2 x 20
segundos à temperatura ambiente); 0,1X SSC/0,2% SDS (2 x 20 segundos à
temperatura ambiente); 0,1X SSC (2 x 20 segundos à temperatura ambiente). A
última lavagem das lâminas foi feita com isopropanol, sendo em seguida
aquecidas a 42°C, e novamente lavadas com isopropanol. Após as lavagens as
lâminas foram aquecidas a 60°C para secagem e posteriormente foram colocadas
no Array Scanner (GE Helathcare Bio-Sciences) para obtenção das imagens.
4.13 Aquisição de imagens de microarrays
As lâminas foram colocadas no aparelho Array Scanner (GE Helathcare
Bio-Sciences) e as imagens obtidas tiveram como parâmetros de leitura para as
duas cores, o comprimento de onda de excitação do laser de 532 nm para o verde
e 633 nm para o vermelho para cada spot. A leitura da lâmina gera dois arquivos
com imagens separadas para os dois canais de cores (Cy3 e Cy5) e uma terceira
imagem sobrepondo Cy3 e Cy5 visualizadas usando o software ImageQuant (GE
Healthcare Bio-Sciences) (Figura 38 – Anexo I).
Material e Métodos
52
4.14 Quantificação e normalização dos dados de microarrays
As intensidades das imagens de hibridação dos arrays foram
transformadas em valores numéricos por meio do programa Spotfinder
(http://www.tigr.org/software) que também analisa a qualidade de pontos e calcula
o background. O programa se baseia na sobreposição de grades que delimitam
os spots gerados pela aquisição das imagens das lâminas, tornando possível a
quantificação do sinal emitido. Permite ainda a geração de arquivos de extensão
.TAV que serão utilizados durante a normalização dos dados. Dois parâmetros
foram considerados para o controle de qualidade neste programa: os pontos de
boa qualidade apresentam valores superiores e/ou igual a 1 valor background
mais 1 valor desvio padrão.
Em seguida, os dados foram normalizados. A normalização dos dados
retira os erros experimentais sistemáticos por balancear a intensidade dos dois
fluorocromos. Esses erros podem ocorrer devido à diferença de incorporação dos
corantes, problemas durante a deposição dos clones na lâmina ou ainda durante
a aquisição das imagens nos dois canais. Para esses ajustes foi utilizada a
plataforma R (www.r-project.org) juntamente com o pacote AROMA
(http://www.maths.lth.se/help/R/aroma/), que retém as funções necessárias à
normalização dos dados de microarrays. Portanto, após a retirada do background
pelo programa Spotfinder, os dados foram importados para o ambiente R e
transformados para o formato de dados “M versus A”, onde M é igual a log2(R/G)
e A é igual a 1/2·log2(R·G). Em seguida, os métodos de normalização “print-tip
Lowess” e “absolute median deviation (MAD) re-scaling” foram aplicados
respectivamente. O primeiro método aplica uma regressão linear nos dados, para
corrigir erros espaciais que possam ter sido gerados durante os experimentos. O
segundo re-escalona as razões de log para cada microarray, de maneira que
cada slide adquire a mesma distribuição dos dados, de acordo com a MAD, capaz
de estimar com robustez a variância de uma amostra.
Utilizando o pacote LIMMA (Linear Models for Microarray Data) (Smyth et
al., 2005) foi aplicado o método Bayesiano empírico para análise estatística da
expressão diferencial.
A plataforma R irá gerar arquivos de extensão .MEV que serão utilizados
no programa TIGR MEV (The Institute for Genomic Research MultiExperiment
Viewer - http://www.tm4.org/mev.html) que inclui o programa SAM (Significance
Material e Métodos
53
Analysis of Microarrays) (Tusher et al., 2001) utilizado para a detecção dos genes
diferencialmente expressos (Smyth, 2004). O programa TIGR MEV gera um heat
map para os valores. O heat map é composto por um código de cores a fim de
facilitar a associação visual dos níveis de expressão gênica.
O programa SAM representa uma evolução dos softwares de análise
estatística para a tecnologia de microarrays e encontra-se disponível no endereço
(http://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM). A análise baseia-se em uma série de
testes-t específicos para cada gene, que são adaptados para a detecção da
expressão gênica diferencial em larga escala. Na figura 10, observamos o pipeline
desenvolvido para análise dos dados.
Material e Métodos
54
Figura 10. Pipeline utilizado na análise de dados de microarrays em lâminas de vidro.
Spotfinder
Spotfinder
Quantificação das imagens de microarrays
Confecção de grades
Filtragem do backgroun d
(1x o desvio-padrão)
Armazenamento dos dados em tabelas
de texto tabuladas (.tav)
Filtragem de valores
negativos e nulos
Plataforma R
Plataforma R
Normalização dos dados
Normalização intra-slides
(Pr in ttip Lo wess)
Normalização inter-slides
(valor de MAD)
Armazenamento dos dados em
arquivos .mev
MultiExperimentViewer
MultiExperimentViewer
Análise estatística dos dados
(SAM - Significant Analysis of Microarrays)
Agrupamento hierárquico
Cons trução do heat map
e dendograma
Arquivos tabulados (.txt)
Análise dos dados gerados
PGE
Spotfinder
Spotfinder
Quantificação das imagens de microarrays
Confecção de grades
Filtragem do backgroun d
(1x o desvio-padrão)
Armazenamento dos dados em tabelas
de texto tabuladas (.tav)
Filtragem de valores
negativos e nulos
Spotfinder
Spotfinder
Quantificação das imagens de microarrays
Confecção de grades
Filtragem do backgroun d
(1x o desvio-padrão)
Armazenamento dos dados em tabelas
de texto tabuladas (.tav)
Filtragem de valores
negativos e nulos
Plataforma R
Plataforma R
Normalização dos dados
Normalização intra-slides
(Pr in ttip Lo wess)
Normalização inter-slides
(valor de MAD)
Armazenamento dos dados em
arquivos .mev
Plataforma R
Plataforma R
Normalização dos dados
Normalização intra-slides
(Pr in ttip Lo wess)
Normalização inter-slides
(valor de MAD)
Armazenamento dos dados em
arquivos .mev
Normalização dos dados
Normalização intra-slides
(Pr in ttip Lo wess)
Normalização inter-slides
(valor de MAD)
Armazenamento dos dados em
arquivos .mev
MultiExperimentViewer
MultiExperimentViewer
Análise estatística dos dados
(SAM - Significant Analysis of Microarrays)
Agrupamento hierárquico
Cons trução do heat map
e dendograma
Arquivos tabulados (.txt)
MultiExperimentViewer
MultiExperimentViewer
Análise estatística dos dados
(SAM - Significant Analysis of Microarrays)
Agrupamento hierárquico
Cons trução do heat map
e dendograma
Arquivos tabulados (.txt)
Análise dos dados gerados
PGE
Material e Métodos
55
A partir da observação de que as flutuações casuais são específicas para
cada gene, o teste SAM é baseado na razão entre a diferença das médias das
situações, como por exemplo, pool de órgãos (Xc) e o timo (Xp), e o desvio
padrão de cada gene, calculados a partir de repetição experimental. A diferença
relativa d(i) na expressão gênica é então definida pela equação 1:
0
)(
)()(
)(
SiS
iXiX
id
cp
+
−
=
Onde Xp(i) e Xc(i) são definidos como níveis médios da expressão do gene
nos estados p (timo) e c (pool de órgãos), respectivamente. A dispersão gene-
específica S(i) é o desvio padrão de medidas repetidas de expressão, e a
constante positiva So no denominador da equação acima, servem para
certificação de que a variância de d(i) é independente da expressão gênica. Para
a determinação de genes com mudanças significativas na expressão, utilizou-se
um gráfico de dispersão d(i), em relação à diferença relativa esperada d
E.
(i). Para
uma grande maioria de genes d(i) ≅ d
E.
(i), mas alguns genes são representados
por pontos distantes da linha d(i) ≅ d
E.
(i). As alterações das expressões dos genes
que se encontram a uma distância maior do que o limiar (∆) é então considerado
significante (Figura 11).
O limiar (∆) determina dois cortes horizontais, ou seja, o menor valor de d(i)
indica que o gene seja considerado significantemente induzido (hiperexpresso), e
o valor menos negativo de d(i) indica que o gene está significantemente reprimido
(hipoexpresso).
A porcentagem de genes identificados por mudanças aleatórias é chamada
de Freqüência de Descobertas Falsas (FDR), um método inicialmente idealizado
por Benjamini & Hochberg (1995) e definido como a proporção esperada de
rejeições falsas. O cálculo de FDR e o número de genes com mudanças
d(i) = diferença relativa
Xp(i) = níveis médios da expressão dos genes no
timo
Xc(i) = níveis médios da expressão dos genes no
pool de órgãos
S(i) = desvio padrão de medidas repetidas de
expressão
So = constante positiva
EQUAÇÃO 1
Material e Métodos
56
significativas estão intimamente relacionados com o limiar ∆. À medida que o
valor de ∆ diminui, o número de genes significantemente alterados aumenta à
custa de um aumento de um FDR. Essa determinação do nível de significância
pelo limiar providencia cortes assimétricos para genes induzidos e genes
reprimidos. Essa assimetria é desejável, posto que os genes induzidos e genes
reprimidos podem se comportar de maneira diferente em alguns experimentos. Ao
utilizar o SAM, o usuário pode escolher o limiar ∆ mais conveniente com base no
nível de significância estimado pelo FDR e no número de genes com os quais se
pretende trabalhar.
O programa estabelece, de forma automática, uma ligação entre o número
de acesso das seqüências utilizadas com as páginas de informações sobre o
clone em questão, situados no banco de dados S.O.U.R.C.E. (Stanford Online
Universal Resource for Clones and ESTs) que compila informações de vários
bancos de dados públicos (UniGene, dbEST, Swiss-Prot, GeneMap99, RHdb,
GeneCards e LocusLink) (http://source.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceSearch).
Figura 11. Ilustração da análise da significância estatística dos genes modulados (induzidos e
reprimidos) usando o programa SAM (Significance Analysis of Microarrays). Comparação entre a
distância relativa observada d(i) e esperada dE(i).
Material e Métodos
57
O programa SAM permite ainda o agrupamento hierárquico, porém, o mais
importante na elaboração deste agrupamento é a decisão sobre qual medida de
similaridade será adotada, a necessidade de se transformar a escala dos valores
de expressão (normalmente transformada em escala logarítmica) e a
dependência dos genes entre si. O agrupamento hierárquico nos permite a
definição de grupos de genes com o mesmo padrão de expressão, seja ele de
indução ou de repressão.
Todas as informações citadas acima foram retiradas do trabalho de Tusher
et al. (2001), do manual do software SAM e de relatórios técnicos publicados na
página de Robert Tibshirani (http://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM).
4.15 Nomenclatura dos genes
Neste trabalho, optou-se por seguir a nomenclatura usual para genes de
camundongos, ou seja, o símbolo do gene em inglês com a primeira letra
maiúscula e as seguintes minúsculas (exemplo: Aire para Autoimmune regulator).
Os nomes dos genes estão em inglês, pois toda a literatura e os bancos de dados
internacionais como Source, GenBank etc. estão neste idioma. Além disso, todos
os arquivos da biblioteca de cDNA estão em inglês.
4.16 Análise da expressão gênica promíscua no timo
Os agrupamentos gênicos gerados durante o processamento dos dados no
programa TIGR MEV foram analisados em termos de Expressão Gênica
Promíscua (PGE) para avaliar a representatividade dos órgãos e sistemas. A
análise foi feita utilizando o banco de dados GNF SymAtlas
(http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/) que permite a visualização da expressividade
de cada gene em um gráfico de barras paralelas que apresenta 60 tecidos, que
representam por sua vez 17 sistemas do organismo. Visando a homogeneização
dos dados optou-se por considerar como tecidos representados por um
determinado gene, apenas aqueles tecidos que obtiveram expressividade superior
à linha da mediana que se encontra presente em cada gráfico. Após a
organização dos dados em sistemas, gerou-se uma planilha contendo o número
de genes que caracterizavam cada sistema em particular e, posteriormente,
gerou-se um gráfico que passou a demonstrar a representatividade de cada
sistema nos agrupamentos definidos. Procurou-se ainda destacar a
Material e Métodos
58
representatividade dos genes no pâncreas em relação às demais glândulas e
ressaltar os genes que foram mais expressos nesse órgão seja na condição de
induzido ou reprimido no agrupamento em questão.
4.17 Análise das regiões cromossômicas de susceptibilidade ao DM-1
Após serem analisados em termos de expressão gênica promíscua (PGE)
utilizando o banco de dados GNF SymAtlas (http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/), os
genes encontrados em todos os agrupamentos foram submetidos a uma análise
em relação à localização cromossômica. O intuito foi procurar estabelecer uma
relação direta entre a localização destes e de genes estabelecidos como de
susceptibilidade ao diabetes tipo 1(DM-1).
Inicialmente foi feito uma busca no banco de dados do MGI Mouse
Genome Informatics (http://www.informatics.jax.org) para a descoberta dos genes
idds (diabetes dependente de insulina) relacionados ao diabetes tipo 1 já
descritos e mapeados. Considerou-se apenas aqueles cuja nomenclatura
obedecia ao seguinte critério: insulin dependent diabetes susceptibility (idds).
Cada gene relacionado oferece um ideograma (Figura 12) capaz de informar a
região cromossômica em que ele se encontra.
Figura 12. Ideograma representativo da idd10 e os genes que se encontram nesta região.
(cromossomo 3 na região E3)(Extraído e modificado do NCBI Map Viewer -
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?taxid=10090&chr=3&MAPS=assembly,genes,mgi-
r&cmd=focus&fill=40&query=uid(9560452)&QSTR=110712%5Bgene%5Fid%5D).
Material e Métodos
59
Repertoriando todas as regiões idds, fizemos a localização dos genes
promíscuos de TRAs.
O banco de dados MGI fornece ainda uma lista de genes relacionados à
patogenia do DM-1 tanto em camundongos quanto em humanos. Da mesma
forma, procurou-se saber se os genes promíscuos de TRAs estão inclusos neste
conjunto.
Delineamento Experimental
Delineamento Experimental
61
5. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
NOD Pré-Autoimunes NOD Autoimunes
Glicemia
Timo Timo
ATOC
RNAi Aire
Estroma
RNA total
PCR TRAs PCR Aire
Sondas de cDNA Cy3
Hibridações com microarrays
Análises dos dados (SAM, SymAtlas,
MGI)
ATOC
Estroma
Resultados
Resultados
63
6. RESULTADOS
6.1 Emergência de diabetes mellitus (DM-1) em camundongos NOD
Durante o andamento deste trabalho adequamos a manutenção dos
camundongos NOD em condições SPF (single patogen free) em nosso próprio
laboratório, o que possibilitou o desenvolvimento do diabetes mellitus do tipo 1
(DM-1) entre os camundongos provenientes do biotério da Universidade Estadual
de Campinas (CEMIB UNICAMP).
Foram adquiridos camundongos fêmeas NOD com idade média de 2
meses. A glicemia destes animais foi analisada periodicamente o que possibilitou
separá-los em 2 grupos distintos, ou seja, o dos pré-autoimunes (com idade ≤ 4,5
meses) e os autoimunes com idade > 4,5 meses de idade. A figura 13 mostra a
freqüência do surgimento de animais autoimunes (diabéticos) nos dois grupos
com idades distintas.
Para o desenvolvimento deste trabalho, foram utilizados animais
autoimunes com idade máxima de 5,5 meses, quando então eram sacrificados
para remoção do timo. A freqüência de surgimento de DM-1 observada foi de
aproximadamente 30%. Possivelmente, se esses animais fossem observados por
mais tempo, a freqüência de DM-1 poderia ser ainda maior. Mas como ocorre
involução tímica com a idade dos camundongos havendo substituição do estroma
por tecido adiposo (Montecino-Rodriquez et al., 2005), não pudemos estudar
animais com mais de 5,5 meses de idade.
Resultados
64
Figura 13. Freqüência de camundongos NOD (fêmeas) pré-autoimunes e autoimunes segundo a
idade em meses.
0
5
10
15
20
25
30
35
≤ 4,5 > 4,5
Idade dos animais em meses
Frequência de animais diabéticos (%)
Resultados
65
6.2 Avaliação da integridade das amostras de RNA
As amostras de RNA total obtidas a partir de estroma tímico, recém
removidos e em cultura ATOC, depletado de timócitos dos camundongos NOD e
de camundongos C57BL/6 para o pool de referência, foram analisadas em
relação a sua integridade por eletroforese em gel de agarose 1,5% denaturante. É
possível observar pela figura 14 a presença de bandas de RNAs ribossômicos 28
S e 18 S e tRNA + RNA 5S, comprovando assim a boa qualidade das amostras
em termos de integridade.
Figura 14. Integridade das amostras de RNA total avaliada por eletroforese em gel de agarose
1,5% denaturante. A) Estroma de timos recém removidos; B) Estroma de timos em cultura ATOC;
C) Estroma tímico em cultura ATOC transfectados com RNA interferente anti-Aire; D) Estroma de
timos de C57BL/6 para o pool de referência.
A B
28 S
18 S
5S +
tRNA
28 S
18 S
28 S
18 S
5S +
tRNA
28 S
18 S
C
28 S
18 S
5S +
tRNA
28 S
18 S
28 S
18 S
5S +
tRNA
28 S
18 S
D
Resultados
66
6.3 Avaliação da expressão do gene Aire e de TRAs no estroma tímico
Após a obtenção de cDNA provenientes das amostras do estroma tímico
dos camundongos NOD pré-autoimunes e autoimunes, de timo recém removidos
e em cultura ATOC, foram realizados experimentos de PCR para avaliação do
gene Aire, cujo RNAm foi alvo do tratamento utilizando-se a técnica de RNA
interferente; o gene Cd3e (antígeno Cd3 cadeia epsilon) foi usado para a
verificação da contaminação de timócitos nas amostras; genes descritos na
literatura considerados TRAs como: Gad67 (Ácido glutâmico descarboxilase 1),
Ia-2 (proteína tirosina fosfatase associada ao insulinoma), Ins-1 (Insulina I) e Ins-2
(Insulina II) também foram avaliados, além do pró-colágeno II (Col II) e do gene
Actb (Beta - actina) usado como controle (Figuras 15 e 16).
Resultados
67
Figura 15. Avaliação da expressão dos genes Actb, Cd3e, Aire e Col II. A) Estroma de timo recém
removido de NOD pré-autoimune; B) Estroma de timo recém removido de NOD autoimune; C)
Estroma de timo em ATOC de NOD pré-autoimune; D) Estroma de timo em ATOC de NOD
autoimune; E) Timócitos (Resultado típico); C+ = Controle Positivo; C - = Controle Negativo.
Actb
Cd3e
Col II
Aire
A
B
C
D
C+ C - 1 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
A
B
C
D
E
C+ C - 1 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
A
B
C
D
C+ C - 1 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
A
B
C
D
C+ C - 1 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
Actb
Cd3e
Col II
Aire
A
B
C
D
C+ C - 1 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
A
B
C
D
E
C+ C - 1 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
A
B
C
D
C+ C - 1 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
A
B
C
D
C+ C - 1 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
Resultados
68
Figura 16. Avaliação da expressão dos genes Gad67, Ia-2, Ins-1 e Ins-2. A) Estroma de timo
recém removido de NOD pré-autoimune; B) Estroma de timo recém removido de NOD autoimune;
C) Estroma de em ATOC de NOD pré-autoimune; D) Estroma de timo em ATOC de NOD
autoimune; C+ = Controle Positivo; C - = Controle Negativo.
Gad67
Ia-2
Ins-2
Ins-1
A
B
C
D
C+ C - 1 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
A
B
C
D
C+ C - 1 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
A
B
C
D
C+ C - 1 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
A
B
C
D
C+ C - 1 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
Gad67
Ia-2
Ins-2
Ins-1
A
B
C
D
C+ C - 1 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
A
B
C
D
C+ C - 1 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
A
B
C
D
C+ C - 1 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
A
B
C
D
C+ C - 1 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
Resultados
69
6.4 Avaliação de apoptose e necrose em ATOC
Para o ensaio de apoptose e necrose, com o objetivo de analisar a
viabilidade celular em ATOC nos animais NOD pré-autoimunes foram realizados
ensaios de anexina V e PI. Os resultados foram obtidos por citometria de fluxo,
sendo utilizado o timo nos tempos: 0 e 24 horas (Figura 17).
Figura 17. Autofluorescência das células de timo total de camundongos NOD e marcação de
Anexina V para ensaio de apoptose, e PI para necrose, nos tempos 0 e 24 horas.
Timo 1 Timo 2
0 horas
24 horas
PI
Annexin V
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
4,90%
8,92%
78,92%
7,26%
PI
Annexin V
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
4,67%
11,39%
77,63%
6,31%
PI
Annexin V
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
0,78%
51,83%
12,06%
35,33%
PI
Annexin V
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
0,83%
46,92%
17,04%
35,22%
Timo 1 Timo 2
0 horas
24 horas
PI
Annexin V
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
4,90%
8,92%
78,92%
7,26%
PI
Annexin V
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
4,67%
11,39%
77,63%
6,31%
PI
Annexin V
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
0,78%
51,83%
12,06%
35,33%
PI
Annexin V
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
0,83%
46,92%
17,04%
35,22%
Resultados
70
6.5 Determinação da seqüência e concentração de RNAi anti-Aire para
ensaio em ATOC
Para realização dos ensaios de RNAi anti-Aire e determinação da
seqüência que melhor promoveu a inibição do transcrito deste gene, utilizou-se
uma linhagem de células mTECs, de camundongos C57BL/6, que possibilitou a
escolha da seqüência de forma rápida e eficiente. O resultado da inibição foi
mensurado por meio de RT-PCR semiquantitativa nas concentrações de 2.5, 5 e
10nM, recomendada pelo kit para ensaio com células em cultura (Figura 18),
sendo possível determinar a seqüência 1 (Figura 19) como aquela que obteve o
maior grau de inibição do transcrito do gene Aire e, portanto, escolhida para os
passos posteriores.
Resultados
71
Figura 18. Eletroforese em gel de agarose de produtos de RT-PCR semiquantitativa para a
detecção do transcrito do gene Aire. PCRs realizadas com as seguintes amostras: mTEC na
ausência de RNA interferente e mTEC em presença das três diferentes seqüências de RNAi anti-
Aire, cada uma em três concentrações (2.5, 5.0 e 10.0 nM). * RNAi e concentração escolhidos
para a continuação dos experimentos. B = Controle negativo
Figura 19. Seqüência 1 do RNAi anti-Aire, utilizada nos experimentos de inibição do transcrito do
gene Aire em timos de camundongos NOD pré-autoimunes em cultura ATOC
.
Resultados
72
Uma vez definida a melhor seqüência, determinou-se a concentração ideal
de RNAi anti-Aire para a inibição do transcrito deste gene no timo em cultura
ATOC. As concentrações utilizadas na cultura foram maiores por se tratar de uma
transfecção em órgão e não em células em cultura.
Utilizando a microscopia de fluorescência confocal determinou-se a
concentração que apresentou um melhor resultado na transfecção sendo
escolhida aquela que apresentou maior fluorescência e consequentemente uma
melhor transfecção. O melhor resultado foi a de concentração igual a 50nM
(Figura 20).
Resultados
73
Figura 20. Avaliação da transfecção dos timos em cultura com RNAi-Cy3. A) 10nM; B) 50nM; C)
100nM. (microscopia de fluorescência confocal aumento 40X).
Resultados
74
6.6 Análise da inibição do transcrito do gene Aire utilizando RNA
interferente
Após determinação da seqüência e da concentração adequadas, a inibição
do transcrito do gene Aire em cultura de timo adulto (ATOC) foi realizada e as
soluções de cDNAs das amostras: controle, controle negativo, controle positivo e
do RNAi anti-Aire, foram submetidas a reações de PCR em diluições de 1:1 a
1: 2048. A partir de uma determinada diluição a amostra tratada com um RNA
interferente para o gene Aire não apresenta mais expressão detectável para o
gene em questão (Figura 21). Partindo-se desse dado, considerou-se a inibição
do transcrito do gene Aire e deu-se seqüência à análise do fenômeno de PGE
utilizando-se na tecnologia de microarrays.
Figura 21. Avaliação da expressão do gene Aire em amostras de estroma tímico de camundongos
NOD pré-autoimunes em cultura ATOC de 24horas com RNAi na concentração de 50nM; Controle
= (meio MEM na ausência de RNAi); C- = controle negativo (MEM + RNAi irrelevante); C + =
controle positivo (MEM + RNAi anti-Hprt).
Resultados
75
6.7 Análise dos genes diferencialmente expressos por agrupamento
hierárquico e da significância estatística do padrão de expressão
Os 4500 valores numéricos quantitativos já normalizados, representando o
conjunto de genes analisados de cada uma das variáveis foram submetidos ao
programa SAM multiclass. Esse tipo de análise apontou seqüências
diferencialmente expressas segundo um valor de exclusão. A partir do qual os
genes são considerados induzidos. Além disso, o programa SAM fornece um FDR
(Freqüência de Descobertas Falsas) que nos orienta na escolha de seqüências
com valores de expressão com alta significância estatística.
A comparação entre o estroma de timos recém removidos de
camundongos NOD de animais pré-autoimunes com animais autoimunes,
utilizando-se um FDR ≤ 20%, proporcionou 109 genes diferencialmente expressos
(Tabela II – Anexo II) sendo que destes, 38 genes encontram-se induzidos (roxo)
e 71 genes reprimidos (amarelo) nos animais pré-autoimunes (Figura 22).
Por outro lado, a comparação entre o estroma de timos em cultura ATOC
de camundongos NOD de animais pré-autoimunes com animais autoimunes,
utilizando-se um FDR ≤ 20%, proporcionou 89 genes diferencialmente expressos
(Tabela III – Anexo II) sendo que destes, 8 genes encontram-se induzidos
(laranja) e 81 genes reprimidos (azul) nos animais pré-autoimunes (Figura 23).
Para um melhor entendimento do que ocorre com a expressão gênica do
estroma tímico de camundongos NOD pré-autoimunes, em presença de um RNA
interferente para o transcrito do gene Aire em cultura ATOC, foram estabelecidos
três estudos comparativos. No primeiro deles, comparou-se o estroma das
seguintes amostras: Controle, RNAi Aire e RNAi controle com um FDR ≤ 20% que
proporcionou 360 genes diferencialmente expressos. Cinco agrupamentos
evidentes puderam ser destacados: 1) genes reprimidos para o RNAi controle; 2)
genes induzidos para o mesmo RNAi; 3) genes induzidos para o RNAi Aire; 4)
genes reprimidos para o RNAi Aire e 5) genes induzidos para o controle (Figura
24).
Procurando evidenciar o efeito da inibição do transcrito do gene Aire,
somente os genes diferencialmente expressos para o RNAi Aire foram
considerados, portanto, foram encontrados 34 genes induzidos (amarelo) e 88
genes reprimidos (azul) (Tabela IV – Anexo II).
Resultados
76
A segunda análise comparativa foi feita entre as amostras controle e
RNAi Aire (Figura 25). Adotando-se um FDR ≤ 20%, 53 genes diferencialmente
expressos foram encontrados sendo 23 genes induzidos (azul) e 30 reprimidos
(amarelo) no RNAi Aire (Tabela V – Anexo II)..
A terceira análise comparativa foi feita entre as amostras RNAi controle e
RNAi Aire (Figura 26). Com um FDR ≤ 20% foi possível encontrar 370 genes
diferencialmente expressos sendo 174 genes induzidos e 196 reprimidos para o
RNAi Aire (Tabela VI – Anexo II).
Resultados
77
Figura 22. Comparação dos perfis de expressão gênica entre camundongos NOD pré-autoimunes
e autoimunes. Matriz de expressão de 109 sequências gênicas (provenientes da estatística SAM)
de estroma de timos recém removidos de animais controles e testes. O vermelho indica indução
da expressão, o verde repressão, o preto ausência de modulação e o cinza ausência de valores.
Cores mais claras representam maior intensidade na alteração da expressão.
Resultados
78
Figura 23. Comparação dos perfis de expressão gênica entre camundongos NOD pré-autoimunes
e autoimunes. Matriz de expressão de 89 sequências gênicas (provenientes da estatística SAM)
de estroma de timos em cultura ATOC de animais controles e testes. O vermelho indica indução
da expressão, o verde repressão, o preto ausência de modulação e o cinza ausência de valores.
Cores mais claras representam maior intensidade na alteração da expressão.
Resultados
79
Figura 24. Comparação dos perfis de expressão gênica de culturas ATOC contendo RNAi Aire em
timos de camundongos NOD pré-autoimunes. Matriz de expressão de 360 sequências gênicas
(provenientes da estatística SAM) de estroma tímico, de timos tratados com RNAi Aire, RNAi
controle e não tratados (controle). O vermelho indica indução da expressão, o verde repressão, o
preto ausência de modulação e o cinza ausência de valores. Cores mais claras representam maior
intensidade na alteração da expressão.
Resultados
80
Figura 25. Comparação dos perfis de expressão gênica de culturas ATOC contendo RNAi Aire em
timos de camundongos NOD pré-autoimunes. Matriz de expressão de 53 sequências gênicas
(provenientes da estatística SAM) de estroma tímico, de timos tratados com RNAi Aire e não
tratados (controle). O vermelho indica indução da expressão, o verde repressão, o preto ausência
de modulação e o cinza ausência de valores. Cores mais claras representam maior intensidade na
alteração da expressão.
Resultados
81
Figura 26. Comparação dos perfis de expressão gênica de culturas ATOC contendo RNAi Aire em
timos de camundongos NOD pré-autoimunes. Matriz de expressão de 370 sequências gênicas
(provenientes da estatística SAM) de estroma tímico, de timos tratados com RNAi Aire e tratados
com RNAi controle. O vermelho indica indução da expressão, o verde repressão, o preto ausência
de modulação e o cinza ausência de valores. Cores mais claras representam maior intensidade na
alteração da expressão.
Resultados
82
6.8 Determinação da expressão gênica promíscua (PGE) no timo
A PGE foi analisada a partir dos genes diferencialmente expressos obtidos
pelo programa SAM e pelos agrupamentos hierárquicos gerados. Foi feita então
uma consulta para cada um dos genes no banco de dados GNF SymAtlas
(http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/) que indica a representatividade do gene
consultado em mais de 60 tecidos e/ou órgãos do camundongo (Figura 27) os
quais foram finalmente agrupados em 17 sistemas.
Figura 27. Gráfico ilustrativo gerado pelo banco de dados GNF SymAtlas
(http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/) mostrando a representação tecidual do gene Rab3d, com os
nomes de cada tecido e/ou órgão.
Resultados
83
As informações de cada gene possibilitaram a construção de gráficos de
setores mostrando as porcentagens de representação dos 17 sistemas diferentes
no timo pelas células do estroma tímico em todas as análises realizadas (Figuras
28 a 32).
Resultados
84
Figura 28. Representação da expressão gênica específica de tecidos em timos recém removidos
de camundongos NOD pré-autoimunes e autoimunes. Os genes significativamente expressos dos
4500 analisados foram anotados caracterizando a expressão promíscua, representando os
antígenos relacionados a tecido. A) Genes induzidos no estroma tímico de camundongos NOD
pré-autoimunes; B) Genes reprimidos no estroma tímico de camundongos NOD pré-autoimunes
Epiderme/Pele
7,0%
Sistema Respiratório
5,3%
Órgãos Sensoriais
6,7%
Sistema Excretor
6,0%
Sistema Digestório
5,3%
Sistema Nervoso Central
7,0%
Sistema Circulatório
4,9%
Ovo/Embrião
6,7%
Intestino
5,3%
Sistema Locomotor
4,3%
Glândulas
7,4%
Tecido Adiposo
6,7%
Olhos
3,2%
Sistema Nervoso
Periférico
4,9%
Músculo esquelético
4,9%
Sistema Reprodutivo
7,7%
Células linfóides
6,7%
Sistema Respiratório
6,5%
Órgãos Sensoriais
6,4%
Sistema Excretor
6,5%
Glândulas
6,9%
Tecido Adiposo
7,1%
Ovo/Embrião
6,9%
Sistema Circulatório
4,4%
Sistema Nervoso Central
6,5%
Sistema Digestório
5,8%
Epiderme/Pele
5,3%
Olhos
4,8%
Sistema Locomotor
5,0%
Intestino
5,7%
Sistema Reprodutivo
7,2%
Sistema Nervoso
Periférico
4,4%
Músculo esquelético
3,9%
Células linfóides
6,7%
A
B
Epiderme/Pele
7,0%
Sistema Respiratório
5,3%
Órgãos Sensoriais
6,7%
Sistema Excretor
6,0%
Sistema Digestório
5,3%
Sistema Nervoso Central
7,0%
Sistema Circulatório
4,9%
Ovo/Embrião
6,7%
Intestino
5,3%
Sistema Locomotor
4,3%
Glândulas
7,4%
Tecido Adiposo
6,7%
Olhos
3,2%
Sistema Nervoso
Periférico
4,9%
Músculo esquelético
4,9%
Sistema Reprodutivo
7,7%
Células linfóides
6,7%
Sistema Respiratório
6,5%
Órgãos Sensoriais
6,4%
Sistema Excretor
6,5%
Glândulas
6,9%
Tecido Adiposo
7,1%
Ovo/Embrião
6,9%
Sistema Circulatório
4,4%
Sistema Nervoso Central
6,5%
Sistema Digestório
5,8%
Epiderme/Pele
5,3%
Olhos
4,8%
Sistema Locomotor
5,0%
Intestino
5,7%
Sistema Reprodutivo
7,2%
Sistema Nervoso
Periférico
4,4%
Músculo esquelético
3,9%
Células linfóides
6,7%
Epiderme/Pele
7,0%
Sistema Respiratório
5,3%
Órgãos Sensoriais
6,7%
Sistema Excretor
6,0%
Sistema Digestório
5,3%
Sistema Nervoso Central
7,0%
Sistema Circulatório
4,9%
Ovo/Embrião
6,7%
Intestino
5,3%
Sistema Locomotor
4,3%
Glândulas
7,4%
Tecido Adiposo
6,7%
Olhos
3,2%
Sistema Nervoso
Periférico
4,9%
Músculo esquelético
4,9%
Sistema Reprodutivo
7,7%
Células linfóides
6,7%
Sistema Respiratório
6,5%
Órgãos Sensoriais
6,4%
Sistema Excretor
6,5%
Glândulas
6,9%
Tecido Adiposo
7,1%
Ovo/Embrião
6,9%
Sistema Circulatório
4,4%
Sistema Nervoso Central
6,5%
Sistema Digestório
5,8%
Epiderme/Pele
5,3%
Olhos
4,8%
Sistema Locomotor
5,0%
Intestino
5,7%
Sistema Reprodutivo
7,2%
Sistema Nervoso
Periférico
4,4%
Músculo esquelético
3,9%
Células linfóides
6,7%
A
B
Resultados
85
Figura 29. Representação da expressão gênica específica de tecidos em timos em cultura ATOC
de camundongos NOD pré-autoimunes e autoimunes. Os genes significativamente expressos dos
4500 analisados foram anotados caracterizando a expressão promíscua, representando os
antígenos relacionados a tecido. A) Genes induzidos no estroma tímico de camundongos NOD
pré-autoimunes; B) Genes reprimidos no estroma tímico de camundongos NOD pré-autoimunes
Sistema Respiratório
3,8%
Órgãos Sensoriais
7,7%
Sistema Excretor
5,2%
Ovo/Embrião
7,7%
Sistema Circulatório
6,4%
Sistema Nervoso Central
7,7%
Sistema Digestório
6,4%
Epiderme/Pele
5,2%
Olhos
3,8%
Tecido Adiposo
5,2%
Glândulas
6,4%
Sistema Locomotor
3,8%
Intestino
6,4%
Sistema Reprodutivo
6,4%
Sistema Nervoso
Periférico
6,4%
Músculo esquelético
3,8%
Células linfóides
7,7%
Sistema Respiratório
6,5%
Órgãos Sensoriais
7,1%
Sistema Excretor
5,9%
Ovo/Embrião
6,8%
Sistema Locomotor
4,2%
Intestino
5,0%
Sistema Circulatório
4,3%
Sistema Nervoso Central
6,3%
Sistema Digestório
5,3%
Epiderme/Pele
6,5%
Olhos
4,7%
Tecido Adiposo
6,5%
Glândulas
7,3%
Sistema Reprodutivo
7,4%
Sistema Nervoso
Periférico
4,2%
Músculo esquelético
4,7%
Células linfóides
7,3%
A
B
Sistema Respiratório
3,8%
Órgãos Sensoriais
7,7%
Sistema Excretor
5,2%
Ovo/Embrião
7,7%
Sistema Circulatório
6,4%
Sistema Nervoso Central
7,7%
Sistema Digestório
6,4%
Epiderme/Pele
5,2%
Olhos
3,8%
Tecido Adiposo
5,2%
Glândulas
6,4%
Sistema Locomotor
3,8%
Intestino
6,4%
Sistema Reprodutivo
6,4%
Sistema Nervoso
Periférico
6,4%
Músculo esquelético
3,8%
Células linfóides
7,7%
Sistema Respiratório
6,5%
Órgãos Sensoriais
7,1%
Sistema Excretor
5,9%
Ovo/Embrião
6,8%
Sistema Locomotor
4,2%
Intestino
5,0%
Sistema Circulatório
4,3%
Sistema Nervoso Central
6,3%
Sistema Digestório
5,3%
Epiderme/Pele
6,5%
Olhos
4,7%
Tecido Adiposo
6,5%
Glândulas
7,3%
Sistema Reprodutivo
7,4%
Sistema Nervoso
Periférico
4,2%
Músculo esquelético
4,7%
Células linfóides
7,3%
Sistema Respiratório
3,8%
Órgãos Sensoriais
7,7%
Sistema Excretor
5,2%
Ovo/Embrião
7,7%
Sistema Circulatório
6,4%
Sistema Nervoso Central
7,7%
Sistema Digestório
6,4%
Epiderme/Pele
5,2%
Olhos
3,8%
Tecido Adiposo
5,2%
Glândulas
6,4%
Sistema Locomotor
3,8%
Intestino
6,4%
Sistema Reprodutivo
6,4%
Sistema Nervoso
Periférico
6,4%
Músculo esquelético
3,8%
Células linfóides
7,7%
Sistema Respiratório
6,5%
Órgãos Sensoriais
7,1%
Sistema Excretor
5,9%
Ovo/Embrião
6,8%
Sistema Locomotor
4,2%
Intestino
5,0%
Sistema Circulatório
4,3%
Sistema Nervoso Central
6,3%
Sistema Digestório
5,3%
Epiderme/Pele
6,5%
Olhos
4,7%
Tecido Adiposo
6,5%
Glândulas
7,3%
Sistema Reprodutivo
7,4%
Sistema Nervoso
Periférico
4,2%
Músculo esquelético
4,7%
Células linfóides
7,3%
A
B
Resultados
86
Figura 30. Representação da expressão gênica específica de tecidos em timos em cultura ATOC
tratados com RNAi Aire, RNAi controle e não tratados (controle) de camundongos NOD pré-
autoimunes. Os genes significativamente expressos dos 4500 analisados foram anotados
caracterizando a expressão promíscua, representando os antígenos relacionados a tecido. A)
Genes induzidos no estroma tímico tratado com RNAi Aire; B) Genes reprimidos no estroma tímico
tratado com RNAi Aire.
Órgãos Sensoriais
8,6%
Sistema Excretor
5,5%
Ovo/Embrião
8,6%
Sistema Circulatório
3,1%
Sistema Nervoso Central
7,0%
Sistema Digestório
5,5%
Epiderme/Pele
6,2%
Olhos
2,7%
Tecido Adiposo
6,2%
Glândulas
9,0%
Células linfóides
8,6%
Sistema Locomotor
3,1%
Intestino
5,1%
Sistema Respiratório
5,5%
Sistema Reprodutivo
8,2%
Sistema Nervoso
Periférico
5,1%
Músculo esquelético
2,0%
Sistema Respiratório
6,2%
Órgãos Sensoriais
7,0%
Sistema Excretor
5,3%
Ovo/Embrião
7,0%
Sistema Circulatório
3,6%
Sistema Nervoso Central
5,7%
Sistema Digestório
6,6%
Epiderme/Pele
4,7%
Olhos
4,0%
Tecido Adiposo
7,5%
Glândulas
7,9%
Sistema Locomotor
3,7%
Intestino
6,2%
Sistema Reprodutivo
8,0%
Sistema Nervoso
Periférico
3,8%
Músculo esquelético
4,0%
Células linfóides
8,8%
A
B
Órgãos Sensoriais
8,6%
Sistema Excretor
5,5%
Ovo/Embrião
8,6%
Sistema Circulatório
3,1%
Sistema Nervoso Central
7,0%
Sistema Digestório
5,5%
Epiderme/Pele
6,2%
Olhos
2,7%
Tecido Adiposo
6,2%
Glândulas
9,0%
Células linfóides
8,6%
Sistema Locomotor
3,1%
Intestino
5,1%
Sistema Respiratório
5,5%
Sistema Reprodutivo
8,2%
Sistema Nervoso
Periférico
5,1%
Músculo esquelético
2,0%
Sistema Respiratório
6,2%
Órgãos Sensoriais
7,0%
Sistema Excretor
5,3%
Ovo/Embrião
7,0%
Sistema Circulatório
3,6%
Sistema Nervoso Central
5,7%
Sistema Digestório
6,6%
Epiderme/Pele
4,7%
Olhos
4,0%
Tecido Adiposo
7,5%
Glândulas
7,9%
Sistema Locomotor
3,7%
Intestino
6,2%
Sistema Reprodutivo
8,0%
Sistema Nervoso
Periférico
3,8%
Músculo esquelético
4,0%
Células linfóides
8,8%
Órgãos Sensoriais
8,6%
Sistema Excretor
5,5%
Ovo/Embrião
8,6%
Sistema Circulatório
3,1%
Sistema Nervoso Central
7,0%
Sistema Digestório
5,5%
Epiderme/Pele
6,2%
Olhos
2,7%
Tecido Adiposo
6,2%
Glândulas
9,0%
Células linfóides
8,6%
Sistema Locomotor
3,1%
Intestino
5,1%
Sistema Respiratório
5,5%
Sistema Reprodutivo
8,2%
Sistema Nervoso
Periférico
5,1%
Músculo esquelético
2,0%
Sistema Respiratório
6,2%
Órgãos Sensoriais
7,0%
Sistema Excretor
5,3%
Ovo/Embrião
7,0%
Sistema Circulatório
3,6%
Sistema Nervoso Central
5,7%
Sistema Digestório
6,6%
Epiderme/Pele
4,7%
Olhos
4,0%
Tecido Adiposo
7,5%
Glândulas
7,9%
Sistema Locomotor
3,7%
Intestino
6,2%
Sistema Reprodutivo
8,0%
Sistema Nervoso
Periférico
3,8%
Músculo esquelético
4,0%
Células linfóides
8,8%
A
B
Resultados
87
Figura 31. Representação da expressão gênica específica de tecidos em timos em cultura ATOC
tratados com RNAi Aire e não tratados (controle) de camundongos NOD pré-autoimunes. Os
genes significativamente expressos dos 4500 analisados foram anotados caracterizando a
expressão promíscua, representando os antígenos relacionados a tecido. A) Genes induzidos no
estroma tímico tratado com RNAi Aire; B) Genes reprimidos no estroma tímico tratado com RNAi
Aire.
Sistema Respiratório
5,2%
Órgãos Sensoriais
8,4%
Sistema Excretor
3,9%
Ovo/Embrião
9,0%
Sistema Circulatório
4,5%
Sistema Nervoso Central
7,1%
Sistema Digestório
6,4%
Epiderme/Pele
5,2%
Olhos
2,0%
Tecido Adiposo
6,4%
Glândulas
9,0%
Sistema Locomotor
3,2%
Intestino
4,5%
Sistema Reprodutivo
8,4%
Sistema Nervoso
Periférico
5,2%
Músculo esquelético
2,6%
Células linfóides
9,0%
Sistema Respiratório
6,7%
Órgãos Sensoriais
6,7%
Sistema Excretor
6,0%
Ovo/Embrião
8,0%
Sistema Circulatório
6,0%
Sistema Nervoso Central
4,7%
Sistema Digestório
5,3%
Epiderme/Pele
5,3%
Olhos
2,7%
Tecido Adiposo
7,3%
Glândulas
7,3%
Células linfóides
8,0%
Sistema Locomotor
4,7%
Intestino
5,3%
Sistema Reprodutivo
8,0%
Sistema Nervoso
Periférico
2,7%
Músculo esquelético
5,3%
A
B
Sistema Respiratório
5,2%
Órgãos Sensoriais
8,4%
Sistema Excretor
3,9%
Ovo/Embrião
9,0%
Sistema Circulatório
4,5%
Sistema Nervoso Central
7,1%
Sistema Digestório
6,4%
Epiderme/Pele
5,2%
Olhos
2,0%
Tecido Adiposo
6,4%
Glândulas
9,0%
Sistema Locomotor
3,2%
Intestino
4,5%
Sistema Reprodutivo
8,4%
Sistema Nervoso
Periférico
5,2%
Músculo esquelético
2,6%
Células linfóides
9,0%
Sistema Respiratório
6,7%
Órgãos Sensoriais
6,7%
Sistema Excretor
6,0%
Ovo/Embrião
8,0%
Sistema Circulatório
6,0%
Sistema Nervoso Central
4,7%
Sistema Digestório
5,3%
Epiderme/Pele
5,3%
Olhos
2,7%
Tecido Adiposo
7,3%
Glândulas
7,3%
Células linfóides
8,0%
Sistema Locomotor
4,7%
Intestino
5,3%
Sistema Reprodutivo
8,0%
Sistema Nervoso
Periférico
2,7%
Músculo esquelético
5,3%
Sistema Respiratório
5,2%
Órgãos Sensoriais
8,4%
Sistema Excretor
3,9%
Ovo/Embrião
9,0%
Sistema Circulatório
4,5%
Sistema Nervoso Central
7,1%
Sistema Digestório
6,4%
Epiderme/Pele
5,2%
Olhos
2,0%
Tecido Adiposo
6,4%
Glândulas
9,0%
Sistema Locomotor
3,2%
Intestino
4,5%
Sistema Reprodutivo
8,4%
Sistema Nervoso
Periférico
5,2%
Músculo esquelético
2,6%
Células linfóides
9,0%
Sistema Respiratório
6,7%
Órgãos Sensoriais
6,7%
Sistema Excretor
6,0%
Ovo/Embrião
8,0%
Sistema Circulatório
6,0%
Sistema Nervoso Central
4,7%
Sistema Digestório
5,3%
Epiderme/Pele
5,3%
Olhos
2,7%
Tecido Adiposo
7,3%
Glândulas
7,3%
Células linfóides
8,0%
Sistema Locomotor
4,7%
Intestino
5,3%
Sistema Reprodutivo
8,0%
Sistema Nervoso
Periférico
2,7%
Músculo esquelético
5,3%
A
B
Resultados
88
Figura 32. Representação da expressão gênica específica de tecidos em timos em cultura ATOC
tratados com RNAi Aire e tratados com RNAi controle de camundongos NOD pré-autoimunes. Os
genes significativamente expressos dos 4500 analisados foram anotados caracterizando a
expressão promíscua, representando os antígenos relacionados a tecido. A) Genes induzidos no
estroma tímico tratado com RNAi Aire; B) Genes reprimidos no estroma tímico tratado com RNAi
Aire.
Sistema Respiratório
6,6%
Órgãos Sensoriais
7,3%
Sistema Excretor
5,6%
Ovo/Embrião
8,3%
Sistema Circulatório
3,2%
Sistema Nervoso Central
7,0%
Sistema Digestório
5,5%
Epiderme/Pele
4,8%
Olhos
2,9%
Tecido Adiposo
6,7%
Glândulas
8,6%
Células linfóides
8,6%
Sistema Locomotor
4,2%
Intestino
4,5%
Sistema Reprodutivo
8,6%
Sistema Nervoso
Periférico
4,7%
Músculo esquelético
2,9%
Sistema Respiratório
7,1%
Órgãos Sensoriais
6,8%
Ovo/Embrião
6,7%
Sistema Circulatório
4,0%
Sistema Nervoso Central
5,7%
Sistema Digestório
6,5%
Epiderme/Pele
5,0%
Olhos
3,6%
Tecido Adiposo
7,2%
Glândulas
8,0%
Sistema Locomotor
4,4%
Intestino
5,9%
Sistema Excretor
6,0%
Sistema Reprodutivo
7,7%
Sistema Nervoso
Periférico
3,7%
Músculo esquelético
3,7%
Células linfóides
8,0%
A
B
Sistema Respiratório
6,6%
Órgãos Sensoriais
7,3%
Sistema Excretor
5,6%
Ovo/Embrião
8,3%
Sistema Circulatório
3,2%
Sistema Nervoso Central
7,0%
Sistema Digestório
5,5%
Epiderme/Pele
4,8%
Olhos
2,9%
Tecido Adiposo
6,7%
Glândulas
8,6%
Células linfóides
8,6%
Sistema Locomotor
4,2%
Intestino
4,5%
Sistema Reprodutivo
8,6%
Sistema Nervoso
Periférico
4,7%
Músculo esquelético
2,9%
Sistema Respiratório
7,1%
Órgãos Sensoriais
6,8%
Ovo/Embrião
6,7%
Sistema Circulatório
4,0%
Sistema Nervoso Central
5,7%
Sistema Digestório
6,5%
Epiderme/Pele
5,0%
Olhos
3,6%
Tecido Adiposo
7,2%
Glândulas
8,0%
Sistema Locomotor
4,4%
Intestino
5,9%
Sistema Excretor
6,0%
Sistema Reprodutivo
7,7%
Sistema Nervoso
Periférico
3,7%
Músculo esquelético
3,7%
Células linfóides
8,0%
Sistema Respiratório
6,6%
Órgãos Sensoriais
7,3%
Sistema Excretor
5,6%
Ovo/Embrião
8,3%
Sistema Circulatório
3,2%
Sistema Nervoso Central
7,0%
Sistema Digestório
5,5%
Epiderme/Pele
4,8%
Olhos
2,9%
Tecido Adiposo
6,7%
Glândulas
8,6%
Células linfóides
8,6%
Sistema Locomotor
4,2%
Intestino
4,5%
Sistema Reprodutivo
8,6%
Sistema Nervoso
Periférico
4,7%
Músculo esquelético
2,9%
Sistema Respiratório
7,1%
Órgãos Sensoriais
6,8%
Ovo/Embrião
6,7%
Sistema Circulatório
4,0%
Sistema Nervoso Central
5,7%
Sistema Digestório
6,5%
Epiderme/Pele
5,0%
Olhos
3,6%
Tecido Adiposo
7,2%
Glândulas
8,0%
Sistema Locomotor
4,4%
Intestino
5,9%
Sistema Excretor
6,0%
Sistema Reprodutivo
7,7%
Sistema Nervoso
Periférico
3,7%
Músculo esquelético
3,7%
Células linfóides
8,0%
A
B
Resultados
89
Levando-se em consideração que os camundongos NOD são o modelo
animal de estudo do diabetes tipo 1, procurou-se destacar a representatividade
dos genes de PGE no pâncreas em relação às demais glândulas e ressaltar os
genes que foram mais expressos nesse órgão seja na condição de induzido ou
reprimido no agrupamento em questão. Uma nova série de gráficos de setores foi
gerada a partir de genes expressos somente em glândulas na qual se encaixa o
principal órgão afetado e relacionado à patogenia da doença (Figuras 33 a 37).
Resultados
90
Figura 33. Representação da expressão gênica de antígenos relacionados a tecidos para
glândulas/pâncreas em timos recém removidos de camundongos NOD pré-autoimunes e
autoimunes caracterizando a expressão promíscua. A) Genes induzidos no estroma tímico de
camundongos NOD pré-autoimunes; B) Genes reprimidos no estroma tímico de camundongos
NOD pré-autoimunes
Pituitária
19,3%
Tireóide
17,8%
Glândula Adrenal
24,2%
Glândula Mamária
12,9%
Glândula Salivar
14,5%
Pâncreas
11,3%
Glândula Salivar
17,6%
Glândula Mamária
18,3%
Glândula Adrenal
21,6%
Tireóide
14,4%
Pituitária
15,7%
Pâncreas
12,4%
A
B
Pituitária
19,3%
Tireóide
17,8%
Glândula Adrenal
24,2%
Glândula Mamária
12,9%
Glândula Salivar
14,5%
Pâncreas
11,3%
Glândula Salivar
17,6%
Glândula Mamária
18,3%
Glândula Adrenal
21,6%
Tireóide
14,4%
Pituitária
15,7%
Pâncreas
12,4%
Pituitária
19,3%
Tireóide
17,8%
Glândula Adrenal
24,2%
Glândula Mamária
12,9%
Glândula Salivar
14,5%
Pâncreas
11,3%
Glândula Salivar
17,6%
Glândula Mamária
18,3%
Glândula Adrenal
21,6%
Tireóide
14,4%
Pituitária
15,7%
Pâncreas
12,4%
A
B
Resultados
91
Figura 34. Representação da expressão gênica de antígenos relacionados a tecidos para
glândulas/pâncreas em timos em cultura ATOC de camundongos NOD pré-autoimunes e
autoimunes caracterizando a expressão promíscua. A) Genes induzidos no estroma tímico de
camundongos NOD pré-autoimunes; B) Genes reprimidos no estroma tímico de camundongos
NOD pré-autoimunes
Glândula Adrenal
18,7%
Glândula Mamária
18,7%
Glândula Salivar
12,6%
Pâncreas
18,7%
Pituitária
12,6%
Tireóide
18,7%
Pâncreas
16,6%
Pituitária
14,6%
Tireóide
13,3%
Glândula Adrenal
22,3%
Glândula Mamária
16,6%
Glândula Salivar
16,6%
A
B
Glândula Adrenal
18,7%
Glândula Mamária
18,7%
Glândula Salivar
12,6%
Pâncreas
18,7%
Pituitária
12,6%
Tireóide
18,7%
Pâncreas
16,6%
Pituitária
14,6%
Tireóide
13,3%
Glândula Adrenal
22,3%
Glândula Mamária
16,6%
Glândula Salivar
16,6%
Glândula Adrenal
18,7%
Glândula Mamária
18,7%
Glândula Salivar
12,6%
Pâncreas
18,7%
Pituitária
12,6%
Tireóide
18,7%
Pâncreas
16,6%
Pituitária
14,6%
Tireóide
13,3%
Glândula Adrenal
22,3%
Glândula Mamária
16,6%
Glândula Salivar
16,6%
A
B
Resultados
92
Figura 35. Representação da expressão gênica de antígenos relacionados a tecidos para
glândulas/pâncreas em timos em cultura ATOC tratados com RNAi Aire, RNAi controle e não
tratados (controle) de camundongos NOD pré-autoimunes caracterizando a expressão promíscua.
A) Genes induzidos no estroma tímico tratado com RNAi Aire; B) Genes reprimidos no estroma
tímico tratado com RNAi Aire.
Glândula Mamária
18,3%
Glândula Adrenal
13,4%
Tireóide
18,3%
Pituitária
10,0%
Pâncreas
20,0%
Glândula Salivar
20,0%
Glândula Mamária
12,4%
Glândula Adrenal
24,0%
Tireóide
14,8%
Pituitária
12,4%
Pâncreas
18,2%
Glândula Salivar
18,2%
A
B
Glândula Mamária
18,3%
Glândula Adrenal
13,4%
Tireóide
18,3%
Pituitária
10,0%
Pâncreas
20,0%
Glândula Salivar
20,0%
Glândula Mamária
12,4%
Glândula Adrenal
24,0%
Tireóide
14,8%
Pituitária
12,4%
Pâncreas
18,2%
Glândula Salivar
18,2%
Glândula Mamária
18,3%
Glândula Adrenal
13,4%
Tireóide
18,3%
Pituitária
10,0%
Pâncreas
20,0%
Glândula Salivar
20,0%
Glândula Mamária
12,4%
Glândula Adrenal
24,0%
Tireóide
14,8%
Pituitária
12,4%
Pâncreas
18,2%
Glândula Salivar
18,2%
A
B
Resultados
93
Figura 36. Representação da expressão gênica de antígenos relacionados a tecidos para
glândulas/pâncreas em timos em cultura ATOC tratados com RNAi Aire e não tratados (controle)
de camundongos NOD pré-autoimunes caracterizando a expressão promíscua. A) Genes
induzidos no estroma tímico tratado com RNAi Aire; B) Genes reprimidos no estroma tímico
tratado com RNAi Aire.
Glândula Adrenal
10,3%
Glândula Mamária
20,5%
Pâncreas
23,1%
Pituitária
5,1%
Tireóide
20,5%
Glândula Salivar
20,5%
Pâncreas
12,5%
Pituitária
9,4%
Tireóide
15,7%
Glândula Adrenal
25,0%
Glândula Mamária
18,7%
Glândula Salivar
18,7%
A
B
Glândula Adrenal
10,3%
Glândula Mamária
20,5%
Pâncreas
23,1%
Pituitária
5,1%
Tireóide
20,5%
Glândula Salivar
20,5%
Pâncreas
12,5%
Pituitária
9,4%
Tireóide
15,7%
Glândula Adrenal
25,0%
Glândula Mamária
18,7%
Glândula Salivar
18,7%
Glândula Adrenal
10,3%
Glândula Mamária
20,5%
Pâncreas
23,1%
Pituitária
5,1%
Tireóide
20,5%
Glândula Salivar
20,5%
Pâncreas
12,5%
Pituitária
9,4%
Tireóide
15,7%
Glândula Adrenal
25,0%
Glândula Mamária
18,7%
Glândula Salivar
18,7%
A
B
Resultados
94
Figura 37. Representação da expressão gênica de antígenos relacionados a tecidos para
glândulas/pâncreas em timos em cultura ATOC tratados com RNAi Aire e tratados com RNAi
controle de camundongos NOD pré-autoimunes caracterizando a expressão promíscua. A) Genes
induzidos no estroma tímico tratado com RNAi Aire; B) Genes reprimidos no estroma tímico
tratado com RNAi Aire.
Pâncreas
14,1%
Pituitária
14,7%
Tireóide
15,3%
Glândula Adrenal
24,8%
Glândula Mamária
17,5%
Glândula Salivar
13,6%
Pâncreas
15,0%
Pituitária
15,7%
Tireóide
16,9%
Glândula Adrenal
25,2%
Glândula Mamária
12,2%
Glândula Salivar
15,0%
A
B
Pâncreas
14,1%
Pituitária
14,7%
Tireóide
15,3%
Glândula Adrenal
24,8%
Glândula Mamária
17,5%
Glândula Salivar
13,6%
Pâncreas
15,0%
Pituitária
15,7%
Tireóide
16,9%
Glândula Adrenal
25,2%
Glândula Mamária
12,2%
Glândula Salivar
15,0%
Pâncreas
14,1%
Pituitária
14,7%
Tireóide
15,3%
Glândula Adrenal
24,8%
Glândula Mamária
17,5%
Glândula Salivar
13,6%
Pâncreas
15,0%
Pituitária
15,7%
Tireóide
16,9%
Glândula Adrenal
25,2%
Glândula Mamária
12,2%
Glândula Salivar
15,0%
A
B
Resultados
95
Dentre os genes de PGE que são expressos em glândulas procurou-se
destacar aqueles que tiveram sua expressão sobressaída no pâncreas nas
análises realizadas. Os dados encontram-se na tabela VII.
Tabela VII. Genes que codificam antígenos específicos de pâncreas em timo de camundongos
NOD.
Análise Genes
Induzidos: Clec1b, Xcl1, Prdm10, Rpl21, Rfxap, Phc3 e Ankrd40 Timos recém
removidos
Reprimidos: C330006K01Rik, 1300012G16Rik, Suz12, Arpp21,
Afmid, Sypl, Tcea3, Pdia4, Irf8, Slc7a11, Nebl, Stx18, Shmt1, P2rx1,
Nsd1, Tssk4, Bclaf1, Igf1r e Plxnd1
Induzidos: CXCL10, IL12A e CD209 Timos em
cultura ATOC
Reprimidos: Nsd1, BRCA1, ATM, Prdx6, FANCC, IRF5, Gzma, Cd8a,
Rpl18a, Smc4, Cyb561d2, Nf2, ITGA5, Elk4, Ubxd1, Etv3, Fcna,
Tssc1, Cxcl4, Tcea3, SLC11A1, Ttll4, Rac2, C3, Ddx51 e Gnpda2
Induzidos: Cebpg, Sema4d, Ctf1, D2Ertd750e, Abca5, Fbxl11, Sh3yl1,
Alg9, 2610318N02Rik, Trim17, Es2el e Ankrd16
Controle
X
RNAi controle
X
RNAi Aire
Reprimidos: 5730494M16Rik, Tcrg-C, Ifit1, 1110018J18Rik, Rrp1b,
2010003O18Rik, Glb1, Ppm1h, Gfi1, Letm2, BC030183, Il4,
1500032D16Rik, Cd4, Shmt1, Chchd8, Chd1, 2510003E04Rik,
Map3k11, Tbce, Ing2 e Tdg
Induzidos: Fbxl11, Trim17, Ankrd16, Cebpg, Abca5, 2610318N02Rik,
Es2el, C230096C10Rik e Alg9
Controle
X
RNAi Aire
Reprimidos: Shmt1, TLR2, CCR5 e Tbce
Induzidos: Paqr8, Hrh3, 4932433N03Rik, Es2el, Nf2, Nup50, Lrpap1,
Dnpep, Flna, Ebi3, Ctsl, Myh11, Sh3yl1, 2610318N02Rik, Trim62,
Trim17, 4932438H23Rik, Msc, Golt1b, C230096C10Rik, BC038156,
Wdr12, Stard9, Dpm1 e Ankrd16
RNAi Aire
X
RNAi controle
Reprimidos: Ccr9, Ing2, Aars, Ifit1, Chd1, Il5, Ptrh1, Chchd8, Plxnc1,
1500032D16Rik, 1110018J18Rik, Btg2, Dnmt3a, Letm2, Gfi1,
BC030183, Cd27, Glb1, Ppm1h, Tcrg-C, 5730494M16Rik, Il4, ME3,
Mll5, Sept1, Skap1, 2510003E04Rik, Nkx6-2, Rab3d, ITGA5, Ercc5,
Stat1, Cep78, Tcea3, Shmt1, Tdg, Tbce e Map3k11
Resultados
96
6.9 Análise das regiões cromossômicas de susceptibilidade ao DM-1
Após serem analisados em termos de PGE utilizando o banco de dados
GNF SymAtlas (http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/), os genes encontrados em
todos os agrupamentos foram submetidos a uma análise em relação à localização
cromossômica.
A busca no banco de dados do Mouse Genome Informatics
(http://www.informatics.jax.org) para a descoberta dos genes idds (diabetes
dependente de insulina) forneceu 40 genes descritos e quase todos apresentaram
ideogramas para a localização cromossômica.
Uma busca no banco de dados Mouse Genome Informatics
(http://www.informatics.jax.org) para a descoberta dos genes idds (diabetes
dependente de insulina) forneceu 40 genes e suas localizações cromossômicas.
Procuramos mais uma vez relacionar os dados de PGE com os genes do referido
banco de dados. Os resultados mostrados nas Tabelas VIII e IX referem-se a
genes encontrados nas análises de PGE de estroma de camundongos NOD pré-
autoimunes e autoimunes que se encontram em regiões coincidentes com as de
genes idds.
Dentre os genes encontrados nas análises 3 deles estão descritos pelo
mesmo banco de dados (MGI) como diretamente relacionados ao diabetes tipo 1
em camundongos. Os genes encontrados foram: Cd4, Cdk4 e IL4.
Resultados
97
Tabela VIII. Genes diferencialmente expressos em estroma de timos recém removidos e em
cultura ATOC de camundongos NOD pré-autoimunes com representatividade da PGE localizados
em regiões coincidentes com idds conhecidas.
Análise Gene Citobanda Idd relacionada
Phc3 3 A3 3
Rragc 4D 9.2 (D1) ou 9.3
(D2.2)
Induzidos
Clec1b 6 F3 6
H2-K1 17B1 1
Epc1 18 A1 21c
Timos recém
removidos
Reprimidos
Hdac1
4 D2.2 9.3
Pdpk1 17 A3.3 16, 16a e 16b Induzidos
9530068E07Rik 11 B1.3 4
Ttll4 1 C3 5b
Sec24c 14 A3 12
Acat3 17 A1 23
Epc1 18 A1 21c
Etv3 3 F1 18
2810403A07Rik 3 F1 18
Timos em
cultura ATOC
Reprimidos
Lck 4 C5 9.1
Resultados
98
Tabela IX. Genes diferencialmente expressos em estroma de timos em cultura ATOC de
camundongos NOD pré-autoimunes após tratamento com RNA interferente com
representatividade da PGE localizados em regiões coincidentes com idds conhecidas.
Análise Gene Citobanda Idd relacionada
Paqr8 1 A5 26
Nck2 1 C1 5a
Wdr12 1 C1-C2 5a C1 / 5 C2
Dnpep 1 C3-C4 5b C3
Sox4 13 A3-A5 14 A3.3
Glo1 17 A3.3 16, 16a e 16b
Hdac1 4 D2.2 9.3
Clec1b 6 F3 6
Reprimidos em
RNAi controle
Rpl15 9 A3 2
Arpc2 1 C3 5b
Il5 11 A5-B1 4 B1.3
Ly86 13 A3.3 14
Shc1 3 F1 18
Cd27 6 F3 6
Rab3d 9 A2-A3 2 A3
Induzidos em
RNAi controle
9530077C05Rik
9 A3 2
Induzidos em
RNAi Aire
Trim17 11 B1.2 - B1.3 4 B1.3
Il4 11 B1.3 4
1500032D16Rik 17 A3.3 16, 16a e 16b
Rrp1b 17 B1 1
Controle
X
RNAi controle
X
RNAi Aire
Reprimidos em
RNAi Aire
BC030183 4 D2.2 9.3
Controle
X
RNAi Aire
Induzidos em
RNAi Aire
Trim17 11 B1.2 - B1.3 4 B1.3
Paqr8 1 A5 26
Nck2 1 C1 5a
Wdr12 1 C1-C2 5a C1 / 5 C2
Dnpep 1 C3-C4 5b C3
Trim17 11 B1.2 - B1.3 4 B1.3
Sox4 13 A3-A5 14 A3.3
Acat3 17 A1 23
Trim62 A D2.2 9.3
Hdac1 4 D2.2 9.3
Induzidos em
RNAi Aire
Clec1b 6 F3 6
Stat1 1 C1.1 5a
Arpc2 1 C3 5b
Il4 11 B1.3 4
1500032D16Rik 17 A3.3 16, 16a e 16b
H2-K1 17B1 1
Shc1 3 F1 18
BC030183 4 D2.2 9.3
Anxa4 6 D1 20
Cd27 6 F3 6
RNAi Aire
X
RNAi controle
Reprimidos em
RNAi Aire
Rab3d 9 A2-A3 2 A3
Discussão
Discussão
100
7. DISCUSSÃO
7.1 Emergência de diabetes mellitus (DM-1) em camundongos NOD
A incidência do diabetes espontâneo em NOD é de 60% a 80% em fêmeas
e de 20% a 30% em machos. A incidência da doença aumenta quando os
camundongos são mantidos em ambiente livre de patógenos e decresce
dramaticamente em condições normais de manutenção (Singh & Rabinovitch,
1993; Bowman et al., 1994). O início do diabetes ocorre entre 12 a 14 semanas
de idade em fêmeas e um pouco depois em machos. Estudos histológicos
mostram que os infiltrados celulares são notados nas ilhotas até
aproximadamente 3 a 4 semanas de idade quando os animais começam a
demonstrar a peri-insulite (Anderson & Bluestone, 2005).
Durante o andamento deste trabalho adequamos a manutenção dos
camundongos NOD em condições SPF (single patogen free) em nosso próprio
laboratório, o que possibilitou o desenvolvimento do diabetes mellitus do tipo 1
(DM-1) entre os camundongos provenientes do biotério da Universidade Estadual
de Campinas (CEMIB UNICAMP).
Foram adquiridos camundongos fêmeas NOD com idade média de 2
meses. A glicemia destes animais foi analisada periodicamente o que possibilitou
separá-los em 2 grupos distintos, ou seja, o dos pré-autoimunes (com idade ≤ 4,5
meses) e os autoimunes com idade > 4,5 meses de idade.
Nossos resultados quanto à emergência temporal do DM-1, ou seja, entre 3
e 4 meses de idade, corroboram com Anderson & Bluestone (2005) (Figura 13). O
que diferiu em relação à literatura, foi a freqüência de animais DM-1, a qual neste
trabalho foi inferior (aproximadamente 30%). Se esses animais fossem
observados por mais tempo, a freqüência de DM-1 poderia ser ainda maior. Mas
como ocorre involução tímica com a idade dos camundongos havendo
substituição do estroma por tecido adiposo (Montecino-Rodriquez et al., 2005),
não pudemos estudar animais com mais de 5,5 meses de idade.
7.2 Expressão do gene Aire e de TRAs no estroma tímico
O timo é um órgão linfóide primário em que os precursores de células T
derivados da medula óssea se submetem a um processo complexo de maturação
no contexto do microambiente tímico, representado por células não linfóides e
Discussão
101
linfóides e por componentes da matriz extracelular (ECM) (Villa-Verde et al.,
1995).
O microambiente estromal é composto essencialmente de células epiteliais
corticais (cTECs) e medulares (mTECs), fibroblastos reticulares, células
dendríticas e macrófagos derivados da medula óssea, além de estruturas
conhecidas como corpúsculos de Hassal, localizados especificamente na medula
tímica e composto de espirais compactas de células epiteliais remanescentes de
células em degeneração (van Ewijk W, 1991; Gray et al., 2002; Abbas & Lichtman
2005). Durante a fase em que o timo se encontra em plena atividade, ou seja, do
nascimento a puberdade, contribuindo com o repertório de células T, a proporção
de timócitos e estroma é alta (Gray et al., 2006). Com o avanço da idade esse
órgão passa por um processo natural de involução havendo substituição do
estroma tímico por tecido adiposo (Montecino-Rodriquez et al., 2005), e essa
proporção se altera.
Existe uma distinção no papel das células TECs. As células corticais não
só auxiliam na atração dos precursores linfóides do sangue para o timo como
também controlam a diferenciação dos timócitos ao estágio em que eles
expressam em sua superfície o receptor de células T αβ completo.
Consequentemente, os peptídeos próprios e as moléculas do complexo de
histocompatibilidade (MHC) encontram afinidade suficiente nessas células sendo
assim selecionadas positivamente. Posteriormente, os timócitos se movem para a
medula. As mTECs apresentam moléculas MHC que expressam peptídeos que
representam muitos tecidos do parênquima. Os timócitos que apresentarem alta
afinidade pelos complexos serão negativamente selecionados ou deletados
(Holländer, 2007).
Todos os grupos de células apresentadoras de antígenos (APCs), assim
como as corticais tímicas (cTECs), medulares tímicas (mTECs), células
dendríticas (DCs) e macrófagos tem suas funções na apresentação de grupos de
peptídeos próprios, e especialização nas suas habilidades para suportar as
seleções positiva e negativa, contribuindo para a diversidade do quadro de
antígenos próprios no timo (Klein & Kyewski, 2000a; Kyewski & Derbinski, 2004;
Anderson et al., 2006).
Discussão
102
Portanto, para o estudo da expressão gênica promíscua, propriedade do
estroma tímico (células TECs), optou-se por estudar somente animais adultos
jovens.
Aplicamos um método de separação do estroma tímico dos demais tipos de
células. O procedimento escolhido foi baseado no trabalho de Gray et al. (2002),
no qual o timo é fragmentado e passa por um processo de agitação em meio de
cultura celular possibilitando a remoção dos timócitos que saem para o meio.
Como o processo não é de todo eficiente, devido à alta aderência do
estroma com os timócitos, foi realizado um monitoramento da presença destes
últimos nas preparações de estroma. Utilizou-se para isto a detecção do RNAm
do receptor Cd3e (antígeno Cd3 cadeia epsilon) que é específico de linfócitos T
por RT-PCR. A detecção de RNAm de Cd3e na preparação de estroma, mostrou
a presença de linfócitos T (Figura 15). Embora presentes essas células não
impediram a detecção da PGE que foi o foco deste trabalho. Mas, reconhecemos
a necessidade de realizarmos uma separação de células estromais mais
adequada.
O método de análise da PGE que possibilita a identificação de cada tipo
celular envolvido compensou esta limitação.
A evidência da expressão de antígenos relacionados a tecidos (TRAs) de
órgãos e tecidos parenquimais pelas células mTEC no timo de camundongos e de
humanos referida como PGE (Jolicoeur et al., 1994; Sospedra et al.,1998;
Derbinski et al., 2001; Gotter et al., 2004; Kyewski & Derbinski, 2004) vem sendo
amplamente estudada e grande parte desses antígenos parece estar sob a
influência de um fator transcricional denominado Aire (Autoimmune regulator)
(Pitkänen et al., 2003) capaz de controlar a expressão de um conjunto grande de
genes de TRAs em mTECs, com uma tendência a genes que cuja expressão é
preferencial de células diferenciadas (Anderson et al., 2002 e 2005; Derbinski et
al., 2005; Derbinski & Kyewski, 2005; Barthlott et al. 2006; Kont et al., 2008).
Portanto, a observação da expressão do gene Aire em nossas amostras de
estroma tímico, tanto de camundongos NOD pré-autoimunes quanto autoimunes,
mostrou que este regulador transcricional poderá estar implicado no controle da
PGE dos camundongos estudados (Figura 15).
Entretanto, nem todos os antígenos expressos pelo timo estão sob o
controle do gene Aire, como por exemplo, a caseína β e κ e o ácido glutâmico
Discussão
103
descarboxilase 67kDa (Gad67) (Derbinski et al., 2005) e da proteína c-reativa
(Anderson et al., 2002).
Alguns dos antígenos sabidamente considerados TRAs estão bem
descritos na literatura em linhagens como C57BL/6 e NOD, como é o caso da
insulina 1 e 2 ( Ins-1 e Ins-2), controlados pelo Aire, e do Gad67, descritos como
expressos em células mTECs de ambas as linhagens (Derbinski et al., 2001; Kont
et al., 2008). Sendo assim, passamos a avaliar a presença dos respectivos RNAm
desses antígenos nas amostras estudadas utilizando-se a técnica de RT-PCR
(Figura 16).
Observando a Figura 16 é possível notar a expressão do gene Ins-1 em
camundongos NOD pré-autoimunes e autoimunes, tanto em timos que foram
recém removidos quanto daqueles que foram submetidos à cultura ATOC. Tal
resultado mostra que a expressão desse gene parece não ser alterada pelo
processo de autoimunidade em um modelo de diabetes nem tão pouco pelo
cultivo do órgão em meio de cultura. Porém, o mesmo não acontece com os
genes Ins-2 e Ia-2, que apresentaram expressão diferenciada, os quais foram
expressos somente nos grupos pré-autoimunes ou mais expressos neles (Figura
16).
Tal observação nos chamou a atenção, pois, considerando que durante a
indução de tolerância intratímica, as células mTEC apresentam os TRAs para os
timócitos e os clones auto reativos são eliminados por apoptose (seleção
negativa). Havendo então redução da expressão de RNAm de Ins-2 e Ia-2 que
são autoantígenos relacionados ao DM-1, isto implicaria numa concomitante
redução da seleção negativa. A redução da expressão de RNAm desses genes
no timo dos camundongos NOD autoimunes (diabéticos) poderá implicar na
redução da seleção negativa de linfócitos auto-reativos contra a insulina 2 e
contra a proteína tirosina fosfatase associada ao insulinoma, possibilitando assim
a reação autoimune na periferia. Por serem autoantígenos pancreáticos, são
considerados como relacionados à patogenia do DM-1.
Foi observado que camundongos C57BL/6 e BALB/c deficientes de Ins-2 e
com baixa expressão de insulina no timo, apresentaram células T auto-reativas à
proinsulina (Chentoufi & Polychronakos, 2002).
Uma demonstração elegante do papel protetor anti diabetes da insulina no
timo foi realizada por Nakayama et al.(2005), cujos pesquisadores compensaram
Discussão
104
sua expressão em camundongos NOD duplamente nocautes para Ins-1 e Ins-2
com um transgene de insulina, observando que os mesmos foram protegidos da
autoimunidade.
O gene do ácido glutâmico descarboxilase (Gad67) não está sob o controle
do gene Aire e foi expresso nos diferentes grupos estudados, ficando claro que
sua expressão parece não ser alterada pelo processo de autoimunidade em NOD
(Figura 16). Sabe-se que as isoformas de Gad são facilmente detectáveis em
humanos e ratos. Porém, em NOD a concentração dessa proteína nas ilhotas
pancreáticas é consideravelmente baixa e a isoforma Gad67 pode ser detectada
mas não sendo totalmente derivada das células β (Atkinson & Leiter, 1999).
Nossos resultados mostram que o RNAm de Gad67 é expresso em todos os
grupos estudados na mesma intensidade (Figura 16).
O gene do pró-colágeno II que codifica a proteína colágeno tipo II,
abundante nas articulações e alvo das reações autoimunes na artrite reumatóide
(Holmdahl et al., 1990) também foi avaliado por se tratar de um auto-antígeno.
Observou-se a expressão desse gene no estroma de camundongos NOD tanto
nas amostras controle (pré-autoimunes) quanto nas amostras testes (autoimunes)
demonstrando que a expressão desse gene parece não ser alterada pelo
processo de autoimunidade em NOD.
Os resultados obtidos por meio de RT-PCR nos possibilitaram uma idéia da
regulação da expressão de genes de autoantígenos no timo de camundongos
NOD, incluindo aqueles diretamente associados à patogenia do DM-1 como Ins-1,
Ins-2, Ia-2 e Gad67. Entretanto, tais achados são ainda pontuais e por isso
passamos a utilizar o método de microarrays para avaliar de forma mais
abrangente a expressão gênica no timo (PGE).
7.3 Avaliação da inibição do transcrito do gene Aire com RNA interferente
O uso do RNA interferente (RNAi) representa atualmente uma técnica
bastante eficiente e relativamente fácil para a inibição da expressão de genes por
meio da degradação de seus respectivos RNAs mensageiros (Caplen et al., 2004;
Leung et al., 2005; Shankar et al., 2005).
No presente trabalho, essa técnica foi útil para o estudo de um gene de
grande importância para o fenômeno da PGE, o gene Aire (autoimmune
regulator).
Discussão
105
Este gene quando mutado é responsável pelo desenvolvimento no homem
de uma doença autoimune órgão específica, a APECED (autoimmune
polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy) de caráter monogênico
autossômico recessivo (Villaseñor et al., 2005; Mathis & Benoist, 2007; Han,
2007). Com a descoberta de que o gene AIRE é o responsável por esta síndrome,
houve muito interesse em saber seu papel no controle da PGE e
consequentemente na tolerância imunológica. A associação deste gene no
fenômeno da PGE surgiu após a detecção de sua expressão nas células mTEC,
as quais expressam TRAs no timo.
Evidências obtidas com camundongos Aire nocaute demonstraram que
este gene é um fator transcricional responsável pela regulação da expressão de
grande parte de antígenos ectópicos, sendo, portanto, de grande importância para
os processos de seleção dos linfócitos T no timo (Zuklys et al., 2000; Anderson et
al., 2002).
Camundongos Aire nocaute possuem um sistema imune relativamente
normal, mas são afligidos por autoimunidade multi-órgão com a presença de
infiltrados inflamatórios e autoanticorpos (Mathis & Benoist, 2007).
Com intuito de padronizarmos a técnica, inicialmente ensaiamos a inibição
de Aire utilizando uma linhagem de células mTEC em cultura (linhagem 3.10
mTEC com fundo de C57Bl/6) que expressam Aire (Figura 18). Uma vez
constatada a efetiva inibição do gene estudado, passamos então para o sistema
de cultura de timos ATOC.
Decidiu-se avaliar a inibição de Aire após 24 h em cultura ATOC levando
em consideração sua máxima eficiência do sistema de RNAi nesse tempo e
também a freqüência de apoptose em ATOC (Figura 17).
Além disso, estudamos a concentração ideal de RNAi em cultura ATOC
que exibisse melhor inibição de Aire, a qual foi de 50 nM / timo (Figuras 20 e 21).
Uma vez com esses parâmetros chave incluídos em nosso protocolo, partimos
para o estudo do efeito da inibição de Aire no fenômeno de PGE.
Mostramos que tal inibição foi o suficiente para desregular genes que
codificam TRAs no timo, desregulação esta manifestada tanto por indução como
por repressão gênica. Os grupos de genes diferencialmente expressos e
analisados por agrupamento hierárquico mostram claramente padrões de
repressão e indução de muitos genes no estroma tímico de camundongos NOD
Discussão
106
pré-autoimunes quando comparados com os controles (Figuras 24, 25 e 26).
Como abordado anteriormente, o significado do controle do gene Aire no
timo foi observado em estudos com animais Aire nocaute. A ausência desse gene
promove o aparecimento de autoanticorpos, especialmente contra antígenos de
olho e de estômago (Devoss et al., 2006; Gavanescu et al., 2007), sendo
suficiente para causar autoimunidade.
Os dados encontrados no presente trabalho corroboram com esses
autores, pois os estromas tímicos de camundongos NOD pré-autoimunes,
tratados com RNAi anti Aire passaram a expressar um numero menor de genes
associados a olho e sistema digestório, incluindo estômago, uma vez que a
porcentagem de genes de PGE reprimidos superou a de genes induzidos após o
tratamento com RNAi Aire (Figuras 30, 31 e 32).
Além disso, observamos que após a inibição de Aire, há repressão de
genes de TRAs associados ao pâncreas (Figuras 35, 36 e 37 e Tabela VII). Tal
achado, nos parece ser de particular interesse pois, relatamos aqui os genes de
TRAs dependentes da presença de Aire.
7.4 Expressão gênica promiscua no timo
Os experimentos realizados em escala genômica objetivam avaliar os
processos biológicos como um todo, mas com precisão molecular. Usando a
tecnologia de microarrays, a expressão dos RNAs de milhares de genes pode ser
mensurada simultaneamente. O uso da bioinformática na análise da expressão
gênica revela uma profunda lógica molecular e biológica no entendimento da
ativação e diferenciação celulares. Genes que codificam componentes de um
mesmo complexo multi-protéico estão sob regulação coordenada. Esta regulação
coordenada é também observada entre genes que apresentam seus produtos
funcionais participando de um mesmo processo biológico (Staudt & Brown, 2000).
A diversidade de antígenos de órgãos e tecidos parenquimais expressos
no timo (TRAs) de camundongos e de humanos é referida como expressão
gênica promíscua (PGE) e tem grande importância na pesquisa em
imunogenética que se ocupa da reavaliação das bases moleculares da tolerância
central das células T na prevenção da autoimunidade (Kyewski & Derbinski,
2004).
Sendo assim, abriram-se perspectivas para se determinar a modulação e a
Discussão
107
extensão da PGE por meio da técnica de microarrays. No caso do presente
estudo, avaliamos camundongos NOD pré-autoimunes e autoimunes, na tentativa
de relacionarmos o fenômeno da PGE com o desenvolvimento do DM-1.
A PGE é identificada atualmente pela análise de dados de microarrays dos
diferentes genes órgão-específicos representados no timo de camundongo,
usando informações combinadas do banco de dados público GNF SymAtlas
(http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/) (Su et al., 2004). Este banco de dados mostra
a expressão gênica de mais de 60 tecidos/órgãos de camundongos avaliada com
microarrays da Affymetrix (http://www.affimetrix.com) (Figura 27).
No presente trabalho, foram considerados os genes promíscuos cuja
expressão foi significativamente induzida ou reprimida no estroma tímico de
camundongos NOD pré-autoimunes e autoimunes e detectada em órgãos ou
tecidos diferentes, além do timo, e cujos níveis de expressão ultrapassaram a
mediana quando comparados aos demais órgãos.
Assim, o envolvimento de microarrays no trabalho e a estringência
estatística usada no programa SAM, permitiram a observação da manifestação da
PGE na indução de autoimunidade, aqui representada pelo DM-1.
Foi possível demonstrar diferentes perfis de expressão entre os animais
pré-autoimunes e autoimunes, tanto nas amostras de estroma de timos recém
removidos quanto nas amostras de estroma de timos em cultura ATOC.
As análises por agrupamento hierárquico da expressão gênica mostraram
que tanto os animais pré como os autoimunes exibiram padrões diferentes de
expressão gênica e, foram, portanto, incluídos em dois grupos separados. Esses
dados permitem inferência de que o desenvolvimento de DM-1 tem como base
eventos moleculares alterados no timo (Figuras 22 e 23).
O diabetes melitus é uma doença metabólica multi sistêmica decorrente do
comprometimento da produção de insulina resultante da destruição das células β
do pâncreas. Inicialmente, ocorre a infiltração das ilhotas do pâncreas pelas
células T auto-reativas levando à insulite que progride para a destruição das
células β (Castaño & Eisenbarth, 1990; Serreze & Leiter, 1994).
Partindo-se dessas informações, realizou-se um estudo mais refinado da
PGE no modelo de DM-1. Os genes encontrados após a análise de dados de
microarrays pela estatística SAM foram submetidos a análise PGE considerando
tanto os genes reprimidos quanto os induzidos. Os camundongos pré-autoimunes
Discussão
108
apresentaram maior número de genes reprimidos em relação aos autoimunes
(Figuras 28 e 29).
Como a doença atinge primária e preferencialmente o pâncreas, avaliou-se
a expressão de genes de TRAs que representam este órgão e, como visto, eles
se mostraram preferencialmente reprimidos (Figuras 33 e 34 e Tabela VII).
7.5 Regiões cromossômicas de susceptibilidade ao diabetes tipo 1
Tanto influências genéticas como ambientais contribuem com o
desenvolvimento do diabetes. O diabetes autoimune (DM-1) é a forma de
diabetes que é mais dependente dos fatores genéticos. O DM-1 desenvolvido por
camundongos NOD apresenta muitas características genéticas e patofisiológicas
comuns ao DM-1 humano. Em ambas as espécies, os genes do MHC e outros
não-MHC contribuem para a susceptibilidade da doença. Cerca de 20 regiões
não-MHC conhecidas como idd (insulin dependent diabetes) foram associadas ao
risco da doença em camundongos NOD (Maier & Wicker, 2005).
Considerando que essas regiões de susceptibilidade podem afetar a
habilidade da deleção clonal de células T precursoras auto-reativas no timo
(Liston et al., 2004b), a habilidade de apresentar autoantígenos e selecionar
células T auto-reativas (Stratmann et al., 2003), a tolerância periférica e a
atividade das células T ou moléculas com potencial regulatório (Salomon et al.,
2000; Kreuwel et al., 2001) ou a agressividade da lesão (Lyons et al., 2000a),
procurou-se, no presente trabalho, relacionar a PGE com essas regiões de
susceptibilidade.
O gene IL4 (interleucina 4) foi relacionado com a patogenia do DM-1 e se
encontra na região cromossômica de susceptibilidade idd4 (11 B1.3). O gene IL4
se mostrou reprimido nas análises em que houve a inibição de Aire, ou seja, a
inibição desse último levou também à inibição do gene IL4 em animais pré-
autoimunes. Em modelos animais de DM-1 qualquer tentativa de favorecer a
atividade Th2, que corresponde a uma população de células T auxiliares com
produção de citocinas específicas (IL4 e IL10), tem levado à prevenção do
diabetes e há fortes evidências que a administração destas citocinas
imunoregulatórias reduzem o diabetes autoimune (Rapaport et al., 1993; Pennline
et al., 1994).
Discussão
109
Os genes Cd4 (antígeno Cd4) e Cdk4 (quinase 4 dependente de ciclina)
também relacionados ao diabetes foram encontrados em nossas análises. Porém,
suas localizações cromossômicas não coincidem com nenhuma idd conhecida.
Sabe-se que um aumento na expressão de Cdk4 leva à proliferação de células β
(Fatrai et al., 2006). Esse gene foi reprimido após inibição de Aire nos animais
pré- autoimunes.
Uma busca no banco de dados Mouse Genome Informatics
(http://www.informatics.jax.org) para a descoberta dos genes idds (diabetes
dependente de insulina) forneceu 40 genes e suas localizações cromossômicas.
Procuramos mais uma vez relacionar os dados de PGE com os genes do referido
banco de dados. Os resultados mostrados nas Tabelas VIII e IX referem-se a
genes encontrados nas análises de PGE de estroma de camundongos NOD pré-
autoimunes e autoimunes que se encontram em regiões coincidentes com as de
genes idds.
Inferimos assim que esses genes podem ser fortes candidatos a genes
diretamente relacionados com a patogenia da doença.
Uma das estratégias para localizar um gene de grande efeito na
susceptibilidade a um determinado distúrbio baseia-se no conceito de ligação
genética (linkage). Esse conceito refere-se ao fato de que dois loci gênicos
situados muito próximos num mesmo cromossomo tendem a ser herdados juntos
(ligados). Estudos de linkage no genoma total demonstram que múltiplas doenças
auto-imunes exibem loci de susceptibilidade comuns (Wanstrat & Wakeland,
2001). Tais conceitos nos possibilitam sugerir que os genes identificados em
nossas análises, estando eles situados nas mesmas regiões de susceptibilidade
ao DM-1, possam também desempenhar um papel na patogênese da doença.
Os resultados desse trabalho são importantes para um melhor
entendimento dos processos genético-moleculares que ocorrem no estroma
tímico, importantes para a indução de tolerância imunológica central e em
particular para o sistema-modelo de desenvolvimento do diabetes melitus tipo1.
Conclusões
Conclusões
111
8. CONCLUSÕES
1) A linhagem de camundongos NOD (Non Obese Diabetic), que reproduz
diabetes melitus do tipo 1, apresentou expressão diferenciada de genes
do repertório de antígenos relacionados a tecidos (TRAs) no estroma
tímico (expressão gênica promíscua) durante a transição do estado pré-
autoimune para o autoimune .
2) As diferenças encontradas envolvem expressão de genes de antígenos
relacionados diretamente com o pâncreas.
3) A expressão gênica promíscua de TRAs no timo inclui genes de
susceptibilidade ao diabetes melitus do tipo 1.
4) A expressão de RNAm de autoantígenos associados ao diabetes (Ins-2
e Ia-2), no estroma tímico, foi reduzido nos camundongos NOD
autoimunes.
5) Dada a preservação das propriedades morfofisiológicas do timo adulto
em cultura (ATOC), o fenômeno da expressão gênica promíscua (PGE)
pôde ser reproduzido neste sistema modelo.
6) O gene Aire (Auto immune regulator) controla um conjunto de genes de
TRAs no estroma do timo de NOD, incluindo aqueles associados ao
pâncreas, olho e sistema digestório (estômago).
Referências Bibliográficas
Referências Bibliográficas
113
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Zhang L, Sun L, Zhao Y. Thymic epithelial progenitor cells and thymus
regeneration: an update. Cell Res. 17(1):50-55, 2007.
Zucchelli S, Holler P, Yamagata T, Roy M, Benoist C, Mathis D. Defective central
tolerance induction in NOD mice: genomics and genetics. Immunity.
22(3):385-396, 2005.
Zuklys S, Balciunaite G, Agarwal A, Fasler-Kan E, Palmer E, Holländer GA.
Normal thymic architecture and negative selection are associated with Aire
expression, the gene defective in the autoimmune-polyendocrinopathy-
candidiasis-ectodermal dystrophy (APECED). J. Immunol. 165(4): 1976-
1983, 2000.
Anexos
Anexo I
Imagens de Microarrays
Anexo I
131
Figura 38. Imagem típica de hibridização de microarray com sondas fluorescentes (Cy3 e Cy5).
Anexo II
Tabelas de genes do SAM
Anexo II
133
Tabela II. Genes diferencialmente expressos (109) e com significância estatística de acordo com o
programa SAM (FDR = 0,20 e delta = 0,501) em amostras de estroma de timos recém removidos
de camundongos NOD pré-autoimunes e autoimunes.
Expressão Simbolo Nome CloneID Citobanda
Rragc Ras-related GTP binding C IMAGE:583913 4 D
EST - IMAGE:640814 -
EST - IMAGE:641060 -
Nol7 Nucleolar protein 7 IMAGE:641156 13 A4
Zwint ZW10 interactor IMAGE:1327907 10 B5
EST - IMAGE:583428 -
EST - IMAGE:576256 -
EST - IMAGE:575254 -
Il18 Interleukin 18 IMAGE:1328063 9 A5
Clec1b
C-type lectin domain family 1,
member b IMAGE:574821 6 F3
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:641074 7
Xcl1 Chemokine (C motif) ligand 1 IMAGE:576815 1 H2.2
Prdm10 PR domain containing 10 IMAGE:640355 9 A4
Slbp Stem-loop binding protein IMAGE:575728 5 B2
Rpl21 Ribosomal protein L21 IMAGE:1243370 5 G3
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:582955 7
EST - IMAGE:640359 -
Rfxap
Regulatory factor X-
associated protein IMAGE:575562 3 D
Phc3
Polyhomeotic-like 3
(Drosophila) IMAGE:1346045 3 A3
Ccnb1 Cyclin B1 IMAGE:576166 13 D1
G3bp1
Ras-GTPase-activating
protein SH3-domain binding
protein 1
IMAGE:640974 11 B1.3
Eif3s5
Eukaryotic translation
initiation factor 3, subunit 5
(epsilon)
IMAGE:575801 7 E3
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:575368 2
EST - IMAGE:640785 -
EST - IMAGE:575672 -
Mmp14
Matrix metallopeptidase 14
(membrane-inserted) IMAGE:573066 14 C2
EST - IMAGE:575780 -
Grb2
Growth factor receptor bound
protein 2
IMAGE:575387 11 E2|
1810020D17Rik
RIKEN cDNA 1810020D17
gene IMAGE:583707 7 E1
Ube2r2
Ubiquitin-conjugating enzyme
E2R 2 IMAGE:582562 4 B1
Ankrd40 Ankyrin repeat domain 40 IMAGE:581765 11 C
Ndufa11
NADH dehydrogenase
(ubiquinone) 1 alpha
subcomplex 11
IMAGE:574266 17 D
EST - IMAGE:583504 -
EST - IMAGE:576190 -
D10Ertd610e
DNA segment, Chr 10,
ERATO Doi 610, expressed IMAGE:576334 10 D3
Mrpl34
Mitochondrial ribosomal
protein L34
IMAGE:575652 8 B3.3
Cyb5b Cytochrome b5 type B IMAGE:640762 8 D2
Genes
Induzidos
2810021B07Rik RIKEN cDNA 2810021B07 IMAGE:576310 13 A3.1
Anexo II
134
Lss Lanosterol synthase IMAGE:641986 10 C1|
EST - IMAGE:640118 -
EST - IMAGE:641125 -
C330006K01Rik
RIKEN cDNA C330006K01
gene
IMAGE:640249 5 G2
1300012G16Rik
RIKEN cDNA 1300012G16
gene IMAGE:640297 5 F
EST - IMAGE:583825 -
Sfrs5
Splicing factor,
arginine/serine-rich 5 IMAGE:583131 12 D2
Prkar2b
Protein kinase, cAMP
dependent regulatory, type II
beta
IMAGE:640704 12 B1
EST - IMAGE:639721 -
Inpp5f
Inositol polyphosphate-5-
phosphatase F
IMAGE:640224 7 F3
Gpld1
Glycosylphosphatidylinositol
specific phospholipase D1 IMAGE:640248 13 A3.1
EST - IMAGE:640624 -
Hnrpd1
Heterogeneous nuclear
ribonucleoprotein D-like IMAGE:640623 5 E4
Hltf
Helicase-like transcription
factor
IMAGE:639807 3 A2
EST - IMAGE:640621 -
Suz12
Suppressor of zeste 12
homolog (Drosophila) IMAGE:640237 11 B5
EST - IMAGE:639825 -
EST - IMAGE:640209 -
Eif4g2
Eukaryotic translation
initiation factor 4, gamma 2 IMAGE:640625 7 E3
Rap1a RAS-related protein-1ª IMAGE:583523 3 F2.2
EST - IMAGE:583778 -
Epc1
Enhancer of polycomb
homolog 1 (Drosophila) IMAGE:583089 18 A1
EST - IMAGE:640840 -
Arpp21
Cyclic AMP-regulated
phosphoprotein, 21 IMAGE:582891 9 F3
Lsp1 Lymphocyte specific 1 IMAGE:640873 7 F5|
EST - IMAGE:640900 -
EST - IMAGE:583106 -
Sfrs1
Splicing factor,
arginine/serine-rich 1
IMAGE:583015 11 C
EST - IMAGE:583826 -
EST - IMAGE:583245 -
Afmid Arylformamidase IMAGE:582985 11 E2
Sox4 SRY-box containing gene 4 IMAGE:639914 13 A3-A5
EST - IMAGE:640241 -
Sypl Synaptophysin-like protein IMAGE:640468 12 B2
Tcea3
Transcription elongation
factor A (SII), 3 IMAGE:573147 4 D3
EST - IMAGE:640428 -
Pdia4
Protein disulfide isomerase
associated 4
IMAGE:4971952 6 B2.3
EST - IMAGE:582951 -
Irf8 Interferon regulatory factor 8 IMAGE:640774 8 E1
Genes
Reprimidos
Slc7a11
Solute carrier family 7
(cationic amino acid
transporter, y+ system),
member 11 IMAGE:575418 3 D
Anexo II
135
Nebl Nebulette IMAGE:639873 2 A2
EST - IMAGE:639849 -
Stx18 Syntaxin 18 IMAGE:640560 5 B3
EST - IMAGE:640033 -
EST - IMAGE:640176 -
EST - IMAGE:640589 -
Shmt1
Serine hydroxymethyl
transferase 1 (soluble)
IMAGE:573743 11 B2
EST - IMAGE:583270 -
P2rx1
Purinergic receptor P2X,
ligand-gated ion channel, 1 IMAGE:576538 11 B4
H2-Q8
Histocompatibility 2, K1, K
region
IMAGE:583608 17 B1
H2-Q8
Histocompatibility 2, K1, K
region IMAGE:583704 17 B1
EST - IMAGE:583010 -
EST - IMAGE:639711 -
EST - IMAGE:640680 -
EST - IMAGE:640793 -
Kdelr1
KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu)
endoplasmic reticulum protein
retention receptor 1
IMAGE:640576 7 B3
Fcho2 FCH domain only 2 IMAGE:639755 13 D1
EST - IMAGE:640909 -
EST - IMAGE:641007 -
Ogt
O-linked N-acetylglucosamine
(GlcNAc) transferase (UDP-
N-
acetylglucosamine:polypeptid
e-N-acetylglucosaminyl
transferase) IMAGE:583678 X D
Tmem115 Transmembrane protein 115 IMAGE:582843 9 F1
EST - IMAGE:640632 -
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:640298 4
5730410I19Rik
RIKEN cDNA 5730410I19
gene IMAGE:640528 12 F1
Hdac1 Histone deacetylase 1 IMAGE:641105 4 D2.2|
Nsd1
Nuclear receptor-binding
SET-domain protein 1 IMAGE:641011 13 B1
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:1361796 14
Bclaf1
BCL2-associated
transcription factor 1
IMAGE:641008 10 A3
EST - IMAGE:640924 -
Igf1r
Insulin-like growth factor I
receptor IMAGE:640403 7 C
Genes
Reprimidos
Plxnd1 Plexin D1 IMAGE:583349 6 E3
Anexo II
136
Tabela III. Genes diferencialmente expressos (89) e com significância estatística de acordo com o
programa SAM (FDR = 0,20 e delta = 0,463) em amostras de estroma de timos em cultura ATOC
de camundongos NOD pré-autoimunes e autoimunes.
Expressão Simbolo Nome CloneID Citobanda
Men1
Multiple endocrine neoplasia
1 IMAGE:576049 19 A
Pdpk1
3-phosphoinositide
dependent protein kinase-1
IMAGE:575945 17 A3.3
EST - IMAGE:575126 -
9530068E07Rik
RIKEN cDNA 9530068E07
gene IMAGE:641079 11 B1.3
CXCL10
Chemokine (C-X-C motif)
ligand 10 IMAGE:2069299 4q21
IL12A
Interleukin 12A (natural killer
cell stimulatory factor 1,
cytotoxic lymphocyte
maturation factor 1, p35) IMAGE:1912458
3q25.33-
q26
Genes
Induzidos
CD209 CD209 molecule IMAGE:469815 19p13
Brd9 Bromodomain containing 9 IMAGE:577648 13 C1
Nsd1
Nuclear receptor-binding
SET-domain protein 1 IMAGE:641011 13 B1
Hnrpul2
Heterogeneous nuclear
ribonucleoprotein U-like 2 IMAGE:576590 19 A
BRCA1 Breast cancer 1, early onset IMAGE:1333778 17q21
Myg1
Melanocyte proliferating gene
1
IMAGE:583514 15 F3
ATM
Ataxia telangiectasia mutated
(includes complementation
groups A, C and D) IMAGE:1877532 11q22-q23
Prdx6 Peroxiredoxin 6 IMAGE:640989 1 H2.1
Park7
Parkinson disease
(autosomal recessive, early
onset) 7
IMAGE:640406 4 E1
S100pbp S100P binding protein IMAGE:640965 4 D2.3
FANCC
Fanconi anemia,
complementation group C IMAGE:1637797 9q22.3
Tmco6
Transmembrane and coiled-
coil domains 6
IMAGE:583157 18 B3
Hspa8 Heat shock protein 8 IMAGE:575712 9 A5.1
Bcl6 B-cell leukemia/lymphoma 6 IMAGE:573624 16 B1
IRF5 Interferon regulatory factor 5 IMAGE:260035 7q32
Gzma Granzyme A IMAGE:572830 13 D
Cd8a CD8 antigen, alpha chain IMAGE:1247019 6 C
EST - IMAGE:583269 -
Jarid1b
Jumonji, AT rich interactive
domain 1B (Rbp2 like) IMAGE:582793 1 E4
Transcribed locus Ribosomal protein L18A IMAGE:583588 8 B3.3
EST - IMAGE:582892 -
Smc4
Structural maintenance of
chromosomes 4
IMAGE:582972 3 E2
EST - IMAGE:583825 -
Cyb561d2
Cytochrome b-561 domain
containing 2 IMAGE:640083 9 F1
Nf2 Neurofibromatosis 2 IMAGE:640467 11 A1
Genes
Reprimidos
R3hdm1
R3H domain 1 (binds single-
stranded nucleic acids) IMAGE:640077
1 E4
Anexo II
137
Spg20
Spastic paraplegia 20, spartin
(Troyer syndrome) homolog
(human)
IMAGE:573449 3 C
Sfrs1
Splicing factor,
arginine/serine-rich 1
(ASF/SF2)
IMAGE:640898 11 C
Parp3
Poly (ADP-ribose)
polymerase family, member 3 IMAGE:640154 9 F1
Zcchc7
Zinc finger, CCHC domain
containing 7 IMAGE:575396 4 B1
ITGA5
Integrin, alpha 5 (fibronectin
receptor, alpha polypeptide)
IMAGE:135671 12q11-q13
EST - IMAGE:640176 -
Transcribed lócus Transcribed locus IMAGE:639657 5 B3
Slc9a3r1
Solute carrier family 9
(sodium/hydrogen
exchanger), isoform 3
regulator 1 IMAGE:582986 11 E2
EST - IMAGE:639969 -
Elk4
ELK4, member of ETS
oncogene family IMAGE:583566 1 E3-G
Bnip2
BCL2/adenovirus E1B
interacting protein 1, NIP2
IMAGE:640945 9 D
EST - IMAGE:640921 -
Ubxd1 UBX domain containing 1 IMAGE:583564 17 C
Pak4
P21 (CDKN1A)-activated
kinase 4 IMAGE:640017 7 A3
Map4k4
Mitogen-activated protein
kinase kinase kinase kinase 4 IMAGE:583185 1
EST - IMAGE:640784 -
Etv3 Ets variant gene 3 IMAGE:583667 3 F1
Fcna Ficolin A IMAGE:583643 2 A3
Tssc1
Tumor suppressing
subtransferable candidate 1 IMAGE:640062 12 A2
EST - IMAGE:640900 -
D4Wsu53e
DNA segment, Chr 4, Wayne
State University 53,
expressed
IMAGE:582868 4 D3
Cxcl4
Chemokine (C-X-C motif)
ligand 4 IMAGE:573339 5 E2
Transcribed lócus Transcribed locus IMAGE:640875 -
Rbm39 RNA binding motif protein 39 IMAGE:640923 2 H1
Tcea3
Transcription elongation
factor A (SII), 3 IMAGE:573147 4 D3
SLC11A1
Solute carrier family 11
(proton-coupled divalent
metal ion transporters),
member 1 IMAGE:140625 2q35
Ttll4
Tubulin tyrosine ligase-like
family, member 4
IMAGE:582821 1 C3
EST - IMAGE:583897 -
EST - IMAGE:639711
Lck
Lymphocyte protein tyrosine
kinase IMAGE:640179 4 D2.2
Genes
Reprimidos
Ywhah
Tyrosine 3-
monooxygenase/tryptophan
5-monooxygenase activation
protein, eta polypeptide
IMAGE:640494 5 B1
Anexo II
138
Mthfr
5,10-
methylenetetrahydrofolate
reductase
IMAGE:640110 4 E2
EST - IMAGE:640518 -
Rac2
RAS-related C3 botulinum
substrate 2 IMAGE:640180 15 E1
EST - IMAGE:640564 -
Mthfr
5,10-
methylenetetrahydrofolate
reductase
IMAGE:640134 4 E2
Epc1
Enhancer of polycomb
homolog 1 (Drosophila)
IMAGE:583089 18 A1
EST - IMAGE:640612 -
EST - IMAGE:640400 -
EST - IMAGE:640861 -
EST - IMAGE:640885 -
Sfrs5
Splicing factor,
arginine/serine-rich 5 (SRp40,
HRS) IMAGE:583131 12 D2
2810403ª07Rik
RIKEN cDNA 2810403ª07
gene
IMAGE:583082 3 F1
C3 Complement component 3 IMAGE:582886 17 E1-E3
EST - IMAGE:582798 -
Sec24c
SEC24 related gene family,
member C (S. cerevisiae) IMAGE:582822 14 A3
Ddx51
DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box
polypeptide 51 IMAGE:639801 5 F
EST - IMAGE:640445 -
2010001A14Rik
RIKEN cDNA 2010001A14
gene
IMAGE:640493 11 B1.3
EST - IMAGE:640540 -
EST - IMAGE:582961 -
Acat3
Acetyl-Coenzyme A
acetyltransferase 2 IMAGE:583609 17 A1
EST - IMAGE:640516 -
Gnpda2
Glucosamine-6-phosphate
deaminase 2
IMAGE:582795 5 D
EST - IMAGE:639726 -
Genes
Reprimidos
EST - IMAGE:582870 -
Anexo II
139
Tabela IV. Genes diferencialmente expressos (122 abordados dos 360 encontrados) e com
significância estatística de acordo com o programa SAM (FDR = 0,20 e delta = 0,251) em
amostras de estroma de timos em cultura ATOC de camundongos NOD pré-autoimunes tratados
com RNAi Aire e com RNAi controle e não tratados (controle).
Expressão Simbolo Nome CloneID Citobanda
Cebpg
CCAAT/enhancer binding
protein (C/EBP), gamma
IMAGE:641074 7 B1
Sema4d
Sema domain,
immunoglobulin domain (Ig),
transmembrane domain (TM)
and short cytoplasmic
domain, (semaphorin) 4D IMAGE:583259 13 B1
EST - IMAGE:640373 -
Bcap31
B-cell receptor-associated
protein 31 IMAGE:574060 X A6
Ctf1 Cardiotrophin 1 IMAGE:1225744 7 F3
D2Ertd750e
DNA segment, Chr 2, ERATO
Doi 750, expressed
IMAGE:575429 2 E5
Aim1 Absent in melanoma 1 IMAGE:640153 10 B2
EST - IMAGE:639776 -
Mmp14
Matrix metallopeptidase 14
(membrane-inserted) IMAGE:573066 14 C2
Mettl3 Methyltransferase-like 3 IMAGE:575046 14 C2
EST - IMAGE:583611 -
Abca5
ATP-binding cassette, sub-
family A (ABC1), member 5
IMAGE:582867 11 E1
2810455D13Rik
RIKEN cDNA 2810455D13
gene IMAGE:582820 19
EST - IMAGE:583324 -
EST - IMAGE:639724 -
2310035C23Rik
RIKEN cDNA 2310035C23
gene IMAGE:573037 1 D
EST - IMAGE:640972 -
EST - IMAGE:573496 -
EST - IMAGE:583924 -
Nol6
Nucleolar protein family 6
(RNA-associated)
IMAGE:583756 4 A5
Fbxl11
F-box and leucine-rich repeat
protein 11 IMAGE:639916 19 A
Tmem115 Transmembrane protein 115 IMAGE:582843 9 F1
Sh3yl1 Sh3 domain YSC-like 1 IMAGE:641043 12 A2
Alg9
Asparagine-linked
glycosylation 9 homolog
(yeast, alpha 1,2
mannosyltransferase) IMAGE:639947 9 A5.3
Myg1
Melanocyte proliferating gene
1
IMAGE:640034 15 F3
2610318N02Rik
RIKEN cDNA 2610318N02
gene IMAGE:1263539 16 A3
Trim17 Tripartite motif protein 17 IMAGE:1263520
11 B1.2-
B1.3
Cd34 CD34 antigen IMAGE:573426 1 H6
EST - IMAGE:640539 -
Es2el
Expressed sequence 2
embryonic lethal
IMAGE:583108 16 B1-B3
Genes
Induzidos
Fen1
Flap structure specific
endonuclease 1 IMAGE:639819 19 A
Anexo II
140
Ankrd16 Ankyrin repeat domain 16 IMAGE:583852
2 A1
Akt1
Thymoma viral proto-
oncogene 1 IMAGE:575486 12 F1-F2
Genes
Induzidos
EST - IMAGE:576044 -
Gdap2
Ganglioside-induced
differentiation-associated-
protein 2
IMAGE:641674 3 F2.2
Ypel2 Yippee-like 2 (Drosophila) IMAGE:576464 11 C
Ube2r2
Ubiquitin-conjugating enzyme
E2R 2 IMAGE:582562 4 B1
Smc4
Structural maintenance of
chromosomes 4
IMAGE:582900 3 E2
5730494M16Rik
RIKEN cDNA 5730494M16
gene IMAGE:583861 18 A2
Tcrg-C
T-cell receptor gamma,
constant region IMAGE:640129 13 A2
Pcmtd2
Protein-L-isoaspartate (D-
aspartate) O-
methyltransferase domain
containing 2 IMAGE:641904 2 H4
Grb2
Growth factor receptor bound
protein 2
IMAGE:575387 11 E2
Ifit1
Interferon-induced protein
with tetratricopeptide repeats
1 IMAGE:575371 19 C1
EST - IMAGE:575796 -
Rbm39 RNA binding motif protein 39 IMAGE:583614 2 H1
Rab2
RAB2, member RAS
oncogene family
IMAGE:573835 4 A1
EST - IMAGE:583009 -
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:138013 X
Slbp Stem-loop binding protein IMAGE:583806 5 B2
Tnfrsf13b
Tumor necrosis factor
receptor superfamily, member
13b
IMAGE:574040 11 B2
1110018J18Rik
RIKEN cDNA 1110018J18
gene IMAGE:639771 13 B3
Rrp1b
Ribosomal RNA processing 1
homolog B IMAGE:575876 17 B1
Atad2
ATPase family, AAA domain
containing 2
IMAGE:1225539 15 D2
EST - IMAGE:575350 -
Golga1
Golgi autoantigen, golgin
subfamily a, 1 IMAGE:578069 2 B
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:1225946 12
Xpot
Exportin, tRNA (nuclear
export receptor for tRNAs) IMAGE:639640 10 D3
Lrba
LPS-responsive beige-like
anchor
IMAGE:573828
Col6a1 Procollagen, type VI, alpha 1 IMAGE:1281632 10 41.1 cM
Hivep2
Human immunodeficiency
virus type I enhancer binding
protein 2
IMAGE:1282235 10
EST - IMAGE:583270 -
2010003O18Rik
RIKEN cDNA 2010003O18
gene IMAGE:583080 5 F
EST - IMAGE:640225 -
Genes
Reprimidos
Ide Insulin degrading enzyme IMAGE:574241 19 C2
Anexo II
141
Mat2b
Methionine
adenosyltransferase II, beta
IMAGE:583812 11 A5
Glb1 Galactosidase, beta 1 IMAGE:583856 9 F3
NKRF NF-kappaB repressing factor IMAGE:21961 Xq24
EST - IMAGE:640247 -
EST - IMAGE:583438 -
Ppm1h
Protein phosphatase 1H
(PP2C domain containing) IMAGE:583693 10 D2
Gfi1 Growth factor independent 1 IMAGE:640751 5 F
EST - IMAGE:640367 -
Letm2
Leucine zipper-EF-hand
containing transmembrane
protein 2
IMAGE:1224844 8 A2
BC030183 CDNA sequence BC030183 IMAGE:575904 4 D2.2
Il4 Interleukin 4 IMAGE:640300 11 B1.3
D4Wsu53e
DNA segment, Chr 4, Wayne
State University 53,
expressed
IMAGE:583830 4 D3
EST - IMAGE:583854 -
EST - IMAGE:576256 -
EST - IMAGE:583215 -
D430001N20
Hypothetical protein
D430001N20 IMAGE:583191 6 C1
1500032D16Rik
RIKEN cDNA 1500032D16
gene IMAGE:583789 17 A3.3
Cd4 CD4 antigen IMAGE:640273 6 F2
EST - IMAGE:575206 -
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:575368 2
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:583382 5
EST - IMAGE:640986 -
EST - IMAGE:583429 -
EST - IMAGE:640117 -
Laptm5
Lysosomal-associated protein
transmembrane 5 IMAGE:639946 4 D2.3
EST - IMAGE:640813 -
Pcbp3 Poly(rC) binding protein 3 IMAGE:583766
10 B5.1-
B5.3
Rnpep
Arginyl aminopeptidase
(aminopeptidase B)
IMAGE:582632 1 E4
EST - IMAGE:583601 -
Shmt1
Serine hydroxymethyl
transferase 1 (soluble) IMAGE:573743 11 B2
Ankrd37 Ankyrin repeat domain 37 IMAGE:576620 8 B1.1
Chchd8
Coiled-coil-helix-coiled-coil-
helix domain containing 8 IMAGE:574276 7 E2
EST - IMAGE:640817 -
2410022M11Rik
RIKEN cDNA 2410022M11
gene
IMAGE:640727 14
G3bp1
ãs-GTPase-activating
protein SH3-domain binding
protein 1 IMAGE:640974 11 B1.3
Prss16 Protease, serine, 16 (thymus) IMAGE:640501 13 A3-A5
Jak2 Janus kinase 2 IMAGE:5068946 19 C1
Chd1
Chromodomain helicase DNA
binding protein 1 IMAGE:640262 17 A2
Hist1h2bc Histone cluster 1, H2bc IMAGE:640662 13 A3.1
EST - IMAGE:640663 -
Genes
Reprimidos
Hist1h2bc
Histone cluster 1, H2bc
IMAGE:640662 13 A3.1
Anexo II
142
Hipk1
Homeodomain interacting
protein kinase 1
IMAGE:583858 3 F3
2510003E04Rik
RIKEN cDNA 2510003E04
gene IMAGE:640070 10 B4
Itm2b Integral membrane protein 2B IMAGE:640094 14 D2
Map3k11
Mitogen activated protein
kinase kinase kinase 11 IMAGE:575211 19 A
EST - IMAGE:583245 -
Sit1
Suppression inducing
transmembrane adaptor 1
IMAGE:576098 4 B1
EST IMAGE:640609 -
Tbce Tubulin-specific chaperone e IMAGE:582730 13 A1
Ing2
Inhibitor of growth family,
member 2 IMAGE:1225637 8 B2
Ly6d
Lymphocyte antigen 6
complex, ócus D
IMAGE:581909 15 D3
Ccl25
Chemokine (C-C motif) ligand
25 IMAGE:575567 8 A1.1
EST - IMAGE:640272 -
C1orf61
Chromosome 1 open reading
frame 61 IMAGE:43771 1q22
Ada Adenosine deaminase IMAGE:577879 2 H3
E2f2 E2F transcription factor 2 IMAGE:640754 4 D3
EST - IMAGE:640791
Genes
Reprimidos
Tdg Thymine DNA glycosylase IMAGE:642198 10 C1
Anexo II
143
Tabela V. Genes diferencialmente expressos (53) e com significância estatística de acordo com o
programa SAM (FDR = 0,20 e delta = 0,414) em amostras de estroma de timos em cultura ATOC
de camundongos NOD pré-autoimunes tratados com RNAi Aire e não tratados (controle).
Expressão Simbolo Nome CloneID Citobanda
Fbxl11
F-box and leucine-rich repeat
protein 11 IMAGE:639916 19 A
EST - IMAGE:582948 -
EST - IMAGE:576020 -
Trim17 Tripartite motif protein 17 IMAGE:1263520
11 B1.2-
B1.3
A430079K02
0 day neonate thymus cDNA,
RIKEN full-length enriched
library, clone:A430079K02
product:unclassifiable, full
insert sequence IMAGE:640409 12
Cd34 CD34 antigen IMAGE:573426 1 H6
EST - IMAGE:583243 -
Mmp14
Matrix metallopeptidase 14
(membrane-inserted) IMAGE:573066 14 C2
2310035C23Rik
RIKEN cDNA 2310035C23
gene IMAGE:573037 1 D
Fbxo46 F-box protein 46 IMAGE:1330038 7 A3
Ankrd16 Ankyrin repeat domain 16 IMAGE:583852 2 A1
Cebpg
CCAAT/enhancer binding
protein (C/EBP), gamma IMAGE:641074 7 B1
Abca5
ATP-binding cassette, sub-
family A (ABC1), member 5
IMAGE:582867 11 E1
EST - IMAGE:582988 -
EST - IMAGE:573496 -
EST - IMAGE:640539 -
2610318N02Rik
RIKEN cDNA 2610318N02
gene IMAGE:1263539 16 A3
Es2el
Expressed sequence 2
embryonic lethal IMAGE:583108 16 B1-B3
Fen1
Flap structure specific
endonuclease 1
IMAGE:639819 19 A
C230096C10Rik
RIKEN cDNA C230096C10
gene IMAGE:583779 4 D3
Alg9
Asparagine-linked
glycosylation 9 homolog
(yeast, alpha 1,2
mannosyltransferase) IMAGE:639947 9 A5.3
Akt1
Thymoma viral proto-
oncogene 1
IMAGE:575486 12 F1-F2
Genes
Induzidos
EST - IMAGE:576044 -
Ankrd37
Ankyrin repeat domain 37
IMAGE:576620 8 B1.1
Shmt1
Serine hydroxymethyl
transferase 1 (soluble) IMAGE:573743 11 B2
TLR2 Toll-like receptor 2 IMAGE:4753177 4q32
CCR5
Chemokine (C-C motif)
receptor 5
IMAGE:2119876 3p21.31
NKRF NF-kappaB repressing factor IMAGE:21961 Xq24
Jak2 Janus kinase 2 IMAGE:5068946 19 C1
EST - IMAGE:640117 -
Genes
Reprimidos
Prss16
Protease, serine, 16 (thymus)
IMAGE:640501 13 A3-A5
Anexo II
144
Taf12
TAF12 RNA polymerase II,
TATA box binding protein
(TBP)-associated factor
IMAGE:583488 4 D2.3
Hist1h2bc Histone cluster 1, H2bc IMAGE:640662 13 A3.1
Anxa1 Annexin A1 IMAGE:640284 19 B
G3bp1
Ras-GTPase-activating
protein SH3-domain binding
protein 1
IMAGE:640974 11 B1.3
Ptpra
Protein tyrosine phosphatase,
receptor type, A IMAGE:583653 2 G
EST - IMAGE:575206 -
Rc3h2
Ring finger and CCCH-type
zinc finger domains 2
IMAGE:583335 2 B
Snora69
Small nucleolar RNA, H/ACA
box 69 IMAGE:640343 X A3.3
EST - IMAGE:640367 -
EST - IMAGE:640391 -
Hist1h2bc Histone cluster 1, H2bc IMAGE:640662 13 A3.1
EST - IMAGE:640986 -
Mis12 MIS12 homolog (yeast) IMAGE:583716 11 B4
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:575368 2
EST - IMAGE:575350 -
EST - IMAGE:583269 -
Cd8a CD8 antigen, alpha chain IMAGE:1247019 6 C
2410022M11Rik
RIKEN cDNA 2410022M11
gene IMAGE:640727 14
EST - IMAGE:640609 -
Tbce Tubulin-specific chaperone e IMAGE:582730 13 A1
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:1225946 12 A1.3
Genes
Reprimidos
EST - IMAGE:583009 -
Anexo II
145
Tabela VI . Genes diferencialmente expressos (370) e com significância estatística de acordo com
o programa SAM (FDR = 0,20 e delta = 0,448) em amostras de estroma de timos em cultura
ATOC de camundongos NOD pré-autoimunes tratados com RNAi Aire e com RNAi controle.
Expressão Simbolo Nome CloneID Citobanda
Dctn4 Dynactin 4 IMAGE:640452 18 D2
EST - IMAGE:641020 -
EST - IMAGE:639831 -
EST - IMAGE:640743 -
EST - IMAGE:640118 -
Pphln1 Periphilin 1 IMAGE:639744 15 E3
2310037I24Rik
RIKEN cDNA 2310037I24
gene IMAGE:640331 15 F2
EST - IMAGE:640934 -
Paqr8
Progestin and adipoQ
receptor family member VIII IMAGE:575398 1 A5
EST - IMAGE:640924 -
Hrh3 Histamine receptor H 3 IMAGE:573677 2 H4
Ube2v1
Ubiquitin-conjugating enzyme
E2 variant 1
IMAGE:583840 2 49.6 cM
4932433N03Rik
RIKEN cDNA 4932433N03
gene IMAGE:640355 9
Hsp110 Heat shock protein 110 IMAGE:582878 5 G3
EST - IMAGE:583456 -
Nlk Nemo like kinase IMAGE:583331 11 B5
Arpp21
Cyclic AMP-regulated
phosphoprotein, 21
IMAGE:582891 9 F3
EST - IMAGE:641075 -
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:640875 7
EST - IMAGE:582940 -
Mmp14
Matrix metallopeptidase 14
(membrane-inserted) IMAGE:573066 14 C2
Rbm39 RNA binding motif protein 39 IMAGE:640923 2 H1
EST - IMAGE:640037 -
9130404D08Rik
RIKEN cDNA 9130404D08
gene IMAGE:583561 8 C1
Acat3
Acetyl-Coenzyme A
acetyltransferase
IMAGE:583609 17 A1
D14Ertd449e
DNA segment, Chr 14,
ERATO Doi 449, expressed IMAGE:640010 14 B
Sox4 SRY-box containing gene 4 IMAGE:573051 13 A3-A5
EST - IMAGE:583611 -
EST - IMAGE:640588 -
Arhgap4
Rho GTPase activating
protein 4
IMAGE:582914 X A7.3
Sfrs1
Splicing factor,
arginine/serine-rich 1
(ASF/SF2) IMAGE:640898 11 C
EST - IMAGE:640948 -
Rpl18a Ribosomal protein L18A IMAGE:583588 8 B3.3
EST - IMAGE:583130 -
Rpl7a Ribosomal protein L7a IMAGE:582916 2 A3
Aim1 Absent in melanoma 1 IMAGE:640153 10 B2
Mecp2 Methyl CpG binding protein 2 IMAGE:581748 X A7.3
Genes
Induzidos
Sirt3
Sirtuin 3 (silent mating type
information regulation 2,
homolog) 3 (S. cerevisiae)
IMAGE:640394 7 F4
Anexo II
146
EST - IMAGE:575254 -
EST - IMAGE:582106 -
EST - IMAGE:583395 -
Anxa3 Annexin A3 IMAGE:573265 5 E3
EST - IMAGE:640642 -
Es2el
Expressed sequence 2
embryonic lethal
IMAGE:583108 16 B1-B3
Rela
V-rel reticuloendotheliosis
viral oncogene homolog A
(avian) IMAGE:574694 19 B1-3
EST - IMAGE:640424 -
Tor1aip1 Torsin A interacting protein 1 IMAGE:639754 1 G3
Nf2 Neurofibromatosis 2 IMAGE:640467 11 A1
EST - IMAGE:640105 -
Hexb Hexosaminidase B IMAGE:575852 13 D1
EST - IMAGE:582796 -
Clec1b
C-type lectin domain family 1,
member b IMAGE:574821 6 F3
EST - IMAGE:583897 -
EST - IMAGE:640562 -
EST - IMAGE:640933 -
Prkar2b
Protein kinase, cAMP
dependent regulatory, type II
beta
IMAGE:640704 12 B1
EST - IMAGE:583899 -
EST - IMAGE:640795 -
Dnaja2
DnaJ (Hsp40) homolog,
subfamily A, member 2 IMAGE:1225247 8 C4
Myg1
Melanocyte proliferating gene
1 IMAGE:640034 15 F3
Grk6
G protein-coupled receptor
kinase 6
IMAGE:640178 13 B1-3
Eif4ebp2
Eukaryotic translation
initiation factor 4E binding
protein 2
IMAGE:582913 10 B4-B5
EST - IMAGE:582865 -
Nup50 Nucleoporin 50 IMAGE:639698 15 E2
EST - IMAGE:640428 -
EST - IMAGE:640404 -
EST - IMAGE:640539 -
Nol7 Nucleolar protein 7 IMAGE:640296 13 A4
EST - IMAGE:640680 -
EST - IMAGE:640984 -
EST - IMAGE:640957 -
Rbms1
RNA binding motif, single
stranded interacting protein 1 IMAGE:583875 2 C3
Fen1
Flap structure specific
endonuclease 1 IMAGE:639819 19 A
Lrpap1
Low density lipoprotein
receptor-related protein
associated protein 1
IMAGE:639699 5 B2
EST - IMAGE:640633 -
Dtymk Deoxythymidylate kinase IMAGE:583035 1 D
0610038F07Rik
RIKEN cDNA 0610038F07
gene
IMAGE:583455 19 A
Akt1
Thymoma viral proto-
oncogene 1 IMAGE:575486 12 F1-F2
Genes
Induzidos
Dnpep
Aspartyl aminopeptidase
IMAGE:641031 1 C3
Anexo II
147
A4galt
Alpha 1,4-
galactosyltransferase
IMAGE:582967 15 E1
Pltp Phospholipid transfer protein IMAGE:640088 2 H3
EST - IMAGE:640373 -
Wrnip1
Werner helicase interacting
protein 1 IMAGE:583479 13 A4
EST
Transcribed locus, strongly
similar to XP_489089.1
hypothetical protein
XP_489089 [Mus musculus] IMAGE:639996 -
Ppp1r14b
Protein phosphatase 1,
regulatory (inhibitor) subunit
14B
IMAGE:639973 19 A
Errfi1
ERBB receptor feedback
inhibitor 1 IMAGE:640765 4 E1
EST - IMAGE:583267 -
Nck2
Non-catalytic region of
tyrosine kinase adaptor
protein 2
IMAGE:640608 1 C1
EST - IMAGE:583319 -
Enoph1 Enolase-phosphatase 1 IMAGE:640354 5 E4
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:583511 17
EST - IMAGE:583103 -
Flna Filamin, alpha IMAGE:640772 X A7.3
EST - IMAGE:641087 -
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:640175 2
Ebi3
Epstein-Barr virus induced
gene 3 IMAGE:1265208 17 C
EST - IMAGE:583367 -
EST - IMAGE:640853 -
EST - IMAGE:583223 -
EST - IMAGE:583365 -
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:640684 9
Sfrs5
Splicing factor,
arginine/serine-rich 5 (SRp40,
HRS) IMAGE:583131 12 D2
EST - IMAGE:583106 -
Smpd4
Sphingomyelin
phosphodiesterase 4
IMAGE:640732 16 B1
EST - IMAGE:640252 -
Ctsl Cathepsin L IMAGE:583530 13 B3
EST - IMAGE:640900 -
EST - IMAGE:641100 -
Hdac1 Histone deacetylase 1 IMAGE:641105 4 D2.2
Bcap31
B-cell receptor-associated
protein 31 IMAGE:574060 X A6
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:639995 13
EG621205 Predicted gene, EG621205 IMAGE:640982 X D
Pkig
Protein kinase inhibitor,
gamma IMAGE:583036 2 H3
EST - IMAGE:575672 -
Nlk Nemo like kinase IMAGE:582998 11 B5
EST - IMAGE:640766 -
EST - IMAGE:641131 -
Hcst
Hematopoietic cell signal
transducer IMAGE:640698 7 B1
Glrx5
Glutaredoxin 5 homolog (S.
cerevisiae) IMAGE:640672 12 E
Genes
Induzidos
EST - IMAGE:640372 -
Anexo II
148
EST - IMAGE:640981 -
Myh11
Myosin, heavy polypeptide
11, smooth muscle
IMAGE:583021 16 A1
EST - IMAGE:639732 -
EST - IMAGE:640909 -
EST - IMAGE:640884 -
Klhdc5 Kelch domain containing 5 IMAGE:640756 6 G3
EST - IMAGE:583294 -
Wdsub1
WD repeat, SAM and U-box
domain containing 1 IMAGE:640769 2 C3
Nol6
Nucleolar protein family 6
(RNA-associated)
IMAGE:583756 4 A5
Sh3yl1 Sh3 domain YSC-like 1 IMAGE:641043 12 A2
EST - IMAGE:583636 -
EST - IMAGE:640812 -
2610318N02Rik
RIKEN cDNA 2610318N02
gene IMAGE:1263539 16 A3
3110001D03Rik
RIKEN cDNA 3110001D03
gene IMAGE:641030 4 C3
Fem1 Fem-1 homolog c (C.elegans) IMAGE:1226596 18 C
Eif5
Eukaryotic translation
initiation factor 5
IMAGE:582912 12 F1
EST - IMAGE:583299 -
EST - IMAGE:583780 -
Trim62 Tripartite motif-containing 62 IMAGE:640707 4 D2.2
Tmem115 Transmembrane protein 115 IMAGE:582843 9 F1
2310035C23Rik
RIKEN cDNA 2310035C23
gene IMAGE:573037 1 D
2810455D13Rik
RIKEN cDNA 2810455D13
gene IMAGE:582820 -
EST - IMAGE:639724 -
EST - IMAGE:640972 -
EST - IMAGE:573496 -
6720401G13Rik
RIKEN cDNA 6720401G13
gene IMAGE:583020 X A4
EST - IMAGE:640964 -
Hs3st3b1
Heparan sulfate
(glucosamine) 3-O-
sulfotransferase 3B1
IMAGE:640008 11 B3
Trim17 Tripartite motif protein 17 IMAGE:1263520
11 B1.2-
B1.3
Cd34 CD34 antigen IMAGE:573426 1 H6
4932438H23Rik
RIKEN cDNA 4932438H23
gene IMAGE:1264334 16 C3.3
Msc Musculin IMAGE:640142 1 A3
EST - IMAGE:582879 -
EST - IMAGE:640767 -
EST - IMAGE:583924 -
Golt1b
Golgi transport 1 homolog B
(S. cerevisiae)
IMAGE:639999 6 G1
C230096C10Rik
RIKEN cDNA C230096C10
gene IMAGE:583779 4 D3
BC038156 CDNA sequence BC038156 IMAGE:640980 9 A4
Fbxl20
F-box and leucine-rich repeat
protein 20
IMAGE:582950 11 D
Dopey1 Dopey family member 1 IMAGE:641044 9 E3.1
Wdr12 WD repeat domain 12 IMAGE:640744 1 C1-C2
Genes
Induzidos
EST - IMAGE:582864 -
Anexo II
149
EST - IMAGE:640852 -
EST - IMAGE:640384 -
Stard9 START domain containing 9 IMAGE:640768 2 F1
Maea
Macrophage erythroblast
attacher
IMAGE:583828 5 B1-B2
Dock8 Dedicator of cytokinesis 8 IMAGE:639971 19 B
EST - IMAGE:640770 -
Dpm1
Dolichol-phosphate (beta-D)
mannosyltransferase 1 IMAGE:640729 2 H3
EST - IMAGE:576044 -
EST - IMAGE:640632 -
Ankrd16 Ankyrin repeat domain 16 IMAGE:583852 2 A1
S100pbp S100P binding protein IMAGE:640965 4 D2.3
Genes
Induzidos
EST - IMAGE:576020 -
Xpot
Exportin, tRNA (nuclear
export receptor for tRNAs)
IMAGE:639640 10 D3
EST - IMAGE:641158 -
Bcl6 B-cell leukemia/lymphoma 6 IMAGE:573624 16 B1
Hipk1
Homeodomain interacting
protein kinase 1 IMAGE:583858 3 F3
EST - IMAGE:639730 -
Cd8a CD8 antigen, alpha chain IMAGE:1247019 6 C
EST - IMAGE:640518 -
Enpp1
Ectonucleotide
pyrophosphatase/phosphodie
sterase 1
IMAGE:581872 10 A4
Ccr9
Chemokine (C-C motif)
receptor 9 IMAGE:573572 9 F
Ing2
Inhibitor of growth family,
member 2 IMAGE:1225637 8 B2
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:582892 -
Lrba
LPS-responsive beige-like
anchor IMAGE:573828 -
EST - IMAGE:640521 -
EST - IMAGE:576256 -
Myb Myeloblastosis oncogene IMAGE:575702 10 A3
Styx
Phosphoserine/threonine/tyro
sine interaction protein IMAGE:582720 14 C1
Aars Alanyl-tRNA synthetase IMAGE:640995 8 E1
EST - IMAGE:0 -
Xpot
Exportin, tRNA (nuclear
export receptor for tRNAs)
IMAGE:639806 10 D3
EST - IMAGE:640247 -
EST - IMAGE:0 -
EST - IMAGE:583240 -
Mapre2
Microtubule-associated
protein, RP/EB family,
member 2 IMAGE:572898 18 A2
Rab2
RAB2, member RAS
oncogene family
IMAGE:573835 4 A1
Rbm39 RNA binding motif protein 39 IMAGE:583614 2 H1
EST - IMAGE:575796 -
Hsp90b1
Heat shock protein 90kDa
beta (Grp94), member 1 IMAGE:575854 10 C1
EST - IMAGE:582823 -
Genes
Reprimidos
A430079K02
0 day neonate thymus cDNA,
RIKEN full-length enriched
library, clone:A430079K02
product:unclassifiable IMAGE:640409 12
Anexo II
150
Ifit1
Interferon-induced protein
with tetratricopeptide repeats
1
IMAGE:575371 19 C1
Grb2
Growth factor receptor bound
protein 2 IMAGE:575387 11 E2
Fgfr1
Fibroblast growth factor
receptor 1
IMAGE:575608 8 A2
EST - IMAGE:583429 -
1810062O18Rik
RIKEN cDNA 1810062O18
gene IMAGE:1429187 14 A2
Hist1h2bc Histone cluster 1, H2bc IMAGE:640662 13 A3.1
Chd1
Chromodomain helicase DNA
binding protein 1
IMAGE:640262 17 A2
EST - IMAGE:640117 -
Prss16 (TSSP) Protease, serine, 16 (thymus) IMAGE:640501 13 A3-A5
Jak2 Janus kinase 2 IMAGE:5068946 19 C1
EST - IMAGE:640272 -
EST - IMAGE:640663 -
Il5 Interleukin 5 IMAGE:972705 11 A5
2410022M11Rik
RIKEN cDNA 2410022M11
gene IMAGE:640727 14
E2f2 E2F transcription factor 2 IMAGE:640754 4 D3
Zhx1
Zinc fingers and homeoboxes
protein 1 IMAGE:640278 -
EST - IMAGE:640817 -
Ptrh1
Peptidyl-tRNA hydrolase 1
homolog (S. cerevisiae)
IMAGE:583513 2 B
Cxcl14
Chemokine (C-X-C motif)
ligand 14 IMAGE:583442
13 B1
Pdia4
Protein disulfide isomerase
associated 4
IMAGE:4971952 6 B2.3
EST - IMAGE:640367 -
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:640343 X
G3bp
Ras-GTPase-activating
protein SH3-domain binding
protein 1
IMAGE:640974 11 B1.3
Sit1
Suppression inducing
transmembrane adaptor 1 IMAGE:576098 4 B1
Chchd8
Coiled-coil-helix-coiled-coil-
helix domain containing 8 IMAGE:574276 7 E2
Casp8 Caspase 8 IMAGE:5099113 1 B
EST - IMAGE:583879 -
Plxnc1 Plexin C1 IMAGE:583517 10 C3
EST - IMAGE:575206 -
Atad2
ATPase family, AAA domain
containing 2
IMAGE:1225539 15 D2
Cd4 CD4 antigen IMAGE:640273 6 F2
ERCC3
Excision repair cross-
complementing rodent repair
deficiency, complementation
group 3 (xeroderma
pigmentosum group B
complementing)
IMAGE:1655018 2q21
1500032D16Rik
RIKEN cDNA 1500032D16
gene IMAGE:583789 17 A3.3
Genes
Reprimidos
Rrp1b
Ribosomal RNA processing 1
homolog B (S. cerevisiae)
IMAGE:575876 17 B1
Anexo II
151
1110018J18Rik
RIKEN cDNA 1110018J18
gene
IMAGE:639771 13 B3
EST - IMAGE:575350 -
Hist1h2bc Histone cluster 1, H2bc IMAGE:640662 13 A3.1
Rpp30
Ribonuclease P/MRP 30
subunit (human) IMAGE:638902 19 C2
Btg2
B-cell translocation gene 2,
anti-proliferative IMAGE:574837 1 E4
Dnmt3a DNA methyltransferase 3A IMAGE:583260 12 A2-A3
Csnk1a1 Casein kinase 1, alpha 1 IMAGE:641129 18 D3
EST - IMAGE:573897 -
Zmat5 Zinc finger, matrin type 5 IMAGE:574272 11 A1
Nxf1
Nuclear RNA export factor 1
homolog (S. cerevisiae) IMAGE:574499 19 A
Casp2 Caspase 2 IMAGE:573760 6 B2.1
EST - IMAGE:575868 -
Vcam1
Vascular cell adhesion
molecule 1 IMAGE:576563 3 G1
Tnfrsf4
Tumor necrosis factor
receptor superfamily, member
4
IMAGE:573690 4 E2
Letm2
Leucine zipper-EF-hand
containing transmembrane
protein 2
IMAGE:1224844 8 A2
Gfi1 Growth factor independent 1 IMAGE:640751 5 F
BC030183 CDNA sequence BC030183 IMAGE:575904 4 D2.2
EST
Adult male thymus cDNA,
RIKEN full-length enriched
library, clone:5830477H05
product:hypothetical protein,
full insert sequence
IMAGE:583030 19
Golga1
Golgi autoantigen, golgin
subfamily a, 1 IMAGE:578069 2 B
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:1225946 12
Shc1
Src homology 2 domain-
containing transforming
protein C1
IMAGE:574066 3 F1
ACVRL1
Activin A receptor type II-like
1 IMAGE:182661 12q11-q14
Cd27 CD antigen 27 IMAGE:575719 6 F3
Tnfrsf13b
Tumor necrosis factor
receptor superfamily, member
13b
IMAGE:574040 11 B2
Slbp Stem-loop binding protein IMAGE:583806 5 B2
EST - IMAGE:640791 -
EST - IMAGE:582680 -
Ide Insulin degrading enzyme IMAGE:574949 19 C2
Tapt1
Transmembrane anterior
posterior transformation 1 IMAGE:576636 5 B3
Ier5 Immediate early response 5 IMAGE:574793 1 G3
C1orf61
Chromosome 1 open reading
frame 61
IMAGE:43771 1q22
Prkra
Protein kinase, interferon
inducible double stranded
RNA dependent activator IMAGE:583424 2 C3
Glb1 Galactosidase, beta 1 IMAGE:583856 9 F3
EST - IMAGE:583215 -
Genes
Reprimidos
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:583763 6
Anexo II
152
EST - IMAGE:640986 -
EST - IMAGE:640793 -
Ube2r2
Ubiquitin-conjugating enzyme
E2R 2
IMAGE:582562 4 B1
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:138013 X
Ypel2 Yippee-like 2 (Drosophila) IMAGE:576464 11 C
Ppm1h
Protein phosphatase 1H
(PP2C domain containing) IMAGE:583693 10 D2
Anxa4 Annexin A4 IMAGE:583430 6 D1
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:575368 2
Lef1
Lymphoid enhancer binding
factor 1
IMAGE:575374 3 G3
Tcrg-C
T-cell receptor gamma,
constant region IMAGE:640129 13 A2
Smc4
Structural maintenance of
chromosomes 4 IMAGE:582900 3 E2
EST - IMAGE:639784 -
D430001N20
Hypothetical protein
D430001N20
IMAGE:583191 6 C1
EST - IMAGE:583470 -
5730494M16Rik
RIKEN cDNA 5730494M16
gene IMAGE:583861 18 A2
Egr1 Early growth response 1 IMAGE:576070 18 C/D
Il4 Interleukin 4 IMAGE:640300 11 B1.3
ME3
Malic enzyme 3, NADP(+)-
dependent, mitochondrial IMAGE:41204
11cen-
q22.3
Rybp
RING1 and YY1 binding
protein
IMAGE:583880 -
EST - IMAGE:583908 -
H2-K1
Histocompatibility 2, K1, K
region IMAGE:583704 17 B1
EST - IMAGE:583438 -
EST - IMAGE:583244 -
Mll5
Myeloid/lymphoid or mixed-
lineage leukemia 5
IMAGE:583357 5 A3
Mecp2 Methyl CpG binding protein 2 IMAGE:576274 X A7.3
Sept1 Septin 1 IMAGE:583672 7 F4
Skap1
Src family associated
phosphoprotein 1 IMAGE:573833 11 D
EST - IMAGE:583854 -
2510003E04Rik
RIKEN cDNA 2510003E04
gene IMAGE:640070 10 B4
Rcor1 REST corepressor 1 IMAGE:575972 12 F1
D4Wsu53e
DNA segment, Chr 4, Wayne
State University 53,
expressed
IMAGE:583830 4 D3
VEGFA
Vascular endothelial growth
factor A IMAGE:34778 6p12
EST - IMAGE:640813 -
EST
Mus musculus, clone
IMAGE:1329925, mRNA
IMAGE:583612 3
Nkx6-2
NK6 transcription factor
related, locus 2 (Drosophila) IMAGE:576409 7 F4
Maea
Macrophage erythroblast
attacher
IMAGE:575996 5 B1-B2
Dph5 DPH5 homolog IMAGE:583454 3 G1
Genes
Reprimidos
Gdap2
Ganglioside-induced
differentiation-associated-
protein 2 IMAGE:641674 3 F2.2
Anexo II
153
Rab3d
RAB3D, member RAS
oncogene family
IMAGE:575981 9 A2-A3
EST - IMAGE:583814 -
ITGA5
Integrin, alpha 5 (fibronectin
receptor, alpha polypeptide) IMAGE:135671 12q11-q13
Hivep2
Human immunodeficiency
virus type I enhancer binding
protein 2
IMAGE:1282235 -
Hnrpul2
Heterogeneous nuclear
ribonucleoprotein U-like 2 IMAGE:576590 19 A
Ercc5
Excision repair cross-
complementing rodent repair
deficiency, complementation
group 5 IMAGE:642033 1 B
Pcmtd2
Protein-L-isoaspartate (D-
aspartate) O-
methyltransferase domain
containing 2 IMAGE:641904 2 H4
EST
CDNA, clone:Y1G0121D18,
strand:minus,
reference:ENSEMBL:Mouse-
Transcript-
ENST:ENSMUST000000481
44, based on BLAT search
IMAGE:640759 1
MSN Moesin IMAGE:583860 X C3
EST - IMAGE:640794 -
Transcribed locus Transcribed locus IMAGE:583382 5
Pcbp3 Poly(rC) binding protein 3 IMAGE:583766
10 B5.1-
B5.3
EST - IMAGE:583928 -
Stat1
Signal transducer and
activator of transcription 1
IMAGE:583302 1 C1.1
Cep78 Centrosomal protein 78 IMAGE:641590 19 A
Ccdc77
Coiled-coil domain containing
77 IMAGE:1265465 6 F1
Rab28
RAB28, member RAS
oncogene family
IMAGE:1328024 5 B2
Ythdf1 YTH domain family 1 IMAGE:573974 2 H4
Ndufa11
NADH dehydrogenase
(ubiquinone) 1 alpha
subcomplex 11 IMAGE:640025 17 D
Ide Insulin degrading enzyme IMAGE:574241 19 C2
Arpc2
Actin related protein 2/3
complex, subunit 2
IMAGE:574365 1 C3
Gbp2
Guanylate nucleotide binding
protein 2 IMAGE:583808 3 H1
NKRF NF-kappaB repressing factor IMAGE:21961 Xq24
Tcea3
Transcription elongation
factor A (SII), 3 IMAGE:573147 4 D3
Rbm15b
RNA binding motif protein
15B
IMAGE:583849 9 F1
Ankrd37 Ankyrin repeat domain 37 IMAGE:576620 8 B1.1
EST - IMAGE:583601 -
Rnpep
Arginyl aminopeptidase
(aminopeptidase B) IMAGE:582632 1 E4
EST - IMAGE:583087 -
EST - IMAGE:640794 -
Genes
Reprimidos
Shmt1
Serine hydroxymethyl
transferase 1 (soluble)
IMAGE:573743 11 B2
Anexo II
154
EST - IMAGE:640792 -
Laptm5
Lysosomal-associated protein
transmembrane 5
IMAGE:639946 4 D2.3
Serinc5 Serine incorporator 5 IMAGE:583286 13 C3
Sec31a
SEC31 homolog A (S.
cerevisiae) IMAGE:583334 5 E3
Zmynd10
Zinc finger, MYND domain
containing 10 IMAGE:1225083 9 F1
EST - IMAGE:576262 -
Nucks1
Nuclear casein kinase and
cyclin-dependent kinase
substrate 1
IMAGE:573338 1 E4
Gpbp1
GC-rich promoter binding
protein 1
IMAGE:583064 13 D2.1
Ly6d
Lymphocyte antigen 6
complex, locus D IMAGE:581909 15 D3
Amica1
Adhesion molecule, interacts
with CXADR antigen 1 IMAGE:640276 9 A5.2
Golga4
Golgi autoantigen, golgin
subfamily a, 4
IMAGE:639987 9 F3
1110001A16Rik
RIKEN cDNA 1110001A16
gene IMAGE:640188 -
Ttc3
Tetratricopeptide repeat
domain 3 IMAGE:583646 16 C3.3-4
Tdg Thymine DNA glycosylase IMAGE:642198 10 C1
Tbce Tubulin-specific chaperone e IMAGE:582730 13 A1|
EST - IMAGE:640609 -
Mat2b
Methionine
adenosyltransferase II, beta
IMAGE:583812 11 A5
Itm2b Integral membrane protein 2B IMAGE:640094 14 D2
Ccl25
Chemokine (C-C motif) ligand
25 IMAGE:575567
8 A1.1
Map3k11
Mitogen activated protein
kinase kinase kinase 11 IMAGE:575211 19 A
Ada Adenosine deaminase IMAGE:577879 2 H3
EST - IMAGE:583269 -
Ier5 Immediate early response 5 IMAGE:639672 1 G3
EST - IMAGE:640225 -
Tox
Thymocyte selection-
associated HMG box gene IMAGE:573967 4 A1
Icam2
Intercellular adhesion
molecule 2
IMAGE:574542 11 E1
EST - IMAGE:583270 -
EST - IMAGE:583245 -
Genes
Reprimidos
EST - IMAGE:583009 -
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