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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
CECÍLIA CARVALHO DE OLIVEIRA
ESTUDO TOXICOLÓGICO PRÉ-CLÍNICO DO EXTRATO
AQUOSO E DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE ALPINIA
ZERUMBET (PERS.) BURTT & SMITH
FORTALEZA
2008
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1
CECÍLIA CARVALHO DE OLIVEIRA
ESTUDO TOXICOLÓGICO PRÉ-CLÍNICO DO EXTRATO AQUOSO E DO
ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE ALPINIA ZERUMBET (PERS.) BURTT &
SMITH
Dissertação submetida à Coordenação do
Curso de Pós-Graduação em
Farmacologia da Universidade Federal do
Ceará como Requisito parcial para
obtenção do grau de Mestre em
Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Manoel Odorico de
Moraes Filho
FORTALEZA
2008
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2
O46e Oliveira, Cecília Carvalho de
Estudo toxicológico pré-clínico do extrato aquoso e do
óleo essencial das folhas de Alpinia zerumbet (Pers.)
Burtt & Smith/ Cecília Carvalho de Oliveira. 2008.
93 f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho
Dissertação (Mestrado)-Universidade Federal do
Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2008.
1. Alpinia. 2. Toxicologia. 3. Genotoxicidade. I. Moraes
Filho, Manoel Odorico de (orient.). II. Título.
CDD 615.905
3
CECÍLIA CARVALHO DE OLIVEIRA
ESTUDO TOXICOLÓGICO PRÉ-CLÍNICO DO EXTRATO AQUOSO E DO ÓLEO
ESSENCIAL DAS FOLHAS DE ALPINIA ZERUMBET (PERS.) BURTT & SMITH
Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em
Farmacologia da Universidade Federal do Ceará como Requisito parcial para
obtenção do grau de Mestre em Farmacologia
A transcrição de qualquer trecho deste trabalho é permitida, desde que
seja feita conforme com as normas de ética científica.
Aprovada em: 15/07/2008
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________
Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho (Orientador)
Universidade Federal do Ceará-UFC
_____________________________________
Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa
Universidade Federal do Ceará -UFC
_____________________________________
Adriana Rolim Campos Barros
Universidade de Fortaleza-UNIFOR
4
Aos meus pais,
exemplos de força, perseverança, caráter e coragem;
à minha avó Dulce,
pelo carinho e pelos ensinamentos;
ao meu irmão,
que sempre foi um espelho para mim;
ao Carlos Windson,
companheiro de horas difíceis e
constante exemplo de coragem e fonte de estímulo sempre.
5
AGRADECIMENTOS
Em especial, ao Prof. Dr. Odorico de Moraes, pela constante confiança em
meu potencial, pelas inúmeras oportunidade de crescimento, pela orientação, pela
compreensão e pelo imenso carinho que sempre demonstrou ter.
Ao meu pai, Joaquim Aristides, por ser sempre meu referencial. Pelas
conversas e conselhos sempre recheados de bom senso, pelo apoio incondicional e
principalmente pelo seu amor e confiança em mim.
A minha mãe, Dulce Carvalho, pelo carinho, pelos cuidados, pelas
preocupações, pelo apoio, pelas conversas e principalmente pela sua torcida e
tentativa de entender o que estava fazendo.
À Profa. Dra. Letícia Veras Costa Lotufo, pelas sugestões técnicas e pela
orientação na ausência do prof. Odorico, que ajudou muito na construção deste
trabalho.
À Profa. Dra. Cláudia do Ó Pessoa, pelas sugestões técnicas e orientação
na ausência do Prof. Odorico.
À Profa. Raquel Carvalho Montenegro, pelas orientações das técnicas
experimentais e pela sempre disponibilidade a ajudar no desenvolvimento dos
trabalhos.
À Kristiana Cerqueira Mousinho, pelas conversas, brincadeiras,
gargalhadas e companheirismo, além das ajudas nos experimentos e inúmeras
trocas de inseguranças, confidências e experiências na vida profissional e pessoal.
Ao José Roberto de Oliveira Ferreira, pelas conversas, brincadeiras,
gargalhadas e companheirismo, além das ajudas nos experimentos e inúmeras
trocas de inseguranças, confidências e experiências na vida profissional e pessoal.
Ao Bruno Coelho, pela ajuda sem tamanho, pois sem ela não teria
conseguido terminar os experimentos no prazo.
Aos professores que compõem o corpo docente do Departamento de
Fisiologia e Farmacologia, pelas orientações e auxílios nos detalhes imprescindíveis
do trabalho, em especial o Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao.
À Dra. Adriana Rolim, pela co-orientação e ajuda nos ensaios de toxicidade
com animais.
À Dra. Vanesca Frota, que foi um anjo que caiu do céu para me ajudar em
muitos experimentos e acabou se tornando uma grande amiga e companheira.
6
Aos amigos do LOE: Michel Ferreira, Washington Barros, Hémerson Yuri,
Paula Jimenez, Daniel Bezerra, Marne Vasconcellos, Danilo Damasceno, Diego
Wilke, Adriana Carvalho, Arinice Costa, Delano Marinho, Ana Jérsia, Felipe,
Hidemburgo, Evelyne, Crisanto Rodrigues, Venúcia Magalhães, pelo ótimo
convívio e a constante disponibilidade de ajuda e troca de experiências.
Às técnicas Silvana França, cuja dedicação e trabalho é indispensável à boa
ordem do laboratório, além das inúmeras ajudas; Luciana França, pela sempre
disponibilidade de ajuda e manutenção do nosso material de trabalho; e Maria de
Fátima, pelo auxílio sempre disponibilizado.
Às secretárias Adelânia e Sheyla, pela imensa atenção e resolução dos
pedidos e problemas arranjados no decorrer dessa empreitada.
À Aura, secretária do Programa de Pós-Graduação, pela enorme contribuição
para nossa formação, com suas informações preciosas e atenção aos nossos apelos
desesperados de estudantes perdidos e angustiados.
Aos porteiros do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Chiquinho e
Alana, que substituiu a querida Mônica quando do nascimento de sua filha Larissa,
que foi acompanhado de pertinho por mim e contribuiu enormemente para execução
de alguns experimentos.
Ao Carlos e à Íris, pessoas maravilhosas e alegres que estavam sempre a
trabalhar para manter o nosso laboratório e Departamento limpo e organizado. Íris,
obrigada pelo cafezinho sempre fresco e cheiroso e pelas conversas.
Ao Seu Bento e aos seus filhos, responsáveis pela manutenção do biotério
e pelo bem-estar e higiene dos nossos animais, carinhosamente tratados por
“bebês”.
Aos amigos do LPN, em especial à Cínthya Iamille e toda sua família, à
Silvéria, ao Michael Will e ao Otacílio, pela troca de informações, ajudas nos
experimentos e principalmente pela amizade, pelas brincadeiras e festinhas feitas
nas nossas casas.
Aos amigos do LAFICA, Roberto César e Roberta Dalcico, pelo
companheirismo e nossos almoços e aniversários comemorados juntos.
Aos amigos e membros da UNIFAC, em especial: Seu Francisco e Seu
Dantas, porteiros, que sempre se disponibilizaram a abrir as portas (literalmente) do
biotério e do laboratório para mim; ao Seu Carlos, pela simpatia e manutenção da
limpeza dos laboratórios; à Flávia, secretária do CEP, pela presteza e ajuda
7
imprescindível ao desenrolamento dos experimentos; à Ana Paula, colega de curso,
pela divisão de trabalho na produção do chá, nas aventuras para liofilizá-lo e pelas
trocas de medos e inseguranças quanto ao futuro da nossa pesquisa; ao Paulo
Magaiver, por tudo, desde o seu bom dia aos inúmeros consertos e favores
prestados; ao Vagnaldo Fechine, pela imensa ajuda com os dados e estatísticas e
tantas outras coisas; à Deysi Wong, pela amizade e eterno carinho.
À Dra. Sônia Felício, pelas experiências e pelos ensinamentos adquiridos
para o desenvolvimento de um trabalho de qualidade e bem construído.
À Profa. Dra. Ana de Fátima Urano Carvalho, pelas imensas ajudas,
conversas e esclarecimentos de dúvidas, além do ensinamento fundamental de
manipulação e tratamento de animais de laboratório e respeito à vida animal.
À Profa. Dra. Vânia Melo, pelas conversas, auxílios experimentais e
esclarecimentos de dúvidas em relação ao trabalho com células e bactérias.
Aos amados e queridos amigos biólogos que estão sempre perto e prontos
para ajudar: Lady Clarissa, Nara Gadelha, Nathanna Mateus, Davi Farias, Daniel
Oriá e Mariana Giovenardi, pelas horas de relaxamento, brincadeiras e
descontração, fossem no laboratório de Fisiologia Animal ou no Fone Pizza e pelas
muitas conversas e trocas de experiências para sobrevivência até o final do nosso
objetivo, a conclusão do curso de pós-graduação.
A minha avó, Maria Dulce, pelos mimos, pelos carinhos, pelas orientações,
pela torcida e por ser essa pessoa sempre maravilhosa em minha vida.
Ao meu irmão, Joaquim Pedro, por sempre ter sido minha figura de exemplo,
pelas ajudas e auxílios, principalmente em relação às tecnologias e pela sua enorme
torcida.
A minha cunhada, Lorena Veras, pelo carinho e pela torcida.
À Beatriz Carvalho, prima querida e amada, pelas várias ajudas,
principalmente em relação ao inglês e traduções, pelo carinho e pela imensa torcida.
À toda minha família pelo apoio e torcida pelo cumprimento de mais essa
etapa em minha vida.
À Dra. Selva Aguiar, sem seu incondicional apoio emocional, não teria
chegado até aqui com tanta garra, alegria e tranqüilidade.
Ao meu namorado, Carlos Windson Cavalcante Mota, pessoa muito
especial, pelas injeções de coragem, pelos seus incentivos, pelas nossas conversas,
pela sua segurança passada nos momentos mais difíceis, pelo seu apoio, pelo seu
8
carinho, pela sua compreensão e por você ter ficado ao meu lado sempre, durante
todo esses anos, além de tornar os meus dias mais coloridos.
9
RESUMO
Alpinia zerumbet, conhecida popularmente como colônia no Nordeste do
Brasil, é uma planta medicinal usada amplamente na medicina popular na forma de
chás e infusões para o tratamento de doenças cardiovasculares, como a hipertensão
arterial. O intenso consumo popular dessas infusões levou-nos a avaliar o perfil
toxicológico e genotoxicológico do extrato aquoso e do óleo essencial das folhas de
A. zerumbet. Esse estudo foi avaliado pelos ensaios de curta duração in vivo e in
vitro. Inicialmente foi avaliada a citotoxicidade e o efeito hemolítico in vitro, porém
não houve resposta tóxica. A DL
50
encontrada para o extrato aquoso foi >5 g/Kg,
demonstrando que os princípios ativos do extrato apresentam baixa toxicidade. Os
estudo de genotoxicidade foram realizados in vivo. Os animais foram tratados, por
via oral, com três doses do extrato aquoso (2 g/Kg, 3,5 g/Kg e 5 g/Kg) e com a dose
de 400 mg/Kg do óleo essencial. Após 24h e 48h, o sangue periférico e a medula
óssea foram coletados. No ensaio do cometa não houve detecção de nenhum
cometa de grau elevado e as análises estatísticas demonstraram um P<0,01 (grau
de significância: P<0,05) para todas as amostras em relação ao controle positivo e
um P>0,05 (grau de significância: P<0,05) para as amostras em relação ao controle
negativo. No ensaio do micronúcleo, todas as doses do extrato aquoso e do óleo
essencial tiveram diferença estatisticamente significante em relação a
ciclofosfamida, um antineoplásico citotóxico, com um P<0,001 e um P>0,05 em
relação ao controle negativo (significância: P<0,05). Todos esses resultados indicam
que o extrato aquoso e o óleo essencial das folhas de A. zerumbet não apresentam
ações citotóxicas nem genotóxicas nos modelos testados.
Palavras-chave: Alpinia. Toxicologia. Genotoxicidade.
10
ABSTRACT
Alpinia zerumbet, known ordinarily as colony in Northwestern Brazil, is a medicinal
plant widely used in popular medicine as tea and infusions for the treatment of
intestinal and cardiovascular illnesses, such as hypertension. Due to the high levels
of consumption of such infusions, we have sought to evaluate the toxicological and
genotoxicological profile of the tea and essential oil made from A. zerumbet leaves.
This study has been evaluated by short term in vivo and in vitro trials. We initially
evaluated the cytotoxicity and the hemolytic effect in vitro; however, there was no
toxic response. The DL
50
found for the tea was of >5 mg/Kg, which demonstrates that
the active principles of the tea present low toxicity. The genotoxicity trials were
carried out in vivo. The animal received treatment orally, with three doses of the tea
(2 g/Kg, 3,5 g/Kg and 5 g/Kg) and with a dosage of 400 mg/Kg of the essential oil.
Peripheral blood and bone marrow were collected after 24 and 48 hours. In the
comet trial no high level comets were detected and the statistical analyses
demonstrate a P<0,01 (significance: P<0,05) for all samples when compared to the
positive control and a P<0,05 (significance: P<0,05) for samples in relation to the
negative control. In the micronucleus test, all doses of the tea and essential oil
presented a statistically significant difference in relation to cyclofosfamide, with a P <
0.001 and a P > 0.05 compared with the negative control (significance: P<0,05). All
those results indicate that the tea and essential oil made from A. zerumbet leaves do
not present cytotoxic or genotoxic action in the tested models.
Keywords: Alpinia. Toxicology. Genotoxicity.
11
LISTA DE ABREVIATURAS
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CEME Central de Medicamentos
IC
50
Concentração inibitória média
CPA Ciclofosfamida
DDA Dose diária aceitável
DDK Dihidro-5,6-deidrokawaina
DL
50
Dose letal média
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleotídeo
DPM Desvio padrão da média
EA Extrato aquoso
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EPC Eritrócitos policromáticos
ENC Eritrócitos normocromáticos
FDA Food and Drugs Administration
ICCVAM
Interagency Coordinating Committee on the Validation of
Alternative Methods
IC Intervalo de confiança
IM Índice de mutagenicidade
LMP Low melting point
12
MEIC
Multicentre Evaluation of Cytotoxicity in vitro
MN Micronúcleo
MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltertrazolim brometo
NCI National Cancer Institute
NMP Normal melting point
OECD Organization for Economic Cooperation and Development
OE Óleo essencial
OMS Organização Mundial de Saúde
PBMC Células mononucleares do sangue periférico
PBS Tampão fosfato de sódio
q. s. p. Quantidade suficiente para
RPM Rotações por minuto
RM Razão de mutagenicidade
SCGE Single Cell Gel Electrophoresis Assay
SFB Soro fetal bovino
TAC Toxicidade Aguda de Classe
TDF Teste da Dose Fixa
TUD Teste do “Up and Down”
US-EPA United States-Environmental Protection Agency
13
LISTA DE FIGURAS
1 Foto ilustrativa de um espécime de A. zerumbet, na época de
floração.............................................................................................
34
2 Foto ilustrativa das flores de Alpinia zerumbet, evidenciando a
estrutura interna da flor e tipo de coloração nas fotos em
detalhe..............................................................................................
34
3 Gráfico do ensaio do cometa in vivo do extrato aquoso de A.
zerumbet após 24h de exposição em camundongos fêmeas...........
59
4 Gráfico do ensaio do cometa in vivo do extrato aquoso de A.
zerumbet após 48h de exposição em camundongos fêmeas...........
59
5 Gráfico do ensaio do cometa in vivo do extrato aquoso de A.
zerumbet após 24h de exposição em camundongos machos..........
60
6 Gráfico do ensaio do cometa in vivo do extrato aquoso de A.
zerumbet após 48h de exposição em camundongos machos..........
60
7 Gráfico do ensaio do cometa in vivo do óleo essencial de A.
zerumbet após 24h de exposição em camundongos fêmeas..........
61
8 Gráfico do ensaio do cometa in vivo do óleo essencial de A.
zerumbet após 48h de exposição em camundongos fêmeas..........
61
9 Gráfico do ensaio do cometa in vivo do óleo essencial de A.
zerumbet após 24h de exposição em camundongos machos.........
62
10 Gráfico do ensaio do cometa in vivo do óleo essencial de A.
zerumbet após 48h de exposição em camundongos machos..........
62
11 Fotomicrografia de cometa do tipo 1................................................ 63
12 Fotomicrografia do cometa, evidenciando vários cometas do tipo
zero...................................................................................................
63
13 Fotomicrografia de eritrócitos policromáticos (PCE) apresentenado
micronúcleo.......................................................................................
68
14 Fotomicrografia de eritrócitos policromáticos (EPC) apresentando
micronúcleo e eritrócitos normocromáticos (NCE)............................
68
14
LISTA DE TABELAS
1 Linhagens celulares tumorais utilizadas no ensaio de citotoxicidade
in vitro através do método do MTT....................................................
48
2 Atividade citotóxica do extrato aquoso e do óleo essencial de A.
zerumbet em células tumorais pelo MTT...........................................
55
3 Atividade citotóxica do extrato aquoso e do óleo esencial de A.
zerumbet em linfócitos normais pelo alamar Blue.............................
56
4 Atividade hemolítica do extrato aquoso e do óleo essencial de A.
zerumbet em eritrócitos de camundongo 2%....................................
56
5 Efeito de doses orais únicas do extrato aquoso de A. zerumbet em
camundongos machos......................................................................
57
6 Efeito de doses orais únicas do extrato aquoso de A. zerumbet em
camundongos fêmas..........................................................................
58
7 Tabela representativa dos resultados do ensaio do micronúcleo do
extrato aquoso de A. zerumbet..........................................................
65
8 Tabela representativa dos resultados do ensaio do micronúcleo do
óleo essencial de A. zerumbet nos animais sacrificados com 24h....
66
9 Tabela representativa dos resultados do ensaio do micronúcleo do
óleo essencial de A. zerumbet nos animais sacrificados com 48h....
67
15
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO....................................................................................... 17
1.1 Toxicologia........................................................................................... 17
1.1.1 Histórico................................................................................................. 17
1.1.2 Divisão metodológica da toxicologia (Como Ciência)............................ 17
1.1.3 Fatores que influenciam na toxicidade...................................................
18
1.1.4 Principais agentes tóxicos......................................................................
18
1.1.5 Causas mais freqüentes de intoxicação............................................... 18
1.1.6 Parâmetros Toxicológicos...................................................................... 19
1.1.7 Toxicidade aguda................................................................................... 20
1.1.8 Citotoxicidade.........................................................................................
21
1.1.9 Mutagenicidade e Genotoxicidade......................................................... 22
1.1.10
Ensaio do Cometa................................................................................. 24
1.1.11
Ensaio do Micronúcleo.......................................................................... 25
1.2 Produtos naturais................................................................................ 26
1.3 Histórico do uso de produtos naturais.............................................. 28
1.4 Fitoterápicos.........................................................................................
29
1.5 A planta................................................................................................. 32
1.5.1 Alpinia zerumbet.................................................................................... 32
2 OBJETIVOS...........................................................................................
38
2.1 Objetivo geral....................................................................................... 38
2.2 Objetivos específicos.......................................................................... 38
3 MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................... 39
3.1 Materiais................................................................................................
39
3.1.1 Equipamentos........................................................................................ 39
3.1.2 Soluções................................................................................................ 40
3.1.3 Reagentes e fármacos........................................................................... 43
3.1.4 Modelos biológicos.................................................................................
44
3.2 Preparação do óleo essencial e do extrato aquoso liofilizado
utilizado no tratamento......................................................................
45
16
3.3 Ensaio de Citotoxicidade pelo MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5
difeniltertrazolim brometo)..................................................................
46
3.3.1 Análise dos dados................................................................................. 47
3.4 Ensaio de Citotoxicidade pelo “Alamar Blue”.................................. 48
3.4.1 Análise Estatística do “Alamar Blue”...................................................... 50
3.5 Teste de hemólise................................................................................ 50
3.6 Toxicidade Aguda................................................................................ 51
3.7 Ensaio do cometa.................................................................................
52
3.8 Ensaio do Micronúcleo........................................................................ 52
4 RESULTADOS.......................................................................................
55
4.1 Ensaio de Citotoxicidade pelo MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5
difeniltertrazolim brometo)..................................................................
55
4.2 Ensaio de citotoxicidade pelo Alamar Blue...................................... 55
4.3 Teste de hemólise................................................................................ 56
4.4 Toxicidade aguda................................................................................. 56
4.5 Ensaio do cometa................................................................................ 58
4.6 Ensaio do micronúcleo....................................................................... 63
5 DISCUSSÃO.......................................................................................... 69
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS...................................................................
79
7 CONCLUSÃO........................................................................................ 80
REFERÊNCIAS...................................................................................................
81
17
1 INTRODUÇÃO
1.1 TOXICOLOGIA
É a ciência que estuda as intoxicações, os venenos que as produzem, seus
sintomas, seus efeitos, seus antídotos e seus métodos de análise. O termo tóxico
vem do grego toxicon, que quer dizer “flecha envenenada” (UNIVERSIDADE
FEDERAL DO PARANÁ, 2008; BARILE, 2007).
1.1.1 Histórico
A fase do descobrimento teve início com o homem primitivo em seu contato
com a natureza como meio de sobrevivência, que em seu dia a dia tomou contato
com plantas e animais, surgindo deste contato a identificação de substâncias que
eram ou não benéficas a sua vida. A fase primitiva é, talvez, a parte mais importante,
pois estuda os venenos como meio de suicídio, de homicídio e até punitivo, trazendo
importantes conclusões inclusive para a toxicologia moderna. A fase moderna teve
início a partir de 1800, com o surgimento de métodos de estudos para identificação
de venenos, o que provocou a redução de atuação criminosa, porém a partir deste
conhecimento houve um aumento significativo de intoxicações acidentais (ex. uso de
agrotóxicos) (UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ, 2008).
1.1.2 Divisão Metodológica da Toxicologia (Como Ciência)
Toxicologia clínica - Estuda os sintomas e sinais clínicos, visando
diagnosticar envenenamentos e orientar terapia;
Toxicologia profilática - Estuda a poluição da água, terra, ar e alimentos,
procurando manter e aumentar a segurança para a vida é saúde humana;
Toxicologia industrial - Estuda as enfermidades industriais e a insalubridade
do ambiente de trabalho;
Toxicologia analítica - Visa a análise dos produtos tóxicos objetivando
determinar sua toxicidade, sua concentração tóxica, metabolismo, dentre outras;
18
Toxicologia forense - Estuda os aspectos médico-legais procurando
esclarecer a “causa-mortis” em intoxicações, visando o esclarecimento e a justiça da
causa das intoxicações (UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ, 2008).
1.1.3 Fatores que infuenciam na Toxicidade
Fatores que dependem do sistema biológico: idade, peso corpóreo,
temperatura, fatores genéticos, estados nutricionais e patológicos;
Quantidade ou concentração do agente tóxico;
Estado de dispersão: é importante a forma e o tamanho das partículas;
Afinidade pelo tecido ou organismo humano;
Solubilidade nos fluídos orgânicos;
Sensibilidade do tecido ou organismo humano;
Fatores da substância em si. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO
PARANÁ, 2008).
1.1.4 Principais Agentes Tóxicos
Tóxicos Gasosos;
Tóxicos Voláteis;
Tóxicos Orgânicos Fixos;
Tóxicos Orgânicos Metálicos;
Tóxicos Orgânicos Solúveis (UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ,
2008).
1.1.5 Causas mais freqüentes de Intoxicações
As principais causas de intoxicações no trabalho são: falhas de técnicas
(como vazamentos dos equipamentos, preparação e aplicação dos produtos sem a
utilização de equipamento adequado de segurança, aplicação contra o vento);
19
trabalhadores que não trocam diariamente de roupa; trabalhadores que não tomam
banho diário ou que tomam banho em água quente, que dilata os poros e facilita a
absorção do produto; trabalhadores, que nos horários de descanso, alimentam-se
sem lavar as mãos; armazenamento inadequado dos produtos químicos; ingestão ou
inalação de produtos químicos desconhecidos na tentativa de estabelecer qual
substância se trata (UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ, 2008; BARILE,
2007).
Outras causas: aplicação de produtos nas horas de maior temperatura (na
qual o calor intenso dilata os poros e facilita a absorção da pele); trabalhadores que
voltam a trabalhar após uma intoxicação ou em períodos de repouso de outras
doenças; trabalhadores com baixa resistência física são mais suscetíveis;
trabalhadores que fazem aplicações de produtos químicos sozinhos e, em caso de
intoxicação, não recebem ajuda imediata; crianças e animais que tem contato com
produtos químicos. As esposas dos operários se intoxicam ao lavar as roupas
utilizadas na aplicação dos produtos dentre muitas outras formas (UNIVERSIDADE
FEDERAL DO PARANÁ, 2008).
1.1.6 Parâmetros Toxicológicos
Toxicidade aguda - É aquela produzida por uma única dose, seja por via
oral, dérmica, intraperitoneal, subcutânea ou pela inalação dos vapores.
Toxicidade crônica - É aquela que resulta da exposição contínua a uma
substância, sendo que esta não pode causar toxicidade aguda por apresentar-se em
baixas concentrações. A toxicidade crônica é mais importante que a toxicidade
aguda, pois normalmente ocorre pela contaminação de alimentos ou lentamente no
seu ambiente de trabalho.
Veneno - É todo e qualquer produto natural ou sintético, biologicamente ativo
que, introduzido no organismo e absorvido, provoca distúrbios da saúde, inclusive
morte, ou, se aplicado sobre tecido vivo é capaz de destruí-lo.
Toxicidade - É a capacidade de uma substância química produzir lesões,
sejam elas físicas, químicas, genéticas ou neuropsíquicas, com repercussões
comportamentais.
20
Intoxicação - É um estado deletério manifestado pela introdução no
organismo de produto potencialmente danoso.
DL
50
(Dose Letal) - É a dose letal média de um produto puro em mg/Kg do
peso do corpo. Esta terminologia pode ser empregada para intoxicação oral,
dérmica, subcutânea, intraperitoneal ou inalatória.
Dosagem Diária Aceitável (DDA) - Quantidade máxima de composto que,
ingerida diariamente, durante toda a vida, parece não oferecer risco apreciável à
saúde.
Efeito Residual - Tempo de permanência do produto nos tecidos, no solo, ar
ou água podendo trazer implicações de ordem toxicológica.
Antídoto - Toda substância que impede ou inibe a ação de um tóxico.
Toxicidade Aguda - O processo tóxico em que os sintomas aparecem nas
primeiras 24 horas após a exposição à substância.
Toxicidade Crônica - Processo tóxico em que os sintomas aparecem após
as primeiras 24 horas, ou mesmo semanas ou meses após a exposição à
substância.
Toxicidade Recôndita - É o processo tóxico em que ocorrem lesões, sem
manifestações clínicas (UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ, 2008).
1.1.7 Toxicidade aguda
A determinação da toxicidade aguda de uma substância é extremamente
importante, principalmente considerando o uso indevido de produtos naturais pela
população (UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ, 2008).
Depois de muitos anos de debates e discussões o teste da DL
50
(dose letal
mediana) foi finalmente banido das diretrizes que norteiam a avaliação da toxicidade
aguda (BOTHAM, 2002). A avaliação da toxicidade é realizada com o objetivo de
determinar o potencial de novas substâncias e produtos causar danos à saúde
humana. Testes que avaliam a toxicidade sistêmica aguda são utilizados para
classificar e, apropriadamente, rotular substâncias de acordo com o seu potencial de
21
letalidade ou toxicidade como estabelecido pela legislação. Além da letalidade,
outros parâmetros são investigados em estudos de toxicidade aguda sistêmica para
identificar o potencial tóxico em órgãos específicos, identificar a toxicocinética e a
relação-dose resposta. Outras informações podem ainda ser obtidas numa avaliação
de toxicidade aguda como: indicativos sobre o mecanismo de ação tóxica;
diagnóstico e tratamento das reações tóxicas; estabelecimento das doses para
estudos adicionais de toxicidade; informações para a comparação de toxicidade
entre substâncias de mesma classe; informações sobre quais seriam as
conseqüências de exposições acidentais no trabalho ou no ambiente doméstico;
além de ser um padrão para a avaliação de testes alternativos ao uso de animais
experimentais (PURCHASE et al., 1998; BLAAUBOER, 2003; PRIETO et al., 2006;
COECKE et al., 2005).
1.1.8 Citotoxicidade
Durante um evento organizado pela ICCVAM (Interagency Coordinating
Committee on the Validation of Alternative Methods) em 2002, a situação corrente
dos métodos in vitro para a avaliação da toxicidade aguda oral foi estudada. Deste
estudo, um processo foi iniciado para oferecer objetivos realísticos em curto prazo e
longo prazo para o refinamento e substituição de estudos animais, pelo menos para
a toxicidade aguda oral, sendo os mesmos princípios aplicáveis à toxicidade dérmica
e inalatória.
Embora naquele momento os ensaios de citotoxicidade in vitro ainda não
estivessem padronizados e validados, ou mesmo existissem protocolos otimizados e
modelos preditivos, estudos consistentes da literatura apontavam para uma
correlação positiva entre citotoxicidade in vitro e efeitos tóxicos agudos in vivo, a
aplicação de métodos in vitro tinha um importante potencial. O documento final
concluiu que a proposta de Spielmann et al. (1999), na qual a citotoxicidade basal
medida em uma ou mais células ou linhagens celulares estava relacionada com a
toxicidade aguda in vivo, poderia ser rapidamente absorvida para otimizar a seleção
da dose inicial nos testes da dose fixa, teste de classe e o teste “Up and Down”. Este
22
procedimento reduziria significativamente o uso de animais, o que iria ao encontro
dos anseios da sociedade e comunidade científica.
Todavia, durante o evento também concluiu-se que a substituição de testes
em animais pelos ensaios in vitro ainda era prematura e necessitaria de muito mais
tempo para ser implementada. Conclusões adicionais foram o desenvolvimento,
padronização e a validação de métodos in vitro para a predição de toxicidade em
humanos ao invés de roedores a serem conduzidas como medidas a longo prazo.
Diante disso, os estudos de Ekwall (1999), denominado “Multicentre Evaluation of
Cytotoxicity in vitro” (MEIC), o qual investigava a correlação entre concentrações
sangüíneas letais agudas humanas e citotoxicidade basal em uma bateria de três
linhagens celulares humanas, foram indicados como um dos estudos mais
promissores a serem validados e implementados.
A citotoxicidade basal é definida como “os efeitos adversos resultantes da
interferência com estrutura e/ou processos celulares essenciais para a sobrevida,
proliferação e/ou função comum a todas as células do organismo” (VALADARES,
2006). A avaliação da citotoxicidade basal é importante, uma vez que as funções
celulares basais suportam as funções celulares órgãos-específicas. A citotoxicidade
basal é expressa como IC
50
(concentração que inibe 50% das células quando
comparado às células controle não-tratadas), a qual pode ser matematicamente
calculada à partir da curva de concentração-efeito. Vários métodos aplicados para
testar a toxicidade geral são úteis na toxicologia in vitro. Como regra geral, as
células são expostas a diferentes concentrações de um produto químico por um
dado período de tempo, sendo posteriormente a função celular mensurada utilizando
diferentes alvos. Os ensaios mais freqüentemente empregados para a avaliação de
citotoxicidade basal são, o teste de redução do tetrazolium MTT e o teste da
captação do corante vital vermelho (VALADARES, 2006).
1.1.9 Mutagenicidade e Genotoxicidade
O DNA sofre alterações denominadas mutações, que podem ser causadas
por erros durante a duplicação do DNA, durante a divisão celular. O aparecimento de
mutações ocorre em todos os seres vivos, sendo um processo fundamental para a
evolução e diversidade das espécies. Muitas das mutações não implicam em
23
mudanças detectáveis na atividade metabólica da célula ou do organismo e,
portanto, passam despercebidas. Outras, porém, podem determinar a morte celular
e, por conseqüência, não são, também, detectáveis. Dessa forma, apenas um
pequeno número de mutações que ocorrem em genes específicos pode determinar
vantagens ou um crescimento desordenado das células (RIBEIRO; MARQUES,
2003).
Os chamados agentes mutagênicos são aqueles que alteram a seqüência de
bases no DNA, provocando a aceleração ou aumentam o aparecimento de
mutações, que estão associadas ao desenvolvimento de neoplasias. Após passar
por várias divisões, uma célula poderá acumular mutações que, se em número
elevado, poderão determinar a perda do controle de sua divisão, determinando o
aparecimento do câncer (RIBEIRO; MARQUES, 2003).
Os agentes mutagênicos podem ser endógenos (óxido nítrico, radicais livres
de oxigênio, nitrosaminas endógenoas), ocupacionais (produtos petroquímicos,
energia nuclear, produção de ferro e aço), dietéticos (mutágenos naturais presentes
na dieta, mutágenos gerados durante o cozimento de alimentos, mutágenos gerados
no processo de preservação dos alimentos), radiação (exposição médica-raios X
para diagnóstico e terapias, exposição ao lixo nuclear), poluição (efluentes
industriais, subprodutos da cloração da água, emissões por motores de veículos,
pesticidas utilizados na agricultura, incineração de lixo), biológico (mutágenos
gerados por infecções crônicas por vírus, bactérias ou parasitas) (RIBEIRO;
MARQUES, 2003).
A Genética Toxicológica avalia os efeitos genotóxicos em potencial, uma vez
que são considerados pré-requisitos importantes para o desenvolvimento de efeitos
adversos à saúde, como o câncer (RIBEIRO; MARQUES, 2003).
A toxicidade genética não é uma medida da carcinogenicidade, mas é
freqüentemente usada como um indicador para o câncer uma vez que os testes de
mutagenicidade medem um evento inicial ou intermediário da tumorigênese,
havendo associação elevada entre respostas positivas em testes de toxicidade
genética e carcinogenicidade, tanto em roedores como no homem. Os testes de
24
toxicidade genética são utilizados para uma avaliação do espectro toxicológico de
compostos químicos e medicamentos (RIBEIRO; MARQUES, 2003).
Um número de testes de curta-duração está disponível para avaliação do
perigo genético. Esses modelos são categorizados pelos indicadores biológicos que
avaliam, ou seja: mutação gênica, dano cromossômico ou lesão no DNA. A
associação íntima desses indicadores biológicos, bem caracterizados e facilmente
quantificados, com os mecanismos conhecidos de ativação de protooncogenes ou
perda de função de genes supressores de tumor, tem fortalecido a importância dos
testes de genotoxicidade (RIBEIRO; MARQUES, 2003).
1.1.10 Ensaio do Cometa
O ensaio do Cometa (Single Cell Gel Electrophoresis assay (SCGE)) não é
utilizado para detectar mutações, mas sim lesões genômicas que, após serem
processadas, podem resultar em mutação. O ensaio avalia o dano ao DNA de
células simples baseado na migração do DNA desnaturado em um campo
eletroforético (ÖSTLING; JOHANSON, 1984; SINGH et al., 1988). Células individuais
ou núcleos são embebidos em agarose, lisadas para expor o DNA, tratado com
agentes alcalinos para desnaturar/relaxar o DNA, logo após é realizada a
eletroforese para separar o DNA (TICE et al., 2000; HARTMANN et al., 2003). O
DNA é visualizado pela coloração de prata ou através de corantes fluorescentes.
Danos ao DNA contendo margens rompidas migram mais no gel que o DNA intacto,
criando uma imagem que lembra um cometa no céu. Quando realizado sob
condições alcalinas, o ensaio do cometa detecta (mas não distingue entre) dupla-fita
quebrada, fita-simples quebrada, sítios sensíveis à alcalinidade (fitas-simples
quebradas), reparo de excisão incompleto (dupla-fita quebrada), interações DNA-
DNA e interações proteínas-DNA. A especificidade do ensaio do cometa pode ser
aumentada para investigar tipos específicos de danos ao DNA pela adição de
enzimas modificadoras do DNA. Enzimas que têm tido sucesso estão sendo
utilizadas no ensaio do cometa, como a Mut M (Fpg) para danos oxidativos, AlkA
para danos de alquilação, Endo III para pirimidinas oxidadas e Proteinase K para
interações DNA-proteínas. O teste do cometa pode ser utilizado também para
estudos de reparo do DNA, trazendo informações importantes sobre a cinética e o
25
tipo de lesão reparada, embora não possibilite inferir fidedignidade do processo de
reparo.
Por sua simplicidade e relativo baixo custo, o teste do cometa é promissor
para avaliação de produtos químicos em larga escala. O teste pode ser utilizado
para distinguir entre danos genotóxicos ou citotóxicos, in vitro, ou entre cancerígenos
de ação genotóxica ou não genotóxica, in vivo de um composto químico ou
industrial. Análises podem incluir organismos, tecidos ou cultura dos quais uma
célula simples ou o núcleo possa ser isolado. O cometa resultante do DNA é
analisado visualmente pela estimativa da extensão do dano ao DNA ou medida do
tamanho da cauda. Ferramentas para análise de imagens estão disponíveis para
analisar os vários parâmetros do cometa, incluindo a percentagem de migração do
DNA e tamanho da cauda. O teste do cometa pode integra as baterias de testes in
vitro/in vivo usadas para fins de regulamentação de produtos químicos, uma vez que
se encontra validado para este fim (TICE et al., 2000).
1.1.11 Ensaio do Micronúcleo
O teste do micronúcleo é o ensaio in vivo mais amplamente utilizado para
detecção de agentes clastogênicos (que quebram cromossomos), e de agentes
aneugênicos (que induzem aneuploidia ou segregação cromossômica anormal)
(MACGREGOR et al., 1987). Os micronúcleos são estruturas presentes no
citoplasma de células em divisão, que possuem características cromatínicas
semelhantes às do núcleo principal e são formados por fragmentos acêntricos ou por
cromossomos inteiros que se atrasam durante a anáfase. Eles aparecem nas
células-filha em decorrência de danos induzidos nas células parentais. Os
fragmentos cromossômicos que resultam de quebras, podem não ser incorporados
no núcleo principal das células-filha após a mitose. Uma membrana nuclear se
formará em volta do fragmento, que será visível como um pequeno (micro) núcleo
separado do núcleo principal da célula. Os micronúcleos podem ser formados a
partir de um cromossomo inteiro, quando ocorre dano no aparelho mitótico da célula,
ou no próprio cromossomo. Nesta situação, o micronúcleo irá conter o centrômero
do cromossomo, o qual pode ser detectado utilizando-se sondas específicas
(RIBEIRO; MARQUES, 2003).
26
Dentre os testes de avaliação de genotoxicidade preconizados pelas agências
internacionais e instituições governamentais, o teste de micronúcleo em medula
óssea de roedores in vivo é amplamente aceito e recomendado para a avaliação e o
registro de novos produtos químicos e farmacêuticos que entram anualmente no
mercado mundial (CHOY, 2001; RIBEIRO; MARQUES, 2003).
Os micronúcleos originam-se de fragmentos cromossômicos acêntricos,
produzidos por quebras cromossômicas, ou ainda de cromossomos inteiros que
sofrem retardo em relação aos demais, durante a migração para os pólos da célula
em anáfase durante a divisão celular. A avaliação da incidência de micronúcleos
vem sendo amplamente utilizada para detectar dano cromossômico estrutural. Evans
et al. (1959) usaram a freqüência de micronúcleos para medir o dano citogenético
induzido em plantas por irradiações. Högstedt e colaboradores (1981a, b)
demonstraram in vivo a ação citogenética de diversas substâncias no esfregaço de
medula óssea por meio do teste de micronúcleos. Na década de 70, o teste de
micronúcleos tornou-se viável e confiável através do estudo de eritrócitos
policromáticos da medula óssea em camundongos, passando a ser um dos mais
úteis indicadores de dano citogenético na medula óssea (HEDDLE, 1973; SCHMID,
1975).
Mais recentemente, o teste de micronúcleo emergiu como um dos métodos
recomendados para avaliar os danos do cromossomo, uma vez que este método
permite a avaliação confiável tanto da perda quanto da ruptura do cromossomo,
(FENECH, 2005). Conseqüentemente, a comparação da freqüência de micronúcleos
entre populações de células em divisão só seria segura quando a cinética de divisão
nuclear, pós o dano ao DNA, fosse idêntica (FENECH et al.,1997).
1.2 Produtos naturais
Desde o início da colonização brasileira, o interesse pelos produtos naturais
originados de plantas nativas tem sido despertado e explorado. Atualmente, novos
seres vivos, além das plantas, vêm sendo alvo de exploração para a descoberta de
novos produtos naturais com propriedades medicinais, como por exemplo, os
animais marinhos, especialmente as esponjas (PEREIRA; SOARES-GOMES, 2002).
27
A importância dos produtos naturais ultrapassa os limites de simples exploração da
natureza (GOTTLIEB; KAPLAN, 1983).
O Brasil possui a maior biodiversidade do mundo, estimada em cerca de 20%
do número total de espécies do planeta. Esse imenso patrimônio genético, já
escasso nos países desenvolvidos, tem na atualidade valor econômico-estratégico
inestimável em várias atividades, mas é no campo do desenvolvimento de novos
medicamentos onde reside sua maior potencialidade A intensidade dessa afirmação
é facilmente observada quando se analisa o número de medicamentos obtidos direta
ou indiretamente a partir de produtos naturais (PANDEY, 1998; CRAGG et al., 1998;
VERPOORTE, 1998; SHU, 1998; HARVEY, 2000; De SMET, 1997). A terapêutica
moderna composta por medicamentos com ações específicas sobre receptores,
enzimas e canais iônicos não teria sido possível sem a contribuição dos produtos
naturais, notadamente das plantas superiores, das toxinas animais e dos
microrganismos (VERPOORTE, 1998).
Embora menos da metade da biodiversidade mundial tenha sido estudada,
140 mil metabólitos intermediários, oriundos, sobretudo de plantas superiores e de
microrganismos, foram isolados e caracterizados, mas ainda não foram avaliados
biologicamente (VERPOORTE, 1998). O interesse pela biodiversidade para a
produção de medicamentos aumentou sensivelmente com a conclusão do genoma
humano, uma vez que o número de possíveis alvos terapêuticos aumentou
sensivelmente com esses novos conhecimentos.
Graças aos produtos naturais, incluindo as toxinas extraídas de animais, de
bactérias, de fungos ou de plantas, os cientistas puderam compreender fenômenos
complexos relacionados à biologia celular e molecular e a eletrofisiologia, permitindo
que enzimas, receptores (como exemplo, receptores nicotínicos), canais iônicos e
outras estruturas biológicas fossem identificados, isolados e clonados. Isso
possibilitou à indústria farmacêutica desenhar drogas dotadas de maior seletividade
e também mais eficazes contra várias patologias de maior complexidade. Além
disso, os produtos naturais são usados como matéria-prima na síntese de moléculas
complexas de interesse farmacológico. Atualmente, as maiores indústrias
farmacêuticas mundiais possuem programas de pesquisa na área de produtos
naturais, pois oferecem vantagens como: grande quantidade de estruturas químicas,
28
muitas delas, complexas; muitas classes de estruturas homólogas; estruturas
químicas bi e tridimensionais; possibilidade de utilização como banco de moléculas
para ensaios de alta velocidade; economia de tempo e recursos; fonte de pequenas
moléculas para alvos moleculares complexos e, mais importante, capazes de serem
absorvidas e metabolisadas pelo organismo (SHU, 1998).
Existem, todavia, problemas que dificultam o aproveitamento da
biodiversidade para o desenvolvimento de novos medicamentos. Os principais são:
falta de leis específicas para o acesso a biodiversidade; grande complexidade das
moléculas isoladas a partir de produtos naturais, que às vezes dificulta sua síntese;
o tempo necessário para o descobrimento de moléculas líderes às vezes é longo; a
descoberta pode ser dispendiosa; poucas bibliotecas de compostos naturais estão
disponíveis; existem poucas informações com relação à estrutura-atividade desses
compostos; freqüentemente, moléculas já conhecidas com pouco interesse, são
isoladas de produtos naturais; os químicos sintéticos muitas vezes são relutantes em
trabalhar com produtos naturais (STROBL, 2000).
1.3 Histórico do uso de produtos naturais
Antigos egípcios, que se desenvolveram na arte de embalsamar os cadáveres
para guardá-los da deterioração, experimentaram muitas plantas, cujo poder curativo
descobriram de outras civilizações, crescendo, dessa forma, a fitoterapia. O papiro
descoberto por Ebers em 1873 está repleto de receitas médicas em que entravam
plantas em misturas com outras substâncias. Os assírios incluíam em seu receituário
nada menos do que 250 plantas terapêuticas, entre as quais, o açafrão, a assa
fétida, o cardamomo e a papoula. Hipócrates (460-361 a.C.), da Grécia, considerado
o pai da medicina, empregava centenas de drogas de origem vegetal. Teofrasto
(372-285 a.C.) em sua historia das plantas, catalogou cerca de 500 espécies
vegetais. Crateus, que viveu no século I a.C., publicou a primeira obra de que se tem
conhecimento na história -O Rhizotomikon- sobre plantas medicinais com ilustrações
(BALBACH, 1974).
Além desses, muitos outros como Dioscorídes, Plínio e os árabes Abd-Allah
Ibn Ab-Bailar e Avicena, produziram obras valiosíssimas, nas quais catalogaram e
descreveram numerosas espécies vegetais úteis à medicina (NEVES, 1982).
29
Galeno, na Idade Média, descreveu um herbário medicinal chamado de Alfabetum
Galieni, no qual cerca de 300 vegetais, minerais e animais são descritos (HALLEUX-
OPSOMER, 1982).
Na Idade Moderna, a medicina chinesa é a que mais se destaca. As primeiras
investigações de farmacologia de ervas chinesas começaram em 1918, por um
jovem chinês de Pequim, K. K. Chen, que se interessou pelas propriedades do óleo
essencial do cinnamon chinês (GRIFFIN, 1979).
O interesse pelas plantas úteis no Brasil remonta desde os tempos coloniais,
até mesmo com tratados volumosos, como o de Gabriel Soares de Souza (1587) e a
obra de Piso (1658). Desde os primeiros dias em sua estada no Brasil, os
colonizadores tentaram obter informações sobre plantas medicinais locais
(GOTTLIEB; MORS, 1978).
1.4 Fitoterápicos
A fase seletiva da fitoterapia começou praticamente com Schmiedeberg
(1839-1921) e seus inúmeros discípulos (GOMES, 1972).
Um emprego importante da biodiversidade refere-se a produção dos
fitomedicamentos, também conhecidos como fitoterápicos. Esses medicamentos
constituem-se em preparações contendo extratos padronizados de uma ou mais
plantas, hoje amplamente comercializados em países pobres ou ricos. De acordo
com a definição proposta pela OMS, os fitomedicamentos são substâncias ativas
presentes na planta como um todo, ou em parte dela, na forma de extrato total ou
processado. Os constituintes responsáveis pela atividade farmacológica são, em
geral, pouco conhecidos e se acredita que a ação farmacológica desses produtos
envolva a interação de inúmeras moléculas presentes no extrato (CALIXTO, 2000).
Nas últimas décadas, houve um aumento expressivo no mercado mundial dos
fitomedicamentos, especialmente nos países industrializados. Os países europeus,
especialmente a Alemanha, os países asiáticos e os Estados Unidos, possuem os
principais mercados consumidores desses medicamentos (CALIXTO, 2000;
GRÜNWALD, 1995). O mercado brasileiro de fitomedicamentos atingiu, em 2001,
cerca de US$ 270 milhões correspondendo a 5.9 % do mercado brasileiro de
30
medicamentos, maior, portanto, que a comercialização dos medicamentos genéricos
que foi de R$ 226 milhões (5% do mercado global brasileiro) (CALIXTO, 2000).
Com a aprovação e a entrada em vigor da lei de propriedade industrial no
Brasil no final da década de 90, várias indústrias farmacêuticas nacionais
estabeleceram parcerias com o setor acadêmico, visando o desenvolvimento de
fitomedicamentos, tendo por base a Resolução número 17 de 24/02/2000 da
ANVISA, que estabelece as normas para o registro e a comercialização desses
medicamentos. No Brasil, o registro de um fitomedicamento necessita de estudos
científicos para a comprovação da qualidade, da eficácia e da segurança de uso.
Uma das poucas iniciativas por parte do governo federal, visando estimular o uso da
biodiversidade brasileira para a produção de medicamentos, foi o programa de
pesquisa em plantas medicinais, idealizado e financiado pela Central de
Medicamentos (CEME), que teve seu início na década de 80. Contudo, com a
extinção da CEME, ocorrida no final dos anos 90, praticamente pouco restou dessa
iniciativa pioneira em nosso país que, sem dúvida, deveria ter continuado.
Entretanto, o programa permitiu o surgimento de vários grupos de pesquisas,
especialmente nas áreas de farmacologia pré-clínica, toxicologia e de farmacologia
clínica interessados no estudo das plantas brasileiras. Comparado ao
desenvolvimento de um novo medicamento sintético, que envolve vultosas somas de
recursos, o desenvolvimento de um fitomedicamento requer menos recursos, e
também menor tempo de pesquisa. Com base no vasto conhecimento popular já
existente para o uso de muitas plantas medicinais, estima-se que os custos para o
desenvolvimento de um fitomedicamento não devem ultrapassar 2 a 3 % daquele
previsto para o desenvolvimento de um novo medicamento sintético. Esses valores
são compatíveis com o atual estágio de desenvolvimento das indústrias
farmacêuticas nacionais (CALIXTO, 2000).
O grande desafio para o aproveitamento racional da biodiversidade brasileira
visando à produção de medicamentos é, sem dúvida, como transformar um imenso
patrimônio genético natural em riquezas, criando indústrias de base tecnológica e
gerando empregos qualificados (CALIXTO, 2000).
É bastante claro, para o Brasil, a importância das plantas medicinais,
considerando-se a enorme população ocupante no imenso território do país e seu
31
nível de renda, que nem sempre tem acesso aos medicamentos industrializados.
Para essa população, os fitoterápicos desempenham um papel fundamental na
manutenção das condições de saúde e cura de seus males (LAINETTI; BRITO,
1980).
O problema da qualidade dos fitoterápicos no Brasil vem sendo apontado há
muito tempo. Para a manutenção e fortalecimento da indústria farmacêutica regional,
considera-se necessária a melhoria da qualidade destes produtos, atendendo as
exigências crescentes dos consumidores e dos órgãos de fiscalização. É preciso que
as pessoas atuantes nessas áreas tenham a consciência de que produtos para uso
terapêutico devem ser tratados de maneira diferenciada e responsável. Colocar no
mercado produtos de segurança e eficácia estabelecidas é um princípio ético que
deve nortear a produção de medicamentos (FARIAS et al., 1985).
A qualidade de um produto é dada por um conjunto de fatores que incluem
desde a matéria-prima, controle do processamento e controle da forma farmacêutica,
até a bula, a embalagem e a propaganda. Todos esses fatores podem afetar a
segurança e eficácia do produto, causando prejuízos ao consumidor (FARIAS et al.,
1985).
A qualidade das formulações farmacêuticas está intimamente ligada à
qualidade da matéria-prima. No caso de fitoterápicos, a análise de insumos vegetais
é relativamente simples; os extratos e formas farmacêuticas derivadas requerem
análises mais sofisticadas, principalmente quando contém misturas de drogas
vegetais. Nesses últimos, a autenticidade do produto é dada exclusivamente pela
sua composição química (FARIAS et al., 1985).
Na análise de matérias-primas os problemas mais freqüentes são as
adulterações, a não uniformidade da composição química e as contaminações. Eles
são decorrentes, em grande parte, da atual forma de exploração das plantas
medicinais e da falta de controle de qualidade. De um modo geral, são utilizadas
plantas silvestres, de acordo com as necessidades dos laboratórios, sem épocas ou
locais definidos de coleta. Através do cultivo de plantas medicinais muitos desses
problemas poderiam ser contornados, entretanto essa prática ainda é pouco usual
em nosso meio (FARIAS et al., 1985).
32
Grande parte das drogas vegetais comercializadas em nosso meio não consta
em nenhuma Farmacopéia ou apenas na Farmacopéia Brasileira I (SCHENKEL,
1983). Essa farmacopéia data de 1926, sendo anterior ao desenvolvimento das
técnicas cromatográficas, atualmente indispensáveis para o controle de qualidade de
fitoterápicos. Em decorrência, para muitas dessas drogas, as normas farmacopéicas
de identificação e qualidade atêm-se à identificação botânica da matéria-prima, o
que, isoladamente, não garante a qualidade dos produtos. Muitos desses vegetais
foram posteriormente estudados química e farmacologicamente: esses trabalhos
encontram-se publicados em revistas especializadas ou em monografias e podem
ser utilizados como recurso na elaboração de técnicas apropriadas de controle de
qualidade. Também para a elaboração de bulas, processos de licenciamento e
desenvolvimento de produtos são indispensáveis o acompanhamento dos trabalhos
realizados ou em andamento. A pesquisa na área de plantas medicinais tem
importância relevante, especialmente para as indústrias farmacêuticas locais e não
pode ser ignorada pelas mesmas (FARIAS et al., 1985).
1.5 A Planta
1.5.1 Alpinia zerumbet
A subclasse Zingiberidae inclui duas grandes ordens: Bromeliales e
Zingiberales. Na ordem Zingiberales, estão incluídas as famílias Musaceae,
Lowiaceae, Cannaceae, Marantaceae e Zingiberaceae (Di STASI, 2002). A família
Zingiberaceae é a maior da ordem Zingiberales, constituída de 53 gêneros e mais de
1.200 espécies nativas de regiões tropicais, especialmente do sul e sudeste da Ásia
(CRONQUIST, 1981), expandindo-se através da África tropical até a América do Sul
e Central (TOMLINSON, 1969), além das Ilhas do Pacífico e Austrália (KRESS et al.,
2005). Suas espécies, principalmente da floresta primária, com média e baixa
elevação, crescem em hábitats sombreados ou semi-sombreados, ricos em húmus e
formam grupos com troncos de tamanhos que variam de 1-3m, embora algumas
espécies ao leste da linha Wallace possam crescer muito mais (DAHLGREN et al.
1985; KRESS et al., 2005). Alpinia regia R. M. Sm. de Moluccas e A. Boia Seem das
Ilhas Fiji, por exemplo, podem alcançar mais de 8m de tamanho. Algumas espécies
33
são encontradas em florestas montanhosas com mais de 2.000 m acima do nível do
mar na Nova Guiné e Sulawesi. Entretanto, muito poucas são tolerantes às geadas
(KRESS et al., 2005).
Alpinia é o maior gênero da família, com mais de 200 espécies (CRONQUIST,
1981) e ocorre na Malásia e nas ilhas do Oceano Pacífico (DAHLGREN et al., 1985).
A espécie estudada, Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt & Smith, muito cultivada pela
beleza de suas flores (JOLY, 1993), é conhecida pelos nomes vulgares de colônia,
paco-seroca, cuité-açu, pacová (ALMEIDA, 1993), gengibre-concha (LORENZI;
SOUZA, 1995), cardamomodo-mato, cardamomo-falso, cana-do-brejo, cana-domato
e paco-seroso (MACHADO, 1996).
Alpinia zerumbet é uma planta herbácea, ligeiramente aromática, rizomatosa,
robusta, perene, com colunas de 2 a 3 metros de altura, lisas, verde-claras,
agrupadas em touceiras (Figura 1). As folhas são simples, lanceoladas, oblongas,
pontudas, invaginantes (que abraçam o caule), dispostas disticamente, com larga
bainha na base e lígula desenvolvida, verde-luzidias, com margens ciliadas com
cerca de 50 a 70 cm de comprimento sobre 10 a 12 de largura e apresentam
nervuras paralelas (Figura 2). As flores são ligeiramente aromáticas, dispostas em
cachos grandes, protegidas por brácteas vistosas, hermafroditas, zigomorfas,
terminais pendentes, amarelo-róseas com três lobos e um grande lábio
(característica da família Zingiberaceae) (Figura 2). Androceu composto de um único
estame fértil com grande antera e um número variável de estaminódios, em geral
quatro, grandes e petalóides, que desempenham a função de atração da flor
(CAMARGO, 1998; ALICE et al., 1995; PANIZZA, 1998). O fruto é uma cápsula
globosa, com dois centímetros de diâmetro e abriga diversas sementes. A
propagação de Alpinia se dá por meio da divisão dos rizomas (FLORES & FOLHAS,
2008).
Muitas espécies da família têm valor econômico fornecendo alimentos
(féculas dos rizomas), perfumes, condimentos de propriedades aromáticas, corantes,
fibras e papel (TOMLINSON, 1969). Zingiber officinale Rosc., vulgarmente conhecido
como gengibre, é utilizado para fins medicinais e como condimento (JOLY, 1993).
No aspecto ornamental destacam-se os gêneros Zingiber, Alpinia, Nicolaia,
Hedychium e Kaempferia pela beleza da folhagem e da inflorescência (WINTERS,
34
1995). A espécie A. purpurata (Vieill.) K. Schum.) é importante planta ornamental
usada em vasos, paisagens e como flores de corte (KRESS et al., 2005).
Figura 1 - Foto ilustrativa de um espécime de A. zerumbet, na época de floração
Figura 2 -
Foto ilustrativa das flores de Alpinia zerumbet, evidenciando a estrutura
interna da flor e tipo de coloração nas fotos em detalhe
A colônia foi trazida para o Brasil no século XIX para o Jardim Botânico do Rio
de Janeiro, onde recebeu o nome de flor-da-redenção e bastão-do-imperador, o
qual, segundo se admite, deve-se ao fato de terem sido usadas as flores dessa
35
planta para presentear a princesa Isabel, logo após ter assinado a Lei Áurea, em 13
de maio de 1888 (CAMARGO, 2008).
É cultivada como planta ornamental devido à fragrância de suas flores e
folhas e empregada em rituais religiosos afro-brasileiros (CAMARGO, 2008).
Atualmente é empregada na medicina popular ao redor do mundo, devido as
suas propriedades antiinflamatórias, bacteriostáticas e fungiostáticas (ZOGHBI et al.,
1999; ITOKAWA et al., 1981a; ITOKAWA et al., 1981b; ITOKAWA et al., 1987). O
chá preparado com as folhas, flores ou raízes tem sido usado no tratamento caseiro
da hipertensão (LORENZI; MATOS, 2002), sendo, também relacionada como
espécie calmante (CAMARGO, 2008).
Segundo Almeida (1993), as propriedades medicinais da espécie estão
relacionadas às folhas, flores e rizomas, sendo consideradas depurativas, diuréticas,
anti-histéricas, estomáquicas e vermífugas. Existem relatos de atividade anti-
helmíntica de Alpinia sp (SUZUKI et al., 1996). É ainda, utilizada por lavradores da
região de Ribeirão Preto (SP) no tratamento de reumatismo e males cardíacos
(CARLINI, 1972).
A espécie tem sido largamente estudada em relação às suas propriedades
farmacológicas. Os estudos com o chá das folhas da colônia realizado por
Mendonça et al. (1991) e Laranja et al. (1992) confirmam o seu efeito hipotensor. Os
estudos realizados por Fonteles e Oliveira (1984 apud ALMEIDA, 1993) revelaram
resultados significativos quanto ao efeito diurético, entretanto, os mesmos não foram
obtidos por Laranja et al. (1992). Santana et al. (1966) mostraram ação
antiinflamatória capaz de inibir processos edematosos. A colônia tem sido também
estudada em relação às atividades antifúngicas (LIMA et al., 1993) e antibacterianas,
além da produção de inseticidas a partir dos óleos essenciais da flor (MORITA,
1992). Foram isolados dos rizomas de A. zerumbet derivados de dehidrokawaina
com atividade antiplaquetária (TENG et al., 1990). Os compostos isolados dos
rizomas de A. zerumbet, dihidro-5,6-dehidrokawaina, e 5,6-dehidrokawaina são os
responsáveis pela atividade protetora da mucosa gástrica e duodenal em modelos
de úlceras induzidas experimentalmente em roedores (HSU, 1987). A análise
fitoquímica de A. zerumbet, através de cromatografia de camada delgada,
36
demonstrou a presença de taninos catéticos, fenóis e alcalóides, além de óleo
essenciail (MENDONÇA et al., 1991). A composição química dos óleos essenciais
encontrados na folha e no rizoma da espécie foi estudada por Fujita e Yamashita
(1973) e por De Pooter et al. (1995). O óleo essencial extraído das folhas de colônia
apresentou atividades relaxantes e antiespasmódicas no íleo de ratos (BEZERRA et
al., 2000). Essa atividade anti-espasmódica é provocada por moléculas de
sesquiterpenos presentes nos extratos metanólicos dos rizomas e das folhas de A.
zerumbet e A. japonica, como o β-eudesmol, nerolidol, epóxido de humulene II e 4α-
hidroxidihidroagarofurano (MORITA et al., 1996). Elaawely et al. (2007a)
observaram que existem três diferentes produtos (óleo essencial, dihidro-5,6-
desidrokawaína (DDK) e compostos fenólicos) que podem ser obtidos das folhas e
do rizoma da A. zerumbet. Os compostos fenólicos e o DDK apresentaram forte
atividade antioxidante. Posteriormente, os mesmo autores isolaram óleo essencial,
compostos fenólicos e DDK de flores e sementes de A. zerumbet e mostraram que
esses compostos também apresentavam atividade antioxidante (ELAAWELY et al.
2007b).
A administração de extrato hidroalcóolico de A. zerumbet produziu excitação
psicomotora, contorções, hipocinese, além de prolongar o tempo de sono (Di STASI,
2002). Estudos toxicológicos (agudos e crônicos) com extratos etanólicos de A.
galanga foram realizados e demonstradas mudanças intensas no ganho de peso e
aumento da motilidade e contagem de espermatozóides (QURESHI et al., 1992).
No nordeste brasileiro, bem como na região amazônica, o chá obtido por
infusão da folha tem sido utilizado pelo efeito cardiovascular e hipotensor (Di STASI,
2002). Entre outros efeitos da medicina popular, verificam-se as propriedades
calmante, antiasmática, diurética e anti-hipertensiva (MATOS, 1987). Seu emprego
sob a forma de chá ou infusão é generalizado entre os cardíacos e hipertensos
(MATOS, 1988). A posologia normal e popular é de 4g da folha para 250 mL de
água fervida, no tratamento da hipertensão, da asma, dispnéias e hidrópsias (barriga
d’água). Utiliza-se de 2-3 xícaras do chá por dia (MATOS, 1987).
Embora o uso da maioria das plantas medicinais não traga prejuízos aos
usuários, o risco de intoxicação sempre existe, principalmente se não for utilizado de
maneira correta. Daí a constante necessidade de avaliação das propriedades
37
atribuídas às plantas com vistas a sua confirmação ou invalidação, além do
estabelecimento da toxicidade e as doses em que essa toxicidade se torna perigosa
à saúde humana e de animais (MATOS, 1988). Com intuito de esclarecer os efeitos
farmacológicos da planta e sugeri-la como possível fitoterápico, realizamos o teste
de toxicidade aguda pela determinação da dose letal para 50% dos animais (DL
50
)
do extrato aquoso bruto por via oral em camundongos, uma vez que esse
conhecimento é exigido pela ANVISA para que o produto seja registrado como
fitomedicamento. A ausência de dados toxicológicos e o uso popular generalizado
do chá de colônia foram os motivos principais que motivaram a execução deste
trabalho.
38
2 OBJETIVO
2.1 Objetivo geral
Estabelecer o perfil toxicológico do extrato aquoso liofilizado dissolvido
em água destilada de Alpinia zerumbet.
2.2 Objetivos específicos
Determinar se o óleo essencial e o extrato aquoso de Alpinia zerumbet
são citotóxicos para HL-60, K-562, CEM, MDA-MB-435, MDA-MB-231,
HCT-8, PC-3, SF-295 e B16;
Determinar se o óleo essencial e o extrato aquoso de Alpinia zerumbet
são hemolíticos;
Determinar a DL
50
do extrato aquoso de Alpinia zerumbet dissolvido em
água destilada;
Determinar se o óleo essencial e o extrato aquoso de Alpinia zerumbet
têm ações genotóxicas.
39
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
3.1.1 Equipamentos
Agitador de placa, MLW Modelo Thys 2
.
Agitador de tubo, Donner AD 8850
.
Banho-maria, DELLTA Modelo 105Di
.
Centrífuga Centimicro, FANEN Modelo 212
.
Centrífuga Excelsa Baby, I FANEN Modelo 206
.
Centrífuga de placas, Eppendorf Modelo Centrifuge 5403
.
Centrífuga de lâminas, Shandon Southern Cytospin
.
Deionizador de água Milli-Q, Milipore
.
Espectrofotômetro de placaDTX-880, Beckman Coulter
.
Incubadora de células, (CO
2
Water-Jacket Incubator) NUAIRETS
Autoflow
.
Fluxo laminar, VECO
.
High Throughput Screening (HTS)/ Laboratory Automation Workstation,
Biomek 3000, Beckman Coulter
.
Máquina fotográfica digital, Olympus C-7070
.
Microondas, Panasonic
.
40
Microscópio óptico, Metrimpex Hungary/ PZO-Labimex Modelo Studar
lab
.
Microscópio óptico de inversão, Nikon Diaphot
.
Microscópio de fluorescência.
Micrótomo, Slee Mainz
.
PHmetro, Micronal B474
.
Pipetas automáticas, Gilson
.
Sistema de Eletroforese Horizontak mini Submarine, Amershan
Bioscience
.
3.1.2 Soluções
Agarose 1%
• 0,5g de agarose (FMC-Bioproducts
)
• Água deionizada q.s.p. 50mL
Agarose LMP 1,5%
• 1,5g de agarose (Gibco
)
• PBS q.s.p 100mL
Agarose NMP 0,5% (Gibco
)
• 0,5g de agarose (Gibco
)
• PBS q.s.p 100mL
Azul de Tripan 10% (Vetec
)
• 10mg de azul de tripan
• PBS q.s.p. 100mL de solução
41
Brometo de Etídio 100µg/mL(Sigma
)
• 1mg de brometo de etídio
• PBS q.s.p. 10mL de solução
Eosina 0,5% (Doles
)
• 0,5g de Eosina (Doles
)
• 80mL de álcool etílico
• 0,5mL de ácido acético
• Água deionizada q.s.p 20mL
Formaldeído 10% (Dinâmica
)
• 100mL de formaldeído (Dinâmica
)
• Água deionizada q.s.p. 1L
Hematoxilina 0,1% (Doles
)
• 0,5g de hematoxilina (Doles
)
• 10mL de Glicerina (Labsynth
)
• 25g de sulfato de alumínio (Labsynth
)
• 0,1g de iodeto de potássio (Labsynth
)
•
Água destilada q.s.p. 500mL solução
MTT (Sigma
)
• 20mg de MTT (Sigma
)
• PBS q.s.p. 100mL solução
Solução fisiológica Ringer-lactato (Laboratórios Biosintética
)
42
Solução de eletroforese
• EDTA 1mM, NaOH 300mM pH>13
Solução de lise
• NaCl 2,5M
• EDTA 100mM
• Tampão tris 10mM
• N-Lauroylsarcosine 1% pH10
• Triton X-100 1%
• DMSO 10%
Solução de neutralização
• Tampão tris 0,4M pH 7,5
Soro Fetal Bovino (SFB) (Cultilab
)
Solução salina (para hemólise)
• 8,5g Cloreto de sódio (0,85%) (Labsynth
)
• 1,11g Cloreto de Cálcio (10mM) (Reagen
)
• Água destilada q.s.p. 1L solução
Tampão de corrida 50 X (TAE)
• 242g Tris
• 57,1mL ácido acético glacial
• 100mL EDTA 0,5M
Tampão fosfato de sódio (PBS)
43
• 8,766g cloreto de sódio (Labsynth
)
• 2,14g NaHPO
4
.7H2O (Labsynth
)
• 0,276g NaHPO
4
.H2O (Labsynth
)
• Água destilada q.s.p. 1L solução (pH 7,2)
Tampão Tris (TBS) 10 X
• Cloreto de sódio 1,5M (Labsynth
)
• Tris 0,5M pH 7,6
• Água destilada q.s.p.
Tripsina 0,25%
• 50mL de tripsina 2,5% (Cultilab
)
• 0,125g EDTA (Proquímios
)
•
450mL PBS
Xilol 10%
•
100mL formaldeído
•
Água destilada q.s.p. 1L
3.1.3 Reagentes e Fármacos
Ácido acético glacial (VETEC
)
Ácido clorídrico (VETEC
)
Álcool etílico (VETEC
)
Corante de Leishman (Cinética
)
Cloreto de cálcio (Labsynth
)
44
Cloreto de sódio (Labsynth
)
Dimetilsulfóxido (DMSO) (VETEC
)
Doxorrubicina-fornecida pelo Instituto do Câncer do Ceará (Sigma
)
EDTA (Qeel
)
Estreptomicina 10mg/mL (Cultilab
)
Ficoll (Sigma
)
Fitohemaglutinina (Sigma
)
Hidróxido de sódio (VETEC
)
Meio de cultura de células RPMI 1640 (Cultilab
)
N-Lauroilsarcosina (Sigma
)
Penicilina-estreptomicina (Cultilab
)
Penicilina 10.000 U.I./mL (Cultilab
)
Resazurina (Sigma
)
Triton X-100 (Isofar
)
3.1.4 Modelos Biológicos
Camundongos albinos (Mus musculus) da linhagem Swiss.
Este projeto, com o n
o
77/08, foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
da Universidade Federal do Ceará e conduzido de acordo com a resolução 196/96
do Conselho Nacional de Saúde.
Os animais, camundongos Swiss (Mus musculus), machos e fêmeas, foram
obtidos do Biotério Central da Universidade Federal do Ceará, com cerca de 3
semanas de idade e pesando cerca de 18g. Foram acondicionados em caixas de
polipropileno autoclaváveis, 303 x 193 x 126 mm, com tampa grade em aço. Os
45
animais receberam água da rede pública (filtrada) ad libitum e foram alimentados
com ração comercial (em todas as idades) fornecida também ad libitum, que atende
as recomendações do National Research Council e National Institute of Health -
Estados Unidos. A temperatura do ambiente foi mantida constante, cerca de 25
±2°C, com fotoperíodo de 12h de claro e 12h de escuro.
Linhagens Celulares tumorais mantidas em cultura (Tabela 1).
Linfócitos murinos isolados de camundongos sadios.
3.2 Preparação do óleo essencial e do extrato aquoso liofilizado utilizado no
tratamento
Folhas frescas de A. zerumbet foram coletadas no sítio Vila Nova, localizado
no distrito de Ladeira Grande, no município de Maranguape. A exata localização
encontra-se a 3º59’26.49’’ de latitude sul e a 38º42’59.10’’ de longitude oeste. A
identificação botânica da planta encontra-se no Herbário Prisco Bezerra-EAC da
Universidade Federal do Ceará sob o número 41.041.
Os
constituintes de um óleo essencial em particular podem ser separados por:
destilação fracionada a pressão reduzida, cristalização ou cromatografia.
O óleo essencial foi isolado através da técnica do arraste de vapor. A técnica
de extração pelo arraste de vapor permite a separação de componentes voláteis,
sem necessidade de temperaturas elevadas, evitando-se assim, a sua
decomposição térmica. Em laboratório, a técnica é realizada por meio de um
sistema de destilação simples, adaptado com um funil de adição, através do qual
água é adicionada constantemente, permitindo assim, que o nível da água no frasco
de destilação permaneça constante (UNIVERSIDADE DE BRASILIA, 2008).
O extrato aquoso de A. zerumbet foi preparado a partir de 1,5 g de folhas
frescas, previamente cortadas, pesadas e empacotadas em sacos apropriados para
produção de chá. Cada saco foi imerso em 200 mL de água destilada em ebulição e
mantido abafado por 5 minutos. O chá produzido foi liofilizado no mesmo dia para a
realização dos testes.
46
3.3 Ensaio de citotoxicidade pelo MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5
difeniltertrazolim brometo)
A citotoxicidade foi avaliada através do método do MTT (MOSMANN,1983), o
qual vem sendo utilizado no programa de “screening” do “National Câncer Institute-
NCI” dos Estados Unidos, que testa mais de 10.000 amostras a cada ano (SKEHAN
et al., 1990). É um método rápido, sensível e barato que analisa a viabilidade e o
estado metabólico da célula, baseado na conversão do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-
2,5-difenil-brometo de tetrazolium (MTT) em azul de formazan, a partir de enzimas
mitocondriais presentes somente nas células metabolicamente ativas. Ou seja, a
solução amarela do MTT é reduzida pela atividade mitocondrial nas células
metabolicamente ativas em um cristal roxo.
As linhagens celulares foram cultivadas em frascos plásticos para cultura
(Corning, 25 cm
2
, volume de 50 mL para células aderidas e 75 cm
2
para células em
suspensão), utilizando o meio de cultura RPMI 1640 complementado com 10% de
soro fetal bovino e 1% de antibióticos (penicilina/estreptomicina). As células foram
incubadas em estufa a 37°C com atmosfera de 5% de C O
2
e 95% de umidade,
seguido da observação de crescimento celular com o auxílio do microscópio de
inversão a cada 24h. Quando necessário, as células foram repicadas em meio de
cultura novo em uma concentração de 0,5-1,0x10
6
células/mL.
As células em suspensão foram plaqueadas em placas de 96 poços. Cada
placa foi incubada em estufa 37ºC com 5% de CO
2
durante 3 horas. Em seguida, foi
adicionado o extrato aquoso de A. zerumbet (100 µL/poço) dissolvido em água
destilada, na concentração de 0,0075 g/mL. A adição do óleo essencial foi realizada
nas mesmas condições que o extrato aquoso, porém o óleo foi usado na
concentração de 100%. O quimioterápico doxorrubicina foi usado como controle
positivo. Após o período de incubação de 72h as placas foram retiradas e
centrifugadas a 1500 rpm/15 minutos. O sobrenadante foi aspirado, e adicionado
200 µg/mL de solução de MTT 10% em meio RPMI 1640. A placa foi colocada na
estufa 37ºC com 5% de CO
2,
durante 3 horas. Posteriormente, a placa foi
centrifugada a 3000 rpm/10 minutos. O sobrenadante foi aspirado. O precipitado foi
ressuspendido em 150 µL de DMSO e agitado por 5-10 minutos, até a completa
47
dissolução dos cristais de formazan. A placa foi lida no espectrofotômetro de placas
a um comprimento de onda de 595 nm.
3.2.1 Análise dos dados
O óleo essencial e o extrato aquoso foram testados em diluições seriadas e
em triplicatas. Suas IC
50
(concentração inibitória média capaz de provocar 50% do
efeito máximo) e seus respectivos intervalos de confiança (IC 95%) foram calculados
a partir da regressão não-linear, utilizando o programa Prisma versão 3.0 (GraphPad
Software).
48
Tabela 1 - Linhagens celulares tumorais utilizadas no ensaio de citotoxicidade in vitro através
do método do MTT
Linhagem Celular
Tipo Histológico do Câncer/ Origem
Concentração de
Plaqueamento
(células/mL)
HL-60 Leucemia promielocítica humana 0,3x10
6
K-562 Leucemia mielocítica crônica humana 0,3x10
6
CEM Leucemia linfocítica humana 0,5x10
6
MDA-MB 435 Carcinoma de mama humano 0,1x10
6
MDA-MB 231 Carcinoma de mama humano 0,1x10
6
HCT-8 Carcinoma de cólon humano 0,7x10
5
PC-3 Carcinoma de próstata humano 0,1x10
6
SF-295 Glioblastoma humano 0,1x10
6
B16 Melanoma murino 0,6x10
5
3.3 Ensaio de citotoxicidade pelo “alamar blue”
A técnica do “Alamar Blue” faz uso de um indicador de óxido-redução (redox),
o “Alamar Blue” ou resazurina (azul e não fluorescente) que é reduzido por células
viáveis a resorufina (róseo e altamente fluorescente) que pode ser reduzida a
hidroresorufina (incolor e não fluorescente). No ensaio do “Alamar blue” é
quantificado apenas a redução da resazurina a resorufina. De acordo com diversos
autores (NAKAYAMA et al., 1997; ZHI-JUN et al., 1997; HAMID et al., 2004), o
“Alamar Blue” não é tóxico para linfócitos e outros trabalhos têm comparado a
sensibilidade deste ensaio com outros métodos de avaliação da proliferação celular
e citotoxicidade, sendo relatado uma maior sensibilidade do “Alamar Blue” (PAGÉ et
49
al., 1993; ANSAR AHMED et al., 1994; De FRIES; MITSUHASHI, 1995; NAKAYAMA
et al., 1997).
O extrato aquoso liofilizado dissolvido em água na concentração de 1mg/mL
(solução-estoque) e o óleo essencial usado na concentração de 100% (solução-
estoque) foram testados em células mononucleares periféricas do sangue de
camundongos (PBMC) durante 72h de exposição. Sangue heparinizado foi coletado
de animais sadios (com idade entre 3-5 semanas) e as PBMC foram isoladas
segundo gradiente de centrifugação de Ficoll-Hypaque. Após o isolamento as PBMC
foram ressuspendidas em meio RPMI 1640 suplementado com 20% de soro fetal
bovino, 100 U/mL, 100 µg/mL de estreptomicina e 4% de fitohemaglutinina. As
células foram plaqueadas em placas de 96 poços na concentração de 0,3x10
6
células/mL. Cada placa foi incubada em estufa 37ºC com 5% de CO
2
durante 24
horas. Em seguida, foi adicionado o extrato aquoso liofilizado de A. zerumbet (100
µL/poço) dissolvido em água destilada, na concentração de 1 mg/mL. A adição d
óleo essencial foi realizada nas mesmas condições que o extrato aquoso, porém o
óleo foi usado na concentração de 100% incialmente. Doxorrubicina foi utilizada
como controle positivo. Com 24h antes do fim do período de incubação, 10 µL de
solução-estoque (0,312 mg/mL) de “Alamar Blue” (resazurina, Sigma-Aldrich Co) foi
adicionada a cada poço. A absorbância foi determinada nos comprimentos de onda
de 570nm (estado oxidado) e 595nm (estado reduzido), utilizando um leitor
multiplaca (DTX 880 Multimode Detector, Beckman Coulter). A percentagem de
“Alamar Blue” reduzido foi calculada segundo a fórmula: % reduzido = A
LW
– (A
HW
x
R
O
) x 100.
Onde: A
LW
= representa a leitura do estado reduzido.
A
HW
= representa a leitura do estado oxidado
R
O
= representa a divisão AO
LW
/AO
HW
.
AO
LW
= representa a absorbância do meio sozinho subtraído da absorbância
do meio com “Alamar Blue” em baixo comprimento de onda.
AO
HW
= representa a absorbância do meio sozinho subtraído da absorbância
do meio com “Alamar Blue” em alto comprimento de onda.
50
3.3.1 Análise Estatística do “Alamar Blue”
Os experimentos foram analisados segundo a média ± desvio padrão da
média (DPM) da porcentagem de inibição do crescimento celular usando o programa
GraphPad Prism 5.
3.4 Teste de hemólise
Esta metodologia, segundo Costa-Lotufo et al. (2002), permite avaliar o
potencial das substâncias em causar lesões na membrana plasmática das células,
seja pela formação de poros ou pela ruptura total.
O sangue foi coletado de três camundongos Swiss (Mus musculus) pela via
do plexo orbital, sendo diluído em 30 volumes de solução salina (NaCl 0,85% +
CaCl
2
10 mM) para a redução da contaminação plasmática e ressupendidos em
salina para obtenção de uma suspensão de eritrócitos a 2%. Os ensaios foram
realizados em placas de 96 poços. Cada poço da primeira coluna recebeu 100 µL da
solução salina. Na segunda coluna, os poços receberam 50 µL da solução salina e
50 µL do veículo de diluição do extrato aquoso liofilizado e do óleo essencial, neste
caso, água e DMSO respectivamente. Aos poços da terceira coluna, foram
adicionados 100 µL de solução salina e 100 µL do extrato aquoso liofilizado
dissolvido em água ou do óleo essencial, nas concentrações inciais de 0,375 mg/mL.
Da quarta coluna em diante, os poços receberam 100 µL da solução salina,
excetuando-se os da última coluna, que receberam 80 µL de solução salina e 20 µL
de Triton X-100 1% (controle positivo). As diluições foram feitas da terceira à décima
primeira cavidade, retirando-se 100 µL da solução da cavidade anterior e
transferindo para a seguinte, de modo que as concentrações foram sempre diluídas
pela metade. Em seguida, 100 µL da suspensão se eritrócitos foram adicionados a
todos os poços. Após incubação de 1h, sob agitação constante à temperatura
ambiente (26 ± 2°C), as amostras foram centrifugadas (5000 rpm/3 min) e o
sobrenadante transferido para uma outra placa para a leitura da absorbância no
espectrofotômetro de placas a 540 nm.
51
3.5 Toxicidade aguda
Os animais foram pesados (peso variando entre 21g e 30g), codificados e
separados aleatoriamente em cinco grupos, A, B, C, D e E. A dose a ser
administrada foi calculada e preparada individualmente. O grupo A recebeu extrato
aquoso na dose de 2.000 mg/Kg de peso corpóreo do animal; o grupo B recebeu a
dose de 2.750 mg/Kg de peso corpóreo do animal; o grupo C recebeu dose de 3.500
mg/Kg do peso corpóreo do animal; o grupo D recebeu dose de 4.250 mg/Kg de
peso corpóreo do animal e o grupo E recebeu a dose de 5.000 mg/Kg de peso
corpóreo do animal. Cada grupo foi formado por 5 machos e 5 fêmeas, mantidos em
caixas separadas, para evitar que eles se reproduzissem.
O extrato aquoso foi pesado de acordo com cada animal e diluído em água
destilada no dia da administração ao animal, para reproduzir ao máximo a
característica do chá tomado popularmente.
Os animais foram mantidos em jejum de 4h antes da administração do extrato
aquoso e cada um recebeu sua dose por via oral, ou seja, gavagem. Os possíveis
efeitos decorrentes da ingestão do extrato aquoso liofilizado da colônia foram
observados por 60 minutos e nas 24 h após a administração inicial. Os animais
foram pesados novamente semanalmente até completar os 14 dias de experimento,
quando foram sacrificados para avaliação macroscópica e retirada dos órgãos
internos para avaliação microscópica.
Após esse teste, avaliou-se a toxicidade do extrato aquoso pelo método de
Miller e Tainter (1944) determinando-se a DL
50
(dose média que mata 50% dos
animais). Através desse método, calculou-se a percentagem de morte, para cada
grupo, que é transformada em probitos segundo uma tabela (CARLINE, 1973) e
aplicada na ordenada, enquanto o logaritmo da dose (Log
dose
) do extrato aquoso
liofilizado dissolvido em água fica plotado na abscissa. Dessa forma, determinou-se
a DL
50
através dos dados obtidos no gráfico.
A DL
50
do óleo essencial foi previamente estabelecida por Calixto (dados não
publicados).
52
3.6 Ensaio do cometa
Os animais foram pesados (peso variando entre 25 e 30g), codificados e
separados em 5 grupos: A, B, C, D e E. O grupo A recebeu o extrato aquoso de A.
zerumbet na dose de 2.000 mg/Kg de peso corpóreo do animal. O grupo B recebeu
o extrato aquoso de A. zerumbet na dose de 3.500 mg/Kg de peso corpóreo do
animal. O grupo C recebeu o extrato aquoso de A. zerumbet na dose de 5.000
mg/Kg de peso corpóreo do animal. O grupo D recebeu ciclofosfamida (CPA, CAS
50-18-0) na dose de 25 mg/Kg. O grupo E recebeu solução salina 0,9%. Todas as
doses foram administradas e, apenas 24h e 48 h após a administração, os animais
tiveram seu sangue coletado para realização do teste.
Em um segundo experimento, outro grupo de animais foi pesado (peso
variando entre 25 e 30g), codificados e separados em 4 grupos: A, B, C e D. O
Grupo A recebeu solução salina 0,9%. O grupo B recebeu óleo essencial na dose de
400 mg/Kg de peso corpóreo do animal. Os grupos C e D receberam ciclofosfamida
(CPA, CAS 50-18-0) na dose de 25 mg/Kg e 50 mg/Kg respectivamente. Todas as
doses foram administradas e, apenas 24h e 48h após a administração, os animais
tiveram seu sangue coletado para realização do ensaio.
O sangue coletado em tubos plásticos heparinizados foi diluído com agarose
LMP e colocado em uma lâmina previamente coberta com uma película de agarose
NMP. As lâminas foram mantidas na solução de lise por cerca de 2h e, em seguida,
foi realizada a eletroforese. Após a corrida, as lâminas foram fixadas em álcool
100%, coradas com brometo de etídio 10% e contadas no microscópio de
fluorescência.
3.7 Ensaio do micronúcleo
Cada animal foi pesado e separado aleatoriamente em cinco grupos, A, B, C,
D e E, correspondente a uma dose do chá de A. zerumbet, um controle positivo e um
controle negativo. Cada um desses grupos foi subdividido em dois, sendo um para
avaliar em 24h e o outro em 48h. Cada grupo avaliado continha 5 animais machos e
5 animais fêmeas, devidamente identificados.
53
A dose do extrato aquoso de A. zerumbet administrado em dose única para o
grupo A foi de 2.000 mg/Kg. A dose administrada em dose única para o grupo B foi
de 3.500 mg/Kg e a dose única administrada para o grupo C foi de 5.000 mg/Kg.
Após a administração por gavagem, os animais foram sacrificados após 24h e 48h.
O grupo de controle negativo recebeu apenas solução de cloreto de sódio 0,9%. O
grupo controle positivo recebeu ciclofosfamida (CPA, CAS 50-18-0) na dose de 25
mg/Kg.
Em um segundo experimento, outro grupo de animais foi pesado (peso
variando entre 25 e 30g), codificados e separados em 4 grupos: A, B, C e D. O
Grupo A recebeu solução salina 0,9%. O grupo B recebeu óleo essencial na dose de
400 mg/Kg de peso corpóreo do animal. O grupo C e D receberam ciclofosfamida
(CPA, CAS 50-18-0) na dose de 25 mg/Kg e 50 mg/Kg respectivamente. Todas as
doses foram administradas e, apenas 24h e 48h após a administração, os animais
foram sacrificados.
Os animais sacrificados com 24 e 48h tiveram suas patas traseiras limpas
com álcool 70%. A pele foi cortada e o fêmur, exposto e retirado de forma íntegra. A
extremidade final do fêmur foi cortada para expor o canal medular. A agulha de uma
seringa de 1mL, previamente preenchida com SFB, foi inserida firmemente na
abertura do fêmur, injetando-se o SFB, de modo a empurrar a medula para dentro de
um tubo falcon previamente marcado com o código do animal. A seringa foi limpa
com SFB e reutilizada para os animais do mesmo grupo.
O material da medula óssea foi ressuspendido em SFB e homogeneizado. A
suspensão de células foi centrifugada a 1000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi
descartado e o precipitado foi ressupendido em 0,5mL de SFB.
Duas gotas da suspensão homogênea foram pingadas em uma lâmina,
previamente identificadas com o código do animal, e realizado um esfregaço. As
lâminas foram secas ao ar, na temperatura ambiente. Foram preparadas três
lâminas de cada animal.
Após secas, as lâminas foram colocadas em cubas de coloração contendo
corante de Leishman puro e coradas por 3 minutos. Após esse tempo, foram
54
transferidas para outra cuba contendo o corante de Leishman diluído em água
destilada na proporção de 1:6, onde permaneceram corando durante 15 minutos.
Depois, as lâminas foram lavadas com água corrente e, em seguida, com água
destilada, para retirar o excesso do corante. Todas as lâminas foram secas ao ar,
em temperatura ambiente, por 24h. A qualidade da coloração foi avaliada e as
lâminas foram montadas e guardadas em caixas próprias.
As células foram contadas de forma diferencial, os eritrócitos
normocromáticos (NCE) ou maduros (células rosadas) e os eritrócitos plicromáticos
(EPC) ou jovens (células arroxeadas). Após essa contagem, foram contadas 1000
células EPC para detectar a ocorrência de micronúcleo.
55
4 RESULTADOS
4.1 Ensaio de citotoxicidade pelo MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5
difeniltertrazolim brometo)
O extrato aquoso e o óleo essencial não se mostraram citotóxicos frente a
células tumorais humanas e murinas pelo método do MTT, como observado pelos
dados da tabela 2.
Tabela 2 - Atividade citotóxica do extrato aquoso e do óleo essencial de A. zerumbet
em células tumorais pelo MTT
Extrato aquoso de
A. zerumbet (IC
50
)
Óleo essencial de A.
zerumbet (IC
50
)
HL-60 > 5µg/mL > 5µg/mL
K-562 > 5µg/mL > 5µg/mL
CEM > 5µg/mL > 5µg/mL
MDA-MB 435 > 5µg/mL > 5µg/mL
MDA-MB 231 > 5µg/mL > 5µg/mL
HCT-8 > 5µg/mL > 5µg/mL
PC-3 > 5µg/mL > 5µg/mL
SF-295 > 5µg/mL > 5µg/mL
B16 > 5µg/mL > 5µg/mL
4.2 Ensaio de citotoxicidade pelo alamar blue
O extrato aquoso e o óleo essencial não apresentaram ação citotóxica frente
a células humanas normais, como os linfócitos, pelo método do alamar blue, que é
mais sensível que o método do MTT, como observado pelos dados da tabela 3.
56
Tabela 3 - Atividade citotóxica do extrato aquoso e do óleo esencial de A. zerumbet
em linfócitos normais pelo alamar blue
Substância IC
50
Extrato aquoso de A. zerumbet
> 5µg/mL
Óleo essencial de A. zerumbet
19,76%
4.3 Teste de hemólise
Conforme observado pelos dados da tabela 4, o extrato aquoso e o óleo
essencial não apresentaram atividade hemolítica frente a eritrócitos de
camundongos.
Tabela 4 - Atividade hemolítica do extrato aquoso e do óleo essencial de A. zerumbet
em eritrócitos de camundongo 2%
Substância EC
50
(µL/mL)
Extrato aquoso de A. zerumbet
> 1000
Óleo essencial de A. zerumbet
> 1000
A hemólise total foi obtida com 50 µl de Triton X-100 1% e 1h de incubação. A EC
50
e
intervalo de confiança de 95 % (IC 95%) foram obtidos por regressão não linear.
4.4 Toxicidade aguda
O extrato aquoso foi testado em cinco doses diferentes, entretanto nenhuma
delas mostrou-se tóxica quando administrada unicamente. Os poucos efeitos
causados pela administração da substância estão apresentados nas tabela 5 e 6.
57
Tabela 5 - Efeito de doses orais únicas do extrato aquoso de A. zerumbet em
camundongos machos
Dose (mg/Kg)
Sexo M/T Latência Sintomas
2.000 Machos 0/5 -
Piloereção, fotofobia,
redução de atividade.
2.750 Machos 0/5 -
Piloereção, fotofobia,
redução de atividade.
3.500 Machos 0/5 -
Piloereção, fotofobia,
redução de atividade.
4.250 Machos 0/5 -
Piloereção, fotofobia,
redução de atividade.
5.000 Machos 0/5 -
Piloereção, fotofobia,
redução de atividade.
Estudo de toxicidade aguda - doses orais (2.000-5.000mg/Kg). O extrato aquoso liofilizado dissolvido
em água destilada (1mg/mL) foi administrado pela via oral por gavagem. Todos os camundongos
tratados (n=10 em cada grupo; 5 machos, 5 fêmeas) foram cuidadosamente examinados durante 14
dias após a administração da dose para avaliar mudanças comportamentais, letalidade e a latência
de morte. M/T=número de camundongos mortos/número de camundongos tratados. Latência=tempo
de morte após administração da dose.
58
Tabela 6 - Efeito de doses orais únicas do extrato aquoso de A. zerumbet em
camundongos fêmas
Dose (mg/Kg)
Sexo M/T Latência Sintomas
2.000 Fêmas 0/5 -
Piloereção, fotofobia,
redução de atividade.
2.750 Machos 0/5 -
Piloereção, fotofobia,
redução de atividade.
3.500 Fêmas 0/5 -
Piloereção, fotofobia,
redução de atividade.
4.250 Fêmeas 0/5 -
Piloereção, fotofobia,
redução de atividade.
5.000 Fêmeas 0/5 -
Piloereção, fotofobia,
redução de atividade.
Estudo de toxicidade aguda - doses orais (2.000-5.000mg/Kg). O extrato aquoso liofilizado dissolvido
em água destilada (1mg/mL) foi administrado pela via oral por gavagem. Todos os camundongos
tratados (n=10 em cada grupo; 5 machos, 5 fêmeas) foram cuidadosamente examinados durante 14
dias após a administração da dose para avaliar mudanças comportamentais, letalidade e a latência
de morte. M/T=número de camundongos mortos/número de camundongos tratados. Latência=tempo
de morte após administração da dose.
4.5 Ensaio do cometa
O extrato aquoso de A. zerumbet, em todas as doses testadas, e o óleo
essencial, na dose testada, não provocaram danos ao DNA celular do sangue dos
camundongos, não havendo a formação do cometa. Nas amostras utilizadas como
controle positivo, ciclofosfamida 25 mg/Kg e 50 mg/Kg, verificamos que de 100
células contadas em cada animal, a maioria recebeu escores 2, 3 e 4. Já as
amostras do controle negativo apresentaram células cujos escores, em sua grande
maioria foi zero, havendo apenas raros casos de escores tipo 1. Dessa forma, as
análises estatísticas mostraram uma semelhança entre as doses testadas e controle
negativo, com um P>0,05; em relação ao controle positivo, houve diferença
59
estatisticamente significante, com um P<0,001. Os resultados indicam que ambas as
amostras não apresentam ação genotóxica.
Extrato Aquoso A. zerumbet 24h
2000 3500 5000 CN CP
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
Salina 0,9%
CPA
25 mg/Kg
Extrato Aquoso A. zerumbet
mg/Kg
*
* p<0,001 ANOVA/Tukey
Índice de dano ao DNA
Figura 3 - Gráfico do ensaio do cometa in vivo do extrato aquoso de A. zerumbet após
24h de exposição em camundongos fêmeas
Extrato aquoso A. zerumbet 48h
AF BF CF DF EF
0
5
10
15
20
25
30
35
EA
2g/Kg
EA
3,5 g/Kg
EA
5 g/Kg
Salina 0,9% CP
25 mg/Kg
*
*p<0,001 ANOVA/Tukey
Índice de dano ao DNA
Figura 4 - Gráfico do ensaio do cometa in vivo do extrato aquoso de A. zerumbet após
48h de exposição em camundongos fêmeas
60
Extrato aquoso A. zerumbet 24h
AM BM CM DM EM
0
10
20
30
Salina 0,9% CP
25 mg/Kg
EA
2 g/Kg
EA
3,5 g/Kg
EA
5 g/Kg
*
*p<0,001 ANOVA/Tukey
Índice de dano ao DNA
Figura 5 - Gráfico do ensaio do cometa in vivo do extrato aquoso de A. zerumbet após
24h de exposição em camundongos machos
Extrato aquoso A. zerumbet 48h
AM BM CM DM EM
0
5
10
15
20
25
30
35
EA
2 g/Kg
EA
3,5 g/Kg
EA
5 g/Kg
Salina 0,9%
CP
25 mg/Kg
*
*p<0,001 ANOVA/Tukey
Índice de dano ao DNA
Figura 6 - Gráfico do ensaio do cometa in vivo do extrato aquoso de A. zerumbet após
48h de exposição em camundongos machos
61
Óleo essencial A.zerumbet 24h
OAM OBM OCM ODM
0
5
10
15
20
25
30
35
Salina 0,9%
OE
400 mg/Kg
CP
25 mg/Kg
CP
50 mg/Kg
*
*
*p<0,001 ANOVA/Tukey
Índice de dano ao DNA
Figura 7 - Gráfico do ensaio do cometa in vivo do óleo essencial de A. zerumbet após
24h de exposição em camundongos fêmeas
Óleo essencial A. zerumbet 48h
OAF OBF OCF ODF
0
5
10
15
20
25
30
35
Salina 0,9%
OE
400 mg/Kg
CPA
25 mg/Kg
CPA
50 mg/Kg
*
*
*p<0,001 ANOVA/Tukey
Índice de dano ao DNA
Figura 8 - Gráfico do ensaio do cometa in vivo do óleo essencial de A. zerumbet após
48h de exposição em camundongos fêmeas
62
Óleo essencial A.zerumbet 24h
OAM OBM OCM ODM
0
5
10
15
20
25
30
35
Salina 0,9%
OE
400 mg/Kg
CPA
25 mg/Kg
CPA
50 mg/Kg
*p<0,001 ANOVA/Tukey
*
*
Índice de dano ao DNA
Figura 9 - Gráfico do ensaio do cometa in vivo do óleo essencial de A. zerumbet após
24h de exposição em camundongos machos
Óleo essencial A. zerumbet 48h
OAM OBM OCM ODM
0
10
20
30
40
Salina 0,9%
OE
400 mg/Kg
CPA
25 mg/Kg
CPA
50 mg/Kg
*
*
*p<0,001 ANOVA/Tukey
Índice de dano ao DNA
Figura 10 - Gráfico do ensaio do cometa in vivo do óleo essencial de A. zerumbet após
48h de exposição em camundongos machos
63
Figura 11 - Fotomicrografia de cometa do tipo 1
Figura 12 - Fotomicrografia do cometa, evidenciando vários cometas do tipo zero
4.6 Ensaio do micronúcleo
Cerca de 1.000 eritrócitos policromáticos (EPC) foram contados e analisados
por animal. No grupo de 24h de animais machos, foram observados 3 micronúcleos
na dose de 2.000 mg/Kg do extrato aquoso liofilizado de A. zerumbet, 3
Cometa 0
Cometa 1
64
micronúcleos na dose de 3.500 mg/Kg do extrato aquoso liofilizado de A. zerumbet e
2 micronúcleos na dose de 5.000 mg/Kg do extrato aquoso liofilizado de A.
zerumbet. No grupo de 48h de animais machos, foram observados 1 micronúcleo na
dose de 2.000 mg/Kg do extrato aquoso liofilizado de A. zerumbet, 2 micronúcleos
na dose de 3.500 mg/Kg do extrato aquoso liofilizado de A. zerumbet e 2
micronúcleos na dose de 5.000 mg/Kg do extrato aquoso liofilizado de A. zerumbet.
No grupo de 24h de animais fêmeas, foi observado 1 micronúcleo na dose de 2.000
mg/Kg do extrato aquoso liofilizado de A. zerumbet, 2 micronúcleos na dose de
3.500 mg/Kg do extrato aquoso liofilizado de A. zerumbet e 2 micronúcleos na dose
de 5.000 mg/Kg do extrato aquoso liofilizado de A. zerumbet. No grupo de 48h de
animais fêmeas, foram observados 1 micronúcleo na dose de 2.000 mg/Kg do
extrato aquoso liofilizado de A. zerumbet, 2 micronúcleos na dose de 3.500 mg/Kg
do extrato aquoso liofilizado de A. zerumbet e 2 micronúcleos na dose de 5.000
mg/Kg do extrato aquoso liofilizado de A. zerumbet. Estes resultados foram
estatisticamente diferentes do resultado da ciclofosfamida, mostrando que o extrato
aquoso não apresenta efeito genotóxico.
Cerca de 1.000 eritrócitos policromáticos (EPC) foram contados e analisados
por animal. No grupo de 24h de animais machos, foram observados 4 micronúcleos
na dose de 400 mg/Kg do óleo essencial de A. zerumbet. No grupo de 48h de
animais machos, foram observados 1 micronúcleo na dose de 400 mg/Kg do óleo
essencial de A. zerumbet. No grupo de 24h de animais fêmeas, foram observados 3
micronúcleos na dose de 400 mg/Kg do óleo essencial de A. zerumbet. No grupo de
48h de animais fêmeas, foram observados 3 micronúcleos na dose de 400 mg/Kg do
óleo essencial de A. zerumbet. Estes resultados foram estatisticamente diferentes do
resultado da ciclofosfamida nas doses de 25 mg/Kg e 50 mg/Kg, com um p<0,001,
evidenciando que o extrato aquoso não apresenta efeito genotóxico, o que corrobora
com os resultados do ensaio do cometa. Os dados de ambas as amostras estão nas
tabelas 6, 7 e 8.
A figura 11 mostra a fotomicrografia de um eritrócito policromático (EPC)
encontrado em uma amostra testada. A figura 12 mostra a diferença de coloração de
um eritrócito policromático (EPC) com um micronúcleo e de um eritrócito
normocromático (ENC).
65
Tabela 7 - Tabela representativa dos resultados do ensaio do micronúcleo do extrato
aquoso de A. zerumbet
Micronúcleos/1.000
EPC/animal
Grupo
Tratamento
(mg/kg)
Sexo
Tempo
b
(h)
Dados individuais Média ± D.P.
24 0
0 0 0 0
0,00
Salina -
48 0
0 0 0 0
0,00
25 24 9
7 4 4 7
6,2 ± 2,16
CPA
25 48 3
5 10 11
8
7,40 ± 3,36
2.000 24 2
0 0 1 0
0,60 ± 0,89
*
48 0
0 0 0 1
0,20 ± 0,44
*
3.500 24 2
0 0 1 0
0,60 ± 0,89
*
48 0
0 1 1 0
0,40 ± 0,54
*
5.000 24 0
0 0 1 1
0,40 ± 0,58
*
Extrato
M
48 0
2 0 1 1
0,80 ± 0,83
*
24 0
0 0 0 0
0,00
Salina -
48 0
0 0 0 0
0,00
25 24 4
11
8 6 8
7,40 ± 2,60
CPA
25 48 5
8 5 7 4
5,80 ± 1,64
2.000 24 0
0 0 0 1
0,20 ± 0,44
*
48 0
0 1 0 0
0,20 ± 0,44
*
3.500 24 0
0 0 2 0
0,40 ± 0,89
*
48 0
1 1 0 0
0,40 ± 0,54
*
5.000 24 0
0 1 1 1
0,60 ± 0,54
*
Extrato
F
48 0
0 1 0 1
0,40 ± 0,54
*
a
Ciclofosfamida (CPA);
b
Tempo de sacrifício após o tratamento. *p<0,001 comparado a ciclofosfamida
por ANOVA seguido por Dunett.
66
Tabela 8 - Tabela representativa dos resultados do ensaio do micronúcleo do óleo essencial
de A. zerumbet nos animais sacrificados com 24h
EPCMN (24h) 24h
n
Média ± D.P.
Salina 0,9% (M) 5
0 0 1 0 2 0,60 ± 0,89
*
Salina 0,9% (F) 5
0 1 0 0 1 0,40 ± 0,54
*
OE 400 mg/Kg (M) 5
1 1 0 1 1 0,8 ± 0,44
*
OE 400 mg/Kg (F) 5
0 0 2 0 1 0,60 ± 0,89
*
CPA 25 mg/Kg (M) 5
6 4 7 4 9 6,00 ± 2,12
CPA 25 mg/Kg (F) 5
7 7 9 5 7 7,00 ± 1,41
CPA 50 mg/Kg (M) 5
11
10
17
8 15
12,20 ± 3,70
CPA 50 mg/Kg (F) 5
12
15
9 13
11
12,00 ± 2,23
*
p<0,001 em relação a ciclofosfamida (25 e 50 mg/mg) comparado a ciclofosfamida por ANOVA
seguido por Dunett.
67
Tabela 9 - Tabela representativa dos resultados do ensaio do micronúcleo do óleo
essencial de A. zerumbet nos animais sacrificados com 48h
EPCMN (48h) 48h
n
Média ± D.P.
Salina 0,9% (M) 5
0 0 0 1
1
0,40 ± 0,54
*
Salina 0,9% (F) 5
1 0 1 1
0
0,60 ± 0,54
*
OE 400 mg/Kg (M)
5
0 0 0 1
0
0,20 ± 0,44
*
OE 400 mg/Kg (F) 5
0 1 1 0
1
0,60 ± 0,54
*
CPA 25 mg/Kg (M)
5
5 7 4 9
7
6,40 ± 1,94
CPA 25 mg/Kg (F)
5
3 8 5 2
4
4,40 ± 2,30
CPA 50 mg/Kg (M)
5
12
8 11
7
8
9,20 ± 2,16
CPA 50 mg/Kg (F)
5
6 10
5 9
9
7,80 ± 2,16
*
p<0,001 em relação a ciclofosfamida (25 e 50 mg/mg) comparado a ciclofosfamida por ANOVA
seguido por Dunett
68
Figura 13 - Fotomicrografia de eritrócitos policromáticos (PCE) apresentenado
micronúcleo
Figura 14 - Fotomicrografia de eritrócitos policromáticos (EPC) apresentando
micronúcleo e eritrócitos normocromáticos (NCE)
MN
EPC
MN
EPC
ENC
69
5 DISCUSSÃO
Desde o início da colonização brasileira, o interesse e a exploração dos
produtos naturais originados de plantas têm sido despertados (PEREIRA; SOARES-
GOMES, 2002).
De acordo com a 31
a
Assembléia da Organização Mundial de Saúde-OMS,
planta medicinal é aquela que administrada ao homem ou a um animal, por qualquer
via e sob qualquer forma, exerce alguma espécie de ação farmacológica (MATOS,
1988).
A espécie A. zerumbet, conhecida popularmente como colônia no Nordeste
brasileiro, é uma planta medicinal usada amplamente na medicina popular como chá
ou infusões para o tratamento de doenças intestinais e cardiovasculares, como a
hipertensão arterial (MENDONÇA et al., 1991; PRUDENTE et al.,1993; BEZERRA et
al., 2000).
Os testes de citotoxicidade com o óleo essencial e com o extrato aquoso de
A. zerumbet foram realizados contra células tumorais de várias linhagens, variando
entre as mais resistentes e as mais sensíveis, como em linfócitos normais de
humanos. Todos os resultados obtidos foram negativos para uma possível ação
citotóxica de alguns dos compostos testados. Esse resultado nos mostra que, apesar
dos constituintes dessa planta apresentar uma série de atividades farmacológicas,
descarta-se logo a possibilidade de que ela possua um composto antitumoral,
embora outras espécies do mesmo gênero, como a A. galanga e A. oxyphylla,
tenham tido substâncias isoladas com essa atividade farmacológica tão importante
para aumentar a possibilidade de tratamentos de doenças com essa (Di STASI,
2002).
O extrato aquoso e o óleo essencial não apresentaram atividade hemolítica
contra hemácias de camundongos, confirmando que são substâncias com baixo
poder tóxico e tanto não desestabilizantes de membrana plasmática, o que torna
seguro para ingestão humana, principalmente na forma popular como é utilizado.
70
No presente trabalho, foi avaliada a toxicidade aguda do extrato aquoso das
folhas de A. zerumbet em modelo de camundongos, utilizando a lesgislação
estabelecida pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (BRASIL, 2004).
Os fitoterápicos são, em sua grande maioria, produtos cuja venda independe
de prescrição médica. A sua propaganda não necessita de autorização prévia do
Ministério da Saúde, desde que observada a seguinte condição: “[...] que o texto,
figura, imagem ou projeções não ensejem interpretação falsa, erro ou confusão
quanto à composição do produto, suas finalidades, modo de usar ou procedência, ou
apregoem propriedades terapêuticas não comprovadas por ocasião de registro a
que se refere o item anterior” (BRASIL, 1977). O mesmo artigo estabelece ainda “[...]
que sejam declaradas obrigatoriamente as contra-indicações, indicações, cuidados e
advertências sobre o uso do produto [...]”(BRASIL, 1977). Entretanto, o que
freqüentemente se observa são propagandas pouco criteriosas, contrariando
frontalmente princípios estabelecidos na terapêutica e na legislação em vigor. No
caso de plantas medicinais, é muito utilizado o mito de que produto natural não
apresenta efeitos indesejáveis e contra-indicações. No entanto, é ou deveria ser do
conhecimento geral que muitas plantas são potencialmente tóxicas, inclusive
algumas utilizadas na terapêutica. Essas propagandas podem trazer retornos
imediatos à indústria, entretanto, a longo prazo podem levar ao descrédito e ao
desprestígio dos fitoterápicos e até mesmo inviabilizar a ampliação do seu uso como
recurso terapêutico. (FARIAS et al., 1985).
Como instrumento de orientação do consumidor, elas devem conter
informações a respeito das indicações, contra-indicações, precauções, doses e
modo de usar (BRASIL, 1984). Essas informações são extremamente importantes
para a eficácia e segurança na utilização do medicamento. São necessários
rigorosos critérios e responsabilidade na elaboração de uma bula. Entretanto, no
comércio de fitoterápicos são comuns as bulas oportunistas e inescrupulosas,
apresentando muitas vezes dezenas de propriedades farmacológicas, grande parte
sem nenhum respaldo, observado em muitas bulas de fitoterápicos, o que configura
uma infração ética, lesando os consumidores tanto no aspecto econômico como no
de saúde (FARIAS et al., 1985).
71
O teste da DL
50
foi inicialmente introduzido em 1927 por Trevan para avaliar
substâncias que seriam utilizadas por seres humanos como a Digitallis e a insulina.
Entretanto, na década de setenta, este teste, o qual tinha como objetivo encontrar
uma única dose letal de uma substância para metade dos animais do grupo teste,
começou a ser empregado amplamente como base de comparação e classificação
da toxicidade de substâncias. Este teste tornou-se gradativamente um teste pré-
requisito para várias agências reguladoras, como a americana Food and Drugs
Administration (FDA), responsáveis pela a aprovação de novos fármacos, aditivos
alimentares, ingredientes cosméticos, produtos domésticos, químicos industriais e
pesticidas. Para a realização do teste da DL
50
, eram empregados mais de 100
animais para cada espécie estudada, normalmente ratos e camundongos, e para
cada substância testada (KRYSIAK; RYDZYNSKI, 1997; STAMMATI et al., 2005;
GUBBELS-VAN HAL et al., 2005).
Em 1981, a Organização para Cooperação Econômica e Desenvolvimento
(Organization for Economic Cooperation and Development; OECD) incorporou o
Teste da DL
50
em suas diretrizes. Entretanto, neste período foi amplamente aceito
que precisão estatística juntamente com dados como a inclinação da curva dose-
resposta, intervalo de confiança da DL
50
, e sinais tóxicos, não seriam necessários
para propostas de avaliação de risco. Diante disso, a diretriz de 1981 para toxicidade
aguda oral (OECD, 401) estabeleceu o uso de apenas 5 animais por sexo, por dose,
por grupo, com 3 grupos de doses por teste, sendo estas doses escolhidas a partir
de estudos prévios ou dados históricos, para estimar o valor da DL
50
. Uma dose
limite superior de 5.000 mg/kg foi também introduzida para substâncias
consideradas atóxicas. Neste documento, o conceito de dose teste limite foi
introduzido, o qual exigia, para substâncias com DL
50
superior a 5.000 mg/kg, que
somente a dose limite superior seria testada. Outras diretrizes também foram
publicadas para a avaliação da toxicidade dérmica (OECD 402) e avaliação da
toxicidade inalatória aguda (OECD 403).
Em 1987, a diretriz 401 da OECD foi revisada essencialmente no que diz
respeito às questões referentes ao bem-estar animal. Como conseqüência, os testes
passariam a ser conduzidos, utilizando apenas um sexo, com uma posterior
confirmação de que não existiam diferenças no material testado na toxicidade aguda
oral testando apenas uma dose no segundo sexo. Isto reduziu o número de animais
72
necessários de 30 para 20. Além disso, a dose limite, que antes era de 5.000 mg/kg,
foi reduzida para 2.000 mg/kg.
Em 1984, Iain Purchase articulou a criação de um grupo de trabalho na
Sociedade Britânica de Toxicologia. Este grupo propôs um novo método para a
avaliação da toxicidade aguda oral, o qual evitava utilizar o critério morte dos
animais como o objetivo final e propôs a observação do aparecimento de sinais
claros de toxicidade decorrentes da exposição a uma série de doses fixas. Este
método ficou conhecido como o Teste da Dose Fixa (TDF), avaliado por agências
Internacionais, sendo posteriormente publicado em 1990 (VAN DENHEUVEL et al.,
1990). Este trabalho demonstrava que o TDF permitia classificar substâncias de
forma compatível com o sistema empregado pela União Européia, o qual qualificava
pelos valores de DL
50
oriundos do teste clássico de toxicidade oral aguda. O TDF
também fornecia a informação necessária sobre a natureza, tempo de início,
duração e desfecho dos sinais de toxicidade, os quais são necessários para a
avaliação de risco. Mais ainda, o TDF utilizava um número menor de animais do que
aquele preconizado pela OECD 401; causava menor mortalidade associada ao
composto teste; além de menor dor e sofrimento aos animais.
Em 1992, o TDF foi adotado pela OECD (OECD 420) como alternativa a
OECD 401 e não, ainda, como uma substituição. Em 1996, surgiu uma segunda
alternativa a OECD 401, o método da Toxicidade Aguda de Classe (TAC) o qual foi
adotado pela OECD (OECD 423) e, em 1998, surgiu o Teste “Up and Down” (TUD)
sendo, também, posteriormente recomendado pela OECD (OECD 425). O Teste
TAC também utiliza o conceito de dose fixas, porém o objetivo final seria a
mortalidade. O TUD, como o nome sugere objetiva estimar o valor da DL
50
testando
seqüencialmente animais individuais, com a dose para cada animal sendo ajustada
para cima ou para baixo, dependendo do resultado prévio do animal anterior.
Contudo, o uso na prática destes três métodos alternativos não foi
amplamente absorvido pela sociedade científica. Em paises como o EUA e Japão,
embora incorporadas as diretrizes e recomendadas, o uso destes métodos ficaram
restritos a aquelas substâncias onde não era obrigado a obtenção do valor da DL
50
,
o intervalo de confiança e a inclinação da curva. Além disso, no caso dos pesticidas,
a legislação vigente ainda solicitava a dose limite de 5.000 mg/kg enquanto que a
73
dose limite recomendada pelos três métodos era de 2.000 mg/kg (VALADARES,
2006).
Durante a década de noventa, de forma controversa, mesmo com a adição
dos métodos alternativos de avaliação de toxicidade, muitos laboratórios ainda
usavam a versão da OECD 1981, a OECD 401. Isto aconteceu principalmente pela
obrigatoriedade de utilizar a dose limite superior de 5.000 mg/kg, usada para
confirmar a ausência de diferença entre os sexos na suscetibilidade à substância
teste, além do desconhecimento dos novos métodos (BOTHAM, 2004).
Neste contexto, para facilitar a aceitação internacional dos três métodos e
iniciar o processo de eliminação definitiva da diretriz OECD 401, a OECD organizou
uma série de reuniões com especialistas no período de 1998 e 2000, o qual resultou
na revisão das diretrizes 420, 423 e 425, além de um documento para o uso e
interpretação de métodos alternativos de avaliação de toxicidade (VALADARES,
2006).
Desde 2000, o grupo de trabalho da OECD para químicos, pesticidas e
produtos biotecnológicos concluiu que a OECD 401 seria banida e as diretrizes 420,
423 e 425, então revisadas, foram definitivamente adotadas e recomendadas. Em
dezembro de 2002, em associação com a ICCVAM (Interagency Coordenation
Committee on the Validation of Alternative Methods) e US-EPA (United States-
Enviromental Protection Agency), o teste da DL
50
foi finalmente banido.
Entretanto, no Brasil, a agência reguladora desse tipo de teste, a ANVISA
estabelece suas diretrizes para aceitar os dados de um estudo feito com um
potencial fitoterápico em sua página na internet (BRASIL, 2004). Apesar de todas as
novas resoluções internacionais lidas, estudadas e preconizadas, as diretrizes
legislativas regidas pela ANVISA foram as seguidas, com o objetivo de estabelecer
todas as características toxicológicas do fitoterápico estudado dentro das leis de
nosso país.
Foram escolhidas três doses: 2.000 mg/Kg, 3.500 mg/Kg e 5.000 mg/Kg,
administradas por via oral. Essas doses foram estabelecidas baseado no trabalho de
Mendonça et al. (1991). Neste trabalho, o autor estabeleceu a DL
50
do extrato
hidroalcóolico de A. zerumbet por via oral, que foi acima de 10.000 mg/Kg do peso
74
corpóreo do animal. Observamos que o chá apresenta baixíssima toxicidade, uma
vez que a DL
50
estabelecida foi um valor acima de 5.000 mg/Kg. Não podemos
afirmar que o extrato aquoso é mais tóxico que o extrato hidroalcóolico, pois a dose
máxima testada no presente trabalho foi de 5.000 mg/Kg, enquanto que no trabalho
realizado por Mendonça (1989), a maior dose testada foi de 18.000 mg/Kg. Não
extrapolamos a dose de 5.000 mg/Kg em respeito às normas de boas práticas com
animais de laboratório e também por que se tornaria inviável a diluição de tão
grande quantidade em tão baixo volume para administrar ao animal. Entretanto,
alguns efeitos comportamentais foram avaliados nos animais após a administração
do chá em suas diversas doses testadas. Cerca de 7 minutos após a administração,
a atividade geral dos animais foi bastante reduzida, permanecendo agrupados, sob a
raspa de suas gaiolas, com os olhos fechados, indicando uma certa fotofobia.
Entretanto, na literatura encontramos que o óleo essencial da colônia produziu
depressão do sistema nervoso central, bloqueio neuromuscular, inibição da
musculatura lisa, provavelmente por diminuição do influxo de íons cálcio durante a
contração (Di STASI, 2002). Uma piloereção também foi observada em todos os
animais que ingeriram o chá da colônia, porém essa reação pode ter alguma relação
com alguns constituintes do óleo essencial que ainda estava presente na infusão.
Esse efeito foi relatado por Mendonça (1989). Todos esses resultados
comportamentais podem estar diretamente relacionado à presença de certa
quantidade de óleo essencial no extrato aquoso, uma vez que não foi realizada
nenhuma separação desses dois constituintes.
A maior parte dos óleos essenciais encontrados é constituído por terpenos,
com traços de sesquiterpenos e diterpenos (MATOS, 1979). Por apresentar taninos
catéquicos, fenóis livres e alcalóides, segundo Mendonça (1989), alguns desses
comportamentos também podem ser explicados pela presença desses taninos. Os
taninos podem produzir efeitos farmacológicos não específicos, como a depressão
do sistema nervoso central, diminuição da pressão arterial sangüínea e antagonismo
dos efeitos estimulatórios de vários agonistas do músculo liso intestinal e uterino
(CALIXTO, 1982; TOKAHASNI, 1982).
O óleo essecial de A. zerumbet é rico em terpinen-4-ol, 1,8 cineol e metil-
eugenol (CRAVEIRO et al., 1981). Esses três constituintes parecem ser os maiores
responsáveis pelo efeito antinociceptivo observado por Araújo Pinho et al. (2005). Já
75
os efeitos de depressão do sistema nervoso central e sedação foram observados e
relacionados à presença do constituinte terpinen-4-ol, que já foi previamente
reportado por Moreira et al. (2001) como responsável por esses efeitos. O 1,8-cineol
foi demonstrado agir por um mecanismo opióde (SANTOS; RAO, 2000), o que indica
que o efeito observado de sedação pode também estar relacionado a esse
constituinte do óleo essencial que está presente no extrato aquoso, mesmo que em
baixas concentrações. Mpalantinos et al. (1998) isolou em seu trabalho flavonóides e
kavapironas do extrato aquoso das folhas de A. zerumbet. As atividades
hipotensoras, diuréticas e anti-ulcerogênicas estão relacionadas aos flavonóides, o
que ajuda a explicar melhor o fato de os animais terem tido uma redução
considerável em sua atividade geral. Derivados dehidrokawaina com atividade
antiplaquetária foram isolados dos rizomas de A. zerumbet. O provável efeito dos
derivados se deve à inibição da formação de tromboxano A2 (TENG et al., 1990).
Compostos isolados dos rizomas de A. zerumbet apresentaram atividade protetora
da mucosa gástrica e duodenal em modelos de úlcera induzidas experimentalmente
em roedores (HSU, 1987). Os rizomas de A. zerumbet também possuem potentes
agentes inibidores da biossíntese de prostaglandinas (KIUCHI et al., 1992). O óleo
essencial de A. zerumbet apresentou atividade analgésica periférica,
anticonvulsivante (Di STASI, 2002), antifúngica (LIMA et al., 1993) e antimicrobiana
(Di STASI, 2002). O extrato hidroalcóolico do rizoma e das folhas não apresentou
atividade moluscicida (Di STASI, 2002). Do óleo essencial das folhas de A. zerumbet
foi isolado o terpinen-4-ol, que apresentou atividade cardiotônica (Di STASI, 2002).
O terpinen-4-ol apresentou também atividade espasmolítica e hipotensora (Di
STASI, 2002). Geraniol e isotimol isolados de A. zerumbet também possuem potente
atividade antimicrobiana contra bactérias patogênicas (Di STASI, 2002).
A via de administração escolhida para realizar o teste de toxicidade aguda foi
a via oral devido termos o interesse de representar com o máximo de fidedignidade a
ingestão de uma infusão pelos humanos, além do fato de a ANVISA preconizar a
escolha da via de administração que se pretende usar em humanos.
O fato de o extrato aquoso não ter apresentado nenhum indício de ser tóxico,
levanta-se o questionamento: não seria termolábil alguma substância que causasse
os efeitos tóxicos dessa planta? Apesar de essa hipótese ser possível, talvez ela
não seja muito relevante diante do fato de não haver na literatura nenhum relato de
76
caso de intoxicação devido a ingestão do chá de colônia, mesmo que ele tenha sido
mal preparado.
Danos ao DNA e defeitos no reparo do DNA são os eventos moleculares
básicos que dirigem a iniciação e progressão do câncer. O ensaio do cometa é
amplamente usado no campo da genética toxicológica, testando células humanas,
animais e vegetais (MCKENNA et al., 2008).
O estudo de danos ao DNA induzido por substâncias de origem natural ou
sintética é uma área essencial da toxicologia genética uma vez que mutação em
cromossomos é um evento importante na carcinogênese (FENECH et al., 2005). Por
outro lado, compostos antitumorais clássicos como a ciclofosfamida são
reconhecidos como um agente potencialmente genotóxico. Quando se busca
estabelecer os constituintes químicos de um produto natural, faz-se necessário
também estabelecer seus possíveis perigos para a saúde humana. Com a A.
zerumbet não se pode deixar de avaliar todos seus possíveis efeitos no genoma das
células animais e humanas, sejam ele benéficos ou maléficos, pois é uma planta
utilizada com bastante freqüência pela população, não só a brasileira, mas a asiática
também. Diante disso, buscamos saber se o extrato aquoso e o óleo essencial
apresentavam atividade genotóxica, o que representaria um fator mutagênico de
efeitos cumulativos a médio e longo prazo.
Os resultados obtidos com o ensaio do cometa foram negativos para ação
genotóxica do extrato aquoso, em todas as doses utilizadas, e do óleo essencial. Em
relação ao controle positivo, a ciclofosfamida nas doses de 25mg/Kg e 50 mg/Kg, a
significância estatística foi bastante relevante, com um P<0,001. Já em relação ao
controle negativo, a salina 0,9%, houve uma semelhaça no comportamento das
substâncias, com um P>0,05. Esses resultados indicam que nem o extrato aquoso
nem o óleo essencial apresentam atividades genotóxicas, sejam elas clastogênicas
ou aneugênicas.
Os micronúcleos (MN) não pequenos corpúsculos compostos de material
cromossômico perdido do núcleo principal, como conseqüência de um dano
genético, que pode ser causado por agentes químicos, físicos ou biológicos,
capazes de interferir no processo de ligação do cromossomo às fibras do fuso, ou
77
que possam induzir a perda de material genético. O teste do micronúcleo detecta
mutagênese cromossômica em eucariotos do tipo clastogênese, aneugênese e
danos no fuso mitótico (VILLELA et al., 2003).
O teste de micronúcleo em organismos de exposição aguda, menos de quatro
semanas, é realizado em eritrócitos jovens, denominados policromatófilos (EPC),
que se cora de forma diferenciada por conter RNA ribossomal.
Os resultados obtidos com os testes do micronúcleo para o extrato aquoso e
para o óleo essencial foram semelhantes entre si, ou seja, em ambos os casos, as
substâncias testadas apresentaram um comportamento semelhante ao do controle
negativo, com um P>0,05 e uma diferença estatisticamente significante do controle
positivo, a ciclofosfamida 25 mg/Kg e 50 mg/Kg, com um P<0,001. Esses resultados
eram esperados, uma vez que em nenhum dos testes in vitro mostrou tendências
tóxicas às células. Outro indício de que essas substâncias não eram genotóxicas é o
fato de mesmo sem ter acesso aos dados científicos a população usa largamente o
chá das folhas da colônia para tratamentos diversos e nunca houve a desconfiança
de que esse chá causasse problemas genotóxicos. Com essas informações,
podemos afirmar que o ensaio do micronúcleo apenas corrobora com os resultados
obtidos do ensaio do cometa, reafirmando uma condição não genotóxica do extrato
aquoso e do óleo essencial de Alpinia zerumbet.
Embora muito pouco a respeito dessa planta esteja disponível na literatura
científica, principalmente no que se refere ao seu perfil toxicológico, é importante
estabelecer esses valores de forma empírica para que se possa fazer o uso de
maneira mais adequada dos produtos naturais com características medicinais no
Brasil e estabelecer a segurança da saúde da população, principalmente daquela
mais carente. Entretanto, reconhecemos que o trabalho ainda está no seu início,
requerendo, essa espécie, maiores testes de toxicidade para afirmarmos com
segurança de que é uma planta com baixa toxicidade para humanos e animais.
Os próximos testes a serem realizados para esse fim serão os testes de
toxicidade crônica, por doses repetidas, e os testes de embriotoxicidade in vivo. Com
essas análises, juntamente com o estudo histopatológico dos órgãos dos animais
tratados nos estudos de toxicidade crônica e embriológica, estabeleceremos o perfil
78
toxicológico completo de A. zerumbet, permitindo assim a realização dos estudos
clínicos de fase I, de fase II e de fase III do extrato aquoso.
Em resumo, podemos dizer que a maior contribuição do presente trabalho foi
permitir o conhecimento básico necessário para a realização dos estudos clínicos
que, por sua vez, proporcionará o conhecimento necessário para a implementação
do uso seguro dessa planta como um fitoterápico seguro e útil à população
brasileira.
79
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Ao final deste trabalho, podemos concluir que:
O perfil toxicológico parcial do extrato aquoso liofilizado das folhas
planta da espécie Alpinia zerumbet foi estabelecido, sendo esta fração
praticamente inócua ao organismo de animais, porém com ações
farmacológicas importantes;
O extrato aquoso liofilizado das folhas da planta Alpinia zerumbet não
mostrou ser uma substância tóxica frente a células tumorais de várias
linhagens humanas e de camundongos nem a células normais
humanas, como os linfócitos, sendo a IC
50
desta substância acima de 5
µg/mL para todas as linhagens de células testadas;
O extrato aquoso liofilizado das folhas da planta Alpinia zerumbet não
mostrou ser uma substância hemolítica;
A DL
50
do extrato aquoso liofilizado das folhas de Alpinia zerumbet foi
acima de 5.000 mg/Kg, mostrando-se uma substância com baixíssima
toxicidade aguda.
O extrato aquoso liofilizado das folhas da planta Alpinia zerumbet não
demonstrou nenhuma atividade genotóxica, resultados evidenciados
tanto pelo ensaio do cometa como o do micronúcleo.
O óleo essencial das folhas da planta Alpinia zerumbet não mostrou
ser uma substância tóxica frente a células tumorais de várias linhagens
humanas e de camundongos sendo a IC
50
desta substância acima de 5
µg/mL para todas as linhagens de células testadas. Essa substância
também não demonstrou ser tóxica contra células normais humanas,
como os linfócitos, sendo a IC
50
cerca de 19,76%;
O óleo essencial não apresentou atividade hemolítica.
O óleo essencial não agiu genotoxicamente, fato evidenciado pelos
resultados dos ensaios do cometa e do micronúcleo.
80
7 CONCLUSÃO
Ao término do trabalho, concluímos que o extrato aquoso e o óleo essencial
não foram tóxicos nem genotóxicos.
81
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