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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE – UFRN
CENTRO DE TECNOLOGIA – CT
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA - DEQ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA - PPGEQ
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA UTILIZANDO
LÍQUIDO DA CASCA DE COCO VERDE
COMO FONTE DE NUTRIENTES
Renata Beltrão Teixeira
Orientadora: Drª Márcia Regina da Silva Pedrini
Co-Orientador: Dr. Gustavo Adolfo Saavedra Pinto
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ii
Ao Senhor Jesus, por me capacitar.
“Com a força que Cristo me dá, posso enfrentar qualquer situação” Fp 4.13
Aos meus primos, Tetelo (in memorian) e Leo (in memorian),
pelo exemplo de amor. Saudades.
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iii
Agradecimentos
Ao Gustavo, pela oportunidade, pela orientação neste trabalho, por partilhar do seu convívio
científico e, principalmente, pelo apoio, amizade e respeito.
À Márcia pela orientação segura, interessada e participativa; pela confiança em mim
depositada e por poder contar com sua amizade.
A Painho e Mainha, pelo amor e incentivo constante. Amo vocês.
Aos meus irmãos, Rogério e Régia. Presentes de Deus na minha vida.
Aos meus tios Otaviano e Risolda, por me adotarem como filha.
À minha prima e irmã Cláudia, pelas boas risadas.
Às amigas Raquel, Fabiana, Monisa, Karla e Patrícia, sempre presentes. Mulheres de Deus.
A Gilma, Salete e Jaime Neto, família que me acolheu. Amo vocês.
A Germano, Leandro e Otidene, pela amizade e companheirismo.
À Robertinha, pela amizade e por estar sempre pronta a me ajudar.
Aos amigos Sandra e Rui Fraga, pelo apoio e incentivo.
A Douglas Silva. Minha grande admiração.
Aos amigos Marconi, Josenilton e Janine, pela amizade e disponibilidade.
Aos amigos do Laboratório de Bioprocessos: Andréa, Cyntia, Germana, João Jaime, Leise,
Monique, Myrella, Natália de Freitas e Tigressa.
iv
À Adriana e Natália, que além de me ajudadarem se tornaram grandes amigas.
Aos colegas e amigos da Embrapa Agroindústria Tropical: Kênya, Alex, Manoel, Érica,
Marcos, Lúcia, Henriette, Edy, Socorro, Laura, Renato, Arthur e Déborah.
Ao Prof. Lindbergue Crisóstomo, pelo profissionalismo, competência e infinita paciência em
me ajudar, e por permitir o uso do Laboratório de Solos e Água.
Aos funcionários do Laboratório de Solos e Água, pela disponibilidade.
Ao Fernando Abreu, pela prontidão em me ajudar e pelo exemplo de profissional.
Ao pesquisador Fernando Aragão, pela contribuição no estudo estatístico dos meus resultados.
Ao Prof. Benvindo e ao Carlos Henrique do CEFET-CE, pela parceria.
Aos professores Everaldo Silvino, Gorete Macedo, Roberta Targino e Sônia Couri, pela
disposição em discutir o projeto e por seus questionamentos, contribuindo para esta forma
final da dissertação.
A Euzamar e Medeiros, da Secretaria do PPGEQ, pelo atendimento correto e atencioso que
sempre me dispensaram.
A todos os colegas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Ao Wander e à Cooperativa do Jangurussu, pelo empenho na coleta das amostras, que foram
fundamentais para realização deste trabalho.
À Embrapa Agroindústria Tropical, em cujas dependências realizei esta dissertação.
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pela oportunidade e condições oferecidas
durante a realização do curso.
Ao CNPq, pelo suporte financeiro.
v
TEIXEIRA, Renata Beltrão – Fermentação alcoólica utilizando líquido da casca de coco
verde como fonte de nutrientes. Dissertação de Mestrado, UFRN, Programa de Pós-
Graduação em Engenharia Química, Área de Concentração: Engenharia de Processos, Sub-
área de Concentração: Alimentos e Biotecnologia, Natal/RN, Brasil.
Orientadora: Prof
a
. Dra. Márcia Regina da Silva Pedrini
Co-orientador: Dr. Gustavo Adolfo Saavedra Pinto
Resumo
A utilização do líquido da casca de coco verde (LCCV) em fermentação surgiu como
uma alternativa ao aproveitamento de um efluente, rico em açúcares fermentáveis, liberado
pelas usinas de beneficiamento da casca de coco verde. A primeira fase deste trabalho foi
avaliar o potencial fermentativo do líquido da casca de coco verde através da fermentação
natural do líquido. Por não possuir informação disponível na literatura e pela dificuldade de se
trabalhar com um efluente orgânico, a segunda fase foi realizar a caracterização do líquido e a
elaboração de um meio sintético, para melhor explorar seu potencial como diluente em
bioprocessos. A terceira fase, estudar a influência de taninos iniciais condensados e
hidrolisáveis em fermentação alcoólica. A última fase foi dividida em três etapas, na qual se
avaliou a influência da quantidade de inóculo no processo fermentativo; a influência da fonte
de carbono e do uso de LCCV como diluente; a temperatura; a agitação e, finalmente, o
estudo comparativo entre o LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo.
Para a caracterização foram realizadas análises físico-químicas do LCCV, bem como os teores
de DQO, DBO e série de sólidos. As fermentações foram realizadas em biorreator de bancada,
com volume de trabalho de 5L, Saccharomyces cerevisiae e 0,30% de óleo de soja como
antiespumante. Nas fermentações foram avaliadas diferentes concentrações de açúcares
iniciais (10 a 20%) e de levedura (5 e 7,5%), e diferentes temperaturas (30 a 50°C) e agitações
(400 e 500rpm). Durante o processo foram analisados o perfil de pH e de açúcares, e a
produção de etanol. A caracterização do LCCV demonstrou a complexidade e variabilidade
do líquido. As melhores condições foram alcançadas nos meios contendo 7,5% de levedura,
15% de açúcares, 40°C, sob agitação de 500rpm, sendo obtida uma eficiência de conversão
em etanol de 98% após 6 horas de processo. Durante o estudo comparativo do LCCV in
vi
natura e sintético, através dos parâmetros avaliados durante a fermentação, um estudo
estatístico revelou a similaridade do meio sintético com o meio natural.
Palavras-chave: LCCV, Saccharomyces cerevisiae, Fermentação alcoólica.
BANCA EXAMINADORA:
Presidente: Profa. Dra. Márcia Regina da Silva Pedrini (DEQ/UFRN)
Membros: Dr. Gustavo Adolfo Saavedra Pinto (pesquisador - EMBRAPA/CE)
Profa. Dra. Gorete Ribeiro de Macedo
(DEQ/UFRN)
Dra. Sonia Couri (EMBRAPA/RJ)
vii
Abstract
The liquid of the rind of green coconut (LCCV), an effluent stream from the
industrial processing of green coconut rind, is rich in sugars and is a suitable feedstock for
fermentation. The first step of this study was to evaluate the potential of natural fermentation
of LCCV. As the literature did not provide any information about LCCV and due to the
difficulty of working with such an organic effluent, the second step was to characterize the
LCCV and to develop a synthetic medium to explore its potential as a bioprocess diluent. The
third step was to evaluate the influence of initial condensed and hydrolysable tannins on
alcoholic fermentation. The last step of this work was divided into several stages: in particular
to evaluate (1) the influence of the inoculum, temperature and agitation on the fermentation
process, (2) the carbon source and the use of LCCV as diluent, (3) the differences between
natural and synthetic fermentation of LCCV, in order to determine the best process
conditions. Characterization of LCCV included analyses of the physico-chemical properties as
well as the content of DQO, DBO and series of solids. Fermentation was carried out in bench-
scale bioreactors using Saccharomyces cerevisiae as inoculum, at a working volume of 5L
and using 0.30% of soy oil as antifoam. During fermentations, the effects of different initial
sugars concentrations (10 - 20%), yeast concentrations (5 and 7.5%), temperatures (30 - 50°C)
and agitation rates (400 and 500 rpm) on pH/sugars profiles and ethanol production were
evaluated. The characterization of LCCV demonstrated the complexity and variability of the
liquid. The best conditions for ethanol conversion were (1) media containing 15% of sugar;
(2) 7.5% yeast inoculum; (3) temperature set point of 40°C and (4) an agitation rate of 500
rpm, which resulted in an ethanol conversion rate of 98% after 6 hours of process. A
statistical comparison of results from natural and synthetic fermentation of LCCV showed
that both processes are similar.
Key-words: LCCV, Saccharomyces cerevisiae, Alcoholic fermentation.
viii
Sumário
Resumo ..................................................................................................................v
Sumário.............................................................................................................. viii
Lista de Figuras.................................................................................................. xiii
Lista de tabelas ................................................................................................. xvii
Nomenclatura................................................................................................... xviii
Capítulo 1...............................................................................................................1
Introdução Geral....................................................................................................1
Capítulo 2...............................................................................................................5
Aspectos teóricos...................................................................................................5
2.1. Melaço da cana-de-açúcar............................................................................6
2.2. Leveduras.....................................................................................................6
2.3. LCCV...........................................................................................................8
2.4. Fermentação alcoólica................................................................................10
2.5. Sistema em batelada...................................................................................12
2.5.1. Temperatura..........................................................................................12
2.5.2. pH do meio de cultivo ..........................................................................13
2.6. Taninos.......................................................................................................14
Capítulo 3.............................................................................................................16
Estado da arte.......................................................................................................16
Capítulo 4.............................................................................................................20
ix
Metodologia experimental...................................................................................20
4.1 Microrganismo............................................................................................21
4.2 Matérias-primas...........................................................................................21
4.2.1 Melaço ...................................................................................................21
4.2.2 Líquido da Casca de Coco Verde..........................................................21
4.3 Fluxograma Experimental...........................................................................21
4.4 Avaliação da fermentação natural do líquido da casca de coco verde .......22
4.5 Caracterização do líquido da casca de coco verde......................................23
4.6 Elaboração do LCCV sintético ...................................................................24
4.7 Avaliação da influência de taninos iniciais condensados e hidrolisáveis em
diferentes concentrações de açúcares................................................................24
4.8 Fermentação em biorreator de bancada ......................................................25
4.8.1 Influência da quantidade de inóculo e de açúcares no processo
fermentativo....................................................................................................26
4.8.2 Influência da fonte de carbono e do uso de LCCV como diluente no
processo fermentativo.....................................................................................26
4.8.3 Influência da agitação no processo fermentativo..................................27
4.8.4 Influência da temperatura no processo fermentativo ............................27
4.8.5 Estudo comparativo entre o LCCV sintético e in natura em condições
ótimas de processo..........................................................................................27
4.9 Determinações analíticas.............................................................................27
4.9.1 Métodos analíticos empregados na caracterização do LCCV...............27
4.9.1.1 pH ..................................................................................................27
4.9.1.2 Condutividade elétrica...................................................................28
4. 5.1.3 Série de sólidos.............................................................................28
x
4. 9.1.4 Demanda Química de Oxigênio...................................................28
4. 9.1.5 Demanda Bioquímica de Oxigênio..............................................28
4. 9.1.6 Amônia total.................................................................................29
4. 9.1.7 Nitrito ...........................................................................................29
4. 9.1.8 Nitrato...........................................................................................29
4. 9.1.9 Determinação de Nitrogênio ........................................................30
4. 9.1.10 Determinação de açúcares redutores..........................................30
4. 9.1.11 Determinação de açúcares redutores totais ................................31
4. 9.1.12 Fenólicos totais...........................................................................31
4. 9.1.13 Taninos condensados..................................................................31
4. 9.1.14 Digestão nitroperclórica.............................................................32
4. 9.1.15 Determinação de Fósforo ...........................................................32
4. 9.1.16 Determinação de Sódio e Potássio.............................................32
4. 9.1.17 Determinação de Cálcio e Magnésio..........................................32
4. 9.1.18 Determinação de Cobre, Ferro, Manganês e Zinco ...................33
4. 9.1.19 Determinação de Enxofre...........................................................33
4.9.2 Métodos analíticos empregados no processo fermentativo...................33
4.9.2.1 Determinação de açúcares redutores totais ...................................33
4.9.2.2 Determinação de etanol.................................................................34
4.9.2.3 Determinação de cor durante a fermentação natural do LCCV....35
4.9.2.4 Caracterização e quantificação da população fúngica durante o
processo fermentativo natural do LCCV...................................................35
4.9.2.5 Determinação de células viáveis ...................................................36
4.9.2.6 Determinação de biomassa............................................................36
4.9.2.7 Determinação de fenólicos totais ..................................................36
4.9.2.8 Determinação dos parâmetros de fermentação .............................37
4.10 Estudo estatístico.......................................................................................38
Capítulo 5.............................................................................................................39
xi
Resultados e discussão.........................................................................................39
5.1 Fermentação natural do LCCV em garrafinhas de polietileno ...................40
5.2 Avaliação da influência de taninos iniciais condensados e hidrolisáveis em
diferentes concentrações de açúcares na fermentação alcoólica ......................46
5.3. Caracterização do Líquido da Casca do Coco Verde ................................49
5.4 Elaboração do LCCV sintético ...................................................................53
5.5 Influência da quantidade de inóculo no processo fermentativo..................54
5.6 Influência da fonte de carbono e do uso de LCCV como diluente no
processo fermentativo .......................................................................................56
5.7 Influência da agitação no processo fermentativo........................................59
5.8 Influência da temperatura no processo fermentativo..................................60
5.9 Estudo comparativo entre o LCCV in natura e o LCCV sintético .............62
5.9.1 Concentração de açúcar.........................................................................63
5.9.2 Concentração de etanol..........................................................................64
5.9.3 pH ..........................................................................................................65
5.9.4 Células viáveis e totais ..........................................................................66
5.9.5 Biomassa................................................................................................67
5.9.6 Fenólicos totais......................................................................................68
5.9.7 Parâmetros cinéticos..............................................................................68
Capítulo 6.............................................................................................................70
Conclusões...........................................................................................................70
xii
Capítulo 7.............................................................................................................72
Referências bibliográficas ...................................................................................72
Anexos ...............................................................................................................811
xiii
Lista de Figuras
Figura 2.1 - Etapas do sistema de processamento da casca de coco verde.................................8
Figura 2.2 - Linha de processamento da casca do coco verde, instalada no desativado Aterro
Sanitário do Jangurussu, em Fortaleza-Ce. Seqüência de etapas do beneficiamento do coco:
alimentação (I), trituração (II); prensagem (III) e classificação (IV).......................................10
Figura 4.1. Fluxograma experimental. .....................................................................................23
Figura 4.2. Fermentação natural do líquido da casca de coco verde em sistema fechado, em
garrafas de PET. .......................................................................................................................23
Figura 4.3. Fermentador de bancada ........................................................................................25
Figura 4.4 - Redução do ácido 3,5-dinitrosalicílico a 3-amino-5-nitrosalicílico pelos açúcares
redutores. ..................................................................................................................................30
Figura 4.5 - Sistema de fermentação: balança acoplada à dorna do fermentador. ...................34
Figura 4.6 - Técnica da diluição em série para obtenção de colônias isoladas em placas de
Petri.(http://www.iq.unesp.br/flotacao/MODULO2/aula3/aula3.htm). ...................................35
Figura 4.7 - Contagem de células em Câmara de Neubauer. ...................................................36
Figura 5.1 - Estimativa de etanol durante a fermentação natural do LCCV. ...........................40
Figura 5.2 - Consumo de açúcares redutores e açúcares redutores totais, durante a fermentação
natural do LCCV. .....................................................................................................................41
Figura 5.3 - Perfil de pH durante a fermentação natural do LCCV..........................................41
Figura 5.4 - Placas de Petri utilizadas na avaliação do perfil da carga microbiana durante
processo fermentação natural do LCCV, segundo o método de plaqueamento por
espalhamento. ...........................................................................................................................42
Figura 5.5 - Perfil dos parâmetros de cor durante a fermentação natural do LCCV. Os
parâmetros L*, a* e b*correspondem à luminosidade, contribuição de vermelho e
xiv
contribuição de amarelo, respectivamente, em uma escala compreendida entre 0 e 100 para
“L” e -60 a +60 para as demais variáveis.................................................................................44
Figura 5.6 - Fermentação natural do LCCV em garrafinhas de polietileno durante os dez dias
de fermentação..........................................................................................................................45
Figura 5.7 - Concentração de grupos fenólicos totais durante a fermentação natural do LCCV.
..................................................................................................................................................46
Figura 5.8 - Concentração estimada de etanol nas fermentações contendo 0, 5, 10, 15 e 20 g.L
-
1
de ácido tânico hidrolisável (a, b e c) e tanino condensado (d, e e f) em 100 (a e d), 150 (b e
e) e 200 g.L
-1
(c e f) de sacarose, e incubadas durante 8 horas. ...............................................48
Figura 5.9 - Velocidade máxima de etanol nas fermentações contendo 0, 5, 10, 15 e 20 g.L
-1
de ácido tânico hidrolisável (a) e tanino condensado (b) em 100, 150 e 200 g.L
-1
de sacarose.
..................................................................................................................................................49
Figura 5.10 - Produção de etanol e perfil de pH nas fermentações inoculadas com 5,0 (a) e
7,5% (b) de levedura, em diferentes concentrações de açúcar inicial. Temperatura: 30°C e
agitação de 500 rpm..................................................................................................................54
Figura 5.11 - Eficiência de conversão em etanol nas fermentações inoculadas com 5,0 (a) e
7,5% (b) de levedura, em diferentes concentrações de açúcar inicial. Temperatura: 30°C e
agitação de 500 rpm..................................................................................................................55
Figura 5.12 – Velocidade de formação de etanol nas fermentações inoculadas com 5,0 (a) e
7,5% (b) de levedura, em diferentes concentrações de açúcar inicial. Temperatura: 30°C e
agitação de 500 rpm..................................................................................................................55
Figura 5.13 - Concentração de etanol e perfil de pH nas fermentações inoculadas com 7,5% de
levedura, em diferentes concentrações de açúcar e diluídos em água (a) e LCCV sintético (b),
respectivamente. Temperatura: 30°C e agitação 500 rpm........................................................57
xv
Figura 5.14 - Eficiência de conversão em etanol nas fermentações inoculadas com 7,5% de
levedura, em diferentes concentrações de açúcar, diluídos em água (a) e LCCV sintético (b),
respectivamente. Temperatura 30°C e agitação de 500 rpm. ...................................................58
Figura 5.15 - Velocidade de formação de etanol nas fermentações inoculadas com 7,5% de
levedura, em diferentes concentrações de açúcar, diluídos em água (a) e LCCV sintético (b),
respectivamente. Temperatura a 30°C e agitação de 500 rpm.58Figura 5.16 - Consumo de
açúcares (a) e concentração de etanol (b) no processo fermentativo em sistemas submetidos a
diferentes agitações...................................................................................................................59
Figura 5.17 - Eficiência de conversão e velocidade de formação de etanol no processo
fermentativo em sistemas submetidos a diferentes agitações...................................................60
Figura 5.18 - Concentração de etanol e de açúcares no processo em sistemas submetidos a
diferentes temperaturas.............................................................................................................61
Figura 5.19 - Eficiência de conversão e velocidade de formação de etanol no processo em
sistemas submetidos a diferentes temperaturas. .......................................................................61
Figura 5.20 - Estudo comparativo entre o LCCV in natura (a) e sintético (b) nas condições
ótimas de processo: 150 g.L
-1
de açúcar, 7,5% de levedura, 500 rpm e 40°C. ........................62
Figura 5.21 - Concentração de açúcares da fermentação, durante o estudo comparativo entre
LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo. Desvio-padrão da triplicata de
cada diluente.............................................................................................................................64
Figura 5.22 - Concentração de etanol na fermentação, durante o estudo comparativo entre
LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo. Desvio-padrão da triplicata de
cada diluente.............................................................................................................................64
Figura 5.23 - Perfil de pH da fermentação, durante o estudo comparativo entre LCCV in
natura e sintético, nas condições ótimas de processo. Desvio-padrão da triplicata de cada
diluente. ....................................................................................................................................64
xvi
Figura 5.24 - Concentração de células viáveis e totais da fermentação, durante o estudo
comparativo entre LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo. Desvio-
padrão da triplicata de cada diluente. .......................................................................................64
Figura 5.25 - Concentração de biomassa da fermentação, durante o estudo comparativo entre
LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo. Desvio-padrão da triplicata de
cada diluente.............................................................................................................................67
Figura 5.26 - Concentração de fenólicos na fermentação, durante o estudo comparativo entre
LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo. Desvio-padrão da triplicata de
cada diluente.............................................................................................................................67
Figura 5.27 - Parâmetros cinéticos dos processos fermentativos: (a) coeficiente de rendimento
em etanol (g etanol/g açúcar consumido); (b) eficiência de produção de etanol (%) e (c)
velocidade de formação de etanol (g.L
-1
.h
-1
)............................................................................67
xvii
Lista de tabelas
Tabela 5.1 - Contagem de células viáveis durante a fermentação natural do LCCV segundo
método de plaqueamento por espalhamento.............................................................................42
Tabela 5.2 - Caracterização do Líquido da Casca de Coco Verde. ..........................................51
Tabela 5.3 - Composição do LCCV sintético...........................................................................53
xviii
Nomenclatura
LCCV Líquido da Casca do Coco Verde
T Temperatura
DBO Demanda Bioquímica de Oxigênio
BQO Demanda Química de Oxigênio
UFC Unidade Formadora de Colônias
rpm Rotações por minuto
ART Açúcares Redutores Totais
C
1
Concentração de açúcares do melaço (g.L
-1
)
C
2
Concentração de açúcares do mosto (g.L
-1
)
V
1
Volume de melaço
V
2
Volume do mosto de fermentação
Ef Eficiência de conversão do processo
P
0
Peso inicial do sistema (Kg)
P
f
Peso final do sistema (Kg)
S
0
Concentração de substrato inicial (g.L
-1
)
a* Contribuição de vermelho
b* Contribuição de amarelo
L* Luminosidade
R
2
Coeficiente de determinação
Capítulo 1
Introdução Geral
__________________________________________________________________________________________
Introdução geral
________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
3
A importância econômica da indústria alcooleira no Brasil está intimamente ligada à
indústria açucareira, pois o álcool era praticamente um subproduto desta indústria. Sendo
estas as primeiras indústrias manufatureiras implantadas no país, existem em todos os estados
e sua produção é muito elevada.
Apesar de ser lembrado como resposta do Brasil às crises do petróleo, o álcool anidro
era usado desde os anos 30 como aditivo na gasolina brasileira. Na busca de autonomia
energética, o país desenvolveu o Programa Nacional do Álcool (Proálcool) e o pioneiro carro
a álcool. Hoje, o Brasil produz cerca de 13 bilhões de litros/ano. Aproximadamente três
milhões de veículos são movidos a álcool hidratado, consumindo 4,9 bilhões de litros/ano.
Usa-se álcool anidro na proporção de 25%, como aditivo para a gasolina. De 1980 para cá,
registrou-se uma economia de US$ 1,8 bilhão por ano, com a substituição pelo álcool, do
equivalente a 200 mil barris de gasolina/dia (UNICA,2004). Dada a importância que o álcool
representa para o nosso país, e por se tratar de um produto renovável e limpo, que contribui
para a redução do efeito estufa e diminui substancialmente a poluição do ar, existe um grande
interesse do Brasil em desenvolver e melhorar técnicas de produção de álcool por via
fermentativa.
O setor sucroalcooleiro do Brasil tem um diferencial ambiental positivo, representado
pela produção do álcool etílico, combustível limpo e renovável, oriundo da cana-deaçúcar. A
utilização extensiva do álcool etílico como combustível automotivo no Brasil, seja em mistura
de 25% com a gasolina, como combustível dos veículos equipados com motor a álcool ou,
ainda, nos recentemente lançados veículos com tecnologia flex fuel que operam com gasolina,
álcool ou qualquer mistura desses combustíveis, confere ao país liderança no cenário
internacional quanto ao seqüestro de carbono e à mitigação do efeito estufa (Macedo at al,
2004).
O consumo crescente de água de coco verde, in natura ou industrializada, vem
acompanhado de expressivo aumento de resíduos, constituídos basicamente pela casca
fibrosa, que corresponde a 85% do fruto (Araújo et al., 2004). A área de produção de coco-
anão verde no Brasil é de 57.000 hectares, correspondendo a uma produção de 5,7 milhões de
toneladas de resíduo por ano (Rosa, 2001). Devido a esta preocupação, a Embrapa
Agroindústria Tropical, recentemente, implantou uma unidade-piloto de beneficiamento da
casca de coco verde em produtos de alto valor agregado (substrato agrícola, composto
orgânico, vasos, artesanatos e artefatos diversos). No entanto, um dos entraves é que o
processamento gera um efluente com alto poder poluidor na etapa de prensagem, o líquido da
casca de coco verde - LCCV, que representa 80% da casca fibrosa. A vazão deste efluente no
__________________________________________________________________________________________
Introdução geral
________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
4
processo de prensagem da unidade-piloto é, em média, 15 m
3
/dia, podendo chegar a 20 m
3
/dia
em períodos de produção intensa. Uma alternativa à redução da carga orgânica deste efluente
é a utilização deste líquido como base de diluição em processos fermentativos.
Existe uma grande preocupação em reduzir os custos de produção industrial de álcool.
Sabendo que os custos com matéria-prima correspondem a 55-75% do custo do produto, a
produção de álcool utilizando matérias-primas de baixo custo tem se tornado uma importante
área de investigação. O melaço é um substrato rico em açúcares diretamente fermentescíveis,
sendo utilizado para correções de mosto, através de diluição. Desta forma, a utilização do
líquido da casca de coco verde (LCCV), efluente proveniente do beneficiamento da casca de
coco verde, como base para diluição de melaços, surgiu como uma alternativa. Este visa a
minimização dos custos de produção do processo fermentativo, o aproveitamento deste
resíduo e, assim, viabilizar o pleno funcionamento de unidades benefeciadoras da casca de
coco verde.
Estando a poucos passos de uma crise energética, com a previsão do fim das reservas
de petróleo e carvão mineral, a energia elétrica também cada vez mais escassa e a energia
nuclear um tanto perigosa, torna-se uma questão vital a busca por fontes alternativas de
energia e inúmeros esforços estão sendo feitos para que seja possível obter o máximo de
energia da biomassa (Silva, 2007). A preocupação de se desenvolver um processo que venha
baratear a produção de álcool, produto estratégico para a matriz energética nacional, e que
vem gradativamente aumentando sua importância internacional, associado a uma alternativa
de utilização de um efluente de grande preocupação ambiental para o Brasil, e em especial
para o Estado do Ceará, como o líquido da casca de coco verde; caracteriza a relevância deste
projeto.
Capítulo 2
Aspectos teóricos
___________________________________________________________________________
Aspectos teóricos
_______________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
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2.1. Melaço da cana-de-açúcar
O melaço é muito utilizado como matéria-prima na fermentação alcoólica por razões
econômicas e, a eficiência do processo depende da utilização de linhagens específicas de
leveduras. A sacarose é hidrolisada pela invertase da levedura à glicose e frutose, e estes
monossacarídeos são substratos utilizados pela levedura para fermentação (Takeshige et al.,
1995).
O melaço da cana-de-açúcar é o líquido que se obtêm como resíduo de fabricação do
açúcar cristalizado. Sua composição é muito variável, e depende da qualidade da cana-de-
açúcar e do método de fabricação. De maneira geral possui, aproximadamente, 19% de água,
57% de açúcares, 8% de cinzas, 8% de materiais nitrogenados e 27% de outros, como gomas
e ácidos. Nas frações de açúcares distinguem-se 32% de sacarose, 37% de dextrose, além de
levulose, podendo-se afirmar que o melaço é um sub-produto com teores de açúcares
diretamente fermentescíveis próximos a 50% (Campos, 2007).
2.2. Leveduras
As leveduras são os microrganismos mais importantes na obtenção do álcool por via
fermentativa. Bactérias, entre as quais a Zymomonas mobilis, são tidas como capazes de
produzir etanol, mas, economicamente, as leveduras do gênero Saccharomyces são os agentes
largamente usados (Lima et al, 2001).
As leveduras são fungos unicelulares, e muitos deles são classificados como
Ascomicetos. As células de levedura são geralmente esféricas, ovais ou cilíndricas, e sua
divisão celular geralmente se dar por brotamento. As leveduras geralmente são encontradas
em habitats onde os açúcares estão presentes, tais como frutos, flores, casca de árvores e etc
(Madigam et al, 1997).
As espécies mais usadas na produção industrial de álcool e aguardentes são os
Saccharomyces cerevisae e Saccharomyces uvarum (Borzani, 2001). A cepa selecionada deve
crescer bem, produzir grande quantidade de etanol e apresentar uma alta tolerância ao produto
sintetizado (Pelczar Jr, 1996).
Saccharomyces cerevisae é um microrganismo facultativo, ou seja, tem capacidade de
se ajustar metabolicamente, tanto em condições de aerobiose como de anaerobiose. Assim,
enquanto uma porção do açúcar é transformado em biomassa e CO
2
em aerobiose, a maior
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parte é convertida em etanol e CO
2
em anaerobiose, processo denominado fermentação
alcoólica (Lima, Basso e Amorim, 2001). Em condições aeróbicas, o metabolismo da
levedura, leva a uma maior produção de moléculas de ATP por unidade de glicose,
favorecendo a produção de biomassa (Moraes, 2001).
O objetivo principal da levedura, ao metabolizar anaerobicamente o açúcar, é gerar
energia, sob a forma de ATP, que será empregada na relação de diversos trabalhos
fisiológicos (absorção, excreção e outros) e biossíntese, necessários à manutenção da vida,
crescimento e multiplicação. O etanol e o CO
2
resultantes se constituem, tão somente, de
produtos de excreção, sem utilidades metabólicas para a célula em anaerobiose (Lima, Basso
e Amorim, 2001).
Maiores concentrações de leveduras permitem fermentações mais rápidas, com maior
produtividade e maior controle das bactérias contaminantes, além de restringir o crescimento
da própria levedura. Por outro lado, elevado teor de levedura exige energia de manutenção
maior, isto é, maior consumo de açúcar para manter as células vivas. Como conseqüência,
resulta em maior competição pelos nutrientes do meio, minerais e vitaminas, diminuindo a
viabilidade do fermento. Daí existir um teor ótimo de levedura na dorna, dependendo das
condições do processo industrial (Lima, Basso e Amorim, 2001).
As leveduras comerciais de hoje são provavelmente muito diferentes das linhagens
selvagens, por terem sido grandemente aperfeiçoadas ao longo dos anos através de seleções
cuidadosas e manipulação genética por microbiologistas industriais (Madigam et al, 1997).
O poder fermentativo de uma levedura pode ser expresso em termos de quantidade de
açúcar que ela degrada, numa dada temperatura, em uma unidade de tempo, por quantidade de
células (Jorgensen, 1939).
Com o progresso da tecnologia de bebidas, as linhagens de levedura foram sendo
selecionadas segundo características desejáveis ao processo e ao produto. A produtividade e a
eficiência de fermentação, a tolerância ao etanol e à temperatura, a resistência às altas
concentrações de açúcares, a habilidade de flocular e de produzir ou não certos componentes
do aroma das bebidas e a propriedade de produzir metabólitos anti-contaminantes são
constantes fontes de interesse (Hammond, J.R.M. apud Ribeiro et al, 1999).
Segundo Lima, Basso e Amorim (2001), dependendo das condições de processo, da
concentração de nitrogênio amoniacal do mosto e da taxa de recirculação do fermento, são
atingidas concentrações excessivas de levedura. A utilização de ácido benzóico mostra-se
capaz de reduzir o crescimento excessivo da levedura, ao mesmo tempo que diminui a
formação de glicerol e aumenta o rendimento da fermentação. Entretanto, devido à redução de
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ácido succínico pela levedura, esta não exerce ação antagônica às bactérias e, no transcorrer
dos reciclos fermentativos, inviabiliza a utilização prática do ácido benzóico nas fermentações
correntes.
Takeshige et al. (1995) estudaram os efeitos da invertase de Saccharomyces cerevisiae
em fermentação alcoólica a base de melaço e observou que alta pressão osmótica é um
importante fator de depreciação da fermentação.
Segundo Zech et al (1995), a inativação da invertase pelo etanol é a principal razão
pela limitada concentração de etanol produzida nos processos de fermentação industrial a base
de melaço.
2.3. LCCV
O Líquido da casca de coco verde (LCCV) é um resíduo proveniente do
beneficiamento da casca do coco verde para aproveitamento das frações de fibra e entre-fibra
(pó), que constitue a parte sólida desta matéria-prima, conforme pode ser observada no
esquema apresentado na Figura 2.1 e na foto do equipamento (Figura 2.2). O nível de
informação disponível na literatura científica sobre o LCCV, até então, é nulo. No entanto,
análises preliminares identificaram a presença de açúcares fermentescíveis, compostos
fenólicos, cátions (cálcio, magnésio, potássio e sódio) e ânions (cloreto, bicarbonato e
sulfato), além de elevados valores de DQO e DBO.
O processo de beneficiamento da casca do coco verde, desenvolvido pela Embrapa
Agroindústria Tropical, representou uma possibilidade de minimização deste abundante
resíduo gerado na orla marítima de cidades brasileiras ou por empresas
processadoras/envasadoras de água de coco (Rosa, 2001). Em 2003, mediante financiamento
do Banco Mundial, uma Unidade Piloto para obtenção de fibra e pó da casaca de coco verde
foi instalada próxima ao Aterro Sanitário do Jangurussu em Fortaleza/CE. Assim, o elevado
potencial poluidor do LCCV foi minimizado, uma vez que este é encaminhado à estação de
tratamento de efeluentes do aterro. Contudo, devido ao baixo valor agregado dos produtos a
implantação de novas unidades pode estar comprometida devido ao custo de tratamento do
LCCV, o que se deve aos seus valores de DQO e DBO.
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Figura 2.1 - Etapas do sistema de processamento da casca de coco verde.
TRITURAÇÃO
PRENSAGEM
CLASSIFICAÇÃO POR PENEIRAS
PÓ
FIBRA
EFLUENTE
Casca do Coco Verde
Casca Triturada Úmida
Casca Triturada Seca
(≈ 3% (v/v))
(≈ 17% (v/v))
(≈ 85% (v/v))
100% (v/v)
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Figura 2.2 - Linha de processamento da casca do coco verde, instalada no desativado Aterro
Sanitário do Jangurussu, em Fortaleza-CE. Seqüência de etapas do beneficiamento do coco:
alimentação (I), trituração (II); prensagem (III) e classificação (IV).
2.4. Fermentação alcoólica
Processo fermentativo é definido atualmente como aquele em que substratos são
convertidos em produtos de interesse, mediante a ação de microrganismos viáveis (Borzani,
2001).
A fermentação alcoólica é a mais importante forma de obtenção de álcool etílico. A
fermentação alcoólica desenvolve-se por uma série de reações (Lima, 2001). Ela consiste,
basicamente, na conversão de açúcar em álcool, no qual o resultado final pode ser expresso
pela equação de Gay-Lussac.
C
6
H
12
O
6
2 C
2
H
5
OH
+
2 CO
2
(1)
I
II
III
IV
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Como se pode observar na Equação (1), o fator estequiométrico é igual a 0,511, ou
seja, cada grama de glicose convertida gera 0,511 g de etanol. A Saccharomyces cerevisiae,
normalmente empregada nesta fermentação, com freqüência permite obter um rendimento da
ordem de 90% deste valor estequiométrico, o que torna este microrganismo o mais
importante para realizar esta conversão, lembrando que vários outros também podem
acumular etanol, a partir da glicose, porém não com rendimento tão elevado (Schmidell et al,
2001).
Um dos fatores que torna a produção de etanol por via fermentativa a forma mais
econômica de obtenção é o grande número de matérias-primas naturais existentes em todo
país. Sua ditribuição geográfica, que encerra diversos climas e tipos de solos, permite seu
cultivo em quase todo o território e durante todo o ano (Lima, Basso e Amorim, 2001).
Numa fermentação alcoólica, pode-se distinguir uma fase preliminar, uma fase
tulmutuosa e uma fase final ou complementar. A fase preliminar inicia-se no momento do
contato do levedo com o mosto, e caracteriza-se por multiplicação celular intensa, pequena
elevação de temperatura e pequeno desprendimento de dióxido de carbono. A fase
tumultuosa caracteriza-se pelo desprendimento volumoso e intenso de dióxido de carbono,
conseqüência da existência de um número suficiente de células para desdobrar os açúcares
fermentescíveis do mosto; a temperatura eleva-se rapidamente, a densidade do mosto reduz-
se e elevam-se as percentagens de álcool e a acidez. A fase complementar caracteriza-se
pela diminuição da intensidade do desprendimento do dióxido de carbono, maior
tranqüilidade no líquido e diminuição da temperatura; nesta fase a concentração de açúcares
chega ao fim (Lima, 2001).
Enquanto existem condições aeróbias, os açúcares sofrem fermentação oxidante
exotérmica produzindo H
2
O e CO
2
. À medida que o meio se torna menos aeróbico, os
açúcares são hidrolisados e submetidos à fermentação etílica com a formação de CH
3
CH
2
OH
e CO
2
(CNPq, 1987).
Os componentes básicos, nutricionalmente importantes, são fonte de carbono, de
nitrogênio, sais minerais, e em alguns casos, fatores de crescimento. A maioria dos processos
biotecnológicos usa carbono e nitrogênio a partir de misturas complexas de produtos e
subprodutos naturais de baixo custo, buscando resíduos e águas residuárias com boa
composição e em disponibilidade (Moraes, 2001).
As concentrações dos mostos, nas destilarias brasileiras, são comumente expressas em
graus Brix, diluindo-se os melaços entre 15 e 20 °Brix. Aumentando-se a concentração de
açúcares, aumenta-se a velocidade de fermentação a produto e, dentro de certos limites,
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acarreta-se menor crescimento do fermento e menor formação de glicerol por unidade de
substrato. Entretanto, elevados teores de açúcar acarretam um estresse osmótico da levedura
de tal sorte que existe, dependendo do processo de fermentação, uma faixa de concentração
considerada ideal (Lima, Basso e Amorim, 2001).
A produção de etanol por via fermentativa é acompanhada pela formação de
compostos como glicerol, ácido succínico e álcoois superiores. A presença de álcoois
superiores é indesejável nas destilarias porque dificulta a obtenção do etanol puro (Gutierrez,
1993). Segundo Ayrapaa (1971), aumentando a disponibilidade de nitrogênio ocorreu redução
na produção de álcoois superiores.
Embora a produção do etanol com concentrações elevadas de melaço esteja realmente
sendo alcançada pela New Energy and Industrial Tecnology Development Organization
(NEDO) no Japão, a produtividade de etanol, a 30ºC, é de apenas 1,3 g.L
-1.
h
-1
, (Morimura, S.
et al, 1997).
2.5. Sistema em batelada
As fermentações descontínuas clássicas, ou simplesmente, fermentações descontínuas,
vêm sendo utilizadas pelo homem desde a Antiguidade e, ainda hoje, são as mais empregadas
para a obtenção de uma variedade de produtos fermentados. São também conhecidos por
fermentação batelada ou processo descontínuo de fermentação (Borzani, 2001).
As grandes vantagens de sistemas em batelada estão em apresentarem menores riscos
de contaminação e grande flexibilidade de operação.
2.5.1. Temperatura
A temperatura tem grande influência no crescimento dos microrganismos. Não é de se
surpreender, uma vez que todos os processos de crescimento são dependentes de reações
químicas que são diretamente afetadas pela temperatura. Os microrganismos, diferentemente
das células de mamíferos, podem crescer em uma ampla faixa de temperatura. (Pelczar,
1996).
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As leveduras são mesófilas e as temperaturas para produção industrial de álcool
situam-se na faixa de 26-35ºC, com média de 30ºC (Lima, 2001). A temperatura ótima para
uma espécie microbiana não é a temperatura mediana entre as temperaturas máxima e
mínima, e sim a mais próxima do limite superior da variação de temperatura, porque a
velocidade das reações enzimáticas aumenta com o aumento da temperatura até o ponto em
que as enzimas são desnaturadas pelo calor e as células param de crescer (Pelczar, 1996).
À medida que a temperatura aumenta, aumenta a velocidade da fermentação, mas
favorece a contaminação bacteriana, ao mesmo tempo que a levedura fica mais sensível à
toxidez do etanol. Por outro lado, temperaturas elevadas permitem maior perda de etanol pela
evaporação em dornas abertas. Tais aspectos justificam o controle da temperatura no processo
industrial (Lima, Basso e Amorim, 2001).
Para uma redução dos custos de produção, Morimura (1997) relatou que o
desenvolvimento de processos a altas temperaturas com altas concentrações de melaço era
necessário. Utilizando linhagens de levedura termotolerantes e halotolerantes, previamente
desenvolvidas, observou que em meios contendo 22% de melaço, em temperaturas acima de
33ºC, a concentração final de etanol foi maior que 90 g.L
-1
e alcançou rendimento superior a
80%.
A temperatura é conhecida por afetar o metabolismo da levedura, e como resultado, a
formação de metabólicos secundários como glicerol, ácido acético, ácido succínico, etc
(Lafon-Lafourcade, 1983). Torija et al (2003) estudaram os efeitos da temperatura em
linhagens de Saccharomyces cerevisiae e observaram que o tamanho da população máxima
foi similar em todas as temperaturas. Em baixas temperaturas (15 e 20ºC), as leveduras
desenvolveram-se lentamente, com uma longa fase lag, mas permaneceram constantes durante
a fermentação alcoólica. Entretanto, a altas temperaturas (35ºC) não houve nenhuma fase lag,
e sim uma rápida fase exponencial e pequena fase estacionária, com uma grande redução de
células viáveis.
2.5.2. pH do meio de cultivo
O pH é um parâmetro importante, afetando o crescimento celular e a formação de
produto. Por sua importância, este é controlado em muitas fermentações (Wang et al, 1979).
Os valores de pH do mosto para a produção de álcool mais adequados encontram-se
na faixa de 4,0 a 5,0. Valores de pH mais ácidos inibem o desenvolvimento de bactérias
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contaminantes, restringem a formação de novas células de leveduras, reduzem a produção de
glicerol, consequenemente aumentando a eficiência de conversão a etanol. O controle de pH
pode ser alcançado com a adição de soluções de ácido sulfúrico e / ou hidróxido de sódio.
2.6. Taninos
Taninos são compostos fenólicos hidrossolúveis comumente encontrados em tecidos
vegetais, que têm a propriedade de se combinar com proteínas, celulose e pectina para formar
complexos insolúveis.
A maioria dos fenólicos não é encontrada no estado livre na natureza, mas sob forma
de ésteres ou de heterosídeos sendo, portanto, solúveis em água e em solventes orgânicos
polares. Por serem fenólicos, os taninos são muito reativos quimicamente, formam pontes de
hidrogênio, intra e intermoleculares. Estes compostos são facilmente oxidáveis, tanto através
de enzimas vegetais específicas quanto por influência de metais, como cloreto férrico, o que
ocasiona o escurecimento de suas soluções (Santos e Mello, 2003).
Taninos condensados e ácidos tânicos hidrolisáveis são as principais classes de
taninos. Taninos hidrolisáveis consistem de um álcool poliédrico, em geral beta-D-glicose,
esterificado com ácido gálico ou derivados, enquanto que taninos condensados, ou
proantocianidinas, são compostos de flavonóides, e, diferentemente dos hidrolisáveis, não
contêm resíduos de açúcares. As unidades monoflavonóides encontram-se unidas por ligações
C-C que não podem ser degradadas por hidrólise (Pizzi, 1994)
Apesar das propriedades antimicrobianas dos taninos, muitos fungos, bactérias e
leveduras são bastante resistentes e conseguem crescer e se desenvolver.
Estudos mostram que os taninos têm efeito inibitório sobre bactérias e fungos (Waage
et al., 1984; Marvan e Nagel, 1986; Santos e Melo, 2003). Existem três hipóteses para o
mecanismo de ação microbiana. A primeira pressupõe a inibição das enzimas de bactérias e
fungos e/ou complexação dos substratos dessas enzimas; a segunda seria a ação dos taninos
sobre as membranas celulares dos microrganismos, modificando o seu metabolismo.
Finalmente a terceira hipótese menciona a complexação dos taninos com os íons metálicos
(Mila et al, 1996), diminuindo, assim, a disponibilidade destes elementos essenciais para o
metabolismo dos microrganismos.
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Segundo Scalbert (1991), taninos condensados e hidrolisáveis não apresentam
diferenças significantes frente a fungos e bactérias, visto que o efeito da toxicidade
relacionado à estrutura molecular do tanino ainda é desconhecido.
Capítulo 3
Estado da arte
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Estado da arte
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O Brasil, que sempre esteve na vanguarda da produção de açúcar, também ocupa uma
posição de destaque como o primeiro país que produziu e utilizou biocombustíveis em sua
frota automotiva (Andrieta et al., 2007).
No Brasil, as indústrias de açúcar e de álcool estiveram intimamente ligadas desde o
tempo do descobrimento. Deduz-se que a produção de álcool iniciou na capitania de São
Vicente, porque nela foi montado o primeiro engenho de açúcar do país, após a vinda das
primeiras mudas de cana-de-açúcar, trazidas da Ilha da Madeira em 1532 (Lima, Basso e
Amorim, 2001). Contudo, o Proálcool (Programa Nacional do Álcool) começou como uma
resposta ao embargo às exportações de petróleo imposto pelos países do Oriente Médio em
1973. Nesta época, a dependência do país em relação ao petróleo importado nos tornava mais
vulneráveis que o maior consumidor mundial desta matéria-prima, os Estados Unidos. Hoje, o
Proálcool é considerado mundialmente um sucesso, sendo que toda a gasolina vendida no país
contém 25% de etanol, além de uma frota de 3 milhões de veículos movidos exclusivamente
por este combustível, bem como uma nova geração de motores capazes de utilizar tanto a
mistura álcool/gasolina, quanto apenas o biocombustível (Grad, 2006).
A observação da natureza dos avanços tecnológicos na produção de etanol ao logo do
período mostra que, nos anos iniciais, as preocupações foram centradas em aumentar a
produção rapidamente (produtividades de equipamentos e processos), mesmo em detrimento
de eficiência de conversão; isso pode ocorrer sempre que a política indutora force metas
muito altas de implementação, com garantia de compra. Nos anos seguintes, os aumentos de
eficiência passaram a ser mais importantes (mesmo porque as garantias de preços não foram
mais observadas); e a terceira dessas “fases” foi o avanço em técnicas gerenciais da produção,
que levou a grandes reduções de custo. O resultado global foi uma forte redução nos custos de
produção, levando o etanol a uma situação em que praticamente não há necessidade de
subsídios para competir com a gasolina, considerando o petróleo a preços acima de US$ 45 o
barril (Macedo, 2007).
A produção mundial de etanol vem crescendo anualmente, sendo que em 2005
alcançou o volume de 46 bilhões de litros (Rass-Hansen et al., 2007). Em 2006 os Estados
Unidos superaram o Brasil como maiores produtores de etanol, produzindo 19,39 bilhões de
litros contra 19,22 produzidos no mesmo período no Brasil. Porém, devido a matéria-prima
utilizada em cada país ser diferente, o custo de produção do etanol brasileiro é de US$ 0,17/L,
enquanto o americano é cotado a US$ 0,32/L (Andrietta, Steckelberg e Andrietta, 2006). O
balanço energético para converter milho em etanol é negativo (1,29:1), ou seja, gasta-se 1,29
kcal para cada 1 kcal de etanol produzido. O balanço da cana é positivo (1:3,24), assim para
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cada 1 kcal de energia consumida, há um ganho líquido de 2,24 kcal de etanol (Andreoli e de
Souza, 2006).
A cana-de-açúcar é a principal matéria-prima para a produção em escala industrial de
etanol no Brasil, sendo que para cada tonelada são obtidos 80L de caldo. A vasta extensão
territorial brasileira permite que este seja o maior produtor desta cultura. Os 5,5 a 6,5 milhões
de hectares representam algo em torno de 2,5% da área total cultivada no país. Podem ainda
ser agregados a esta cultura mais 80 a 100 milhões de hectares dormentes, sem impactar os
ecossistemas nativos e florestais (Grad, 2006; Andrieta et al., 2007).
O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, seguido por Índia e Austrália.
Em média, nas últimas cinco safras, 52% dessa produção destinou-se às fábricas de etanol
(anidro e hidratado) e 48% às de açúcar (refinado, cristal e demerara). A cultura espalha-se
pelo Centro-Sul e pelo Norte-Nordeste do País, em dois períodos de safra, ocupando 2,4% da
área agricultável do solo brasileiro, perto de 5,5 milhões de hectares (UNICA, 2004).
Quase todas operam com equipamentos fabricados por empresas nacionais de bens de
capital, cuja tecnologia permitiu ao país alcançar rendimento industrial invejável. Se destinada
apenas à fabricação de álcool, cada tonelada de cana-de-açúcar moída resultaria hoje em 89
litros de etanol hidratado ou 85 litros de etanol anidro; direcionada exclusivamente à produção
açucareira, renderia 118 kg de açúcar e 10 litros de álcool do mel residual. Entretanto, em
regime normal de operação de mercado, o rendimento médio nacional para cada tonelada de
cana-de-açúcar moída fornece 71 kg de açúcar, 42 litros de álcool ou 11,5 toneladas de
açúcares totais recuperáveis por hectare de cana-de-açúcar cultivada (UNICA, 2004).
Quando o Proalcoól foi introduzido, a maioria das unidades de fermentação operava
exclusivamente com o caldo de cana. Porém, atualmente todas as unidades produtoras
incorporaram a produção de açúcar, que tem como subproduto o melaço. Este pode alcançar
90
o
Brix, com 60% deste total sendo açúcares redutores. Além dos carboidratos, possui outros
compostos necessários ao metabolismo microbiano (Andrieta et al., 2007). Uma outra
vantagem do melaço é a possibilidade de ser estocado por longos períodos sem depender de
cadeia de frio, devido à baixa atividade de água em função do elevado teor de sólidos
solúveis. Isto permite às unidades processadoras ampliar o seu período de operação.
Leveduras do gênero Saccharomyces são largamente usadas por esta indústria. Este
microrganismos é o mais indicado para este propósito, devido a alguns de seus atributos. A
habilidade de rapidamente converter açúcares em etanol, e tolerância ao produto formado, a
concentração de sais e grandes variações de temperatura, além de sua elevada atividade
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metabólica em meios com pH em torno de 4, conferem as linhagens de Saccharomyces serem
os principais agentes da fermentação alcoólica (Andrieta et al., 2007).
Duas particularidades estão associadas ao processo fermentativo empregado nas
indústrias brasileiras. Primeiro, o caldo não recebe nenhum tratamento para a eliminação da
microbiota natural. E por outro lado, a levedura escolhida para ser utilizada é propagada no
início da safra e reciclada, batelada após batelada ao longo desta (Andrieta et al., 2007). Este
processo de fermentação, comumente utilizado no Brasil, é conhecido como Melle-Boinot. As
células de levedura recuperadas são recirculadas, mantendo elevada a concentração celular, e
obtendo-se, assim, um aumento do rendimento alcoólico devido o menor consumo de açúcar
para multiplicação e crescimento do agente fermentativo (Lopes, 1989). Hoje se tem
conhecimento que a levedura inoculada no início da safra é substituída ao longo dos ciclos
fermentativos por uma levedura selvagem. Essa substituição só foi perceptível com o advento
de técnicas moleculares (Andrieta et al., 2007).
Acredita-se que no Brasil 70% das usinas ainda utilizem o processo em batelada
(Wheals et al., 1999). No auge do Proálcool foram instaladas as primeiras plantas contínuas,
fruto de adaptações de baixo custo e, em sua maioria, mal sucedidas. Este fato continua até os
dias de hoje, a implantação de plantas contínuas (Andrieta et al., 2007).
Capítulo 4
Metodologia experimental
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Metodologia experimental
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4.1 Microrganismo
Para este trabalho o microrganismo utilizado foi a levedura Saccharomyces cerevisiae,
fermento comercial liofilizado para massa salgada, da marca Fermipan.
4.2 Matérias-primas
4.2.1 Melaço
O melaço da cana-de-açúcar comercial, adquirido no mercado popular São Sebastião
(Fortaleza-CE), foi utilizado como fonte de carbono no processo fermentativo.
4.2.2
Líquido da Casca de Coco Verde
O LCCV foi obtido na unidade de beneficiamento instalada no Aterro Sanitário do
Jangurussu, localizado no município de Fortaleza-CE.
4.3 Fluxograma Experimental
Por tratar-se de um material até então desconhecido, e pela dificuldade de trabalhar-se
com um efluente orgânico, a primeira fase deste trabalho foi avaliar o potencial fermentativo
do LCCV através da fermentação natural do líquido. A segunda fase destinou-se à
caracterização química e fisico-química do extrato líquido da casca de coco verde (LCCV) e a
elaboração de um meio sintético a partir do LCCV. A terceira fase, foi avaliar a influência de
taninos iniciais condensados e hidrolisáveis no processo fermentativo. A última fase foi
dividida em três etapas, na qual se avaliou : (i) a influência da quantidade de inóculo no
processo fermentativo, (ii) a influência da fonte de carbono e do uso de LCCV como diluente,
(iii) a influência da temperatura e (iii) da agitação, e finalmente, (iv) o estudo comparativo
entre o LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo (Figura 4.1).
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Metodologia experimental
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Figura 4.1 - Fluxograma experimental.
4.4 Avaliação da fermentação natural do líquido da casca de coco verde
Com o objetivo de avaliar a viabilidade de utilização do extrato da casca de coco verde
em um processo fermentativo foram realizados testes preliminares, entre eles a fermentação
natural do líquido da casca de coco verde em um sistema fechado.
O LCCV utilizado nesta etapa do trabalho foi proveniente da unidade-piloto de
beneficiamento da própria Embrapa/CNPAT, que utiliza, em sua maioria, cocos cedidos pela
empresa Ducoco Alimentos S.A. Após a extração, o líquido foi previamente filtrado em
Fermentação natural do LCCV
Influência da quantidade de inóculo no processo fermentati
vo
Influência da fonte de carbono e do uso de LCCV como diluente no processo fermentativo
Estudo comparativo entre o LCCV
in natura
e LCCV sintético
Influência da agitação no processo fermentativo
Influência da temperatura no processo fermentativo
Fase I
Fase IV
Influência de taninos iniciais condensados e hidrolisáveis no processo fermentativo
Fase III
Caracterização do LCCV
Elaboração do LCCV sintético
Fase II
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Metodologia experimental
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peneira de 0,3 mm de diâmetro de poro, para redução do número de partículas suspensas, e
devidamente distribuído em garrafas de polietileno - PET.
A fermentação natural do LCCV foi realizada em sistema fechado, em garrafas de
PET de 330 mL de volume com 240 mL de líquido (Figura 4.2), hermeticamente fechadas, e
incubadas a 30º C por até 10 dias.
Figura 4.2. Fermentação natural do líquido da casca de coco verde em sistema fechado, em
garrafas de PET.
As amostras foram analisadas a cada 24 horas. Foram avaliadas a produção de etanol,
a concentração de açúcares redutores e açúcares totais, o perfil de pH, a concentração de
fenólicos totais, cor e unidades formadoras de colônias (UFC) de bolores e leveduras. Cada
amostra consistia da remoção aleatória de duas garrafas de PET, sendo o líquido fermentado
centrifugado a 15.000 rpm por 10 minutos. O experimento foi realizado em duplicata.
4.5 Caracterização do líquido da casca de coco verde
As coletas das amostras foram realizadas na Unidade-Piloto de Beneficiamento da
Casca do Coco Verde, localizada no Aterro Sanitário do Jangurussu, atualmente desativado,
em Fortaleza-CE, sob a supervisão do Laboratório Integrado de Águas de Mananciais e
Residuárias - LIAMAR do CEFET- CE. Durante um turno de trabalho, de aproximadamente 3
horas, a cada 20 minutos uma amostra simples era coletada na saída do efluente líquido da
prensa, sendo estas homogeneizadas de forma a se obter amostras compostas. As amostras
foram acondicionadas em isopor refrigerado, e encaminhadas aos respectivos laboratórios para
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Metodologia experimental
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serem analisadas. De forma a garantir a representatividade da caracterização, 3 amostras
compostas foram coletadas em intervalos de aproximadamente 1 mês.
Para caracterização do líquido foram realizadas análises de pH, Condutividade Elétrica,
Amônia Total, Nitrito, Nitrato, Nitrogênio Total, NTK, Fósforo Total, Ortofosfato Solúvel,
Açúcares Redutores e Totais, Fenólicos Totais, Tanino Condensado, Sódio, Potássio, Cálcio,
Magnésio, Fósforo, Enxofre, Cobre, Ferro, Manganês e Zinco, bem como teores de DQO,
DBO e Série de Sólidos. Todas as análises foram realizadas em triplicata.
4.6 Elaboração do LCCV sintético
A proposta de elaborar o LCCV sintético se mostrou a melhor alternativa de se
trabalhar com um efluente orgânico. A caracterização do líquido revelou sua complexidade e
variabilidade. Uma tentativa de controlar essa variabilidade seria trabalhar com um efluente
proveniente de um mesmo processamento, o que obrigaria a se dispor de grandes espaços para
o congelamento do material, uma vez que o LCCV fermenta tanto em temperatura ambiente
quanto sob refrigeração. Não obstante, a aparência do líquido, principalmente a cor, é alterada
mesmo estando congelado, o que denuncia uma alteração física ou química em sua
composição. Levando em conta problemas de logística, transporte e estocagem sob ambiente
refrigerado, e a variabilidade do líquido, o meio sintético proporcionou um maior controle das
variáveis do processo e fácil disponibilidade.
O LCCV foi elaborado a partir de 15 reagentes. Nitrato de sódio, nitrito de sódio,
fosfato de sódio, glicose, sacarose, sulfato de magnésio, cloreto de potássio, sulfato de zinco,
cloreto de cálcio, sulfato de manganês, sulfato de sódio e ácido tânico foram adquiridos da
Vetec. A peptona adquirida da Fluka. Tanino condensado e sulfato ferroso amoniacal foram
adquiridos da Labsynth.
4.7 Avaliação da influência de taninos iniciais condensados e hidrolisáveis
em diferentes concentrações de açúcares
Para avaliar o efeito de polifenóis na fermentação alcoólica, diferentes concentrações
de taninos, condensados e hidrolisáveis, das marcas Labsynth e Vetec, respectivamente, foram
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Metodologia experimental
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avaliadas em um meio à base de sacarose comercial Alteza, utilizando S. cerevisiae como
agente fermentador.
Os testes foram realizados utilizando-se 100mL de meio em erlenmeyers de 500mL.
As concentrações avaliadas foram de 5, 10, 15 e 20 g.L
-1
de taninos condensados ou
hidrolisáveis em 100, 150 e 200 g.L
-1
de sacarose como fonte de carbono e 7,5% de levedura.
Os meios foram incubados a 30º C por 8 horas, sem agitação em incubadora BOD, e
analisados em intervalos regulares. A produção de etanol foi avaliada através da perda de
massa do sistema. O experimento foi realizado em triplicata.
4.8 Fermentação em biorreator de bancada
Após corroborar a viabilidade da presença de taninos na fermentação alcoólica, deu-se
início o estudo do processo fermentativo em um biorreator de bancada. O biorreator
empregado, New Brunswinck Scientific Co., modelo Bioflo 3000, com capacidade nominal
de 14 L, e volume de trabalho de 10 L. A placa superior é provida de orifícios, que permitem
alimentação, inoculação e coleta de amostras, eletrodo de pH e termômetro. Através de um
“display” digital é possível acompanhar e controlar os parâmetros do processo (Figura 4.3).
Figura 4.3. Fermentador de bancada
Os mostos utilizados foram elaborados a partir do melaço da cana-de-açúcar e do
LCCV. O óleo de soja comercial foi utilizado como antiespumante numa concentração de
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0,30%. As fermentações foram conduzidas em regime de batelada simples, com duração de 6
horas. Os meios não foram esterilizados.
4.8.1 Influência da quantidade de inóculo e de açúcares no processo fermentativo
Para conhecer melhor como a fermentação se comportaria, os primeiros parâmetros a
serem estudados no biorreator foram a quantidade de inóculo (5,0 e 7,5% (p/v)) e a
concentração de açúcar inicial (100, 150 e 200 g.L
-1
).
Para elaboração do mosto de fermentação (V
2
= 5000 mL), primeiramente, avaliou-se
a concentração do melaço (diluído aproximadamente 50%). Como a composição do melaço
comercial é muito variável, para se certificar da real concentração de açúcares (C
1
), análises
de açúcares redutores totais (ART) foram realizadas previamente. A partir deste resultado,
através da Equação (2), calculava-se o volume de melaço (V
1
) necessário para alcançar a
concentração de açúcar desejada (C
2
).
C
1
.V
1
= C
2
.V
2
(2)
Conhecido o volume de melaço, levando em conta a massa de levedura e de óleo de
soja, encontrava-se então o volume de água necessário para completar os 5000 mL de meio.
A fermentação foi conduzida a 30°C e 500 rpm durante 6 horas de experimento. Em
intervalos de 30 minutos foram avaliados concentração de etanol e perfil de pH.
4.8.2 Influência da fonte de carbono e do uso de LCCV como diluente no processo
fermentativo
Em uma outra etapa deste trabalho foi avaliado o uso do LCCV sintético como
diluente. A fermentação foi conduzida conforme descrito no item 4.8.1, comparando-o com a
água destilada até então utilizada. Os cálculos da concentração de açúcar inicial para
elaboração do mosto, a partir da diluição melaço, não levaram em conta os açúcares presentes
no LCCV.
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Metodologia experimental
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4.8.3 Influência da agitação no processo fermentativo
Estabelecida as melhores concentrações de inóculo (7,5%) e de açúcar (15%) no
processo fermentativo, estudou-se então diferentes rotações (400 e 500 rpm). O mosto foi
elaborado conforme descrito no item 4.8.1. Em intervalos de 30 minutos foram avaliados
concentração de etanol, consumo de açúcares e perfil de pH durante todo o processo.
4.8.4 Influência da temperatura no processo fermentativo
O último parâmetro a ser estudado foi a temperatura. As temperaturas testadas foram
de 30, 35, 40, 45 e 50°C. O mosto foi elaborado e a fermentação foi conduzida conforme
descrito no item 4.8.1, levando em conta as melhores condições estudadas.
4.8.5 Estudo comparativo entre o LCCV sintético e in natura em condições ótimas
de processo
Estabelecidas as condições ótimas de processo, finalmente realizou-se um estudo
comparativo entre o LCCV sintético e in natura como diluente. O mosto foi elaborado
conforme descrito no item 4.8.1. Nesta etapa, diferentemente das outras, analisou-se a
concentração de etanol, o consumo de açúcar, o perfil de pH, a concentração de biomassa, a
viabilidade celular e a concentração de fenólicos totais durante as 6 horas de processo. Este
experimento foi realizado em triplicata.
4.9 Determinações analíticas
4.9.1 Métodos analíticos empregados na caracterização do LCCV
4.9.1.1 pH
O pH foi determinado potenciometricamente, pHmetro ANALYSER - modelo 300 M,
segundo o Standard Methods for the Examination of Wastewater (APHA et al, 1998).
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Metodologia experimental
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4.9.1.2 Condutividade elétrica
A condutividade elétrica foi determinada instrumentalmente, em condutivímetro
Digimed – modelo DM3, segundo APHA et al (1998).
4. 5.1.3 Série de sólidos
As análises da série de sólidos (sólidos totais, sólidos totais fixos, sólidos totais
voláteis, sólidos suspensos totais, sólidos suspensos fixos, sólidos suspensos voláteis, sólidos
dissolvidos totais) seguiram a recomendação de APHA et al (1998). Esta análise consiste em
determinar a concentração de sólidos presentes no líquido, expressando-os em mg.L
-1
.
4. 9.1.4 Demanda Química de Oxigênio
A análise de DQO – Demanda Química de Oxigênio foi realizada pela técnica de
Digestão por Refluxo Fechado, segundo APHA et al (1998). As amostras foram preparadas da
seguinte maneira: em cada tubo foram adicionados 1,5ml da solução digestora, 2,5ml da
amostra, previamente diluída, e 3,5ml da solução catalisadora de sulfato de prata. Em seguida,
os tubos foram levados ao digestor por a 150°C por 2 horas. Após resfriadas, as amostras
foram transferidas para seus respectivos béqueres contendo 10ml de água ultrapura.
Adicionou-se 1 gota de solução de Ferroína às amostras e as titulou com solução de sulfato
ferroso amoniacal até o aparecimento de uma cor avermelhada. Todas as análises foram
realizadas em triplicata. A partir dos volumes gastos na titulação realizou-se o cálculo de
DQO em mg
O
2
/L.
4. 9.1.5
Demanda Bioquímica de Oxigênio
A Demanda Bioquímica de Oxigênio - DBO é a medida da quantidade de oxigênio
consumido no processo biológico de oxidação da matéria orgânica
.
Esta análise
foi
realizada
através da técnica de Demanda Bioquímica de 5 Dias (DBO
5
) segundo APHA et al (1998).
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Metodologia experimental
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4. 9.1.6 Amônia total
O método consiste na formação da cor amarela obtida quando amostras contendo mais
que 20 µg.L
-1
são tratadas com o reagente de Nessler, após terem sido pré-tratadas com uma
solução de sulfato de zinco, hidróxido de sódio 6N e sal de Rochelle. Alíquotas de 100 mL
das amostras foram adicionadas a erlenmeyers de 250 mL. Foi adicionado 1mL da solução de
Sulfato de Zinco
e em seguida 1mL NaOH 6N. Após a formação de precipitado (15min),
foram retirados 5 mL do sobrenadante e a este foram adicionadas 2 gotas Sal de Rochelle. A
amostra foi aferida em 50 mL com água isenta de amônia. Finalmente, foi adicionado 1 mL
do Reagente de Nessler, e após 10 minutos, para o desenvolvimento da cor, realizou-se leitura
em espectrofotômetro (FEMTO – modelo 660plus) a 450 nm (APHA, et. al., 1998).
4. 9.1.7 Nitrito
Esta análise foi realizada pelo método de espectrofotometria de absorção molecular
pela Técnica da Diazotação Sulfanilamida – NED, segundo APHA et al (1998). O método
permite obter resultados a partir da formação de um corante azóico púrpura avermelhado
produzido em pH entre 2,0 e 2,5 mediante a reação da sulfanilamida com o dicloreto de N-
(1Naftil)-etilenodiamino (NED), que pode ser medido espectrofotometricamente em
comprimento de onde de 543 nm, cuja intensidade é proporcional à sua concentração.
4. 9.1.8 Nitrato
Esta análise foi realizada pelo método de espectrofotometria de absorção molecular
pela Técnica do Salicilato de Sódio, segundo Rodier (1975). O volume de 50 mL da amostra,
devidamente homogeneizada, foi filtrada em membrana de 0,45 µm de poro e o filtrado
armazenado em frasco escuro. Alíquotas de 50 ml do filtrado foram transferidas para cápsulas
de porcelana e 1 mL da solução de salicilato de sódio 0,5% foi adicionado à amostra. As
cápsulas foram levadas ao banho-maria quente (75–80
o
C), até evaporação completa. Após
resfriadas à temperatura ambiente, foram adicionados 2 mL de ácido sulfúrico concentrado à
amostra, deixando-as em repouso durante 10 minutos. Cuidadosamente, acrescentou-se 15 mL
de água destilada e 15 mL de solução alcalina de tartarato duplo de sódio e potássio. Após o
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Metodologia experimental
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30
desenvolvimento da cor, efetuaram-se as leituras de absorbância no espectrofotômetro
(FEMTO – modelo 660 plus) a 420 nm.
4. 9.1.9 Determinação de Nitrogênio
A determinação de nitrogênio, Nitrogênio Orgânico e NTK foi realizada pelo método
espectrofotométrico, através da Digestão e Destilação em Macro-Kjeldahl seguida de
Nesslerização Direta, segundo APHA et al (1998).
4. 9.1.10 Determinação de açúcares redutores
As análises foram feitas pelo método do ácido 3-5-dinitrossalicílico, segundo Instituto
Adolfo Lutz - IAL, 1985. Este método baseia-se na formação de um complexo de cor
castanho-alaranjado, por redução do ácido 3,5-dinitrosalicílico a 3-amino-5-nitrosalicílico
pelos açúcares redutores (Figura 4.4) A concentração desse complexo corado é proporcional à
concentração de açúcares redutores na amostra.
COOH
OH
NO
2
O
2
N
COOH
OH
NH
2
O
2
N
CHO
+
COOH
+
OH
Ácido
3,5-dinitro-salicílico
Açúcar redutor
Ácido
3-amino 5-nitro-salicílico
Ácido aldônico
Figura 4.4 - Conversão do ácido 3,5-dinitro-salicílico a ácido 3-amino-5-nitro-salicílico pela
reação com açúcares redutores.
Num tubo de ensaio adicionou-se 1 ml da solução a analisar (amostra ou padrão
contendo açúcares redutores entre 100 e 1000 mg.L
-1
, valores entre os quais se determinou a
curva de calibração) a 1 mL da solução de DNS. As amostras foram incubadas, durante 5 min,
num banho de água fervendo, resfriadas em água corrente e agitadas no vortex após a adição
de 8 mL de água destilada. Os açúcares redutores foram quantificados por espectrofotômetro
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Metodologia experimental
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(Varian, modelo Cary 50) com comprimento de onda de 540 nm, contra um branco preparado
em condições idênticas, mas utilizando 1mL de água destilada em substituição à amostra.
4. 9.1.11 Determinação de açúcares redutores totais
Para a determinação de açúcares redutores totais adicionou-se a 1mL da amostra 1mL
de HCl 2N e incubou-se em banho-maria termostatizado a 80°C por 30 minutos. Após,
resfriou-se a amostra rapidamente à temperatura ambiente, neutralizou-a com 3 mL de NaOH
1N. O procedimento para a quantificação dos açúcares totais foi o mesmo utilizado para
açúcares redutores acima descritos.
4. 9.1.12 Fenólicos totais
A determinação de fenólicos totais foi realizada segundo o método de Lowry et al
(1947). Este método se baseia na utilização de ácido tânico como padrão numa faixa de
diluição de 10-100 mg.L
-1
e da formação de um complexo de cobre.
4. 9.1.13 Taninos condensados
Para quantificar taninos condensados utilizou-se Butanol:HCl (95:5 v/v) para extração,
segundo o método de Saura et al (1991). Adicionou-se 5 mL da amostra e 40 mL da mistura
extratora (Butanol:HCl) em erlenmeyers de 250 mL e incubou-se em banho-maria
termostatizado a 100°C por 3 horas. as amostras foram resfriadas a temperatura ambiente e
aferidas a 50 mL com a mistura Butanol:HCl. Em tubos de ensaio adicionou-se 1 mL do
extrato a 6 mL de Butanol:HCl e 0,2 mL da solução de sulfato férrico de amônio III (0,5 g de
FeNH
4
(SO
4
)
2
.12H
2
O dissolvidos em 25 mL de HCl 2N). Incubou-se em banho-maria
termostatizado a 100°C por 50 minutos e , após resfriadas em água corrente, realizou-se a
leitura da absorbância em espectrofotômetro (Varian, modelo Cary 50) a 550 nm, contra um
branco preparado em condições idênticas, mas utilizando-se 1mL de água destilada em
substituição à amostra.
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Metodologia experimental
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4. 9.1.14 Digestão nitroperclórica
Transferiu-se 5 mL de amostra do líquido para tubos de digestão, adicionou-se 8 mL
da mistura ácida, composta por ácido nítrico e ácido perclórico na proporção HNO
3
:HClO4
(3:1 v/v), mantendo a frio por 3 a 4 horas. Os tubos foram levados ao bloco digestor, marca
TECNAL (modelo TE007D), e aquecidos lentamente até 120°C, mantidos nesta temperatura
até cessar o desprendimento de fumos castanhos. Elevou-se a temperatura a 200°C e
mantendo esta temperatura até cessar o desprendimento de fumaça branca, levando 3 a 4
horas. Resfriou-se a amostra e completou-se o volume final a 50 mL.
A amostra digerida foi utilizada para determinações de fósforo, potássio, sódio, cálcio,
magnésio, sódio, cobre, ferro, manganês e zinco, conforme descrito por Silva (1999).
4. 9.1.15 Determinação de Fósforo
Transferiu-se 5 mL de cada extrato para frascos de Erlenmeyers de 25 mL, adicionou-
se a solução de molibidato de amônio (10%), adicionou-se uma pitada de ácido ascórbico e
agitou-se. Após 30 minutos fez-se leitura em espectrofotômetro (Femto – modelo 660 plus) a
660 nm, conforme descrito por Silva (1999).
4. 9.1.16 Determinação de Sódio e Potássio
Os extratos nitroperclóricos foram diluídos na proporção de 1:10. Após o fotômetro de
chama ser calibrado com padrões de 0 e 10 mg.L
-1
de K e Na, realizou-se a curva padrão com
padrões intermediários. As leituras dos extratos foram realizadas em fotômetro de chama
marca Digimed - modelo DM-61, segundo Silva (1999).
4. 9.1.17 Determinação de Cálcio e Magnésio
As concentrações de Ca e Mg foram determinadas por espectrofotômetro de absorção
atômica contra curvas específicas para cada íon. Adicionou-se 2 mL do extrato nitroperclórico
previamente diluído em 8 mL de solução de lantânio (10 g.L
-1
). Realizou-se leitura em
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Metodologia experimental
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espectrofotômetro de absorção atômica, de marca Perkin-Elmer (modelo A -Analyst 300), de
acordo com Silva (1999).Os extratos nitroperclóricos foram diluídos na proporção de 1:10.
4. 9.1.18 Determinação de Cobre, Ferro, Manganês e Zinco
A concentração dos íons de metais de transição foi determinada por espectrofotômetro
de absorção atômica, a partir de leituras diretas dos extratos nitroperclóricos, em equipamento
de marca Perkin-Elmer (modelo A-Analyst 300), com chama ar/acetileno. Os comprimentos
de onda utilizados para esses minerais estão de acordo com Silva (1999). As concentrações de
Ca e Mg foram determinadas em espectrofotômetro de absorção atômica.
4. 9.1.19 Determinação de Enxofre
Foram adicionados 1 mL do extrato nitroperclórico e 9 mL de água deionizada em
Erlenmeyers de 50 mL e 1 mL da solução HCl 6N. Foram adicionados, então, cerca de 500
mg de cloreto de bário e após um minuto, agitou-se a amostra por alguns segundos, até
completa dissolução do sal. Realizou-se leitura em espectrofotômetro (Femto – modelo 660
plus) a 420 nm.
4.9.2 Métodos analíticos empregados no processo fermentativo
4.9.2.1 Determinação de açúcares redutores totais
A concentração de açúcares redutores totais foi realizada conforme descrito no item
4.9.1.11.
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Metodologia experimental
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4.9.2.2 Determinação de etanol
Fermentação natural do LCCV em garrafas PET
A produção de etanol foi avaliada através da perda de peso do sistema baseada na
equação de Gay-Lussac, consiste na conversão de açúcar em álcool e dióxido de carbono,
mediante a ação de microrganismos viáveis, com fator estequiométrico igual a 0,511, ou seja,
cada grama de glicose convertida gera 0,511 g de etanol e 0,489 g de CO
2
. Análise de
produção de CO
2
foi realizada através da perda de peso, na qual garrafinhas foram levemente
abertas para liberação do gás, novamente fechadas, agitadas por 5 vezes, e reabertas. Este
procedimento foi padronizado e repetido por três vezes para garantir uma total liberação do
gás produzido e, em seguida, pesadas em balança semi-analítica.
Fermentação em biorreator de bancada
Através de uma balança (Toledo - modelo 2096DD), diretamente acoplada à dorna do
fermentador (Figura 4.5), foi possível controlar todo CO
2
liberado e assim, através da perda
de peso do sistema, estimar a concentração de etanol produzido durante a fermentação.
Figura 4.5 - Sistema de fermentação: balança acoplada à dorna do fermentador.
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Metodologia experimental
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4.9.2.3 Determinação de cor durante a fermentação natural do LCCV
A análise de cor foi realizada em colorímetro Minolta, modelo CR-300, o qual emite
um feixe de luz sobre o material e, em seguida, captura a luz refletida, fornecendo três
variáveis representadas pelas letras L* (cor variando de preto a branco), a* (de verde a
vermelho) e b* (de azul a amarelo), em uma escala compreendida entre 0 a 100 para a
variável “L*” e -60 a +60, para as demais variáveis.
4.9.2.4 Caracterização e quantificação da população fúngica durante o processo
fermentativo natural do LCCV
A contagem de colônias fúngicas, com o objetivo de avaliar o perfil da carga
microbiana durante o processo de fermentação natural do LCCV, foi realizada segundo o
método de plaqueamento por espalhamento (Silva et al, 1997).
Alíquotas da amostra foram inoculadas sob diferentes diluições em meio BDA (0,2%
dextrose, 0,15% ágar, 20% infusão batata). As análises foram realizadas de acordo com a
Figura 4.6, em dias alternados. Esta análise foi realizada em duplicata.
Figura 4.6- Técnica da diluição em série para obtenção de colônias isoladas em placas de Petri
(http://www.iq.unesp.br/flotacao/MODULO2/aula3/aula3.htm).
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Metodologia experimental
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4.9.2.5 Determinação de células viáveis
A concentração de células viáveis e total foi determinada pela contagem em volume
conhecido (0,1 mm
3
) da suspensão previamente diluída, através da técnica de exclusão pela
coloração com azul de metileno (Reagen) 0,1%, em Câmara de Neubauer (Figura 4.7). As
células que permitirem a entrada do corante e tornarem-se azul não apresentarão a membrana
intacta, e serão consideradas não-viáveis, enquanto que as células viáveis liberam uma enzima
que as tornam transparentes. A concentração celular é expressa pelo número de células por
mililitro. Esta metodologia foi empregada durante o estudo em biorreator de bancada.
Figura 4.7 - Contagem de células em Câmara de Neubauer.
4.9.2.6 Determinação de biomassa
Amostras do caldo fermentado foram centrifugadas a 5000 rpm por 10 minutos,
reservando-se o sobrenadante para as outras análises. O precipitado foi lavado duas vezes com
água destilada e centrifugado. A biomassa foi determinada pela medida da densidade óptica
da suspensão celular em 600 nm e convertida em peso seco (g.L
-1
) usando uma curva de
calibração de densidade óptica versus biomassa seca (KWON; KAUL; MATTIASSON,
1996).
4.9.2.7 Determinação de fenólicos totais
A concentração de compostos fenólicos foi realizada conforme descrito no item
4.9.1.12
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Metodologia experimental
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4.9.2.8 Determinação dos parâmetros de fermentação
Velocidade de formação de etanol
A velocidade de formação de etanol calculada de acordo com a Equação(3):
(
)
TempoVolume
PfPo
×
×
−
=
04499,1
etanol de formação de Velocidade
(3)
onde:
Velocidade de formação de etanol (g.L
-1
. h
-1
)
Po = Peso inicial do sistema (g)
Pf = Peso final do sistema (g)
1,04499 = Fator de conversão da massa de CO
2
liberada em massa equivalente de etanol
Volume = Volume do mosto (L)
Tempo de fermentação (h)
Eficiência de conversão em etanol
A eficiência de conversão em etanol foi calculada de acordo com a Equação 4, com
base no rendimento teórico proveniente da equação de Gay-Lussac (51,1 g etanol / 100g
glicose):
(
)
100
511,0
04499,1
×
×
×
−
=
So
PfPo
Ef
(4)
onde:
Ef = Eficiência de conversão (%)
Po = Peso inicial do sistema (g)
Pf = Peso final do sistema (g)
1,04499 = Fator de conversão da massa de CO
2
liberada em massa equivalente de etanol
So = Massa de açúcar inicial
0,511 = Fator de conversão da massa de açúcar (glicose) em massa equivalente de etanol
___________________________________________________________________________
Metodologia experimental
________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
38
4.10 Estudo estatístico
Com o intuito de avaliar a similaridade entre os sistemas LCCV (líquido da casca de
coco verde) in natura e LCCV sintético, ao longo do tempo, foi realizada análise de variância
da regressão linear e quadrática, para todas as características estudadas. As variáveis avaliadas
foram: produção de etanol, concentração de açúcares redutores totais, células viáveis, células
totais, fenóis, pH e biomassa.
A partir dos parâmetros estimados na análise de regressão foram determinadas as
curvas linear (y = a + bx) e quadrática (y = a + bx + cx
2
) para cada característica, dentro de
cada sistema. As curvas (linear ou quadrática) com melhor ajuste aos dados observados foram
escolhidas com base no nível de significância de cada parâmetro e no coeficiente de
determinação (R
2
) das equações. A significância dos parâmetros foi calculada por meio do
teste T, avaliando se o valor do parâmetro diferia ou não de zero. O coeficiente de
determinação das equações foi estimado na própria análise de regressão dos dados
observados.
Por fim, para determinar se as curvas de uma mesma característica são semelhantes ou
não, foi realizado o teste T entre os respectivos parâmetros das equações de cada sistema. Isto
é, se o parâmetro “a” da curva do sistema LCCV in natura diferia do parâmetro “a” da curva
do sistema LCCV sintético, sendo o mesmo procedimento aplicado ao parâmetro “b”, para
equação linear e, também, ao parâmetro “c”, para equação quadrática. Quando pelo menos um
dos parâmetros foi diferente, as curvas foram consideradas distintas.
Capítulo 5
Resultados e discussão
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
40
5.1 Fermentação natural do LCCV em garrafinhas de polietileno
O LCCV quando colocado em recipientes fechados sempre produziu grandes
liberações de gás e odor característico de etanol. Levando em conta que nenhum inóculo ou
fonte de carbono foi adicionado ao LCCV, este demonstrou ser uma matéria-prima altamente
sujeita a alterações microbianas.
Baseado nestas informações, a primeira etapa deste trabalho foi avaliar o potencial
fermentativo do LCCV, através da fermentação natural do líquido. Durante 10 dias de
incubação acompanhou-se a liberação de CO
2
, o consumo de açúcares, o perfil de pH, o perfil
microbiano do líquido, a mudança na coloração e a concentração de fenólicos do meio
fermentativo. Esse potencial pôde ser constatado pelos resultados apresentados nas Figuras
5.1 a 5.7 que evidenciaram o perfil da fermentação.
Através da liberação de CO
2
do meio, estimou-se a concentração de etanol produzida
pelo meio (Figura 5.1). A fermentação natural do LCCV se encerra, praticamente, após 4 dias,
com a produção de aproximadamente 20 g.L
-1
de etanol (Figura 5.1) e com um consumo de
aproximadamente 80% dos açúcares iniciais (Figura 5.2).
0 2 4 6 8 10
0
5
10
15
20
25
Concentração de etanol (g.L
-1
)
Tempo (dia)
Figura 5.1 - Estimativa de etanol durante a fermentação natural do LCCV.
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
41
0 2 4 6 8 10
0
10
20
30
40
50
Concentração de açúcares (g.L
-1
)
Tempo (dia)
Redutores
Totais
Figura 5.2 - Consumo de açúcares redutores e açúcares redutores totais, durante a fermentação
natural do LCCV.
0 2 4 6 8 10
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
pH
Tempo (dia)
Figura 5.3 - Perfil de pH durante a fermentação natural do LCCV.
Para avaliar o perfil microbiano do líquido (Figura 5.4), durante a fermentação natural
do LCCV foi realizado o plaqueamento segundo o método de plaqueamento por espalhamento
(Tabela 5.1). Embora os resultados obtidos sejam limitados quanto às espécies de
microrganismos presentes no LCCV, foi possível observar uma variação do número de
colônias e tipos de bolores e leveduras presentes no líquido durante os dez dias de
fermentação (Figura 5.4). No “Dia 0”, amostra in natura, o grande número de bolores
predomina sobre as leveduras; no “Dia 1”, amostra após 24 horas de fermentação, predomina
a presença de leveduras e a partir do “Dia 2”, amostra após 48 horas de fermentação, há uma
sucessão de populações, os bolores morrem e as leveduras permanecem.
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
42
Figura 5.4 - Placas de Petri utilizadas na avaliação do perfil da carga microbiana durante
processo fermentação natural do LCCV, segundo o método de plaqueamento por
espalhamento: (a) Amostra in natura; (b) amostra após 24 horas de fermentação; (c) amostra
após 48 horas de fermentação; (d) amostra após 240 horas de fermentação.
Segundo Moraes (2001), cada microrganismo responde com a própria personalidade
ao ambiente e é esta personalidade que lhe provê uma seletiva e competitiva vantagem em seu
nicho ecológico. A resposta do microrganismo ao ambiente é por vezes interativa: enquanto
cresce e se reproduz, ou quando se adapta ao ambiente, o microrganismo modifica o próprio
ambiente, como uma conseqüência de suas próprias atividades de crescimento e, em alguns
casos, para melhorar suas vantagens competitivas contra outros microrganismos.
Através da contagem de colônias (UFC) realizada durante o período de fermentação,
foi possível observar que o crescimento microbiano se deu durante os quatro primeiros dias,
verificando-se, a partir de então, um declínio da carga microbiana.
Tabela 5.1 - Contagem de células viáveis durante a fermentação natural do LCCV segundo
(c)
(a)
(b)
(d)
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
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43
método de plaqueamento por espalhamento.
Dias Número de Colônias (UFC/mL)
0 >300.000 – diluição de 10
3
2 340.000
4 1.630.000
6 >300.000 – diluição de 10
3
8 288.000
10 214.000
O acompanhamento da microbiota do LCCV durante sua fermentação natural permitiu
isolar diferentes tipos de leveduras em função do tempo. O isolamento e a identificação de
espécies presentes no LCCV, trabalho que já está sendo desenvolvido, é de grande valia, pois
podem ser identificados tipos ou grupos de leveduras diretamente responsáveis pela
fermentação alcoólica, reduzindo custos e aumentando a eficiência do processo.
A Figura 5.5 ilustra graficamente a mudança dos parâmetros de cor durante a
fermentação natural do LCCV e a Figura 5.2 mostra as garrafas PET durante os 10 dias de
fermentação.
Para o parâmetro L* (luminosidade) observa-se que, de modo geral, permaneceu
constante, indicando que o LCCV não escureceu ou clareou ao longo do tempo. No caso dos
parâmetros a* (contribuição de vermelho a verde) e b* (contribuição de amarelo a azul)
ocorreu uma diminuição desses valores no início, tendendo a se estabilizar ao final do
período, indicando desvanecimento da coloração da solução. Note que os valores de a* e b*
são valores muito pequenos, indicando que a solução é pobre em coloração. De forma geral,
ocorre uma variação intensa da cor nos primeiros dias, que tende a se estabilizar com o tempo.
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
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44
0 2 4 6 8 10
0
10
20
30
40
50
60
Cor (L* a* b*)
Tempo (dia)
L*
a*
b*
Figura 5.5 - Perfil dos parâmetros de cor durante a fermentação natural do LCCV. Os
parâmetros L*, a* e b* correspondem à luminosidade, contribuição de vermelho e
contribuição de amarelo, respectivamente, em uma escala compreendida entre 0 e 100 para
“L” e -60 a +60 para as demais variáveis.
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
45
Figura 5.6 - Fermentação natural do LCCV em garrafinhas de polietileno durante os dez dias
de fermentação.
1
0
3
2
4
5
6
7
8
9
10
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
46
A Figura 5.7 apresenta a concentração de grupos fenólicos totais durante a
fermentação. O consumo de aproximadamente 10% destes compostos durante o processo
sugere que eles tenham sido utilizados como fonte de carbono (Lewis e Starkey, 1969), ou
ainda que tenham sofrido uma oxidação química ou enzimática.
0 2 4 6 8 10
0
2
4
6
8
10
Concentração de fenólicos (g/L)
Tempo (dia)
Figura 5.7 - Concentração de grupos fenólicos totais durante a fermentação natural do LCCV.
5.2 Avaliação da influência de taninos iniciais condensados e hidrolisáveis
em diferentes concentrações de açúcares na fermentação alcoólica
Pesquisas sobre a atividade biológica dos taninos evidenciaram importante ação contra
determinados microrganismos (Scalbert, 1991). Após a caracterização do líquido, a alta
concentração de taninos presentes no LCCV tornou-se uma grande preocupação. Apesar de
várias pesquisas realizadas sob diferentes abordagens com teores de taninos, a associação
destas informações em processos fermentativos é escassa. Com o objetivo de simular o efeito
de polifenóis em fermentação alcoólica, diferentes concentrações de taninos, condensados e
hidrolisáveis, comercialmente disponíveis, foram avaliadas em um meio à base de sacarose,
utilizando S. cerevisiae como agente fermentador.
A Figura 5.8 apresenta a concentração estimada de etanol em meios de fermentação
alcoólica contendo 5, 10, 15 e 20 g.L
-1
de ácido tânico hidrolisável (Figuras 5.8 (a), (b) e (c))
e tanino condensado (Figuras 5.8 (d), (e) e (f)) em 10, 15 e 20% (p/v) de sacarose,
respectivamente.
No sistema contendo 10% de sacarose e na presença e ácido tânico hidrolisável
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
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Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
47
(Figura 5.8-a), o equilíbrio foi alcançado após 3 horas de fermentação nas diferentes
concentrações testadas. No caso da ausência de ácido tânico, este equilíbrio foi alcançado
somente após 5,5 horas de fermentação. Já no sistema com a presença do tanino condensável
(Figura 5.8-d), observou-se que o equilíbrio foi atingido de forma mais lenta, em torno de 6
horas, porém a produção estimada de etanol foi de 50 g.L
-1
, tanto na presença de ácido tânico
hidrolisável ou tanino condensado, sendo que a maior produtividade fora alcançada nos
sistemas contendo 5 g.L
-1
de tanino em todas as condições testadas neste trabalho, atingindo
um valor máximo de (23,46 g.L
-1
.h
-1
) (Anexo 3).
O aumento da concentração de glicose para 15% (Figuras 5.8 - b e 5.8-e) e 20%
(Figuras 5.8-c e 5.8-f) resultou no aumento expressivo de etanol para aproximadamente 75
g.L
-1
e 97 g.L
-1
, respectivamente. Comparando estes resultados com os obtidos por Roukas
(1996), que também utilizou substrato com concentrações iniciais de açúcares próximas às
aqui avaliadas, podemos observar que a fermentação teve um maior rendimento, e também
gerou maior quantidade de produto num menor espaço de tempo.
Nos ensaios onde havia a presença de tanino condensado, concentrações superiores
promoveram uma leve inibição na produção, o que não foi observado na presença de ácido
tânico. Segundo Scalbert (1991), taninos condensados são mais resistentes ao ataque
microbiano que taninos hidrolisáveis.
De forma geral, observou-se que presença de ácido tânico ou tanino condensado não
inibiu a eficiência do processo e que os melhores resultados foram observados quando baixas
concentrações de tanino foram utilizadas (5 e 10 g.L
-1
), em comparação ao experimento
controle.
Os resultados, ao contrário do esperado, mostraram que apesar das concentrações de
taninos já serem consideradas elevadas, pouca ou nenhuma inibição foi observada na
eficiência do processo fermentativo. Em contrapartida, as concentrações mais reduzidas de
taninos chegaram a aumentar a produtividade de álcool durante a fermentação, quando
comparadas ao experimento controle.
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
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48
0 2 4 6 8
0
25
50
75
100
Concentração de etanol (g.L
-1
)
Tempo (h)
Controle
5 g.L
-1
10 g.L
-1
15 g.L
-1
20 g.L
-1
0 2 4 6 8
0
25
50
75
100
Concentração de etanol (g.L
-1
)
Tempo (h)
Controle
5 g.L
-1
10 g.L
-1
15 g.L
-1
20 g.L
-1
0 2 4 6 8
0
25
50
75
100
Concentração de etanol (g.L
-1
)
Tempo (h)
Controle
5 g.L
-1
10 g.L
-1
15 g.L
-1
20 g.L
-1
0 2 4 6 8
0
25
50
75
100
Concentração de etanol (g.L
-1
)
Tempo (h)
Controle
5 g.L
-1
10 g.L
-1
15 g.L
-1
20 g.L
-1
0 2 4 6 8
0
20
40
60
80
100
Concentração de etanol (g.L
-1
)
Tempo (h)
Controle
5 g.L
-1
10 g.L
-1
15 g.L
-1
20 g.L
-1
0 2 4 6 8
0
25
50
75
100
Concentração de etanol (g.L
-1
)
Tempo (h)
Controle
5 g.L
-1
10 g.L
-1
15 g.L
-1
20 g.L
-1
Figura 5.8 - Concentração estimada de etanol nas fermentações contendo 0, 5, 10, 15 e 20 g.L
-
1
de ácido tânico hidrolisável (a, b e c) e tanino condensado (d, e e f) em 100 (a e d), 150 (b e
e) e 200 g.L
-1
(c e f) de sacarose, e incubadas durante 8 horas.
A Figura 5.9 avalia a velocidade de formação de etanol máxima nas diferentes
(a)
(f)
(e)
(b)
(c)
(d)
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Resultados e discussão
________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
49
concentrações de ácido tânico hidrolisável (a) e tanino condensado (b). De forma geral,
observou-se que presença de ácido tânico ou tanino condensado influenciou positivamente na
eficiência do processo e que os melhores resultados foram observados quando baixas
concentrações de taninos (5 e 10 g.L
-1
) foram utilizadas, em comparação ao experimento
controle.
0 5 10 15 20
0
5
10
15
20
25
Velocidade máxima de formação de etanol (g.L
-1
.h
-1
)
Concentração de ácido tânico (g.L
-1
)
100 g.L
-1
150 g.L
-1
200 g.L
-1
0 5 10 15 20
0
5
10
15
20
25
100 g.L
-1
150 g.L
-1
200 g.L
-1
Velocidade máxima de formação de etanol (g.L
-1
.h
-1
)
Concentração de tanino condensado (g.L
-1
)
Figura 5.9 –Velocidade máxima de formação de etanol nas fermentações contendo 0, 5, 10,
15 e 20 g.L
-1
de ácido tânico hidrolisável (a) e tanino condensado (b) em 100, 150 e 200 g.L
-1
de sacarose.
5.3. Caracterização do Líquido da Casca do Coco Verde
Por não possuir informação disponível na literatura, um dos objetivos desta etapa do
trabalho foi caracterizar o líquido da casca de coco verde para melhor avaliar seu potencial na
produção de etanol por processo fermentativo. A Tabela 5.2 apresenta os resultados da
caracterização do LCCV.
Através da Tabela 5.2 é possível observar a complexidade do LCCV. Comparando a
composição do LCCV a meios padrões de cultivo de microrganismos (Anexo 1), como meio
YM e meio Sabouraud (DIFCO, 1998), o LCCV dispõe de todos os nutrientes necessários ao
crescimento microbiano.
Dentre as exigências nutricionais requeridas pelos microrganismos, os elementos
nutritivos mais importantes representam-se pelo carbono, nitrogênio, fosfatos, sais de
(a)
(b)
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Resultados e discussão
________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
50
magnésio, potássio e cálcio. Elementos menores como manganês e cobalto atuam
favoravelmente em suas atividades vitais. (Lima, 2001).
O pH é um dos principais parâmetros que influenciam o meio físico do microrganismo
(Pelzcar et al, 1981). Comparado a parâmetros de fermentação alcoólica, o pH do LCCV,
4,65, encontra-se bem próximo da faixa ótima (4,0 - 4,5), o que explicaria o aumento na
contagem de células de levedura e a acumulação de CO
2
nos recipientes fechados.
A condutividade elétrica (CE) é um parâmetro que está diretamente relacionado à
presença de íons dissolvidos no meio. Cálcio, magnésio, potássio, sódio, ferro, zinco, cobre,
manganês, bem como sulfatos e cloretos, dentre outros presentes no LCCV, são os íons
diretamente responsáveis pelo valor da condutividade. Apesar da CE estar sendo utilizada
para monitorar fermentações láticas, bem como determinar parâmetros cinéticos na produção
de queijos (Paquet et al, 2000), não existem referências de estudos que avaliem o efeito deste
parâmetro em fermentação alcoólica.
A Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO) é o parâmetro mais usual de medição da
poluição orgânica aplicado a águas residuárias. É a quantidade de oxigênio necessária para
oxidar a matéria orgânica por decomposição microbiana aeróbica a uma forma inorgânica
estável (Silva et al., 2003). A DBO no LCCV é da ordem de 70 g.L
-1
, devido ao fato de ela ser
rica em componentes orgânicos, como açúcares (42,67 g.L
-1
), compostos fenólicos (8,08
g. L
-1
) e proteínas (2,97 g.L
-1
). A DBO presente no LCCV, assim como no efluente da silagem
(Loures et al, 2003), é tida como alta, chegando a superar os valores encontrados no esgoto
doméstico. Assim sendo, é considerado um sério poluente caso venha a ser lançado em cursos
d’água.
A Demanda Química de Oxigênio (DQO) é outro parâmetro também utilizado para
medir o conteúdo de matéria orgânica de águas residuárias e define-se como sendo a
quantidade de oxigênio necessária para oxidação da matéria orgânica através de um agente
químico. A DQO é mais alta do que a DBO, em virtude da maior facilidade com que grande
número de compostos podem ser oxidados por via química (Silva et al., 2003). A DQO do
LCCV foi estimada em 81,48 g.L
-1
.
A relação entre os parâmetros de DBO e DQO é uma importante ferramenta na
escolha de processos e operações mais adequados para tratamento de águas residuárias, e
indica quão facilmente o efluente é biodegradável. Segundo Ben e Mc Auliffe (1975), a razão
DBO/DQO igual 0,87 (LCCV) indica que o líquido é facilmente tratado por processo
biológico.
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
51
Tabela 5.2 - Caracterização do Líquido da Casca de Coco Verde.
Parâmetro Concentração Unidade
pH 4,65 -
Condutividade Elétrica 4,91 mS.cm
-1
Sólidos Totais 58,70 g.L
-1
Sólidos Totais Fixos 12,92 g.L
-1
Sólidos Totais Voláteis 45,78 g.L
-1
Sólidos Suspensos Totais 17,97 g.L
-1
Sólidos Suspensos Fixos 0,544 g.L
-1
Sólidos Suspensos Voláteis 17,43 g.L
-1
Sólidos Dissolvidos Totais 40,72 g.L
-1
DQO
(1)
81,48 g.L
-1
DBO
5
(2)
70,72 g.L
-1
Açúcares Redutores 37,22 g.L
-1
Açúcares Redutores Totais 42,67 g.L
-1
Fenólicos Totais 8,08 g.L
-1
Taninos Condensados 2,73 g.L
-1
Nitrogênio Orgânico 475,63 mgN.L
-1
Proteína
(3)
2,97 g.L
-1
Amônia Total 127,4 mgN.L
-1
Nitrito 1,54 mgN.L
-1
Nitrato 28,38 mgN.L
-1
NTK
(4)
561,74 mgN.L
-1
Fósforo Total 144,23 mg.L
-1
Ortofosfato Solúvel 28,34 mg.L
-1
Potássio 4.245,00 mg.L
-1
Sódio 900,00 mg.L
-1
Magnésio 471,42 mg.L
-1
Cálcio 226,92 mg.L
-1
Fósforo 306,45 mg.L
-1
Enxofre 111,52 mg.L
-1
Ferro 67,23 mg.L
-1
Zinco 10,52 mg.L
-1
Manganês 1,6 mg.L
-1
Cobre N.D.
(5)
mg.L
-1
(1)
DQO – Demanda química de oxigênio;
(2)
DBO5 – Demanda bioquímica de oxigênio;
(3)
Proteínas -
determinada através da concentração de nitrogênio orgânico utilizando-se o fator de conversão 6,25 (AOAC,
1990);
(4)
NTK – Nitrogênio Total Kjeldahl – medida de nitrogênio orgânico e amoniacal total no efluente;
(5)
N.D. – Não Detectado.
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
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Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
52
Levando-se em conta que a legislação brasileira estipula que os valores da DBO e
DQO sejam, no máximo, 60 e 90 mg.L
-1
, respectivamente, para os esgotos e dejetos lançados
em cursos de água ou rios (COPAM, 1986; FEAM, 1998), este efluente oferece grande poder
poluidor.
Segundo Torija et al., 2003, sais de amônio são excelentes fontes de nitrogênio para a
S. cerevisiae e são amplamente empregados, tanto na Europa quanto nos Estados Unidos, na
forma de sulfato ou fosfato de amônio, para produção de vinho. De acordo com estes dados, o
LCCV demonstra ser capaz de suprir a demanda de nitrogênio necessária ao crescimento
microbiano.
Apesar das propriedades antimicrobianas dos taninos, muitos fungos, bactérias e
leveduras são bastante resistentes e conseguem crescer e se desenvolver em presença deles
(Deschamps, 1989 apud Bhat et al, 1998).
Concentrações de nitrogênio amoniacal maiores que 30 mg.L
-1
não são recomendadas
para a irrigação (Ayres e Westcot, 1991 apud Sousa et al, 2005). A concentração de 127,4 mg
N.L
-1
de amônia total no LCCV demonstra que a aplicação deste líquido na irrigação é
inexeqüível.
Os açúcares presentes no LCCV, em torno de 45 g.L
-1
, é um dos fatores que valida a
aplicação do líquido em processos fermentativos, aumentando o rendimento do processo, sem
custo adicional.
Segundo Takeshige et al. (1994), magnésio forma um complexo com ATP e serve
como substrato para várias enzimas pela via glicolítica. Quando magnésio estava ausente,
uma leve produção de etanol foi observada, e a adição de Mg retomou a fermentação, e
nenhum efeito inibitório foi observado na presença de 24,31 mg.L
-1
de magnésio.
Na tentativa de diminuir custos de processo, têm-se utilizado resíduos industriais
como componente do meio de cultivo para microrganismos. Estudos de aplicação da
manipueira, resíduo líquido resultante do processo de fabricação da farinha da mandioca,
como substrato para síntese de ácido cítrico, têm sido realizados, visto que esta apresenta
características físico-químicas favoráveis ao crescimento do fungo Aspergillus niger, com alto
potencial de rendimento na conversão (Leonel e Cereda, 1995). A manipueira (Anexo 2),
assim como o LCCV, contém minerais como nitrogênio, carbono, fósforo, potássio, cálcio,
enxofre, zinco, manganês, cobre, enxofre, ferro e sódio (Ribas e Barana, 2003).
Comparando estes resultados com os estudos realizados por Sousa (2005), que
investigou os parâmetros do esgoto doméstico bruto afluente da Estação de Tratamento
Biológico de Esgotos da Companhia de Águas e Esgotos do Estado da Paraíba (CAGEPA),
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
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Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
53
Campina Grande/PB, todos os parâmetros do LCCV estão muito acima dos parâmetros
encontrados no esgoto doméstico.
Assim como o processo de beneficiamento da casca do coco verde, os processos
têxteis são grandes geradores de efluentes volumosos e complexos, com elevada carga
orgânica, aliado ao elevado teor de sais orgânicos (Cegarra, 2000).
5.4 Elaboração do LCCV sintético
A caracterização do líquido revelou sua complexidade e variabilidade. A proposta de
elaborar o LCCV sintético se mostrou a melhor alternativa de se trabalhar com um efluente
orgânico. De acordo com a caracterização do LCCV (Tabela 5.3), levando em conta os
parâmetros que pudessem vir a interferir no processo fermentativo, foi elaborado um meio
sintético, composto por 15 reagentes.
Tabela 5.3 - Composição do LCCV sintético.
COMPOSIÇÃO DO LCCV SINTÉTICO Concentração
Unidade
Glicose 40,0 g.L
-1
Sacarose 5,0 g.L
-1
Peptona 20,0 g.L
-1
Tanino condensado 3,0 g.L
-1
Ácido tânico 5,0 g.L
-1
Fosfato de sódio dibásico 1,3 g.L
-1
Sulfato de magnésio heptahidratado 3,5 g.L
-1
Sulfato de sódio 1,5 g.L
-1
Cloreto de potássio 7,5 g.L
-1
Cloreto de cálcio 800,0 mg.L
-1
Sulfato ferroso amoniacal 500,0 mg.L
-1
Nitrato de Sódio 50,0 mg.L
-1
Sulfato de zinco 15,0 mg.L
-1
Sulfato de manganês 5,0 mg.L
-1
Nitrito de sódio 3,0 mg.L
-1
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
54
5.5 Influência da quantidade de inóculo no processo fermentativo
Após evidenciar o potencial fermentativo do líquido da casca de coco verde, foi
realizada uma caracterização detalhada do efluente e avaliar a influência dos taninos em
fermentação, deu-se início o estudo dos parâmetros da fermentação, agora em um biorreator
de bancada, empregando o melaço da cana-de-açúcar como fonte da carbono.
Esta etapa teve início com o estudo de diferentes concentrações de inóculo (5,0 e
7,5%) e diferentes concentrações de açúcar inicial (100, 150 e 200 g.L
-1
). As Figuras 5.10,
5.11 e 5.12 apresentam a concentração de etanol, a eficiência de conversão e a velocidade de
formação de etanol no processo, respectivamente.
Nos sistemas contendo 5% de levedura (Figura 5.10-a), para as diferentes
concentrações de açúcar (100, 150 e 200 g.L
-1
), é possível observar uma diminuição do etanol
produzido, em relação aos sistemas contendo 7,5% de levedura (Figura 5.10-b).
No sistema contendo 200 g.L
-1
de açúcar e 7,5% de levedura (Figura 5.10-b)
observou-se uma expressiva produção de etanol, alcançando a marca de 100 g.L
-1
após 6
horas de processo.
O pH do meio, em ambos os sistemas, é descendente até duas horas de fermentação, e
se estabiliza em torno de 4,4. Este comportamento está de acordo com os relatos de Starzak
(1994), que em seus estudos observou uma sistemática diminuição nos níveis de pH no
decorrer da fermentação, indicando que a formação do íon hidrogênio estava associada ao
crescimento microbiano.
0 1 2 3 4 5 6
0
25
50
75
100
Concentração de etanol (g.L
-1
)
Tempo (h)
100 g.L
-1
150 g.L
-1
200 g.L
-1
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
pH
0 1 2 3 4 5 6
0
25
50
75
100
pH
Concentração de etanol (g.L
-1
)
Tempo (h)
100g.L
-1
150g.L
-1
200g.L
-1
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
Figura 5.10 – Produção de etanol e perfil de pH nas fermentações inoculadas com 5,0 (a) e
7,5% (b) de levedura, em diferentes concentrações de açúcar inicial. Temperatura: 30°C e
agitação de 500 rpm.
A Figura 5.11 apresenta a eficiência da produção de etanol nos sistemas contendo 5,0
(a) (b)
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
55
e 7,5% de levedura nas diferentes concentrações de açúcar inicial (100, 150 e 200 g.L
-1
). Em
todos os sistemas é possível observar que o aumento da concentração de açúcares inicial
reduz a eficiência do processo.
0 1 2 3 4 5 6
0
20
40
60
80
100
Eficiência (%)
Tempo (h)
100 g.L
-1
150 g.L
-1
200 g.L
-1
0 1 2 3 4 5 6
0
20
40
60
80
100
Eficiência (%)
Tempo(h)
100 g.L
-1
150 g.L
-1
200 g.L
-1
Figura 5.11 – Eficiência conversão em etanol nas fermentações inoculadas com 5,0 (a) e 7,5%
(b) de levedura, em diferentes concentrações de açúcar inicial. Temperatura: 30°C e agitação
de 500 rpm.
A Figura 5.12 apresenta a produtividade de etanol nos sistemas contendo 5% (a) e
7,5% (b) de levedura, em diferentes concentrações de açúcares (100 150 e 200 g.L
-1
). A
produtividade nos sistemas contendo 7,5% de levedura é superior aos sistemas contendo
5,0%, devido a maior quantidade de biocatalisador presente.
0 1 2 3 4 5 6
0
5
10
15
20
25
30
Velocidade de formação de etanol (g.L
-1
.h
-1
)
Tempo (h)
100 g.L
-1
150 g.L
-1
200 g.L
-1
0 1 2 3 4 5 6
0
5
10
15
20
25
30
Velocidade de formação de etanol (g.L
-1
.h
-1
)
Tempo (h)
100 g.L
-1
150 g.L
-1
200 g.L
-1
Figura 5.12 – Velocidade de formação de etanol no processo nas fermentações inoculadas
com 5,0 (a) e 7,5% (b) de levedura, em diferentes concentrações de açúcar inicial.
Temperatura: 30°C e agitação de 500 rpm.
Apesar de o sistema contendo 7,5% de levedura e 100 g.L
-1
de açúcar apresentar
(b)
(a)
(a)
(b)
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
56
melhor velocidade de formação e eficiência de conversão (25 g.L
-1
.h
-1
e 95%,
respectivamente), levando em conta rendimento de processo e custos operacionais, trabalhar
com um sistema contendo maiores concentrações de açúcar (150 g.L
-1
) torna o processo mais
viável, tendo em vista que este alcança a mesma eficiência em quatro horas de processo.
Através deste estudo, fixou-se 7,5% de levedura como a melhor concentração.
5.6 Influência da fonte de carbono e do uso de LCCV como diluente no
processo fermentativo
Apesar da etapa anterior já ter avaliado a influência de da concentração de açúcares
iniciais na eficiência do processo, por se trabalhar com LCCV como diluente, fez-se
necessário um novo estudo da concentração de açúcares, tendo em vista que a presença dos
açúcares provenientes do LCCV poderia alterar esse resultado. Esta é a primeira vez em que o
LCCV é empregado como diluente.
A Figura 5.13 (a) e (b) apresenta a estimativa de produção de etanol e o perfil de pH
em meios diluídos com água e LCCV sintético, respectivamente. Os gráficos mostram que a
utilização de LCCV como diluente (b), em substituição à água (a), em meios contendo 100 e
150 g.L
-1
de açúcar, aumentou a produção de etanol. No entanto, no sistema contendo 200
g.L
-1
, apesar da maior concentração de açúcar, a produção de etanol foi similar ao sistema
contendo 150 g.L
-1
. Alguns fatores podem explicar estes resultados. Quando o LCCV foi
utilizado como diluente, os açúcares presentes no mesmo não foram levados em conta durante
o cálculo do volume de melaço necessário para obtenção da concentração de açúcar a ser
estudada. Ou seja, nos sistemas onde se empregou LCCV como diluente, “150 g.L
-1
”, por
exemplo, na prática continha mais açúcares que 150 g.L
-1
. Portanto, no sistema contendo 200
g.L
-1
e utilizando LCCV como diluente, a elevada concentração de açúcares pode ter inibido a
produção de etanol. Segundo Zayed (1997), em concentrações de açúcares acima de 250 g.L
-1
o rendimento de etanol começa a declinar devido ao fenômeno osmótico no qual a plasmólise
da levedura começa a ocorrer. Um outro fator que deve ser levado em conta é a concentração
de sais presentes no meio. Para elaboração de mostos com diferentes concentrações de
açúcares, foram utilizados diferentes volumes de melaço. Isso implica em diferentes volumes
de LCCV necessários para diluir o mosto e alcançar os 5000 mL de volume de trabalho.
Partindo desta prerrogativa, quanto maior a concentração de açúcar do mosto, menor a
concentração de sais no meio. De acordo com os resultados, quantidades intermediárias de
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
57
sais, ou seja, 150 g.L
-1
foi o melhor sistema.
Os gráficos da Figura 5.13 (a) e (b) apresentam também o perfil de pH, onde ocorre
uma diminuição sistemática do mesmo, tendendo a se estabilizar após 2 horas de processo.
0 1 2 3 4 5 6
0
25
50
75
100
pH
Concentração de etanol (g.L
-1
)
Tempo (h)
100g.L
-1
150g.L
-1
200g.L
-1
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
0 1 2 3 4 5 6
0
25
50
75
100
pH
Concentração de etanol (g.L
-1
)
Tempo (h)
100 g.L
-1
150 g.L
-1
200 g.L
-1
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
Figura 5.13 - Concentração de etanol e perfil de pH em meios contendo 7,5% de levedura, em
diferentes concentrações de açúcar e diluídos em água (a) e LCCV sintético (b),
respectivamente. Temperatura: 30°C e agitação 500 rpm.
Para a obtenção da eficiência do processo nos meios utilizando LCCV como diluente,
(Figura 5.14-b) foram levados em conta os açúcares presentes no melaço e no LCCV. Estes
gráficos são os que melhor evidenciam o efeito do LCCV na fermentação. Em todos os
sistemas (Figura 5.14 – (a) e (b)) o aumento da concentração de açúcares reduz a eficiência do
processo. O meio contendo 150 g.L
-1
de açúcar e LCCV como diluente se destaca, alcançando
aproximadamente 98% de eficiência após 6 horas de processo.
(a)
(b)
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
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58
0 1 2 3 4 5 6
0
20
40
60
80
100
Eficiência (%)
Tempo(h)
100 g.L
-1
150 g.L
-1
200 g.L
-1
0 1 2 3 4 5 6
0
20
40
60
80
100
Eficiência (%)
Tempo (h)
100 g.L
-1
150 g.L
-1
200 g.L
-1
Figura 5.14 - Eficiência de conversão do processo na produção de etanol em meios contendo
7,5% de levedura, em diferentes concentrações de açúcar, diluídos em água (a) e LCCV
sintético (b), respectivamente. Temperatura 30°C e agitação de 500 rpm.
A Figura 5.15 apresenta a velocidade de formação de etanol nos sistemas de
fermentação utilizando água (a) e LCCV (b) como diluente. Apesar da maior produção de
etanol em meios diluídos com LCCV, como apresentados anteriormente, através dos gráficos é
possível observar que a presença do LCCV promove uma leve redução da velocidade de
formação de etanol, no início do processo, comparado aos meios diluídos com água, em ambas
as concentrações de açúcares. No entanto, a presença de LCCV consegue sustentar a
produtividade por um maior espaço de tempo.
0 1 2 3 4 5 6
0
5
10
15
20
25
30
Velocidade de formação de etanol (g.L
-1
.h
-1
)
Tempo (h)
100 g.L
-1
150 g.L
-1
200 g.L
-1
0 1 2 3 4 5 6
0
5
10
15
20
25
30
Velocidade de formação de etanol (g.L
-1
.h
-1
)
Tempo(h)
100 g.L
-1
150 g.L
-1
200 g.L
-1
Figura 5.15 – Velocidade de formação de etanol em meios contendo 7,5% de levedura, em
diferentes concentrações de açúcar, diluídos em água (a) e LCCV sintético (b),
respectivamente. Temperatura a 30°C e agitação de 500 rpm.
(a)
(b)
(a)
(b)
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
59
Para as etapas subseqüentes fixou-se 7,5% de levedura e 150 g.L
-1
de sacarose,
utilizando LCCV como diluente, e foram estudadas duas agitações e diferentes temperaturas.
5.7 Influência da agitação no processo fermentativo
Até encontrar um antiespumante que conseguisse controlar o processo, a agitação que
melhor conseguiu amenizar as intensas espumas geradas na fermentação foi de 500rpm, daí a
justificativa de se trabalhar com esta agitação. De forma a averiguar se a agitação até então
empregada era a mais adequada, estudou-se a influência de duas rotações (500 e 400 rpm).
A Figura 5.16 apresenta o consumo de açúcares (a) e as concentrações de etanol (b)
durante o processo fermentativo em diferentes agitações. Como é possível observar, de
maneira geral, não há uma variação significativa entre os sistemas avaliados. No entanto, se
avaliarmos o experimento de forma qualitativa, através do perfil das curvas, o sistema
submetido a 500 rpm é o que mais se destaca. Como a concentração de etanol é estimada
através da perda de peso do sistema, esta ocilação na concentração de etanol é proveniente da
variação do peso do sistema. Durante os experimentos foi observado que a rotação de 400
rpm não conseguiu quebrar de forma efetiva a espuma gerada, mantendo o meio
extremamente gaseificado, interferindo diretamente no peso do sistema e, conseqüentemente,
na estimativa da produção de etanol.
0 1 2 3 4 5 6
0
50
100
150
200
Concentração de açúcares (g.L
-1
)
Tempo (h)
500 rpm
400 rpm
0 1 2 3 4 5 6
0
25
50
75
100
Concentração de etanol (g.L
-1
)
Tempo (h)
500 rpm
400 rpm
Figura 5.16 – Consumo de açúcares (a) e concentração de etanol (b) no processo fermentativo
em sistemas submetidos a diferentes agitações.
(a)
(b)
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
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60
0 1 2 3 4 5 6
0
25
50
75
100
Eficiência (%)
Tempo (h)
500 rpm
400 rpm
0 1 2 3 4 5 6
0
5
10
15
20
25
30
Velocidade de formação de etanol (g.L
-1
.h
-1
)
Tempo (h)
500 rpm
400 rpm
Figura 5.17 - Eficiência do processo (a) e velocidade de formação de etanol (b) no processo
fermentativo em sistemas submetidos a diferentes agitações.
Desta forma, os gráficos de eficiência de conversão e velocidade de formação de
etanol (Figura 5.17 (a) e (b)) reiteram que a agitação de 500 rpm foi adequada à fermentação.
5.8 Influência da temperatura no processo fermentativo
Após estabelecer as melhores condições de trabalho até então estudadas, 150 g.L
-1
de
açúcar, 7,5% de levedura e 500 rpm de agitação, estudou-se, então, processos submetidos a
diferentes temperaturas (30, 35, 40, 45 e 50°C).
As Figuras 5.18 e 5.19 apresentam o estudo das diferentes temperaturas. Como já foi
mencionado anteriormente, existe uma grande preocupação em reduzir os custos de produção
industrial de etanol por via fermentativa. E para alcançar este objetivo é muito importante o
desenvolvimento de processos que suportem altas temperaturas com altas concentrações de
melaço (Morimura et al., 1997).
Através da Figura 5.18 é possível observar que a melhor faixa de temperatura para
produção de etanol se manteve entre 35 e 40°C, onde o término da fermentação ocorre
aproximadamente após 4 horas de processo. Em temperaturas mais elevadas (45 e 50°C) a
concentração de açúcar residual nestes sistemas é relativamente alta. Segundo estudos
realizados por Prince et al. (1982), a hidrólise da sacarose numa taxa muito maior que a
utilização de açúcares, promoveria o acúmulo de glicose residual no final da fermentação.
(a) (b)
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
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61
0 1 2 3 4 5 6
0
50
100
150
200
Concentração de açúcares (g.L
-1
)
Tempo (h)
30°C
35°C
40°C
45°C
50°C
0 1 2 3 4 5 6
0
25
50
75
100
Concentração de etanol (g.L
-1
)
Tempo (h)
30°C
35°C
40°C
45°C
50°C
Figura 5.18 - Concentração de açúcares (a) e de etanol (b) no processo em sistemas
submetidos a diferentes temperaturas.
A partir da Figura 5.19 é possível observar que nas temperaturas 30 e 50°C, houve
uma diminuição tanto na produtividade quanto na eficiência do processo.
0 1 2 3 4 5 6
0
20
40
60
80
100
Eficiência (%)
Tempo (h)
30°C
35°C
40°C
45°C
50°C
0 1 2 3 4 5 6
0
10
20
30
40
Velocidade de formação de etanol (g.L
-1
.h
-1
)
Tempo (h)
30°C
35°C
40°C
45°C
50°C
Figura 5.19 - Eficiência de conversão e velocidade de formção de etanol no processo em
sistemas submetidos a diferentes temperaturas.
Após o estudo dos diversos parâmetros fermentativos, estabeleceu-se que a melhor
condição para produção de etanol encontrava-se em meios contendo 7,5% de levedura e 150
g.L
-1
de açúcar, e submetidos a 500 rpm e 40°C.
(b)
(a)
(a) (b)
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
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62
5.9 Estudo comparativo entre o LCCV in natura e o LCCV sintético
Estabelecidos os parâmetros de fermentação, realizou-se, então, um estudo
comparativo entre o LCCV in natura e o LCCV sintético (Figura 5.20), nas condições ótimas
de processo.
Figura 5.20 - Estudo comparativo entre o LCCV in natura (a) e sintético (b) nas condições
ótimas de processo: 150 g.L
-1
de açúcar, 7,5% de levedura, 500 rpm e 40°C.
Para o sistema LCCV in natura, a análise de variância da regressão linear foi
significativa para produção de etanol, concentração de açúcares e células viáveis, e a
regressão quadrática significativa para concentração de etanol, concentração de açúcares e
pH. Para o LCCV sintético, a análise de variância da regressão linear foi significativa para
concentração de etanol, concentração de açúcares, células viáveis e biomassa, e a regressão
quadrática significativa para concentração de etanol, concentração de açúcares e pH. A
distribuição espacial (gráfica) dos dados observados e as curvas e equações estimadas para
cada característica são apresentadas nos Anexos 4 a 10.
Apenas as características concentração de etanol e concentração de açúcar
apresentaram significância na regressão linear e quadrática para os dois sistemas LCCV.
Nestes casos, a curva com melhor ajuste foi escolhida com base no coeficiente de
determinação (R
2
) e nos valores estimados e na significância dos parâmetros das equações
linear e quadrática de cada característica, para cada sistema (Anexo 12). De modo geral, os
(a) (b)
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
63
coeficientes de determinação estimados nas análises de regressão, que foram significativas,
variaram de razoáveis (54,18%) a excelentes bons (99,78%).
Pode-se observar, também, que não houve regressão, de qualquer natureza, para as
características células totais e fenóis, ou seja, não existe um modelo que explique o
comportamento destas variáveis, ao longo do tempo observado.
A avaliação da semelhança entre as curvas de cada sistema, para uma mesma
característica, encontra-se no Anexo 13.
5.9.1 Concentração de açúcar
A Figura 5.21 apresenta o desvio-padrão entre a média dos experimentos realizados,
empregando LCCV in natura e sintético como diluente. O desvio-padrão inicial pode ser
justificado pela concentração de açúcares presentes no melaço empregado. Um melaço mais
concentrado requer um maior volume de diluente, para atingir a concentração de açúcar a ser
estudada. Como os açúcares também estão presentes no LCCV, isto resulta em pequenas
variações na concentração inicial de açúcar, que se estendem ao longo do processo e tendem a
minimizar-se ao término da fermentação. Nos dois sistemas, o açúcar presente no meio é
completamente consumido, com uma produção de etanol de aproximadamente 95 g.L
-1
em
apenas 4 horas de processo.
A característica do parâmetro concentração de açúcares apresentou maiores valores
de R
2
na equação quadrática (Anexo 4). Entre as curvas do LCCV in natura e LCCV
sintético não foi observada diferença, pois os respectivos parâmetros das equações
quadráticas não apresentaram diferenças significativas entre si.
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
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64
0 1 2 3 4 5 6
0
50
100
150
200
Concentração de açúcares (g.L
-1
)
Tempo (h)
LCCV in natura
LCCV sintético
Figura 5.21 – Concentração de açúcares da fermentação, durante o estudo comparativo entre
LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo. Desvio-padrão da triplicata de
cada diluente.
5.9.2 Concentração de etanol
A Figura 5.22 apresenta a produção de etanol e o desvio-padrão para cada intervalo de
tempo, durante o estudo comparativo entre os diluentes.
Para a característica produção de etanol os mais altos valores de R
2
foram obtidos na
equação quadrática, e o parâmetro “a”, que retrata o instante inicial da observação, foi
diferente de zero, não sendo coerente com os dados observados. Portanto, a curva que melhor
descreve os dados é a quadrática para ambos os sistemas (Anexo 5).
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
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65
0 1 2 3 4 5 6
0
20
40
60
80
100
120
LCCV in natura
LCCV sintético
Concentração de etanol (g.L
-1
)
Tempo (h)
Figura 5.22 - Concentração de etanol na fermentação, durante o estudo comparativo entre
LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo. Desvio-padrão da triplicata de
cada diluente.
5.9.3 pH
Na Figura 5.23 apresenta o perfil médio do pH entre o LCCV in natura e sintético.
Em ambos os sistemas, na primeira hora de processo há um redução do pH, no entanto, após
três horas de processo, possivelmente, a levedura morta sofre uma lise celular, sendo esse
material substrato protéico das leveduras ativas (Andrietta, 2006), elevando o pH do meio.
Embora tenha apresentado valores de R
2
mais baixos do que produção de etanol e
concentração de açúcares, a parâmetro pH se comportou de modo semelhante a esta (Anexo
6), pois o melhor ajuste foi o da regressão quadrática para ambos os sistemas e, não houve
diferença significativa entre os respectivos parâmetros.
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
66
0 1 2 3 4 5 6
3,6
3,8
4,0
4,2
4,4
4,6
4,8
5,0
5,2
5,4
LCCV in natura
LCCV sintético
pH
Tempo (h)
Figura 5.23 - Perfil de pH da fermentação, durante o estudo comparativo entre LCCV in
natura e sintético, nas condições ótimas de processo. Desvio-padrão da triplicata de cada
diluente.
5.9.4 Células viáveis e totais
A Figura 5.24 apresenta a contagem de células viáveis e totais do meio fermentativo.
A considerável diferença nos valores do coeficiente de determinação do sistema in natura
para o sintético refletiu na baixa significância do coeficiente angular (b) da equação do
sistema LCCV sintético e, consequentemente, na diferença com o parâmetro (b) da curva
do sistema LCCV in natura (Anexo 7). A diferença entre os coeficientes angulares revela a
divergência entre as curvas e, consequentemente, entre os sistemas empregados. Estes
resultados são coerentes se levarmos em conta a elevada carga microbiana presente no
LCCV in natura.
Em relação ao parâmetro “células totais”, devido à dispersão dos dados, em ambos
os sistemas, não foi possível ajustar um modelo que descrevesse uma associação do
comportamento das células totais no processo fermentativo, em função do tempo (Anexo 8).
Mais uma vez, a carga microbiana do LCCV in natura interferiu nestes resultados.
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
67
0 1 2 3 4 5 6
0,00
2,00x10
5
4,00x10
5
6,00x10
5
8,00x10
5
1,00x10
6
1,20x10
6
LCCV in natura
LCCV sintético
Concentração de células (células/mL)
Tempo (h)
Figura 5.24 – Concentração de células viáveis e totais durante o estudo comparativo entre
LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo. Desvio-padrão da triplicata de
cada diluente.
5.9.5 Biomassa
A Figura 5.25 apresenta a concentração de biomassa no meio fermentativo. Não
houve regressão significativa para o sistema LCCV in natura. Por outro lado, no sistema
contendo LCCV sintético, a regressão linear (equação do 1º grau) foi significativa,.
Portanto, o comportamento da característica biomassa em função do tempo é diferente, para
ambos os sistemas. Esta divergência entre o os sistemas é esperada, porque a presença de
biomassa proveniente do meio natural interfere nos resultados (Anexo 9).
0 1 2 3 4 5 6
0
20
40
60
80
100
120
Biomassa (g.L
-1
)
Tempo (h)
LCCV in natura
LCCV sintético
Figura 5.25 – Concentração de biomassa da fermentação, durante o estudo comparativo entre
LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo.
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
68
5.9.6 Fenólicos totais
A Figura 5.26 apresenta a concentração de compostos fenólicos presentes no meio
fermentativo. Por não haver alteração da concentração com o tempo, não houve qualquer
ajuste de equações, para ambos os sistemas (Anexo 10). E por esta razão, embora não tenha
regressão, podemos inferir que existe semelhança em entre os dois sistemas.
0 1 2 3 4 5 6
0
2
4
6
8
10
12
LCCV in natura
LCCV sintético
Fenólicos totais (g.L
-1
)
Tempo (h)
Figura 5.26 – Concentração de fenólicos totais da fermentação, durante o estudo comparativo
entre LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo. Desvio-padrão da
triplicata de cada diluente.
5.9.7 Parâmetros cinéticos
A Figura 5.27 apresenta os parâmetros cinéticos dos processos fermentativos
referentes ao estudo comparativo entre o LCCV in natura e o LCCV sintético. Os coeficientes
de rendimento em etanol (Y
P/S
) (Figura 5.27-a), expressos em grama de etanol por grama de
açúcar consumido, em meios diluídos com LCCV in natura e sintético, foram de
aproximadamente 16 e 12 g/g, respectivamente. É interessante apresentar que, apesar da
similaridade entre os sistemas, o meio sintético subestima a capacidade do LCCV in natura.
A Figura 5.27-b apresenta a eficiência de conversão de etanol. Em ambos os sistemas
a eficiência de conversão de 100% é alcançada após 5 horas de processo. A produtividade de
etanol (Figura 27-c) foi máxima após 1 hora de processo, atingindo 35,17 e 36,62 g.L
-1
.h
-1
em
meios diluídos com LCCV in natura e sintético, respectivamente.
___________________________________________________________________________
Resultados e discussão
________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
69
0 1 2 3 4 5 6
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Y
(P/S)
Tempo (h)
LCCV in natura
LCCV sintético
0 1 2 3 4 5 6
0
20
40
60
80
100
Eficiência %
Tempo (h)
LCCV in natura
LCCV sintético
0 1 2 3 4 5 6
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Velocidade de formação de etanol (g.L
-1
.h
-1
)
Tempo (h)
LCCV in natura
LCCV sintético
Figura 5.27 – Parâmetros cinéticos dos processos fermentativos: (a) coeficiente de rendimento
em etanol (g etanol/g açúcar consumido); (b) eficiência de produção de etanol (%) e (c) e
velocidade de formação de etanol (g.L
-1
.h
-1
).
(a)
(b)
(c)
Capítulo 6
Conclusões
___________________________________________________________________________
Conclusões
________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, maio/2005
71
A fermentação natural do LCCV demonstrou o poder fermentativo do líquido, sua
capacidade de sustentar uma fermentação alcoólica e, em condições sem aeração, ser um meio
seletivo para leveduras.
A caracterização do LCCV demonstrou a complexidade e variabilidade do líquido. A
riqueza de sais minerais presentes no líquido é capaz de fornecer condições ideais para o
cultivo de microrganismos. Sem destino adequado ele é altamente poluente devido à sua
elevadíssima carga orgânica.
A partir da caracterização do líquido da casca do coco verde foi possível a elaboração
de um meio sintético para estudos experimentais em biorreator.
Durante o estudo da influência de taninos observou-se que a presença de ácido tânico
ou tanino condensado não interferiu na eficiência do processo e que em baixas concentrações
de tanino houve um aumento da produtividade.
No estudo da quantidade de inóculo, 7,5% de levedura se mostrou a concentração mais
adequada ao processo fermentativo, e atingiu maior eficiência em menor tempo.
Provavelmente, uma maior concentração de levedura é menos suscetível à toxicidade pelo
produto.
A presença do LCCV promove uma leve redução da produtividade, no início do
processo, comparado aos meios diluídos com água, em todas as concentrações de açúcares..
No entanto, a presença de LCCV consegue sustentar a produtividade por um maior espaço de
tempo. Em todos os sistemas o aumento da concentração de açúcares reduz a eficiência do
processo. O meio contendo 150 g.L
-1
de açúcar e LCCV como diluente se destacou,
alcançando aproximadamente 98% de eficiência após 6 horas de processo.
Agitação de 400 rpm não conseguiu quebrar de forma efetiva as espumas geradas,
mantendo o meio extremamente gaseificado. De acordo com os resultados a agitação de 500
rpm foi adequada à fermentação.
Durante o estudo da influência da temperatura foi possível observar que a melhor faixa
de temperatura para produção de etanol se manteve entre 35 e 40°C. Em temperaturas mais
elevadas (45 e 50°C) a concentração de açúcar residual nestes sistemas é relativamente alta.
Durante o estudo comparativo do LCCV, através dos parâmetros avaliados durante a
fermentação, consumo de açúcares, produção de etanol, perfil de pH, biomassa, células
viáveis e totais e concentração de fenólicos, a sobreposição das curvas revelou a similaridade
dos meio sintético proposto.
Capítulo 7
Referências bibliográficas
__________________________________________________________________________________________
Referências Bibliográficas
_______________________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
73
ANDREOLI
, C.
, SOUZA,
S. P. Cana-de-açúcar: a melhor alternativa para conversão da
energia solar e fóssil em etanol. Economia & Energia, 59. Disponível em:.
http://ecen.com/eee59/eee59p/cana_melhor_conversorl.htm. Acesso em: 31 maio de 2007.
ANDRIETTA, M.G.S.; ANDRIETTA, S.R.; STECKELBERG, C.; STUPIELLO, E.N.A.
(2007). Bioethanol - Brazil, 30 years of Proálcool. International Sugar Journal, 59, 1299,
199-200.
ANDRIETTA, M.G.S.; STECKELBERG, C.; ANDRIETTA, S.R. (2006) Bioetanol –
Brasil, 30 anos na vanguarda. Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e
Agrícolas (CPQBA)- Divisão de Biotecnologia e Processos.Universidade de Campinas,
Campinas-São Paulo.
APHA - AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION (1981). Standard method for
the examination of dairy products. 14 ed. Washington.
ARAÚJO, A. M.; ROSA, M. F.; CRISÓSTOMO, L. A.; FIGUEIREDO, M. C. B. ;
CUNHA, E. A. (2004). Avaliação do potencial brasileiro de aproveitamento do líquido da
casca de coco verde. In: Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos, 19,
Anais, Recife-Pe.
AOAC - Association of Official and Agricultural Chemists (1990). Official methods of
analysis of the association. 15. ed. Washington: Board, V. 1.
ATIYEH, H.; DUVNJAK, Z. (2002). Production of fructose and ethanol from sugar beet
molasses using Saccharomyces cerevisiae ATCC36858. Biotechnol. Prog., 18, 234-239.
AYRAPAA, T. (1971). Biosynthetic formation of higher alcohols by yeast: dependence on
the medium. Journal of the Institute of Brewing, London, 77, 266-276.
BASTOS, R.K.X. (2003).Utilização de esgotos tratados em fertirrigação, hidroponia e
piscicultura. Prosab, Viçosa, 3.
__________________________________________________________________________________________
Referências Bibliográficas
_______________________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
74
BEN, F.R.; MC AULIFFE, C.A. (1975). Química e Poluição. Livros Técnicos e
Científicos. ED. S/A – EDUSP, 134p.
BHAT, T.K., SINGH, B. SHARMA, O.P. (1998). Microbial degradation of tannins – A
current perspective. Biodegradation, 9, 343-357.
BORZANI, W. (2001). Processo fermentativo industrial genérico. In: BORZANI, W.;
SCHIMIDELL, W.; LIMA, U.A.; AQUARONE, E. Biotecnologia industrial-Fundamentos.
Ed. Edgard Blucher Ltda. São Paulo, V.1.
CAMPOS, V.M.C. (2007). Composição da vinhaça e do melaço de cana. Serviço Brasileiro
de Resposta Técnica Disponível em: http://sbrt.ibict.br/upload/sbrt5114.pdf. Acesso em: 30
maio de 2007.
CAT/CNPq. Avaliação tecnológica do álcool etílico (1978). Ed. Gráfica e Papelaria
Tipogresso Ltda.
CEGARRA, J. (2000) Quim Têxtil 200, 58, 5.
CNPq, (1987). Fontes energéticas brasileiras, Inventário/ Tecnologia cana de açúcar,
Companhia Hidroelétrica do São Francisco, BRASCEP ENGENHARIA LTDA, Rio de
Janeiro, V 2.
COPAM.( 1986). Legislação ambiental. 3.ed. Belo Horizonte: Imprensa Oficial. 183p.
DAVIS, M.L.; CORNWELL, D.A. (1991). Introduction to Environmental Engineering.
Editora McGraw-Hill International, 2ª edição.
DIFCO (1998). Laboratories, Division of Becton Dickinson and Company Sparks,
Maryland 21152 USA, 11ª edição.
ERGUN, M.; MUTLU, S.F.(2000). Application of statistical technique to the production of
ethanol from beet molasses by Saccharomyces cerevisiae. Bioresource Technology, 73,
251-255.
__________________________________________________________________________________________
Referências Bibliográficas
_______________________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
75
FAÇANHA, S. H. F. (1998). Estudo dos parâmetros cinéticos básicos da fermentação
alcoólica do suco de caju (Anacardium occidentale L.) clarificado. Dissertação,
Departamento de Tecnologia de Alimentos - Programa de Pós-Graduação em Engenharia
Alimetos - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 133p.
FEAM. (1998) Licenciamento ambiental: Coletânea de legislação. In: Manual de
saneamento e proteção ambiental para municípios. Belo Horizonte: FEAM, 382p.
FLEMING,I.D.; PEGLER,H.F.( 1963). The determination of glucose in the presence of
maltose and isomaltose by a stable, specific enzymic reagent. Analyst, 88, 967-968.
GRAD, P. (2006). Biofuelling Brazil. Re-Focus, 56-59.
GUTIERREZ, L.E. (1993). Produção de álcoois superiors por linhagens de Saccharomyces
cerevisiae durante a fermentação alcoólica. Scientia Agricola, Piracicaba, 50, 3, 464-472.
HOLEBERG, I., MAGALITH, P. (1981). Alcoholic fermentation by immobilized yeast at
high sugar concentrations. Eur. J. Appl. Microbiol., 13, 133-140.
INSTITUO ADOLFO LUTZ - IAL (1985). Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz:
métodos químicos e físicos para análises de alimentos. 3. ed., São Paulo, V.1, 533p.
IBGE – Produção Agrícola no Brasil (2003).
JORGENSEN, A. (1939). Microorganisms and fermentation. 6 ed. London:Chales Griffin
and Company.
KWON, Y. J.; KAUL, R.; MATTIASSON, B. (1996). Extractive lactic acid fermentation
in poly(ethyleneimine) - based aqueous two-phase system. Biotechnology and
Bioengineering, 50, 280-290.
LAFON-LAFOURCADE, S. (1983). Wine and brandy. In: Rehm, H.J., Reed, G. Food and
Feed Production with Microorganisms. Biotechnology.Verlag Chemie, Weinheim, 5, 81-
163.
__________________________________________________________________________________________
Referências Bibliográficas
_______________________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
76
LALUCE, C. et al. (2007). Elementos de Microbiologia para Cultivo de Leveduras
<http://www.iq.unesp.br/flotacao/MODULO2/aula3/aula3.htm>. Acesso em: 15 de
fevereiro de 2007.
LEKHA, P.K.; LONSANE, B.K. (1997). Production and application of tannin acyl
hydrolase: state of the art. Advances in applied microbiology, 44, 215–260.
LEONEL, M.; CERADA, M.P. (1995). Manipueira como substrato na biossíntese de ácido
cítrico por Aspergillus niger. Scientia Agricol., 52, 2., 229-304.
LEWIS, J.A.; STARKEY, R.L. (1969). Decomposition of plant tannin content in canola
meal by some soil microorganisms. Soil Sci.,107, 235-241.
LIMA, G.J.M.M. (1983). Uso da levedura seca (Saccharomyces cerevisiae) de destilarias
de álcool de cana-de-açúcar na alimentação de matrizes suínas em gestação e lactação.
Dissertação (Mestrado) - Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Universidade
de São Paulo. Piracicaba, 139p.
LIMA, U.A. (1975). Produção de etanol. In: BORZANI, W.; SCHIMIDELL, W.; LIMA,
U.A.; AQUARONE, E. Biotecnologia industrial. São Paulo : Edgard Blucher.
LIMA, U.A.; BASSO, L.C.; AMORIM, H.V. (2001). Produção de etanol In: LIMA, U.A.;
AQUARONE, E; BOZANI, W.; SCHMIDELL, W. Biotecnologia industrial - Processos
fermentativos e enzimáticos. São Paulo. Blücher.
LLAMES, H.P. (1956). Fabricacion del alcohol. Ed. Salvat Editores, S.A.
LOPES, J.J.C.( 1989). Bagaço de nutrientes minerais no processo Melle-Boinot de
fermentação alcoólica. Piracicaba, Dissertação (Mestrado) - Escola Superior de Agricultura
"Luiz de Queiroz", Universidade de São Paulo. 74p.
LOURES, D.R.S. et al. (2003). Características do efluente e composição químico-
bromatológica da silagem de capim-elefante sob diferentes níveis de compactação. R. Bras.
Zootec., 32, 6, 1851-1858.
__________________________________________________________________________________________
Referências Bibliográficas
_______________________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
77
LOWRY, O.H.; ROSEMBROUH, N.J.; FARR, A.L.(1947). Protein measurement with
folin fenol reagent. Journal of Biological Chemistry, 170, 23, 265-270.
MACEDO,
I. C., ( 2007). Estudos avançados 21, 59, 157-165.
MACEDO,
I. C.; LEAL, M. R. L. V.; SILVA, J.E.A.R. (2004).Balanço das emissões de
gases do efeito estufa na produção e no uso do etanol no Brasil.
Disponível em:
http://www.portalunica.com.br/portalunica/files/referencia_publicacoes_relatoriostecnicos-
3-Arquivo.PDF. Acesso em: 30 maio de 2007.
MADIGAM, M.T.; MARTINKO, J.M.; PARKER, J. (1997). Brock Biology of
Microorganisms. 8 ed., Prentice Hall, 768-784.
MILA, I.; SACALBERT, A.; EXPERT, D. (1996). Iron withholding by plant polyphenols
and resistance to pathogens and rots. Phitochemistry, 42, 1551-1555.
MILLER, G.L. (1959). Use of dinitrosalicycle acid reagent for determination of reducing
sugars. Analytical Chemistry, Washington, 31, 226- 248.
MORAES, I.O. (2001). Produção de microrganismos In: LIMA, U.A.; AQUARONE, E;
BOZANI, W.; SCHMIDELL, W. Biotecnologia industrial - Processos fermentativos e
enzimáticos. São Paulo. Edgard Blucher, V. 3.
MORIMURA, S; LING, Z.I., KIDA, K. (1997). Ethanol production by repeated-batch
fermentation at high temperature in molasses medium containing a high concentration of
total sugar by a thermotolerant flocculating yeast with improved salt-tolerance. Journal of
Fermentation and Bioengineering, 83, 3, 271-274.
PAQUET, J. et al.. (2000). Electrical conductivity as a tool for analysing fermentation
processes for production of cheese starters. International Dairy Journal, 10, 391-399.
PELCZAR, M.; REID, R.; CHAN, E.C.S. (1981) In: PELCZAR. Microbiologia. Brasil:
McGraw-Hill do Brasil,. 493-517, V.2.
__________________________________________________________________________________________
Referências Bibliográficas
_______________________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
78
PELCZAR Jr., M.J.; CHAN, E.C.S.; KRIEG, N.R. (1996). In: Microbiologia. Conceitos e
aplicações. São Paulo: Makron Books do Brasil. 2ª edição. V.2.
PIZZI, A. (1994). Tannin-basead wood adhesives. In: PIZZI, A.Advanced Wood Adhesives
Technology. Mareel Dekker Inc. New York, 149-217.
PRINCE, I. G.; BARFORD, J. P.; TOWER. (1982). Fermentation of sugar cane juice.
Biotechnology Letter, 4, 7, 469-474.
RASS-HANSEN; J. et al. (2007). Perspective Bioethanol: fuel or feedstock? J Chem
Technol Biotechnol, 82, 329–333.
REICHARDT, K. (1990). A água em sistemas agrícolas. Editora Monole Ltda.
RIBAS, M.M.F; BARANA, A.C. (2003). Processo de partida em um biodigestor do tipo
plug-flow para tratamento da manipueira. Scientia Agrícola, 2, 223-229.
RIBEIRO, C.A.F.; HORII, J. (1999). Potencialidades de linhagens de levedura
Saccharomyces cerevisiae para a fermentação do caldo de cana. Science of Agriculture, 56,
2, 255-263.
ROSA, M.F. et al. (2001). Caracterização do pó da casca do coco verde usado como
substrato agrícola. Comunicado Técnico Embrapa Agroindústria Tropical, n.54.
ROUKAS, T. (1996). Ethanol production from non-sterilized beet molasses by free and
immobilized Saccharomyces cerevisiae cells using fed-batch culture. Journal of Food
Engineering, 27, 87-96.
SANTOS, S.C.; MELLO, J.C.P. Taninos. In: SIMÕES, C.M.O. et al. (2003).
Farmacognosia: da Planta ao Medicamento. Editora Universidade/ UFRGS, Porto Alegre.
614-656.
SAURA C. et al. (1991). Klason Lignin, condensed tannins and resistant protein as dietary
fibre constituents: determination in grape pomares. Food Chemistry, 299-309.
__________________________________________________________________________________________
Referências Bibliográficas
_______________________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
79
SCALBERT, A. (1991). Antimicrobial properties of tannins. Phitochemistry, 30, 3875-
3883.
SCHMIDELL, W. et al. (2001). Biotecnologia Industrial - Engenharia Bioquímica. São
Paulo: Edgard Blücher. V. 1. 541 p.
SILVA, F. C. (1999). Manual de análises químicas de solos, plantas e fertilizantes.
Brasília: Embrapa Comunicação para Transferência de Tecnologia/Embrapa
Solos/Embrapa Informática para Agricultura. 370 p.
SILVA, F.F et al. (2003). Variação da carga orgânica do efluente de fecularia de mandioca.
Acta Scientiarum: Agronomy. Maringá, 25, 1, 161-165.
SILVA, J. L., A. (2004). Reutilização de leveduras de fermentação alcoólica na produção
de etanol. Dissertação, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 64p.
SILVA, N.; AMSTALDEN, V. C. (1997). Manual de análise microbiológica de alimentos;
Livraria Varela, São Paulo.
SILVA, W.M. (2007). Biocombustíveis. Pólo Nacional de Biocombustíveis. Disponível
em: http://www.polobio.esalq.usp.br/biocombustiveis.html. Acesso em: 28 de março de
2007.
SOUSA, J. T. et al. (2005). Treatment of sewage for use in the agriculture of the semi-arid
north east Brazil. Eng. Sanit. Ambiental, Rio de Janeiro, 10, 3, 260-265.
STARZAK, M. et al. (1994). Macroapproach kinetics of ethanol fermentation by
Saccharomyces cerevisiae: experimental studies and mathematical modeling. The
Cheamical Engineering Journal, 54, 221-240.
TAKESHIGE, K; OUCHI, K. (1995). Factors affetingtha ethanol productivity of yeast in
molasses. Journal of fermentation and Bioengineering, 79, 5, 449-452.
__________________________________________________________________________________________
Referências Bibliográficas
_______________________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
80
TAILLANDIER, P et al. (2007). Effect of ammonium concentration on alcoholic
fermentation kinetics by wine yeast for hight sugar content. Food Microbiology, 14, 95-
100.
TORIJA, M.J. et al. (2003). Effects of fermentation temperature on the strain population of
Saccharomyces cerevisiae. International Journal of Food Microbiology, 80, 47-53.
UNICA – União da Agroindústria Canavieira de São Paulo (2007). A energia da cana-de-
açúcar - doze estudos sobre a agroindústria da cana-de-açúcar no Brasil e a sua
sustentabilidade, 65p.
UNICA – União da Agroindústria Canavieira de São Paulo. Disponível em
<http://www.única.com.br/pages/alcool_impactoambiental.asp>. Acesso em: 20 março,
2006.
WHEALS,E.A. et al. (1999). Fuel ethanol after 25 years TIBTECH, 17, 482-486.
ZAYED, G. (1997). Production of alcohol from sugar beet molasses without heat or filter
sterilization. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 19, 39-42.
Anexos
__________________________________________________________________________________________
Anexos
_______________________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
82
Anexo 1 - Composição dos meios de cultura padrão Sabouraud e YM para o cultivo de
bolores e leveduras.
Fonte: DIFCO, 1998
Fonte: DIFCO, 1998
Meio Sabouraud
Glicose 20 g
Extrato de levedura 5 g
Ágar 15 g
Peptona 10 g
pH 5,8
Bactericida 100 mg
Meio YM
Extrato de levedura 3 g
Extrato de malte 3 g
Peptona 5 g
Dextrose 10 g
pH 6,2
__________________________________________________________________________________________
Anexos
_______________________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
83
Anexo 2 - Características físico-químicas da matéria-prima manipueira, coletada na
indústria.
CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS DA
MATÉRIA-PRIMA MANIPUEIRA,
COLETADA NA INDÚSTRIA
Umidade 90,00
pH 6,27
Acidez normal 0,83
HCN livre ppm 52,20
HCN total ppm 459,86
Amido % 5,71
Carboidratos totais % 6,35
ART %
(1)
2,93
Nitrogênio ppm 1421,0
Fósforo ppm 293,0
Potássio ppm 2650,0
Cálcio ppm 220,0
Magnésio ppm 340,0
Enxofre ppm 74,0
Zinco ppm 3,20
Cobre ppm 0,90
Ferro ppm 7,60
Manganês ppm 3,90
Fonte: Cerada e Leonel, 1995. (1) ART – Açúcares
Redutores Totais.
__________________________________________________________________________________________
Anexos
_______________________________________________________________________________________
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84
Anexo 3 –Velocidade de formação de etanol nas fermentações contendo 0, 5, 10, 15 e 20
g.L
-1
de ácido tânico hidrolisável (a, b e c) e tanino condensado (d, e e f) em 100 (a e d),
150 (b e e) e 200 g.L
-1
(c e f) de sacarose, e incubadas durante 8 horas.
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
Velocidade de formação de etanol (g.L
-1
.h
-1
)
Tempo (h)
Controle
5 g.L
-1
10 g.L
-1
15 g.L
-1
20 g.L
-1
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
Velocidade de formação de etanol (g.L
-1
.h
-1
)
Tempo (h)
Controle
5 g.L
-1
10 g.L
-1
15 g.L
-1
20 g.L
-1
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
Velocidade de formação de etanol (g.L
-1
.h
-1
)
Tempo (h)
Controle
5 g.L
-1
10 g.L
-1
15 g.L
-1
20 g.L
-1
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
Velocidade de formação de etanol (g.L
-1
.h
-1
)
Tempo (h)
Controle
5 g.L
-1
10 g.L
-1
15 g.L
-1
20 g.L
-1
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
Velocidade de formação de etanol (g.L
-1
.h
-1
)
Tempo (h)
Controle
5 g.L
-1
10 g.L
-1
15 g.L
-1
20 g.L
-1
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
Velocidade de formação de etanol (g.L
-1
.h
-1
)
Tempo (h)
Controle
5 g.L
-1
10 g.L
-1
15 g.L
-1
20 g.L
-1
(a)
(f)
(e) (b)
(c)
(d)
__________________________________________________________________________________________
Anexos
_______________________________________________________________________________________
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85
Anexo 4 - Concentração de açúcares (g.L
-1
) na fermentação, durante o estudo comparativo
entre LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo.
y = 8,917x
2
- 80,721x + 177,893
R
2
= 0,984
y = 8,449x
2
- 74,654x + 159,357
R
2
= 0,979
-10
10
30
50
70
90
110
130
150
170
190
0 1 2 3 4 5 6
Tempo (h)
Concentração de açúcares (g.L
-1
)
LCCV in natura
LCCV sintético
__________________________________________________________________________________________
Anexos
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86
Anexo 5- Concentração de etanol (g.L
-1
) na fermentação, durante o estudo comparativo
entre LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo.
0
0,5
1
2
3
4
5
6
y = -3,668x
2
+ 36,853x + 0,103
R
2
= 0,998
y = -3,919x
2
+ 38,008x + 1,318
R
2
= 0,998
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6
Tempo (h)
Concentração de etanol (g.L
-1
)
LCCV in natura
LCCV sintético
__________________________________________________________________________________________
Anexos
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87
Anexo 6 - Perfil de pH na fermentação, durante o estudo comparativo entre LCCV in
natura e sintético, nas condições ótimas de processo.
y = 0,067x
2
- 0,413x + 4,608
R
2
= 0,547
y = 0,055x
2
- 0,305x + 4,566
R
2
= 0,542
2
3
4
5
6
0 1 2 3 4 5 6
Tempo (h)
pH
LCCV in natura
LCCV sintético
__________________________________________________________________________________________
Anexos
_______________________________________________________________________________________
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88
Anexo 7 - Concentração de células viáveis (células/mL) na fermentação, durante o estudo
comparativo entre LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo.
y = 3,111x + 27,981
R
2
= 0,574
y = 9,522x + 15,167
R
2
= 0,906
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6
Tempo (h)
Células viáveis (células.mL
-1
)
LCCV in natura
LCCV sintético
__________________________________________________________________________________________
Anexos
_______________________________________________________________________________________
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89
Anexo 8 - Concentração de células totais (células/mL) na fermentação, durante o estudo
comparativo entre LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo.
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
0 1 2 3 4 5 6
Tempo (h)
Células totais (células.mL
-1
)
LCCV in natura
LCCV sintético
__________________________________________________________________________________________
Anexos
_______________________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
90
Anexo 9 - Concentração de biomassa (g.L
-1
) na fermentação, durante o estudo comparativo
entre LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo.
y = -2,966x + 104,82
R
2
= 0,7538
90
92
94
96
98
100
102
104
106
108
110
0 1 2 3 4 5 6
Tempo (h)
Biomassa (g.L
-1
)
LCCV in natura
LCCV sintético
__________________________________________________________________________________________
Anexos
_______________________________________________________________________________________
Renata Beltrão Teixeira, junho/2007
91
Anexo 10– Concentração de fenólicos totais (g.L
-1
) na fermentação, durante o estudo
comparativo entre LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo.
8
9
10
11
12
0 1 2 3 4 5 6
Tempo (h)
Fenólicos totais (g.L
-1
)
LCCV in natura
LCCV sintético
__________________________________________________________________________________________
Anexos
_______________________________________________________________________________________
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92
Anexo 11 - Significância do teste F da análise de variância da regressão linear e quadrática
com os respectivos coeficientes de Determinação (R
2
).
LCCV in natura LCCV sintético
linear quadrática linear quadrática
Características
P* R
2
P R
2
P R
2
P R
2
Etanol
<0,01 84,75 <0,01 99,78 <0,01 86,82 <0,01 99,75
ART
<0,01 75,63 <0,01 97,90 <0,01 78,37 <0,01 98,44
Células viáveis
<0,01 90,64 0,24 92,96 0,02 57,38 0,25 70,08
Células totais
>0,99 23,24 >0,99 24,12 >0,99 16,30 0,13 65,39
Fenólicos totais
>0,99 0,06 0,29 80,96 >0,99 26,93 >0,99 45,64
pH
0,22 1,57 <0,01 54,18 0,10 1,88 <0,01 54,74
Biomassa
>0,99 6,32 >0,99 20,15 <0,01 75,38 0,15 90,91
*/ probabilidade do teste F da análise de regressão.
____________________________________________________________________________________________________________________
Anexos
_________________________________________________________________________________________________________________
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94
Anexo 12- Valores estimados e significância dos parâmetros das equações linear e quadrática de cada característica, para
cada sistema.
Linear (y = a + bx) Quadrática (y = a + bx + cx
2
)
a b a b c
Características Sistema LCCV
valor P* valor P* valor P* valor P* valor
P*
In natura 18,26
<0,01
15,07
<0,01
1,32
0,67
38,01
<0,01
-3,92
<0,01
Etanol
Sintético
15,96
<0,01
15,38
<0,01
0,10
0,97
36,85
<0,01
-3,67
<0,01
In natura 122,83
<0,01
-25,20
<0,01
159,36
<0,01
-74,65
<0,01
8,45
<0,01
ART
Sintético
139,34
<0,01
-28,53
<0,01
177,89
<0,01
-80,72
<0,01
8,92
<0,01
In natura 15,17
0,05
9,52
<0,01
19,24
0,05
4,01
0,63
0,94
0,50
Células viáveis
Sintético
27,98
<0,01
3,11
0,17
24,07
0,02
8,40
0,32
-0,90
0,52
In natura 84,83
<0,01
1,96
0,60
85,78
<0,01
0,69
0,96
0,22
0,92
Células totais
Sintético
76,44
<0,01
1,88
0,61
67,73
<0,01
13,67
0,32
-2,01
0,62
In natura 9,12
<0,01
0,01
0,98
9,35
<0,01
-0,31
0,56
0,05
0,55
Fenólicos totais
Sintético
9,66
<0,01
-0,07
0,65
9,80
<0,01
-0,26
0,63
0,03
0,70
In natura 4,32
<0,01
0,02
0,52
4,57
<0,01
-0,31
<0,01
0,05
<0,01
pH
Sintético
4,32
<0,01
-0,02
0,66
4,61
<0,01
-0,41
<0,01
0,07
<0,01
In natura 99,41
<0,01
-0,31
0,84
100,64
<0,01
-1,97
0,74
0,28
0,77
Biomassa
Sintético
104,82
<0,01
-2,97
0,07
108,41
<0,01
-7,83
0,19
0,83
0,59
(*)
probabilidade do teste T, aplicado para verificar se os parâmetros diferem de zero.
____________________________________________________________________________________________________________________
Anexos
_________________________________________________________________________________________________________________
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94
Anexo 13 - Curvas com melhor ajuste para cada característica, dentro de cada sistema, e a significância do teste T entre
os respectivos parâmetros das equações.
(1)
O teste T é aplicado entre os respectivos parâmetros, ou seja: a x a, b x b e, c x c;
(2)
a regressão linear e quadrática,
bem como os parâmetros de inclinação das curvas (b e c) não foram significativos;
(3)
Apenas um dos sistemas apresentou
regressão significativa, logo, os sistemas são distintos, ao longo do tempo.
Sistema LCCV
P (teste T)
parâmetros
1
Características
In natura
Sintético a
I
* a
S
b
I
* b
S
c
I
* c
S
Etanol
y = 1,32 + 38,01x - 3,92x
2
y = 0,10 + 36,85x - 3,67x
2
0,22 0,67 0,58
ART
y = 159,36 - 74,65x + 8,45x
2
y = 177,89 - 80,72x + 8,92x
2
0,13 0,57 0,78
Células viáveis
y = 15,17 + 9,52x y = 27,98 + 3,11x 0,09 <0,01 - - -
Células totais
- - - - - - - - - - - - - - -
Fenólicos totais
- - - - - - - - - - - - - - -
pH
y = 4,57 - 0,31x + 0,05x
2
y = 4,61 - 0,41x + 0,07x
2
0,65 0,18 0,64
Biomassa
- - -
2
y = 104,82 - 2,97x - - - difere
3
- - -
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