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FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
CENTRO DE PESQUISAS AGGEU MAGALHÃES
Mestrado em Saúde Pública
CARACTERIZAÇÃO CITOQUÍMICA ULTRA-
ESTRUTURAL DA CERCÁRIA de Schistosoma mansoni
RECIFE
2008
Marília Gabriela dos Santos Cavalcanti
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CARACTERIZAÇÃO CITOQUÍMICA ULTRA-ESTRUTURAL DA
CERCÁRIA DE Schistosoma mansoni
Recife
2008
MARÍLIA GABRIELA DOS SANTOS CAVALCANTI
Dissertação apresentada ao Mestrado em Saúde
Pública do Centro de Pesquisas Aggeu
Magalhães, Fundação Oswaldo C
ruz para
obtenção do grau de Mestre em Ciências.
Orientadores:
Dr. Luiz Carlos Alves e
Dr. Fábio André Brayner dos Santos
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Catalogação na fonte: Biblioteca do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
C376c
Cavalcanti, Marília Gabriela dos Santos.
Caracterização citoquímica ultra-estrutural da
cercaria de Schistosoma mansoni / Marília Gabriela dos
Santos Cavalcanti. — Recife: M. G. dos S. Cavalcanti,
2008.
112 p. : il., tabs.
Dissertação (mestrado em saúde pública) — Centro
de Pesquisas Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo
Cruz, 2008.
Orientador: Luiz Carlos Alves.
Co-orientador: Fábio André Brayner dos Santos.
1. Schistosoma mansoni – ultraestrutura. 2.
Histocitoquímica. I. Alves, Luiz Carlos. II. Santos,
Fábio André Brayner dos.
CDU 616.995.122
MARÍLIA GABRIELA DOS SANTOS CAVALCANTI
CARACTERIZAÇÃO CITOQUÍMICA ULTRA-ESTRUTURAL DA
CERCÁRIA DE Schistosoma mansoni
APROVADO EM: 14/01/2008
BANCA EXAMINADORA
________________________________________________
Prof°. Dr. Luiz Carlos Alves
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM-FIOCRUZ)
________________________________________________
Profª. Dra. Constança Clara Gayoso Simões Barbosa
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM-FIOCRUZ)
________________________________________________
Prof°. Dr. Álvaro Aguiar Coelho Teixeira
Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE)
________________________________________________
Prof°. Dr. Fábio Lopes de Melo
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM-FIOCRUZ)
________________________________________________
Profª. Dra. Valéria Wanderley Teixeira
Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE)
Dissertação apresentada ao Mestrado em
Saúde Pública do Centro de Pesquisas Aggeu
Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz para
obtenção do grau de Mestre em Ciências.
Dedico
Dedico Dedico
Dedico
Aos meus pais, Francisco e
Valdemira, aos meus irmãos,
Cláudia e Helder e ao meu noivo Felipe Santana por serem
o meu apoio em todos os momentos.
Ofereço
OfereçoOfereço
Ofereço
Aos meus orientadores e amigos Luiz Carlos e Fábio
Brayner pelos ensinamentos que levarei por toda a vida e
a Helena Araújo pelo ombro amigo.
AGRADECIMENTOS
A Deus que me concedeu todas as condições para chegar até aqui, mostrando o
melhor caminho, guiando-me na direção certa.
Aos meus pais, Francisco de Assis e Valdemira Cavalcanti, e meus irmãos Cláudia e
Helder que sempre estiveram ao meu lado e se esforçaram para que eu pudesse
continuar minha jornada.
Ao Felipe Santana pelos ensinamentos, amor, amizade, paciência, carinho, respeito e
confiança que sempre tem depositado em mim.
A toda minha família e a de meu noivo pelos momentos felizes, apoio, companheirismo
e cumplicidade.
Aos meus orientadores e grandes amigos Fábio Brayner e Luiz Carlos, pela orientação,
confiança, ensinamentos, companheirismo, paciência, estímulo e por todo o
aprendizado durante minha caminhada científica.
À Helena Rocha pelo companheirismo, amizade e presença constante em todos os
momentos da minha vida profissional.
Aos alunos de iniciação científica Fabiana Lira, Gabriela Brito, Sílvia, Henrique,
Eduardo, Fernando Caldeira, Juvenal Júnior e Adriana Burgo pela ajuda imprescindível
na realização dos experimentos.
À Lânia Ferreira pela oportunidade de poder começar a iniciação científica no Centro de
Pesquisas Aggeu Magalhães.
Aos técnicos Sérgio Santos, Raimundo Pimentel do Deptº. de Biologia Celular e Ultra-
estrutura do CPqAM/ FIOCRUZ e Rafael Padilha do Laboratório de Microscopia
Eletrônica do LIKA pela ajuda no processamento das amostras e obtenção das fotos
em microscopia eletrônica.
Às técnicas do Departamento de Parasitologia do CPqAM/FIOCRUZ, Fábia e Diana
(CPqAM/FIOCRUZ), pela amizade, compreensão, e ajuda em todos os trabalhos que
realizei.
Aos amigos e amigas do extinto Departamento de Biologia Celular e Ultra-estrutura do
CPqAM/FIOCRUZ.
Ao diretor do LIKA, Dr. José Luiz de Lima Filho pela infra-estrutura que possibilitou a
realização desta pesquisa.
À Carmel, Guilherme, Mércia e Simone pela amizade, carinho e força nos momentos
difíceis.
À Nalva Menezes, Joselice Pinto, Nilda Lima e Ana Paula da secretaria Acadêmica do
NESC/CPqAM, pelo suporte essencial para conclusão deste trabalho.
A Lula e Robson Nascimento pela amizade, paciência, competência e ensinamentos
indispensáveis na execução deste trabalho.
A toda equipe do Laboratório de Esquistossomose, Departamento de Parasitologia pela
obtenção das cercárias para realização dos experimentos.
À Dra. Constança Clara Gayoso Simões Barbosa pelas contribuições que permitiram o
aperfeiçoamento deste trabalho.
À Dra. Valéria Teixeira e Dr. Álvaro Teixeira pelas considerações feitas na dissertação e
por ter aceitado participar da banca.
Ao Dr. Fábio Melo pela válida contribuição prestada à dissertação.
Ao Marcelo Paiva pela ajuda no desenvolvimento do artigo científico e a Duschinka pela
amizade e apoio.
Aos amigos da informática e do serviço de xerox do CPqAM/FIOCRUZ por sempre me
socorrer nas horas mais importantes.
Aos amigos da biblioteca pela colaboração na obtenção das informações científicas.
À Viviane, Gircelly, Aline, Soraya, Juliana, Joseane e Cybelle que sempre me apoiaram
nos momentos mais difíceis e por fazerem parte da minha família.
Aos amigos do CIC pelos maravilhosos e inesquecíveis momentos juntos.
As minhas avós, Celina e Joana pelo carinho.
Aos meus companheiros da turma de mestrado 2006-2008 pelo apoio, carinho e
companheirismo.
Por fim a todos os doutores, técnicos, estagiários, colaboradores e amigos do Centro de
Pesquisas Aggeu Magalhães-CPqAM/FIOCRUZ e do Laboratório de Imunopatologia
Keizo Asami/LIKA que de alguma forma direta ou indireta contribuíram para a
realização deste trabalho.
"Há homens que lutam um dia e são bons.
Há outros que lutam um ano e são melhores.
Há os que lutam muitos anos e são muito bons.
Porém, há os que lutam toda a vida.
Esses são os imprescindíveis."
Bertolt Brecht.
CAVALCANTI, Marília Gabriela dos Santos. Caracterização citoquímica ultra-
estrutural da cercária de Schistosoma mansoni. 2007. Dissertação (Mestrado em
Saúde Pública) - Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz,
Recife, 2008.
_____________________________________________________________________
RESUMO
Uma alternativa para identificar a base de processos críticos necessários ao
estabelecimento do parasito no hospedeiro é enfocar o estágio responsável pela
invasão primária, ou seja, a estrutura infectante. O principal objetivo do trabalho foi
realizar uma caracterização ultra-estrutural da cercária de Schistosoma mansoni,
através de técnicas citoquímicas. Para a identificação de lipídios saturados e
insaturados foi utilizado, respectivamente, as técnicas de Filipina e do Tampão Imidazol,
para localização de proteínas básicas foram empregadas as técnicas do Ácido
Fosfotúngstico (PTA) e da Prata Amoniacal. Para localizar sítios de cálcio utilizamos a
técnica descrita por Hepler (1980) e para evidenciar grupamentos aniônicos
empregamos ferritina cationizada além do tratamento enzimático com tripsina,
condroitinase e neuraminidase de Vibrio cholerae. Foi observada a presença de lipídios
insaturados de formato globular em toda a região externa da larva infectante,
tegumento, glândula da cabeça, glândula pré-acetabular e corpos de inclusão.
Utilizando a técnica de filipina, identificamos a presença de colesterol delimitando vários
compartimentos da larva e também no tegumento, músculo e membranas de células
subtegumentares. Através da técnica de PTA foi identificada a presença de proteínas
básicas no tegumento, núcleo e nucléolo de células subtegumentares, corpos de
inclusão e glândulas pré-acetabulares. Já na prata amoniacal, identificamos forte
marcação em toda larva infectante além de marcações no núcleo das células
musculares, tecido muscular circular e glândulas pré-acetabulares. A localização de
sítios de cálcio mostrou-se bastante uniforme, demarcando os espaços internos da
larva, principalmente, o tecido muscular da larva. As amostras tratadas com ferritina
cationizada apresentaram uma forte marcação em nível cuticular. O tratamento das
amostras com a neuraminidase não alterou o padrão de marcação dessas partículas na
superfície do trematóide. Porém, o tratamento com tripsina ou condroitinase resultou
numa ausência de marcação na superfície da larva. O esclarecimento da composição
bioquímica da larva infectante de S. mansoni fornece dados para um melhor
entendimento a respeito da biologia do parasito bem como a intrigante relação parasito-
hospedeiro, além de contribuir para um possível controle químico.
Palavras chaves: Citoquímica. Ultra-estrutura. Cercária. Schistosoma mansoni.
CAVALCANTI, Marília Gabriela dos Santos. Cytochemical Ultrastructural
Caracterization of Cercaria of Schistosoma mansoni. 2007. Dissertação (Mestrado
em Saúde Pública) - Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz,
Recife, 2008.
_____________________________________________________________________
ABSTRACT
An alternative to identify the basis for critical processes necessary for the establishment
of the parasite in the host focus is the primary stage for invasion, the structure infectant.
The main objective of this work was realize an structural characterization of cercaria of
Schistosoma mansoni, through cytochemical technical. For the identification of saturated
and unsaturated lipids was used, respectively, Filipin and the buffer Imidazol techniques
for localization of proteins basic were employed Acid Fosfotúngstico (PTA) and the
Silver Amoniacal techniques. To locate calcium sites was used the tec hnique described
by Hepler (1980) and to highlight anionics groups employ cationized ferritin than
enzymatic treatment with trypsin, condroitinase and neraminidase of Vibrio cholerae. It
was observed the presence of unsaturated lipids of globular form in the infective larvae,
husk, head of the gland, preacetabular gland and inclusions bodies. Using the technique
of Filipin, identified the presence of cholesterol demarcate various compartments of the
larvae and also in the husk, and muscle membranes of cells subtegumentares. Through
the technique of PTA has identified the presence of protein in the husk basic, core and
nucleolus cell subtegumentares, bodies of inclusion and glands pre-acetabulares. In
ammoniacal silver, identified strong marking throughout infective larvae addition to
highlighting the nucleus of muscle cells, muscle tissue and glands circular pre-
acetabulares. The location of calcium sites has been fairly uniform, hightlight the internal
spaces of the larvae, especially the muscle cells. The samples treated with cationized
ferritin made a strong mark on cuticula level. Treatment with neuraminidase of the
samples did not alter the pattern of marking such particles on the surface of the
trematode. However, treatment with trypsin or condroitinase resulted in a lack of
markings on the surface of the larvae. The clarification of the biochemical composition of
the infective larvae of S. mansoni provides data for a better understanding about the
biology of the parasite and the parasite-host relationship intriguing, in addition to
contributing to a possible chemical control.
Keywords: Cytochemical. Ultrastructure. Cercaria. Schistosoma mansoni.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Ciclo de vida de Schistosoma spp
19
Figura 2
Biomphalaria glabrata
20
Figura 3
Vermes adultos (Macho e Fêmea) de S. mansoni
22
Figura 4
Ovo de S. mansoni
23
Figura 5
Desenho esquemático da cercária de S. mansoni
26
Figure 6
Desenho esquemático do tegumento da cercária de S. mansoni
27
Figura 7
Desenho esquemático do sistema nervoso da cercária de S. mansoni
30
Figura 8
Desenho esquemático do sistema excretório da cercária de S. mansoni
33
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
13
2 REVISÃO DA LITERATURA
15
2.1 Esquistossomose
16
2.2 Ciclo
18
2.3 Vetor
19
2.4 Morfologia do Schistosoma mansoni
21
2.4.1 Esquistossômulo 21
2.4.2 Vermes Adultos 21
2.4.3 Ovo 23
2.4.4 Miracídio 23
2.4.5 Esporocisto 24
2.4.6 Cercária 25
2.4.6.1 Tegumento
26
2.4.6.2 Musculatura
29
2.4.6.3 Sistema Nervoso
30
2.4.6.4 Sistema Digestivo
31
2.4.6.5 Órgãos Secretores
32
2.4.6.6 Sistema Excretório
33
2.5 Citoquímica
34
2.5.1 Localização de Lipídios Saturados 34
2.5.2 Localização de Lipídios Insaturados 35
2.5.3 Localização de Partículas Carregadas Negativamente 35
2.5.4 Localização de Cálcio 36
2.5.5 Localização de Proteínas Básicas 36
3 JUSTIFICATIVA
38
4 PERGUNTA CONDUTORA
40
5 HIPÓTESE
42
6 OBJETIVOS
44
6.1 Geral
45
6.2 Específicos
45
7 MATERIAIS, MÉTODOS E RESULTADOS
46
Artigo 1: Cytochemical characterization of lipids in the cercaria of Schistosoma
mansoni.
48
Artigo 2: Ultrastructural and Cytochemical Aspects of the cercaria of Schistosoma
mansoni.
68
8 DISCUSSÃO
90
9 CONCLUSÕES
97
10 REFERÊNCIAS
99
ANEXOS
110
Anexo A: Parecer da Comissão de Ética do CPqAM/FIOCRUZ
111
Anexo B: Confirmação de Submissão do Artigo, Revista: Parasitology 112
1- INTRODUÇÃO
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
14
A esquistossomose é uma doença parasitária causada pelo helminto
Schistosoma mansoni. Esta helmintíase é uma endemia mundial, atingindo 74 países e
territórios, principalmente na América do Sul, África, Caribe e leste do Mediterrâneo. Em
termos de extensão de área endêmica e quantidade de pessoas infectadas, esta
doença continua a ocupar a segunda posição no mundo entre as parasitoses
(LESCANO et al., 2004; KATZ; ALMEIDA, 2003).
O S. mansoni apresenta um ciclo de vida heteroxênico, no qual o parasita
apresenta vários estágios evolutivos adaptados para cada situação que varia desde o
caramujo até seu hospedeiro definitivo (SCHNEIDER; ZELCK, 2001).
O estágio responsável pela infecção no hospedeiro definitivo é a cercária de S.
mansoni. Esta fase evolutiva é especializada em executar as funções de locomoção,
encontro do hospedeiro, invasão do mesmo e de maturar-se em vermes sexualmente
maduros (DORSEY et al., 2002).
A ultra-estrutura da larva infectante do S. mansoni tem sido examinada por
muitos anos resultando no acúmulo de muitas informações, porém a maioria desses
trabalhos está concentrada em órgãos e sistemas ou em áreas limitadas da larva tal
como o tegumento (DORSEY et al., 2002).
Como as cercárias irão evoluir até os vermes adultos, o estudo da mesma pode
ser entendido como uma investigação sobre o estágio adulto prematuro, pois células
germinativas das cercárias irão dar origem a vários órgãos do verme adulto (DORSEY
et al., 2002).
Uma alternativa para identificar a base de processos críticos necessários ao
estabelecimento do parasita no hospedeiro é enfocar o estágio responsável pela
invasão primária, ou seja, o estágio infectante. Para isso, faz-se necessária uma análise
ultra-estrutural citoquímica para que se possa obter dados que certamente deverão ser
utilizados para o melhor entendimento da biologia do parasito bem como esclarecer a
intrigante relação parasito-hospedeiro.
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
15
2- REVISÃO DA LITERATURA
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
16
2.1 Esquistossomose
A esquistossomose também conhecida, no Brasil, como "barriga d'água",
"xistose" ou "mal-do-caramujo" é causada por vermes trematódeos do gênero
Schistosoma. Várias espécies desse gênero apresentam importância epidemiológica
como: S. haematobium, S. japonicum, S. intercalatum e S. mekongi (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 1998).
As espécies do gênero Schistosoma que afetam o homem chegaram às
Américas no século XVII através do tráfico de escravos e com imigrantes orientais e
asiáticos (nos quais foram detectados numerosos indivíduos parasitados pelo S.
haematobium e S. japonicum). Entretanto, apenas o S. mansoni aqui se fixou, pelo
encontro de bons hospedeiros intermediários (Biomphalaria) e pelas condições
ambientais semelhantes às da região de origem (NEVES et al., 2005).
A presença desta parasitose é um indicador de atraso sócio-econômico e
representa um sério problema de saúde pública, infectando mundialmente mais de 200
milhões de pessoas em 74 países. No Brasil, onde há cerca de 10 milhões de
infectados, a maior parte dos casos — entre seis a oito milhões — concentra-se na
região Nordeste (BARRETO, 1993; ALVES et al., 1998).
Entre os fatores que contribuíram para propagação da esquistossomose estão os
movimentos migratórios, a exploração inadequada de recursos hídricos, a distribuição
ampla dos hospedeiros intermediários, a longevidade da doença e a falta de educação
em saúde (RIBEIRO et al., 2004).
B. glabrata é um importante vetor do S. mansoni nas Américas, devido ao alto
potencial biológico de infecção natural e vasta distribuição (SOUZA et al., 1995;
BARBOSA et al., 2000). No Brasil, a dominância de B. glabrata abrange a região
Nordeste, ao longo da faixa costeira e áreas interiores adjacentes dos estados do Rio
Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Alagoas, Sergipe até o sudeste da Bahia. Na
região Sudeste, atinge parte de Minas Gerais, leste do Rio São Francisco, e o norte do
Espírito Santo; existem, ainda, focos periféricos isolados deste molusco no Maranhão,
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
17
Pará, Goiás, São Paulo, Paraná (PARAENSE, 1972) e no Rio Grande do Sul
(CARVALHO et al., 1998).
No estado de Pernambuco, a esquistossomose é historicamente endêmica na
região rural (COUTINHO et al., 1997). A migração de trabalhadores rurais, aliada à
gradual ocupação e modificação dos espaços urbanos, têm determinado a contínua
expansão da esquistossomose e o estabelecimento de novos focos urbanos em
Pernambuco (BARBOSA et al., 1998), Ceará (ALMEIDA et al., 1991), Minas Gerais
(BARATA et al., 2000), Sergipe (SILVA et al., 2000) e São Paulo (LIMA, 1995).
Também vem se notando uma mudança no perfil epidemiológico da doença. Em
áreas rurais, a esquistossomose se apresenta predominantemente sob a forma crônica,
incidindo na classe social de baixa renda e tendo como vetor a B. straminea (BARBOSA
et al., 2001). No litoral, a doença é representada por casos agudos em pessoas de
classes média e alta, sendo o vetor a B. glabrata (BARBOSA et al., 2000).
As principais manifestações clínicas da esquistossomose ocorrem em menos de
10% da população infectada e estão caracterizadas por distúrbios intestinais, aumento
do fígado, esplenomegalia e varizes esofagianas. A doença pode evoluir dependendo
da intensidade da infecção, e diversos outros fatores podem conduzir ao sangramento
gastrintestinal, ascite e anemia (XIMENES et al., 2000).
O controle da esquistossomose deve ser considerado sob dois aspectos, ou seja,
morbidade e transmissão. Para o controle da morbidade, que visa diminuir o
aparecimento de casos da forma grave, o diagnóstico e o tratamento são suficientes,
apesar de que o sucesso da quimioterapia no tratamento da esquistossomose em áreas
de alta prevalência não tem sido duradouro, havendo a rápida re-infecção. Em relação
à transmissão, apenas o tratamento das populações infectadas não é suficiente sendo
necessário também interromper o ciclo evolutivo do parasito. São medidas como obras
de engenharia sanitária, possibilitando o aporte adequado de água para as casas e a
adequada eliminação dos dejetos, impedindo que os mesmos contaminem os recursos
hídricos, além de obras que modifiquem o meio ambiente. Outra medida importante é a
educação, fazendo com que as populações residentes em zonas endêmicas não
apenas tenham consciência do problema, mas que modifiquem o seu comportamento
interrompendo o ciclo (KATZ, 1980).
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
18
2.2 Ciclo
O ciclo biológico de S. mansoni é compreendido por uma série de mudanças
adaptativas (Figura 1). A transmissão do trematóide depende da presença do portador
humano, eliminando ovos do parasito nas fezes; da existência de hospedeiro
intermediário, o caramujo, e finalmente, do contato do homem com água contendo
cercárias (REY, 2001).
O ciclo inicia-se com o caramujo que é o hospedeiro intermediário do
Schistosoma, este invertebrado alberga o ciclo assexuado. Nos seus tecidos o S.
mansoni multiplica-se originando os esporocistos, dando mais tarde origem à forma
infectante ao homem, a cercária (NEVES, et al., 2005).
A infecção do hospedeiro definitivo ocorre quando o homem entra em contato
com a água onde existem caramujos infectados liberando cercárias. Se estas larvas
encontrarem o hospedeiro definitivo na água, penetram pela pele nua e intacta ou pelas
mucosas. O parasito penetra nos tecidos até encontrar os vasos sangüíneos, seguindo
pelas veias, passa pelo coração e atinge os pulmões, coração até atingirem o fígado.
Lá ocorre o amadurecimento das larvas em formas sexuais adultas: macho e fêmea, e o
acasalamento (forma sexuada). Após este acasalamento, os parasitas migram juntos,
contra o fluxo sanguíneo (migração retrógrada), atingindo as veias mesentéricas e do
plexo hemorroidário superior. Nessas veias, os parasitas põem milhares de ovos todos
os dias, durante anos. Os ovos ao chegarem à luz do intestino são eliminados pelas
fezes e em contato com a água, liberam os miracídios que nadam livres até encontrar
um caramujo completando o ciclo (REY, 2001).
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
19
2.3 Vetor
No ciclo de vida do Schistosoma, o hospedeiro intermediário (caramujo) exerce
um papel fundamental na manutenção da parasitose (SCHNEIDER; ZELCK, 2001).
As espécies vetoras pertencem à ordem Pulmonata, subordem Basommatophora,
família Planorbidae e compreendem apenas moluscos terrestres ou de água doce, sem
opérculo que feche a concha quando o animal se retrai para dentro (REY, 2001).
Os planorbídeos habitam desde grandes lagos até pequenos córregos, brejos e
poços rasos.
Ainda que a presença de planorbídeos possa ser freqüente em coleções naturais,
sua densidade populacional costuma ser maior em criadouros artificiais, como canais,
vala de drenagem pluvial, entre outros (REY, 2001).
Figura 1
-
Ciclo de vida de
Schistosoma spp
.
Fonte: CENTERS FOR DISEASE CONTROL (2004).
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
20
Atualmente três espécies de moluscos planorbídeos transmitem, em condições
naturais, o S. mansoni em nosso meio: B. glabrata (Figura 2), B. tenagophila e B.
straminea. Destes, a B. glabrata é o mais suscetível dos hospedeiros intermediários no
Brasil devido à sua distribuição e eficiência na transmissão da esquistossomose. Já a
B. tenagophila possui distribuição ao longo da costa, desde o estado da Bahia até o Rio
Grande do Sul. Por outro lado, a B. straminea, uma das mais adaptadas às variações
climáticas, é encontrada em quase todas as bacias hidrográficas e apresenta uma alta
resistência à infecção pelo S. mansoni (MARCHIORI, 1999).
O número de cercárias produzidas varia de acordo com a espécie de molusco
hospedeiro, sendo muito alto em B. glabrata, que pode eliminar cerca de 1.000 a 3.000
cercárias de S. mansoni por dia e mais de 100.000 durante toda a vida do molusco. As
espécies africanas de Biomphalaria produzem geralmente menos de 500 cercárias por
dia (REY, 2001).
Figura 2 - Biomphalaria glabrata
Fonte: UNIVERSITÄT BIELEFELD (2006).
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
21
2.4 Morfologia do S. mansoni
2.4.1 Esquistossômulo
Logo quando a cercária penetra no hospedeiro definitivo, ocorrem algumas
alterações estruturais, esta adaptação está relacionada à mudança do ambiente. Além
da perda da cauda o trematóide forma rapidamente uma camada de microvilosidade
sobre todo o tegumento, modifica a respiração (passando da forma aeróbica para
anaeróbica), desenvolve uma sensibilidade à água e uma resistência ao sistema
complemento, modifica ou altera o glicocálice e modifica a membrana trilaminar para a
heptalaminar (STIREWALT, 1974). Toda essa adaptação estrutural dá origem a um
outro estágio larval chamado de esquistossômulo.
Os esquistossômulos permanecem nos tecidos da derme por dois a três dias, ao
fim dos quais se não forem destruídos pelo sistema imune do hospedeiro, acabam
penetrando em um vaso cutâneo e é passivamente arrastado pela circulação em
direção ao coração e pulmões. Após uma semana eles se localizam no sistema porta
intra-hepático, onde pela primeira vez apresentam pigmento hemático no intestino,
onde crescem e amadurecem até o final da quarta semana (REY, 2001).
2.4.2 Vermes Adultos
Contrariamente à generalidade dos trematódeos, apresentam-se como vermes
dióicos e morfologicamente são delgados e longos (Figura 3) (NEVES et al., 2005).
O macho de S. mansoni mede cerca de 1,0 cm de comprimento e apresentam
coloração branca. Na extremidade anterior traz uma ventosa oral afilada, e a pequena
distância desta, uma segunda ventosa, o acetábulo. O curto segmento anterior
compreendido entre as duas ventosas é cilíndrico e mais fino que o segmento posterior.
Este é muito mais longo, achatado dorsoventralmente, porém enrolado de maneira a
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
22
formar uma calha ou tubo longitudinal conhecido como canal ginecóforo, pois nele
costuma-se estar alojada a fêmea (REY, 2001).
A fêmea tem corpo cilíndrico, mais longo e mais fino que a do macho (1,2 a 1,6
cm de comprimento). Apresenta uma coloração escura e acinzentada devido à
presença, no tubo digestivo, de um pigmento derivado da digestão do sangue
(hemozoína). Possui duas ventosas pequenas, estando a ventosa acetabular,
pedunculada, muito perto da oral (REY, 2001).
Como nos demais trematódeos, o revestimento externo dos vermes adultos é
formado por uma citomembrana espessa que recobre o tegumento. Este é constituído
por uma camada sincicial anucleada, mas que liga por pontes citoplasmáticas a células
nucleadas, situadas mais profundamente (NEVES et al., 2005).
A superfície do tegumento exibe grande quantidade de pequenos tubérculos,
mas abundantes na superfície dorsal. Estruturas mais delicadas podem ser observadas
com grande aumento, consistindo de minúsculos espinhos situados principalmente na
superfície interna das ventosas assim como nos botões sensoriais (NEVES et al.,
2005).
Logo abaixo do tegumento estão as camadas musculares da parede do corpo do
helminto, responsáveis pela movimentação. Todo espaço interior entre os órgãos
internos, é ocupado por um tecido denominado estroma, formado de células estreladas
e lacunas cheias de um líquido intersticial (REY, 2001).
Figura 3
-
Vermes adultos (Macho e Fêmea) de
S. mansoni
Fonte: UNIVERSITÄT BIELEFELD (2006).
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
23
2.4.3 Ovo
As fêmeas põe cerca de um ovo por vez, e o total diário eliminado pelos vermes
é em torno de 300 ovos. Este mede 110 a 180 µm de comprimento por 45 a 70 µm de
largura. Apresenta um pólo anterior mais delgado e o posterior mais volumoso, com um
espinho lateral saliente e agudo (REY, 2001).
Apresenta uma resistente casca dupla, a mais interna envolve o embrião
(miracídio) (Figura 4). A expectativa de vida dos ovos maduros é de aproximadamente
20 dias e caso o miracídio não ecloda após três a quatro semanas, o mesmo morre
dentro do ovo (NEVES et al., 2005).
O mecanismo de eclosão parece depender, sobretudo da hipotenicidade do
meio, que promovendo a passagem da água para dentro da casca, determina aumento
da tensão interna e sua ruptura.
2.4.4 Miracídio
O miracídio de S. mansoni é o primeiro estágio infectante no complexo ciclo do
parasito, e o futuro de todo este ciclo depende da capacidade desse estágio larval
localizar e penetrar no hospedeiro invertebrado apropriado (PAN, 1980). Os miracídios
Figura 4 - Ovo de S. mansoni
Fonte: UNIVERSITY OF CAMBRIDGE (1998)
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
24
medem cerca de 160 por 60µm e estão revestidos por pequeno número de células
epiteliais pavimentosas providas de numerosos cílios (REY, 2001).
De acordo com o estudo realizado por Pan (1980) a organização celular do
miracídio apresenta-se dividida em oito categorias: a) sistema epitelial b) terebratório c)
musculatura d) células intersticiais e) glândulas de penetração f) sistema excretório g)
sistema nervoso h) células germinativas.
Na extremidade anterior do miracídio, abre-se um par de glândulas adesivas e
uma glândula de penetração, todas unicelulares contendo no seu interior um material
supostamente enzimático (PAN, 1980).
2.4.5 Esporocisto
Ao penetrar no interior do molusco, o miracídio perde seu revestimento epitelial
ciliado, permanece nas proximidades do ponto de penetração e se transforma em uma
estrutura sacular alongada. No oitavo dia a larva se apresenta com um tubo enovelado,
imóvel e cheio de células germinativas em multiplicação e passa a ser denominado de
esporocisto primário (REY, 2001).
No seu interior, as células germinativas vão se transformar em esporocistos de
segunda geração, com a mesma arquitetura e por volta da segunda semana de
existência mede 1,5 mm ele se rompe para liberar entre 20 e 40 esporocistos filhos
(REY, 2001).
Os esporocistos secundários migram para o hepatopâncreas e o ovotésteis do
molusco, onde continuam a crescer. Quando maduros, exibem na extremidade anterior
uma protuberância móvel e um poro para eliminação de cercárias. O tempo necessário
para a maturação dos esporos filhos e formação das primeiras cercárias é de 3 a 4
semanas, variando com a temperatura ambiente (REY, 2001).
De acordo com alguns trabalhos, depois de terem produzido cercárias por certo
tempo, os esporocistos secundários podem voltar a formar uma terceira geração de
esporocistos capaz de retomar a produção de nova geração de cercárias (NEVES et al.,
2005).
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
25
Saindo do esporocisto, as cercárias ganham a hemocele que envolvem o
hepatopâncreas e o ovotésteis, encaminham-se pela corrente circulatória e chegam a
algumas áreas bem vascularizadas do tegumento. Aí provocam a formação de
minúsculas vesículas na superfície externa, usando aparentemente o conteúdo de um
par de glândulas unicelulares; e, ao romperem-se as vesículas saem para o meio
exterior (REY, 2001).
2.4.6 Cercária
A cercária de S. mansoni é a fase evolutiva infectante especializada em executar
as funções de locomoção, encontro do hospedeiro, invasão do mesmo e de maturar-se
em vermes sexualmente maduros. Ela mede cerca de 500µm, mas pode variar
consideravelmente devido a habilidade de contração e alongamento, Figura 5
(DORSEY et al., 2002).
Devido à capacidade da cercária de se contrair e estender longitudinalmente as
células que a compõe não são estáticas e os processos citoplasmáticos estão,
provavelmente, em um fluxo constante. De acordo com Dorsey et al. (2002) a
capacidade da cercária de se alongar depende do tamanho da lâmina basal fibrosa. Ela
apresenta um elevado volume de células musculares necessárias para o vigoroso
movimento durante a natação, contração e extensão da cauda, corpo e ventosas.
Estruturalmente, a cercária de S. mansoni, apresenta-se dividida em: órgão
anterior ou ventosa oral, segmento do corpo (com cutícula recoberta de espinhos) e
cauda medindo cerca de 300 µm, terminando em uma bifurcação, Figura 5 (DORSEY et
al., 2002; NEVES et al., 2005). Esta última região da cercária será perdida rapidamente
no seu processo de penetração no hospedeiro definitivo.
O órgão anterior e o segmento do corpo da larva infectante de S. mansoni
apresentam aproximadamente 0,5 µm de espessura (HOCKLEY, 1973), toda essa área
é envolvida por duas camadas musculares. A larva apresenta uma membrana
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
26
superficial trilaminar de aproximadamente 7nm de espessura (VOGEL; MINNING, 1949;
MORRIS, 1971).
2.4.6.1 Tegumento
A estrutura básica do tegumento é semelhante na cercária, esquistossômulo e
vermes adultos (HOCKLEY, 1972). Ele é constituído por glicocálice (G), membrana
superficial ou plasmalema externo do citoplasma sincicial (MS, à direita), citoplasma
sincicial (CS), espinhos (SP, central), plasmalema sincicial interno (PSI), pericário (PK)
e conecções citoplasmáticas (não mostrado), Figura 6 (STIREWALT, 1974).
A cercária jovem é coberta por um epitélio primitivo de 0,5µm de espessura. Este
epitélio permanece até a fase embrionária e possui poucos núcleos e nenhuma junção
celular é observada. Este tecido primitivo tem a função de proteger o tegumento
Figura 5
-
Desenho esquemático da cercária de
S. mansoni.
Fonte: Dorsey et al (2002).
Nota: 1-4 Órgão Anterior ou Ventosa Oral; 5-10: Corpo e 10-13: Cauda
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
27
verdadeiro até que o mesmo esteja formado. No final da fase embrionária, o tegumento
primitivo é completamente substituído por uma fina camada sincicial presente sob o
epitélio. O desenvolvimento do tegumento é precedido pela perda gradual da maioria
dos ribossomos e núcleos e o sincício se torna completamente preenchido por um
material granular denso que está mais concentrado no corpo do que na cauda
(HOCKLEY, 1972).
Os SP aparecem no tegumento no mesmo momento do material granular, eles
são cobertos pela MS, estão apoiados no PSI e se encontram completamente inseridos
no tegumento (Figura 6).
De acordo com Morris (1971) os espinhos da cercária são menores que a dos
adultos. Na cercária eles são mais numerosos no corpo, porém sua distribuição nesta
área não é uniforme sendo maiores e mais concentrados na ventosa ventral e não
estão presentes na região envolta da boca, extremidade oral, áreas ao redor da ventosa
oral, nas papilas sensoriais (ROBSON; ERASMUS, 1970) e na região do pescoço
(RACE et al., 1971).
F
igura
6
-
Desenho esquemático do tegumento da cercária de
S. mansoni
.
Fonte: Adaptado de Stirewalt (1974).
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
28
Sob o tegumento da cercária encontram-se, consecutivamente, a lâmina basal e
arranjo de músculos fibrosos circulares (MC) e longitudinais (ML) (HOCKLEY, 1972).
No CS estão presentes pequenas mitocôndrias espalhadas e corpos de inclusão.
Estas inclusões podem apresentar formato esférico, alongado ou discóide e
apresentam, em geral, uma região central eletrondensa e periferia translúcida. Esses
corpos parecem originar-se do Complexo de Golgi nas células subtegumentares. A
função desses corpos de inclusão está na formação da membrana heptalaminar
externa (DORSEY et al., 2002).
O tegumento reveste toda a cercária com a camada citoplasmática e esta é
contínua ao epitélio da cavidade oral, esôfago, sistema excretório e algumas porções
de ductos excretórios (POWER; SOGANDARES, 1970).
Vários estudos mostraram que as cercárias que perdem o revestimento de
superfície não sobrevivem na água (STIREWALT, 1963; BENNETT, 1963). De acordo
com Bennett (1963) a camada superficial pode selecionar íons, por outro lado, Kent
(1967) em seus experimentos concluíram que a camada de glicoproteína não permite a
troca iônica. O autor sugere que esse revestimento pode atuar como um dispositivo de
gel-filtração. Assim, a superfície cercarial pode simplesmente atuar como uma proteção
mecânica evitando possíveis danos na superfície da cercária.
Analisando o tegumento utilizando o microscópio eletrônico de transmissão é
possível observar uma camada de aproximadamente 0,5µm de espessura recobrindo a
membrana superficial. Essa camada chamada de glicocálice (G) se apresenta
perpendicular à superfície do tegumento e é composta por fibras ramificadas e
interconectadas formando uma rede difusa (MORRIS, 1971; HOCKLEY, 1972; STEIN;
LUMSDEN, 1973).
A origem do glicocálice tem sido bastante discutida, Rifkin (1970) encontrou em
seus estudos que o glicocálice é formado no estado embrionário e é resultante de
células esporocísticas. Porém, outros trabalhos revelaram que o glicocálice é uma parte
integral da membrana externa do tegumento e é provavelmente produzido pelo
tegumento, pelo fato de que algumas fibras que formam o glicocálice estarem
firmemente inseridas na membrana externa do tegumento (KEMP,1970; STEIN;
LUMSDEN, 1973).
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
29
O glicocálice presente na cercária é bem diferente do esquistossômulo. Na
cercária, ele está presente em toda a superfície e no esquistossômulo pode estar
ausente, interrompido ou funcionalmente modificado, se tornando uma estrutura não-
funcional (STIREWALT, 1974).
Apesar do papel do glicocálice não ter sido completamente elucidado, há uma
grande variedade de possíveis funções para o mesmo como: adesão e lubrificação
(KRUIDENIER, 1951), proteção contra adversidades do meio (KRUIDENIER, 1951,
1953a, 1953b; STIREWALT, 1963), controle da permeabilidade (MORRIS, 1971;
STEIN; LUMSDEN, 1973) e adaptação fisiológica (KRUIDENIER, 1951; MORRIS,
1971).
2.4.6.2 Musculatura
A musculatura cercarial envolve os músculos circulares externos, uma ou mais
camadas subjacentes de músculo longitudinais fibrosos, músculos fibrosos mais
profundos orientados diagonalmente, musculatura cônica e oral da ventosa, músculos
presentes ao redor de órgãos internos (como o trato digestivo e glândulas) e pequenas
e discretas células musculares presentes no parênquima (KRUIDENIER; VATTER,
1960; DORSEY; STIREWALT, 1971; STIREWALT; DORSEY, 1973).
A musculatura do corpo difere da cauda em vários aspectos. Há usualmente
apenas uma única camada de músculo longitudinal e circular no subtegumento do
corpo, enquanto duas ou três miofibrilas podem constituir a camada longitudinal da
cauda. Essas miofibrilas longitudinais parecem ser mais forte, compacta e contém mais
miofilamentos na região caudal do que no corpo (STIREWALT; DORSEY, 1973).
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
30
2.4.6.3 Sistema Nervoso
O sistema nervoso do S. mansoni se torna mais complexo na medida que o
parasito avança no estágio de miracídio e cercária até se tornarem vermes adultos
(DEI-CAS et al. 1980).
O sistema nervoso da cercária é distribuído através dos três segmentos
anatômicos da larva e consiste de papilas sensoriais, um gânglio central, dois pares de
nervos centrais (um anterior e outro posterior) e doze nervos periféricos, distribuídos ao
redor do gânglio (COUSIN;DORSEY, 1991), Figura 7.
F
igura
7
-
Desenho esquemático do sistema nervoso da cercária de
S. mansoni
.
Fonte: Adaptação de Cousin e Dorsey (1991).
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
31
As papilas sensoriais estão conectadas a processos dentríticos, esses processos
nervosos terminais estão localizados na superfície cercariana e fazem contato com o
ambiente através de cílios ou aberturas no tegumento (DORSEY; COUSIN, 1986). De
acordo com Short e Cartrett (1973) há aproximadamente 76 papilas, geralmente
distribuídas bilateralmente e de forma simétrica em ambos segmentos do corpo e no
órgão anterior. A maioria delas se concentra na porção oral e tendem a serem menos
numerosos na cauda. A função da maioria das papilas ainda não é totalmente
conhecida, mas pode estar envolvida na recepção de sinais fotoluminescentes,
mecânicos e/ou químicos.
O gânglio central (CG) é uma estrutura bilobular e é o maior componente do
sistema nervoso da cercária, o gânglio está localizado na área anterior do segmento do
corpo próximo ao esôfago. Dele partem nervos periféricos que estão relacionados com
a musculatura periférica do corpo e dois pares de nervos centrais. O par de nervo
central anterior (AC) se localizam próximos a glândula acetabular indo em direção ao
órgão anterior da cercária, seu papel está relacionado à musculatura dos ductos
esofágicos e glândulas acetabulares. O par de nervos centrais posteriores (PC)
projetam-se da área central do gânglio e estão associados à musculatura que envolve o
sistema digestivo e ductos das glândulas acetabulares (COUSIN; DORSEY, 1991).
2.4.6.4 Sistema Digestivo
Existem, no sistema digestivo da cercária de S. mansoni, quatro regiões
morfologicamente distintas: boca, cavidade oral, esôfago e ceco (EBRAHIMZADEH;
KRAFT,1969).
Embora exista um sistema digestivo, há várias razões para este trato ser
considerado não-funcional como, por exemplo: a) não há evidências de ingestão oral,
nem atividade peristáltica; b) ausência de glicogênio no intestino (AXMANN, 1947); c)
nenhum desenvolvimento tem sido observado na cercária emergida.
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
32
2.4.6.5 Órgãos Secretores
A cercária possui um complexo sistema secretório e consiste de pelo menos três
diferentes tipos de glândulas: as pré e pós-acetabulares e as glândulas da cabeça.
Além das glândulas citadas, as cercárias antes de sair do caramujo, apresentam
também glândulas de escape. Essas glândulas tem fundamental importância no
processo de saída do caramujo e após a liberação do hospedeiro intermediário essas
glândulas desaparecem (EBRAHIMZADEH, 1970).
As glândulas pré-acetabulares, pós-acetabulares e a glândula da cabeça diferem
em localização, função, características histoquímicas, microscópica e ultra-estruturais
(EBRAHIMZADEH, 1970; MORRIS, 1971; DORSEY; STIREWALT, 1971; STIREWALT;
WALTERS, 1973).
A glândula pré-acetabular contém cálcio (STIREWALT; KRUIDNIER, 1961) e
enzimas (STIREWALT, 1974). As enzimas provavelmente estão relacionadas com a
degradação do tecido do hospedeiro auxiliando durante a penetração e migração dos
esquistossômulos (STIREWALT, 1974). Outro possível papel da secreção da glândula
pré-acetabular é na transformação da cercária em esquistossômulo (GAZZINELLI et al.,
1973).
A glândula pós-acetabular produz secreção que apresenta várias funções, entre
elas, a adesão da cercária à superfície do hospedeiro (STIREWALT, 1966;
STIREWALT;DORSEY, 1974), o muco produzido pode ser um importante fator na
transformação da cercária em esquistossômulo além de estar relacionado com a
proteção da mesma (STIREWALT; WALTERS, 1973). Com exceção da função adesiva,
as outras funções mencionadas anteriormente são apenas especulativas.
A glândula da cabeça é um órgão encontrado tanto na cercária como no
esquistossômulo (MORRIS, 1971), ela apresenta forma irregular com vários corpos de
inclusão (delimitados por membrana) de diferentes eletrondensidades. Ela está
localizada na região anterior da cercária e consiste em um fundo que se afila em um
sistema de ductos múltiplos que se abrem no tegumento da ventosa oral. De acordo
com Morris (1971) a glândula da cabeça libera grânulos, através dos ductos, em direção
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
33
ao tegumento na extremidade anterior da ventosa oral. Esses grânulos secretrórios
provavelmente fornecem material para reparo e reorganização do tegumento da
ventosa oral danificada após a penetração, contribuindo dessa forma, no
desenvolvimento da cercária até o esquistossômulo, já que o processo de penetração
pode ser destrutivo (DORSEY, 1976).
2.4.6.6 Sistema Excretório
Este sistema compreende as células flama periféricas, túbulos coletor primário e
secundário, um par de tubos coletores principal no corpo e um tubo simples na cauda,
bexiga excretória, átrio e poros excretórios, Figura 8 (GORDON et al., 1934; KUNTZ,
1950; KRUIDENIER, 1959; EBRAHIMZADEH; KRAFT, 1971; MEULEMAN, 1972).
Cel. Flama
Cel. Ciliadas
Principal canal coletor
Cel. Flama
Vesícula excretória
Poro Ex
cretor
F
igura
8
-
Desenho esquemático do sistema excretório da cercária
de
S. mansoni
Fonte: GORDON et al. (1934).
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
34
O desenvolvimento do sistema excretório inicia no embrião e surgem a partir de
uma massa oval de células (CHENG; BIER, 1972 ).
A ultra-estrutura da cercária de S. mansoni tem sido bem abordada resultando no
acúmulo de muitas informações (DORSEY et al., 2002), porém, apesar de ser bastante
importante correlacionar morfologia com composição química, a abordagem citoquímica
é ainda pouco explorada. A organização da cutícula do parasito e sua composição
bioquímica são de extrema importância para o entendimento do desenvolvimento do
parasito no hospedeiro devido a sua intrínseca relação com o processo imune do
hospedeiro. Estudos da composição química celular e dos processos biológicos em
nível molecular que ocorrem no interior dos parasitas, podem ser a chave para o
controle e eliminação das parasitoses. Sendo assim, as técnicas citoquímicas utilizadas
para microscopia eletrônica são de grande importância devido ao conhecimento e
localização de moléculas presentes nos parasitos e suas relações nos sistemas
biológicos, levando a um melhor entendimento da relação parasito-hospedeiro.
2.5 Citoquímica
Através de uma caracterização citoquímica é possível identificar a composição
bioquímica de um determinado sistema biológico e através da associação dessa técnica
à ultra-estrutura possibilita a identificação “in loco” de proteínas, carboidratos, lipídios
entre outros, permitido não só a identificação como também a localização e
quantificação desses compostos (SOUZA, 1998).
2.5.1 Localização de Lipídios Saturados
A composição lipídica de helmintos parasitas tem sido alvo de inúmeros estudos,
particularmente pelo fato deste elemento contribuir para sua proteção contra condições
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
35
desfavoráveis do meio (PEIXOTO et al., 1994; ARAÚJO et al., 1995), e ainda por serem
utilizados como moléculas de reserva energética, comunicação entre células e por
serem componentes estruturais das mesmas (BRADSHAW; WALKER, 2005).
Os esteróis de membranas podem ser detectadas por meio de um antibiótico
poliênico filipina. A filipina se liga ao colesterol e outros β-hidroxi-esteróis, formando
complexos filipina-colesterol. A ligação pode ser vista através de criofratura, MET
transmissão e varredura. O aspecto ondulado da marcação é característico da presença
de complexos filipina-esterol (SOUZA, 1998).
2.5.2 Localização de Lipídios Insaturados
A técnica citoquímica que permite a identificação de lipídios insaturados é a
técnica do tampão imidazol. Que através do complexo ósmio-imidazol facilita a
interação da molécula do tetróxido de ósmio com os lipídios insaturados, contrastando
fortemente as inclusões lipídicas. A rápida penetração nos tecidos e membranas
celulares e o aumento no contraste são devidos ao tampão utilizado na técnica
(SOUZA, 1998).
2.5.3 Localização de Partículas Carregadas Negativamente
Uma das formas de avaliar a natureza protéica da superfície dos parasitas têm
sido a utilização de partículas ligantes carregadas positivamente como a ferritina
(SOUZA et al., 1989; SOUZA, 2005).
O desenvolvimento da larva infectante de alguns helmintos parasitas é
acompanhada por mudanças na sua superfície (PROUDFOOT et al., 1993a, 1993b) e
foi sugerido que essas mudanças talvez sejam um sinal da progressão do
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
36
desenvolvimento ou uma adaptação para invadir o tecido que envolve o hospedeiro
(AKHKHA et al., 2004).
De acordo com Murrell et al. (1983), a presença de grupamentos aniônicos na
superfície de helmintos como os nematóides, possivelmente se relaciona com a
proteção contra dessecação. Além disso, esses grupamentos carregados
negativamente poderiam ativar o complemento via fator de Hageman ou fator XII da
coagulação, desencadeando reações inflamatórias.
2.5.4 Localização de Cálcio
Como os íons de cálcio desempenham papel de muita relevância em uma série
de atividades celulares, entre elas a contração muscular, o movimento de cílios e
flagelos, fenômenos de despolarização e secreção, ativação de microtúbulos e
microfilamentos, endocitose e exocitose, entre outras, é de grande interesse a
localização precisa na célula, bem como organelas envolvidas no seqüestro deste íon
(SOUZA, 1998).
Quando se tem por objetivo localizar sítios celulares que contenham cálcio pode-
se utilizar a técnica do piroantimoniato de potássio (SPICER et al., 1968), a técnica de
Oschman e Wall (1972) e a técnica de Hepler (1980) que utiliza o CaCl
2
no
glutaraldeído e a pós-fixação com tetróxido de ósmio com ferricianeto de potássio.
2.5.5 Localização de Proteínas Básicas
As proteínas constituem uma importante classe entre os componentes químicos
presentes na célula por desempenhar uma série de funções essenciais, entre as quais
constituir o principal elemento estrutural, enzimas e encontrar-se associado a outros
elementos importantes tais como lipídios, carboidratos, ácidos nucléicos, dentre outros.
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
37
A sua identificação e precisa localização permite que se conheça melhor os
mecanismos e função de determinado tipo e/ou estrutura celular. Desse modo,
atualmente a citoquímica tem auxiliado a identificação de proteínas (SOUZA, 1998).
A localização de proteínas pode ser feita através de tratamentos enzimáticos ou
através de técnicas específicas para reconhecimento de determinada classe de
proteínas como as básicas. Uma das proteínas básicas mais importantes são as
histonas que desempenham um importante papel e se encontram comprometidas numa
série de funções celulares tais como a diferenciação celular e a regulação da função
gênica de células eucarióticas (SOUZA, 1998).
Para a detecção de proteínas básicas em nível ultra-estrutural são utilizadas
principalmente, em citoquímica duas técnicas: a do PTA e a prata amoniacal. De acordo
com vários estudos aplicando-se as técnicas de prata amoniacal e do PTA em
diferentes tipos celulares, verificou-se que possuem especificidades diferentes, o PTA
revela proteínas ricas em histidinas e a prata amoniacal, arginina e lisina (SOUZA,
1998).
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
38
3 - JUSTIFICATIVA
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
39
A esquistossomose constitui um dos mais graves e complexos problemas de
saúde pública em nosso território devido à falta de uma vacina, às falhas na tentativa de
erradicar o molusco vetor e ao desenvolvimento de resistência do parasita às drogas
anti-esquistossomóticas (KALIFE et al., 2000).
Apesar de um século da sua descoberta e do grande número de pesquisas
desenvolvidas, a esquistossomose atinge 74 países, envolvendo milhões de pessoas
em países latino-americanos e africanos (MALAGUEÑO; SANTANA, 1994;
ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 1998).
No Brasil, a esquistossomose apresenta ampla distribuição e em Pernambuco, a
doença é historicamente endêmica na região rural apresentando, dos seus 115
municípios, 82 deles endêmicos para esta parasitose (COUTINHO et al., 1997;
FUNDAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE, 2001).
Mesmo com empenho de muitos pesquisadores e instituições de pesquisa de
várias partes do mundo, na busca de um possível controle, esta parasitose continua em
franca expansão. Apesar de vários trabalhos relacionados ao estudo da fase parasitária
responsável pela infecção, a cercária, nenhum deles enfocou a caracterização
citoquímica em nível ultra-estrutural.
Uma alternativa para identificar a base de processos críticos necessários ao
estabelecimento do parasita no hospedeiro é enfocar o estágio responsável pela
invasão primária, ou seja, o estágio infectante. Para isso, se faz necessária uma análise
citoquímica em nível ultra-estrutural para que se possa obter dados que certamente
deverão ser utilizados para o melhor entendimento da biologia do parasito bem como
esclarecer a intrigante relação parasito-hospedeiro.
Além disso, pelo fato da organização bioquímica da larva infectante de S.
mansoni estar relacionada com a sua funcionalidade a caracterização citoquímica pode
ser empregada para diferenciar cepas. Compreendendo melhor a composição
bioquímica é possível entender que características da larva infectante podem contribuir
para existência de cepas mais virulentas que outras.
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
40
4 - PERGUNTA CONDUTORA
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
41
Como estão distribuídos alguns componentes bioquímicos na cercária de
Schistosoma mansoni?
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
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5 - HIPÓTESE
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
43
A distribuição de alguns componentes bioquímicos na cercária de S. mansoni
está provavelmente relacionada com a função infectante da larva.
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
44
6 - OBJETIVOS
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
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6.1 Geral
a) Caracterizar ultra-estruturalmente alguns componentes bioquímicos da cercária
de S. mansoni utilizando técnicas citoquímicas.
6.2 Específicos
a) Caracterizar ultra-estruturalmente o tegumento da cercária de S. mansoni;
b) Identificar a presença e localização de lipídios saturados e insaturados;
c) Identificar a localização de proteínas básicas através das técnicas de PTA e prata
amoniacal;
d) Localizar sítios celulares de cálcio na larva de S. mansoni;
e) Investigar a presença de sítios aniônicos e caracterizar proteínas envolvidas na
carga através do tratamento enzimático.
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
46
7 - MATERIAIS, MÉTODOS E RESULTADOS
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
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Esta dissertação resultou em dois artigos. Cada um deles com sua metodologia
própria e resultados referentes aos objetivos específicos.
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
48
ARTIGO 1 -
For Peer Review
Cytochemical characterization of lipids in the cercaria of Schistosoma
mansoni
Journal: Parasitology
Manuscript ID: draft
Manuscript Type: Research Article
Date Submitted by the
Author:
n/a
Complete List of Authors: Cavalcanti, Marília; Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães,
Parasitologia
Araújo, Helena; Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães,
Parasitologia
Paiva, Marcelo; Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, Entomologia
Barbosa, Constança; Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães,
Parasitologia
Nascimento, Robson; Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães,
Parasitologia
Lima-Filho, José; Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami, LIKA
Brayner, Fabio; Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães,
Parasitologia
Alves, Luiz; Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, Parasitologia;
Universidade de Pernambuco, Parasitologia; Faculdade São Miguel,
Imunologia; Faculdade de Ciências Humanas da Olinda, Imunologia
Key Words:
Schistosoma mansoni, Cercaria, Ultrastructure , Cytochemistry,
Lipids
Parasitology
For Peer Review
Cytochemical characterization of lipids in the cercaria of Schistosoma mansoni
Cavalcanti, M. G. S; Araújo, H. C. R; Paiva, M. H. S. Barbosa, C. C. G. S.; Nascimento, R.C.;
Lima-Filho, J. L.; Brayner, F. A; Alves, L. C.
Departamento de Parasitologia, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (FIOCRUZ), Recife - PE, Brazil.
Departamento de Entomologia, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (FIOCRUZ), Recife - PE, Brazil.
Laboratório de Imunopatologia Prof°. Keizo Asami (LIKA) da Universidade Federal de Pernambuco, Recife -
PE, Brazil.
Faculdade São Miguel, Recife - PE, Brazil.
Faculdade de Ciências Humanas de Olinda (Facho), Olinda –PE, Brazil
Universidade de Pernambuco (UPE), Recife - PE, Brazil.
Corresponding author:
Marília Gabriela dos Santos Cavalcanti
Department of Parasitology
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/ FIOCRUZ
Av. Moraes Rego s/n, Campus da UFPE
CEP 50670-420, Recife, Pernambuco - Brazil.
E-mail address: [email protected]
Phone: +55 81 21012643
Fax: +55 81 34532449
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For Peer Review
Abstract
Lipidic composition of nematodes has been the objective of several studies, mainly because
this element contributes to protection against unfavorable environment condition, as
energetic storage, communication between cells and for being part of its structural
component. The objective of the present study was to identify, by using ultrastructural
cytochemistry, the presence and localization of saturated and insaturated lipids in
Schistosoma mansoni cercariae. For the saturated and insaturated lipid detection, it was
used, respectively, filipin and imizadol techniques. It was observed by transmission
microscopy the presence of cholesterol in tegument limiting the larva inner spaces. Such
stain was extremely evident in the muscle tissue of infecting larvae. By transmission and
scanning microscopy, we evidenced the presence of triglycerides and its sterols, in a
globular format, in all external regions of the infecting larva, as well as in others structures.
The lipid localization in the external region of the larvae may serve as a facilitator agent in
the host approximation. Besides, it may be related to the larvae protection against external
environment adversities (in the water and after the penetration in the definitive host);
possess a hydrostatic role and helping in the larvae locomotion decreasing the atrict with
the aquatic environment.
Keywords: Schistosoma mansoni, cercaria, ultrastructure, cytochemistry, lipids.
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Introduction
Schistossomosis is a disease spread worldwide, and representing in 3
rd
world
countries, one of the most important helmint infections. It is estimated that this disease
affects more than 200 million people living in tropical and sub-tropical countries. The
severity and organic deficit produced by such parasites makes this illness the most
important tropical disease behind malaria (WHO, 1998 ).
Cercaria represents the Schistosoma mansoni infecting stage, producing effects to
the host by penetrating skin and mucosal. This early stage is programmed to exist for only a
short period in the water and being specialized in executing locomotion functions, finding
the host, invading it and turning into sexually matured worms (Dorsey et al., 2002).
The ultrastructure of S. mansoni cercariae has been examined for many years,
resulting in an accumulation of information, however, the majority of such studies is
concentrated in organs and systems or in larvae limited areas, such as tegument (Dorsey et
al 2002).
Based on the evolution of this early stage to adult worms, the study of cercariae may
be understood as an investigation about the premature adult stage, because cercariae
germinal line cells will originate several worm organs (Dorsey et al., 2002).
The composition of nematode lipids, mainly the parasite ones, has been the
objective of many studies, particularly by the fact that this element contributes to is own
protection against unfavorable environment conditions (Peixoto et al., 1994; Araújo et al.,
1995), and still for being used as energetic storage molecules, communication between cell
and for being structural components of such nematodes (Bradshaw and Walker, 2005).
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For Peer Review
Two lipid types may be detected by Transmission Electronic Microscopy (MET):
esterols and storage lipids. Membrane esterols can be identified by polienic antibiotics. The
filipin attaches to cholesterols and other ȕ-hidroxi-esterols, forming multimolecular
complexes (filipin-cholesterol) that can be recognized by transmission microscopy (De
Souza, 1998).
Triglycerides accumulate in the cell cytoplasm under the shape of lipid inclusion.
After the routine fixation for MET, such inclusions present as circular structures, with a
homogenous matrix and the increase in contrast are due to the imidazol buffer used in this
technique (De Souza, 1998).
Although S. mansoni lipids have been quantified by Allan et al. (1987) and Furlong
and Caulfield (1988), no study has yet identified the localization “in locus” of such
components.
The objective of the present study is to characterize the saturated and insaturated
lipids of S. mansoni larvae and from such data, correlate it to the localization of such
constitutive with its function.
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For Peer Review
Materials e Methods
Cercariae: Infected Biomphalaria glabrata snails were submitted to an aquatic
environment, under artificial light at 28 ºC for 30 minutes, until cercariae release whose
strain is from Belo Horizonte – Brasil. The next step was the determination of parasitemic
load in order to perform experiments.
Transmission Electron Microscopy (TEM), Routine (DE SOUZA et al., 1989): Samples
were fixed in a 2.5% glutaraldehyde solution, 4% paraformaldehyde, 5mM CaCl
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in 0.1M
cacodylate buffer (pH 7.2), for two hours at room temperature, washed in the same buffer
and postfixed in 1% OsO
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in 0.1 M sodium cacodylate buffer (pH 7.2), for one hour. After
postfixation, samples were washed in the same buffer, counterstained in block with uranyl
acetate, once again washed and dehydrated in increasing series of acetone. The material
was infiltrated and embedded in Epon resin.
Scanning Electron Microscopy (VEM): Cercariae were washed and fixed in 2.5%
glutaraldehyde solution in 0.1M cacodylate buffer (pH 7.2), for two hours at room
temperature. Later on, samples were postfixed in 1% OsO
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in the same buffer, for one hour.
Samples went through the critical point and, subsequently labeled with gold particles and
finally observed in scanning microscopy, Jeol.
Cytochemistry
Imidazol (TEM): For lipid detection, cercariae were fixed in a 2.5% glutaraldehyde
solution and 2.5% paraformaldehyde in 0.1M cacodylate buffer (pH 7.2), samples were
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For Peer Review
washed with the same buffer and then washed in 0.1M imidazol buffer (pH 7.2), cercariae
were postfixed in a solution containing 2% OsO
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in 0.1M imidazol buffer, dehydrated in
acetone and embedded in Epon 812. Ultrathin sections were collected and visualized by
TEM, with no counterstain.
For the control group, all steps above mentioned were made, except the imidazol
buffer incubation.
Imidazol (SEM): For lipid detection using scanning electron microscopy, cercariae were
processed for the imidazol technique (above described), later on postfixed, washed and
dehydrated in ethanol. Samples went through point and metalized in gold before analysis.
Filipin (TEM): Cercariae were fixed for two hours in 2.5% glutaraldehyde solution and
0.1M cacodylate buffer (pH 7.2), later on the material was fixed and washed in the same
buffer, incubated for 60 minutes at room temperature in filipin solution, washed in 0.1M
cacodylate buffer (pH 7.2), postfixed for one hour (1% OsO
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in 0.1M cacodylate buffer)
and subsequently washed in the same buffer. The material was dehydrated in acetone (30,
50, 70, 90, 100, 100, 100%), embedded in Epon, sectioned and counterstained in uranyl
acetate and lead citrate. Alternatively, it is also possible to incubate the material with filipin
during fixing procedure. In this study, the material was fixed for one hour at room
temperature, with 2.5% glutaraldehyde solution and 0.1M cacodylate buffer (pH 7.2),
containing 50µg/ml filipin.
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Results
General morphology
Using the routine procedure, S. mansoni cercariae were analyzed by Transmission
Electronic Microscopy (Fig.1 A-B).
By transversal cut, we were able to detect the presence of spikes in the body´s
tegument and in the tail. Over the tegument, we evidenced the presence of basal lamina,
circular muscle and longitudinal. Inclusion bodies were identified in the sincicial cytoplasm
and presented itself in different shapes and electron-densities. In some of those inclusion
bodies, we could observe a higher electron-density in the inner periphery.
7.2 Localization of saturated lipids
The presence of a filipin-sterol complex in the circular muscles was observed after
the use of the filipin technique (Fig 2 A-D). Besides the muscular stain, we have identified
a reaction well-distributed delimiting some compartments of the infecting larvae. The
reaction was also observed in the nuclear membrane of subtegument-cells.
Although we have used two variations of the filipin technique (incubation of the
filipin in the fixing solution or after fixing it), we achieved the same results following the
two methodologies. However, the material processed using the filipin in the fixation
showed itself less preserved.
Localization of insaturated lipids
In our studies, using transmission electronic microscopy, was identified insaturated
lipids in the S. mansoni cercariae using the imidazol buffer. We observed such lipids in
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For Peer Review
globular shape in all external regions of the infecting larvae (Fig.3A). It was also evidenced
that such insaturated material was attached to the surface by a ligament, and the stain
pattern shows the presence of lipid in its constitution (Fig.3B). Besides the external region,
there was a stain in all cercaria tegument (Fig.3 A-C).
Regarding to the inner region of the larvae, it was observed the presence of
insaturated lipids in the head gland (not shown), pre-acetabular gland (not shown) and
inclusion bodies (Fig.3D).
Using the scanning microscopy, we also observed a globular stain pattern
distributed in the cercaria surface (Fig.4 D-F). This stain was evident in all body and tale of
the infecting larvae, being more evident in the two ventral suckers of the larva.
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For Peer Review
Discussion
The presence of lipids in nematodes has brought many questions due to its
innumerous functions that such component can perform.
Although the Z line is a prominent entity from the striated muscle, its composition
and function during the contraction remains unknown. The stain of the Z line after
processing by the filipin technique indicates the presence of lipids as cholesterol and its
esters in this structure. Such results are in accordance to the observation of Garamvolgyi
(Garamvolgyi, 1965, 1968 ; Harsanyi and Garamvolgyi, 1969), which after the removal of
the Z line with pancreatic lipase of insect muscles and rabbit skeletal muscle, suggested that
this line may contain besides proteins, lipidic components.
The technique used to detect insaturated lipids was the imidazol buffer, which
applies the osmium-imidazole complex. By using this technique it was possible to evidence
that some S. mansoni cercaria treated with imidazol buffer presented a strong stain in all
parasite surface. The use of a higher increase showed that the surface lipidic material is
connected to the larvae by a material that contains in its composition insaturated lipids,
however, with a different electrodensity.
According to Shiff et al. (1972), lipids presented in the human host skin influenciate
the S. mansoni and S. haematobium cercariae during the penetration. According to this
author, the infecting larva is stimulated by the presence of fatty acids displayed on the host
surface. Similarly, Stirewalt (1966) evidenced the importance of the host lipids as a
stimulus to the cercaria penetration.
With the presence of insaturated lipids on the cercaria surface, it is possible this
lipidic material works as a facilitator agent bringing the host closer, since the host also
presents lipids on its surface.
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Although the ultra-structural localization of insaturated lipids, our study did not
clarify where such components came from. However, considering that cercariae were
obtained a few hours after freed from the snail, it is possible that some insaturated lipids
evidenced by the imidazol buffer were from the invertebrate host. Therefore, our results
are in agreement with Ivanov (1950), which indicated thta the lipids presentes in the
cercaria body are synthesized from the fat absorbed from the intermediate host. Faust
(1917) elucidated experimentally the presence of lipids in the cytoplasm of the
hepatopancreas of infected snail. The results obtained by Faust were confirmed by Hurst
(1972) which also demonstrated a discrete increase of the lipidic material in Physa
occidentalis infected with Echinostoma revolutum.
Another possible function for the presence of lipidic small globules in the cercaria
surface is the possible correlation of the larvae protection to the external environment
adversity.
Considering that cercariae need to swim in order to reach the host, the presence of
insaturated lipids on its surface may influence the movement of the infecting larva since the
polar interaction of the water with apolar (lipid) allows a better slide of the cercaria in the
aquatic solution. This would be energetically in favor since the atrict with the water would
be reduced.
According to Ginecinskij (1961), the lipid presented in nematodes can also play a
hydrostatic role, because it reduces the body weight. The same author has also shown that
non-swimmer species did not present lipid, however small amounts could be observed in
sliding-species and a quite large amount in those species with swimming characteristics.
As previously established, it is known that cercariae do not feed in aquatic
environments and, it is possible that the energy storage may be correlated to the lipids. In
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For Peer Review
our study, as lipids were also found inside the infecting larva, such components may be
related to the energy storage after freed from the snails. Ginecinskij (1961), studying other
species as Opisthioglyphae ranae, Cotylurus brevis and Cercaria spinulosa, observed that
lipids are completely consumed during the larva get around and only Cercaari helvetica
presented a lipid decrease. In this study, the author has also observed that there is no lipid
storaged in cercaria which do not swim and there is a quite higher amount in active
cercaria, suggesting, therefore, a relation between the degree of activity and storage lipids.
The instaturated lipids were evidenced in the tegument, head gland, pré-acetabular
gland and inclucion bodies. One of the possible functions of the head gland if to provide
material to repare and reorganize the oral sucker tegument after the host penetration
(Hockley and McLaren, 1973). As we observer the presence of lipid material in the head
gland, it is possible that among repairing components insaturated lipids may be present.
The “in locus” localization of saturated and insaturated lipids provides solind
information to a better understanding over the functional role of these components in the
infecting larva. The information obtained in this study will, doubtless, be a useful tool in
designing more specific control methods against this S. mansoni stage.
Knowledments
This study was developed in the Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, Fundação
Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Conselho Nacional Científico e Tecnológico (CNPq) e
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami.
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For Peer Review
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For Peer Review
Figure 1
Tegument of Cercaria of S. mansoni
Routine procedure
Figure 1 (A
-
B)
-
Transmission electron micrograph of infective larvae of
S.
mansoni
. The following structures
are indicated: tegumet (t), spines (sp),
granule cercarial (cg), circular muscle (cm), longitudinal muscle (lm),
basal lamina (bl) nucleus of muscle cell (n)
, inclusions bodies (ib), multiciliated pit (mp) in the anterior organ.
Bar = 1ȝm , TEM.
n
A
B
t
t
sp
cg
cm
cm
lm
bl
n
ib
mp
sp
ib
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For Peer Review
Figure 2
Cercaria of S. mansoni
Cholesterol localization
Filipin technique
Figure 2 (A
-
D)
-
Ultrathin sections of cercaria of
S. mansoni
p
rocesse
d for the identification of saturated lipids
.
Transversal section showing reaction product, distributed in the circular muscles (arrows) besides of
reaction product
in the internal compartments of the infective larva (arrowheads). Bar A e B = 1ȝm, C e D = 2 ȝm, TEM.
A B
C D
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For Peer Review
Figure 3
Cercaria of S. mansoni
Localization of insaturated lipid (MET)
Techniques of imidazole buffer
T
A
T
*
*
*
*
T
Figure 3 (A
-
D)
-
Ultrathin sections of cercaria of
S. mansoni
postf
ixed in imidazole osmium tetroxide solution
.
Fig
A.
Transversal section showing reaction product, globular shape, uniformly distributed on the helminth surface (arrows).
Observe the reaction on the tegument (arrowhead). Fig. B, The unsaturated fatty acids
are bond in the cercaria surface.
Fig. C, Observe the reaction in the tegument (arrowheads). Fig. D
, Reaction product int the inclusion bodies (asterisks). T=
tegument, Bar= 4 ȝm, TEM.
B
D C
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For Peer Review
Figure 4
Cercaria of S. mansoni
Localization of insaturated lipid (VEM)
Techniques of imidazole buffer
Figure 4 (A
-
F)
–
Cercaria of
S. mansoni
observed by MEV. Fig
A
,
B
and
C
: cercaria control. Fig.
D
,
E
and
F
, cercaria processed for location of unsaturated lipids
(Technique of imidazole buffer), observe the presence of reaction product of globular shape in the body and tail. Fig. A = 1.300x, Fig.
B = 800x, Fig. C = 950x,
Fig. D= 2.000x, Fig. E = 4.000x, and Fig. F = 800x.
A
B
C
E D
F
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ARTIGO 2
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
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Ultrastructural and Cytochemical Aspects of the cercaria of Schistosoma
mansoni
a, b
Cavalcanti, M. G. S;
a
Araújo, H. C. R;
a
Pimentel, R.N.C.;
a
Barbosa, C. C. G. S.;
a
Nascimento, R.C.;
b
Lima-Filho, J. L.;
a b,c
Brayner, F. A;
a b,c,d
Alves, L. C.
a
Departamento de Parasitologia, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (FIOCRUZ),
Recife - PE, Brazil.
b
Laboratório de Imunopatologia Prof°. Keizo Asami (L IKA) da Universidade Federal de
Pernambuco, Recife - PE, Brazil.
c
Faculdade São Miguel, Recife - PE, Brazil.
d
Universidade de Pernambuco (UPE), Recife - PE, Brazil.
Corresponding author:
Marília Gabriela dos Santos Cavalcanti
Department of Parasitology
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/ FIOCRUZ
Av. Moraes Rego s/n, Campus da UFPE
CEP 50670-420, Recife, Pernambuco - Brazil.
E-mail address: [email protected]
Phone: +55 81 2101-2643
Fax: +55 81 2101-2516
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
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Resumo
Uma alternativa para identificar a base de processos críticos necessários ao
estabelecimento do parasito no hospedeiro é enfocar o estágio responsável pela
invasão primária, ou seja, a estrutura infectante. O enfoque deste trabalho foi realizar
uma caracterização ultra-estrutural da cercária de Schistosoma mansoni, através de
técnicas citoquímicas. Para a identificação de proteínas básicas foram empregadas as
técnicas do ácido fosfotungstico (PTA) e da Prata Amoniacal. Para localizar sítios de
cálcio utilizamos a técnica descrita por Hepler (1980) e para a evidenciar grupamentos
aniônicos empregamos ferritina cationizada além do tratamento enzimático com tripsina,
condroitinase e neraminidase de Vibrio cholerae. Através da PTA foi identificada a
presença de proteínas básicas no tegumento, núcleo e nucléolo de células
subtegumentares, corpos de inclusão e glândulas pré-acetabulares. Com a prata
amoniacal, identificamos forte marcação em toda larva infectante principalmente no
núcleo das células musculares, tecido muscular circular e glândulas pré-acetabulares. A
localização de sítios de cálcio mostrou-se bastante uniforme, demarcando os espaços
internos da larva, principalmente as células musculares. As amostras tratadas com
ferritina cationizada apresentaram uma forte marcação em nível cuticular. O tratamento
das amostras com a neuraminidase não alterou o padrão de marcação dessas
partículas na superfície do trematóide. Porém, o tratamento com tripsina ou
condroitinase resultou numa ausência de marcação na superfície da larva. O
esclarecimento da composição bioquímica da larva infectante de S. mansoni fornece
dados para um melhor entendimento a respeito da biologia do parasito bem como
fornecer subsídios para esclarecer a intrigante relação parasito-hospedeiro.
Palavras-chave: cercária de Schistosoma mansoni, citoquímica ultra-estrutural
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71
Introdução
A esquistossomose constitui um dos mais graves e complexos problemas de
saúde pública em nosso território devido à falta de uma vacina, às falhas na tentativa de
erradicar o molusco vetor e ao desenvolvimento de resistência do parasita às drogas
anti-esquistossomóticas (KALIFE et al., 2000).
Apesar de um século da sua descoberta e do grande número de pesquisas
desenvolvidas, a esquistossomose atinge 74 países, envolvendo milhões de pessoas
em países latino-americanos e africanos (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1998).
O controle desta helmintíase deve ser considerado sob dois aspectos, ou seja: o
da morbidade e o da transmissão. Para o controle da morbidade, que visa diminuir o
aparecimento de casos da forma grave, o diagnóstico e o tratamento são suficientes,
apesar de que o sucesso da quimioterapia no tratamento da esquistossomose em áreas
de alta prevalência não tem sido duradouro, havendo a rápida re-infecção. Em relação
à transmissão, apenas o tratamento das populações infectadas não é suficiente sendo
necessário também interromper o ciclo evolutivo do parasito no hospedeiro
intermediário (KATZ, 1980).
Mesmo com empenho de muitos pesquisadores e instituições de pesquisa de
várias partes do mundo, na busca de um possível controle, esta parasitose continua em
franca expansão. Apesar de vários trabalhos relacionados ao estudo da fase parasitária
responsável pela infecção, a cercária, nenhum deles enfocou a caracterização
citoquímica em nível ultra-estrutural.
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
72
Existem, na literatura, alguns trabalhos caracterizando morfologicamente a
cercária de S. mansoni, porém poucos correlacionam a morfologia com a composição
química da mesma.
Através de uma caracterização citoquímica é possível identificar a composição
bioquímica de um determinado sistema biológico e através da associação dessa técnica
à ultra-estrutura possibilita a identificação “in loco” de proteínas, carboidratos, lipídios
entre outros, permitido não só a identificação como também a localização e
quantificação desses compostos (SOUZA, 1998).
O presente artigo tem como objetivo localizar proteínas básicas, cálcio e sítios
aniônicos na cercária de S. mansoni utilizando técnicas citoquímicas aplicadas à ultra-
estrutura. A relação desses componentes bioquímicos e sua localização podem facilitar
na identificação de prováveis funções para estes constituintes.
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73
Materiais e Métodos
Parasitas: As cercárias de S. mansoni foram obtidas de caramujos da espécie
Biomphalaria glabrata. Estes moluscos eram infectados com miracíidos de S. mansoni ,
cepa Belo Horizonte, e mantidos no Laboratório de Esquistossomose, Centro de
Pesquisas Aggeu Magalhães, Recife, Brasil.
Ultra-estrutura: As amostras foram fixadas em glutaraldeído a 2,5%, paraformaldeído a
4%, CaCl
2
a 5mM em tampão cacodilato de sódio a 0,1M, pH 7,2, por 2 horas em
temperatura ambiente, lavadas no mesmo tampão e pós-fixadas em OsO
4
a 1% em
tampão cacodilato de sódio a 0,1M, pH 7,2, por 1 hora. Após a pós-fixação foram
lavadas no mesmo tampão, contrastadas em bloco com acetato de uranila a 2%,
lavadas novamente e desidratadas em séries crescentes de acetona. A infiltração e o
emblocamento foram realizados com a resina Epon.
Marcação Citoquímica
PTA: As cercárias foram fixadas (GA 2,5% em T. caco a 0,1M) overnight e lavadas em
T. Caco a 0,1M, após a lavagem, o material foi desidratado em concentrações
crescentes de etanol, em seguida, o material foi incubado em PTA a 2% em etanol
durante 24 a 72h, após a incubação, foi realizado a lavagem em etanol puro (2X, 10
min) e posteriormente, em etanol e acetona (1:1) por 10 min e acetona absoluta 2X por
10 min. Após a desidratação o material foi embebido e emblocado em Epon.
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
74
Prata Amoniacal: Após a obtenção das cercárias, as mesmas foram fixadas utilizando
o GA a 2.5% em tampão Caco a 0.1M. Após a fixação, o material foi lavado
exaustivamente em água destilada e posteriormente incubado por 5 min em uma
solução de prata amoniacal. Após a incubação foi realizada uma lavagem em água e
posteriormente o material foi incubado em formaldeído 3% durante 5 min, lavado em
água destilada e pós fixado em ósmio a 1%. Depois, as amostras foram processadas
para a rotina e observados no MET.
Cálcio: As cercárias obtidas foram lavadas e fixadas em glutaraldeído 2,5% em tampão
cacodilato 0,1M, pH 7,2 com CaCl2 5mM overnight a temperatura ambiente. Após a
fixação, o material foi lavado em T. Caco 0,1M, pH 7,2 contendo 10mM de cloreto de
cálcio durante 10 min (duas vezes). A pós-fixação foi realizada utilizando-se ósmio a 1%
em T. caco a 0,1M, pH 7,2 contendo 10mM de cloreto de cálcio e 0,8% de ferricianeto
de potássio durante 2h no escuro. Duas lavagens foram realizadas com T. Caco 0,1M
contendo 10mM de cloreto de cálcio durante 10 min. Em seguida, foi realizada a
contrastação em bloco, com acetato de uranila aquoso a 2% durante 2h. A desidratação
e a inclusão foram feitas como rotina.
Ferritina Cationizada: para localização de sítios aniônicos, os parasitas foram fixados
e depois incubados por 60 min em temperatura ambiente em uma solução contendo 1
mg/ml de partículas de ferritina cationizada, pH 7.2 (DANON et al. 1972). Após a
incubação, as amostras foram lavadas 03 vezes no mesmo tampão, desidratadas e
infiltradas com resina Epon.
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Tratamento enzimático: as cercárias foram incubadas por 5 min em uma solução
contendo 500 µg/ml de tripsina (Sigma tipo III, pH7,2 ) ou por 60 min na presença de
0.03 U/ml de neuraminidase de Vibrio cholerae (Sigma) em pH 6.0 ou por 18 h na
presença de 0.1 U/ml de condroitinase AB (Sigma) pH 8.0. Todos esses tratamentos
foram conduzidos em 37ºC sob agitação (SOUZA et al. 1989).
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
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Resultados
Morfologia Geral
Utilizando procedimento de rotina, as cercárias de S. mansoni foram analisadas
através do Microscópio Eletrônico de Transmissão (Fig. 1A). Foi evidenciado que a
mesma apresenta espinhos que são facilmente visíveis estando presentes tanto no
corpo como na cauda.
Sob o tegumento da cercária encontram-se, consecutivamente, a lâmina basal
(lb) e arranjo de músculos fibrosos circulares (mc) e longitudinais (ml). Ainda no
tegumento é possível evidenciar estruturas eletrondensas denominadas de corpos
cercarianos (Fig. 1A).
Corpos de inclusão (ib) podem apresentar formato esférico, alongado ou discóide
e apresentam, em geral, uma região central eletrondensa e região periférica translúcida
(Fig. 1A).
Localização de Proteínas Básicas (PTA e Prata Amoniacal)
Para a detecção de proteínas básicas, foram utilizadas as técnicas de PTA e
Prata Amoniacal. O material processado de acordo com PTA foi incubado no período
de 24 a 72 horas em (PTA a 2% em etanol puro). Através da técnica do ácido
fosfotúngstico foi identificado a presença de proteínas básicas no tegumento (Fig. 2A),
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
77
núcleo e nucléolo de células subtegumentares (Fig. 2B e C), corpos de inclusão (não
mostrado) e glândulas pré-acetabulares (Fig. 2D).
Utilizando a técnica de prata amoniacal, identificamos uma forte marcação sobre
toda a larva infectante (Fig. 3 A e B). Evidenciamos também, marcações no núcleo de
células musculares (não mostrado), tecido muscular circular (Fig. 3C) e nas glândulas
pré-acetabulares (Fig. 3D).
Localização de Cálcio
Através da técnica de Hepler (1980) que utiliza o CaCl
2
no glutaraldeído e a pós-
fixação com tetróxido de ósmio com ferricianeto de potássio, identificamos a presença
de sítios celulares que contém cálcio. A marcação ficou evidente em todo interior da
cercária. A distribuição mostra a presença de cálcio entre os compartimentos da larva,
indicando que há uma distribuição uniforme nos espaços internos da larva infectante
(Fig. 4A-B).
Tratamento Enzimático:
As amostras tratadas com ferritina cationizada apresentaram uma boa
preservação das estruturas internas e forte marcação em nível cuticular, mostrando
uma marcação uniforme em toda superfície (Fig. 5A). O tratamento das amostras com a
neuraminidase seguido de incubação com ferritina cationizada não alterou o padrão de
marcação dessas partículas na superfície do trematóide (Fig. 5A). Porém, o tratamento
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
78
com condroitinase (Fig. 5C) ou tripsina (Fig. 5D) resultou numa ausência de marcação
na superfície da larva infectante.
Discussão
No presente estudo, utilizamos duas técnicas citoquímicas (PTA e a prata
amoniacal) para detecção de proteínas básicas a nível ultra-estrutural. Apesar de ambas
as técnicas detectam proteínas básicas, as mesmas possuem diferentes especificidades,
o PTA revela proteínas ricas em histidinas e a prata amoniacal, arginina e lisina (SOUZA,
1998).
De acordo com a técnica de PTA identificamos a presença de proteínas básicas no
tegumento, núcleo e nucléolo de células subtegumentares, corpos de inclusão e
glândulas pré-acetabulares.
Como a técnica de PTA detecta proteínas ricas em histidina e estas estão
comprometidas numa série de funções celulares tais como a diferenciação celular e a
regulação da função gênica de células eucarióticas, a localização delas no núcleo e
nucléolo de células subtegumentares só confirmam a especificidade da reação.
De acordo com Dorsey et al. (2002) os corpos de inclusão originam-se do
complexo de golgi e apresentam como função a formação da membrana heptalaminar
externa. Como esta membrana apresenta em sua constituição proteínas, é possível que
muitas delas sejam básicas por se originarem dos corpos de inclusão.
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
79
Segundo o estudo realizado por Stirewalt (1959) as glândulas pré-acetabulares
apresentam secreções importantes na penetração da cercária no hospedeiro, tais
secreções possuem ação proteolítica. De acordo com nossos resultados, a marcação de
PTA nessas glândulas indicam a presença de proteínas básicas ricas em histidina que
podem estar relacionadas no processo de penetração do hospedeiro.
Utilizando a técnica de prata amoniacal, identificamos uma forte marcação sobre
toda a larva infectante. Evidenciamos também, marcações no núcleo de células
musculares, tecido muscular circular e assim como a PTA, as glândulas pré-acetabulares
também foram marcadas.
Os íons de cálcio desempenham papel de muita relevância em uma série de
atividades celulares e estão envolvidos com a contração muscular, o movimento de cílios
e flagelos, despolarização, secreção, ativação de microtúbulos e microfilamentos,
endocitose e exocitose (SOUZA, 1998).
Apesar de haver alguns trabalhos sobre a presença do cálcio na cercária,
nenhum fez esta abordagem ultra-estruturalmente. A elucidação da localização de
depósitos de cálcio na larva infectante em nível ultra-estrutural seria de extrema
importância, pois evidenciaria com detalhe a distribuição do íon e dessa forma torna-se
possível correlacionar a localização “in loco” com a função.
Em nosso trabalho ficou evidente a presença de cálcio em toda a região interna da
cercária. De acordo com a marcação, o íon está distribuído de forma regular, e parece
demarcar os espaços internos da larva infectante.
O cálcio foi evidenciado também nas glândulas pré-acetabulares (dados não
mostrados). Utilizando técnicas histoquímicas vários trabalhos identificaram a presença
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
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de cálcio nas glândulas pré-acetabulares (GORDON; GRIFFITH, 1951; STIREWALT,
1959). De acordo com Dresden e Asch (1977) o cálcio encontrado na glândula está
combinado formando o carbonato de cálcio. Este achado está embasado na análise da
secreção da glândula e na análise físico-química da cercária.
Vários estudos indicaram que o complexo enzima-secreção da cercária de S.
mansoni são responsáveis pelas alterações histológicas e histoquímicas do extrato
córneo e conecções acelulares das barreiras teciduais do hospedeiro durante a
passagem tecidual pela pele (LEWERT, 1958; STIREWALT, 1963). Existem várias
evidências de que algumas dessas enzimas estão presentes nas glândulas pré-
acetabulares e possuam ação proteolítica (STIREWALT, 1959). Alguns trabalhos têm
levantado a possibilidade dos íons de cálcio atuarem como ativadores enzimáticos nesse
processo.
A coloração seletiva de Alizarin Red S (ARS) pela glândula pré-acetabular
sugere que os íons de cálcio estão presentes na glândula. Utilizando Schiff Base, glyoxal-
bis (2 hydroxyanil), ou GBHA para a detecção citoquímica de íons de cálcio foi
evidenciado a presença do íon nas glândulas pré-acetabulares e ductos de S. mansoni ,
tal método é até mais específico para a detecção de íons de cálcio do que o ARS (Lewert
et al., 1966).
A observação do material liberado da cercária de S. mansoni após o estímulo
confirma as diferenças físicas e histoquímicas da composição das glândulas pré e pós-
acetabular. Essas diferenças no conteúdo das duas glândulas refletem as diferenças na
função, pois a secreção da glândula pós-acetabular tem função adesiva, de proteção e
ação enzimática, em contraste com a função lítica do conteúdo liberado pela glândula
pré-acetabular (LEWERT et al., 1966).
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
81
Utilizando técnicas físico-químicas Dresden e Edlin (1975) encontraram que cada
cercária apresenta em média cerca de 10 a 15ng de cálcio.
De acordo com Lewert e Lee (1954) o cálcio e/ou magnésio apresentam funções
similares. De acordo com os autores eles podem desempenhar funções semelhantes à
de uma co-enzima ou serem ativadores de enzimas líticas localizadas na secreção da
glândula. Além disso, existe uma correlação in vitro do efeito do cálcio, magnésio e íons
de zinco na atividade enzimática da cercária de S. mansoni, e o efeito in vivo na atuação
desses íons durante a penetração. Nesse estudo foi constatado que o sucesso na
penetração da cercária depende da concentração de íons na água. Isso pode explicar,
em parte, as diferentes taxas de infecção encontradas em vários laboratórios.
Murrel et al (1983) relacionaram a presença de grupamentos carregados
negativamente na superfície de nematódeos com a proteção contra a dessecação. Por
outro lado, é possível que tais grupamentos ativem o sistema complemento via fator de
Hageman ou fator VII da coagulação, e conseqüentemente, desencadeando reações
inflamatórias.
Utilizando ferritina cationizada, pH 7,2 observamos a presença de sítios
aniônicos associados com a camada externa da larva. Esses resultados são similares
aos observados em outros helmintos: L3 de Wuchereria bancrofti (SILVA et al 2006),
Strongyloides ratti e Trichinella spirallis (MURREL et al. 1983).
O tratamento das amostras com a neuraminidase seguido de incubação com
ferritina cationizada não alterou o padrão de marcação dessas partículas na superfície
do trematóide. Nossos resultados utilizando a neuraminidase de elevada especificidade
indicam que o grupamento carboxílico não está envolvido na carga de superfície da
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
82
cercaria de S. mansoni. Estes resultados estão de acordo com o que foi observado por
Himmelhoch e Zucherman (1978) trabalhando com C. briggsae.
O tratamento com tripsina resultou numa ausência de marcação, esta
observação indica que ao contrário do que é encontrado em outros sistemas biológicos,
as glicoproteínas sensíveis a tripsina devem estar contribuindo de forma significativa na
superfície negativa da cercária (SOUZA, 1989).
Os resultados também evidenciam que o tratamento nas cercárias in vivo com
condroitinase AB, que possui especificidade para os glicosaminoglicanos condroitina-4-
sulfato (A) e dermatan sulfato (B) inibe a ligação com partículas cationizadas de
ferritina. Esta observação sugere que a presença de glicosaminoglicanas no tegumento
da cercária de S. mansoni. Porém, mais estudos bioquímicos são necessários para
confirmar esta observação citoquímica.
Através da análise de proteínas básicas, cálcio e grupamentos aniônicos na
cercária de S. mansoni pudemos concluir que a localização desses compostos está
fortemente relacionados às diversas funções da larva que vão desde a locomoção para
encontro do hospedeiro até mesmo a sobrevivência dessas cercárias no ambiente.
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
83
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Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
85
Figura 1
Cercária de S. mansoni
Processamento de Rotina
Controle
A
gc
t
sp
ci
n
lb
Fig. 1 A
: Cercária de S. mansoni
processada para rotina. Observar, no
tegumento (t), a presença de espinhos (sp) e grânulos cercarianos (gc).
Abaixo do tegumento, a lâmina basal (lb
), presença de corpos de inclusão
(ci) e núcleo de células subtegumentares (n), Barras= 1
µm.
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
86
Figura 2
Cercária de S. mansoni
Localização de Proteínas Básicas
PTA
Fig.2 A
-
D
, Cortes transversais da cercárias de S. mansoni
submetidas à PTA para a detecção de
proteínas básicas. Na fig. A, marcação de PTA sobre todo o tegumento, Fig. B-C, marcação no
núcleo (N) de células subtegumentares. Na Fig. D, marcação (setas
) de proteína básica na glândula
pré-acetabular. Barras A e C = 0,5
µm, Barras B e D = 1 µm
B
D
A
C
N
T
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
87
Figura 3
Cercária de S. mansoni
Localização de Proteínas Básicas
Técnica da Prata Amoniacal
Fig 3 A
-
D.
Cortes transversais da cercarias de S. mansoni processadas segundo a
técnica da
Prata Amoniacal. Marcação (setas) sobre toda a larva infectante (Fig. A e B), presença
de
proteínas básicas (setas) no tecido muscular circular (mc) (Fig. C) e nas glândulas pré-
acetabulares (setas), Fig. D. Barra A= 0,5
µm e Barras B-D = 2 µm
A B
C D
mc
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
88
Figura 4
Cercária de S. mansoni
Localização de Cálcio
Técnica de Hepler
Fig. 4 A
-
B:
Cortes transversais da cercária de S. mansoni
processadas segundo a
técnica de Hepler. A marcação (setas)
ficou evidente em todo interior da cercária. A
distribuição mostra a presença de cálcio entre os compartimentos da larva infectante.
Barras= 2
µm, MET.
A B
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
89
Figura 5
Cercária de S. mansoni
Localização de Cargas Aniônicas
Fig. A
– Cercária de S. mansoni processadas para
detecção de sítios
aniônicos, observa-se uma marcação uniforme na superfície (setas). Fig. B –
Tratamento com neuraminidase permitiu uma ligação com partículas catiônicas
(seta). Fig. C –
Tratamento com condroitinase AB, aboliu completamente a
ligação com partículas catiônicas. Fig. D –
Tratamento com tripsina inibiu
totalmente a ligação com partículas de ferritina. Barras = 1
µm.
A B
C D
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
90
DISCUSSÃO
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
91
A presença de lipídios nos nematóides tem atraído muita atenção devido às
inúmeras funções que este componente pode desempenhar.
Apesar da linha Z ser uma entidade proeminente do músculo estriado, sua
composição e função durante a contração permanece incerta. A marcação da linha Z
após o processamento pela técnica de filipina indica a presença de lipídios como
colesterol e seus ésteres nessa estrutura. Tais resultados estão de acordo com as
observações de Garamvolgyi (1965, 1968) e Harsanyi e Garamvolgyi (1969) que após a
remoção da linha Z com lipase pancreática de músculos de insetos e músculos
esqueléticos de coelhos sugeriram que esta linha possa ter além de proteínas,
componentes lipídicos.
Takahashi et al., (2001) identificaram que os principais lipídios encontrados na
linha Z foram: fosfolipídios, triacilgliceróis, colesterol e ácidos graxos livres. Foi descrito
também que tais lipídios provavelmente estejam servindo como agentes auxiliadores na
estruturação eletrostática de filamentos Z vizinhos, além disso, esses lipídios
reforçariam a estrutura da linha Z e desempenhariam um papel importante na
transmissão da força muscular.
Como identificamos também a presença de lipídios saturados na cercária de S.
mansoni esse material lipídico certamente estará contribuindo estruturalmente na
especialidade da larva infectante que é o processo de locomoção.
A técnica utilizada para a detecção de lipídios insaturados foi a do tampão
imidazol que emprega o complexo ósmio-imidazol. Através da utilização desta técnica
foi possível evidenciar que as cercárias de S. mansoni tratadas com tampão imidazol
apresentaram uma forte marcação em toda a superfície do parasito. Utilizando um
maior aumento ficou claro que o material lipídico de superfície está conectado a larva
através de um material que possui na sua composição lipídios insaturados, porém, com
eletrondensidade diferente.
Shiff et al. (1972) identificaram que lipídios presentes na pele do hospedeiro
humano influenciam a cercária de S. mansoni e S. haematobium durante a penetração.
De acordo com seus estudos, a larva infectante é estimulada pela presença de ácidos
graxos na superfície do hospedeiro. Da mesma forma, Stirewalt (1966) evidenciou a
importância de lipídios do hospedeiro como estímulo para as cercárias na penetração.
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
92
Como há lipídios insaturados na superfície da cercária é possível que este
material lipídico esteja servindo como um agente facilitador na aproximação com o
hospedeiro já que o mesmo também apresenta lipídio na superfície da pele.
Apesar da localização ultra-estrutural de lipídios insaturados, o nosso trabalho
não deixou claro de onde surgiu este componente. Porém, como as cercárias foram
obtidas poucas horas após a liberação do caramujo, é possível que os lipídios
insaturados evidenciados pela técnica do tampão imidazol sejam adquiridos do
hospedeiro invertebrado. Dessa forma, nossos resultados estão de acordo com Ivanov
(1950) que indicou que os lipídios presentes no corpo da cercária são sintetizados a
partir da gordura absorvida do hospedeiro intermediário. Faust (1917) através de
experimentos elucidou a presença de lipídios no citoplasma das células do
hepatopâncreas de caramujos infectados. Os resultados obtidos por Faust foram
confirmados por Hurst (1927) que também demonstrou um discreto aumento do
material lipídico em Physa occidentalis infectado com Echinostoma revolutum.
Outra possível função da presença de gotículas lipídicas na superfície cercariana
é que estas podem estar relacionadas com a proteção da larva às adversidades do
meio externo.
Como a cercária precisa nadar até chegar o hospedeiro a presença de lipídios
insaturados na superfície poderia facilitar durante a locomoção da larva infectante na
água já que a interação polar da água com apolar (lipídio) permite um melhor
deslizamento da cercária na solução aquosa. Isso seria energeticamente mais favorável
já que o atrito com a água seria menor.
De acordo com Ginecinskij (1961) o lipídio presente em nematóides pode
desempenhar também um papel hidrostático, pois diminui o peso do corpo. Ele mostrou
que em espécies não-nadadoras não foi encontrado lipídio, porém o mesmo pôde ser
encontrado em pequenas quantidades em espécies que deslizam e uma quantidade
relativamente grande naquelas que apresentam uma ativa função nadadora.
Como as cercárias não se alimentam no meio aquático é possível que o estoque
de energia possa estar associado aos lipídios. Em nossos estudos como os lipídios
também foram encontrados no interior da larva infectante, estes componentes podem
estar envolvidos com a reserva energética da mesma após sua saída do caramujo.
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
93
Ginecinskij (1961) ao estudar outras espécies como: Opisthioglyphae ranae, Cotylurus
brevis e Cercaria spinulosa observou que os lipídios são completamente consumidos
durante a locomoção da cercária e apenas a espécie Cercaari helvetica apresentou
uma diminuição dos lipídios. Nesse estudo o autor observou também que não há
nenhum lipídio estocado em cercárias que não nadam e há uma quantidade
relativamente maior em cercárias ativas, sugerindo, dessa forma, uma relação entre o
grau de atividade e lipídios estocados.
Os lipídios insaturados foram evidenciados no tegumento, glândula da cabeça,
glândula pré-acetabular e corpos de inclusão. Uma das possíveis funções da glândula
da cabeça é prover material para reparar e reorganizar o tegumento da ventosa oral
após a penetração no hospedeiro (HOCKLEY; MCLAREN, 1973). Como observamos a
presença de material lipídico na glândula da cabeça, é possível que entre os
componentes reparadores existam lipídios insaturados.
A localização “in loco” dos lipídios saturados e insaturados ajudam no melhor
entendimento sobre o papel funcional desse componente na larva infectante. O
conhecimento proporcionado a partir deste estudo é sem dúvida uma importante
ferramenta para que se possam traçar métodos de controle ainda mais específicos
contra esta fase evolutiva do S. mansoni.
Para a detecção de proteínas a nível ultra-estrutural utilizamos duas técnicas
citoquímicas: E-PTA e a prata amoniacal. Ambas as técnicas detectam proteínas
básicas, mas possuem diferentes especificidades, o E-PTA revela proteínas ricas em
histidinas e a prata amoniacal, arginina e lisina (SOUZA, 1998).
Utilizando a técnica de PTA identificamos a presença de proteínas básicas no
tegumento, núcleo e nucléolo de células subtegumentares, corpos de inclusão e
glândulas pré-acetabulares.
Como a E-PTA detecta proteínas ricas em histidina e estas estão
comprometidas numa série de funções celulares tais como a diferenciação celular e a
regulação da função gênica de células eucarióticas, a localização delas no núcleo e
nucléolo de células subtegumentares só confirmam a especificidade da reação.
Dorsey et al. (2002) identificaram que corpos de inclusão, presentes no
tegumento cercarial originam-se do complexo de golgi e apresentam como função a
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
94
formação da membrana heptalaminar externa. Como esta membrana apresenta em sua
constituição proteínas, é possível que muitas delas sejam básicas por se originarem dos
corpos de inclusão.
Segundo o estudo realizado por Stirewalt (1959) as glândulas pré-acetabulares
apresentam secreções importantes na penetração da cercária no hospedeiro, tais
secreções possuem ação proteolítica. De acordo com nossos resultados, a marcação
de E-PTA nessas glândulas indicam a presença de proteínas básicas ricas em histidina
que podem estar relacionadas no processo de penetração do hospedeiro.
Utilizando a técnica de prata amoniacal, identificamos uma forte marcação
sobre toda a larva infectante. Evidenciamos também, marcações no núcleo de células
musculares, tecido muscular circular e assim como a E-PTA, as glândulas pré-
acetabulares também foram marcadas.
Os íons de cálcio desempenham papel de muita relevância em uma série de
atividades celulares e estão envolvidos com a contração muscular, o movimento de
cílios e flagelos, despolarização, secreção, ativação de microtúbulos e microfilamentos,
endocitose e exocitose (SOUZA, 1998).
Apesar de haver alguns trabalhos sobre a presença do cálcio na cercária,
nenhum fez esta abordagem ultra-estruturalmente. A elucidação da localização de
depósitos de cálcio na larva infectante em nível ultra-estrutural seria de extrema
importância, pois evidenciaria com detalhe a distribuição do íon e dessa forma torna-se
possível correlacionar a localização “in loco” com a função.
Em nosso trabalho ficou evidente a presença de cálcio em toda a região interna
da cercária. De acordo com a marcação, o íon está distribuído de forma regular, e
parece demarcar os espaços internos da larva infectante.
O cálcio foi evidenciado também nas glândulas pré-acetabulares (dados não
mostrados). Utilizando técnicas histoquímicas vários trabalhos identificaram a presença
de cálcio nas glândulas pré-acetabulares (GORDON; GRIFFITH, 1951; STIREWALT,
1959). De acordo com Dresden e Asch (1977) o cálcio encontrado na glândula está
combinado formando o carbonato de cálcio. Este achado está embasado na análise da
secreção da glândula e na análise físico-química da cercária.
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
95
Vários estudos indicaram que o complexo enzima-secreção da cercária de S.
mansoni são responsáveis pelas alterações histológicas e histoquímicas do extrato
córneo e conecções acelulares das barreiras teciduais do hospedeiro durante a
passagem tecidual pela pele (LEWERT, 1958; STIREWALT, 1963). Existem várias
evidências de que algumas dessas enzimas estão presentes nas glândulas pré-
acetabulares e possuam ação proteolítica (STIREWALT, 1959). Alguns trabalhos têm
levantado a possibilidade dos íons de cálcio atuarem como ativadores enzimáticos
nesse processo.
A coloração seletiva de Alizarin Red S (ARS) pela glândula pré-acetabular
sugere que os íons de cálcio estão presentes na glândula. Utilizando Schiff Base,
glyoxal- bis (2 hydroxyanil), ou GBHA para a detecção citoquímica de íons de cálcio foi
evidenciado a presença do íon nas glândulas pré-acetabulares e ductos de S. mansoni,
tal método é até mais específico para a detecção de íons de cálcio do que o ARS
(LEWERT et al., 1966).
A observação do material liberado da cercária de S. mansoni após o estímulo
confirma as diferenças físicas e histoquímicas da composição das glândulas pré e pós-
acetabular. Essas diferenças no conteúdo das duas glândulas refletem as diferenças na
função, pois a secreção da glândula pós-acetabular tem função adesiva, de proteção e
ação enzimática, em contraste com a função lítica do conteúdo liberado pela glândula
pré-acetabular (LEWERT et al., 1966).
Utilizando técnicas físico-químicas Dresden e Edlin (1975) encontraram que
cada cercária apresenta em média cerca de 10 a 15ng de cálcio.
De acordo com Lewert e Lee (1954) o cálcio e/ou magnésio apresentam
funções similares. De acordo com os autores eles podem desempenhar funções
semelhantes à de uma co-enzima ou serem ativadores de enzimas líticas localizadas na
secreção da glândula. Além disso, existe uma correlação in vitro do efeito do cálcio,
magnésio e íons de zinco na atividade enzimática da cercária de S. mansoni, e o efeito
in vivo na atuação desses íons durante a penetração. Nesse estudo foi constatado que
o sucesso na penetração da cercária depende da concentração de íons na água. Isso
pode explicar, em parte, as diferentes taxas de infecção encontradas em vários
laboratórios.
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
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Murrel et al (1983) relacionaram a presença de grupamentos carregados
negativamente na superfície de helmintos com a proteção contra a dessecação. Por
outro lado, é possível que tais grupamentos ativem o sistema complemento via fator de
Hageman ou fator VII da coagulação, e conseqüentemente, desencadeando reações
inflamatórias.
Utilizando ferritina cationizada, pH 7,2 observamos a presença de sítios
aniônicos associados com a camada externa da larva. Esses resultados são similares
aos observados em outros helmintos: L3 de Wuchereria bancrofti (SILVA et al 2006) e
Strongyloides ratti and Trichinella spirallis (MURREL et al. 1983).
O tratamento das amostras com a neuraminidase seguido de incubação com
ferritina cationizada não alterou o padrão de marcação dessas partículas na superfície
do trematóide. Nossa observação utilizando a neuraminidase de elevada especificidade
indica que grupamentos carboxílicos não estão envolvidos na carga de superfície da
cercaria de S. mansoni. Estes resultados estão de acordo com o que foi observado por
Himmelhoch e Zucherman (1978) trabalhando com C. briggsae.
O tratamento com tripsina resultou numa ausência de marcação, esta
observação indica que ao contrário do que é encontrado em outros sistemas biológicos,
as glicoproteínas sensíveis a tripsina devem estar contribuindo de forma significativa na
superfície negativa da cercária.
Os resultados também evidenciam que o tratamento nas cercárias in vivo com
condroitinase AB, que possui especificidade para condroitina-4-sulfato e dermatan
sulfato (B) inibe a ligação com partículas cationizadas de ferritina. Esta observação
sugere que a presença de glicosaminoglicanas no tegumento da cercária de S.
mansoni. Porém, mais estudos bioquímicos são necessários para confirmar esta
observação citoquímica.
Através da análise de proteínas básicas, cálcio e grupamentos aniônicos na
cercária de S. mansoni pudemos concluir que a localização desses compostos está
fortemente relacionados às diversas funções da larva que vão desde a locomoção para
encontro do hospedeiro até mesmo a sobrevivência dessas cercárias no ambiente.
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CONCLUSÕES
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
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1. Lipídios saturados foram evidenciados nos músculos circulares, principalmente na
linha Z. Além da marcação muscular foi observada uma reação bem distribuída
delimitando alguns compartimentos da larva infectante.
2. Lipídios insaturados foram encontrados em todo tegumento, glândula da cabeça,
glândula pré-acetabular e corpos de inclusão da cercária de S. manosoni.
Provavelmente estão relacionados ao processo de locomoção, aproximação com o
hospedeiro, proteção contra a perda de líquidos além de ter um papel hidrostático.
3. Através da técnica de PTA identificamos a localização de proteínas básicas no
tegumento, núcleo e nucléolo de células subtegumentares, corpos de inclusão e
glândulas pré-acetabulares. Utilizando a técnica de prata amoniacal identificamos a
localização de proteínas básicas sobre toda a larva infectante, núcleo de células
musculares, tecido muscular circular e nas glândulas pré-acetabulares.
4. Sítios celulares que contém cálcio foram identificados na cercária de S. manosoni e
estão distribuídos de forma uniforme nos espaços internos.
5. Através de ferritina cationizada foi possível evidenciar a presença de sítios aniônicos
na superfície da larva infectante de S. mansoni. A ausência de marcação após o
tratamento enzimático com tripsina e condroitinase AB indicam que glicoproteínas e
glicosaminoglicanos específicos para tripsina e condroitinase respectivamente podem
estar conferindo a carga aniônica.
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
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Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
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Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
110
ANEXOS
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
111
ANEXO A: Parecer da Comissão de Ética
Cavalcanti, M.G.S.. Caracterização citoquímica...
112
ANEXO B: Confirmação de Submissão do Artigo, Revista: Parasitology
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