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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DANIEL MACEDO DE MELO JORGE
Busca de inibidores naturais contra o veneno de Apis mellifera
Ribeirão Preto - SP
2008
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DANIEL MACEDO DE MELO JORGE
Busca de inibidores naturais contra o veneno de Apis mellifera
Ribeirão Preto - SP
2008
Dissertação de mestrado apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo, para obtenção do título de Mestre em Ciências.
Área de concentração: Genética.
Orientador: Profa. Dra. Silvana Giuliatti
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FICHA CATALOGRÁFICA
Jorge, Daniel Macedo de Melo
Busca de inibidores naturais contra o veneno de Apis
mellifera, São Paulo. Ribeirão Preto, 2008.
p. 142 : il. ; 30cm
Dissertação de mestrado, apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto/USP – Área de concentração:
Genética.
Orientador: Giuliatti, Silvana.
1. Apis. 2. banco de dados. 3. Fosfolipase. 4. Melitina. 5.
Docking. 6. Antiveneno.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Daniel Macedo de Melo Jorge
Busca de inibidores naturais contra o veneno de Apis mellifera.
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, para
obtenção do título de Mestre em Ciências.
Área de concentração: Genética
Aprovada em:
Banca examinadora
Prof. Dr. ____________________________________________________________
Instituição:_____________________ Assinatura:____________________________
Prof. Dr. ____________________________________________________________
Instituição:_____________________ Assinatura:____________________________
Prof. Dr. ____________________________________________________________
Instituição:_____________________ Assinatura:____________________________
Dedicatória
Aos meus pais, Luquesio Petrola de Melo Jorge e
Katia Macedo de Melo Jorge,
pela educação, apoio, dedicação e contribuição,
sempre presentes de forma decisiva
em simplesmente todos os momentos.
Aos meus irmãos, Karina e Felipe, pelo apoio e carinho.
Ao meu grande amor Luiza por toda a ajuda, apoio,
carinho, que sem seu auxilio seria impossível
realizar o trabalho, sempre presente em todos os momentos,
me apoiando ou simplesmente estando perto,
isso fez toda a diferença nos momentos mais difíceis,
te admiro e sempre serei grato a você e
te quero sempre ao meu lado. Muito obrigado por tudo
Amo vocês!!!
Agradecimentos
Primeiramente a DEUS, por tudo!
Em especial a Profa. Dra. Silvana Giuliatti, pela orientação, grande paciência,
companheirismo, apoio e por ter me proporcionado as condições para desenvolver esse
trabalho;
Aos membros da banca examinadora da minha dissertação pela atenção, discussão
e sugestões que enriqueceram este trabalho;
Ao Prof. Dr. Andreimar Martins Soares pela orientação, pelo apoio e por permitir a
realização dos experimentos em seu laboratório;
Ao Prof. Dr. Carlos Henrique Tomich de Paula da Silva pelo apoio e por permitir a
realização das análises em seu laboratório;
Ao CNPq pela concessão bolsa de mestrado, e à Fundação de Amparo a Pesquisa
do Estado de São Paulo – FAPESP pelo suporte financeiro, sem os quais seria impossível a
realização desta pesquisa;
Ao Clayton Zambeli Oliveira pela amizade e companheirismo, pelo auxílio, ajuda e
apoio durante todos os experimentos no Laboratório de Toxinas Animais e Inibidores
Naturais e Sintéticos, sua ajuda foi imprescindível para realização dos experimentos;
Ao Renato David Puga pela amizade, companheirismo, viagens, apoio, suporte,
paciência em todas as minhas duvidas computacionais sua ajuda foi muito importante no
desenvolvimento do sistema;
Ao Vinicius Barreto da Silva pela amizade, auxílio, ajuda e apoio durante todos os
experimentos no Laboratório de Química Medicinal de Produtos Sintéticos e Naturais, sua
ajuda foi essencial para realização das análises na bioinformática estrutural;
Ao Curso de pós-graduação em Genética da FMRP – USP, na pessoa de seus
Professores e Funcionários pelos ensinamentos e pela convivência;
Às secretárias da pós-graduação Susie Adriana Penha Nalon e Maria Aparecida
Oliveira Silva Elias, pela eficiência, pelo permanente apoio, amizade e orientação durante
todo o período do mestrado;
Ao Professor Dr. Ademilson Espencer Egea Soares pela amizade, ajuda, apoio e
orientação nas diversas comissões em que participei. Sempre motivando os alunos e
apoiando em todas as atividades;
À Profa. Dra. Catarina Satie Takahashi pela amizade, ajuda e apoio em todas as
atividades realizadas no departamento;
À Profa Dra. Elza Tiemi Sakamoto Hojo pela amizade e apoio;
Ao Prof. Dr. Victor Evangelista de Faria Ferraz pela amizade, apoio e orientação
durante o estagio PAE;
Ao grande amigo Andre Breve pelo apoio, conversas, amizade, companheirismo,
sempre presente, um amigo para todos os momentos;
Ao Luciano Bernardes um grande amigo sempre sério, mas sabe ser engraçado e
divertido nos momentos adequados;
Aos amigos de laboratório que fazem parte do grupo de Bioinformática: Gabi,
Gustavo, Pablo, Saulo, Vitor, Mariana, Alynne e as outras pessoas que já passaram pelo
nosso laboratório;
À grande amiga Ana Claudia Teixeira por toda amizade, conversas, discussões,
brincadeiras, mas sempre apoiando e ajudando presente em todos os momentos, uma
amiga muito importante e companheira de mestrado;
À amiga Aline Poersch pela amizade, conversas, apoio e todas as risadas e
momentos de descontração;
Aos amigos Cristiano Profeta e Raquel Alves por toda a amizade, conversas e
companheirismo;
Aos grandes colegas do Bloco G: Ana Paula, Paulo Roberto, Igor Magela, Stephano
Spanó, Patrícia Carminati, Danilo Jordão, Douglas Oliveira, Maria Sol, Giovana da Silva,
Danillo Lucas, Paula Lumy, Leonardo Pereira, Junior e Sueli;
A todos os colegas do Laboratório de Toxinas Animais e Inibidores Naturais e
Sintéticos;
A todos os colegas do Laboratório de Química Medicinal de Produtos Sintéticos e
Naturais;
Aos meus grandes amigos de Fortaleza, que apesar da distância continuam ser
grandes amigos: Joel, Luciana, Igor, Davi, Carlos Eduardo e tantos outros que sempre
fizeram parte da minha vida;
Aos grandes colegas Virologistas: Alberto, Liz, Juliana, Vanessa, Glauciane, Viviane,
Alessandra; Dani, Emiliana, Keny, Kleber, Maira, Mariana, Rafael, Teresa, Paula e Camila
O meu muito obrigado!
" Cada segundo é tempo para mudar tudo para sempre."
Charles Chaplin
RESUMO
JORGE, D. M.M. Busca de inibidores naturais contra o veneno de Apis mellifera. 2008.
142 f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de
São Paulo, Ribeirão Preto, 2008.
Os insetos são os mais numerosos animais encontrados no mundo, com mais de 675 mil
espécies conhecidas. Pertencentes à ordem Hymenoptera, da superfamília Apoidea, as
abelhas são encontradas distribuídas em aproximadamente 20 mil espécies. No Brasil
estima-se que existam 1.700 espécies. Uma das principais espécies é a Apis mellifera, com
ocorrência cosmopolita. A Apis mellifera, popularmente conhecida como abelha
africanizada, é agressiva, enxameia várias vezes ao ano e utiliza uma grande variedade de
locais para nidificar. Esse comportamento aumenta o contato direto entre o inseto e a
população, aumentando o número de acidentes. Os acidentes com abelhas representam um
problema de saúde pública em diversos países do mundo pela freqüência com que ocorrem
e pela mortalidade que ocasionam. O presente estudo propõe a busca por inibidores
naturais contra o veneno de abelhas. Um sistema e uma base de dados foram
desenvolvidos para a integração entre dados de plantas medicinais antivenenos e os
venenos de abelhas. As atividades anti-hemorrágica, anti-proteolítica, anti-miotóxica, anti-
fosfolipase e anti-edema de plantas medicinais antiveneno foram analisadas por meio de
ensaios farmacológicos. As possíveis interações entre as toxinas Melitina e Fosfolipase A2
com inibidores foram avaliadas, através do docking virtual. O banco de dados, denominado
Bee Venom, foi implementado e os dados de bancos de dados públicos foram inseridos no
sistema. O sistema foi liberado para acesso público no endereço eletrônico
http://gbi.fmrp.usp.br/beevenom/. Durante a análise da proteína Melitina foram encontradas
as regiões da proteína em que os possíveis inibidores devem interagir e identificadas as
propriedades químicas que os inibidores devem possuir para interagir corretamente com a
Melitina. Nas análises in silico foi possível identificar 10 possíveis inibidores que interagiram
corretamente com o sítio ativo da Fosfolipase A2. Algumas espécies do Banco de
Germoplasma da FMRP/USP foram obtidas e utilizadas nos experimentos de atividade
fosfolipásica indireta e de Edema, sendo possível observar inibição do veneno total e da
proteína Fosfolipase A2. Os compostos sintéticos e inibidores avaliados não causaram
inibição em todos os experimentos avaliados. Já as plantas obtidas no laboratório de
Toxinas Animais e Inibidores Naturais e Sintéticos causaram inibição do veneno total e da
proteína Fosfolipase A2.
Palavras chaves: Apis, banco de dados, fosfolipase, melitina, docking, antiveneno.
ABSTRACT
JORGE, D. M.M. A search for natural inhibithiros against Apis mellifera venom. 2008.
142 p. Dissertation (Master) - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de
São Paulo, Ribeirão Preto, 2008.
Insects are the most numerous animals worldwide, with more than 675 thousand known
species. Belonging to Hymenoptera order, Apoidea, superfamily, bees are found distributed
in approximately 20 thousand species. In Brazil there are about 1,700 species. One of the
major species is Apis mellifera, with cosmopolitan occurrence. Apis mellifera, popularly
known as Africanized bee, is aggressive, swarm several times per year and uses a great
variety of locals to nidificate. This behavior raises the contact between the insect and the
population, increasing the accidents numbers. Bee accidents represent a public health
problem in many countries because of their frequency and mortality. The present study
proposes to search for natural inhibitors of bee venom. A system and a data base have been
developed to integrate anti-venom medicinal plants data and bee venoms. Plants activities
against venom have been evaluated by farmacological assays, such as anti-hemorraghic,
anti-proteolitic, anti-myotoxicity, anti-Phospholipase and anti-edema. The possible
interactions between Melittin and Phospholipase A2 toxins with inhibitors have been
evaluated by virtual docking. The data base, denominated Bee Venom, was implemented
and the data from public data bases have been inserted in the system. The system was
released to public access in the following address http://gbi.fmrp.usp.br/beevenom/. In
Melittin analysis the protein regions which the inhibitors may act have been found and also
the chemical properties that the inhibitors must have to interact with Melitina have been
identified. During in silico analysis it was possible to identify 10 possible inhibitors that
interacted well with Phospholipase A2 active site. Some plants species from FMRP/USP
Germoplam Bank have been obtained and used in the indirect Phospholipase activity and
edema, being possible to observe inhibitions of total venom and Phospholipase A2 protein.
The synthetic compounds and inhibitors evaluated did not cause inhibition in any
experiments. However, the plants obtained on Animals Toxins and Natural and synthetic
Inhibitors laboratory have caused inhibition of total venom and Phospholipase A2 protein.
Key words: Apis, data bases, Melittin, Phospholipase docking, anti-venom.
SUMÁRIO
I - INTRODUÇÃO................................................................................................................
01
1.1 – Abelhas......................................................................................................................
02
1.2 – Acidentes com abelhas no Brasil e no mundo...........................................................
03
1.3 – Sintomatologia no acidente com abelhas...................................................................
09
1.4 – Veneno.......................................................................................................................
12
1.4.1 – Os fatores farmacológicos................................................................................
14
1.5 – Plantas medicinais.....................................................................................................
15
1.5.1 – Plantas medicinais antiveneno.........................................................................
17
1.5.2 – Banco de germoplasma de plantas...................................................................
20
1.6 – Bioinformática.............................................................................................................
21
1.6.1 – Banco de dados de toxinas...............................................................................
22
1.6.2 – Sistemas de Gerenciamento de Conteúdo (CMS)............................................
23
1.6.3 – Docking e Screening Virtual..............................................................................
24
1.6.4 – Determinação dos potenciais de interação molecular fármaco-receptor.........
26
1.6.5 – Potenciais eletrostáticos moleculares...............................................................
27
1.6.6 – Campos de interação molecular........................................................................
28
II - OBJETIVOS...................................................................................................................
29
III - MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................................................
32
3.1 – Aquisição das seqüências..........................................................................................
33
3.2 – Aquisição das estruturas............................................................................................
34
3.3 – Desenvolvimento do Sistema.....................................................................................
34
3.3.1 – Criação de conteúdos específicos....................................................................
35
3.3.2 – Categorização do Banco de Dados...................................................................
35
3.3.3 – Banco de Dados................................................................................................
36
3.3.4 – Política de Segurança.......................................................................................
36
3.4 – Modelagem do Sistema..............................................................................................
37
3.4.1 – Escopo..............................................................................................................
37
3.4.2 – Cadastrar usuários............................................................................................
38
3.4.3 – Criar tipo de conteúdo.......................................................................................
38
3.4.4 – Cadastrar categorias, termos e campos...........................................................
39
3.4.5 – Cadastrar tipos de conteúdos...........................................................................
39
3.4.5.1. – Enviar dados de plantas (antiveneno)...................................................
39
3.4.5.2. – Enviar dados de proteínas de venenos de abelhas..............................
40
3.4.5.3. – Enviar estruturas de proteínas de veneno de abelhas..........................
40
3.4.5.4. – Enviar dados de referências de venenos de abelhas...........................
41
3.4.5 5. – Enviar dados de experimentos laboratoriais de venenos de abelhas...
41
3.4.6 – Visualizar conteúdo...........................................................................................
41
3.4.7 – Diagramas de UML...........................................................................................
41
3.4.7.1. – Visão global dos atores e use-cases.....................................................
42
3.4.7.2. – Diagrama de Colaboração....................................................................
43
3.5 – Docking Virtual...........................................................................................................
53
3.5.1 – Simulações de screening virtual........................................................................
54
3.5.2 – Almond..............................................................................................................
55
3.5.3 – Q-Site Finder.....................................................................................................
54
3.6 – Ensaios laboratoriais..................................................................................................
55
3.6.1 – Obtenção do veneno.........................................................................................
55
3.6.2 – Extratos Vegetais das Plantas do Banco de Germoplasma da USP/RP..........
56
3.6.2.1. – Coleta dos vegetais...............................................................................
56
3.6.2.2. – Preparação dos extratos.......................................................................
56
3.6.3 – Atividade Fibrinogenolítica................................................................................
57
3.6.4 – Atividade Miotóxica...........................................................................................
57
3.6.5 – Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE).......
57
3.6.6 – Estudos de Inibição das Atividades Biológicas e Enzimáticas..........................
58
3.6.7 – Atividade fosfolipásica.......................................................................................
59
3.6.8 – Edema em camundongos.................................................................................
61
IV – RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................................
62
4.1 – Aquisição das seqüências..........................................................................................
63
4.2 – Aquisição das estruturas proteicas............................................................................
65
4.3 – Desenvolvimento do Sistema.....................................................................................
66
4.4 – Bioinformática estrutural.............................................................................................
88
4.4.1 – Melitina..............................................................................................................
88
4.4.2 – Screening Virtual...............................................................................................
92
4.5 – Ensaios laboratoriais..................................................................................................
96
4.5.1 – Extratos Vegetais das Plantas do Banco de Germoplasma da USP/RP..........
96
4.5.1.1. – Coleta dos vegetais...............................................................................
96
4.5.1.2. – Preparação dos extratos.......................................................................
96
4.5.2 – Atividade Fibrinogenolítica................................................................................
96
4.5.3 – Atividade Miotóxica...........................................................................................
97
4.5.4 – Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE).......
98
4.5.5 – Interação extratos ou inibidores-venenos.........................................................
98
4.5.6 – Avaliação da atividade fosfolipásica indireta.....................................................
99
4.5.7 – Edema em camundongos.................................................................................
114
V - CONCLUSÕES............................................................................................................
129
VI - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................................
132
VII - ANEXOS.....................................................................................................................
141
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. A expansão das abelhas africanizadas no Brasil e datas de chegada destas abelhas
em outros países da América do Sul. Fonte: (Barraviera,
1999)..........................................................................................................................................06
Figura 2. Esquema representando o procedimento experimental realizado durante o
desenvolvimento do
projeto........................................................................................................................................33
Figura 3. Modelo simplificado da interação dos três tipos de usuários com os recursos
disponíveis de acordo com a permissão atribuída a cada
usuário.......................................................................................................................................38
Figura 4. Visão Global dos Atores e Use-cases. Os atores Administrador e Colaborador fazem
papel de usuário do sistema interagindo com os eventos que cada um tem permissão de realizar,
e o ator Visitante não entra como usuário cadastrado do sistema, porém, pode visualizar os
dados
públicos..........................................................................................................................................42
Figura 5. Diagrama de colaboração do Use-case Criar tipo de conteúdo – Fluxo Básico.
Representa os eventos que o ator Administrador realiza para criar um novo tipo de conteúdo,
descrevendo as entradas de dados a serem preenchidas e as mensagens para cada
evento.........................................................................................................................................44
Figura 6. Diagrama de colaboração do Use-case Cadastrar Categorias – Fluxo Básico.
Representa os eventos que o ator Administrador realiza para criar uma nova categoria,
descrevendo as entradas de dados a serem preenchidas e as mensagens para cada
evento........................................................................................................................................45
Figura 7. Diagrama de colaboração do Use-case Adicionar Termos – Fluxo Básico. Representa
os eventos que o ator Administrador realiza para adicionar um novo termo em uma categoria,
descrevendo as entradas de dados a serem preenchidas e as mensagens para cada
evento........................................................................................................................................46
Figura 8. Diagrama de colaboração do Enviar dados de plantas com atividade Antiveneno –
Fluxo Básico. Representa os eventos que o ator usuário (Administrador ou Colaborador) realiza
para enviar dados de plantas, descrevendo as entradas de dados a serem preenchidas e as
mensagens para cada
evento.................................................................................................................................47
Figura 9. Diagrama de colaboração do Use-case Enviar Dados de Seqüências de abelhas –
Fluxo Básico. Representa os eventos que o ator usuário (Administrador ou Colaborador) realiza
para enviar dados de animais, descrevendo as entradas de dados a serem preenchidas e as
mensagens para cada
evento................................................................................................................................48
Figura 10. Diagrama de colaboração de Enviar Dados de Estruturas de Proteínas de veneno de
abelha – Fluxo Básico. Representa os eventos que o ator usuário (Administrador ou
Colaborador) realiza para enviar dados de plantas, descrevendo as entradas de dados a serem
preenchidas e as mensagens para cada
evento............................................................................................................49
Figura 11. Diagrama de colaboração do Use-case Enviar Dados Laboratoriais – Fluxo Básico.
Representa os eventos que o ator usuário (Administrador ou Colaborador) realiza para enviar
dados de animais, descrevendo as entradas de dados a serem preenchidas e as mensagens
para cada
evento................................................................................................................................................
..50
Figura 12. Diagrama de colaboração Enviar Dados de Referências de Abelhas – Fluxo Básico.
Representa os eventos que o ator usuário (Administrador ou Colaborador) realiza para enviar
dados de plantas, descrevendo as entradas de dados a serem preenchidas e as mensagens
para cada
evento................................................................................................................................................
.51
Figura 13. Diagrama de colaboração do Use-case Alterar Dados – Fluxo Básico. Representa os
eventos que o ator Administrador realiza para alterar dados de plantas e venenos de abelhas,
descrevendo as entradas de dados a serem preenchidas e as mensagens para cada evento.
.........52
Figura 14. Diagrama de colaboração do Use-case Visualizar Conteúdo – Fluxo Básico.
Representa os eventos que o ator Visitante realiza para visualizar o conteúdo público do sistema,
descrevendo as entradas de dados a serem preenchidas e as mensagens para cada
evento...............................53
Figura 15. Esquema representando dos ensaios laboratoriais realizados em todo o procedimento
experimental, apresentando o fluxo
básico.........................................................................................55
Figura 16. Esquema representando a preparação dos extratos brutos aquoso, metanólico e
clorofórmico......................................................................................................................................
56
Figura 17. Tela inicial do sistema Bee Venom. a) site para os tipos de visualização do conteúdo.
b) visualização do número de dados de seqüências, plantas, referências e de dados laboratoriais
cadastrados, c) módulo de busca simples por palavra chave, d) acesso rápido aos diversos tipos
de categorias e) site para registro no sistema e login para os usuários colaboradores
cadastrados; f) Artigos do Pubmed inseridos no
sistema...........................................................................................67
Figura 18. Tela do site map do projeto Bee Venom. a) Categorias existentes no sistema b)
Termo criados nas categorias contendo o número de informações depositadas sobre o termo. c)
Termos criados nas categorias contendo informação a respeito das espécies de
animais.............................68
Figura 19. Tela inicial de formulário de busca dentro do banco de dados do Bee Venom, onde
pode ser feita uma busca simples ou uma busca
avançada........................................................................68
Figura 20. Visualização do Statistics do sistema, onde é possível visualizar todos os conteúdos.
a) Conteúdo do sistema Bee Venom. b) a porcentagem do termo relacionada aos outros da
mesma categoria e o número total de ocorrências
dele.................................................................................69
Figura 21. Visualização do Animal datalist do sistema, permite realizar buscas em todos os
conteúdos relacionados às espécies animais. a) Filtro usado para a busca. b) Resultado da
busca.................................................................................................................................................
..70
Figura 22. Tela de visualização do Proteins. Lista das proteínas cadastradas no sistema, sendo
divididas em peptídeos (a) e enzimas
(b)............................................................................................71
Figura 23. Tela de visualização da proteína Melitina. É possível observar uma pequena
descrição da proteína Melitina (a) e algumas informações a respeito da origem da Melitina
(b)........................71
Figura 24. Continuação da tela de visualização da proteína Melitina. Destacados os links para as
proteínas e estruturas depositadas em seqüências e estruturas dentro do sistema Bee
Venom.......72
Figura 25. Tela de visualização das seqüências de proteína depositadas no sistema. As
seqüências de proteína foram obtidas no banco de dados públicos do Genbank. a) Filtro para
busca de seqüências através da espécie e proteína. b) Tela com resultado de uma busca da
proteína Apamina existente no
sistema...........................................................................................................72
Figura 26. Tela de visualização da seqüência da proteína Apamina. Todas as informações da
proteína obtidas no banco de dados públicos do GenBank. a) Título escolhido durante o depósito
da seqüência. b) Tags que foram criadas durante o depósito da seqüência ao sistema que
permitem buscas rápidas. c) Informações à respeito da proteína
Apamina.......................................................73
Figura 27. Tela de visualização das estruturas de proteínas de veneno. Todas as informações
das proteínas foram obtidas no banco de dado público do PDB. a) Filtro para busca de
seqüências através da espécie e proteína. b) As estruturas de proteínas depositadas no sistema.
.....................74
Figura 28. Tela de visualização da estrutura da proteína Fosfolipase A2. Todas informações, das
proteínas foram obtidas no banco de dado público do PDB. a) Título escolhido durante o
deposito da estrutura da proteína. b) Tags que foram criadas durante o depósito da estrutura da
proteína no sistema que permitem buscas rápidas. c) Informações a respeito da estrutura da
proteína Fosfolipase
A2...................................................................................................................................74
Figura 29. Tela de visualização da estrutura da proteína Fosfolipase A2. Todas as informações
das proteínas foram obtidas no banco de dado público do PDB. a) Imagens no formato jpg da
proteína Fosfolipase A2 b) Site para visualizar a proteína Fosfolipase A2 com Webmol. c)
Imagem no formato jpg do ligante da Fosfolipase
A2........................................................................................................75
Figura 30. Tela de visualização da estrutura da proteína Fosfolipase A2 em imagem 3D através
do programa
Webmol.............................................................................................................................75
Figura 31. Tela de visualização dos dados de plantas com atividade antiveneno. Todas as
informações da proteína foram obtidas nos bancos de dados públicos. a) Filtro para busca de
plantas através da espécie e família. b) As plantas depositadas no sistema Bee
Venom..................76
Figura 32. Tela de visualização dos dados de plantas com atividade antiveneno. Todas as
informações das proteínas foram obtidas nos bancos de dados públicos. a) Título escolhido
durante o depósito da planta. b) Tags que foram criadas durante o depósito da planta no sistema
que permitem buscas rápidas. c) Informações a respeito da planta Echinodorus ellipticus.
.....................77
Figura 33. Tela de visualização dos dados laboratoriais do sistema Bee
Venom..............................77
Figura 34. Tela de visualização das Tools do sistema Bee Venom. Em destaque a ferramenta
disponível até o momento, que é o
clustalw......................................................................................78
Figura 35. Tela de visualização dos dados de referências sobre veneno de abelhas. Todas
informações da proteína obtidas nos bancos de dados públicos. a) Filtro para busca de
referências através do tipo de referência e autores. b) Tela inicial das referências de
abelhas...........................79
Figura 36. Tela de visualização do
Links..........................................................................................79
Figura 37. Formulário para cadastro de usuários. Informações pessoais e profissionais são
obrigatórias para o cadastro, um nome de usuário e e-mail para onde a senha de acesso será
enviada..............................................................................................................................................
..80
Figura 38. Campos de escrita do cadastro de seqüência de proteína que permitem a
categorização da seqüência. Podem ser cadastradas as informações através de termos livres e
termos já categorizados. a) Título da seqüência a ser cadastrada e escolha da categoria de tipo
de conteúdo, b) A primeira parte do cadastro da seqüência que está relacionado com as
informações sobre as abelhas e vespas. c) Segunda parte do cadastro informações da
seqüência. d) Terceira parte do cadastro que possui o campo de escrita para inserção da
seqüência fasta.......................................82
Figura 39. Campos de escrita do cadastro de plantas com atividade antiveneno que permite a
categorização da seqüência. Podem ser cadastradas as informações através de termos livres e
termos já categorizados. a) Título da planta a ser cadastrada e escolha da categoria de tipo de
conteúdo, b) A primeira parte do cadastro está relacionado com as informações sobre o planta.
c) Segunda parte do cadastro são informações sobre o composto. d) Terceira parte do cadastro
que possui campos para submeter imagens do composto e da
planta.....................................................83
Figura 40. Campos de escrita do cadastro de estruturas protéicas de veneno de abelhas que
permitem a categorização da estrutura. Podem ser cadastradas as informações através de
termos livres e termos já categorizados. Está dividido em quatro partes. a) Título da estrutura a
ser cadastrada e inserção dos autores e categorização do tipo de conteúdo, b) A primeira parte
do cadastro está relacionada com as informações sobre a proteína, c) A segunda parte do
cadastro está relacionada com as informações sobre o animal, d) Terceira parte do cadastro são
informações sobre a estrutura, e) Quarta parte do cadastro são informações sobre o
ligante...............................84
Figura 41. Campos de escrita do cadastro da estrutura da proteína do veneno, sendo possível a
submissão de imagens da proteína e do ligante e submissão de arquivos no formato PDB e MOL
da proteína e do
ligante..........................................................................................................................85
Figura 42. Campos de escrita do cadastro de dados laboratoriais de experimentos que permitem
a categorização da estrutura. Podem ser cadastradas as informações através de termos livres e
termos já categorizados. Está dividido em três partes. a) Título do experimento a ser cadastrado
e inserção dos autores e, categorização do tipo de conteúdo e inserção da instituição onde foram
realizados os experimentos, b) Informações a respeito dos experimentos e informações
adicionais, c) Campos para envio de arquivos adicionais que sejam relacionados aos
experimentos................86
Figura 43. Campos de escrita do cadastro de referências de veneno de abelhas que permitem a
categorização da estrutura. Podem ser cadastradas as informações através de termos livres e
termos já categorizados. Está dividido em três partes. a) Título da estrutura a ser cadastrada e
inserção dos autores, categorização do tipo de conteúdo, ano em que foi publicado as
referências, linguagem da referência e editora da publicação b) O resumo da referência, c)
Informações adicionais com inserção da instituição onde foram realizados os experimentos,
inserção da área de estudo e inserção do site para a
referência........................................................................................87
Figura 44. Resultado obtido do Almond da proteína Melitina, sendo o campo de prova nitrogênio
de amida. A região com círculo representa o local do sitio ativo da proteína. As regiões em azul
(*) são os locais onde, potencialmente, ocorreriam ligações com amidas. A ocorrência dessa
região é na extremidade da
proteína...................................................................................................................89
Figura 45. Resultado obtido do Almond da Melitina, sendo o campo de prova hidrofóbico. A
região com circulo representa o local do sítio ativo da proteína. As regiões em branco (*) são os
sítios onde existem campos de força para interações do tipo pontes de hidrogênio, que estão
próximos ao sitio ativo da
proteína...............................................................................................................................90
Figura 46. Resultado obtido do Almond da Melitina, sendo o campo de prova oxigênio da
carbonila. A região com círculo representa o local do sitio ativo da proteína. As regiões em
vermelho (*) são os sítios de ligação de hidrogênio que ocorrem na extremidade da
proteína..........................................91
Figura 47. Resultado obtido do site Q-Site Finder da Melitina. A região em marrom representa os
locais da proteína que têm sítios de interação com ligantes ou proteínas. Os círculos em
vermelho representam os sítios ativos da Melitina. O retângulo preto marca o sítio identificado no
sitio ativo..92
Figura 48. Todos os inibidores de Fosfolipase A2 selecionados através do GOLD na base de
dados do Ilibdiverse. Os 10 ligantes foram sobrepostos, onde pode-se observar que possuem
estruturas similares. Duas formas de visualizar os ligantes sobrepostos em A e em B. As
estruturas das proteínas são visualizadas através do programa
PYMOL..................................................................93
Figura 49. Todos os inibidores de Fosfolipase A2 selecionados através do software GOLD na
base de dados do Ilibdiverse. O número ao lado dos 10 ligantes representa o número do ligante
dentro da base de dado do
Ilibdiverse...............................................................................................................93
Figura 50. A proteína Fosfolipase A2 interagindo com todos os ligantes selecionados através do
software GOLD, sendo visualizadas na forma de linhas (A) e da estrutura secundária (B) no
software PYMOL (DeLano,
2002)......................................................................................................................95
Figura 51. Resultado do site Q - Site Finder da proteína Fosfolipase A2 sem inibidores e com os
sítios de interações
possíveis............................................................................................................95
Figura 52. Avaliação da Fosfolipase A2 e os ligantes através do site Q site-finder, onde foram
identificados as regiões da proteína que interagem com outras moléculas. Nessa figura, pode-se
observar que todos os inibidores ficaram sobrepostos à região onde ocorre o sítio ativo. Na parte
A da figura tem uma visão geral e na parte B um zoom no sítio
ativo....................................................96
Figura 53. Fibrinogênio: 1-Fibri (80µg); 2- Fibri + Apis mellifera (0,5µg); 3- Fibri + Apis mellifera
(1µg); 4- Fibri + Apis mellifera (5µg); 5- Fibri + Apis mellifera (10µg); 6- Fibri + Apis mellifera
(20µg); 7- Fibri + Apis mellifera (30µg); 8- Fibri + Apis mellifera
(50µg)..........................................................97
Figura 54. SDS-PAGE: 1- PPM; 2- Apis mellifera (5µg); 3- Apis mellifera (15µg); 4- Apis mellifera
(30µg); 5- PLA2 Apis mellifera (0,1µg); 6- PLA2 Apis mellifera (0,5µg); 7-PLA2 Apis mellifera
(3µg)..................................................................................................................................................
98
Figura 55. Gel SDS-PAGE: Apis mellifera + Casearia Folhas 28 e 29 (teste de degradação de
proteínas). SDS-PAGE: 1- Apis mellifera VB (30µg); 2- Apis mellifera + Casearia Folhas 28 e 29
1:1; 3- Apis mellifera + Casearia Folhas 28 e 29 1:5; 4- Apis mellifera + Casearia Folhas 28 e 29
(1:10); 5- Apis mellifera + Casearia Folhas 28 e 29
(1:20)............................................................................98
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Número de acidentes com abelhas, mamangavas e vespas no período de 1954 a 1969
Fonte: (Cardoso et al.,
2003)................................................................................................................4
Tabela 2. Incidência*, óbitos e letalidade dos acidentes por Himenópteros (abelhas, vespas e
marimbondos) no período de 1993 a 1998 - Estado de São
Paulo......................................................8
Tabela 3. Casos Registrados de Intoxicação Humana por Agente Tóxico e Zona de Ocorrência.
Brasil,
2005.........................................................................................................................................9
Tabela 4. Número de solicitações recebidas no Centro de Controle de Zoonoses do Município de
São Paulo para retirada de colônias e enxames viajantes nos anos de 1994 a
1997..........................9
Tabela 5. Classificação das reações alérgicas sistêmicas à picada de
Himenóptera........................12
Tabela 6. Lista de todas as espécies que estão sendo preservadas no Banco de Germoplasma
da USP/RP. Com seus respectivos nomes científicos, nome vulgar e
família.........................................21
Tabela 7. Permissão dos três níveis de usuários do
sistema............................................................37
Tabela 8. Lista das espécies utilizadas, inicialmente, para produção de extratos, com o nome da
família a que pertence, nome científico e nome popular das plantas
estudadas...............................57
Tabela 9. Experimentos avaliados na atividade fosfolipásica
indireta...............................................59
Tabela 10. Plantas utilizadas contra veneno total e Fosfolipase
A2.................................................59
Tabela 11. Plantas avaliadas no teste de edema veneno total e Fosfolipase
A2..............................61
Tabela 12. Número total de seqüências separadas por tipo de seqüência e por palavra de
busca...63
Tabela 13. Número de seqüências separadas por tipo de seqüência e
espécie..............................64
Tabela 14. Lista das estruturas encontradas no PDB, separadas por proteína, com nome do
depósito, método de obtenção, a espécie, a resolução e a data do
depósito...................................65
Tabela 15. Categorias do sistema Bee
Venom................................................................................88
Tabela 16. Resultado obtido do software GOLD na coluna scores e resultados obtidos dos
parâmetros da Regra dos Cinco. Em vermelho são apresentados os valores que ultrapassaram o
valor
limite.........................................................................................................................................94
Tabela 17. Plantas utilizadas contra veneno
total............................................................................102
Tabela 18. Plantas avaliadas contra Fosfolipase
A2........................................................................103
Tabela 19. Plantas avaliadas no teste de edema veneno
total.........................................................115
Tabela 20. Fosfolipase A2 teste de
edema....................................................................................116
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Número de acidentes por abelhas notificados no Brasil entre os anos de 2001 a 2006
pelo SINAM. Fonte:
DataSUS..............................................................................................................6
Gráfico 2. Número de acidentes por abelhas notificados no Brasil em relação à evolução dos
casos entre os anos de 2001 a 2006 pelo SINAM. Fonte:
SINAN.................................................................7
Gráfico 3. Número de acidentes com animais peçonhentos no Estado de São Paulo no período
de 1988 a 2006. Fonte:
CVE...................................................................................................................7
Gráfico 4. Avaliação da atividade miotóxica do veneno de PLA2. Não foi encontrado atividade
miotóxica...........................................................................................................................................
97
Gráfico 5. Teste da atividade Fosfolipásica indireta. A: Avaliação para escolha da melhor dose
de Veneno Total a ser utilizada durante os ensaios de avaliação da atividade fosfolipásica. B:
Avaliação do efeito do pH sobre a atividade do veneno da Apis, demonstrando que o pH não
interfere, significativamente, sobre a ação da Fosfolipase A2 C: Avaliação do efeito do EDTA
sobre a atividade do veneno da Apis, demonstrando que o EDTA não interfere,
significativamente, sobre a ação da Fosfolipase
A2....................................................................................................................104
Gráfico 6. Teste da atividade Fosfolipásica indireta e avaliação do efeito das plantas sobre a
atividade do veneno da Apis. A: Avaliação do efeito dos íons sobre a atividade do veneno da
Apis, demonstrando que os íons não interferem, significativamente, sobre a ação da Fosfolipase
A2. B: Avaliação do efeito da temperatura sobre a atividade do veneno da Apis, demonstrando
que a temperatura não interfere, significativamente, sobre a ação da Fosfolipase A2. C:
Avaliação do efeito das plantas coletadas na USP sobre a atividade do veneno da Apis. A
Canafistula, Pau-Pereira e Pau-Ferro foram identificados como potenciais inibidores do veneno
da Apis. ...............................105
Gráfico 7. Avaliação do efeito dos extratos de plantas sobre a atividade do veneno da Apis. A:
Avaliação do efeito de Mandevilla sobre a atividade do veneno da Apis. Quando se utilizou raízes
extraídas em extrato de álcool houve inibição completa do veneno da Apis. B: Avaliação do efeito
da Casearia sobre a atividade do veneno da Apis. Com o aumento das concentrações foi
possível observar alguma inibição; entretanto, o aumento da concentração pode ser tóxico. C:
Avaliação do efeito de diversos extratos de plantas sobre a atividade do veneno da Apis.
Somente o precipitado (1:30), ETOH Guaraçonuga, extrato aquoso e acetato apresentaram
inibição................................106
Gráfico 8. Avaliação do efeito de substâncias sintéticas sobre a atividade do veneno da Apis. A:
Avaliação do efeito de extratos de CSF sobre a atividade do veneno da Apis. O CSF 28 e 29,
CSF 23 e CSF 25 apresentaram inibição do veneno de Apis. B: Avaliação do efeito de extratos
de CSF sobre a atividade do veneno da Apis. O CSF 28 e 29, CSF 23, CSF 25 e CSF 22
apresentaram inibição do veneno de Apis. C: Avaliação do efeito de extratos de CSF sobre a
atividade do veneno da Apis. O CSF 28 e 29, CSF 23 e CSF 25 apresentaram inibição do
veneno de Apis...................107
Gráfico 9. Avaliação do efeito dos extratos de plantas e substâncias sintéticas sobre a atividade
do veneno da Apis. A: Avaliação do efeito de extratos de plantas sobre a atividade do veneno da
Apis. O Barbatimão, Miconia albicans, Miconia fallax, Eclipta e Tibouchina stenocarpa
apresentaram inibição do veneno de Apis. B: Avaliação do efeito de extratos de Sedum
dendroideum sobre a atividade do veneno da Apis. Apresentou inibição do veneno de Apis. C:
Avaliação do efeito de extratos de AH sobre a atividade do veneno da Apis. Os extratos de AH
apresentaram inibição do veneno de
Apis...............................................................................................................................108
Gráfico 10. Avaliação do efeito de substâncias sintéticas sobre a atividade do veneno da Apis.
A: Avaliação do efeito de extratos de CP sobre a atividade do veneno da Apis. O CP 47
apresentou inibição do veneno de Apis. B: Avaliação do efeito de extratos de P sobre a atividade
do veneno da Apis. O P2 e P3 apresentaram inibição do veneno de
Apis.............................................................109
Gráfico 11. Avaliação do efeito dos extratos de plantas e substâncias sintéticas sobre a
atividade da Fosfolipase A2 da Apis. A: Avaliação para escolha da melhor dose de Fosfolipase
A2 a ser utilizada durante os ensaios de avaliação da atividade fosfolipásica. B: Avaliação do
efeito de extratos do banco de germoplasma sobre a atividade de PLA2 de Apis. A canafistula,
cabriúva, amendoin bravo, jatobá, pau-ferro e pau-pereira apresentaram inibição de PLA2 de
Apis. C: Avaliação do efeito de extratos de Barbatimão sobre a atividade de PLA2 de Apis.
Apresentaram inibição de PLA2 de
Apis.................................................................................................................................................1
10
Gráfico 12. Avaliação do efeito dos extratos de plantas sobre a atividade da Fosfolipase A2 da
Apis. A: Avaliação do efeito de extratos de SD2 sobre a atividade de PLA2 de Apis.
Apresentaram inibição de PLA2 de Apis. B: Avaliação do efeito de extratos de SD6 sobre a
atividade de PLA2 de Apis. Apresentaram inibição de PLA2 de Apis. C: Avaliação do efeito de
extratos de Frações isoladas sobre a atividade de PLA2 de Apis. Onde Eclidwl e Ecliwl
apresentaram inibição de PLA2 de
Apis.................................................................................................................................................1
11
Gráfico 13. Avaliação do efeito dos extratos de plantas sobre a atividade da Fosfolipase A2 da
Apis. A: Avaliação do efeito de extratos de Miconia albicans sobre a atividade de PLA2 de Apis.
A Miconia albicans apresentou uma pequena inibição de PLA2 de Apis. B: Avaliação do efeito de
extratos de Miconia fallax sobre a atividade de PLA2 de Apis. A Miconia fallax apresentou uma
pequena inibição de PLA2 de Apis. C: Avaliação do efeito de extratos de Mandi F RETOH sobre
a atividade de PLA2 de Apis. O Mandi F RETOH apresentou inibição de PLA2 de
Apis..................................................112
Gráfico 14. Avaliação do efeito dos extratos de plantas sobre a atividade da Fosfolipase A2 da
Apis. A: Avaliação do efeito de extratos de Tibouchina stenoscarpa sobre a atividade de PLA2 de
Apis. A Tibouchina stenoscarpa apresentou inibição de PLA2 de Apis. B: Avaliação do efeito de
extratos de Anacardium humile sobre a atividade de PLA2 de Apis. O AH (46 – 65) apresentaram
inibição de PLA2 de
Apis.....................................................................................................................................113
Gráfico 15. Teste de edema. A: Avaliação dos vários tempos do teste para escolha do tempo
adequado para os experimentos com veneno de Apis mellifera. B: Avaliação dos vários tempos
do teste para escolha do tempo adequado para os experimentos com veneno total e PLA2, onde
foram escolhidos os tempos 15 e 30 minutos. C: Avaliação dos vários tempos do teste para
escolha do tempo adequando para os experimentos com
PLA2........................................................................117
Gráfico 16. Teste de edema e avaliação do efeito das plantas e substâncias sintéticas sobre o
edema. A: Avaliação para verificar se o PBS interferiria no teste para escolha do tempo
adequado para os experimentos com veneno total e PLA2. B: Avaliação da atividade de
Mandevila sobre o veneno total de Apis para verificar atividade. Onde em concentrações maiores
apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade do veneno total de Apis. C: Avaliação
da atividade de Barbatimão sobre o veneno total de Apis para verificar atividade. Nas
concentrações maiores apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade do veneno
total de Apis......................118
Gráfico 17. Avaliação do efeito dos extratos de plantas sobre o edema. A: Avaliação da
atividade de Casearia sylvestris sobre o veneno total de Apis para verificar atividade. Em
concentrações maiores apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade do veneno
total de Apis. B: Avaliação da atividade de Tibouchina stenocarpa sobre o veneno total de Apis
para verificar atividade. Em concentrações maiores apresentou uma diminuição do edema,
inibindo a atividade do veneno total de Apis. C: Avaliação da atividade de Miconia albicans sobre
o veneno total de Apis para verificar atividade. No tempo inicial causou um maior edema,
entretanto no tempo de 30 minutos a maior concentração diminui o
edema.......................................................................................................119
Gráfico 18. Avaliação do efeito dos extratos de plantas e substâncias sintéticas sobre o edema.
A: Avaliação da atividade de Eclipta prostata sobre o veneno total de Apis para verificar
atividade. Apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade do veneno total de Apis. B:
Avaliação da atividade de CSF 28 e 29 sobre o veneno total de Apis para verificar atividade. No
tempo de 30 minutos apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade do veneno total
de Apis. C: Avaliação da atividade de Balsamo sobre o veneno total de Apis para verificar
atividade. Apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade do veneno total de
Apis.........................................120
Gráfico 19. Avaliação do efeito dos extratos de plantas sobre o edema. A: Avaliação da
atividade de AH (46-65) sobre o veneno total de Apis para verificar atividade. No tempo de 30
minutos apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade do veneno total de Apis. B:
Avaliação da atividade de Bauhinia forficata sobre o veneno total de Apis para verificar atividade.
No tempo de 30 minutos apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade do veneno
total de Apis. C: Avaliação da atividade de Dwl sobre o veneno total de Apis para verificar
atividade. Na concentração 1:30 apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade do
veneno total de Apis..............121
Gráfico 20. Avaliação do efeito dos extratos de plantas sobre o edema. A: Avaliação da
atividade de WL sobre o veneno total de Apis para verificar atividade. Apresentou uma
diminuição do edema, inibindo a atividade do veneno total de Apis. B: Avaliação da atividade de
Canafistula sobre o veneno total de Apis para verificar atividade. No tempo de 30 minutos
apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade do veneno total de
Apis..................................................................122
Gráfico 21. Avaliação do efeito dos extratos de plantas sobre o edema contra PLA2. A:
Avaliação da atividade de Mandevila sobre o PLA2 de Apis para verificar atividade. Apresentou
uma diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis. B: Avaliação da atividade de
Barbatimão sobre o PLA2 de Apis para verificar atividade. Apresentou uma diminuição do
edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis. C: Avaliação da atividade de Casearia sobre o
PLA2 de Apis para verificar atividade. Apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade
de PLA2 de Apis................................123
Gráfico 22. Avaliação do efeito dos extratos de plantas sobre o edema contra PLA2. A:
Avaliação da atividade de Miconia fallax sobre o PLA2 de Apis para verificar atividade. No tempo
30 apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis. B: Avaliação da
atividade de Eclipta prostata sobre o PLA2 de Apis para verificar atividade. Apresentou uma
diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis. C: Avaliação da atividade de CSF
28 e 29 sobre o PLA2 de Apis para verificar atividade. Apresentou uma diminuição do edema,
inibindo a atividade de PLA2 de
Apis..................................................................................................................................124
Gráfico 23. Avaliação do efeito dos extratos de plantas sobre o edema contra PLA2. A:
Avaliação da atividade de Balsamo sobre o PLA2 de Apis para verificar atividade. Apresentou
uma diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis. B: Avaliação da atividade de
Ah (46-65) sobre o PLA2 de Apis para verificar atividade. No tempo 30 minutos apresentou uma
diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis. C: Avaliação da atividade de
Mandevila sobre o PLA2 de Apis para verificar atividade. No tempo 30 apresentou uma
diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de
Apis...................................................................................................................................125
Gráfico 24. Avaliação do efeito dos extratos de plantas e substâncias sintéticas sobre o edema
contra PLA2. A: Avaliação da atividade de Precipitado sobre o PLA2 de Apis para verificar
atividade. No tempo 30 minutos apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade de
PLA2 de Apis. B: Avaliação da atividade de SD2 sobre o PLA2 de Apis para verificar atividade.
No tempo 30 apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis. C:
Avaliação da atividade de DWL sobre o PLA2 de Apis para verificar atividade. No tempo 30, nas
concentrações 1:10 e 1:30, apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2
de Apis.............126
Gráfico 25. Avaliação do efeito das plantas sobre o edema contra PLA2. A: Avaliação da
atividade de Wl sobre o PLA2 de Apis para verificar atividade. No tempo 30, apresentou uma
diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis. B: Avaliação da atividade de
Tibouchina stenocarpa sobre o PLA2 de Apis para verificar atividade. Apresentou uma
diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis. C: Avaliação da atividade de
Miconia albicans sobre o PLA2 de Apis para verificar atividade. No tempo 30 apresentou uma
diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de
Apis...................................................................................................................................127
Gráfico 26. Avaliação da atividade de Canafistula sobre o PLA2 de Apis para verificar atividade.
Apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de
Apis................................128
1
1
.
.
I
I
N
N
T
T
R
R
O
O
D
D
U
U
Ç
Ç
Ã
Ã
O
O
Introdução
2
1. INTRODUÇÃO
1.1. Abelhas
Os insetos são os mais numerosos animais encontrados no mundo, com mais de 675
mil espécies conhecidas. Pertencentes à ordem Hymenoptera, da superfamília Apoidea, as
abelhas são encontradas distribuídas em aproximadamente 20 mil espécies. No Brasil
estima-se que existam 1700 espécies. Uma das principais espécies é a Apis mellifera, com
ocorrência cosmopolita (Silveira; Melo e Almeida, 2002).
O gênero Apis apresenta quatro espécies: Apis mellifera (Linnaeus, 1758), Apis
florea (Fabricius, 1787), Apis dorsata (Fabricius, 1793) e Apis cerana (Fabricius, 1793).
Dentre as quatro, a Apis mellifera sempre despertou interesse, devido a sua grande
importância econômica (Camargo e Stort, 1973; Kato, 1997; D'Ávila e Marchini, 2005) e,
sobretudo, pelas novas possibilidades de usos de seus produtos na área médica (Maia,
2002; Costa Neto e Pacheco, 2005).
Como espécie, a Apis mellifera apresenta uma grande complexidade, incluindo 24
subespécies diferentes, que podem ser identificadas por análises morfométricas, por sua
biogeografia e comportamento, sendo que 14 delas foram confirmadas por meio de estudos
de DNA mitocondrial (Ruttner, 1988; Arias e Sheppard, 1996). Esta espécie apresenta
ampla distribuição, podendo ser encontrada desde locais de clima temperado frio a zonas
tropicais. No entanto, apesar disto e de sua adaptação nas Américas, Apis mellifera é uma
espécie exótica no Brasil, sendo a Apis mellifera mellifera (Linnaeus, 1758) a primeira
subespécie a ser introduzida pelos imigrantes alemães. A européia foi introduzida em 1839
e, posteriormente, em 1956, a espécie africana se difundiu por todo o Brasil (Figura 1). A
partir de 1956, deu-se origem a formação da atual raça da Apis mellifera brasileira,
ocorrendo um processo de africanização. Estudos comprovam que no genoma da Apis
mellifera existe uma herança genética africana e européia (Barraviera, 1999).
A Apis mellifera, popularmente conhecida como abelha africanizada ou abelha de
mel, são mais agressivas, enxameiam várias vezes ao ano e utilizam uma grande variedade
de locais para nidificar. Esse comportamento aumenta o número de acidentes. Uma das
preocupações com acidentes com abelhas está associada à freqüência de enxameações,
que ocorrem de três a quatro vezes ao ano (Diniz, 1990), além da existência de uma grande
variedade de abrigos em áreas urbanas. Tais abrigos aumentam o contato entre inseto e
população. Estes acidentes estão relacionados ao fato das pessoas entrarem em contato
com locais próximos onde estão situados os abrigos, atirarem objetos e produtos químicos,
tentarem remover ou destruir os abrigos de maneira inadequada (Mello; Silva e Natal, 2003).
Introdução
3
Segundo Soares et al. (1994), a abelha africanizada apresenta dois modelos de
dispersão. O primeiro enxame reprodutivo ocorre quando existe grande oferta de alimento e
população numerosa. Ocorre formação de uma nova rainha e parte das abelhas da colônia
voa com a rainha mais velha ao encontro de novo local de nidificação. O segundo modelo,
enxame de abandono, ocorre quando existe escassez de alimento, condições climáticas
desfavoráveis e ameaça de predação e todas as abelhas deixam a colméia e migram para
outro local. O primeiro ocorre entre agosto, setembro e outubro. O segundo é mais
significativo entre os meses de março, abril e maio (Soares et al., 1994).
1.2. Acidentes com abelhas no Brasil e no mundo
Os registros sobre a incidência dos acidentes por himenópteros além de serem
subnotificados são incompletos. O que se sabe, no entanto, é que os casos fatais
provocados por ataques maciços de abelhas têm aumentado desde a década de 60, fato
esse atribuído à introdução das abelhas africanas no Brasil em 1956. Rosenfeld (1972)
observou, porém, que a partir de 1963, casos fatais provocados por múltiplas picadas de
abelhas passaram a ser atendidos no Hospital Vital Brasil, e que o número de atendimentos
de picados por abelhas sofreu um aumento significativo nos anos seguintes, mesmo quando
comparado aos picados por mamangavas e vespas (Tabela 1)(Rosenfeld, 1972; Cardoso et
al., 2003).
Figura 1. A expansão das abelhas africanizadas no Brasil e datas de chegada destas abelhas em outros
países da América do Sul. Fonte: (Barraviera, 1999)
Introdução
4
Tabela 1. Número de acidentes com abelhas, mamangavas e vespas no período de 1954 a 1969
Fonte: (Cardoso et al., 2003)
Quadriênios
APIDAE
VESPIDAE
TOTAL
Abelhas
Mamangavas
Vespas
Nº
%
Nº
%
Nº
%
1954-57
12
17,4
16
23,2
41
59,4
69
1985-61
62
27,9
11
4,9
149
67,1
222
1962-65
185++
44,8
18
4,3
210
50,8
413++
1966-69
457+
60,7
23
3,0
273
36,3
753+
O aumento de casos de acidentes com abelhas está relacionado à rápida expansão
das abelhas africanizadas no continente americano e ao seu maior grau de agressividade,
quando comparadas às espécies européias, anteriormente presentes no Brasil. Estima-se
que a letalidade causada por abelhas africanizadas, na América Latina, desde 1957, esteja
entre 700 a 1.000 óbitos (Cardoso et al., 2003).
Por outro lado, casos fatais devidos a reações alérgicas anafiláticas desencadeadas
por picadas de himenópteros são conhecidos desde a Antigüidade. Inscrições no túmulo do
faraó Menes, do Egito, descrevem a sua morte em decorrência da ferroada de uma vespa
em 2.621 a.C. (Cardoso et al., 2003).
Estatísticas americanas documentam aproximadamente 40 óbitos por ano devido à
anafilaxia por picada de insetos (Cardoso et al., 2003), podendo ser esse número ainda
maior, pois foram encontrados níveis sangüíneos elevados de IgE específica para veneno
de himenóptero numa parcela de pacientes que tiveram morte súbita de causa
desconhecida. Na Europa, estima-se que esse número seja em torno de 100 óbitos
(Cardoso et al., 2003). Estudos epidemiológicos têm apontado uma incidência de 0,15 a
3,3% de reações alérgicas sistêmicas e de 15 a 25% de sensibilização aos diferentes
venenos de himenópteros na população geral em diversas partes do mundo (Cardoso et al.,
2003).
Desde 1993, as abelhas foram incluídas como “animal agressor” na ficha de
investigação de acidentes por animal peçonhento no Centro de Vigilância Epidemiológica
(CVE) “Prof. Alexandre Vranjac”, da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo (Mello et
al., 2003). No período compreendido entre 1993 a 1997, o CVE registrou 30.291 notificações
de acidentes com animais peçonhentos no Estado de São Paulo. Delas, em média para todo
o período, 6,3% ocorreram por causa de himenópteros, dos quais 89,7% eram abelhas
africanizadas. Mello et al. (2003), utilizando os relatórios de campo preenchidos após cada
atendimento realizado pelo Centro de Controle de Zoonoses do Município de São Paulo
para retirada de colméias e enxames de abelhas africanizadas, fizeram um levantamento
dos principais locais de instalação destas abelhas correlacionando com as condições
Introdução
5
climáticas. Durante o período de 1994 a 1997 foi constatada a ocorrência de 3.061
solicitações para retirada de colônias (abelhas instaladas no local com presença de favos de
mel) e enxames viajantes (aglomerado de abelhas que pousa nos mais diversos locais até
encontrar abrigo adequado) (Mello et al., 2003). Os locais mais freqüentes de instalação de
colônias em 1997 foram o forro de casas (29,0%) e o interior de paredes (22,5%) refletindo
certo grau de sinantropia, mostrando uma adaptação desses insetos às condições impostas
pela cidade (poucas áreas verdes e muitas edificações). Os locais de pouso de enxames
viajantes foram a árvore (28,2%) e parede externa (22,6%). Houve correlação positiva entre
número de solicitações para retirada de colônias e temperatura média nos 4 anos
estudados. Segundo Brandeburgo (1986), temperatura e insolação correlacionam-se
positivamente tanto com o comportamento agressivo, como com o número de abelhas
campeiras (refletindo maior atividade da colônia). As colônias e enxames viajantes também
foram encontrados em interiores de caixas, tambores, caixas de luz e relógios de água,
mobiliários, postes, caixas d‟água, caixas de inspeção de esgoto e porões (Brandeburgo,
1986).
Atualmente no Brasil, o número de acidentes tem aumentado, em parte devido ao
aumento de áreas de plantações de cana-de-açúcar. As plantações atraem as abelhas e
durante o período de colheita da cana-de-açúcar, ocorrem às queimadas com isso, as
colônias enxameiam para regiões urbanas podendo causar acidentes. Na região urbana de
Ribeirão Preto ocorre uma maior incidência de enxames nos meses de março, abril, agosto,
setembro e outubro.
Outra forma de ocorrência de acidentes existe através de uma prática bastante
comum e antiga: a apitoxinoterapia, ou a utilização da peçonha de abelhas (apitoxina) com
fins terapêuticos. Vem sendo praticada desde o Antigo Egito e considerada eficaz no
tratamento de artroses, artrites, celulites, varizes, bursite, asma e tendinite (Costa Neto et
al., 2005). Há cerca de 2.500 anos, Hipócrates já empregava ferroadas de abelha em seus
procedimentos terapêuticos. No século II de nossa era, outro médico grego, Galeno,
escreveu sobre o tratamento com veneno; Carlos Magno, no século VIII, foi tratado com
ferroadas de abelha para combater suas inflamações nas juntas (Maia, 2002). O tratamento
muitas vezes consiste na aplicação direta da apitoxina através das ferroadas.
Atualmente, no Brasil, existem diversos bancos de dados relacionados à saúde que
monitoram os diversos tipos de ocorrências no Brasil. Entretanto, os dados não possuem
valores idênticos, e sim próximos. Esse fato pode ser devido à falta de centralização dos
dados em um único sistema. As informações de acidentes com abelhas apresentadas a
seguir, foram obtidas de três bases diferentes: Sistema Nacional de Informações Tóxico-
Farmacológicas (SINITOX), Sistema de Informação de Agravos de Notificação (Sinan) e o
Introdução
6
Sistema de Vigilância Epidemiológica (SVE). As três bases apresentam diferenças em seus
resultados pelo fato de serem alimentadas por fontes diferentes e não compartilharem seus
dados. Além destas três bases, foram também obtidos dados de acidentes em artigos
científicos e livros (Bochner e Struchiner, 2002).
Segundo dados do Sinan (Sistema de Informação de Agravos de Notificação), que
estão associados aos dados do Departamento de Informática do SUS (DataSUS), no
período de 2001 a 2006, ocorreram 20.861 acidentes com abelhas (Gráfico 1). Deste total,
19.488 apresentaram cura sem seqüelas e 134 apresentaram cura com seqüelas.
Entretanto, 61 causaram óbitos no Brasil. Os estados com maior número de óbitos foi Minas
Gerais (15 óbitos), seguido por Santa Catarina (9 óbitos) e São Paulo (9 óbitos). No caso de
acidentes com cura e com seqüelas, São Paulo (25 casos) foi o estado com maior número
de acidentes, seguido por Santa Catarina (25 casos) e Minas Gerais (22 casos).
No período de 2001 a 2006, dos 20.861 acidentes com abelhas, 259 foram acidentes
graves, 2.251 acidentes moderados e 17.150 leves. Em relação ao número total de
notificações de acidentes (20.861 acidentes) o estado em que ocorreu um maior número de
acidentes foi São Paulo (7.309 casos), seguido por Santa Catarina (3.164 casos) e Minas
Gerais (2.606 casos). Nesse mesmo período, o ano em que ocorreu maior número de
notificações e o maior número de casos graves foi 2006, sendo que em 2002 ocorreu o
maior número de óbitos e o segundo maior número de casos graves, devido a acidentes de
abelhas.
Gráfico 1. Número de acidentes por abelhas notificados no Brasil entre os anos de 2001 a 2006
pelo SINAM. Fonte: DataSUS
Acidentes por abelhas - Notificações - SINAN
2103
2528
3005
3865
4455
4860
20816
0
5000
10000
15000
20000
25000
2001 2002 2003 2004 2005 2006 Total
Ano
Numero de acidentes
Introdução
7
Em relação à classificação final dos casos versus evolução dos casos (Gráfico 2),
dos 259 casos graves, 172 apresentaram cura sem seqüelas, 6 curas com seqüelas e 59
óbitos, dentre os casos leves 2 levaram a óbito e 98 curas com seqüelas. Possivelmente,
estes valores de óbitos deva-se a casos de pessoas alérgicas ao veneno das abelhas.
A partir da década de 90, o número de acidentes com animais peçonhentos no
estado de São Paulo teve um aumento de uma forma geral, demonstrando a grande
importância em se estudar venenos de animais na busca de inibidores naturais e sintéticos
(Gráfico 3).
Gráfico 2. Número de acidentes por abelhas notificados no Brasil em relação à evolução dos
casos entre os anos de 2001 a 2006 pelo SINAM. Fonte: SINAN
Acidentes por Abelhas - Notificações - Sinan
789
364
3
0
1156
251
16799
98
2
17150
71
2153
27
0
2251
22
172
6
59
259
1133
19488
134
61
20816
0
5000
10000
15000
20000
25000
Ign/Branco Cura Cura com
seqüela
Óbito Total
Evolução do caso
Número de acidentes
Ign/Branco
Leve
Moderado
Grave
Total
Gráfico 3. Número de acidentes com animais peçonhentos no Estado de São Paulo no
período de 1988 a 2006. Fonte: CVE
Introdução
8
Segundo os dados do Sistema de Vigilância Epidemiológica (SVE), no estado de São
Paulo, no período de 1993 a 1998, houve um aumento do número de casos de acidentes
com Himenópteros (abelhas, vespas e marimbondos) (Tabela 2).
Tabela 2. Incidência*, óbitos e letalidade dos acidentes por Himenópteros (abelhas, vespas e
marimbondos) no período de 1993 a 1998 - Estado de São Paulo.
ANO
NÚMERO DE
CASOS
COEF. DE
INCIDÊNCIA
ÓBITO
LETALIDADE
1993
243
0,75
0
0,00
1994
349
1,06
4
1,15
1995
388
1,16
1
0,26
1996
426
1,25
0
0,00
1997
503
1,45
0
0,00
1998
553
1,57
2
0,36
TOTAL
2.462
7
0,28
* Por 100.000 habitantes (Fonte: Divisão de Zoonoses / CVE)
Segundo os dados obtidos através do SINITOX (Sistema Nacional de Informações
Tóxico-Farmacológicas), no período de 1999 a 2005, as regiões do Brasil em que mais
aconteceram acidentes com animais peçonhentos e óbitos foram Sudeste e Sul. A base de
dados do SINITOX não apresenta de forma individualizada acidentes somente com abelhas,
ela considera todos os animais peçonhentos com exceção de aranhas, serpentes e
escorpiões. Na base de dados do SINITOX foi possível observar, em relação ao local de
ocorrência dos acidentes, que a grande maioria dos acidentes acontecem em área urbana e
não rural, demonstrando que as abelhas estão cada vez mais inseridas dentro das cidades
aumentando a possibilidade de acidentes (Tabela 3). Esse fato também foi observado por
Mello et al (1993). Neste trabalho foi realizado um levantamento de número de solicitações
de Centro de Controle de Zoonoses do Município de São Paulo para retirada de colônias e
enxames viajantes nos anos de 1994 a 1997. Foi observado um aumento de solicitações
como mostra a tabela 4. As abelhas foram divididas em dois grupos: exames viajantes
(identificados como enxames que não tinham colônia formada, isto é, formação de colméia)
e colônias (colméias formadas).
Introdução
9
Tabela 3. Casos Registrados de Intoxicação Humana por Agente Tóxico e Zona de Ocorrência.
Brasil, 2005
Zona
Agentes
Rural
Urbana
Ignorada
T o t a l
n
o
n
o
n
o
n
o
%
Medicamentos
857
20.299
770
21.926
25,96
Agrotóxicos/Uso Agrícola
2.052
3.252
273
5.577
6,6
Agrotóxicos/Uso Doméstico
167
2.360
63
2.590
3,07
Produtos Veterinários
163
690
24
877
1,04
Raticidas
202
2.929
82
3.213
3,8
Domissanitários
251
6.062
193
6.506
7,7
Cosméticos
17
768
23
808
0,96
Produtos Químicos Industriais
302
4.198
131
4.631
5,48
Metais
39
595
86
720
0,85
Drogas de Abuso
424
1.842
676
2.942
3,48
Plantas
181
1.530
54
1.765
2,09
Alimentos
157
628
48
833
0,99
Animais Peç./Serpentes
3.597
1.154
193
4.944
5,85
Animais Peç./Aranhas
1.089
3.383
189
4.661
5,52
Animais Peç./Escorpiões
898
7.085
225
8.208
9,72
Outros Animais Peç./Venenosos
921
4.457
456
5.834
6,91
Animais não Peçonhentos
1.682
3.272
192
5.146
6,09
Desconhecido
242
1.265
498
2.005
2,37
Outro
113
1.122
35
1.270
1,5
T o t a l
13.354
66.891
4.211
84.456
100
%
15,81
79,2
4,99
100
Fonte: MS / FIOCRUZ / SINITOX
Tabela 4. Número de solicitações recebidas no Centro de Controle de Zoonoses do Município de São
Paulo para retirada de colônias e enxames viajantes nos anos de 1994 a 1997.
Solicitações
1994
1995
1996
1997
Total
Remoção de colônias
338
373
525
754
1.990
Remoção de enxames viajantes
229
193
283
319
1.024
Total
569
571
817
1.104
3.061
1.3. Sintomatologia no acidente com abelhas
Os acidentes causados por picadas de abelhas e vespas apresentam manifestações
clínicas distintas, dependendo da sensibilidade do indivíduo ao veneno e do número de
picadas. Um acidente com abelhas pode tornar-se mais grave por dois motivos: pelo fato
das colônias serem grandes (muitas abelhas) e pelos ferormônios liberados pela abelha
após a ferroada. Estes ferormônios estimulam a agressividade de outras abelhas, indicando
onde atacar. Entretanto, o acidente mais freqüente é aquele no qual um indivíduo, não
sensibilizado ao veneno, é acometido por poucas picadas.
Introdução
10
Nestes casos, o quadro clínico se limita à reação inflamatória local com pápulas
eritematosas, dor e calor local. Na maioria das vezes, esta situação é resolvida sem a
participação médica (Barraviera, 1999). Devido a esse tipo de tratamento, o número total de
acidentes com abelhas, possivelmente, pode estar abaixo do número real de acidentes.
Outra forma de apresentação clínica destes acidentes é aquela na qual o indivíduo,
previamente sensibilizado a um ou mais componentes do veneno, manifesta reação de
hipersensibilidade imediata. É uma ocorrência grave, podendo ser desencadeada por
apenas uma picada e exige a intervenção imediata do médico. O quadro clínico em geral se
manifesta por edema de glote e brancopasmo acompanhado de choque anafilático
(Barraviera, 1999).
A terceira forma de apresentação deste tipo de acidente é a causada por múltiplas
picadas. O acidente ocorre quando a pessoa é atacada, geralmente, por um enxame de
abelhas do gênero Apis, em geral durante o trabalho no campo ou entrando em contato com
algum exame na cidade. Neste caso, grande quantidade de veneno é inoculada, devido às
múltiplas picadas, em geral centenas ou milhares (Barraviera, 1999). Em decorrência,
manifestam-se vários sinais e sintomas devido à ação das diversas frações do veneno. Este
tipo de acidente é raro e o quadro clínico apresentado pelo doente é decorrente da ação das
diferentes frações do veneno (Habermann, 1972; Hegner; Schummer e Schnepel, 1973). Os
doentes acometidos por muitas ferroadas evoluem rapidamente para um quadro clínico
grave de insuficiência respiratória e renal aguda (Barraviera, 1999).
Classicamente, as manifestações clínicas decorrentes de picadas por himenópteros
são classificadas em reações tóxicas, atribuídas à ação farmacológica dos componentes do
veneno, e em reações alérgicas, nas quais mecanismos alérgicos de hipersensibilidade
estão envolvidos.
As reações tóxicas podem ser divididas em locais e sistêmicas. As reações tóxicas
locais, também chamadas de reações habituais, se caracterizam pela presença de dor,
eritema e edema, não muito intensos, que surgem no local da picada e persistem por
algumas horas. Geralmente não requerem tratamento, a não ser a aplicação de compressas
frias e o uso de analgésicos, além da retirada do ferrão, quando presente. As reações locais
extensas devem ser tratadas com o uso de anti-inflamatórios não-hormonais e anti-
histamínicos.
As reações tóxicas sistêmicas são decorrentes de múltiplas picadas, em geral, acima
de 100 no caso dos acidentes provocados por abelhas. Entretanto, acidentes em crianças
com poucas dezenas de picadas, podem apresentar toxicidade sistêmica. Nas reações
tóxicas sistêmicas decorrentes de múltiplas picadas, o prognóstico costuma ser grave em
Introdução
11
adultos que receberam mais que 500 picadas de abelhas e em crianças, idosos e em
portadores de doenças cardiopulmonares que receberam relativamente poucas picadas. O
quadro clínico inicia-se com uma intoxicação histamínica caracterizada por sensação de
prurido, rubor e calor generalizados, podendo surgir pápulas e placas urticariformes
disseminadas pelo corpo. Seguem-se hipotensão, taquicardia, cefaléia, náuseas e/ou
vômitos, cólicas abdominais e broncoespasmo. Já que complicações importantes como a
hemólise intravascular, rabdomiólise, necrose tubular aguda e colapso respiratório e
cardiovascular podem ocorrer, a terapêutica apropriada deve ser instituída o mais
precocemente possível. Em pacientes com quadro clínico grave, após um grande número de
picadas, a transfusão sangüínea ou a plasmaferese, devem ser consideradas, uma vez que
pode haver evolução para choque e insuficiência respiratória aguda. O uso empírico de altas
doses de anti-histamínicos e corticosteróides tem-se mostrado benéfico para o combate da
intoxicação histamínica e dos efeitos inflamatórios do envenenamento, não sendo
estabelecido um tratamento adequado para esses pacientes (Barraviera, 1999).
As reações alérgicas às picadas de abelhas são comuns e, mesmo que raramente,
podem levar à morte. Entretanto existe um aumento do risco de sensibilização ao veneno
com o envelhecimento (Golden et al., 1989). A alergia aos venenos de Hymenoptera é um
fenômeno imunológico. Ela ocorre quando, numa primeira picada, a exposição a
determinados alérgenos presentes no veneno induz uma resposta imunológica no indivíduo
denominada "sensibilização”. Após a sensibilização, o indivíduo permanecerá assintomático
até que ocorra uma nova picada. Quando essa ocorre, os alérgenos do veneno reagem com
anticorpos específicos induzindo uma resposta inflamatória, responsável pelos sinais e
sintomas encontrados na reação alérgica (Cardoso et al., 2003).
As reações alérgicas podem ser divididas em locais e sistêmicas. As reações
alérgicas locais são caracterizadas pela formação de um processo inflamatório acentuado
nas áreas contíguas ao local da picada, com a formação de edema, geralmente maior que
10cm de diâmetro, que progride por até 48 horas e persiste por alguns dias. Eventualmente,
pode ocorrer a formação de uma bolha com conteúdo seroso no local da picada. Nem
sempre se pode afirmar que essas reações são mediadas por mecanismos alérgicos ou
devidas à ação farmacológica do veneno, com a liberação de mediadores inflamatórios por
mecanismos não imunológicos. Entretanto, em muitos pacientes que apresentam esse tipo
de reação local extensa, os testes alérgicos cutâneos com extrato de veneno são positivos,
sugerindo mecanismo alérgico mediado por IgE (Cardoso et al., 2003).
As reações alérgicas sistêmicas, ou anafiláticas, são classificadas, segundo
MUELLER (1966), em quatro graus, levando-se em consideração a intensidade da
sintomatologia (Tabela 5).
Introdução
12
Tabela 5. Classificação das reações alérgicas sistêmicas à picada de Himenóptera.
Grau
Sintomatologia
I
Urticária generalizada, prurido, mal estar, ansiedade.
II
Um dos sintomas anteriores e dois ou mais dos seguintes: angioedema (isoladamente
também define grau II), broncoconstrição leve, náuseas, vômitos, diarréia, dor
abdominal, vertigens.
III
Um dos sintomas anteriores e dois ou mais dos seguintes: dispnéia, sibilos, estridor
(isoladamente qualquer um desses três define grau III), disfagia, disartria, rouquidão,
fraqueza, confusão mental, sensação de morte iminente.
IV
Um dos sintomas anteriores e dois ou mais dos seguintes: queda da pressão arterial,
colapso, perda da consciência, incontinência (urinária, fecal), cianose.
Fonte: (Mueller, 1966)
Esses sintomas surgem em torno de 15 minutos após a picada e há uma tendência
de serem mais graves quanto mais precoce for o seu aparecimento. Raramente aparecem
horas após o acidente. As reações de graus I e II que incluem angioedema, prurido e
urticária, são consideradas sem risco de vida, enquanto que nas reações de graus III e IV,
compreendendo edema de glote, crise de broncoespasmo e choque anafilático, ocorre risco
de vida. O tratamento das reações alérgicas sistêmicas deve ser abordado de acordo com o
grau de gravidade, utilizando-se adrenalina, corticosteróides, anti-histamínicos medidas de
suporte cardiorrespiratórias, não diferindo o tratamento daquele recomendado para as
reações anafiláticas de outras causas (Cardoso et al., 2003).
A imunoterapia (IT) com extratos de venenos purificados tem-se mostrado altamente
eficaz para a maioria dos pacientes alérgicos a venenos de insetos Hymenoptera, na
profilaxia e prevenção de reações a picadas subseqüentes. A IT consiste na administração
de extratos purificados de venenos, por via subcutânea, em quantidades pequenas e
crescentes. Outra forma de tratamento dos acidentes com abelhas é por meio da utilização
de plantas com atividade antiveneno.
1.4. Veneno
As glândulas de veneno estão presentes em todos os Himenópteros, excetuando-se
os grupos em que a glândula atrofiou (Cruz-Landim e Abdalla, 2002). Entretanto, a
composição do veneno é variada entre os diversos tipos de Himenópteros. Na A. mellifera, a
composição do veneno varia de acordo com a raça (subespécie), fase do desenvolvimento e
com os hábitos alimentares (Palma e Brochetto-Braga, 1993). As principais alterações
encontradas são variações nas concentrações das proteínas do veneno ao longo das
estações do ano, demonstrando uma influência do meio (Abreu, 1996).
No desenvolvimento das abelhas, durante a fase de pupa inicia-se a secreção do
veneno e o seu armazenamento, que continua até o 10º ao 15º dia de vida adulta da
Introdução
13
operária. Após esse período, a secreção do veneno deixa de ser produzida (Cruz-Landim et
al., 2002).
Abreu (1996) encontrou variações no conteúdo protéico do veneno de operárias
coletadas em diferentes estações do ano e de um ano para outro, denotando influências do
meio sobre a quantidade de proteína na secreção. O veneno produzido pela glândula de
veneno de Apis mellifera é um líquido transparente, incolor e muito solúvel em água. Possui,
aproximadamente, 50 componentes identificados, sendo muitos deles tóxicos para vários
animais (Cruz-Landim et al., 2002).
O comportamento de ferroar das abelhas é, geralmente, desencadeado em
competição por alimento, na maioria das vezes contra outros artrópodes. A ferroada injeta o
correspondente a, aproximadamente, 0,5 µL de veneno que causa dor e reações anafiláticas
em grandes animais. Para os insetos essa dose é, muitas vezes, letal. No momento da
ferroada, o aparelho do ferrão, juntamente com o saco de veneno (reservatório) fica preso à
vítima, assegurando que todo o veneno seja injetado. A própria vítima garante o sucesso da
injeção do veneno quando tenta remover o ferrão, promovendo, assim, a compressão do
reservatório (Cruz-Landim et al., 2002).
Os 0,5 µL de veneno injetados em uma ferroada contêm aproximadamente 50 µg de
matéria seca. As principais proteínas presentes são a Melitina (50% do peso de seco do
veneno), Fosfolipase A2 (12% do peso seco), fator degranulador de mastocitós (3% do peso
seco), hialuronidase (3% do peso seco) e apamina (2% do peso seco). Além disso, estão
presentes numerosas aminas biogênicas, entre elas histamina (1 % do peso seco),
dopamina (0,5% do peso seco) e noradrenalina (0,5% do peso seco). Também estão
presentes muitos acetatos voláteis que, presumivelmente, estimulam o comportamento
agressivo de outras abelhas (Cruz-Landim et al., 2002).
A composição e o modo de ação dos venenos das abelhas melíferas têm sido mais
bem estudados a partir da década de 1950 (Cardoso et al., 2003). A toxicidade desses
venenos é atribuída a três tipos fundamentais de componentes protéicos: enzimas
(Fosfolipases A2 e Hialuronidase), grandes peptídeos (Melitina, Apamina e Peptídeo
degranulador de mastócitos - PDM) e pequenas moléculas (Peptídeo e Aminas biogênicas),
que possuem atividades alérgicas e farmacológicas. Os fatores alergênicos são enzimas
como fosfolipases, hialuronidases, lipases e fosfotases, proteínas antigênicas que
inoculadas durante a ferroada, iniciam respostas imunes responsáveis pela
hipersensibilidade de alguns indivíduos e pelo início da reação alérgica.
Introdução
14
1.4.1. Os fatores farmacológicos
Os fatores alergênicos presentes no veneno são representados, principalmente,
pelas fosfolipases, hialuronidase, lípases e fosfatases, que são as substâncias responsáveis
pelo início da reação. A hialuronidase hidrolisa o ácido hialurônico, que faz parte da
substância intersticial dos tecidos e cujas propriedades adesivas mantêm as células unidas.
A hialuronidase fluidiza o ácido hialurônico, facilitando a difusão dos componentes do
veneno através dos espaços intercelulares dos tecidos, sendo conhecido como "fator
propagador". A Fosfolipase A2 encontrada no veneno de abelhas é a mais ativa das
fosfolipases conhecidas. Seu mecanismo de ação está relacionado à destruição de
fosfolípides de membrana, convertendo-os da forma cilíndrica para a forma cônica, levando
à ruptura do arranjo nas membranas, com conseqüente formação de "poros", lise celular e
permitindo a entrada do veneno nas células. As lipases e as fosfatases atuam na destruição
dos resíduos provenientes das células lisadas (Cardoso et al., 2003; Lima e Brochetto-
Braga, 2003).
A Melitina é a toxina mais ativa do veneno de abelhas, possui uma conformação
especial, sendo a com menor peso molecular encontrada no veneno de abelhas, contendo
apenas 26 aminoácidos. A conformação da molécula de Melitina é tal que esta apresenta
uma extremidade hidrofóbica e outra hidrofílica. Em certas condições, quatro moléculas de
Melitina unem-se e formam tetrâmeros com as partes hidrofóbicas voltadas para o interior.
Nessa forma a Melitina não possui ação lítica e é assim que é estocada no reservatório de
veneno. Entretanto, quando diluída, dissocia-se em monômeros que são altamente ativos,
incorporando-se as membranas celulares, causando desorganização dos fosfolipídios,
podendo levar à lise celular. Tanto as fosfolipases A2 quanto a Melitina são tóxicas quando
presentes separadamente, porém seus efeitos são potencializados quando estão
associadas, fazendo com que a lise celular ocorra mesmo na presença de baixas
concentrações desses componentes. A Melitina e Fosfolipase A2 agem de forma sinérgica
sobre fosfolipídios de membranas, resultando no comprometimento da integridade da
membrana celular e da membrana mitocondrial, comprometendo a fosforilação oxidativa e a
cadeia respiratória, ocasionando dano tecidual. Essa atividade é exercida sobre diversos
grupos celulares como hemácias, células musculares, hepatócitos, fibroblastos, mastócitos e
leucócitos. A lise de membranas celulares pode levar à liberação de produtos de
degradação do ácido araquidônico (Cardoso et al., 2003; Lima et al., 2003).
Outro componente farmacológico importante, contido no veneno, é a apamina. É a
menor neurotoxina conhecida, que age nas membranas pós-sinápticas do sistema nervoso
central e periférico, bloqueando a transmissão de determinados impulsos inibitórios. Como
muitas neurotoxinas potentes presentes nos venenos de cobras, ela liga-se firmemente aos
Introdução
15
receptores dos canais de potássio (K
+
) que são cálcios (Ca
2+
) dependentes, alterando as
condições de polarização de membrana e a permeabilidade das membranas sinápticas
(Cardoso et al., 2003; Lima et al., 2003).
Já o peptídeo degranulador de mastócitos (PDM) é o principal responsável pela
liberação de mediadores de mastócitos e basófilos, como a histamina, serotonina, derivados
do ácido araquidônico e fatores que atuam sobre plaquetas e eosinófilos. Desempenha,
dessa forma, papel no quadro de intoxicação histamínica observada nas fases iniciais do
acidente (Cardoso et al., 2003; Lima et al., 2003).
As aminas biogênicas são, em sua maioria, constituintes comuns dos venenos de
insetos e ofídios. As informações sobre seus efeitos em insetos são escassas, sabendo-se
apenas que algumas atuam como neurotransmissores. A histamina é a amina biogênica
mais comum e o seu conteúdo no veneno de Apis mellifera está relacionado com a idade da
abelha. Seu conteúdo aumenta de zero, logo após a emergência, para 2.000 ng entre 35 e
45 dias de vida. A pequena quantidade de histamina encontrada no veneno tem papel
insignificante para explicar seus efeitos no envenenamento, quando comparada com a
capacidade de liberação dessa amina bioativa pelo PDM e pela associação da Melitina com
a Fosfolipase A2. A histamina ocasiona vasodilatação e aumento da permeabilidade capilar,
podendo também, quando em níveis elevados, ativar a liberação de adrenalina, explicando o
quadro clínico compatível com intoxicação adrenérgica observado no início do
envenenamento. A concentração das catecolaminas também varia com a idade. Outras
aminas biogênicas, também encontradas, são serotonina, dopamina e noradrenalina que
têm sido identificadas no veneno de abelhas (Cardoso et al., 2003; Lima et al., 2003).
Existem muitos outros peptídeos encontrados no veneno, alguns dos quais já foram
identificados tais como secapina, tertiapina e procamina. Muitos deles não são encontrados
em todas as amostras de veneno e sua presença pode variar muito, tanto quantitativa como
qualitativamente, de acordo com a linhagem e a subespécie de Apis mellifera (Palma et al.,
1993). São também encontrados aminoácidos livres, carboidratos e constituintes lipídicos
provenientes da hemolinfa. Segundo Banks & Shipolini (1986) devem ser considerados
como componentes orgânicos, de baixo peso molecular e característicos do veneno, apenas
aqueles que não são encontrados também na hemolinfa (Banks e Shipolini, 1986; Lima et
al., 2003).
1.5. Plantas medicinais
Grande parte dos medicamentos que estão no mercado origina-se de produtos
naturais, em especial, de plantas. Entre as vinte drogas mais vendidas nos EUA em 1988,
apenas sete não derivavam diretamente de produtos naturais. Ainda assim, estes
Introdução
16
participaram em algum momento da história farmacológica dessas drogas. Naturalmente, o
Brasil, com a sua enorme biodiversidade, pode contribuir para o desenvolvimento de novos
medicamentos produzidos a partir de plantas.
O mercado mundial de produtos farmacêuticos movimenta US$ 320.000.000/ano dos
quais, US$ 20.000.000, são originados de substâncias ativas derivadas de plantas
(Robbers; Speedle e Tyler, 1993). As plantas medicinais têm um papel fundamental na
saúde mundial, por serem fontes de muitas combinações farmacológicas ativas como
flavonóides e taninos. Muitos destes compostos se assemelham a combinações biológicas e
esta similaridade é a base da ação fisiológica delas (Robbers et al., 1993).
No Brasil, estima-se que 25% dos US$ 8 bilhões de faturamento, em 1996, da
indústria farmacêutica, sejam originados de medicamentos derivados de plantas. Apenas
8% das espécies vegetais da flora brasileira foram estudadas em busca de compostos
bioativos e 1.100 espécies vegetais avaliadas em suas propriedades medicinais (Garcia et
al., 1996).
Sem recursos e tempo para resolver seus problemas de saúde, o Brasil e outros
países, com apoio da Organização Mundial de Saúde, começaram a resgatar a medicina
popular e nesta as plantas medicinais ressurgiram com força e vigor. Nos últimos anos, tem-
se verificado um grande avanço científico envolvendo os estudos químicos e farmacológicos
de plantas medicinais que visam identificar e obter novos compostos com propriedades
terapêuticas (Souza Brito e Souza Brito, 1996).
O uso de plantas medicinais tem sido uma prática consagrada em épocas diversas
da história humana, cujo acúmulo de informações, obtido através de experiências de vários
povos, representa milênios de história, desde quando os únicos recursos medicamentosos
disponíveis eram em grande parte provenientes dos vegetais.
Neste contexto, é importante mencionar que as plantas, além de seu uso na
medicina popular com finalidades terapêuticas, têm contribuído, ao longo dos anos para a
obtenção de vários fármacos, até hoje utilizados, como por exemplo, a morfina (anestésico),
a vincristina (antitumoral) e a rutina (vasodilatadora) isoladas de várias espécies de plantas
(Cechinel Filho e Yunes, 1998).
As substâncias com atividade de interesse na maioria das vezes estão presentes em
quantidades mínimas na planta, dependendo de vários fatores como a variabilidade sazonal
e até mesmo o dia e à hora da coleta, estágio de crescimento, o clima e a composição do
solo predominantes nas diferentes regiões e também as partes da planta onde são
produzidos ou armazenados os compostos de interesse. Algumas substâncias de grande
valia para a indústria farmacêutica são obtidas diretamente das plantas, em grande
Introdução
17
quantidade, e utilizadas na elaboração de diversos fármacos. No entanto, é necessária a
síntese química de medicamentos a partir de seus análogos naturais isolados de plantas em
quantidades ínfimas e caracterizados estrutural e farmacologicamente.
1.5.1. Plantas medicinais antiveneno
Os acidentes com animais peçonhentos representam sério problema de saúde
pública em diversos países do mundo pela freqüência com que ocorrem e pela mortalidade
que ocasionam. Existe uma grande diversidade de animais peçonhentos como serpentes,
abelhas, escorpiões e outros animais. Apesar de existir uma grande quantidade de animais
peçonhentos, as serpentes são os animais mais estudados em relação a plantas
antiveneno. No Brasil, ocorrem em torno de 25.000 acidentes com os mais diversos animais
peçonhentos, onde 4.847 foram causados por abelhas e vespas. Dessa forma, as plantas
medicinais representam uma importante fonte de obtenção de compostos bioativos capazes
de auxiliar diretamente no tratamento do envenenamento ou indiretamente suplementando a
sorologia existente atualmente.
O uso de extratos de planta como antídoto para venenos animais é uma antiga
opção utilizada em muitas comunidades que não têm um acesso pronto a terapia de soro.
Além disso, dependendo do tempo entre o acidente e o tratamento, a habilidade do anti-soro
para neutralizar efeitos locais de envenenamento é somente parcial. Extratos vegetais se
tornam um material de pesquisa importante, bem como um suplemento alternativo para anti-
soro (Rizzini; Mors e Pereira, 1988; Ruppelt et al., 1991; Martz, 1992). Estes extratos
podem, futuramente, substituir o tratamento tradicional utilizado em envenenamentos
humanos, podendo ser de grande importância para acidentes com animais, uma vez que, o
anti-soro não é disponibilizado neste caso.
Centenas de plantas têm sido relatadas com ação antiveneno a nível mundial,
mostrando a presença de biomoléculas capazes de neutralizar variados efeitos locais e
sistêmicos. Extrato aquoso das raízes de Mimosa pudica neutralizou a letalidade e a
miotoxicidade induzidas pelo veneno bruto de Naja Kaouthia (Mahanta e Mukherjee, 2001),
Musa sp. mostrou inibição total da atividade fosfolipásica dos venenos de B. jararacussu e
C. d. terrificus e neutralização da atividade hemorrágica do veneno de B. jararacussu
(Borges et al., 2001), extrato das folhas de Schizolobium parahyba mostrou-se inibitório
sobre as atividades fosfolipásica, coagulante e hemorrágica do veneno bruto de B.
alternatus (Mendes et al., 2002), extrato aquoso de Kalanchoe brasiliensis mostrou inibição
do edema e necrose em cães quando injetados com veneno bruto de B. alternatus (Silva Jr.
et al., 2002).
Introdução
18
Melo et al. (1994; 1999) testaram os efeitos do extrato bruto de Eclipta prostata
(Asteraceae) e verificaram a presença de substâncias antiproteolíticas e anti-hemorrágicas e
a capacidade da wedelolactona em inibir os efeitos induzidos por venenos crotálicos. Borges
et al. (2000; 2001) testaram os efeitos antiofídicos da Casearia sylvestris (Flacourtiaceae)
que demonstrou inibição das atividades fosfolipásica, miotóxica, edematogênica,
hemorrágica e proteolítica, induzidas por diferentes venenos de serpentes, miotoxinas e
proteases isoladas (Melo et al., 1994; Melo e Ownby, 1999; Borges et al., 2000; Borges et
al., 2001).
Mors et al. (2000) citam 104 plantas indicadas pela medicina popular como
antiofídicas e ainda as várias classes de compostos relacionados com ação antiofídica,
ressaltando a importância de espécies da família Apocynaceae (Mors et al., 2000).
Além das tentativas de se compreender o mecanismo de ação destas toxinas
animais, a busca de formas alternativas para o tratamento do envenenamento tornou-se
alvo freqüente e importante de diversos pesquisadores. As diferentes isoformas de toxinas
de venenos podem ser reconhecidas e inibidas por anticorpos policlonais e/ou monoclonais,
e também por algumas moléculas de diversas naturezas, incluindo agentes quelantes,
heparina, fatores plasmáticos de origem animal (inclusive das próprias serpentes) e extratos
de plantas (Melo et al., 1999; Borges et al., 2000; Borges et al., 2001; Biondo et al., 2003;
Biondo et al., 2004). A neutralização da ação dos venenos e suas toxinas são
imprescindíveis na busca de tratamentos antiveneno.
Em razão de suas excelentes propriedades medicinais, as plantas vêm sofrendo
exploração predatória excessiva nos últimos anos e correm o risco de desaparecerem, antes
mesmo que estudos ecológicos e agronômicos pormenorizados sejam efetuados (Vieira,
1992). Portanto, o aumento de pesquisas com plantas medicinais nativas do cerrado
brasileiro, mata atlântica e outras regiões típicas, tem grande importância, por tratar-se de
estímulo adicional ao estudo das espécies destas regiões, o que contribui com os esforços
para a preservação da biodiversidade vegetal.
Outras atividades, também identificadas para as plantas medicinais, são contra
diversos tipos de patologias, tais como diabetes (Aritajat; Wutteerapol e Saenphet, 2004;
Chhetri; Parajuli e Subba, 2005), diarréia (Agunu et al., 2005), malária (Krettli et al., 2001;
Asase et al., 2005; Koch et al., 2005) e câncer (Kimura, 2005). Têm sido usadas também
como analgésicos (Almeida; Navarro e Barbosa-Filho, 2001), bactericidas (de Boer et al.,
2005; Hersch-Martinez; Leanos-Miranda e Solorzano-Santos, 2005; Kloucek et al., 2005),
antivirais (Andrighetti-Frohner et al., 2005), antifúngicos (de Boer et al., 2005),
antimicrobianos (de Souza et al., 2004) e antivenenos (Hutt e Houghton, 1998; Lans et al.,
Introdução
19
2001; Daduang et al., 2005; Jimenez-Ferrer et al., 2005). A possibilidade de usar plantas
antivenenos é de grande importância para a saúde pública e indústria de fármacos.
Outra forma de obter plantas que inibam a atividade de veneno seria com estudos
farmacológicos, pois diversas atividades são demonstradas com os extratos e frações de
algumas dessas plantas usadas na medicina tradicional como: atividade antiinflamatória,
antiviral e antivenenos (Mors et al., 2000; Soares et al., 2004; Soares et al., 2005). O
metabolismo das plantas medicinais oferece algum produto ou subproduto que pode ser
utilizado de alguma forma pelo homem. Tais produtos têm sido administrados com sucesso
em diferentes formas para um grande número de problemas de saúde. Assim como seus
benefícios, as contra-indicações também tem sido registradas. Algumas plantas com
reputação de antiofídicas na medicina popular, mostraram-se inativas em experimentos
clínicos e farmacológicos. Numerosas espécies vegetais da flora brasileira são conhecidas
popularmente como antiofídicas, no entanto, poucas espécies foram testadas
cientificamente e menos ainda tiveram seus princípios ativos isolados e caracterizados do
ponto de vista estrutural e funcional (Mors et al., 2000; Soares et al., 2004; Soares et al.,
2005). Sendo assim, a identificação de uma atividade, pode permitir que o composto ou o
extrato da planta venha ser avaliado contra o veneno.
O uso popular das plantas medicinais tem crescido nos últimos anos e o mercado
mundial de plantas medicinais movimenta cerca de US$ 500 bilhões anuais
(www1.folha.uol.com.br/folha/reuters/ult112u12329.shl). Entretanto, o consumo elevado e a
falta no controle de plantio podem levar à extinção de várias espécies de plantas medicinais
utilizadas hoje em dia pela população.
O conhecimento etnobotânico-farmacológico é a base para o desenvolvimento de
fármacos. Sendo assim, os metabólicos secundários vegetais apresentam um grande valor
social e econômico para o país, uma vez que, são usados em grande escala, como por
exemplo, para a produção de inseticidas, corantes e medicamentos
(www.biotecnologia.com.br/materias/).
Em 2002, o Brasil começou a desenvolver o primeiro banco de dados para mapear a
enorme biodiversidade de plantas medicinais existentes no país (cerca de 20% das espécies
do planeta), tentando combater o comércio ilegal
(www1.folha.uol.com.br/folha/reuters/ult112u12329.shl). “A Organização Mundial da Saúde
calcula que, ainda hoje, 80% da população mundial recorra à prática de curar-se por meio
de plantas medicinais” (De Lucca, 2004). Atualmente, existem diversos esforços para
promover a conservação da biodiversidade existente, permitindo que as plantas possam ser
estudadas sem causar a extinção das mesmas. A formação de um banco de germoplasma
Introdução
20
seria uma forma de aumentar a conservação e viabilizar diversos tipos de estudos sem
afetar a natureza (Barbosa, 2001).
1.5.2. Banco de germoplasma de plantas
Os bancos de germoplasma são importantes ferramentas para conservação da
biodiversidade, permitem manter um grande numero de espécimes com uma grande
diversidade genética (Barbosa, 2001). O banco de germoplasma da USP de Ribeirão Preto
possui uma grande diversidade de plantas que estão ameaçadas de extinção. As plantas
representadas são plantas pertencentes à mata nativa, que devem ser conservadas.
Atualmente, existe um total de 44 espécies (Tabela 6) que são conservadas em viveiros.
Dentre as 44 espécies, algumas têm importância econômica e medicinal, devido a esse fato
a conservação do banco é essencial. Muitas informações têm sido geradas a partir de
experimentos com plantas medicinais. Para análise desses experimentos, são utilizados
computadores. Devido a esse fato, houve um grande avanço entre a informática e biologia,
e com isto surgiu uma nova área que se denomina bioinformática.
Introdução
21
Tabela 6. Lista de todas as espécies que estão sendo preservadas no Banco de Germoplasma da
USP/RP. Com seus respectivos nomes científicos, nome vulgar e família.
1.6. Bioinformática
A bioinformática é uma área que tem crescido exponencialmente devido à grande
quantidade de dados biológicos gerados e aos grandes avanços da computação, permitindo
que ocorra uma interação cada vez maior entre as duas áreas. Suas aplicações são
variadas, seja na análise de seqüências, anotação de genomas, modelagem de proteínas,
diagnóstico de doenças, desenvolvimento de novos fármacos ou estudos das relações
Família
Nome
científico
Nome
vulgar
Família
Nome
científico
Nome vulgar
Anacardiaceae
Schinus
tereventifollius
Aroeira
vermelha
Lecythidaceae
Cariniana
legalis
Jequitibá rosa
Anacardiaceae
Astronium
graviolens
Guaritá
Lythraceae
Lafoensia pacori
Dedaleiro
Apocynaceae
Aspidosperma
polyneuron
Peroba-
rosa
Melastomataceae
Tibouchina
granulosa
Quaresmeira rosa
Araliaceae
Didymopanax
morototonii
Morototó ou
mandiocão
Meliaceae
Cedrela fissilis
Cedro
Arecaceae
Acrocomia
aculeata
Macaúba
Meliaceae
Guarea
guidonia
Marinheiro
Arecaceae
Syagrus
romanzofiana
Jerivá
Mimosidae
Acacia
polyphylla
Monjoleiro
Bignoniaceae
Tabebuia roseo
alba
Ipê branco
Mimosidae
Anedenanthera
macrocarpa
Angico
vermelho/branco
Bignoniaceae
Tabebuia
vellosoi
Ipê amarelo
Mimosidae
Enterolobium
contorsiliquum
Tamboril
Bombaceae
Chorisia
speciosa
Paineira
Myrtaceae
Eugenia uniflora
Pitanga
Boraginaceae
Cordia
trichotoma
Louro-pardo
Papilionoideae
Machaerum
villosum
Jacarandá do
Mato
Caesalpinioideae
Pterogyne
nitens
Amendoim
bravo
Papilionoideae
Centrolobium
domentosoum
Araribá
Caesalpinioideae
Schizolobium
parahyba
Guapuruvu
Papilionoideae
Platycyamus
elegants
Amendoim do
campo
Caesalpinioideae
Pelthophorum
dubium
Canafístula
Papilionoideae
Platycyamus
regnelli
Pau-pereira
Caesalpinioideae
Caesalpinea
ferrea
Pau-ferro
Papilionoideae
Holocalys
balansae
Alecrim de
Campinas
Caesalpinioideae
Copaifera
langsdorffii
Óleo de
copaíba
Papilionoideae
Myroxylum
peruiferum
Cabreuva
Caesalpinioideae
Hymenaea
courbaril
Jatobá
Phytolaccaceae
Galesia
integrifolia
Pau d`álho
Cecropiaceae
Cecropia
pachystachya
Embauba
Rubiaceae
Genipa
americana
Genipapo
Euphorbiaceae
Croton
floribundus
Capixingui
Rutaceae
Zanthoxyllum
riedelianum
Mamica de porca
Euphorbiaceae
Croton
urucurana
Sangra
d`água
Rutaceae
Balfourodendro
m riedelianum
Pau-marfim
Lauraceae
Nectandra
megapotâmica
Canelinha
Rutaceae
Esembeckia
leiocarpa Engl.
Guarantã
Lecythidaceae
Cariniana
estrellensis
Jequitibá
branco
Sterculiaceae
Guazuma
ulmifolia
Mutambo
Verbenaceae
Aegiphila
sellowiana
Tamanqueiro
Introdução
22
filogenéticas. Cada nova área exige conhecimentos específicos além da própria biologia e
computação, necessitando de pessoas com conhecimentos cada vez mais variados. Devido
ao grande volume de dados biológicos torna-se necessário armazená-lo de forma
organizada em banco de dados, facilitando assim novas pesquisas.
1.6.1. Banco de dados de toxinas
Animais peçonhentos produzem uma grande variedade de importantes componentes
farmacológicos. Os componentes do veneno são utilizados nos estudo de canais iônicos e
receptores, para a descoberta de medicamentos e formulação de inseticidas. Informações
sobre toxinas estão dispersas em bases de dados públicas, que fornecem a seqüência
estrutural e descrições, porém escassas informações funcionais de anotação. O crescimento
exponencial de dados de toxinas recém identificadas criou a necessidade de melhores
formas de gerenciamento e armazenamento dos dados. Veneno-informática é uma
abordagem sistemática da bioinformática, em que são obtidos dados armazenados em
repositórios, classificados, organizados e integrados em um novo banco de dados especifico
que utiliza ferramentas avançadas de bioinformática para análise da estrutura e função de
toxinas (Tan; Khan e Brusic, 2003). Dessa forma, o foco da veneno-informatica é a
bioinformática dirigida para a aquisição, manipulação e análise de dados de venenos. Sendo
possível encontrar na internet alguns bancos de dados específicos sobre venenos, dentre
eles podem ser citados: SCORPION, MOLLUSK, svPLA2 database, Venom e BioVenom. Na
área de toxinas de abelhas, atualmente, os bancos de dados se concentram em apresentar
tipos de alérgenos. Portanto, torna-se necessário um banco de dados que permita a
organização dos dados existentes e também a sua análise. Um banco de dados pode ser
considerado uma coleção de dados inter-relacionados, estruturados, projetado para suprir
as necessidades de um grupo específico de aplicações e usuários.
Os venenos são fontes de pesquisa na área biológica, e com a existência e
acessibilidade aos bancos de dados na Internet, pesquisadores de todo o mundo podem
acessar informações de forma instantânea, como características biológicas, localização
geográfica ou outras características de acordo com os critérios de sua pesquisa (Perez et
al., 2001), economizando tempo e recursos. Para controlar o acesso e armazenamento de
informações é necessária a utilização de um Sistema de Gerenciamento de Banco de Dados
(DBMS). Um DBMS é um software que gerencia os pedidos dos usuários para acesso às
informações e, também, controla o armazenamento, a recuperação e a modificação dos
dados de interesse dos usuários.
Há muitas maneiras de organizar os dados, enquanto a maioria dos dados biológicos
está armazenada em bancos de dados de arquivos simples, esse tipo de banco de dados
Introdução
23
torna-se ineficiente quando a capacidade de dados que está sendo armazenada é
extremamente grande. Em um banco de dados de arquivos simples, todas as informações
sobre o objeto de estudo são armazenados em um grande arquivo de texto estruturado. Em
um banco de dados relacional, as informações são armazenadas em um conjunto de tabelas
e os dados são organizados em linhas, onde cada linha representa um registro no banco de
dados. Uma linha pode conter várias informações separadas (campos). Cada campo no
banco de dados pode conter uma informação distinta. A função do DBMS é fazer as
conexões entre as tabelas relacionadas, localizando rapidamente os elementos comuns que
estabelecem esses relacionamentos (Gibas e Jambeck, 2001).
O MySQL é um sistema de gerenciamento de bancos de dados relacional, que
permite armazenar dados em tabelas separadas em vez de colocar todos os dados em um
só local. Isso proporciona velocidade e flexibilidade. O Programa de Banco de Dados
MySQL é um sistema cliente/servidor que consiste de um servidor SQL multitarefa que
suporta acessos diferentes, diversos programas clientes e bibliotecas, ferramentas
administrativas e diversas interfaces de programação (API's), sendo necessário uma linha
de código para estabelecer a conexão com o banco de dados, utilizando a linguagem PHP,
que possui suporte incorporado para a interação com bancos de dados MySQL, PostgreSQL
e Oracle. O PHP (um acrônimo recursivo para "PHP: Hypertext Preprocessor") é uma
linguagem de script Open Source de uso geral, muito utilizada e especialmente guarnecida
para o desenvolvimento de aplicações Web (Meloni, 2000).
1.6.2. Sistemas de Gerenciamento de Conteúdo (CMS)
O CMS é uma sigla em inglês para Content Management Systems ou em português
Sistema de Gerenciamento de Conteúdo e, geralmente, apresenta-se na forma de códigos
abertos (open sources), com livre distribuição nos servidores de seus desenvolvedores.
Dessa forma, é um sistema escrito em alguma linguagem de programação que controla os
dados sem que o usuário precise ficar editando todos os arquivos.
Geralmente, um CMS grava os dados em um banco de dados, mas isso não é uma
premissa. O gerenciador de conteúdos é uma ferramenta que permite integrar e automatizar
todos os processos relacionados à criação, catalogação, indexação, personalização,
controle de acesso e disponibilização de conteúdos em portais web.
O sistema Drupal é um CMS altamente configurável, portanto o administrador de um
website pode ativar e desativar diferentes recursos e fazer várias configurações que mudem
a aparência e a funcionalidade do mesmo, além de realizar novas implementações
específicas, de acordo com o projeto desenvolvido. Possui um sistema de privilégios que faz
com que seja possível criar diferentes tipos de usuários, com diferentes níveis de acessos e
Introdução
24
administração interna, como por exemplo, visitantes, membros, equipe, parceiros, editores,
entre outros (Mercer, 2006).
O Drupal é projetado para ser facilmente estendido através de módulos - blocos de
código que provêm funcionalidade extra ou aprimoramentos ao desempenho do website,
permitindo novas implementações sem comprometer o sistema. Alguns módulos vêm com
toda instalação do Drupal (módulos-padrão), enquanto outros podem ser obtidos
individualmente, através do site do Drupal e instalados, separadamente, (módulos
contribuídos). Para desenvolvedores, ele dá uma base sólida para estender e implementar
soluções de gerenciamento de conteúdos personalizados.
Algumas características e módulos peculiares destacam-se na possibilidade de uma
perfeita associação com ferramentas e/ou interface, em sistemas e portais de
Bioinformática, como os recursos de taxonomia (categorização do banco de dados),
diferentes tipos de conteúdos, flexibilidade de blocos, relacionamentos (conteúdo versus
blocos), diferentes formatos de entrada de dados (Textos, HTML, PHP, etc.), URL´s
alternativas, agregador e sindicância de conteúdos (XML, RSS, RDF), indexação total para
sistema de busca, manipulação de expressões para idiomas (.pot files), códigos
extremamente limpos, temas em PHP Template, XHTML, CSS, estatísticas, rastreador,
watchdog, controle de acesso definido por papéis e, principalmente, os Snippets, fragmentos
de códigos que proporcionam customizações, associados com PHP, SQL e arquivos do
template (Temas).
1.6.3. Docking e Screening Virtual
O processo de triagem orientado pelo alvo molecular, característico do paradigma
industrial, vem sendo influenciado pela revolução da biologia molecular e pelos avanços da
bioinformática. A habilidade de desenvolver modelos que predigam o reconhecimento
molecular de uma micromolécula (ligante) por um determinado biorreceptor, associada à
disponibilidade de amplo banco de dados virtual de pequenas moléculas e de proteínas no
PDB (Protein Data Bank) (Berman et al., 2000), impulsionou o desenvolvimento de
softwares para triagem in silico, aplicando-se a abordagem conhecida como screening
virtual (Lima, 2007; Silva e Silva, 2007).
Embora esta estratégia vise acelerar o processo de identificação de ligantes,
contribuindo para o processo da descoberta de fármacos, a utilidade do método permanece
limitada, tanto pelo valor quantitativo, previsto, como pelas diferenças entre as estruturas
moleculares concebidas pelo programa, muitas vezes sem análise crítica do operador, com
aquelas factíveis de serem sintetizadas.
Introdução
25
Segundo Kubinyi (2003), o êxito na aplicação desta abordagem depende muito mais
da descrição adequada das propriedades moleculares que do método específico utilizado.
Embora a análise de farmacóforos e o docking (atracamento molecular) sejam técnicas
importantes no processo de desenho racional de ligantes e candidatos a protótipos de
fármacos, elas são freqüentemente aplicadas de forma inadequada. Ademais, a
complexidade do processo de interação ligante-receptor - considerando fatores entrópicos e
entálpicos - a presença de moléculas de água, a flexibilidade do ligante e do sítio de
interação são outros fatores complicadores, que podem comprometer a descrição
quantitativa da interação, através da afinidade prevista pelos modelos de docking (Kubinyi,
2003).
Recentemente, a estratégia de screening virtual vem sendo empregada dentro da
abordagem conhecida por in silico antitarget screening, visando contribuir para o aumento
da taxa de acerto no processo de seleção de novos candidatos a fármacos (NCEs). Esta
abordagem vem sendo utilizada como parâmetro para eliminação de ligantes pré-
selecionados, a partir de uma atividade in vitro sobre um alvo terapêutico específico,
importante para o controle e/ou tratamento de uma determinada doença, baseando-se num
conjunto de informações geradas a partir da análise da atividade in silico sobre alvos
reconhecidamente envolvidos com a resposta tóxica e efeitos adversos, permitindo
antecipar um perfil de seletividade e ausência de toxicidade, que assegure o sucesso na
etapa seguinte do processo da descoberta de fármacos (Kitchen et al., 2004).
Sendo assim, o desenho de drogas baseado em estrutura tornou-se uma tecnologia
altamente desenvolvida e utilizada nas maiores empresas farmacêuticas. A modelagem
molecular comparativa ou por homologia é uma chave característica de um esforço
integrado no descobrimento de novas drogas, porque ela permite que estas informações
genômicas sejam utilizadas no desenvolvimento de ligantes alvos ou na engenharia de
especificidade de ligantes (Lima, 2007; Silva et al., 2007).
O docking de um ligante a um receptor, podendo ser uma proteína, é uma das mais
importantes técnicas utilizadas em conjunto com a modelagem molecular em biologia
estrutural. Se a estrutura do receptor é conhecida, então, a aplicação é, essencialmente, de
um desenho de droga baseado em estrutura. Estes métodos têm alguns objetivos
relacionados, tais como: procurar identificar a localização do sítio ativo do ligante e talvez a
geometria do ligante no sítio ativo. Outra meta é a classificação de uma série de ligantes
relacionados em termos de sua afinidade ou avaliar a energia livre de ligação absoluta tão
precisamente quanto possível (Silva, 2007).
Introdução
26
Atualmente, modelos comparativos estão sendo usados em conjunto com screening
virtual para identificar novos inibidores. Vários pesquisadores têm demonstrado em seus
trabalhos o sucesso no uso de modelos estruturais para auxiliar no desenho racional de
drogas contra parasitas. Modelos comparativos foram usados em simulações de docking,
identificando uma baixa constante de inibição para inibidores não peptídicos de proteases
em malária e Schistosoma (Ring et al., 1993). Adicionalmente, modelos comparativos foram
usados para justificar a afinidade de ligantes pelo sítio de ligação em E. histolytica (Silva,
2007).
Computadores rápidos e a disponibilidade de clusters de computadores de custo,
relativamente baixo têm aumentado a velocidade na qual as drogas podem ser identificadas
e avaliadas in silico. O primeiro ciclo para o desenho de novas drogas inclui a determinação
da estrutura da proteína alvo por um dos três principais métodos usados para desenho de
drogas: cristalografia de raios X, Ressonância Magnética Nuclear (RMN) ou modelagem
molecular comparativa de estruturas de proteínas. Uma vez que o alvo foi identificado, é
necessário obter informações sobre a precisão estrutural. Todas as estruturas devem ser
avaliadas por vários programas para determinar desvios do comprimento de ligação com
relação à geometria ideal, as quais não devem ser maiores que 0,015 Ǻ ou 3º para ângulos
de ligação. Átomos planares não devem estar mais que 0,015 Ǻ fora do plano e não deve
haver centros quirais incorretos. Finalmente, no mínimo 90% dos ângulos φ e ψ da cadeia
principal devem cair na região mais favorável do gráfico de Ramachandran garantindo maior
precisão aos modelos (Lima, 2007; Silva, 2007).
As estruturas 3D de novas proteínas alvo, relevantes terapeuticamente, estão se
tornando disponíveis numa razão dramaticamente crescente através da determinação de
estruturas por cristalografia de raios X, RMN ou por modelagem molecular comparativa.
Devido ao crescimento do conhecimento estrutural, os experimentos de docking estão se
tornando essenciais no desenho racional de drogas. Este interesse é atribuído ao screening
virtual a bancos de dados de ligantes por métodos computacionais levando à identificação
de novos alvos terapêuticos.
1.6.4. Determinação dos potenciais de interação molecular fármaco-receptor
A formação de um complexo fármaco-receptor se inicia através do processo de
reconhecimento molecular, em que o receptor precisa reconhecer as propriedades
moleculares do fármaco que se aproxima para realizar uma interação forte e específica. A
etapa de reconhecimento molecular ocorre através da formação de interações, que termina
com a formação de complexos. O campo eletrostático que envolve cada molécula apresenta
um papel crítico no reconhecimento molecular. Quando a distância entre as superfícies do
Introdução
27
fármaco e do receptor diminui, outras propriedades moleculares, como polarizabilidade e
hidrofobicidade, tornam-se determinantes (Höltje et al., 2003).
Os potenciais de interação molecular podem ser determinados na estrutura do
receptor através de cálculos sistemáticos que envolvem energias de interação entre o
receptor e grupos químicos de prova de interesse, em que dados representativos para o
entendimento dos potenciais de interação naquele receptor, sem informações prévias de
ligantes, são gerados. Essa abordagem se torna ainda mais interessante quando se deseja
identificar protótipos promissores para novos e atrativos alvos terapêuticos.
1.6.5. Potenciais eletrostáticos moleculares
O conhecimento de potenciais eletrostáticos se torna de vital importância quando
interações moleculares são estudadas. As forças eletrostáticas de longo alcance governam
o contato inicial de moléculas que se aproximam. Existem diversos tipos de interações
intermoleculares que podem manter um complexo fármaco-receptor, entre elas: interações
iônicas, ligações de hidrogênio, interações de Van der Waals, dipolo-dipolo, íon-dipolo e
interações hidrofóbicas (Höltje et al., 2003; Patrick, 2005).
Em princípio, as forças de interação molecular podem ser agrupadas em três
componentes: eletrostática, indutiva e dispersiva. As interações de ordem eletrostática
ocorrem entre moléculas polares que possuem carga ou um momento de dipolo
permanente. As forças indutivas são formadas por moléculas polares que interagem com
moléculas não-polares. As cargas ou dipolos das moléculas polares produzem um campo
elétrico que é capaz de mudar a distribuição dos elétrons nas moléculas não-polares e,
dessa forma, induzir um momento de dipolo nas mesmas. Quando as moléculas que
interagem entre si apresentam características, predominantemente, hidrofóbicas, as forças
dispersivas são majoritárias. Em moléculas hidrofóbicas a flutuação dos elétrons pode
induzir a formação de um momento de dipolo na molécula vizinha. As forças dispersivas são
consideradas fracas e se desfazem facilmente com o aumento da distância entre as
moléculas. Entretanto, formam o principal componente de atração entre moléculas neutras
apoiares (Höltje et al., 2003).
As interações intermoleculares aparecem amplamente nas regiões moleculares que
apresentam carga. Devido às cargas, sobretudo aos momentos de dipolo, um campo
eletrostático tridimensional é gerado no ambiente que envolve as moléculas. Mesmo entre
moléculas neutras, a distâncias consideradas moderadas, existe um potencial eletrostático
significante. Esse potencial pode ser representado como a energia de interação entre a
distribuição eletrônica molecular e uma carga pontual positiva que está localizada em um
grid tridimensional em qualquer região do espaço ao redor da molécula. Dessa forma, para a
Introdução
28
determinação de potenciais eletrostáticos as propriedades eletrônicas das moléculas
precisam de tratamento minucioso.
1.6.6. Campos de interação molecular
As forças de interação não-covalentes determinam a geometria e a simetria do
arranjo molecular entre um fármaco e seu sítio ligante. Como regra geral, a ligação entre
fármaco e receptor só ocorre, efetivamente, se a energia de interação gerada supera as
forças repulsivas de Van der Waals. Os campos de interação molecular (MIF, do inglês,
molecular interaction fields) podem ser utilizados na investigação das condições energéticas
entre um receptor e seu ligante (Goodford, 1985; Höltje et al., 2003).
Os campos de interação molecular podem ser calculados para qualquer molécula
com estrutura tridimensional conhecida. Os MIFs descrevem a variação espacial da energia
de interação entre um alvo molecular e um grupo químico de prova. O alvo molecular pode
ser uma macromolécula, um complexo molecular ou até um composto de baixo peso
molecular (Höltje et al., 2003; Wade, 2006).
Existem vários softwares capazes de computar os MIFs ao redor de uma molécula.
Para que se proceda a esta análise, é necessária a obtenção das coordenadas atômicas x,
y e z do alvo molecular. O alvo molecular é, então, envolvido por uma grade ortogonal
imaginário, onde os MIFs são calculados para os grupos químicos de prova em cada ponto
da grade. Os grupos químicos de prova representam átomos ou pequenos grupos de
átomos, como a prova oxigênio de carbonila, que é um átomo de oxigênio com dois pares
de elétrons sp2. Os grupos químicos de prova refletem as características químicas de um
componente que pode interagir com o alvo molecular (Wade, 2006). Através da utilização de
gráficos computacionais, os campos de interação molecular podem ser representados como
contornos tridimensionais isoenergéticos. Os contornos com energias altamente positivas
indicam regiões pelas quais o grupo de prova seria repelido, enquanto que as regiões
amplamente: negativas correspondem a regiões que favorecem energeticamente interações
com o grupo químico de prova (Höltje et al., 2003).
No decorrer do cálculo, o grupo de prova é movido sistematicamente através dos
pontos regulares do grid. A cada ponto alcançado a energia de interação entre o grupo de
prova e o alvo molecular é calculada (GOODFORD, 1985). A energia de interação não-
covalente é calculada a cada coordenada x, y e z através da soma de vários componentes.
2
2
.
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O
O
B
B
J
J
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E
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V
V
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O
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Objetivos
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2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
O presente projeto propõe a busca por inibidores naturais contra o veneno de
abelhas. Um sistema e uma base de dados foram desenvolvidos para a integração entre
plantas medicinais antivenenos e os venenos de abelhas, abordando os seguintes aspectos:
(i) a criação de um banco de dados contendo informações científicas sobre plantas
medicinais com propriedades antivenenos, venenos de abelhas e seus constituintes
isolados tanto de plantas (inibidores naturais) quanto das abelhas (principais toxinas), (ii)
estudar as possíveis interações entre algumas toxinas de animais e inibidores vegetais pré-
selecionados, (iii) análise e apresentação dos dados laboratoriais obtidos em triagem de
plantas medicinais antivenenos de abelhas, (iv) estudar e avaliar as possíveis interações
entre as toxinas Melitina e Fosfolipase A2 com inibidores, através do docking Virtual.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Construção de base de dados: Plantas medicinais antivenenos e venenos de abelhas.
1.1. Banco de plantas: contendo famílias, espécies, fonte do extrato, propriedades
antiveneno, região onde são encontradas e compostos químicos isolados;
1.2 Banco de venenos de abelhas: contendo seqüências protéicas, distribuições
geográficas e dados biológicos caracterizando as espécies com suas
particularidades.
2. Desenvolvimento do Sistema: O sistema permitirá:
2.1 Um levantamento estatístico obtido como resultado dessa pesquisa.
2.2 Ao pesquisador, o cadastro de propriedades e estruturas químicas de princípios
ativos isolados, assim como de proteínas de venenos. Todas as informações
somente serão cadastradas perante comprovação científica.
2.3 Desenvolvimento de um sistema web denominado Bee Venom, que será o
repositório de todas informações obtidas.
3. Ambiente WEB: Toda pesquisa realizada pelo usuário será feita através de um
ambiente web, de forma que a comunidade científica terá acesso, de forma simples e
rápida, aos dados depositados nos bancos.
Objetivos
31
4. Ensaios laboratoriais: Obtenção e análise de resultados dos ensaios farmacológicos
dos venenos e suas antitoxinas, realizados, experimentalmente, em laboratório. Triagem de
plantas medicinais antiveneno de abelhas (atividades anti-hemorrágica, anti-proteolítica,
anti-miotóxica, anti-fosfolipase e anti-edema). Com a colaboração do Banco de
Germoplasma da Floresta da USP, novas plantas poderão ter sua ação antivenenos
avaliada.
5. Docking Virtual: Busca virtual de inibidores das toxinas Fosfolipase A2 e Melitina e
análise das possíveis interações.
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3
.
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M
M
A
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S
Materiais e Métodos
33
3. MATERIAIS E MÉTODOS
A maior parte desse projeto foi conduzida no Laboratório do Grupo de Bioinformática
(GBI) do departamento de Genética da FMRP, onde foi realizado o desenvolvimento do
sistema. A experimentação animal foi realizada em colaboração com o Laboratório de
Toxinas Animais e Inibidores Naturais e Sintéticos coordenado pelo Prof. Dr Andreimar
Soares Martins, localizado na Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP de Ribeirão
Preto. As análises da bioinformática estrutural foram realizadas em colaboração com o
Laboratório de Química Medicinal de Produtos Sintéticos e Naturais coordenado pelo Prof.
Dr Carlos Henrique Tomich de Paula da Silva, localizado também na Faculdade de Ciências
Farmacêuticas da USP de Ribeirão Preto. A figura 2 representa todas as atividades
realizadas durante o desenvolvimento do projeto.
3.1. Aquisição das seqüências
As seqüências foram obtidas através do banco de dados públicos do GenBank
(www.ncbi.nlm.nih.gov). As buscas foram realizadas através da ferramenta “Taxonomy”.
Trabalhou-se com o taxa Hymenoptera, especificamente as abelhas, e as palavras utilizadas
Figura 2. Esquema representando o procedimento experimental realizado durante o desenvolvimento do projeto.
Materiais e Métodos
34
nas buscas foram “venom” e “toxin”. As seqüências obtidas foram divididas em aminoácidos
e nucleotídeos. Posteriormente, as seqüencias foram separadas por tipo de proteína e foram
inseridas no banco de dados, para outras análises.
3.2. Aquisição das estruturas
As estruturas foram obtidas por meio do banco de dados públicos do PDB
(www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Foram realizadas buscas com os termos “venom” e
“toxin”. Entre os resultados da busca foram escolhidas somente estruturas que pertenciam
ao grupo Hymenoptera.
3.3. Desenvolvimento do Sistema
O sistema foi implementado sobre o CMS Drupal (http://www.drupal.org) (Mercer,
2006), que gerencia todo o conteúdo do sistema, o qual está em um servidor HP Pentium
Xeon 3.0 de 2Gb de memória, com o sistema operacional GNU/Linux Fedora 6. O CMS
(Content Manager System) apresenta ferramentas que permitem integrar e automatizar os
processos relacionados à criação, armazenamento, catalogação, indexação,
personalização, modificação, recuperação, controle de acesso e disponibilização de
conteúdos em portais Web (Michelinakis, 2004; Mercer, 2006).
O CMS escolhido para a implementação do sistema foi o Drupal versão 5 que
corresponde a um CMS de código aberto liberado pela política GPL (General Public
License). O drupal é mantido e desenvolvido por uma comunidade de milhares de usuários e
desenvolvedores de todo o mundo. A principal vantagem do Drupal é ser um programa
modular, que pode crescer de acordo com a necessidade do usuário. No inicio o Drupal não
foi desenvolvido para uma aplicação específica, sendo um programa dinâmico e versátil
(Mercer, 2006).
O Drupal gerencia todos os tipos de conteúdos e serviços atribuídos à interface Web,
por exemplo, o acesso dos usuários (Login), métodos de busca, inserção de novos dados,
atualizações, alterações, entre outros. A estrutura do CMS Drupal foi implementada na
linguagem PHP (Meloni, 2000) (http://www.php.net), que corresponde a um módulo de pré-
processamento de hipertexto para o servidor da Web, permitindo ler e interpretar código
PHP incorporado em páginas da Web. Essa plataforma permite também acoplar outras
linguagens de programação como Perl (Practical Extraction and Report Language),
(http://www.perl.com/) (Wall; Christiansen e Orwant, 2001), que é uma linguagem mais
popular para escrita de scripts CGI (Guelich e Gundavan, 2001). A linguagem Perl é uma
linguagem de programação especialmente desenvolvida para processamento de texto, que
Materiais e Métodos
35
no sistema foi utilizada na análise de dados, como em scripts para inserção de dados
decorrentes de arquivos texto de bancos de dados públicos.
A linguagem de programação usada para criação de páginas Web foi HTML
(Hypertext Markup Language), juntamente com pacotes gráficos de desenvolvimento na
criação de ferramentas dinâmicas interagindo com o sistema, como o content type que exibe
uma estrutura gráfica a porcentagem de dados depositados e relacionados com as
categorias do sistema. Relacionando também com ferramentas específicas de
Bioinformática tais como Webmol, Clustal, entre outras também foram acopladas ao sistema
(Gibas et al., 2001).
O sistema apresenta um banco de dados baseado na estrutura de tabelas do CMS
Drupal, porém esse banco é flexível e expande de acordo com os diversos tipos de
conteúdo que possam surgir.
3.3.1. Criação de conteúdos específicos
Os conteúdos específicos foram criados utilizando o módulo CCK, que cria diferentes
tipos de conteúdos de forma flexível, com administração no painel de controle, juntamente
com o gerenciamento dos conteúdos inseridos no portal, permitindo a criação de qualquer
classe de conteúdo como, publicações, dados laboratoriais, seqüências, estruturas, além
dos tipos já existentes, como matérias, páginas e outros. O administrador pode definir os
campos requeridos na inserção dos dados correspondentes ao conteúdo criado, editando-os
de acordo com a necessidade específica do conteúdo, podendo ser um campo de texto
simples, data e hora, imagem, área para composição de mensagem, lista de menus, caixa
de seleção, URL, galeria de imagem, seleção de cores, endereço eletrônico, tabela e
recursos de mídia como MP3, além do campo de anexos de arquivos.
Após criar um novo tipo de conteúdo, foram adicionados os tipos de campos
necessários e algumas configurações sobre instruções de preenchimento, descrição,
opções de visualização em listagem de conteúdos, requisição do campo e o valor do peso
para a ordenação.
3.3.2. Categorização do Banco de Dados
A flexibilidade na organização das categorias hierárquicas e a adição de sub-
categorias para a maioria dos conteúdos, relacionando em sistemas de “nós”, puderam ser
realizadas através do módulo “Taxonomy”. Neste módulo, as classes de categorias são
chamadas de “Vocabulários”, que contêm seus respectivos termos, compondo a estrutura
de categorias do website. Com o auxílio deste módulo, foi possível listar os termos para as
Materiais e Métodos
36
diversas frentes de conteúdos, como matérias de artigos, seqüências e estruturas,
permitindo ainda relacioná-los com diferentes tipos de conteúdos existentes.
3.3.3. Banco de Dados
O sistema para gerenciamento de bancos de dados escolhido foi o open source
MySQL 5 (http://www.mysql.com). O MySQL (Structured Query Language - Linguagem
Estrutural de Consultas) é sistema de gerenciamento do tipo relacional, que permite
armazenar dados em tabelas local e proporcionando velocidade e flexibilidade. A linguagem
padrão é SQL, que é usada para acessar banco de dados, sendo definida pelo Padrão
ANSI/ISO SQL. O MySQL usa a política GPL (GNU General Public License - Licença
Pública Geral GNU) (http://www.fsf.org/licenses).
3.3.4. Política de Segurança
O sistema possui uma política de segurança. Onde os cada grupo possui permissões
especificas de acordo com a tarefa a ser realizada. As tarefas são:
a) quanto à submissão de dados:
Os dados submetidos ao sistema serão avaliados e, se aprovados, serão
armazenados no banco de dados.
b) quanto ao acesso ao banco de dados:
A política de segurança será estabelecida pelos seguintes critérios:
As informações de domínios públicos permanecerão com o status de domínio
público a todos os pesquisadores cadastrados no sistema;
A informação pertinente, quer seja a um grupo de pesquisa ou a um pesquisador
em particular, o status será selecionado pelo grupo ou pesquisador. Ou seja,
caberá ao grupo ou pesquisador decidir a quem suas informações deverão ser
liberadas;
A alteração do status somente será feita mediante uma requisição por escrito
vinda do coordenador do grupo ou pesquisador responsável.
Os status disponíveis são:
Público (B): Os dados obtidos dos bancos públicos serão disponibilizados a
todos os grupos e pesquisadores nacionais cadastrados.
Grupos (G): O grupo ou pesquisador poderá selecionar qual(is) grupo(s) que
terá(ão) acesso às suas informações submetidas.
Materiais e Métodos
37
3.4. Modelagem do Sistema
A linguagem UML (Unified Modeling Language) foi utilizada para a modelagem do
sistema. Uma das principais características da linguagem UML é o fato de ser uma
linguagem gráfica para visualização, especificação e documentação de artefatos dos
sistemas complexos de software. Dessa forma, proporciona uma forma-padrão para a
preparação de planos de arquitetura de projetos incluindo, também, aspectos conceituais
(Booch; Jacobson e Rumbaugh, 2006).
Neste trabalho, a UML está relacionada aos procedimentos que devem ser
executados pelos atores no sistema; sendo assim, o sistema utiliza uma infra-estrutura já
estabelecida que é o CMS Drupal. A modelagem exemplifica o desenvolvimento de criação
de conteúdos, categorias, permissões e todas as opções que existem no sistema.
3.4.1. Escopo
O sistema Bee venom é responsável por centralizar os dados de experimentos in
silico, in vivo e in vitro, relacionados à inibição de proteínas do veneno e do extrato total do
veneno. Dessa forma, a centralização desses dados em uma única base de dados é muito
importante, pois permite integrar informações a respeito das proteínas do veneno, das
plantas medicinais antiveneno, estruturas de proteínas do veneno, seqüências de proteínas
do veneno, referências e dados laboratoriais relacionados ao veneno de Apis mellifera. A
integração dos dados está disponibilizada na Web e os dados inseridos no sistema
consistem de dados coletados de bancos de dados púbicos, publicações científicas e
através de pesquisadores e colaboradores.
No sistema, os usuários podem ser registrados como: administrador, colaboradores
e visitantes. Os usuários possuem atribuições diferentes de acordo com cada tipo de acesso
ao sistema (Tabela 7). A figura 3 apresenta um esquema simplificado do funcionamento do
sistema e de sua interação com os usuários, permissões e principais módulos do CMS
Drupal.
Tabela 7. Permissão dos três níveis de usuários do sistema.
USUÁRIO
PERMISSÃO DE ACESSO
Administrador
Acesso completo (Cria tipo de conteúdo, Cria categorias, Adiciona termos, Envia
dados de plantas, abelhas, vespas e administração geral)
Colaboradores
Acesso restrito (Envia dados de plantas e abelhas, vespas e altera os dados
submetidos).
Visitantes
Acesso restrito (Visualização do conteúdo público)
Materiais e Métodos
38
3.4.2. Cadastrar usuários
Os usuários possuem diferentes tipos de permissões de acesso. O sistema possui
uma parte chamada Create new account, que permite o cadastro de um novo usuário. Os
campos para criação de um novo usuário são: Personal information (Full name, City, State e
Country), Account information (Username e E-mail address) e Professional information
(Profession, Institution, Group, City, State e Country). Todos os campos são obrigatórios.
Após a avaliação dos coordenadores, uma senha será criada e enviada para o e-mail do
novo usuário cadastrado. Os usuários cadastrados poderão enviar dados ao sistema e
buscar dados restritos a um determinado grupo de usuário.
3.4.3. Criar tipo de conteúdo
Os novos tipos de conteúdos são as informações que devem ser inseridas no
sistema. A inserção de informações ocorre através de campos específicos de entrada de
dados. O módulo CCK (Content Construction Kit) do Drupal permite criar novos tipos de
Figura 3. Modelo simplificado da interação dos três tipos de usuários com os recursos disponíveis
de acordo com a permissão atribuída a cada usuário.
Materiais e Métodos
39
conteúdos, que interagem diretamente com o banco MySQL. É permitido apenas ao
administrador criar tipos de conteúdo no sistema.
3.4.4. Cadastrar categorias, termos e campos
O sistema é composto por categorias e subcategorias, que são utilizadas para
classificar e organizar os conteúdos. As categorias podem ser especificas para um único
tipo de conteúdo ou comum para vários. A categorização correta do conteúdo é
fundamental, pois permite que as buscas sejam feitas de forma mais eficiente, através de
buscas por palavras chaves e utilizando o módulo Views do Drupal para fazer uma busca
relacionando os termos das categorias.
Os dados podem ser cadastrados de duas formas: categorias ou campos. As
categorias são partes do sistema que podem ser comuns a vários conteúdos permitindo que
sejam associadas e usadas como ferramentas de buscas, já os campos são conteúdos
específicos e não podem ser relacionados com outros conteúdos.
Somente o administrador pode criar categorias, termos e campos. Caso o
pesquisador não encontre um termo específico no sistema para categorizar o dado é
oferecido a ele um campo de escrita para que ele entre com seu termo. Os dados
submetidos ao sistema são liberados após a análise do administrador, que avaliará a
necessidade de criação do termo.
3.4.5. Cadastrar tipos de conteúdos
Os conteúdos podem ser cadastrados no sistema em conteúdos específicos. Os
dados submetidos são analisados pelos coordenadores antes do acesso ao sistema ser
liberado. Os cadastros podem ser do tipo: dados de plantas (por exemplo: nome de
espécies de plantas antiveneno), dados de proteínas de veneno de abelhas (por exemplo:
seqüencias de DNA e proteínas de veneno), estrutura de proteínas de veneno de abelhas
(por exemplo: estruturas terciárias de proteínas de abelhas), dados de referências de
veneno de abelhas (por exemplo: artigos e livros relacionados com veneno de abelhas),
dados experimentais de venenos de abelhas (por exemplo: experimentos de inibição de
componentes do veneno).
3.4.5.1. Enviar dados de plantas (antiveneno)
O tipo de conteúdo Data of Plant é o local onde são cadastrados os dados de plantas
medicinais. É necessário para enviar dados de plantas acessar como usuário cadastrado.
Após isso, deve-se acessar Create content e entrar em Plant. Os seguintes campos e
categorias devem ser selecionados: Scientific Name, categoria (Content type) e Additional
Materiais e Métodos
40
Information. As outras informações necessárias para o cadastro das plantas estão divididas
em três áreas. A primeira área é a Plant information existem os campos Common Name,
Distribution e Characteristic. Já as categorias existem Family, Activity, Country, Part of plant
used and Scientific Name. A segunda área corresponde aos compostos tem os campos
Chemical formula e Compoud Name. A terceira área é Image, com os campos para envio de
imagens de Compound e Plant. O campo (Anti-Venom plants) pertence ao próprio sistema e
serve para listar as categorias relacionadas a essa planta, portanto não deve ser alterado.
3.4.5.2. Enviar dados de proteínas de venenos de abelhas
Os dados de proteínas de venenos de abelhas e outros himenópteros são
cadastrados através do tipo de conteúdo Sequence. Para enviar dados de venenos de
abelhas deve-se entrar no sistema como usuário cadastrado e acessar Create content e
entrar em Sequence. Os seguintes campos e categorias devem ser selecionados: campo de
escrita (Title) e tipo de categoria (Content type). Os outros campos e categorias estão
divididos em três áreas. A primeira área é Animal Information, por exemplo informações a
respeito da abelha ou vespa, que possui as categorias Animal, Genus Animal e Scientific
Name. A segunda área é Sequence information, que apresenta as categorias Protein e
Sequence type e o campo Acession (número de acesso). Na terceira área existe o campo
Fasta.
3.4.5.3. Enviar estruturas de proteínas de veneno de abelhas
As estruturas de veneno de abelhas são cadastradas através do tipo de conteúdo
Sequence. Para enviar as estruturas de venenos de abelhas deve-se entrar no sistema
como usuário cadastrado e acessar Create content e entrar em Structure. Os seguintes
campos e categorias devem ser selecionados: campo de escrita (Title), categoria (Content
type), categoria (Genus animal), categoria (Type of Strucure), categoria (Authors) e o campo
(Additional Information). Os outros campos e categorias estão divididos em cinco áreas. A
primeira área é Animal Information, que possui as categorias Animal e Scientific Name. A
segunda área é Structure information, que apresenta as categorias Protein, Classifcation e
EC Number. A terceira área é Structure Information existem as categorias Structure
(Obtaining Method) e PDB Number e os campos Parameters, PDB Link, Reference (Primiry
Citation) e Reference Link. A quarta área é Ligand Information, que possui as categorias
Type of Ligand, Ligand Name, Action e Formula e o campo Ligand Chemical Component. A
quinta área é Files, que apresenta locais para submeter imagens e arquivos PDB do ligante
e proteínas.
Materiais e Métodos
41
3.4.5.4. Enviar dados de referências de venenos de abelhas
Os dados de referências de venenos de abelhas são cadastrados através do tipo de
conteúdo Bee Venom Reference. Para enviar dados de venenos de abelhas deve-se entrar
no sistema como usuário cadastrado e acessar Create content e entrar em Bee Venom
Reference. Os seguintes campos e categorias devem ser selecionados: campo de escrita
(Title), categoria (Content type) e o campo Abstract. Os outros campos e categorias estão
divididos em duas áreas. A primeira área é Details, que possui as categorias Type of
reference, Year, Authors, Publisher e Language. A segunda área é Additional information,
que possui as categorias Field of Study e Institution e os campos URL e Additional
Information, com um campo para enviar um arquivo no formato PDF.
3.4.5.5. Enviar dados de experimentos laboratoriais de venenos de abelhas
Os dados de experimentos laboratoriais de venenos de abelhas e outros himenópteros
são cadastrados através do tipo de conteúdo Laboratorial Data. Para enviar dados de
experimentos de inibição de componentes do veneno de abelhas deve-se entrar no sistema
como usuário cadastrado e acessar Create content e entrar em Laboratorial Data. Os
seguintes campos e categorias devem ser selecionados: campo de escrita (Title), categoria
(Content type), campo de escrita (Assay) e campo de escrita (Additional Information). Os
outros campos e categorias estão divididos em duas áreas. A primeira área é Authors
Information, que possui as categorias Authors e Institution. A segunda área é Files, que
apresenta campos para envio de arquivos textos e imagens.
3.4.6. Visualizar conteúdo
Os dados liberados podem ser disponíveis como público ou restrito a algum grupo.
No caso de dados com acesso público, existem diversas formas de visualizações. A
visualização por categorias permite um acesso rápido e eficiente quando o pesquisador
conhece bem o que deseja analisar. Já o taxonomy graph permite visualizar a quantidade de
dados armazenados no sistema de maneira dinâmica, utilizando-se os termos das
categorias. Os conteúdos podem ser visualizados também por nomes.
3.4.7. Diagramas de UML
A forma de visualizar os blocos de construção é através de diagramas. O diagrama é
uma apresentação gráfica de um conjunto de elementos, geralmente representado como um
gráfico conectado de vértices (itens) e arcos (relacionamentos). Na UML existem vários tipos
de diagramas que são utilizados na modelagem que especificam modelos a partir dos quais
são construídos sistemas executáveis (Booch, Jacobson e Rumbaugh 2006).
Materiais e Métodos
42
3.4.7.1. Visão global dos atores e use-cases
A Visão global dos atores e use-cases (Figura 4) é um diagrama que representa
graficamente os atores e suas interações com as use-cases. O ator é qualquer pessoa ou
sistema externo que tenha interação com o sistema que está em desenvolvimento e a use-
case é um conjunto de funcionalidades de um sistema, representado por fluxos de eventos
iniciados por um ator que apresenta um resultado de valor a um ator (Cardoso et al. 2003).
Os atores do sistema, Administrador e Colaborador, possuem uma seta que os
ligam ao ator de sistema Usuário, isso significa que tanto o Administrador quanto o
Colaborador podem fazer o papel do Usuário e executam o Use-Case Visualizar Conteúdo,
Enviar dados de estrutura de Proteínas, Enviar dados laboratoriais, Enviar dados de
Figura 4. Visão Global dos Atores e Use-cases. Os atores Administrador e Colaborador fazem papel de
usuário do sistema interagindo com os eventos que cada um tem permissão de realizar, e o ator
Visitante não entra como usuário cadastrado do sistema, porém, pode visualizar os dados públicos.
Materiais e Métodos
43
Referências, Enviar dados de Seqüências, Enviar Dados de Plantas e Alterar os
Dados.
3.4.7.2. Diagrama de Colaboração
A colaboração é representada por meio de diagramas que demonstram o
relacionamento das classes no que diz respeito ao sentido das mensagens e ao número de
mensagem, dando ênfase à organização dos objetos que participam de uma interação
(Cardoso, 2003). O diagrama de colaboração contém seu Fluxo Básico, ou seja, o fluxo
padrão de funcionamento de um determinado Use-Case e os Fluxos Alternativos, que
correspondem a quaisquer outros tipos de eventos fora do fluxo padrão, levando-se em
consideração a ordem em que se encontram os atores e estereótipos.
Os diagramas gerados são dos eventos: criar um tipo de conteúdo (Figura 5),
cadastrar categorias (Figura 6), adicionar termos (Figura 7), enviar dados de plantas com
atividade antiveneno (Figura 8), enviar dados de seqüências de abelhas (Figura 9), enviar
dados de estruturas de proteínas de abelhas (Figura 10), dados laboratoriais (Figura 11),
dados de referências de abelhas (Figura 12), alterar dados (Figura 13) e visualizar
conteúdos (Figura 14). Os diagramas demonstram o fluxo a ser seguido para realização das
atividades com todas as etapas dos processos.
O diagrama de criar conteúdo mostra todos os passos envolvidos na criação de um
novo conteúdo, permite observar o fluxo das informações e onde os possíveis problemas
podem ocorrer (Figura 5).
Materiais e Métodos
44
O diagrama de cadastrar categorias mostra fluxo das etapas envolvidas no cadastro
de uma categoria, permite observar o fluxo das informações e onde os possíveis problemas
podem ocorrer (Figura 6).
Figura 5. Diagrama de colaboração do Use-case Criar tipo de conteúdo – Fluxo Básico. Representa
os eventos que o ator Administrador realiza para criar um novo tipo de conteúdo, descrevendo as
entradas de dados a serem preenchidas e as mensagens para cada evento.
Materiais e Métodos
45
O diagrama de adicionar termos mostra fluxo das etapas envolvidas na adição de
novos termos na base de dados, permite observar o fluxo das informações e onde os
possíveis problemas podem ocorrer (Figura 7).
Figura 6. Diagrama de colaboração do Use-case Cadastrar Categorias – Fluxo Básico. Representa os
eventos que o ator Administrador realiza para criar uma nova categoria, descrevendo as entradas de
dados a serem preenchidas e as mensagens para cada evento.
Materiais e Métodos
46
O diagrama de enviar dados de plantas com atividade antiveneno permite observar o
fluxo das etapas envolvidas no envio de dados de plantas, sendo possível observar o fluxo
das informações e onde os possíveis problemas podem ocorrer (Figura 8).
Figura 7. Diagrama de colaboração do Use-case Adicionar Termos – Fluxo Básico. Representa os
eventos que o ator Administrador realiza para adicionar um novo termo em uma categoria, descrevendo
as entradas de dados a serem preenchidas e as mensagens para cada evento.
Materiais e Métodos
47
O diagrama de enviar dados de seqüências de abelhas apresenta o fluxo das etapas
envolvidas no envio de seqüências de abelhas, permitindo observar o fluxo das informações
e onde os possíveis problemas podem ocorrer (Figura 9).
Figura 8. Diagrama de colaboração do Enviar dados de plantas com atividade Antiveneno – Fluxo
Básico. Representa os eventos que o ator usuário (Administrador ou Colaborador) realiza para enviar
dados de plantas, descrevendo as entradas de dados a serem preenchidas e as mensagens para cada
evento.
Materiais e Métodos
48
O diagrama de enviar dados de estruturas de proteínas de veneno de abelhas
mostra fluxo das etapas envolvidas no envio de dados de estruturas de proteínas, sendo
possível observar o fluxo das informações e onde os possíveis problemas podem ocorrer
(Figura 10).
Figura 9. Diagrama de colaboração do Use-case Enviar Dados de Seqüências de abelhas – Fluxo
Básico. Representa os eventos que o ator usuário (Administrador ou Colaborador) realiza para enviar
dados de animais, descrevendo as entradas de dados a serem preenchidas e as mensagens para cada
evento.
Materiais e Métodos
49
O diagrama de enviar dados laboratoriais mostra fluxo das etapas envolvidas no
envio de dados laboratoriais, permitindo observar o fluxo das informações e onde os
possíveis problemas podem ocorrer (Figura 11).
Figura 10. Diagrama de colaboração de Enviar Dados de Estruturas de Proteínas de veneno de abelha
– Fluxo Básico. Representa os eventos que o ator usuário (Administrador ou Colaborador) realiza para
enviar dados de plantas, descrevendo as entradas de dados a serem preenchidas e as mensagens para
cada evento.
Materiais e Métodos
50
\
O diagrama de enviar dados de referências de abelhas mostra todos os passos
envolvidos no envio de referências de abelhas, permitindo observar o fluxo das informações
e onde os possíveis problemas podem ocorrer (Figura 12).
Figura 11. Diagrama de colaboração do Use-case Enviar Dados Laboratoriais – Fluxo Básico.
Representa os eventos que o ator usuário (Administrador ou Colaborador) realiza para enviar dados de
animais, descrevendo as entradas de dados a serem preenchidas e as mensagens para cada evento.
Materiais e Métodos
51
O diagrama de alterar dados mostra etapas necessárias para alterar os dados que
estejam depositados no sistema, permitindo observar o fluxo das informações e onde os
possíveis problemas podem ocorrer (Figura 13).
Figura 12. Diagrama de colaboração Enviar Dados de Referências de Abelhas – Fluxo Básico.
Representa os eventos que o ator usuário (Administrador ou Colaborador) realiza para enviar dados de
plantas, descrevendo as entradas de dados a serem preenchidas e as mensagens para cada evento.
Materiais e Métodos
52
Figura 13. Diagrama de colaboração do Use-case Alterar Dados – Fluxo Básico. Representa os
eventos que o ator Administrador realiza para alterar dados de plantas e venenos de abelhas,
descrevendo as entradas de dados a serem preenchidas e as mensagens para cada evento.
Materiais e Métodos
53
3.5. Docking Virtual
De maneira geral, os softwares de docking são formados por uma combinação de
dois componentes: um algoritmo de busca e uma função de score (Taylor; Jewsbury e
Essex, 2002; Verdonk et al., 2003). O algoritmo é utilizado na busca de possíveis modos de
ligação e permite explorar os graus de liberdade translacional e rotacional do Iigante, bem
como, os graus de liberdade conformacional de ambos, ligante e proteína. A função de
score é aplicada para tentar distinguir os modos de ligação mais próximos dos obtidos
experimentalmente entre os demais modos de ligação explorados pelo algoritmo de busca e,
dessa forma, ordenar os diferentes modos de ligação apresentados. As funções de score
podem ser estabelecidas de acordo com campos de força mecânica molecular, parâmetros
empíricos de cálculos de energia livre ou até de acordo com parâmetros denominados
knowledge-based, que são conhecimentos prévios da estrutura.
Nas análises de bioinformática estrutural foram utilizadas as proteínas Fosfolipase
A2 e Melitina obtidas a partir do PDB, pois a Melitina e Fosfolipase A2 são as proteinas
majoritárias e as principais responsáveis pelos efeitos do veneno das abelhas.
Figura 14. Diagrama de colaboração do Use-case Visualizar Conteúdo – Fluxo Básico. Representa os
eventos que o ator Visitante realiza para visualizar o conteúdo público do sistema, descrevendo as
entradas de dados a serem preenchidas e as mensagens para cada evento.
Materiais e Métodos
54
3.5.1. Simulações de screening virtual
As simulações de screening virtual foram realizadas com o software GOLD 3.3
(Verdonk et al., 2003) para a proteína Fosfolipase A2 (código: 1POC) em relação à base de
dados (IIibdiverse) (http://www.inteligand.com/ilibdiverse/index.shtml) de estruturas de
moléculas de fármacos, substâncias ativas e/ou moléculas com propriedades drug-like. O
banco de dados IIibdiverse contém, aproximadamente, 1.200 estruturas moleculares virtuais
de fármacos ou substâncias ativas, as quais foram utilizadas nas simulações de screening
virtual. As coleções de moléculas têm suas próprias particularidades, apresentam diversas
estruturas de moléculas pequenas contendo propriedades drug-like e abrangem diversas
características farmacofóricas espaciais relevantes para realizar interações com os mais
diversos alvos terapêuticos que possuam alta probabilidade de encontrar protótipos com
grande potencial de biodisponibilidade por via oral e capacidade de penetrar a barreira
hematoencefálica (BHE).
A base metodológica do software GOLD é a execução de simulações de docking
flexível utilizando um algoritmo genético. Os cálculos de docking foram realizados dentro de
uma esfera de raio de 10 Å tendo como centro o átomo de carbono delta 1 da cadeia lateral
do resíduo de PHE67. A orientação de melhor score para cada composto foi selecionada
através de uma função matemática, implementada no software GOLD, denominada
GoldScore. Com base nessa função, o software classifica as orientações das moléculas do
banco de dados de acordo com um padrão de afinidade (score), do ponto de vista de
estabilidade energética, em relação ao sítio ligante da proteína. Foram selecionadas 10
simulações referentes, respectivamente, a 10 diferentes orientações para um mesmo
composto, que seriam as 10 melhores.
3.5.2. Almond
Os campos de interação molecular (Molecular Interaction Fields, MIFs) foram
gerados com o módulo Almond (Pastor et al., 2000) do pacote computacional Sybyl v.7.3
(Tripos(Inc.), 2005) para a proteína Melitina (código PDB: 2MLT). Os cálculos foram
realizados com base nas interações moleculares do domínio da Melitina com 3 grupos
químicos de prova, sendo eles: hidrofóbico (DRY), oxigênio de carbonila e nitrogênio de
amida. Depois de gerados os campos de interação molecular MIFs, da estrutura da Melitina
são identificados os locais de interação para realizar as simulações de screening virtual.
3.5.3. Q-Site Finder
As proteínas Melitina e Fosfolipase A2 foram submetidas ao programa Q-Site Finder
(http://bmbpcu36.leeds.ac.uk/qsitefinder/) com o objetivo de verificar sítios de
Materiais e Métodos
55
reconhecimento nas proteínas. Esses sítios seriam possíveis locais onde as proteínas têm
capacidade de interagir com outras proteínas e ligantes. Nessas regiões das proteínas,
normalmente existem sítios importantes para a proteína, como por exemplo, o sitio ativo.
Esse programa pode confirmar os sítios ativos encontrados na literatura (Laurie e Jackson,
2005).
3.6. Ensaios laboratoriais
Este estudo foi executado com o consentimento do Comitê de Ética em
Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – FMRP (Processo nº
107/2007) (ANEXO A). A Figura 15 apresenta todos os experimentos realizados nos ensaios
laboratoriais, sendo possível visualizar o fluxograma dos experimentos.
3.6.1. Obtenção do veneno
O extrato total foi obtido junto ao serpentário da USP/RP, onde o veneno foi extraído
com choques elétricos e coletado em uma placa. A Fosfolipase A2 foi obtida junto à
empresa Sigma.
Figura 15. Esquema representando dos ensaios laboratoriais realizados em todo o procedimento
experimental, apresentando o fluxo básico.
Materiais e Métodos
56
3.6.2. Extratos Vegetais das Plantas do Banco de Germoplasma da USP/RP
3.6.2.1. Coleta dos vegetais
As espécies vegetais selecionadas foram localizadas e coletadas em seu „habitat‟
natural ou cultivadas e identificadas. Durante as coletas, foram selecionadas folhas que se
apresentavam íntegras e sem possíveis parasitas.
3.6.2.2. Preparação dos extratos
Ao chegar ao laboratório, o material foi pesado e dividido em duas partes de peso
igual, onde uma parte do material foi usada fresca e a outra parte seca. O material usado
fresco foi lavado em água corrente para retirada de contaminantes. Após a lavagem, as
folhas foram cortadas em pequenos pedaços para aumentar a superfície de contato.
Posteriormente, foi acrescentado água na temperatura aproximada de 100
o
C. A água ficou
em contato com a folha por, aproximadamente, 3 a 5 horas (dependendo do tamanho da
folha picada e tipo de folha). Após o tempo necessário, o material foi filtrado e congelado
para posterior liofilização. No caso do material seco, as folhas foram lavadas e colocadas
em uma estufa por cerca de 16 horas. Esse processo foi interrompido quando as folhas se
apresentavam completamente secas. Após a secagem das folhas, o material foi moído para
aumentar a superfície de contato. Posteriormente, a água, com temperatura aproximada de
100
o
C foi acrescentada. Novamente, a água ficou em contato com a folha durante o período
noturno. Após esse processo, o material foi filtrado e congelado para posterior liofilização.
Após a liofilização do extrato, ele foi ressuspendido para sua utilização. As plantas
selecionadas para obtenção do extrato são encontradas na tabela 8 (Figura 16).
Figura 16. Esquema representando a preparação dos extratos brutos aquoso, metanólico e
clorofórmico.
Materiais e Métodos
57
Tabela 8. Lista das espécies utilizadas, inicialmente, para produção de extratos, com o nome da
família a que pertence, nome científico e nome popular das plantas estudadas.
Banco de germoplasma USP/RP
Sub-Família
Nome científico
Nome Popular
Caesalpinioidae
Pterogyne nitens
Amendoim bravo
Caesalpinioidae
Schizolobium parahyba
Guapuruvu
Caesalpinioidae
Pelthophorum dubium
Canafístula
Caesalpinioidae
Caesalpinea férrea
Pau ferro
Caesalpinioidae
Copaifera langsdorffii
Óleo de copaíba
Caesalpinioidae
Hymenaea courbaril
Jatobá
Papilionoideae
Machaerum villosum
Jacarandá do Mato
Papilionoideae
Centrolobioum domentosoum
Araribá
Papilionoideae
Platycyamus elegans
Amendoim do campo
Papilionoideae
Platycyamus regnelli
Pau-pereira
Papilionoideae
Holocalyx balansae
Alecrim de Campinas
Papilionoideae
Myroxylum peruiferum
Cabreuva
3.6.3. Atividade Fibrinogenolítica
O método descrito por Rodrigues et al. (2000) foi utilizado com algumas modificações.
Os extratos de folhas e caule foram, previamente, incubados com os venenos por 30min a
37ºC. Amostras, contendo 50 µg de fibrinogênio bovino dissolvido em solução salina
tamponada com fosfato (Phosphate Buffered Saline, PBS) foram incubadas com as
soluções de venenos/extratos, por 2h a 37°C. A reação foi finalizada adicionando-se tampão
Tris-HCl 0,05 M pH 8.8, contendo glicerol 10%, 2-mercaptoetanol 10 %, SDS 2 % e azul de
bromofenol 0,05%. A seguir, as amostras foram analisadas em eletroforese com gel de
poliacrilamida (Rodrigues et al., 2000).
3.6.4. Atividade Miotóxica
Grupos de 03 camundongos Swiss machos (18–22 g) foram injetados via intra-
muscular (i.m.) no gastrocnêmico direito com diferentes doses de venenos em 50 L de
PBS. Os controles receberam somente PBS e, três horas depois, os camundongos foram
sangrados pela cauda, coletando-se o sangue em capilares heparinizados e, imediatamente,
centrifugado. A atividade da enzima creatina-cinase foi determinada utilizando-se 4 L de
plasma pelo Kit CK-UV cinético da Sigma Chem. Co., procedendo conforme especificações
do fabricante. A atividade creatina cinase foi expressa em U / L, constituindo uma unidade o
resultado da fosforilação de um nano Mol de creatina por minuto a 25°C (Soares et al., 2000;
Soares et al., 2000; Soares et al., 2001).
3.6.5. Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE)
As amostras do extrato total do veneno e de Fosfolipase A2 de Apis mellifera foram
submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de agentes desnaturantes,
Materiais e Métodos
58
para verificação da integridade das proteínas dos venenos. Para aplicação no gel, foi
adicionado o tampão de corrida às amostras e estas foram fervidas a 100ºC durante 4 min,
para desnaturação. A eletroforese foi realizada conforme a metodologia descrita por
Laemmli (1970). O gel de resolução a 12% em acrilamida (bis-acrilamida: acrilamida 1,0: 19)
foi preparado em tampão Tris-HCl 0,5 M pH 8.8 e SDS a 1%. O gel de concentração a 12%
em acrilamida foi preparado em tampão Tris-HCl 0,5 M pH 6.8 e SDS a 0,1%. Após a
corrida, o gel foi retirado e corado por 15 minutos em azul comassie G-250 a 0,1%
dissolvido em água: metanol: ácido acético (40: 50: 10) e descorado em ácido acético 10%.
Em seguida, foi embebido em solução de gelatina incolor 5% (m/v) e seco em papéis
celofanes (Laemmli, 1970).
Posteriormente, as amostras foram submetidas a um estudo preliminar da inibição do
veneno e da Fosfolipase A2 em relação ao extrato de Casearia folhas 28 e 29 (CSF 28 e
29), pois apresentou atividade inibitória reconhecida em outros experimentos. Esse
experimento foi realizado através da incubação do veneno de A. mellifera e da toxina
Fosfolipase A2 de A. mellifera, nas proporções de 1:1, 1:5, 1:10 e 1:20, por 30min a 37ºC,
com o Casearia folhas 28 e 29 (CSF 28 e 29). A precipitação, proteólise das proteínas dos
venenos ou ligação destas a alguma substância dos extratos, pôde ser visualizada por
eletroforese em gel de poliacrilamida, na presença de agentes desnaturantes. As amostras
foram submetidas à preparação para aplicação no gel, por adição de tampão de corrida para
proteínas e fervura a 100ºC por 4 min, para desnaturação. A eletroforese foi realizada
conforme descrito anteriormente.
3.6.6. Estudos de Inibição das Atividades Biológicas e Enzimáticas
Em todas as atividades anteriormente descritas, os estudos de neutralização foram
realizados incubando-se, previamente, os extratos vegetais e/ou inibidores isolados com os
diferentes venenos e/ou toxinas isoladas por 30 min a 37°C. As doses de veneno e/ou
toxinas foram selecionadas após estudos dose tempo resposta para cada atividade em
particular. Estes ensaios foram usados e validados em estudos de neutralização pelos
antivenenos (Escalante et al., 2000). As proporções para incubação de toxinas e venenos
com os inibidores foram determinadas em cada ensaio biológico específico. Nos controles
negativos foram usados PBS de acordo com os volumes previamente determinados em
cada atividade testada, enquanto que, nos controles positivos, foram utilizados venenos e/ou
toxinas diluídos em PBS. Posteriormente, foram efetuados estudos de inibição sem prévia
incubação na tentativa de se verificar a real possibilidade de aplicação prática destes
inibidores para o tratamento do envenenamento ofídico.
Materiais e Métodos
59
3.6.7. Atividade fosfolipásica
A atividade fosfolipásica foi determinada por hemólise indireta por gel de agarose
contendo hemácias de carneiro e usando emulsão de gema de ovo como substrato,
conforme descrito por Gutiérrez (1988). Cerca de 0,3 mL de eritrócitos humanos foram
lavados quatro vezes com tampão fosfato em salina (PBS) e foram adicionados juntamente
com 0,3 mL de gema de ovo (diluída1:4 em solução salina) e 0,25 de CaCl
2
0,01M a 25 mL
de agarose 1% dissolvida em salina tamponada com fosfato pH 8,1. A mistura foi colocada
em placas de petri (135 por 80mm) para solidificar o gel. Posteriormente, os orifícios de 0,3
mm de diâmetro foram preenchidos com 40 µL das soluções de veneno bruto e Fosfolipase
A2. A placa foi incubada 37C por 20h e o diâmetro dos halos de hemólise foi medido com
régua. Como controles, foram aplicados 40 µL de salina, apenas venenos brutos ou
Fosfolipase A2. Os experimentos foram feitos em triplicata, sendo utilizadas diferentes
proporções de venenos e extratos. Posteriormente, os gráficos foram gerados com o valor
médio obtido e o desvio padrão. Os ensaios de inibição foram realizados com incubação
prévia dos venenos com os extratos e posterior aplicação ao gel de hemólise e incubação.
As plantas avaliadas contra o veneno total e Fosfolipase A2 são apresentadas na tabela 10.
Na tabela 9 é possível observar todas as análises realizadas contra o veneno total e
Fosfolipase A2 (Gutierrez et al., 1988).
Tabela 9. Experimentos avaliados na atividade fosfolipásica indireta.
Tabela 10. Plantas utilizadas contra veneno total e Fosfolipase A2.
Plantas
Concentração avaliada
Compostos
sintéticos
Concentração avaliada
Canafistula*
1:5; 1:10; 1:30
CP 01
1:5
Cabriúva*
1:5; 1:10; 1:30
CP 02
1:5
Amendoim Bravo*
1:5; 1:10; 1:30
CP 10
1:5
Jatobá*
1:5; 1:10; 1:30
CP 11
1:5
Pau ferro*
1:5; 1:10; 1:30
CP 17
1:5
Mikania glomerataᶱ
1:5; 1:10; 1:30; 1:60
CP 20
1:5
Lippia 6
1:5; 1:10; 1:30
CP 21
1:5; 1:10
Mandevillaᶱ
1:5; 1:10; 1:30
CP 25
1:5; 1:10
Zeyheniaᶱ
1:5; 1:10; 1:30
CP 26
1:5; 1:10
Cordia verbanacea (Cor
e = 29)
1:10
CP 27
1:5; 1:10
Parâmetros analisados
Variáveis
pHs
2,5; 3,5; 4,5; 5,5; 7; 8; 10
Ácido Etilenodiamino Tetra-
Acético (EDTA)
10, 20, 30, 50
Íons
Co++, Mg++, Fe++, Na++, Zn++, Ca++
Temperatura
-20, 4, 25, 37, 50, 60, 80, 100
o
C
Plantas
Amostras do germoplasma e amostras
existentes no laboratório
Substâncias sintéticas
P ( originário das quinolinonas), CP e I
Materiais e Métodos
60
Bauhinia fortificataᶱ
1:1; 1:3; 1:6; 1:5; 1:10; 1:30;
1:60
CP 29
1:5; 1:10
Casearia silvestrisᶱ
1:10; 1:30
CP 31
1:5; 1:10
Amburana cearensisᶱ
1:5; 1:10; 1:30; 1:60
CP 32
1:5
Casearinaᶱ
1:5; 1:10; 1:30; 1:60
CP 33
1:5; 1:10
Caseariaᶱ
1:5; 1:10; 1:30; 1:60
CP 37
1:5
Extrato da Casearia
(MeOH ) ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
CP 39
1:5
Extrato da Casearia
(Precipitado) ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
CP 40
1:5; 1:10
Extrato da Casearia
(Acetato) ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
CP 41
1:5; 1:10
EtOH Guaçatonga ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
CP 42
1:5; 1:10
Extrato aquoso ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
CP 43
1:5; 1:10
Casearia folhas 20 ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
CP 46
1:5; 1:10
Casearia folhas 21 ᶱ
1:5; 1:10;
CP 47
1:1; 1:3; 1:5; 1:6; 1:10; 1:12;
1:24
Casearia folhas 22 ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
CP 48
1:5; 1:10
Casearia folhas 23 ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
CP 50
1:5; 1:10
Casearia folhas 25 ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
I1
1:5; 1:10;
Casearia folhas 27 ᶱ
1:10
I2
1:5; 1:10;
Casearia folhas 28 e 29 ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
I3
1:5; 1:10;
Miconia fallaxᶱ
1:5; 1:10; 1:30
I4
1:5; 1:10;
Miconia albicansᶱ
1:0,1; 1:1; 1:5
I5
1:5; 1:10;
Miconia pipericarpaᶱ
1:0,1; 1:1; 1:5
I6
1:5; 1:10;
Tibouchina stenocarpaᶱ
1:1; 1:5; 1:10; 1:30
I7
1:5; 1:10;
Raiz eclipta
1:5
CP 52
1:5; 1:10
Stryphnodendron
barbatimanᶱ
1:0,1; 1:1; 1:5
CP 53
1:5; 1:10
Eclipta ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
CP 54
1:5; 1:10
Calos sapindus Fração
acida A1 ᶱ
1:10; 1:30
CP 55
1:5; 1:10
Calos sapindus
MeOH/H2O ᶱ
1:10; 1:30
P1
1:10
Calos sapindus
CH2CL2/MeOH ᶱ
1:10; 1:30
P2
1:1; 1:3; 1:6; 1:10; 1:12; 1:24
Rp-18 Sapindus ᶱ
1:10; 1:30
P3
1:1; 1:3; 1:6; 1:10; 1:12; 1:24
Fração A2 Sapindus ᶱ
1:10; 1:30
P4
1:10
Fração B2 Sapindus ᶱ
1:10; 1:30
P5
1:10
Sapindus calus 1º F ᶱ
1:10; 1:20; 1:60
P6
1:10
Sapindus saponaria Calos
1º F ᶱ
1:10; 1:30
P7
1:10
Sedum Dendroideumᶱ
1:5; 1:10; 1:20; 1:30
P8
1:10
Phyllacantus ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
Eclipta alba -
dimetilwedelolactona
(Eclidwl) ᶱ
1:10
AH (46-65)
1:1; 1:3; 1:5; 1:6; 1:12; 1:24
AH (1-9)
1:5
Ah (10-23)
1:5
Legenda: * amostras do germoplasma,
ᶱ extratos e frações de plantas existentes no laboratório
ᶲ inibidores sintéticos
Materiais e Métodos
61
3.6.8. Edema em camundongos
Grupos de 03 camundongos Swiss machos (18-22g) foram injetados via intradérmica
(i.d) na região subplantar da pata direita posterior com 50 µL de soluções contendo
diferentes quantidades de venenos brutos e Fosfolipase A2, dissolvidos em PBS. Os
venenos foram previamente incubados com os extratos por 30min a 37ºC, em diferentes
proporções e injetados nos animais. A mensuração da espessura das patas foi realizada
previamente, antes da inoculação das amostras (tempo 0 h). Os controles foram realizados
com injeções de 50 µL de PBS por animal e apenas extratos na maior concentração para as
incubações. Em seguida, a mensuração das patas foi efetuada em diferentes intervalos de
tempo após as administrações, 30 min, 1 h e 3 h. Os valores obtidos foram subtraídos dos
valores inicialmente aferidos no tempo 0 h. Posteriormente, os resultados foram inseridos
em gráficos, onde somente o valor médio e o desvio padrão são apresentados. O aumento
do volume na pata dos camundongos foi medido com um paquímetro de baixa pressão 0.01
mm (Mytutoyo, Japão) e expresso em percentagem direta de edema induzido (Soares et al.,
2000). As plantas avaliadas nos experimentos com veneno total e Fosfolipase A2 estão na
tabela 11.
Tabela 11. Plantas avaliadas no teste de edema veneno total e Fosfolipase A2.
Legenda: * amostras do germoplasma,
ᶱ extratos e frações de plantas existentes no laboratório,
ᶲ inibidores sintéticos
Plantas
Concentração avaliada
Mandevila ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
Stryphnodendron barbatiman (Barbatimão) ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
Casearia sylvestris ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
Miconia fallax ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
Tibouchina stenoscarpa ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
Miconia albicans ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
Eclipta prostata ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
Casearia folhas 28 e 29 ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
Casearia folhas 23 ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
Balsamo ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
Anacardium humile (AH 46 – 65) ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
Bauhinia forficata ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
Extrato da Casearia (Precipitado) ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
Sedum dendroideum 2 (SD2) ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
Sedum dendroideum 6 (SD6) ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
P2 ᶲ
1:5; 1:10; 1:30
Cordia verbanacea - ácido rosmarinico (CV – AM 28) ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
Cordia verbanacea (COR E 29) ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
Eclipta - dimetilwedelolactona (DWL) ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
Eclipta - wedelolactona (WL) ᶱ
1:5; 1:10; 1:30
Canafistula *
1:5; 1:10; 1:30
4
4
.
.
R
R
E
E
S
S
U
U
L
L
T
T
A
A
D
D
O
O
S
S
E
E
D
D
I
I
S
S
C
C
U
U
S
S
S
S
Ã
Ã
O
O
Resultados e Discussão
63
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Aquisição das seqüências
Durante o processo de aquisição das seqüências de Apis mellifera, observou-se que
existiam aproximadamente 20 seqüências de veneno de proteínas no GenBank. Com intuito
de ampliar as análises, seqüências de outras espécies de Apoidea foram obtidas e,
posteriormente, foram adicionados outros himenópteros (Tabela 13). Todas as seqüências
foram obtidas através do banco de dados público do GenBank. Quando foram utilizados os
termos “toxin” e “venom” foram encontradas no total: 44 seqüências de DNA e 86 de
proteínas (Tabela 12). Foi possível observar que a maioria das seqüências foram
depositadas com o termo “venom”, pois um dos problemas encontrados durante as buscas
foi obter seqüências que fossem exclusivas de abelhas e outros himenópteros. Utilizando
esse tipo de filtro foram obtidas as seqüências de DNA e proteínas das abelhas e vespas.
Entretanto, apenas algumas proteínas do GenBank estão completamente categorizadas. O
total de seqüências de DNA e proteínas foi 130, que corresponde ao número de proteínas
relacionadas ao veneno do grupo taxonômico Apoidea (Tabela 13). As seqüências obtidas
foram filtradas, tendo sido retiradas seqüências redundantes. Durante as análises foram
incluídas somente seqüências de DNA e proteínas de abelhas.
Tabela 12. Número total de seqüências separadas por tipo de seqüência e por palavra de busca.
Tipo de
seqüência
Palavra
Total
Toxin
Venom
DNA
2
42
44
Proteína
15
71
86
Resultados e Discussão
64
Tabela 13. Número de seqüências separadas por tipo de seqüência e espécie.
Todas as seqüências selecionadas foram categorizadas por espécie com intuito de se
observar a diversidade de organismo e gêneros representados em cada tipo de proteína
(Tabela 13). As seqüências obtidas foram categorizadas de acordo com o tipo de proteína,
entretanto algumas proteínas provenientes do GenBank não possuíam uma classificação
definida, sendo possível, com o desenvolvimento do sistema e categorização do banco de
dados, auxiliar na anotação de proteínas sem classificação. Conforme o esperado, o
organismo que apresenta o maior número de proteínas é a Apis mellifera, demonstrando a
sua grande importância e o quanto tem sido estudada diferente de outras abelhas.
Apoidae
Tipo de seqüência
DNA
Proteína
Secapin
Apis mellifera
3
6
Apis cerana cerana
1
1
Phospholipase A2
Apis cerana
0
1
Apis mellifera
3
6
Bombus terrestris
0
1
Bombus pennsylvanicus
0
1
Apis dorsata
0
1
Melittin
Apis mellifera
1
6
Apis cerana cerana
2
3
Apis cerana
0
1
Apis dorsata
0
1
Apis flórea
0
1
Mast cell degranulating
Apis mellifera
2
4
Bombus pennsylvanicus
0
1
Apis cerana cerana
1
1
Bombus SP
0
1
Hyaluronidase
Apis mellifera
3
6
Apis cerana cerana
1
1
Apamin
Apis mellifera
2
4
Apis cerana cerana
1
1
Acid phosphatase
Apis mellifera
4
4
Protease
Apis mellifera
0
4
Tertiapin
Apis mellifera
0
3
Seqüências de DNA sem classificação
Apis mellifera
14
10
Bombus pennsylvanicus
0
5
Resultados e Discussão
65
A aquisição das seqüências é muito importante para construção do banco, pois
fornece as informações para criação do banco de dados. Foi observado, durante o processo
de aquisição das seqüências, que não existia até o momento, nenhum banco de dados que
contivesse somente informações a respeito de abelhas e outros himenópteros. Entretanto,
há denominado um banco de dados com informações gerais e seqüências de venenos de
animais chamado BioVenom (Puga, 2008). Outros bancos de veneno encontrados estavam
relacionados a outros animais. O depósito de informações de abelhas em um único banco
de dados público e disponível por meio da internet é de grande importância.
4.2. Aquisição das estruturas protéicas
As estruturas foram obtidas por meio do banco de dados públicos do PDB
(www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Foram realizadas buscas com o termo “venom” e
“toxin”. Foram escolhidas somente estruturas que pertenciam a Apis mellifera” (Tabela 14).
As estruturas de Melitina e Fosfolipase A2 obtidas foram utilizadas nas análises de
modelagem e docking.
Tabela 14. Lista das estruturas encontradas no PDB, separadas por proteína, com nome do depósito,
método de obtenção, a espécie, a resolução e a data do depósito.
Toxina
Número
(PDB)
Métodos experimentais
Organismo
Resolução
(angstrom)
Ano do
depósito
Melitina
2MLT
Cristalografia de Raios-X
Construção
sintética
2.00
15/10/1990
1BH1
Espectroscopia de
Ressonância Magnética
Nuclear (RMN)
Apis mellifera
X
06/01/1999
Fosfolipase
A2
1POC
Cristalografia de Raios-X
Apis mellifera
2.00
07/09/1992
Tertiapina
1TER
Espectroscopia de
Ressonância Magnética
Nuclear (RMN)
Apis mellifera
X
08/04/1994
Hialuronidase
1FCQ
Cristalografia de Raios-X
Apis mellifera
1.60
01/10/2001
1FCU
Cristalografia de Raios-X
Apis mellifera
2.10
01/10/2001
1FCV
Cristalografia de Raios-X
Apis mellifera
2.65
01/10/2001
2J88
Cristalografia de Raios-X
Apis mellifera
2.60
23/10/2006
Nos estudos de estruturas protéicas terciárias foi observada uma pequena quantidade
de proteínas de Apis mellifera, apesar de ser uma abelha muito estudada. Durante a
aquisição das seqüências de DNA e proteínas, nove tipos de proteínas diferentes foram
encontrados; entretanto, somente quatro tipos de proteínas foram encontrados no PDB,
demonstrando a possibilidade de novos estudos estruturais com as proteínas ainda não
avaliadas. Em relação às proteínas disponíveis no PDB, as proteínas majoritárias do veneno
da abelha já estão disponíveis, que são: Fosfolipase A2 e Melitina.
Resultados e Discussão
66
4.3. Desenvolvimento do Sistema
O desenvolvimento de um sistema em que se concentrem somente informações de
abelhas é de grande importância, devido ao número cada vez maior de acidentes por
abelhas. Desta forma, a criação e a existência deste banco de dados públicos vêm ocupar
uma lacuna existente nos bancos de dados disponíveis. As informações contidas neste
sistema auxiliariam os estudos com veneno de abelhas, uma vez que o objetivo do é obter e
concentrar informações de experimentos in vitro, in silico e in vivo de inibição do veneno de
abelhas.
O sistema Bee Venom (http://gbi.fmrp.usp.br/beevenom/) está finalizado. Entretanto
o sistema permanecerá em constantes atualizações para suprimento de uma maior
quantidade de dados, que ocorrerá por meio de colaborações. No sistema, as informações
de plantas medicinais, proteínas e estruturas de venenos de abelhas, referências e dados
laboratoriais coletados de bancos de dados públicos continuam sendo inseridas e
categorizadas. As seqüências de proteínas de venenos de abelhas e vespas foram
coletadas de bancos de dados público, como NCBI (National Center for Biotechnology
Information) (Sirotkin, 2006). As estruturas protéicas foram obtidas no banco de dados
públicos do PDB, os dados de plantas medicinais obtidos do banco de dados público como
Brazilian-Plants (Hashimoto, 2002), as referências obtidas por meio do levantamento
bibliográfico do PUBMED (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=PubMed). Os dados
laboratoriais foram obtidos por meio de experimentos laboratoriais realizados durante a
realização desse projeto. Já as informações a respeito das proteínas de veneno de Apis
mellifera foram obtidas através de artigos e do banco de dados públicos do UniProt
(http://beta.uniprot.org/). Os dados de acidentes com abelhas foram obtidos através dos
bancos de dados públicos de saúde do Brasil: Sistema de Informação de Agravos de
Notificação (SINAN), Centro de Vigilância Epidemiológica (CVE), DATASUS e outros. Os
Links sugeridos no sistema são de sites visitados durante a realização do projeto. A
ferramenta Clustal foi inserida nos sistema para auxiliar as análises. Esses dados foram
submetidos até o momento ao sistema que já está apto a receber dados de colaboradores
cadastrados.
A tela principal do sistema (Figura 17) contém informações sobre o projeto (Group,
Project, Contact Information e site map). Ainda na tela principal, o link Categories é um dos
tipos de visualização do conteúdo público do sistema através das categorias. O link
Categories utiliza o módulo taxonomy_dhtml do Drupal para separar e quantificar todo o
conteúdo usando os termos das categorias (Figura 17). Na Figura 17a, pode-se visualizar o
menu do sistema com todos os conteúdos existentes. Em 17b vê-se o número dados
depositados no site até o momento. Na Figura 17c, observa-se a parte do sistema onde
Resultados e Discussão
67
pode-se fazer buscas há um outro menu que fica no topo da página e na Figura 17d,
observa-se um link para acesso rápido aos diversos tipos de categorias. Já na Figura 17e,
pode-se ver o link para registro no sistema e login para os usuários colaboradores
cadastrados. Os artigos encontrados Pubmed podem também observados (Figura 17f).
O site map permite observar toda a estrutura do sistema, visualizando a quantidade
de informação em cada categoria. É uma forma de visualizar os diversos tipos de
categorias. Na Figura 18, pode-se visualizar a categoria protein, onde está apresentado o
número de ocorrências de cada termo, e acessar, de forma rápida, os conteúdos presentes
no sistema.
Figura 17. Tela inicial do sistema Bee Venom. a) site para os tipos de visualização do conteúdo. b) visualização
do número de dados de seqüências, plantas, referências e de dados laboratoriais cadastrados, c) módulo de
busca simples por palavra chave, d) acesso rápido aos diversos tipos de categorias e) site para registro no
sistema e login para os usuários colaboradores cadastrados; f) Artigos do Pubmed inseridos no sistema.
c
a
b
e
d
f
Resultados e Discussão
68
Os dados submetidos podem ser visualizados utilizando os recursos disponíveis no
sistema como: busca simples por palavras-chaves, por nomes e relacionando termos das
categorias ou busca avançada, que permite acessar conteúdos específicos do sistema
(Figura 19). Todos esses dados armazenados já foram publicados e definidos como público.
Figura 19. Tela inicial de formulário de busca dentro do banco de dados do Bee Venom, onde
pode ser feita uma busca simples ou uma busca avançada.
Figura 18. Tela do site map do projeto Bee Venom. a) Categorias existentes no sistema b) Termo
criados nas categorias contendo o número de informações depositadas sobre o termo. c) Termos
criados nas categorias contendo informação a respeito das espécies de animais.
a
b
c
Resultados e Discussão
69
A visualização por statistics é a forma mais simples e rápida de interagir com os
dados. A parte de statistics pode-se visualizar os termos nos diversos conteúdos existentes
no sistema e quantificar o número de ocorrências de cada um dos termos dos conteúdos
selecionados, por cada categoria (Figura 20). Com base nas categorias é possível realizar
uma busca relacionando os termos das diferentes categorias. Os resultados decorrentes das
diversas formas de busca no sistema exibem informações com títulos e outras informações
relacionadas à pesquisa, podendo relacionar a busca com conteúdos específicos. O
statistics permite uma busca clara e dinâmica, devido à interação dos dados selecionados,
obtidos através das categorias e termos.
O Animal data list é um tipo de busca específica e eficiente que utiliza termos de
várias categorias e relaciona com o tipo de conteúdo existente no banco de dados do
sistema, disponibilizando, assim, o agrupamento dos termos desejados, criando uma busca
filtrada e específica por meio de termos (Figura 21).
a
b
Figura 20. Visualização do Statistics do sistema, onde é possível visualizar todos os conteúdos. a)
Conteúdo do sistema Bee Venom. b) a porcentagem do termo relacionada aos outros da mesma
categoria e o número total de ocorrências dele.
Resultados e Discussão
70
O Proteins permite visualizar os tipos de proteínas existentes no veneno de abelhas,
sendo divididas de acordo com o tamanho da proteína: peptídeo e enzimas. Cada proteína
possui uma descrição detalhada, que permite visualizar todas as informações obtidas
através do banco de dados públicos do Uniprot (http://beta.uniprot.org/) e artigos científicos
(Figura 22 e Figura 23). Nas páginas das proteínas existem sites para as seqüências e
estruturas depositadas no banco de dados do Bee Venom (Figura 24). Alguns artigos
citados nas referências foram adicionados no sistema Bee Venom no conteúdo de
referências de abelhas. Entretanto, a página de proteins não está completa, pois novas
proteínas têm sido identificadas com técnicas mais precisas (Peiren et al., 2005) e, à medida
que novas proteínas forem identificadas, elas serão adicionadas ao sistema.
Figura 21. Visualização do Animal datalist do sistema, permite realizar buscas em todos os
conteúdos relacionados às espécies animais. a) Filtro usado para a busca. b) Resultado da busca.
a
b
Resultados e Discussão
71
Figura 22. Tela de visualização do Proteins. Lista das proteínas cadastradas no sistema, sendo divididas
em peptídeos (a) e enzimas (b).
b
a
Figura 23. Tela de visualização da proteína Melitina. É possível observar uma pequena descrição da
proteína Melitina (a) e algumas informações a respeito da origem da Melitina (b)
a
b
Resultados e Discussão
72
O sequence permite visualizar todas as seqüências depositadas no banco de dados
do Bee Venom. Este tipo de visualização lista o titulo e o tipo de seqüência, a espécie e
nome de proteína (Figura 25), sendo possível filtrar pelo nome da espécie e pelo nome da
proteína. Nas seqüências depositadas, é possível observar todas as informações relativas à
seqüência como: tipo de animal, gênero do animal, nome científico, proteína, tipo de
seqüência, número de acesso e a seqüência fasta (Figura 26). Durante o processo de
submissão, alguns termos da proteína foram depositados como categoria. Sendo assim, na
visualização das seqüências é possível ver as palavras chaves (tag), o que permite listar
todo o conteúdo depositado nas seqüências relacionado com os termos, facilitando a busca
dentro do sistema para listar informações relacionadas.
Figura 25. Tela de visualização das seqüências de proteína depositadas no
sistema. As seqüências de proteína foram obtidas no banco de dados públicos do
Genbank. a) Filtro para busca de seqüências através da espécie e proteína. b)
Tela com resultado de uma busca da proteína Apamina existente no sistema.
b
a
Figura 24. Continuação da tela de visualização da proteína Melitina. Destacados os links para as
proteínas e estruturas depositadas em seqüências e estruturas dentro do sistema Bee Venom.
Resultados e Discussão
73
O structure permite visualizar informações e as estruturas protéicas existentes
depositadas no banco de dados do Bee venom. No structure, as proteínas são listadas com
o titulo, tipo de estrutura, proteína e espécie, sendo possível filtrar por proteínas e espécies
(Figura 27). As informações contidas nas estruturas correspondem às informações relativas
à forma de obtenção da estrutura, autores, informações à respeito da publicação
relacionada à estrutura, informações da abelha e verificar a existência de algum ligante
relacionado a essa molécula (Figura 28 e Figura 29). Imagens relativas às estruturas
depositadas no Bee Venom estão disponíveis para visualização, sendo possível visualizar a
estrutura 3D do arquivo pdb através do programa Webmol (Walther, 1997) (Figura 30).
Durante o processo de submissão alguns termos da estrutura foram depositados como
categoria, desta maneira na visualização das estruturas é possível ver as palavras chaves
(tag), que permitem listar todo o conteúdo depositado nas estruturas relacionado com os
termos, dessa forma facilita a busca dentro do sistema para listar informações relacionadas.
A página de structure contém, atualmente, somente estruturas de proteínas, mas o
objetivo é ter todas as informações de estruturas inclusive ligantes que causem a inibição
das proteínas do veneno. Dessa forma, o sistema conteria informações sobre experimentos
in silico com venenos de abelhas, por exemplo, docking. Atualmente, o sistema possui
campos para depósitos somente dos ligantes e durante o desenvolvimento do trabalho
alguns ligantes foram encontrados; entretanto, serão submetidos ao sistema somente após
a publicação dos experimentos in silico. Os dados dos experimentos in silico podem vir a
auxiliar nos experimentos in vitro.
Figura 26. Tela de visualização da seqüência da proteína Apamina. Todas as informações da
proteína obtidas no banco de dados públicos do GenBank. a) Título escolhido durante o depósito da
seqüência. b) Tags que foram criadas durante o depósito da seqüência ao sistema que permitem
buscas rápidas. c) Informações à respeito da proteína Apamina.
a
b
c
Resultados e Discussão
74
Figura 28. Tela de visualização da estrutura da proteína Fosfolipase A2. Todas informações, das
proteínas foram obtidas no banco de dado público do PDB. a) Título escolhido durante o deposito
da estrutura da proteína. b) Tags que foram criadas durante o depósito da estrutura da proteína
no sistema que permitem buscas rápidas. c) Informações a respeito da estrutura da proteína
Fosfolipase A2.
a
b
c
Figura 27. Tela de visualização das estruturas de proteínas de veneno. Todas as informações das proteínas
foram obtidas no banco de dado público do PDB. a) Filtro para busca de seqüências através da espécie e
proteína. b) As estruturas de proteínas depositadas no sistema.
a
b
Resultados e Discussão
75
Figura 30. Tela de visualização da estrutura da proteína Fosfolipase A2 em imagem 3D
através do programa Webmol.
Figura 29. Tela de visualização da estrutura da proteína Fosfolipase A2. Todas as informações
das proteínas foram obtidas no banco de dado público do PDB. a) Imagens no formato jpg da
proteína Fosfolipase A2 b) Site para visualizar a proteína Fosfolipase A2 com Webmol. c) Imagem
no formato jpg do ligante da Fosfolipase A2.
a
b
c
Resultados e Discussão
76
O anti-venom plants possibilita visualizar todas as plantas depositadas no sistema
que possuem atividade antiveneno identificadas. O anti-venom plants lista o título, a família
da planta e espécies (Figura 31), sendo possível filtrar por espécie e família. As informações
em anti-venom plants inclui campos sobre a família, espécie da planta, parte da planta
utilizada contra o veneno, nome científico, características e imagens das plantas (Figura 32).
Durante o processo de submissão, alguns termos das plantas foram depositados como
categorias, sendo assim, na visualização das plantas é possível ver as palavras chaves
(tag), que permitem listar todo o conteúdo depositado nas plantas relacionado com os
termos, dessa forma facilita a busca dentro do sistema para listar informações relacionadas.
Durante os experimentos in vitro, foram identificadas plantas que possuem atividade
antiveneno; entretanto, serão inseridas no sistema somente depois de terem sido
submetidas à publicação.
Figura 31. Tela de visualização dos dados de plantas com atividade antiveneno. Todas as informações da
proteína foram obtidas nos bancos de dados públicos. a) Filtro para busca de plantas através da espécie
e família. b) As plantas depositadas no sistema Bee Venom.
a
b
Resultados e Discussão
77
O laboratorial data contém informações relativas a experimentos in vitro e in vivo que
foram realizados para inibir proteínas de veneno de abelha. O laboratorial data lista os
experimentos por título e proteínas avaliadas (Figura 33). Entretanto, não foram depositados
resultados ainda, pois será necessária a publicação para, posteriormente, serem
disponibilizados na internet.
Figura 33. Tela de visualização dos dados laboratoriais do sistema Bee Venom.
Figura 32. Tela de visualização dos dados de plantas com atividade antiveneno. Todas as
informações das proteínas foram obtidas nos bancos de dados públicos. a) Título escolhido durante o
depósito da planta. b) Tags que foram criadas durante o depósito da planta no sistema que permitem
buscas rápidas. c) Informações a respeito da planta Echinodorus ellipticus.
a
b
c
Resultados e Discussão
78
O Bee’s accidents (statistics) tem por objetivo mostrar aos usuários, estatísticas de
acidentes com abelhas no mundo e no Brasil. Os dados de acidentes do Brasil foram
levantados e serão inseridos no sistema Bee Venom.
O Tools visa disponibilizar para o usuário ferramentas de bioinformática. Atualmente,
a única ferramenta disponível é de alinhamento de seqüências, sendo possível submeter um
grupo de seqüências e gerar o alinhamento das mesmas (Figura 34). Entretanto à medida
que houver necessidade outras ferramentas serão inseridas.
O Bee Venom Reference visa centralizar e divulgar todas as informações sobre
estudos com veneno de abelhas, sendo possível submeter: livros, notícias e referências. O
Bee Venom Reference lista todas as referências depositadas no sistema. É possível ver o
titulo, a área de estudo e o tipo de referência, podendo ser filtradas através do tipo de
referência e autores (Figura 35). Durante o processo de submissão alguns termos das
referências foram depositadas como categorias, sendo assim, na visualização das
referências é possível observar as palavras chaves (tag), que permitem listar todo o
conteúdo depositado nas referências relacionado com os termos. As palavras chaves
facilitam a busca dentro do sistema para listar informações relacionadas.
Figura 34. Tela de visualização das Tools do sistema Bee Venom. Em destaque a ferramenta disponível até o
momento, que é o clustalw.
Resultados e Discussão
79
O links permite visualizar os diversos bancos de dados públicos disponíveis na
internet com conteúdo relacionado ao Bee Venom (Figura 36), juntamente com os utilizados
para desenvolvimento do sistema.
Figura 36. Tela de visualização do Links.
Figura 35. Tela de visualização dos dados de referências sobre veneno de abelhas. Todas informações
da proteína obtidas nos bancos de dados públicos. a) Filtro para busca de referências através do tipo de
referência e autores. b) Tela inicial das referências de abelhas.
a
b
Resultados e Discussão
80
Para acessar os dados públicos por qualquer tipo de visualização não é necessário
utilização de registro de usuário, mas para inserir, alterar e remover dados do sistema é
necessário o registro. Portanto, para cadastrar um novo usuário no sistema, deve-se
preencher o formulário disponível no sistema (Figura 37) que se encontra no site Register
(Figura 17 E). Neste formulário, é obrigatório o preenchimento de informações pessoais,
profissionais, nome de usuário e endereço de e-mail, para onde a senha para acessar o
sistema será enviada.
Após o cadastro no sistema, o novo usuário poderá acessar as propriedades de
conteúdo e enviar seus próprios dados para o sistema.
Para enviar dados de plantas (Figura 39), seqüências de proteínas de venenos de
abelhas e vespas ao sistema (Figura 38), estrutura de proteínas de veneno de abelhas
(Figura 40 e 41), dados laboratoriais (Figura 42) e referências de sobre abelhas (Figura 43),
primeiramente, deve-se categorizar os dados que serão inseridos. Portanto, foram atribuídas
Figura 37. Formulário para cadastro de usuários. Informações pessoais e
profissionais são obrigatórias para o cadastro, um nome de usuário e e-mail para onde
a senha de acesso será enviada.
Resultados e Discussão
81
categorias no sistema que melhor representem e recuperem os dados que estão sendo
inseridos no sistema. No momento de enviar um conteúdo, é necessário que se faça uma
categorização dos dados, pois o sistema de busca interage, diretamente, com as categorias
e termos em que estiverem relacionados. Caso não exista um termo específico na categoria
selecionada no momento de classificar os dados, é possível a utilização de categorias do
tipo livre, sendo necessário que o curador revise os dados submetidos no sistema,
possibilitando, assim, o uso deste termo em outros conteúdos. Os campos e categorias
escolhidos em cada cadastro foram escolhidos de acordo com as informações existentes
nos dados públicos de onde foram retirados os dados, sendo cada ficha de cadastro
específica para cada tipo de conteúdo. As fichas de cadastro são independentes, entretanto,
durante uma busca, é possível relacioná-las.
O cadastro de dados de seqüências de veneno de abelhas possui um campo para
titulo e a categoria do tipo de conteúdo. Os outros campos estão divididos em três partes. A
primeira parte corresponde à informações sobre as abelhas e vespas, como o nome
científico, juntamente, com todas as categorias que possibilitam a categorização do
conteúdo, que apresentam campo livre de escrita, sendo possível adicionar novos termos no
sistema. A segunda parte corresponde à informações sobre a seqüência, onde os campos
são categorias do tipo de seqüência, tipo de proteína e o número de acesso é um campo de
escrita. A terceira parte é relativa à seqüência FASTA. (Figura 38).
Resultados e Discussão
82
Após preencher os campos do formulário de cadastro de seqüências de DNA e
proteínas, os dados entrarão em uma fila de espera aguardando análise dos
administradores e colaboradores do sistema para que sejam disponibilizadas para
visualização como conteúdo público.
O cadastro de dados de plantas com atividade antiveneno também está dividido em
três partes: informações sobre as plantas, informações de seus compostos e imagens. Além
dessas três partes, existe um campo para título, tipo de conteúdo e informações adicionais.
Foram criados campos de categoria livre para inserção de novos termos, sendo possível
enviar imagens das plantas e dos compostos. Os campos mostrados com asterisco são
campos de preenchimento obrigatório, conforme mostrado na Figura 39.
Figura 38. Campos de escrita do cadastro de seqüência de proteína que permitem
a categorização da seqüência. Podem ser cadastradas as informações através de
termos livres e termos já categorizados. a) Título da seqüência a ser cadastrada e
escolha da categoria de tipo de conteúdo, b) A primeira parte do cadastro da
seqüência que está relacionado com as informações sobre as abelhas e vespas. c)
Segunda parte do cadastro informações da seqüência. d) Terceira parte do cadastro
que possui o campo de escrita para inserção da seqüência fasta.
a
b
c
d
Resultados e Discussão
83
O cadastro de dados de estruturas protéicas (Figura 40 e 41), dados laboratoriais
(Figura 42) e referências de abelhas (Figura 43) são similares aos cadastros anteriores;
entretanto, os campos obrigatórios podem mudar e variar. Cada um dos cadastros possui
grupos de categorias específicos que permitem filtros rápidos e dinâmicos. Após preencher
os campos do formulário, os dados entrarão em uma fila de espera aguardando análise dos
administradores e colaboradores do sistema, para que sejam disponibilizados para a
visualização como conteúdo público.
Figura 39. Campos de escrita do cadastro de plantas com atividade antiveneno
que permite a categorização da seqüência. Podem ser cadastradas as
informações através de termos livres e termos já categorizados. a) Título da planta
a ser cadastrada e escolha da categoria de tipo de conteúdo, b) A primeira parte
do cadastro está relacionado com as informações sobre o planta. c) Segunda parte
do cadastro são informações sobre o composto. d) Terceira parte do cadastro que
possui campos para submeter imagens do composto e da planta.
a
b
c
d
Resultados e Discussão
84
c
Figura 40. Campos de escrita do cadastro de estruturas protéicas de
veneno de abelhas que permitem a categorização da estrutura. Podem
ser cadastradas as informações através de termos livres e termos já
categorizados. Está dividido em quatro partes. a) Título da estrutura a
ser cadastrada e inserção dos autores e categorização do tipo de
conteúdo, b) A primeira parte do cadastro está relacionada com as
informações sobre a proteína, c) A segunda parte do cadastro está
relacionada com as informações sobre o animal, d) Terceira parte do
cadastro são informações sobre a estrutura, e) Quarta parte do
cadastro são informações sobre o ligante.
a
b
e
d
c
Resultados e Discussão
85
Figura 41. Campos de escrita do cadastro da estrutura da proteína do veneno,
sendo possível a submissão de imagens da proteína e do ligante e submissão de
arquivos no formato PDB e MOL da proteína e do ligante.
Resultados e Discussão
86
Figura 42. Campos de escrita do cadastro de dados laboratoriais de
experimentos que permitem a categorização da estrutura. Podem ser
cadastradas as informações através de termos livres e termos já
categorizados. Está dividido em três partes. a) Título do experimento a ser
cadastrado e inserção dos autores e, categorização do tipo de conteúdo e
inserção da instituição onde foram realizados os experimentos, b)
Informações a respeito dos experimentos e informações adicionais, c)
Campos para envio de arquivos adicionais que sejam relacionados aos
experimentos.
a
b
c
Resultados e Discussão
87
As categorias criadas para classificação dos dados cadastrados no sistema são
adicionadas pelo administrador do sistema (Tabela 15) e possibilitam que os dados não
fiquem dispersos no sistema por isso a importância de uma categorização correta quando
um conteúdo é cadastrado.
As categorias do sistema estão dividas em:
Figura 43. Campos de escrita do cadastro de referências de veneno de abelhas que
permitem a categorização da estrutura. Podem ser cadastradas as informações através de
termos livres e termos já categorizados. Está dividido em três partes. a) Título da estrutura
a ser cadastrada e inserção dos autores, categorização do tipo de conteúdo, ano em que
foi publicado as referências, linguagem da referência e editora da publicação b) O resumo
da referência, c) Informações adicionais com inserção da instituição onde foram realizados
os experimentos, inserção da área de estudo e inserção do site para a referência.
a
b
c
Resultados e Discussão
88
Tabela 15. Categorias do sistema Bee Venom.
Categoria
Função
Protein
Tipos de proteínas de veneno
Animal
Tipo de animais
Genus Animal
Gênero do animal
Scientific name (animal)
Nome científico do animal
Sequence type
Nucleotídeo ou aminoácido
Action (Ligand)
Forma de ação do ligante na estrutura
Activity
Atividade do composto da planta
Authors
Autores de referências de abelhas
Authors (laboratorial data)
Autores dos dados laboratoriais
Classification (protein)
Classificação da proteína
Content type
Tipo de conteúdo a ser cadastrado
Country
Pais da planta antiveneno
EC number
Número de classificação das enzimas
Family (plant)
Família das plantas
Field of study
Área de estudo da referência
Formula (Ligand)
Formula química do ligante
Institution (Bee venom reference)
Instituição da referencia de abelha
Institution (laboratorial data)
Instituição dos dados laboratoriais
Language
Linguagem das referências de abelhas
Ligand
Nome do ligante
Part of plant used
Parte da planta usada nas plantas antiveneno
Publisher
Editora da referência de abelha
Scientific name (plant)
Nome científico da planta
Structure (Authors)
Autores da estrutura
Structure (obtaining Method)
Métodos de obtenção
Type of Ligand
Tipos de ligante
Type of reference
Tipos de referências
Type of Structure
Tipos de estrutura
Year
Ano da publicação da referência
Até o momento estão armazenadas no sistema 12 espécies de plantas medicinais
categorizadas 408 seqüências de proteínas de venenos de animais, 08 estruturas de
proteínas e 04 referências de abelhas categorizadas. Entretanto, posteriormente, serão
adicionados outros dados.
4.4. Bioinformática estrutural
4.4.1. Melitina
A estrutura de Melitina (2MLT) obtida através do banco de dados públicos do PDB foi
inserida no programa Almond (Tripos(Inc.), 2005) e Q-Site Finder (Laurie et al., 2005) para a
análise dos campos de interação. A Melitina é uma proteína de, aproximadamente, 26
aminoácidos. Devido ao seu pequeno tamanho, surgiu a dificuldade de encontrar um ligante
que se ligasse, exclusivamente, com o sítio ativo, provocando a inibição da proteína. As
análises no Almond e no Q-Site Finder servem para identificar os locais onde os ligantes
Resultados e Discussão
89
devem se ligar. A estrutura de Melitina utilizada possui duas cadeias, pois quando foi
realizado o processo de obtenção de sua estrutura obteve-se nessa conformação. Todas as
análises posteriores a Melitina têm duas cadeias, pois na natureza ela ocorre nesse fold. O
programa Almond faz análise para três grupos químicos de prova diferentes: hidrofóbicos,
oxigênio de carbonila e nitrogênio de amida. A utilização desses grupos de provas distintos
tem por objetivo a definição de sítios receptores virtuais no sítio ligante, para grupos com
características químicas consideradas relevantes na realização de interações de ligantes
com a proteína.
O grupo de prova hidrofóbico identifica os sítios na proteína que favorecem a
acomodação, do ponto de vista energético, de porções hidrofóbicas de ligante. O grupo de
prova oxigênio de carbonila representa fragmentos de ligantes que podem agir como
receptores de ligação de hidrogênio. O grupo de prova nitrogênio de amida identifica regiões
na proteína que favorecem interações com regiões doadoras de ligação de hidrogênio em
ligantes (Pastor et al., 2000).
No campo de interação do grupo químico de prova nitrogênio de amida existem
regiões capazes de receber ligações de hidrogênio. Entretanto, esses sítios ocorrem na
extremidade das proteínas, regiões que são ricas nesse tipo de doadores. Contudo, essas
regiões doadoras não ocorrem no sítio ativo da proteína, ou seja, no aminoácido 14 (uma
prolina). Na Figura 44, o aminoácido 14 está marcado com um círculo e não é possível
identificar sítios virtuais no sítio ativo da proteína.
*
*
Figura 44. Resultado obtido do Almond da proteína Melitina, sendo o campo de prova nitrogênio de
amida. A região com círculo representa o local do sitio ativo da proteína. As regiões em azul (*) são os
locais onde, potencialmente, ocorreriam ligações com amidas. A ocorrência dessa região é na
extremidade da proteína.
Resultados e Discussão
90
Em relação ao campo de interação do grupo químico de prova hidrofóbica foram
encontradas regiões que permitem uma acomodação de regiões hidrofóbicas. Uma das
regiões ocorre exatamente sobre o sitio ativo, na prolina, pois a prolina possui um anel
aromático, causando, assim, uma região hidrofóbica. Dessa forma, um bom ligante para
essa proteína deve ter uma região hidrofóbica interagindo com a prolina. O sitio ativo está
circulado na Figura 45.
Em relação ao campo de interação do grupo químico de prova oxigênio de cabonila
foram encontradas regiões que possuem grupos receptores de ligação de hidrogênio. Essas
regiões ocorrem nos aminoácidos finais da proteína e não apresentam sítios virtuais no sitio
ativo da proteína. O sítio ativo está circulado na Figura 46.
*
*
Figura 45. Resultado obtido do Almond da Melitina, sendo o campo de prova hidrofóbico. A região
com circulo representa o local do sítio ativo da proteína. As regiões em branco (*) são os sítios
onde existem campos de força para interações do tipo pontes de hidrogênio, que estão próximos
ao sitio ativo da proteína.
Resultados e Discussão
91
Os campos de força encontrados através do programa Almond se localizam na
extremidade da proteína. Apenas um sítio virtual foi encontrado próximo ao sitio ativo e
somente em caso de sítios hidrofóbicos, demonstrando a dificuldade de um ligante interagir
com a Melitina. Entretanto, no desenvolvimento de ligantes para inibir o veneno, é essencial
inibir a Melitina por ser um componente majoritário do veneno. Uma possibilidade que
poderia ser usada seria utilizar um ligante que fosse capaz de interagir com o sítio ativo e a
extremidade da proteína, simultaneamente.
Alguns trabalhos têm citado que a extremidade da proteína, juntamente com o sítio
ativo, seriam responsáveis por sua atividade, demonstrando que um inibidor deve interagir
com as duas regiões (Raghuraman e Chattopadhyay, 2007).
A proteína foi submetida a um programa chamado Q Site-Finder (Laurie et al., 2005)
(http://bmbpcu36.leeds.ac.uk/qsitefinder/), que faz uma busca na estrutura da proteína por
sítios de interação com outras moléculas. Durante a busca foram localizados o sítio ativo e
outras regiões que possam interagir com moléculas. Na Figura 47, pode-se observar com
circulo vermelho, o anel aromático da prolina (14 aa), que representa o sítio ativo, onde é
possível observar, no retângulo preto, uma região marrom que representa o local de
interação com o sítio ativo. O retângulo preto representa essa região que seria o sítio ativo
(Dempsey, 1990). As outras regiões em marrom representam locais de interação da
*
*
*
Figura 46. Resultado obtido do Almond da Melitina, sendo o campo de prova oxigênio da carbonila. A
região com círculo representa o local do sitio ativo da proteína. As regiões em vermelho (*) são os sítios
de ligação de hidrogênio que ocorrem na extremidade da proteína.
Resultados e Discussão
92
proteína com ligantes. Foram representadas no total 10 posições, sendo a primeira
identificada e com maior relevância próximo ao sítio ativo.
Esse tipo de análise foi importante, pois confirmou os sítios encontrados
anteriormente e confirmou o sítio ativo, onde os inibidores devem interagir. Através dessas
análises foi possível identificar as características necessárias e o local que um ligante deve
interagir para causar a inibição da Melitina.
4.4.2. Screening Virtual
As simulações de screening virtual foram realizadas com o software GOLD (Verdonk
et al., 2003) para a Fosfolipase A2 disponível no PDB (1POC). A base de dado utilizada foi:
Ilibdiverse. A base de dado foi utilizada com o objetivo de selecionar compostos com o
potencial de se ligarem através da abordagem de docking flexível, presente no software
GOLD (Verdonk et al., 2003). Na simulação, foi selecionada apenas a melhor orientação
para as 10 melhores estruturas filtradas pelo “software” para a base de dados. Dessa forma,
foram escolhidas as 10 melhores orientações. Na Figura 48, é possível visualizar todos os
ligantes sobrepostos, demonstrando que os ligantes possuem estruturas similares, com
tamanho aproximado e com os mesmos grupos químicos. Todas apresentam anéis
aromáticos.
Figura 47. Resultado obtido do site Q-Site Finder da Melitina. A região em marrom representa os
locais da proteína que têm sítios de interação com ligantes ou proteínas. Os círculos em vermelho
representam os sítios ativos da Melitina. O retângulo preto marca o sítio identificado no sitio ativo.
Resultados e Discussão
93
Na Figura 49, podem ser visualizados todos os ligantes selecionados, demonstrando
suas estruturas similares, podendo ser visualizadas na forma plana.
A
B
Figura 48. Todos os inibidores de Fosfolipase A2 selecionados através do GOLD na base de dados do
Ilibdiverse. Os 10 ligantes foram sobrepostos, onde pode-se observar que possuem estruturas
similares. Duas formas de visualizar os ligantes sobrepostos em A e em B. As estruturas das proteínas
são visualizadas através do programa PYMOL
I 41
I 240
I 7
I26
I 76
I 52
I 455
I 40
I 25
I 163
Figura 49. Todos os inibidores de Fosfolipase A2 selecionados através do software GOLD na base de
dados do Ilibdiverse. O número ao lado dos 10 ligantes representa o número do ligante dentro da base de
dado do Ilibdiverse.
Resultados e Discussão
94
As moléculas selecionadas foram avaliadas quanto às propriedades físico-químicas
relacionadas aos parâmetros da Regra dos Cinco, de Lipinski et al. (1997), as quais foram
calculadas e são mostradas na Tabela 16. Segundo a Regra dos Cinco, a maioria dos
fármacos que apresentam biodisponibilidade por via oral obedece pelo menos três dos
seguintes parâmetros: peso molecular menor que 500 (kda), Log P menor que 5, número de
receptores de ligação de hidrogênio menor ou igual a 10 e número de doadores de ligação
de hidrogênio menor ou igual a 5. Todos os 10 compostos selecionados nas simulações de
screening virtual se enquadram nos parâmetros da Regra dos Cinco. Apenas dois
compostos tiveram um dos valores acima do permitido no Log de P. Na Tabela 16 é possível
visualizar os valores de score dos compostos obtidos através do software GOLD (Lipinski et
al., 1997; Lipinski, 2004).
Tabela 16. Resultado obtido do software GOLD na coluna scores e resultados obtidos dos
parâmetros da Regra dos Cinco. Em vermelho são apresentados os valores que ultrapassaram o
valor limite.
Composto
Score
NOMES
Peso
Molecular
(kda)
Aceptores
Receptores
Log
Probabilidade
Violações
7
32,95
'(+)-himbacine'
309,39
3
1
3,2356
0
25
35,62
'(+/-)-Butaclamol'
280,34
3
3
2,823
0
26
32,56
'(+/-)-Chloro-APB'
361,57
2
1
5,0452
1
40
35,54
'(+/-)-PPHT'
329,85
3
2
4,4767
0
41
35,92
'(+/-)-SKF 38393, N-allyl-'
309,49
2
1
5,1888
1
52
33,84
'(-)-Frondosin D'
295,41
3
2
3,9587
0
76
34,1
'(4-benzyl-piperidin-1-yl)-
(5-amidinomethyl-3ah-
indol-2-yl-methanone'
338,43
4
1
3,7732
0
163
33,44
'1-benzyl-5-methoxy-2-
methyl-1h-indol-3-yl)-
acetic acid'
326,47
3
1
3,0305
0
240
35,33
'1r,2s,3r,4s-tetrahydro-
benzo[a]anthracene-
2,3,4-triol'
345,58
3
0
4,1112
0
455
32,43
'3-O-Methylcalocarpin'
361,51
2
2
0,851899
0
Os ligantes foram visualizados juntamente com a proteína Fosfolipase A2. Os
ligantes interagiram com a Fosfolipase A2 no sítio ativo da proteína, que também foi
confirmado através do site Q-Site Finder (Figura 50). Essa primeira análise foi preliminar,
para, posteriormente, ser mais bem avaliada com outros softwares. Entretanto, os
resultados encontrados foram satisfatórios, as moléculas selecionadas obtiveram scores
bons e próximos, além de bons valores nas análises da Regra dos Cinco.
Resultados e Discussão
95
A proteína e as moléculas foram submetidas ao site Q – Site Finder, onde se buscou
identificar as regiões na proteína que possuem sítios de interação. Na Figura 51, foi avaliada
a proteína sem os ligantes, sendo possível identificar os principais sítios da proteína.
A proteína com os inibidores também foram submetidos ao site Q – Site Finder
(Figura 52) e observou-se os ligantes interagindo com um dos sítios identificados e ligados
ao sitio ativo interagindo com a histidina (34 aa), aspartato (64 aa) e tirosina (87 aa), que
são os principais componentes do sítio ativo. Os aminoácidos aspartato e a tirosina têm
regiões de ligação a hidrogênios, sendo importantes sítios de interação da Fosfolipase A2.
Os ligantes interagem com esses sítios; entretanto, são necessárias mais análises para
confirmar a inibição (Annand et al., 1996).
Figura 51. Resultado do site Q - Site Finder da proteína Fosfolipase A2 sem inibidores e com os
sítios de interações possíveis.
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
1,5
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (Minutos)
1:30
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
PLA
2
Apis mellifera (5µg):
DWL
B
A
Figura 50. A proteína Fosfolipase A2 interagindo com todos os ligantes selecionados através do software
GOLD, sendo visualizadas na forma de linhas (A) e da estrutura secundária (B) no software PYMOL (DeLano,
2002)
Resultados e Discussão
96
4.5. Ensaios laboratoriais
4.5.1. Extratos Vegetais das Plantas do Banco de Germoplasma da USP/RP
4.5.1.1. Coleta dos vegetais
As plantas selecionadas foram localizadas e coletadas em seu „habitat‟ natural ou
cultivadas e identificadas. Inicialmente, foram selecionadas para os experimentos somente
as plantas da família Fabaceae, devido a sua grande importância econômica. Não foram
coletadas amostras das espécies vegetais: Schizolobium parahyba, Copaifera langsdorffii,
Machaerum villosum, e Centrolobioum domentosoum, pois nas árvores encontradas não foi
possível obtenção de folhas. Já as espécies vegetais: Platycyamus elegans e Holocalyx
balansae foram coletadas; entretanto, não foi obtido material vegetal suficiente para as
análises. As outras espécies foram coletadas, as extrações ocorreram com sucesso, e,
materiais vegetais para todas as análises foram obtidos.
4.5.1.2. Preparação dos extratos
As espécies vegetais Platycyamus elegans e Holocalyx balansae foram coletadas.
Entretanto, a maioria das folhas estava velha e fungada, sendo assim não foram preparados
extratos suficientes para análises. As demais espécies vegetais foram extraídas e
liofilizadas. Após a preparação os extratos foram armazenados a – 4 C
o
.
4.5.2. Atividade fibrinogenolítica
O método descrito por Rodrigues et al. (2000) foi utilizado com algumas modificações.
Amostras contendo 50 µg de fibrinogênio bovino dissolvido em PBS foram incubadas com
as soluções de venenos, por 2h a 37°C. As amostras incubadas foram, posteriormente,
submetidas à eletroforese com gel de poliacrilamida de 12 % (Figura 53) (Rodrigues et al.,
2001).
A
B
Figura 52. Avaliação da Fosfolipase A2 e os ligantes através do site Q site-finder, onde foram
identificados as regiões da proteína que interagem com outras moléculas. Nessa figura, pode-se
observar que todos os inibidores ficaram sobrepostos à região onde ocorre o sítio ativo. Na parte A da
figura tem uma visão geral e na parte B um zoom no sítio ativo.
Resultados e Discussão
97
Figura 53. Fibrinogênio: 1-Fibri (80µg); 2- Fibri + Apis mellifera (0,5µg); 3- Fibri + Apis mellifera (1µg);
4- Fibri + Apis mellifera (5µg); 5- Fibri + Apis mellifera (10µg); 6- Fibri + Apis mellifera (20µg); 7- Fibri
+ Apis mellifera (30µg); 8- Fibri + Apis mellifera (50µg).
O extrato do veneno não causou degradação do fibrinogênio, apesar de haver um
aumento da concentração. O surgimento da banda no canto inferior do gel se deve ao
aumento da concentração do veneno.
4.5.3. Atividade Miotóxica
O gráfico 4 permite verificar que a fração Fosfolipase A2, comparativamente a uma
fosfolipase, CB cdt, isolada, não induziu a miotoxicidade no músculo gastrocnemius do
camundongo. Os efeitos de miotoxicidade produzidos pelo veneno podem ser evidenciados
por meio da liberação in vitro de creatina cinase muscular. O efeito de hemorragia causado
pelo veneno, provavelmente, está relacionado ao mecanismo de ação distinto.
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
CB Cdt (10µg)
PLA
2
Apis (10µg)
PLA
2
Apis (5µg)
PLA
2
Apis (1µg)
PLA
2
Apis (0,1µg)
Miotoxicidade (U/L)
1 2 3 4 5 6 7 8
Gráfico 4. Avaliação da atividade miotóxica do veneno de PLA2. Não foi encontrado atividade
miotóxica.
Resultados e Discussão
98
4.5.4. Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE)
Amostras de extratos e/ou inibidores em diferentes concentrações foram incubadas
com venenos de serpentes por 30 min a 37°C e submetidas à eletroforese em gel de
poliacrilamida na presença de agentes desnaturantes, para verificação da integridade das
proteínas dos venenos para análises posteriores (Figura 54).
Figura 54. SDS-PAGE: 1- PPM; 2- Apis mellifera (5µg); 3- Apis mellifera (15µg); 4- Apis mellifera
(30µg); 5- PLA2 Apis mellifera (0,1µg); 6- PLA2 Apis mellifera (0,5µg); 7-PLA2 Apis mellifera (3µg).
As proteínas se apresentaram de forma íntegra, sem degradação aparente,
demonstrando a integridade do material. Desta forma puderam ser utilizadas nos
experimentos posteriores.
4.5.5. Interação extratos ou inibidores-venenos:
Este experimento foi realizado através de incubação do veneno de A. mellifera e da
toxina Fosfolipase A2 de A. mellifera, nas proporções de 1:10 e 1:50, por 30min a 37ºC, com
os extratos de caule e folhas. A precipitação, proteólise das proteínas dos venenos, ou
ligação destas a alguma substância dos extratos, pode de visualizada em eletroforese com
gel de poliacrilamida, na presença de agentes desnaturantes (Figura 55).
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5 6 7
Figura 55. Gel SDS-PAGE: Apis mellifera + Casearia Folhas 28 e 29 (teste de degradação de proteínas).
SDS-PAGE: 1- Apis mellifera VB (30µg); 2- Apis mellifera + Casearia Folhas 28 e 29 1:1; 3- Apis mellifera
+ Casearia Folhas 28 e 29 1:5; 4- Apis mellifera + Casearia Folhas 28 e 29 (1:10); 5- Apis mellifera +
Casearia Folhas 28 e 29 (1:20).
Resultados e Discussão
99
O composto de Casearia folhas 28 e 29 causaram degradação dos componentes do
veneno e com isso degradando o veneno. Dessa forma apresentou uma potencial atividade
antiveneno.
4.5.6. Avaliação da atividade fosfolipásica indireta
Foram realizados ensaios iniciais com a finalidade de determinar qual seria a
concentração a ser utilizada nos experimentos posteriores. Os ensaios foram realizados
para o extrato total e para a Fosfolipase A2. Após a determinação da concentração foram
realizados ensaios para verificar se temperatura, íons e tampão inibiriam a atividade
fosfolipásica. Então, foram realizados os ensaios para avaliar a inibição da atividade
fosfolipasica.
No primeiro experimento, onde se procurou identificar qual seria a concentração a
ser utilizada nos experimentos, foi identificada a concentração de 5µg para o veneno total e
0,1µg para a Fosfolipase A2. Esses dois valores foram usados em todos os outros ensaios
de atividade fosfolipásica, por serem valores médios aos comparados com as outras
concentrações. Nestes valores, foi possível observar uma boa reação com uma menor
utilização do veneno total e da Fosfolipase A2.
Os valores escolhidos no ensaio preliminar foram utilizados em todas as outras
atividades fosfolipásicas. Todos os resultados das atividades fosfolipásicas estão
representados nos gráficos 5 a 14 e encontram-se divididos em dois tipos: ensaios com o
veneno total e ensaios com a Fosfolipase A2. As plantas, extratos ou compostos que
apresentam atividade antiveneno com o veneno total foram também avaliadas contra a
Fosfolipase A2. Entretanto, foram inseridas nesse trabalho somente os gráficos que
apresentaram alguma inibição, de acordo com a Tabela 17 e Tabela 18, que resumem todos
os resultados de atividade fosfolipásica.
Após a identificação da concentração do veneno total, foram realizados experimentos
para verificar se o pH, EDTA, íons e temperatura inibiriam a atividade do veneno total.
Entretanto, nenhum desses parâmetros causou inibição da ação do veneno total de Apis
mellifera. Os experimentos com EDTA foram verificados, uma vez que sua atividade
quelante é conhecida. Entretanto, foi observada atividade somente em uma concentração
muito alta, impedindo, assim, a sua utilização. No caso dos íons, sabe-se que algumas
Fosfolipases A2 são dependentes de cálcio, o que significa que na presença de cálcio sua
ação seria aumentada. Entretanto, isso não ocorreu para o veneno total.
Posteriormente, foram realizados os experimentos com as plantas, inibidores
artificiais e outros compostos. Os resultados podem ser observados na Tabela 17 para o
Resultados e Discussão
100
veneno total e na Tabela 18 para a Fosfolipase A2. As plantas que apresentaram inibição
foram utilizadas em experimentos de teste de edema. Em relação às plantas do
germoplasma da USP, três apresentaram inibição da atividade do veneno total: canafistula,
pau-pereira e pau-ferro. As plantas pau-ferro e pau-pereira apresentaram inibição somente
em concentrações mais altas No caso da canafistula, houve inibição em todas as
concentrações, sendo, então, mais eficiente que as outras duas. No caso da Fosfolipase A2,
as plantas encontradas com atividade inibitória foram: canafistula, cabriúva, amendoim-
bravo, jatobá, pau-pereira e pau-ferro, em todas as concentrações avaliadas, com exceção
de jatobá e pau-pereira. Demonstrando um potencial de atividade anti-fosfolipase A2 de Apis
mellifera, essas plantas devem se melhor estudadas para compreensão dessa atividade,
pois foram mais eficientes para inibir a proteína isolada, uma das razões desse resultado
seria devido à ação do veneno ser sinérgica, isto é, os componentes interagem juntos. Não
foram encontradas referências sobre essas plantas com a atividade antiveneno identificada.
Esses resultados demonstram o grande potencial que o banco de germoplasma apresenta,
dessa forma a sua conservação é de grande importância.
Nos experimentos foram também avaliados 7 inibidores, que já possuíam inibição
eficiente comprovada. Entretanto, nas análises com veneno total e Fosfolipase A2 não foram
observadas ação inibitória. No caso dos compostos CPs, somente o CP 47 apresentou
inibição ao veneno total. Entretanto, ao serem avaliadas contra a Fosfolipase A2 não
apresentaram ação inibitória. Os compostos Ps apresentaram inibição da atividade somente
do composto P2 e P3 para o veneno total. Entretanto, para a Fosfolipase A2 isolada não
foram encontradas atividades inibitórias. Foram também avaliados compostos do tipo CSF,
que apresentaram atividade inibitória comprovada, com exceção de CSF 20, CSF 21 e CSF
27. No caso da Fosfolipase A2 não foram encontradas ação inibitória.
As outras plantas utilizadas são plantas existentes no laboratório de Toxinas
Animais e Inibidores Naturais e Sintéticos, onde foram realizados os experimentos. Algumas
destas plantas já possuem atividades anti-fosfolipásicas reconhecidas para veneno de
outros organismos. As plantas obtidas no laboratório de Toxinas Animais e Inibidores
Naturais e Sintéticos estão na Tabela 17 para veneno total e Tabela 18 para a Fosfolipase
A2. Foram encontradas atividade inibitória em Mandevilla, Casearia, precipitado, acetato,
EtOH Guaçatonga, Extrato aquoso, Miconia fallax, Miconia albicans, Tibouchina stenocarpa,
Stryphnodendro barbatiman, Eclipta, Sedum dendroideum e Anacardium humile (46-65).
Dentre as plantas com atividade inibitória, a Eclipta e Acetato inibiram somente em altas
concentrações, já a Tibouchina stenocarpa inibiu somente em concentrações mais baixas.
As plantas: Anacardium humile (46-65), Mandevilla, Casearia, Miconia fallax, Sedum
dendroideum, apresentaram inibição em todas as concentrações, demonstrando uma maior
Resultados e Discussão
101
eficiência na atividade inibitória. Sendo assim, essas plantas apresentam um grande
potencial para serem utilizadas como antiveneno de abelhas. Essas plantas não tinham sido
identificadas como plantas antiveneno para abelhas, mas algumas já tinham sido
identificadas como antiveneno em serpentes.
Nos experimentos com Fosfolipase A2, as plantas identificadas com atividade
inibitória foram: Miconia Albicans, Stryphnodendro barbatiman, Micania Fallax, Mandi F
RETOH, Tibouchina stenoscarpa, Anacardium humile (46 – 65), Sedum dendroideum 2 e 6,
Eclipta Alba - dimetilwedelolactona (Eclidwl) e Eclipta Alba - wedelolactona (Ecliwl). Todas as
plantas apresentaram inibição, sendo que: Eclidwl, Sedum dendroideum 2 e 6,
Stryphnodendro barbatiman, Mandi F RETOH e Anacardium humile (46 – 65) foram mais
eficientes, pois apresentaram uma inibição em um número maior de concentrações. Já a
Micania Fallax apresentaram inibição somente em altas concentrações. No caso da Ecliwl,
foi obtida inibição somente em concentrações menores. Entretanto, era esperado um maior
número de inibições devido ao fato que a proteína isolada deveria ser mais facilmente
inibida, que não foi observado nos resultados encontrados.
Resultados e Discussão
102
Tabela 17. Plantas utilizadas contra veneno total.
Plantas
Inibição
Concentração
da inibição
Plantas/Inibidores
Inibição
Concentração
da inibição
Canafistula
Sim
1:5; 1:10; 1:30
Anacardium humile
(46-65)
Sim
1:1; 1:3; 1:5;
1:6; 1:12; 1:24
Cabriúva
Não
Anacardium humile
(1-9)
Não
Amendoim Bravo
Não
AH (10-23)
Não
Jatobá
Não
I1
Não
Pau-pereira
Sim
1:10
I2
Não
Pau-ferro
Sim
1:30
I3
Não
Mikania glomerata
Não
I4
Não
Lippia 6
Não
I5
Não
Mandevilla
Não
I6
Não
Mandevilla (RAIZ)
Sim
1:5; 1:10; 1:30
I7
Não
Zeyhenia
Não
CP 01
Não
Cordia verbanacea
(Cor e = 29)
Não
CP 02
Não
Bauhinia fortificata
Não
CP 10
Não
Casearia silvestris
Não
CP 11
Não
Amburana cearensis
Não
CP 17
Não
Casearina
Não
CP 20
Não
Casearia
Sim
1:5; 1:10; 1:30;
1:60
CP 21
Não
Extrato da Casearia
(MeOH)
Não
CP 25
Não
Extrato da Casearia
(Precipitado)
Sim
1:10; 1:30
CP 26
Não
Extrato da Casearia
(Acetato)
Sim
1:30
CP 27
Não
EtOH Guaçatonga
Sim
1:10; 1:30
CP 29
Não
Extrato aquoso
Sim
1:10; 1:30
CP 31
Não
Casearia folhas 20
Não
CP 32
Não
Casearia folhas 21
Não
CP 33
Não
Casearia folhas 22
Sim
1:10
CP 37
Não
Casearia folhas 23
Sim
1:5; 1:10; 1:30
CP 39
Não
Casearia folhas 25
Sim
1:5; 1:10; 1:30
CP 40
Não
Casearia folhas 27
Não
CP 41
Não
Casearia folhas 28 e 29
Sim
1:5; 1:10; 1:30
CP 42
Não
Miconia fallax
Sim
1:5 1:10; 1:30
CP 43
Não
Miconia albicans
Sim
1:1; 1:5
CP 46
Não
Miconia pipericarpa
Não
CP 47
Sim
1:5
Tibouchina stenocarpa
Sim
1:5
CP 48
Não
Raiz eclipta
Não
CP 50
Não
Stryphnodendron
barbatiman
Sim
1:5
CP 51
Não
Eclipta
Sim
1:30
CP 52
Não
Sedum dendroideum
Sim
1:5; 1:10; 1:30
CP 53
Não
Calos Sapindus Fração
acida A1
Não
CP 54
Não
Calos Sapindus
MeOH/H2O
Não
CP 55
Não
Calos Sapindus
CH2CL2/MeOH
Não
P1
Não
Rp-18 Sapindus
Não
P2
Sim
1:10
Fração A2 Sapindus
Não
P3
Sim
1:10
Fração B2 Sapindus
Não
P4
Não
Sapindus calus 1º F
Não
P5
Não
Sapindus saponaria
Calos 1º F
Não
P6
Não
Phyllacantus
Não
P7
Não
Eclipta alba (Eclidwl)
Não
P8
Não
Resultados e Discussão
103
Tabela 18. Plantas avaliadas contra Fosfolipase A2.
Plantas
Inibição
Concentração da Inibição
Canafistula
Sim
1:5; 1:10; 1:30
Cabriúva
Sim
1:5; 1:10; 1:30
Amendoim Bravo
Sim
1:5; 1:10; 1:30
Jatobá
Sim
1:5; 1:30
Pau-pereira
Sim
1:5; 1:30
Pau-ferro
Sim
1:5; 1:10; 1:30
Stryphnodendron barbatiman
Sim
1:5; 1:10; 1:30
SD2
Sim
1:1; 1:6; 1:10
SD3
Não
SD6
Sim
1:1; 1:3; 1:6; 1:10
SD1
Não
SD4
Não
Eclipta alba -
dimetilwedelolactona (Eclidwl)
Sim
1:1; 1:3; 1:6; 1:10
Eclipta alba - wedelolactona
(Ecliwl)
Sim
1:6
Cordia verbanacea (COR – E =
29)
Não
Cordia verbanacea - ácido
rosmarinico (CV – AM =28)
Não
Casearia Folhas 27
Não
Eclipta - dimetilwedelolactona
(DWL)
Não
Casearia Folhas 22
Não
CP 47
Não
S 1P
Não
P2
Não
P3
Não
Bauhinia forficata
Não
Miconia albicans
Sim
1:10; 1:30
Micania fallax
Sim
1:30
Mandi F RETOH
Sim
1:5; 1:10; 1:30
Tibouchina stenoscarpa
Sim
1:10; 1:30
Sapindus saponaria
Não
Eclipta Alba
Não
I1
Não
I2
Não
I3
Não
I4
Não
I5
Não
I6
Não
I7
Não
Anacardium humile (46 – 65)
Sim
1:6; 1:12; 1:24
Amburana cearensis
Não
Mikania glomerata
Não
Resultados e Discussão
104
Gráfico 5. Teste da atividade Fosfolipásica indireta. A: Avaliação para escolha da melhor dose de Veneno Total a ser utilizada durante os ensaios de avaliação da
atividade fosfolipásica. B: Avaliação do efeito do pH sobre a atividade do veneno da Apis, demonstrando que o pH não interfere, significativamente, sobre a ação da
Fosfolipase A2 C: Avaliação do efeito do EDTA sobre a atividade do veneno da Apis, demonstrando que o EDTA não interfere, significativamente, sobre a ação da
Fosfolipase A2.
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Apis mellifera (Dose-resposta)
Apis mellifera (50µg)
Apis mellifera (30µg)
Apis mellifera (20µg)
Apis mellifera (10µg)
Apis mellifera (5µg)
Apis mellifera (2µg)
Bothrops jararacussu (10µg)
Bothrops moojeni (10µg)
Atividade Fosfolipásica (cm)
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
pH 10
pH 8,0
pH 7,0
pH 5,5
pH 4,5
pH 3,5
pH 2,5
Apis mellifera (5µg)
Apis mellifera (5µg): PHs
Atividade Fosfolipásica (cm)
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Apis mellifera: EDTA
EDTA 50mM
EDTA 30mM
EDTA 20mM
EDTA 10mM
Apis mellifera (5µg)
Atividade Fosfolipásica (nm)
A
B
C
Resultados e Discussão
105
Gráfico 6. Teste da atividade Fosfolipásica indireta e avaliação do efeito das plantas sobre a atividade do veneno da Apis. A: Avaliação do efeito dos íons sobre a
atividade do veneno da Apis, demonstrando que os íons não interferem, significativamente, sobre a ação da Fosfolipase A2. B: Avaliação do efeito da temperatura sobre
a atividade do veneno da Apis, demonstrando que a temperatura não interfere, significativamente, sobre a ação da Fosfolipase A2. C: Avaliação do efeito das plantas
coletadas na USP sobre a atividade do veneno da Apis. A Canafistula, Pau-Pereira e Pau-Ferro foram identificados como potenciais inibidores do veneno da Apis.
2 4 6 8
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Pau Pereira (1:30)
Pau Pereira (1:10)
Pau Pereira (1:5)
Pau ferro (1:30)
Pau ferro (1:10)
Pau ferro (1:5)
Jatoba seco (1:30)
Jatoba seco (1:10)
Jatoba seco (1:5)
Amendoim bravo (1:30)
Amendoim bravo (1:10)
Amendoim bravo (1:5)
Cabriuva (1:5)
Cabriuva (1:10)
Cabriuva (1:30)
Canafistula (1:30)
Canafistula (1:10)
Canafistula (1:5)
Apis mellifera (5µg)
Atividade fosfolipásica (cm)
Espécies - Banco de Germoplasma USP-RP
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Apis mellifera: íons
Apis mellifera (5µg)
Ca
++
Zn
++
Na
++
Fe
++
Mg
++
Co
++
Atividade fosfolipásica (cm)
1 2 3 4
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
1 2 3 4
100ºC
80ºC
60ºC
50ºC
37ºC
25ºC
4ºC
- 20ºC
Apis mellifera (5µg)
Atividade Fosfolipásica (cm)
Apis mellifera
em diferentes temperaturas
A
B
C
Resultados e Discussão
106
Gráfico 7. Avaliação do efeito dos extratos de plantas sobre a atividade do veneno da Apis. A: Avaliação do efeito de Mandevilla sobre a atividade do veneno da
Apis. Quando se utilizou raízes extraídas em extrato de álcool houve inibição completa do veneno da Apis. B: Avaliação do efeito da Casearia sobre a atividade do
veneno da Apis. Com o aumento das concentrações foi possível observar alguma inibição; entretanto, o aumento da concentração pode ser tóxico. C: Avaliação do
efeito de diversos extratos de plantas sobre a atividade do veneno da Apis. Somente o precipitado (1:30), ETOH Guaraçonuga, extrato aquoso e acetato apresentaram
inibição.
1 2 3 4 5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Raíz (EtOH) (1:30)
Raíz (EtOH) (1:10)
Raíz (EtOH) (1:5)
Raíz de Itatinga (1:30)
Raíz de Itatinga (1:10)
Raíz de Itatinga (1:5)
Raiz (1:30)
Raíz (1:10)
Raíz (1:5)
Apis mellifera (5µg)
Atividade Fosfolipásica (cm)
Apis mellifera: Mandevilla
1 2 3 4 5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
1 2 3 4 5
Extrato aquoso (1:30)
ETOH Guaçatonga (1:30)
Precipitado (1:30)
Acetato (1:30)
MeOH (1:30)
Extrato aquoso (1:10)
ETOH Guaçatonga (1:10)
Precipitado (1:10)
Acetato (1:10)
MeOH (1:10)
Apis mellifera (5µg)
Atividade Fosfolipásica (cm)
Apis mellifera: Extratos
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
(1:60)
(1:30)
(1:10)
(1:5)
Apis mellifera (5µg)
Atividade Fosfolipásica (cm)
Apis mellifera:
Extrato aquoso (Casearia)
A
B
C
Resultados e Discussão
107
Gráfico 8. Avaliação do efeito de substâncias sintéticas sobre a atividade do veneno da Apis. A: Avaliação do efeito de extratos de CSF sobre a atividade do
veneno da Apis. O CSF 28 e 29, CSF 23 e CSF 25 apresentaram inibição do veneno de Apis. B: Avaliação do efeito de extratos de CSF sobre a atividade do veneno
da Apis. O CSF 28 e 29, CSF 23, CSF 25 e CSF 22 apresentaram inibição do veneno de Apis. C: Avaliação do efeito de extratos de CSF sobre a atividade do veneno
da Apis. O CSF 28 e 29, CSF 23 e CSF 25 apresentaram inibição do veneno de Apis.
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
CSF 25
CSF 23
CSF 22
CSF 28 e 29
CSF 20
Apis mellifera (5µg)
Atividade Fosfolipásica (cm)
Apis mellifera: CSF (1:30)
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
CSF 25
CSF 23
CSF 22
CSF 28 e 29
CSF 21
CSF 20
Apis mellifera (5µg)
Atividade fosfolipásica (cm)
Apis mellifera: CSF (1:10)
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
CSF 25
CSF 23
CSF 22
CSF 28 e 29
CSF 21
CSF 20
Api(5µg)
Atividade Fosfolipásica (cm)
Apis mellifera:CSFs (1:5)
A
B
C
Resultados e Discussão
108
Gráfico 9. Avaliação do efeito dos extratos de plantas e substâncias sintéticas sobre a atividade do veneno da Apis. A: Avaliação do efeito de extratos de
plantas sobre a atividade do veneno da Apis. O Barbatimão, Miconia albicans, Miconia fallax, Eclipta e Tibouchina stenocarpa apresentaram inibição do veneno de Apis.
B: Avaliação do efeito de extratos de Sedum dendroideum sobre a atividade do veneno da Apis. Apresentou inibição do veneno de Apis. C: Avaliação do efeito de
extratos de AH sobre a atividade do veneno da Apis. Os extratos de AH apresentaram inibição do veneno de Apis.
2 4 6 8 10
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
2 4 6 8 10
Eclipta (1:30)
Eclipta (1:10)
Eclipta (1:5)
Tibouchina stenoscarpa (1:30)
Tibouchina stenoscarpa (1:10)
Tibouchina stenoscarpa (1:5)
Tibouchina stenoscarpa (1:1)
Miconia pipericarpa (1:5)
Miconia pipericarpa (1:1)
Miconia pipericarpa (1:01)
Miconia albican (1:5)
Miconia albican (1:1)
Miconia albican (1:01)
Stryphnodendron barbatiman (1:5)
Stryphnodendron barbatiman (1:1)
Stryphnodendron barbatiman (1:01)
Miconia Fallax (1:30)
Miconia Fallax (1:10)
Miconia Fallax (1:5)
Apis mellifera (5µg)
Atividade fosfolipásica (cm)
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2
Sedum Dendroideum (1:30)
Sedum Dendroideum (1:10)
Sedum Dendroideum (1:5)
Apis mellifera (5µg)
Atividade Fosfolipásica (cm)
Apis mellifera:Sedum Dendroideum
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
Apis mellifera (5µg)
AH (46-65 (1:24)
AH (46-65 (1:12)
AH (46-65 (1:6)
AH (46-65 (1:3)
AH (46-65 (1:1)
Atividade fosfolipásica (cm)
Apis mellifera: AH (46-65)
A
B
C
Resultados e Discussão
109
Gráfico 10. Avaliação do efeito de substâncias sintéticas sobre a atividade do veneno da Apis. A: Avaliação do efeito de
extratos de CP sobre a atividade do veneno da Apis. O CP 47 apresentou inibição do veneno de Apis. B: Avaliação do efeito de
extratos de P sobre a atividade do veneno da Apis. O P2 e P3 apresentaram inibição do veneno de Apis.
2 4 6 8 10 12 14 16
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
CP 39
CP 37
CP 02
CP 01
CP 20
CP 17
CP 10
CP 11
CP 21
CP 25
CP 27
CP 29
CP 31
CP 40
CP 32
CP 33
CP 41
CP 42
CP 43
CP 46
CP 48
CP 47
CP 50
CP 51
CP 52
CP 53
CP 54
CP 55
(5µg)
Atividade Fosfolipásica (cm)
Apis mellifera: CPs (1:5)
1 2 3 4 5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
1 2 3 4 5
P5
P1
P3
P4
P6
P7
P8
P3
P2
Apis mellifera (5µg)
Atividade Fosfolipásica (cm)
Apis mellifera:Ps (1:10)
A
B
Resultados e Discussão
110
Gráfico 11. Avaliação do efeito dos extratos de plantas e substâncias sintéticas sobre a atividade da Fosfolipase A2 da Apis. A: Avaliação para escolha da
melhor dose de Fosfolipase A2 a ser utilizada durante os ensaios de avaliação da atividade fosfolipásica. B: Avaliação do efeito de extratos do banco de germoplasma
sobre a atividade de PLA2 de Apis. A canafistula, cabriúva, amendoin bravo, jatobá, pau-ferro e pau-pereira apresentaram inibição de PLA2 de Apis. C: Avaliação do
efeito de extratos de Barbatimão sobre a atividade de PLA2 de Apis. Apresentaram inibição de PLA2 de Apis.
2 4 6 8
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Pau Pereira (1:30)
Pau Pereira (1:10)
Pau Pereira (1:5)
Pau ferro (1:30)
Pau ferro (1:10)
Pau ferro (1:5)
Jatoba seco (1:30)
Jatoba seco (1:10)
Jatoba seco (1:5)
Amendoim bravo (1:30)
Amendoim bravo (1:10)
Amendoim bravo (1:5)
Cabriuva (1:5)
Cabriuva (1:10)
Cabriuva (1:30)
Canafistula (1:30)
Canafistula (1:10)
Canafistula (1:5)
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
Atividade fosfolipásica (cm)
Espécies - Banco de Germoplasma USP-RP
1 2
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
PLA
2
Apis mellifera + Stryphnodendron barbatiman (1:30)
PLA
2
Apis mellifera + Stryphnodendron barbatiman (1:10)
PLA
2
Apis mellifera + Stryphnodendron barbatiman (1:5)
PLA
2
Apis mellifera (0,1µg)
Atividade Fosfolipásica (cm)
PLA
2
Apis mellifera:
Stryphnodendron barbatiman
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
(5µg)
(5µg)
(1µg)
(0,1µg)
Apis mellifera (5µg)
Atividade fosfolipásica (cm)
PLA
2
Apis mellifera
A
B
C
Resultados e Discussão
111
Gráfico 12. Avaliação do efeito dos extratos de plantas sobre a atividade da Fosfolipase A2 da Apis. A: Avaliação do efeito de extratos de SD2 sobre a
atividade de PLA2 de Apis. Apresentaram inibição de PLA2 de Apis. B: Avaliação do efeito de extratos de SD6 sobre a atividade de PLA2 de Apis. Apresentaram
inibição de PLA2 de Apis. C: Avaliação do efeito de extratos de Frações isoladas sobre a atividade de PLA2 de Apis. Onde Eclidwl e Ecliwl apresentaram inibição de
PLA2 de Apis.
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
PLA
2
+ SD2 (1:10)
PLA
2
+ SD2 (1:6)
PLA
2
+ SD2 (1:3)
PLA
2
(0,1µg)
PLA
2
+ SD2 (1:1)
Atividade fosfolipásica (cm)
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
PLA
2
(0,1µg)
PLA
2
+ SD6 (1:10)
PLA
2
+ SD6 (1:6)
PLA
2
+ SD6 (1:3)
PLA
2
+ SD6 (1:1)
Atividade fosfolipásica (cm)
1 2 3 4 5 6 7 8
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
1 2 3 4 5 6 7 8
CSF=27 (1:6)
CSF=27 (1:3)
CSF=27 (1:1)
CV-Am=28 (1:6)
CV-Am=28 (1:3)
CV-Am=28 (1:1)
COR-E =29 (1:6)
COR-E =29 (1:3)
COR-E =29 (1:1)
Ecliwl (1:6)
Ecliwl (1:3)
Ecliwl (1:1)
Eclidwl (1:6)
Eclidwl (1:3)
Eclidwl (1:1)
PLA
2
Apis mellifera (0,1µg)
Atividade fosfolipásica (cm)
PLA
2
Apis mellifera: Frações isoladas
A
B
C
Resultados e Discussão
112
Gráfico 13. Avaliação do efeito dos extratos de plantas sobre a atividade da Fosfolipase A2 da Apis. A: Avaliação do efeito de extratos de Miconia albicans sobre a
atividade de PLA2 de Apis. A Miconia albicans apresentou uma pequena inibição de PLA2 de Apis. B: Avaliação do efeito de extratos de Miconia fallax sobre a atividade de
PLA2 de Apis. A Miconia fallax apresentou uma pequena inibição de PLA2 de Apis. C: Avaliação do efeito de extratos de Mandi F RETOH sobre a atividade de PLA2 de
Apis. O Mandi F RETOH apresentou inibição de PLA2 de Apis.
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2
PLA
2
Apis mellifera + Miconia Albicans (1:30)
PLA
2
Apis mellifera + Miconia Albicans (1:10)
PLA
2
Apis mellifera + Miconia Albicans (1:5)
PLA
2
Apis mellifera (0,1µg)
Atividade Fosfolipásica (cm)
PLA
2
Apis mellifera: Miconia albicans
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
PLA
2
Apis mellifera + M. fallax (1:30)
PLA
2
Apis mellifera + M. fallax (1:10)
PLA
2
Apis mellifera + M. fallax (1:5)
PLA
2
Apis mellifera (0,1µg)
Atividade Fosfolipásica (cm)
PLA
2
Apis mellifera: Micania Fallax
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
PLA
2
Apis mellifera + MandiF RETOH (1:30)
PLA
2
Apis mellifera + MandiF RETOH (1:10)
PLA
2
Apis mellifera + MandiF RETOH (1:5)
PLA
2
Apis mellifera (0,1µg)
Atividade Fosfolipásica (cm)
PLA
2
Apis mellifera: Mandi F RETOH
A
B
C
Resultados e Discussão
113
Gráfico 14. Avaliação do efeito dos extratos de plantas sobre a atividade da Fosfolipase A2 da Apis. A: Avaliação do efeito de
extratos de Tibouchina stenoscarpa sobre a atividade de PLA2 de Apis. A Tibouchina stenoscarpa apresentou inibição de PLA2 de Apis.
B: Avaliação do efeito de extratos de Anacardium humile sobre a atividade de PLA2 de Apis. O AH (46 – 65) apresentaram inibição de
PLA2 de Apis.
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2
PLA
2
apis mellifera:
Tibouchina stenoscarpa
PLA
2
Apis mellifera (0,1µg)
PLA
2
Apis mellifera: Tibouchina stenoscarpa (1:30)
PLA
2
Apis mellifera: Tibouchina stenoscarpa (1:10)
PLA
2
Apis mellifera: Tibouchina stenoscarpa (1:5)
Atividade Fosfolipásica (cm)
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
PLA
2
Apis mellifera + AH (46 - 65) (1:24)
PLA
2
Apis mellifera + AH (46 - 65) (1:12)
PLA
2
Apis mellifera + AH (46 - 65) (1:6)
PLA
2
Apis mellifera + AH (46 - 65) (1:3)
PLA
2
Apis mellifera + AH (46 - 65) (1:1)
PLA
2
Apis mellifera (0,1µg)
Atividade Fosfolipásica (cm)
PLA
2
Apis mellifera:
Anacardium humile
A
B
Resultados e Discussão
114
4.5.7. Edema em camundongos
As plantas avaliadas nos experimentos seguem nas Tabelas 19 para o veneno total e
20 para a Fosfolipase A2. As plantas foram escolhidas a partir dos ensaios de atividade
fosfolipásica indireta. Os experimentos foram realizados em triplicata para cada planta e os
valores médios foram inseridos nos gráficos. Os gráficos com os resultados do veneno total
correspondem aos gráficos 15 a 20 e os gráficos da Fosfolipase A2 correspondem aos
gráficos 21 a 26.
Nos experimentos de teste de edema poucas plantas ou compostos não apresentaram
atividade inibitória para o veneno total. As que não inibiram foram: CSF 23, Miconia fallax,
Precipitado, Sedum dendroideum 2 e 6, P2, CV – AM 28 e COR E 29 para o veneno total. Já
a Eclipta - dimetilwedelolactona (DWL), apresentou inibição somente na concentração de
1:30 no tempo de 15 minutos. No tempo de 30 minutos não houve inibição. No tempo de 30
minutos as plantas: Tibouchina stenoscarpa, Miconia Albicans, CSF 28 e 29, AH (46 – 65),
Bauhinia forficata apresentaram inibição. No tempo de 15 minutos, não houve diferença
significativa para o controle. Provavelmente, as plantas demoram um tempo maior para
interagir e reagir com o veneno total e o camundongo para causar uma inibição. Já as
plantas: Mandevila, Barbatimão, Eclipta próstata, Balsamo, WL e Canafistula, apresentaram
inibição no tempo de 15 minutos e 30 minutos, demonstrando uma maior eficiência e ação
mais forte e um potencial de serem usadas como inibidores.
No caso da avaliação contra Fosfolipase A2 foi mais eficiente conforme esperado,
devido ao fato da proteína estar isolada. As plantas e extratos: CSF 23, Sedum
dendroideum 6, P2, CV – AM 28 e COR E não inibiram o veneno total. Já as plantas Miconia
fallax, Precipitado, Sedum dendroideum 2 que não tinham apresentado inibição ao veneno
total, quando avaliadas contra a proteína isolada apresentaram inibição, sendo essa inibição
somente no tempo de 30 minutos. Isto pode ser devido à necessidade de um maior tempo
para começo da inibição. O restante das plantas também causou inibição no tempo de 30
minutos, com exceção das plantas: Casearia sylvestris, Eclipta próstata, CSF 28 e 29,
Balsamo, WL e Canafistula, que apresentaram inibição no tempo de 15 e 30 minutos, dessa
forma demonstrando uma maior eficiência na inibição. As plantas selecionadas que
apresentaram inibição têm que ser mais bem estudadas e avaliadas para que as suas
atividades sejam melhores compreendidas e assim identificar o mecanismo de inibição.
Resultados e Discussão
115
Tabela 19. Plantas avaliadas no teste de edema veneno total.
Plantas
Diminuição
do edema
Concentração da
Inibição 15 min
Concentração da
Inibição 30 min
Mandevila
Sim
1:30
1:5; 1:10; 1:30
Barbatimão
Sim
1:10; 1:30
1:5; 1:10; 1:30
Casearia sylvestris
Sim
1:10; 1:30
1:10; 1:30
Miconia fallax
Não
Tibouchina stenoscarpa
Sim
1:5; 1:10; 1:30
Miconia albicans
Sim
1:30
Eclipta prostata
Sim
1:5; 1:10; 1:30
1:5; 1:10; 1:30
Casearia folhas 28 e 29
Sim
1:5; 1:10; 1:30
Casearia folhas 23
Não
Balsamo
Sim
1:5; 1:10; 1:30
1:5; 1:10; 1:30
AH (46 – 65)
Sim
1:5; 1:10; 1:30
Bauhinia forficata
Sim
1:10; 1:30
Precipitado
Não
SD2
Não
SD6
Não
P2
Não
Cordia verbanacea - ácido
rosmarinico (CV – AM 28)
Não
Cordia verbanacea (COR E
29)
Não
Eclipta -
dimetilwedelolactona (DWL)
Sim
1:30
Eclipta - wedelolactona
(WL)
Sim
1:10; 1:30
1:10; 1:30
Canafistula
Sim
1:5; 1:10; 1:30
1:5; 1:10; 1:30
Resultados e Discussão
116
Tabela 20. Fosfolipase A2 teste de edema.
Plantas
Diminuição
do edema
Concentração da
Inibição 15 min
Concentração da
Inibição 30 min
Mandevila
Sim
1:5; 1:10; 1:30
Barbatimão
Sim
1:5; 1:10; 1:30
Casearia sylvestris
Sim
1:10; 1:30
1:5; 1:10; 1:30
Miconia fallax
Sim
1:5; 1:10; 1:30
Eclipta prostata
Sim
1:10; 1:30
1:5; 1:10; 1:30
Casearia folhas 28 e 29
Sim
1:10; 1:30
1:5; 1:10; 1:30
Casearia folhas 23
Não
Balsamo
Sim
1:10; 1:30
1:5; 1:10; 1:30
AH (46 – 65)
Sim
1:5; 1:10; 1:30
Bauhinia forficata
Sim
1:5; 1:10; 1:30
Precipitado
Sim
1:5; 1:10; 1:30
SD2
Sim
1:5; 1:10; 1:30
SD6
Não
P2
Não
Cordia verbanacea - ácido
rosmarinico (CV – AM 28)
Não
Cordia verbanacea (COR E
29)
Não
Eclipta -
dimetilwedelolactona (DWL)
Sim
1:10; 1:30
Eclipta - wedelolactona
(WL)
Sim
1:10; 1:30
1:5; 1:10; 1:30
Tibouchina stenoscarpa
Sim
1:5; 1:10; 1:30
Miconia albicans
Sim
1:5; 1:10; 1:30
Canafistula
Sim
1:5; 1:10; 1:30
1:5; 1:10; 1:30
Resultados e Discussão
117
Gráfico 15. Teste de edema. A: Avaliação dos vários tempos do teste para escolha do tempo adequado para os experimentos com veneno de Apis mellifera. B:
Avaliação dos vários tempos do teste para escolha do tempo adequado para os experimentos com veneno total e PLA2, onde foram escolhidos os tempos 15 e 30
minutos. C: Avaliação dos vários tempos do teste para escolha do tempo adequando para os experimentos com PLA2.
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
0,0
0,5
180Min
60Min
30Min
Edema (mm)
Apis mellifera (5µg)
Apis mellifera (10µg)
Apis mellifera (30µg)
Apis mellifera (100µg)
CB Cdt (10µg)
CB Cdt (30µg)
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
0,0
0,5
1,0
180Min
60Min
Edema (mm)
30Min
PLA
2
Apis mellifera (0,1µg)
PLA
2
Apis mellifera (1µg)
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
PLA
2
Apis mellifera (10µg)
CB Cdt (10µg)
CB Cdt (5µg)
A
B
C
Resultados e Discussão
118
Gráfico 16. Teste de edema e avaliação do efeito das plantas e substâncias sintéticas sobre o edema. A: Avaliação para verificar se o PBS interferiria no teste
para escolha do tempo adequado para os experimentos com veneno total e PLA2. B: Avaliação da atividade de Mandevila sobre o veneno total de Apis para verificar
atividade. Onde em concentrações maiores apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade do veneno total de Apis. C: Avaliação da atividade de
Barbatimão sobre o veneno total de Apis para verificar atividade. Nas concentrações maiores apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade do veneno total
de Apis.
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (minutos)
1:30
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
Apis mellifera (5µg):
Mandevila (Raiz ETOH)
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (minutos)
1:10
1:30
1:30
1:10
1:5
1:5
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
Apis mellifera (5µg):
Barbatimão
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0,0
0,5
1,0
1,5
Tempo (minutos)
1 5 15 30 45 60
Apis mellifera (5µg)
PLA
2
Apis mellifera (0,1µg)
PBS
Edema (mm)
A
B
C
Resultados e Discussão
119
Gráfico 17. Avaliação do efeito dos extratos de plantas sobre o edema. A: Avaliação da atividade de Casearia sylvestris sobre o veneno total de Apis para verificar
atividade. Em concentrações maiores apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade do veneno total de Apis. B: Avaliação da atividade de Tibouchina
stenocarpa sobre o veneno total de Apis para verificar atividade. Em concentrações maiores apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade do veneno total
de Apis. C: Avaliação da atividade de Miconia albicans sobre o veneno total de Apis para verificar atividade. No tempo inicial causou um maior edema, entretanto no
tempo de 30 minutos a maior concentração diminui o edema.
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
1,5
15 30 (minutos)
Apis mellifera (5µg):
Casearia Sylvestris
1:30
1:10
1:30
1:10
1:5
1:5
Apis mellifera (5µg)
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
15 30 (minutos)
Apis mellifera
Apis mellifera
1:10
1:30
1:30
1:10
1:5
1:5
Edema (mm)
Apis mellifera (5µg):
Tibouchina stenocarpa
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (minutos)
1:30
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
Apis mellifera (5µg):
Miconia albicans
A
B
C
Resultados e Discussão
120
Gráfico 18. Avaliação do efeito dos extratos de plantas e substâncias sintéticas sobre o edema. A: Avaliação da atividade de Eclipta prostata sobre o veneno
total de Apis para verificar atividade. Apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade do veneno total de Apis. B: Avaliação da atividade de CSF 28 e 29
sobre o veneno total de Apis para verificar atividade. No tempo de 30 minutos apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade do veneno total de Apis. C:
Avaliação da atividade de Balsamo sobre o veneno total de Apis para verificar atividade. Apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade do veneno total
de Apis.
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (minutos)
1:30
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
Apis mellifera (5µg):
Eclipta prostata
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (minutos)
1:10
1:30
1:30
1:10
1:5
1:5
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
Apis mellifera (5µg):
CSF 28 e 29
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (minutos)
1:30
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
Apis mellifera (5µg):
Balsamo
A
B
C
Resultados e Discussão
121
Gráfico 19. Avaliação do efeito dos extratos de plantas sobre o edema. A: Avaliação da atividade de AH (46-65) sobre o veneno total de Apis para verificar atividade.
No tempo de 30 minutos apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade do veneno total de Apis. B: Avaliação da atividade de Bauhinia forficata sobre o
veneno total de Apis para verificar atividade. No tempo de 30 minutos apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade do veneno total de Apis. C: Avaliação
da atividade de Dwl sobre o veneno total de Apis para verificar atividade. Na concentração 1:30 apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade do veneno
total de Apis.
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (minutos)
1:30
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
Apis mellifera (5µg):
AH (46-65)
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (minutos)
1:30
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
Apis mellifera (5µg):
Bauhinia forficata
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (minutos)
1:30
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
Apis mellifera (5µg):
DWL
A
B
C
Resultados e Discussão
122
Gráfico 20. Avaliação do efeito dos extratos de plantas sobre o edema. A: Avaliação da atividade de WL sobre o veneno total
de Apis para verificar atividade. Apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade do veneno total de Apis. B: Avaliação
da atividade de Canafistula sobre o veneno total de Apis para verificar atividade. No tempo de 30 minutos apresentou uma
diminuição do edema, inibindo a atividade do veneno total de Apis.
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (minutos)
1:30
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
Apis mellifera (5µg):
WL
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (minutos)
1:30
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
Apis mellifera (5µg):
Canafistula
A
B
Resultados e Discussão
123
Gráfico 21. Avaliação do efeito dos extratos de plantas sobre o edema contra PLA2. A: Avaliação da atividade de Mandevila sobre o PLA2 de Apis para verificar
atividade. Apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis. B: Avaliação da atividade de Barbatimão sobre o PLA2 de Apis para verificar
atividade. Apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis. C: Avaliação da atividade de Casearia sobre o PLA2 de Apis para verificar atividade.
Apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis.
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
1,5
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (Minutos)
1:30
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
PLA
2
Apis mellifera (5µg):
Mandevila (Raiz ETOH)
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
1,5
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (Minutos)
1:30
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
PLA
2
Apis mellifera (5µg):
Barbatimão
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
1,5
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (Minutos)
1:30
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
PLA
2
Apis mellifera (5µg):
Casearia
A
B
C
Resultados e Discussão
124
Gráfico 22. Avaliação do efeito dos extratos de plantas sobre o edema contra PLA2. A: Avaliação da atividade de Miconia fallax sobre o PLA2 de Apis para verificar
atividade. No tempo 30 apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis. B: Avaliação da atividade de Eclipta prostata sobre o PLA2 de Apis
para verificar atividade. Apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis. C: Avaliação da atividade de CSF 28 e 29 sobre o PLA2 de Apis
para verificar atividade. Apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis.
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
1,5
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (Minutos)
1:30
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
PLA
2
Apis mellifera (5µg):
Miconia fallax
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
1,5
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (Minutos)
1:30
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
PLA
2
Apis mellifera (5µg):
Eclipta prostata
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
1,5
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (Minutos)
1:30
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
PLA
2
Apis mellifera (5µg):
CSF 28 e 29
A
B
C
Resultados e Discussão
125
Gráfico 23. Avaliação do efeito dos extratos de plantas sobre o edema contra PLA2. A: Avaliação da atividade de Balsamo sobre o PLA2 de Apis para verificar atividade.
Apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis. B: Avaliação da atividade de Ah (46-65) sobre o PLA2 de Apis para verificar atividade. No tempo
30 minutos apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis. C: Avaliação da atividade de Mandevila sobre o PLA2 de Apis para verificar atividade.
No tempo 30 apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis.
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
1,5
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (Minutos)
1:30
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
PLA
2
Apis mellifera (5µg):
Balsamo
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
1,5
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (Minutos)
1:30
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
PLA
2
Apis mellifera (5µg):
AH (46-65)
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
1,5
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (Minutos)
1:30
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
PLA
2
Apis mellifera (5µg):
Bauhinia forficata
A
B
C
Resultados e Discussão
126
Gráfico 24. Avaliação do efeito dos extratos de plantas e substâncias sintéticas sobre o edema contra PLA2. A: Avaliação da atividade de Precipitado sobre o PLA2
de Apis para verificar atividade. No tempo 30 minutos apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis. B: Avaliação da atividade de SD2 sobre
o PLA2 de Apis para verificar atividade. No tempo 30 apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis. C: Avaliação da atividade de DWL sobre
o PLA2 de Apis para verificar atividade. No tempo 30, nas concentrações 1:10 e 1:30, apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis.
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
1,5
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (Minutos)
1:30
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
PLA
2
Apis mellifera (5µg):
Precipitado
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
1,5
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (Minutos)
1:30
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
PLA
2
Apis mellifera (5µg):
SD2
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
1,5
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (Minutos)
1:30
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
PLA
2
Apis mellifera (5µg):
DWL
A
B
C
Resultados e Discussão
127
Gráfico 25. Avaliação do efeito das plantas sobre o edema contra PLA2. A: Avaliação da atividade de Wl sobre o PLA2 de Apis para verificar atividade. No tempo 30,
apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis. B: Avaliação da atividade de Tibouchina stenocarpa sobre o PLA2 de Apis para verificar
atividade. Apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis. C: Avaliação da atividade de Miconia albicans sobre o PLA2 de Apis para verificar
atividade. No tempo 30 apresentou uma diminuição do edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis.
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
1,5
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (Minutos)
1:30
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
PLA
2
Apis mellifera (5µg):
WL
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
1,5
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (Minutos)
1:30
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
PLA
2
Apis mellifera (5µg):
Tibouchina stenocarpa
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
1,5
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (Minutos)
1:30
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
PLA
2
Apis mellifera (5µg):
Miconia albicans
A
B
C
Resultados e Discussão
128
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,0
0,5
1,0
1,5
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
15 30 (Minutos)
1:30
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
1:10
1:5
1:30
1:10
1:5
PLA
2
Apis mellifera (5µg)
Edema (mm)
PLA
2
Apis mellifera (5µg):
Canafistula
Gráfico 26. Avaliação da atividade de Canafistula sobre o PLA2
de Apis para verificar atividade. Apresentou uma diminuição do
edema, inibindo a atividade de PLA2 de Apis.
5
5
.
.
C
C
O
O
N
N
C
C
L
L
U
U
S
S
Õ
Õ
E
E
S
S
Conclusões
130
5. CONCLUSÕES
O banco de dados Bee Venom foi desenvolvido e está disponível para acesso
através do endereço http://gbi.fmrp.usp.br/beevenom/. Novos dados devem ser
inseridos, mantendo o sistema, constantemente atualizado. Os dados disponíveis no
banco de dados são de domínio publico permitindo o acesso ao sistema.
A Melitina apesar de ser uma proteína de apenas 26 aminoacidos e ter uma estrutura
linear, nas análises estruturais foi possível identificar regiões que serão os possíveis
sítios de interação com outras proteínas para promover a inibição da Melitina. Nas
análises do software Almond foi possível identificar que um possível inibidor deve
apresentar regiões com propriedades hidrofóbicas, pois interagiria corretamente com
o sítio ativo da proteína.
A proteína Fosfolipase A2 foi analisada com o programa GOLD e foi possível
identificar dez possíveis inibidores na base de dados Ilibdiverse. Os inibidores
interagiram com a região do sítio ativo da proteína, apresentando potencial para inibir
a Fosfolipase A2. Os dez inibidores apresentaram potencial de serem biodisponíveis,
entretanto, devem ser mais analisados in silico para confirmação da atividade
inibitória.
As plantas do Germoplasma da FMRP/USP foram obtidas e extraídas para obteção
dos extratos. Nas análises, a planta que apresentou melhores inibições na atividade
fosfolipásica indireta e de edema foi a Canafistula, que em todos os ensaios inibiu o
veneno total e a proteína Fosfolipase A2. Já as plantas pau-pereira e pau-ferro, que
também apresentaram inibição ao veneno total e Fosfolipase A2 somente nos
ensaios de atividade fosfolipásica indireta. As plantas do Germoplasma
demonstraram um grande potencial para serem utilizadas com possíveis plantas
antiveneno.
Os inibidores sintéticos avaliados não causaram inibição do veneno total e da
proteína Fosfolipase A2, nos ensaios avaliados.
As plantas Eclipta prostata, Casearia folhas 28 e 29, Balsamo e Stryphnodendro
barbatiman depositadas no laboratório de Toxinas Animais e Inibidores Naturais e
Sintéticos causaram inibição do veneno total e da proteína Fosfolipase A2 nos
Conclusões
131
ensaios realizados, sendo necessárias outras análises para um melhor entendimento
de qual componente dos extratos é responsável pela inibição. Já as plantas Casearia
sylvestris, Eclipta - wedelolactona (WL) foram mais eficientes para inibir o teste de
edema, mas não inibiram a atividade fosfolipásica indireta.
6
6
.
.
R
R
E
E
F
F
E
E
R
R
Ê
Ê
N
N
C
C
I
I
A
A
S
S
B
B
I
I
B
B
L
L
I
I
O
O
G
G
R
R
Á
Á
F
F
I
I
C
C
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A
S
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A
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S
S
Anexos
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7. ANEXOS
ANEXO A – Parecer do comitê de ética em pesquisa de experimentação animal.
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