( PDF ) Estudo dos mecanismos envolvidos no efeito do bisfosfonato alendronato dissódico na doença periodontal experimental

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO

FARMACOLOGIA

ESTUDO DE MECANISMOS ENVOLVIDOS NO EFEITO DO BISFOSFONATO

ALENDRONATO DISSÓDICO NA DOENÇA PERIODONTAL EXPERIMENTAL

Adriana Magalhães Andrade de Menezes

Fortaleza – Ceará

2003

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO

FARMACOLOGIA

ESTUDO DE MECANISMOS ENVOLVIDOS NO EFEITO DO

BISFOSFONATO ALENDRONATO DISSÓDICO NA DOENÇA

PERIODONTAL EXPERIMENTAL

Adriana Magalhães Andrade de Menezes

ORIENTADORA: Prof. Gerly Anne de Castro Brito

Fortaleza- Ceará

Outubro/2003

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Aos meus pais, Braga e Marta, por

tudo.

Ao meu marido, João Marcelo, pelo

amor, paciência e companheirismo.

“A Sabedoria é radiante, não fenece,

facilmente é contemplada por aqueles que a

amam e se deixa encontrar por aqueles que

a buscam.Ela mesmo se dá a conhecer aos

que a desejam. Quem por ela madruga não

se cansa: encontra-a sentada à porta.

Meditá-la é a perfeição da inteligência;

quem vigia por ela logo se isenta de

preocupações; ela mesmo busca, em toda

parte, os qua a merecem; benigna, aborda-

os pelos caminhos e a cada pensamento os

precede” (Sab 6, 12-16)

AGRADECIMENTOS

À Professora Gerly Anne, por ter me orientado e incentivado com

toda a presteza, dedicação e amizade na realização deste trabalho.

Ao Professor Ronaldo, por ter me acolhido em seu laboratório e pelo

seu exemplo de competência e amor à pesquisa.

À Professora Cibele, do Setor de Microbiologia, pela sua decisiva

colaboração e suas idéias no decorrer desta pesquisa.

Ao Professor Fernando Cunha e à Giuliana Bertozi, da Faculdade de

Ribeirão Preto – USP, pela gentileza na realização da dosagem de citocinas.

Ao Laboratório Merck Sharp & Domme, pela gentileza no

fornecimento do medicamento usado neste trabalho.

À Hellíada Vasconcelos, pela valiosa ajuda neste trabalho.

Aos colegas de laboratório (LAFICA), pela agradável convivência e

amizade.

À Vandinha, pela sua simpatia e atenção.

Ao José Ivan, pela sua boa vontade na confecção das lâminas

histológicas.

À Dra. Artemísia pela atenção concedida às minhas solicitações no

biotério.

Aos funcionários do Departamento de Farmacologia e Fisiologia,

sempre dispostos a ajudar.

Ao CNPq, pelo apoio financeiro.

ABREVIATURAS UTILIZADAS NESTE TRABALHO

AD Alendronato dissódico

AINEs Antiinflamatórios não-esteroidais

ANOVA Análise de variância

ATP Adenosina trifosfato

BHI Brain Heart Infusion

COX Cicloxigenase

COX-2 Cicloxigenase-2

CMT Tetraciclina quimicamente modificada

DNA Ácido desoxirribonucléico

DX Doxiciclina

DX5 Doxiciclina dose 5mg/kg

DX10 Doxiciclina dose 10 mg/kg

DPE Doença periodontal experimental

EPM Erro padrão da média

G Gauge

GM-CSF Fator estimulador de colônias granulócito-macrófago

GNPA Anaeróbios Gram-negativos pigmentados

HE Hematoxilina-eosina

HETE Ácido hidroxieicosatetraenóico

HOCl Ácido perclórico

HTAB Tampão de brometo de hexadecil-metil-amônio

ICAM Molécula de adesão intercelular

IL-1 Interleucina-1

IL-1α Interleucina-1α

IL-1β Interleucina-1β

IL-6 Interleucina-6

IL-8 Interleucina-8

i.p. intraperitoneal

IPO Índice de perda óssea

kg quilograma

M Molar

mm Milímetro

mg Miligrama

MMP Metaloproteinases de matriz

MMP-1 Metaloproteinases de matriz-1, tipo fibroblasto, colagenase-1

MMP-2 Metaloproteinases de matriz-2 ou gelatinase A

MMP-3 Metaloproteinases de matriz -3 ou “stromelysin”-1

MMP-7 Metaloproteinases de matriz-7 ou “matrilysin”

MMP-8 Metaloproteinases de matriz-8, tipo neutrofílico, colagenase-2

MMP-9 Metaloproteinases de matriz-9 ou gelatinase B

MMP-10 Metaloproteinases de matriz-10 ou “stromelysin”-2

MMP-11 Metaloproteinases de matriz-11 ou “stromelysin”-3

MMP-12 Metaloproteinases de matriz-12 ou metaloelastase

MMP-13 Metaloproteinases de matriz-13 ou colagenase-3

MMP-14 Metaloproteinases de matriz-14

MMP-15 Metaloproteinases de matriz-15

MMP-16 Metaloproteinases de matriz-16

MMP-17 Metaloproteinases de matriz-17

MMP-18 Metaloproteinases de matriz-13 ou colagenase-4

MMP-19 Metaloproteinases de matriz-19

MMP-20 Metaloproteinases de matriz-19 ou “enamelysin”

MT-MMP Metaloproteinases de matriz tipo membrana

MPO Mieloperoxidase

NF-κB Fator nuclear-κB

PAF Fator ativador de plaquetas

PBS Solução salina tamponada

PEA Feniletil álcool

pg picograma

PG Prostaglandina

PGE

Prostaglandina E

PGI

Prostaglandina I

PMN Leucócitos polimorfonucleares

Nm nanômetro

NO Óxido nítrico

OPD o-fenilenediamina diidrocloreto

RNAm Ácido ribonucléico mensageiro

r.p.m. Rotações por minuto

SAP Complexo Strepto-avidina peroxidase

sp Espécies

s.c. Subcutânea

TIMP Inibidores teciduais das metaloproteinases

TIMP-1 Inibidores teciduais das metaloproteinases-1

TNF Tumor de necrose tumoral

uPA Ativador de plasminogênio tipo uroquinase

°C Graus Célsius

µl microlitro

µg micrograma

RESUMO

ESTUDO DOS MECANISMOS ENVOLVIDOS NO EFEITO DO BISFOSFONATO

ALENDRONATO DISSÓDICO NA DOENÇA PERIODONTAL EXPERIMENTAL –

ADRIANA MAGALHÃES ANDRADE DE MENEZES.

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-graduação em farmacologia do

Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da

Universidade Federal do Ceará, como pré-requisito para obtenção do título de

mestre em Farmacologia. Data da defesa: 10 de outubro de 2003. Orientador:

Gerly Anne de Castro Brito.

A periodontite, a principal causa de perda de dentes em adultos, é uma doença

inflamatória onde ocorre perda do osso alveolar e destruição das fibras do

ligamento periodontal. Tanto as bactérias periodontopatogênicas como os fatores

provenientes do hospedeiro são necessários para o desenvolvimento e

progressão desta patologia. Os bisfosfonatos constituem uma nova classe de

drogas, os quais inibem a reabsorção do osso causando alterações morfológicas

ou apoptose nos osteoclastos. O objetivo do presente estudo foi investigar os

mecanismos envolvidos no efeito de um bisfosfonato Alendronato Dissódico (AD)

na doença periodontal experimental (DPE), comparando seus efeitos com a

doxiciclina, tratamento já estabelecido. A DPE foi induzida passando-se fio de

náilon 3.0 em torno do segundo molar superior esquerdo de ratos Wistar fêmeas,

permanecendo durante 11d. AD (0,25mg/kg, s.c.) foi administrado 30 minutos

antes e diariamente (tratamento preventivo) ou AD (0,25mg/kg, s.c.), DX (5 ou 10

mg/kg) ou salina (0,2ml) foram injetados a partir do 5° dia da indução da DPE

(tratamento curativo). Os parâmetros avaliados foram: índice de perda óssea

(IPO), análise histopatológica e microbiológica, imunohistoquímica, migração de

neutrófilos, mieloperoxidase (MPO), leucogramas realizados antes e após a

cirurgia (6h e 1, 7 e 11 dias) e variação da massa corpórea. No IPO, AD reduziu

consideravelmente a reabsorção óssea tanto de forma preventiva como curativa

sendo comparável à doxiciclina. Na análise histopatológica, o periodonto dos

animais tratados com AD mostrou preservação do osso alveolar, cemento e das

fibras colágenas, além de redução do infiltrado neutrofílico gengival de 6h. Esta

inibição da migração neutrofílica foi confirmada através da MPO e em modelo de

peritonite abdominal e o leucograma mostrou uma redução da neutrofilia. A

imunohistoquímica mostrou que o AD diminuiu a marcação para TNF em 6h e 11d.

No microbiológico, AD inibiu qualitativamente o crescimento de bactérias

características da DP, tais como pigmentados e Fusobacterium nucleatum. AD

promoveu um aumento na massa corpórea em relação ao grupo salina. Esses

resultados mostram que o AD possui importante atividade na DPE, sugerindo a

relevância de testes clínicos dos bisfosfonatos no tratamento da doença

periodontal.

ABSTRACT

STUDY OF THE MECHANISMS INVOLVED IN EFFECT OF BISPHOSPHONATE

DISSODIC ALENDRONATE IN EXPERIMENTAL PERIODONTAL DISEASE -

ADRIANA MAGALHÃES ANDRADE DE MENEZES.

Dissertation submitted as a partial fulfillment of the requirement to degree of

master’s in Pharmacology to Graduation Pharmacology Course of the Physiology

and pharmacology Department of the Medicine Faculty of the Ceará Federal

University. Defense date: 2003, October 10. Professor: Gerly Anne de Castro Brito.

Periodontitis, the major cause of teeth loss in adults, is an inflammatory disease in

which occurs alveolar bone resorption and collagen fibers destruction. Bacteria and

host factors are necessary to the development of this pathology. Bisphosphonates

are a new class of drugs that inhibit bone resorbtion by causing morphological

alterations or death of osteoclasts. The objetive of this study is to investigate the

effect of the bisphosphonate Dissodic Alendronate (DA) in periodontitis, comparing

it with the doxicicline (DX), treatment currently used. Periodontitis was induced by

a nylon thread ligature surgically placed around the cervix of the second left

maxillary molars of female Wistar rats. Animals were treated with DA (0.25 mg/kg,

s.c.) 30 minutes before periodontits induction and daily until sacrifice on 11

day

(preventive group). Additionally, saline, DA or DX (5 or 10 mg/kg) were injected s.c.

from 5

day and daily up to the 11

day of periodontal disease (curative

treatment). The parameters analysed were alveolar bone loss (ABL),

histopathologic and microbiological analysis, immunohistochemistry,

myeloperoxidase (MPO), neutrophil migration, leukogram measured before and

after challenge (6h and 1, 7 and 11 days) and body mass variation. AD, as curative

or preventive treatment, reduced this alveolar bone loss similar DX.

Histopatologically, the periodontium of animals treated with DA showed

preservation of alveolar bone, cementum and collagen fibers of periodontal

ligament, and reduced neutrophilic and mononuclear cell infiltrate. This effect on

neutrophilic infiltrate was confirmed by MPO and in model of peritonitis induced by

carrageenan. In imunohistochemistry, there was marked reduction of

immunostaining for TNF in the group treated with DA compared to the saline

group. In microbiologic analysis, DA inhibited the growth of bacteria involved in

periodontitis. DA increased body mass compared to saline group. These results

support clinical testing of bisphosphonates in the treatment of periodontal disease.

ÍNDICE

LISTA DE ABREVIATURAS………………………………………….......................…i

RESUMO..................................................................................................................v

ABSTRACT.............................................................................................................vi

I. INTRODUÇÃO.......................................................................................................1

1. Periodonto...........................................................................................................2

1.1. Desenho esquemático do dente com seu periodonto.................................4

2. Doença periodontal.............................................................................................5

2.1. Doença periodontal e colágeno.................................................................12

2.2. Doença periodontal e mieloperoxidase.....................................................15

3. Bisfosfonatos.....................................................................................................17

3.1. Histórico....................................................................................................17

3.2. Estrutura química......................................................................................18

3.3. Mecanismo de ação..................................................................................20

3.4. Bisfosfonato e inflamação.........................................................................22

3.5. Bisfosfonato e colágeno............................................................................24

3.6. Bisfosfonato e microrganismos.................................................................26

4. Tetraciclinas......................................................................................................27

5. Objetivos e justificativas....................................................................................31

II. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................32

1. Animais...............................................................................................................33

2. Aparelhos e instrumentos laboratoriais..............................................................33

3. Meios de cultura.................................................................................................35

4. Drogas, Soluções, Líquidos e Corantes Utilizados............................................35

5. Tampões utilizados para o ensaio imunoenzimático.........................................37

6. Protocolo experimental......................................................................................38

6.1. Modelo de doença periodontal experimental............................................38

6.2. Grupos experimentais...............................................................................41

6.2.1. Grupo normal..................................................................................41

6.2.2. Grupo com doença periodontal experimental.................................41

6.2.3. Grupo tratado com alendronato dissódico (preventivo)..................41

6.2.4. Grupo tratado com alendronato dissódico (curativo)......................42

6.2.5. Grupo tratado com doxiciclina........................................................42

6.2.6. Grupo tratado com alendronato dissódico + doxiciclina.................42

6.3. Parâmetro avaliados.................................................................................43

6.3.1. Análise da estrutura óssea alveolar...............................................43

A. Estudo morfométrico do tecido ósseo na DPE.......................43

B. Análise histopatológica do osso alveolar................................46

6.3.2. Análise Histopatológica da Gengiva...............................................48

6.3.3. Imunohistoquímica para TNF.........................................................48

6.3.4. Dosagem de IL-1............................................................................49

6.3.5. Dosagem de mieloperoxidase........................................................50

6.3.6. Análise microbiológica....................................................................51

6.3.7. Estudo hematológico......................................................................52

6.3.8. Análise da variação da massa corpórea.........................................53

6.3.9. Migração de leucócitos em modelo de peritonite...........................53

7. Análise estatística..............................................................................................54

III. RESULTADOS..................................................................................................57

1. Efeito do Alendronato Dissódico (AD) e da Doxiciclina (DX) sobre o tecido

ósseo alveolar na DPE induzida por corpo estranho em ratas..............................58

2. Efeito do Alendronato Dissódico (AD) e da Doxiciclina (DX) sobre as

alterações histopatológicas observadas na DPE em ratas...................................63

2.1. Tabela dos escores histopatológicos...................................................66

3. Efeito do Alendronato Dissódico (AD) e da Doxiciclina (DX) sobre as

alterações das fibras colágenas observadas na DPE em ratas.............................69

4. Efeito do Alendronato Dissódico (AD) sobre as alterações da gengiva

de ratas submetidas a DPE....................................................................................72

5. Efeito do Alendronato Dissódico (AD) sobre a marcação de TNF pelo

método de imunohistoquímica................................................................................75

6. Efeito do Alendronato Dissódico (AD) sobre a produção de

interleucina-1 (IL-1).................................................................................................79

7. Efeito do Alendronato Dissódico sobre o leucograma das ratas

submetidas a DPE..................................................................................................80

8. Efeito da Doença Periodontal Experimental (DPE) sobre a

dosagem de mieloperoxidase (MPO) em gengiva de ratas....................................80

9. Efeito do Alendronato Dissódico (AD) sobre a dosagem de

mieloperoxidase em ratas após 6 horas da indução da DPE.................................80

10. Efeito do Alendronato Dissódico (AD) sobre a migração de

leucócitos em modelo de peritonite...................................................................85

11. Efeito do Alendronato Dissódico (AD) sobre as alterações

microbiológicas em ratas submetidas a DPE....................................................88

12. Efeito do Alendronato Dissódico (AD) sobre a variação de massa

corpórea de ratas submetidas a DPE induzidas por corpo estranho...............94

IV. DISCUSSÃO................................................................................................96

V. CONCLUSÕES...........................................................................................112

VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................113

I. Introdução

I. INTRODUÇÃO

1. PERIODONTO

O periodonto (peri = em torno de, odonto = dente) compreende uma

estrutura dinâmica, composta por gengiva (G), ligamento periodontal (LP),

cemento radicular (C) e osso alveolar (AO) (Ilustração 1). É de fundamental

importância para a inserção do dente no tecido ósseo da maxila e da mandíbula e

manutenção da integridade da superfície da mucosa da cavidade oral. A estrutura

e função dos tecidos que compõem o periodonto são mutuamente dependentes,

mantendo entre si, uma harmoniosa relação sob condições normais (LINDHE;

KARRING, 1999; HOLMSTRUP, 2001).

A gengiva é o elemento do periodonto que se sobrepõe ao osso alveolar e

envolve toda a porção cervical do dente. Constitui o único dos tecidos periodontais

que é diretamente visível à inspeção sob condições normais. Divide-se em

gengiva marginal livre e gengiva inserida. A gengiva livre possui cor rósea,

consistência firme e forma um pequeno sulco entre o tecido gengival e o dente

(sulco gengival). Em continuidade a esta, há a gengiva inserida, a qual possui uma

textura firme, aspecto de casca de laranja e estende-se em direção apical até a

junção mucogengival, onde a gengiva funde-se com a mucosa oral. O tecido

conjuntivo gengival é composto principalmente por densas redes de fibras

colágenas que funcionam de forma interdependente, fornecendo firmeza à

gengiva e, também, promovendo a inserção desta ao cemento e ao osso alveolar

subjacente (HOLMSTRUP, 2001).

O ligamento periodontal é constituído de tecido conjuntivo rico em fibras

colágenas, o qual é bastante vascularizado, contendo células, substância

fundamental amorfa, nervos e ilhas epiteliais. As fibras colágenas do ligamento

periodontal ligam o cemento radicular ao osso alveolar e situam-se no estreito

espaço entre estes dois, promovendo, assim, a ancoragem do dente. O colágeno

tipo I representa aproximadamente 80% do componente das fibras do ligamento

periodontal. Além destas, existem também fibras elásticas, as quais estão

incorporadas nas paredes dos vasos sanguíneos arteriais (LINDHE; KARRING,

1999; HOLMSTRUP, 2001).

O cemento radicular consiste em um tecido calcificado especializado que

recobre a raiz dos dentes, cuja função é prender as fibras do ligamento periodontal

à superfície radicular. Cerca de 50% do cemento é constituído por material

orgânico, tais como proteoglicanas, glicoproteínas e colágenos, sendo que este

último compreendendo a grande maioria. O cemento não contém vasos

(sanguíneos e linfáticos) nem nervos, não sofre remodelação e reabsorção

fisiológicas, contudo, sofre deposição contínua ao longo da vida (LINDHE;

KARRING, 1999; HOLMSTRUP, 2001).

O processo alveolar é um tecido mineralizado inervado e vascularizado,

compreendendo a parte da maxila e da mandíbula que proporciona suporte para

as raízes dos dentes. Esses processos são dependentes da presença dos dentes

e estão sujeitos à reabsorção quando a unidade dental é perdida. O osso alveolar

está continuamente sofrendo remodelação como resultado de sua adaptação às

necessidades funcionais (LINDHE; KARRING, 1999; HOLMSTRUP, 2001).

Ilustração 1: Desenho esquemático do dente com seu periodonto. G: gengiva;

LP: ligamento periodontal; C: cemento radicular; OA: osso alveolar propriamente

dito; PA: processo alveolar (fonte: LINDHE, 1999).

2. DOENÇA PERIODONTAL

Apesar da ênfase e da melhora na prática da higiene oral, a periodontite

permanece a principal causa de perda de dentes em adultos. Com o aumento da

expectativa de vida da população, espera-se um crescimento na prevalência e

severidade da doença, já que o número de pessoas que cuidam e,

conseqüentemente, conservam seus dentes naturais também tem se tornado cada

vez maior (GOLUB et al, 1998).

Os microrganismos habitam a cavidade oral do ser humano desde o

nascimento até a morte, colonizando todos os tecidos bucais, mineralizados ou

não. A colonização bacteriana das superfícies dentárias forma a placa dental. Esta

representa uma película de seres vivos os quais interagem entre si e com o meio

bucal constituindo um biofilme. A deficiência da higiene oral leva a um aumento da

quantidade de microrganismos no biofilme. Com isso, haverá mudanças nos

fatores ecológicos locais, o que levará a alterações nos microrganismos e

permitirá o aparecimento de novas espécies. Além das bactérias, outros

microrganismos podem compor o biofilme, tais como fungos, protozoários e vírus.

(RODRIGUES; NEWMAN, 2002).

Com o desenvolvimento da microbiota da placa, tanto o aumento da

quantidade de bactérias já existentes como o aparecimento de novas espécies,

levam a alterações inflamatórias começam manifestar-se clinicamente,

caracterizando a gengivite. Quando o processo inflamatório progride em direção

ao ligamento periodontal, ocorrendo perda do osso alveolar e destruição das fibras

do próprio ligamento periodontal com formação de bolsas periodontais, este

processo é denominado periodontite (RODRIGUES; NEWMAN, 2002).

A maior parte das pessoas, mesmo periodontalmente saudáveis, podem

formar placa dental que é composta de aproximadamente 75% de bactérias gram-

positivas facultativas, enquanto que a periodontite está associada a uma placa

cuja composição é caracterizada por bactérias gram-negativas e anaeróbicas

(MORENO et al, 1999; TANNER; TAUBMAN, 1999; RODRIGUES; NEWMAN,

2002). Moreno et al (1999) observou que as bactérias mais freqüentemente

encontradas em pacientes com periodontite eram anaeróbios Gram-negativos

pigmentados (GNPA), Fusobacterium nucleatum e Actinomyces sp. Entre os

GNPA, Prevotella sp. existe em maior proporção que Porphyromonas sp. As

principais bactérias relacionadas com a periodontite estão descritas na tabela 1.

Espécies predominantes asociadas à periodontitie

Actinobacillus actinomycetemcomitans Fusobacterium nucleatum

Actinimyces naeslundii Peptostreptococcus micros

Bacteróides forsythus Prevotella intermédia

Campylobacter rectus Porphyromonas gingivalis

Eikenella corrodens Selenomonas sputigena

Espécies Eubacterium Streptococcus intermedius

Espécies Treponema

Tabela 1: Principais patógenos envolvidos com a periodontite (fonte:

KORNMAN, 2001).

Até a década de 70, pensava-se que apenas as bactérias existentes na

placa e seus produtos mediavam a destruição tecidual existente na doença

periodontal. Atualmente, sabe-se que as bactérias são agentes essenciais, porém

apenas sua presença não é suficiente. São necessários fatores provenientes do

hospedeiro para o desenvolvimento e progressão desta patologia (PAGE;

SCHROEDER, 1981; PAQUETTE; WILLIAMS, 2000; KORNMAN, 2001).

As bactérias desenvolvem mecanismos a fim de escapar ou neutralizar a

resposta imune do hospedeiro, dentre os quais podemos citar enzimas, toxinas,

componentes da parede celular e metabólitos (GETKA et al, 1996). Contudo, a

permanência de patógenos e seus produtos nos tecidos bucais do hospedeiro

desencadearão resposta do hospedeiro (PAQUETTE; WILLIAMS, 2000), a qual

tem o potencial de limitar, assim como agravar a doença periodontal (KLAUSEN,

1991; GOLUB et al, 1998).

Desafio

bacteriano

Respostas

imune e

inflamatória

hospedeiro

Tecido

conjuntivo e

destruição

óssea

Sinais

clínicos

doença

Ilustração 2: Os sinais clínicos e patológicos das doenças periodontais são

definidos pela resposta do hospedeiro perante o desafio bacteriano (fonte:

KORNMAN, 2001).

O evento inicial da resposta do hospedeiro corresponde ao recrutamento e

migração de leucócitos polimorfonucleares neutrófilos (PMN) para o local da

infecção periodontal. Os neutrófilos são importantes na proteção do periodonto

contra certas infecções bacterianas. Estas células, além de realizarem fagocitose,

liberam substâncias inflamatórias e antibacterianas capazes de eliminar os

microrganismos, tais como lisozima, lactoferrina, fosfatase alcalina, hidrolases

ácidas, proteínas catiônicas e, também, mieloperoxidase (MPO) (ÖVER et al,

1993; BRETZ, 1996; MIYASAKI; NEMIROVSKIY, 1997). Contudo, a liberação das

enzimas lisossomais e também de radicais de oxigênio durante este processo

bactericida, pode promover destruição tecidual (LIU et al, 2001). PMN também foi

capaz de produzir citocinas, tais como interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6) e

fator de necrose tumoral (TNF) (GALBRAITH et al, 1997).

A infiltração dos PMN e sua ativação nos tecidos inflamados são

mediadas por quimiocinas, moléculas de adesão e citocinas, entre estas IL-8,

molécula de adesão intercelular-1 (ICAM -1), IL-1β e TNF. Em contrapartida, os

neutrófilos ativados podem produzir mais destes mediadores levando a uma auto-

amplificação do recrutamento e da ativação dos PMN, perpetuando a resposta

inflamatória e a destruição tecidual. Estas citocinas (IL-8, IL-1β e TNF) são

consideradas pró-inflamatórias (LIU et al, 2001).

As citocinas são proteínas solúveis, as quais transmitem informações de

uma célula a outra através de mecanismos autócrinos ou parácrinos. Em geral, as

citocinas atuam objetivando a eliminação de microrganismos parasitas e

promovendo a reparação do dano tecidual (GENCO, 1992). Contudo, as citocinas

pró-inflamatórias desencadeiam eventos de sinalização intracelular e

comportamentos celulares catabólicos através de ligações específicas a seus

receptores (PAQUETTE; WILLIAMS, 2000). As citocinas desempenham

importante papel na patogênese da doença periodontal (GALBRAITH et al, 1997).

As principais citocinas envolvidas na periodontite são a IL-1 e TNF, as

quais atuam direta e sinergisticamente estimulando a degradação da matriz de

tecido conjuntivo, ativação dos osteoclastos e a reabsorção óssea (KJELDSEN et

al, 1995; LIU et al, 2001; PAQUETTE; WILLIAMS, 2000). Estas citocinas

compartilham muitas propriedades biológicas em virtude de estimularem

mensageiros intracelulares semelhantes, mesmo por diferentes mecanismos,

ativando a mesma cascata de metabolismo intracelular (KOBAYASHI et al, 1999).

A IL-1 é uma citocina sintetizada predominantemente pelos macrófagos e

linfócitos, contudo, pode ser produzida por outras células, tais como neutrófilos,

fibroblastos, ceratinócitos e células epiteliais. A IL-1 desempenha um importante

papel na patogênese da doença periodontal destrutiva (ALEXANDER et al, 1996;

KOBAYASHI et al, 1999). Esta citocina induz a liberação de prostaglandina E

(PGE

) e de metaloproteinases, contribuindo, assim, para a perpetuação da

degradação do tecido conjuntivo e da reabsorção óssea (EBERSOLE; CAPPELLI,

2000; PAQUETTE; WILLIAMS, 2000). A IL-1 também promove a ativação de

linfócitos T, proliferação de linfócitos B e estimulação da produção de anticorpos,

modulação da função da célula endotelial, o qual inclui a liberação de fator

estimulador de colônias granulócito-macrófago (GM-CSF), prostaciclina (PGI

) e

síntese do fator ativador de plaquetas (PAF) (PREISS; MEYLE, 1994). A IL-1

consiste de pelo menos dois subtipos, IL-1α e IL-1β, os quais têm homologia

limitada ao nível de peptídeos e nucleotídeos, mas possuem atividade biológica

comum e, também, ligam-se aos mesmos receptores celulares (KOBAYASHI et al,

1999).

TNF é uma proteína trimérica, secretada por monócitos e macrófagos, a

qual desempenha um papel fundamental na doença periodontal (ROSSOMANDO;

WHITE, 1993; EBERSOLE; CAPPELLI, 2000; SANDROS et al, 2000). TNF está

presente tanto no sulco gengival, como também nos tecidos gengivais inflamados.

Este achado sustenta a hipótese de que citocinas, tais como TNF, poderiam

representar uma ponte entre o processo inflamatório e a destruição tecidual

(ROSSOMANDO; WHITE, 1993). Para tal, mostrou-se que TNF induz à

reabsorção da cartilagem e do osso, através da secreção de colagenase pelos

fibroblastos (ROSSOMANDO et al, 1990; ROSSOMANDO; WHITE, 1993;

SANDROS et al, 2000). Recentemente nosso laboratório demonstrou a

importância do TNF na doença periodontal experimental, através de estudos com

inibidores da síntese de TNF (clorpromazina, pentoxifilina e talidomida), mostrando

que estes reduziram de forma significativa o índice de perda óssea, as alterações

histológicas e a leucocitose 11 dias após a indução da doença (LIMA et al, 2000;

LIMA et al, 2003). Experimentos in vitro mostraram que esta citocina também é

capaz de modular a função dos leucócitos polimorfonucleares (MEYLE, 1993).

Contudo, Fredriksson et al (2002) encontraram uma menor liberação in

vitro de TNF por neutrófilos periféricos em pacientes com periodontite em

comparação a pacientes saudáveis, sem a doença. Rossomando et al (1990)

também mostraram existir uma relação inversa entre a presença da inflamação

gengival e TNF.

Os metabólitos do ácido araquidônico são importantes mediadores

inflamatórios e desempenham papel fundamental na doença periodontal. Estes

metabólitos incluem uma variedade de compostos derivados dos ácidos graxos

que são enzimaticamente produzidos, através da ação da cicloxigenase (COX) e

lipoxigenase, e liberados em resposta à lesão tecidual local. Como exemplo

destes metabólitos, podemos citar prostaglandinas (PG), prostaciclinas (PGI

tromboxanos (TX), leucotrienos (LT) e outros ácidos hidroxieicosatetraenóico

(HETE) (PAQUETTE; WILLIAMS, 2000).

Os metabólitos do ácido araquidônico têm sido considerados os principais

mediadores catabólicos da doença periodontal desde que eles são potentes

estimuladores da reabsorção óssea, estão presentes nos tecidos gengivais e

estão elevados em indivíduos com esta patologia (BEZERRA et al, 2000;

PAQUETTE; WILLIAMS, 2000). A eficácia dos AINEs no tratamento da doença

periodontal está associada à inibição dos metabólitos do ácido araquidônico

(PAQUETTE; WILLIAMS, 2000). Lohinai et al (2001) mostraram um aumento

significativo nos níveis de PGE

bem como na expressão da isoforma COX-2

durante a doença periodontal experimental em relação ao grupo sem a doença.

Em nosso laboratório, Bezerra et al (2000) observaram que a inibição da COX,

promovida por fármacos antiinflamatórios não-esteoidais (AINEs), foi capaz de

prevenir a perda óssea alveolar na doença periodontal experimental.

O óxido nítrico (NO), outro mediador inflamatório, também aparece na

cascata inflamatória que ocorre na doença periodontal. O NO é um radical livre

com importantes funções fisiológicas em baixa concentração. Contudo, em

resposta a um estímulo inflamatório, são sintetizadas altas concentrações de NO,

as quais são citotóxicas para bactérias, fungos, protozoários e células tumorais.

Essas altas concentrações de NO também produzem efeitos prejudiciais ao

próprio hospedeiro, tais como dano ao DNA, peroxidação lipídica, dano protéico e

estimulação da liberação de citocinas inflamatórias (PAQUETTE; WILLIAMS,

2000). Também em nosso laboratório, foi demonstrada uma participação do NO

na doença periodontal experimental (DPE) em ratos e que, no entanto, gel

contendo NO em altas concentrações era capaz de inibir a reabsorção óssea

induzida pela DPE (LEITÃO, 2002).

A determinação da presença de produtos inflamatórios no fluido gengival é

de grande valia na avaliação do estado da doença periodontal e, com isso, do

resultado esperado após a terapia (ALEXANDER et al, 1996).

2.1. Doença periodontal e colágeno

O colágeno constitui a proteína estrutural básica de todos os tecidos

periodontais, compreendendo cerca de 60% das proteínas da gengiva e do

ligamento periodontal e mais de 90% da matriz orgânica do osso alveolar (GOLUB

et al, 1985).

As metaloproteinases de matriz (MMP) constituem uma família de enzimas

proteolíticas, as quais promovem a degradação de macromoléculas que compõem

a matriz extracelular, incluindo colágeno, fibronectina, laminina e proteoglicanos.

Estas enzimas são secretadas na forma latente e tornam-se ativas no meio

pericelular através da clivagem da ligação Zn

-cisteína. Esta ligação bloqueia a

reatividade do sítio ativo da enzima. (BIRKEDAL-HANSEN, 1993).

Estas enzimas estão envolvidas em vários eventos fisiológicos, tais como

involução do útero após o parto, desenvolvimento embrionário, remodelação

tecidual, erupção dental, entre outros. Porém, as MMPs também participam de

processos patológicos, entre os quais podemos citar doença periodontal, artrite,

aterosclerose, enfisema pulmonar e osteoporose (RYAN; GOLUB, 2000).

As MMP são divididas em quatro grupos dependendo do seu substrato e

da homologia da seqüência, os quais são: colagenases (tipo fibroblasto ou MMP-

1, tipo neutrofílico ou MMP-8, colagenase-3 ou MMP-13 e colagenase-4 ou MMP-

18); gelatinases (A ou MMP-2 e B ou MMP-9); “stromelysin” (-1 ou MMP-3, -2 ou

MMP-10, -3 ou MMP-11 e “matrilysin” ou MMP-7); e MT-MMPs (MMP tipo

membrana, tais como MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17 e MT1-MMP).

Metaloelastase (MMP-12), MMP-19 e MMP-20 (“enamelysin”) também fazem parte

da grande família das MMP (DAHAN et al, 2001).

As metaloproteinases são produzidas por várias células, dentre as quais

encontram-se os osteoclastos e, também, os osteoblastos. O osteoblasto pode

iniciar a reabsorção óssea através da síntese de proteinases, incluindo MMPs, as

quais vão degradar o osteóide. A liberação destes produtos da degradação e a

liberação de mediadores biológicos pelos osteoblastos, tais como osteocalcina e

citocinas, vão promover a migração dos osteoclastos (LLAVANERAS et al,

2001).Estes sofrem polarização, com o desenvolvimento de uma área

especializada na membrana destas células, a qual é responsável pela fixação

destas células à superfície óssea, iniciando, assim, sua reabsorção (MUNDY,

1991).

As MMP desempenham papel crítico na destruição dos tecidos de suporte

da estrutura dentária. A MMP-8 (colagenase do tipo neutrofílico ou colagenase-2)

é o tipo predominante na periodontite (TERONEN et al, 1997).

A presença da MMP-8 ativada no fluido gengival é uma característica

marcante da doença periodontal. A principal origem desta colagenase é a partir de

neutrófilos desgranulados e extravasados, os quais estão presentes na gengiva

inflamada. Atualmente, sabe-se que a transcrição de MMP-8 também pode ocorrer

através de células mesenquimais de linhagem não-neutrofílica, como, por

exemplo, de fibroblastos do ligamento periodontal e da gengiva, indicando a

habilidade destas células mesenquimais em produzir MMP-8 (TERONEN et al,

1997).

Além da MMP-8, também são encontrados outros tipos de

metaloproteinases nos tecidos periodontais, tais como MMP-1 e MMP-3. Mostrou-

se que a MMP-3 (“stromelysin”-1) é capaz de degradar numerosos substratos da

matriz extracelular, incluindo colágeno tipo IV e IX. Além disso, MMP-3 exerce

uma ação indireta através da ativação da MMP-1, que é uma colagenase própria

dos mamíferos (NAKAYA et al, 2000).

A IL-1β é um mediador inflamatório importante associado com a doença

periodontal. Assim, tanto MMP-1 como MMP-3 encontram-se aumentados no

ligamento periodontal em resposta a estimulação por IL-1β (NAKAYA et al, 2000).

A regulação intrínseca da atividade das MMPs envolve uma família de

proteínas denominada inibidores teciduais das metaloproteinases (TIMP). Estas

proteínas possuem ampla distribuição nos tecidos e nos fluidos corporais e são

eficazes no bloqueio da atividade das MMPs (NAKAYA et al, 2000).

De modo particular, TIMP-1 inibe de forma eficiente a atividade da

colagenase. O inibidor forma complexos com a molécula da colagenase ativa,

atuando como inibidor competitivo da enzima e, talvez, limitando o início da

cascata colagenolítica (NAKAYA et al, 2000).

Tanto as células residentes da gengiva como os fibroblastos do ligamento

periodontal produzem colagenases que estão envolvidas com a fisiologia tecidual.

Colagenase tipo fibroblasto (MMP-1) e seu RNAm têm sido detectados no fluido e

no tecido gengival, respectivamente, de pacientes com periodontite, contudo, é

responsável principalmente pelo turnover tecidual normal e não pela degradação

patológica (RYAN; GOLUB, 2000).

2.2. Doença periodontal e mieloperoxidase

A importância dos mecanismos de defesa do hospedeiro na doença

periodontal já está bem estabelecida. O acúmulo de neutrófilos, macrófagos e

linfócitos no local da lesão constitui um dos estágios mais importantes da proteção

do organismo. Os neutrófilos possuem um papel primordial, pois eles representam

a primeira linha de defesa contra o ataque microbiano (ÖVER et al, 1993).

A mieloperoxidase (MPO) está presente nos grânulos azurofílicos dos

neutrófilos e é considerada uma enzima antibacteriana devido às espécies

reativas geradas a partir do sistema MPO-H

-haleto (BRADLEY et al, 1982;

ÖVER et al, 1993; YAMALIK et al, 2000). Över et al (1993) sugere que esta

enzima é eficaz na eliminação de Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus,

Staphylicoccus aureus e do microrganismo periodontopatogênico Actinobacillus

actinomycetemcomitans.

Porém, a MPO também está envolvida na patogênese da doença

periodontal, tendo uma contribuição na atividade das proteases. A MPO promove

a ativação das proteases através da inibição das antiproteases. Ácido perclórico

(HOCl) , produto de uma reação catalizada por MPO, inativa o inibidor α

-protease

pela oxidação do resíduo metionina, o qual é essencial para a ação deste inibidor .

Com isso, são criadas condições favoráveis para a maioria das proteases. A

ativação das proteases latentes e a inibição das antiproteases alteram o equilíbrio

proteases/antiprotease, sendo este um importante passo para a ruptura do tecido

conjuntivo (YAMALIK et al, 2000).

Como a MPO é encontrada primariamente nos grânulos neutrofílicos, ela

pode ser considerada um indicador do acúmulo de neutrófilos no tecido.

Ocorrendo aumento no número dos PMN nos tecidos periodontais, quando estes

se encontram inflamados, haverá, conseqüentemente, uma elevação na atividade

das MPO. Foi demonstrado que a atividade da MPO é significativamente menor

após terapia periodontal ou em pacientes sem comprometimento destes tecidos

(CAO; SMITH, 1989; ÖVER et al, 1993).

Pelo fato da MPO poder ser detectada tanto enzimaticamente como

espectrofotometricamente com certa facilidade, ela pode ser usada no diagnóstico

clínico da doença periodontal (ÖVER et al, 1993; MIYASAKI & NEMIROVSKIY,

1997).

3. BISFOSFONATOS

3.1. Histórico

Em 1865, químicos alemães sintetizaram o primeiro protótipo dos

bisfosfonatos. Porém, foi em 1897 que o primeiro bisfosfonato, o etidronato, foi

sintetizado (FLEISCH, 2000).

Os bisfosfonatos constituem uma nova classe de drogas estruturalmente

semelhantes aos pirofosfatos. Estes últimos são produtos normais do metabolismo

ósseo humano podendo estarem presentes no soro e na urina (TENENBAUM et

al, 2002).

A descoberta dos bisfosfonatos foi baseada em estudos com pirofosfatos

inorgânicos por Fleisch e colaboradores. Estes pesquisadores mostraram que o

pirofosfato (P - O - P) ligava-se fortemente ao fosfato de cálcio e inibia tanto a

formação dos cristais de fosfato de cálcio como sua dissolução in vitro. Porém,

nenhum efeito era observado na reabsorção óssea in vivo, provavelmente devido

à falta de estabilidade do pirofosfato in vivo, o qual sofria rapidamente hidrólise em

sua ligação P – O – P. Surgiu, então, a necessidade de uma droga análoga ao

pirofosfato, com propriedades físico-químicas semelhantes a este, contudo

resistente à hidrólise enzimática: os bisfosfonatos (LIN, 1996; FLEISCH, 2000;

TENEMBAUM et al, 2002).

3.2. Estrutura química

Os bisfosfonatos possuem duas ligações químicas C - P, localizadas no

mesmo átomo de carbono, resultando em uma estrutura P - C - P (HIRAGA et al,

1996; FLEISCH, 2000). Assim, os bisfosfonatos tornaram-se completamente

resistentes à hidrólise enzimática, sendo extremamente estáveis. Essa estrutura

permite uma grande quantidade de variações possíveis tanto por alteração das

duas cadeias laterais do átomo de carbono, como pela esterificação do grupo

fosfato (EZRA; GOLOMB, 2000; FLEISCH, 2000; TENEMBAUM et al, 2002).

(Ilustração 3)

A ligação ao osso mineral é intensificada pela inclusão de um grupo

hidroxil em R1. A configuração de R2 determinará os efeitos celulares dos

bisfosfonatos e sua eficácia como inibidor da reabsorção óssea (TENEMBAUM et

al, 2002).

Como família, todos os bisfosfonatos possuem propriedades físico-

químicas semelhantes. Porém, a capacidade de inibir a reabsorção óssea

−

P O

−

P O

−

P O

−

P O C

pirofosfato

bisfosfonato

Ilustração 3: Estrutura química do pirofosfato e do bisfosfonato

diferencia substancialmente entre eles. Esta atividade é consideravelmente

aumentada quando da existência de um grupo amino na cadeia do carbono

alifático. Podemos citar como exemplo o alendronato, o qual é um

aminobisfosfonato e apresenta-se 700 vezes mais potente que o etidronato, tanto

in vitro como in vivo (LIN, 1996). (Ilustração 4)

Os bisfosfonatos constituem uma classe de drogas que, como os

pirofosfatos, ligam-se avidamente ao osso. Devido a esta propriedade, acrescida

de sua habilidade em afetar o metabolismo ósseo, estas drogas têm sido usadas

em diversas doenças ósseas e do metabolismo do cálcio, tais como osteoporose,

doença de Paget, neoplasias malignas com metástase óssea, entre outras

(FLEISCH, 2000; SHIBUTANI et al, 2000; EVANS, 2002; HU et al, 2002).

−

P O

−

P O C

−

P O

−

P O C

(CH

)

etidronato

alendronato

Ilustração 4: Estrutura química de dois bisfosfonatos: etidronato e

alendronato (aminobisfosfonato)

3.3. Mecanismo de ação

A afinidade dos bisfosfonatos à hidroxiapatita do osso constitui a base

para seu uso como inibidores da reabsorção óssea e da calcificação ectópica

(EZRA; GOLOMB, 2000).

Inicialmente, acreditava-se que a inibição da reabsorção óssea era

mediada pelos efeitos físico-químicos dos bisfosfonatos através da inibição da

formação, agregação e dissolução dos cristais de fosfatos de cálcio. Sabe-se,

atualmente, que os bisfosfonatos agem por meio de mecanismos celulares

(FLEISCH, 2000).

Segundo Fleisch (2000) o mecanismo de ação dos bisfosfonatos

compreende três níveis, os quais são estreitamente interligados:

- A nível tecidual, seu principal efeito é a diminuição do turnover ósseo.

Isso ocorre devido a uma diminuição do número e da atividade dos

osteoclastos, os quais estão implicados na reabsorção óssea;

- A nível celular, os bisfosfonatos agem através da inibição do

recrutamento, da adesão e da atividade dos osteoclastos. Também

diminuem a vida útil destas células, através da indução de apoptose

(ITO et al, 1999; FLEISCH, 2000), o que leva a uma diminuição no

número de osteoclastos, fato normalmente observado após tratamento

com bisfosfonatos;

- A nível molecular, a baixa concentração necessária para sua atividade

sugere que os bisfosfonatos amplificam o mecanismo de transdução

celular.

Os bisfosfonatos podem influenciar os osteoclastos de forma direta ou

indireta. Os efeitos diretos ocorrem devido à captação do fármaco pelos

osteoclastos. Vários são os efeitos diretos dos bisfosfonatos nestas células, entre

eles destacamos o fato destas drogas alterarem a morfologia dos osteoclastos,

inclusive com a interrupção da formação da borda pregueada. Estes fármacos

também podem agir de forma indireta por meio de outras células, como por

exemplo, os osteoblastos. Os bisfosfonatos induzem os osteoblastos a

sintetizarem inibidores do recrutamento dos osteoclastos, inibindo, assim, a

reabsorção óssea (FLEISCH, 2000).

Além dos mecanismos supracitados, Tenembaum et al (2002)

acrescentam a estes o fato dos bisfosfonatos estimularem a produção de fatores

inibitórios de osteoclastos e a prevenção do desenvolvimento dos osteoclastos a

partir de precursores hematopoiéticos.

O bisfosfonato alendronato também promoveu uma elevação nos níveis

de cálcio intracelular em uma linhagem de células semelhantes a osteoclastos.

Este achado sugere a presença de receptores para bisfosfonatos nos osteoclastos

(TENEMBAUM et al, 2002).

Os bisfosfonatos que contêm um grupamento amina, denominados de

aminobisfosfonatos, tais como alendronato, pamidronato e ibandronato, também

inibem a via do mevanolato (a qual é responsável pela produção de colesterol e

lipídeo isoprenóide), mais especificamente inibe a enzima “farnesyl pyrophosphate

synthase” em osteoclastos. Esta inibição resulta em déficit da prenilação protéica

e, nos mamíferos, esta parece ser a principal razão para a inibição da função dos

osteoclastos e a apoptose secundária promovida pelos aminobisfosfonatos

(FRITH et al, 2001; MONTALVETTI et al, 2001; TÖYRÄS et al, 2003).

3.4. Bisfosfonato e inflamação

Pesquisas mostram que vários bisfosfonatos diferem nos seus efeitos e

propriedades farmacológicas no processo inflamatório (MÖNKKÖNEN et al, 1998).

Alguns bisfosfonatos, tais como clodronato, etidronato e tiludronato,

inibem a liberação de citocinas pró-inflamtórias (IL-1, IL-6, TNF) e óxido nítrico

pelos macrófagos, possuindo, assim, atividade antiinflamatória in vivo

(MAKKONEN et al, 1995; MÖNKKÖNEN; MAKKONEN, 1995; MÖNKKÖNEN et al,

1998).

O clodronato inibiu a produção tanto de IL-6 como do TNF por macrófagos

in vitro. O efeito do clodronato foi intensificado quando este era encapsulado em

lipossomos. A explicação para isto está no fato de que o clodronato como droga

livre não entra prontamente nas células, enquanto que a droga em lipossomos é

absorvida através da endocitose dos liposomos, resultando em uma ação inibitória

mais potente. Este efeito antiinflamatório sugere o uso deste bisfosfonato em

doença inflamatória crônica, especialmente na artrite reumatóide (MÖNKKÖNEN,

1994)

Os aminobisfosfonatos atuam de forma contrária ao grupo anterior. Eles

sensibilizam os macrófagos a intensificarem a produção de citocinas pró-

inflamatórias (IL-1β, IL-6 e TNF), podendo causar uma resposta de fase aguda,

febre transitória e artromialgia em mais de 50% dos pacientes quando a droga é

ingerida pela primeira vez. A razão para a ocorrência destes efeitos colaterais

ainda não é clara, mas provavelmente envolve a secreção de citocinas por

macrófagos e monócitos. (MÖNKKÖNEN; MAKKONEN, 1995; MÖNKKÖNEN et

al, 1998; TÖYRÄS et al, 2003).

Os metabólitos do clodronato e do tiludronato participam das ações

antiinflamatórias destes fármacos, em contraste com os aminobisfosfonatos, os

quais não são metabolizados. O clodronato é metabolizado em um análogo tóxico

do ATP, sendo este metabólito responsável pelo efeito inibitório sobre a liberação

de citocinas. (MÖNKKÖNEN et al, 1998; FRITH et al, 2001; TÖYRÄS et al, 2003).

Este efeito é mediado pela inibição do fator nuclear-κB (NF-κB), o qual regula a

expressão de vários genes envolvidos na inflamação e na resposta de fase aguda.

O alendronato, por sua vez, intensifica a ligação de NF-κB ao DNA, promovendo,

com isso, a liberação de citocinas pró-inflamatórias (TÖYRÄS et al, 2003).

Makkonen et al (1995) observaram que o pamidronato inibiu a produção

de NO in vitro por macrófagos. Porém, este efeito foi atribuído à toxicidade deste

fármaco.

O efeito do tiludronato e do pamidronato no crescimento de macrófagos foi

analisado por Mönkkönen et al (1998). Observou-se que o pamidronato, assim

como outros aminobisfosfonatos, é um inibidor do crescimento de macrófagos

mais potente quando comparado a bisfosfonatos sem o grupamento amina.

Töyräs et al (2003) também mostrou o efeito do alendronato na diminuição do

crescimento de macrófagos in vitro.

Contudo, Lissoni et al (1996) observou que a infusão de pamidronato pode

induzir a uma rápida, porém transitória, diminuição da concentração de IL-6 no

sangue de pacientes com metástase óssea devido ao tumor sólido. De acordo

com Ebersole e Cappelli (2000), a IL-6 é uma citocina pleiotrópica envolvida na

regulação da resposta imune, na resposta de fase aguda e na hematopoiese.

3.5. Bisfosfonato e colágeno

Na doença periodontal, pelo fato das MMP promoverem destruição

proteolítica tecidual, drogas com atividade anticolagenolítica, tais como as

tetraciclinas e os bisfosfonatos, têm sido estudadas (GOLUB et al, 1983;

TERONEN et al, 1997).

Relatos anteriores mostram que o bisfosfonato tiludronato inibe de forma

concentração-dependente a atividade das MMP-1 e MMP-3 em cultura de células

do ligamento periodontal humano, porém este efeito ocorre sem alteração do

RNAm para estas enzimas (NAKAYA et al, 2000). Então, propôs-se que os

bisfosfonatos atuariam através da quelação dos cátions (Ca

e Zn

) das MMPs,

já que na ausência de Ca

as MMPs são completamente inativas (TERONEN et

al, 1997; NAGAYA et al, 2000).

Estudo feito por Llavaneras et al (2001) mostrou que o uso do clodronato

promove uma ligeira inibição das gelatinases, ao passo que reduz

consideravelmente os níveis de colagenases ativas. Estas observações indicam

que este bisfosfonato simplesmente interage e inibe as MMPs ativas, mas não

diminui a sua expressão.

Teronen et al (1997) demonstraram o potencial anticolagenolítico do

clodronato sobre MMP-8 de forma dose-dependente tanto in vitro como in vivo. A

inibição da enzima foi vista em exsudato inflamatório humano do fluido gengival

em tampão contendo concentrações fisiológicas de cálcio e zinco, indicando que,

seja qual for o mecanismo de ação do clodronato, este também exerceria sua

ação in vivo.

O clodronato inibiu MMP-8 e também MMP-1 em exsudato inflamatório

humano. Assim, sugeriu-se que esta droga pode ser usada, tanto localmente

como sistemicamente, no tratamento de várias doenças que possuem excessiva

atividade colagenolítica (TENOREN et al, 1995).

Garnero et al (2001) observaram que um potente bisfosfonato

heterocíclico de 3ª geração denominado zoledronato diminuiu de forma direta a

degradação do colágeno tipo II em pacientes com doença de Paget. O colágeno

tipo II, colágeno das cartilagens, é degradado por metaloproteinases, incluindo

MMP-1, -2, -3, -7 e -13. Com isso, o autor sugere que os bisfosfonatos possuem

efeito condroprotetor em humanos.

Tenoren et al (1997) mostrou que pamidronato e alendronato podem, em

doses terapêuticas, inibir MMP-13 (colagenase-3 humana recombinante), MMP-3

(“stromelysin”-1) e MMP-1 (colagenase-1 tipo fibroblasto).

Clodronato, alendronato, pamidronato e zoledronato, em concentrações

terapêuticas e não-citotóxicas, foram capazes de inibir MMP-3, -12, -13 e -20 e,

também, -1, -2, -8, -9, mas não inibiram o ativador de plasminogênio tipo

uroquinase (uPA), que é uma proteinase e ativador pro-MMP. Assim, os

bisfosfonatos foram considerados inibidores de MMPs de amplo espectro

(HEIKKILA et al, 2002).

No entanto, o efeito dos bisfosfonatos como agente inibidor da destruição

do colágeno nos tecidos periodontais ainda foi pouco estudado.

3.6. Bisfosfonato e microrganismos

Alguns fármacos que normalmente são usados em patologias não

infecciosas têm mostrado alguma atividade antimicrobiana in vitro. Essas drogas

são denominadas “não-antibióticos”. Recentemente foi demonstrado que entre

estas drogas, encontram-se os bisfosfonatos (KRUSZEWSKA et al, 2002).

O alendronato inibe Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa in

vitro, porém não é eficaz para Candida albicans e Escherichia coli

(KRUSZEWSKA et al, 2002). Além disso, este fármaco como também outros

aminobisfosfonatos, parecem ser ativos, tanto in vivo como in vitro, contra o

protozoário Trypanossoma cruzi, em concentrações que não exercem toxicidade

nas células do hospedeiro (MONTALVETTI et al, 2001).

Alguns bisfosfonatos foram eficazes em inibir o crescimento de

Streptococcus mutans. Esta inibição parece ser devido a quelação do Mg

e pode

ser revertida através da adição de Mg

ou por outros cátions divalentes (HSU et

al, 1995).

Çíftçíoglu et al (2002) mostraram que etidronato e clodronato inibiram

completamente, de forma bactericida, o crescimento de uma nanobactéria, a qual

foi recentemente descoberta em rins de pacientes com doença renal policística.

Além disso, os bisfosfonatos também podem eliminar as células cancerosas,

através da inibição das metaloproteinases, que são enzimas também encontradas

nos microrganismos.

4. TETRACICLINAS

Descobertas em 1948, as tetraciclinas surgiram a partir da fermentação de

uma bactéria do solo denominada Streptomyces aureofaciens, originando o

composto clortetraciclina, a qual foi a primeira tetraciclina a ser completamente

caracterizada tanto química como clinicamente (NELSON, 1998). Desde então,

outros fármacos foram surgindo, os quais compartilhavam semelhanças na sua

estrutura molecular e no seu espectro de ação, tais como oxitetraciclina,

doxiciclina, minociclina, entre outras (CIANCIO, 1976).

Estes medicamentos representam um grupo de antibióticos que

possuem amplo espectro de atividade antimicrobiana, sendo efetivos contra

bactérias aeróbicas e anaeróbicas Gram-positivas e Gram-negativas, inclusive

aquelas que são encontradas na cavidade oral (CIANCIO, 1976; KAPUSNIK-

UNER et al, 1996). As tetraciclinas são fármacos bacteriostáticos, atuando

diretamente através da inibição da síntese protéica bacteriana ao ligarem-se ao

ribossomo 30S da bactéria (NELSON, 1998; KAPUSNIK-UNER et al, 1996; RYAN

& ASHLEY, 1998) e, de forma indireta, promovendo uma alteração na membrana

celular das bactérias, interferindo no movimento de cálcio para dentro e para fora

da célula bacteriana, afetando, assim, os eventos moleculares (RYAN; ASHLEY,

1998).

Pesquisadores e clínicos mostraram que a doença periodontal tem

respondido bem à terapia antimicrobiana. A razão para o uso destes fármacos é o

fato de que os microrganismos representam o agente causal desta patologia.

Vários antimicrobianos têm sido propostos conforme a susceptibilidade das

bactérias orais (GENCO, 1981).

De acordo com Genco (1981) o antibiótico metronidazol mostrou-se

efetivo contra anaeróbios, mas não demonstrou efeito contra bactérias

facultativas, tais como Eikenella corrodens, Actinomyces, Actinobacillus

actinomycetemcomitans e espécie Capnocytophaga. A penicilina parece ter ação

contra a maioria das bactérias associadas com a periodontite, com exceção de

algumas cepas de Actinomyces, as quais são resistentes a este fármaco. No

entanto, a tetraciclina mostrou-se efetiva contra os principais microrganismos

periodontopatogênicos conhecidos atualmente, dentre os quais podemos citar

Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas melaninogenicus, Fusobacterium

nucleatum, Veillonella parvula, espiroquetas e Actinobacillus

actinomycetemcomitans.

As tetraciclinas têm sido usadas como coadjuvantes no tratamento das

doenças periodontais (KORNMAN; KARL, 1982; GOLUB et al, 1987; GOLUB et al,

2001), devido a sua capacidade de suprimir microrganismos, tais como

Porphyromonas gingivalis e Actinobacillus actinomycetemcomitans, que são

periodontopatogênicos (GENCO 1981; KORNMAN; KARL, 1982; GOLUB et al,

1987; GOLUB et al, 1994) e, também, pelo fato de que a concentração da droga

ativa no fluido gengival alcança níveis bem maiores quando comparados àqueles

encontrados no sangue (GENCO, 1981; GOLUB et al, 1987). De forma vantajosa

sobre os outros antimicrobianos, a tetraciclina se liga à superfície radicular, sendo

liberada lentamente, prolongando, assim, seu efeito antimicrobiano (GOLUB et al,

1994; CATON et al, 2001).

Entretanto, Golub e colaboradores (1983) descobriram um outro

mecanismo de ação das tetraciclinas independente de sua ação antimicrobiana,

que é a capacidade de inibir a atividade das metaloproteinases (MMP) em dose

menor que aquela necessária para a ação antimicrobiana, atividade que foi

confirmada posteriormente por outros autores (GOLUB et al, 1983; GOLUB et al,

1987; INGMAN, T, 1993; GOLUB et al, 1994; VERNILLO et al, 1994;

POURTAGHI, 1996; CIANCIO, 1998; THOMAS et al, 1998; CATON et al, 2001).

CIANCIO, 1998, mostrou que a administração sistêmica de doses

subantimicrobianas de doxiciclina (20 mg), juntamente com procedimentos de

raspagem, alisamento e polimento radicular, promovia resultados

significativamente melhores em relação à profundidade de sondagem,

sangramento a sondagem, nível do ligamento periodontal e redução da perda

óssea alveolar, quando comparados a pacientes que receberam apenas a terapia

mecânica.

A descoberta desse novo mecanismo de ação das tetraciclinas foi de

grande importância para a terapia periodontal, pois quando usadas em doses

subantimicrobianas evita o risco de promover resistência bacteriana e minimiza os

efeitos colaterais gastrintestinais normalmente relacionados ao seu uso

prolongado (GOLUB et al, 1994; GOLUB et al, 2001; BEZERRA et al, 2002). Isto

acontece pois o nível sérico máximo da droga esta reduzido em cerca de 90%

quando comparado ao nível das doses antimicrobianas (GOLUB et al, 1994).

Além da diminuição das bactérias periodontais e também da atividade das

MMPs na gengiva, as tetraciclinas podem reduzir a ativação das pro-MMPs,

prevenir a degradação do inibidor endógeno das MMPs (TIMP-1) e, também, do

inibidor da α

-proteinases (α

–antitripsina) (GOLUB et al, 1994; POURTAGHI,

1996; RYAN; ASHLEY, 1998) e, também, inibir a reabsorção óssea através de

uma ação direta na função dos osteoclastos (GOLUB et al, 1998).

Apesar das tetraciclinas inibirem a atividade das MMP, estas drogas não

alteram a inflamação induzida pelos microrganismos (GOLUB et al, 2001). Porém,

alguns estudos mostram que estes fármacos possuem propriedades

antiinflamatórias, as quais não estão relacionadas com seu efeito antimicrobiano,

mas com a habilidade em inibir a atividade da proteína quinase C e das MMPs,

como também de modular as células (neutrófilos) e os mediadores inflamatórios,

tais como radicais de oxigênio, ácidos araquidônico, PGE

e óxido nítrico (NO)

(D’AGOSTINO et al, 2001).

5. Objetivos e justificativas

As medicações sistêmicas são de grande valor na terapia periodontal.

Vários benefícios têm sido associados a estas, tais como redução da profundidade

de sondagem, recuperação do ligamento periodontal, redução dos patógenos

periodontais e diminuição da necessidade de cirurgia periodontal (CIANCIO,

2002).

Os fármacos usados sistemicamente podem ser divididos em dois grandes

grupos: o primeiro, contendo medicamentos que atuam nos patógenos

periodontais e; o segundo, com medicações capazes de modular a resposta do

hospedeiro (CIANCIO, 2002).

Alguns trabalhos mostram que os bisfosfonatos, quando usados em

modelo de doença periodontal, diminuem de forma significante a perda óssea

alveolar, diminuindo, conseqüentemente, a perda dentária (BRUNSVOLD et al,

1992; REDDY et al, 1995; MITSUTA et al, 2002; ALENCAR et al, 2002). Porém, o

exato mecanismo pelo qual estas drogas atuam, ainda não está totalmente

esclarecido. Além disso, a maioria dos trabalhos acima utilizaram os bisfosfonatos

de forma preventiva.

Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi estudar os mecanismos

envolvidos na ação do bisfosfonato alendronato, de forma preventiva e curativa,

no modelo de periodontite experimental em ratos, desenvolvido por vários autores

(CRAWFORD et al, 1978; SALLAY et al, 1992; SAMEJIMA et al, 1990; KOIDE et

al, 1995) e modificado no Laboratório de Farmacologia da Inflamação e do Câncer

– LAFICA (BEZERRA et al, 2000; LIMA et al, 2000).

II. Materiais e Métodos

II. MATERIAIS E MÉTODOS

1. Animais

Foram utilizadas ratas Wistar (Rattus novergicus) fêmeas, com massa

corpórea entre 150 e 200 gramas, provenientes do Biotério Central do Campus do

Pici - UFC e transferidas para o Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia e

Farmacologia - UFC. Os animais foram mantidos em gaiolas apropriadas, em

número de 6 animais por gaiola. Todos receberam água e alimentação ad libitum e

permaneceram nas mesmas condições ambientais durante os experimentos.

O protocolo experimental foi realizado de acordo com as diretrizes

aprovadas pelo Conselho da Sociedade de Psicologia Americana (1980) para o

uso de animais experimentais.

Os experimentos foram realizados no Laboratório de Farmacologia da

Inflamação e do Câncer (LAFICA) do Departamento de Fisiologia e Farmacologia

– UFC; no Laboratório de Anaeróbios, Setor de Microbiologia do Departamento de

Patologia e Medicina Legal – UFC; e, no Laboratório do Professor Fernando

Cunha da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP.

2. Aparelhos e Instrumentos Laboratoriais

Durante o curso dos experimentos, foram utilizados diversos aparelhos e

instrumentos, os quais são citados a seguir:

• Balança digital eletrônica para pesagem dos animais - Filizola;

• Balança analítica (Analytical Standard - Ohaus®;

• Câmara de Neubauer (0,100/0,0025mm

);

• Centrífuga (Centrifuge 5804R – Eppendorf);

• Citocentrífuga Cito-Ciclo (Revan®);

• Cuba de ultra-som (Thornton);

• Envelopes geradores de anaerobiose (Anaerogen

– Oxoid);

• Escala de McFarland (Probac);

• Espectrofotômetro (Spectronic®20 Genesys);

• Estufa bacteriológica 37°C;

• Fio de náilon para sutura - 3.0;

• Geladeira e freezer (-70°C);

• Instrumental cirúrgico (pinças, bisturis, tesouras, agulhas, etc.)

• Jarra de anaerobiose (Oxoid);

• Micropipetas automáticas;

• Microscópio óptico binocular;

• Micrótomo (Olympus);

• Milli-Q (Millipore);

• Ultra Turrax T8.10 (IKA Labortechnik);

• Vortex.

3. Meios de Cultura

• BHI - Brain Heart Infusion (Ágar) - DIFCO

Suplementado com 5% de sangue desfibrinado de carneiro e com

hemina/menadione.

• BHI - Brain Heart Infusion - DIFCO

Suplementado com hemina/menadione.

• PEA – Feniletil álcool (Agar) - DIFCO

Suplementado com 5% de sangue desfibrinado de carneiro e com

hemina/menadione.

4. Drogas, Soluções, Líquidos e Corantes Utilizados

• Alendronato dissódico: comprimidos de 70 mg - Fosamax® (Merck Sharp &

Dohme);

• Doxiciclina: comprimidos de 100 mg - Vibramicina® (Pfizer);

• Carragenina:

• Heparina 5.000 UI/ml (Roche);

• Anticorpo para TNF primário e secundário (Endogen);

• Anticorpo anti-IL1β (S5/B3);

• Anticorpo biotinilado anti-IL1β (S329/B4);

• Albumina bovina 1%;

• Avidina-peroxidase (DAKO);

• Ácido nítrico 7%;

• Água destilada;

• Álcool etílico 70%;

• Cloral hidratado 10%;

• Complexo Strepto-avidina peroxidase (SAP);

• Complexo DAB;

• Diidrocloreto de O-dianisidina;

• Éter sulfúrico;

• Formaldeído 40%;

• Líquido de Turk (diluidor para contagem total de células):

Ácido acético glacial P.A..........................................20,0 ml

Violeta de genciana....................................................2,0 ml

Água destilada.........................................................1000 ml

• Peróxido de hidrogênio 1%;

• PBS;

• o-fenilenediamina diidrocloreto – dissolvido no tampão substrato descrito no

protocolo de ELISA;

• Tampão de brometo de hexadecil-metil-amônio (HTAB);

• Tampão fosfato de potássio;

• Tampão citrato;

• Tween 20;

• Soro fisiológico 0,9% (NaCl 0,15M);

• Soro normal de carneiro;

• Sulfato de sódio 5%;

• Xilol;

• Azul de metileno 1%;

• Azul de anilina;

• Ácido fosfotungstico;

• Corante Rápido - HEMA 3®;

• Eosina;

• Fucsina ácida;

• Hematoxilina;

• Hematoxilina de Harris;

• Orange G.

Alendronato dissódico (AD) foi diluído em água destilada e Doxiciclina

(DX) em solução salina 0,9%.

5. Tampões utilizados para o ensaio imunoenzimático

- Tampão bicarbonato pH 8.2

NaHCO

P.A. (Merck, Sharp and Dohme – MSD, USA).................…0,1M

NaCl P.A. (Merck, Sharp and Dohme – MSD, USA)………………….0,1M

- Tampão Substrato

Ácido Cítrico .................................................................................34,7mM

HPO

(Merck).........................................................................66,7mM

- Substrato

OPD................................................................................................0,4mg

...............................................................................................0,4µl

Tampão substrato q.s.p. ................................................................1 ml

- Tampão de lavagem PBS-tween 20, 0,1% v/v.

6. Protocolo Experimental

6.1. Modelo de Doença Periodontal Experimental

Utilizou-se o modelo da Doença Periodontal Experimental (DPE),

desenvolvido por vários autores (CRAWFORD et al., 1978; SALLAY et al., 1982;

SAMEJIMA et al., 1990; KOIDE et al.,1995) e modificado no Laboratório de

Farmacologia da Inflamação e do Câncer (LAFICA) do Departamento de Fisiologia

e Farmacologia, Faculdade de Medicina, UFC (BEZERRA et al., 2000; LIMA et al.,

2000).

Os animais foram anestesiados com hidrato de cloral a 10% (400 mg/kg)

por via intraperitoneal (i.p.). Procedeu-se à indução da Doença Periodontal

Experimental (DPE) através da inserção cirúrgica de um fio de sutura de náilon

(3.0) ao redor do segundo molar superior esquerdo. Previamente à passagem do

fio, utilizou-se uma guia nos espaços interproximais mesial e distal do dente

supracitado, a fim de facilitar a colocação do fio. Este era adaptado de modo que o

nó cirúrgico ficasse voltado para a face vestibular da boca do animal. Após 11

dias, sacrificava-se o animal através de deslocamento cervical, sendo tal

procedimento precedido por anestesia em câmara de éter (Ilustração 5).

O dia escolhido para o sacrifício foi baseado em estudos prévios realizado

no LAFICA, os quais constataram destruição total do processo alveolar e

destruição importante do cemento no 11º dia de experimento (LIMA et al., 2000).

Ilustração 5: Indução da Doença Periodontal Experimental (DPE). A DPE foi

induzida através da inserção cirúrgica de um fio de náilon (3.0) em torno do

segundo molar superior esquerdo, permanecendo por 11 dias.

6.2. Grupos Experimentais

Foram utilizados duzentos e treze animais durante o decorrer desse

estudo, os quais foram divididos nos diversos grupos experimentais a seguir:

6.2.1. Grupo normal (naive)

Esse grupo foi constituído por 6 animais, que não foram submetidos à

Doença Periodontal Experimental (DPE), a fim de verificar a existência de alguma

alteração nos parâmetros analisados entre as duas hemiarcadas superiores.

6.2.2. Grupo com Doença Periodontal Experimental (Salina)

Esse grupo foi constituído por animais submetidos à doença periodontal

experimental. Os animais receberam injeções de solução salina a 0,9% (0,2 ml;

via subcutânea - s.c.) 30 minutos antes e diariamente após a cirurgia ou a partir do

5° dia da indução da DPE até o 11° dia, sendo, então, sacrificados.

6.2.3. Grupo Tratado com Alendronato Dissódico (Preventivo)

Esse grupo foi constituído por 6 animais que receberam Alendronato

Dissódico (Fosamax®) na dose de 0.25 mg/kg (de acordo com estudos prévios do

LAFICA), administradas por via subcutânea 30 minutos antes e diariamente após

a cirurgia até o 11° dia, quando ocorreu o sacrifício.

6.2.4. Grupo Tratado com Alendronato Dissódico (Curativo)

Esse grupo foi constituído por 6 animais que receberam Alendronato

Dissódico (Fosamax®) na dose de 0.25 mg/kg , administradas por via subcutânea,

diariamente, a partir do 5° dia da indução da DPE, sendo sacrificados no 11° dia.

6.2.5. Grupo Tratado com Doxiciclina

Esse grupo foi constituído por 6 animais que receberam Doxiciclina

(Vibramicina®) nas doses de 5 e 10 mg/kg (de acordo com estudos prévios do

LAFICA), administradas por via subcutânea (s.c.), diariamente a partir do 5º dia

após a cirurgia até o 11º dia.

6.2.6. Grupo Tratado com Alendronato Dissódico + Doxiciclina

Esse grupo foi constituído por 6 animais que receberam Alendronato

Dissódico (0.25 mg/kg), seguido da aplicação simultânea de Doxiciclina (5mg/kg)

administradas por via subcutânea (s.c.) diariamente a partir do 5º dia após a

cirurgia até o 11º dia.

6.3. Parâmetros Avaliados

6.3.1. Análise da Estrutura Óssea Alveolar

Para o estudo da estrutura óssea alveolar na doença periodontal

experimental, foram realizadas análises morfométrica e histopatológica. As

hemiarcadas contralaterais, ou seja, sem doença periodontal foram utilizadas

como controle.

A. Estudo Morfométrico do Tecido Ósseo na DPE

Os animais foram sacrificados no 11º dia após o procedimento cirúrgico.

Suas maxilas foram removidas e fixadas no formol a 10%, durante 24 horas. Após

esse período, as maxilas foram separadas em duas hemiarcadas (direita e

esquerda), dissecadas e coradas com azul de metileno a 1%, a fim de distinguir o

tecido ósseo dos dentes, os quais coram-se com menos intensidade. Para a

quantificação da reabsorção óssea, as duas hemiarcadas foram acomodadas com

massa de modelar em lâminas para posterior observação em microscópio óptico

munido de ocular graduada (aumento de 4x). As medidas foram feitas em sete

pontos diferentes, nas faces vestibulares dos três dentes molares: três no primeiro

molar, visto que esse dente possui três raízes, denominadas mesial (m1), média

(md) e distal (d1); dois pontos nos segundo (m2 e d2) e terceiro (m3 e d3)

molares, respectivamente (CRAWFORD et al., 1978). As diferenças ou variações

(∆) foram obtidas a partir das medidas das hemiarcadas com DPE, subtraídas

daquelas realizadas nas hemiarcadas contralaterais (controle) (SAMEJIMA et al.,

1990). A soma das sete variações corresponde ao índice de perda óssea (IPO),

expresso em mm (CRAWFORD et al., 1978) (Ilustração 6)

Índice de Perda Óssea

Ilustração 6: Desenho esquemático das medidas da reabsorção óssea: as

diferenças (setas vermelhas, ∆) foram obtidas a partir das medidas feitas nas

hemiarcadas com DPE (seta azul), subtraídas daquelas realizadas nas

hemiarcadas contralaterais (seta verde, controle). A soma das sete variações

correspondeu ao índice de perda óssea (IPO), expresso em mm.

B. Análise Histopatológica do Osso Alveolar

As análises histopatológicas foram realizadas em cortes seriados da

hemiarcada. Decorridos 11 dias após o procedimento cirúrgico (colocação do fio

de náilon), os animais foram sacrificados e suas hemiarcadas, removidas. Estas

foram fixadas em formol a 10% durante 24 horas, sendo, posteriormente,

submetidas a tratamento com ácido nítrico a 7%, por aproximadamente 5 dias,

para a desmineralização. A seguir, as hemiarcadas foram suspensas em sulfato

de sódio a 5%, sendo, então, incluídas em parafina. Após este procedimento,

foram feitos cortes seriados de 5 µm em micrótomo apropriado e as lâminas

obtidas foram coradas pelos métodos HE e Tricrômio de Mallory.

Para a análise microscópica da hemiarcada com a coloração HE, foi

considerada a região entre os 1º e 2º molares, sendo avaliados os aspectos

inflamatórios como presença/intensidade de infiltrado celular, além do estado de

preservação do processo alveolar e cemento. Tais achados foram classificados de

acordo com os escores padronizados no Laboratório da Farmacologia da

Inflamação e do Câncer - LAFICA, citados no quadro a seguir:

Escore 0:

Infiltrado celular ausente ou discreto;

Escassos ou raros osteoclastos;

Processo alveolar preservados;

Cemento preservado.

Escore 1:

Infiltrado celular moderado;

Presença de alguns osteoclastos;

Pequena reabsorção do processo alveolar;

Cemento preservado.

Escore 2:

Infiltrado celular acentuado;

Presença de grande número de osteoclastos;

Processo alveolar com digestão acentuada;

Destruição parcial do cemento.

Escore 3:

Infiltrado inflamatório acentuado;

Processo alveolar ausente;

Destruição acentuada do cemento.

Para análise microscópica da hemiarcada pela coloração Tricrômio de

Mallory, também foi considerada a região entre os 1º e 2º molares, sendo avaliada

a existência de fibras colágenas de forma qualitativa, além de sua direção e

continuidade.

6.3.2. Análise Histopatológica da Gengiva

Após 6 horas ou 11 dias do procedimento cirúrgico, os animais foram

sacrificados. Realizou-se a remoção da gengiva vestibular da região dos molares

superiores esquerdos e fixação da mesma em formol a 10% por 24 horas. A

seguir, a gengiva foi processada e incluída em parafina.Então, foram feitos cortes

a 5µm em micrótomo apropriado e as lâminas obtidas foram coradas pelo método

HE para análise mais detalhada do infiltrado inflamatório.

6.3.3. Imunohistoquímica para TNF

Para a realização da imunohistoquímica, foi usada a gengiva vestibular da

região de molares superiores esquerdos de modo igual ao usado na metodologia

descrita no item anterior. Os cortes histológicos são colocados em lâminas

especiais as quais são recobertas com poli-L-lisina ou gelatina.

Inicialmente, as lâminas foram deixadas em estufa a 66-88°C durante 3

horas. Após este tempo, estas são mergulhadas em xilol aquecido por 10 min e,

depois, em álcool. Logo em seguida, as lâminas foram colocadas em recipiente

contendo tampão citrato pH 6,0 em microondas por 15 min. Após o esfriamento

das mesmas, elas foram introduzidas em peroxidase 3% durante 15 min. Então,

as lâminas foram incubadas em anticorpo primário “overnight”.

Decorrido este tempo, banhou-se as lâminas em PBS para depois serem

incubadas no anticorpo secundário. Após 30 min, houve uma nova incubação no

complexo Strepto-avidina peroxidase (SAP). Após esta etapa, incubou-se com

DAB, para em seguida, fazer uma contra-coloração com hematoxilina de Harris.

6.3.4. Dosagem de IL-1

Após 6 horas do procedimento cirúrgico, os animais foram sacrificados.

Realizou-se a remoção da gengiva vestibular da região dos molares superiores

esquerdos e congelados a –70°C. No dia da análise, o material estocado foi

descongelado, homogeneizado em Tampão inibidor de Protease . O sobrenadante

foi removido para quantificação da citocina IL-1β por ELISA.

Inicialmente, o sobrenadante foi incubado em placa de 96 poços, com 2

µg/ml de anticorpo anti IL-1β (S5/B3) (anticorpo de captura) diluído em tampão de

bicarbonato (pH 8.2; 100 µl/poço) por 16-24h a 4°C. Então, lavou-se a placa com

PBS-tween20, para em seguida realizar o bloqueio com albumina bovina 1%

diluída em tampão de lavagem durante 2h à temperatura ambiente. Após a

lavagem da placa, esta foi incubada com a curva padrão de IL-1β (2000-1,95

pg/ml) diluída em tampão de lavagem juntamente com as amostras a serem

dosadas durante 16-24h a 4°C. Novamente, lavou-se a placa e esta foi incubada

com anticorpo biotinilado anti-IL-1β (S329/B4) (anticorpo de detecção) diluído

1:1000 em tampão de lavagem contendo 1% de soro normal de carneiro por 1h à

temperatura ambiente. Nova lavagem da placa. Então, realizou-se nova incubação

com avidina-peroxidase (DAKO) diluída 1:5000 em tampão de lavagem

(100µl/poço) por 15 min à temperatura ambiente. Novamente, lavou-se a placa,

para em seguida incubá-la com o-fenilenediamina diidrocloreto (OPD) em tampão

substrato (100µl/poço). A placa foi coberta e colocada no escuro por 5-20 min à

temperatura ambiente. A reação foi parada com 150µl/poço de H

1M. A

leitura foi realizada em espectrofotômetro a 490nm. Os resultados são expressos

em µg/ml como a curva padrão.

6.3.5. Dosagem de Mieloperoxidase

A medida de MPO foi avaliada de acordo com o método de Kaplow descrito

por Bradley et al, 1982.

Utilizou-se a gengiva da região de molares superiores para a dosagem de

MPO. As amostras de tecido foram homogeneizadas em tampão de brometo de

hexadecil-metil-amônio (HTAB). Neste momento, congelam-se as amostras. Em

seguida, mais tampão HTAB é adicionado a fim de compor 400 µl de tampão para

15 mg de tecido. Realiza-se nova homogeneização. Então, centrifugou-se as

amostras a 4.500 r.p.m. por 12 minutos. Terminada a centrifugação, 0,1 ml do

sobrenadante é removido e a este é adicionado 2 ml da solução de o-dianisidina,

tampão fosfato de sódio, peróxido de hidrogênio e água detilada. Esta mistura é

colocada em um espectrofotômetro a fim de medir a absorbância em 460 nm nos

tempos 0, 30 segundos, 1,3 e 5 minutos. Uma unidade de MPO equivale a uma

mudança na absorbância de 1,13 x 10

-2

nm. Com os tempos acima descritos, foi

feito uma curva e foi escolhido o tempo 1 minuto como mais representativo do

evento.

6.3.6. Análise Microbiológica

Realizou-se a análise microbiológica de animais normais (grupo naive) e de

animais que foram submetidos a DPE e que receberam 0,2 ml de salina (grupo

DPE) ou AD (0,25 mg/kg - grupo DPE+AD). Após o sacrifício dos animais, a

gengiva da região de molares superiores esquerdos foi coletada, colocada

assepticamente em 0,3 ml em meio de cultura líquido (Brain Heart Infusion –

BHI/DIFCO) e transportada imediatamente para o setor de Microbiologia. O

fragmento coletado foi colocado em placa estéril e com lâmina de bisturi estéril

homogeneizou-se o tecido. O espécime clínico foi semeado com alça

bacteriológica em meio de cultura sólido (Brain Heart Infusion agar - BHI ágar) e

em placa de feniletil álcool ágar (PEA). Os meios foram incubados em atmosfera

de anaerobiose por 7 dias a 37°C. Para a obtenção da atmosfera de anaerobiose

foram utilizadas jarras (OXOID) e envelope gerador de anaerobiose (OXOID)

(Ilustração 7). Após o período de incubação do crescimento bacteriano, foi

realizado bacterioscopia pelo método de Gram e teste tipo respiratório. O teste

tipo respiratório consiste em semear a colônia bacteriana em meio de cultura

sólido e incubar em diferentes atmosferas de incubação (anaerobiose,

microaerofilia e em atmosfera convencional) para caracterização da bactéria como

anaeróbia estrita, aeróbia estrita ou anaeróbia facultativa (KONEMAN et al, 2001).

Com a finalidade de verificar a ação inibitória do AD sobre as bactérias da

doença periodontal, foi isolado Peptostreptococcus sp. de um rato com DPE. Em

seguida, foram separados dois tubos de ensaio contendo BHI e em cada tubo foi

inoculado 0,6 ml de uma cultura recente (24h) de Peptostreptococcus sp. O

primeiro tubo continha apenas o meio de cultura líquido (BHI), o qual foi

denominado tubo controle. No segundo tubo, além do meio de cultura, havia 28

mg/ml de AD (tubo teste). Os tubos foram incubados em atmosfera convencional

por 24 horas. Após este período foi realizada a leitura, a qual foi feita por inspeção

visual, comparando a turvação dos tubos inoculados com a turvação da escala

McFarland (Ilustração 8). A partir do crescimento destas bactérias em meio

líquido, foi feito bacterioscopia pelo método de Gram e repicado em placa com

ágar-sangue.

6.3.7. Estudo Hematológico

Animais foram anestesiados utilizando-se uma câmara de éter. Em

seguida, a ponta da cauda do animal foi cortada com uma tesoura. A primeira gota

de sangue foi desprezada e a seguinte colhida a fim de confeccionar o esfregaço

corado pelo corante rápido (HEMA-3®), para a realização das contagens

diferenciais. Adicionalmente, 20 µl de sangue foram diluídos em 380 µl de Líquido

de Turk, para a contagem do número total de leucócitos, utilizando-se a câmara de

Neubauer. Logo após, os animais tiveram suas caudas cauterizads, com o objetivo

de evitar infecções. Os hemogramas foram realizados imediatamente antes da

cirurgia, 6 e 24 horas após e nos 7° e 11° dias pós-cirúrgicos.

6.3.8. Análise da Variação da Massa Corpórea

Todos os animais tiveram suas massas corpóreas medidas antes da

cirurgia e, após esta, diariamente, durante os 11 dias do período experimental. Os

valores encontrados foram expressos como a variação de massa corpórea (mg)

em relação à massa inicial.

6.3.9. Migração de leucócitos em modelo de peritonite

Os animais foram pré-tratados com Alendronato Dissódico (0,25 mg/kg ) ou

salina (0,2 ml) por via subcutânea (s.c.) 30 minutos antes da injeção de 1 ml do

estímulo inflamatório Carragenina (300 µg/ml, i.p.). Após quatro horas, os animais

foram sacrificados por deslocamento cervical, a fim de avaliar a migração de

leucócitos, especialmente neutrófilos, para a cavidade peritoneal.

Em seguida, a cavidade peritoneal foi lavada com 10 ml de solução de PBS

contendo 0,1 ml de heparina. Os abdomens dos animais foram agitados

levemente, expostos e foram coletados cerca de 6 ml de fluido de lavagem com

pipeta Pasteur.

Do exsudato colhido, 20 µl foram diluídos em 380 µl de líquido de Turk

(diluição 1:20) e usados para contagem total de células em câmara de Neubauer.

Para contagem diferencial das células, foram utilizados 25 µl do exsudato

restante na preparação dos esfregaços, em citocentrífuga, a 1000 r.p.m., durante

10 min, sendo estes corados pelo corante rápido HEMA –3. As células foram

examinadas em microscópio óptico através de objetiva de imersão em óleo

(aumento 100x), onde foram contadads 100 células em cada lâmina,

diferenciando-se em 4 tipos: neutrófilos, eosinófilos, mastócitos e mononucleares.

O número de neutrófilos foi estimado multiplicando-se o percentual encontrado

destas células (contagem diferencial) pelo número total de leucócitos (contagem

total), dividido por 100. Os resultados foram expressos como média ± EPM do

número de neutrófilos/ml do lavado peritoneal e comparados àqueles obtidos dos

animais que foram injetados com salina estéril.

7. Análise Estatística

Os resultados foram expressos como média ± EPM. Para comparações

entre os grupos foram utilizados: Análise de Variância (ANOVA) e teste de

Bonferroni.

Nas análises histopatológicas, os dados obtidos foram expressos como

mediana e o teste estatístico aplicado foi o de Kruskal-Wallis para dados não-

paramétricos. Em todas as situações, foi adotado o nível de significância de pelo

menos p<0,05.

Ilustração 7: Jarra (OXOID). A jarra é utilizada juntamente com envelope gerador

de atmosfera adequada para a obtenção de anaerobiose.

Ilustração 8: Escala McFarland. Nesta escala, observam-se as diferentes

turvações equivalentes a concentrações bacterianas/ml, de acordo com a tabela

abaixo:

Tubo Concentração bacteriana/ml Tubo Concentração bacteriana /ml

3 x 10

6 x 10

9 x 10

12 x 10

15 x 10

18 x 10

21 x 10

24 x 10

27 x 10

30 x 10

1 2 3 5 4 6 7 8 9 10

III. Resultados

III. RESULTADOS

1. Efeito do Alendronato Dissódico (AD) e da Doxiciclina (DX) sobre o

tecido ósseo alveolar na DPE induzida por corpo estranho em ratas

A. Estudo do Índice de Perda Óssea (IPO)

A indução da DPE nos animais que receberam apenas solução fisiológica a

0,9% (salina) resultou em reabsorção óssea significativa em relação aos animais

sem DPE, cujo IPO foi próximo de zero. Observou-se que o AD administrado a

partir do 5° dia da indução da DPE e diariamente até o 11° dia (tratamento

curativo) reduziu de forma significativa (p<0,001) o IPO, representado pela

redução na reabsorção óssea na face vestibular das maxilas em 74,71% em

relação ao grupo de animais que receberam salina. Este efeito é comparável ao

do tratamento preventivo com AD administrado 30 minutos antes da cirurgia e

diariamente (83,9%), ao da DX na dose de 5 e 10 mg/kg (60,51% e 78,95%,

respectivamente) e ao da associação entre as duas drogas (85,20%)(Figura 1).

B. Aspecto macroscópico da doença periodontal experimental (DPE)

induzida por corpo estranho

Observou-se a partir da avaliação macroscópica da hemiarcada superior

esquerda do grupo de animais submetidos a DPE e que recebeu salina (Figura

2B), que a permanência do fio de náilon foi capaz de induzir a doença periodontal

experimentalmente, de forma a reproduzir os principais sinais clínicos da doença

periodontal em humanos, tais como: reabsorção óssea alveolar, exposição de

raízes e perda de contato interdental, em comparação aos animais normais, sem

DPE (Figura 2A). Foi observada redução da perda óssea tanto no grupo tratado

com AD 30 minutos antes e diariamente após a cirurgia (Figura 2C) como no

tratado a partir do 5° dia da indução da DPE (Figura 2D), em relação ao grupo de

animais com DPE que receberam salina (Figura 2B). A diminuição do IPO

promovida pelo AD também foi semelhante à observada nos animais após a

administração de DX5 (Figura 3B), DX10(Figura 3C) e DX associada com AD

(Figura 3D).

Salina AD prev AD cur DX 5 DX 10 AD + DX

0.0

2.5

5.0

7.5

Salina

AD prev

AD cur

DX 5

DX 10

AD + DX

Índice de perda óssea

(mm)

Figura 1: Efeito do Alendronato Dissódico (AD) e da Doxiciclina (DX) sobre o

Índice de Perda Óssea (IPO) na doença periodontal experimental (DPE)

induzida por corpo estranho em ratas. AD (0,25mg/kg, s.c.) foi administrado 30

minutos antes e diariamente após a cirurgia (preventivo). AD (0,25mg/kg, s.c.), DX

(5 ou 10 mg/kg) ou salina (0,2ml) foram injetados a partir do 5° dia da indução da

DPE (curativo). A DPE foi induzida através da inserção cirúrgica do fio de náilon

em torno dos segundos molares superiores esquerdos das ratas. Os animais

foram sacrificados 11 dias após o procedimento cirúrgico. Observou-se que o AD

reduziu de forma significativa a reabsorção na face vestibular das maxilas, tanto

no tratamento curativo como no preventivo de forma comparável à doxiciclina em

ambas as doses e à associação. As barras representam média ± EPM de, no

mínimo, cinco animais com DPE. *(p<0,001) indica diferença estatística em

relação aos animais com DPE que receberam apenas salina (ANOVA, Bonferroni)

Figura 2: Aspecto macroscópico de maxilas de ratos normais ou de animais

submetidos à doença periodontal experimental (DPE) tratados com salina ou

Alendronato Dissódico (AD). Os animais foram submetidos à indução da DPE

por corpo estranho e receberam salina (0,2 ml;s.c.) ou alendronato (0,25 mg/kg;

s.c.) 30 minutos antes e diariamente após a cirurgia (preventivo) ou a partir do 5°

dia da indução da DPE (curativo). Os animais foram sacrificados no 11° dia e suas

maxilas foram removidas e fixadas em formol a 10%. Em seguida, as hemiarcadas

foram separadas, dissecadas, coradas em azul de metileno a 1% e acomodadas

em massa de modelar para posterior observação em microscópio com ocular

graduada. A: Maxila de animal normal que não foi submetido a DPE. B: Maxila de

animal com DPE, no qual foi administrada salina, mostrando intensa destruição

óssea alveolar, exposição das raízes e perda do contato interdentário. C: Maxila

de animal que foi submetido a DPE e recebeu AD como tratamento preventivo

apresentando redução acentuada da reabsorção do osso alveolar. D: Maxila de

animal com DPE que recebeu AD de forma curativa mostrando também uma

diminuição da perda óssea alveolar.

A B

Figura 3: Aspecto macroscópico de maxilas de ratos normais ou de animais

submetidos à doença periodontal experimental (DPE) tratados com salina,

Doxiciclina (DX) ou DX associado a Alendronato Dissódico (AD): Os animais

foram submetidos à indução da DPE por corpo estranho e receberam salina (0,2

ml;s.c.), DX (5 ou 10 mg/kg; s.c.- DX5 ou DX10, respectivamente) ou AD(0,25

mg/kg) associado a DX5 diariamente, a partir do 5° dia após a cirurgia. Os animais

foram sacrificados no 11° dia e suas maxilas foram removidas e fixadas em formol

a 10%. Em seguida, as hemiarcadas foram separadas, dissecadas, coradas em

azul de metileno a 1% e acomodadas em massa de modelar para posterior

observação em microscópio com ocular graduada. A: Maxila de animal com DPE,

no qual foi administrado salina, mostrando intensa destruição óssea alveolar e

exposição das raízes. B: Maxila de animal sujeito a DPE no qual foi aplicada DX 5

mg/kg, apresentando redução da reabsorção do osso alveolar. C: Maxila de

animal com DPE e que recebeu DX 10mg/kg, revelando resultado semelhante ao

anterior. D: Maxila de animal com DPE que recebeu AD e DX 5, indicando que

também houve uma diminuição da reabsorção óssea alveolar, porém sem efeito

sinérgico entre os medicamentos.

A B

C D

2. Efeito do Alendronato Dissódico (AD) e da Doxiciclina (DX) sobre as

alterações histopatológicas observadas na DPE em ratas

A análise histopatológica realizada no 11° dia das maxilas das ratas

submetidas a DPE que receberam salina (Figura 4B), mostrando presença de

infiltrado celular inflamatório acentuado, reabsorção completa do processo alveolar

e destruição do cemento em relação ao grupo de animais normais, sem a doença

(Figura 4A). Nos animais tratados com AD (0,25 mg/kg) 30 minutos antes e

diariamente após a cirurgia (Figura 4C) observou-se preservação do processo

alveolar e do cemento, com discreto infiltrado inflamatório. No grupo de animais

tratados com AD a partir do 5° dia após a cirurgia, constatou-se ainda presença de

discreto infiltrado celular inflamatório e preservação do processo alveolar e

cemento (Figura 4D).

Nos animais nos quais foram administrados DX5, pôde-se observar

manutenção parcial da integridade do processo alveolar e cemento, com presença

de infiltrado celular inflamatório (Figura 5C). Em animais que receberam DX10,

verificou-se processo alveolar e cemento preservados e ainda com discreto

infiltrado inflamatório celular (Figura 5D). Os animais que foram tratados com a

associação das duas drogas (AD + DX5) apresentaram preservação do processo

alveolar e cemento radicular e ausência de infiltrado inflamatório (Figura 5E).

Aumento de 40x.

A B

C D

Figura 4: Fotomicrografias de periodontos de animais submetidos a DPE,

que receberam salina ou Alendronato Dissódico (AD) e de animal normal

sem DPE na coloração hematoxilina-eosina (HE). Os animais foram submetidos

à indução da DPE através da inserção cirúrgica de um fio de náilon 3.0 em torno

de seus segundos molares superiores esquerdos. As ratas receberam AD (0,25

mg/kg, s.c.) ou salina (0,2 ml, i.p.) 30 minutos antes e diariamente após a cirurgia

(preventivo) ou a partir do 5° dia da indução da DPE (curativo). No 11° dia, foi feito

o sacrifício dos animais com remoção das hemiarcadas, as quais foram

processadas para coloração pelo método HE. A. Periodonto de animal normal sem

DPE. B. Periodonto de animal submetido a DPE que recebeu salina. C. Periodonto

de animal normal com DPE ao qual foi administrado AD de forma preventiva,

mostrando preservação do processo alveolar e do cemento e discreto infiltrado

inflamatório. D. Periodonto de animal submetido a DPE que recebeu AD de modo

curativo, onde observou-se preservação parcial do processo alveolar, com

presença de discreto infiltrado inflamatório e destruição parcial do cemento. G:

gengiva; LP: ligamento periodontal; PA: processo alveolar; C: cemento. Aumento

de 40x.

A B

C D

Figura 5: Fotomicrografias de periodontos de animais normais ou de animais

submetidos à doença periodontal experimental (DPE) tratados com salina,

Doxiciclina (DX) ou Alendronato Dissódico (AD) associado à DX em

coloração Hematoxilina-Eosina (HE): Os animais foram submetidos à indução

da DPE por corpo estranho e receberam salina (0,2 ml;s.c.), DX (5 ou 10 mg/kg;

s.c.- DX5 ou DX10, respectivamente) ou AD (0,25 mg/kg; s.c) associado a DX5

diariamente, a partir do 5° dia após a cirurgia. Os animais foram sacrificados no

11° dia e suas maxilas foram removidas e processadas para coloração pelo

método HE. A. Periodonto de animal submetido a DPE que recebeu salina. B.

Periodonto de animal normal com DPE ao qual foi administrado DX5, mostrando

preservação parcial do processo alveolar e do cemento e presença de infiltrado

inflamatório. C. Periodonto de animal submetido a DPE que recebeu DX10, onde

observou-se processo alveolar e cemento preservados, com presença de infiltrado

celular inflamatório discreto. D. Periodonto de animal submetido à DPE que

recebeu AD e DX 5, mostrando processo alveolar e cemento preservados e

discreto infiltrado inflamatório. Aumento de 40x.

2.1. Tabela dos escores histopatológicos

A tabela 3 representa os escores atribuídos à análise histopatológica das

maxilas referente à figura 4. Os animais receberam AD 30 minutos antes e

diariamente após a cirurgia (preventivo) ou a partir do 5° dia da indução da DPE

(curativo) e foram sacrificados no 11° dia. A partir dos cortes seriados das

hemiarcadas, observou-se que o tratamento com AD, tanto de forma preventiva

como curativa, reduziu de forma estatisticamente significativa (p<0,05) as

alterações histopatológicas vistas na DPE, quando comparada às observadas em

animais que receberam apenas salina.

A tabela 4 representa os escores atribuídos à análise histopatológica das

maxilas referente à figura 5. Os animais receberam salina, DX 5, DX 10, AD

associado a DX a partir do 5° dia da indução da DPE e diariamente, sendo

sacrificados no 11° dia. A partir dos cortes seriados das hemiarcadas, observou-se

que os tratamentos com DX5, DX10 e AD associado à DX5 reduziram de forma

estatisticamente significativa (p<0,05) as alterações histopatológicas vistas na

DPE, quando comparada às observadas em animais que receberam apenas

salina.

Tabela 3: Efeito do Alendronato Dissódico (AD) sobre as alterações

histopatológicas observadas na DPE em ratas

A DPE foi induzida através da inserção cirúrgica de um fio de náilon 3.0 em

torno dos segundos molares superiores esquerdos de ratas devidamente

anestesiadas. Os animais receberam AD (0,25 mg/kg, s.c.) ou salina (0,2 ml, i.p.)

30 minutos antes e diariamente após a cirurgia (preventivo) ou a partir do 5° dia da

indução da DPE (curativo). No 11° dia foi feito o sacrifício dos animais e remoção

das hemiarcadas para confecção dos cortes seriados, processados para coloração

pelo método HE. Os dados representam mediana e variação de pelo menos 5

animais, onde as regiões entre os 1° e 2° molares foram consideradas para

análise dos seguintes parâmetros: presença de infiltrado celular e grau de

preservação do processo alveolar e cemento. *p<0,05 em relação ao grupo que

recebeu apenas salina (Kruskal-Wallis).

Escores

Tratamentos

Salina Curativo

Preventivo

Naive

0 (0-0) 3 (2-3) 0 (0-1)* 1 (1-1)*

Tabela 4: Efeito da doxiciclina (DX) e da associação do Alendronato

Dissódico (AD) com doxiciclina (DX) sobre as alterações histopatológicas

observadas na DPE em ratas

A DPE foi induzida através da inserção cirúrgica de um fio de náilon 3.0 em

torno dos segundos molares superiores esquerdos de ratas devidamente

anestesiadas. Os animais receberam salina (0,2 ml, i.p.), DX (5 ou 10 mg/kg; s.c.-

DX5 ou DX10, respectivamente) ou AD (0,25 mg/kg) associado a DX5

diariamente, a partir do 5° dia após a cirurgia. No 11° dia foi feito o sacrifício dos

animais e remoção das hemiarcadas para confecção dos cortes seriados,

processados para coloração pelo método HE. Os dados representam mediana e

variação de pelo menos 5 animais, onde as regiões entre os 1° e 2° molares foram

consideradas para análise dos seguintes parâmetros: presença de infiltrado celular

e grau de preservação do processo alveolar e cemento. *p<0,05 em relação ao

grupo que recebeu apenas salina (Kruskal-Wallis).

Escores

Tratamentos

Salina AD+DX5

DX5

Naive

0 (0-0) 3 (2-3) 1 (1-1)* 1 (0-2)*

DX10

1 (1-2)*

4. Efeito do Alendronato Dissódico (AD) e da Doxiciclina (DX) sobre as

alterações das fibras colágenas observadas na DPE em ratas

A análise das fibras colágenas realizada no 11° dia das maxilas das ratas

com DPE que receberam apenas salina (Figura 6B), mostrou destruição e

desorganização das fibras colágenas, em relação ao grupo de animais normais

sem a doença, nos quais as fibras colágenas se encontram organizadas na

gengiva e no ligamento periodontal na direção cemento-osso alveolar (Figura 6A).

Nos animais tratados com AD 30 minutos antes e diariamente após a cirurgia

(Figura 6C) observou-se preservação importante das fibras colágenas do

ligamento periodontal e das fibras gengivais. No grupo de animais tratados com

AD a partir do 5° dia após a cirurgia, constatou-se preservação parcial das fibras

colágenas em comparação ao periodonto de animais com DPE que receberam

salina (Figura 6D).

Na análise das fibras colágenas realizada no 11° dia das maxilas das ratas

com DPE nas quais foram administrados DX (5 mg/kg), observou-se as fibras

colágenas parcialmete peservadas (Figura 7C). Nos animais que receberam DX

(10 mg/kg) verficou-se preservação parcial das fibras colágenas porém sem

orientação definida (Figura 7D). Quando os animais receberam a associação das

duas drogas (AD e DX 5), constatou-se fibras colágenas íntegras e bem

orientadas (Figura 7E).

A B

C D

Figura 6: Fotomicrografias de periodontos de animais submetidos a DPE,

que receberam salina ou Alendronato Dissódico (AD) e de animal normal

sem DPE na coloração Tricrômio de Mallory. Os animais foram submetidos à

indução da DPE através da inserção cirúrgica de um fio de náilon 3.0 em torno dos

segundos molares superiores esquerdos. As ratas receberam AD (0,25 mg/kg,

s.c.) ou salina (0,2 ml, i.p.) 30 minutos antes e diariamente após a cirurgia

(preventivo) ou a partir do 5° dia da indução da DPE (curativo). No 11° dia foi feito

o sacrifício dos animais, com remoção das hemiarcadas, as quais foram

processadas para coloração pelo método Tricrômio de Mallory. A. Periodonto de

animal normal sem DPE. B. Periodonto de animal submetido a DPE que recebeu

salina. C. Periodonto de animal normal com DPE ao qual foi administrado AD de

forma preventiva, mostrando preservação parcial das fibras colágenas do

ligamento periodontal e destruição parcial das fibras gengivais. D. Periodonto de

animal submetido a DPE que recebeu AD de modo curativo, onde também foi

observado as fibras colágenas parcialmente preservadas. Aumento de 100x.

A B

C D

Figura 7: Fotomicrografias de periodontos de animais normais ou de animais

submetidos à doença periodontal experimental (DPE) tratados com salina,

Alendronato Dissódico (AD), Doxiciclina (DX) ou AD associado à DX em

coloração Tricrômio de Mallory: Os animais foram submetidos à indução da

DPE por corpo estranho e receberam salina (0,2 ml;s.c.), AD (0,25 mg/kg; s.c), DX

(5 ou 10 mg/kg; s.c.- DX5 ou DX10, respectivamente) ou AD associado a DX5

diariamente, a partir do 5° dia após a cirurgia. Os animais foram sacrificados no

11° dia e suas maxilas foram removidas e processadas para coloração pelo

método HE. A. Periodonto de animal submetido a DPE que recebeu salina. B.

Periodonto de animal submetido a DPE que recebeu DX5, onde observou-se as

fibras colágenas do ligamento periodontal parcialmente preservadas. C.

Periodonto de animal com DPE, no qual foi administrado DX10, onde observa-se

preservação das fibras colágenas porém sem orientação definida. D. Periodonto

de animal submetido à DPE que recebeu AD e DX 5, mostrando fibras colágenas

íntegras e bem orientadas. Aumento de 40x.

5. Efeito do Alendronato Dissódico (AD) sobre as alterações da gengiva de

ratas submetidas a DPE

Análise da gengiva vestibular de animais submetidos DPE durante 6

horas

O grupo de animais submetidos à DPE e que recebeu salina (Figura 8C e

8D) apresentou intenso infiltrado inflamatório com predomínio de

polimorfonucleares. Além disso, observou-se gengiva inflamada com hemorragia,

edema e infiltração de polimorfonucleares no epitélio em relação ao grupo de

animais normais sem a doença (Figura 8A e 8B). Nas ratas tratadas com AD 30

minutos antes da cirurgia observou-se redução acentuada do infiltrado inflamatório

com ausência de polimorfonucleares (Figura 8E e 8F).

Análise da gengiva vestibular de animais submetidos DPE durante 11

dias

Observou-se nos animais submetidos a DPE e que receberam apenas

salina a existência de infiltrado inflamatório com predomínio de mononucleares,

além da presença de eosinófilos e polimorfonucleares (Figura 9B). As ratas, tanto

as que receberam AD 30 minutos antes e diariamente após a cirurgia como

aquelas que receberam a partir do 5° dia, apresentaram uma redução do infiltrado

inflamatório às custas de mononucleares e ausência de neutrófilos (Figura 9C e

9D, respectivamente).

A B

C D

E F

Figura 8: Fotomicrografias da gengiva vestibular de animal sem DPE e de

animais submetidos à DPE e que receberam salina ou Alendronato

Dissódico (AD): Os ratos foram submetidos à indução da DPE através da

colocação cirúrgica do fio de náilon em torno dos segundos molares superiores

esquerdos e receberam salina (0,2 ml) ou AD (0,25 mg/ml; s.c.) trinta minutos

antes da cirurgia (preventivo). Os animais foram sacrificados na 6

ª hora, suas

hemiarcadas foram dissecadas a fim de remover a gengiva na região do segundo

molar superior esquerdo, sendo estas processadas para coloração pelo método

HE. A e B: Gengiva de animal normal sem DPE. C e D: Gengiva de animal com

DPE que recebeu salina, mostrando edema, além de um intenso infiltrado

inflamatório com predomínio de polimorfonucleares. E e F: Gengiva de animal que

foi submetido a DPE e com administração de AD, apresentando-se uma redução

acentuada do infiltrado neutrofílico. Aumento de 400x à esquerda e 1000x à

direita.

A B

Figura 9: Fotomicrografias da gengiva vestibular de animal normal e de

animais submetidos à doença periodontal experimental (DPE) durante 11

dias e que receberam salina ou Alendronato Dissódico (AD). Os ratos foram

submetidos à indução da DPE através da colocação cirúrgica do fio de náilon em

torno dos segundos molares superiores esquerdos e receberam salina (0,2 ml) ou

AD (0,25 mg/ml; s.c.) trinta minutos antes da cirurgia e diariamente (preventivo) ou

a partir do 5° dia após a cirurgia (curativo). Os animais foram sacrificados no 11°

dia, suas hemiarcadas foram dissecadas a fim de remover a gengiva na região

dos molares superiores esquerdos, sendo estas processadas para coloração pelo

método HE. A: Gengiva de animal normal sem DPE. B: Gengiva de animal que foi

submetido à DPE e que recebeu salina, mostrando presença de intenso infiltrado

inflamatório com predomínio de mononucleares e presença de polimorfonucleares,

eosinófilos e mastócitos. C: Gengiva de animal com DPE que recebeu AD de

forma preventiva, mostrando redução do infiltrado inflamatório às custas de

mononucleares e ausência de neutrófilos. D: Gengiva de animal submetido à DPE,

no qual foi administrado AD de modo curativo, discreto infiltrado inflamatório com

predomínio de mononucleares, presença de eosinófilos e ausência de neutrófilos

(Aumento 1000x).

6. Efeito do Alendronato Dissódico (AD) sobre a marcação de TNF pelo

método de imunohistoquímica

Análise da gengiva vestibular de animais submetidos DPE durante 6

horas

As ratas, pertencentes ao grupo com DPE e que recebeu apenas salina,

apresentaram infiltrado celular inflamatório com presença de mastócitos e grande

quantidade de polimorfonucleares marcados e alguns mononucleares

discretamente marcados (Figura 10C) em relação ao grupo normal sem doença,

onde há leve marcação dentro dos mastócitos (Figura 10B). No grupo que recebeu

tratamento com AD 30 minutos antes da cirurgia, foi observado uma redução do

infiltrado inflamatório e da marcação para TNF por imunohistoquímica (Figura

10D).

Análise da gengiva vestibular de animais submetidos DPE durante 11

dias

Após 11 dias, no grupo de animais submetidos a DPE e que recebeu salina

constatou-se a existência de intenso infiltrado inflamatório com predomínio de

mononucleares e presença de mononucleares marcados (Figura 11B), além da

ocorrência de marcação no epitélio, endotélio e músculos em relação ao grupo

sem DPE (dado não mostrado). Os animais que receberam tratamento com AD,

tanto de modo preventivo como curativo, apresentaram um discreto infiltrado

celular inflamatório com redução da marcação dos mononucleares (Figura 11C e

11D, respectivamente).

7. Efeito do Alendronato Dissódico (AD) sobre a produção de interleucina-1

(IL-1)

As ratas que foram submetidas à DPE e que recebeu apenas salina,

apresentaram intensa produção de IL-1 em relação ao grupo normal sem doença.,

No grupo que recebeu tratamento com AD 30 minutos antes da cirurgia, também

foi observado um aumento significativo na produção desta citocina quando

comparado ao grupo naive. Não houve diferença entre os grupos submetidos à

DPE e que receberam salina ou AD (Figura 12).

A B

C D

Figura 10: Imunohistoquímica da gengiva de animais sem DPE e de animais

submetidos à DPE e que receberam salina ou alendronato: As ratas foram

submetidas à indução da DPE através da colocação cirúrgica do fio de náilon em

torno dos segundos molares superiores esquerdos e receberam salina (0,2ml) ou

alendronato (0,25 mg/ml;s.c.) trinta minutos antes da cirurgia. Os animais foram

sacrificados na 6ª hora, suas hemiarcadas foram dissecadas a fim de remover a

gengiva na região do segundo molar superior esquerdo, sendo processadas por

imunohistoquímica. A. Gengiva de animal com DPE não incubadas com o

anticorpo marcador para TNF. B. Gengiva de animal normal sem DPE, com

marcação para TNF apenas dentro dos mastócitos. C. Gengiva de animal que foi

submetido a DPE e recebeu salina, mostrando grande quantidade de

polimorfonucleares intensamente marcados, com presença de mastócitos e

mononucleares também marcados. D. Gengiva de animal com DPE no qual foi

administrado AD observando-se uma diminuição da marcação de TNF por

imunohistoquímica. Aumento 1000x.

A B

C D

Figura 11: Imunohistoquímica da gengiva de animais sem DPE e de animais

submetidos à DPE durante 11 dias e que receberam salina ou alendronato.

As ratas foram submetidas à indução da DPE através da colocação cirúrgica do fio

de náilon em torno dos segundos molares superiores esquerdos e receberam

salina (0,2ml) ou alendronato (0,25 mg/ml;s.c.) todos os dias a partir do 5° dia

após a cirurgia ou desde trinta minutos antes da mesma. Os animais foram

sacrificados no 11° dia, suas hemiarcadas foram dissecadas a fim de remover a

gengiva na região do segundo molar superior esquerdo, sendo estas processadas

por imunohistoquímica. A. Gengiva de animal normal sem DPE, mostrando

ausência quase total de marcação para TNF. B. Gengiva de animal que foi

submetido a DPE e que recebeu salina, mostrando presença de mononucleares

marcados. C. Gengiva de animal com DPE no qual foram administrado AD desde

o 5° dia após a cirurgia, apresentando mononucleares discretamente marcados. D.

Gengiva de animal submetido a DPE e que recebeu AD desde 30 minutos antes e

diariamente após a cirurgia, também mostrando uma diminuição da marcação

para TNF. Aumento 100x.

Naive DPE AD

500

1000

1500

DPE

Naive

IL-1 (pg/ml)

Figura 12: Efeito do Alendronato Dissódico (AD) sobre a produção de

interleucina-1β (IL-1β) em gengivas de ratas normais (naive) ou submetidas à

doença periodontal experimental (DPE).

As ratas foram submetidas à indução

da DPE através da colocação cirúrgica do fio de náilon em torno dos segundos

molares superiores esquerdos e receberam salina (0,2ml) ou alendronato (0,25

mg/ml; s.c.) trinta minutos antes da cirurgia. Os animais foram sacrificados na 6ª

hora, suas hemiarcadas foram dissecadas a fim de remover a gengiva na região

dos molares superiores esquerdos, sendo processadas para análise de IL-1

β por

ELISA. Observou-se um aumento na produção de IL-1

β nos animais tratados com

AD ou salina em relação ao grupo naive (*p<0,001).

8. Efeito do Alendronato Dissódico sobre o leucograma das ratas

submetidas a DPE

AD administrado de forma preventiva foi capaz de reduzir de forma

significativa a leucocitose e a neutrofilia na 6ª hora, assim como a leucocitose, o

número de mononucleares e de neutrófilos no 11° dia. Quando administrado de

modo curativo, AD promoveu a diminuição do número de leucócitos totais, de

neutrófilos e de mononucleares no 11° dia (Figura 13).

9. Efeito da Doença Periodontal Experimental (DPE) sobre a dosagem de

mieloperoxidase (MPO) em gengiva de ratas

Em animais submetidos a DPE, constatou-se um aumento significativo da

MPO na gengiva 6 horas após a cirurgia (p<0,01) tanto em relação a animais sem

a doença como em relação a animais com 11 dias de DPE (Figura 14).

10. Efeito do Alendronato Dissódico (AD) sobre a dosagem de

mieloperoxidase em ratas após 6 horas da indução da DPE

No grupo de animais submetidos à DPE e tratados com AD, ocorreu uma

diminuição significativa da absorbância na dosagem de MPO na gengiva destes

animais em relação aos animais com DPE e que receberam salina, observada

pelos valores da área sob a curva (ASC) (p<0,001). Houve também diferença

estatística, entre o grupo de animais normais e os grupos com DPE e que

receberam tratamento com AD ou salina (p < 0,001; Figura 15).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

curativo

preventivo

tempo (d)

n°de leucócitos x 10

/ml

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tempo (d)

n° de neutrófilos x

/ml

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tempo (d)

n° de mononucleares x

/ml

Figura 13: Efeito do Alendronato Dissódico (AD) sobre o leucograma das

ratas submetidas a doença periodontal experimental (DPE).

AD (0,25 mg/kg,

s.c.) administrado 30 minutos antes da indução da DPE e durante os 11 dias

subseqüentes (preventivo), reduziu significativamente a leucocitose e a neutrofilia

na 6ª hora, além de diminuir também o número de leucócitos e de mononucleares

no 11° dia. Quando administrado a partir do 5° dia após a indução da DPE

(curativo), AD promoveu diminuição significativa na leucocitose, no número de

neutrófilos e no aumento de mononucleares no 11° dia. Os pontos representam

média ± EPM do número de leucócitos totais (A), neutrófilos (B) e células

mononucleares (C) x 10

/ml. *p<0,05 indica diferença estatística do grupo tratado

com AD em relação ao grupo submetido à DPE e tratado com salina. O número

de animais utilizados para cada tratamento foi, no mínimo, cinco (ANOVA,

Bonferroni).

naive DP 6h DP 11d

100

125

150

175

200

naive

DP 11d

DP 6h

Unidade de MPO

Figura14: Dosagem de mieloperoxidase (MPO) nas gengivas de ratas

normais (naive) ou ratas submetidas à doença periodontal experimental

(DPE).

Os animais foram submetidos à indução da DPE através da colocação de

um fio de náilon na cervical dos segundos molares superiores. As ratas foram

sacrificadas na 6ª hora e no 11° dia. A medida da MPO foi realizada por

observação em espectrofotômetro após 1 minuto do início da reação colorimétrica

pelo método de Kaplow. Observou-se um aumento significativo de MPO na

gengiva na 6ª hora após a indução da DPE. As barras representam média ± EPM.

*p<0,01 representa diferença estatística significante em relação ao grupo naive e

ao grupo com DPE e sacrificado após 11 dias da cirurgia (ANOVA, Bonferroni).

naive DP AD

nai ve

ASC (unidades

arbitrárias)

Figura 15: Efeito do Alendronato Dissódico (AD) sobre a dosagem de MPO

em ratas submetidas a doença periodontal experimental (DPE).

Os animais

foram submetidos à indução da DPE através da colocação de um fio de náilon na

cervical dos segundos molares superiores. As ratas receberam salina (0,2 ml) ou

AD (0,25 mg/ml; s.c.) trinta minutos antes da cirurgia, sendo sacrificadas 6 horas

após a cirurgia. A medida da MPO foi realizada por observação em

espectrofotômetro após 1 minuto do início da reação colorimétrica pelo método de

Kaplow. As curvas representam a variação de absorbância de acordo com o

tempo. As barras representam média

± EPM para os valores da área sob a curva

(ASC) em unidades arbitrárias. *p<0,001 em relação ao grupo naive. +p<0,001 em

relação ao grupo com DPE e que recebeu apenas salina.

0 1 2 3 4

Tempo (min)

Absorbância (nm)

11. Efeito do Alendronato Dissódico (AD) sobre a migração de leucócitos

em modelo de peritonite

Efeito do AD sobre a migração do número de leucócitos totais em modelo

de peritonite

O pré-tratamento com AD diminuiu significativamente a migração de

leucócitos totais para a cavidade peritoneal após 4 horas do estímulo inflamatório

(Carragenina) em comparação com os animais pré-tratados com salina (p<0,001;

Figura 16).

Efeito do AD sobre a migração de neutrófilos em modelo de peritonite

O pré-tratamento com AD diminuiu significativamente a migração de

neutrófilos para a cavidade peritoneal após 4 horas do estímulo inflamatório

(Carragenina) em comparação com os animais pré-tratados com salina (p<0,001;

Figura 17).

Controle Cg Cg + AD

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

Cg + AD

Controle

n° de leucócitos x

/ml

Figura 16: Efeito do Alendronato Dissódico (AD) sobre a migração de

leucócitos em modelo de peritonite.

AD (0,25 mg/kg, s.c.) ou salina (0,2 ml)

foram administrados 1 hora antes da indução da peritonite com Carragenina

(300

µg/ml). Os animais foram sacrificados 4 horas após o estímulo inflamatório.

Observou-se diminuição significante do número de leucócitos na cavidade

peritoneal no grupo que recebeu Cg + AD (*p<0,001) em relação ao grupo que

recebeu Cg e tratado com salina. As barras representam média ± EPM de 6

animais por grupo (Anova, Bonferroni).

Controle Cg Cg + AD

0.0

2.5

5.0

7.5

Cg + AD

Controle

n° de neutrófilos x

/ml

Figura 17: Efeito do Alendronato Dissódico (AD) sobre a migração de

neutrófilos em modelo de peritonite.

A peritonite foi induzida através da

administração de Carragenina (300

µg/ml, i.p.). Foram administrados AD (0,25

mg/kg, s.c.) ou salina (0,2 ml) 1hora antes da indução e os animais sacrificados 4

horas após a indução da inflamação. Mostrou-se que o AD inibiu de forma

significativa a migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal (*p<0,001). As

barras representam média ± EPM de 6 animais por grupo (ANOVA, Bonferroni).

12. Efeito do Alendronato Dissódico (AD) sobre as alterações

microbiológicas em ratas submetidas a DPE

Observou-se o crescimento de

Fusobacterium nucleatum e bacilos Gram-

negativos pigmentados em todos os animais submetidos a DPE e tratados com

salina. O AD inibiu o crescimento de bactérias próprias da doença periodontal,

como por exemplo,

Fusobacterium nucleatum e bacilos Gram-negativos

pigmentados, sendo a flora bacteriana nestes animais semelhante àquela

encontrada em animais normais sem DPE. Contudo, foi observado em apenas 2

animais (23%) o crescimento de

Fusobacterium nucleatum mostrando, ainda

assim, um efeito inibitório significativo do AD em relação ao grupo que recebeu

apenas salina. (Tabela 5).

Efeito do Alendronato Dissódico (AD) sobre o crescimento de

Peptostreptococcus sp. isolado de um animal submetido a DPE

O AD inibiu o crescimento de Peptostreptococcus sp. em meio de cultura

líquido (BHI), sendo observada turvação de acordo com a escala McFarland n° 2,

quando comparado com o meio de cultura sem AD, onde a turvação de acordo

com a mesma escala foi n° 10 (Figura 18). O efeito inibitório do AD também foi

observado na bacterioscopia pelo método de Gram (Figura 19) e em cultura em

ágar-sangue (Figura 20).

Tabela 5: Estudo microbiológico comparativo entre animais normais, com

DPE e tratados com Alendronato Dissódico.

Ratos Microbiota % de animais

Naive Isolamento de Peptostreptococcus sp, Streptococcus sp

e diplococos Gram-negativos. Presença também de

bacilos Gram-negativos facultativos.

100%

DPE Isolamento de Fusobacterium nucleatum, bacilos Gram-

negativos pigmentados,

Peptostreptococcus sp, bacilos

Gram-negativos e facultativos e

Proteus sp.

100%

DPE+

Isolamento de Peptostreptococcus sp, cocobacilo Gram-

negativo anaeróbio,

Streptococcus sp, bacilo Gram-

negativo facultativo. Nenhuma cultura do material de

gengiva dos animais apresentou bacilos Gram-negativos

pigmentados e em apenas 23 % dos animais, foi isolado

Fusobacterium nucleatum.

77%

Observou-se que o AD foi capaz de inibir o crescimento de bactérias

características da doença periodontal, tais como bacilos Gram-negativos

pigmentados e

Fusobacterium nucleatum, sendo a flora bacteriana encontrada

nestes animais semelhante àquela dos animais normais. Porém, houve

crescimento de

Fusobacterium nucleatum em apenas 2 dos 9 animais no grupo

tratado com AD. Em ratas com DPE e tratadas com salina, foi observado o

crescimento de

Fusobacterium nucleatum e bacilos Gram-negativos pigmentados

em todos os animais. A coluna 3 representa a porcentagem dos animais que

possuem a flora bacteriana representada na coluna 2.

Figura 18: Efeito do AD sobre o crescimento de Peptostreptococcus sp.

isolado de um animal submetido a DPE em meio de cultura líquido

Peptostreptococcus sp foi isolado de uma rata após 11 dias de DPE e o mesmo foi

inoculado em tubos de ensaio contendo meio de cultura líquido (BHI). A leitura da

turvação é realizada a olho nu comparando-se a turvação dos tubos de ensaio

com o tubo da escala McFarland. Na figura, pode ser observado o crescimento de

Peptostreptococcus

sp no tubo controle (TC) equivalente a McFarland n° 10 (McF

10). No tubo teste (TT), o qual continha 28 mg/ml de AD, o crescimento desta

bactéria equivaleu a McFarland n° 2 (McF 2), mostrando que o AD inibiu o

crescimento de

Peptostreptococcus sp.

TT TC McF2 McF10

Figura 19: Efeito do AD sobre o crescimento de Peptostreptococcus sp.

isolado de um animal submetido a DPE pelo método de Gram.

A partir do

crescimento de

Peptostreptococcus sp. em meio líquido, foi realizada

bacterioscopia pelo método de Gram. Observou-se um maior crescimento de

bactérias Gram-positivas (

Peptostreptococcus sp.) na lâmina feita a partir do tubo

controle (TC) em comparação à lâmina do tubo teste(TT), o qual continha AD.

Figura 20: Efeito do AD sobre o crescimento de Peptostreptococcus sp.

isolado de um animal submetido a DPE em meio de cultura sólido.

conteúdo do tubo controle (TC) e do tubo teste (TT), o qual continha AD, foi

repicado em placa com ágar sangue. Após 48 horas de incubação em atmosfera

de anaerobiose, verificou-se maior crescimento destas bactérias no lado onde foi

repicado o conteúdo do tubo controle, comprovando o efeito inibitório do AD.

13. Efeito do Alendronato Dissódico (AD) sobre a variação de massa

corpórea de ratas submetidas a DPE induzidas por corpo estranho

AD quando administrado 30 minutos antes e diariamente após a cirurgia, foi

capaz de prevenir a perda da massa corpórea dos animais com periodontite

induzida em todos os tempos de forma comparável aos animais normais em

relação aqueles submetidos a DPE e que receberam apenas salina. As ratas, nas

quais foi administrado AD apenas a partir do 5° dia, apresentaram uma diminuição

da perda de massa corpórea a partir do 7° de forma significativa em comparação

ao grupo salina (Figura 21).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

-10

Naive

curativo

preventivo

Salina

Tempo(d)

∆

massa corpórea

Figura 21: Efeito do Alendronato Dissódico sobre a variação de massa

corpórea de ratas submetidas a doença periodontal experimental (DPE)

induzida por corpo estranho

. A DPE foi induzida pela inserção de fio de náilon

em torno dos segundos molares dos animais. As massas corpóreas dos animais

foram medidas imediatamente antes da cirurgia e, após esta, diariamente, durante

11 dias. Os pontos representam média ± EPM da variação de massa corpórea (g)

calculada através das diferenças das massas dos animais em relação à massa

inicial (ANOVA, Bonferroni).

IV. Discussão

IV. DISCUSSÃO

A periodontite é uma doença caracterizada pela extensiva perda óssea,

sendo a maior causa de perda dentária nos adultos. Esta patologia tem sido

tradicionalmente tratada por procedimentos mecânicos, tais como raspagem,

alisamento e polimento radicular, associados ou não a procedimentos cirúgicos, a

fim de descontaminar a superfície radicular (GOLUB et al, 1998; MOMBELLI,

1999; LLAVANERAS et al, 2001; SALLUM et al, 2002). No entanto, esta

abordagem provoca prejuízos ao tecido duro, o qual consiste em perda de

substância dental, e recessão gengival. Além disso, a terapia mecânica pode não

eliminar por completo os patógenos periodontais, pois os mesmos podem estar

em áreas inacessíveis à abordagem mecânica (MOMBELLI, 1999).

Apesar da terapia periodontal mecânica trazer bons resultados na maioria

dos casos, podem ocorrer resultados insatisfatórios, devido a persistência ou

recrescimento de certos microrganismos em locais tratados, resultando em

pacientes portadores de periodontites crônicas com colapso contínuo. Estas

pessoas podem beneficiar-se com o uso de antimicrobianos sistêmicos (GOLUB et

al, 1998; MOMBELLI, 1999; SALLUM et al, 2002).

Contudo, com o conhecimento de que a resposta do hospedeiro é

fundamental para a ocorrência da doença, também se pode lançar mão de

fármacos capazes de modular esta resposta, tais como antiinflamatórios não-

esteroidais e bisfosfonatos (GOLUB et al, 1998; PAQUETTE; WILLIAMS, 2000).

Os bisfosfonatos constituem uma nova classe de drogas, os quais são

considerados potentes inibidores da reabsorção óssea, sendo bastante usados

como agentes terapêuticos em várias doenças ósseas metabólicas, tais como

Doença de Paget, osteoporose, neoplasias malignas com metástases ósseas,

entre outras (SAHNI et al, 1993; GARNERO et al, 2001; TÖYRÄS et al, 2003). Nos

últimos anos, tem sido estudado o uso dos bisfosfonatos como coadjuvante na

terapia periodontal (BRUNSVOLD et al, 1992; WEINREB et al, 1994; REDDY et al,

1995; MITSUTA et al, 2002; ALENCAR et al, 2002).

No presente estudo, buscou-se verificar o efeito do tratamento preventivo e

curativo com o bisfosfonato alendronato dissódico (AD) bem como elucidar os

mecanismos pelos quais esse fármaco atua na periodontite em modelo animal,

comparando-o com um antimicrobiano já aceito, a doxiciclina. Para tal, a doença

periodontal foi induzida através da inserção de fio de náilon 3.0 ao redor dos

segundos molares superiores esquerdos de ratas Wistar, de acordo com modelo

desenvolvido por vários autores (CRAWFORD et al, 1978; SALLAY et al, 1992;

SAMEJIMA et al, 1990; KOIDE et al, 1995) e modificado no Laboratório da

Farmacologia da Inflamação e do Câncer – LAFICA (BEZERRA et al, 2000; LIMA

et al, 2000).

A estrutura e a organização do tecido periodontal da região de molares

em ratos, incluindo epitélio gengival oral, epitélio sulcular oral, epitélio juncional,

fibras colágenas periodontais, cemento celular e acelular e osso alveolar, são

muito semelhantes às do ser humano. A maior diferença consiste no fato de que o

epitélio sulcular gengival dos ratos é queratinizado. Porém, estudos mostram que

não se deve pensar que a barreira funcional gengival é diferente nos ratos e nos

seres humanos, embora a extensão da área afetada seja maior no homem. Dessa

forma, o modelo aqui utilizado foi capaz de reproduzir as principais características

encontradas na periodontite em humanos, sendo apropriado para o estudo dessa

doença (BEZERRA et al, 2000; LIMA et al, 2000).

Neste trabalho, escolhemos o bisfosfonato alendronato dissódico (AD) em

detrimento do clodronato, utilizado anteriormante em nosso laboratório por Alencar

et al (2002) devido ao fato do AD ser mais potente, possuir apresentação para

administração via oral através de comprimidos, ser de custo mais acessível e

também ser facilmente adquirido comercialmente. A doxiciclina também foi

escolhida não só devido à sua ação antimicrobiana, mas também ao seu efeito

anticolagenolítico. Vários autores demonstram que o uso deste fármaco em dose

subantimicrobiana é eficaz como coadjuvante no tratamento da periodontite, em

virtude da inibição da atividade das metaloproteinases e, conseqüentemente, da

destruição dos tecidos periodontais. Além disso, o uso de uma menor dose não

contribui para a ocorrência de alterações na suscetibilidade da microflora

periodontal, não ocorrendo, assim, a resistência bacteriana (CHANG et al, 1994;

CROUT et al, 1996; CIANCIO, 1998; GOLUB et al, 1998; BEZERRA et al, 2000;

CATON et al, 2001; GOLUB et al, 2001). Entretanto, estudos relatam que a

resistência bacteriana pode ser resultado direto da ação do fármaco

antimicrobiano e não, apenas, da seleção de microrganismos resistentes

(TAVARES, 1996; FERES et al, 2002).

Aqui, de acordo com trabalhos anteriores (SALLAY et al, 1982; BEZERRA

et al, 2000; LIMA et al, 2000), observou-se uma significativa perda óssea alveolar

no 11° dia após a indução da doença periodontal experimental (DPE), a qual foi

avaliada através do índice de perda óssea (IPO) e da análise histopatológica. De

acordo com nossos achados, os autores citados anteriormente que induziram a

DPE da mesma forma, notaram que a perda óssea alveolar teve início a partir do

3° dia, alcançando valores máximos entre o 7° e o 11° dias.

No presente estudo, a administração de AD a partir do 5° dia após a

indução de doença, ou seja , após o início da reabsorção óssea como tratamento

curativo, mostrou-se capaz de reduzir de forma significativa o IPO, de forma

comparável ao do AD administrado no mesmo dia da cirurgia, como tratamento

preventivo e, também, de modo semelhante ao tratamento com a doxiciclina, tanto

na dose antimicrobiana como na dose anticolagenolítica administrada, também, de

forma curativa.

Os bisfosfonatos foram utilizados em vários estudos de periodontite como

tratamento preventivo (BRUNSVOLD et al, 1992; MITSUTA et al, 2002) e também

como tratamento curativo (REDDY et al, 1995; ALENCAR et al, 2002), os quais

comprovam a diminuição da reabsorção óssea, que ocorre por meio da redução

turnover ósseo, diminuição do número e da atividade dos osteoclastos, inibição

do recrutamento e da adesão dos osteoclastos através da alteração da morfologia

destas células, ocorrendo a interrupção da formação da borda pregueada

(FLEISCH, 2000). Porém, os autores citados anteriormente estudaram apenas os

efeitos clínicos e histopatológicos dos bisfosfonatos, limitando-se à ação desta

droga sobre os osteoclastos, sem estudar os mecanismos envolvidos no seu

efeito.

Com finalidade de verificar se os dois medicamentos possuíam efeitos

sinérgicos, administrou-se simultaneamente ambas as drogas apenas de modo

curativo. Porém, nenhum efeito adicional no IPO foi verificado. Este efeito foi

contraditório ao verificado por Llavaneras et al (2001), cujo estudo mostrou que a

associação de uma tetraciclina quimicamente modificada (CMT) e do clodronato

reduzia de forma significativa o IPO em relação a terapia com apenas um dos dois

fármacos. Provavelmente, este efeito ocorreu porque o AD, por nós utilizado, é

mais de 10 vezes mais potente que o clodronato, usado no estudo supracitado, já

se alcançando o efeito máximo com a dose utilizada. Em relação à doxiciclina,

também não houve diferença quando usada sozinha, provavelmente porque

mesmo quando ocorre a reabsorção do osso alveolar, com formação de

seqüestros ósseos, as fibras do ligamento periodontal as quais estão preservadas

em função do efeito da doxiciclina, sustentam esse osso, não sendo detectada

diferença estatística no IPO.

Considerando a análise histopatológica, o periodonto de animais

submetidos à DPE apresentou intenso infiltrado celular inflamatório no 11° dia

após a cirurgia, além de destruição total do processo alveolar e destruição

acentuada do cemento, achados que conferem com os estudos de Bezerra et al

(2000); Lima et al (2000). Adicionalmente, aos dados anteriores, nós mostramos,

através de uma coloração especial, uma acentuada destruição das fibras

colágenas. O AD foi capaz de reduzir a reabsorção do osso alveolar e do cemento

radicular, além de preservar de modo parcial a destruição das fibras colágenas do

ligamento periodontal, tanto usado de forma preventiva como curativa. Este efeito

também foi análogo ao encontrado com o uso da menor dose da doxiciclina. Com

a maior dose de doxiciclina, houve uma melhor preservação das fibras colágenas

quando comparado com a dose menor. Contudo, a preservação ideal pôde ser

obtida com o uso da associação de ambos os medicamentos.

Ainda analisando os achados histopatológicos nesse estudo, observou-se

na 6ª hora após a cirurgia um intenso infiltrado celular inflamatório com predomínio

de polimorfonucleares, com presença também de mononucleares no tecido

gengival, inclusive no próprio epitélio (dado não mostrado), além de hemorragia e

edema. O aumento do infiltrado neutrofílico na 6ª hora após a indução da DPE foi

confirmado através da realização da medida da MPO, enzima neutrofílica, a qual

encontrou-se aumentada na 6ª hora. Estes dados estão de acordo com os

achados do leucograma que mostram uma neutrofilia na 6ª hora. Provavelmente,

esta neutrofilia resulta de um efeito sistêmico do processo inflamatório local. A

administração de AD previamente à cirurgia, promoveu uma redução acentuada

do infiltrado neutrofílico na 6ª hora, sugerindo um efeito inibitório deste

bisfosfonato na migração dos leucócitos PMNs. Esses dados estão de acordo com

Tani-Ishii et al (2003), que verificaram uma diminuição significativa da infiltração

de leucócitos PMNs em tecido gengival de ratos após tratamento com incadronato,

o qual possui semelhança química com o AD, sendo ambos aminobisfosfonatos.

Vale ressaltar que os leucócitos PMNs consistem na primeira linha de

defesa do organismo, os quais são fundamentais na preservação do periodonto,

pois além de realizarem fagocitose, liberam substâncias inflamatórias e

antibacterianas capazes de eliminar os microrganismos (ÖVER et al, 1993;

MIYASAKI & NEMIROVSKIY, 1997). Contudo, o papel dos neutrófilos pode ser

considerado “uma espada de dois gumes”, pois além de proteger, pode promover

a destruição tecidual, através da liberação de enzimas, radicais reativos de

oxigênio e, também, de citocinas (GALBRAITH et al, 1997; LIU et al, 2001).

A redução na migração de neutrófilos pelo AD foi confirmada através do

modelo de peritonite, onde observou-se que a administração prévia de AD reduziu

de forma significativa a migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal

estimulada com Carragenina. De acordo com o dado anterior, foi também

constatada no leucograma, a redução do número de neutrófilos e da leucocitose 6

horas após a cirurgia em animais que receberam AD previamente à mesma.

Um outro achado que demonstra o efeito inibitório do AD na migração de

leucócitos PMNs é a verificação da atividade de MPO. A atividade desta enzima

foi reduzida de forma significativa através da análise da absorbância nos tempos

0, 30 segundos, 1 e 3 minutos. Esses dados são consistentes com estudo de

Kowolik et al (1991), que mostrou a redução da atividade da MPO pelo etidronato,

o qual, assim como o alendronato, não possui cloro na sua estrutura. De acordo

com o mesmo autor, o cloro na molécula da droga intensifica a atividade de MPO,

como é o caso do clodronato, um bisfosfonato que contém cloro na sua

composição.

Com isso, este trabalho mostrou que o AD diminui a resposta inflamatória

inicial, o que pode refletir também nas conseqüências posteriores da doença

periodontal, como reabsorção óssea e do cemento.

Desde que osteoclastos e macrófagos pertencem ao sistema

mononuclear fagocítico, seria esperado que os bisfosfonatos não afetassem

somente o metabolismo ósseo, mas também a resposta inflamatória

(PIETSCHMANN et al, 1998). Dessa forma, o AD além de ter inibido a migração

de neutrófilos, também reduziu a infiltração de mononucleares. Fato este

observado na gengiva dos animais com 11 dias de DPE, nos quais foi

administrado AD tanto de forma curativa como preventiva, mostrando que os

mesmos apresentavam redução do infiltrado celular inflamatório com predomínio

de mononucleares, embora havendo ainda presença também de eosinófilos e

mastócitos, porém com redução do número de neutrófilos. Como reflexo sistêmico

desta redução da inflamação local, observamos no leucograma, uma redução da

leucocitose bem como da monocitose dos animais tratados com AD. Da mesma

forma, constatou-se uma diminuição do infiltrado celular no periodonto de animais

tratados com AD após 11 dias da indução da DPE.

De acordo com Pietschmann et al (1998), o AD aumentou

significantemente a porcentagem de mononucleares que migraram através do

endotélio dos vasos, contudo os mesmos autores demonstram que o tratamento

com AD não alterou o ritmo de migração subseqüente das células mononucleares,

sugerindo, assim, que o AD possui um mecanismo próprio que influenciaria a

migração transendotelial das células mononucleares do sangue periférico

in vitro.

O trabalho de Nakamura et al (1996) relata que houve exacerbação da artrite em

camundongos com o uso de um aminobisfosfonato, sugerindo que este efeito

pode ser por causa da estimulação da síntese de histamina e, também, pelo

aumento do número de macrófagos. Pietschmann et al (1998), em seu estudo,

mostraram que o AD induziu a proliferação de células mononucleares

in vitro. A

aparente contradição entre os nossos dados e os dados apresentados por estes

autores poderia ser explicado pelo efeito antimicrobiano do AD mostrado no

presente trabalho. A inibição do crescimento bacteriano reduziria a resposta

inflamatória do hospedeiro, diminuindo, portanto, a inflamação aguda e crônica,

sendo que este efeito antibacteriano superaria qualquer atividade pró-inflamatória

do aminobisfosfonato.

Adicionalmente, no nosso trabalho demonstramos que a DPE induziu um

aumento de IL-1

β no tecido gengival após 6 horas da indução da doença. Estudos

anteriores mostram que, na doença periodontal, há um aumento da citocina pró-

inflamatória interleucina-1

β (IL-1β), a qual pode ser produzida por diferentes

células, tais como monócitos, macrófagos e, também, por neutrófilos (KJELDSEN

et al, 1995; MILLER et al, 1996). A administração prévia do AD nos animais não

inibiu a produção desta citocina, ao contrário, IL-1

β foi produzida de forma

comparável aos animais que receberam apenas salina e de forma estatisticamente

diferente dos animais sem a doença, nos quais não houve produção da enzima.

Este achado está de acordo com trabalhos realizados por Mönkkönen; Makkonen

(1995); Mönkkönen et al (1998); Töyräs et al (2003), os quais mostram que o AD

não reduz a síntese de citocinas, ao contrário, é capaz de aumentar a produção de

citocinas, tais como IL-1

β, TNF e IL-6.

Demonstramos aqui também que havia TNF armazenado dentro dos

mastócitos e mononucleares, indicando que em tecido gengival sem doença

periodontal, esta citocina já existe, o que é consistente com o fato de que a

cavidade oral é naturalmente contaminada e que os mastócitos possuem

normalmente TNF pré-fabricado dentro de seus grânulos (TRACEY; CERAMI,

1994). Lima et al (2000) demonstraram que o TNF amplifica a resposta

inflamatória local causando destruição tecidual e perda óssea na doença

periodontal experimental. Observamos na 6ª hora que o AD administrado

previamente à cirurgia promoveu uma diminuição da marcação para TNF em

neutrófilos e mononucleares do tecido gengival por imunohistoquímica em relação

ao tecido dos animais que não receberam AD. A imunohistoquímica realizada em

tecido gengival de animais tratados de forma curativa e preventiva demonstrou

também redução da marcação para TNF em mastócitos e mononucleares no 11°

dia. Estes achados sugerem um efeito antiinflamatório do AD reduzindo a

infiltração celular aguda e crônica, bem como a expressão local de TNF. Estes

dados são contraditórios com o fato de que o AD, sendo um aminobisfosfonato,

atuaria como droga pró-inflamatória, intensificando a produção de citocinas, tais

como IL-1, TNF e IL-6 (MÖNKKÖNEN; MAKKONEN, 1995; MÖNKKÖNEN et al,

1998; TÖYRÄS et al, 2003). No entanto, estes fatos divergentes podem resultar da

redução da proliferação bacteriana no local como conseqüência do efeito

antimicrobiano do AD mostrado neste trabalho.

Neste estudo, também foi analisado a variação de massa corpórea dos

animais submetidos à DPE. Verificou-se perda significativa de massa corpórea

dos animais no primeiro dia após a indução da doença, provavelmente devido ao

trauma provocado pelo ato cirúrgico, ocasionando um processo inflamatório

agudo, o qual dificultaria a alimentação dos animais. Após o primeiro momento,

ocorreu um ganho lento da massa corpórea nos animais que receberam apenas

salina, com retorno do peso aos níveis iniciais. Contudo, nos animais nos quais foi

administrado AD de forma preventiva, observou-se ganho progressivo de peso de

forma significativa em relação com o grupo com DPE tratado com salina em todos

os tempos avaliados. Nos animais que receberam AD de forma curativa,

observou-se ganho de peso significativo a partir do 6° dia, resultando ainda em

uma curva ponderal diferente da dos animais sem a doença. Esses achados são

consistentes com o trabalho de Lima et al (2000), no qual afirma que após os

animais perderem 10% de seu peso no primeiro dia depois da indução da doença,

retornaram ao peso inicial. Contudo, Koide et al (1995), demonstraram que a

perda de peso ocorreu nos três primeiros dias após a cirurgia. Esta divergência,

provavelmente, decorre da diferença da técnica utilizada.

Além deste trabalho analisar a modulação da resposta do hospedeiro pelo

AD, também foi avaliado o efeito deste fármaco sobre as bactérias

periodontopatogênicas, as quais são essenciais para o desenvolvimento da

periodontite.

Inicialmente, investigamos as bactérias que fazem parte da microbiota

normal da cavidade oral dos ratos e as que colonizam o periodonto destes animais

após a indução da doença. Observou-se neste trabalho que a microbiota em ratos

submetidos à doença periodontal experimental é diferente da flora de animais sem

a doença, sendo formada predominantemente de bactérias Gram-negativas

anaeróbicas, dentre as quais destacamos

Fusobacterium nucleatum e bacilos

Gram-negativos pigmentados. Segundo a literatura, estes bacilos Gram-negativos

pigmentados compreendem os gêneros

Porphyromonas sp e Prevotella sp.

Nossos dados confirmam estudos anteriores (KLAUSEN, 1991; MORENO et al,

1999) que mostram que há alteração na constituição microbiológica na doença

periodontal semelhante ao encontrados por nós, sendo estes microrganismos

periodontopatogênicos (

Fusobacterium nucleatum, bacilos Gram-negativos

pigmentados, entre outros) presentes tanto em humanos como em ratos.

No presente estudo, surpreendentemente, notamos que o AD inibiu o

crescimento das bactérias características da doença periodontal, pois em nenhum

animal que recebeu AD foi observado o crescimento de bacilos Gram-negativos

pigmentados. Houve crescimento de

Fusobacterium nucleatum em apenas dois de

nove animais (23%) com DPE e nos quais foi administrado AD. Apesar deste

achado, o AD inibiu o crescimento desta bactéria em 77% dos animais, sendo este

dado significativo em relação aos animais que não receberam AD. Provavelmente,

o crescimento de

Fusobacterium nucleatum em 23% dos animais deve-se ao fato

do AD não se dissolver completamente no veículo utilizado, o que pode ter

dificultado o alcance de concentrações antimicrobianas no periodonto.

Para melhor caracterizar o efeito antimicrobiano do AD, foi isolado dos

próprios animais com periodontite, microrganismos do gênero

Peptostreptococcus,

sp os quais são representantes das bactérias anaeróbias Gram-positivas. Estes

microrganismos estão implicados com a doença periodontal e têm sido detectados

freqüentemente em grande quantidade em sítios ativos de destruição periodontal

quando comparados com sítios sadios ou apenas com gengivite. Vale ressaltar

que, em sítios periodontais tratados com sucesso, os níveis e a freqüência desta

espécie encontram-se diminuídos (SOCRANSKY & HAFFAJEE, 1999).

A partir do isolamento desta bactéria, foi realizado teste de cultura em

meio líquido, utilizando-se dois tubos de ensaio, onde em um destes continha

apenas o meio de cultura BHI e no outro havia BHI e AD. Por meio das diferentes

turvações observadas nos dois tubos e comparando-as com as turvações da

escala McFarland, observou-se que o AD realmente inibiu o crescimento de

Peptostreptococcus sp. A partir deste experimento, foi feita bacterioscopia pelo

método de Gram seguida da repicação em placa com ágar-sangue. Na

bacterioscopia, foi observado na lâmina correspondente ao tubo sem AD uma

quantidade significativamente maior de

Peptostreptococcus, os quais coram-se

pela coloração de Gram pelo fato de serem Gram-positivos, em relação à lâmina

que corresponde ao tubo que continha AD. A placa onde foi realizado o repicado

em meio de cultura sólido também confirmou os dados obtidos anteriormente.

Infelizmente, devido à limitação da metodologia utilizada no presente

estudo, não foi possível a realização do teste descrito anteriormente com bacilos

Gram-negativos pigmentados, pois estes possuem uma exigência maior em

relação à atmosfera de crescimento.

De posse desses dados, fomos pesquisar na literatura e encontramos, em

trabalhos recentes que alguns fármacos que normalmente são usados em

patologias não infecciosas têm mostrado alguma atividade antimicrobiana

in vitro.

Essas drogas são denominadas “não-antibióticos”. Entre estas drogas,

encontram-se os bisfosfonatos (KRUSZEWSKA et al, 2002).

Recentemente, também foi demonstrado o efeito antimicrobiano do AD

sobre

Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa (MONTALVETTI et al,

2001) e, também, sobre o protozoário

Trypanossoma cruzi (KRUSZEWSKA et al,

2002). Outros bisfosfonatos foram capazes de inibir o crescimento de uma

nanobactéria, a qual foi descoberta em rins de pacientes com doença renal

policística (ÇÍFTÇÍOGLU et al, 2002). Já um trabalho um pouco mais antigo

mostrava que alguns bisfosfosnatos possuíam capacidade de inibir o crescimento

Streptococcus mutans (HSU et al, 1995). Porém, ainda não havia sido

mostrada a ação do AD sobre as bactérias periodontopatogênicas anaeróbias

estritas.

Portanto, os dados apresentados no presente trabalho mostram que o AD

possui ações relevantes, verificadas tanto na microbiota envolvida na DPE quanto

na resposta do hospedeiro, podendo, assim, ser considerado um medicamento

promissor para o tratamento da periodontite, sendo necessário estudos clínicos

em humanos.

V. Conclusões

V. CONCLUSÕES

• Alendronato Dissódico, utilizado tanto de forma preventiva como de forma

curativa, reduziu o índice de perda óssea, de forma comparável à

doxiciclina, porém não houve amplificação do efeito sobre o índice de perda

óssea com a associação de ambos.

• Alendronato Dissódico reduziu a destruição das fibras colágenas do

ligamento periodontal e da gengiva de forma similar à doxiciclina.

• Alendronato Dissódico reduziu o infiltrado inflamatório neutrofílico e a MPO

na 6ª hora da doença, assim como a infiltração de células mononucleares e

a expressão de TNF por imunohistoquímica no 11º dia.

• Alendronato Dissódico inibiu o crescimento de bactérias características da

doença periodontal, tais como pigmentados e

Fusobacterium nucleatum.

VI. Referências Bibliográficas

IV. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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