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MARIANA LIMA VALE
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DA
TALIDOMIDA, PENTOXIFILINA E CLORPROMAZINA EM
MODELOS EXPERIMENTAIS.
Tese submetida à Coordenação
do Curso de Pós-Graduação
em Farmacologia, da
Universidade Federal do Ceará,
como requisito parcial para
obtenção do grau de Doutor em
Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Ronaldo
de Albuquerque Ribeiro
Co-Orientador: Prof. Dr.
Fernando de Queirós Cunha.
Trabalho desenvolvido no Laboratório de Farmacologia da Inflamação e do
Câncer (LAFICA) da Universidade Federal do Ceará e no Laboratório de
Inflamação e Dor da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.
FORTALEZA
2003
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1
V243a Vale, Mariana Lima
Avaliação da Atividade Antinociceptiva da Talidomida,
Pentoxifilina e Clorpromazina em Modelos Experimentais / Mariana
Lima Vale – Fortaleza, 2003.
193f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro
Tese (Doutorado). Universidade Federal do Ceará.
Departamento de Fisiologia e Farmacologia.
1. Dor (inflamação). 2. Talidomida. 3. Pentoxifilina
4. Clorpromazina. I. Título
CDD 616.0473
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2
Os fílhos
(Gibran Kahlil)
“Teus filhos não são teus filhos”.
São filhos e filhas da ânsia da vida por si mesma.
Vêm através de ti, mas não de ti,
E embora estejam contigo, a ti não pertencem.
Podes dar-lhes teu amor, mas não teus
pensamentos,
Pois eles têm seus pensamentos próprios.
Podes abrigar seus corpos, mas não suas almas,
Pois suas almas residem na casa do amanhã,
Que não podes visitar sequer em sonhos.
Podes esforçar-te por te parecer com eles,
Mas não procures fazê-los semelhante a ti.
Pois a vida não recua, e não se retarda no ontem.
Tu és o arco do qual teus filhos, como flechas
vivas,
São disparados.
...................................................
Que a tua inclinação, na mão do arqueiro,
Seja para a alegria
Pois, assim como ELE ama a flecha que voa,
Também ama o arco que permanece estável!”.
Aos meus pais e à minha querida Marina
3
Agradecimentos
Ao Meu orientador Prof. Ronaldo Ribeiro pela confiança e incentivo durante
todos esses anos e principalmente pelo exemplo de caráter e amor ao que
faz.
Ao Prof. Fernando Cunha pela co-orientação, pelo apoio e gentileza em
todos os momentos e por ter me recebido e cooperado para a realização
deste trabalho.
À profa. Gerly Anne por sua delicadeza e paciência diante das minhas
dúvidas e por ter contribuído na parte final deste trabalho.
Ao Prof. Aírton Rocha pelas críticas e sugestões recebidas e pelas lições
aprendidas.
À Dani Sachs pela participação direta na parte experimental e pela amizade
Á Verônica Benevides pela ajuda na parte experimental
À Raquel Montenegro pela ajuda com a imunohistoquímica
Ao Prof. Vietla S. Rao por ter cedido o aparelho de placa quente
Aos colegas da pós-graduação: Virgínia, Mirlane, Mila, Silvia Bona, Adriana,
Vilma, Renata, Mirna, Rondinelli, Marcio Uetti, Ingrid, Antoniela, Rosemary,
Helliada, Milena, Carlos Rocha, Antero, Ana Paula e a todos os colegas do
laboratório que me proporcionaram um ambiente alegre e descontraído
para trabalhar.
À nossa técnica Vandinha pela dedicação ao laboratório e pela preciosa
ajuda em todos os momentos.
Aos Funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia: Rose,
Joana, Marta, Fernando, Chiquinho, Íris pela disposição em sempre me
atender.
4
Ao Ivan do Departmento de Morfologia pelos cortes histológicos
Às secretárias da Pós-graduação em Farmacologia: Sílvia e Áurea pela
ajuda com as questões burocráticas.
Aos Técnicos do laboratório de inflamação e dor do Departamento de
Farmacologia – FMRP – USP: Sergio Rosa (Serginho), Ieda, Giuliana, Kátia,
Fabíola.
À Dra. Artemísia pela atenção a mim concedida nas solicitações de animais
no biotério.
Ao Christian e Caio pela ajuda com o computador
Ao CNPq pelo apoio financeiro
5
“Nenhum tempo é tempo bastante para a
ciência do ver e rever.”
Carlos Drummond de Andrade
6
ABREVIATURAS E SIGLAS UTILIZADAS NESTE TRABALHO
AAc ácido acético
AMP adenosina monofosfato
AMPc adenosina monofosfato cíclico
ATP adenosina trifosfato
BK bradicinina
BK
1
receptor do tipo B
1
da bradicinina
BK
2
receptor do tipo B
1
da bradicinina
Ca
++
íon de cálcio
Cg Carragenina
CINC-1 Quimioatraente para neutrófilos induzido por citocina
C5a Quinto componente do sistema complemento ativado
CLP clorpromazina
COX ciclooxigenase
COX-1 ciclooxigenase constitutiva
COX-2 ciclooxigenase induzida
D
1
receptor do tipo D
1
da dopamina
Db-GMPc dibutiril guanosina monofosfato cíclico
ENL Eritema Nodoso da Lepra
EPM erro padrão da média
g grama
G-CSF Fator estimulador de colônia de granulócitos
GM-CSF Fator estimulados de coloônia de granulócitos e macrófagos
GMP-c Guanosina monofosfato cíclico
7
H
1
Receptor da histamina tipo H
1
H
2
Receptor da histamina tipo H
2
HOE-140 ([D-Arg
1
, Thi
6
, (1,2,3,4-tetrahydroisoquilonin-2-yl-arbonyl)
8
,
((3as,7as)-octahydroindol-2yl-carbonyl)9]bradykinin
IASP International Association for the Study of Pain
IFN interferon
IFN-( interferon-alfa
IFN-( interferon-gama
IgE anticorpo IgE
IL-1 Interleucina-1
IL-1ra antagonistas do receptor para IL-1
IL-2 Interleucina-2
IL-3 Interleucina-3
IL-4 Interleucina-4
IL-6 Interleucina-6
IL-8 Interleucina-8
IL-10 Interleucina-10
IL-13 Interleucina-13
ILO iloprost
Kda Quilodalton (s)
kg Kilograma (s)
l Litro
L-NAME L-NG-nitro arginine methyl ester ,
LPS Lipopolissacarídeo de bactéria
LTB4 Leucotrieno B4
8
LTC4 Leucotrieno C4
MCAF fator ativador e quimiotáxico para monócito,
MHC Complexo de histocompatibilidade maior
mg miligrama (s)
min minuto (s)
ml mililitro
mm milimetros
MNF Fator nociceptivo secretado por macrófagos
Nº Número
ng Nanograma (s)
NO óxido nítrico
NOS enzima óxido nítrico sintase
NOSi enzima óxido nítrico sintase induzida
NOSc enzima óxido nítrico sintase constitutiva
PBS Solução salina tamponada
PGI2 Prostaciclina
PGE2 Prostaglandina E2
Pkc Proteína-quinase-C
PM peso molecular
PTX pentoxifilina
Rhu Recombinante humana
RNA Ácido ribonucleico
RNAm Ácido ribonucleico mensageiro
RPMI Meio de cultura RPMI
s.c. Subcutâneo
9
Th2 linfócitos T helper 2
TALD talidomida
Tg Tioglicolato
TGF ..Fator transformador de crescimento
TNF ..Fator de necrose tumoral
TNFR1 Receptor 1 do fator de necrose tumoral
TNFR1 Receptor 1 do fator de necrose tumoral
sTNFR1 receptor solúvel 1 do fator de necrose tumoral
sTNFR2 receptor solúvel 2 do fator de necrose tumoral
UI .Unidade (s) internacional (is)
v/v volume por volume
Zym Zymosan
( alfa
( beta
( Gama
(g Micrograma
(l Microlitro
ºC Graus Célsius
< menor
10
LISTA DE FIGURAS E ILUSTRAÇÕES
Ilustração 1.1. A redução da população de células residentes diminui
significativamente a atividade nociceptiva do zymosan (ZYM) e do ácido
acético mas não a do Iloprost
(ILO)....................................................................
16
Ilustração 1.2. O pré-tratamento com tioglicolato aumenta
significativamente a atividade nociceptiva do zymosan (ZYM) e do ácido
acético mas não a do Iloprost (ILO).
....................................................................................................
16
Ilustração 1.3. IMediadores Inflamatórios liberados por mastócitos
ativados....
17
Ilustração 1.4. O pré-tratamento crônico com o composto 48/80 diminui
significativamente a atividade nociceptiva do zymosan (ZYM) e do ácido
acético, mas não a do iloprost
(ILO)....................................................................
17
Ilustração 1.5. Efeito antinociceptivo da IL-4, IL-10 e IL-13 sobre as
contorções abdominais e incapacitação articular induzida por zymosan
(ZYM).
26
Ilustração 1.6. Efeito amplificador dos anticorpos específicos contra IL-4,
IL-10 e IL-13 sobre a nocicepção induzida por zymosan nos modelos de
contorções abdominais e incapacitação articular.
..............................................
26
Ilustração 1.7. Fator de necrose tumoral (TNF) e a sinalização através dos
subtipos de receptores TNFR1 e TNFR2 (receptor para o TNF tipo 1 e
2).........
45
Ilustração 2.1. Teste de contorção abdominal em camundongos induzido
por zymosan, ácido acético ou
iloprost......................................................................
64
Ilustração 2.2. Teste de incapacitação articular em joelho de rato induzido
por
zymosan.........................................................................................................
.....
65
Ilustração 2.3. Teste da hiperalgesia mecânica em pata de rato (Randall-
11
Selitto modificado por Ferreira e Cols., 1978) induzida por diversos
estímulos.
66
Ilustração 2.4. Teste da placa quente em
camundongos...................................
67
Ilustração 2.5. Obtenção do sobrenadante de cultura de células
peritoneais estimuladas in vivo com
zymosan.......................................................................
68
Ilustração 2.6. Obtenção do sobrenadante do lavado articular da cavidade
articular de joelho ratos estimulados com
zymosan............................................
69
Ilustração 2.7. Obtenção de peças histológicas para realização do ensaio
de
imunohistoquímica..........................................................................................
.....
70
FIGURA 1. Efeito antinociceptivo da talidomida nas contorções abdominais
induzidas por ácido acético ou zymosan.
...........................................................
73
FIGURA 2. Efeito antinociceptivo da talidomida sobre a incapacitação
articular induzida por
zymosan..........................................................................................
74
FIGURA 3. Efeito da administração sistêmica de talidomida sobre a
intensidade de hiperalgesia (Δ tempo de reação) induzida por
carragenina.......
75
FIIGURA 4. Efeito da administração sistêmica de talidomida sobre a
intensidade de edema induzido por carragenina.
...............................................
76
FIGURA 5. Efeito do pós-tratamento com talidomida sobre a intensidade
de hiperalgesia (Δ tempo de reação) induzida por carragenina.
..............................
77
FIGURA 6. Efeito da administração sistêmica de talidomida sobre a
intensidade de hiperalgesia (Δ tempo de reação) induzida por bradicinina,
fator de necrose tumoral, ou prostaglandina E
2
.
.......................................................
79
12
FIGURA 7 Efeito dos anticorpos anti-interleucina-4 ou anti-interleucina-10
no efeito anti-hiperalgésico da talidomida.
.............................................................
80
FIGURA 8. Efeito da naloxona sobre a atividade antinociceptiva da
talidomida e morfina nas contorções abdominais induzidas por
zymosan...........................
81
FIGURA 9. Efeito da talidomida sobre o tempo de reação no teste da placa
quente.
................................................................................................................
83
FIGURA 10. Efeito da talidomida na liberação do fator de necrose tumoral
(TNF), interleucina-1 beta (IL-1β) e interleucina-10 (IL-10) por células
peritoneais residentes estimuladas in vivo com zymosan.
..................................
84
FIGURA.11. Efeito da talidomida sobre a liberação do fator de necrose
tumoral (TNF), interleucina-1beta (IL-1β), interleucina-10 (IL-10),
interleucina-6 (IL-6) ou CINC-1 na cavidade articular de joelho de ratos
estimulados com zymosan.
............................................................................................................
85
FIGURA 12. Efeito da administração sistêmica de talidomida sobre o nível
de RNAm para TNF in vivo de células colhidas da cavidade peritoneal de
camundongos injetados com zymosan.
.............................................................
87
FIGURA 13. Tratamento com talidomida reduz a produção do fator de
necrose tumoral demonstrado por reação imunohistoquímica em pele de
pata de rato estimulada com
carragenina................................................................................
88
FIGURA 14. Efeito antinociceptivo da pentoxifilina nas contorções
abdominais induzidas por ácido acético ou zymosan.
...........................................................
90
FIGURA 15. Efeito da pentoxifilina abdominais induzidas por zymosan (0.5
mg/animal) ou iloprost (0.5 mg/animal).
..............................................................
91
FIGURA 16. Efeito antinociceptivo da pentoxifilina sobre a incapacitação
13
articular induzida por zymosan.
..........................................................................
92
FIGURA 17. Efeito da administração sistêmica de pentoxifilina sobre a
intensidade de hiperalgesia (Δ tempo de reação) induzida por carragenina.
.....
94
FIGURA 18. Efeito da administração local de pentoxifilina sobre a
intensidade de hiperalgesia (Δ tempo de reação) induzida por carragenina.
........................
95
FIGURA 19. Efeito do pós-tratamento com pentoxifilina sobre a
intensidade de hiperalgesia (Δ tempo de reação) induzida por carragenina.
.............................
96
FIGURA 20. Efeito da administração local de pentoxifilina sobre a
intensidade de hiperalgesia (Δ tempo de reação) induzida por bradicinina,
fator de necrose tumoral, interleucina-1 ou prostaglandina E
2
.
....................................................
97
FIGURA 21. Efeito da naloxona sobre a atividade antinociceptiva da
pentoxifilina e morfina nas contorções abdominais induzidas por zymosan.
......
99
FIGURA 22. Efeito da pentoxifilina sobre o tempo de reação no teste da
placa quente.
...............................................................................................................
10
0
FIGURA 23. Efeito da pentoxifilina na liberação do fator de necrose
tumoral (TNF), interleucina-1beta (IL-1β) e interleucina-10 (IL-10) por
células peritoneais residentes estimuladas in vivo com zymosan.
..................................
10
1
FIGURA 24. Efeito da pentoxifilina sobre a liberação do fator de necrose
tumoral (TNF), interleucina-1beta (IL-1β), interleucina-10 (IL-10),
interleucina-6 (IL-6) ou CINC-1 na cavidade articular de joelho de ratos
estimulados co.m zymosan.
.............................................................................................................
10
3
Figura 25. Tratamento com pentoxifilina reduz a produção do fator de
necrose tumoral demonstrado por reação imunohistoquímica em pele de
pata de rato estimulada com
10
4
14
carragenina................................................................................
FIGURA 26. Efeito antinociceptivo da clorpromazina nas contorções
abdominais induzidas por ácido acético ou zymosan.
.......................................
10
6
FIGURA 27. Efeito da clorpromazina nas contorções abdominais induzidas
por iloprost.
..........................................................................................................
10
7
FIGURA 28. Efeito antinociceptivo da clorpromazina sobre a incapacitação
articular induzida por zymosan.
..........................................................................
10
8
FIGURA 29. Efeito da administração sistêmica de clorpromazina sobre a
intensidade de hiperalgesia (Δ tempo de reação) induzida por carragenina.
.....
11
0
FIGURA 30. Efeito da administração local de clorpromazina sobre a
intensidade de hiperalgesia (Δ tempo de reação) induzida por carragenina.
.....
11
1
FIGURA 31. Efeito do pós-tratamento com clorpromazina sobre a
intensidade de hiperalgesia (Δ tempo de reação) induzida por carragenina.
.........................
11
2
FIGURA 32. Efeito da administração sistêmica de clorpromazina sobre a
intensidade de hiperalgesia (Δ tempo de reação) induzida por bradicinina,
fator de necrose tumoral, interleucina-1 ou prostaglandina E
2
.
..................................
11
3
FIGURA 33. Efeito da naloxona sobre a atividade antinociceptiva da
clorpromazina e morfina nas contorções abdominais induzidas por
zymosan....
11
5
FIGURA 34. Efeito da clorpromazina sobre o tempo de reação no teste da
placa quente.
......................................................................................................
11
6
FIGURA 35. Efeito da clorpromazina na liberação do fator de necrose
tumoral (TNF), interleucina-1beta (IL-1β) e interleucina-10 (IL-10) por
células peritoneais residentes estimuladas in vivo com
zymosan....................................
11
7
15
FIGURA 36. Efeito da clorpromazina sobre a liberação do fator de necrose
tumoral (TNF), interleucina-1beta (IL-1β), interleucina-10 (IL-10),
interleucina-6 (IL-6) ou CINC-1 na cavidade articular de joelho de ratos
estimulados com zymosan.
............................................................................................................
11
9
FIGURA 37. Tratamento com clorpromazina reduz a produção do fator de
necrose tumoral demonstrado por reação imunohistoquímica em pele de
pata de rato estimulada com carragenina.
..................................................................
12
0
RESUMO
Avaliação da Atividade Antinociceptiva da Talidomida, Pentoxifilina e
Clorpromazina em Modelos Experimentais. Mariana Lima Vale, Tese apresentada
ao Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de
Doutor em Farmacologia. Orientador: Prof. Dr. Ronaldo de Albuquerque Ribeiro, Co-
orientador: Prof. Dr. Fernando de Queirós Cunha, Fortaleza, 2003.
Já está estabelecido que a liberação de produtos da ciclooxigenase e aminas
simpatomiméticas, medidores finais da hiperalgesia inflamatória é precedido pela
geração de uma cascata de citocinas pró-inflamatórias e nociceptivas. Dados
anteriores demonstraram que a ativação desta cascata de citocinas é dependente
também da presença de células residentes como macrófagos e mastócitos no local da
injúria. Talidomida (TALD), pentoxifilina (PTX) e clorpromazina (CLP) são drogas que
dentre outras funções são descritas como imunomoduladoras por modularem a
produção de algumas citocinas e vem chamando atenção pelas suas propriedades
16
antiinflamatórias na prática clínica e em modelos experimentais. Com base nesses
achados, o objetivo do presente trabalho foi estudar uma possível atividade
antinociceptiva de TALD, PTX e CLP correlacionando à essa atividade
imunomodulatória. Para tanto injetou-se por via i.p. talidomida (TALD; 5-45 mg;kg),
pentoxifilina (PTX; 0.5 – 45 mg\kg) ou clorpromazina (CLP; 0.1 – 1 mg\kg) 30 min
antes da administração de ácido acético (AAc), zymosan (Zym) ou iloprost (ILO) para o
teste de contorções abdominais em camundongos (CA), ou 30 min antes do Zym
intrarticular no teste da incapacitação articular (IA) em joelho de rato (teste de
nocicepção articular). TALD, PTX e CLP também foram testadas em diferentes doses
por via sistêmica (i.p.) ou local (intraplantar) no teste da hiperalgesia (HYP) mecânica
induzida por carragenina (Cg), bradicinina (Bk), fator de necrose tumoral (TNF),
interleucina-1 (IL-1) ou prostaglandina E
2
(PGE
2
) e no teste da placa quente (PQ).
TALD, PTX ou CLP também foi injetada em camundongos 30 min antes do zymosan e
após 15 min foi feita a coleta do fluido peritoneal contendo células residentes onde o
mesmo foi posto bem cultura para avaliar a produção de citocinas por essas células. O
fluido articular de ratos tratados com TALD, PTX ou CLP e estimulados com Zym
intrarticular também foi analisado no mesmo sentido. Nossos resultados demonstram
que TALD, PTX e CLP são antinociceptivas tanto no modelo de CA induzidas por
zymosan (85.6, 82.9 e 63.7% de inibição, respectivamente, p<0.001) ou AAc (60.3,
89.8 e 89% de inibição, efeito máximo respectivamente, p<0.001), como também a IA
induzida por Zym (75, 89 e 99% de inibição, respectivamente, p<0.001), mas não nas
CA induzidas por ILO . TALD foi capaz de inibir o efeito hiperalgésico da Cg (78.6%) e
Bk (82.4%), mas não o de TNF e PGE
2
. PTX inibiu a HYP induzida por Cg (73.3%), Bk
(55.2%), TNF (45.6%), mas não a por IL-1 ou PGE
2
. CLP inibiu a HYP induzida por
todos os estímulos, mas em graus diferentes (68.16, 58.5, 42, 38.8 e 21.1%de inibição
respectivamente para Cg, Bk, TNF, IL-1 e PGE
2
). Estes efeitos antinociceptivos
parecem ser de domínio periférico visto que as drogas não modificaram o tempo de
reação na PQ e não dependem da liberação de opióides endógenos, pois naloxona
não reverteu a atividade antinociceptiva das drogas. Contudo a atividade
antinociceptiva parece depender da inibição da liberação de citocinas pró-nociceptivas
por células residentes visto que TALD, PTX e CLP inibiram a liberação de TNF (100,
85 e 54.4% de inibição respectivamente p< 0.001) e IL-1 (97% de inibição para PTX)
por células peritoneais residentes de camundongos como também a produção de TNF
(77 e 87.5%de inibição respectivamente para TALD e PTX) e IL-1 (47 e 32.6% de
inibição respectivamente para PTX e CLP) na cavidade articular de ratos estimulados
com Zym.
17
ABSTRACT
Study of the Antinociceptive activity of Thalidomide, Pentoxifillyne and
Chlorpromazine in Experimental Models. MARIANA LIMA VALE. Thesis submitted
as partial fulfillment of requirement to degree of Doctor in Pharmacology to the post -
graduation Pharmacology course of the Ceará Federal University. Superviser: Dr.
Ronaldo de Albuquerque Ribeiro, Co-Superviser: Dr. Fernando de Queirós Cunha,
Fortaleza 2003.
The release of cyclo-oxygenase products and sympathomimetic amines, the
final mediators of inflammatory pain, is preceded by the generation of pro-inflammatory
and nociceptive cytokines by resident cells. Recently drugs such as thalidomide
(TALD), pentoxifylline (PTX) and chlorpromazine (CLP), despite of other effects, have
been associated with immunomodulatory activity in clinical practice mainly for their
modulatory properties upon cytokine production. Since those drugs are able to inhibit
the production of pro-inflammatory cytokines and the pivotal role of resident cells in the
development of inflammatory pain we have decided to test the possibility of TALD, PTX
and CLP, to modulate inflammatory pain. TALD (5 – 45mg/kg), PTX (0.5 – 45mg/kg) or
CLP (0.1 – 1mg/kgl) was given 30 min before either acetic acid (AAc) or zymosan
(Zym) or iloprost (ILO) administration in the writhing model. TALD, PTX or CLP, at the
same doses were injected, i.p., 30 min before Zym (1 mg/animal; intra-articular) in the
zymosan-induced rat knee joint incapacitation test (JI). Those drugs were also tested
upon hyperalgesic effect of carrageenin (Cg), bradykinin (Bk), tumor necrosis factor
(TNF), interleukin (IL) -1 and prostaglandin E
2
(PGE
2
) on mechanical hyperalgesia test
(HYP). Doses of those drugs that exerted maximum effect in the writhing test were also
injected 30 min before the hot plate test. These same doses were injected ip before
naloxone administration in the AAc-induced writhing model in mice. Cytokines levels
(TNF, IL-1, IL-10 and IL-4) were determined in the supernatant of a macrophage
culture, which were collected from peritoneal fluid of mice treated with Zym and pre-
treated with the drugs under test and in the supernatant of articular fluid of rats pre-
treated with the drugs and stimulated with Zym (TNF, IL-1β, IL-10, IL-6 and CINC-1).
Our results showed that TALD, PTX and CLP inhibited the writhing response in mice
induced by AAc or Zym up to 60.3, 89.8 e 89%, and up to 85.6, 82.9 and 63.7%
respectively (p<0.001), but not the nociceptive response to ILO. Similar results were
observed in the JI induced by Zym: 75, 89 e 99% of inhibition, respectively (p<0.01).
TALD inhibited hyperalgesic effect of Cg (78.6%) and Bk (82.4%), but not the
hyperalgesic effect of TNF or PGE
2
. PTX inhibited Cg, TNF or Bk-induced HYP in 73.3,
55.2 and 45.6% of inhibition respectively, but not IL-1 or PGE
2
hyperalgesic activity.
CLP inhibited a hyperalgesic effect of all stimuli in different levels (68.16, 58.5, 42, 38.8
and 21.1% of inhibition for Cg, Bk, TNF, IL-1 e PGE
2,
respectively). The antinociceptive
activity of TALD, PTX and CLP seems to be peripheral, since these drugs presented no
effect in the reaction time of the animals on hot plate test. This antinociceptive effect
seems to have no relation with endogen opioid release since naloxone (opioid receptor
antagonist) had no effect in reverting the antinociceptive effect of these drugs in the
Zym-induced writhing in mice. The antinociceptive activities seems to be dependent of
the release inhibition of pro-nociceptive cytokines by resident cells since TALD, PTX
and CLP inhibited the release of TNF (100, 85 e 54.4%, respectively - p<0.005) and of
IL-1β (97%, PTX effect - p<0,01) by mice peritoneal resident cells as well as the
production of both TNF (77 e 87.5% by TALD and PTX respectively) and IL-1β (47 e
32.6% by PTX and CLP, respectively) in the articular cavity of ZYM stimulates rats.
18
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS..............................................................................
vi
LISTA DE FIGURAS E ILUSTRAÇÕES............................................................
x
RESUMO...........................................................................................................
xiv
ABSTRACT.......................................................................................................
xv
I. INTRODUÇÃO...............................................................................................
1
1. DOR........................................................... .................................................
2
1.1. Definição................................................................................................
2
1.2. Dor nociceptiva......................................................................................
3
1.3. Dor neuropática.....................................................................................
5
1.4. Dor visceral............................................................................................
6
2. DOR INFLAMATÓRIA.................................................................................
8
2.1. Aspectos gerais.....................................................................................
8
2.2. Mediadores da dor inflamatória.............................................................
8
3. PAPEL DE CÉLULAS RESIDENTES NA GERAÇÃO DA DOR..................
12
3.1. Macrófagos............................................................................................
12
3.2. Mastócitos.............................................................................................
13
4. MODULAÇÃO DA DOR POR CITOCINAS.................................................
18
4.1. Citocinas e indução da resposta nociceptiva........................................
19
4.2. Citocinas e inibição da resposta nociceptiva........................................
23
5. MANIPULAÇÃO FARMACOLÓGICA DA MEDIAÇÃO DA DOR POR
CITOCINAS.................................................................................................
25
5.1. Talidomida............................................................................................
27
5.2. Análogos da talidomida.........................................................................
33
5.3. Pentoxifilina...........................................................................................
33
5.4. Clorpromazina.......................................................................................
37
5.5. Agentes Biológicos................................................................................
41
6. JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS................................................................
46
II. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................
47
1. ANIMAIS........................................................... ..........................................
48
1.1. Camundongos e Ratos..........................................................................
48
2. APARELHOS E INSTRUMENTOS LABORATORIAIS................................
48
19
3. DROGAS, SOLUÇÕES, CITOCINAS E ANTISOROS................................
50
3.1. Drogas...................................................................................................
50
3.2. Soluções................................................................................................
51
3.3. Tampões utilizados para o ensaio imunoenzimático.............................
51
3.4. Tampões e soluções e reagentes utilizados para o ensaio de
imunohistoquímica...... .........................................................................
52
3.5. Meio de Cultura.....................................................................................
52
3.6. Citocinas e Antisoros............................................................................
53
3.6.1. Citocinas.....................................................................................
53
3.6.2. Anticorpos específicos.................................................................
53
4. TESTES NOCICEPTIVOS...........................................................................
54
4.1. Teste de contorção abdominal induzido por ácido acético ou
zymosan................................................................................................
54
4.2. Teste de incapacitação articular............................................................
54
4.3. Teste da hiperalgesia mecânica em pata de rato.................................
55
4.4. Teste da placa quente...........................................................................
55
5. MÉTODOS UTILIZADOS NA OBTENÇÃO DE FLUIDOS E TECIDOS
PARA ANÁLISE...........................................................................................
56
5.1. Obtenção do sobrenadante de cultura de macrófagos.........................
56
5.2. Coleta do lavado articular de joelho de rato..........................................
56
5.3. Coleta da pele de pata de rato..............................................................
56
6. DOSAGEM E IMUNOHISTOQUIMICA PARA A DETECÇÃO DE
CITOCINAS......... .......................................................................................
57
6.1. Dosagem de citocinas no sobrenadante de cultura de macrófago e
em sobrenadante de lavado articular. ..................................................
57
6.2. Imunohistoquímica em pele de pata de rato para a detecção de TNF
58
6.3. Reação em cadeia de polimerase por transcriptase reversa (RT-
PCR)......................................................................................................
59
7. PROTOCOLO EXPERIMENTAL.................................................................
60
7.1. Efeito da talidomida, pentoxifilina ou clorpromazina sobre as
contorções abdominais induzidas por ácido acético, zymosan ou
iloprost. .................................................................................................
60
20
7.2. Efeito da talidomida, pentoxifilina ou clorpromazina sobre a
incapacitação articular induzida por zymosan.......................................
70
7.3. Efeito do pré-tratamento com talidomida, pentoxifilina ou
clorpromazina sobre a hiperalgesia mecânica em pata de rato
induzida por diversos estímulos. .........................................................
70
7.4. Efeito do pré-tratamento com os anticorpos anti-interleucina-4 ou
anti-interleucina-10 na atividade de talidomida na hiperalgesia
induzida por carragenina.......................................................................
61
7.5. Efeito da talidomida e pentoxifilina no teste da placa quente...............
61
7.6. Efeito da naloxona sobre a atividade antinociceptiva da talidomida,
pentoxifilina ou da clorpromazina. .......................................................
61
7.7. Efeito da talidomida, pentoxifilina ou clorpromazina na liberação de
diversas citocinas por macrófagos peritoneais de camundongos
estimulados in vivo por zymosan. .......................................................
62
7.8. Efeito da talidomida, pentoxifilina ou clorpromazina sobre os níveis
de citocinas presentes no lavado articular do joelho de ratos
submetidos á artrite experimental por zymosan...................................
62
7.9. Efeito do pré-tratamento com talidomida, pentoxifilina ou
clorpromazina sobre a detecção de TNF por imunohistoquímica em
pele de rato estimulada com carragenina.............................................
62
8. ANÁLISE ESTATÍSTICA..............................................................................
63
III. RESULTADOS.............................................................................................
71
1. Inibição da atividade nociceptiva do zymosan e do acido acético por
talidomida no modelo de contorções abdominais. ......................................
72
2. Efeito do pré-tratamento com talidomida sobre a atividade nociceptiva do
zymosan no modelo de incapacitação articular em joelho de rato..............
72
3. Efeito antinociceptivo da talidomida sobre a intensidade de hiperalgesia
induzida por carragenina. ...........................................................................
72
4. Efeito da talidomida sobre a intensidade de hiperalgesia induzida por
bradicinina, fator de necrose tumoral (TNF) ou prostaglandina E
2
(PGE
2
).
78
5. Efeito dos anticorpos anti-interleucina-4 ou anti-interleucina-10 no efeito
anti-hiperalgésico da talidomida. ...............................................................
78
6. Efeito do pré-tratamento com naloxona na antinocicepção obtida pela
21
injeção prévia de talidomida nas contorções abdominais induzidas por
zymosan. .....................................................................................................
78
7. Efeito da talidomida sobre o tempo de reação no teste da placa quente
82
8. Efeito da talidomida na liberação de citocinas por macrófagos peritoneais
residentes murinos estimulados in vivo com zymosan................................
82
9. Efeito da talidomida na liberação de citocinas na cavidade articular de
joelhos de ratos estimulados com zymosan................................................
82
10. Efeito da talidomida nos níveis de RNAm para TNF induzido , in vivo, por
zymosan em camundongos.........................................................................
86
11. Efeito do tratamento com talidomida na produção do fator de necrose
tumoral por células residentes da pele da pata de rato estimuladas com
carragenina demonstrado por reação imunohistoquímica.
86
12. Efeito da pentoxifilina no teste de contorções abdominais induzido por
ácido acético, zymosan ou iloprost..............................................................
89
13. Efeito da pentoxifilina sobre a atividade nociceptiva do zymosan no
modelo de incapacitação articular...............................................................
89
14. Efeito da pentoxifilina sobre a hiperalgesia em pata de rato induzida por
carragenina..................................................................................................
93
15. Efeito do pré-tratamento com pentoxifilina sobre a hiperalgesia em pata
de rato induzida por bradicinina, fator de necrose tumoral (TNF),
interleucina-1 (IL-1) ou prostaglandina e
2
(PGE
2
). .....................................
93
16. Efeito do pré-tratamento com naloxona na antinocicepção obtida pela
injeção prévia de pentoxifilina nas contorções abdominais induzidas por
zymosan. ....................................................................................................
98
17. Efeito da pentoxifilina sobre o tempo de reação no teste da placa quente
98
18. Efeito da pentoxifilina na liberação de citocinas por macrófagos
peritoneais residentes murinos estimulados in vivo com zymosan.............
98
19. Efeito da pentoxifilina na liberação de citocinas para a cavidade articular
de joelhos de ratos estimulados com zymosan..........................................
102
20. Efeito do tratamento com pentoxifilina na produção do fator de necrose
tumoral por células residentes da pele da pata de rato estimuladas com
carragenina demonstrado por reação imunohistoquimica...........................
102
21. Efeito da clorpromazina no teste de contorções abdominais induzido por
22
zymosan, ácido acético ou iloprost. ...........................................................
105
22. Efeito do pré-tratamento com clorpromazina sobre a atividade
nociceptiva do zymosan no modelo de incapacitação articular em joelho
de rato. ........................................................................................................
105
23. Efeito da clorpromazina sobre a hiperalgesia em pata de rato induzida
por carragenina....... ....................................................................................
109
24. Efeito do pré-tratamento com clorpromazina sobre a hiperalgesia em
pata de rato induzida por bradicinina, fator de necrose tumoral (TNF),
interleucina-1 (IL-1) ou prostaglandina e
2
(PGE
2
). .....................................
109
25. Efeito do pré-tratamento com naloxona na antinocicepção obtida pela
injeção prévia de clorpromazina nas contorções abdominais induzidas
por zymosan................................................................................................
114
26. Efeito da clorpromazina sobre o tempo de reação no teste da placa
quente. .......................................................................................................
114
27. Efeito da clorpromazina na liberação de citocinas por macrófagos
peritoneais residentes murinos estimulados in vivo com zymosan.............
114
28. Efeito da clorpromazina na liberação de citocinas para a cavidade
articular de joelhos de ratos estimulados com zymosan.............................
118
29. Efeito do tratamento com clorpromazina na produção do fator de necrose
tumoral por células residentes da pele da pata de rato estimuladas com
carragenina demonstrado por reação imunohistoquímica. .........................
118
IV. DISCUSSÃO................................................................................................
121
V. CONCLUSÃO...............................................................................................
142
VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................
144
23
I. INTRODUÇÃO
24
1. DOR
1.1. Definição
A dor é uma condição inerente à vida. Foi considerada no passado um
fator “ofensivo” ao indivíduo; simplesmente uma fonte de sofrimento e
expressão de uma punição. O pensamento moderno identifica a dor como um
sinal de presença de estimulação nociceptiva, ou seja, um “defensor” que alerta
para a existência de algum comprometimento da integridade física ou funcional
do indivíduo, permitindo que mecanismos que propiciam prevenir ou limitar o
agravamento de lesões teciduais sejam acionados. Sem a participação das
unidades nociceptivas, a vida normal seria impossível. Na síndrome da
insensibilidade congênita à dor, a não percepção da ocorrência das lesões
teciduais acarreta seqüelas ou até a morte, muitas vezes, durante a primeira
idade ou na juventude (TEIXEIRA e FIGUERÓ, 2001).
Cumprido o seu valor biológico de alerta, a dor quando se torna
crônica pode constituir razão para incapacidade funcional, situação esta que
justifica medidas destinadas à sua supressão. Entretanto muitas vezes,
manifesta-se mesmo na ausência de agressões teciduais vigentes, tal como
ocorre em casos de neuropatia periférica ou central e em certas afecções
psicopatológicas (TEIXEIRA e FIGUERÓ, 2001).
A dor pode ser definida como sendo uma “experiência sensorial e
emocional desagradável, que é associada ou descrita em termos de lesões
teciduais. A dor é sempre subjetiva. Cada individuo utiliza a palavra dor de
acordo com o aprendizado frente a suas experiências prévias. É uma sensação
desagradável localizada em uma parte do corpo” (definição segundo a
International Association for the Study of Pain – IASP).
A dor manifesta-se através de dois componentes importantes: o
componente nociceptivo que é sensorial e discriminativo; e o componente
afetivo que é comportamental e associa-se às reações provocadas pela dor
(ansiedade, medo, pânico, sofrimento).
25
1.2. Dor nociceptiva
Nocicepção deriva do Latim (nocere + capêre), onde nocere significa
nocivo e capêre significa captar, receber. Ou seja, literalmente nocicepção
significa captação do nocivo. Refere-se à recepção de sinais pelo SNC,
evocado pela ativação de receptores sensoriais especializados que transmitem
informações (a transformação dos estímulos ambientais em potenciais de
ação) que são transferidas para o sistema nervoso central por vias nervosas
íntegras. Esses receptores são chamados de nociceptores e são representados
por terminações nervosas livres presentes em fibras aferentes sensitivas,
principalmente as fibras C e A-delta.
As fibras aferentes primárias cutâneas sensitivas podem ser
classificadas essencialmente em cinco tipos com base no diâmetro, estrutura e
velocidade de condução. As fibras C são finas, amielínicas e de condução
lenta; as fibras A-delta são médias, pouco mielinizadas e de condução
intermediária; e as fibras A-beta são calibrosas, mielinizadas e de condução
rápida. Há ainda as fibras A alfa e as fibras A gama que são de grosso calibre e
estão associadas a propagação de estímulos táteis. Cada classe de fibras
aferentes codifica informações sensoriais, mas diferem na sensibilidade a
estímulos nocivos ou não nocivos. Em condições normais apenas as fibras A-
delta e C são capazes de transmitir informação nociceptiva (MILLAN, 1999).
Generalizando, durante a exposição a um estímulo nocivo as fibras
mielinizadas A-delta iniciam uma fase rápida, primária da dor que é aguda por
natureza, enquanto que, as fibras C invocam a segunda fase que é a de dor
latejante e lenta. Os receptores de alto limiar localizados geralmente nas fibras
C codificam informações pertencentes a estímulos nocivos mecânicos,
químicos ou térmicos. É abundante o tipo de nociceptores que respondem a
estímulos nocivos térmicos e mecânicos e o termo polimodal reserva-se à
população de nociceptores que responde também a estímulos químicos
irritantes além dos térmicos e mecânicos.
A atividade dos receptores nociceptivos é modulada pela ação de
substâncias químicas denominadas de algiogênicas presentes no ambiente
tecidual que são liberadas no local frente a algum estímulo. Essas substâncias
algiogênicas são liberadas por diversas fontes como mastócitos, macrófagos,
vasos sanguíneos, células traumatizadas e são responsáveis pela hiperalgesia
26
observada em lesões traumáticas, inflamatórias e isquêmicas. Então além de
estimular diretamente os nociceptores essas substâncias também podem
torna-los sensíveis a estímulos térmicos e mecânicos de baixa intensidade.
Dentre as principais substancias algiogênicas encontramos: aceticolina,
prostaglandinas, bradicinina, histamina, citocinas, serotonina, substância P,
neurotrofinas, radicais ácidos, íons potássio dentre outras. O peptídeo
relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) e a substância P podem ser
liberadas retrogradamente pelas terminações nervosas nociceptivas e podem,
indiretamente, participar da liberação de vários mediadores químicos por
células, na chamada inflamação neurogênica.
Há uma outra classe de nociceptor que recentemente vem atraindo
interesse no contexto da dor prolongada: os chamados “silenciosos” ou
“nociceptores dormentes”. Entretanto nenhuma classe de nociceptores
apresenta atividade espontânea, o termo “silencioso” refere-se a uma porção
(talvez 10-20%) de fibras C amielínicas na pele, articulações e vísceras que
normalmente não são responsivas a estímulos nocivos agudos. Nas condições
de inflamação e injúria tecidual, esse nociceptores silenciosos são
sensibilizados e ativados por uma variedade de mediadores químicos
(CERVERO et al., 1994). O recrutamento desses nociceptores durante os
estados patológicos deve contribuir para a somação temporal e espacial
aumentando o envio de informação das fibras C para o corno dorsal da medula
espinhal. Por exemplo, fibras aferentes primárias em articulações artríticas
desenvolvem tanto atividade espontânea como emitem sinais em resposta a
movimentos articulares antes inofensivos, e a inflamação de vísceras pode
aumentar enormemente sua sensibilidade para estímulos mecânicos inócuos.
A ativação de nociceptores silenciosos pode explicar a natureza distinta
dos estados inflamatórios dolorosos prolongados quando comparado à
exposição aguda a estímulos nocivos passageiros. De fato, o recrutamento de
nociceptores silenciosos promove uma importante contribuição para a
sensibilização e as mudanças de adaptação central que suportam a
hiperalgesia primária causada por inflamação tecidual (MILLAN, 1999).
O caminho entre a exposição inicial ao estímulo nocivo e a apreciação
consciente da dor é uma extraordinária complexa e interativa série de
mecanismos pelo qual o estímulo nocivo é codificado como mensagem
27
nociceptiva e é progressivamente transmitida aos e processada nas estruturas
cerebrais superiores. Tal evento modulatório ocorre na periferia, no corno
dorsal da medula espinhal (processamento primário), sítios supra espinhais
como o tálamo (processamento secundário), assim como nas estruturas
corticolímbicas.
1.3. Dor neuropática
Enquanto a dor nociceptiva é gerada por estímulos que acionam
unidades nociceptivas periféricas e centrais onde é necessária a integridade
das vias sensitivas, a dor por desaferentação ou dor neuropática refere-se a
dor ocasionada por lesão neural periférica ou central. Pode ser causada por
afecções traumáticas físicas ou químicas, doenças inflamatórias ou infecciosas
degenerativas, oncopáticas, vasculares, tóxicas etc. O dano parcial ou mesmo
a destruição de nervos periféricos deve estar associado a uma variedade de
síndromes incluindo: o aumento da sensibilidade a estímulo nocivo
(hiperalgesia), reposta dolorosa a estímulos mecânicos ou frios normalmente
inócuos (alodinia), sensações parestésicas ou disestésicas e dor espontânea.
Os mecanismos periféricos integrados no terminal nociceptivo dos aferentes
primários sensitivos parecem ser os principais causadores da hiperalgesia
primária fenômeno ligado a dor nociceptiva inflamatória, enquanto que a dor
neuropática e a hiperalgesia secundária parecem estar largamente ligadas a
mudanças ocorrendo ao longo da fibra aferente primária, como por exemplo o
traumatismo da fibra (MILLAN, 1999).
Para que a informação sensitiva seja processada de modo adequado
as propriedades funcionais dos axônios e das unidades centrais devem ser
mantidas íntegras. Havendo modificações na função ou na anatomia das
terminações nervosas (ex: modificação de canais iônicos), troncos nervosos
periféricos ou das vias de condução e de processamento central da informação
sensitiva, pode-se manifestar a dor espontânea ou a gerada por estímulos não
nocivos.
Os mecanismos mais importantes envolvidos na gênese da dor por
desaferentação são a atividade neuronal ectópica nos neurônios lesados e nos
gânglios das raízes sensitivas; as correntes efáticas; a sensibilização das
28
unidades neuronais centrais; o desenvolvimento de sinapses aberrantes e as
reações físicas, psíquicas e neuroendócrinas associadas à dor e à
incapacidade (TEIXEIRA e FIGUEIRÓ, 2001).
1.4. Dor Visceral
A dor visceral é a forma mais comum de dor produzida por doença e
uma das mais freqüentes razões pelas quais os pacientes procuram
atendimento médico. A visão convencional trata a dor visceral como uma
variante simples da dor somática, uma visão baseada na crença de que um
único mecanismo neurológico é responsável por todos os tipos de dor. No
entanto, apesar de os dois processos possuírem muitos fatores em comum
também possuem importantes pontos diferentes. Este tema foi extensamente
estudado por CERVERO et al. durante vários anos e em uma revisão atual o
autor aponta as principais características e as novas descobertas feitas na área
(CERVERO e LAIRD, 1999)
Os mecanismos neurológicos da dor visceral diferem daqueles
observados na dor somática além da percepção e processamento psicológico
serem distintos na dor visceral.
A dor visceral possui cinco importantes características clínicas: (1) não
é evocada por todas s vísceras (órgãos sólidos como o fígado e rim não são
sensitivos para a dor; (2) nem sempre está associada à injúria visceral (cortar o
intestino não causa dor, por outro lado um estiramento da bexiga, o que não
caracteriza injúria, causa dor); (3) é uma dor difusa e pouco localizada; (4) é
referida para outras localizações e (5) é acompanhada de reflexos motores e
autonômicos como náusea, vômito e tensão dos músculos lombares como
ocorre nas cólicas renais.
O fato de a dor não poder ser evocada por todas as víscera e que não
está necessariamente associada à injúria levou a noção de que em algumas
vísceras falta inervação aferente. Agora sabe-se que na verdade esse
fenômeno é devido às propriedades funcionais dos receptores periféricos dos
nervos presentes em certos órgãos viscerais e pelo fato de que várias vísceras
são inervadas por receptores que não evocam percepção nociva e portanto
não são receptores sensitivos no sentido estrito.
29
Estudos mais recentes indicam que há duas classes distintas de
receptores sensoriais nociceptivos que inervam os órgãos internos. O primeiro
tipo possui alto limiar para estímulos naturais (de maioria mecânicos) e são
ativados por estímulos potencialmente nocivos. Estes receptores foram
identificados no coração, veias, pulmões, vias aéreas, esôfago, intestino, cólon,
bexiga e uretra. (CERVERO, 1996; GEBHART e SENGUPTA, 1994). A
segunda classe de nociceptores codifica a intensidade do estímulo, possuem
baixo limiar para estímulos naturais (na maioria mecânicos) e detém uma
função codificadora que abrange a classificação da intensidade de estímulo de
inócuo a nocivo. Estes receptores constituem uma categoria homogênea que
codificam a intensidade do estímulo de acordo com a magnitude de sua
descarga. Já foram localizados no coração, esôfago, cólon, bexiga e testículo
(CERVERO, 1996; GEBHART e SENGUPTA, 1994). As evidências mostram
que receptores de alto limiar e os receptores codificadores de intensidade
contribuem para a captação dos eventos nocivos nas vísceras.
No que diz respeito aos eventos bioquímicos que ocorrem na dor
visceral há duas classes bioquímicas de fibras aferentes primárias amielínicas
de fino calibre que inervam ao tecidos somáticos e viscerais: a primeira classe
contem neurônios que expressam peptídeos neurotransmissores como a
substância P e o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) e
segunda classe de fibras não expressam esses peptídeos (SNIDER e
McMAHON, 1998). As fibras somáticas incluem as duas classes bioquímicas
de neurônios mas o papel funcional das duas classes ainda não está bem
esclarecido. Em contraste a maioria das fibras aferentes amielínicas viscerais
parecem pertencer ao do tipo que expressa os peptídeos neurotransmissores
(PERRY e LAWSON, 1998; SEMENENKO e CERVERO, 1992). Esta
descoberta tem importante implicação para o desenvolvimento futuro de
terapias para a dor visceral, pois sugere que peptídeos são particularmente
importantes na transmissão da informação à partir da víscera.
30
2. DOR INFLAMATÓRIA
2.1. Aspectos gerais
A dor nos estados inflamatórios está geralmente associada à presença de
mediadores químicos que são liberados por células não neuronais no local da
injúria. Dependendo da natureza do mediador este poderá apenas sensibilizar,
isto é, diminuir o limiar de ativação do nociceptor, ativar o receptor ou então
ambas as coisas. A sensibilização do nociceptor vem sendo denominada
clinicamente como hiperalgesia, caracterizada pelo abaixamento do limiar a
estímulos térmicos, mecânicos ou químicos na área inflamada. Os receptores
descritos geralmente associados à essa sensação de dor são os polimoidais de
alto limiar pertencentes a fibras C amielínicas.
2.2. Mediadores da dor inflamatória
Durante o processo inflamatório várias etapas parecem estar associadas
à ação de substâncias endógenas que modificam fisiológica e bioquimicamente
a estrutura do local afetado. Essas substâncias químicas, geralmente
chamadas de mediadores, são inicialmente liberadas no local da injúria por
uma reação de alarme, onde macrófagos parecem ter um papel crucial
(FERREIRA, 1980). Estas células sinalizam a presença de material estranho ou
a injúria através da liberação de mediadores clássicos da inflamação e/ou de
citocinas. Esses mediadores e citocinas recrutam células migrantes como
leucócitos polimorfonucleares, macrófagos, eosinófilos e/ou linfócitos que
possuem um papel amplificador no desenvolvimento da resposta inflamatória.
A ação de mediadores e citocinas em receptores específicos sinalizam a
resposta tecidual, os mecanismos de defesa, e produzem os sintomas da
inflamação do qual a dor tem seu papel particular (FERREIRA, 1993).
Os mediadores associados á dor no processo inflamatório podem ser
classificados em dois tipos: (1) aqueles que causam a sensibilização do
nociceptor (hiperalgésicos) e (2) aqueles que causam a sua ativação direta,
provocando a dor declarada em humanos, ou o comportamento característico
em animais experimentais.
31
Mediadores hiperalgésicos
A sensibilização dos receptores da dor vem sendo denominador comum
da dor inflamatória. Essa sensibilização dos nociceptores leva a um estado
conhecido como hiperalgesia\alodinia. Após a sensibilização, estímulos que
antes eram pouco efetivos ou totalmente inefetivos agora causam dor
declarada em humanos ou comportamento característico em animais de
experimentação. A hiperalgesia pode ser classificada como imediata, tardia ou
persistente dependendo da duração do platô. Prostaciclina (PGI
2
) produz
hiperalgesia imediata, atingindo o pico em 30 min e declinando com 1h de sua
injeção, sem obter platô. Hiperalgesia tardia pode ser induzida por PGE
2
e
aminas simpatomiméticas (FERREIRA et al., 1978; NAKAMURA e FERREIRA,
1987) a qual tem evolução lenta, atinge o pico após 2 a 3 horas seguido de um
platô de 2 horas e declina em seguida. Hiperalgesia persistente é gerada por
períodos freqüentes de sensibilização de nociceptor e tem duração de
semanas. A injeção sucessiva diária de PGE
2
ou dopamina induz hiperalgesia
persistente (FERREIRA et al., 1990).
Os mecanismos associados à hiperalgesia inflamatória vem sendo
estudados e há evidências de que mediadores capazes de aumentar a
concentração intracelular de adenosina monofosfato cíclico (AMPc) e do íon
cálcio (Ca
++
) estão associados com a sensibilização dos nociceptores. Foi
demonstrado que, a administração de dibutiryl AMPc (um análogo de AMPc
capaz de atravessar a membrana plasmática) ou Ca
++
causa hiperalgesia
quando injetada em pata de rato (FERREIRA & NAKAMURA, 1979a). A mesma
evidência foi suportada por outros autores em outros modelos (FOLLENFANT
et al., 1990; TAIWO et al., 1989). Prostaglandinas e aminas simpatomiméticas
(dopamina ou noradrenalina) são mediadores conhecidos por estimular a
síntese de AMPc neuronal e já foram comprovados como substâncias que
causam sensibilização de nociceptores (WIESENFELD-HALLIN e HALLIN,
1984). Em 1972 FERREIRA demonstrou, no modelo de hiperalgesia plantar em
ratos, que a injeção local de prostaglandina causa hiperalgesia e que drogas
inibidoras da ciclooxigenase inibem esse efeito hiperalgésico. Da mesma
maneira, foi demonstrado que a injeção de agonistas adrenérgicos (dopamina,
adrenalina, isoprenalina) causava hiperalgesia em pata de rato e que o pré-
32
tratamento com bloqueadores adrenérgicos foi capaz de inibir essa
hiperalgesia como também aquela induzida por carragenina. Isso comprovou
que além de um componente eicosanóide, há um componente simpático
participando da sensibilização do nociceptor durante o processo inflamatório,
provavelmente mediado pelo receptor D
1
da dopamina. No entanto o tipo de
receptor envolvido pode variar de acordo com o modelo experimental e com o
tipo de animal utilizado (NAKAMURA & FERREIRA, 1987).
A importância dos dois tipos de mediadores na dor inflamatória foi
suportada por outros autores em outros modelos experimentais como o de
contorções abdominais induzidas por ácido acético e zymosan (DUARTE et al.,
1988; THOMAZZI, 1996). Em adição, mediadores capazes de estimular a
síntese de prostaglandinas ou de aminas simpatomiméticas são também ditos
hiperalgésicos como é o caso de citocinas como IL-1, TNF e IL-8. E ainda,
mediadores que estimulam a síntese dessas citocinas hiperalgésicas como é o
caso da bradicinina, também podem entrar nessa mesma classificação.
No entanto, há um outro sistema que parece participar da regulação dos
receptores da dor durante a inflamação, dessa vez, aumentando o limiar de
excitabilidade dos nociceptores. O bloqueio direto da hiperalgesia, já instalada,
induzida por prostaglandina E
2
(PGE
2
) foi observado após a administração local
de pequenas doses de dibutiril guanosina monofosfato cíclico (Db-GMPc)
(FERREIRA & NAKAMURA., 1979b) ou de substâncias que estimulam a
guanilato ciclase neuronal como por exemplo carbacol e geradores de óxido
nítrico (DUARTE et al., 1992). Parece que a regulação funcional de
nociceptores depende do equilíbrio entre as concentrações de AMPc e GMPc.
Mediadores que ativam diretamente o nociceptor
Dentre os mediadores capazes de ativar diretamente o nociceptor, a
bradicinina merece um papel de destaque. A injeção subcutânea de
bradicinina, em humanos, vem sendo há muito tempo associada à
manifestação de dor (ARMSTRONG et al., 1953; SICUTERI et al., 1965;
FERREIRA, 1972). Mas também já foi demonstrado que bradicinina em alguns
modelos experimentais, causa um posterior efeito hiperalgésico demorado.
Sugeriu-se que esse efeito hiperalgésico era mediado pela liberação de
prostanóides, pois foi inibido pela administração de indometacina (inibidor da
33
cicloxigenase), contudo, tal efeito não estava associado à dor declarada
(TAIWO & LEVINE, 1988; STERANKA et al., 1987; 1988).
Como já foi visto, a bradicinina parece ter um duplo papel na modulação
da dor, pois foi descrita como substância capaz de ativar diretamente o
nociceptor e como um mediador hiperalgésico. Isso pode ser explicado pela
sua ligação a diferentes tipos de receptores. Já foram descritos até 4 tipos de
receptores para a bradicinina (Bk
1
- Bk
4
) mas dois deles, Bk
1
e Bk
2 ,
merecem
destaque na modulação da dor inflamatória. O receptor Bk
2
foi associado com
a ativação direta de fibras aferentes finas que foram descritas como condutoras
de estímulos da nocicepção (STERANKA e BURCH, 1991; FARMER e
BURCH, 1992). Entretanto, em um estudo mais recente, esse receptor foi
associado também à sensibilização do nociceptor, mediada pela liberação de
uma cascata de citocinas que irão estimular a liberação de produtos da
cicloxigenase e de aminas simpatomiméticas (FERREIRA et al., 1993), tema
que será abordado posteriormente. Então o receptor Bk
2
já foi associado com
nocicepção e com hiperalgesia. Através do receptor Bk
1
foi demonstrada a
participação da bradicinina na ativação direta do nociceptor. O antagonista para
esse receptor da bradicinina foi capaz de inibir a fase imediata do teste da
formalina em camundongos (SHIBATA et al., 1989; CORREA E CALIXTO,
1993). Em estudos posteriores (1997), TONUSSI e FERREIRA, usando
antagonistas específicos para cada tipo de receptor, demonstraram, no modelo
de incapacitação articular em ratos, que bradicinina induzia a sensibilização do
nociceptor através dos receptores Bk
2
e que a ativação do nociceptor se devia
à sua ação em receptores Bk
1
.
Histamina, um mediador inflamatório conhecido, parece também estar
associado à resposta dolorosa. Encontra-se principalmente estocada em
grânulos no interior de mastócitos e é um dos principais mediadores da
resposta alérgica. É liberada também durante a reposta inflamatória e parece
participar da dor inflamatória por ativar diretamente o nociceptor. Entretanto,
sua liberação está associada principalmente com a sensação de prurido
(FERREIRA., 1980). Além da histamina e da bradicinina outros mediadores
parecem também participar da ativação das terminações nociceptivas durante
a inflamação dentre eles: serotonina, substância P, adenosina trifosfato (ATP) e
prótons H
+
(RANG et al., 1991).
34
Em muitos casos a ativação do receptor por esses mediadores, para
manifestação de dor, só é possível mediante a sensibilização prévia por
mediadores hiperalgésicos. Dentre esses mediadores hiperalgésicos as
citocinas merecem destaque.
3. PAPEL DE CÉLULAS RESIDENTES NA GERAÇÃO DA DOR AGUDA
3.1. Macrófagos
Macrófagos tradicionalmente são associados com inflamação crônica.
Na verdade, são residentes nos tecidos e constituem as células de alarme do
organismo (FERREIRA,1980). São hábeis em reconhecer o “não próprio” e
com isso promover a sinalização do processo inflamatório. Eles fazem isso por
meio de liberação de mediadores como prostaglandinas ou através da
liberação de citocinas, substâncias que agem tanto no local como
sistemicamente. São células altamente secretoras. Seus produtos, ao todo,
mais de 100 descritos, incluem enzimas, inibidores enzimáticos, proteínas do
sistema complemento, proteínas regulatórias tipo IL-1, IL-8, IL-6, fator
transformador de crescimento-β (TGF-β), além dos derivados do ácido
araquidônico (TAKAEMURA & WERB, 1984; NATHAN, 1987; ADAMS &
HAMILTON, 1989). A maioria dessas moléculas são importantes na reação
inflamatória, sendo que, a secreção de muitas delas depende do estado
metabólico do macrófago o que por sua vez depende da interação do mesmo
com seu microambiente (NATHAN , 1987).
Já foi descrito que macrófagos estimulados com lipopolissacarídeo
derivado de E. Coli (LPS) liberam, em cultura, um fator com um PM maior que
10 kDa que quando injetado intraperitonealmente, em camundongos, é capaz
de induzir contorções abdominais. Essa substância, liberada por monocamadas
de macrófagos, foi denominada fator nociceptivo derivado de macrófago (MNF)
(DE CAMPOS et al., 1988). Posteriormente a esses achados, foi demonstrado
que o MNF não é um produto da cicloxigenase, visto que inibidores dessa
enzima, como indometacina ou paracetamol, não afetam a sua liberação. Foi
sugerido então, que o MNF é um composto protéico, e que sua atividade é
devido à presença de citocinas como IL-1, IL-8 e TNF-α (THOMAZZI et al.,
35
1997), já descritas como componentes do sobrenadante de macrófagos
estimulados com LPS usado na preparação desse fator (RIBEIRO et al., 1991;
1995). Em adição, a indução de contorções abdominal por MNF foi inibida pelo
pré-tratamento dos animais com indometacina, paracetamol, guanetidina e
atenolol, indicando que a sua atividade nociceptiva resulta da indução da
liberação de produtos da cicloxigenase e de simpatomiméticos pelas citocinas
supracitadas (THOMAZZI et al., 1997).
A importância da presença de células residentes, como macrófagos, no
local da injúria para a sinalização dos eventos da resposta inflamatória já foi
descrita. Alguns achados nesse sentido demonstram que a intensidade de
neutrófilos que migram para a cavidade peritoneal de animais estimulados com
carragenina, zymosan e LPS (estímulos exógenos) ou com IL-1 e TNF-α
(estímulos endógenos) é proporcional ao número de macrófagos residentes
presente nessa cavidade (FACCIOLLI et al., 1990; CUNHA & FERREIRA,
1986; DE SOUZA & FERREIRA, 1985; SOUZA et al, 1988). Na dor inflamatória
a presença dessas células parece ser crucial da mesma forma. O nosso
laboratório tem demonstrado, nos últimos anos, a importância de macrófagos
residentes na nocicepção induzida por estímulos como ácido acético e
zymosan no modelo de contorções abdominais. Alguns resultados demonstram
que a depleção de células residentes da cavidade peritoneal, por lavagem
prévia, diminui significativamente a atividade nociceptiva do ácido acético e do
zymosan (ver ilustração 1) mas não a do iloprost (análogo estável da PGI
2
).
Quando aumentamos a população de macrófagos, através do pré-tratamento
dos animais com tioglicolato (ver ilustração 1.1 e 1.2), aumentam-se também o
número de contorções induzidas por esses estímulos (THOMAZZI, 1996,
RIBEIRO et al, 2000).
3.2. Mastócitos
Os mastócitos são células capazes de secretar e produzir mediadores
que podem modificar eventos vasculares e celulares. Exercem um importante
papel não só em reações alérgicas, mas também em inúmeros processos
inflamatórios. Frente a um estímulo inflamatório, mastócitos liberam
mediadores (i) alguns pré-formados, estocados em grânulos, como: histamina,
36
serotonina, proteases, heparina e TNF liberados imediatamente na presença
do estímulo; (ii) outros sintetizados a partir do metabolismo de lipídeos da
membrana (prostaglandinas, leucotrienos e fator de ativação plaquetária) que
são liberados em poucos minutos; (iii) e também são capazes de produzir
citocinas dentre elas: IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8 e TNF (ilustração 1.3).
Além disso, são capazes de liberar óxido nítrico (MANNAIONI et al, 1991;
BISSONNETTE et al, 1991; SALVEMINI et al, 1990; MASINI et al, 1991).
A produção de citocinas por mastócitos não é uma mera resposta aguda
à ativação celular mediada por IgE, ela persiste por várias horas após a
ativação por uma variedade de estímulos incluindo produtos bacterianos e
prostanóides. (MARSHALL et al., 1996). Outros autores demonstraram que
TNF liberado por mastócitos estimulados por IgE é derivado de duas diferentes
fontes: o pré-formado, que faz parte dos mediadores que são liberação nos
primeiros 10 min após a estimulação, e o recém sintetizado, que é
continuamente liberado após estimulação. Indicando que TNF representa um
tipo de mediador associado ao mastócito, célula que expressa bioatividade
através dos efeitos de produtos pré-formados e recém sintetizado (GORDON
AND GALLI, 1991).
A importância dos mastócitos na modulação da dor já é assunto
discutido na literatura. Mastócitos são uma parte constitutiva do eixo
“neuroimune” e já foi mostrado, através de microscopia eletrônica, que essas
células estão intimamente associadas à fibras nervosas sensitivas contendo
neuropeptídeos como substância P e o peptídeo relacionado ao gene da
calcitonina (CGRP) (STEAD et al., 1989) conhecidos por estarem envolvido na
fisiopatologia da dor (MAYER et al., 1994) e também por induzir a secreção de
mediadores por mastócitos humanos (LOWMAN et al., 1998). Além disso, os
mediadores liberados por mastócitos como histamina, bradicinina, serotonina e
citocinas são considerados moléculas pró-nociceptivas que ativam direta ou
indiretamente aferentes primários sensitivos induzindo hiperalgesia (LEVINE et
al., 1992).
Nesse sentido, dados nossos já publicados demonstram que mastócitos
residentes da cavidade peritoneal parecem importantes no desenvolvimento da
resposta dolorosa do ácido acético e zymosan. A depleção de mastócitos
peritoneais de camundongos pelo pré-tratamento com o composto 48/80
37
diminui significativamente a atividade nociceptiva do ácido acético e do
zymosan no modelo de contorções abdominais (ver ilustração 1.4; RIBEIRO et
al., 2000).
Mastócitos também devem contribuir para a migração de neutrófilos,
pois camundongos WBB6F1-W/W
v
(W/W
v
) deficientes de mastócitos mostraram
uma significante redução da migração de neutrófilos, que se segue à injeção de
zymosan, quando comparados com controles apropriados (cepa WWB6F1-+/+)
(RAO et al, 1994). Além disso, a migração de neutrófilos induzida por IL-8 ou
leucotrieno B
4
(LTB
4
) depende do número da população de mastócitos
residentes presentes no sítio do estímulo (RIBEIRO et al., 1991; RIBEIRO et
al., 1997).
38
39
40
4. MODULAÇÃO DA DOR POR CITOCINAS
Citocinas são polipeptídios simples, ou glicopeptídeos, de peso
molecular menor ou igual a 80 kDa, com propriedades pleiotrópicas e
regulatórias. São produzidas e secretadas por diversos tipos celulares em
resposta a uma infinidade de estímulos, para agir em receptores específicos
presentes em células alvo. Como são substâncias com diversas funções
regulatórias, tais moléculas não são produzidas de maneira contínua. A sua
produção é induzida ou suprimida por estímulos aos quais o organismo precisa
responder. Os vários tipos de citocinas incluem as interleucinas (IL), os fatores
de necrose tumoral (TNF), os interferons (IFN), os fatores estimulantes de
colônia da medula óssea e uma variedade de outros fatores de crescimento
(fatores de crescimento derivados de fibroblastos, da epiderme e das
plaquetas) (HOPKINS, 1990).
Alguns estudos têm demonstrado que citocinas podem influenciar a
direção de uma resposta imune por mecanismos parácrinos, endócrinos e
autócrinos. A capacidade que possuem de exercer efeito local, regional e
sistêmico é um ponto importante da biologia dessas substâncias, pois
demonstra o papel fisiopatológico desses mediadores na doença. A elevação
da temperatura, indução de sono e supressão do apetite são todas
manifestações sistêmicas de doença, porém, isso pode representar apenas
alterações dos níveis de citocinas que normalmente controlam a nossa
fisiologia circadiana. Um aumento dos níveis de citocinas que estão associadas
com a inflamação pode concomitantemente ativar células inflamatórias e alterar
a fisiologia normal. Ambos os eventos podem ser importantes no combate à
doença através dos mecanismos de defesa. Em adição, os efeitos sistêmicos
associados com inflamação severa podem ser exercidos pela produção
exagerada de citocinas e pela manutenção dessa produção pelas próprias
citocinas (KUNKEL et al., 1991).
Uma citocina tende a ter múltiplas células alvo e múltiplas funções, no
entanto, citocinas diferentes podem ter ações similares. A exposição de células
a duas ou mais citocinas diferentes pode levar a respostas qualitativamente
diferentes. Além disso, uma citocina pode aumentar (ou diminuir) a produção
de outra citocina (ou dela mesma) ou a expressão de receptores para outra
41
citocina e assim resultar em ações indiretas. Um exemplo disso seria a
demonstração da ação mitogênica da IL-1 em timócitos murinos, uma das
primeiras descobertas nesse sentido. Essa ação mitogênica envolve a
estimulação da produção de IL-2 por IL-1, sendo IL-2 a verdadeira molécula
efetora responsável pela estimulação da proliferação de timócitos (SMITH et
al., 1980). Esse efeito estimulatório de IL-1 na produção de IL-2 e o papel
dessa interação na proliferação de células T tornaram-se um paradigma para
as ações de muitas outras citocinas. Após isto, descobriu-se que IL-1 também
é capaz de estimular a produção de IL-6 (CONTENT et al., 1985), GM-CSF
(ZUCALI et al., 1986), IL-8 (MATSUSHIMA et al., 1989), e o fator ativador e
quimiotáxico para monócito, MCAF (LARSEN et al., 1989) em vários tipos
celulares. Todas essas citocinas são também induzidas por TNF o que está em
consonância com as inúmeras similaridades vistas entre as ações de IL-1 e
TNF (LE e VILCEK, 1987, NETA et al., 1992). Em monócitos tanto TNF como
IL-1 agem como agentes estimulatórios com resposta individual, e em adição,
eles estimulam a produção um do outro, o que amplifica a resposta individual
de ambos (NETA et al., 1992).
4.1. Citocinas e indução de resposta nociceptiva
A participação de citocinas na dor inflamatória é um assunto que
atualmente vem sendo muito estudado. Diversos autores utilizando modelos
distintos ou mesmo estudos clínicos vem sendo realizados no intuito de
demonstrar a participação desses mediadores na fisiopatologia da dor.
Observou-se a sua importância na hiperalgesia inflamatória. Como já foi dito, a
hiperalgesia parece ser causada pela ação de mediadores liberados por duas
vias distintas: a hiperalgesia causada por eicosanóides e a hiperalgesia
causada por simpáticomiméticos. Após essas confirmações, foi demonstrado
que a liberação de produtos da ciclooxigenase e de aminas simpatomiméticas
é subseqüente à liberação IL-1β (FERREIRA et al., 1988) e de IL-8 (CUNHA et
al., 1991) respectivamente, o que foi evidenciado no modelo de hiperalgesia
mecânica em pata de rato (Randall-Selitto modificado por FERREIRA et al.,
1978). Nesses estudos, a hiperalgesia induzida por IL-1β foi bloqueada por
indometacina (inibidor da ciclooxigenase), mas não por drogas simpatolíticas
42
(propranolol, atenolol ou guanetidina), enquanto que a hiperalgesia induzida
por IL-8 foi bloqueada pelo pré-tratamento com simpatolíticos, mas não por
indometacina. Ademais, a hiperalgesia induzida por carragenina foi
parcialmente bloqueada por ambos os tipos de drogas (CUNHA et al., 1991).
Sabendo da capacidade de várias citocinas em induzir a sua própria
produção e a produção de outras citocinas como: TNF que induz a produção de
IL-1 (DINARELLO et al., 1986), IL-1 que induz a produção de IL-1 (DINARELLO
et al., 1987), IL-6 (VAN DAMME et al., 1987), e IL-8 (STREITER et al., 1989),
esses mesmos autores CUNHA et al., em 1992a, demonstraram um papel de
pivô para o TNF na modulação da hiperalgesia induzida por carragenina no
mesmo modelo experimental. Foi proposto que TNF ativa uma cascata de
liberação de citocinas. A indução da liberação de IL-8 ou CINC-1
(quimioatraente par neutrófilo) por TNF leva à hiperalgesia mediada por
simpáticomiméticos, e a indução de IL-1β e IL-6 por TNF leva à hiperalgesia
mediada por produtos da ciclooxigenase. Isso foi confirmado pelo fato de que a
injeção de TNF mimetizou a capacidade da carragenina em induzir a produção
de IL-1β, IL-6 e IL-8/CINC-1 e também pelo fato de que uma única injeção com
o anticorpo anti-TNF foi capaz de abolir esse efeito da carragenina (CUNHA et
al., 1992a; LORENZETTI et al., 2002). As mesmas evidências foram
demonstradas no modelo de contorções abdominais (DUARTE et al., 1988;
THOMAZZI, 1996). A cascata de citocinas iniciada por TNF já havia sido
demostrada em um modelo de sepse experimental onde foi sugerido que TNF
exerce importante papel na propagação da cascata de mediadores que
participam da defesa do hospedeiro. Em 1990, FONG AND LOWRY, revisaram
tal assunto e concluíram que TNF: (i) é um dos primeiros mediadores
secretados em resposta a um estímulo nocivo; (ii) a sua administração a
animais e humanos induz a liberação de outros mediadores endógenos; (iii) a
neutralização da sua atividade diminui a liberação de outros mediadores
durante uma bacteriemia. Dentre os mediadores que são liberados em resposta
ao TNF estão as citocinas IL-1 e IL-6. Esta liberação ocorre em forma de
cascata. TNF é liberado após 15-30 min da injeção de um agente infeccioso,
sendo o pico de TNF circulante aos 90 min. IL-1 não atinge o pico antes das 4
horas após a injeção do agente estimulante enquanto que os níveis de IL-6
ainda estão subindo ao final de 8 h de observação. A administração profilática
43
do anticorpo monoclonal anti-TNF foi capaz de inibir a liberação de IL-1 e IL-6
no modelo de sepse observado em tal estudo confirmando os dados anteriores.
Hoje sabe-se que a cascata de citocinas promovida por TNF na
hiperalgesia inflamatória, em alguns casos, era subseqüente à ação da
bradicinina, dependendo da intensidade e do tipo de estímulo. Isto foi
demonstrado por FERREIRA et al. (1993) em experimentos onde o pré-
tratamento de animais com HOE-140, um antagonista seletivo para o receptor
Bk
2
da bradicinina, foi efetivo em bloquear hiperalgesia induzida por
carragenina, mas não foi capaz de bloquear a hiperalgesia induzida por TNF.
Além disso, ao se pré-tratar os animais com um anti-soro específico para TNF
(anti-TNF) a hiperalgesia induzida por bradicinina ficou bastante reduzida,
sugerindo que bradicinina estaria induzindo a liberação de TNF. Em adição, a
hiperalgesia induzida por altas doses de LPS não foi inibida por HOE-140,
propondo que se o estímulo hiperalgésico é de magnitude suficiente, a cascata
de citocinas pode ser acionada independentemente da estimulação do receptor
Bk
2
(FERREIRA et al, 1993).
Bradicinina pode não só iniciar a cascata de mediadores, mas também
contribuir para a manutenção dessa cascata e da injúria através dos receptores
Bk
1
, receptores que são ativados por IL-1β mas não por TNF, demonstrado em
modelos de hiperalgesia térmica e mecânica (PERKINS & KELLY, 1993;
DAVIS & PERKINS, 1994). Foi proposto, então, que receptores Bk
2
participariam da fase inicial da resposta dolorosa inflamatória e Bk
1
manteria o
estado doloroso (DRAY & PERKINS, 1993). No modelo de contorções
abdominais também foi demonstrado o papel inicial da bradicinina, a qual
mesmo em doses altas não foi capaz de induzir resposta nociceptiva, porém, a
administração prévia de HOE-140 diminui as contorções induzidas pela
associação de TNF, IL-1 e IL-8 (THOMAZZI, 1996).
O contrário também é válido, TNF induz a liberação de Bradicinina. Em
1999 foi demonstrado por TONUSSI e FERREIRA que TNF pode induzir
incapacitação articular quando dado em articulações previamente estimuladas
(72 h antes) com carragenina. Esta incapacitação é mais intensa, atinge o pico
em 1 hora e pode durar até 5 horas. A incapacitação é inibida pelo pré-
tratamento com o antagonista de receptor B
1
da bradicinina. Os autores
sugerem que a persistência da incapacitação deve-se a um feedback positivo
44
entre os dois mediadores (bradicinina gerando TNF e TNF gerando
bradicinina). Neste mesmo estudo foi observado ainda que a incapacitação
induzida por carragenina é mediada por TNF, pois o pré-tratamento com
anticorpo anti-TNF inibiu a nocicepção. Alem disso TNF também induz a
liberação de leucotrieno, visto que o inibidor da lipoxigenase MK 886 inibiu a
incapacitação persistente induzida por TNF (TONUSSI e FERREIRA, 1999).
O papel de TNF além de IL-1β e IL-8 na dor crônica experimental foi
observada no modelo de hiperalgesia persistente (SACHS et al., 2002).
Demonstrou-se que a injeção diária de TNF, IL-1β ou IL-8 por mais de 18 dias
induzia uma hiperalgesia persistente que durava 30 dias após o término da
indução. A hiperalgesia persistente induzida por IL-8 era abolida pelo pré-
tratamento diário com atenolol, a induzida por IL-1β era abolida pelo tratamento
diário com indometacina e a hiperalgesia persistente induzida por TNF era
totalmente abolida pelo tratamento diário com a associação indometacina e
atenolol. Estudos prévios relatam que a hiperalgesia persistente é causada por
estímulo persistente e os autores sugerem que estímulos persistentes induzem
uma produção contínua de TNF o que levaria a liberação de IL-1β e IL-8 assim
induzindo a liberação de mediadores finais como eicosanóides e
simpatomiméticos que então sensibilizariam o nociceptor.
Em um estudo recente de dor crônica foi desenvolvido um modelo
experimental em que a injeção de carragenina, numa dose que produz
inflamação de curta duração, causa uma facilitação crônica da hiperalgesia
induzida pela administração subseqüente de mediadores inflamatórios. Durante
este estado latente ou facilitado, o qual dura pelo menos 30 dias, o limiar
nociceptivo mecânico retorna a seu nível basal (pré-carragenina), no entanto
quando é feita a administração de PGE
2
há o aparecimento de uma
hiperalgesia prolongada que dura até 24 horas. Tal modelo caracteriza o
estado de facilitação da hiperalgesia crônica (ALEY et al., 2000). Em 2003
PARADA et al. demonstraram que TNF media a facilitação da hiperalgesia
crônica (ou hiperalgesia crônica latente) induzida por carragenina pois o
tratamento com talidomida ou anticorpo anti-TNF antes da carragenina tanto
inibiu a hiperalgesia aguda (medida 4 horas após estímulo) como a facilitação
crônica que foi medida depois de 5 dias da injeção de carragenina e evocada
45
com PGE
2
. Os mesmos autores ainda observaram que TNF também por si só
induz tanto a hiperalgesia aguda assim como a facilitação da hiperalgesia
crônica e que essa hiperalgesia latente não é inibida por indometacina ou por
um inibidor simpático indicando que o papel de TNF na facilitação da
hiperalgesia crônica é diferente do da hiperalgesia aguda. Outros dados do
mesmo estudo sugerem que TNF induz a hiperalgesia crônica latente através
de seu receptor TNFR1 ativando a proteína quinase Cε enquanto que sua ação
na hiperalgesia aguda seria de uma maneira indireta talvez induzindo a
liberação de outros mediadores.
Outro estudo relata que a atividade nociceptiva de TNF está relacionada
principalmente a fibras do tipo C onde a citocina produziria uma sensibilização
aguda de mecanismo rápido talvez por ação em receptores presentes nas
fibras C ou então ativando a enzima COX levando a geração de eicosanóides
(JUNGER AND SORKIN, 2000). Outros dados revelam que a administração
intraperitoneal de LPS e IL-1β produz hiperalgesia via estimulação
subdiafragmática de aferentes vagais que carregam a informação de injúria
diretamente ao tronco encefálico, ao invés de passar pela medula espinhal.
TNF também induz hiperalgesia dose-dependente quando dado i.p.,
mensurada pelo teste de retirada da cauda. Tal hiperalgesia é bloqueada tanto
pelo antagonista do receptor de IL-1 como pela vagotomia subdiafragmática
sugerindo que TNF causa hiperalgesia por induzir a liberação endógena de IL-1
e também que o efeito é suportado por uma rota neural ao invés de humoral
(WATKINS et al., 1995a e b). De fato a vagotomia subdiafragmática bloqueia o
aumento da imunorreatividade Fos-like e de RNAm no cérebro induzido por
LPS e IL-1 periféricos. Esses efeitos parecem ser produzidos por uma ligação
das citocinas à paragânglia que forma sinapses com fibras vagais onde já foi
demonstrado existirem sítios de ligação tanto para TNF como para IL-
1(WATKINS et al., 1995b).
4.2. Citocinas e inibição da resposta nociceptiva
Vem tornando-se cada vez mais importante a inibição de citocinas que
participam da resposta inflamatória e da dor inflamatória por estas serem de
fundamental importância para o desenvolvimento de ambas. Muitos estudos
46
utilizam inibidores como os antagonistas do receptor para IL-1 (IL-1ra) ou
proteínas ligantes para TNF ou IL-1, como os seus receptores solúveis para
esse fim. Outros trabalhos utilizando citocinas que inibem a síntese de TNF e
IL-1, dentre outras citocinas pró-inflamatórias, como também citocinas que
promovem a produção de seus inibidores naturais, mostraram que a resposta
inflamatória tem moduladores negativos endógenos, servindo como um freio
para a inflamação. Essas citocinas tem a vantagem de inibir tanto a síntese de
IL-1 e TNF como a de outras citocinas e mediadores. Na lista de citocinas que
possuem essas propriedades inibitórias estão: IL-4,. IL-10, IL-13, IL-6, TGF-β e
IFN-α.
IL-10 é produzida por diversos tipos celulares incluindo linfócitos Th2,
monócitos, macrófagos e mastócitos (FIORENTINO et al., 1989). Acredita-se
que IL-10 tem um papel inibitório importante nas reações de hipersensibilidade
tardia (HOWARD AND O´GARRA, 1992) e na supressão das funções de
macrófagos como a expressão de MHC classe II (DE WAAL MALEFYT et al.,
1991b, adesão (FIORENTINO et al., 1991), síntese de citocinas pró-
inflamatórias e expressão de COX-2 e NOSi (BOGDAN et al., 1991; DE WAAL
MALEFYT et al., 1991a; FIORENTINO et al., 1991; OSWALD et al., 1992;
CUNHA et al. 1992b, NIIRO et al., 1995, 1997). Também já foi demonstrado
que IL-10 inibe a hiperalgesia inflamatória mecânica induzida por carragenina
através de dois mecanismos: inibição de citocinas hiperalgésicas e bloqueio da
indução de COX-2 (POOLE et al., 1995)
IL-4 e IL-10 são produzidas principalmente por linfócitos Th2 e por
mastócitos (McKENZIE et al., 1993; BURD et al., 1995; DE WAAL MALEFYT et
al., 1995) e possuem inúmeras atividades biologias parecidas que incluem a
inibição de citocinas pró-inflamatórias (HART et al., 1989; CALLARD et al.,
1996; MUCHAMUEL et al., 1997) e a indução de COX-2 e de NOSi com a
conseqüente redução da produção de prostaglandinas e óxido nítrico (SEITZ et
al., 1994; NIIRO et al., 1995; ONOE et al., 1996). IL-4 também inibe a
hiperalgesia tardia em animais experimentais e em humanos (ROCKEN et al.,
1996), possivelmente pela sua capacidade de induzir resposta de linfócitos
Th2. IL-13 parece exercer papel inibitório importante na artrite reumatóide
desde que está presente em alta quantidade no fluído sinovial e inibe a
produção de IL-1 e TNF por células mononucleares (ISOMAKI et al., 1996).
47
Recentemente foi demonstrado que IL-4 provavelmente liberada por mastócitos
e IL-13 (provavelmente liberada por linfócitos T locais) inibem a hiperalgesia
inflamatória mecânica induzida por carragenina e bradicinina (CUNHA et al.,
1999; LORENZETTI et al., 2001). Esse efeito anti-hiperalgésico parece ser
devido à inibição de prostaglandina E
2
e produção de citocinas.
Utilizando modelos experimentais recentemente demonstramos o efeito
antinociceptivo de IL-10, IL-4 e IL-10 na dor inflamatória. Nesse estudo
observamos o efeito antinociceptivo das três citocinas nas contorções
abdominais induzidas por ácido acético ou zymosan e incapacitação articular
induzida por zymosan (ilustração 1.5), que parece ser de domínio periférico. O
efeito possivelmente não deve ser mediado por opióides endógenos visto que a
administração do antagonista de receptores opióides, naloxona, não foi capaz de
reverter o efeito inibitório das citocinas. Foram dosados os níveis de citocinas
pró-inflamatórias presentes no fluido articular e peritoneal estando estes
diminuídos em animais tratados com IL-4, IL-10 ou IL-13. O tratamento com os
anti-soros anti-IL-10, IL-4 e IL-13 amplificou tanto as contorções abdominais
assim como a incapacitação articular sugerindo um papel modulador negativo
endógeno para essas citocinas na dor inflamatória (ver ilustração 1.6; VALE et
al., 2003)
5. MANIPULAÇÃO FARMACOLÓGICA DA MEDIAÇÃO DA DOR POR
CITOCINAS
Como já foi dito, vem se tornando cada vez mais evidente a participação
de citocinas na modulação da dor inflamatória tanto aguda quanto crônica. Foi
visto que nesse processo multi-mediado há a participação de citocinas
modulando positivamente ou negativamente o processo doloroso. Muitos
estudos agora estão voltados para o controle da dor sob a ótica das citocinas e
vem se pesquisando drogas capazes de modular a produção das mesmas. A
exemplo disto a literatura cita vários tipos de drogas que inibem a produção de
citocinas pró-inflamatórias e ou induzem a produção de citocinas como os
inibidores de fosfodiesterase, talidomida e análogos, clorpromazina,
corticóides, bioefetores dentre outros. No presente estudo procuramos
investigar o efeito de algumas dessas drogas no controle da dor inflamatória.
Procuramos dar enfoque a algumas delas.
48
49
5.1. Talidomida
A talidomida (α-N-ptalidomidoglutaramida) foi originalmente introduzida
na clínica como uma droga sedativa com a vantagem de não possuir os efeitos
colaterais dos barbitúricos nos anos 50 por Chemie Grunenthal (STIRILING,
1996). Após experimentos em animais em que não demonstrou efeitos tóxicos,
rapidamente talidomida tornou-se um sedativo popular na Europa e Canadá,
também foi utilizada como hipnótico e antiemético principalmente no tratamento
da hemese matinal em mulheres grávidas. Relatos de neuropatia começaram a
aparecer em 1960, com crescentes evidências de focomelia, severo defeito das
extremidades e deformidade de órgãos internos em recém-nascidos. MCBRIDE
(MCBRIDE, 1961) e LENZ (LENZ, 1962) foram os primeiros em documentar
uma associação entre o uso de talidomida por mulheres grávidas e o repentino
aparecimento de má-formação de membros e órgãos internos nos recém
nascidos. Por volta de 1961, talidomida foi retirada do mercado, mas não antes
que 10 a 20 mil crianças fossem afetadas. Além disso, talidomida também foi
associada ao aparecimento de neuropatia periférica (DE IONGH, 1990). As
propriedades teratogênicas e neurotóxicas da talidomida catalisaram o
desenvolvimento da atual regulamentação da aprovação de drogas. Antes da
talidomida não eram requisitados regulamentos de testes em varias espécies
para detectar teratogenicidade. O efeito teratogênico da talidomida foi
tardiamente revelado ser espécie específica em modelos animais, desde que
foi difícil de promover má formação em ratos, camundongos, hamsters ou
embriões de aves. No entanto em coelhos talidomida demonstrou induzir
embriopatias parecidas com as apresentadas em fetos humanos. Coelhas
tratadas com talidomida apresentaram fetos com má-formação de ossos longos
(PEUCKMANN et al., 2000).
A descoberta em 1965 por SHESKIN de que talidomida era uma
excelente droga para tratar o eritrema nodoso da lepra (ENL) ou reação do tipo
II, uma condição inflamatória associada à lepra lepromatosa caracterizada por
sintomas sistêmicos severos que incluem febre, lesões cutâneas dolorosas,
artrite, glomerulonefrite e a presença de imunocomplexos circulantes
(SHESKIN, 1965; RIDLEY, 1969) levou a conclusão de talidomida possui
propriedades imunomodulatórias. Nesta complicação séria da lepra, talidomida
50
tem excelente efeito diminuindo a inflamação e melhorando, dramaticamente, o
estado geral do paciente (BARNHILL and McDOUGALL, 1982). À partir desta
descoberta inicial, em 1998, o FDA aprovou a droga para o tratamento do ENL
permanecendo como droga de escolha na terapia do ENL. Posteriormente
descobriu-se que o principal mediador envolvido na fisiopatologia do eritema
nodoso da lepra era TNF (SARNO et al., 1991)
Talidomida encontra-se sob avaliação para o tratamento de uma
variedade de doenças que incluem condições que envolvem bases
inflamatórias ou imunes, malignidades e complicações de infecções pelo HIV.
Contudo, métodos de controle de natalidade em mulheres utilizando talidomida
e os monitoramentos dos efeitos neurológicos são requisitados a todos os
pacientes. O interesse nos seus efeitos anti-inflamatórios, imunomodulatórios e
antiangiogênicos fez com que aumentassem o números de prescrições e
pesquisas recentes demonstram resultados promissores da talidomida em
pacientes com perda de peso progressiva relacionado à cânceres avançados e
HIV. A terapia com talidomida também está sendo avaliada em doenças como
tuberculose, sarcoidosis, ulceras aftosas da AIDS e doença de Behçet, artrite
reumatóide, doença do enxerto versus hospedeiro, pyoderma gangrenosum,
doença inflamatória intestinal, syndrome de Sjögren e lupus eritematoso.
Estudos preliminares indicam o uso de talidomida em diversas síndromes
relacionadas a cânceres avançados como caquexia, náusea crônica, insônia,
transpiração abundante e dor. A descoberta de um efeito antiangiogênico
provocou uma investigação de um potencial terapêutico em alguns cânceres
que incluem o mieloma múltiplo, síndromes mielodisplasticas, gliomas,
sarcoma de Kaposi, carcinoma de célula renal, tumores de mama, colon e
próstata avançados (NG et al., 2002)
Mecanismo de ação da talidomida
Em 1991 SAMPAIO et al. reportaram que talidomida é um inibidor
seletivo de TNF em monócitos humanos estimulados in vitro com
lipopolisacarídeo e outros estímulos (SAMPAIO et al., 1991). Outros dados
sugerem que sua ação inibitória sobre TNF deve se a um aumento da
degradação do RNAm para esta citocina (MOREIRA et al., 1993), o qual a meia
vida declina de 30 para 17 min, sendo assim um mecanismo de ação diferente
51
da pentoxifilina e dos glicocorticóides. Talidomida inibe TNF sem, no entanto
afetar a produção de IL-1, IL-6 ou GMC-SF (SAMPAIO et al., 1991). Contudo,
dados mais recentes indicam que talidomida possui a propriedade de aumentar
a produção de IL-10 em cultura de células estimuladas com LPS (CORRAL et
al., 1996), em soro de animais estimulados com LPS (MOREIRA et al., 1997)
assim como também a IL-10 endoneural em animais com neuropatia crônica
constritiva (GEORGE et al., 2000). Esta propriedade, porém parece depender
do modelo experimental utilizado visto que outros autores não observaram tal
fato (HUIZINGA et al., 1996; ROWLAND et al., 1998). Outros dados também
mais recentes já sugerem que talidomida inibe a produção de IL-6 o que pode
explicar a neuropatia em pacientes utilizando a droga em altas dosagens
durante longos períodos (CALABRESE et al., 2000). Outra citocina também
afetada por talidomida é a IL-8. Experimentos feitos in vitro demonstraram que
talidomida bloqueia a produção de IL-8 por células endoteliais estimuladas com
LPS, ao contrário de quando estas células são estimuladas com TNF, o qual
talidomida aumenta a produção de IL-8 (DUNZENDORFER et al., 1999).
Talidomida também parece aumentar a cicatrização de feridas através de uma
ação sobre queratrinócitos onde estas células produzem mais IL-8 na presença
da droga.
Talidomida além de aumentar a degradação do RNAm de TNF também
é capaz de bloquear a ativação do fator de transcrição nuclear NF-κβ o qual
controla a ativação do gene do TNF. Parece que talidomida inibe a ativação de
NF-κβ induzida, mas não a ativação constitutiva. A supressão de NF-κβ por
talidomida está acompanhada da inibição da ligação do NF-κβ ao DNA,
supressão da degradação de I-κβα e da I-κβα quinase (KEIFER et al., 2001).
Recentemente foi descrito quer talidomida inibe a angiogênese induzida
por citocinas angiogênicas como o fator de crescimento básico de fibroblastos
(bFGF) e fator de crescimento celular derivado do endotélio (VEGF) (D´AMATO
et al., 1994; KENYON et al., 1997). Do ponto de vista terapêutico a inibição da
angiogenese poderia levar a um impedimento do crescimento tumoral em
neoplasias malignas. O crescimento de tumores sólidos é dependente da
angiogênese, pois vasos sanguíneos são necessários para levar suprimento de
nutrientes e oxigênio para o crescimento tumoral. O recrutamento de vasos
52
para o sítio tumoral leva à proliferação do tumor e permite que as células
cancerígenas alcancem a corrente sanguínea para provocar metástases. O
efeito anti-angiogênico da talidomida é decorrente da sua ação inibitória sobre
o crescimento de células endoteliais e não um efeito citotóxico, por isso é
menos provável que talidomida cause supressão da medula óssea, distúrbios
gastrintestinais ou alopécia. No entanto a terapia anti-angiogênica necessita de
tratamento prolongado sem interrupções (NG et al., 2002).
Farmacocinética
Talidomida é um análogo sintético da glutamina. Consiste de uma
estrutura contendo dois anéis com um carbono assimétrico no anel glutarimida
e existe como uma mistura equilibrada de enantiomeros S-(-) e R-(+) que se
interconvertem rapidamente em condições fisiológicas. O anel glutaramina é
supostamente responsável pelo seu efeito sedativo e hipnótico enquanto que o
isômero S tem sido relacionado com o seu efeito teratogênico (THOMAS e
KANTARJIAN, 2001). Foi descrito que a talidomida encaixa no modelo
farmacocinético de primeira ordem (FIGG et al., 1999). A pouca solubilidade da
droga em solução aquosa faz com que sua bioavaliação seja desconhecida e a
formulação i.v. impossível. Quando dada por via oral talidomida tem meia vida
de absorção de 1.7 + 1.05 h,com o pico de concentração no plasma é
alcançado aproximadamente com 4 - 5 h (TEO et al., 2000). A meia vida de
eliminação e de aproximadamente 8.7 + 4.1 h (TSENG et al., 1996), podendo
variar com a dosagem de talidomida administrada (PISCITELLI et al., 1997;
FIGG et al., 1999). A droga é metabolizada principalmente por clivagem
enzimática hidrolítica, contudo a biotransformação catalisada pelo citocromo
p450 também ocorre (MEYRING et al., 2000). Menos de 1% é excretada na
urina, no entanto alguma parte da droga sofre clearence na bile (RADOMSKY e
LEVINE, 2000). Há pelo menos 1 metabólito formado por hidroxilação da
droga: 5´-OH talidomida que pode ser o responsável pelo seu efeito
antiangiogênico (BAUER et al., 1998)
Efeitos adversos
Os efeitos adversos mais comuns da talidomida são sonolência e
vertigem. Para minimizar essas complicações talidomida deve ser administrada
53
em uma dose única no final do dia. O efeito tóxico mais conhecido da
talidomida é a teratogenicidade que pode acontecer mesmo com uma única
dose. A teratogenicidade a talidomida é conhecida como focomelia defeitos
severos os membros e deformidade dos órgãos internos. Focomelia é mais
comum nos membros superores 65 - 75% dos casos. Em 10 –25% dos casos
os membros superiores e inferiores são afetados e em 2-5% somente as
pernas são afetadas (STEPHENS et al., 2000). Em adição o uso da droga por
mulheres grávidas pode levar à amelia, hipoplastia, deformidades do ouvido
externo e defeitos cardíacos congênitos nos recém nascidos. O período crítico
da administração da talidomida ocorre 34 a 50 dias após o último período
menstrual (QUILITZ, 1999). O mecanismo teratogênico da talidomida
permanece obscuro, no entanto mais de 30 hipóteses já foram aventadas. Foi
descrito que o efeito antiangiogênico da talidomida coincide com a
teratogenicidade, mas não o efeito sedativo ou immunomodulatório, e parece
ser independente da sua habilidade de inibir a produção de TNF. A teoria mais
aceita é a de que talidomida intercala o DNA e também pode causar dano ao
DNA por oxidação através de radicais livres (NG et al., 2002)
Terapias crônicas com talidomida demonstraram produzir neuropatia
periférica que começa com um adormecimento dos dedos do pé e depois uma
perda sensorial superficial em pés e mãos. Se a terapia não for descontinuada
as parestesias dos pés e mãos progridem até se tornarem permanentes. Além
disso, já foram observadas neutropenia, fotossensibilidade, e vários efeitos
endócrinos, sendo estes os efeitos adversos menos comuns da talidomida.
Talidomida e Dor
Antes do descobrimento dos efeitos teratogênicos da talidomida, a
droga foi utilizada como analgésica em um estudo e bons resultados foram
obtidos na dor associada a inflamação, dor pós-operatória, e dor do câncer
(MILLER et al., 1960). Em 1966 talidomida foi usada no tratamento da neurite
leprótica (BELDA et al., 1996). Pacientes HIV positivos com síndromes
hiperalgésicas da boca e faringe refratários a analgésicos comuns foram
tratados com talidomida e obtiveram alivio completo da dor (GEHANNO et al.,
1990). Talidomida também se mostra eficiente na inibição da dor neuropática
no modelo de injuria por contrição crônica onde foi capaz de inibir a produção
54
de TNF endoneural assim como aumentou a produção de IL-10 endoneural e
teve um efeito modulatório positivo sobre a metil encefalina do corno dorsal da
medula espinhal (SOMMER et al., 1998; GEORGE et al., 2000).
Uma revisão da literatura recente descreve o uso potencial da talidomida
no controle da dor (PEUCKMANN et al., 2003). Neste trabalho PEUCKMANN e
cols. relatam que até a presente data não há ensaios clínicos especificamente
designados para explorar o potencial analgésico da talidomida sugerindo a
realização de estudos à cerca dos possíveis benefícios dessa droga nas
condições dolorosas que pouco respondem ao tratamento convencional como
a dor neuropática, neuralgia pós herpética ou então o fenômeno de dor central.
Devido ao seu mecanismo de ação que é distinto de outras drogas como
esteroides, talidomida oferece a possibilidade de um tratamento combinado
com outras drogas sem a sobreposição dos efeitos tóxicos (PEUCKMANN et
al., 2003).
Outro estudo recente aponta a inibição de TNF como sendo de extrema
importância no controle da dor crônica (PARADA et al., 2003). Os autores
descrevem que a inibição experimental de TNF pelo seu anticorpo ou por
talidomida é capaz de inibir a hiperalgesia latente, que consiste de um estado
nociceptivo observado após a injeção de PGE
2
decorridos cinco dias da
indução da hiperalgesia aguda por carragenina. Este tipo de hiperalgesia é
independente da ação de células residentes (e liberação de mediadores por
estas), dura mais de 24 horas, diferente da hiperalgesia inflamatória aguda, e
não é inibida por indometacina. Foi observado que a hiperalgesia latente era
dependente de receptores presentes em fibras sensitivas aferentes ao corno
dorsal da medula espinhal e que a perda de receptores TNFR1 inibia o
surgimento de tal hiperalgesia. Os autores propuseram que a ativação dos
receptores TNFR1 presente nas fibras por TNF desencadearia o processo
nociceptivo que seria de característica crônica e que drogas inibidoras de tal
condição seriam de extrema relevância no controle da dor crônica (PARADA et
al., 2003).
Dentre outros objetivos o presente trabalho avalia a atividade analgésica
da talidomida focando o seu efeito sobre TNF na dor inflamatória aguda
experimental assunto pouco estudado mais de importante relevância.
55
5.2. Análogos da talidomida
A atividade clínica da talidomida e a importância da inibição do TNF
levou a busca de inibidores de TNF que não possuíssem efeitos adversos ou
teratogênicos. Neste intuito novos compostos com essas propriedades vem
sendo desenvolvidos e testados. Foram sintetizados uma série de análogos da
talidomida derivados do ácido β-amino-β-arilproanóico que são potentes
inibidores de TNF (MULLER et al., 1996). Estudos posteriores revelaram estes
compostos potentes inibidores da fosfodiesterase do tipo 4 (Muller et al., 1998)
enzima presente principalmente em macrófagos e monócitos e que é
conhecidamente inibidora da adenil ciclase assim aumentando o nível de AMPc
intracelular resultando na inibição da síntese de TNF.
Um trabalho mais recente demonstrou a descoberta de 3 novos potentes
inibidores de TNF: (1) um deles por substituição a porção 4-amino da
talidomida, (2) o EM-12 e (3) a α-metil-talidomida. O análogo (S)-4-amino
substituído demonstrou ser ~15,000 vezes mais potente do que a talidomida
em inibir a produção de TNF em monócitos humanos estimulados por LPS. O
análogo amino substituído EM-12 demonstrou ter 4 isômeros, mas apenas um
deles possui atividade inibitória sobre TNF. O análogo α-metil da talidomida
também possui atividade inibidora da síntese de TNF e não possui o centro
quiral racemizável encontrado na talidomida. Nenhum dos os três análogos
demonstrou atividade inibitória significante sobre a fosfodiesterase 4 (MULLER
et al., 1999).
5.3. Pentoxifilina
A pentoxifilina, 1-(5-oxohexil)-3,7-(dimetilxantina) é o análogo da
metilxantina teobromina. Foi inicialmente caracterizada como agente
hemorreológico para o tratamento de doenças vasculares periféricas (Muller,
1981) e claudicação intermitente (ACETTO, 1982; PORTER et al., 1982). Foi
proposto que pentoxifilina altera a flexibilidade da membrana de hemácias
permitindo assim o seu acesso através dos microcapilares que possuem
menos da metade do diâmetro da célula. Esse efeito também é atribuído a sua
56
capacidade de aumentar a produção de prostaciclina (PGI
2
) pela parede
vascular e de aumentar a produção de AMPc em plaquetas, leucócitos e
monócitos. Acredita-se que pentoxifilina por reduzir a viscosidade do sangue,
diminuir a agregação de células vermelhas do sangue e plaquetas e reduzir os
níveis de fibrinogênio, permite uma melhora da circulação e assim previne os
ataques isquêmicos característicos da claudicação intermitente (SMITH et al.,
1989).
Mecanismo de ação
Geralmente é assumido que pentoxifilina exerce seu efeito
farmacológico por inibir as fosfodiesterases do AMPc intracelular, portanto
aumentando a concentração intracelular de AMPc. Diversos estudos relatam
que efeito modulatório da pentoxifilina sobre a rede de citocinas é
possivelmente devido à capacidade de elevar o nível de AMPc intracelular
assim reduzindo a atividade fagocítica, produção do íon superóxido, e liberação
de enzima lisossomial por polimorfonucleares (BESSLER et al., 1986).
Em 1988 STRIETER e Cols demonstraram que pentoxifilina inibe a
síntese de TNF induzida por LPS por inibir a transcrição de seu gene assim
como também por aumentar a degradação do RNAm para tal citocina. Estudos
posteriores demonstraram que pentoxifilina inibe a síntese de TNF apenas na
sua fase transcricional não interferindo na degradação do RNAm (DOHERTY et
al., 1991). Nesse trabalho os autores avaliaram a o efeito inibidor da
pentoxifilina sobre a produção de TNF induzido por LPS in vitro e in vivo. Os
mesmos autores e outros associam a atividade farmacológica da pentoxifilina
com a sua ação inibitória sobre a fosfodiesterase do AMPc (DOHERTY et al.,
1991; BESSLER et al., 1986). Vários estudos apontam que o aumento da
concentração intracelular de AMPc inibe a síntese de TNF in vitro
(TANNENBAUM and HAMILTON, 1989; TAFFET et al., 1989). Outros agentes
que aumentam a concentração intracelular de AMPc (como o dibutiril AMPc e a
toxina da cólera) também demonstraram atividade inibitória sobre a transcrição
do gene do TNF e acúmulo de proteína (TANNENBAUM and HAMILTON,
1989). Já foi observado também que pentoxifilina inibe a produção de TNF por
macrófagos alveolares humanos in vitro (MARQUES et al., 1999) assim como a
57
produção de TNF in vitro e in vivo em pacientes com o eritema nodoso da lepra
(SAMPAIO et al., 1998).
No entanto, a inibição da fosfodiesterase somente não explica cada um
dos efeitos complexos da pentoxifilina. Teofilina, outra xantina que também
inibe a fosfodiesterase com a mesma eqüipotência, demonstrou-se menos
eficaz em inibir a atividade metabólica de polimorfonucleares (PARK et al.,
1971). Diferente da pentoxifilina, teofilina em concentrações equimolares não
exerceu atividade inibitória sobre células assassinas (REED and DEGOWIN,
1992). Os níveis de AMPc alcançados pela administração de 500 a 1000mg/ml
de pentoxifilina estão bem abaixo do que é necessário para inibir quimiotaxia e
produção de superóxido por polimorfonucleares (CONFER and EATON,1982).
Então o mecanismo de ação exato da pentoxifilina ainda não está
esclarecido. Apesar de originalmente se pensar que pentoxifilina inibia
exclusivamente a produção de TNF, há evidências crescentes de que
pentoxifilina também afeta a produção e atividade de outras citocinas como: IL-
1 (SULLIVAN et al.,1988), IL-6 (SCHANDENE et al., 1992), GM-CSF
(MOREIRA et al., 1993), IFN-g (THANHÄUSER et al., 1993) e IL-2
(THANHÄUSER et al., 1993, ALEGRE et al., 1991). No entanto dados
relacionados a outras citocinas que não o TNF ainda são parcialmente
controversos. Por exemplo, tem sido descrito que a liberação de IL-6 não é
afetado por pentoxifilina (ZABEL et al., 1989), enquanto outros pesquisadores
observaram o aumento da liberação de IL-6 por pentoxifilina (SCHANDENE et
al., 1992).
Em 1994 NEUNER et al.. observaram o efeito da pentoxifilina na
produção de citocinas (TNF, IL-1, IL-6 e IL-8) em células mononucleares
periféricas sanguíneas humanas com tratamento in vitro e in vivo. Tal estudo
demonstrou que quando as células eram obtidas de indivíduos normais e
cultivadas, in vitro, com pentoxifilina, uma inibição da liberação de TNF era
observada, enquanto que IL-1β e IL-8 não eram afetadas e a secreção de IL-6
estava significativamente aumentada. Esses dados, in vitro, encontram-se de
acordo com outros autores (SCHANDENE et al., 1992; MOREIRA et al., 1993),
entretanto os dados in vivo mostraram-se diferentes. Quando as células eram
colhidas de indivíduos que foram tratados com pentoxifilina houve uma inibição
da liberação de todas as citocinas. Os autores teorizam que em sistemas in
58
vivo outros mediadores podem estar agindo influenciando o resultado. Outra
explicação seria a que houve inibição das citocinas somente quando os
indivíduos eram tratados com pentoxifilina por diversos dias. Foi feito um
experimento in vitro mimetizando essas condições observadas in vivo e assim
foram obtidos resultados semelhantes. Também foi feito um estudo para saber
se o efeito inibitório da pentoxifilina in vivo era regulado a nível transcricional.
As células estimuladas com LPS e tratadas in vivo com pentoxifilina tiveram o
RNA extraído e foi observado a inibição da expressão do RNAm para todas as
citocinas (NEUNER et al., 1994).
Além de inibir a síntese de citocinas o potencial antiinflamatório da
pentoxifilina também pode ser explicado por sua inibição da expressão da
molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) in vitro e in vivo (NEUNER et
al.,1997), além de sua controversa ação sobre a produção de óxido nítrico
(PARK et al., 2001; LOFTIS et al., 1997; BESHAY et al., 2001; LAUTERBACH
et al.,1995). Parece que sua atuação sobre a produção de NO depende do tipo
celular estudado (TRAJKOVIC et al., 1997).
Farmacocinética
Em humanos, após administração oral, a pentoxifilina é rapidamente
absorvida. Uma dose única oral de pentoxifilina produz pico de concentração
no soro de cerca de 1100 ug/l de droga não metabolizada e cerca de 1.900 ug/l
de seu primeiro metabólito a hidroxipentoxifilina. Preparações orais possuem
apenas 20 a 30% de biodisponibilidade por causa do alto clearance de primeira
passagem. Em voluntários saudáveis pentoxifilina é eliminada da circulação
com uma meia vida de eliminação de 0.9 horas após administração oral e cerca
de 1 a 1.6 horas após administração intravenosa. As transformações
metabólicas são responsáveis pela baixa e variável biodisponibilidade da
droga, e menos de 1% da dose é excretada de forma inalterada na urina. Além
da transformação metabólica observada no fígado o próprio sangue pode ser
capaz de metabolizar pentoxifilina. Sete metabólitos de pentoxifilina são
conhecidos, mas hidroxipentoxifilina e carboxipentoxifilina são os 2 compostos
mais presente em humanos (SMITH et al.,1986).
59
Efeitos adversos
Numerosos estudos com pentoxifilina demonstraram sua segurança e
efeitos adversos mínimos mesmo quando administrada durante longos
períodos. Distúrbios gastro-intestinais ocorre em menos de 2.6% dos
pacientes, efeitos adversos cardiovasculares, psicológicos hepáticos e
dermatológicos ocorrem em menos de 0.25% dos pacientes. Estudos
farmacocinéticos com pentoxifilina IV em indivíduos saudáveis mostraram que
os efeitos adversos predominantes da pentoxifilina foram náuseas e vômitos
assim como nos indivíduos com distúrbios hematológicos (WINDMEIER e
GRESSNER, 1997).
Pentoxifilina e dor
A atividade analgésica da pentoxifilina foi pouco estudada, contudo há
relatos na literatura acerca do assunto. A maioria trata do efeito analgésico
observado no tratamento da claudicação intermitente. Mas, já foi demonstrado
o efeito da pentoxifilina na hiperalgesia pós-injúria em ratos e em dor pós-
operatória em humanos. Neste estudo o pré-tratamento com pentoxifilina foi
capaz de inibir a hiperalgesia induzida por formalina, onde foi proposto que a
atividade antinociceptiva da droga seria de maneira indireta devido à inibição
da cascata de citocinas induzida pós-injúria. Foi observado também que
pacientes que recebiam pentoxifilina no pré-operatório tiveram uma menor
requisição de opióides do que o grupo controle (WORDLICZECK et al., 2000).
Outro artigo estuda o efeito benéfico da pentoxifilina no tratamento da dor
ciática experimental devido a herniação discal (YABUKI et al., 2001).
5.4. Clorpromazina
Clorpromazina, uma fenotiazina (derivado de metilxantina) e antagonista
do cálcio, é um neuroléptico comumente usado em desordens psiquiátricas. O
efeito imunomodulatório de medicamentos antipsicóticos foi descrito desde a
década de 50. Logo após a introdução de clorpromazina na prática clínica esta
demonstrou proteger camundongos do choque séptico induzido por
lipopolissacarídeo (CHEDID, 1954). Paralelamente a isso foi relatada a sua
propriedade tuberculostática em humanos (GEIGER and FINKELSTAIN, 1954;
60
FISHER and TELLER, 1959;). Em adição, efeitos colaterais da clorpromazina e
outras fenotiazinas como agranulocitose (PISCIOTTA, 1969), trombocitopenia
(ZUCKER et al., 1990) e indução de lupus eritematoso sistêmico (DUBOIS et
al., 1972; ANANTH and MINN, 1973) suportam a idéia de que essa classe de
drogas antipsicóticas é potente moduladora de funções imunes.
O efeito protetor de clorpromazina no choque séptico induzido por LPS
foi estudado e foi associado à inibição da produção de TNF (GADINA et al.,
1991; MENGOZZI et al., 1994). Clorpromazina também inibe síntese de TNF
induzida por diferentes estímulos como a injúria hepática por concavalina A
(IKEDA et al., 1997), bactérias gram positivas inativadas por calor (MENGOZZI
et al., 1994), e durante infecção com klebsiella pneumoniae ou Candida
albicans (NETEA et al., 1995). De fato clorpromazina inibe, in vitro, a síntese e
a citotoxicidadede TNF por monócitos humanos (ZINETTI et al., 1995).
Os efeitos de clorpromazina na liberação de outras citocinas são menos
freqüentemente investigados. Contudo há relatos da inibição de IL-1β induzida
por enterotoxina B de estafilococo (SEB) ou endotoxina (NETEA et al., 1995;
TARAZONA et al., 1995). Em adição SEB induz a liberação de IL-2, IFN-gama,
IL-4 e GM-CSF os quais também são inibidos por clorpromazina (TARAZONA
et al., 1995). Em contraste com supressão de algumas citocinas pró-
inflamatórias clorpromazina demonstrou uma atividade estimulatória sobre a
produção da citocina antiinflamatória IL-10 em resposta a endotoxina, SEB e
concavalina A (MENGOZZI et al., 1994; TARAZONA et al.,1995; IKEDA et al.,
1997).
Em adição a seus efeitos sobre a produção de citocinas clorpromazina
possui inúmeras atividades farmacológicas: é antagonista de receptor de
histamina e de 5-HT, é antagonista de adrenoceptor, inibidora de fosfolipase
A2 e tem atividade antioxidante. Alguma dessas ações podem explicar a
inibição da produção de TNF, e de fato outros antagonistas de 5-HT, de
receptor alfa (não Beta) adrenérgico , antagonista de histamina e inibidores da
fosfolipase A2 inibem a produção de TNF, in vivo, induzido por LPS. Outro
estudo semelhante mostrou o efeito de drogas anti-serotoninérgicas, anti-
dopaminérgicas, anti-colinérgicas, anti-β-adrenérgicas, anti-α-adrenérgicas,
anti-histamínicas, depletoras de catecolamina inibidoras de fosfolipase A
2
,
inibidoras de cicloxigenase, inibidoras de lipoxigenase e inibidoras de
61
lipo/cicloxigenase) sobre a produção de TNF induzida por LPS em animais
normais ou adrenalectomizados. A adrenalectomia foi realizada para excluir a
possibilidade de alguma droga estar agindo por induzir a produção de
corticóide. Foi observado que todas as drogas inibem a produção de TNF
exceto os antagonistas β adrenérgicos e a indometacina (inibidor de
cicloxigenase) que ao invés de inibir aumentou em até 100% os níveis de TNF.
Clorpromazina também foi estudada e foi capaz de inibir a produção de TNF
em animais adrenalectomizados (GHEZZI et al., 1996).
Outro estudo procurou demonstrar o mecanismo de inibição da
produção de TNF da clorpromazina utilizando artifício diferente. Foram
sintetizadas diferentes análogos da clorpromazina e analisadas as suas
habilidades para inibir a produção de TNF. Derivados quaternários da
clorpromazina foram desenvolvidos com o objetivo de se obter moléculas
incapazes de passar a barreira hematoencefálica para que assim não tivessem
atividade no sistema nervoso central. Todos os derivados inibiram a produção
de TNF, uns mais outros menos. Foi observado que a perda do efeito sedativo
não influenciou na inibição da síntese de TNF. Foi avaliada a afinidade dos
análogos por alguns receptores importantes no mecanismo de ação da
clorpromazina e foi visto que houve uma redução da afinidade por todos os
receptores testados, mas em diversas ordens de magnitude. Os autores
propuseram que os efeitos anti-noradrenérgico, anti-dopaminérgico e anti-
serotoninérgico não são essenciais para o efeito inibitório sobre a síntese de
TNF. A respeito da propriedade inibitória da clorpromazina sobre a fosfolipase
A
2
, dois análogos que não demonstraram nenhuma inibição da enzima
obtiveram ótimos resultados inibitórios sobre a produção de TNF. Resultados
dissociativos similares foram observados entre atividade inibidora do TNF e o
efeito na atividade da NO sintase. Finalmente ao experimentar a atividade
antioxidante dos análogos foi visto que há uma correlação entre a atividade
antioxidante e a inibição de TNF. Um dos compostos que não apresentava tal
atividade também teve fracasso ao inibir a produção de TNF. Com isso foi
sugerido que a atividade antioxidante da clorpromazina tem um importante
papel na inibição da produção de TNF induzida por LPS (GHEZZI et al., 1996).
Uma revisão atual sobre o efeito de drogas antipsicóticas na produção
de citocinas dá destaque á clorpromazina e são comentados os possíveis
62
mecanismos de ação dessa fenotiazina sobre a rede de citocinas. Há poucos
artigos, portanto tal mecanismo de ação a nível celular e subcelular ainda são
desconhecidos. Contudo, há evidências sugerindo que o aumento da produção
de IL-10 por clorpromazina deve envolver o receptor D1 da dopamina
(TARAZONA et al., 1995) e que seu efeito sobre as citocinas pró-inflamatórias
está longe de ser atribuído a um só receptor de neurotransmissor. Em adição
ao bloqueio de neuroreceptor inúmeros outros efeitos das fenotiazinas podem
contribuir para alterar a produção de citocinas como a inibição da proteína,
quinase C, fosfolipase A e C e calmodulina. Uma esperança de se desvendar o
mecanismo de ação das drogas neurolépticas na produção de citocinas seria
os estudos in vitro utilizando vária células imunocompetentes. Mas os poucos
estudos realizados nesse sentido obtiveram resultados que são inconsistentes
com o efeito das drogas in vivo. Essas discrepâncias sugerem que a
imunomodulação por drogas antipsicóticas in vivo envolve mecanismos que
não são efetivos, in vitro, como a presença de metabólitos produzidos pelo
fígado, outras células que não as imunocompetentes são também capazes de
sintetizar citocinas, a produção de citocinas pode ser modulada indiretamente
por neurotransmissores agindo no SNC para a liberação de outras substâncias
que então interfeririam com a rede de citocinas (POLLMÄCHER et al., 2000).
Clorpromazina e dor
Há poucos dados na literatura sobre a atividade analgésica da
clorpromazina. A maioria dos artigos contendo tal informação são estudos
clínicos e relatos de casos. Foi visto que clorpromazina parece ter bons
resultados no tratamento da enxaqueca (ISERSON, 1983; KELLY et al., 1997),
no tratamento da dor crônica (MEHL-MADRONA, 1999; MERSKEY, 1997) e da
dor do membro fantasma (LOGAN, 1983). O papel analgésico da
clorpromazina em modelos experimentais também foi pouco estudado,
Demonstrou-se que clorpromazina inibe a hiperalgesia induzida por estresse
na dose de 5 mg\kg medida no modelo de retirada da cauda em ratos
(JAKOUBEK, 1984). Contudo outro estudo utilizando o mesmo modelo
clorpromazina não inibiu a resposta nociceptiva induzida por estímulo
ultrassônico enquanto que morfina, acetaminofeno, flubiprofeno e indometacina
foram capaz de diminuir tal nocicepção (MOHRLAND, 1983).
63
5.5. Agentes Biológicos
Cada vez mais vem se estudando o efeito de substâncias biológicas em
doenças de difícil cura como as auto-imunes e dor crônica. Dentre essas
substâncias as mais estudadas são as capazes de inibir a atividade de
citocinas pró-inflamatórias. Por exemplo, a produção aumentada de TNF está
associada a inúmeras condições patológicas e isso levou a busca de caminhos
para a sua neutralização ou inibição de seus efeitos. Muitas drogas são
usadas, como as que já comentamos, além das drogas imunossupressoras
como a ciclosporina A e a dexametasona que demonstram atividade inibitória
sobre TNF, mas inúmeros efeitos colaterais. Na medida que entendemos mais
sobre os mecanismos envolvidos na produção do TNF, e sua ação em células,
mais estratégias específicas estão surgindo. Isto está levando tanto ao
desenvolvimento de novos agentes e novas drogas assim como a modificação
das existentes para que se diminuam os efeitos tóxicos, as torne mais potentes
e mais específicas.
Anticorpo anti-citocinas
Os anticorpos anti-TNF vem sendo utilizados para tratar condições
associadas com alto nível de TNF. Inicialmente isto foi demonstrado pelo uso
de imunização passiva para prevenir a endotoxemia em camundongos
(BEUTLER et al., 1985). Entretanto resultados mistos foram obtidos durante
estudos preliminares de fase I\II em humanos quando anticorpo monoclonal
anti-TNF murino foi usado para tratar pacientes com condições em que o TNF
estava associado com a patogênese (EXLEY et al., 1990; KWIATKOWSKI et
al., 1993; HERVE et al., 1992). Esses estudos demonstraram que inicialmente
havia uma melhora dos pacientes durante o tratamento, mas depois uma
regressão.
Ultimamente vêm sendo desenvolvidos anticorpos quiméricos anti-TNF
usando engenharia genética. Estudos clínicos foram realizados para testar sua
tolerabilidade e poder de neutralização do TNF. Os estudos clínicos
começaram com o uso do Infliximab, inicialmente chamado de cA2, um
anticorpo monoclonal murino quimérico Fv humanizado que liga-se com alta
afinidade ao TNF humano. Estudos de fase I\II mostraram a eficácia do
64
Infliximab no tratamento da artrite reumatóide onde houve uma redução de 60-
70% dos sintomas e pelo menos 79% dos pacientes obtiveram melhora com a
maior dose em comparação com o grupo placebo (ELLIOTT et al., 1994).
Entretanto o tratamento prolongado teve uma eficácia limitada podendo ser
associado a alto grau de clearance do Infliximab infundido ou desenvolvimento
de anticorpos que impediriam a sua ligação ao TNF. Posterior estudo de fase III
demonstrou ser o primeiro de duração suficiente para avaliar a terapia anti-TNF
na arquitetura da articulação (MAINI et al., 1999).
A eficácia no tratamento clínica da dor ciática também foi avaliada.
Constatou-se que em pacientes com dor ciática severa causada por herniação
discal o tratamento com Infliximab reduziu em 50% a dor na perna com 1 hora
de administração, com 2 semanas 60% dos pacientes tiveram redução da dor
aumentando e 3 meses após o tratamento 90% dos pacientes relatavam
redução da dor (KARPPINEM et al., 2003). O mesmo agente também mostrou
benefícios quando usados para tratar pacientes com doença de Crohn ativa, a
qual é associada com elevado TNF além de outras citocinas. Em um estudo
clínico fase I\II uma única infusão de Infliximab induziu melhora constatada por
endoscopia em 80% dos pacientes com doença corticoide-resistente (VAN
DULLEMEN et al., 1995) que persistiu em 41% dos pacientes tratados com
Infliximab comparado a 12% do grupo placebo (TARGAN et al., 1997).
Outra citocina que também é alvo dos estudos anti-citocina é a IL-1.
Quando IL-1 foi bloqueada ela administração de IL-1ra (Anakinra – Amgen) em
um estudo multicentro randomizado e duplo-cego controlado com pacientes
portadores de artrite reumatóide houve resultados positivos mas menos
dramáticos do que os obtidos com a terapia anti-TNF. Eles revelaram uma
melhora clínica de acordo com os conceitos do ACR e as observações
radiológicas (BRESNIHAN et al, 1998; JIANG et al., 2000; WATT and COBBY,
2001). Este agente foi recentemente aprovado pelo FDA para uso no
tratamento da artrite reumatóide.
Em modelos animais há evidencias consistentes do envolvimento das
duas citocinas tanto na artrite como em outras doenças autoimunes assim
como também na dor já havíamos comentado antes. Um estudo recente em
modelo experimental de dor neuropática mostra que o tratamento com uma
mistura de anticorpo anti-TNF e anti-IL-1 induz uma melhora acentuada da dor
65
do que quando a terapia é efetuada somente com um dos anticorpos
(SCHÄFERS et al., 2001).
IL-6 também foi alvo de estudos principalmente no que diz respeito a
artrite reumatóide. Em um estudo clínico a administração de um anticorpo
murino anti-IL-6 humana demonstrou uma melhora de curta duração, no
entanto o numero de pacientes utilizados foi pequeno. Em outro estudo clínico
controlado a administração de anticorpo monoclonal humanizado também
induziu melhora dos sintomas em pacientes com artrite reumatóide havendo a
normalização dos níveis de proteínas de fase aguda dentro de 2 semanas
(YOSHIZAKI et al., 1998). Contudo o efeito dos tratamentos anti-IL-6 parecem
ser mais lentos do que os observados com TNF o que parece razoável, visto
que TNF é o possível iniciador de uma cascata de citocinas na qual IL-6 está
inserida além de outras.
Receptores solúveis
As citocinas exercem suas ações biológicas por meio da ligação com
seus receptores presentes nas células. O TNF, por exemplo, exerce suas
atividades através de dois receptores distintos, TNFR1 (p55 ou CD120a) e
TNFR2 (p75 ou CD120b) que pertencem a uma super-família de receptores
homólogos (ver ilustração 1.7): TNFR1, TNFR2, receptor para linfotoxina
(LTβR), Fas (CD95), CD40, receptores para o NGF, RANK, TRAIL. Algumas
evidências mostram que o TNF de membrana liga-se preferencialmente ao
TNFR2 enquanto que a forma solúvel de TNF parece ter alta afinidade pelo
receptor TNFR1 (VANDENABEELE et al., 1995).
Quando clivados os domínios extracelulares de ambos receptores
podem ser detectados como formas solúveis (sTNFR1 e sTNFR2). Os
receptores solúveis do TNF agem bloqueando as ações desta citocina por se
ligarem diretamente ao TNF impedindo que este interaja com o TNFR1 ou
TNFR2 de membrana (ver ilustração 1.7). A função exata dos receptores
solúveis do TNF ainda não está clara, entretanto, foi sugerido que
concentrações fisiológicas de sTNFRs são capazes de estabilizar a molécula
de TNF, potenciando suas ações a longo prazo. Entretanto quando presente
em altas concentrações os sTNFR são capazes de inibir os efeitos do TNF.
Diversos estudos demonstram níveis elevados de sTNFR no soro de pacientes
66
com artrite reumatoide (TOUSSIROT et al., 1994; HIDAKA et al., 2001;
KLIMIUK et al;. 2001).
Outro agente anticitocina de ocorrência natural é o antagonista do
receptor da IL-1 (IL-1ra). Semelhante ao sTNFR, L-1ra inibe a atividade da IL-1
competindo pela ligação ao seu receptor sem no entanto induzir uma resposta.
sTNFR e IL-1ra são proteínas de ocorrência natural presentes no soro de
pacientes com artrite reumatóide e outras doenças inflamatórias.
Em um modelo experimental de dor neuropática em rato o tratamento
com o IL-1ra e o sTNFR inibiu a alodinia de forma bastante significativa,
demonstrando ausência de tolerância e efeitos colaterais como se observa
comumente com o uso de opióides (SWEITZER et al., 2001). O efeito dos
receptores solúveis de TNF e IL-1 também foi estudada na inflamação
pulmonar aguda induzida pela injeção intratraqueal de lipopolissacarídeo e
observou-se que houve uma inibição da infiltração de neutrófilos na lavagem
broncoalveolar e da expressão de citocinas pró-inflamatórias (ULICH et al.,
1994). Estudos clínicos foram realizados utilizando um novo agente terapêutico
que age de maneira similar ao sTNFR. O Etanercept uma proteína solúvel,
dimérica, recombinante composta pelo domínio extracelular dos dois
receptores humanos p75 do TNF fusionados à porção Fc do IgG1 humano,
mostrou excelentes resultados no tratamento da artrite reumatóide em estudos
randomizados, placebo controlados em crianças e adultos. Etanercept causou
melhora geral dos pacientes inclusive da dor, com demonstração radiológica
quando dado sozinho ou em combinação com o metotrexato, além de causar
poucos efeitos adversos (MORELAND et al., 2002). Outros dados demonstram
o efeito do entanercept no controle da dor onde foi observada a atividade anti-
hiperalgesica na dor neuropática experimental induzida pela injúria por
constrição crônica do nervo ciático (SOMMER et al., 2001).
67
68
6. JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS
Em face ao exposto, ficou estabelecido que as drogas apresentadas
talidomida, pentoxifilina e clorpromazina além de outras atividades são
imunomoduladoras e são descritas como inibidoras do processo inflamatório.
Esta característica comum entre as drogas deve-se principalmente ao fato de
modularem a produção de citocinas, principalmente as chamadas de pró-
inflamatória, dentre elas o TNF. Esta citocina já foi extensivamente estudada e
mostra fundamental importância no desenvolvimento da resposta nociceptiva.
Contudo, no campo da dor inflamatória a atividade analgésica destas drogas é
ainda pouco abordada e o que está descrito na literatura limita-se a casos
clínicos e modelos de dor neuropática sem muita especulação sobre o
mecanismo de ação dessas drogas. Ademais até o início deste trabalho a
atividade antinociceptiva destas drogas em modelos experimentais de dor
inflamatória ainda não havia sido demonstrada.
Portanto, o objetivo geral deste trabalho foi avaliar a atividade
antinociceptiva da talidomida, pentoxifilina, e clorpromazina na dor inflamatória
experimental assim como os mecanismos e mediadores envolvidos nesta
atividade.
Especificamente procurou-se avaliar, na atividade antinociceptiva da
talidomida, pentoxifilina e clorpromazina, o papel de células residentes
(macrófagos e mastócitos) e das citocinas que possivelmente estão sendo
liberadas por estas células ativando ou inibindo a nocicepção.
69
II. MATERIAIS E MÉTODOS
70
1. ANIMAIS
1.1. Camundongos e Ratos
Foram utilizados camundongos Swiss (Mus muscullus), machos, pesando
entre 25 e 30 gramas, e ratos Wistar (Ratus novergicus), machos, pesando
entre 180 e 200 gramas, provenientes do Biotério Central do Campus do Pici –
Universidade Federal do Ceará e Biotério Setorial do Departamento de
Fisiologia e Farmacologia dessa mesma universidade e do Biotério do
Departamento de Farmacologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto –
USP. Os animais foram mantidos em caixas de plástico com livre acesso a
ração e água
2. APARELHOS E INTRUMENTOS LABORATORIAIS
Durante o decorrer dos experimentos foram utilizados diversos
aparelhos e instrumentos nomeados a seguir:
- Aparelho para medir a incapacitação articular (gentilmente cedido e
elaborado pelo Prof. Marcus R. Vale e adaptado pelo Prof. Airton
Rocha do Depto. de Fisiologia e Farmacologia- UFC,)
- Aparelho utilizado no teste da placa quente (gentilmente cedido pelo
Prof. Vietla S. Rao, Depto. de Fisiologia e Farmacologia- UFC)
- Aparelho utilizado para medir a hiperalgesia mecânica em pata de
rato (Randall-Selitto modificado), gentilmente cedido pelo Prof.
Sérgio Henrique Ferreira do Depto de Farmacologia da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto – USP.
- Aparelho de ultracentrifugação (Amicon Corporation)
- Autoclave (FABE)
- Balança para pesagem de animais, mod. ID-1500 (FILIZOLA)
- Balança analítica mod. AL200 e Ohaus, mod. AS260D (MARTE)
- Beckers (SIMAX)
- Bastão de vidro
- Câmara de Neubauer 0.100/0.0025 mm2
- Capela de fluxo laminar, vertical (modelo VLFS-12, Veco do Brasil
Ind. Com. Equip. Ltda, Campinas, SP, Brasil)
71
- Centrifuga Eppendorf – Mod. 5804R
- Estufa de CO
2
para cultura (Nuaire TS Autoflow)
- Funis de vidro grandes
- Forno microondas
- Material cirúrgico (tesoura, pinça clínica e dente de rato)
- Membranas de ultrafiltração diaflo RYM-10 (Amicon Corporation)
- Microscópio óptico binocular (Nikon)
- Microscópio invertido (Nikon)
- Micropipetas automáticas (GILSON)
- Micrótomo
- Ponteiras para pipetas automáticas – 20, 200 ul e 1 ml (SIGMA)
- Seringas de 5 e 3 ml novas ou recicladas por autoclave
- Seringas novas de 1 ml
- Sonicador (Sonics & Materiais Inc. Danbury – Connecticut – USA)
- Tubos Eppendorf -1.5 ml (GIBCO)
- Tubos de ensaio de vidro (PIREX)
- Tubos plásticos de 15 ml (FALCON)
- Lâminas para microscopia Probe on plus (Fischer)
72
3. DROGAS, SOLUÇÕES, CITOCINAS E ANTISOROS
3.1. Drogas
- Zymosan (from Saccharamyces cerevisiae, Sigma Chemical Co. St Louis,
USA), dissolvido em salina.
- Carragenina (FMC, Philadelphia USA)
- Talidomida (RBI, USA)
- Pentoxifilina (Sigma Chemical Co. St Louis USA)
- Clorpromazina (Sigma Chemical Co. St Louis USA)
- Indometacina (Merck, Sharp and Dohme-MSD, USA) – dissolvida em
solução de bicarbonato de sódio a 5%.
- Prostaglandina E
2
(Sigma)
- Bradicinina (Sigma)
- Iloprost (ZK36374, Shering AG)
- Cloridrato de morfina (Dimorf; Laboratório Cristália-Brasil ) diluída em salina.
- Cloridrato de naloxona (Narcan – Rhodia Farma) diluído em salina.
- Éter Etílico (Syth)
- Xilol (Reagen)
- Reagentes do kit Vector para immunohistquiímica
- Peróxido de hidrogênio (Smith)
- Heparina (Laboratório Cristália – Brasil)
- Hidrato de Cloral (Reagen)
- avidina-peroxidase (DAKO)
- o-fenilenediamina diidrocloreto (Sigma Chemical Co., St Louis, USA)-
disolvido no tampão substrato descrito no protocolo de ELISA.
- Reagente Trizol (GibcoBRL, MD, USA)
- dNTP (Pharmacia, Uppsala, Swissa)
- Transcriptase reversa (GibcoBRL)
- First Strand Buffer (GibcoBRL)
- Taq DNA polimerase (GibcoBRL)
- DNA ladder (GibcoBRL)
73
3.2. Soluções
- Solução de ácido acético
Ácido Acético Glacial (Reagen), utilizado a 0.6% (v/v; concentração de 629
mg/100 ml), dissolvido em água deionizada.
- Solução de bicarbonato de sódio
Bicarbonato de sódio (Merck, Sharp and Dohme – MSD, USA) utilizado a
5% (p/v) dissolvido em água destilada.
- Solução Salina 0.9% estéril (Endogen)
- Solução de H
2
SO
4
a 1M.
- Albumina bovina 1% diluída em tampão de lavagem (Sigma)
- Soro normal de carneiro
- Solução de Turk
Ácido acético glacial (Reagen )...........................................................20.0 ml
Violeta de genciana (Reagen)...............................................................2.0 ml
Água destilada.................................................................................1000.0 ml
- PBS pH 7.4
- Peróxido de Hidrogênio 3%
3.3. Tampões utilizados para o ensaio imunoenzimático
- Tampão bicarbonato pH 8.2
NaHCO
3
P.A. (Merck, Sharp and Dohme – MSD, USA)...................….0,1 M
NaCl. P.A.(Merck, Sharp and Dohme – MSD, USA).......................…....0,1 M
- Tampão Substrato pH 5.0
Ácido Cítrico.................................................................................................34,7
mM
Na
2
HPO
4
.(Merck)...............................................................................66,7 mM
- Substrato
OPD......................................................................................................0,4 mg
H
2
O
2
......................................................................................................0,4 μl
Tampão substrato q.s.p. ........................................................................1 ml
- Tampão de lavagem PBS-tween 20, 0,1% v/v.
74
3.4. Tampões e soluções e reagentes utilizados para o ensaio de
imunohistoquimica
- Tampão Citrato 0.1M pH 6.0
Citrato de sódio monohidratado.....................................................................21g
H
2
O destilada....................................................................................................1L
A solução mãe (1M) foi diluída 10 vezes (concentração final 0.1M)
- Solução PBS-BSA 5%
PBS (pH 7.3)...............................................................................................10ml
Albumina Bovina.........................................................................................0.5mg
- Complexo ABC (Kit Vectastain®)
Reagente A (avidina DH).............................................................................10 μl
Reagente B (peroxidase biotinilada H)........................................................10 μl
PBS..............................................................................................................1.6 ml
- Solução peróxido de hidrogênio 3%
- Solução DAB/peróxido (DAKO®)
H
2
O destilada..............................................................................................2.5ml
H
2
O
2
.............................................................................................................50 μl
Tris HCl pH7.0...........................................................…….......................... 50μl
DAB ……………………………………………………….........………………...50μl
3.5. Meio de Cultura
- RPMI simples :
Meio RPMI 1640 Medium (Sigma, St Louis, USA; lote H0763)................10.4 g
Hepes.(Sigma Chemical Co., USA)..........................................................2.38 g
Bicarbonato de sódio (Merk, Sharp and Dohme – MSD, USA)................2.20 g
Água deionizada Milli-Q autoclavada............................................................1 L
- RPMI completo:
Soro fetal bovino........................................................................................10 ml
Gentamicina (Gentamicin sulfate solution; Sigma G-1522)......................500 μl
Penicilina-Streptomicina (Sigma P-3539).............................................500 μl
Meio RPMI simples q.s.p. ....................................................................100 ml
75
O meio de cultura foi filtrado em filtro Durapore (0.22 umGV) com
membranas estéreis (Millipore) de modo que após preparado o meio estava
asséptico e apirogênico.
3.6. Citocinas e Antisoros
3.6.1. Citocinas
- Fator de Necrose Tumoral humano (TNF) 40.000 UI 1 mg/ampola.
- Interleucina 1 beta humano (IL-1β):.) 100.000 UI 1 mg/ampola.
- Obtidos do National Institute for Biological Standards and Control
(NIBSC), Inglaterra.
3.6.2. Anticorpos
- Anticorpo monoclonal IgG anti IL-4 (BVDG) e anti IL-10 (JEA.5.1.)
Universidade de Glasgow, UK (Prof. F.Liew)
- Anticorpo secundário – imunohistoquímica (Anti-goat IgG H+L – Vector,
BA5000)
- Concentrações de anticorpos e proteínas para ELISA
Murino
citocina Ac 1
ario
Ac 2
ario
Curva (11 pontos)
TNF-α
H92/090899/JW H92/120899/JW 2000pg/ml
IL-1β
S5/150799/JW S329/B4/190799/JW 2000pg/ml
IL-10 18141D 18152D 2000pg/ml
IL - 4 18181D 18042D 2000pg/ml
Rato
citocina Ac 1
ario
Ac 2
ario
Curva (11 pontos)
TNF-α
SB230499GR SB54/450499/GR 4000pg/ml
IL-1β
SB1002/260499 SB1002/280499 4000pg/ml
IL-10 S142BM/0511200 S142/060300 4000pg/ml
IL-6 SB206/210499/Gr SB206/203499/GR 4000pg/ml
Todas as citocinas e antisoros foram gentilmente cedidas pelo Prof.
Fernando de Queiróz Cunha do Departamento de Farmacologia da Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto – USP.
76
4. TESTES NOCICEPTIVOS
4.1. Teste de contorção abdominal induzido por ácido acético ou zymosan
O modelo utilizado foi descrito anteriormente por COLLIER et al (1968).
Foram utilizados camundongos Swiss machos, pesando entre 25 e 30 g. Os
estímulos: ácido acético (0,6%; 0.01 ml/g de peso), zymosan (1 mg/animal;
250μl) ou iloprost (0.5 μg/animal; 250μl) foram injetados por via i.p. e a
intensidade de nocicepção foi quantificada pelo número total de contorções
abdominais ocorridas nos primeiros 30 min após administração do estímulo.
Uma contorção foi identificada como a extensão das patas traseiras
acompanhada por contrição do abdômen.
4.2. Teste de incapacitação articular
O modelo foi descrito anteriormente por TONUSSI & FERREIRA (1992),
posteriormente modificado (VIANA et al., 1998; ROCHA et al., 1999) e
adaptado para o nosso laboratório. Ratos Wistar machos, pesando entre 180 a
200 g receberam a injeção intrarticular, no joelho posterior direito, de zymosan
(1 mg/animal; 50 μl) e foram postos para deambular forçadamente em um
carrossel de piso metálico (cilindro de alumínio, 30 cm de diâmetro x 50 cm de
largura, coberto por uma tela de alumínio nas mesmas proporções), giratório,
com capacidade para 3 animais. A velocidade utilizada foi de 3 RPM. As patas
traseiras foram calçadas com sapatilhas metálicas, onde a sapatilha da pata
direita é conectada à porta de dados de um microcomputador. Ao tocar com a
sapatilha no piso metálico fecha-se um circuito e ao final de 1 min o
computador registra o tempo de suspensão da pata (TSP), isto é, o tempo que
o animal permaneceu com a pata levantada sem encostar-la ao piso. O TSP é
medido antes da injeção do estímulo (tempo zero) e de hora em hora até a 4ª
hora. Dessa forma, um aumento do TSP indica nocicepção (incapacitação
articular), isto é, a incapacidade do animal deambular normalmente sobre o
carrossel. Vale ressaltar, que antes da realização dos ensaios o animais foram
treinados, permitindo-se um período de deambulação e adaptação ao
ambiente.
77
4.3. Teste da hiperalgesia mecânica em pata de rato
O teste hiperalgesia mecânica foi realizado de acordo com a
metodologia já descrita anteriormente por FERREIRA e colaboradores em
1978. Uma pressão constante de 20mmHg é aplicada nas patas traseiras de
ratos e descontinuada quando eles apresentam uma reação típica de
“congelamento”. Essa reação é caracterizada por uma redução dos
movimentos de escape: os animais usualmente fazem movimentos severos
para escapar da posição imposta pela situação do experimento. Esses são
seguidos de alterações na freqüência respiratória acompanhado de um ataque
de tremores. A intensidade da hiperalgesia foi quantificada como uma variação
no tempo de reação (Δ tempo de reação) obtido subtraindo-se valores medidos
após a administração de substâncias hiperalgésicas dos valores obtidos do
tempo (controle) de reação (medidos antes da injeção no tempo zero, Ferreira
et al., 1978). O tempo de reação foi medido 1, 3 e 5 horas após a injeção das
substâncias hiperalgésicas.
4.4. Teste da placa quente
Para testar a eficácia contra a nocicepção térmica e de ação central foi
utilizado o método de EDDY & LEIMBACH (1953) com pequenas modificações.
Durante o experimento foi seguido o protocolo ético (NIH Guide for Care and
Use of Laboratory Animals).
Camundongos machos, pesando entre 25 e 30 g, foram postos em uma
placa quente mantida a 55 + 1º C e foram retirados quando observada a reação
de saltar ou lamber as patas traseiras. Foram feitas duas triagens separadas
por um intervalo de 30 min, onde a primeira familiarizou o animal com o teste e
serviu como uma pré-seleção (aqueles que mostraram um tempo de reação
superior a 10 segundos foram descartados). A segunda serviu como o registro
do tempo zero (tempo medido antes da administração das substâncias a serem
testadas). Além do tempo zero os animais foram testados nos 30, 60 e 90 min
após a administração das drogas. Quarenta segundos foi considerado o tempo
máximo de reação para prevenir danos nas patas dos animais.
78
5. MÉTODOS UTILIZADOS NA OBTENÇÃO DE FLUIDOS E TECIDOS PARA
ANÁLISE
5.1 Obtenção do sobrenadante de cultura de macrófagos
Os macrófagos foram tratados e estimulados in vivo. Para isso,
camundongos Swiss foram injetados, em grupos de 4 animais, por via ip com
salina ou zymosan (1mg/animal) e após 15 minutos foram sacrificados em
câmara de éter. A cavidade peritoneal foi lavada com 2 ml de meio de cultura
RPMI completo em ambiente asséptico (Fluxo laminar). Colheu-se o exsudado
e este foi colocado em uma placa de cultura (1 poço por animal). Foram
encubadas por 12 horas em estufa de CO
2
a 37º C, numa atmosfera de 5%.
Após a adesão dos macrófagos os sobrenadantes foram colhidos e estocados
a –70º C para posterior análise. Todo o procedimento foi cuidadosamente
elaborado de forma apirogênica. Após o período de incubação foi verificada a
possibilidade de contaminação por bactérias, sendo esta descartada.
5.2. Coleta do lavado articular de joelho de rato
Os animais receberam a injeção intrarticular de zymosan (1 mg/animal;
50 μl) no joelho posterior direito, após 3 horas foram anestesiados com éter e
sacrificados por decaptação exsanguinação. A pele e os ligamentos articulares
do joelho injetado foram removidos e procedeu-se a lavagem da cavidade
articular pela injeção de 400 μl de salina heparinizada (40 UI/ml) através da
membrana sinovial recolhendo-se o exsudato articular. As alíquotas foram
colocadas em tubos ependorfs e centrifugadas. O sobrenadante foi estocado a
–70ºC para posterior análise.
5.3. Coleta da pele de pata de rato
Os animais receberam a injeção de carragenina (100 μg/pata; 100 μl)
por via intraplantar seguindo o mesmo protocolo adotado para a indução de
hiperalgesia no modelo de hiperalgesia mecânica em pata de rato. Duas horas
após a indução do estímulo os animais foram sacrificados e foi feita a remoção
das peles com bisturi. As peles foram fixadas em solução formol 10% durante
79
12 horas. Após a fixação o tecido foi desidratado e incluído em parafina para a
realização de cortes histológicos para posterior ensaio imunohistoquímico.
6. DOSAGEM E IMUNOHISTOQUIMICA PARA A DETECÇÃO DE
CITOCINAS
6.1. Dosagem de citocinas em sobrenadante de cultura de macrófagos e
em sobrenadante do lavado articular de joelho de rato
O sobrenadante estocado foi descongelado para a quantificação de
citocinas como TNF, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-4 e CINC-1. O material foi dosado
pelo protocolo de ELISA descrito a seguir:
• Incubação com 2 μg/ml de anticorpo (anticorpo de captura) diluído em
tampão de bicarbonato (pH 8.2) - 100 μl/poço (placa de 96 poços) por 16-
24h a 4° C.
• Lavagem da placa (3x) com PBS-tween 20, 0,1% v/v.
• Bloqueio com albumina bovina 1% diluída em tampão de lavagem, 100
μl/poço por 2h à temperatura ambiente.
• Lavagem da placa (3x)
• Incubação com a curva padrão das citocinas diluídas em tampão de lavagem
e das amostras a serem dosadas (100 μl/poço por 16-24h à 4° C).
• Lavagem da placa (3x)
• Incubação com anticorpo biotinilado diluído a 1:1000 em tampão de lavagem
contendo 1% de soro normal de carneiro por 1 h à temperatura ambiente
• Lavagem da placa (3x)
• Incubação com avidina-peroxidase (DAKO) diluída 1:5000 em tampão de
lavagem, 100 μl/poço por 15 min à temperatura ambiente.
• Lavagem da placa (3x)
• Incubação com o-fenilenediamina diidrocloreto (OPD) em tampão substrato,
100 μl/poço, cobrir a placa e deixar no escuro por 5-20 min à temperatura
ambiente.
• A reação foi parada com 150 μl/poço de H
2
SO
4
1M.
• A leitura foi feita em espectrofotômetro a 490 nm.
80
• Os resultados são expressos em ug/ml como a curva padrão.
6.2. Imunohistoquímica em pele de pata de rato para a detecção de TNF.
As peças histológicas foram desparafinizadas e em seguida
hidratadas. O ensaio imunohistoquímico foi realizado seguindo o protocolo a
seguir:
• Após a hidratação as peças foram imersas em tampão citrato 0,1 M (pH
6.0) e aquecidas a ~100oC durante 15 min.
• Resfriamento em temperatura ambiente durante 20 min
• Lavagem em PBS (5 min)
• Bloqueio da peroxidase endógena com solução peróxido de hidrogênio
3% durante 15 min
• Lavagem com PBS
• Diluição do anticorpo primário em PBS – BSA 5% (vide reagentes e
soluções)
• Incubação com anticorpo primário anti-TNF de rato (Vector)- overnight
• Lavagem com PBS
• Diluição do anticorpo secundário (Anti-goat IgG H+L – Vector, BA5000)
em PBS-BSA 5%
• Incubação com anticorpo secundário (30 min)
• Preparo do complexo ABC (vide reagentes e soluções)
• Lavagem das peças em PBS
• Incubação com o complexo ABC
• Lavagem com PBS
• Incubação com DAB/peróxido (2 min)
• Lavagem com H
2
O destilada
• Contra-coloração com hematoxilina de Harry´s
• Desidratação e montagem das lâminas
6.3. Reação em cadeia de polimerase por transcriptase reversa (RT-PCR)
As células peritoneais foram coletadas de camundongos previamente
(30 min) estimulados com zymosan (1 mg/animal). As células serão submetidas
81
ao protocolo de RT-PCR para a determinação dos níveis de RNAm para TNF
descrito a seguir:
• Contagem das células em contador automático (COULTER A
c
T, Miami,
USA).
• Homogeneização de 0.5 milhões de células em 1.0 ml de reagente
Trizol.
• Adição de 0.2 ml de clorofórmio às amostras e agitação vigorosa por 30s
• Centrifugação das amostras a 4
o
C por 15 min (13,000 X g)
• A fase aquosa é transferida para um tubo novo onde foi adicionado um
volume equivalente de isopropanol e posterior mistura
• Incubação por 15 min a –20
o
C
• Centrifugação a 4
o
C por 15 min (13,000 X g) para precipitação do RNA
• O RNA precipitado foi lavado com 0.5 ml de etanol
• Suspensão da preparação com 50 μl de água dietilpirocarbonada
contendo EDTA 1μM
• Transcrição reversa com a incubação de 10 μl do RNA com dNTP, 200
U do superscript da transcriptase reversa, tampão Strand, e água
dietilpirocarbonada (
DEPc
H
2
O) por 1 hora 37
o
C
• A reação foi parada aquecendo-se a 90
o
C por 5 min e resfriamento a
4
o
C por 5 min.
• A amplificação da cadeia de polimerase utilizou os primers para o
TNFm (Fwd –GATCTCAAAGACAACCAACTAGTG;Rvs–
CTCCAGCTGGAAGACTCCTC-CCAG) e β-actina (Fwd –
TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC; Rvs – TAA-
AACGCAGCTCAGTAACAGTCCG) sendo realizado na presença da Taq
DNA polimerase, tampão PCR, MgCl
2
(1.5 mM), a mistura dNTP e água
estéril.
• O PCR é conduzido em sistema Perkin-Elmer Cetus GeneAmp 9600
começando com uma incubação de 3 min a 95
o
C, seguido de 35 ciclos
de desnaturação a 94
o
C por 60 s, anelando a 65
o
C por 60s e extensão a
72
o
C por 2 min. A extensão final é feita a 72
o
C por 7 min.
82
7. PROTOCOLO EXPERIMENTAL
7.1. Efeito da talidomida, pentoxifilina ou clorpromazina sobre as
contorções abdominais induzidas por ácido acético, zymosan ou iloprost.
Talidomida (5 – 45 mg/kg), pentoxifilina (0.5 – 45 mg\kg) ou
clorpromazina (0.1 - 1 mg\kg) foram injetadas num volume de 0.3 ml/ 30 g de
peso do animal por via i.p. 30 min antes da injeção também i.p. do estímulo
ácido acético (0.6%), zymosan (1 mg/animal) ou iloprost (0.5 ug\animal). As
contorções abdominais foram computadas durante 30 min após a
administração dos mesmos (ilustração 2.1).
7.2. Efeito da talidomida, pentoxifilina ou clorpromazina sobre a
incapacitação articular induzida por zymosan.
Talidomida (5 –45 mg/kg), pentoxifilina (0.5 – 45 mg\kg) ou
clorpromazina (0.1 a 1 mg\kg) foram injetadas num volume de 500 μl/200g de
peso do animal por via i.p. 30 min antes da injeção intrarticular de zymosan (1
mg/animal; 50 μl). O tempo de suspensão da pata foi medido durante 60
segundos de hora em hora até a 4ª hora após a injeção do estímulo (ilustração
2.2.).
7.3. Efeito do pré-tratamento com talidomida, pentoxifilina ou
clorpromazina sobre a hiperalgesia mecânica em pata de rato induzida
por diversos estímulos.
Talidomida (5 –45 mg/kg; i.p.), pentoxifilina (0.5 – 100 mg\kg; i.p.
ou 1 – 9mg\pata; i.pl.) ou clorpromazina (0.1 a 1 mg\kg; i.p. ou 0.02 –
0.2mg\pata; i.pl.) foram injetadas 30 min antes do estímulo: carragenina (100
ug\pata), bradicinina (500 ng\;pata), TNF (2.5 pg\pata), IL-1 (1 pg\pata) ou
PGE
2
(100ng\pata). A intensidade de hiperalgesia foi medida como citado
anteriormente (ilustração 2.3).
83
7.4. Efeito do pré-tratamento com os anticorpos anti-interleucina-4 ou
anti-interleucina-10 na atividade de talidomida na hiperalgesia induzida
por carragenina. Ratos foram injetados com 50 μg de anticorpo anti IL-4 ou
anti IL-10, ou com um soro controle, 50 μl, via i.pl. 30 min depois foi
administrado salina ou talidomida (45mg/kg; i.p.). Interleucina-4 (IL-4; 10 ng/50
μl) ou interleucina-10 (IL-10, 100ng/50 μl) foram administradas na mesma pata
que recebereu os anticorpos correspondentes. Após 30 min Carragenina (100
μg/pata; 100 μl) foi injetada e a intensidade de hiperalgesia foi mensurada 3
horas após como descrito acima.
7.5. Efeito da talidomida e pentoxifilina no teste da placa quente.
Após a tomada do tempo zero, talidomida (45 mg/kg), pentoxifilina
(1.6 mg/kg), clorpromazina (1 mg\kg), morfina (5 mg/kg) ou indometacina (2
mg/kg) foram injetadas por via i.p. e 30, 60 e 90 min depois foi registrado o
tempo de reação (s) na placa quente (55 + 1º C) ver ilustração 2.4.
7.6. Efeito da naloxona sobre a atividade antinociceptiva da
talidomida, pentoxifilina ou da clorpromazina.
Camundongos Swiss foram previamente tratados (30 min; i.p.) com
salina (300 μl), talidomida (45 mg/kg), pentoxifilina (1,6 mg/kg), clorpromazina
(1 mg\kg) ou morfina (5 mg/kg; 15 min antes). Salina ou naloxona (2 mg/kg) por
via s.c. foi administrada 15 min antes dos tratamentos. Zymosan (1 mg\animal)
foi administrado por via i.p. e logo em seguida as contorções abdominais foram
computadas durante 30 min.
84
7.7. Efeito da talidomida, pentoxifilina ou clorpromazina na
liberação de diversas citocinas por macrófagos peritoneais de
camundongos estimulados in vivo por zymosan.
Os camundongos foram pré-tratados com talidomida (45 mg/kg),
pentoxifilina (0.5 – 45 mg/kg) ou clorpromazina (1 mg\kg) antes da injeção i.p.
de zymosan (1 mg/animal). 15 min depois, os animais foram sacrificados e o
exudato peritoneal foi colhido e posto em cultura por 12 horas. O sobrenadante
foi retirado para a realização da dosagem de TNF, IL-1β, IL-10, IL-4 e IL-6 pelo
protocolo de ELISA descrito anteriormente (ilustração 2.5).
7.8. Efeito da talidomida, pentoxifilina ou clorpromazina sobre os
níveis de citocinas presentes no lavado articular do joelho de ratos
submetidos á artrite experimental por zymosan.
Talidomida (45 mg/kg), pentoxifilina (1.6 mg/kg) ou clorpromazina
(1 mg\kg) foi injetada por via i.p. 30 min antes da injeção intrarticular de
zymosan (1 mg/animal; 50 μl). A lavagem da cavidade articular para a coleta do
exudato foi feita 2 horas após a injeção do estímulo. O exudato foi centrifugado
e o sobrenadante estocado para posterior análise (ilustração 2.6).
7.9. Efeito do pré-tratamento com talidomida, pentoxifilina ou
clorpromazina sobre a detecção de TNF por imunohistoquímica em pele
de rato estimulada com carragenina.
Os animais foram pré-tratados com talidomida (45 mg/kg; i.p.),
pentoxifilina (9mg/pata; i.pl.) ou clorpromazina (1mg/kg; i.p.) 30 min antes da
injeção i.pl. de carragenina (100 ug/pata; 100 ul). Após 2h da injeção do
estímulo as peles foram removidas para a realização de imunohistoquímica de
acordo com o protocolo supracitado (ilustração 2.7).
85
8. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos como média + o erro padrão da média
(EPM). As médias dos vários procedimentos experimentais foram comparadas
utilizando a análise de variância (ANOVA), e a significância entre os grupos
estabelecida pelo teste Turkey. O numero (N) de animais por grupo
experimental está descrito nas figuras. A significância mínima foi aceita ao nível
de P<0.05.
86
87
88
89
90
91
92
93
III. RESULTADOS
94
1. Inibição da atividade nociceptiva do zymosan e do acido acético por
talidomida no modelo de contorções abdominais.
A injeção intraperitoneal de talidomida nas doses de 5, 15 e 45 mg/kg,
30 min antes do estímulo nociceptivo, foi capaz de reduzir de forma dose-
dependente as contorções abdominais induzidas por zymosan (1 mg/animal,
i.p.; Figura 1A) ou ácido acético (0.6%, i.p.; Figura 1B). O bloqueio foi
significante nas três doses quando o estímulo era zymosan com 33.9%, 51.7%
e 85.6% (p<0.001, na resposta máxima) de inibição respectivamente para as
doses de 5, 15 e 45 mg/kg e 40.4% e 60.3% (p<0.001, na resposta máxima) de
inibição respectivamente para as doses de 5 e 45, quando o estímulo utilizado
foi o ácido acético.
2. Efeito do pré-tratamento com talidomida sobre a atividade nociceptiva
do zymosan no modelo de incapacitação articular em joelho de rato.
Talidomida foi administrada por via i.p. nas doses de 1, 5 e 45 mg/kg, 30
min antes da injeção intrarticular de zymosan (1 mg/animal; 50 μl). Na Figura 2
a cinética mostra que o pico de incapacitação ocorreu na 4
a
hora e que
talidomida inibiu a incapacitação articular (Δ tempo de suspensão da pata), de
modo significativo, na 3
a
hora (89%, p<0.05, dose de 45mg/kg) e na 4
a
hora
(71,4% e 70%, p<0.05, respectivamente para as doses de 15 e 45 mg/kg).
3. Efeito antinociceptivo da talidomida sobre a intensidade de
hiperalgesia induzida por carragenina.
Talidomida nas doses de 5 a 45 mg/kg foi administrada por via i.p., 30
min antes ou 1 hora depois da injeção intraplantar de carragenina (100 μg/pata)
Foi observado que talidomida nas doses de 5 e 45 mg/kg inibe de forma
significativa a hiperalgesia induzida por carragenina em até 72% na 2
a
hora,
78% na 3
a
hora e 76.8% na 4
a
hora (p<0.001) na dose de 45 mg/kg (figura 3,
painel A) quando injetada previamente á carragenina mas não quando injetada
após o estímulo (Figura 5). Nas mesmas doses em que inibe a hiperalgesia
talidomida não inibe o edema de pata induzido por carragenina (figura 4). O
painel B da figura 3 mostra a inibição dose-dependente observada na 3
a
hora
(pico de hiperlgesia).
95
96
97
98
99
100
4. Efeito da talidomida sobre a intensidade de hiperalgesia induzida por
bradicinina, fator de necrose tumoral (TNF) ou prostaglandina E
2
(PGE
2
).
O pré-tratamento com talidomida (45 mg/kg) por via i.p., 30 min antes do
estímulo bradicinina (500 ng/pata) inibiu, de forma significativa, a intensidade
de hiperalgesia (Δ tempo de reação) em 82,4% (p<0.001). No entanto
talidomida na mesma dose não inibiu a hiperalgesia induzida por TNF (2.5
pg/pata) ou PGE
2
(100 ng/pata) quando comparado ao grupo de animais pré-
tratados com salina (figura 6).
5. Efeito dos anticorpos anti-interleucina-4 ou anti-interleucina-10 no
efeito anti-hiperalgésico da talidomida. O anticorpo anti IL-4 (50μg) ou anti
IL-10 (50μg) quando administrados por via intraplantar não alteraram a
atividade anti-hiperalgésica da talidomida (45mg/kg; i.p.; figura 7 painel A)
quando comparado com o grupo que recebeu talidomida e soro controle. No
entanto as mesmas quantidades dos respectivos anticorpos foram capazes de
reverter a atividade inibitória de Interleucina-4 (IL-4; 10 ng/50 μl) ou
interleucina-10 (IL-10, 100ng/50 μl) quando administradas na mesma pata que
receberam os anticorpos correspondentes (figura 7, painel B).
6. Efeito do pré-tratamento com naloxona na antinocicepção obtida pela
injeção prévia de talidomida nas contorções abdominais induzidas por
zymosan.
Naloxona (2 mg/kg,; s.c.) quando injetada antes da administração de
talidomida (45 mg/kg, i.p.; dose de maior efeito) não foi capaz de reverter o
bloqueio por talidomida das contorções abdominais induzidas por zymosan (1
mg/animal; i.p.) quando comparada ao grupo pré-tratado somente com
talidomida na mesma dose. No entanto a mesma dose de naloxona foi capaz
de reverter completamente o bloqueio das contorções abdominais por morfina
(5mg/kg), quando este grupo é comparado ao grupo pré-tratado somente com
morfina (Figura 8).
101
102
103
104
7. Efeito da talidomida sobre o tempo de reação no teste da placa quente.
Talidomida (45mg/kg; doses de maior efeito no teste de contorção
abdominal), a exemplo do observado com a indometacina ou salina, quando
dada por via i.p., não foi capaz de modificar o tempo de reação dos animais no
teste da placa quente (Figura 9). Efeito este diferente da morfina (5 mg/kg; ip)
que foi capaz de aumentar esse tempo em até 100% (p<0,001; maior efeito).
8. Efeito da talidomida na liberação de citocinas por macrófagos
peritoneais residentes murinos estimulados in vivo com zymosan.
Talidomida na dose que induziu o maior efeito inibitório sobre as
contorções abdominais (45 mg/kg) foi capaz de inibir em 100% (p<0.001) a
liberação de TNF (Figura 10, painel A) mas não a liberação de IL-1β ou IL-10
(Figura 10, painel B e C) por macrófagos peritoneais quando injetada in vivo 30
min antes do estímulo zymosan, na mesma dose capaz de induzir contorções
abdominais (1 mg/animal). A inibição da liberação de TNF por talidomida foi
constatada pela dosagem das mesmas nos sobrenadantes de cultura dos
macrófagos obtidos das cavidades previamente tratadas com talidomida e
estimuladas com zymosan. Para tal utilizou-se imunoensaios específicos para
as citocinas como descrito anteriormente.
9. Efeito da talidomida na liberação de citocinas para a cavidade articular
de joelhos de ratos estimulados com zymosan
Talidomida na dose que induziu o maior efeito no bloqueio da
incapacitação articular (45 mg/kg) foi capaz de inibir em 77% (p<0.001) a
liberação de TNF (Figura 11, painel A) mas não a liberação de IL-1β, IL-10, IL-6
ou CINC-1 (Figura 11, painel B, C, D e E) para a cavidade articular de joelhos
de ratos estimulados com zymosan na mesma dose capaz de induzir
incapacitação articular (1 mg/cavidade). A inibição da liberação de TNF por
talidomida foi constatada pela dosagem da mesma no sobrenadante do fluido
coletado através da lavagem da cavidade articular de juntas estimuladas com
zymosan. Para tal utilizou-se imunoensaios específicos para as citocinas como
descrito anteriormente.
105
106
107
108
10. Efeito da talidomida, in vivo, nos níveis de RNAm para TNF induzido
por zymosan em camundongos.
A injeção i.p. de zymosan (1mg/animal) em camundongos induziu um
aumento nos níveis de RNAm para TNF murino determinado por RT-PCR em
células peritoneais colhidas 30 min após a injeção de zymosan. Talidomida (45
mg/kg) administrada 30 min antes do zymosan reduziu os níveis de RNAm para
TNF mas não afetou os níveis do RNAm para β-actina (Figura 12).
11. Efeito do tratamento com talidomida na produção do fator de necrose
tumoral por células residentes da pele da pata de rato estimuladas com
carragenina demonstrado por reação imunohistoquímica.
Talidomida (45 mg/kg) foi administrada previamente a carragenina (100
μg/pata) na dose em que demonstrou antinocicepção máxima no teste da
hiperalgesia mecânica em pata de rato. Os protocolos de tratamento e indução
foram os mesmos utilizados na hiperalgesia mecânica. Foi observado que
carragenina induziu a produção de TNF por células residentes demonstrado
por uma intensa marcação por imunohistoquímica (figura 13 C). O pré-
tratamento com talidomida diminuiu visivelmente a marcação por
imunohistoquímica (figura 13 D).
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110
111
12. Efeito da pentoxifilina na atividade nociceptiva do zymosan, acido
acético e iloprost no modelo de contorções abdominais.
A injeção intraperitoneal de pentoxifilina 30 min antes do estímulo, foi
capaz de reduzir de forma significativa e dose-dependente as contorções
abdominais induzidas por zymosan (1 mg/animal, i.p.; Figura 14A) ou ácido
acético (0.6%, i.p.; Figura 14B) sendo o bloqueio significativo apenas nas
doses de 1.6 e 5 mg/kg quando o estímulo foi zymosan com 82.9% e 58.5%
(p<0.001 na resposta máxima) de inibição respectivamente e 52.3%, 89.8% e
47.6% (p<0.001) de inibição respectivamente para as doses de 0.5, 1.6 e 5,
quando o estímulo utilizado foi o ácido acético. No entanto a maior dose de
PTX (45 mg/kg) não produziu efeito inibitório sobre a atividade desses dois
estímulos e quando a dose de zymosan é rebaixada observamos um discreto
aumento das contorções abdominais por PTX nesta mesma dose (figura 15 A).
Quando o estímulo utilizado foi o iloprost foi observado uma amplificação do
número de contorções com a dose maior de PTX (45 mg/kg) e uma ausência
de inibição das contorções abdominais quando utilizou-se a dose de 1.6 mg/kg
(Figura 15 B)
13. Efeito pré-tratamento com pentoxifilina sobre a atividade nociceptiva
do zymosan no modelo de incapacitação articular em joelho de rato.
Pentoxifilina foi administrada por via i.p. nas doses de 0.5 a 45 mg/kg, 30
min antes da injeção intrarticular de zymosan (1 mg/animal; 50 μl). Na Figura
16 a cinética mostra que o pico de incapacitação ocorreu na 3
a
hora e que
pentoxifilina inibiu a incapacitação articular (Δ tempo de suspensão da pata), de
modo significativo, na 2
a
hora (89%, p<0.01, dose de 1.6mg/kg), na 3
a
hora
(73.6% e 63.8%, p<0.01, respectivamente para as doses de 1.6 e 5 mg/kg) e
na 4
a
hora (80.3%, p<0.01, para a dose de 1.6 mg/kg).
112
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14. Efeito da pentoxifilina sobre a hiperalgesia em pata de rato induzida
por carragenina
Pentoxifilina (0.5 – 45 mg/kg) por via i.p. ou via intraplantar (1 – 9
mg/pata) foi administrada 30 min antes do estímulo carragenina (100 μg/pata).
Foi observada inibição significativa de 42.3% e 52.3% (p<0.001) para as doses
de 15 e 45 mg/kg respectivamente, na 3
a
hora (figura 17, painel B) quando o
pré-tratamento foi feito por via i.p. A figura 18 painel A mostra que pentoxifilina
inibe a hiperalgesia de forma significativa na 3
a
e 5
a
hora após a administração
do estímulo com 73,3% (p<0.001) de inibição máxima na 3
a
hora (pico de
hiperalgesia) para a dose de 9 mg/pata. O Painel B da figura 18 mostra a
inibição de forma dose dependente da PTX na 3
a
hora de hiperlgesia. Quando
PTX é administrada 1 hora após o estímulo observamos uma inibição de 60%,
no entanto quando administrada 2 horas após o estímulo não observamos
efeito inibitório sobre a hiperalgesia induzida por carragenina (figura 19)
15. Efeito do pré-tratamento com pentoxifilina sobre a hiperalgesia em
pata de rato induzida por bradicinina, fator de necrose tumoral (TNF),
interleucina-1 (IL-1) ou prostaglandina E
2
(PGE
2
).
Pentoxifilina (9 mg/pata) por via intraplantar foi injetada 30 min antes dos
estímulos bradicinina (500 ng/pata), TNF (2.5 pg/pata), IL-1 (1 pg/pata) ou
PGE
2
(100 ng/pata). A figura 20 mostra que pentoxifilina inibe de forma
significativa a intensidade de hiperalgesia (Δ tempo de reação) induzida por
bradicinina e TNF em 55.2% e 45.6% (p<0.001) respectivamente, mas não a
por IL-1 ou PGE
2
quando comparado ao grupo pré-tratado com salina.
116
117
118
119
120
16. Efeito do pré-tratamento com naloxona na antinocicepção obtida pela
injeção prévia de pentoxifilina nas contorções abdominais induzidas por
zymosan.
Naloxona (2 mg/kg,; s.c.) quando injetada antes da administração de
pentoxifilina (1.6 mg/kg, i.p.; dose de maior efeito) não foi capaz de reverter o
bloqueio das contorções abdominais induzidas por zymosan (1 mg/animal; i.p.)
quando comparada ao grupo pré-tratado somente com pentoxifilina na mesma
dose. No entanto a mesma dose de naloxona foi capaz de reverter
completamente o bloqueio das contorções abdominais por morfina (5mg/kg),
quando este grupo é comparado ao grupo pré-tratado somente com morfina
(Figura 21).
17. Efeito da pentoxifilina sobre o tempo de reação no teste da placa
quente.
Pentoxifilina (1.6mg/kg; doses de maior efeito no teste de contorção
abdominal), a exemplo do observado com a indometacina ou salina, quando
dada por via ip, não foi capaz de modificar o tempo de reação dos animais no
teste da placa quente (Figura 22). Efeito este diferente da morfina (5 mg/kg; ip)
que foi capaz de aumentar esse tempo em até 100% (p<0,001; maior efeito).
18. Efeito da pentoxifilina na liberação de citocinas por macrófagos
peritoneais residentes murinos estimulados in vivo com zymosan.
Pentoxifilina (0.5 - 45 mg/kg) foi capaz de inibir em até 87.5% (p<0.01;
dose de 1.6 mg/kg) a liberação de TNF (Figura 23 painel A) e em até 97% a
liberação de IL-1β mas não a liberação de IL-10 (Figura 23, painel B e C) por
macrófagos peritoneais quando injetada, in vivo, 30 min antes do estímulo
zymosan, na mesma dose capaz de induzir contorções abdominais (1
mg/animal). A inibição da liberação de TNF e IL-1 por pentoxifilina foi
constatada pela dosagem das mesmas nos sobrenadantes de cultura dos
macrófagos obtidos das cavidades previamente tratadas com pentoxifilina e
estimuladas com zymosan. Para tal utilizou-se imunoensaio específico para
cada citocina já descrito anteriormente.
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19. Efeito da pentoxifilina sobre liberação de citocinas na a cavidade
articular de joelhos de ratos estimulados com zymosan
Pentoxifilina na dose que induziu o maior efeito no bloqueio da
incapacitação articular (1.6 mg/kg) foi capaz de inibir em 53.9% (p<0.01) a
liberação de TNF (Figura 24, painel A) e em 47% a liberação de IL-1β (p<0.01,
figura 24, painel B) mas não a liberação de IL-10, IL-6 ou CINC-1 (Figura 24,
painel C, D e E) para a cavidade articular de joelhos de ratos estimulados com
zymosan na mesma dose capaz de induzir incapacitação articular (1
mg/cavidade). A inibição da liberação de TNF e IL-1 por pentoxifilina foi
constatada pela dosagem das mesmas nos sobrenadantes de cultura dos
macrófagos obtidos das cavidades previamente tratadas com pentoxifilina e
estimuladas com zymosan. Para tal utilizou-se imunoensaio específico paras
cada citocina já descritos anteriormente.
20. Efeito do tratamento com pentoxifilina na produção do fator de
necrose tumoral por células residentes da pele da pata de rato
estimuladas com carragenina demonstrado por reação
imunohistoquimica.
Pentoxifilina (9mg/pata) foi administrada previamente a carragenina (100
μg/pata) dose em que demonstrou antinocicepção máxima no teste da
hiperalgesia mecânica em pata de rato. Os protocolos de tratamento e indução
foram os mesmos utilizados na hiperalgesia mecânica. Foi observado que
carragenina induziu a produção de TNF por células residentes demonstrado
por uma intensa marcação por imunohistoquímica (figura 25 C). O pré-
tratamento com talidomida e pentoxifilina diminuiu visivelmente a marcação por
imunohistoquímica (figura 25 D).
125
126
127
21. Efeito da clorpromazina no teste de contorções abdominais induzido
por zymosan, ácido acético ou iloprost.
A injeção intraperitoneal de clorpromazina nas doses de 0.1, 0.3 e 1.0
mg/kg, 30 min antes do estímulo, foi capaz de reduzir de forma dose-
dependente as contorções abdominais induzidas por zymosan (1 mg/animal,
i.p.; Figura 26 painel A) ou ácido acético (0.6%, i.p.; Figura 26 painel B) sendo
o bloqueio significante em todas as doses quando o estímulo utilizado foi o
zymosan com 35%, 41.6% e 63.7% (p<0.001 na resposta máxima) de inibição
respectivamente e apenas para as doses de 0.3 e 1.0 mg/kg com 62.6% e 89%
(p<0.001) de inibição respectivamente, quando o estímulo utilizado foi o ácido
acético. Clorpromazina não foi capaz de inibir de modo significativo as
contorções abdominais induzidas por iloprost (Figura 27).
22. Efeito do pré-tratamento com clorpromazina sobre a atividade
nociceptiva do zymosan no modelo de incapacitação articular em joelho
de rato.
Clorpromazina foi administrada por via i.p. nas doses de 0.1 a 1 mg/kg,
30 min antes da injeção intrarticular de zymosan (1 mg/animal; 50 μl). Na
Figura 28 a cinética mostra que o pico de incapacitação ocorreu na 3
a
hora e
que clorpromazina inibiu a incapacitação articular (Δ tempo de suspensão da
pata), de modo significativo, na 2
a
hora (94%, p<0.01, apenas na dose de
0.3mg/kg), na 3
a
hora (99% e 48%, p<0.01, respectivamente para as doses de
0.3 e 1 mg/kg) e na 4
a
hora (82%, p<0.01, para a dose de 0.3 mg/kg).
Observou-se que a dose de maior eficácia foi a dose de 0.3 mg/kg.
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131
23. Efeito da clorpromazina sobre a hiperalgesia em pata de rato induzida
por carragenina
Clorpromazina (0.1 – 1 mg/kg) por via i.p. quando administrada 30 min
antes do estímulo carragenina (100 μg/pata) inibiu de forma significativa a
hiperalgesia induzida por carragenina em 39% e 65.5% (p<0.001) para as
doses de 0,3 e 1 mg/kg respectivamente, na 3
a
hora e 41,1% e 68.1% para as
mesmas doses (p<0.001) na 5
a
hora quando o pré-tratamento foi feito por via
i.p. (figura 29 Painel A). O painel B da figura 29 mostra a inibição dose-
dependente na 3
a
hora de hiperalgesia. Quando administrada por via
intraplantar, clorpromazina demonstrou menor efeito inibitório alcançando
somente 18% (p<0.05) de inibição (figura 30 B). Clorpromazina também foi
capaz de inibir de forma significativa (52%, P<0,001) a atividade hiperalgésica
da carragenina mesmo quando administrada 2 horas apos o estímulo (Figura
31).
24. Efeito do pré-tratamento com clorpromazina sobre a hiperalgesia em
pata de rato induzida por bradicinina, fator de necrose tumoral (TNF),
interleucina-1 (IL-1) ou prostaglandina E
2
(PGE
2
).
Clorpromazina (1 mg/pata) por via i.p. foi injetada 30 min antes dos
estímulos bradicinina (500 ng/pata), TNF (2.5 pg/pata), IL-1 (1 pg/pata) ou
PGE
2
(100 ng/pata). A figura 32 mostra que clorpromazina inibe de forma
significativa a intensidade de hiperalgesia (Δ tempo de reação) induzida por
todos os estímulos com 58.5%, 42%, 38.8% e 21,14% de inibição
respectivamente para bradicinina, TNF, IL-1 e PGE
2
quando comparado ao
grupo pré-tratado com salina.
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135
136
25. Efeito do pré-tratamento com naloxona na antinocicepção obtida pela
injeção prévia de clorpromazina nas contorções abdominais induzidas
por zymosan.
Naloxona (2 mg/kg,; s.c.) quando injetada antes da administração de
clorpromazina (1mg/kg, i.p.; dose de maior efeito) não foi capaz de reverter o
bloqueio das contorções abdominais induzidas por zymosan (1 mg/animal; i.p.)
quando comparada ao grupo pré-tratado somente com clorpromazina na
mesma dose. No entanto a mesma dose de naloxona foi capaz de reverter
completamente o bloqueio das contorções abdominais por morfina (5mg/kg),
quando este grupo é comparado ao grupo pré-tratado somente com morfina
(Figura 33).
26. Efeito da clorpromazina sobre o tempo de reação no teste da placa
quente.
Clorpromazina (1mg/kg; doses de maior efeito no teste de contorção
abdominal), a exemplo do observado com a indometacina ou salina, quando
dada por via ip, não foi capaz de modificar o tempo de reação dos animais no
teste da placa quente (Figura 34). Efeito este diferente da morfina (5 mg/kg; ip)
que foi capaz de aumentar esse tempo em até 100% (p<0,001; maior efeito).
27. Efeito da clorpromazina na liberação de citocinas por macrófagos
peritoneais residentes murinos estimulados in vivo com zymosan.
Clorpromazina na dose que induziu o maior efeito no bloqueio das
contorções abdominais (1 mg/kg) foi capaz de inibir em 54.04% (p<0.05) a
liberação de TNF (Figura 35, painel A) mas não a liberação de IL-1β ou IL-10
(Figura 35, painel B e C) por macrófagos peritoneais quando injetada in vivo 30
min antes do estímulo zymosan, na mesma dose capaz de induzir contorções
abdominais (1 mg/animal). A inibição da liberação de TNF-α por clorpromazina
foi constatada pela dosagem das mesmas nos sobrenadantes de cultura dos
macrófagos obtidos das cavidades peritoneais previamente injetadas com
clorpromazina e estimuladas com zymosan. Para tal utilizou-se imunoensaios
específicos paras cada citocina já descritos anteriormente.
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138
139
140
28. Efeito da clorpromazina na liberação de citocinas na cavidade articular
de joelhos de ratos estimulados com zymosan
Clorpromazina na dose que induziu o maior efeito no bloqueio da
incapacitação articular (0.3 mg/kg) foi capaz de inibir em 32.6% (p<0.01) a
liberação de IL-1 (Figura 36, painel B) mas não a liberação de TNF, IL-10, IL-6
ou CINC-1 (Figura 36, painel A, C, D e E) para a cavidade articular de joelhos
de ratos estimulados com zymosan na mesma dose capaz de induzir
incapacitação articular (1 mg/cavidade). A inibição da liberação de TNF-α por
clorpromazina foi constatada pela dosagem das mesmas nos sobrenadantes
de lavado articular obtidos de animais previamente tratados com clorpromazina
e estimulados com zymosan. Para tal utilizou-se imunoensaios específicos para
cada citocina já descritos anteriormente.
29. Efeito do tratamento clorpromazina na produção do fator de necrose
tumoral por células residentes da pele da pata de rato estimuladas com
carragenina demonstrado por reação imunohistoquimica.
Clorpromazina (1 mg/kg) foi administrada previamente a carragenina
(100 μg/pata) , dose em que demonstrou antinocicepção máxima no teste da
hiperalgesia mecânica em pata de rato. Os protocolos de tratamento e indução
foram os mesmos utilizados na hiperalgesia mecânica. Foi observado que
carragenina induziu a produção de TNF por células residentes demonstrado
por uma intensa marcação por imunohistoquímica (figura 37 C). O pré-
tratamento com clorpromazina diminuiu de modo discreto a marcação por
imunohistoquímica (figura 37 D).
141
142
143
IV. DISCUSSÃO
144
O objetivo do presente trabalho foi investigar a atividade
antinociceptiva da talidomida, pentoxifilina e clorpromazina em modelos
experimentais de dor induzida por estímulos inflamatórios. Além disso, estudar
as possíveis citocinas envolvidas na promoção da nocicepção induzida por
diferentes estímulos assim como o efeito das drogas na modulação dessas
citocinas. Dentre os modelos experimentais utilizados no trabalho o de
contorções abdominais já foi extensivamente estudado e descrito na literatura e
vem sendo utilizado por nosso grupo em diversos estudos. Escolhemos os
estímulos ácido acético e zymosan nesse modelo, pois já estão bem
estabelecidos na literatura.
Foi sugerido que o ácido acético induz nocicepção por um mecanismo
indireto possivelmente por liberar substâncias endógenas que excitam as
terminações nociceptivas (COLLIER et al., 1968). Confirmando esses dados,
em estudo anterior, demonstramos que ácido acético induz nocicepção
(contorção abdominal) por agir sobre células residentes como macrófagos e
mastócitos da cavidade peritoneal de camundongos induzindo a liberação de
mediadores inflamatórios (RIBEIRO et al., 2000).
Por sua vez zymosan, o polissacarídeo da parede celular do fungo
Saccharomyces Cerevisiae, é capaz de induzir a liberação de diversos
mediadores inflamatórios dentre eles: componentes do sistema complemento,
prostaglandinas e leucotrienos (BONNEY et al., 1978; SCOTT et al., 1980;
HUMES et al., 1982), fator de ativação plaquetária (ROUBIN et al., 1982),
espécies reativas do oxigênio (NAUSEEF et al., 1983) e TNF e IL-1β (RIBEIRO
et al., 2000, VALE et al., 2003; PETTIPHER AND SALTER, 1996). O zymosan
induz extravasamento de proteínas plasmática e infiltrado de células
inflamatórias, resultando numa cascata de eventos incluindo ativação do
sistema do complemento, degranulação de mastócitos e geração dos produtos
do metabolismo do ácido araquidônico (DOHERTY et al., 1985; RAO et al.,
1994). Assim como ácido acético zymosan também induz nocicepção visceral
quando injetado por via i.p. As doses utilizadas no estudo estão de acordo com
publicação anterior (RIBEIRO et al., 2000).
No mesmo modelo já foi demonstrado que células residentes da
cavidade peritoneal de camundongos desempenham papel crucial no
desenvolvimento da resposta nociceptiva do zymosan (RIBEIRO et al., 2000).
145
Como já discutido na introdução do presente estudo, a presença de
macrófagos e mastócitos residentes iniciam a resposta nociceptiva e a
depleção destas células, da cavidade peritoneal, inibe o desenvolvimento da
nocicepção. Tais células são capazes de produzir e liberar diversos
mediadores dentre estes as citocinas.
Citocinas como TNF age como iniciador da cascata de mediadores
responsáveis pela gênese da dor inflamatória assunto bem discutido e
estabelecido na literatura. A liberação de TNF e IL-1 por células residentes
peritoneais murinas estimuladas, in vivo, com zymosan já foi demonstrada em
trabalho recente (VALE et al., 2003), assim como também que a inibição da
gênese dessas citocinas está associada à inibição da nocicepção, pois
anticorpos específicos para essas citocinas foram capazes de diminuir o
número de contorções abdominais induzidas tanto por ácido acético como por
zymosan (RIBEIRO et al., 2000). As drogas estudadas no presente trabalho
são moduladoras da produção de tais citocinas e esse fato nos levou a estudar
uma possível atividade antinociceptiva neste modelo experimental.
Os outros testes nociceptivos utilizados também já estão bem
estabelecidos na literatura. A incapacitação articular em joelho de rato é um
modelo experimental fácil e objetivo que permite o estudo de drogas
analgésicas periféricas e de efeito central (TONUSSI & FERREIRA, 1992;
MAGALHÃES et al., 1997; VIANA et al., 1998; ROCHA et al., 1999). Ademais,
a cavidade articular permite a avaliação de parâmetros inflamatórios através da
coleta do exsudato articular para a avaliação da migração leucocitária e
dosagem de mediadores liberados diretamente no local da inflamação.
No presente trabalho o exsudato articular foi utilizado para dosagem de
citocinas, mas não para avaliar migração celular, pois em estudo anterior
(VALE, 2000) não parece haver correlação entre o aumento do número de
leucócitos e nocicepção. Ainda no mesmo modelo ROCHA e colaboradores
demonstraram que a injeção de zymosan em articulações intactas induz uma
periartrite a qual é responsável pelo fenômeno da incapacitação articular,
diferente de quando o zymosan é injetado diretamente na sinóvia através de
um acesso cirúrgico o qual não promove incapacitação articular (ROCHA et al.,
1999). Esses achados estão de acordo com a literatura, onde já foi
demonstrado que a membrana sinovial possui poucos nociceptores onde a
146
maioria deles participam da função vascular autônoma (HASSELBACHER et
al., 1981), ao contrário da inervação da cápsula fibrosa, ligamento articular e
periósteo, estruturas ricamente inervadas por fibras simpáticas e somáticas
(KENNEDY et al., 1982; GRÖNBLAD et al., 1985). Foi sugerido que além da
presença de mediadores liberados no local, a estrutura peri-articular é
importante, tornando o local da injeção da substâcia algiogênica crucial para o
desenvolvimento da incapacitação articular.
Assim como no teste de contorções abdominais, o papel de TNF no
modelo de incapacitação articular foi anteriormente demonstrado, porém,
utilizando carragenina como estímulo (TONUSSI e FERREIRA et al., 1999).
Neste estudo observou-se que o anticorpo para TNF inibiu a incapacitação
articular induzida por carragenina. No entanto, quando o próprio TNF foi
utilizado como estímulo em articulações naive, não induziu incapacitação
articular, mas sim em articulações previamente estimuladas (72 h) com
carragenina alcançando efeito máximo já na primeira hora e permanecendo por
várias horas. Os autores sugerem que alguns eventos prévios à liberação de
TNF sensibilizam a articulação para o efeito da citocina. Uma hipótese seria a
liberação prévia de bradicinina ao TNF, pois antagonistas da cinina
administrados previamente à carragenina inibem a incapacitação assim como o
antagonista do receptor B1 da bradicinina inibe parcialmente a incapacitação
evocada por TNF, indicando que TNF também deve induzir a liberação de
bradicinina (TONUSSI e FERREIRA et al., 1999).
Na artrite experimental por zymosan, onde o mesmo é injetado na
cavidade articular de ratos, também já foi demonstrado por dosagem de
citocina que há produção local de TNF na cavidade articular atingindo
concentrações máximas em 1 a 2 horas após a indução (PETTIPHER AND
SALTER, 1996). Assim, observamos que o modelo de incapacitação articular
induzida por zymosan seria de valia para o estudo da possível atividade
antinociceptiva de talidomida, pentoxifilina e clorpromazina, na dor articular por
nocicepção, drogas que dentre outras atividades são moduladoras da síntese
de citocinas. Ademais diversos autores comentam a importância das citocinas
pró-inflamatórias na gênese das doenças articulares, onde a dor é um fator
limitante, demonstrando que as terapias mais promissoras neste sentido seriam
147
as direcionadas para o bloqueio da gênese dessas citocinas principalmente a
nível local (MORELAND, 1999; REIMOLD, 2002).
A hiperalgesia mecânica em pata de rato (Randall-Selitto modificado por
FERREIRA et al., 1989) é um método subjetivo que exige treinamento prévio
do observador mas que tem a vantagem da homogeneidade entre as amostras
e é bastante fidedigno. Utilizamos tal modelo para que outros estímulos
pudessem ser avaliados e pudessem servir de ferramentas farmacológicas.
Como já comentado na introdução deste estudo, no teste de hiperalgesia
mecânica em pata de rato foi demonstrado o papel modulador de citocinas
sobre a hiperalgesia induzida por diversos estímulos e é um método que
permite avaliar o efeito central ou periférico de drogas analgésicas, bem como
a ação local ou sistêmica das mesmas.
Os dados do presente trabalho demonstram que talidomida inibe de
modo significativo e dose-dependente as contorções abdominais induzidas
tanto por ácido acético como por zymosan. As doses utilizadas partiram de
informações retiradas da literatura. Da dose sugerida foi feita uma curva dose-
resposta para obter a dose antinociceptiva ideal. A dose de maior efeito
antinociceptivo foi a de 45 mg/kg que alcançou até 85,6% de inibição. O
bloqueio da produção de TNF pode explicar o efeito antinociceptivo da
talidomida neste modelo. Confirmando essa sugestão, nossos dados
demonstram que o tratamento com talidomida reduziu os níveis de RNAm nas
células peritoneais residentes colhidas de camundongos injetados com
zymosan. Essa redução dos níveis de RNAm para TNF está de acordo com a
demonstração de que o mecanismo pelo qual talidomida inibe a produção de
TNF é devido a sua habilidade de aumentar a degradação do RNAm para TNF
(MOREIRA et al., 1993).
Diante de dados da literatura que descrevem uma seletividade de
talidomida pela inibição de TNF e de outros dados que descrevem uma não
seletividade desta droga, procurou-se investigar a atividade da talidomida sobre
a produção de citocinas por células residentes da cavidade peritoneal. Para
isso as células foram colhidas e postas em cultura por 12 horas e no
sobrenadante da cultura foram dosados os níveis das citocinas murinas TNF,
IL-1β, IL-10 e IL-4 por ensaio imunoenzimático. É importante salientar que as
células residentes que foram postas em cultura foram estimuladas in vivo, isto
148
é, procuramos reproduzir o protocolo utilizado para o tratamento e indução das
contorções abdominais segundo o modelo descrito anteriormente e só após
tais procedimentos as células foram colhidas e postas em cultura. Este
protocolo também serviu para a realização do RT-PCR para avaliar os níveis
de RNAm para TNF. Os níveis de citocinas não foram dosados diretamente no
exsudato colhido pra evitar resultados falsos positivo/negativo, devido ao
clearance elevado observado na cavidade peritoneal.
Os dados mostram que zymosan induz um aumento significativo dos
níveis de TNF e IL-1β no sobrenadante de cultura quando comparado ao grupo
de animais que recebeu somente salina como tratamento (naive) e que o grupo
pré-tratado com talidomida 45mg/kg obteve valores semelhantes ao grupo
salina. Talidomida, portanto neste modelo exerceu uma atividade inibitória
sobre a liberação de TNF, observou-se uma inibição de 100% dos níveis desta
citocina. O mesmo não foi observado com a dosagem dos níveis de IL-1β no
mesmo sobrenadante. Zymosan foi capaz de induzir de maneira significativa a
liberação de IL-1β quando comparado ao grupo salina, mas talidomida não
inibiu tal efeito. Estes dados estão de acordo com outro estudo que descreve a
inibição da produção de TNF por talidomida em monócitos humanos
estimulados com LPS sem, no entanto, influenciar a síntese protéica geral ou a
síntese de IL-1, IL-6 e GM-CSF (SAMPAIO et al., 1991). Esses dados talvez
demonstrem também que na cavidade peritoneal de camundongos a produção
de IL-1 induzida por zymosan não segue exatamente o modelo de cascata de
citocinas observada em outros modelos, visto que talidomida inibe TNF, mas a
produção de IL-1 continua aumentada. Corroborando com este resultado estão
dados nossos anteriores que mostram que o pré-tratamento com anticorpo anti-
TNF reduz o numero de contorções abdominais apenas pela metade (Ribeiro et
al., 2000)
Dados de outros autores, publicados anteriormente, demonstram uma
controversa indução da produção de IL-10 e IL-4 por talidomida, onde é
sugerido, em alguns estudos, que talidomida induz a produção dessas duas
citocinas e há outros sugerindo que talidomida não age sobre IL-4 e IL-10
(McHUGH et al., 1995; ROWLAND et al., 1998; GEORGE et al., 2000,
MOREIRA et al, 1997). O fato de talidomida induzir ou não a produção de IL-4
149
ou IL-10 é relevante na presente investigação visto que já demonstramos o
importante papel dessas citocinas no controle da dor inflamatória e que as
mesmas quando administradas previamente ao estímulo inflamatório são
capazes de inibir a resposta nociceptiva em animais experimentais (VALE et
al., 2000). Os resultados do presente trabalho com a dosagem dos níveis de IL-
10, no sobrenadante de cultura de macrófagos, demonstram que talidomida
não exerceu efeito algum sobre os níveis desta citocina quando comparado ao
grupo não tratado (controle positivo). Entretanto não podemos afirmar que
talidomida não tenha efeito sobre a citocina em camundongos, pois este fato
pode estar relacionado com o tempo em que as amostras foram coletadas ou
talvez com fatores endógenos que são excluídos no momento em que as
células são postas em cultura. De fato, outros autores utilizando um modelo de
dor crônica observaram que o aumento dos níveis de IL-10 induzidos por
talidomida só foram significativos após 2 dias da administração da droga
(SOMMER et al., 1998). Mesmo assim podemos sugerir que talidomida no
tempo e dose aqui utilizados tem efeito antinociceptivo no modelo de
contorções abdominais induzido por zymosan por um mecanismo independente
da modulação da produção de IL-10.
É interessante observar que o grupo que não recebeu estímulo
inflamatório apresentou níveis de IL-10 semelhantes ao grupo controle,
indicando, talvez, que essa citocina possa ser constantemente produzida por
células peritoneais residentes. Na verdade, em publicação anterior já havíamos
demonstrado que quando suprimimos a IL-10 endógena através do pré-
tratamento com anticorpo específico para esta citocina observamos que há
uma exacerbação da nocicepção induzida por zymosan, sugerindo então um
papel protetor ou modulatório negativo sobre o efeito do zymosan. Os mesmos
procedimentos também foram feitos para avaliar os níveis de IL-4, no entanto
não foi possível detecta-lo, no ensaio talvez por níveis muito baixos desta
citocina (dados não mostrados).
Os resultado acima podem ser confirmados pelo fato de que o pré-
tratamento de ratos, submetidos à hiperalgesia plantar induzida por
carragenina, com os anticorpos anti-IL-10 e anti IL-4 não reverteu o efeito
antinociceptivo da talidomida. Estes dado sugerem que o efeito antinociceptivo
150
da talidomida neste modelo parece não depender da indução dessas duas
citocinas.
No modelo de incapacitação articular em joelho de rato o tratamento
com zymosan induziu nocicepção avaliada como sendo o tempo de suspensão
da pata em segundos quando os ratos são colocados no aparelho para medir
incapacitação articular descrito anteriormente em materiais e métodos. A dose
de 1 mg/animal foi escolhida baseado em dados anteriores (ROCHA et al.,
1999; VALE, 2000) que mostram que essa dose induz artrite e apresenta efeito
máximo nociceptivo no modelo descrito. Como o aparelho mede o tempo que
cada animal permanece com a pata direita suspensa durante 1 min, todos os
animais foram testados antes da injeção da substância algiogênica (tempo
zero) para determinar esse tempo em uma deambulação normal. Os resultados
são mostrados em forma de delta (Δ) onde o valor de cada medida é subtraído
do tempo zero, ficando assim mais nítido o real tempo de incapacitação.
Nossos resultados mostram que talidomida, quando administrada
sistemicamente antes da substância nociceptiva, inibe incapacitação articular
induzida por zymosan de maneira dose-dependente. Observou-se a inibição
principalmente na 3
a
e 4
a
horas após a injeção da substância nociceptiva. O
pico de incapacitação articular apresentado pelos animais pode variar entre a
3
a
e 4
a
horas e nesse experimento o pico se apresentou na 4
a
hora, entretanto
não houve diferenças estatísticas quando foram comparados os dois tempos
no grupo controle (teste T de student). Das doses utilizadas a de 45 mg/kg foi a
mais eficaz em inibir o efeito nociceptivo do zymosan, alcançando 89% de
inibição na 3
a
hora de incapacitação.
Com base nestes resultados a dose de 45mg/kg foi utilizada para
investigar o efeito da talidomida na produção de citocinas na cavidade articular
dentre elas: TNF, IL-1, IL-10, IL-6 e CINC-1. Para isso os animais foram pré-
tratados com talidomida e foi induzida artrite por zymosan seguindo o mesmo
protocolo visto para o teste de incapacitação articular. Nossos dados mostram
que zymosan é capaz de induzir a liberação de TNF, IL-1, IL-6 e CINC-1 no
lavado articular e que talidomida inibe a produção de TNF de modo
significativo, mas não a das outras citocinas. Vale ressaltar que CINC-1
(quimioatraente para neutrófilos induzido por citocina) é uma quimiocina que
medeia funções da IL-8 no rato, visto que ratos não produzem IL-8 (GUEX-
151
CROSIER et al., 1996; YOSHIDA et al., 1998). Ademais IL-8 e CINC-1
compartilham o mesmo receptor para quimiocinas CXCR2 (WUYTS et al, 1999;
SHIBATA et al., 2000). Também observamos a presença de IL-10 no lavado
articular dos animais não estimulados em níveis semelhantes ao grupo controle
(tratados com zymosan) e mais uma vez talidomida não alterou os níveis de IL-
10 de modo significativo. De posse desses resultados podemos sugerir que
atividade antinociceptiva da talidomida na nocicepção articular induzida por
zymosan está associada à sua atividade inibitória sobre a produção de TNF na
cavidade articular.
A produção de TNF por zymosan parece não depender de células que
migram para o local da inflamação, pois a imunohistoquímica para detecção de
TNF feita nas células colhidas do lavado articular não demonstrou marcação
para TNF (dados não mostrados). Estes resultados corroboram com dados
prévios da literatura que descrevem que a indução da produção de TNF por
zymosan não depende de neutrófilos e monócitos que migram para a cavidade
articular, mas possivelmente deve-se sinoviócitos do tipo A residentes da
sinóvia (PETTIPHER and SALTER, 1996).
No teste de hiperalgesia mecânica em pata de rato (Randall-Selitto
modificado) induzido por carragenina a talidomida demonstrou atividade anti-
hiperalgésica dose-dependente, quando administrada previamente ao estímulo,
sendo a dose de 45 mg/kg a de maior efeito, semelhante ao que foi observado
nos dois modelos anteriores. Paralelo a isso foi avaliado o seu efeito sobre o
edema de pata induzido por carragenina. No entanto talidomida não
demonstrou efeito anti-edematogênico nas doses em que inibiu a hiperalgesia.
Está descrito que TNF, IL-1 ou IL-8, em doses que causam hiperalgesia não
induzem edema (POOLE et al., 1999a). Supomos que no presente modelo os
eventos iniciais que sucedem a injeção de carragenina incluem a formação de
cininas causando aumento da permeabilidade vascular por liberação de
prostaciclina pelo endotélio potenciando as ações diretas das cininas sobre a
vasculatura. Por outro lado a sensibilização de neurônios aferentes primários
por eicosanoide e aminas simpatomiméticas depende da liberação de citocinas
por outras células residentes via estímulo inflamatório ou bradicinina
(FERREIRA et al., 1993; POOLE et al., 1999a e b).
152
Talidomida parece agir na cascata de mediadores hiperalgésicos por
inibir a síntese de TNF, pois além de inibir a hiperalgesia induzida por
carragenina também inibiu a hiperalgesia induzida por bradicinina, mas não
teve efeito sobre a hiperalgesia induzida por TNF ou prostaglandina E
2
. Assim
podemos supor que o seu efeito sobre carragenina e bradicinina seja devido à
prevenção da liberação de TNF, não tendo efeito quando a hiperalgesia é
induzida pela própria citocina ou por mediadores finais como é o caso da
prostaglandina, que é sabidamente dependente da indução por TNF da cascata
de citocinas (CUNHA et al., 1992; FERREIRA et al., 1993). O fato de talidomida
não ter demonstrado efeito anti-hiperalgésico quando administrada 1h após a
carragenina está de acordo com a liberação prévia de TNF ao surgimento da
hiperalgesia, além de demonstrar que talidomida não inibe a liberação de IL-1,
citocina que só é detectada 2 h pós a indução por carragenina (CUNHA, 2000).
Outro dado da literatura que suporta essa sugestão é a demonstração de que o
tratamento com talidomida diminui a imunorreatividade endoneural ao TNF,
causada por injúria por constrição crônica em secções do nervo ciático de rato
(SOMMER et al., 1998). A redução de imunorreatividade ao TNF está
correlacionada à redução da dor por constrição do nervo ciático (SOMMER et
al., 1998).
Para investigar a possibilidade de talidomida estar induzindo a liberação
de opióides endógenos ou agindo em receptores opióides resolvemos verificar
o efeito do pré-tratamento com naloxona (antagonista de receptor opioide não
específico, mas preferencial para o tipo μ) no efeito antinociceptivo da
talidomida no modelo de contorções abdominais induzido por ácido acético. Foi
observado que naloxona não reverteu o efeito da talidomida na mesma dose
em que foi capaz de reverter completamente o efeito analgésico da morfina.
Embora não tenhamos usado antagonistas específicos para cada tipo de
receptor, sugerimos que talidomida, neste modelo, parece estar agindo por um
mecanismo que possivelmente não envolve a liberação de opióides
endógenos.
Em adição para avaliar um possível componente central do efeito
antinociceptivo talidomida, o teste da placa quente foi utilizado. Este modelo
lança mão do estímulo térmico para provocar nocicepção fisiológica e é útil
para testar drogas analgésicas de efeito central. Enquanto morfina causou um
153
significativo aumento do tempo de reação na placa quente, talidomida, à
semelhança de indometacina, não teve efeito em tal modelo sugerindo que na
dose de 45 mg/kg talidomida parece não demonstrar analgesia central.
Um protocolo experimental semelhante ao seguido para induzir
hiperalgesia foi feito em animais pré-tratados ou não com talidomida na mesma
dose em que foi capaz de inibir a hiperalgesia no modelo experimental por nos
utilizado. Assim poderíamos avaliar o tecido plantar das patas injetadas por
imunohistoquímica para detectar a presença de TNF. Nosso objetivo era
verificar quais células estavam produzindo tal citocina e se a talidomida estaria
inibindo essa produção. Os dados mostram que células residentes do tecido
conjuntivo principalmente mastócitos e macrófagos são as principais células
envolvidas na produção de TNF, pois apresentaram intensa marcação nas
lâminas avaliadas. O pré-tratamento com talidomida reduziu visivelmente a
marcação nos mesmos tipos celulares. O presente resultado somando-se aos
anteriores sugere que carragenina quando injetada por via intraplantar promove
a produção e liberação de TNF por células residentes do tecido conjuntivo e
que talidomida previne a produção desta citocina sendo esse possivelmente o
mecanismo pelo qual promove antinocicepção neste modelo experimental.
Pentoxifilina tem atraído interesses devido ao seu efeito
imunomodulatório, principalmente sobre citocinas que causam inflamação e
dor, como também pelo fato da baixa incidência de efeitos tóxicos adversos
relacionados a essa droga. Tendo em vista que por possuir estas propriedades
imunomodulatórias a pentoxifilina poderia também exercer atividade
antinociceptiva em modelos experimentais de dor que envolvem o sistema
imune, como a geração de citocinas por estímulos inflamatórios, o que nos
motivou a estudar a atividade dessa droga nos modelos descritos
anteriormente assim como sugerir um mecanismo através do qual ela exerce
esse efeito, além de constatar que o assunto até a presente data ainda não foi
discutido na literatura.
Inicialmente, utilizando o modelo de contorções abdominais induzidas
por ácido acético e zymosan, procuramos avaliar um possível efeito
antinociceptivo da pentoxifilina. Uma curva dose resposta foi realizada e
observamos que o efeito antinociceptivo no modelo era significativo e dose
dependente e que pentoxifilina na dose de 1.6 mg/kg foi capaz de inibir até
154
89.8% das contorções abdominais. No entanto quando aumentamos a dose o
efeito parece diminuir, chegando a se anular quando dose chega a 45 mg/kg.
Tentando entender tal efeito encontramos respaldo na literatura e
inclusive em dados nossos já publicados. Pentoxifilina, como já comentado na
introdução do presente trabalho, é inibidor inespecífico de fosfodiesterases do
AMPc. A inibição desse tipo de fosfodiesterase promove o aumento da
concentração intracelular de AMPc gerado pela adenil ciclase. Diversos
estudos relatam que o efeito modulatório da pentoxifilina sobre a rede de
citocinas é possivelmente devido à capacidade de elevar o nível de AMPc
intracelular. Por meio desse mecanismo é capaz de reduzir também a atividade
fagocítica, produção do íon superóxido, e a liberação de enzima lisossomial por
polimorfonucleares (BESSLER et al., 1986). Outros autores apontam que o
aumento da concentração intracelular de AMPc inibe a síntese de TNF, in vitro
(TANNENBAUM e HAMILTON, 1989; TAFFET et al., 1989), do mesmo modo
que outros agentes que aumentam a concentração intracelular de AMPc (como
o dibutiril AMPc e a toxina da cólera) também demonstraram atividade inibitória
sobre a transcrição do gene do TNF e acúmulo de proteína (TANNENBAUM e
HAMILTON, 1989).
Dados nossos anteriores demonstram um papel dual do AMPc nas
contorções abdominais induzidas por ácido acético ou zymosan (BRITO et al.,
2001), onde pequenas doses de dibutiril AMPc (db-AMPc; análogo estável do
AMPc capaz de atravessar membranas) mostram-se antinociceptivas e doses
mais elevadas são pró-nociceptivas. Neste estudo foi proposto que o aumento
da concentração intracelular de AMPc, mimetizado pela administração das
doses menores de db-AMPc, inibiria a liberação de mediadores por células
residentes, o que está amparado por outros dados da literatura (RENZ et al.,
1988; MARONE et al., 1987, KAST et al., 2000). Da mesma forma atuariam
outras substâncias que agem aumentando o AMPc intracelular (forskolin, toxina
da cólera e aminofilina). Além do seu efeito inibitório sobre células residentes,
foi proposto que db-AMPc, em concentrações mais elevadas, diminui o limiar
de ativação dos terminais nervosos nociceptivos (BRITO et al., 2001) por
mecanismos conhecidos e já estudados (MIZUMURA et al., 1993; FERREIRA
and NAKAMURA, 1979a; CUNHA et al., 1999, TAIWO and LEVINE, 1991).
155
Nossos resultados estão de acordo com o que está proposto na
literatura, pois pentoxifilina inibe a nocicepção em baixas doses e não possui
efeito quando administrada em doses mais altas no modelo de contorções
abdominais induzidas por ácido acético (0.6%) ou zymosan (1 mg/animal). Para
verificar se PTX na maior dose tinha mesmo efeito nulo ou se aumentava o
número de contorções resolvemos baixar a dose de zymosan para observar
alguma amplificação, visto que vínhamos utilizamos a dose de zymosan de
efeito máximo. Foi constatado um efeito amplificador significativo de PTX sobre
as contorções abdominais induzidas por tal estímulo. Em adição procuramos
investigar se tal efeito amplificador da PTX estaria presente diante de um
estímulo com mecanismo diferente dos anteriores. Utilizando um análogo
estável de prostaciclina (iloprost), que sabidamente não induz contorções
abdominais via estimulação de células residentes (RIBEIRO et al., 2000),
observamos que PTX na dose de 45 mg/kg amplifica o efeito nociceptivo do
iloprost enquanto que a dose de 1.6 mg/kg não modifica a resposta desse
estímulo nociceptivo.
Assim podemos sugerir que: (1) possivelmente o efeito anti-nociceptivo e
pró-nociceptivo de PTX nesse modelo seja semelhante ao do dibutiril-AMPc
anteriormente comentado; e que (2) em doses menores, PTX possui atividade
antinociceptiva nesse modelo provavelmente por agir sobre células residentes
da cavidade peritoneal, visto que na presença de zymosan ou ácido acético
(estímulos que atuam via células residentes) PTX é inibitória, enquanto que
quando iloprost (estímulo nociceptivo não dependente de células residentes) foi
administrado como estímulo, PTX teve efeito nulo. Ademais, para afastar a
possibilidade de PTX estar atuando como irritante da cavidade peritoneal, e por
essa razão estar causando hiper-nocicepção, testamos o seu efeito por outra
via de administração (subcutânea), e não observamos diferenças significativas
quando comparada ao grupo i.p. (dados não mostrado). Também não
observamos efeito diferente quando combinada com naloxona, o antagonista
não específico de receptores opióides, indicando que possivelmente neste
modelo o seu efeito antinociceptivo não depende da liberação de opióides
endógenos.
Considerando o fato de PTX exercer inibição sobre a produção de
algumas citocinas pró-inflamatórias e após constatar um efeito antinociceptivo
156
(nas doses baixas) no teste de contorções abdominais, procuramos observar o
seu comportamento sobre a produção de citocinas por células peritoneais
residentes utilizando o mesmo raciocínio descrito antes para talidomida. Foi
observado que pentoxifilina inibiu, de modo significativo, a produção de TNF e
IL-1β nas doses crescentes à partir de 1.6 mg/kg, sugerindo que o seu efeito
antinociceptivo pode estar relacionado à inibição de tais citocinas. PTX, mesmo
na dose alta que provoca aumento da resposta nociceptiva, inibe francamente
a produção de IL-1 e TNF. Sugerimos que este efeito amplificador da PTX
sobre a nocicepção possivelmente seja devido ao aumento de AMPc em
terminais nervosos nociceptivos semelhante ao mecanismo de ação da
prostaglandina E
2
demonstrado por FERREIRA e NAKAMURA (1979a).
Em adição, à semelhança do que observamos com a talidomida, PTX
também não modula a produção de IL-10 por células residentes peritoneais,
pelo menos no período observado no presente trabalho, apesar de alguns
autores descreverem ações modulatórias de PTX sobre a produção de IL-10,
que parecem depender do estímulo utilizado (FUJIMOTO et al., 1999; VAN
FURTH et al., 1997; D'HELLENCOURT et al., 1996). Nossos resultados estão
de acordo com outros autores (SAMPAIO et al., 1998).
No modelo de incapacitação articular induzido por zymosan o pré-
tratamento com PTX produziu efeito antinociceptivo significativo, quando
comparado ao grupo controle, principalmente na 2
a
e 3
a
horas após a injeção
da substâcia algiogênica. A dose de 1.6 mg/kg foi a que causou efeito máximo
de inibição à semelhança do que foi visto no outro teste nociceptivo. Contudo,
não houve diferença estatística entre os grupos pré-tratados com PTX. O que
observamos é que PTX tende a ser menos eficaz em inibir a incapacitação
articular na maior dose, entretanto não observamos diferenças estatísticas
significativas entre esse grupo e o grupo que recebeu PTX 1.6 mg/kg como
pré-tratamento.
Ao pesquisar o efeito do pré-tratamento com PTX sobre a produção de
citocinas na cavidade articular observamos que houve uma diminuição
significativa dos níveis de TNF e IL-1 no lavado articular e tendeu a inibir IL-6,
mas o dado é estatisticamente não significativo. PTX também não exerceu
efeito modulatório sobre a produção de CINC-1 ou IL-10 no lavado articular.
157
A partir dos dados acima expostos podemos observar que PTX possui
atividade antinociceptiva neste modelo de dor articular e que provavelmente o
fato deve-se a sua atividade inibitória sobre a produção de citocinas pró-
inflamatórias como TNF e IL-1.
A atividade de PTX também foi estudada no modelo de hiperalgesia.
Observamos resultados diferentes dos obtidos nos modelos anteriores. PTX
quando administrada por via i.p. previamente à carragenina não inibiu de modo
significativo a hiperalgesia nas doses de maior efeito (1.6 e 5 mg/kg) em que foi
capaz de inibir a nocicepção nos testes comentados anteriormente. PTX
alcançou níveis de inibição significativos somente quando a dose foi
aumentada para 15 e 45 mg/kg. A dose de 100 mg/kg também foi testada, mas
não foi diferente das demais (dados não mostrados). Todavia o efeito de PTX
quando administrada no local, ou seja, por via intraplantar, produziu melhores
resultados no que diz respeito ao seu potencial anti-nociceptivo, chegando a
alcançar 73.3% de inibição na dose de 9 mg/pata.
Pentoxifilina também parece modular a cascata de citocinas
hiperalgésicas, pois mostrou atividade inibitória significativa sobre a
hiperalgesia induzida por bradicinina e, em adição, também inibiu o efeito
hiperalgésico do TNF, mas não o da IL-1 e PGE
2
, sugerindo uma atividade não
seletiva sobre a produção de citocinas. Possivelmente PTX age inibindo não
apenas produção de TNF, mas também de IL-1, citocina supostamente liberada
após o surgimento de TNF neste modelo (CUNHA et al., 1992; FERRREIRA et
al., 1993; WATKINS et al., 1995). Relacionado a tal dado está a observação de
que mesmo quando administrada 1 hora após o estímulo, PTX local demonstra
efeito anti-hiperalgésico, sugerindo que dessa forma PTX ainda seria capaz de
inibir a liberação de IL-1β. Está descrito que a carragenina intraplantar induz a
liberação de TNF e IL-1 em tempos diferentes. Foram dosados os níveis de
TNF e IL-1 em patas de ratos estimuladas com carragenina e foi observado
que somente após 2 horas aparecem quantidades significativas de IL-1
(CUNHA, 2000). Contudo PTX não inibe a hiperalgesia induzida por
carragenina quando injetada como pós-tratamento 2 horas depois, sugerindo
que os eventos que ocorrem após a liberação de TNF e IL-1β não são inibidos
por PTX.
158
A pentoxifilina também foi avaliada no teste da placa quente para
pesquisar a possibilidade de um sítio central de ação. Não observamos efeito
significativo no tempo de reação quando comparado ao grupo salina. Somado
a esse fato está a observação de que o pré-tratamento local com PTX não
influencia na hiperalgesia induzida por carragenina na pata contralateral e nem
altera o tempo de reação no mesmo modelo experimental quando administrada
em patas não estimuladas (dados não mostrados).
Ao avaliar a marcação por imunohistoquímica para TNF observamos
uma acentuada diminuição da marcação nas células inflamatórias do tecido
retirado de patas pré-tratadas com PTX quando comparado visualmente com o
grupo pré-tratado com salina. Este dado somando se aos demais sugerem um
efeito ant-hiperalgesico da PTX no presente modelo que possivelmente está
associado a sua atividade inibitória sobre a produção de citocinas
principalmente TNF e IL-1β.
Diante dos resultados acima observados é válido discutir que zymosan e
ácido acético induzem contorções abdominais pouco tempo após a sua
administração (5 a 10 min após) e que essa atividade nociceptiva é de
mecanismo indireto, isto é, agem induzindo a liberação de mediadores
inflamatórios que vão ativar ou diminuir o limiar de ativação dos terminais
nociceptivos. Neste ponto sugerimos que possivelmente mastócitos são as
células responsáveis pelo início da liberação desses mediadores, pois estas
células, como comentado na introdução, possuem grânulos que contém
substâncias pré-formadas inclusive TNF (ver ilustração 1.3).
Em estudo sobre a capacidade de mastócitos produzirem TNF,
GORDON e GALLI em 1991 demonstraram que mastócitos murinos peritoneais
liberam TNF e 5-HT após estimulação dependente de IgE atingindo o pico em
aproximadamente 10 min. O TNF liberado em até 10 min parece ser pré-
formado e proveniente do conteúdo dos grânulos dessas células seguindo a
mesma cinética observada para 5-HT. Após essa rápida liberação de TNF pré-
formado, mastócitos são capazes de produzir e liberar novas quantidades TNF
em minutos. No mesmo estudo foi demonstrado que mastócitos são a maior
fonte de RNAm para TNF in vivo (GORDON e GALLI, 1991) . Neste sentido a
nocicepção induzida por acido acético e zymosan no modelo de contorções
abdominais pode ter início na degranulação de mastócitos peritoneais
159
residentes e ser continuada na liberação de outros mediadores dependentes da
indução por TNF. A teoria de que mastócitos podem ser os responsáveis pelo
início da atividade nociceptiva de ambos estímulos é respaldada pelo fato que
a simples depleção dos grânulos mastocitários pelo pré-tratamento crônico com
composto 48/80 é capaz de inibir em até aproximadamente 60% o número de
contorções abdominais induzidas por estes estímulos contra o efeito de 80%
obtido em animais depletados de células residentes totais (RIBEIRO et al.,
2000).
O TNF inicialmente liberado por degranulação mastocitária poderia
excitar as terminações nervosas nociceptivas como sugerido por JUNGER e
SORKIN (2000). A prevenção da liberação deste mediador, pré-formado, por
talidomida ou pentoxifilina, por exemplo, poderia explicar como estas drogas
inibem as contorções abdominais que se iniciam poucos minutos após a
injeção da substância nociceptiva. De fato, parece que pentoxifilina inibe a
degranulação de mastócitos como mostram SCHMIDT-CHOUDHURY, et al.
(1996). Neste estudo é comparado o efeito da dexametazona e da pentoxifilina
sobre a degranulação de mastócitos murinos dependente de IgE, onde
somente pentoxifilina tem efeito inibitório neste modelo (SCHMIDT-
CHOUDHURY, et al., 1996). No que diz respeito à talidomida e clorpromazina
nada está descrito na literatura sobre a relação entre a inibição da
degranulação de mastócitos por essas drogas. Contudo tal suposição precisa
ser estudada com mais cautela, visto que, existem outras células que devem
participar do fenômeno assim como outros mediadores podem estar
envolvidos. Além disso, mastócitos também são capazes de produzir e liberar
mediadores, após estimulação, distintos daqueles que são estocados nos
grânulos.
Mastócitos também são capazes de produzir prostaglandina em poucos
minutos em resposta a estímulos. Essa produção parece ter duas fases
distintas a primeira que se inicia 10 a 15 min após estimulação e que é
bloqueada por aspirina demonstrando ser depende da atividade da enzima
constitutiva COX e uma segunda fase (iniciada 1 hora após) que depende da
expressão de COX induzida a qual é bloqueada por dexametasona (KAWATA
et al., 1995). Essas observações talvez possam servir de base hipotética de
como indometacina exerce atividade antinociceptiva no modelo de contorções
160
abdominais induzidas por ácido acético e zymosan indicando que eicosanóides
devem participar da resposta nociceptiva de ambos estímulos provavelmente
agindo como mediadores liberados após o TNF. Isto colabora com a idéia de
que a indução da nova síntese de TNF por mastócitos (não originária dos
grânulos) ou por macrófagos também colabora na indução de contorções
abdominais.
O mecanismo pelo qual zymosan induz nocicepção na cavidade
articular e carragenina induz na pata parece ser diferente do que foi observado
na cavidade peritoneal, visto que nesses dois modelos o pico de atividade
nociceptiva acontece na 3
a
e 4
a
horas após a indução. Nos modelo de
incapacitação articular e hiperalgesia inflamatória é possível que mastócitos
não exerçam função tão importante na nocicepção induzida por este estímulo
do que no modelo de contorções abdominais, ou talvez estas células não estão
presentes em quantidades suficientes para iniciar uma resposta nociceptiva de
modo rápido. Outra explicação poderia ser de que na incapacitação por
zymosan e hiperalgesia por carragenina a seqüência de liberação de
mediadores realmente segue a cascata proposta por CUNHA et al. (1992). Nos
modelos que tem pico nociceptivos mais tardios as drogas por nós avaliadas
possivelmente inibem a nocicepção por inibir a síntese de TNF e/ou IL-1 por
células residentes
Clorpromazina, neuroléptico comumente usado em desordens
psiquiátricas, e no tratamento de alguns tipos de cefaléia, foi avaliado no
presente estudo quanto a sua capacidade antinociceptiva em modelos
experimentais. As doses utilizadas em um experimento piloto foram retiradas
da literatura por serem descritas como antiinflamatórias provavelmente por
inibir a produção de TNF (DE LIMA et al., 2000). Então inicialmente foram
testadas as doses de 1, 3 e 9 mg de clorpromazina, entretanto observamos que
as doses de 3 e 9 mg/kg além de apresentar efeito antinociceptivo também
induziam sedação impossibilitando a sua utilização. A partir dessas
observações resolvemos baixar a dose e assim conseguimos obter uma curva
dose-resposta onde a dose de maior efeito foi a de 1 mg/kg tanto quando o
estímulo utilizado foi o ácido acético como o zymosan. É válido observar que
clorpromazina tem efeito antinociceptivo nesta dose sem, no entanto induzir
sedação. Esse fato foi confirmado quando os animais são colocados no
161
aparelho para testar a incapacitação articular, onde não houve problema na
deambulação normal dos animais quando esta dose foi utilizada.
Clorpromazina quando administrada previamente ao iloprost tende a inibir as
contorções abdominais, contudo o efeito não é estatisticamente significativo.
Ademais no estudo feito com as dosagens de citocinas do sobrenadante de
cultura de células peritoneais estimuladas, in vivo, observamos um efeito
inibitório significativo, porém fraco, sobre a produção de TNF. Nesta mesma
dose clorpromazina não mostrou atividade modulatória sobre as outras
citocinas. Estes dados sugerem que talvez clorpromazina na maior dose além
de estar atuando sobre células residentes, provavelmente por inibir a produção
de TNF, também esteja atuando por um mecanismo diferente. Mecanismo este
não dependente de receptores opióides ou da liberação opióides endógenos,
visto que não observamos reversão do efeito antinociceptivo de clorpromazina
por naloxona nas contorções abdominais induzidas por zymosan.
Escassos resultados são encontrados na literatura sobre o assunto em
modelos experimentais (JAKOUBEK, 1984), Todavia, a atividade analgésica de
clorpromazina já foi estudada em humanos, mas sem a discussão sobre o seu
provável mecanismo de ação (ISERSON, 1983; KELLY et al., 1997; MEHL-
MADRONA, 1999; MERSKEY, 1997; LOGAN, 1983).
Clorpromazina também demonstrou atividade antinociceptiva dose-
dependente na nocicepção articular avaliada no modelo de incapacitação
articular em joelho de rato induzida por zymosan. No entanto esse efeito nos
parece intrigante. Enquanto que o pré-tratamento com clorpromazina 0.3 mg/kg
bloqueou em 99% a incapacitação articular, a dose de 1 mg/kg demonstrou
menos de 50% de inibição, sendo este resultado confirmado pela repetição do
experimento. Novos experimentos são necessários para explicar o fato.
Por ter demonstrado atividade antinociceptiva dose-dependente no
modelo de incapacitação articular, nos propusemos a avaliar o efeito da dose
de 0.3 mg/kg sobre a produção de citocinas na cavidade articular. Utilizando a
mesma metodologia já descrita anteriormente no presente estudo, os níveis de
citocinas demonstraram que esta dose de clorpromazina inibe de maneira
discreta, porém significativa, a produção de IL-1β, mas não das demais
citocinas avaliadas. No entanto outros estudos demonstram que clorpromazina
inibe a produção de TNF e aumenta a produção de IL-10 como no modelo
162
experimental de disfunção múltipla de órgãos em camundongos induzida por
zymosan (JANSEN et al., 1998). Neste estudo, por exemplo, são utilizadas
doses de clorpromazina que variam de 4 a 16 mg/kg/dia começando o
tratamento 2 dias antes da indução com zymosan. GADINA et al. descrevem o
efeito protetor da clorpromazina na toxicidade induzida por endotoxina por inibir
TNF (GADINA et al., 1991) utilizando doses de 4 mg/kg. A inibição da síntese
TNF cerebral e aumento da liberação de IL-10 em camundongos também
utiliza doses de 4 e 3 mg/kg. IKEDA et al. (1997) chega a usar 10 mg/kg como
dose de clorpromazina capaz de inibir totalmente a produção de TNF. Talvez
clorpromazina só iniba a síntese de TNF em doses elevadas como no caso
acima. O presente estudo utiliza doses que variam de 0.1 a 1mg/kg sendo 1
mg/kg dose ótima com efeito antinociceptivo sem efeito sedativo marcante. Ao
aumentar a dose para 3mg/kg o efeito sedativo é tão intenso que não permite
avaliar os animais quanto à nocicepção. Supomos que atividade antinociceptiva
de clorpromazina, neste modelo, está em algum aspecto relacionado à inibição
de citocinas, entretanto outros mecanismos possivelmente estão atuando
colaborando para tal efeito.
A hiperalgesia induzida por carragenina foi inibida por clorpromazina de
modo significativo e dose dependente quando administrada por via i.p., em até
68% na dose maior (1 mg/kg) em que não observou-se sedação. Quando
aumentávamos a dose para 3 mg/kg observamos um efeito sedativo. Porém
quando o pré –tratamento era feito por via intraplantar, observamos discreto
efeito anti-hiperalgésico, todavia significativo na dose máxima (0.2 mg/pata) em
que não se ressaltou um efeito sedativo. Esse efeito parece não ter sítio
relevante de ação central, pelo menos nessas doses, pois em outro
experimento onde é feita a administração de clorpromazina na pata contra-
lateral à pata que recebeu carragenina não alterou o efeito hiperalgésico da
carragenina. Ademais não observamos efeito importante no teste da placa
quente em camundongos.
Clorpromazina inibiu de modo significativo também todos os outros
estímulos utilizados no teste da hiperalgesia mecânica, porém de maneira
discreta quando o estímulo era PGE
2
. Não houve diferenças entre o pré-
tratamento e o pós-tratamento (2 horas) com clorpromazina, além de ter
observado visivelmente apenas uma inibição modesta da produção de TNF por
163
células inflamatórias da pata dos animais tratados com clorpromazina ilustrado
pela immunohistoquímica. Sugere-se um mecanismo de ação periférico
adicional ao seu efeito sobre a produção de citocinas.
Por fim, o presente estudo procurou avaliar a atividade antinociceptiva
das drogas talidomida, pentoxifilina e clorpromazina, inicialmente por estas
serem inibidoras da síntese de citocinas pró-inflamatórias principalmente TNF.
A analgesia promovida por talidomida e pentoxifilina está de acordo com o pré-
suposto, no entanto o efeito antinociceptivo de clorpromazina parece ser
parcialmente dependente deste mecanismo, podendo haver outro componente
influenciando nos resultados o que necessita de maiores estudos. Em adição
nossos resultados alertam para a importância da dosagem utilizada para se
obter analgesia adequada principalmente a respeito da PTX .
A introdução dos agentes anti-TNF (comentados na parte da introdução)
na prática clínica reumatológica tem promovido alívio substancial da dor e
inibição da progressão da doença (artrite reumatóide). Os dados atuais
sugerem uma administração relativamente segura, no entanto alguns estudos
demonstram o aumento da incidência de neoplasias e de infecções
oportunistas com o uso desses agentes (FURST et al., 2003). Em adição,
devido a sua natureza imune, o aparecimento de anticorpos contra esses
agentes, limita a longo prazo, a sua utilização, em alguns pacientes.
Pelo menos em alguns pacientes, estratégias para bloquear a produção
de TNF e outras citocinas inflamatórias associadas ao uso dos chamados
“agentes biológicos”, poderiam trazer benefícios na prática clínica, tanto por
aumentar a sua eficácia clínica como por diminuir os seus custos. Os dados
apresentados no presente estudo demonstrando que o efeito antinociceptivo da
talidomida, pentoxifilina e clorpromazina em vários modelos experimentais está
associado à inibição de citocinas inflamatórias (TNF e IL-1) claramente indica
que estudos em seres humanos que explorem este aspecto merecem
consideração.
164
V. CONCLUSÕES
165
CONCLUSÕES
1. Talidomida possui potente atividade antinociceptiva demonstrada nos
modelos de contorções abdominais, incapacitação articular e
hiperalgesia mecânica induzida por estímulos inflamatórios. Tal atividade
parece ser periférica, e está associada à inibição da produção do fator
de necrose tumoral, por células residentes.
2. Pentoxifilina possui potente atividade antinociceptiva demonstrada nos
modelos de contorções abdominais, incapacitação articular e
hiperalgesia mecânica induzida por estímulos inflamatórios. Tal atividade
é periférica e está relacionada a uma inibição da produção de citocinas
principalmente o fator de necrose tumoral e a lnterleucina-1beta, por
células residentes do sítio da injúria.
3. Pentoxifilina dependendo da dose e do modelo experimental poderá ter
efeito hiperalgésico possivelmente relacionado ao seu mecanismo
amplificador sobre a concentração de AMPc.
4. Clorpromazina possui potente atividade antinociceptiva demonstrada
nos modelos de contorções abdominais, incapacitação articular e
hiperalgesia mecânica induzida por estímulos inflamatórios. Tal atividade
é periférica, pelo menos nas doses consideradas no presente estudo, e
parece dever-se parcialmente a inibição de citocinas por células
residentes do local da injúria, mas outros mecanismos desconhecidos
possivelmente estão envolvidos.
166
VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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