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ESTUDO DO PAPEL DE GALECTINA-3 NO
FENÓTIPO MALIGNO DE CÉLULAS DE
MELANOMA PRIMÁRIO E METASTÁTICO
PATRICIA ABRÃO POSSIK
Tese de Doutorado apresentada à Fundação
Antônio Prudente para a obtenção do Grau de
Doutor em Ciências
Área de concentração: Oncologia
Orientador: Dr. Luiz Fernando Lima Reis
São Paulo
2008
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FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca da Fundação Antônio Prudente
Possik, Patricia Abrão
Estudo do papel de galectina-3 no fenótipo maligno de células
de melanoma primário e metastático / Patricia Abrão Possik. – São
Paulo, 2008.
124p.
Tese (Doutorado)-Fundação Antônio Prudente.
Curso de Pós-Graduação em Ciências-Área de concentração:
Oncologia.
Orientador: Luiz Fernando Lima Reis.
Descritores: 1. MELANOMA. 2. GALECTINA 3. 3. INTERFERÊNCIA
DE RNA. 4. NEOPLASIAS. 5. LENTIVIRUS.
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I find that the great thing in this world is not
so much where we stand, as in what
direction we are moving.
Oliver Wendell Holmes
DEDICATÓRIA
Ao meu querido pai, Renaldo Abrão Possik
O exemplo de sabedoria e humanidade mais importante da minha vida
AGRADECIMENTOS
À todas as pessoas que passaram pela minha vida durante estes quatro
anos. Cada pessoa que me acrescentou um pouco de conhecimento,
humano e científico. Cada pessoa que discordou e me mostrou um ponto de
vista diferente. Cada um que me mostrou o lado bom das coisas, e também
à quem me mostrou o lado ruim. À cada pessoa que me fez rir em
momentos difíceis ou chorar de tanto rir. À todas as pessoas que
contribuíram para me formar uma pessoa mais forte e capaz de se equilibrar
em mundo onde o que mais falta é o equilíbrio.
Ao meu orientador Luiz Fernando Lima Reis, por ter acreditado em mim
desde o início. Por me deixar envolver em um projeto que me fez encarar
alegrias, frustrações, motivação, nervosismo, ansiedade e glória. E que,
resumidamente, me fez ganhar auto-confiança, me formou pesquisadora e
me fez sentir capaz de dar passos cada vez maiores.
Ao meu supervisor Meenhard Herlyn, por ter me dado a oportunidade de
trabalhar em seu laboratório, por ter facilitado minha adaptação, por ter
sempre confiado em meu potencial, por ter me mostrado diferentes faces da
pesquisa, por ter me dado oportunidades de aprender ciência além do meu
projeto e por ter se preocupado em me formar pesquisadora.
Aos meus pais Diney e Renaldo, e as minhas irmãs Priscila, Paula, por
acreditarem que eu sou “a pesquisadora de maior potencial em todo o
mundo”. Por não me deixarem cair em nenhum momento. Por me darem
muito amor.
Às minhas queridas avós, Dilce e Chance, por estarem sempre por perto.
Pelo amor, carinho e orgulho que me faz andar sempre para frente.
Ao meu tio André Polito Lomar pelo incessante incentivo, entusiasmo e
atenção. Detalhes que fizeram com que eu acreditasse em mim mesma e
me convenceram que tudo isso vale à pena.
Ao meu tio Rafael Abrão Possik, meu sincero agradecimento pela amizade e
presença nos momentos importantes de minha vida.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo
auxílio financeiro com a concessão da bolsa de doutorado.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes),
pela oportunidade de estágio no exterior através do Programa PDEE.
Ao Meenhard e ao Instituto Wistar, pelo auxílio financeiro concedido para a
extensão da minha estadia como visitante na instituição.
À Fundação Antonio Prudente, pela estrutura e apoio na execução deste
projeto e pela grande contribuição na minha formação de Doutora em
Ciências.
Às secretárias do Programa de Pós Graduação Ana Maria Kuninari e
Luciana Pitombeira, pela paciência, bom humor e eficiência.
À Sueli Franscisco e à todos os funcionários da Biblioteca do Hospital
A.C.Camargo, pela constante colaboração e formatação final deste trabalho.
Aos membros da Banca de Qualificação, Dr. Enrique Boccardo e Dra.
Mariângela Esther Alencar Marques, pela avaliação periódica e sugestões
que contribuíram imensamente para a execução deste projeto.
Ao Dr. Enrique Boccardo, pela colaboração na elaboração de experimentos
de reconstituição dérmica com células de melanoma que, embora não
tenham sido utilizadas neste trabalho, foram muito importantes na minha
formação.
À todos do Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer, onde conheci
amigos eternos e pesquisadores brilhantes.
Aos meus colegas e amigos do Instituto Wistar, pelo excelente ambiente de
trabalho e acesso à pesquisa de extrema qualidade.
Ao pessoal do laboratório de Meenhard Herlyn, em especial À Sandy
Parsons, John T Lee, Ronan MacDaid, Mizuho Fukanaga-Kalabis, Susan
Zabierovski, Ling Li, Gabi Martinez, Angela Cipolla, Nikolas Haass, Keiran
Smalley, Jun e Gao Zhang pela ajuda de todos os dias e por fazerem do
laboratório um ótimo ambiente de trabalho.
Aos meus amigos que ficaram na Filadélfia: Érica, Elisa, Isabela, Melissa,
Marcio, Jana, Paulinho, Sibele, Júlia, Juliana, Rodrigo, Cláudio. Por todos os
dias que eles não deixaram eu me sentir sozinha, nem deixar a bola cair.
À todos os membros e ex-membros dos laboratórios de Genômica Funcional
e de Experimentação Animal da Fundação Antonio Prudente. Em especial,
aos que mais me agüentaram: Luiz FL Reis, Aline Pacífico, Sarah Marques,
Mariana Santos, Waleska Martins, Mariana Morato, Graziela Spilborghs,
Juliana Real, Chamberlein Mendonça, Ana Helena Pagotto, Anna Coló, Nair
Muto, Tatiana Munhoz, Alex Fiorini e Adriana Abalen, Bianca Barreto, Letícia
Lerner, Camila Melo, Marina Baeta, Bárbara Mello, Anderson Souza e
Vladmir Lima.
À Dra. Anamaria Camargo e ao Dr. Newton Verbisck, pela contribuição na
metodologia de RNAi e por serem tão solícitos quando eu precisei de algo.
Ao Dr. Roger Chammas, pelas conversas e conselhos que contribuíram
imensamente para o meu aprendizado em Biologia Celular e Molecular de
Tumores, claro que especialmente em Galectina-3.
Aos amigos Fred e a Jamie da Microscopy Facility, pela alegria diária, pelo
auxílio e treinamento no uso dos Microscópios e pelo incessante apoio
durante a execução da maioria dos experimentos.
Ao Carlinhos Nascimento e à Sueli Nogogaki, pela realização de análises
imunoistoquímicas de excelente qualidade.
Aos amigos Nair Muto e Vladmir Lima, pelas sugestões fornecidas durante a
composição desta tese.
À Juliana Real, pela companhia e auxílio na impressão final da tese, após
um dia de muitas emoções.
RESUMO
Possik PA. Estudo do papel de galectina-3 no fenótipo maligno de
células de melanoma primário e metastático. São Paulo; 2008. [Tese de
Doutorado-Fundação Antonio Prudente].
Galectina-3 (Gal-3) é uma proteína com atividades pleiotrópicas expressa
em uma grande variedade de células e tecidos. Suas diversas atividades
variam de acordo com o compartimento celular em que esta é encontrada.
Estudos recentes demonstram que a expressão e distribuição intracelular de
Gal-3 em melanoma está correlacionada com a progressão tumoral. Desta
forma, o efeito do silenciamento de Gal-3, obtido através da técnica de
shRNA mediado por lentivírus, foi estudado em células de melanoma de
diferentes fases de progressão tumoral. Células de melanoma de
crescimento vertical (WM793) deficientes para Gal-3 (shGal-3) apresentaram
alteração da morfologia, menor habilidade de crescimento independente de
ancoragem (soft agar) e capacidade reduzida de invasão em matriz de
colágeno. Finalmente, o crescimento de tumores gerados pela injeção
subcutânea de WM793 shGal-3 em camundongos NOD/SCID é
drasticamente afetado. Interessantemente, não foram observadas alterações
fenotípicas nas células metastáticas 1205Lu shGal-3. O silenciamento de
Gal-3 nas células WM793 é acompanhado da diminuição da ativação de
AKT e o aumento da expressão de proteínas pró-apoptóticas.
Concomitantemente, é observado o aumento da expressão de p16 e
hipofosforilação de Rb. Análises por microscopia confocal demonstram que
Gal-3 co-localiza com β-catenina em células de melanoma e que o
silenciamento de Gal-3 diminui a presença de β-catenina nuclear. Entretanto,
em melanócitos e células de crescimento radial, a ausência de Gal-3 nuclear
não impede a distribuição nuclear de β-catenina. Os dados apresentados
aqui indicam que Gal-3 possui um papel crucial em melanomas de
crescimento vertical. O silenciamento de Gal-3 não parece ser suficiente
para afetar melanomas metastáticos, que possivelmente adquirem
estratégias complementares de sobrevivência para o escape de mecanismos
supressores de tumor.
SUMMARY
Possik PA. [Galectin-3 supports the malignant phenotype of vertical
growth phase melanomas]. São Paulo; 2008. [Tese de Doutorado-
Fundação Antonio Prudente].
Galectin-3 (Gal-3) is a pleiotropic protein expressed in a variety of tissues. It
has diverse activities that are contingent upon its subcellular localization.
Previous studies have demonstrated that Gal-3 expression and subcellular
distribution is correlated to melanoma progression. Here, the effects of Gal-3
depletion were investigated in melanoma cells derived from different stages
of tumor progression using lentiviral shRNA. Gal-3-deficient (shGal-3) vertical
growth phase (WM793) melanoma cells displayed altered cell morphology,
impaired growth in soft agar, as well as reduced invasiveness. Tumor growth
in NOD/SCID mice injected subcutaneously with WM793 shGal-3 was
dramatically affected. Interestingly, shGal-3 caused no phenotypic changes
in metastatic melanoma cells. Impaired AKT activation and upregulation of
pro-apoptotic proteins were detected, as well as upregulation of p16 and
hipophosphorilation of Rb. Immunofluorescence analyses demonstrated that
Gal-3 and β-catenin co-localize, and that Gal-3 knockdown caused
decreased nuclear β-catenin localization. However the absence of nuclear
Gal-3 in melanocytes and RGP melanoma cells do not affect nuclear β-
catenin distribution. Together, these data demonstrate that Gal-3 has a
crucial role in VGP melanoma. Furthermore, Gal-3 depletion is not sufficient
to affect metastatic cells, which likely develop complementary survival
strategies to escape tumor suppressive mechanisms.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Esquema ilustrativo da pele....................................................... 3
Figura 2 Números de casos estimados para cada tipos de câncer em
2008 na população brasileira..................................................... 5
Figura 3 Principais alterações na transformação de melanócitos............ 8
Figura 4 Desenho esquemático do modelo de progressão do
melanoma proposto por Clark.................................................... 13
Figura 5 Esquema simplificado da estrutura primária da proteína
Galectina-3................................................................................ 15
Figura 6 Implicações de Galectina-3 em vias que levam a morte celular
por apoptose............................................................................ 18
Figura 7 Participação de Galectina-3 na Via Wnt/b-catenina................. 20
Figura 8 Mecanismo de Silenciamento por RNA de interferência.......... 28
Figura 9 Análise do perfil de expressão gênica pela técnica de
Microarray................................................................................. 30
Figura 10 Análise da expressão de Galectina-3 pela técnica de Tissue
Microarray................................................................................. 32
Figura 11 Dados brutos da expressão de Gal-3 em linhagens de
melanoma................................................................................. 52
Figura 12 Análise da expressão de Gal-3 em linhagens de melanoma..... 53
Figura 13 Inibição da expressão de Galectina-3 em células de
melanoma.................................................................................. 55
Figura 14 Morfologia de células de melanoma silenciadas para Gal-3..... 57
Figura 15 Análise da proliferação celular pelo método de MTT................. 58
Figura 16 Ensaio de Crescimento independente de ancoragem de
células WM793 e 1205Lu.......................................................... 59
Figura 17 Ensaio de Crescimento independente de ancoragem de
células WM983A e WM983B..................................................... 60
Figura 18 Ensaio de Migração Celular com as células WM793 shGal-3 e
WM793 pLKO.1....................................................................... 62
Figura 19 Ensaio de Migração Celular com as células 1205Lu shGal-3 e
1205Lu pLKO.1.......................................................................... 63
Figura 20 Quantificação da migração de células silenciadas para Gal-3
e controle................................................................................... 64
Figura 21 Ensaios de invasão tumoral....................................................... 65
Figura 22 Diferença no potencial de invasão das células controles e as
silenciadas para Gal-3.............................................................. 66
Figura 23 Crescimento Tumoral das linhagens WM793 e 1205Lu
silenciadas para Gal-3 em camundongos NOD/SCID.............. 67
Figura 24 Crescimento Tumoral de linhagens WM983A e WM983B
silenciadas para Gal-3 em camundongos NOD/SCID............... 68
Figura 25 Análise da expressão de proteínas relacionadas à p53 e ao
mecanismo de apoptose em células silenciadas para
Galectina-3................................................................................. 70
Figura 26 Análise da expressão de membros da via p16/Rb em células
silenciadas para Galectina-3..................................................... 71
Figura 27 Localização Subcelular de Galectina-3 e β-catenina em
melanócitos.............................................................................. 74
Figura 28 Localização Subcelular de Galectina-3 e β-catenina em
células de WM35....................................................................... 75
Figura 29 Localização Subcelular de Galectina-3 e β-catenina em
células WM793......................................................................... 76
Figura 30 Localização Subcelular de Galectina-3 e β-catenina em
células WM278 e WM983.......................................................... 77
Figura 31 Localização Subcelular de Galectina-3 e β-catenina em
células de 1205Lu..................................................................... 78
Figura 32 Localização Subcelular de Galectina-3 e β-catenina em
células WM1617 e WM983B...................................................... 79
Figura 33 Localização Subcelular de Galectina-3 e β-catenina em
células de melanoma WM793 shGal-3...................................... 80
Figura 34 Localização Subcelular de Galectina-3 e β-catenina em
células de melanoma 1205Lu shGal-3...................................... 81
Figura 35 Análise da expressão de componentes da via Wnt/catenina
em células silenciadas para Gal-3.............................................
82
Figura 36 Regulação do Ciclo Celular.......................................................
104
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Células melanocíticas separadas em melanócitos e
melanomas de diferentes fases de desenvolvimento.............. 36
Quadro 2 Lista de anticorpos primários utilizados e seus respectivos
fabricantes................................................................................
48
Quadro 3 Descrição das mutações dos genes BRAF, NRAS, MYC,
TP53, CDK4 e PTEN em linhagens de melanoma..................
98
LISTA DE ABREVIAÇÕES
Sigla Definição Inglês Definição Português
254CF 254 Calcium Free 254 Livre de Cálcio
APAF-1
Apoptotic Protease Activating
Factor 1
Fator Ativador de Protease
Apoptotica
ARF Alternative Reading Frame Fase Alternativa de Leitura
BAD Bcl-2 Antagonist of Cell Death
Antagonista de Bcl-2 Pró-morte
Celular
BAX Bcl-2 Associated X Protein Proteína X Associada a Bcl-2
Bcl-2 B cell CLL/Limphoma 2 Célula B CLL/Linfoma 2
bFGF Basic Fibroblast Growth Factor
Fator Básico de Crescimento de
Fibroblastos
BIM
Bcl-2 Interacting Mediator of
Cell Death
Mediador de Morte Celular que
interage com Bcl-2
BLASTn
Nucleotide Basic Local
Alignment Search Tool
Ferramenta de Busca de
Alinhamento Local Básico de
Nucleotídeos
BrDu BromodeoxyuridinE Bromodioxiuridina
BSA Bovine Serum Albumin Albumina de Soro Bovino
cAMP
cyclic Adenosine
monophosphate
Adenosina Monofosfato Cíclico)
FTG6 Cyclin D1 Ciclina D1
CDK2 Cyclin-dependent Kinase 2
Ciclina dependente de Quinases
2
CDK4 Cyclin-dependent Kinase 4
Ciclina dependente de Quinases
4
CDKN2A
Cyclin-dependent Kinase
Inhibitor 2A
Inibidor de Ciclinas dependente
de Quinases 2A
cDNA complementary DNA DNA complementar
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
CGH
Comparative Genome
Hybridization
Hibridização Genômica
Comparativa
CLL Chronic Lymphocytic Leukemia Leucemia Linfocítica Crônica
CRD
Carbohydrate Recognition
Domain
Domínio de Reconhecimento de
Carboidratos
CRE cAMP responsible element Elemento Responsivo a cAMP
DISC
Death-Inducing Signaling
Complex
Complexo Sinalizador Induzido
por Morte
DMEM
Dulbelcco’s Modified Eagle’s
Medium
Meio de Eagle Modificado por
Dulbelcco
DMSO Dimethyl Sulfoxide Dimetil Sulfóxido
DNA Deoxyribonucleic Acid Ácido Desoxirribonucléico
ECM Extracellular Matrix Matriz Extracelular
EDTA Ethylenediamine-tetraacetic acid
Ácido Etilenodiamino-tetra-
acético
EMEM
Eagle’s Minimum Essencial
Medium
Meio Mínimo Essencial de Eagle
ENV Envelope Envelope
ET-3 Endothelin 3 Endotelina 3
FACS
Fluorescence-activated Cell
Sorting
Separação de Células ativada por
Fluorescência
FBS Fetal Bovine Serum Soro Fetal Bovino
FF Foreskin Fibroblasts Fibroblastos de prepúcio
FGF2 Fibroblast Growth Factor 2
Fator de Crescimento de
Fibroblastos 2
FM Faculdade de Medicina
FMRP
Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto
GAG Group-specific Antigen Antígeno Grupo-especifico
Gal-3 Galectin-3 Galectina-3
GFP Green Fluorescent Protein Proteína Verde Fluorescente
GSK3β Glycogen Synthase Kinase 3
β
Quinase 3 β da Sintase do
Glicogênio
HBSS Hank’s Balanced Salt Solution
Solução Salina Balanceada de
Hank
HDM2 Human Double Minute 2 Doublé Minute 2 Humano
HEPES
Hydroxiethyl Piperazine
Ethanesulfonic Acid
Hidroxietil Piperazina Ácido
Etanosulfônico
HGF Hepatocyte Growth Factor
Fator de Crescimento de
Hepatócitos
HIPK2
Homeodomain Interacting
Protein Kinase 2
Proteína Quinase 2 que interage
com Homeodomínio
HIV-1
Human Immunodeficiency Vírus
1
Vírus da Imunodeficiência
Humana
IACUC
Institutional Animal Care and
Use Committee
Comitê Institucional de Cuidado e
Uso Animal
INCA Instituto Nacional de Câncer
L15 Leibovitz 15
LB Luria Bertani
MDM2 Mouse Double Minute 2 Double Minute 2 Murino
MMP2 Metaloprotease 2 Metaloprotease 2
MMP9 Metaloprotease 9 Metaloprotease 9
MTT
Dimethylthiazol
Diphenyltetrazolium Bromide
Brometo de Dimetiltiazol
Dipeniltetrazolium
NOD/
SCID
Non Obese Diabetic/Severe
Combined Immunodeficient
Diabético Não
Obeso/Imunodeficiente Severo
Combinado
NWGR Anti-Death Domain
Domínio Anti-morte -
Asparagina,Triptofano,Glicina,
Arginina
OMS Organização Mundial da Saúde
PBS Phosphate Buffered Saline
Solução Salina Tamponada com
Fosfato
PCNA
Proliferating Cell Nuclear
Antigen
Antígeno Nuclear de Células
Proiferativas
PI3K Phosphoinositide-3-kinase Quinase 3 Fosfoinosinositídeo
PKB Protein Kinase B Proteína Quinase B
PMSF Phenylmethanesulphonylfluoride Fenilmetilsulfonilflúor
POL Polymerase Polimerase
PTEN
Phosphatase and Tensin
homolog
Homólogo de Fosfatase e
Tensina
PVDF Polyvinylidene Fluoride Fluoreto de Polivinilideno
Rb Retinoblastoma Retinoblastoma
RGP Radial Growth Phase Fase de Crescimento Radial
RNA Ribonucleic Acid Acido Ribonucléico
RNAi RNA interference RNA de interferência
RNAm RNA mensageiro
RPM Rotations per minute Rotações por minuto
RPMI Roswell Park Memorial Institute
SCF Stem Cell Factor Fator de Células Tronco
SDS-
PAGE
Sodium Dodecyl Sulfate –
Polyacrilamide Gel
Eletrophoresis
Sulfato Dodecil de Sódio-
Eletroforese de Gel de
Poliacrilamida
shRNA short hairpin RNA RNA em grampo curto
siRNA small interfering RNA RNA pequeno de interferência
SNP Single Nucleotide Polymorphism
Polimorfismo de Nucleotídeo
Único
SP1 Specificity Protein 1 Proteína Especifica 1
TBS-T Tris-buffered saline with tween
Solução Salina Tamponada por
Tris com Tween
TCF-4 T Cell Specific Factor – 4 Fator Específico de Células T – 4
TNF Tumor Necrosis Factor Fator de Necrose Tumoral
TRAIL
TNF-related apoptosis inducing
ligand
Ligante Indutor de Apoptose
relacionado à TNF
Tu0% Tumor 0% Tumor 0%
Tu2% Tumor 2% Tumor 2%
USP Universidade de São Paulo
UVB Ultraviolet B Ultravioleta B
VGP Vertical Growth Phase Fase de Crescimento Vertical
WM Wistar Melanoma Collection Coleção de Melanoma do Wistar
Wnt Wingless Sem asas
ÍNDICE
1 INTRODUÇÃO 1
1.1 A estrutura geral da pele 1
1.2 Epidemiologia do melanoma 3
1.3 Principais alterações genéticas em melanoma 5
1.4 O microambiente e o desenvolvimento do melanoma 8
1.5 A progressão do melanoma 11
1.6 Galectina-3 13
1.6.1 Estrutura 14
1.6.2 Galectina-3 citoplasmática 15
1.6.3 Galectina-3 nuclear 18
1.6.4 Galectina-3 extracelular 20
1.7 Galectina-3 na progressão tumoral 22
1.8 Galectina-3 em melanoma 23
1.9 RNA de interferência e vetores lentivirais 25
2 JUSTIFICATIVA 29
3 OBJETIVOS 34
3.1 Objetivo Geral 34
3.2 Objetivos Específicos 34
4 MATERIAIS E MÉTODOS 35
4.1 Cultura de células e ensaios biológicos 35
4.1.1 Cultura de células de melanoma 35
4.1.2 Isolamento e cultura dos demais tipos celulares 36
4.2 RNA de interferência 38
4.2.1 Análise das seqüências de shRNA 38
4.2.2 Produção das partículas lentivirais 39
4.2.3 Transdução de células de melanoma 40
4.3 Ensaios Funcionais 41
4.3.1 Análise de Proliferação Celular (MTT) 41
4.3.2 Ensaio de Crescimento Independente de ancoragem 42
4.3.3 Ensaio de Migração Celular por Cicatrização 43
4.3.4 Ensaio de Invasão Tumoral 44
4.3.5 Análise de Tumorigenicidade em camundongos imunodeficientes 45
4.4 Análises Bioquímicas 46
4.4.1 Western Blotting 46
4.4.2 Imunofluorescência 48
4.5 Microscopia 49
4.6 Estatística 50
5 RESULTADOS 51
5.1 Expressão de Galectina-3 em linhagens de melanoma 51
5.2 Silenciamento de Galectina-3 em linhagens de melanoma primário
e metastático 54
5.3 Análise das linhagens silenciadas para Galectina-3 56
5.3.1 Morfologia Celular 56
5.3.2 Proliferação Celular 58
5.3.3 Crescimento Independente de ancoragem 59
5.3.4 Migração Celular 60
5.3.5 Invasão Tumoral 64
5.3.6 Crescimento Tumoral em camundongos imunodeficientes 66
5.4 Elucidação de mecanismos regulados pela presença ou ausência
de Galectina-3 68
5.4.1 Proteínas ligadas à p53 e aos mecanismos de apoptose 68
5.4.2 Proteínas da via de p16/Rb 70
5.4.3 Proteínas da via de Wnt/β−catenina 72
6 DISCUSSÃO 83
6.1 A expressão de Galectina-3 em melanoma 83
6.2 O efeito da inibição da expressão de Galectina-3 no fenótipo
de células de melanoma 86
6.2.1 Morfologia Celular 89
6.2.2 Proliferação Celular 90
6.2.3 Crescimento Independente de ancoragem 91
6.2.4 Migração Celular 92
6.2.5 Invasão Tumoral 94
6.2.6 Crescimento Tumoral em camundongos imunodeficientes 95
6.3 Indícios de mecanismos possivelmente implicados no fenótipo
observado 97
6.3.1 Alterações de p53 e proteínas relacionadas à apoptose 98
6.3.2 Alterações da via de p16/Rb 104
6.3.3 Alterações da via de Wnt/β−catenina 108
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS 112
8 CONCLUSÕES 115
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 117
ANEXO
Anexo 1 “Transforming the melanocyte – More than just MAPK”. Mini-
revisão publicada
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 A ESTRUTURA GERAL DA PELE
A pele é o órgão mais externo do corpo humano, sendo geralmente
representada em camadas (Figura 1A). A primeira delas, a epiderme, é
formada por um epitélio escamoso, estratificado e em contínua renovação,
composta principalmente por queratinócitos, melanócitos e células de
Langherans. Os queratinócitos representam aproximadamente 80% das
células da epiderme e se apresentam em progressiva diferenciação
controlada por eventos extrínsecos (do microambiente) e intrínsecos
(genéticos e sistêmicos). Esta diferenciação é ilustrada pela organização
destas células em camadas nomeadas de acordo com a posição e
propriedades estruturais das células (basal, espinhosa, granulosa e córnea)
(CHU et al. 2003).
Os melanócitos são células produtoras de melanina que se limitam
especialmente à camada basal da epiderme. Através de seus
prolongamentos, estas células se comunicam com os queratinócitos, e esta
interação é essencial para a sua diferenciação e função (Figura 1B). Em
condições fisiológicas normais, melanócitos e queratinócitos formam a
“Unidade Epidérmica de Melanina”. Estas células se alinham na zona da
membrana basal na razão 1 melanócito para cada 5 à 8 queratinócitos. Cada
melanócitos transporta melanossomos para aproximadamente 35
2
queratinócitos das camadas superiores da epiderme através de seus
prolongamentos. Conseqüentemente ocorre a pigmentação da camada
basal e das camadas mais superficiais da pele, principal responsável pela
proteção aos danos de radiação, incluindo o desenvolvimento de tumores
como o melanoma (CHU et al. 2003). O controle dos queratinócitos sobre
proliferação, número de prolongamentos e expressão de moléculas de
superfície do melanócito evidencia que esta organização serve como base
estrutural para a regulação intercelular (LI e HERLYN 2000).
A Junção Dermo-epidérmica é uma zona de membrana basal que
comunica a derme e a epiderme. Ela serve de suporte para a epiderme,
determina a polaridade de estratificação, direciona a organização do
citoesqueleto nas células basais, disponibiliza sinais de desenvolvimento e
ainda serve como uma barreira semipermeável. Sua estrutura é formada
quase que totalmente por fatores secretados pelos queratinócitos basais,
com uma pequena contribuição dos fibroblastos presentes na derme (CHU
et al. 2003).
A derme é um sistema integrado de tecido conectivo fibroso e
filamentoso, que acomoda tecidos nervoso e vascular, apêndices
epidérmicos, fibroblastos, macrófagos, mastócitos e outras células
sanguíneas, incluindo linfócitos, em resposta a certos estímulos. Ela é
organizada nas regiões papilar e reticular e a matriz do tecido dérmico é
formada principalmente de colágeno e elastina (CHU et al. 2003). Dentre as
células da derme destacam-se os fibroblastos, que são células
mesenquimais responsáveis pela síntese e degradação das proteínas da
3
matriz do tecido conectivo fibroso e não fibroso e de fatores solúveis, além
de estarem envolvidos com o controle da proliferação dos melanócitos
(CORNIL et al. 1991).
Legenda: A) Detalhe das três camadas que compõem a pele: epiderme, derme e
hipoderme. B) Localização dos melanócitos na camada basal da epiderme. A comunicação
destes com os queratinócitos é representada pela transferência da melanina, pigmento que
dá cor a pele.
Fonte: Adaptação de Medline Plus, Medical Encyclopedia, Melanin (2008).
Figura 1 - Esquema ilustrativo da pele.
1.2 EPIDEMIOLOGIA DO MELANOMA
O desenvolvimento do melanoma cutâneo é resultante da
transformação maligna de melanócitos e, como na maioria dos cânceres, a
predisposição genética e exposição à certas condições ambientais são
fatores de risco. O fator ambiental clássico relacionado ao risco de
4
melanoma é a exposição à luz solar (MOAN et al. 1999). História de
queratose solar e câncer de pele não-melanoma também são fatores de
risco importantes. Dentre os fatores de predisposição, além de história
familial, destaca-se a côr da pele. Acredita-se que pessoas com pele mais
clara sejam mais susceptíveis aos danos solares. A presença de um grande
número de nevos atípicos ou comumente adquiridos representa outro fator
importante (MARKS 2000).
A incidência de melanoma cutâneo tem apresentado crescimento
constante durante várias décadas. Enquanto que em 1935, o risco de
desenvolvimento de melanoma nos Estados Unidos era de 1 em cada 1500
habitantes, em 2007 ocorreu 1 caso de melanoma invasivo para cada 63
habitantes. De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS),
melanoma é a malignidade que está aumentando mais rapidamente em todo
o mundo (RIGEL 2008). A estimativa para 2008 nos Estados Unidos é de
aproximadamente 62.480 novos casos e 8.420 mortes relacionadas à este
tumor. Estes dados excluem melanoma in situ, que, de acordo com estas
estatísticas, será responsável por 54.020 casos (JEMAL et al. 2008). No
Brasil, o Instituto Nacional de Câncer (INCA) estima para 2008 o número de
aproximadamente 3.000 novos casos em homens e 3.000 em mulheres.
Embora, quando comparado a outros tipos de tumores, estes números
sejam baixos, a letalidade é elevada (Ministério da Saúde 2007).
A detecção precoce, contudo, tem aumentado a sobrevida dos
pacientes com este tipo de câncer. Nos países desenvolvidos, a sobrevida
5
média estimada em cinco anos é de 73%, enquanto que, para os países em
desenvolvimento a sobrevida média é de 56% (Ministério da Saúde 2007).
Fonte: Adaptação de Ministério da Saúde/Instituto Nancional do Câncer-INCA 2007.
Figura 2 – Números de casos estimados para cada tipos de câncer em 2008
na população brasileira.
1.3 PRINCIPAIS ALTERAÇÕES GENÉTICAS EM MELANOMA
Mutações em oncogenes e genes supressores de tumor são fatores
clássicos no desenvolvimento e progressão tumoral. Em outras palavras,
estas alterações genéticas conferem vantagens de sobrevivência e
proliferação às células e ainda permitem que estas ignorem mecanismos de
diferenciação celular. O fenótipo maligno contribui, por exemplo, para a
proliferação descontrolada na ausência de fatores de crescimento e de
ancoragem à um substrato. Estas células são também capazes de quebrar a
6
homeostase tecidual, escapar do controle de fatores estromais e finalmente
formar tumores.
Fatores genéticos e epigenéticos contribuem juntos para a
transformação maligna das células. Mutações somáticas e adquiridas,
incluindo deleções, amplificações e translocações, já foram descritas em
lesões melanocíticas malignas e pré-malignas.
O papel da via de MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) foi bem
estabelecido na literatura há mais de três décadas. DAVIES et al. (2002)
demonstraram a presença de mutações no gene BRAF em dois terços dos
melanomas. Mutações em NRAS ocorrem em aproximadamente 15% dos
melanomas (POLLOCK et al. 2003), enquanto KIT (mais conhecido por c-
Kit), um receptor tirosina quinase também capaz de ativar a mesma via,
aparece mutado em cerca de 4% (CURTIN et al. 2005). Interessantemente,
estas mutações raramente se sobrepõem. Nos poucos casos em que a via
de MAPK não se encontra ativada em melanoma pelas mutações em RAF e
RAS, mutações em CCND1 (gene que codifica a proteína Ciclina D1) ou
CDK4 (cyclin-dependent kinase 4) podem ser encontradas (MUTHUSAMY et
al. 2006). Em adição, o lócus CDKN2A (cyclin-dependent kinase inhibitor
2A), que abriga dois importantes genes supressores de tumor conhecidos
por p16 ou INK4a e p14 ou ARF, é também perdido em aproximadamente
50% dos melanomas (CURTIN et al. 2006).
Embora comum em muitos outros tumores, o melanoma raramente
apresenta mutações em TP53 (também conhecido como p53). Neste caso, é
possível que ARF seja pelo menos em parte responsável pela perda da
7
função da proteína p53. Quando expressa, ARF inibe a atividade da
ubiquitina ligase HDM2 (em camundongos, conhecida por MDM2) que,
consequentemente, não consegue direcionar p53 para a degradação via
proteossoma. De fato, a superexpressão de HDM2 já foi relatada em
melanomas (MUTHUSAMY et al. 2006; POLSKY et al. 2001). Finalmente,
mutações em BRAF aparecem geralmente acompanhadas da perda de
PTEN e uma pequena proporção de melanomas possui amplificações em
MYC (também conhecido como c-Myc) (KRAEHN et al. 2001).
Assim, fica clara a implicação da via de MAPK no desenvolvimento e
progressão do melanoma, embora outras vias possam exercer papéis
auxiliares no desenvolvimento da doença. A figura 3 ilustra um resumo dos
principais genes envolvidos na transformação de melanócitos em células de
melanoma.
8
Legenda: Melanócitos normais adquirem mutações que provocam um aumento transiente
na proliferação celular seguido da entrada em um estado de senescência (nevo). Não se
sabe se todos os melanócitos entram em senescência ou se alguns adquirem novas
anormalidades genéticas (mutações pontuais/deleções/amplificações) que permitem o
escape da senescência induzida por oncogenes (OIS). Em ambos os exemplos, a aquisição
de anomalias genéticas parece transformar células benignas em melanomas malignos.
Figura 3 - Principais alterações na transformação de melanócitos.
Mais detalhes sobre este tema podem se encontrados em
“Transforming the Melanocyte, more than just MAPK” (“Transformando o
melanócito, mais do que apenas MAPK”) revisão escrita por Patrícia Possik,
em colaboração com John Lee e Meenhard Herlyn (POSSIK et al. 2008)
(Anexo I).
1.4 O MICROAMBIENTE E O DESENVOLVIMENTO DO
MELANOMA
O controle do comportamento celular e a manutenção estrutural do
tecido dependem da homeostase tecidual. Esta, por sua vez, é controlada
via fatores solúveis como hormônios, fatores de crescimento e citocinas
(comunicação extracelular), via mensageiros secundários e redes de
transdução de sinal (comunicação intracelular) e via adesão célula–célula e
9
célula-matriz (comunicação intercelular) (LI e HERLYN 2000). No caso do
tecido cutâneo, a homeostase é mantida especialmente por interações entre
melanócitos, queratinócitos e fibroblastos, e destes com a matriz
extracelular. Assim, durante a transformação dos melanócitos em células de
melanoma, as interações com o microambiente são desreguladas.
Alguns fatores secretados por queratinócitos atuam na regulação da
proliferação dos melanócitos como, por exemplo, bFGF (também conhecido
por FGF2) (basic Fibroblast Growth Factor, Fibroblast Growth Factor 2) e
endotelinas. Fibroblastos, por sua vez, são responsáveis pela produção de
bFGF, SCF (Stem Cell Factor) e HGF (Hepatocyte Growth Factor)
(IMOKAWA et al. 1992). O Fator de Crescimento bFGF demonstra ser o
mais importante fator de crescimento em melanomas desde a descoberta
como um fator de crescimento natural para os melanócitos. Em modelos de
reconstituição dérmica, células de melanomas primários necessitam da
ativação do gene FGF2 para sua sobrevivência, proliferação e invasão
dérmica (MEIER et al. 2000).
Em excesso, alguns destes fatores podem ter o efeito oposto. A
superexpressão de EDN3, KITLG e FGF2, que codificam respectivamente,
os fatores de crescimento ET-3 (endotelina 3), SCF e bFGF, pode contribuir
para o debalanço com o microambiente. Foi demonstrado que a introdução
de adenovírus carregando estes genes em pele humana transplantada no
dorso de camundongos imunodeficientes, em combinação com à luz
ultravioleta, pode levar à um fenótipo alterado dos melanócitos presentes na
10
epiderme e contribuir para a transformação maligna (BERKING et al. 2001;
BERKING et al. 2004).
O controle dos queratinócitos sobre os melanócitos é interrompido
com a perda da comunicação e adesão intercelular após a transformação de
células normais em nevos ou melanomas. Melanócitos isolados em cultura,
por exemplo, expressam moléculas de superfície que não são normalmente
expressas, a não ser em células de melanoma (VALYI-NAGY et al. 1993).
Entretanto, quando em contato com queratinócitos normais, estes
melanócitos desenvolvem múltiplos prolongamentos que atingem os
queratinócitos, as moléculas de superfície características de melanoma
desaparecem em alguns dias e seu crescimento e número celular é
novamente controlado (VALYI-NAGY et al. 1993). Foi também demonstrado
que o contato entre melanócitos e queratinócitos controla a proliferação dos
queratinócitos (DEVECI et al. 2001).
Dentre as moléculas de adesão célula-célula mais importantes na
pele destacam-se as E-Caderinas, componentes importantes de junções
aderentes, participando assim da adesão entre queratinócitos e melanócitos.
A perda deste mecanismo de adesão pode levar a proliferação contínua e
formação de nevos (SATYAMOORTHY et al. 2000).
Células névicas e células de melanoma não expressam E-caderina,
mas sim N-Caderina, o que diminui a sua adesão aos queratinócitos (TANG
et al. 1994). Além do mais, a expressão de N-Caderina leva a formação de
junções aderentes destas células com fibroblastos e células endoteliais
11
(HSU et al. 2000), o que pode ter implicações funcionais muito importantes
para o desenvolvimento e progressão do melanoma.
Recentemente, HEDLEY et al. (2002) sugeriram que, em um modelo
de reconstituição dérmica, a pigmentação dos melanócitos também pode
ocorrer em resposta a ausência da membrana basal e remoção de
fibroblastos, o que indica que os fibroblastos possuem um papel importante
auxiliando os melanócitos à lidar com estresse. Fibroblastos presentes na
derme também podem controlar negativamente o desenvolvimento de lesões
benignas e este poder inibitório é revertido em estímulo de crescimento para
células malignas (CORNIL et al. 1991).
Desta forma, o melanoma tem sido estudado não mais
exclusivamente como uma alteração dos melanócitos, mas como resultado
da perda da homeostase cutânea.
1.5 A PROGRESSÃO DO MELANOMA
Baseado em características histopatológicas e clínicas, foi proposto
um modelo de desenvolvimento e progressão dos melanomas, composto por
5 etapas (CLARK et al. 1984), sendo elas:
(0) Melanócitos precursores;
(1) Nevos comuns, adquiridos ou congênitos, com melanócitos
estruturalmente normais e sem anormalidades citogenéticas ou
alterações no período de vida;
12
(2) Nevos displásicos, com atipía estrutural e arquitetural, possivelmente
precursores de melanomas e assim com densidade correlacionada ao
risco de desenvolvimento do tumor;
(3) Fase de crescimento radial (RGP), com células de melanoma primário
na epiderme e sem capacidade de metastatização;
(4) Fase de crescimento vertical (VGP), com células de melanomas
primários invadindo a derme e com capacidade de metastatização;
(5) Melanoma metastático.
De acordo com este modelo (Figura 4), a progressão do melanoma
seria linear, passando por vários estágios desde a formação do nevo até o
desenvolvimento de lesões mais invasivas e metastáticas. Entretanto, dados
mostram que nem sempre a presença do melanoma está associada a um
nevo pré-existente. Enquanto MARKS et al. (1990) demonstraram que
aproximadamente 20% dos melanomas evoluem a partir de nevos, outro
estudo observou que pelo menos 51% dos melanomas apresentavam-se
associados à algum tipo de nevo (SKENDER-KALNENAS et al. 1995)
Assim, embora a presença de nevos seja um fator de risco importante
em melanoma, isto nem sempre significa que estas sejam lesões
precursoras. Mesmo assim, a classificação proposta por Clark é muito
utilizada por propôr cinco grupos de melanomas com diferenças estruturais
comumente diagnosticadas em pacientes.
13
Legenda: Melanócitos, que em condições normais se distribuem na camada basal da
epiderme, acumulariam alterações que levariam à formação de nevos. Células de
melanoma de crescimento vertical surgiriam a partir destes nevos. O acúmulo de alterações
genéticas adicionais e a influência de fatores do microambiente favoreceriam o
desenvolvimento de células de crescimento vertical (VGP) que neste estágio já possuem a
habilidade de formar metástases.
Fonte: Adaptação do website de Meenhard Herlyn
Figura 4 - Desenho esquemático do modelo de progressão do melanoma
proposto por Clark.
1.6 GALECTINA-3
Galectinas são lectinas que apresentam afinidade de ligação a β-
galactosídeos. Já foram identificados 14 membros da família das Galectinas,
caracterizadas por possuírem uma seqüência de aminoácidos
evolutivamente conservada.
Dentre estas destaca-se Galectina-3 (aqui muitas vezes referida por
Gal-3), uma proteína de 35kDa, com atividades pleiotrópicas, cujo papel não
se resume a ligação à carboidratos. Alguns mecanismos, ainda não
totalmente elucidados, permitem que a proteína Gal-3 transite entre o núcleo
e o citoplasma de uma grande variedade de células (HONJO et al. 2001;
NAKAHARA et al. 2006; NAKAHARA e RAZ 2006). Embora esta localização
14
varie entre diferentes linhagens celulares e tipos de tumores, o papel
biológico de Gal-3 é definido de acordo com sua localização subcelular.
1.6.1 Estrutura
A família das Galectinas é caracterizada principalmente pela presença
de um domínio de ligação e reconhecimento de carboidratos denominado
CRD (Carbohydrate Recognition Domain) (DUMIC et al. 2006). Além do
domínio CRD, Gal-3 possui um domínio amino-terminal rico em glicina e
prolina denominado Domínio Similar ao Colágeno (collagen-like) por possuir
33.5% de identidade com a cadeia II do Colágeno α1 da cartilagem bovina.
A extremidade amino-terminal desta proteína também possui um sítio de
fosforilação responsável especialmente pela localização subcelular de Gal-3
e por algumas de suas funções (Figura 5).
O domínio CRD é principalmente responsável pela atividade de
lectina de Galectina-3, mas também está envolvido em outras funções, como
nas interações homofílicas dependentes de carboidratos. Dentro deste
domínio, encontra-se um motivo altamente conservado nas proteínas da
família Bcl-2 (B cell CLL/Limphoma 2). Este motivo, denominado NWGR
(composto pelos aminoácidos Asparagina, Triptofano, Glicina, Arginina), é
responsável pela atividade anti-apoptótica de Gal-3.
15
Legenda: Gal-3 é basicamente formada por um domínio amino-terminal rico em prolina e
glicina, denominado Domínio Similar ao Colágeno (amarelo). Os 12 aminoácidos na
extremidade amino-terminal estão implicados na localização subcelular de Gal-3 (verde).
Nesta região da proteína, encontra-se o sítio de fosforilação essencial para a translocação
entre citoplasma e núcleo (serina 6). No domínio de ligação à carboidratos (azul) encontra-
se o motivo NWGR (vermelho), geralmente encontrado em membros da família de Bcl-2.
Figura 5 - Esquema simplificado da estrutura primária da proteína Galectina-
3.
1.6.2 Galectina-3 citoplasmática
Uma das mais estudadas funções citoplasmáticas de Gal-3 é a
resistência à apoptose. A participação de Galectina-3 na resistência à
apoptose induzida por anti-Fas e staurosporina (YANG et al. 1996),
cisplatina (AKAHANI et al. 1997), anoikis (apoptose induzida por perda de
ancoragem) (KIM et al. 1999), cicloheximida/TNF (Tumor Necrosis Factor),
irradiação UVB (Ultravioleta B) (MATARRESE et al. 2000), óxido nítrico
(MOON et al. 2001) entre outros, já foram reportados.
Em resposta à diferentes estímulos, Galectina-3 transloca do
citoplasma ou do núcleo para membrana mitocondrial (YU et al. 2002; VAN
DEN BRULE et al. 2000) onde se envolve no controle da apoptose
possivelmente através da interação com a proteína Bcl-2 (YANG et al. 1996).
Esta translocação é dependente de sua interação com a proteína Sinexina
(Synexin), cuja expressão é fundamental para a função anti-apoptótica de
Galectina-3 (YU et al. 2002). Embora não seja membro da mesma família,
Gal-3 apresenta propriedades estruturais semelhantes à Bcl-2 e outros
16
membros da mesma família, especialmente devido à presença do motivo
NWGR (YANG et al. 1996; AKAHANI et al. 1997).
A interação direta com o receptor CD95 (Apo/Fas) indica a
participação de Galectina-3 também em mecanismos da via extrínseca de
apoptose. Sabe-se que o receptor CD95 pode acionar dois tipos de
respostas apoptóticas, sendo as células denominadas de acordo com o tipo
de resposta ativada (células tipo I e tipo II). Resumidamente, células tipo I,
diante de estímulos apoptóticos, induzem a formação do complexo DISC
(death-inducing signaling complex) e ativação de caspase 8. Já em células
do tipo II, complexo DISC se forma ineficientemente. Os autores observaram
que Gal-3 é expressa apenas em linfócitos classificados como do tipo I.
Adicionalmente, foi demonstrado que Gal-3 interage com CD95 e que a
expressão desta lectina em células tipo II converte estas ao fenótipo das
células de tipo I (FUKUMORI et al. 2004).
Algumas inconsistências quanto à função anti-apoptótica de Gal-3
podem ser encontradas na literatura. A expressão de Gal-3 em células de
carcinoma mamário, por exemplo, é capaz de promover apoptose induzida
por TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand), em parte pela inibição de
AKT (também conhecida por PKB) (LEE et al. 2003). Por outro lado, em
células de carcinoma de bexiga, a expressão de Gal-3 torna as células
resistêntes ao estímulo apoptótico, desta vez induzindo a ativação de AKT
(OKA et al. 2005). Tais diferenças podem em parte ser atribuídas ao uso de
diferentes tipos celulares ou tipos tumorais.
17
Estímulos apoptóticos podem também regular a transcrição do gene
que codifica Gal-3 (LGALS3). A fosforilação de p53 pela quinase HIPK2
(Homeodomain Interacting Protein Kinase 2), por exemplo, ocorre em
resposta a irradiação ultravioleta e leva à repressão da transcrição de Gal-3
e à ativação de apoptose dependente de p53 (CECCHINELLI et al. 2006).
NF-κB e c-Jun também estão envolvidos na indução da expressão de
Galectina-3 em resposta a irradiação ultravioleta (DUMIC et al. 2000).
Recentemente, demonstrou-se que a proteína Nucling inibe a translocação
de complexo NFκB para o núcleo e, conseqüentemente, a ativação da
expressão de LGALS3. Esta proteína também interage diretamente com
Galectina-3 no citoplasma (LIU et al. 2004).
Ainda no citoplasma, e complementar a sua função anti-apoptótica,
Galectina-3 pode interagir com K-Ras. A expressão de ambas as proteínas
aumenta a ativação da via de PI3K/AKT (ELAD-SFADIA et al. 2004), uma via
especialmente envolvida em mecanismos de sobrevivência celular e que
pode inclusive levar à ativação de fatores anti-apoptóticos.
Interessantemente, em células de câncer de mama, Galectina-3 influencia a
mudança de expressão de N-Ras para K-Ras (SHALOM-FEUERSTEIN et al.
2005).
18
Legenda: A presença de Galectina-3 pode influenciar a resposta à certos estímulos que
levam à apoptose. Dentre os possíveis mecanismos implicados na função anti-apoptótica de
Gal-3, destacam-se as interações com Bcl-2, CD95 e Sinexina. O controle da expressão de
Gal-3 por p53 também deve contribuir para esta função de Gal-3.
Figura 6 - Implicações de Galectina-3 em vias que levam a morte celular por
apoptose.
1.6.3 Galectina-3 nuclear
Uma das primeiras funções descritas para Gal-3 nuclear foi a de
envolvimento no processamento do RNA mensageiro (RNA splicing). Dentro
deste compartimento, Galectina-3 interage diretamente com a proteína
Gemin4, fazendo parte do complexo envolvido na formação do
espliceossoma (spliceosome) e indiretamente com o RNA mensageiro
preliminar (pré-RNAm) (PARK et al. 2001).
19
Atualmente, outras funções nucleares vêm sendo reconhecidas, como
por exemplo a regulação da expressão de CCND1, gene que codifica Ciclina
D1, importante fator envolvido em proliferação celular. A indução de Ciclina
D1 em células epiteliais de mama resulta da estabilização do complexo
formado pelas proteínas nucleares e o DNA nos sítios de SP1 (Specific
Protein 1) e CRE (cAMP responsible element) do promotor deste gene (LIN
et al. 2002). Recentemente, uma lista de genes modulados pela expressão
de Galectina-3 fosforilada (serina 6) foram revelados em um estudo de
análise de expressão gênica em células epiteliais (MAZUREK et al. 2005).
Dentre eles, destacam-se genes que codificam proteínas importantes no
ciclo celular como Rb (Proteína associada ao retinoblastoma ou pRb),
Ciclina D1 e Ciclina B2, assim como diferentes tipos de colágeno.
Alguns estudos sugerem a participação de Gal-3 na via Wnt/β-
catenina. Segundo os autores, Gal-3 faz parte do complexo com β-catenina
e Axina no citoplasma e pode ser fosforilada por GSK3-β (Glycogen
Synthase Kinase 3
β
) (SHIMURA et al. 2005). Adicionalmente, a presença de
Gal-3 seria essencial para a retenção de β-catenina no núcleo de células de
câncer de mama, o que sugeriu a participação de Gal-3 na translocação
nuclear de β-catenina (SHIMURA et al. 2004). Também foi observada a
interação da proteína Gal-3 com o fator de transcrição TCF4, envolvido na
expressão de genes regulados por β-catenina, como por exemplo, CCND1
(SHIMURA et al. 2004).
20
Legenda: Gal-3 interage com diversos componentes da via Wnt/β-catenina, como Axina,
GSK3β e β-catenina. Gal-3 pode também interagir com TCF/LEF e induzir a expressão de
genes regulados com a ativação desta via, como CCND1, gene que codifica Ciclina D1.
Figura 7 - Participação de Galectina-3 na Via Wnt/β-catenina.
1.6.4 Galectina-3 extracelular
A proteína Galectina-3 pode também ser secretada e uma vez no
meio extracelular, está livre pra se ligar a proteínas glicosiladas presentes na
superfície de células ou na matriz extracelular (ECM). Já foi demonstrada a
habilidade de Gal-3 de se ligar a Laminina, Fibronectina, Elastina, Colágeno
IV, Tenascina-C e Tenascina-R (HUGHES 2001; DUMIC et al. 2006). A
expressão de Gal-3 pode inclusive aumentar as propriedades adesivas de
células tumorais a algumas destas proteínas, como Laminina, Vitronectina e
Fibronectina (MATARRESE et al. 2000). Em adição, foi reportado que Gal-3
21
aumenta a adesão de células epiteliais ao Colágeno I, o que pode contribuir
para o fenótipo invasivo destas células (FRIEDRICHS et al. 2007).
Algumas integrinas podem também servir de receptores para Gal-3.
Em macrófagos, Gal-3 pode se ligar a α1β1 e a subunidade α de αMβ1. Gal-
3 também pode se ligar a CD98, promovendo sua dimerização e
conseqüente ativação de integrinas na superfície de monócitos, macrófagos
e linfócitos T ativados (DONG e HUGHES 1997).
A ligação ao domínio extracelular de integrinas pode modular
positivamente ou negativamente a sua ativação e a ligação à componentes
da ECM. Enquanto Galectina-3 aumenta a adesão de neutrófilos à vários
substratos, este efeito é bloqueado com anticorpos para algumas integrinas,
como para αMβ1 (KUWABARA e LIU 1996). Por outro lado, o tratamento de
células tumorais com Galectina-3 recombinante pode reduzir a adesão à
matriz extracelular (OCHIENG et al. 1998).
É importante ressaltar que Galectina-3 extracelular pode também
servir de substrato para metaloproteases MMP2 e MMP9 (matrix
metaloproteases 2 e 9). A clivagem de Gal-3 por estas enzimas diminui a
sua capacidade de homodimerização e aumenta sua capacidade de ligação
à laminina contendo β-galactosídeos (OCHIENG et al. 1998).
Galectina-3 também pode participar de mecanismos de apoptose
quando no meio extracelular. Diferente da função anti-apoptótica de Gal-3
quando no citoplasma, a forma extracelular desta proteína pode ter um papel
pró-apoptótico ativado pela ligação à certos receptores celulares. Gal-3
extracelular é fator importante para a indução de apoptose em certos tipos
22
celulares, como linfócitos T, células mononucleares de sangue periférico e
células de leucemia. As proteínas CD7 e CD29 foram identificadas como
receptores de Gal-3 na superfície destas células e acredita-se que este seja
um importante mecanismo utilizado pelas células tumorais no escape do
sistema imune (FUKUMORI et al. 2003). De acordo com esta afirmação,
Gal-3 poderia estar implicada na indução de apoptose em linfócitos T
infiltrantes (NAKAHARA et al. 2005).
1.7 GALECTINA-3 NA PROGRESSÃO TUMORAL
Muitos estudos demonstram que a alteração da expressão de
Galectina-3 está envolvida com o desenvolvimento e progressão de diversos
tipos de tumores. Os resultados já reportados na literatura, entretanto, são
de difícil interpretação devido às inconsistências apresentadas para um
mesmo tipo tumoral ou entre diferentes tipos de tumor.
Enquanto a expressão de Gal-3 aumenta durante a progressão do
carcinoma de cólon (LOTZ et al. 1993), a mesma diminui em carcinoma de
mama em relação ao tecido normal (CASTRONOVO et al. 1996; IDIKIO
1998). Interessantemente, o silenciamento de Gal-3 em células de
carcinoma de mama em cultura resulta em um fenótipo menos maligno, com
aquisição de inibição por contato, diminuição da proliferação independente
de soro, anulação de crescimento dependente de ancoragem e menor
tumorigenicidade in vivo (HONJO et al. 2001). Já a superexpressão de Gal-3
23
em linhagens tumorais de mama aumenta o potencial invasivo e metastático
(MATARRESE et al. 2000).
Não somente os níveis de expressão, mas também a localização
subcelular de Gal-3 tem se mostrado como um importante fator de
progressão tumoral. Em próstata, enquanto que glândulas normais
expressam Gal-3 no citoplasma e núcleo, a localização nuclear é perdida em
lesões malignas e a distribuição citoplasmática de Gal-3 correlaciona com a
progressão do tumor. Tais resultados sugerem que Gal-3 tenha funções anti-
tumorais quando presente no núcleo, enquanto que no citoplasma esta
favoreceria a progressão tumoral (VAN DEN BRULE et al. 2000).
Experimentos in vitro confirmaram os dados de van den Brule e
demonstraram que Gal-3 citoplasmática está associada a maiores taxas de
invasão e promoção de crescimento independente de ancoragem de células
de câncer de próstata (CALIFICE et al. 2004). No mesmo trabalho foi
demonstrado que Gal-3 citoplasmática é anti-apoptótica, enquanto que a
nuclear é pró-apoptótica. Estes experimentos foram comprovados in vivo, e
foi observado que a presença de Gal-3 citoplasmática contribui para a
formação e tamanho do tumor, apoptose e angiogênese em camundongos
atímicos.
1.8 GALECTINA-3 EM MELANOMA
Galectina-3 é expressa em diversos tecidos e órgãos. Na pele, esta
lectina é expressa por queratinócitos, fibroblastos, células de Langerhans,
24
células de Schwann (DUMIC et al. 2006) e melanócitos (observações
pessoais).
Em um estudo imunoistoquímico, VEREECKEN et al. (2005)
observaram maior expressão de Galectina-3 em lesões primárias em
comparação com lesões benignas. Em adição, melanomas mais invasivos e
metástases apresentaram uma diminuição na expressão desta proteína. O
estudo envolveu 89 lesões primárias, 11 metástases e 15 nevos benignos. O
mesmo grupo analisou o soro de pacientes com melanoma metastático em
estágio IV e observaram um aumento significativo da presença de Galectina-
3 no soro destes pacientes em relação a pessoas sadias (VEREECKEN e
HEENEN 2006; VEREECKEN et al. 2006; VEREECKEN et al. 2007a, b).
Paralelamente, outro estudo demonstrou que a expressão de Galectina-3 em
células de melanoma se correlaciona com apoptose de linfócitos T
infiltrantes (ZUBIETA et al. 2006).
Mais recentemente, um trabalho utilizando Tissue Microarray analisou
a expressão de Galectina-3 em 17 amostras de nevos benignos, 18 de
nevos displásicos, 23 de melanoma primários e 31 de melanoma metastático
(PRIETO et al. 2006). Os autores demonstraram que, no painel de amostras
estudado, a expressão citoplasmática de Gal-3 aumenta de acordo com as
fases de progressão tumoral (nevo benigno ‹ nevo displásico ‹ melanoma ‹
metástase). Embora não tenha sido encontrada a mesma correlação para a
localização nuclear, é importante destacar que não foi encontrada marcação
nuclear em nevos (benignos ou displásicos). Adicionalmente, metástases
subcutâneas raramente apresentaram marcação nuclear enquanto que as
25
disseminadas para os nódulos linfáticos e vísceras demonstraram expressão
nuclear aumentada.
Ainda neste trabalho, os autores demonstraram que apenas as lesões
em áreas de exposição à luz solar apresentaram marcação citoplasmática
para Gal-3. Em adição, a marcação nuclear parece ser exclusiva de lesões
em áreas de exposição crônica.
Assim, conhclui-se que os trabalhos que analisaram a expressão e
localização de Gal-3 em melanoma apresentaram dados conflitantes. As
inconsistências entre os trabalhos poderiam ser explicadas, por exemplo,
pela utilização de anticorpos monoclonais diferentes e utilização de um
painel de amostras distintas.
1.9 RNA DE INTERFERÊNCIA E VETORES LENTIVIRAIS
O silenciamento da expressão de um gene através de RNA de
interferência (RNAi) pode ser obtido com o uso de pequenos RNAs de
interferência sintetizados quimicamente (siRNA – small interfering RNA) ou
através de clonagem do referente cDNA em vetores plasmidiais (shRNA –
short hairpin RNA). siRNA sintéticos possuem meia-vida curta e,
conseqüentemente, a inibição é restrita à curtos períodos. As principais
vantagens da clonagem em vetores são: a maior estabilidade molecular do
DNA; a possibilidade de amplificação em bactéria; o silenciamento
permanente do gene alvo; a produção de um grande número de células
26
silenciadas e a manutenção do fenótipo alterado por longos períodos de
tempo (PADDISON et al. 2002).
Atualmente, sistemas de RNAi utilizam lentivírus para uma melhor
eficiência na entrega do shRNA de interesse na célula alvo. Lentivírus são
originalmente derivados do HIV-1 (Human Immunodeficiency Vírus -1) que,
entretanto, são incapazes de se replicar. Uma vez dentro da célula, o RNA
viral sofre transcrição reversa e é transportado para o núcleo (LEWIS e
EMERMAN 1994) onde é finalmente integrado ao genoma
(BUCHSCHACHER e WONG-STAAL 2000).
Para a produção destes lentivírus, o plasmídeo de expressão
codificando o shRNA de interesse é transfectado em conjunto com outros
dois plasmídeos auxiliares que expressam in trans as proteínas estruturais e
as necessárias para a etapa de transcrição. Com o auxílio da maquinaria
celular, os lentivírus produzem partículas virais contendo o shRNA, que se
acumulam no sobrenadante do meio de cultura. Este sobrenadante pode ser
então utilizado para a transdução das células de interesse, ou seja, as
células alvo para o silenciamento do gene.
No caso de shRNA, a seqüência inibidora do gene alvo é inserida no
vetor nas orientações 5´-3´ e 3´-5´, que por sua vez são separadas por um
espaçador referente à região formadora do grampo e uma região de
terminação do transcrito. Uma vez na célula de interesse, a seqüência
transcrita gera pequenos RNAs dupla fita em forma de grampo (shRNA) que,
após clivagem pela enzima DICER, originam transcritos de
aproximadamente 20 nucleotídeos com extremidades 3´ protrusivas. Estas
27
seqüências são reconhecidas pela maquinaria celular de RNAi, que inclui um
complexo com atividade nucleásica denominado RISC (RNA-induced
silencing Complex), que atuará na degradação do RNA mensageiro (RNAm)
correspondente ao gene alvo (PADDISON et al. 2002).
A utilização de lentivírus para a transdução e expressão em cultura de
células apresenta diversas vantagens em relação aos outros sistemas. A
utilização de plasmídeos não é tão eficiente quanto os sistemas virais,
principalmente em se tratando de culturas primárias. Como resultado,
somado à maior dificuldade de integração da seqüência exógeno no genoma
da célula hospedeira, a seleção de clones estáveis é mais laboriosa. Dentre
as vantagens em relação à outros sistemas virais, destaca-se a capacidade
dos lentivírus de infectar tanto células em divisão quanto células
quiescentes, diferentemente dos sistemas retrovirais conhecidos (NALDINI
et al. 1998). Em adição, este sistema permite a expressão em longo prazo
do gene de interesse, o que não é obtido com os sistemas adenovirais
(DULL et al. 1998).
28
Legenda: A seqüência inibitória inserida no genoma da célula alvo (azul mais escuro)
codifica um shRNA, ao mesmo tempo que o RNAm alvo é normalmente produzido no
núcleo. Uma vez no citoplasma, o shRNA é reconhecido pela enzima DICER, que através
de sua função RNásica, processa o shRNA deixando apenas a seqüência dupla-fita com
extremidades protuberantes. Este RNA dupla-fita é reconhecido pelo complexo RISC, que
participa do reconhecimento e clivagem do RNAm. A degradação do O RNAm é então
finalizada pela maquinaria celular, impedindo assim a tradução da proteína.
Figura 8 - Mecanismo de Silenciamento por RNA de interferência.
29
2 JUSTIFICATIVA
A incidência e mortalidade de melanoma têm aumentado em muitos
países e os maiores problemas em se lidar com este tumor são a sua alta
habilidade de formar metástases e resistência à terapias (MARKS 2000). Os
estudos para a identificação de genes possivelmente implicados no
desenvolvimento e na progressão do melanoma são de grande importância
a fim de contribuir para o entendimento da doença e conseqüentemente para
o desenvolvimento de novas estratégias diagnósticas ou terapêuticas.
O laboratório de Genômica Funcional da Fundação Antônio Prudente
é classicamente um laboratório de análise de expressão gênica de diferentes
tipos tumorais. Dentre as principais ferramentas utilizadas pelo grupo,
destaca-se a técnica de cDNA Microarray para análise da expressão gênica
global de amostras de tumores ou linhagens celulares. Atualmente, projetos
que abordam os aspectos funcionais e biologia destes tumores têm sido
criados com o objetivo principal de explorar os inúmeros dados gerados por
estas análises.
Recentemente, dois projetos de análise da expressão gênica em
melanomas e nevos foram concluídos. Os trabalhos foram realizados pelas
alunas Waleska Martins e Nair Muto e geraram listas de genes
diferencialmente expressos entre melanoma primário e metastático
(MARTINS 2007) e entre melanomas e nevos (MUTO 2007).
30
Especialmente nas listas geradas nas análises de MARTINS (2007),
observamos entre os genes diferencialmente expressos a presença de
Galectina-3. De acordo com estes dados, Gal-3 é mais expressa em
amostras de tumor primário quando comparado com metastático (Figura 9).
Legenda: A esquerda, ilustração da lâmina de cDNA Microarray utilizada. A direita, Box Plot
ilustrando as diferenças de expressão gênica entre tumores primários (verde) e metastáticos
(vermelho). Os valores representam o log
2
das amostras tumorais sobre a amostra
referência. Galectina-3 é mais expressa em melanomas primários versus metastático
(p=0.016).
Figura 9 - Análise do perfil de expressão gênica pela técnica de cDNA
Microarray.
Galectina-3 é uma proteína expressa por diversos tipos tumorais. Em
melanoma, poucos trabalhos já foram realizados sobre Gal-3. Embora a
expressão de Gal-3 e a correlação de acordo com a progressão do
melanoma já tenham sido demonstradas, os trabalhos divergem em pontos
importantes e assim são inconclusivos (VEREECKEN et al. 2005; PRIETO et
al. 2006).
31
Com o objetivo de validar os dados de expressão gênica de Gal-3 em
melanoma, nosso grupo realizou um experimento de Tissue Microarray para
Gal-3. Este estudo foi realizado pela aluna Waleska Martins em colaboração
com o grupo de Patologia Clínica do Hospital A.C. Camargo, antes de sair
na literatura o trabalho de PRIETO et al. (2006), já comentado
anteriormente.
A lâmina de Tissue Microarray utilizada para a análise de expressão
de Galectina-3 possui 111 amostras em duplicata, incluindo 72 tumores
primários (extensivos superficiais maiores do que 1 mm), 29 metástases (13
cutâneas, 8 linfonodais, 8 pulmonares) e 10 nevos compostos (DE SÁ 2005).
A Figura 10 ilustra os dados obtidos pelos experimentos de Tissue
Microarray. Galectina-3 apresentou expressão nuclear diminuída em lesões
metastáticas em relação às lesões primárias, embora esta diferença não
tenha sido estatisticamente significante (p=0,052). A freqüência de marcação
nuclear em lesões primárias e metastáticas foram, respectivamente, 47,5% e
27,6%. A marcação nuclear foi mais expressiva em melanomas primários de
menor espessura (1 à 2 mm) quando comparados aos do grupos de tumores
mais invasivos.
Em tumores primários, foi observada a correlação entre a espessura
do tumor e a expressão de Galectina-3 citoplasmática e essa
imunoreatividade apresentou significativa associação com índice de Breslow
(p=0,007). Galectina-3 apresentou marcação citoplásmica positiva em 13,6%
dos melanomas menos invasivos (T2) e 62,5% nos melanomas mais
invasivos (T4).
32
Legenda: A) Exemplo de marcação de Gal-3 em melanoma primário. B) Exemplo de
marcação de Gal-3 em melanoma metastático. C) Gráfico ilustrando a correlação
significativa entre o escore médio no citoplasma e o índice de Breslow. D) Gráfico ilustrando
a porcentagem dos diferentes tipos de amostras de tumor primário que expressam
Galectina-3 citoplasmática. Análise imunoistoquímica em Tissue Microarray mostrou que a
expressão de Gal-3 aumenta de acordo com o índice de Breslow nos melanomas primários
e diminui em metástases.
Figura 10 – Análise da expressão de Galectina-3 pela técnica de Tissue
Microarray.
33
Baseado nestes dados e na potencial importância de Galectina-3 na
progressão tumoral justifica-se o estudo da participação de Galectina-3 em
melanoma a fim de esclarecer a contribuição desta proteína nesta
malignidade.
34
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Inibir a expressão de Galectina-3 em linhagens de melanoma primário
e metastático e analisar as alterações fenotípicas em relação à
tumorigenicidade e malignidade.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Construir um sistema de inibição de Galectina-3 pela técnica de RNA
de interferência mediado por lentivírus, em células de melanoma;
• Analisar os efeitos biológicos resultantes da inibição de Galectina-3
por métodos in vitro e in vivo;
• Examinar a correlação entre a localização subcelular de Galectina-3 e
β-catenina em células de melanoma
• Investigar os possíveis mecanismos envolvidos nas mudanças
fenotípicas induzidas pelos silenciamento de Galectina-3
35
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 CULTURA DE CÉLULAS E ENSAIOS BIOLÓGICOS
O projeto foi devidamente apreciado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa (CEP) do Hospital A.C.Camargo em 26 de agosto de 2004, e
aprovado para a realização do estudo (n˚628/04).
Os ensaios in vivo foram realizados no Biotério do The Wistar Institute
of Pathology and Anatomy (Filadélfia, EUA) após aprovação do Institutional
Animal Care and Use Committee (IACUC) (Protocolo n˚111983),
responsável pelo programa que assegura a manutenção de cuidados, uso e
tratamento aceitável dos animais nos Estados Unidos.
4.1.1 Cultura de células de melanoma
A maioria das linhagens utilizadas neste trabalho são linhagens de
melanoma humano WM (Wistar Melanoma Collection - Coleção de
Melanoma do Instituto Wistar) de diversas fases de progressão do
melanoma. Algumas das linhagens WM foram cedidas pelo Laboratório da
Dra. Enilza Espreafico, da FMRP-USP (WM35, WM902, WM278, WM1617).
As outras linhagens WM utilizadas foram cedidas diretamente pelo
laboratório de Meenhard Herlyn durante o estágio da aluna no exterior
(WM793, 1205Lu, WM983A, WM983B). A linhagem melan-a (BENNET et
36
al.1987) (melanócito murino imortalizado) foi cedida pelo laboratório do Dr.
Roger Chammas.
Dentre as linhagens mais utilizadas, algumas formam pares de origem
comum. A linhagem 1205Lu foi isolada a partir de uma metástase em
pulmão gerada pela injeção de células WM793 em camundongos. As
linhagens WM983A e WM983B são originárias do mesmo paciente, tendo a
primeira sido isolada de um melanoma de crescimento vertical e a segunda
isolada de uma metástase linfonodal.
As linhagens WM foram cultivadas em meio Tu2% (Tumor 2%),
composto por MCDB153 (Sigma) e L15 (Invitrogen) na proporção 3:1,
suplementado com 2% de soro fetal bovino (FBS) (Cansera), insulina 5ug/ml
(Sigma) e CaCl
2
1,68mM (Sigma). As outras linhagens, quando utilizadas,
foram cultivadas em meio RPMI (Invitrogen) suplementado com 10% de
FBS.
Quadro 1 – Células melanocíticas separadas em melanócitos e melanomas
de diferentes fases de desenvolvimento.
Melanócitos
Fase de Crescimento
Radial
Fase de Crescimento
Vertical
Metástase
FOM173 WM35 WM278 WM1617
melan-a WM793 1205Lu
WM983A WM983B
WM902
4.1.2 Isolamento e cultura dos demais tipos celulares
Fibroblastos, queratinócitos e melanócitos foram isolados à partir de
amostras de remoção de prepúcio de recém nascidos (circuncisão).
37
Para o isolamento de melanócitos, fragmentos de amostras de
prepúcio (5X5mm) foram incubados em Dispase II (Neutral Protease Grade
II) (Boehriger Mannhein) por 18 a 20 horas à -80
0
C. Após este período, a
epiderme e a derme foram separadas utilizando-se uma pinça e a epiderme
foi transferida para uma placa de petri. À esta placa, foi adicionado Tripsina
0,0125% em Versene (Sigma-aldrich) e, com o auxílio de uma lâmina de
bisturi, os fragmentos foram picados o máximo possível. Finalmente, a
Tripsina foi neutralizada utilizando o inibidor de tripsina SoyBean Trypsin
Inhibitor (Invitrogen) e a suspensão celular foi transferida para um tubo de
15ml. Após centrifugação à 1500 RPM por 5 minutos, as células foram
ressuspendidas em 5 ml de meio 254CF (Cascade Biologicals) e cultivadas
em estufa à 37°C e 5% de CO
2
, ou armazenadas à 4
0
C em 254CF contendo
5% Dimetil Sulfóxido (DMSO) (Fisher Scientific).
Para a obtenção de queratinócitos, realizou-se o mesmo protocolo
detalhado no parágrafo anterior, porém com algumas alterações. Utilizou-se
Tripsina contendo 0,25% EDTA em Versene para a dissociação a epiderme
e meio Epilife (Cascade Biologicals) para a cultura dos queratinócitos
isolados.
Para o isolamento dos fibroblastos, a etapa de dissociação com
Dispase II foi novamente utilizada. Entretanto, a epiderme foi descartada (ou
utilizada para o isolamento de melanócitos ou queratinócitos) e a derme foi
digerida com Colagenase tipo IV 1mg/ml (Sigma-Aldrich) por 12 À 18 horas
à temperatura ambiente. Após este período, a suspensão celular foi
centrifugada por 5 minutos à 1500RPM e ressuspendida em meio DMEM
38
(CellGro) contendo 10% de FBS. As células foram mantidas em estufa à
37°C e 5% de CO
2
ou armazenadas à -80
0
C em FBS contendo 10% DMSO.
4.2 RNA DE INTERFERÊNCIA
4.2.1 Análise das seqüências de shRNA
A inibição de Galectina-3 foi realizada pela técnica de RNAi (RNA de
interferência). Vale destacar que, neste trabalho, quando refere-se a inibição
ou silenciamento de Gal-3, isto significa a inibição da tradução da proteína
Gal-3 devido a degradação do RNAm.
Para a inibição da expressão de Galectina-3, foi utilizado o sistema
Mission shRNA (Sigma-Aldrich), que disponibiliza 5 plasmídeos contendo
diferentes seqüências shRNA para serem testadas quanto a capacidade de
inibição da expressão de um gene específico.
Anteriormente ao uso destes plasmídeos, as seqüências que estes
codificam, foram analisadas quanto a presença de similaridades com outros
genes, a fim de prevenir os chamados efeitos off-target. As cinco seqüências
de shRNA para o silenciamento específico de LGALS3 (gene que codifica
Galectina-3) foram analisadas pelo programa Nucleotide Basic Local
Alignment Search Tool (BLASTn)
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Nucleotides&PROGRAM=blas
tn&MEGABLAST=on&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=Blas
tSearch&SHOW_DEFAULTS=on), sendo os parâmetros ajustados para
buscas de seqüências curtas, como sugerido pelo programa. Os 5 vetores
39
provenientes do fabricante e contendo as seqüências estão listados abaixo.
Em negrito, as seqüências específicas para LGALS3.
1)TRCN0000029304:
CCGGGC
TCACTTGTTGCAGTACAATCTCGAGATTGTACTGCAACAAGTGAGCTTTTT
Identidade do clone: NM_002306.1-664s1c1
2)TRCN0000029305:
CCGGGC
CCACGCTTCAATGAGAACAACTCGAGTTGTTCTCATTGAAGCGTGGGTTTTT
Identidade do clone: NM_002306.1-498s1c1
3)TRCN0000029306:
CCGGGC
AAACAGAATTGCTTTAGATCTCGAGATCTAAAGCAATTCTGTTTGCTTTTT
Identidade do clone: NM_002306.1-442s1c1
4)TRCN0000029307:
CCGGGC
AGTACAATCATCGGGTTAACTCGAGTTAACCCGATGATTGTACTGCTTTTT
Identidade do clone: NM_002306.1-675s1c1
5)TRCN0000029308:
CCGGGC
AATACAAAGCTGGATAATACTCGAGTATTATCCAGCTTTGTATTGCTTTTT
Identidade do clone: NM_002306.1-536s1c1
4.2.2 Produção das partículas lentivirais
Para a produção dos lentivírus contendo os shRNA de interesse, foi
primeiramente feita a preparação plasmidial. Colônias bacterianas (E. coli)
contendo o plasmídeo foram crescidas em meio Luria Bertani (LB) (CellGro)
com 0,1 mg/ml de ampicilina (CellGro) por 12 horas e o protocolo de
extração de DNA foi realizado segundo recomendações do fabricante
(Qiagen). Foram também preparados os plasmídeos auxiliares necessários
40
para empacotamento do lentivírus, pCMV-VSVg (ENV) e pCMV-∆R8.2
(GAG-POL), e o vetor vazio controle, pLKO.1 (Sigma-Aldrich).
Para a produção das partículas virais, células HEK293T (ATCC
n°CRL-11268) foram semeadas em placas de cultura de 100mm e
cultivadas em DMEM 10% FBS com 25 mM HEPES (Fisher Scientific) até
atingirem 60% de confluência. Um total de 8µg de DNA plasmidial (1µg de
pCMV-VSVg, 3µg de pCMV-∆R8.2 e 4µg de shRNAGal-3 – clones 1-5 ou
pLKO.1 vazio) foi adicionado à um coquetel contendo 20µl de Lipofectamina
2000 (Invitrogen) em meio Optimen (Invitrogen). Este coquetel foi adicionado
às células cultivadas com 5ml de meio DMEM 10% FBS com 25 mM HEPES
por 4 horas à 37°C e 5% de CO
2
. Após este intervalo, foram adicionados 5
ml de meio fresco e a incubação foi mantida por mais 12-18 horas nas
mesmas condições. O sobrenadante contendo as partículas lentivirais foi
então coletado e centrifugado a 2000 RPM por 10 minutos. Um novo meio
foi adicionado e o mesmo procedimento foi realizado após 24 e 48 horas.
Alíquotas de 2ml de sobrenadante, referentes aos dias 1, 2 e 3, foram
estocadas à -80
0
C até o uso.
4.2.3 Transdução de células de melanoma
Para a transdução das células alvo, sete placas de cultura de 100mm
foram semeadas com células de melanoma em aproximadamente 60% de
confluência (5 placas para shRNAGal-3, clones 1 À 5; 1 placa para pLKO.1;
1 placa sem transfecção para o controle de seleção com puromicina). No dia
seguinte, as células foram lavadas com tampão HBSS (Invitrogen) e 7 ml de
41
meio Tu2% foi adicionado. Uma alíquota do estoque de cada vetor lentiviral
contendo as seqüências alvo para Gal-3 (sobrenadante coletado no passo
anterior) foi descongelada e adicionada cuidadosamente sobre as células,
juntamente com 8 µg/ml de Polybrene (hexadimethrine bromide) (Sigma-
Aldrich). As células foram mantidas em estufa à 37°C e 5% de CO
2
por 12-
18 horas. A transdução foi interrompida pela substituição do meio contendo
os lentivírus por um novo meio Tu2% fresco.
Após 2 ou 3 dias, iniciou-se a seleção em meio Tu2% contendo
2µg/ml de puromicina (Sigma-Aldrich). Quando não foi mais possível
observar células vivas na placa controle (não transduzida), a seleção foi
interrompida com a substituição do meio por Tu2% sem antibiótico. Após a
seleção, as células foram congeladas em FBS contendo 10% DMSO. Por
precaução, as células foram freqüentemente re-selecionadas após períodos
extensos em cultura.
4.3 ENSAIOS FUNCIONAIS
4.3.1 Análise de Proliferação Celular (MTT)
O ensaio de MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide] é baseado na habilidade de uma desidrogenase mitocondrial em
clivar os anéis tetrazolium do corante MTT, resultando na formação de
cristais azuis. Estes cristais formazan são impermeáveis à membrana
plasmática e, desta forma, se acumulam no interior de células viáveis. A
adição de DMSO solubiliza as células, resultando na liberação dos cristais e,
42
conseqüentemente, na coloração azul. O número de células viáveis é
diretamente proporcional aos níveis de cristais azuis formados, sendo que a
coloração pode ser medida utilizando um espectrofotômetro para placas de
96 poços (MOSMANN 1983).
Para a realização do ensaio de incorporação de MTT, as células
WM793 e 1205Lu, controle e shGal-3, foram semeadas em placas de 96
poços (1.500 células por poço) e uma estimativa do número de células foi
medida durante o período de 5 à 6 dias. Para tal, 10% de MTT (5mg/ml)
(Sigma-Aldrich) foram adicionados à cada poço. A placa foi incubada por 3
horas em estufa à 37°C e 5% de CO
2
. O meio contendo MTT foi removido e
substituído por 100µl de DMSO. Após 10 minutos à 37°C, medições da
coloração gerada foram analisadas em espectrofotômetro à 490nm (Biorad).
Os gráficos e análises estatísticas foram realizadas pelo programa
GraphPad Prism 4.0.
4.3.2 Ensaio de Crescimento Independente de ancoragem
O protocolo para o ensaio de crescimento independente de
ancoragem foi adaptado do protocolo do laboratório da Dra. Mina Bissel,
pesquisadora da Universidade da California, em Berkeley.
Em placas de 6 poços, foi semeado 1 ml de uma solução acelular
contendo ágar (Difco-grau de eletroforese) 0,5% em meio Tu2%. Após
contagem, 5.000 células foram misturadas em 1ml de uma solução de ágar
0,35% em Tu2% e semeadas sobre a camada acelular. Após solidificação
da camada celular, foi adicionado 1ml de meio Tu2%. O meio foi trocado a
43
cada 2 dias por meio fresco. Após aproximadamente 30 dias, as placas
foram coradas com uma solução de Violeta de Genciana (0,05% em PBS
1X) por duas horas à temperatura ambiente, e descoradas com uma solução
de 5% ácido acético, 20% Metanol em PBS 1X em três lavagens de 10
minutos cada. O ensaio foi realizado em replicas de 5 experimentos
individuais.
Para a quantificação de colônias no ensaio de Soft Agar, os poços
foram demarcados em 16 regiões e as colônias foram contadas em uma
área visível sobre a Objetiva 10X em microscópio óptico. Opcionalmente, o
cálculo do número de colônias foi realizado pelo programa ImagePro 6.2.
Nesta abordagem, assumiu-se um valor mínimo de 100µm para o diâmetro
mínimo das colônias. A média dos valores obtidos nas réplicas foi então
utilizada para determinar o número médio de colônias por linhagem celular e
um gráfico foi gerado com o auxílio do programa GraphPad Prism 4.0.
4.3.3 Ensaio de Migração Celular por Cicatrização
Células foram semeadas em placas de cultura de 6 poços em 90-95%
de confluência (aproximadamente 250.000 células por poço). Através de
uma incisão longitudinal com o auxílio de uma ponteira de pipeta
automática, foram removidas 2 ou 3 fileiras paralelas de células na placa de
cultura. Os ensaios foram realizados em meio Tu2% e meio Tu0%.
As células foram incubadas em estufa à 37°C e 5% de CO
2
e
medições foram realizadas nos momentos 0, 12, 24 e 48 horas. A migração
foi quantificada em réplicas (4 à 6 réplicas por célula e condição).
44
Para a avaliação da migração, foram realizadas 4 medidas da
distância entre as duas extremidades da cicatriz nos tempos 0 e 12 horas.
As medições foram realizadas com o auxílio do programa ImagePro 6.2.
Estas medidas foram utilizadas para o cálculo da média de migração por
cicatriz pelo programa GraphPad Prism 4.0.
4.3.4 Ensaio de Invasão Tumoral
Anteriormente ao ensaio de Invasão Tumoral, as células de
melanoma foram transduzidas com o vetor hx-GFP e as células verde-
fluorescentes foram submetidas a Separação de Células por Fluorescência
(FACS) (etapa realizada na The Wistar Institute Flow Cytometry Facility). A
fluorescência de 100% das células foi confirmada em microscópio invertido
de fluorescência.
Para a produção de esferóides, placas de 96 poços foram preparadas
previamente com 100µl de Ágar (DIFCO) 1,5% em PBS 1X, previamente
esterilizado em autoclave. As células de melanoma (5.000 células por poço)
foram semeadas nestas condições de não-adesão e cultivadas em meio
Tu2% à 37°C e 5% de CO
2.
Após aproximadamente 72 horas, as células de
um poço se agruparam formando os esferóides, que foram coletados.
Para a cultura tridimensional, preparou-se a mistura acelular
composta por 1% de FBS em 1X EMEM (Lonza Walkersville), 200mM de L-
Glutamina (Invitrogen), 7,5% de NaHCO
3
(Cambrex)) e 0,78-1,01mg/ml de
Colágeno I bovino (Organogenesis). Para a formação da camada acelular,
300µl desta mistura foram adicionados às placas de 24 poços. Os esferóides
45
foram então adicionados ao restante da mistura e semeados sobre a
camada acelular. Foram adicionados 1,3ml de meio Tu2% e as células
mantidas à 37°C e 5% de CO
2.
Foram registradas fotos no tempo zero, 24, 48 e 72 horas, as quais
foram utilizadas para quantificar a invasão das células na matriz de
Colágeno I.
Para a quantificação da invasão, a medida da distância do ponto 0
(core) até a extremidade da célula invadindo o Colágeno foi realizada em 20
pontos randomicamente escolhidos em cada esferóide. As medições foram
realizadas pelo programa ImagePro 6.2. Um total de 4-5 esferóide foi
analisado por tipo celular e a média foi colocada em um gráfico utilizando o
programa GraphPad Prism 4.0.
4.3.5 Análise de Tumorigenicidade em Camundongos
Imunodeficientes
Para a análise da tumorigenicidade das linhagens silenciadas para
Galectina-3, foram utilizados camundongos NOD/SCID (Non Obese
Diabetic/Severe Combined Immunodeficient).
Camundongos NOD/SCID são resultantes do retrocruzamento de
camundongos SCID com a linhagem NOD/LtSz. Os camungondos SCID são
homozigotos para a mutação no gene SCID, que causa ineficiência no
rearranjo do DNA, prevenindo assim o rearranjo de imunoglobulinas e genes
de receptores de linfócitos T. O resultado é a deficiência de linfócitos B e T,
mantendo, porém, uma imunidade residual devido à presença de células
46
citotóxicas naturais, sistema complemento funcional e células mielóides. O
retrocruzamento com a linhagem NOD rendeu a este modelo uma menor
imunidade residual, uma vez que os camundongos NOD apresentam defeito
no sistema complemento e na função de macrófagos (SHULTZ et al. 1995,
LAPIDOT et al. 1997).
Os camundongos, de aproximadamente 6 semanas, receberam
injeções subcutâneas de células de melanoma embebidas em matrigel na
proporção 1:1 no dorso direito (shGal-3) e esquerdo (pLKO.1). Para as
linhagens metastáticas, foram injetadas 1.000.000 células. Para as
linhagens de tumor primário, foram utilizadas 2.000.000 células.
A medição do crescimento tumoral foi realizada duas vezes por
semana, com o auxílio de um paquímetro. Foram realizadas duas medidas
perpendiculares do diâmetro do tumor e uma medida da altura. Estes
valores foram utilizados para o cálculo do volume tumoral.
4.4 ANÁLISES BIOQUÍMICAS
4.4.1 Western Blotting
Para a análise da expressão protéica, as células foram retiradas da
placa de cultura e centrifugadas à 1500 RPM por 5 minutos. Todas as
etapas subseqüentes foram realizadas à 4ºC. O precipitado celular foi
incubado em tampão de lise celular (50mM de TRIS pHc 7,5, 150mM NaCl,
5mM EDTA pH 8, 1% Triton 2µg/ml, 2µg/ml aprotinina, 1mM PMSF, 1µg/ml
Leucopeptina) por 15 minutos e centrifugado à 13000 RPM por 30 minutos.
47
A concentração de proteínas extraídas por amostra foi realizada com
o kit BioRad Protein Assay (BioRad) utilizando uma curva de BSA (Albumina
de soro bovino) com as concentrações 1; 2; 3; 4; 5;6;7;8;9 µg/µl.
Para a realização do Western Blotting, 30µg de amostra de cada
proteína foi submetida à SDS-PAGE em gel 10% ou gel gradiente 4-10% em
condições desnaturantes (Invitrogen). A separação das amostras foi
acompanhada com a utilização do marcador de peso molecular Rainbow
Low Range (Amershan Biosciences). Após a corrida, o aparato de
transferência foi montado utilizando uma membrana de PVDF Hybond P
(Amershan Biosciences) e submetido a uma corrente de 180-250mA em
câmara fria por 1 hora. A transferência foi confirmada corando-se a
membrana com o reagente de Ponceau (Sigma-Aldrich).
A membrana foi então lavada com TBS-T (0,1M TRIS-HCl; 0,4M
NaCl; 0,05% Tween) e incubada em solução de bloqueio (TBS-T contendo
5% de leite desnatado) por 1 hora. As incubações com os anticorpos
primários foram realizadas por 2 horas à temperatura ambiente ou por 12-16
horas a 4ºC. As membranas foram então lavadas com TBS-T e incubadas
com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase por 1 hora à
temperatura ambiente. A detecção foi realizada utilizando o kit ECL Western
(Amershan Biosciences). A lista dos anticorpos primários utilizados neste
trabalho se encontra no Quadro 2. Os anticorpos secundários (anti-
camundongo, anti-coelho e anti-rato conjugados com peroxidase) foram
adquiridos da Amershan Biosciences.
48
Quadro 2 - Lista de anticorpos primários utilizados e seus respectivos
fabricantes.
Anticorpo Tipo Fabricante
Anti- Galectina-3
M3138
Monoclonal Laboratório do Dr. Roger Chammas (FM-USP, São
Paulo, SP
Anti-AKT Policlonal Cell Signaling
Anti-FosfoAKT Policlonal Cell Signaling
Anti-CDK4 Policlonal Cell Signaling
Anti-p16/INK4a Monoclonal Santa Cruz Biotechnology
Anti-FosfoRb Monoclonal Cell Signaling
Anti-Rb Monoclonal Cell Signaling
Anti-Ciclina D1 Policlonal Santa Cruz Biotechnology
Anti-β-catenina Monoclonal BD Biosciences
Anti-BAD Policlonal Cell Signaling
Anti-BAX Policlonal Cell Signaling
Anti-Bcl-2 Policlonal Cell Signaling
Anti-BIM Policlonal Cell Signaling
Anti-p53 Monoclonal Calbiochem
Anti-HDM2 Monoclonal Santa Cruz Biotechnology
Anti-αTubulina Monoclonal Sigma-Aldrich
Anti-β-actina Monoclonal Sigma-Aldrich
Anti-c-jun Policlonal Santa Cruz Biotechnology
Anti-GSK3β
Policlonal Cell Signaling
Anti-pTEN Policlonal Cell Signaling
4.4.2 Imunofluorescência
Para a imunofluorescência, 20.000 células foram semeadas em
lamínulas estéreis colocadas em placas de 24 poços e, após 12 horas,
fixadas em Paraformaldeído 2% em PBS1X. As células foram então
permeabilizadas em Triton X-100 0,2% e bloqueadas em 10%BSA em
PBS1X. Cada lamínula foi incubada com os anticorpos primários Anti-Gal-3
M3138 (1:40) e β-catenina (1:20) em BSA1%/PBS1X por 12-16 horas a 4°C.
49
IgG de rato e camundongo (1:500) (Sigma-Adrich) foram utilizados como
controles dos anticorpos primários Gal-3 e β-catenina, respectivamente.
Após três lavagens, as lamínulas foram incubadas com 50µl da
mistura dos dois anticorpos secundários (Anti-rato conjugado com Alexa 448
e anti-camundongo conjugado com Alexa 568) (1:500) (Invitrogen). As
lamínulas foram lavadas novamente e transferidas para uma lâmina
contendo 10µl de reagente de montagem (Vector).
4.5 MICROSCOPIA
As imagens de contraste de fase foram obtidas no Microscópio
Invertido de Fluorescência Nikon TE2000. As imagens de fluorescência do
experimento de esferóides foram capturadas no mesmo microscópio. Os
ajustes das imagens capturadas foram realizadas utilizando o programa
ImagePro 6.2, mantendo a fidelidade ao resultado.
As imagens adquiridas pelo ensaio de imunofluorescência foram
capturadas no Microscópio Confocal LEICA TCS-SP2. As análises foram
realizadas utilizando o pacote de análises fornecido pelo fabricante.
O programa ImagePro 6.2 possui diversas ferramentas que
permitiram a análise e quantificação de resultados.
50
4.6 ESTATÍSTICA
Para comparação de variáveis contínuas, quando existiam apenas
dois grupos de comparação, foi empregado o teste t de Student não-
pareado ou Mann-Whitnney, de acordo com a distribuição dos valores das
variáveis (normal ou não).
Na avaliação da proliferação celular pelo método de MTT e das
curvas de crescimento tumoral, foi utilizado o teste de ANOVA ou Kruskal-
Wallis (dependendo da distribuição dos valores das variáveis), seguido do
teste de Tukey ou Dunn´s para comparações par à par entre os grupos
considerados.
Foram considerados valores estatisticamente significantes aqueles
com p<0,05. Os gráficos representativos dos resultados descritos e as
análises estatísticas foram realizados utilizando-se o programa GraphPad
Prism 4.0.
51
5 RESULTADOS
5.1 EXPRESSÃO DE GALECTINA-3 EM LINHAGENS DE
MELANOMA
O Instituto Wistar possui um banco de linhagens de melanoma, cujas
células foram isoladas pelo laboratório do Dr. Meenhard Herlyn. Uma das
principais ferramentas do laboratório é a modulação de genes de interesse,
como oncogenes e genes supressores de tumor em melanócitos e em
células de melanoma. Assim, o laboratório criou um painel com dados
relativos ao padrão da expressão gênica da maioria destas linhagens. A
análise foi realizada por técnicos do laboratório, utilizando o sistema de
Oligoarrays da Affymetrics (UI33A). Resumidamente, amostras de RNAm
das linhagens celulares foram hibridizadas nos Oligoarrays e os níveis de
RNAm representantes de um painel de genes humanos foi gerado. Estes
dados são disponibilizados aos membros do laboratório para uma análise
inicial de expressão de genes candidatos e para a escolha da célula alvo.
Os números representam a intensidade média da fluorescência obtida pela
hibridização na sonda representante deste gene, sendo o background
previamente subtraído e os Oligoarrays normalizados.
Estes dados foram utilizados para analisar a expressão de Gal-3
entre estas linhagens. Observando os dados do gráfico nota-se que Gal-3 é
expressa em todas as linhagens de melanoma listadas (Figura 11) e em
52
melanócitos e fibroblastos (dados não mostrados). Entretanto, a expressão
de Gal-3 mostrou grande variação entre as diferentes linhagens. Embora
dados da literatura indiquem que a expressão de Gal-3 se correlaciona com
a evolução do melanoma em amostras de tumor (VEERECKEN et al. 2005;
PRIETO et al. 2006), esta análise não mostrou a mesma correlação entre
linhagens celulares estabelecidas para cultura em laboratório.
Legenda: As células estão agrupadas conforme a fase de progressão de melanoma (RGP,
VGP e metástase). Os valores são referentes a intensidade de fluoresência extraída da
lâmina de Oligoarray. Os dados mostram que Galectina-3 é expressa em todas as células
analisadas.
Figura 11 - Dados brutos da expressão de Gal-3 em linhagens de
melanoma.
Foi então realizada análise da expressão protéica em diversas
linhagens melanocíticas, representantes de fases de progressão tumoral. A
linhagem melan-a representa um melanócito murino imortalizado. A
linhagem FF representa fibroblastos humanos isolados a partir de prepúcio.
Ambas melan-a e FF serviram como controle positivo de expressão de Gal-
3.
53
A análise demonstrou que Gal-3 está presente em todas as células
analisadas (Figura 12). Entretanto, novamente não foi encontrada correlação
entre as fases de progressão do tumor e a expressão de Galectina-3.
Legenda: Análise da expressão de Gal-3 por Western Blotting em linhagens de melanoma
humano. Melanócitos murinos MelanA (Mn) e Fibroblastos (FF) serviram como controle
positivo. A) Mw (metástase), WM35 (RGP), WM278 (VGP), WM902 (VGP), WM1617
(metástase). B) WM35 (RGP), WM793 (VGP), C8151 (metástase) e 1205Lu (metástase). A
expressão da proteína Gal-3 foi detectada em todas as linhagens analisadas.
Figura 12 – Análise da expressão de Gal-3 em linhagens de melanoma.
54
5.2 SILENCIAMENTO DE GALECTINA-3 EM LINHAGENS DE
MELANOMA PRIMÁRIO E METASTÁTICO
Anteriormente ao uso de shRNA para Gal-3 nas linhagens celulares,
as seqüências foram analisadas utilizando o programa BLASTn. Foi
observado que todas as cinco seqüências apresentam similaridade apenas
com o gene LGALS3 (NM_002306.2) e com a forma variante comumente
chamada de GALIG (NR_003225.1). A isoforma GALIG é codificada a partir
de um processamento alternativo do gene e pode também ser chamada de
LGALS3 isoforma 2 (GUITTAUT et al. 2001). Todos os shRNA são
direcionadas para seqüências dentro da região codificante das duas
isoformas do gene LSGAL3.
Os estudos de Gal-3 foram iniciados utilizando as linhagens WM793
(VGP) e 1205Lu (metástase). Primeiramente, foi realizada a transdução da
linhagem 1205Lu com os 5 vetores carregando as diferentes seqüências de
shRNA para Gal-3. Dois vetores mostraram os maiores níveis de inibição
sh1 e sh4 (dado não mostrado). Estes vetores e o vetor vazio foram então
utilizados para a transdução da linhagem WM793 (Figura 13A).
Outro par de linhagens de melanoma (VGP e metastático) foi
posteriormente utilizado para algumas validações dos dados obtidos com as
linhagens WM793 e 1205Lu. As linhagens WM983A e WM983B também são
originárias do mesmo paciente, sendo a primeira isolada de um melanoma
de crescimento vertical e a última originária de uma metástase linfonodal. O
silenciamento de Gal-3 obtido nestas linhagens, apenas com o sh4, estão
55
demonstrados na figura 13B. A maioria dos experimentos descritos a seguir
utilizou somente o vetor contendo a seqüência sh4.
Legenda: A) WM793 (VGP) e 1205Lu (metástase) transduzidas com os vetores shGal-3
sh1 e sh4. B) WM983A (VGP) e WM983B (metástase) transduzidas com o vetor sh4. As
linhagens transduzidas com o vetor vazio (pLKO.1) foram utilizadas como controle positivo
(C). A expressão de Gal-3 foi significantemente diminuída por RNAi.
Figura 13 - Inibição da expressão de Galectina-3 em células de melanoma.
56
5.3 ANÁLISE DAS LINHAGENS SILENCIADAS PARA
GALECTINA-3
5.3.1 Morfologia Celular
A observação de 1205Lu shRNAGal-3 ao microscópio ótico por
contraste de fase não indicou alterações morfológicas para as células
1205Lu shRNAGal-3 em relação as células controle (Figura 14A-D). As
células WM793 shRNAGal-3 apresentam um formato mais chato e com
menos espalhamento em relação ao controle. Outra diferença observada
para estas células foi na distribuição na placa. As células WM793
normalmente se distribuem e crescem de forma desordenada, geralmente
se agrupando em regiões da placa de cultura (Figura 14E,F).
Interessantemente, as células WM793 shGal-3 perdem esta característica
(Figura 14G,H).
57
Legenda: A,B) 1205Lu pLKO.1. C,D) 1205Lu shGal-3. E,F) WM793 pLKO.1. G,H) WM793
shGal-3. Aumentos de 4X (esquerda); 10X (direita). WM793 shGal-3 apresenta alteração na
morfologia celular.
Figura 14 - Morfologia de células de melanoma silenciadas para Gal-3
58
5.3.2 Proliferação Celular
O ensaio de MTT mede o número de células viáveis aderidas na
placa de cultura. Esta medição foi realizada nos tempos 0, 1, 3 e 5 dias.
Todas as linhagens celulares demonstraram crescimento, sendo a diferença
entre os dias zero e cinco significante (p<0,001). Para as células 1205Lu,
não foi observada diferença entre as células controle e as células
silenciadas para Gal-3 (p>0,05). Já as células WM793 controle cresceram
mais rapidamente do que as células WM793 shRNA Gal-3 (p<0,001) (Figura
15). Esta diferença é representada por dois experimentos independentes e é
estatisticamente significativa.
Legenda: Os gráficos mostram a incorporação de MTT pelas células selvagem e
silenciadas para Gal-3 (y) durante 5 dias (x). A) WM793 pLKO.1, WM793 Gal-3 (p<0,001).
B) 1205Lu pLKO.1, 1205Lu Gal-3 (p>0,05). Os resultados ilustram a média de 2
experimentos independentes. Para a análise estatística foi utilizado o teste de ANOVA
seguido do teste de Tukey, comparando-se os valores obtidos no dia 5. A comparação dos
valores dos dias 0 e 5 mostrou um crescimento significante para todas as linhagens
celulares (p<0,001). O silenciamento de Gal-3 influencia o crescimento de células de
melanoma WM793.
Figura 15 - Análise da proliferação celular pelo método de MTT.
59
5.3.3 Crescimento Independente de Ancoragem
O ensaio de Soft Agar mostrou que não há diferença no crescimento
independente de ancoragem para as células 1205Lu pLKO.1 e 1205Lu
shGal-3 (Figura 16B). Entretanto, há uma diferença estatisticamente
significante no número de colônias observada entre as células WM793
pLKO.1 e WM793 shGal-3 (p=0,0074) (Figura 16A).
É importante ressaltar que além da diferença numérica, observa-se
uma grande diferença no tamanho das colônias. As colônias formadas pelas
células WM793 pLKO.1 são notavelmente maiores do que as colônias
formadas pelas células WM793 shGal-3 (Figura 16C-D).
Legenda: Os gráficos ilustram as diferenças entre o número de colônias formadas pelas
diferentes linhagens. A) WM793 pLKO.1 e shGal-3 (p=0,0074). B) 1205Lu pLKO.1 e shGal-
3 (p>0,05). Para a análise estatística foi utilizado o teste t de student. Na parte inferior,
colônias formadas pelas diferentes linhagens. C) WM793 pLKO.1. D) WM793 shGal-3. E)
1205Lu pLKO.1. F) 1205Lu shGal-3. Aumento de 20X. Células WM793 shGal-3 formam
colônias menores, e em menor número, do que células controle.
Figura 16 - Ensaio de Crescimento independente de ancoragem de células
WM793 e 1205Lu.
60
Os ensaios de crescimento independente de ancoragem também
foram realizados com o outro par de linhagens de melanoma, WM983A e
WM983B. Os resultados obtidos são similares aos obtidos para as linhagens
WM793 e 1205Lu, porém não foi observada diferença no tamanho das
colônias (Figura 17).
Legenda: Os gráficos ilustram as diferenças entre o número de colônias formadas pelas
diferentes linhagens. A) WM983A pLKO.1 e shGal-3 (p=0,0145). B) WM983B pLKO.1 e
shGal-3 (p>0,05). Para a análise estatística foi utilizado o teste t de student. Células
WM983A shGal-3 formam menos colônias do que células controle.
Figura 17 - Ensaio de Crescimento independente de ancoragem de células
WM983A e WM983B.
5.3.4 Migração Celular
No ensaio de migração por cicatrização in vitro, células foram
removidas de uma cultura em monocamada (com o auxílio de uma ponteira
de pipeta automática) e a capacidade das células de migrar e cobrir
novamente a camada acelularizada foi analisada.
Para aumentar a possibilidade de observar diferenças entre os pares
de células, o ensaio foi realizado em condições normais (em meio Tu2%) e
em condições de deprivação de soro (em meio Tu0%).
61
Fotos foram registradas em 4 à 6 regiões diferentes da placa nos
tempos zero, 12, 24, 36 e 48 horas. Em 12 horas, já foi possível notar um
fechamento parcial da cicatriz devido a migração celular (Figuras 18,19).
Somente em aproximadamente 48 horas a cicatriz foi totalmente coberta por
células, provavelmente devido à migração em conjunto com proliferação
celular. As análises comparativas foram realizadas entre as fotos
representativas do tempo zero e 12 horas. Em nenhuma das condições foi
encontrada diferenças significativas no potencial de migração de células
pLKO.1 controle e as células silenciadas para Gal-3 (Figura 20).
62
Legenda: Em vermelho, as distâncias que foram medidas entre as duas extremidades da
cicatriz nos tempos 0 e 12 horas. O experimento foi realizado na presença (Tu2%) e
ausência (Tu0%) de soro. Aumento 10X. Não foram observadas diferenças no potencial de
migração das células WM793 silenciadas para Gal-3.
Figura 18 - Ensaio de Migração Celular com as células WM793 shGal-3 e
WM793 pLKO.1.
63
Legenda: Em vermelho, as distâncias que foram medidas entre as duas extremidades da
cicatriz nos tempos 0 e 12 horas. O experimento foi realizado na presença (Tu2%) e
ausência (Tu0%) de soro. Aumento 10X. Não foram observadas diferenças no potencial de
migração de células das células 1205Lu silenciadas para Gal-3.
Figura 19 - Ensaio de Migração Celular com as células 1205Lu shGal-3 e
1205Lu pLKO.1.
64
Legenda: A) WM793 pLKO.1 e WM793 shGal-3 em Tu0%. B) WM793 pLKO.1 e WM793
shGal-3 em Tu2%. C) 1205Lu pLKO.1 e 1205Lu shGal-3 em Tu0%. D) 1205Lu pLKO.1 e
1205Lu shGal-3 em Tu2%. Para a análise estatística foi utilizado o teste t de student. Não
foi observada uma diferença significativa entre as células controle e as silenciadas para
Gal-3.
Figura 20 - Quantificação da migração de células silenciadas para Gal-3 e
controle.
5.3.5 Invasão Tumoral
Esferóides compostos de células 1205Lu GFP e 1205Lu shGal-3, e
células WM793 GFP e WM793 shGal-3, foram embebidas em Colágeno I e
fotos foram registradas nos tempos 0, 12, 24, 48 e 72 horas. A figura 21
mostra os esferóides embebidos em Colágeno I por 24 horas.
A quantificação da invasão em Colágeno I e a análise estatística
mostrou que há uma diferença significativa no potencial de invasão entre as
células controle e silenciadas para Gal-3, tanto em WM793 quanto para
1205Lu. Esta diferença é maior entre as células WM793 GFP e WM793
shGal-3 (Figura 22).
65
Legenda: Esferóides embebidos em Colágeno I. A,B) 1205u GFP. C,D) 1205Lu-shGal-3.
E,F) WM793 GFP. G,H) WM793-shGal-3. Imagens adquiridas após 24 horas. Aumento 10X.
O silenciamento de Gal-3 inibe a capacidade de invasão de células de melanoma WM793 e
1205Lu.
Figura 21 - Ensaio de invasão tumoral.
66
Legenda: Gráficos ilustrando a quantificação da invasão das células de melanoma em
Colágeno I. Para a análise estatística foi utilizado o teste t de Student. A perda da
capacidade de invasão é estatisticamente significante.
Figura 22 - Diferença no potencial de invasão das células controles e as
silenciadas para Gal-3.
5.3.6 Crescimento Tumoral em camundongos imunodeficientes
A capacidade tumorigênica de linhagens celulares pôde ser analisada
pela capacidade destas células formarem tumores em camundongos. Assim,
as células WM793 e 1205Lu, controle e shGal-3, foram injetadas em
camundongos imunodeficientes (NOD/SCID) e o crescimento tumoral foi
acompanhado.
A comparação dos valores de volume tumoral obtidos após
aproximadamente 30 dias com os do dia 0 mostrou um crescimento tumoral
significante para todas as linhagens celulares (p<0,001), com exceção das
WM793 shGal-3 (p>0,05). As células WM793 shGal-3 demonstraram um
crescimento extremamente reduzido quando comparado ao crescimento
observado para as células controle WM793 pLKO.1 (p<0,01) (Figura 23A).
Não foi observada diferença entre o crescimento de 1205Lu pLKO.1 e
1205Lu shGal-3 (p>0,05) (Figura 23B).
67
Legenda: Os gráficos (esquerda) ilustram o crescimento tumoral (mm
3
) medido durante
aproximadamente 30 dias. A) WM793 pLKO.1 e shGal-3 (p<0,01). B) 1205Lu pLKO.1 e
shGal-3 (p>0,05). As células pLKO.1 e shGal-3 foram injetadas, respectivamente, nos
flancos esquerdo e direito dos camundongos (direita). Os resultados ilustram a média de 2
experimentos independentes. Para a análise estatística foi utilizado o teste de Kruskal
Wallis seguido do teste de Dunn’s, comparando os valores obtidos no último dia de medição
para as células controle e shGal-3. A comparação destes valores com os do dia 0 mostrou
um crescimento tumoral significante para todas as linhagens celulares (p<0,001), com
exceção das WM793 shGal-3 (p>0,05). O silenciamento de Gal-3 em camundongos
NOD/SCID diminui drasticamente o crescimento tumoral de WM793.
Figura 23 - Crescimento Tumoral das linhagens WM793 e 1205Lu
silenciadas para Gal-3 em camundongos NOD/SCID.
Para confirmar o resultado, o ensaio foi repetido com as linhagens
WM983A e WM983B silenciadas para Gal-3. Novamente observou-se uma
diferença significativa no crescimento tumoral apenas para a linhagem de
melanoma de crescimento vertical, WM983A (p<0,05) (Figura 24).
68
Legenda: Os gráficos ilustram o crescimento tumoral (mm
3
) medido durante
aproximadamente 35 dias. A) WM983A pLKO.1 e shGal-3 (p<0,05) ; B) WM983B pLKO.1 e
shGal-3 (p>0,05). Para a análise estatística foi utilizado o teste de Kruskal Wallis seguido do
teste de Dunn’s, comparando os valores obtidos no último dia de medição para as células
controle e shGal-3. A comparação destes valores com os do dia 0 mostrou um crescimento
tumoral significante para todas as linhagens celulares (p<0,001). O silenciamento de Gal-3
em camundongos NOD/SCID diminui o crescimento tumoral de WM983A.
Figura 24 - Crescimento Tumoral de linhagens WM983A e WM983B
silenciadas para Gal-3 em camundongos NOD/SCID.
5.4 ELUCIDAÇÃO DOS MECANISMOS REGULADOS PELA
PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE GALECTINA-3
5.4.1 Proteínas ligadas à p53 e ao mecanismo de apoptose
Para melhor entender o mecanismo envolvido no fenótipo observado
para as células com depleção de Galectina-3, análises de expressão e
fosforilação de proteínas importantes em certos processos celulares foram
realizadas.
Sendo apoptose uma das funções melhores descritas para Galectina-
3, foi investigado o perfil de algumas proteínas envolvidas neste tipo de
morte celular programada.
69
A figura 25 mostra que a ativação de AKT, medida pela fosforilação
desta proteína na serina localizada na posição 473, é diminuída em células
silenciadas para Gal-3 (Figura 25A). De acordo com este dado, a expressão
de PTEN e p53 demonstra estar aumentada nas células shGal-3, tanto
WM793 como 1205Lu (Figura 25A,B). Não foram observadas diferenças de
expressão de HDM2 (Figura 25C). Expressão de proteínas pró-apoptóticas
(BAD, BAX), entretanto, encontram-se aumentadas apenas nas linhagens
WM793 shGal-3 quando comparadas ao controle pLKO.1. As células 1205Lu
shGal-3, porém, apresentam aumento de outra proteína pró-apoptótica, BIM
(Figura 25D). Embora não haja diferença da expressão de Bcl-2 entre as
células WM793 pLKO.1 e shGal-3, há um aumento da expressão desta
proteína em células 1205Lu shGal-3 (Figura 25A).
70
Legenda: A expressão de determinadas proteínas foi analisada por Western Blotting. A
expressão de β-actina foi utilizada como normalizadora. A inibição de Gal-3 altera a
expressão de p53 e proteínas relacionadas à apoptose.
Figura 25 - Análise da expressão de proteínas relacionadas à p53 e ao
mecanismo de apoptose em células silenciadas para Galectina-3.
5.4.2 Proteínas da via de p16/Rb
Outra via importante que poderia contribuir para o fenótipo observado
nas células WM793 shGal-3 é a de p16/Rb. De fato, análise de expressão
por western blotting revelou que a expressão de p16 é maior em células
71
WM793 shGal-3 comparado ao controle (Figura 26A). Adicionalmente,
diminuições na expressão de CDK4 e ciclina D1, assim como na fosforilação
da proteína Rb foram observados nestas células (Figura 26B,C).
Legenda: A expressão de determinadas proteínas foi analisada por Western Blotting. A
expressão de β-actina foi utilizada como normalizadora. A inibição de Gal-3 altera a
expressão de proteínas importantes na via de p16/Rb.
Figura 26 - Análise da expressão de membros da via p16/Rb em células
silenciadas para Galectina-3.
72
5.4.3 Proteínas da via Wnt/β−catenina
As análises da localização subcelular de Galectina-3 foram realizadas
pela marcação destas células por imunofluorescência e análise por
microscopia confocal.
Galectina-3 foi observada em diferentes compartimentos celulares
dependendo do tipo celular. Melanócitos isolados à partir de prepúcio
(FOM173) (Figura 27) e células de melanoma de crescimento radial (WM35)
(Figura 28) apresentaram Gal-3 apenas no citoplasma. Células de
melanoma de crescimento vertical (WM278, WM983A, WM793) (Figuras 29,
30) e metastáticas (WM1617, WM983B, 1205Lu) (Figuras 31, 32), por outro
lado, apresentaram Gal-3 distribuída pelo citoplasma e núcleo.
β-catenina foi observada no citoplasma e núcleo de todas as células
estudadas. É importante ressaltar que as células que não possuem Gal-3
nuclear como, por exemplo, FOM173 e WM35, mesmo assim apresentaram
marcação nuclear de β-catenina (Figuras 27, 28). Este dado indica que,
diferente do sugerido para células de câncer de mama (SHIMURA et al.
2004), β-catenina pode translocar para o núcleo de maneira independente
de Gal-3.
Nas células silenciadas para Gal-3, é possível observar algumas
células com marcação de β-catenina diminuída (Figuras 33, 34). Enquanto
que nas células selvagem, a marcação forte de β-catenina no núcleo é
praticamente unânime, algumas células silenciadas para Gal-3
apresentaram marcação mais intensa no núcleo em relação ao citoplasma.
73
Entretanto, não foi feita nenhuma quantificação de número de células
marcadas ou intensidade para obter dados mais objetivos.
Mais uma vez, foi confirmado que a ausência de Galectina-3 não
impede β-catenina de se localizar no núcleo, pelo menos nas células de
melanoma utilizadas.
74
Legenda: Melanócitos foram marcados com anticorpos conjugados a fluorocromos e
analisados por microscopia confocal. A,B) Marcação de Galectina-3. C,D) Marcação de β-
catenina. E,F) Sobreposição das duas imagens. Aumento 100X. Melanócitos apresentam
marcação citoplasmática para Gal-3 e nuclear e citoplasmática para β-catenina.
Figura 27 - Localização Subcelular de Galectina-3 e β-catenina em
melanócitos.
75
Legenda: Células WM35 foram marcadas com anticorpos conjugados a fluorocromos e
analisadas por microscopia confocal. A,B) Marcação de Galectina-3. C,D) Marcação de β-
catenina. E,F) Sobreposição das duas imagens. Aumento 200X. Células de melanoma de
crescimento radial WM35 apresentam marcação para Gal-3 no citoplasma e para β-catenina
no citoplasma e núcleo.
Figura 28 - Localização Subcelular de Galectina-3 e β-catenina em células
de WM35.
76
Legenda: Células WM793 foram marcadas com anticorpos conjugados a fluorocromos e
analisadas por microscopia confocal. A,B) Marcação de Galectina-3. C,D) Marcação de β-
catenina. E,F) Sobreposição das duas imagens. Aumento 200X. Células de melanoma de
crescimento vertical WM793 apresentam marcação para Gal-3 e β-catenina no citoplasma e
núcleo.
Figura 29 - Localização Subcelular de Galectina-3 e β-catenina em células
WM793.
77
Legenda: As células (WM278 À esquerda e WM983A À direita) foram marcadas com
anticorpos conjugados a fluorocromos e analisadas por microscopia confocal. A,B)
Marcação de Galectina-3. C,D) Marcação de β-catenina. E,F) Sobreposição das duas
imagens. Aumento 200X. Células de melanoma de crescimento vertical WM278 e WM983A
apresentam marcação para Gal-3 e β-catenina no citoplasma e núcleo.
Figura 30 - Localização Subcelular de Galectina-3 e β-catenina em células
WM278 e WM983.
78
Legenda: Células 1205Lu foram marcadas com anticorpos conjugados a fluorocromos e
analisadas por microscopia confocal. A,B) Marcação de Galectina-3. C,D) Marcação de β-
catenina. E,F) Sobreposição das duas imagens. Aumento 200X. Células de melanoma
metastático 1205Lu apresentam marcação para Gal-3 e β-catenina no citoplasma e núcleo.
Figura 31 - Localização Subcelular de Galectina-3 e β-catenina em células
de 1205Lu.
79
Legenda: As células (WM1617 À esquerda e WM983B À direita) foram marcadas com
anticorpos conjugados a fluorocromos e analisadas por microscopia confocal. A, B)
Marcação de Galectina-3. C,D) Marcação de β-catenina. E,F) Sobreposição das duas
imagens. Aumento 200X. Células de melanoma metastático WM1617 e WM983B
apresentam marcação para Gal-3 e β-catenina no citoplasma e núcleo.
Figura 32 - Localização Subcelular de Galectina-3 e β-catenina em células
WM1617 e WM983B.
80
Legenda: Células WM793 shGal-3 foram marcadas com anticorpos conjugados a
fluorocromos e analisadas por microscopia confocal. A,B) Marcação de Galectina-3. C,D)
Marcação de β-catenina. E,F) Sobreposição das duas imagens. Aumento 200X. O
silenciamento de Gal-3 diminui porem não impede a localização nuclear de β-catenina em
células WM793.
Figura 33 - Localização Subcelular de Galectina-3 e β-catenina em células
de melanoma WM793 shGal-3.
81
Legenda: Células 1205Lu shGal-3 foram marcadas com anticorpos conjugados a
fluorocromos e analisadas por microscopia confocal. A,B) Marcação de Galectina-3. C,D)
Marcação de β-catenina. E,F) Sobreposição das duas imagens. Aumento 200X. O
silenciamento de Gal-3 diminui porem não impede a localização nuclear de β-catenina em
células 1205Lu.
Figura 34 - Localização Subcelular de Galectina-3 e β-catenina em células
de melanoma 1205Lu shGal-3.
82
A análise da expressão de β-catenina, c-Jun e Ciclina D1 foi então
analisada por western blotting e demonstrou que, em células WM793, há um
aumento na expressão de β-catenina e uma diminuição na expressão de C-
jun e Ciclina D1.
Legenda: A expressão de determinadas proteínas foi analisada por Western Blotting. A
expressão de β-actina foi utilizada como normalizadora. A inibição de Gal-3 altera a
expressão de β-catenina e proteínas alvo da via Wnt/β-catenina.
Figura 35 - Análise da expressão de componentes da via Wnt/β−catenina
em células silenciadas para Gal-3.
83
6 DISCUSSÃO
6.1 A EXPRESSÃO DE GALECTINA-3 EM MELANOMA
Os estudos de cDNA Microarray realizados previamente por nosso
grupo mostraram que Galectina-3 é mais expressa em tumores primários
quando comparado a metastáticos (MARTINS 2007) (Figura 9). Estes dados
foram elegantemente validados por imunoistoquímica, utilizando uma
plataforma de Tissue Microarray com amostras de melanoma cutâneos
extensivos superficiais (DE SÁ 2005). De acordo com estes dados, a
expressão citoplasmática de Galectina-3 correlaciona com o índice de
Breslow, isto é, com o padrão invasivo da lesão. A mesma correlação não foi
encontrada para a distribuição nuclear de Galectina-3 nas amostras de
melanoma (MARTINS 2007) (Figura 10).
A fim de explorar a importância do padrão de expressão de Galectina-
3 em melanoma, nosso objetivo foi iniciar um estudo funcional utilizando
como modelo linhagens de células de melanoma de diferentes fases de
progressão tumoral: melanoma de crescimento radial (RGP), melanoma de
crescimento vertical (VGP), melanoma metastático.
Primeiramente, diversas linhagens foram analisadas quanto à
expressão de Galectina-3. Em uma abordagem mais indireta, foi feito um
levantamento dos níveis de expressão de Gal-3 no banco de dados de
expressão em células de melanoma mantido pelo laboratório do Dr.
84
Meenhard Herlyn (Instituto Wistar). Entretanto, de acordo com estes dados,
não foram observadas diferenças significativas nos níveis de RNA
mensageiro de Gal-3 em linhagens de melanoma de crescimento radial, de
crescimento vertical e em linhagens metastáticas (Figura 11).
Embora este resultado não confirme os resultados do cDNA
Microarray e do Tissue Microarray, a expressão protéica de Galectina-3 foi
analisada por western blotting. Novamente, não foi observada uma
correlação entre os níveis de expressão de Gal-3 e as fases de progressão
do melanoma (Figura 12).
Linhagens celulares são geralmente estabelecidas à partir de tecidos
procedentes de cirurgías de excisão ou biópsias. Assim, seria esperado que
as análises de expressão de Gal-3 em linhagens de melanoma fossem
similares às obtidas para amostras de melanoma. Entretanto, alguns estudos
indicam que linhagens celulares nem sempre representam fielmente o tumor
de onde são provenientes.
Inconsistências como, por exemplo, na freqüência de mutações,
indicam que células em cultura por longos períodos de tempo podem perder
parte das similaridades em relação aos tumores. Mutações em p16/INK4a,
por exemplo, são encontradas em aproximadamente 36% de amostras de
melanoma nunca submetidas à cultura. Por outro lado, p16 encontra-se
mutado em cerca de 70% das linhagens de melanoma estabelecidas. Outros
genes seguem o mesmo padrão, indicando que tal inconsistência pode ser
explicada, em parte, pelo acúmulo de mutações em linhagens mantidas em
cultura por períodos extensos (PIEPKORN 2000).
85
Células em cultura podem apresentrar diferenças em relação à célula
quando no tecido original que pode não ser resultado de uma alteração
genética. Melanócitos cultivados in vitro, por exemplo, perdem parte dos
prolongamentos (observações pessoais) e expressam um padrão de
moléculas de superfície característico de células de melanoma.
Interessantemente, este padrão é revertido ao normal de melanócitos
quando estes são cultivados em conjunto com queratinócitos (VALYI-NAGY
et al. 1993). Tal fato indica que diferenças observadas entre linhagens
celulares e amostras tumorais podem também ser resultantes do fato dos
sistemas in vitro, na sua maioria, não considerarem fatores estromais e do
microambiente tumoral. Tais fatores são conhecidos por influenciar o
fenótipo tumoral e vem cada vez mais sendo considerados nos estudos de
melanoma e outros tumores.
Entretanto, os estudos com linhagens em cultura podem oferecer
respostas importantes para o entendimento de uma característica ou mesmo
de uma patologia e são ferramenta essencial de estudos funcionais que
exploram a modulação de expressão gênica in vitro. Estes modelos, todavia,
devem ser utilizados com cautela e fica clara a importância de complementar
os estudos com experimentos que considerem os fatores do microambiente,
como experimentos in vivo e análises de amostras de pacientes.
Os dados de MARTINS (2007) mostram a expressão diferencial
significativa entre melanoams primários e metastáticos. Em adição, estes
dados foram validados por imunoistoquímica em amostras de pacientes. A
falta de consistência encontrada na expressão de Gal-3 em linhagens
86
tumorais nos levou a utilizar mais de uma linhagem de melanoma nos
estudos subseqüentes a fim de evitar efeitos linhagem-específicos, isto é,
que não representariam o melanoma no geral. Desta forma, além de serem
escolhidas uma linhagem de crescimento vertical e uma metastática para os
estudos funcionais, a maioria dos experimentos, incluindo o in vivo, foi
repetida com outro par de linhagens.
Finalmente, vale à pena ressaltar que vários estudos apontam para a
importância de Gal-3 em tumores não estar resumida à expressão gênica ou
protéica, mas sim a localização subcelular de Gal-3 (VAN DEN BRULE et al.
2000; CALIFICE et al. 2004). Estes dados nos levaram a prosseguir com os
estudos no intuito de elucidar a importância de Gal-3 em melanoma e
contribuir para o entendimento das funções desta proteína nesta
malignidade.
6.2 O EFEITO DA INIBIÇÃO DA EXPRESSÃO DE GALECTINA-3
NO FENÓTIPO DE CÉLULAS DE MELANOMA
A fim de compreender a importância da relação dos níveis de
expressão de Gal-3 com a progressão tumoral, um sistema de inibição de
Gal-3 em células de melanoma foi desenvolvido utilizando a tecnologia de
RNA de interferência (RNAi).
Para a entrega das seqüências de RNAi no interior das células, foram
utilizados vetores lentivirais carregando seqüências shGal-3 (shRNA
específico para Gal-3) ou as seqüências controle. A escolha de utilização de
87
lentivírus como vetor de entrega das seqüências shRNA na célula alvo se
deu principalmente pela alta eficiência da transdução combinada a facilidade
de inserção no genoma da célula alvo (PADDISON et al. 2002).
Assim, o estudo iniciou-se com cinco vetores, fornecidos pelo
fabricante, carregando seqüências distintas de shGal-3. Primeiramente, as
seqüências foram analisadas utilizando o programa BLASTn e observou-se
que estas são específicas para a região codificante do gene Gal-3
(NM_002306.2) e de sua forma alternativa Galig (NR_003225.1). Desta
forma, elimina-se a possibilidade da existência de efeitos off-target, isto é,
efeitos resultantes de inibição de outros genes, em conjunto ou não com o
gene alvo, que podem alterar as características da linhagem celular e assim,
contribuir para a alteração fenotípica da célula.
Uma segunda preocupação na utilização de estratégias de shRNA,
especialmente utilizando vetores lentivirais, é a capacidade de inserção não
direcionada no genoma da célula alvo. Este tipo de inserção é, na verdade,
tida como uma desvantagem da utilização de vetores lentivirais (PADDISON
et al. 2002). A utilização de linhagens transduzidas com o vetor vazio como
controle é de grande utilidade nestes sistemas, pois considera os efeitos que
as linhagens podem sofrer quando modificadas com a inserção não
direcionada de DNA exógeno em seu genoma. Desta forma, utilizou-se a
linhagem celular transduzida com o vetor vazio (pLKO.1) como controle.
Alguns experimentos foram, porém, repetidos com a linhagem selvagem.
Como não foi observada nenhuma alteração entre as células selvagens e
88
pLKO.1, os experimentos foram padronizados com a utilização do controle
com o vetor vazio (dados não mostrados).
As seqüências de shGal-3 foram testadas quanto à eficiência de
inibição da proteína. Embora a análise da expressão de Gal-3 tenha sido
realizada em diversas linhagens de melanoma, duas linhagens foram
escolhidas para o prosseguimento do estudo: WM793 e 1205Lu. A escolha
deste par se deu devido, principalmente, a origem comum das linhagens. A
linhagem 1205Lu foi isolada a partir de uma metástase em pulmão gerada
pela injeção de células WM793 em camundongos.
Ao final do estudo, alguns experimentos foram repetidos com outro
par de linhagens: WM983A e WM983B. Estas duas linhagens são originárias
do mesmo paciente, tendo a primeira sido isolada de um melanoma de
crescimento vertical e a segunda isolada de uma metástase linfonodal.
Para todas as linhagens transduzidas com o vetor carregando a
seqüência shGal-3 foi obtido um silenciamento eficiente de Gal-3. Como a
inibição quase total foi obtida principalmente com o vetor contendo a
seqüência sh4 (Figura 13), este vetor foi utilizado na maioria dos
experimentos funcionais.
A escolha dos ensaios funcionais de cultura de células em
monocamada, dos ensaios tridimensionais e do ensaio in vivo se deram
considerando as principais características de malignidade que podem
evidenciar diferenças entre células controle e silenciadas para Gal-3.
Morfologia, proliferação, migração, invasão, capacidade de crescimento
89
independente de ancoragem e tumorigenicidade em camundongos são
características extremamente importantes em células tumorais.
6.2.1 Morfologia Celular
Como já demonstrado para linhagens de tumor de mama, o
silenciamento de Gal-3 pode causar uma alteração notável na morfologia
celular (HONJO et al. 2001). De acordo, observou-se uma clara diferença na
morfologia das células WM793 shGal-3 em relação ao controle (Figura 14E-
H). As células WM793 selvagens e transduzidas com o vetor vazio crescem
na placa de uma maneira característica formando agrupamentos cercados
de espaços vazios. Quando transduzidas com o vetor shGal-3, estas células
perdem esta característica e passam a exibir um formato mais plano.
Diferenças no tamanho das células, entretanto, não são evidentes.
Interessantemente, não foi observada diferença entre as células 1205Lu
controle e shGal-3 (Figura 14A-D).
Alguns trabalhos já demonstraram que a expressão de Galectina-3
contribui diretamente para a capacidade de adesão de células tumorais à
componentes da matriz extracelular (OCHIENG et al. 2004). A capacidade
de Gal-3
recrutar integrinas para a membrana plasmática, assim como a sua
capacidade de interação com componentes da matriz extracelular (HUGHES
2001), pode contribuir para a alteração na morfologia das células WM793
shGal-3, principalmente no que se diz respeito ao espalhamento da célula
sobre a placa. De fato, HONJO et al. (2001) demonstrou uma alteração no
formato das células de câncer de mama similar ao observado neste trabalho.
90
Ensaios de adesão celular e a análise de expressão de integrinas
podem oferecer respostas importantes de diferenças de adesão em células
silenciadas para Gal-3.
6.2.2 Proliferação Celular
O ensaio de incorporação de MTT foi realizado para analisar a
diferenças na proliferação celular in vitro. Entretanto, este tipo de ensaio não
é especifico de proliferação celular, visto que o resultado é a indicação do
número de células viáveis no momento da leitura da placa. Muitos trabalhos,
todavia, utilizam a medição de incorporação de MTT em tempos diferentes a
fim de inferir a proliferação celular.
Assim, o crescimento de células controle e shGal-3 foi avaliado
durante 5 dias. Os resultados mostraram que o silenciamento de Gal-3
comprometeu o crescimento das células WM793, mas nenhum efeito foi
observado para as células 1205Lu (Figura 15).
É importante ressaltar que, como MTT não é um ensaio específico de
proliferação celular, não se sabe que fatores podem contribuir para esta
diferença. Não se pode descartar a possibilidade da simples introdução de
shGal-3 causar um estresse capaz de levar a morte celular. Como o ensaio
de MTT não discrimina o que está influenciando o número de células viáveis,
e levando em consideração a literatura indicando o papel anti-apoptótico de
Gal-3 intracelular, não se pode afirmar inequivocamente que existe uma
diferença de proliferação a partir deste tipo de ensaio. Outros experimentos,
como por exemplo, de incorporação de Brdu (bromodioxiuridina), marcação
91
de PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) ou de Ki67, que são
marcadores específicos de proliferação celular, seriam mais recomendados.
6.2.3 Crescimento independente de ancoragem
Diferenças de crescimento independente de ancoragem, analisadas
pelo experimento de Soft Agar, ficaram evidentes apenas para as células
WM793 (Figura 16A,B). As células WM793 shGal-3 formaram menos
colônias, sendo estas de tamanho bem reduzido quando comparados ao
controle (Figura 16C,D).
A habilidade de crescimento independente de ancoragem é uma
característica restrita a células tumorais e um indicativo de malignidade
muito utilizado na biologia de tumores. Este ensaio analisa a capacidade das
células crescerem independentemente de estarem aderidas à um substrato.
O fato de não terem sido encontradas diferenças para as células
1205Lu shGal-3 indica que a inibição de Gal-3 nestas células não é
suficiente para modificar este fenótipo. Vale destacar que o experimento foi
repetido com as linhagens WM983A e WM983B e resultados similares foram
obtidos (Figura 17).
Os dados apresentados neste trabalho, de fato, corroboram com
dados já publicados. Já foi demonstrado que o silenciamento de Gal-3
diminui a habilidade de crescimento independente de ancoragem utilizando
uma abordagem muito similar com células de tumor mamário (HONJO et al.
2001). Em adição, foi demonstrado que a distribuição citoplasmática de Gal-
3 está associada com um aumento na formação de colônias, enquanto que
92
Gal-3 nuclear diminui o número de colônias em Soft Agar. Neste trabalho, os
autores ainda associaram a presença de Gal-3 citoplasmática à inibição de
apoptose, e a distribuição nuclear à indução de apoptose (CALIFICE et al.
2004).
Baseado nestes resultados conclui-se que a ausência de Gal-3
dificulta o crescimento independente de ancoragem de células de melanoma
de crescimento vertical. Entretanto, esta habilidade não é alterada em
células de melanoma metastático.
6.2.4 Migração Celular
O único experimento que não mostrou diferença entre as células
silenciadas para Gal-3 e as controle, tanto para WM793 quanto para 1205Lu,
foi o ensaio de migração celular. A capacidade de migração destas células
foi analisada utilizando o ensaio mais conhecido por “scratch assay”, ou
ensaio de cicatrização. Este ensaio mede a habilidade das células se
moverem em direção a uma região vazia da placa de cultura. Esta região é
criada artificialmente, removendo uma fileira de células da placa de cultura e
gerando assim uma “cicatriz”.
Não foram observadas diferenças significativas entre shGal-3 e
controle para nenhuma das linhagens celulares (Figuras 18-20). O ensaio foi
também realizado na ausência de soro, com o intuito de diminuir a
velocidade de migração e assim aumentar a possibilidade de visualizar
possíveis diferenças. Mais uma vez, não foram observadas diferenças
significativas.
93
Uma das dificuldades encontradas durante a realização deste ensaio
foi a movimentação desorganizada das células, tanto as WM793 quanto as
1205Lu. Esta característica dificultou a medição e foi necessário
desconsiderar as células que migraram mais e chegaram ao meio da cicatriz
rapidamente e assumir como parâmetro a camada de células que se moviam
juntas. Assim, não se pode descartar a possibilidade de artefatos da técnica
influenciarem a interpretação dos resultados. Outros ensaios de migração,
porém, podem ser utilizados para analisar novamente este fenótipo, como
por exemplo, ensaios de Boyder-Chamber, onde células são semeadas
sobre uma membrana porosa e a capacidade de migração em direção ao
meio mais rico em nutrientes é analisada.
É importante ressaltar que os trabalhos disponíveis na literatura que
relatam a participação de Gal-3 na migração de células tumorais foram
realizados sobre algum tipo de matriz como, por exemplo, Matrigel (LE
MARER e HUGHES 1996; HITTELET et al. 2003). A propriedade de Gal-3
se ligar a diversos componentes da matriz pode ter contribuido para o
aumento de motilidade celular observada nestes ensaios. No ensaio discrito
neste trabalho, foi analisada a propriedade de Gal-3 contribuir para a
migração de células de melanoma, independente da presença de
compontentes da matriz. Entretanto, é possível que o enriquecimento da
superfície da placa com compontentes de matriz altere o resultado aqui
descrito.
94
6.2.5 Invasão Tumoral
O fenótipo invasivo de células tumorais é característico de estágios
mais tardios da progressão do tumor, especialmente do melanoma. O ensaio
de esferóides de células de melanoma embebidos em Colágeno I pode ser
utilizado como um ensaio de invasão celular pois ele avalia a capacidade
das células que compõem o esferóide de se moverem e invadirem colágeno
ao seu redor.
Interessantemente, os experimentos demonstraram a perda da
habilidade invasiva das células silenciadas para Gal-3, tanto WM793 quanto
1205Lu. Embora a diferença entre as células controle e silenciadas para Gal-
3 seja significante para ambas as linhagens, a diferença é mais significativa
para as células WM793 (Figuras 21,22).
Galectina-3 interage com diversos componentes da matriz extracelular
e já foi reportado que Gal-3 aumenta a adesão à proteínas como Laminina,
Fibronectina, Colágeno IV e Colágeno I (DUMIC et al. 2006; HUGHES 2001;
FRIEDRICHS et al. 2007). Assim, a perda da habilidade de invasão das
células em Colágeno I pode ser atribuída, pelo menos parcialmente, a perda
da expressão de Gal-3 e conseqüentemente, diminuição da interação com
componentes da matriz extracelular.
Em adição, células de melanoma mais invasivas expressam algumas
proteases, em especial MMP2 e MMP9 (HOFMANN et al. 2000).
Interessantemente, a forma solúvel de Gal-3, isto é, após secreção no meio
extracelular, é clivada por estas metaloproteases, o que aumenta
capacidade de ligação à Laminina (OCHIENG et al. 1998). Tal evento mais
95
uma vez mostra como Gal-3 pode participar de eventos que promovem a
invasão tumoral.
De fato, existem relatos na literatura que relacionam Gal-3 ao
potencial invasivo e metastático de linhagens de carcinoma de mama
(MATARRESE et al. 2000; SONG et al. 2002). Os dados apresentados aqui
confirmam que o fenótipo também ocorre em células de melanoma.
Finalmente, os resultados do ensaio de invasão corroboram com os
resultados de Tissue Microarray realizado por nosso grupo, que mostram
que a expressão citoplasmática de Gal-3 aumenta com o padrão invasivo da
lesão melanocítica (MARTINS 2007).
6.2.6 Crescimento Tumoral em camundongos imunodeficientes
Finalmente, foi realizado um experimento em camundongos para
confirmar os dados obtidos in vitro. O ensaio in vivo é um dos mais
importantes experimentos de um trabalho funcional, pois confirma a validade
dos dados em um modelo mais próximo ao real. O crescimento de tumores
em camundongos é, por exemplo, influenciado por fatores do microambiente
e células estromais, ausente na maioria dos experimentos in vitro.
Foram utilizados camundongos NOD/SCID, caracterizados por
possuírem um sistema imune extremamente comprometido. Estes
camundongos não possuem linfócitos T e B, apresentam comprometimento
de função de macrófagos e um nível menor de células citotóxicas naturais
(SHULTZ et al. 1995, LAPIDOT et al. 1997).
96
Neste caso, é importante salientar que alguns estudos sugerem a
participação de Gal-3 na resposta imune tumoral. Camundongos deficientes
para Gal-3, por exemplo, apresentam insuficiência nas respostas
inflamatórias em modelos de inflamação peritonial e das vias aéreas. Gal-3
pode ainda induzir a ativação de várias células do sistema imune, além de
atrair monócitos e macrófagos. Por outro lado, Gal-3 pode induzir apoptose
de linfócitos infiltrantes (NAKAHARA et al. 2005; ZUBIETA et al. 2006).
Desta forma, considerando as restrições do modelo, o ensaio in vivo pode
contribuir para a avaliação da tumorigenicidade de células de melanoma
silenciadas para Gal-3 independente de fatores do sistema imune.
Células de melanoma, pLKO.1 e shGal-3, foram injetadas
subcutâneamente nos flancos esquerdo e direito, respectivamente, dos
camundongos. Os resultados mostraram o efeito do silenciamento de Gal-3
nas células WM793; O tumor gerado por estas células praticamente não
cresceu. Entretanto, os tumores gerados por injeções de células 1205Lu
pLKO.1 e shGal-3 cresceram exponencialmente, sem diferenças
significativas (Figura 23).
Para confirmar que os resultados obtidos não foram linhagem-
específicos, o experimento in vivo foi repetido com outro par de linhagens,
WM983A e WM983B. Mais uma vez confirmou-se a influência do
silenciamento de Gal-3 apenas para células de melanoma de crescimento
vertical (Figura 24). O fato de os dados obtidos com um par de linhagens
serem confirmado em outro par independente valida a importância de Gal-3,
especialmente em linhagens de crescimento vertical.
97
Desta forma, podemos concluir que a ausência de Gal-3 altera o
crescimento tumoral de células de melanoma de crescimento vertical na
ausência de um sistema imune funcional. O crescimento de tumores
derivados de linhagens metastáticas não é afetado pela ausência de Gal-3.
6.3 INDÍCIOS DE MECANISMOS POSSIVELMENTE IMPLICADOS
NO FENÓTIPO OBSERVADO
Devido à diversidade funcional de Gal-3, são diversos os mecanismos
que podem estar envolvidos no fenótipo menos maligno ocasionado pela
inibição deste gene. No caso de células de melanoma de crescimento
vertical e metastático, a busca por um mecanismo se torna ainda mais
laborioso pelo fato de Gal-3 não estar restrita somente a um compartimento
celular.
Neste trabalho, foram realizados estudos preliminares no intuito de
elucidar alguns mecanismos potencialmente envolvidos na perda de
malignidade de células de melanoma de crescimento vertical quando
silenciadas para Galectina-3.
Primeiramente, vale a pena discutir algumas das características
genômicas das células utilizadas neste trabalho. Todos os ensaios
funcionais foram realizados no laboratório do Dr. Meenhard Herlyn. A
maioria das linhagens celulares pertencentes ao laboratório foi anteriormente
analisada quanto à presença de mutações gênicas, assim como ganhos ou
perdas de regiões do genoma (dados não publicados). O quadro abaixo
98
ilustra, de forma resumida, as principais alterações presentes nas células
utilizadas neste trabalho.
Quadro 3 - Descrição das mutações dos genes BRAF, NRAS, MYC, TP53,
CDK4 e PTEN em linhagens de melanoma.
BRAF NRAS MYC TP53 CDKN2A CDK4 PTEN
WM793
V600E* wt wt P72R Hemi-del K22Q Hemi-del
1205Lu
V600E wt wt P72R Homo-del K22Q Hemi-del / W274X
WM983A
V600E wt wt P72R Hemi-del wt wt
WM983B
V600E wt wt P278L Hemi-del wt Wt
*V600E: Substituição de Valina por Ácido Glutâmico na posição 600 da proteína B-Raf. wt:
selvagem; P72R: Substituição de Prolina por Arginina na posição 72 da proteína p53.
Homo-del: Homozigoto para a deleção; Hemi-del: Heterozigoto para a deleção; K22Q:
Substituição de Lisina por Glutamina na posição 22 da proteína CDK4. W274X: Substituição
de Valina por Ácido Glutâmico na posição 600 da proteína PTEN.
6.3.1 Alterações de p53 e proteínas relacionadas à apoptose
A proteína p53 é um fator de transcrição que, em condições normais,
é constantemente degradado. Entretanto, diversos sinais de estresse celular,
como a ativação de oncogenes, danos no DNA e hipóxia, são capazes de
estabilizar p53 através da indução da expressão de ARF/p14. ARF
(Alternative Reading Frame) se liga ao fator HDM2 (Human Double Minute
2), impedindo que este se ligue a p53 e direcione-o para a degradação
dependente de ubiquitina. Com o aumento da expressão de ARF, a
degradação de p53 mediada por HDM2 é bloqueada e a atividade
transcricional de p53 é consequentemente aumentada. Uma vez no núcleo,
99
p53 ativa a transcrição de genes envolvidos, por exemplo, na inibição do
ciclo celular e indução da apoptose (CZAJKOWSKI et al. 2002) .
A inibição do ciclo celular em resposta a ativação de p53 ocorre
principalmente pela indução de p21. A ligação de p21 ao complexo
CiclinaE/CDK2 impede a fosforilação de Rb (proteína associada ao
Retinoblastoma) e, conseqüentemente, a progressão do ciclo celular. A
forma hipofosforilada de Rb mantém-se complexada ao fator de transcrição
E2F, impedindo este de induzir a expressão de genes importantes na
progressão do ciclo celular (CZAJKOWSKI et al. 2002) (Figura 36).
A falha no reparo do DNA pode induzir a expressão de fatores pró-
apoptóticos que vão participar de processos que culminam com a
permeabilização da membrana mitocondrial e liberação de citocromo c. A
ligação de citocromo com a molécula adaptadora APAF-1 (Apoptotic
Protease Activating Factor 1) induz a formação do apoptossomo (composto
por APAF-1, citocromo c, dATP, pró-caspase 9). A ativação auto-catalítica
de caspase 9 leva então a ativação da cascata de caspases efetoras
(caspases 3, 6 e 7) que promove a morte celular por apoptose (HUSSEIN et
al. 2003) (Figura 6).
A família das proteínas Bcl-2 é composta de fatores pró-apoptóticos e
anti-apoptóticos. Os fatores pró-apoptóticos se dividem em dois grupos: o
grupo das proteínas similares a BAX (BAX-like), que incluem BAX e BAK, e
o grupo das proteínas BH3-only, que incluem as proteínas BAD, BIM, BID,
PUMA e NOXA. As proteínas BH3-only são essenciais para a iniciação da
resposta pró-apoptótica, enquanto que as proteínas BAX e BAK são
100
fundamentais mais tardiamente no processo de permeabilização da
membrana mitocondrial (LABI et al. 2006).
Dentre as proteínas que protegem a célula dos mecanismos de morte
celular destaca-se Bcl-2 principalmente por controlar a permeabilização da
membrana mitocondrial. A interação de Bcl-2 e BAX, por exemplo, impede a
função apoptótica deste último (YIN et al. 1994).
Desta forma, podemos assumir que a sobrevivência ou não da célula
após ser submetida à um estresse capaz de ativar p53 vai depender,
primeiramente, da capacidade de reparo do DNA. Caso o erro no DNA
persista, o destino da célula depende do balanço entre as proteínas anti e
pró-apoptóticas capazes de reagir ao estímulo e iniciar o processo de morte
celular programada. A alteração deste balanço é comumente chamada de
“Apoptotic Switch”.
Alguns destes fatores pró-apoptóticos são ativados diretamente por
p53 através da indução da transcrição, como BAX, NOXA e PUMA
(HUSSEIN et al. 2003; HENRY et al. 2002). BAD, por outro lado, é regulado
negativamente pela via de PI3K/AKT, freqüentemente ativada em tumores
devido a perda de PTEN ou pela perda de seu regulador transcricional, p53
(LABI et al. 2006).
Mutações em TP53 são comuns em aproximadamente 50% dos
tumores sólidos. Em melanoma estas mutações são raras, tanto em tumores
primários quanto metastáticos (revisad em CHIN et al. 2006). Entretanto,
mutações em HDM2 e ARF/p14 contribuem indiretamente para a inativação
de p53 em células de melanoma (MUTHUSAMY et al. 2006). Em adição,
101
alguns estudos mostraram que a inibição da expressão de p53, acoplada a
ativação da via de MAPK são suficientes para a transformação de células
melanocíticas (PATTON et al. 2005; BARDEESY et al. 2001; YU et al. 2008).
Além de mutações que levam a inativação de p53, alguns
polimorfismos que conferem a proteína um ganho de função em relação à
forma selvagem já foram identificados. O primeiro SNP (single nucleotide
polymorphism) descrito para TP53 (HARRIS et al. 1986) resulta na
substituição do aminoácido prolina por arginina no códon 72 da proteína
(P72R). A forma variante P72R apresenta um maior potencial pró-apoptótico
em relação à forma selvagem, ou seja, resulta em um ganho de função da
proteína p53 (DUMONT et al. 2003; BERGAMASCHI et al. 2006).
Neste trabalho, foi observado que silenciamento de Gal-3 em células
de melanoma, tanto metastáticas quanto de crescimento vertical, leva ao
aumento de p53 e de PTEN e à diminuição na fosforilação de AKT (Figura
25A,B). Como resultado, observa-se o aumento da expressão de proteínas
pró-apoptóticas. Enquanto BIM é aumentada em ambas as linhagens, BAD,
BAX são reguladas positivamente apenas na linhagem WM793 shGal-3
(Figura 25D). Interessantemente, embora a expressão de Bcl-2 seja estável
nas células WM793 shGal-3, há um aumento desta proteína anti-apoptótica
nas células 1205Lu shGal-3 (Figura 25A).
De fato, alguns estudos indicam a correlação entre a ativação de AKT
e a expressão de Gal-3, contribuindo assim para o fenótipo resistente à
estímulos apoptóticos de células tumorais (OKA et al. 2005; MAZUREK et al.
2007). Em contrapartida, LEE et al. (2003) demonstraram que Gal-3 em
102
células de tumor de mama promove apoptose, em parte pela inibição de
AKT.
A presença de uma região de ligação à p53 no promotor de Gal-3 já
foi identificado e tal evento leva a inibição da expressão de Gal-3 (RAIMOND
et al. 1995; GAUDIN et al. 1997). A fosforilação de p53 pela quinase HIPK2
também pode inibir a transcrição de Gal-3, culminando com a ativação da via
de apoptose dependente de p53 (CECCHINELLI et al. 2006) (Figura 6).
Contudo, a regulação da expressão de p53 por Gal-3 nunca foi descrita.
As linhagens WM793 e 1205Lu possuem o polimorfismo P72R no
gene p53, que resulta em um ganho de função pró-apoptótica desta proteína
(DUMONT et al. 2003; BERGAMASCHI et al. 2006). Tal fato pode ter
contribuído para as diferenças observadas em alguns experimentos, como o
in vivo, entre o par de células WM793 e 1205Lu e o par WM983A e
WM983B, e chama a atenção para a variabilidade genética entre as
linhagens disponíveis para cultura de células.
Assim, os resultados apresentados neste trabalho sugerem que a
inibição de Gal-3 em células de melanoma resulta na ativação de
mecanismos supressores de tumor, envolvendo a expressão de p53 e
inativação da via PI3K/AKT. A ativação de p53 leva ao aumento de proteínas
pró-apoptóticas, principalmente nas células de melanoma de crescimento
vertical WM793. A inabilidade das células 1205Lu em ativar os mesmos
genes ativados nas células WM793 (BAD e BAX) mas manter a expressão
aumentada de BIM, em conjunto com o aumento de Bcl-2 é consistente com
103
os resultados funcionais, que mostram que esta linhagem metastática não é
influenciada da mesma maneira que células WM793.
Alguns experimentos preliminares foram realizados para analisar se a
inibição de Gal-3 induzia um aumento real na apoptose das células em
cultura. Para tal, as células controle e inibidas para Gal-3 foram tratadas
com o agente quimioterápico Cisplatina e a quantidade de células em
apoptose foi medida pela marcação de Anexina V e medição do potencial de
embrana mitocondrial (dados não mostrados). Os resultados indicaram um
aumento na taxa de apoptose das células WM793 silenciadas para
Galectina-3. Entretanto, estes dados são preliminares e precisam ainda ser
repetidos e confirmados.
104
Legenda: Fatores ambientais que induzam estresse celular podem levar a ativação de
genes supressores de tumor, como p16, p21 e p53, que controlam a progressão do ciclo
celular através do controle da fosforilação de Rb.
Figura 36 – Regulação do Ciclo Celular.
6.3.2 Alterações da via de p16/Rb
O gene p16 é um gene supressor de tumor que regula o controle do
ciclo celular principalmente na progressão das fases G0/G1 para a fase de
replicação do DNA (S). A função desta proteína é principalmente inibir a
ativação das ciclinas dependente de quinases CDK4 e CDK6, responsáveis
pela fosforilação da proteína Rb. Uma vez fosforilada, Rb não interage mais
com o fator de transcrição E2F, que vai então regular a expressão de genes
relacionados à progressão do ciclo celular. Assim, a ausência de p16 pode
105
levar a hiperfosforilação de Rb e, conseqüentemente, a proliferação celular
descontrolada (PIEPKORN 2000) (Figura 36).
Células tumorais desenvolvem mecanismos para inibir a expressão
de p16, seja por deleções ou por metilação do seu promotor. Células de
melanoma raramente expressam a proteína p16. Mutações, especialmente
deleções, são mais freqüentes em melanoma familiar, embora haja relatos
de deleções deste lócus gênico (CDKN2A) em tumores esporádicos
(CURTIN et al. 2006). Linhagens celulares apresentam uma freqüência
maior de deleções deste gene, chegando a 70% (PIEPKORN 2000).
A repressão da transcrição de p16 por metilação ocorre em
aproximadamente 90% dos cânceres. Em melanoma, 10% das células que
possuem pelo menos um dos alelos intactos apresentam metilação do
promotor de p16 (GONZALES-ZULUETA et al. 1995).
Embora em que momento a inativação de p16 ocorre durante o
desenvolvimento e progressão do melanoma não seja conhecido, diversos
estudos mostram a perda da expressão de p16 com a progressão do tumor
(REED et al. 1995; GROVER et al. 1998; SPARROW et al. 1998; KELLER-
MELCHIOR et al. 1998). Interessantemente, nevos, lesões benignas que
podem dar origem ao melanoma, apresentam expressão elevada de p16
acompanhada de fenótipo de senescência celular (MICHALOGLOU et al.
2005).
Mutações em CDK4 também já foram relatadas em melanoma. As
mutações nos códons 22 ou 24 do gene de CDK4 resultam na inabilidade de
ligação à p16. Entretanto, não existem relatos de mutações em CDK6 e
106
mutações no gene RB1, que codifica a proteína Rb, são muito raras
(BARTKOVA et al. 1996).
Em condições normais, células WM793 e 1205Lu não expressam p16.
Entretanto, o silenciamento de Gal-3 induz a expressão de p16 apenas na
linhagem WM793 (Figura 26A). De acordo, a expressão de CDK4 e Ciclina
D1 é diminuída nas células WM793 shGal-3, e observa-se ainda uma
diminuição na fosforilação da proteína Rb (Figura 26B,C). Embora o mesmo
não seja observado para as células 1205Lu, dados de CGH (Comparative
Genome Hybridization), realizados no laboratório do Dr. Meenhard Herlyn,
indicam que os dois alelos deste gene estão deletados nas células 1205Lu,
enquanto que WM793 seria heterozigota para esta deleção (Quadro 3).
A linhagem 1205Lu, por não possuir o gene p16, dificulta a
interpretação completa da importância da expressão de p16 controlada por
Gal-3 em melanoma, demonstrando que o par de linhagens 1205Lu/WM793
não é o melhor modelo para estudar esta característica. Entretanto, vale
destacar que as linhagens WM983A e WM983B são heterozigotas para a
deleção de p16 e, mesmo assim, o silenciamento de Gal-3 na linhagem
WM983A diminui a malignidade desta célula. Tal fato indica que não
somente um mecanismo estaria envolvido na malignidade, mas uma
combinação de alterações é necessária para causar mudanças fenotípicas
observáveis.
Como descrito no quadro 3, as células WM793 e 1205Lu apresentam
uma mutação no códon 22 de CDK4, que impediria a inibição por p16.
Entretanto, não foram observadas mutações no gene CDK6 e outras
107
quinases dependentes de ciclina que poderiam contribuir para a fosforilação
de Rb.
Com estes resultados, pode-se especular que a inibição de Gal-3 em
células de melanoma regula positivamente a expressão de p16 e
conseqüentemente, outros genes implicados na progressão do ciclo celular.
Tal alteração pode levar a ativação de mecanismos supressores de tumor
que contribuem para o bloqueio da progressão do ciclo celular.
Células que não possuem nenhum dos alelos do gene p16, como por
exemplo, 1205Lu, não estão sujeitas a este mecanismo, restrito as células
que possuem o gene p16 funcional. De fato, vale lembrar que as células
WM983A e WM983B são heterozigotas para a deleção de p16 e não
possuem mutações no gene CDK4. Esta e outras diferenças no genoma de
linhagens tumorais podem explicar as variações encontradas nos resultado
de alguns ensaios e reforçar a importância da utilização de mais de uma
linhagem tumoral em estudos funcionais.
Experimentos preliminares sugerem o bloqueio da progressão do ciclo
celular em células WM793 shGal-3 (dados não mostrados). Estes
experimentos foram realizados pela marcação do DNA com iodeto de
propídeo seguido por citometria de fluxo e mostraram principalmente um
aumento de células na fase G0/G1 e diminuição na fase S. Entretanto, o
experimento foi realizado apenas uma vez e, desta forma, estes dados ainda
precisam ser confirmados.
108
6.3.3 Alterações da via de Wnt/β-catenina
Estudos recentes apontam para a participação de Gal-3 na via Wnt/β-
catenina (Figura 7). Foi demonstrado que Gal-3 interage com β-catenina e
que esta interação é inibida pela presença de carboidratos, sugerindo que a
mudança conformacional de Gal-3 pela ligação a carboidratos influencie a
formação do complexo Gal-3/ β-catenina. Devido à ausência de β-catenina
nuclear em células silenciadas para Gal-3, os autores ainda sugeriram que
Gal-3 seria responsável pela translocação de β-catenina para este
compartimento celular (SHIMURA et al. 2004). Entretanto ambas as
proteínas não possuem sinais de localização nuclear.
O mapeamento da região de interação entre Gal-3 e β-catenina
demonstrou que a extremidade carboxi-terminal de Gal-3 interage com a
amino-terminal de β-catenina, na mesma região de interação com α-
catenina. Baseado nestes dados, os autores sugeriram que haveria uma
competição entre Gal-3 e α-catenina, que poderia levar ao deslocamento de
β-catenina da membrana plasmática (SHIMURA et al. 2004).
Em um estudo subseqüente, o mesmo grupo de pesquisa demonstrou
que Gal-3 interage com Axina e que pode ser fosforilada por GSK3- β. Os
estudos foram realizados em linhagens de câncer de cólon e mama e
indicam uma possível participação de Gal-3 na via Wnt (SHIMURA et al.
2005).
Em adição, foi demonstrado que Gal-3 interage com TCF-4, ativando
a transcrição de genes como CCND1 e MYC (SHIMURA et al. 2005). A
contribuição de Gal-3 para o aumento da expressão de Ciclina D1 pode
109
também ser direta, pela indução da atividade do promotor do gene (LIN et al.
2002).
Mais recentemente, foi observado que o tratamento de células de
câncer coloretal com siRNA para Gal-3 desestabiliza β-catenina, causando
como conseqüência uma diminuição na atividade TCF-dependente e na
expressão de Ciclina D1. Um efeito maior na ativação da via Wnt/β-catenina
foi obtido pela inibição concomitante de Wnt2a, indicando uma possível
sinergia entre estas duas proteínas na ativação da via (SHI et al. 2007).
Um estudo imunoistoquímico em carcinoma de tiróide demonstrou
que a expressão citoplasmática e nuclear de Gal-3 se correlaciona com a
alta expressão de β−catenina e Ciclina D1 neste tipo de lesão tumoral. A
mesma correlação não foi encontrada em lesões com localização de
β−catenina na membrana plasmática, sugerindo a relação entre a presença
de Gal-3 e a ativação da via Wnt (WEINBERGER et al. 2007).
Baseado nestes achados, e no fato de a relação entre Gal-3 e a via
Wnt não ter sido estudada em melanoma, a expressão de β-catenina foi
analisada em células de melanoma de diversas fases de progressão tumoral
e em células silenciadas para Gal-3. O principal objetivo destes ensaios foi
observar se a presença de Gal-3 seria essencial para a localização nuclear
de β−catenina.
Foi observado que, em células de melanoma de crescimento radial
(WM35) e em melanócitos (FOM173), β-catenina encontra-se distribuída
pelo citoplasma e núcleo. Entretanto, a distribuição de Gal-3 nestas células
se restringe ao citoplasma (Figuras 27, 28). Nas células WM793, 1205Lu,
110
WM983A, WM983B, WM278, WM1617, representantes de melanoma de
crescimento vertical e metástases, Gal-3 e β-catenina colocalizam no
citoplasma e no núcleo (Figuras 29-32).
Como células de melanoma de crescimento radial mantêm a
localização nuclear de β-catenina mesmo sem a presença de Gal-3, pode-se
inferir que a presença de Gal-3 não é essencial para a translocação de β-
catenina para o núcleo. O resultado foi confirmado ao analisar as células
silenciadas para Gal-3 (WM793 shGal-3 e 1205Lu shGal-3). Nestas células,
a expressão nuclear de β-catenina diminuiu na maioria das células. Algumas
células, entretanto, mantiveram a expressão nuclear forte de β-catenina
(Figuras 33, 34). A diminuição da expressão nuclear de Gal-3, embora
parcial, indica que, a presença de Gal-3 não é essencial, mas pode contribuir
para a retenção nuclear de β-catenina em células de melanoma.
A expressão de β-catenina, Ciclina D1, c-jun foi então analisada por
western blotting. A expressão de β-catenina aumenta levemente, juntamente
com uma pequena diminuição da expressão de Ciclina D1 e c-jun em células
WM793 (Figura 35).
O aumento de β−catenina total nas células WM793 não
necessariamente indica a ativação da Via Wnt. Quando β-catenina se
encontra livre no citoplasma, e na ausência de sinais via Wnt, ela é
complexada às proteínas APC, Axina e β-TrCP, fosforilada por GSK3-β e
degradada. Quando a via Wnt está ativada, a fosforilação de β-catenina é
inibida, promovendo sua estabilidade no citoplasma. Assim, ela pode migrar
para o núcleo e participar de regulação de transcrição via TCF. Dentre os
111
alvos desta via, na tumorigênese destacam-se c-myc, ciclina-D1 e PPARδ,
matrilisina, c-jun e fra1 (WEERARATNA 2005) (Figura 7).
Estudos anteriores demonstraram que Gal-3 é capaz de se ligar a
β−catenina, competindo assim com α−catenina (SHIMURA et al. 2005).
Desta forma, a perda de expressão de Gal-3 permitiria uma maior
estabilidade de β−catenina da membrana plasmática. De fato, os
experimentos de imunofluorescência mostraram que a perda de Gal-3 leva a
uma diminuição de β−catenina nuclear. Estes dados são consistentes com a
diminuição de c-jun e Ciclina D1, alvos chave da via Wnt/β−catenina nas
células WM793.
Em conclusão, os resultados apresentados neste trabalho indicam
que alterações na via Wnt/β−catenina causadas pelo silenciamento de
Galectina-3 contribuem para a alteração do fenótipo maligno das células de
melanoma de crescimento vertical. Estudos que busquem entender mais
profundamente o papel das alterações nesta podem contribuir enormemente
para o entendimento da função (ou das funções) celulares de Galectina-3
em melanoma.
112
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este estudo demonstrou que Gal-3 contribui para o fenótipo maligno
de células de melanoma de crescimento vertical. Células metastáticas,
porém, são pouco influenciadas pelo silenciamento de Gal-3.
Na ausência de Gal-3, células de melanoma de crescimento vertical
alteram sua morfologia, crescem mais devagar em cultura, diminuem sua
habilidade de crescimento independente de ancoragem, tornam-se menos
invasivas e menos tumorigênicas em camundongos imunodeficientes.
Estas células são marcadas por um aumento na expressão de
proteínas como p16, p53, BAD e BAX, implicadas em importantes
mecanismos supressores de tumor. Em adição, o silenciamento de Gal-3
parece influenciar a localização e expressão de β−catenina, e
conseqüentemente, alterar a expressão de proteínas alvo da via Wnt/β-
catenina.
Os mecanismos responsáveis por estas mudanças no fenótipo de
células de melanoma de crescimento vertical e não de células metastáticas
fica ainda em aberto. A ausência de p16 pode certamente contribuir para o
mecanismo responsável pela ausência de fenótipo nas células 1205Lu. Da
mesma maneira, a ausência do aumento da expressão de proteínas pró-
apoptóticas como BAD e BAX combinado com um aumento de Bcl-2 nas
células 1205Lu deve contribuir para as diferenças observadas entre WM793
e 1205Lu. Entretanto, algumas alterações bioquímicas também ocorrem em
113
células 1205Lu, como o aumento de p53, PTEN, a diminuição da ativação
de AKT e a diminuição na localização nuclear de β−catenina.
Em melanoma, células metastáticas são originárias de células de
melanoma de crescimento vertical que adquirem novas alterações genéticas
e epigenéticas tornando-as mais agressivas, capazes de invadir vasos, se
alojar em outros órgãos e formar novos focos tumorais. Nesta situação, a
inibição de apenas um gene, ou em alguns casos mesmo de uma via inteira,
pode não ser suficiente para bloquear a tumorigenicidade celular. Tal
explicação valida os dados apresentados neste trabalho, onde um fenótipo
menos tumorigênico foi encontrado apenas em células de crescimento
vertical submetidas ao silenciamento de Gal-3. Células metastáticas
apresentaram poucas modificações, tanto funcionais quanto bioquímicas,
após o silenciamento de Gal-3.
Adicionalmente, linhagens celulares em cultura por muitos anos
possuem outros mecanismos de escape, possivelmente por um acúmulo
ainda maior de alterações genéticas e epigenéticas, que lhes confiram
tantas características favorecendo o comportamento tumoral que maiores
mudanças sejam necessárias para observar um efeito biológico. Outra
possibilidade, não menos importante, é que essas mudanças sejam
refletidas apenas quando fatores do microambiente sejam considerados.
Entretanto, estudos adicionais que visem elucidar mecanismos responsáveis
pelo fenótipo destas células podem proporcionar respostas importantes.
A modulação da expressão de alguns genes que mostraram alteração
de expressão nas células silenciadas para Gal-3 pode contribuir com
114
respostas chaves sobre qual via seria importante que, quando alterada,
devolva o fenótipo maligno às células WM793. O silenciamento de p16 nas
células WM793 shGal-3, por exemplo, pode trazer respostas importantes
sobre a contribuição da via de p16/Rb e a progressão do ciclo celular. Da
mesma forma, a inibição de p53 ou β−catenina nas células WM793 shGal-3
e 1205Lu shGal-3 pode fornecer informações fundamentais sobre a
contribuição da apoptose e da via Wnt/β−catenina, respectivamente, no
fenótipo maligno de células de melanoma.
115
8 CONCLUSÕES
• O silenciamento de Galectina-3 influencia o crescimento celular in
vitro de células de melanoma de crescimento vertical;
• Células WM793 apresentam morfologia alterada após silenciamento
da expressão de Galectina-3;
• O silenciamento de Galectina-3 afeta as propriedades de crescimento
independente de ancoragem de células de melanoma de crescimento
vertical;
• A ausência de Galectina-3 diminui a habilidade de invasão em matriz
de Colágeno I principalmente das células WM793, mas também das
células 1205Lu.
• A tumorigenicidade de células de melanoma de crescimento vertical
silenciadas para Galectina-3 é drasticamente diminuída em
camundongos NOD/SCID;
• A inibição da expressão de Galectina-3 resulta no aumento da
expressão da proteína p16, e diminuição da expressão de CDK4 e
Ciclina D1 e da fosforilação da proteína Rb apenas nas células de
crescimento vertical.
• A inibição de Galectina-3 ocasiona uma diminuição da fosforilação de
AKT e um aumento da expressão da proteína p53 nas células de
WM793 e 1205Lu;
116
• Os fatores pró-apoptóticos BAD e BAX são regulados positivamente
em células WM793 silenciadas para Gal-3. Entretanto, a proteína BIM
é aumentada tanto em WM793 quanto em 1205Lu silenciadas para
Gal-3;
• A proteína anti-apoptótica Bcl-2 é aumentada apenas nas células
1205Lu silenciadas para Gal-3;
• A localização subcelular de Galectina-3 em células de melanoma
varia de acordo com as fases de progressão do tumor: melanócitos e
células de melanoma de crescimento radial não possuem Galectina-3
nuclear; Células de melanoma de crescimento vertical e células
metastáticas apresentam Galectina-3 distribuída pelo citoplasma e
núcleo.
• β-catenina se distribui pelo citoplasma e núcleo de todas as células
de melanoma.
• O silenciamento de Galectina-3 nas linhagens de melanoma diminui
parcialmente a presença de β-catenina nuclear.
• As células de crescimento radial e melanócitos apresentam Gal-3
apenas no citoplasma mas mantém a localização nuclear de
β−catenina, indicando que localização de β-catenina não é totalmente
dependente da distribuição de Gal-3.
• Células WM793 sienciadas para Gal-3 apresentam um aumento de β-
catenina total e diminuição da expressão de Ciclina D1 e c-jun,
indicando alteração da via Wnt/β-catenina.
117
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ANEXO
Transforming the Melanocyte
More than Just MAPK
The Molecular Signature of Melanoma
The advent of gene expression profiling
over the past decade has led to immense
advances in the understanding of the ge-
netic events that contribute to develop-
ment of disease. A role for MAPK signal-
ling has been well-established in the
literature for nearly three decades, but a
seminal paper was the first to describe a
major role for this pathway in melanoma
in 2002; there, Davies et al. demon-
strated that B-Raf is activated via a point
mutation in nearly 2/3 of all melanomas
[1]. Furthermore, N-Ras is also mutated
in approximately 15 % of melanomas [2],
while c-Kit, a receptor tyrosine kinase
upstream of the MAPK pathway, is mu-
tated in ~ 4 % of melanocytic tumours [3].
Interestingly, the aforementioned muta-
tions very rarely overlap, although the
importance of this observation is still un-
der scrutiny.
In those rare cases where Ras or B-
Raf are not activated in melanoma, am-
plificiations of cyclin D1 or CDK4 can of-
ten be found. Moreover, the CDKN2A
locus, which encodes the INK4a/ARF tu-
mour suppressors, is also lost in ~ 50 %
of melanomas [4]. Although common in
many other tumours, melanomas rarely
harbour p53 mutations; instead, ARF is a
strong candidate that may be responsible
for inhibition of p53 function through
modulation of HDM2 activity. In support
of this latter hypothesis, overexpression
of HDM2 has been reported in melanoma
[5]. Lastly, B-Raf mutations are often ac-
companied by PTEN loss and a small per-
centage of melanomas harbour amplica-
tions of c-myc [6]. Together, the data
strongly implicate MAPK signalling in the
development and progression of mela-
noma, but also demonstrate that other
pathways may play auxiliary roles in de-
velopment of disease.
Barriers to Tumourigenesis
Senescence was first described as a per-
manent cellular state in which cells are
growth arrested in response to telomere
erosion [7]. More recently, senescence
has been observed in response to onco-
genic insult, a phenomenon known as
OIS.
According to the model of melanoma
progression [8], nevi are pre-malignant
lesions that possess the potential to de-
velop into melanoma. These lesions are
usually stable clusters of melanocytes
with low proliferative capacity. Intrigu-
ingly, B-Raf and N-Ras mutations have
been observed in nevi [2], suggesting that
this proliferative arrest could be a result
of an OIS mechanism initiated by these
oncogenic gene products; accordingly,
nevi also display markers of OIS, such as
p16 expression and SA-ßGal activity
[9,10].
Although the candidate mechanisms
involved in the induction of OIS are the
p16/ARF gene products, one described
mechanism is the DNA double strand
break repair response (DDRR); blockade
of ATM, Chk2, HDM2, or p53 function al-
lows cells to bypass senescence imposed
by different oncogenic stimuli [11,12].
Recent studies demonstrate that mela-
noma lesions and cell lines, as well as
dysplasic nevi, are highly-positive for nu-
clear foci that depict replication stress
From left: Meenhard Herlyn DVM, Patricia A
Possik, MSc, and John T Lee, PhD
The mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway is a prominent factor in
melanomagenesis, with approximately four out of five tumours exhibiting muta-
tions within the pathway. However, mutational activation of Ras or Raf initiates
a preventative checkpoint known as oncogene-induced senescence (OIS); the
mechanisms that underlie escape from OIS are poorly understood. In this cur-
sory review, we discuss the putative roles of MAPK signalling in melanocytic
transformation and relevant data that describe escape from OIS.
C A N C E R R E S E A R C H
2 • BIOforum Europe 6/2008
Anexo 1 - Revisão publicada
and DNA double-strand breaks (DSBs)
[13, 14]. These studies suggest that B-
Raf or N-Ras activation initiates S-phase
entry, causing stress at the DNA replica-
tion fork which culminates in DNA DSBs,
activation of a cell response mechanism,
cell cycle arrest, and OIS.
Bypassing OIS
OIS has been extensively studied and fo-
cus has been given to the role of INK4a,
ARF, and p53 in this process. Restoration
of p16 expression in INK4a/ARF-/- mu-
rine melanocytes was demonstrated to
rescue the senescent phenotype, while
reexpression of ARF actually induced cell
death [15]. Contrasting these findings,
establishment of ARF expression in a
transgenic mouse model appeared es-
sential to induce senescence; further-
more, when combined with activation of
N-Ras and INK4a, loss of ARF trans-
formed murine melanocytes, in a man-
ner independent of p53 [16]. While seem-
ingly diverse, the collective data strongly
implicate the CDKN2a locus for its roles
in preventing tumourigenesis through
the induction of OIS.
Much evidence of the cooperation of
MAPK activation and senescence bypass
in melanocytic transformation has come
from studies using a murine model of
constitutive activation of H-Ras, where
individual loss of INK4a, ARF, or p53
leads to melanomagenesis [17-19]. Other
work has shown that short term expres-
sion of B-Raf V600E in human melano-
cytes leads to a proliferation burst, but
long term expression results in cell cycle
arrest associated with p16 upregulation
and SA-ßGal activity [9, 10]. No evidence
of p53 or p21 activity in this process was
observed. Ironically, cell cycle arrest was
observed even in p16-deficient fibro-
blasts, suggesting that other genes may
be involved in the initiation of OIS. Con-
trasting these results, Patton et al. have
shown that zebrafish solely expressing
B-Raf V600E form non-malignant nevi,
but when combined with p53 deficiency,
these lesions develop into invasive mela-
nomas [20]. p16 inactivation, however, is
not sufficient for melanocyte immortali-
sation in vitro, possibly implicating other
immortalizing factors, such as hTERT
[21]. In fact, hTERT contributes to the
malignant transformation of human me-
lanocytes when combined with activated
N-Ras or PI3K and disruption of both the
Rb and p53 pathways [22]. B-Raf activa-
tion, however, did not result in a similar
phenotype.
Most recently, a genome-wide RNAi
approach identified 17 genes that block
the proliferative arrest imposed by B-Raf
activation [23]. IGFBP7, an insulin-like
growth factor binding protein, is upregu-
lated after B-Raf activation in melano-
cytes and induces senescence in an auto-
crine/paracrine manner. The mechanism
involving this secreted factor seems to be
independent of both p16 and p53, an ob-
servation that is interesting, particularly
considering that p53 was another gene
identified that synergises with V600E to
bypass OIS in the same study.
Conclusion
While the data do not always correlate
well, it appears that potentiation of onco-
genic activity combined with an escape
from tumour suppressor mechanisms is
necessary to transform melanocytes into
melanoma cells. The evidence discussed
here underscores the mechanisms em-
ployed by cells to repress tumour forma-
tion. The participation of well-known tu-
mour suppressor genes p16, ARF, and
p53 are prominent in this response, par-
ticularly in the realm of OIS – to what ex-
tent each of these genes contributes to
evasion of transformation is still not en-
tirely clear. The most recent data open
the possibility of other mechanisms, such
as DDRR and secreted factors (i.e.,
IGFBP7), might play a role in melano-
cytic transformation.
References
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Further references are available from
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www.eMagazineBIOforum.com
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Meenhard Herlyn DVM, PhD
The Wistar Institute
Philadelphia, PA, USA
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Fig. 1: Progression of melanocytic transformation. Normal melanocytes acquire oncogenic mutations that initiate a transient proliferative burst followed by
entrance into a senescent state (nevi); it is currently unknown whether all oncogene-affected melanocytes enter senescence or a small percentage acquire
additional genetic abnormalities (i.e., mutations, deletions/amplifications) that enable bypass of oncogene-induced senescence. In either event, the acquisi-
tion of those genetic anomalies appears to transform benign nevi into malignant melanoma.
C A N C E R R E S E A R C H
BIOforum Europe 6/2008 • 3
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