( PDF ) Avaliação de instabilidade de microssatélites e expressão imunoistoquímica das proteínas HMLH1 e HMSH2 em pacientes com suspeita de câncer colorretal hereditário sem polipose

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AVALIAÇÃO DE INSTABILIDADE DE

MICROSSATÉLITES E EXPRESSÃO

IMUNOISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS HMLH1 E

HMSH2 EM PACIENTES COM SUSPEITA DE CÂNCER

COLORRETAL HEREDITÁRIO SEM POLIPOSE

LIGIA PETROLINI DE OLIVEIRA

Dissertação apresentada à Fundação Antônio

Prudente para obtenção do título de Mestre em

Ciências

Área de concentração: Oncologia

Orientador: Dr. Benedito Mauro Rossi

Co-orientadores: Dra. Renata de Almeida Coudry

Dra. Dirce Maria Carraro

São Paulo

2008

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FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca da Fundação Antônio Prudente

Oliveira, Ligia Petrolini de

Avaliação de instabilidade de microssatélites e expressão

imunoistoquímica das proteínas hMLH1 e hMSH2 em pacientes com

suspeita de câncer colorretal hereditário sem polipose / Ligia Petrolini de

Oliveira – São Paulo, 2008.

134p.

Dissertação (Mestrado)-Fundação Antônio Prudente.

Curso de Pós-Graduação em Ciências - Área de concentração: Oncologia.

Orientador: Benedito Mauro Rossi

Descritores: 1. CÂNCER COLORRETAL. 2. CÂNCER COLORRETAL

HEREDITÁRIO SEM POLIPOSE. 3. IMUNOHISTOQUÍMICA. 4.

INSTABILIDADE DE MICROSSATÉLITES. 5. REPARO DO DNA.

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Não gosto quando vejo alguns rostos de angústia das pessoas que fazem tratamento

de câncer no hospital, dia após dia... Por outro lado me sinto bem, pois estas pessoas

tornam meus estudos um tanto nobre. Então me motivo em prosseguir e fico feliz,

por tentar ajudar, de alguma forma, contra o que ninguém está completamente livre...

(Por muitas vezes, meus pensamentos)

Apenas aqueles que entendem os segredos do ciclo da vida e tornam firme a lição de

"nada de novo" são imperadores despreocupados.

(Palavras do meu orientador)

E enfim, “tudo vale a pena, quando a alma não é pequena”.

(Fernando Pessoa)

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, para quem tudo é possível.

Agradeço ao meu marido Beto, simplesmente por existir em minha vida, por

tudo que já vivemos e pela família que vamos construir.

Agradeço aos meus pais Lizete e Vitor, pelo amor, carinho, dedicação,

educação, investimento e oportunidades. Sem eles estar aqui teria sido muito mais

difícil. Saibam que todas as suas privações por mim serão recompensadas. Obrigada

por me ajudarem a realizar meus sonhos.

Agradeço aos meus irmãos, Valéria e Ivan, por partilharem a minha infância e

por me ajudar a amadurecer.

Agradeço as minhas adoráveis vovós, pela educação, pelo cuidado, pelos

mimos, pelos doces. Com certeza vocês são os meus melhores exemplos de vida.

Agradeço aos meus tios e primos, pelas companhias de viagem e

comemorações sempre tão divertidas. Muito de mim deve-se a esta convivência

extremamente saudável e indispensável. Agradeço especialmente a minha Tia Luzia,

pela dedicação em cuidar de mim quando criança.

Agradeço ao meu eterno cãozinho Godofredo, por ter feito de mim a criança

mais feliz do mundo.

Agradeço as minhas melhores amigas, Tata e Raquel, pela amizade sincera,

pela confiança, pela convivência.

Agradeço as minhas amigas de faculdade, Dri, Alê, Bru, Ju, Mari e Ro por

me ajudarem a morar longe de casa e por tornarem os meus anos de faculdade muito

alegres.

Agradeço a todos os meus amigos de pós-graduação e do Grupo de Pesquisa

em Câncer Colorretal.

Agradeço aos amigos de laboratório, Alice, André, Cláudia, Edaise, Felipe,

Fernanda, Gwen, Isabela, Juliana, Katia, Luciane, Luciene, Marcilei, Rodrigo, Yukie,

por dividir comigo todos os meus dias de muito trabalho, problemas, almoços,

risadas e principalmente, muito frio. Agradeço principalmente a minha amiga Mila, a

pessoa para quem “as coisas só acontecem com ela”, pela amizade, pelos almoços,

pela bancada de trabalho e mais do que tudo, por me fazer rir todos os dias.

Agradeço a todos os funcionários da Imuno, da Técnica, do SAME, do

Arquivo, da Pós-Graduação e da Biblioteca pela imensa ajuda em tudo.

Agradeço a Alexandra, Carlinhos, Gilmara, Ivanildo e Severino por todos os

auxílios prestados.

Agradeço a FAPESP, pelo suporte financeiro indispensável ao

desenvolvimento deste projeto.

Agradeço aos membros de qualificação, Bernardo Garicochea e Venancio

Avancini Ferreira Alves pelas correções e sugestões desse estudo, e aos membros da

banca examinadora desta dissertação, por aceitarem o convite e pela disposição em

ler e argüir este trabalho.

Agradeço ao meu orientador de Iniciação Científica, Marcelo Menossi, pelo

início dos meus ensinamentos.

Agradeço ao Fernando Soares, em nome de todo o departamento de Anatomia

Patológica, onde realizei todos os meus experimentos.

Agradeço a enfermeira Erika, por toda a ajuda neste e nos demais projetos,

pela confiança em compartilhar comigo algumas responsabilidades do GETH e por

me ajudar nas análises estatísticas.

E por fim, agradeço aos meus orientadores, Benedito Mauro Rossi, Renata de

Almeida Coudry e Dirce Maria Carraro, pela oportunidade, pelos ensinamentos, pela

motivação e principalmente, pelo entusiasmo contagiante de todos os dias.

Esta conquista é para todos vocês!

RESUMO

Oliveira LP. Avaliação de instabilidade de microssatélites e expressão

imunoistoquímica das proteínas hMLH1 e hMSH2 em pacientes com suspeita de

câncer colorretal hereditário sem polipose. São Paulo; 2008. [Dissertação de

Mestrado-Fundação Antonio Prudente].

Embora existam estudos isolados sobre câncer colorretal hereditário sem polipose

(HNPCC ou síndrome de Lynch) em pacientes brasileiros, a avaliação da abordagem

molecular da síndrome vem sendo realizada em famílias norte-americanas e européias. O

objetivo principal deste estudo foi o de identificar, através da pesquisa de instabilidade

de microssatélites - MSI (painel de 10 marcadores) e da expressão imunoistoquímica das

proteínas MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2, dentre pacientes portadores de câncer

colorretal (CCR) com critérios clínicos para suspeita de síndrome de Lynch (Amsterdam

I/II ou Bethesda), aqueles portadores de defeito no sistema de reparo do DNA. Os

resultados foram correlacionados com os dados clínicos, anatomopatológicos, e de

antecedentes familiares. O estudo foi realizado com 86 pacientes selecionados a partir do

registro de câncer colorretal hereditário do Hospital do Câncer AC Camargo, São Paulo,

Brasil. Os dados clínicos foram coletados em fichas padronizadas e armazenadas em

banco de dados para análise. Dos 95 casos analisados por imunoistoquímica, 31,6%

apresentaram perda de expressão protéica, 7,4% de MLH1/PMS2, 15,8% de

MSH2/MSH6 e 8,5% de proteínas isoladas. Em relação à localização do tumor, 66,7%

dos casos localizados no lado direito do cólon apresentaram alteração na

imunoistoquímica. Em relação à histologia do tumor, 68,8% dos adenocarcinomas que

possuíam componente mucinoso apresentaram alteração na imunoistoquímica. Não foi

possível realizar a técnica de MSI nos adenocarcinomas emblocados em parafina por

dificuldades na extração de DNA. A técnica foi realizada em 26 amostras de tecido

fresco oriundas do Banco de Tumores. Do total de 26 casos analisados, 53,85% foram

classificados como MSS, 38,46% como MSI-H e 7,69% como MSI-L. Todos os casos

analisados possuíam dados de imunoistoquímica condizentes, ou seja, os casos com

MSI-H apresentaram perda de expressão protéica e os casos MSI-L e MSS não

apresentaram.

SUMMARY

Oliveira LP. [Evaluation of microsatellite instability and immunohistochemistry

testing of hMLH1 and hMSH2 proteins in patients with suspect of hereditary

nonpolyposis colorectal cancer]. São Paulo; 2008. [Dissertação de Mestrado-

Fundação Antonio Prudente].

The main studies about hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC or Lynch

syndrome) have been conducted analyzing North-American or European families.

The objective of this project was to analyze the results of microsatellite instability

(MSI) (panel of 10 markers) and immunohistochemistry for the proteins MLH1,

MSH2, MSH6 and PMS2 among HNPCC suspected patients with colorectal cancer

(CCR), fulfilling clinical criteria (Amsterdam I/II or Bethesda) in order to identify

those with of defect in DNA mismatch repair system. Moreover, these results were

connected with the clinical features, pathological information and family history.

Eighty-six unrelated patients were selected from the Hereditary Colorectal Registry,

Hospital do Câncer AC Camargo, Brazil. The pathological and clinical data were

collected using standardized forms, in order to construct a database for analysis. Of

the 95 cases examined by immunohistochemistry, 31.6% showed loss of protein

expression, 7.4% of MLH1/PMS2, 15.8% of MSH2/MSH6 and 8.5% of one isolated

protein. Regarding the location of the tumor, 66.7% of the cases located on the right

side of the colon showed alteration in immunohistochemistry. Regarding histology of

the adenocarcinoma, 68.8% of tumors that had mucinous component presented

alteration in DNA repair proteins. It was unable to perform the technique of MSI in

paraffin tumors by difficulties in extracting the DNA from these samples. The

technique was conducted on 26 samples of frozen samples from the AC Camargo

Hospital Tumor Bank. Of the 26 cases examined, 53.85% were classified as MSS,

38.46% as MSI-H and 7.69% as MSI-L. All cases that demonstrated MSI-H also

showed alteration in the DNA repair proteins and MSI-L and MSS samples had not

presented.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1

Sistema de Reparo do DNA..............................................................

Figura 2

Padronização dos anticorpos............................................................ 53

Figura 3

Adenocarcinomas colorretais com positividade para a proteína de

reparo MSH6....................................................................................

Figura 4

Fotos de imunoistoquímica de casos com ausência de expressão

protéica...............................................................................................

Figura 5

Graus de diferenciação dos adenocarcinomas segundo a OMS........ 67

Figura 6

Fotos de lâminas mostrando casos de adenocarcinomas que

apresentam budding...........................................................................

Figura 7

Fotos de lâminas de adenocarcinomas............................................... 73

Figura 8

Fotos de imunoistoquímica de casos com ausência de expressão

protéica tanto no adenocarcinoma quanto no adenoma.....................

Figura 9

Adecarcinoma colorretal demonstrando perda de expressão da

proteína de reparo MGMT................................................................. 75

Figura 10

Teste de aplificação das amostras...................................................... 82

Figura 11

Teste de amplificação das amostras extraídas................................... 83

Figura 12

Teste de amplificação........................................................................ 85

Figura 13

Teste de amplificação dos primers..................................................... 86

Figura 14

Teste de amplificação das amostras de parafina................................ 87

Figura 15

Teste do kit Pico Pure........................................................................ 89

Figura 16

Teste de amplificação das amostras................................................... 92

Figura 17

Teste de amplificação das amostras................................................... 94

Figura 18

Teste de amplificação das amostras................................................... 96

Figura 19

Teste de amplificação das amostras................................................... 97

Figura 20

Eletrofluorograma derivado do software GeneMapper.................. 100

Figura 21

Reprodução dos picos Stutters. Eletrofluorograma derivado do

software GeneMapper........................................................................

102

Figura 22

Amostras de DNA amplificadas com todos os primers..................... 104

Figura 23

Eletrofluorogramas para um caso com perda de expressão protéica

de MSH2/MSH6................................................................................

109

Figura 24

Eletrofluorogramas para um caso com perda de expressão protéica

de MLH1/PMS2.................................................................................

111

Figura 25

Eletrofluorogramas para um caso com perda de expressão protéica

apenas para MLH1............................................................................. 113

Figura 26

Eletrofluorogramas para um caso classificado como MSI-L e sem

perda de expressão protéica............................................................... 115

Figura 27

Eletrofluorogramas para um caso com expressão protéica normal... 116

LISTA DE TABELAS

Tabela 1

Critérios de Amsterdam I................................................................. 7

Tabela 2

Critérios de Amsterdam II................................................................ 7

Tabela 3

Critérios de Bethesda........................................................................ 8

Tabela 4

Critérios de Bethesda Revisados...................................................... 9

Tabela 5

Sequência dos primers de MSI......................................................... 44

Tabela 6

Avaliação da expressão das proteínas de reparo do DNA................ 55

Tabela 7

Discriminação da expressão protéica por imunoistoquímica em 86

pacientes com suspeita para SL........................................................ 56

Tabela 8

Classificação clínica de acordo com os CAI, CAII, CCF e B em

relação às alterações encontradas na imunoistoquímica das

proteínas de reparo............................................................................ 59

Tabela 9

Sexo em relação às alterações encontradas na imunoistoquímica

das proteínas de reparo..................................................................... 60

Tabela 10

Localização do adenocarcinoma em relação às alterações

encontradas na imunoistoquímica das proteínas de reparo.............. 60

Tabela 11

Tumores primários em relação às alterações encontradas na

imunoistoquímica das proteínas de reparo.......................................

Tabela 12

Estadiamento T em relação às alterações encontradas na

imunoistoquímica das proteínas de reparo.......................................

Tabela 13

Estadiamento N em relação às alterações encontradas na

imunoistoquímica das proteínas de reparo.......................................

Tabela 14

Estadiamento M em relação às alterações encontradas na

imunoistoquímica das proteínas de reparo....................................... 64

Tabela 15

Invasão sanguínea em relação às alterações encontradas na

imunoistoquímica das proteínas de reparo....................................... 64

Tabela 16

Invasão linfática em relação à alteração na

imunoistoquímica.............................................................................

Tabela 17

Invasão perineural em relação às alterações encontradas na

imunoistoquímica das proteínas de reparo.......................................

Tabela 18

Grau de diferenciação em relação às alterações encontradas na

imunoistoquímica das proteínas de reparo....................................... 66

Tabela 19

Infiltrado tipo Crohn em relação às alterações encontradas na

imunoistoquímica das proteínas de reparo....................................... 68

Tabela 20

Infiltrado linfocitário peritumoral em relação às alterações

encontradas na imunoistoquímica das proteínas de reparo.............. 69

Tabela 21

Desmoplasia em relação às alterações encontradas na

imunoistoquímica das proteínas de reparo.......................................

Tabela 22

Budding em relação às alterações encontradas na

imunoistoquímica das proteínas de reparo.......................................

Tabela 23

Tipo histológico em relação às alterações encontradas na

imunoistoquímica das proteínas de reparo....................................... 71

Tabela 24

Tumores presentes nas famílias dos pacientes estudados em

relação às alterações encontradas na imunoistoquímica das

proteínas de reparo dos pacientes estudados....................................

Tabela 25

Tamanho dos alelos encontrados...................................................... 101

Tabela 26

Marcadores instáveis........................................................................ 105

LISTA DE ABREVIATURAS

µg micrograma

µl microlitro

B Critérios de Bethesda

CAI Critérios de Amsterdam I

CAII Critérios de Amsterdam II

CCF Preenchimento de pelo menos três dos Critérios de Amsterdam

CCR câncer colorretal

CEP comitê de ética em pesquisa

CpG dinucleotídeo cg

DNA ácido desoxirribonucléico

dNTP deoxinucleotídeos tri-fosfato

EDTA ácido etileno-diamino-tetraacético

FAM 6-carboxi-fluoresceina – fluoróforo azul

HE Hematoxilina e Eosina

HNPCC câncer colorretal hereditário sem polipose

INCA Instituto Nacional do Câncer

LIZ fluoróforo laranja

mg miligrama

MgCl

cloreto de magnésio

MGMT O

-methylguanine DNA methyltransferase

ml mililitro

mM milimolar

MSI instabilidade de microssatélites

MSI-H Instabilidade alta de microssatélites

MSI-L Instabilidade baixa de microssatélites

MSS Estabilidade de microssatélites

NaOH hidróxido de sódio

NED fluoróforo amarelo

ng nanograma

OMS Organização Mundial de Saúde

pb pares de bases

PCR polymerase chain reaction

rpm rotações por minuto

SL Síndrome de Lynch

VIC fluorórofo verde

ÍNDICE

1 INTRODUÇÃO 1

1.1 Câncer Colorretal 1

1.2 Síndrome de Lynch 4

1.3 Imunoistoquímica 20

1.4 Instabilidade de Microssatélites 24

1.5 Proteínas de Reparo 29

2 OBJETIVO 33

3 MATERIAL E MÉTODOS 34

3.1 Pacientes 34

3.1.1 Aspectos Éticos 34

3.1.2 Convocação dos Pacientes 34

3.1.3 Inclusão dos Pacientes 34

3.1.4 Seleção dos Pacientes 35

3.1.5 Dados Clínicos 36

3.2 Imunoistoquímica 36

3.2.1 Anticorpos 36

3.2.2 Protocolo para material em parafina 37

3.2.3 Protocolo para material congelado 39

3.2.4 Soluções para Imunoistoquímica 40

3.2.5 Calssificação Hitológica 41

3.3 Instabilidade de Microssatélites 43

3.3.1 Marcadores 43

3.3.2 Extração de DNA e Amplificação das Amostras do Banco de Tumores 46

3.3.3 Eletroforese 47

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 49

4.1 Imunoistoquímica 49

4.2 Instabilidade de Microssatélites 80

4.2.1. Marcadores 80

4.2.2 Extração de DNA e Amplificação das Amostras Emblocadas em

Parafina 81

4.2.3 Extração de DNA e Amplificação das Amostras do Banco de Tumores 103

5 CONCLUSÃO 122

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 124

ANEXOS

Anexo 1 Termo de Consentimento

Anexo 2 Ficha de Dados

Introdução 1

1 INTRODUÇÃO

1.1 CÂNCER COLORRETAL

Todas as células existem sob estrita regulação de sinais para crescimento,

apoptose, diferenciação, interação célula-célula e interação célula-matriz

extracelular. O câncer é o resultado de um processo de múltiplas etapas, dirigidas por

alterações genéticas que levam ao surgimento de um clone de células com vantagens

proliferativas sobre as demais, além de modificar a arquitetura normal dos tecidos,

levando progressivamente a disfunções (PELTOMÄKI 2005; CHAMMAS e

NOWAK 2005). Os eventos genéticos seqüenciais múltiplos envolvidos na

tumorigênese resultam da ativação de oncogenes e na inativação de genes

supressores de tumor, o que permite escape das células da estrita regulação normal

(LIU et al. 2005). Tais alterações genéticas podem estar presentes nas linhagens

germinativas, como já foi descrito em determinadas síndromes predisponentes ao

câncer, ou na forma de mutações somáticas, sendo responsável pela maioria dos

casos esporádicos das neoplasias.

O câncer colorretal (CCR) é uma das causas mais freqüentes de morte por

câncer nos países industrializados, tanto para homens quanto para mulheres, com

uma incidência anual de 800.000 novos casos no mundo, representando 8,5% de

todos os novos tumores (GATALICA e TORLAKOVIC 2008). No Brasil, o CCR é o

quarto tipo de câncer mais freqüentemente diagnosticado em homens - depois de

pulmão, estômago e próstata, e o terceiro mais comum em mulheres - depois de

Introdução 2

mama e colo e útero (FERLAY et al. 2001). Estima-se que o CCR seja responsável

por 13% das mortes relacionadas ao câncer (ASHKTORAB et al. 2007). Em 2008,

segundo estimativa de incidência do Instituto Nacional do Câncer (Ministério da

Saúde 2007), o país poderá ter 26.990 casos, sendo 12.490 em homens e 14.500 em

mulheres, ou seja, esses valores correspondem a 13 novos casos para 100 mil homens

e 15 novos casos para 100 mil mulheres. A maior incidência de casos ocorre na faixa

etária entre 50 e 70 anos, mas as possibilidades de desenvolvimento já aumentam a

partir dos 40 anos. As estatísticas do IARC para o Brasil são calculadas de acordo

com os dados do Registro da região de Campinas (Campinas, Joaquim Egídio,

Souzas, Nova Aparecida e Barão Geraldo), de 1991 a 1995 e de acordo com os dados

do Registro de Goiânia, de 1995 a 1998 (PARKIN et al. 2003).

Nos últimos anos, a incidência de CCR tem aumentado em áreas antes

consideradas de baixo risco. Acredita-se que isso se deva ao envelhecimento das

populações, à adoção de estilos de vida com tendência mais sedentária e a um

aumento na preferência e aceitação de dietas pouco saudáveis (FRANCO e

FRANCO 2005). A história natural da doença é condizente com uma prevenção

eficaz: o CCR é a conseqüência final de uma série de erros genéticos que se

acumulam durante vários anos, sendo o segundo câncer mais prevalente no mundo,

depois do câncer de mama. Estima-se hoje que, globalmente, haja 2,4 milhões de

pessoas vivas com esse diagnóstico nos últimos 5 anos. O risco acumulado de

desenvolvimento do CCR ao longo da vida é de 6% (FERLAY et al. 2001). A

prevalência do CCR tem aumentado rapidamente, enquanto que as taxas de

mortalidade têm caído como resultado de melhoras no tratamento e programas de

rastreamento e sobrevida mais eficazes (ROSSI e SILVA 2005).

Introdução 3

Embora as síndromes familiares sejam responsáveis por apenas uma pequena

proporção dos casos de CCR (em torno de 6% a 8%), indivíduos com predisposição

hereditária têm o processo carcinogênico facilitado, com aumento do risco de

desenvolvimento de CCR em relação aos casos esporádicos, que pode chegar entre

80% e 100% (FEARNHEAD et al. 2002). As principais síndromes hereditárias de

predisposição relacionadas ao CCR são a Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) e o

Câncer Colorretal Hereditário sem Polipose (HNPCC - Hereditary NonPolyposis

Colorectal Cancer), também chamada de Síndrome de Lynch.

O modelo proposto por KNUDSON (1971), chamado de “two-hit theory”,

ajudou no entendimento, em especial, das síndromes de predisposição ao câncer.

Segundo o modelo, dois eventos são necessários para o desenvolvimento da doença,

ou seja, um indivíduo que herda um alelo mutado para determinado gene supressor

de tumor necessita da inativação do segundo alelo, este normal, evento através do

qual a função do gene é perdida, contribuindo significativamente a neoplasia. Já nos

casos esporádicos, a inativação dos dois alelos se faz necessária para o

desenvolvimento da doença, já que neste caso, os dois alelos herdados são normais,

ou seja, possuem sua atividade inalterada. O característico acometimento mais tardio

dos casos esporádicos é resultante da necessidade de inativação de ambos os alelos

ao longo da vida do indivíduo para a neoplasia.

Introdução 4

1.2 SÍNDROME DE LYNCH

A primeira família descrita com a síndrome foi em 1913, por Warthin,

patologista da Universidade de Michigan, como a família de câncer G, que

apresentava muitos casos de câncer. Depois de 12 anos, o próprio Warthin escreveu

um artigo sobre a família G relatando que a maioria dos tumores ocorreu no cólon,

estômago ou útero. Em 1966, Henry Lynch identificou duas famílias, denominadas N

e M (de Nebraska e Michigan). Notando as semelhanças entre as famílias descritas, o

sucessor de Warthin entrou em contato com Lynch para uma reunião, onde foram

catalogados 600 descendentes da família G. Os pesquisadores verificaram um

inequívoco padrão de herança autossômico dominante nas seis gerações desta

família. Foram sugeridos para explicar o mecanismo desta doença apenas

agrupamentos ao acaso ou exposições ambientais compartilhadas. Entretanto, foi

observado que apenas alguns órgãos estavam sob maior risco. Além disso, o cólon

proximal apresentava um risco particular, pois os indivíduos acometidos

apresentavam idade de acometimento anormalmente reduzida. Outra observação

importante da família G foi a de que os filhos dos membros afetados na família

continuavam a apresentar risco aumentado de câncer por muitas gerações, enquanto

que os filhos dos membros não afetados da família não apresentavam (BOLAND

2005; VASEN 2005).

No final de 1970 tais famílias eram referidas como “fraternidades

cancerosas”, “câncer de cólon hereditário sítio-específica” e “síndrome de câncer

familial”. De 1970 até 1990 muitos estudos se esforçaram em entender

biologicamente a doença, e em 1984 o termo “Síndrome de Lynch” foi usado pela

Introdução 5

primeira vez em referência a Henry Lynch. Em 1985 a síndrome foi nomeada de

HNPCC, para evidenciar o fato de que esta doença era distinta da FAP, mas focava

toda a atenção para os tumores colorretais apenas (BOLAND 2005).

Nos últimos anos intensificaram-se os debates em relação ao nome da

síndrome, de modo que o nome HNPCC, utilizado com maior freqüência para

caracterizá-la, não seria o mais adequado, já que a expressão “sem polipose” poderia

excluir famílias cujos indivíduos apresentam um ou mais adenomas. Além disso, os

pacientes de famílias denominadas como HNPCC não apresentam predisposição

somente ao câncer colorretal, mas também a outros tumores. Desta maneira, o termo

Síndrome de Lynch tem sido utilizado para identificar pacientes portadores de câncer

colorretal e tumores extracolônicos que preencham os critérios clínicos (BOLAND

2005).

A Síndrome de Lynch é uma doença autossômica dominante, responsável por

2% a 6% dos casos de CCR (MÜLLER et al. 2001; JONG et al. 2004; BOLAND

2005. É caracterizada por um pequeno número de pólipos, acometimento em idade

precoce, mutações germinativas nos genes de reparo do DNA, e, por isso, um

processo carcinogênico acelerado no cólon, já que, com um alelo inativado devido à

mutação herdada, a inativação do alelo normal remanescente sinaliza para o

desenvolvimento da neoplasia (ROSSI et al. 2002; BAUDHUIN et al. 2005; VASEN

2005). A razão adenoma-carcinoma nesses indivíduos é de praticamente 1:1,

enquanto a estimativa equivalente para a população em geral é de 30:1. Isso ocorre

devido a uma acelerada transição adenoma-carcinoma (FISHEL 2001; JASS et al.

2002). Acredita-se que a maioria dos pólipos adenomatosos não tratados nesses

indivíduos sofre transformação maligna.

Introdução 6

Os portadores da Síndrome de Lynch possuem risco aumentado de

desenvolver CCR (60% a 70% aos 70 anos), carcinoma endometrial (30% a 40% aos

70 anos) e, com menores riscos, carcinomas de intestino delgado, de células

transicionais do trato urinário superior, câncer de ovário, câncer de estômago,

tumores cerebrais (Síndrome de Turcot), e tumores de glândulas sebáceas (Síndrome

de Muir-Torre) (HENDRIKS et al. 2006a).

Em virtude das diferentes manifestações da síndrome, existe ainda a recente

sugestão de classificá-la como Lynch I, Lynch II e Lynch III. Os portadores de CCR

seriam caracterizados como Lynch I, os portadores de tumores extracolônicos como

Lynch II e os portadores de tumores hematológicos, cerebrais e gastrointestinais,

espectro de tumores característico de portadores de duas mutações germinativas nos

genes de reparo, seriam caracterizados como Lynch III (FELTON et al. 2007a).

O risco cumulativo de desenvolvimento de CCR nos USA é de

aproximadamente 6%. Mais de 15% dos casos são atribuíveis a predisposições

herdadas ou familiares (HENDRIKS et al. 2006a). Os pacientes com síndrome de

Lynch possuem de 60% a 80% de risco de desenvolver câncer colorretal durante a

vida (GOECKE et al. 2006).

O critério diagnóstico para Síndrome de Lynch é controverso devido a

variações de fenótipos clínicos associados à síndrome nas diferentes áreas ou países

(WANG et al. 2007). Atualmente, o diagnóstico clínico da síndrome de Lynch tem

como base os antecedentes familiares de câncer, de acordo com os critérios de

Amsterdam I e II e a suspeita clínica é realizada através dos critérios de Bethesda

(VASEN 2005).

Introdução 7

Em 1991, o Grupo Colaborativo Internacional (ICG/HNPCC) publicou os

chamados Critérios de Amsterdam I, com a intenção de promover uma padronização

internacional no diagnóstico clínico da Síndrome de Lynch (VASEN et al. 1991)

(Tabela 1).

Tabela 1 - Critérios de Amsterdam I.

- Pelo menos três membros de uma mesma família com CCR;

- Um dos membros parente em primeiro grau dos outros 2;

- Pelo menos duas gerações acometidas;

- Pelo menos um dos membros com CCR e idade menor que 50 anos;

- Exclusão de polipose adenomatosa familiar (FAP).

Os Critérios de Amsterdam I tiveram aceitação internacional e são de extrema

valia para a padronização do diagnóstico clínico, porém, foram criticados por serem

muito restritivos e não considerarem os tumores extracolônicos. Por isso, em 1999, o

mesmo ICG/HNPCC acrescentou novos critérios aos anteriormente estabelecidos,

criando desta forma os Critérios de Amsterdam II (VASEN et al. 1999) (Tabela 2).

Tabela 2 - Critérios de Amsterdam II.

- Pelo menos três membros de uma mesma família com CCR;

- Um dos membros parente em primeiro grau dos outros 2;

- Pelo menos duas gerações acometidas;

- Pelo menos um dos membros com CCR e idade menor que 50 anos;

- Exclusão de polipose adenomatosa familiar (FAP);

- Adenocarcinoma de endométrio;

- Adenocarcinoma de intestino delgado;

- Carcinoma de células transicionais de vias excretoras renais (pelve renal e ureter).

Introdução 8

O espectro de diagnóstico da Síndrome de Lynch foi ampliado com os novos

Critérios de Amsterdam II, entretanto, ainda existem críticas, principalmente devido

à dificuldade de diagnóstico clínico em famílias pequenas, com poucos descendentes.

O uso dos critérios de Amsterdam alcançou o seu propósito original de identificar as

famílias portadoras, mas a sua baixa sensibilidade restringe muito o número de

pacientes que poderiam ser avaliados com testes genéticos.

Dessa maneira, visando melhorar o rastreamento de pacientes, em 1996, após

um simpósio internacional sobre HNPCC/Síndrome de Lynch, foram propostas

algumas recomendações, conhecidas como Critérios de Bethesda, com o intuito de

identificar indivíduos que deveriam ser submetidos aos testes genéticos (BOLAND

et al. 1998) (Tabela 3).

Tabela 3 - Critérios de Bethesda.

- Indivíduos que preenchem os Critérios de Amsterdam;

- Indivíduos com dois tumores relacionados à síndrome, incluindo CCR sincrônico e

metacrônico ou associado a tumores extracolônicos;

- Indivíduos com CCR e um parente de primeiro grau com CCR e/ou tumor

extracolônico relacionado à síndrome e/ou adenoma colorretal; um dos tumores

diagnosticados antes dos 45 anos, e o adenoma diagnosticado antes dos 40 anos;

- Indivíduos com CCR ou câncer endometrial diagnosticado antes de 45 anos;

- Indivíduos com CCRs no cólon direito com padrão histológico indiferenciado

(sólido/cribiforme) antes dos 45 anos;

- Indivíduos com CCR com células em anel de sinete diagnosticado antes dos 45

anos;

- Indivíduos com adenomas diagnosticados antes dos 40 anos.

Introdução 9

Posteriormente, em 2004, os Critérios de Bethesda foram revisados em

workshop do National Cancer Institute, conforme Tabela 4 (URSO et al. 2008).

Tabela 4: Critérios de Bethesda Revisados.

- CCR diagnosticado em paciente com menos de 50 anos;

- Presença de CCR sincrônico ou metacrônico ou outro tumor extracolônico

associado a síndrome, independente da idade;

- CCR com histologia MSI-H* diagnosticado em paciente com menos de 60 anos;

- CCR diagnosticado em um ou mais parentes de primeiro grau com tumor

relacionado à síndrome, com um dos tumores tendo sido diagnosticado antes dos 50

anos;

- CCR diagnosticado em um ou mais parente de primeiro ou segundo graus com

tumores relacionados à síndrome, independente da idade.

* A histologia MSI-H representa a presença de linfócitos infiltrando o tumor, reação linfocítica

Crohn-like, diferenciação mucinosa ou em anel se sinete ou padrão de crescimento medular.

Apesar do conhecimento desses critérios, cerca de 85% dos CCR ainda são

diagnosticados em estádio avançado (SPEIGHTS et al. 1991; AVERBACH e

BORGES 2005. Pela elevada incidência, alta prevalência de indivíduos em fase sub-

clínica, existência de precursores conhecidos, possibilidade de diagnóstico precoce,

e, benefícios do tratamento e do seguimento, famílias/indivíduos com suspeita de

síndrome de Lynch são elegíveis para estratégias de prevenção primária e secundária

(BAUDHUIN et al. 2005; GOULART et al. 2005).

Dentre os conceitos epidemiológicos, o rastreamento é um dos mais

importantes. Rastreamento pode ser definido, segundo MORRISON (1998), como “a

investigação de pessoas assintomáticas a fim de classificá-las como possuindo alta ou

baixa probabilidade de desenvolver uma determinada doença”. O objetivo básico de

uma estratégia de rastreamento é detectar uma doença antes de sua manifestação

Introdução 10

clínica, em uma fase em que ela possa ser tratada com altos índices de cura. A

extensão deste objetivo é reduzir a morbidade e a mortalidade atribuídas à doença.

As características ideais de um instrumento de rastreamento são: segurança, boas

sensibilidade e especificidade, boa relação custo-efetividade, fácil aplicação, e,

principalmente, possibilitar formas de tratamento menos agressivas em doenças,

devido a diagnósticos mais precoces. Além disso, aplicar estratégias de seguimento

restritas aos indivíduos considerados como de alto risco.

Apropriados testes pré-sintomáticos podem ser oferecidos para reduzir a

mortalidade entre os membros das famílias de risco e seus parentes fora de risco

podem evitar um seguimento intensivo desnecessário e incerto. É essencial

identificar indivíduos com risco aumentado para oferecer programas de seguimento

adequados para prevenir o desenvolvimento de tumores ou reconhecê-los em estágio

precoce. A colonoscopia é, atualmente, o mais importante recurso, útil não apenas

para o diagnóstico, como também para o estadiamento e tratamento do CCR. Possui

elevada sensibilidade e especificidade, além de permitir a execução de biópsias e

remoção de lesões, reduzindo significativamente a incidência e a mortalidade do

CCR. A Sociedade Americana de Câncer (American Cancer Society - ACS)

recomenda a colonoscopia a cada 5 anos a partir dos 40 anos, ou 10 anos antes do

diagnóstico mais precoce se o indivíduo tiver dois ou mais parentes de primeiro grau

com CCR, ou um único parente com CCR ou pólipos adenomatosos diagnosticados

antes dos 60 anos (HENDRIKS et al. 2006a). Para as mulheres, também se

recomenda realizar exames de urina, biópsia de endométrio e ultrassonografia

transvaginal anualmente a partir de 30-35 anos.

Introdução 11

O seguimento de famílias com diagnóstico clínico e/ou molecular da

Síndrome de Lynch deve ser feito com base nas seguintes orientações: colonoscopia

com 1-2 anos de intervalo e início entre os 20-25 anos; ultrassonografia transvaginal

anual, com início entre os 25-35 anos; ultrassonografia abdominal e pélvica anual,

com início entre os 25-35 anos; exame de urina tipo I e citologia urinária anual, com

início entre os 25-35 anos, principalmente nas famílias com carcinoma de células

transicionais de vias excretoras renais; endoscopia digestiva alta com 1-3 anos de

intervalo, com início entre os 25-35 anos, principalmente nas famílias com tumores

gástricos; dosagem de CA-125 anual, com início entre os 25-35 anos, principalmente

nas famílias com câncer de ovário (ROSSI et al. 1998).

Para pacientes com Síndrome de Lynch deve ser considerada, na escolha da

conduta terapêutica, a colectomia total e anastomose ileorretal, independentemente

da localização do tumor no cólon. Essa conduta é indicada em razão da alta

probabilidade de o indivíduo desenvolver nova lesão colônica no decorrer de sua

vida. A histerectomia ou ooforectomia é uma opção para mulheres após terem

engravidado, de acordo com recente evidência de eficácia (CASE et al. 2008).

A era da genética molecular para a síndrome de Lynch começou nos anos

1990, quando PELTOMÄKI et al. (1993) identificaram um locus no cromossomo

2p16, através de análise de ligação (linkage analysis), como sítio para um gene de

predisposição para a síndrome de Lynch. Depois de um ano, um segundo locus no

cromossomo 3p21 foi identificado por LINDBLOM et al. (1993), na Suécia. Nessa

época, demonstrou-se também que tumores de pacientes com síndrome de Lynch

apresentavam uma mudança molecular característica, chamada de fenótipo de erro de

replicação (RER), o que atualmente é conhecido como MSI (Instabilidade de

Introdução 12

Microssatélites). O reconhecimento subseqüente de que a MSI é conseqüência de

defeito no sistema de reparo de erros de replicação do DNA levou à descoberta, nos

loci 2p16 e 3p21, dos genes MSH2 e MLH1, considerados os principais responsáveis

pela síndrome de Lynch. Os dois genes são responsáveis por aproximadamente 85-

90% das mutações conhecidas associadas à síndrome (PELTOMÄKI 2005;

GOECKE et al. 2006). Posteriormente foram identificados o locus 2q31-33,

correspondente ao gene PMS1 (postmeiotic segregation 1), o locus 7p22,

correspondente ao gene PMS2 (postmeiotic segregation 2) e o locus 2p16,

correspondente ao gene MSH6/GTBP (mutS homolog 6) (DRUMMOND et al. 1994;

PALOMBO et al. 1995). Mutações em MLH3 e EXO1 foram encontradas tanto em

famílias que preenchem os critérios de Amsterdam quanto em famílias que não

preenchem, porém com relevância biológica ainda não esclarecida (LAGERSTEDT

et al. 2007).

Mutações no sistema de reparo causam freqüentes alterações nos tratos

polióligo ou em seqüências repetitivas de bases, espalhadas pelo DNA, também

conhecidas como microssatélites. Cerca de 90% dos indivíduos portadores de CCR e

síndrome de Lynch apresentam instabilidade de microssatélites (MSI) (CHAPELLE

2005).

O sistema de reparo do DNA realiza a função de revisão ou integridade,

durante a replicação, mantendo sua fidelidade por reparar os danos de mal-

pareamento de bases ou inserção/deleção de alças de DNA (loops). Este processo é

altamente conservado desde a Escherichia coli até os mamíferos. As proteínas de

reparo também são importantes no processamento de erros de bases incorporados por

danos ao DNA incluindo o O

-methylguanine 8-oxoguanine, adutos de cisplatina e

Introdução 13

fotoprodutos de ultravioleta. Multifuncionais, as proteínas também contribuem para a

checagem dos pontos G1 e G2 do ciclo celular, na resposta apoptótica iniciada por

danos ao DNA e para fidelidade da recombinação genética (FELTON et al. 2007b).

Células que perdem a função efetiva de reparo do DNA acumulam mutações em

taxas muito altas, geralmente em genes importantes na carcinogênese, como o APC,

TP53, Kras, entre outros. Como os genes do sistema de reparo estão envolvidos

também na sinalização da apoptose induzida por danos, sua inativação, além de

aumentar a ocorrência de mutações, também proporciona vantagens seletivas de

crescimento para as células alteradas (PELTOMÄKI 2005). Uma mutação que

inativa algum desses genes leva a um acúmulo de mutações na célula a cada divisão

celular, resultando na transformação maligna (BLANES e DIAZ-CANO 2006).

O fenótipo MSI-H requer a inativação bi-alélica do gene de reparo

responsável pelo desenvolvimento do tumor, através do modelo “two-hit”. Nos

tumores da síndrome de Lynch a inativação somática do alelo selvagem

remanescente pode ocorrer por diferentes mecanismos: perda de heterozigose (LOH),

mutação somática e metilação do promotor.

As mutações somáticas como o segundo hit têm sido encontradas tanto em

tumores deficientes para MLH1 quanto para MSH2, apesar de em baixas freqüências.

A perda do alelo selvagem tem sido detectada em 33% a 86% e acredita-se que esta

seja o maior mecanismo somático para o segundo hit. A contribuição da metilação de

MLH1 como segundo hit é controversa, pois muitos pesquisadores acreditam que

esta seja uma diferenciação entre os tumores da síndrome de Lynch e os esporádicos.

Entretanto, a metilação de MLH1 tem sido detectada de 0% a 46% dos CCRs da

síndrome de Lynch, com freqüente metilação em adenomas colorretais (53%). Dessa

Introdução 14

maneira, a relevância da metilação mono-alélica na síndrome de Lynch não está

excluída. Os padrões de eventos somáticos diferem, dependendo do tecido e da

mutação germinativa, o que pode explicar, em parte, a susceptibilidade para tumores

em diferentes órgãos da síndrome de Lynch (IMAI e YAMAMOTO 2008).

O reconhecimento de indivíduos e famílias com predisposição hereditária ao

câncer de acordo com características genéticas e clínicas, somado à vigilância

intensiva e a programas de manejo, podem contribuir de forma substancial para

melhores resultados relacionado ao CCR. A análise de MSI pode ser útil nesse

reconhecimento, contribuindo na decisão de indicação do teste de predisposição

germinativa.

Quando se identifica a mutação germinativa em uma família, deve-se oferecer

o teste genético aos indivíduos sob risco, condição sine qua non para o diagnóstico

definitivo de portadores assintomáticos da predisposição ao câncer (ENG et al.

2000). Além disso, a falta das proteínas de reparo no tecido tumoral está altamente

relacionada com a MSI (BAUDHUIN 2005).

O freqüente achado de mutações germinativas em um dos genes de reparo do

DNA em famílias suspeitas para síndrome de Lynch não só confirma o diagnóstico,

como também identifica os membros da família que são portadores e precisam,

portanto, de um seguimento mais agressivo. Devido ao fato de que os filhos de pais

afetados nestas famílias também devem ser considerados sob risco, mesmo sem as

análises de mutação terem sido realizadas, o real benefício do rastreamento de

determinada mutação, freqüentemente reside na habilidade de caracterizar e assim,

excluir os não portadores (LYNCH et al. 2007).

Introdução 15

Devido à heterogeneidade do espectro de mutações nos genes do Sistema de

Reparo do DNA, o rastreamento das mutações é demorado e caro. Assim, aliado à

história familiar, MSI e a imunoistoquímica podem ser utilizadas para identificar

famílias elegíveis para a análise de mutação. Em 1997, o critério de Bethesda propôs

que as famílias que preenchessem tais critérios deveriam ser selecionadas para a

análise de MSI. A técnica de MSI e de imunoistoquímica é usada como pré-seleção

para selecionar indivíduos elegíveis para análises de mutação do DNA no sangue

através de DGGE, MLPA e seqüenciamento, o que pode evitar análises demoradas,

caras e desnecessárias.

De acordo com JONG et al. (2004), fazem parte da síndrome os genes MLH1,

MSH2, MSH6, PMS2 e PMS1. O banco de dados de mutações descritas do

International Society of Hereditary Gastrointestinal Tumors (www.insight-

group.org) publicou no ano de 2004 em seu levantamento 448 mutações patogênicas,

sendo 50% em MLH1, 39% em MSH2 e 7% em MSH6. Já o mais recente banco de

dados do Canadá (www.med.mun.ca/MMRvariants), baseado em mutações

publicadas na literatura revela alterações nos genes sendo 39% em MLH1, 40% em

MSH2, 16% em MSH6 e 6% em PMS2 (NILBERT et al. 2008).

Mutações patológicas têm sido encontradas em 88% de famílias que

preenchem os critérios de Amsterdam, em 59% de famílias que não preenchem os

critérios de Amsterdam e em 80% de pacientes que apresentam MSI (LYNCH et al.

2007).

Um estudo recente sugere, através de análises de segregação de CCR familial

sem a presença de mutações nos genes de reparo relacionados à síndrome, a

existência de raros alelos em padrão de herança recessiva. A proteína MLH3 interage

Introdução 16

com MLH1 através da porção C-terminal e a proteína EXO1 é uma nuclease 5´-

3´específica de ligação tanto ao MLH1 quanto ao MSH2, participando das funções

de reparo e de recombinação. Foram encontradas mutações missense e SNPs nestes

genes em pacientes com CCR familial, mas em menor freqüência ou ausentes em

controles saudáveis. O estudo concluiu que tais alterações em alelos podem estar

envolvidas no risco de CCR familial, possivelmente como genes modificadores ou de

penetrância reduzida (KIM et al. 2007).

Famílias que preenchem os critérios clínicos para síndrome de Lynch, mas

que não apresentam mutação em nenhum dos genes de reparo não podem ser

considerados como portadores da síndrome. Estas famílias representam um

importante grupo para estudos clínicos e moleculares, pois pouco se sabe sobre as

alterações genéticas responsáveis pelo câncer nessas famílias. Dentro da

heterogeneidade clínica do CCR familial, um subgrupo de indivíduos com maior

idade de acometimento, tumores MSS localizados do lado esquerdo e ausência de

tumores em outros locais tem sido caracterizadas recentemente como “Câncer

Colorretal Familial do tipo X”. Tais famílias apresentam aumento de risco de

desenvolvimento apenas de CCR, e este risco parece ser menor do que o apresentado

pelas famílias que apresentam mutação nos genes de reparo (BOLAND 2005; CASE

et al. 2008).

Novos estudos metilação germinativa hemi-alélica de MLH1, chamada de

epimutação, como um novo caso na síndrome de Lynch. Foi demonstrada a

transmissão vertical do alelo metilado de MLH1. Outros autores mostraram

epimutação germinativa de MLH1 em um homem que teve o alelo metilado herdado

de sua mãe, na qual o mesmo alelo não se encontrava metilado, sugerindo que a

Introdução 17

epimutação surgiu como um evento de novo. A epimutação herdada em MSH2

também já foi encontrada em uma família com síndrome de Lynch (IMAI e

YAMAMOTO 2008).

Mutações somáticas no oncogene BRAF têm sido usadas para distinguir entre

tumores associados à Síndrome de Lynch e tumores esporádicos que exibem

instabilidade de microssatélites. As mutações em BRAF foram primeiramente

demonstradas em melanomas e outros tipos de cânceres. Aproximadamente 10% dos

cânceres colorretais esporádicos possuem mutações em BRAF, sendo que a mutação

é quase sempre a V600E. Existe forte associação entre o tipo da mutação em BRAF e

a MSI nos CCR e, mais do que isso, tal mutação é freqüentemente associada à

metilação do promotor do gene MLH1, e quase nunca encontrada em tumores da

síndrome de Lynch (LAGERSTEDT et al. 2007).

Assim, a análise de BRAF no tecido tumoral é uma estratégia efetiva e de

baixo custo para distinguir entre o evento somático da hipermetilação e uma possível

mutação germinativa no gene MLH1. Se a mutação específica V600E for encontrada

em BRAF, no DNA tumoral, a análise de mutação no gene MLH1 não será então

indicada (HENDRIKS et al. 2006a). No estudo de LAGERSTEDT et al. (2007), a

presença da mutação V600E excluiu o diagnóstico da Síndrome de Lynch em 5

famílias de 7 que não preenchiam os critérios de Amsterdam e que mostraram

ausência de expressão de MLH1.

A síndrome de Lynch representa um problema de saúde pública altamente

significativo. Acredita-se que seja uma das síndromes hereditárias mais comuns na

espécie humana, com incidência entre 1:2000 e 1:660 (CHAPELLE 2005). É

fundamental que famílias/pacientes sob risco realizem programas de rastreamento e

Introdução 18

protocolos de manejo, a fim de otimizar a prevenção de câncer. Vale ressaltar que

ainda não existem dados sobre a incidência de síndrome de Lynch no Brasil.

A grande maioria dos estudos foi realizada em populações

predominantemente brancas, de países industrializados. A situação pode ser diferente

em países menos industrializados e em populações não-brancas (CHAPELLE 2005).

Poucos estudos sobre a síndrome de Lynch foram publicados no Brasil. Em

estudo no estado de Minas Gerais os pesquisadores detectaram 25% de MSI nos

pacientes (FUZIKAWA et al. 1997). CARVALHO et al. (2005) encontraram 22

(12%) pacientes dentre 184 que apresentaram instabilidade para BAT26. COSSIO et

al. (2007) avaliaram os marcadores BAT26 e BAT25 em 216 pacientes do sul do

Brasil quanto as suas variações polimórficas. Encontraram 6% e 7% de variação

alélica, respectivamente, evidenciando a necessidade dos estudos comparativos entre

tecido tumoral e normal de cada paciente. ROSSI et al. (2002) analisaram 25 famílias

não relacionadas, suspeitas de síndrome de Lynch. Foram encontradas 10 mutações

(40%), sendo 8 no gene MLH1 e 2 no gene MSH2. Esse resultado não é coincidente

com os dados da literatura, onde existe um equilíbrio na freqüência de mutações

nestes dois principais genes de reparo. Portanto, esses resultados sugerem que o

perfil de mutações nos genes de reparo nas famílias brasileiras possa ser diferente do

perfil de famílias européias (principalmente finlandesas e holandesas) e americanas.

Recentemente, um estudo revelou duas mutações germinativas em MLH1 não

descritas encontradas em pacientes brasileiros (DOMINGUEZ 2008). Com relação à

América do Sul, poucos trabalhos foram publicados até o momento, com séries

pequenas de pacientes e que não elucidam os pontos aqui colocados (SARROCA et

al. 2000; SARROCA et al. 2003, 2005; GIRALDO et al. 2005).

Introdução 19

Cabe ressaltar ainda que o tratamento e o acompanhamento de pacientes com

síndrome de Lynch é diferente em relação aos pacientes com CCR esporádico

(MÜLLER et al. 2001; VASEN 2005). Para pacientes com câncer de cólon e

síndrome de Lynch deve ser considerada, por exemplo, na escolha da conduta

terapêutica, a colectomia total e anastomose ileorretal, independentemente da

localização do tumor no cólon. Tal conduta é indicada em razão da alta probabilidade

de o indivíduo desenvolver nova lesão colônica no decorrer de sua vida. Por isso, é

importante identificar, entre os pacientes com CCR, aqueles portadores da síndrome

de Lynch, pois, não só o paciente poderá se beneficiar de uma melhor definição da

conduta terapêutica a ser empregada, como também os familiares assintomáticos

portadores da síndrome poderão ser identificados.

Finalmente, é importante estudar os genes de reparo relacionados à síndrome

de Lynch, particularmente em razão de evidências de suas heterogeneidades

fenotípica e genotípica (LYNCH et al. 2005). O conhecimento na área adquirido

pode ser traduzido em rastreamento e protocolos de manejo específicos. No futuro,

esse conhecimento pode, até mesmo, contribuir para o desenvolvimento de drogas

alvo-específicas com base molecular, através de onco-genômica, proteômica,

rastreamento altamente direcionado (high-throughput screening) e bioinformática.

Introdução 20

1.3 IMUNOISTOQUÍMICA

A imunoistoquímica é uma técnica que possui grande destaque em detectar

alterações moleculares como prática clínica de exames laboratoriais, unindo os

achados dos estudos da pesquisa básica à rotina de diagnóstico dos pacientes, já que

se trata de uma técnica de custo acessível a muitos laboratórios. Muitas patologias

resultam em produção anormal de moléculas, o que através dos avanços da biologia

molecular, passam a ser detectáveis, permitindo melhor diagnóstico, prognóstico ou

mesmo planejamento do tratamento das doenças.

O princípio básico da imunoistoquímica constitui-se na defesa imunológica

do organismo estimulada pela exposição ao que lhe é estranho. Na resposta

imunológica adquirida humoral os linfócitos B são capazes de desenvolver

anticorpos específicos contra antígenos estranhos, visando sua posterior destruição.

Assim, a imunoistoquímica se baseia no desenvolvimento de anticorpos

específicos (monoclonais) que reconhecem as proteínas de interesse do tecido,

simulando a resposta imunológica. A técnica mais usada para produção de anticorpos

monoclonais consiste na imunização de camundongos com o antígeno objeto de

estudo. Os linfócitos B coletados do baço ou linfonodo do camundongo são

fusionados a uma linhagem tumoral de linfócito B imortalizada (hibridoma). Os

hibridomas cultivados sofrem posteriormente uma triagem buscando os clones que

produzem o anticorpo de interesse (ABBAS et al. 2003).

A técnica de imunoistoquímica é utilizada para detectar a presença de

antígeno nos cortes histológicos de tecidos pelo uso de anticorpo específico para

aquele antígeno ligado a uma enzima. A enzima converte um substrato incolor em

Introdução 21

uma substância insolúvel colorida que se precipita no sítio do corte do tecido onde

está o anticorpo e também, o antígeno, observado posteriormente por microscopia de

luz convencional.

A interpretação diagnóstica através dos métodos imunoistoquímico depende,

na maioria das vezes, da boa qualidade dos espécimes utilizados e da preservação

dos seus antígenos, que requer cuidados prévios ao longo de toda a rotina

histopatológica, incluindo obtenção, o manuseio e a fixação adequados. O uso de

fixadores à base de formaldeído pode alterar, destruir ou “mascarar” alguns

antígenos ou epítopos, dada à sua composição e processo de ligação às moléculas,

formando pontes aldeído-proteína e alterando a estrutura terciária dos antígenos, que

podem prejudicar as ligações entre antígeno e anticorpo (SANTOS et al. 1999).

As amostras fixadas em formalina, especialmente quando não é possível obter

o controle do pH ou do tempo de fixação, requerem recuperação antigênica para a

grande maioria dos epítopos habitualmente pesquisados, já que este processo elimina

as ligações cruzadas entre as moléculas, incluindo entre certas cadeias de

aminoácidos não hidrolisados por digestão química (SANTOS et al. 1999).

A imunoistoquímica é indicada para mutações que resultam em proteína

truncada, como as nonsense, frameshif, splicesite mutations e grandes rearranjos

cromossômicos. Mutações missense mudam a composição da proteína devido a troca

do aminoácido. Os efeitos fenotípicos são em princípio mais drásticos quanto maior

for a diferença na natureza química das cadeias laterais dos resíduos dos aminoácidos

trocados, e também dependem altamente do papel que esse resíduo desempenha na

estrutura e função da proteína, podendo resultar na inativação da proteína, ou em

uma atividade anormal da mesma. Assim, a significância patológica destas mutações

Introdução 22

é incerta, já que testes de funcionalidade para acessar a competência das proteínas de

reparo in vitro não está disponível atualmente. Assim, a muitas das mutações

missense são caracterizadas como “variantes não classificadas”, que não servem,

portanto, aos propósitos diagnósticos, já que nestes casos a proteína pode ser

funcionalmente anormal, mas ainda ser detectada na imunoistoquímica (HENDRIKS

et al. 2006a).

As mutações nonsense ocorrem quando a troca das bases gera um códon de

terminação, o que geralmente culmina com a formação de uma proteína truncada. As

mutações frameshift ocorrem quando a inserção ou deleção de bases muda a fase de

leitura do DNA, podendo também gerar um códon de terminação prematura e

conseqüentemente uma proteína truncada. As splicesite mutations ocorrem quando

mutações nas regiões de splicing levam a sítios alternativos de splicing podendo

resultar em um processamento errado do RNA.

A grande maioria das mutações nos genes MLH1 e MHS2 resultam em

expressão imunoistoquímica anormal de suas respectivas proteínas (BOLAND 2005;

KIRK 2006). Portanto, outra ferramenta diagnóstica importante é a análise da

expressão imunoistoquímica dessas proteínas. A pesquisa da expressão

imunoistoquímica das proteínas MLH1 e MSH2, no tecido tumoral de pacientes

suspeitos de síndrome de Lynch, tem se mostrado eficaz como exame de

rastreamento para indicação do seqüenciamento do respectivo gene (MÜLLER et al.

2001; BAUDHUIN 2005). Apesar de ainda não haver consenso na literatura sobre a

indicação de investigação do gene MSH6, o número de famílias com mutações

detectadas em MSH6 tem aumentado substancialmente (JIRICNY e NYSTRÖM-

LAHTI 2000). Até o momento, a freqüência de mutação em MSH6 nas famílias com

Introdução 23

síndrome de Lynch varia bastante de acordo com a população estudada e o número

de pacientes analisados, variando de 6% a 16% (DOVRAT et al. 2005). LINDOR et

al. (2002) encontraram 100% de sensibilidade da imunoistoquímica na detecção de

MSI com amostras de 1.144 pacientes considerados de alto risco para CCR.

Como as proteínas de reparo do DNA formam heterodímeros, padrões de

imunoistoquímica distintos são esperados. O reconhecimento de erros de bases

simples e de loops de inserção e deleção (IDLs) é realizado pelo heterodímero MSH2

e MSH6 (MutSα), enquanto que o heterodímero MSH2 e MLH3 reconhece os IDLs

na falta de MSH6. O heterodímero MLH1 e PMS2 (MutLα) medeia a interação do

reconhecimento do erro e de seu reparo (HALVARSSON et al. 2006). Na falta de

PMS2, a proteína MLH3 é a candidata para formar o heterodímero com MLH1.

Assim, indivíduos podem ser selecionados para a análise de mutação conhecendo-se

qual gene deverá ser testado primeiro.

Os anticorpos utilizados na imunoistoquímica apresentam padrão de

coloração nuclear. Células tumorais apresentando coloração citoplasmática, ausência

ou redução de coloração na presença de células não-neoplásicas com coloração

nuclear, serão consideradas como tendo um padrão anormal.

Introdução 24

1.4 INSTABILIDADE DE MICROSSATÉLITES

O DNA humano é formado por regiões codificantes, que correspondem a

menos de 5% do genoma humano, e por regiões não codificantes, que compreendem

cerca de 95% do genoma. Dentre as regiões não codificantes, as sequências

repetitivas correspondem a pelo menos 50% ou mais (LANDER et al. 2001). Estas

seqüências são divididas em repetições dispersas ou satélites, sendo assim chamadas

devido ao aparecimento, na espectrometria ótica, de uma banda “anexa”, ou

“satélite”, junto à banda principal (ALBERTS et al. 1999; BAUDHUIN et al. 2005).

Os satélites são classificados de acordo com a extensão da seqüência repetitiva.

Os microssatélites pertencem a uma classe das mais abundantes de seqüências

repetitivas intergênicas do genoma eucariótico, e contém repetições de motivos de 1

a 5 pares de bases, podendo chegar a ter até 200 pares de base de extensão total

(ALBERTS et al. 1999). São chamados de mononucletotídeos para repetições de

mesma base, como por exemplo, repetições de poliadeninas; dinucleotídeos para

repetições de duas bases, como por exemplo, de citosina/adenina (CA); e assim por

diante até o agrupamento de seis bases. Em relação a freqüência, a repetição

dinucleotídica de CA são as mais comuns, totalizando 0,5% do genoma; as

repetições mononucleotídicas A e T representam 0,3% e as repetições dinucleotídicas

GT ou AG representam 0,2%. As repetições mononucleotídicas de C ou de G são

raras e as dinucleotídicas CG são mais propensas a metilação e subseqüente

desaminação, resultando em TG, ou em CA na fita oposta (FERNANDES 2007).

Apesar de serem altamente polimórficos nas populações humanas, eles permanecem

Introdução 25

estáveis dentro do pouco tempo relativo que é o tempo de vida de um indivíduo

(SAKURAI et al. 2007).

Os microssatélites são úteis como marcadores moleculares devido a sua vasta

presença no genoma, caracterização por PCR, padrão de herança mendeliana co-

dominante e seu polimorfismo extremo, mas sua origem e função ainda não estão

claras. Eles têm sido muito importantes em delineação de linhagens celulares,

clonagem posicional, e muitas outras implicações em medicina forense. Qualquer

expansão ou redução anômala das repetições devido à instabilidade de

microssatélites resulta em bandas extras (BLANES e DIAZ-CANO 2006).

Seqüências repetitivas compostas de pequenas unidades como os

microssatélites, são particularmente propensas a sofrerem deslizes das DNA

polimerases por desalinhamento da dupla fita durante a replicação, resultando

freqüentemente em desalinhamentos das fitas de DNA. Se não forem reparadas, estes

erros se fixam como mutações, através de inserções ou deleções de um ou mais

repetições durante as replicações subseqüentes (IMAI e YAMAMOTO 2008).

As proteínas produzidas a partir dos genes do Sistema de Reparo do DNA

exercem sua função de forma contínua, preservando a integridade do genoma. A

observação de alterações nas seqüências de microssatélites, em um determinado

tecido tumoral, demonstra ausência de função normal no reparo do DNA.

Diante da observação de que o DNA extraído de células de alguns tumores

apresentava alterações no número de bases repetidas, em um ou mais microssatélites,

comparado aos mesmos microssatélites existentes em amostras de DNA de um tecido

normal do mesmo indivíduo, esta alteração foi denominada instabilidade de

microssatélites (MSI). A MSI foi descrita pela primeira vez em 1993, na Síndrome

Introdução 26

de Lynch, levando a uma via alternativa de tumorigênese (PELTOMÄKI et al. 1993).

Assim, o fenótipo MSI, no qual as células acumulam alterações no

comprimento das repetições dos microssatélites, é utilizado por refletir a deficiência

do Sistema de Reparo do DNA em corrigir erros que ocorrem durante a replicação do

DNA (SAKURAI et al. 2007). Assim, tumores da via MSI acumulam mutações que

resultam em ativação ou inativação de genes relacionados ao câncer, tanto com papel

negativo quanto positivo no crescimento e sobrevivência celular, os quais conduzem

aos múltiplos passos da carcinogênese (IMAI e YAMAMOTO 2008).

A perda de atividade das proteínas de reparo acelera significativamente a taxa

de acumulação de mutações em genes responsáveis por restringir o crescimento

celular, o que fornece uma hipótese razoável para o rápido crescimento dos

adenomas e a transição para carcinoma, visto na síndrome de Lynch (BOLAND et al.

2008).

A MSI em genes alvo freqüentemente leva a mutações frameshift e inativação

da função das proteínas afetadas, provendo assim, uma vantagem seletiva de

crescimento para as células com o sistema de reparo deficiente. Já foram relatados 32

genes alvo no genoma humano que possuem repetições mononucleotídicas nas suas

regiões condificantes (BOLAND et al. 2008). Como exemplos, os genes β-catenina,

TCF-4, caspase-5, PTEN, E2F4, MSH3, MSH6 e o receptor insulin-like growth

factor II mostram seqüências repetitivas em suas regiões codificantes (FISHEL 2001;

PLASCHKE et al. 2002; BAUDHUIN et al. 2005). O receptor TGFβII (transforming

growth factor β receptor II) e o gene pró-apoptótico BAX são freqüentemente

inativados por mutações nos tratos mononucleotídicos presentes nas suas regiões

codificadoras. Estes achados são considerados como a ligação causal entre MSI e

Introdução 27

mutações em genes relacionados ao câncer e são também exemplos persuasivos de

diferenças entre as vias de mutação e de supressão para o câncer. Regiões não

codificantes também possuem papel na MSI. Estudos mostram a relação de

repetições em introns dos genes ATM e hMRE11 e na região promotora do gene

MMP-3 (matrix metalloproteinase-3) com a tumorigênese de MSI (IMAI e

YAMAMOTO 2008).

Os microssatélites podem ainda ser reconhecidos por fatores de transcrição ou

afetar a estrutura da cromatina e conseqüentemente, a conformação do DNA

(FERNANDES 2007).

Dessa maneira, é como se as células tumorais apresentassem “impressões

digitais” defeituosas em seu DNA tumoral, quando comparadas aos tecidos normais

do organismo do mesmo indivíduo (PINHO et al. 2005).

A MSI pode ser analisada comparando o padrão eletroforético do DNA do

tumor com o padrão do DNA do tecido colônico normal, amplificados por PCR. A

classificação é feita de acordo com a freqüência de instabilidade dos marcadores,

sendo considerada estável quando nenhum marcador se apresentar instável (MSS),

alta quando mais de 30% dos marcadores forem instáveis (MSI-H) e baixa quando

menos de 30% dos marcadores forem instáveis (MSI-L), seguindo a sugestão do

Instituto Nacional de Câncer dos Estados Unidos – NCI (National Cancer Institute),

dentre o painel proposto de 5 marcadores: dois mononucleotídeos (BAT25 e BAT26)

e três dinucleotídeos (D2S123, D5S346 e D17S250) (BOLAND et al. 1998;

JENKINS et al. 2007).

Existe ainda a sugestão de classificar o fenótipo MSI qualitativamente em

dois subgrupos, o Tipo A e o Tipo B, de acordo com o modelo de mudança no

Introdução 28

comprimento dos microssatélites dinucleotídicos. O Tipo A seria definido como

mudanças no comprimento ≤6 pb e o Tipo B como mudanças mais drásticas, ≥8 pb.

Em tumores colorretais a MSI Tipo B tende a ocorrer na maioria dos marcadores

analisados, enquanto que o Tipo A tem a tendência de ser mais notado em um

número limitado de marcadores. Desta maneira, os tipos A e B podem corresponder a

MSI-L ou -H, respectivamente. Os autores mostraram que todos os tumores do Tipo

B foram categorizados em MSI-H e todos os tumores MSI-L exibiram instabilidade

do Tipo A (SAKURAI et al. 2007).

O diagnóstico de MSI é realizado verificando-se características de

microssatélites no tecido tumoral. Após a extração de DNA, é feita sua amplificação

por PCR, e, em seguida, a extensão de um ou mais microssatélites é verificada por

eletroforese.

Assim, existem atualmente três razões principais para se testar MSI: é uma

ferramenta de rastreamento de pacientes com Síndrome de Lynch, é um marcador

prognóstico e pode ser um preditor de processos terapêuticos e de seguimento

(HANSEN et al. 2006).

Introdução 29

1.5 Proteínas de Reparo do DNA

O sistema de reparo do DNA consiste em várias proteínas nucleares que agem

em conjunto para detectar e reparar erros que ocorrem durante a fase S da replicação

do DNA. O reparo dos erros de replicação é necessário para a transição da fase S

para a G2 para a mitose.

Os elementos críticos para o sistema de reparo mais relevantes na síndrome

de Lynch são as famílias de proteínas homólogas ao MutS (MSH) e homólogas ao

MutL (MLH). As proteínas agem em heterodímeros, onde a proteína MSH2 é a peça

obrigatória do sistema, que dimeriza com dois outros membros da família, MSH6 e

MSH3 através de uma ligação por um ADP em uma configuração aberta. O

heterodímero MSH2-MSH6 (MutSα) monitora, reconhece e se liga

preferencialmente a erros de base simples, como um pareamento G-T ou A-C, ou em

repetições mononucleotídicas. Ao reconhecer um erro, através de um processo que

consome energia, os complexos MutSα livres interagem com a fita de DNA

sintetizada no local do erro, ocorre a troca de ADP para ATP no dímero de forma a

fechar sua configuração, e então ele forma um “grampo” deslizante ao redor do

DNA, abraçando-o. Alternativamente, o heterodímero MSH2-MSH3 (MutSβ)

reconhece preferencialmente erros grandes de loops, que podem ocorrer nas

repetições dinucleotídicas ou outras seqüências repetitivas (BOLAND et al. 2008).

O complexo MutS sinalizam o lugar do reparo, entretanto, para o processo

completo, proteínas adicionais são necessárias. A família de proteínas MutL consiste

na peça obrigatória, o MLH1, que dimeriza com as proteínas PMS2, PMS1 e também

MLH3. Pouco se sabe sobre a família MutL além da função do heterodímero MLH1-

Introdução 30

PMS2, que é chamado de MutLα. Este heterodímero possui atividade de

endonuclease, interage com o complexo MutS-DNA e juntos, com a ExoI, PCNA e

outras enzimas necessárias à síntese do DNA, destroem a nova fita no local do erro e

re-sintetizam a fita de DNA.

Na presença de mutação germinativa em MSH2 a ausência da respectiva

proteína e usualmente vista em conjunto com a ausência de expressão de MSH6. Isto

porque a maioria das mutações em MSH2 criam stop códons prematuros, alteram os

sítios de splicing, ou são grandes deleções ou rearranjos no gene, o que provoca a

total ausência de expressão protéica. Deleções nos exons 1 a 6 são particularmente

comuns, e as grandes deleções podem chegar a até 1/3 das mutações germinativas em

MSH2 (BOLAND et al. 2008).

A síndrome de Lynch causada por mutações em MLH1 é mais complicada.

Na maioria dos casos de perda de expressão de MLH1 por uma deleção ou um stop

códon prematuro ocorre também a perda de expressão de PMS2 na

imunoistoquímica. Entretanto, a freqüência de mutações missense é mais alta do que

em MSH2. Algumas destas mutações levarão à perda de atividade enzimática de

MLH1, mas as expressões protéicas de MLH1 e PMS2 podem ser preservadas, de

forma a provocar uma leitura falsamente “negativa”. Um cenário comum é o de

encontrar marcação fraca ou ambígua para MLH1 com ausência de marcação para

PMS2, o que parece ser mais representativo de uma mutação missense em MLH1. As

mutações missense que possuem maiores possibilidades de serem patogênicas são as

localizadas em domínios de interação entre MLH1 e PMS2 ou ExoI, ou entre os

heterodímeros MutS e MutL (BOLAND et al. 2008).

Introdução 31

O uso de imunoistoquímica para PMS2 pode ser útil nos casos inconclusivos

da síndrome de Lynch “tipo MLH1”, já que, nos casos em que houver ambigüidade

de interpretação da expressão de MLH1, a perda de expressão em PMS2 é útil para

confirma o achado. Como a proteína MLH1 é expressa em menor abundância do que

a MSH2, é preciso experiência na interpretação das lâminas. Além disso, a expressão

das proteínas de reparo é suprimida em resposta ao estresse oxidativo e hipóxia, o

que também podem ser fatores de confusão (BOLAND et al. 2008).

A síndrome de Lynch causada por mutações em MSH6 produz fenótipo

atenuado, por causa da compensação parcial fornecida pela proteína MSH3. Os

tumores nestes casos tendem a ocorrer em idades mais tardias e com freqüente

desenvolvimento de câncer de endométrio em mulheres aos 70 anos (71%). Da

mesma forma como com MLH1, mutações missense em MSH6 aumentam o risco,

mas os tumores continuam a apresentar expressão protéica de MSH6 na

imunoistoquímica (BOLAND et al. 2008).

A síndrome de Lynch causada por mutações em PMS2 é a forma mais

desafiadora da doença devido a existência de um grande número de pseudogenes.

Estas mutações levam a um fenótipo atenuado com fraca história familiar e idades

mais avançadas de acometimento. Entretanto, existe uma sugestão de que mutações

em PMS2 seriam tão comuns as em MSH2. Os tumores “tipo PMS2” mostram MSI e

isolada perda de expressão de PMS2 em imunoistoquímica. O desafio diagnóstico é

distinguir esta doença de certas mutações missense em MLH1 que levam a

desestabilização e isolamento da proteína PMS2 (BOLAND et al. 2008).

A Figura 1 a seguir mostra como funciona o sistema de reparo do DNA.

Introdução 32

Legenda: A- A polimerase pareou erroneamente uma base G na fita-filha de acordo com um T não-

complementar da fita molde criando um mal-pareamento. B- O heterodímero hMSH2/hMSH6

(MutSα) se liga ao ADP e em uma configuração aberta monitora a fita de DNA recém sintetizada a

procura de erros de pareamento. Uma vez encontrado o erro G-T, ocorre a mudança de ATP por ADP,

e a configuração do MutSα é fechada, formando um grampo em torno do DNA. C- O grampo formado

pode migrar em qualquer direção do erro, e conforme esta ação ocorre, MutSα adicionais podem ser

recrutados ao local do erro. O MutSα se movimentando na direção 5´-3´ eventualmente encontra um

complexo PCNA-DNApolimerase, e de acordo com uma hipótese, desaloja as enzimas envolvidas na

síntese do DNA. D- A exonuclease I, juntamente com o MutL, recorta a fita-filha recém sintetizada

voltando ao local do erro, removendo a base mal-pareada. E- O erro é corrigido por re-síntese. (B)

Reconhecimento de erros de inserção/deleção de sequências pelo MutSβ. Lesões na forma de loops

são causadas pelo deslizamento de sequências repetitivas durante a replicação do DNA, e são

reconhecidas pelo heterodímero hMSH2/hMSH3 (MutSβ). Nesta ilustração o deslizamento criou um

pequeno loop na fita nascente de DNA, o que poderia levar a uma mutação por alteração no código de

leitura dada a inserção ou deleção de bases após a replicação.

Fonte: BOLAND et al. (2008).

Figura 1 - Sistema de reparo do DNA. (A) Reparo de um erro de nucleotídeo

simples na fase S pelo MutSα.

Objetivo

2 OBJETIVO

Este estudo teve os seguintes objetivos:

• Analisar a expressão imunoistoquímica das proteínas MLH1, MSH2, MSH6 e

PMS2 em adenocarcinomas de pacientes portadores de CCR, com critérios

clínicos para suspeita de síndrome de Lynch (Amsterdam I/II ou Bethesda);

• Padronizar a técnica de MSI, utilizando um painel de 10 marcadores, no

mesmo grupo de pacientes;

• Correlacionar os resultados com dados clínicos, anatomopatológicos, e de

antecedentes familiares.

Material e Métodos 34

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 PACIENTES

3.1.1 Aspectos Éticos

O estudo foi conduzido de acordo com a Resolução 196/96 que regulamenta a

pesquisa em seres humanos; e a resolução 340/04 que regulamenta a pesquisa em

genética humana. Todos os pacientes que aceitaram participar da pesquisa assinaram

o termo de consentimento livre e esclarecido. Os resultados dos testes serão

confidenciais divulgados apenas ao paciente, se assim desejar. O projeto foi

submetido ao Comitê de Ética e Pesquisa (CEP) do Hospital AC Camargo e obteve

parecer favorável em 30 de maio de 2006 sob todos os aspectos analisados sendo,

portanto, aprovado com a identificação 796/06.

3.1.2 Convocação dos Pacientes

Os pacientes selecionados foram convidados a participarem do estudo através

de carta-convite. Os participantes compareceram ao Hospital AC Camargo para

consulta de aconselhamento genético, que teve duração média de 1 hora e 30

minutos, para a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

3.1.3 Inclusão de Instituições

Devido ao fato de que o presente projeto de mestrado faz parte do estudo

“Avaliação da Freqüência de Mutações nos Genes de Reparo de DNA em Pacientes

Material e Métodos 35

com Suspeita de Câncer Colorretal Hereditário sem Polipose: Estudo Colaborativo

Sul-Americano”, aprovado pela FAPESP em 20 de abril de 2006, com registro

número 2005/05155-6 e pelo CEP do Hospital AC Camargo com registro número

781/06, os centros estrangeiros participantes Hospital de Las Fuerzas Armadas

(Montevideo, Uruguai) e Hospital Italiano (Buenos Aires, Argentina) também foram

incluídos nas análises. As amostras tumorais foram enviadas, revisadas e analisadas

no Hospital AC Camargo.

3.1.4 Seleção dos Pacientes

Os pacientes do Hospital AC Camargo, com heredograma cadastrado no

Registro de Câncer Colorretal Hereditário foram selecionados com base no

preenchimento dos critérios de Amsterdam I/II ou Bethesda. Os dados foram revistos

nos prontuários individuais e familiares, foi realizada a revisão de lâminas de cada

caso para confirmação do diagnóstico juntamente com o patologista e verificada a

disponibilidade de material biológico (tecido normal e tumoral).

Dentre os pacientes cadastrados no registro de câncer colorretal hereditário 85

pacientes possuíam peça de tumor colorretal identificada e revisada, pacientes que

foram efetivamente incluídos no estudo, dentro da Instituição. Além destes, 10

pacientes que fizeram acompanhamento posterior na Instituição e que, quando

convocados para o estudo se dispuseram a solicitar os blocos do local de tratamento

anterior, também foram incluídos no estudo.

Dessa maneira, foram incluídos no projeto 95 pacientes do Registro de

Câncer Colorretal Hereditário, Departamento de Cirurgia Pélvica, Hospital AC

Camargo – São Paulo, Brasil, que fizeram ou fazem o acompanhamento na

Material e Métodos 36

Instituição, 12 pacientes enviados pelo Hospital Italiano, Buenos Aires, Argentina

(apenas adenocarcinomas) e 3 pacientes (1 adenoma e 3 adenocarcinomas) pelo

Hospital Central de las Fuerzas Armadas, Montevideo, Uruguai.

3.1.5 Dados Clínicos

Foram levantados os dados clínicos dos pacientes que possuíam relevância

com os resultados dos testes que foram realizados para as futuras correlações com os

achados. De acordo com dados já descritos na literatura foram incluídos na ficha os

seguintes itens: classificação segundo história familiar, sexo, tumores diagnosticados,

localização do tumor colorretal, estadiamento TNM, presença de metástase, grau de

diferenciação do tumor, presença de embolização vascular sanguínea ou linfática,

invasão perineural, tipo histológico.

3.2 IMUNOISTOQUÍMICA

3.2.1 Anticorpos

A análise imunoistoquímica das proteínas de reparo em cortes parafinados foi

realizada utilizando-se os seguintes anticorpos:

1. MLH1 – clone 168-728 – BD PharMingen – diluição 1/600

2. MSH2 – clone FE11 – BD Calbiochem – diluição 1/1000

3. MSH6 – clone 44 – BD PharMingen – diluição 1/40

4. PMS2 – clone A16-4 - BD PharMingen – diluição 1/500

Material e Métodos 37

3.2.2 Protocolo para material em parafina

Os cortes histológicos presentes nas lâminas foram submetidos ao seguinte

protocolo para todos os anticorpos:

1) Desparafinização:

a) 3 banhos em xilol por 5 minutos

b) 4 banhos rápidos de etanol 100%

c) lavar em água corrente por 5 minutos

2) Recuperação antigênica

a) MLH1, MSH2 e MSH6

• Panela de Pressão e Tampão citrato pH 6,0

a. colocar lâminas na cuba de plástico e adicionar tampão até cobri-las

b. colocar 1500 ml de água destilada na panela

c. Programar a panela para 25 minutos ou quando começar a pressão deixar por

15 minutos

d. Desligar a panela (depois que acabar a pressão), retirar a cuba e esfriar por 20

minutos à temperatura ambiente

b) PMS2

• Banho-maria e Tampão EDTA + Tris pH 9,0

a. Banho Maria e tampão a 96˚C

b. Colocar as lâminas na cuba (redondas de plástico)

c. Incubar no banho por 40 minutos

d. Esfriar por 20 minutos à temperatura ambiente

- após a recuperação, lavar em água corrente por 5 minutos. Secar as lâminas

rapidamente com papel filtro e circular os cortes com caneta de silicone.

3) Bloqueio da peroxidase endógena

a. incubar as amostras em H

10 volumes (peróxido de hidrogênio 3%) por 3

vezes durante 5 minutos

Material e Métodos 38

b. lavar em água corrente por 5 minutos

4) Bloqueio de proteínas inespecíficas (para evitar ou reduzir o background)

a. adicionar 100 µl da solução Protein Block Serum-Free (Dako, Califórnia,

Estados Unidos)

b. incubar por 20 minutos em câmara úmida

c. retirar solução

5) Incubação com anticorpo primário

a. diluir o anticorpo com Antibody Diluent with Background Reducing

Component (Dako). Se o intervalo entre a diluição e o uso for longo, cobrir

com papel alumínio e deixar na geladeira

b. adicionar 100 µl do anticorpo diluído sobre o corte

c. incubar por 2 horas em câmara úmida

d. lavar cada lâmina separadamente com PBS 1X

e. lavar as lâminas em PBS 1X por 3 vezes durante 5 minutos

6) Amplificação (sistema polímero) - NovoLink Max Polymer (Novocastra, UK)

a. adicionar 100 µl de Post Primary Block Novolink

b. incubar por 30 minutos em câmara úmida

c. lavar cada lâmina separadamente com PBS 1X

d. lavar as lâminas separadamente com PBS 1X por 3 vezes durante 5 minutos

e. adicionar 100 µl de Polymer Novolink

f. incubar por 30 minutos em câmara úmida

g. lavar cada lâmina separadamente com PBS 1X

h. lavar as lâminas em PBS 1X por 3 vezes durante 5 minutos

7) Coloração - DAB (diaminobenzidine tetrahydrochloride)

d. diluir DAB 1:50 - Liquid DAB + Substrate Chromogen System (Dako,

Califórnia, Estados Unidos)

a. adicionar 100 µl de DAB nas lâminas por até 5 minutos, observando a

coloração marron

Material e Métodos 39

b. retirar o excesso de DAB em água destilada

c. lavar em água corrente por 5 minutos

d. incubar em Hematoxilina de Harris (Merek) por 1 minuto para contra-

coloração

e. lavar em água corrente para retirar o excesso de hematoxilina

f. passar rapidamente pelo Diferenciador (etanol + HCl)

g. lavar em água corrente por 5 minutos

8) Montagem das lâminas

a. 4 banhos rápidos em etanol 100%

b. banho rápido em etanol 100%+xilol

c. 3 banhos rápidos em xilol

d. pingar Entelan (Merck) na lamínula e colocar a lâmina

e. limpar lâmina com xilol

3.2.3 Protocolo para material congelado

1) Fixação

a. fixar o corte em paraformoldeído 2-4% imediatamente após o corte ou

retirada do freezer

b. aguardar 5 minutos

c. realizar 3 lavagens de 5 minutos cada com PBS + Tween 1%

d. lavar em água corrente por 5 minutos

e. lavar uma vez com água destilada

- prosseguir a partir do item 4 do protocolo para material em parafina descrito acima

(bloqueio de proteínas inespecíficas).

Material e Métodos 40

3.2.4 Soluções para Imunoistoquímica

1) Tampão citrato 10 mM pH 6,0

a. 12,6 g de ácido cítrico

b. água destilada q.s.p. 6,0 L

c. corrigir o pH com NaOH 2N

2) Tampão Tris-EDTA pH 9,0

a. 0,372 g de EDTA

b. 1,21 g de Tris

c. água destilada q.s.p. 1,0 L

d. corrigir o pH com NaOH 2N

3) Tampão PBS 0,01 M pH 7,4 20X (concentrado)

a. 160 g de NaCl

b. 27,31 g de fosfato de sódio dibásico

c. 4,86 g de fosfato de sódio monobásico

d. água destilada q.s.p. 1,0 L

4) Diferenciador

a. 500 ml de etanol 50%

b. 27 gotas de HCl

5) Água DEPC 0,02%

a. em 1 litro de água destilada, colocar 200 µl de DEPC (dietilpirocarbonato)

b. agitar por 2 horas, até dissolver o DEPC

c. esterilizar em autoclave

6) Parafolmoldeído em PBS

a. preparar PBS com 700 ml de água DEPC com:

4 g de fosfato de sódio monobásico

6,5 g de fosfato de sódio dibásico

b. agitar e aquecer a solução a 60˚C

Material e Métodos 41

c. após diluída a solução, acrescentar:

40 g de paraformoldeído (PFA – SIGMA P-6148)

d. agitar a 60˚C até dissolver

e. ajustar o pH a 7,2-7,4 com HCl ou NaOH

f. acrescentar água DEPC até completar 1 litro

3.2.5 Classificação Histológica

O adenocarcinoma colorretal leva em consideração a extensão da aparência

glandular do tumor que é dividida em bem diferenciado, quando este exibe mais de

95% de estruturas glandulares; moderadamente diferenciado, quando exibe de 50% a

95% de estruturas glandulares; pouco diferenciado quando apresenta de 5% a 50% de

estruturas glandulares; e os indiferenciados, que apresentam menos que 5% de

estruturas glandulares (classificação da OMS) (REDSTON 2004).

Na classificação histológica utilizada, que segue a OMS e internacionalmente

aceita, os tumores que apresentam glândulas e aspectos tubulares foram designados

como adenocarcinoma tubular; aqueles que apresentam mais que 50% de mucina

extracelular foram designados como adecarcinoma mucinoso; e aqueles que

apresentam entre 10 e 50% de mucina como adenocarcinoma com diferenciação

mucinosa (REDSTON 2004). Os adenocarcinomas mucinosos e os adenocarcinomas

com diferenciação mucinosa foram agrupados para as análises.

Os adenocarcinomas que demonstram células com mucina intracelular em

mais que 50% do tumor foram designados como adenocarcinomas em anel de sinete.

E os carcinomas medulares, que é um subtipo de adenocarcinoma apenas

recentemente reconhecido pelo OMS, foram designados quando apresentavam de

tumores sólidos, com células poligonais, com núcleo vesicular e marcado infiltrado

tumoral linfocítico (REDSTON 2004).

Material e Métodos 42

O termo budding denota que na fronte de invasão das células tumorais dos

adenocarcinomas colorretais, células epiteliais neoplásicas isoladas ou em pequenos

agregados se apresentam destacadas das glândulas neoplásicas, migrando em direção

ao estroma desmoplásico. A classificação “budding” é realizada para grupos de até

cinco células tumorais. Esta característica morfológica tem sido amplamente

reconhecida como um fator forte e robusto de prognóstico adverso, pois tem sido

considerado como uma fase inicial de invasão do tumor, associado tanto com

atividade metastática quanto prognóstico (SOHN et al. 2007).

A migração celular tumoral ocorre como um componente da desdiferenciação

observada na margem invasiva. Tais células apresentam protrusões citoplasmáticas

estava em contato direto com o tecido intersticial adjacente, como “pés”, que são

formados durante a migração celular, resultado da re-organização do citoesqueleto

após a redução de contato célula-célula e célula-matriz extracelular (PRALL 2007).

A maioria dos adenocarcinomas colorretais da síndrome de Lynch não

apresentam budding. A explicação consiste no fato de que os adenocarcinomas da

síndrome apresentam sistema de reparo do DNA deficiente. Assim, mutações que

inativam alguns dos genes-chave para desencadear a migração celular podem evitar a

formação de buddings. Como exemplo, o gene TGFβRII contém uma repetição de

adeninas na sua região codificante, podendo ser, portanto, alvo freqüente de

mutações que não são reparadas pelo sistema deficiente de reparo do DNA. Assim, a

falta da sinalização desencadeada pelo TGFβRII pode ser a explicação pela baixa

freqüência de budding nos adenocarcinomas da síndrome de Lynch (PRALL 2007).

Material e Métodos 43

3.3 INSTABILIDADE DE MICROSSATÉLITES

3.3.1 Marcadores

A pesquisadora e co-orientadora deste projeto Renata de Almeida Coudry

viajou como professora visitante a Mayo Clinic (Rochester, Estados Unidos) e ao

Fox Chase Cancer Center (Philadelphia, Estados Unidos), no período de 09 de abril

até 30 de maio de 2007 para padronização da técnica de Instabilidade de

Microssatélites.

De acordo com a visita e treinamento da Dra. Renata Coudry, optou-se por

seguir o protocolo e a metodologia aplicados rotineiramente no Laboratório de

Genética Molecular do Departamento de Laboratório Médico e Patologia da Mayo

Clinic. Desta maneira, serão avaliados ao invés de sete, 10 marcadores de MSI,

quatro mononucleotídicos (BAT25, BAT26, BAT34c4 e BAT40), cinco

dinucleotídicos (D10S197, D17S250, D18S55, D5S246 e ACTC) e um de

composição variável, sendo mononucleotídico flanqueado por repetições tetra ou

pentanucleotídicas (MYCL), através de uma reação de PCR fluorescente.

Os oligonucleotídeos dos marcadores analisados foram confeccionados pela

empresa ABI de acordo com a seqüência de bases da Tabela 5.

Material e Métodos 44

Tabela 5 – Sequência de primers de MSI.

BAT-26-F: 5`-(6-FAM)-TGACTACTTTTGACTTCAGCC-3`

BAT-26-R: 5`-AACCATTCAACATTTTTAACCC-3`

BAT-40-F: 5`-(6-FAM)-ATTAACTTCCTACACCACAAC-3`

BAT-40-R: 5`-GTAGAGCAAGACCACCTTG-3`

D10S197-F: 5`-(6-FAM)-ACCACTGCACTTCAGGTGAC-3`

D10S197-R: 5`-GTGTCTTGTGATACTGTCCTCAGGTCTCC-3`

D17S250-F: 5`-(6-FAM)-GGAAGAATCAAATAGACAAT-3`

D17S250-R: 5`-GTGTCTTGCTGGCCATATATATATTTAAACC-3`

BAT-34c4-F: 5`-(VIC)-ACCCTGGAGGATTTCATCTC-3`

BAT-34c4-R: 5`-AACAAAGCGAGACCCAGTCT-3`

BAT-25-F: 5`-(NED)-TCGCCTCCAAGAATGTAAGT-3`

BAT-25-R: 5`-TCTGCATTTTAACTATGGCTC-3`

D18S55-F: 5`-(NED)-GGGAAGTCAAATGCAAAATC-3`

D18S55-R: 5`-GTGTCTTAGCTTCTGAGTAATCTTATGCTGTG-3`

D5S346-F: 5`-(VIC)-ACTCACTCTAGTGATAAATCGGG-3`

D5S346-R: 5`-GTGTCTTAGCAGATAAGACAGTATTACTAGTT-3`

ACTC-F: 5`-(NED)-TTCCATACCTGGGAACGAGT-3`

ACTC-R: 5`-GTGTCTTTTGACCTGAATGCACTGTGA-3`

MYCL-F: 5`-(VIC)-TGGCGAGACTCCATCAAAG-3`

MYCL-R: 5`-GTGTCTTCCTTTTAAGCTGCAACAATTTC-3`

Os pares de primers confeccionados pela Applied Biosystems (Califórnia,

Estados Unidos) chegaram liofilizados contendo 80.000 pmol. Com estes foram

confeccionadas soluções estoque de 100 pmol/µl adicionando 800 µl de água Sigma

em cada tubo. A solução de trabalho foi diluída a 10 pmol/µl.

A solução estoque foi testada quanto a sua integridade através de uma

eletroforese em gel de acrilamida a 12% e 80 mV. Todos os primers apresentavam-se

sem degradação.

O composto fluorescente 6-FAM apresenta coloração azul, o VIC apresenta

coloração verde e o NED apresenta coloração amarela. Por serem sensíveis a

luminosidade, tais compostos foram manuseados protegendo-os da luz. Um controle

normal e controle sem DNA foram utilizados em cada análise. As reações de PCR

Material e Métodos 45

foram realizadas de acordo com o seguinte programa de ciclagem: Ativação da Taq-

Gold a 95°C por 12 minutos. Denaturação a 95°C por 30 segundos. Anelamento a

55°C por 30 segundos. Extensão a 72°C por 30 segundos. Número de ciclos = 35.

Extensão final a 72°C por 10 minutos. Armazenamento a 5°C.

Os produtos de PCR foram submetidos à análise no equipamento ABI PRISM

3130 Automated Genetic Analyser, utilizando o software GeneMapper (Applied

Biosystems, Califórnia, Estados Unidos). Ao produto de PCR diluído é adicionado

formamida e um macador de peso molecular, seguindo o seguinte protocolo:

1- Fazer um mix de formamida Hi-Di

com o marcador de peso molecular

(GeneScan Size Standard 600Liz®) respeitando a proporção de 11,5 µl de

formamida e 0,5 μl de Size Standard para cada amostra. Adicionar 12 µl do mix

em cada poço da placa.

2- Adicionar 1 µl de produto de PCR (concentrado ou diluído) por poço da placa de

96 poços já contendo o mix de formamida e marcador. Centrifugar rapidamente.

3- Colocar a placa em termociclador para denaturar as amostras por 2 minutos a

95˚C e logo a seguir colocar em gelo por 3 minutos.

4- Colocar a placa no ABI PRISM 3130 para análise.

A análise é feita comparando-se o eletrofluorograma do tecido normal com o

tecido tumoral. A presença de picos de comprimentos diferentes entre as amostras do

mesmo paciente demonstram variação no tamanho dos alelos, o que caracteriza a

instabilidade daquele marcador estudado.

A classificação foi realizada de acordo com a freqüência de instabilidade dos

marcadores, sendo considerada alta quando mais de 30% dos marcadores forem

instáveis (MSI-H), baixa quando menos de 30% dos marcadores forem instáveis

(MSI-L) e estável quando nenhum dos marcadores forem instáveis, seguindo a

sugestão do NCI.

Material e Métodos 46

A extração de DNA das amostras tumorais emblocadas em parafina seria

realizada utilizando o kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen, Hilden, Germany),

seguindo as orientações do fabricante. O DNA obtido seria quantificado em

espectrofotômetro e armazenado a –20˚C. Entretanto, muitos problemas ocorreram e

não foi possível realizar a análise de instabilidade de microssatélites nas amostras

emblocadas em parafina. As dificuldades serão descritas a seguir juntamente com os

resultados obtidos.

Dessa maneira, buscando aplicar os conhecimentos adquiridos e realizar uma

análise dos dados, ainda que em uma amostra pequena, decidiu-se realizar a técnica

de instabilidade de microssatélites em um conjunto de 26 pacientes que dispunha de

tecido fresco congelado no Banco de Tumores da Instituição.

3.3.2 Extração de DNA e Amplificação das Amostras do Banco de Tumores

Foram realizados quinze cortes de cinco µm de cada amostra tumoral e dez

cortes das amostras de mucosa colônica normal, sendo que uma delas foi corada

imediatamente com HE e analisada por um patologista para avaliação da presença de

tumor no material e para demarcar a área de tumor a ser raspada, sempre

considerando a necessidade de mais de 70% de tumor na amostra para a obtenção de

resultados acurados.

O DNA das a

mostras de tecido fresco do Banco de Tumores foi extraído

utilizando-se o kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen, Hilden, Germany), de acordo

com as orientações do fabricante.

Os DNAs extraídos foram quantificados no NanoDrop ND-1000 (NanoDrop

Technologies, Delaware, Estados Unidos). A quantidade obtida de DNA das

Material e Métodos 47

amostras apresentou resultados variáveis dependendo do tamanho do tecido, mas

sempre com quantidade e qualidade adequadas. Para as reações de PCR todas as

amostras foram ajustadas para 20 ng/µl.

3.3.3 Eletroforese

Para a confecção de géis de acrilamida são preparadas as seguintes soluções:

1) Acrilamida 29% / Bisacrilamida 1%

a. 29 g - acrilamida

b. 1 g - bisacrilamida

c. 100 ml - H

O milli-Q

d. 1 hora sob agitação

e. filtrar com papel filtro

f. armazenar em geladeira protegido da luz

2) TBE 10X (Tris-Borato-EDTA) pH 8,3

a. 108 g - tris base

b. 55 g - ácido bórico (H

)

c. 40 ml - EDTA ½ M pH 8,0

d. H

O milli-Q qsp 1 L

e. acertar o pH em 8,3 e autoclavar

3) NaOH 3%

a. 30 g em 1 L H

O milli-Q

b. armazenar em vidro ou plástico

4) Prata (AgNO

0,45%)

a. 0,45 g em 100 ml H

O milli-Q

b. armazenar em frasco protegido da luz

5) APS 10% (Persulfato de Amônia)

Material e Métodos 48

a. 0,1 g em 1 ml de H

O milli-Q

b. aliquotar e armazenar a -20˚C

6) Fixador

a. 100 ml - etanol 100%

b. 7,5 ml - ácido acético

c. H2O qsp 1L

7) Tampão de Amostra

a. 0,25% - azul de bromofenol

b. 0,25% - xileno cianol

c. 30% - glicerol em H2O ou 15% - ficoll em H2O

8) “Sopa” (total 6 ml)

a. 1,6 ml - acrilamida/bisacrilamida

b. 0,6 ml - TBE 10X

c. 3,8 ml - H2O milli-Q

9) Gel

a. 6 ml - sopa

b. 60 μl - APS 10%

c. 6 μl – TEMED

Resultados e Discussão 49

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 IMUNOISTOQUÍMICA

BAUDHUIN et al. (2005) relatam que os ensaios imunoistoquímicos para as

proteínas de reparo do DNA possuem a reputação de serem difíceis de serem

realizados e interpretados. GATALICA e TORLAKOVIC (2008) relatam que na

avaliação da expressão das proteínas de reparo por imunoistoquímica qualquer

expressão nuclear nas células tumorais é considerada positiva, devido à

heterogeneidade de expressão e dificuldades de padronização do teste. No entanto,

controles internos positivos têm de ser observados, caso contrário, a coloração será

informativa. Outra observação feita pelos pesquisadores foi de que na mucosa

normal, a intensidade de coloração nuclear dos enterócitos diminui em direção à

superfície. No presente estudo foram conseguidos resultados excelentes para todos os

anticorpos analisados.

Um estudo que visava identificar o potencial da imunoistoquímica em

identificar corretamente portadores de mutações em MLH1 e MSH2 mostrou que a

recuperação antigênica é o processo chave no procedimento. Os autores compararam

resultados de 20 CCRs enviados a 18 laboratórios para as análises. As conclusões do

estudo mostram que além da interferência do processo de fixação e processamento

das amostras de cada laboratório, para a recuperação antigênica deve ser utilizado

tampão com EDTA ou com citrato. Além disso, o estudo mostrou que a sensibilidade

e a especificidade em detectar a ausência de expressão protéica nos casos que

Resultados e Discussão 50

apresentavam mutação germinativa foram significativamente mais baixas para MLH1

do que para MSH2. Os problemas variaram entre coloração muito fraca, falta de

controle interno positivo, ou ainda, elevado background. A conclusão do estudo foi

de que para estes anticorpos, principalmente no caso de MLH1, cada laboratório

deve aperfeiçoar tanto a recuperação antigênica quanto os protocolos de colorações,

de acordo com a própria rotina de fixação das amostras (MÜLLER et al. 2001).

Devido ao fato de que os achados de pacientes portadores de mutações em

MSH6 e em PMS2 terem aumentado consideravelmente, variando em freqüência de

acordo com o estudo, visando melhor e mais completa de caracterização do grupo de

pacientes estudado, foi decidido incluir a investigação imunoistoquímica das

proteínas MSH6 e PMS2 neste estudo.

Estudos mostraram alta sensibilidade em detectar mutações em MSH2 (92%)

e MSH6 (90%) aplicando a imunoistoquímica nos tumores. A imunoistoquímica para

MLH1 apresentou sensibilidade menor, de 48%, quando foi utilizado apenas

anticorpo contra MLH1. Entretanto, quando a imunoistoquímica para PMS2 foi

adicionada ao teste, a taxa aumentou de 23% para 71% (HENDRIKS et al. 2006b).

JONG et al. (2004) mostraram que houve concordância na ausência de

expressão protéica entre MLH1 e PMS2 em 88% dos casos. Do estudo de 1048

carcinomas colorretais, 16 casos (1,5%) apresentaram ausência de expressão protéica

de PMS2 e MSI. Nenhuma das 6 famílias nas quais foram encontradas mutações

truncadas preenchiam os critérios de Amsterdam. Entretanto, 5 das 6 famílias

preenchiam os critérios de Bethesda (HENDRIKS et al. 2006a). Outro estudo

mostrou que resultados concordantes com perda de expressão tanto de MLH1 quanto

de PMS2 foram encontrados em 98% dos tumores (HALVARSSON et al. 2006).

Resultados e Discussão 51

O padrão de imunoistoquímica que mostre ausência de expressão tanto de

MSH2 quanto de MSH6 e presença de MLH1 e PMS2 indica mutação em MSH2 na

maioria dos casos e em menor número indica mutação em MSH6 (HENDRIKS et al.

2006b).

A ausência de expressão de MLH1 e PMS2 com presença de expressão de

MSH2 e MSH6 são indicativas de mutação em MLH1. Na falta de MLH1 o

heterodímero com a proteína PMS2 não é formado, a proteína PMS2 é rapidamente

degradada, e ambas as proteínas não apresentarão marcação na imunoistoquímica. A

ausência de marcação de MLH1 também pode ser causada por hipermetilação da

região promotora do gene, um evento somático que se restringe ao tumor e não tem

relação com a mutação germinativa em MLH1 (HENDRIKS et al. 2006b). Mais de

90% dos carcinomas da síndrome de Lynch exibem MSI-H, em contraste com os

esporádicos, que corresponde de 10% a 15%, o que usualmente ocorre devido a

metilação do promotor de MLH1 (MÜLLER et al. 2006).

Devido ao fato de que a proteína PMS2 forma um heterodímero com a

proteína MLH1, é possível esperar que a falta da proteína MLH1 devido a uma

mutação germinativa também levaria a uma perda de expressão da proteína PMS2,

causada por uma anulação do complexo protéico normal. Entretanto, os achados de

presença protéica de MLH1 com ausência protéica de PMS2 indicam que mais

portadores de mutações em MLH1 podem ser identificados. O que pode explicar este

fato é o tipo de mutação que acomete o gene MLH1, que seria responsável pelos

achados de presença protéica no núcleo, enquanto que a ligação com PMS2 estaria

anulada (JONG et al. 2004). Em uma pequena parcela dos casos, combinações não

Resultados e Discussão 52

usuais das proteínas mostram perda de expressão. A origem destas combinações

anormais não está totalmente clara (BAUDHUIN et al. 2005).

Se um segundo tumor é facilmente obtido, a imunoistoquímica do segundo

tumor deve ser considerada para análise. Tal ação é também recomendada nos casos

em que a análise de MSI do primeiro tumor mostrar um fenótipo de marcadores

estáveis. Os adenomas também são adequados a análises de imunoistoquímica se eles

são grandes, se possuem displasia de alto grau, e se ocorrem em pacientes menores

do que 50 anos (HENDRIKS et al. 2006a).

Os anticorpos MSH2 e PMS2 apresentaram-se de forma muito semelhante em

quase todas as lâminas realizadas, obedecendo quase que exclusivamente ao

protocolo padronizado. Já os anticorpos MLH1 e MSH6 mostraram-se bastante

suscetíveis às variações de cada lâmina, provavelmente apresentando interferências

devido aos diferentes tempos entre a retirada do espécime até a sua fixação em

formalina, e principalmente a idade do bloco. Assim, muitas lâminas necessitaram

ser repetidas ajustando melhor as diluições e alternando entre as marcas dos

polímeros utilizados, ora NovoLink (Novocastra, Newcastle, Reino Unido), ora

Advance HRP (Dako, Califórnia, Estados Unidos), sempre buscando melhores

resultados.

A leitura das lâminas foi realizada em microscópio óptico comum por um

único patologista. Os cortes histológicos de neoplasias foram examinados, e

considerados perda do gene de reparo quando ocorreu a negatividade nuclear na

coloração imunoistoquímica nas áreas tumorais, porém com presença de expressão

protéica em mucosa colônica normal adjacente e/ou células do estroma.

Resultados e Discussão 53

Os anticorpos adquiridos foram submetidos aos testes para padronização da

reação imunoistoquímica buscando sempre a melhor eficiência. As fotos abaixo

representam o melhor resultado atingido da padronização das reações

imunoistoquímicas realizadas para os anticorpos estudados em tecidos colônicos

normais. Por serem proteínas responsáveis pelo reparo do DNA, quando expressas

apresentam marcação nuclear, como verificado da Figura 2.

Figura 2 - Fotos de lâminas coradas positivamente para as proteínas dos genes de

reparo. Aumentos de 40x.

As padronizações foram realizadas utilizando lâminas de mucosa colônica

normal. Entretanto, quando as reações com o anticorpo MSH6 foram iniciadas, os

resultados não se mostraram da mesma forma como padronizados no controle.

Assim, decidiu-se trocar o anticorpo MSH6 clone 44 - ABCAM (Cambridge, Estados

Unidos) pelo clone 44 - BD PharMingen (San Diego, Califórnia), que apresentou

Resultados e Discussão 54

melhores resultados nas lâminas de adenocarcinomas. A comparação entre os

resultados dos dois anticorpos é exemplificada em uma lâmina analisada, como

referência do padrão apresentado (Figura 3).

Legenda: A: anticorpo MSH6 ABCAM. B: anticorpo MSH6 BD PharMingen.

Figura 3 - Adenocarcinomas colorretais com positividade para a proteína de reparo

MSH6.

As reações dos anticorpos MSH2 e PMS2 foram padronizadas e realizadas no

equipamento AutoStainer DakoCytomation (Dako, Califórnia, Estados Unidos). As

lâminas com resultados conflitantes foram repetidas manualmente. As reações dos

anticorpos MLH1 e MSH6 foram realizadas manualmente, pois não apresentaram

resultados satisfatórios utilizando o equipamento.

Foram avaliados 110 casos totais, compreendendo 85 pacientes do Hospital

AC Camargo, 10 pacientes tratados em outra instituição que trouxeram seus blocos

de parafina, 12 pacientes da Argentina e três pacientes do Uruguai.

Dentre os 95 pacientes brasileiros, foi possível analisar apenas o adenoma de

9 pacientes, e de outros 15 pacientes foi possível analisar além do adenocarcinoma, o

adenoma também. Dentre os 12 pacientes argentinos, 11 deles possuem peça de

Resultados e Discussão 55

adenocarcinoma e um apenas de adenoma. Dentre os 3 pacientes uruguaios, 1 deles

apresentava peça de adenocarcinoma e adenoma.

Os dados relatados a seguir referem-se apenas aos pacientes pertencentes ao

Registro de Câncer Colorretal do Hospital AC Camargo cujos dados clínicos foram

possíveis de serem recuperados. Sendo assim, os resultados de imunoistoquímica dos

pacientes da Argentina e do Uruguai serão discutidos posteriormente, pois não foram

enviados os dados clínicos destes. Dos 95 casos analisados nove deles, apesar de

pertencerem às famílias que preenchem os critérios clínicos para o projeto, possuíam

apenas adenomas ou não foi possível resgatar a peça do adenocarcinoma do

indivíduo analisado. Dessa maneira, o levantamento mostrado a seguir revela

números totais diferentes de acordo com o dado analisado.

A Tabela 6 mostra os achados de ausência protéica para pelo menos uma das

proteínas de reparo na imunoistoquímica dos 95 pacientes analisados.

Tabela 6 – Avaliação da expressão das proteínas de reparo do DNA.

Expressão protéica Número Porcentagem

Presente

65 68,4%

Ausente

30 31,6%

Os resultados mostram que 31,6% dos casos apresentaram uma possível

alteração no sistema de reparo do DNA, já que nem todas as proteínas de reparo

apresentaram-se expressas. Em se tratando de uma amostra com pacientes que

preenchem tanto os critérios de Amsterdam quanto os de Bethesda, o resultado

mostrado é condizente com o relatado em literatura. Apenas um caso apresentou

resultado inconclusivo após várias repetições para a proteína MSH6, porém como

Resultados e Discussão 56

presença protéica nos demais genes. Tal fato é provavelmente decorrente do processo

de fixação do material. Este caso foi considerado nesta tabela como um caso sem

alteração na imunoistoquímica.

A Tabela 7 mostra os achados de ausência protéica (na tabela relatado como

negatividade) para as proteínas de reparo individualmente, ou em dímeros, para os 95

pacientes analisados.

Tabela 7 – Discriminação da expressão protéica por imunoistoquímica em 86

pacientes com suspeita para SL.

Imunoistoquímica Número Porcentagem

Positivos

64 67,4%

MLH1/PMS2 negativos

7 7,4%

MSH2/MSH6 negativos

15 15,8%

MLH1 negativo

1 1,1%

PMS2 negativo

6 6,3%

MSH6 negativo

1 1,1%

Inconclusivo

1 1,1%

Dos 95 pacientes analisados, 31,6% deles apresentaram alguma perda de

expressão protéica. Diferentemente do que encontrado na literatura, o dímero

MSH2/MSH6 apresentou maior freqüência de alteração do que o dímero

MLH1/PMS2. Este achado evidencia a possível heterogeneidade da população

brasileira. Além disso, muitos estudos mostram uma alta sensibilidade em predizer

mutações em MSH2 (92%) através da imunoistoquímica, porém baixa sensibilidade

para MLH1 (48%) (WANG et al. 2007).

Para representar os achados, a Figura 4 apresenta um dos casos em que houve

perda do heterodímero MLH1/PMS2 e um caso em que houve perda do heterodímero

MSH2/MSH6.

Resultados e Discussão 57

MLH1 (-) PMS2 (-)

MSH2 (+) MSH6 (+)

MLH1 (+) PMS2 (+)

MSH2 (-) MSH6 (-)

Legenda: A – Caso de ausência de expressão para o heterodímero MLH1/PMS2. B – Caso de

ausência de expressão para o heterodímero MSH2/MSH6. (-) indica ausência de expressão. (+) indica

presença de expressão.

Figura 4 - Fotos de imunoistoquímica de casos com ausência de expressão protéica.

Foi encontrado apenas um caso de ausência protéica isolada de MLH1,

achado provavelmente decorrente de hipermetilação do promotor do gene, caso que

foi encaminhado a outro estudo para busca de mutação no gene BRAF.

Resultados e Discussão 58

Os resultados apresentados mostram uma porcentagem de 6,3% de ausência

protéica isolada para a proteína PMS2. Este dado é condizente com a literatura.

Foram identificados recentemente quatro rearranjos genômicos em PMS2 em um

grupo de 112 pacientes suspeitos para síndrome de Lynch que foram negativos para

mutações em MLH1, MSH2 e MSH6. Além disso, em um grupo de oito indivíduos

com ausência de marcação na imunoistoquímica para PMS2, apenas em um tumor

relacionado à síndrome de Lynch foram encontradas três diferentes mutações

pontuais patogênicas no gene PMS2. O achado demonstrou o papel de PMS2 na

síndrome de Lynch. Mutações em PMS2 têm sido descritas em pacientes com

síndrome de Turcot, possivelmente com um padrão de herança recessivo

(HENDRIKS et al. 2006b). Outro estudo mostrou que de 12 tumores MSH-H que

mantiveram expressões dos genes MLH1, MSH2 e MSH6, 8 deles mostraram perda

de expressão de PMS2 (HALVARSSON et al. 2006).

A Tabela 8 mostra os achados da imunoistoquímica em relação à

classificação das famílias dos indivíduos analisados.

Resultados e Discussão 59

Tabela 8 – Classificação clínica de acordo com os CAI, CAII, CCF e B em relação

às alterações encontradas na imunoistoquímica das proteínas de reparo.

Classificação Sem alteração Com alteração Total

Amsterdam I número

Porcentagem

35,7%

64,3%

29,8%

Amsterdam II número

Porcentagem

100%

2,1%

CCF número

Porcentagem

85%

14,3%

29,8%

Bethesda número

Porcentagem

83,8%

16,2%

38,9%

Total número

Porcentagem

68,4%

31,6%

100%

p < 0,001 (Teste Qui-quadrado)

CCF = pacientes que preenchem pelo menos 3 dos critérios de Amsterdam

O resultado mostra, de forma significativamente estatística (p<0,001) que os

pacientes classificados como Amsterdam I ou II apresentam alteração nas proteínas

de reparo com maior freqüência (64,3% e 100%) do que os pacientes classificados

como CCF ou Bethesda (14,3% e 16,2%). Este dado é condizente com a literatura.

Em relação à freqüência entre os pacientes no estudo, 31,9% preenchiam os critérios

de Amsterdam, 29,8% preenchiam os critérios CCF e 38,9% preenchiam os critérios

de Bethesda.

A Tabela 9 mostra a relação entre o sexo e os achado de imunoistoquímica.

Resultados e Discussão 60

Tabela 9 – Sexo em relação às alterações encontradas na imunoistoquímica das

proteínas de reparo.

Sexo Sem alteração Com alteração Total

Masculino número

porcentagem

62,2%

37,8%

38,9%

Feminino número

porcentagem

72,4%

27,6%

61,1%

Total número

porcentagem

68,4%

31,6%

100%

p = 0,295 (Teste Qui-quadrado)

O resultado mostra, ainda que não de forma estatisticamente significativa, que

o sexo masculino apresentou maior freqüência de alteração protéica do que em

relação às mulheres (37,8% x 27,6%). Em relação à freqüência entre os pacientes,

61,1% pertenciam ao sexo feminino.

A Tabela 10 mostra a relação da localização do tumor no cólon com os

achados de imunoistoquímica. Serão relatados os dados de 90 pacientes. Os demais

possuíam localização do adenocarcinoma ignorada ou apenas adenomas.

Tabela 10 – Localização do adenocarcinoma em relação às alterações encontradas na

imunoistoquímica das proteínas de reparo.

Localização Tumor CCR Sem alteração Com alteração Total

Cólon direito número

porcentagem

33,3%

66,7%

40%

Cólon esquerdo número

porcentagem

90%

10%

22,2%

Reto número

porcentagem

91,2%

8,8%

37,8%

Total número

porcentagem

67,8%

32,2%

100%

p < 0,001 (Teste Qui-quadrado)

Resultados e Discussão 61

O resultado mostra, de forma estatisticamente significativa (p<0,001), que a

maioria dos pacientes que apresentaram alteração de expressão protéica possuíam

adenocarcinoma localizado do lado direito do cólon, o que é condizente com a

literatura. Em relação à freqüência entre os pacientes, a localização apresentou-se

quase uniformemente distribuída.

A Tabela 11 mostra a relação entre os tumores primários apresentados pelo

indivíduo e os achados de imunoistoquímica.

Tabela 11 – Tumores primários em relação às alterações encontradas na

imunoistoquímica das proteínas de reparo.

Tumores primários Sem alteração Com alteração Total

Adenoma ou número

um tumor primário porcentagem

77,6%

22,4%

80%

Dois tumores número

primários ou mais porcentagem

31,6%

68,4%

20%

Total número

porcentagem

68,4%

31,6%

100%

p < 0,001 (Teste Qui-quadrado)

O resultado mostra maior freqüência de alteração protéica para os pacientes

que apresentaram dois ou mais tumores primários do que os pacientes que

apresentaram adenomas ou apenas um tumor primário (68,4% x 22,4%). Em relação

à freqüência entre os pacientes, 80% possuíam adenomas ou apenas um tumor

primário. Dentro os demais tumores, três pacientes apresentaram tumores de

endométrio (idade média de diagnóstico de 47,67 anos), um de estomago (idade

média de diagnóstico de 42 anos), um hepatobiliar (idade média de diagnóstico de 50

anos), dois de intestino delgado (idade média de diagnóstico de 48 anos), um de

pelve renal e ureter (idade média de diagnóstico de 44 anos) e três de mama (idade

Resultados e Discussão 62

média de diagnóstico de 47 anos). A média de idade de diagnóstico dos pacientes

com adenocarcinomas colorretais foi de 44,7 anos.

Os estudos mostram que o risco cumulativo para desenvolvimento de

qualquer câncer aos 70 anos é estimado em 65% a 90% para portadores de mutação

em MLH1 e MSH2 e até 73% para portadores de mutação em MSH6. A idade média

de diagnóstico de câncer colorretal é 43 a 46 anos para portadores de mutação em

MLH1 e MSH2 e de 51 a 57 anos para portadores de mutação em MSH6. O câncer de

endométrio, que é geralmente diagnosticado 5 anos depois do câncer colorretal,

mostra tendência similar de idade de acometimento, independente do gene mutado

do portador (PELTOMÄKI 2005).

A Tabela 12 mostra a relação entre o Estádio T e os achados de

imunoistoquímica. Os dados apresentados referem-se a 72 pacientes, dos quais foi

possível obter tal estadiamento.

Tabela 12 – Estadiamento T em relação às alterações encontradas na

imunoistoquímica das proteínas de reparo.

Estadiamento T Sem alteração Com alteração Total

T1 número

Porcentagem

20%

80%

6,9%

T2 número

Porcentagem

70,8%

29,2%

33,3%

T3 número

Porcentagem

82,8%

17,5%

40,3%

T4 número

Porcentagem

57,1%

42,9%

19,4%

Total número

Porcentagem

69,4%

30,6%

100%

p = 0,027 (Teste Qui-quadrado)

Resultados e Discussão 63

O resultado mostra que não houve diferenças significativas entre o Estádio T

e os achados de alterações protéicas. Em relação à freqüência entre os pacientes,

33,3% apresentou estadiamento classificado com T2 e 40,3% como T3.

A Tabela 13 mostra a relação entre o Estádio N e os achados de

imunoistoquímica. Os dados apresentados referem-se a 79 pacientes, dos quais foi

possível obter tal estadiamento.

Tabela 13 – Estadiamento N em relação às alterações encontradas na

imunoistoquímica das proteínas de reparo.

Estadiamento N Sem alteração Com alteração Total

N0 número

porcentagem

62,1%

37,9%

73,4%

N1 número

porcentagem

78,6%

21,4%

17,7%

N2 número

porcentagem

100%

8,9%

Total número

porcentagem

68,4%

31,6%

100%

p = 0,083 (Teste Qui-quadrado)

O resultado mostra que não houve diferenças significativas entre o Estádio N

e os achados de alterações protéicas. Em relação à freqüência entre os pacientes,

73,4% apresentou estadiamento classificado com N0.

A Tabela 14 mostra a relação entre o Estádio M e os achados de

imunoistoquímica. Os dados apresentados referem-se a 93 pacientes, dos quais foi

possível obter tal estadiamento.

Resultados e Discussão 64

Tabela 14 – Estadiamento M em relação às alterações encontradas na

imunoistoquímica das proteínas de reparo.

Estadiamento M Sem alteração Com alteração Total

M0 número

porcentagem

71%

29,9%

74,2%

M1 número

Porcentagem

67,7%

33,3%

25,8%

Total número

Porcentagem

69,9%

30,1%

100%

p = 0,689 (Teste Qui-quadrado)

O resultado mostra que não houve diferenças significativas entre o Estádio M

e os achados de alterações protéicas. Em relação à freqüência entre os pacientes,

74,2% apresentou estadiamento classificado com M0.

A Tabela 15 mostra a relação entre Invasão Sanguínea e os achados de

imunoistoquímica. Os dados apresentados referem-se a 70 pacientes, dos quais foi

possível obter tal informação.

Tabela 15 – Invasão sanguínea em relação às alterações encontradas na

imunoistoquímica das proteínas de reparo.

Invasão Sanguínea Sem alteração Com alteração Total

Ausente número

Porcentagem

72,3%

27,7%

67,1%

Presente número

Porcentagem

69,6%

30,4%

32,9%

Total número

Porcentagem

71,4%

28,6%

100%

p = 0,809 (Teste Qui-quadrado)

O resultado mostra que não houve diferenças significativas entre a Invasão

Sanguínea e os achados de alterações protéicas. Em relação à freqüência entre os

Resultados e Discussão 65

pacientes, 67,1% apresentou adenocarcinomas classificados com presença de invasão

sanguínea.

A Tabela 16 mostra a relação entre Invasão Linfática e os achados de

imunoistoquímica. Os dados apresentados referem-se a 70 pacientes, dos quais foi

possível obter tal informação.

Tabela 16 – Invasão linfática em relação às alterações encontradas na

imunoistoquímica das proteínas de reparo.

Invasão Linfática Sem alteração Com alteração Total

Ausente número

Porcentagem

70,7%

29,3%

58,6%

Presente número

Porcentagem

72,4%

27,6%

29%

41,4%

Total número

Porcentagem

71,4%

28,6%

100%

p = 0,878 (Teste Qui-quadrado)

O resultado mostra que não houve diferenças significativas entre a Invasão

Linfática e os achados de alterações protéicas. Em relação à freqüência entre os

pacientes, 58,6% apresentou adenocarcinomas com invasão linfática.

A Tabela 17 mostra a relação entre Invasão Perineural e os achados de

imunoistoquímica. Os dados apresentados referem-se a 67 pacientes, dos quais foi

possível obter tal informação.

Resultados e Discussão 66

Tabela 17 – Invasão perineural em relação às alterações encontradas na

imunoistoquímica das proteínas de reparo.

Invasão Perineural Sem alteração Com alteração Total

Ausente número

Porcentagem

73,8%

26,2%

62,7%

Presente número

Porcentagem

68%

32%

37,3%

Total número

Porcentagem

78,6%

28,4%

100%

p = 0,620 (Teste Qui-quadrado)

O resultado mostra que não houve diferenças significativas entre a Invasão

Perineural e os achados de alterações protéicas. Em relação à freqüência entre os

pacientes, 62,7% apresentou adenocarcinomas com invasão perineural.

A Tabela 18 mostra a relação entre o Grau de Diferenciação e os achados de

imunoistoquímica. Os dados apresentados referem-se a 76 pacientes, dos quais foi

possível obter tal informação.

Tabela 18 – Grau de diferenciação da neoplasia em relação às alterações encontradas

na imunoistoquímica das proteínas de reparo.

Grau de diferenciação Sem alteração Com alteração Total

Bem número

Porcentagem

44,4%

55,6%

11,8%

Moderado número

Porcentagem

68,2%

31,8%

86,8%

Pouco número

porcentagem

100%

1,3%

Total número

Porcentagem

65,8%

34,2%

100%

p = 0,285 (Teste Qui-quadrado)

Resultados e Discussão 67

O resultado mostra que não houve diferenças marcantes entre o grau de

diferenciação e os achados de alterações protéicas. As freqüências indicam maior

probabilidade de alteração quanto mais diferenciado for o adenocarcinoma. Em

relação à freqüência da classificação entre os pacientes, a grande maioria (86,8%)

apresentou adenocarcinomas moderadamente diferenciados. A Figura 5 mostra

exemplos dos graus de diferenciação dos adenocarcinomas.

Figura 5 - Graus de diferenciação dos adenocarcinomas segundo a OMS.

Resultados e Discussão 68

A Tabela 19 mostra a relação entre o Infiltrado tipo Crohn e os achados de

imunoistoquímica. Os dados apresentados referem-se a 52 pacientes, dos quais foi

possível obter tal informação.

Tabela 19 – Infiltrado tipo Crohn em relação às alterações encontradas na

imunoistoquímica das proteínas de reparo.

Infiltrado tipo Crohn Sem alteração Com alteração Total

Ausente número

Porcentagem

64,7%

35,3%

98,1%

Presente número

Porcentagem

100%

1,9%

Total número

Porcentagem

65,4%

34,6%

100%

p = 1,000 (Teste Exato de Fisher)

O resultado mostra que não houve diferenças significativas entre o Infiltrado

tipo Crohn e os achados de alterações protéicas. Em relação à freqüência entre os

pacientes, 98,1% apresentou adenocarcinomas sem esta característica.

A Tabela 20 mostra a relação entre o Infiltrado linfocitário peritumoral e os

achados de imunoistoquímica. Os dados apresentados referem-se a 51 pacientes, dos

quais foi possível obter tal informação.

Resultados e Discussão 69

Tabela 20 – Infiltrado linfocitário peritumoral em relação às alterações encontradas

na imunoistoquímica das proteínas de reparo.

Infiltrado Linfocitário

Peritumoral

Sem alteração Com alteração Total

Ausente número

Porcentagem

75%

25%

7,8%

Presente número

Porcentagem

63,8%

36,2%

92,2%

Total número

Porcentagem

64,7%

35,3%

100%

p = 1,000 (Teste Exato de Fisher)

O resultado mostra que não houve diferenças significativas entre o Infiltrado

Linfocitário Peritumoral e os achados de alterações protéicas. Em relação à

freqüência entre os pacientes, 92,2% apresentou adenocarcinomas com esta

característica.

A Tabela 21 mostra a relação entre Desmoplasia e os achados de

imunoistoquímica. Os dados apresentados referem-se a 50 pacientes, dos quais foi

possível obter tal informação.

Tabela 21 – Desmoplasia em relação às alterações encontradas na imunoistoquímica

das proteínas de reparo.

Desmoplasia Sem alteração Com alteração Total

Ausente número

Porcentagem

72%

28%

50%

Presente número

Porcentagem

56%

44%

50%

Total número

Porcentagem

64%

36%

100%

p = 0,239 (Teste Qui-quadrado)

Resultados e Discussão 70

O resultado mostra que não houve diferenças significativas entre Desmoplasia

e os achados de alterações protéicas, e também em relação à freqüência entre os

pacientes, sendo que 50% dos casos apresentaram e 50% dos casos não apresentaram

esta característica.

A Tabela 22 mostra a relação entre a presença de Budding e os achados de

imunoistoquímica. Os dados apresentados referem-se a 86 pacientes, dos quais foi

possível obter tal informação.

Tabela 22 – Budding em relação às alterações encontradas na imunoistoquímica das

proteínas de reparo.

Budding Sem alteração Com alteração Total

Ausente número

Porcentagem

66,2%

33,8%

93%

Presente número

Porcentagem

83,3%

16,7%

Total número

Porcentagem

67,4%

32,6%

100%

p = 0,659 (Teste Exato de Fisher)

O resultado mostra que não houve diferenças significativas entre Budding e

os achados de alterações protéicas. Em relação à freqüência entre os pacientes, 93%

dos casos não apresentaram esta característica. A Figura 6 mostra exemplos de

Budding nos adenocarcinomas analisados.

Resultados e Discussão 71

Figura 6 - Fotos de lâminas mostrando casos de adenocarcinomas que apresentam

budding. As setas mostram os agrupamentos celulares.

A Tabela 23 mostra a relação entre o Tipo Histológico do Adenocarcinoma e

os achados de imunoistoquímica. Os dados apresentados referem-se a 80 pacientes,

dos quais foi possível obter tal informação. Os demais possuíam classificação do

adenocarcinoma ignorada ou apenas adenomas.

Tabela 23 – Tipo histológico em relação às alterações encontradas na

imunoistoquímica das proteínas de reparo.

Tipo Histológico Adenocarcinoma Sem alteração Com alteração Total

Tubular número

porcentagem

69,4%

30,6%

61,2%

Componente Mucinoso número

porcentagem

31,2%

68,8%

20%

Cribriforme número

porcentagem

85,7%

14,3%

8,8%

Outros número

porcentagem

100%

10%

Total número

porcentagem

62,2%

33,8%

100%

p = 0,003 (Teste Qui-Quadrado)

Outros = tipo medular ou com células em anel de sinete

Resultados e Discussão 72

O resultado mostra que não houve diferenças significativas entre o Tipo

Histológico e os achados de alterações protéicas. Os adenocarcinomas com

componente mucinoso apresentam maior freqüência de alteração (68,8% deles

apresentam alteração protéica) e os adenocarcinomas cribiformes apresentam menor

freqüência de alteração (14,3%). Em relação à freqüência entre os pacientes, 61,2%

dos casos apresentaram adenocarcinomas tubulares. A Figura 7 mostra exemplos de

dois tipos histológicos de adenocarcinomas, um com componente mucinoso e um

cribiforme.

Legenda: A – Representação de um adenocarcinoma com componente mucinoso. B – Representação

de um adenocarcinoma cribiforme.

Figura 7 - Fotos de lâminas de adenocarcinomas.

Em relação aos achados de imunoistoquímica para os adenomas, dos 15

(15,79%) pacientes que possuíam blocos de adenocarcinoma e de adenoma, os

resultados para as reações de imunoistoquímica foram concordantes para todos os

casos, exceto três deles. No primeiro caso, a ausência de expressão protéica para a

proteína MSH6 foi verificada apenas na lâmina de adenocarcinoma analisada. O caso

foi enviado a outro projeto do grupo de pesquisa, que investigará a freqüência de

mutações em MSH6 em pacientes do Registro de Câncer Colorretal Hereditário do

Resultados e Discussão 73

Hospital do Câncer AC Camargo através de seqüenciamento direto. No segundo caso

o paciente apresentou fraca positividade para a proteína MLH1 no adenocarcinoma,

porém com positividade normal no adenoma. É possível que este achado seja

resultante de hipermetilação do promotor do gene MLH1. E no terceiro caso, que

apresentou dois adenomas, um dos adenomas apresentou resultado igual ao do

adenocarcinoma (perda de PMS2), entretanto, seu segundo adenoma mostrou a perda

tanto de PMS2 quanto de MLH1. Os dois últimos pacientes serão avaliados quanto à

presença de mutação em BRAF.

De acordo com BAUDHUIN et al. (2005), até 57% dos adenomas colorretais

apresentam MSI. Em relação à perda de expressão protéica, dado que os adenomas

são bem estabelecidos como a lesão precursora do câncer colorretal, é esperado que

tal estágio pré-canceroso também apresente a perda de expressão verificada no

adenocarcinoma. Estes achados indicam que a deficiência no sistema de reparo é um

evento molecular precoce na carcinogênese dos tumores que seguem a via “mutante”

(MÜLLER et al. 2006). A Figura 8 mostra um dos casos estudados em que houve

concordância entre adenocarcinoma e adenoma quanto a perda de expressão protéica.

Resultados e Discussão 74

MLH1 (+) PMS2 (+)

MSH2 (-) MSH6 (-)

MLH1 (+)

PMS2 (+)

MSH2 (-) MSH6 (-)

Legenda: A – Caso de ausência de expressão para o heterodímero MSH2/MSH6 no adenocarcinoma.

B – Caso de ausência de expressão para o heterodímero MSH2/MSH6 no adenoma. (-) indica ausência

de expressão. (+) indica presença de expressão.

Figura 8 - Fotos de imunoistoquímica de casos com ausência de expressão protéica

tanto no adenocarcinoma quanto no adenoma.

Resultados e Discussão 75

Um dos casos apresentou-se de forma anômala e será relatado em particular.

Um paciente classificado como Amsterdam teve um adenocarcinoma com

componente mucinoso aos 36 anos de idade que apresentou perda de expressão

protéica do dímero MSH2/MSH6. Aos 47 anos teve outro adenocarcinoma, também

com componente mucinoso, que apresentou perda de expressão de PMS2, MSH2 e

MSH6, combinação atípica de negatividade, não relatada ainda em literatura.

Dois pacientes apresentavam neoplasias de aspecto serrilhado, sendo que um

dos pacientes apresentava concomitantemente adenoma e adenocarcinoma e outro

apenas com adenocarcinoma. Lâminas referentes a estes 3 casos foram

confeccionadas para a realização de imunoistoquímica de MGMT (O

Methylguanine-DNA Methyltransferase). A lâmina do paciente que apresentava

apenas o adenocarcinoma apresentou perda da expressão protéica de MGMT (Figura

9).

Figura 9 - Adecarcinoma colorretal demonstrando perda de expressão da proteína de

reparo MGMT.

A seta representa a

presença de positividade da

marcação nos linfócitos do

estroma.

Resultados e Discussão 76

Em relação aos familiares dos pacientes analisados neste estudo, foi

verificada também a relação dos tumores apresentados com a alteração nas proteínas

de reparo. Dentre os pacientes analisados, dois pacientes eram da mesma família que

outros dois. Assim, nesta análise, foram retirados dois pacientes por possuírem a

mesma história familiar de outros dois já relacionados. A Tabela 24 mostra a média

de tumores em relação aos achados de imunoistoquímica.

Tabela 24 – Média de tumores presentes nas famílias dos pacientes estudados em

relação às alterações encontradas na imunoistoquímica das proteínas de reparo dos

pacientes estudados.

Tumores Sem alteração Com alteração p (Teste T)

Colorretal

2,09 5,22 p < 0,001

Endométrio

0,03 0,33 p = 0,002

Estômago

0,35 0,41 p = 0,824

Hepatobiliar

0,05 0,04 p = 0,815

Intestino Delgado

0,02 0,07 p = 0,167

Pelve Renal/Ureter

0 0 -

Ovário

0,03 0,04 p = 0,910

Pâncreas

0,11 0 p = 0,115

SNC*

0,10 0,11 p = 0,856

Sebáceo

0 0,04 p = 0,130

Mama

0,32 0,11 p = 0,098

* Sistema Nervoso Central

O resultado mostra, de forma estatisticamente significativa, o envolvimento

maior dos tumores colorretais e de endométrio na síndrome de Lynch, o que já foi

mostrado em estudo anterior deste serviço que buscou caracterizar a freqüência de

tumores extra-colônicos em pacientes que preenchiam os critérios clínicos para a

síndrome de Lynch com pacientes do Registro de Câncer Colorretal Hereditário do

Hospital AC Camargo (FERREIRA et al. 2004). O estudo avaliou 61 famílias

Resultados e Discussão 77

suspeitas de síndrome de Lynch, onde foram estudados 347 indivíduos, sendo

observados 212 tumores colorretais e 169 tumores extra-colônicos. O tumor mais

freqüente nos homens, associado ao CCR, foi o de estômago, com uma taxa de

incidência para as famílias com síndrome de Lynch de 3.762,37/100.000; esse tumor

não está agrupado dentre os tumores descritos nos Critérios de Amsterdam. Nas

mulheres, o tumor mais freqüentemente encontrado foi o de mama, que também não

está agrupada dentre os tumores descritos nos Critérios de Amsterdam, com um taxa

de incidência de 1.993,86/100.000 para as famílias com síndrome de Lynch.

No presente estudo, os familiares dos pacientes com alteração nas proteínas

de reparo apresentaram uma menor incidência de câncer de mama quando comparada

com aqueles pacientes com história familiar de câncer colorretal, mas sem a perda

das proteínas de reparo. Este achado pode ser decorrente de um agrupamento familiar

em virtude de outras síndromes de predisposição ao câncer colorretal. MEIJERS-

HEIJBOER et al. (2003) publicaram um estudo sobre famílias com associação entre

câncer colorretal e câncer de mama. As famílias foram testadas para os genes BRCA1

e BRCA2, e para os genes de reparo relacionados à síndrome de Lynch. No grupo

sem mutações identificadas nesses genes, mas com fenótipo familiar de câncer

mama-cólon, houve significativo aumento da incidência da mutação CHEK2

1100delC (18,2%) em relação às famílias sem o mesmo fenótipo. Os achados dos

estudos nesta instituição podem sugerir uma associação da mutação de CHEK2

1100delC nas pacientes estudadas.

Em relação aos demais tumores, o número pouco expressivo pode ser

explicado pela falta de gerações acometidas, já que a amostra estudada possui mais

da metade dos casos de pacientes que preenchem apenas os critérios de Bethesda ou

Resultados e Discussão 78

CCF. Além disso, é preciso considerar o diagnóstico de Síndrome de Li Fraumeni,

uma síndrome rara causada por mutações no gene TP53. Inicialmente, a

caracterização do espectro tumoral da síndrome tinha como principais critérios para

diagnóstico: osteossarcomas, sarcomas de partes moles, câncer de mama em

mulheres na pré-menopausa, tumores cerebrais, tumores adrenocorticais e leucemias

agudas. Atualmente também são relacionados os tumores de cólon e reto, estômago,

pulmão, melanoma e tumores de células germinativas (BIRCH et al. 2001).

As análises dos tumores extra-colônicos apresentados pelos familiares em

relação às alterações encontradas na imunoistoquímica revelam maior freqüência de

alteração do heterodímero MSH2/MSH6, para todos os tumores. Das nove famílias

que apresentaram câncer de endométrio entre os familiares, em cinco delas foram

encontradas alterações em MSH2/MSH6, em uma foi encontrada alteração no

heterodímero MLH1/PMS2, em uma foi encontrada alteração em PMS2 e em duas

famílias não foram encontradas alterações. Das 22 famílias que apresentaram câncer

de estômago entre os familiares, em cinco delas foram encontradas alterações em

MSH2/MSH6, em duas foram encontradas alterações no heterodímero MLH1/PMS2,

em 15 famílias não foram encontradas alterações. O achado de 15 famílias com

acometimento de câncer de estômago deve-se a alta incidência de câncer de

estômago na população brasileira. De acordo com dados do INCA, são estimados

7.200 novos casos de câncer de estômago para homens em 2008, número maior do

que o número esperado para câncer colorretal, e 3.950 novos casos de câncer de

estômago para mulheres em 2008, número menor do que o esperado para câncer

colorretal (Ministério da Saúde 2007). Das três famílias que apresentaram câncer de

intestino delgado entre os familiares, em duas delas foram encontradas alterações em

Resultados e Discussão 79

MSH2/MSH6 e em uma família não foi encontrada alteração. E por fim, das 19

famílias com acometimento de câncer de mama, apenas em uma delas foi encontrada

alteração em MSH2/MSH6. As demais 18 famílias não apresentaram alteração nas

proteínas analisadas na imunoistoquímica, o que ressalta a possibilidade de

envolvimento de outras síndromes de predisposição ao câncer.

Em relação aos 12 pacientes oriundos do Hospital Italiano na Argentina, dois

deles apresentaram ausência de expressão protéica do heterodímero MLH1/PMS2

(16,67%). Nenhum paciente do Uruguai apresentou perda de expressão protéica dos

genes de reparo. Devido ao fato de que não foi possível obter os dados anteriormente

analisados destes pacientes, conjuntamente com a diminuta quantidade de casos, não

foi possível realizar análises mais detalhadas destes pacientes.

E finalmente, é importante avaliar as proteínas de reparo de tumores de

pacientes que preenchem os critérios clínicos para síndrome de Lynch, pois, alguns

casos de mutações missense ou alterações sem mudar o frame de transcrição, que não

afetam diretamente as proteínas de reparo, podem ainda, conferir um aumento no

risco de câncer por mecanismos que explicam a patogenicidade, como levar a

instabilidade da proteína ou alterar a sua habilidade de induzir a apoptose

(PELTOMÄKI 2005). Dessa maneira, a caracterização genética, bioquímica e clínica

das alterações nas proteínas de reparo e seus fenótipos associados têm o potencial de

revelar mecanismos alternativos de patogenicidade e ligações com novas vias

biológicas, o que podem ser úteis no desenho de estratégias preventivas e

terapêuticas no futuro.

Resultados e Discussão 80

4.2 INSTABILIDADE DE MICROSSATÉLITES

4.2.1 Marcadores

A fim de aperfeiçoar os resultados e reduzir falsos negativos, o painel

organizado pelo NCI em 1998 sugere que sejam pesquisados pelo menos cinco

microssatélites (BAUDHUIN et al. 2005). Entretanto, em razão da complexidade do

exame, alguns autores sugerem que a pesquisa de um único microssatélite,

denominado BAT26, possa ser suficiente para evidenciar a existência de MSI, já que

este marcador possui sensibilidade próxima de 100% (NASH 2003; CARVALHO et

al. 2005). Já outros autores acreditam que deveria ser considerado o maior número de

marcadores possíveis, para concluir com precisão a instabilidade de determinado

tumor (BOLAND et al. 1998; THIBODEAU et al. 1998). No presente estudo, a

utilização apenas do marcador BAT26 não detectaria todos os casos que foram

classificados como MSI-H com o uso de 10 marcadores, conforme será descrito a

seguir.

Além disso, muitos pesquisadores utilizam os marcadores BAT26 e BAT25

sem a correspondência do tecido normal, pois são marcadores mais conservados

entre indivíduos. Entretanto, dependendo da etnia do indivíduo, alelos menores

podem ser encontrados (IMAI e YAMAMOTO 2008). Em se tratando da população

brasileira, que possui miscigenação de etnias, tal análise excluindo-se a referência do

tecido normal poderia levar a resultados falso-positivos. No presente estudo, todos os

casos que apresentaram o marcador BAT26 estável apresentaram alelos de tamanhos

fora do intervalo de tamanho dos alelos apresentados pelos casos que apresentaram

este marcador estável, ou seja, o uso de apenas tecido tumoral para detectar

Resultados e Discussão 81

instabilidade seria suficiente para caracterizar todos os casos instáveis para este

marcador, considerando o intervalo de tamanho para os alelos entre 113,89 e 121,63

pb de acordo, e para esta população estudada. Já o marcador BAT25 não

possibilitaria o uso apenas de tecido tumoral para as análises, já que tanto os casos

que apresentaram este marcador instável, quanto os casos que apresentaram este

marcador estável, apresentaram alelos no mesmo intervalo de tamanho, entre 111,20

e 122,64, para esta população estudada.

4.2.2 Extração de DNA e Amplificação das Amostras Emblocadas em Parafina

Amostras de blocos de parafina e uma amostra de tecido fresco de cólon

normal foram selecionadas para extração de DNA com o kit DNeasy Blood and

Tissue (Qiagen, Hilden, Germany), de acordo com as orientações do fabricante. A

amostra de tecido fresco foi utilizada como controle da extração.

Os DNAs extraídos foram quantificados no NanoDrop ND-1000 (NanoDrop

Technologies, Delaware, Estados Unidos). A quantidade obtida de DNA das

amostras de parafina não foi satisfatória (entre 4 a 6 ng/µl), enquanto que a

quantidade de DNA do tecido fresco se mostrou adequada para reações de PCR (48,5

ng/µl), o que indica que esta reação ocorreu como esperado.

Mesmo não obtendo quantidade de DNA adequada da amostra de parafina,

decidiu-se prosseguir para um passo de amplificação da mesma e também da amostra

de tecido fresco. Como um controle positivo desta reação, utilizou-se um DNA

extraído de sangue que já havia sido testado com sucesso. A reação de amplificação

foi realizada de acordo com o ciclo acima descrito utilizado na Mayo Clinic

Resultados e Discussão 82

(Rochester, Estados Unidos). Foram utilizados dois pares de primers do laboratório

que apresentavam bons resultados. Primer A – gene MSH2. Primer B – gene MSH6.

A Figura 10 mostra o resultado da reação de PCR em gel de agarose 0,8%

com voltagem de 100 mV.

Figura 10 – Teste de aplificação das amostras. M - marcador de peso molecular.

O resultado mostra que não houve amplificação do DNA extraído de parafina,

conforme já hipotetizado, provavelmente devido à pequena quantidade de DNA.

Paralelamente às tentativas de extração de DNA de parafina, buscou-se testar

os primers de MSI. Foram escolhidos inicialmente os pares dos marcadores BAT26,

D5S346, D17S250 e ACTC para teste com duas marcas de enzimas Taq Polimerase,

Taq Gold (Applied Biosystems, Califórnia, Estados Unidos) e Taq Platinum

(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Estados Unidos), objetivando melhor

eficiência. O ciclo e quantidade de reagentes utilizados seguiram as orientações do

protocolo fornecido pela Mayo Clinic e descrito em “materiais e métodos”. Foi

Legenda: 1: amostra de DNA de

parafina com primer A. 2:

amostra de DNA de parafina com

primer B. 3: amostra de DNA de

tecido fresco com primer A. 4:

amostra de DNA de tecido fresco

com primer B. 5: amostra de

DNA de sangue com primer A. 6:

amostra de DNA de sangue com

rimer B.

Resultados e Discussão 83

utilizado o DNA de tecido fresco de cólon para os testes, já que apresentou

quantidade adequada.

As temperaturas de anelamento sugeridas pela Mayo Clinic é a mesma para

todos os pares de primers (55°C). Entretanto, buscando maior eficiência da reação,

haja vista que a quantidade de DNA seria limitante na reação, foram encontradas no

programa de predição e simulação de PCR da Universidade Santa Cruz, Califórnia

(www.genome.ucsc.edu) temperaturas de anelamento diferentes, de acordo com os

tamanhos dos primers e conteúdo das bases nitrogenadas (purínicas e pirimidínicas).

Assim, na reação de PCR a seguir (Figura 11) foram testados 2 Taqs Polimerase, 4

pares de primers e 2 temperaturas de anelamento.

Legenda: M – marcador de peso molecular. 1 a 9: Taq Gold. 1: primer BAT26 e TM 55°C. 2: primer

BAT26 e TM 63°C. 3: primer D5S346 e TM 55°C. 4: primer D5S346 e TM 70°C. 5: primer D17S250

e TM 55°C. 6: primer D17S250 e TM 59°C. 7: primer ACTC e TM 55°C. 8: primer ACTC e TM

68°C. 9: Primer controle. 10 a 18: Taq Platinum.

10: primer BAT26 e TM 55°C. 11: primer BAT26 e

TM 63°C. 12: primer D5S346 e TM 55°C. 13: primer D5S346 e TM 70°C. 14: primer D17S250 e TM

55°C. 15: primer D17S250 e TM 59°C. 16: primer ACTC e TM 55°C. 17: primer ACTC e TM 68°C.

18: Primer controle. DNA extraído de tecido fresco de cólon.

Figura 11 – Teste de amplificação das amostras extraídas.

Resultados e Discussão 84

Primeiro teste: as reações com a Taq Gold não apresentaram resultado

satisfatório. As reações com a Taq Platinum embora apareçam fracas, apresentam

algum resultado. Segundo teste: os quatro primers testados mostraram amplificação

com a Taq Platinum. Terceiro teste: apesar dos tamanhos e conteúdo das bases dos

primers, as bandas mais intensas se apresentaram com temperatura de anelamento de

55°C.

A presença de bandas inespecíficas deve-se ao fato de que os primers

confeccionados foram otimizados para amplificação de DNA oriundo de blocos de

parafina. De acordo com resultados de testes realizados, o DNA obtido de amostras

emblocadas em parafina apresenta-se altamente degradado, de forma que é possível

obter fragmentos apenas em torno de 200 pb, sendo bastante variável e dependente

da espécime para fragmentos acima deste tamanho. Assim, as bandas inespecíficas

apresentadas neste gel devem-se ao fato de que foi utilizada uma amostra de DNA de

tecido fresco de cólon para as reações.

É possível perceber ainda, que a intensidade das bandas de amplificação com

os primers de MSI são menores do que com o primer controle, o que demonstra a

menor eficiência destes, provavelmente devido ao grau de expressão de determinado

gene e ainda, dado a marcação com compostos fluorescentes dos primers.

As reações acima apresentadas foram feitas em termociclador com gradiente

de temperatura, entretanto, o ciclo a ser escolhido deve ser apenas um por reação.

Como no resultado apresentado comparou-se a atuação de Taqs Polimerases

diferentes, buscou-se posteriormente ajustar melhor o ciclo de acordo com as

necessidades da Taq Platinum, já que o ciclo anterior se ajustava melhor às

necessidades da Taq Gold, que não apresentou resultado satisfatório (Figura 12). A

Resultados e Discussão 85

temperatura de anelamento escolhida foi que melhor apresentou resultado, 55°C, e o

DNA foi o mesmo utilizado.

Figura 12 – Teste de amplificação. M – marcador de peso molecular.

Aparentemente não houve grande variação na amplificação. Assim, buscando

maior eficiência na reação, foram testadas diferentes concentrações de cloreto de

magnésio (MgCl

) na reação. Todas as reações foram feitas com um volume final de

20 µl de reação, DNA de tecido fresco de cólon e temperatura de anelamento de

55°C (Figura 13).

De acordo com as quantidades de MgCl

utilizadas nas reações anteriores,

decidiu-se utilizar o seguinte gradiente:

- primers BAT16 e D5S346: 0,8 µl, 1,2 µl e 1,6 µl.

- primers D17S250 e ACTC: 0,4 µl, 0,8 µl e 1,2 µl.

Legenda: 1: primer BAT26. 2:

primer D5S346. 3: primer

D17S250. 4: primer ACTC. 5:

primer controle. DNA extraído de

tecido fresco de cólon.

Resultados e Discussão 86

Legenda: M – marcador de peso molecular. 1: primer BAT26 e 0,8 µl de MgCl

. 2: primer BAT26 e

1,2 µl de MgCl

. 3: primer BAT26 e 1,6 µl de MgCl

. 4: primer

D5S346 e 0,8 µl de MgCl

5: primer

D5S346 e 1,2 µl de MgCl

6: primer

D5S346 e 1,6 µl de MgCl

7: primer D17S250 e 0,4 µl de

MgCl

. 8: primer D17S250 e 0,8 µl de MgCl

. 9: primer D17S250 e 1,2 µl de MgCl

. 10: primer

ACTC e 0,4 µl de MgCl

. 11: primer ACTC e 0,8 µl de MgCl

. 12: primer ACTC e 1,2 µl de MgCl

13: controle positivo.

Figura 13 – Teste de amplificação dos primers.

O resultado mostra que os quatro primers apresentaram melhor resultado de

amplificação com 1,2 µl de MgCl

. As bandas inespecíficas apresentadas devem-se

ao tipo de DNA utilizado. Obtida esta padronização, decidiu-se testar o DNA

oriundo de parafina. Foram utilizadas duas amostras de DNA de parafina e um

controle de tecido fresco (Figura 14).

Resultados e Discussão 87

Legenda: M – marcador de peso molecular. 1: primer BAT26 e DNA fresco. 2: primer BAT26 e

DNA parafina1. 3: primer BAT26 e DNA parafina2. 4: primer

D5S346 e DNA fresco. 5: primer

D5S346 e DNA parafina1. 6: primer

D5S346 e DNA parafina2. 7: primer D17S250 e DNA fresco. 8:

primer D17S250 e DNA parafina1. 9: primer D17S250 e DNA parafina2. 10: primer ACTC e DNA

fresco. 11: primer ACTC e DNA parafina1. 12: primer ACTC e DNA parafina2.

Figura 14 – Teste de amplificação das amostras de parafina.

Apesar de difícil visualização na foto apresentada, no momento da revelação

do gel foi possível verificar bandas com os mesmos padrões apresentados

anteriormente, apenas para as canaletas onde continham as reações feitas com DNA

de tecido fresco, o que demonstra que o DNA extraído não apresenta quantidade nem

qualidade satisfatória.

Como o protocolo até então seguido é o mesmo utilizado em outros lugares

do mundo, como na Mayo Clinic, por exemplo, onde a análise de instabilidade de

microssatélites é feita em sua rotina laboratorial, surgiu a hipótese de que o material

utilizado nesta Instituição não apresentaria DNA de boa qualidade. Um potencial

interferente seria a qualidade da Formalina utilizada, já que o serviço já usa

formalina tamponada desde o ano de 1997. Para testar tal hipótese, realizou-se a

fixação do tecido com formalina da marca Merck (Darmstadt, Alemanha) e DEPC

(diethylpyrocarbonate), a qual é considerada uma formalina de excelente qualidade.

Resultados e Discussão 88

Além disso, realizou-se novos testes com diferentes metodologias de extração de

DNA.

O primeiro método a ser testado foi o Pico Pure DNA Extraction Kit

(Arcturus, MDS Analytical Technologies, Califórnia, Estados Unidos), realizado

seguindo as orientações do fabricante.

Para os testes foram selecionados dois blocos recentes que se encontravam

armazenados no arquivo do Hospital e uma amostra de tecido fresco, e dois blocos de

biópsias de cólon feitas na Instituição cujos tecidos foram fixados com Formalina

Merck + DEPC. Para evitar interferência relacionada à idade do material utilizado,

buscou-se usar amostras muito recentes do arquivo deste Serviço. Após a extração

das amostras, o DNA foi quantificado no NanoDrop ND-1000. O resultado é

mostrado a seguir:

Amostra [DNA] A260/A280

1) bloco arquivo A Æ 98 ng/µl Æ 0,99

2) bloco arquivo B Æ 77,8 ng/ µl Æ0,88

3) bloco Merck A Æ 130 ng/ µl Æ1,09

4) bloco Merck B Æ 137,9 ng/ µl Æ 1,09

5) tecido fresco Æ 73,3 ng/ µl Æ 1,09

De acordo com SAMBROOK e RUSSEL (2000) a razão de pureza

A260/A280 ideal que fornece maior quantidade de DNA é 1,8. Valores menores

representam contaminação por proteínas ou fenóis. Assim, foi possível verificar que

este kit de extração de DNA apesar de fornecer um alto valor de quantificação, este

valor não corresponde somente a DNA.

Como as razões A260/A280 entre as amostras foram parecidas, é possível

compará-las entre si em relação a quantidade de DNA. Assim, como é possível

Resultados e Discussão 89

perceber, as amostras fixadas com formalina Merck apresentam quantidades

superiores de DNA em relação as amostras do arquivo.

As amostras de DNA foram submetidas a reações de amplificação utilizando

primer controle e Taq Platinum (Figura 15). Visando melhor comparação entre elas,

foram utilizadas para o teste as duas amostras de DNA dos blocos do arquivo, duas

amostras de DNA dos blocos Merck, uma amostra de DNA de tecido fresco extraído

com o kit Arcturus, uma amostra de DNA de tecido fresco extraído com o kit da

Qiagen e uma amostra de DNA extraído de sangue, usado como controle da reação.

Figura 15 - Teste do kit Pico Pure.

O resultado mostra que as amostras extraídas de blocos com Formalina

Merck, dos tecidos frescos e de sangue apresentaram amplificação. Dentre as

amostras do arquivo, canaleta número um não apresenta banda e a canaleta número

quatro apresenta uma banda fraca.

O kit acima testado forneceu boa quantificação no NanoDrop ND-1000,

entretanto, com razões de pureza ruins. Na tentativa de melhorar os resultados, as

amostras foram purificadas com clorofórmio. A quantidade de DNA recuperada foi

Legenda: M – marcador de peso

molecular. 1: DNA arquivo A. 2:

DNA Merck A. 3: DNA Merck

B. 4: DNA arquivo B. 5: DNA

fresco Arcturus. 6: DNA fresco

Qiagen. 7: DNA sangue. 8:

controle negativo sem DNA.

Resultados e Discussão 90

ainda menor do que as primeiramente obtidas com o kit da Qiagen (entre 1,7 e 3,2

ng/µl). Assim, tais amostras não foram utilizadas para testes subseqüentes.

O segundo protocolo de extração que foi paralelamente testado é um

protocolo modificado fornecido pelo Dr. David Sidransky Deportas, do Johns

Hopkins University, mais rápido do que o original, descrito a seguir:

1. Coletar 4 ou 5 cortes de 5 μm (10-30 μm) em um tubo de 1,5 ml.

2. Adicionar 1 ml de xilol. Agitar por inversão. Incubar por 5 minutos a 57°C.

3. Centrifugar por 10 min a 12.000 rpm. Remover o sobrenadante com a pipeta.

4. Repetir o procedimento. Descartar o xilol em lixo orgânico.

5. Adicionar 500 μl de EtOH 100% à amostra. Homogeneizar por inversão até

dissolver o pellet.

6. Centrifugar por 15 min a 13.500 rpm. Remover o sobrenadante com a pipeta.

7. Repetir o procedimento com EtOH 70% e EtOH 50%.

8. Ressuspender em 200 μl Tampão de Digestão:

- 10 μl de 0,5M EDTA

- 5 μl sodium dodecysulphate 20%

- 5 μl NaCl 4M

- 2 μl Tris-HCl 1M pH 8,0

- 8 μl Proteinase K 10 μg/μl

- 170 μl de água MilliQ

9. Passar parafilme e incubar a 52°C em agitação (700rpm) por 18 horas.

10. Adicionar mais 4 μl de Proteinase K, caso o tecido não tenha dissolvido por

completo.

11. Centrifugar o tubo Phase Lock Gel (PLG) por 1 min a 13.500 rpm para que toda

a resina desça para o fundo.

12. Transferir a amostra para o tubo PLG. Adicionar 300 μl de fenol-clorofórmio-

álcool isoamílico

13. Homogeneizar por inversão por 1 min. Centrifugar por 10 min a 13.500 rpm.

Resultados e Discussão 91

14. Transferir a fase aquosa (acima da resina do tubo) para um novo tubo PLG.

Adicionar 300 μl de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (25:24:1). Homogenizar.

Centrifugar por 10 min a 13.500 rpm.

15. Transferir a fase aquosa para um novo tubo. Adicionar 300 μl de clorofórmio.

16. Homogenizar por inversão por 1 min. Centrifugar por 10 min a 13.500 rpm.

17. Transferir a fase aquosa para um novo tubo e adicionar 0,5 μl de glicogênio (20

mg/ml), 100 μl de acetato de amônio 7.5M e 800 μl de EtOH 100 % gelado.

Homogeneizar bem por inversão.

18. Incubar por 2 horas a -80ºC.

19. Centrifugar por 30 min a 12.000 rpm a 4ºC.

20. Remover o sobrenadante.

21. Lavar o pellet 3x com 1 ml de EtOH 70% gelado. Não é necessário ressuspender

o pellet.

22. Centrifugar por 5 min a 14.000 rpm a 4ºC.

23. Remover o sobrenadante (retirar o excesso com a pipeta). Secar o pellet a 42ºC.

24. Incubar a 55ºC por 10 minutos.

25. Ressuspender em 36 μl de H

O. Deixar overnight a 4ºC.

26. Quantificar o DNA. Avaliar integridade com 0,5 µg em gel de agarose ou por

PCR (β-actina – intron).

27. Armazenar em freezer -20ºC.

Para testar o protocolo acima, utilizou-se quatro amostras: duas do arquivo

anteriormente testadas, a Merck B também anteriormente testada e outra amostra de

arquivo de outra instituição que continha maior quantidade de tecido emblocado

(bloco arquivo C). Após a extração as amostras foram quantificadas no NanoDrop

ND-1000. O resultado é mostrado a seguir:

Amostra [DNA] A260/A280

1) bloco arquivo A Æ 22,3 ng/µl Æ 2,19 Æ 5 cortes

2) bloco Merck B Æ 10 ng/ µl Æ 2,08 Æ 2 cortes

3) bloco arquivo B Æ 31,8 ng/ µl Æ1,92 Æ 5 cortes

4) bloco arquivo C Æ 135,9 ng/ µl Æ1,72 Æ 5 cortes

Resultados e Discussão 92

De acordo com o resultado, o número de cortes utilizados para a extração

interfere significativamente na quantidade de DNA final obtida, já que a menor

quantidade de DNA obtida é resultante também do menor número de cortes

utilizados, bem como a maior quantidade de DNA obtida é resultante de maior

número de cortes e com maior tamanho de tecido no bloco.

Além disso, a razão de pureza A260/A280 apresentou-se mais próxima do

ideal de 1,8 em relação às amostras extraídas com o kit anterior (Arcturus). Dessa

maneira, já que os primers de MSI são mais sensíveis e o grau de pureza foi melhor,

decidiu-se testar a amplificação dos DNAs das amostras acima com um primer

controle e o BAT26. Dado que em tentativas anteriores a Taq Gold não haviam

funcionado, decidiu-se testar nova alíquota recém adquirida juntamente com a Taq

Platinum. A Figura 16 mostra o resultado da amplificação.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

50pb

100pb

200pb

50pb

100pb

200pb

Platinum Gold Platinum Gold

Legenda: M – marcador de peso molecular. A: Gel com as reações com o primer BAT26. 1 a 6: Taq

Platinum. 7 a 12: Taq Gold. B: Gel com as reações com o primer controle. 1 a 6: Taq Platinum. 7 a

12: Taq Gold. Amostras seguem mesma ordem em ambos géis. 1 e 7: DNA arquivo A. 2 e 8: DNA

Merck B. 3 e 9: DNA arquivo B. 4 e 10: DNA arquivo C. 5 e 11: fresco Qiagen. 6 e 12: fresco

Arcturus. 13: controle negativo Platinum. 14: controle negativo Gold.

Figura 16 – Teste de amplificação das amostras.

Resultados e Discussão 93

O resultado do Gel A mostra que todas as amostras utilizadas para

amplificação com o BAT26 apresentam amplificação, ainda que pouco intensa,

mesmo com a Taq Gold que não funcionara anteriormente. É possível que tenha sido

um problema com o lote da Taq Gold anterior, dúvida que foi reportada ao fabricante

para as devidas providências.

O resultado do Gel B mostra que apenas as amostras Merck B e dos tecidos

frescos apresentaram amplificação. As três amostras de parafina do arquivo

utilizadas não apresentam amplificação. Este resultado corresponde apenas para a

Taq Platinum, pois com a Taq Gold apenas uma das amostras controle de tecido

fresco apresentou amplificação. Uma possível explicação para o fato seria uma maior

sensibilidade desta enzima.

Com os resultados em relação ao primer controle apresentados

satisfatoriamente apenas para amostras Merck e de tecido fresco, amostras que se

espera ter DNA menos fragmentado, surgiu a hipótese de que o primer testado não

seria um bom controle para amostras de parafina, pois o gene pode se apresentar

pouco expresso. Assim, foi utilizado um primer intrônico do gene β-actina, já usado

para verificar a integridade do DNA extraído com este protocolo. As reações foram

feitas utilizando-se as mesmas amostras de DNA anteriormente testadas e Taq

Platinum (Figura 17).

Resultados e Discussão 94

Figura 17 – Teste de amplificação das amostras.

O resultado mostra que com este primer a amplificação melhora, tanto em

relação à intensidade quanto em relação às amostras, já que ao menos neste caso uma

das amostras de parafina apresentou boa amplificação (DNA arquivo B).

A terceira tentativa de extração que foi testada em paralelo foi o próprio

protocolo fornecido pelo Dr. David Sidransky, do Johns Hopkins University, sem as

modificações que diminuem o tempo de extração, descrito a seguir:

1. Raspar 10 cortes de 5 μm e adicionar 750 μl de xilol

2. Incubar as amostras por 2 horas a 48˚C

3. Centrifugar por 15 minutos a 13000 rpm

4. Retirar o sobrenadante cuidadosamente com a pipeta

5. Adicionar 500 μl de etanol 100% e homogenizar por inversão. Centrifugar por 15

minutos a 13000 rpm. Retirar o sobrenadante cuidadosamente com a pipeta

6. Adicionar 500 μl de etanol 70% e homogenizar por inversão. Centrifugar por 15

minutos a 13000 rpm. Retirar o sobrenadante cuidadosamente com a pipeta

7. Adicionar 500 μl de etanol 50% e homogenizar por inversão. Centrifugar por 15

minutos a 13000 rpm. Retirar o sobrenadante cuidadosamente com a pipeta

8. Preparar solução SDS-PK 1% (proteinase K). Adicionar 300 μl de SDS-PK 1% e

incubar a 48˚C por 48 horas

9. Adicionar 5 μl de PK 20% a cada 8 horas

Legenda: M – marcador de peso

molecular. 1: DNA arquivo A. 2:

DNA Merck B. 3: DNA arquivo

B. 4: DNA arquivo C. 5: DNA

fresco Qiagen. 6: DNA fresco

Arcturus.

Resultados e Discussão 95

10. Adicionar 300 μl de fenol-clorofórmio pH 8,0 e vortexar

11. Transferir para tubos Phase-Lock Gel, previamente centrifugados por 30

segundos

12. Centrifugar as amostras por 10 minutos a 13000 rpm

13. Transferir a fase aquosa para novos tubos

14. Adicionar 750 μl de etanol 100% gelado, 100 μl de acetado de amônio 7,5M e 2

μl de glicogênio 20 mg/ml

15. Homogeneizar por inversão

16. Precipitar overnight a -20˚C

17. Centrifugar por 30 minutos a 12000 rpm a 4˚C

18. Descartar o sobrenadante vertendo o tubo

19. Secar o pellet a temperatura ambiente com o tubo virado de boca pra baixo

20. Ressuspender o pellet em 30 μl de H

21. Deixar as amostras a 4˚C overnight para re-hidratar o DNA

22. Quantificar e estocar a -20˚C

Para os testes foram utilizadas duas amostras anteriormente testadas, dentre

estas, uma do arquivo e outra confeccionada com formalina Merck, e duas novas

amostras recentes do arquivo, pois as anteriores deveriam ser preservadas para uso

no projeto. Após a extração as amostras foram quantificadas no NanoDrop ND-1000.

O resultado é mostrado a seguir:

Amostra [DNA] A260/A280

1) bloco arquivo C Æ 521 ng/µl Æ 1,81 Æ10 cortes

2) bloco arquivo D Æ 132 ng/ µl Æ 1,88 Æ10 cortes

3) bloco arquivo E Æ 760 ng/ µl Æ1,94 Æ 9 cortes

4) bloco Merck A Æ 31,7 ng/ µl Æ1,78 Æ 2 cortes

Resultados e Discussão 96

As amostras foram amplificadas utilizando primer de β-actina intrônico com

Taq Platinum, e primer de MSI D17S250 com Taq Gold. As Taqs utilizadas foram as

que melhor forneceram resultados para cada primer (Figura 18).

Legenda: M – marcador de peso molecular. A: Gel com as reações com o primer β-actina. B: Gel

com as reações com o primer D17S250. Amostras seguem mesma ordem em ambos géis. 1: DNA

arquivo C. 2: DNA arquivo D. 3: DNA arquivo E. 4: DNA Merck A. 5: DNA fresco Qiagen.

Figura 18 – Teste de amplificação das amostras.

O resultado do Gel A mostra que todas as amostras apresentam amplificação,

ainda que em graus diferentes.

O resultado do Gel B mostra bandas pouco intensas para todas as amostras,

com exceção da amostra de DNA do arquivo E, que embora tenha apresentado

amplificação satisfatória com o primer de β-actina, reação realizada

concomitantemente, neste gel apresentou padrão de amostra de DNA degradado.

Conforme já visto e, portanto, esperado, a amostra de tecido fresco apresenta duas

bandas.

Devido a pouca intensidade das bandas apresentadas nos géis quando se

utilizavam primers de MSI, decidiu-se testar uma alteração no ciclo de

termociclagem das reações de PCR conforme sugerido no curso fornecido pela

Resultados e Discussão 97

empresa Applied Biosystems (Califórnia, Estados Unidos). Visando aumentar a

estabilidade da Taq Gold utilizada, de forma que sua eficiência seja mantida do

começo até o final dos ciclos da PCR, a ciclagem foi ajustada para ter uma

temperatura de denaturação das fitas de 95˚C nos primeiros 10 ciclos e temperatura

de 89˚C nos últimos 20 ciclos.

A reação de PCR modificada foi realizada seguindo as mesmas condições da

reação anterior. O resultado é mostrado na Figura 19.

Figura 19 – Teste de amplificação das amostras.

O resultado mostra que não houve melhoras significativas na amplificação

com a ciclagem dupla. Tal modificação é sugerida pelo fabricante para evitar um

artefato de interpretação que pode ocorrer na análise dos picos mostrados no

eletrofluorograma, confundindo picos reais com fragmentos menores de mesma

seqüência, porém com sua cauda poli-A de tamanho menor. A diferença de

temperatura entre os ciclos garante maior estabilidade da Taq polimerase e a

homogeneidade de cada fragmento, de forma que a etapa final de poli-adenilação das

fitas sintetizadas ocorra mais eficientemente.

Legenda: M – marcador de peso

molecular. Primer D17S250. 1:

DNA arquivo C. 2: DNA

arquivo D. 3: DNA arquivo E. 4:

DNA Merck A. 5: fresco

Qiagen.

Resultados e Discussão 98

Dado que os resultados ainda não se mostravam de forma adequada, decidiu-

se testar outro kit de extração de DNA da Qiagen que vem sendo utilizado em

medicina forense para extração de amostras escassas.

Amostras de DNA de um paciente oriundas de blocos de parafina

correspondentes ao tecido normal de cólon e ao adenocarcinoma foram utilizadas

para o teste. A extração de DNA foi realizada seguindo as instruções do fabricante.

Após a desparafinização do tecido raspado da lâmina, o pellet resultante foi pesado

em balança analítica para verificação do peso do tecido, antes da incubação para lise

das células. Este procedimento foi realizado para não saturar a coluna de extração

fornecida com o kit, já que, de acordo com o protocolo fornecido, o kit utilizado

permite a extração de DNA de forma eficiente de até 10 mg de tecido. Dessa

maneira, utilizou-se a amostra X com 5 µg de tecido e a amostra Y com 9,6 µg de

tecido. O DNA eluído da coluna foi quantificado, com resultado mostrado a seguir:

Amostra [DNA] A260/A280

1) bloco arquivo X (adenocarcinoma) Æ 25,7 ng/µl Æ 2,23 Æ2 cortes

2) bloco arquivo Y (mucosa normal) Æ 13,2 ng/ µl Æ 2,31 Æ2 cortes

Estas amostras foram utilizadas para testar se a PCR utilizando os primers de

MSI ocorreria de forma satisfatória. Para o teste foram utilizados dois pares de

primers, BAT26 e BAT40, dois marcadores mononucleotídicos usados com

freqüência em literatura (repetição de A e de T, respectivamente). Juntamente com

esta amostra de DNA, utilizou-se DNA de tecido fresco de cólon como controle

positivo da reação.

O resultado mostrou bandas fracas acompanhadas de um “arraste” (dados não

mostrados). Para verificar se o fragmento de DNA teria sido amplificado neste

Resultados e Discussão 99

padrão, decidiu-se submeter os produtos de PCR à eletroforese no equipamento ABI

PRISM 3130 (Applied Biosystems, Califórnia, Estados Unidos) para detecção da

fluorescência e tamanho dos fragmentos amplificados. Os produtos de PCR foram

utilizados na forma concentrada, diluída 10 vezes e diluída 50 vezes. O resultado que

forneceu a melhor intensidade de fluorescência variou entre a diluição de 10 e de 50

veses.

O Size Standard consiste em um pool de fragmentos de tamanhos conhecidos

marcados com uma fluorescência específica (no caso LIZ) e diferente da usada para

identificar o fragmento de interesse no estudo. A solução contendo todos os

fragmentos juntamente com todas as amostras é essencial para que o software

determine corretamente o tamanho dos picos da amostra analisada.

A corrida demora cerca de 50 minutos a cada injeção, sendo que cada injeção

analisa ao mesmo tempo quatro amostras. Os resultados coletados são analisados no

software GeneMapper (Applied Biosystems, Califórnia, Estados Unidos), que após a

definição dos parâmetros de análise, mostra o eletrofluorograma de cada corrida,

seguida dos tamanhos dos alelos encontrados. A análise deve ser feita comparando o

padrão do tecido colorretal normal com o padrão do adenocarcinoma. A MSI é

verificada quando o tamanho dos alelos mostrado no eletrofluorograma é diferente

entre os tecidos correspondentes ao mesmo paciente.

O resultado desta comparação é mostrado a seguir (Figura 20).

Resultados e Discussão 100

Legenda: Os picos azuis correspondem aos fragmentos estudados e os picos laranjas correspondem ao

Size Standard. O tamanho circulado em vermelho corresponde a 100 pb, marcado apenas para servir

de referência. A: picos da amostra X amplificada com BAT26 (adenocarcinoma – C01); B: picos da

amostra Y amplificada com BAT26 (mucosa normal – H01); C: picos da amostra Y amplificada com

BAT40 (mucosa normal – C02); D: picos da amostra X amplificada com BAT40 (adenocarcinoma –

F01); E: picos da amostra controle de tecido fresco amplificada com BAT26 (G02); F: picos da

amostra controle de tecido fresco amplificada com BAT40 (B03).

Figura 20 - Eletrofluorograma derivado do software GeneMapper.

TUMOR

BAT26

NORMAL

BAT26

NORMAL

BAT40

TUMOR

BAT40

CONTROLE

BAT26

CONTROLE

BAT40

Resultados e Discussão 101

O resultado acima mostra que aparentemente foi detectada uma instabilidade

entre os eletrofluorogramas A e B e entre C e D (correspondentes às amostras de

adenocarcinoma e da mucosa normal), de acordo com o tamanho dos alelos,

conforme descrito a Tabela 25 seguir:

Tabela 25 – Tamanho dos alelos encontrados.

Amostra Tecido Primer Alelo 1 Alelo 2

Adenocarcinoma BAT26 106,74 108,74

Mucosa normal BAT26 105,96 115,31

Adenocarcinoma BAT40 110,89 113,07

Mucosa normal BAT40 98,97 119,20

De acordo com a variação de tamanho entre os alelos verifica-se a

instabilidade. Entretanto, estes resultados devem ser interpretados com cautela, e

neste caso, os dados apresentados são considerados como inconclusivos. O padrão

apresentado pelas amostras normais analisadas em comparação com o controle de

tecido fresco utilizado é bastante diferente e não condizente com o esperado. Por se

tratar de marcadores mononucleotídicos, o esperado seria encontrar uma faixa única

de apresentação de picos no eletrofluorograma das amostras correspondentes a

mucosa normal, dentro da faixa de tamanho esperada para cada marcador. Como é

possível observar nos resultados A e C da Figura 12, duas faixas de picos são

apresentadas, diferentemente do padrão apresentado pelo controle de tecido fresco.

Os picos menores à esquerda (menores em tamanho) do pico maior são

artefatos inerentes das amplificações de unidades repetitivas, os picos “stutter”.

Trata-se de unidades de repetições mais curtas em relação ao alelo principal. Os

picos stutters são bastante reprodutíveis para determinado alelo amplificado,

Resultados e Discussão 102

conforme é possível verificar na figura correspondente ao controle normal de cólon

de tecido fresco submetidos novamente a outra PCR utilizando-se os mesmos

primers (Figura 21). O tamanho dos alelos encontrados pelo software foram

exatamente os mesmos entre as duas PCRs com a mesma amostra.

Legenda: Os picos azuis correspondem aos fragmentos estudados e os picos laranjas correspondem ao

Size Standard. O tamanho circulado em vermelho corresponde a 100 pb, marcado apenas para servir

de referência. A: picos da amostra controle de tecido fresco amplificada com BAT26 (A05); B: picos

da amostra controle de tecido fresco amplificada com BAT40 (D05).

Figura 21 - Reprodução dos picos Stutters. Eletrofluorograma derivado do software

GeneMapper.

Concluindo, até o presente momento não foi possível obter DNA de boa

qualidade para a realização do experimento de MSI. Apesar dos problemas

enfrentados na tentativa de estabelecer a técnica de MSI na Instituição, um

importante benefício resultante deste projeto foi a substituição da formalina

anteriormente utilizada para uma formalina de melhor qualidade (Merck), que

proporcionará aos pesquisadores que seus projetos subseqüentes sejam realizados

com sucesso.

Na tentativa de resolver o problema da qualidade do DNA obtido de parafina,

buscaram-se os mesmos pacientes no Banco de Tumores de tecido congelado da

Resultados e Discussão 103

Instituição. Foram encontrados 26 pacientes pertencentes ao Registro de Câncer

Colorretal Hereditário que possuíam tecido fresco congelado. Mesmo em se tratando

de uma pequena amostra, a análise de MSI foi realizada nestes pacientes.

4.2.3 Extração de DNA e Amplificação das Amostras do Banco de Tumores

O DNA das amostras de tecido fresco do Banco de Tumores foi extraído

utilizando-se o kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen, Hilden, Germany), de acordo

com as orientações do fabricante. Foram utilizados quatro cortes de 5 µm de cada

amostra.

Os DNAs extraídos foram quantificados no NanoDrop ND-1000 (NanoDrop

Technologies, Delaware, Estados Unidos). A quantidade obtida de DNA das

amostras apresentou resultados variáveis dependendo do tamanho do tecido, mas

sempre com quantidade e qualidade adequadas. Para as reações de PCR todas as

amostras foram ajustadas para 20 ng/µl.

Amostras de três pacientes, de mucosa normal e tumoral, foram utilizadas

para os testes de amplificação, juntamente com a amostra controle utilizada em todos

os testes anteriores, no intuito de verificar se as reações ocorreriam de forma

adequada. Dessa maneira, os resultados a seguir representam as reações que foram

realizadas para todos os pacientes analisados.

As reações de amplificação foram feitas da mesma forma conforme já

descrito para todos os primers, utilizando-se 20 ng de DNA para cada reação. As

figuras a seguir apresentam os resultados da amplificação em géis de acrilamida

0,8% (Figura 22).

Resultados e Discussão 104

BAT26

BAT40

BAT25

BAT34c4

D10S197

D17S250

M 1 2 3 4 5 6 7 n

M 1 2 3 4 5 6 7 n M 1 2 3 4 5 6 7 n

M 1 2 3 4 5 6 7 n

M 1 2 3 4 5 6 7 n M 1 2 3 4 5 6 7 n

100 pb

100 pb 100 pb

MYCL

M 1 2 3 4 5 6 7 n M 1 2 3 4 5 6 7 n

100 pb

M 1 2 3 4 5 6 7 n M 1 2 3 4 5 6 7 n

D18S55

D5S346

ACTC

Legenda: Cada figura possui o nome do seu marcador: BAT26, BAT40, BAT25, BAT34c4,

D10S197, D17S250, D18S55, D5S346, ACTC e MYCL. M = marcador. 1-6 = amostras testadas. 7 =

controle positivo. N = controle negativo.

Figura 22 - Amostras de DNA amplificadas com todos os primers.

Resultados e Discussão 105

Os produtos de PCR foram diluídos na proporção 1:30, pois nos testes

anteriores os melhores resultados ocorreram entre as proporções 1:10 e 1:50. A

eletroforese no equipamento ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems, Califórnia,

Estados Unidos) para detecção da fluorescência e tamanho dos fragmentos

amplificados foi realizada conforme já descrito.

Dos 26 pacientes analisados, 12 deles apresentaram instabilidade em pelo

menos um dos marcadores. A Tabela 25 a seguir mostra o resultado dos marcadores.

Tabela 26 – Marcadores instáveis.

Casos BAT26 BAT40 BAT25 BAT34c4 D10S197 D17S20 D18S5S D5S346 ACTC MYCL Alteração

X Ausente

X X Ausente

X X X X X MSH2/MSH6

X X X X X X MSH2/MSH6

X X X X X X X X MSH2/MSH6

X X X X X X X X MLH1/PMS2

X X X X X X X X X X MSH2/MSH6

X X X X X X X X X X MLH1/PMS2

X X X X X X X X X X MSH2/MSH6

X X X X X X X X X X MLH1

? X ? X X X MSH2/MSH6

Os dois primeiros casos são classificados como MSI-L, ou seja, possuem

instabilidade em até 30% dos marcadores. Os demais casos são classificados como

MSI-H, ou seja, possuem mais do que 30% dos marcadores instáveis. Dessa maneira,

do total de 26 casos analisados, 53,85% foram classificados como MSS, 38,46%

como MSI-H e 7,69% como MSI-L.

O fenótipo MSI-H é encontrado de 85% a 92% dos CCRs associados à

Síndrome de Lynch e em 10% a 15% dos CCR esporádicos. A técnica de MSI possui

Resultados e Discussão 106

uma sensibilidade de 93% em detectar deficiências no reparo do DNA em

carreadores de mutações patogênicas nas proteínas envolvidas (HENDRIKS et al.

2006A; WANG et al. 2007). Aproximadamente 95% dos casos com MSI-H estão

ligados a perda de expressão de MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2, enquanto que os 5%

restantes devem-se a outras etiologias (BAUDHUIN et al. 2005). BURGART (2005)

relata que 100% dos adenocarcinomas relacionados à síndrome possuem MSI. Os

casos de tumores com MSS com mutação encontrada são reportados na literatura em

uma freqüência de 10% (JONG et al. 2004).

Dos 12 casos que apresentaram instabilidade todos os classificados como

MSI-H apresentaram alteração em pelo menos uma proteína de reparo. Sete dos

casos apresentaram perda de expressão protéica em MSH2 e MSH6, dois em MLH1

e PMS2 e um dos casos apresentou perda de expressão apenas em MLH1. Este

último caso apresentou todos os marcadores instáveis e foi encaminhado para outro

projeto que verificará se o promotor do gene se encontra hipermetilado. Da mesma

forma como os resultados de imunoistoquímica se apresentaram, a freqüência de

alteração no heterodímero MSH2/MSH6 nos casos MSH-H também foi superior a

freqüência de alteração no heterodímero MLH1/PMS2 (70% x 20%), caracterizando

mais uma vez diferenças apresentadas pela população estudada, representativa da

população brasileira.

Do caso 12 não foi possível amplificar os fragmentos para os marcadores

BAT26 e BAT25 da amostra de tecido de mucosa colônica normal. Dessa forma, não

foi possível verificar se existe instabilidade destes marcadores. Ainda assim, devido

ao fato de que a paciente apresentou além dos dois marcadores inconclusivos, quatro

Resultados e Discussão 107

marcadores instáveis e ainda ausência de expressão protéica de MSH2 e MSH6, este

caso já pode ser classificado como MSH-H e portador da síndrome de Lynch.

Os marcadores foram considerados instáveis quando houve alteração no

tamanho dos fragmentos amplificados comparando o tecido da mucosa colônica

normal com o tecido de adenocarcinoma. Os marcadores mostraram tamanhos

médios de fragmentos de 114,18 pb para o marcador BAT26; 120,59 pb para o

marcador BAT40; 120,18 pb para o marcador BAT25; 128,28 pb para o marcador

BAT34c4; 169,23 pb para o marcador D10S197; 154,88 pb para o marcador

D17S250; 142,69 pb para o marcador D18S5S; 121,29 pb para o marcador D5S346;

81,15 pb para o marcador ACTC e 180,97 pb para o marcador MYCL. Todos os

tamanhos encontrados são condizentes com os PCRs in silico realizados no site da

Universidade de Santa Cruz, na Califórnia (www.genome.ucsc.edu).

A instabilidade dos marcadores mononucleotídicos é mais informativa para

uma real deficiência no Sistema de Reparo do DNA do que a instabilidade dos

marcadores dinucleotídicos, isso porque as alterações nas repetições de mais de um

nucleotídeo podem também ocorrer devido a erros espontâneos de replicação destas

seqüências altamente instáveis (JONG et al. 2004). A instabilidade dos marcadores

dinucleotídicos é característica de tumores estáveis ou com pouca instabilidade

(BLANES e DIAZ-CANO 2006). Os marcadores mononucleotídicos tendem a ser

monomórficos ou quasimonomórficos. Além disso, as repetições dinucleotídicas são

menos sensíveis do que as mononucleotídicas em detectar MSI-H. Se apenas os

marcadores dinucleotídicos se apresentarem instáveis para dado tumor, existe a

recomendação de se testar marcadores mononucleotídicos adicionais. Os marcadores

Resultados e Discussão 108

tri-, tetra- ou pentanucleotídicos tendem a ser mais estáveis em tumores com MSI,

mas servem como excelentes controles de qualidade (BAUDHUIN et al. 2005).

Para os marcadores dinucleotídicos é freqüente a presença tanto de novos

fragmentos maiores quanto menores, devido a expansões e contrações das repetições.

Para os marcadores mononucleotídicos, entretanto, fragmentos de tamanho menor

são tipicamente detectados (BAUDHUIN et al. 2005).

As mutações em MLH1, MSH2 e PMS2 levam a uma instabilidade tanto em

marcadores mono- quanto dinucleotídicos. Já as mutações em MSH6 parecem estar

mais fortemente associadas com instabilidade nos marcadores mononucleotídicos.

Dado que a proteína MSH6 está envolvida no reparo de bases únicas, mas não no

reparo de inserção/deleção de loops, é intuitivo que defeitos em MSH6 resultariam

apenas em instabilidade mononucleotídica (BAUDHUIN et al. 2005).

Nas Figuras a seguir (Figuras 23 a 27) a seguir são apresentados resultados

dos eletrofluorogramas de cinco casos representativos da amostra de estudo. Os picos

dos eletrofluorogramas apresentam-se alinhados nas amostras referentes aos tecidos

normais e tumorais de cada paciente, de acordo com o tamanho dos alelos

encontrados, determinado pelo mesmo Size Standard em todas as amostras. Dessa

maneira, picos mostrados de forma não alinhada quando comparados em relação às

duas amostras do mesmo paciente caracterizam a instabilidade daquele marcador.

O primeiro caso representado na Figura 23 apresenta instabilidade de 10

marcadores e ausência de expressão protéica de MSH2 e MSH6.

Resultados e Discussão 109

BAT26

BAT40

BAT25

BAT34c4

D10S197

D18S5S

D17S250

ACTC

MYCL

D5S346

Legenda: Todos os marcadores apresentam-se instáveis. N = mucosa colônica normal (normal); T =

adenocarcinoma (tumor).

Figura 23 - Eletrofluorogramas para um caso com perda de expressão protéica de

MSH2/MSH6.

Resultados e Discussão 110

O resultado mostrado revela a existência de alelos de tamanhos diferentes no

tecido tumoral quando comparados com o tecido normal para todos os marcadores de

MSI.

O segundo caso representado na Figura 24 apresenta instabilidade de 10

marcadores e ausência de expressão protéica de MLH1 e PMS2.

Resultados e Discussão 111

BAT26

BAT40

BAT25

BAT34c4

D10S197

D18S5S

D17S250

D5S346

ACTC

MYCL

Legenda: Todos os marcadores apresentam-se instáveis. N = mucosa colônica normal (normal); T =

adenocarcinoma (tumor).

Figura 24 - Eletrofluorogramas para um caso com perda de expressão protéica de

MLH1/PMS2.

Resultados e Discussão 112

O resultado mostrado revela a existência de alelos de tamanhos diferentes no

tecido tumoral quando comparados com o tecido normal para todos os marcadores de

MSI.

O terceiro caso representado na Figura 25 apresenta instabilidade de 10

marcadores e ausência de expressão protéica apenas de MLH1.

Resultados e Discussão 113

BAT26

BAT40

BAT25

BAT34c4

D10S197

D18S5S

D17S250

D5S346

ACTC

MYCL

Legenda: Todos os marcadores apresentam-se instáveis. N = mucosa colônica normal (normal); T =

adenocarcinoma (tumor).

Figura 25 - Eletrofluorogramas para um caso com perda de expressão protéica

apenas para MLH1.

Resultados e Discussão 114

O marcador MYCL apresenta um segundo pico menor em tamanho e menor

em intensidade, imediatamente antes do pico maior (alelo amplificado). Trata-se de

picos “-A”, resultado do mesmo fragmento com uma base a menos, a adenina,

conseqüência da adenilação ausente ou reduzida que ocorre no período de extensão

dos produtos de PCR. Para evitar ou reduzir este efeito o tempo de extensão do ciclo

da PCR é aumentado.

O quarto caso representado na Figura 26 apresenta instabilidade apenas em

dois marcadores, BAT26 e BAT40, sendo classificado como MSI-L. A expressão das

proteínas de reparo foi normal.

Resultados e Discussão 115

BAT26

BAT40

BAT25

BAT34c4

D10S197

D18S5S

D17S250

D5S346

ACTC

MYCL

Legenda: Apenas os marcadores BAT26 e BAT40 apresentam-se instáveis (setas). N = mucosa

colônica normal (normal); T = adenocarcinoma (tumor).

Figura 26 - Eletrofluorogramas para um caso classificado como MSI-L e sem perda

de expressão protéica.

Resultados e Discussão 116

O quinto caso representado na Figura 27 não apresenta instabilidade em

nenhum dos marcadores e expressão normal de todas as proteínas estudadas.

BAT34c4

D10S197

BAT26

BAT40

BAT25

D18S5S

D17S250

D5S346

ACTC

MYCL

Legenda: Todos os marcadores apresentam-se estáveis. N = mucosa colônica normal (normal); T =

adenocarcinoma (tumor).

Figura 27 - Eletrofluorogramas para um caso com expressão protéica normal.

Resultados e Discussão 117

O resultado mostrado revela alelos de mesmo tamanho no tecido tumoral

quando comparados com o tecido normal para todos os marcadores de MSI. Todas as

proteínas estudadas apresentaram expressão normal.

Tumores com MSI apresentam características histológicas semelhantes: 90%

estão localizados à direita do cólon, são pouco diferenciados, mucinosos e

geralmente têm infiltração por linfócitos T citotóxicos e acúmulo de células B e T ao

redor do tumor. Diversas teorias têm sido postuladas para explicar porque tumores

MSI-H apresentam melhor prognóstico, apesar das características histológicas

desfavoráveis. SAMOWITZ et al. (2001) demonstraram que o valor prognóstico do

status de MSI poderia ser significativamente evidenciado pela avaliação combinada

com o número de linfócitos citotóxicos ativos intratumoral. Isso deu suporte à

hipótese de que tumores MSI-H podem continuamente produzir novos epítopos

imunogênicos como conseqüência de um sistema de reparo defeituoso, o que poderia

explicar porque pacientes com câncer colorretal esporádico MSI-H são capazes de

apresentar uma reposta imune antitumor mais efetiva, tendo um resultado clínico

mais favorável. É possível ainda, que o acúmulo de anormalidades genéticas leve à

expressão de proteínas aberrantes, reconhecidas pelo sistema imune culminando com

a destruição das células tumorais. Outra teoria relaciona o defeito no sistema de

reparo com a melhor sobrevida, pois, uma vez que várias mutações não são reparadas

durante a replicação, o acúmulo destas torna-se incompatível com a vida celular

(SAMOWITZ et al. 2001).

Pacientes com tumores MSI possuem melhor taxa de sobrevida e respostas

modificadas a quimioterapia convencional. A razão para a resposta diferencial pode

estar relacionada à distinta cinética celular associada com a subregulação das

Resultados e Discussão 118

proteínas de reparo, aumentando significativamente a apoptose e diminuindo a

proliferação celular, o que certamente contribui na resistência das células tumorais à

quimioterapia convencional (BLANES e DIAZ-CANO, 2006).

Nos tumores com MSI-H, a deficiência dos genes de reparo pode gerar muitas

proteínas truncadas aberrantes por mutações frameshift, fornecendo uma fonte

anormal de peptídeos que podem ser apresentados aos linfócitos T citotóxicos. O

prognóstico favorável pode ser explicado pela marcada infiltração linfocítica vista

nos CCRs com MSI-H, que é relacionada especificamente à resposta imune

direcionada ao antígeno. Comparando o padrão de expressão gênica de tumores MSI-

H e MSS, BANERJEA et al. (2004) mostraram que muitos genes imuno-

modulatórios importantes, como as moléculas chaperones, citocinas pró-

inflamatórias e mediadores citotóxicos são super-regulados em tumores MSI-H,

sugerindo uma reposta imune antitumoral ativada nestes tumores. Em relação às

análises de expressão de transcritos, KIM et al. (2004) também encontraram genes

que são relevantes na discriminação de CCRs MSI-H e MSS, além de uma resposta

imune peritumoral intensa relacionada às características fenotípicas de CCRs MSI-H.

Estes resultados suportam a hipótese de que os tumores MSI-H possam ser mais

imunogênicos do que os MSS.

Os recentes estudos retrospectivos e prospectivos comparando pacientes MSI-

H com quimioterapia com 5-fluorouracil (5-FU) e os pacientes sem quimioterapia

indicaram que os pacientes com CCR MSS estádio II e III se beneficiam da

quimioterapia com 5-FU, enquanto que os pacientes com CCR MSI-H não se

beneficiaram (RIBIC et al. 2003). Entretanto, uma análise recente do National

Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project não atesta o uso de MSI-H como um

Resultados e Discussão 119

marcador preditivo de benefício com a quimioterapia. Estudando linhagens celulares

de CCR com deficiência nos genes do sistema de reparo BOLAND et al. (2008)

verificaram que as células eram resistentes aos efeitos citotóxicos de muitas drogas,

incluindo agentes alquilantes e o 5-FU, sugerindo, desta forma, que pacientes com

MSI mostrariam menor benefício com este tipo de tratamento do que os pacientes

com MSS. Assim, os dados atuais disponíveis não justificam a exclusão de pacientes

com CCR MSI-H para tratamento com 5-FU. Considerando a heterogeneidade

molecular do fenótipo MSI em relação com as características genéticas e

epigenéticas, pode ser difícil utilizar a MSI-H como um único marcador preditivo

para guiar o uso de 5-FU e outras drogas quimioterápicas em pacientes com CCR

(IMAI e YAMAMOTO 2008).

VAN RIJNSOEVER et al. (2003) mostraram que CCRs com o fenótipo

metilador de ilhas CpGs alta (CIMP+) é um preditor de benefício com quimioterapia

com 5-FU independentemente do status de MSI. A CIMP+ é caracterizada pela

presença de metilação em dois ou mais sítios analisados. A explicação para os

achados estão nas ligações demonstradas entre o metabolismo de folato e mudanças

na metilação do DNA. A hipótese é de que a hipermetilação observada nos tumores

com CIMP+ pode ser um marcador substituto para aberrações generalizadas no

metabolismo celular de folato e de grupo metil. Tais mudanças podem render às

células tumorais com CIMP+ maior sensibilidade para terapias anti-folato, incluindo

5-FU e ácido folínico. Outra explicação para a aparente quimiosensibilidade de

tumores CIMP+ é que o silenciamento transcricional associado com este fenótipo

inativaria genes necessários à sobrevivência celular na presença de 5-FU.

Resultados e Discussão 120

A presença e o papel de tumores MSI-L ainda é controversa. A natureza da

MSI-L ainda não foi substancialmente caracterizada por defeitos nos genes de reparo

do DNA ou outros defeitos. As análises de mutações em genes alvo para a MSI-H

revelaram que elas são ausentes nos tumores MSI-L. Os tumores MSI-L são

indistinguíveis dos MSS em muitos parâmetros. Dessa forma, acredita-se que estas

alterações isoladas de microssatélites não representam indicadores de instabilidade

genômica, apesar se serem marcadores úteis de clonalidade ou de atividade mitótica.

As mutações observadas em tumores MSI-L podem representar um nível de

instabilidade genética presente em todos os tumores e em suas células precursoras

normais. Se um número suficiente de marcadores for analisado, todos os tumores

além dos MSI-H exibiriam MSI-L, de acordo com o critério de classificação do NCI.

É proposto ainda, que a variação de nível de instabilidade encontrada nos CCRs

MSI-L são quantitativas e que provavelmente refletem a história evolucionária dos

tumores, mais do que diferenças qualitativas nas vias genéticas de tumorigênese

(IMAI e YAMAMOTO 2008).

Por outro lado, muitos estudos sugerem que os tumores MSI-L formam uma

entidade única, associada à perda de expressão da proteína O

-methylguanine-DNA

methyltransferase (MGMT). Assim, a perda de MGMT e de MLH1 devido a

metilação, têm sido sugeridos por serem mecanismos para a MSI-L. O silenciamento

de MGMT favorece mutações nos genes por subjugar o sistema de reparo do DNA

(WHITEHALL et al. 2001).

É preciso demonstrar ainda se os tumores MSI-L compõem dois grupos, um

indistinguível dos tumores MSS e outro distinto que pode apresentar muitas

mutações devido a uma instabilidade baixa ou transiente. O principal problema

Resultados e Discussão 121

reside na dificuldade em estabelecer um critério para a distinção destes possíveis

tumores MSI-L “verdadeiros” do restante de tumores MSS ou MSI-L “falsos”,

baseado no número de alterações de marcadores dinucleotídicos. Uma possibilidade

seria usar especificamente marcadores mononucleotídicos nos tumores MSI-H e

descobrir algum marcador dinucleotídico que poderia estar alterado apenas nos

tumores MSI-L e não nos tumores MSS (IMAI e YAMAMOTO 2008).

Conclusão 122

5 CONCLUSÃO

O estudo mostra que os pacientes investigados, representativos da população

brasileira, também podem usufruir do estudo imunoistoquímico das proteínas de

reparo do DNA, pois também possuem a perda da expressão destas proteínas como

marcadores importantes no estabelecimento da síndrome de Lynch.

A realização da técnica de MSI com a quantidade de marcadores adequada

para reduzir os casos falso-negativos é comprometida pelo uso de material fixado em

formalina que não seja de boa qualidade, mesmo que esta seja tamponada. Este fato

foi evidenciado na tentativa de obtenção de DNA das amostras deste serviço, que

utiliza formalina tamponada desde 1996, e mesmo assim, não foi possível obter DNA

necessário para a realização de MSI.

Dessa forma, a técnica de MSI foi realizada em amostras de tecido congelado

oriundas do Banco de Tumores. Houve concordância entre os achados de

imunoistoquímica e MSI, ou seja, os casos com MSI-H apresentaram alteração

protéica e os casos MSI-L e MSS não apresentaram.

Entre os achados clínicos que apresentaram correlação com a perda de

expressão das proteínas de reparo estão a localização do tumor do lado direito do

cólon e o tipo histológico de adenocarcinomas com componente mucinoso.

O tumor extra-colônico que foi encontrado nesta casuística entre os familiares

com maior freqüência em relação aos indivíduos que apresentaram perda da

expressão de proteínas de reparo foi o adenocarcinoma de endométrio. No entanto,

Conclusão 123

com relação aos indivíduos que não apresentaram perda de expressão das proteínas

de reparo, o mais freqüente foi o carcinoma de mama.

As técnicas de imunoistoquímica para os genes de reparo do DNA e de

instabilidade de microssatélites são ferramentas importantes na identificação de

indivíduos com risco elevado de serem portadores da síndrome de Lynch.

Referências Bibliográficas 124

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXOS

Anexo 1 - TERMO DE CONSENTIMENTO PÓS-INFORMADO

(Obrigatório para Pesquisa Clínica em Seres Humanos – Resolução N. 196/96 e resolução

CNS 252/97 do Ministério da Saúde)

PROJETO: A

VALIAÇÃO DA FREQÜÊNCIA DE MUTAÇÕES NOS GENES DO SISTEMA DE

REPARO DE DNA EM PACIENTES COM SUSPEITA DE CÂNCER COLORRETAL

HEREDITÁRIO SEM POLIPOSE: ESTUDO COLABORATIVO SUL-AMERICANO

DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO PACIENTE OU RESPONSÁVEL LEGAL

NOME DO PACIENTE:_________________________________________________________

Sexo: masculino feminino Data de nascimento:___/___/_____

Documento de identidade n.:__________________

Endereço: ____________________________________________________________________

Número: _________________________________Complemento:________________________

Cidade: __________________________________Estado: _____________________________

CEP: ____________________________________TEL: _______________________________

RESPONSÁVEL: ______________________________________________________________

Sexo: masculino  feminino Data de nascimento:___/___/_____

Documento de identidade n.:__________________

Endereço: ____________________________________________________________________

Número: _________________________________Complemento:________________________

Cidade: __________________________________Estado: _____________________________

CEP: ____________________________________TEL: _______________________________

II. OBJETIVOS DO ESTUDO

Você foi convidado a participar deste estudo, pois sua família pode ser portadora de uma

síndrome hereditária de câncer do intestino grosso. Isto significa que os indivíduos de sua

família podem ter risco aumentado de desenvolver câncer do intestino grosso. Este risco

aumentado pode ser conseqüência de alteração nos genes.

Este estudo tem por objetivo verificar se indivíduos que pertencem a famílias com câncer

colorretal hereditário sem polipose têm alterações nos genes MLH1 e MSH2.

A maioria dos tumores de intestino grosso é esporádica, ou seja, sem história familiar.

Porém, entre 5% a 10% dos casos (ou um em cada 10 tumores do intestino grosso), são

chamados hereditários, pois são causados por alterações nos genes chamadas mutações.

Os genes são códigos dentro das células que funcionam como programas que determinam

como as células do organismo devem funcionar. Quando ocorrem as alterações chamadas

mutações, os genes podem não funcionar direito e enviar sinais errados para o

funcionamento das células. Quando as mutações ocorrem em genes que atuam no

crescimento das células, isto pode levar ao desenvolvimento de tumores.

Existem diversas doenças hereditárias que aumentam o risco de câncer do intestino grosso,

dentre elas está o HNPCC (câncer colorretal hereditário sem polipose). Para o diagnóstico da

doença HNPCC há um critério clínico (características baseadas na história familiar) e o

diagnóstico molecular (feito através de um exame de sangue específico). Quando indivíduos

de famílias com diagnóstico do HNPCC baseado na história familiar realizam o exame de

sangue, é possível em 60% dos casos encontrar alterações em um dos seis genes

identificados até o momento. Dois, destes seis genes (chamados MLH1 e MSH2) são

responsáveis pela maioria das alterações.

III. PROCEDIMENTOS

Após a assinatura deste consentimento (autorização para o estudo), você realizará uma

entrevista com a enfermeira que irá explicar todos os procedimentos. A história de câncer da

sua família será revisada. Ao terminar esta entrevista, você será encaminhado ao laboratório

para a retirada da amostra de sangue. No laboratório serão retirados 20ml de sangue

(aproximadamente duas colheres de sopa) através de uma agulha colocada no seu braço. O

sangue será colocado em dois tubos, identificado e enviado ao laboratório para análise. No

laboratório, o sangue passará por uma máquina que irá verificar se dois genes, o hMLH1 e o

HMSH2 têm alguma alteração. Essas alterações são chamadas mutações.

Além de avaliar o seu sangue, iremos avaliar um pedaço do tumor que foi retirado na sua

cirurgia e está guardado no arquivo do hospital. É possível que algumas das alterações

observadas nos genes retirados do seu sangue possam estar presentes no tumor. Estas

alterações são chamadas de instabilidade de microssatélites.

Uma vez que os testes estiverem prontos, você será comunicado por telefone e deverá marcar

uma consulta com o médico que solicitou o exame.

Quando o resultado estiver pronto, você receberá um contato por telefone para agendar uma

consulta de retorno. Nesta consulta será divulgado o resultado, e serão discutidas as

implicações do teste sobre o risco de câncer do intestino grosso. Você pode se recusar a

receber o resultado.

Existem três possibilidades de resultados:

1 – você pode ter a alteração nos genes MLH1 e MSH2 que está associada a um maior risco

de câncer de intestino grosso; é o que chamamos de resultado positivo; se você tem a

alteração no gene, tem 50% de chance de passar a alteração para os seus filhos. O fato de ter

alteração não significa que a pessoa irá ter câncer. Um indivíduo com alteração em um dos

genes examinados tem entre 20 a 80% de risco de desenvolver câncer do intestino grosso

durante toda a vida. Algumas pessoas com a alteração genética não têm câncer. Uma pessoa

que tem a alteração pode realizar acompanhamento para detectar o câncer. Este

acompanhamento consiste de colonoscopia, endoscopia, ultrassonografia do abdome e

exame de urina anuais;

2 – o exame não identificou alterações nos genes MLH1 e MSH2. Isto é chamado de

resultado inconclusivo. Isto pode ocorrer em duas situações: você tem alterações em outros

genes que não foram estudados, ou o teste de laboratório utilizado não conseguiu encontrar a

alteração; os indivíduos com teste inconclusivo devem prosseguir com os exames de

seguimento;

3 – o exame encontrou uma alteração que não é possível determinar se ela está associada a

um risco maior de câncer.

O resultado será divulgado apenas para você. Você pode optar, em qualquer momento do

estudo, a não saber do resultado dos exames. A decisão de contar aos seus familiares é sua.

Os seus familiares podem se beneficiar com esta informação, pois podem programar com

que freqüência os exames de seguimento podem ser realizados. O seu teste não terá custo.

IV - BENEFÍCIOS

A participação estudo pode não trazer benefícios para você ou para os membros de sua

família; mas pode ajudar os médicos a compreender como o câncer se desenvolve. Se o teste

mostrar que você tem alteração no gene, isto pode auxiliar o médico nas orientações que

serão fornecidas sobre os exames preventivos.

V - RISCOS

Os riscos associados com sua participação nesse estudo são dor ou queimação no local da

retirada do sangue.

Além disso, o teste pode causar alterações psicológicas. Ao saber sobre o seu risco de câncer

devido alterações nos genes você poder sentir aumento na ansiedade, ou raiva, ou medo do

futuro.

Confidencialidade:

A confidencialidade das suas informações será mantida. Apenas as pessoas envolvidas

diretamente nesse estudo poderão inspecionar as informações se necessário. Cada família e

cada indivíduo inserido na família terá um número identificador para manter a privacidade.

Esse número será o meio pelo qual você será identificado. Seu nome e informações pessoais

não serão incluídos em nenhum estudo de pesquisa que possa fazer uso de seu sangue e/ou

de pedaço de tecido.

A sua participação neste estudo é voluntária, tendo o direito de retirar-se do estudo a

qualquer momento. Sua recusa ou desistência não irá prejudicar o tratamento.

A identidade dos pacientes será preservada, sendo que somente os membros da equipe

médica e da Comissão de Ética terão acesso aos registros.

Qualquer dúvida sobre o estudo, você poderá entrar em contato com a enfermeira Erika no

telefone 2189 5000 ramal 2304. Se o pesquisador principal não fornecer as

informações/esclarecimentos suficientes, por favor, entre em contato com o Coordenador do

Comitê de Ética do Hospital do Câncer – SP, pelo telefone 21895000, ramais 1113 ou 1117.

Declaro que fui esclarecido: sobre os procedimentos, riscos e benefícios sobre este estudo;

que tenho liberdade em retirar o meu consentimento a qualquer momento, sem que isto traga

prejuízo a continuidade do meu tratamento; que não haverá remuneração financeira para este

estudo; sobre a segurança de que minha identidade será preservada, mantendo-se todas as

informações em caráter confidencial e concordo em participar deste estudo.

São Paulo, ____ de _____________de _____.

______________________________________________

Assinatura do paciente ou responsável/representante local

____________________________________

Assinatura do pesquisador ou representante

Anexo 2 – Ficha de Dados

PREDISPOSIÇÃO HEREDITÁRIA AO CÂNCER COLORRETAL: DADOS

CLÍNICOS, HISTÓRIA FAMILIAR E INVESTIGAÇÃO FAMILIAR.

Família (RCCH)

Classificação segundo história familiar

S N Ign 

HNPCC (Amsterdam I)……………………………………………….. 

HNPCC (Amsterdam II)……………………………………………….. 

Bethesda...................................................................................... 

Padrão Familiar........................................................................... 

SMOH......................................................................................... 

Mama-cólon............................................................................... 

Síndrome Li-Fraumeni 

Síndrome Li-Fraumeni like 

Outra 

Data de inclusão no estudo

Identificação do estudo

Identificação PINGA

Tubo de sangue__________________

Tubo de leucócito_________________

Tubo de DNA____________________

Dados do Probando

Nome

RGH

Sexo (1) Masculino (2) Feminino

Data de nascimento

Data de admissão

Tumores

S N Idade

Colorretal (exceto adenomas)………………………………………….. ______

Adenomas colorretais……………………………………………….. ______

Endométrio ______

Estômago........................................................................... ______

Sistema hepatobiliar............................................................ ______

Intestino delgado........................................................................... ______

Pelve renal e/ou ureter ______

Ovário ______

Pâncreas ______

SNC............................................................ ______

Sebáceos.......................................................................... ______

Mama ______

______

Número de tumores malignos primários

Número de tumores benignos primários

DADOS CLÍNICOS E ANATOMOPATOLÓGICOS DO TUMOR COLORRETAL

Data do diagnóstico do câncer colorretal

Tumor primário colorretal

(0) não tem CCR (1) cólon prox (D+T) (2) cólon distal (E+S) (3) reto

(4) adenomas (9) ignorado

(0) não (1) QT (2) RxT

Data_____________

(0) não (1) colectomia parcial (2) colectomia total

(4) RA/APP (5) Ampliada/Exenteração

(7) Ressecção aberta/transanal

(0) não operado (1) curativa (2) paliativa

(0) T0 (1) T1 (2) T2

(4) T4 (9) Tx

(0) N0 (1) N1 (2) N2

(0) M0 (1) M1 retroperitônio (2) M1 fígado

(0) sem metástase (1) sim (2) não

(1) Bem

Diferenciado

(2) moderadamente

diferenciado

(3) pouco

Diferenciado

(1) exofítica (2) endofítica (3) difusa

(8) outras (9) ign

(1) infiltrativa (2) expansiva (9) ign

(0) ausente (1) presente (9) ign

(0) V0 (1) V1 (2) V2

(0) L0 (1) L1 (2) L2

(0) ausente (1) presente (9) ign

(0) não operado (1) livres (2) comprometida

(1) Adenocarcinoma tubular

(3) Adenoca mucinoso (>50%)

(5) CEC

(7) Adenoescamoso

(9) Pequenas células

(11) Medular

(0) não (1) sim (9) ign

(0) não (1) QT (2) RxT

(0) sem QT (1) 5-FU/LV (2) FOLFOX/FLOX

(4) Bevacizumab (8) outros (9) ign

(0) sem QT (1) incompleta (2) completa

Primeira recidiva

S N Ign 

a. Pélvica.............................................................................................. 

b. Parede abdominal............................................................................ 

c. Peritôneo......................................................................................... 

d. Anastomose.................................................................................... 

e. Linfonodo........................................................................................ 

f. Outra local____________________________________________ 

g. Fígado.............................................................................................. 

h. Pulmão............................................................................................ 

g. Osso............................................................................................... 

h. Outro________________________________________________ 

Data_____________

Data da última informação____________

(1) VSED (2) VCED (3) VSOE (4) MOCA (5) MO s/ CA

(6) MOSOE (7) Perdido de vista

AP da peça colorretal ___________________________________

AP outra peça__________________________________________

AP outros_______________________________________________

Dados Moleculares

Tecidos disponíveis

(1) Sangue

(2) Tumor

(3) Normal colorretal

(4) Adenoma (5) Normal outro (6) Outro tumor (9) ignorado

Imunoistoquímica

(0) Não realizado (1) negativo (2) positivo (3) inconclusivo (9) ign

MLH1 MSH2 MSH6 PMS2

Tumor

Normal

Adenoma

Normal outro

Outro Tumor

Instabilidade de Microssatélites

(0) Não realizado (1) estável (2) instável (3) inconclusivo (9) ign

Tumor

Normal

Adenoma

Normal outro

Outro Tumor

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