( PDF ) Estudo da interação entre monócitos humanos e vírus dengue sorotipo 2: vias de ativação e mecanismos de apoptose

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Ministério da Saúde

Fundação Oswaldo Cruz

Instituto Oswaldo Cruz

Curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária

ESTUDO DA INTERAÇÃO DE MONÓCITOS HUMANOS E VÍRUS DENGUE

SOROTIPO 2: VIAS DE ATIVAÇÃO E MECANISMOS DE APOPTOSE

por

AMANDA TORRENTES DE CARVALHO

Dissertação submetida ao Curso de Pós-

graduação em Biologia Parasitária da

Fundação Oswaldo Cruz, visando à

obtenção do grau de Mestre em Ciências.

Orientadora: Dr

Claire Fernandes Kubelka

Rio de Janeiro

Maio 2008

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Ministério da Saúde

Fundação Oswaldo Cruz

Instituto Oswaldo Cruz

Curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária

ESTUDO DA INTERAÇÃO DE MONÓCITOS HUMANOS E VÍRUS DENGUE

SOROTIPO 2: VIAS DE ATIVAÇÃO E MECANISMOS DE APOPTOSE

por

AMANDA TORRENTES DE CARVALHO

Orientadora: Dr

Claire Fernandes Kubelka (IFIOCRUZ)

Banca Examinadora Dr

Andrea Henriques Pons (FIOCRUZ)

Andrea Cheble de Oliveira - Revisora (UFRJ)

Luzia Maria Oliveira Pinto (FIOCRUZ)

Suplentes: Dr

Roberta Olmo Pinheiro (FIOCRUZ)

Landi Veivi Guillermo Costilla (UFRJ)

Rio de Janeiro

Maio de 2008

Dedico esse trabalho a meus Pais,

Frank e Regina, e minha Irmã Carolina,

que sempre me apoiaram e acreditaram

no meu potencial. Amo muito vocês!

“Pensamentos tornam-se ações, ações

tornam-se hábitos, hábitos tornam-se

caráter, e nosso caráter torna-se nosso

destino."

Autor Desconhecido

AGRADECIMENTOS

A Deus, por sempre estar ao meu lado, me guiando nas horas difíceis e iluminando meu

caminho.

À minha família, que constitui a parte mais importante da minha vida, por sempre

estarem ao meu lado nas conquistas e fracassos. Agradeço por tudo que fizeram e fazem por

mim e por sempre acreditarem em mim. Amo muito vocês!

Ao meu noivo Ricardo, por todo amor e carinho que tive e, especialmente, pelo

companheirismo, pela compreensão e dedicação em todos os momentos, principalmente nos

momentos mais difíceis.

À minha orientadora, Dr

Claire Fernandes Kubelka, por me aceitar no Laboratório de

Imunologia Viral, pela orientação, competência, incentivo, paciência e confiança no meu

trabalho.

À Mariana Gandini, amiga, por seus conselhos, sua ajuda, suas risadas, seu entusiasmo.

Apesar de nossas diferenças e semelhanças, você sempre me apoiou, e muitas vezes, me

compreendeu nas horas difíceis.

À Dr

Elzinandes, mais conhecida como Naide, minha co-orientadora de coração,

agradeço pela paciência, pela amizade, por seus conselhos, pelas horas no citômetro, os

lanches na quadra, as caronas e conversas.

À família do Laboratório de Imunologia Viral, por me aceitar, pelo companheirismo,

amizade e ensinamentos. Em especial: Sônia e Luzia, pelos estímulos e conselhos valiosos;

Alessandro, Cynthia, Maryrose, Lucianas e Lidiane, pelos ficolls, cálculos, conversas e

risadas. Agradeço por todos os momentos, bons e difíceis, que todos vocês estiveram ao meu

lado, me apoiando, alegrando e incentivando.

À Dr

Andrea Henriques Pons, pelo uso dos aparelhos de citometria e as dicas valiosas.

À Dr

Andréa Cheble de Oliveira e Daniel Sanches, do Laboratório de Termodinâmica

de Proteínas e Estruturas virais Gregorio Weber, UFRJ, pela colaboração, fornecimento de

material usado nesse projeto e uso do aparelho de Microscopia Confocal.

vii

Aos integrantes da banca, pela gentileza de aceitarem o convite.

Ao CNPq e à FIOCRUZ, pelo apoio científico e financeiro.

A todos aqueles que, de forma direta ou indireta, contribuíram para a realização deste

trabalho.

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1: Mapa de distribuição dos sorotipos do DENV no Brasil

Figura 1.2: Organização do genoma de Flavivírus, com suas proteínas resultantes e a

localização dos principais alvos da resposta imune.

Figura 1.3: A estrutura do DENV.

Figura 1.4: Esquema representativo das principais subpopulações monocíticas em humanos.

Figura 1.5: Esquema ilustrativo das vias de sinalização e principais fatores envolvidos na

apoptose, desde a membrana plasmática, mitocôndria, núcleo, RE e lisossomos.

Figura 4.1: Estabelecimento das regiões de monócitos derivados do sangue periférico

humano, com ênfase nas características morfológicas e fenotípicas.

Figura 4.2: Cinética de infecção de monócitos humanos pelo DENV-2.

Figura 4.3: Caracterização de monócitos humanos infectados ou não com DENV-2.

Figura 4.4: Detecção do Ag viral DENV-2 em monócitos por citometria de fluxo.

Figura 4.5: Detecção de Ag DENV em monócitos humanos após infecção in vitro com

DENV-2 por imunofluorescência através de microscopia confocal.

Figura 4.6: Caracterização fenotípica da expressão de CD16 em monócitos infectados por

DENV-2.

Figura 4.7: Efeito da infecção por DENV-2 na expressão da molécula CD16 em monócitos

humanos.

Figura 4.8: Detecção de morte celular programada em monócitos humanos infectados por

DENV-2.

Figura 4.9: Detecção de fosfatidilserina extracelular e perda da integridade de membrana em

monócitos infectados por DENV-2.

Figura 4.10: Caracterização fenotípica de monócitos humanos expressando o receptor de

morte Fas durante a infecção por DENV-2.

Figura 4.11: Detecção de receptor de morte Fas em monócitos humanos infectados por

DENV-2.

Figura 4.12: Detecção da expressão da oncoproteína Bcl-2 em monócitos CD14+ infectados

por vírus DENV-2.

Figura 4.13: Expressão de Bcl-2 em monócitos CD14+ infectados por DENV-2.

Figura 4.14: DENV-2 promove decréscimo no potencial de membrana mitocondrial de

monócitos humanos.

Figura 4.15: Detecção da alteração no potencial de membrana mitocondrial de monócitos

humanos infectados por DENV-2 através de imunofluorescência.

Figura 6.1: Hipótese das vias de sinalização envolvidas na indução de morte e ativação

celulares na infecção de monócitos pelo vírus Dengue.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.1: Visão geral das mudanças celulares provocadas pelos principais mecanismos de

morte celular e função de cada um, com destaque no sistema imunológico.

Tabela 4.1: Detecção de células Anexina-V

sob diferentes condições de tratamento em

cultura: células tratadas com meio de cultura (Controle), células tratadas com vírus inativado

(Inativado) e células infectadas com DENV-2 cepa 16681 (Infeccioso). Relação entre os

valores percentuais obtidos da análise por citometria de fluxo. ** P<0,01

Tabela 4.2: Detecção de células Fas

sob diferentes condições de tratamento em cultura:

células tratadas com meio de cultura (Controle), células tratadas com vírus inativado

(Inativado) e células infectadas com DENV2 cepa 16681 (Infeccioso). Valores percentuais

obtidos da análise por citometria de fluxo. ** P<0,01

ABREVIATURAS

AA – Ácido Aracdônico

Ac - Anticorpo

ADE - Facilitação dependente de anticorpo (do inglês antibody-dependent enhancement)

AIDS – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

AIF – Fator indutor de apoptose (do inglês Apoptosis inducer factor)

Ag - Antígeno

Apaf-1 - fator de ativação de apoptose 1

APC - Aloficocianina

APC - Célula apresentadora de antígeno (do inglês antigen-presenting cell)

ATP - Adenosine-5'-triphosphate

BSA – Albumina de Soro Bovino

BRF A – Brefeldina A

CCR - Receptor de quimiocina motivo CC

CIVD - Canais Iônicos Voltagem-Dependentes

CPE – Efeito Citopático

CXCR – Receptor de quimiocina motivo CXC

DCs – Célula(s) dendrítica(s) (do inglês dendritic cells)

CTLs – Linfócitos T citotóxicos (do inglês cytotoxic T lymphocytes)

DC-SIGN - Ligante de molécula de adesão intercelular não integrina específica de DC (do

inglês DC-specific ICAM-grabbing nonintegrin)

DENV - Vírus Dengue

DENV-1,2,3 ou 4 – Vírus Dengue sorotipo 1,2,3 ou 4

DIC – Contraste Interferencial Diiferencial

DIOC6(3) - 3,38-dihexiloxadicarbocyanine

DMSO – Dimetilsulfóxido

DNA - Ácido desoxirribonucléico (do inglês Deoxyribonucleic acid)

ELISA - Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

FACs - Análise multi-paramétrica de partículas em suspensão (do inglês Fluorescence

Activated-cell Sorting)

FADD - Fas Associated protein with Death Domain

Fc - Fragmento cristalizado

FcγR - Receptor para porção Fc de anticorpos classe γ (G)

FD - Febre do Dengue

xii

FHD - Febre Hemorrágica do Dengue

FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz

FITC - Fluoresceína

FSC - Forward Scatter cytometric

HIV - Vírus da Imunodeficiência Humana

GM-CSF - Fator Estimulador de Colônia Granulócito Macrófago

HbsAg – Antígeno de superfície do vírus da Hepatite B

HCV – Vírus da Hepatite C

HEPES – Solução tampão

HTLV - Vírus T-linfotrópicos humanos tipo I

HLA - Antígeno leucocitário humano (do inglês human leukocyte antigen)

IAPs – Proteínas Inibidoras de Apoptose

IFN - Interferon

Ig – Imunoglobulina

IgG – Imunoglobulina G

IL - Interleucina

iNOS - óxido nítrico sintetase induzida

LPS – Lipopolissacarídeo

MAPKs - proteínas kinases ativadas por mitógenos

MIF - fator inibidor de macrófago (do inglês Macrophage Factor)

MIF - Intensidade média de fluorescência do inglês (Mean Fluorescence Intensity)

MIP-1α - Macrophage inflammatory protein 1 α

MHC - Complexo de histocompatibilidade principal (do inglês Major Histocompatibility

Complex)

MS – Ministério da Saúde

NK - Célula Natural Killer

NF-κB - Fator de transcrição nuclear κB (Nuclear factor-κB)

NO – Óxido nítrico (Nitric Oxide)

OMS - Organização Mundial da Saúde

ORF- Open Reading Frame

PAF – Fator de Ativação Plaquetária

PBMCs - Células mononucleares do sangue periférico (do inglês Peripheral Blood

Mononuclear Cells)

PBS - Phosphate-Buffered Saline

PE - Ficoeritrina

xiii

pH – Potencial Hidrogênico

PI – Iodeto de Propídeo

PI3K - Phosphoinositide-3 kinase

PLA2 - Phospholipase A2

Proteína C - Proteína do capsídeo

Proteína E - Proteína do envelope

Proteína M - Proteína de membrana

Pr M - Proteína M na forma precursora

Proteína NS - Proteína não estrutural (do inglês nonstructural)

PRR - Receptores de reconhecimento de padrões moleculares (do inglês Pattern Recognition

Receptors)

RANTES – CCL5 – Quimiocina com motivo CC

RE – Retículo Endoplasmático

RIP - Receptor-Interating Protein

RNA - Ácido ribonucléico (do inglês Ribonucleic Acid)

ROS – Espécies reativas de oxigêncio (do inglês Reactive oxygen species)

SCD - Síndrome do Choque do Dengue

SFB - Soro Fetal Bovino

SSC - Side Scatter Cytometric

sTNFRI – forma solúvel do TNFRI

sTNFRII – forma solúvel do TNFRII

SVS – Secretaria de Vigilância em Saúde

TCID

- 50% tissue culture infectious dose

Th - do inglês T helper

TLR - Receptor Toll-like

TMP - Transição da Permeabilidade Mitocondrial

TNF - Fator de necrose tumoral (do inglês Tumor Necrosis Factor)

TNFRI, TNFp55 ou receptor de TF tipo I

TNFRII TNFp75 ou receptor de TF tipo II

TRAF - TNF Receptor Associated Factor family of proteins

TRAIL – Indutor de apoptose relacionado ao TNF (TNF Related Apoptosis-Inducing)

TRAPP - Domínio de Morte Associado ao TNFR1

∆Ψm – Potencial de membrana mitocondrial

xiv

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO............................................................................................................. 1

1.1 Histórico da doença e suas características epidemiológicas.............................. 2

1.1.1 Dengue nas Américas e no Brasil.................................................................... 4

1.2 O vírus: Características estruturais, vetor e ciclo de vida................................... 6

1.3 Manifestações clínicas............................................................................................. 10

1.3.1 Manifestações brandas..................................................................................... 11

1.3.2 Manifestações graves ....................................................................................... 11

1.4 Respostas imunológica durante a infecção pelo DENV....................................... 13

1.4.1 Teoria da Facilitação Dependente de Anticorpo (ADE)............................... 13

1.4.2 Teoria da virulência viral................................................................................ 13

1.4.3 Teoria da Gravidade por Polimorfismo genético.......................................... 14

1.4.4 Teoria do Pecado Original............................................................................... 14

1.4.5 Teoria do Mimetismo molecular..................................................................... 15

1.4.6 Teoria da interação multifatorial.................................................................... 15

1.5 A imunopatogenia do vírus Dengue....................................................................... 16

1.5.1 Células–alvo e suas alterações frente à infecção............................................ 16

1.5.2 Respostas imunológicas ao vírus Dengue: Citocinas e mediadores

Químicos..................................................................................................................... 19

1.6 Os monócitos/macrófagos e a Doença.................................................................. 23

1.6.1 Heterogeneidade fenotípica e funcional dos macrófagos.............................. 23

1.6.2 As subpopulações de monócitos...................................................................... 24

1.6.3 O papel dos monócitos/macrófagos na Dengue..............................................27

1.7 Morte celular........................................................................................................... 29

1.7.1 A apoptose......................................................................................................... 30

1.7.1.1 Características morfológicas e bioquímicas.......................................... 32

1.7.1.2 Vias de sinalização da Apoptose............................................................. 32

1.7.1.3 Via extrínseca........................................................................................... 33

1.7.1.4 Via intrínseca........................................................................................... 33

1.7.1.5 As proteínas Kinases (MAPKs) e seu papel na apoptose..................... 37

1.8 A apoptose na infecção pelo Dengue...................................................................... 39

2. OBJETIVO.................................................................................................................... 42

2.1 Objetivo Geral......................................................................................................... 43

2.2 Objetivos específicos................................................................................................ 43

3. METODOLOGIA.......................................................................................................... 44

3.1 Cepa viral................................................................................................................. 45

3.2 Cultivo de células C6/36 e produção de massa viral............................................ 45

3.3 Titulação e diluição do estoque viral..................................................................... 46

3.4 Obtenção de leucócitos mononucleares do sangue periférico.............................. 47

3.5 Isolamento e cultura de monócitos do sangue periférico..................................... 47

3.6 Infecção dos monócitos com DENV-2.................................................................... 48

3.7 Cinéticas de infecção............................................................................................... 48

3.8 Imunofluorescência em cultura de monócitos infectados com DENV-2............ 48

3.8.1 Detecção do vírus em monócitos infectados................................................... 49

3.8.2 Detecção de alteração no ∆ψm em monócitos infectados............................. 49

3.9 Análise por Citometria de Fluxo............................................................................ 50

3.9.1 Marcação Extracelular.................................................................................... 50

3.9.1.1 Detecção de marcadores de superfície característicos dos

monócitos............................................................................................................. 50

3.9.1.2 Marcação para o receptor de morte FAS (CD95)................................ 50

3.9.2 Marcação intracelular...................................................................................... 51

xvi

3.9.2.1 Detecção de antígenos DENV-2 em monócitos infectados................... 51

3.9.2.2 Detecção de apoptose em monócitos infectados utilizando

Anexina-V/PI........................................................................................................ 51

3.9.2.3 Detecção de molécula anti-apoptótica Bcl-2 em monócitos

infectados............................................................................................................. 52

3.9.2.4 Avaliação do ∆ψm em monócitos infectados........................................ 52

3.10 Estatística............................................................................................................... 52

3.11 Soluções.................................................................................................................. 53

3.12 Meios de cultura e Reagentes............................................................................... 54

3.13 Anticorpos.............................................................................................................. 55

4. RESULTADOS.............................................................................................................. 56

4.1 Infecção in vitro de monócitos periféricos humanos por DENV-2...................... 57

4.1.1 Identificação da população de monócitos utilizando características

Morfológicas e fenotípicas........................................................................................ 57

4.1.2 Cinética de infecção in vitro pelo DENV-2 em monócitos humanos............ 60

4.1.3 Detecção de Ag DENV em monócitos humanos infectados por DENV-2

Através de microscopia confocal.............................................................................. 64

4.2 Modulação na expressão de CD16 em células CD14

durante a infecção....... 66

4.3 Alterações morfológicas e fenotípicas envolvidas na morte celular

programada de monócitos frente à infecção por DENV-2........................................... 69

4.3.1 Aspectos membranares envolvidas na morte de monócitos após infecção

por DENV................................................................................................................ 69

4.3.2 Detecção da expressão de receptor Fas em monócitos infectados por

DENV-2.................................................................................................................... 74

4.3.3 Expressão diferencial da oncoproteína Bcl-2 em monócitos

humanos infectados por DENV-2........................................................................... 78

xvii

4.3.4 A infecção de monócitos humanos por DENV-2 induz alterações

no ∆ψm..................................................................................................................... 81

5. DISCUSSÃO.................................................................................................................. 85

6. CONCLUSÃO................................................................................................................ 97

7. PERSPECTIVAS........................................................................................................... 101

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................ 104

9. ANEXO........................................................................................................................... 120

xviii

RESUMO

Os monócitos/macrófagos representam alvos importantes da replicação do vírus

Dengue (DENV), com a produção de mediadores inflamatórios e disseminação viral na fase

inicial da doença. A apoptose é um processo ativo de autodestruição celular geneticamente

regulado, no qual é ativada uma cadeia enzimática complexa podendo ocorrer durante

processos celulares desencadeados por várias infecções virais. Uma vez que os mecanismos

de apoptose em células-alvo infectadas por DENV ainda não estão totalmente esclarecidos,

torna-se de extrema relevância desenvolver este conhecimento. Neste estudo, investigamos a

interação vírus-célula utilizando como modelo a infecção de monócitos humanos primários

com vírus DENV-2 (16681), enfatizando os mecanismos de apoptose. Uma cinética de

infecção demonstrou, por citometria de fluxo, um pico de detecção viral no segundo dia, onde

60% de células CD14

são DENV-2

, sendo que a presença de vírus no citoplasma das células

foi demonstrada por microscopia confocal. Um aumento significativo (P<0,01) na expressão

da molécula de ativação CD16 foi detectado em monócitos CD14

na presença de DENV-2,

em comparação ao controle e ao vírus inativado por calor. Como esperado, foi observada

influência da infecção viral na indução de morte celular programada em monócitos humanos,

devido ao aumento significativo (P<0,05) na expressão de fosfatidilserina, confirmada pela

marcação com Anexina-V em células infectadas, em comparação ao controle e ao vírus

inativado. Monócitos apresentaram um aumento significativo (P<0,05) na expressão de Fas

(receptor de morte celular programada) 2 dias após infecção, comparado com o controle e o

vírus inativado. Entretanto, não houve alteração aparente na expressão da proteína anti-

apoptótica Bcl-2 em culturas infectadas avaliadas durante 5 dias. Monócitos infectados

apresentaram, em resultados preliminares, uma alteração no potencial de membrana

mitocondrial, medida pela intensidade de fluorescência (MIF) com marcação pelo

fluorocromo DIOC6 (MIF=28; controle MIF=68 e inativado MIF=60). Esses resultados

sugerem o papel da via intrínseca mitocondrial na indução de apoptose de monócitos

infectados. Em conclusão, nossos dados suportam a hipótese de que o vírus modula fatores

extrínsecos e intrínsecos envolvidos na apoptose em modelo de infecção in vitro de monócitos

humanos por DENV-2 e que podem estar interferindo nos mecanismos de morte dessas

células.

xix

ABSTRACT

The monocytes/macrophages are important targets for Dengue viral (DENV)

replication which induces production of inflammatory mediators, and are sources of viral

dissemination in the initial phase of the disease. Apoptosis is an active process of cellular

autodestruction genetically regulated, in which a complex enzymatic pathway is activated.

Apoptosis may occur during cellular processes trigged by many viral infections. As apoptotic

mechanisms in Dengue infected target-cells are not yet totally understood, advances in this

field are extremely necessary. In this work, we investigated virus-cell interaction using a

model of primary monocyte infection with DENV-2, strain 16681, aiming the study of

apoptotic mechanisms. It was investigated, by flow citometry, an infection kinetics, which

DENV antigen positive cells peaked at the second day. ¨Detection of DENV-2 antigen

occurred in 60% of CD14 positive cells and was visualized in the cytoplasm of infected cells

by confocal microscopy. The expression of the activation marker CD16 was significantly

enhanced (p<0,01) in CD14

monocyte infected cultures, when compared with control and

heat-inactivated virus. Anexin-V

staining was higher (P<0,05) in DENV infected cells, as

compared to control and heat-inactivated virus, indicating fosfatidilserine externalization.

These results indicate a possible viral interference with programmed cell death induction in

human monocytes. A significant expression (P<0,05) of Fas (programmed cell death receptor)

was detected at the second day of infection, when compared with control and heat-inactivated

virus. However, there was no detectable changes in the expression of the anti-apoptotic

protein Bcl-2 on infected cultures at different points of infection (up to five days). Infected

monocytes presented, in preliminary results, a dysfunction in mitochondrial potential

membrane, when cells were stained with DIOC6. Analysis was performed using

Mean

Fluorescence Intensity (MIF) values (

DENV-2 MIF=28; control MIF=68 e heat inactivated

virus MIF=60). These results suggest an important role of mitochondrial intrinsic pathway in

DENV-2-induced apoptosis of infected human monocytes. Our data support virus modulation

of extrinsic and intrinsic apoptotic factors at the in vitro model of human monocyte DENV-2

infection.

1. INTRODUÇÃO

Conhecida como a arbovirose (doença causada por artrópode) mais importante no

mundo atualmente, a Dengue é responsável por cerca de 50-100 milhões de casos febris

anualmente, incluindo mais de 0,5% de casos de Febre Hemorrágica do Dengue (FHD) e

Síndrome do Choque (SCD) - manifestações graves da doença, com uma taxa de fatalidade de

cerca de 20% (Pang, Cardosa et al., 2007). Hoje, a Dengue é considerada endêmica em mais

de 100 países, com mais de dois milhões de pessoas em risco de adquirir a infecção ao longo

das regiões tropicais e subtropicais (Organização Mundial da Saúde - OMS). Considerada

uma doença febril aguda e de evolução benigna na forma clássica, e grave quando se

apresenta geralmente na forma hemorrágica e de choque, a Dengue constitui um sério

problema de saúde pública no mundo, especialmente nos países tropicais, como o Brasil, onde

as condições e o meio ambiente favorecem o desenvolvimento e a proliferação do principal

mosquito vetor (Gibbons e Vaughn, 2002). A Dengue também impõe uma carga considerável

nas finanças e infra-estrutura dos sistemas de saúde em países em desenvolvimento

considerados epidêmicos, como o Brasil. Por causa da escala de problemas, existe um esforço

grande na geração de uma vacina para o controle eficiente da doença. Portanto, se faz

necessário o conhecimento dos mecanismos imunopatológicos envolvidos na resposta à

infecção para se compreender melhor a patogenia das formas graves da doença e, dessa

forma, desenvolver terapias mais eficazes e seguras para a população em risco.

1.1 Histórico da doença e suas características epidemiológicas

Muito se tem discutido sobre a origem do vírus Dengue (DENV). Alguns autores

especulam que o vírus tenha se originado na África, espalhando-se pelo mundo através do

tráfego de escravos. Outros acreditam que as viroses tenham surgido de ciclos florestais

envolvendo pequenos primatas e mosquitos vetores. Provavelmente o surgimento das

infecções humanas pelo DENV se deu com a derrubada das florestas e o desenvolvimento de

povoados, fazendo com que seu vetor se movesse da floresta para o ambiente rural. Adaptado

ao ambiente peridoméstico, o mosquito encontrou condições favoráveis para seu

desenvolvimento e, consequentemente, a disseminação do vírus. A expansão do comércio

internacional foi responsável pela introdução do vírus na África e nas Américas, durante os

séculos XVII, XVIII e XIX, principalmente nas cidades portuárias onde o vetor infectado

vinha nos porões de navios (Gubler, 1997).

No final do século 18, e ao longo do século 19 e início do século 20, a maioria das

epidemias de dengue ocorreu nas Américas, sul da Europa, norte da África, Mediterrâneo,

Ásia, Austrália, Índia, Oceania, regiões sul e central do Pacífico, e no Caribe. O aumento na

frequência de casos relatados coincidiu com o período em que o mosquito Aedes aegypti,

principal vetor, disseminando-se da África e todos os trópicos, através do tráfego de escravos

e quando o fluxo de pessoas entre os continentes tornou-se mais constante. O mosquito

adaptou-se muito bem ao ambiente urbano, vivendo próximo à população e se reproduzindo

eficientemente (WHO/CDS/CSR/ISR/2000.1). Nos meados e final do século 20, vários

fatores ecológicos desencadearam um aumento dramático nos casos de Febre do dengue (FD),

e o surgimento da forma mais grave, a Febre Hemorrágica do dengue (FHD) da doença como

um grande problema de saúde pública nas Américas e na Ásia. A urbanização desenfreada

resultou num aumento da população vivendo em áreas de alta densidade, com sistemas de

abastecimento e esgoto inadequados. Essas áreas promoveram condições ideais para o

crescimento do Aedes aegypti (WHO/CDS/CSR/ISR/2000.1).

Cabe destacar que dois eventos específicos importantes contribuíram para a

disseminação da Dengue no sudoeste asiático e nas Américas. Primeiro, as atividades

relacionadas à Segunda Guerra Mundial e o período pós-guerra foram particularmente

relacionados ao aumento da FD e FHD no sudoeste da Ásia. Os suprimentos de água e redes

de abastecimento foram destruídos durante a guerra, resultando em condições mais favoráveis

de crescimento do mosquito vetor. Segundo, o movimento de tropas, a maioria susceptível a

doença por curtos períodos de tempo, expondo o vírus a novos hospedeiros susceptíveis,

aumentou a disseminação da doença. O contínuo fluxo dessas pessoas para outras áreas

facilitou a circulação dos sorotipos virais por toda a região, tornando-a hiper-endêmica

(circulação de mais de um sorotipo ao mesmo tempo). Durante o pós-guerra, milhões de

pessoas susceptíveis de áreas pobres hiper-endêmicas para a Dengue se deslocavam para as

grandes cidades, promovendo um fluxo contínuo de pessoas susceptíveis e o aumento dos

casos (WHO/CDS/CSR/ISR/2000.1).

1.1.1 Dengue nas Américas e no Brasil

Nas Américas, a FD surgiu ainda durante a Segunda Guerra Mundial e evidências

apontam uma endemia pelo DENV-2 na região do Caribe, porém, a primeira epidemia

americana foi registrada em 1963 (Gubler, 1997). Uma provável explicação para o longo

período sem registros da doença foram os grandes programas de erradicação do mosquito

contra a Febre Amarela, os quais tiveram conseqüências importantes para a Dengue. Porém,

com a descontinuidade do programa no início de 1970, ocorreu uma reinfestação nas

Américas com o Aedes aegypti que, combinado com a rápida urbanização e o aumento de

viagens e comércio, tiveram importantes conseqüências no aumento da incidência (Gubler,

1997). A emergência de FD/FHD como um problema de saúde pública vem sendo o fator

mais dramático nas Américas. Epidemias com uma alta freqüência de gravidade continuam a

se expandir geograficamente na América do Sul. A OMS estima uma incidência 30 vezes

maior nos últimos 50 anos e, até o presente, a distribuição global do mosquito vetor é

comparável ao do vetor da malária (Navarro-Sanchez, Despres et al., 2005).

Após uma ausência no Brasil por mais de 60 anos, os primeiros casos de Dengue

iniciaram durante os anos 80, se disseminando por todo o país e tornando-se endêmica durante

os anos 90, com maior freqüência no verão (Azeredo, Zagne et al., 2001). Com seus 165

milhões de habitantes, o país está amplamente exposto aos surtos da doença que ocorrem nos

últimos 16 anos, iniciados no Rio de Janeiro e se disseminando por todas as regiões do país

As atividades de controle do vetor ainda não são totalmente capazes de controlar a

transmissão da Dengue. Nos últimos 5 anos, o Brasil vem contando com 70% dos casos

relatados de FD nas Américas. Dois padrões de epidemia para o dengue foram observados:

epidemias localizadas (1986-1993), e uma circulação endêmica e epidêmica do vírus por todo

o país (1994-2002) (Siqueira, Martelli et al., 2005). Atualmente, os sorotipos DENV-1, 2 e 3

em quase todos os estados. Em quatro estados, detectou-se a circulação simultânea dos

sorotipos DENV-1, 2 e 3; em seis estados a circulação simultânea dos sorotipos DENV-2 e 3;

em oito estados a circulação exclusiva do sorotipo DENV-3; e em um estado, a circulação do

sorotipo DENV2 (Figura 1.1) (SVS-Ms, 2007). Viagens aéreas proporcionam que indivíduos

infectados disseminem o vírus. Esses fatores podem mudar uma região, antes não-endêmica,

para hipoendêmica (um sorotipo presente) ou até mesmo hiper-endêmica (múltiplos sorotipos

presentes). Em função da contínua circulação de três sorotipos do vírus, o número de casos de

FHD e a taxa de letalidade vêm aumentando no país. Só no ano de 2007, a Secretaria de

Vigilância em Saúde (Svs-Ms) / Ministério da Saúde registrou mais de 559 mil casos

suspeitos com mais de 1500 confirmados de FHD e 158 óbitos (SVS-Ms, 2007).

Na tentativa de compreender a reemergência da Dengue, é necessário considerar ainda

que o diagnóstico precoce de casos da doença não tem sido regra, pois, com freqüência, é

confundida com outras doenças, principalmente rubéola ou viroses indeterminadas. Quando o

diagnóstico é feito, o vírus já está infectando grande número de pessoas e atingindo áreas

geográficas extensas, dificultando o controle da epidemia.

Figura 1.1: Mapa de distribuição dos sorotipos do DENV no Brasil (Extraído de SVS-MS, 2007)

Apesar do aumento do impacto na saúde e economia, ainda não existe uma terapia

específica para infecção causada pelo vírus dengue (DENV) e o tratamento depende,

essencialmente, dos procedimentos médicos sintomáticos. Não se encontra disponível uma

vacina eficaz para uso preventivo, apesar de todos os esforços de pesquisa para a sua

produção e desenvolvimento. Aliado a esse fator, a falta de um modelo animal adequado para

o estudo da doença dificulta, em parte, a busca de um tratamento eficaz contra a infecção

(Gibbons e Vaughn, 2002). Enquanto não se puder contar com essa medida de controle, o

único elo vulnerável da cadeia epidemiológica é o vetor. Além disso, poucos programas de

controle são efetivos contra os mosquitos. Dessa forma, o desenvolvimento de uma vacina

eficaz depende fundamentalmente do conhecimento dos mecanismos envolvidos em resposta

à infecção, bem como dos mecanismos de patogênese da infecção (Schatzmayr, 2003).

1.2 O vírus: Características estruturais, vetor e ciclo de vida

O DENV pertence ao gênero Flavivirus, família Flaviviridae, um grupo pequeno de

vírus envelopados e com nucleocapsídeo icosaédrico, que infectam vertebrados e

frequentemente causam infecções graves e algumas vezes fatais, em humanos (Zhang,

Chipman et al., 2003). Ele é responsável pelas maiores taxas de doença e mortalidade dentre

os membros desse gênero (Mukhopadhyay, Kuhn et al., 2005).

O viron apresenta um genoma RNA de fita simples positiva de aproximadamente 10-

11 kb. Uma característica importante dos flavivírus é a presença de uma fase aberta de leitura

(ORF- Open Reading Frame) de mais ou menos 10.000 pares de bases, que começa no

resíduo metionina e codifica uma poliproteína que é processada por proteases virais e

celulares em proteínas estruturais e não estruturais. É o caso do DENV, cujo genoma é

sintetizado em um polipeptídeo, que é clivado por proteases virais e do hospedeiro em 10

proteínas. A ordem de codificação do ORF do DENV é: 5`-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-

NS4B-NS5-3` (Figura 1.2) (Rothman, 2004). As principais proteínas codificadas incluem

três proteínas estruturais: proteína do capsídeo C (nucleocapsídeo), proteína associada à

membrana M, sintetizada na sua forma precursora (prM), e proteína do envelope E; e sete

proteínas não-estruturais (NS) (Figura 1.3) (Fink, Gu et al., 2006). A proteína do capsídeo é

constituída de 120 aminoácidos que, envolvendo o genoma viral, forma o nucleocapsídeo. A

prM, de 165 aminoácidos, e a proteína E, de 495 aminoácidos, são glicoproteínas. Além disso,

a proteína E contém sítio(s) de ligação ao receptor e um peptídeo de fusão (Mukhopadhyay,

Kuhn et al., 2005).

Figura 1.2: Organização do genoma de Flavivírus, com suas proteínas resultantes e a localização dos

principais alvos da resposta imune. A intensidade das respostas humoral e adaptativa a proteínas virais

individuais estão indicadas abaixo (Rothman, 2004).

Anticorpo

Células T

Figura 1.3: A estrutura do DENV. (A) Esquema ilustrativo da estrutura do DENV, representando a proteína

associada à membrana M, proteína do envelope E, genoma viral (RNA) e a proteína C do nucleocapsídeo,

mostrando uma conformação icosaédrica. (B) Ilustração computadorizada da estrutura tridimensional do DENV.

Os dímeros da proteína E estão representados em azul, vermelho e amarelo, com as regiões de fusão em verde,

formando uma concha protetora que recobre toda a partícula. (B) (Kuhn, Zhang et al., 2002).

A transmissão do DENV se faz pela picada dos mosquitos Aedes aegypti, no ciclo

homem – vetor – homem. Biologicamente, o vírus é altamente adaptado aos seus mosquitos

hospedeiros, sendo mantido na natureza através de transmissão vertical em espécies de

mosquitos responsáveis por ciclos florestais. Todos esses vetores pertencem ao gênero Aedes.

Dois fatores principais regulam a população desses vetores: o clima e a disponibilidade de

sítios artificiais para o desenvolvimento larvar (Gubler, 1997). Após um repasto de sangue

infectado, o mosquito está apto a transmitir o vírus, depois de 8 a 12 dias de incubação

extrínseca. A transmissão mecânica também é possível, quando o repasto é interrompido e o

mosquito, imediatamente, se alimenta num hospedeiro susceptível próximo. Não há

transmissão por contato direto de um doente ou de suas secreções com uma pessoa sadia, nem

de fontes de água e alimento. O mosquito é considerado um eficiente vetor por várias razões:

ele se alimenta preferencialmente de sangue humano; vive nas proximidades humanas; se

alimenta diariamente; sua mordida é quase imperceptível; e, por ser um mosquito bastante

ativo, qualquer movimento interrompe sua alimentação e, assim, várias pessoas podem ser

mordidas em um curto período de tempo em um único repasto sanguíneo. Ao contrário de

outros mosquitos, o Aedes aegypti faz mais de um repasto sanguíneo durante seu ciclo

gonotrópico – isto é, antes da oviposição. Em muitas áreas, as epidemias de Dengue ocorrem

durante as estações chuvosas, favorecendo a abundância de mosquitos e um período de

incubação extrínseco mais curto (Gubler, 1997).

A B

Durante a infecção, o DENV liga-se a receptores específicos e entra na célula por

endocitose mediada por receptor. Dentre os vários candidatos sugeridos como receptores

primários para o vírus, incluímos as moléculas DC-SIGN (dendritic cell-specific intercellular

adhesion molecule 3-grabbing non-integrin), GRP78/BiP (proteína reguladora de glicose 78)

e moléculas associadas ao CD14 (Chen, Wang et al., 1999; Navarro-Sanchez, Altmeyer et al.,

2003). Recentemente vem se demonstrando a importância do receptor de manose na infecção

de macrófagos por DENV (Miller, deWet, et al., 2008). A interação mais bem caracterizada

se faz com o DC-SIGN, presente em DCs, podendo mediar ai infecção dos 4 sorotipos. Sua

expressão ectópica confere permissividade à infecção sobre aquelas células geralmente não

permissivas (Clyde, Kyle et al., 2006). Alternativamente, o vírus se liga a anticorpos (Acs)

subneutralizantes, de uma infecção prévia, e é endocitado via receptores Fc de monócitos, por

exemplo. Ele é internalizado em compartimentos endossomais, onde o pH ácido promove

mudanças conformacionais na proteína E. Esta sofre uma trimerização irreversível para expor

seu peptídeo de fusão, permitindo a fusão do envelope com a membrana endossomal e

liberação do genoma no citoplasma. Este é traduzido em uma única poliproteína, processada

por proteases virais e do hospedeiro, formando o complexo de replicação viral na membrana

do retículo endoplasmático (RE). Os genomas recém sintetizados são empacotados pelas

proteínas estruturais formando o nucleocapsídeo que é envolto pelo envelope lipídico

contendo glicoproteínas de membrana, formando partículas virais. As partículas virais

imaturas são transportadas através da rede trans-Golgi, sofrendo glicosilações e clivagens por

proteases do hospedeiro. Ao término da via de secreção, as partículas são, então, secretadas

como maduras por exocitose (Mukhopadhyay, Kuhn et al., 2005).

As viroses de Dengue circulam na natureza na forma de 4 tipos sorologicamente

distintos: DENV-1, 2, 3 e 4. Tais sorotipos exibem cerca de 65-70% de seqüências homólogas

(Green e Rothman, 2006). A especificidade sorológica parece ser uma característica marcante,

porém isolados marcados temporária e geograficamente podem ser distinguíveis ao nível de

nucleotídeos, aminoácidos ou antigeinicidade (Bielefeldt-Ohmann, 1997). Diferenças

estruturais específicas entre genótipos diferentes do DENV-2 afetam a patogenia do Dengue

(Diamond, Edgil et al., 2000). A infecção secundária ocorre após a inoculação com um

sorotipo diferente. Neste caso, o vírus entra nas células através de um receptor primário, mas

também pode formar imuno-complexos com Acs não-neutralizantes pré-existentes. E

interagirir com receptores alternativos resultando no aumento da infecção dependente de Ac

(Halstead, 1988). A ligação destes Acs ao vírus, por epítopos não-neutralizantes, pode

aumentar a captação viral por linhagens monocíticas através de interações com receptores de

Imunoglobulina (Ig) de membrana (Halstead, 1988; Rothman, 2004).

Com relação ao papel das proteínas estruturais e não estruturais, muitos estudos vêm

mostrando a importáncia dessas proteínas no ciclo de vida do DENV. Acredita-se que a prM

possa proteger a proteína E de sua reorganização estrutural induzida pelo pH e uma

conseqüente fusão prematura durante a secreção da partícula viral. Como já citado, a entrada

do vírus na célula parece ocorrer por endocitose mediada por receptores e sua replicação está

associada com a indução viral de estruturas de membrana dentro do citoplasma da célula

infectada (Navarro-Sanchez, Despres et al., 2005). Acredita-se que os domínios responsáveis

pela neutralização, fusão e interações com receptores virais estejam associados com a proteína

do envelope. A glicoproteína E é o principal componente da superfície externa do vírus e é o

alvo dominante das respostas humorais contra DENV. A proteína é glicosilada de forma

diferente de acordo com o sorotipo e as células nas quais o vírus está se propagando. Sua

glicosilação tem sido associada com a ligação ao receptor celular e fusão endossomal (Clyde,

Kyle et al., 2006). Os Acs contra E mostram graus variáveis de reatividade cruzada entre os

diferentes sorotipos.

A proteína NS3 parece interagir com proteínas que se ligam a receptores nucleares,

modulando o tráfego intracelular RE/Golgi, tendo um importante papel na distribuição celular

e indução de algumas estruturas membranares observadas durante a infecção pelos flavivírus

(Clyde, Kyle et al., 2006). A NS5 serve como uma polimerase dependente de RNA viral, bem

como uma metiltransferase, ambas envolvidas na replicação viral. Ela também parece induzir

IL-8 que, como veremos adiante, tem um importante papel na imunopatogenia da doença

(Clyde, Kyle et al., 2006). A glicoproteína NS1 é expressa sob 3 formas: residente no RE,

ancorada à membrana na superfície de células infectadas e também secretada na circulação

através de multímeros solúveis. Esta molécula é glicosilada em 2 sítios, ambos tendo um

importante papel na replicação viral em células de mosquito (Clyde, Kyle et al., 2006). Além

disso, a NS1 é outro alvo para Acs contra o DENV. Acs contra NS1 podem levar à lise

mediada por complemento de células infectadas por DENV in vitro (Rothman, 2004). Alguns

estudos sugerem que os níveis de NS1 secretadas estariam associados com os níveis de

viremia em infecções secundárias com DENV-2, sendo esta usada como diagnóstico (Green e

Rothman, 2006). As demais proteínas não estruturais ainda não foram bem caracterizadas.

Sabe-se que a NS4B e, em uma menor extensão, a NS2A e NS4A, são capazes de bloquear a

transdução de sinal mediada por interferon. A NS4A, sozinha, é um potente inibidor de INF-β

e γ, importantes mediadores antivirais (Clyde, Kyle et al., 2006).

1.3 Manifestações clínicas

A infecção por DENV causa uma doença cujo espectro inclui desde infecções

inaparentes até quadros de hemorragia e choque, podendo evoluir para o êxito letal. A

infecção pode também se apresentar sob a forma de uma febre indiferenciada, com ou sem a

presença de exantema. Em humanos, cada um dos 4 sorotipos vem sendo associado as

manifestações brandas e graves. A susceptibilidade é universal e a imunidade é permanente

para um mesmo sorotipo (homóloga). Dessa forma, a infecção com um desses sorotipos é

vista a produzir uma imunidade duradoura contra o sorotipo em questão, porém, a imunidade

cruzada (heteróloga) para outros sorotipos, é temporária (Halstead, 1988). De acordo com a

OMS, as doenças causadas por DENV são classificadas em categorias distintas: a Dengue

branda (FD), a Febre Hemorrágica do Dengue (FHD) e a Síndrome do Choque por Dengue

(SCD). Embora seja viável para alguns propósitos, a classificação de FD e FHD/SCD pode

ser insatisfatória para a caracterização das manifestações clínicas. No Brasil, as formas graves

frequentemente não se enquadram nessa classificação (Neves-Souza, Azeredo et al., 2005).

Como muitas outras doenças, as várias manifestações do dengue podem ser vistas

como uma continuidade a partir de reações brandas até as graves, sendo determinadas por

fatores tais como virulência do vírus, idade do hospedeiro, características nutricionais,

genéticas e imunológicas, e co-infecções. Esta visão é corroborada por variações no quadro

clínico e patológico entre casos de dengue, bem como as mudanças em grupos afetados entre

as epidemias. Notavelmente, essas variações independem do(s) sorotipo(s) envolvido(s). No

Brasil, adultos são internados quando apresentam hipotensão ou plaquetopenia excessiva,

considerados sinais de alerta. A FHD/SCD constitui uma das principais causas de

hospitalização e óbito entre a população infantil em países asiáticos que apresentam caráter

endêmico-epidêmico, onde existe a circulação dos 4 sorotipos. A infecção com um deles não

promove uma imunidade protetora cruzada, portanto, pessoas vivendo em áreas endêmicas

podem ter as 4 infecções durante suas vidas. Embora a minoria das infecções virais lidere, em

último caso, a manifestação grave da doença, isso se torna relevante se levarmos em conta que

cerca de 50-100 milhões de infecções por dengue ocorrem anualmente, com uma resultante de

mais ou menos 500.000 casos de FHD. 90% desses casos graves ocorrem em infecções

secundárias, enquanto 10% acontecem em infecções primárias, geralmente em infantes. Vem

sendo postulado que, nesses indivíduos, a transmissão vertical de Acs sub-neutralizantes

esteja envolvida na ADE e, consequentemente, na susceptibilidade à forma grave da doença

(Green e Rothman, 2006).

1.3.1 Manifestações brandas

Muitos indivíduos infectados são assintomáticos ou desenvolvem uma doença branda,

conhecida como FD. O quadro clínico é muito variável. Seus sinais e sintomas incluem febre

alta, mialgia, dores retro-orbitais, nas articulações, náuseas, vômito, exantema, prurido

cutâneo e perda de apetite com 3-7 dias de infecção. A hepatomegalia dolorosa pode ocorrer,

ocasionalmente, desde o aparecimento da febre. Também uma leucopenia branda e

trombocitopenia menos freqüente, sendo mais discreta do que na FHD (WHO, 1997). Menos

freqüente, mas não rara, são as manifestações hemorrágicas tais como petéquia, sangramento

gengival, gastro-intestinal e hipermenorréia. Os títulos virais sanguíneos desaparecem, em

média, após 5 dias, correlacionando com o desaparecimento da febre. A grande maioria das

infecções, especialmente em crianças de 15 anos, são assintomáticas ou ligeiramente

sintomáticas. Estudos populacionais vêm mostrando um aumento na idade do paciente

asiático assim como infecções repetidas (Rigau-Perez, Clark et al., 1998). Ao contrário, no

Brasil há um aumento na gravidade, principamente na população infantil.

Um teste clássico, de torniquete (prova do laço) positivo, pode ser observado em cerca

de 1/3 dos pacientes com FD. As manifestações clínicas apenas não são precisas para

distinguir a FD de outras doenças febris, tais como Sarampo, Leptospirose, Tifóide ou

Malária. Se os sintomas iniciam-se com mais de 2 semanas após o paciente ter saído de uma

área endêmica, ou se a febre durar mais do que 2 semanas, a dengue pode ser efetivamente

descartada. A FD é uma doença bastante debilitante, contudo seu prognóstico na maioria dos

casos é favorável. A recuperação pode ser associada com cansaço e depressão prolongados,

principalmente em adultos (WHO, 1997).

1.3.2 Manifestações graves

A manifestação grave da infecção pelo DENV pode ser caracterizada pela

permeabilidade vascular aguda acompanhada por anormalidades na homeostasia vascular.

Seus sintomas iniciais são semelhantes aos da FD, evoluindo rapidamente para manifestações

hemorrágicas de gravidade variável. Porém, o que distingue a gravidade não é a presença de

hemorragia e sim um aumento na permeabilidade vascular levando, ao extravasamento do

plasma através das junções epiteliais.

A FD começa, normalmente, com um rápido aumento de temperatura e outros

sintomas. Em casos benignos, após o desaparecimento da febre, todos os sintomas

desaparecem. Já nos graves, após o desaparecimento da febre, o estado do paciente se agrava

rapidamente. As manifestações clínicas incluem, além do extravasamento plasmático,

tendência a sangramento, com comprometimento do fígado com uma elevação branda de

transaminases séricas. O extravasamento capilar evolui ao longo de horas, próximo ao final do

período febril, quando os sintomas clássicos da FD se resolvem. Tal fenômeno fisiopatológico

decorre da liberação de substâncias que aumentam a permeabilidade vascular, em

conseqüência da ativação dos fagócitos mononucleares infectados. Efusões pleurais, ascites e

hemoconcentração são indícios de perda do volume intravascular. Tais fatores promovem,

rapidamente, a progressão do choque. As manifestações hemorrágicas resultam em um teste

torniquete positivo para sangramento espontâneo do nariz ou trato gastro-intestinal. A

hemoconcentração e a trombocitopenia pronunciada, seguidas de falência circulatória, são

duas características principais da FHD/SCD, de acordo com a Organização Mundial de Saúde

(OMS), e que podem levar o paciente ao óbito em 12-14 horas se não receberem ressuscitação

fluídica intravascular (Malavige, Fernando et al., 2004). Três sistemas orgânicos

(hematológico, vascular e hepático) estão envolvidos. A disfunção desses 3 sistemas induzida

pela infecção, ambas direta ou indiretamente, evoluem para as manifestações graves (Lei, Yeh

et al., 2001).

Os quatro sinais de alarme para impedir que o choque aconteça são: dores abdominais

intensas e mantidas, uma rápida mudança da febre para uma hipotermia com sudorese e

prostração seguida de hipotensão. O desenvolvimento de qualquer um desses sinais é

indicativo para admissão hospitalar e tratamento para prevenção do choque. Dessa forma,

alterações laboratoriais decorrentes (trombocitopenia e hemoconcentração) são utilizadas para

diferenciar a FD da FHD em seus graus mais benignos. Ocorrendo hemoconcentração e

plaquetopenia, o paciente será considerado como acometido de FHD/SCD, definidos de

acordo com o grau de gravidade da OMS (WHO, 1997). Por não existir uma terapia antiviral

para o tratamento de pacientes com Dengue, a reposição de fluídos e eletrólitos é eficaz se

aplicada precocemente e, nos casos mais graves, deverá ser administrada via parenteral sendo

fundamentais na redução da taxa de mortalidade.

1.4 Resposta imunológica durante a infecção pelo DENV

Hoje, muito se tem aprendido sobre a estrutura e biologia do DENV, receptores virais

e suas interações com células do hospedeiro, a virulência intrínseca de determinadas cepas

virais, o efeito da infecção na imunidade inata, e o papel de outros fatores virais e do

hospedeiro (Pang, Cardosa et al., 2007). Apesar de todo esse conhecimento, a evolução para o

quadro clínico grave não está bem esclarecida, sendo que várias hipóteses são propostas para

tentar explicar a patogênese do Dengue (Rothman, 2004).

1.4.1 Teoria da Facilitação Dependente de Anticorpo (ADE)

Halstead propôs a teoria da ADE como um mecanismo que pode estar contribuindo

para a gravidade da Dengue. O primeiro indício de uma base imunológica para a FHD foi a

partir de estudos epidemiológicos realizados na Tailândia nos anos 60 e 70, cuja ocorrência de

FHD em 85% das crianças que haviam tido infecção secundária com um sorotipo diferente da

primeira infecção (Halstead e O'rourke, 1977). A ADE contribuiria para o aumento da

replicação viral em macrófagos via Acs heterólogos. Em infecções secundárias com o vírus de

sorotipo diferente daquele que causou a infecção primária, os Acs que reagem cruzadamente

com este novo sorotipo, falham em neutralizá-lo. Dessa forma, ocorre um aumento no número

de monócitos infectados quando os complexos Ag-Acs são captados por essas células via

receptores Fcγ I (CD64) e II (CD32), resultando no aumento da infecção dependente de Ac

(Diamond, Edgil et al., 2000); (Halstead, 1988). Esta endocitose poderia resultar na ativação

de linfócitos T CD4 e CD8 citotóxicos por reatividade-cruzada. A liberação rápida de

citocinas causada pela ativação dessas células e pela lise de monócitos infectados, mediada

por linfócitos, pode resultar no extravasamento plasmático e hemorragias que ocorre na FHD.

1.4.2 Teoria da virulência viral

Tal teoria relaciona o aparecimento de FHD à virulência da cepa infectante, de modo

que as formas mais graves sejam resultantes de cepas extremamente virulentas. Essa teoria é

diferente dos mecanismos de facilitação dependente de Acs, provocada pela segunda infecção,

e explica que a gravidade da doença se deve às variações genéticas e antigênicas em

diferentes cepas infectantes. O mais provável é que, em ambos os mecanismos, as

características virais e reações exacerbadas provocada pela segunda infecção estejam

envolvidos e desempenhem papéis importantes (Leitmeyer, Vaughn et al., 1999).

1.4.3 Teoria da Gravidade por Polimorfismo genético

É muito provável que fatores individuais, como os polimorfismos de genes

relacionados com o sistema imunológico, determinem o curso da infecção por dengue e sua

gravidade (Quírico-Santos, Kubelka et al., 2006). Nas Flaviviroses, incluindo Dengue, o

aumento na expressão de moléculas do sistema antigênico leucocitário humano

(HLA) de

classe I e II em células infectadas e o nível de resposta imunológica contra epítopos virais

podem também ser responsáveis pela imunopatologia da infecção (Polizel, Bueno et al.,

2004). Sakuntabnai e colaboradores mostraram através de estudos com pacientes tailandeses

com Dengue, uma variação no gene promotor que codifica para o receptor viral DC-SING em

células dendríticas (DCs), associado com um decréscimo na sua expressão e, possivelmente,

uma diminuição na susceptibilidade do hospedeiro (Sakuntabhai, Turbpaiboon et al., 2005).

Outro trabalho vem demonstrando efeitos opostos dos alelos HLA de classe I, incluindo um

papel protetor do HLA A33 e um patogênico para o HLA A24 em vietnamitas com Dengue

(Green e Rothman, 2006). Também Polizel e colaboradores mostraram uma alta freqüência de

antígenos HLA-DQ1 entre pacientes com FD na população branca de brasileiros na região sul

do país (Polizel, Bueno et al., 2004). Além desses resultados, Fernandez-Mestre e

colaboradores mostraram o papel do alelo TNF-308A, aumentado significativamente nos

pacientes com Dengue e, consequentemente, níveis elevados de Fator de Necrose Tumoral α

(TNF-α), provavelmente relacionados com a permeabilidade vascular e hemorragia nesses

pacientes (Fernandez-Mestre, Gendzekhadze et al., 2004).

1.4.4 Teoria do Pecado Original

Existe uma forte evidência in vivo da ativação de células T CD4 e CD8 durante a

infecção por Dengue sendo que, tal ativação seria mais intensa em pacientes graves do que

aqueles com a forma branda da doença (Mentor e Kurane, 1997). Sugere-se que a doença

possa ser causada pela ativação dessas células. O nível de citocinas como TNF-α, assim como

a magnitude das respostas via células T, estariam correlacionados com a gravidade da doença.

Seguindo a replicação viral via ADE em monócitos e macrófagos, antígenos virais são

apresentados e reconhecidos por moléculas na superfície de linfócitos. Esta replicação é

acompanhada por uma ativação de linfócitos T que, durante a infecção primária, se expandem

e apresentam uma maior afinidade pelos epítopos presentes no sorotipo infectante,

ocasionando a formação de células de memória para este sorotipo. Entretanto, na infecção

secundária por outro sorotipo, as células de memória sensibilizadas durante uma infecção

prévia, seriam ativadas e se expandiriam mais rapidamente que as células virgens específicas

para o sorotipo infectante. Os clones de células de memória teriam menor afinidade ao

sorotipo presente e, consequentemente, não exerceriam suas funções efetoras em eliminar o

vírus. Porém, teriam alta capacidade em produzir mediadores inflamatórios e poderiam, de

fato, promover a imunopatologia do dengue (Mongkolsapaya, Dejnirattisai et al., 2003). A

liberação de citocinas pró-inflamatórias por essas células, como Interferon γ (IFN-γ) e TNF-α,

podem agir diretamente sobre o endotélio vascular e resultar no extravasamento de plasma,

característico das infecções graves (Pang, Cardosa et al., 2007).

1.4.5 Teoria do Mimetismo molecular

O mimetismo molecular propõe que a patogênese da Febre do Dengue seja resultado

de uma reação autoimune. O desenvolvimento de Acs de reatividade-cruzada ao

plasminogênio (devido a uma similaridade em 20 aminoácidos da glicoproteína do envelope

viral e uma família de fatores da coagulação) poderia ter uma relação com a hemorragia na

FHD. O aumento da destruição de plaquetas ou a diminuição na sua produção poderia resultar

na trombocitopenia (Rothman, 2004).

1.4.6 Teoria da interação multifatorial

Outros fatores, além da reatividade cruzada, cepa viral, genética e mimetismo, também

são considerados para o entendimento da patogênese da dengue. Fatores epidemiológicos,

bem como a intensidade de transmissão viral e a circulação simultânea dos sorotipos, vêm

sendo considerados como fatores de risco. Alguns autores acreditam que os riscos para o

desenvolvimento da gravidade são resultantes multifatoriais. Apesar da alta incidência de

infecções secundárias em áreas endêmicas, apenas um pequeno percentual progride para a

FHD. Portanto, o ambiente, o hospedeiro e fatores virais também estariam contribuindo na

progressão da doença. Podemos considerar que uma associação de teorias estariam envolvidas

na susceptibilidade à gravidade da doença (Malavige, Fernando et al., 2004).

1.5 A imunopatogenia do vírus Dengue

A formação de uma rápida defesa do hospedeiro pode ser um fator limitante para o

alastramento da infecção pelo DENV. Uma das várias questões envolvendo a patogenia da

Dengue é identificar as células que desempenham um papel crucial na imunidade inata ao

vírus, no início da infecção. Com a reinfecção por um sorotipo diferente, é provável que a

propensão à gravidade da doença esteja relacionada a uma série de fatores imunopatológicos,

incluindo altos níveis de Acs e linfócitos T de reatividade cruzada e, consequentemente, um

aumento na replicação viral, na fase inicial da doença. Essa condição é acompanhada por uma

cascata de ativação de células T de memória e uma intensa produção de citocinas e outros

mediadores químicos. Esses componentes são liberados, principalmente, por células T,

monócitos/macrófagos, células dendríticas (DCs) e células endoteliais, promovendo a

permeabilidade vascular (Pang, Cardosa et al., 2007).

1.5.1 Células–alvo e suas alterações frente à infecção

A infecção de células do hospedeiro pelo DENV processa-se pela ligação inicial a

fatores de interação do vírus e receptores celulares. As células-alvo da infecção são

predominantemente do sistema retículo endotelial (baço, fígado, medula óssea). O DENV foi

isolado e detectado em vários órgãos como fígado, baço, pulmão e cérebro (Bunyaratvej,

Butthep et al., 1997; Jessie, Fong et al., 2004). Os fagócitos mononucleares são considerados

os principais alvos para a replicação viral. Monócitos/macrófagos apresentam Ags em

amostras patológicas de pacientes com FHD (Neves-Souza, Azeredo et al., 2005). Outros

tipos celulares, incluindo células epiteliais, endoteliais e fibroblastos, suportam a replicação

viral mesmo na ausência de Acs antivirais (Diamond, Roberts et al., 2000). Diamond e

colaboradores demonstraram infecções Ac-dependente e Ac-independente de múltiplas

linhagens celulares utilizando isolados de DENV-2 obtidos de pacientes (Diamond, Edgil et

al., 2000). Linfócitos B, monócitos, hepatócitos e DCs são descritos como alvos potenciais do

DENV. O vírus também é capaz de induzir apoptose em diversos tipos celulares em cultura.

Estudos demonstram a indução de apoptose em células endoteliais infectadas, com a produção

de citocinas como IL-8 e RANTES, quimiocinas envolvidas no processo inflamatório

(Avirutnam, Malasit et al., 1998).

Na circulação periférica de um indivíduo saudável existem mais linfócitos T CD4 do

que T CD8. Alguns trabalhos mostram que, em pacientes com Dengue, a taxa CD4/CD8

inverte-se durante a infecção aguda, voltando ao normal após 15 dias. Além disso, a

porcentagem de células mononucleares da periferia (PBMC) é maior nos dias 6-7, caindo para

níveis abaixo daqueles observados após o período de convalescencia. Há uma ativação

primária de PBMCs confirmada pela expressão do marcador de ativação precoce CD69,

mantido em linfócitos bem como em monócitos, sendo expresso mais extensivamente em

células T CD8 do que em T CD4. Essa aparência atípica de linfocitose, bem como de células

TCD4/CD8, sugere que uma ativação imune aberrante deve ocorrer durante a infecção por

DENV. As células T efetoras reativas a DENV produzem predominantemente altos níveis de

IFN-γ, TNF-α / ß e quimiocinas, incluindo proteína 1 inibidora de macrófago (MIP-1), após a

interação com células apresentadoras de antígenos (APCs) (Rothman, 2004). Estudos feitos

por Azeredo e colaboradores mostraram que, em pacientes brasileiros com Dengue, muitos

apresentaram leucopenia durante a fase aguda da doença que poderia ser resultante da

supressão de linfócitos, pois apresentavam marcadores de superfície CD2, CD4 e CD8 com

freqüência reduzida dentre os leucócitos mononucleares (Azeredo, Zagne et al., 2001). Ao

invés da ativação de células T, anergia ou imunossupressão precoce poderia estar ocorrendo,

de acordo com resultados prévios de outros autores. Tal supressão pode ser devida ambos a

uma modulação direta de células infectadas por vírus ou por produção de citocinas que

deprimem a regulação hematopoiética (Azeredo, Zagne et al., 2001).

As células endoteliais também representam importantes sítios de infecção viral. In

vitro, alguns estudos vêm demonstrando que linhagens de células endoteliais humanas

produtivamente infectadas com DENV podem produzir mediadores pró-inflamatórios (IL-6,

IL-8 e RANTES, reguladas sob ativação de linfócitos T), alterar a expressão de moléculas de

adesão do tipo I e a estrutura do citoesqueleto de actina, e aumentar a permeabilidade de

pequenas moléculas. Outros estudos, de soro de pacientes com infecção aguda induziram a

ativação e apoptose de células endoteliais cultivadas. Tal processo pode ser parcialmente

revertido com o uso de Acs monoclonais anti-TNF-α, sugerindo que, durante a doença,

mediadores inflamatórios podem ser responsáveis pela indução de extravasamento plasmático

(Green e Rothman, 2006)

As células Natural Killer (NK), que compreendem outra população efetora do sistema

imune inato, também têm um importante papel na infecção pelo dengue. Elas podem

promover o clearence de células infectadas através da citotoxicidade direta ou por uma

citotoxicidade mediada por Ac-célula (Azeredo, De Oliveira-Pinto et al., 2006; Green e

Rothman, 2006).

Após a picada do mosquito infetado, acredita-se que a replicação viral ocorra

inicialmente nas DCs. Vários estudos vêm sugerindo que uma lectina do tipo C, CD209/DC-

SIGN, possa se ligar à proteína E e, provavelmente, servir como um co-receptor para a

entrada viral (Tassaneetrithep, Burgess et al., 2003; Green e Rothman, 2006). A habilidade

dessas células em “atrair” os vírus e direcionar a resposta imune adaptativa direta ou

indiretamente, vem tendo um grande impacto na qualidade, quantidade e duração da resposta

imune. As DCs podem também produzir IFN-γ e TNF-α, tendo um importante papel no

estabelecimento de uma resposta imunológica primária. Como já visto, elas podem ser alvos

precoces do vírus DENV durante a resposta imune inata, amplificando a imunidade celular

que pode ser modulada pela presença ou ausência de IFN no ambiente adjacente às DCs

infectadas (Libraty, Pichyangkul et al., 2001). Sabe-se que os receptores do tipo Toll (TLRs),

importantes devido a suas especificidades a padrões moleculares conservados compartilhados

por uma gama de patógenos, também são ativados durante a infecção viral. Sua expressão

diferencial em DCs capacitam-nas a discriminar entre diferentes estímulos. Esses ligantes

exercem uma função na ativação de diferentes vias, quer para a produção de citocinas pró-

inflamatórias que, aparentemente, exercem os mecanismos patológicos, quer para a produção

de IFNs inibidores da replicação viral. Dessa forma, eles podem interferir num importante

papel das DCs em modular o perfil de respostas Th1/Th2 frente a infecções (Agrawal,

Agrawal et al., 2003). Neves-Souza e colaboradores descreveram a indução do TLR-2 em

monócitos humanos nas infecções por dengue (Neves-Souza, Azeredo et al., 2005).

Os monócitos/macrófagos, principais alvos do DENV, são responsáveis pela

disseminação do vírus após sua entrada inicial via picada do mosquito vetor. As células da

linhagem monocítica são fundamentais para o propósito de exacerbar a infecciosidade

dependente de Acs como base do início da FHD/SCD. Pelo fato de pacientes com FHD/SCD

apresentarem evidências de infecção prévia com um sorotipo diferente, foi proposto que tal

infectividade aumentada estaria relacionada à ligação do complexo Ag-Ac heterólogo a

receptores Fc em monócitos e macrófagos, resultando numa produção exacerbada de vírus e

supostamente a uma maior gravidade da doença (Pryor, Carr et al., 2001). Além disso, sabe-se

que DCs derivadas de monócitos humanos podem ser infectadas pelo DENV e ter um papel

extremamente importante na modulação das respostas imunológicas. Considerando que

monócitos/macrófagos são células fagocíticas metabolicamente ativas, com componentes

lisossomais capazes de eliminar microorganismos, a interação do DENV com tais células

pode também resultar em efeitos deletérios para ambos os vírus e células, como veremos

adiante.

1.5.2 Respostas imunológicas ao vírus Dengue: Citocinas e mediadores químicos

Os principais mecanismos pelos quais a infecção por DENV causa doença são bastante

controversos. Embora a resposta pareça operar em ambas a imunidade protetora e patológica

ao DENV, uma consideração imunológica principal é a natureza heteróloga da infecção

secundária e sua influência na gravidade da doença.

Uma resposta secundária a um sorotipo diferente resulta em interações de menor

avidez entre Acs pré-existentes e o novo sorotipo, facilitando a infecciosidade viral. Por outro

lado, o efeito de seqüências epítopos virais diferentes reconhecidos por receptores de células

T leva a uma gama de respostas efetoras, induzindo diferentes sinais de ativação em linfócitos

T antígeno-específicos e, portanto, modulando as funções efetoras de células T CD4 e CD8.

Esses epítopos variantes agonistas parciais de células T, em geral, têm um maior efeito na

resposta proliferativa do que na citotoxidade celular. Alguns agonistas parciais de células T

falham em induzir a produção de citocinas, enquanto outros induzem o perfil de resposta

alterado de citocinas. Além disso, a infecção secundária com um sorotipo diferente de DENV

pode modular a expansão de populações de células T de memória pré-existentes de menor

avidez ao sorotipo em questão, se sobrepondo à expansão de populações de T naive, que têm

maior avidez. Todos os mecanismos citados acima podem influenciar na gravidade da doença,

pois causam uma alteração na hierarquia das respostas de células T, prejudicando os

mecanismos de clearence viral e, ao mesmo tempo, promovendo uma tempestade de citocinas

de padrão alterado, exacerbando a inflamação, aumentando a inflamação tecidual e

contribuindo para a doença. Esses efeitos combinados, que participam na ativação do

endotélio e no aumento da permeabilidade vascular, estariam relacionados com a

sintomatologia da FHD (Rothman, 2004).

Como já mencionado, as células mononucleares fagocíticas são os principais alvos

durante uma infecção aguda por DENV. Quando ativadas, estas células produzem uma gama

de mediadores pró-inflamatórios. Muitos estudos acompanhando pacientes com a infecção

aguda vêm mostrando níveis séricos / plasmáticos aumentados de numerosos mediadores

solúveis, alguns desses mais elevados em indivíduos com FHD comparados com aqueles com

a forma branda (Green e Rothman, 2006). Em alguns casos, por exemplo, um aumento inicial

de mediadores imunes estaria associado ao subseqüente extravasamento de plasma. A cascata

de eventos gerados devido à desregulação da resposta Th1 pode, assim, contribuir para os

múltiplos aspectos da patogenia da FD (Chakravarti e Kumaria, 2006).

Para muitas viroses, um passo inicial no estabelecimento da infecção é a evasão da

resposta imune inata antiviral promovida pelo sistema de IFN celular. O tipo I de IFNs é

induzido por infecções virais e inclui IFN-α (leucócitos, DCs) e IFN- β (fibroblastos). Eles

exibem múltiplas propriedades biológicas, incluindo respostas antiproliferativas, efeitos

antivirais e imunomoduladores (Navarro-Sanchez, Despres et al., 2005). O Tipo II de IFNs, o

IFN-γ, é secretado por linfócitos T ativados e células NK, tendo um efeito antiviral direto

através da indução de moléculas efetoras como óxido nítrico (NO) via DCs e monócitos e,

indiretamente através de uma apresentação aumentada de Ags e a indução de apoptose

(Diamond, Roberts et al., 2000). Alguns trabalhos mostram que o pré-tratamento com IFN-α e

γ ou IFN-β e γ inibe a replicação do DENV (Fink, Gu et al., 2006). Porém, as respostas

normais do INF podem ser diretamente inibidas pelo DENV. Por exemplo, a expressão da

NS4b em linhagens de células endoteliais mostrou reduzir a expressão do gene para IFN-β

((Fink, Gu et al., 2006). Controversamente, a citocina pode promover a replicação viral e a

inflamação. Diamond e colaboradores demonstraram que o INF-γ inibe a infecção por vírus

Dengue, porém seu efeito é variável, pois, ao mesmo tempo que inibe uma infecção

independente de Acs ele aumenta a infecção dependente de Acs em monócitos,

presumivelmente por aumentar a expressão de receptores Fc γ (Diamond, Roberts et al.,

2000); (Pang, Cardosa et al., 2007). Adicionalmente, a presença de IFN-γ aumentaria a

expressão de moléculas do complexo de histocompatibilidade principal de classe II (MHC-II),

ativando a capacidade dos monócitos em produzir mediadores pró-inflamatórios.

Possivelmente, esses mecanismos estariam correlacionados com a gravidade da infecção.

Mentor e Kurane demonstraram que linfócitos T de indivíduos com uma infecção prévia pelo

DENV produziam IFN-γ, interleucina-2 (IL-2), interleucina 4 (IL-4) e TNF-β após uma

estimulação antigência com um sorotipo heterólogo do Dengue (Mentor e Kurane, 1997). Em

resposta aos Ags do Dengue, as células T CD4 produzem TNF-α e IFN-γ. A ativação de

células T CD8 e NK, observadas em crianças com FHD, são fontes potenciais de IFN-γ. Um

aumento de IFN-γ pode liderar com uma maior ativação de células T e, consequentemente,

um aumento de TNF-α e IFN-γ. Os níveis de IFN-γ são observados em períodos precoces

durante o curso da doença, o que poderia ter um importante papel no processo de inflamação

aguda (Azeredo, Zagne et al., 2001). O vírus poderia estar induzindo à liberação de outras

citocinas como TNF-α, IL-6 e IL-1, tardiamente, contribuindo na patogenia do choque

endotóxico, que compartilha várias características com FHD/SCD.

A IL-10 é produzida por monócitos e linfócitos T sendo uma potente citocina anti-

inflamatória e quimiocina. Ela também promove uma linfopenia transiente e um decréscimo

na proliferação de PBMCs. Isso poderia explicar a depressão linfoproliferativa presente em

pacientes estudados por Azeredo e colaboradores (Azeredo, Zagne et al., 2001). Níveis

elevados de IL-10 têm sido detectados em pacientes com FD e FHD, sendo freqüentemente

associados a gravidade da doença (Green, Pichyangkul et al., 1999; Perez, Garcia et al.,

2004). Foi proposto que a IL-10 possui papel imunomodulador, sendo capaz de inibir a

função apresentadora de DCs com DENV (Palmer, Sun et al., 2005). Dessa forma, a geração

de citocinas anti-inflamatórias estaria ocorrendo na tentativa de balancear a inflamação

(Azeredo, Zagne et al., 2001; Nguyen, Lei et al., 2004). Em relação ao fenômeno de ADE, a

ligação do Ac ao receptor Fc nos monócitos estimulados, induz a produção precoce de IL-10,

resultando na produção de sinais supressores de citocinas. (Suhrbier e La Linn, 2003).

A expressão de IL-8 pode ser modulada pelo DENV através da NS5. Sua função,

dentre outras, é promover o recrutamento de eosinófilos, neutrófilos e células T naive para a

superfície do endotélio, além de aumentar a expressão de moléculas de adesão e, dessa forma,

promover o extravasamento de monócitos e plasma. Essa atividade quimiotática em

neutrófilos foi demonstrada pela sua degranulação em pacientes com FD e FHD/SCD, com

um aumento de elastase, um produto da degranulação, bem como níveis elevados de IL-8 em

pacientes com SCD (Juffrie, Van Der Meer et al., 2000). Monócitos/macrófagos também são

importantes fontes de IL-8 durante a infecção pelo DENV (Bosch, Xhaja et al., 2002).

Considerada uma citocina pró-inflamatória multifatorial, o TNF-α tem um importante

papel nas respostas imunológicas. Dentre outras funções, ele regula as respostas imunes,

hematopoiese e morfogênese, e também vem sendo relacionando aos processos tumorais,

soque séptico, replicação viral, reabsorção óssea, artrite reumatóide, diabete, infarto do

miocárdio e imunodeficiências adquiridas. O TNF também induz a produção de espécies

reativas de oxigênio intermediárias que resultam na apoptose da célula. As citocinas da

superfamília do TNF medeiam seus efeitos através da ativação de fatores de transcrição,

incluindo o fator de transcrição NF-KappaB (NF-κB), culminando na apoptose e/ou

proliferação celular (Chaturvedi, Nagar et al., 2006; Chaturvedi, 2006). O TNF-α está dentre

as primeiras citocinas detectadas no soro de pacientes com FHD. Um aumento significativo

na expressão do alelo TNF-308A, que predispõe geneticamente a expressão de altos níveis de

TNF, é observado entre os pacientes com FHD (Chaturvedi, 2006). Níveis de TNF, IL-10 e

do receptor TNF do tipo II solúvel (TNFRIIs) foram significativamente maiores em pacientes

com FHD 2 dias após a desfervecência, período em que o extravasamento de plasma e o

choque acontecem tipicamente (Green e Rothman, 2006). Azeredo e colaboradores, estudando

pacientes brasileiros durante as epidemias de dengue de 1998, mostraram uma correlação de

citocinas, como TNF, IL-6 e IL-1, e níveis solúveis de TNFRp55 e Rp75, com a gravidade da

doença (Azeredo, Zagne et al., 2001). O TNF-α também produz um efeito direto nas células

vasculares, aumentando a permeabilidade vascular induzindo-as a produzirem citocinas e

mediadores inflamatórios, como o próprio TNF-α e IL-1, IL-6, IL-8 e PAF ((Tracey e

Cerami, 1992b; 1992a), contribuindo para a disfunção endotelial nos casos graves da dengue

(Anderson, Wang et al., 1997).

Durante a infecção secundária, as células T tornam-se ativadas devido às interações

com monócitos infectados e DCs. As DCs, como já descrito acima, têm uma enorme

plasticidade funcional, interagindo com outras células do sistema imunológico inato e

adaptativo, sendo responsáveis pelo direcionamento das respostas de linfócitos Th1 ou Th2

(Agrawal, Agrawal et al., 2003). A infecção de DCs pelo DENV estimula a sua própria

maturação e produção de citocinas. Estas interagem com células T levando à sua proliferação,

ativação e produção de citocinas. INF-γ, IL-2 e TNF- α, citocinas pró-inflmatórias, estão

aumentadas durante os primeiros dias de infecção, enquanto IL-4 e IL-10, citocinas de perfil

Th2, aparecem ao final da infecção, tendo um papel controlador das respostas Th1 (Neves-

Souza, Azeredo et al., 2005). Embora a elevação de ambos os perfis de citocinas do tipo I

(Th1) e II (Th2) seja detectada nas formas graves, o tempo de sua produção parece ser um

importante fator. De fato, citocinas pró-inflamatórias e componentes anti-inflamatórios vêm

sendo detectados em pacientes com infecção por DENV (Rothman, 2004), ocorrendo uma

indução inicial de citocinas de perfil Th1 associadas com a doença mais grave e, fatores anti-

inflamatórios, elevados nos estágios mais tardios da doença (fase de desfervescência). Entre

eles, estão associados à gravidade: IL-1Ra, TGF-β1 e IL-10, presentes em pacientes

brasileiros estudados por Azeredo e colaboradores (Azeredo, Zagne et al., 2001). Além desses

mediadores químicos imunes, marcadores de ativação circulantes, como CD8 solúvel,

receptores de IL-2 solúveis e receptores de TNF (TNF rp55 e Rp75), foram associados com a

gravidade da doença (Bethell, Flobbe et al., 1998; Azeredo, Zagne et al., 2001). Tais

características correlacionam-se com a freqüência aumentada de células T ativadas em

infecções secundárias por Dengue, também gerando uma desregulação da resposta ao DV.

Alternativamente, monócitos infectados seriam ativados induzindo a síntese de citocinas,

ácido aracdônico, NO (Nitric Oxide), entre outros fatores inflamatórios (Fink, Gu et al.,

2006).

As citocinas poderiam ser liberadas diretamente de monócitos/macrófagos infectados

ou após interações entre células do sistema imune, ou ambos. É sabido que as citocinas

podem induzir a liberação e a produção de outras citocinas que interagem de forma complexa,

promovendo uma exacerbação nos níveis de citocinas e outros mediadores químicos.

Citocinas também podem ter efeitos sinérgicos, por exemplo, TNF-α, IFN-γ e IL-1 que,

juntas, podem ter um grande efeito sobre a permeabilidade vascular, comparado com a ação

de cada uma, sozinha. Também, moléculas do sistema complemento teriam um importante

papel na patogenia do dengue. A ativação do complemento, que está associada aos níveis

elevados de NS1 secretada, ocorre num período próximo ao extravasamento de plasma (Green

e Rothman, 2006). Todos esses resultados, em conjunto, suportam o importante papel do

sistema imune na gravidade da Dengue. O desenvolvimento de estudos sobre o papel das

citocinas na Dengue e nas imunoterapias contribui para o aprimoramento no tratamento da

doença e prevenção de sua forma grave.

1.6 Os monócitos/macrófagos e a Doença

1.6.1 Heterogeneidade fenotípica e funcional dos macrófagos

Os monócitos/macrófagos representam uma subpopulação dos leucócitos

mononucleares, com função fagocítica e secretória, importantes tanto na imunidade inata

como na adquirida. Eles se originam na medula óssea a partir de um progenitor mielóide

comum. Após sua maturação, os monócitos caem na corrente sanguínea, onde circulam por

aproximadamente 72 horas antes de migrarem para os tecidos e reabastecer a população de

macrófagos teciduais ou se diferenciarem em DCs (Skrzeczynska-Moncznik, Bzowska et al.,

2008). A heterogeneidade e plasticidade são características marcantes dessas células, que

constituem cerca de 5 – 10% dos leucócitos de sangue periférico em humanos (Gordon e

Taylor, 2005). Vários fatores, incluindo metabólitos teciduais, citocinas, quimiocinas e

mediadores inflamatórios, podem influenciar na diferenciação de macrófagos no tecido. Uma

vez nos tecidos, essas células adquirem propriedades funcionais e morfológicas distintas. Elas

constituem um sistema de vigilância, que protege o hospedeiro contra agentes externos,

incluindo organismos infecciosos. Os monócitos/macrófagos têm um importante papel de

induzir, amplificar, mas também limitar a inflamação, participando na produção, mobilização,

ativação e regulação de diversas células do sistema imunológico.

Em resposta a citocinas e produtos microbianos, fagócitos mononucleares expressam

propriedades fenotípicas funcionais especializadas e polarizadas. O efeito de citocinas e

outros estímulos extrínsecos determinam o fenótipo de maturação de monócitos. Um

reconhecimento microbiano direto pode engatilhar as vias do TLR, mas também podem

resultar numa expressão aumentada de Ags via receptores específicos (Tacke e Randolph,

2006). Acompanhando a nomenclatura Th1/Th2, muitos autores referem-se a macrófagos

polarizados como sendo células M1 e M2. Macrófagos M1, classicamente ativados, vêm

sendo incluídos como aqueles induzidos por INF-γ apenas ou por outras citocinas, como

TNF-α e GM-CSF, ou por estímulos microbianos (como LPS). Esse tipo de ativação pode

potencializar a função de receptores envolvidos na imunidade inata como os TLRs. Citocinas

como IL-4 e IL-13 vêm sendo incluídas não apenas como inibidoras de ativação de

macrófagos, mas também por induzir uma forma alternativa de ativação dessas células. M2 é

um nome genérico para as várias formas de ativação de macrófagos, que não a sua forma

clássica M1. Os macrófagos pertencentes à nomenclatura M2 são ativados por exposição a IL-

4 ou IL-13, imunocomplexos, IL-10 e hormônios (Mantovani, Sica et al., 2007).

Em geral, os macrófagos M1 apresentam um fenótipo IL-12

high

IL-23

high

IL-10

low

. Eles

são produtores eficientes de moléculas efetoras, como espécies reativas de oxigênio e

citocinas inflamatórias (IL-1β, TNF-α e IL-6), e participam como indutores e efetores em

respostas Th1. Os macrófagos M1 também medeiam resistência contra parasitas intracelulares

e tumores. Ao contrário, as várias formas de macrófagos M2 compartilham um fenótipo IL-

low

IL-23

low

IL-10

high

e possuem uma capacidade variável de produzir citocinas inflamatórias

dependendo do sinal utilizado para ativação. Em geral, essas células participam em respostas

Th2, promovem morte e encapsulação de parasitas, apresentam um elevado crescimento

celular, estão presentes em tumores estabelecidos e promovem progressão tumoral, reparo

tecidual e remodelagem, e têm funções imunomoduladoras (Mantovani, Sica et al., 2007).

1.6.2 As subpopulações de monócitos

Nos tecidos, os monócitos, agora denominados macrófagos, diferenciam-se em células

fenotípica e funcionalmente distintas, incluindo macrófagos alveolares, osteoclastos ou

células de microglia. Eles abastecem as populações de macrófagos de DCs teciduais enquanto

outros se diferenciam em macrófagos com funções de clearence de patógenos e na resolução

da inflamação local. Embora a heterogeneidade desses macrófagos teciduais seja bem

estabelecida, a heterogeneidade de monócitos foi claramente demonstrada apenas

recentemente. Por mais de 20 anos, vem sendo reconhecido que existem dois tipos distintos

de populações de monócitos no sangue periférico de humanos (Mobley, Leininger et al.,

2007). Estes foram inicialmente identificados pela expressão elevada de CD14, uma molécula

que faz parte do receptor para lipopolissacarídeos microbianos. Entretanto, a identificação da

expressão diferencial de marcadores antigênicos mostrou a grande heterogeneidade dessas

células. Esses subtipos diferem em muitos aspectos, incluindo a expressão de moléculas de

adesão, receptores de quimiocinas (CCR e CXCR) e de CD16, um receptor de baixa afinidade

para IgG (FcγRIII). A análise da expressão diferencial de genes nessas subpopulações sugere

que esses subtipos tenham diferenças funcionais bastante distintas na resposta imune inata,

com maior atividade. Essas células apresentam uma grande atividade estimulatória e migração

(Mobley, Leininger et al., 2007).

Em geral, a expressão diferencial de CD14 e CD16 permitiu classificar os monócitos

em dois subtipos: as células CD14

high

CD16

e as células CD14

CD16

. As células

CD14

high

CD16

foram descritas originalmente como monócitos “clássicos” devido ao fato

delas representarem 90-95% da população monocítica total em um indivíduo saudável. Essas

células também expressam CCR2, um receptor envolvido no recrutamento de monócitos em

sítios inflamados, CD62L (L-selectina/molécula de adesão) e CD64 (FcγRI). Portanto,

monócitos com esse padrão de expressão de proteínas, embora sejam responsáveis pelo

abastecimento de macrófagos e DCs residentes em tecidos, eles também estão envolvidos na

remoção de células mortas ou debris, mas são equipados para defesa contra patógenos

(Figura 1.4) (Tacke e Randolph, 2006; Mobley, Leininger et al., 2007).

Passlick e colaboradores foram os primeiros a descreverem uma população de

monócitos expressando CD16 no sangue periférico de humanos (Passlick, Flieger et al.,

1989). Em um adulto saudável, essa subpopulação consiste de 5-10% do total de monócitos

no sangue (Strauss-Ayali, Conrad et al., 2007). Há poucos anos atrás, foi descoberto que o

subtipo de células CD14

low

CD16

produz mais citocinas inflamatórias e sua prevalência

permanece mais elevada no sangue em várias doenças inflamatórias crônicas e agudas. Por

esta razão, essas células foram classificadas como “pró-inflamatórias”. A subpopulação de

monócitos CD16

produz baixos níveis de IL-10 em resposta ao agonista de TLR-4 e grande

quantidade de TNF-α e IL-6 em resposta a agonistas de TLR-4 e 2 (Belge, Dayyani et al.,

2002; Mobley, Leininger et al., 2007). Interessantemente, enquanto alguns autores sugerem

que essas células sejam pro-inflamatórias por natureza, outros vêm demonstrando, in vitro,

que o TNF-α também desempenha um importante papel na diferenciação de células

CD14

CD16

em monócitos CD14

low

CD16

, acompanhando a exposição a Ags bacterianos

(Figura 1.4) (Skinner, Macisaac et al., 2005; Skrzeczynska-Moncznik, Bzowska et al., 2008).

Figura 1.4: Esquema representativo das principais subpopulações monocíticas em humanos. Monócitos

humanos são esquematizados, mostrando suas principais características funcionais e fenotípicas. HSC –

Hematopoietic Stem Cell / CNP – committed myeloid progenitor / CCR, CXCR – receptores de quimiocinas /

CD62(L) - /l lectina/ GMP – granulocyte/macrophage progenitor / DCs – células dendríticas / M1 – macrófagos

Th1 / M2 – macrófagos Th2 / Estímulos / produtos (Adaptado de Gordon e Taylor, 2005; Mantovani, Sica

et al., 2007; Skrzeczynska-Moncznik, Bzowska et al., 2008).

O padrão diferencial de expressão de genes codificando moléculas de adesão,

determinados receptores de quimiocinas, fatores de diferenciação e proteínas defensinas

implica que a subpopulação de monócitos CD16

, bem como sua progênie de macrófagos,

sirvam como sentinelas nos tecidos periféricos, sendo capazes de matar diretamente

microorganismos invasores (Mobley, Leininger et al., 2007). Essas células carecem de CCR2,

porém expressam outros receptores de quimiocina, como CCR5, e têm altos níveis de MHC-II

e CD32 (FcγRII). Esse padrão diferencial de expressão de receptores e moléculas pode ter

conseqüências funcionais importantes para essas células, resultando não apenas diferenças nos

padrões de migração e estimulação, mas também conferindo uma susceptibilidade diferencial

a infecções. Organismos como os vírus HIV e do Oeste do Nilo, que podem explorar esses

tipos de receptores para estabelecer as infecções, infectam, portanto, de maneira preferencial,

subpopulações específicas de monócitos (Strauss-Ayali, Conrad et al., 2007).

Recentemente, vem se demonstrando a presença de um padrão diferencial de

populações de monócitos CD16

. Uma população intermediária que tem um fenótipo

CD14

high

CD16

diferencia-se in vitro e provavelmente é o subtipo de monócitos CD16

que

expressa CCR5, considerado um mediador potencial de tráfego nesta subpopulação (Tacke e

Randolph, 2006). Essas células também diferem por sua alta capacidade fagocítica comparado

aos subtipos CD14

low

CD16

, embora seja semelhante à população de monócitos clássicos.

Skrzeczynska-Moncznik e colaboradores demonstraram que, sob estimulação com LPS,

monócitos CD14

high

CD16

produziam mais IL-10, avaliando proteína e RNAm, em

comparação às demais subpopulações de monócitos, mostrando um padrão funcional

diferencial com propriedades “anti-inflamatórias” (Figura 1.4) (Skrzeczynska-Moncznik,

Bzowska et al., 2008).

1.6.3 O papel dos monócitos/macrófagos na Dengue

O primeiro evento a ser considerado durante a ativação macrofágica é o tipo de ligante

presente no microambiente. As células da linhagem monocítica são importantes elementos da

defesa imunológica que fagocitam materiais externos e que são usados para o reconhecimento

de uma grande variedade de receptores de superfície, sinalização intracelular e mudanças

complexas na ativação e repressão de genes. As funções celulares induzidas em monócitos

incluem adesão e migração alteradas, secreção de vários fatores, processamento e

apresentação do Ag a células T, e ativação de funções efetoras, incluindo a produção de uma

gama de citocinas como TNF-α, IL-1β, IL-12 e IL-6. A expressão de citocinas por estas

células é eficientemente desencadeada por estímulos de produtos bacterianos, como

lipopolissacarídeos (LPS) ou Pam3Cys (Belge, Dayyani et al., 2002). Ambas as moléculas

ligam-se ao CD14 na superfície celular com LPS agindo via co-receptor TLR-4, enquanto a

Pam3Cys age via co-receptor TLR-2. A ligação desses complexos de receptores resulta na

ativação de cascatas de transdução de sinal, que culmina com a ativação de NF-kB, expressão

de moléculas co-estimulatórias e expressão de citocinas, como IFN-α e β, TNF-α, e

mediadores inflamatórios, como NO. O TNF é a citocina mestre que regula as respostas

imunológicas por agir em outras células levando ao aumento da proliferação, expressão de

receptores e migração celular. Adicionalmente, o TNF-α regula a produção de outras citocinas

(Belge, Dayyani et al., 2002).

A via clássica de ativação dos monócitos/macrófagos é bastante estudada requerendo

dois sinais necessários: o primeiro é obrigatoriamente o IFN-γ, que prepara a célula para ser

ativada pelo segundo sinal, proveniente do patógeno (como LPS e proteínas virais) e citocinas

(como o TNF-α). A ativação também pode acontecer via ligantes para TLRs (com o LPS,

ácido lipoteicóico ou peptídeoglicanas) ou via IL-4 ou IL-13. Como já citado, mudanças

ocorridas nessas células ativadas incluem a produção de mediadores inflamatórios como NO e

moléculas co-estimulatórias (Gordon & Taylor, 2005). Essas modificações aumentam a

habilidade dessas células em processar e apresentar os Ags e de matar patógenos. Durante

esse processo, uma grande quantidade de IL-12 também é produzida, ativando células T de

perfil Th1 a produzirem INF-γ, numa retroalimentação positiva (Gordon, 2003; Mosser,

2003). A ativação de células Th2 foi descoberta pelo estudo da ligação de complexos imunes

aos receptores Fc na superfície de monócitos/macrófagos. Observou-se que essa ligação

causava um efeito de parada imediata na produção de IL-12 e a secreção de grande quantidade

de IL-10. Apesar da produção de IL-10, essas células continuavam produzindo citocinas pró-

inflamatórias como IL-1, IL-6 e TNF. O papel da IL-10 nestas células parece ser de controle

da resposta, bem como a indução do perfil Th2 por células T (Anderson, Gerber et al., 2002).

Chen e Wang mostraram que citocinas como a IL-12, MIP-1α, RANTES, IL-1β, TNF-

α e INF-α, desempenham um importante papel na patogenia da infecção por DENV. Tais

mediadores têm como função iniciar respostas Th1 e ativar células NK e linfócitos T

citotóxicos (CTLs) (Chen e Wang, 2002). Após a infecção de monócitos/macrófagos humanos

pelo DENV, citocinas e quimiocinas são liberadas em quantidades, cinéticas e durações

distintas. Como resultado, tais mediadores estariam atuando aumentando a permeabilidade

vascular e a resposta inflamatória local. Esse fenômeno estaria contribuindo para a

proliferação, ativação e manutenção de células efetoras como NK, CTLs e Th1, modificando

as respostas imunológicas do hospedeiro na infecção viral. Portanto, durante a infecção pelo

DENV, a proteção ou a patogenia é determinada pela interface da imunidade inata e

adaptativa controlada por citocinas inatas produzidas como conseqüência da interação do

vírus Dengue com seus principais alvos celulares, monócitos/macrófagos humanos. Espina e

colaboradores demonstraram que o DENV-2 pode ser eficientemente fagocitado por

monócitos/macrófagos humanos, mostrando seu papel no clearence viral (Espina, Valero et

al., 2003). Porém, uma pequena proporção delas permite a replicação viral e é fonte de

disseminação de citocinas na circulação. Reis e colaboradores caracterizaram, em um modelo

de infecção in vitro de monócitos por DENV-2, o papel de múltiplas citocinas como TNF-α,

INF-α, IL-6 e IL-10, produzidas na infecção. Quando as células infectadas eram tratadas com

dexametasona, um glicocorticóide usado para o tratamento de patologias originadas por

inflamação e autoimunidade, modulando um decréscimo na freqüência de monócitos

infectados, bem como na inibição da produção de citocinas. Tais resultados reforçam a busca

de substâncias como novos terápicos para o controle da doença. Tal controle estaria

envolvendo a modulação de citocinas que teriam um importante papel na replicação do vírus

((Reis, Valente et al., 2008). Com já mencionado, a IL-8 também influencia na gravidade da

Dengue. Bosch e colaboradores demonstraram que, dentre as citocinas pró-inflamatórias

produzidas por monócitos humanos infectados com DENV-2, a IL-8 foi a principal citocina

secretada (Bosch, Xhaja et al., 2002). Sua expressão está relacionada com a ativação do fator

de transcrição NF-B. Interessantemente, in vitro, células endoteliais infectadas por DENV-2

também produzem IL-8 mediada pela ativação de NF-B, ativam o complemento e podem

sofrer apoptose. Uma das funções da IL-8 é promover o extravasamento capilar e, portanto,

modular a patogenia da FHD/SCD.

De acordo com a idéia de que a Dengue é uma doença aguda e de curta duração, e que

os IFN-α/γ são moléculas que induzem mecanismos de defesa antiviral, é esperado que a

replicação do DENV seja amplamente inibida em fagócitos mononucleares. Sabe-se que o NO

é produzido por monócitos ativados via IFN-γ. A via de ativação de NO é catalizada pelo

óxido nítrico sintase (NOS). Estudos em nosso laboratório mostram que monócitos isolados

de pacientes com infecção por DENV-1 se encontram ativados e expressam a enzima NOS

tipo II (iNOS) resultando na produção de NO. O bloqueio da iNOS aumenta a produção viral

identificando, assim, o papel antiviral do NO bem como um gerador de NO bloqueando a

replicação viral de DENV (Neves-Souza, Azeredo et al., 2005). Embora tenha um papel

benéfico na infecção por DENV, o NO poderia também desempenhar um papel na gravidade

da FHD provavelmente quando produzido em altas concentrações, por afetar o tônus vascular

e contribuir para a SCD (Liao, Lin et al., 2001). Alternativamente, células que interagem com

os Ags virais tornam-se provavelmente ativadas e morrem por apoptose induzida pelo vírus.

1.7 Morte Celular

A morte celular é um evento essencial tanto na vida normal dos organismos quanto

nos processos patofisiológicos que desencadeiam a doença (Lemasters, 2005). A

nomenclatura clássica distingue três principais formas de morte celular: apoptose (tipo I), a

autofagia (tipo II) e a necrose (tipo III). A apoptose compreende um processo controlado de

morte celular. Ele é orquestrado por uma cascata de eventos bioquímicos, liderando com

mudanças morfológicas e finalmente morte celular. A autofagia também é um processo

programado pelo qual células digerem parte de seu próprio material citosólico, de forma a

prolongar a sobrevivência celular. Ela ocorre sob condições de carência de nutrientes ou

remodelamento da estrutura intracelular para diferenciação celular. Quando essas condições

persistem a célula morre. Embora o fenótipo de células apoptóticas e autofágicas seja muito

semelhante, os eventos moleculares envolvidos em ambos os processos diferem

consideravelmente (Tabela 1.1). Finalmente, a necrose é a morte celular acidental em tecidos

ou órgãos. Ela evolui por uma conseqüente interrupção dos processos celulares. Inflamação,

câncer, lesões teciduais ou infecções podem originá-la (Bruchhaus, Roeder et al., 2007).

1.7.1 A apoptose

A apoptose aparentemente é compartilhada por todos os organismos multicelulares,

sendo um mecanismo pelo qual as células com DNA danificado podem ser eliminadas sem

prejuízo. Tal processo ativo de autodestruição celular com fatores morfológicos e bioquímicos

distintos, geneticamente regulados, culmina na ativação de uma cadeia enzimática complexa

de sistemas de sinalização intracelular, que levam à destruição de componentes essenciais à

sobrevivência das células. Ela ocorre em resposta a uma variedade de sinais e de estímulos,

tanto internos como extracelulares, incluindo deficiência de fatores de crescimento,

hormônios, citocinas, células suicidas, ativação de receptores de morte e proteases endógenas,

pela interação via granzima B/perforinas utilizadas por células do sistema imune ou ainda por

agentes virais, químicos ou físicos. Sua indução pode estar mais ou menos desregulada em

determinadas situações patológicas levando, por exemplo, ao aparecimento de cânceres,

quando defeituoso, ou ao desenvolvimento de doenças neurodegenerativas ou AIDS, quando

excessiva (Lemasters, 2005).

Tipo de morte

celular Características Principais eventos Função geral Papel no sistema imune

Diminuição celular; Via intrínseca (citocromo c, Seleção negativa de linfócitos T;

Condensação da cromatina; Apaf1, caspase 9); Desenvolvimento embriônico; Maturação celular;

Apoptose

Degradação proteolítica; Morte celular induzida

Corpúsculos membranares; Via extrínsica (receptores de Homeostasia celular em adulto; por ativação (ou Ag);

Dependência energética; morte, FADD, caspase 8/10); Mecanismo de morte

Sem resposta inflamatória; por citotoxicidade;

Geneticamente programada; RE

Geneticamente programada; Genes Autofágicos (Beclin 1); Balanço no deficit de energia? Defesa imune contra

Engatilhada por deprivação

de nutrientes; Via da PI3K; Programa distinto de suicídio? patógenos intracelulares;

Autofagia

Vacúolos autofágicos de

membrana dupla; Regulador Tor positivo e negativo; Apresentação de Ag via MHC II;

Degradação de proteína lisossomal;

Sem resposta inflamatória;

Morte celular passiva devido Intermediários reativos de oxigênio; Possivelmente programada quando

a depleção catastrófica de ATP; Proteases lisossomais; a apoptose ou autofagia falham; Indução de resposta inflamatória;

Necrose

Perda da integridade e

ruptura celular; Morte acidental.

Causa inflamação;

Tabela 1.1: Visão geral das mudanças celulares provocadas pelos principais mecanismos de morte celular e função de cada um, com destaque no sistema imunológico

(Adaptado de Feig e Peter, 2007).

1.7.1.1 Características morfológicas e bioquímicas da apoptose

A nível celular, a apoptose é caracterizada pela compactação e marginação da

cromatina nuclear e, posteriormente, citoplasmática, com formação dos corpos apoptóticos

contendo organelas íntegras. Esses corpos são fagocitados pelas células ao redor e degradados

no interior dos lisossomos. Como já é sabido, as células hematopoiéticas normais possuem

uma disposição assimétrica dos fosfolipídios de membrana, como a fosfatidilcolina e

esfingomielina, localizando-se preferencialmente na sua posição externa, e a

fosfatidiletanolamida e a fosfatidilserina na sua porção interna. Com a evolução do processo

apoptótico ou autofágico, ocorre a perda dessa assimetria e a exposição da fosfatidilserina na

superfície externa da célula, que na apoptose, é seguida da quebra das alças de DNA, porém,

sem a ruptura da integridade de membrana (Vermes, Haanen et al., 1995; Merchant,

Gonchoroff et al., 2001). A nível bioquímico, o que ocorre, inicialmente, independente do

estímulo desencadeador, é a clivagem do DNA de dupla hélice nas regiões de ligação dos

nucleossomos. Com isso, há a produção de múltiplas cadeias de pares de bases. Este processo

de clivagem é feito por endonucleases endógenas e estreitamente controlada por vários genes,

como a família dos genes bcl-2 e a família dos genes ativadores de endonucleases (Vaux,

Haecker et al., 1994).

1.7.1.2 Vias de sinalização da Apoptose

O programa de apoptose pode ser engatilhado por duas vias. Embora ambas possam

funcionar independentemente, existem muitas convergências, o que permite a amplificação do

sinal de morte. A forma pela qual a célula responde à morte pode ser através do ambiente (via

extrínseca/receptores de morte) ou por sinais internos, que induzem a ativação do programa

apoptócio (via intrínseca/via mitocondrial). Independente de como ela é iniciada, a apoptose

resulta na ativação de uma classe específica de cisteína-proteases, as caspases, de extrema

importância, pois clivam proteínas celulares que culminam na desestruturação celular. As

caspases são divididas em dois grupos, aquelas denominadas iniciadoras (caspases 2, 9 e 10),

envolvidas nos eventos iniciais reguladores da apoptose, e as efetoras (3, 6 e7), que são

proteoliticamente ativadas em uma cascata conduzindo à desintegração celular. Dessa forma,

a amplificação do sinal pela cascata de caspases assegura uma ativação completa do programa

de morte celular (Feig e Peter, 2007).

1.7.1.3 Via extrínseca

O principal evento pelo qual se origina a apoptose consiste na transdução de um sinal

através de receptores de morte.

A via extrínseca é ativada quando TNF-α, Fas ligante ou

TRAIL, ligam-se a seus respectivos receptores, que fazem parte da família dos receptores

TNF (TNFR)/TNF: TNFR1, TRAIL-R1/2 e Fas (CD95/APO-1). Quando estimulados, eles

são recrutados para a superfície por exocitose de endomembranas. A forma mais simples de

sinalização conduz à trimerização dos receptores pelos seus respectivos ligantes. Como esses

receptores não apresentam uma atividade enzimática intrínseca, proteínas adaptadoras

associadas, como FADD (domínio de morte associado ao Fas) ou TRAPP (domínio de morte

associado ao TNFR1) ativam a cascata enzimática levando à degradação da célula (Lemasters,

2005). No entanto, outras proteínas adaptadoras poderiam ser também recrutadas, como as

TRAFs (fator associado ao TNFR) ou RIP (Receptor-Interating Protein), que teriam

propriedades anti-apoptóticas (Hsu, Shu et al., 1996). Seguindo a trimerização dos receptores

e o recrutamento das proteínas adaptadoras, cisteína-proteases inativas, também conhecidas

como pró-caspases 8 e 10, são também recrutadas e, conseqüentemente ativadas, resultando

na clivagem proteolítica. Quando clivadas, essas caspases são liberadas no citosol, onde

participam no orquestramento do processo apoptótico: a ativação da caspase-3. Quando

ativada, essa caspase promove a ativação de proteínas importantes que induzem danos ao

DNA (Feig e Peter, 2007).

1.7.1.4 Via intrínseca

Os mecanismos moleculares envolvidas na ativação da via intrínseca para a apoptose

ainda não estão totalmente esclarecidos. Ela é induzida por toxinas ou estresse causado por

carência de fatores de crescimento, instabilidade genômica, privação de energia, infecção

viral, drogas ou UV (Feig e Peter, 2007). A família dos genes bcl-2 representa um fator chave

na via de apoptose. Ela codifica duas classes de proteínas: aquelas com atividade anti-

apoptótica (por exemplo, Bcl-2 e Bcl-xl) e as com atividade pró-apoptótica (por exemplo,

Bak, Bid e Bax). A característica mais marcante dos membros dessa família é a habilidade de

formar heterodímeros, sugerindo uma competição neutralizante entre eles. Funcionalmente,

essas proteínas têm a capacidade de se associarem às membranas. Elas também carregam um

domínio C-terminal hidrofóbico, que é essencial para suas funções de membrana, como

permeabilização. Outro componente importante da maquinaria de morte celular, como já

citado, é o sistema proteolítico envolvendo as caspases (Lemasters, 2005).

A passagem de elétrons ao longo da cadeia respiratória na mitocôndria libera energia

suficiente. O transporte de elétrons gera um gradiente de voltagem por toda extensão da

membrana interna mitocondrial (∆Ψm). A energia liberada é usada para bombear os prótons

) para fora da membrana interna mitocondrial, criando um gradiente eletroquímico que é

positivo e ácido do lado de fora (no espaço intermembranar) e negativo e alcalino do lado de

dentro (matriz mitocondrial). Sabe-se que a mitocôndria desempenha um papel central em

uma ampla variedade de sinais apoptóticos, em diversos tipos celulares. Alterações no

potencial de membrana externa mitocondrial (∆ψm) e a produção de espécies reativas de

oxigênio vêm sendo relacionadas com os eventos iniciais que envolvem todo o sistema

apoptótico. Quando sinais de morte alcançam a mitocôndria, levam ao colapso do ∆ψm, bem

como a uma transição da permeabilidade mitocondrial (TPM). Ao mesmo tempo, a água do

espaço entre membranas passa para a matriz mitocondrial, levando à ruptura da organela e

conseqüente liberação de proteínas pró-apoptóticas para o citoplasma (Loeffler e Kroemer,

2000; Gupta, 2003).

Os diferentes sinais indutores de apoptose são detectados pela mitocôndria, fazendo

com que ocorra um desacoplamento da cadeia respiratória e conseqüente liberação de

citocromo c e proteínas ativadoras da apoptose para o citosol. A alteração no ∆ψm promove

mudanças nas membranas interna e externa mitocondrial, que estariam envolvidas na abertura

de canais iônicos voltagem-dependentes (CIVD) e, conseqüentemente, a liberação desses

mediadores de seu espaço intermembranar e que amplificam a cascata apoptótica. Além disso,

a membrana mitocondrial é local de muitos dos membros da família Bcl-2 e seu papel ativo

na indução/inibição no programa mitocondrial de apoptose implicam que eles sejam parte do

mecanismo efetor de morte baseado nesta organela (Gross, 2001; Dejean, Martinez-Caballero

et al., 2006). Elas poderiam interagir na abertura desses canais e promover a permeabilização

da membrana externa mitocondrial (Schwarz et al., 2007). Além da liberação de moléculas

pela mitocôndria, a indução da TPM leva à perda da homeostasia celular, interrompendo a

síntese de ATP e aumentando a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) (Kroemer e

Reed, 2000). O aumento nos níveis de ROS leva à oxidação de lipídios, proteínas e ácidos

nucléicos, aumentando o colapso do ∆ψm (Green e Kroemer, 2004). A resposta da

mitocôndria ao dano oxidativo é uma via importante no início da apoptose. Além disso, é

sabido que as ROS induzem a ativação das caspases 9 e 3 (Gottlieb, Vander Heiden et al.,

2000; Gottlieb, 2001). Foi descrita a participação, na via mitocondrial, de uma flavoproteína

conhecida por Fator Indutor de Apoptose (AIF). A AIF migra da mitocôndria para o núcleo

após um estímulo de apoptose e induz a condensação da cromatina e fragmentação do DNA

em fragmentos de 50 kb, independente da ativação das caspases (Broker, Kruyt et al., 2005).

De acordo com a via extrínseca, seguindo a trimerização dos receptores de morte e o

recrutamento das proteínas adaptadoras, pró-caspases são também recrutadas e,

consequentemente, ativadas, implicando na clivagem proteolítica. A caspase 8, iniciadora,

ativa a caspase 3 levando à desintegração celular. A caspase 8 também cliva uma proteína

citosólica, a p22 Bid, no seu fragmento carboxi-terminal (Bidt). Essa tem um importante

papel, pois interconecta tanto a via extrínseca quanto a intrínseca. Quando clivada, o

fragmento Bidt é translocado para a mitocôndria e engatilha a ativação dos membros da

família Bcl-2 Bad e Bax e, conseqüente a liberação do citocromo c, um importante fator pró-

apoptótico. A função da Bidt em promover a liberação do citocromo c estaria relacionada à

sua habilidade de formar canais em membranas artificiais (Figura 1.5). Porém, como citado

anteriormente, outros fatores estariam envolvidos na abertura de CIVDs ou poros na

membrana mitocondrial. Na via extrínseca, a permeablização da membrana mitocondrial

serve como uma alça amplificadora da ativação de caspases efetoras (Schwarz, Andrade-

Navarro et al., 2007; Maniati, Potter et al., 2008).

A função do citocromo c consiste em modular a ativação do fator Apaf-1 (fator 1

ativador de protease apoptótica) para ativar a pro-caspase 9 em um complexo conhecido como

apoptossomo. Consequentemente, a caspase 3 é ativada numa cascata dependente de ATP.

Proteínas com funções pró-apoptóticas também são liberadas por esses canais, como a

Smac/DIABLO, que bloqueia IAPs, proteínas inibidoras de apoptose que inibem a caspase 9

(Lemasters, 2005). O oncogene p53 também é um importante regulador, tanto no ciclo celular

como na apoptose. O sinal que promove sua ativação consiste em dano ao DNA. Sua ativação

leva à indução de genes e expressão de proteínas pro-apoptóticas (PUMA, NOXA, Mcl-1),

que, quando translocadas para a mitocôndria, interagem inibindo proteínas anti-apoptóticas e

estimulando a via apoptótica mitocondrial. Como mencionado, a mitocôndria desempenha um

papel central em uma ampla variedade de sinais apoptóticos, tendo sua resposta bastante

regulada por proteínas da família do gene Bcl-2. Ela não só está envolvida na liberação de

vários mediadores que promovem a amplificação da cascata apoptótica, como também

proteínas com atividade anti-apoptótica. Tais proteínas, ao se fixarem no citocromo c, o

impedem de modular a ativação da cascata enzimática (Figura 1.5) (Yang, Liu et al., 1997).

O proto-oncogene Bcl-2 foi o primeiro membro da família Bcl-2 a ser descoberto. O

gene codifica uma proteína, Bcl-2, que inibe a apoptose. Embora a Bcl-2 seja integrada à

membrana interna mitocondrial, existem múltiplos sítios intracelulares para sua expressão,

incluindo RE, envelope nuclear de vários tecidos com exceção de tecido muscular e hepático

(Eguchi, Ewert et al., 1992; Chleq-Deschamps, Lebrun et al., 1993; De Jong, Prins et al.,

1994). Todas as células hematopoiéticas e linfóides contêm a proteína Bcl-2, além de muitas

células epiteliais (Carson e Ribeiro, 1993). Sua função de proteger a célula da morte celular

vem sido demonstrada em vários modelos experimentais. A expressão inapropriada do Bcl-2

lidera com o crescimento neoplásico numa taxa menor do que outros oncogenes induzidos.

Além do papel das proteínas da família Bcl-2 inibidoras de caspases, vários outros

mecanismos regulatórios existem para inibir a morte celular. Dentre esses, podemos citar o

papel das IAPS. Os receptores de morte também estimulam, através de proteínas adaptadoras,

sinais anti-apoptóticos. Quando ativado por essa via anti-apoptótica, fatores de transcrição são

translocados para o núcleo e ativam a expressão de genes, incluindo as IAPs, iNOS e outros

fatores de sobrevivência.Outra via inibitória da apoptose compreende a via da PI3 kinase

inibindo a proteína pro-apoptótica Bad (Figura 1.5) (Lemasters, 2005).

O principal regulador das decisões de vida ou morte celular é o fator de transcrição

NF-κB. Uma variedade de mecanismos existe para modular sua atividade e, portanto, afetar o

destino da célula. Sinais como citocinas pró-inflamatórias, incluindo TNF-α, produtos

microbianos como LPS e infecções virais, ativam sua função de ligação em regiões

promotoras de genes. Essa ligação leva à codificação de uma variedade de fatores importantes

envolvidos na adesão celular, controle do crescimento celular, funções imunológicas e

controle apoptótico (Karin e Lin, 2002). Um dos estímulos para a ativação de NF-κB

geralmente compreende o estresse oxidativo. Com isso, radicais oxidativos podem causar

danos à membrana mitocondrial e, finalmente desencadear a morte celular. Um dos genes-

alvo para a ação do NF-κB é o gene p53 (Tan, Yu et al., 2003). Ao contrário de seu papel

antiviral em promover a produção de uma série de citocinas inflamatórias, uma grande

variedade de vírus são capazes de ativar NF-κB em células infectadas (Liao, Lin et al., 2001).

O RE também é uma importante fonte de sinais pró-apoptóticos. Suas principais

funções incluem a síntese de proteínas e o armazenamento para uma rápida mobilização de

cálcio. Estresse oxidativo e outras perturbações celulares podem inibir a retenção e ativar as

vias de liberação de cálcio do RE para o citosol. O acúmulo de cálcio no citosol é captado

pela mitocôndria. Isso induz a uma permeabilidade mitocondrial dependente da abertura de

canais de cálcio levando a liberação de cálcio via RE também ativa a Fosfolipase A2 (PLA2)

e a formação de ácido aracdônico, outro indutor da permeabilidade mitocondrial. A depleção

de cálcio pelo RE altera também os mecanismos envolvidos no enovelamento e montagem de

proteínas recém-formadas no lúmen de suas cisternas. Inibidores de glicosilação, toxinas e a

síntese de proteínas mutantes podem também gerar um “stress” no RE. Essas disfunções na

organela promovem a ativação de certas proteínas que estariam sendo inibidas por chaperonas

dependentes de cálcio. Essas proteínas ativas iniciam, então, as vias de sinalização

apoptóticas, associando-se a fatores ativadores de caspases e quinases (Figura 1.5).

Os lisossomos estão envolvidos no processo de morte celular associado à autofagia.

Durante a autofagia, elementos ao redor do RE e porções do citoplasma são

compartimentalizadas em vacúolos de dupla-fita denominados autofagossomos. Estes se

fundem com os lisossomos para formar os autolisossomos. Desta forma, constituintes

celulares são removidos e digeridos. Algumas evidências sugerem que a autofagia possa

desencadear a apoptose, em certas circunstâncias. Enzimas provenientes de

lisossomos/autolissosomos como catepsinas e outras hidrolases, podem promover a

permeabilização mitocondrial e a ativação de caspases (Gozuacik e Kimchi, 2004; Boya,

Gonzalez-Polo et al., 2005). A permeabilização lisossomal também estaria correlacionada a

apoptose dependente de receptores estimulados por TNF-α. O sinal desencadeado por esta

citocina promove a permeabilização lissosomal em decorrência da clivagem da proteína Bit

por uma via dependente de caspase 8. Dessa forma, a liberação fatores lisossomais

contribuem para a ativação da via mitocondrial apoptótica (Figura 1.5) (Stoka, Turk et al.,

2001; Bidere, Lorenzo et al., 2003).

1.7.1.5 As proteínas quinases (MAPKs) e seu papel na apoptose

MAPKs e fosfatase são enzimas responsáveis por determinar o estágio de fosforilação

de certas proteínas e, assim, o sinal a ser transduzido por elas. As vias de sinalização

envolvendo as MAPKs desempenham um importante papel na transdução de sinal,

modulando muitos eventos celulares incluindo ativação celular, respostas imunes e apoptose

(Schaeffer e Weber, 1999; Ludwig, Pleschka et al., 2006). A via da JNK regula a expressão

de IFN-β, tendo um importante papel como mediador de respostas antivivais (Ludwig,

Pleschka et al., 2006). A ativação da JNK também modula a apoptose. A depleção de cálcio

do RE promove a ativação da quinase IRE1 que, quando ativada, promove a ativação da

caspase 12 e a JNK. A caspase 12 ativa a caspase 3 e a JNK junto com outra proteína, ativa a

via mitocondrial de morte celular (Figura 1.5) (Lemasters, 2005). A MAPK p38 também é

induzida principalmente por um ambiente de estresse e por citocinas e estímulos pró-

inflamatórios, tais como LPS, IL-1, RANTES, IL-18, TGF-β e TNF-α, incluindo infecções

virais, sugerindo seu papel controlador de respostas inflamatórias (Lee, Cheung et al., 2005).

Também modelos experimentais transgênicos vêm evidenciando as funções da MAPK p38 no

mecanismo de apoptose em células-alvo (Ashwell, 2006; Schito, Demidov et al., 2006). A

ativação da via da ERK geralmente funciona para proteger a célula de uma variedade de

estresses celulares. Suas principais funções compreendem promover a diferenciação e

proliferação celular. Alguns trabalhos vêm mostrando que o fator inibidor de macrófago

(MIF) induz ERK1/2 via geração de AA em cultura (Sawatzky, Willoughby et al., 2006). O

ácido aracdônico (AA) é um importante indutor de abertura de poros na membrana externa

mitocondrial na via apoptótica mitocondrial (Figura 1.5). Portanto, a via da ERK pode ser

responsável, parcialmente, pele proliferação ou morte celular. A fludarabina, um análogo

denucleosídeo, foi originalmente desenvolvido para o tratamento de enfermidades

hematológicas. Vem sido demonstrado que a exposição de linhagem de célula humana

monocítica a fludarabina estaria associada com a apoptose. Calloti e colaboradores mostraram

que esse composto induz a via da em células monocíticas de pacientes com leucemia

linfocítica crônica, que corresponde o principal alvo terapêutico da fludarabina (Fernandez-

Calotti, Gamberale et al., 2006).

Figura 1.5: Esquema ilustrativo das vias de sinalização e principais fatores envolvidos na apoptose, desde

a membrana plasmática, mitocôndria, núcleo, RE e lisossomos (Lemasters, 2005).

1.8 A apoptose na infecção pelo DENV

A apoptose é um fator regulatório do sistema imune, fundamental na resposta imune

inata à infecção viral. Ela pode ser dependente do Ag e iniciada por sinais através de

receptores de morte, como CD95 (Fas), ou ocorrer por negligência, quando receptores Ag-

específicos não são estimulados. Interferir no mecanismo de apoptose, inibindo-a ou

estimulando-a, pode representar uma estratégia viral eficaz para escapar do sistema

imunológico e garantir sua sobrevivência e replicação ou facilitar disseminação do patógeno

no organismo. Por outro lado, a apoptose pode representar um mecanismo de resposta do

hospedeiro apropriado para limitar a replicação viral (Myint et al, 2006). De fato, diversos

trabalhos têm demonstrado que uma variedade de proteínas virais é capaz de interferir nas

vias apoptóticas, seja por homologia estrutural ou por mimetismo funcional com os fatores

que intervém ao nível da transdução de sinais pró ou anti-apoptóticos. Além disso,

moduladores inflamatórios induzidos pelos patógenos podem também interferir nos

mecanismos de morte celular (Barber, 2001).

A desregulação da apoptose é vista como um fator na depleção de linfócitos T CD4

em infecção por HIV na anergia associada a infecções por sarampo e zoster varicela em

infantes, e em hepatócitos em hepatites virais (Myint et al, 2006). A apoptose vem sendo

descrita em várias infecções por Flavivírus. Mais do que isso, ela vem sendo responsável por

um mecanismo citopatológico em resposta à infecção por DENV in vitro e in vivo em vários

tipos celulares (Catteau, Kalinina et al., 2003). A infecção in vitro de células neuroblásticas,

Kuppfer, endoteliais, hepatócitos e linfócitos pode induzir apoptose. Citocinas secretadas por

linfócitos T também induzem apoptose de células infectadas, sugerindo um mecanismo de

controle da viremia, embora na patogenia da FHD/SCD isso não esteja totalmente esclarecido.

Lamonta e colaboradores (Limonta, Capo et al., 2007) demonstraram ocorrer apoptose em

diferentes tecidos de casos fatais de FHD/SCD. Estudos testando uma cepa neurovirulenta

mutante do vírus DENV-1 (FGA/89) mostraram a capacidade desta em induzir apoptose em

neurônios corticais e em regiões do hipocampo de camundongo neonato. Também foi

observada apoptose em linhagens de células neuronais de murinos e humanos, indiando que a

replicação do DENV induz apoptose sugerindo um fenômeno similar na FHD/SCD (Despres

et al.,1998; Courageot et al., 2003). Matsuda e colaboradores mostraram que a apoptose

induzida por DENV-2 em linhagens de células humanas de hepatoma (HepG2) foi dependente

de Apo2L/TRAIL, sugerindo que a infecção possa causar um ambiente de citocinas no tecido

hepático e contribuir para a indução da apoptose em células não infectadas (Matsuda,

Almasan et al., 2005).

A produção intracelular de proteínas virais é considerada essencial para a indução de

apoptose pelo DENV. As proteínas M e NS3 vêm mostrando possuir atividade pro-apoptótica

(Courageot, Catteau et al., 2003). Além disso, alguns estudos demonstram a apoptose

mediada por mecanismos imunes em células endoteliais que poderiam estar relacionados com

o extravasamento de plasma na FHD/SCD (Lin, Lei et al., 2002; Cardier, Marino et al.,

2005); (Lin, Lei et al., 2002; Courageot, Catteau et al., 2003). Anticorpos específicos para a

NS1 em células endoteliais infectadas resultam na ativação celular e conseqüente inflamação

por um mecanismo de mimetismo molecular. Adicionalmente, o papel de proteínas virais do

Dengue na indução da apoptose em células–alvo vem sendo sugerido por Catteau e

colaboradores (Catteau, Roue et al., 2003). Tal estudo mostrou propriedades pró-apoptóticas

de resíduos de aminoácidos da proteína M viral (ApoptoM), provocando disfunção

mitocondrial e ativação de caspase em linhagens de células epiteliais HeLa infectadas com

DENV-2. A apoptose mediada por Fas/FasL é uma importante via para ativação da morte

celular dependente de Ag. A via do Fas/FasL também é induzida em infecções por DENV,

com o envolvimento de clones de linfócitos T específicos para a NS3. Durante a infecção

aguda, a maioria das células T específicas para NS3 do DENV expressam o receptor Fas e

têm baixos níveis de Bcl-2. O grande percentual de células apoptóticas sugere que exista uma

alta taxa proliferativa balanceada por apoptose em massa de linfócitos T durante a fase aguda

da Dengue (Mongkolsapaya, Dejnirattisai et al., 2003). Myint e colaboradores mostraram

níveis elevados de CD95 solúvel (CD95s) em sujeitos com FHD, comparados com aqueles

com FD, refletindo o elevado grau de ativação dessas células e subseqüente apoptose mediada

por Fas nos indivíduos graves ((Myint, Endy et al., 2006). Além desses, outro trabalho vem

demonstrando o papel da proteína C na apoptose de hepatócitos infectados por DENV. Nesse

estudo, os autores demonstraram que a proteína do vírus interage com a proteína Daxx,

associada ao domínio de morte do receptor Fas. A estimulação do receptor Fas causa a

translocação da Daxx do núcleo para o citoplasma, onde interage com um fator que promove

a ativação da JNK (Limjindaporn, Netsawang et al., 2007).

Tem sido considerado que a ação do NO em células-alvo infectadas pelo vírus pode

envolver mecanismos apoptóticos Lin e colaboradores mostraram que Acs de camundongos

anti-NS1 do DENV induzem apoptose de células endoteliais, via expressão de iNOS e

produção de NO (Lin, Lei et al., 2002). Os possíveis mecanismos envolvidos na produção de

NO estariam também relacionados ao aumento da regulação de p53 e da proteína pró-

apoptótica Bax e uma baixa regulação de Bcl-2 e Bcl-xl. O aumento na regulação de proteínas

pró-apoptóticas levaria à ativação da via das caspases, culminando na apoptose dessas células

e a disfunção endotelial.

Os mecanismos intrínsecos que modulam apoptose em infecções virais vêm sendo

extensamente estudados. Alguns trabalhos mostram o papel de MAPKs na indução ou

inibição da apoptose em células infectadas por diferentes sorotipos do DENV. Liao e

colaboradores demonstraram que o salicilato, uma droga anti-inflamatória, não apenas inibe a

replicação do DENV-2 em cultivo celular, mas também previne a apoptose dessas células em

parte, por inibir a ativação da MAPK p38 (Liao, Lin et al., 2001). Também foi observado que

o DENV-2 pode desencadear apoptose neuronal através da ativação da fosfolipase (PLA2),

geração de anion superóxido, liberação de citocromo c, ativação da caspase 3 e ativação de

NF-κB (Jan, Chen et al., 2000). Espina e colaboradores mostraram que, não só uma efetiva

atividade fagocítica de partículas virais de DENV-2, mas que essas células infectadas também

sofrem apoptose e, interessantemente, a presença do vírus é crucial para desencadear esse

processo. Além disso, há um aumento na expressão de TNF-α, um indutor da apoptose em

diferentes tipos celulares (Jaeschke, Farhood et al., 2000; Niwa, Hara et al., 2000; Liao, Lin et

al., 2001; Espina, Valero et al., 2003)

Embora ainda não esteja esclarecido como o efeito da infecção pelo DENV modula

esse processo, os resultados citados acima sugerem a importância do conhecimento das vias

de sinalização desencadeadas por células infectadas por DENV que, eventualmente lideram

com a apoptose. Dessa forma, contribuição desses estudos leva a uma melhor compreensão

dos mecanismos envolvidos na patogenia da doença. O DENV pode induzir apoptose de

forma a disseminar a progênie viral a células vizinhas através da fagocitose de corpos

apoptóticos, num processo mimetizando a resposta imune ou, inibir a morte celular e garantir

sua sobrevivência e replicação. Uma vez que monócitos/macrófagos representam um dos

principais alvos da infecção por DENV e têm um papel essencial na gravidade da doença,

seria de extrema relevância conhecer os processos que modulam os efeitos da interação entre

o vírus e essas células, enfatizando as vias de sinalização envolvidas nos mecanismos de

morte celular.

2. OBJETIVO

2.1 Objetivo Geral

Estudar a interação vírus-célula hospedeira utilizando como modelo a infecção in vitro

de monócitos humanos primários com vírus DENV-2, com ênfase especial nos mecanismos

de ativaçãoc e apoptose.

2.2 Objetivos específicos

1. Determinar as taxas de infecção por citometria de fluxo e a presença do antígeno por

microscopia confocal em monócitos humanos infectados com DENV-2;

2. Avaliar a expressão de moléculas de ativação (CD16) em monócitos humanos

infectados com DENV-2;

3. Detectar por citometria a taxa de apoptose e algumas vias relacionadas em monócitos

infectados, utilizando diversos marcadores;

• Apoptose precoce: Exposição de fosfatidilserina (Anexina-V

)

• Detecção de receptor de morte Fas

• Detecção de proteína anti-apoptótica Bcl-2

4. Determinar a ativação da apoptose pela via mitocondrial de apoptose em monócitos

infectados, medindo-se o ∆ψm por FACS e microscopia confocal.

3. METODOLOGIA

3.1 Cepa viral

A cepa DENV-2 padrão internacional de origem asiática (16681), fornecida pelo Dr.

Scott Halstead do Instituto Militar de Pesquisa Walter Reed, Maryland/EUA, foi utilizada nos

ensaios de infecção. O lote 13, passagem 2 em células LLC MK2 (célula epitelial de rim de

macaco Rhesus), foi crescido em células do clone C6/36 originadas de glândula salivar de

mosquito A. albopictus. O vírus foi inicialmente ativado em tubos de ensaios contendo

monocamada de células C6/36. A cultura foi mantida a 28

C, com observação diária de 7 a 10

dias para verificação do efeito citopático (CPE). Quando observado mais de 50% de CPE na

cultura, o sobrenadante foi recolhido, aliquotado e, posteriormente, congelado a -70 ºC. A

presença do vírus nas células foi detectada por imunofluorescência indireta.

3.2 Cultivo de células C6/36 e produção de massa viral

Células C6/36 de mosquito A. albopictus foram cultivadas em garrafas de 150 cm²

com 50 mL de meio Leibovitz (L-15) suplementado com 2 mL de bicarbonato de sódio (7,5%

p/v); L-glutamina 1%; fungizona 0,4%; penicilina-estreptomicina 1%; aminoácidos não-

essenciais 0,5%; triptose fosfato 10%; e SFB 10%. As culturas foram incubadas em estufa a

28°C até a formação da monocamada completa. Em seguida, foram utilizadas para produção

de massa e titulação viral. O isolamento e produção do estoque viral foi realizado em garrafas

de cultura celular de 150 cm

, utilizando clones de células C6/36 com 5 mL de meio L-15

suplementado sem SFB. Foram adicionados 3 mL de inóculo do vírus diluído 1/10 em meio

L-15. Após 90 min de adsorção em estufa 28°C, o inóculo viral foi retirado e o sobrenadante

centrifugado e aliquotado. À cultura foi adicionado 50 mL de meio L-15 suplementado com

2% de SFB, 40 µL de BM-Cyclin 1 e 20 µL de BM-Cyclin 2 (ação anti-micoplasma). As

garrafas foram mantidas a 28ºC por um período de 5 a 10 dias, com observação diária para

verificação da presença de efeito citopático (CPE). Quando observado mais de 50% de CPE

na cultura, o sobrenadante foi recolhido, centrifugado a 1200 RPM por 10 min (Beckman GS-

15R), aliquotado e armazenado a -70°C para posterior titulação. A presença do vírus nas

células foi detectada por imunofluorescência indireta por observação em microscópio de

fluorescência utilizando filtro para fluoresceína (FITC). A massa viral de DENV-2 (16681)

utilizada nos experimentos com monócitos foi obtida na sexta passagem celular em células

C6/36 e recuperada no nono dia após infecção.

3.3 Titulação e diluição do estoque viral

Para a titulação viral do DENV-2, foram utilizadas microplacas de 96 poços contendo

camada confluente de células C6/36. A cultura foi mantida por um período de 7 a 10 dias em

estufa a 28ºC, com observação diária para verificação da presença de efeito CPE. Quando

observado mais de 50% de CPE na cultura, parte do sobrenadante foi descartado e a cultura

celular, com cada diluição do vírus, ressuspendida e depositada em lâminas fixadas com

acetona por 5 min. Estas foram marcadas com anticorpo primário anti-dengue 1/100 e

secundário anti-IgG de camundongo marcado com FITC 1/50. A leitura das lâminas foi feita

em microscópio óptico de fluorescência. Para o cálculo do título viral, foi utilizada a fórmula

de Reed e Munch (1938) e, segundo os cálculos, o titulo viral foi de 1,37x10

-8

TCID

/ mL.

TCID

(do inglês 50% tissue culture infectious dose).

Diluição # poços

positivos

# poços

negativos

Total positivo Total negativo Razão %

-1

-2

-3

-4

-5

-6

-7

-8

-9

-10

-11

Fórmula de Reed & Müench:

(nº % imediatamente acima de 50%) – (% abaixo 50%)____________ = 50 – (% imediatamente abaixo 50%)

dose imediatamente acima de 50% – dose imediatamente abaixo 50% X – dose imediatamente abaixo 50%

A diluição do estoque viral de 1/5 mostrou-se adequada para a infecção de culturas de

monócitos humanos, pois, obteve infecção de pelo menos 50% dos monócitos humanos

durante os ensaios (TCID

50).

3.4 Obtenção de leucócitos mononucleares do sangue periférico

As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram obtidas de doadores

saudáveis do Banco de sangue – HEMOCENTRO – no Hospital Universitário Clementino

Fraga, UFRJ. As bolsas de fase leucocitária “Buffy coat” continham, em média, 50 mL de

volume celular e foram doadas após confirmação de testes sorológicos negativos para VDRL

(Sífilis) e Chagas (hemaglutinação/ELISA), Hepatites – HbsAg , anti-HCV, anti-HIV 1 e 2 e

anti-HTLV-1 e 2 (ELISA). A liberação para o uso das bolsas foi obtida mediante confirmação

de sorologia negativa.

3.5 Isolamento e cultura de monócitos do sangue periférico

Os PBMCs, obtidos a partir de bolsas de Fase Leucocitária Buff Coat, foram diluídos

1:2 em meio RPMI 1640 suplementado com 1% de L-glutamina (5 mL), 1% de antibiótico

penicilina-estreptomicina (5 mL) e 20 mM de HEPES, totalizando um volume final de 100

mL. O volume de 1/4 do sangue diluído (aproximadamente 25 mL) foi cuidadosamente

adicionado sobre 15 mL de Ficoll-Paque em tubo do tipo Falcon estéril de 50 mL. Em

seguida, o gradiente foi centrifugado a 1500 rpm durante 30 min. à temperatura ambiente.

Após centrifugação, o anel de leucócitos, que se forma na interface entre o meio RPMI 1640 e

o Ficoll, foi recuperado e submetido a três lavagens, adicionando 20 mL de meio RPMI com

posterior centrifugação a 1500 rpm por 10 min a 20

C. Após as lavagens os leucócitos totais

foram ressuspendidos 1/10 em meio RPMI sem SFB e, em seguida, acondicionados em

garrafas plásticas de cultura de 150 cm

e incubados em estufa a 37

C / 5% CO

por 90 min.

Após esse período, o sobrenadante foi descartado e foram realizadas mais duas lavagens

consecutivas com meio a 8 ºC para a retirada de células não-aderentes. A população aderente,

rica em monócitos, foi recuperada com o auxílio de um raspador e meio RPMI 1640 contendo

10% de SFB, centrifugadas a 1500 rpm por 10 min. Uma alíquota de suspensão celular foi

diluída (1:10) em Azul de Tripan (0,2%) para verificar a viabilidade e concentração celular

após a aderência. A concentração celular foi ajustada para 2,5 x 10

céls/poço (câmaras

Labtech em lâminas) e para 1 x10

células por poço (em placas de 24 poços). A suspensão

celular, 1 mL por poço, foi distribuída em placas de 24 poços, e em seguida incubada numa

estufa com 5% de CO

à 37 ºC por 24 horas. Para lâminas Labtech, à suspensão celular foi

adicionado 300 uL por poço.

3.6 Infecção dos monócitos com DENV-2

Após 24 horas de infecção em culturas ricas em monócitos, o sobrenadante das placas

foi retirado e adicionado 300 µL do DENV-2 em placa de 24 e 50 µL em lâminas Labtech,

diluído em meio RPMI sem SFB. As placas foram incubadas a 37

C / 5% CO

por duas

horas. Após adsorção, o inóculo foi descartado e os poços completo com meio RPMI

completo com 2% SFB (1 mL / poço da placa de 24 e 300 µL/poço de Labtech), deixando-se

incubar por períodos que variaram de 0 e 120 horas. Após cada tempo, as células foram

recuperadas e utilizadas para os diferentes ensaios. Para o controle negativo, foram utilizados

vírus inativado por calor, mantendo-se por 30 min em “Banho Maria” a uma temperatura de

56 °C. Para controle positivo da apoptose foi utilizada Brefeldina A (BRF A) nas

concentrações de 0,5/1/10 µg/mL, obtidos a partir de uma alíquota estoque na concentração

de 5 mg/mL.

3.7 Cinética de infecção

Para o estabelecimento do melhor dia de infecção com DENV-2, as células infectadas

foram incubadas por um período de 5 dias. Diariamente as células foram recuperadas por

raspagem e foi realizada a marcação intracelular do antígeno viral, avaliando-se

quantitativamente por citometria de fluxo (FACS) (FACSCalibur BD/FIOCRUZ - Pavilhão

Carlos Chagas). A análise dos resultados foi feita pelo programa FlowJo (FreeStar Co.)ou

Summit (Dako).

3.8 Imunofluorescência em cultura de monócitos infectados com DENV-2

Para a avaliação qualitativa da morfologia dos monócitos foi utilizada a microscopia

confocal de fluorescência (UFRJ - Instituto de Bioquímica Médica / FIOCRUZ – Pavilhão

Gomes de Faria). Os fluróforos utilizados foram: Alexa flúor 488 (Excitação: 488

nm/Emissão: 519 nm – Fluorescência verde); DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole)

(Excitação: 358 nm/ Emissão: 461 nm – Fluorescência azul); DIOC

(excitação: 488

nm/Emissão: 540 nm – Fluorescência verde) e Hoescht 33342 (Emissão: 346 nm/ Emissão:

460 nm – Fluorescência azul). Para a visualização nuclear utilizou-se DAPI

e Hoescht 33342.

O DAPI é um fluorocromo permeável a membrana plasmática, altamente específico e sensível

para marcar DNA de dupla fita. Semelhante, o Hoechst 33342 é permeável a célula, ligando-

se ao DNA celular, inserindo-se preferencialmente entre os pares de bases A-T.

3.8.1 Detecção do vírus em monócitos infectados

Para análise da imunofluorescência, a cultura de monócitos foi feita no sistema de

cultivo em câmaras sobre lâminas (Labtech). As células foram diretamente fixadas em 100 µL

de paraformaldeído 2% contendo Triton 0,2%. Em seguida, foi adicionado 100 µL de PBS-

BSA contendo 0,15% saponina e as lâminas foram incubadas por 10 min. Após, adicionou-se

100 µL de solução de bloqueio (PBS 1x pH 7.4, BSA 1%, azida 0,1% e 2,5% de plasma

humano inativado), incubando-se por 30 min/4ºC. Foi adicionado 20 µL de anticorpo

primário anti-Dengue diluído 1/100 em PBS-BSA contendo 0,15% saponina, incubando por

60 min/4ºC. Em seguida, adicionou-se o anticorpo secundário anti-mouse IgG-Alexa 488®,

diluído 1/400 em PBS-BSA contendo 0,15% saponina, por 30 min/4ºC. Ao término dessa

etapa, as lâminas foram lavadas por duas vezes, incubando-se por 5 min em PBS-BSA e, ao

final, retirando-se o sobrenadante. Adicionou-se 50 µL de DAPI, (1,2 µL de DAPI para 1 ml

de tampão). As células foram encubadas com esse corante por 5 min. a temperatura ambiente.

Em seguida, o corante foi retirado e as lâminas lavadas com água destilada. Elas foram,

posteriormente, desmontadas, rinsadas em água destilada e deixadas secando à temperatura

ambiente. As lâminas foram montadas em glicerol (Merck-EUA) e lamínula, seladas com

esmalte e observadas por microscopia confocal.

3.8.2 Detecção de alteração no ∆ψm em monócitos infectados

Para análise da imunofluorescência, a cultura de monócitos foi feita no sistema de

cultivo em câmaras sobre lâminas (Labtech). Após 48 horas de infecção, retirou-se o

sobrenadante da cultura. As células foram lavadas com PBS 1x duas vezes seguindo

incubação por 5 min à temperatura ambiente. Após retirar o sobrenadante, foram adicionados

40 µL do marcador nuclear Hoescht 33342 em uma concentração de 10 µg/mL por 30 min. As

lâminas foram, então, lavadas com PBS 1x e foi retirado o sobranadante. Em seguida, foram

adicionados 40 µL do marcador fluorescente de ∆ψm, 3,38-dihexiloxadicarbocyanine

(DIOC

) a 20 nM. Para a marcação nuclear foi utilizado fluorocromo Hoechst 33342. As

lâminas foram encubadas no escuro a temperatura ambiente por 25 min. Após o período de

incubação, elas foram lavadas com PBS 1x duas vezes com período de incubação de 5 min.

Após retirar o sobrenadante, as lâminas foram desmontadas, mantidas úmidas e montadas em

lamínula, selando com esmalte e observadas por microscopia confocal.

3.9 Análise por Citometria de Fluxo

A técnica FACS foi utilizada para se avaliar quantitativamente os diferentes dados

obtidos nessa dissertação, de forma rápida e precisa. O modelo usado foi o FACSCalibur BD.

Nesse estudo, os Acs com fluorocromo utilizados para a marcação extra e/ou intracelular

foram selecionados de forma as fluorescências emitidas fossem detectadas pelo mesmo

aparelho. Os flurocromos utilizados nessa dissertação foram: Alexa Flúor 488 (Excitação: 488

nm/Emissão: 519 nm – Fluorescência verde) lido no FL-1; FITC (Excitação: 490-495

nm/Emissão: 520 nm – Fluorescência verde) lido no FL-1; R-PE (Excitação: 480-565

nm/Emissão: 578 nm – Fluorescência laranja) lido no FL-2; PE-Cy5 (Excitação: 480-565-650

nm/Emissão: 670 nm – Fluorescência vermelha) lido no FL-3; APC, Alexa Flúor 647

(Excitação: 650 nm/Emissão: 660 nm – Fluorescência amarela) lido no FL-4.

3.9.1 Marcação extracelular

3.9.1.1 Detecção de marcadores de superfície característicos dos monócitos

Após recuperar as células infectadas por raspagem em temperatura fria e transferi-las

para tubos do tipo eppendorf, elas foram centrifugadas a 1200 RPM por 7 min (Beckman GS-

15R), lavadas em solução de lavagem e novamente centrifugadas, desprezando, ao final, o

sobrenadante. Após, as células foram bloqueadas com 50 µL de solução de bloqueio por 30

min/4ºC para impedir marcações inespecíficas via receptores Fc. As células foram, em

seguida, lavadas com solução de lavagem e centrifugadas a 1200 RPM por 7 min. Após

desprezar o sobrenadante, o pellet foi ressuspendido em 20µL de anticorpos específicos

diluídos em solução de lavagem. Todos foram incubados por 30 min a 4ºC. Seguindo outra

lavagem, as células foram ressuspensas em 300 µL de paraformaldeído 2% e transferidas para

tubos de citometria. A análise dos resultados foi feita pelo programa FlowJo ou Summit.

3.9.1.2 Marcação para o receptor de morte FAS (CD95)

O procedimento para obtenção de células, lavagem e marcação foi semelhante ao item

3.9.1.1. Foi feita marcação extracelular direta com o anticorpo de camundongo anti-CD95

FITC humano diluído 1/4 e seu respectivo isotipo IgG1-FITC diluído também 1/4. A análise

dos resultados foi feita pelo programa FlowJo e Summit.

3.9.2 Marcação intracelular

3.9.2.1 Detecção de antígenos DENV-2 em monócitos infectados

Após dois dias de cultivo nas diferentes condições experimentais (controle, inoculação

com vírus inativado e vírus infeccioso), as células foram recuperadas por raspagem,

transferidas para tubos do tipo eppendorf e centrifugadas a 1200 RPM por 7 min. Em seguida,

o sobrenadante foi descartado e a suspensão lavada 2x com PBS-BSA e centrifugada a 1200

RPM por 7 min. Após a lavagem e desprezado o sobrenadante, as células foram fixadas com

paraformaldeído 2%, incubando-se por 20 min/4 ºC. Foi adicionado igual volume de

saponina, uma solução permeabilizante, às células que foram homogeneizadas e lavadas.

sobrenadante foi descartado e adicionado solução de permeabilização, seguida incubação de

10 min a 4

C. As células foram lavadas. Para impedir ligações inespecíficas, foi adicionada

solução de bloqueio, seguindo incubação por 30 min a 4

C. Após centrifugação e desprezo do

sobrenadante, as células foram ressuspendidas em 20 µL de anticorpo primário monoclonal

anti-DENV-2 diluído 1/100 em PBS-BSA e incubadas por 60 min/4ºC. O anticorpo

secundário de camundongo anti-IgG Alexa 488® diluído 1/400 foi adicionado após esse

período e incubado por 30 min a 4 °C. As células foram lavadas e fixadas com

paraformaldeído 2% em volume de 300 µL e transferidas para os tubos de citometria para

posterior aquisição no FACScalibur. A análise dos resultados foi feita pelo programa FlowJo

e Summit.

3.9.2.2 Detecção de apoptose em monócitos infectados utilizando Anexina-V/PI

Os monócitos infectados e não-infectados (controle e inativado), bem como aqueles

tratados com BRF A (controle positivo para apoptose) foram recuperados após raspagem em

temperatura fria, transferidos para os tubos do tipo eppendorf e lavados duas vezes com PBS1

x seguindo centrifugação com 1200 RPM por 7 min. Em seguida, foram descartados os

sobrenadantes e as células foram ressuspensas em 100 uL (para 10

células/mL) de solução

tampão de ligação. Foram adicionados 5 µL de Anexina-V (conjugada a Alexa Flúor 488) e 5

µL de Iodeto de Propídio (PI), a cada 100 µL de suspensão celular. As células foram, então,

incubadas por 15 min a 4ºC, protegidas da luz. Após o período de incubação, adicionou-se

400 µL de Binding Buffer1x (Apoptosis detection Kit I # 556547 – BD Pharmingen

homogeneizando as amostras. A leitura no citômetro FACScalibur foi feita 30min depois. A

análise dos resultados foi feita pelo programa FlowJo e Summit.

3.9.2.3 Detecção da molécula anti-apoptótica Bcl-2 em monócitos infectados

Após o procedimento inicial de recuperação, lavagem, fixação e bloqueio conforme o

item 3.10.1, as células foram ressuspensas em 20 µL do anticorpo de camundongo anti-

humano BCL-2 PE e seu respectivo isotipo IgG2a-PE, ambos diluídos 1/50, de acordo com as

instruções do fabricante. Ao final da etapa de incubação e seguindo os procedimentos de

lavagem, as células foram novamente fixadas em paraformaldeído 2% e transferidas para

tubos de citometria para posterior aquisição em FACScalibur. A análise dos resultados foi

feita pelo programa FlowJo e Summit.

3.9.2.4 Avaliação de ∆ψm em monócitos infectados

O procedimento de obtenção e lavagem dos monócitos cultivados por 48 horas foi

feito de acordo com o item 3.9.2. Para o ensaio de marcação, foi utilizado DIOC

concentração estoque de 2 µM (diluído em DMSO). As células foram ressuspensas em 1 µL

de reagente diluído 10.000 vezes (concentração final de 20 nM) e incubadas por 15 min a 4ºC,

protegidas da luz. Após o período de incubação, adicionou-se 300 uL de solução Binding

Buffer 1x (Apoptosis detection Kit I # 556547 – BD Pharmingen

), homogeneizando as

amostras e mantendo-as em temperatura fria. A leitura no citômetro FACScalibur foi feita

imediatamente. A análise dos resultados foi feita pelo programa FlowJo e Summit.

3.10 Estatística

Todos os resultados obtidos foram analisados no programa Prism 4 (GraphPad

Software, San Diego, CA, USA). A partir do teste KS de normalidade foram empregados os

testes estatísticos descritos a seguir. O teste one way-Anova foi utlizado para comparar mais

de duas variáveis. Ele foi aplicado para se determinar a significância de todos os aspectos

abordados durante a infecção in vitro. O teste Tukey's Multiple Comparison foi utilizado para

comparar significância das variáveis entre si. Valores de p<0,05 foram considerados

significativos.

3.11 Soluções

PBS (Tampão fosfato) pH 7.4 (10x)

Cloreto de sódio......................................................... 80 g

Cloreto de potássio..................................................... 2 g

Fosfato dibásico de sódio........................................... 28,98 g

Fosfato monobásico de potássio................................ 2 g

Água destilada q.s.p. ................................................. 1000 mL

Bicarbonato de sódio

Bicarbonato de Sódio ............................................... 7,5 g

Água destilada q.s.p. ................................................ 100 mL

Solução de azul de trypan 2%

Azul de trypan .......................................................... 2 g

PBS q.s.p. ................................................................. 100 mL

Soluções para Citometria de Fluxo

Solução de Lavagem I – BSA 1% Azida 0,1% PBS 1x

Azida Sódica........................................................... 0,1 g

BSA ........................................................................ 1 g

PBS q.s.p. ............................................................... 100 mL

Solução de bloqueio I – BSA 1% Azida 0,1% Plasma autólogo 5% PBS 1x

Azida sódica............................................................. 0,1 g

BSA ......................................................................... 1 g

Plasma autólogo ...................................................... 5 mL

PBS q.s.p. ................................................................ 100 mL

O plasma autólogo deve ser inativado a 56°C por 30 min.

Solução de permeabilização – BSA 1% Azida 0,1% Saponina 0,15% PBS 1x

Azida sódica ........................................................... 0,1 g

BSA ........................................................................ 1 g

Saponina ................................................................. 0,15 g

PBS q.s.p. ............................................................... 100 mL

Solução de fixação – Paraformaldeído 2% PBS 1x

Paraformaldeído ..................................................... 2 g

PBS q.s.p. ............................................................... 100 mL

3.12 – Meios de Cultura e Reagentes

Meio L15 (Leibovitz) #41300-070 – Gibco

Meio RPMI 1640 #11876-093 – Gibco

Albumina Bovina (BSA) #A-8022 – Sigma

Aminoácidos não essenciais #11140-050 – Gibco

Annexin V-FITC Apoptosis detection Kit I # 556547 – BD Pharmingen

Azul de Trypan – Sigma

Bicarbonato de Sódio P.A. #302 – ISOFAR

Brefeldina A # B7651 - Sigma

DAPI # D1306 – Molecular Probes

3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide DIOC

(3) # D273 – Molecular Probes

Ficoll-Paque™ Plus #17-1440-03 – Amersham Biosciences AB

Glicerol – Merck-EUA

HEPES #15630-080 – Gibco

Hoechst 33342 - Molecular Probes Inc.

L-Glutamina #21051-024 – GibcoBRL

Paraformaldeído #P6148-500G – Sigma

Penicilina-Estreptomicina #15140-122 – Gibco

Saponina #S-7900 – Sigma

Soro Fetal Bovino #10270-106 – Gibco

Triptose Fosfato #T8782 – Sigma

Triton X-100 # 036k00851 - Sigma

Tween 20™ (Polyoxythylene Sorbitan Monolaurate) #P-1379 – Sigma

3.13– Anticorpos

Anticorpo anti-Dengue complexo feito em camundongo (1/100) # MAB8705–Chemicon

International;

Alexa Flúor 647 # A-20186 – Molecular Probes;

Anticorpo anti-humano CD14-RPE feito em camundongo (1/50) # NHCD1404 – Caltag;

Anticorpo anti-humano CD14–PE / Cyc5.5 feito em camundongo (1/50) # 9561-16 –

Southern Biotech;

Anticorpo anti-humano CD16–FITC feito em camundongo(1/50) # F701 – Dako Cytomation;

Anticorpo anti-humano CD16-PE feito em camundongo (1/50) # PNIM1238 – IOTest;

Anticorpo anti-humano CD95-FITC feito em camundongo (1/4) # 9730-02 – Southern

Bioteck;

Anticorpo anti-humano Bcl-2-RPE feito em camundongo (1/50) - Caltag;

Anticorpo anti-humano phosphoERK1/2-Alexa647 feito em camundongo (1/5) # 612593 –

BD Pharmingen;

Anticorpo anti-humano phosphop38MAPK-Alexa488 feito em camundongo (1/5) # 612594–

BD Pharmingem;

Anticorpo anti-IgG de camundongo (F(ab’)

) – RPE (1/50) # R0480 – Dako Cytomation;

Anticorpo IgG1–RPE feito em camundongo (1/50) # NG104 – Caltag;

Anticorpo IgG1–PE/Cyc5.5 feito em camundongo (1/50) # 012012-16 – Southern Biotech;

Anticorpo IgG1–FITC feito em camundongo (1/50) # X0927 – Dako Cytomation;

Anticorpo IgG1–PE feito em camundongo (1/50) # PNIM0670 – IOTest;

Anticorpo IgG1–FITC feito em camundongo (1/4) # X0927 – Dako Cytomation;

Anticorpo IgG2a–RPE feito em camundongo (1/50) # NG2a04 – Caltag;

Anticorpo IgG1-Alexa 647 feito em camundongo (1/5) # 5577823 - BD Pharmingem;

Anticorpo IgG1-Alexa 488 feito em camundongo (1/5) # 557782 - BD Pharmingem;

Anticorpo monoclonal Ig-Alexa488 feito em galinha (1/400)#A-21200-Molecular Probes.

4. RESULTADOS

4.1 Infecção in vitro de monócitos periféricos humanos por DENV-2

4.1.1 Identificação da população de monócitos utilizando características

morfológicas e fenotípicas:

Com o intuito de selecionar quantitativamente os monócitos humanos sob diferentes

condições fenotípicas, com ênfase nos mecanismos abordados nessa dissertação, foi utlizada a

técnica de citometria de fluxo (FACS). Essa técnica mostrou-se eficaz e sensível. Ela

proporciona a capacidade de gerar, em uma única operação, o maior número de dados

diferentes com rapidez e precisão a partir de uma única amostra. Os monócitos humanos

foram obtidos a partir de aderência de PBMCs do sangue periférico de doadores saudáveis,

como descrito previamente na seção de Metodologia. A citometria permitiu avaliar os ensaios

para determinação quantitativa de monócitos infectados por DENV e seus controles, sob

diversos parâmetros incluindo fatores morfológicos, fenotípicos e funcionais, em diferentes

cinéticas de infecção.

Antes de dar continuidade a avaliação de todos os ensaios que necessitavam da

utilização da técnica de citometria, foi padronizada uma região celular específica,

individualizando-a, para a melhor análise da subpopulação em questão: os monócitos.

A região celular de monócitos foi criada, traçada em circulo, inicialmente, em um

gráfico de dot plot, que mostra a população total celular contida na amostra analisada na

forma de eventos (Figura 4.1A). A subpopulação foi separada de acordo com suas

características morfológicas, utilizando os parâmetros de tamanho (FSC, do inglês Forward

Scatter) e CD14 (SSC, do inglês Side Scatter). Na Figura 4.1 B, a análise por FACS das

células aderentes recuperadas por raspagem demonstra que cerca de 58,14% da população são

monócitos, de acordo com sua morfologia.

A região R2, ilustrada na Figura 4.1 B, caracterizada pela região morfológica (FSC x

SSC) de monócitos, pode ser confirmada utilizando uma análise fenotípica da mesma

amostra, ou de outras, provenientes do mesmo doador, quando marcada com um Ac

específico para uma molécula que seja característica da subpopulação em questão. Os

monócitos ex vivo (células aderentes), no 1

◦

, 2

◦

, 3

◦

, 4

◦

, ou 5

◦

dia de cultura, foram

caracterizados através da imunofenotipagem utilizando Ac monoclonal para receptor de

superfície celular específico, o CD14. Portanto, a seleção da região positiva para CD14 é

estabelecida e caracterizada por uma cor, através de ferramentas fornecidas pelo programa de

software Summit. Podemos, então, sobrepor à região fenotípica selecionada no gráfico de dot

plot (FSC x CD14), representado pela Figura 1.4A, para outro gráfico com parâmetros

morfológicos (FSC x SSC), representado pela Figura 1.4B. Essa ferramenta, chamada

retrogate, ajuda a comprovar que as duas regiões, morfológica e fenotípica, selecionam

praticamente os mesmos eventos celulares. As células CD14 positivas representaram cerca de

52,36 % do total, na região estabelecida R1 (Figura 4.1A).

É interessante ressaltar que, para cada condição experimental adotada, ou seja, culturas

tratadas com meio apenas (controle), tratadas com BRF A, com vírus inativado ou vírus

infeccioso, a morfologia das células pareceu variar, tanto de forma sutil quanto drástica. Isso

se deve ao fato de que, durante os procedimentos de obtenção, tratamento e marcação para

posterior análise dos monócitos, as células sofreram diferentes condições de privação de

nutrientes ou ocorrência de estímulos, proporcionando a ativação ou morte celular.

Figura 4.1: Estabelecimento das regiões de monócitos derivados do sangue periférico humano, com ênfase

nas características morfológicas e fenotípicas. A: Dot plot (eixo x, FSC e eixo y, CD14-Cy5) da análise por

citometria de monócitos enriquecidos pela aderência de PBMCs. A R1 representa a região lógica de monócitos

marcados com Ac monoclonal CD14-Cy5. B: Dot plot (eixo x, FSC e eixo y, SSC) representativo ilustrando

região R2 estabelecida de acordo com a morfologia de monócitos humanos. A R2 em vermelho é resultado de

uma retrogate da R1. Valores representam o percentual de eventos celulares delimitados em cada região: R1-

52,36% e R2-58,14%.

4.1.2 Cinética de infecção in vitro pelo DENV-2 em monócitos humanos:

Os monócitos foram infectados por DENV-2, cepa padrão 16681, para avaliação da

capacidade replicativa do vírus medida pela taxa de detecção de Ags virais entre as células,

por diferentes cinéticas de infecção. A caracterização da infectividade foi realizada pela

determinação do percentual de células Ag

por citometria de fluxo, comparando-se vírus

inativado.

A diluição do DENV infeccioso ideal para infecção foi pré-estabelecida por estudos

feitos por Reis e colaboradores em nosso laboratório. A diluição 1/5 do DENV-2 título 1,37 x

-8

TCID

/mL, foi usada nos procedimentos de infecção. A taxa de detecção antigênica

usando a diluição 1/5 mostrou ser ideal e foi a utilizada em todos os ensaios ao longo dessa

dissertação. Foram considerados apenas aqueles doadores com taxa de infecção superior a

10%.

Os monócitos infectados foram avaliados em diferentes cinéticas, para

estabelecimento do pico máximo de detecção de células DENV2 positivas. A cinética de

infecção foi realizada por um período de 5 dias, na qual as células foram recuperadas

diariamente e submetidas ao procedimento de marcação intracelular do Ag viral com Ac anti-

Dengue complexo e Ac secundário Alexa 488. A detecção foi feita FACS utilizando filtro de

detecção do fluorocromo FL-1. Como controle de marcação em cultura de células infectadas

com DENV-2, foi utilizado o Ac isotipo IgG2a de camundongo. Como ilustrado na Figura 4.

2, durante as primeiras 14 horas do primeiro dia após infecção, já foram detectados Ags virais

permanecendo presentes em todos os dias analisados. O aumento se manteve até o segundo

dia com pico máximo de células DENV-2 positivas. No terceiro dia ocorreu uma queda

brusca que se manteve até o quinto dia (Figura 4.2).

Os monócitos cultivados 2 dias após infecção foram recuperados e marcados

extracelularmente com AC monoclonal anti-humano CD14 feito em camundongo e, em

seguida, intracelularmente com anti-DENV, para a seleção da região lógica de monócitos e

determinação de células DENV

. A Figura 4.3 ilustra os contour plots das células CD14

DENV

, do total de monócitos CD14

, nas condições controle (0%), inativado (0,52%) e

infeccioso (33,03%). A detecção do Ag nas culturas com vírus infeccioso foi estatisticamente

significativa (**P < 0,001), quando comparado às culturas com vírus inativado e meio de

cultura apenas. Interessantemente, avaliando-se monócitos humanos de 12 doadores com

DENV-2 no segundo dia após infecção, demonstra-se uma variação na taxa de infecção, entre

18,7% e 58,29%. Figura 4.4.

Figura 4.2: Cinética de infecção de monócitos humanos pelo DENV-2. Cerca de 1 x 10

células aderentes por

mL foram infectadas com DENV-2 cepa 16681. Durante os tempos de 0, 14, 24, 48, 72 e 120 horas após

infecção, as células foram recuperadas por raspagem e marcadas com Ac anti-complexo Dengue ou com seu

respectivo isotipo anti-IgG2a de camundongo. Foi utilizado Ac secundário Alexa 488, detectado no filtro FL-1.

Os monócitos foram analisados por citometria e o percentual de células infectadas está demonstrado no gráfico.

Células tratadas apenas com meio ou com vírus inativado foram usados como controles negativos da detecção

antigênica. O gráfico representa média do percentual±Desvio Padrão (DP) de monócitos obrtidos de 13 doadores

e cultivados sob condições controle, inativado e vírus infeccioso durante uma cinética de 5 dias. O eixo x

representa os intervalos de tempo (em horas) e o eixo y o percentual de células DENV-2

0 14 24 48 72 120

Inativado

Infeccioso

Controle

Tempo (horas)

% Células Ag-DENV-2+

Figura 4.3: Caracterização de monócitos humanos infectados ou não com DENV-2. Monócitos foram

tratados com meio de cultura apenas (A), vírus inativado (B) ou vírus infeccioso (C). As células foram

recuperadas e marcadas extracelularmente com Ac anti-CD14 PE e em seguida, intracelularmente com anticorpo

anti-dengue conjugado com Alexa fluor 647. O percentual de células CD14+, infectadas ou não, foi estabelecido

através da seleção de uma região, de acordo com a Figura 4.1. Os valores representados à direita do gráfico de

contour plot na porção superior do quadrante, correspondem ao percentual de monócitos CD14

DENV

relação ao total de células CD14

. O eixo y representa, em escala logarítmica, os eventos celulares marcados com

fluorescência APC (Aloficocianina), detectado no filtro FL4-H, correspondendo à marcação para DENV. O eixo

x representa, em escala logarítmica, os eventos celulares marcados com fluorescência PE (Ficoeritrina),

detectados no filtro FL2-H, correspondendo a marcação para CD14. Os dados são representativos de 1 em 4

experimentos individuais.

CD14 PE

DENV APC

Controle DENV-2 Inativado

DENV

Infeccioso

A B

2 dias

Figura 4.4: Detecção do Ag viral DENV-2 em monócitos por citometria de fluxo. Monócitos humanos

obtidos de PBMCS de doadores saudáveis foram cultivados e cerca de 1 x 10

células tradas com meio de cultura

(controle), vírus inativado ou infectadas com DENV-2. As células foram recuperadas após 2 dias e marcadas

com Ac anti-DENV para detecção de monócitos DENV-2-Ag

. Foi utilizado Ac secundário Alexa 488,

detectado no filtro FL-1. Análise foi feita por FACS. O gráfico representa a média ± DP da análise de 12

doadores. Para avaliação de significância nas taxas de células DENV-2-Ag

,sob diferentes condições de

tratamento na cultura, foi utilizado o teste “one way-Anova”, que compara mais de duas variáveis. O teste

Tukey's Multiple Comparison foi utilizado para comparar significância das variáveis entre si. **P> 0,001

controle Inativado Infeccioso

% Células Ag-DENV-2+

2 dias após infecção

4.1.3 Detecção de Ag DENV em monócitos humanos infectados por DENV-2 através de

microscopia confocal

Para análise qualitativa da presença de Ag viral DENV-2, culturas ricas em monócitos

humanos foram submetidas ao ensaio de microscopia confocal. PBMCs do sangue periférico

humano foram obtidos de acordo com o procedimento detalhado na seção de Metodologia.

Após a obtenção de população rica em monócitos, cerca de 2,5 x 10

células aderentes foram

distribuídas em câmaras de cultivo em lâminas (marca LabTech) e tratadas com meio apenas,

vírus inativado ou DENV infeccioso. Após dois dias de infecção, as amostras foram fixadas,

marcadas com Ac primário anti-DENV e Ac secundário Alexa Flúor 488, cobertas com

glicerol e visualizadas e registradas em microscopia confocal para observação do aspecto das

culturas. O DAPI, um marcador de ácido nucléico, foi utilizado como corante de núcleo,

correspondente a fluorescência azul. A marcação pelo DEN-2 foi detectada utilizando o

fluorocromo Alexa 488, correspondente a fluorescência verde. Para a vizualização de células

não-marcadas com qualquer um dos fluorocormos, foi utilizada a ferramenta de contraste

interferencial diferencial (Sciortino, Perri et al.).

Como ilustrado na Figura 4.5 B, observa-se a presença de partículas de DENV-2 no

citoplasma das células infectadas, representadas pela fluorescência verde, comparando-se com

células tratadas com vírus inativado (A) (Figura 4.5 B).

Figura 4.5: Detecção de Ag DENV em monócitos humanos após infecção in vitro com DENV-2 por

imunofluorescência através de microscopia confocal. Monócitos recuperados do sangue periférico humano

(1x10

células/mL) foram incubados por 2 dias com vírus inativado (A) ou DENV-2 16681 (B). Células foram

marcadas com Acs para Ag-DENV-2 e anti-mouse IgG-Alexa 488. A marcação nuclear foi feita utilizando

DAPI. A marcação do Ag viral é representada pela fluorescência verde e a marcação nuclear pela fluorescência

azul. A figura 4.5B1 representa um campo em maior escala de duas células marcadas com fluorescência verde,

indicando presença de Ags virais. As imagens foram realizadas utilizando o microscópio de fluorescência de

excitação por dois fótons (Two-photon excitation LSM meta 510) e a lente objetiva usada foi a Plan-

Apochromat 63x/1,4 Oil DIC M27. Os dados são representativos de 1 em 3 experimentos individuais.

10 µm 10 µm

10 µm

A1 B1

DAPI

DENV-2 Inativado

(A)

DENV-2 Infeccioso

(B)

20 µm

10 µm

4.2 Modulação na expressão de CD16 em células CD14

durante a infecção

Com o intuito de avaliar uma possível modulação na expressão da molécula CD16

(receptor Fcγ III) no modelo de infecção in vitro de monócitos humanos infectados por

DENV-2, as populações de monócitos cultivados com meio apenas, vírus inativado e vírus

infeccioso, foram recuperadas 1 e 2 dias após a infecção e identificadas de acordo com a

expressão de CD14 e CD16, utilizando Acs monoclonais específicos para cada molécula. A

quantificação das células foi feita utilizando FACS. Como demonstrado na Figura 4.6, logo

no primeiro dia após a infecção, do total de células CD14

infectadas, cerca de 14,35%

expressavam CD16, comparando-se com as células sob condições controle (3,05%) e

inativado (5,14%). Embora o ensaio tenha sido realizado com apenas células de dois

doadores, os gráficos ilustrativos de contour plot das condições controle, inativado e

infeccioso de um deles (Figura 4.6 A, B e C) bem como a análise da média ± DP dos

resultados dos dois doadores agrupada (Figura 7 A), demonstram uma tendência ao aumento

na expressão da molécula de ativação CD16 em monócitos humanos infectados com DENV-2

já no primeiro dia após infecção, correlacionando-se com as taxas de infecção já elevadas 24

horas (Figura 4.2).

Considerando que o segundo dia representou o pico de maior infectividade, pelo

elevado percentual de monócitos DENV

(Figura 4.2), foi de interesse confirmar se a

presença do vírus estaria correlacionada com o aumento na expressão de CD16. A avaliação

por FACS de células CD14

, ilustrada pelo contour plot de um de cinco doadores, mostrou

um aumento significativo (**P < 0,05) no percentual de células CD14

CD16

nas culturas

infectadas pelo DENV-2 (24,81%), em comparação aos seus respectivos controles tratados

com meio (3,53%) ou com vírus inativado (3,84%) (Figura 4.6 D, E e F). O gráfico B da

Figura 4.7 mostra os dados da média ± DP

de cinco doadores, nas diferentes condições de

tratamento. Esses resultados, em conjunto, sugerem que o vírus DENV-2 e/ou outros fatores

modulados pela infecção estariam influenciando na ativação de monócitos humanos,

confirmada pelo aumento na expressão de CD16.

Figura 4.6: Caracterização fenotípica da expressão de CD16 em monócitos infectados por DENV-2. Monócitos enriquecidos a partir do sangue periférico humano foram

plaqueados e cultivados. Cerca de 1x10

céls/mL foram incubadas com meio de cultura (controle), vírus inativado (inativado) ou infectadas com vírus DENV-2 cepa 16681

(infeccioso) e recuperadas 1 (A,B e C) e 2 (D, E e F) dias após infecção. As células foram marcadas extracelularmente com Ac anti-CD14-Cy5; anti CD16-PE ou anti CD16-FITC e

seu respectivo isotipo IgG1-PE ou IgG1-FITC, para avaliação quantitativa da expressão da molécula CD16, por FACS. Os monócitos foram selecionados em uma região morfológica

ou lógica e os gráficos contour plot estabelecidos. Os gráficos em menor escala representam os contour plots do tamanho (FSC) vs a marcação com o isotipo do CD16 (FL1-H: IgG1

FITC / FL2-H: IgG1 PE). De acordo com a posição dos quadrantes nos gráficos-isotipo foram estabelecidos os quadrantes nos gráficos contour plots maiores, que representam as

diferentes condições de tratamento nas culturas: Controle (A e D), vírus DENV-2 inativado (B e E) e vírus DENV-2 infeccioso (C e F). A porção superior à direita do quadrante, em

todos os gráficos, corresponde ao percentual de monócitos CD14+CD16+. Os dados obtidos 1 dia após infecção são representativos de um de dois experimentos independentes. Os

dados obtidos 2 dias após infecção são representativos de um de seis experimentos independentes.

Controle Inativado

Infeccioso

2 dias

CD14 Cy5

CD16 PE/CD16 FITC

1 dia

CD14 Cy5

IgG-FITC IgG-FITC IgG-FITC

IgG-PE IgG-PE IgG-PE

Figura 4.7: Efeito da infecção por DENV-2 na expressão da molécula CD16 em monócitos humanos. A

expressão de CD16 em monócitos CD14+ infectados e seus respectivos controles negativos (controle e

inativado), 1 e 2 dias após infecção, é representada nos gráficos cujos valores foram obtidos pelas médias ± DP

de dois (A) e seis (B) doadores. Para avaliação de significância nas taxas de células CD14

CD16

no segundo

dia de infecção,, foi utilizado o teste one way-Anova, que compara mais de duas variáveis. O teste Tukey's

Multiple Comparison foi utilizado para comparar significância das variáveis entre si. ** P> 0,01

Controle Inativado Infeccioso

2 dias

% células CD14 + CD16 +

Controle Inativado Infeccioso

1 dia

% células CD14 + CD16 +

A B

4.3 Alterações morfológicas e fenotípicas envolvidas na morte celular programada de

monócitos frente à infecção por DENV-2

4.3.1 Aspectos membranares envolvidos na morte de monócitos após infecção por

DENV-2

Um dos métodos mais utilizados para detecção de células mortas compreende a

citometria de fluxo, utilizando marcadores específicos. Um desses marcadores é a Anexina-V

FITC, cuja fluorescência emite comprimentos de onda absorvidos pelo FL-1 do citômetro. A

Anexina-V é usada para identificar tanto células apoptóticas como autofágicas nos primeiros

estágios do processo de morte, como também nas fases tardias que precedem a perda da

integridade de membrana, onde a célula pode estar em apoptose tardia acompanhada de

necrose ou em necrose. Portanto, os ensaios são geralmente feitos utilizando Anexina-V e um

marcador vital impermeável à membrana, os iodetos de propídio (PI), cuja fluorescência,

emitida numa faixa de comprimento de onda absorvida no filtro FL-2 do citômetro. Os dois

marcadores são utilizados em conjunto para se diferenciar as células em morte celular

programada (Anexina-V

) daquelas em apoptose tardia seguida de necrose (Anexina

)

e células necróticas (Anexina

–

A fim de demonstrar que o DENV estaria induzindo apoptose de monócitos humanos

cultivados, a detecção de fosfatidilserina na membrana citoplasmática das células cultivadas

sob diferentes condições de tratamento foi realizada pela marcação com Anexina-V-FITC

associada à incorporação de PI. Como controle positivo da reação, foi utilizado nos ensaios de

cultura o tratamento com BRF A, um metabólito fúngico muito usado em processos celulares

que envolvem tráfego intracelular. A BRF A inibe reversivelmente a translocação de

proteínas, bloqueando a via secretória do RE para o Golgi e a perda eventual do aparato

morfológico do Golgi. Quando usada em determinadas concentrações, sob um período

prolongado, ela pode induzir ativação de caspases e a fragmentação do DNA associadas com

apoptose (Shao, Shimizu et al., 1996; Guo, Tittle et al., 1998). Dessa forma, a BRF A foi

utilizada na concentração de 1 µg/mL no tratamento dos monócitos. Neste sistema, os

monócitos foram infectados com DENV-2 e a morte celular programada foi avaliada dois dias

após, concomitante com o pico máximo de infecção.

Na Figura 4.8, os contour plots representam as células de culturas controle positivo

(A), controle negativo (B), vírus inativado (C) e vírus infeccioso (D), dois dias após infecção.

Não houve diferença significante entre células infectadas e não-infectadas com relação ao

percentual de células em apoptose seguida de necrose (Anexina-V

/Figura 4.9 B) e

necróticas (PI

/Figura 4.9 C). A presença de células Anexina-V

em culturas controle e com

vírus inativado mostra que a morte celular já ocorre sem interferência do vírus, sugerindo que

fatores técnicos, como o uso de meio e a não troca deste por um período de 48 horas bem

como o procedimento de raspagem durante a obtenção de monócitos, estaria gerando algum

tipo de estresse, induzindo a morte nessas condições. Houve um aumento importante no

percentual de células infectadas Anexina-V

(55,13%) comparando com o controle (37,06%)

e inativado (37,99%). O controle positivo revela um percentual semelhante de células em

morte programada em comparação ao infeccioso (54,15%). Como podemos observar nos

gráficos das médias ± DP

de cinco doadores (Figura 4.9 A), esse aumento foi significativo

(*P < 0,05). Interessantemente, se analisarmos os resultados dos cinco doadores

separadamente, podemos distinguir um perfil bastante variável com relação ao percentual de

células Anexina-V

entre as diferentes condições de cultivo, com uma tendência ao aumento

na condição infeccioso (Tabela 4.1). Essa variabilidade sugere que fatores genéticos do

hospedeiro estariam influenciando na susceptibilidade à infecção.

Figura 4.8: Detecção de morte celular programada em monócitos humanos infectados por DENV-2. Os

monócitos humanos foram obtidos de PBMCs de doadores saudáveis. 1x10

céls/mL foram infectadas por

DENV-2 cepa 16681 e avaliadas 2 dias após a infecção, juntamente com seus respectivos controles negativos:

controle e inativado. As células foram duplamente marcadas com Anexina-V – indicador de morte programada, e

PI - indicador de necrose, com exclusão de PI para análise de células possivelmente apoptóticas. Como controle

positivo, foi utilizado a Brefeldina A (BRF A). A quantificação das células apoptóticas foi realizada por FACs,

utilizando região morfológica de monócitos. Os contour plots são representativos das diferentes condições de

tratamento: A – Controle + BRF A; B – Controle; C – Inativado e D – Infeccioso. O quadrante superior à direita

corresponde às células Anexina-V

, com seu respectivo percentual celular. Os dados são representativos de um

entre cinco experimentos.

Anexina-V-FITC

Controle

Inativado

BRF A

Infeccioso

Figura 4.9: Detecção de fosfatidilserina extracelular e perda de integridade de membrana em monócitos

infectados por DENV-2. As análises obtidas por FACs da exposição de fosfatidilserina em células

possivelmente apoptóticas, representadas pela marcação simples com Anexina-V (A); células em necrose duplo

positivas para Anexina-V e PI (B) e células mortas marcadas apenas com PI (C), e seus respectivos controles

negativos, são mostradas. A análise foi feita 2 dias após infecção sendo representada nos gráficos os valores

obtidos da média ± DP de cinco doadores. Para avaliação de significância nas taxas de células, sob diferentes

condições de tratamento na cultura (controle, inativado e infeccioso), foi utilizado o teste one way-Anova, que

compara mais de duas variáveis. O teste Tukey's Multiple Comparison foi utilizado para comparar significância

das variáveis entre si. ** P< 0,01

Brefeldina Controle Inativado Infeccioso

2 dias após infecção

% células Anexina +

Controle Inativado Infeccioso

2 dias após infecção

% células Anexina+ PI+

Controle Inativado Infeccioso

2 dias após infecção

% células PI +

A B

Tabela 4.1: Detecção de células Anexina-V

sob diferentes condições de tratamento em cultura: células tratadas

com meio de cultura (Controle), células tratadas com vírus inativado (Inativado) e células infectadas com

DENV-2 cepa 16681 (Infeccioso). Relação entre os valores percentuais obtidos da análise por citometria de

fluxo. ** P<0,01

Monócitos Anexina-V+ (%)

Doador Controle Inativado Infeccioso **

1 34 34 47

2 38 38 55

3 34 33 48

4 30 30 39

5 16 7 26

4.3.2 Detecção da expressão de receptor Fas em monócitos infectados por DENV-2

Dentre os receptores de superfície celular, o receptor Fas (CD95), um membro da

família de receptores de morte TNF, exerce um papel crucial em desencadear a sinalização

apoptótica e a maquinaria efetora. Sob estimulação com um agonista anti-Fas ou seu ligante

natural, o FasL, várias proteínas com funções distintas, como proteínas adaptadoras

citosólicas, são recrutadas para o domínio citoplasmático do Fas, ligando-se à caspase

iniciadora, Caspase 8. Subseqüentemente, a clivagem dessa caspase leva a um processo

altamente regulado, desencadeando a ativação de caspases efetoras que eventualmente

lideram com a apoptose. Já se sabe que esse mecanismo extrínsico apoptótico é sensibilizado

em algumas infecções virais (Servet-Delprat, Vidalain et al., 2000; Wang, Gregori et al.,

2004; Limjindaporn, Netsawang et al., 2007).

Com o intuito de investigar se os monócitos humanos infectados por DENV-2 in vitro

seriam sensibilizados pela apoptose mediada por Fas, as culturas de células foram infectadas e

analisadas quantitativamente por FACS 1 e 2 dias após infecção, utilizando um Ac de

camundongo específico para o receptor Fas humano. Inicialmente, analisando os resultados

obtidos de células de dois doadores, 1 dia após infecção, podemos sugerir uma modulação da

expressão de Fas, visto que há um leve aumento no percentual de células Fas+ quando as

culturas são infectadas pelo DENV-2 (21,43% - Figura 4.10 C), em comparação ao controle

(7,89% - Figura 4.10 A) e inativado (6,69% - Figura 10 B; Figura 4.11 A). Para confirmar

nossos resultados, analisamos o percentual de células infectadas Fas

dois dias após infecção.

Como esperado, há um aumento significativo no percentual de monócitos Fas

após infecção

por DENV-2 (34,60% - Figura 4.10 F) em comparação ao controle (8,82% - Figura 4.10 D)

e vírus inativado (8,07% Figura 10 E). A análise da média ± DP dos resultados de 5 doadores,

confirma os resultados significantes (Figura 4.11 B). Interessantemente, e assim como

observado nos resultados de Anexina-V, cada doador apresentou um perfil diferente de

expressão da molécula de morte, embora, em todos os casos, as células infectadas

apresentavam um percentual elevado de expressão desse receptor de morte (Tabela 4.2).

Figura 4.10: Caracterização fenotípica de monócitos humanos expressando o receptor de morte Fas durante a infecção por DENV-2. Monócitos obtidos de PBMCs foram

plaqueados e cultivados. Cerca de 1x10

céls/mL foram incubadas com meio de cultura, vírus inativado ou infectadas com vírus DENV-2 cepa 16681, e recuperadas 1 (A,B e C) e 2

(D, E e F) dias após infecção. As células foram marcadas extracelularmente com Ac anti Fas-FITC e seu respectivo isotipo IgG1 FITC, para avaliação quantitativa da expressão do

receptor Fas, por FACs. Os monócitos foram selecionados em uma região morfológica de monócitos e os gráficos dot plot estabelecidos. Os gráficos em menor escala representam os

contour plots do tamanho (FSC) x marcação com o isotipo de Fas (FL1-H: IgG1 FITC). De acordo com a posição dos quadrantes nos gráficos-isotipo foram estabelecidos os

quadrantes nos gráficos contour plots maiores, que representam as diferentes condições de tratamento nas culturas: Controle (A e D), vírus inativado (B e E) e vírus infeccioso (C e

F). A porção superior do quadrante em todos os gráficos corresponde ao percentual de monócitos Fas

. Os dados obtidos 1 dia após infecção são representativos de um de dois

experimentos independentes. Os dados obtidos 2 dias após infecção são representativos de um de quatro experimentos independentes.

Controle Inativado

Infeccioso

FSC - Tamanho

Fas-FITC

FSC FSC FSC

FSC

FSC FSC

IgG-FITC

IgG-FITC IgG-FITC

IgG-FITC

Figura 4.11: Detecção de receptor de morte Fas em monócitos humanos infectados por DENV-2. As

análises obtidas por citometria da expressão de Fas em monócitos infectados e seus respectivos controles

negativos (controle e inativado), 1 e 2 dias após infecção, são representadas nos gráficos dos valores obtidos da

média ± DP de dois (A) e seis (B) doadores. Para avaliação de significância nas taxas de células Fas

, sob

diferentes condições de tratamento na cultura, foi utilizado o teste one way-Anova, que compara mais de duas

variáveis. O teste Tukey's Multiple Comparison foi utilizado para comparar significância das variáveis entre si.

** P> 0,01

Controle Inativado Infeccioso

2 dias após infecção

% monócitos Fas+

Controle Inativado Infeccioso

1 dia após infecção

% monócitos Fas+

A B

Tabela 4.2: Detecção de células Fas

sob diferentes condições de tratamento em cultura: células tratadas com

meio de cultura (Controle), células tratadas com vírus inativado (Inativado) e células infectadas com DENV-2

cepa 16681 (Infeccioso). Valores percentuais obtidos da análise por citometria de fluxo. ** P<0,01

Monócitos Fas+ (%)

Doador Controle Inativado Infeccioso **

1 3 6 39

2 5 4 16

3 13 12 32

4 7 8 35

5 15 15 61

6 0 0 25

4.3.3 Expressão diferencial da oncoproteína Bcl-2 em monócitos humanos

infectados por DENV-2

Em mamíferos, o proto-oncogene Bcl-2 funciona como um importante repressor da

morte celular programada em vários tipos celulares. O gene codifica para uma oncoproteína

localizada na membrana de mitocôndrias, RE e membranas perinucleares, estando envolvida

no processo de controle da morte celular programada. Dado ao fato de que monócitos

humanos infectados in vitro por DENV-2 estariam mais susceptíveis à morte e o papel da

proteína Bcl-2 na inibição da apoptose, nós avaliamos este controle protéico na sobrevivência

de monócitos infectados via proteína Bcl-2.

Utilizando o ensaio de marcação intracelular com Ac de camundongo anti Bcl-2-PE

humano e posterior análise quantitativa por FACS, foi determinado o percentual de células

CD14

Bcl-2

em uma cinética de 0 a 120 horas, após a infecção com o vírus infeccioso, em

comparação ao controle e vírus inativado. O intuito desse ensaio foi estimar se a expressão da

proteína Bcl-2 estaria sendo modulada pela infecção viral. Como controle positivo, foi

utilizada BRF A na concentração de 1 µg/mL. Ao contrário do esperado, como representado

nos contour plots representaivos de um de oito doadores diferentes, 2 dias após a infecção, os

monócitos infectados ainda sim expressavam a proteína anti- apoptótica (54,21%) em níveis

semelhantes aos detectados nas condições controle (52,80%) e inativado (54,94%) (Figura

4.12 A, B, C e D). O perfil permanece semelhante quando analisamos os dados

imediatamente (0 hora) e 14, 24, 72 e 120 horas após infecção. A Figura 4.13 A e B ilustra o

contour plots de células Bcl-2

DENV

nas condições de cultura com vírus inativado e vírus

infeccioso. A Figura 4.13 C representa o gráfico da média ± DP

dos resultados Bcl-2

cinética de até 5 dias após infecção e a Figura 4.13 D representa o gráfico da média ± DP dos

resultados Bcl-2

DENV

nas quatro condições avaliadas: controle positivo (BRF A),

controle, vírus inativado e vírus infeccioso.

Figura 4.12: Detecção da expressão da oncoproteína Bcl-2 em monócitos CD14

infectados por DENV-2.

Monócitos enriquecidos a partir do sangue de indívíduos saudáveis foram plaqueados e cultivados. Cerca de

1x106 céls/mL foram incubadas com meio de cultura, vírus inativado ou infectadas com vírus DENV-2 cepa

16681. As células foram mantidas durante 0 a 48 horas após infecção para posterior análise da influência do

vírus na expressão intracelular da proteína pró-apoptótica Bcl-2. Para controle positivo, foi utilizada Brefeldina

A (BRF A). A avaliação foi realizada por FACs em cada ponto da cinética por região lógica de monócitos,

seguindo a marcação com anti-CD14 Cy5. As células duplamente marcadas com anti-CD14Cy5 + Bcl-2 PE, 48

horas após infecção, são representados pelos contour plots sob diferentes condições: A células tratadas com BRF

A (A); controle (B); tratadas com vírus inativado (C) e com vírus DENV-2 (D). Os gráficos em menor escala

representam os dot plots da marcação para CD14 (FL3-H: CD14 cyc) x marcação com o isotipo de Bcl-2 (FL2-

H: IgG2 PE). De acordo com a posição dos quadrantes nos gráficos-isotipo foram estabelecidos os quadrantes

nos gráficos contour plots maiores representados pelas marcações para CD14 (FL3-H: CD14 cy5) x marcação

com o Bcl-2 (FL2-H: Bcl-2 PE). Os resultados são representativos de 1 entre 4 experimentos.

CD14 Cy5

Bcl-2 PE

Controle BRF A

Inativado Infeccioso

A B

C D

CD14 Cy5

CD14 Cy5 CD14 Cy5

CD14 Cy5

IgG-PE IgG-PE

2 dias

Figura 4.13: Expressão de Bcl-2 em monócitos CD14

infectados por DENV-2. Os gráficos de contour plot

A e B representam monócitos que foram selecionados em uma região morfológica por citometria sendo que, os

gráficos em menor escala representam os dot plots do tamanho (FSC) x marcação com o isotipo de Bcl-2 (FL2-

H: IgG PE). De acordo com a posição dos quadrantes nos gráficos-isotipo foram estabelecidos os quadrantes nos

gráficos dot plots maiores, que representam as diferentes condições de tratamento nas culturas: inativado (A) e

infeccioso (B). A porção superior à direita do quadrante em todos os gráficos corresponde ao percentual de

monócitos Bcl-2

DENV

. C representa o gráfico da média percentual ± DP de células expressando Bcl-2 sob as

diferentes condições de tratamento, controle, inativado e infeccioso, numa cinética de 0 a 48 horas após a

infecção. O gráfico D representa a média do percentual ± DP das células duplo positivas para DENV-2 e Bcl-2,

também sob as diferentes condições citadas. Os gráficos de contour plot são representativos de 1 entre 4

experimentos.

0 14 24 48

100

Controle

Inativado

Infeccioso

Tempo (Hs)

% Células Bcl-2+

0 14 24 48

Controle

Inativado

Infeccioso

Tempo (Hs)

% Células DENV-Ag + Bcl-2+

Bcl-2 PE

DENV Alexa 488

A B

C D

Inativado Infeccioso

FSC

Iso DENV - IgG488 FSC

Iso Bcl-2 - IgG PE

FSC

Iso Bcl-2 - IgG PE

Iso DENV - IgG488

2 dias

4.3.4 A infecção de monócitos humanos por DENV-2 induz alterações no ∆

∆∆

∆Ψ

ΨΨ

Ψm

O teste de potencial de membrana mitocondrial (∆Ψ

) foi realizado utilizando-se

DIOC

e o marcador nuclear Hoechst 33342. O teste baseia-se na determinação de processos

biológicos referentes à indução de ativação da via mitocondrial apotótica. O decréscimo ou

perda do ∆Ψm corresponde a um dos primeiros eventos da apoptose. Interações entre

proteínas promotoras e inibidoras da família Bcl-2, localizadas na membrana mitocondrial e

associadas umas às outras, parecem desempenhar um papel importante no controle do ∆Ψm e

outras funções associadas aos eventos envolvidos na apoptose. Em adição a sua capacidade

direta de formar poros, essas proteínas podem afetar indiretamente o ∆Ψm, por regular a

função poros dependentes de voltagem, envolvidos na permeabilidade mitocondrial. Em

baixos níveis de condutância, a abertura transiente desses poros, combinada com a contínua

atividade respiratória mitocondrial, mantêm o ∆Ψm estável. A indução de uma alta

condutância dos poros leva a um colapso irreversível do potencial culminando na ruptura da

membrana interna e externa mitocondrial (perda da integridade de membrana mitocondrial).

Interessantemente, a abertura desses poros é facilitada por proteínas pró-apoptóticas ou

prejudicada por proteínas anti-apoptóticas (Bedner, Li et al., 1999).

Vários tipos de fluorocromos catiônicos lipofílicos, permeáveis à membrana, podem

servir como marcadores de ∆Ψm em citometria de fluxo e imunofluorecência. Eles são

atraídos por membranas hiperpolarizadas, mais especificadamente, por membranas carregadas

positivamente, como é o caso da membrana mitocondrial interna. O DiOC

(3) é um dos mais

frequentemente utilizados e sua especificidade é amplamente aumentada quando utilizado em

baixas concentrações (10-40 nM), apresentando uma alta especificidade pela membrana

mitocondrial. Quando as células viáveis são incubadas na sua presença, os marcadores

acumulam-se na membrana mitocondrial, sendo que a extensão de sua captação, medida por

intensidade de fluorecência celular, é considerada reflexo do ∆Ψm. Quando á uma

despolarização da membrana mitocondrial interna durante a apoptose, ocorre uma alteração

na sua polaridade devido à abertura de canais ou poros e conseqüente fluxo de moléculas. A

abertura desses canais, juntamente com rupturas nas membranas, gera um colapso no

gradiente eletroquímico. O marcador, então, perde sua capacidade de interajir e não mais se

acumula na membrana. Com isso a fluorescência vai decaindo. O DIOC

(3) foi utilizado para

detectar as mudanças no ∆Ψm no modelo de infecção in vitro de monócitos humanos por

DENV-2. A análise das imagens fluorescentes foi realizada utilizando-se microscopia

confocal e a medida da intensidade de fluorescência, por FACS. Como mostrado previamente,

o vírus facilita a indução da apoptose de monócitos humanos. Assim, este poderia exercer

seus efeitos citotóxicos por ativar a via mitocondrial apoptótica. Portanto, determinamos se a

presença do vírus estaria induzindo alterações do ∆Ψm.

A análise da medida de intensidade de fluorescência (MIF), realizada a partir da média

dos valores obtidos por FACS, sugere que o vírus possa interferir na via apoptótica

mitocondrial. De acordo com a Figura 4.14, podemos observar, pelos gráficos representativos

do histograma de células tratadas com meio apenas (Figura 4.14 A-controle), expostas a vírus

inativado (Figura 4.14 B-inativado) ou infectadas com DENV-2 (Figura 4.14 C-infeccioso),

que, embora o percentual de células DIOC

seja semellhante, há uma diminuição drástica no

MIF na condição infeccioso (28,40), em comparação aos seus respectivos controle (67,67) e

inativado (60,02) (Figura 4.14 D).

De acordo com as imagens fornecidas peã microscopia confocal podemos observar um

maior número de células marcadas com fluorescência verde, correspondendo ao DiOC6 (3),

no citosol ou ao redor dos núcleos, corados em azul, tanto na condição controle quanto no

inativado. Interessantemente, nas células infectadas (infeccioso), a marcação de ∆Ψm é

menos intensa ou nula e, quando presente, encontra-se sobreposta à coloração azul nuclear,

diferente do visto no controle e vírus inativado (Figura 4.15). Também podemos observar

células não marcadas, tanto no controle, quanto no vírus inativado, o que pode ser reflexo de

que estas também estariam em morte celular programada causada por outros fatores que não o

vírus.

Estes resultados são preliminares, pois foram obtidos de um único doador para cada

uma das metodologias, mas são bastante sugestivos por complementar as outras análises

anteriores.

Figura 4.14: DENV-2 promove decréscimo no potencial de membrana mitocondrial de monócitos

humanos. Monócitos aderentes, obtidos de PBMCs de doadores saudáveis, foram cultivados com meio de

cultura apenas, incubados com vírus inativado ou infeccioso por 2 dias à temperatura de 37

◦

C e CO

. 1 x 10

céls/mL foram recuperadas e incubadas com 1 µL de DIOC

a 20nM, por 15 min e, em seguida, avaliadas por

FACs para análise do percentual de células DIOC6

. O histograma A representa o percentual de células DIOC

na condição controle, B na condição inativado e C na condição infeccioso. O histograma D representa a

associação dos 3 histogramas citados com os respectivos valores do MIF (mean intensity fluorescence) de cada

condição. A fluorescência foi captada usando filtro apropriado para emissão verde.

Infeccioso Inativado Controle

Controle

Inativado

Infeccioso

A B C

2 dias

Figura 4.15: Detecção da alteração no potencial de membrana mitocondrial de monócitos humanos

infectados por DENV-2 através de imunofluorescência. Monócitos aderentes obtidos de PBMCs de doadores

saudáveis foram cultivados com meio de cultura apenas em lâminas do tipo LabTech. 2,5 x 10

céls/mL foram

incubadas com vírus inativado ou infeccioso por 2 dias à temperatura de 37

◦

C, em estufa de 5% CO

. As células

foram tratadas com 1 µL de DIOC

a 20nM, por 15 min em temperatura ambiente e em seguida, avaliadas por

microscopia confocal. A marcação nuclear foi feita utilizando Hoescht, na fluorescência azul. e a marcação do

DIOC

é representada pela fluorescência verde. Os dados são representativos de um experimento preliminar.

imagens foram realizadas utilizando o microscópio de fluorescência de excitação por dois fótons (Two-photon

excitation LSM meta 510) e a lente objetiva usada foi a EC plan-Neofluoar 40x/1,30 Oil DIC M27.

Controle Inativado

Infeccioso

5. DISCUSSÃO

As formas graves da Dengue vêm se tornando um dos principais problemas de saúde

pública (Figueiredo, 2003). Dado o fato de que a intensidade de replicação do DENV durante

o início da infecção possa determinar as manifestações clínicas, é importante o entendimento

do impacto da infecção na imunidade inata do hospedeiro (Navarro-Sanchez, Despres et al.,

2005).

A montagem eficaz de uma defesa inata do hospedeiro pode ser um fator limitante no

decorrer da infecção pelo Dengue no organismo. Um das questões mais importantes na

patogenia é identificar as células-alvo que tenham um papel principal na imunidade inata

antiviral ao DENV, nas primeiras horas da infecção. Os monócitos/macrófagos e DCs são os

principais alvos do DENV, tanto in vitro como in vivo e, portanto, a interação do vírus com

essas células é de extrema relevância (Halstead e O'rourke, 1977; Halstead, 1988; Wu,

Grouard-Vogel et al., 2000; Neves-Souza, Azeredo et al., 2005). Vários estudos vêm

demonstrando a importância dessas células na produção de citocinas e quimiocinas, bem

como na ativação de vias de sinalização e expressão de moléculas de superfície, modulando a

interface entre a imunidade inata e adaptativa e, consequentemente, determinando a proteção

ou patogenia frente à infecção (Frankenberger, Sternsdorf et al., 1996; Bosch, Xhaja et al.,

2002; Strauss-Ayali, Conrad et al., 2007). Diferenciados ou não, os monócitos humanos são

fisiologicamente competentes em um contexto de infecção viral. No decorrer da infecção, 2

desafios são impostos ao sistema imune do hospedeiro: primeiro, eliminar o vírus e células

infectadas e, segundo, modular a resposta imunológica adaptativa ativada pelo vírus. A

habilidade da resposta imunológica do hospedeiro em superar esses dois obstáculos é

diretamente refletida na gravidade clínica da doença.

A apoptose é um processo ativo de autodestruição celular envolvendo fatores

extrínsecos e intrínsecos, geneticamente regulado, que ativam uma cadeia enzimática

complexa. Tais fatores compreendem receptores, como Fas e seus ligantes, proteínas

reguladoras da família Bcl-2, enzimas e fatores de transcrição. Já se sabe que o DENV pode

interferir nesse processo através da regulação desses e outros fatores em diferentes tipos

celulares (Bunyaratvej, Butthep et al., 1997; Jessie, Fong et al., 2004). A apoptose representa

um mecanismo potencialmente importante em modular as respostas imunológicas, podendo

servir como uma estratégia de disseminação da progênie viral a células vizinhas, através da

fagocitose de corpos apoptóticos, mimetizando uma resposta. A replicação do DENV parece

ser essencial para induzir a atividade fagocítica bem como a apoptose de monócitos humanos

(Espina, Valero et al., 2003; Neves-Souza, Azeredo et al., 2005). Como os mecanismos de

apoptose em células-alvo infectadas por DENV ainda não estão totalmente esclarecidos, é de

extrema relevância seu conhecimento. Neste estudo, buscamos investigar a interação vírus-

célula utilizando como modelo a infecção de monócitos humanos primários in vitro com vírus

DENV-2 (16681), enfatizando os mecanismos extrínsecos e intrínsecos envolvidos na

apoptose dessas células.

A manutenção de monócitos humanos em sistemas de cultura, e sua susceptibilidade à

infecção, utilizando cepas virais capazes de replicar in vitro, são ferramentas importantes

utilizadas para a reprodutibilidade experimental in vitro. Com a ausência de um modelo

animal que repoduza fielmente a patologia da dengue, utilizam-se ensaios alternativos

bastante válidos para se compreender os mecanismos envolvidos na imunopatogenia desta

infecção (Sydow, Santiago et al., 2000; Chen e Wang, 2002). O genótipo americano do

DENV-2 é descrito como não virulento e com uma habilidade reduzida de crescimento em

culturas celulares e de mosquitos. Esses dados são baseados em estudos epidemiológicos em

regiões geográficas onde outros genótipos não circulam. Porém, alguns autores sugerem que,

o aumento da gravidade em países latino-americanos poderia estar associado à introdução de

um genótipo asiático do DENV, substituindo o genótipo autóctone local (Salas, Tovar et al.,

1998; Cologna e Rico-Hesse, 2003; Miagostovich, Cerqueira et al., 2003; Cologna,

Armstrong et al., 2005). Em contraste, o genótipo asiático do DENV-2 mostra-se mais rápido

e eficaz em ser transmitido pelo mosquito vetor e está associado às manifestações graves da

doença (Cologna e Rico-Hesse, 2003; Halstead, 2007). O DENV-2, cepa asiática 16681, é

capaz de se replicar em culturas primárias de monócitos humanos do sangue periférico

(Halstead e O'rourke, 1977; Chen e Wang, 2002; Cologna e Rico-Hesse, 2003) e se mostrou

reprodutível em nosso modelo de infecção in vitro, tanto nos ensaios de crescimento de massa

viral e titulação, como também em infecções usando monócitos de doadores brasileiros.

Sendo assim, o modelo foi adotado para a realização dos ensaios nessa dissertação (Sydow,

Santiago et al., 2000; Neves-Souza, Azeredo et al., 2005).

Nossos primeiros experimentos foram feitos com o intuito de se averiguar em que

ponto da cinética de infecção apresentou-se o maior pico de replicação viral. Dessa forma, o

pico de infecção ocorreu no segundo dia, embora uma replicação precoce já possa ser

detectada 14 horas após a infecção. Esses resultados se assemelham com os já vistos na

literatura utilizando a cepa DENV-2 16681 e outras quimeras de genótipo asiático e

americano. Interessantemente, não só a cepa, mas também a dose do inoculo, pode influenciar

no percentual de células DENV

ao longo da cinética (Cologna e Rico-Hesse, 2003).

A maioria dos doadores de monócitos testados em nossos experimentos apresentava

alguma susceptibilidade para a infecção viral, devido a uma variabilidade na taxa de infecção

entre diferentes doadores. Esses resultados se refletem, provavelmente, na genética de cada

um. É bem documentado que a carga viral e, dessa forma, a massa de células infectadas, é um

dos fatores que estariam envolvidos na gravidade clínica em infecções por dengue (Libraty,

Endy et al., 2002). Qualquer um dos mecanismos envolvidos na resposta imunológica frente à

infecção está sob controle genético do hospedeiro: a habilidade de reconhecer e processar Ags

e produzir Acs, as respostas celulares, os receptores envolvidos direta e indiretamente com o

DENV, ou os parâmetros de eficiência replicativa em células infectadas. Uma série de

variações genéticas individuais está associada com a gravidade da doença (Quírico-Santos,

Kubelka et al., 2006). O polimorfismo nos genes HLA de classe I e II, receptores Fc, para

vitaminas D e A, para citocinas, assim como a freqüência de alelos envolvidos na síntese de

mediadores pró-inflamatórios, em diferentes populações incluindo brasileiros, estão

intimamente relacionados com a incidência da doença tanto na sua forma branda como nas

graves (Halstead, 2002; Loke, Bethell et al., 2002; Polizel, Bueno et al., 2004; Sierra, Alegre

et al., 2007). Também diferenças étnicas / raciais e a susceptibilidade à FHD são

documentadas (Kouri, Guzman et al., 1987; Pelaez, Guzman et al., 2004). Em virtude do

Brasil ter uma população bastante miscigenada isso também explicaria a grande variabilidade

genética populacional influenciando na susceptibilidade à Dengue (Quírico-Santos, Kubelka

et al., 2006).

Os monócitos desempenham um importante papel em diversas doenças inflamatórias.

Essas células são caracterizadas por diferentes subpopulações, cada qual exercendo sua

função frente a uma infecção (Chen e Wang, 2002; Gordon e Taylor, 2005; Mantovani, Sica

et al., 2007). Funcionalmente, os monócitos CD14

CD16

são considerados maduros, pois

são conhecidos por se expandirem durante infecções e respostas inflamatórias,

particularmente durante sepsis e HIV (Fingerle, Pforte et al., 1993) . Em infecções por HIV,

essas células parecem desempenhar um importante papel na interação com consequente

ativação de linfócitos T bem como sua susceptibilidade à infecção (Ancuta, Autissier, et al.,

2006). Alguns trabalhos também vêm demonstrando que monócitos CD16

são mais

permissivos a infecção pelo HIV in vivo devido a maior capacidade de reconhecimento dessas

células pelo vírus via interação com receptores específicos, como CCR5 e subsequente

replicação viral, além de representarem importantes reservatórios virais, mesmo em pacientes

recebendo terapia antiretroviral (Ancuta, Kunstman, et al., 2005; Ellery, Tippett, et al., 2007).

A expressão de moléculas envolvidas com apresentação de Ags e migração, bem como sua

capacidade de produzir citocinas como TNF, e pouca ou nenhuma citocina anti-inflamatória,

caracterizam essas células com sendo pro-inflamatórias (Frankenberger, Sternsdorf et al.,

1996). Com o intuito de se avaliar os mecanismos de ativação de monócitos humanos

infectados por DENV-2, estudamos o papel da infecção na modulação da expressão de CD16

em monócitos CD14+. Pela primeira vez demonstramos que células CD14+ CD16+

encontram-se elevadas durante o pico de infecção. Também em nosso laboratório, Azeredo e

colaboradores demonstraram que monócitos CD14

CD16

estariam aumentados em pacientes

brasileiros infectados por DENV na fase aguda da doença (Azeredo, Oliveira-Pinto et al.,

2007). Esses resultados sugerem que a replicação viral seja importante para a regulação da

expressão dessa molécula. Os monócitos CD14

CD16

“ativados” representam apenas 10%

do total de células CD14+ no sangue e encontram-se elevados em uma variedade de

condições patológicas (Gordon e Taylor, 2005; Strauss-Ayali, Conrad et al., 2007).

Interessantemente, enquanto alguns autores sugerem que essas células sejam pro-

inflamatórias por natureza, outros vêm demonstrando, in vitro, que o TNF-α também

desempenha um importante papel na expressão dessa molécula, acompanhando a exposição a

Ags bacterianos (Skinner, Macisaac et al., 2005; Skrzeczynska-Moncznik, Bzowska et al.,

2008). O aumento da expressão de CD16 em macrófagos também já foi demonstrado em

artrite reumatóide, correlacionando com o elevado nível de TNF-α. Resultados obtidos em

nosso laboratório (Anexo I) demonstram altos níveis de TNF-α no sobrenadante de culturas

de monócitos infectadas 2 dias após infecção, consistente com dados também obtidos

utilizando o plasma de pacientes brasileiros (Pinto, Oliveira et al., 1999; Azeredo, Zagne et

al., 2001; Reis, Valente et al., 2008). Podemos sugerir que essa subpopulação CD16+ exerça

um importante papel na indução de respostas pró-inflamatórias frente à infecção pelo DENV.

A modulação do Ag de superfície HLA-DR é vista em vários estudos envolvendo

reações inflamatórias agudas como choque séptico (Ono, Tsujimoto et al., 2004; Antoniades,

Berry et al., 2006). As principais funções dos monócitos compreendem a fagocitose,

apresentação de Ags e produção de citocinas, todas mediadas por certas moléculas de

superfície, como CD14 e HLA-DR. Em outras palavras, o HLA-DR permite a apresentação

de Ag às células T e é crucial para a iniciação das respostas imunes celulares. Monócitos

CD14

CD16

expressam maior intensidade de HLA-DR, sendo mais eficazes como APCs.

Porém, um estudo recente mostrou que a expressão desses Ags está reduzida em pacientes

com sepsis ((Tsujimoto, Ono et al., 2006). Estudos feitos por Azeredo e colaboradores

também mostram uma diminuição na expressão dessa molécula em monócitos de pacientes

com a forma grave da Dengue (Azeredo, Oiliveira-Pinto et al., 2007). Esses resultados são

concordantes com os observados em pacientes com sepsis, especialmente naqueles com

choque séptico (Ono, Tsujimoto et al., 2004). Seria de interesse avaliar e comparar se essa

subpopulação CD16

estaria mais elevada ou não durante as manifestações brandas e graves

da dengue de forma a sugerir um possível papel dessas células na gravidade da doença.

A morte celular, tanto programada quanto necrótica, é um mecanismo frequentemente

dominante durante os processos patológicos. A morte celular programada é um processo

regulatório fundamental do sistema imunológico. Na resposta imune a infecções virais, a

apoptose pode ocorrer como um mecanismo patogênico direto de disseminação viral e escape

do sistema imune ou pode representar uma resposta apropriada do hospedeiro para limitar a

replicação viral. Ela pode ser Ag-dependente e iniciada via sinalização por receptores de

morte, ou pode ocorrer por negligência quando receptores Ag-específicos não são estimulados

ou quando fatores de sobrevivência solúveis são privados do microambiente celular, um

fenômeno conhecido como autofagia. A modulação da morte celular programada desempenha

um papel muito importante em várias patogenias relacionadas a doenças infecciosas virais,

como AIDS e sarampo (Oyaizu e Pahwa, 1995; Marianneau, Cardona et al., 1997; Avirutnan,

Malasit et al., 1998); (Servet-Delprat, Vidalain et al., 2000).

Os monócitos/macrófagos são os principais alvos do DENV. Juntamente com DCs,

essas células são responsáveis pela disseminação do vírus após a entrada inicial via picada do

mosquito vetor. Vários estudos vêm mostrando que fatores solúveis liberados por

monócitos/macrófagos infectados por DENV exercem influência predominante nas

propriedades biológicas de células endoteliais e em populações celulares mielóides (Shaio,

Cheng et al., 1995; Anderson, Wang et al., 1997), sugerindo que a interação do DENV com

essas células pode desempenhar um papel na patogenia do dengue. Pelo fato de

monócitos/macrófagos serem células fagocíticas ativas, com componentes lisossomais

citoplasmáticos capazes de eliminar microorganismos, a interação do DENV com essas

células pode também resultar em efeitos deletérios para ambos os vírus e células. Espina e

colaboradores demonstraram qualitativamente, utilizando microscopia eletrônica, que o vírus

DENV-2 é eficientemente fagocitado por monócitos humanos e degradados, sugerindo que a

fagocitose seja um mecanismo de clearence viral. Porém, nesse mesmo estudo, foi visto que

monócitos humanos infectados sofriam apoptose. Entretanto, embora estes estudos tenham

demonstrado evidências de apoptose em monócitos infectados por Dengue in vitro, estas não

são muito claras. O trabalho não descreve réplicas do experimento e os gráficos de citometria

não estão muito claros (Espina, Valero et al., 2003). Com o intuito de se estudar melhor esse

fenômeno, investigamos o possível dano celular induzido pelo DENV-2 cepa 16681 em

monócitos de indivíduos brasileiros saudáveis, num modelo de infecção in vitro, inicialmente,

conduziu os experimentos utilizando metodologias mais quantitativas e sensíveis para a

detecção das fases iniciais de morte celular programada.

A marcação celular com Anexina-V-FITC e o corante de exclusão, PI, avaliada através

de citometria de fluxo é uma das técnicas mais utilizadas para quantificar células em morte

celular programada. Usando esse método, podemos distinguir 3 populações celulares

diferentes: as células viáveis (duplo negativa), as em processo de morte celular programada

(Anexina-V

) e as em necrose ou já mortas (PI

e Anexina-V

), baseadas na exposição de

fosfatidilserina sobre a membrana plasmática, graças à fixação da Anexina-V. Seguindo a

optimização da infecção dos monócitos pelo DENV-2, nós detectamos, de forma

esclarecedora, a morte celular programada, mostrando que o vírus é capaz de induzir apoptose

de forma marcante 2 dias após infecção. Em virtude de o segundo dia representar o ponto de

maior produção de citocina pró-inflamatória TNF-α, também um importante indutor de

apoptose, podemos sugerir que o processo de maturação e produção de citocinas por essas

células ativariam vias envolvidas na apoptose. Observamos também que monócitos cultivados

na ausência de vírus infeccioso também morrem. Podemos sugerir que o tipo de morte

induzida nessas células seja diferente do que observamos em monócitos infectados, mesmo

ambos tendo características morfológicas semelhantes, como a exposição de fosfatidilserina.

Um tipo de morte celular programada, que muitos autores caracterizam como não-apoptótica,

mas que também apresenta características muito semelhantes a apoptose é a autofagia. Esse

mecanismo é desencadeado por estímulos de estresse ambiental, como carência de nutrientes,

danos induzidos por citocinas e condições de hipoxia. Nesses casos, as células consomem

parte de seus componentes internos de forma a sobreviver a essas condições. Quando a essa

condição permance por longos períodos, a morte é desencadeada, com ou sem a ativação de

caspases ou pela via Fas/FasL (Perlman, Pagliari et al., 2001; Lemasters, 2005; Yu, Chow et

al., 2006). A autofagia pode explicar o porquê de monócitos cultivados apenas em presença

de meio ou tratados com vírus inativado apresentem taxas consideráveis de morte celular

programada. A ausência da troca do meio de cultura por 2 dias e os procedimentos de

raspagem para obtenção dessas células seriam considerados como formas de estresse celular.

Estudos recentes vêm demonstrando morte celular espontânea de monócitos humanos

cultivados em meio enriquecido de SFB (Yu, Chow et al., 2006). Nesses estudos, cerca de

34% de monócitos cultivados por 48 horas, em presença de meio apenas, sofriam morte

celular programada, avaliada pela marcação com Anexina-V e PI. Esses resultados

corroboram com os dados que obtivemos em nossos experimentos.

Vários estudos documentam que a infecção pelo DENV pode induzir apoptose em

diferentes tipos celulares in vitro e in vivo, e que esses dados estariam correlacionados com a

gravidade da doença (Mongkolsapaya, Dejnirattisai et al., 2003; Myint, Endy et al., 2006;

Limonta, Capo et al., 2007). É sabido que uma proporção da população de monócitos pode

suportar à replicação viral do DENV-2 e que, portanto, células infectadas podem ser fontes de

disseminação viral após a diferenciação e liberação do vírus e citocinas para a corrente

sanguínea (O'sullivan e Killen, 1994). A replicação viral em células-alvo e/ou a exposição a

proteínas virais e mediadores inflamatórios poderiam desencadear a apoptose de células

infectadas, garantindo, em parte, a disseminação da progêne viral. Mostramos neste trabalho

que o percentual de monócitos apoptóticos é elevado em cultura infectada, em comparação a

células tratadas com meio apenas ou com vírus inativado, o que sugere a presença do vírus

para desencadear a morte celular. A apoptose pode representar uma estratégia viral para

escapar do sistema imune e garantir sua disseminação no organismo. No sistema de co-cultura

DC e linfócitos T, DCs infectadas por vírus do sarampo aumentam a expressão de Fas,

tornando-se mais susceptíveis à apoptose mediada pelo sistema Fas/FasL. Este processo

parece facilitar a liberação do vírus no sobrenadante da co-cultura, facilitando a infecção de

células vizinhas, além de induzir simultaneamente a maturação de DCs não infectadas. Além

disso, o estudo também especula o possível papel da apoptose de DCs mediada por Fas/FasL,

contribuindo para a infecção de fagócitos vizinhos, embora ainda não se saiba de fato que

fagócitos possam ser infectados por corpúsculos apoptóticos de células infectadas contendo

vírus (Servet-Delprat, Vidalain et al., 2000). Contraditoriamente, a apoptose pode ter um

efeito oposto e deletério para as progênies virais e representar uma tentativa do hospedeiro em

conter a infecção. Células apoptóticas ou corpúsculos apoptóticos infectados podem ser

digeridos por fagócitos vizinhos. Considerando que a fagocitose de células mortas é essencial

para prevenir uma resposta inflamatória desregulada e por iniciar respostas imunes

específicas, a apoptose pode ser reflexo de uma tentativa do sistema imune do hospedeiro em

conter a infecção. Interessantemente, monócitos infectados podem produzir uma série de

mediadores inflamatórios, incluindo o TNF-α. Essa citocina poderia acelerar a apoptose

induzida pelo vírus, concomitante com a redução da progênie viral. A lise prematura de

células infectadas por DENV pode ter um papel significativo na supressão da multiplicação

viral, concomitante com as taxas de infecção reduzidas observadas 72 e 120 horas após a

infecção. A aceleração da apoptose pode ajudar macrófagos a reconhecer e remover células

infectadas.

A via extrínseca de ativação da apoptose envolve uma série de receptores da família

TNF. O receptor Fas compreende um deles. Alguns trabalhos mostram seu envolvimento em

patogenias, incluindo infecções virais como Sarampo, Hepatite B e Dengue (Servet-Delprat,

Vidalain et al., 2000; Wang, Gregori et al., 2004; Limjindaporn, Netsawang et al., 2007). Um

estudo recente demonstrou que a presença da proteína do capsídeo do vírus Dengue é

fundamental na indução de apoptose de células HepG2 em uma via dependente de Fas

(Limjindaporn, Netsawang et al., 2007). A via de sinalização Fas/FasL pode representar um

mecanismo mais complexo, envolvendo ativação de kinases, fatores de transcrição e a

regulação de fatores pro-apoptóticos, como o citocromo C. Alguns estudos mostram que a

indução de Fas promove ativação de kinases e fatores de transcrição (Liu et al., 2006).

Investigações demonstraram que a ativação do NF-κB, num contexto de infecção por vírus

influenza, modula alguns fatores pró-apoptóticos como Fas e, consequentemente, a apoptose e

propagação do vírus (Wurzer, Ehrhardt et al., 2004). Li e colaboradores demonstraram que o

IFN-γ, produzido inicialmente, induziu um aumento na expressão de CD95 em uma linhagem

de células endoteliais microvasculares (Li, Zou et al., 2002). Já se sabe que DCs derivadas de

monócitos, quando infectadas com o vírus do sarampo, aumentam expressão de Fas e são

mais susceptíveis à apoptose quando co-cultivadas na presença de linfócitos T (Servet-

Delprat, Vidalain et al., 2000). Embora seja de extrema relevância na ativação da via

extrínseca apoptótica, o receptor Fas também parece induzir respostas inflamatórias em

diferentes tipos celulares, via produção de citocinas. A sinalização via Fas induz a produção

de IL-8, TNF-α e IL-1β em monócitos e macrófagos teciduais humanos, modulando respostas

pró-inflamatórias por uma via dependente de caspases (Park, Thomsen et al,. 2003).

Em virtude de se confirmar se monócitos infectados por DENV-2 in vitro estariam

entrando em apoptose na presença do vírus, foi avaliada a influência do receptor Fas na morte

dessas células. Pela primeira vez demonstramos que a expressão de Fas é significativa,

concomitante com o pico de infecção viral, comprovando a influência da via extrínseca

apoptótica na indução de morte celular programada no nosso modelo de infecção de

monócitos com DENV. Este processo leva à liberação do vírus no sobrenadante da cultura,

facilitando a infecção de células vizinhas, além de induzir simultaneamente a maturação de

monócitos. Embora nossos resultados mostrem que a presença do vírus e/ou proteínas virais

possa induzir apoptose de monócitos por uma via dependente de Fas/FasL, eles não

descartam a participação do receptor TNF-α/TNFR, citocinas e/ou outros mecanismos

envolvidos na gravidade da doença. Azeredo e colaboradores demonstraram elevados níveis

solúveis de TNF-α, bem como os receptores TNFRI e II no plasma de pacientes brasileiros

infectados por Dengue (Azeredo, Zagne et al., 2001). Evidências sugerem o papel dessa

citocina como um indutor da apoptose em neutrófilos e células parenquimais via receptor e

ativação de NF-kB. (Jaeschke, Farhood et al., 2000; Niwa, Hara et al., 2000; Liao, Lin et al.,

2001; Espina, Valero et al., 2003). Interessantemente, a variabilidade conferida aos diferentes

valores percentuais de células Fas

em cada doador analisado pode também ser reflexo de

fatores genéticos individuais influenciando na susceptibilidade à infecção in vitro por DENV

e, conseqüentemente, ao padrão diferencial de expressão do receptor.

O produto citoplasmático do proto-oncogene Bcl-2 tem sido extensamente estudado e

participa no prolongamento da sobrevivência celular, por inibir a apoptose. A proteína Bcl-2 e

o Ag Fas têm efeitos opostos na apoptose. Portanto, a expressão diferencial dessas moléculas

pode resultar em uma desregulação do processo apoptótico em certas patologias, como

doenças neoplásicas e virais (Boudet, Lecoeur et al., 1996; Molica, Mannella et al., 1996).

Em nosso projeto, ao contrário do esperado, não ocorreram alterações significativas com

relação à expressão de Bcl-2 em monócitos infectados por DENV-2. Isso abre margem para

especularmos que outras proteínas anti-apoptóticas, como Bcl-xL, estariam sendo reguladas

negativamente durante a infecção. A mitocôndria é uma organela fundamental na apoptose,

regulando o processo através de proteínas da família Bcl-2. Proteínas pró-apoptóticas

induzem a morte celular via permeabilização da membrana mitocondrial e conseqüente

liberação de moléculas envolvidas em vias dependentes ou independentes de caspases. Ao

contrário, proteínas antiapoptóticas garantem a sobrevivência celular, em parte por inibir a

permeabilização da membrana mitocondrial. Essa inibição pode ser feita pelo aumento na

expressão de Bcl-2 e Bcl-xL, porém, parece que ambas as proteínas, e o conseqüente balanço

entre a expressão delas, desempenham funções distintas na morte celular. Um estudo mostrou

que a estimulação da expressão de Bcl-2 aumentou a morte celular, o que estaria associado

com uma diminuição na regulação de Bcl-xL em células tumorais (Arriola, Rodriguez-Lopez

et al., 1999). Além da troca na funcionalidade dessas proteínas em certas situações, o Bcl-xL

parece ter um papel mais eficaz em inibir as sinalizações envolvidas com os eventos iniciais

da via de apoptose induzida por TNF ou por ligantes associados à proteína adaptadora do

receptor Fas, em células tumorais (Keogh, Walczak et al., 2000). Proteínas virais envolvidas

na infecção pelo HIV modulam a sobrevivência de linhagens celulares precursoras de

macrófagos, através da indução na expressão de Bcl-xL (Choi e Smithgall, 2004). Em outro

estudo, foi demonstrado que linfócitos B também representam alvos importantes na infecção

por HIV e que anormalidades podem ocorrer em termos de ativação e apoptose dessas células,

concomitante com a elevada viremia plasmática. (Ho, Moir et al., 2006). Os resultados

obtidos em nosso trabalho sugerem que a indução da apoptose possa envolver tanto por uma

associação entre as vias extrínseca e intrínseca, quanto individualmente. Nossos dados

corroboram a hipótese de que, no modelo de infecção por DENV-2, o vírus e/ou mediadores

inflamatórios produzidos em decorrência da infecção, promovam a indução da apoptose em

monócitos humanos, modulada por uma diminuição na expressão de uma proteína anti-

apoptótica, por uma via dependente ou independente de Fas/FasL. Podemos especular que

mecanismos distintos estariam associados à apoptose de monócitos frente à infecção, em

conseqüência do grau de ativação dessas células. Porém, ambas podem convergir, ao final e

contribuir para alterações funcionais vitais de monócitos frente à infecção por Dengue.

Os vírus desenvolveram estratégias para driblar as respostas celulares e assegurar seu

sucesso durante a infecção. Muitas dessas estratégias envolvem alterações no metabolismo

energético. A modulação das funções mitocondriais compreende uma dessas. Essa resposta

envolve o mecanismo de apoptose que inclui, em grande parte, alterações na integridade dessa

organela. Um experimento preliminar feito por nós mostrou que monócitos humanos

infectados por DENV-2 apresentam uma disfunção mitocondrial caracterizada por alterações

no ∆ψm. Alguns artigos vêm demonstrando que proteínas associadas ao vírus podem

desencadear a apoptose em diferentes tipos celulares e sua expressão intracelular provocar

disfunções mitocondriais, com a ativação da via dependente de caspases (Catteau, Roue et al.,

2003). Recentemente, demonstrou-se, em um modelo de infecção in vitro, que uma disfunção

bioenergética e mitocondrial em células hepáticas humanas envolve vírus DENV-2. Tal

disfunção foi conseqüência de um decréscimo no ∆ψm, alterando propriedades respiratórias e

a morfologia dessa organela (El-Bacha, Midlej et al., 2007). Nossos resultados, embora

preliminares, sugerem uma diminuição no ∆ψm de monócitos infectados. Se isso for

confirmado, poderemos dizer que a disfunção mitocondrial seja decorrente da influência viral.

O fluorocromo DiOC

(3), em baixas concentrações, é amplamente utilizado para

visualizar a estrutura membranar mitocondrial, pois se acumula na célula de acordo com a

hiperpolarização da membrana (Bedner, Li et al., 1999). O ∆ψm é dependente do

balanceamento de prótons no espaço intermembranar e na matriz mitocondrial. Mudanças no

tráfego desses íons podem levar à despolarização e conseqüente abertura de canais ou poros,

que permitem o fluxo de moléculas para o citoplasma, desencadeando a ativação da via final

de indução da morte celular programada. Interessantemente, apesar de observarmos uma leve

queda na fluorescência de monócitos infectados, usando microscopia confocal, a maioria

deles apresentava marcações dentro do núcleo, diferentemente do visto na condição controle e

inativado. A condensação da cromatina é um evento morfológico descrito na morte celular

programada em vários animais e plantas. A habilidade de se formar massas de cromatina

requer uma desestruturação nuclear interna. A fragmentação nuclear é típica da apoptose,

ocorrendo concomitante com a degradação do DNA. Yamanda e colaboradores

demonstraram, em estudos com uma espécie de planta, a presença de pequenas massas de

DNA fragmentado envoltas por membrana nuclear durante a morte celular programada. De

forma interessante, cada estrutura dessas apresentou fluorescência lipofílica por DIOC

(Yamada, Ichimura et al., 2006). Quando o marcador é usado em concentrações relativamente

altas, ele pode se acumular em outros domínios lipídicos, como RE, microtúbulos e envelope

nuclear (Gregori, Denis et al., 2002). Sugerir que isso possa estar acontecendo em nosso

modelo de infecção é ainda especulação. Mas, se nossos resultados forem confirmados, essas

mudanças morfológicas nucleares estariam ocorrendo em monócitos humanos infectados e

poderíamos associá-las a morte dessas células. Porém, os resultados preliminares não

descartam o possível papel da mitocôndria na apoptose de monócitos.

A abordagem desses estudos, frente ao modelo de infecção desenvolvido em nosso

laboratório, contribui para um melhor entendimento do papel da apoptose, bem como expande

nossos conhecimentos sobre os diferentes mecanismos envolvidos na patogenia e gravidade

da Dengue.

6. CONCLUSÃO

O modelo adotado nesse estudo de infecção in vitro de monócitos periféricos humanos

por vírus DENV-2, assim como as metodologias utilizadas para comprovar ou hipotetizar

nossas especulações, reconstitui de forma reprodutível a infecção, e contribui para a

compreensão dos eventos que ocorrem nas células do hospedeiro frente à infecção pelo vírus

e, possivelmente dos processos que desencadeiam a morte celular. De acordo com os nossos

resultados, podemos concluir que:

• Com a cinética de infecção de monócitos humanos por vírus DENV-2, estabeleceu-se

o pico máximo de detecção de células DENV

no segundo dia após infecção. Portanto,

esse estudo serviu como uma forma de estipularmos o período de maior infecciosidade

viral e, assim, obtermos os melhores resultados, sob diferentes abordagens, cuja

influência da presença viral fosse significativa.

• Observamos que as taxas de infecção viral variavam muito de um doador de leucócitos

para outro, em conseqüência da susceptibilidade de cada um à infecção. No entanto, a

infecção ocorreu na maioria deles, confirmando-se um modelo adequado por

reproduzir a infecção do vírus e a variação, que deve ocorrer na natureza devido às

variabilidades genéticas do hospedeiro.

• Mostramos que, no pico de infecção pelo DENV-2, os monócitos são mais

estimulados e ativados pelo aumento significativo de células CD14

expressando a

molécula CD16, em culturas infectadas. A maturação e expansão dessas células só

ocorrem durante a exposição ao vírus infeccioso.

• Confirmamos que, de fato, a infecção viral do DENV-2 é importante para induzir

mudanças morfológicas em monócitos humanos, que estariam associadas à etapa

inicial da via apoptótica nessas células. A externalização precoce de fosfatidilserina,

um marcador morte de celular programada, foi detectada pela Anexina-V, com

exclusão de PI.

• Pela primeira vez mostramos que, num modelo de infecção in vitro, a presença do

DENV-2 foi capaz de desencadear apoptose dependente de Fas em monócitos

humanos. O aumento de monócitos Fas

em culturas infectadas demonstra que o vírus

modula a via extrínseca apoptótica na indução de morte celular.

• Curiosamente, não observamos nenhuma alteração significativa na expressão da

proteína anti-apoptótica Bcl-2 em monócitos infectados. Em virtude da família das

proteínas Bcl-2 comportarem uma gama de moléculas anti-apoptóticas, podemos

sugerir que a modulação de outra(s) proteínas(s) estaria sendo influenciada na

presença do DENV-2 .

• Monócitos humanos infectados por DENV-2 apresentaram, em um experimento

preliminar, uma disfunção mitocondrial caracterizada por alterações no ∆ψm. Essas

alterações na integridade da organela podem estar envolvidas na apoptose e indicam

que poderá ser confirmado um papel da mitocôndria e conseqüentemente, da via

intrínseca apoptótica, na indução de morte celular de monócitos infectados.

De acordo com os dados obtidos nessa dissertação, e em outros trabalhos de

relevância, desenvolvemos um esquema ilustrativo das possíveis vias de sinalização

envolvidas na indução de morte e ativação celulares na infecção de monócitos humanos pelo

vírus Dengue (Figura 6.1) (Diamond, Roberts et al., 2000; Grandvaux, TenOever et al., 2002;

Neves- Zouza, 2005; Seth, Sun et al., 2006; Azeredo, Oiliveira-Pinto et al., 2007; Reis, 2007).

100

Figura 6.1: Hipótese das vias de sinalização envolvidas na indução de morte e ativação celulares na

infecção de monócitos pelo vírus Dengue. Após inoculação do vírus DENV pelo mosquito Aedes aegypti na

pele do hospedeiro humano, (1.) o vírus infectaria uma das principais células-alvo, os monócitos circulantes, via

co-receptores como TLR-2 (CD14-TLR2 ) ou ainda, por um outro receptor celular ainda desconhecido. O

reconhecimento e/ou endocitose viral mediada por esses receptores levaria à ativação de fatores de transcrição

responsáveis tanto pela indução da secreção de citocinas quanto pela secreção de outros mediadores envolvidos

no clearance viral e na sobrevivência e/ou morte da célula infectada. Dentre os fatores de transcrição, (2.) o

complexo IκB-NF-κB é dissociado, permitindo a translocação do NF-κB ao núcleo e consequentemente, (3.)

indução da expressão de citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-α. (4.) A interação do TNF-a com seu receptor

transmembranar, particularmente o TNFR1, induz o recrutamento de uma outra série de proteínas sinalizadoras

citoplasmáticas que levam inicialmente a (5.) ativação da caspase-8 (6.). Numa seqüência de eventos bem

ordenada, a caspase-8 induz ativação da caspase efetora 3 (7.), envolvida na inibição e/ou ativação de

constituintes citoplasmáticos responsáveis pela manutenção da sobrevivência da célula (8.). Na infecção é

também possível observar o aumento da expressão do receptor Fas, que ao interagir com seu ligante FasL,

expresso numa célula vizinha, é capaz de desencadear a cascata de sinalização da apoptose semelhante à via

TNF/TNFR (9.). A infecção também seria capaz de ativar a via intrínseca de morte celular na qual a mitocôndria

tem papel crucial. De fato, vários trabalhos têm demonstrado que a alteração da permeabilidade da membrana

mitocondrial promove uma disfunção da organela e (10.) secreção de proteínas pró-apoptóticas capazes de ativar

a caspase 9 que, em seguida, ativar a caspase 3 (11.). A alteração da permeabilidade e do potencial da membrana

mitocondrial leva à secreção de radicais livres (12.) que, por exemplo, contribuiriam ao processo de morte

celular ao induzirem a exposição da fosfatidilserina na membrana externa da célula apoptótica, facilitando, desta

forma, o reconhecimento dessas últimas por células fagocíticas (13.). A ativação da morte celular poderia ser

acompanhada por eventos de ativação dos monócitos, uma vez que tem sido observado (14.) o aumento da

expressão de CD16 (FCγIII), característico de monócitos com capacidade altamente pró-inflamatória. Por outro

lado, a infecção pelo vírus Dengue induziria (15.) o fator de transcrição IRF3 envolvido no aumento da indução

de citocinas anti-virais como IFN-α (16.). A via efetora dos IFNs tipo I induziriam a expressão de genes anti-

virais envolvidos na inibição da replicação viral (17.). Desta forma, existiria uma complexa interação vírus vs

hospedeiro que, provavelmente envolvidos na patogenia, estariam contribuindo para a gravidade e evolução da

doença.

Proteína viral

DENV

αα

κκ

αα

Célula

Citoplasma

Ac anti-DENV

RNA viral

Bcl-xL Bak

101

7. PERSPECTIVAS

102

Os estudos em modelos de infecção in vitro para o vírus Dengue representam formas

reprodutíveis de estímulos para que possamos compreender melhor os aspectos envolvidos na

imunopatologia da infecção in vivo e, consequentemente, da gravidade da doença.

Adicionalmente, estes modelos fornecem ferramentas cruciais para que possamos ter uma

abordagem mais detalhada, destrinchando as vias que modulam a morte celular e suas

implicações na FHD/SCD. Os resultados obtidos neste trabalho são importantes para a

compreensão dos aspectos que modulam a imunopatogenia da infecção. Porém, mais estudos

deverão ser desenvolvidos para aperfeiçoarmos e validarmos nossos resultados. Ainda resta

esclarecer a relevância do grau de ativação dos monócitos frente à infecção viral e a

conseqüência disso no estabelecimento de uma resposta imune antiviral eficiente. Para isto,

outros marcadores fenotípicos de ativação devem ser levados em consideração, como o papel

dos TLRs, já abordados em nosso laboratório por Neves-Souza e colaboradores. A proporção

de ativação celular e sua relação com a susceptibilidade ou resistência à infecção pelo DENV

devem ser levadas em consideração. Poderão ainda ser realizadas análises da produção de

citocinas, como IL-10 e TNF-α, importantes indicadores de diferentes subpopulações

monocíticas, e suas conseqüências funcionais para o estabelecimento da infecção. Apesar de o

modelo adotado ser reprodutível e utilizado em diversos ensaios, variáveis técnicas

influenciaram na nossa abordagem de estudo. Portanto, pretendemos aperfeiçoar esse modelo

de infecção de forma a eliminar ou reduzir qualquer tipo de “estresse” físico ou químico que

possa influenciar nos nossos resultados. O uso de sistemas de cultura utilizando placas de

teflon representa uma alternativa para limitar a aderência de monócitos e, assim, reduzir o

estresse celular conferido em virtude das raspagens para obtenção das células. Também é

preciso um estudo mais intenso sobre o possível papel das vias intrínsecas e extrínsecas

apoptóticas. Portanto, a pesquisa de moléculas-chaves, incluindo outros receptores de morte

como TNFR, MAPKs, caspases e fatores de transcrição, possivelmente estimuladas no

decorrer da infecção, seria de extrema relevância para a elucidação não apenas das vias

envolvidas na ativação dessas células, mas também na indução de apoptose de monócitos

humanos. Por fim, é crucial a realização de experimentos para que possamos confirmar que

monócitos infectados, ou não, tornam-se mais susceptíveis a apoptose e se esta é uma forma

de estratégia adotada pelo DENV para burlar as defesas inatas do hospedeiro, garantindo sua

sobrevivência e disseminação. Para isso, o uso de inibidores apoptóticos, como inibidores de

caspases e Acs anti-TNF, e a utilização da técnica de TUNEL são importantes ferramentas

para que possamos correlacionar as taxas de infecção por DENV-2 com a apoptose.

103

Desta forma, poderemos expandir nossos conhecimentos de forma a incorporá-los

como intervenções estratégicas de prevenção e terapia para controle da Dengue e,

futuramente, suas aplicações na clínica.

104

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120

9. ANEXO

121

ANEXO I

1 2

250

500

750

1000

MOCK

Inativado

Infeccioso

Tempo (dias)

Concentração (Pg/mL)

Cinética de produção de citocina pró-inflamatória TNF-α por monócitos humanos infectados in vitro por

DENV-2 (16681). (Reis, Gandini et al., 2006).

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