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IDENTIFICAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES
EM CÂNCER DE MAMA ATRAVÉS DA TÉCNICA
DE MICROARRAY UTILIZANDO UMA PLATAFORMA
DE EXONS TUMOR-ASSOCIADOS
MARIA CRISTINA RODRIGUES RANGEL
Tese de Doutorado apresentada à Fundação
Antônio Prudente para a obtenção do Grau de
Doutor em Ciências
Área de Concentração: Oncologia
Orientadora: Dra. Dirce Maria Carraro
Co-Orientadora: Dra. Helena Paula Brentani
São Paulo
2008
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca da Fundação Antônio Prudente
Rangel, Maria Cristina Rodrigues
Identificação de marcadores moleculares em câncer de mama
através da técnica de microarray utilizando uma plataforma de
exons tumor-associados / Maria Cristina Rodrigues Rangel – São
Paulo, 2008.
166p.
Tese(Doutorado)-Fundação Antônio Prudente.
Curso de Pós-Graduação em Ciências-Área de concentração:
Oncologia.
Orientadora: Dra. Dirce Maria Carraro
Descritores: 1. CÂNCER DA MAMA. 2. PROCESSAMENTO
ALTERNATIVO. 3. EXONS. 4. ANALISES MICROARRAY.
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“Mas a ciência e a vida de todo dia não podem e não devem ser separadas.
A ciência, para mim, (...) é baseada em fato, conhecimento e
experimentação.”
Rosalind Franklin
“Plante seu jardim e decore sua alma, ao invés de esperar que alguém lhe
traga flores...E você aprende que realmente pode suportar...que realmente é
forte, e que pode ir mais longe, depois de pensar que não pode mais...”
Willian Shakespeare
DEDICATÓRIA
A Deus, meu criador
Ao meu marido Eros, minha fortaleza
À minha família, que sempre acreditou em mim, rezou e torceu por cada
conquista
Aos meus amigos, companheiros incondicionais
Às pacientes que contribuíram para este trabalho
Ao querido tio João que lutou até o fim contra o câncer, mas teve sua missão
encerrada aos 03 de maio deste ano,
Dedico.
AGRADECIMENTOS
A Deus pela vida, por me permitir chegar até aqui e por me dar forças e
sabedoria para continuar nesta caminhada.
Em especial à minha orientadora Dra. Dirce Maria Carraro pela amizade,
e por todo o apoio e dedicação. Obrigada pela paciência e confiança ao longo
desses anos, e pela oportunidade de realizar este trabalho da melhor forma.
À minha co-orientadora Dra. Helena P. Brentani pela fundamental
contribuição e pelas importantes sugestões ao longo deste trabalho. Obrigada
por estar sempre disponível a ajudar.
Ao Hospital A.C. Camargo e Fundação Antônio Prudente, São Paulo, na
pessoa do ilustre diretor Dr. Ricardo Renzo Brentani.
Ao Instituto Ludwig de Pesquisa Sobre o Câncer, São Paulo, na pessoa
da ilustre diretora Dra. Luisa Lina Villa.
À Dra. Luisa Villa agradeço em especial pelo grande exemplo, e por todo
o carinho e amizade. Muito obrigada pelo incentivo e disponibilidade em ajudar.
Ao Dr. Sandro J. de Souza pela colaboração e importantes sugestões.
Ao Departamento de Anatomia Patológica do Hospital A.C. Camargo em
nome do Dr. Fernando Augusto Soares.
A todos os integrantes do Laboratório de Biologia Molecular e Genômica
do Hospital A.C. Camargo pela convivência, amizade, apoio e ensinamentos.
Aderbal, Alexandre, Elen, Elisa, Eloísa, Fábio, Felipe, Gustavo, Louise, Luana,
Mariana, Mev, Nádia, Sabrina, Thiago e Vera. Obrigada pelos bons momentos
vividos dentro e fora do laboratório.
Aos grandes amigos: Thiago (‘Kakóviski’), por todo ensinamento sobre
petulância, pela amizade incondicional e muitas, muitas risadas; Nádia
(‘Friendoca’) pela força e incentivo durante todos esses anos, por toda
dedicação e tempo dispensados, pelos bons conselhos e por sempre me
compreender
; Sabrina (‘Salssitcha’), pelo exemplo de organização e resolução
de problemas, pela imensa ajuda com tudo, pelas risadas e pelos inesquecíveis
abraços de urso! Elen (‘Tchuca’), pelo exemplo de doação e perseverança,
obrigada por toda a ajuda, pela amizade sincera e por sempre me ouvir e
incentivar; Mev (‘Mevita’) pelos momentos de reflexão sobre a vida no cafézinho
ou Rei do Mate, obrigada por tudo ‘amiguinha’, principalmente pelo exemplo de
otimismo
; Aderbal (‘Dedé’) pela amizade repleta de risadas, bons momentos e
‘lindas’ canções. Enfim, meus amigos obrigada por acreditarem em mim, pelos
ensinamentos e por sempre lerem em meu olhar o que estava sentindo, me
apoiarem incondicionalmente e serem responsáveis por momentos
inesquecíveis que me lembrarei com muita saudade! Amizades sinceras que
sempre cultivarei!
A todos os amigos mais que especiais que colaboraram de alguma forma
para a execução deste trabalho: Elisa, Elen, Jane, Laura, Louise e Reimar. Sem
vocês, cada um do seu modo, certamente tudo teria sido mais difícil. Muito
obrigada por tudo e pelo carinho! À amiga Mariana (‘Mari’) quero agradecer pela
disponibilidade em me ajudar muitas vezes também e pela amizade sincera!
À amiga Natanja Kirschbaum-Slager pela importante contribuição neste
trabalho, pela amizade e as inesquecíveis conversas sobre o futuro.
A todos os inesquecíveis ex-integrantes do Laboratório de Biologia
Molecular que fizeram parte da minha jornada aqui, mas seguiram antes de
mim: Adriana (‘Heydrian’), Jamila, Jane (‘Jeyne’), Laura (‘Laurita’), Leandra,
Paulo (‘Meso’), Rafael, Reimar (‘Rei do Mar’), Waleska (‘Wal’) e Wilson (‘Wirso’).
Obrigada pelo imenso carinho e amizade!
Aos queridos ‘agregados’ do Laboratório de Biologia Molecular e
Genômica: David (‘Davidson’), Fernanda, L. Paulo, Rodolfo (‘Rodis’) e Rodrigo,
com quem pude compartilhar muitos bons momentos ao longo desses anos!
À Dra. Maria do Socorro Maciel e à Dra. Adriane Pimentel pela grande
ajuda na revisão dos prontuários, em especial à Dra. Socorro pela amizade e
todo aprendizado.
Ao Dr. João Gonçalves pelas análises estatísticas da parte clínica e pelo
aprendizado.
À Dra. Sabrina Silva, pela imensa ajuda com a parte clínica deste
trabalho.
Às meninas da Patologia, Fernanda, Alexandra, Yukie, Luciane e Edaíse
pela amizade e pelos bons momentos passados juntas (até os com o prof ‘De’!).
Às amigas Walleska Martins, Elza Durham, Nair Muto e Bárbara Melo
pelo carinho, pelas inesquecíveis conversas e bons momentos vividos juntas.
Ao André Silva pela boa vontade em ajudar na localização das amostras.
Aos colegas do Laboratório de Biologia Computacional do Hospital A. C.
Camargo. Ao Luiz Paulo pela análise dos dados de microarray, ao Daniel pelo
auxílio com o mapeamento das membranas, e ao Dr. Eduardo Abrantes, Diogo,
César e Arthur pela atenção de sempre e disponibilidade em ajudar.
Aos colegas do Laboratório de Biologia Molecular e Genômica do
Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer em nome da Dra. Anamaria A.
Camargo. Em especial à Anna Chris que me ajudou muito com as primeiras
hibridizações, ao Murilo Vieira (ex-integrante) pela ajuda com o GeNorm, à
Valéria Paixão, sempre pronta a ajudar em tudo, ao Ricardo Moura pela atenção
de sempre, à MaCris pela ajuda com o seqüenciamento, à Ana Paula Medeiros
pela disponibilidade em ajudar com o Real Time, enfim à todos os integrantes e
companheiros pela atenção de sempre e disponibilidade em ajudar.
Aos funcionários Carlinhos, Severino e Miuky pela confecção das
lâminas histopatológicas utilizadas neste estudo.
Ao Dr. Hugo Campos e Dra. Cíntia Ozório pela revisão das lâminas
histopatológicas. À Dra. Cíntia em especial pela atenção e boa vontade em
esclarecer minhas dúvidas no corredor.
Ao Dr. Humberto Torloni e a Sra. Hirde Contesini, responsáveis pelo
SAME (Serviço de Arquivo Médico) e a todos os funcionários pelo auxílio na
obtenção dos prontuários.
À pós-graduação da Fundação Antônio Prudente, pela grande
contribuição à pesquisa científica. Em especial ao diretor Dr. Luiz Fernando L.
Reis, à coordenadora Ana Maria A. Kuninari e à secretária Luciana Pitombeira,
pela excelente administração, auxílio constante e grande competência.
Às queridas funcionárias da biblioteca da Fundação Antônio Prudente em
nome da Sra. Suely Francisco. Agradeço por sempre dispensaram sua atenção
e tempo comigo. Agradeço também pela amizade e imensa colaboração na
obtenção do material bibliográfico para o desenvolvimento deste manuscrito e
sua revisão criteriosa. Em especial agradeço à ‘Su’, ‘Fran’ e Rosi’ que
acompanham minha jornada desde o começo e sempre foram muito amáveis.
À Banca de qualificação: Dra. Anamaria Aranha Camargo, Dr. Eduardo
Moraes Rego Reis, Dra. Maria Aparecida Koike Folgueira e à Dra. Ana Tereza
Ribeiro de Vasconscelos, pela importante contribuição durante esses anos,
através de críticas e sugestões que foram fundamentais no decorrer do
desenvolvimento deste trabalho.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
pelo apoio financeiro e ao parecerista pelas críticas e sugestões durante a
análise dos relatórios científicos.
Ao Dr. Alex Fiorini de Carvalho e Chamberlein Mendonça, do Microarray
Facility, pela confecção da membrana de microarray e por todo o aprendizado.
Às pacientes que cooperaram com esta pesquisa. Sem vocês
simplesmente não seria possível.
Aos queridos amigos Erika Taniguti (‘Gueixita’), Carolina Cappi (‘Carol’),
Andrea Glatt (‘Dêa’), Jeanne Andrade (‘Jê’), Marcelo Zerillo (‘Ma’), Marcos
Ternero (‘Suba’), Mônica Serra (‘Monikinha’), (UNESP), Anastásia Staack
(‘Stase’), Ana Márcia Cardoso, Laila Salman (‘Lailita’), Liane Leobons (‘Li’),
Renata Cobianchi (‘Rê’), Leonardo Moraes (‘Leo’), Maria Tereza Aquino
(‘Teresoca’), Thamy Quintanilha, (LORENA), Daniela Truffi (‘Dani’), Thayne
Munhoz (‘Tha’), Viviane Rezende (‘Vivi’), (USP-ESALQ), que mesmo longe,
estarão sempre presentes. Obrigada pelo carinho e amizade!
Ao meu amigo inseparável ‘Ma’ agradeço em especial pelos momentos
inesquecíveis desde o tempo da Faculdade, pela paciência, carinho e toda a
confiança durante esses anos. Obrigada também por me fazer dar tanta risada
e me tornar uma pessoa mais feliz!
À querida D. Irene, que me acolheu com muito amor em minha chegada
a Rio Claro, e aos amigos Andréa, Baço e Pixuco pelo carinho e acolhida.
Aos meus grandes amigos e padrinhos Nádia Castro e Marcelo Zerillo,
que além de me ouvirem, apoiarem incondicionalmente e sempre se importarem
comigo, mudaram o rumo da minha vida. Obrigada por sempre me incentivarem
e por me ajudarem a realizar este trabalho da melhor forma possível.
À Dra. Cláudia B. Monteiro-Vitorello, grande amiga e exemplo de
pesquisadora que levarei por toda a minha vida. Obrigada pela grande ajuda,
pelos ensinamentos e por sempre ter acreditado em mim!
Ao Dr. Luis Eduardo Aranha Camargo, pela oportunidade, carinho e
amizade. Devo a você muito do que sou hoje!
Ao Dr. Carlos F. M. Menck, exemplo admirável de inteligência e amor à
ciência, obrigada pela oportunidade e por todo o aprendizado.
Ao Dr. Januário B. Cabral Neto, que me abriu as portas para a Ciência e
me inspirou a ser quem sou hoje. Obrigada pela oportunidade de ter te
conhecido como pessoa e cientista.
Em especial aos meus pais queridos, Sérgio e Telma, pelo exemplo de
caráter, determinação e união familiar. Por terem anulado seus sonhos muitas
vezes em função dos meus e por seu esforço constante em me oferecer as
melhores condições para que eu chegasse até aqui. Obrigada por todo o amor
e por sempre acreditarem em mim!
Aos meus amados irmãos Sérgio, Renato e Thaís (Tati), e minha
cunhada Kariza por todo apoio, ajuda, paciência e cuidado ao longo desses
anos. Obrigada principalmente pela amizade verdadeira!
Tati, em especial quero agradecer a você por todo companheirismo e
compreensão nesta caminhada. Obrigada por me livrar de alguns apuros
também! Ao Serginho, em especial, muito obrigada pela ajuda fundamental com
o inglês! Renato e Kariza obrigada principalmente pelo maior presente que pude
receber durante esses anos: Gigi e Gabi!
Às minhas lindas princesas Giovanna e Gabriela. Vocês são a alegria da
‘tia-dinda’ e meu principal incentivo!
À minha família no Rio em nome da minha avó Alidéa e da tia-dinda
Vany, e à família do Eros em Lorena em nome da minha sogra Dona ‘Marilu’
(todos os meus amados sobrinhos e cunhados), que sempre estiveram em meu
coração e me apoiaram e incentivaram durante esta longa caminhada. Obrigada
a cada um pelo amor, carinho e pela compreensão da minha ausência.
Aos meus queridos padrinhos, Vany e Moacyr, grandes exemplos de
sabedoria, dedicação e oração.
Ao meu inesquecível e amado primo Robson. Obrigada pelo amor e lição
de vida. Você será sempre um exemplo alegria, bondade e altruísmo pra mim!
Ao meu amado marido Eros. Obrigada pela compreensão e
companheirismo ao longo desses anos e pelo amor incondicional. Pelo olhar
carinhoso, quando eu mais precisava e pelas palavras de consolo quando eu
mais me desesperava. Por seu apoio constante, imensa ajuda, paciência e
presença em todos os momentos, principalmente nos mais difíceis. Obrigada
meu amor por ser quem você é! Sem você ao meu lado eu simplesmente não
teria conseguido!
RESUMO
Rangel, MCR. Identificação de marcadores moleculares em câncer de
mama através da técnica de microarray utilizando uma plataforma de
exons tumor-associados. São Paulo; 2008. [Tese de Doutorado-Fundação
Antônio Prudente]
Análises recentes têm mostrado a ocorrência de splicing alternativo (AS) do
mRNA em pelo menos 60% dos genes humanos, sendo que 80% desses
eventos ocorrem dentro da região codificadora, aumentando a diversidade
proteômica. Sabe-se que algumas variantes geradas por AS são
preferencialmente expressas em tumores humanos e são potenciais
marcadores moleculares, podendo contribuir para o desenvolvimento de
fatores diagnósticos e prognósticos mais precisos, assim como novos alvos
terapêuticos. Para identificar variantes de splicing diferencialmente
reguladas em câncer de mama, 270 exons expressos em tecidos tumorais
foram selecionados através de uma análise computacional, dos quais 75
foram associados a mama, por apresentarem expressão em bibliotecas
originadas de tecido tumoral de mama e não no correspondente normal.
Esses exons foram imobilizados em membranas de nylon juntamente com
controles positivos e negativos, e hibridizados contra amostras tumorais e
normais de mama. Para identificar os exons mais expressos em tecidos
tumorais, três comparações foram realizadas: 4 amostras de linhagem
tumoral contra 2 de linhagem normal de mama (LTxLN), 27 amostras de
tecido tumoral contra 5 de tecido não neoplásico de mama (TxN), e
comparação entre 4 amostras de tecido pareadas tumor-normal (PTxPN).
Foi aplicado o teste TStudent para determinar os exons diferencialmente
expressos (p<0,05) em cada comparação (LTxLN; TxN; PTxPN), sendo
identificados como superexpressos 24 exons na comparação LTxLN, 79
exons na comparação TxN e 195 exons na comparação PTxPN. Para
validação técnica, foram selecionados aqueles exons que apresentaram fold
change ≥ 3 em amostras tumorais e que foram identificados em pelo menos
2 comparações. Quatorze exons foram identificados pelos experimentos de
microarray, os quais foram avaliados através de RT-PCR quantitativo (qRT-
PCR), usando o mesmo grupo de amostras já utilizadas anteriormente. Para
testar se os exons selecionados por microarray pertenciam, de fato, à
variantes de splicing superexpressas e não ao gene como um todo, foram
adotados 2 critérios: (1) validação por qRT-PCR da variante que contém o
exon superexpresso (VCE) (fold change ≥ 3); (2) para os candidatos
confirmados pelo critério (1), avaliação da expressão do gene como um todo
(através da análise da expressão constitutiva do gene). Três VCE foram
confirmadas através de qRT-PCR como superexpressas em tumor de
mama, sendo elas TRIM37-VCE, MK-STYX-VCE e BRRN1-VCE. A
expressão constitutiva do gene (EC) foi analisada por qRT-PCR, através do
desenho de iniciadores em exons constitutivos, isto é, presente em todas as
variantes do gene. Os resultados mostraram que a razão do nível de
expressão entre as 3 VCE e a expressão constitutiva do gene (VCE/EC) foi
significativamente maior em amostras tumorais de mama quando
comparadas às amostras normais (p<0,05), sugerindo que TRIM37-VCE,
MK-STYX-VCE e BRRN1-VCE são, de fato, variantes de splicing
superexpressas em câncer de mama. Essas variantes foram também
avaliadas em um grupo independente de 40 amostras tumorais de mama
para validar biologicamente a superexpressão da VCE em amostras
tumorais de mama quando comparadas às amostras normais. Todos os
dados foram correlacionados com características clínicas e histopatológicas
das amostras, e algumas associações significativas foram encontradas, tais
como a expressão de receptores de estrógeno (ER+) e progesterona (PgR+)
com TRIM37-VCE. Embora um maior grupo de dados experimentais seja
requerido para a completa exploração do estudo desenvolvido, os resultados
sugerem 3 variantes de splicing superexpressas em carcinoma ductal de
mama, candidatos a marcadores moleculares.
SUMMARY
Rangel, MCR. [Identification of breast cancer molecular markers
through microarray technology using a tumor-associated exons
platform]. São Paulo; 2008. [Tese de Doutorado-Fundação Antônio
Prudente]
Current analyses have shown that alternative mRNA splicing (AS) appears in
at least 60% of human genes and 80% of these events occurs within the
coding region, increasing the proteomic diversity. Some AS variants have
been preferentially expressed in human tumors and are potential molecular
markers, contributing to the development of more accurate diagnostic and
prognostic factors as well as therapeutic targets. To identify differentially
regulated splicing variants in breast cancer, 270 exons expressed in tumor
tissues were selected by a computational analysis, of which 75 were
associated with breast, because they are found to be expressed in libraries
that originated from breast tumors and they were not found in the
corresponding normal libraries. These exons were immobilized on nylon
membranes together with positive and negative controls, and hybridized
against tumor and normal breast samples. To identify the most highly
expressed exons in tumor tissues, 3 comparisons were performed: 4 tumor
against 2 normal breast cell lines (LTxLN), 27 tumor against 5 non-neoplasic
breast tissues (TxN) and 4 matched tumor-normal samples (PTxPN). A T-
student test was used to select for differentially expressed exons (p<0.05) in
each comparison (LTxLN; TxN; PTxPN). Here, 24 were selected as over
expressed exons in the LTxLN comparison, 79 exons in the TxN comparison
and 195 exons in the PTxPN comparison. For technical validation, those
exons having a fold change of ≥ 3 in tumor samples and being present in at
least 2 comparisons were selected. Fourteen exons were identified by
microarray experiments and evaluated through quantitative RT-PCR (qRT-
PCR), using the same sample set utilized previously. In order to test whether
the exons selected by microarray experiments belonged to a prone over
expressed splicing variant, 2 criteria were adopted: (1) Validation by qRT-
PCR of the variant that comprises the selected over expressed exon (VCE)
(fold change ≥ 3); (2) For those exons confirmed in criterion (1), evaluation of
whole gene expression (through the analysis of constitutive gene expression)
is adopted as a secondary criterium. Three of the VCE’s were confirmed
through qRT-PCR as being over expressed in breast tumor, such as
TRIM37-VCE, MK-STYX-VCE and BRRN1-VCE. The constitutive expression
of the gene (EC) was analyzed by qRT-PCR, through the primer design
within constitutive exons, that is, present in all variants of the gene. The
results showed that the expression level ratio between the 3 VCE’s and the
constitutive expression of genes (VCE/EC) was significantly higher in tumor
samples when compared to normal samples (p<0.05), suggesting that
TRIM37-VCE, MK-STYX-VCE and BRRN1-VCE are indeed breast tumor
associated variants. These variants were also evaluated in an independent
set of 40 breast tumor samples to biologically validate the VCE over
expression in tumor samples as compared to normal samples. All data were
correlated with clinical and histopathological samples features, and some
significative associations were found, such as the expression of estrogen
(ER+) and progesterone (PgR+) receptors with TRIM37-VCE. Although an
increase of the experimental data is required for the complete exploration of
this study, the results suggest 3 splicing variants that are over expressed in
ductal carcinoma of the breast, and are candidates for molecular markers.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Tipos de splicing alternativo 18
Figura 2 Seqüenciamento do exon 115538_6 39
Figura 3 Representação das bandas 28S e 18S de RNA
ribossomal de 3 amostras de tecido tumoral extraídas
por CsCl 45
Figura 4 Representação de RNAa de 3 linhagens celulares de
mama-1: MDA-MB-435; 2: MDA-MB-231 e 3: MCF7. 47
Figura 5 Representação de RNAa de 4 amostras de tecido
tumoral de mama- 1: 19T, 2: 26T; 3: 27T; 4: 28T. 47
Figura 6 Representação esquemática do pareamento dos
iniciadores na VCE (a) e na VSE (b). 54
Figura 7 Esquema 1 = Representação hipotética do pareamento
inespecífico do iniciador F-SE na variante com o exon
(VCE).
57
Figura 8 Modelo matemático para quantificação relativa em
qRT-PCR. 63
Figura 9 Representação de alguns produtos amplificados. 66
Figura 10 Representação de membrana hibridizada com amostra
de tecido tumoral de mama. 68
Figura 11 Gráfico de Correlação de Pearson. 70
Figura 12 Gráfico de dispersão - amostra MN04. 71
Figura 13 Gráfico representativo da intensidade média dos exons
em relação à extremidade 3’. 72
Figura 14 Diagrama de Venn, representando os exons que
apareceram superexpressos nas comparações.
76
Figura 15 Bay Boots. a: exon 4363_4; b: exon 89442_12 e c:
exon 115216_14.
78
Figura 16 Representação esquemática do desenho dos
iniciadores nas seqüências da VCE do gene TRIM37. 83
Figura 17 Representação dos produtos amplificados por RT-PCR
para o gene GAPDH
1101
, confirmando o tamanho
esperado de 102pb.
84
Figura 18 Representação das VCE amplificadas com a enzima
Taq Gold (Applied Biosystems) na temperatura de
54ºC. 84
Figura 19 Análise pelo programa geNorm para a identificação
dos genes mais estáveis para o conjunto de amostras
utilizadas no presente estudo. 86
Figura 20 Gráfico da média dos valores de estabilidade de
expressão dos genes GAPDH, ACTB, HPRT, RPLP0 e
BCR. 87
Figura 21 Análise pelo programa geNorm dos normalizadores
para a identificação dos genes mais estáveis no
conjunto de amostras utilizadas nesse estudo. 88
Figura 22 Gráfico da média dos valores de estabilidade de
expressão dos genes GAPDH, ACTB e HPRT. 89
Figura 23 Gráficos representando à curva de dissociação, os
CTs das triplicatas e a curva padrão para o gene
GAPDH e VCE do gene TRIM37 respectivamente. 92
Figura 24 Gráficos de amplificação das amostras e a curva de
dissociação para os genes GAPDH e da VCE do gene
TRIM37 respectivamente.
94
Figura 25 Representação esquemática do pareamento dos
iniciadores. 97
Figura 26 Representação dos produtos amplificados utilizando
iniciadores no exon 1 e 3. Em todos os genes houve
amplificação da variante VCE, mais forte, e VSE, mais
fraca. 98
Figura 27 Alinhamento das seqüências das 2 variantes (VCE e
VSE) seqüenciadas do gene TRIM37 contra o genoma
humano e seqüências de mRNA disponíveis nos
bancos de dados, com auxílio da ferramenta BLAT
(UCSC).
100
Figura 28 Representação esquemática do desenho dos
iniciadores nas seqüências da variante VSE do gene
TRIM37.
101
Figura 29 Esquema 2 103
Figura 30 Representação do teste de especificidade do iniciador
F-VSE1.3 para os genes TRIM37, MK-STYX e BRRN1.
104
Figura 31 Análise entre VCE e VSE pertencentes aos genes
TRIM37 e MK-STYX. 106
Figura 32 Análise entre VCE e o fragmento correspondente à
expressão constitutiva dos genes TRIM37, MK-STYX e
BRRN1. 107
Figura 33 Análise entre VCE e o fragmento correspondente à
expressão constitutiva dos genes TRIM37, MK-STYX e
BRRN1. 109
Figura 34 Análise entre VCE e o fragmento correspondente à
expressão constitutiva dos genes TRIM37, MK-STYX e
BRRN1. 110
Figura 35 Mapeamento do exon associado a tumor pertencente à
VCE do gene TRIM37 na seqüência protéica.
111
Figura 36 Mapeamento do exon associado a tumor pertencente à
VCE do gene MK-STYX na seqüência protéica.
112
Figura 37 Mapeamento do exon associado a tumor pertencente à
VCE do gene BRRN1 na seqüência protéica. 112
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Número de exons associados a tumores para cada
tecido analisado através de análise computacional. 28
Tabela 2 Exons superexpressos em tumor em 3 comparações.
75
Tabela 3 Exons selecionados para marcador molecular entre as
comparações TxN, PTxPN e LTxLN.
80
Tabela 4 Iniciadores forward e reverse para cada gene. F-CE:
forward, desenhado inteiro no exon 2; R: reverse,
desenhado no exon 3. 82
Tabela 5 Genes e seus respectivos valores de slope, eficiência
e coeficiente de regressão (R2).
93
Tabela 6 Resumo dos resultados de expressão relativa das
amostras tumorais em relação às normais das
variantes com o exon (VCE) para os 13 genes
avaliados. 95
Tabela 7 Análise da VSE dos 3 genes através de
seqüenciamento e evidências em bancos de dados. 99
Tabela 8 Iniciadores forward e reverse para cada gene. F-
VSE1.3: forward da variante sem o exon, desenhado
na junção entre o exon 1 e o exon 3; R: reverse,
desenhado no exon 3.
101
Tabela 9 VSE dos genes TRIM37 e MK-STYX e seus
respectivos valores de slope, eficiência e coeficiente
de regressão (R2). 105
Tabela 10 Fragmento correspondente à expressão constitutiva
dos genes TRIM37, MK-STYX e BRRN1, e seus
respectivos valores de slope, eficiência e coeficiente
de regressão (R2) 107
Tabela 11 Dados clinicopatológicos, demográficos e sobre o
tratamento dos pacientes portadores de carcinoma
ductal invasivo de mama incluídos neste estudo. 116
Tabela 12 Associação entre a VCE do gene TRIM37 e as
variáveis clinicopatológicas.
118
Tabela 13 Associação entre a expressão da VCE do gene
TRIM37 nas amostras ER+ e a variável menarca.
119
Tabela 14 Associação entre a expressão da VCE do gene
TRIM37 nas amostras PgR+ e a variável faixa etária.
119
Tabela 15 Associação entre a relação VCE/EC do gene TRIM37
e as variáveis clinicopatológicas. 120
Tabela 16 Associação entre a expressão da VCE do gene MK-
STYX e as variáveis clinicopatológicas. 121
Tabela 17 Associação entre a expressão da razão VCE/EC do
gene MK-STYX e as variáveis clinicopatológicas. 122
Tabela 18 Associação entre a relação VCE/EC do gene MK-
STYX nas amostras não menopausa e os estádios
clínicos I e II. 123
Tabela 19 Associação entre a expressão da VCE do gene
BRRN1 e as variáveis clinicopatológicas. 123
Tabela 20 Associação entre a relação VCE/EC do gene BRRN1 e
as variáveis clinicopatológicas.
124
LISTA DE ABREVIAÇÕES
AJCC do inglês The American Joint Committee on Cancer
AS do inglês Alternative Splicing
BLAST do inglês Basic Local Alignment Search Tool
BRCA 1 do inglês Breast Cancer Gene 1
BRCA 2 do inglês Breast Cancer Gene 2
CDS do inglês Coding Sequence
CsCl Cloreto de Césio
cDNA do inglês complementary DNA
cm centímetro
C
T
do inglês Cycle Treshold
DCIS do inglês Ductal Carcinoma in situ
DNA do inglês deoxyribonucleic acid
dNTP do inglês deoxynucleoside 5’ triphosphato
DEPC do inglês Di-etil pirocarbonato
DTT do inglês 1,4-dithiothreitol
EC Expressão constitutiva do gene
EDTA do inglês ethylenediamine tetraacetate
ER do inglês Estrogen Receptor
ERBB2 Membro da família de receptores de fator de crescimento
epidermal
ESE do inglês Exonic Splicing Enhancers
ESS do inglês Exonic Splicing Silencer
ESTs do inglês Expressed Sequence Tags
FAPESP Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São
Paulo
HB4a Linhagem de células epiteliais mamárias humanas
HB4a C5.2 Linhagem de células epiteliais mamárias humanas transfectada
com o oncogene ERBB2
hnRNP A1 do inglês heterogeneous nuclear ribonueoprotein A1
IDC do inglês Invasive Ductal Carcinoma
IPTG do inglês isopropyl-
β
-D-thiogalactoside
ISE do inglês Intronic Splicing Enhancers)
ISS do inglês Intronic Splicing Silencer
M Molar
MgCl
2
Cloreto de Magnésio
mL Mililitro
mM Milimolar
MM Microdissecção Manual
mm milímetro
mRNA do inglês messenger RNA
NaCl do inglês sodium chloride
NCBI do inglês National Center for Biotechnology Information
ng nanograma
nm nanômetro
ORF do inglês Open Reading Frame
PCR do inglês polimerase chain reaction
pb pares de base
PgR do inglês Progesterone Receptor
pH do inglês hydrogen ionic potential
Poli-A do inglês polyadenylate
qRT-PCR do inglês Quantitative Reverse transcriptase –
polymerase chain reaction
RNA do inglês acid ribonucleic
rpm do inglês rotation per minute
RT-PCR do inglês Reverse transcriptase – polymerase chain
reaction
RNAa do inglês amplified RNA
rpm rotações por minuto
SAGE do inglês Serial Analysis of Gene Expression
siRNA do inglês small interfering RNA
snRNPs do inglês small nuclear ribonucleoproteins
Taq Thermus aquaticus
Tris do inglês hydroxymethyl aminomethane
UICC do francês Union Internationale Contre le Cancer
U Unidade
VCE Variante com o exon associado a tumor
VSE Variante sem o exon associado a tumor
µg microgramas
µg/µL microgramas por microlitro
µL microlitro
µm micrometro
µM micromolar
°C graus Celsius
> Maior
< Menor
X-GAL do inglês 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside
ÍNDICE
1 INTRODUÇÃO 1
1.1 Câncer de mama 1
1.2 A genética do câncer de mama 5
1.3 Marcadores moleculares e câncer 9
1.4 Splicing Alternativo 15
1.5 O estudo do splicing alternativo na busca por novos marcadores
moleculares 21
2 OBJETIVOS 30
2.1 Objetivo Geral 30
2.2 Objetivos específicos 30
3 MATERIAIS E MÉTODOS 32
3.1 Comitê de Ética em Pesquisa 32
3.2 Construção da Plataforma de microarray 32
3.2.1 Escolha dos iniciadores para extensão dos fragmentos 32
3.2.2 DNA molde para extensão dos fragmentos 33
3.2.3 Extensão dos fragmentos 34
3.2.4 Desenho dos iniciadores para extensão de fragmentos dos genes
GAPDH e ACTB 35
3.2.5 Purificação dos fragmentos 37
3.2.6 Clonagem, seqüenciamento e análise das seqüências 37
3.2.7 Construção das membranas 39
3.3 Amostras 41
3.3.1 Amostras utilizadas nos expreimentos de microarray e validação
através de RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) 41
3.3.2 Amostras utilizadas para validação em um grupo independente
através de qRT-PCR 43
3.4 Extração de RNA 44
3.4.1 Avaliação da qualidade do RNA extraído 44
3.5 Amplificação de RNA (RNAa) 45
3.5.1 Avaliação da qualidade do RNA amplificado (RNAa) 46
3.6 Marcação e Hibridização 47
3.7 Captura do dados 49
3.8 Correção do valor de sinal obtido 49
3.9 Remoção dos outliers 50
3.10 Normalização do dados 50
3.11 Controle de qualidade experimental das membranas 50
3.12 Análise estatística 51
3.13 Análise dos genes em bancos de SAGE 52
3.14 Validação através da análise do nível de expressão por RT-
PCR em tempo real (qRT-PCR) 53
3.14.1 Desenho dos iniciadores 53
3.14.2 Síntese de cDNA 55
3.14.3 Estabelecimento das condições da reação de RT-PCR 56
3.14.4 Teste de especificidade do iniciador forward da variante sem o
exon (VSE) desenhado na junção exon1-exon3 57
3.14.5 RT-PCR em tempo real (qRT-PCR) 58
3.14.6 Padronização das concentrações de cDNA e de iniciadores 59
3.14.7 Seleção dos genes normalizadores 61
3.14.8 Análise dos dados de expressão gênica 62
3.14.9Análises Estatísticas 63
3.15 Análises clínicas e histopatológicas 64
4 RESULTADOS 66
4.1 Construção da Plataforma 66
4.1.1 Extensão dos fragmentos 66
4.1.2 Clonagem, seqüenciamento e análise das seqüências 67
4.2 Marcação e Hibridização 67
4.3 Controle de qualidade experimental das membranas 69
4.4 Análise dos dados de microarray 73
4.4.1 Resultados das comparações 74
4.4.2 Representatividade dos exons previamente selecionados pela
análise computacional como associados a tumor de mama 75
4.4.3 Seleção dos exons superexpressos para confirmação através de
RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) 76
4.4.4 Análise de expressão dos genes correspondentes a cada exon
em bancos de SAGE 79
4.5 Confirmação da superexpressão do exon através de qRT-PCR 81
4.5.1 Avaliação da VCE através de qRT-PCR 81
4.6 Confirmação da superexpressão da VCE e não do gene como um
todo 95
4.6.1 Identificação da seqüência correspondente à junção exon1-exon3 98
4.6.2 Teste de especificidade dos iniciadores desenhados nas junções
exon1-exon3 102
4.6.3 Avaliação por qRT-PCR da variantes sem o exon (VSE) 105
4.6.4 Avaliação da expressão por qRT-PCR do gene como um todo
através de iniciadores desenhados em 2 exons constitutivos 106
4.7 Confirmação da superexpressão da VCE em relação ao
seu respectivo gene em um grupo independente de amostras 108
4.8 Identificação dos domínios funcionais através das seqüências
protéicas do gene e da VCE 110
4.9 Características clínicas e histopatológicas das amostras 113
4.10 Correlação entre as variáveis clínicas e histopatológicas e os
dados de expressão obtidos 117
5 DISCUSSÃO 126
6 CONCLUSÕES 144
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 145
ANEXOS
Anexo 1 cTNM
Anexo 2 pTNM
Anexo 3 Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa
Anexo 4 Consentimento Informado
Anexo 5 Gel de agarose 1%
Anexo 6 Amostras
Anexo 7 Linhagens Celulares
Anexo 8 Extração de RNA por CsCl
Anexo 9 Extração de RNA por TRIzol
®
Reagent
Anexo 10 Amplificação de RNA (RNAa)
Anexo 11 Gráficos de amplificação das amostras por qRT-PCR e
curva de dissociação obtida para todas as VCE estudadas
Anexo 12 Amostras Independentes
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 CÂNCER DE MAMA
O câncer de mama está entre as neoplasias de maior incidência no
mundo todo e é uma das mais importantes causas de mortalidade por
câncer em mulheres, sendo responsável por um quinto dos óbitos em
mulheres na faixa etária entre 40 e 50 anos (RADICE e REDAELLI 2003).
No Brasil, de acordo com as estimativas de incidência de neoplasias para
2008, será o segundo câncer mais incidente, com 49.400 casos e um risco
médio estimado de 51 casos a cada 100 mil mulheres. Na região Sudeste, o
câncer de mama é o mais incidente entre as mulheres com um risco
estimado de 68 novos casos por 100 mil. Depois dos tumores de pele não
melanoma, o câncer de mama é também o mais freqüente nas mulheres das
regiões Sul (67/100.000), Centro-Oeste (38/100.000) e Nordeste
(28/100.000). Na região Norte é o segundo câncer mais incidente
(16/100.000) (Ministério da Saúde 2008).
Histologicamente o câncer de mama pode se apresentar sob a forma
de carcinoma in situ e invasivo, e 90% dos casos pertence aos carcinomas
que se originam das células luminais do epitélio dos lóbulos e ductos da
glândula mamária, sendo o carcinoma ductal mais frequente, representando
cerca de 80% dos casos. Os carcinomas lobular in situ (cuja sigla do inglês é
LCIS) e ductal in situ (cuja sigla do inglês é DCIS) são o resultado de uma
2
proliferação anormal de células neoplásicas confinada aos lóbulos ou ductos
da glândula mamária, respectivamente. Já no carcinoma lobular invasivo
(cuja sigla do inglês é ILC) e no carcinoma ductal invasivo (cuja sigla do
inglês é IDC) as células rompem a membrana basal do epitélio lobular e
ductal, respectivamente, invadindo tecidos adjacentes e penetrando no
endotélio de vasos sangüíneos e/ou linfáticos.
A etiologia do câncer de mama é bastante complexa, sendo
influenciada tanto por fatores endógenos (história familial e níveis
hormonais), quanto exógenos (dieta e uso de contraceptivos). Outros
fatores, como menarca precoce, idade avançada (a cada 10 anos as taxas
de incidência dobram), menopausa tardia (após os 50 anos), e a
nuliparidade ou a primeira gestação após os 30 anos de idade podem
ocasionar uma maior susceptibilidade a essa doença (Ministério da Saúde
2008). Os sintomas relacionados ao aparecimento da doença incluem a
presença de nódulos palpáveis, que nem sempre provocam dor, alterações
na pele que recobre a mama e o aparecimento de nódulos na axila. A
detecção precoce da doença em conjunto com tratamentos como a
intervenção cirúrgica, terapia hormonal, quimio e radioterapia podem levar à
cura em muitos casos. Apesar de no Brasil o índice de detecção precoce ter
aumentado nos últimos anos, ainda são diagnosticados casos de câncer de
mama em estágios bastante avançados, o que dificulta muito o tratamento e
diminui as chances de cura da doença. Assim, há diversas campanhas de
âmbito nacional que estimulam o rastreamento e detecção precoce da
doença, incluindo o auto-exame das mamas, o exame clínico palpatório e a
3
mamografia. Há também exames auxiliares, como a ultra-sonografia,
exames citológicos (PAAF- punção aspirativa com agulha fina e citologia de
descarga papilar) e histopatológicos (biópsia), que combinados aumentam
ainda mais a acurácia no diagnóstico da doença.
O estadiamento do câncer de mama é baseado no sistema de
classificação TNM, que é o método mais utilizado para a classificação de
tumores malígnos e a descrição de sua extensão anatômica. Esse sistema
foi criado pela Union Internationale contre le Cancer (UICC) e pelo The
American Joint Committee on Cancer (AJCC) e está baseado tanto em
evidências anteriores ao tratamento, obtidas normalmente pelo exame físico
e diagnóstico por imagem, caracterizando o cTNM (Anexo 1), quanto em
evidências após o tratamento cirúrgico - pTNM (Anexo 2), sendo evidenciado
pelo exame histopatológico do espécime cirúrgico e dos linfonodos, para
detectar a presença ou ausência de metástases em linfonodos regionais. O
sistema TNM de classificação considera a extensão do tumor primário (T),
presença e extensão de metastáses em linfonodos regionais (N) e presença
de metástases à distância (M). Os estadios são numerados de 0 à IV, em
ordem decrescente em relação à sobrevida, sendo estadio 0: carcinoma in
situ , estadio I: carcinoma invasivo localizado, estadio II: carcinoma invasivo
localmente limitado ou espalhado regionalmente, estadio III: carcinoma
invasivo localmente extensivo ou espalhado regionalmente, e estadio IV:
carcinoma invasivo extensivo com presença de metástases à distância
(STYBLO e WOOD 1998). O tamanho do tumor e a presença de metástases
linfonodais são os mais significantes fatores de risco para a recorrência do
4
câncer de mama e a piora da sobrevida global (SMART et al. 1997). No
entanto, algumas pacientes sem acometimento de linfonodos apresentam
recorrência da doença (VAN´T VEER et al. 2002; CLARKE et al. 2005).
O grau histológico tem como base a combinação de parâmetros como
a razão de índice mitótico, grau nuclear e arranjo do tumor. De acordo com a
intensidade de cada parâmetro (discreta, moderada ou elevada) são
atribuídas pontuações (1 a 3). Assim, a soma dos 3 parâmetros fornece um
determinado valor (escore) que corresponde ao grau histológico, sendo grau
1: escore 3-5, grau 2: escore o 6 ou 7 e grau 3: escore 8 ou 9, de acordo
com Scarff-Bloom-Richardson (SBR) (DOUSSAL et al. 1989; HOWEL et al.
1994) (ANEXO 2).
Desse modo, a classificação atual é baseada principalmente em
análise clínica e histológica aliada à utilização de alguns marcadores
moleculares disponíveis, agrupando muitas vezes tumores com
comportamento clínico distinto em classes únicas (SOTIRIOU et al. 2003).
Isso se deve ao comportamento altamente heterogêneo da tumorigênese da
mama, desencadeado por alterações em genes envolvidos em vários
processos celulares que devem ser altamente controlados em uma célula
saudável, tais como proliferação e adesão celular, apoptose, reparo de DNA
e outros (SOTIRIOU et al. 2006; LONNING et al. 2007). A perda de controle
desses processos podem por sua vez desencadear uma diversidade de
alterações em outros processos celulares, conferindo a alta heterogeneidade
no câncer de mama que resulta em comportamentos clínicos bastante
5
particulares em relação à resposta a quimio e hormônioterapia, influenciando
de forma distinta na evolução da doença em cada paciente.
1.2 A GENÉTICA DO CÂNCER DE MAMA
Diversas alterações genéticas e epigenéticas (que alteram o padrão de
expressão gênica sem alterar a seqüência de DNA) têm sido detectadas em
tumores de mama envolvendo proto-oncogenes e genes supressores de
tumor (FOLGUEIRA e BRENTANI 2004; COSTA et al. 2004; CARRAWAY et
al. 2008), sendo as alterações genéticas mais comuns a amplificação gênica
e a perda de heterozigose (LOH). Além das alterações envolvendo grandes
regiões cromossômicas (duplicações, translocações, inserções e deleções),
mutações pontuais (substituições, deleções e inserções) têm sido
detectadas em tumores esporádicos e hereditários da mama (CORVELLO
1999). A forma esporádica, quando a mutação ocorre em células somáticas,
constitui mais de 90% de todos os casos, e cerca de 5-10% corresponde à
forma hereditária, a qual está associada com mutações na linhagem
germinativa.
No câncer de mama, a seqüência de eventos genéticos que
conduzem à formação de um tumor ainda não está claramente
compreendida. Entretanto, algumas alterações comumente encontradas
nesses tumores já foram descritas. Nesse processo de malignização, ocorre
o envolvimento de diversos proto-oncogenes (c-MYC, ERBB2, ERBB1 e
6
ciclina D1) e genes supressores de tumor (BRCA1, BRCA2, TP53, p16, E-
caderina entre outros) (FOLGUEIRA e BRENTANI 2004).
Os genes BRCA1 (BReast CAncer suceptibility gene 1) e BRCA2
(BReast CAncer suceptibility gene 2) são os dois maiores genes que causam
susceptibilidade genética ao câncer de mama e ovário (WOOSTER e
WEBER 2003). São genes supressores de tumor, desempenhando função
de proteção, uma vez que têm um papel importante na sinalização e reparo
de DNA, regulação transcricional, regulação do ciclo celular, apoptose e
duplicação do centrossomo (PHILLIPS 2001; VENKITARAMAN 2002;
YOSHIDA e MIKI 2004). O gene BRCA1 está localizado no cromossomo
17q21 e sua proteína compreende 1.863 aminoácidos. BRCA2 está no
cromossomo 13q12 e é ainda maior, codificando uma proteína de 3.418
aminoácidos. Dado o tamanho desses genes, não é surpreendente que por
volta de 1.500 mutações distintas e variantes de splicing têm sido
documentadas em cada um deles. Mutações nesses genes explicam a
maioria dos cânceres de mama hereditários (ROSEN et al. 2005).
O gene TP53 é o supressor de tumor que apresenta a maior freqüência
de mutações pontuais somáticas no câncer de mama, e aproximadamente
50% dos tumores primários de mama apresentam alguma alteração nesse
gene que codifica uma fosfoproteína nuclear, cuja principal função é a
regulação do ciclo celular (GREENBLATT et al. 1994). Esse gene é
conhecido como o “guardião do genoma”, pois a proteína codificada por ele
impede a progressão do ciclo celular quando há algum dano na molécula de
DNA, permitindo que ela seja reparada, ou pode alternativamente induzir a
7
célula à apoptose (morte celular programada) caso o DNA não seja
reparado. Portanto, quando Tp53 sofre mutações, as células com danos no
DNA podem desencadear a transformação maligna, pois escapam do
mecanismo de reparo e de apoptose, podendo dar início a um clone maligno
(WEINERT 1998; NAKAMURA et al. 2002). A proteína mutante p53 está
associada à negatividade para os receptores hormonais em câncer de mama
e à maior proliferação celular, conferindo maior resistência das células
neoplásicas a estímulos apoptóticos (MEGHA et al. 2002; ROLLAND et al.
2007).
A busca por alterações genéticas presentes nos tumores de mama e
a associação destas alterações com os dados clínicos e histopatológicos
têm permitido identificar alguns fatores genéticos associados à progressão
da doença. Assim, além dos fatores envolvidos no prognóstico do câncer de
mama como tamanho do tumor, presença de metástases em linfonodos
regionais e metástases à distância, subtipo histológico e grau histológico,
alguns marcadores moleculares já são bastante utilizados na classificação
desta neoplasia, o que determina algumas vezes mudança na conduta
clínica. Esses marcadores incluem a expressão de receptores de estrógeno
(ER) e progesterona (PgR), e a amplificação e ativação de proto-oncogenes,
como o ERBB2, os quais tem grande importância na predição da resposta
ao tratamento.
Estrógeno desempenha um papel importante no crescimento e
diferenciação da glândula mamária normal, assim como no desenvolvimento
e progressão do carcinoma de mama. Ele age via seu receptor (ER),
8
estando envolvido na regulação de processos transcricionais relacionados
ao crescimento e diferenciação celular da glândula mamária. Os efeitos
biológicos do estrógeno são mediados através dos receptores de estrógeno
α e β (ERα e Erβ), os quais são membros de uma grande família de
receptores nucleares (MATTHEWS e GUSTAFSSON 2003).
O receptor tirosina quinase ERBB2, também conhecido como HER2
ou HER-2/neu, é um membro da família de genes que codificam receptores
transmembrana para fatores de crescimento, incluindo o receptor de fator de
crescimento epidermal EGFR (ou ERBB1/ HER1), ERBB3 (ou HER3) e
ERBB4 (ou HER4). O domínio intracelular de HER2 tem atividade tirosina
quinase que regula etapas importantes da fisiologia, crescimento e
diferenciação de células (YARDEN e SLIWKOWSKI 2001; CHO et al. 2003).
A amplificação do oncogene ERBB2 (localizado no cromossomo 17q21.1) e
de elementos genéticos relacionados à região amplificada no cromossomo
17 causam um aumento na sua expressão na superfície de células de tumor
de mama de até 100 vezes o nível usual (BURSTEIN 2005). A
superexpressão desse gene pode transformar células em cultura a um
fenótipo malígno e tumorigênese acelerada. Foi estabelecido um sistema
modelo para investigar o papel do gene ERBB2 no processo tumorigênico
do câncer de mama, através da transfecção da linhagem HB4a de mama
normal com o cDNA do gene ERBB2, originando as linhagens HB4a C5.2 e
HB4a C3.6 (HARRIS et al. 1995). A linhagem HB4a foi originada a partir de
células epiteliais de lúmen de mama imortalizadas pelo antígeno T do vírus
SV40 (STAMPS et al. 1994), as quais são cubóides, bem organizadas e
9
apresentam inibição de crescimento por contato (HARRIS et al. 1995). As
células da linhagem HB4a C5.2 são finas e alongadas com perda de inibição
de crescimento por contato, e cada célula expressa aproximadamente 106
receptores ERBB2, que é uma quantidade similar à de linhagens tumorais de
mama como SKBR3, ou ainda superior a outras linhagens tumorais de
mama, como BT474. Este modelo tem sido utilizado por muitos trabalhos
que procuram investigar a influência deste gene no processo de
tumorigênese bem como caracterizar as proteínas envolvidas nas vias de
ativação de ERBB2 (TIMMS et al. 2002; MACKAY et al. 2003; SILVA 2006).
1.3 MARCADORES MOLECULARES E CÂNCER
Inúmeros avanços têm sido realizados nos últimos anos na melhor
caracterização molecular dos diferentes tipos de câncer, que aliados a um
aprimoramento contínuo dos métodos de estudo têm fornecido uma grande
variedade de candidatos a marcadores tumorais de importância clínica.
Esses marcadores podem ser proteínas ou frações delas, detectáveis no
tecido por imunohistoquímica ou no soro por Elisa ou radioimunuensaio,
além de marcadores genéticos variados, detectáveis pela avaliação de
mutações gênicas ou alterações cromossômicas, e através do nível de
expressão de RNA mensageiro (COSTA e DEL GIGLIO 2003).
Na maioria dos tipos de câncer, o diagnóstico é realizado através do
exame microscópico dos tecidos, auxiliado pela avaliação de marcadores
moleculares, resultando em uma classificação patológica usada para
10
diferenciar classes de tumores que podem apresentar características
distintas tanto no prognóstico quanto na resposta à terapia.
Alguns exemplos de marcadores moleculares introduzidos
rotineiramente na prática clínica são o antígeno prostático superficial (PSA),
utilizado no rastreamento, diagnóstico e pesquisa de doença residual após
tratamento do câncer de próstata (FENELEY e PARTIN 2000); a enzima
desidrogenase lática no soro de pacientes com linfoma não-Hodgkin, que
exerce uma correlação entre o marcador e a resposta do câncer ao
tratamento (SHIPP et al. 1993); o antígeno cárcino-embrionário (CEA)
utilizado no diagnóstico, prognóstico e predição de tratamento em tumores
colorretais (POSNER e MAYER 1994; COMPTON et al. 2000); a
superexpressão da proteína codificada pelo oncogene ERBB2 que é um
fator prognóstico adverso e está associado a tumores de mama de alto grau,
pouco diferenciados, com altas taxas de proliferação e envolvimento
linfonodal, conferindo uma relativa resistência a certos tipos de quimioterapia
(BURSTEIN 2005).
Marcadores prognósticos são utilizados para fornecer informações
sobre o provável comportamento de um tumor no futuro, fornecendo
informações sobre a evolução do tumor, independente de uma terapia
adjuvante sistêmica, enquanto fatores preditivos são utilizados, por exemplo,
para selecionar prospectivamente a resposta ou resistência a um tratamento
específico (DUFFY 2005).
O receptor ERα é expresso em aproximadamente 70-80% de todos os
carcinomas de mama (PARL 2003). A presença deste receptor não apenas
11
prediz resposta à terapia endócrina, como se correlaciona com um melhor
prognóstico, sendo que pacientes com o fenótipo ERα negativo apresentam
menor sobrevida livre de doença e menor sobrevida global quando
comparados a pacientes com fenótipo positivo para ERα (MOKBEL 2003).
Em pacientes ER positivo podem ser utilizados tratamentos com
hormonioterápicos bem conhecidos, como o tamoxifeno, que tem alta
afinidade em ligar-se a ER, bloqueando a ação do hormônio. Os benefícios
do tamoxifeno e sua relativa baixa toxicidade têm garantido seu uso num
período de 5 anos como profilaxia em tumores ER positivos (FISHER et al.
2001; BUZDAR et al. 2003).
Quando medido acuradamente, o status do receptor de progesterona
(PgR) é um fator preditivo independente para o benefício da terapia
endócrina adjuvante e poderia ser utilizado para estimar redução de risco
relativo esperado do tratamento endócrino com pacientes individuais. O
status PgR melhora significativamente a predição de resultado à terapia
endócrina sobre o status ER isoladamente (BARDOU et al. 2003).
Aproximadamente 70% dos tumores ER/PgR positivos apresentam resposta
ao tamoxifeno, enquanto apenas 34% dos tumores ER positivos/PgR
negativos respondem. Além disso, são observados 45% de respostas em
pacientes ER negativos/PgR positivos (CLARKE et al. 2001).
ERBB2 é considerado tanto um indicador de mau prognóstico para
câncer de mama, quanto um marcador preditivo de resposta a agentes
terapêuticos utilizados no tratamento dessa doença (PETIT et al. 2001;
DUFFY 2005). Tem sido demonstrada a superexpressão deste gene em 20
12
a 30% de todos os tumores de mama (ALBANELL e BASELGA 2001;
SLAMON et al. 2001) e alguns estudos indicam uma correlação significativa
entre a sua superexpressão e redução da sobrevida de pacientes com
câncer de mama (CAMP et al. 2003). Alguns estudos mostram que a
presença concomitante de alterações nas proteínas codificadas por ERBB2
e Tp53 se correlaciona com um prognóstico ainda pior e maiores taxas de
recorrência da doença (TAKIKAWA et al. 1994; BARBATI et al. 1997;
RUDOLPH et al. 2001). Porém a superexpressão de ERBB2 é também um
marcador preditivo de resposta a trastuzumab (Herceptina
®
), que é um
anticorpo monoclonal humanizado (mAb) contra ERBB2, dirigido contra o
domínio extracelular da proteína. Esse mAb é utilizado para o tratamento do
câncer de mama e tem uma excelente atividade anti-tumoral, inibindo o
crescimento das células que têm expressão aumentada de ERBB2,
particularmente quando usado em combinação com doxorubicina e paclitaxol
(KUMAR e MADISON 2001; SLAMON e PEGRAM 2001).
Desse modo, marcadores moleculares, tanto preditivos como de
prognóstico, têm sido extensivamente investigados em câncer de mama com
o objetivo de fornecer informações cada vez mais acuradas para tratamentos
mais individualizados, conferindo melhores resultados aos pacientes
acometidos por essa doença. No entanto, apesar do emprego desses
marcadores, muitas pacientes com mesmo diagnóstico e prognóstico clínico
podem apresentar resultados muito diferentes tanto em nível de resposta a
tratamento, como progressão, recidiva e surgimento de metástase (SORLIE
13
et al. 2001; SOTIRIOU et al. 2003), por isso é muito importante a busca por
novos marcadores moleculares tumorais.
Poderosas tecnologias, desenvolvidas através de avanços da biologia
molecular e da bioinformática têm proporcionado o amplo conhecimento dos
processos celulares através da análise da expressão gênica diferencial. A
análise do perfil de expressão gênica tem sido uma ferramenta poderosa na
classificação prognóstica do câncer de mama. Além disso, tem se mostrado
útil na subclassificação de tumores que apresentam a mesma classificação
morfológica e características distintas quanto a resposta à quimioterapia e à
progressão tumoral, permitindo estabelecer correlações com finalidades
preditivas do comportamento tumoral (FOLGUEIRA et al. 2005).
A tecnologia de cDNA microarray ou biochip de cDNA está sendo
empregada com muita eficiência na área de câncer, permitindo que
pesquisadores analisem a expressão de milhares de genes simultaneamente
e relacionem seus dados com parâmetros clínicos. O método consiste na
hibridização de genes imobilizados em uma lâmina de vidro ou membrana
de nylon, por amostras fluorescentes ou radioativas de cDNA,
respectivamente. As amostras são preparadas a partir de RNA de células,
tecidos ou outras fontes biológicas. Moléculas da amostra fluorescente ou
radioativa reagem com suas seqüências complementares ordenadas na
lâmina de vidro ou membrana, que emitem fluorescência ou radiação em
cada spot (várias moléculas de cDNA de mesma seqüência arranjadas na
lâmina). A intensidade da fluorescência ou radiação emitida é proporcional
14
ao nível de expressão do gene que corresponde àquela determinada
seqüência (SCHENA 2003).
Vários estudos têm sido desenvolvidos, comprovando a importância
da utilização desta técnica para o melhor entendimento do processo de
tumorigênese (NISHIDATE et al. 2004) e progressão do câncer de mama
(MA et al. 2003), assim como para identificar assinatura molecular de
predição de resposta ou resistência à quimioterapia (WOLFF e DAVIDSON
2000; CHANG et al. 2003; SHIMIZU et al. 2004; FOLGUEIRA et al. 2005).
Além disso essa metodologia pode auxiliar na busca por grupos de genes
com valor preditivo de potencial metástatico e associação do perfil de
expressão com possibilidade de recidiva para pacientes linfonodo negativo
(VAN´T VEER et al. 2002; SOTIRIOU et al. 2003). Neste sentido foi
desenvolvido o teste prognóstico multigene MammaPrint
®
(VAN DE VIJVER
ET AL. 2002), ensaio composto por 70 genes, com capacidade de predizer
recorrência da doença para pacientes linfonodo negativo.
Esses estudos mostram que a utilização dos dados de expressão
gênica gerados pela técnica de microarray pode nos fornecer melhor
embasamento biológico na determinação de prognósticos mais precisos
para os tumores de mama e na predição de resposta a tratamento, quando o
perfil de expressão gênica está vinculado a observações clínicas e
histopatológicas.
15
1.4 SPLICING ALTERNATIVO
A arquitertura da maioria dos genes em eucariotos superiores
consiste em exons codificantes intercalados por íntrons não-codificantes. A
remoção dos íntrons e junção dos exons é realizada através de eventos de
splicing do RNA imaturo (pré-mRNA), que é um passo essencial no
processamento de mRNA funcional. Em cada evento de splicing, um íntron é
removido através de duas reações de trans-esterificação, unindo dois exons.
Essa reação é catalizada pelo spliceossomo, um complexo macromolecular
que contém cinco moléculas de RNA ricas em uracila U1, U2, U4, U5 e U6,
conhecidas como snRNAs (small nuclear RNA), as quais se associam a 6 a
10 proteínas formando partículas ribonucleoprotéicas, snRNPs (small
nuclear ribonucleoprotein particles), que por sua vez estão associadas a um
grande número de proteínas adicionais, formando um grande complexo. Há
estudos que relatam a existência de até 300 proteínas associadas ao
spliceossomo (JURICA e MOORE 2003; NILSEN 2003). Durante a
montagem do spliceossomo diversos complexos são formados em uma
ordem definida para o reconhecimento dos sítios de splicing, excisão dos
íntrons e junção dos exons. Sítios de splicing são sinais seqüenciais
específicos de reconhecimento nas junções exon/íntron, sendo geralmente
os dinucleotídeos conservados GU na porção 5’ do íntron e os
dinucleotídeos AG bem na porção 3’ do íntron. Outras seqüências
conservadas são encontradas nessa região, como o ponto de quebra ou
ramificação e o trato de polipirimidinas (ALBERTS et al. 2002; NILSEN
16
2003). Entretanto, essas seqüências não são suficientes para definir a
ocorrência do splicing, e seqüências adicionais ao redor desses sítios e até
distante deles são requeridas, os elementos reguladores cis: splicing
enhacers e splicing silencers. Splicing enhancers estão localizados tanto nos
exons, quanto nos íntrons (ESE - Exonic Splicing Enhancers; ISE- Intronic
Splicing Enhancers) e auxiliam a maquinaria do spliceossomo no
reconhecimento dos sítios de splicing, enquanto splicing silencers podem
atuar inibindo o reconhecimento desses sítios (ESS - Exonic Splicing
Silencer; ISS - Intronic Splicing Silencer) (BLACK 2003). Há ainda proteínas
conhecidas como fatores de splicing (reguladores trans) que se ligam a
essas seqüências também regulando a definição dos sítios de splicing, e, de
acordo com o grupo funcional ao qual pertencem, atuam ativando ou inibindo
o processamento de um determinado exon, ocasionando na sua inclusão ou
exclusão do transcrito. Os dois grupos mais conhecidos são a família de
proteínas SR (serine/arginine rich) que são fatores de splicing essenciais,
que recrutam direta ou indiretamente componentes do spliceossomo e se
ligam geralmente a seqüências ESE, aumentando a taxa de splicing; e as
proteínas hnRNP, em particular hnRNP A1 (heterogeneous nuclear
ribonueoprotein A1), que se ligam em sua maioria às seqüências ESS,
inibindo o processamento (MATLIN et al. 2005). Desse modo, a composição,
localização e concentração desses fatores reguladores trans e sua influência
nos elementos reguladores cis podem alterar o padrão de splicing do pré-
mRNA, e em muitos casos mais de um mRNA maduro pode ser produzido
pela escolha alternativa de sítios 5’ e 3’ pela maquinaria de splicing,
17
fenômeno conhecido como splicing alternativo (AS). Mudanças na expressão
relativa de vários fatores de splicing podem modular o tipo e a concentração
relativa das variantes correspondentes a vários genes (CACERES e
KORNBLIHTT 2002), sendo observadas em diferentes tipos celulares e em
algumas doenças, como, por exemplo, o câncer (HANAMURA et al. 1998;
STICKELER et al. 1999).
Splicing alternativo (AS) é o processo pelo qual um único transcrito
primário gera diferentes RNAs maduros, podendo levar à produção de
isoformas de proteínas com funções diversas e até mesmo antagônicas,
sendo este processo importante no desenvolvimento normal das células
como um meio de criar diversidade protéica em organismos complexos
(MANIATIS e TASIC 2002; BLACK 2003).
O fato da maioria dos genes humanos serem constituídos por dois ou
mais exons permite que, através de diferentes combinações, múltiplos RNA
mensageiros maduros distintos sejam formados a partir de uma única
molécula de mRNA imaturo pelo processo de splicing alternativo.
Estimativas sugerem que mais de 70% dos genes humanos sofrem splicing
alternativo (JOHNSON et al. 2003), havendo casos em que um único gene
pode gerar inúmeros transcritos diferentes (BLACK 2000; CARNINCI et al.
2005) aumentando a diversidade transcricional dos organismos.
Aparentemente a maior parte dos eventos de splicing alternativo (74%)
ocorre na região codificante do gene (coding sequence), também gerando
uma grande contribuição para a diversidade proteômica (MODREK e LEE
2002). Assim, este fenômeno explica em parte a complexidade de
18
organismos superiores frente ao pequeno número de genes (GRAVELEY
2001; WIEBEN 2003; BRINKMAN 2004; KALNINA et al. 2005).
Há diversos tipos de splicing alternativo (Figura 1): exons cassetes
(ou regulados) podem ser incluídos ou excluídos (exon skipping) de um
determinado transcrito; sítios doadores e/ou aceptores crípticos podem ser
usados ao invés dos sítios de splicing originais, o que gera exons mais
curtos ou longos; seqüências intrônicas podem ser usadas como exons em
alguns transcritos (íntron retention) e exons podem sofrer splicing
mutuamente exclusivo (os dois exons nunca serão encontrados
simultaneamente no mesmo transcrito). A exclusão de exons parece ser o
tipo de splicing alternativo mais freqüente (BRETT et al. 2002) e a retenção
de íntrons o mais raro (KIM et al. 2007).
Legenda: (A) uso alternativo de exons, (B) uso de sítios crípticos 5’ ou 3’, (C) retenção de
íntrons e (D) uso mutuamente exclusivo de exons. Os retângulos azuis representam os
exons que são alternativamente processados. As linhas que ligam retângulos (exons)
mostram quais exons serão combinados depois dos diferentes tipos de splicing alternativo.
Figura 1 - Tipos de splicing alternativo.
19
O seqüenciamento do genoma humano e a introdução de análises em
larga escala de etiquetas de seqüências expressas (do inglês expressed
sequence tags- ESTs) tem tornado possível avaliar variantes de splicing em
nível genômico. Os primeiros estudos sobre o genoma humano mostraram
haver um número relativamente pequeno de genes (30.000-40.000)
(LANDER et al. 2001; VENTER et al. 2001) em relação à complexidade
observada através de 100.000-150.000 genes preditos, no nível de mRNA.
Diante destas observações, foi sugerida a grande importância do AS na
geração da diversidade transcricional, sendo o maior responsável pela
complexidade funcional do genoma humano (BLACK 2000; GRAVELEY
2001; MODREK e LEE 2002). Esse mecanismo pode causar impactos
significativos na atividade funcional das próprias proteínas além de alterar
suas interações com outras proteínas (MINNEMAN 2001; THAI e KEARNEY
2004; SCHEPER et al. 2004).
A bioinformática tem sido fundamental na caracterização de novas
variantes de splicing através do desenvolvimento de estratégias e
ferramentas computacionais (FERREIRA et al. 2007). Muitos esforços têm
sido realizados neste sentido, onde, por exemplo, análises computacionais
através do alinhamento de ESTs contra a seqüência genômica humana, em
conjunto com o uso de softwares de predição gênica, têm fornecido
ferramentas para a identificação de novos eventos de splicing alternativo
(BLACK 2000; GALANTE et al. 2004; GUPTA et al. 2004; HSU et al. 2005).
Uma abordagem experimental interessante para a identificação de AS
é a construção de bibliotecas de cDNA enriquecidas para eventos de
20
splicing, através da captura de heteroduplexes formados entre duas
diferentes variantes de splicing do mesmo gene (WATAHIKI et al. 2004).
Essa metodologia é muito promissora, uma vez que qualquer tipo de evento
de splicing pode ser identificado, sem conhecimento prévio dos transcritos.
A tecnologia de microarray é uma poderosa ferramenta para o estudo
de expressão gênica em larga escala (SCHENA et al. 2003), utilizando uma
grande quantidade de amostras. Considerando-se que essa tecnologia pode
ser muito útil na caracterização do perfil de expressão de diferentes
transcritos de um gene, diversos estudos em larga escala têm sido
desenvolvidos através da utilização da tecnologia de microarray para
analisar eventos de splicing alternativo. A utilização de plataformas que
cobrem grandes regiões genômicas (tiling microarrays) tem se mostrado
eficiente na identificação de novas isoformas de splicing (HU et al. 2001;
FAN et al. 2006). Além disso, a construção de plataformas de sondas de
oligonucleotídeos que representam junções exon-exon conhecidas permite a
avaliação do perfil de expressão de diversas variantes além de obter uma
medida quantitativa de sua abundância (JOHNSON et al. 2003;
CUPERLOVIC-CULF et al. 2006;
GARDINA et al. 2006).
Uma variante de splicing pode ser definida como sendo funcional se
for requerida durante o ciclo de vida normal do organismo e se for ativada de
maneira regulada (SOREK et al. 2004). Entretanto, não está claro quantas
das variantes de splicing preditas a partir de ESTs são funcionais e quantas
representam splicing aberrantes ou artefatos da metodologia utilizada para
sua detecção (GRAVELEY 2001; MANIATIS e TASIC 2002; MODREK e LEE
21
2002). Tanto mutações somáticas em sítios de splicing ou nas seqüências
cis enhancers e silencers, além de SNPs (single nucleotide polymorfism)
nessas regiões podem influenciar na seleção dos sítios de splicing
(FAUSTINO e COOPER 2003) ou ainda resultar em splicing aberrante,
gerando proteínas truncadas (SOREK et al. 2004). Além disso, erros na
maquinaria do spliceossomo também têm sido propostos como um
mecanismo que pode resultar em transcritos não funcionais que produzem
geralmente proteínas truncadas (GRAVELEY 2001).
Um dos maiores objetivos de estudo atualmente é identificar eventos
de splicing alternativo fisio e patologicamente relevantes, para determinar
onde e quando eles ocorrem, quais são seus papéis específicos e como
estão regulados (PAN et al. 2005). Essas questões fundamentais requerem
avanços de tecnologias em larga escala para o monitoramento do AS.
1.5 O ESTUDO DO SPLICING ALTERNATIVO NA BUSCA POR
NOVOS MARCADORES MOLECULARES
Tem sido mostrado que o splicing alternativo está envolvido em
diversas doenças humanas (FAUSTINO e COOPER 2003; GARCIA-
BLANCO et al. 2004; PAGANI e BARALLE 2004) e o seu controle pode estar
desregulado nessas doenças, e estudos mostram ainda que está
notavelmente alterado em câncer (STIMPFL et al. 2002; BRINKMAN 2004;
VENABLES 2004; KIM et al. 2008), sendo evidenciada uma correlação direta
entre a expressão diferencial de determinadas variantes de splicing e o
22
processo de tumorigênese em diferentes tipos de tumor (GE et al. 1999;
BAUDRY et al. 2000; CRAGG et al. 2002; WANG Z et al. 2003).
Têm sido documentadas numerosas isoformas de splicing alternativo
associadas a câncer que podem afetar a função de proteínas, incluindo
fatores de transcrição, componentes de sinalização celular, reguladores da
apoptose e componentes da matriz-extracelular (VENABLES 2004). Em
muitos exemplos de AS associado a tumores, a função da isoforma protéica
parece ser consistente com um possível papel no câncer, embora muitas
vezes esteja relacionada a processos não exclusivos de células tumorais,
onde as funções exercidas pelas isoformas alternativas, em conjunto com
um possível desbalanço entre elas, poderiam ter um efeito na transformação
maligna através de, por exemplo, indução positiva do ciclo celular pela perda
da função de um gene supressor de tumor ou ganho de função de um
oncogene. Os exemplos mais conhecidos são o receptor multifuncional
CD44 (SNEATH e MANGHAM 1998; NAOR et al. 2002) e o fator de
transcrição WT1- Wilms’ tumor gene (BAUDRY et al. 2000; WAGNER et al.
2003). O gene CD44 é um receptor glicoprotéico de membrana constituído
por 20 exons, dos quais 9 são variáveis (do 6 ao 15 ocorre splicing
alternativo), levando à formação de variantes preferencialmente expressas
em tumores. Uma variante particular de CD44 (v6), é encontrada em câncer
de mama (HERRERA-GAYOL e JOTHY 1999), bexiga (COOPER 1995) e
cólon (HERRLICH et al. 2000), estando relacionada com pior prognóstico, e
a expressão elevada de variantes de CD44 contendo o exon 6 (CD44v6)
está positivamente relacionada com estágios avançados em carcinoma
23
gástrico, indicando progressão tumoral (XIN et al. 2001). O gene WT1 possui
quatro domínios de dedos de zinco, o que lhe confere a capacidade de se
ligar ao DNA, agindo como fator de transcrição. Splicing alternativo de WT1
produz várias isoformas de proteínas com distintos domínios de ligação ao
DNA, proporcionando atividades transcricionais altamente reguladas
durante, por exemplo, a diferenciação do rim. Foi mostrado por BAUDRY et
al. (2000) que mutações em WT1 são observadas em 10% dos casos de
tumor de Wilms esporádicos, e 63% dos casos apresentam alterações de
splicing, sendo sugerido que o desbalanço entre as variantes (uma contendo
o exon 5 e outra não) afeta vários aspectos da fisiologia celular deste tumor.
Um exemplo de AS de um gene supressor de tumor é a proteína
neurofibromatose tipo1 (NF1). NF1 é um supressor de tumor neuronal, que
funciona em parte inativando a sinalização do oncogene RAS. Uma variante
alternativa de NF1 com a inserção de 63 nucleotídeos em seu quadro aberto
de leitura (ORF), perde parte dessa função supressora de tumor e está
superexpressa em meduloblastomas e tumores ectodérmicos primitivos
(SCHEURLEN e SENF 1995). Outro exemplo é o gene spleen tyrosine
kinase (Syk), um supressor de metástase tumoral que está altamente
expresso em células epiteliais mamárias normais e sua perda de expressão
está associada com o aumento da capacidade invasiva em tumores de
mama. Uma variante de Syk, conhecida como Syk(S) está superexpressa
nesse tipo de tumor e não exerce o papel supressor de metástase. A única
diferença entre as duas formas está na perda de 23 resíduos de aminoácidos
dentro do interdomínio B (IDB) da variante Syk(S). A ausência desses
24
resíduos leva à alteração de localização da proteína e perda da função
(WANG L et al. 2003).
Outros exemplos de genes que apresentam variantes associadas a
tumores são EGFR (WIKSTRAND et al. 1995), BIN1 (GE et al. 1999), MUC-
1 (BARUCH et al. 1999) e CD79b (CRAGG et al. 2002). Também os genes
envolvidos no processo de apoptose BCL-X, CASPASE-9, CED-4,
CASPASE-2/ICH-1 e HTID-1 codificam diferentes variantes pró e anti-
apoptose (BRINKMAN 2004).
Recentemente têm sido descobertas novas variantes de splicing que
ocorrem no gene PTEN, um supressor de tumor que leva à parada do ciclo
celular na fase G1, o qual aparece inativado na síndrome de Cowden,
caracterizada por alto risco de câncer de mama e tireóide. Tem sido
sugerido que a expressão diferencial de PTEN e suas variantes de splicing
poderiam desempenhar um papel na patogênese de câncer de mama
esporádico podendo servir como alvo terapêutico (AGRAWAL e ENG 2006).
Outra variante de splicing associada ao câncer de mama é a variante do
gene BRCA1 - BRCA1-IRIS, cuja proteína não interage com BARD1, não
formando o complexo BRCA1: BRAD1, o qual medeia a atividade ubiquitina
ligase, que pode ser importante para a supressão de tumores (HASHIZUME
et al. 2001). BRCA1-IRIS está associada a proteínas envolvidas na
replicação do DNA, e tem sido postulado que influencia positivamente a
replicação de DNA (EL SHAMY e LIVINGSTON 2004).
Esses exemplos mostram que o splicing alternativo está notavelmente
alterado em câncer, gerando muitas vezes variantes aberrantes que podem
25
desempenhar um papel importante na tumorigênese e progressão tumoral
(CABALLERO et al. 2001; VENABLES 2004; PETTIGREW e BROWN 2008),
e poderiam ser utilizadas como marcadores tumorais, ou ainda como
estratégia terapêutica, através do bloqueio da função dessas variantes.
Entretanto não se sabe ao certo se o padrão de splicing em câncer é um
fator causal para células normais tornarem-se tumorais ou se o processo
tumorigênico por si só altera a taxa de replicação celular e, ainda, o modo de
síntese de mRNA, de forma que a maquinaria de splicing passe a gerar
isoformas espúrias (Xu & Lee, 2003).
A exploração da variabilidade transcricional gerada por splicing alternativo
pode ser promissora, especialmente na identificação de novos marcadores
para alvo terapêutico (AGRAWAL e ENG 2006; LU et al. 2007; SAMPATH e
PELUS 2007), uma vez que a droga seria mais específica, atingindo a
variante e não o gene como um todo. Por exemplo, Ding et al. (2002)
mostraram que o aumento da expressão de uma isoforma alternativa do
receptor de secretina impede a ligação do receptor constitutivo ao seu ligante
(Ding et al., 2002). Assim, foi demonstrado que a redução da ativação do
receptor original devido à competição com o receptor variante permitiu o
crescimento tumoral. Neste caso, o bloqueio da isoforma alternativa do
receptor, tanto através do uso de anticorpos específicos ou eliminando seu
respectivo mRNA por siRNA (RNA de interferência), poderia apresentar um
valor terapêutico.
Neste sentido, recentes estudos em larga escala têm sido realizados para
avaliação da associação entre splicing alternativo e câncer (XIE et al. 2002;
26
XU et al. 2002; WANG Z et al. 2003; HUI et al. 2004; KIRSCHBAUM-
SLAGER et al. 2005), sendo que alguns estudos têm aplicado a tecnologia
de microarray com esse objetivo (RELOGIO et al. 2005; LI et al. 2006;
MILANI et al. 2006; THORSEN et al. 2008).
Nesse contexto, um estudo computacional foi realizado no Laboratório
de Bioinformática do Instituto Ludwig, sob coordenação do Dr. Sandro J. de
Souza, com objetivo de identificar variantes de splicing associadas a
tumores, cujos exons apresentavam expressão predominante em bibliotecas
de tecido tumoral em comparação com seu respectivo normal. Foi utilizado
um banco de dados relacional (MySQL) contendo seqüências de cDNA
alinhadas com a seqüência genômica humana, com informações do
mapeamento no genoma, expressão tecidual e anotação funcional dos
genes. O padrão de expressão de isoformas de 318.272 clusters (grupos de
seqüências que compartilham regiões de similaridade, supostos genes
únicos), foi analisado, dos quais 21.306 possuíam ao menos 1 seqüência
completa de mRNA. Desses 21.306 clusters, foram selecionados aqueles
que continham pelo menos uma variante com um evento de inserção de
exon (variantes que contêm o exon alternativo) expressa em bibliotecas de
tecido tumoral e não em bibliotecas do correspondente normal. Após análise
estatística foram identificados 1.295 genes, contendo 2.878 exons com
expressão exclusiva em tecidos tumorais em relação ao seu respectivo
normal, sendo denominados exons ‘associados a tumor’.
Como em nenhum trabalho da literatura foi demonstrado uma variante
de splicing que possua expressão ‘tumor-específica’, ou seja, que apresente
27
expressão apenas em tecido tumoral, e não seja expressa em nenhum outro
tecido normal, decidiu-se utilizar o termo ‘associado a tumor’ para variantes
que mostraram uma expressão mais abundante em tecido tumoral em
relação a tecido normal, e cujo ‘protótipo’ (onde não foi observada a
presença do exon inserido) não apareceu superexpresso em tecido tumoral.
Os exons foram alinhados contra o banco de dados Unigene para excluir
aqueles que alinham com mais de um cluster de ESTs, sendo identificados,
então, 932 exons ‘associados a tumor’ (Tabela 1). Uma validação
experimental desses candidatos foi realizada através de experimentos de
RT-PCR, onde alguns deles foram randomicamente selecionados, sendo
que 4 de 10 (40%) e 5 de 6 (83,3%) puderam ser confirmados como
superexpressos em linhagem e tecido tumoral, respectivamente
(KIRSCHBAUM-SLAGER et al. 2005).
28
Tabela 1 - Número de exons associados a tumores para cada tecido
analisado através de análise computacional.
Tecido
Exons associados
a tumores
Glândula adrenal 63
Bexiga 118
Ossos 226
Cérebro 54
Mama 80
Cartilagem 127
Cólon 156
Denis-drash
51
Ouvido 9
Embrião 30
Epidídimo 32
Olho 16
Cabeça e pescoço 339
Rim 135
Fígado 30
Pulmão 62
Linfa 130
Boca 206
Músculo 145
Sistema Nervoso 30
Ovário 351
Pancreas 156
Próstata 43
Pele 219
Estômago 35
Testículo 1
Útero 54
29
Assim, foram delineados os objetivos desse trabalho, aliando o
potencial da metodologia de microarray em analisar o nível de expressão de
um grande número de seqüências a uma análise computacional
(KIRSCHBAUM-SLAGER et al. 2005), com o objetivo de identificar variantes
de splicing superexpressas em tumores de mama. Para isso, uma
plataforma de microarray com seqüências correspondentes a exons
associados a tumores foi construída e hibridizada contra amostras tumorais
e normais de mama. Os exons mais expressos em câncer de mama
identificados através de hibridizações contra amostras de tecido tumoral e
normal de mama foram selecionados. Neste trabalho, as variantes que
contêm os exons analisados serão chamadas VCE (variante com o exon).
Os exons mais expressos em tumores selecionados pela técnica de
microarray foram validados por RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) através de
iniciadores desenhados no próprio exon e no exon flanqueador a 3’. Essa
medida de expressão se refere à VCE. Para a confirmação da
superexpressão dessa variante e não do gene como um todo, foi realizada
avaliação da expressão constitutiva do gene (EC) através do desenho de
iniciadores em 2 exons constitutivos, pertencentes a todas as variantes. O
balanço entre a expressão da VCE e a EC foi avaliado em amostras
tumorais e normais de mama. Aqueles candidatos que foram confirmados
como variantes de splicing superexpressas em câncer de mama no grupo de
amostras iniciais e posteriormente em um grupo independente de amostras
foram correlacionados com características clínicas e histopatológicas.
30
2 OBJETIVO
2.1 OBJETIVO GERAL
Identificar variantes de splicing superexpressas em câncer de mama e
correlacionar com características clínicas e histopatológicas.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Construir plataforma de microarray com seqüências de DNA
correspondentes a exons superexpressos em tumores selecionados
por análise computacional;
2. Hibridizar contra amostras de tecido normal e tumoral de mama;
3. Identificar exons superexpressos em amostras de tecidos tumorais de
mama;
4. Validar por RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) os exons identificados
como superexpressos em câncer de mama no mesmo grupo inicial de
amostras através do desenho de iniciadores no exon superexpresso e
no flanqueador a 3’ (essa expressão se refere à VCE) ;
5. Verificar se as variantes de splicing que contêm o exon (VCE) se
tratam, de fato, de variantes superexpressas em câncer de mama,
através da análise da expressão do gene como um todo (através do
desenho de iniciadores em exons constitutivos);
31
6. Validação dos achados em um grupo independente de amostras
tumorais;
7. Correlacionar com características clínicas e histopatológicas.
32
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
O desenvolvimento deste projeto, bem como a utilização das
amostras, foram autorizados pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital
A.C. Camargo, sob o processo de número 586/04 (Anexo 3). Para todas as
amostras há um termo de consentimento livre e esclarecido pós-informado
assinado (Anexo 4).
3.2 CONSTRUÇÃO DA PLATAFORMA DE MICROARRAY
3.2.1 Escolha dos Iniciadores para Extensão dos Fragmentos (Exons)
Os iniciadores forward (F) e reverse (R) foram desenhados utilizando-
se o programa PRIMER 3 (http://www.basic.neu.edu/biotools/Primer3.html).
De acordo com os critérios estabelecidos, os fragmentos estendidos por
esses iniciadores deveriam ter no mínimo 100 pb e apresentar um conteúdo
GC de 50 a 60%. O par (F+R) deveria ser desenhado no mesmo exon
associado a tumor, começar e terminar com G ou C, ter 16 a 21 pares de
bases, temperatura de pareamento variando entre 58 e 68ºC, sendo que a
diferença em graus de temperatura de pareamento permitida entre os pares
de iniciadores deveria ser de no máximo 4ºC. Em seguida eles passaram por
uma análise manual, com o auxílio do programa OLIGOTECH versão 1.00
33
(Copyright
©
1995), para avaliação das estruturas secundárias (stem loop e
homodimer), permitindo temperaturas de até 30ºC. Foram selecionados 270
pares de iniciadores (F+R), sendo que 75 deles correspondem a exons
associados a tumor de mama, 54 a tumor de cérebro e 141 a outros tecidos.
Todos os 540 iniciadores foram diluídos a uma concentração estoque de
100uM, de onde foram feitas diluições trabalho de 0,2uM para serem
utilizadas nas reações de amplificação do DNA molde.
3.2.2 DNA Molde para Extensão dos Fragmentos
Foi extraído DNA de leucócitos normais humanos, que serviram como
molde na extensão dos fragmentos de exons associados a tumor. A extração
seguiu o método fenol:clorofórmio. Foi acrescentado ao sangue 2ml de
TRIS-EDTA-SDS, agregando 10ul de proteinase K (20mg/ml) na
concentração final de 100ug/ml. Incubou-se a 55
o
C overnight. Após digestão
com proteinase K, o DNA foi extraído das amostras com igual volume de
fenol saturado com 1 M TrisHCl, pH 8,0. Esse material foi agitado por 5
minutos e centrifugado por 10 minutos a 3000 rpm. O sobrenadante (fase
aquosa), foi então transferido para outro tubo e acrescentou-se o mesmo
volume de clorofórmio e álcool isoamílico (24:1). Agitou-se por 5 minutos e
centrifugou-se por 10 minutos a 3.000 rpm. O sobrenadante foi separado
(fase aquosa), sendo transferindo para outro tubo. Acrescentou-se o mesmo
volume de clorofórmio e álcool isoamílico (24:1), e agitou-se por 5 minutos,
centrifugando-se em seguida por 10 minutos a 3.000 rpm. O sobrenadante
foi separado e transferido para um tubo Corex. O DNA contido na fase
34
aquosa foi então precipitado com 2,5 volumes de etanol absoluto, em
presença de 10% de 3M acetato de sódio e mantido por 14-16 horas a -20°C
ou 1 hora a -80°C. Depois centrifugou-se por 20 minutos a 12.000 rpm (ultra
centrífuga), desprezando-se o sobrenadante. Adicionou-se então 5ml de
etanol 70% e centrifugou-se por 10 minutos a 12.000 rpm, desprezando o
sobrenadante, e o precipitado foi submetido à temperatura ambiente por
aproximadamente 20 minutos e ressuspendido em um volume de tampão TE
(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) de cerca de 200ul. A concentração
do DNA foi determinada por leitura espectrofotométrica a 260/280nm e
realizou-se eletroforese em gel de agarose 1% corado com Brometo de
Etídeo para avaliação da qualidade do DNA (Anexo 5).
3.2.3 Extensão dos Fragmentos
Os fragmentos foram amplificados através de uma reação de PCR,
utilizando-se a enzima Taq Pht (PHONEUTRIA Biotec. e Serviços Ltda) a
partir de aproximadamente 100ng de DNA genômico. Para as reações foram
necessárias as seguintes concentrações finais de cada reagente: 1,5mM de
MgCl2; 0,05µM de cada iniciador; 0,2 mM de cada dNTP; 0,05 unidade de
Taq Pht, 1X tampão adequado e 1M do enhancer Betaína. As reações foram
realizadas em um volume final de 100µL. O aparelho utilizado para
incubação foi o termociclador PTC 100™ (MJ RESEARCH, INC).
As condições de termociclagem seguiram os passos de touchdown
descritos a seguir: 1 ciclo: 96ºC por 3 min. 6 ciclos: 96ºC por 1 min; 60ºC
por 1 min; 72ºC por 1 min. 6 ciclos: 96ºC por 1 min; 58ºC por 1 min; 72ºC
35
por 1 min. 12 ciclos: 96ºC por 30 seg; 55ºC por 30 seg; 72ºC por 1 min. 16
ciclos: 96ºC por 30 seg; 53ºC por 30 seg; 72ºC por 1 min. 1 ciclo: 72ºC por
7 min.
Alíquotas de 5,0µL das reações de PCR foram, em seguida, aplicadas
em gel de agarose 1,0% corado com Brometo de Etídio em uma corrida com
duração de 60 minutos na voltagem de 60 mV, a fim de se confirmar os
tamanhos dos fragmentos esperados.
3.2.4 Desenho dos iniciadores para extensão de fragmentos dos genes
GAPDH e ACTB
As seqüências dos genes utilizados como normalizadores foram
obtidas através do banco de dados Ref Seq, sendo que 8 iniciadores foram
desenhados, 2 pares para cada gene, resultando em 1 fragmento referente à
região exônica e 1 à região intrônica, que se referem a controles positivos e
negativos, respectivamente.
GAPDH (NM_002046.2)
Iniciadores para a região EXÔNICA: Desenhados no exon 8 do gene a 333
pb da região 3’ (tamanho do fragmento: 199 pb)
GAPDH-EXON-Foward (GGAAGCTCACTGGCATGG)
GAPDH-EXON-Reverse (GAGTGGGTGTCGCTGTTG)
Iniciadores para a região INTRÔNICA: Desenhados entre os exons 7 e 8
(tamanho do fragmento: 147 pb)
GAPDH-INTRON-Foward (GCTCCCACCTTTCTCATCC)
36
GAPDH-INTRON-Reverse (CTGCAGCGTACTCCCCAC)
ACTB (NM_001101.2)
Iniciadores para a região EXÔNICA: Desenhados no exon 5 do gene a 742
pb da região 3’ (tamanho do fragmento: 156 pb)
ACTB-EXON-Foward (CACGAAACTACCTTCAACTC)
ACTB-EXON-Reverse (CTTCATTGTGCTGGGTGC)
Iniciadores para a região INTRÔNICA: Desenhados entre os exons 3 e 4
(tamanho do fragmento de 211 pb)
ACTB-INTRON-Foward (GTGTTGTGGGTGTAGGTAC)
ACTB-INTRON-Reverse (CATGTCACACTGGGGAAG).
Os iniciadores foram diluídos a uma concentração estoque de 100uM,
de onde foram feitas diluições trabalho de 10µM para serem utilizadas nas
reações de amplifcação do DNA molde. Para as reações foram necessárias
as seguintes concentrações finais de cada reagente: 1,5mM de MgCl2;
0,05µM de cada iniciador; 0,2 mM de cada dNTP; 0,05 unidade de Taq Pht;
1X tampão adequado e 1M do enhancer Betaína. As reações foram
realizadas em um volume final de 100µL. O aparelho utilizado para
incubação foi o termociclador PTC 100™ (MJ RESEARCH, INC).
As condições de termociclagem seguiram os seguintes passos: 1
ciclo: 95ºC por 2 min. 40 ciclos: 95ºC por 45 seg; 57ºC por 45 seg; 72ºC
por 1 min. 1 ciclo: 72ºC por 7 min.
37
Assim, 5µL de cada um dos 4 fragmentos foram corridos em gel de
agarose 1% corado com Brometo de Etídio em uma corrida com duração de
60 minutos na voltagem de 60 mV, onde foram confirmados os tamanhos
mencionados acima.
3.2.5 Purificação dos Fragmentos
Os fragmentos a serem imobilizados, depois de confirmados os seus
tamanhos em gel de agarose 1% corado com Brometo de Etídeo, foram
concentrados a um volume de aproximadamente 25µL e aplicados em gel de
agarose 1,0%, para serem purificados de acordo com o tamanho esperado
com o auxílio do Kit GFX PCR DNA and Gel Band Purification (GE
Healthcare Life Sciences), seguindo-se as recomendações do fabricante. Os
fragmentos foram então quantificados em espectofotômetro (Gene Quant
pro) e corridos em gel de acrilamida 8%. Esse procedimento foi adotado com
a finalidade de descartar a presença de possíveis bandas inespecíficas que
pudessem favorecer hibridizações cruzadas.
3.2.6 Clonagem, Seqüenciamento e Análise das Seqüências
Após o procedimento de purificação dos fragmentos, parte do volume
deles foi utilizada para a construção da membrana e o restante preparado
para clonagem e seqüenciamento. Todos os 270 fragmentos, mais os
fragmentos correspondentes a íntrons e exons dos genes GAPDH e ACTB
foram clonados no plasmídeo pTZ57R/T (InsT/A clone PCR Product Cloning
Kit - Fermentas) e seqüenciados em seguida. Foi utilizado o kit de
38
seqüenciamento BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit (Applied
Biosystems), seguindo-se as especificações do fabricante. O aparelho
seqüenciador utilizado foi o ABI Prism 3100 (Applied Biosystems).
O procedimento de clonagem dos fragmentos foi adotado com a
finalidade de incluí-los em outra plataforma de cDNA em vidro que foi
construída pela equipe do Microarray facility do Hospital AC Camargo.
A identidade das seqüências foi analisada com o auxílio da
ferramenta disponível no site do NCBI (National Center for Biotechnology
Information), Blast 2 Sequences (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/
bl2.html) (Figura 2).
A) Seqüência ABI Prism 3100:
>C04 seqüência exportada do cromatograma
CCCAAGCCCCGCTTTTACCCAGCATATCTGAGTCACCTGCAGACAGGATGAGAACCCA
GACCCCTTCCCGTGAGTCCACATGCCCCGGCTGCCCTGGGACCAGCTGCCTGGCTCC
TACCTAGGTGGCTCTCCTCTCCTTTTCCTCTGCCTTGACCTCTCTGCAGCTCTGATTCTG
GAAGATTCTGTCCCCTTAAAATCCATGAAGCAGCACTGGCCTGGGTCTCCCCTCACCCT
TCTCATAGGCTTGGCTATGACTTC
B) Seqüência do exon 115538_6:
>115538_6
CTCACCACAGACCCCGCCCAGAAGGCACAGCCTGAGGCACTCAGCACAGTCCAGGGC
CCCAAGCTGAGACACACTCCAAGAACACAACTCACAACCCCCAGCAATATCTGAGTCAC
CTGCAAGACAGGATGAGAAACCAGACCCCTTCCCGTGAGTCCACATGCCCCGGCTGCC
CTGGGACCAGCTGCCTGGCTCCTACCTAGGTGGCTCTCCTCTCCTTTTCCTCTGCCTTG
ACCTCTCTGCAGCTCTGATTCTGGAAGATTCTGTCCCCTTAAAATCCATGAAGCAGCAC
TGGCCTGGGTCTCCCCTCACCCTTCTCATAGGCTTGGCT
39
C) Blast 2 Sequences:
Legenda: A) Seqüência obtida com o seqüenciamento do exon 115538_6; B) seqüência
FASTA do exon; C) Blast 2 Sequences - Gráfico representativo da comparação da
seqüência do exon 115538_6 com a seqüência obtida através de seqüenciamento.
Figura 2 - Seqüenciamento do exon 115538_6.
3.2.7 Construção das Membranas
Aproximadamente 150 nanolitros de cada fragmento (em média 5-10
ng) foram arranjados em membrana de nylon (Hybond N+ Amersham) em
quadruplicata com o auxílio do robô Flexys (Genome Solutions, UK). Todas
as etapas de confecção das membranas foram coordenadas pelo Dr. Alex
Fiorini de Carvalho do grupo do Dr. Luiz Fernando Lima Reis, da equipe de
Microarray Facility do Instituto Ludwig e Hospital AC Camargo. Os exons
foram imobilizados em grupos de 96 subarrays, cada um contendo 16 spots.
Em cada subarray foram imobilizados 2 controles negativos (água milliQ) e 2
controles positivos de marcação e hibridização (cDNA correspondente a um
fragmento do lambda fago Q gene). Foram imobilizados também os dois
fragmentos, um de 199 pb, do exon 8 e outro de 156 pb do exon 5,
correspondentes ao genes normalizadores GAPDH e ACTB,
2
1
Sequence 1
lcl|115538_6
Length
331 (1 .. 331)
Sequence 2
lcl|C04
Length
258 (1.. 258)
40
respectivamente. Para garantir que os sinais captados correspondem à
região de cDNA, e monitorar a contaminação genômica das amostras, um
fragmento intrônico de 147 pb (íntron entre os exons 7 e 8) e outro de 211 pb
(íntron entre os exons 3 e 4) dos mesmos genes foram também
imobilizados. As membranas foram, em seguida, desnaturadas por 2
minutos em solução de 0,5N NaOH; 1,5M NaCl e neutralizadas por 2
minutos em solução de 1,5M NaCl; 0,5M Tris-Hcl (pH 7,4). Em seguida os
fragmentos de DNA foram fixados à membrana pela exposição à luz
ultravioleta (120µJ/cm
2
) do aparelho Crosslinker UV (Fisher Biotech, USA) e
à temperatura de 80ºC por 2 horas.
Em resumo, a plataforma contém um total de 1.536 spots, distribuídos
em 96 subarrays, contendo cada um 16 spots: 12 correspondentes a 6
exons associados a tumor em duplicata, 02 controles positivos de marcação
(λQgene) e 02 controles negativos (água). Cada um dos 270 exons
associados a tumor foi imobilizado 4 vezes na mesma membrana. Foram
imobilizadas também 24 réplicas de exons dos genes normalizadores
GAPDH e ACTB e 12 réplicas de íntrons dos mesmos genes para controle
negativo de expressão.
41
3.3 AMOSTRAS
3.3.1 Amostras utilizadas nos experimentos de microarray e validação
através de RT-PCR quantitativo (qRT-PCR)
Para o grupo inicial, foram selecionadas 27 amostras de tecido
tumoral de mama de pacientes operadas no Hospital AC Camargo
arquivadas no Banco de Tumores desta Instituição (Biorrepositório Hospital
AC Camargo) e 09 amostras de tecido normal de mama, sendo 04 bordas de
fibroadenoma (MN04, MN12, MN13, MN16), 01 amostra de mamoplastia
(MN46) e 04 bordas de carcinoma invasor (MN06, MN08, MNP12 e MN32)
que eram bordas livres de doença de amostras tumorais (6T, 8T, 12T e 32T),
respectivamente.
As amostras foram obtidas cirurgicamente e congeladas em nitrogênio
líquido (–196ºC). Antes de serem processadas, todas as amostras foram
submetidas à confirmação histopatológica. Esta validação visa não somente
a confirmação do diagnóstico, mas também a avaliação da amostra quanto à
presença de necrose, infiltrado inflamatório, estroma, epiderme e tecido
adiposo. As amostras foram incluídas em Tissue-Tek® e, com auxílio de um
criostato (a –30°C), foram cortadas a 5 μm de espessura e fixadas em
lâminas histológicas, as quais foram coradas com hematoxilina e eosina
(H&E). As lâminas foram avaliadas por um patologista e o critério mínimo da
presença do tecido de interesse (tumoral ou normal) em todas as amostras
foi de 70%. Quando necessário as amostras foram dissecadas manualmente
pelo patologista, guiado pelas lâminas de H&E.
42
Todas as amostras foram selecionadas de pacientes do sexo feminino
com diagnóstico de carcinoma ductal invasivo, e não submetidas a
tratamento prévio à cirurgia (quimioterapia, hormônio terapia ou
radioterapia), sendo que 04 pertenciam ao estadio I; 14 ao estadio IIA; 07 ao
estadio IIB; e 02 ao estadio IIIA.
A partir das informações coletadas, 11 casos foram classificados
como linfonodo-positivo e 16 casos linfonodo-negativo. A idade das
pacientes variou entre 32 e 87 anos, apresentando uma média de 54,7 anos
e mediana de 55 anos. Dados referentes aos marcadores moleculares
receptor de estrógeno (ER), ERBB2, receptor de Progesterona (PgR)
também foram coletados. Em relação ao marcador ER, 22 casos eram
positivos, 05 negativos; em relação ao marcador ERBB2, 21 casos eram
positivos, 06 negativos; em relação ao marcador PgR, 15 casos eram
positivos, 12 negativos.
Todas as informações detalhadas a respeito dessas amostras estão
apresentadas no Anexo 6.
Foram também utilizadas no estudo 04 amostras correspondentes a
linhagens celulares tumorais de mama da “American Type Culture
Collection” (ATCC): MCF7 (ATCC: HTB-22 - célula epitelial de
adenocarcinoma), MDA-MB-231 (ATCC: HTB-26 - célula epitelial de
adenocarcinoma), MDA-MB-435S (ATCC: HTB-129 - célula epitelial de
carcinoma ductal invasivo), e HB4a C5.2 (célula epitelial de lúmen de mama
normal transfectada com o oncogene ERBB2) e 02 correspondentes a
linhagens de mama normal: HB4a (célula epitelial de lúmen de mama
43
normal) e MCF10A (ATCC: CRL-10317- célula epitelial de doença
fibrocística). No Anexo 7 estão relacionadas todas as linhagens utilizadas no
estudo e as informações detalhadas a respeito do status dos marcadores de
prognóstico ER e PgR.
3.3.2 Amostras utilizadas para validação em grupo independente
através de qRT-PCR
Foram utilizadas 40 amostras tumorais de mama obtidas de pacientes
operadas no Hospital AC Camargo arquivadas no Banco de Tumores de
nossa Instituição (Biorrepositório Hospital AC Camargo). Para essa
validação foram incluídas duas amostras normais bordas de fibroadenoma
(MN02 e MN23) e duas amostras de glândula mamária normal (Clontech,
cat#636576, sendo uma do lote#7020050 e outra de lote desconhecido),
uma vez que não restou material do grupo inicial. O critério para seleção das
amostras foi o mesmo utilizado anteriormente, sendo todas as amostras de
pacientes do sexo feminino com diagnóstico de carcinoma ductal invasivo, e
não submetidas a tratamento prévio à cirurgia (quimioterapia, hormônio
terapia ou radioterapia). Todas as informações detalhadas a respeito dessas
amostras estão apresentadas no Anexo 12.
Uma tabela caracterizando clinicamente toda a casuística utilizada
neste trabalho está apresentada em resultados (página 116).
44
3.4 EXTRAÇÃO DE RNA
A metodologia de extração de RNA total utilizada para o grupo inicial
e para todas as amostras normais foi através de gradiente isopícnico de
Cloreto de Césio - CsCl (GLISIN et al. 1974) (Anexo 8), uma vez que esta
técnica possibilita maior recuperação do RNA total com melhor qualidade
das amostras de mama normal quando comparada à extração por TRIzol
®
Reagent. Foi também extraído RNA das 06 linhagens celulares de mama
(HB4a, HB4a C5.2, MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB-435S e MCF10A), as
quais seguiram o método TRIZOL
®
(Invitrogen Life Technologies™),
seguindo-se as especificações do fabricante (Anexo 9). Esse procedimento
também foi utilizado para amostras tumorais do grupo independente.
3.4.1 Avaliação da qualidade do RNA extraído
A qualidade do RNA extraído foi analisada através de eletroforese em
gel de agarose 1,0% utilizando-se 5,0µL de tampão de corrida desnaturante
(3X Loading Buffer bromofenol blue e 7M uréia) antes de ser aplicada no gel.
Em seguida adicionou-se 2,0µL de brometo de etídio 0,5 µg/µL à amostra. A
corrida foi realizada a 60 mV por 50 minutos. A análise da integridade foi
feita avaliando-se a relação entre as bandas correspondentes aos RNA
ribossomais 28S e 18S, cuja relação deve ser ≥ a 1 (Figura 3). A
quantificação do RNA total foi feita pela leitura da absorbância em
espectofotômetro (Gene Quant pro), com comprimento de onda equivalente
a 260 nm, considerando-se que 1 OD a 260 nm equivale a 40 ng/μl de RNA.
45
A razão das leituras 260/280 foi utilizada como parâmetro na estimativa do
grau de contaminação do RNA por fenol ou proteínas, sendo utilizado RNA
com razão ≥ 1,8.
Legenda: 1 - amostra 18T; 2 - amostra 19T; 3 - amostra 21T; 0,5ug RNA total - Gel de
agarose 1,0%. Relação entre as bandas 28S/18S: 2:1.
Figura 3 - Representação das bandas 28S e 18S de RNA ribossomal de 3
amostras de tecido tumoral extraídas por CsCl.
3.5 AMPLIFICAÇÃO DE RNA (RNAa)
Os RNA totais foram submetidos à metodologia de amplificação de
mRNA, baseado em GOMES et al. (2003), para obtenção de quantidade
suficiente para a realização dos experimentos de hibridização. Foram
utilizados 4ug de RNA total na presença do iniciador: Oligo dT (18)-T7
iniciador. O iniciador possui uma cauda poli T que ancora na cauda poli-A
dos RNA mensageiros e possuem região correspondente ao promotor da
RNA polimerase do fago T7, para a reação de transcrição in vitro. Esse
método utiliza dois rounds de amplificação para que a quantidade de RNA
28S
18S
1 2 3
46
seja suficiente para os experimentos que se seguirão, permitindo a
amplificação de mRNA na ordem de 3x10
2
a 3x10
3
(Anexo 10).
3.5.1 Avaliação da qualidade do RNA amplificado (RNAa)
A avaliação das amostras de RNA amplificado foi realizada em gel de
agarose 1,0%, em uma corrida com duração de 50 minutos na voltagem de
60 mV. 1µg de RNA amplificado foi adicionada a 5,0µL de tampão TAE com
uréia 7M, 3X Loading Buffer azul de bromofenol e 2,0µL de brometo de
etídio 0,5 µg/µL antes de ser aplicada no gel. Somente as amostras que
apresentaram um perfil de amplificação onde a maior concentração de RNA
amplificado (RNAa) estava pelo menos entre 350-750 pb foram utilizadas,
pois correspondem a uma qualidade de hibridização satisfatória. A
quantificação do RNA amplificado foi feita pela leitura da absorbância em
espectofotômetro (Gene Quant pro), com comprimento de onda equivalente
a 260 nm, considerando-se que 1 OD a 260 nm equivale a 40 ng/μl de
RNAa. A razão das leituras 260/280 foi utilizada como parâmetro na
estimativa do grau de contaminação do RNAa por fenol ou proteínas, sendo
utilizado RNA com razão ≥ 1,8. As figuras 4 e 5 representam alguns
exemplos de RNAs amplificados.
47
3.6 MARCAÇÃO E HIBRIDIZAÇÃO
A hibridização das membranas foi realizada em duplicata de acordo
com o método de CHURCH e GILBERT (1984). Para tanto, 5μg de RNA
amplificado foram marcados com α
32
P-dCTP em uma reação de transcrição
reversa segundo o procedimento descrito por HAUSER et al. (1998). A cada
tubo contendo RNAa foram adicionados 3μL de iniciadores randon primer
dN6 (3μg/μl), 0,3μl de RNA de fago λ Qgene. O volume da reação foi
completado com água DEPC para 15,9μl e foi realizada uma incubação à
70ºC durante 10 min. Em seguida foram adicionados 3,0μL da enzima
Transcriptase Reversa (200u/μL) (SuperScript II, Invitrogen Life
Technologies™), 0,5μL de RNase IN (40u/μL), 60μCi de α
32
P-dCTP, 1,66μM
de dCTP, 0,25 mM de cada um dos demais dNTPs (dATP, dTTP e dGTP),
Legenda: 1 ug RNAa. Gel de agarose
1,0%. M: marcador de peso molecular
1kb Plus (Invitrogen).
Figura 4 - Representação de
RNAa de 3 linhagens celulares de
mama-1: MDA-MB-435; 2: MDA-
MB-231 e 3: MCF7.
1000pb
500pb
1 2 3
Legenda: 1 ug RNAa. Gel de agarose
1,0%. M: marcador de peso molecular
1kb Plus (Invitrogen).
Figura 5 - Representação de
RNAa de 4 amostras de tecido
tumoral de mama- 1: 19T, 2:
26T; 3: 27T; 4: 28T.
1 2 3 4
M
M
1000pb
500pb
48
3,0μL de DDT (0,1M), 10,0μl de tampão 5X e água DEPC q.s.p. o volume
final de 50μL de reação para a síntese da primeira fita de cDNA. A reação foi
incubada durante 2 horas a 43ºC e em seguida foi feita a hidrólise do RNA
através da adição de 1,5μL de 1% SDS, 1,5μL de 0,5M EDTA, 3,0μL de 3M
NaOH, durante 30 minutos a 67ºC e 15 minutos à temperatura ambiente. A
seguir a reação foi neutralizada adicionando-se 1,5μL de 1M Tris-HCL
pH8,0 e 4,5μL de 2N HCl. Os nucleotídeos radioativos não incorporados
foram removidos por centrifugação em coluna Sephadex G50 previamente
equilibrada com água MilliQ.
A membrana foi pré-hibridizada em solução de 0,25M Na
2
HPO
4
pH
7,2, 7% SDS, 1% BSA e 1mM EDTA durante 1 hora a 65ºC em forno
giratório. A seguir foram adicionados os cDNAs marcados radioativamente
para que ocorresse a hibridização sob a temperatura de 65ºC durante um
período de 16 horas. A membrana foi, então, lavada duas vezes por 30 min.
a 65ºC em solução contendo 0,5M Na
2
HPO
4
pH 7,2, 1% SDS, e 1mM EDTA
e uma vez em solução contendo 0,25M Na
2
HPO
4
pH 7,2, 1% SDS, e 1mM
EDTA. Em seguida a membrana foi exposta a Phosphosimager (Molecular
Dynamics, USA) durante um período de 96 horas e escaneada em aparelho
STORM 840 (Molecular Dynamics, USA).
49
3.7 CAPTURA DOS DADOS
Os sinais gerados nas membranas foram capturados em
Phosphosimager (Molecular Dynamics, USA) e a imagem gerada foi
analisada pelo programa Array Vision™ (Imaging Research Inc, USA). Este
programa localiza automaticamente os sinais gerados pela hibridização,
devendo ser feito posteriormente um ajuste manual ponto a ponto. Em
seguida o programa quantifica a intensidade deste sinal através da média de
distribuição dos pixels. Para cada elemento, o valor fornecido pelo software
é chamado de volume. O volume total é correspondente ao valor da média
de todos os pixels contidos no spot multiplicado pela área do spot.
3.8 CORREÇÃO DO VALOR DE SINAL OBTIDO
As análises matemáticas e estatísticas foram realizadas pelo
Laboratório de Bioinformática do Hospital AC Camargo (LBHC) sob a
coordenação da Dra. Helena P. Brentani. O valor de intensidade do
background local foi subtraído do valor de intensidade de expressão do
foreground obtido para cada elemento, sendo considerados apenas os
pontos que apresentaram valor positivo. Após esta etapa todos os valores
foram trabalhados na escala logarítimica com base 2.
50
3.9 REMOÇÃO DOS OUTLIERS
Como há oito medidas correspondentes a cada exon (duplicata de
membrana com 4 spots do mesmo exon em cada uma), foi feita uma média
dos 8 valores de intensidade para cada exon e os valores que ultrapassaram
+/-2σ da média foram excluídos da análise.
3.10 NORMALIZAÇÃO DOS DADOS
A normalização foi realizada através da média de intensidade das 24
réplicas de exons dos genes normalizadores GAPDH e ACTB imobilizados
na membrana. Assim, foi criada uma constante através da média dos 24
pontos (K) em cada membrana e a normalização foi feita membrana a
membrana e ponto a ponto, isto é, cada exon foi normalizado
individualmente através da subtração do valor de K.
3.11 CONTROLE DE QUALIDADE EXPERIMENTAL DAS
MEMBRANAS
Após a subtração do valor de intensidade do background e
normalização, as membranas passaram por um controle de qualidade
experimental.
51
Para verificar a reprodutibilidade experimental entre a membrana
principal e sua réplica foi calculada a Correlação de Pearson (R
2
), onde
somente foram aceitas amostras com correlação acima de 0,8.
Foi analisada a variabilidade entre cada exon em cada experimento.
Para isso, foi feita uma distribuição dos valores de intensidade após
normalização para cada um dos 270 exons.
3.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Após a normalização dos dados, foi aplicado o teste estatístico
TStudent, sendo considerados exons com expressão diferencial significativa
aqueles que apresentaram p<0,05 entre os diferentes grupos de amostras.
Para verificar a representatividade dos exons diferencialmente
expressos que estavam entre os 75 previamente selecionados pela análise
computacional como associados a tumor de mama, levou-se em
consideração todos os exons diferencialmente expressos da análise e os
270 imobilizados na membrana, aplicando-se o teste de Qui-quadrado (X
2
)
com intervalo de confiança 1 e considerando-se um p<0,05 (5%).
Para avaliação da variabilidade dos valores de intensidade entre os
exons pertencentes a cada classe analisada foi utilizada uma ferramenta da
web que implementa a ferramenta estatística Bay Boots (bayesian bootstrap)
(http://blasto.iq.usp.br/~rvencio/bayboots/index.php), baseada no BER
(Bayes error rate), onde são considerados diferencialmente expressos os
valores de intensidade cuja comparação não apresente sobreposição de
52
curvas maior que 30% (BER<0,3). Essa ferramenta estatística foi aplicada
em todos os exons diferencialmente expressos em todos os grupos e entre
todas as comparações.
3.13 ANÁLISE DOS GENES EM BANCOS DE SAGE
Com o intuito de aumentar a chance de selecionar variantes de
splicing mais expressas em tumores e não genes mais expressos, uma
análise prévia em bancos de SAGE foi realizada pelo Laboratório de
Bioinformática do Hospital AC Camargo (LBHC). Para selecionar os exons
superexpressos que tinham probabilidade de pertencer somente à variante
de splicing que contém o exon (VCE) e não ao gene como um todo, foi
investigada a expressão de cada cDNA full length em bancos de dados de
SAGE. Foram geradas tags virtuais das seqüências completas que
continham uma cauda poliA. Para isso foram inicialmente mapeadas as tags
virtuais com a predição de uma seqüência de 10 pb determinada pelo sítio
de restrição da enzima NlaII, a partir da extremidade 3’ da seqüência. Foram
excluídas tags localizadas em regiões repetitivas, uma vez que as regiões
genômicas repetitivas (repetitive regions) aparecem em diferentes
localizações do genoma, e tags inespecíficas, isto é, que representam mais
de um gene. A freqüência da tag correspondente ao cDNA full length foi
comparada nos dois tipos de bibliotecas de mama (tumoral e normal),
utilizando-se uma ferramenta da web denominada SAGEbetaBin (VENCIO et
al. 2004), um modelo bayesiano beta-binomial que analisa a variabilidade
53
entre classes e está baseado no BER (Bayes error rate), o qual considera
diferencialmente expressos os valores de intensidade cuja comparação não
apresente sobreposição de curvas maior que 30% (BER<0,3).
3.14 VALIDAÇÃO ATRAVÉS DA ANÁLISE DO NÍVEL DE
EXPRESSÃO POR RT-PCR QUANTITATIVO (qRT-PCR)
3.14.1 Desenho dos iniciadores
Para avaliar o nível de expressão através de RT-PCR quantitativo
foram desenhados iniciadores para as 2 variantes: VCE (com o exon
associado a tumor), VSE (sem o exon associado a tumor) e para o gene
como um todo. Para a variante contendo exon, o primer forward foi
desenhado dentro do exon 2 associado a tumor (F-VCE, Figura 6a) e para a
variante sem o exon, o primer forward foi desenhado na junção exon-exon
(exon1-exon3) do transcrito que não contém o exon associado a tumor (F-
VSE1.3, Figura 6b). Foi utilizado um iniciador reverse comum (R) para as
duas formas desenhado no exon 3, que flanqueia à 3’ o exon associado a
tumor (Figura 6a e b). Para a avaliação do gene como um todo os
iniciadores foram desenhados em exons constitutivos (página 29).
54
a) (VCE)
b) (VSE)
Legenda: (VCE) - Variante com o exon; (VSE) - variante sem o exon; 1- exon flanqueador
usptream; 2- exon associado a tumor; 3- exon flanqueador downstream; F-VCE- iniciador
forward desenhado no exon 2, associado a tumor; F-VSE1.3- iniciador forward desenhado
na junção exon1-exon3 da variante sem o exon; R- iniciador reverse desenhado no exon 3,
comum às duas variantes (VCE e VSE).
Figura 6 - Representação esquemática do pareamento dos iniciadores na
VCE (a) e na VSE (b).
Para evitar extensão inespecífica, no caso da variante sem o exon
(VSE), para os iniciadores desenhados nas junções exon1-exon3, foi
estabelecido um critério de sobreposição da porção 3’ do iniciador forward
ser de no máximo 4 bases pareando no exon 3, segundo recomendação de
SHULZHENKO et al. (2003). Esse critério foi estabelecido, uma vez que os
fragmentos gerados a partir das duas combinações de iniciadores
correspondentes aos dois tipos de transcritos (VCE e VSE) compartilham
seqüências comuns (exon 3), e o que os diferencia é apenas a trecho da
seqüência correspondente ao exon 1 da VSE e do exon 2 (associado a
tumor) da VCE. Os iniciadores apresentaram de 11 a 19 bases, temperatura
1
5’ 3’
F-VCE
R
F-VSE1.3
R
3’
5’
3
2
3
1
Exon associado a
tu
m
or
55
de pareamento variando entre 52 e 62ºC, sendo que a diferença em graus
de temperatura permitida entre os pares de iniciadores foi de no máximo
3ºC. Para verificar a presença de estruturas secundárias (stem loop e
homodimer) foi utilizado o programa OLIGOTECH versão 1.00 (Copyright
©
1995), permitindo temperaturas de no máximo 20ºC. Todos os iniciadores
foram diluídos a uma concentração estoque de 100uM, de onde foram feitas
diluições trabalho de 10uM, as quais foram utilizadas nas reações de qRT-
PCR.
3.14.2 Síntese de cDNA
O cDNA de todas as amostras foi sintetizado a partir de 1ug de RNA
total, adicionando-se 1ul de iniciadores 0,5 ug/ul oligo dT, e em seguida
incubou-se a 70ºC por 10 minutos. Uma mistura composta por 4ul de 5x First
strand buffer; 2ul 0,1 M DTT; 1ul de Rnase IN; 2ul de 10mM dNTP; 1ul de
Superscript II (Invitrogen Life Technologies™); água DEPC q.s.p. 20ul foi
adicionado, e em seguida incubou-se a reação 42°C em termociclador PTC
100™ (MJ Research, INC). Após 45 minutos foi adicionado mais 1ul de
Superscript II e incubou-se por mais 45 minutos a 42ºC. Para a verificação
da integridade do cDNA foram feitas reações de RT-PCR para o gene
normalizador GAPDH
1101
, utilizando-se iniciadores localizados a 1.101pb da
porção 3’ do gene (F: GAAGGTGAAGGTCGGA; R:
GGGTCATTGATGGCAAC), em um volume final de 20μl, sendo 2,0 μl de
tampão (10X); 1,5 mM de MgCl
2
; 0,4 mM de iniciador forward; 0,4 mM de
iniciador reverse; 1 U de Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen Life
56
Technologies™) e 10,0ng de cDNA. O programa apresentou as seguintes
etapas: 4 minutos a 94ºC, seguidos de 23 ciclos de 45 segundos a 94ºC, 45
segundos a 60ºC para o pareamento dos iniciadores e 1 minuto a 72ºC. Por
fim, estendeu-se 6 minutos a 72ºC, terminando-se em 16ºC infinito.
Alíquotas de 5,0µL das reações de RT-PCR foram, em seguida, aplicadas
em gel de agarose 1,0% corado com Brometo de Etídio em uma corrida com
duração aproximada de 60 minutos na voltagem de 80 mV, a fim de se
confirmar a amplificação de um fragmento de 102pb correspondente ao gene
normalizador GAPDH
1101
.
3.14.3 Estabelecimento das condições da reação de RT-PCR
As reações de RT-PCR foram feitas em um volume final de 20μl,
sendo 2,0 μl de tampão (10X); 1,5 mM de MgCl
2
; 0,4μl de iniciador forward;
0,4μl de iniciador reverse; 1 U de Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen
Life Technologies™) e quantidade de cDNA correspondente a 20 ng de RNA
total. O programa apresentou a seguinte ciclagem de temperatura: 4 minutos
a 94ºC, seguidos de 35 ciclos de 45 segundos a 94ºC, 45 segundos na
temperatura específica de pareamento de cada iniciador e 1 minuto a 72ºC.
Por fim, estendeu-se por 6 minutos a 72ºC, terminando-se em 16ºC infinito.
Alíquotas de 5,0μL das reações de RT-PCR foram, em seguida,
aplicadas em gel de poliacrilamida 8,0% em uma corrida com duração
aproximada de 60 minutos na voltagem de 80 mV, a fim de se confirmar os
tamanhos dos fragmentos esperados.
57
3.14.4 Teste de especificidade do iniciador forward da variante sem o
exon (VSE) desenhado na junção exon1-exon3
O iniciador forward da VSE (F-VSE1.3) ancora com especificidade
total na junção exon1-exon3 desta variante, e pode ancorar de forma parcial
na junção exon2-exon3 da VCE, pareando de forma específica somente na
região correspondente ao exon 3 (Figura 7-Esquema 1). Isso pode ocorrer
mesmo que o pareamento desses iniciadores seja de apenas 4pb conforme
já descrito anteriormente. Dessa forma, para teste de especificidade foi
utilizado como molde os amplicons constituídos pelos exons 2+3 da VCE,
que representavam a junção exon2-exon3, e os iniciadores F-VSE1.3 e R,
complementares à junção exon1-exon3 e ao exon 3, respectivamente. A
presença ou ausência de amplificação do fragmento de tamanho esperado
sinaliza ocorrência de amplificação inespecífica ou específica,
respectivamente.
Figura 7 - Esquema 1 = Representação hipotética do pareamento
inespecífico do iniciador F-SE na variante com o exon (VCE).
F-VSE1.3
F-VSE1.3
58
3.14.5 RT-PCR quantitativo (qRT-PCR)
qRT-PCR ou RT-PCR em tempo real avalia o acúmulo do produto na
fase logarítmica da reação de amplificação e está diretamente relacionado à
quantidade de transcritos existentes no início da reação. O sistema de
detecção utilizado neste trabalho foi o SYBR® Green, que se baseia na
utilização de uma molécula fluorescente denominada SYBR® Green I que,
quando intercalada à dupla fita de DNA, passa a emitir fluorescência.
Durante os ciclos iniciais da reação de PCR o sinal de fluorescência emitido
pelo SYBR® Green I é fraco para ser detectado (não ultrapassando o sinal
de fluorescência de fundo). Entretanto, no decorrer dos ciclos da reação de
PCR, há um aumento do produto amplificado e conseqüentemente do sinal
fluorescente, que passa então a ser detectável, sendo que quanto menor o
ciclo em que a fluorescência atinge o limite determinado pelo aparelho,
maior é o nível de expressão do transcrito analisado (MORRISON et al.
1998). Desta forma, valores quantitativos são obtidos do ponto em que a
amplificação do produto foi detectada, diferente da reação de PCR
convencional, na qual a detecção acontece depois de um número fixo de
ciclos, o que representa a quantidade final de cada produto acumulado.
Nesta metodologia, a quantificação da expressão gênica é baseada no
parâmetro de CTs (Threshold Cycle ou ciclo limite) ou CPs (Crossing Point
ou ponto de cruzamento), definido como o número do ciclo em que a
fluorescência gerada atinge um limite acima da fluorescência de fundo (Livak
et al., 2001), sendo os dados de quantificação analisados pelo programa de
análise do aparelho (MORRISON et al. 1998).
59
As reações foram realizadas no aparelho ABI Prism® 7500 Sequence
Detection System (Applied Biosystems) em um volume final de 20µl em
placas de 96 wells - MicroAmp® Optical (Applied Biosystems. Cada reação
foi realizada em duplicata na presença de 10µl de SYBR® Green PCR
Master Mix (Applied Biosystems) e as reações que apresentaram valores de
desvio padrão acima de 0,6 foram desconsideradas.
3.14.6 Padronização das concentrações de cDNA e de iniciadores
Para cada gene estudado foi realizada uma cinética de amplificação
numa reação de qRT-PCR usando diferentes concentrações de iniciadores e
diferentes diluições de cDNA convertido de RNA de uma mesma amostra, e
as quantidades ideais foram padronizadas individualmente. Para seu
estabelecimento foram utilizadas as seguintes quantidades finais de cada
iniciador: 200, 500 ou 800nM, e cDNA a partir de 10 e 30ng de RNA total.
Para a padronização da quantidade de cDNA foi selecionada,
preferencialmente, a mínima concentração que mostrasse um C
T
não muito
variável em relação a uma maior concentração, a fim de economizar
amostra.
As concentrações dos iniciadores foram padronizadas considerando-
se dois fatores: a utilização, sempre que possível, das menores
concentrações de iniciadores a fim de evitar a formação de dímeros, e a
obtenção dos menores valores de C
T
possíveis.
As condições de amplificação consistiram em 2 minutos a 50ºC para a
ativação da enzima AmpErase, 10 minutos a 95ºC para a ativação da
60
enzima AmpliTaq Gold DNA Polymerase, seguidos de 40 ciclos de
desnaturação a 95ºC durante 15 segundos e um minuto na temperatura
ideal de cada iniciador para o seu pareamento e extensão. Ao final da
amplificação foi adicionada uma etapa de 20 minutos de duração, na qual a
temperatura aumenta gradualmente de 60°C para 95°C a 0,2°C por segundo
com a contínua aquisição da fluorescência (MORRISON et al. 1998), a partir
da qual se obtém uma curva de dissociação, utilizada para confirmação da
especificidade da amplificação. A especificidade de cada fragmento foi
também analisada em gel de poliacrilamida a 8%.
Para determinar a eficiência de amplificação dos iniciadores
específicos para os transcritos de interesse (transcritos alvo) ou
normalizadores, foi construída uma curva padrão utilizando 5 diferentes
concentrações de cDNA em triplicata (100ng, 20ng, 4ng, 0,8ng e 0,16ng)
obtidas por meio da diluição seriada de cDNA calculado a partir da
quantidade de RNA total de linhagem celular de mama normal HB4a. O
cálculo da eficiência de amplificação foi feito para cada gene através da
fórmula [Ef = 10
(-1/slope)
], recomendada pelo manual da Applied Biosystems,
em que slope corresponde à inclinação da reta obtida quando se analisa a
variação do C
T
dos transcritos alvo e do gene normalizador em função do log
das diferentes quantidades de cDNA.
Foram aceitos valores mínimos de eficiência de 70% e do coeficiente
de regressão da reta (R
2
) de 0,97.
61
3.14.7 Seleção dos genes normalizadores
Para a análise dos dados de expressão das amostras foram testados
5 genes normalizadores, GAPDH (NM_002046.2), ACTB (NM_001101.2) -
ambos utilizados como genes normalizadores nos experimentos de
microarray -, HPRT (NM_000194), BCR (NM_004327) e RPLP0
(NM_001002) - selecionados com base nos dados da literatura como
apresentando expressão constitutiva (VANDESOMPELE et al. 2002; DE
KOK et al. 2004; HUGGETT et al. 2005). Para seleção do gene
normalizador, os valores foram tabulados em planilha EXCEL 9.0/2000
(Microsoft, EUA) e foi utilizada a ferramenta geNorm (Visual Basic
Application - VBA), disponível online
(http://medgen.urgent.be/~jvdesomp/genorm/) desenvolvida para o Microsoft
Excel (VANDESOMPELE et al. 2002). Esse programa calculou
automaticamente quais dos genes testados foram os mais estáveis no grupo
de cDNA de amostras para serem utilizados como normalizadores.
A estabilidade dos genes normalizadores é determinada partindo-se
do princípio de que dois genes normalizadores ideais possuem razões de
expressão idênticas em todas as amostras de cDNA analisadas,
independente de quaisquer condições experimentais ou tipos celulares. A
razão de expressão de cada gene normalizador em relação aos demais é
analisada sempre aos pares, o que permite a exclusão dos genes menos
estáveis. A cada gene normalizador excluído, o programa automaticamente
atribui um novo valor referente à estabilidade dos demais genes
normalizadores nas amostras de cDNA. Esse processo ocorre diversas
62
vezes até que permaneçam apenas os genes cujos níveis de expressão
sejam os mais estáveis, determinando, assim, a combinação adequada de
genes normalizadores a ser utilizada nas análises de RT-PCR quantitativo.
3.14.8 Análise dos dados de expressão gênica
A expressão diferencial dos transcritos alvo foi determinada pelo
método de quantificação relativa a um gene normalizador. Para cálculo da
medida relativa de expressão foi utilizado o modelo matemático proposto por
PFAFFL (2001) que analisa individualmente as eficiências de amplificação
de cada gene (E) e leva em consideração a eficiência de amplificação de
cada par de iniciadores (Figura 8). Nesta equação, E alvo corresponde à
eficiência de amplificação dos iniciadores específicos para o transcrito alvo,
E normalizador corresponde à eficiência de amplificação dos iniciadores
específicos para o gene normalizador, ΔC
T
alvo corresponde à diferença
entre o C
T
do transcrito alvo obtido para a amostra em análise e o C
T
do
transcrito alvo obtido para a amostra calibradora, ΔC
T
normalizador
corresponde à diferença entre o C
T
do gene normalizador obtido para a
amostra em análise e o C
T
do gene normalizador obtido para a amostra
calibradora.
A linhagem celular de mama normal HB4a foi utilizada como amostra
calibradora em todos os experimentos de RT-PCR quantitativo. Assim, o
cDNA desta linhagem foi utilizado em duplicata em cada uma das placas de
reação de qRT-PCR.
63
Expressão
relativa
(E
alvo
+ 1)
ΔCt alvo
(E
endógeno
+ 1)
ΔCt endógeno
=
Expressão
relativa
(E
alvo
+ 1)
ΔCt alvo
(E
endógeno
+ 1)
ΔCt endógeno
=
Expressão
relativa
(E
alvo
+ 1)
ΔCt alvo
(E
endógeno
+ 1)
ΔCt endógeno
=
Fonte: PFAFFL (2001)
Figura 8 - Modelo matemático para quantificação relativa em qRT-PCR.
3.14.9 Análises Estatísticas
A expressão diferencial dos transcritos de interesse (transcritos alvo)
foi determinada a partir dos dados normalizados pelo método de
quantificação relativa considerando um gene normalizador (PFAFFL 2001),
apresentado no item anterior. Para cada gene alvo foram obtidas 3 medidas
relativas: 1) da variante que contém o exon (VCE), 2) da variante que não
contém o exon (VSE) e 3) da expressão constitutiva do gene (EC).
Para avaliação da significância estatística das diferenças de
expressão foi utilizado o programa computacional GraphPad Prism version
4.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) aplicando o teste T Student
não-pareado, e foram considerados como significativos valores de p<0,05.
Foram consideradas como variantes superexpressas em amostras tumorais
de mama aquelas que: 1) apresentaram um fold-change ≥ 3 no cálculo da
média do nível de expressão da VCE nas amostras tumorais em relação à
média do nível de expressão da VCE nas amostras normais e, 2) um valor
relativo de expressão T/N da VCE maior que a VSE [(VCE tumor / VCE
normal) > (VSE tumor / VSE normal)], ou ainda um valor relativo de
expressão T/N da VCE maior que a EC [(VCE tumor / VCE normal) > (EC
64
tumor / EC normal)] avaliados pelo teste estatístico TStudent, sendo
considerados valores estatisticamente significativos aqueles com p<0,05.
Para esses cálculos foram considerados os valores de expressão
normalizados pelo gene normalizador de cada amostra tumoral dividido pela
média dos respectivos valores das amostras normais. Os detalhes para essa
análise serão apresentados nos resultados.
3.15 ANÁLISES CLÍNICAS E HISTOPATOLÓGICAS
Os dados coletados dos prontuários dos pacientes foram transcritos
em ficha padronizada e digitados em banco de dados específico
confeccionado no programa “ Excel 2003 – Microsoft Office”. As informações
histopatológicas e dos marcadores moleculares também foram passadas
para o mesmo banco de dados onde estavam registradas as características
clínicas dos pacientes. Após conclusão do banco de dados com todas as
informações, a análise estatística dos dados foi realizada utilizando o
software estatístico SPSS 15.0 for Windows (Statistical Package for Social
Science, SPSS 15.0).
A caracterização da população de estudo e do tratamento efetuado foi
feita por meio de estatística descritiva, calculando-se, inicialmente, as
freqüências de todas as variáveis estudadas. Para associação dos valores
de expressão obtidos através dos experimentos de RT-PCR quantitativo
(qRT-PCR) com as variáveis clínicas e histopatológicas, os valores foram
divididos em quartis, e a associação foi realizada através do teste estatístico
65
qui-quadrado de Pearson ou pelo teste exato de Fisher quando aplicável. As
diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando o valor
de p< 0,05.
66
4 RESULTADOS
4.1 CONSTRUÇÃO DA PLATAFORMA DE MICROARRAY
4.1.1 Extensão dos Fragmentos
Todos os 270 fragmentos puderam ser amplificados com tamanho
esperado, representando uma aproveitamento de 100%. Inicialmente,
obteve-se aproveitamento de 90% nas amplificações de fragmentos
seguindo-se o protocolo de touchdown estabelecido. Os fragmentos que não
estenderam nessas condições, foram submetidos a reações de PCR com
pequenas variações de temperatura e concentração de cloreto de magnésio.
Na Figura 9 estão representado alguns dos fragmentos amplificados.
Legenda: 1: exon 113282_9 (486pb), 2: exon 114644_12 (228pb), 3: exon 1152216_20
(100pb), 4: exon 115216_23 (190pb), 5: exon 115216_25 (274pb), 6: exon 115216_26
(485pb). Gel de agarose 1,0%. Foram aplicados 5,0 μL de cada amostra. M: marcador de
peso molecular 1Kb Plus.
Figura 9 - Representação de alguns produtos amplificados.
1 2 3 4 5 6
M
100pb
200pb
300pb
400pb
500pb
67
4.1.2 Clonagem, Seqüenciamento e Análise das Seqüências
Todos os fragmentos amplificados foram clonados e seqüenciados
para confirmação de sua identidade. Os resultados de seqüenciamento
mostraram que 95,2% das seqüências (257 de 270) imobilizadas
apresentaram identidade confirmada.
Foi confirmada também através de seqüenciamento a identidade de
todos os 4 fragmentos amplificados correspondentes aos exons e íntrons do
genes normalizadores GAPDH e ACTB.
Os exons que não tiveram confirmação de sua identidade estão
listados a seguir: 118648_12, 120490_2, 154681_10, 4435_11, 4845_2,
232465_9, 282067_7, 9779_10, 50245_6, 156333_8, 89010_10, 230795_9 e
84250_12.
4.2 MARCAÇÃO E HIBRIDIZAÇÃO
Foram hibridizadas 27 amostras de tecido tumoral de mama, 09
amostras de tecido normal de mama e 06 amostras de linhagem celular de
mama, sendo 04 tumorais e 02 normais.
Na Figura 10 está representada uma foto da membrana hibridizada
correspondente à amostra tumoral BS-IDC-ECIIA-9T-46, para apresentar a
localização dos controles positivos, negativos e as réplicas dos exons
imobilizados.
68
Legenda: rosa: representação de um subarray; marrom: controles negativos - água milliQ;
roxo: controles positivos - λ phago Q gene; azul: exons dos genes normalizadores GAPDH e
ACTB; verde: íntrons dos genes normalizadores GAPDH e ACTB; laranja, amarelo,
vermelho e azul turquesa: ilustração da distribuição das 4 replica tas de alguns exons na
membrana AS01-2103, amostra BS-IDC-ECIIA-9T-46 (carcinoma ductal invasivo, estadio
IIA, ERBB2 positivo e ER positivo, com 46 horas de exposição no Phosphosimager).
Figura 10 - Representação de membrana hibridizada com amostra de tecido
tumoral de mama.
Como citado no material e métodos (item 3.2.7) cada membrana
apresentou um total de 1.536 spots, que estão distribuídos em 96 subarrays,
contendo cada um 16 spots: 12 correspondentes a 6 exons associados a
tumor em duplicata, 02 controles positivos de marcação (λQgene) e 02
controles negativos (água). Cada um dos 270 exons associados a tumor foi
imobilizado 4 vezes na mesma membrana, além de 24 fragmentos que
69
correspondem a genes normalizadores para controle de expressão positiva e
12 que correspondem a regiões intrônicas dos genes normalizadores para
controle negativo de expressão. Assim, considerando que cada amostra foi
hibridizada em replicata e cada membrana apresenta 4 replicas de cada
exon, foram gerados 8 medidas de expressão para cada um dos exons.
4.3 CONTROLE DE QUALIDADE EXPERIMENTAL DAS
MEMBRANAS
Para todas as membranas foi obtido o valor da correlação entre os
valores de intensidade da membrana principal e sua réplica, os quais
variaram entre 0,80 e 0,97, apresentando uma correlação média de 0,90
entre todos os experimentos. Pode ser observado na Figura 10 uma maior
dispersão dos valores de intensidade baixos, o que é esperado, uma vez
que o tipo de normalização utilizada não leva em conta as faixas de variação
de intensidade de sinal. Isso foi verificado em todos os gráficos
correspondentes de cada amostra.
70
Legenda: R
2
=0,967- amostra MN04. Na abscissa está representada a membrana principal
e na ordenada a sua réplica.
Figura 11 - Gráfico de Correlação de Pearson.
Para se verificar a variabilidade entre as 8 réplicas de cada exon (4
exons da membrana principal e 4 exons da membrana controle) em cada
experimento foi construído um gráfico de dispersão através da distribuição
dos valores de intensidade após normalização para cada um dos 270 exons,
os quais estão representados na abscissa da Figura 12. Como esperado,
verificou-se uma maior variabilidade nos pontos de baixa intensidade, o que
foi observado em todos os gráficos correspondentes de cada amostra.
71
Legenda: pontos verdes: exons da membrana principal; vermelhos: exons da membrana
réplica). Na abscissa estão representados os 270 exons e na ordenada o valor de
intensidade normalizada de cada uma das 8 réplicas de cada exon.
Figura 12 - Gráfico de dispersão - amostra MN04.
Neste trabalho como a quantidade de RNA total obtido das amostras
foi, na maioria das vezes, insuficiente para a realização dos experimentos,
decidiu-se utilizar amostras de RNA amplificado. Para isso foi avaliada a
correlação dos dados das intensidades médias de cada exon (8 medidas)
obtidos de membranas hibridizadas em duplicatas com RNA total de
HB4aC5.2 e RNA antisense amplificado (RNAa) do mesmo RNA total (dados
não mostrados). O valor de correlação entre elas foi aceitável (correlação de
Pearson 0,71). Dessa forma decidiu-se utilizar RNAa amplificado em 2 ciclos
para todas as amostras utilizadas nesse trabalho.
72
Relatos da literatura mostram que a amplificação de RNA mensageiro
não gera viéses na quantidade relativa dos transcritos (WANG et al. 2000,
GOMES et al. 2003). No entanto, a metodologia resulta em menor
representação da porção 5’ dos transcritos, sendo que a recomendação no
desenho das plataformas é que a sonda representativa de cada transcritos
seja desenhada no máximo a 1.500 pb da região 3’ (BRENTANI et al. 2005).
Nesse trabalho, como os exons são distribuídos ao longo de todo o
transcrito, apresentando diferentes distâncias da extremidade 3’, variando de
110 a 3.338pb, nós resolvemos avaliar a intensidade média dos diferentes
exons em relação a sua distância 3’. Os dados obtidos mostraram que o
sinal de intensidade média não apresentou decréscimo inversamente
proporcional à distância dos exons a extremidade 3’ dos transcritos (Figura
13).
-3 -2 -1 0 1 2
0-500
500-1000
1000-1500
1500-2000
>2000
desvio
media
Legenda:
Figura 13 - Gráfico representativo da intensidade média dos exons em
relação à extremidade 3’. Valores logados na base 2.
Distância da
extremidade 3’ (pb)
Número de
exons
Média Desvio
0-500 46 -1,04 1,19
500-1000 50 -0,78 1,2
1000-1500 61 -1,38 1,23
1500-2000 35 -2,21 1,40
>2000 36 -1,10 1,28
73
4.4 ANÁLISE DOS DADOS DE MICROARRAY
Para identificação dos exons superexpressos tumores de mama foram
realizadas várias comparações no sentido de evitar resultados artefatuais e
conseguir dados mais robustos. Essas comparações se apresentam da
seguinte maneira:
1) amostras tumorais x normais (TxN): para essa comparação foram
utilizadas 27 amostras de carcinoma ductal de mama como amostras
tumorais e 5 amostras de tecido normal (sendo que foram
consideradas como normais aquelas amostras que eram bordas de
fibroadenoma);
2) amostras tumorais x normais pareadas (PTxPN): para essa
comparação foram utilizadas 4 amostras pareadas, sendo
considerado como morfologicamente normal o tecido adjacente (6N,
MN08, MNP12, MN32) ao tecido tumoral (6T, 8T, 12T, 32T);
3) linhagens tumorais x normais (LTxLN): para essa comparação
foram consideradas as linhagens MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB-
435S e HB4a C5.2 no grupo de amostras tumorais e as linhagens
HB4a e MCF10A no grupo de amostras normais.
74
4.4.1 Resultados das Comparações
Foram selecionados os exons superexpressos em tumor de mama
apenas por diferença de expressão baseadas em significância estatística (T
student; p<0,05). Foi analisada a representatividade dos exons associados a
tumor a mama nos grupos de exons superexpressos de cada comparação
nos experimentos de microarray. Os dados estão apresentados a seguir.
1) Amostras tumorais x normais (27Tx5N): 79 exons apresentaram-se
superexpressos em amostras tumorais em relação à amostras
normais, sendo que a variação no número de vezes (fold) no nível de
intensidade entre as classes variou de 1,1 a 2,8. Dezoito dos 79
estavam entre os 75 exons associados a tumor de mama
selecionados nas análises computacionais.
2) amostras pareadas (04 amostras): 195 exons apresentaram-se
superexpressos em amostras tumorais em relação à amostras
normais, sendo que a variação no número de vezes (fold) no nível de
intensidade entre as classes variou de 1,3 a 5,9. Cinqüenta e nove
dos 195 estavam entre os 75 exons associados a tumor de mama
selecionados nas análises computacionais.
3) linhagens tumorais x linhagens normais (4LTx2LN): 24 exons
apresentarem-se superexpressos em linhagens tumorais em relação
à linhagens normais, sendo que a variação no número de vezes (fold)
75
no nível de intensidade entre as classes variou de 1,4 a 4,1. Dezoito
dos 24 estavam entre os 75 exons associados a tumor de mama
selecionados nas análises computacionais.
4.4.2 Representatividade dos exons previamente selecionados pela
análise computacional como associados a tumor de mama
Para verificar a significância estatística da representatividade dos
exons previamente selecionados pela análise computacional como
associados a tumor de mama em relação aos superexpressos em tumor em
cada comparação, aplicou-se o teste estatístico Qui-quadrado (X
2
), levando
em consideração os 270 exons imobilizados na membrana. Essa análise
mostrou que apenas na comparação linhagem tumoral contra linhagem
normal (LTxLN) houve uma super representatividade de exons associados a
mama (p<0,001).
Os resultados dessas análises estão apresentados de forma resumida
na Tabela 2.
Tabela 2 - Exons superexpressos em tumor em 3 comparações.
Comparação
Nº total de exons
superexpressos*
Fold change
Nº exons de mama
superexpressos*
X
2
TxN
79 1,1 a 2,8 18 p=0,2
PTxPN
195 1,3 a 5,9 59 p=0,5
LTxLN
24 1,4 a 4,1 18 p<0,001
Legenda: Tumor x Normal (TxN), Pareadas (PTxPN) e Linhagem Tumor x Linhagem
Normal (LTxLN), *considerando-se p<0,05 e X
2
com grau de liberdade 1.
76
4.4.3 Seleção dos exons superexpressos para confirmação através de
RT-PCR quantitativo (qRT-PCR)
Para seleção de exons para validação através de qRT-PCR, decidiu-
se utilizar 2 critérios de análise, que estão descritos a seguir:
1) Exons superexpressos que foram comuns em mais de 1 comparação
e apresentaram fold>3,0. Para isso, foi construído inicialmente um
diagrama de Venn (Figura 14).
Legenda: TxN: amostras tumorais x normais (79 exons superexpressos, sendo 18
identificados pela análise computacional como associados a tumor de mama), PTxPN:
amostras pareadas tumorais x normais (195 exons superexpressos, sendo 59 associados a
mama) e LTxLN: linhagens tumorais x normais (24 exons superexpressos, sendo 18
associados a mama). As intersecções mostram os exons comuns entre duas comparações
(01 exon entre TxN e LTxLN; 14 exons entre LTxLN e PTxPN; 41 exons entre TxN e
PTxPN), e entre as três comparações (07 exons).
Figura 14 - Diagrama de Venn, representando os exons que apareceram
superexpressos nas comparações.
31
133
02
07
41
01
14
TxN
(79)
PTxPN
(195)
LTxLN
(24)
18 mama
59 mama
18 mama
77
Essa análise mostrou que 56 exons diferencialmente expressos foram
comuns entre 2 comparações (41 entre amostras e amostras pareadas; 14
entre amostras pareadas e linhagem; 01 entre amostras e linhagem), sendo
que desses, 24 foram previamente selecionados pela análise computacional
como associados a tumor de mama, constatando-se uma representatividade
significativa de exons associados a mama nesse grupo (p<0,001). Entre os 7
exons que foram comuns nas 3 comparações, 04 foram previamente
selecionados pela análise computacional como associados a tumor de
mama, o que também mostra, de acordo com o teste Qui-quadrado, uma
representatividade significativa desse grupo (p<0,001).
Considerando-se o critério de aparecer em pelo menos 2
comparações e apresentar fold maior que 3, 12 candidatos foram
selecionados, sendo que 5 deles foram diferencialmente expressos nas 3
comparações (TxN, PTxPN e LTxLN). Os 7 exons restantes estavam
diferencialmente expressos entre 2 comparações. Dos 12 exons
selecionados, foi verificado que 8 foram previamente identificados pela
análise computacional como associados a tumor de mama, mostrando uma
representatividade significativa (p<0,001).
2) O segundo critério considerou exons superexpressos que
apresentaram fold>3 e BER<0,3. A ferramenta estatística Bay Boots
(bayesian bootstrap) é baseada no BER (Bayes error rate), e
considera diferencialmente expressos os valores de intensidade cuja
comparação não apresente sobreposição de curvas maior que 30%
78
(BER<0,3). Essa ferramenta estatística foi aplicada em todos os
exons diferencialmente expressos entre todas as comparações (TxN,
PTxPN e LTxLN) com a finalidade de identificar os exons
diferencialmente expressos com menor variabilidade de intensidade
dentro das classes avaliadas.
Considerando-se esse segundo critério, somente na comparação
PTxPN foram identificados 3 exons que apresentaram BER<0,3
(sobreposição de curvas de no máximo 30%). Sendo eles: 4363_4
(BER=0,178; fold 3,0), 89442_12 (BER=0,298; fold 4,3) e 115216_14
(BER=0,288; fold 5,9) (Figuras 14 a, b e c). Os 3 exons foram selecionados,
uma vez que apresentaram valor de BER<0,3 em relação aos dados de
intensidade do array e apresentaram fold maior que 3.
Legenda: Na abscissa estão distribuídos os pontos referentes a todos os valores de
intensidade dos respectivos exons nas duas classes estudadas: tumoral (verde) e normal
(vermelho) e o valor de sobreposição entre as classes (BER). Na ordenada estão
representados os valores de densidade de probabilidade da população.
Figura 15 - Bay Boots. a: exon 4363_4; b: exon 89442_12 e c: exon
115216_14.
a b
c
79
Como o exon 89442_12 foi identificado nos 2 critérios, o número total
de exons selecionados como candidatos pertencentes à variantes de splicing
associadas a câncer de mama foi 14.
4.4.4 Análise de expressão dos genes correspondentes a cada exon
em bancos de SAGE
Considerando-se que a superexpressão dos 14 exons pode ser
devido à superexpressão do gene como um todo, e não da variante de
splicing, foi investigada a expressão dos cDNAs full lengths correspondentes
aos genes em bancos de dados de SAGE. Essa análise identificou 171 tags
únicas dos 270 analisados, que tiveram informação de expressão nas
bibliotecas de SAGE normais e tumorais. Dessa forma foi comparada a
freqüência da tag correspondente ao gene candidato nos dois tipos de
bibliotecas (tecido normal e tumoral). Foram considerados como
diferencialmente expressos, aqueles genes cujas tags apresentaram
BER<0,3. Essa análise mostrou que, dos 171, apenas 14 deles eram
superexpressos em bibliotecas tumorais em relação às bibliotecas normais,
o que sugere que os 157 restantes são candidatos à superexpressão da
variante.
Dos 14 candidatos previamente selecionados, para 4 deles não foi
possível obter informação de SAGE. Para os 10 candidatos com informação,
nenhum apresentou BER<0,3 nas análises das bibliotecas em bancos de
SAGE, o que significa que a superexpressão do exon provavelmente é
80
devido à superexpressão da variante e não do gene, tornando esses
candidatos mais promissores para validação por qRT-PCR.
Os resultados referentes aos 14 exons selecionados estão
apresentados de forma resumida na Tabela 3.
Tabela 3 - Exons selecionados para marcador molecular entre as
comparações TxN, PTxPN e LTxLN.
Exon
Gene
Symbol
mRNA
Accession
Number
Nome
Fold em cada
comparação
SAGE-BER
50321_8 BAP1 NM_004656
BRCA1 associated
protein-1 (ubiquitin
carboxy-terminal
hydrolase)
TxN (1,5), PTxPN (4,8)
e LTxLN (2,2)
0,9
234267_14 LIP8 NM_053051
LYST-interacting
protein LIP8
TxN (2,3), PTxPN (2,7)
e LTxLN (4,0)
0,4
116016_5 MK-STYX NM_016086
map kinase
phosphatase-like
protein MK-STYX
TxN (1,8), PTxPN (3,9)
e LTxLN (2,0)
0,3
15801_14 BRRN1 NM_015341
barren homolog
(Drosophila)
TxN (1,8), PTxPN (3,6)
e LTxLN (1,7)
Sem
informação
230795_7 MBTPS1 NM_003791
membrane-bound
transcription factor
protease, site 1
TxN (2,2), PTxPN (3,0)
e LTxLN (2,7)
0,5
89442_12 KIAA0676 NM_198868 KIAA0676 protein
TxN (1,8) e PTxPN
(4,3)
0,9
274389_10 PRKD2 AK095884 protein kinase D2
TxN (2,3) e PTxPN
(4,5)
0,4
393_5 FLJ10315 AK091861
hypothetical protein
FLJ10315
TxN (2,8) e PTxPN
(4,4)
0,9
281313_8 ASC1p100 AY013289
ASC-1 complex
subunit P100
TxN (2,3) e PTxPN
(3,0)
0,6
9779_9 FLJ12528 BC007824
threonyl-tRNA
synthetase
PTxPN (3,1) e LTxLN
(4,1)
Sem
informação
310552_20 GRIA 3 NM_181894
glutamate receptor,
ionotrophic, AMPA3
PTxPN (2,6) e LTxLN
(3,2)
Sem
informação
267445_3 TRIM37
NM_001005207
tripartite motif-
containing 37
PTxPN (2,1) e LTxLN
(3,0)
0,6
4363_4 PPP1R8 NM_138558
protein phosphatase
1, regulatory
(inhibitor) subunit 8
PTxPN (3,0) 0,6
115216_14 SND1 NM_014390
staphylococcal
nuclease domain
containing 1
PTxPN (5,9)
Sem
informação
Legenda: Negrito: exons previamente selecionados pela análise computacional como
associados a tumor de mama. Sublinhado: comparação com fold≥3,0.
81
4.5 CONFIRMAÇÃO DA SUPEREXPRESSÃO DO EXON
ATRAVÉS DE qRT-PCR
Para confirmação da superexpressão do exon através de qRT-PCR
foram desenhados iniciadores em 2 exons distintos. Um iniciador no exon
superexpresso analisado no microarray e outro no exon flanqueador a 3’. A
expressão obtida se refere à variante que contém o exon (VCE). Para essa
avaliação foram utilizadas as mesmas amostras do grupo inicial.
4.5.1 Avaliação da VCE através de qRT-PCR
A Desenho dos iniciadores
Como citado anteriormente, foram desenhados iniciadores forward e
reverse para a VCE de cada um dos 14 genes selecionados, sendo os
iniciadores forward (F-CE) desenhados no exon 2, ou superexpresso, e os
iniciadores reverse (R) desenhados no exon 3, flanqueados a 3’ (Tabela 4).
Esses iniciadores variaram de 12 a 18 mers em tamanho e apresentaram
TM de 54,8ºC a 62,2ºC de acordo com o programa OLIGOTECH versão 1.00
(Copyright
©
1995).
82
Tabela 4 - Iniciadores forward e reverse para cada gene. F-CE: forward,
desenhado inteiro no exon 2; R: reverse, desenhado no exon 3.
NOME SEQÜÊNCIA AMPLICON (F+R) pb
3BAP1-F-VCE GTACTAGAGGCTCTG 100
3BAP1-R CTGACTTGGACTCC
3LIP8-F-VCE CACAAGGCAGTGG 104
3LIP8-R CTGGTAGAGTCGC
3MK-STYX-F-VCE GATCATCTGGATGC 106
3MK-STYX-R CTTGGGGTCACAG
3TRIM37-F-VCE GGGTTTCACGACTC 122
3TRIM37-R CATCTGTATTGAAGCTG
3FLJ103-15-F-VCE CTTCAGGACCTACTC 121
3FLJ103-15-R GGAGGCCATGTGG
3BRRN1-F-VCE GGCCATGTTGCTG 121
3BRRN1-R CTTCGGAGACATTG
3MBTPS1-F-VCE GATGGCCTGTATG 118
3MBTPS1-R GGTCCTTGAAAGTC
3KIAA0696-F-VCE GACACGGCCAAG 66
3KIAA0696-R CAGCTCTTCAATGG
3PRKD2-F-VCE CAGTTTGGAGTGGTC 87
3PRKD2-R GGTAGGGAAGCGC
3FLJ125-28-F-VCE CAAGGGTGTATAATGCAC 88
3FLJ125-28-R GAAAACAGTGTGGGAG
3ASC1p100-F-VCE CGGAGGAAGAGG 79
3ASC1p100-R GAGATGAGAGAGTC
3GRIA3-F-VCE GTTCACCAGGTGG 111
3GRIA3-R CTCAAGAAGGGAGG
3PPPIR8-F-VCE GGCTTCCAGAGG 79
3PPPIR8-R GTAAGGGTAGAAATC
3SDN1-F-VCE GAGACAGTGCCTG 114
3SDN1-R CTGCCGGTATCTG
Na seqüência representada na Figura 16 está ilustrado o desenho dos
2 iniciadores para a VCE do gene TRIM37.
83
Variante com o exon (VCE):
GGCTAATGCTAAAGGAGGTCATCTGGAAGGACTGCAGATGACTGATTTGGAAAATAATTC
TGAAACTGGAGAGTTACAGCCTGTACTACCTGAAGGAGCTTCAGCTGCCCCTGAAGAAG
GAATGAGTAGCGACAGTGACATTGAATGTGACACTGAGAATGAGGAGCAGGAAGAGCAT
ACCAGTGTGGGCGGGTTTCACGACTC
CTTCATGGTCATGACACAGCCCCCGGATGAAGA
TACACATTCCAGTTTTCCTGATGGTGAACAAATAGGCCCTGAAGATCTCAGCTTCAATAC
AGATGAAAATAGTGGAAG
Legenda: 1) VCE - variante com a presença do exon 2 (associado a tumor); seqüência em
vermelho - exon 2; seqüências em azul: à esquerda do exon 2 = exon 1, e à direita do exon
2 = exon 3.
GGGTTTCACGACTC
: 3TRIM37-F-VCE; CAGCTTCAATACAGATG:3TRIM37-R.
Figura 16 - Representação esquemática do desenho dos iniciadores nas
seqüências da VCE do gene TRIM37.
B Síntese de cDNA das amostras e padronização das reações de
RT-PCR para cada gene
Para confirmação da superexpressão da VCE através de qRT-PCR
foram utilizadas nas reações as mesmas amostras utilizadas na primeira
etapa do projeto (experimentos de microarray). Das 27 amostras de tecido
tumoral de mama usadas nos experimentos de microarray, foram utilizadas
19 amostras para os experimentos de qRT-PCR, uma vez que para 8
amostras não havia RNA total ou cDNA disponível. Para essa validação
foram incluídas 2 amostras normais bordas de fibroadenoma e duas
amostras de glândula mamária normal (clontech), uma vez que para as
amostras normais iniciais não havia RNA total ou cDNA disponível.
A qualidade da síntese do cDNA das 19 amostras tumorais e 2
normais (borda de fibroadenoma), assim como das 2 amostras normais da
clontech foi verificada através de RT-PCR para o gene normalizador
84
GAPDH
1101
(102pb), conforme representado na Figura 17. Todas as
amostras apresentaram qualidade satisfatória.
Legenda: Gel de poliacrilamida 8%. (M) Marcador 100pb (Invitrogen Life Technologies™); 1
e 2: amostras normais; 3 a 9: amostras tumorais; 10: NO.
Figura 17 - Representação dos produtos amplificados por RT-PCR para o
gene GAPDH
1101
, confirmando o tamanho esperado de 102pb.
Para 13 dos 14 genes conseguiu-se o estabelecimento das condições
da reação de RT-PCR para amplificação da VCE. A temperatura de
pareamento ideal para todos os pares de iniciadores variou de 54ºC a 58ºC.
Foi utilizado cDNA de linhagem de mama normal HB4a como molde. Nessas
condições os fragmentos foram amplificados com sucesso, e se mostraram
específicos (Figura 18).
Legenda: Gel de poliacrilamida 8%. (M) Marcador 100pb (Invitrogen Life Technologies™);
1- LIP8ce; 2- NO; 3- BAP1ce; 4- NO; 5- BRRN1ce; 6- NO; 7- ASC1p100ce; 8- NO; 9-
KIAA0696ce; 10- NO ; 11- PPP1R8ce ; 12- NO.
Figura 18 - Representação das VCE amplificadas com a enzima Taq Gold
(Applied Biosystems) na temperatura de 54ºC.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
100pb
100pb
85
Desse modo 13 variantes com o exon dos genes selecionados
seguiram para os experimentos de qRT-PCR, exceto o gene FLJ103-15,
para o qual não se obteve amplificação desta variante.
C RT-PCR quantitativo (qRT-PCR)
9 Escolha dos genes normalizadores utilizando o programa
GENORM
Antes de iniciar os experimentos de qRT-PCR com as VCE de 13 dos
14 genes selecionados, foi escolhido através do programa geNorm
(VANDESOMPELE et al. 2002) o melhor gene normalizador. O programa
geNorm calcula automaticamente uma medida de estabilidade de expressão,
denominada M, para todos os genes normalizadores no grupo de amostras
utilizadas. O programa permite a eliminação do gene normalizador com a
pior pontuação, ou seja, aquele com o mais alto valor M, que representa a
maior variabilidade de expressão no grupo de amostras avaliado, e recalcula
um novo valor M para os genes restantes. O valor M sugerido pelo programa
é de 1,5, abaixo do qual se tem os genes normalizadores mais estáveis.
Na primeira análise do geNorm foram incluídos os cinco genes
normalizadores GAPDH, ACTB, HPRT1, BCR e RPLP0, conforme resultado
mostrado na Figura 19.
86
Legenda: (verde) gene normalizador mais estável, (vermelho) gene normalizador menos
estável, M: medida de estabilidade gênica. Os valores apresentados para cada amostra em
cada gene correspondem à eficiência de cada gene normalizador elevada ao ΔC
T
de cada
amostra para o gene normalizador avaliado.
Figura 19 - Análise pelo programa geNorm para a identificação dos genes
mais estáveis para o conjunto de amostras utilizadas no presente estudo.
Os genes BCR e RPLP0 apresentaram valores muito elevados de M,
ou seja, mostraram-se os menos estáveis nas amostras testadas, como
pode ser comprovado pelo gráfico da Figura 20, que é disponibilizado pelo
geNorm e demonstra a maior instabilidade de um dado gene em relação aos
demais.
87
Legenda: Os genes que estão localizados à esquerda do gráfico apresentam menor
estabilidade comparado aos genes que se localizam à direita do gráfico. Assim, os genes
mais estáveis determinados pelo geNorm são: GAPDH e ACTB e o menos estável é BCR.
Figura 20 - Gráfico da média dos valores de estabilidade de expressão dos
genes GAPDH, ACTB, HPRT, RPLP0 e BCR.
Essa análise mostrou que os genes que receberam os menores
valores de M, sendo, portanto, os que menos variam a expressão no grupo
de amostras desse estudo, foram: GAPDH, ACTB e HPRT1. Sendo assim,
foi realizada uma nova análise na qual os genes BCR e RPLP0 foram
excluídos. O resultado dessa nova análise pode ser visualizado na Figura
21, e mostra valores de M menores que 1,5 para os 3 genes.
Genes menos estáveis Genes mais estáveis
88
Legenda: (verde) gene normalizador mais estável, (vermelho) gene normalizador menos estável, M:
medida de estabilidade gênica.
Os valores apresentados para cada amostra em cada gene
correspondem à eficiência de cada gene normalizador elevada ao ΔCT de cada amostra.
Figura 21 - Análise pelo programa geNorm dos normalizadores para a
identificação dos genes mais estáveis no conjunto de amostras utilizadas
nesse estudo.
Essa segunda análise apontou o gene GAPDH como o mais estável
no conjunto de amostras testadas, e o gene HPRT1 como o menos estável
com base nos valores de M calculados pelo programa (Figura 22).
89
Legenda: Os genes que estão localizados à esquerda do gráfico apresentam menor
estabilidade comparado aos genes que se localizam à direita do gráfico. Assim, os genes
mais estáveis determinados pelo geNorm são: GAPDH e ACTB.
Figura 22 - Gráfico da média dos valores de estabilidade de expressão dos
genes GAPDH, ACTB e HPRT.
Dentre os quatro genes normalizadores testados nas amostras deste
trabalho, os genes de menor variação, segundo os dados gerados pela
ferramenta geNorm (Visual Basic Application - VBA) foram GAPDH e a
ACTB. O gene BCRP apresentou maior variabilidade de expressão entre as
amostras. Além de determinar o gene mais estável, o geNorm calculou a
variação sistemática através da análise de variação pareada (V) em que
valores de V abaixo de 0,15 indicam que a inclusão de um gene
normalizador adicional não é necessário. Neste cálculo o valor de V2/3
correspondeu a 0,001 (V2/3 < 0,15), indicando que não haveria diferença
real na utilização de dois ou três genes normalizadores. Desta forma, os
dados de expressão diferencial de qRT-PCR para cada transcrito de
Genes menos estáveis
Genes mais estáveis
90
interesse foi realizada individualmente relativa ao gene apontado pelo
programa como o mais estável: GAPDH.
9 Padronização dos experimentos de qRT-PCR
Através de um ensaio de padronização, foram estabelecidas a partir
da análise dos Cts, as quantidades de cDNA e iniciadores ideais para cada
gene. Em relação à concentração de cDNA foi selecionada
preferencialmente a menor concentração na qual houve extensão do
fragmento a fim de economizar amostra. A concentração de iniciadores
escolhida foi a menor concentração a partir do momento em que um
aumento na quantidade de iniciador não acarretou em uma diferença
significativa do ciclo onde a fluorescência é captada (Ct). As quantidades de
iniciadores e cDNA estabelecidas para todos os genes foi de 800nM e 40ng
respectivamente. A temperatura de pareamento dos iniciadores variou de 54
ºC a 60ºC.
9 Eficiência de Amplificação dos Iniciadores
Os valores das eficiências foram calculados utilizando o coeficiente
angular da equação da reta da curva padrão (slope). O cálculo da eficiência
foi realizado para os genes de interesse, além do gene normalizador
GAPDH. As reações foram feitas em triplicatas, sendo que triplicatas com
valores de desvio padrão acima de 0,6 foram desconsideradas. Portanto,
nos casos onde as triplicatas apresentavam valores de desvio padrão
maiores que o estabelecido, o ponto correspondente a essas triplicatas foi
91
desconsiderado e a curva de diluição foi calculada a partir dos 3 ou 4 pontos
restantes. A eficiência variou de 79 a 100% e o valor mínimo do coeficiente
de regressão da reta (R
2
) obtido foi de 0,97.
Na Figura 23A pode-se visualizar 3 gráficos: o primeiro (superior)
referente à curva de dissociação gerada para o fragmento correspondente
ao gene GAPDH
1101
, o segundo (meio) representando os CTs das triplicatas
de diferentes diluições do cDNA molde de HB4a e o terceiro (inferior) gerado
para o cálculo da eficiência de amplificação do gene GAPDH
1101
. Na Figura
23B pode-se visualizar também 3 gráficos: o primeiro (superior) referente à
curva de dissociação gerada para o fragmento correspondente à VCE do
gene TRIM37, o segundo (meio) representando os CTs das triplicatas de
diferentes diluições do cDNA molde de HB4a e o terceiro (inferior) gerado
para o cálculo da eficiência de amplificação da VCE do gene TRIM37.
92
Legenda:
(A) gene GAPDH1101; (B) VCE do geneTRIM37. Superior: especificidade da
reação de amplificação avaliada por meio do perfil da curva de dissociação do fragmento
amplificado; meio: relação entre os CTs das triplicatas de diferentes diluições do cDNA
molde de HB4a e threshold estabelecido (verde); inferior: eficiência da reação de
amplificação calculada utilizando diluições seriadas do cDNA molde de HB4a. Após a
reação, o programa do aparelho constrói uma reta na qual o valor do CT foi analisado em
função do logaritmo da diluição. A inclinação da reta foi utilizada para calcular a eficiência
de amplificação segundo a fórmula E = 10
(-1/slope)
, em que o slope corresponde à inclinação
da reta.
Figura 23 - Gráficos representando à curva de dissociação, os CTs das
triplicatas e a curva padrão para o gene GAPDH e VCE do gene TRIM37
respectivamente.
A
B
93
Os iniciadores utilizados não tiveram o mesmo desempenho durante
as reações de qRT-PCR, logo, as reações não apresentaram a mesma
eficiência de amplificação, porém, estavam dentro do intervalo de confiança
acima de 97% (R
2
>0,7). A eficiência de amplificação foi calculada usando o
slope da curva padrão de cada gene. A eficiência média obtida foi de 95%.
Os valores de slope e da eficiência de cada gene estão representados na
Tabela 5.
Tabela 5 - Genes e seus respectivos valores de slope, eficiência e
coeficiente de regressão (R
2
).
GENE Slope Eficiência Eficiência (%) R
2
PRKD2ce -3,86 0,815797 81 0,9929
LIP8ce -3,5 0,930698 93 0,9966
SND1ce -3,95 0,791284 79 0,9821
MBTPS1ce -3,66 0,875962 87 0,9975
TRIM37ce -3,37 0,980322 98 0,9961
MK-STYXce -3,33 0,996642 100 0,9701
BRRN1ce -3,48 0,938011 94 0,9937
PPP1R8ce -3,27 1,022136 100 0,9985
BAP1ce -3,44 0,952979 95 0,9971
KIAA0696ce -3,24 1,035363 100 0,9964
ASC1p100ce -3,46 0,945438 94 0,9814
FLJ125-28ce -3,34 0,992513 99 0,9788
GAPDH1101 -3,36 0,984354 98 0,9899
9 Validação das VCE Superexpressas através de qRT-PCR
Depois do estabelecimento dos valores de eficiência de amplificação
de 12 VCE, esses foram submetidos às reações de qRT-PCR usando as
amostras de pacientes do grupo inicial. Para o gene GRIA3 os resultados
dos experimentos, tanto de eficiência, quanto de amplificação das amostras,
94
não foram satisfatórios, uma vez que o gráfico da curva de dissociação
apresentou diversos picos, resultantes de provável não especificidade da
reação. Os gráficos de amplificação das amostras e da curva de dissociação
para os genes GAPDH e da VCE do gene TRIM37 estão representados na
Figura 24, os demais estão apresentados no Anexo11.
Legenda: qRT-PCR utilizando amostras tumorais e normais. (A) gene GAPDH
1101;
(B) VCE
do gene TRIM37. Superior: CTs das duplicatas de diferentes amostras e threshold
estabelecido (verde); inferior: especificidade da reação de amplificação avaliada por meio do
perfil da curva de dissociação do fragmento amplificado.
Figura 24 - Gráficos de amplificação das amostras e a curva de dissociação
para os genes GAPDH e da VCE do gene TRIM37 respectivamente.
Assim, após a realização dos experimentos de qRT-PCR foram feitas
análises da expressão através da razão (fold change) entre as médias de
expressão das amostras tumorais e das amostras normais (VCE tumor /
VCE normal), sendo considerados como critério de validação valores de fold
A
B
95
≥ 3. Seguindo-se esse critério, 3 genes (25%) mostraram superexpressão da
VCE nas amostras tumorais em relação às normais, sendo eles: TRIM37
(5,69), MK-STYX (3,29) e BRRN1 (10,17). Os resumos dos dados de
expressão relativa de todos os genes estão representados de forma
resumida na Tabela 6.
Tabela 6 - Resumo dos resultados de expressão relativa (fold change) da
média das 19 amostras tumorais em relação à média das amostras normais
das variantes com o exon (VCE) para os 12 genes avaliados.
Legenda: Negrito - genes cuja relação VCE tumor / VCE normal apresentou valor ≥ 3.
4.6 CONFIRMAÇÃO DA SUPEREXPRESSÃO DA VCE E NÃO DO
GENE COMO UM TODO
Para testar se a VCE é realmente superexpressa nas amostras
tumorais de mama e não o gene como um todo, foram adotados 2 critérios:
1) Fold-change ≥ 3, obtido através da média do nível de expressão da
variante que contém o exon (VCE) nas amostras tumorais em relação
GENE Fold change VCE tumor / VCE normal
BAP1 1,56
MK-STYX 3,29
BRRN1 10,17
MBTPS1 -10,68
KIAA0676 1,61
PRKD2 2,53
FLJ12528 1,35
ASC1P100 -1,20
TRIM37 5,69
PPP1R8 -1,46
SND1 1,59
LIP8 2,92
96
à média do nível de expressão da VCE nas amostras normais [(VCE
tumor / VCE normal) ≥ 3];
2) Valor relativo de expressão da variante que contém o exon (VCE) no
tumor em relação ao normal seja significativamente maior (p<0,05)
que o valor relativo de expressão do gene como um todo (EC),
definido aqui como expressão de variantes que possuem exons
constitutivos, na comparação (T/N) [(VCE tumor / VCE normal) > (EC
tumor / EC normal)].
As 3 VCE (genes TRIM37, MK-STYX e BRRN1) preencheram o
critério 1, sendo validadas por qRT-PCR como superexpressas em câncer
de mama. Assim, inicialmente pretendia-se confirmar a superexpressão da
VCE e não do gene como um todo através da avaliação da expressão da
variante que não continha o exon superexpresso (associado a tumor), a qual
foi denominada VSE. Várias análises foram realizadas, e alguns problemas
encontrados, que serão apresentados a seguir. Além disso, algumas
atividades foram realizadas em paralelo às reações de qRT-PCR da VCE
(critério 1), sem esperar a conclusão de cada etapa para passar para a
seguinte que definiria quais variantes seriam superexpressas. Desse modo,
algumas atividades, como o estudo das 2 variantes (VCE e VSE) em bancos
de dados e o seu seqüenciamento, assim como a avaliação da
especificidade da VSE, foram realizados simultaneamente. Dessa forma,
para os 3 genes validados, a expressão da variante que não contém o exon
(VSE) foi avaliada no mesmo grupo de amostras.
97
Para amplificação das duas variantes (VCE e VSE), foram
desenhados iniciadores nos exons flanqueadores (exon1 e exon3). Assim,
amplificou-se as duas variantes numa única reação de PCR a partir de
iniciadores forward desenhados no exon 1, e reverse desenhados no exon 3
(ambos flanqueiam o exon associado a tumor) (Figura 25), utilizando cDNA
da linhagem de mama normal HB4a (STAMPS et al. 1994) como molde.
Assim, amplicons de cada variante, sendo um maior (da variante que contém
o exon 2 associado a tumor) e outro menor (da variante sem o exon 2),
foram isolados a partir de gel de agarose 1%, purificados e seqüenciados.
Esse procedimento foi utilizado com a finalidade de mapear o sítio de junção
exon1-exon3 para cada gene, confirmando a presença do transcrito sem o
exon 2 (VSE).
Figura 25 - Representação esquemática do pareamento dos iniciadores.
Para os genes TRIM37, MK-STYX e BRRN1 conseguiu-se amplificar
as duas variantes utilizando o par de iniciadores PE1+R3, as quais
apresentaram tamanho esperado (Figura 26), confirmando a existência da
VSE.
Exon associado a
tumor
5’ 3’
PE1
R3
1
3
2
98
Legenda: A: TRIM37; B: MK-STYX; C: BRRN1
Figura 26 - Representação dos produtos amplificados utilizando iniciadores
no exon 1 e 3. Em todos os genes houve amplificação da variante VCE, mais
forte, e VSE, mais fraca.
4.6.1 Identificação da seqüência correspondente à junção exon1-exon3
O seqüenciamento da VSE foi muito importante para confirmação da
junção exon1-exon3, como citado anteriormente, na qual seriam desenhados
os iniciadores para avaliação da VSE. Esse procedimento permitiu a
confirmação de variantes sem o exon (VSE) de 2 dos 3 genes (TRIM37 e
MK-STYX), identificando a seqüência da junção exon1-exon3 dessa variante
e a presença de sítios de splicing conservados. Para BRRN1 não foi
possível o seqüenciamento da VSE, uma vez que o isolamento do fragmento
correspondente à VSE apresentou quantidade insuficiente para seu
seqüenciamento. Desse modo foi realizado o alinhamento desse gene no
genoma humano e seqüências de mRNA disponíveis nos bancos de dados
(RefSeq, MGC e GenBank), predições gênicas (Ensembl, Gene id e
Genscan) e seqüências de ESTs (Expressed Sequence Tags) com auxílio
da ferramenta BLAT (UCSC, University of Califórnia, Santa Cruz - Assembly:
BRRN1 VCE - 283pb
BRRN1 VSE - 149pb
100
p
b
C
100
p
b
B
MK VCE - 320pb
MK VSE -193pb
A
100
p
b
TRIM VCE - 249pb
TRIM VSE - 114pb
99
mar 2006) para identificar uma seqüência correspondente a essa variante, e
assim confirmar indiretamente a seqüência da junção exon1-exon3. Os
resultados estão apresentados na Tabela 7.
Tabela 7 - Análise da VSE dos 3 genes através de seqüenciamento e
evidências em bancos de dados.
Na Figura 27 pode ser visualizada uma representação do alinhamento
das seqüências obtidas por seqüenciamento das duas variantes em estudo
do gene TRIM37.
GENE
Confirmação através
de seqüenciamento
da VSE
Presença da VSE nos
bancos de dados
Avaliação manual
da presença de SS
conservados
MK-STYX OK
Sim, variante sem o exon 2
(associado a tumor)
OK
BRRN1 ____ Não OK
TRIM37 OK
Sim, variante sem o exon 2
(associado a tumor)
OK
100
Legenda: As flechas em vermelho determinam a localização dos iniciadores nos exons 1 e
3. TRIM37-menor representa a variante sem o exon (VSE); TRIM37-maior representa a
variante com o exon (VCE).
Figura 27 - Alinhamento das seqüências das 2 variantes (VCE e VSE)
seqüenciadas do gene TRIM37 contra o genoma humano e seqüências de
mRNA disponíveis nos bancos de dados, com auxílio da ferramenta BLAT
(UCSC).
Dessa forma, os iniciadores forward foram desenhados na junção
entre o exon 1 e 3, e foi utilizado o mesmo iniciador reverse empregado na
avaliação da VCE (desenhado no exon flanqueador 3), o qual é
compartilhado pelas 2 variantes (Tabela 8).
Esses iniciadores variaram de 14 a 17 mers em tamanho e
apresentaram TM de 53,8ºC a 55,6ºC de acordo com o programa
OLIGOTECH versão 1.00 (Copyright
©
1995).
101
Tabela 8 - Iniciadores forward e reverse para cada gene. F-VSE1.3: forward
da variante sem o exon, desenhado na junção entre o exon 1 e o exon 3; R:
reverse, desenhado no exon 3.
NOME SEQÜÊNCIA AMPLICON (F+R) pb
3MK-STYX-F-VSE1.3
GATGGCAAAGGAAC 97
3MK-STYX-R
CTTGGGGTCACAG
3TRIM37-F-VSE1.3
CCCTGAAGAAGATAC 77
3TRIM37-R
CATCTGTATTGAAGCTG
3BRRN1-F-VSE1.3
CAACCAACTTTAAAATG 122
3BRRN1-R
CTTCGGAGACATTG
Na seqüência representada na Figura 28 estão ilustrados os 2
iniciadores utilizados para avaliar a variante sem o exon (VSE) do gene
TRIM37.
Variante sem o exon (VSE):
GGCTAATGCTAAAGGAGGTCATCTGGAAGGACTGCAGATGACTGATTTGGAAA
ATAATTCTGAAACTGGAGAGTTACAGCCTGTACTACCTGAAGGAGCTTCAGCTG
CCCCTGAAGAAG*ATAC
ACATTCCAGTTTTCCTGATGGTGAACAAATAGGCCCT
GAAGATCTCAGCTTCAATACAGATG
AAAATAGTGGAAG
Legenda: 2) VSE - variante sem o exon 2, apresenta apenas o exon 1 e 3. Asterisco
vermelho: junção exon1-exon3.
CCCTGAAGAAG*ATAC
:3TRIM37-F-VSE1.3; CAGCTTCAATACAGATG:3TRIM37-R.
Figura 28 - Representação esquemática do desenho dos iniciadores nas
seqüências da variante VSE do gene TRIM37.
Para os genes TRIM37 e MK-STYX conseguiu-se o estabelecimento
das condições da reação de RT-PCR para amplificação da VSE, sendo que
a temperatura ideal de pareamento dos iniciadores estabelecida foi de 57ºC
e 58ºC, respectivamente, e foi utilizada como molde a linhagem de mama
normal HB4a. Já para o gene BRRN1 não foi possível a amplificação desta
102
variante. É importante lembrar que para TRIM37 e MK-STYX foi confirmada
a presença da VSE tanto através de seqüenciamento, quanto nos bancos de
dados analisados. Já para o gene BRRN1 não foi verificada a presença
desta variante nem nos bancos de dados analisados, o que, de certa forma,
pode explicar a dificuldade em amplificar essa variante utilizando os
iniciadores F-VSE1.3, provavelmente pelo baixo nível de sua expressão em
amostras tumorais. No entanto, a existência da VSE do gene BRRN1 foi
confirmada pela extensão dos 2 fragmentos numa única reação utilizando os
iniciadores flanqueadores do exon associado a tumor (PE1 e R3) na
linhagem HB4a (Figura 26C, página 98), o que confirma a sua existência.
4.6.2 Teste de especificidade dos iniciadores desenhados nas junções
exon1-exon3
Testes foram realizados para avaliação de especificidade de
amplificação do iniciador F-VSE1.3 (forward da variante sem o exon -
pareamento nos limites exon1-exon3), juntamente com o iniciador R. Foi
contemplada a possibilidade do pareamento parcial do iniciador da junção
somente nas 4 bases do exon flanqueador 3 da VCE, como ilustrado a
seguir (Figura 29, Esquema 2a). Para isso foram utilizados como molde
amplicons constituídos pelos exons 2+3 (presentes na VCE), que trazem a
junção do exon2-exon3, e os iniciadores das junções exon1-exon3 (F-
VSE1.3). Como controle positivo (C+) foram utilizados os iniciadores que
pareiam no exon 2 (F-VCE) (Figura 29, Esquema 2b).
103
Legenda: a) Representação do pareamento inespecífico do iniciador F-VSE1.3 no molde
2+3 da VCE; b) Representação do controle positivo utilizando o iniciador F-VCE e o molde
2+3 da VCE.
Figura 29 - Esquema 2
Os testes foram realizados para os 3 genes validados, dos quais
apenas BRRN1 mostrou especificidade para o iniciador F-VSE1.3, não
amplificando nenhum fragmento na presença do molde 2+3 e dos iniciadores
F-VSE1.3+R, e amplificando o controle positivo representado pelos
iniciadores F-VCE+R na presença do mesmo molde 2+3 (Figura 30). Os
genes TRIM37 e MK-STYX apresentaram expressão na presença dos
iniciadores F-VSE1.3 quando foi utilizado como molde o amplicon 2+3, o que
representa amplificação inespecífica, resultante do pareamento parcial das 4
bases do exon 3 flanqueador a 3. É importante ressaltar que para os genes
TRIM37 e MK-STYX a expressão inespecífica do molde 2+3 na presença
dos iniciadores F-VSE1.3, apesar de menor do que a específica, pode
prejudicar a validação da superexpressão da VCE em relação à VSE, uma
vez que a expressão da VSE será contabilizada de forma artefatual,
podendo diminuir a razão do nível de expressão da VCE em relação à VSE.
5’
F-VSE1.3
R
5’
F-VCE
R
a
b
104
Legenda: Gel de poliacrilamida 8%. (M) Marcador 100pb (Invitrogen Life Technologies™);
1- C+ TRIM37 (molde 2+3 e iniciadores F-VCE+R); 2- TRIM37 inespecífico (houve
amplificação utilizando iniciadores F-VSE1.3+R na presença do molde 2+3); 3- C+ MK-
STYX (molde 2+3 e iniciadores F-VCE+R); 4- MK-STYX inespecífico (houve amplificação
utilizando iniciadores F-VSE1.3+R na presença do molde 2+3); 5- C+ BRRN1 (molde 2+3 e
iniciadores F-VCE+R); 6- BRRN1 específico (não houve amplificação utilizando iniciadores
F-VSE1.3+R na presença do molde 2+3); 7- NO.
Figura 30 - Representação do teste de especificidade do iniciador F-VSE1.3
para os genes TRIM37, MK-STYX e BRRN1.
Como citado anteriormente, o teste de especificidade dos iniciadores
Forward para as VSE foram concluídos após os experimentos de qRT-PCR
dessa variante para os 3 genes selecionados. Como foi detectada a
amplificação inespecífica da VSE, o cálculo relativo da VCE foi realizado
também em relação à exons constitutivos, isto é, presentes nas 2 variantes
(VCE e VSE). Assim, para os genes TRIM37 e MK-STYX foi avaliada a
expressão do gene através de desenho de iniciadores em exons
constitutivos. A idéia seria que o desbalanço entre as variantes fosse
salientado nessa segunda situação, uma vez que a expressão artefatual da
VSE não estaria sendo contabilizada. Dessa forma para os genes TRIM37 e
MK-STYX serão apresentados 2 cálculos relativos, com a variante sem o
exon (VSE) e com o fragmento correspondente à expressão constitutiva.
M 1 2 3 4 5 6 7
105
4.6.3 Avaliação por qRT-PCR da variante sem o exon (VSE)
A eficiência de amplificação foi avaliada para as VSE dos genes
TRIM37 e MK-STYX estão representadas na Tabela 9.
Tabela 9 - VSE dos genes TRIM37 e MK-STYX e seus respectivos valores
de slope, eficiência e coeficiente de regressão (R
2
).
GENE Slope Eficiência Eficiência (%) R
2
TRIMse -3,39 0,97 97 0,99
MK-STYXse -3,70 0,86 86 0,98
A expressão da VSE dos genes TRIM37 e MK-STYX foi avaliada por
qRT-PCR no mesmo grupo de amostras utilizadas previamente nos
experimentos de microarray e em seguida comparada com os resultados
obtidos para a VCE no mesmo grupo de amostras. Na comparação [(VCE
tumor / VCE normal) / (VSE tumor / VSE normal)] observou-se que o balanço
entre as 2 variantes foi significativamente diferente entre amostras tumorais
e normais para o gene TRIM37 (p=0,0481; Figura 31a), confirmando que a
VCE parece ser, de fato, uma variante associada a tumor. Para o gene MK-
STYX o balanço entre as duas variantes não foi significativamente diferente
no grupo de amostras em questão (p=0,4172; Figura 31b), provavelmente
pela amplificação inespecífica da VCE pelos iniciadores F-VSE1.3, o que
pode ter diminuído indiretamente a razão do nível de expressão da VCE em
relação à VSE.
106
Legenda: TRIM37 (a) e MK-STYX (b). CE: VCE tumor / VCE normal. SE: VSE tumor / VSE
normal. Programa Graph Pad Prism versão 5.0 (pvalor < 0,05).
Figura 31 - Análise entre VCE e VSE pertencentes aos genes TRIM37 e
MK-STYX, considerando as amostras iniciais.
4.6.4 Avaliação da expressão por qRT-PCR do gene como um todo
através de iniciadores desenhados em 2 exons constitutivos
Como a VSE apresentou resultados artefatuais de expressão, a
confirmação da superexpressão da VCE (e não do gene como um todo) em
tumor foi avaliada através da relação da VCE e dos exons constitutivos
(EC). Os iniciadores foram desenhados nos exons 1 e -1 (downstream ao
exon 1) para o gene TRIM37, e 4 e 5 para o gene MK-STYX. Para o gene
BRRN1 o desenho de iniciadores foi realizado nos exons constitutivos -1
(downstream ao exon 1) e -2 (downstream ao exon -1). A eficiência de
amplificação dos iniciadores está representada Tabela 10.
a b
107
Tabela 10 - Fragmento correspondente à expressão constitutiva dos genes
TRIM37, MK-STYX e BRRN1, e seus respectivos valores de slope, eficiência
e coeficiente de regressão (R
2
).
GENE Slope Eficiência Eficiência (%) R
2
TRIM37const -4,33 0,70195 70 0,9964
MK-STYXconst -3,95 0,791284 79 0,9993
BRRN1const -4,33 0,70195 70 0,9904
Para os 3 genes foi observado um balanço significativamente
diferente entre a VCE e o fragmento correspondente à expressão
constitutiva (EC) em amostras tumorais em relação às normais (TRIM37,
p<0,0001; MK-STYX, p=0,0019; BRRN1, p=0,0034). Isso sugere que a VCE
é realmente uma variante superexpressa em tumor de mama. Os resultados
estão demonstrados nas Figuras 32a, 32b e 32c.
Legenda: TRIM37 (a), MK-STYX (b) e BRRN1 (c). CE: VCE tumor / VCE normal. CONST:
EC tumor / EC normal. Programa Graph Pad Prism versão 5.0 (pvalor < 0,05).
Figura 32 - Análise entre VCE e o fragmento correspondente à expressão
constitutiva dos genes TRIM37, MK-STYX e BRRN1, considerando as
amostras iniciais.
a
b
c
108
Pode-se observar um aumento significativo na diferença da média da
razão de expressão entre a VCE e o fragmento correspondente à expressão
constitutiva do gene TRIM37 (Figura 32a, p<0,0001) em relação à média da
razão da expressão entre a VCE e VSE (Figura 31a, p=0,0481) do mesmo
gene, reforçando que a VCE é uma variante superexpressa em tumor de
mama. Do mesmo modo, a relação VCE/VSE para o gene MK-STYX não foi
significativa, provavelmente pela quantificação inespecífica de transcritos da
VCE na presença dos iniciadores F-VSE1.3.
4.7 CONFIRMAÇÃO DA SUPEREXPRESSÃO DA VCE EM
RELAÇÃO AO SEU RESPECTIVO GENE EM UM GRUPO
INDEPENDENTE DE AMOSTRAS
Para os genes TRIM37, MK-STYX e BRRN1 a VCE e o fragmento
correspondente à expressão constitutiva foram avaliados em um grupo
independente de 40 amostras tumorais de mama (Anexo 12) para validar
biologicamente a superexpressão da VCE em amostras tumorais de mama
quando comparadas às amostras normais. Os mesmos critérios para testar
se, de fato, os exons selecionados pertencem a uma variante superexpressa
e não ao gene como um todo, foram adotados (página 95).
Os experimentos foram realizados de acordo com o item 3.14.5 de
material e métodos e os iniciadores foram os mesmos utilizados nos
experimentos anteriores. Os 3 genes apresentaram fold ≥ 3, respondendo ao
critério 1, TRIM37 (6,20), MK-STYX (9,57) e BRRN1 (17,37). Os resultados
109
de análise da expressão constitutiva do gene revelaram um aumento
significativo na diferença de expressão entre a VCE e o fragmento
correspondente à expressão constitutiva para 2 genes (MK-STYX, p<0,0001;
BRRN1, p<0,0001), e o gene TRIM37 manteve a mesma diferença
(p<0,0001), conforme mostra a Figura 33, comprovando que são, de fato,
variantes superexpressas em tumor de mama.
Legenda: TRIM37 (a), MK-STYX (b) e BRRN1 (c). CE: VCE tumor / VCE normal. CONST:
EC tumor / EC normal. Programa Graph Pad Prism versão 5.0 (pvalor < 0,05).
Figura 33 - Análise entre VCE e o fragmento correspondente à expressão
constitutiva dos genes TRIM37, MK-STYX e BRRN1, considerando as
amostras independentes.
Em seguida, a razão entre a VCE e o fragmento correspondente à
expressão constitutiva foi avaliada para cada um dos 3 genes utilizando os 2
grupos de amostras (19+40) ao mesmo tempo. Esse resultado pode ser
observado na Figura 34.
a
b
c
110
Legenda: TRIM37 (a), MK-STYX (b) e BRRN1 (c). CE: VCE tumor / VCE normal. CONST:
EC tumor / EC normal. Programa Graph Pad Prism versão 5.0 (pvalor < 0,05).
Figura 34 - Análise entre VCE e o f
ragmento correspondente à expressão
constitutiva
dos genes TRIM37, MK-STYX e BRRN1, considerando todas as
amostras (iniciais + independentes).
4.8 IDENTIFICAÇÃO DOS DOMÍNIOS FUNCIONAIS ATRAVÉS
DAS SEQÜÊNCIAS PROTEICAS DO GENE E DA VCE
As diferentes isoformas protéicas geradas por variantes de splicing
podem acarretar mudanças na estrutura da proteína que podem esconder ou
expor domínios funcionais, ou alterar a atividade de interação com outras
proteínas ou complexos protéicos. Para conhecer a provável influência da
inserção do exon associado a tumor na função da proteína, primeiramente
foi verificado se todos os 3 exons pertencentes às variantes identificadas
como superexpressas neste trabalho (TRIM37, MK-STYX e BRRN1)
estavam na fase aberta de leitura, isto é, se estavam contidos na região
codificadora do gene (CDS). Foi confirmado que todos os exons estavam
contidos na CDS. Para identificar eventual presença de algum domínio
funcional presente nas variantes identificadas como superexpressas em
a
b
c
111
câncer de mama, os domínios funcionais foram mapeados na seqüência de
aminoácidos, utilizando a ferramenta Pfam (http://www.sanger.ac.uk
/Software/Pfam). Para a VCE do gene TRIM37 pode-se observar que o exon
associado a tumor estava a aproximadamente 500aa (1.500pb) do domínio
funcional mais próximo: MATH_TRIM37 domain, seguido por um RING-
finger (Really Interesting New Gene) domain (Figura 35). Já o exon
associado a tumor do gene MK-STYX aparece inserido dentro de um
domínio funcional denominado RHOD, Rhodanese homology domain e está
próximo de outro domínio denominado DSPc, Dual specificity phosphatase
domain (Figura 36). O exon associado a tumor do gene BRRN1, por sua vez,
aparece inserido no domínio funcional denominado Barren (Figura 37).
Figura 35 - Mapeamento do exon associado a tumor pertencente à VCE do
gene TRIM37 na seqüência protéica.
GENE TRIM37
VCE
-
TRIM37
gene
1 3588
408
3302
678 804
ZFbBOX
1257 1581
MATH AA
CDS
gene
VCE
1 3588
408
3302
3001 3219
678 804
exon
ZFbBOX
1257 1581
MATH AA
CDS
112
Figura 36 - Mapeamento do exon associado a tumor pertencente à VCE do
gene MK-STYX na seqüência protéica.
Figura 37 - Mapeamento do exon associado a tumor pertencente à VCE do
gene BRRN1 na seqüência protéica.
GENE MK
-
STYX
VCE
-
MK
-
STYX
GENE BRRN1
V
CE-BRRN1
13599344
1285
CDS
DSPc 68352
RHOD
gene
395
764
DSPc
721 1241
13599344
650 797
CDS
exon
gene
VCE
1285
DSPc 68352
RHOD
395
764
DSPc
721 1241
domain
domain
1 4495
85
2310
542 679
exon
Barren
CDS
81
2220
VCE
gene
1 4495
85
2310
Barren
CDS
81
2220
gene
113
4.9 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E HISTOPATOLÓGICAS DAS
AMOSTRAS
Foram estudados 59 casos (19+40) de carcinoma ductal invasivo de
mama, que foram acompanhados por um período mínimo de 10 meses e
máximo de 93 meses, sendo todos os pacientes do sexo feminino, e tumores
primários sem nenhum tratamento prévio.
A idade das pacientes no momento do diagnóstico variou de 26 a 88
anos, sendo a média de 54 e mediana de 56 anos. A raça branca foi
preponderante, sendo 54 casos (91,5%) e apenas 5 (8,5%) não-brancas. A
média e mediana de idade da menarca dessas pacientes foi de 13 anos. Das
59 pacientes, para 5 não havia informação sobre status menopausal. Para
as 54 com informação, 24 (44,4%) não eram menopausadas e 30 (55,6%)
sim, sendo a média de idade da menopausa de 47 anos e mediana de 49
anos. Dezoito pacientes (30,5%) nunca tiveram filhos e 41 (69,5%) tiveram
pelo menos 1 parto. Trinta e dois pacientes (54,2%) nunca fizeram uso de
anticoncepcionais, 25 (42,4%) fizeram e para 2 (3,4%) não havia informação.
Das 57 pacientes para as quais havia informação sobre reposição hormonal
(TRH), 41 (69,5%) não fizeram e apenas 16 (27,1%) fizeram TRH, para 2
não havia informação (3,4%). Das 59 pacientes, 20 (33,9%) tinham história
familiar de câncer de mama e 36 (61,0%) não, e para 3 (5,1%) não havia
informação.
Para analisar os casos que compuseram esta amostra foram
realizados cortes histológicos de 5μm corados com hematoxilina e eosina
114
(H&E) que revelaram presença de células epiteliais malignas, com variados
graus de pleomorfismo celular e nuclear. Segundo a gradação
histopatológica das amostras (de acordo com Scarff-Bloom-Richardson,
SBR), 7 casos (11,9%) foram classificados como grau I, ou seja, o tumor
estava bem diferenciado exibindo morfologia semelhante a do tecido epitelial
normal. A maioria dos espécimes (30 casos ou 50,8%) foi classificada como
grau II, ou moderadamente diferenciado e 22 casos (37,3%) foram
enquadrados como grau III ou pouco diferenciados (Tabela 11).
Microscopicamente, apenas 1 caso (1,7%) apresentou invasão vascular, 19
(32,2%) invadiram vasos linfáticos, e em 4 casos (6,8%) foi notada presença
de invasão perineural. Os pacientes incluídos neste estudo foram tratados
de acordo com o protocolo vigente no Departamento de Mastologia do
Hospital A.C. Camargo, São Paulo. Dos casos estudados, 4 pacientes
(6,8%) foram tratados somente com cirurgia, 8 (13,5%) casos com cirurgia
associada à quimioterapia, 10 casos (16,9%) com cirurgia associada à
radioterapia e quimioterapia, 6 casos (10,2%) com cirurgia associada à
radioterapia e hormônio terapia, 4 casos (6,8%) com cirurgia associada à
quimioterapia e hormônio terapia, 26 casos (44,1%) com cirurgia associada
à radioterapia, quimioterapia e hormônio terapia e 1 caso (1,7%) com
cirurgia associada somente à hormônio terapia. Dos pacientes que tiveram
linfonodos removidos, 27 casos (45,8%) confirmaram o comprometimento
microscópico, ou seja, havia infiltração de células malignas nos linfonodos. O
tempo médio de detecção das recorrências do tumor foi de 22 meses após o
115
início do tratamento, sendo o tempo mínimo de 3 meses e máximo de 59
meses.
De acordo com a última informação obtida (23/01/2008), 8 pacientes
(13,7%) evoluíram para óbito, sendo 4 (6,8%) devido à doença e 4 (6,8%) de
outras causas. Dos pacientes vivos, 43 (72,9%) estão livres da doença e 7
(11,9%) apresentam doença. Apenas 1 (1,7%) caso foi perdido de vista e
não se conseguiu nenhuma informação do paciente após o tratamento.
Na Tabela 11 estão resumidas as principais informações sobre os
aspectos clínicos e histopatológicos estudados neste trabalho.
116
Tabela 11 - Dados clinicopatológicos, demográficos e sobre o tratamento
dos 59 pacientes portadores de carcinoma ductal de mama incluídos neste
estudo.
Variáveis n (%)
Branca 54 (91,5)
Raça
Não Branca 5 (8,5)
≤ 40 anos 16 (27,1)
Idade
> 40 anos 43 (72,9)
≤ 12 anos 24 (40,7)
Menarca
> 12 anos 35 (59,3)
Não 18 (30,5)
Parto
Sim 41 (69,5)
Pré-menopausa 26 (44,1)
Status Menopausal
Pós-menopausa 33 (55,9)
T1+T2 47 (79,6)
Estadiamento T
T3+T4 12 (20,4)
N0 31 (52,5)
Estadiamento N
N+ 28 (47,5)
EC I e II (doença localizada) 46 (77,9)
Estadio Clínico
EC III e IV (doença avançada) 13 (22,1)
1 (bem diferenciado) 7 (11,9)
2 (moderadamente) 30 (50,8)
Grau SBR
3 (pouco diferenciado) 22 (37,3)
Não 31 (52,5)
Status Nodal (presença de
metástase linfonodal)
Sim
Ignorado
27 (45,8)
1 (1,7)
Negativo 17 (28,8)
Receptor de Estrógeno
Positivo 42 (71,2)
Negativo 26 (44,1)
Receptor de Progesterona
Positivo 33 (55,9)
0+1 (Negativo) 25 (42,4)
2+3 (Positivo) 32 (54,2)
ERBB2
Ignorado 2 (3,4)
Negativo 36 (61)
Positivo 11 (18,6)
p53
Ignorado 12 (20,3)
Não 17 (28,8)
Radioterapia adjuvante
Sim 42 (71,2)
Não 11 (18,6)
Quimioterapia adjuvante
Sim 48 (81,4)
Não 22 (37,3)
Hormônio terapia adjuvante
Sim 37 (62,7)
Não 46 (78)
Recorrência
Sim 13 (22)
Não 51 (86,4)
Morte
Sim 8 (13,6)
117
4.10 ASSOCIAÇÃO ENTRE AS VARIÁVEIS CLÍNICAS E
HISTOPATOLÓGICAS E OS DADOS DE EXPRESSÃO OBTIDOS
Para cada gene realizou-se comparação dos dados de expressão da
variante que contém o exon associado a tumor (VCE), assim como da
relação entre a VCE e o fragmento correspondente à expressão constitutiva
do gene (VCE/EC) com as variáveis clínicas e histopatológicas de cada
paciente.
9 Os resultados referentes à associação entre a VCE do gene TRIM37
e as variáveis clínicopatológicas estão representados na Tabela 12.
118
Tabela 12 - Associação entre a VCE do gene TRIM37 e as variáveis
clinicopatológicas.
TRIM37ce
Variáveis clinicopatológicas
1º quartil n
(%)
2º quartil n
(%)
3º quartil n
(%)
4º quartil n
(%)
pvalor
TRIM37ce
≤ 40 anos 6 (37,5) 3 (18,8) 1 (6,3) 6 (37,5)
Faixa etária
> 40 anos 9 (20,9) 12 (27,9) 14 (32,6) 8 (18,6)
0,087
≤ 12 anos 8 (33,3) 8 (33,3) 3 (12,5) 5 (20,8)
Menarca
> 12 anos 7 (20) 7 (20) 12 (34,3) 9 (25,7)
0,188
Não 8 (30,8) 7 (26,9) 4 (15,4) 7 (26,9) Status
menopausal
Sim 7 (21,2) 8 (24,2) 11 (33,3) 7 (21,2)
0,456
I+II 11 (23,9) 11 (23,9) 13 (28,3) 11 (23,9)
Estadio
Clínico
III+IV 4 (30,8) 4 (30,8) 2 (15,4) 3 (23,1)
0,792
1 1 (14,3) 1 (14,3) 4 (57,1) 1 (14,3)
2 8 (26,7) 7 (23,3) 7 (23,3) 8 (26,7)
Grau SBR
3 6 (27,3) 7 (31,8) 4 (18,2) 5 (22,7)
0,571
Negativo 10 (32,3) 5 (16,1) 10 (32,3) 6 (19,4)
Status nodal
Positivo 5 (17,9) 10 (35,7) 5 (17,9) 8 (28,6)
0,161
Negativo 8 (47,1) 6 (35,3) 3 (17,6) 0 (0)
Receptor de
Estrógeno
Positivo 7 (16,7) 9 (21,4) 12 (28,6) 14 (33,3)
0,009*
Negativo 9 (34,6) 10 (38,5) 4 (15,4) 3 (11,5)
Receptor de
Progesterona
Positivo 6 (18,2) 5 (15,2) 11 (33,3) 11 (33,3)
0,024*
Negativo 7 (28) 4 (16) 7 (28) 7 (28)
ERBB2
Positivo 7 (21,9) 11 (34,4) 7 (21,9) 7 (21,9)
0,486
Negativo 6 (16,7) 9 (25) 10 (27,8) 11 (30,6)
p53
Positivo 6 (54,5) 4 (36,4) 1 (9,1) 0 (0)
0,021*
Não 10 (21,7) 10 (21,7) 14 (30,4) 12 (26,1)
Recorrência
Sim 5 (38,5) 5 (38,5) 1 (7,7) 2 (15,4)
0,189
* p<0,05
A expressão de receptores de estrógeno (ER+) apresentou uma
associação significativa (0,009) com a VCE do gene TRIM37. Assim todos
os 42 casos ER+ foram comparados às demais variáveis, sendo observada
uma associação estatisticamente significativa (p=0,033) dos casos ER+ com
a variável idade da menarca superior a 12 anos (Tabela 13).
119
Tabela 13 - Associação entre a expressão da VCE do gene TRIM37 nas
amostras ER+ e a variável menarca.
TRIM37ce ER+
Variáveis clinicopatológicas
1º quartil n
(%)
2º quartil n
(%)
3º quartil n
(%)
4º quartil n
(%)
pvalor
TRIM37ce
ER+
≤ 12 anos 4 (22,2) 7 (38,9) 2 (11,1) 5 (27,8)
Menarca
> 12 anos 3 (12,5) 2 (8,3) 10 (41,7) 9 (37,5)
0,033*
* p<0,05
A expressão de receptores de progesterona (PgR+) também
apresentou uma associação significativa (0,024) com a VCE do gene
TRIM37. Assim, todos os 33 casos PgR+ foram comparados às demais
variáveis, sendo observada uma associação estatisticamente significativa
(p=0,037) dos casos PgR+ com a variável idade das pacientes superior a 40
anos (Tabela 14).
Tabela 14 - Associação entre a expressão da VCE do gene TRIM37 nas
amostras PgR+ e a variável faixa etária.
TRIM37ce PgR+
Variáveis
clinicopatológicas
1º quartil n
(%)
2º quartil n
(%)
3º quartil n
(%)
4º quartil n
(%)
pvalor
TRIM37ce
PgR+
≤ 40 anos 2 (22,2) 1 (11,1) 0 (0) 6 (66,7)
Faixa etária
> 40 anos 4 (16,7) 4 (16,7) 11 (45,8) 5 (20,8)
0,037*
* p<0,05
9 Os resultados referentes à associação entre a relação VCE/EC do
gene TRIM37 e as variáveis clínicopatológicas estão representados
na Tabela 15.
120
Tabela 15 - Associação entre a relação VCE/EC do gene TRIM37 e as
variáveis clinicopatológicas.
TRIM37cec
Variáveis
clinicopatológicas
1º quartil n (%)
2º quartil n
(%)
3º quartil n
(%)
4º quartil n
(%)
pvalor
TRIM37c
ec
≤ 40 anos 3 (18,8) 2 (12,5) 4 (25) 7 (43,8)
Faixa etária
> 40 anos 10 (27) 11 (29,7) 9 (24,3) 7 (18,9)
0,233
≤ 12 anos 7 (30,4) 5 (21,7) 5 (21,7) 6 (26,1)
Menarca
> 12 anos 6 (20) 8 (26,7) 8 (26,7) 8 (26,7)
0 841
Não 4 (16,7) 6 (25) 5 (20,8) 9 (37,5) Status
menopausal
Sim 9 (31) 7 (24,1) 8 (27,6) 5 (17,2)
0,335
I+II 10 (23,8) 9 (21,4) 12 (28,6) 11 (26,2)
Estadio Clínico
III+IV 3 (27,3) 4 (36,4) 1 (9,1) 3 (27,3)
0,534
1 3 (42,9) 1 (14,3) 2 (28,6) 1 (14,3)
2 3 (11,5) 7 (26,9) 9 (34,6) 7 (26,9)
Grau SBR
3 7 (35) 5 (25) 2 (10) 6 (30)
0,291
Negativo 8 (25,8) 7 (22,6) 9 (29) 7 (22,6)
Status nodal
Positivo 5 (22,7) 6 (27,3) 4 (18,2) 7 (31,8)
0,753
Negativo 2 (11,8) 7 (41,2) 4 (23,5) 4 (23,5)
Receptor de
Estrógeno
Positivo 11 (30,6) 6 (16,7) 9 (25) 10 (27,8)
0,205
Negativo 5 (20) 9 (36) 5 (20) 6 (24)
Receptor de
Progesterona
Positivo 8 (28,6) 4 (14,3) 8 (28,6) 8 (28,6)
0,329
Negativo 7 (30,4) 4 (17,4) 3 (13) 9 (39,1)
ERBB2
Positivo 4 (14,3) 9 (32,1) 10 (35,7) 5 (17,9)
0,065
Negativo 4 (12,9) 6 (19,4) 11 (35,5) 10 (32,3)
p53
Positivo 2 (20) 6 (60) 2 (20) 0 (0)
0,040*
Não 9 (22,5) 10 (25) 11 (27,5) 10 (25)
Recorrência
Sim 4 (30,8) 3 (23,1) 2 (15,4) 4 (30,8)
0,801
* p<0,05
A variável p53 negativo apresentou uma associação significativa
(0,040) com a relação VCE/EC do gene TRIM37. Assim os 31 casos p53-
foram comparados às demais variáveis, porem não apresentaram
associação estatisticamente significativa com nenhuma delas.
Os resultados referentes à associação entre a VCE do gene MK-
STYX e as variáveis clínicopatológicas estão representados na Tabela 16.
121
Tabela 16 - Associação entre a expressão da VCE do gene MK-STYX e as
variáveis clinicopatológicas.
MK-STYXce
Variáveis
clinicopatológicas
1º quartil n
(%)
2º quartil n
(%)
3º quartil n
(%)
4º quartil n
(%)
pvalor
MK-
STYXce
≤ 40 anos 4 (25) 3 (18,8) 4 (25) 5 (31,3)
Faixa etária
> 40 anos 10 (25,6) 11 (28,2) 10 (25,6) 8 (20,5)
0,812
≤ 12 anos 5 (20,8) 7 (29,2) 8 (33,3) 4 (16,7)
Menarca
> 12 anos 9 (29) 7 (22,6) 6 (19,4) 9 (29)
0,475
Não 4 (15,4) 6 (23,1) 8 (30,8) 8 (30,8)
Status
menopausal
Sim 10 (34,5) 8 (27,6) 6 (20,7) 5 (17,2)
0,298
I+II 10 (23,3) 13 (30,2) 9 (20,9) 11 (25,6)
Estadio Clínico
III+IV 4 (33,3) 1 (8,3) 5 (41,7) 2 (16,7)
0,257
1 1 (16,7) 3 (50) 2 (33,3) 0 (0)
2 8 (29,6) 4 (14,8) 8 (29,6) 7 (25,9)
Grau SBR
3 5 (22,7) 7 (31,8) 4 (18,2) 6 (27,3)
0,447
Negativo 9 (31) 9 (31) 6 (20,7) 5 (17,2)
Status nodal
Positivo 5 (19,2) 5 (19,2) 8 (30,8) 8 (30,8)
0,375
Negativo 6 (35,3) 5 (29,4) 4 (23,5) 2 (11,8)
Receptor de
Estrógeno
Positivo 8 (21,1) 9 (23,7) 10 (26,3) 11 (28,9)
0,459
Negativo 7 (26,9) 10 (38,5) 6 (23,1) 3 (11,5)
Receptor de
Progesterona
Positivo 7 (24,1) 4 (13,8) 8 (27,6) 10 (34,5)
0,09
Negativo 7 (30,4) 5 (21,7) 3 (13) 8 (34,8)
ERBB2
Positivo 7 (22,6) 9 (29) 10 (32,3) 5 (16,1)
0,211
Negativo 10 (29,4) 9 (26,5) 6 (17,6) 9 (26,5)
p53
Positivo 3 (7,3) 4 (36,4) 4 (36,4) 0 (0)
0,211
Não 11 (26,2) 11 (26,2) 10 (23,8) 10 (23,8)
Recorrência
Sim 3 (23,1) 4 (30,8) 3 (23,1) 3 (23,1)
0,966
* p<0,05
A expressão da VCE do gene MK-STYX não apresentou associação
estatisticamente significativa com nenhuma das variáveis analisadas.
9 Os resultados referentes à associação entre a relação VCE/EC do
gene MK-STYX e as variáveis clínicopatológicas estão representados
na Tabela 17.
122
Tabela 17 - Associação entre a relação VCE/EC do gene MK-STYX e as
variáveis clinicopatológicas.
MK-STYXcec
Variáveis
clinicopatológicas
1º quartil n
(%)
2º quartil n
(%)
3º quartil n
(%)
4º quartil n
(%)
pvalor MK-
STYXcec
≤ 40 anos 2 (12,5) 6 (37,5) 2 (12,5) 6 (37,5)
Faixa etária
> 40 anos 11 (30,6) 7 (19,4) 11 (30,6) 7 (19,4)
0,123
≤ 12 anos 6 (26,1) 6 (26,1) 5 (21,7) 6 (26,1)
Menarca
> 12 anos 7 (24,1) 7 (24,1) 8 (27,6) 7 (24,1)
0,972
Não 2 (8) 7 (28) 6 (24) 10 (40) Status
menopausal
Sim 11 (40,7) 6 (22,2) 7 (25,9) 3 (11,1)
0,018*
I+II 11 (27,5) 11 (27,5) 7 (17,5) 11 (27,5)
Estadio
Clínico
III+IV 2 (16,7) 2 (16,7) 6 (50) 2 (16,7)
0,158
1 3 (50) 1 (16,7) 1 (16,7) 1 (16,7)
2 9 (34,6) 6 (23,1) 5 (19,2) 6 (23,1)
Grau SBR
3 1 (5) 6 (30) 7 (35) 6 (30)
0,254
Negativo 8 (27,6) 10 (34,5) 6 (20,7) 5 (17,2)
Status nodal
Positivo 5 (21,7) 3 (13) 7 (30,4) 8 (34,8)
0,204
Negativo 4 (23,5) 4 (23,5) 5 (29,4) 4 (23,5)
Receptor de
Estrógeno
Positivo 9 (25,7) 9 (25,7) 8 (22,9) 9 (25,7)
0,967
Negativo 6 (24) 6 (24) 7 (28) 6 (24)
Receptor de
Progesterona
Positivo 7 (25,9) 7 (25,9) 6 (22) 7 (25,9)
0,972
Negativo 4 (18,2) 8 (36,4) 5 (22,7) 5 (22,7)
ERBB2
Positivo 9 (31) 5 (17,2) 7 (24,1) 8 (27,6)
0,435
Negativo 9 (28,1) 9 (28,1) 5 (15,6) 9 (28,1)
p53
Positivo 3 (30) 1 (10) 4 (40) 2 (20)
0,339
Não 10 (25,6) 11 (28,2) 8 (20,5) 10 (25,6)
Recorrência
Sim 3 (23,1) 2 (15,4) 5 (38,5) 3 (23,1)
0,583
* p<0,05
A variável status menopausal negativo apresentou uma associação
significativa (0,018) com a relação VCE/EC do gene MK-STYX. Assim, todos
os 25 casos menopausa negativos foram isolados e comparados às demais
variáveis. Foi observada uma associação estatisticamente significante
(p=0,012) dos casos menopausa negativos com os estadios clínicos I e II
(Tabela 18).
123
Tabela 18 - Associação entre a da relação VCE/EC do gene MK-STYX nas
amostras não menopausa e os estádios clínicos I e II.
MK-STYXcec não menopausa
Variáveis clinicopatológicas
1º quartil n (%)
2º quartil n
(%)
3º quartil
n (%)
4º quartil n
(%)
pvalor
MK-
STYXce
c
I+II 2 (10) 7 (35) 2 (10) 9 (45)
Estadio Clínico
III+IV 0 (0) 0 (0) 4 (80) 1 (20)
0,012*
* p<0,05
9 Os resultados referentes à associação entre a VCE do gene BRRN1 e
as variáveis clínicopatológicas estão representados na Tabela 19.
Tabela 19 - Associação entre a expressão da VCE do gene BRRN1 e as
variáveis clinicopatológicas.
BRRN1ce
Variáveis clinicopatológicas
1º quartil n
(%)
2º quartil n
(%)
3º quartil n
(%)
4º quartil n
(%)
pvalor
BRRN1ce
≤ 40 anos 1 (9,1) 2 (18,2) 3 (27,3) 5 (45,5)
Faixa etária
> 40 anos 9 (31) 8 (27,6) 7 (24,1) 5 (17,2)
0,222
≤ 12 anos 4 (22,2) 4 (22,2) 5 (27,8) 5 (27,8)
Menarca
> 12 anos 6 (27,3) 6 (27,3) 5 (22,7) 5 (22,7)
0,939
Não 4 (22,2) 3 (16,7) 6 (33,3) 5 (27,8)
Status menopausal
Sim 6 (27,3) 7 (31,8) 4 (18,2) 5 (22,7)
0,568
I+II 6 (13) 8 (17,4) 7 (15,2) 25 (54,3)
Estadio Clínico
III+IV 3 (23,1) 2 (15,4) 2 (15,4) 6 (46,2)
0,844
1 3 (60) 1 (20) 1 (20) 0 (0)
2 6 (33) 6 (33) 3 (16,7) 3 (16,7)
Grau SBR
3 1 (5,9) 3 (17,6) 6 (35,3) 7 (41,2)
0,084
Negativo 6 (19,4) 5 (16,1) 6 (19,4) 14 (45,2)
Status nodal
Positivo 3 (10,7) 5 (17,9) 3 (10,7) 17 (60,7)
0,543
Negativo 1 (8,3) 4 (33,3) 3 (25) 4 (33,3)
Receptor de
Estrógeno
Positivo 9 (32,1) 6 (21,4) 7 (25) 6 (21,4)
0,414
Negativo 1 (5,3) 6 (31,6) 5 (25,3) 7 (36,8)
Receptor de
Progesterona
Positivo 9 (42,9) 4 (19) 5 (23,8) 3 (14,3)
0,04*
Negativo 4 (25) 4 (25) 3 (18,8) 5 (31,3)
ERBB2
Positivo 5 (21,7) 5 (21,7) 6 (26,1) 7 (30,4)
0,958
Negativo 7 (26,9) 5 (19,2) 7 (26,9) 7 (26,9)
p53
Positivo 1 (16,7) 2 (33,3) 0 (0) 3 (50)
0,377
Não 9 (28,1) 8 (25) 7 (21,9) 8 (25)
Recorrência
Sim 1 (12,5) 2 (25) 3 (37,5) 2 (25)
0,741
* p<0,05
124
A ausência da expressão de receptores de progesterona (PgR-)
apresentou uma associação significativa (0,040) com a VCE do gene
BRRN1. Assim, os 19 casos PgR- foram comparados às demais variáveis,
porém não apresentaram associação estatisticamente significativa com
nenhuma delas. Os resultados referentes à associação entre a relação
VCE/EC do gene BRRN1 e as variáveis clínicopatológicas estão
representados na Tabela 20.
Tabela 20 - Associação entre a relação VCE/EC do gene BRRN1 e as
variáveis clinicopatológicas.
BRRN1cec
Variáveis clinicopatológicas
1º quartil n
(%)
2º quartil n
(%)
3º quartil n
(%)
4º quartil n
(%)
pvalor
BRRN1c
ec
≤ 40 anos 1 (9,1) 2 9(18,2 3 (27,3) 5 (45,5)
Faixa etária
> 40 anos 8 (29,6) 7 (25,9) 7 (25,9) 5 (18,5)
0,29
≤ 12 anos 5 (27,8) 3 (16,7) 5 (27,8) 5 (27,8)
Menarca
> 12 anos 4 (20) 6 (30) 5 (25) 5 (25)
0,799
Não 4 (23,5) 3 (17,6) 4 (23,5) 6 (35,3) Status
menopausal
Sim 5 (23,8) 6 (28,6) 6 (28,6) 4 (19)
0,681
I+II 6 (19,4) 8 (25,8) 8 (25,8) 9 (29)
Estadio Clínico
III+IV 3 (42,9) 1 (14,3) 2 (28,6) 1 (14,3)
0,544
1 2 (40) 1 (20) 1 (20) 1 (20)
2 6 (35,3) 6 (35,3) 1 (5,9) 4 (23,5)
Grau SBR
3 1 (6,3) 2 (12,5) 8 (50) 5 (31,3)
0,065
Negativo 4 (16,7) 7 (29,2) 7 (29,2) 6 (25)
Status nodal
Positivo 5 (35,7) 2 (14,3) 3 (21,4) 4 (28,6)
0,489
Negativo 2 (16,7) 2 (16,7) 5 (41,7) 3 (25)
Receptor de
Estrógeno
Positivo 7 (26,9) 7 (26,9) 5 (19,2) 7 (26,9)
0,51
Negativo 3 (15,8) 3 (15,8) 8 (42,1) 5 (26,3)
Receptor de
Progesterona
Positivo 6 (31,6) 6 (31,6) 2 (10,5) 5 (26,3)
0,133
Negativo 5 (31,3) 1 (6,3) 4 (25) 6 (37,5)
ERBB2
Positivo 4 (19) 7 (33,3) 6 (28,6) 4 (19)
0,185
Negativo 5 (20,8) 6 (25) 7 (29,2) 6 (25)
p53
Positivo 2 (33,3) 1 (16,7) 1 (16,7) 2 (33,3)
0,833
Não 7 (23,3) 8 (26,7) 8 (26,7) 7 (23,3)
Recorrência
Sim 2 (25) 1 (12,5) 2 (25) 3 (37,5)
0,794
* p<0,05
125
A relação VCE/EC do gene BRRN1 não apresentou associação
estatisticamente significativa com nenhuma das variáveis analisadas.
126
5 DISCUSSÃO
Splicing alternativo do mRNA é um dos mais importantes mecanismos
de geração de variabilidade transcricional, influenciando o repertório de
proteínas existentes em uma célula, podendo de certa forma justificar o
número relativamente pequeno de genes humanos encontrados (LANDER et
al. 2001; VENTER et al. 2001). Há relatos na literatura de que entre 60% e
81% dos genes humanos sofrem splicing alternativo (JOHNSON et al. 2003;
KAMPA et al. 2004; HUI et al. 2004; KIM et al. 2007) e que as variações nos
processos de splicing também ocorrem durante a tumorigênese, gerando
muitas vezes variantes aberrantes que podem desempenhar um papel chave
na progressão tumoral (CABALLERO et al. 2001; VENABLES 2004; KIM et
al. 2008). Essas variantes podem ser utilizadas como marcadores tumorais
em câncer, sendo muito promissora a identificação de exons alternativos
superexpressos em células tumorais que, quando situados na região
codificadora do gene, podem produzir um peptídeo que sirva como alvo
terapêutico.
A identificação de alterações moleculares que distinguem células
tumorais de normais ajuda a conhecer a natureza da célula tumoral e
entender o seu comportamento patológico. O câncer de mama é bastante
heterogêneo, com diferenças moleculares que requerem tratamentos
específicos (VAN’T VEER e BERNARDS 2008). Alguns marcadores
moleculares têm sido utilizados na rotina deste tipo de neoplasia, auxiliando
127
no prognóstico dos pacientes e na determinação da terapia adjuvante a ser
adotada (MOLINA et al. 2005; DUFFY 2005; BURSTEIN 2005). Porém
muitos pacientes com o mesmo status desses marcadores podem evoluir de
maneiras bastante distintas, o que leva à necessidade da busca por novos
marcadores moleculares. Muitas evidências mostram a ocorrência de splicing
alternativo ou aberrante durante o desenvolvimento, progressão e metástase
do câncer de mama, como por exemplo, a ocorrência de variantes de splicing
em vários genes, incluindo receptores de estrógeno (ER), BRCA1, AIB1,
CD44, ERBB2 e VEGF em linhagens ou amostras deste tipo de neoplasia
(VENABLES 2004). Assim, a exploração da variabilidade transcricional
gerada por splicing alternativo torna-se promissora na identificação de novos
marcadores moleculares em câncer de mama.
Recentes estudos têm sido realizados nos quais a associação entre
splicing alternativo e câncer é investigada em larga escala (WANG Z et al.
2003; XIE et al. 2002; XU et al. 2002; HUI et al. 2004; KIRSCHBAUM-
SLAGER et al. 2005). E mais recentemente alguns estudos têm aplicado a
tecnologia de microarray com esse objetivo (RELOGIO et al. 2005;
GARDINA et al. 2006; MILANI et al. 2006; LI et al. 2006; NAKAYA et al.
2007). Plataformas de microarray contendo exons pertencentes a variantes
de splicing com expressão preferencial em tecido tumoral são
significativamente poderosas na busca por marcadores moleculares para
câncer, possibilitando a identificação de indicadores clínicos, tanto para
diagnóstico, quanto para prognóstico dos tumores, do mesmo modo que
poderiam ser utilizados como alvos terapêuticos.
128
No presente estudo foi empregada a tecnologia de microarray em
dados obtidos por análises computacionais (KIRSCHBAUM-SLAGER et al.
2005) para identificar variantes de splicing superexpressas em câncer de
mama. Para isso foram imobilizados em uma membrana de nylon 270 exons
pertencentes a variantes de transcritos identificados como superexpressos
em bibliotecas de tecido tumoral, daí denominados de exons associados a
tumores. Desses, 75 foram identificados em bibliotecas tumorais de mama,
sendo portanto associados a tumor de mama. Essa plataforma foi
hibridizada com amostras tumorais e normais de mama, incluindo amostras
de pacientes e linhagens celulares.
Já está bem estabelecido o uso de cDNA microarray em membrana
de nylon utilizando RNA total e mRNA (MEIRELES et al. 2003; LOPEZ et al.
2004; SHARMA et al. 2005). Neste trabalho, como a quantidade de RNA
total obtido das amostras foi, na maioria das vezes, insuficiente para a
realização dos experimentos, decidiu-se utilizar amostras de RNA
amplificado. Para isso foi avaliada a correlação dos dados das intensidades
médias dos 270 exons em membranas hibridizadas com RNA total e
amplificado de linhagem celular de mama HB4a, apresentando valor de
correlação aceitável (dados não mostrados). Há evidências demonstrando
que o processo de amplificação leva a uma diminuição da representatividade
da região 5’ dos transcritos (NYGAARD e HOVIG 2006), devendo portanto
as sondas imobilizadas se localizarem a no máximo 1.500 pb da região 3’ do
gene (Brentani et al. 2005). O fato de alguns exons desse estudo se
posicionarem em regiões mais distantes da extremidade 3’ (variando de 110
129
a 3.338 pb), levou-nos a preocupação com a reprodutibilidade e robustez
dos dados de expressão. Para isso foram avaliadas as médias do sinal de
intensidade dos exons obtidos por hibridização com RNA amplificado de
acordo com sua posição no transcrito (distância 3’). O resultado obtido
mostrou que o sinal de intensidade média foi independente da distância 3’,
não sugerindo nenhuma diferença que indicasse que as sondas mais
distantes estariam sendo prejudicadas por um diminuição de sinal (por
estarem sub-representadas no RNA amplificado), o que acarretaria maiores
possibilidades de variabilidade experimental desses exons. Dessa forma,
decidiu-se utilizar RNA amplificado em 2 ciclos (GOMES et al. 2003) para
todas as amostras.
Tem sido sugerido que a utilização da tecnologia de microarray requer
vários controles experimentais para se alcançar resultados reprodutíveis e
robustos (BRENTANI et al. 2005; ALLISON et al. 2006; CARRARO et al.
2007). Neste trabalho, com a finalidade de se controlar ao máximo as
alterações decorrentes de variações experimentais, foram estabelecidos
alguns critérios para monitoramento da qualidade das membranas. Os altos
valores de correlação de Pearson (média: 0,90) obtidos entre as duplicatas
experimentais revelaram uma boa reprodutibilidade entre os experimentos,
garantindo a confiabilidade dos dados. Nos exons de menor intensidade foi
observada uma maior dispersão entre esses valores, mesmo entre os pontos
da mesma membrana, o que levou a se cogitar a sua remoção da análise,
porém, como haveria perda de um número considerável de pontos, foi
decidido não remover nenhum exon, mesmo aqueles com baixa intensidade
130
e utilizar outros mecanismos para se obter dados mais robustos. Assim,
neste trabalho, várias comparações foram realizadas utilizando-se tanto
amostras quanto linhagens normais e tumorais com o objetivo de identificar
exons superexpressos em tumores em mais de uma comparação.
Primeiramente, foi comparado o grupo total de amostras normais e tumorais
(TxN), o que identificou superexpressão de 24% dos exons previamente
selecionados pela análise computacional como associados a tumor de
mama. Em relação à comparação de amostras pareadas (PTxPN),
observou-se uma porcentagem surpreendentemente maior desses exons
superexpressos (78,6%). Esse número revelou que uma grande parcela das
variantes parece estar de fato superexpressa em tumor quando se controla a
variabilidade biológica entre as amostras. No entanto, a representatividade
dos exons associados à mama (75) em relação aos demais exons
superexpressos não foi significativa em nenhuma dessas comparações. Tem
sido sugerido que as alterações na geração de variantes no tumor não são
eventos randômicos de processamentos incorretos do pré-mRNA e sim que
a ampla maioria dessas alterações podem estar relacionadas ao processo
tumorigênico de uma maneira não tecido-específica (XU e LEE 2003). Isso,
de certa forma, justificaria a baixa representatividade daqueles exons
previamente selecionados como associados à mama na maior parte das
comparações. Já na comparação das linhagens tumorais em relação às
linhagens normais (LTxLN), observou-se superexpressão de 24% dos exons
associados a tumor de mama, havendo nesta comparação uma
representatividade significativa dos 75 exons associados a tumor de mama
131
em relação aos demais (18 de 24; p<0,001). Foi também observado que à
medida em que se aumentou a estringência para a seleção dos candidatos,
aumentou-se a representatividade desses exons. Isso foi visto entre os
20,7% de exons superexpressos que foram comuns entre 2 comparações,
apresentando uma representatividade com significância estatística (24 de
56; p<0,001) daqueles associados a mama. Também nos 2,6% de exons
comuns entre as 3 comparações, 04 dos 07 superexpressos foram
inicialmente selecionados como associados a mama (p<0,001).
A concordância relativamente baixa entre as 2 abordagens, análise
computacional baseada em dados de ESTs, e microarray através da análise
de amostras e linhagens tumorais e normais, pode estar relacionada ao
menor número de seqüências de ESTs referentes a amostras normais em
bancos de dados (103.261 seqüências tumorais e 74.396 seqüências
normais - KIRSCHBAUM-SLAGER et al. 2005), além do fato de que bancos
de dados públicos não estão completos em sua cobertura de formas de
splicing alternativo em humanos (JIN et al. 2004; XU e LEE 2003). Análises
realizadas por ROY et al. (2005), mostraram que bancos de dados públicos
não apresentam muitas formas de splicing alternativo, e este efeito é muito
mais pronunciado em formas de splicing que estão associadas a tecidos
normais, em relação às formas associadas a tumor, mostrando que algumas
variantes de splicing tumor-associadas podem estar apenas super-
representadas em relação às normais. Foi mostrado em seu estudo que
aproximadamente 2/3 das variantes de splicing câncer-associadas
132
previamente desconhecidas em tecido normal apareceram expressas em
amostras normais, das quais 40% foram dominantes neste tecido.
Abordagens computacionais e análises de expressão por microarray
podem ser influenciadas por vários fatores. O fato de a plataforma
desenvolvida neste trabalho apresentar exons imobilizados supostamente
superexpressos em tecido tumoral impossibilitou a utilização do método de
energia total para a normalização dos dados. Assim, a utilização de genes
normalizadores, tais como GAPDH e ACTB pode ter introduzido um viés nos
resultados, pois há relatos na literatura de que GAPDH, por exemplo, pode
apresentar expressão diferencial em mama (REVILLION et al. 2000), o que
de certa forma poderia explicar a baixa concordância entre os resultados
experimentais e in silico (KIRSCHBAUM-SLAGER et al. 2005), pois as
normalizações dos dados foram realizadas de maneiras diferentes.
Validação experimental através de RT-PCR desse mesmo grupo de
variantes (KIRSCHBAUM-SLAGER et al. 2005) mostrou que em amostras
tumorais houve um maior percentual de validação de candidatos (5 de 6:
83,3%) em relação às linhagens celulares utilizadas (4 de 10: 40%). Esses
dados discordam em parte dos dados de array do presente estudo, uma vez
que foi encontrado o mesmo número de exons (18) superexpressos
associados a mama em amostras e linhagens celulares.
No estudo realizado por WANG Z et al. (2003) foi relatado que 59,2%
das isoformas de splicing selecionadas eram específicas de tumor, ou seja,
quando uma variante era detectada em um tumor, ela somente aparecia
naquele tecido tumoral. Alguns estudos mostram que na maior parte dos
133
casos há expressão no tecido normal, mesmo que seja menor, e, portanto,
essas variantes deveriam ser chamadas de variantes de splicing associadas
a tumores (KIRSCHBAUM-SLAGER et al. 2005; ROY et al. 2005). Isso
ocorre também no caso oposto, onde as variantes associadas a tecido
normal podem apresentar expressão, mesmo que menor, no tecido tumoral
(XU e LEE 2003).
Neste trabalho, de acordo com os critérios estabelecidos, foram
selecionados 14 exons candidatos que apareceram superexpressos em
amostras de câncer de mama, sendo 9 deles previamente selecionados por
análise computacional como associados a tumor de mama, o que significa
que 12% dos 75 apareceram superexpressos em mais de uma comparação
através de análise experimental. Num primeiro momento foram selecionados
a partir dos 14 exons aqueles cujos genes não apresentam superexpressão
em tecido tumoral, analisados com dados disponíveis de SAGE e, em
seguida, todos foram avaliados através de RT-PCR quantitativo (qRT-PCR)
para seleção daqueles que apresentaram superexpressão da variante e não
do gene como um todo.
Critérios foram estabelecidos para seleção das variantes
superexpressas. Primeiramente, os dados de expressão da VCE deveriam
apresentar fold-change ≥ 3, obtido através da média do nível de expressão
da VCE nas amostras tumorais em relação à média do nível de expressão
da VCE nas amostras normais, para tornar mais estringente a seleção dos
candidatos. Desse modo, após a realização dos experimentos de qRT-PCR
foram feitas análises da expressão através da razão entre as médias de
134
expressão das amostras tumorais e das amostras normais (VCE tumor /
VCE normal), e, seguindo-se o critério estringente fold ≥ 3, dos 12 genes
avaliados, somente 3 (25%) mostraram superexpressão da VCE nas
amostras tumorais em relação às normais, sendo eles: TRIM37 (5,69), MK-
STYX (3,29) e BRRN1 (10,17). Outros genes, tais como LIP8 (2,92), PRKD2
(2,53), KIAA0676 (1,61), SND1 (1,59), BAP1 (1,56) e FLJ12528 (1,35) não
preencheram o critério 1 (fold ≥ 3), embora tenham se mostrado mais
expressos em tecido tumoral em relação ao normal.
O baixo percentual de validação técnica dos dados de microarray
(25%), comparado com outros índices de validação do nosso grupo, por
volta de 60-70% (Maschietto et al. submitted; Castro et. al. submitted), pode
estar associado ao fato de estarmos quantificando variantes de splicing, e
não genes como um todo. É visto na literatura taxa de validação de variantes
de splicing selecionadas por microarray utilizando-se a técnica de qRT-PCR
em torno de 30% (GARDINA et al. 2006), sendo similar ao percentual obtido.
Se considerarmos os folds resultantes da comparação TxN obtidas pelos
dados de array, veremos que variou de 1,8 a 2,8 dentre os 14 genes
selecionados para validação, e o fold ≥ 3 (um dos critérios de seleção) foi
garantido pelas demais comparações (PTXPN e LPXLN). Se o fold adotado
na validação dos nossos candidatos fosse de 1,5, como é o caso de muitos
trabalhos na literatura (SUNDE et al. 2006; MEMON et al. 2006; FROMER et
al. 2006), teríamos uma validação técnica dos dados de array de
aproximadamente 67%. Assim utilizando-se o critério de fold ≥ 3, foram
selecionadas três VCE.
135
O segundo critério seria: para aqueles genes que responderam ao
primeiro critério (TRIM37, MK-STYX e BRRN1), o valor relativo de expressão
(fold change) da VCE no tumor em relação ao normal deveria ser
significativamente maior (p<0,05) que o valor relativo de expressão da
variante não contém o exon (VSE) na mesma comparação (T/N) [(VCE
tumor / VCE normal) > (VSE tumor / VSE normal)]. Como foi detectada a
amplificação inespecífica da VSE para os genes TRIM37 e MK-STYX, e
como para o gene BRRN1 não foi possível a amplificação desta variante
utilizando-se os iniciadores de junção exon1-exon3, o cálculo relativo da
VCE foi realizado também em relação à exons constitutivos, isto é,
presentes nas 2 variantes (VCE e VSE). Assim, para os 3 casos, foi avaliada
a expressão constitutiva do gene (EC) através do desenho de iniciadores em
exons constitutivos.
Partimos então para a avaliação do gene como um todo para verificar
se a superexpressão se referia realmente àquela variante específica, ou
ainda, mesmo no caso de haver aumento da expressão do gene como um
todo no tumor, se a variante apresentava maiores diferenças, acarretando
um desbalanço entre variantes do mesmo gene nas amostras tumorais em
relação às normais. Para isso foi avaliada a expressão do gene como um
todo nas mesmas amostras e avaliou-se a expressão relativa nas amostras
tumorais em relação às normais (EC tumor / EC normal). Desse modo, as 3
VCE (TRIM37, MK-STYX e BRRN1) tiveram seus respectivos genes
avaliados. Todas elas foram confirmadas como variantes de splicing
superexpressas em câncer de mama, apresentando diferenças de expressão
136
significativamente maior (p<0,05) nas VCEs em relação ao gene como um
todo (VCE tumor / VCE normal) > (EC tumor / EC normal), indicando um
desbalanço entre elas no tumor e tecido normal de mama. Vale lembrar que
o gene como um todo também teve sua expressão aumentada no tumor em
relação ao normal, no entanto quando sua expressão foi comparada à
expressão da VCE no tumor em relação ao normal, esta foi significantemente
maior, mostrando um notável desbalanço entre elas. Tem sido demosntrado
que alterações no balanço de transcritos alternativos são conhecidas por
afetar a angiogênese (Woolard et al. 2004), a diferenciação celular (Sturla et
al. 2003) e invasão (SINGH et al. 2004).
Uma vez validados tecnicamente, esses 3 genes foram avaliados em
um grupo independente de 40 amostras tumorais. É importante destacar a
grande robustez que se adquire ao se trabalhar com um grupo independente
de amostras, pois demonstra que os dados obtidos não são dependentes
daquele grupo específico. Validar em amostras independentes é
especialmente importante em câncer de mama devido a sua alta
heterogeneidade. Os dados obtidos no grupo inicial foram confirmados no
grupo independente, demonstrando superexpressão da VCE dos 3 genes
selecionados em amostras tumorais em relação às normais: TRIM37 (fold
change: 6,20), MK-STYX (fold change: 9,57) e BRRN1 (fold change: 17,37).
Além disso, as 3 VCE foram confirmadas como variantes de splicing
superexpressas em câncer de mama em relação ao gene como um todo
(p<0,05) neste grupo de amostras, tornando os dados ainda mais confiáveis.
137
O gene TRIM37 (tripartite motife-containing 37) apresenta 9 formas
alternativas de splicing e está localizado na região 17q23.2 do cromossomo
17, codificando uma proteína de 964 aminoácidos com 108 kD. A proteína
TRIM37 é um novo membro da subfamília RING-B-box-coiled-coil (RBCC)
de proteínas de dedo-de-zinco (KALLIJÄRVI et al. 2002). Essas proteínas
estão localizadas no núcleo e citoplasma, e medeiam diversos processos
celulares, tais como apoptose, replicação viral, controle do ciclo celular e
biogênese do peroxissomo (BORDEN e FREEMONT 1996; BORDEN 2000).
Mutações gênicas que ocasionem defeitos em TRIM37 (muitas vezes
resultando em uma alteração do quadro de leitura e levando a uma proteína
truncada) estão associadas com nanismo mulibrey, também chamado de
nanismo músculo-fígado-cérebro-olho, uma desordem autossomal recessiva
que envolve vários tecidos de origem mesodérmica (AVELA et al. 2000). As
principais características incluem falha severa no início do crescimento pré-
natal e pericárdio constritivo com conseqüente hepatomegalia. Além disso,
são comuns: hipotonia do músculo, J-shaped sella turcica, pontos
amarelados no fundo ocular, características dimórficas típicas e hipoplasia
de várias glândulas endócrinas causando deficiência hormonal (GeneCards-
http://www.genecards.org; Swiss-Prot - http://ca.expasy.org/sprot).
O gene MK-STYX está localizado na região 7q11.23 do cromossomo
7 e apresenta 10 formas alternativas de splicing. Codifica a proteína
phosphatase-dead dual specificity phosphatase-like com 313 aminoácidos e
35818 Da, que por sua vez está implicada na regulação de MAP quinases.
Embora sua função esteja ainda sob investigação, é uma provável
138
pseudofosfatase que contém um resíduo de serina ao invés de císteína em
sua alça catalítica e provavelmente interage com MAPKs de uma maneira
análoga às MKPs (Dual specificity protein phosphatases) (WISHART e
DIXON 1998), inativando suas quinases alvo por desfosforilar tanto os
resíduos fosfoserina/treonina quanto os fosfotirosina. Essa proteína está
superexpressa em ESFT (Ewing's sarcoma family tumors) (SILIGAN et al.
2005).
BRRN1 (barren homolog-Drosophila), está localizado na região
2q11.2 do cromossomo 2 e apresenta 8 formas alternativas de splicing.
Codifica uma proteína de 741 aminoácidos e 82563 Da. É uma subunidade
regulatória do complexo condensina, um complexo requerido para a
conversão de cromatina na intérfase em cromossomos condensados na
mitose, e está presente em células em proliferação. O complexo condensina
introduz provavelmente supercoils no DNA relaxado na presença de
topoisomerases tipo I e converte DNA nicked em formas knotted na
presença de topoisomerases tipo II. Essa associação é requerida para a
segregação cromossomal por facilitar a decatenação de cromátides na
anáfase (BHAT et al. 1996).
Variantes de splicing de genes envolvidos em diferenciação, apoptose
e proliferação celular existem freqüentemente em um equilíbrio delicado, o
qual é encontrado perturbado em tumores (VENABLES 2006). O aumento
das VCEs desses 3 genes e o conseqüente desbalanço entre variantes em
tecidos tumorais e normais de carcinoma ductal de mama, podem ter um
papel importante na tumorigênese e progressão do câncer, no entanto,
139
maiores investigações são necessárias para definir melhor o papel dessas
variantes.
Diferentes isoformas de proteínas geradas por variantes de splicing
podem desempenhar funções distintas ou até mesmo antagônicas nas
células, podendo estar envolvidas em processos tumorigênicos de uma
maneira geral, seja através da perda ou ganho de uma função, via
mudanças na estrutura da proteína que podem esconder ou expor domínios
funcionais, ou através da alteração da atividade de interação com alguma
proteína ou complexos protéicos.
Uma variante de splicing do gene BRCA1, exon 13A-containing
transcript, contém um exon adicional in-frame (FORTIN et al. 2005). O
peptídeo adicional codificado pelo exon 13A parece modificar o domínio de
transativação 1 de BRCA1 AD1 (HU et al. 2000; HU e LI 2002) além do
domínio de interação de BRCA1 com as proteínas hMSH2 (human mismatch
repair protein) (WANG et al. 2001), BRCA2 (CHEN et al. 1998) e AR
(androgen receptor) (YEH et al. 2000). Sugere-se que a inserção desse exon
modificaria os domínios de interação através de alterações no folding da
proteína BRCA1 (FORTIN et al. 2005).
Outro exemplo de que variantes de splicing podem influenciar nas
interações entre proteínas é o gene Elk1, pertencente à família de fatores de
transcrição que apresentam o domínio ETS. Elk1 possui um domínio de
interação ETS, o qual foi encontrado interagir com BRCA1. Elk1 é um
regulador do protooncogene c-Fos e parece que o complexo Elk1:BRCA1
age através da inibição da expressão de genes ativados por Elk1, tal como o
140
c-Fos. Foi observado que BRCA1 não interage com a variante de splicing de
Elk1 (ΔElk-1), influenciado a regulação de vários genes, dentre eles o
protooncogene c-Fos. Sugere-se, desse modo, que Elk1, mas não a sua
variante ΔElk1, pode melhorar a atividade supressora de tumor de BRCA1
em células de câncer de mama humanas (CHAI et al. 2001).
Sabendo-se que possíveis mudanças na conformação de proteínas
causadas por splicing alternativo, podem afetar de maneira significativa a
estrutura das proteínas, sua função, localização e as interações proteína-
proteína (BOUÉ et al. 2002; GARCIA et al. 2004), a investigação do efeito
que splicing alternativo pode exercer em proteínas sabidamente envolvidas
em processos celulares importantes, pode contribuir para uma melhor
compreensão do envolvimento das variantes de splicing no processo
tumorigênico. Assim, fica evidente não apenas a necessidade de se estudar
a expressão de diferentes variantes de splicing, como também analisá-las do
ponto de vista funcional.
Com o objetivo de identificar eventual presença de algum domínio
funcional nas variantes que contêm o exon associado a tumor (VCE)
identificadas como superexpressas neste trabalho, os domínios funcionais
foram mapeados na seqüência de aminoácidos, utilizando a ferramenta
Pfam (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam). Essa análise mostrou que a
variante que contém o exon associado a tumor de MK-STYX (de 42
aminoácidos) e de BRRN1 (de 45 aminoácidos) estavam contidos em
domínios funcionais, e sugere-se que a presença do exon inserido pode, de
certa forma, interferir na função desta proteína, o que poderá ser explorado
141
em estudos posteriores. Para o gene TRIM37, os domínios foram localizados
fora da região do exon alternativo (de 45 aminoácidos), sugerindo que, se a
presença do exon na variante tem um papel importante na função da
proteína no câncer de mama via domínio funcional, deve ser por alteração
na estrutura da proteína resultante, que pode estar, por exemplo,
escondendo ou super-expondo esse domínio.
Procuramos também saber se as proteínas codificadas pelos genes
TRIM37, MK-STYX e BRRN1 interagiam com outras proteínas para
especular se as variantes de splicing identificadas neste estudo como
superexpressas em câncer de mama poderiam influenciar nesta interação.
TRIM37 interage com TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5,
TRAF6, que são membros da família de proteínas de fatores associados a
receptores de TNF (TNFR). Proteínas TRAF se associam com a superfamília
de vários receptores de TNFR e medeiam a sua transdução de sinal. MK-
STYX interage com EWS-FLI1, fator de transcrição expresso nos tumores de
Ewing (ESFT). BRRN1 interage com CAPG, que codifica um membro de
proteínas reguladoras de actina, as quais bloqueiam reversivelmente os
filamentos de actina F, contribuindo para o controle de motilidade baseado
em actina em células não musculares.
O estudo de potenciais marcadores moleculares tumorais associados
ao conhecimento dos fatores prognósticos da doença é fundamental. Para
isso neste trabalho foi feita a correlação dos achados com dados clínicos e
histopatológicos dos pacientes. Para cada gene realizou-se comparação dos
dados de expressão da variante que contém o exon associado a tumor
142
(VCE) e da relação entre a VCE e o fragmento correspondente à expressão
constitutiva do gene (VCE/EC) com as variáveis clínicas e histopatológicas
de cada paciente. Algumas associações foram encontradas, tais como a
expressão de receptores de estrógeno (ER+) e progesterona (PgR+), que
mostraram uma associação significativa (p=0,009 e p=0,024,
respectivamente) com a VCE do gene TRIM37. Já a variável p53 negativo
apresentou uma associação significativa (p=0,040) com a relação VCE/EC
do gene TRIM37. A variável status menopausal negativo apresentou uma
associação significativa (p=0,018) com a relação VCE/EC do gene MK-STYX
e a ausência da expressão de receptores de progesterona (PgR-)
apresentou uma associação significativa (p=0,040) com a VCE do gene
BRRN1.
Porém os dados obtidos nesse estudo são insuficientes para inferir
alguma explicação para as associações clínicas apresentadas. Isso se deve
a vários motivos. Entre eles ao pequeno número de amostras avaliadas.
Embora tenha sido um bom número do ponto de vista de confiabilidade dos
dados obtidos, para associações confiáveis com características clínicas
ainda é um número pequeno. O mais interessante seria análise por
imunohistoquímica usando anticorpo específico para cada variante, podendo
assim avaliar um grande número de amostras e estabelecer associações
mais confiáveis.
Em resumo, embora um maior grupo de dados experimentais seja
requerido para a completa exploração do estudo desenvolvido, os resultados
143
relatados aqui sugerem 3 variantes de splicing superexpressas em
carcinoma ductal de mama, candidatos a marcadores moleculares.
144
6 CONCLUSÕES
9 A tecnologia de microarray mostrou-se eficaz para rastrear candidatos
a variantes de splicing superexpressas em câncer de mama, a partir
de dados computacionais;
9 Quanto mais estringentes foram as análises para seleção de exons
superexpressos em tumor, maior a representatividade dos exons
associados a câncer de mama;
9 Esse estudo identificou 3 genes que apresentam variantes de splicing
superexpressas em câncer de mama, TRIM37, MK-STYX e BRRN1;
9 Os resultados de expressão apresentados foram validados em um
grupo independente de amostras, o que confere grande confiabilidade
dos dados;
9 O estudo sugere variantes de splicing superexpressas em carcinoma
ductal de mama candidatos a marcadores moleculares;
9 Os dados obtidos nesse estudo são ainda insuficientes para inferir
alguma explicação para as associações clínicas encontradas.
145
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Agrawal S, Eng C. Differential expression of novel naturally occurring splice
variants of PTEN and their functional consequences in Cowden syndrome
and sporadic breast cancer. Hum Mol Genet 2006; 15:777-87.
Albanell J, Baselga J. Unraveling resistance to trastuzumab (Herceptin):
insulin-like growth factor-I receptor, a new suspect. J Natl Cancer Inst 2001;
93:1830-2.
Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Molecular
biology of the cell. 4
th
ed. New York: Garland Publishing; 2002. How Cells
Read the Genome: From DNA to Protein; p.299-375.
Allison DB, Cui X, Page GP, Sabripour M. Microarray data analysis: from
disarray to consolidation and consensus. Nat Rev Genet 2006; 7:55-65.
Avela K, Lipsanen-Nyman M, Idänheimo N, et al. Gene encoding a new
RING-B-box-Coiled-coil protein is mutated in mulibrey nanism. Nat Genet
2000; 25:298-301.
Barbati A, Cosmi EV, Sidoni A, et al. Value of c-erbB-2 and p53 oncoprotein
co-overexpression in human breast cancer. Anticancer Res 1997; 17:401-5.
Bardou VJ, Arpino G, Elledge RM, Osborne CK, Clark GM. Progesterone
receptor status significantly improves outcome prediction over estrogen
receptor status alone for adjuvant endocrine therapy in two large breast
cancer databases. J Clin Oncol 2003; 21:1973-9.
146
Baruch A, Hartmann M, Yoeli M, et al. The breast cancer-associated MUC1
gene generates both a receptor and its cognate binding protein. Cancer Res
1999; 59:1552-61.
Baudry D, Hamelin M, Cabanis MO, et al. WT1 splicing alterations in Wilm’s
tumors. Clin Cancer Res 2000; 6:3957-65.
Bhat MA, Philp AV, Glover DM, Bellen HJ. Chromatid segregation at
anaphase requires the barren product, a novel chromosome-associated
protein that interacts with Topoisomerase II. Cell 1996; 87:1103-14.
Black DL. Protein diversity from alternative splicing: a challenge for
bioinformatics and post-genome biology. Cell 2000; 103:367-70.
Black DL. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annu
Rev Biochem 2003; 72:291-336.
Borden KL, Freemont PS. The RING finger domain: a recent example of a
sequence-structure family. Curr Opin Struct Biol 1996; 6:395-401.
Borden KL. RING domains: master builders of molecular scaffolds? J Mol
Biol 2000; 295:1103-12. Review. Erratum in: J Mol Biol 2000; 297:1027.
Boué S, Vingron M, Kriventseva E, Koch I. Theoretical analysis of alternative
splice forms using computational methods. Bioinformatics 2002; 18 Suppl
2:S65-73.
Brentani RR, Carraro DM, Verjovski-Almeida S, et al. Gene expression
arrays in cancer research: methods and applications. Crit Rev Oncol
Hematol 2005; 54:95-105.
147
Brett D, Pospisil H, Valcarcel J, et al. Alternative splicing and genome
complexity. Nat Genet 2002; 30:29-30.
Brinkman BM. Splice variants as cancer biomarkers. Clin Biochem 2004;
37:584-94.
Buchhagen DL, Qiu L, Etkind P. Homozygous deletion, rearrangement and
hypermethylation implicate chromosome region 3p14.3-3p21.3 in sporadic
breast-cancer development. Int J Cancer 1994; 57:473-9.
Burstein HJ. The distinctive nature of HER2-positive breast cancers. N Engl
J Med 2005; 353:1652-4.
Buzdar A, O'Shaughnessy JA, Booser DJ, et al. Phase II, randomized,
double-blind study of two dose levels of arzoxifene in patients with locally
advanced or metastatic breast cancer. J Clin Oncol 2003; 21:1007-14.
Caballero OL, de Souza SJ, Brentani RR, Simpson AJ. Alternative spliced
transcripts as cancer markers. Dis Markers 2001; 17:67-75.
Caceres JF, Kornblihtt AR. Alternative splicing: multiple control mechanisms
and involvement in human disease. Trends Genet 2002; 18:186-93.
Camp RL, Dolled-Filhart M, King BL, Rimm DL. Quantitative analysis of
breast cancer tissue microarrays shows that both high and normal levels of
HER2 expression are associated with poor outcome. Cancer Res 2003;
63:1445-8.
Carraro DM, Brentani HP, Soares FA, Reis LFL, Brentani RR. From Tissue
Samples to Tumor Markers. In: Krishanarao A, organizador. From basics to
diagnostics. New Jersey; Humana Press; 2007. p.17-28.
148
Carninci P, Kasukawa T, Katayama S, et al. Genome science group
(Genome Network Project Core Group). The transcriptional landscape of the
mammalian genome. Science 2005; 309:1559-63. Erratum in: Science
2006; 311:1713.
Carraway HE, Wang S, Blackford A, et al. Promoter hypermethylation in
sentinel lymph nodes as a marker for breast cancer recurrence. Breast
Cancer Res Treat 2008.
Castro NP, Osório CABT, Torres C, et al. Evidence of molecular program of
ductal carcinoma progression taking place before morphological alterations.
2008 (Submitted).
Chang JC, Wooten EC, Tsimelzon A, et al. Gene expression profiling for the
prediction of therapeutic response to docetaxel in patients with breast cancer.
Lancet 2003; 362:362-9.
Chai Y, Chipitsyna G, Cui J, et al. c-Fos oncogene regulator Elk-1 interacts
with BRCA1 splice variants BRCA1a/1b and enhances BRCA1a/1b-mediated
growth suppression in breast cancer cells. Oncogene 2001; 20:1357-67.
Chen J, Silver DP, Walpita D, et al. Stable interaction between the products
of the BRCA1 and BRCA2 tumor suppressor genes in mitotic and meiotic
cells. Mol Cell 1998; 2:317-28.
Cho HS, Mason K, Ramyar KX, et al. Structure of the extracellular region of
HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature 2003; 421:756-
60.
Church GM, Gilbert W. Genomic sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A
1984; 81:1991-5.
149
Clarke R, Leonessa F, Welch JN, Skaar TC. Cellular and molecular
pharmacology of antiestrogen action and resistance. Pharmacol Rev 2001;
53:25-71.
Clarke M, Collins R, Darby S, et al. Effects of radiotherapy and of differences
in the extent of surgery for early breast cancer on local recurrence and 15-
year survival: an overview of the randomised trials. Early Breast Cancer
Trialists' Collaborative Group (EBCTCG). Lancet 2005; 366:2087-106.
Review.
Compton CC, Fielding LP, Burgart LJ, et al. Prognostic factors in colorectal
cancer, College of American Pathologists Consensus Statement 1999. Arch
Pathol Lab Med 2000; 124:979-94.
Cooper DL. Retention of CD44 introns in bladder cancer: understanding the
alternative splicing of pre-mRNA opens new insights into the pathogenesis of
human cancers. J Pathol 1995; 177:1-3.
Corvello CM. Genética molecular do câncer de mama: predisposição e
prognóstico. In: Rossi BM, Pinho M, editores. Genética e biologia para o
cirurgião. São Paulo: Lemar; 1999. p.201-11.
Costa FF, Verbisck NV, Salim AC, et al. Epigenetic silencing of the adhesion
molecule ADAM23 is highly frequent in breast tumors. Oncogene 2004;
23:1481-8.
Costa LJM, del Giglio A. Marcadores moleculares em oncologia. In: Brentani
MM, Coelho FRG, Kowalski LP, editores. Bases da oncologia. São Paulo:
Lemar; 2003. p.309-26.
150
Cragg MS, Chan HT, Fox MD, et al. The alternative transcript of CD79b is
overexpressed in B-CLL and inhibits signaling for apoptosis. Blood 2002;
100:3068-76.
Cuperlovic-Culf M, Belacel N, Culf AS, Ouellette RJ. Microarray analysis of
alternative splicing. OMICS 2006; 10:344-57.
de Kok JB, Roelofs RW, Giesendorf BA, et al.Normalization of gene
expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous
control genes. Lab Invest 2005; 85:154-9.
Ding, W.Q., Cheng, Z.J., McElhiney, J., Kuntz, S.M., Miller, L.J. Silencing of
secretin receptor function by dimerization with a misspliced variant secretin
receptor in ductal pancreatic adenocarcinoma. Cancer Res 2002; 18:5223-9.
Doussal VL, Tubiana-Hulin M, Friedman S, Hacene K, Spyratos F, Brunet M.
Prognostic value of histologic grade nuclear components of Scarff-Bloom-
Richardson (SBR). Cancer 1989; 64:1914-21.
Duffy MJ. Predictive markers in breast and other cancers: a review. Clin
Chem 2005; 51:494-503.
El Shamy WM, Livingston DM. Identification of BRCA1-IRIS, a BRCA1 locus
product. Nat Cell Biol 2004; 6:954-67.
Fan C, Oh DS, Wessels L, et al. Concordance among gene-expression
based predictors for breast cancer. N Engl J Med 2006; 355:560-6.
Faustino NA, Cooper TA. Pre-mRNA splicing and human disease. Genes
Dev 2003; 17:419-37.
151
Feneley MR, Partin AW. Diagnosis of localized prostate cancer: 10 years of
progress. Curr Opin Urol 2000; 10:319-32.
Ferreira EN, Galante PA, Carraro DM, de Souza SJ. Alternative splicing: a
bioinformatics perspective. Mol Biosyst 2007; 3:473-7.
Fisher B, Dignam J, Bryant J, Wolmark N. Five versus more than five years
of tamoxifen for lymph node-negative breast cancer: updated findings from
the National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project B-14 randomized
trial. J Natl Cancer Inst 2001; 93:684-90.
Folgueira MAK, Brentani MM. Oncologia molecular. São Paulo: Atheneu;
2004. Câncer de mama. p.135-44.
Folgueira MA, Carraro DM, Brentani H, et al. Gene expression
profileassociated with response to doxorubicin-based therapy in breast
cancer. Clin Cancer Res 2005; 11:7434-43.
Fortin J, Moisan AM, Dumont M, et al. A new alternative splice variant of
BRCA1 containing an additional in-frame exon. Biochim Biophys Acta
2005; 1731:57-65.
Galante PA, Sakabe NJ, Kirschbaum-Slager N, de Souza SJ. Detection and
evaluation of intron retention events in the human transcriptome. RNA 2004;
10:757-65.
Garcia A, Cayla X, Caudron B, Deveaud E, Roncal F, Rebollo A. New
insights in protein phosphorylation: a signature for protein phosphatase 1
interacting proteins. C R Biol 2004; 327:93-7.
Garcia-Blanco MA, Baraniak AP, Lasda EL. Alternative splicing in disease
and therapy. Nat Biotechnol 2004; 22:535-46.
152
Gardina PJ, Clark TA, Shimada B, et al. Alternative splicing and differential
gene expression in colon cancer detected by a whole genome exon array.
BMC Genomics 2006; 7:325.
Ge K, DuHadaway J, Du W, Herlyn M, Rodeck U, Prendergast GC.
Mechanism for elimination of a tumor suppressor: aberrant splicing of a
brain-specific exon causes loss of function of Bin1 in melanoma. Proc Natl
Acad Sci U S A 1999; 96:9689-94.
Glisin V, Crkvenjakov R, Byus C. Ribonucleic acid isolated by cesium
chloride centrifugation. Biochemistry 1974; 13:2633-7.
Gomes LI, Silva RL, Stolf BS, et al. Comparative analysis of amplified and
nonamplified RNA for hybridization in cDNA microarray. Anal Biochem
2003; 321:244-51.
Graveley BR. Sex, AGility, and the regulation of alternative splicing. Cell
2002; 109:409-12.
Greenblatt MS, Bennett WP, Hollstein M, Harris CC. Mutations in the p53
tumor suppressor gene: clues to cancer etiology and molecular
pathogenesis. Cancer Res 1994; 54:4855-78.
Gupta S, Zink D, Korn B, Vingron M, Haas SA. Genome wide identification
and classification of alternative splicing based on EST data. Bioinformatics
2004; 20:2579-85.
Hanamura A, Caceres JF, Mayeda A, Franza BR Jr, Krainer AR. Regulated
tissue-specific expression of antagonistic pre-mRNA splicing factors. RNA
1998; 4:430-44.
153
Harris RA, Hiles ID, Page MJ, O'Hare MJ. The induction of apoptosis in
human mammary luminal epithelial cells by expression of activated c-neu
and its abrogation by glucocorticoids. Br J Cancer 1995; 72:386-92.
Hashizume R, Fukuda M, Maeda I, et al. The RING heterodimer BRCA1-
BARD1 is a ubiquitin ligase inactivated by a breast cancer-derived mutation.
J Biol Chem 2001; 276:14537-40.
Herrera-Gayol A, Jothy S. Adhesion proteins in the biology of breast cancer:
contribution of CD44. Exp Mol Pathol 1999; 66:149-56.
Herrlich P, Morrison H, Sleeman J, et al. CD44 acts both as a growth- and
invasiveness-promoting molecule and as a tumor-suppressing cofactor. Ann
N Y Acad Sci 2000; 910:106-18; discussion 118-20.
Hoffman JD, Hallam SE, Venne VL, Lyon E, Ward K. Implications of a novel
cryptic splice site in the BRCA1 gene. Am J Med Genet 1998; 80:140-4.
Howel L, Gandour-Edwards R, O’Sullivan D. Application of the Scarff-Bloom-
Richardson tumor grading system to fine needle aspirates of the breast. Am
J Clin Pathol 1994; 101:262-5.
Hsu FR, Chang HY, Lin YL, et al. AVATAR: a database for genome-wide
alternative splicing event detection using large scale ESTs and mRNAs.
Bioinformation 2005; 1:16-18.
Hu GK, Madore SJ, Moldover B, et al. Predicting splice variant from DNA
chip expression data. Genome Res 2001; 11:1237-45.
Hu YF, Li R. JunB potentiates function of BRCA1 activation domain 1 (AD1)
through a coiled-coil-mediated interaction. Genes Dev 2002; 16:1509-17.
154
Hui L, Zhang X, Wu X, et al. Identification of alternatively spliced mRNA
variants related to cancers by genome-wide ESTs alignment. Oncogene
2004; 23:3013-23.
Huggett J, Dheda K, Bustin S, Zumla A. Real-time RT-PCR normalisation;
strategies and considerations. Genes Immun 2005; 6:279-84.
Jensen DE, Proctor M, Marquis ST, et al. BAP1: a novel ubiquitin hydrolase
which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell
growth suppression. Oncogene 1998; 16:1097-112.
Jensen DE, Rauscher FJ 3rd. BAP1, a candidate tumor suppressor protein
that interacts with BRCA1. Ann N Y Acad Sci 1999; 886:191-4.
Jin P, Fu GK, Wilson AD, et al. PCR isolation and cloning of novel splice
variant mRNAs from known drug target genes. Genomics 2004; 83:566-71.
Johnson JM, Castle J, Garrett-Engele P, et al. Genome-wide survey of
human alternative pre-mRNA splicing with exon junction microarrays.
Science 2003; 302:2141-4.
Jurica MS, Moore MJ. Pre-mRNA splicing: awash in a sea of proteins. Mol
Cell 2003; 12:5-14.
Kallijärvi J, Avela K, Lipsanen-Nyman M, Ulmanen I, Lehesjoki AE. The
TRIM37 gene encodes a peroxisomal RING-B-box-coiled-coil protein:
classification of mulibrey nanism as a new peroxisomal disorder. Am J Hum
Genet 2002; 70:1215-28.
Kalnina Z, Zayakin P, Silina K, Linē A. Alterations of pre-mRNA splicing in
cancer.Genes Chromosomes Cancer 2005; 42:342-57.
155
Kampa D, Cheng J, Kapranov P, et al. Novel RNAs identified from an in-
depth analysis of the transcriptome of human chromosomes 21 and 22.
Genome Res 2004; 14:331-42.
Kim E, Magen A, Ast G. Different levels of alternative splicing among
eukaryotes. Nucleic Acids Res 2007; 35:125-31.
Kim E, Goren A, Ast G. Alternative splicing and disease. RNA Biol 2008; 5.
Kirschbaum-Slager N, Parmigiani RB, Camargo AA, de Souza SJ.
Identification of human exons over-expressed in tumors through the use of
genome and expressed sequence data. Physiol Genomics 2005; 21:423-
32.
Koduri S, Goldhar AS, Vonderhaar BK. Activation of vascular endothelial
growth factor (VEGF) by the ER-alpha variant, ERDelta3. Breast Cancer
Res Treat 2006; 95:37-43.
Kumar CC, Madison V. Drugs targeted against protein kinases. Expert Opin
Emerg Drugs 2001; 6:303-15.
Lander ES, Linton LM, Birren B, et al. Initial sequencing and analysis of the
human genome. Nature 2001; 409:860-921.
Li C, Kato M, Shiue L, Shively JE, Ares M Jr, Lin RJ. Cell type and culture
condition-dependent alternative splicing in human breast cancer cells
revealed by splicing-sensitive microarrays. Cancer Res 2006; 66:1990-9.
Lonning PE, Knappskog S, Staalesen V, Chrisanthar R, Lillehaug JR. Breast
cancer prognostication and prediction in the postgenomic era. Ann Oncol
2007; 18:1293-306.
156
Lu Y, Yao HP, Wang MH. Multiple variants of the RON receptor tyrosine
kinase: biochemical properties,tumorigenic activities, and potential drug
targets. Cancer Lett 2007; 257:157-64.
Ma XJ, Salunga R, Tuggle JT, et al. Gene expression profiles of human
breast cancer progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003; 100:5974-9.
Mackay A, Jones C, Dexter T, et al. cDNA microarray analysis of genes
associated with ERBB2 (HER2/neu) overexpression in human mammary
luminal epithelial cells. Oncogene 2003; 22:2680-8.
Maniatis T, Tasic B. Alternative pre-mRNA splicing and proteome expansion
in metazoans. Nature 2002; 418:236-43.
Matlin AJ, Clark F, Smith CW. Understanding alternative splicing: towards a
cellular code. Nat Rev Mol Cell Biol 2005; 6:386-98.
Matthews J, Gustafsson JA. Estrogen signaling: a subtle balance between
ER alpha and ER beta. Mol Interv 2003; 3:281-92. Review.
Megha T, Ferrari F, Benvenuto A, et al. p53 mutation in breast cancer:
correlation with cell kinetics and cell of origin. J Clin Pathol 2002; 55:461-6.
Meireles SI, Carvalho AF, Hirata R, et al. Differentially expressed genes in
gastric tumors identified by cDNA array. Cancer Lett 2003; 190:199-211.
Memon AA, Sorensen SB, Nexo E. The epidermal growth factor family has a
dual role in deciding the fate of cancer cells. Scand J Clin Lab Invest 2006;
66:623-30.
157
Milani L, Fredriksson M, Syvanen AC. Detection of alternatively spliced
transcripts in leukemia cell lines by minisequencing on microarrays. Clin
Chem 2006; 52:202-11.
Minneman KP. Splice variants of G protein-coupled receptors. Mol Interv
2001; 1:108-16.
Ministério da Saúde. Instituto Nacional do Câncer. Câncer de mama.
Disponível em: <URL:http://www.inca.gov.br/conteudo_view.asp?id=336>.
[2008 mar 13].
Modrek B, Lee C. A genomic view of alternative splicing. Nat Genet 2002;
30:13-9.
Mokbel K. Focus on anastrozole and breast cancer. Curr Med Res Opin
2003; 19:683-8.
Molina R, Barak V, van Dalen A, et al. Tumor markers in breast cancer-
European Group on Tumor Markers recommendations. Tumour Biol 2005;
26:281-93.
Morrison TB, Wei, JJ e Wittwer, C.T. Quantification of low-copy transcripts by
continuous SYBR Green I monitoring during amplification. Biotechniques
1998; 954-62.
Nakamura S, Gomyo Y, Roth JA. C-terminus of p53 is required for G(2)
arrest. Oncogene 2002; 27:2102-7.
Nakaya HI, Beckedorff FC, Baldini ML, Fachel AA, Reis EM, Verjovski-
Almeida S. Splice variants of TLE family genes and up-regulation of a TLE3
isoform in prostate tumors. Biochem Biophys Res Commun 2007;
364:918-23.
158
Naor D, Nedvetzki S, Golan I, Melnik L, Faitelson Y. CD44 in cancer. Crit
Rev Clin Lab Sci 2002; 39:527-79.
Nishidate T, Katagiri T, Lin ML, et al. Genome-wide gene-expression profiles
of breast-cancer cells purified with laser microbeam microdissection:
identification of genes associated with progression and metastasis. Int J
Oncol 2004; 25:797-819.
Nilsen TW. The spliceossome: the most complex macromolecular machine in
the cell? Bio Essays 2003; 1147-9.
Nygaard V, Hovig E. Options available for profiling small samples: a review of
sample amplification technology when combined with microarray profiling.
Nucleic Acids Res 2006; 34:996-1014.
Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time
RT-PCR. Nucleic Acids Res 2001;29:e45.
Pagani F, Baralle FE. Genomic variants in exons and introns: identifying the
splicing spoilers. Nat Rev Genet 2004; 5:389-96.
Pan Q, Bakowski MA, Morris Q, et al. Alternative splicing of conserved exons
is frequently species-specific in human and mouse. Trends Genet 2005;
21:73-7.
Parl FF. Multiple mechanisms of estrogen receptor gene repression
contribute to ER-negative breast cancer. Pharmacogenomics J 2003;
3:251-3.
Petit T, Borel C, Ghnassia JP, et al. Chemotherapy response of breast
cancer depends on HER-2 status and anthracycline dose intensity in the
neoadjuvant setting. Clin Cancer Res 2001; 7:1577-81.
159
Pettigrew CA, Brown MA. Pre-mRNA splicing aberrations and cancer. Front
Biosci 2008; 13:1090-105.
Phillips KA. Current perspectives on BRCA1- and BRCA2-associated breast
cancers. Intern Med J 2001; 31:349-56.
Posner MR, Mayer RJ. The use of serologic tumor markers in gastrointestinal
malignancies. Hematol Oncol Clin North Am 1994; 8:533-53.
Radice D, Redaelli A. Breast cancer management: quality-of-life and cost
considerations. Pharmacoeconomics 2003; 21:383-96.
Relogio A, Ben-Dov C, Baum M, et al. Alternative splicing microarrays reveal
functional expression of neuron-specific regulators in Hodgkin lymphoma
cells. J Biol Chem 2005; 280:4779-84.
Revillion F, Pawlowski V, Hornez L, Peyrat JP. Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase gene expression in human breast cancer. Eur J Cancer
2000; 36:1038-42.
Rolland P, Spendlove I, Madjid Z, Rakha EA, Patel P, Ellis IO, Durrant L. The
p53 positive Bcl-2 negative phenotype is an independent marker of prognosis
in breast cancer. Int J Cancer 2007; 120:1311-7.
Rosen EM, Fan S, Isaacs C. BRCA1 in hormonal carcinogenesis: basic and
clinical research. Endocr Relat Cancer 2005; 12:533-48.
Roy M, Xu Q, Lee C. Evidence that public database records for many cancer-
associated genes reflect a splice form found in tumors and lack normal splice
forms. Nucleic Acids Res 2005; 33:5026-33.
160
Rudolph P, Alm P, Olsson H, et al. Concurrent overexpression of p53 and c-
erbB-2 correlates with accelerated cycling and concomitant poor prognosis in
node-negative breast cancer. Hum Pathol 2001; 32:311-9.
Sampath J, Pelus LM. Alternative splice variants of survivin as potential
targets in cancer. Curr Drug Discov Technol 2007; 4:174-91.
Schena M. Microarray analisys: introduction to microarray analisys.
New Jersey: Johan Willey & Sons; 2003.
Scheper W, Zwart R, Baas F. Alternative splicing in the N-terminus of
Alzheimer's presenilin 1. Neurogenetics 2004; 5:223-7.
Scheurlen WG, Senf L. Analysis of the GAP-related domain of the
neurofibromatosis type 1 (NF1) gene in childhood brain tumors. Int J Cancer
1995; 64:234-8.
Shimizu D, Ishikawa T, Ichikawa Y, et al. Current progress in the prediction of
chemosensitivity for breast cancer. Breast Cancer 2004; 11:42-8.
Shipp M, Harringrton D, Anderson J, et al. A predictive model for aggressive
non Hodgkin’s lymphoma. N Engl J Med 1993; 329:987-4.
Shulzhenko N, Smirnova AS, Morgun A, Gerbase-DeLima M. Specificity of
alternative splice form detection using RT-PCR with a primer spanning the
exon junction. Biotechniques 2003; 34:1244-9.
Siligan C, Ban J, Bachmaier R, et al. EWS-FLI1 target genes recovered from
Ewing's sarcoma chromatin. Oncogene 2005; 24:2512-24.
161
Silva APM. Caracterização de genes diferencialmente expressos em
linhagens celulares de mama que expressam diferentes níveis de c-
erbB2. São Paulo; 2006. [Tese de Doutorado-Fundação Antônio Prudente].
Singh A, Karnoub AE, Palmby TR, Lengyel E, Sondek J, Der CJ. Rac1b, a
tumor associated, constitutively active Rac1 splice variant, promotes cellular
transformation. Oncogene 2004; 58:9369-80.
Slamon D, Pegram M. Rationale for trastuzumab (Herceptin) in adjuvant
breast cancer trials. Semin Oncol 2001; 28(1 Suppl 3):13-9.
Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, et al. Use of chemotherapy plus a
monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that
overexpresses HER2. N Engl J Med 2001; 344:783-92.
Smart CR, Byrne C, Smith RA, et al. Twenty-year follow-up of the breast
cancers diagnosed during the Breast Cancer Detection Demonstration
Project. CA Cancer J Clin 1997; 47:134-49.
Sneath RJ, Mangham DC. The normal structure and function of CD44 and its
role in neoplasia. Mol Pathol 1998; 51:191-200.
Sorek R, Shamir R, Ast G. How prevalent is functional alternative splicing in
the human genome? Trends Genet 2004; 20:68-71.
Sotiriou C, Neo SY, McShane LM, et al. Breast cancer classification and
prognosis based on gene expression profiles from a population-based study.
Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100:10393-8.
162
Stamps AC, Davies SC, Burman J, O'Hare MJ. Analysis of proviral
integration in human mammary epithelial cell lines immortalized by retroviral
infection with a temperature-sensitive SV40 T-antigen construct. Int J
Cancer 1994; 57:865-74.
Stickeler E, Kittrell F, Medina D, Berget SM. Stage-specific changes in SR
splicing factors and alternative splicing in mammary tumorigenesis.
Oncogene 1999; 18:3574-82.
Stimpfl M, Tong D, Fasching B, et al. Vascular endothelial growth factor
splice variants and their prognostic value in breast and ovarian cancer. Clin
Cancer Res 2002; 8:2253-9.
Sturla LM, Merrick AE, Burchill SA. FGFR3IIIS: a novel soluble FGFR3
spliced variant that modulates growth is frequently expressed in tumour cells.
Br J Cancer 2003; 7:1276-84.
Styblo TM, Wood WC. Traditional prognostic factors in breast cancer In:
Bland KI, Copeland III EM, editors. The breast: comprehensive
management of benign and malignant diseases. 2
nd
ed. Philadelphia: W B
Saunders; 1998. p.419-25.
Sunde JS, Donninger H, Wu K, et al. Expression profiling identifies altered
expression of genes that contribute to the inhibition of transforming growth
factor-beta signaling in ovarian cancer. Cancer Res 2006; 66:8404-12.
Takikawa Y, Noguchi M, Kitagawa H, Thomas M. Detection of p53 and c-
erbB-2 proteins: prognostic significance in operable breast cancer. Breast
Cancer 1994; 30:17-23.
Thai TH, Kearney JF. Distinct and opposite activities of human terminal
deoxynucleotidyltransferase splice variants. J Immunol 2004; 173:4009-19.
163
Timms JF, White SL, O´Hare MJ, Waterfield MD. Effects of ErbB-2
overexpression on mitogenic signaling and cell cycle progression in human
breast luminal epithelial cells. Oncogene 2002; 21:6573-86.
Thorsen K, Sørensen KD, Brems-Eskildsen AS. Alternative splicing in colon,
bladder, and prostate cancer identified by exon-array analysis. Mol Cell
Proteomics 2008.
van de Vijver MJ, He YD, van't Veer LJ, Dai H, Hart AA, Voskuil DW. A gene-
expression signature as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J
Med 2002; 25:1999-2009.
Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, et al. Accurate normalization of real-
time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal
control genes. Genome Biol 2002; 3:RESEARCH0034.
Van't Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ, et al. Gene expression profiling
predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 2002; 415:530-6.
Van't Veer LJ, Bernards R. Enabling personalized cancer medicine through
analysis of gene-expression patterns. Nature 2008; 452:564-70.
Venables JP. Aberrant and alternative splicing in cancer. Cancer Res 2004;
64:7647-54.
Venables JP. Unbalanced alternative splicing and its significance in
cancer.Bioessays 2006; 28:378-86.
Vêncio RZ, Brentani H, Patrão DF, Pereira CA. Bayesian model accounting
for within-class biological variability in Serial Analysis of Gene Expression
(SAGE). BMC Bioinformatics 2004; 5:119.
164
Venkitaraman AR. Cancer susceptibility and the functions of BRCA1 and
BRCA2. Cell 2002; 108:171-82.
Venter JC, Adams MD, Myers EW, et al. The sequence of the human
genome. Science 2001; 291:1304-51.
Wagner KD, Wagner N, Schedl A. The complex life of WT1. J Cell Sci 2003;
116:1653-8.
Wang E, Miller LD, Ohnmacht GA, Liu ET, Marincola FM. High-fidelity mRNA
amplification for gene profiling. Nat Biotechnol 2000; 18:457-9.
Wang Q, Zhang H, Guerrette S, et al. Adenosine nucleotide modulates the
physical interaction between hMSH2 and BRCA1. Oncogene 2001; 20:4640-
9.
Wang L, Duke L, Zhang PS, et al. Alternative splicing disrupts a nuclear
localization signal in spleen tyrosine kinase that is required for invasion
suppression in breast cancer. Cancer Res 2003; 63:4724-30.
Wang Z, Lo HS, Yang H, et al. Computational analysis and experimental
validation of tumor-associated alternative RNA splicing in human cancer.
Cancer Res 2003; 63:655-7.
Watahiki A, Waki K, Hayatsu N, et al. Libraries enriched for alternatively
spliced exons reveal splicing patterns in melanocytes and melanomas. Nat
Methods 2004; 1:233-9.
Weinert T. DNA damage and checkpoint pathways: molecular anatomy and
interactions with repair. Cell 1998; 94:555-8.
165
Wieben ED. Primer on medical genomics. Part VII: The evolving concept of
the gene. Mayo Clin Proc 2003; 78:580-7.
Wikstrand CJ, Hale LP, Batra SK, et al. Monoclonal antibodies against
EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and
malignant gliomas. Cancer Res 1995; 55:3140-8.
Wishart MJ, Dixon JE. Gathering STYX: phosphatase-like form predicts
functions for unique protein-interaction domains. Trends Biochem Sci 1998;
23:301-6.
Wolff AC, Davidson NE. Primary systemic therapy in operable breast cancer.
J Clin Oncol 2000; 18:1558-69.
Woolard J, Wang WY, Bevan HS, Qiu Y, Morbidelli L, Pritchard-Jones RO et
al. VEGF165b, an inhibitory vascular endothelial growth factor splice variant:
mechanism of action, in vivo effect on angiogenesis and endogenous protein
expression. Cancer Res 2004; 21:7822-35.
Wooster R, Weber BL. Breast and ovarian cancer. N Engl J Med 2003;
348:2339-47.
Xie H, Zhu WY, Wasserman A, Grebinskiy V, Olson A, Mintz L.
Computational analysis of alternative splicing using EST tissue information.
Genomics 2002; 80:326-30.
Xin Y, Grace A, Gallagher MM, Curran BT, Leader MB, Kay EW. CD44V6 in
gastric carcinoma: a marker of tumor progression. Appl Immunohistochem
Mol Morphol 2001; 9:138-42.
166
Xu Q, Lee C. Discovery of novel splice forms and functional analysis of
cancer-specific alternative splicing in human expressed sequences. Nucleic
Acids Res 2003; 31:5635-43.
Xu Q, Modrek B, Lee C. Genome-wide detection of tissue-specific alternative
splicing in the human transcriptome. Nucleic Acids Res 2002; 30:3754-66.
Yamashita H, Yando Y, Nishio M, et al. Immunohistochemical evaluation of
hormone receptor status for predicting response to endocrine therapy in
metastatic breast cancer. Breast Cancer 2006; 13:74-83.
Yarden Y, Sliwkowski MX. Untangling the ErbB signalling network. Nat Rev
Mol Cell Biol 2001; 2:127-37.
Yeh S, Hu YC, Rahman M, et al. Increase of androgen-induced cell death
and androgen receptor transactivation by BRCA1 in prostate cancer cells.
Proc Natl Acad Sci U S A 2000; 97:11256-61.
Yoshida K, Miki Y. Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair,
transcription, and cell cycle in response to DNA damage. Cancer Sci 2004;
95:866-71.
Anexo 1 - cTNM- Classificação Clínica Baseada em evidências anteriores
ao tratamento
O estadiamento pelo sistema TNM (Classification of Malignant
Tumors) é o método mais utilizado na classificação de tumores malignos e a
descrição de sua extensão anatômica, desenvolvido e publicado pela União
Internacional Contra o Câncer - UICC. Para descrever a extensão anatômica
da doença, o sistema TNM é baseado na avaliação de três componentes: T-
extensão do tumor primário, N- ausência ou presença de metástases em
linfonodos regionais e M- ausência ou presença de metástases à distância.
T- Características do tumor
TX- Tumor primário não pode ser avaliado
T0- Não há evidência de tumor primário.
Tis- Carcinoma in situ.
T1- Tumor de 2cm ou menos em sua maior dimensão.
T2- Tumor de mais de 2cm, porém não mais de 5cm em sua maior
dimensão.
T3- Tumor de mais de 5cm em sua maior dimensão.
T4- Tumor de qualquer dimensão, com extensão direta à parede
torácica ou à pele.
N- Linfonodos Regionais
NX- Linfonodos regionais não podem ser avaliados.
N0- Ausência de metástase em linfonodos regionais.
N1- Metástase em linfonodo(s) axilar(es), homolateral(ais), móvel(eis).
N2- Metástase em linfonodo(s) axilar(es), homolateral(ais), fixo(s) uns
aos outros ou a outras estruturas.
N3-Metástase em linfonodo(s) mamário(s) interno(s), homolateral(ais).
M- Metástase à distância
MX- A presença de metástase à distância não pode ser avaliada.
M0- Ausência de metástase à distância.
M1- Metástase à distância.
TNM- Grupamento por Estadios
Estadio 0
Tis N0 M0
Estadio I
T1 N0 M0
Estadio IIA
T0
T1
T2
N1
N1
N0
M0
M0
M0
Estadio IIB
T2
T3
N1
N0
M0
M0
Estadio IIIA
T0
T1
T2
T3
N2
N2
N2
N1, N2
M0
M0
M0
M0
Estadio IIIB
T4
Qualquer T
Qualquer N
N3
M0
M0
Estadio IV
Qualquer T Qualquer N M1
Fonte: SOBIN e WITTEKIND (2002)
Anexo 2 - pTNM- Classificação Patológica
A classificação histopatológica pós-cirúrgica é baseada nas
evidências observadas antes do tratamento, suplementada ou modificada
pela evidência adicional alcançada através da cirurgia e do exame
histopatológico. A avaliação histopatológica do tumor primário (pT0) exige a
ressecção do tumor primário ou biópsia adequada para avaliar a maior
categoria pT. A avaliação histopatológica dos linfonodos regionais (pN)
exige a remoção representativa de nódulos para comprovar a ausência de
metástases em linfonodos regionais (pN0) e suficiente para avaliar a maior
categoria pN. A investigação histopatológica de metástases à distância
(pM0) exige o exame macroscópico.
pT- Características do tumor
As categorias pT correspondem às categorias T.
pN- Linfonodos Regionais
pNX- Linfonodos regionais não podem ser avaliados (não removidos
para estudo ou previamente removidos).
pN0- Ausência de metástase em linfonodos regionais.
pN1-Metástase em linfonodo(s) axilar(es), homolateral(ais), móvel(eis)
[PN1a, PN1b (PN1bi, PN1bii, PN1biii, Pnbiv)].
pN2- Metástase em linfonodo(s) axilar(es), homolateral(ais), fixo(s)
uns aos outros ou a outras estruturas.
pN3-Metástase em linfonodo(s) mamário(s) interno(s),
homolateral(ais).
pM- Metástase à distância
As categorias pM correspondem às categorias M.
G- Graduação Histopatológica
GX- O grau de diferenciação não pode ser avaliado.
G1- Bem diferenciado.
G2- Moderadamente diferenciado.
G3- Pouco diferenciado.
G4- Indiferenciado.
R- Classificação R- ausência ou presença de tumor residual após
tratamento
RX- A presença de tumor residual não pode ser avaliada.
R0- Ausência de tumor residual.
R1- Tumor residual microscópico.
R2- Tumor residual macroscópico.
(UICC- União Internacional Contra o Câncer- TNM- Classification of malignat
tumors, SOBIN & WITTEKIND, 2002).
Anexo 3 - Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa
Anexo 4 - Consentimento informado
Anexo 5 - Gel de Agarose 1%
- 0,30 gr de agarose
- 30 ml de TBE (Tris;Acido Borico;EDTA)
Misturar os reagentes, esquentar no microondas até a agarose
estar totalmente diluída (cerca de 1 minuto), aguardar esfriar e
acrescentar 0,01% de brometo de etideo. Transferir para uma cuba de
eletroforese.
Aguardar o gel solidificar e aplicar as amostras. Correr durante 60
minutos na voltagem de 60 mV.
Anexo 6 - Amostras Iniciais
Quadro 1 - Relação das 27 amostras utilizadas.
Nome Estadiamento Idade TNM LN
Grau
Marcadores
Moleculares
1T IIa 69 anos T2N0M0 Negativo
grau II de SBR
grau nuclear:3
ER -/ PR -/ p53 +/
ERBB2+ (3+)
2T IIa 63 anos T2N0M0 Negativo
grau I de SBR
grau nuclear:1
ER+/ PR+/ p53 -/
ERBB2- (1+)
4T IIa 67 anos T1cN0M0 Negativo
grau II de SBR
grau nuclear:2
ER +/ PR -/ p53 +/
ERBB2+ (2+)
2B IIa 48 anos T2N0M0 Negativo
grau II de SBR
grau nuclear:3
ER+/ PR+/ p53 +/
ERBB2+
6T IIa 78 anos T1N1M0 Positivo
grau III de SBR
grau nuclear:3
ER+/ PR+/ p53 -/
ERBB2- (1+)
7T IIa 40 anos T2N0M0 Negativo
grau II de SBR
grau nuclear:3
ER+/ PR+/ p53 +/
ERBB2+ (2+)
8T
IIa
43 anos T1cN1M0 Positivo
grau I de SBR
grau nuclear:2
ER+/ PR+/p53 +/
ERBB2+ (3+)
9T IIa 55 anos T2N0M0 Negativo
grau I de SBR
grau nuclear:2
ER +/ PR +/ p53 -/
ERBB2+ (3+)
3B IIa 43 anos T1cN0M0 Negativo
grau II de SBR
grau nuclear:3
ER +/ PR -/ p53 -/
ERBB2+ (3+)
11T IIa 46 anos T3N0M0 Negativo
grau II de SBR
grau nuclear:2
ER +/ PR +/ p53 -/
ERBB2+ (2+)
12T IIa 78 anos T2N0M0 Negativo
grau II de SBR
grau nuclear:2
ER +/ PR +/ p53 -/
ERBB2+ (2+)
14T IIa 70anos T1N0M0
Negativo
grau II de SBR
grau nuclear:3
ER +/ PR +/ p53 - /
ERBB2+ (2+)
17T IIb 36 anos T2N1M0
Positivo
grau II de SBR
grau nuclear:3
ER +/ PR+/ p53 +/
ERBB2+ (2+)
18T IIb 41 anos T2N0M0 Negativo
grau II de SBR
grau nuclear:2
ER +/ PR +/ p53 +/
ERBB2+ (3+)
19T IIa 67 anos T2N0M0 Negativo
grau II de SBR
grau nuclear:3
ER -/ PR -/ p53 -/
ERBB2+ (3+)
20T IIb 87 anos T2N0M0 Negativo
grau II de SBR
grau nuclear:2
ER +/ PR -/ p53 -/
ERBB2+ (3+)
21T IIb 67 anos T2N1M0 Positivo
grau II de SBR
grau nuclear:2
ER+/ PR+/ p53/
ERBB2+
22T IIb 56 anos T2N1M0 Positivo
grau III de SBR
grau nuclear:3
ER +/ PR -/ p53 -/
ERBB2+ (2+/3+)
26T IIb 32 anos T3N1M0 Positivo
grau II de SBR
grau nuclear:3
ER +/ PR +/ p53+/
ERBB2+ (2+)
27T IIb 45 anos T2N1M0 Positivo grau nuclear:3 ER -/ PR -
28T IIIa 42 anos T2N2M0 Positivo
grau II SBR grau
nuclear III
ER +/ PR -/ p53 -/
ERBB2+ (+3)
30T IIa 35 anos T2N0M0 Negativo
grau III de SBR
grau nuclear:3
ER -/ PR -/ p53 -/
ERBB2- (0)
32T I 59 anos T2N0M0 Positivo
grau I de SRB
grau nuclear:2
ER +/ PR +/ p53 -/
ERBB2+ (2+)
33B I 38 anos T1cN0M0 Positivo
grau III de SBR
grau nuclear:3
ER +/ PR -/ p53 -/
ERBB2-
36T I 45 anos T1N0M0 Negativo
grau III SBR
grau nuclear 3
ER +/ PR -/ p53 -/
ERBB2+ (3)
37T I 63 anos T2N0M0 Negativo
grau I SRB /
grau nuclear 1
ER +/ PR + / p53-
/ERBB2- (0)
38T IIIa 69 anos T3N2M0 Positivo
grau III SBR
grau nuclear 3
ER -/ PR-/ p53+/
ERBB2-(+1)
Legenda: LN: Status linfonodal; ER- Receptor de Estrógeno; PR- Receptor de Progesterona.
Quadro 2 - Relação das 9 amostras normais utilizadas.
MN04 N Tecido Normal- borda de fibroadenoma
MN06 N Tecido Normal- borda de carcinoma invasor
MN08 N Tecido Normal- borda de carcinoma invasor
MN12 N Tecido Normal- borda de fibroadenoma
MNP12 N Tecido Normal- borda de carcinoma invasor
MN13 N Tecido Normal- borda de fibroadenoma
MN16 N Tecido Normal- borda de fibroadenoma
MN32 N Tecido Normal- borda de carcinoma invasor
MN46 N Tecido Normal- mamoplastia
Legenda: N: Tecido Normal. Para as amostras 6T, 8T, 12T e 32T também foram utilizadas
margem de tecido normal.
Anexo 7 - Linhagens Celulares
Quadro 3 - Relação de todas as linhagens utilizadas no estudo.
Linhagem T/N Características
MCF7 T célula epitelial de adenocarcinoma, ER+, PgR+
MDA-MB-231 T célula epitelial de adenocarcinoma, ER-, PgR-
MDA-MB-435S T célula epitelial de carcinoma ductal invasivo, ER-, PgR-
HB4aC5.2 T célula epitelial de lúmen de mama normal transfectada com o oncogene ERBB2
HB4a N célula epitelial de lúmen de mama normal
MCF10A N célula epitelial de doença fibrocística
Legenda: T: Linhagem Tumoral; N: Linhagem Normal; ER+: Presença de receptor de
estrógeno; ER-: ausência de receptor de estrógeno; PgR+: Presença de receptor de
progesterona; PgR-: ausência de receptor de progesterona.
Anexo 8 - Extração de RNA por Cloreto de Césio
Utilizando-se o método de GLISIN et al. (1974), com algumas
modificações, pipeta-se 2 ml de solução de lise nos tubos do Politron
®
1600
E System (Kinematica AG). “Politronar” o tumor com a solução de lise. Em
seguida dividir o material em outro tubo e adicionar 1ml de solução de lise
em cada tubo. Preparar os tubos da ultracentrífuga adicionando 4ml da
solução de Cloreto de Césio 5,7 M e ao final adicionar com cuidado ao
colchão de Césio a solução de lise até completar 4ml para cada tubo,
balanceando-os. Centrifugar 29000rpm, 20°C, 20horas. Com o auxílio de
uma pipeta pasteur plástica retirar cuidadosamente o material do tubo,
deixando aproximadamente 1ml da solução. Emborcar o tubo e deixá-lo
invertido sobre um lenço de papel autoclavado. Com auxilio de uma pinça e
lenço de papel autoclavado limpar o interior da parede do tubo retirando o
excesso de Cloreto de Césio que pode ter ficado na parede, tendo sempre o
cuidado de não tocar o fundo do tubo. Ressuspender o pellet em 30μl de
H
2
O DEPC e passar o material para um tubo eppendorf de 2ml.
Ressuspender novamente o pellet com mais 30μl de H
2
O DEPC e passar o
material para o mesmo tubo. Fazer a leitura espectrofotométrica (OD
260
e
OD
280
) e correr um gel de agarose 1% corado com Brometo de Etídeo para
avaliação da qualidade do RNA.
Anexo 9 - Extração de RNA por TRIZOL
®
De acordo com o fabricante, em tubos de Politron
®
Pt 1600 E System
(Kinematica AG), pipeta-se 1ml de TRIZOL
®
(Invitogen™), insere-se o tumor
e “politrona-o” (limpar ou trocar todo o material sempre que mudar de
amostra). Deixar as amostras descansando no TRIZOL
®
entre 10 minutos e
uma hora. Em seguida, centrifugar as amostras por 10 minutos a 4°C e
14000 rpm. Transferir o sobrenadante para um novo tubo eppendorf e
adicionar 200μl de clorofórmio, agitar vigorosamente por 15 segundos e
centrifugar 15 minutos a 4°C e 14000rpm. Transferir o sobrenadante para
um novo tubo e adicionar 500μl de Isopropanol. Deixar precipitando por no
mínimo 12 horas a -20°C. Centrifugar as amostras 15 minutos a 4°C e
14000rpm. Descartar o sobrenadante. Lavar o pellet com Etanol 70% e
centrifugar 10 minutos a 4°C e 14000rpm duas vezes. Eluir em água tratada
com DEPC (0,1%) e a seguir quantificar em espectrofotômetro (OD
260
e
OD
280
) e correr as amostras em gel de agarose 1% corado com Brometo de
Etídeo para avaliação da qualidade do RNA.
Anexo 10 - Amplificação de RNA mensageiro (aRNA)
Protocolo para amplificação de RNA mensageiro Baseado em GOMES et al.
2003. Modificado.
Seqüências dos primers (Empresa IDT)
• Oligo dT (18)-T7 primer: (5’AAA CGA CGG CCA GTG AAT
TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG CGC T(15)3’)[57-pb]
• TS (template switch) oligo primer: (5’ AAG CAG TGG TAA
CAA CGC AGA GTA CGC GGG 3’) [30-pb]
Nota: As incubações são todas feitas em termocicladores.
São utilizadas de 3 a 5 μg de RNA total.
Obs: A integridade e qualidade do RNA dever ser verificado em gel de
agarose analisando das bandas correspondentes ao RNA ribossômico 18S e
28S.
1 Primeiro round de amplificação
1.1 Síntese da primeira fita de cDNA:
Tubo de PCR 0,2 ml
Reação:
3-5ug de RNA total (máximo de 6 ul)
Água tratada com DEPC (H
2
O/DEPC) q.s.p. 6ul
1ul de 0,5 ug/ul oligo dT(15)-T7 primer
Incubar 70 °C por 5 minutos
4 °C
Mix para reação da 1a. fita de cDNA:
4ul 5x First strand buffer
3ul 0,5 ug/ul TS (template switch) primer
2ul 0,1 M DTT
1ul Rnase IN
2ul 10mM dNTP
1ul Superscript II (SSII)
Spin
Incubar a 42°C por 1hora no termociclador
Adicionar 1 ul de SSII
Incubar a 42°C por 1 hora
4
o
C
1.2 Síntese da 2a. fita de cDNA:
Reação:
104ul água tratada DEPC
15ul Advantage PCR buffer
3ul 10mM dNTP mix
1ul RNase H
5ul Advantage Polymerase
Incubar:
37°C por 10 min para digestão do RNA
94°C por 3 min para denaturação
65°C por 5 min para a ligação dos primers
75°C por 30 min para extensão
Parar a reação com solução de 7,5ul 1M NaOH 2mM EDTA
Incubar a 65°C por 10 minutos para inativação enzimática
1.3 Purificação com Fenol : Clorofórmio : Álcool isoamílico
Adicionar 150ul de Fenol:Clorofórmio:Isoamilico (25:24:1) pH 8.0
Vortex bem e descansar 1 min
Centrifugar por 10 min a 14000 rpm (temperatura ambiente)
Cuidadosamente retirar aproximadamente 140ul da fase aquosa
Dispensar em um tubo novo
Adicionar 150ul de Clorofórmio
Vortex bem e descansar 1 min
Centrifugar por 10 min a 14000 rpm (temperatura ambiente)
Cuidadosamente retirar aproximdamente140ul da fase aquosa
Dispensar em um tubo novo
1.4 Precipitação
Adicionar 70ul de 3M Acetato de sódio (Na
2
OAC), pH 5.2
Adicionar 500 ul de etanol absoluto (-20C)
Vortex bem
Centrifugar a 14000 rpm a 4ºC por 30min
Remover com a pipeta o sobrenadante e reservar
Lavar 3x com 1ml de etanol 70% preparado DEPC (-20C)
Centrifugar a 14000 rpm, a 4ºC por 5min
Secar a 37ºC por 10 minutos para evaporar o etanol residual
Diluir em 21ul H
2
O/DEPC e quantificar o dscDNA em diluição 1:100
1.5 Transcrição in vitro
20μl dscDNA (entrar com máximo de 40μg de cDNA)
Reação: 20ul ds cDNA
15ul of 25mM rNTP (A,G,C and UTP, prepare apenas o necessário para a
reação)
10ul 5x reaction buffer
5ul enzyme mix (Rnase inhibitor and T7 phage polymerase)
Incubar a 37°C por 5-6hs.
1.6 Purificação do RNA usando Trizol
(centrífuga refrigerada a 4°C e ETOH a -20ºC)
Adicionar 1ml of Trizol em cada tubo
Adicionar 200 ul clorofórmio por 1 ml de solução de Trizol
Vortex
Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos
Centrifugar 12.000g por 15 minutos a 4°C
Transferir a fase aquosa para um novo tubo e adicionar isopropanol na
proporção de 1:1 em relação à fase aquosa. Vortex
Incubar a temperatura ambiente por 10 minutos
Centrifugar a 14.000 rpm por 15 minutos
Lavar os pellets 3 vezes com 1 ml de solução 70% ETOH preparado com
água DEPC
Centrifugar a 14.000 rpm por 5 minutos
Secar os pellets e ressuspender em 10ul de água DEPC
Verificar a concentração e a pureza do RNA por espectrofotômetro através
de OD 260 e OD 280
1 Segundo round de amplificação (fase exponencial)
2.1 Síntese da 1a. fita de cDNA:
Concentrar o RNA amplificado (0.5-1ug) para um volume de 7ul
Adicionar 1ul (2ug/ul) random hexamer (por exemplo: dN6)
Incubar 70 °C por 5 minutos
4º C
Reação: 4ul 5x First strand buffer
1ul de 0,5 ug/ul oligo dT(15)-T7 primer
2ul 0,1 M DTT
1ul Rnase IN
2ul 10mM dNTP
1ul Superscript II (SSII)
Incubar a 42°C por 1hora no termociclador
Adicionar 1ul de SSII
Incubar a 42°C por 1 hora
4
o
C
2.2 Síntese da 2a. fita de cDNA
Mix:
104ul água tratada com DEPC
15ul Advantage PCR buffer
3ul 10mM dNTP mix
1ul RNase H
5ul Advantage Polymerase
Incubar à:
37°C por 10 min para digestão do RNA
94°C por 3 min para denaturação
65°C por 5 min para a ligação dos primers
75°C por 30 min para extensão
Parar a reação com solução de 7,5ul 1M NaOH 2mM EDTA
Incubar a 65°C por 10 minutos para inativação enzimática
2.3 Purificação com Fenol : Clorofórmio : Álcool isoamílico
Adicionar 150ul de Fenol:Clorofórmio:Isoamilico (25:24:1) pH 8.0
Vortex bem e descansar 1min
Centrifugar por 10 min a 14000 rpm à temperatura ambiente
Cuidadosamente retirar aproximadamente 140ul da fase aquosa
Dispensar em um tubo novo
Adicionar 150ul de Clorofórmio
Vortex bem e descansar 1min
Centrifugar por 10 minutos a 14000 rpm à temperatura ambiente
Cuidadosamente retirar aproximadamente 140ul da fase aquosa
Dispensar em um tubo novo
2.4 Precipitação
Adicionar 70ul de 3M Acetato de sódio (Na
2
OAC), pH 5.2
Adicionar 500 ul de etanol absoluto (-20C)
Vortex bem
Centrifugar a 14000 rpm a 4ºC por 30minutos
Remover com a pipeta o sobrenadante e reservar
Lavar 3x com 1ml de etanol 70% DEPC (-20C)
Centrifugar a 14000 rpm a 4ºC por 5min
Secar a 37ºC por 10 min para evaporar o etanol residual
Eluir em 21ul H
2
O/DEPC e quantificar o dscDNA em diluição 1:100
2.5 Transcrição in vitro
20μl dscDNA (entrar com máximo de 40μg de cDNA)
Reação: 20ul ds cDNA
15ul of 25mM rNTP (A,G,C and UTP, prepare somente o suficiente para a
reação)
10ul 5x reaction buffer
5ul enzyme mix (Rnase inhibitor and T7 phage polymerase)
Incubar a 37°C por 5-6hs.
2.6 Purificação do RNA usando Trizol
(centrífuga refrigerada a 4°C e ETOH a -20ºC)
Adicionar 1ml of Trizol em cada tubo
Adicionar 200 ul clorofórmio por 1 ml de solução de Trizol. Vortex
Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos
Centrifugar 12.000g por 15 minutos a 4°C
Transferir a fase aquosa para um novo tubo e adicionar isopropanol na
proporção de 1:1 em relação à fase aquosa
Vortex
Incubar a temperatura ambiente por 10 minutos
Centrifugar a 14.000 rpm por 15 minutos
Lavar os pellets 3 x com 1 ml de solução 70% ETOH preparado com DEPC
Centrifugar a 14.000 rpm por 5 minutos
Secar o pellet e ressuspender em 10ul de água DEPC
Verificar a concentração e a pureza do RNA por espectrofotômetro (OD 260)
através OD260 e OD 280
3 Avaliar a integridade e qualidade do RNA amplificado em gel de
agarose
Aplicar 0,5 a 1 μg de RNA em gel de agarose 1% corado com brometo de
etídeo.
Anexo 11 - Gráficos de amplificação das amostras por qRT-PCR e curvas
de dissociação obtidas para todas as VCE estudadas
MK-STYX
BAP1
FLJ125-28
PPP1R8
BRRN1
LIP8
PRKD2
SND1
ASC1p100
KIAA0696
MBTPS1
Anexo 12 - Amostras Independentes
Quadro 4 - Relação das 40 amostras utilizadas.
Amostra Estadiamento
Idade
(anos)
TNM LN GrauSBR
Marcadores
Moleculares
44 T II 66 T3N0M0 Negativo 3
ER -/ PR -/ p53 +/
ERBB2- (1+)
50 T II 55 T2N1M0 Negativo 2
ER+/ PR+/ ERBB2-
(0)
51 T II 47 T2N0M0 Positivo Não informado
ER +/ PR +/ p53 -/
ERBB2+ (2+)
54 T II 70 T2N0M0 Negativo 3
ER+/ PR-/ ERBB2-
(0)
58 T II 67 T2N1M0 Negativo 2
ER+/ PR+/ p53 -/
ERBB2+ (2+)
59 T II 62 T2N1M0 Negativo 3
ER-/ PR-/ p53 -/
ERBB2+ (2+)
60 T II 68 T2N0M0 Negativo 1
ER+/ PR+/ ERBB2-
(1+)
61 T I 39 T1N0M0 Negativo 1
ER +/ PR +/ p53 -/
ERBB2- (0)
62 T II 51 T2N0M0 Positivo 3
ER +/ PR +/
ERBB2- (1+)
64 T I 57 T1N0M0 Negativo 2
ER +/ PR +/
ERBB2- (1+)
65 T II 88 T2N1M0 Negativo 3 ER -/ PR -
67 T II 76 T2N1M0 Negativo 1 Não informado
68 T II 47 T2N0M0 Negativo 3
ER -/ PR-/ p53 -/
ERBB2- (1+)
70 T II 66 T2N1M0 Positivo 3
ER +/ PR -/ p53 -/
ERBB2+ (2+)
71 T III 62 T2N1M0 Positivo 3
ER +/ PR +/ p53 -/
ERBB2+ (2+)
BIO QT 01 II 49 T2N0M0 Positivo 2
ER -/ PR -/ p53 -/
ERBB2+ (3+)
BIO QT 04 III 71 T4N1M0 Positivo 2
ER +/ PR +/ p53 -/
ERBB2- (1+)
BIO QT 05 II 58 T2N0M0 Positivo 2
ER -/ PR -/ p53 -/
ERBB2+ (2+)
BIO QT 15 III 56 T4N1M0 Positivo 2
ER+/ PR+/ p53 -/
ERBB2- (1+)
BIO QT 33 III 72 T4N1M0 Negativo 2
ER -/ PR -/ p53 -/
ERBB2+ (2+)
BIO QT 42 III 52 T4N1M0 Negativo 2
ER +/ PR +/ p53 +/
ERBB2+ (3+)
BIO QT 49 II 48 T2N1M0 Positivo 2
ER -/ PR-/ p53 -/
ERBB2- (1+)
BIO QT 71 III 48 T4N1M0 Não informado 2
ER +/ PR +/ p53 -/
ERBB2+ (2+)
BIO QT 83 III 47 T4N1M0 Negativo 2
ER+/ PR+/ p53 -/
ERBB2- (0)
MJ 2 T II 30 T2N1M0 Positivo 2
ER+/ PR+/ p53 -/
ERBB2+ (3+)
MJ 3 T II 26 T2N0M0 Negativo 3 ER-/ PR-/ ERBB2-
MJ 5 T II 29 T2N0M0 Negativo 3
ER+/ PR-/ ERBB2-
(1+)
MJ 7 T II 29 T2N1M0 Positivo 3
ER +/ PR +/
ERBB2+ (2+)
MJ 12 T I 29 T1N0M0 Negativo 3
ER -/ PR-/ ERBB2-
(0)
MJ 13 T II 29 T2N1M0 Positivo 3
ER+/ PR+/ p53 -/
ERBB2- (0)
MJ 14 T II 35 T2N0M0 Negativo 3
ER -/ PR -/ p53 +/
ERBB2+ (2+)
MJ 16 T II 29 T2N0M0 Negativo 2
ER +/ PR +/ p53 -/
ERBB2- (1+)
MJ 8T-2 II 33 T2N0M0 Positivo 3
ER +/ PR -/ p53 +/
ERBB2- (0)
53 T IV 77 T4N1M1 Positivo 2
ER+/ PR-/ p53 -/
ERBB2+ (2+)
72 T II 56 T2N0M0 Negativo 2
ER -/ PR-/ ERBB2+
(3+)
BIO QT 43 IV 57 T2N2M1 Positivo 2
ER+/ PR+/ p53 -/
ERBB2- (1+)
BIO QT 65 IV 43 T4N2M1 Positivo 3
ER +/ PR +/ p53 +/
ERBB2+ (2+)
MJ 11T-2 III 30 T2N1M0 Positivo 2
ER -/ PR -/ p53 +/
ERBB2+ (3+)
MJ-1T IV 28 T1N1M1 Positivo 2
ER +/ PR +/
ERBB2+ (3+)
BIOQT64 IV 67 Positivo 3
ER +/ PR -/ p53 -/
ERBB2- (0)
Legenda: LN: Status linfonodal; ER: Receptor de Estrógeno; PR: Receptor de
Progesterona.
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