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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE GENÉTICA E BIOQUÍMICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA
BUSCA DE VARIAÇÕES NOS GENES MSX-1: RELAÇÃO COM A HIPODONTIA
ELISÂNGELA RIBEIRO DA SILVA
Uberlândia – MG
2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE GENÉTICA E BIOQUÍMICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA
BUSCA DE VARIAÇÕES NOS GENES MSX-1: RELAÇÃO COM A HIPODONTIA
ELISÂNGELA RIBEIRO DA SILVA
Orientador: Prof. Dr.Warwick Estevam Kerr
Co-Orientador: Prof. Dr. Rinaldo Wellerson Pereira
Tese apresentada à Universidade Federal de
Uberlândia como parte dos requisitos para
obtenção do Título de Doutor em Genética e
Bioquímica (Área Genética)
UBERLÂNDIA
2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE GENÉTICA E BIOQUÍMICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA
BUSCA DE VARIAÇÕES NOS GENES MSX-1: RELAÇÃO COM A HIPODONTIA
ELISÂNGELA RIBEIRO DA SILVA
COMISSÃO EXAMINADORA
Presidente : Prof. Dr. Warwick Estevam Kerr
Examinadores: Prof. Dr. Adriano Mota Loyola
Prof. Dr.Foued Salmen Espíndola
Prof. Dr. Otávio de Tolêdo Nobrega
Profa. Dra. Silviene Fabiana de Oliveira
Data da defesa: 28/09/2007.
As sugestões da Comissão Examinadora e as normas da PGGB para o formato da Tese
foram contempladas
__________________________________
(Orientador)
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
S586b
Silva, Elisângela Ribeiro da, 1974-
Busca de variações nos genes MSX-1 : relação com a
hipodontia / Elisângela Ribeiro da Silva. - 2007.
63 f. : il.
Orientador: Warwick Estevam Kerr.
Co-orientador: Rinaldo Wellerson Pereira.
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Uberlândia,
Programa
de Pós-Graduação em Genética e Bioquímica.
Inclui bibliografia.
1. Polimorfismo (Genética) - Teses. I. Kerr, Warwick
Estevam. II. Pereira, Rinaldo Wellerson. III.Universidade
Federal de Uberlândia. Programa de Pós-Graduação em
Genética e Bioquímica. III. Título.
CDU:
575.113
Elaborado pelo Sistema de Bibliotecas da UFU / Setor de Catalogação e Classificação
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DEDICATÓRIA
À toda minha família...
Todos vocês são especiais, cada um com seu jeitinho todo único de falar, agir e amar.
Através de cada um, mudamos diariamente nossos pensamentos e atitudes para vivermos
em harmonia e simplesmente sermos felizes!
Aos meus pais Esperança e Orestes (in memoriam),
o meu muitíssimo obrigado pela vida e pela oportunidade de conhecer o verdadeiro sentido
da palavra Amor.
As minhas filhas...
Milla e Laura,
que são a razão e força para que eu possa continuar subindo alguns degraus tentando
proporcioná-los algo que julgo importante quando se tenta educar alguém: o exemplo.
Desculpem a mamãe pela ausência e pela falta de paciência, e “...Nunca se esqueçam
nenhum segundo que eu tenho o amor maior do mundo, como é grande o meu amor por
vocês...”
Ao meu amor...
Sandro,
Companheiro, amigo, namorado, marido, que esteve comigo em todos os momentos, me
apoiando e me oferecendo meios para que eu pudesse seguir em frente.
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Ao Anjo de Deus...
Dr. Gideon,
Vaso de Deus aqui na terra, benção na minha vida. Obrigada e que Deus te abençoe e
continue te usando para Sua obra.
Ao Poder Judiciário...
Que sem distinção de pessoas trabalha sempre em busca da justiça, anulando assim
qualquer tipo de abuso de poder ou de autoridade.
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AGRADECIMENTOS
À Deus, Por ter sido instrumento da tua vontade, confiando à minha guarda duas lindas
criaturas, por ter me concedido a vida para tentar alcançar os meus objetivos no trabalho,
como Filha, Amiga e Mãe, por hoje ter tão pouco a pedir e tanto a agradecer!
Aos meus pais Esperança e Orestes (in memorian), por tudo desde o início até o fim!
Ao Prof. Dr. Warwick Estevam Kerr, pela amizade e paciência, pela oportunidade e pelo
convívio agradável, O meu muitíssimo Obrigada..
Ao Prof. Dr. Luiz Ricardo Goulart Filho, pelos inúmeros esclarecimentos prestados
nesse trabalho, por toda ajuda e solicitude, O meu muitíssimo Obrigada.
Ao Meritíssimo Juiz de Direito, da 2° vara Federal, na comarca de Uberlândia, que tornou
possível a conclusão desse trabalho quando jogou por terra toda injustiça e perseguição, O
meu muitíssimo Obrigada.
Ao Douto Procurador da República, da 2° vara Federal, na comarca de Uberlândia, o
meu muitíssimo Obrigada, pois sem a intervenção do poder judiciário eu teria sido tolhida
de um direito, o de concluir minha pós-graduação.
Ao Dr. Paulo Almeida e Família, que sempre me auxiliaram e me ajudaram com a
competência pertinente aos excelentes advogados O meu muitíssimo Obrigada.
À Universidade Federal de Uberlândia (UFU), pela utilização de suas instalações desde a
minha graduação e por ter me proporcionado conhecimentos.
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Ao grande amigo Prof. Dr. Rinaldo Wellerson Pereira, pessoa ímpar, que merece todo o
meu respeito. Sem a ajuda desse grande homem seria impossível a realização desse projeto.
Serei eternamente grata.
Aos colegas de laboratório que participaram comigo de todos os sofrimentos e de todas as
conquistas.
Aos indivíduos que fizeram parte desse trabalho cedendo gentilmente seu material genético,
viabilizando a execução da pesquisa.
A todos os componentes da Banca Examinadora, o meu muito obrigada por participar
comigo de um dia tão importante de minha vida,
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ÍNDICE
Descrição Página
Introdução 1
Proposição 5
Capítulo I: Anomalias Dentárias – Agenesias e supranumerários – Revisão
Bibliográfica 6
Capítulo II: A genética da Odontogênese 15
Capítulo III: Uso de novo método para extração de DNA genômico de células
descamadas da mucosa oral para utilização em estudos genéticos 38
Resumo 39
Introdução 40
Material e Método 41
Resultado 43
Discussão 44
Abstract 45
Referência bibliográfica 46
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Capítulo IV: Mutação no gene MSX1 está relacionada a agenesia dental 48
Resumo 49
Introdução 50
Material e Método 52
Resultado 54
Discussão 55
Considerações finais 58
Abstract 59
Referência bibliográfica 60
Referencias 62
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LISTA DE FIGURAS
Capítulo I Página
Figura 1: Fotografia de paciente com agenesia dental 6
Figura 2: Paciente portador de Displasia Ectodérmica Anidrótica, apresentando
Oligodontia característica 8
Figura 2A: Radiografia de paciente com agenesia dental 8
Figura 2B: Fotografia de paciente com agenesia dental 8
Figura 3A-B: Radiografia de paciente com agenesia dental 8
Figura 4:Fotografia de paciente com agenesia dental 9
Figura 5A-B: Radiografia de paciente com agenesia dental 10
Capítulo III
Figura 1: DNA genômico humano. Cada banda que aparece no gel de agarose é DNA de
um indivíduo diferente. 43
Figura 2: Reações de PCR. As bandas são de 668 pb, amplificadas por iniciadores
referentes ao gene MSX1 43
i
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Capítulo IV
Figura 1: Heredograma que elucida a família estudada 54
Figura 2: Gel apresentando o padrão de migração para a família, sendo o padrão de 4
bandas referente aos indivíduos não-portadores e o padrão de 3 bandas referente aos
indivíduos portadores de agenesia dental 54
ii
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Introdução
Agenesia dental e hipodontia são termos apropriados para significar a ausência
congênita de um ou mais (até seis) dentes permanentes e/ou decíduos (Stewart et al., 1982).
Oligodontia é definida como a ausência congênita de seis ou mais dentes, excluindo-se os
terceiros molares (Schalk-Van Der Weide et al.,1994). Encontra-se também o termo
anodontia parcial, com significado análogo a hipodontia, em alguns livros e artigos
anteriores a 1978, quando foi considerado obsoleto (Erwin & Cockern, 1949; Shafer et al.,
1958). Os indivíduos que possuem oligodontia além de apresentar número
consideravelmente reduzido de dentes, o tamanho destes é menor e a forma muitas vezes é
anômala. Observa-se também erupção dental tardia, fato mais evidente em indivíduos do
sexo masculino (Schalk-Van Der Weide et al, 1994).
Segundo Schalk-Van Der Weide et al, 1994 a hipodontia ou oligodontia
(dependendo do número de dentes ausentes) é uma das características observadas em mais
de 120 síndromes, sendo em algumas delas uma característica importante para o
diagnóstico. Em algumas síndromes a agenesia dental é meramente descrita como uma
característica associada. Uma das principais síndromes em que a ausência congênita de
dentes é uma característica-chave para o diagnóstico é a Displasia Ectodérmica Anidrótica.
Com relação à dentição, esta síndrome apresenta número variável de dentes ausentes, indo
da hipodontia até completa anodontia, incluindo-se o fato de que a forma dos dentes
presentes é anormalmente simples (cônicos) e de tamanho reduzido (Kurisu & Tabata,
1997; Thesleff, 1996). Polimorfismos genéticos podem ser entendidos como variações
genéticas que ocorrem naturalmente em uma população. Estas variações podem ter um
efeito direto sobre a expressão genética e afetar a função protéica. Estudos recentes 1
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têm mostrado que polimorfismos em regiões codificadoras e regiões reguladoras da
transcrição parecem ser freqüentes, e que estas variações são responsáveis por
características fenotípicas individuais. Pouco se sabe sobre o papel de polimorfismos
genéticos na determinação das características morfológicas de um indivíduo. Em última
análise as características morfológicas seriam causadas por polimorfismos genéticos
atuando durante o desenvolvimento embrionário e crescimento. É importante salientar que
pequenas alterações durante o processo embrionário podem levar a grandes alterações no
indivíduo adulto. Da mesma maneira, entende-se que as alterações que levaram a
diferenciação das espécies durante a evolução são resultantes de alterações sutis que
ocorreram durante a embriogênese. O desenvolvimento da dentição é um dos principais
modelos usados em estudos que tentam conectar desenvolvimento e evolução (evodevótica)
em mamíferos (Jernvall 2000, Jervall E Thesleff 2000, Neubuser et al. 1997, Polly 2000).
O estudo das alterações genéticas que afetam a dentição pode fornecer
informações importantes sobre o papel de genes específicos e também ajudar a entender os
mecanismos moleculares que regulam este processo. Entre estas anomalias a hipodontia,
ausência de um ou mais dentes, é um modelo especialmente interessante. A agenesia dental
tende a ocorrer na ordem reversa na qual os dentes se formam durante o desenvolvimento, o
que também caracteriza o padrão geral de que ocorreu durante a evolução dos mamíferos
placentários (Peyer 1968). Além disso, os dentes são estruturas simétricas e possuem
homologia seriada, o que permite a localização e quantificação (número de dentes ausentes)
dos efeitos de mutações ou polimorfismos genéticos específicos e determinar a fase da
odontogênese afetada. 2
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Dentre os diversos fatores responsáveis pela agenesia dental, o fator genético
destaca-se pela complexidade. O estudo das alterações genéticas que afetam a dentição
pode fornecer informações importantes sobre o papel de genes específicos e também ajudar
a entender os mecanismos moleculares que regulam este processo (Jernvall, Keranen,
Thesleff, 2000). A identificação e o entendimento dos mecanismos genéticos responsáveis
pela diversidade fenotípica que existe em uma população é um dos principais desafios da
genética moderna. As características fenotípicas podem ser causadas ou influenciadas por
polimorfismos genéticos atuando durante o desenvolvimento embrionário e crescimento.
A agenesia dental pode ser entendida como um “erro” da morfogênese que ocorreu
nas fases iniciais da odontogênese. No entanto, a agenesia dental de terceiros molares,
segundos pré-molares superiores, e incisivos laterais superiores, pode ser entendida como
uma variação da normalidade (quando aparece como uma forma isolada), devido a sua
presença freqüente na população. Desta maneira, a agenesia dental, não associada a
síndromes, é um modelo particularmente interessante para estudos que visam correlacionar
variações genéticas com variações morfológicas do desenvolvimento (Line 2001, Line
2001a, Line 2003). Além disso, a descoberta de marcadores genéticos relacionados a
hipodontia possibilitaria a identificação de indivíduos susceptíveis. Estas informações
podem ser clinicamente relevantes, uma vez que, permitiriam o desenvolvimento de
estratégias de prevenção e planejamento clínico individualizados. Estudos têm sido
conduzidos com objetivo de mostrar a participação de diversos genes na odontogênese e
entender o papel que desempenham, auxiliando desta forma no desenvolvimento do
planejamento de cada indivíduo. 3
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Estas informações podem ser clinicamente relevantes, uma vez que,
permitiriam o desenvolvimento de estratégias de prevenção e planejamento clínico
individualizados. Estudos têm sido conduzidos com objetivo de mostrar a participação de
diversos genes na odontogênese e entender o papel que desempenham, auxiliando desta
forma no desenvolvimento do planejamento de cada indivíduo.
A maioria dos ortodontistas já tratou ou tratará em sua rotina ortodôntica, pelo
menos um paciente com agenesia dentária ou com alguma discrepância de tamanho
dentário. É importante ressaltar que em busca dos melhores resultados a serem alcançados,
todos os elementos de diagnóstico devem ser claros e minuciosamente analisados. Assim, é
impossível atingir bons resultados de tratamentos e bons prognósticos se o profissional
eliminar o diagnóstico diferencial científico, que pode levar a melhor escolha de
procedimentos.
O gene MSX1 é expresso durante a odontogênese. Vários estudos mostram relação
entre esse gene e formas de agenesia dental (SCAREL,et al.,2003).
O objetivo do presente estudo foi analisar a relação existente entre
polimorfismos no gene MSX1 em uma família portadora da alteração. A amostra foi
composta pelo DNA genômico de 12 indivíduos, sendo 5 deles portadores do fenótipo em
estudo. Após a obtenção e extração do DNA, a região de interesse foi amplificada por
reação em cadeia da enzima polimerase (PCR) e cada amostra foi submetida a análise de
polimorfismo conformacional de fita simples (SSCP) para detecção de polimorfismos.
Nossas análises mostram que polimorfismos na região do segundo éxon do gene MSX1
estão presentes na população estudada e apresentam relação com o fenótipo da hipodontia.4
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A GENÉTICA DA ODONTOGÊNESE
Silva E. R.
1
, Alves J. B.
1
1-Department of morphologic, Universidade de Uberaba, Uberaba, Minas Gerais, Brazil.
Campus Aeroporto -
Avenida Nenê Sabino, Uberaba MG.
Correspondence to:
Elisângela R. da Silva
Universidade de Uberaba-UNIUBE
Avenida Nenê Sabino, Campus Aeroporto.
Uberaba, MG, Brazil.
Phone: +55-34-3232-2105
e-mail: elislaura@hotmail.com
Artigo ACEITO pela revista Bioscience Journal em agosto de 2007.
15
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A GENÉTICA DA ODONTOGÊNESE
RESUMO
Este artigo apresenta uma revisão bibliográfica sobre as evidências mais atuais
sobre os aspectos genéticos da formação dos dentes. São abordadas nesse artigo as
principais moléculas envolvida na interação epitélio-mesênquima, responsável pela
formação da estrutura dental. O objetivo é contribuir para um melhor entendimento da
expressão genética envolvida na formação do dente, bem como auxiliar na prática
odontológica, procurando despertar a atenção do profissional para o conhecimento
científico e facilitar assim a identificação de possíveis problemas relacionados à formação
dos elementos dentais.
UNITERMOS: Interação epitélio-mesênquima, Odontogênese, Evolução
16
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ABSTRACT
Through a review of the literature, this article discusses the genetic mechanisms
that control tooth morphogenesis. Emphasis is placed upon the structure and function of
some key molecules that participate in interactions between its epithelial-mesenchimal
components. In this paper we will can understand the mechanisms that control tooth
morphogenesis and the dentistry should pay special attention to possible consequences of
tooth number anomalies.
UNITERMS: Epithelial-Mesenchymal Interactions, Tooth Development, Evolution
17
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INTRODUÇÃO
O sorriso é uma expressão facial que diferencia os homens de outros primatas. O
principal componente de um sorriso perfeito é uma dentição sadia e completa (TREVOR;
PARIMAL; PRAGNA; 2005; SILVA; PEREIRA; FAGGIONI JÚNIOR, 2005). Uma
dentição completa e funcional é pré-requisito também para a sobrevivência de muitos
animais (ELISÂNGELA et al., 2003). A dentição dos mamíferos consiste de dentes que se
desenvolveram como órgãos discretos, e no homem, no sentido ântero-posterior da arcada,
a dentição é dividida dentro das regiões de incisivos, caninos, pré-molares e molares
(SCAREL et al., 2003).
Os dentes são mais que estruturas duras que cortam ou trituram os alimentos.
Vivos ou mortos, são de grande contribuição para os estudos de biologia, ecologia e
palenteologia. O dente é composto basicamente por fosfato de cálcio, em forma de cristais
de hidróxiapatita, e proteínas fibrosas em diferentes proporções. Anatomicamente são
divididos em dois componentes principais, a coroa e a raiz, separados por uma região
denominada colo. É formado em sua maior porção pela dentina, tecido mineralizado
presente tanto na coroa quanto na raiz. A coroa é coberta pelo esmalte, um tecido altamente
mineralizado e a raiz é coberta por um tecido semelhante ao osso, denominado cemento.
Dentro do dente existe a polpa dental, tecido conjuntivo especializado que aloja vasos e
nervos (BERGQVIST, 2003).
Nos últimos anos muitos progressos têm sido feitos no entendimento do
mecanismo que controla a formação do dente. O desenvolvimento do dente é controlado
por interações específicas entre o epitélio e o mesênquima. Esta é a formidável tarefa de
mais de 200 genes que participam da formação dos dentes (THESLEFF & HUMERINTA,
1981, THESLEFF & JERNVALL, 2000).O objetivo dessa revisão bibliográfica é contribuir
para um melhor entendimento da expressão genética envolvida na formação do dente, bem
como auxiliar na prática odontológica, procurando despertar a atenção do profissional para
o conhecimento científico e facilitar assim a identificação de possíveis problemas
relacionados à formação dos elementos dentais.
18
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ODONTOGÊNESE
Nos mamíferos, o desenvolvimento dos dentes é um processo complexo que
envolve a interação recíproca entre o epitélio dental e o ectomesênquima originário das
células da crista neural, envolvendo mudanças no potencial odontogênico desses tecidos no
decorrer desse processo. O primeiro sinal do desenvolvimento do dente aparece com a
banda epitelial primaria, onde o processo odontogênico inicia com a formação de botões
epiteliais localizados na região dos futuros dentes. Células ectomesenquimais se
diferenciam em volta do botão epitelial para formar a papila dental, precursora da polpa
dental e dentina, sendo esta secretada em fases mais avançadas do desenvolvimento por
células já diferenciadas, os odontoblastos. Os estágios subseqüentes são; capuz, campânula,
coroa e raiz, sendo a fase de campânula àquela onde os ameloblastos, formadores do
esmalte iniciaram sua diferenciação. A matriz da dentina que se forma na periferia da
papila dental durante a dentinogênese e subsequentemente a deposição do esmalte ou
amelogênese inicia na junção amelodentinária. Finalmente, após completada a deposição de
esmalte e dentina na coroa, o dente inicia a formação de sua raiz e entra em erupção
(SCAREL et al., 2003).
EVOLUÇÃO DA DENTIÇÃO
A complexidade e a dinâmica da formação do dente pode ser exemplificada
observando as mudanças nas dentições ocorridas durante o curso da evolução dos
vertebrados. Dentes cônicos formam a dentição de vertebrados inferiores, e não há oclusão
entre as mandíbulas opostas. A função é usualmente limitada a preensão e perfuração de
comida. O estabelecimento da oclusão dental em mamíferos permitiu um melhor
processamento da comida e um conseqüente aumento na eficiência da entrada de nutrientes
no sistema digestório. O desenvolvimento da mastigação foi, no entanto, um passo chave
que permitiu aos mamíferos competir com o aumento da demanda de energia necessária
para suportar os altos níveis de atividade. O dente é usualmente o fator mais significante de
controle da oclusão, porque o ajuste entre maxila e mandíbula durante a mastigação é
regulado principalmente pelos contatos oclusais entre as cúspides, depressões, e fissuras de
dentes opostos das mandíbulas (KEMP, 1982). 19
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Embora o mecanismo básico da interação celular epitélio-mesênquima, que guia a
diferenciação dos tecidos odontogênicos, seja altamente preservado, a passagem de répteis
para mamíferos implicou na mudança da dentição. Muitos répteis são homodontes, tendo
todos os dentes com forma similar, e são polifiodontes, significando que os dentes são
continuamente repostos até o final da vida. O aparecimento da heterodontia e difiodontia
nos mamíferos foi um processo gradual, pois esta característica surgiu durante o período
permiano e triássico (KEMP, 1982).
Durante o curso da evolução dos mamíferos, a mudança na forma dos molares
mostra a mudança da capacidade do dente de perfurar e cortar para a de esmagar e moer,
bem como a tendência contínua da redução do número de dentes (STOCK et al., 1997).
Neste cenário, a agenesia dental em humanos pode ser entendida como uma tendência
evolucionária e qualquer um dos genes envolvidos na formação do dente pode ter
participado durante a evolução da dentição.
GENES ENVOLVIDOS NA ODONTOGÊNESE
A interação epitélio-mesênquima governa o desenvolvimento não só dos dentes,
como também de órgãos epidermais como folículos pilosos e glândulas mamárias. Esta
interação é recíproca e seqüencial, onde cada componente tem um papel importante na
organogênese, dependendo do órgão e estágio de desenvolvimento (LUMSDEN, 1988;
JAHODA, 1992). A fase inicial do desenvolvimento desses órgãos é semelhante, sendo
caracterizado por um botão epitelial cercado por células mesenquimais. A partir daí, o
desenvolvimento desses órgãos diverge para formar órgãos especializados e com grandes
diferenças morfológicas, celulares e funcionais (DASSULE & MCMAHON, 1998;
JERNVALL & THESLEFF, 2000)
Embora o mecanismo molecular relacionado ao desenvolvimento normal dos
dentes, em humanos, não seja ainda completamente conhecido, estudos em outros
vertebrados têm mostrado várias moléculas envolvidas na interação epitélio-mesênquima,
que comanda o desenvolvimento de todos os órgãos derivados do ectoderme incluindo os
dentes, pêlos e glândulas mamárias (ELISÂNGELA et al., 2003). 20
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Três mecanismos têm sido propostos para a transmissão indutiva dos sinais na
interação dos tecidos durante a organogênese: fatores difusíveis, contato célula-célula, e
interação mediada pela matriz extracelular (SEXÉN et al., 1976).
Mais de 200 genes foram identificados no desenvolvimento do dente em
mamíferos (JERNVALL & THESLEFF, 2000; PARR & MCMAHON, 1994). Alguns
desses genes pertencem a família HOX, que contem uma região denominada homeobox,
uma seqüência de DNA conservada durante a evolução, encontradas inicialmente em genes
de drosófilas (MAAS & BEI, 1997; MCGINNIS et al., 1984). Na região homeobox
encontra-se a região de homeodomínio, um ligante do DNA onde se associam os fatores de
transcrição (DAVIDSON, 1995; MANZANARES & KRUMLAUF, 2001). Os genes
homeóticos estudados em mamíferos são homólogos aos genes das drosófilas. O conjunto
dos genes Hox está presente dos cefalocordados até os mamíferos porém, sua ortografia é
um pouco diferente entre os invertebrados, ratos e humanos, por exemplo, o gene msh da
drosófila é homólogo ao Msx1 do rato e ao MSX1 humano (SCAREL et al., 2003).
A expressão combinada de membros de grupos da família de genes homeóticos
(genes Hox) reguladores, desempenha importante papel na especificação posicional de
estruturas no sistema esquelético. Análises de expressão em embriões mostraram que genes
Hox têm uma combinação específica de alguns de seus genes, como um “código Hox”,
responsável pelo “modelamento” ou embriogênese de determinadas regiões do embrião
(HUNT et al., 1991). De acordo com essa idéia, o código Hox utilizado para modelamento
da região craniofacial dos vertebrados (considerando-se os aspectos evolutivos), inclui
membros dos grupos de genes Muscle segment (Msx), Distal-less (Dlx), Goosecoid (Gsc) e
Paired (Pax). Estes grupos de genes foram propostos para definir, pela sobreposição dos
domínios de expressão, as regiões em que se originarão os dentes incisivos, molares e
caninos na mandíbula em desenvolvimento (SHARPE et al., 1995).
No desenvolvimento do dente, além dos fatores de transcrição, existem
outras moléculas que têm papel importante no processo, como fatores de crescimento e
moléculas da matriz extra-celular (ECM) (VAAHTOKARI; VAINIO; THESLEFF, 1991).
21
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Esse grupo de moléculas tem expressão combinada na dinâmica interação entre os
tecidos epitelial e mesenquimal como uma cascata molecular, que promove o
desenvolvimento do dente (SHARPE et al., 1995).
FATORES DE TRANCRIÇÃO
Fatores de transcrição são moléculas que interagem com o DNA modulando a
expressão de um gene. A inativação do gene que codifica um fator de transcrição pode
modificar o fenótipo, especialmente se sua expressão ocorrer nos estágios iniciais da
embriogênese (SATOKATA & MAAS, 1994). Serão citados a seguir alguns fatores de
transcrição envolvidos na odontogênese.
1 - DLX: DISTAL-LESS HOMEOBOX
O grupo Dlx recebeu sua denominação a partir da homologia observada com o
genoma de Drosophila, e é composto por seis membros no genoma de mamíferos que são
arranjados em 3 pares mais estreitamente ligados: Dlx1 e Dlx2- Dlx7 e Dlx3- Dlx6 e Dlx5
(WEISS; STOCK; ZHAO, 1998).
Os genes Dlx1 e Dlx2 são expressos nos processos mandibulares e maxilares. O
domínio de expressão do Dlx1 nos arcos mandibulares é mais distalmente restringida do
que o Dlx2, Dlx5 e Dlx6. A expressão do Dlx3 e Dlx7 no arco mandibular é claramente
coincidente com a área formadora do dente (ZHAO, 2000).
O papel do Dlx3 na amelogênese foi comprovado por uma mutação em humanos
que foi associada com hipoplasia do esmalte (PRICE et al., 1998). A inativação do Dlx5
afeta a maturação do esmalte dental (DEPEW et al., 1999).
2 - LEF: LYMPHOID ENHANCER-BINDING FACTOR 1
Lef1 é um fator de transcrição expresso em linfócitos de ratos adultos, em células
da crista neural, germes dentais, folículos pilosos, e outros lugares durante a embriogênese
(TRAVIS et al., 1991; WATERMAN et al., 1991; OOSTERWEGEL et al., 1993;
VANGENDEREN et al., 1994; ZHOU et al., 1995). 22
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Este gene foi mapeado no cromossomo humano 4 (q23-q25) e em ratos no
cromossomo 3, perto do Egf (fator de crescimento epidermal) (MILATOVICH et al.,
1991).
Este gene é um membro da família de proteínas HMG (high mobility group
proteins) que tem a capacidade de induzir uma dobra na dupla hélice do DNA (GIESE et
al., 1992; LOVE et al., 1995). No entanto, Lef1 ativa a transcrição somente com a
colaboração de outras proteínas ligantes do DNA (CARLSSON et al., 1993). No contexto
do receptor de célula T (T-cell receptor), a proteína Lef1 aparece tendo um papel
arquitetural, participando da formação de um complexo nucleoprotêico, promovendo a
justaposição de sítios de transcrição não adjacentes (LOVE et al., 1995).
Lef1 reconhece uma seqüência específica de nucleotídeos no DNA através do
domínio HMG (high-molility-group). Estudos revelaram que o domínio HMG se liga ao
sulco menor da dupla hélice. A região básica se liga de forma cruzada ao estreito sulco
maior e contribui para o reconhecimento do DNA (LOVE et al., 1995).
As proteínas com domínios HMG podem ser classificadas em duas subfamílias.
Membros de uma subfamília, que incluem HMG-1 e HMG-2, têm múltiplos domínios
HMG, se liga ao DNA com pouca ou nenhuma especificidade e são encontradas em todos
os tipos de células. Membros da outra subfamília, que incluem Lef1, contem um único
domínio HMG, liga em seqüência específica do DNA e são expressos em poucos tipos
celulares (LOVE et al., 1995).
Estudos sugerem um papel essencial de Lef1 na formação de vários órgãos e
estruturas que requerem a interação indutiva de tecidos (VAN GENDEREN, et al., 1994;
TRAVIS, et al., 1991; MILATOVICH et al., 1991, ZHOU et al., 1995). Ratos mutantes
para Lef1 perdem dentes, glândulas mamárias e cabelos, mas não mostram defeitos óbvios
na população de célula linfóide ao nascimento. O desenvolvimento do dente é iniciado em
mutantes para Lef1, no entanto é interrompido antes da formação da papila dental. Portanto,
o desenvolvimento dos folículos pilosos do corpo e glândulas mamárias é incompleto ou
paralisado antes da morfogênese. Todos órgãos afetados pela mutação de Lef1 requerem
uma interação de tecidos para seu desenvolvimento (KRATOCHWIL, 1996). 23
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A super-expressão forçada de Lef1 em células ectodermais de ratos transgênicos
foi testada, resultando em formação aberrante de folículos pilosos e estruturas parecidas
com dentes na região do sulco labial (ZHOU et al., 1995; KRATOCHWIL et al., 1996).
3 - MSX: MUSCLE SEGMENT BOX
A família dos Msx (em ratos) consiste em três membros cromossomicamente não
ligados. O gene Msx1 pertence a um grupo de genes altamente conservados dentro da
escala evolutiva. Em humanos existem os genes MSX1 e MSX2, que não se localizam no
mesmo cromossomo (DAVIDSON, 1995), e estão estreitamente envolvidos na
odontogênese (MAAS & BEI, 1997). O gene MSX1 foi localizado no Cromossomo 4p16.3-
p16.1, enquanto que o MSX2 está em 5q34-q35
Ratos com inexpressão do gene Msx1 têm os dentes molares paralisados no
estágio de botão e os deficientes de Msx2, têm defeitos na morfogênese das cúspides,
formação da raiz e diferenciação do órgão do esmalte (MAAS & BEI, 1997; SATOKATA
& MAAS, 1994).
Nos humanos, o papel dos genes MSX no desenvolvimento crânio facial tem sido
esclarecido em estudos que identificaram mutações nesses genes associadas a alterações da
normalidade. Uma transversão na região homeobox do gene MSX1, que resulta na
substituição de uma arginina por uma prolina, em um domínio de conservação da proteína,
é causa de uma forma de agenesia dental. No entanto, mutações nos MSX não explicam
todas as formas de agenesia dental (SCAREL, et al., 2000).
Experimentos realizados com ratos transgênicos, em que o gene Msx1 foi tornado
não-funcional, geraram animais com palato fendido e anodontia, permanecendo a
odontogênese interrompida na fase de botão. Vale acrescentar que esses animais não
apresentaram mal-formações em outros órgãos. Pode-se explicar esse fato devido à
redundância funcional entre os genes Msx1 e Msx2 e sua co-expressão em muitos sítios.
Comprovou-se esse dado por um outro experimento, com ratos transgênicos, em que os
genes Msx1 e Msx2 eram não-funcionais; os animais apresentaram além de anodontia,
sérios defeitos no desenvolvimento de muitos órgãos. 24
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Conclui-se a importância indubitável da proteína Msx1 na odontogênese, e
compreende-se o fato de ratos transgênicos para o Msx1 não terem sido compensados pelo
gene Msx2, já que este é expresso principalmente nos estágios da odontogênese mais
avançados ao de botão. Tal padrão de expressão foi comprovado em ratos transgênicos para
o gene Msx2, os quais não exibiram alteração no número de dentes, mas sim defeitos na
morfogênese das cúspides, das raízes dentais e dos órgãos do esmalte (SATOKATA &
MAAS, 1994; MAAS & BEI, 1997; THESLEFF, 1996).
4 - PAX: PAIRED BOX
Um outro grupo de genes homeóticos é o Pax, cujo nome também advém da
homologia com um gene chamado paired em Drosophila. Esse grupo é formado por nove
membros em mamíferos, que apresenta uma região conservada ligante do DNA, nomeada
domínio paired (UNDERHILL, 2000), sendo que os membros mais estreitamente ligados à
odontogênese são os Pax1 e Pax9.
Mutação nos genes paxs causa profundos defeitos no desenvolvimento em
organismos diversos como moscas, ratos e humanos (CHI & EPSTEIN, 2002).
Experimentos com ratos em que o gene Pax9 foi deletado, a odontogênese de
molares apresentou-se interrompida na fase de botão, o que é fenotipicamente similar aos
resultados em ratos transgênicos para o gene Msx1 (MAAS & BEI, 1997; STRACHAN &
READ, 1994). Recentemente também foi mostrado que mutação no gene PAX9 está
associado com a oligodontia em humanos, afetando principalmente os dentes posteriores da
dentição permanente (STOCKTON et al., 2000).
O gene PAX9 em humanos é locado em 14q12-q13. Mutação nesse gene foi
implicada na agenesia dental de uma família com oligodontia autossômica dominante, onde
foram afetados pré-molares e molares (STOCKTON et al., 2000). Em outro caso, dois
membros de uma pequena família mostraram a ausência de molares e pré-molares tanto na
maxila quanto na mandíbula e também de alguns incisivos, causada por uma deleção no
PAX9. Esses achados sugerem a relação de PAX9 com a formação do dente em humanos
(DAS, 2002).
25
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5 - OUTROS IMPORTANTES FATORES DE TRANSCRIÇÃO
O gene Sonic hedgehog (Shh) é um homólogo vertebrado do gene hedgehog (hh),
que controla na drosófila a seguimentação e a organogênese (HAMMERSHMIDT;
BROOK; MCMAHON, 1997; JOHNSON & TABIN, 1995). O gene patched (ptc),
originalmente identificado como um gene seguimentador da drosófila (HOOPER &
SCOTT, 1989) codifica uma proteína transmembrana que serve como receptora para Shh.
Interessantemente, a expressão ectópica do Shh leva a expressão ectópica do Ptc no
desenvolvimento de vários órgão dos vertebrados (ZHANG et. al., 1999). No
desenvolvimento do dente, Shh pode estar envolvido neste processo ativando a expressão
do receptor Ptc e o fator de transcrição Gli1. No entanto, Gli1 é um componente do
caminho sinalizador do Shh (ZHANG et. al., 1999).
Experimentos com camundongos “knockout” mostraram que a deleção de outros
genes como a activina e genes Gli1 e Gli2 também causam agenesia dental e portanto, estão
envolvidos na odontogênese (PETERS & BAILING, 1999). Um resumo dos genes cujo
envolvimento na odontogênese foi comprovado por experimentos em camundongos
“knockout” é mostrado na tabela a seguir.
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TABELA 2 - Sumário das principais alterações na dentição causado pela deleção de genes
em camundongos. ++: presença; -: ausência; S: dentes pequenos; F: dentes fusionados; ++
++: dente extranumerário; ( ): achado ocasional.
Genes
Incisivos
maxilares
Incisivos
mandibulares
Molares
maxilares
Molares
mandibulares
Estágio
paralisado
Gli 3-/- + + + +
Gli2 -/- + (F) + (+) + +
Gli2 +/- Gli3 +/-
+ + + +
Gli2 -/- Gli3 +/-
- + S + + S Botão
Gli2-/- Gli3 -/- - - - - Botão
Msx1 -/- - - - - Botão
Msx2 -/- + + + +
Msx1 +/- Msx2 -
/
+ + + +
Msx1 -/-
Msx2 +/
- - - - Botão
Msx1 -/- Msx2 -/
-
- - - - Lâmina
Dlx1-/- + + + +
Dlx2 -/- + + + +
Dlx1 -/- Dlx2 -/-
+ + - + (-) Lâmina
Pax9 -/- - - - - Botão
Activin
A -/-
+ - + - Botão
EDA X
-
/Y + S + S + S + S
Lef1-/- - - - - Botão
Pax6 ++ + + +
FATORES DE CRESCIMENTO
Fatores de crescimento são importantes moléculas sinalizadoras. Um fator de
crescimento produzido por uma célula pode afetar o desenvolvimento de outra célula na
vizinhança (parácrino) ou pode ter um efeito autócrino (SCAREl, et. al., 2003). 27
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Os efeitos dos fatores de crescimento são sempre diretamente mediados pela
ligação de receptores de superfície em células específicas (THESLEFF, 1995). A interação
sinalizadora que determina a localização, identidade, tamanho e forma do dente, tem lugar
durante os estágios iniciais do desenvolvimento do dente. Os sinais mais estudados são os da
família Fgf, Egf, Tgf. Cada família consiste de vários sinais codificados por diferentes genes
(THESLEFF, 2000).
1 – FGF: FATOR DE CRESCIMENTO FIBROBLASTICO
Fgf é uma grande família de proteínas que tem efeitos morfogenéticos potentes em
vários órgãos e são também potentes estimuladores da proliferação celular. Eles induzem a
divisão celular no mesênquima e no epitélio em vários estágios da morfogênese do dente
(JERNVALL, 1994; KETTUNEN & THESLEFF, 1998). Elas também previnem apoptose
no mesênquima dental (VAAHTOKARI; ABERG; THESLEFF, 1996). Dez membros da
família Fgf foram identificados. Essas moléculas têm efeitos biológicos muito similares e
existe uma possível redundância funcional entre elas (THESLEFF & SHARPE, 1997;
THESLEFF & ABERG, 1999; KETTUNEN & THESLEFF, 1998).
2 – EGF: FATOR DE CRESCIMENTO EPIDERMAL
Egfs têm sido encontradas em tecidos embrionários e a expressão é relatada para a
proliferação epitelial (NEXO et al., 1980; PARTANEM, 1990). De fato eles são mitógenos
para a ectoderme, endoderme e mesoderme, estimulando a proliferação das células do
embrião durante a morfogênese in vivo e in vitro (CARPENTER & COHEN, 1979). Egfs
interagem especificamente com seu receptor, sendo Egfs-R glicoproteínas transmembrana
que estão presentes em muitos tipos de células derivadas dos três folhetos embrionários
(CARPENTER & COHEN, 1979; ADAMSON, 1990). Egfs e Egfs-R parecem ter sido
conservados estrutural e funcionalmente durante a evolução (LIVNEH et al., 1985). Em
camundongos, a iniciação da odontogênese é totalmente inibida pelo bloqueio da produção
de Egfs in situ (KRONMILLER; UPHOLT; KOLLAR, 1991). Esses achados indicam que
Egfs estimula ou mantém a proliferação de células indiferenciadas durante o
desenvolvimento embriológico. 28
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3 - TGFb: FATOR DE CRESCIMENTO TRANSFORMANTE BETA
Membros da super família dos fatores de Tgfb regulam a proliferação celular
diferenciação e apoptose, controlando o desenvolvimento e manutenção de vários tecidos
(HSU et al., 2002; PERES et al., 2004). Tgfb é um fator de crescimento que tem lugar na
cascata sinalizadora durante os estágios iniciais do desenvolvimento do dente (SHIMO et
al., 2002; VAAHTOKARI; VAINIO; THESLEFF, 1991).
3.1 – BMP: PROTEÍNA MORFOGENÉTICA DO OSSO
Pertence a família Tgfb uma classe de proteínas denominadas Bmps (Proteína
Morfogenética do Osso), que regulam o desenvolvimento de ossos e cartilagens (DE
CONTO, et. al., 2004). A família de Bmps nos mamíferos, é formada por oito membros que
podem ser agrupados em 3 subclasses, baseado na similaridade de aminoácidos.
Nos vertebrados, o subgrupo de Bmp2 e Bmp4 é o mais semelhantes ao gene
decapentaplegic (dpp) em drosófila, com aproximadamente 75% de similaridade entre
aminoácidos. Esses genes têm 95% de similaridade e podem ser um fator chave para a
iniciação e morfogênese do dente (MAAS & BEI, 1997; THESLEFF, 1995).
A proteína Bmp4 tem sido identificada como um sinal indutivo do epitélio na
formação dos dentes. A proteína Bmp2 guarda uma homologia de 95% com a Bmp4. A
expressão da Bmp2 indica forte correlação com o gene Msx2 na formação dos dentes, de
maneira que pode haver uma regulação recíproca entre eles. Bmps atuam como sinais que
estimulam outros genes, e o envolvimento deles na cascata de eventos de sinalização
recíproca tem sido esclarecidos (MAAS & BEI, 1997).
4 – MOLÉCULAS DA MATRIZ EXTRACELULAR
A matriz extracelular esta envolvida na interação epitélio-mesenquima durante a
morfogênese e diferenciação do dente. A morfogênese e diferenciação do dente podem ser
perturbadas por mutações de genes do colágeno e proteoglicanas (MAAS & BEI, 1997).
Estudos funcionais in vitro têm mostrado que a integridade da membrana basal é pré-
requisito para morfogênese epitelial do dente (SAHLBERG; AUKHIL; THESLEFF, 2001).
29
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No desenvolvimento do elemento dental, a membrana basal do epitélio contém
colágeno do tipo 1, 3 e 4, laminina, fibronectina e várias proteoglicanas (THESLEFF et al.,
1981). Essas moléculas são expressas ao mesmo tempo quando a interação mediada pela
membrana basal regula a diferenciação de células ectomesenquimais em odontoblastos
(LESOT et. al., 1990). Tgfb1 pode promover a síntese de proteínas da ECM. Pode também
modificar receptores da superfície celular e prevenir a degradação de ECM (RASMUSSEN
& RAPRAEGER, 1988; RIZZINO et al., 1988).
“CASCATA MOLECULAR” DA SINALIZAÇÃO RECIPROCA NO
DESENVOLVIMENTO DO DENTE.
A sinalização molecular no desenvolvimento do dente é expressa nos diferentes
estágios da odontogênese. A respeito dos estágios de iniciação, explicando o modelo
genético da regulação, a expressão dos genes têm sido proposta por vários pesquisadores
(BEI & MAAS, 1998; ZHANG et al., 1999). A expressão de Msx1 no mesênquima dental é
inicialmente induzida por derivados epiteliais de Bmps e Fgfs. Interessantemente, Bmps não
podem induzir Fgfs e nem o contrário, sugerindo que Bmps e Fgfs atuem em caminhos
diferentes na indução do mesênquima dental. Porém, Fgf8 e Bmp4 podem induzir Msx1 no
mesênquima dental e somente Bmp4 pode induzir a expressão de Msx2. Bmp4 e Fgf8
induzem a expressão de Dlx2 no mesênquima dental e somente Fgf8 pode induzir a
expressão de Dlx1. Fgf8 estimula a expressão de Dlx1, Dlx2 e Pax9 no mesênquima dental.
A parada do desenvolvimento do dente em rato mutante para Msx1 foi associada com a
baixa regulação de Bmp4, Fgf3, Lef1, Ptc. Isso sugere que Msx1 está colocado acima dos
outros genes na cascata. No entanto, Shh epitelial induz a expressão de Gli1 no mesênquima.
Gli pode ativar a expressão de Ptc pela interação com o produto de Msx1, que é induzido no
mesênquima por um derivado epitelial, o Bmp4. Bmp4 mesenquimal, que induz Lef1, requer
produtos de Msx1 para induzir a expressão de Ptc e promover um feedback positivo para
manter a expressão de Msx1 (RAPRAEGER, 1989; TUCKER; KHAMIS; SHARPE, 1998).
Estudos recentes tem elucidado alguns aspectos da sinalização molecular que
ocorre durante o estagio de botão da odontogênese. A regulação do Bmp4 no mesênquima
de molar, causa a regulação de Lef1 e Dlx2 no botão epitelial. 30
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Isso foi deduzido da observação de que a adição de Bmp4 exógeno pode
parcialmente resgatar o fenótipo do dente e induzir a expressão de Lef1 e Dlx2 no germe
molar do mutante Msx1 (BEI & MAAS, 1998). Interessantemente, a expressão ectópica de
Bmp4 no mesênquima dental de mutantes Msx1, não pode resgatar a expressão dos genes
Fgf3 e sindecan1 (ZHAO et al., 2000). Similarmente, para muitos outros órgãos
embrionários, o desenvolvimento dos dentes de mamíferos remonta largamente a interação
epitélio-mesênquima.
COMENTÁRIOS E CONCLUSÕES
O desenvolvimento do dente pode ser dividido em múltiplos estágios, onde o
número, tamanho e tipo de dentes são determinados. Mais de 200 genes estão envolvidos
no desenvolvimento de elemento dental, entre eles vários fatores de transcrição, fatores de
crescimento e moléculas da matriz extracelular. As mudanças na dentição, ocorridas no
curso da evolução dos vertebrados, permitiram um melhor processamento da comida e
maior eficiência na absorção de nutrientes pelo organismo, possibilitando aos mamíferos
competir pela energia necessária à sobrevivência.
Os dentes são estruturas homologas que permite a localização e quantificação
dos efeitos de mutações genéticas específicas. No entanto, é possível também determinar a
fase da odontogênese afetada por essa condição. Esse aspecto faz o desenvolvimento do
dente um importante sistema para entendermos um intrincado mecanismo molecular que
regula o desenvolvimento, abastecendo uma ligação entre o desenvolvimento e a genética
evolucionária.
31
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37
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Uso de novo método para extração de DNA genômico de células descamadas a mucosa
oral para utilização em estudos genéticos
Silva E. R.
1
, Alves J. B.
1
and Pereira R. W.
2
1- Department of morphologic, Universidade de Uberaba, Uberaba, Minas Gerais, Brazil.
Campus Aeroporto -
Avenida Nenê Sabino, Uberaba MG.
2- Department of genetic, Universidade Católica de Brasília, Brasília, D.F., Brazil
Campus
II – SGAN 916 Norte – Av. WS Cep: 70.790-160 – Brasília D.F.
Correspondence to:
Elisângela R. da Silva
Universidade de Uberaba-UNIUBE
Avenida Nenê Sabino, Campus Aeroporto.
Uberaba, MG, Brazil.
Phone: +55-34-3232-2105
e-mail: elislaura@hotmail.com
38
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Resumo
Uso de novo método para extração de DNA genômico de células descamadas a mucosa
oral para utilização em estudos genéticos
A análise do DNA é largamente usada em estudos genéticos. O DNA humano, em
muitos casos, é obtido através de amostras de sangue periférico. O uso de células
descamadas da mucosa oral, como fonte de DNA para amplificação por PCR, tem
apresentado muitas vantagens. Nesse estudo, nosso objetivo foi padronizar extração de
DNA de células obtidas da mucosa oral, usando um novo método. Para testar a qualidade
do DNA, nós amplificamos o segundo éxon do gene MSX1 em pacientes com hipodontia.
Criamos um novo método de extração de DNA através de células da mucosa oral, que
apresenta baixo custo e rápidos resultados, indicando que o DNA dessas células,quando
extraídos por essa técnica, é suficiente para estudos genéticos. O DNA extraído mostrou-se
adequado em quantidade e qualidade, para estudos de PCR e análises de polimorfismos.
Palavras-Chave: PCR, Extração de DNA, Análise de polimorfismos
39
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Introdução
A análise do DNA humano é largamente usada em estudos genéticos e, em muitos
casos, esse material é obtido através de amostras de sangue periférico.
1,2,3,4
No entanto, a
retirada de sangue se faz através de procedimentos invasivos e a coleta pode envolver
problemas éticos. Faz-se necessário também a supervisão de profissionais capacitados
durante o processo de coleta, o que contribui para aumentar o custo do procedimento.
5, 6,7,8,9
Estudos têm demonstrado amplificações de fragmentos de DNA obtidos de células
da mucosa oral de humanos, e posteriormente submetidos a técnicas de análise de DNA,
onde os resultados apresentam-se satisfatórios.
5, 6
Usa-se freqüentemente em laboratórios a
extração orgânica de DNA, através de fenol, porém esse reagente é altamente tóxico para
animais.
13
Nós padronizamos um novo método para extração de DNA a partir de células da
mucosa oral. Esse método é de baixo custo e rápidos resultados, e o DNA genômico obtido
através dele de ótima qualidade para realização de estudos genéticos.
40
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Materiais e Métodos
Amostras de saliva de 50 indivíduos da região sudeste do Brasil foram coletadas
através de bochechos com solução isomolar de sacarose a 3% (aprovado pelo comitê de
ética em pesquisa da Universidade Federa de Uberlândia-UFU, protocolo 109/2004). A
mistura foi então centrifugada a 2000 rpm durante 10 minutos, originando um pellet. O
sobrenadante foi então descartado e o pellet ressuspenso em 500 µl de Master Mix [10 mM
Tris-HCL (pH 8), 5 mM EDTA, 0.5% SDS]. As amostras foram então congeladas a –20ºC,
até a extração do DNA.
Extração de DNA - Protocolo
Após o descongelamento das amostras, adicionou-se 2,5 µl de proteinase K
(10mg/ml) e incubou-se, a 56°C durante toda a noite, em constante agitação, para digestão
de proteínas. As amostras foram então centrifugadas a 12000 rpm por 15 minutos, para
separar os restos de proteínas. A fase aquosa, contendo o DNA, foi pipetada e transferida
para um microtubulo limpo.
Adicionamos 200µl de NaCl a 7M em cada microtubulo. As amostras foram
incubadas a 0°C durante 10 minutes. Centrifugamos as amostras durante 15 minutos a 1
2000 rpm, e então coletamos a fase aquosa transferindo-a para microtubulos limpos. O
DNA foi então precipitado com 1 ml de etanol absoluto. Novamente as amostras foram
centrifugadas durante 10minutos a 12000 rpm, para nova precipitação. 41
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Dispensamos então o sobrenadante e adicionamos 1ml de etanol 70%. Após nova
centrifugação, 10minutos a 12000 rpm,.removemos o sobrenadante e deixamos os
microtubulos abertos descansando durante 2 horas em temperatura ambiente, para o total
evaporação do álcool. Ressuspendemos o DNA seco com 200µl de água mili-Q.
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
A amplificação foi realizada com 500 ng de DNA em um volume total da reação em
50 µl, contendo tampão 10X, 2,5 mM MgCl, nucleotídeos (200 unidades de cada), 1 Un
dos iniciadores, 2U da enzima taq DNA polimerase (PROMEGA). A seqüência dos
iniciadores usados foram:
MSX1:
5’ACT TGG GGG CAC TCA ATA TC 3’ – sense
5’TGT GAG GGT TAA AGG GAA GG 3’ – anti-sense
Ciclo de amplificação:
Aquecimento inicial a 95ºC por 5 minutos, 35 ciclos com temperatura de
desnaturação de 95ºC por 50 segundos, temperatura de anelamento de 60ºC por 1 minuto,
temperatura de extensão de 72ºC por 1 minuto e temperatura de 72ºC por 5 minuto para
extensão final. Os produtos amplificados foram visualizados em gel de agarose com
brometo de etídio, em tampão 0,5X TBE (89 mM Tris-Borato, 89 mM acido bórico, 2 mM
EDTA), e então coradas com prata.
42
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Resultados
Os resultados obtidos por esse processo de extração foram satisfatórios. A
amplificação do 2° exons do gene MSX1, seguida de posterior analise de polimorfismo
(figura 2 e 3) foram realizadas também com grande sucesso. O DNA genômico mostrou-se
adequado para análise genéticas, devido a quantidade e qualidade do material genético.
Figura 1: Produtos da extração do DNA de células descamadas da mucosa oral. Gel de
agarose a 1% contendo brometo de etídio.
Figura 2: Produtos de PCR obtidos pela amplificação do 2 éxon do gene MSX1, 668
pb, em gel de agarose a 1% contendo brometo de etídio.
43
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Discussão
O uso de células descamadas da mucosa oral para obtenção de DNA genômico,
oferece vantagens em ralação as células do sangue periférico. Dessa forma, o material
genético pode ser obtido inclusive de pacientes resistentes a qualquer forma invasiva de
coleta e, não necessita o acompanhamento de profissionais especializados durante a coleta.
Vale ainda ressaltar que os riscos de contaminação são mínimos.
10,11,12
Nós amplificamos através de
PCR, e posteriormente submetemos à técnicas de
análise de polimorfismos, DNA extraído através desse método. O DNA extraído de 50
indivíduos apresentou quantidade e qualidade adequadas para estudos genéticos.
Estudos anteriores reportaram amplificação de fragmentos de DNA obtidos de
células descamadas da mucosa oral de humanos.
5, 6
Nós padronizamos um novo método
para extração desse DNA genômico. Este método apresenta baixo custo e facilidade de
execução. E um método seguro graças a não toxidade dos produtos utilizados.
A extração orgânica (fenol-cloroformio) é largamente utilizada em laboratórios
porém, os produtos utilizados para tal são tóxicos, podendo comprometer o sistema
endócrino dos animais.
13
Nesse artigo mostramos que através do método descrito, podemos
obter DNA em quantidade e qualidade satisfatórias para estudos genéticos. Análises
genéticas realizadas com DNA obtido por esse método mostraram excelentes resultados.
44
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Abstract
Use of New Method For Genomic DNA Extraction From Jugal Epithelial Cells For
Utilization In Polymerase Chain Reaction
The analysis of DNA is widely employed in the genetic studies. Human DNA in most cases is
performed with samples obtained from peripheral blood. The use of buccal epithelial cells as a
source of DNA for PCR amplifications has several advantages over blood sampling. In the
present study our objective was to standardize DNA extraction from an oral swab, using a simple
method. To test DNA quality, we amplified the exons 2 of MSX1 gene and the promoter region
of LEF1 gene to patients with hypodontia. In conclusion, we standardized a simple DNA
extraction of oral cells, which presented lower costs and faster results, indicating to that DNA
from oral brushes/swabs are a reliable source for genetic studies. The quantity and quality of
extracted DNA was shown to be adequate for PCR and polymorphism analyses.
Keywords: PCR, Extraction of DNA, Polymorphism analyses.
45
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Mutação no gene MSX1 está relacionada a agenesia dental
Silva E. R.
1
, Alves J. B.
1
, Vieira C. U.
2
, Pereira B. B.
2
and Pereira R. W.
3
1- Department of morphologic, Universidade de Uberaba, Uberaba, Minas Gerais, Brazil.
Campus Aeroporto -
Avenida Nenê Sabino, Uberaba MG.
2- Department of genetic, Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, Minas Gerais,
Brazil, Campus Umuarama –Avenida Pará, Uberlândia MG.
3- Department of genetic, Universidade Católica de Brasília, Brasília, D.F., Brazil
Campus
II – SGAN 916 Norte – Av. WS Cep: 70.790-160 – Brasília D.F.
Correspondence to:
Elisângela R. da Silva
Universidade de Uberaba-UNIUBE
Avenida Nenê Sabino, Campus Aeroporto.
Uberaba, MG, Brazil.
Phone: +55-34-3232-2105
e-mail: elislaura@hotmail.com
48
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Resumo
Mutação no gene MSX1 está relacionada à agenesia dental
Hipodontia, a ausência congênita de dentes, é uma das alterações mais comuns na dentição
humana. Vários dentes podem estar ausentes porém, os mais comuns são os terceiros
molares, segundo pré-molares e incisivos laterais superiores.
Embora essa alteração de
número não represente um problema de saúde pública, ela pode causar disfunções
mastigatórias e problemas estéticos graves. Nos humanos, o papel do gene MSX1 no
desenvolvimento crânio facial tem sido esclarecido em estudos que identificaram mutações
nesses genes, associadas a alterações da normalidade. Mutações-polimorfismos no gene
MSX1 têm sido relatadas como responsáveis pela agenesia dental, no entanto, mutações
neste gene não explicam todas as formas dessa alteração. Nossos resultados sugerem que
polimorfismos no gene MSX1 estão associados com a hipodontia.
Palavras-chave: Hipodontia, MSX1, Polimorfismo
49
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Introdução
A hipodontia, ausência congênita de dentes, é uma das alterações mais comuns na
dentição humana. Vários dentes podem estar ausentes porém, os mais comuns são os
terceiros molares (20%), segundo pré-molares (3.4%), e incisivos laterais superiores
(2.2%).
1
Embora essa alteração de número não represente um problema de saúde pública,
ela pode causar disfunções mastigatórias e problemas estéticos graves.
2
A hipodontia pode
ocorrer como uma herança familial (autossômica dominante, autossômica recessiva ou
ligada ao cromossomo X) ou como um traço isolado.
3
Polimorfismos genéticos são mecanismos responsáveis pelo surgimento de
características individuais consideradas biologicamente normais em uma população.
Polimorfismos foram também mostrados relacionados com susceptibilidade a doenças.
Muitos polimorfismos alteram a função dos genes e podem ocorrer em alta freqüência em
uma população.
4
Nos últimos anos muitos fatores de crescimento e fatores de transcrição foram
descobertos durante o desenvolvimento do dente.
5,6
A participação direta de vários genes
envolvidos na odontogênese foi evidenciada pela fenótipo de ausência de dentes em
camundongos que tiveram esses genes deletados através de experimentos.
7
O gene MSX1 é
um fator de transcrição que participa na cascata molecular que comanda o processo de
odontogênese. Esse gene é expresso no mesênquima durante os estágios de botão, capuz e
campânula da odontogênese. O gene MSX1 regula a expressão do gene BMP4 no
mesênquima dental, passo essencial para o desenvolvimento do elemento dental.
2
50
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Em humanos o papel do gene MSX1 no desenvolvimento crânio facial tem sido
identificado través de mutações polimorfismos nesse gene. Polimorfismos-mutação na
região homeobox do gene MSX1 resultam na substituição de uma arginina por uma prolina,
causando um forma específica de agenesia dental.
8
Porém, mutações no gene MSX1 não
podem explicar todas as causas de agenesia dental.
9
Nosso estudo analisou a presença de polimorfismos-mutações no gene MSX1 em uma
família portadora de agenesia dental, relacionando tal polimorfismo a hipodontia.
Materiais e Métodos
Casuística
Doze indivíduos de uma mesma família, cinco portadores de agenesia dental sem
sinais de outras desordens, foram analisados. A ausência congênita dos incisivos laterais e
terceiros molares foi confirmada por análises radiográficas (detalhes não mostrados).
Obtenção do DNA
O DNA genômico foi obtido através de bochechos com solução isomolar com a
saliva, glicose a 3%, durante 2 minutos. A solução resultante do bochecho foi centrifugada
durante 10 minutos a 2000 rpm. Ao precipitado de material celular foram acrescentados
500µl de Master mix (pH 8), contendo TrisCl a 10 mM, EDTA a 0,1 M e SDS a 0,5%. A
solução foi homogeneizada e armazenada a -20ºC até o momento da extração do DNA.
Amplificação por PCR
Os iniciadores utilizados para amplificar a região de 668 pb de parte do íntron e do
segundo éxon do gene MSX1 foram: 51
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5’ ACT TGG CGG CAC TCA ATA TC 3´ (forward)
5´ TGT GAG GGT TAA AGG GAA GG 3´ (reverse).
Para as reações de PCR foram utilizadas quantidades aproximadas de 500 ng de
DNA em um volume total de 50µl, contendo TrisCl a 10 mM (pH 8), KCl a 50 mM, 0,5 U
de Taq DNA polimerase (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) e 5µl de cada
iniciador. O DNA genômico de cada amostra foi desnaturado a 95ºCpor 5 minutos e
submetido a 35 ciclos de 95ºC por 1 minuto, 60ºC por um minuto, 72ºC por 1 minuto,
finalizando a reação com uma extensão final na mesma temperatura por 5 minutos.
As reações de PCR foram realizadas em termociclador GeneAmp® PCR System
2400 (Perkin Elmer).
Eletroforese das amostras
As seqüências amplificadas foram submetidas a eletroforese em géis de
poliacrilamida: bis-acrilamida (29:1) a 7,%. O volume de DNA aplicado em gel era de 4µl,
acrescidos de 3µl de tampão carreador (azul de bromofenol a 0,25%, xilenocianol a 0,25%
e glicerol a 30%).
Análise de Polimorfismos por conformação de cadeias simples (SSCP)
Os produtos de PCR de todos os indivíduos da família estudada foram desnaturados
a 98ºC por 5 minutos, com 7µl de tampão desnaturante (formamida a 95%, xilenocianol a
0,05%, azul de bromofenol a 0,05%, EDTA a 20mM). A seguir, as amostras foram
conservadas em temperatura de 0ºC enquanto foram aplicadas em gel de poliacrilamida/bis-
acrilamida (29:1) e submetias a eletroforese realizada a 4ºC e 10mA. A concentração do gel
foi padronizada a 7,5% e o tempo de corrida foi de 4 horas. Após a eletroforese, os géis
foram corados com prata. 52
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Resultados
A amplificação dos fragmentos do gene MSX1 apresentou 99% de sucesso; esses
fragmentos por apresentarem excelente quantidade de DNA foram utilizados para o estudo.
Os seguimentos amplificados foram submetidos a técnica de SSCP, a qual revelou padrão
diferente de migração das bandas no gel, ou seja, houve indicação de
polimorfismo/mutação na amostra nessa técnica.
O achado foi considerado conclusivo.
Figura 1- Heredograma que elucida a família estudada.
Figura 2 – Gel apresentando o padrão de migração para a família, sendo o padrão de
4 bandas referente aos indivíduos não-portadores e o padrão de 3 bandas referente
aos indivíduos portadores de agenesia dental.
53
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Discussão
Uma dentição completa e funcional é pré-requisito para sobrevivência de muitos
mamíferos. A dentição dos mamíferos consiste de dentes que se desenvolveram como
órgãos discretos, e de anterior para posterior, a dentição é dividida dentro das regiões de
incisivos, caninos, pré-molares e molares. Particularmente, os dentes molares são muito
diversificados nas suas formas.
6
A hipodontia é a ausência congênita de um a seis dentes permanentes e/ou decíduos.
Representa uma das alterações mais freqüentes da dentição humana. Embora não constitua
um problema de saúde pública, a agenesia dental pode causar alterações na função
mastigatória e fala, assim como problemas estéticos que podem afetar a vida social do
indivíduo.
10,11
Esta alteração pode ocorrer associada a síndromes ou como uma entidade
isolada, podendo, neste caso, seguir um padrão herdado ou não. Os terceiros molares são
os dentes mais afetados, estando ausentes em aproximadamente 20% da população,
seguidos pelos segundos pré-molares (3,4%) e incisivos laterais maxilares (2,2%)
12,13
Os processos de amplificação e análise de polimorfismos genéticos requerem DNA
genômico em quantidade e nível de pureza satisfatórios para o sucesso das reações. Os
resultados obtidos mostram que células descamadas da mucosa bucal oferecem material de
boa qualidade para técnicas de análise em biologia molecular, como, no caso, para pesquisa
de polimorfismos genéticos. Esse método se constituiu em um meio simples, de baixo custo
e inofensivo ao paciente.
14
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A técnica de SSCP promove a identificação de polimorfismos conformacionais nas
fitas simples de DNA, com o objetivo de se confirmar polimorfismos/mutações. Nessa
técnica, a partir de produtos de PCR, separa-se a dupla fita de DNA que se houver mutação
migrará com padrão diferente no gel, devido a conformação.
O polimorfismo encontrado somente nos pacientes com agenesia dental foi
considerado conclusivo para a presença do fenótipo, considerando que o padrão diferente
foi observado somente nos pacientes com agenesia, determinando assim relação direta com
a manifestação da anomalia.
A análise por SSCP permite que a dupla fita do DNA seja desnaturada, impedindo
sua renaturação imediata, para que, quando submetidas a eletroforese, as fitas separadas
possam ter mobilidades diferentes no gel caso existissem diferenças entre as bases que as
compunham. Assim é possível detectar polimorfismos ou indivíduos heterozigotos.
15
É
importante observar que a técnica de análise de polimorfismo por conformação de fita
simples não substitui o seqüenciamento, pois somente essa última técnica identifica o
polimorfismo/mutação por demonstrar a base ou seqüência que se mostra alterada.
A família que participou desse estudo não apresenta características síndrômicas,
sendo que alguns indivíduos possuem fenótipo de hipodontia de incisivos laterais
superiores e terceiros molares. Evidenciamos um padrão migratório diferente de bandas
para o gene MSX1 nos indivíduos que apresentam o fenótipo da hipodontia.
No entanto não parece sensato desconsiderar fatores epigenéticos e a influência
ambiental na odontogênese. Estudos paleoantropológicos enfocando os aspectos evolutivos
da dentição referem, a potencial contribuição de fatores ambientais ao longo do processo.
14
Mecanismos epigenéticos podem ter contribuído para a redução do complexo 55
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mastigatório, por exemplo. A contínua tendência de redução do número de dentes (terceiro
molar) pode ser vista como um processo evolutivo, e o gene MSX1 seria uma das moléculas
relacionadas com tal efeito. Aliando-se a perspectiva evolutiva com técnicas de biologia
molecular, seria possível compreender mais amplamente a odontogênese. Assim, não só os
fatores genéticos seriam considerados, mais seria investigado um provável papel que
interações gene/ambiente tenha desempenhado ao longo do processo.
15
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Considerações finais
1-A extração do DNA a partir de células descamadas da mucosa jugal e um método
simples, de baixo custo e inofensivo ao paciente, o qual permite a obtenção de um material
intacto e de boa qualidade para técnicas de biologia moléculas,como,no caso,a pesquisa de
existência de polimorfismos genéticos.
2-A extração de DNA com Master Mix apresentou excelentes resultados quanto a
quantidade e qualidade do material extraído.
3-Foram detectados padrão diferencial de migração das bandas do gel de SSCP para
as amostras dos pacientes com agenesia dental, sugerindo, então, que esses polimorfismos
estão relacionados a presença de tal alteração
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Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer aos Doutores Warwick Estevam Kerr e Luis Ricardo
Goulart Filho, da Universidade Federal de Uberlândia, pela incrível contribuição
nesse trabalho. Sem dúvida, sem a ajuda desses grandes cientistas esse trabalho não
teria sido realizado.
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Abstract
Mutação no gene MSX1 está relacionada à agenesia dental
Hypodontia, the congenital absence of one or a few teeth, is one of the most common
alterations of the human dentition. The most common permanent missing teeth are the third
molars, second premolars, and maxillary lateral incisors. Although hypodontia does not
represent a serious public health problem, it may cause masticatory and speech
dysfunctions and esthetic problems. In human the participation of MSX1 gene in
craniofacial development have been evidenced by the studes that showed mutations in this
gene. Hypodontia were shown to be caused by mutations in the MSX1 gene in human
however, the mutation in the MSX1 gene cannot explain all types of tooth agenesis. Our
data suggest that polymorphisms in MSX1 gene are associated with hypodontia.
Key words: Hypodontia, polimorphism, MSX1
59
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