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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE GENÉTICA E BIOQUÍMICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA
Avaliação de derivados sintéticos da testosterona pelo teste
de mutação e recombinação somática (SMART) em
Drosophila melanogaster
Aluno: Bruno Lassmar Bueno Valadares
Orientador: Prof. Dr. Mário Antônio Spanó
Uberlândia – MG
2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE GENÉTICA E BIOQUÍMICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA
Avaliação de derivados sintéticos da testosterona pelo teste
de mutação e recombinação somática (SMART) em
Drosophila melanogaster
Aluno: Bruno Lassmar Bueno Valadares
Orientador: Prof. Dr. Mário Antônio Spanó
Tese apresentada à Universidade Federal
de Uberlândia, como parte dos requisitos
para obtenção do Título de Doutor em
Genética e Bioquímica (Área: Genética).
Uberlândia – MG
2007
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3
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
V136a
Valadares, Bruno Lassmar Bueno, 1977-
Avaliação de derivados sintéticos da testosterona pelo teste de muta-
ção e recombinação somática (SMART) em Drosophila melanogaster /
Bruno Lassmar Bueno Valadares. - 2007.
113 f. : il.
Orientador: Mário Antônio Spanó.
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Uberlândia, Programa de
Pós-Graduação em Genética e Bioquímica.
Inclui bibliografia.
1. Mutagênese - Teses. I. Spanó, Mário Antônio. II. Universidade
Federal de Uberlândia. Programa de Pós-Graduação em Genética e
Bioquímica. II. Título.
CDU: 575.224.4
Elaborado pelo Sistema de Bibliotecas da UFU / Setor de Catalogação e Classificação
Palavras chave: Teste de Mutação e Recombinação Somática (SMART); esteróides
androgênicos anabólicos; derivados sintéticos de testosterona; Deca Durabolin;
Durateston; Hemogenin; Winstrol Depot; citocromo P450; Uretano.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE GENÉTICA E BIOQUÍMICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA
Avaliação de derivados sintéticos da testosterona pelo teste
de mutação e recombinação somática (SMART) em
Drosophila melanogaster
Aluno: Bruno Lassmar Bueno Valadares
COMISSÃO EXAMINADORA
Presidente: Prof. Dr. Mário Antônio Spanó (Orientador)
Examinadores:
Profª
.
Drª
.
Lusânia Maria Greggi Antunes
Profª. Drª. Sandra Morelli
Prof. Dr. Edson José Fragiorge
Prof. Dr. Francis de Morais Franco Nunes
Data da Defesa: 23 de outubro de 2007
As sugestões da Comissão Examinadora e as Normas da PGGB para o formato da
Tese foram contempladas
______________________________
Prof. Dr. Mário Antônio Spanó
Orientador
5
Aos meus pais, Geraldo Antônio Valadares e Emilia
Maria Lassmar Bueno Valadares, dedico este trabalho e
meu empenho em concluir mais esta etapa.
6
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Mário Antônio Spanó, pelos ensinamentos, conselhos,
paciência, compreensão, dedicação e atenção nesses mais de dez anos de
orientação (desde março de 1997, quando vim pedir meu primeiro estágio na
graduação, a outubro 2007, quando encerro meu curso de doutorado); pelo
exemplo de pessoa e profissional que pretendo seguir, e com quem espero
manter os laços na carreira científica.
Ao Prof. Dr. Ulrich Graf, do Physiology and Animal Husbandry, Institute
of Animal Sciences, ETH Zürich, Switzerland, pelo fornecimento das linhagens
de Drosophila melanogaster e material necessário para a realização do Teste
de Mutação e Recombinação Somática.
Aos membros da Comissão Examinadora, Prof
a
. Dr
a
. Lusânia Maria
Greggi Antunes, Prof. Dr. Edson José Fragiorge, Prof
a
. Dr
a
. Sandra Morelli
e Prof. Dr. Francis de Morais Franco Nunes, pela disponibilidade e atenção
para oferecer suas valiosas sugestões a este trabalho.
Aos companheiros de trabalho do Laboratório de Mutagênese: Prof. Dr.
Edson José Fragiorge; Prof
a
Dr
a
Silma Maria Alves de Melo; Prof
a
Dr
a
Silmara de Moraes Pantaleão; Prof
a
Dr
a
Wanderlene Blanco Nunes; MSc.
Denise Gonçalves Pereira; MSc. Zaira da Rosa Guterres e Alexandre
Azenha Alves de Rezende, pelo convívio, amizade e cooperação. Em
especial à MSc Neila Coelho de Sousa, pela importante colaboração em
momentos decisivos para a conclusão deste trabalho.
Ao Sr. Paulo Roberto Moderno e à Srª. Maria Aparecida Vilela,
auxiliares técnicos do Laboratório de Mutagênese (INGEB-UFU), pela
dedicação e colaboração na realização dos nossos trabalhos, além da amizade
e grande carinho com todos do laboratório.
À Profª Dr
a
. Nora Ney Santos Barcelos, Profª MSc. Eleusa Gallo
Rosenburg e ao Sr. Anselmo de Oliveira (Instituto de Biologia – UFU), pela
amizade, incentivo, exemplo profissional e humano.
Aos coordenadores de cursos do Centro Universitário de Caratinga
(UNEC): MSc. Lamara Laguardia Valente Rocha (Ciências Biológicas), MSc.
Paulo Cézar Tostes Júnior (Farmácia), MSc. Thelma Regina Alexandre
Sales Ferreira (Nutrição), MSc. Marco Antônio Gomes (Psicologia) e MSc.
Daniela Fonseca Genelhu (Medicina) pelo apoio e credibilidade.
Ao Sr. João Batista de Andrade, gerente administrativo da Unidade II
da UNEC, pela confiança e permissão de utilização de equipamentos de
microscopia, em momentos necessários, fora das dependências da UNEC e ao
7
técnico, Sr. Jesus Ferreira de Sousa pela constante presteza no Centro de
Estudos de Biologia (CEB – UNEC), que muito colaboraram para a conclusão
da análise do material deste trabalho.
Aos colegas de trabalho, professores do Centro Universitário de
Caratinga, MSc. Claudinelli Galvão, MSc. Patrícia Silva Santos, MSc.
Márcio Luiz da Gama Lisboa, Dr
a
Marciane Oliveira e Dr. Sílvio Dolabella,
pelo incentivo, amizade e apoio.
Aos meus ex-alunos, Thiago Mafra Batista e Gleidson Teixeira, hoje
mestrandos (UFOP e UNICAMP, respectivamente), pelo auxilio com material
bibliográfico on-line, pela consideração e amizade.
Aos meus alunos e orientados do Centro Universitário de Caratinga
(UNEC), pelo especial carinho e incentivo.
Aos personal-trainers Prof. Felipe Zago (Uberlândia) e Prof. Diego
Andrade (Caratinga) pela amizade, incentivo, paciência e importantes
informações sobre o objeto de estudo deste trabalho.
Ao grande companheiro, Danilo Cunha Nascimento, pela compreensão
e paciência exercitadas nesse período e pelas incontáveis vezes que colaborou
de forma simples, mas com ajudas decisivas para que este trabalho
acontecesse.
Aos amigos: Rone Cardoso, Alessandra Cristina da Silveira, Hélica
Macedo, Marley Garcia Silva, Daniel Maziero, Wilson Réu Júnior, Bruno
Pueyo do Amaral, Fabiana Loureiro Pueyo do Amaral, Jupyracyara
Jandira Carvalho Barros, Graziela Ribeiro de Oliveira e Paolla Barcelar
Cardoso e à minha prima, Anna Elisa Saad Campos, que estiveram presente
e me acompanharam nessa trajetória, colaborando com grande incentivo.
À minha tia Therezinha Lassmar, que sempre me incentivou o gosto
pelo estudo e acompanhou, de perto ou de longe, toda minha trajetória.
Aos meus pais, Geraldo Antônio Valadares e Emília Maria Lassmar
Bueno Valadares, pelo empenho em me amparar em todos os momentos de
dificuldades desse período, ao meu irmão, Victor Saad Bueno Valadares; aos
meus avós, tios e primos, pelo grande apoio e incentivo, sem o qual não
alcançaria meus objetivos.
A todos que, de forma direta ou indireta, contribuíram com a realização
deste trabalho e com minha formação.
M
M
u
u
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t
t
o
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O
O
b
b
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a
a
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d
o
o
.
.
8
Apoio Financeiro
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Mutagênese do Instituto de
Genética e Bioquímica da Universidade Federal de Uberlândia (Uberlândia-
MG) com apoio financeiro das seguintes Agências de Fomento e Instituições:
• Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES);
• Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq);
• Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG);
• Universidade Federal de Uberlândia (UFU);
• Centro Universitário de Caratinga (UNEC).
9
Eu não vou me importar com a maldade de quem nada sabe
E se alguém interessa saber
Sou bem feliz assim
Muito mais do que quem já falou ou vai falar de mim.
(Maysa)
10
Lista de Figuras
Figura 1.1
Estrutura comum à maioria dos esteróides derivados
sintéticos da testosterona, com indicação das posições na
molécula onde se encontram os tipos de variações (A, B e
C) das diferentes classes de esteróides anabolizantes
(adaptado de Mottram e George, 2000).
15
Figura 1.2
Estruturas químicas dos esteróides anabólico-
androgênicos (EAA) Estanozolol (Winstrol Depot® – WIN)
(A); Oximetolona (Hemogenin® – HEM) (B); Decanoato de
nandrolona (Deca Durabolin ® – DEC) (C).
18
Figura 1.3
Estruturas químicas dos esteróides anabólico-
androgênicos (EAA) constituintes do Durateston
®
(DUR):
Propionato de testosterona (A); Fenilpropionato de
testosterona (B); Isocaproato de testosterona (C);
Decanoato de testosterona (D).
19
Figura 1.4
Representação esquemática do cruzamento padrão (ST):
fêmeas virgens da linhagem “flr
3
” (+TM3,Bd
S
/+flr
3
) são
cruzadas com machos “mwh” (mwh + / mwh +), originando
descendentes trans-heterozigotos marcados – MH
(+flr
3
/mwh+) e descendentes heterozigotos balanceados –
BH (+TM3,Bd
S
/mwh+).
29
Figura 1.5
Pares de asas de D. melanogaster: A – Asas com bordas
lisas; característica dos indivíduos da linhagem “mwh”,
herdada pelos descendentes trans-heterozigotos
marcados (MH); B – Asas com bordas recortadas (serate);
característica dos indivíduos das linhagens “flr
3
” e “ORR;
flr
3
”, herdada pelos descendentes heterozigotos
balanceados (BH).
30
Figura 1.6
Representação esquemática de cromossomos de células
dos discos imaginais de asas, presentes na fase de larva
de D. melanogaster, em divisão mitótica normal (adaptado
de Graf et al., 1984).
31
11
Figura 1.7
Representações esquemáticas de cromossomos de
células dos discos imaginais de asas, presentes na fase
de larva de D. melanogaster, em divisão mitótica, com
ocorrência de deleção (A), e de mutação de ponto (B)
levando à formação de manchas mutantes simples do tipo
“mwh” (adaptado de Graf et al., 1984).
32
Figura 1.8
Representações esquemáticas de cromossomos de
células dos discos imaginais de asas, presentes na fase
de larva de D. melanogaster, em divisão mitótica, com
ocorrência de recombinação entre os loci flr
3
e mwh (A),
com formação de mancha simples; e recombinação entre
o centrômero e o locus flr
3
(B), com a conseqüente
formação de mancha gêmea (adaptado de Graf et al.,
1984).
33
Figura 1.9
Fotografias de pêlos de asa de D. melanogaster, ao
microscópio óptico de luz (aumento de 400x), mostrando:
A - mancha simples (contornada pela linha) com pêlos
múltiplos (“mwh”) e B - mancha gêmea (contornada pela
linha) com pêlos em forma de chama (“flr
3
”), indicados pela
seta branca; e pêlos múltiplos (“mwh”), indicados pela seta
preta.
34
Figura 2.1
Distribuição das freqüências de manchas por classes
(número de células/mancha) observadas em asas de
descendentes heterozigotos marcados (MH) de Drosophila
melanogaster dos cruzamentos: A - padrão (ST) e B - de
alta capacidade de bioativação metabólica (HB), obtidas
por meio do teste para detecção de mutação e
recombinação somática, tratadas com as diferentes
concentrações de Hemogenin® (HEM) (0,625; 1,25 e
2,5mg/mL) e seus respectivos controles positivo (URE
0,891 mg/mL) e negativo (água destilada estéril).
77
12
Figura 2.2
Distribuição das freqüências de manchas por classes
(número de células/mancha) observadas em asas de
descendentes heterozigotos marcados (MH) de Drosophila
melanogaster dos cruzamentos: A - padrão (ST) e B - de
alta capacidade de bioativação metabólica (HB), obtidas
por meio do teste para detecção de mutação e
recombinação somática, tratadas com as diferentes
concentrações de Deca Durabolin® (DEC) (0,15625;
0,3125; 0,625; 1,25 e 2,5mg/mL) e seus respectivos
controles positivo (URE 0,891 mg/mL) e negativo (1%
Tween-80 + 3% etanol em água).
79
Figura 2.3
Distribuição das freqüências de manchas por classes
(número de células/mancha) observadas em asas de
descendentes heterozigotos marcados (MH) de Drosophila
melanogaster dos cruzamentos: A - padrão (ST) e B - de
alta capacidade de bioativação metabólica (HB), obtidas
por meio do teste para detecção de mutação e
recombinação somática, tratadas com as diferentes
concentrações de Durateston® (DUR) (0,195; 0,39; 0,78;
1,56 e 3,125mg/mL)e seus respectivos controles positivo
(URE 0,891 mg/mL) e negativo (1% Tween-80 + 3% etanol
em água).
81
Figura 3.1
Fórmulas estruturais dos compostos: A – Winstrol Depot®
(WIN), estanozolol (Disponível on-line:
http://pt.wikipedia.org/wiki/Estanozolol. Acesso em 03
outubro 2007); B – Etilcarbamato (uretano – URE)
(Disponível on-line: http://es.wikipedia.org/wiki/Uretano.
Acesso em 03 outubro 2007).
104
Figura 3.2
Regressão linear obtida pela correlação direta de dose
dependência no percentual de inibição pelas diferentes
concentrações (0,625; 1,25 e 2,5 mg/mL) de estanozolol
(WIN) nas freqüências totais de manchas mutantes por
indivíduos, induzidas pelo uretano (URE 0,891 mg/mL) em
células de asas de descendentes trans-heterozigotos
marcados (MH) de D. melanogaster dos cruzamentos
padrão (ST) e de alta capacidade de ativação metabólica
(HB) em co-tratamentos de aproximadamente 48 horas.
108
13
Figura 3.3
Distribuição das freqüências de manchas por classes
(número de células/mancha) observadas em asas de
descendentes heterozigotos marcados (MH) de Drosophila
melanogaster dos cruzamentos: A - padrão (ST) e B - de
alta capacidade de bioativação metabólica (HB), obtidas
por meio do teste para detecção de mutação e
recombinação somática, tratadas com as diferentes
concentrações de Winstrol® (WIN) (0,625; 1,25 e
2,5mg/mL) e seus respectivos controles positivo (URE
0,891 mg/mL) e negativo (água destilada estéril).
110
Figura 3.4
Distribuição das freqüências de manchas por classes
(número de células/mancha) observadas em asas de
descendentes heterozigotos marcados (MH) de Drosophila
melanogaster dos cruzamentos: A - padrão (ST) e B - de
alta capacidade de bioativação metabólica (HB), obtidas
por meio do teste para detecção de mutação e
recombinação somática, tratadas com as diferentes
concentrações de Winstrol® (WIN) (0,625; 1,25 e
2,5mg/mL) associado a uretano (URE) (0,891 mg/mL) e
seus respectivos controles positivo (URE 0,891 mg/mL) e
negativo (água destilada estéril).
112
14
Lista de Tabelas
Tabela 2.1
Esteróides anabólico-androgênicos derivados de
testosterona utilizados nos tratamentos de larvas de
Drosophila melanogaster para o teste de detecção de
mutação e recombinação somática
71
Tabela 2.2
Freqüências de manchas mutantes observadas em asas
de descendentes heterozigotos marcados (MH) de D.
melanogaster dos cruzamentos padrão (ST) e de alta
capacidade de bioativação metabólica (HB), após
tratamento crônico (~ 48h) com diferentes concentrações
(0,625; 1,25 e 2,5 mg/mL) do anabolizante Hemogenin®
(HEM), e seus respectivos controles negativo (água
destilada estéril) e positivo (URE 0,891 mg/mL)
72
Tabela 2.3
Freqüências de manchas mutantes observadas em asas
de descendentes heterozigotos marcados (MH) de D.
melanogaster dos cruzamentos padrão (ST) e de alta
capacidade de bioativação metabólica (HB), após
tratamento crônico (~ 48h) com diferentes concentrações
(0,15625; 0,3125; 0,625; 1,25 e 2,5 mg/mL) do
anabolizante Deca Durabolin® (DEC), e seus respectivos
controles negativo (1% Tween-80 + 3% etanol em água) e
positivo (URE 0,891 mg/mL)
73
Tabela 2.4
Freqüências de manchas mutantes observadas em asas
de descendentes heterozigotos marcados (MH) de D.
melanogaster dos cruzamentos padrão (ST) e de alta
capacidade de bioativação metabólica (HB), após
tratamento crônico (~ 48h) com diferentes concentrações
(0,195; 0,39; 0,79; 1,56 e 3,125 mg/mL) do anabolizante
Durateston® (DUR), e seus respectivos controles negativo
(1% Tween-80 + 3% etanol em água) e positivo (URE
0,891 mg/mL)
75
15
Tabela 3.1
Freqüências de manchas mutantes simples pequenas
(MSP), simples grandes (MSG) e gêmeas (MG)
observadas em asas de descendentes heterozigotos
marcados (MH) de D. melanogaster do cruzamento padrão
(ST), obtidas por meio do teste de mutação e
recombinação somática, após tratamento crônico (~ 48h)
com diferentes concentrações (0,625; 1,25 e 2,5 mg/mL)
do anabolizante estanozolol (WIN), isoladamente, e
associado ao uretano (URE) 10Mm, e seus respectivos
controles negativo (água destilada estéril) e positivo (URE
0,891 mg/mL)
106
Tabela 3.2
Freqüências de manchas mutantes simples pequenas
(MSP), simples grandes (MSG) e gêmeas (MG)
observadas em asas de descendentes heterozigotos
marcados (MH) de D. melanogaster do cruzamento de alta
capacidade de ativação metabólica (HB), obtidas por meio
do teste de mutação e recombinação somática, após
tratamento crônico (~ 48h) com diferentes concentrações
(0,625; 1,25 e 2,5 mg/mL) do anabolizante estanozolol
(WIN), isoladamente, e associado ao uretano (URE)
10Mm, e seus respectivos controles negativo (água
destilada estéril) e positivo (URE 0,891 mg/mL)
107
16
Lista de Abreviaturas
BH
Heterozigoto balanceado
CAS
Chemical Abstracts Service
DEC
Decadurabolin® (decanoato de nandrolona)
DUR
Durateston® (associação de propionato de testosterona,
fenilpropionato de testosterona, isocaproato de testosterona e
decanoato de testosterona)
EAA
Esteróides androgênicos anabólicos
flr
3
flare
3
HB
Cruzamento de alta bioativação
HEM
Hemogenin® (oximetolona)
MH
Heterozigoto marcado
mwh multiple wing hairs
ORR;flr
3
Oregon R, flare
3
SMART
Teste de Mutação e Recombinação Somática
ST
Cruzamento padrão
URE
Uretano (etilcarbamato)
WIN
Winstrol Depot® (estanozolol)
17
Sumário
Apresentação 1
Capítulo I
Fundamentação teórica
6
Corpo, sexualidade e o uso de esteróides pelo gênero masculino 6
Testosterona e seus derivados sintéticos 12
O citocromo P450 e o metabolismo de agentes xenobióticos 22
Alterações genéticas e a carcinogênese 24
Teste para detecção de mutação e recombinação somática (SMART) 26
Referências Bibliográficas
35
Capítulo II
Avaliação genotóxica de esteróides androgênicos anabólicos (EAA)
sintéticos derivados da testosterona em células somáticas de Drosophila
melanogaster
47
Resumo 50
Abstract 52
Introdução 53
Material e métodos
Agentes químicos
Obtenção das larvas e tratamentos
Preparação das lâminas e análise do material
Tratamento estatístico dos dados
56
56
56
57
58
Resultados e discussão 59
Referências bibliográficas 64
18
Capítulo III
Efeitos inibidores do estanozolol sobre ação genotóxica do etilcarbamato
em células somáticas de Drosophila melanogaster
84
Resumo 87
Abstract 89
Introdução 90
Material e métodos
Agentes químicos
Linhagens de moscas, cruzamentos e tratamentos
Preparação das lâminas e análise do material
Análise estatística
93
93
93
94
95
Resultados e discussão 96
Referências bibliográficas 100
19
APRESENTAÇÃO
1
Apresentação
Mais do que a simples utilização de esteróides anabolizantes, ou seus
possíveis efeitos genotóxicos e metabólicos, as questões subjetivas
relacionadas ao gênero masculino, pouco exploradas, e muitas vezes
subestimadas pela nossa cultura, foram as razões da idealização deste
trabalho. Os motivos pelos quais um indivíduo encontra nos anabolizantes a
solução para os anseios de atender a padrões sociais de estética e virilidade
são suficientes para tornar o universo dessa classe de substâncias digno de
maior atenção no meio científico.
O desenvolvimento de um estudo para avaliar os efeitos genotóxicos
(mutegênicos e recombinogênicos) de esteróides androgênicos anabólicos
(EAA), derivados sintéticos da testosterona, visa preencher uma importante
lacuna existente entre as poucas informações a respeito dessas substâncias, o
indício dos EAA terem efeitos carcinogênicos, sendo que estes apresentam
resultados negativos em testes convencionais de genotoxicidade.
Questões como estas levam à discussão de hipóteses, como a
possibilidade de uma ação carcinogênica epigenética e não-mutagênica dos
EAA; a ineficiência dos testes empregados para detectar tipos específicos de
alterações do material genético, como a recombinação gênica; e até mesmo de
falhas amostrais nos estudos epidemiológicos, que relacionam a utilização de
EAA com a incidência de câncer nos usuários.
Os EAA Winstrol Depot®, Hemogenin®, Deca Durabolin® e
Durateston®, utilizados na realização desse trabalho, foram escolhidos
levando-se em consideração: informações obtidas em academias de
musculação, com profissionais da área de educação física; informações
médicas; dados de literatura; possibilidade de aquisição de EAA em farmácias
e academias de fisiculturismo; realização de experimentos que permitem
avaliar comparativamente o potencial genotóxico dos mesmos; possibilidade de
correlacionar a estrutura química com a atividade genotóxica.
A escolha do teste para detecção de mutação e recombinação somática
(SMART) em células de asas de Drosophila melanogaster, como método
2
investigativo, foi devida, além de todas as suas vantagens de baixo custo,
rapidez e confiabilidade de resultados, à possibilidade da detecção de
recombinações gênicas somáticas. Testes tradicionais já empregados para
avaliação de esteróides não detectaram efeitos genotóxicos, mas os mesmos
têm a recombinação gênica como um “ponto cego”, não detectando esse tipo
especial de alteração genética de grande importância na carcinogênese.
Assim, um efeito positivo, recombinogênico, detectado pelo SMART,
responderia à questão da relação de efeitos carcinogênicos de uma substância
química, com esse tipo específico de alteração genética, assim como um efeito
negativo, reforçaria a idéia de causas epigenéticas e não-mutagênicas.
Outra razão que favoreceu a escolha do SMART, como meio de
investigação, foi a possibilidade de avaliar a ativação metabólica dos esteróides
pelo sistema enzimático citocromo P450, responsável pelo metabolismo de
agentes xenobióticos, presente na D. melanogaster.
No caso especial de uma das substâncias avaliadas, o Winstrol Depot®
(WIN), a informação prévia de que seu constituinte, estanozolol, apresenta
interação com o citocromo P450, motivou a realização de um teste
complementar onde foi verificada a interferência dessa interação na ativação
metabólica do uretano (URE - etilcarbamida), um agente com propriedades
mutagênicas comprovadas, que tem sua ação potencializada pela presença do
citocromo P450. A detecção dessa interação inibitória do citocromo P450
reforça a possibilidade de ação epigenética e não-mutagênica dessa
substância química na carcinogênese, pois, a inibição do citocromo P450,
possibilitaria a ação de eventuais xenobióticos carcinogênicos, não
metabolizados.
O estudo de EAA sintéticos da testosterona entra em um campo, onde
há muito a ser explorado, e que desperta interesse em diversas áreas, com
relações científicas multidisciplinares, pois, não serão descobertas de
mecanismos de ação genotóxica, ou efeitos epigenéticos de alterações
metabólicas indesejáveis, e até mesmo a confirmação de efeitos
carcinogênicos, que farão reduzir o grande número de indivíduos que aderem,
a cada dia, ao uso dos anabolizantes, pois as razões pelas quais essas
3
substâncias são utilizadas envolvem relações complexas de auto-imagem e
questões culturais que superam o medo e o risco de sua utilização.
Este trabalho, enquanto pesquisa básica, espera contribuir como
alicerce para outras descobertas sobre os anabolizantes, que ofereçam formas
para minimizar seus efeitos indesejáveis e tornar seu uso mais seguro, ou
então, argumentos para reforçar o controle da sua comercialização e o
investimento em campanhas educativas para conscientizar usuários, efetivos
ou em potencial, sobre seus riscos, uma vez que é fácil julgar o que é certo ou
errado quando se olha algo apenas por um único ângulo, cartesiano e traçado
sobre verdades absolutas, inquestionáveis e imutáveis. Mas, a realidade é que
se vive um momento de crise e mudança de paradigmas, quando chegamos à
necessidade de refletir e repensar razões, atitudes e escolhas.
Para a apresentação deste trabalho, o mesmo foi dividido em três
capítulos:
Capítulo 1 - Apresenta uma revisão geral da literatura, com informações sobre:
o corpo, a sexualidade, e o uso de esteróides pelo gênero masculino; as
características físico-químicas e efeitos biológicos dos EAA sintéticos derivados
da testosterona, Winstrol® (WIN – estanozolol); Hemogenin® (HEM –
oximetolona); Deca Durabolin® (DEC – decanoato de nandrolona); e
Durateston® (DUR – associação de propionato de testosterona, fenilpropionato
de testosterona, isocaproato de testosterona e decanoato de testosterona); os
sistemas enzimáticos responsáveis pelo metabolismo de agentes xenobióticos;
assim como sobre a D. melanogaster e o teste para detecção de mutação e
recombinação somática.
Capítulo 2 - Apresenta o manuscrito denominado “Avaliação genotóxica de
esteróides androgênicos anabólicos (EAA) sintéticos derivados da testosterona
em células somáticas de Drosophila melanogaster”, a ser enviado para
publicação na revista científica Environmental and Molecular Mutagenesis, no
qual, foram avaliados os EAA Hemogenin® (HEM - oximetolona); Deca
Durabolin® (DEC - decanoato de nandrolona); e Durateston® (DUR -
associação de propionato de testosterona, fenilppropionato de testosterona,
4
isocaproato de testosterona e decanoato de testosterona), por meio do teste
para detecção de mutação e recombinação somática (Somatic Mutation And
Recombination Test - SMART) em células de asas de D. melanogaster.
Capítulo 3 - Apresenta o manuscrito denominado “Efeitos inibidores do
estanozolol sobre ação genotóxica do etilcarbamato em células somáticas de
Drosophila melanogaster”, a ser enviado para publicação na revista científica
Environmental and Molecular Mutagenesis, que teve como objetivo avaliar a
genotoxicidade do WIN quando administrado isoladamente, e a sua
antigenotoxicidade quando associado ao etilcarbamato (URE – uretano), por
meio do SMART de asas de D. melanogaster.
5
CAPÍTULO I
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
6
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
Corpo, sexualidade e o uso de esteróides pelo gênero masculino
A era moderna tem como uma de suas características a razão de
produtividade, observada na busca insana por uma eficiência sobre-humana
refletida na necessidade da obtenção de maior quantidade de resultados, em
menor espaço de tempo, que é favorecida pelo desenvolvimento da tecnologia
em todas as áreas da ciência (Santos, 1997).
Buscando atender as exigências da modernidade, vivemos uma
constante busca pela superação de expectativas, pois, nos vemos submetidos
a constantes avaliações, algumas externas, e outras (a maioria), vindas de nós
mesmos. Desta forma, o corpo e a sexualidade são também submetidos a
constantes provações, enquadrando o indivíduo em um padrão definido por
Lowen (1988) como “sofisticação da sexualidade”.
De acordo com Gaiarsa (1986), tanto os adultos quanto as crianças
gostam muito de fazer pose quanto às suas virtudes e, de regra, têm
consciência muito limitada de seus próprios defeitos, buscando acreditar em
sua plena perfeição.
O indivíduo moderno, sexualmente sofisticado, busca mais atender a
uma expectativa de uma “avaliação” de seu corpo e de seu desempenho, a
atingir sua própria satisfação, pois, este sim, seria seu verdadeiro sucesso. É
precisamente no medo do fracasso, por não corresponder às expectativas, que
o homem sexualmente sofisticado revela a presença de culpas e aflições
básicas quanto à sexualidade (Lowen, 1988). Em função de atender tantas
exigências, provoca-se ansiedade e insegurança na vida humana. Para muitos
homens, a vida sexual é um “blefe”, pois lutam desesperadamente para manter
a imagem da infalível “máquina masculina”, tornando a vida sexual competitiva,
voltada mais para a aparência e o desempenho, do que para o próprio prazer
(McCarty, 1981).
7
O desempenho dos papéis de gênero são estabelecidos pela sociedade,
existindo sempre uma linha, mais ou menos comum, a todos os homens e
mulheres, em termos de comportamento. As diferenças vão acontecer de
cultura para cultura ou de época para época (Costa, 1994). O mito da
masculinidade sempre existiu na história da humanidade, em toda sociedade
patriarcal, não só relacionado à auto-imagem corporal, como também à
virilidade (Santos, 2000).
O porquê de se comportarem assim faz parte de uma tradição muito
antiga, de uma visão de mundo como completo em si mesmo, com suas
próprias regras, códigos, significados e respostas para todas as perguntas.
Certamente não foram os homens de hoje, como indivíduos, que formularam a
idéia de “sexualidade masculina” tal como nós conhecemos. Os homens de
hoje nasceram numa sociedade com uma carga imensa de imperativos
culturais que, por meio da censura ou do aplauso, os adaptaram a certos
padrões de comportamento e pensamento. Diferenças situam um homem fora
do grupo de “homens” e tornam a vida difícil. Eventualmente, muitos homens
parecem perder a capacidade de distinguir entre seus próprios sentimentos e
essa ideologia violentamente reforçada que impregna a cultura. Embora estas
definições culturais não tornem os homens particularmente felizes, a maioria
sente-se compelida a continuar exercendo esse papel (Hite, 1981).
No mundo atual se vê uma valorização de músculos e de força, numa
simbologia de virilidade, competência e de conquistas. O carro, a velocidade e
o estilo são novos símbolos de poder masculino, como também o dinheiro e a
casa em que ele reside. Também é importante para a auto-estima do homem,
mostrar que ainda é bastante forte seu vigor sexual (Santos, 2000).
Uma desvantagem de grande importância na vida do homem, e que o
coloca sempre numa situação angustiante, é a necessidade de esconder
sentimentos e “mostrar-se forte”. O que acontece, é que o próprio conceito de
ser forte é mal compreendido. Forte, não é o indivíduo que suporta a dor sem
demonstrar seus sentimentos. Essa é, na verdade, a pessoa que não consegue
demonstrar suas emoções. Forte, é quem reconhece que tem medo e que
precisa de muita coragem para enfrentar os seus fracassos. O homem insiste
na imagem que lhe foi transmitida desde a infância, de que é capaz de vencer
8
todos os obstáculos. Com isso, não consegue humanizar suas relações com as
pessoas, perde a oportunidade de falar de si próprio e de externar sentimentos
que lhe incomodam. Essa angústia impede que trocas afetivas importantes
sejam realizadas. O isolamento dentro de si próprio constitui o perfil típico do
indivíduo que, em determinado momento da vida, começa a ter problemas de
ordem psico-somática, como úlcera duodenal, hipertensão arterial, infarto ou
impotência sexual. O homem que não revela seus sentimentos e
preocupações, e não descarrega suas tensões, torna-se reprimido e
enclausurado dentro de suas emoções (Costa, 1993).
Os homens da geração atual sofrem de uma baixa auto-estima,
resultante das cobranças da sociedade e da mídia para que tenham corpos
perfeitos. Esse fenômeno é denominado de “Complexo de Adônis”, também
chamado de “bigorexia” ou “anorexia nervosa reversa”. Faz com que os
homens, cada vez mais, possuam uma auto-imagem distorcida de seus corpos
e sintam-se deprimidos por isso (Pope et al., 1999).
É exigido do homem um maior cuidado com a aparência, diante da idéia
de que, se estiver em melhor forma física e bem apresentável, terá maior
chance no mercado de trabalho, mais disposição nas horas de lazer, maior
satisfação consigo próprio e, acima de tudo, maior sucesso na atração sexual.
Com isso, busca atender ao padrão de beleza aceito como ideal pela
sociedade. Aqueles que não conseguem se adequar a esse padrão,
desenvolvem um sentimento de inferioridade, ficando inibidos nas iniciativas de
conquistas sexuais e profissionais, devido à baixa auto-estima (Valadares,
2001).
Mais do que nunca, os homens estão lutando com a mesma e enorme
pressão para obter a perfeição física, à qual eram submetidas anteriormente as
mulheres. Do halterofilismo compulsivo, até o uso de esteróides, dos implantes
de cabelo até a cirurgia plástica, cada vez maior número de homens está
procurando satisfazer as exigências por músculos, pele e cabelos perfeitos,
ultrapassando a linha do interesse normal em direção à obsessão patológica.
Esta nova obsessão com a aparência aflige homens de todas as idades e com
todos os tipos de vida. Em suas formas mais severas, podem criar uma
9
ameaça à saúde tão insidiosa e mortal quanto os distúrbios da alimentação,
como a bulimia e anorexia, para mulheres (Pope et al., 1999).
Com os movimentos feministas, a identidade feminina está relatada,
discutida e apresentada em muitos estudos e pesquisas, em especial, desde a
década de 1960. No entanto, só a partir da década de 1990, estudos e
publicações voltadas para questões masculinas vêm ganhando atenção e
espaço (Rodrigues Jr., 1995).
Goldenberg (2005) destaca o paradoxo que o culto ao corpo gera nesta
cultura das camadas médias urbanas. Quanto mais se impõe o ideal de
autonomia individual, mais aumenta a exigência de conformidade aos modelos
sociais do corpo. Considerando verdade que o corpo tenha se emancipado de
muitas de suas antigas prisões sexuais, ele se encontra, atualmente,
submetido a novas coerções estéticas. A obsessão com a magreza, a
multiplicação das academias de musculação, o uso de anabolizantes, são
apenas alguns dos exemplos que testemunham o poder de normalização (ou
padronização) dos modelos, um desejo maior de conformidade estética que se
choca com o ideal individualista e sua exigência de singularização dos sujeitos.
Com o desenvolvimento de técnicas de treinamento, conhecimento
nutricional e administração hormonal, o culto ao corpo passou a ser
supervalorizado e, uma de suas conseqüências, é um padrão estético baseado
no desenvolvimento muscular. Sobretudo, em países de clima tropical, como o
nosso, onde o corpo fica mais a mostra, esse culto é ainda mais exacerbado,
se expressando na possibilidade de desenvolver ao máximo o potencial da
massa muscular como padrão de beleza. A idéia de que um indivíduo forte é
um indivíduo saudável, ultrapassou a esfera do bom senso e mascarou as
conseqüências do uso de esteróides anabolizantes, e seu emprego passou a
ter um caráter totalmente secundário ao objetivo principal de obter músculos
(Neves et al., 2005).
Em casos mais graves de distorção da auto-imagem, temos a dismorfia
muscular, um subtipo do transtorno corporal que ocorre principalmente em
homens que, apesar da grande hipertrofia muscular, consideram-se pequenos
e fracos. É um quadro ainda pouco estudado, mas que parece ser prevalente
entre indivíduos do sexo masculino. Sua gênese pode ser parcialmente
10
explicada por fatores ambientais como uma crescente pressão exercida em
grande parte pela mídia para que os homens tenham um corpo forte e
musculoso, acarretando um aumento na incidência do transtorno. A dismorfia
muscular está associada a sofrimento e danos em várias áreas de
funcionamento do indivíduo, com prejuízos sociais, ocupacionais e recreativos,
além de sua presença aumentar o risco de uso de esteróides anabolizantes.
Apesar de seu tratamento ainda não estar definido, é importante que o quadro
seja identificado e que as diretrizes terapêuticas atualmente disponíveis sejam
aplicadas (Assunção, 2002).
Diante dessa crescente valorização do corpo nas sociedades de
consumo pós-industriais, exibida nos meios de comunicação de massa, um
número crescente de jovens e adolescentes também se envolve com o uso de
esteróides anabolizantes, na intenção de desenvolver rapidamente massa
muscular, como uma tentativa precoce de uma identidade de destaque em
seus grupos (Coutrine, 1995).
O consumo dessas substâncias, especialmente entre jovens atletas, tem
sido registrado com freqüência ascendente em vários países (Perry et al.,
1992; Nilson, 1995; Scott et al., 1996; Lise et al., 1999). Nos Estados Unidos,
um estudo populacional estimou em mais de um milhão o número de usuários
de anabolizantes (Yesalis et al., 1993).
Tricker et al. (1989) estabeleceram um perfil de usuários e não-usuários
de esteróides anabolizantes nos estados do Kansas e Missouri (EUA),
detectando 54% de usuários entre o público fisiculturista do gênero masculino
e, 10%, do feminino. Em relatório do National Institute on Drug Abuse (NIDA) é
informado um aumento de 50% entre os estudantes de cursos secundários
(high school) que utilizam estas substâncias em um tempo de quatro anos. O
aumento do uso de suplementos alimentares e anabolizantes levou o governo
norte-americano a lançar uma campanha nacional para alertar os jovens dos
perigos associados à sua utilização (Durant et al., 1993; Yesalis et al., 1997).
No Brasil, estudos que abordam o uso de anabolizantes são escassos,
não existindo dados epidemiológicos que indiquem a extensão do consumo
dessas substâncias. Alguns indícios, no entanto, sugerem que o uso de
anabolizantes é crescente entre os jovens e adolescentes pertencentes às
11
diferentes classes sociais, podendo representar, em breve, um importante
problema de saúde pública (Manetta e Silveira, 2000; Araujo et al., 2002; Silva
et al., 2002; Souza e Fisberg, 2002; Silva et al., 2003; De Micheli e Formigoni,
2004; Carreira Filho e Martins Filho, 2005; Neves et al., 2005; Dal Pizzol Tda et
al., 2006; Lucas et al., 2006).
Outra questão importante dentro do gênero masculino é a necessidade
de manter-se jovem, além da aparência forte e saudável, ainda com as
atividades mentais, físicas e sexuais inalteradas. O processo de
envelhecimento do homem é associado com o declínio progressivo na
produção androgênica. Só recentemente, no entanto, um significativo interesse
foi desenvolvido em torno da importância do problema, que é conhecido como
climatério masculino, andropausa, declínio androgênico no homem que
envelhece, ou, mais apropriadamente, deficiência androgênica no
envelhecimento masculino (Cairoli, 2004).
O termo “andropausa”, embora biologicamente inoportuno e não muito
bem definido, representa transformações físicas e emocionais que, mesmo
relacionadas ao envelhecimento em geral, estão associadas principalmente a
uma significante alteração hormonal (Morales et al., 2004).
Diante de uma condição controversa e pouco conhecida, diversos
estudos procuram por dados contundentes na busca de uma base sólida para a
discussão de questões relacionadas à andropausa. Conseqüências da
deficiência de testosterona parecem ser mais salientes em termos físicos que
psicológicos, quando testadas cientificamente. Tratando-se especificamente de
terapia de reposição hormonal, ainda se procura o androgênio ideal, específico
para órgãos alvo e sem efeitos direcionados a outras funções fisiológicas. O
papel dos níveis de testosterona é primordialmente importante na
caracterização do quadro de andropausa, porém, os sinais e sintomas do
envelhecimento são de origem multifatorial (Molle et al., 2004).
Na maioria das vezes, não se verifica no sexo masculino um declínio
abrupto das funções gonadais, como ocorre no sexo feminino. No homem, com
o passar do tempo, ocorre progressiva redução da atividade sexual, diminuição
da libido, diminuição da força e massa muscular. Não se afigura como
completamente benéfica a terapêutica com suplementação androgênica em
12
homens idosos, ainda mais na eminência de possíveis relações entre os
androgênios e o câncer de próstata (Silva, 2006).
A testosterona é há muito conhecida pelos seus efeitos anabolizantes,
no entanto, não se sabe se o declínio da força e massa muscular está
relacionado à queda paralela de testosterona no envelhecimento. Por outro
lado, sabe-se que a reposição hormonal com testosterona provocará uma
melhora tanto na força muscular e na massa óssea (Cairoli, 2004).
A utilização de esteróides derivados de testosterona pode resolver
também o problema da diminuição da libido, mas, não há comprovações de
que solucione problemas de disfunção ou impotência erétil, devido justamente
às múltiplas origens das disfunções da ereção (Molle et al., 2004).
Distúrbios endócrinos correspondem a cerca de 3% a 5% dos casos de
disfunção erétil. Na maioria dos casos, o distúrbio hormonal guarda relação
com a baixa dosagem de testosterona no sangue (hipogonadismo), ocasionada
geralmente por condições mórbidas. Um tema muito controverso atualmente é
a diminuição dos níveis sangüíneos da testosterona em homens acima de 50
anos, sem doença endócrina detectável, sendo um fenômeno que se manifesta
em aproximadamente 15% dos indivíduos do gênero masculino. A Indicação do
tratamento com reposição hormonal tem sido motivo de discussão e
controvérsias em congressos e publicações médicas (Gromatzky, 2000).
Testosterona e seus derivados sintéticos
Nos humanos, a testosterona constitui o androgênio mais importante
secretado pelo testículo. No homem são produzidos diariamente 8,0 mg de
testosterona, sendo aproximadamente 95% sintetizada pelas células de Leydig,
nos testículos, e 5% pelas supra-renais. Os níveis plasmáticos de testosterona
no homem são em torno de 0,6 µg/dL após a puberdade e, geralmente,
declinando depois dos 50 anos de idade do indivíduo (Katzung, 2006).
13
No período embrionário, a partir da oitava ou nona semana, as células
de Leydig fetais produzem testosterona, que estabiliza os ductos de Wolff,
permitindo sua diferenciação em epidídimos, canais deferentes, vesículas
seminais e ductos ejaculatórios. A testosterona é convertida pela enzima 5α-
reductase tipo 2 em diidrotestosterona, que viriliza os rudimentos genitais
externos entre a nona e a décima segunda semana de gestação (Maciel-
Guerra e Guerra Júnior, 2002).
Nos tecidos, a diidrotestosterona constitui o principal androgênio ativo. A
conversão da testosterona em estradiol pela aromatase P450 também ocorre
em alguns tecidos, incluindo o tecido adiposo, o fígado e o hipotálamo, onde
pode ser importante na regulação gonadal (Katzung, 2006).
Os hormônios são, em vários casos, substâncias que ativam a
transcrição de genes específicos. No caso dos esteróides, devido à sua
natureza lipídica, podem penetrar na célula por lipossolubilidade e se
associarem aos receptores no núcleo. Estas moléculas podem se ligar ao DNA
em regiões promotoras e acentuadoras de transcrição (Mottran e George,
2000).
A partir do progressivo entendimento da regulação da biossíntese e da
secreção dos andrógenos, bem como de seus efeitos, teve lugar a aplicação
terapêutica destas substâncias. Inícialmente, nos tratamentos de diferentes
estados hipogonadais masculinos, e, por extensão, na oligospermia. Em
seguida, surgiu sua utilização como anabolizante para o sexo masculino e, com
uma procura não tão expressiva, pelo público feminino. Mais recentemente,
como conseqüência do melhor conhecimento das modificações na
espermatogênese sob ação androgênica, admite-se a especulação e a
pesquisa em torno da hipótese de sua utilização como anticoncepcional
masculino (Silva, 2006).
Em 1888, foram realizados experimentos onde extratos de testículos de
animais eram injetados em cães e humanos, promovendo um aumento de força
muscular, apetite e funcionamento do trato intestinal, mas só em 1920
intensificou-se a pesquisa com hormônios e os mecanismos de ação e
regulação do sistema endócrino. Os esteróides anabolizantes foram
desenvolvidos primeiramente da década de 1930, onde cientistas alemães
14
utilizavam em cães e em seus próprios soldados na segunda guerra mundial,
sendo acusados de desenvolver pesquisas com humanos prisioneiros para o
desenvolvimento dos anabolizantes. Muitos resultados destes experimentos se
perderam por nunca terem sido publicados, havendo relatos de que
anabolizantes eram administrados aos soldados para aumentar a
agressividade das tropas. Na década de 1950, atletas russos e europeus
passaram a fazer uso de esteróides, considerando os benefícios que estes
proporcionavam em competições e, uma década mais tarde, os esteróides
estavam disponíveis no mercado (Santos, 2003).
Os esteróides anabólico-androgênicos, comumente chamados de
anabolizantes, são substâncias derivadas sintéticas do hormônio masculino
testosterona, geralmente extraído de testículos de bovinos e modificadas em
laboratório. Esta substância promove o anabolismo protéico, um aumento da
síntese de proteínas no organismo, que associada a exercícios físicos,
aumenta a força e a massa muscular, mudando a aparência do corpo sem
grandes esforços. Em doses altas, os anabolizantes aumentam o metabolismo
basal, o número de hemácias e a capacidade respiratória. Estas alterações
provocam ainda uma redução da taxa de gordura corporal (Muniz et al., 1997;
Iriart e Andrade, 2002).
Os esteróides anabólico-androgênicos são originados de três tipos de
alterações na molécula de testosterona para minimizar ou excluir o
metabolismo hepático destas substâncias químicas, sendo que estas
alterações também definem as classes de anabolizantes (Mottran e George,
2000). A estrutura básica da testosterona com os tipos de modificações que a
mesma pode sofrer na síntese dos diferentes tipos de esteróides está
representada na Figura 1.1.
As modificações na molécula objetivam alterar suas propriedades,
aumentando a ação anabólica (síntese protéica) em relação aos efeitos
androgênicos (acentuação dos caracteres sexuais masculinos secundários)
deste hormônio (Muniz et al., 1997; Kimtz et al., 1999; Mottram e George, 2000;
Santos, 2003; Neves et al., 2005).
15
Figura 1.1 – Estrutura comum à maioria dos esteróides derivados sintéticos da
testosterona, com indicação das posições na molécula onde se encontram os
tipos de variações (A, B e C) das diferentes classes de esteróides
anabolizantes (adaptado de Mottram e George, 2000).
As modificações na molécula de testosterona podem ser diferenciadas
em grupos:
• Classe A – esteróides produzidos via esterificação do grupo 17β-
hidroxil, como o propionato, fenilpropionato, cipionato e enantato de
testosterona. Estes derivados androgênicos são mais solúveis em
veículo lipídico, utilizado para injeções. A testosterona, quando injetada
em uma solução de óleo, é rapidamente absorvida, metabolizada e
excretada.
• Classe B – análogos alquilados na posição 17α, como a
metiltestosterona.
O
R
1
(tipo A)
(tipo C – em qualquer um destas posições)
R
2
(tipo B)
1
2
3
4
8
5
6
7
11
10
9
12
16
19
18
17
14
13
15
16
• Classe C – são anabolizantes produzidos por diferentes alterações em
qualquer posição nos anéis de sua estrutura (ex. estanozolol e
oximetolona).
As classes B e C são mais utilizadas em preparações via oral.
Apresentam boa absorção e excreção rápida, porém, maior toxicidade hepática
que os injetáveis (Lise et al., 1999; Mottran e George, 2000; Santos, 2003).
Winstrol Depot
®
(WIN), apresentado como solução injetável, em
ampolas de 1 mL contendo 50 mg de estanozolol (CAS 10418-03-8), distribuído
pelo Laboratório Zambon S.A. (Barcelona, Espanha). É um derivado sintético
do hormônio testosterona, indicado no tratamento de angioedema hereditário,
para diminuir a freqüência e a severidade das crises (Sanofi-Synthelabo, 1999)
e também para o tratamento de anemias (Reynolds e Prasad apud Rendic e
Ruf, 1988), asma, artrite reumatóide, anorexia, fraturas de lenta consolidação,
queimaduras extensas e períodos pré e pós-operatório. É considerado um
esteróide de efeito androgênico e efeitos colaterais relativamente baixos. Em
doses altas, pode causar danos ao fígado (Santos, 2003). Sua fórmula
estrutural é apresentada na Figura 1.2A.
Hemogenin
®
(HEM), apresentado na forma de comprimidos contendo
50 mg de oximetolona (CAS 434-07-1), distribuído pela Aventis Pharma Ltda.
(Suzano – SP, Brasil). É um esteróide de uso oral, indicado para o tratamento
de anemias causadas pela produção deficiente de eritrócitos e mielofibrose
(Lima, 2004). É um forte anabolizante, mas com ação androgênica alta,
comparada à testosterona. Proporciona rápido ganho de força e massa
muscular, mas, é tóxico ao fígado, causa retenção de líquidos, aumento de
pressão arterial, acne, ginecomastia, problemas estomacais e calvície, devido à
elevação dos níveis de diidrotestosterona (Santos, 2003). Sua fórmula
estrutural é apresentada na Figura 1.2B.
Deca Durabolin
®
(DEC), apresentado como solução injetável, em
ampolas de 1 mL contendo 50 mg de decanoato de nandrolona (CAS 360-70-
03), distribuído pelo Laboratório Organon (São Paulo – SP, Brasil). É indicado
como coadjuvante para terapias específicas e medidas dietéticas, em
17
condições patológicas caracterizadas por balanço de nitrogênio negativo, como
doenças debilitantes crônicas, terapias prolongadas com glicocorticóides e
após grandes cirurgias, traumas e osteoporose. Em mulheres, apresenta
efeitos de virilização, aumento da libido, aumento de pêlos pubianos, hipertrofia
clitoriana e amenoréia; para pré-puberes do sexo masculino, aumento fálico e
da freqüência de ereções, inibição da espermatogênese; fechamento epifisário
prematuro e retenção de água e sais (Lima, 2004). É o esteróide mais utilizado,
com efeitos androgênicos e anabólicos, muitas vezes administrado em
associação com outras substâncias químicas (Santos, 2003). Sua fórmula
estrutural é apresentada na Figura 1.2C.
Durateston
®
(DUR), apresentado como solução injetável, em ampolas
de 1 mL, distribuído pelo Laboratório Organon (São Paulo – SP, Brasil).
Combina a ação de quatro compostos derivados por esterificação do grupo
17β-hidroxil da testosterona: propionato de testosterona, 30 mg (CAS 57-85-2);
fenilpropionato de testosterona, 60 mg (CAS 1255-49-8); isocaproato de
testosterona, 60mg (CAS 15262-86-9); e decanoato de testosterona, 100 mg
(CAS 5721-91-5). É utilizado para reposição da testosterona em distúrbios
hipogonadais no homem, como após castração, eunucoidismo,
hipopituitarismo, impotência endócrina, sintomas do climatério masculino
(diminuição da libido e decréscimo da atividade mental e física), infertilidade
devido a distúrbios da espermatogênese e osteoporose por origem deficitária
de andrógenos (Lima, 2004). Apresenta ação imediata e por tempo prolongado
em ganho de massa muscular e força (Santos, 2004). As fórmulas estruturais
dos quatro compostos presentes nesta substância são apresentadas na Figura
1.3.
18
(A) Estanozolol (CAS: 10418-03-8)
(B) Oximetolona (CAS: 434-07-1)
(C) Decanoato de nandrolona (CAS: 360-70-03)
Figura 1.2. Estruturas químicas dos esteróides anabólico-androgênicos (EAA)
Estanozolol (Winstrol Depot® – WIN) (A); Oximetolona (Hemogenin® – HEM)
(B); Decanoato de nandrolona (Deca Durabolin® – DEC) (C).
19
(A) Propionato de testosterona
(CAS: 57-85-2)
(B) Fenilpropionato de testosterona
(CAS: 1255-49-8)
(C) Isocaproato de testosterona
(CAS: 15262-86-9)
(D) Decanoato de testosterona
(CAS: 5721-91-5)
Figura 1.3. Estruturas químicas dos esteróides anabólico-androgênicos (EAA)
constituintes do Durateston
®
(DUR): Propionato de testosterona (A);
Fenilpropionato de testosterona (B); Isocaproato de testosterona (C);
Decanoato de testosterona (D).
20
A Comissão Médica do Comitê Olímpico Internacional considera os
esteróides anabolizantes como agentes de doping e proíbe seu uso dentro do
atletismo, havendo controle e punição severa de atletas que fazem uso de
qualquer anabolizante para melhorar sua performance (Rendic e Ruf, 1988;
Huenerbein et al., 2003).
De acordo com o National Institute on Drug Abuse (NIDA, 2007), são
desenvolvidos nos Estados Unidos da América do Norte (USA) mais de 100
tipos de esteróides anabolizantes, que requerem prescrição médica para serem
usados legalmente, mas não há estimativas de quantidade e controle de uso e
produção, quando estes são sintetizados ilegalmente em laboratórios
clandestinos.
Entre os fisiculturistas, a principal razão do uso de esteróides
anabolizantes está relacionada ao fato de que estas substâncias são
importantes para vencerem competições e, ainda, é motivada por dados
consistentes de relatórios de ganhos significativos de força e musculatura pelos
usuários (Tricker et al.,1989).
Estudos indicam que o aumento mais significativo da massa muscular e
da força, durante a administração de esteróides anabolizantes são observadas
apenas em atletas que realizam trabalho de treinamento intensivo, com
continuidade, e mantendo ainda uma dieta hiper-calórica e rica em proteínas e
aminoácidos (Kibble e Ross, 1987).
O uso inadequado de anabolizantes pode causar sérios prejuízos à
saúde, como problemas cardíacos, hipertensão arterial, distúrbios psicológicos
provocados pelo aumento da agressividade, complicações hepáticas e redução
dos hormônios sexuais. No homem, pode haver diminuição da produção de
espermatozóides, além da atrofia dos testículos e aumento das mamas
(ginecomastia). As mulheres podem apresentar aumento do clitóris e
crescimento excessivo de pêlos (Mottran e George, 2000; Katzung, 2006; Silva,
2006).
Iñigo et al. (2000) descrevem diversas formas de utilização dos
esteróides anabolizantes por esportistas e, ainda, efeitos colaterais relatados
ou apresentados pelos atletas usuários. As formas de administração combinam
21
diversos tipos de substâncias em doses elevadas, ocorrendo em períodos
denominados como “ciclos”.
A lista dos prejuízos é extensa e incompleta, porque, como não há
controle, os jovens e atletas, no anonimato, usam doses excessivas e com
diversas associações de anabolizantes, assim, dificultando a identificação de
efeitos colaterais que podem ainda surgir com o tempo de uso (Muniz et al.,
1997).
Iriart e Andrade (2002) descrevem a falta de informações sobre a
extensão dos danos à saúde, decorrentes do uso de anabolizantes por parte
dos usuários, mostrando que, para muitos, o desejo de desenvolver massa
muscular e alcançar o corpo ideal se sobrepõe ao risco de efeitos colaterais.
De modo geral, a pouca informação desses usuários sobre esses produtos,
suas propriedades farmacológicas e efeitos colaterais, são oriundas da
experiência pessoal, da observação dos usuários das academias e dos relatos
de casos vivenciados por amigos ou conhecidos. Sintomas menores e
temporários, tais como, cefaléia, náuseas, tonturas, irritabilidade, acne, febre e
aumento dos pêlos corporais, com o tempo, são considerados “normais” pelos
usuários de anabolizantes, não transparecendo preocupações com os
possíveis efeitos em longo prazo que o uso contínuo dessas substâncias possa
produzir.
Alguns estudos discutem uma possível relação causa-conseqüência da
utilização de hormônios sexuais (estradiol, testosterona e seus derivados) com
a ocorrência de alguns tipos de tumores, especialmente de fígado e próstata
em humanos, e em experimentos com animais (Carrasco et al., 1985; Taylor,
1987; Anthony, 1988; Froehner et al., 1999; Socas et al., 2005; Bosland, 2006;
Giannitrapani et al., 2006; Ricke et al., 2006; Gorayski, et al., 2007), ao mesmo
tempo em que estes hormônios não apresentaram potencial mutagênico em
testes com Salmonella/microssoma e linhagens de células V79 de hamster
chinês (Lang e Redmann, 1979; Lang e Reimann, 1993) e testes de aberrações
cromossômicas em linfócitos humanos e micronúcleo em medula óssea de
camundongos (Reimann et al., 1996), sugerindo um efeito carcinogênico
destas substâncias químicas por ação epigenética e não-genotóxica.
22
Resultados não genotóxicos também foram encontrados para o
anabolizante Hemogenin® (HEM), oximetolona, por meio do teste de troca
entre cromátides irmãs em linfócitos humanos (Ahmad et al., 2003); e por
Holden et al. (1999) em ensaios com microrganismos e com células de
mamíferos (aberrações cromossômicas em linfócitos humanos in vitro, teste de
micronúcleo em eritrócitos de sangue periférico de roedores).
Citocromo P450 e o metabolismo de agentes xenobióticos
A exposição diária a uma grande variedade de agentes xenobióticos
(compostos estranhos ao organismo) pode ser inadvertida, acidental, e às
vezes inevitável, levando à absorção não intencional e inconsciente destes,
através dos pulmões e pele, ou ingestão, como o que acontece com
contaminantes presentes nos alimentos e na água. Por outro lado, a exposição
pode ser deliberada e consciente, como acontece, por exemplo, na forma de
medicamentos, com fins terapêuticos ou não. Alguns agentes xenobióticos são
inofensivos, outros, porém, podem provocar respostas biológicas de natureza
farmacológica ou tóxica. Essas respostas biológicas geralmente dependem da
conversão da substância absorvida em um metabólito ativo ou não, com a
finalidade principal de ser eliminada (Oshima-Franco e Franco, 2003).
A biotransformação de agentes xenobióticos ocorre no interior das
células, promovida por enzimas que modificam estas substâncias, geralmente
lipossolúveis, em estruturas polares, solúveis em água e de fácil eliminação
(Meyer, 1996). As reações de biotransformação ocorrem por meio de enzimas
em vários tecidos do organismo (sangue, rins, pulmões, pele, tecido nervoso,
intestino delgado e fígado), mas, é principalmente no fígado, que encontramos
a maior expressão dessas enzimas (Watkins, 1992).
A maioria dos xenobióticos atinge o organismo através da via
gastrointestinal e, neste sentido, o fígado é o principal órgão de
biotransformação devido a sua posição, suprimento de sangue e função. As
23
enzimas envolvidas na biotransformação estão localizadas principalmente no
retículo endoplasmático liso e no citosol das células hepáticas, em número
menor, estão presentes ainda nas mitocôndrias e em outras organelas
(Oshima-Franco e Franco, 2003).
As enzimas citocromo P450 formam uma grande família de
hemoproteínas envolvidas especialmente no metabolismo de substâncias
químicas (agentes xenobióticos), como também na biossíntese de lipídeos,
esteróides, vitaminas e outros metabólitos naturais das células (Chefson e
Auclair, 2006), sendo essenciais para todo organismo vivo, tanto procarioto
quanto eucarioto (Nebert e Gonzalez, 1987; Nebert et al., 1989).
A família de genes do citocromo P450 diversificou-se desde sua origem,
há mais 3,5 bilhões de anos, para adaptar-se ao metabolismo de um número
crescente de substâncias químicas ambientais, toxinas alimentares e
substâncias químicas ingeridas diariamente (Benet e Scheiner, 1987).
O componente primordial desse complexo enzimático é o citocromo
P450, monoxigenase que apresenta um núcleo pirrólico com átomo de ferro,
semelhante à hemoglobina, sendo, por esse motivo, considerada uma
hemoproteína. Os outros componentes do sistema microssomal hepático são
três flavoproteínas (NADPH-citocromo P450 redutase, NADH-citocromo b5-
redutase e N-oxidade), responsáveis pela transferência de elétrons, e outra
hemoproteína, o citocromo b5 (Oga, 2003).
O sistema enzimático citocromo P450 pode ser isolado a partir de
seqüências de homogeneização e ultracentrifugação de tecido hepático, que
levam à fragmentação e re-selamento do retículo endoplasmático liso, em
vesículas que mantém suas características, denominadas microssomas.
Enzimas desidrogenases, esterases, amidases e transferases são encontratas
na fração solúvel (citoplasmática) e monoamino oxidases, na fração
mitocondrial (Oshima-Franco e Franco, 2003).
Algumas substâncias são capazes de se ligar ao o P450, como é o caso
do estanozolol, derivado sintético de testosterona, que tem a propriedade de
interagir com o citocromo P450 formando um complexo com alta afinidade de
ligação (Rendic e Ruf, 1988), sendo que essa interação inibe a ação
metabólica do citocromo P450 (Nakajin et al., 1989).
24
As conseqüências da inibição correspondem à menor velocidade de
biotransformação, aumento dos níveis do agente xenobiótico no organismo,
aumento dos efeitos farmacológicos, e maior toxicidade da substância química
(Benet e Scheiner, 1987).
Os agentes xenobióticos podem, na biotransformação, tanto ser
inativados, quanto gerar metabólitos com atividade aumentada, ou com efeitos
tóxicos, mutagênicos, teratogênicos e carcinogênicos (Oshima-Franco e
Franco, 2003), como é o caso do uretano (URE – etilcarbamato), um agente
genotóxico que tem sua ação potencializada pelo metabolismo do P450
(Frölich e Würgler, 1990; Graf e van Scheik, 1992; Abraham e Graf, 1996;
Dogan et al., 2005).
Alterações genéticas e a carcinogênese
No decorrer da vida, o material genético sofre alterações denominadas
de mutações, que podem ser causadas por erros durante a duplicação do DNA.
As mutações ocorrem em todo ser vivo, sendo um processo fundamental para
a evolução e diversidade das espécies, mas, na maioria dos casos, as
mutações podem não ser percebidas, ou por não causarem modificações
detectáveis na atividade metabólica, ou por determinar a morte celular. Desta
forma, apenas um pequeno número de mutações que ocorrem em genes
específicos pode ser detectado, determinando assim, vantagens para o
organismo ou então um crescimento desordenado de células (Ribeiro e
Marques, 2003).
As alterações genéticas e a carcinogênese estão estreitamente
associadas, porque ambas representam alterações em uma única célula,
permanentes e herdáveis pelas células filhas. Por isso, os testes de
mutagenicidade são recomendados para pré-seleção de agentes químicos a
serem avaliados quanto ao seu potencial carcinogênico (Rabelo-Gay et al.,
1991).
25
Os agentes mutagênicos aceleram o aparecimento de mutações e estão
relacionados ao aparecimento das neoplasias. Após passar por várias divisões,
uma célula pode acumular mutações que, se em número elevado, poderão
determinar o aparecimento do câncer (Ribeiro e Marques, 2003).
Os tumores surgem através de um processo de múltiplas etapas no qual
ocorrem as mutações herdadas (derivadas de células germinativas) e
mutações somáticas de genes celulares, seguidas de uma seleção clonal da
progênie variante com propriedades de crescimento mais robustas e
agressivas. A grande maioria das mutações que contribuem para o
desenvolvimento e comportamento das células tumorais são mutações
somáticas que surgem durante o desenvolvimento do tumor e estão presentes
apenas nas células neoplásicas do paciente. Uma pequena fração de todas as
mutações que ocorrem no câncer pode ser constitucional, estando, dessa
forma, presentes em todas as células somáticas dos indivíduos afetados; tais
mutações podem não apenas predispor o indivíduo ao câncer, como também
ser passadas para as gerações futuras (Ojopi e Dias Neto, 2002).
As causas de um tumor são variadas, podendo ser endógenas ou
exógenas, estando, no entanto, inter-relacionadas. As causas exógenas
relacionam-se ao ambiente, são agentes normalmente presentes no meio (luz
solar, radiações ionizantes ou agentes químicos) e aos hábitos ou costumes
sócio-culturais associados ao estilo de vida e qualidade da dieta, enquanto, as
causas endógenas, são geneticamente pré-determinadas e estão ligadas à
capacidade do organismo se defender das agressões externas ou a pré-
disposição ao desenvolvimento da neoplasia. Esses fatores podem se interagir
de várias formas, aumentando a probabilidade de transformações malignas nas
células normais (Setlow, 2001; Ribeiro e Marques, 2003).
A maioria das alterações genéticas mais importantes no câncer ocorrem
nos genes que controlam a proliferação celular (proto-oncogenes e genes
supressores tumorais), resultando em um crescimento descontrolado
característico da célula maligna. Além disso, há ainda o envolvimento de genes
associados ao processo de reparo de danos no DNA, os quais, quando
inativos, podem elevar a taxa de mutação das células, causando,
26
eventualmente, a alteração de genes importantes na carcinogênese (Ojopi e
Dias Neto, 2002).
A genética toxicológica tem centrado suas investigações no uso de
diferentes bioensaios capazes de detectar mutações pontuais, aberrações
cromossômicas e eventos aneuploidogênicos. Ainda que a alta correlação
entre estas lesões e o desenvolvimento do processo carcinogênico seja um
fato iquestionável, permanecem as considerações sobre a existência de
carcinógenos destituídos de atividade mutagênica, seja ela gênica ou
cromossômica (Richard, 1994 apud Andrade e Lehmann, 2003).
Novos sistemas de testes foram desenvolvidos para a detecção de um
parâmetro especial de alteração genética, a recombinação mitótica. Alguns
agentes recombinogênicos podem estar envolvidos diretamente com a
carcinogênese (Andrade e Lehmann, 2003).
O principal argumento que reforça a participação da recombinação entre
homólogos como um dos fatores preponderantes no processo carcinogênico é
a demonstração de que a recombinação homóloga é o mecanismo que mais
contribui para a perda da heterozigoze em células somáticas (Bishop e
Schiestl, 2000 apud Andrade e Lehmann, 2003).
A perda da heterozigose pode levar à espressão de genes mutantes,
antes mascarados pelo alelo selvagem (Gusmán-Rincón e Graf, 1995). Assim
sendo, as recombinações somáticas apresentam um papel iniciador na
carcinogênese envolvidas em etapas secundárias e subseqüentes, onde
mutações oncogênicas recessivas são reveladas (Bishop e Schiestl, 2002).
Teste para detecção de Mutação e Recombinação Somática (SMART)
O teste para detecção de mutação e recombinação somática ("Somatic
Mutation And Recombination Test" - SMART) em células de asas de Drosophila
melanogaster foi desenvolvido por Graf et al. (1984), sendo considerado um
teste rápido, barato e que produz resultados confiáveis, inequívocos e
altamente reproduzíveis. A D. melanogaster apresenta, ainda, as vantagens de
ter um curto período de geração, o que possibilita a rapidez do teste; um
27
pequeno número de cromossomos; linhagens muito bem caracterizadas
geneticamente; e um sistema enzimático semelhante ao dos mamíferos, que
permite o metabolismo de agentes xenobióticos (Baars, 1980 apud Graf et al.,
1984).
Este teste detecta a perda da heterozigose, que pode ocorrer
espontaneamente ou ser induzida por agentes físicos e químicos, em células
primordiais dos discos imaginais de asas, no período de larva.
No SMART de asa são utilizadas as linhagens de D. melanogaster
"multiple wing hairs" (mwh), flare
3
(flr
3
) e "Oregon R, flare
3
" (ORR; flr
3
). A
linhagem "mwh" (com constituição genética y; mwh jv) possui o marcador mwh
que se localiza no cromossomo 3 (3-3,0) e que tem sua manifestação
fenotípica caracterizada por três ou mais pêlos por célula da asa. A linhagem
"flr
3
" (de constituição genética flr
3
/ ln(3LR)TM3, ri p
p
sep l(3)89Aa bx
34e
e Bd
S
)
possui o marcador flr
3
, também no cromossomo 3, numa posição mais proximal
(3-38,8) e sua manifestação fenotípica é caracterizada por um pêlo modificado
em forma de chama. O marcador flr
3
em homozigose é letal, ou seja, zigotos
homozigotos para o flr
3
não conseguem se desenvolver até a fase adulta (Graf
et al., 1984; Guzmán-Rincón e Graf, 1995). Para isso, foi desenvolvido um
cromossomo balanceador TM3, Bd
S
(Third Multiple 3, beaded-serrate) que
mantém a heterozigose da linhagem. A presença deste balanceador impede
que haja recombinação, ou seja, a troca de material genético entre
cromossomos homólogos, devido à presença de múltiplas inversões neste
cromossomo (Lindsley e Zimm, 1992 apud Graf et al., 1996).
Na linhagem "ORR; flr
3
" (de constituição genética ORR; flr
3
/
ln(3LR)TM3, ri p
p
sep l(3)89Aa bx
34e
e Bd
S
) o marcador flr
3
também encontra-se
presente. No entanto, esta linhagem difere da linhagem "flare
3
" por apresentar
uma alta atividade das enzimas citocromo P450 (Hällström e Blanck, 1985
apud Graf e van Shaik, 1992), as quais são responsáveis pela metabolização e
ativação de promutágenos e procarcinógenos (Dapkus e Marell, 1977 apud
Guzmán-Rincón e Graf, 1995). Os cromossomos 1 e 2 são provenientes da
linhagem Oregon R, resistente ao DDT, construída por Frölich e Würgler
(1989).
28
No teste para detecção de mutação e recombinação somática, em
células de asas de D. melanogaster, são utilizados machos "mwh" (mwh + /
mwh +) cruzados com fêmeas virgens das linhagens "flr
3
" (+ flr
3
/ + TM3, Bd
S
) -
cruzamento padrão (ST) - e "ORR; flr
3
" (ORR / ORR; + flr
3
/ + TM3, Bd
S
) -
cruzamento de alta capacidade de ativação metabólica (HB). Ambos
cruzamentos produzem indivíduos trans-heterozigotos marcados (MH), com
constituição genotípica mwh + / + flr
3
; e indivíduos heterozigotos balanceados
(BH), constituídos por mwh + / + TM3 Bd
S
(Figura 1.4), que podem ser
facilmente identificados pelo aspecto fenotípico das asas (Figura 1.5).
A análise dos indivíduos MH permite detectar a ocorrência de mutações
de ponto, pequenas aberrações cromossômicas e recombinações mitóticas
proximais e distais. A análise dos indivíduos BH permite detectar a ocorrência
de mutações de ponto e pequenas aberrações cromossômicas. No entanto,
devido à presença de inversões múltiplas no cromossomo balanceador, as
células resultantes de recombinação mitótica são inviáveis. A célula que sofreu
perda do alelo selvagem irá desenvolver o fenótipo mutante, durante a
metamorfose no estágio de pupa, e pode ser diferenciada facilmente das
demais (Guzmán-Rincón e Graf, 1995).
Na Figura 1.6 estão representados cromossomos de células primordiais
dos discos imaginais de asas, presentes na fase de larva de D. melanogaster,
em divisão mitótica normal (adaptado de Graf et al., 1984).
As Figuras 1.7 e 1.8 mostram os diferentes mecanismos genéticos
(deleção, mutação de ponto, e recombinação) responsáveis pelo aparecimento
de manchas mutantes em asas de D. melanogaster (adaptado de Graf et al.,
1984).
A Figura 1.9 mostra fotografias de asas de D. melanogaster, ao
microscópio óptico de luz (aumento 400x), com manchas mutantes simples
(“mwh”) e gêmeas (“mwh” e “flr”).
O Teste de Mutação e Recombinação Somática (SMART) vem se
mostrando eficiente na avaliação de efeitos genotóxicos e antigenotóxicos para
uma grande diversidade de compostos, como mostram os trabalhos produzidos
pelo Laboratório de Mutagênese do Instituto de Genética e Bioquímica da
29
Universidade federal de Uberlândia (Valadares et al., [in press]; Fragiorge et al.,
[in press]; Silva et al., [in press]; Fragiorge et al., 2007; Pantaleão et al., 2007;
Silva et al., 2006).
Figura 1.4 – Representação esquemática do cruzamento padrão (ST): fêmeas
virgens da linhagem “flr
3
” (+TM3,Bd
S
/+flr
3
) são cruzadas com machos “mwh”
(mwh + / mwh +), originando descendentes trans-heterozigotos marcados – MH
(+flr
3
/mwh+) e descendentes heterozigotos balanceados – BH
(+TM3,Bd
S
/mwh+).
30
Figura 1.5 – Pares de asas de D. melanogaster: A – Asas com bordas lisas;
característica dos indivíduos da linhagem “mwh”, herdada pelos descendentes
trans-heterozigotos marcados (MH); B – Asas com bordas recortadas (serate);
característica dos indivíduos das linhagens “flr
3
” e “ORR; flr
3
”, herdada pelos
descendentes heterozigotos balanceados (BH).
B A
31
Figura 1.6 – Representação esquemática de cromossomos de células dos
discos imaginais de asas, presentes na fase de larva de D. melanogaster, em
divisão mitótica normal (adaptado de Graf et al., 1984).
32
Figura 1.7 – Representações esquemáticas de cromossomos de células dos
discos imaginais de asas, presentes na fase de larva de D. melanogaster, em
divisão mitótica, com ocorrência de deleção (A), e de mutação de ponto (B)
levando à formação de manchas mutantes simples do tipo “mwh” (adaptado de
Graf et al., 1984).
33
Figura 1.8 – Representações esquemáticas de cromossomos de células dos
discos imaginais de asas, presentes na fase de larva de D. melanogaster, em
divisão mitótica, com ocorrência de recombinação entre os loci flr
3
e mwh (A),
com formação de mancha simples; e recombinação entre o centrômero e o
locus flr
3
(B), com a conseqüente formação de mancha gêmea (adaptado de
Graf et al., 1984).
34
Figura 1.9 – Fotografias de pêlos de asa de D. melanogaster, ao microscópio
óptico de luz (aumento de 400x), mostrando: A - mancha simples (contornada
pela linha) com pêlos múltiplos (“mwh”) e B - mancha gêmea (contornada pela
linha) com pêlos em forma de chama (“flr
3
”), indicados pela seta branca; e
pêlos múltiplos (“mwh”), indicados pela seta preta.
A
B
35
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46
CAPÍTULO II
Avaliação genotóxica de esteróides androgênicos anabólicos (EAA)
sintéticos derivados da testosterona em células somáticas de Drosophila
melanogaster
47
Manuscrito para Environmental and Molecular Mutagenesis 02-10-2007
Avaliação genotóxica de esteróides androgênicos anabólicos (EAA)
sintéticos derivados da testosterona em células somáticas de Drosophila
melanogaster
Bruno Lassmar Bueno Valadares e Mário Antônio Spanó
Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia,
Uberlândia (MG) Brasil
Running title: Avaliação genotóxica de derivados da testosterona
Autor para correspondência: Mário Antônio Spanó, Universidade Federal de
Uberlândia, Instituto de Genética e Bioquímica, Laboratório de Mutagênese,
Bloco D – sala 2D52, Campus Umuarama, 38400-902 Uberlândia (MG) Brasil.
Tel. +55 34 3218 2505.
E-mail: [email protected]
48
Fontes de financiamento:
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais
Universidade Federal de Uberlândia
49
Palavras chave: Hemogenin, deca durabolin, durateston, Teste de Mutação e
Recombinação Somática – SMART.
50
Resumo
Os esteróides androgênicos anabólicos (EAA) sintéticos derivados da
testosterona, empregados na medicina humana com fins terapêuticos, são
utilizados de forma indiscriminada, por atletas e fisiculturistas, com o objetivo
de ganhar maior força e massa muscular, apesar de pouco se conhecer sobre
seus efeitos colaterais. Hemogenin® (HEM) (oximetolona); Deca Durabolin®
(DEC) (decanoato de nandrolona); e Durateston® (DUR) (associação de
propionato de testosterona, fenilpropionato de testosterona, isocaproato de
testosterona e decanoato de testosterona), encontram-se entre os EAA mais
utilizados para tais fins. Este trabalho teve como objetivo avaliar
comparativamente os possíveis efeitos genotóxicos de diferentes EAA
sintéticos derivados da testosterona. Para tanto, foi empregado o teste para
detecção de mutação e recombinação somática (Somatic Mutation And
Recombination Test - SMART) em células de asas de Drosophila
melanogaster. Larvas de terceiro estágio, descendentes dos cruzamentos
padrão (ST) (fêmeas flr3 / TM
3
, Bd
S
cruzadas com machos mwh) e de alta
capacidade de bioativação metabólica (HB) (fêmeas ORR; flr3 / TM
3
, Bd
S
cruzadas com machos mwh) foram tratadas com diferentes concentrações
(0,625; 1,25 e 2,5 mg/mL) de HEM diluído em água destilada estéril; com DEC
(0,15625; 0,3125; 0,625; 1,25 e 2,5 mg/mL) e DUR (0,195; 0,39; 0,78; 1,56 e
3,125 mg/mL), isoladamente, diluídos em 1% Tween-80 + 3% etanol em água.
Como controle positivo e negativo foram utilizados, respectivamente, o pró-
mutágeno uretano (URE) 0,891 mg/mL, e os solventes utilizados nas diluições
dessas substâncias. As freqüências de manchas mutantes observadas nos
grupos tratados com as diferentes concentrações de EAA, em ambos
cruzamentos (ST e HB), foram estatisticamente não significativas quando
comparadas com os controles negativos. Estes resultados nos permitem
concluir que, nessas condições experimentais, os EAA HEM, DEC e DUR não
possuem efeitos genotóxicos em células de asas de D. melanogaster.
51
Key words: Hemogenin, deca durabolin, durateston, Somatic Mutation and
Recombination Test – SMART.
52
Abstract
Anabolic steroids are synthetic derivatives of testosterone modified to enhance
the anabolic rather than the androgenic actions of the hormone. There are
numerous side-effects to anabolic steroids, including carcinogenesis.
Hemogenin® (HEM) (oximetholone); Deca Durabolin® (DEC) (decanoate of
nandrolon); and Durateston® (DUR) (propionate of testosterone,
fenilppropionate of testosterone, isocaproate of testosterone and decanoate of
testosterone) are listed as the more used steroids. This study evaluated the
genotoxic effects of derivatives of testosterone compounds presents in three
drugs by means of the wing spot test of D. melanogaster (Somatic Mutation and
Recombination Test – SMART). Third-instar larvae derivated from standard
cross (ST), where flr3 / In(3LR) TM3, ri p
p
sep l(3)89Aa bx
34e
e Bd
S
females
were mated with mwh males, and high bioactivation cross (HB), where ORR;
flr3 / In(3LR) TM3, ri p
p
sep l(3)89Aa bx
34e
e Bd
S
females were mated with mwh
males, were treated for approximately 48 h with different concentrations of HEM
(0.625; 1.25 e 2.5 mg/mL) in water; DEC (0.15625; 0.3125; 0.625; 1.25 e 2.5
mg/mL) and DUR (0.195; 0.39; 0.78; 1.56 e 3.125 mg/mL), in solution of 1%
Tween-80 + 3% ethanol in water; like positive control was used urethane (URE
0.891 mg/mL), and negative, the respective solvents used. The results obtained
with the two different crosses were rather similar, and three drugs showed non-
mutagenic effects in D. melanogaster somatic cells.
53
Introdução
Os esteróides androgênicos anabólicos (EAA) sintéticos derivados da
testosterona são compostos químicos modificados para aumentar a ação
anabólica (síntese protéica), em relação aos efeitos androgênicos (acentuação
dos caracteres sexuais masculinos secundários) deste hormônio (Muniz et al.,
1997; Kintz et al., 1999; Mottram e George, 2000; Santos, 2003; Neves et al.,
2005).
A testosterona e seus derivados sintéticos EAA, são utilizados para fins
terapêuticos de reposição hormonal em indivíduos no período de climatério
masculino (andropausa), com sinais e sintomas de diminuição da libido,
decréscimo na atividade mental e física e impotência por razão endócrina; em
casos de distúrbios hipogonadais, castração, eunucoidismo e hipopituitarismo;
tratamento de osteoporose com origem na deficiência de andrógenos e para
tipos diversos de anemias (Comhaire, 2000; Bonaccorsi, 2001; Rangel et al.,
2002; Cairoli, 2004; Lima, 2004; Dourado e Godoy, 2004; Morales et al., 2004).
São utilizados por atletas para obtenção, à curto prazo, de melhores resultados
em ganho de massa muscular (Lise et al., 1999; Araujo et al., 2002; Iriart e
Andrade 2002; Silva et al., 2002; Jazayeri e Amani, 2004; Santos et al., 2006;
Aqulló-Calatayud et al., 2007), sendo relatado, ainda, o uso por adolescentes e
jovens universitários de ambos os sexos (Yesalis et al., 1997; Bahrke et al.,
1998; Faigenbaum et al., 1998; Neilor et al., 2001; Kindlundh et al., 2001;
Labre, 2002; Souza e Fisberg, 2002; De Micheli e Formigoni, 2004; Dal Pizzol
et al., 2006; Pallesen et al., 2006; Lucas et al., 2006 Dal Pizzol et al., 2006;
Pallesen et al., 2006; Lucas et al., 2006; Elliot et al., 2007; Wanjek B et al.,
2007; vandenBerg et al., 2007). Comumente, é encontrada a utilização de
diferentes EAA administrados simultaneamente de forma indiscriminada ou em
períodos denominados “ciclos”, com doses exacerbadamente maiores que as
determinadas em tratamentos clínicos (Pope e Katz, 1988; Iñigo et al., 2000;
Manetta e Silveira, 2000).
Efeitos adversos causados pelo uso de EAA são freqüentes e, alguns
deles, irreversíveis, o que se contrapõe aos benefícios estéticos e fisiológicos
advindos da utilização destas substâncias (Kimbble e Ross, 1987; Evans, 1997;
54
Korkia e Stimson, 1997; Rich et al., 1999; Iñigo et al., 2000; Hartgens e
Kuipers, 2004). Vários estudos relatam os danos à saúde, causados pelo seu
uso, tais como hipertensão arterial e problemas cardíacos (Clark e Schofiels,
2005; Kindermann, 2006), distúrbios psicológicos, provocados pelo aumento da
agressividade (Choi et al., 1990; Pope e Katz, 1994; Peluso et al., 2000; Talih
et al., 2007), acne (Melnik et al., 2007) e complicações hepáticas (Stimac et al.,
2002; Socas et al., 2005; Kafrouni et al., 2007). Promovem ainda a redução na
produção natural de hormônios sexuais, o que pode causar, nos homens,
diminuição na produção de espermatozóides, atrofia dos testículos e
ginecomastia, enquanto, em mulheres, pode ocorrer aumento do clitóris,
crescimento excessivo dos pêlos e masculinização na voz e na musculatura
(Pope e Katz, 1994; Lise et al., 1999; Mottram e George, 2000; Babigian e
Silverman, 2001; de Luis et al., 2001; Santos, 2003; Silva e Moreau, 2003;
Neves et al., 2005). Comumente, o usuário não tem informações a respeito
das propriedades farmacológicas dos EAA e, muitas vezes, seus efeitos
colaterais são subestimados (Muniz et al., 1997; Iriart e Andrade, 2002).
Hemogenin
®
(HEM) (ou Anandrol), Deca-Durabolin
®
(DEC) e
Durateston
®
(DUR), juntamente com outras substâncias químicas, são listados
entre os compostos EAA, derivados sintéticos da testosterona, que geram
efeitos anabolizantes mais freqüentemente utilizados, especialmente no Brasil
(Manetta e Silveira, 2000; Mottram e George, 2000; Iriart e Andrade, 2002;
Silva et al., 2002; Santos et al., 2006).
Alguns estudos discutem uma possível relação causa-conseqüência da
utilização de hormônios sexuais (estradiol, testosterona e seus derivados) com
a ocorrência de alguns tipos de tumores, especialmente de fígado e próstata
em humanos e em experimentos com animais (Carrasco et al., 1985; Anthony,
1988; Taylor, 1987; Froehner et al., 1999; Socas et al., 2005; Bosland, 2006;
Giannitrapani et al., 2006; Ricke et al., 2006; Gorayski, et al., 2007), ao mesmo
tempo em que estes hormônios não apresentaram potencial mutagênico em
testes com Salmonella/microssoma e linhagens de células V79 de Hamster
chinês (Lang e Redmann, 1979; Lang e Reimann, 1993) e testes de aberrações
cromossômicas em linfócitos humanos e micronúcleo em medula óssea de
55
camundongo (Reimann et al., 1996), sugerindo um efeito carcinogênico destas
substâncias químicas por ação epigenética e não-genotóxica.
O teste para detecção de mutação e recombinação somática ("Somatic
Mutation and Recombination Test" - SMART) foi desenvolvido por Graf et al.
(1984), sendo considerado um teste rápido, barato e que produz resultados
confiáveis, inequívocos e altamente reproduzíveis. Utiliza como organismo
teste a Drosophila melanogaster, que apresenta as vantagens de ter um curto
período de geração, o que possibilita a rapidez do teste, um pequeno número
de cromossomos e linhagens muito bem caracterizadas geneticamente. A D.
melanogaster possui, ainda, o sistema enzimático P450 semelhante ao dos
mamíferos, que permite o metabolismo de agentes xenobióticos (Baars, 1980
apud Graf et al., 1984).
O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial genotóxico de EEA,
derivados sintéticos de testosterona, pelo teste de mutação e recombinação
somática em células somáticas de D. melanogaster, por meio dos cruzamentos
padrão (Graf et al., 1989) e de alta capacidade de bioativação metabólica (Graf
e van Schaik, 1992).
56
Material e métodos
Agentes químicos
A Tabela 2.1 apresenta as especificações técnicas e químicas dos
esteróides anabólico-androgênicos (EAA) derivados da testosterona
[Hemogenin® (HEM), Deca-durabolin® (DEC) e Durateston® (DUR)].
HEM (0,625; 1,25 e 2,5 mg/mL) foi diluído em água destilada estéril.
Devido à insolubilidade em água, DEC (0,15625; 0,3125; 0,625; 1,25 e 2,5
mg/mL) e DUR (0,195; 0,39; 0,78; 1,56 e 3,125 mg/mL) foram diluídos em
solução de tween-80 (3%) e etanol (1%) em água destilada estéril. Para a
determinação das concentrações de DUR, foi considerado o total dos quatro
ésteres de testosterona constituintes do composto químico, de acordo com
Carreira Filho e Martins Filho (2005); Rangel et al. (2002) e Ferreira et al.
(1998). Uretano (URE 0,891 mg/mL), etil carbamato (C
3
H
7
NO
2
/NH
2
COOC
2
H
5
,
massa molecular 89.09 e CAS N° 51-79-6), Fluka Chemie AG (Buchs,
Switzerland), foi utilizado como controle positivo, devido às suas propriedades
mutagênicas bem estabelecidas (Frölich e Würgler, 1990; Graf e van Schaik,
1992; Abraham e Graf, 1996; Dogan et al., 2005). Todas as diluições foram
realizadas imediatamente antes do uso.
Obtenção de larvas e tratamentos
As linhagens mutantes de D. melanogaster, mwh (y; mwh jv), flare-3
(flr
3
/In(3LR)TM3, ri p
p
sep I(3)89Aa bx
34e
e Bd
S
) e ORR; flare-3 (ORR;
flr
3
/In(3LR)TM3, ri p
p
sep I(3)89Aa bx
34e
e Bd
S
) foram mantidas em frascos de
1/4 de litro contendo meio de cultura para Drosophila (820mL de água; 25g de
fermento biológico; 11g de ágar; 150g de banana e 1g de nipagin).
Foram realizados os cruzamentos: 1] padrão (ST) (fêmeas virgens flare-
3 cruzadas com machos mwh) (Graf et al., 1984, 1989); e 2] de alta capacidade
de bioativação metabólica (HB) (fêmeas virgens ORR; flr-3 cruzadas com
machos mwh) (Graf e van Schaik, 1992).
57
Os ovos foram coletados durante um período de 8 horas em frascos
contendo uma base sólida de ágar (3% de ágar em água) e uma camada de
fermento suplementado com sacarose. Após 72 ± 4 h, as larvas de 3º estágio
foram lavadas com água corrente e coletadas com auxílio de uma peneira de
malha fina e transferidas para frascos contendo 1,5 g de meio de cultura
alternativo (purê de batata instantâneo, Yoki®) e 5 mL das diferentes
concentrações de EAA derivados sintéticos da testosterona (HEM, DEC e
DUR). Como controle positivo de todos os experimentos foi utilizado URE
(0,891 mg/mL). Para os controles negativos, os solventes empregados nas
diluições das substâncias químicas (água destilada estéril nos experimentos
com HEM e solução de tween-80 3% e etanol 1% em água destilada estéril
para os experimentos com DEC e DUR). Os tratamentos foram realizados por
um período de aproximadamente 48 horas (tratamento crônico), em frascos
âmbar, para evitar a possibilidade de foto-degradação dos compostos.
Preparação das lâminas e análise do material
Adultos emergentes de ambos cruzamentos (ST e HB), portadores dos
genótipos trans-heterozigotos marcados - MH (mwh + / + flr
3
) e heterozigotos
balanceados - BH (mwh + / + TM3, Bd
S
) foram coletados e conservados em
etanol 70%. As asas foram extraídas das moscas com auxílio de microscópio
estereoscópico, Olimpus
®
, utilizando-se um par de pinças entomológicas. As
asas foram fixadas entre lâmina e lamínula com solução de Faure (30g de
goma arábica, 20ml de glicerol, 50g de hidrato cloral e 50ml de água) e
analisadas, quanto à ocorrência de diferentes tipos de manchas mutantes, em
microscópio óptico de luz, marca Olimpus
®
, com aumento de 400 X.
Os adultos são diferenciados fenotipicamente, pois o marcador Bd
S
(presente nos descendentes BH) provoca, durante a metamorfose, um recorte
na borda das asas, deixando-as com aspecto serrilhado, enquanto que os
adultos MH apresentam asas com bordas lisas (Graf et al., 1984).
Durante a análise das lâminas foi registrado o número de manchas
mutantes, assim como o tipo e tamanho (número de células mutantes na
mancha).
58
Tratamento estatístico dos dados
A análise estatística dos dados foi feita de acordo com o teste do X
2
para
proporções, bicaudal, com nível de significância: α=β=0,05 de acordo com Frei
e Würgler (1988), comparando as freqüências obtidas com os grupos tratados
e controle.
59
Resultados e discussão
Os três EAA derivados sintéticos da testosterona, Hemogenin® (HEM);
Deca Durabolin® (DEC) e Durateston® (DUR), investigados neste trabalho,
foram escolhidos devido à sua ampla e indiscriminada utilização por atletas e
fisiculturistas, sem conhecimento de possíveis efeitos adversos, tais como
efeitos genotóxicos. Para avaliar comparativamente o potencial genotóxico
desses EAA, duas versões do SMART de asa em Drosophila (cruzamentos ST
e HB) foram usados em dois experimentos repetidos. Os resultados obtidos em
cada experimento foram agrupados, após verificar que não havia diferenças,
estatisticamente significativas, entre os experimentos individuais.
Os resultados obtidos na análise dos descendentes trans-heterozigotos
marcados (MH) dos cruzamentos ST e HB, tratados com diferentes
concentrações de HEM (0,625; 1,25 e 2,5 mg/mL); DEC (0,15625; 0,3125;
0,625; 1,25 e 2,5 mg/mL) e DUR (0,195; 0,39; 0,78; 1,56 e 3,125 mg/mL) e
seus respectivos controles positivo (URE 0,891 mg/mL) e negativo (água
destilada estéril ou 1% Tween-80 + 3% etanol em água), estão apresentados
nas Tabelas 2.2, 2.3 e 2.4.
As freqüências de manchas mutantes (simples pequenas, simples
grandes e gêmeas), assim como o total de manchas, observadas nos tratados
com as diferentes concentrações de HEM, DEC e DUR, foram estatisticamente
não significativas ou inconclusivas (α>0,05) quando comparadas com as
freqüências de manchas mutantes observadas em seus respectivos controles
negativo, para ambos os cruzamentos (ST e HB).
As Figuras 2.1, 2.2 e 2.3, mostram a distribuição das freqüências de
manchas por classe (número células mutantes/mancha) observadas em asas
de descendentes MH, provenientes dos cruzamentos ST e HB, tratados,
respectivamente, com HEM, DEC e DUR e seus respectivos controles negativo
e positivo.
O tratamento crônico de indivíduos MH com HEM, DEC e DUR, resultou
em uma distribuição no tamanho de manchas mutantes, na qual as manchas
simples pequenas (com uma célula) predominam, enquanto que as manchas
maiores aparecem em freqüência decrescente, de acordo com o aumento do
60
número de células mutantes presentes nas manchas. Estes resultados estão
de acordo com o descrito por Graf et al. (1984); Rodriguez-Arnaiz et al. (1996)
e Spanó et al. (2001).
A prevalência de manchas pequenas, observadas nas asas dos
descendentes MH de ambos os cruzamentos (ST e HB), demonstra que em
todos os tratamentos, com todas as substâncias químicas, assim como nos
respectivos controles, as mutações nas células dos discos imaginais de asas
ocorreram numa fase tardia do desenvolvimento das larvas de D.
melanogaster. Manchas formadas em estágios iniciais do desenvolvimento
apresentam maior número de células, que é o caso da menor quantidade de
manchas encontradas neste experimento.
Não houve diferenças estatisticamente significativas, nas freqüências
totais de manchas mutantes, encontradas nos indivíduos dos grupos controle
negativo, quando comparado com as freqüências observadas nos tratados com
as diferentes concentrações dos EAA derivados sintéticos da testosterona
HEM, DEC e DUR do cruzamento ST, quando comparado com os resultados
observados, respectivamente, nesses mesmos grupos de tratamento, do
cruzamento HB.
Os resultados negativos encontrados nos descendentes do cruzamento
HB, permitem concluir que nas condições experimentais utilizadas, HEM, DEC
e DUR não são agentes pró-mutágenos, e que as enzimas citocromo P450,
altamente expressas na linhagem “ORR; flr
3
” não interferem no potencial
genotóxico dessas substâncias.
As diferenças estatisticamente significativas observadas nas
freqüências de manchas mutantes dos controles positivo (URE) de ambos os
cruzamentos (ST e HB) comprova que URE é um pró-mutágeno, que tem sua
genotoxidade potencializada pelas enzimas citocromo P450, presentes em
maior quantidade nos indivíduos descendentes do cruzamento HB.
Katz e Foley (1993) verificaram que temperaturas abaixo e acima de
25ºC induzem aumentos nas freqüências de mutações espontâneas em D.
melanogaster, sendo que as temperaturas em torno de 25ºC são as que
induzem menores taxas de mutação. Assim sendo, neste trabalho, durante o
período de tratamento, as larvas foram mantidas em estufa B.O.D. (Biological
61
Oxygen Demand), sob temperatura controlada de 25 ± 1ºC, para evitar
oscilações de temperatura que pudessem interferir nos resultados obtidos.
Os cruzamentos ST e HB permitem a obtenção de descendentes MH,
identificados fenotipicamente pela borda lisa das asas; e descendentes BH,
identificados pela borda da asa recortada. Quando o aumento na freqüência de
manchas mutantes observado nos descendentes MH é estatisticamente
significativo, indica a ocorrência de mutações de ponto, aberrações
cromossômicas e recombinações mitóticas. Assim sendo, devem ser
analisados os descendentes BH, nos quais as freqüências de manchas
mutantes são devidas apenas às mutações de ponto e aberrações
cromossômicas. A diferença entre as freqüências de manchas mutantes
detectadas nos indivíduos MH e BH representa a freqüência de recombinação
mitótica. Como os resultados obtidos com os descendentes MH tratados com
as substâncias químicas testadas (HEM, DEC e DUR), nas diferentes
concentrações, foram estatisticamente não significativos em ambos os
cruzamentos, não se justifica a análise dos indivíduos BH.
Foi verificado um aumento estatisticamente significativo (α<0,05) nas
freqüências de manchas mutantes simples pequenas, e no total de manchas,
nos descendentes MH do cruzamento ST tratados com URE, quando
comparado com as freqüências de manchas mutantes observadas no controle
negativo (água destilada estéril) dos experimentos com HEM. Nos lotes de
experimentos com DEC e DUR, foi verificado nos descendentes MH do
cruzamento ST tratados com URE, um aumento estatisticamente significativo
(α<0,05) nas freqüências de manchas mutantes simples pequenas, simples
grandes, e no total de manchas, quando comparado com o controle negativo
(1% Tween-80 + 3% etanol em água).
Nos descendentes MH do cruzamento HB, tratados com URE, foi
verificado um aumento estatisticamente significativo (α<0,05) nas freqüências
de todas as classes de manchas (simples pequenas, simples grandes e
gêmeas) e no total de manchas, quando comparado com as freqüências de
manchas mutantes dos controles negativos de todos os experimentos (HEM,
DEC e DUR).
62
Uma vez observado o efeito positivo do URE, é possível afirmar que os
resultados negativos obtidos com os EAA derivados sintéticos da testosterona,
contidos nas substâncias químicas utilizadas, são resultados legítimos e não
deficiência ou artefato da metodologia empregada.
HEM não apresentou efeitos genotóxicos, quando avaliado por meio do
teste de troca entre cromátides irmãs em linfócitos humanos, na presença e na
ausência de ativação metabólica (Ahmad et al., 2003); e em ensaios com
microrganismos e com células de mamíferos (aberrações cromossômicas em
linfócitos humanos in vitro; e teste de micronúcleos em eritrócitos de sangue
periférico de roedores) (Holden et al., 1999).
Não foram encontrados relatos na literatura de estudos de genotoxidade
para as demais substâncias químicas avaliadas neste trabalho (DEC e DUR).
Resultados negativos também são descritos por Lang e Reimann (1993)
e Lang e Redmann (1979), em testes com Salmonella/microssoma e linhagens
de células V79 de hamster chinês; e Reimann et al. (1996), em testes de
aberrações cromossômicas em linfócitos humanos e micronúcleo em medula
óssea de camundongo, que avaliaram outros derivados de hormônios
esteróides.
É importante considerar que testes com Salmonella/microssoma
detectam apenas mutações de pequeno tamanho, o que se considera uma
alteração em um número pequeno de pares de bases. Testes de aberrações
cromossômicas e micronúcleo, por sua vez, já detectam alterações genéticas
de maior tamanho, envolvendo, geralmente, quebras cromossômicas com
proporções maiores de material genético. Alterações genéticas envolvendo
proporções intermediárias de DNA e, ainda, a recombinação gênica, não
seriam detectadas por estes testes tradicionais.
O teste de mutação e recombinação somática (SMART) desenvolvido
por Graf et al. (1984) apresenta, além de todas as outras vantagens já
descritas anteriormente, a capacidade de detectar um espectro maior de
variabilidade de alterações genéticas, incluindo especialmente a recombinação
somática, um dos principais fatores relacionados com a carcinogênese. Os
resultados negativos obtidos com as quatro substâncias químicas mostram que
também não possuem efeito recombinogênico.
63
Os resultados observados neste trabalho nos permitem concluir que, nas
condições experimentais utilizadas, os EAA derivados sintéticos da
testosterona Hemogenin® (HEM), Deca Durabolin® (DEC) e Durateston®
(DUR), não possuem efeitos genotóxicos (mutagênicos, clastogênicos e/ou
recombinogênicos) em células somáticas de D. melanogaster, tanto na
presença quanto na ausência de ativação metabólica pelo sistema enzimático
citocromo P450.
64
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71
Tabela 2.1 - Esteróides anabólico-androgênicos derivados de testosterona utilizados nos tratamentos de larvas de Drosophila
melanogaster para o teste de detecção de mutação e recombinação somática
Nome
comercial
Princípio ativo
Conteúdo
(mg)
CAS N° Apresentação Excipiente Fabricante Lote
Hemongenin®
(HEM)
Oximetolona 50 434-07-1 Comprimido
Amido de milho,
estearato de
magnésio, lactose
monohidratada e
povidona K30
Aventis Pharma
Ltda.
(Suzano – SP)
500867
Deca-Durabolin®
(DEC)
Decanoato de nandrolona 50 360-70-03
Solução injetável em
ampola de 1mL
Óleo de amendoin e
álcool benzílico
Organon
(São Paulo - SP)
18124
Durateston®
(DUR)
Propionato de testosterona
Fempropionato de
testosterona
Isocaproato de testosterona
Decanoato de testosterona
30
60
60
100
57-85-2
1255-49-8
15262-86-9
5721-91-5
Solução injetável em
ampola de 1mL
Óleo de amendoin e
álcool benzílico
Organon do Brasil
(São Paulo - SP)
18042
72
Tabela 2.2 - Freqüências de manchas mutantes observadas em asas de descendentes heterozigotos marcados (MH) de D.
melanogaster dos cruzamentos padrão (ST) e de alta capacidade de bioativação metabólica (HB), após tratamento crônico (~ 48h)
com diferentes concentrações (0,625; 1,25 e 2,5 mg/mL) do anabolizante Hemogenin® (HEM), e seus respectivos controles
negativo (água destilada estéril) e positivo (URE 0,891 mg/mL)
Tratamentos
N
o
de
moscas
(n)
Manchas por indivíduo (n
o
de manchas) diagnóstico estatístico
a
Total de
manchas
mwh
c
Manchas simples
pequenas
(1-2 céls)
b
M = 2
Manchas
simples grandes
(>2 céls)
b
m = 5
Manchas
gêmeas
m = 5
Total de manchas
m = 2
Concentrações
(mg/mL)
Cruzamento ST
Controle negativo
50 0,32
(16) 0,06
(03) 0,02
(01) 0,40
(20) 20
Hem 0,625 50 0,26
(13) - 0,04
(02) i 0,02
(01) i 0,32
(16) - 16
Hem 1,25 53 0,28
(15) - 0,04
(02) i 0,00
(00) i 0,32
(17) - 17
Hem 2,5 50 0,42
(21) i 0,00
(00) - 0,00
(00) i 0,42
(21) - 20
Controle positivo 50 1,34
(67) + 0,16
(08) i 0,06
(03) i 1,56
(78) + 78
Cruzamento HB
Controle negativo 50 0,36
(18) 0,08
(04) 0,02
(01) 0,46
(23) 22
Hem 0,625 50 0,46
(23) i 0,04
(02) i 0,00
(00) i 0,50
(25) - 25
Hem 1,25 50 0,42
(21) i 0,02
(01) - 0,00
(00) i 0,44
(22) - 22
Hem 2,5 50 0,28
(14) - 0,08
(04) i 0,06
(03) i 0,42
(21) - 21
Controle positivo 50 4,84
(242) + 0,86
(43) + 0,72
(36) + 6,42
(321) + 316
a
Diagnóstico estatístico de acordo com Frei e Würgler (1988): +, positivo; -, negativo; i, inconclusivo. m, fator de multiplicação para a avaliação
de resultados significativamente negativos. Níveis de significância α = β = 0,05.
b
Incluindo manchas simples flr
3
raras.
c
Considerando os clones mwh para as manchas simples mwh e para as manchas gêmeas.
73
Tabela 2.3 - Freqüências de manchas mutantes observadas em asas de descendentes heterozigotos marcados (MH) de D.
melanogaster dos cruzamentos padrão (ST) e de alta capacidade de bioativação metabólica (HB), após tratamento crônico (~ 48h)
com diferentes concentrações (0,15625; 0,3125; 0,625; 1,25 e 2,5 mg/mL) do anabolizante Deca Durabolin® (DEC), e seus
respectivos controles negativo (1% Tween-80 + 3% etanol em água) e positivo (URE 0,891 mg/mL)
Tratamentos
N
o
de
moscas
(n)
Manchas por indivíduo (n
o
de manchas) diagnóstico estatístico
a
Total de
manchas
mwh
c
Manchas simples
pequenas
(1-2 céls)
b
M = 2
Manchas
simples grandes
(>2 céls)
b
m = 5
Manchas
gêmeas
m = 5
Total de manchas
m = 2
Concentrações
(mg/mL)
Cruzamento ST
Controle negativo 50 0,42 (21) 0,02 (01) 0,10 (05) 0,54 (27) 27
DEC 0,15625 58 0,29 (17) - 0,07 (04) i 0,02 (01) - 0,38 (22) - 22
DEC 0,3125 48 0,38 (18) - 0,04 (02) i 0,04 (02) i 0,46 (22) - 21
DEC 0,625 43 0,33 (14) - 0,05 (02) i 0,02 (01) - 0,40 (17) - 17
DEC 1,25 40 0,25 (10) - 0,00 (00) i 0,00 (00) - 0,25 (10) - 10
DEC 2,5 29 0,21 (06) - 0,03 (01) i 0,00 (00) - 0,24 (07) - 7
Controle positivo 50 1,20 (60) + 0,14 (07) + 0,10 (05) i 1,44 (72) + 72
Cruzamento HB
Controle negativo 55 0,33
(18) 0,07
(04) 0,05
(03) 0,45
(25) 25
DEC 0,15625 61 0,31
(19) - 0,05
(03) i 0,05
(03) i 0,41
(25) - 24
DEC 0,3125 59 0,25
(15) - 0,07
(04) i 0,07
(04) i 0,39
(23) - 23
DEC 0,625 60 0,28
(17) - 0,05
(03) i 0,03
(02) i 0,37
(22) - 21
74
Tabela 2.3 (cont.)
DEC 1,25 79 0,32
(25) - 0,11
(09) i 0,04
(03) i 0,47
(37) - 37
DEC 2,5 57 0,37
(21) i 0,02
(01) - 0,05
(03) i 0,44
(25) - 22
Controle positivo 60 5,22
(313) + 1,02
(61) + 0,87
(52) + 7,10
(426) + 417
a
Diagnóstico estatístico de acordo com Frei e Würgler (1988): +, positivo; -, negativo; i, inconclusivo. m, fator de multiplicação para
a avaliação de resultados significativamente negativos. Níveis de significância α = β = 0,05.
b
Incluindo manchas simples flr
3
raras.
c
Considerando os clones mwh para as manchas simples mwh e para as manchas gêmeas.
75
Tabela 2.4 - Freqüências de manchas mutantes observadas em asas de descendentes heterozigotos marcados (MH) de D.
melanogaster dos cruzamentos padrão (ST) e de alta capacidade de bioativação metabólica (HB), após tratamento crônico (~ 48h)
com diferentes concentrações (0,195; 0,39; 0,79; 1,56 e 3,125 mg/mL) do anabolizante Durateston® (DUR), e seus respectivos
controles negativo (1% Tween-80 + 3% etanol em água) e positivo (URE 0,891 mg/mL)
Tratamentos
N
o
de
moscas
(n)
Manchas por indivíduo (n
o
de manchas) diagnóstico estatístico
a
Total de
manchas
mwh
c
Manchas simples
pequenas
(1-2 céls)
b
M = 2
Manchas
simples grandes
(>2 céls)
b
m = 5
Manchas
gêmeas
m = 5
Total de manchas
m = 2
Concentrações
(mg/mL)
Cruzamento ST
Controle negativo 53 0,38
(20) 0,08
(04) 0,06
(03)
0,51
(27) 29
DUR 0,195 45 0,36
(16) - 0,07
(03) i 0,09
(04)
i 0,51
(23) - 35
DUR 0,39 58 0,28
(16) - 0,02
(01) - 0,02
(01)
i 0,31
(18) - 45
DUR 0,78 50 0,44
(22) i 0,12
(06) i 0,02
(01)
i 0,58
(29) - 45
DUR 1,56 32 0,19
(06) - 0,06
(02) i 0,06
(02)
i 0,31
(10) - 41
DUR 3,125 36 0,25
(09) - 0,06
(02) i 0,03
(01)
i 0,33
(12) - 12
Controle positivo 50 1,14
(57) + 0,24
(12) + 0,14
(07)
i 1,52
(76) + 76
Cruzamento HB
Controle negativo 54 0,69
(37) 0,11
(06) 0,11
(06)
0,91
(49) 49
DUR 0,195 40 0,53
(21) - 0,05
(02) i 0,03
(01)
- 0,60
(24) - 23
DUR 0,39 54 0,48
(26) - 0,17
(09) i 0,09
(05)
i 0,74
(40) - 39
DUR 0,78 50 0,76
(38) - 0,06
(03) i 0,04
(02)
- 0,86
(43) - 43
76
Tabela 2.4 (cont.)
DUR 1,56 45 0,78
(35) - 0,16
(07) i 0,07
(03)
i 1,00
(45) - 45
DUR 3,125 38 0,63
(24) - 0,11
(04) i 0,03
(01)
- 0,76
(29) - 29
Controle positivo 54 5,52
(298) + 0,78
(42) + 0,35
(19)
+ 6,65
(359) + 357
a
Diagnóstico estatístico de acordo com Frei e Würgler (1988): +, positivo; -, negativo; i, inconclusivo. m, fator de multiplicação para
a avaliação de resultados significativamente negativos. Níveis de significância α = β = 0,05.
b
Incluindo manchas simples flr
3
raras.
c
Considerando os clones mwh para as manchas simples mwh e para as manchas gêmeas.
77
Tamanho das manchas (n
o
de células/mancha)
ST - HEM
Tamanho das manchas (n
o
de células/mancha)
HB - HEM
Freqüências de
manchas
A
Freqüências de
manchas
B
78
Figura 2.1 - Distribuição das freqüências de manchas por classes (número de
células/mancha) observadas em asas de descendentes heterozigotos
marcados (MH) de Drosophila melanogaster dos cruzamentos: A - padrão (ST)
e B - de alta capacidade de bioativação metabólica (HB), obtidas por meio do
teste para detecção de mutação e recombinação somática, tratadas com as
diferentes concentrações de Hemogenin® (HEM) (0,625; 1,25 e 2,5mg/mL) e
seus respectivos controles positivo (URE 0,891 mg/mL) e negativo (água
destilada estéril).
79
Tamanho das manchas (n
o
de células/mancha)
Tamanho das manchas (n
o
de células/mancha)
ST - DEC
HB - DEC
Freqüências de
manchas
A
Freqüências de
manchas
B
80
Figura 2.2 - Distribuição das freqüências de manchas por classes (número de
células/mancha) observadas em asas de descendentes heterozigotos marcados (MH)
de Drosophila melanogaster dos cruzamentos: A - padrão (ST) e B - de alta
capacidade de bioativação metabólica (HB), obtidas por meio do teste para detecção
de mutação e recombinação somática, tratadas com as diferentes concentrações de
Deca Durabolin® (DEC) (0,15625; 0,3125; 0,625; 1,25 e 2,5mg/mL) e seus respectivos
controles positivo (URE 0,891 mg/mL) e negativo (1% Tween-80 + 3% etanol em
água).
81
Freqüências de
manchas
Tamanho das manchas (n
o
de células/mancha)
ST - DUR
A
Freqüências de
manchas
Tamanho das manchas (n
o
de células/mancha)
HB - DUR
B
82
Figura 2.3. Distribuição das freqüências de manchas por classes (número de
células/mancha) observadas em asas de descendentes heterozigotos
marcados (MH) de Drosophila melanogaster dos cruzamentos: A - padrão (ST)
e B - de alta capacidade de bioativação metabólica (HB), obtidas por meio do
teste para detecção de mutação e recombinação somática, tratadas com as
diferentes concentrações de Durateston® (DUR) (0,195; 0,39; 0,78; 1,56 e
3,125mg/mL)e seus respectivos controles positivo (URE 0,891 mg/mL) e
negativo (1% Tween-80 + 3% etanol em água).
83
CAPÍTULO III
Efeitos inibidores do estanozolol sobre ação genotóxica do etilcarbamato
em células somáticas de Drosophila melanogaster
84
Manuscrito para Environmental and Molecular Mutagenesis 03-10-2007
Efeitos inibidores do estanozolol sobre ação genotóxica do etilcarbamato
em células somáticas de Drosophila melanogaster
Bruno Lassmar Bueno Valadares e Mário Antônio Spanó
Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia,
Uberlândia (MG) Brasil
Running title: Efeitos protetores do estanozolol em Drosophila melanogaster
Autor para correspondência: Mário Antônio Spanó, Universidade Federal de
Uberlândia, Instituto de Genética e Bioquímica, Laboratório de Mutagênese,
Bloco D – sala 2D52, Campus Umuarama, 38400-902 Uberlândia (MG) Brasil.
Tel. +55 34 3218 2505.
E-mail: [email protected]
85
Fontes de financiamento:
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais
Universidade Federal de Uberlândia
86
Palavras chave: Winstrol Depot, Teste de Mutação e Recombinação Somática
– SMART, uretano.
87
Resumo
Estanozolol, nome commercial Winstrol Depot®, é um derivado sintético da
testosterona, usado no tratamento de anemias, angioedema hereditário e
como esteróide anabólico androgênico (EAA) por atletas fisiculturistas. Este
composto interage com o citocromo P450, formando um complexo com alta
afinidade de ligação. Este trabalho avaliou, por meio do Teste de Mutação e
Recombinação somática (Somatic Mutation and Recombination Test -
SMART) os efeitos do estanozolol associado ao uretano (URE), um conhecido
agente genotóxico ativado metabolicamente pelo citocromo P450. Larvas de
terceiro estágio provenientes dos cruzamentos padrão (ST), fêmeas flr3 /
In(3LR) TM3, ri p
p
sep l(3)89Aa bx
34e
e Bd
S
cruzadas com machos mwh, e de
alta capacidade de ativação metabólica (HB), fêmeas ORR; flr3 / In(3LR) TM3,
ri p
p
sep l(3)89Aa bx
34e
e Bd
S
cruzadas com machos mwh. Foram tratadas
aproximadamente por um período de 48h com difentes concentrações (0.625;
1.25 e 2.5 mg/mL) de WIN isoladamente e em associação com URE (0,891
mg/mL). Os resultados observados em ambos os cruzamentos sugerem que
WIN, nestas condições experimentais não apresentaram atividade
mutagênica, e, nos tratamentos combinados de WIN e URE, foi observado em
todas as concentrações de WIN testadas, uma inibição dos efeitos do URE.
Provavelmente, este efeito é um resultado da interação entre o WIN e o P450.
A redução da atividade genotóxica do URE foi diretamente proporcional á
dose de WIN. Este trabalho sugere a necessidade de mais estudos
relacionados ao metabolismo de agentes xenobióticos, como os EAA, pelo
citocromo P450 e sua relação com a carcinogênese.
88
Key words: Winstrol Depot, Somatic Mutation and Recombination Test –
SMART, uretano.
89
Abstract
Stanozolol, commercial name Winstrol® (WIN), is a synthetic derivative of
testosterone, used for the treatment of anemia, hereditary angioedema and
used by sportsmen like anabolic-androgenic steroid. This drug interacts with
cytocrome P450, forming a high-affinity ligand complex. This study evaluated,
by means of wing spot test of Drosophila melanogaster (Somatic Mutation and
Recombination Test - SMART), the effects of stanozolol associated with
urethane (URE), known genotoxic agent metabolized by cytocrome P450.
Third-instar larvae derived from standard cross (ST), where flr3 / In(3LR) TM3,
ri p
p
sep l(3)89Aa bx
34e
e Bd
S
females were mated with mwh males, and high
bioactivation cross (HB), where ORR; flr3 / In(3LR) TM3, ri p
p
sep l(3)89Aa
bx
34e
e Bd
S
females were mated with mwh males, were treated approximately
48 h with different concentrations (0.625; 1.25 e 2.5 mg/mL) of WIN isolated
and in association with URE (0.891 mg/mL). The results observed in both
crosses suggest that WIN at these experimental conditions, showed non-
mutagenic effects and combined treatment of WIN and URE displayed,
throughout all concentrations assayed, an inhibition of the effects of URE by
WIN, probably this effect is a result of the inhibit-interaction among WIN and
cytocrome P450. The relactive proportion of this inhibition was proportional to
the concentrations applied. This work proposes the necessity of more studies
about metabolism of xenobiotcs agents, like EAA, by cytocrome P450 and their
relation with genotoxicity.
90
Introdução
O estanozolol, conhecido comercialmente como Winstrol Depot® (WIN),
é um esteróide androgênico anabólico (EAA) sintético derivado da testosterona,
utilizado no tratamento da anemia (Reynolds e Prasad apud Rendic e Ruf,
1988), e do angioedema hereditário, para diminuir a freqüência e a severidade
das crises (Sanofi-Synthelabo, 1999). Este EAA é usado por praticantes de
musculação, geralmente em combinação com outros agentes anabolizantes,
assim como com suplementos, que melhoram o condicionamento físico, sendo
listado entre os anabolizantes mais utilizados por homens e mulheres
fisiculturistas (Tricker et al., 1989; Manetta e Silveira, 2000; Mottram e George,
2000; Iriart e Andrade, 2002; Silva et al., 2002; Santos et al., 2006).
Organismos vivos expostos a agentes xenobióticos apresentam
respostas biológicas (farmacológicas ou tóxicas) que geralmente dependem da
conversão da substância absorvida em um metabólito ativo ou não (Oshima-
Franco e Franco, 2003). A biotransformação de agentes xenobióticos ocorre no
interior das células, promovidas por enzimas que modificam estas substâncias,
geralmente lipossolúveis, em estruturas polares, solúveis em água e de fácil
eliminação (Meyer, 1996). Os agentes xenobióticos podem, na
biotransformação, ser inativados, ou gerar metabólitos com maior atividade ou
com propriedades tóxicas, mutagênicas, teratogênicas e carcinogênicas
(Oshima-Franco e Franco, 2003).
As enzimas microssomais do fígado, citocromo P450, formam uma
grande família de hemoproteínas envolvidas especialmente no metabolismo de
substâncias (agentes xenobióticos), como também na biossíntese de lipídeos,
esteróides, vitaminas e outros metabólitos naturais das células (Chefson e
Auclair, 2006), sendo essenciais para todo organismo vivo, tanto procariontes
quanto eucariontes (Nebert e Gonzalez, 1987; Nebert et al., 1989).
Interações entre o estanozolol e enzimas citocromo P450, obtidas de
fígado de roedores, formando um complexo com alta afinidade de ligação, são
descritas por Rendic e Ruf (1988). Nakajin et al. (1989) relatam a inibição de
91
enzimas citocromo P450 de testículos de suínos, devido à interação com o
estanozolol.
Efeitos adversos, tais como efeitos carcinogênicos, têm sido atribuídos a
tratamentos com hormônios androgênicos como o estanozolol (Sanofi-
Synthelabo, 1999) e outros derivados de hormônios sexuais como estradiol,
testosterona (Carrasco et al., 1985; Taylor, 1987; Anthony, 1988; Froehner et
al., 1999; Socas et al., 2005; Bosland, 2006; Giannitrapani et al., 2006; Ricke et
al., 2006; Gorayski et al., 2007). No entanto, não há na literatura especializada,
trabalhos que comprovem os efeitos genotóxicos e carcinogênicos destas
substâncias.
A Drosophila melanogaster é um organismo eucarionte muito bem
caracterizado genéticamente, que apresenta curto período de geração,
pequeno número de cromossomos, e sistema enzimático (citocromo P450)
semelhante ao de mamíferos (Baars, 1980 apud Graf et al., 1984). A D.
melanogaster é utilizada na detecção de agentes genotóxicos diretos e
indiretos, por meio do teste de mutação e recombinação somática (“Somatic
Mutation and Recombination Test” – SMART), desenvolvido por Graf et al.
(1984), um teste rápido, barato e que produz resultados confiáveis, inequívocos
e altamente reproduzíveis.
A influência do sistema enzimático citocromo P450, na atividade
genotóxica de agentes químicos, pode ser verificada pelo SMART devido à
utilização de dois tipos de cruzamentos distintos: 1] cruzamento padrão (ST)
(machos da linhagem "mwh" (mwh +/ mwh +) cruzados com fêmeas virgens da
linhagem "flr
3
" (+ flr
3
/ + TM3, Bd
S
) (Graf et al., 1984, 1989); 2] cruzamento de
alta capacidade de bioativação metabólica (HB) (machos "mwh" (mwh +/ mwh
+) cruzados com fêmeas virgens "ORR; flr
3
" (ORR/ORR; + flr
3
/ +TM3 Bd
S
)
(Graf e van Schaik, 1992). A linhagem "ORR; flr
3
" difere da linhagem "flr
3
" por
apresentar os cromossomos 1 e 2 provenientes da linhagem Oregon R,
construída por Frölich e Würgler (1989), com genes para resistência ao DDT, e
uma maior expressão das enzimas citocromo P450 (Hällström e Blanck, 1985
apud Graf e van Schaik, 1992), as quais são responsáveis pela metabolização
e ativação de promutágenos e procarcinógenos (Dapkus e Marell, 1977 apud
Guzmán-Rincón e Graf, 1995).
92
Este trabalho teve como objetivo avaliar a genotoxicidade do WIN,
isoladamente, e os seus efeitos moduladores, quando associado ao pró-
mutágeno etilcarbamato (uretano - URE), por meio do SMART de asa de D.
melanogaster.
93
Material e métodos
Agentes químicos
Winstrol Depot® (WIN), estanozolol (7β-hidroxi-17-metil-5α-
androstano[3,2-c]pirazol; C
21
H
32
N
2
O; massa molecular 328,49; CAS N
o
10418-
03-8; apresentado na forma de solução injetável, em ampolas de 1mL;
distribuído por Zambon Laboratórios Farmacêuticos LTDA., São Paulo - SP –
Brasil. Etilcarbamato (Uretano - URE); (C
3
H
7
NO
2
/NH
2
COOC
2
H
5
; massa
molecular 89,09; CAS N° 51-79-6; fabricado por Fluka Chemie AG (Buchs,
Switzerland). As substâncias químicas foram diluídas em água destilada estéril,
imediatamente antes do uso. A Figura 3.1 mostra as fórmulas estruturais do
WIN e URE.
Linhagens de moscas, cruzamentos e tratamentos
Foram utilizadas as linhagens de Drosophila melanogaster "multiple wing
hairs" (mwh), flare
3
(flr
3
) e "Oregon R, flare
3
" (ORR; flr
3
). A linhagem "mwh"
(com constituição genética y; mwh jv) possui o marcador mwh que se localiza
no cromossomo 3 (3-3,0) e que tem sua manifestação fenotípica caracterizada
por três ou mais pêlos por célula da asa. A linhagem "flr
3
" (de constituição
genética flr
3
/ ln(3LR)TM3, ri p
p
sep l(3)89Aa bx
34e
e Bd
S
) possui o marcador
flr
3
, também no cromossomo 3, numa posição mais proximal (3-38,8) e sua
manifestação fenotípica é caracterizada por um pêlo modificado em forma de
chama. Sendo o marcador flr
3
letal em homozigose, esta linhagem apresenta
um cromossomo balanceador TM3, Bd
S
(Third Multiple 3, beaded-serrate) que
mantém sua heterozigose (Graf et al., 1984; Guzmán-Rincón e Graf, 1995). A
presença deste balanceador é caracterizada fenotipicamente pela borda
serrilhada da asa e também impede a ocorrência de recombinações, devido à
presença de múltiplas inversões neste cromossomo (Lindsley e Zimm, 1992,
apud Graf et al., 1996).
94
Estas linhagens foram mantidas em frascos de 1/4 de litro contendo
meio de cultura para Drosophila (820mL de água; 25g de fermento biológico -
Sacharomyces cerevisae; 11g de ágar; 150g de banana e 1g de nipagin).
Foram realizados os seguintes cruzamentos: 1] cruzamento padrão
(ST) (Graf et al., 1984, 1989), no qual fêmeas virgens da linhagem “flr
3
” foram
cruzadas com machos “mwh” ; 2] cruzamento de alta capacidade de
bioativação metabólica (HB) (Graf e van Schaik, 1992), no qual fêmeas
virgens “ORR; flr
3
” foram cruzadas com machos “mwh”.
Ovos de ambos os cruzamentos foram coletados durante um período de
8 horas em frascos contendo uma base sólida de ágar (3% de ágar em água) e
uma camada de fermento biológico (S. cerevisae) suplementado com sacarose.
Após 72 ± 4 h, larvas de terceiro estágio provenientes dos cruzamentos
ST e HB foram lavadas com água corrente e coletadas com auxílio de uma
peneira de malha fina e transferidas para os frascos de tratamento contendo
1,5 g de meio de cultura alternativo (purê de batata instantâneo, Yoki®) e 5 mL
de diferentes concentrações (0,625; 1,25 e 2,5 mg/mL) de WIN, isoladamente,
e associadas a URE 0,891 mg/mL. Como controles negativo e positivo foram
utilizados, respectivamente, água destilada esterilizada e URE (0,891 mg/mL).
Os tratamentos foram realizados em frascos âmbar para evitar a
possibilidade de fotodegradação dos compostos. As larvas foram submetidas a
tratamento crônico, por um intervalo de tempo de aproximadamente 48 horas,
até o período em que estas sobem às paredes do frasco, passando ao estágio
de pupa. Durante esse período as larvas permaneceram em condições de
temperatura ambiente controlada (25
o
C) em câmara BOD (“Biological Oxigen
Demand”) apropriada para manutenção de linhagens de D. melanogaster. De
acordo com Katz e Foley (1993), temperaturas abaixo e muito diferentes de
25ºC induzem aumentos na freqüência de mutações espontâneas em
Drosophila melanogaster.
Preparação das lâminas e análise do material
Adultos emergentes portadores dos dois tipos de genótipos trans-
heterozigotos marcados - MH (mwh + / + flr
3
) e heterozigotos balanceados - BH
95
(mwh + / + TM3, Bd
S
) foram coletados e conservados em etanol 70%. As asas
foram extraídas das moscas sob microscópio estereoscópico, marca Olimpus
®
,
utilizando-se um par de pinças entomológicas. As asas foram fixadas entre
lâmina e lamínula com solução de Faure (30g de goma arábica, 20ml de
glicerol, 50g de hidrato cloral e 50ml de água) e analisadas, quanto à
ocorrência de diferentes tipos de manchas mutantes, em microscópio óptico de
luz, marca Olimpus
®
, com aumento de 400 X.
Os adultos são diferenciados fenotipicamente, pois o marcador TM3, Bd
S
provoca, durante a metamorfose, um recorte na borda das asas, deixando-as
com aspecto serrilhado, enquanto que os adultos trans-heterozigotos
apresentam a borda da asa lisa (Graf et al., 1984).
Análise estatística
Durante a leitura das lâminas foi registrado o número de manchas
mutantes, assim como o tipo e tamanho das mesmas. A análise estatística dos
experimentos de genotoxicidade foi feita de acordo com o teste do X
2
para
proporções, bicaudal, com nível de significância: α=β=0,05 de acordo com Frei
e Würgler (1988). Para avaliar o efeito modulador da genotoxidade, as
freqüências de cada tipo de mancha por mosca foram comparadas aos pares
(i.e. URE isoladamente vs. URE associado ao WIN) empregando o teste-U, não
paramétrico, de Mann-Whitney e Wilcoxon, de acordo com Frei e Würgler
(1995).
96
Resultados e discussão
O EAA derivado sintético da testosterona, Winstrol Depot® (WIN),
investigado neste trabalho, foi escolhido devido à sua ampla e indiscriminada
utilização por atletas e fisiculturistas, sem conhecimento dos seus possíveis
efeitos adversos. Para avaliar o potencial genotóxico do WIN, foram usadas
duas versões do SMART de asa em D. melanogaster (cruzamentos padrão –
ST; e cruzamento de alta capacidade de bioativação metabólica - HB), em dois
experimentos repetidos. Os resultados obtidos foram agrupados, após verificar
que não havia diferenças, estatisticamente significativas, entre os experimentos
individuais.
Os resultados obtidos na análise dos descendentes trans-heterozigotos
marcados (MH) dos cruzamentos ST e HB, tratados com diferentes
concentrações de WIN (0,625; 1,25; e 2,5 mg/mL), isoladamente, e os
controles negativo (água destilada estéril) e positivo (URE), estão
apresentados, respectivamente, nas Tabelas 3.1 e 3.2.
As freqüências de manchas mutantes (simples pequenas, simples
grandes, gêmeas, e o total de manchas), observadas nos tratados com as
diferentes concentrações de WIN, em ambos os cruzamentos, comparadas
com as freqüências de manchas mutantes observadas no controle negativo,
foram estatisticamente não significativas (α>0,05).
Assim sendo, nestas condições experimentais, WIN não é um agente
genotóxico (mutagênico; clastogênico ou recombinogênico) direto ou indireto
(pró-mutágeno), quando analisado por meio do teste de detecção de mutação e
recombinação somática em células de asas de D. melanogaster. Os resultados
negativos encontrados no cruzamento HB permitem concluir que as enzimas
citocromo P450, altamente expressas na linhagem “ORR; flr
3
” não interferem
no potencial genotóxico do WIN.
Após comprovar que WIN não possui efeitos genotóxicos em células
somáticas de D. melanogaster, e diante de informações prévias de que WIN
interage com enzimas citocromo P450, inibindo-as (Rendic e Ruf, 1988;
Nakajin et al., 1989), foram analisadas as séries tratadas com diferentes
97
concentrações de WIN (0,625; 1,25; e 2,5 mg/mL) associadas a URE (0,891
mg/mL).
Os resultados obtidos na análise dos descendentes MH dos
cruzamentos ST e HB, das séries co-tratadas com diferentes concentrações de
WIN e URE, estão apresentados, respectivamente, nas Tabelas 3.1 e 3.2. Os
controle negativo (água destilada estéril) e positivo (URE) são os mesmos das
séries tratadas com WIN isoladamente, uma vez que todos os tratamentos
foram realizados simultaneamente.
Para a análise estatística, os resultados observados nas moscas
tratadas com WIN combinado com URE foram comparados com os dados dos
correspondentes controles positivos. No cruzamento ST (Tabela 3.1), o
tratamento simultâneo, entre todas as concentrações de WIN e URE, mostrou
um efeito inibitório significativo contra a freqüência de manchas simples
pequenas e no total de manchas. Para as freqüências de manchas simples
grandes e gêmeas, foram encontradas diferenças estatisticamente
inconclusivas para todas as concentrações de WIN associadas com URE,
assim como para URE isoladamente.
No cruzamento HB (Tabela 3.2), o tratamento com URE, isoladamente,
mostrou aumento estatisticamente significativo para todas as categorias de
manchas mutantes, quando comparado com o controle negativo (água
destilada estéril). Os co-tratamentos de URE com todas as concentrações de
WIN, mostraram efeito inibitório significativo contra as freqüências de todas as
categorias de manchas mutantes, assim como no total de manchas.
Comparando-se os resultados obtidos nos tratamentos com URE em
ambos os cruzamentos (ST e HB), apresentados respectivamente nas Tabelas
3.1 e 3.2, encontra-se uma diferença estatisticamente significativa entre os
cruzamentos. Este dado é justificado pelo fato do URE ser uma substância que
apresenta propriedades pró-mutagênicas muito bem estabelecidas, sendo
estas, potencializadas pela ação metabólica do sistema enzimático citocromo
P450 (Frölich e Würgler, 1990; Graf e van Schaik, 1992; Abraham e Graf, 1996;
Dogan et al., 2005).
Os aumentos estatisticamente significativos (α<0,05) observados nas
freqüências de manchas mutantes nos tratados com URE, quando comparado
98
com as freqüências de manchas mutantes observadas no controle negativo,
possibilitam afirmar que os resultados negativos obtidos com WIN, tanto em ST
quanto HB são resultados legítimos e não deficiência ou artefato da
metodologia empregada.
Não foram encontrados relatos na literatura de estudos de genotoxidade
com WIN. No entanto, trabalhos com outros hormônios esteróides, e seus
derivados sintéticos, também não apresentaram ação mutagênica em testes de
aberrações cromossômicas em linfócitos humanos, e micronúcleos em medula
óssea de camundongo (Reimann et al., 1996) e testes com
Salmonella/microssoma e linhagens de células V79 de hamster chinês (Lang e
Redmann, 1979; Lang e Reimann, 1993).
A inibição dos efeitos genotóxicos do URE pelo WIN, observada tanto
em ST quanto HB, pode estar relacionada à interação do WIN com o citocromo
P450, descrita por Rendic e Ruf (1988) e Nakajin et al. (1989). Os indivíduos
descendentes do cruzamento ST, mesmo apresentando as enzimas do
complexo citrocromo P450 em expressões mais baixas, também são afetados
pela presença do WIN.
Com base nos percentuais de inibição promovidos pelo WIN sobre os
efeitos de URE, obteve-se os índices de correlação para os descendentes MH
do cruzamento ST (r = 0,981981); e do cruzamento HB (r = 0,95514). Uma vez
comprovada a correlação existente, determinou-se a regressão linear, que
representa uma aproximação das correspondentes curvas de dose-resposta,
apresentadas na Figura 3.2.
Os coeficientes de correlação entre o percentual de inibição na
freqüência total de manchas e as diferentes concentrações de WIN associadas
ao URE, foram altamente significativos para os descendentes do cruzamento
ST e HB, mostrando uma relação de resposta diretamente proporcional à dose,
o que é confirmado pelas retas ascendentes obtidas nas regressões lineares
de ambos os cruzamentos.
As freqüências de distribuição dos tamanhos de manchas mutantes
(número células mutantes/mancha) observadas na análise dos descendentes
MH, provenientes dos cruzamentos ST (A) e HB (B), dos grupos controle
negativo (água destilada estéril), controle positivo (URE 0,891mg/mL) e grupos
99
tratados, são apresentadas na Figura 3.3, para as diferentes concentrações de
WIN isoladamente, e na Figura 3.4, para as diferentes concentrações de WIN
associadas ao URE, com predominância de manchas com apenas uma célula
mutante, e um decréscimo gradual, de acordo com o aumento do tamanho das
manchas, para todos os tratados com as diferentes concentrações de WIN
isoladamente ou associadas ao URE.
Com relação à distribuição no tamanho de manchas mutantes, foi
verificado que os indivíduos MH, de todas as séries analisadas (tratados e
controles), apresentam uma predominância de manchas pequenas, sobre
manchas grandes. Estes resultados estão de acordo com Graf et al. (1984) e
Spanó et al. (2001), que descreveram que um tratamento de 48h implica na
predominância de manchas pequenas de uma célula, sobre as demais
manchas.
A ação inibitória do WIN sobre a atividade genotóxica do uretano,
relacionada à sua interação com o sistema enzimático citocromo P450, pode
ser um indício da ação epigenética dos esteróides e seus derivados sintéticos
na carcinogênese, uma vez que a utilização da testosterona e seus derivados
estão relacionados à indução de carcinomas em diferentes organismos (Sanofi-
Synthelabo, 1999). A interação do WIN com o complexo citocromo P450 inibiria
essas enzimas de atuarem no metabolismo de agentes xenobióticos
carcinogênicos, impedindo o metabolismo, desativação e eliminação,
causando, desta forma, danos celulares graves e irreversíveis ao organismo.
Os resultados obtidos neste trabalho nos permitem concluir que, nas
condições experimentais utilizadas, o WIN, não apresenta efeitos genotóxicos,
mas efeitos inibidores contra a ação genotóxica do URE, em células de asas
de D. melanogaster. A proteção do WIN deve ser devida, provavelmente, por
inibição do sistema enzimático citocromo P450. No entanto, estudos
complementares devem ser realizados para uma melhor elucidação da
atividade biológica dos agentes xenobióticos EAA nos diferentes organismos.
100
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104
A
B
105
Figura 3.1 - Fórmulas estruturais dos compostos: A – Winstrol Depot® (WIN),
estanozolol (Disponível on-line: http://pt.wikipedia.org/wiki/Estanozolol. Acesso
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http://es.wikipedia.org/wiki/Uretano. Acesso em 03 outubro 2007).
106
Tabela 3.1 - Freqüências de manchas mutantes simples pequenas (MSP), simples grandes (MSG) e gêmeas (MG) observadas
em asas de descendentes heterozigotos marcados (MH) de D. melanogaster do cruzamento padrão (ST), obtidas por meio do
teste de mutação e recombinação somática, após tratamento crônico (~ 48h) com diferentes concentrações (0,625; 1,25 e 2,5
mg/mL) do anabolizante estanozolol (WIN), isoladamente, e associado ao uretano (URE) 10Mm, e seus respectivos controles
negativo (água destilada estéril) e positivo (URE 0,891 mg/mL)
Tratamento
N
o
de
moscas
(n)
Manchas por indivíduo (n
o
de manchas) diagnóstico estatístico
a
Total de
manchas
mwh
c
Inibição
d
(%)
Concentrações
Manchas
simples
pequenas
(1-2 céls)
b
m = 2
Manchas simples
gêmeas
(>2 céls)
b
m = 5
Manchas
gêmeas
m = 5
Total de
manchas
m = 2
WIN URE
mg/mL
mg/mL
0 0
54 0,28
(15) 0,04
(02) 0,06
(03) 0,37
(20) 20
0,625 0
61 0,30
(18) i 0,07
(04) i 0,03
(02) i 0,39
(24) - 24
1,25 0
55 0,36
(20) i 0,07
(04) i 0,05
(03) i 0,49
(27) i 27
2,5 0
60 0,27
(16) - 0,07
(04) i 0,05
(03) i 0,38
(23) - 23
0 0,891
50 1,32
(66) +
0,12
(06) i 0,04
(02) i 1,48
(74) + 74
0,625 0,891
50 0,90
(45) +
0,06
(03) i 0,06
(03) i 1,02
(51) f+
51 31,1
1,25 0,891
50 0,74
(37) +
0,04
(02) i 0,04
(02) i 0,82
(41) + 41 44,6
2,5 0,891
50 0,52
(26) +
0,06
(03) i 0,04
(02) i 0,62
(31) + 31 58,1
a
Diagnóstico estatístico de acordo com Frei e Würgler (1995): +, positivo; f+, fraco positivo; -, negativo; i, inconclusivo. m, fator de
multiplicação para a avaliação de resultados significativamente negativos. Nível de significância α = β = 0,05.
b
Incluindo manchas simples flr
3
raras.
c
Considerando os clones mwh para as manchas simples mwh e para as manchas gêmeas.
d
Calculado por [URE isolado – URE + WIN) / URE isolado] X 100, de acordo com Abraham (1994).
107
Tabela 3.2 - Freqüências de manchas mutantes simples pequenas (MSP), simples grandes (MSG) e gêmeas (MG) observadas
em asas de descendentes heterozigotos marcados (MH) de D. melanogaster do cruzamento de alta capacidade de ativação
metabólica (HB), obtidas por meio do teste de mutação e recombinação somática, após tratamento crônico (~ 48h) com diferentes
concentrações (0,625; 1,25 e 2,5 mg/mL) do anabolizante estanozolol (WIN), isoladamente, e associado ao uretano (URE) 10Mm,
e seus respectivos controles negativo (água destilada estéril) e positivo (URE 0,891 mg/mL)
Tratamento
N
o
de
moscas
(n)
Manchas por indivíduo (n
o
de manchas) diagnóstico estatístico
a
Total de
manchas
mwh
c
Inibição
d
(%)
Concentrações
Manchas
pequenas
siples
(1-2 céls)
b
m = 2
Manchas
grandes simples
(>2 céls)
b
m = 5
Manchas
gêmeas
m = 5
Total de
manchas
m = 2
WIN URE
mg/mL
mg/mL
0 0 60 0,50
(30) 0,03
(02) 0,07
(04) 0,60
(36) 36
0,625 0 58 0,34
(20) - 0,07
(04) I 0,02
(01) - 0,43
(25) - 25
1,25 0 64 0,34
(22) - 0,05
(03) I 0,00
(00) - 0,39
(25) - 25
2,5 0 60 0,32
(19) - 0,07
(04) I 0,07
(04) i 0,45
(27) - 27
0 0,891 50 5,34
(267)
+ 0,88
(44) + 0,76
(38) + 6,98
(349) + 344
0,625 0,891 50 4,56
(228)
f+ 0,30
(15) + 0,16
(08) + 5,62
(281) f+ 251 19,5
1,25 0,891 50 2,98
(149)
+ 0,14
(07) + 0,14
(07) + 3,26
(163) + 163 53,3
2,5 0,891 56 1,52
(85) + 0,11
(06) + 0,04
(02) + 1,66
(93) + 93 76,2
a
Diagnóstico estatístico de acordo com Frei e Würgler (1995): +, positivo; f+, fraco positivo; -, negativo; i, inconclusivo. m, fator de
multiplicação para a avaliação de resultados significativamente negativos. Nível de significância α = β = 0,05.
b
Incluindo manchas simples flr
3
raras.
c
Considerando os clones mwh para as manchas simples mwh e para as manchas gêmeas.
d
Calculado por [URE isolado – URE + WIN) / URE isolado] X 100, de acordo com Abraham (1994).
108
0,625 1,25 2,5
109
Figura 3.2. Regressão linear obtida pela correlação direta de dose dependência no percentual de inibição pelas diferentes
concentrações (0,625; 1,25 e 2,5 mg/mL) de estanozolol (WIN) nas freqüências totais de manchas mutantes por indivíduos,
induzidas pelo uretano (URE 0,891 mg/mL) em células de asas de descendentes trans-heterozigotos marcados (MH) de D.
melanogaster dos cruzamentos padrão (ST) e de alta capacidade de ativação metabólica (HB) em co-tratamentos de
aproximadamente 48 horas.
110
Freqüências de
manchas
Tamanho das manchas (n
o
de células/mancha)
ST
A
Freqüências de
manchas
Tamanho das manchas (n
o
de células/mancha)
HB
B
111
Figura 3.3 - Distribuição das freqüências de manchas por classes (número de
células/mancha) observadas em asas de descendentes heterozigotos
marcados (MH) de Drosophila melanogaster dos cruzamentos: A - padrão (ST)
e B - de alta capacidade de bioativação metabólica (HB), obtidas por meio do
teste para detecção de mutação e recombinação somática, tratadas com as
diferentes concentrações de Winstrol® (WIN) (0,625; 1,25 e 2,5mg/mL) e seus
respectivos controles positivo (URE 0,891 mg/mL) e negativo (água destilada
estéril).
112
Freqüências de
manchas
Tamanho das manchas (n
o
de células/mancha)
ST
A
Freqüências de
manchas
Tamanho das manchas (n
o
de células/mancha)
HB
B
113
Figura 3.4 - Distribuição das freqüências de manchas por classes (número de
células/mancha) observadas em asas de descendentes heterozigotos
marcados (MH) de Drosophila melanogaster dos cruzamentos: A - padrão (ST)
e B - de alta capacidade de bioativação metabólica (HB), obtidas por meio do
teste para detecção de mutação e recombinação somática, tratadas com as
diferentes concentrações de Winstrol® (WIN) (0,625; 1,25 e 2,5mg/mL)
associado a uretano (URE) (0,891 mg/mL) e seus respectivos controles positivo
(URE 0,891 mg/mL) e negativo (água destilada estéril).
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