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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ESTUDO FITOQUÍMICO E INVESTIGAÇÃO DAS ATIVIDADES
BIOLÓGICAS DA FRAÇÃO METANÓLICA CONTENDO ISOFLAVONAS
OBTIDA DE Glycine max (L.) Merril (SOJA)
VANESSA DA SILVA CARRARA
MARINGÁ
2007
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VANESSA DA SILVA CARRARA
ESTUDO FITOQUÍMICO E INVESTIGAÇÃO DAS ATIVIDADES
BIOLÓGICAS DA FRAÇÃO METANÓLICA CONTENDO ISOFLAVONAS
OBTIDA DE Glycine max (L.) Merril (SOJA)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas – Área
de Concentração: Produtos Naturais e
Sintéticos Biologicamente Ativos, da
Universidade Estadual de Maringá
Orientador: Prof. Dr. Diógenes Aparício
Garcia Cortez.
MARINGÁ
2007
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Dedico este trabalho,
À Deus, meu Mestre, que conduz os meus passos e aos meus pais, Cinaldo e Leda, pelo apoio
incondicional, amor e incentivo que me deram todos estes anos.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Diógenes Aparício Garcia Cortez, pela orientação, incentivo, apoio e confiança
depositada em mim no desenvolvimento deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Roberto B. Bazotte pelo auxílio e oportunidade para a concretização deste
estudo.
Ao Prof. Dr. Benedito Prado Dias Filho pela ajuda oportuna.
Ao José Marcos Gontijo Mandarino, pesquisador da Embrapa Soja (Empresa Brasileira de
Pesquisa Agropecuária), pela quantificação das isoflavonas e pela análise de transgenia.
Ao professor Prof. Dr. Francisco Neves e à Angélica Amato, da Universidade de Brasília,
pela atenção dispensada durante a realização dos experimentos sobre os receptores PPAR.
À Prof Dr
a.
Ciomar Aparecida Bersani Amado pela importante colaboração na realização dos
experimentos.
À Prof Dr
a.
Izabel Cristina Piloto Ferreira pela correção do presente trabalho.
À todos os professores do curso de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, que com
dedicação nos transmitiram seus preciosos conhecimentos.
À COAMO Cooperativa Agroindustrial, pelo fornecimento das sementes de soja.
À técnica Dr
a.
Ivânia Teresinha Albrecht Schuquel, do Departamento de Química da UEM
pela obtenção dos espectros de RMN.
Ao Carlos Eduardo de Oliveira, técnico do Laboratório de Farmacologia Endócrina, pelo
auxílio técnico em meus experimentos.
Ao Jailson Araújo Dantas e Célia Regina Miranda, técnicos do Laboratório de Inflamação,
pela amizade e pelo acessoramento técnico.
Ao técnico Admir Arantes, do Laboratório de Farmacognosia, pela assistência técnica.
À secretária do Departamento de Farmácia e Farmacologia, Francisca Helena M. de Carvalho,
pela dedicação e pelos serviços prestados.
À Juliana Oliveira de Melo e Simoni Obici, pelo subsídio técnico nos ensaios farmacológicos.
Aos colegas de pós-graduação, pela amizade e incentivo constante.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas que nos proporcionou condições
necessárias para a execução do presente trabalho.
“Deixe o alimento ser seu medicamento e o
medicamento ser seu alimento.” (Hipócrates)
RESUMO
A partir das sementes congeladas de soja convencional obteve-se a fração metanólica
contendo isoflavonas. Realizou-se CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) desta
fração. Foram encontradas nove isoflavonas com seus respectivos teores em 100g de semente:
daidzina (6,99 mg); glicitina (2,29 mg); genistina (7,08 mg); malonildaidzina (13,27 mg);
malonilglicitina (5,08 mg); malonilgenistina (22,39 mg); daidzeína (2,77 mg); gliciteína (1,09
mg); genisteína (3,6 mg). O teor de isoflavonas totais na semente de soja foi 64,56 mg/100 g.
Através da purificação da fração metanólica, isolaram-se malonildaidzina e malonilglicitina.
As substâncias foram identificadas por análise espectral de RMN
1
H (Ressonância Magnética
Nuclear de Hidrogênio). Esta fração foi usada para investigar: 1) a ação antiinflamatória em
modelo experimental de inflamação empregando edema de orelha induzida pelo óleo de
cróton; 2) o efeito sobre os receptores PPARα, PPARλ e PPARβ/γ em células U937; 3) efeito
antidiabético e hipolipemiante pela ingestão subcrônica da fração em ratos Wistar não
diabéticos; 4) a toxicidade aguda e a hepatotoxicidade. Observou-se atividade do PPARα (400
a 1600 µg) e do PPARβ/γ (800 a 1600 µg). Não houve ativação do PPARλ. Não apresentou
efeitos antidiabético e hipolipemiante no modelo experimental utilizado. A fração metanólica
nas doses 0,625, 1,25 e 2,5 mg/kg, inibiu significativamente o edema de orelha, quando
comparada ao grupo controle. As porcentagens de inibição foram respectivamente: 44,23% (p
< 0,05), 60,68% (p < 0,01), 65,68% (p < 0,01). Houve redução da atividade da enzima
mieloperoxidase (64,79%, p < 0,05). Estes resultados demonstraram que a fração metanólica
com isoflavonas apresentou atividade antiinflamatória neste modelo experimental. Não houve
toxicidade aguda em camundongos Swiss (25-35g) pela administração da fração pelas vias
oral e intraperitoneal, nas doses de 1000, 2000, 3000 e 4000 mg/kg. A hepatotoxicidade foi
investigada em ratos Wistar (200-250g) que receberam 20 mg/kg da fração durante 15 dias.
Não houve mudanças significativas das enzimas aspartato aminotransferase (AST) e alanina
aminotransferase (ALT). Portanto, o tratamento agudo nas doses de 1000 a 4000 mg/kg e o
tratamento subcrônico na dose de 20mg/kg não causaram toxicidade.
Palavras-chave: soja, isoflavonas, CLAE, RMN
1
H, antiinflamatória, PPAR,
antidiabética, hipolipemiante, toxicidade aguda, hepatotoxicidade.
ABSTRACT
From frozen seeds of conventional soybean, it was obtained the methanolic fraction
containing isoflavones. It was realized HPLC method (High Performance Liquid
Chromatography) of the methanolic fraction. It were found nine isoflavones with their
respective tenor in 100 g of soybean seeds: daidzin (6.99 mg); glycitin (2.29 mg); genistin
(7.08 mg); malonyldaidzin (13.27 mg); malonylglycitin (5.08 mg); malonylgenistin (22.39
mg); daidzein (2.77 mg); glycitein (1,09 mg); genistein (3.6 mg). The tenor of total
isoflavones from soybean seeds was 64.56 mg/100 g. Through purification of the fraction, it
were isolated malonyldaidzin, malonylglycitin. These compounds were identified by spectral
analyse of
1
H NMR (Hydrogen Nuclear Magnetic Resonance). This fraction was used to
investigate: 1) the anti-inflammatory action in the inflammation experimental model using
croton oil-induced ear oedema; 2) the effect on the PPARα, PPARλ and PPARβ/γ pathways in
U937 cells; 3) the antidiabetic and hipolipidemic effects by the subchronic intake of the
fraction in non diabetic Wistar rats; 4) acute toxicity and hepatotoxicity. It was observed
activity of the PPARα (400 to 1600 µg) and of the PPARβ/γ (800 to 1600 µg). There was not
activation of the PPARλ. It did not present antidiabetic and hipolipidemic effects in the
experimental model used. The methanolic fration in the doses 0,625, 1,25 e 2,5 mg/kg,
inhibited significantly the ear oedema when compaired to the control group. The inhibition
percentages were respectively: 44,23% (p < 0,05), 60,68% (p < 0,01), 65,68% (p < 0,01).
There was reduction of the activity of the mieloperoxydase enzyme (64,79%, p < 0,05). These
results showed that the methanolic fraction containing isoflavones had anti-inflammatory
activity in this experimental model. There was not acute toxicity in Swiss mice (25-35g)
through application of the fraction by the oral and intraperitoneal pathways, in the doses 1000,
2000, 3000 and 4000 mg/kg. The hepatotoxicity was researched in Wistar rats (200-250g) that
received 20 mg/kg of the fraction during 15 days. There were not significant changes in the
serum concentration of the enzyms aspartate aminotransferase (AST) and alanine
aminotransferase (ALT). Therefore, the acute treatment in the doses 1000 to 4000 mg/kg and
the subchronic treatment in the dose 20mg/kg did not cause toxicity.
Key words: soybean, isoflavones, HPLC,
1
H NMR, anti-inflammatory, PPAR,
antidiabetic, hipolipidemic, acute toxicity, hepatotoxicity.
.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
........................................................................................................................15
2. REVISÃO DE LITERATURA..........................................................................................17
2.1 SOJA...................................................................................................................................17
2.2. ISOFLAVONAS................................................................................................................19
2.2.1 Farmacocinética.............................................................................................................27
2.2.2. Propriedades biológicas das isoflavonas.....................................................................29
2.2.2.1 Atividade estrogênica e antiestrogênica........................................................................30
2.2.2.2 Benefício sobre a osteoporose.......................................................................................31
2.2.2.3 Atividade antioxidante..................................................................................................32
2.2.2.4 Atividade anticarcinogênica..........................................................................................34
2.2.2.5 Atividade anti-hemolítica..............................................................................................35
2.2.2.6 Atividade antimicrobinana............................................................................................35
2.2.2.7 Benefícios sobre as doenças cardiovasculares, Diabetes mellitus tipo 2 e sintomas
vasomotores..............................................................................................................................35
2.2.2.8 Atividade antiinflamatória............................................................................................39
3. OBJETIVOS........................................................................................................................42
4. MATERIAIS E MÉTODOS..............................................................................................43
4.1. SOJA..................................................................................................................................43
4.2 ANÁLISE DE TRANSGENIA...........................................................................................43
4.3 EXTRAÇÃO DAS ISOFLAVONAS.................................................................................44
4.3.1 Cromatografia em camada delgada (CCD).................................................................44
4.3.2 Análise Espectrofotométrica.........................................................................................45
4.3.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)...................................................45
4.3.3.1 Cálculo do teor de isoflavonas na semente de soja.......................................................47
4.4 ISOLAMENTO DAS SUBSTÂNCIAS ATIVAS..............................................................47
4.4.1 Identificação das substâncias isoladas por RMN
1
H...................................................47
4.5 EFEITO SOBRE OS RECEPTORES PPAR......................................................................48
4.5.1 Procedimentos.............................................................................................................48
4.5.2 Transfecções...................................................................................................................49
4.5.2.1 Avaliação da atividade da fração metanólica sobre PPARα ........................................49
4.5.2.2 Avaliação da atividade da fração metanólica sobre PPAR β/δ.....................................49
4.5.2.3 Avaliação da atividade da fração metanólica sobre PPARγ.........................................50
4.5.2.4 Observação....................................................................................................................50
4.5.3 Leitura da atividade da luciferase em células U937....................................................51
4.6 INVESTIGAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIDIABÉTICA E HIPOLIPIDÊMICA DA
FRAÇÃO METANÓLICA EM RATOS WISTAR..................................................................51
4.6.1 Dosagem de glicose.........................................................................................................52
4.6.2 Dosagem de triglicerídeos..............................................................................................52
4.6.3 Dosagem de colesterol total...........................................................................................53
4.7 INDUÇÃO DO EDEMA DE ORELHA.............................................................................54
4.7.1 Atividade da mieloperoxidase (MPO)..........................................................................55
4.8 TOXICIDADE....................................................................................................................55
4.8.1 Hepatotoxicidade...........................................................................................................55
4.8.1.1 Determinação quantitativa da atividade da alanina aminotransferase (ALT) no soro..56
4.8.1.2 Determinação quantitativa da atividade da aspartato aminotransferase (AST) no
soro............................................................................................................................................56
4.8.2 Toxicidade Aguda (DL
50
)..............................................................................................57
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................................................57
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................................58
5.1 ANÁLISE DE TRANSGEINA...........................................................................................58
5.2 ANÁLISE ESPECTROFOTOMÉTRICA DA FRAÇÃO METANÓLICA.......................59
5.3 CONTEÚDO DE ISOFLAVONAS DA FRAÇÃO METANÓLICA DA SOJA...............60
5.4 DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DAS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS........................64
5.5 EFEITO DA FRAÇÃO METANÓLICA SOBRE OS RECEPTORES PPARs.................69
5.5.1 Atividade sobre o receptor PPARα..............................................................................70
5.5.2 Atividade sobre o receptor PPARγ...............................................................................72
5.5.3 Atividade sobre o receptor PPARβ/δ...........................................................................73
5.6 INVESTIGAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIDIABÉTICA E HIPOLIPIDÊMICA DA
FRAÇÃO METANÓLICA EM RATOS WISTAR..................................................................74
5.7 EFEITO DA FRAÇÃO METANÓLICA DE SOJA SOBRE O EDEMA DE ORELHA..75
5.7.1 Efeito da fração metanólica com isoflavonas sobre a atividade da mieloperoxidase
(MPO).......................................................................................................................................78
5.8 TOXICIDADE....................................................................................................................80
5.8.1 Hepatotoxicidade............................................................................................................80
5.8.2 Toxicidade Aguda..........................................................................................................81
5.9 CONCLUSÕES.................................................................................................................82
6. REFERÊNCIAS..................................................................................................................83
1. INTRODUÇÃO
Atualmente, há um grande interesse na utilização das isoflavonas de soja na terapia de
reposição hormonal. Isto se deve ao fato de que a utilização convencional de estrógenos
sintéticos traz grandes riscos à saúde humana, tais como, a trombose e os cânceres de mama,
ovário e endométrio. Além disso, estudos epidemiológicos evidenciam a possibilidade das
isoflavonas prevenirem doenças degenerativas e associadas ao climatério, como tumores de
mama, próstata e osteoporose. Vários estudos apontam para a comprovação destes efeitos
devido às seguintes atividades destas substâncias: (1) estrogênica, antiestrogênica, benefícios
na hipercolesterolemia, osteoporose, arteriosclerose e sintomas vasomotores; (2) ação
anticarcinogênica (cânceres de pele, mama, endométrio, próstata, cólon), (3) antioxidante, (4)
anti-hemolítica, (5) antimicrobiana (6) antiinflamatória e (7) antidiabética (Aguiar, 2004;
Dijsselbloem et al., 2004).
Há uma estreita relação entre a inibição de processos inflamatórios por estes
isoflavonóides e a prevenção das doenças crônico-degenerativas. Nestes mesmos trabalhos, as
isoflavonas pareceram inibir a produção de interleucina-6, que é considerada como um
marcador diagnóstico para a progressão de metástase tumoral em vários tipos de câncer. Pode
ser afirmado que esta citocina também está associada a várias desordens inflamatórias e
desconfortos do envelhecimento acima comentados (Dijsselbloem et al., 2004).
Testes in vitro mostram que os fitoestrógenos da soja inibem a produção de
prostaglandinas através da inibição da enzima ciclooxigenase-2. Ainda, as agliconas são
agonistas dos receptores ativados por proliferadores de peroxissoma (PPARα e PPARγ),
levando a inibição da ciclooxigenase-2, da produção de interleucinas e da ativação do fator
NF-KB.
Os mecanismos de ação ainda não foram esclarecidos. Estes receptores PPAR, uma
vez ativados, também estão envolvidos nas ações antidiabética e hipolipidêmica, contribuindo
para redução dos riscos e tratamento do Diabetes mellitus tipo 2 e das doenças
cardiovasculares (Clausell e Tavares, 2004; Ricketts et al., 2005).
Neste sentido, foi interessante avaliar a atividade antiinflamatória em animais,
investigando, inicialmente, se a fração com isoflavonas apresentava ação antiedematogênica.
Foi importante avaliar a atividade in vitro da fração de soja contendo tanto as formas
glicosídicas quanto as agliconas sobre os receptores PPAR, analisando mais um possível meio
de atuação destes compostos no processo inflamatório e em doenças crônicas.
Apesar de os flavonóides serem conhecidos por terem baixa toxicidade, torna-se
necessário assegurar a utilização da fração de soja com isoflavonas em medicamentos
fitoterápicos e alimentos. Assim, foram estudadas a toxicidade aguda e a hepatotoxicidade.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 SOJA
A soja, Glycine max (L.) Merril, é uma planta herbácea, originária da China,
pertencente à família Leguminosae e à classe Fabacea (Simões et al., 1999). A semente é
formada por: (1) cotilédone, correspondendo cerca de 90% de sua massa total; (2) hipocótilo
(gérmen), compreendendo cerca de 2 a 3 %; (3) tegumento (casca), representando cerca de
6% do total da semente (Aguiar, 2004).
Durante séculos, vem sendo consumida em vários países, sendo utilizada para
diferentes finalidades e aplicações. A soja participa da dieta humana através do consumo dos
grãos e de alimentos elaborados a partir destes, tais como, leite, tofu, missô e tempeh, além de
derivados protéicos, por exemplo, farinhas desengorduradas, texturizados, concentrados e
isolados protéicos (Góes-Favoni et al., 2004). É considerada produto GRAS (Generally
Recognized As Safe), isto é, reconhecida como seguro para o consumo pela FDA-USA (Food
and Drug Administration - United States of América, 1999).
No Brasil, a soja começou a ser cultivada no final do século XIX (1882) (Vernetti,
1977). Atualmente, é o segundo maior produtor e exportador mundial. Entretanto, não há um
consumo generalizado da soja, devido à falta de hábito dos consumidores. Sua popularização
tem sido aumentada, graças ao valor nutricional e à disponibilidade de tecnologias que
melhoram o sabor, tais como o melhoramento genético para a eliminação das lipoxigenases,
responsáveis pelo sabor característico e pela disponibilidade de novos produtos.
A soja é utilizada na prevenção e no tratamento da desnutrição em populações de
baixa renda. A composição química média da soja, em 100g de grãos em base seca, possui
40% de proteínas, 35% de carboidratos (oligossacarídeos e polissacarídeos), 20% de lipídios,
dos quais 83% são ácidos graxos poliinsaturados essenciais (linoléico e linolênico), 0,01 a
0,3% de isoflavonas, 220mg de magnésio, 580mg de fósforo, 1900mg de potássio, 230mg de
cálcio, 9,4 mg de ferro, dentre outros minerais (Carrão-Panizzi, et. al, 1999; Lilienthal et al.,
2005; Park et al., 2002).
Vários estudos epidemiológicos têm mostrado que, as populações orientais que
ingerem grandes quantidades de soja, apresentam baixos riscos para o desenvolvimento de
sintomas e desordens relacionados ao climatério: ondas de calor, doenças cardiovasculares,
cânceres de mama, e próstata, hiperlipidemia, diabetes, osteoporose, doença renal crônica,
depressão e irritabilidade. O risco de câncer para a população asiática, especialmente câncer
de próstata e mama, aumenta quando ocorre a migração para os países ocidentais. Esta
observação indica que fatores relacionados à mudança na dieta, em vez de fatores puramente
genéticos, contribuem para o surgimento dessas patologias. A ingestão de isoflavonas pelos
japoneses é de cerca de 20 a 50mg por dia, contrastando com os ocidentais, que ingerem
menos de 1mg por dia (Dijsselbloem et al., 2004).
Os efeitos protetores, que também foram verificados em estudos de intervenção
nutricional em animais, parecem ser devido às isoflavonas presentes na soja (Bhathena e
Ohno et al., 2003; Velásquez, 2002). Estes fármacos são fitoestrógenos, compostos com ação
semelhante à do estrógeno. As isoflavonas da soja são as mais abundantes na dieta humana e
as mais estudadas em pesquisa clínica e animal (Bu e Lephard, 2005). Após a constatação
científica da atividade destes compostos, tem-se verificado um crescente interesse pela soja
como fonte alimentar ou fitoterápico, tanto pelos consumidores, quanto pela indústria
alimentícia e farmacêutica.
Investigações recentes sobre efeitos a longo-prazo da terapia de reposição hormonal
com hormônios sintéticos têm demonstrado um alto risco de trombose e incidência de câncer
de mama, endométrio e ovário, além do aumento de “fogachos”. Neste aspecto, as isoflavonas
de soja recebem atenção como alternativas superiores à terapia de reposição hormonal
(Dijsselbloem et al., 2004).
Desta forma, é importante destacar a soja como alimento funcional, uma vez que
contém substâncias nutrientes e não nutrientes que promovem algum benefício à saúde ou que
tem papel na redução dos riscos às doenças. De acordo com a Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA), alimento funcional ou nutracêutico é aquele capaz de desempenhar
funções nutricionais básicas (fonte de energia e substrato para a formação de células e
tecidos), possui uma ou mais sustâncias que desencadeiam efeitos benéficos à saúde e é
seguro para o consumo sem supervisão médica.
2.2. ISOFLAVONAS
São substâncias pertecentes ao grupo dos flavonóides, caracterizados por uma cadeia
arila-C3-arila, do tipo difenil-1,2-propano (Simões et al., 1999).
São encontradas no grão de soja, brotos de alfafa, sementes de linhaça, trevo
vermelho, entre outros vegetais. A soja é a planta com o maior teor de isoflavonas,
aproximadamente 3mg/g, sendo essas substâncias encontradas em todo o grão, tendo sua
maior concentração no hipocótilo. (ANVISA).
Foram isoladas doze isoflavonas dos grãos de soja (Figura 1.), sendo divididas em
isoflavonas livres ou agliconas e isoflavonas conjugadas. As três principais isoflavonas
agliconas são: daidzeína, genisteína e gliciteína. As isoflavonas β-glicosídicas conjugadas,
podem estar na forma de 7-O-β-glicosídeos (daidzina, genistina e glicitina), 7-O-β-(6’’-O-
acetil)-glicosídeos (acetildaidzina, acetilgenistina, acetilglicitina), e 7-O-β-(6’’-O-malonil)-
glicosídeos (malonildaidzina, malonilgenistina, malonilglicitina), sendo que a malonildaidzina
e a malonilgenistina correspondem juntas 66% do total (Kudou et al., 1991). Fukutake et al.
(1996) declarou que a genistina e daidzina são as principais isoflavonas, constituindo de 50 a
90% das isoflavonas presentes na farinha de soja.
OH
O
O
OH
O
OH
O
O
H
H
H
H
OH
OH
H OH
OH
O
Daidzeína Daidzina
O
O
H
H
H
H
OH
OH
H OH
O
O
H
O
O
O CH
3
Acetildaidzina Malonildaidzina
Figura 1. Estruturas das isoflavonas de soja
O
H
H
H
H
OH
OH
H OH
O
O
O
O
OH
O
O
OH
OH
O
O
OH
OH
O
O
H
H
H
H
OH
OH
H OH
OH
O
OH
OOH
Genisteína Genistina
O
O
H
H
H
H
OH
OH
H OH
O
OH
O
O
O CH
3
OH
O
O
H
H
H
H
OH
OH
H OH
O
OH
O
O
O
OH
O
OH
Acetilgenistina Malonilgenistina
Figura 1. Estruturas das isoflavonas de soja (continuação)
OH
O
O
O
H
H
3
CO
O
O
H
H
H
H
OH
OH
H OH
OH
H
3
CO
O
OH
O
Gliciteína Glicitina
O
O
H
H
H
H
OH
OH
H OH
O
OH
O
O
O CH
3
H
3
CO
Acetilglicitina Malonilglicitina
Figura 1. Estruturas das isoflavonas de soja (continuação)
Kudou et al. (1991) relataram que o conteúdo total de isoflavonas de soja no
hipocótilo foi 5,5 a 6 vezes maior que nos cotilédones. As formas glicitina ocorreram somente
no hipocótilo. O acúmulo de isoflavonas ocorre durante a fase de formação da semente, entre
O O
O
OH
H
3
CO
O
H
H
H
H
OH
OH
H OH
O
O
O
OH
35 e 60 dias depois do florescimento, com o conteúdo de genistina e malonilgenistina
aumentando no final do desenvolvimento da semente. Daidzeína e malonildaidzina
aumentaram durante o período inteiro.
De acordo com Carrão-Panizzi et al. (1998), a concentração de isoflavonas em soja é
determinada geneticamente e influenciada por fatores ambientais, principalmente pela
temperatura do local e de cultivo.
Segundo Genovese e Lajolo (2001), existem alguns fatores que afetam composição de
isoflavonas na soja e nos produtos derivados: (1) variedade e condições de cultivo; (2)
metodologias de análise; (3) condições de processamento da soja.
O mercado tem exigido cultivares de soja, com teores em torno de 3mg de isoflavonas
por 1g de grãos. O efeito das condições ambientais foi avaliado por Carrão-Panizzi et al.
(1999; 2003). Os cultivares produzidos na cidade de Vacaria no estado do Rio Grande do Sul,
com temperatura média de 19º C, tiveram as mais altas concentrações de isoflavonas (218,7 e
163mg/100g de soja respectivamente). Grãos colhidos em Palmas no Paraná, onde a
temperatura média é em torno de 19º C, tiveram as maiores concentrações de isoflavonas
totais (280mg/100g) do que em outros locais do estado. Os cultivares produzidos em regiões
de temperaturas mais altas tiveram os menores teores de isoflavonas.
Uma vez que a soja possui em maior concentração as malonil-glicosil isoflavonas,
almejam-se processos industriais que promovam a desesterificação obtendo-se as glicosil-
isoflavonas, que podem ser convertidas em agliconas por via fermentativa.
Os métodos mais empregados para alcançar tais finalidades são: temperatura elevada,
hidrólise ácida e hidrólise enzimática
O processo de aquecimento altera a distribuição das isoflavonas em produtos à base de
soja. Alguns métodos, como torrar os grãos resulta em uma perda de 15 a 21% de daidzeína e
genisteína respectivamente. Carrão-Panizzi et al. (2003) realizaram tratamento hidrotérmico
dos grãos de soja às temperaturas de 50 e 60º C durante dezoito horas e verificaram a
concentração total de isoflavonas. Após o tratamento térmico, houve redução de 40% no
conteúdo total de isoflavonas. A formação de espuma durante o processo de aquecimento
para a produção de bebidas de soja também pode remover isoflavonas (Jackson et al., 2002).
A forma malonil-isoflavona é transformada a glicosil-isoflavona durante o processo de
extração do óleo de soja a temperaturas de 100
o
C. Kudou et al. (1991) afirmaram que a
extração alcoólica a quente promove a transformação de malonil-isoflavona, por meio da
desesterificação, nas formas β-glicosiladas. Park et al. (2002) relataram que à temperatura de
120º C, parte das malonil-isoflavonas foi convertida aos seus conjugados glicosilados, porém,
houve uma redução em torno de 15% do total de isoflavonas.
Muitos autores testaram vários sistemas solventes para a extração das isoflavonas.
Sistemas alcoólicos acidificados promovem maior extração das isoflavonas da farinha
desengordurada de soja, porém requerem maior complexidade em relação ao preparo e ao
ajuste do potencial hidrogeniônico (~pH 3,5) das mesmas. Uma vez que grande parte das
proteínas de soja possui ponto isoelétrico na faixa de pH 4-4,5, torna-se inviável a aplicação
de uma solução com pH 3,5, sem que haja precipitação das proteínas da soja (Aguiar, 2004).
Genovese e Lajolo (2001) verificaram que a hidrólise ácida para a obtenção de agliconas foi
inadequada, por causar redução significativa nos teores de isoflavonas.
A hidrólise enzimática tem sido empregada principalmente na obtenção de produtos de
soja com maiores teores de isoflavonas agliconas, tais como tofú, missô e tempeh. Trabalhos
indicam que as isoflavonas glicosiladas presentes em alimentos não são absorvidas, devido
principalmente ao açúcar ligado na posição beta (Setchell et al., 2002). Somente as
isoflavonas livres (agliconas) são capazes de passar através da parede do intestino delgado
(Xu et al., 1995). Atualmente, sabe-se que a clivagem da cadeia glicosídica acontece
principalmente através da enzima
β-glicosidase da microflora do intestino grosso (Izumi et al.,
2000; Lambert et al., 1999; Turner et al., 2003). Lambert et al. (1999), relataram que enzimas
citosólicas, tais como a β-glicosidase (EC 3.2.1.21), podem romper a ligação β-glicosídica de
flavonóides glicosilados. A biodisponibilidade de isoflavonas em humanos depende da
capacidade de ação da flora intestinal em transformar a forma glicosilada em aglicona, e é
influenciada pela quantidade ingerida na dieta (Setchell et al., 2001). A alta ingestão de
carboidratos pode causar o aumento da fermentação intestinal, e consequentemente excessiva
biotransformação das isoflavonas. A absorção, excreção e concentração de isoflavonas no
plasma dependem da dose ingerida e da flora intestinal (Xu et al., 1995).
A enzima β-glicosidase retira a molécula de glicose das isoflavonas glicosiladas
aumentando o teor de isoflavonas agliconas (Setchell et al., 2002; Xu et al., 1995) e com isto,
há o aumento da disponibilidade de tais substâncias ativas. A β-glicosidase é uma enzima do
complexo celulolítico responsável pela quebra da ligação de glicosídica β-1,4 de
celooligossacarídeos, liberando a glicose, no processo de degradação de celulose. Esta enzima
pode ser produzida por microrganismos ou ser extraída de frutas e leguminosas (Lima, 2003).
Muitas glicosidases vegetais e microbianas podem catalisar a hidrólise de glicosil-
flavonóides, tais como a hidrólise de isoflavonas glicosiladas de soja (Carrão Panizzi e
Bordingnon, 2000; Esaki et al., 1999; Park et al., 2001a; Park et al., 2001b).
De acordo com os estudos, esta enzima é catiônica com carga negativa, possui peso
molecular em torno de 60 kDa. Pode ser intracelular ou extracelular. É purificada através de
cromatografia de troca iônica em coluna aberta utilizando resinas. Possui pH ótimo de
aproximadamente 5,5 e uma temperatura ótima de 50º C (Lima, 2003).
As β-glicosidases microbianas podem ser produzidas por fermentação semi-sólida, em
que se utiliza farelo de trigo ou de soja como fonte de carbono. Esta é uma metodologia
adequada para se observar o crescimento microbiano, o rendimento da enzima, bem como sua
atividade enzimática (Aguiar, 2004; Lima, 2003). Sabe-se que quanto maior a atividade
enzimática, maior a quantidade de massa transformada por unidade de tempo (Bratch et al.,
2003).
Park et al. (2001b) concluiram que a β-glicosidase produzida por Aspergillus oryzae
hidrolizou as isoflavonas glicosiladas a agliconas, em 48 horas, quando esta enzima foi
aplicada sobre farinha desengordurada de soja durante fermentação semi-sólida. Matsuda et
al. (1992) mostraram que a β-glicosidase de Lactobacillus casei subsp. rhamnosus IFO 3425
mostrou grande capacidade hidrolítica de isoflavonas glicosiladas em xarope de soja. Klus e
Barz (1998) reportaram que durante processos térmicos e fermentativos, estes compostos
fenólicos glicosilados dos grãos de soja são transformados em suas respectivas agliconas, que
são acumulados no produto final. Observa-se o fato de que em produtos fermentados, tais
como, missô e tempeh, a conversão de 7-D-glicosil-isoflavonas está associada à β-glicosidase
bacteriana (Coward et al., 1993; Chiou e Cheng, 2001; Fukutake et al., 1996). Wang e
Murphy (1996) observaram que o aumento das quantidades de daizeína e genisteína durante a
produção de tempeh e proteína isolada de soja provavelmente foi devido à hidrólise
enzimática e alcalina respectivamente. Em leite fermentado de soja, as bactérias do gênero
Bifidobacteria também foram eficientes na conversão das isoflavonas (Chien et al., 2006).
Existe outro problema encontrado em fitoterápicos à base de soja existentes no
mercado. Há a falta de padronização do processo extrativo, da escolha do método mais
adequado aliado ao solvente, da temperatura e até mesmo da quantidade de soja a ser
utilizada. Isto resulta numa resposta farmacológica sem eficácia em pessoas que fazem o uso
dessas substâncias para fins terapêuticos.
2.2.1 Farmacocinética
A absorção das isoflavonas requer hidrólise inicial das moléculas glicosiladas por
enzimas liberadas de bactérias intestinais. Em seguida, daidzeína e genisteína são metiladas
pelas enzimas bacterianas formando a formononetina e biochanina A, respectivamente. Além
disso, essas moléculas podem sofrer outras modificações estruturais. A daidzeína é reduzida
a:
1) equol (4’, 7
-
dihidroxiisoflavanona);
2) O-demetilangolensina (O-dma, 2’, 4’, 4”-trihidroxi-methyldeoxibenzoina);
3) dihidrodaidzeína (4,7’-dihidroxiisoflavanona);
4) cis-4-OH-equol (4’, 7-dihidroxiisoflavan-4-ol);
5) formononetina.
Genisteína é metabolizada a:
1) dihidrogenisteína (4’, 5,7-trihidroxiisoflavanona);
2) 6’-OH-O-dma (2’, 4’, 6’, 4”-tetrahidroxi-metildeoxibenzoina);
3) ácido 2-(4-hidroxifenil)-propanóico;
4) trihidroxibenzeno;
5) biochanina A.
Os metabólitos de redução da gliciteína são:
1) dihidrogliciteína;
2) 5’-OMe-O-dma;
3) 6-OMe-equol.
Após a difusão passiva através da parede do intestino, estes compostos alcançam a circulação
entero-hepática. No fígado, a formononetina pode dar origem a daidzeína. Esta e seus
metabólitos podem ser oxidados a:
1) 3,’4’, 7-, 4’, 6,7- trihidroxiisoflavona;
2) 4’, 7,8-trihidroxiisoflavona;
3) 7, 8,3’, 4’-tetrahidroxiisoflavona;
4) 6,7, 4’8,4’-tetrahidroxiisoflavona;
5) 6, 7,3’, 4’-tetrahidroxiisoflavona.
Os metabólitos de oxidação da genisteína são:
1) 3’-OH-genisteína,
2) 3’, 4’, 5,7-tetrahidroxiisoflavona;
3) 5, 6, 7,4’-tetrahidroxiisoflavona;
4) 5, 7, 8,4’-tetrahidroxiisoflavona;
5) 5, 7,3’, 4’-tetrahidroxiisoflavona;
6) 2, 5, 7,4'-tetrahidroxiisoflavona;
7) 5, 7, 8,3', 4'-pentahidroxiisoflavona;
8) 5, 6, 7,3', 4'-pentahidroxiisoflavona.
Estas reações de oxidação são menos abundantes e ocorrem somente com uma porcentagem
mínima do total dos metabólitos de isoflavonas.
Os metabólitos são conjugados principalmente com o ácido glicurônico e em uma
menor quantidade com ácido sulfúrico. Somente uma pequena porção (menos que 3%) das
agliconas livres podem ser detectadas no sangue. Estes metabólitos foram descobertos após o
consumo de produtos derivados de soja contendo isoflavonas (Heinonen et al., 2003; Hu et
al., 2003; Kulling et al., 2001; Zhang et al., 2002).
A soja tem uma pequena quantidade de isoflavonas agliconas, que são prontamente
absorvidas no estômago e conjugadas no fígado (Piskula et al., 1999).
Na maioria dos adultos, as concentrações do pico plasmático da genisteína após a
ingestão da aglicona estão entre 4 e 7 horas, considerando que depois da ingestão da genistina,
as concentrações dos picos plasmáticos estão entre 8 e 11 horas.
Há uma grande variação entre indivíduos na conjugação e na metabolização das
isoflavonas pelas bactérias intestinais, uma vez que esta depende da dieta e da microflora
gastrointestinal. O conhecimento sobre os fatores envolvidos na absorção e metabolismo das
isoflavonas, incluindo o papel da microflora intestinal pode ser importante para determinar a
eficácia clínica. O papel biológico dos metabólitos e das moléculas conjugadas precisa ser
definido. É preciso descobrir a concentração total destas substâncias no plasma e nos tecidos,
a farmacocinética, e assim verificar a eficácia, a dosagem, a segurança e a toxicidade de
extratos padronizados de soja. Como os metabólitos gerados no intestino podem exercer um
papel importante na redução dos riscos ou no tratamento de doenças é interessante avaliar a
segurança do consumo de produtos derivados de soja contendo isoflavonas glicosídicas, mas
não daqueles que contêm somente as agliconas. Estes fatores ainda precisam ser observados
antes de se verificar a eficácia em longo prazo (Dijsselbloem et al., 2004; Zhao et al., 2005).
2.2.2. Propriedades biológicas das isoflavonas
As isoflavonas da soja possuem as seguintes propriedades biológicas: (1) atividades
estrogênica e antiestrogênica, (2) benefício sobre a osteoporose (3) atividade antioxidante (4)
atividade anticarcinogênica (mama, endométrio, próstata, cólon), (5) atividade anti-hemolítica
(6) atividade antimicrobiana (7) benefícios sobre as doenças cardiovasculares, Diabetes
mellitus tipo 2 e sintomas vasomotores e (8) atividade antiinflamatória (Aguiar, 2004; Esteves
e Monteiro 2001).
2.2.2.1 Atividades estrogênica e antiestrogênica
Os receptores de estrógeno (RE) pertencem a uma família de receptores nucleares.
REα e REβ foram encontrados no útero, ovário, mamas e vasos sanguíneos. As proporções
dos subtipos α e β variam de acordo com os tecidos alvos e o status fisiológico e patológico
deles. REα é abundante no cérebro, rim, testículo, pulmão, próstata, osso e miométrio de
mulher grávida. REβ é mais encontrado no cérebro, timo, bexiga, próstata, pulmão, osso e
miométrio de grávida.
As isoflavonas são consideradas moduladoras seletivas de receptores estrogênicos,
possuindo afinidade com os receptores de estrógeno.
O primeiro passo na cascata de transdução do RE é a ligação dessas substâncias ao
RE, que induz dimerização e ligação do dímero RE aos elementos responsivos ao estrógeno
(EREs) dentro da região promoter do seu gene alvo. Pela interação com fatores de transcrição
e coativadores do RE, o complexo RE-coativador permite a transcrição do gene alvo. A partir
do RNAm forma-se uma proteína específica, que induz o efeito estrogênico no tecido alvo,
dependendo do estágio de desenvolvimento. Esta cascata de sinalização molecular induzida
por ligantes, como as isoflavonas, pode ser monitoradas em vários estágios e permite a
caracterização do potencial estrogênico e antiestrogênico (Mueller, 2002).
A afinidade de ligação ao receptor e a mudança conformacional induzida pelo
composto após se ligar ao receptor, são importantes parâmetros para determinar a eficácia
transcricional e atividades agonista e antagonista de um ligante. As isoflavonas possuem
estrutura química similar a dos estrógenos, pois possuem grupos hidroxila (OH) que podem
ser posicionados num alinhamento esterioquímico idêntico ao do estrógeno. A posição e o
número de substituintes hidroxila nas isoflavonas parecem determinar a afinidade de ligação.
A genisteína tem afinidade 20 vezes maior para REβ do que para REα. A eliminação
de um grupo OH (daidzeína, biochanina A) ou dois grupos OH (formononetina) leva uma
considerável perda de afinidade de ligação (Benassayag et al., 2002).
As isoflavonas são 100 a 1000 vezes mais fracas em ligações aos REs que 17β-
estradiol. Entretanto, essas substâncias competem com este hormônio para se ligarem aos
receptores. As isoflavonas inibiram a especificidade de ligação do 17-β-estradiol ao RE em
útero humano e de rato e em glândula mamária humana, de acordo com a dose (Benassayag et
al., 2002). Hwang et al. (2006) realizaram um teste in vitro e observaram que os metabólitos
dihidrodaidzina, tetrahidrodaidzina e dihidrogenistina se ligaram mais fracamente aos
receptores de estrógeno do que seus precursores daidzina e genistina. Equol, um metabólito da
daidzeína, teve a mais forte afinidade de ligação ao receptor estrogênico. Os isoflavonóides
testados atuaram como antagonistas de estrógeno em dose premenopausal de estrógeno. Em
baixas doses de estrogênio como aquelas encontradas no soro de mulheres na pós-menopausa,
exerceram sua atividade agonista. Patisaul et al. (2001) também verificaram a ação
antiestrogênica das isoflavonas de soja em ambos os REα e REβ do cérebro de ratas na
presença de estrógeno.
2.2.2.2 Benefício sobre a osteoporose
Os receptores de estrógenos são encontrados nos osteoblastos, células responsáveis
pela mineralização e síntese da parte orgânica da matriz óssea, composta por colágeno tipo I,
glicoproteínas e proteoglicanas. Os osteoclastos, que são responsáveis pelos processos de
absorção e remodelagem do osso, não possuem esses receptores.
Daidzeína e genisteína estimularam a síntese de proteína e a liberação de fosfatase
alcalina em vários tipos de células de osteoblastos in vitro. Suprimem a atividade dos
osteoclastos por vários mecanismos possíveis independentes de estrógeno: indução de
apoptose, ativação da tirosina fosfatase, mudanças de cálcio intracelular, despolarização de
membrana e inibição de citocinas. A genisteína parece prevenir a reabsorção óssea.
Provavelmente, isto ocorre pela estimulação da síntese de osteoproteregina, que é um receptor
para a citocina e bloqueia sua expressão. Esses mecanismos, em que as isoflavonas conservam
a integridade e a atividade das células ósseas, foram sugeridos por Setchel e Olsen (2003).
Estes autores também mostraram vários estudos realizados em animais confirmando o papel
das isoflavonas em modular o turnover ósseo e retardar a perda óssea em deficiência aguda de
estrógeno.
Esteves e Monteiro (2001) revelaram em estudos em animais em que os extratos
enriquecidos com isoflavonas aumentaram a massa óssea. Além disso, destacaram que a
genisteína, em alta concentração (10
-4
M), é tóxica às células ósseas e, em baixas
concentrações, exerce efeito benéfico.
2.2.2.3 Atividade antioxidante
A atividade antioxidante está envolvida em vários efeitos biológicos: antibacteriano,
antiviral, antiinflamatório, antialérgico, antitrombótico, antimutagênico, anticarcinogênico,
antienvelhecimento e efeitos vasodilatadores (Benassayag et al., 2002).
Lee et al. (2005) compararam o potencial antioxidante de genisteína, daidzeína e suas
formas glicosídicas correspondentes com epicatequina e α-tocoferol. A atividade antioxidante
foi testada por três métodos: oxidação de lipoproteína de baixa densidade (LDL), poder
férrico redutor-antioxidante (PFRA) e testes anti-2,2 difenil-1-picrilhidrasil (DPPH) radical
livre. Observou-se similar potencial antioxidante entre as isoflavonas glicosídicas e as
agliconas nos testes anti-DPPH radical livre e PFRA. O ensaio de oxidação de LDL mostrou
que as isoflavonas glicosídicas têm menor potencial antioxidante do que suas respectivas
agliconas. Os resultados evidenciaram que as agliconas e seus glicosídeos da soja não foram
antioxidantes efetivos comparados à epicatequina e α-tocoferol.
Park et al. (2001c) também demonstraram em seus experimentos que a atividade
antioxidante da daidzeína e da genisteína foi superior à das formas glicosiladas (daidzina e
genistina).
As isoflavonas apresentam a seguinte ordem decrescente de efeito antioxidante:
genisteína > genistina > daidzeína > daidzina > gliciteína > glicitina. Isto pode ser devido à
posição das hidroxilas e ao grau de hidroxilação (Aurora et al., 1998; Pratt et al., 1979).
Lee (2006) verificou que, genisteína e proteína isolada de soja administradas em ratos
diabéticos, aumentaram significativamente a atividade de enzimas hepáticas antioxidantes,
melhorando o sistema de defesa desses animais.
Paradkar et al. (2004) observaram que dieta com o extrato de soja Novasoy® levou ao
aumento das taxas de glutationa, um potente antioxidante.
Naim et al. (1976) relataram que as isoflavonas inibiram a ação da enzima
lipoxigenase, prevenindo a hemólise peroxidativa de eritrócitos de ovelhas in vitro.
Wei et al. (1995) demonstraram a potente ação inibidora da genisteína sobre a enzima
xantina oxidase, inibindo a produção do ânion superóxido.
Desta forma, o potencial antioxidante das isoflavonas parece estar relacionado com a
inibição de enzimas envolvidas no processo de oxidação, com aumento da atividade de
enzimas antioxidantes e com a estimulação para produzir substâncias antioxidantes.
2.2.2.4 Atividade anticarcinogênica
As isoflavonas podem agir de diferentes maneiras, levando à inibição da
carcinogênese.
Os mecanismos podem estar relacionados com as propriedades anticarcinogênicas,
antioxidativas, antiestrogênicas, antiproliferativas e antiinflamatórias destas moléculas.
(Esteves e Monteiro, 2001). Estes fitoestrógenos também interferem na ação da toposiomerase
II, S6-quinase ribossomal, fosfoinositídeo 3-quinase (PI 3-quinase) e proteína quinase C
(PKC), enzimas ligadas ao ciclo, diferenciação e proliferação celular (Gamet-Payrastre et al.,
1999). Segundo Matsuda et al. (1994), a inibição dessas enzimas resultaria na proteção contra
cânceres de intestino, próstata e mama. Outros mecanismos de proteção podem estar
associados, tais como, à síntese do DNA, ao reparo de DNA, inibição de agentes mutagênicos
com o DNA e prevenção da nitrosilação de compostos N-nitrosos (Fergurson, 2001; Esteves e
Monteiro 2001).
Wei et al. (1998) estudaram o efeito da genisteína na carcinogênese de pele dos
animais. De acordo com os resultados, esta substância pareceu exercer efeitos inibitórios na
carcinogênese de pele pela inibição do desenvolvimento de alterações do DNA, inibição da
oxidação e da inflamação in vivo.
Hewitt e Singletary (2003) observaram maior inibição do crescimento do
adenocarcinoma mamário em ratos FE3II que foram tratados com extrato de soja, do que
aqueles foram tratados somente com genisteína. Este fato sugeriu que a genisteína junto com
outros componentes do extrato de soja podem ter contribuido para a supressão do crescimento
do tumor.
Lu et al. (2001) sugeriram que a redução do risco de câncer de mama pode ser devido
ao fato das isoflavonas diminuirem as taxas de hormônios ovarianos.
2.2.2.5 Atividade anti-hemolítica
Há somente um estudo in vitro indicando a ação anti-hemolítica das isoflavonas em
eritrócitos de ovelhas. Como mencionado anteriormente, a prevenção da hemólise ocorreu
através da inibição da enzima lipoxigenase (Naim et al., 1976).
2.2.2.6 Atividade antimicrobiana
Naim et al. (1974) descobriram a atividade antifúngica das agliconas, por inibirem o
crescimento dos fungos a seguir, em ordem decrescente de inibição Trichoderma lignorum,
Pythium spp., Fusarium oxysporum, Rhizopus spp., Sclerotium rolfsii. Aguiar (2004)
observou que as isoflavonas inibiram parcialmente a bactéria Staphylococcus aureus.
2.2.2.7 Benefícios sobre as doenças cardiovasculares, Diabetes mellitus tipo 2 e sintomas
vasomotores
Os receptores ativados por proliferadores de peroxissoma (PPAR) são fatores de
transcrição e pertencem à família de receptores nucleares em que se ligam agonistas
específicos. Estão intimamente relacionados ao metabolismo celular de carboidratos, lipídios
e proteínas e na diferenciação celular. Há muitos trabalhos destacando a importância dos
PPARs no processo inflamatório e lipídico em doenças cardiovasculares. Estudos evidenciam
que glitazonas e fibratos, ativadores dos PPARs, exercem efeitos antiinflamatórios em
modelos experimentais de aterosclerose e insuficiência cardíaca.
Até agora, foram identificadas três isoformas destes receptores: PPARα, PPARβ/δ e
PPAR
γ.
PPARα é encontrado no fígado, rim, coração, músculo, tecido adiposo e está
envolvido no catabolismo de ácidos graxos, no aumento do colesterol HDL plasmático, na
redução da intolerância à glicose, na inibição da transcrição do fator nuclear NF-KappaB (NF-
KB) e na inibição da resposta inflamatória em vasos sanguíneos. A ativação deste receptor
leva a inibição inflamatória pela redução das taxas de fator de necrose tumoral (TNF- α),
interferon-gama, interleucina-6 (IL-6), interleucina-2 (IL-2), proteína ativadora-1 (AP-1) e
pela inibição da enzima ciclooxigenase-2 (COX-2).
PPARβ/δ é encontrado no coração, tecido adiposo, cérebro, pulmão, nas glândulas
adrenais, no baço e na pele. Está relacionado com taxas menores de triglicerídeos e ácidos
graxos livres, com o aumento da oxidação de ácidos graxos e com o controle do status
inflamatório de macrófagos.
PPARγ está localizado no tecido adiposo, intestino e sítios celulares de diferenciação
celular e estoque de lipídios. A sua ativação causa a redução da intolerância à glicose, o
aumento da sensibilidade à insulina e da diferenciação dos adipócitos. Além disso, ocorre a
inibição da ativação de macrófagos e da transcrição de NF-KB. Antagoniza outros fatores de
transcrição, AP-1 e STAT, responsáveis pelo controle da expressão de genes pró-
inflamatórios, tais como a gelatinase B. Inibe a expressão do gene SR-A, que codifica uma
proteína de superfície celular associada a eventos de adesão celular. Inibe a enzima óxido
nítrico sintase.
Desta forma, substâncias que atuam através destes receptores, reduzem a inflamação
vascular, a trombose e as concentrações de glicose e lipídios no sangue. A diminuição da
inflamação e da vasoconstricção inibe monócitos quimiotáticos, proliferação de células
musculares lisas na parede vascular, diminuindo a produção de moléculas de adesão e de
metaloproteinases (Clausell e Tavares, 2004; Ricketts et al., 2005).
Há vários estudos in vitro mostrando a ativação dos receptores PPAR
α e PPARγ pelas
isoflavonas agliconas, mas não pelas formas glicosídicas da soja (Dijesselbloem et al., 2004;
Mezei, 2004; Ricketts et al., 2005; Shen et al., 2006).
As isoflavonas também podem atuar através de outros mecanismos. Kerckhoffs et al.
(2002) destacaram que os efeitos hipocolesterolêmicos das isoflavonas da soja podem ser
explicados pela propriedade estrogênica, que aumenta a excreção de ácidos biliares, a
atividade pelo receptor LDL, o hormônio estimulador de tiroxina e tireóide e supressão da
absorção do colesterol. Desta maneira, ocorre redução da suscetibilidade do LDL à oxidação e
aumento da complacência arterial.
Além disso, relataram que em homens e mulheres com concentração normal de
colesterol e com pouca hipercolesterolemia, a ingestão de proteína de soja com isoflavonas
não causou diminuição significativa do colesterol (3 e 4% respectivamente). Houve um
decréscimo de 7% e 20 % em indivíduos com média e alta hipercolesterolemia
respectivamente.
Estudos feitos em animais mostram que as isoflavonas parecem ser essenciais para
reduzir o colesterol sanguíneo. Animais que ingeriram isolados protéicos sem isoflavonas
foram normo ou hipercolesterolêmicos (Esteves e Monteiro, 2001).
Crouse et al. (1999) observaram que o efeito da proteína de soja em reduzir o
colesterol depende do seu conteúdo de isoflavonas. Neste estudo, homens e mulheres
consumiram 25 gramas de proteína de soja com 3, 27, 37 ou 62 mg/g de isoflavonas durante 9
semanas. As proteínas de soja com 3 e 27 mg de isoflavonas não produziram efeitos
favoráveis sobre as lipoproteínas e o perfil lipídico do plasma. Aquela com 37 mg causou uma
redução na concentração do colesterol LDL em 8%. A proteína de soja que tinha o maior teor
de isoflavonas desencadeou uma redução de 6% em indivíduos moderadamente
hipercolesterolêmicos e 9% em altamente hipercolesterolêmicos. Os níveis de triglicerídeos e
lipoproteína de alta densidade (HDL) não foram afetados.
Messina (2000) confirmou que a proteína de soja rica em isoflavonas inibe a oxidação
de LDL e teria um maior efeito na redução do colesterol que aquelas proteínas de soja com
baixo teor de isoflavonas.
Powell e Kroon (1994) descobriram que após a ingestão de isoflavonas ocorre a
regulação do LDL hepático.
Anthony et al. (1996) sugeriram que as isoflavonas podem reduzir o LDL, aumentar o
HDL e proteger contra o desenvolvimento de placas de ateroma. Potter et al. (1996)
comentaram que as isoflavonas podem agir como antioxidantes, inibindo o processo
trombótico e bloqueando a proliferação de células musculares lisas nas paredes das artérias.
Nestel (2004) afirmou em seu trabalho que nem todas as isoflavonas podem ser
efetivas em reduzir a concentração de colesterol no sangue, pelo fato de a biochanina e não a
formononetina apresentar este efeito.
Nahas et al. (2004) verificaram que mulheres em fase de pós-menopausa que
ingeriram gérmen de soja contendo isoflavonas tiveram um redução de 11,8% de LDL e um
aumento de 27,3% de HDL depois de 6 meses. As isoflavonas reduziram em 44% os fogachos
contra 10% do placebo.
Faure et al. (2002) investigaram o efeito do extrato padronizado de soja (Phytosoya)
em mulheres que sofriam pelo menos 7 fogachos por dia. O tratamento durou 4 meses. Na
quarta semana, houve uma redução de 38% dos fogachos. Na oitava semana, houve uma
redução de 51%. No final de 16 semanas, o extrato de soja reduziu em 61% os fogachos
contra 21% do placebo.
Albert et al. (2002) avaliaram a eficácia de um extrato de isoflavonas em aliviar os
sintomas da menopausa, principalmente, fogachos, mas também, ansiedade, depressão, secura
vaginal, perda e libido e dor óssea. O extrato, obtido da Phytosoya continha 17,5 mg de
isoflavonas. As mulheres em pós menopausa receberam 35 mg de isoflavonas por dia em
duas doses durante 4 meses. Houve uma redução de 80,8% dos fogachos em mulheres que
ingeriam o extrato e apenas 5,48% de melhora em pacientes que não receberam o tratamento.
Nestel et al. (1997) testaram o efeito da ingestão de 80mg diárias de isoflavonas (45
mg de genisteína) sobre a elasticidade dos vasos de 21 mulheres em um período de 5 a 10
semanas. Houve um melhora significativa na elasticidade dos vasos de mulheres em fase de
climatério, cujo tempo de exposição foi semelhante às terapias de reposição hormonal
convencionais.
2.2.2.8 Atividade antiinflamatória
Dijesselbloem et al. (2004) afirmaram que durante o climatério, a redução de
estrógeno e progesterona resulta em elevação das taxas de IL-6. O excesso de IL-6 está
relacionado com o surgimento de várias doenças: inflamação crônica, doenças autoimunes,
osteoporose, Alzheimer, câncer (pulmão, ovário, próstata, mama e cólon), artrite reumatóide,
aterosclerose, leucemia e diabetes. Nesta revisão, mencionaram alguns trabalhos in vitro e in
vivo, em que as isoflavonas genisteína, daidzeína reduzem processos inflamatórios, por
diminuirem a produção de IL-6 através da inibição da transcrição do fator NF-KB.
Entre vários fatores que podem inibir a expressão genética de IL-6 são hormônios
(corticosteróides, hormônios sexuais, etc.) por mecanismos endocrinológicos de feedback e
antioxidantes. Além disso, ocorre modulação transcricional recíproca entre NF-KB e vários
receptores de hormônio nuclear, incluindo PPARα, PPARγ, receptores de glicocorticóide,
progesterona e de vitamina D. Como as isoflavonas parecem induzir estes receptores, além
dos receptores de estrógenos, a complexidade da relação deste hormônio fitoquímico com NF-
KB é aumentada.
Paradkar et al. (2004) induziram inflamação no fígado e no intestino de camundongos
machos, através da injeção de lipopolissacarídeo. Verificaram que a dieta com o extrato de
soja Novasoy® levou ao aumento das taxas de glutationa, um potente antioxidante e diminuiu
a expressão de indicadores inflamatórios tais como metalotioneína e manganês superóxido
dismutase, prevenindo a inflamação. Realizaram testes in vitro para elucidarem os possíveis
mecanismos de ação. Descobriram que as isoflavonas genisteína, daízeína e biochanina A, os
principais metabólitos das isoflavonas, diminuiram significativamente a expressão da IL-6 e
proteínas mediadoras da inflamação.
Zhao et al. (2005) observaram que a genistina e genisteína também diminuiram a
produção de IL-6, assim como, a produção de IL1-β e TNF-α, em ratos com inflamação aguda
no fígado induzida por lipopolissacarídeo.
Outros mecanismos podem estar associados. Testes in vitro feitos com gliciteína e
genisteína, nas doses de 50 e 100 µM, respectivamente, mostraram que estas substâncias
inibem a enzima COX-2, sem interferir na atividade da enzima COX-1. A gliciteína também
reduziu a liberação de IL1-β, TNF-α e de óxido nítrico. Nas doses de 0,1 a 1 µM, a genisteína
aumentou a expressão da COX-2 (Hermenegildo et al., 2005; Park et al., 2006). Hooshmand
et al. (2005) verificaram que a genisteína inibiu a produção de óxido nítrico e a enzima COX-
2, mas não a enzima COX-1.
Genisteína e daidzeína, na dose de 10 µM, inibiram a produção de óxido nítrico e de
prostaglandinas em aorta isolada de ratos espontaneamente hipertensivos (Vera et al., 2005).
Mahesha et al. (2007) relataram que genisteína e daidzeína, nas doses de 60 e 80 µM
respectivamente, inibiram a atividade das enzimas 1- e 5-lipoxigenase em linfócitos humanos
polimorfonuleares.
Desta forma, os fitohormônios podem modular a produção de prostaglandinas e
leucotrienos envolvidos em câncer e proteger as células contra peroxidação lipídica e
aterosclerose.
Wei et al. (1998) estudaram o efeito da genisteína na carcinogênese de pele de
animais. De acordo com os resultados, esta substância pareceu exercer efeitos antiiniciais e
antipromocionais na carcinogênese de pele pela inibição do desenvolvimento de alterações do
DNA, inibição da oxidação e inflamação in vivo.
Em função dos benefícios das isoflavonas à saúde e a redução dos riscos às doenças,
principalmente às mulheres no climatério, o presente trabalho investigou o perfil destas
substâncias na semente de soja e suas propriedades biológicas.
3. OBJETIVOS
Os objetivos do presente estudo foram:
1) Extração das isoflavonas de soja;
2) Avaliar o teor de isoflavonas totais da fração com isoflavonas;
3) Isolamento e identificação das substâncias isoladas;
4) Investigar a atividade sobre os receptores PPAR(s) da fração com isoflavonas;
5) Avaliar as atividades antidiabética e hipolipemiante da fração com isoflavonas;
6) Estudar a atividade antiinflamatória da fração com isoflavonas;
7) Avaliar a toxicidade aguda e a hepatotoxicidade desta fração.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. SOJA
A soja foi fornecida pela COAMO Cooperativa Agroindustrial.
4.2 ANÁLISE DE TRANSGENIA
Este teste foi executado na EMBRAPA Soja (Londrina), que possui autorização da
Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio), através do Certificado de Qualidade
em Biossegurança (CQB n
o.
0002/96) para trabalhos com organismos modificados
geneticamente.
Cultivares transgênicos resistentes ao herbicida glifosato contêm o gene CP4 EPSPS
proveniente da bactéria Agrobacterium tumefasciens. O gene codifica a enzima de mesmo
nome.
Uma amostra de 20 g de grãos de soja foi avaliada quanto à presença desta enzima
pelo kit Trait Crop and Grain Testing, fornecido pela empresa Strategic Diagnostics Inc.
(Newark, Delare, Estados Unidos). Os controles positivos e negativos foram respectivamente:
grãos de genótipos de soja contendo o gene CP4 EPSPS e grãos de soja convencional, não
modificados geneticamente. Os grãos transgênicos foram originados do evento elite GTS-40-3
e fornecidos pela empresa Monsanto. As sementes foram trituradas durante 10 segundos em
liquidificador com água. Pipetou-se 0,5 mL do extrato de sementes trituradas e colocado em
um tubo de 1,5 mL. Com o auxílio da tira de teste observou-se o resultado.
Anticorpos específicos para proteína CP4 EPSPS foram ligados a um reagente
colorido e incorporados na tira do teste. A tira foi introduzida em uma pequena fração do
extrato. Se o extrato contém a proteína CP4 EPSPS, forma-se um co-anticorpo que
incorporado ao reagente colorido, flui na tira através de uma membrana porosa. A membrana
contém duas zonas de captura, uma específica para a proteína CP4 EPSPS e outra para os
anticorpos não reagidos. O teste foi realizado conforme as instruções do fabricante. A técnica
é capaz de detectar um grão geneticamente modificado em 999 não modificados
geneticamente (0,1%).
4.3 EXTRAÇÃO DAS ISOFLAVONAS
A extração das isoflavonas de soja e a análise qualitativa por cromatografia em
camada delgada foram feitos no Laboratório de Farmacognosia do Departamento de Farmácia
e Farmacologia (DFF) da Universidade Estadual de Maringá (UEM).
1 kg de grãos de soja congelados em freezer foi triturado em multiprocessador. O pó
resultante foi desengordurado com 12 L de hexano, por remaceração e à temperatura ambiente
durante 20 dias. A suspensão foi filtrada a vácuo em funil de buckner acoplado a kitasato,
utilizando-se papel de filtro. O solvente foi recuperado através de evaporador rotativo à
pressão reduzida. Obteve-se 700g de pó desengordurado. A seguir, produziram-se 48 g de
fração metanólica. O rendimento foi de 4,8% (Aguiar, 2004; Ho et al., 2002).
4.3.1 Cromatografia em camada delgada (CCD)
Alíquotas da fração e das subfrações foram aplicadas em cromatoplacas (5x10 cm)
Kieselgel 60 F
254
(Merck Co., Alemanha). Usou-se como sistema de solventes acetato de
etila-metanol-água (6: 3:1), em fluxo ascendente. Após o desenvolvimento do cromatograma,
as placas foram observadas sob luz ultravioleta a 254 nm e 366 nm. Em seguida, foram
borrifadas com o agente revelador cloreto-férrico 4,5% (4,5 g de cloreto férrico em 100 mL de
água destilada) para a visualização das isoflavonas.
4.3.2 Análise Espectrofotométrica
A análise espectrofotométrica foi efetuada no Laboratório de Farmacotécnica do DFF.
Pesaram-se 40 mg da fração metanólica que foram solubulizadas em 10 mL de
metanol. Determinou-se o espectro de absorção na região do UV-Visível na faixa de 200 a
500 nm (UV scanning) através do espectrofotômetro da marca Shimadzu, UV 1650PC.
4.3.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
A análise quantitativa das isoflavonas da fração metanólica de soja foi laborada na
Embrapa Soja, localizada na cidade de Londrina.
A extração das isoflavonas foi realizada de acordo com a metodologia de Carrão-
Panizzi et al., 2002. 100 mg da fração metanólica foram solubilizados em álcool 70%
contendo 0,1% ácido acético. Os tubos contendo as amostras e a solução extratora foram
homogeneizados em agitador de tubos do tipo “Vortex” e submetidos à extração por uma hora
em temperatura ambiente. A cada intervalo de 15 minutos os tubos eram agitados com o
auxílio do agitador de tubos. 1,5 mL do extrato foram transferidos para tubos de
microcentrífuga do “tipo Ependorff”, e centrifugados por 15 minutos a 14.000 rpm, numa
temperatura de 5ºC. O sobrenadante foi filtrado através de membrana com poros de 0,45 µm,
da marca “Millipore”. 20 µL do extrato filtrado foram utilizados para injeção no cromatógrafo
líquido.
A separação e a quantificação das isoflavonas foram realizadas de acordo com a
metodologia preconizada por Berhow, 2002, em cromatógrafo líquido da marca Waters,
modelo 2690, com injetor automático de amostras. Utilizou-se, para tanto, uma coluna de fase
reversa do tipo ODS C18 (YMC Pack ODS-AM Columm) com 250mm de comprimento x
0,4mm de diâmetro interno e partículas de 5µm. Para a separação das isoflavonas, adotou-se o
sistema de gradiente linear binário, tendo-se como fases móveis: 1) metanol contendo 0,025%
ácido trifluoroacético (TFA) (solvente A) e 2) água destilada deionizada ultrapura contendo
0,025% de TFA (solvente B). A condição inicial do gradiente foi de 20% para o solvente A,
que aos 40 minutos atingiu a concentração de 100%. Em seguida, retornou a 20% aos 41
minutos e permaneceu nestas condições até os 60 minutos. Portanto, o tempo total de corrida
para cada amostra foi de 60 minutos. A vazão da fase móvel foi de 1 mL/min e a temperatura
durante a corrida, 25ºC. Para a detecção das isoflavonas, foi utilizado o detector de arranjo de
foto diodo da marca Waters, modelo 996, ajustado para o comprimento de onda igual à 260
nm. Para a identificação dos picos correspondentes à cada uma das isoflavonas foram
utilizados padrões de daidzina, daidzeína, genistina e genisteína, da marca Sigma,
solubilizados em metanol (grau CLAE), nas seguintes concentrações: 0,00625 mg/mL; 0,0125
mg/mL; 0,0250 mg/mL; 0,0500 mg/mL e 0,1000 mg/mL. Para a quantificação das 12 formas
de isoflavonas, por padronização externa (área dos picos), foram utilizados os padrões como
referência, bem como o coeficiente de extinção molar de cada uma delas para o cálculo das
outras formas malonil e acetil.
4.3.3.1 Cálculo do teor de isoflavonas na semente de soja
A quantidade média de cada isoflavona observada na fração metanólica foi
multiplicada pelo rendimento de 4,8%, resultando nas respectivas concentrações encontradas
na semente.
4.4 ISOLAMENTO DAS SUBSTÂNCIAS ATIVAS
O isolamento das isoflavonas foi realizado no Laboratório de Farmacognosia do DFF.
2g da fração metanólica foram solubilizadas em metanol e aplicadas em SEPHADEX
LH-20. Realizou-se o fracionamento com 1 L de metanol. As frações foram monitoradas em
cromatografia de camada delgada.
Obteve-se 8 mg da fração FEG e 26 mg da fração FE7. Estas duas frações foram
solubilizadas em metanol-água (1:1), filtradas em algodão e fracionadas em coluna LOBAR
de fase reversa C
18
, utilizando uma bomba peristáltica. Utilizaram-se 30 mL do sistema
eluente metanol: água (1:1). A partir de FE7 isolou-se a FE7B (2,4 mg) e por FEG isolou-se a
FEGB (1mg).
4.4.1 Identificação das substâncias isoladas por RMN
1
H
As análises foram realizadas no Departamento de Química da UEM.
As substâncias FE7B e FEGB foram analisadas por RMN
1
H (Ressonância Magnética
Nuclear de Hidrogênio) em espectrômetro VARIAN, modelo GEMINI 2000 BB, 300 MHz.
Foi utilizada como solvente água deuterada (D
2
O) (Aldrich), e como referência interna o
tetrametilsilano (TMS, δ=0,0 ppm).
4.5 EFEITO SOBRE OS RECEPTORES PPAR
O teste in vitro foi feito no Laboratório de Farmacologia Molecular da Universidade
de Brasília.
Este experimento é conhecido como ensaio de gene repórter, em que foi realizada a
transfecção dos plasmídeos em células U937 (células de linfoma humano). Os plasmídeos
utilizados são:
1. Expressão: PPARα, PPARλ e PPARβ/γ;
2. Gene repórter: DR1-Luc (gene repórter da luciferase dirigido por promotor
contendo sequência DR1).
4.5.1 Procedimentos
Procedeu-se o teste de acordo com os procedimentos a seguir:
As cubetas e placas de 12 poços, contendo os meios RPMI (Roswell Park Memorial
Institute) e PBS (fosfato do sódio) com cálcio e glicose, foram mantidas abertas e expostas à
luz UV durante 30 min, na capela e a 37ºC. As células U937 foram coletadas em tubos
cônicos (“falcon”) de 50 mL. A centrifugação foi realizada a 4000 rpm por 3 min e descartou-
se o sobrenadante. As células foram ressuspendidas na solução de PBS com cálcio e glicose
(500 µl por transfecção).
Para a contagem de células em câmara de Neubauer, tomaram-se 100 µL de células +
900 µL de PBS com cálcio e glicose. O número de células contadas x 10
4
(correção da câmara
para mL) x 10 (diluição) é igual ao número de células por mL.
Em seguida, foram colocados 500 µL da suspensão de células em eppendorfs com os
plasmídeos e a homogeneização foi feita com a própria pipeta. Transferiu-se a suspensão de
células com plasmídeos para as cubetas. Após esta etapa, fez-se a eletroporação a 300 kV
(950 µF). O conteúdo das cubetas foi ressuspendido nos tubos cônicos (“falcon”) de 15 mL ou
50 mL contendo meio RPMI. Posteriormente, a suspensão de células transfectadas foi
transferida para as placas: 1 mL de suspensão de células por poço da placa. Então, as
substâncias foram adicionadas para o tratamento das células, de acordo com o tipo de
experimento. As placas com as células foram mantidas na incubadora a 37
o
C, 5% CO
2
, por
22h às 24h.
4.5.2 Transfecções
4.5.2.1 Avaliação da atividade da fração metanólica sobre PPARα
1. PPARα (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + água
2. PPARα (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + DMSO/Etanol 1:1
3. PPARα (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + bezafibrato 10
-5
M
4. PPARα (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + bezafibrato 10
-4
M
5. PPARα (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + fração metanólica 200 µg/mL
6. PPARα (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + fração metanólica 400 µg/mL
7. PPARα (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + fração metanólica 800 µg/mL
8. PPARα (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + fração metanólica 1600 µg/mL
4.5.2.2 Avaliação da atividade da fração metanólica sobre PPARβ/δ
1. PPAR
δ (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + água
2. PPARδ (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + DMSO/Etanol 1:1
3. PPARδ (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + bezafibrato 10
-5
M
4. PPARδ (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + bezafibrato 10
-4
M
5. PPARδ (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + fração metanólica 200 µg/mL
6. PPARδ (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + fração metanólica 400 µg/mL
7. PPARδ (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + fração metanólica 800 µg/mL
8. PPARδ (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + fração metanólica 1600 µg/mL
4.5.2.3 Avaliação da atividade da fração metanólica sobre PPARγ
1. PPARγ (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + água
2. PPARγ (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + DMSO/Etanol 1:1
3. PPARγ (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + troglitazona 10
-5
M
4. PPARγ (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + fração metanólica 200 µg/mL
5. PPARγ (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + fração metanólica 400 µg/mL
6. PPARγ (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + fração metanólica 800 µg/mL
7. PPARγ (1,5 µg) + DR1-Luc (3 µg) + fração metanólica 1600 µg/mL
4.5.2.4 Observação
Tratamento com água: controle de tratamento com fração metanólica (diluídas
em água)
Tratamento com DMSO/Etanol: controle do tratamento com ligantes de PPAR
(troglitazona e bezafibrato, diluídos em DMSO/Etanol).
4.5.3 Leitura da atividade da luciferase em células U937
A suspensão de células nas placas foi coletada e transferida para tubos de 1,5 mL
devidamente identificados (de acordo com o experimento). Os eppendorfs foram
centrifugados a 13.000 rpm por 2 minutos. Aspirou-se o sobrenadante com o auxílio de
bomba de vácuo acoplada a uma ponteira. Depois, foram acrescentados 150µL do tampão de
lise 1X e incubou-se por 30 minutos à -80
o
C. Os eppendorfs foram agitados em vortex para
misturar o pellet e o tampão de lise. Após este passo, transferiu-se o lisado celular para placas
de 96 poços (20 µL de cada tubo de 1,5mL com lisado por poço). Finalmente, procedeu-se a
leitura da atividade da luciferase.
4.7 INVESTIGAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIDIABÉTICA E HIPOLIPIDÊMICA DA
FRAÇÃO METANÓLICA EM RATOS WISTAR
Este ensaio farmacológico foi executado no Laboratório de Endocrinologia do DFF. A
utilização dos animais seguiu os critérios exigidos pelo Comitê de Ética da UEM.
Foram utilizados ratos machos adultos, da linhagem Wistar pesando 200-250 gramas.
Os animais foram divididos em dois grupos. O primeiro grupo recebeu somente água por
gavagem (via oral). O segundo foi tratado por gavagem com a dose de 20 mg da fração
metanólica (solubilizada em água) por 1kg de peso corporal. Os animais foram tratados
durante 15 dias. Passado este período, foram submetidos a um jejum de 15 horas e
sacrificados por decapitação para a coleta do sangue. Após a coleta sem uso de
anticoagulante, o sangue total permaneceu em banho-maria, para retração do coágulo. Em
seguida, foi centrifugado para obtenção do soro, que foi estocado sob refrigeração até o
momento das determinações bioquímicas. As determinações séricas de glicose, triacilglicerol
e colesterol total foram feitas pelo kit da Gold Analisa Diagnóstica
®
. Empregou-se o
espectrofotômetro Vitalab Selectra 2, com cubeta de quartzo de 1 cm para a realização das
análises.
4.6.1 Dosagem de glicose
Empregou-se o método da glicose-oxidase, específico para quantificação de glicose
(BERGMEYER & BERNT, 1974).
O método consistiu na oxidação enzimática da glicose pela glicose-oxidase (GOD)
gerando ácido glucônico e peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
). O H
2
O
2
em presença de peroxidase
(POD) reagiu com 4-aminoantipirina (4-AMP), por uma reação oxidativa de acoplamento,
gerando a antipirilquinonimina. O produto formado foi de coloração avermelhada e sua
intensidade foi diretamente proporcional à concentração de glicose na solução. A cor
avermelhada, formada pela reação, foi medida em espectrofotômetro, com absorção máxima
em 510nm de comprimento de onda.
Glicose + O
2
+ H
2
O GOD ácido glucônico + H
2
O
2
2H
2
O
2
+ 4AMP POD 4-antipirilquinonimina + 4 H
2
O
A glicemia foi expressa em mg/dL.
4.6.2 Dosagem de triglicerídeos
A quantificação de triglicerídeos foi realizada por um método enzimático (BUCOLO e
DAVID, 1973).
Os triglicerídeos foram hidrolisados pela lípase protéica e o glicerol formado foi
fosforilado pela lipase protéica, liberando o glicerol. Este, por sua vez, foi fosforilado pela
glicerolquinase, formando o glicerol fosfato. Este produto, por ação da glicerol-3-fosfato
oxidase, foi oxidado à dihidroxicetona e peróxido de hidrogênio. Pela reação de acoplamento
oxidativo, catalisada pela peroxidase, a água oxigenada reagiu com a 4-aminoantipirina (4-
AMP) e 4-clorofenol, produzindo a quinoneimina (vermelha), cuja absorbância, medida em
500 nm, foi diretamente proporcional à concentração de triglicérides.
Triglicérides + H
2
O lipase protéica glicerol + ácido graxos
Glicerol + ATP glicerolquinase Mg
2+
glicerol-3-P + ADP
Glicerol-3-P + O
2
G-3-P oxidase dihidroxiacetona + H
2
O
2
2H
2
O
2
+ 4-AMP + 4-clorofenol
peroxidase 4H
2
O
+ quinoneimina
4.6.3 Dosagem de colesterol total
Para a quantificação de colesterol total usou-se o método enzimático (ALLAIN et al.,
1974).
Pela ação da colesterol esterase, os ésteres de colesterol foram hidrolisados a colesterol
livre e ácidos graxos. A colesterol oxidase oxidou o colesterol livre formando a colest-4-en-
ona e H
2
O
2
.
Na presença da enzima peroxidase (POD) e de H
2
O
2
, o fenol e a 4-aminoantipirina (4-
AP) foram oxidados formando uma quinoneimina de coloração vermelha. O complexo
formado teve absorbância a 500 nm e a intensidade da cor foi diretamente proporcional à
concentração de colesterol.
Ésteres do colesterol colesterol esterase colesterol + ácidos graxos
Colesterol + O
2
colesterol oxidase colest-4-en-ona + H
2
O
2
2H
2
O
2
+ fenol + 4-AP POD quinoneimina + 4H
2
O
4.7 INDUÇÃO DO EDEMA DE ORELHA
A avaliação da atividade antiinflamatória foi executada no Laboratório de
Inflamação do DFF. A manipulação dos camundongos foi de acordo com o Comitê de Ética
da UEM.
O edema foi induzido em camungondos Swiss (25-35 g) pela aplicação de óleo de
Cróton, uma substância irritante, ambas as faces internas das orelhas. Foram aplicados 20 µl
deste agente diluído numa solução de acetona/água 7:3. A concentração da solução foi de 200
µg do óleo/ orelha (Van Arman, 1974). A indometacina (1 mg) e a dexametasona (0,1 mg)
foram utilizadas como antiinflamatórios de referência (controle positivo). Os fármacos foram
solubilizados em acetona/água (7:3). A seguir, foram aplicados 20 µL da solução de fração
metanólica, também solubilizada em acetona/água (7:3), nas doses de 0,625, 1,25, 2,5 e 5,0
mg/orelha na superfície interna da orelha esquerda (E) (tratada). A orelha direita (D) recebeu
apenas 20µL do veículo acetona/água 7:3. Depois de 6 horas, os animais foram sacrificados e
as orelhas foram seccionadas com um vazador de metal, em discos circulares de 6 mm de
diâmetro. Estas secções foram pesadas em balança analítica e o edema foi avaliado como a
diferença de peso em (mg) entre as orelhas direita e esquerda. A porcentagem de inibição de
edema foi determinada pela fórmula:
(%) de inibição = peso da orelha E
controle
– peso da orelha E
tratada
peso da orelha E
controle
– peso da orelha D
veículo
4.7.1 Atividade da mieloperoxidase (MPO)
A atividade da MPO foi avaliada no sobrenadante de homogenados das secções de
orelhas (controles e tratadas com fração metanólica – 2,5 mg e dexametasona – 0,1 mg), de
acordo com a técnica de Bradley et al. (1982). A orelha foi colocada em tampão fosfato de
potássio 50 mM, pH 6,0, contendo 0,5 % de brometo de hexadeciltrimetil-amônio (Sigma-
1ml/50 mg de tecido) em homogeneizador de Potter. O homogenato foi agitado em vórtex.
Posteriormente, centrifugou-se durante 5 min a 2500 rpm. Adicionaram-se 10 µL do
sobrenadante obtido em microplaca de 96 cavidades, em triplicata. Foram adicionados 20 µL
de solução tampão contendo dihidrocloreto de o-dianisidina (Sigma – 16,7 mg), 90 mL de
água bidestilada, 10 mL de tampão de fosfato de potássio e 50 ml de H
2
O
2
1 % . A atividade
da enzima foi determinada pela medida da absorbância em 460 nm, em leitor Spectra Max
Plus e registrada em intervalos de 15 seg durante 2 min.
4.8 TOXICIDADE
4.8.1 Hepatotoxicidade
O estudo da hepatotoxicidade foi efetuado no Laboratório de Endocrinologia do DFF.
O emprego dos animais para o ensaio farmacológico obedeceu as normas estabelecidas pelo
Comitê de Ética da UEM.
Para este experimento, empregaram-se ratos machos adultos, da linhagem Wistar
pesando 200-250 gramas, que foram divididos em dois grupos: controle e fração metanólica.
O primeiro grupo recebeu somente água por gavagem e o segundo recebeu também por
gavagem a fração metanólica solubilizada em água, na quantidade de 20mg/kg. Os animais
foram tratados durante 15 dias. Após este período, passaram por um jejum de 15 horas e
foram sacrificados por decapitação para a coleta do sangue. As determinações séricas de
aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT), foram realizadas com o
kit da Gold Analisa Diagnóstica
®
. Após a coleta sem uso de anticoagulante, o sangue total
permaneceu em banho-maria, para retração do coágulo. Em seguida, foi centrifugado para
obtenção do soro, que foi estocado sob refrigeração até o momento das determinações
bioquímicas. O equipamento utilizado nesta análise foi um espectrofotômetro Vitalab Selectra
2, com cubeta de quartzo de 1 cm.
4.8.1.1 Determinação quantitativa da atividade da alanina aminotransferase (ALT) no soro
A ALT catalisa a transferência do grupo amina da alanina para o cetoglutarato com
formação de lactato desidrogenase (LDH), enquanto que a coenzima NADH é oxidada a
NAD
+
.
A atividade enzimática da ALT na amostra é calculada com base na redução da
absorbância em 340 nm.
Alanina + cetoglutarato ALT piruvato + glutamato
Piruvato + NADH + H
+
LDH lactato + NAD
+
4.8.1.2 Determinação quantitativa da atividade da aspartato aminotransferase (AST) no soro
O grupo amina do aspartato é transferido para o cetoglutarato através da ALT,
formando-se glutamato a oxalacetato. O oxalacetato é reduzido a malato pela malato
desidrogenase (MDH), enquanto que a coenzima NADH é oxidada a NAD
+
. A atividade
enzimática da AST é calculada com base na redução da absorbância em 340 nm.
Aspartato + cetoglutarato AST oxalacetato + glutamato
Oxalacetato + NAD + H
+
MDH Malato + NAD
+
4.8.2 Toxicidade Aguda (DL
50
)
A toxicidade aguda da fração metanólica foi investigada no Laboratório de
Inflamação do DFF. A utilização dos animais correspondeu aos requisitos preconizados pelo
Comitê de Ética da UEM.
Os camundongos Swiss (25-35 g) sob jejum de 18 horas receberam as doses de
1000, 2000, 3000 e 4000 mg da fração metanólica (solubilizada em água) por 1 kg de peso
corporal, por gavagem ou por via intraperitoneal. Os animais foram observados por 7 dias e
durante este período, receberam água e ração livremente. O número de mortes foi observado
e a DL
50
calculada através da Análise de Probitos (MILLER & TAINTER, 1944).
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram apresentados como média (M) ± erro padrão da média (EPM). Os
dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste de Tukey,
utilizando o programa estatístico Primer versão 4.0. Foi aceito o nível de confiança de 95%
(p<0,05) para todas as comparações.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 ANÁLISE DE TRANSGENIA
A amostra não apresentou material geneticamente modificado para o gene CP4 EPSPS
(Figura 2).
Segundo a SEAB (Secretaria de Agricultura e Abastecimento), a soja transgênica foi
desenvolvida para possibilitar o uso do herbicida glifosato, que não é empregado no cultivo da
soja convencional.
Um estudo feito por este órgão em 2004 verificou a presença de altos índices de
glifosato na maioria das amostras de soja transgênica analisadas. Em 2007, encontraram
níveis deste agrotóxico acima do permitido. Deste modo, a SEAB questiona o aumento do
limite de 0,2 mg/kg de glifosato para 10mg/kg preconizado pela ANVISA. A utilização deste
herbicida é feita depois que a soja já germinou e atinge a parte aérea da planta. Em contato
com as folhas é absorvido e atinge os grãos, que podem conter o glifosato e/ou seu metabólito
de similar toxicidade o AMPA (ácido aminometilfosfônico).
No Brasil, o monitoramento de resíduos é pouco efetivo. Aumentando-se a margem de
tolerância, aumentam-se a margem do risco de contaminação dos produtos e de danos à saúde
humana e animal. Os sinais clínicos de contaminação por glifosato são: inflamação de
garganta, dor abdominal, vômito, edema pulmonar, úlceras erosivas do esôfago e do
estômago, pneumonia, diminuição do volume de urina, hipertensão e dermatite.
Figura 2. Resultado da análise do kit Trait Crop and Grain Testing para a enzima CP4 EPSPS.
5.2 ANÁLISE ESPECTROFOTOMÉTRICA DA FRAÇÃO METANÓLICA
A análise preliminar da fração metanólica de soja, pela observação do espectro de
absorção na região do UV-Visível (200-500 nm) (Figura 3), demonstrou que a absorção
máxima foi de 262 nm, região característica das isoflavonas, que absorvem próximo a 260 nm
(Aguiar, 2004).
Fração metanólica (λ
máx
= 262,00; Abs = 0,626)
Figura 3. Espectro de absorção na região UV-Visível da fração metanólica
5.3 CONTEÚDO DE ISOFLAVONAS DA FRAÇÃO METANÓLICA DA SOJA
Para utilização segura das isoflavonas de soja em alimentos processados,
medicamentos fitoterápicos e cosméticos, a padronização é necessária para garantir que o
conteúdo de princípios ativos corresponda aos padrões de qualidade. Utiliza-se a
cromatografia líquida de alta eficiência para analisar o teor de isoflavonas em produtos de
soja, por ser um método automatizado, rápido e eficaz. (Celeghini, et al., 2001). Desta forma,
avaliou-se o conteúdo de isoflavonas da fração metanólica de soja. Conforme a figura 4, a
fração apresentou as isoflavonas agliconas, malonil-glicosídicas e não apresentou as
isoflavonas acetil-glicosídicas.
Figura 4. Perfil cromatográfico da fração metanólica de soja. 1. Daidzina, 2.Glicitina, 3.
Genistina, 4. Malonildaidzina, 5. Malonilglicitina, 6. Malonilgenistina, 7. Daidzeína, 8.
Gliciteína 9. Genisteína
Tempo (min)
Tabela 1. Teores de isoflavonas da fração metanólica de soja
mg de isoflavonas/100g de fração metanólica de soja
1. Daidzina
145, 67 ± 3,14
2. Glicitina
47,69 ± 1,86
3. Genistina
147, 54 ± 5,54
4. Malonildaidzina
276,54 ± 4,21
5. Malonilglicitina
105,73 ± 1,17
6. Malonilgenistina
466, 54 ± 7,37
7. Daidzeína
57,73 ± 1,26
8. Gliciteína
22,61 ± 0,36
9. Genisteína
75, 04 ± 1,61
Isoflavonas Totais 1345, 09
Os dados representam miligramas de isoflavonas por 100 gramas de fração metanólica de soja
± desvio padrão da média de três determinações.
Tabela 2. Teores de isoflavonas na semente de soja
mg isoflavonas/100g de soja
1. Daidzina 6,99
2. Glicitina 2,29
3. Genistina 7,08
4. Malonildaidzina 13,27
5. Malonilglicitina 5,08
6. Malonilgenistina 22,39
7. Daidzeína 2,77
8. Gliciteína 1,09
9. Genisteína 3,6
Isoflavonas Totais 64,56
Os dados representam miligramas de isoflavonas por 100 gramas de semente de soja
A isoflavona mais abundante na fração foi malonilgenistina. O teor de isoflavonas
totais foi 1345,09 mg/100g de fração (Tabela 1). O teor de isoflavonas totais na semente de
soja foi 64,56 mg/100g (Tabela 2). Estes resultados estão de acordo com os valores obtidos na
literatura para a soja brasileira, 10 a 300mg/100g (Carrão-Panizzi et al., 1999, Tsukamoto et
al., 2001). A baixa concentração de isoflavonas na semente pode ser devido às variações na
época de plantio, no local de cultivo e, principalmente, da temperatura durante a fase de
formação dos grãos.
Segundo Murphy et al. (2002), as isoflavonas apresentaram os valores máximos de
absorção nos seguintes comprimentos de onda: daidzina (250,3 nm), glicitina (258,9 nm),
genistina (259,8 nm), malonildaidzina (250,3 nm), malonilglicitina (259 nm), acetildaidzina
(249,1 nm), acetilglicitina (258,6 nm), malonilgenistina (259,8 nm), daidzeína ( 249,1 nm),
gliciteína (257,4 nm), acetilgenistina (260,9 nm), genisteína ( 259,8 nm). Os valores de
absorção máxima das soluções-padrão de isoflavonas com as quais trabalhamos tiveram
valores semelhantes aos obtidos por estes autores.
5.4 DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL DAS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS
De acordo com os dados de RMN
1
H da literatura, na subfração FE7B identificou-se a
substância majoritária malonilglicitina. FEGB foi identificada como malonildaidzina (Tabela
3 e 4; Figuras 5 e 6).
Tabela 3. Dados de RMN
1
H (300 MHz) de FE7B em D
2
O de comparados com os valores de
malonilglicitina (400 MHz) em DMSO
-d6,
descritos na literatura (Kudou et al, 1991).
C FE7B malonilglicitina
C-2 8,32 s 8,32 s
C-5 No. 7,47 s
C-6 No. No.
C-8 7,17 s 7,31 s
OMe 3,74 s 3,88 s
C-2’ e C-6’ 7,41 br 7,40 d (8.8)
C-3’ e C-5’ 6,99 d (6.6) 6,82 d (8.8)
C-1” No. 5,20 d (7.8)
C-2”-6” 3,13-3,89 m 3,15-3,80 m
C-6”a 4,47 d (12.6) 4,38 d (12.2)
C-6”b 4,34 dd (12.2; 5.8) 4,12 dd (12.2; 6.8)
C-2”’ 3,39 s 3,38 s
No. = não observado
OCH
3
3’’
2’’- 6’’
2
2’,6’
8
3’,5’
6”a
6’’b
2’’’
O
O
OH
O
H
3
CO
O
H
H
H
H
OH
OH
H OH
O
O
O
OH
8
10
9
2
1’
2’
3’
5’
6’
2’’
1’’
4’’
5’’
1’’’
2’’’
3’’’
6’’
5
3
Figura 5. Espectro de RMN
1
H da substância malonilglicitina na subfração FE7B (300 MHz; D
2
O)
OCH
3
3’’
Tabela 4. Dados de RMN
1
H (300 MHz) de FEGB em D
2
O comparados com os valores de
malonildaidzina (400 MHz) em DMSO
-d6,
descritos na literatura (Kudou et al, 1991).
C FEGB Malonildaidzina
C-2 8,33 s 8,35 s
C-5 8,11 d (9.0) 8,07 d (8.8)
C-6 7,22 dd (9.3; 2.2) 7,14 d (8.8; 2.4)
C-8 7,27 d (2.4) 7,22 d (2.4)
C-2’ e C-6’ 7,42 d (8.4) 7,40 d (8.8)
C-3’ e C-5’ 7,00 d (8.4) 6,82 d (8.8)
C-1” 5,25 d (7.2) 5,14 d (7.3)
C-2”-6” 3,32-3,95 m 3,15-3,80 m
C-6”a 4,55 d (10.2) 4,41 d (12.0)
C-6”b 4,39 dd (12.0; 5.4) 4,11 dd (12.0; 7.1)
C-2”’ 3,36 s 3,40 s
O
O
OH
O
O
H
H
H
H
OH
OH
H OH
O
O
O
OH
1’’
6’’
2’’’
1’’’
2’’
3’’
4’’
5’’
8
5
6
2
3
1’
2’
3’
5’
6’
9
10
3’’’
5
2’, 6’
8
6
3’, 5’
1’’
6’’ a
6’’ b
2’’- 6’’
2
2’’’
Figura
6
. Espectro de RMN
1
H da substância
malonildaidzina (
FEGB
)
(300 MHz; D
2
O)
69
5.5 EFEITO DA FRAÇÃO METANÓLICA SOBRE OS RECEPTORES PPARs
PPARα e PPARβ/δ são alvos terapêuticos de fibratos, drogas largamente usadas para
reduzir os triglicerídeos e o colesterol LDL, e aumentar HDL e a reduzir a intolerância à
glicose em pacientes com dislipidemia, aterosclerose e obesidade. PPARγ é alvo para ligantes
tais como a troglitazona da classe das tiazolidinedionas, utilizada para aumentar a
sensibilidade à insulina no tratamento do Diabetes mellitus tipo 2. A ativação destes
receptores também pode contribuir para combater a inflamação. Drogas agonistas destes
receptores oferecem ação farmacológica sobre a síndrome metabólica (Shen et al., 2006).
De acordo com a literatura, extratos comerciais contendo as isoflavonas agliconas,
mas não as glicosídicas da soja, ativam os receptores PPARα e PPARγ in vitro (Mezei, 2004;
Ricketts et al., 2005). Todavia, estes autores não testaram doses crescentes de extratos com
isoflavonas glicosídicas ou agliconas, não se observando uma curva dose-efeito.
A fração metanólica com maior concentração de isoflavonas glicosídicas ativou os
receptores PPARα e PPARβ/δ nas concentrações mais altas, de modo dose-dependente e
semelhante aos fibratos. Contudo, não levou à ativação do receptor PPARγ (Figuras 7, 8 e 9).
Não se pode afirmar que somente as agliconas são agonistas destes receptores, pelo
fato de não se conhecer profundamente o papel das isoflavonas conjugadas e de outras
substâncias presentes na fração. O método de extração das isoflavonas também pode ter
interferido nos resultados.
Como já foi verificado, o teor de agliconas da fração é baixo, podendo ser um dos
motivos do receptor PPARγ não ter sido ativado. Shen et al. (2006) testaram o efeito de
isoflavonas sobre a ativação dos receptores PPARα e PPARγ em células de carcinoma
hepatocelular HepG2. Relataram que em baixas doses, biochanina A e formononetina, mas
não daidzeína e genisteína ativaram o receptor PPAR
γ. Nestas mesmas concentrações, todas
70
estas substâncias causaram ativação do receptor PPARα, sendo biochanina A, formononetina
e genisteína os mais potentes ativadores.
É importante considerar que as isoflavonas glicosídicas necessitam ser metabolizadas
pela microflora intestinal a agliconas, tais como, genisteína, daidzeína, biochanina A e
formononetina, para serem absorvidas pelo organismo. Desta forma, não se pode concluir que
esta fração metanólica de soja não tem ação sobre todos os subtipos de receptores PPAR in
vivo.
5.5.1 Atividade sobre o receptor PPARα
Bezafibrato a 10
-4
M ativou significativamente o receptor PPARα em células U937
transfectadas (taxa de ativação igual 3,86, P < 0,001). A fração metanólica na dose de 200 µg
não causou ativação quando comparado ao veículo. Houve ativação nas doses de 400, 800 e
1600 µg (taxa de ativação 2,26 P < 0,01; 3,01 P < 0,001; 3,95 P < 0,001 respectivamente). Os
resultados são mostrados na figura 7.
71
200 400 800 1600
0
1
2
3
4
5
**
*
**
**
Taxa de ativação
Veículo Bezafibrato
10
-5
M
Bezafibrato
10
-4
M
[Fração metanólica] µg
*
p < 0,01 (x veículo)
**
p < 0,01 (x veículo)
Figura 7. Efeito do bezafibrato e quantidades crescentes da fração metanólica de soja sobre a
ativação de PPARα. Células U937 foram co-transfectadas com vetor de expressão codificando
o receptor PPARα e com um vetor repórter DR1-Luc (gene repórter da luciferase dirigido por
promotor contendo sequência DR1). As células transfectadas foram tratadas com veículo
(etanol: DMSO). Bezafibrato a 10
-5
e 10
-4
M; 200, 400, 800, e 1600 µg de fração testados
para a atividade da luciferase. * P < 0,01 vs. veículo, ** P < 0,001 vs. veículo (ANOVA,
Teste de Tukey).
72
5.5.2 Atividade sobre o receptor PPARγ
Troglitazona a 10
-5
M ativou significativamente o receptor PPARγ em células U937
em células transfectadas (taxa de ativação igual a 5,02, P < 0,01) . Nenhuma das doses
testadas da fração metanólica levou a ativação deste receptor. Os resultados estão
apresentados na figura 8.
200 400 800 1600 3200
0
1
2
3
4
5
*
Taxa de ativação
Veículo Troglitazona
10
-5
M
*
p < 0,01 (x veículo)
[Fração metanólica] µg
Figura 8. Efeito da troglitazona e quantidades crescentes da fração metanólica de soja sobre a
ativação de PPARγ. Células U937 foram co-transfectadas com vetor de expressão codificando
o receptor PPARγ e com um vetor repórter DR1-Luc (gene repórter da luciferase dirigido por
promotor contendo sequência DR1). As células transfectadas foram tratadas com veículo
(etanol: DMSO). Troglitazona a 10
-5
M; 200, 400, 800, 1600 e 3.200 µg da fração testados
para a atividade da luciferase. * P < 0,01 vs. veículo (ANOVA, Teste de Tukey).
73
5.5.3 Atividade sobre o receptor PPARβ/δ
Bezafibrato a 10
-4
M ativou significativamente o receptor PPARβ/δ em células U937
transfectadas (taxa de ativação igual 2,76, P < 0,05). A fração metanólica na dose de 200 e
400 µg não causaram ativação quando comparado ao veículo. Houve ativação nas doses de
800 e 1600 µg (taxa de ativação 2,58 e 3,3 P < 0,05 respectivamente). Os resultados são
mostrados na figura 9.
200 400 800 1600
0
1
2
3
4
5
*
*
*
Taxa de ativação
Veículo Bezafibrato
10
-5
M
Bezafibrato
10
-4
M
*
p < 0,05 (x veículo)
[Fração metanólica] µg
Figura 9. Efeito do bezafibrato e quantidades crescentes da fração metanólica de soja sobre a
ativação de PPARβ/δ. Células U937 foram co-transfectadas com vetor de expressão
codificando o receptor PPARβ/δ e com um vetor repórter DR1-Luc (gene repórter da
luciferase dirigido por promotor contendo sequência DR1). As células transfectadas foram
tratadas com veículo (etanol: DMSO). Bezafibrato a 10
-5
e 10
-4
M; 200, 400, 800, e 1600 µg
da fração testados para a atividade da luciferase. * P < 0,05 vs. veículo (ANOVA, Teste de
Tukey).
74
5.6 INVESTIGAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIDIABÉTICA E HIPOLIPIDÊMICA DA
FRAÇÃO METANÓLICA EM RATOS WISTAR
Ae et. al (2006) estudaram os efeitos antidiabéticos da genisteína e da genistina em
camundongos machos não diabéticos. Observaram redução significativa da glicose, da
intolerância à glicose, do colesterol total, dos triglicerídeos, dos ácidos graxos livres e da taxa
de glucagon.
Diferentemente destes autores, os resultados indicaram que não houve mudanças
significativas nos níveis de glicose, triglicerídeos e colesterol, após o tratamento subcrônico
com a fração (Tabela 5). A fração metanólica com isoflavonas pareceu não exercer efeitos
antidiabético e hipolipemiante em ratos não diabéticos.
É preciso realizar estudos posteriores com tratamentos agudo, subcrônico e crônico em
ratos diabéticos ou não, para verificar se realmente esta fração apresenta benefícios no
Diabetes mellitus tipo 2 e doenças cardiovasculares. Este modelo experimental não é
adequado para avaliar a redução das taxas de lipídios, necessitando utilizar animais e técnicas
mais aprimoradas (Galletto, 2003).
75
Tabela 5. Efeito do tratamento subcrônico (15 dias) com 20mg/kg da fração metanólica de
soja contendo isoflavonas uma vez ao dia, administrada pela via oral (gavagem) na
concentração sérica de glicose (mg/dl), de triglicerídeos (mg/dl), de colesterol (mg/dl) em
ratos Wistar.
Controle Fração metanólica
Glicose
98,08 ± 2,27 89,59 ± 3,34
Triglicerídeos
72,72 ± 5,04 76,35 ± 5,56
Colesterol
80,75 ± 2,76 86,25 ± 4,19
Os resultados são apresentados como média ± desvio-padrão. O grupo controle recebeu água
e o grupo soja recebeu a fração metanólica com isoflavonas; N = 8, p >0,05 se comparado
controle vs. soja (ANOVA, Teste de Tukey).
5.7 EFEITO DA FRAÇÃO METANÓLICA DE SOJA SOBRE O EDEMA DE ORELHA
O óleo de cróton (OC) é o agente irritante que provoca dano celular e ativa a enzima
fosfolipase-A2, que libera o ácido araquidônico da membrana plasmática. A partir desta
substância, há a produção de prostaglandinas pelas COX-1 e COX-2, e de leucotrienos pela
enzima 5-lipoxigenase. Os eicosanóides formados produzem quimiotaxia de neutrófilos e
induzem à produção de elastase, colagenase e outras proteases. Estas enzimas clivam as
proteínas estruturais em peptídeos. Consequentemente há o aumento da permeabilidade
vascular e da pressão hidrostática resultando no fluxo de água de dentro para fora da célula
através da membrana plasmática por osmose. Então, ocorre o edema e a migração de
neutrófilos no tecido lesado.
A indometacina é um inibidor não específico da COX. Portanto, reduz a inflamação
por inibir a produção de prostaglandinas. A dexametasona bloqueia ou retarda todos os passos
76
do processo inflamatório (Silva, 2002).
A aplicação do óleo de cróton induziu significativamente a resposta inflamatória na 6ª.
hora. No grupo que recebeu OC + veículo aumentou o peso da orelha direita
aproximadamente duas vezes quando comparado com o grupo basal. Os tratamentos com os
controles positivos indometacina e dexametasona causaram uma inibição acentuada na
resposta inflamatória (Tabela 6). A fração metanólica de soja contendo isoflavonas (FMS) nas
doses de 0,625, 1,25 e 2,5 mg/kg reduziu significativamente a intensidade do edema (Figura
10). A porcentagem de inibição foi semelhante nestas três doses. Não houve diferença
estatística quando comparados os tratamentos com os controles positivos e a fração
metanólica de soja contendo isoflavonas (P > 0,05). Assim, pode ser afirmado que esta fração
metanólica inibiu o edema semelhantemente aos fármacos de referência, mostrando atividade
antiedematogênica.
Os flavonóides são conhecidos como antiinflamatórios por inibirem as enzimas
fosfolipase, COX e 5-lipoxigenase (Havsteen, 2002).
As isoflavonas genisteína e gliciteína nas doses de 50 a 100 µM inibiram a COX-2,
mas não a COX-1 em células microgliais estimuladas por lipopolissacarídeo (Park et al.,
2006). Genisteína, na dose de 50 µM inibiu a COX-2 e não a COX-1 em condrócitos
humanos (COX-1). Vera et al., (2005), observaram que a genisteína e daidzeína, na dose de
10 µM, inibiram a produção de prostaglandinas em aorta isolada de ratos espontaneamente
hipertensivos. Genisteína e daidzeína inibiram a atividade das enzimas 1- e 5-lipoxigenase em
linfócitos humanos polimorfonuleares, nas doses de 60 e 80 µM respectivamente (Mahesha et
al., 2007). Genisteína, daidzeína, biochanina A e formononetina inibiram a liberação de ácido
araquidônico na dose de 50 µM em macrófagos RAW 264.7, pela inibição da enzima
fosfolipase A2 (Jun et al., 2005).
A inibição do edema pode ter ocorrido pela inibição das enzimas fosfolipase-A2,
77
COX-2, e lipoxigenase, confirmando os efeitos das isoflavonas de soja in vitro.
B
a
s
al
OC+
Ve
í
c
ulo
OC+
I
n
d
o
1
,
0
OC+
D
EX
0
,
1
O
C
+FMS 0,62
5
O
C
+
F
MS
1
,
2
5
OC+
F
MS
2
,
5
0
5
10
15
*
**
***
***
***
Peso (mg)
Figura 10. Efeito da fração metanólica de soja (FMS) sobre o edema de orelha
induzido pelo óleo de cróton (OC) em camundongos. Os animais (n=9) foram tratados por via
tópica com a fração, nas concentrações indicadas, imediatamente após a aplicação do óleo de
cróton (200 µg) na orelha esquerda. A indometacina (Indo) 1 mg e a dexametasona (DEX) 0,1
mg foram utilizadas como antiinflamatórios de referência (controle positivo). Orelhas que
receberam somente aplicação do veículo (Basal). Cada coluna representa o peso médio das
orelhas ± E.P.M., 6 h após aplicação de óleo de cróton. * P<0,05, ** P<0,01, *** P<0.001
comparado ao grupo controle, P>0,05 comparação entre os grupos tratados (ANOVA, teste de
Tukey).
78
Tabela 6. Porcentagem de inibição do edema de orelha induzido pelo óleo de cróton (200µg)
Grupos Dose (mg/orelha) Inibição %
OC - -
OC + Indo 1,0 1,0 81,4
OC + DEX 0,1 0,1 66,95
OC + FMS 0,625 0,625 44, 23
OC + FMS 1,25 1,25 60,68
OC + FMS 2,5 2,5 65,68
Óleo de cróton (OC), indometacina (Indo), dexametasona (DEX), fração metanólica de soja
(FMS).
5.7.1 Efeito da fração metanólica com isoflavonas sobre a atividade da mieloperoxidase
(MPO)
A mieloperoxidase é uma enzima presente nos grânulos intracelulares de neutrófilos. É
considerada como marcadora do influxo de leucócitos polimorfonuleares em tecidos
inflamados. A sua inibição é indicativa de atividade antiinflamatória.
O óleo de cróton aumentou a atividade da enzima na 6ª. hora depois que o estímulo foi
aplicado. A fração metanólica de soja com isoflavonas (FMS 2,5 mg) e a dexametasona (0,1
mg) reduziram significativamente a atividade da enzima (64,79% e 64,64%, p < 0,05,
respectivamente). Os resultados estão apresentados na figura 11. É importante destacar que a
quantidade de isoflavonas totais nesta dose é de 0,03 mg. As isoflavonas parecem exercer
uma grande atividade antiinflamatória. Entretanto, não se pode descartar a hipótese de que
outros compostos tenham contribuido para tal ação. Pode ser afirmado que a fração
metanólica contendo isoflavonas inibiu o extravasamento de líquido e o influxo celular,
79
evidenciando uma atividade antiinflamatória.
B
a
s
al
OC+
Ve
í
c
ulo
OC+
D
EX
0
,
1
OC+
F
MS
2
,
5
0.0
0.1
0.2
*
*
DO (450 nm)
Figura 11. Efeito da fração metanólica de soja (FMS) sobre a atividade da MPO no tecido das
orelhas de camundongos. Os animais foram tratados por via tópica com a fração, na
concentração indicada, logo após a aplicação do óleo de cróton (200 µg) na orelha esquerda.
A dexametasona (DEX) 0,1 mg foi utilizada como antiinflamatório de referência (controle
positivo). Orelhas que receberam somente a aplicação do veículo (Basal). Cada coluna
representa a atividade mediada MPO ± E.P.M., 6 h após a aplicação do óleo de cróton. * P <
0,05 se comparado ao grupo controle (ANOVA, teste de Tukey).
80
5.8 TOXICIDADE
5.8.1 Hepatotoxicidade
Lesões hepatocelulares de qualquer etiologia levam à liberação das enzimas aspartato
aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT).
O grupo soja que recebeu tratamento subcrônico com a fração metanólica contendo
isoflavonas não apresentou toxicidade hepática, pois não se alterou a atividade enzimática das
enzimas AST e ALT no soro sanguíneo quando comparado ao grupo controle. Os valores
obtidos estão na tabela 7.
Os flavonóides podem lesar células hepáticas em concentrações extremamente altas
após longo período de ingestão destas substâncias. Assim, são consideradas drogas mais
seguras já conhecidas (Havsteen, 2002).
Tabela 7. Efeito do tratamento subcrônico (15 dias) com 20mg/kg da fração metanólica de
soja contendo isoflavonas uma vez ao dia, administrada pela via oral (gavagem) na atividade
enzimática de AST (U/L) e ALT (U/L) em ratos Wistar.
Controle Fração metanólica
AST
73,91 ± 6,86 71,96 ± 3,87
ALT
20,23 ± 1,18 21,97 ± 2,15
Os resultados estão apresentados como média ± desvio-padrão. O grupo controle recebeu
água e o grupo soja recebeu a fração metanólica com isoflavonas; N = 8, p >0,05 se
comparado controle vs. soja (ANOVA, Teste de Tukey).
81
5.8.2 Toxicidade Aguda
Não houve mortes nem pela administração da fração de soja por via oral nem pela via
intraperitoneal, nas doses de 1000, 2000, 3000 e 4000 mg/kg, indicando ausência de
toxicidade aguda.
82
5.9 CONCLUSÕES
1. A soja utilizada no presente trabalho não era geneticamente modificada;
2. Foram encontradas nove isoflavonas com seus respectivos teores em 100g de semente:
daidzina (6,99 mg); glicitina (2,29 mg); genistina (7,08 mg); malonildaidzina (13,27 mg);
malonilglicitina (5,08 mg); malonilgenistina (22,39 mg); daidzeína (2,77 mg); gliciteína (1,09
mg); genisteína (3,6 mg). A isoflavona mais abundante foi malonilgenistina. O teor de
isoflavonas totais na semente foi 64,56 mg/100g, cujo valor encontra-se dentro da faixa de 10
a 300mg/100g de isoflavonas na soja brasileira;
3. Foram isoladas as substâncias malonildaidzina e malonilglicitina a partir da fração;
4. A fração metanólica contendo principalmente isoflavonas glicosídicas ativou os receptores
PPARα e PPARβ/δ e não ativou PPARγ.
5. A ingestão subcrônica da fração metanólica não reduziu as concentrações de glicose,
triglicerídeos e colesterol total no soro sanguíneo de ratos Wistar. Portanto, não apresentou as
atividades antidiabética e hipolipemiante neste modelo experimental;
6. A fração metanólica contendo isoflavonas no modelo experimental edema de orelha,
apresentou atividade antiinflamatória, pois inibiu a produção de prostaglandinas e
leucotrienos e reduziu a atividade da enzima mieloperoxidase;
6. A fração metanólica contendo isoflavonas não apresentou toxicidade aguda e
hepatotoxicidade.
83
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