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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA - MESTRADO
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM CLÍNICA INTEGRADA
ARIADNE CRISTIANE CABRAL DA CRUZ
CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E AVALIAÇÃO DE
BIOCOMPATIBILIDADE DE BIOVIDROS – ESTUDO LABORATORIAL E
HISTOMORFOMÉTRICO EM RATOS
PONTA GROSSA
2004
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0
ARIADNE CRISTIANE CABRAL DA CRUZ
CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E AVALIAÇÃO DE
BIOCOMPATIBILIDADE DE BIOVIDROS – ESTUDO LABORATORIAL E
HISTOMORFOMÉTRICO EM RATOS
Dissertação apresentada para obtenção do
título de mestre na Universidade Estadual de
Ponta Grossa, no curso de Mestrado em
Odontologia – Área de concentração em
Clínica Integrada.
Orientador: Prof. Dr. Fábio André dos Santos
PONTA GROSSA
2004
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1
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Central da UEPG
Cruz, Ariadne Cristiane Cabral da
C957 Caracterização físico-química e avaliação de biocompatibilidade
de biovidros - estudo laboratorial e histomorfométrico em ratos./
Ariadne Cristiane Cabral da Cruz. Ponta Grossa, 2004.
123f. il.
Dissertação ( mestrado ) - Universidade Estadual de Ponta
Grossa.
Orientador : Prof. Dr. Fábio André dos Santos.
1- Materiais biocompatíveis - biovidros. 2- Microscopia
eletrônica - varreduras. 3- Vidro. 4- Substitutos ósseos. I. T.
CDD : 574.192
2
ARIADNE CRISTIANE CABRAL DA CRUZ
CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E AVALIAÇÃO DE
BIOCOMPATIBILIDADE DE BIOVIDROS – ESTUDO LABORATORIAL E
HISTOMORFOMÉTRICO EM RATOS
Dissertação apresentada para obtenção do título de mestre na Universidade
Estadual de Ponta Grossa, curso de Mestrado em Odontologia – Área de
concentração em Clínica Integrada.
Ponta Grossa, 17 de junho de 2004.
Prof. Dr. Fábio André dos Santos - Orientador
Universidade Estadual de Ponta Grossa
Prof. Dr. Gibson Luiz Pilatti
Universidade Estadual de Ponta Grossa
Prof. Dr. Joni Augusto Cirelli
Universidade Estadual Paulista
3
DEDICATÓRIA
Aos meus maravilhosos pais, Alceu e Mariliza, que desde minha
graduação vem fazendo possível à realização de sonhos. O sacrifício de vocês
em prol dos filhos será eternamente guardado em nossas lembranças com muito
carinho e gratidão. Agradeço dia após dia ter nascido em seus lares.
Ao Neto, meu grande companheiro, por ter me ajudado, nas mais
diversas formas, a materializar o sonho do mestrado.
À Nessa, minha irmã predileta, por se fazer sempre tão perto,
mesmo a muitos quilômetros de distância.
Ao Thiago, meu eterno irmãozinho.
Obrigada por compreenderem a ausência, a distância e minha dedicação a este
delicioso sonho. Amo muito vocês!
4
AGRADECIMENTOS
DEUS, obrigada pela oportunidade desta existência e tudo o que
a acompanha.
Ao Prof. Dr. Fábio André dos Santos, meu orientador, por estender
seu amplo conhecimento as pessoas que o cercam. Por me ensinar o valor das
perguntas e da dedicação aos trabalhos de pesquisa. Pelo auxílio e informações
fornecidas durante a execução deste trabalho. Pelo exemplo de dedicação à
pesquisa e docência. Por seu senso crítico. A sua colaboração reside em cada
página deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Laerte Luiz Bremm e Prof. Dr. Márcio Grama
Hoeppner por terem sido meus primeiros orientadores e terem me feito tomar gosto
pela Odontologia. Obrigada por terem me incentivado e acreditado em mim.
Ao Prof. Dr. José Caetano Zurita da Silva pela colaboração e
fundamental apoio no desenvolvimento desta pesquisa.
À Prof
a
. Mt. Josélia Borba Daher pelas importantes informações e
conhecimentos transmitidos sobre os ratos, amigos de tempos longos.
Ao Prof. Dr. Newton Capella pelo imprescindível apoio que tornou
possível a conclusão deste trabalho.
5
Ao Prof. Dr. Ricardo Tramonti pela orientação e acolhida no
Laboratório de Histologia da Universidade Federal de Santa Catarina.
À Dra. Daniela Serafin Couto Vieira por ter cedido seu precioso
tempo à realização das fotos das lâminas histológicas.
Ao Prof. Dr. João Carlos Gomes, pelos esforços para a elaboração
e manutenção de um curso de Mestrado com qualidade. Pela exemplar dedicação à
Universidade Estadual de Ponta Grossa. Pelo incentivo aos mestrandos. Somos
gratos!
Ao Prof. Dr. Gibson Luiz Pilatti por suas importantes idéias.
Ao Prof. Nino e sua equipe pela confecção das lâminas histológicas.
À colega e hoje amiga, Leyla Antoinette Delgado Cotrina. Seu
apoio, incentivo e amizade com certeza fizeram esta jornada mais interessante,
animada e menos árdua.
Ao Neto, meu companheiro, pelo seu carinho e amor.
À Nessa, minha querida irmã pelo apoio incondicional durante todo o
mestrado.
6
Aos colegas de Mestrado Adriana Büher Samra, Adriana de
Oliveira Silva, Alfredo Adimari Jr., Ana Cláudia Rodrigues Chibinski, Andrea
Maria de Sousa, Carlos Antônio Pelissari, Douglas Roderjan, Edison do Rócio
Meister, Flávia Tanaka, João Paulo Filgueiras Ribeiro, Leyla Antoinette Delgado
Cotrina, Milko Javier Villlaroel Córtes, Protásio Vargas Neto por dividirmos as
mesmas angústias e expectativas. Sinto saudades dos ótimos momentos que
passamos juntos.
Às queridas e atenciosas funcionárias do Biotério da UEPG, Bete e
Mari, pela amizade, apoio e proficiência no exercício de suas funções.
À Morgana Maria das Graças por sua atenção, carinho e auxílio.
À Mari pelos primeiros ensinamentos de processamento histológico,
confecção de lâminas e técnicas de coloração.
À Maria Luzia Fernandes Bertholino pelas correções da tese.
À Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior
– CAPES pela presteza e dedicação ao fomento da pesquisa.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para o
desenvolvimento deste trabalho, MUITO OBRIGADA!
7
RESUMO
O presente trabalho se propôs a avaliar as características físico-químicas e a
biocompatibilidade do biovidro desenvolvido pelo departamento de Química da
UEPG (Biovidro UEPG) e compará-lo com o PerioGlas
®
e Biogran
®
. Realizou-se a
caracterização físico-química através da microscopia eletrônica de varredura (MEV)
(tamanho e morfologia das partículas); microscopia eletrônica de varredura/ energia
dispersiva de Raios X (MEV/EDX) (elementos químicos); difratometria de Raios X
(DFR) (estrutura); fluorescência de Raios X FRX (elementos químicos). Para o teste
de biocompatibilidade utilizou-se 100 ratos, sendo: GI- PerioGlas
®
- 25 animais; GII-
Biogran
®
- 25 animais; GIII- Biovidro UEPG - 25 animais; GIV- Controle
(procedimento cirúrgico sem implantação do biomaterial) - 25 animais. Avaliou-se os
animais em 7, 15, 21, 45 e 60 dias. Através de histomorfometria determinou-se o
tamanho da reação inflamatória, tamanho dos grânulos, presença e quantidade de
células polimorfonuclear (PMN), mononuclear (MN) e fibroblasto (F). Os resultados
mostraram que as partículas dos três materiais apresentaram-se não uniformes e
com rugosidade superficial. Os grânulos de PerioGlas
®
apresentaram-se com
tamanho médio de 222,00±40,64µm. O Biogran
®
com 385,09±68,51µm. E o
Biovidro-UEPG com 102,86±36,22µm. Houve diferença significativa no tamanho dos
grânulos (p<0,001- ANOVA). Identificou-se nas três amostras cálcio, oxigênio, sódio,
fósforo e sílica, agrupados em óxido de sílica, óxido de sódio, óxido de cálcio e óxido
de fósforo. Os materiais mostraram-se não cristalinos e com pontos de cristalização.
Houve diferença significativa no tamanho da reação inflamatória entre os grupos,
tempos e interação (grupo*tempo) (p<0,001). Na contagem de MN não houve
diferença significativa entre os grupos (p=0,117), havendo entre os tempos
(p<0,001) e interação (p=0,022). Houve diferença significativa (p<0,001) na
contagem de PMN entre os tempos, grupos e interação. A contagem de F não
mostrou diferença significativa entre os grupos (p=0,131) e interação (p=0,665),
havendo diferença entre os tempos (p=0,008). Houve diferença significativa no
tamanho dos grânulos entre os grupos, tempo e interação (p<0,001). Concluiu-se
que os três materiais apresentaram-se biocompatíveis e bioreabsorvíveis, sem
indício de capacidade osteoindutora.
Palavras-chave: Materiais biocompatíveis/ vidro/ substitutos ósseos
8
ABSTRACT
The purpose of this study was to evaluate physic-chemical characteristics and the
biocompatibility of the bioglass, developed by the UEPG Chemistry Department,
(UEPG Bioglass) and compare it with the PerioGlas
®
e Biogran
®
. The physic-
chemical characterization was made by scanning electron microscopy (SEM) (size
and morphology of particles); scanning electron microscopy/energy dispersive X Ray
(MEV/EDAX) (chemical elements); X Ray diffractometry (DRX) (structure); X Ray
fluorescence (FRX) (chemical elements) For the biocompatibility test was used 100
rats: Gl-PerioGlas
®
- 25 animals; Gll – Biogran® - 25 animals; Glll – Biovidro UEPG –
25 animals; GIV – Control (surgical procedure without implantation of biomaterial) –
25 animals. The animals were evaluated at 7, 15, 21, 45 and 60 days. It was used
histomorphometric analysis to determine the size of inflammatory reaction, size of
granules, the presence and quantity of polymorphonuclear cells (PMN), mononuclear
(MN) and fibroblast (F). The results shown that the particles of the three materials
were irregular with superficial roughness. The medial size of PerioGlas
®
granules
was 222,00±40,64 µm. The Biogran
®
granules with 385.09±68.51µm. And the UEPG
Bioglass was 102.86±36.22µm. There was significant difference in the size of
granules (p<0.001-ANOVA). The three samples presented calcium, oxygen, sodium,
phosphorus and silica, aggregated on silica oxide, sodium oxide, calcium oxide and
phosphorus oxide. The materials were no crystalline and with crystalline points in
their surfaces. There was significant difference on size of inflammatory reaction
between groups, times and interaction (group*time) (p<0.001). There was not
significant difference between on the count of MN between groups (p=0.117), there
was difference between times (p<0.001) and interaction (p=0.022). There was
significant difference (p<0.001) on the count of PMN between the times, groups and
interaction. There was not significant difference on the count of F between the groups
(p=0.131) and interaction (p=0.665), with significant difference between the times
(p=0.008). There was significant difference on granules size between the groups,
time and interaction (p<0.001). It was concluded that the three materials were
biocompatible and bioreabsorbable, without sign of osteoinducture capacity.
Key-words: Biocompatible materials / glass / bone substitutes
9
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Esquema 1
Os 100 animais da pesquisa foram divididos em 4 grupos, com 25
animais em cada. Os grupos foram divididos em cinco subgrupos
de tempo, como 5 animais em cada................................................. 62
Esquema 2
Cada animal recebeu o tratamento nos dois lados do dorso,
resultando em duas amostras por animal. Assim, cada grupo
apresentou cinco animais por tempo operatório, resultando em 10
amostras por tempo operatório em cada grupo................................ 63
Figura 1.1
Incisão de aproximadamente 15mm realizada com tesoura de
ponta romba...................................................................................... 64
Figura 1.2
Implantação do biomaterial no tecido subcutâneo do rato............... 64
Figura 1.3
Dorso do animal, após o tratamento, suturado com fio mononylon
agulhado Shalon®............................................................................ 64
Figura 1.4
Remoção da peça contendo o material implantado.......................... 64
Figura 2.1
Lâmina corada com HE, aumento de 100x. Medição do tamanho
da reação inflamatória...................................................................... 65
Figura 2.2
Lâmina corada com HE, aumento de 400x. Contagem de PMN,
MN e F.............................................................................................. 65
Figura 2.3
Lâmina corada com HE, aumento de 100x. Medição do tamanho
do grânulo dos biovidros, após implantação nos animais................ 65
Figura 2.4
Microscopia eletrônica de varredura, aumento de 100x. Medição
do tamanho do grânulo dos biovidros previamente à implantação... 65
Figura 3.1
Micrografia eletrônica de varredura do PerioGlas
®
. Aumento de
100x..................................................................................................
84
Figura 3.2
Micrografia eletrônica de varredura do PerioGlas
®
. Aumento de
5000x................................................................................................ 84
Figura 3.3
Micrografia eletrônica de varredura do Biogran
®
. Aumento de
100x............................................................................................. 84
Figura 3.4
Micrografia eletrônica de varredura do Biogran
®
. Aumento de
5000x........................................................................................... 84
Figura 3.5
Micrografia eletrônica de varredura do Biovidro-UEPG. Aumento
10
de
100x..................................................................................................
84
Figura 3.6
Micrografia eletrônica de varredura do Biovidro-UEPG. Aumento
de
5000x................................................................................................
84
Figura 4.1
X
. PerioGlas
®
, indicando presença de sódio, cálcio, sílica e fósforo..
85
Figura 4.2
MEV/EDX. Biogran
®
, indicando presença de sódio, cálcio, sílica e
fósforo............................................................................................... 85
Figura 4.3
MEV/EDX. Biovidro-UEPG, indicando presença de sódio, cálcio,
sílica e fósforo................................................................................... 85
Figura 4.4
Elementos químicos e percentagens encontradas nos
biomateriais, segundo MEV/EDX...................................................... 85
Figura 5.1
Biogran
®
. Aumento de 100x. Grânulo sem fissura aos sete dias.... 86
Figura 5.2
Biogran
®
. Aumento de 400x. Presença de PMN aos sete dias
(seta)................................................................................................ 86
Figura 5.3
PerioGlas
®
. Aumento de 100x. Início de formação de fissuras aos
quinze dias........................................................................................ 86
Figura 5.4
PerioGlas
®
. Aumento de 400x. Presença de PMN aos quinze dias
(seta)................................................................................................ 86
Figura 5.5
Biovidro-UEPG. Aumento de 100x. Grânulo com fissuras aos vinte
e um dias.......................................................................................... 86
Figura 5.6
PerioGlas
®
. Aumento de 400x. Predominância de célula MN aos
vinte e um dias (setas)..................................................................... 86
Figura 6.1
Biovidro-UEPG. Aumento de 400x. Presença de fibrócitos aos 45
dias (setas)....................................................................................... 87
Figura 6.2
Biogran
®
. Aumento de 100x. Fissuras e degradação do grânulo
aos 45 dias (setas)............................................................................ 87
Figura 6.3
Biovidro-UEPG. Aumento de 400x. Vasos sangüíneos e capilares
aos 60 dias (setas)........................................................................... 87
Figura 6.4
PerioGlas
®
. Aumento de 100x. Presença de fissuras aos 60 dias
(setas)............................................................................................... 87
Figura 6.5
Biovidro-UEPG. Aumento de 400x. Presença de fibroblastos aos
60 dias (setas).................................................................................. 87
11
Figura 6.6
Biogran
®
. Aumento de 40x. Aspecto geral das partículas aos 60
dias (setas)....................................................................................... 87
12
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 7.1
Tamanho dos grânulos previamente à implantação ........................ 88
Gráfico 7.2
Tamanho da reação inflamatória...................................................... 88
Gráfico 7.3
Contagem de PMN nos quatro grupos e cinco tempos de análise... 88
Gráfico 7.4
Contagem de MN nos quatro grupos e cinco tempos de análise..... 88
Gráfico 7.5
Contagem de F nos quatro grupos e cinco tempos de análise......... 88
Gráfico 8.1
Determinação do tamanho dos grânulos dos biovidros após
implantação nos animais nos cinco tempos de análise....................
89
Gráfico 8.2
Difratograma da amostra de PerioGlas
®
, indicando fase cristalina.. 89
Gráfico 8.3
Difratograma da amostra de Biogran
®
, indicando fase cristalina...... 89
Gráfico 8.4
Difratograma da amostra de Biovidro-UEPG, indicando fase
cristalina........................................................................................... 89
Gráfico 9.1
Reprodutibilidade dos dados de tamanho dos grânulos (µm),
obtidos em duas análises feitas em dois momentos distintos (48h)
- Coeficiente de correlação intraclasse............................................ 122
Gráfico 9.2
Reprodutibilidade dos dados de tamanho da reação inflamatória
(µm), obtidos em duas análises feitas em dois momentos distintos
(48h) - Coeficiente de correlação intraclasse................................... 122
Gráfico 9.3
Reprodutibilidade dos dados de contagem de células, obtidos em
duas análises feitas em dois momentos distintos (48h) -
Coeficiente de correlação intraclasse............................................... 122
Gráfico 9.4
Reprodutibilidade dos dados de determinação do tamanho dos
grânulos após implantação nos animais, obtidos em duas análises
feitas em dois momentos distintos (48h) - Coeficiente de
correlação intraclasse....................................................................... 122
13
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Estatística descritiva- Tamanho dos grânulos previamente à
implantação....................................................................................... 68
Tabela 2
Pós-teste Tukey HSD. Comparação entre os grupos - Tamanho
dos grânulos previamente à implantação......................................... 69
Tabela 3
Estatística descritva – Tamanho de reação inflamatória (valores
transformados em log). Fator interação grupos * tempo (dias)........
73
Tabela 4
Pós-teste Games Howell. Comparação entre os grupos -
Tamanho da reação inflamatória (valores transformados
log)....................................................................................................
74
Tabela 5
Pós-teste Games Howell. Comparação entre os tempos (dias) -
Tamanho da reação inflamatória (valores transformados em
log)................................................................................................... 74
Tabela 6
Estatística descritiva - Contagem de PMN (valores transformados
em percentagens)............................................................................. 76
Tabela 7
Pós-teste Games Howell. Comparação entre os grupos -
Contagem de PMN (valores transformados em
percentagens)................................................................................... 77
Tabela 8
Pós-teste Games Howell. Comparação entre os tempos (dias) -
Contagem de PMN (valores transformados em
percentagens).................................................................................. 77
Tabela 9
Estatística descritiva - Contagem de MN (valores transformados
em percentagens)............................................................................. 78
Tabela 10
Pós-teste Games Howell. Comparação entre os tempos (dias) -
Contagem de MN (valores transformados em
percentagem)................................................................................... 79
Tabela 11
Estatística descritiva - Contagem de F (valores transformados em
percentagens)................................................................................... 80
Tabela 12
Pós-teste Games Howell. Comparação entre os tempos -
Contagem de F (valores transformados em
percentagem).................................................................................... 81
Tabela 13
Estatística descritiva - Tamanho dos grânulos. Fator interação
grupos * tempo (dias)....................................................................... 82
14
Tabela 14
Pós-teste de Tukey HSD. Fator Grupos - Tamanho dos
grânulos............................................................................................ 82
Tabela 15
Pós-teste de Tukey HSD. Fator Tempo - Tamanho dos
grânulos............................................................................................ 83
Tabela 16
Tamanho dos grânulos (µm) previamente à implantação................ 107
Tabela 17
Média do tamanho da reação inflamatória (µm) em sete dias de
pós-operatório................................................................................... 108
Tabela 18
Média do tamanho da reação inflamatória (µm) em quinze dias de
pós-operatório................................................................................... 108
Tabela 19
Média do tamanho da reação inflamatória (µm) em vinte e um dias
de pós-operatório............................................................................. 108
Tabela 20
Média do tamanho da reação inflamatória (µm) em quarenta e
cinco dias de pós-operatório............................................................ 109
Tabela 21
Média do tamanho da reação inflamatória (µm) em sessenta dias
de pós-operatório.............................................................................. 109
Tabela 22
Média da contagem de PMN, MN e F presentes na região de
intervenção em sete dias de pós-operatório..................................... 109
Tabela 23
Média da contagem de PMN, MN e F presentes na região de
intervenção em quinze dias de pós-operatório................................ 110
Tabela 24
Média da contagem de PMN, MN e F presentes na região de
intervenção em vinte e um dias de pós-operatório........................... 110
Tabela 25
Média da contagem de PMN, MN e F presentes na região de
intervenção em quarenta e cinco dias de pós-operatório................. 110
Tabela 26
Média da contagem de PMN, MN e F presentes na região de
intervenção em sessenta dias de pós-operatório............................. 111
Tabela 27
Mensuração do tamanho (µm) dos grânulos em sete dias de pós-
operatório......................................................................................... 112
Tabela 28
Mensuração do tamanho (µm) dos grânulos em quinze dias de
pós-operatório................................................................................... 113
Tabela 29
Mensuração do tamanho (µm) dos grânulos em vinte e um dias de
pós-operatório................................................................................... 114
Tabela 30
Mensuração do tamanho (µm) dos grânulos em quarenta e cinco
dias de pós-operatório...................................................................... 115
15
Tabela 31
Mensuração do tamanho (µm) dos grânulos em sessenta dias de
pós-operatório................................................................................... 116
Tabela 32
Teste de normalidade - Tamanho dos grânulos previamente à
implantação....................................................................................... 117
Tabela 33
Teste de normalidade - Tamanho da reação inflamatória (valores
transformados em log).....................................................................
117
Tabela 34
Teste de normalidade - Contagem de PMN (valores transformados
em percentagem) ............................................................................
117
Tabela 35
Teste de normalidade - Contagem de MN (valores transformados
em percentagem).............................................................................. 117
Tabela 36
Teste de normalidade - Contagem de F (valores transformados
em percentagem)............................................................................. 118
Tabela 37
Teste de normalidade - Tamanho dos grânulos............................... 118
Tabela 38
Teste Levene para equivalência de variância - Tamanho dos
grânulos previamente à implantação............................................... 118
Tabela 39
ANOVA (um critério) - Tamanho dos grânulos previamente à
implantação....................................................................................... 118
Tabela 40
Levene para equivalência de variância - Tamanho da reação
inflamatória (valores transformados log).......................................... 118
Tabela 41
ANOVA (dois critérios) - Tamanho de reação inflamatória (valores
transformados em log)...................................................................... 119
Tabela 42
ANOVA (dois critérios) – Contagem de PMN (valores
transformados em percentagem)...................................................... 120
Tabela 43
Teste Levene para equivalência de variância – Contagem de PMN
(valores transformados em percentagens)....................................... 120
Tabela 44
ANOVA (dois critérios) – Contagem de MN (valores transformados
em percentagens)............................................................................. 120
Tabela 45
Teste Levene para equivalência de variância – Contagem de MN
(valores transformados em percentagens)....................................... 120
Tabela 46
ANOVA (dois critérios) – Contagem de F (valores transformados
em percentagens)............................................................................ 121
Tabela 47
Teste Levene para equivalência de variância – Contagem de F
(valores transformados em percentagens)....................................... 121
16
Tabela 48
Estatística descritiva - Contagem de PMN. Fator interação grupos
* tempo (dias)................................................................................... 121
17
LISTA DE ABREVIATURAS
Al
2
O
3
Óxido de alumina
B
4
C
Carbeto de boro
BV
Biovidro
CaCO
3
Carbonato de cálcio
Ca
2
F
Fluoreto de cálcio
CaO
Óxido de cálcio
CaMgSi
2
O
6
Diopsida
CaSiO
3
Wollastonita
CC
Carbonato de cálcio
EDX
Energia dispersante de Raios X
Fe
2
O
3
Óxido férrico
F
Fibroblasto
Ga
2
O
3
Óxido de gadolínio
HÁ
Hidroxiapatita
HE
Hematoxilina e Eosina
K
2
O
Óxido de potássio
La
2
O
3
Óxido de Lantânio
M
Molar
MEV
Microscópico eletrônico de varredura
MgO
Óxido de magnésio
Mg(OH)
2
Hidróxido de magnésio
Ml
Mililitro
18
MO
Microscopia óptica
Na
2
O
Óxido de sódio
NS
Não significativo
µm
Micrometro
P
Nível de significância
P.M.
Pré-molar
PMN
Polimorfonuclear
P
2
O
5
Óxido de fósforo
S
Significativo
SiO
2
Óxido de sílica
Si
3
N
4
Nitreto de silício
Ta
2
O
5
Óxido de Tântalo
WO
3
Óxido de tungstênio
19
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO....................................................................................
21
2 PROPOSIÇÃO....................................................................................
26
3 REVISÃO DE LITERATURA..............................................................
27
3. 1 CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS E TESTES IN VITRO.......
27
3. 2 TESTES IN VIVO................................................................................ 33
4 MATERIAL E MÉTODO.....................................................................
51
4.1 ANÁLISE FÍSICA................................................................................ 52
4.1.1 Microscópico eletrônico de varredura (MEV)...................................... 52
4.2 ANÁLISE QUÍMICA............................................................................ 53
4.2.1 Fluorescência de Raios X................................................................... 53
4.2.2. Difratometria de Raios X..................................................................... 53
4.2.3 Microscópico eletrônico de varredura/ Energia dispersante de Raios
X (MEV-EDX)......................................................................................
53
4.3 ANÁLISE DE BIOCOMPATIBILIDADE............................................... 54
4.3.1 Estudo piloto....................................................................................... 55
4.3.2 Procedimento cirúrgico....................................................................... 55
4.3.3 Cuidados pós-operatórios................................................................... 59
4.3.4 Obtenção das peças........................................................................... 59
4.3.5 Processamento histológico................................................................. 59
4. 3.6 Análise histológica.............................................................................. 60
4.3.7 Determinação do tamanho da reação inflamatória............................. 60
4.3.8 Determinação de polimorfonuclear (PMN), mononuclear (MN) e
fibroblasto (F)......................................................................................
61
20
4.3.9 Determinação do tamanho do grânulo................................................ 62
4.4 ANÁLISE DOS DADOS...................................................................... 62
5 RESULTADOS...................................................................................
66
5. 1 OBSERVAÇÕES CLÍNICAS............................................................... 66
5. 2 ANÁLISE FÍSICA................................................................................ 67
5.2.1 MEV.................................................................................................... 67
5. 3 ANÁLISE QUÍMICA............................................................................ 69
5. 3. 1 Fluorescência de Raios X .................................................................. 69
5. 3. 2 Difratometria de Raios X .................................................................... 69
5.3. 3 MEV/EDX............................................................................................ 70
5. 4 ANÁLISE DE BIOCOMPATIBILIDADE............................................... 73
5. 4. 1 Análise histológica – Microscópico óptico........................................... 73
5. 4. 2 Determinação do tamanho da reação inflamatória............................. 77
5. 4. 3 Contagem de PMN, MN e F................................................................ 79
5. 4. 4 Determinação do tamanho dos grânulos dos biovidros...................... 82
6 DISCUSSÃO.......................................................................................
88
7 CONCLUSÃO.....................................................................................
98
REFERÊNCIAS...............................................................................................
99
APÊNDICE – Tabelas 16 a 62/ Prancha 9....................................................
103
Introdução
21
1 INTRODUÇÃO
rocedimentos de enxerto ósseo são freqüentemente
necessários em cirurgias bucais. O aumento e/ou manutenção do tecido ósseo pode
ser necessário no tratamento de perdas ósseas em traumas, defeitos ósseos
periodontais, lesões císticas, deficiências congênitas, aumento de rebordo alveolar,
lesões apicais e preparação de leito para a colocação de implantes osteointegrados.
(CHAN et al., 2002; GRANJEIRO et al., 1992).
A busca de um material ideal para ser utilizado como substituto ósseo
vem sendo objeto de pesquisa por anos. Quanto a sua origem, estes podem ser
classificados em: Autógeno - obtido do próprio indivíduo, podendo ser de sítios
intrabucais ou extrabucais. Alógeno ou homógeno - obtido de indivíduos da mesma
espécie, contudo geneticamente diferentes. Xenógeno ou heterógeno - advém de
doadores de espécie diferente do receptor, como osso bovino. Aloplástico - material
sintético, de natureza polimérica, metálica ou cerâmica. (CANCIAN, 1998; CHAN et
al., 2002; OLIVEIRA et al., 1993; SANTOS, 2000).
Os enxertos/implantes ósseos tradicionais incluem materiais
autógenos e homógenos (AL RUHAIMI, 2001; SCHMIT et al., 1997). Enquanto o
osso autógeno apresenta-se como uma excelente alternativa biológica pelas suas
propriedades osteocondutora e osteoindutora, possui alguns fatores desfavoráveis
bem significativos, como a necessidade de uma área doadora, maior período de
convalescença, morbidade e susceptibilidade de infecção no sítio doador, limitada
quantidade de tecido ósseo, custo elevado (especialmente de sítios extrabucais) e
um procedimento cirúrgico adicional. (AL RUHAIMI, 2001; CHAN et al., 2002;
Introdução
22
FURUSAWA et al., 1998; GRANJEIRO et al., 1992; KAUFMANN et al., 2000; NARY
FILHO; OKAMOTO, 1996; SANADA et al., 2003; SCHEPERS et al., 1991;
WHEELER et al., 1997; 1998).
Por outro lado, os enxertos homógenos e heterógenos, apesar de
terem sido há muito tempo utilizados, apresentam limitações como a necessidade de
um banco de ossos, reabsorção prematura (especialmente o osso medular) alta
variabilidade das propriedades de osteoindução (variam de acordo com a área
obtida, tipo de tecido ósseo, idade do doador, processamento do tecido ósseo e
técnica de esterilização empregada) (HALL et al., 1999; PINHEIRO, 2001) e o
potencial de transmissão de doenças infectocontagiosas e priônicas. (AMERICAN
ACADEMY OF PERIODONTOLOGY, 2001; PINHEIRO, 2001; SOGAL; TOFE,
1999).
Quanto ao mecanismo de ação, os substitutos ósseos podem ser
agrupados em: Osteoindutores - capazes de estimular células ectomesenquimais
indiferenciadas a diferenciar-se em osteoblastos e/ou condroblastos.
Osteocondutores - servem como um arcabouço para a proliferação de vasos
sanguíneos, tecido perivascular e células osteoprogenitoras do leito, que trarão os
componentes necessários à formação e deposição óssea. O substituto ósseo pode
ficar incorporado a matriz óssea neoformada ou sofrer um processo de reabsorção
e/ou dissolução. Osteogenitores - capazes de formar tecido ósseo por si mesmo
(apresentam osteoblastos viáveis). (AL RUHAIMI, 2001; CHAN et al., 2002;
SANTOS, 2000).
Como uma alternativa à utilização do enxerto ósseo autógeno,
alógeno e heterógeno vem tentando-se empregar uma variedade significativa de
materiais aloplásticos. A aplicabilidade destes materiais em organismos humanos
Introdução
23
depende de suas propriedades, especialmente biocompatibilidade, estabilidade
enzimática e hidrolítica, além de propriedades químicas, físicas e mecânicas
similares ao tecido que está sendo substituído. (STRNAD, 1992).
Os materiais a base de cerâmica (naturais ou sintéticos) vem sendo
largamente empregados em procedimentos de enxertos ósseos. Dentre os naturais
estão as hidroxiapatitas (HA) – Ca
10
(PO
4
)
6
(OH)
2
, obtidas a partir de estruturas de
coral ou de matriz mineral de tecido ósseo bovino. De origem sintética tem-se
hidroxiapatita, beta fosfato tricálcio (ß-TCP) - Ca
3
(PO
4
)
2
, fosfato de cálcio bifásico
(HA+ß-TCP) e os vidros bioativos. Os biovidros representam materiais promissores
(STRNAD, 1992) por apresentar elevada biocompatibilidade e possuir propriedades
osteocondutivas. (AL RUHAIMI, 2001; CANCIAN, 1998; FETNER et al., 1994;
FURUSAWA; MIZUNUMA, 1997; FURUSAWA et al., 1998; JOHNSON et al., 1997;
KAUFMANN et al., 2000; KARATZAS et al., 1999; SILVER; DEAS; ERICINSKA,
2001; VOGEL et al., 2001; WHEELER et al., 1997; 1998).
A composição química dos biovidros usualmente inclui fósforo,
cálcio, sódio, sílica e oxigênio (AMARAL et al., 2002; COSTA et al., 2003; SILVER et
al., 2001; STRNAD, 1992; VOGEL et al., 2001), sendo similar à composição
inorgânica do tecido ósseo, formado principalmente por cálcio e fosfato, além de
hidroxilas, carbonatos, citratos, e pequena quantidade de sódio, magnésio e flúor.
(GLIMCHER, 1990).
A preparação dos vidros bioativos abrange a fundição de diferentes
pós de vidro e formação de produtos com cristalização controlada. De acordo com
os componentes utilizados e a técnica de fabricação empregada, os biovidros podem
apresentar variação nos elementos constituintes, na quantidade dos mesmos,
tamanho e superfície da partícula. Estas características físico-químicas estão
Introdução
24
intimamente relacionadas com o desempenho biológico destes materiais, como
bioatividade e osteocondução. (AMARAL et al., 2002; COSTA et al., 2003;
ROSENGREN et al., 2003; STRNAD, 1992).
Estudos têm comprovado que os biovidros a base de 45% de óxido
de sílica (SiO
2
), 24,5% de óxido de sódio (Na
2
O), 24,5% de óxido de cálcio (CaO) e
6% de óxido de fósforo (P
2
O
5
) apresentam bioatividade in vitro em solução de fluido
corporal simulado (AMARAL et al., 2002; BRANDA et al., 2002; COSTA et al., 2003;
SILVER; DEAS; ERECINSKA, 2001; STRNAD, 1992) e in vivo (FURUSAWA;
MIZUNUMA, 1997). Sugere-se que in vivo ocorra a formação de uma camada
externa rica em hidroxiapatita, enquanto internamente há perda de sílica para o
meio, o que permitiria a inserção e proliferação de osteoblastos na superfície do
vidro e osteointegração. Este evento é importante para que o processo de
dissolução do biovidro se estabilize, e possibilite que os processos físico-químicos
ocorram e formem ligações químicas entre a superfície vítrea e o tecido recém-
formado. (STRNAD, 1992). Além de determinar o grau de reabsorção ou de
incorporação das partículas vítreas na matriz óssea neoformada.
Trabalhos na literatura têm destacado a importância da composição,
porosidade, densidade, nível de entrelaçamento dos cristais e tamanho das
partículas de biovidro como características que afetam grandemente a capacidade
de dissolução destes biomateriais e sua atividade nos tecidos. (ALIZADEH;
MARGHUSSIAN, 2002; AMARAL et al., 2002; BRANDA et al., 2002; COSTA et al.,
2003; KAUFMANN et al., 2000; SILVER DEAS; ERECINSKA, 2001; STRNAD, 1992;
VOGEL et al., 2001).
Tendo em vista a importância do desenvolvimento e aplicabilidade de
novos substitutos ósseos para redução de custos, aumento da quantidade de
Introdução
25
materiais seguros e surgimento de alternativas de tratamentos, o presente trabalho
teve o propósito de analisar um biovidro desenvolvido pelo Departamento de
Química - DEQUIM-CIPP da Universidade Estadual de Ponta Grossa - UEPG e
compará-lo com dois biovidros disponíveis no comércio (Biogran
®
e PerioGlas
®
).
Revisão de Literatura
26
2 REVISÃO DE LITERATURA
om o intuito de abranger trabalhos pertinentes aos propósitos
deste estudo, encontram-se na revisão de literatura trabalhos sobre reparo ósseo,
testes de biocompatibilidade, alterações decorrentes da composição e forma de
fabricação de biovidros, influência das propriedades físico-químicas de biovidros e
hidroxiapatitas sobre a resposta biológica.
2. 1 CARACTERÍSITCAS FÍSICO-QUÍMICAS E TESTES IN VITRO
Granjeiro et al. (1992) avaliaram algumas características físico-
químicas das hidroxiapatitas: Biohidroxi-Inodon®, Osteosynt®, HA-40®, Osteogen®
e HA-Padrão Sigma. Através da análise por microscopia óptica de campo escuro
observou-se que a Biohidroxi-Inodon® apresentou contornos irregulares, pequena
espessura, superfície lisa e permitiu passagem de luz. Os demais materiais
analisados apresentaram-se na forma de partículas densas, superfície irregular, não
permitindo passagem de luz. A análise de microscopia eletrônica de varredura
determinou o tamanho médio das partículas, sendo: Biohidroxi-Inodon: 10-50µm;
Osteosynt®: 400-600µm; HA-40®: 1000-2000µm e Osteogen®: 200-300µm. O perfil
espectrofotométrico determinou o grau de pureza dos materiais, sendo que a HA-
40® apresentou contaminantes como o titânio, estrôncio, ferro, enxofre e potássio. A
Biohidroxi-Inodon® foi o único material que liberou totalmente o cálcio e fosfato no
Revisão de Literatura
27
teste de dissolução ácida. Segundo os resultados da difração de Raios X todos os
materiais foram identificados como hidroxiapatita.
Strnad (1992) realizou testes in vitro e in vivo com intuito de verificar
a influência do parâmetro estrutural Y no comportamento biológico de implantes
aloplásticos vidros-cerâmicas. Este parâmetro pode ser definido como o número
médio de pontes de oxigênio por poliedro na cadeia do vidro. Utilizou-se quatro
diferentes composições de biovidro. Dois corpos de prova de cada tipo de material
permaneceram dois meses imersos em solução de fluido corporal simulado (SBF-
0,2g cloreto de potássio, 8g cloreto de sódio, 0,2g cloreto de cálcio, 2g óxido de
hidrogênio, 0,05g dihidrogeno fosfato de sódio, 1g bicarbonato de sódio, 0,1g cloreto
de magnésio hidratado e 1g glicose para 1000ml de água). A análise in vivo ocorreu
por meio da implantação dos materiais em tíbias e fêmur de cães. Sacrificou-se os
animais após dois meses e analisou-se as biópsias através do microscópico
eletrônico de varredura (MEV). Os resultados mostraram que uma composição
apropriada da fase vítrea residual dos vidros-cerâmicas bioativos pode ser
controlada com base no cálculo do parâmetro estrutural Y. Quando Y é maior que 3,
os vidros perdem sua bioatividade. O valor de Y ideal é igual a 2. Conclui-se que o
parâmetro estrutural de Y pode ser usado como uma ferramenta para teorizar
bioatividade.
O objetivo desse trabalho de Kaufmann et al. (2000) foi determinar o
efeito da porosidade e tamanho de poro de vidro bioativo (45S5) na expressão e
manutenção de fenótipo osteoblásticos. Células ROS 17/2.8 foram cultivadas em
substratos com diferentes tamanhos de poros e porosidades por um período de sete
Revisão de Literatura
28
e quatorze dias. Analisaram-se as características das células e matriz extracelular.
Os resultados demonstraram que substrato do vidro suportou a proliferação e
crescimento de células tipo osteoblastos. A morfologia da célula diferiu nos vários
substratos. O formato e a extensão da membrana celular sugeriu alta atividade
metabólica. Células em todos substratos expressaram altos níveis de atividade de
fosfatase alcalina e produção de matriz extracelular. A porosidade de 44% do
tamanho do poro não dirigiu nem modulou a expressão de fenótipos osteoblástico in
vitro. Por outro lado, a porosidade afetou a função celular. A média de poro de
92μm, como a porosidade de 35 a 59%, reduziu a atividade osteoblástica. Um
aumento na porosidade ocasiona um aumento na área total dos espécimes. Com
aumento da porosidade e área superficial, a reação do biovidro com o meio pode
apresentar longa duração e altas intensidades, afetando a composição do meio
local.
Com propósito de determinar o efeito das reações que ocorrem na
superfície das partículas de Bioglass® na viabilidade de bactérias supra e
subgengivais Allan; Newman e Wilson (2001) analisaram as seguintes bactérias:
Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis, Actinobacillus
actinomycetemcomitans, Actinomyces viscosus, Porphyromonas gingivalis,
Fusobacterium nucleatun e Prevotella intermedia. Os resultados mostraram efeito
antibacteriano contra os espécimes supra e subgengivais. As medições de pH
mostraram que houve aumento do mesmo em todos os meios de cultura
empregados. Concluiu-se que as partículas do Bioglass® exerceram considerável
efeito antibacteriano contra as bactérias bucais, incluindo as causadoras das
doenças cárie e periodontal.
Revisão de Literatura
29
Utilizando modelo de cultura de osteoblasto, Silver, Deas e Erecinska
(2001) avaliaram as alterações metabólicas, viabilidade celular, mudanças nas
concentrações intracelulares de íons, proliferação e diferenciação celular, através do
uso dos seguintes biovidros: Bioglass® 45S5 (forma fundida), 58S e 77S (ambos na
forma de gel). Empregou-se como controle soda-sílica-cal e vidro de boro silicato.
Tanto os materiais teste quanto controle apresentavam partículas com tamanho de
90-150µm. Os resultados mostraram que o Bioglass® 45S5 promoveu alcalinização
extra e intracelular. Apresentou uma pequena membrana hiperpolarizada. E também
aumentou a produção de lactato. A atividade glicolítica foi estimulada tanto através
de células em contato direto com as partículas do Bioglass® 45S5 como através da
comunicação pelo meio. O Bioglass® 45S5 não afetou a viabilidade, proliferação e
diferenciação osteoblástica. Os biovidros 77S e 58S não alteraram os níveis de íons
e a atividade metabólica. Concluiu-se que o Bioglass® 45S5 promoveu acentuada
alcalinização externa e interna, a qual foi responsável pelo aumento da glicólise e
produção de ATP celular. Alterações na concentração de íons hidrogênio podem
contribuir para alterações na concentração de outros íons. O aumento na
concentração de íons cálcio pode influenciar a atividade de enzimas intracelulares.
O objetivo deste trabalho de Alizadeh e Marghussian (2002) foi
investigar as propriedades mecânicas e bioatividade de vidros contendo óxido férrico
(Fe
2
O
3
) e óxido de tungstênio (WO
3
) como agentes de nucleação. Prepararam o
vidro com pós de óxido de sílica (SiO
2
), carbonato de cálcio (CaCO
3
), hidróxido de
magnésio (Mg(OH)
2
), Fe
2
O
3
(óxido férrico) e WO
3
(óxido de tungstênio). Realizaram
análise de difração de Raios X (identificação dos elementos da fase cristalina),
medição da resistência à fratura e flexural (teste SENB-S), análise microestrutural
Revisão de Literatura
30
(MEV e espectroscopia infra-vermelho) e teste in vitro com SBF. A análise de Raios
X demonstrou que a fase cristalina era formada basicamente por wollastonita
(CaSiO
3
) e diopsida (CaMgSi
2
O
6
), e uma quantidade menor de cristobalita. A
presença de fibras de diopsida e partículas de wollastonita aumentaram os valores
de força e dureza dos materiais. A resistência flexural e a fratura de amostras
contendo 3%, em peso, de óxido de magnésio (MgO) foi 116 MPa e 1,48MPa.m½,
respectivamente. Os resultados do teste in vitro indicaram a formação da camada
superficial de hidroxiapatita. Concluiu-se que a presença do Fe
2
O
3
e WO
3
como
agentes de nucleação provocou a formação de diopsida e wollastonita, retardando a
formação de cristobalita. As amostras com grandes quantidades de MgO (>6%) não
são aceitáveis.
Amaral et al. (2002) realizaram este trabalho com intuito de descrever
o processo utilizado para preparação de biovidro de alta densidade, contendo nitreto
de silício (Si
3
N
4
). Incluindo descrição do mecanismo de densificação, caracterização
mecânica e micro-estrutural. Os resultaram mostraram que a densificação obtida em
vinte amostras foi de 97,0±0,9%. O processo utilizado na preparação do material
resultou em um produto altamente poroso. Através da análise de difratometria de
Raios X verificou-se que não houve formação de fase cristalina adicional. Os
resultados da caracterização mecânica foram: resistência a fratura K
IC
= 4,4MPa;
dureza Vickers H
V
=10,3GPa; módulo de Young E=197GPa; resistência a torção
R=383MPa. Concluiu-se que os valores obtidos representam propriedades atrativas
deste novo biomaterial, com propriedades biológicas e considerável resistência
mecânica.
Revisão de Literatura
31
Branda et al. (2002) com intuito de relatar o efeito da substituição do
óxido de cálcio (CaO) por M
2
O
3
(M = La, Y, In, Ga, Al) na bioatividade do vidro
2,5CaO.2SiO
2
, realizaram este trabalho. Preparou-se o biovidro através da fundição
dos seguintes reagentes: CaCO
3
, óxido de gadolínio (Ga
2
O
3
), óxido de alumina
(Al
2
O
3
), In
2
O
3
e SiO
2
. Avaliou-se a bioatividade através da colocação das amostras
de molho em SBF. Analisou-se a capacidade de formar a camada de apatita através
de MEV, equipado com sistema de energia de dispersão de Raios X (EDX) para
análise de elementos, e espectroscopia de infravermelho. Verificou-se que a
substituição do CaO por M
2
O
3
reduziu progressivamente a capacidade de formação
da camada de cálcio-fosfato na superfície exposta ao SBF. Tal fato pode ser
atribuído ao efeito desta substituição nas propriedades ácidas dos grupos com sílica.
Costa et al. (2003) propuseram preparar um vidro na forma de
espuma que apresentasse bioatividade e poros que permitissem osteocondução em
seu interior. Preparou-se um biovidro com a seguinte composição: 12% óxido de
sódio (Na
2
O), 28% óxido de cálcio (CaO), 10% óxido de fósforo (P
2
O
5
) e 50% óxido
de sílica (SiO
2
), a partir de óxidos puros via fusão. Combinou-se este biovidro com o
aditivo de carbeto de boro (B
4
C), resultando no vidro tipo espuma. Realizou-se
caracterização do novo material por fluorescência de Raios X, difratometria de Raios
X, picnômetro de hélio, análise termogravimétrica e microscopia eletrônica de
varredura. Também se fez ensaios in vitro em meio de SBF. Os resultados
mostraram que a mistura de aditivos ao biovidro provocou a formação de poros de
tamanhos variados e interconectados. A caracterização química por fluorescência de
Raios X indicou que o material, segundo o diagrama de fases, apresentou-se na
faixa de bioatividade. Os ensaios in vitro das amostras resultaram na formação de
Revisão de Literatura
32
uma película à base de fosfato de cálcio na superfície, indicando bioatividade do
material.
Rosengren et al. (2003) estudaram, através de cromatografia e gel de
eletroforese bidimensional, a adsorção de proteínas de plasma humano em dois
vidros-cerâmicas bioativos: -AP40 (44,00% SiO
2
, 32,16% CaO, 2,84% MgO, 5,00%
CaF
2
, 4,60% Na
2
O, 0,2 K
2
O, 11,20% P
2
O
5
) e -RKKP (43,94% SiO
2
, 31,93% CaO,
2,79% MgO, 4,94% CaF
2
, 4,55% Na
2
O, 0,19 K
2
O, 10,27% P
2
O
5
, 0,99% Ta
2
O
5,
0,50% La
2
O
3
). A análise quantitativa mostrou que os dois biomateriais apresentaram
boa capacidade de adsorção de proteínas, entretanto os melhores resultados foram
obtidos com o AP40 (ausência de Ta
2
O
5,
e La
2
O
3
) Encontrou-se correlação entre a
composição química e a quantidade de proteínas adsorvidas. Concluiu-se que a
presença de Ta (Tântalo) e La (Lantânio) diminuíram a adsorção de proteínas.
2. 2 TESTES IN VIVO
Utilizando defeitos ósseos criados em rebordo de cães, Schepers et
al. (1991) avaliaram o Calcite
®
, Interpore 200
®
e o Biogran
®
como material de
preenchimento ósseo. Em um mês as partículas de biovidro, próximas a parede do
defeito, estavam incorporadas com o tecido ósseo. O centro das partículas
apresentava-se com fissuras. Através da análise microquímica das partículas de
Biogran
®
verificou-se a formação de uma camada externa rica em cálcio e fósforo,
enquanto o centro apresentava-se rico em sílica. Observou-se, com dois meses,
tecido ósseo formado nas fissuras do biovidro sem conexão com o tecido ósseo
Revisão de Literatura
33
externo. Em três meses as partículas de Calcite®, no centro do defeito,
apresentavam-se encapsuladas por tecido fibroso. Todos os materiais foram
melhores que o grupo controle (sem implantação de biomaterial). O Biogran
®
apresentou os melhores resultados.
Utilizando ratos como modelo experimental, Oliveira et al. (1993)
analisaram a resposta tecidual de micropartículas de hidroxiapatitas implantadas em
tecido subcutâneo. Utilizaram-se trinta animais divididos em tempos de três e vinte e
quatro horas e sete, vinte e um, trinta e sessenta dias de pós-operatório. Em três e
vinte e quatro horas verificou-se reação inflamatória aguda, principalmente em vinte
e quatro horas. Em sete dias houve formação de granulomas do tipo corpo estranho
envolvendo as partículas de material. Aos vinte e um e trinta dias a resposta
inflamatória era semelhante aos sete dias, porém o granuloma apresentava-se mais
duro. Após sessenta dias percebeu-se redução aparente no volume dos granulomas.
A ausência de resposta inflamatória exacerbada no tecido subcutâneo de ratos
reforçou a biocompatibilidade do material.
Através de defeitos periodontais criados em primatas, Fetner et al.
(1994) examinaram, clinica e histologicamente, as propriedades do PerioGlas
®
(biovidro- BV), hidroxiapatitas (HA), fosfato tricálcio (TCP) e controle (não
implantado) no processo de reparo. Empregou-se duas formulações diferentes de
PerioGlas®, 45S5 e 45S5-F (alto conteúdo de flúor). Selecionaram-se materiais com
duas variações de tamanho de partículas: 90-310µm (Syntograft® - TCP, PerioGlas
®
- BV e Periograf
®
- HA), e de 500-710µm (PerioGlas
®
- BV, Alveolograft
®
- HA e
Augmen
®
- TCP). Após um mês, não houve formação de osso ou cemento em
Revisão de Literatura
34
nenhum dos defeitos. Percebeu-se pequena reabsorção radicular em todos os sítios,
sendo mais significativa no grupo do PerioGlas
®
em ambas formulações. Os
espécimes tratados com PerioGlas
®
apresentaram pequena migração do epitélio
juncional para apical. As avaliações histométricas dos sítios com PerioGlas
®
, em
quatro e seis meses, apresentaram 68% de nova inserção no defeito. O TCP
apresentou 55%, HA 38% e controle 34%. O reparo ósseo do PerioGlas
®
foi de 47%
da altura do defeito, TCP 31%, HA 18% e controle 21%. Em relação ao tamanho das
partículas, não houve diferença no processo de reparo entre os materiais. Todos os
materiais foram bem tolerados histologicamente.
Greghi e Campos Júnior (1994) compararam a biocompatibilidade da
hidroxiapatita FOB-USP com Interpore 200®, Bioapatite®, esmalte dental humano
em pó e particulado, e esponja de PVC (cloridrato de polivinil), através da
implantação em subcutâneo de ratos. As cerâmicas fosfato de cálcio foram
analisadas após um, dois e doze meses, enquanto os outros materiais apenas em
um e dois meses. Realizou-se análise histológica qualitativa (análise histopatológica)
e quantitativa (volumetria de pontos). Em relação à esponja de PVC verificou-se
grande quantidade de macrófagos e células gigantes multinucleadas após um e dois
meses. O grau de fibrosamento variou entre discreto e moderado. Para o esmalte
particulado, tanto em um e dois meses, todos os parâmetros mostraram-se
discretos, exceto o fibrosamento que evoluiu de discreto/moderado para
moderado/intenso. Contrariamente, o esmalte em pó apresentou grande quantidade
de linfócitos, macrófagos e células gigantes multinucleadas. A Interpore 200®
apresentou uma reação muito discreta em trinta dias, tornando-se ainda menor (dois
e doze meses). Apenas o fibrosamento aumentou, passando de discreto (um e dois
Revisão de Literatura
35
meses) para intenso (doze meses). A Bioapatite® apresentou vários macrófagos e
células gigantes multinucleadas, sendo que esta apresentou os piores resultados. A
HA FOB-USP mostrou inicialmente escore alto para macrófagos, células gigantes e
proliferação vascular. Aos sessenta dias houve redução deste quadro e aos doze
meses a reação apresentou-se semelhante a Interpore 200®.
Macedo et al. (1995) realizaram a implantação da HA-40® (sintética)
e hidroxiapatita obtida a partir de coral (natural) no tecido subcutâneo de ratos, com
intuito de verificar a reação tecidual após sete, quatorze, vinte e um e trinta dias. O
grupo HA-40® apresentou pigmentos escuros, de natureza granular, que poderiam
representar contaminantes ou impurezas. Os dois materiais induziram resposta
inflamatória que persistiu por todo período de avaliação, sendo menor no grupo
hidroxiapatita coral. Ambos materiais não mostraram potencial osteoindutivo.
Pollick et al. (1995) compararam a degradação de implantes de
cerâmica porosa, implantados em tecido mole (subcutâneo e muscular) e em tecido
ósseo. Utilizaram Interpore-200® e Pro Osteon-500®. Os implantes para
preenchimento ósseo apresentaram 15mm de comprimento e 8mm de diâmetro.
Para tecido mole utilizaram blocos de 8mm. Criaram três defeitos ósseos em cada
fêmur de dois cães, resultando em doze defeitos. Colocaram vinte e um implantes
intramusculares, através da dissecação do músculo e criação de um envelope.
Inseriram vinte e cinco implantes no subcutâneo do dorso dos animais. Sacrificaram
os animais após quatro meses. Os resultados mostraram reabsorção dos implantes
no tecido ósseo de 16,7-24,4%, no tecido muscular de 4,9-10,1% e de 5,0-9,7% no
subcutâneo. Sendo estatisticamente significativa apenas no tecido ósseo. Os
Revisão de Literatura
36
autores observaram crescimento ósseo em 67% dos implantes colocados no tecido
mole.
Utilizando alvéolo dental de ratos, Nary Filho e Okamoto (1996)
avaliaram a biocompatibilidade do Hapset® (sulfato de cálcio associado a
hidroxiapatita densa). Extraiu-se o incisivo superior direito de vinte animais.
Imediatamente após a extração implantou-se um tubo de polietileno, com guta-
percha (controle) em uma extremidade e Hapset® na outra. Sacrificou-se os animais
sete, quinze, vinte e um e trinta dias após a cirurgia. Os resultados mostraram
resposta inflamatória desde os períodos iniciais, sendo maior para o grupo teste.
Houve atraso na organização dos tecidos próximo ao Hapset®, com persistência do
infiltrado e atraso na formação do trabeculado ósseo.
Com a proposta de avaliar a bioatividade e osteocondutividade do
Biogran
®
em procedimentos de elevação da mucosa do seio maxilar Furusawa e
Mizunuma (1997) realizaram o procedimento cirúrgico em vinte pacientes. Avaliou-se
a formação óssea através de radiografias, tomografias computadorizadas, análise
histológica, distribuição dos elementos, análise bioquímica e de microdureza. Os
resultados foram obtidos após sete meses de cicatrização. As radiografias e
tomografias mostraram que os sítios preenchidos com biomaterial apresentaram
altura desejável. Segundo a análise histológica houve crescimento ósseo e os
grânulos apresentaram dissolução na parte central e desenvolvimento de fissuras.
Não observaram células inflamatórias. A análise de microdureza mostrou diminuição
na dureza dos grânulos após o período de implantação. Os resultados sugerem que
o biovidro apresenta propriedades osteocondutivas.
Revisão de Literatura
37
Johnson et al. (1997) determinaram a interface entre PerioGlas
®
,
implantes de titânio e tecido ósseo em coelhos. Cada animal recebeu quatro
implantes de 3,3x8mm de titânio. Um foi colocado sem a criação de defeito ósseo.
Os outros três receberam defeitos ósseos periféricos, adjacentes à porção coronária.
Preencheu-se dois defeitos com PerioGlas
®
e um não foi preenchido (controle). Em
uma semana os defeitos do grupo controle estavam preenchidos com tecido
fibrovascular com mínima formação óssea. Os preenchidos com PerioGlas
®
apresentavam abundante formação de matriz osteóide ao redor do material. Com
duas semanas o grupo teste demonstrou calcificação parcial, com formação de
matriz osteóide através do defeito. O grupo controle apresentava mínima formação
óssea, com ausência de contato com o implante. Em três semanas, os defeitos do
grupo controle apresentavam poucas mudanças, enquanto os do PerioGlas
®
estavam quase completamente preenchidos com osso imaturo. Com seis semanas o
grupo controle estava quase totalmente preenchido por tecido ósseo e o grupo
PerioGlas
®
estava completamente preenchido com osso cortical imaturo. Na décima
segunda e vigésima quarta semana, observou-se osso maduro formado
preenchendo tanto os defeitos do grupo controle quanto no teste. Entretanto, o osso
formado nos defeitos com biomaterial apresentavam-se mais densos e com melhor
adaptação a superfície do implante. Não se observou reação de corpo estranho para
o grupo tratado com PerioGlas
®
.
Schmitt et al. (1997) realizaram um estudo em osso rádio de coelhos
com intuito de comparar a capacidade de regeneração óssea do Bio-Oss® (osso
poroso mineral) e PerioGlas® (biovidro), através de análise radiográfica e
Revisão de Literatura
38
histomorfométrica. Dividiu-se os vinte e quatro animais em tempos de cicatrização
de quatro e oito semanas. Fizeram as análises radiográficas a cada duas semanas.
Utilizou-se modelo de defeito de tamanho crítico, que não cicatriza
espontaneamente, com 20mm. Imediatamente ao pós-operatório e duas semanas
após, ambos materiais mostraram similar radiopacidade, entretanto, em quatro
semanas o Bio-Oss® foi significativamente mais radiopaco, mantendo-se assim em
seis e oito semanas. Com oito semanas os defeitos tratados com Bio-Oss®
mostraram uma consolidação de suas características radiopacas e contorno
semelhante ao pré-operatório, não ocorrendo o mesmo com o PerioGlas®.
Histologicamente, os defeitos tratados com Bio-Oss® mostraram crescimento ósseo
uniforme, enquanto que para o PerioGlas® o crescimento se deu das margens para
o centro do defeito. Não houve evidência de reabsorção osteoclástica para nenhum
material, embora as partículas de biovidro diminuíram seu tamanho de quatro para
oito semanas. O PerioGlas® apresentou maior atividade fibroblástica que o Bio-
Oss®. Houve significativamente mais formação óssea nos defeitos tratados com
Bio-Oss® do que com PerioGlas®.
Turunen et al. (1997) utilizaram coelhos como modelo experimental
para comparar biovidro (BV) com carbonato de cálcio Biocoral® (CC) como material
de preenchimento ao redor de implantes de titânio e de biovidro, no interior de
defeitos ósseos. Os quinze animais receberam quatro defeitos em cada tíbia
totalizando cento e vinte defeitos. Avaliaram-se os tempos de três, seis e doze
semanas de pós-operatório. Os resultados histológicos demonstraram discreta
reação inflamatória (células mononucleares) ao redor dos grânulos de BV e CC em
três semanas, para todos os grupos. A reação inflamatória não persistiu nos demais
Revisão de Literatura
39
tempos de análise. Todas as partículas de CC foram reabsorvidas após doze
semanas. Não houve reabsorção das partículas de BV Segundo a análise
histomorfométrica, foi significativamente maior (p<0,001) a área de tecido ósseo
formada ao redor do grupo de implantes de titânio com o BV do que com o CC. Não
houve diferença significativa (p=0,227) nos grupos de implantes de BV. Melhores
resultados foram obtidos com os implantes de BV, comparado com os de titânio,
avaliando-se o contato entre o tecido ósseo formado e o implante, independente do
biomaterial utilizado.
Com objetivo de determinar a capacidade do Bioglass® em promover
reparação óssea em defeitos de 20mm, unilaterais, no osso radio de coelhos,
Wheeler et al. (1997) utilizaram quarenta e oito animais divididos em tempos de
quatro e oito semanas de cicatrização. Um grupo recebeu Bioglass® e outro não foi
tratado (controle). A formação óssea foi determinada através de medidas
histomorfométricas e mecânicas. Através da microscopia de fluorescência verificou-
se que a quantidade de osso formado dos defeitos tratados foi significantemente
maior (p=0,04) em quatro semanas. Não houve diferença em oito semanas (p=0,23).
O Bioglass® mostrou-se mais efetivo nos períodos iniciais da cicatrização. A análise
biomecânica não mostrou diferença significativa entre o grupo tratado e controle.
Utilizando doze cavidades ósseas cirurgicamente criadas em
mandíbula de macacos, Cancian (1998) avaliou histologicamente a efetividade do
Calcite® (Hidroxiapatita densa) e do Biogran
®
(Biovidro) no reparo ósseo. As
cavidades foram preenchidas com Calcite
®
, Biogran
®
e deixadas sem implantação
do biomaterial (controle). Os animais foram sacrificados após cento e oitenta dias.
Revisão de Literatura
40
Os resultados demonstraram que não ocorreu formação óssea no grupo controle. O
Biogran
®
propiciou neoformação óssea com reparação total do defeito. A maioria das
partículas foi reabsorvida e substituída por tecido ósseo. O Calcite
®
não permitiu
formação óssea, e suas partículas apresentaram-se envoltas por tecido fibroso.
Através de defeitos ósseos criados na mandíbula de ratos Furusawa
et al. (1998) avaliaram as propriedades de osteocondução do Biogran
®
. Criaram
defeitos com 2mm de diâmetro e 1-1,5mm de profundidade em dezoito animais.
Aplicaram o biovidro nos sítios e cobriram com uma membrana reabsorvível.
Dividiram a amostra em seis grupos: um, dois, três, quatro, oito e dezesseis
semanas de cicatrização. Os resultados da análise histológica mostraram após uma
semana redução das bordas agudas, por reabsorção dos grânulos. Observou-se
células osteoprogenitoras nos espaços entre os grânulos. Em duas semanas notou-
se dissolução adicional das partículas e aparecimento de fissuras. Na terceira
semana observaram fissuras atingindo o centro dos grânulos, preenchidas por
células osteogênicas. Após quatro semanas houve reabsorção do centro do grânulo,
fagocitose e formação de matriz osteóide. Com oito semanas notou-se fagocitose e
invasão de célula osteogênicas nos grânulos. Em dezesseis semanas muitos
grânulos apresentavam-se incorporados por tecido ósseo.
Com objetivo de determinar a eficácia do Biogran
®
no tratamento de
defeitos ósseos previamente à colocação de implantes de titânio, Schepers et al.
(1998) realizaram um estudo com cães. Os animais tiveram todos os pré-molares e o
1
o
molar extraídos de ambos os lados da mandíbula. Imediatamente após, um lado
recebeu implantes de Biogran
®
e o outro serviu como controle. Após quatro meses,
Revisão de Literatura
41
colocou-se três implantes em cada lado da mandíbula. No grupo controle, o
crescimento ósseo deu-se das margens do alvéolo em direção ao implante,
enquanto que com Biogran
®
este crescimento ocorreu ao redor das partículas em
direção ao implante. Observou-se maior crescimento ósseo para o grupo teste.
Próximo à superfície do implante praticamente todos os grânulos sofreram
reabsorção e aumento do diâmetro interno. Alguns grânulos foram completamente
reabsorvidos. Este estudo demonstrou alta atividade de remodelação em
decorrência do uso do Biogran
®
.
Wheeler et al. (1998) analisaram as características biomecânicas e
histológicas do PerioGlas
®
e Biogran
®
implantados em defeitos ósseos de fêmur de
coelhos, verificando se o tamanho da partícula afeta o reparo. Utilizaram doze
animais divididos em dois grupos com tempos de reparo de quatro e doze semanas.
Removeu-se um cilindro ósseo medular do fêmur (6x1x2mm) dos espécimes. O
PerioGlas
®
foi implantado no membro direito e o Biogran
®
no esquerdo. Um grupo de
dez animais foi utilizado para os testes biomecânicos. Verificou-se que a
porcentagem de novo osso dentro do defeito foi maior com a utilização do
PerioGlas
®
em quatro e doze semanas. Não se observou diferença na deposição
mineral entre os dois materiais. As partículas de Biogran
®
dentro do defeito
apresentaram áreas significativamente maiores (p<0,05) que as de PerioGlas
®
, em
ambos os tempos. Não se verificou diferença na porção de material reabsorvido nos
dois grupos. Havia mais partículas de biovidro nos defeitos preenchidos com
PerioGlas
®
. No grupo do Biogran
®
a média do tamanho das partículas variou de
626μm, 333μm e 299μm, para os tempos zero, quatro e doze semanas,
respectivamente. No grupo do Perioglas
®
diminui de 416μm para 168μm (quatro
Revisão de Literatura
42
semanas) e 137μm (doze semanas). Histologicamente os grânulos de biovidros
mostraram-se não cristalinos, alguns com fissuras, especialmente após 12 semanas.
Observou-se infiltrado de células ectomesenquimais dentro destas fissuras em 4,5 %
das partículas de Perioglas
®
no tempo de quatro semanas e 32,5% em doze
semanas. Para o Biogran
®
, observou-se 6% e 16%, respectivamente em quatro e
doze semanas.
Hall et al. (1999) avaliaram a cicatrização de defeitos ósseos em
cães. Os defeitos foram criados ao redor de implantes de titânio e tratados com dois
biovidros de diferentes tamanhos (NRG 300-355µm e BRG 90-710µm), osso
desmineralizado seco e congelado de cão (DFDBAc) e deixados vazio (controle).
Extraíram-se os pré-molares e o 1º molar inferior dos animais. No terceiro mês de
cicatrização os cães receberam quatro implantes. Previamente a colocação do
implante, criou-se um defeito intra-ósseo (3x5x5mm). Após três meses de
cicatrização e integração dos implantes as cavidades receberam os tratamentos.
Sacrificou-se os cães após quatro meses. Através da histomorfometria, observou-se
diferença significativa (p=0,0379) na média da porcentagem de osso em contato com
o implante entre o grupo DFDBAc e controle. Não houve diferença significativa
entre os grupos controle, BRG e NRG. Quando comparado a porcentagem de novo
osso preenchendo o defeito na área implantada, DFDBAc mostrou resultados
significativamente melhores (p<0,05) que o grupo controle. Não houve diferença
significativa entre o grupo controle, BRG e NRG. A quantidade de partículas
remanescentes de material no tecido mole foi estatisticamente maior (p=0,0304) nos
sítios tratados com NRG do que com DFDBAc. Não houve diferença significativa
entre BRG e DFDBAc. Conclui-se que a porcentagem de osso em contato com o
Revisão de Literatura
43
implante e a porcentagem de preenchimento ósseo no defeito ao redor do implante
foram estatisticamente melhores com o uso do DFDBAc comparado com os
biovidros.
Utilizando macacos como modelo experimental, Karatzas et al.
(1999) determinaram histologicamente o efeito das partículas de PerioGlas
®
na
cicatrização de defeitos periodontais. Removeu-se o osso palatino e interproximal na
região dos pré-molares e dois primeiros molares superiores. Criou-se oito defeitos
em cada um dos dois animais. Após oito semanas de cronicidade, preencheu-se
metade dos defeitos com PerioGlas
®
e metade não foi preenchida com biomaterial
(controle). Sacrificou-se os macacos após oito semanas. Os resultados mostraram
ausência de reabsorção radicular e anquilose nos grupos teste e controle. Havia
partículas remanescentes de PerioGlas
®
em todos os espécimes. Estas
aparentavam estarem envoltas por uma camada de tecido conjuntivo, sem sinais de
inflamação ou de reação de corpo estranho. A quantidade de osso e cemento
formada, bem como inibição da migração apical do epitélio juncional foi
estatisticamente maior no grupo do biovidro do que controle.
Oliveira et al. (1999) avaliaram microscópica e bioquimicamente a
resposta celular de dois materiais obtidos a partir de osso cortical bovino, através da
implantação no tecido subcutâneo de ratos. Os animais foram divididos em três
grupos: GI- cápsulas de colágeno vazias; GII- cápsulas com partículas de osso
cortical microgranular desproteinizado a 100ºC (Gen-Ox®); GIII- cápsula com
partículas de osso cortical microgranular desproteinizado a 1000ºC. Os animais
foram sacrificados após dez, vinte, trinta e sessenta dias. Os resultados mostraram
Revisão de Literatura
44
que a implantação do tecido ósseo mineralizado e desproteinizado induziu a
formação de grânuloma com recrutamento de macrófagos e células gigantes
multinucleadas, independentemente da temperatura. Os autores concluíram que
estes biomateriais podem ser empregados como substitutos ósseos.
Carvalho (2000) avaliou a matriz óssea humana desmineralizada em
forma de gel (Grafton DBM Gel) colocada em cavidades cirurgicamente
confeccionadas em tíbias de ratos e no interior de tubos de polietileno, no tecido
subcutâneo do dorso dos mesmos animais. As cavidades cirúrgicas foram cobertas
com membrana de politetrafluoretileno não-expandido (Teflon-membrana Dentoflex).
Os animais foram sacrificados aos sete, quinze, trinta e sessenta dias pós-
operatórios. Na cavidade cirúrgica houve aceleração da formação de trabéculas
ósseas e as partículas do osso implantado foram incorporadas. O material atuou
como osteocondutor. Conclui-se que o material não induz à formação óssea em
contato com o tecido conjuntivo e causa reação inflamatória de leve à moderada.
Santos (2000) se propôs a avaliar o comportamento biológico de
quatro biomateriais, sendo duas hidroxiapatitas sintéticas (Osteogen
®
e Bioapatita
®
),
uma hidroxiapatita natural (Bio-Oss
®
) e um biovidro (Biogran
®
), implantados em
alvéolos de cães. Extraiu-se os primeiros e terceiros pré-molares, de ambas arcadas
e ambos os lados, de dez animais. Avaliou-se a cicatrização em trinta, sessenta e
duzentos dias. Os resultados histológicos mostraram que a maioria das partículas de
Osteogen
®
estava em íntimo contato com tecido ósseo neoformado, porém algumas
estavam envoltas por tecido conjuntivo. As partículas de Bio-Oss
®
não foram
totalmente reabsorvidas e apresentaram deposição direta de tecido ósseo. Os
Revisão de Literatura
45
grânulos de Biogran
®
, em alguns espécimes, estavam ausentes sugerindo
reabsorção. Em outros espécimes as partículas estavam recobertas por tecido
calcificado e este circundado por tecido conjuntivo. Conclui-se que a resposta
histológica foi semelhante para todos os materiais. O Bio-Oss® apresentou maior
número de partículas envolvidas por tecido ósseo, seguido pelo Osteogen® e
Biogran
®
. Não se observou Bioapatita
®
nos alvéolos, sugerindo completa reabsorção
ou expulsão. Todos os materiais retardaram o processo de reparo.
Al Ruhaimi (2001) investigou o potencial de reparo de seis materiais
osteocondutivos: HTR (polimetil metacrilato /polihidróxido metil metacrilatoo/
hidróxido de cálcio/sulfato de bário-sintético), BOP (copolímero de metilmetacrilato-
sintético), Biogran
®
(biovidro–sintético), Laddec
®
(hidroxiapatita-natural), Dembone
®
(hidroxiapatita-humana) e Osteograf
®
(hidroxiapatita-sintética), em defeitos ósseos
criados em tíbia de coelhos de 8mm de diâmetro. Utilizou-se vinte e oito coelhos,
sendo quatro do grupo controle e vinte e quatro do grupo tratado. Os vinte e quatro
animais foram divididos em seis grupos. O período de reparo foi de oito semanas.
Metade do número de defeitos destinou-se a análise histológica com microscopia
óptica através de coloração de Hematoxilina e Eosina e metade por meio de
microscopia eletrônica de varredura. Verificou-se que o Laddec
®
possuiu o melhor
potencial para osteocondução, seguido do Biogran® e do Osteograf
®
. Os piores
reparos ósseos foram demonstrados pelo HTR e BOP, sendo que o Dembone
®
não
apresentou atividade de reparo ósseo.
Schliephake e Kage (2001) avaliaram o uso de implantes
reabsorvíveis para reparo de defeitos ósseos no osso parietal de ratos. Utilizaram-se
Revisão de Literatura
46
oitenta animais divididos em quatro grupos, sendo três tratados e um controle (não
implantados com biomaterial). Utilizou-se implante de cerâmica porosa (α -tricálcio
fosfato), cerâmica porosa com superfície tratada com vidro-cerâmica, e um implante
de compósito sólido com superfície tratada com vidro cerâmico e ácido polilático, de
8mm de diâmetro por 2mm de espessura. Avaliou-se os tempos de seis, treze, vinte
e seis e cinqüenta e duas semanas. O grupo controle mostrou regeneração
incompleta, com formação de osso de 1,66mm em média após cinqüenta e duas
semanas. O grupo de α -tricálcio fosfato mostrou que o osso formado durante os
estágios iniciais sofreu reabsorção posterior. O reparo ósseo após cinqüenta e duas
semanas foi de 1,83mm. O implante de vidro-cerâmica exibiu extensiva formação
óssea, quase preenchendo o defeito criado, com 3,9mm de crescimento ósseo em
média. A degradação da cerâmica foi quase total, com poucas partículas
circundadas por tecido mole. O implante de compósito mostrou um crescimento na
média de 0,63mm. A degradação do polímero não foi completa em cinqüenta e duas
semanas.
Vogel et al. (2001) investigaram partículas de Bioglass® de três
diferentes composições - 45S5, 52S, 55S - para avaliar o efeito da variação de
solubilidade na reparação óssea em defeitos criados em coelhos. De acordo com o
fabricante, os tamanhos de partícula variam de 90-710μm. A medição de cento e
sessenta e duas partículas de material mostrou a média de 507±180μm. Uma
cavidade de 4mm de diâmetro com 8mm de profundidade foi criada anterior-
posteriormente na epífise distal do fêmur. Dos doze sítios criados, preencheu-se
onze com 100mg de material e um serviu como controle (não preenchido com
biomaterial). Sacrificaram os animais depois de sete, vinte e oito e oitenta e quatro
Revisão de Literatura
47
dias. Dos sítios tratados, analisou-se seis com microscópio óptico, três com
hibridização in situ, um com microscopia eletrônica e um permaneceu congelado em
nitrogênio líquido. Verificou-se que todos os materiais foram reabsorvidos e
mostraram incorporação com o tecido ósseo. Regeneração óssea ocorreu da
periferia para o centro do defeito. O material 45S5 mostrou os melhores resultados
de incorporação com o tecido ósseo e de reabsorção.
Zendron (2001) investigou a formação óssea vertical em torno de
implantes osteointegrados, em cães. Através de acesso cirúrgico expôs-se e
aplainou-se a base da mandíbula. Inseriu-se parcialmente quatro implantes,
permitindo que a rosca de três implantes ficassem posicionadas acima da cortical
óssea. Parafusou-se dispositivos de exclusão tecidual à cortical óssea, cobrindo a
porção exposta dos implantes. Os dispositivos haviam sido previamente preenchidos
com os seguintes materiais: Osso autógeno; Controle (não preenchido com
biomaterial); Biogran
®
(biovidro) e Bio-Oss
®
(osso bovino inorgânico). Sacrificou-se
os animais após três meses de acompanhamento. Os resultados mostraram que a
formação óssea vertical foi significativamente maior no grupo de osso autógeno. O
resultado obtido com o emprego do Biogran
®
foi similar ao Bio-Oss
®
e controle.
Utilizando modelos de reparação óssea em defeitos criados em
coelhos, Chan et al. (2002) avaliaram o efeito da adição de dextrano (polissacarídeo
formado por resíduos de glicose) ao Bioglass® 45S5 no comportamento biológico
deste material. O dextrano foi adicionado ao material para melhorar as propriedades
de manipulação, aumentando a consistência. Foram preparados defeitos de 7-8 mm
na porção lateral do côndilo do fêmur e preenchidos com os materiais, sendo
Revisão de Literatura
48
divididos em grupos: GI - osso autógeno (obtido durante a confecção do defeito), GII
- Bioglass® 45S5, GIII - Bioglass® 45S5 associado com dextrano, GIV - Bioglass®
45S5 em associação com osso autógeno, GV - Bioglass® 45S5 em conjunto com
osso autógeno e dextrano. Utilizaram-se oito animais em cada tempo e os dois
fêmures de cada espécime, totalizando dezesseis sítios por período, sendo três
sítios para cada material e um reserva. Os períodos de reparo foram de dois dias,
uma, duas, três, seis e doze semanas. Os resultados não mostraram evidência de
toxicidade do material contendo dextrano. Todos os defeitos, independente do
material, mostraram total preenchimento ósseo após seis semanas. Concluiu-se que
a adição de dextrano de médio peso molecular não alterou o comportamento
biológico do Bioglass®.
Por meio de defeitos criados em tíbia de ratos Holzhausen et al.
(2002) compararam a eficácia de duas hidroxiapatitas para regeneração óssea, nos
tempos de sete, quinze, trinta, sessenta e cento e vinte dias. Sessenta animais
receberam defeitos em ambas as tíbias, perfazendo cento e vinte defeitos que
receberam os seguintes tratamentos: GI- cavidade óssea sem implante de material
(controle); GII- cavidade óssea preenchida com Osteogen® (controle positivo); GIII-
cavidade preenchida com hidroxiapatita experimental (HAF). A utilização de ambas
hidroxiapatitas provocou uma regeneração mais lenta do defeito ósseo em relação
ao grupo controle. A hidroxiapatita Osteogen® apresentou maior eficácia em relação
a HAF, no que se refere à capacidade de reparar os defeitos ósseos.
Sanada et al. (2003) realizaram avaliações histológicas, radiográficas
e de imunoglobulinas (IgG e IgM) após implantação de enxerto de osso esponjoso
Revisão de Literatura
49
bovino desmineralizado em blocos (Gen-Ox®) no músculo abdutor da coxa de ratos.
O material foi cortado em cilindros de 5mmx12mm. Realizou-se as análises aos três,
sete, quatorze, vinte e um e vinte e oito dias de pós-operatório. Os resultados
histológicos mostraram em três e sete dias reação inflamatória aguda com
predominância de neutrófilos. No décimo quarto dia observou-se reabsorção das
partículas de biomaterial, aumento de macrófagos, células gigantes multinucleadas e
de fibrosamento. Aos vinte e um dias observou-se intensa e extensa angiogênese e
reabsorção do material. Em vinte e oito dias não houve variação dos tipos e
quantidades celulares. As análises radiográficas e histológicas não detectaram
osteogênese no tecido muscular. As concentrações de IgG e IgM foram similares
entre os períodos experimentais. Concluiu-se que o material é biocompatível,
bioabsorvível sem capacidade osteoindutora.
O objetivo deste trabalho de Stvrtecky et al. (2003) foi avaliar
histologicamente a resposta de alvéolo humano ao uso de partículas de Biogran
®
,
previamente a colocação de implante metálico e a performance clínica e radiográfica
após a colocação do mesmo. Após a extração de dente e colocação do Biogran
®
aguardou-se seis meses de cicatrização. O exame radiográfico deste período
mostrou que o sítio estava quase completamente preenchido por tecido ósseo.
Realizou-se a biópsia e colocação do implante. Após nove meses expôs-se o
abutment e confeccionou-se a coroa provisória. A análise histológica demonstrou
tecido ósseo maduro e partículas do biovidro em íntimo contato com o tecido ósseo
e outras rodeadas por tecido fibroso, sem sinais de resposta inflamatória.
Proposição
50
3 PROPOSIÇÃO
presente trabalho se propôs a avaliar características físico-
químicas e a biocompatibilidade de um biovidro desenvolvido pelo Departamento de
Química – DEQUIM - CIPP da Universidade Estadual de Ponta Grossa – UEPG e
compará-lo com dois biovidros disponíveis no comércio (PerioGlas
®
e Biogran
®
),
através da implantação no tecido subcutâneo de ratos.
Material e Método
51
4 MATERIAL E MÉTODO
presente estudo foi aprovado pela Pró-reitoria de pesquisa -
PROPESP da Universidade Estadual de Ponta Grossa (01205/2003).
A pesquisa se dividiu em análise das características físico-químicas e
avaliação da biocompatibilidade dos biovidros, através da implantação dos materiais
no tecido subcutâneo de ratos.
Utilizaram-se três biovidros, sendo dois disponíveis no comércio e
outro desenvolvido pelo Departamento de Química – DEQUIM - CIPP da
Universidade Estadual de Ponta Grossa - UEPG:
PerioGlas
®
(US Biomaterials Corporation, Alachua - Flórida,
lote 3156T2) adquirido junto a revendedora no Brasil-
Promodent.
Biogran
®
(Orthovita Palm Beach Gardens - Flórida, lote
1203598) adquirido junto à revendedora no Brasil - Implant
inovations.
Biovidro - UEPG preparado através da mistura de pó de vidro
(45% SiO
2
, 24,5% CaO, 24,5% Na
2
O e 6% P
2
O5, por peso) e
fundição em recipiente de platina a 1350ºC. As partículas foram
limpas com ultra-som e esterilizadas em autoclave (Cristófoli
®
,
Brasil) a 130ºC por 2 horas. Não se realizou nenhum
tratamento na superfície das partículas.
Os materiais foram pesados em câmara de fluxo laminar com balança
analítica e acondicionados em frascos plásticos codificados por cor sem o
conhecimento prévio do operador. O desenvolvimento de toda a pesquisa
Material e Método
52
(caracterização físico-química e análise de biocompatibilidade) caracterizou um
estudo cego (operador não tinha conhecimento do material a ser analisado).
4.1 ANÁLISE FÍSICA
4.1.1 Microscópico eletrônico de varredura (MEV)
Determinou-se o tamanho das partículas e sua morfologia original
(previamente à implantação nos animais) através do MEV JEOL JSM T330
(Shimadzu, Kyoto, Japão). Utilizou-se uma pequena quantidade de material,
suficiente apenas para cobrir o porta-amostra do microscópio. Fixou-se a amostra
com uma fita adesiva específica para esta análise. As amostras foram recobertas
com ouro puro até a deposição de uma camada de 20-25nm de espessura.
Realizaram-se micrografias com aumento de 100 vezes para determinação do
tamanho e morfologia das partículas e 5000 vezes para análise da superfície das
partículas.
As imagens foram digitalizadas com uma câmara digital. O tamanho
do grânulo foi determinado através do software de análise de imagens Mocha
®
versão 1.2 (Jandel Corporation, USA), medindo-se os pontos mais eqüidistantes da
partícula. Mediu-se todos os grânulos presentes na micrografia eletrônica de
varredura. Prancha 2 - figura 1.4.
Material e Método
53
4.2 ANÁLISE QUÍMICA
4.2.1 Fluorescência de Raios X (FRX)
Utilizando o aparelho de fluorescência de Raios X EDX-700
(Shimadzu, Kyoto, Japão) identificou-se os elementos químicos presentes.
Empregou-se uma pequena quantidade de material, suficiente apenas para cobrir o
porta-amostra.
4.2.2 Difratometria de Raios X (DRX)
Através do aparelho de difratometria de Raios X XRD-6000
(Shimadzu-XRD-6000, Kyoto, Japão) determinou-se a estrutura das amostras,
verificando se eram ou não cristalinas.Empregou-se uma pequena quantidade de
material, suficiente apenas para cobrir o porta-amostra.
4.2.3 Microscópico eletrônico de varredura/ Energia dispersiva de Raios X (MEV-
EDX)
Utilizando o MEV-EDX JEOL SEM 8400 (Shimadzu, Kyoto, Japão)
determinou-se à composição química dos materiais. Utilizou-se uma pequena
quantidade de material, suficiente apenas para cobrir o porta-amostra do
Material e Método
54
microscópio. Fixou-se a amostra com uma fita adesiva específica para esta análise.
O tempo de aquisição dos dados foi de 300 segundos, utilizando 20Kv.
4.3 ANÁLISE DE BIOCOMPATIBILIDADE
Para a realização deste estudo utilizou-se 100 ratos (Norvergicus
albinus wistar), machos e fêmeas (COSTA, 2001), com idade variando de 2-3 meses
e peso de 200-300 gramas. Os animais procederam do biotério da Universidade
Estadual de Ponta Grossa, onde os mesmos mantinham-se em condições de saúde
satisfatória, recebendo alimentação adequada (Nuvilab®, Nuvital Nutrientes Ltda,
Colombo - Brasil), sendo que dez dias durante o mês esta alimentação recebeu
vermífugo (Nuvilab SBZ®, Nuvital Nutrientes Ltda, Colombo - Brasil) e água “ad
libitum”.
Dividiu-se os animais em quatro grupos:
GI - PerioGlas
®
- vinte e cinco animais
GII - Biogran
®
- vinte e cinco animais
GIII - Biovidro UEPG - vinte e cinco animais
GIV - Grupo controle (procedimento cirúrgico sem implantação
do biomaterial) - vinte e cinco animais
Subdividiu-se esses quatro grupos em cinco tempos para análise do
material implantado, sendo sete, quinze, vinte e um, quarenta e cinco e sessenta
dias. Esquema 1 e 2.
Material e Método
55
4.3.1 Estudo piloto
Previamente a execução da parte experimental realizou-se um estudo
piloto para determinação da dose anestésica ideal para os animais, treinamento dos
procedimentos cirúrgicos e determinação do protocolo cirúrgico a ser empregado.
4.3.2 Procedimento cirúrgico
Inicialmente pesou-se e identificaram-se os ratos. Os animais foram
anestesiados com 10mg/ml de Rompun®
(cloridrato de 2-(2,6 xilidino)-5, 6-dihidro-4H
1, 3- tiazina a 2% - Bayer do Brasil) em água destilada associado a 30mg/ml de
Vetanarcol® (cloridrato de 2-(0-clorofenil)-2(metilamino) ciclohexanona – König do
Brasil) em água destilada, via intraperitonial, aplicando 0,2ml da solução final por 100
gramas de peso do animal.
Realizou-se a tricotomia da região dorsal (COSTA, 2001; OLIVEIRA et
al., 1999) e anti-sepsia com álcool iodado (95% de álcool a 70% em 5% de iodo).
Fez-se a incisão e divulsão através de uma tesoura de ponta romba (COSTA, 2001)
Metzenbaum-14 Duflex® (SS White, Brasil). A incisão ocorreu na linha sagital
mediana no terço médio do dorso (GREGHI; CAMPOS JÚNIOR, 1994; PESCININI,
1995), com cerca de 15mm. Prancha 1 - figura 1.1. A divulsão ocorreu tanto do lado
direito como do esquerdo com aproximadamente 18mm de extensão com 15mm de
largura. Se durante o procedimento de divulsão ocorresse sangramento o animal
seria descartado da pesquisa.
Material e Método
56
Cada animal recebeu somente um material, sendo implantados 30mg
(OLIVEIRA et al., 1993) de cada lado, por meio de uma cureta Duflex®
n
o.
85 (SS
White, Brasil). Prancha 1 - figura 1.2. Para melhorar as propriedades de manipulação
dos biovidros e facilitar a implantação no tecido subcutâneo, acrescentou-se uma
gota de solução salina 0,9%. A sutura foi realizada com pontos isolados utilizando-se
fio agulhado mononylon 5-0 Shalon® e porta-agulha Duflex® (SS White, Brasil).
Prancha 1 - figura 1.3.
4.3.3 Cuidados pós-operatórios
No pós-operatório os grupos de animais permaneceram em suas
respectivas caixas, mantendo-os desta forma separados de acordo com o tempo de
pós-operatório. Os animais receberam alimentação convencional e água “ad libitum”.
Não foi dado nenhum medicamento aos animais, tendo em vista que no trabalho
piloto não se observou sinais clínicos de infecção ou inflamação.
4.3.4 Obtenção das peças
A biópsia ocorreu depois de transcorrido o tempo determinado para
cada subgrupo. Anestesiou-se novamente os animais. Feita a anti-sepsia, conforme
já descrito, procedeu-se à biópsia da região implantada. Prancha 1 - figura 1.4.
Posteriormente, sacrificou-se o animal por meio de deslocamento cervical.
Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados por um único
operador treinado.
Material e Método
57
4.3.5 Processamento histológico
Obteve-se duas amostras em cada animal (uma do lado direito e
outra do esquerdo). Fez-se duas lâminas para cada amostra, sendo uma corada com
Hematoxilina e Eosina (HE) e outra com Tricrômico de Masson. Cada lâmina
apresentou três cortes. Fixou-se as peças com solução de Alfac (álcool 80% - 85ml,
formol - 10ml, ácido acético - 5ml) por 12 horas. Lavou-se em água corrente.
Manteve-se as biópsias acondicionadas em álcool 70% até o momento da
desmineralização. Em seguida desmineralizou-se com solução de Morse (ácido
fórmico a 50% e citrato de sódio a 20%, em partes iguais) por 14 dias, em média. As
peças foram desidratadas em solução de álcool etílico 70% por 12h, álcool 90%
durante 1h e álcool absoluto por 20h. Incluiu-se as peças em parafina e cortou-se em
micrótomo manual. Os cortes foram realizados transversalmente à região implantada,
com 5µm de espessura, e semi-seriados com espaçamento de 150µm. Esticou-se os
cortes em banho-maria a 45
o
C e colocou-se em lâminas de vidro.
4.3.6 Análise histológica
Através de microscópico óptico analisou-se as lâminas
confeccionadas, avaliando-se os grânulos dos materiais, tecido conjuntivo, tipos
celulares e resposta inflamatória adjacente aos grânulos.
Material e Método
58
4.3.7 Determinação do tamanho da reação inflamatória
Realizou-se uma análise prévia das lâminas histológicas,
selecionando-se as uniformemente isotrópicas (apresentam as mesmas
características em todas as direções). As lâminas isotrópicas foram aleatoriamente
selecionadas e empregadas para determinação do tamanho da reação inflamatória,
tamanho do grânulo e determinação das células.
Para determinação do tamanho da reação inflamatória analisaram-se
quatro lâminas coradas por HE e quatro coradas com Tricrômico de Masson, para
cada tempo e cada grupo experimental, através de microscopia óptica (MO) com
aumento final de 100x. Obtiveram-se cinco medidas de cinco diferentes áreas, de
cada uma das lâminas histológicas analisadas.
A medição da reação inflamatória ocorreu com auxílio de uma lâmina
objeto apresentando uma régua ocular previamente calibrada com coeficiente
micrométrico, conforme método preconizado por Mandarim-de-Lacerda (2003) para
medidas lineares. Para esta análise, utilizou-se como parâmetro posicionar a régua
ocular sobre a primeira camada de células em contado com o biovidro introduzido no
subcutâneo e medir o tamanho do tecido conjuntivo, com a reação inflamatória, até a
primeira camada de células musculares estriadas presentes na derme do animal.
Prancha 2 - figura 2.1. No grupo controle mediu-se a reação inflamatória presente
entre os tecidos musculares.
Material e Método
59
4.3.8 Determinação de polimorfonuclear (PMN), mononuclear (MN) e fibroblasto (F)
Para esta análise utilizaram-se cinco lâminas coradas por HE, para
cada grupo experimental e cada tempo pós-operatório. Realizou-se a contagem
destas células em cinco diferentes áreas de cada lâmina histológica, através de
microscopia óptica com aumento final de 400x.
Para quantificar o número das respectivas células presentes em torno
do material implantado no tecido subcutâneo dos ratos, criou-se um sistema teste
linear com dez pontos de referência. O sistema baseou-se em uma lâmina objeto
apresentando uma régua ocular previamente calibrada. A régua era posicionada
paralelamente e perpendicularmente as partículas, delimitando uma área com
tamanho conhecido. Contou-se o número de células mononuclear (MN),
polimorfonuclear (PMN) e fibroblasto (F), presentes no tecido conjuntivo no interior da
área delimitada. As células que tocavam na régua eram excluídas da contagem.
Prancha 2 - figura 2.2.
4.3.9 Determinação do tamanho do grânulo
Para mensuração do tamanho dos grânulos, utilizaram-se as
mesmas lâminas selecionadas para a determinação das células. Mediram-se cinco
grânulos aleatórios de cada lâmina histológica, através de microscopia óptica com
aumento final de 100x.
Realizou-se a medição do tamanho das partículas dos biovidros com
auxílio de uma lâmina objeto apresentando uma régua ocular previamente calibrada
Material e Método
60
com coeficiente micrométrico. A régua era colocada sobre a partícula e efetuava-se
a medida. Prancha 2- figura 2.3.
4.4 ANÁLISE DOS DADOS
A análise de reprodutibilidade dos dados obtidos com as variáveis:
tamanho dos grânulos, previamente à implantação (MEV), tamanho da reação
inflamatória (MO), tamanho dos grânulos nos vários tempos pós-operatórios (MO) e
contagem das células PMN, MN e F (MO), foi realizada em dois momentos distintos,
em ordem aleatória, pelo examinador. Os dados foram analisados obtendo-se as
diferenças entre as medidas em dois momentos, testando-se a reprodutibilidade
através do coeficiente de correlação intraclasse.
As comparações dos resultados para as variáveis dependentes:
tamanho dos grânulos previamente à implantação, reação inflamatória, contagem das
células e tamanho dos grânulos foram realizadas através de análise de variância
(ANOVA com um e dois critérios). Foram considerados fatores fixos (variáveis
independentes) o tempo e material, sendo analisados os resultados individuais, bem
como as interações entre os fatores.
Realizou-se o teste de Kolmogorov-Smirnov para verificar se os
dados apresentavam distribuição normal. Verificou-se se os dados apresentavam
equivalência de variância através do teste de Levene.
O nível de significância adotado foi de 0,05, desta forma se p>0,05 a
hipótese nula (Ho), na qual não haveria diferença significativa entre os grupos seria
aceita. Caso p≤0,05, Ho não seria aceita, indicando diferenças significativas entre os
Material e Método
61
grupos. Diante desta condição a comparação entre os valores médios das variáveis
foi realizada através do teste de Tukey HSD, com o objetivo de determinar entre
quais grupos havia as diferenças significativas. Aos dados que não apresentaram
equivalência entre as variâncias foi aplicado o teste de comparações múltiplas de
Games-Howell. Os dados de contagem de PMN, MN e F foram transformados em
percentagem. Os dados de tamanho da reação inflamatória foram transformados
através de logaritmo na base natural. Todos os cálculos foram realizados através do
software estatístico SPSS® (Statistical Package for the Social Science), versão
11.5.1 for Windows (SPSS Inc. Chicago, Illinois).
Material e Método
62
25
25
25
Perioglas®
Perioglas
Perioglas
®
®
Biogran®
Biogran®
Biovidro
UEPG
Biovidro
UEPG
Controle
Controle
25
5
5
5
5
5
15 dias
21 dias
45 dias
60 dias
7 dias
100 ratos
5
5
5
5
5
15 dias
21 dias
45 dias
60 dias
7 dias
5
5
5
5
5
15 dias
21 dias
45 dias
60 dias
7 dias
5
5
5
5
5
15 dias
21 dias
45 dias
60 dias
7 dias
Esquema 1- Os 100 animais da pesquisa foram divididos em 4 grupos, com 25 animais em cada. Os
grupos foram divididos em cinco subgrupos de tempo, como 5 animais em cada.
Material e Método
63
GRUPO
GRUPO
GRUPO
5 animais
5 animais
5 animais
5 animais
5 animais
(15 dias)
(21 dias)
(45 dias)
(60 dias)
(07 dias)
10 amostras
10 amostras
10 amostras
10 amostras
10 amostras
(15 dias)
(21 dias)
(45 dias)
(60 dias)
(07 dias)
Esquema 2- Cada animal recebeu o tratamento nos dois lados do dorso, resultando em duas amostras
por animal. Assim, cada grupo apresentou cinco animais por tempo operatório, resultando
em 10 amostras por tempo operatório em cada grupo.
Material e Método
64
PRANCHA 1- Procedimentos cirúrgicos.
Figura 1.1 Figura 1.2
Figura 1.3 Figura 1.4
Figura 1.1- Incisão de aproximadamente 15mm realizada com tesoura de ponta romba.
Figura 1.2- Implantação do biomaterial no tecido subcutâneo do rato.
Figura 1.3- Dorso do animal, após o tratamento, suturado com fio mononylon agulhado Shalon®.
Figura 1.4- Remoção da peça contendo o material implantado.
Material e Método
65
PRANCHA 2- Microscopias ópticas e eletrônicas empregadas na metodologia.
02040608030 907010 5002040608030 907010 5002040608030 907010 50
02040608030 907010 50
02040
60
8030 907010 50
02040608030 907010 5002040608030 907010 50
02040
60
8030 907010 5002040
60
8030 907010 50
Figura 2.1 Figura 2.2
0
2
0
4
0
6
0
8
0
3
0
9
0
7
0
1
0
5
0
0
2
0
4
0
6
0
8
0
3
0
9
0
7
0
1
0
5
0
0
2
0
4
0
6
0
8
0
3
0
9
0
7
0
1
0
5
0
Figura 2.3 Figura 2.4
Figura 2.1- Lâmina corada com HE, aumento de 100x. Medição do tamanho da reação inflamatória.
Figura 2.2- Lâmina corada com HE, aumento de 400x. Contagem de PMN, MN e F.
Figura 2.3- Lâmina corada com HE, aumento de 100x. Medição do tamanho dos grânulos dos
biovidros, após implantação nos animais.
Figura 2.4- Microscopia eletrônica de varredura, aumento de 100x. Medição do tamanho dos grânulos
dos biovidros previamente à implantação (seta).
Resultados
66
5 RESULTADOS
teste de biocompatibilidade é considerado um pré-requisito para
materiais que estão em processo de desenvolvimento, como neste caso o Biovidro-
UEPG. O Perioglass® e o Biogran
®
, produtos comercialmente disponíveis, de
eficácia clínica e histológica cientificamente comprovada foram utilizados como
controles positivos.
Apresentaremos os resultados divididos em observações clínicas,
análise físico-química e análise de biocompatibilidade.
5. 1 OBSERVAÇÕES CLÍNICAS
Nenhum animal da pesquisa apresentou problemas de saúde
durante os procedimentos cirúrgicos, bem como no tempo de pós-operatório. Da
mesma forma, durante a divulsão, não ocorreu sangramento e/ou perfuração do
peritônio. Deste modo, nenhum rato foi descartado durante a pesquisa.
Todos os materiais testados apresentaram boas características de
manipulação.
Resultados
67
5. 2 ANÁLISE FÍSICA
5.2.1 MEV
Por meio do microscópico eletrônico de varredura determinou-se o
tamanho e morfologia das partículas dos biovidros previamente à implantação nos
animais. O coeficiente de correlação intraclasse para a determinação do tamanho
das partículas através do MEV foi α=0,99, mostrando adequada reprodutibilidade por
parte do pesquisador. Prancha 9 - gráfico 9.1 (ANEXO). Os resultados apresentam-
se divididos de acordo com os materiais.
PerioGlas
®
O PerioGlas
®
apresentou-se como blocos grandes, não uniformes
com bordas pontiagudas e arredondadas. O tamanho médio das partículas foi de
222,00±40,64µm. Prancha 3 - figura 3.1. Tabela 16 (ANEXO). As faces
apresentaram rugosidade superficial.
A microscopia eletrônica de varredura com aumento de 5000x
confirmou a rugosidade superficial, através da presença de pequenas partículas
(0,5-1µm) com faces planas na superfície dos grânulos. Prancha 3 - figura 3.2.
Resultados
68
Biogran
®
Conforme se observa na prancha 3 - figura 3.3, o Biogran
®
exibiu
partículas na forma de blocos irregulares, pontiagudos e arredondados com tamanho
médio de 385,09±68,51µm. Tabela 16 (ANEXO). A superfície das partículas
apresentou-se rugosa. Em aumento de 5000x comprovou-se a rugosidade superficial
através de dendritos com tamanho de 1,5-2µm. Prancha 3 - figura 3.4.
Biovidro – UEPG
As partículas do biovidro-UEPG apresentaram-se não uniformes
com bordas pontiagudas, arredondadas e superfície rugosa. O tamanho médio dos
grânulos foi de 102,86±36,22µm. Prancha 3 - figura 3.5. Tabela 16 (ANEXO).
Através do aumento de 5000x comprovou-se a rugosidade superficial. Prancha 3 -
figura 3.6.
De acordo com o teste estatístico ANOVA um critério, houve
diferença significativa no tamanho dos grânulos (p<0,001). Tabela 1 e 2. Prancha 7 -
gráfico 7.1. Tabela 37, 38 e 39 (ANEXO).
Os três materiais apresentaram estrutura não cristalina com pontos
de cristalização.
Tabela 1- Estatística descritiva - Tamanho dos grânulos previamente à implantação.
Grupos N Média Desvio padrão
Erro padrão
PerioGlas
®
20 221,996 40,644 9,08845
Biovidro UEPG
30 102,868 36,224 6,61361
Biogran
®
10 385,086 68,506 21,66362
Total
60 189,613 112,029 14,46299
p<0,001 fator tempo, grupo e interação (tempo*grupo)
Resultados
69
Tabela 2- Pós-teste Tukey HSD. Comparação entre os grupos - Tamanho dos grânulos previamente
à implantação.
Grupos Diferença entre as médias Erro padrão Valor de p
PerioGlas
®
X Biovidro UEPG 119,128 12,777 < 0,001*
PerioGlas
®
X Biogran
®
-163,090 17,143 < 0,001*
Biovidro UEPG X Biogran
®
-282,218 16,162 < 0,001*
* Diferenças significativas
5. 3 ANÁLISE QUÍMICA
5. 3. 1 Fluorescência de Raios X (FRX)
Utilizando FRX identificou-se na amostra dos três biovidros cálcio,
oxigênio, sódio, fósforo e sílica. Os resultados demonstraram que os elementos
químicos presentes estão na forma de: óxido de sílica (SiO
2,
) óxido de sódio (Na
2
O
,
),
óxido de cálcio (CaO) e óxido de fósforo (P
2
O
5
).
5. 3. 2 Difratometria de Raios X (DRX)
Os resultados da DRX comprovaram que as três amostras são
materiais não cristalinos. Prancha 8 - gráficos 8.1, 8.2, 8.3 e 8.4.
Resultados
70
5.3. 3 MEV/EDX
Os resultados do MEV/EDX indicaram a presença de sílica, cálcio,
fósforo e sódio nas três amostras. Nenhum dos materiais apresentou impurezas,
sendo visualizados somente os elementos participantes segundo informações dos
fabricantes. Prancha 4 - figuras 4.1, 4.2, 4.3 e 4.4.
5. 4 ANÁLISE DE BIOCOMPATIBILIDADE
5. 4. 1 Análise histológica – Microscópico óptico
SETE DIAS
Em sete dias os grânulos de todos os biomateriais apresentaram-se
sem fissuras. Observaram-se células polimorfonucleares e mononucleares ao redor
das partículas. O tecido conjuntivo apresentava fibroblastos e alguns fibrócitos.
Notou-se vasos sanguíneos e capilares na área analisada. O tecido do grupo
controle estava semelhante ao dos grupos teste. Prancha 5 - figura 5.1 e 5.2.
QUINZE DIAS
O tecido conjuntivo apresentava-se semelhante para os quatro
grupos experimentais, com a presença de fibroblastos e alguns fibrócitos. Notou-se
Resultados
71
vasos sanguíneos e capilares na área analisada. Observou-se alguns
polimorfonucleares e mononucleares em maior quantidade. Encontrou-se células
gigantes multinucleadas, entretanto em pouca quantidade. Houve inicio a formação
de fissuras nos grânulos. Prancha 5 - figura 5.3 e 5.4.
VINTE E UM DIAS
Os grânulos apresentaram quantidade significativa de fissuras.
Observou-se tecido conjuntivo no interior destas. Notou-se células
polimorfonucleares e mononucleares ao redor das partículas. O tecido conjuntivo
apresentava fibroblastos e poucos fibrócitos. Havia vasos sanguíneos e capilares na
área analisada. Os resultados do grupo controle foram semelhantes. Prancha 5 -
figura 5.5 e 5.6.
QUARENTA E CINCO DIAS
Em quarenta e cinco dias observou-se células polimorfonucleares,
mononucleares, fibroblastos, fibrócitos, vasos sanguíneos e capilares nos quatro
grupos analisados. Os grânulos apresentaram muitas fissuras, preenchidas por
tecido conjuntivo. Houve grande variação no tamanho das partículas dos biovidros.
Prancha 6 - figura 6.1 e 6.2.
Resultados
72
SESSENTA DIAS
Em sessenta dias, os grânulos apresentaram grandes fissuras. A
maioria dos grânulos estava dividida em várias partes em decorrência das fissuras,
que estavam preenchidas por tecido conjuntivo. Observou-se, nos grupos teste e
controle, células polimorfonucleares e mononucleares em menor quantidade. O
tecido conjuntivo apresentava fibroblastos e fibrócitos. Prancha 6 - figura 6.3, 6.4, 6.5
e 6.6.
5. 4. 2 Determinação do tamanho da reação inflamatória
O coeficiente de correlação intraclasse para a determinação do
tamanho da reação inflamatória foi α=1, mostrando boa consistência na obtenção
dos dados pelo pesquisador. Prancha 9 - gráfico 9.2 (ANEXO). Os resultados do
tamanho da reação inflamatória dos quatro grupos experimentais nos cinco tempos
de análise estão agrupados na prancha 7 - gráfico 7.2.
Segundo o teste estatístico ANOVA dois critérios houve diferença
significativa (p<0,001) no tamanho da reação inflamatória entre os grupos, tempos e
interação (grupo e tempo). Tabela 3, 4 e 5. Tabela 17, 18, 19, 20, 21, 33, 40 e 41
(ANEXO).
Resultados
73
Tabela 3- Estatística descritiva - Tamanho de reação inflamatória (valores transformados log). Fator
interação grupos * tempo (dias).
Grupos Tempo (dias) Média Desvio Padrão N
PerioGlas
®
7 dias 4,5163 0,46363 8
15 dias 3,0918 0,35441 8
21 dias 3,9116 0,89386 8
45 dias 4,9401 0,50781 8
60 dias 4,2990 0,23054 8
Total 4,1518 0,81354 40
Biovidro-UEPG
7 dias 4,7973 0,48035 8
15 dias 5,2588 0,42523 8
21 dias 5,0867 0,31617 8
45 dias 5,1643 0,88060 8
60 dias 4,5542 0,48694 8
Total 4,9723 0,58547 40
Controle
7 dias 4,6052 0,00000 8
15 dias 4,5185 0,24506 8
21 dias 4,4319 0,32086 8
45 dias 4,6052 0,00000 8
60 dias 3,9987 0,24506 8
Total 4,4319 0,30397 40
Biogran
®
7 dias 4,6523 0,34006 8
15 dias 4,3207 0,37270 8
21 dias 4,4955 0,54595 8
45 dias 4,7927 0,53037 8
60 dias 4,7997 0,29700 8
Total 4,6122 0,44716 40
Total
7 dias 4,6428 0,37072 32
15 dias 4,2974 0,86050 32
21 dias 4,4814 0,68743 32
45 dias 4,8756 0,58317 32
60 dias 4,4129 0,43636 32
Total 4,5420 0,63820 160
p<0,001 fator tempo, grupo e interação (tempo*grupo)
Resultados
74
Tabela 4- Pós-teste Games Howell. Comparação entre os grupos - Tamanho da reação inflamatória
(valores transformados log).
Grupos Diferença entre as médias Erro padrão Valor de p
PerioGlas
®
X Biovidro UEPG -0,820 0,158 < 0,001*
PerioGlas
®
X Controle -0,280 0,137 0,187
PerioGlas
®
X Biogran
®
-0,460 0,146 0,014*
Biovidro UEPG X Controle -0,540 0,104 < 0,001*
Biovidro UEPG X Biogran
®
-0,360 0,116 0,015*
Controle X Biogran
®
-0,180 0,85 0,161
* Diferenças significativas
Tabela 5- Pós-teste Games Howell. Comparação entre os tempos (dias) - Tamanho da reação
inflamatória (valores transformados log).
Tempo Diferença entre as médias Erro padrão Valor p
7 dias X 15 dias 0,345 0,165 0,246
7 dias X 21 dias 0,161 0,138 0,769
7 dias X 45 dias -0,232 0,122 0,327
7 dias X 60 dias 0,229 0,101 0,169
15 dias X 21 dias -0,184 0,194 0,878
15 dias X 45 dias -0,578 0,183 0,022*
15 dias X 60 dias -0,115 0,170 0,960
21 dias X 45 dias -0,394 0,159 0,110
21 dias X 60 dias 0,068 0,143 0,989
45 dias X 60 dias 0,462 0,128 0,006*
* Diferenças significativas
Resultados
75
5. 4. 3 Contagem de PMN, MN e F
O coeficiente de correlação intraclasse para contagem das células
selecionadas foi α=0,99, mostrando boa reprodutibilidade dos dados obtidos pelo
pesquisador. Prancha 9 - gráfico 9.3 (ANEXO).
Os valores das contagens de polimorfonucleares, mononucleares e
fibroblastos presentes na reação tecidual dos cinco tempos de avaliação estão
apresentados em percentuais na prancha 7 - gráficos 7.3, 7.4 e 7.5.
Polimorfonuclear (PMN)
Segunda a análise estatística através do teste de ANOVA dois
critérios houve diferença significativa (p<0,001) no percentual de células
polimorfonucleares nos fatores grupo, tempo e interação (tempo e grupo). Porém,
não houve diferença significativa entre os grupos de biovidro, havendo apenas entre
esses e o grupo controle. Tabela 22, 23, 24, 25, 26, 34, 42, e 43 (ANEXO).
Resultados
76
Tabela 6- Estatística descritiva - Contagem de PMN (valores transformados em percentagens).
Grupos Tempo (dias) Média Desvio padrão N
7 dias 4,532 2,543 5
15 dias 6,410 7,400 5
21 dias 20,246 13,177 5
45 dias 19,378 9,767 5
60 dias 8,538 2,416 5
PerioGlas
®
Total 11,820 10,105 25
7 dias 8,324 1,555 5
15 dias 4,642 3,535 5
21 dias 19,212 6,658 5
45 dias 23,304 4,523 5
60 dias 16,560 3,384 5
Biovidro UEPG
Total 14,408 8,064 25
7 dias 0,000 0,000 5
15 dias 2,968 4,068 5
21 dias 4,444 7,244 5
45 dias 0,000 0,000 5
60 dias 2,858 6,390 5
Controle
Total 2,054 4,644 25
7 dias 5,214 1,748 5
15 dias 11,870 4,840 5
21 dias 21,558 4,818 5
45 dias 13,498 7,630 5
60 dias 8,550 3,383 5
Biogran
®
Total 12,138 7,172 25
7 dias 4,517 3,438 20
15 dias 6,472 5,861 20
21 dias 16,365 10,602 20
45 dias 14,045 10,894 20
60 dias 9,126 6,301 20
Total
Total 10,105 9,0032 100
p<0,001 fator tempo, grupo e interação (tempo*grupo)
Resultados
77
Tabela 7- Pós-teste Games Howell. Comparação entre os grupos - Contagem de PMN (valores
transformados em percentagens).
Grupos Diferença entre as médias Erro padrão Valor p
PerioGlas
®
X Biovidro UEPG -2,587 2,5857 0,75
PerioGlas
®
X Controle 9,766 2,2243 0,001*
PerioGlas
®
X Biogran
®
-0,317 2,4784 0,999
Biovidro UEPG X Controle 12,354 1,8612 <0,001*
Biovidro UEPG X Biogran
®
2,270 2,1585 0,720
Controle X Biogran
®
-10,084 1,7090 <0,001*
* Diferenças significativas
Tabela 8- Pós-teste Games Howell. Comparação entre os tempos (dias) - Contagem de PMN (valores
transformados em percentagens).
Tempo Diferença entre as médias Erro padrão Valor p
7 dias X 15 dias -1,955 1,519 0,701
7 dias X 21 dias -11,847 2,492 0,001*
7 dias X 45 dias -9,527 2,554 0,009*
7 dias X 60 dias -4,609 1,605 0,054
15 dias X 21 dias -9,892 2,709 0,008*
15 dias X 45 dias -7,572 2,766 0,072
15 dias X 60 dias -2,654 1,924 0,644
21 dias X 45 dias 2,320 3,399 0,959
21 dias X 60 dias 7,238 2,757 0,090
45 dias X 60 dias 2,814 2,814 0,421
* Diferenças significativas
Mononuclear (MN)
De acordo com o teste estatístico ANOVA dois critérios não houve
diferença significativa na contagem de células mononucleares nos fatores grupo
(0,117). Houve diferença significativa na interação (p=0,022) e tempo (p<0,001).
Tabela 22, 23, 24, 25, 26, 35, 44 e 45 (ANEXO).
Resultados
78
Tabela 9- Estatística descritiva - Contagem de MN (valores transformados em percentagens).
Grupos Tempo (dias) Média Desvio padrão N
7 dias 38,910 15,481 5
15 dias 46,656 6,583 5
21 dias 16,650 6,533 5
45 dias 18,778 2,896 5
60 dias 25,048 11,684 5
PerioGlas
®
Total 29,208 14,852 25
7 dias 44,712 6,786 5
15 dias 38,838 15,926 5
21 dias 32,940 15,325 5
45 dias 13,960 6,861 5
60 dias 4,670 2,055 5
Biovidro UEPG
Total 27,024 18,408 25
7 dias 34,320 8,832 5
15 dias 23,486 6,436 5
21 dias 14,446 13,475 5
45 dias 18,254 25,961 5
60 dias 16,858 20,513 5
Controle
Total 21,4728 16,874 25
7 dias 46,8580 6,245 5
15 dias 27,1720 8,417 5
21 dias 21,0920 3,178 5
45 dias 21,6980 8,676 5
60 dias 23,4500 16,021 5
Biogran
®
Total 28,0540 13,11802 25
7 dias 41,200 10,502 20
15 dias 34,038 13,260 20
21 dias 21,282 12,349 20
45 dias 18,172 13,321 20
60 dias 17,506 15,491 20
Total
Total 26,439 15,977 100
p=0,117 grupo
p<0,001 tempo
p=0,022 interação
Resultados
79
Tabela 10- Pós-teste Games Howell. Comparação entre os tempos (dias) - Contagem de MN (valores
transformados em percentagens).
Tempo Diferença entre as médias Erro padrão Valor p
7 dias X 15 dias 7,162 3,782 0,339
7 dias X 21 dias 19,918 3,624 <0,001*
7 dias X 45 dias 23,028 3,793 <0,001*
7 dias X 60 dias 23,694 4,185 <0,001*
15 dias X 21 dias 12,756 4,051 0,025*
15 dias X 45 dias 15,865 4,202 0,005*
15 dias X 60 dias 16,531 4,559 0,007*
21 dias X 45 dias 3,109 4,061 0,939
21 dias X 60 dias 3,775 4,430 0,912
45 dias X 60 dias 4,568 4,568 1,000
* Diferenças significativas
Fibroblastos (F)
Em relação à contagem de fibroblastos, através do teste ANOVA dois critérios não
houve diferença significativa nos fatores grupo (p=0,131) e interação (p=0,665).
Houve diferença significativa no fator tempo (p=0,008). Tabela 22, 23, 24, 25, 26, 36,
46 e 47 (ANEXO).
Resultados
80
Tabela 11- Estatística descritiva - Contagem de F (valores transformados em percentagens).
Grupos Tempo (dias) Média Erro padrão N
7 dias 56,552 16,552 5
15 dias 46,932 4,795 5
21 dias 63,106 13,555 5
45 dias 58,178 13,564 5
60 dias 66,414 13,390 5
PerioGlas
®
Total 58,236 13,666 25
7 dias 45,964 7,408 5
15 dias 56,520 16,875 5
21 dias 47,846 18,570 5
45 dias 62,736 8,691 5
60 dias 78,770 4,520 5
Biovidro UEPG
Total 58,567 16,480 25
7 dias 64,722 10,564 5
15 dias 73,546 6,704 5
21 dias 61,110 34,507 5
45 dias 61,746 41,968 5
60 dias 80,284 21,054 5
Controle
Total 68,281 21,495 25
7 dias 47,926 6,828
5
15 dias 60,916 12,532
5
21 dias 57,350 4,335
5
45 dias 64,804 13,125
5
60 dias 68,000 16,141
5
Biogran
®
Total 59,799 12,685
25
7 dias 54,041 12,539
20
15 dias 59,478 14,271
20
21 dias 57,353 20,054
20
45 dias 61,866 21,627
20
60 dias 73,367 15,257
20
Total
Total 61,221 18,023 100
p=0,131 grupo
p=0,008 tempo
p=0,665 interação
Resultados
81
Tabela 12- Pós-teste Games Howell. Comparação entre os tempos - Contagem de F (valores
transformados em percentagens).
Tempo Diferença entre as médias Erro padrão Valor de p
7 dias X 15 dias -5,437 4,248 0,705
7 dias X 21 dias -3,312 5,288 0,970
7 dias X 45 dias -7,825 5,590 0,632
7 dias X 60 dias -19,326 4,416 0,001*
15 dias X 21 dias 2,125 5,503 0,995
15 dias X 45 dias -2,387 5,794 0,994
15 dias X 60 dias -13,888 4,671 0,039*
21 dias X 45 dias -4,513 6,595 0,959
21 dias X 60 dias -16,014 5,634 0,054
45 dias X 60 dias -11,501 5,918 0,315
* Diferenças significativas
5. 4. 4 Determinação do tamanho dos grânulos dos biovidros
O coeficiente de correlação intraclasse para determinação do
tamanho dos grânulos de biovidros após implantação nos animais foi α=1. Prancha 9
- gráfico 9.4. Segundo o teste estatístico ANOVA dois critérios houve diferença
significativa (p<0,001) nos fatores grupo, tempo e interação (grupo e tempo).
Prancha 8 - gráfico 8.1. Tabela 27, 28, 29, 30, 31, 32, 37 e 48 (ANEXO).
Resultados
82
Tabela 13- Estatística descritiva - Tamanho dos grânulos. Fator interação grupos * tempo (dias).
Grupos Tempo (dias) Média Desvio padrão N
7 dias 299,600
54,22914 5
15 dias 299,600
63,34667 5
21 dias 269,200
39,30903 5
45 dias 376,400
23,19483 5
60 dias 240,800
48,05414 5
PerioGlas
®
Total
270,2400 50,96182 25
7 dias 145,600
42,27056 5
15 dias 217,000
43,93177 5
21 dias 207,600
49,30314 5
45 dias 165,600
35,33836 5
60 dias 150,000
24,97999 5
Biovidro UEPG
Total 177,1600
47,42861 25
7 dias 418,800
22,20811 5
15 dias 394,000
66,79820 5
21 dias 369,200
48,42727 5
45 dias 286,400
57,98965 5
60 dias 272,800
60,14316 5
Biogran
®
Total
348,2400 76,98987 25
288,0000 122,03278 15
303,5333 92,60428 15
282,0000 80,97619 15
231,3333 64,32803 15
221,2000 69,06643 15
Total
265,2133 91,92966 75
p<0,001 fator tempo, grupo e interação
Tabela 14- Pós-teste de Tukey HSD. Fator Grupos - Tamanho dos grânulos.
Grupos Diferença entre as médias Erro padrão Valor de p
PerioGlas
®
X Biovidro UEPG 119,960 13,672 <0,001*
PerioGlas
®
X Biogran
®
-51,120 13,672 0,001*
Biovidro UEPG X Biogran
®
-171,080 13,672 <0,001*
* Diferenças significativas
Resultados
83
Tabela 15- Pós-teste de Tukey HSD. Fator Tempo - Tamanho do grânulo.
Tempo Diferença entre as médias Erro padrão Valor p
7 dias X 15 dias -15,533 17,651 0,903
7 dias X 21 dias 6,000 17,651 0,997
7 dias X 45 dias 11,866 17,651 0,962
7 dias X 60 dias 66,800 17,651 0,003*
15 dias X 21 dias 21,533 17,651 0,740
15 dias X 45 dias 27,400 17,651 0,533
15 dias X 60 dias 82,333 17,651 <0,001*
21 dias X 45 dias 5,866 17,651 0,997
21 dias X 60 dias 60,800 17,651 0,009*
45 dias X 60 dias 54,933 17,651 0,023
* Diferenças significativas
Resultados
84
PRANCHA 3- Microscopias eletrônicas de varredura.
Figura 3.1 Figura 3.2
Figura 3.3 Figura 3.4
Figura 3.5 Figura 3.6
Figura 3.1- Micrografia eletrônica de varredura do PerioGlas
®
. Aumento de 100x.
Figura 3.2- Micrografia eletrônica de varredura do PerioGlas
®
. Aumento de 5000x.
Figura 3.3- Micrografia eletrônica de varredura do Biogran
®
. Aumento de 100x.
Figura 3.4- Micrografia eletrônica de varredura do Biogran
®
. Aumento de 5000x.
Figura 3.5- Micrografia eletrônica de varredura do Biovidro-UEPG. Aumento de 100x.
Figura 3.6- Micrografia eletrônica de varredura do Biovidro-UEPG. Aumento de 5000x.
Resultados
85
PRANCHA 4- Resultados do MEV/EDX.
Figura 4.1 Figura 4.2
Figura 4.3 Figura 4.4
Figura 4.1- MEV/EDX. PerioGlas
®
, indicando presença de sódio, cálcio, sílica e fósforo.
Figura 4.2- MEV/EDX. Biogran
®
, indicando presença de sódio, cálcio, sílica e fósforo.
Figura 4.3- MEV/EDX. Biovidro – UEPG, indicando presença de sódio, cálcio, sílica e fósforo.
Figura 4.4- Elementos químicos encontrados nos biomateriais, segundo MEV/EDX e fluorescência
de Raios X.
PerioGlas
®
Biovidro
UEPG
Biogran
®
Si
X X X
Na
X X X
Ca
X X X
O
X X X
P
X X X
Resultados
86
PRANCHA 5- Lâminas histológicas.
Figura 5.1 Figura 5.2
Figura 5.3 Figura 5.4
Figura 5.5 Figura 5.6
Figura 5.1- Biogran
®
. Aumento de 100x. Grânulo sem fissura aos sete dias.
Figura 5.2- Biogran
®
. Aumento de 400x. Presença de PMN aos sete dias (seta).
Figura 5.3- PerioGlas
®
. Aumento de 100x. Início de formação de fissuras aos quinze dias.
Figura 5.4- PerioGlas
®
. Aumento de 400x. Presença de PMN aos quinze dias (seta).
Figura 5.5- Biovidro-UEPG. Aumento de 100x. Grânulo com fissuras aos vinte e um dias.
Figura 5.6 PerioGlas
®
. Aumento de 400x. Predominância de célula MN aos vinte e um dias (setas).
Resultados
87
PRANCHA 6- Lâminas histológicas.
Figura 6.1 Figura 6.2
Figura 6.3 Figura 6.4
Figura 6.5 Figura 6.6
Figura 6.1- Biovidro-UEPG. Aumento de 400x. Presença de fibrócitos aos 45 dias (setas).
Figura 6.2- Biogran
®
. Aumento de 100x. Fissuras e degradação do grânulo aos 45 dias (setas).
Figura 6.3- Biovidro-UEPG. Aumento de 400x. Vasos sangüíneos e capilares aos 60 dias (setas).
Figura 6.4- PerioGlas
®
. Aumento de 100x. Presença de fissuras aos 60 dias (setas).
Figura 6.5- Biovidro-UEPG. Aumento de 400x. Presença de fibroblastos aos 60 dias (setas).
Figura 6.6- Biogran
®
. Aumento de 40x. Aspecto geral das partículas aos 60 dias (setas).
Resultados
88
PRANCHA 7- Gráficos.
PerioGlas Biovidro-UEPG Biogran
100,00
200,00
300,00
400,00
500,00
T
a
m
a
n
h
o
d
o
g
r
â
n
u
l
o
(
u
m
)
V
Gráfico 7.1
7 dias 15 dias 21 dias 45 dias 60 dias
Tempo (dias)
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
T
a
m
a
n
h
o
d
a
r
ea
ç
ão
(
l
o
g
n
)
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
Gráfico 7.2
7 dias 15 dias 21 dias 45 dias 60 dias
Tempo (dias)
0,00
25,00
50,00
75,00
100,00
C
o
n
t
a
g
e
m
d
e
P
M
N
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
Gráfico 7.3
7 dias 15 dias 21 dias 45 dias 60 dias
Tempo (dias)
0,00
25,00
50,00
75,00
100,00
C
o
n
t
a
g
em
d
e
M
N
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
Gráfico 7.4
7 dias 15 dias 21 dias 45 dias 60 dias
Tempo (dias)
0,00
25,00
50,00
75,00
100,00
C
o
n
t
a
g
e
m
d
e
F
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
Gráfico 7.5
W
PerioGlas
W
Biovidro-UEPG
W
Controle
W
Biogran
Gráfico 7.1- Tamanho dos grânulos previamente à implantação.
Gráfico 7.2- Tamanho da reação inflamatória.
Gráfico 7.3- Contagem de PMN nos quatro grupos e cinco tempos de análise.
Gráfico 7.4- Contagem de MN nos quatro grupos e cinco tempos de análise.
Gráfico 7.5- Contagem de F nos quatro grupos e cinco tempos de análise.
p<0,001 – S – ANOVA 2 critérios
p< 0,001 – S – ANOVA 1 critério
p<0,001 – S – ANOVA 2 critérios
p=0,117 (grupo)– NS – ANOVA 2 critérios
p=0,022 (interação)– S – ANOVA 2 critérios
p<0,001 (tempo)– S – ANOVA 2 critérios
p=0,131 (grupo)– NS – ANOVA 2 critérios
p=0,665 (interação)– NS – ANOVA 2 critérios
p=0,008 (tempo)– S – ANOVA 2 critérios
Resultados
89
PRANCHA 8- Gráficos.
7 dias 15 dias 21 dias 45 dias 60 dias
Tempo (dias)
100,00
200,00
300,00
400,00
500,00
T
a
m
a
n
h
o
d
o
g
r
â
n
u
l
o
(
u
m
)
WW
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
Gráfico 8.1
W
PerioGlas
W
Biovidro-UEPG
W
Controle
W
Biogran
Gráfico 8.2
Gráfico 8.3
Gráfico 8.4
Gráfico 8.1- Determinação do tamanho dos grânulos dos biovidros após implantação nos animais nos
cinco tempos de análise.
Gráfico 8.2- Difratograma da amostra de PerioGlas
®
, indicando fase cristalina.
Gráfico 8.3- Difratograma da amostra de Biogran
®
, indicando fase cristalina.
Gráfico 8.4- Difratograma da amostra de Biovidro-UEPG, indicando fase cristalina.
p<0,001 – S – ANOVA 2 critérios
Discussão
90
6 DISCUSSÃO
rocedimentos de enxerto ósseo são realizados com
freqüência em cirurgias bucais e maxilofaciais. Em decorrência deste fato, a busca
de um material ideal como substituto ósseo vem sendo objeto de pesquisa por anos.
O substituto ósseo ideal deveria apresentar composição química e física similar ao
tecido ósseo que está sendo implantado, ser fonte de cálcio e fosfato, apresentar
porosidades, ser de fácil manipulação, ser degradado, biocompatível e não
apresentar potencial de transmissão de doenças priônicas e infecto-contagiosas.
(COSTA et al., 2003; HALL, 1999; PINHEIRO, 2001; SANTOS, 2000; STRNAD,
1992).
Com intuito de suprir as limitações de técnica e tentar alcançar a
excelência biológica do osso autógeno, vem tentando-se empregar uma quantidade
significativa de materiais aloplásticos. (AL RUHAIMI, 2001). A aplicabilidade desses
materiais em organismos humanos depende de suas propriedades biológicas,
químicas, físicas e mecânicas. (ALIZADEH; MARGUSSIAN, 2002; BRANDA et al.,
2002; COSTA et al., 2003; STRNAD, 1992).
Tendo em vista a importância do desenvolvimento e emprego de
materiais novos e ao mesmo tempo seguros e eficazes, para tratamento de perdas
ósseas, juntamente com a relevância de se avaliar as características físico-químicas
e a biocompatibilidade dos substitutos ósseos aloplásticos, no presente estudo
avaliou-se as características físico-químicas do PerioGlas
®
, Biogran
®
e Biovidro-
UEPG, com intuito de determinar o tamanho das partículas previamente à
Discussão
91
implantação em tecidos vivos, concentração e estrutura dos elementos presentes,
morfologia das partículas e características superficiais dos grânulos. Através da
implantação dos materiais no tecido subcutâneo de ratos, avaliou-se também o
tamanho da reação inflamatória gerada, presença e número de células
polimorfonucleares, mononucleares, fibroblastos e degradação dos grânulos.
Em relação às características físicas, os resultados desta pesquisa
mostraram, através de MEV, que as partículas de Biogran
®
apresentaram-se com
tamanho de 385,09±68,51µm, enquanto o PerioGlas
®
com 222,00±40,64µm e o
Biovidro-UEPG com 102,86±36,22µm (diferença significativa p<0,001). A
microscopia eletrônica de varredura mostrou ainda que as partículas dos três
materiais apresentaram-se irregulares e com rugosidade superficial, especialmente o
PerioGlas
®
. Esta rugosidade superficial sugere que algum tratamento de superfície
foi realizado, podendo ser condicionamento ácido da superfície das partículas ou
cristalização superficial da massa vítrea. Trabalhos como os de Rosengren et al.
(2003), Kaufmann et al. (2000) e Silver, Deas; Erecinska (2001) tem mostrado que a
superfície dos biovidros influencia a resposta biológica. Costa et al. (2003) afirmam
ainda que a natureza da superfície dos grânulos influencia as propriedades
osteocondutoras. Cho et al. (1997) e Salinas et al. (2001) comprovaram que o
condicionamento da superfície de biovidros, com ácido clorídrico, melhora a
bioatividade desses materiais. Deste modo, a realização de tratamentos superficiais
nas partículas de biovidros visam melhorar as propriedades desses quando
implantados em tecidos vivos.
A uniformidade das partículas que compõe o material também se faz
importante, uma vez que alguns materiais podem apresentar grande variação no
tamanho de partícula, enquanto outros se apresentam uniformes. Quando o material
Discussão
92
apresenta partículas uniformes e pequenas, os espaços entre os grânulos não são
preenchidos. Entretanto, se há partículas grandes e pequenas no mesmo material,
as menores ocupam os espaços entre as grandes, culminando com uma infiltração
celular e regeneração tecidual mais lenta. (SCHEPERS et al., 1998). Segundo a
microscopia eletrônica de varredura utilizada nesta pesquisa, o PerioGlas
®
e o
Biogran
®
apresentaram partículas mais uniformes, comparados com o Biovidro-
UEPG.
O tamanho e morfologia das partículas de materiais aloplásticos
estão ainda diretamente relacionados à degradação sofrida por estas quando
implantadas em tecidos vivos. Em algumas intervenções a degradação do material é
desejável, como em procedimentos ortopédicos que suportam carga. Em outras
indesejáveis, como os onlays de osso craniofacial. (AL RUHAIMI, 2001). Trabalhos
como os de Al Ruhaimi (2001), Fetner et al. (1994), Hall et al. (1999), Johnson et al.
(1999), Wheeler et al. (1997) e Wheeler et al. (1998) têm destacado a importância de
que, em procedimentos de implantes ósseos, o processo de degradação das
partículas ocorra concomitantemente à formação óssea, uma vez que estes
materiais devem atuar como um arcabouço, permitindo a formação óssea. Os vidros
bioativos podem ser degradados completamente ou parcialmente. Segundo Fetner
et al. (1994), Hall et al. (1999) e Schepers et al. (1998) o ideal é que as partículas
degradadas sejam substituídas por tecido ósseo e as partículas remanescentes
estejam em íntimo contato com o tecido ósseo neoformado. Al Ruhaimi (2001)
concorda com esses autores e acrescenta que a degradação sofrida pelos
substitutos ósseos pode ocorrer por dois processos: - hidrólise enzimática, mediado
por solução e – fagocitose, mediado por células. Segundo Schepers et al. (1991) a
Discussão
93
de troca iônica, entre as partículas de biovidros e o meio, pode levar a uma
dissolução parcial da partícula resultando em partículas menores.
Pesquisas como as de Al Ruhaimi (2001), Holzhausen et al. (2002) e
Pollick et al. (1995) tem mostrado que além do tamanho e morfologia, a composição
e concentração dos elementos químicos presentes nos materiais sintéticos também
são muito relevantes na degradação das partículas. Os resultados da fluorescência
de Raios X e do MEV/EDX indicam que as três amostras apresentaram a mesma
composição: cálcio, sódio, oxigênio, sílica e fósforo, na forma de óxido de sílica
(SiO
2,
) óxido de sódio (Na
2
O), óxido de cálcio (CaO) e óxido de fósforo (P
2
O
5
).
Biovidros com formulações semelhantes a essas vem mostrando resultados
satisfatórios quando implantados em tecido ósseo de acordo com observações de Al
Ruhaim, (2001), Cancian (1998) Chan et al. (2002), Furusawa; Mizunuma, (1997),
Furusawa et al. 1(998), Johnson et al. (1997), karatzas et al. (1999), Santos (2000),
Schepers et al. (1991), Wheleer et al. (1997) e (1998). Através da composição
química dos materiais consegue-se também teorizar, por meio do diagrama de
fases, se os mesmos são biocompatíveis e bioativos. Comparando-se as
concentrações dos elementos químicos nas amostras empregadas neste trabalho
com os dados de Strnad (1992) pode-se teorizar que as três amostras são bioativas
e biocompatíveis.
Ainda em relação à degradação dos biomateriais, Holzhausen et al.
(2002) afirmam que a fase cristalina também é uma característica química que pode
influenciá-la. Sendo que materiais não cristalinos apresentam degradação mais
rápida. Partindo-se do fato dos três materiais estudados nesta pesquisa serem não
cristalinos e apresentar basicamente a mesma composição química, o Biovidro-
UEPG seria mais rapidamente degradado, por apresentar as partículas menores.
Discussão
94
Rosengren et al. (2003) afirmam que a composição química,
processo de dissolução, grau de cristalização, hidrofobicidade, característica e
reatividade de superfície dos biovidros são fatores que podem influenciar na
adsorção de proteínas nestes materiais e conseqüentemente influenciar no
comportamento biológicos dos mesmos.
Partindo do fato de que segundo os testes físico-químicos os
materiais apresentaram potencial de serem bioativos e biocompatíveis realizou-se o
teste de biocompatibilidade em ratos. Esses testes têm por objetivo a avaliação de
materiais experimentais, permitindo assim sua segurança de aplicação clínica em
seres humanos. (COSTA, 2001).
O protocolo para testes de biocompatibilidade recomenda que esse
seja executado no tecido subcutâneo de ratos através da implantação do material
em tubos de polietileno. (COSTA, 2001). O propósito da utilização destes tubos é
determinar a localização do material a ser analisado. Tal fato é relevante quando se
avaliam materiais pastosos ou géis, que poderiam ser espalhados no tecido do
animal, não sendo possível precisar se o local avaliado é realmente o que recebeu o
tratamento. Todavia, a localização de materiais granulares parcialmente degradáveis
é facilmente determinada, como se observou no estudo piloto e na execução desta
pesquisa. Além deste fato, a introdução dos materiais em tubos de polietileno
permitiria a avaliação da resposta tecidual frente à implantação dos materiais, mas
não o comportamento das partículas frente ao tecido que foi implantado, como
degradação e formação de fissuras. Portanto, neste trabalho preferiu-se implantar os
materiais diretamente no tecido subcutâneo, sem auxílio dos tubos. Trabalhos como
os de Greghi e Campos Júnior (1994), Macedo et al. (1995) e Pollick et al. (1995)
também não utilizaram o tubo de polietileno ao avaliarem biocompatibilidade de
Discussão
95
biomateriais em tecido subcutâneo. Da mesma forma que Sanada et al. (2003) ao
avaliar biocompatibilidade, em tecido muscular. Contrariamente, Pescinini (1995) e
Carvalho (2000) empregaram o tubo de polietileno em sua metodologia. Convém
salientar que ambos trabalhos avaliaram materiais pastosos que poderiam se
espalhar pelos tecidos.
Como já salientado, através da implantação do material no tecido
subcutâneo dos ratos avaliou-se o tamanho da reação inflamatória, o tamanho dos
grânulos e a contagem de PMN, MN e F. Em relação ao tamanho da reação
inflamatória observou-se uma diminuição nos grupos do Biogran
®
e Perioglas
®
até
os quinze dias e um aumento posterior, que pode ser explicada pelo provável
tratamento superficial ocorrido nestas partículas (observado no MEV com aumento
de 5000x). Assim, esse tratamento superficial poderia ter influenciado a resposta
inflamatória. Possivelmente, a partir de quinze dias o organismo dos animais
modificou e/ou eliminou as alterações causadas por este tratamento e a reação
inflamatória aumentou.
Partindo-se do fato de que as três amostras apresentaram em sua
composição os mesmos elementos químicos e basicamente as mesmas
concentrações, poderíamos sugerir que a resposta inflamatória esta na dependência
de outros fatores como tamanho dos grânulos, morfologia, características
superficiais e uniformidade das partículas. Concordando com Alizadeh e
Marghussian (2002), Al Ruhaimi (2001), Amaral et al. (2002), Costa et al. (2003),
Granjeiro et al. (1992), Greghi e Campos Júnior (1994), Holzhausen et al. (2002),
Kaufmann et al. (2000), Macedo et al. (1995), Oliveira et al. (1993), Silver; Deas;
Erecinska (2001), Strnad (1992), Wheeler et al. (1997) e (1998). Novamente é válido
salientar que o Biovidro-UEPG apresentou-se como partículas menores e não
Discussão
96
uniformes, enquanto o PerioGlas
®
e Biogran
®
apresentaram-se com provável
tratamento de superfície. Schepers et al. (1998) afirmaram que a resposta
inflamatória causada pela degradação de partículas de biovidro menores impede a
estimulação de células osteoprogenitoras em contato com as partículas maiores.
Acrescenta-se o trabalho de Rosengren et al. (2003) que afirmam que os biovidros
têm potencial de sofrerem adsorção por diferentes glicoproteínas e proteoglicanas e
em variadas composições, as quais poderiam interferir na resposta inflamatória.
Os resultados da contagem de PMN mostraram não haver diferença
significativa entre os biovidros, havendo apenas diferença significativa (p<0,001)
entre os materiais e o grupo controle. A contagem de F não apresentou diferença
significativa entre os grupos (p=0,131) e interação (0,665), havendo apenas entre os
tempos (p=0,008). Por sua vez, a contagem de MN não apresentou diferença
significativa (p=0,117) entre os grupos, incluindo controle, havendo diferença apenas
entre os tempos (p<0,001) e interação (p=0,022). Partindo-se do fato de que o
PerioGlas
®
e o Biogran
®
vem sendo utilizados com êxito como substitutos ósseos
em procedimentos clínicos (FROUM et al., 1998; LOVELACE et al., 1998;
SCHEPERS et al., 1993; STVRTECKY et al., 2003; ZAMET et al., 1997), não haver
diferença significativa na contagem de células inflamatórias e fibroblastos entre estes
dois materiais disponíveis comercialmente e o Biovidro-UEPG é um fator bem
favorável para este biomaterial em fase experimental.
Costa (2001) afirma que a interpretação dos resultados de
biocompatibilidade deve ser feita de acordo com a evolução do quadro reacional,
podendo ser considerada aceitável ou não aceitável. Sendo não aceitável quando a
reação aos 60 dias apresenta-se moderada ou intensa, mesmo estando discreta ou
insignificante aos sete dias. Por sua vez, a reação é aceitável quando se encontra
Discussão
97
insignificante ou discreta aos sessenta dias, seja insignificante/discreta desde os
períodos iniciais, ou estando moderada/intensa e reduzindo posteriormente. A
interpretação dos resultados histomorfométricos de tamanho da reação inflamatória
deste trabalho mostram que apesar de ter havido diferença significativa entre os
grupos (p<0,001), os três biomateriais apresentaram resposta inflamatória aceitável,
mostrando serem biocompatíveis.
Os resultados observados nos estudos revisados neste trabalho
mostraram que as partículas de biovidro são bem toleradas pelos tecidos, induzindo
reação inflamatória transitória. (AL RUHAIMI, 2001; CANCIAN, 1998; FETNER et al.,
1994; FURUSAWA; MIZUNUMA, 1997; FURUSAWA et al., 1998; HALL, 1999;
JOHNSON, 1997; KARATZAS et al., 1999; SANTOS, 2000; SCHEPERS, 1991;
SCHEPERS et al., 1998; TURUNEN et al., 1997; VOGEL et al., 2001; WHEELER et
al., 1997; 1998). Concordando com os achados do presente estudo.
Em relação ao tamanho dos grânulos houve diferença significativa
(p<0,001) entre todos os grupos. Sendo que em todos os tempos o tamanho médio
das partículas foi maior no grupo do Biogran
®
, seguido pelo PerioGlas
®
e Biovidro-
UEPG. O tamanho médio das partículas de Biogran
®
e PerioGlas
®
diminuíram desde
sete até sessenta dias. Houve um aumento do tamanho médio dos grânulos de
Biovidro-UEPG de sete até quinze dias e posteriormente uma redução dos mesmos,
provavelmente pelo fato das partículas menores serem degradadas mais
rapidamente que as maiores, concordando com Holzhausen et al. (2002). Assim,
provavelmente ocorreu degradação completa das partículas menores entre sete e
quinze dias, fazendo com que em quinze dias o tamanho médio dos grânulos fosse
maior do que em sete. Após quinze dias as partículas menores já haviam sido
completamente degradadas. Então a degradação dos grânulos remanescentes
Discussão
98
culminou com diminuição do tamanho médio das partículas. Trabalhos como os
Cancian (1998), Fetner et al. (1994), Furusawa e Mizunuma (1997), Furusawa et al.
(1998), Hall et al. (1999), Johnson et al. (1997), Schepers et al. (1991), Schmitt et al.
(1997), Turunen et al. (1997), VogeL et al. (2001), Wheeler et al. (1997) e (1998)
mostraram que as partículas de biovidros tendem a ser parcialmente degradadas.
Resultados similares aos encontrados em nossa pesquisa. Greghi e Campos Júnior
(1994) afirmam que o tamanho das partículas de biomaterial pode influenciar a
biocompatibilidade dos mesmos.
Quando os vidros bioativos são colocados no interior de tecidos
vivos ocorre o aparecimento de fissuras nos grânulos atingindo o centro dos cristais,
como observado por Cancian (1998), Furusawa; Mizunuma (1997), Furusawa et al.
(1998) e Santos (2000). Essa dissolução das partículas forma um arcabouço de
cálcio fosfato, liberando um gel rico em sílica, que Furusawa; Mizunuma (1997) e
Furusawa et al. (1998) sugerem ter propriedades de atrair células osteogênicas.
Utilizando defeitos ósseos criados em rebordo de cães como modelo experimental
Schepers et al. (1991) verificaram que muitas partículas de Biogran
®
apresentaram-
se com erosão internamente através de pequenas crateras. Nestas crateras centrais
foi detectado tecido ósseo neoformado com ausência de comunicação com o tecido
ósseo externo. Concordando com a literatura citada, em nossa pesquisa verificou-se
a presença de fissuras nas partículas a partir de quinze dias, para os três biovidros.
Em estágios tardios houve aumento do número e do tamanho destas fissuras e as
mesmas estavam preenchidas por tecido conjuntivo, similar ao que envolvia os
grânulos.
Outra importante propriedade dos biovidros, com composição similar
aos testados neste trabalho, é que quando expostos a soluções fisiológicas, ou
Discussão
99
fluidos corporais eles perdem íons sódio para o meio e formam uma camada
superficial rica em óxido de sílica, o que provoca a formação de uma camada de gel
de fosfato de cálcio, inicialmente amorfo e gradualmente evolui para uma camada
policristalina de hidroxiapatita, comprovado por Costa et al. (2003), Furusawa;
Mizunuma (1997), Johnson et al. (1999), Kaufmann et al. (2000), Schepers et al.
(1991) e Strnad (1992). Rosengren et al. (2003) afirmam que esta camada é
importante para a adsorção de glicoproteínas na superfície dos biovidros, mas ainda
não se sabe exatamente como influencia o reparo ósseo. Além da formação de
hidroxiapatita externa, outro fenômeno observado nos biovidros quando imersos em
fluidos teciduais é a transformação de sílica solúvel em sílica ácida e conseqüente
alcalinização externa; que segundo Silver; Deas; Erecinska (2001) pode influenciar o
metabolismo celular, a atividade de enzimas intracelulares, promover síntese de
colágeno, formação de hidroxiapatita e influenciar a atividade de enzimas
intracelulares. Essas mudanças no pH destes materiais podem trazer
conseqüências, até mesmo, nos potenciais benéficos do uso dos biovidros.
(SILVER; DEAS; ERECINSKA 2001). Allan et al. (2001) comprovaram esta
alcalinização ao avaliarem o efeito antibacteriano de partículas de Bioglass® em
bactérias supra e subgengival. Os autores observaram efeito antibacteriano das
partículas. Contudo, não é possível concluir que esta atividade bacteriana dependa
exclusivamente do aumento do pH.
Considerando-se as características físico-químicas e a
biocompatibilidade dos biovidros, com mesma formulação analisada neste trabalho,
pode-se afirmar que estes materiais têm futuro promissor como substitutos ósseos
na área médico-odontológica. Havendo ainda a vantagem de ser prontamente
disponível, apresentar composição química compatível com o tecido ósseo, ser de
Discussão
100
fácil manipulação, parcialmente degradado, não apresentar potencial de transmissão
de doenças infecto-contagiosas e priônicas, dispensar um procedimento cirúrgico
adicional e todos os inconvenientes que o acompanham.
Conclusão
101
7 CONCLUSÃO
Os três materiais testados apresentaram características físico-químicas
compatíveis com biocompatibilidade e bioatividade;
Através da análise da implantação dos materiais no tecido subcutâneo de
ratos os três materiais mostraram-se biocompatíveis e bioabsorvíveis, sem
indicio de capacidade osteoindutora;
Apesar de haver diferença estatisticamente significativa no tamanho dos
grânulos dos três materiais, sendo o Biovidro-UEPG menor, seguido do
PerioGlas
®
e Biogran
®
, todos se mostraram biocompatíveis.
Referências
102
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Odontologia) Faculdade de Odontologia, Universidade de São Paulo.
Apêndice
107
Tabela 16- Tamanho dos grânulos (µm) previamente à implantação.
PerioGlas
®
Biovidro UEPG
Biogran
®
173,10 53,72 305,09
175,20 126,37 317,87
181,10 141,43 349,81
181,10 164,32 395,96
189,70 174,35 423,26
193,26 177,61 514,69
197,24 181,63 317,87
205,08 100,54 372,89
205,08 110,73 468,97
212,41 111,25 384,45
217,24 116,99
223,64 119,74
229,30 121,44
231,63 125,46
233,24 61,45
242,55 66,36
245,12 67,12
277,98 68,00
295,90 92,67
325,87 92,87
95,45
97,15
65,49
72,36
73,21
75,36
77,10
82,14
82,26
91,47
Apêndice
108
Tabela 17- Média do tamanho da reação inflamatória (µm) em sete dias de pós-operatório.
Lâmina
PerioGlas
®
Biovidro UEPG
Biogran
®
Controle
(não preenchido)
1 200 94 110 100
2 110 100 80 100
3 90 50 80 100
4 104 130 90 100
5 46 104 184 100
6 54 226 116 100
7 80 182 70 100
8 120 178 154 100
Tabela 18- Média do tamanho da reação inflamatória (µm) em quinze dias de pós-operatório.
Lâmina
PerioGlas
®
Biovidro UEPG
Biogran
®
Controle
(não preenchido)
1 38 320 98 100
2 30 300 70 100
3 18 180 100 100
4 24 170 44 50
5 14 210 98 50
6 26 80 106 100
7 14 210 78 100
8 22 180 42 100
Tabela 19- Média do tamanho da reação inflamatória (µm) em vinte e um dias de pós-operatório.
Lâmina
PerioGlas
®
Biovidro UEPG
Biogran
®
Controle
(não preenchido)
1 100 222 110 100
2 154 230 108 100
3 10 180 40 100
4 40 100 35 100
5 38 110 124 100
6 44 140 120 50
7 30 108 120 100
8 126 160 140 50
Apêndice
109
Tabela 20- Média do tamanho da reação inflamatória (µm) em quarenta e cinco dias de pós-
operatório.
Lâmina
PerioGlas
®
Biovidro UEPG
Biogran
®
Controle
(não preenchido)
1 290 140 54 100
2 190 154 80 100
3 210 164 134 100
4 190 132 96 100
5 84 80 170 100
6 94 80 100 100
7 70 184 154 100
8 120 158 308 100
Tabela 21- Média do tamanho da reação inflamatória (µm) em sessenta dias de pós-operatório.
Lâmina
PerioGlas
®
Biovidro UEPG
Biogran
®
Controle
(não preenchido)
1 46 48 214 50
2 74 144 128 50
3 100 68 88 100
4 86 134 84 50
5 66 134 120 50
6 70 48 140 50
7 84 144 104 50
8 76 100 134 50
Tabela 22- Média da contagem de PMN, MN e F presentes na região de intervenção em sete dias de
pós-operatório.
PerioGlas
®
Biovidro UEPG
Biogran
®
Controle
PMN MN F PMN MN F PMN MN F PMN MN F
1 25 64 3 21 18 3 18 20 0 13 15
2 17 43 4 23 24 2 16 22 0 12 18
4 45 22 4 16 23 2 17 11 0 9 20
3 12 23 3 17 24 1 14 14 0 6 14
2 18 21 6 30 21 2 25 28 0 7 22
Apêndice
110
Tabela 23- Média da contagem de PMN, MN e F presentes na região de intervenção em quinze dias
de pós-operatório.
PerioGlas
®
Biovidro UEPG
Biogran
®
Controle
PMN MN F PMN MN F PMN MN F PMN MN F
0 16 14 3 13 42 1 4 14 0 2 7
3 21 17 4 23 14 4 10 13 1 2 10
6 12 14 0 29 26 3 7 11 1 4 9
1 11 14 2 14 45 3 5 10 0 5 11
1 23 23 2 16 22 2 4 18 0 2 8
Tabela 24- Média da contagem de PMN, MN e F presentes na região de intervenção em vinte e um
dias de pós-operatório.
PerioGlas
®
Biovidro UEPG
Biogran
®
Controle
PMN MN F PMN MN F PMN MN F PMN MN F
4 5 11 5 5 15 5 6 13 0 0 0
3 3 12 5 14 5 10 10 25 1 0 5
3 4 12 4 6 7 5 6 20 0 4 10
2 3 25 6 7 12 7 8 21 0 3 11
8 2 9 2 6 18 7 4 13 1 4 8
Tabela 25- Média da contagem de PMN, MN e F presentes na região de intervenção em quarenta e
cinco dias de pós-operatório.
PerioGlas
®
Biovidro UEPG
Biogran
®
Controle
PMN MN F PMN MN F PMN MN F PMN MN F
6 3 11 6 2 13 2 5 12 0 0 0
3 6 18 6 3 28 2 5 8 0 5 4
5 5 15 5 2 13 1 2 15 0 5 9
2 5 18 5 4 13 6 5 12 0 0 3
5 3 10 6 6 13 3 4 18 0 0 7
Apêndice
111
Tabela 26- Média da contagem de PMN, MN e F presentes na região de intervenção em sessenta
dias de pós-operatório.
PerioGlas
®
Biovidro UEPG
Biogran
®
Controle
PMN MN F PMN MN F PMN MN F PMN MN F
3 10 12 5 2 20 1 7 8 0 1 1
2 6 17 5 1 37 1 4 20 1 1 5
3 4 26 6 2 28 2 6 8 0 0 4
1 4 7 7 1 26 2 2 16 0 1 4
1 3 15 6 2 31 1 1 8 0 0 4
Apêndice
112
Tabela 27- Mensuração do tamanho (µm) dos grânulos em sete dias de pós-operatório.
Lâmina
PerioGlas
®
Biovidro UEPG
Biogran
®
360 130 430
280 120 400
250 70 300
130 200 620
1
210 200 400
média 246 144 430
400 120 280
340 90 360
620 210 450
340 130 430
2
240 70 400
média 388 124 384
400 150 450
300 200 350
210 180 460
280 180 520
3
170 60 280
média 272 154 412
300 70 330
470 130 420
220 150 640
280 100 290
4
150 30 450
média 284 96 426
400 200 420
300 200 380
280 300 390
200 220 600
5
360 130 420
média 308 210 442
Apêndice
113
Tabela 28- Mensuração do tamanho (µm) dos grânulos em quinze dias de pós-operatório.
Lâmina
PerioGlas
®
Biovidro UEPG
Biogran
®
450 170 420
550 200 370
350 350 420
150 230 550
1
200 180 350
média 340 223 422
560 180 350
430 300 220
170 80 350
400 170 320
2
100 320 200
média 332 210 288
200 200 420
400 190 450
50 300 430
200 270 400
3
450 310 300
média 260 254 400
380 160 550
410 240 320
410 130 400
530 110 330
4
60 90 750
média 358 146 470
310 250 420
120 370 470
180 170 230
130 290 330
5
300 180 500
média 208 252 390
Apêndice
114
Tabela 29- Mensuração do tamanho (µm) dos grânulos em vinte e um dias de pós-operatório.
Lâmina
PerioGlas
®
Biovidro UEPG
Biogran
®
380 250 460
420 310 320
300 330 440
200 210 440
1
200 330 200
média 300 286 372
320 300 530
430 100 230
500 120 420
200 80 470
2
140 200 400
média 318 160 410
350 230 310
100 150 230
320 180 230
140 220 360
3
320 250 300
média 246 206 286
280 270 380
240 100 550
260 200 530
220 180 280
4
300 110 210
média 260 172 390
250 160 490
280 100 400
210 230 350
120 330 250
5
250 250 450
média 222 214 388
Apêndice
115
Tabela 30- Mensuração do tamanho (µm) dos grânulos em quarenta e cinco dias de pós-operatório.
Lâmina
PerioGlas
®
Biovidro UEPG
Biogran
®
300 230 450
220 270 210
320 230 470
130 130 160
1
150 250 160
média 220 222 260
170 110 430
180 120 430
250 180 150
230 120 370
2
400 100 450
média 246 126 366
200 110 500
170 180 350
300 100 400
180 250 160
3
300 130 210
média 230 154 324
450 270 150
320 110 320
280 100 250
200 180 300
4
150 120 80
média 280 156 220
450 100 420
130 130 350
90 270 180
250 230 100
5
250 120 260
média 234 170 262
Apêndice
116
Tabela 31- Mensuração do tamanho (µm) dos grânulos em sessenta dias de pós-operatório.
Lâmina
PerioGlas
®
Biovidro UEPG
Biogran
®
300 150 330
320 120 280
200 250 400
210 110 350
1
290 150 120
média 264 156 296
160 190 160
320 200 240
170 80 130
160 230 300
2
320 180 250
média 226 176 216
210 160 450
180 170 150
200 50 230
300 60 190
3
60 160 250
média 190 120 254
530 50 230
430 70 250
370 150 480
120 120 470
4
110 250 400
média 312 128 366
150 70 100
100 160 340
70 190 310
560 200 110
5
180 230 300
média 212 170 232
Apêndice
117
Tabela 32- Teste de normalidade - Tamanho dos grânulos previamente à implantação.
Tabela 33- Teste de normalidade - Tamanho da reação inflamatória (valores transformados log).
Tabela 34- Teste de normalidade - Contagem de PMN (valores transformados em percentagens).
Kolmogorov-Smirnov
Grupos
Estatística Graus de liberdade Valor p
PerioGlas
®
0,207 25 0,007
Biovidro UEPG
0,125 25 0,200
Controle
0,471 25 <0,001
Biogran
®
0,113 25 0,200
Tabela 35- Teste de normalidade - Contagem de MN (valores transformados em percentagens).
Kolmogorov-Smirnov
Grupos
Estatística Graus de liberdade Valor p
PerioGlas
®
0,139 25 0,200
Biovidro UEPG
0,142 25 0,200
Controle
0,178 25 0,039
Biogran
®
0,152 25 0,141
Kolmogorov-Smirnov
Grupos
Estatística Graus de liberdade Valor p
PerioGlas
®
0,141 20 0,200
Biovidro UEPG
0,129 30 0,200
Biogran
®
0,137 10 0,200
Kolmogorov-Smirnov
Grupos
Estatística Graus de liberdade Valor p
PerioGlas
®
0,122 40 0,134
Biovidro UEPG
0,138 40 0,053
Controle
0,466 40 <0,001
Biogran
®
0,109 40 0,200
Apêndice
118
Tabela 36- Teste de normalidade - Contagem de F (valores transformados em percentagens).
Kolmogorov-Smirnov
Grupos
Estatística Graus de liberdade Valor p
PerioGlas
®
0,091 25 0,200
Biovidro UEPG
0,120 25 0,200
Controle
0,198 25 0,013
Biogran
®
0,231 25 0,001
Tabela 37- Teste de normalidade - Tamanho dos grânulos.
Kolmogorov-Smirnov
Tempo (dias)
Estatística Graus de liberdade Valor p
7
0,184 15 0,182
15
0,148 15 0,200
21
0,133 15 0,200
45
0,163 15 0,200
60 dias
0,105 15 0,200
Tabela 38- Teste Levene para equivalência de variância - Tamanho dos grânulos previamente à
implantação.
F Graus de liberdade 1 Graus de liberdade 2 Valor p
3,110 2 57 0,052
Tabela 39- Anova (um critério) - Tamanho dos grânulos previamente à implantação.
Causas de
variação
Soma dos
quadrados
Graus de
liberdade
Quadrados
médios
F Valor de p
Tratamentos 628811,0 2 314405,481 160,469 < 0,001*
Resíduos 111679,8 57 1959,294
Total 740490,7 59
* Diferenças significativas
Tabela 40- Teste Levene para equivalência de variância - Tamanho da reação inflamatória (valores
transformados log).
F Graus de liberdade 1 Graus de liberdade 2 Valor p
2,956 19 140 <0,001
Apêndice
119
Tabela 41- Anova (dois critérios) - Tamanho da reação inflamatória (valores transformados em log).
Causas de
variação
Soma dos
quadrados
Graus de
liberdade
Quadrados
médios
F Valor de p
Grupos 14,178 3 4,726 22,943 < 0,001*
Tempos 6,450 4 1,613 7,828 < 0,001*
Grupos x Tempo 15,293 12 1,274 6,187 < 0,001*
Tratamentos 35,921
a
19 1,891 9,178 < 0,001*
Resíduo 28,839 140 0,206
Total 64,760 159
* Diferenças significativas
Apêndice
120
Tabela 42- ANOVA (dois critérios) - Contagem de PMN (valores transformados em percentagens).
Causas de
variação
Soma dos
quadrados
Graus de
liberdade
Quadrados
médios
F Valor de p
Grupos 2260,373 3 753,458 22,952 < 0,001*
Tempos 2001,677 4 500,419 15,244 < 0,001*
Grupos x Tempo 1136,416 12 94,701 2,885 < 0,001*
Tratamentos 5398,466 19 284,130 8,655 < 0,001*
Resíduo 2626,231 80 32,828
Total 8024,696 99
* Diferenças significativas
Tabela 43- Teste Levene para equivalência de variância - Contagem de PMN (valores transformados
em percentagens).
F Graus de liberdade 1 Graus de liberdade 2 Valor p
2,309 19 80 0,005
Tabela 44- ANOVA (dois critérios) - Contagem de MN (valores transformados em percentagens).
Causas de
variação
Soma dos
quadrados
Graus de
liberdade
Quadrados
médios
F Valor de p
Grupos 882,135 3 294,045 2,025 0,117
Tempos 9007,318 4 2251,830 15,507 < 0,001*
Grupos x Tempo 3766,524 12 313,877 2,161 0,022*
Tratamentos 13,655,977 19 718,736 4,949 < 0,001*
Resíduo 11617,308 80 145,216
Total 25273,285 99
* Diferenças significativas
Tabela 45- Teste Levene para equivalência de variância - Contagem de MN (valores transformados
em percentagens).
F Graus de liberdade 1 Graus de liberdade 2 Valor p
4,318 19 80 <0,001
Apêndice
121
Tabela 46- ANOVA (dois critérios) - Contagem de F (valores transformados em percentagens).
Causas de
variação
Soma dos
quadrados
Graus de
liberdade
Quadrados
médios
F Valor de p
Grupos 1695,602 3 565,201 1,935 0,131
Tempos 4349,829 4 1087,457 3,723 0,008*
Grupos x Tempo 2748,299 12 229,025 0,784 0,665
Tratamentos 374802,309 1 374802,309 1283,264 < 0,001*
Resíduo 23365,559 80 292,069
Total
* Diferenças significativas
Tabela 47- Teste Levene para equivalência de variância - Contagem de F (valores transformados em
percentagens).
F Graus de liberdade 1 Graus de liberdade 2 Valor p
2,979 19 80 <0,001
Tabela 48- Teste Levene para equivalência de variância - Tamanho dos grânulos.
F Graus de liberdade 1 Graus de liberdade 2 Valor p
0,883 14 60 0,581
Apêndice
122
Prancha 9: Gráficos de coeficiente de correlação intra-classe.
0,00 20000,00 40000,00 60000,00 80000,00 100000,00 120000,00
Médias das medidas
-500,00
0,00
500,00
1000,00
1500,00
2000,00
D
i
f
e
r
en
ças
e
n
t
r
e
a
s
m
ed
i
d
as
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
Gráfico 9.1
100,00 200,00 300,00 400,00
Médias das medidas
-1,00
-0,50
0,00
0,50
1,00
D
i
f
e
r
e
n
ç
a
s
e
n
t
r
e
a
s
m
e
d
i
d
a
s
WWWWWWWWWWWWWWWWWWW W
Gráfico 9.2
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00
Médias das contagens
-0,30
-0,15
0,00
0,15
0,30
D
i
f
e
r
e
n
ç
a
s
e
n
t
r
e
a
s
c
o
n
t
a
g
e
n
s
W
W
WWWW
W
W
W
W
W
WWWWWWWWWWW
W
WWW WWW
W
WWW
Gráfico 9.3
100,00 200,00 300,00 400,00
Médias das medidas
-1,00
-0,50
0,00
0,50
1,00
D
i
f
e
r
e
n
ç
a
s
e
n
t
r
e
a
s
m
e
d
i
d
a
s
WWWWWWWWWWWWWWWWWWW W
Gráfico 9.4
Gráfico 9.1- Reprodutibilidade dos dados de tamanho dos grânulos (µm), obtidos em duas análises
feitas em dois momentos distintos (48h) - Coeficiente de correlação intraclasse.
Gráfico 9.2- Reprodutibilidade dos dados de tamanho da reação inflamatória (µm), obtidos em duas
análises feitas em dois momentos distintos (48h) - Coeficiente de correlação intraclasse.
Gráfico 9.3- Reprodutibilidade dos dados de contagem de células, obtidos em duas análises feitas
em dois momentos distintos (48h) - Coeficiente de correlação intraclasse.
Gráfico 9.4- Reprodutibilidade dos dados de tamanho dos grânulos (µm) após implantação nos
animais, obtidos em duas análises feitas em dois momentos distintos (48h) - Coeficiente
de correlação intraclasse.
α =0,99
α =0,99
α =1
α =1
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