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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA – MESTRADO
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: CLÍNICA INTEGRADA
PROTÁSIO VARGAS NETO
AÇÃO ANTIFÚNGICA DE PLANTAS MEDICINAIS E DA PRÓPOLIS FRENTE A
LEVEDURAS DO GÊNERO Candida ISOLADAS DA CAVIDADE BUCAL
PONTA GROSSA
2004
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PROTÁSIO VARGAS NETO
AÇÃO ANTIFÚNGICA DE PLANTAS MEDICINAIS E DA PRÓPOLIS FRENTE A
LEVEDURAS DO GÊNERO Candida, ISOLADAS DA CAVIDADE BUCAL
PONTA GROSSA
2004
Dissertação apresentada à Universidade Estadual de
Ponta Grossa para obtenção do título de mestre no
Curso de Mestrado em Odontologia - Área de
Concentração em Clínica Integrada.
Orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Elizabete Brasil dos Santos.
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Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca
Central da UEPG
Vargas Neto, Protásio
V297 Ação antifúngica de plantas medicinais e da
própólis
frente a leveduras do gênero candida, isoladas da
cavidade
bucal. / Protásio Vargas Neto. Ponta Grossa, 2004.
98f.; il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual de PontaGrossa.
Orientadora : Prof
a
.. Dr
a
Elizabete Brasil dos Santos
1-Plantas medicinais. 2-Candida, 3- própolis, 4- Cavidade
bucal.
I. T.
CDD :
616.969
TERMO DE APROVAÇÃO
PROTÁSIO VARGAS NETO
AÇÃO ANTIFÚNGICA DE PLANTAS MEDICINAIS E DA PRÓPOLIS FRENTE A
LEVEDURAS DO GÊNERO Candida, ISOLADAS DA CAVIDADE BUCAL
Dissertação apresentada para obtenção do título de mestre à Universidade Estadual de Ponta
Grossa, Mestrado em Odontologia - Área de concentração em Clínica Integrada.
Ponta Grossa, 29 de julho de 2004.
Prof
a
. Dr
a
. Elizabete Brasil dos Santos – Orientadora
Universidade Estadual de Ponta Grossa
Profª. Drª.Terezinha Inês Svidzinski
Universidade Estadual de Maringá
Prof. Dr. Luís Antônio Esmerino
Universidade Estadual de Ponta Grossa
A Vocês que me incentivaram e apoiaram
desde o início, Maria Angela (esposa),
Daniella e Felippe (filhos), o meu amor..
AGRADECIMENTOS
A Professora Doutora Elizabete Brasil dos Santos, que com seu grande
conhecimento, compreensão e boa vontade dedicou-se à orientação deste trabalho.
Não somente sua competência mas também sua figura humana nos ajudaram muito.
Ao Professor Doutor João Carlos Gomes, cujo incentivo e amizade sempre
estiveram presentes quando precisamos.
Ao Professor Doutor Fábio André dos Santos, quando algumas situações pareceram
insolúveis, sua competência e compreensão das dificuldades sempre nos ajudaram.
OUTROS AGRADECIMENTOS
Ao Pró-Reitor de Administração Dr. Carlos Luciano Sant’Ana Vargas, por sua
colaboração sempre que necessária.
A você Elaine Cristina de Souza, que muito fez para este trabalho.
Aos funcionários Morgana das Graças Procz dos Santos e Celso Bilynkievycz dos
Santos , sempre prontos a ajudar.
Ao Doutor Mario de Montemor, sua ajuda nos foi muito importante.
A Mestre Maria Luzia Fernandes Bertholino, Diretora da BICEN, que usou de suas
horas de lazer para nos auxiliar.
Ao chefe da DIMAPA José Vinícius Volpi, resolvendo as situações complicadas com
amizade e presteza.
Aqueles que comigo fizeram este Mestrado mais que colegas, se tornaram amigos:
Andréa Maria de Sousa, Ariadne Cristiane Cabral da Cruz, Leyla Antoinette Delgado
Cotrina, Adriana de Oliveira Silva, Adriana Postiglione Bührer Samra, Ana Cláudia
Rodrigues Chibinski, Flávia Tanaka, Carlos Antonio Pelissari, Douglas Augusto
Roderjan, Milko Javier Villarroel Cortés, João Paulo Filgueiras Ribeiro, Edison do
Rocio Meister e Alfredo Adimari Júnior.
RESUMO
A Candidose é uma infecção de ocorrência comum na cavidade bucal, conseqüência
de parasitismo temporário por leveduras do gênero Candida. Nesta pesquisa, foram
coletadas amostras de saliva de 86 pacientes, 40 do sexo masculino e 46 do sexo
feminino, com idade entre 18 e 82 anos, sem candidose clinicamente visível. Destes
86 pacientes 38 (44,18%) foram positivos para Candida, sendo 20 (23,25%) homens
e 18 (20,93%) mulheres. Foram isoladas 38 amostras de 6 espécies, 18
caracterizadas como C. albicans, 13 C. tropicalis, 3 C. parapsilosis, 2 C.
guilliermondii, 1 C. krusei e C. kerfyr. Foi avaliada a sensibilidade destas cepas de
Candida frente a três fitoterápicos; Anacardium occidentale, Arctium lappa, Plantago
major e o produto natural própolis, através de dois testes in vitro e dois in vivo. Os
testes in vitro foram o teste de difusão em agar e o teste em tubo de ensaio para
determinar o número de células sensíveis aos extratos. Os testes in vivo foram de
recuperação de Candida da boca de ratos e desenvolvimento de candidose na
língua de ratos. Como comparação foram também realizados dois testes de
sensibilidade aos antifúngicos comerciais, o teste de difusão em ágar com discos
impregnados em antifúngicos da Cecon Ltda (antifungigrama) e o teste da ATB
Fungus (bioMérieux). Os resultados mostraram uma efetiva ação da própolis tanto
nos testes in vivo quanto in vitro. O fitoterápico mais efetivo frente às amostras de
Candida foi o cajueiro. A bardana e a tanchagem apresentaram menor ação sobre
as leveduras e não mostraram diferenças significativas entre si.
Palavras-chave: plantas medicinais, Candida, cavidade bucal, própolis
ABSTRACT
Candidosis is a current intraoral infection, resulting from temporary parasitism of
Candida, mostly C. albicans. The use of phytotherapics for prevention and control of
candidosis is not well stablished. The presence of Candida was determined in the
oral cavity of 86 patients, 40 males and 46 females, aging from 18 to 82 yars, without
clinical signs of candidosis by plating saliva samples on sabouraud dextrose.
Candida was found in 38 (44,18%) individuals, 20 (23,25%) male and 18 (20,93%)
female. From 38 samples, 18 were C. albicans, 13 C. tropicalis, 3 C. parapsilosis, 2
C. guilliermondii, 1 C. Krusei and 1 C. kerfyr. The sensitivity of these Candida
isolates were evaluated throught three phytotherapics, Anacardium occidentale,
Arctium lappa, Plantago major and the natural product propolis. The sensitivity of the
yeasts was demonstrated in vitro, using a test of diffusion in agar and a test in tube to
determine the number of yeasts killed by the phytotherapics and in vivo by the
recovery of Candida from the oral cavity of rats treated with them and by the
induction of candidosis in the rat´s tongue. As a comparison, tests with two types of
commercial antifungal agents were performed. The results showed an effective
action of propolis in both in vivo and in vitro tests. The most effetive phytotherapic
was the cajueiro (Anacardium occidentale). Bardana (Arctium lappa) and tanchagem
(Plantago major) showed less effetiveness without statistical significance.
Key-words: phytotherapics, oral cavity, Candida, propolis
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Anacardium occidentale (cajueiro)................................................. 34
Figura 2 - Arctium lappa (bardana)................................................................ 34
Figura 3 - Plantago major (tanchagem).......................................................... 34
Figura 4 - Própolis bruta................................................................................ 34
Figura 5 - Extratos de cajueiro, bardana, tanchagem e própolis de uso
comercial, utilizados no experimento............................................ 40
Figura 6 - A -Inoculação de C. albicans na cavidade bucal dos ratos; B-
Transferência do "swab" para o tubo de ensaio contendo
solução fisiológica, após recuperação da levedura; C- Diluição
da amostra; D- Semeadura em ágar Sabouraud Dextrose; E -
contagem do número e ufc/mL de C. albicans recuperado da
cavidade bucal dos animais.......................................................... 44
Figura 7 - Antifúngicos comerciais utilizados no experimento do teste de
difusão em ágar............................................................................. 47
Figura 8 - Sistema ATB FUNGUS - A- ATB - MÉDIUM: meio de preparo da
suspensão de Candida; B -ATB - BUFFER: solução tampão; C -
Galeria de antifúngicos em diferentes concentrações................... 48
Figura 9 - Sistema ATB FUNGUS: Pipetador automático e densitômetro
para padronização da suspensão de Candida.............................. 49
Figura 10 - Sistema ATB FUNGUS : Leitor da galeria de antibióticos e
software (bioMeriéux) para o teste................................................ 49
Figura 11 - Halo de inibição de crescimento produzido pela própolis frente a
amostra de C. albicans.................................................................. 56
Figura 12 - Halos de inibição produzidos pelos extratos de cajueiro,
bardana, tanchagem e própolis frente à amostra de C. albicans
(A) e C. parapsilosis (B)................................................................. 57
Figura 13 - Efeito bactericida sobre C. albicans após 10 minutos em contato
com os extratos de cajueiro (A) bardana (B), tanchagem (C) e
própolis (D), quando comparados com o controle (E)................... 58
Figura 14 - Área de candidose observada na região das papilas cônicas
simples de um animal controle, onde se observa a presença de
hifas no interior da camada de queratina.400X............................. 60
Figura 15 - Presença de infiltrado inflamatório polimorfonuclear, com
formação de microabscesso intraepitelial sem a presença de
hifas de C. albicans, na região das papilas cônicas simples de
rato controle. 400X......................................................................... 61
Figura 16 - Halos de inibição de crescimento observado em antifungigrama
com discos de papel realizado nas amostras de C. albicans (A),
C. tropicalis (B) e C. guilliermondii (C).......................................... 63
Figura 17 - Galeria ATB-FUNGUS com amostra de Candida semeada para
incubação e teste frente aos antifúngicos...................................... 64
Figura 18 - Galeria ATB-FUNGUS após incubação mostrando a resistência
de C. tropicalis a dois antifúngicos, como mostrado na tabela
10.................................................................................................... 65
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - Halos de inibição de crescimento de C. albicans, C. tropicalis,
C. parapsilosis, C.guilliermondii, C. krusei e C. kerfyr frente ao
extrato de cajueiro
52
Gráfico 2 - Halos de inibição de crescimento de C. albicans, C. tropicalis,
C. parapsilosis, C.guilliermondii, C. krusei e C. kerfyr frente ao
extrato de bardana....................................................................... 53
Gráfico 3 - Halos de inibição de crescimento de C. albicans, C. tropicalis,
C. parapsilosis, C.guilliermondii, C. krusei e C. kerfyr frente ao
extrato de tanchagem................................................................... 54
Gráfico 4 - Halos de inibição de crescimento de C. albicans, C. tropicalis,
C. parapsilosis, C.guilliermondii, C. krusei e C. kerfyr frente ao
extrato de própolis........................................................................ 55
Gráfico 5 - ufc x 10
3
/mL com as diferenças entre substâncias e
inoculações (Média e Erro padrão).............................................. 68
Gráfico 6 - Escores dos halos de inibição par C albicans ............................ 69
Gráfico 7 - Escores dos halos de inibição par C albicans2............................ 70
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Descrição das características dos fitoterápicos testados frente
às amostras de Candida isoladas da cavidade bucal.................. 40
Tabela 2 - Número de amostras de C. albicans, C. tropicalis, C.
parapsilosis, C. guilliermondii, C. krusei e C. Kerfy que
apresentaram sensibilidade ao extrato de cajueiro...................... 51
Tabela 3 - Número de amostras de C. albicans, C. tropicalis, C.
parapsilosis, C. guilliermondii, C. krusei e C. kerfyr que
apresentaram sensibilidade ao extrato de bardana..................... 53
Tabela 4 - Número de amostras de C. albicans, C. tropicalis, C.
parapsilosis, C. guilliermondii, C. krusei e C. kerfyr que
apresentaram sensibilidade ao extrato de tanchagem. ............... 54
Tabela 5 - Número de amostras de C. albicans, C. tropicalis, C.
parapsilosis, C. guilliermondii, C. krusei e C. kerfyr que
apresentaram sensibilidade ao extrato de própolis..................... 55
Tabela 6 - Número e porcentagem de amostras sensíveis aos extratos de
cajueiro, bardana, tanchagem e própolis e média do diâmetro
(em mm) dos halos de inibição do crescimento das espécies de
Candida testadas.......................................................................... 56
Tabela 7 - Efeito bactericida de extratos de cajueiro, bardana, tanchagem
e própolis frente a amostras de Candida...................................... 58
Tabela 8 - Média e desvio padrão do número de ufc/mL de C. albicans
recuperado da cavidade bucal dos ratos 24h após 3
inoculações da levedura............................................................... 59
Tabela 9 - Média e desvio padrão do número de ufc/mL de C. albicans
recuperado da cavidade bucal dos ratos 24h após inoculação
única da levedura......................................................................... 59
Tabela 10 - Diâmetro dos halos de inibição de crescimento produzido pelos
antifúngicos testados frente a amostras de Candida................... 62
Tabela 11 - Sensibilidade das amostras de Candida aos antifúngicos
testados no teste ATB-Fungus..................................................... 64
Tabela 12 - Teste de normalidade (Shapiro-Wilk) para a recuperação de
ufc/10
3
mL nos grupos................................................................... 67
Tabela 13 - Teste de equivalência das variâncias (Levene) para a
recuperação de ufc/10
3
mL nos grupos......................................... 67
Tabela 14 - Análise de variância – dois critérios. ufc10
3
/mL........................ 67
Tabela 15 - Comparações múltiplas de Tukey – Fator substâncias................ 68
Tabela 16 - Postos médios para os escores de halo de inibição para C.
albicans – a Teste de kruskal-Wallis............................................
69
Tabela 17 - Diferenças entre os grupos – Comparações múltiplas de Dunn.. 69
Tabela 18 - Postos médios para os escores de halo de inibição para C
albicans2 – a Teste de kruskal-Wallis........................................
70
Tabela 19 Diferenças entre os grupos – Comparações múltiplas de Dunn.. 70
SUMÁRIO
1-
INTRODUÇÃO......................................................................................... 14
2-
REVISÃO DE LITERATURA.................................................................. 16
2.1- Gênero Candida...................................................................................... 16
2.1.1- Candidose bucal...................................................................................... 17
2.2- Ação Antimicrobiana de Fitoterápicos..................................................... 23
2.2.1- Anacardium occidentale (cajueiro) ......................................................... 27
2.2.2- Arctium lappa (bardana) ........................................................................ 29
2.2.3- Plantago sp (tanchagem) ........................................................................ 30
2.2.4- Própolis.................................................................................................... 32
3-
PROPOSIÇÃO......................................................................................... 35
4- MATERIAL E MÉTODOS........................................................................
36
4.1- Coleta de Saliva e Isolamento de Candida.............................................. 36
4.2- Identificação das Espécies de Candida................................................... 37
4.2.1- Formação do tubo germinativo................................................................ 37
4.2.2- Microcultivo em ágar fubá....................................................................... 37
4.2.3- Fermentação de carboidratos.................................................................. 38
4.2.4- Assimilação de carboidratos.................................................................... 38
4.2.5- Interpretação dos testes para identificação das espécies de Candida.... 39
4.3- Manipulação dos Fitoterápicos................................................................ 39
4.4- Sensibilidade dos Isolados de Candida aos fitoterápicos........................ 41
4.4.1- Testes realizados para determinação da sensibilidade de Candida aos
fitoterápicos.............................................................................................. 41
4.5- Sensibilidade de Candida a Antifúngicos Comerciais.............................. 45
4.5.1- Testes realizados..................................................................................... 45
4.5.2- Preparação do inóculo............................................................................. 47
4.5.3- Inoculação da galeria............................................................................... 47
4.5.4- Leitura da galeria e interpretação............................................................. 47
5-
RESULTADOS......................................................................................... 50
5.1- Coleta de Saliva e Isolamento de Candida.............................................. 50
5.2- Identificação das Espécies de Candida................................................... 50
5.3- Sensibilidade dos Isolados de Candida aos Fitoterápicos (in vitro e in
vivo)........................................................................................................
50
5.3.1- Cajueiro................................................................................................... 51
5.3.2- Bardana.................................................................................................. 52
5.3.3- Tanchagem............................................................................................. 53
5.3.4- Própolis................................................................................................... 54
5.4- Sensibilidade dos Isolados de Candida aos Antifúngicos Comerciais
(Antifungigrama)....................................................................................... 62
5.5- Análise Estatística.................................................................................... 66
6-
DISCUSSÃO............................................................................................ 71
7-
CONCLUSÕES....................................................................................... 75
REFERÊNCIAS.................................................................................................... 76
ANEXO A - Termo de Consentimento ............................................................. 82
ANEXO B - Meios de Cultura - Ágar Fubá........................................................ 84
ANEXO C - Prova de Assimilação de Carboidratos........................................ 87
ANEXO D - Certificados de Análise dos Produtos Utilizados....................... 88
ANEXO E - Tabela CECON-Centro de Controle e Produtos para
Diagnóstico Ltda............................................................................
93
ANEXO F - ATB Fungus..................................................................................... 95
ANEXO G - Declaração da Propesp quanto à Pesquisa................................. 97
1- INTRODUÇÃO
A candidose é uma infecção endógena de ocorrência comum na
cavidade bucal, sendo conseqüência de parasitismo temporário por leveduras do
gênero Candida. Dentro deste gênero encontramos mais de 200 espécies, sendo
que as mais importantes como patógenos humanos são: C. albicans, C. tropicalis, C.
parapsilosis, C. kruzei, C. kerfyr, C. glabrata, C. guilliermondii e C. dublinensis
(Cannon et al., 1995 ; Samanarayake ; Samanarayake, 2001). Dentre estas
espécies, C. albicans merece destaque na micologia médica do ponto de vista
etiológico e seu índice de incidência, que varia de 33% a 60% (Jorge et al., 1997 ;
Lima et al., 1994). As infecções fúngicas estão cada vez mais prevalentes pelo
aumento do número de pacientes com imunossupressão. Doenças crônicas como
câncer ou transplantes de medula ou órgãos sólidos; uso prolongado de
corticosteróides, infecções por HIV, deixam os pacientes mais suscetíveis à
infecções fúngicas oportunistas. Em hospitais, procedimentos cirúrgicos complexos,
uso de dispositivos implantáveis e o uso de antibióticos de amplo espectro,
aumentam a incidência de infecções fúngicas. Em revisão sobre infecções fúngicas,
Keuneth e Rolston (2003), Anderson Câncer Center, Houston, Texas, declarou que
as várias espécies de Candida são a quarta principal causa de infecções da corrente
sanguínea, sendo associadas a uma alta letalidade, de 40%. Na sua forma
convencional, o tratamento da candidose consiste no uso de antifúngicos de uso
tópico ou sistêmico sendo os derivados poliênicos e azólicos, os mais usados
(COSTA, 1999), porém a possibilidade de efeitos colaterais principalmente em
pacientes imunodeprimidos deve ser considerada (LAGUNA et al., 1996).
15
O uso de plantas medicinais vem dos primórdios da medicina, papiro
de Ebers XVIII Dinastia egípcia. No Brasil este uso data do século XVI, quando
Gabriel Soares de Souza autor do Tratado Descritivo do Brasil de 1587, denominava
os produtos medicinais utilizados pelos índios de “as árvores e ervas da virtude”.
Muito se tem pesquisado em relação às plantas medicinais e seu uso terapêutico.
Estes números estão crescendo ainda mais, tendo em vista nossa enorme
biodiversidade. Tendo isto em vista nos propusemos a estudar as ações terapêuticas
do cajueiro (Anacardium occidentale), bardana (Arctium lappa), tanchagem
(Plantago major) e da própolis em relação a Candida isolada da cavidade bucal.
16
2- REVISÃO DA LITERATURA
2.1- Gênero Candida
Dentro do gênero Candida, encontram-se cerca de 200 espécies,
sendo que as mais importantes como patógenos humanos são C. albicans, C.
tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei, C. kerfyr, C. glabrata, C. guilliermondii e C.
dublinensis (CANNON et al., 1995; SAMARANAYAKE ; SAMARANAYAKE, 2001).
Dentre essas espécies, C. albicans merece destaque na micologia médica por sua
alta patogenicidade.
Espécies de Candida fazem parte da microbiota normal do homem e
podem ser encontradas na orofaringe, boca, secreção brônquica, dobras da pele e
vagina de 60 a 70% da população adulta jovem sadia (STENDERUP, 1990).
Candida são fungos imperfeitos, da classe dos Deuteromycetes que
podem ser encontrados na forma de leveduras e hifas (FARAH et al., 2000). Na
forma de leveduras apresentam-se como organismos eucarióticos, unicelulares, com
morfologia variando entre ovóide, redonda, cilíndrica, alongada e apiculada, medindo
aproximadamente 2 a 8μm de largura por 3 a 14 μm de comprimento. Hifas são
filamentos lineares contendo múltiplas unidades celulares divididas por septos
(WEBB et al., 1998). São microrganismos Gram positivos, cultivados em aerobiose,
mas podendo crescer em anaerobiose (MEYER, 1987). São cultivadas em agar
Sabouraud dextrose, apresentando-se como colônias brancas ou branco-
amareladas, com diâmetro entre 4 e 8 mm, úmidas, cremosas e com odor
característico. C. albicans para passar da forma leveduriforme para a forma de hifas
requer um estágio nutritivo apropriado, fatores indutores, temperatura maior que
33ºC e pH próximo ao neutro (SAMARANAYAKE ; McFARLANE, 1990).
17
Lacaz (1980) demonstrou que na forma leveduriforme, C. albicans é
constituída quimicamente de 60% de polissacarídeos, 13% de proteínas, 8.5% de
lipídios e 18.5% de compostos inertes, enquanto que nas hifas observou-se uma
quantidade de quitina 3 vezes maior e também maior quantidade de proteína.
A identificação das espécies de Candida é feita através do
microcultivo em ágar fubá, onde se observa a formação de estruturas globosas
denominadas clamidoconídio ou clamidósporos; formação de tubo germinativo após
inoculação em soro estéril a 37ºC; fermentação e assimilação de açúcares como
glicose, maltose, sacarose, lactose, galactos, rafinose e outros (LACAZ, 1998).
Meios cromógenos também são utilizados pra identificação de espécies de Candida.
Em ágar CHROM, C. albicans apresenta colônias verdes; C. tropicalis colônias
azuis; C. krusei, rosa pálido; e C. glabrata, colônias roxas (WILLIAMS ; LEWIS,
2000).
2.1.1- Candidose bucal
Candidose bucal é uma infecção oportunista causada por leveduras
do gênero Candida, especialmente C. albicans. Outras espécies estão
freqüentemente relacionadas ao desenvolvimento de candidoses, na maioria dos
casos em indivíduos imunocomprometidos. A capacidade de Candida causar
infecção está relacionada ao estado geral de saúde do hospedeiro ou à presença de
fatores predisponentes, locais ou sistêmicos. Assim, a virulência de Candida é
determinada mais pelo hospedeiro que por fatores inerentes à própria levedura
(ALLEN, 1992 ; BUDTZ-JORGENSEN, 1990).
18
Os mecanismos de patogenicidade de C. albicans não estão
completamente esclarecidos, pois dependem do tipo e local de infecção, estágio de
invasão e resposta do hospedeiro (HAYNES, 2001). Vários fatores têm sido
implicados na patogenicidade de Candida. Entre estes fatores podemos citar a
capacidade de aderência à mucosa, habilidade em formar tubo germinativo e hifas,
produção de enzimas histolíticas e toxinas (AKPAN ; MORGAN, 2002).
Um dos passos mais importantes para o desenvolvimento de
candidose bucal é a capacidade de aderência das leveduras ás células epiteliais. Os
mecanismos envolvidos neste processo podem ser a interação entre moléculas de
superfície do microrganismo e receptores específicos no hospedeiro; forças
eletrostáticas, agregação celular e hidrofobicidade de superfície (COTTER;
KAVANAH, 2000; GHANNOUM et al., 1990). A aderência deve-se a moléculas
especializadas, chamadas adesinas, que reconhecem estruturas nos tecidos, como
proteínas celulares, colágeno, fibrinogênio, fibronectina e laminina (CANNON et al.,
1995 ; WEBB et al., 1998). Dentre as adesinas temos glucano, quitina, proteínas da
parede celular, lipídios e manoproteínas, sendo essas últimas consideradas as mais
importantes (PENDRAK; KLOTZ, 1995). A adesão de Candida às células epiteliais
ocorre através da porção protéica da manoproteína da levedura e fucose ou N-
acetilglicosamina, nas glicoproteínas das células epiteliais (WEBB et al., 1998). A
aderência é necessária para a colonização inicial. Sem se aderir, a taxa de
crescimento de C. albicans é insuficiente para manter o fungo na boca ou trato
gastrintestinal.
Macourtie e Douglas (1984) encontraram relação direta entre a
composição da superfície celular, aderência e virulência de C. albicans. Amostras de
C. albicans foram capazes de sintetizar uma camada de superfície fibrilar em
19
resposta às altas concentrações de açúcar no meio e esta modificação resultou no
aumento de adesão às células epiteliais e na virulência para camundongos.
Dente as espécies de Candida, a C. albicans possui maior
capacidade de aderência às células epiteliais e outras superfícies, o que pode estar
diretamente relacionado com sua maior patogenicidade, quando comparada às
outras espécies (KIMURA; PEARSAL, 1978).
Outro importante mecanismo de patogenicidade é a formação de
tubo germinativo e hifas por C. albicans. Estes mecanismos são importantes, uma
vez que aumentam a capacidade de aderência das leveduras aos tecidos, acrílico e
pele e aumentam a capacidade de invasão no hospedeiro (KIMURA; PEARSAL,
1980); aumentam a resistência à fagócitos devido às dimensões físicas
(SAMARANAYAKE; SAMARANAYAKE, 2001). Martin et al., (1984) verificaram que
cepas de C. albicans que não formavam tubo germinativo eram incapazes de causar
candidose bucal em camundongos enquanto que as amostras produtoras de tubo
germinativo causavam lesões com inflamação crônica, invasão dos tecidos por hifas
e hiperplasia epitelial.
A produção de enzimas hidrolíticas geralmente contribui para a
patogênese de infecções microbianas. C. albicans produz um grande número de
enzimas, como fosfolipase, lípase, fosfomonoesterase, hexosaminidases e pelo
menos 3 proteínas aspárticas. As proteinases são secretadas predominantemente
por espécies patogênicas de Candida, especialmente C. albicans e C. tropicalis. A
capacidade proteolítica de C. parapsilosis é moderada e as demais espécies que
são de menor interesse médico não secretam proteinase (CANNON, 1995 ; HOEGL
et al., 1996). A fosfolipase também é uma enzima importante para C. albicans, pois
20
catalisa a hidrólise de fosfolipídios que são importantes componentes das
membranas celulares (GHANNOUM, 2000 ; LANE; GARCIA, 1991).
A produção de toxina é um importante fator de virulência para C.
albicans. Iwata (1975) isolou a canditoxina, uma toxina endógena, protéica, que tem
ação letal sobre outros fungos e bactérias. O fator Killer é uma exotoxina
inicialmente observada em Sacharomyces cereviseae por Bevan e Makower (1963
apud MAGLIANE et al., 1997) e tem sido usada na diferenciação biológica de
leveduras dentro da mesma espécie, podendo ser usado como marcador
epidemiológico (BENDOVA, 1986).
Vários são os fatores predisponentes presentes no hospedeiro que
favorecem o desenvolvimento de candidose bucal. Estes podem ser locais ou
sistêmicos. Dentre os fatores locais, a xerostomia e o uso de antibióticos são
considerados os mais importantes, principalmente pela alteração do equilíbrio da
microbiota indígena local (FOTOS et al., 1992). Indivíduos xerostômicos apresentam
facilidade de implantação de Candida. Primeiro porque a limpeza mecânica da boca,
exercida pela saliva, está ausente ou diminuída, contribuindo para a presença de
maior número de microrganismos na boca e para retenção de alimentos. Além disso,
a ausência de substâncias antimicrobianas presentes na saliva como a lisozima,
lactoferrina, lactoperoxidase, comprometem a integridade local. Antibióticos,
principalmente de largo espectro, podem impedir ou inibir o desenvolvimento de
microrganismos indígenas que atuariam como antagonistas à implantação da
levedura, seja por competição por alimentos ou pela aderência à receptores nas
células epiteliais que também servem de receptores para a Candida (OKSALA,
1990).
21
Sherman et al. (2002) e Takakura et al. (2003) citam entre os fatores
predisponentes a candidose bucal a imunossupressão, distúrbios endócrinos,
deficiência nutricional, medicações, doenças malignas, próteses dentárias,
alterações epiteliais, mudança quantitativa ou qualitativa da saliva, dieta rica em
carboidrato, idade, higiene oral deficiente e tabagismo. Santos et al (1999)
estudaram a influência do uso de próteses removíveis na presença de Candida na
cavidade bucal de adultos e encontraram 88.2% dos usuários de prótese removíveis
positivos para Candida, sendo que em 17.4% o número de leveduras ultrapassou
400 ufc/mL. Os autores observaram ainda que 91.2% dos pacientes apresentavam
higiene bucal e das próteses regular ou deficiente. Ainda Santos et al., (1999)
estudando o perfil da população que busca atendimento odontológico universitário,
verificaram que o uso de próteses totais ou parciais mal adaptadas e mal
higienizadas foi o principal fator predisponente à presença de número elevado de
Candida na boca.
Candidose é um termo usado para determinar um grupo de doenças
resultantes da infecção por Candida spp (McINTYRE, 2001). Essas lesões podem
variar desde lesões superficiais na mucosa até infecções sistêmicas extremamente
graves (WEBB et al., 1998).
Clinicamente, a candidose bucal pode apresentar-se como
pseudomembranosa, eritematosa e hiperplásica (SAMARANAYAKE;
SAMARANAYAKE, 2001). A forma pseudomembranosa caracteriza-se como placas
brancas e cremosas aderentes à mucosa bucal que quando removidas pela
raspagem expõe uma mucosa adjacente normal ou eritematosa (SHERMAN et al.,
2002). Histologicamente a pseudomembrana é formada por tecidos necróticos,
restos alimentares, leucócitos e bactérias, juntamente com leveduras e hifas de
22
Candida, que podem apresentar invasão na camada queratinizada do epitélio.
Observa-se ainda acantose, edema e microabscessos intraepiteliais. Infiltrado
inflamatório PMN, linfócitos e macrófagos estão presentes no tecido conjuntivo
(FARAH et al., 2000; REICHARD et al., 2000). Os sítios mais freqüentemente
atingidos por esse tipo de candidose são o palato mole, orofaringe, dorso da língua,
mucosa jugal e gengiva (McINTYRE, 2001). A candidose eritematosa tem sido
associada com infecção pelo HIV, representando cerca de 50% das candidoses
encontradas nesses pacientes. Ocorrem na maioria dos casos no dorso da língua,
ou palato, como áreas avermelhadas de bordas pouco definidas. Histologicamente,
o aspecto é semelhante ao observado na pseudomembranosa, entretanto a
quantidade de hifas é menor e a reação inflamatória no tecido conjuntivo é mais
intensa (BUDTZ-JORGENSEN, 1990).
A forma hiperplásica é uma condição crônica cujo aspecto clínico é
caracterizado pela presença de placas brancas que não podem ser removidas pela
raspagem. É caracterizada por intensa penetração de hifas na superfície do epitélio,
que apresenta hiperplasia e acantose, com reação inflamatória variando de
moderada a severa, no tecido conjuntivo subepitelial (NEVILLE et al., 1998 ;
REICHARD et al., 2000 ; SHERMAN et al., 2002).
23
2.2- Ação Antimicrobiana de Fitoterápicos
A procura de plantas com poder curativo para diferentes doenças
data de muitos anos. Desde a pré-história até os dias atuais, centenas, senão
milhares de plantas têm sido usadas por pessoas de todos os continentes, seja na
forma de emplastos, infusões, decocção, e outros. Embora cerca de ¼ a ½ dos
fármacos distribuídos nos Estados Unidos tenham origem de plantas superiores,
poucos são usados como agentes antimicrobianos, uma vez que bactérias e fungos
são as principais fontes desses agentes (COWAN, 1999).
Com o advento dos antibióticos na década de 50, o uso de derivados
de plantas como antimicrobianos é quase inexistente. Entretanto, microbiologistas
têm pelo menos duas razões para verificar a eficácia antimicrobiana de extratos de
plantas medicinais. Primeiro observa-se na literatura que em média, dois ou três
antibióticos produzidos por microrganismos são lançados no mercado a cada ano,
mostrando que o tempo de vida de qualquer antibiótico é extremamente curto
(CLARK, 1996) e que novos agentes antimicrobianos (incluindo vacinas) devem ser
pesquisados e dentro dessas novas fontes de pesquisa, encontram-se as plantas.
Segundo, a população já está tomando conhecimento dos problemas de prescrição
desnecessária e incorreta dos antibióticos tradicionais e querem ter mais autonomia
sobre seus cuidados médicos e uma grande quantidade de compostos de plantas
são facilmente encontrados no mercado. Na década de 90, aproximadamente 1/3 da
população americana já tinha feito uso de pelo menos um tipo de terapia não
convencional (EISENBERG et al., 1993). Neste contexto, o interesse em plantas
com propriedades terapêuticas abrangendo aquelas com atividade antimicrobiana
tem crescido bastante, não apenas por constituir-se em recurso terapêutico
24
alternativo, mas ainda devido às perspectivas de isolar substâncias que apresentem
eficácia significativa e menor índice de desvantagens (QUEIROZ, 1998).
As plantas possuem uma infinidade de compostos aromáticos, a
maioria deles fenóis e seus derivados. Cerca de 12.000 metabólitos secundários já
foram isolados e este número corresponde a apenas 10% do total (SCHULTES,
1978). Dentre os principais grupos de compostos derivados de plantas que
apresentam efeito antimicrobiano estão os fenólicos e polifenóis. Estragão e tomilho
contêm ácido cafeico, cuja eficácia já foi demonstrada contra vírus, bactéria e fungos
(BRANTNER et al., 1996 ; DUKE, 1985). Catecol e pirogalol são compostos
hidroxilados com ação antimicrobiana. Um dos mecanismos responsáveis pela
toxicidade do fenol para microrganismos é a inibição enzimática pelos compostos
oxidados (MASON; WASSERMAN, 1987). Eugenol é um representante dos
compostos fenólicos já bem caracterizados. É um óleo essencial encontrado no
cravo da índia, considerado bacteriostático e fungistático (DUKE, 1985 ; THOMSON,
1978).
As plantas constituem uma grande reserva de recursos
medicamentosos e os princípios ativos de várias plantas têm sido investigados
quanto à ação antimicrobiana. Plantas medicinais, principalmente na América do Sul,
constituem a primeira linha no tratamento de várias doenças infecciosas e não
infecciosas. Leal-Cardoso e Fonteles (1999) estudaram a ação farmacológica de 15
espécies de plantas aromáticas do nordeste brasileiro. Segundo os autores, os óleos
essenciais tiveram efeitos sobre a contração muscular, antiespasmódico, analgésico,
antiinflamatório, anticonvulsivante e antibacteriano, validando assim seu uso na
medicina popular. Eugenol, obtido da planta Ocimum gratissimum, usado na
medicina popular brasileira, demonstrou atividade contra bactérias Gram positivas e
25
negativas. Tradicionalmente é usado para controle de infecções do trato respiratório
superior, diarréia, infecções na pele, pneumonia, tosse, febre e conjuntivite
(NAKAMURA et al., 1999).
O efeito das quinonas sobre microrganismos é extremamente
grande pois estas são uma fonte estável de radicais livres e formam complexos
irreversíveis com aminoácidos nucleofílicos nas proteínas, geralmente levando à
quebra da proteína e perda da função. Os possíveis alvos nas células bacterianas
são as adesinas e polipeptídios da parede celular e enzimas ligadas à membrana.
Kazmi et al (1994) demonstram ação bacteriostática das quinonas para B. anthracis,
Corynebacterium pseudodiphthericum e P. aeruginosa e bactericida para P.
pseudomalliae.
Outro composto fenólico com efeito antimicrobiano são os
flavonóides. Estes são sintetizados pelas plantas em resposta a uma infecção
microbiana. Sua atividade deve-se provavelmente a sua habilidade de formar
complexos com proteínas solúveis e extracelulares e com a parede celular de
bactérias. Alguns flavonóides lipofílicos podem também quebrar as membranas
bacterianas, como foi demonstrado por Tsuchiya et al. (1994) frente a
Staphylococcus aureus meticilina resistentes. Tanino é o nome de um grupo de
substâncias fenólicas poliméricas. As atividades antimicrobianas dos taninos, como
das quinonas, devem-se à capacidade de inativar adesinas, enzimas e proteínas de
transporte do envelope celular (HASLAN, 1996). Cumarina são substâncias fenólicas
com efeito anti-trombótico, antiinflamatório e vasodilatador. Thornes (1997) na busca
de agentes para tratamento de candidose vaginal em mulheres grávidas demonstrou
o efeito “in vitro” da cumarina contra C. albicans.
26
A fragrância das plantas deve-se aos óleos essenciais ou terpenos.
Óleos essenciais ou tepernóides são ativos contra bactérias (AMARAL et al., 1998 ;
BARRE et al., 1997) vírus (FUJIOKA; KASHIWADA, 1994) e fungos (AYAFOR et al.,
1994 ; KUBO et al., 1993 ; RANA, 1997). Petalotemunol é um terpeno com grande
atividade contra bactérias Gram positivas e moderada ou fraca ação contra Gram
negativas e contra Candida (HUFFORD et al., 1993). Batista et al. (1994)
demonstraram a eficácia de dois diterpenos no controle de Candida albicans. C.
albicans também foi sensível ao extrato de Soanum nigrescens, demonstrando a
mesma sensibilidade que apresenta para nistatina (GIRON et al., 1988).
Queiroz (1998) testaram a ação de extratos e óleos essenciais de
Anacardium occidentale (cajueiro), Plectranthus amboinicus (malva), Punica
granatum (romã) e Phithecellobium avaremotemo (barbatemão) frente a isolados de
C. albicans, C. stellatoidea, C. guilliermondii, C. kruzei e C. tropicallis e observou que
todos os extratos e óleo essencial mostraram efeito inibitório frente às leveduras
estudadas.
Compostos heterocíclicos de nitrogênio são chamados de alcalóides
e o primeiro exemplo de um alcalóide usado como medicamento é a morfina.
Apresenta ação antifúngica, antimicrobiana, antiparasitária (COWAN, 1999).
As lectinas e polipeptídios com ação sobre microrganismos foram
demonstrados em 1942. Seu mecanismo de ação é provavelmente a formação de
canais de íons na membrana do microrganismo ou através da inibição competitiva
das proteínas do microrganismo aos receptores polissacarídicos no hospedeiro.
A ascensão do HIV determinou a investigação de derivados de
plantas que possam ter eficácia no seu controle, principalmente para o uso em
países subdesenvolvidos que têm acesso limitado aos medicamentos atuais (DE
27
CLERCK, 1995). Alves et al. (2000) verificaram que 42 dentre 60 espécies de
plantas medicinais da savana brasileira apresentaram efeitos antimolusco,
antifúngica e antibacteriana. Extrato purificado de Prunela vulgaris foi capaz de
bloquear a transmissão célula-célula do vírus HIV-1, preveniu a formação de
sincícios e interferiu na habilidade do HIV-1 e da proteína GP-120 de se ligarem ao
receptor CD4. Análise por PCR confirmou a ausência de DNA proviral do HIV-1 em
células expostas ao vírus na presença do extrato, sugerindo que o extrato purificado
inibe a infecção de células susceptíveis pelo HIV-1, impedindo a adesão do vírus ao
receptor CD4 (YAO et al., 1992).
Várias das indicações fitoterápicas são de conhecimento popular e
muitas delas tem comprovação científica para seu uso, mesmo assim, a fitoterapia
em odontologia ainda é incipiente no contexto da odontologia oficial. Apesar da
utilização de produtos naturais como o eugenol, guta percha, timol e outros, todos de
origem vegetal, usados na manipulação de alguns materiais dentários, cujas ações
bacteriostática e bactericida estão devidamente comprovadas, a fitoterapia em
odontologia constitui um tema recente (MATOS, 1994 ; SAMPAIO, 1997).
2.2.1- Anacardium occidentale (cajueiro)
Pertencente à família Anacardiaceae, o cajueiro, também conhecido
por acajuba, acajaíba, caju-manso, cacaju, oacaju e anacardo é uma árvore
amazônica que pode atingir até 15m de altura. Tem origem na América do Sul,
estando largamente espalhado pela faixa litorânea da região tropical e subtropical do
Brasil. Seu principal endemismo encontra-se na região nordeste. Botanicamente, a
pseudofruta é um pedúnculo macio que cresce atrás da fruta propriamente dita e
serve de suporte para esta; possui uma espessa polpa suculenta que é utilizada
28
para fabricação de sucos. O verdadeiro fruto, a castanha, cresce na extremidade da
pseudofruta ou pedúnculo, é recoberta por duas conchas e entre essas conchas
existe óleo tóxico e cáustico espesso chamado cardol, que deve ser removido antes
que esta possa ser ingerida. Os princípios ativos do cajueiro podem ser isolados das
folhas e casca, onde temos os taninos, gomas, resinas, material corante e
saponinas; do pseudofruto pode-se isolar taninos, vitamina C, açúcares fibras e
água; da castanha obtém-se ácido anacárdico, anacardol, cardol, taninos e da
amêndoa (semente), óleo fixo, proteínas e sais minerais. A atividade antimicrobiana
do cajueiro foi documentada pela primeira vez, num estudo in vitro de 1982.
Akipendu (2001) demonstraram ação antimicrobiana do extrato metanólico da casca
do cajueiro frente a 13 de 15 espécies bacterianas isoladas, na concentração de
20mg/mL. Kudi (1999) demonstraram que extratos brutos da casca do cajueiro
apresentaram ação antibacteriana, tanto para bactérias Gram positivas quanto para
Gram negativas, como Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. Helicobacter
pylori é um microrganismo atualmente relacionado à causa da gastrite aguda. Kubo
et al (1993) demonstraram que ácidos anacárdicos e (E)-2 hexenal extraídos do
cajueiro possuem atividade anti Helicobacter pylori e que estes produtos apresentam
capacidade de inibir urease, um mecanismo de virulência desses microrganismos.
Os diferentes compostos produzidos a partir do cajueiro apresentam uma ampla
gama de aplicação. A casca e a folha do cajueiro são grandes fontes de taninos, um
grupo de fitoquímicos com propriedades biológicas bem documentadas. Em países
como Brasil e Peru, o chá feito com a casca ou folha do cajueiro é usado em banhos
como anti-séptico vaginal. No Brasil a fruta é usada no tratamento de lesões de pele
relacionadas à sífilis. Princípios ativos de plantas da medicina popular têm sido
investigados. Santos Filho (1990) examinaram a ação antibacteriana de 120
29
espécies de plantas pertencentes a 28 famílias, dentre elas Anacardiaceae e
demonstraram ação dessa espécie no controle de microrganismos.
2.2.2 Arctium lappa (bardana)
A bardana, pertencente à família Compositae, é comumente usada
na medicina popular no tratamento de distúrbios sanguíneos, circulatórios,
digestivos, imunes, nos rins, fígado e pulmões. Possui ação antibiótica, antifúngica,
anti-séptica e anti-tumoral (BLANCO, 2003).
Apresenta como princípios ativos óleo essencial até 0,2%, polifenóis,
inulina 40 a 50%, mucilagens, lapatina, taninos, sais minerais, princípio antibiótico,
ácido clorogênico, vitaminas do grupo B e A, fuquinona, glicosídeos, resina, cálcio,
potássio, magnésio, princípio amargo. Conhecida desde a antiguidade na medicina
caseira, nunca tendo sido contestada ao longo dos séculos. As raízes e as folhas
tenras podem ser utilizadas como alimento, podendo a raiz também ser consumida
crua. Na Europa as folhas e brotos novos são consumidos como verdura e no Japão
é cultivada uma variedade para produção de raízes comestíveis. No Brasil tem um
crescimento vigoroso, sendo considerada uma espécie daninha em pomares e
terrenos baldios no sul do Brasil. Antigamente era utilizada em mistura com outras
ervas, para clarear a pele, a bardana tem hoje aplicações como depurativo e
cicatrizante (BLANCO, 2003).
O decocto de suas raízes é eficaz, como purificador do sangue, em
doenças reumáticas, afecções renais e distúrbios digestivos. Externamente, prepara-
se com elas uma pomada para eczema e uma loção para evitar a queda de cabelo.
Do ponto de vista nutricional, esta raiz apresenta boas qualidades: fornece
proteínas, glicídios, fibras, cálcio, fósforo, ferro, vitamina A, B1, riboflavina, niacina e
30
vitamina C. Assim como todas as raízes, a bardana também é rica fonte de sais
minerais.
Uma cataplasma das folhas frescas alivia as dores provocadas por
picadas de insetos, torções e hemorróidas, e a sua infusão serve para limpar feridas
e inflamações cutâneas. O extrato das sementes e também suas infusões ou
decocções são especialmente indicados para a cura de enfermidades crônicas da
pele. As folhas esmagadas e aplicadas diretamente sobre a epiderme têm uma ação
bactericida e antimicótica que a torna um remédio eficaz contra inúmeras doenças
de pele, como dermatoses úmidas e purulentas, acnes, eczemas, pruridos, tinha,
seborréia da face ou do couro cabeludo e herpes simples. O óleo de bardana é
considerado um estimulante capilar.
2.2.3 Plantago sp (tanchagem)
Tanchagem pertence à família das plantagináceas, que compreende
muitas espécies, cinco das quais são comestíveis: Plantago maior L., Plantago
australis Lam. var hirtella (HBK) Banhn, Plantago guilheminiana Desc., Plantago
catharinea Desc. e Plantago tomentosa Engl. Todas elas são conhecidas
vulgarmente no Brasil como língua-de-vaca, plantagem, tanchagem ou tansagem.
São plantas perenes, de raízes curtas e fibrosas. É uma planta ereta, sem caule,
atingindo mais de 40cm de altura. Suas folhas, de formato variado, são agrupadas
na base, dotadas de nervuras bem marcadas, com ou sem pelos. Em forma de
rosetas, saem diretamente do solo e medem cerca de 20 cm de comprimento. As
flores são pequenas, entre esverdeadas e acastanhadas, agrupadas em espigas
alongadas, contínuas ou não, providas de um longo eixo. Pode-se observar numa
31
mesma planta vários eixos com idade e altura diferentes, o que possibilitará mais
tarde a existência de sementes se propagando por um período de tempo mais longo
do que se todas as espigas se desenvolvessem na mesma época. Os frutos são
muitos pequenos, com sementes escuras e achatadas. Como planta de clima
temperado, desenvolve-se melhor em solos úmidos e locais frescos e com boa
iluminação. P. major contém compostos biologicamente ativos como
polissacarídeos, lipídios, derivados de ácido cafeico, flavonóides, iridóides e
tepernóides. Também foram isolados alcalóides e alguns ácidos orgânicos
(SAMUELSEN, 2000).
Pesquisas com espécie Plantago australiana realizadas na
Universidade Federal do Paraná comprovaram a presença de aucubina e catalpol,
responsáveis pela ação antiinflamatória e antibiótica. Zanon et al. (1999)
demonstraram o efeito antiviral de extrato alcoólico de Plantago brasiliensis e
Plantago major contra Herpes suis vírus, inibindo 2x mais a infectividade desse
vírus. PMII é um polissacarídeo solúvel isolado das folhas de P. major. Hertland
(1999) induziram infecção sistêmica por Streptococcus pneumoniae em
camundongos e demonstraram que este polissacarídeo conferiu proteção contra a
infecção quando este foi administrado sistemicamente antes da inoculação do
microrganismo e que os efeitos protetores devem-se à estimulação do sistema
imune inato e não da resposta adaptativa.
Holetz et al. (2002) verificaram o efeito antibacteriano e antifúngico
de 13 extratos de plantas, entre elas o cajueiro e tanchagem, contra C. albicans, C.
krusei, C. parapsilosis e C. tropicais, isoladas de pacientes com candidose. Através
da técnica de microdiluição em caldo Miller Hinton e determinação da concentração
inibitória mínima, verificaram que Plantago major demonstrou resposta moderada
32
contra C. krusei, fraca atividade contra C. tropicalis e não demonstrou atividade
contra C. albicans e C. parapsilosis.
Extratos de Plantago apresenta uma série de atividades biológicas
que incluem cicatrização de feridas, ação antiinflamatória, analgésica, antioxidante,
antibiótica, regulatória do sistema imune e atividade antiulcerogênica, o que faz seu
uso bastante freqüente na medicina popular (SAMUELSEN, 2000).
2.2.4 Própolis
Própolis é uma substância resinosa produzida pelas abelhas (Apis
mellifera L) e utilizada pela medicina popular devido às propriedades
farmacodinâmicas e antimicrobianas (VICENTE; HIROOKA, 1987).
Os componentes químicos da própolis têm sido isolados e
analisados em diferentes países, sendo o ácido cafeico, ácido cumárico e
flavonoides os possíveis responsáveis pelo poder antibiótico da resina. Pinocembrin,
galangin, sakuranetin, kaempferol e ácido hydroxycinamico, isolados e identificados
em própolis brasileiras são considerados flavonóides de ação antibiótica.
Essa substância é composta por 55% de resinas e bálsamos, 30%
de ceras, 10% de óleos voláteis 5% de pólem, sendo identificados ainda ácidos
aromáticos insaturados, flavonóides e microelementos. A composição química da
própolis varia de acordo com a espécie de abelha, a área geográfica de origem e
dos métodos de extração e controle de qualidade do produtor e até da época do
ano.
33
Própolis tem sido utilizada pela população mundial como
medicamento alternativo, indiscriminadamente e sem indicação médica. É ainda
considerada um cosmético.
A própolis é alvo constante de estudos in vitro e in vivo, em diversos
países, com o objetivo de se obter o máximo de informações, na tentativa de fazer
com que a Organização Mundial de Saúde (OMS), bem como os Ministérios de
Saúde dos diversos países aprovem a própolis como medicamento.
Segundo Cruz (1992) o extrato alcoólico de própolis apresenta
atividade antifúngica na concentração de 1,25g/mL, no entanto, apresenta apenas
atividade inibitória parcial para o desenvolvimento de leveduras nas concentrações
estudadas 1,25g/mL, 2,5g/mL e 5,0g/mL. Vicente e Hirooka (1987) estudaram a
atividade antimicrobiana de própolis frente a Streptococcus pyogenes,
microrganismos da microbiota bucal e fungos produtores de micotoxinas. Os autores
observaram que houve inibição da produção de hemolisina pelo S. pyogenes
quando semeado em ágar sangue e efeito bactericida da própolis sobre este
microrganismo em caldo BHI. Houve ação bacteriostática sobre a microbiota oral e
os fungos produtores de micotoxina não foram inibidos pela própolis.
Considerando que a própolis tem um baixo custo e por ser de fácil
acesso à população, não existindo contra-indicações quanto ao seu uso terapêutico,
ela poderá ser utilizada topicamente em pacientes portadores de candidose. Estudos
in vivo deverão ser feitos com rigor, considerando a dinâmica do corpo humano
como um todo, bem como a interferência de parâmetros sistêmicos na ecologia
bucal.
34
Figura 1- Anacardium occidentale (cajueiro) Figura 2- Arctium lappa (bardana)
Figura 3- Plantago major (tanchagem) Figura 4- Própolis bruta
35
3- PROPOSIÇÃO
Propusemo-nos a avaliar a ação antifúngica de três plantas
medicinais tradicionalmente usadas na medicina popular e da própolis frente a
leveduras do gênero Candida isoladas da cavidade bucal.
36
4- MATERIAL E MÉTODOS
4.1- Coleta de Saliva e Isolamento de Candida
Foram coletadas amostras de saliva de 86 pacientes, sendo 40
homens e 46 mulheres, com idade entre 18 e 82 anos, que procuraram atendimento
nas clínicas odontológicas da Universidade Estadual de Ponta Grossa. A saliva foi
coletada após o paciente estar ciente dos procedimentos a serem realizados e ter
assinado um termo de consentimento (Anexo A). Nenhum paciente apresentava
candidose clinicamente.
A saliva foi coletada com “swab” esterilizado, que foi passado por
toda a superfície da cavidade bucal, especialmente língua e palato. A seguir o
material foi semeado em placas contendo ágar Sabouraud Dextrose adicionado de
0.1mg de cloranfenicol (Carlo Erba – 0.1mg/mL de meio). As placas foram incubadas
a 37ºC/48h. Após este período, verificou-se o crescimento de colônias
características de Candida (colônias esféricas, branco-foscas com aspecto de
porcelana e odor característico) que foram confirmadas através de esfregaços
corados pelo Gram, onde se observou células Gram positivas, ovaladas, com ou
sem brotamento. Uma colônia de Candida de cada paciente foi transferida para água
destilada esterilizada e estocada para posterior identificação.
37
4.2 - Identificação das espécies de Candida
Para identificação das espécies de Candida, as amostras estocadas
em água destilada esterilizada foram semeadas em ágar Sabouraud Dextrose e
incubadas a 37ºC/24-48h. A identificação das espécies foi realizada de acordo com
o descrito por Samaranayake e MacFarlane, (1990) e Sandvén (1990) com
modificações, consistindo nas provas de formação de tubo germinativo, microcultivo
em ágar fubá, fermentação e assimilação de carboidratos.
4.2.1- Formação de tubo germinativo
A formação de tubo germinativo a partir das células leveduriformes
foi verificada inoculando-se uma alçada de cultura pura de 24h da levedura em 0.5
mL de soro de coelho estéril em tubo de ensaio. O tubo foi levado ao banho-maria a
37ºC por até 3h e a seguir o material foi homogeneizado e uma gota foi colocada
entre lâmina e lamínula para observação em microscopia de luz.
4.2.2- Microcultivo em ágar fubá
O ágar fubá (Anexo B) adicionado de 1% de Tween 80, previamente
fundido, foi colocado sobre lâminas de vidro esterilizadas no interior de placas de
Petri. Após solidificação do ágar, as amostras a serem identificadas foram semeadas
em estria central única na superfície do meio e cobertas com lamínulas. O material
foi incubado em temperatura ambiente por até 7 dias e a seguir levado ao
microscópio de luz para observação de clamidoconídios, hifas e leveduras.
38
4.2.3 Fermentação de carboidratos
Para verificação da fermentação de carboidratos pelas espécies de
Candida, utilizou-se o meio de cultura caldo vermelho de fenol adicionado de 1% dos
seguintes açúcares: glicose, maltose, sacarose e lactose. O meio de cultura com o
respectivo açúcar foi distribuído em tubos de ensaio contendo tubos de Duhran
invertidos em seu interior. Os tubos foram semeados com culturas puras de 24h das
amostras a serem identificadas e incubados a 37ºC por até 7 dias. Após este
período verificou-se a fermentação dos açúcares através da produção de ácido e
formação de gás. A produção de ácido foi observada pela queda do pH do meio de
cultura que faz com que sua cor inicialmente vermelha torne-se amarela. A produção
de gás foi verificada pela presença de bolhas de ar aprisionadas no interior do tubo
de Duhran.
4.2.4- Assimilação de carboidratos
Para esta prova, um meio quimicamente definido (Anexo C) foi
fundido e ao atingir a temperatura de 45ºC, foi vertido sobre 0.1 mL de suspensão de
Candida preparada a partir de crescimento de 24h da levedura e com concentração
correspondente ao tubo 10 da escala de McFarland. Após homogeneização em
movimentos em forma de 8 (oito), o meio foi deixado para solidificação. A seguir,
discos de papel de filtros embebidos em soluções a 20% de glicose, maltose,
sacarose, lactose, galactose e rafinose, foram colocados sobre a superfície do ágar.
Após incubação a 37ºC/48h, observou-se assimilação do açúcar através do
crescimento da levedura ao redor do disco de papel de filtro.
39
4.2.5 - Interpretação dos testes para identificação das espécies de Candida
As amostras de Candida foram identificadas através da interpretação
dos testes fornecida em Samaranayake e MacFarlane (1990) e Sandvén (1990) com
modificações e estão apresentadas no quadro abaixo.
QUADRO 1- Identificação de espécies de Candida através de formação de tubo germinativo (TG),
clamidoconídio (CL), hifas (HIF), provas de fermentação e assimilação de
carboidratos.
Fermentação Assimilação
Espécies de
Cândida
TG CL HIF GL S M L GA GL S M L GA R
C. albicans
+ + + A/G A/- A/G -/- A/G + + + - + -
C. Stellatoidea
V V + A/G A/- A/G -/- A/G + - + - + -
C.
guilliermondii
- - + A/G A/G -/- -/- A/G + + + - + +
C. glabrata
- - - A/G -/- -/- -/- -/- + - - - - -
C. krusei
- - + -/- -/- -/- -/- -/- + - - - - -
C. lipolytica
- - + A/G -/- -/- -/- -/- + - - - - -
C. lusitaniae
- - + A/G A/G -/- -/- A/G + + + - + -
C. parapsilosis
- - + A/G -/- -/- -/- V + + + - + -
C. tropicalis
- V + A/G A/G A/G -/- V + + + - + -
C. kerfyr
- - + A/G A/G -/- A/G A/G + + - + + -
GL: glicose, S: sacarose, M: maltose, L: lactose, Ga: galactose, R: rafinose
A: ácido; G: gás
(+): prova positiva; (-): prova negativa, (v): prova variável
4.3 - Manipulação dos Fitoterápicos
Para realização deste estudo foram manipulados extratos alcoólicos de
cajueiro (Anacardium occidentale), bardana (Arctium lappa), tanchagem (Plantago
major) a 60ºGL e tintura de própolis a 30% (Farmácia de Manipulação Ervafarma,
Ponta Grossa, PR), (Fig. 1). Os certificados de análise dos produtos utilizados foram
fornecidos pela Ervafarma manipulação, farmacêutica responsável Drª. Vera Lúcia
Daniel Pupo (Anexo D). Na tabela 1 está demonstrada a concentração dos extratos
e qual parte da planta utilizada para preparação dos mesmos.
40
TABELA 1- Descrição das características dos fitoterápicos testados frente à amostras de Candida
isoladas da cavidade bucal.
Planta Parte da planta Solvente Concentração
Cajueiro Casca Álcool de cereais 60%
Bardana Raiz Álcool de cereais 60%
Tanchagem Folha e flor Álcool de cereais 60%
Própolis - Álcool de cereais 30%
Figura 5 - Extratos de cajueiro, bardana, tanchagem e própolis de uso comercial, utilizados no
experimento.
41
4.4- Sensibilidade dos Isolados de Candida aos Fitoterápicos
4.4.1 Testes realizados para determinação da sensibilidade de Candida aos
fitoterápicos
A verificação da sensibilidade das amostras de Candida aos
fitoterápicos foi verificada através de testes in vitro e in vivo. Os testes in vitro foram:
a) teste de difusão em ágar, com discos de papel de filtro embebido no fitoterápicos
e com poços confeccionados nos meios de cultura; b) teste em tubo, com diluições
seriadas da levedura. Os testes in vivo foram: c) recuperação de C. albicans da
cavidade bucal de ratos tratados com fitoterápicos e d) desenvolvimento de
candidose na língua de ratos tratados com fitoterápicos. Os testes foram realizados
como descrito abaixo.
Testes in vitro
a) Teste de difusão em ágar (disco e poço)
A ação antifúngica dos extratos alcoólicos de cajueiro, bardana,
tanchagem e da tintura de própolis foi determinada através do teste de difusão em
ágar. As amostras de Candida, já identificadas foram semeadas em ágar Sabouraud
Dextrose e incubadas a 37ºC/ 24h. Do crescimento foi preparada uma suspensão
comparativa com o tubo 0.5 da escala de McFarland e ajustada em
espectrofotômetro, contando aproximadamente 10
6
ufc/mL. Após homogeneização,
alíquotas de 0.1 mL da suspensão foram semeadas em duplicata em placas
contendo ágar Sabouraud Dextrose. As placas foram levadas à estufa por 10 min
42
para secagem. A seguir, discos de papel de filtro foram embebidos com 10μL dos
fitoterápicos e depositados na superfície do ágar. As placas foram incubadas a
37ºC/48h. Após realizou-se a medição dos halos de inibição do crescimento fúngico.
Considerou-se o produto ativo contra as espécies fúngicas em estudo, aquele que
produziu halos acima de 10mm de diâmetro (QUEIROZ, 1998).
Em outras placas semeadas com as leveduras, poços de 0.5mm de
diâmetro por 0.4mm de profundidade foram confeccionados no ágar Sabouraud. A
seguir os poços foram preenchidos com os fitoterápicos e o processo seguiu-se
semelhante ao anterior.
b) Teste em tubo
A partir de suspensão de Candida comparativa com o tubo 0.5 da
escala de McFarland e ajustada em espectrofotômetro, contando aproximadamente
10
6
ufc/mL, foram feitas diluições decimais até 10
-5
. Da amostra mãe e de cada
diluição, foi transferido 1 mL para tubo de ensaio contendo 0.1 mL dos extratos de
cajueiro, bardana, tanchagem e própolis. Os tubos foram homogeneizados e
deixados em repouso por 10 min. A seguir 0.1 mL de cada tubo foi semeado em
placas contendo ágar Sabouraud Dextrose. As placas foram incubadas a 37ºC/48h e
a seguir foi determinado o número de ufc/mL de Candida viável em cada diluição.
43
Testes in vivo
c) Recuperação de Candida da cavidade bucal de ratos
Vinte e cinco ratos (Rattus novergicus albinus), machos, pesando
cerca de 250g, provenientes do biotério da Universidade Estadual de Ponta Grossa,
foram divididos em cinco grupos de quatro animais. Com o auxílio de uma seringa de
1 mL, os animais receberam 3 inoculações de 0.2 mL de suspensão contendo 10
8
células de C. albicans/mL na cavidade bucal, com intervalos de 1h entre elas. A
amostra de C. albicans utilizada foi isolada de um paciente deste estudo. Uma hora
após a última inoculação, os animais receberam os extratos de cajueiro, bardana,
tanchagem e própolis na água de beber, na concentração de 1,5% durante 24h.
Cinco ratos receberam água “ad libitum” e foram usados como controle. Vinte e
quatro horas após a inoculação, foi realizada a recuperação da levedura da cavidade
bucal dos ratos com o auxílio de um “swab” esterilizado que foi passado na pelas
estruturas bucais durante 1 minuto. O “swab” foi colocado em um tubo de ensaio
contendo 1.0 mL de solução fisiológica. A partir dessa amostra, foram feitas diluições
decimais até 10
-3
e alíquotas de 0.1mL da suspensão inicial e das diluições foram
semeadas em duplicata em ágar Sabouraud Dextrose adicionado de cloranfenicol.
As placas foram incubadas a 37ºC/48h e a seguir realizou-se a contagem do número
de ufc/mL de levedura recuperado da boca dos animais (Fig. 6). O mesmo
procedimento foi realizado fazendo-se uma única inoculação da levedura, com
sacrifício dos animais também após 24h.
44
d) Candidose na língua de ratos
Após realização da coleta de material para recuperação de Candida,
os animais foram sacrificados por inalação excessiva de éter etílico e a língua foi
retirada e fixada em formol a 10% para análise histológica. A língua foi seccionada
sagitalmente e transversalmente na região do tubérculo intermolar, processada e
incluída em parafina. Os cortes obtidos, de 5μm, foram corados pelas técnicas de
HE e PAS-H. A presença de candidose foi verificada por toda a extensão do epitélio
da língua, compreendendo as papilas cônicas simples da região anterior e as papilas
gigantes e verdadeiras da parte posterior da língua.
A B
C D
45
E
Figura 6 - A- Inoculação de C. albicans na cavidade bucal dos ratos; B - Transferência do “swab”
para tubo de ensaio contendo solução fisiológica, após recuperação da levedura; C-
Diluição da amostra; D – Semeadura em ágar sabouraud Dextrose; E – contagem do
número de ufc/mL de C. albicans recuperado da cavidade bucal dos animais.
4.5- Sensibilidade de Candida a antifúngicos comerciais (Antifungigrama)
4.5.1- Testes realizados
A sensibilidade das amostras de Candida aos antifúngicos
comerciais foi determinada através de dois testes: a) teste de difusão em ágar, com
discos embebidos no antifúngico (CECON Ltda) e b) teste ATB Fungus (bioMeriéux),
seguindo-se a metodologia determinada pelo fabricante, e descrita a seguir.
a) Teste de difusão em Agar
Das amostras de Candida isoladas e identificadas, foi selecionada
uma amostra de cada espécie para realização do antifungigrama. As espécies de
Candida foram semeadas em ágar sabouraud dextrose e incubadas a 37ºC/24h. Do
crescimento foi preparada uma suspensão comparativa com o tubo 0.5 da escala de
46
McFarland e ajustada em espectrofotômetro, contando aproximadamente 10
6
ufc/mL. Após homogeneização, alíquotas de 0.1 mL da suspensão foram semeadas
em duplicata em placas contendo ágar Sabouraud dextrose. As placas foram
levadas à estufa por 10 min para secagem. A seguir, discos de papel de filtro
embebidos nos antifúngicos (Nistatina 100 UI, Ketoconazol 50 mcg, Anfotericina B
100 mcg, Fluconazol 25 mcg, Clotrimazol 50mcg, Miconazol 50 mcg, 5
Fluorocitosina 1 mcg, 5 Fluorocitosina 10 mcg, CECON – Centro de Controle e
Produtos para Diagnóstico Ltda.), foram depositados sobre a superfície do meio de
cultura. Após incubação a 37ºC/48h, foi realizada a medição dos halos de inibição do
crescimento e feita comparação com tabela enviada pelo fabricante (Anexo E) (Fig
6).
b)- ATB fungus
As galerias ATB FUNGUS (bioMeriéux – Anexo F) permitem
determinar a sensibilidade das leveduras em meio semi-sólido. As galerias contêm
16 pares de cúpulas; 04 pares não contêm antifúngico e servem de controle de
cultura. Os outros pares contém diferentes antifúngicos em duas concentrações para
classificar as estirpes. Dois antifúngicos estão presentes em várias concentrações, o
que permite completar a resposta mediante uma CMI. A levedura a analisar é posta
em suspensão e depois transferida para o meio de cultura e inoculada na galeria.
Após 24-48 horas de incubação, a leitura do crescimento fez-se com o sistema ATB.
O resultado permite classificar a estirpe como Sensível, Intermediaria ou Resistente
(Fig. 4).
47
4. 5.2- Preparação do inóculo
Preparou-se uma suspensão de leveduras com opacidade equivalente ao
padrão dois de McFarland na ampola presente no Kit; utilizou-se para verificação o
densitômetro fornecido pela bioMérieux. Transferiram-se 100μl desta suspensão
para uma ampola de ATB F Medium utilizando-se uma pipeta automática (Fig. 9).
4.5.3 - Inoculação da galeria
Foi utilizado o método automático, no qual colocou-se no suporte do
inoculador ATB uma galeria, uma ponta ATB e duas ampolas de ATB F Medium,
inoculadas como acima mencionado. A ampola da direita recebeu 50μl de ATB F
Buffer (substância tampão). O inoculador realiza automaticamente a
homogeneização do ATB F Medium e o preenchimento das cúpulas (Figura 5).
Colocou-se uma tampa na galeria e incubou-se por 48 horas a 30° C em aerobiose.
4.5.4- Leitura da galeria e interpretação
Foi usado o método automático, com o software fornecido pela
bioMérieux. Colocou-se a galeria no suporte do aparelho ATB e deu-se a ordem de
leitura ao computador (Figura 10). Os antifúngicos usados no teste foram Flucitosina,
Anfotericina B, Nistatina, Miconazol, Econazol e Ketoconazol.
48
Figura 7 - Antifúngicos comerciais utilizados no experimento
do teste de difusão em ágar
A B
C
Figura 8 - Sistema ATB FUNGUS – A: ATB- MÉDIUM: meio de preparo da suspensão de
Candida, B: ATB- BUFFER: solução tampão, C: Galeria de antifúngicos em
diferentes concentrações.
49
Figura 9 - Sistema ATB FUNGUS: Pipetador automático e densitômetro para padronização da
suspensão de Candida.
Figura 10 - Sistema ATB FUNGUS: Leitora da galeria de antifúngicos
e software (bioMeriéux) para o teste.
5- RESULTADOS
5.1- Coleta de Saliva e Isolamento de Candida.
A pesquisa de Candida na cavidade bucal foi realizada em 86
pacientes, sendo 40 do sexo masculino e 46 do sexo feminino, com idade entre 18 e
82 anos. Destes 86 pacientes, 38 (44.18%) foram positivos para Candida, sendo 20
(23.25%) homens e 18 (20.93%) mulheres. Nenhum dos pacientes apresentava
candidose clínica.
5.2- Identificação das Espécies de Candida
Das 38 amostras isoladas, 18 foram caracterizadas como C.
albicans, 13 como C. tropicalis, 3 como C. parapsilosis, 2 como C. guilliermondii, 1
C. krusei e 1 C. kerfyr.
5.3- Sensibilidade dos Isolados de Candida aos Fitoterápicos e Própolis
Foram realizados quatro tipos de testes, dois in vitro e dois in vivo:
Os testes in vitro são: a) teste de difusão em agar, b) teste em tubo de ensaio. Os
testes in vivo são: c) recuperação de Candida da boca de ratos e d) candidose na
língua de ratos.
51
a) Teste de difusão em agar
Quando se comparou os resultados obtidos nos métodos de discos
de papel e poços confeccionados no ágar, os resultados foram semelhantes. Assim,
apenas os resultados em disco de papel serão apresentados.
As amostras foram consideradas sensíveis aos extratos de cajueiro, bardana,
tanchagem e própolis, quando os halos de inibição de crescimento foram superiores
a 10mm, segundo proposto por Queiroz (1998).
5.3.1- Cajueiro
O número e porcentagem de amostras de Candida sensíveis ao
extrato de cajueiro está demonstrado na tabela 2.
Das 18 amostras de C. albicans testadas, em sete não houve
inibição do crescimento (0 mm); e em 4 amostras o diâmetro variou entre 6 e 7 mm.
Sete isolados apresentaram halos com diâmetros maiores que 10mm, que variaram
entre 11 e 15mm. Para C. tropicalis, sensibilidade ao extrato de cajueiro foi
observada em 4 das 13 espécies, com halos entre 10 e 13mm. As amostras de C.
parapsilosis, C. guillliermondii, C. krusei e C. kerfyr não foram inibidas pelo extrato
(Gráfico 1).
Tabela 2- Número de amostras de C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. guillliermondii, C.
krusei e C. kerfy que apresentaram sensibilidade ao extrato de cajueiro.
Espécies de
Candida
Número de amostras sensíveis % de amostras
sensíveis
C. albicans (n=18) 7 38.9%
C. tropicallis (n=13) 4 30.8%
C. parapsilosis (n=3) 0 0
C. guilliermondii (n=1) 0 0
C. krusei (n=1) 0 0
C. kerfyr (n=1) 0 0
52
0
2
4
6
8
10
12
14
16
halos em mm
C. Albicans C. Tropicallis C. Parapsilosis C. Guilliermondii C. Krusei C. Kerfyr
1
2
3
4
5
6
7
Gráfico 1 - Halos de inibição de crescimento de C. albicans, C. tropicallis, C. parapsilosis,
C.guilliermondii, C. krusei e C. kerfyr frente ao extrato de cajueiro
5.3.2- Bardana
O número de amostras de Candida sensíveis ao extrato de bardana
está demonstrado na tabela 3.
Das 18 amostras de C. albicans testadas, em 11 não houve inibição
do crescimento (0 mm); e em cinco amostras o diâmetro variou entre 6 e 9 mm.
Apenas 2 das amostras isoladas apresentaram halos de inibição com diâmetros
maiores que 10mm, sendo uma com 11mm e a outra com 12mm. Para C. tropicalis,
sensibilidade ao extrato de bardana foi observada em 1 amostra, com inibição de
crescimento de 14mm; 11 foram negativas e apenas 1 apresentou halo de 9mm. As
amostras de C. parapsilosis, C. guilliermondii, C. krusei e C. kerfyr não foram
inibidas pelo extrato (Gráfico 2).
53
Tabela 3 - Número de amostras de C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. guillliermondii, C.
krusei e C. kerfyr que apresentaram sensibilidade ao extrato de bardana.
Espécies de
Candida
Número de amostras sensíveis % de amostras
sensíveis
C. albicans (n=18) 2 11.1%
C. tropicallis (n=13) 1 7.6%
C. parapsilosis (n=3) 2 66.6%
C. guilliermondii (n=1) 0 0
C. krusei (n=1) 0 0
C. kerfyr (n=1) 0 0
0
2
4
6
8
10
12
14
halos em mm
C. Albicans C. Tropicallis C. Parapsilosis C. Guilliermondii C. Krusei C. Kerfyr
1
2
Gráfico 2 - Halos de inibição de crescimento de C. albicans, C. tropicallis, C. parapsilosis,
C.guilliermondii, C. krusei e C. kerfyr frente ao extrato de bardana.
5.3.3- Tanchagem
O número de amostras de Candida sensíveis ao extrato de
tanchagem está demonstrado na tabela 4. Das 18 amostras de C. albicans testadas,
em 11 não houve inibição do crescimento (0 mm); e em cinco amostras o diâmetro
variou entre 6 e 9 mm. Apenas 2 das amostras isoladas apresentaram halos de
inibição com diâmetros de 10mm. Para C. tropicalis, sensibilidade ao extrato de
tanchagem foi observada em 1 amostra, com inibição de crescimento de 12mm e as
54
demais foram negativas. A amostra de C. guilliermondii apresentou halo de inibição
de 9mm. As amostras de C. parapsilosis, C. krusei e C. kerfyr não foram inibidas
pelo extrato (Gráfico 3).
Tabela 4 - Número de amostras de C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. guilliermondii, C.
krusei e C. kerfyr que apresentaram sensibilidade ao extrato de tanchagem.
Espécies de
Candida
Número de amostras sensíveis % de amostras
sensíveis
C. albicans (n=18) 2 11.1%
C. tropicallis (n=13) 1 7.6%
C. parapsilosis (n=3) 0 0
C. guilliermondii (n=1) 0 0
C. krusei (n=1) 0 0
C. kerfyr (n=1) 0 0
9
9,5
10
10,5
11
11,5
12
halos em mm
C. Albicans C. Tropicalis
1
2
Gráfico 3 - Halos de inibição de crescimento de C. albicans, C. tropicallis, C. parapsilosis,
C.guilliermondii, C. krusei e C. kerfyr frente ao extrato de tanchagem
5.3.4- Própolis
Dentre os extratos testados, a própolis foi a mais eficaz, inibindo o
crescimento de 72.2% das amostras de C. albicans, 84.6% das amostras de C.
tropicalis, 66.6% das amostras de C. parapsilosis. C. kruzei não foi sensível ao
extrato de própolis (Tabela 5).
55
Das 18 amostras de C. albicans testadas, em três não houve
inibição do crescimento (0 mm); e em duas amostras o diâmetro foi de 9mm. Nas 13
restantes, o diâmetro dos halos de inibição variou entre 10 e 23 mm. Para C.
tropicalis, sensibilidade ao extrato de própolis foi observada em 11 das 13 amostras
estudadas, sendo que nas duas outras os halos apresentavam 7 e 8 mm. Uma
amostra de C. parapsilosis e a amostra de C. krusei apresentaram halos medindo
respectivamente 6 e 8 mm. As duas amostras de C. parapsilosis apresentaram halos
de inibição entre 12 e 14 mm e as de C. guilliermondii e C. kerfyr, apresentaram
respectivamente 13 e 19 mm de diâmetro do halo de inibição (Gráfico 4).
Tabela 5 - Número de amostras de C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. guillliermondii, C.
krusei e C. kerfy que apresentaram sensibilidade ao extrato de própolis.
Espécies de
Candida
Número de amostras sensíveis % de amostras
sensíveis
C. albicans (n=18) 13 72.2%
C. tropicallis (n=13) 11 84.6%
C. parapsilosis (n=3) 2 66.6%
C. guilliermondii (n=1) 1 100%
C. krusei (n=1) 0 0%
C. kerfyr (n=1) 1 100%
0
5
10
15
20
25
halos em mm
C. Albicans C. Tropicallis C. Parapsilosis C. Guilliermondii C. Krusei C. Kerfyr
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Gráfico 4 - Halos de inibição de crescimento de C. albicans, C. tropicallis, C. parapsilosis,
C.guilliermondii, C. krusei e C. kerfyr frente ao extrato de própolis
56
Própolis apresentou maior atividade inibitória frente a todas as
espécies, exceto C. kruzei, que não foi sensível a nenhum deles. Cajueiro foi eficaz
para inibir grande número de amostras de C. albicans e C. tropicalis. Bardana e
tanchagem mostraram efeito apenas sobre um número pequeno de amostras. C.
kruzei não foi inibida por nenhum dos produtos testados (Tabela 6).
Tabela 6 - Número e porcentagem de amostras sensíveis aos extratos de cajueiro, bardana,
tanchagem e própolis e média do diâmetro (em mm) dos halos de inibição do
crescimento das espécies de Candida testadas.
Extratos Cajueiro Bardana Tanchagem Própolis
amostras halo amostras halo amostras halo amostras halo
C. albicans
7 (38.9%) 12 2 (11.1%) 11,5 2 (11.1%) 10 13 (72.2%) 15,8
C. tropicalis
4 (30.8%) 11.5 1 (7.6%) 14 1 (7.6%) 12 11 (84.6%) 16.2
C. parapsilosis
0 2 (66.6%) 13 0 2 (66.6%) 13
C. guilliermondii
0 0 0 1 (100%) 13
C. kruzei
0 0 0 0
C. kerfyr
0 0 0 1 (100%) 19
Figura 11 – Halo de inibição de crescimento produzido pela própolis frente a
amostra de C. albicans.
D
57
Figura12- Halos de inibição produzidos pelos extratos de cajueiro, bardana, tanchagem e própolis
frente à amostra de C. albicans (A) e C. parapsilosis (B).
b) Teste em tubo
Quando a suspensão das espécies de C. albicans, C. tropicalis, C.
parapsilosis, C. guilliermondii, C. krusei e C. kerfyr, padronizada através do tubo 0.5
da escala de McFarlane e espectrofotômetro foi semeada em ágar Sabouraud
Dextrose, determinou-se a presença de 3.6 a 4.0 X 10
6
células/mL. Após 10 min em
contato com os extratos de cajueiro, bardana, tanchagem e própolis, houve redução
acentuada no número de leveduras viáveis (Tabela 7).
O crescimento de C. albicans e C. tropicalis foi completamente
inibido pelos extratos de tanchagem e própolis. Ocorreu redução de 10
6
para 10
4
células/mL com o extrato de cajueiro e de 10
6
para 10 com o extrato de bardana.
Após 10 min, não houve crescimento de C. parapsilosis, C. guilliermondii,
C. krusei e C. kerfyr submetidas à ação da bardana, tanchagem e própolis (Tabela
7).
58
Tabela 7- Efeito bactericida de extratos de cajueiro, bardana, tanchagem e própolis frente a amostras
de Candida.
Espécies Controle Cajueiro Bardana Tanchagem Própolis
C. albicans
3.6 X 10
6
2.0 X 10
4
3.0X 10 0 0
C. tropicallis
4.0 X 10
6
18.2 X 10
4
2.0 X 10 0 0
C. parapsilosis
4.0 X 10
6
2.0 X 10
3
0 0 0
C. guilliermondii
3.6 X 10
6
0 0 0 0
C. kruzei
3.6 X 10
6
0 0 0 0
C. kerfyr
3.6 X 10
6
0 0 0 0
Figura13- Efeito bactericida sobre C. albicans após 10 minutos em contato com os extratos de
cajueiro (A) bardana (B), tanchagem (C) e própolis (D), quando comparados com o controle
(E).
bardana
cajueiro
Tanchagem
Própolis
Control
59
c) Recuperação de C. albicans da cavidade bucal dos ratos
C. albicans foi recuperada da cavidade bucal dos animais 24h após
inoculação da levedura. Os produtos mais eficazes na redução de C. albicans na
cavidade bucal dos ratos foram, em ordem decrescente: própolis, tanchagem,
bardana. O extrato de cajueiro não foi eficaz, sendo o número de leveduras
recuperado superior ao controle (Tabela 8).
Tabela 8- Média e desvio padrão do número de ufc/mL de C. albicans recuperado da cavidade
bucal dos ratos 24h após 3 inoculações da levedura.
Extratos ufc/mL de C. albicans
Cajueiro
14.3x10
2
±13.3x10
2
Bardana
11.2x10
2
±13.5x10
2
Tanchagem
4.1x10
2
±1.5x10
2
Própolis
0.8x10
2
±0.4x10
2
Controle
12.6x10
2
±6.8x10
2
Tabela 9 - Média e desvio padrão do número de ufc/mL de C. albicans recuperado da cavidade bucal
dos ratos 24h após inoculação única da levedura.
Extratos ufc/mL de C. albicans
Cajueiro
1.25x10
3
±1.19x10
3
Bardana
0,60x10
3
±0,27x10
3
Tanchagem
0,27x10
3
±0,16x10
3
Própolis
0,31x10
3
±0,22x10
3
Controle
1,02x10
3
±1.3210
3
c) Candidose na língua de ratos
Candidose foi verificada no epitélio da superfície dorsal da língua,
abrangendo as papilas cônicas simples, gigantes e verdadeiras. Candidose
caracterizou-se pela presença de hifas no interior da camada de queratina do
60
epitélio. Após 3 inoculações consecutivas, com intervalos de 1h entre elas, não
foram observadas áreas de candidose nos grupos tratados com os fitoterápicos. Nos
animais controle, o número de áreas com candidose foi extremamente baixo, tendo
sido observadas 3 áreas em 3 animais. Presença de microabscesso intraepitelial
também foi observada em uma dessas áreas. Em um rato tratado com tanchagem,
observou-se a presença de microabscesso intraepitelial, sem a presença de hifas.
Todas as áreas de candidose foram encontradas na região das papilas cônicas
simples que revestem a porção anterior da língua.
Podemos deduzir que a não fixação da C. albicans na língua dos
ratos pode ser devido a baixo patogenicidade das cepas ou falta de tatos
predisponentes.
Figura 14 - Área de candidose observada na região das papilas cônicas simples de um animal
controle, onde se observa a presença de hifas no interior da camada de queratina.400X.
61
Figura 15- Presença de infiltrado inflamatório polimorfonuclear, com formação de microabscesso
intraepitelial sem a presença de hifas de C. albicans, na região das papilas cônicas
simples de rato controle. 400X
5.4- Sensibilidade dos Isolados de Candida aos Antifúngicos Comerciais
a) Teste de difusão em ágar (antifungigrama)
O antifungigrama foi realizado com uma amostra de cada espécie de
C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. guilliermondii isolada da cavidade
bucal. As amostras foram testadas frente aos seguintes antifúngicos: Fluconazol
62
25mcg (FLU), 5 Fluorocitosina 10mcg (5FC), 5 Fluorocitosina 1mcg (5FC),
Ketoconazol 50mcg (KET), Nistatina 100UI (NY), Miconazol 50mcg (MCZ),
Clotrimazol 50mcg (CTR), Econazol 50mcg (EC), Anfotericina B 100mcg (AB) –
CECON - Centro de Controle e Produtos para Diagnóstico. A interpretação dos
resultados é realizada de acordo com a especificação técnica do fabricante (Anexo
E). As amostras de C. albicans e C. tropicalis A testadas apresentaram resistência
ao 5FC 1 e 10mcg.
Tabela 10 - Diâmetro dos halos de inibição de crescimento produzido pelos antifúngicos testados
frente a amostras de Candida.
Antifúngicos
C. albicans C. tropicalis C. parapsilosis C. guilliermondii
FLU
S S S S
5 FC 10
R R S S
5 FC 1
R R S S
KET
S S S S
NY
S S S S
MCZ
S S S S
CTR
R S S S
EC
S S S S
AB
S S S S
63
Figura 16- Halos de inibição de crescimento observado em antifungigrama com discos de papel
realizado nas amostras de C. tropicalis (B) e C. guilliermondii (C).
b) ATB-Fungus
A leitura das galerias com os antifúngicos frente a amostras de
Candida estão demonstradas na tabela 10. Apenas 2 amostras de C. tropicalis
mostraram-se resistentes miconazol, Econazol e ketoconazol (Fig. 5).
64
Tabela 11- Sensibilidade das amostras de Candida aos antifúngicos testados no teste ATB-Fungus.
Amostras Flucitosina Anfotericina Nistatina Miconazol Ecoconazol Ketoconazol
C. albicans A
S S S S S S
C. albicans B
S S S S S S
C. tropicalis A
S S S S S S
C. tropicalis B
S S S S R R
c. Tropicalis C
S S S R R R
C. parapsilosis
S S S S S S
C. guilliermondii
S S S S S S
C. Kerfyr
S S S S S S
Figura 17- Galeria ATB-FUNGUS com amostra de Candida semeada para incubação e teste
frente aos antifúngicos.
65
Figura 18- Galeria ATB-FUNGUS após incubação mostrando a resistência de C. tropicalis
a dois antifúngicos, como mostrado na tabela 10.
66
5.5- Análise estatística
Para análise dos dados obtidos com os testes in vivo foi utilizado o
modelo paramétrico de análise de variância de dois critérios (ANOVA – two way),
considerando as variáveis fixas, o número de inoculações e as substâncias
utilizadas, sendo a variável de comparação o número de unidades formadoras de
colônias/mL (10
3
). A normalidade foi testada através do teste de Shapiro-Wilk, a
equivalência das variâncias (hemocedasticidade) analisada com o teste de Levene.
Caso fossem observadas diferenças significativas entre os grupos, as comparações
seriam feitas através do teste de comparações múltiplas de Tukey.
A análise dos dados referentes à diâmetro dos halos de inibição
obtidos com os ensaios in vitro, foi realizada com o teste não paramétrico de
Kruskal-Wallis. Caso fossem encontradas diferenças entre os grupos, as
comparações entre os grupos seriam realizadas com o teste de Dunn.
O nível de significância estabelecido foi de 5% (α=0,05), ou seja, se
p<0,05, as diferenças entre os grupos seria considerada significativa, não aceitando
assim a hipótese de nulidade (H
o
). Todos os cálculos foram realizados utilizando os
softwares SPSS® (Statistical Package for the Social Sciences) version 11.5.1 for
Windows (SPSS Inc. Chigaco Illinois USA) e GraphPad InStat version 3.05
(GraphPad Software, Inc., San Diego California USA).
Resultados
O resultado do teste de normalidade para o ensaio in vivo, mostrou
que a maioria dos grupos apresentava uma aproximação de uma distribuição normal
de acordo com o teste de Shapiro-Wilk (Tabela 12). A análise da equivalência das
variâncias (teste de Levene) não foi significativa considerando os grupos
independentes do número de inoculações (p=0,058), conforme a Tabela 13.
67
Tabela 12- Teste de normalidade (Shapiro-Wilk) para a recuperação de ufc/10
3
mL nos grupos
Substância Estatística Graus de Liberdade Signficância
Cajueiro 0,888 10 0,162
Bardana 0,855 10 0,066
Tanchagem 0,850 10 0,058
Própolis 0,750 10 0,004*
Controle 0,903 10 0,238
*p<0,05 – considerado signficativo
Tabela 13- Teste de equivalência das variâncias (Levene) para a recuperação de ufc/10
3
mL nos
grupos.
Fisher Graus de Liberdade 1 Graus de Liberdade 2 Significância
2,055 9 40 0,058
*p<0,05 – considerado signficativo
Os resultados da comparação contagem de UFC10
3
/mL utilizando o
teste ANOVA com dois critérios, mostraram diferenças significativas considerando os
fatores inoculação (p<0,001), substâncias (p=0,001), não ocorrendo diferenças
significativas entre a interação inoculação e substâncias (p=0,059). Os resultaddos
são apresentados na Tabela 14.
Tabela 14- Análise de variância – dois critérios. ufc10
3
/mL
Causas de variação
Soma dos
quadrados
Graus de
liberdade
Médias dos
quadrados
F Significância.
Inoculação
8,225 1 8,225 16,289 P<0,001*
Susbstâncias
11,748 4 2,937 5,817 P=0,001*
Inoculação x substâncias
5,008 4 1,252 2,480 P=0,059
Tratamentos
24,981 9 2,776 5,947 P<0,001*
Residuo
20,197 40 0,505 - - - - - -
Total
45,178 59 - - - - - - - - -
*p<0,05 – considerado signficativo
68
Como foram observadas diferenças estatísticas para o fator
substâncias, realizou-se o teste de comparações múltiplas de Tukey, para identificar
onde situavam-se as diferenças (Gráfico 5 e Tabela 15).
Tabela 15- Comparações múltiplas de Tukey – Fator substâncias
Intervalo de confiança 95%
(I) Substância
(J) Substância
Diferenças media
(I-J)
Significância.
Limite inferior
Limite
superior
Cajueiro - Bardana 0,3628 P=0,784 -0,5448 1,2704
Cajueiro - Tanchagem
0,2128 P=0,962 -0,6948 1,1204
Cajueiro - Própolis
1,1269 P=0,008* 0,2193 2,0345
Cajueiro - Controle
-0,3266 P=0,841 -1,2342 0,5810
Bardana - Tanchagem
-0,1500 P=0,989 -1,0576 0,7576
Bardana - Própolis 0,7641 P=0,135 -0,1436 1,6717
Bardana - Controle
-0,6894 P=0,212 -1,5971 0,2182
Tanchagem - Própolis
0,9140 P=0,048* 0,0064 1,8217
Tanchagem - Controle
-0,5394 P=0,447 -1,4471 0,3682
Própolis- Controle
-1,4535 P<0,001* -2,3611 -0,5459
Inoculação-1
Inoculação-3
Inoculação
Cajueiro Bardana Tanchagem Própolis Controle
Substância
0,00
1,00
2,00
3,00
U
FC
x
1
0
0
0
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
*
* versus Cajueiro, Tanchagem e Controle p<0,05 - Significativo
Gráfico 5- UFC x 10
3
/mL com as diferenças entre substâncias e inoculações (Média e Erro padrão).
69
Os dados obtidos com os ensaios in vitro com C. albicans,
mostraram diferenças significativas (Teste de Kruskal-Wallis) considerando as
substâncias (p<0,001), os dados são mostrados na Tabela 16. As diferenças entre
os grupos foram analisadas através do teste de comparações múltiplas de Dunn
(Tabela 17). Os resultados são apresentados no Gráfico 6.
Tabela 16- Postos médios para os escores de halo de inibição para C. albicans – a Teste
de kruskal-Wallis
Substâncias N Soma dos Postos Postos Médios
Cajueiro
18 695,00 38,61
Bardana
18 511,00 28,39
Tanchagem
18 479,00 26,61
Própolis
18 943,00 52,39
KW=19,527 (corrigido para empates) – p<0,001* - Diferenças significativas
Tabela 17- Diferenças entre os grupos – Comparações múltiplas de Dunn.
Comparação Diferenças entre os postos Significância
Cajueiro x Bardana 10,222 P>0,05
Cajueiro x Tanchagem 12,000 P>0,05
Cajueiro x Própolis -13,778 P>0,05
Bardana x Tanchagem 1,778 P>0,05
Bardana x Própolis -24,000 P<0,01*
Tanchagem x Própolis -25,778 P<0,001*
0
1
2
3
E
s
c
o
r
e
(
H
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l
o
)
*
C
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j
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p
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l
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S
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n
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2
4
6
8
1
0
C
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s
d
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i
n
i
b
i
ç
ã
o
* versus Bardana e Tanchagem p<0,05 - Significativo
Gráfico 6- Escores dos halos de inibição para C. albicans .
70
Os escores de diâmetro dos halos de inibição para C albicans2
considerando as substâncias, apresentaram diferenças significativas utilizando o
teste de Kruskal-Wallis (p<0,001). Os dados são apresentados na Tabela 18. As
diferenças entre os grupos foram analisadas através do teste de comparações
múltiplas de Dunn (Gráfico 7 e Tabela 19).
Tabela 18- Postos médios para os escores de halo de inibição para C albicans2 – a Teste
de kruskal-Wallis
substâncias N Soma dos Postos Postos Médios
Cajueiro
13 319,00 24,54
Bardana
13 251,00 19,01
Tanchagem
13 233,00 17,92
Própolis
13 575,00 44,23
KW=32,190 (corrigido para empates) – p<0,001* - Diferenças significativas
Tabela 19- Diferenças entre os grupos – Comparações múltiplas de Dunn.
Comparação Diferenças entre os postos Significância
Cajueiro x Bardana 5,231 P>0,05
Cajueiro x Tanchagem 6,615 P>0,05
Cajueiro x Própolis -19,692 P<0,01*
Bardana x Tanchagem 1,385 P>0,05
Bardana x Própolis -24,923 P<0,001*
Tanchagem x Própolis -26,308 P<0,001*
0
1
2
3
H
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C
a
j
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B
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,
0
2
,
5
5
,
0
7
,
5
1
0
,
0
C
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n
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g
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m
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s
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s
c
o
r
e
s
d
e
h
a
l
o
d
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i
n
i
b
i
ç
ã
o
*
* versus todos os grupos p<0,05 - Significativo
Gráfico 7- Escores dos halos de inibição par C albicans2 .
6- DISCUSSÃO
A candidose bucal é uma infecção oportunista acometendo na
maioria das vezes indivíduos imunocomprometidos. (NORD, 1990).
O avanço da medicina em técnicas de transplantes nos leva à
indução de imunossupressão. Novos antibióticos de amplo espectro causam
distúrbios na microbiota residente. Portadores de HIV tem distúrbios graves do
sistema imunológico (KEUNETH; ROLSTON, 2003). A forma tradicional de
tratamento é o uso de antifúngicos derivados poliênicos e azólicos (COSTA, 1996).
Porém a possibilidade de efeitos colaterais deve ser considerada (LAGUNA et al.,
1996). Embora poucas plantas sejam usadas como princípios curativos (COWAN,
1999), o uso de plantas medicinais e produtos naturais devem ser considerados uma
alternativa válida de tratamento da candidiase bucal. A literatura sobre a ação
antifúngica de produtos naturais e fitoterápicos é escassa, sendo que a maioria dos
estudos verifica seu potencial como antibióticos, antiinflamatórios, colagogos e
produtos dermatológicos. Produtos naturais como substâncias antimicóticas não são
muito estudados. O efeito antifúngico de plantas como, estragão e tomilho já foram
demonstrados (DUKE; 1985; BRANTNER et al., 1996). O eugenol extraído do cravo
da índia tem efeito antifúngico (DUKE, 1985). O Anacardiun occidentale (cajueiro) foi
estudado (AKIPENDU, 2001) quanto a sua ação antibacteriana, mostrando-se
efetivo para bactérias G+ e G- (KUDI, 1999). Também a ação do cajueiro contra o
Helicobacte. pillori foi eficiente (KUBO et al., 1999). Em um estudo (QUEIROZ, 1999)
demonstrou a ação antifúngica do cajueiro no percentual de 64,3% contra o gênero
Candida nas espécies: C.albicans, C. stellatoidea, C.guilliermondiii, C. krusei C.
tropicalis. Na concentração de 5000mg/mL.
72
Nossos resultados com o cajueiro, in vitro demonstraram inibição de
11 amostras de C. albicans das 18 encontradas, 4 de C. tropicalis das 13
encontradas, sendo nossos resultados 38,9% e 30% de inibição respectivamente.
Não tendo ação inibitória sobre as outras espécies de Candida descritas nos
resultados. Talvez essa diferença com os resultados de (QUEIROS, 1999) a
pesquisadora obteve uma ação inibitória de 64,3% na maior concentração por ela
utilizada (5000ug/mL) se deva ao veículo usado por essa pesquisadora (solução
aquosa); nós usamos solução alcoólica na concentração de 60% (comercial) no
estudo de Queiroz foi 4% (preparo próprio).
No teste in vivo (recuperação de C.albicans da cavidade bucal de
ratos), o cajueiro não foi eficaz, sendo o número de leveduras recuperadas
superiores ao do controle. No exame histopatológico não foram encontradas hifas
indicando não haver efetiva colonização.Isto talvez devido à ausência nos animais
de fatores predisponentes ou a pouca patogenicidade da levedura (visto que na
coleta nenhum paciente tinha candidose clinicamente detectável. A ação dos
quimioterápicos como mostram os resultados foi considerada dentro da normalidade
nos dois testes efetuados (disco impregnado e ATB Fungus).
Arctium lappa (bardana) possui ação antibiótica, antifúngica
comprovada por Blanco (2003). Sua ação medicamentosa é antiga, porém de modo
empírico sempre foi usada e pouquíssimo foi realizado até os dias de hoje em
termos científicos. Apresenta boas qualidades nutricionais, sendo consumida não só
no Brasil, como na Europa e Japão. Também é popularmente usada como
depurativo e cicatrizante. No nosso experimento de 11 amostras de Candida 5
demonstraram sensibilidade a bardana sendo 2 C.albicans 1 C. tropicalis e 2
C.parapsilosis, com halos de inibição de crescimento superiores a 10mm.
73
No teste em tubo a redução ocorre no valor de 10
6
para 10 ufc/mL.
No teste in vivo a bardana comportou-se com uma redução de 4 vezes o número
ufc/mL.
A Plantago major (tanchagem) pertence a uma família de inúmeros
membros, sendo conhecida em nosso país por nomes como tansagem e língua de
vaca. Foi demonstrado por Zanon et al. (1999) seu efeito antiviral, contra o Herpes
vírus. Também Hertland (1999) mostrou sua ação antibiótica contra o Streptococcus
pneumoniae em camundongo. Estudos de Holetz et al. (2002) demonstraram sua
ação antibacteriana e antifúngica. Samuelsen (2002) demonstrou seu uso na
medicina popular como antiinflamatório, analgésico e cicatrizante. Em nosso
experimento, nos testes in vitro a tanchagem teve ação antimicótica com 2 amostras
de C. albicans e 1 C. tropicalis. Sendo que nos testes em tubo C. albicans e C.
tropicalis foram inibidas completamente. O teste in vivo sua recuperação foi igual ao
da bardana, isto é uma redução de 4 vezes o número de ufc/mL.
Sobre a substância natural própolis existem estudos de mais
consistência sobre suas propriedades medicinais, porém como antimicótico não
existem muitos trabalhos sobre sua ação. Suas propriedades antimicrobianas foram
descritas por Vicente e Hirooka (1987). Seu poder de evitar a decomposição foi visto
por Franco e Bueno (1999). Sua ação contra o Streptococcus pyogenes foi estudada
por Vicente e Hirooka (1987). Sua ação antifúngica na concentração de 1.25mg/mL
foi demonstrado por Cruz (1992). Em nossos testes a própolis foi o produto que teve
a melhor ação antifúngica entre os analisados.
Nos testes in vitro provocou inibição em 72.2% das amostras de C.
albicans, 84,6% das amostras de C. tropicalis, 66,6% das amostras de C.
parapsilosis, com halos de inibição igual ou superior a 10mm. No teste em tubo o
74
crescimento de C. albicans e C. tropicalis foi inibido completamente. No exame in
vivo o menor índice de recuperação, isto é, a melhor ação antimicótica foi a da
substância natural própolis.
Quando se investigam novos produtos ou técnicas, não se tem a
pretensão de elucidar completamente o tema, mas estabelecer-se bases sólidas de
um estudo com consistência. O uso de plantas medicinais e substâncias naturais
como antimicóticos é um assunto novo que merecem mais atenção e pesquisas. Os
resultados deste estudo sugerem uma sensibilidade de espécies de Candida,
principalmente à própolis. Estudos posteriores são necessários para se determinar o
uso de tais substâncias como agentes profiláticos e terapêuticos nas candidoses
bucais, tornado-os mais uma arma na mão de cirurgiões dentistas no controle de
infecções oportunistas tão freqüentemente encontradas na odontologia como as
candidoses.
As comprovações cientificas, seus resultados e ações merecem um
estudo de maior profundidade, visto que seu baixo custo, efeitos colaterais de pouca
intensidade e a grande biodiversidade de nosso país os justificam plenamente.
7- CONCLUSÕES
• O produto natural própolis apresentou melhor ação antifúngica
frente às espécies de Candida albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C.
guilliermondii e C. kerfyr, tanto in vitro quanto in vivo.
• Os fitoterápicos cajueiro (Anacardium occidentale) e tanchagem
(Plantago major) mostraram ação antifúngica frente às espécies C. albicans e C.
tropicalis.
• O fitoterápico bardana (Arctium lappa) mostrou ação antifúngica
frente às espécies C. albicans, C. tropicalis e C. parapsilosis.
.
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82
ANEXO A - Termo de Consentimento
83
84
ANEXO B - Meios de Cultura - Ágar Fubá
85
86
ANEXO C - Prova de Assimilação de Carboidratos
87
88
ANEXO D - Certificados de Análise dos Produtos Utilizados
89
90
91
92
93
ANEXO E - Tabela CECON-Centro de Controle e Produtos para
Diagnóstico Ltda
94
95
ANEXO F - ATB Fungus
96
97
ANEXO G - Declaração da Propesp quanto à Pesquisa
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