( PDF ) Avaliação de micronucleos em células epiteliais bucais de estudantes de odontologia

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA – MESTRADO

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM CLÍNICA INTEGRADA

RICARDO KERN

AVALIAÇÃO DE MICRONUCLEOS EM CÉLULAS EPITELIAIS BUCAIS DE

ESTUDANTES DE ODONTOLOGIA

PONTA GROSSA

2006

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RICARDO KERN

AVALIAÇÃO DE MICRONUCLEOS EM CÉLULAS EPITELIAIS BUCAIS DE

ESTUDANTES DE ODONTOLOGIA

Dissertação apresentada para obtenção do título de

mestre na Universidade Estadual de Ponta Grossa, no

curso de Mestrado em Odontologia – Área de

concentração em Clínica Integrada.

Orientador: Prof°. Dr Gibson Luiz Pilatti

PONTA GROSSA

2006

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Kern, Ricardo

K39a Avaliação de micronúcleos em células epiteliais bucais em

estudantes de odontologia / Ricardo Kern. Ponta Grossa, 2006.

68 f.; il.

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Ponta

Grossa, curso de Mestrado em Odontologia – área de concentração

em Clínica Integrada

Orientador Prof. Dr. Gibson Luiz Pilatti

1-Micronúcleo. 2-Óleos essenciais. 3-Clorexidina. 4-Trauma

mecânico. IT.

CDD: 617.63

RESUMO

O constante aperfeiçoamento dos testes genéticos, como o Teste de Micronúcleos (MN),

os tornaram importantes auxiliares na prevenção do câncer. Com o objetivo de melhor

compreender a etiologia do desenvolvimento de neoplasias bucais, o presente trabalho

se propôs a estudar a influência do fumo, álcool, trauma mecânico e de substância

contidas em colutórios sobre a Freqüência de Micronúcleos (FMN) em células epiteliais

bucais de alunos do curso de Odontologia. Para tanto, 40 alunos foram divididos em 4

grupos assim caracterizados G1 – Abstêmios (controle); G2 Alcoolistas; G3 – Usuários

de aparelho ortodôntico; G4 – Fumantes alcoolistas, e submetidos ao TMN.

Posteriormente estes mesmos alunos receberam de forma aleatória, 4 diferentes

tratamentos, por 10 dias, a base de colutórios: T1 (óleos essenciais), T2 (álcool 11%), T3

(álcool, 11% + clorexidina 0,12%), T4 (clorexidina 0,12%), sendo então novamente

submetidos ao TMN. Os resultados da FMN demonstraram diferenças significativas entre

os 4 grupos G (p =

0,043 Kruskal-Wallis), sendo indicado diferença entre G1 e G3 (Mann-

Whitney p ≤ 0,01) e entre G1 e G4 (Mann-Whitney p ≤ 0,05), contudo, em relação aos

tratamentos com colutórios, todos os tratamentos T não alcançaram resultados

significativos (Wilcoxon p > 0,05). Os resultados sugerem que o trauma mecânico

causado por aparelho ortodôntico assim como a associação de fumo com bebidas

alcoólicas favorecem um aumento na prevalência de MN quando comparados ao

controle. A utilização de colutórios bucais, em curto prazo, não foi capaz de causar

aumento na freqüência de Micronúcleos.

Palavras – chave: Micronúcleo. Óleos essenciais. Clorexidina. Fumo. Álcool. Trauma

mecânico.

ABSTRACT

The constant perfectioning of genetic tests, as the Test of Micronuclei (TMN), had

become important in the cancer prevention. With the objective of better understanding

the etiology of the development of cancer, the present work considered studying the

influence of the tobacco, alcohol, mechanical injury and mouth rinses substances on

Micronuclei Frequency (FMN) of buccal epithelial cells of Dentistry School’s students.

Forty (40) students had been divided in 4 groups thus characterized G1 - Abstemious

(control); G2 Alcohol consumers; G3 - Orthodontic device’s users; G4 - Smoking

alcoolistas, and submitted to the TMN. These same pupils had later received from random

form, 4 different treatments, per 10 days, based on mouth rinses substances: T1

(essential oils), T2 (alcohol 11%), T3 (alcohol, 11% + clorexidina 0.12%), T4 (clorexidina

0.12%), being submitted again to the TMN. The results of FMN had demonstrated

significant differences between 4 groups G (p = 0,043 Kruskal-Wallis), being indicated

difference between G1 and G3 (Mann-Whitney p ≤ 0,01) and between G1 and G4 (Mann-

Whitney p ≤ 0,05), however, in relation to the treatments with month rinses substances, all

treatments T had not reached significant results (Wilcoxon p > 0,05). We concluded that

the mechanical injury caused by orthodontic device as well as the tobacco association

with alcoholic beverages favors an increase in the prevalence of MN when compared with

control. The use of mouth rinses substances, in short term, was not capable to cause

increase in the FMN.

Key-words: Micronuclei. Essential oils. Chlorhexidine. Tobacco. Alcohol. Mechanical

injury.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Representação espacial das taxas brutas de mortalidade por

câncer de boca, por 100.000 homens, nas Unidades da

Federação, entre 1995 e 1999...................................................................... 12

Figura 2 - Representação espacial das taxas brutas de mortalidade por

câncer de boca, por 100.000 mulheres, nas Unidades da

Federação, entre 1995 e 1999...................................................................... 13

Figura 3 - Formação de micronúcleo. ........................................................................... 14

Figura 4a - Célula contendo o MN................................................................................ 33

Figura 4b - Célula contendo o MN................................................................................ 34

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Tabela de contingência para o teste de concordância do operador

para contagem de MN..................................................................................................35

Tabela 2 – Distribuição dos grupos, número da amostra pertencente ao grupo,

idade e contagem do número de células micronucleadas por

amostra. .................................................................................................... 36

Tabela 3 – Análise descritiva dos grupos com idade média, número de

amostragem, mediana, média, desvio padrão e posto médio.

Análise de variância não paramétrica entre os quatro grupos

(Kruskal-Wallis) e grupo a grupo (Mann-Whitney). .................................... 37

Tabela 4 – Disposição das contagens absolutas de MN nos momentos inicial e

final do experimento, organizadas em grupos distintos conforme o

tratamento recebido. .................................................................................. 38

Tabela 5 – Comparação inicial e final para cada modalidade de tratamento

para Média e Desvio Padrão, Posto Médio, Soma dos Postos e

valor de Z e p para o teste de Wilcoxon..................................................... 39

Tabela 6 – Freqüência de MN utilizadas como referências controles em

diferentes investigações de mutagenicidade descritas na literatura. ......... 50

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

broken-egg

cariólise

= célula normal.

CMN

célula com micronúcleo.

cariorréxe

= valor do nível de significância do teste de Kruskal-Wallis .

= micronúcleo

probabilidade.

TMN

total de micronúcleo

= valor do nível de significância do teste de Mann-Whitney

desvio da normalidade.

grau de liberdade.

média

erro padrão da média.

média

desvio padrão da média.

= número de indivíduos.

= teste t de significância da diferença das médias entre dois grupos.

Significância

= P>0,05 - não significante;

P<0,05 - significante;

P< 0,01 - altamente significante;

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO..............................................................................................................9

2 REVISÃO DE LITERATURA......................................................................................15

2.1 TESTE DE MICRONÚCLEOS..................................................................................15

2.1.1 Definições.............................................................................................................................15

2.1.2 Utilização da análise de micronúcleos para monitoramento de processos carcinogênicos..17

2.1.3 Análise de Micronúcleos em Linfócitos...............................................................................18

2.1.4 Utilização da análise de micronúcleos para monitoramento de células epiteliais................19

2.2 AGENTES GENOTÓXICOS.....................................................................................22

3 PROPOSIÇÃO............................................................................................................25

4 MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................................26

4.1 FASE 1 – PREVALÊNCIA DE MICRONÚCLEOS.....................................................26

4.1.1 Caracterização da amostra....................................................................................................27

4.1.2 Técnica de coleta das células: teste do micronúcleo............................................................28

4.2 FASE 2 – INCIDÊNCIA DE MICRONÚCLEOS.........................................................30

4.3 PLANEJAMENTO ESTATÍSTICO............................................................................32

5 RESULTADOS...........................................................................................................33

5.2 PREVALÊNCIA DE MN – FASE UM DO ESTUDO...................................................35

5.3

INCIDÊNCIA DE MN – FASE DOIS DO ESTUDO....................................................38

6 DISCUSSÃO...............................................................................................................40

7 CONCLUSÕES...........................................................................................................49

REFERÊNCIAS.............................................................................................................50

APÊNDICE - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO...................57

ANEXO A – QUESTIONÁRIO DE CONSUMO DE BEBIDAS ALCOÓLICAS..............60

ANEXO B – QUESTIONÁRIO DE HÁBITOS................................................................63

1 INTRODUÇÃO

Câncer bucal é uma denominação genérica para referenciar qualquer

lesão maligna dessa região. Os tumores malignos das regiões anatômicas que

constituem a cavidade bucal – lábios, língua, assoalho de boca, mucosa bucal, gengivas,

palato duro e mandíbula – perfazem cerca de 5% de todas as formas de câncer que

ocorrem no corpo humano (DEL REGATO; SPJUT, 1977).

No Brasil, a estimativa de incidência de câncer para 2005 (Gráfico 1)

aponta a manifestação bucal como a 8º forma mais freqüente entre os homens (com

9.985 casos estimados) e a 9º entre as mulheres (com 3.895 casos estimados); com

distribuição da prevalência ocorrendo de forma não homogênea entre as unidades da

Federação, tanto para o sexo masculino (Figura 1) como para o sexo feminino (Figura 2)

(INSTITUTO NACIONAL DO CANCER - INCA, 2005).

Embora as neoplasias malignas possam ter origem em todos os tecidos

que compõe a boca, aquelas oriundas do tecido epitelial de revestimento são as mais

comuns, por sua maior exposição à ação de agentes potencialmente carcinogênicos. Os

tecidos epiteliais entram em contato direto com substâncias genotóxicas inaladas ou

ingeridas, sendo ainda que pulmões e bexiga podem entrar em contato com substâncias

tóxicas metabolizadas pelo próprio organismo, esta condição caracteriza que a maioria

dos tumores é iniciada especificamente por células epiteliais (FENECH et al., 1999).

Entre todos os tumores malignos da boca, de 90% a 95% são diagnosticados como

epidermóide, também denominado espinocelular ou de células escamosas (INCA, 2005).

Diversos agentes são relacionados como fatores de risco para o

desenvolvimento de lesões malignas na cavidade bucal. O potencial genotóxico –

potencial de causar dano ao DNA celular - existente em vários produtos como o fumo,

álcool, mate, medicações e alimentos, têm sido bem descrito na literatura (DIETZ et al.,

2000). Má higienização bucal, traumas mecânicos e exposição ocupacional também são

relacionados como contribuintes ao câncer (HOMANN et al., 2000).

Fatores ambientais atuam como agentes etiológicos em cerca de 80% dos

cânceres humanos (HEDDLE et al., 1983). A crescente introdução de compostos tóxicos

nas áreas industrializadas torna cada vez mais urgente à utilização de métodos

confiáveis capazes de detectar e medir o DNA lesado no homem.

As alterações do genoma humano geram uma preocupação quanto à

adoção de mecanismos de proteção às gerações futuras, tornando os testes genéticos

úteis no rastreamento de agentes com potencial mutagênico.

Diversas formas de avaliação do dano genético tem sido desenvolvidas.

Dentre elas, citamos como método clássico, a Análise de Células Metafásicas. Esta exige

um técnico altamente especializado e requer o exame de um grande número de

metáfases (a metáfase é uma das fases do processo de divisão celular), fundamental

para a confiabilidade da análise estatística, o que demanda tempo e dificulta seu

emprego em estudos populacionais (BREWEN; PRESTON, 1978).

Como alternativa à Análise de Células Metafásicas, propôs-se utilizar o

Teste de Freqüência de Micronúcleos, que é tido com um método sensível para medir o

dano citogenético (referente ao material genético, DNA, da célula). Os micronúcleos são

formações globulares de DNA, originados a partir de fragmentos cromossômicos ou de

cromossomos inteiros, não incorporados ao núcleo da célula filha ao final do processo de

divisão celular (FENECH et al., 1999).

A presença de micronúcleos nas células serve como parâmetro para a

determinação da extensão do dano que um agente do ambiente pode estar causando no

processo de divisão celular do tecido acometido, afetando o DNA tecidual e,

conseqüentemente, predispondo ao desenvolvimento de câncer bucal (VINE, 1990).

Desta forma, podemos utilizar o Teste de Micronúcleos para identificarmos e avaliarmos

diversos fatores que podem trazer algum dano ao DNA de diferentes tecidos.

Em odontologia, a aplicação deste teste consiste em uma ferramenta

extremamente valiosa para avaliarmos, de modo sensível, a ação genotóxicas de

substâncias que entram em contato com o epitélio bucal.

Agentes químicos (fumo, álcool, hábitos alimentares), físicos (trauma

mecânico por próteses, aparelhos ortodônticos, má oclusão, radiação) ou biológicos

(biofilme dental), são exemplos de fatores de presença comum ao ambiente bucal, e que

podem representar um potencial de formação de micronúcleos às células epiteliais

(FENECH et al., 1999).

A compreensão dessa interação de agentes químicos, físicos e biológicos,

com potencial mutagênico, torna-se importante para que possamos melhor compreender

e controlar os fatores que predispõem nossos pacientes a ocorrência do câncer bucal.

Neste sentido, a elaboração de estudos controlados e de caso controle,

por meio de testes de micronúcleo, possibilita estudar a ampla interação de fatores que

concebem a um paciente uma maior pré-disponibilidade para o desenvolvimento do

câncer bucal.

Gráfico 1 - Tipos de câncer mais incidentes, estimados para 2005, na população brasileira

Fonte: INCA (2005)

Figura 1 - Representação espacial das taxas brutas de mortalidade por câncer de boca, por 100.000

homens, nas Unidades da Federação, entre 1995 e 1999

Fonte: INCA (2005)

Figura 2 - Representação espacial das taxas brutas de mortalidade por câncer de boca, por 100.000

mulheres, nas Unidades da Federação, entre 1995 e 1999

Fonte: INCA (2005)

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 TESTE DE MICRONÚCLEOS

2.1.1 Definições

De acordo com Ramirez e Saldanha (2002, p. 140).

O Micronúcleo é um núcleo adicional e separado do núcleo principal de uma

célula durante a divisão celular por cromossomos ou fragmentos de cromossomos

que se atrasam em relação aos demais [Figura 4]. Resulta de alterações

estruturais cromossômicas espontâneas ou experimentais induzidas ou ainda, de

falhas no fuso celular, sendo portanto, excluído do novo núcleo formado na

telófase.

Figura 3- Formação de micronúcleo

Nota: No processo de divisão da célula durante a anáfase, na qual pode ocorrer a falha na incorporação

de fragmentos de cromossomos ou de cromossomos inteiros ao núcleo da célula filha.

Fonte: Fenech et al. (1999)

O Food and Drug Administration (FDA), nos EUA, em uma cartilha para

aspectos regulatórios de testes de genotoxicidade para a indústria farmacêutica (Specific

Aspects of Regulatory Genotoxicity Tests for Pharmaceuticals) define Micronúcleo como

partícula microscopicamente detectável contendo DNA nuclear, podendo conter parte ou

todo um cromossomo. (FDA, 2005)

O micronúcleo (MN) apresenta entre 1/5 a 1/20 do tamanho do núcleo e

geralmente há um micronúcleo por célula (SCHMID, 1975). Devem ser analisados em

grupos celulares que estiveram em processo de divisão no momento da exposição ao

agente agressor, ficando sua análise comprometida em populações de células que não

estão em processo de divisão celular (HEDDLE et al., 1983).

Historicamente os micronúcleos foram descritos há mais de um século,

sendo chamados de “fragmentos de material nuclear” por Howell ou “corpúsculos

intraglobulares” na terminologia utilizada por Jolly no inicio do século passado. O termo

“Corpúsculos de Howell-Jolly” ficou conhecido entre os hematologistas para designar o

aparecimento de eventos de micronúcleos (KIRSCH-VOLDERS et al., 2003).

A primeira tentativa de utilizar os micronúcleos como indicadores de dano

citogenético foi feita por Evans et al. (1959 apud EVANS, 1997) que usaram a freqüência

de micronúcleos para medir a dano induzido em raiz de cebola por neutros e raios-gama.

Relatos prévios relacionados aos micronúcleos foram realizados por Thoday (1951 apud

EVANS, 1997), referindo-se ao aparecimento de um “núcleo fragmentado” em seus

estudos com raízes de Vicea faba.

O marco decisivo na utilização do teste de micronúcleo com um meio de

monitorar a ação de agentes com potencial genotóxico veio dos trabalhos realizados por

Boller e Schmid, (1970) que sugeriram o termo “teste de micronúcleo” pela primeira vez,

e por Heddle (1977 apud EVANS, 1997) com seus trabalhos utilizando eritrócitos de

ratos, nos quais quantificaram o DNA de micronúcleos e verificaram que esta quantidade

correspondia a de cromossomos ou fragmentos de cromossomos acêntricos. (KIRSCH-

VOLDERS et al., 2003).

Ainda em eritrócitos de camundongos, os pesquisadores aplicaram tanto o

teste de micronúcleo como o de análise clássica de aberrações cromossômicas, com

finalidade de comparar a sensibilidade do teste do micronúcleo (KLIESCH; ADLER,

1980). Trabalhos subseqüentes tentaram postular a relação entre o tamanho do

micronúcleo e o tipo de alteração cromossômica. Os micronúcleos menores seriam

formados por fragmentos cromossômicos, enquanto os maiores por cromossômos

inteiros. Tal associação contribuiu para a classificação de agentes mutagênicos em

clastogênicos ou aneugênicos (VANDERKERKEN et al., 1989).

Entretanto devemos entender; também, a terminologia “micronúcleo” na

concepção zoologista, que se refere à ocorrência de pequenos núcleos presente no

citoplasma dos ciliados. Caracterizados como pequenos corpos arredondados numa

freqüência variada de um a vinte micronúcleos, dependendo da espécie de ciliado, sendo

responsáveis pela recombinação genética, reorganização nuclear e pela origem do

macronúcleo nestas espécies (BARNES; RUPERT, 1994).

2.1.2 Utilização da análise de micronúcleos para monitoramento de processos

carcinogênicos

Aparentemente a ação de qualquer agente químico genotóxico pode

induzir ao aumento na freqüência de micronúcleos. Diferentes tecidos, desde que

realizem multiplicação celular podem ser acometidos pela ocorrência de aberrações

cromossômicas. Em vista disso, o teste de micronúcleos tornou-se uma ferramenta

amplamente utilizada nos mais diversos campos da pesquisa para aferir a segurança de

inúmeras substâncias, classificando-as ou não como carcinogênicos.

Há um esforço crescente em avaliar os impactos ambientais, genéticos e

de mudança no estilo de vida sobre a estabilidade genômica na população humana. A

importância do teste de micronúcleo vem de sua vantagem sobre os demais testes

existentes, pois é relativamente fácil de se realizar, fornecendo resultados com forte

suporte estatístico. (FENECH et al., 1999)

A simplicidade de seu emprego leva a uma ampla adoção mundial como

teste de genotoxicidade in vitro assim como no monitoramento da população humana.

Como é de se esperar a adoção de uma nova técnica em várias partes do mundo acaba

gerando pequenas divergências na padronização da técnica assim como nos resultados

obtidos. Todavia, o estabelecimento de um protocolo consagrado para o emprego do

teste de micronúcleo se encontra incompleto. Havendo inclusive um programa de

colaboração mundial HUman MicroNucelus Project (HUMN) para se delinear e obter

dados de diferentes centros e populações com o objetivo de se identificar as variáveis de

confusão (viés) na metodologia empregada (FENECH et al., 1999).

As duas principais técnicas desenvolvidas para o teste de micronúcleo

são realizadas em linfócitos sanguíneos ou em células epiteliais descamadas.

2.1.3 Análise de Micronúcleos em Linfócitos

Krepinsky e Heddle (1983 apud EVANS, 1997) demonstraram que o

teste de micronúcleo poderia ser efetivamente usado para detectar danos em linfócitos

de seres humanos expostos à radiação ionizante. Entretanto, em virtude da fragilidade

dessas células durante a manipulação, e as respostas variadas dos linfócitos aos

estímulos mitogênicos, novas alterações foram realizadas nos protocolos desses testes.

A mais importante foi o uso da Citocalacina B para marcar a divisão celular, uma vez que

essa droga é inibidora da cariocinese, ficando as células com o número de núcleos

correspondentes ao número de divisões celulares à que foram submetidas.

Desde a descoberta da Citocalacina B, o teste de micronúcleo em

linfócitos vem auxiliando os estudos da genética toxicológica no biomonitoramento de

populações humanas expostas a agentes mutagênicos e/ou carcinogênicos de atuação

sistêmicas (ANWAR, 1992; SAVOLDI-BARBOSA; SAKAMOTO-HOJO; TAKAHASHI,

1999). Paralelamente aos primeiros estudos da freqüência de micronúcleos em linfócitos

humanos, alguns pesquisadores se interessaram pelo estudo da freqüência de

micronúcleos em outros tecidos, para que houvesse uma avaliação conjunta tanto do

efeito sistêmico, como do efeito local das substâncias genotóxicas (AGOSTINI; OTTO;

WAJNTAL, 1986) ampliando a relevância no monitoramento de populações expostas.

2.1.4 Utilização da análise de micronúcleos para monitoramento de células epiteliais

A pesquisa descrevendo danos citogenéticos em células epiteliais

humanas teve um grande crescimento a partir da década de 80, com números cada vez

maiores de laboratórios e pesquisadores utilizando o teste de micronúcleos (FENECH et

al., 1999). As células esfoliadas possuem um grande potencial como ferramenta de

biomonitoramento de populações humanas expostas a agentes genotóxicos pela

facilidade com que se pode proceder a coletas de células. Mucosa epitelial da boca, nariz

e bexiga são exemplos de regiões que podem fornecer material por meio de técnicas

simples e não invasivas.

Para análise de MN em cavidade bucal, podemos utilizar a coleta de

células da mucosa ou da borda lateral da língua, pois estes tecidos epiteliais estão em

constante processo de divisão celular com renovação do tecido pela descamação das

células superficiais. As células epiteliais esfoliadas não se dividem mais, mas refletem

anormalidades citogenéticas que ocorreram na população de células na camada basal.

Na análise de micronúcleo a coleta das células deve ocorrer entre 5 a 24 dias após a

exposição do tecido ao agente genotóxico (exposição aguda), uma vez que as células da

camada basal têm um tempo de migração de aproximadamente 5-7 dias e as células

expostas descamam totalmente em cerca de três semanas (VINE, 1990). A coleta é um

procedimento rápido e não invasivo, realizada com o auxilio de uma pequena escova de

cerdas macias (cytobrush) que é levemente friccionada de forma indolor contra a região

de coleta.

Reis et al. (2002) realizaram um estudo por meio do teste de micronúcleo

em células esfoliadas da mucosa jugal e da língua de 40 indivíduos alcoólatras não

fumantes e de 20 abstêmios de álcool e fumo e observaram um aumento

estatisticamente significante da freqüência de micronúcleos em células esfoliadas da

língua no grupo exposto ao etanol em relação ao grupo controle. A freqüência de

micronúcleos em células esfoliadas da mucosa jugal apresentou-se maior no grupo de

indivíduos alcoólatras quando comparado ao grupo controle, porém sem diferença

significante.

Em estudos de radiação ionizante, o teste de micronúcleo tem sido

utilizado para avaliar danos genéticos após exposição ocupacional a radiação X, medir a

radio-sensibilidade celular, para estudar aberrações cromossomais e células em divisão,

para detectar efeitos genotóxicos em células de diferentes tecidos, assim como mediante

a exposição a diferentes técnicas de radiologia (CERQUEIRA et al., 2004). Não houve

diferença significante na formação de micronúcleo, projeções nucleares ou alterações

nucleares degenerativas nas medições realizadas antes e dez dias após a exposição.

Fatores ocupacionais, como a exposição ao etanol em frentistas de postos

de gasolina foi pesquisada (GATTÁS et al., 2001) comparando a incidência de formação

de micronúcleo, na mucosa bucal, em período de três anos, no qual ocorreu à introdução

do etanol nas misturas de combustível (33% metanol, 60% etanol and 7% gasolina).

Houve um amento significativo na formação de micronúcleos nos funcionários expostos à

formação de vapor do combustível.

A ação do fumo sobre as células da mucosa bucal foi estudada (SUHAS

et al., 2004) que comparando a formação de micronúcleo na mucosa bucal, palato e

língua, entre fumante e não fumantes. Tanto o grupo controle como o grupo teste

possuíam 25 indivíduos. A diferença na media de micronúcleos foi significativa na

mucosa bucal e palato do grupo de fumantes.

Outro estudo (BAGWE; BHISEY, 1993) com foco no efeito do fumo como

agente carcinogênico foi realizado em trabalhadores da indústria do tabaco na Índia. A

exposição ocupacional, com o contato direto ao fumo, foi estudada tanto em operários

não fumantes das lavouras de fumo como nos operários que enrolavam fumo nas

fábricas. Juntamente com a análise da freqüência de micronúcleos das células epiteliais

bucais, foi quantificado o percentual de nicotina existente na saliva. Os resultados

demonstraram uma diferença do efeito e da exposição ocupacional, sendo que os

indivíduos que trabalhavam no processamento do plantio do fumo obtiveram aumento

significante tanto nos níveis de nicotina salivares como na freqüência de micronúcleo.

Aumento na freqüência de micronúcleos também foi verificada em

pacientes alcoolistas portadores de carcinomas orofaríngeos, sendo inclusive sugerido

sua utilização como método para monitorar a evolução clínica da lesão, comparando

freqüência intra e inter indivíduos, tanto no processo pré-tratamento como pós-tratamento

(RAMIREZ; SALDANHA, 2002).

Deficiência de folato usualmente encontrado em mulheres no período pós-

menopausa, mesmo sem sintomas clínicos de anemia, resulta em altos níveis de dano

citogenético. Neste estudo (TITENKO-HOLLAND et al., 1998) foram acompanhados a

freqüência de micronúcleos, em células da mucosa e em linfócitos, em nove mulheres

durante três períodos distintos: antes da reposição com folato, durante e ao final da

reposição. Durante os estudos houve melhora significativa nos níveis plasmáticos de

folato e vitamina B-12, acompanhado pela queda na freqüência de micronúcleos.

2.2 AGENTES GENOTÓXICOS

Freqüentemente depara-se com populações expostos a vários fatores

tidos como genotóxicos. Pacientes fumantes e alcoolistas acabam por constituir uma

população com uma incidência maior ao câncer bucal (BOFFETTA et al. 1992). Em

estudos epidemiológicos demonstrou-se que indivíduos alcoólatras apresentavam risco

de câncer 6,4 vezes maior que indivíduos abstêmios de álcool, fato este decorrente do

efeito sinérgico do álcool aos componentes do cigarro, como o Benzopireno e o 4-

(methilInitrosamina)1(3-pyridyl), sabidamente agentes carcinogênicos (WELLS et al.,

1997).

A ação tóxica local do álcool leva a uma injúria da membrana e da célula,

com um subseqüente aumento na proliferação celular. A hiperproliferação por si só

aumenta a exposição à outros agentes carcinogênicos e, em se tornando permanente, é

o primeiro passo para um processo de transformação maligna (SEITZ; PÖSCHL;

SIMANOWSKI, 1998).

Com relação ao desenvolvimento de lesões malignas, o fumo tem sido

relatado como um dos principais fatores de risco (ADHVARYU; DAVE; TRIVEDI, 1991).

O consumo de álcool, por outro lado, é citado como forte agente potencializador no

desencadeamento de lesões cancerosas, agindo de forma sinergística com vários outros

produtos com potencial citotóxico, devidamente por aumentar a permeabilidade dos

tecidos a estas substâncias

(BARAONA; GUERRA; LIEBER, 1981). Em indivíduos que

fumam, o consumo de álcool apresenta comprovadamente um efeito sinérgico na

indução do câncer bucal (FRANCESCHI et al., 1990). Porém, o efeito do álcool

isoladamente parece ser mal esclarecido, ainda que sua atividade mutagênica tenha sido

descrita na literatura (FEINMAN; LIEBER, 1988).

Os danos causados pelo álcool à mucosa bucal e ao trato digestivo

superior são principalmente decorrentes da ação local e não sistêmica do consumo de

álcool. (SEITZ; PÖSCHL; SIMANOWSKI, 1998). Tornado preocupantes hábitos que

venham a expor o paciente ao contato com o álcool e que, propriamente, não seja o de

consumo de bebidas alcoólicas.

O acetaldeido, subproduto metabólico do álcool, comprovadamente com

ação carcinogênica, seria o responsável pela maior incidência de câncer em pacientes

alcoolistas. Parte da produção de acetaldeido é realizada por bactérias bucais, ocorrendo

concordância com pesquisas que encontraram maior incidência de câncer entre os

alcoolistas com deficiência de higiene bucal (VISAPÃÃ; TILLONEN; SALASPURO, 2002).

O aumento da disponibilidade de diferentes marcas de colutórios e a

popularização de hábito do bochecho como forma complementar de higienização bucal,

chamam a atenção, tanto pela utilização de álcool na composição da maioria destes

produtos, como pela utilização de agentes químicos suspeitos de serem genotóxicos,

como a clorexidina (MASHBERG; BARSA; GROSSMAN, 1985).

Os produtos odontológicos possuem valores variáveis de álcool em sua

composição, alguns deles, tendo com base o principio ativo clorexidina, atingem

concentrações variando de 3,5% (Noplak®) a 11,6%(Peridex®; Periogard®). Outros

produtos podem alcançar concentrações de álcool de até 26,9% (Listerine®).

Os colutórios têm sido alvos de diversos estudos epidemiológicos de

câncer bucal. Em amplo estudo populacional de caso-controle realizado nos Estados

Unidos (WINN et al., 1991), os resultados demonstraram que o hábito de utilização de

colutórios está associado com um aumento de 40% no risco de desenvolvimento de

lesões malignas na cavidade bucal em homens, e de 60% entre as mulheres, isto após

os ajustes de exposição a fatores como o hábito de fumar e de ingestão de bebidas

alcoólicas, sendo que os riscos aumentam quanto maior há freqüência de bochecho e o

tempo de uso; pessoas utilizando o produto 60 ou mais vezes por mês têm seu risco

aumentado 1.7 a 2.0, enquanto que os usuários a mais de 40 anos tem 1.4 à 1.9

aumento no risco de desenvolver um câncer bucal.

Em outros estudos de câncer bucal associado com colutórios, os

resultados tem sido inconsistentes, com a variação na correlação ao risco indo de 0.8 à

2.5 (MASHBERG; BARSA; GROSSMAN, 1985; WEAVER; FLEMING; SMITH, 1979).

Obviamente a grande variedade de fatores que podem interferir como carcinogênicos

podem evidentemente não ser quantificados da forma adequada, atuando, então, como

viés nesses estudos.

3 PROPOSIÇÃO

1. Este trabalho teve por objetivo verificar a prevalência de micronúcleos

em células epiteliais da mucosa bucal de alunos de odontologia

comparando grupos de alunos abstêmios, usuários de aparelho

ortodôntico, fumantes assim como em fumantes alcoolistas;

2. Este trabalho também se propôs comparar a incidência de

micronúcleos em células epiteliais da mucosa bucal de alunos de

odontologia, causada por álcool, por clorexidina e por óleos essenciais;

em concentrações correlatas às empregadas nas formulações de

colutórios.

4 MATERIAL E MÉTODOS

Todos os procedimentos dessa pesquisa foram realizados nas

dependências da Universidade Estadual de Ponta Grossa.

Antes da seleção da amostra, este presente projeto (processo

n°00463/2005) foi submetido à aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da

Universidade Estadual de Ponta Grossa.

Todos os indivíduos participantes deste estudo foram selecionados no

universo de estudantes do curso de Odontologia da Universidade Estadual de Ponta

Grossa – PR, aderindo, voluntariamente, após o esclarecimento de suas incumbências,

responsabilidades e direito, de maneira formalizada por meio da assinatura do Termo de

Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice).

De acordo com as diferentes proposições deste trabalho, dividiremos o

Material e Métodos em Fase 1 – Prevalência de Micronúcleos; e Fase 2 – Incidência de

Micronúcleos.

4.1 FASE 1 – PREVALÊNCIA DE MICRONÚCLEOS

Na fase um, o objetivo do estudo foi avaliar a prevalência de

micronúcleos, no universo dos acadêmicos do curso de odontologia, avaliando a

influência das seguintes variáveis independentes: consumo de bebidas alcoólicas,

fumantes, usuários de aparelhos ortodônticos fixos.

4.1.1 Caracterização da amostra

Para que pudéssemos avaliar a influência das variáveis citadas

anteriormente, o estudo selecionou 40 indivíduos que se enquadrassem nos requisitos de

quatro diferentes grupos: 10 Abstêmios (Controle, G1), 10 Alcoolistas (G2), 10 Abstêmios

usuários de aparelho ortodôntico (G3), 10 Fumantes alcoolistas (G4).

Esta composição serviu para realizarmos o levantamento da prevalência

de micronúcleos, relacionado-o às características da amostragem de cada grupo descrito

acima. Infere-se assim, a influência do trauma mecânico do uso do aparelho, do

consumo de álcool e da associação do consumo de álcool e tabaco sobre a freqüência

de MN, quando comparados ao grupo controle.

A separação dos voluntários em cada grupo ocorreu por meio do

preenchimento de dois diferentes questionários: Caracterização de Hábitos (Anexo B) e

Diário de Consumo de Bebidas Alcoólicas (Anexo A); assim como pela realização de um

exame clínico e anamnese.

Os critérios de inclusão e exclusão utilizados na seleção dos voluntários

foram os seguintes:

1. Os indivíduos que fossem elegíveis deveriam se enquadrar em apenas

uma das variáveis independentes, com exceção das variáveis álcool e

fumo, pela dificuldade de se encontrar indivíduos apenas fumantes

abstêmios ao consumo de álcool;

2. Consumo de bebidas alcoólicas: os indivíduos foram divididos em

abstêmios (ausência total de consumo) ou consumidores (média de

consumo maior que 14 doses nas duas últimas semanas). Os

indivíduos que não se enquadraram em nenhum dos perfis descritos,

ou seja, aqueles que consumiam bebidas alcoólicas, mas abaixo da

média de 14 doses, foram excluídos da pesquisa;

3. Fumo: foram considerados fumantes aqueles com hábito de consumo

de mais de cinco cigarros ao dia. A adoção desse critério visou evitar

os fumantes de baixo consumo pela característica de uso esporádicos

que estes apresentaram durante a anamnese. Os voluntários de

menor consumo foram excluídos do trabalho. Observação: todos os

fumantes selecionados se enquadravam no perfil de consumidor (mais

de 14 doses) de bebidas alcoólicas;

4. Uso de aparelho ortodôntico: foram considerados portadores as

pessoas com aparelho ortodôntico fixo de uso contínuo. Os voluntários

que retiraram a aparelhagem ortodôntica a menos de seis meses ou os

que faziam uso casual do aparelho removível foram excluídos da

pesquisa.

Após a ordenação dos voluntários nos quatro grupos realizou-se o Teste

de Micronúcleos.

4.1.2 Técnica de coleta das células: teste do micronúcleo

A técnica de coleta e análise das células da mucosa bucal será descrita

conforme a técnica relatada por Titenko-Holland et al.(1998).

Utilizando uma escova tipo cytobrush, Um único operador coletou as

células da mucosa da região interna da bochecha de cada indivíduo, transferiram-se,

então, as células para um tubo de ensaio imergindo e agitando o cytobrush em uma

solução fisiológica (3 ml de solução salina 0,9%). As células então são separadas, por

um processo de centrifugação por 10 minutos a 1500 r.p.m., do sobrenadante, que é

desprezado. O material restante, com uma alta concentração de células, é então

espalhado sobre lâminas aquecidas em água destiladas a 55°C. A fixação do material é

realizada com a imersão da lâmina em álcool PA por 20 minutos a 0°C.

Após a fixação, as lâminas recebem um tratamento com ácido cloridrico

(HCL 1N) na seguinte seqüência de variação de tempo e temperatura: 1 minuto a 22°C,

10 minutos a 65°, esfriamento a temperatura ambiente por 10 minutos, 5 minutos a 22°C.

Lavam-se com água destilada por 10 minutos.

Procederam-se à coloração das lâminas com a coloração de Schiff e

contra-coloração com Fast-Green. Para cada coleta foram realizadas duas lâminas de

modo a alcançar uma contagem de três mil células por voluntário.

A análise das lâminas foi feita com a utilização de um microscópio óptico

em aumento de 400x, sendo que mediante alguma dúvida quanto à existência de

micronúcleo analisava-se sob aumento de 1000x.

A classificação e contagem de micronúcleos seguiram um protocolo

sugerido por Tolber et al (1992) e ocorreram da seguinte maneira:

a) Contagem de células: foram incluídas as células que tenham os

núcleos normais e intactos, com perímetro nuclear liso e distinto, e que

apresentem o citoplasma também intacto, com exceção das que

tenham pequenas dobras e pouca ou nenhuma sobreposição com as

células adjacentes;

b) Contagem dos micronúcleos: foram considerados micronúcleos as

estruturas que apresentarem um halo circundante sugestivo de uma

membrana, menos de 1/3 do diâmetro do núcleo associado,

intensidade da coloração com Feulgen semelhante ao núcleo e mesmo

plano focal à microscopia e ausência de sobreposições ou pontes com

o núcleo. Considerou-se o número total de micronúcleos assim como o

de células acometidas pelo aparecimento de micronúcleos em seu

citoplasma.

Toda a análise das lâminas foi realizada por um único operador de modo

que este não soubesse a qual grupo esta amostra era proveniente. Para cada amostra foi

realizada a contagem de 3000 células epiteliais.

4.2 FASE 2 – INCIDÊNCIA DE MICRONÚCLEOS

Após a realização da primeira fase do estudo, caracterizada como um

estudo transversal em que se classificou a população estudada em 4 grupos distintos de

hábitos característicos, procedeu-se a segunda fase deste trabalho caracterizado como

um estudo experimental com a mesma amostragem populacional sub-divididas de

maneira randômica em quatro grupos de tratamentos. O objetivo desta fase foi avaliar a

incidência de micronúcleos provocados por produtos existentes nos colutórios bucais

(álcool, clorexidina, óleos essenciais). Para tanto, participaram 40 alunos divididos em

quatro grupos distintos.

Cada grupo se caracterizou por tratamentos distintos com bochechos

diários (10ml, duas vezes ao dia, por um minuto, pelo período oito dias) de uma

substância específica, sendo elas:

Tratamento T1 - Óleos essenciais: Listerine®, 200ml.

Tratamento T2 - Álcool: essência de menta, solução em álcool a 11,6%,

água q.s.p 200ml

Tratamento T3– Álcool e Clorexidina: chlorexidina 0,12%, essência de

menta, álcool 12%, água q.s.p 200ml.

Tratamento T4 – Clorexidina: clorexidina 0,12%, essência de menta, água

q.s.p. 200ml.

Os indivíduos foram orientados a realizarem o bochecho trinta minutos

após a escovação normal, de modo que não houvesse interferência dos produtos

contidos em dentifrícios, especialmente as substâncias detergentes desta, com o agente

de cada grupo.

O período experimental seguiu o seguinte calendário:

Dia 01 - Coleta de Células e Teste do micronúcleo.

Dia 02 a dia 09 - Período de bochechos com a substância específica de

cada grupo durante 08 dias.

Dia 12 - Coleta de Células e Teste do micronúcleo.

Todos os procedimentos para realização deste teste foram realizados de

forma idêntica à primeira fase.

4.3 PLANEJAMENTO ESTATÍSTICO

Para aferir a reprodutibilidade da contagem de MN, verificando a

concordância intra-avaliador, adotou-se o teste K (Kappa) sobre os dados da análise de

10 amostras.

A formação de micronúcleo é uma ocorrência rara que segue uma

distribuição aleatória conhecida por Poisson, sendo que a significância estatística dos

dados deve ser aferida por meio de testes não paramétricos (GATTÁS et al., 2001) para

comparação entre grupos (Kruskal-Wallis), entre pares de grupos (Mann-Whitney) –

dados referentes à primeira fase do estudo – e entre amostras (final/inicial) de grupos

relacionados (Wilcoxon) – dados referentes à segunda fase do estudo.

5 RESULTADOS

Para a conformação dos resultados analisaram-se, em cada fase do

estudo, 3000 células epiteliais para cada indivíduo participante do estudo. A princípio,

cada célula epitelial íntegra foi avaliada quanto à presença de micronúcleos em seu

citoplasma, sendo que os resultados foram computados tanto para o número total de

micronúcleo, quanto para o número de células portadoras de micronúcleo. Devido à

ocorrência de apenas uma célula contendo dois micronúcleos em seu interior, todos os

resultados aqui descritos são relacionados tão somente a ocorrência de células com

micronúcleo em seu interior.

Figura 4a – Célula contendo Micronúcleo

Nota: A célula contendo o MN está disposta no centro do campo fotográfico. A fotografia aparece com a

formação do micronúcleo na mesma linha horizontal e a esquerda do núcleo principal.

Figura 4b – Célula contendo Micronúcleo

Nota: A fotografia mostra uma formação de um pequeno e discreto MN à esquerda e abaixo de núcleo da

célula.

5.1 TESTE DE REPRODUTIBILIDADE (KAPPA) PARA AVALIAÇÃO DA CONTAGEM

DE MN

O exame microscópico das células coletadas foi realizado por um único

pesquisador “mascarado” a fim de evitar a variação inter-examinadores. Todavia, para

avaliar a concordância da análise, foi realizado um teste de concordância K (Kappa) em

que foram examinadas, em períodos distintos separados por 30 dias, 10 amostras

aleatórias pertencentes a este estudo. Os resultados e os dados utilizados neste teste

estão descritos na tabela 1.

As 10 amostras que receberam uma dupla avaliação pelo pesquisador

foram retiradas do universo total de 40 amostras da primeira fase do estudo de maneira

aleatória. Este fato somado ao tempo de 30 dias separando as duas avaliações permitiu

o descarte de qualquer identificação da amostragem pelo pesquisador.

A diagonal descendente da direita para a esquerda, demarcada com

grifo, representa as avaliações que concordaram quanto ao número de MN existentes na

amostra, salvo as ocorrências devido ao acaso da avaliação que também é levada em

conta no resultado do teste. O coeficiente do teste K com valor 0.411 representa,

segundo a própria escala arbitrária apresentada pelo idealizador do teste para interpretar

o grau de concordância entre os exames, uma concordância moderada do examinador.

Tabela 1 – Tabela de contingência para o teste de concordância do operador para contagem de MN.

1º exame

2º exame

0 1 2 3 4 5 6 Soma

2 0 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0

0 0

1 2 0 0 0

0 0 0

0 1 1 0

0 0 0 0

1 0 0

0 0 0 0 0

0 1

0 0 0 0 0 0

Soma

2 1 1 2 2 1 1

Nota: Valor calculado de K (Kappa) 0.411.

5.2 PREVALÊNCIA DE MN – FASE UM DO ESTUDO

A freqüência absoluta das células micronucleadas foi disposta na Tabela-

2, apresentando o número de células micronucleadas encontrada no exame de cada

indivíduo.

Tabela 2– Distribuição dos grupos, número da amostra pertencente ao grupo, idade e contagem do

número de células micronucleadas por amostra de 3000 células.

Grupos Amostra Idade Contagem de Micronúcleos

1- Abstêmios

1 21 1

2 20 3

3 19 0

4 22 0

5 23 0

6 22 0

7 24 4

8 20 0

9 20 3

10 19 5

2- Alcoolistas

1 19 1

2 18 5

3 25 3

4 22 0

5 23 2

6 21 7

7 22 0

8 23 4

9 20 0

10 21 3

3- Aparelho

1 18 2

2 18 3

3 22 6

4 23 6

5 20 3

6 21 4

7 19 7

8 20 5

9 20 1

10 20 11

4- Fumantes alcoolistas

1 20 5

2 20 0

3 21 4

4 22 6

5 22 7

6 21 1

7 20 3

8 24 0

9 19 6

10 21 11

Devido à homogeneidade da idade dos voluntários (20,4), a média de

idade dos grupos (Tabela 3) apresentou uma variação pequena, de 2,3 anos, entre os

grupos com menor e maior média. Os dados postados na tabela 3 apresentam ainda

dados referentes à mediana e à média das contagens de MN, sendo que ambas,

apresentam uma discrepância grande entre os grupos, tendo valores variando de 0,5 a

4,5 para mediana e de 1,6 a 4,8 para média.

A disposição dos valores de freqüência de MN por 1000 células (Tabela 3)

apresentou a seguinte ordem: 0,53 (Grupo 1) < 0,83 (Grupo 2) < 1,43 (Grupo 4) < 1,6

(Grupo 3). Embora estes valores não sirvam como dados estatísticos, acabam tendo

sua importância na comparação descritiva entre dados obtidos na literatura assim como

para comparação da média esperada na população.

A comparação dos valores dos postos médios por meio do teste de

variância não paramétrico de Kruskal-Wallis verificou a existência de diferença

estatisticamente significante (p = 0,043) entre os quatro grupos. Para que fosse identificado

entre quais grupos existe diferença foi realizado a comparação entre pares de grupo pelo

teste de Mann-Whitney. Os resultados apontam diferenças estatística entre os grupos 1 e

3 (p ≤ 0,01) e entre os grupos 1 e 4 (p ≤ 0,05).

Tabela 3 – Análise descritiva dos grupos com idade média, número de amostragem, mediana, média,

desvio padrão e posto médio. Análise de variância não paramétrica entre os quatro grupos

(Kruskal-Wallis) e grupo a grupo (Mann-Whitney).

Grupo Idade n Mediana Média ± DP Freqüência

de MN por

1000 células

Posto

Médio

19,1 10 0,5 1,6±1,96 0,53 26,65

21,4 10 2,5 2,5±2,37 0,83 13,50 * °

20 10 4,5 4,8±2,9 1,6 17,65

21,1 10 4,5 4,3±3,47 1,43 24,20

Diferença entre os grupos H (χ²) = 8,153

p = 0,043 (Kruskal-Wallis)

Notas: * diferenças significante entre os grupos 1 e 3 (Mann-Whitney p ≤ 0,01)

° diferenças significante entre os grupos 1 e 4 (Mann-Whitney p ≤ 0,05)

5.3 INCIDÊNCIA DE MN – FASE DOIS DO ESTUDO

A tabela 4 demonstra as freqüências absolutas da contagem de MN para

os 40 indivíduos, ao início do experimento e após o período de tratamento de 10 dias,

agrupados de acordo com a modalidade de tratamento realizada.

Tabela 4 – Disposição das contagens absolutas de MN nos momentos inicial e final do experimento,

organizadas em grupos distintos conforme o tratamento recebido.

Tratamento Contagem inicial de MN Contagem após tratamento

1 – Óleos essenciais

5 3

7 9

6 6

3 4

0 0

1 0

0 2

3 3

6 5

7 6

2 – Álcool

6 6

0 2

5 7

7 7

3 5

0 0

0 3

3 5

4 5

11 9

3 – Álcool + Clorexidina

4 3

3 1

1 2

2 3

0 0

0 3

4 4

2 3

3 3

1 2

4 -Clorexidina

0 1

1 0

11 5

0 1

4 6

3 5

0 1

5 7

6 5

5 4

A análise estatística dos diferentes grupos foi realizada com o teste não

paramétrico de Wilcoxon comparando os dados pareados de cada modalidade de

tratamento em momentos distintos, inicial e final. Os diferentes tratamentos não

produziram nenhuma mudança significativa da freqüência de células micronucleadas

sendo, inclusive, que para os grupos T 1 (Óleos essências) os valores de média

permaneceram exatamente os mesmos nos momentos inicial e final. A maior diferença

encontrada, porem não significante (p = 0,079) foi para o grupo T 2 (álcool).

Tabela 5 – Comparação inicial e final para cada modalidade de tratamento para Média e Desvio Padrão,

Posto Médio, Soma dos Postos e valor de Z e p para o teste de Wilcoxon.

Grupo

Média±DP Mediana

dos

postos

Posto

médio

Soma

dos

postos

Significância (p)

Inicial 3,8±2,7 4 5,75 20,50

T 1

Final 3,8±2,8 3,5 5,13 34,50

-0,732 0,464

Inicial 3,9±3,5 3,5 4,00 24,00

T 2

Final 4,9±2,6 5 4,00 04,00

-1,754 0,079

Inicial 2,0±1,4 2 3,80 19,00

T 3

Final 2,4±1,1 3 4,50 09,00

-0,877 0,380

Inicial 3,5±3,5 3,5 3,50 10,50

T 4

Final 3,1±2,72 3 3,00 10,50

0,000 0.84

6 DISCUSSÃO

Ao longo da vida de um indivíduo, inúmeros são os fatores a que se

encontra exposto. A atuação de substâncias químicas, agentes físicos e biológicos

associada a fatores genéticos herdados ou não, pode agir sobre células normais e

aumentar a freqüência de aparecimento de mutações celulares que estão

correlacionadas ao desenvolvimento dos tumores. Portanto, um estímulo patológico pode

ocasionar a divisão caótica e desenfreada das células de um local gerando assim um

crescimento tecidual autônomo que foge dos padrões genéticos e fisiológicos (BORAKS,

1999).

Os resultados obtidos com a análise de células micronucleadas

permitem relacionar os fatores agressores existentes no ambiente bucal com as

alterações cromossômicas condizentes com a pré-disponibilidade ao desenvolvimento de

neoplasias bucais.

A organização deste trabalho em duas fases permitiu o estudo de vários

agentes químicos e físicos atuantes na cavidade bucal. A primeira fase, consistida de um

estudo transversal, permitiu a avaliação de agentes químicos, provenientes dos hábitos

dos voluntários estudados, como o fumo e o álcool de bebidas, e físicos provenientes da

intervenção profissional, como é o caso da utilização de aparelhos ortodônticos. A

segunda fase, consistida de um estudo clinico paralelo duplo cego, permitiu a

investigação da ação dos agentes químicos existentes na composição dos colutórios

bucais, como os óleos essências, o álcool e a clorexidina, sobre a formação de MN na

mucosa bucal.

Estatisticamente os resultados apontaram uma prevalência maior de

células micronucleadas para o grupo dos usuários de aparelho ortodôntico e para o grupo

de fumantes alcoolistas, ambos quando comparados ao grupo controle (abstêmios).

Dentre os objetivos da pesquisa a incorporação de um grupo

exclusivamente de voluntários que utilizavam aparelhagem ortodôntica visou representar

um universo de situações em que o trauma mecânico perfaz uma ação física constante

sobre as células epiteliais. Em uma primeira análise, a verificação de uma maior

prevalência de MN em usuários de aparelhos ortodônticos, nos chama atenção pela

correlação positiva que temos entre presença de MN e alterações cromossômicas

predisponentes a neoplasias. Dentro desse aspecto, a ação física de trauma

representada pelo aparelho ortodôntico deve ser similarizada a situações bucais em que

também temos a presença constante de trauma e que apresentam um vasto histórico de

predisposição ao desenvolvimento de neoplasias. O exemplo clássico dessa correlação é

ação de próteses mal adaptadas, câmeras de sucção, próteses quebradas, no

desenvolvimento do câncer bucal (TOMMASI; GARRAFA, 1980). Obviamente, estas

condições clínicas não podem ser apontadas como causa única direta do

desenvolvimento de lesões cancerosas. A diversidade do ambiente bucal nos faz avaliá-

las como co-fatores predisponentes, assim como dentro da presente pesquisa não

podemos isolar os resultados dos grupos como causa única do aumento da freqüência de

células micronucleadas. Portanto, para comparação da hiperqueratose desenvolvida pelo

aparelho ortodôntico ao trauma de algumas situações clínicas deve ser feita alguma

observações.

A hiperqueratose irritativa como o próprio nome indica, é uma

hiperplasia da camada superficial de queratina provocada por trauma mecânico de baixa

intensidade (BÓRAKS, 1999). A hiperqueratose por atrito desenvolvesse na mucosa

bucal em resposta a irritação de baixa intensidade, crônica (CAWSON et al., 1997). A

atrição ou fricção contra uma área da mucosa bucal pode resultar em uma lesão branca

hiperceratótica, análoga a um calo cutâneo. A resposta tecidual representa uma proteção

contra um traumatismo contínuo de baixa intensidade (REGEZI; SCIUBBA, 1991). É

reversível, uma vez removido o agente causal a hiperqueratose desaparece (BÓRAKS,

1999). Assim, de acordo com Tommasi e Garrafa (2002), a hiperqueratose pode ser

resumida como sendo uma lesão branca da mucosa bucal, caracterizada

histologicamente por aumento da camada de ceratina, com tendência à regressão e cura

espontânea, uma vez removido o agente causador, quase sempre irritativo (fumo, álcool,

arestas dentárias cortantes, aparelhos ortodônticos, próteses).

Nas lesões hiperceratóticas friccionais simples não se observam

alterações epiteliais displásicas (REGEZI; SCIUBBA, 1991). Há uma espessa camada de

ortoqueratina, seguidas vezes com aumento da camada de células granulares e grau

variável de acantose. Freqüentemente o cório mostra-se infiltrado por células

inflamatórias crônicas (CAWSON et al., 1997). A hiperproliferação por si só aumenta a

exposição à outros agentes carcinogênicos e, em se tornando permanente, é o primeiro

passo para um processo de transformação maligna (SEITZ; PÖSCHL; SIMANOWSKI,

1998).

Em um estudo retrospectivo sobre o risco do câncer de vias

aerodigestivas superiores, o uso de próteses dentárias não foi associado a um risco

aumentado, todavia história de úlceras orais secundárias à má adaptação e má higiene

oral devido à baixa freqüência de escovações dentárias foram tidos como fatores de risco

(VELLY; FRANCO; SCHLECHT, 1998).

A composição de uma amostra experimental exclusivamente por alunos

de odontologia com a divisão dos voluntários de acordo com variáveis independentes

exclusivas para alguns grupos, como o fumo e o uso de aparelho, procurou criar

homogeneidade das amostras diminuindo a possível ação de vieses. Embora fatores

como a predisposição genética intrínseca do individuo, microbiota bucal, hábitos de

alimentação acabam sendo fatores sabidamente influentes na manifestação de MN.

A falta ou deficiência de qualquer nutriente pode ser prejudicial ao

organismo humano, tornando-o mais susceptível a ação de substâncias carcinogênicas.

(PETRIDOU, 2002).

Em um estudo sobre o consumo freqüente de uma dieta rica em gordura

animal saturada e risco de desenvolvimento de câncer oral os autores verificaram a

presença de uma relação positiva entre essas duas variáveis. Sugeriram que programas

de promoção de saúde poderiam abordar a adoção de hábitos alimentares para

proporcionar uma mudança no risco de desenvolvimento de câncer oral e objetivar

conseqüentemente efeitos benéficos para o controle de diabetes, doenças

cardiovasculares e outros cânceres (TOPORKOV; ANTUNES; TAVARES, 2004). Existe

redução de 20 a 60% no risco para o câncer oral na adoção de uma dieta rica em

vegetais verde-amarelos e frutas frescas assinalando o efeito protetor proporcionado

pelos micro-nutrientes presentes nesses alimentos (STEWART; KEYHUES, 2003).

A agressão direta ao DNA celular tem sido atribuída a alguns tipos de

vírus no processo da carcinogênese do carcinoma de células escamosas. O Papiloma

vírus humano (HPV) tem sido estudado quanto ao possível envolvimento nesse processo

(SUGIYAMA et al., 2003), assim como a Cândida Albicans (FIELD; FIELD; MARTIN,

1989; KIGNEL; BIRMAN, 2000)

Harris et al. (2003) estudaram a associação entre álcool e lesões orais e

não encontraram relação de risco do álcool isoladamente. Quando analisado o

sinergismo álcool/tabaco, observaram um incremento no risco de desenvolvimento de

lesões orais.

No presente estudo o grupo constituído por fumantes alcoolistas

apresentou diferença significativa (p ≤ 0,05) na freqüência de micronúcleos quando

comparado ao grupo de abstêmios. Historicamente a literatura apresenta uma vasta

revisão associando álcool e fumo como o câncer.

O tabaco libera quantidades consideráveis de nitrosaminas, que dão

forma a um grupo de carcinógenos químicos principais entre os mais de 4000 produtos

químicos identificados no fumo do tabaco (STICH; ROSIN, 1983). Os nitrosaminas

específicas do tabaco são solúveis na saliva, sendo potentes carcinogênicos,

responsáveis pela indução de aberrações cromossômicas, o que resulta no aumento

freqüências de MN (SUHAS, 2004). O efeito sinergístico entre álcool e fumo decorre do

possível aumento da permeabilidade tecidual dos compostos da combustão do fumo

quando associado ao álcool (BARAONA; GUERRA; LIEBER, 1981).

Pacientes fumantes e alcoolistas acabam por constituir uma população

com uma incidência maior ao câncer bucal (BOFFETTA et al., 1992). Em estudos

epidemiológicos demonstrou-se que indivíduos alcoólatras apresentavam risco de câncer

6,4 vezes maior que indivíduos abstêmios de álcool, fato este decorrente do efeito

sinérgico do álcool aos componentes do cigarro, como o Benzopireno e o 4-

(methilInitrosamina)1(3-pyridyl), sabidamente agentes carcinogênicos (WELLS et al.,

1997).

A presença de MN ocorre de forma concomitante com outras anomalias

metanucleares. Alterações degenerativas, apoptóticas e carcinogênicas tem sua

freqüência correlacionada não só a presença do agente agressor, mas também a sua

intensidade. A ação clastogênica causada pelo álcool e pelo fumo pode configurar

quadros de agressão fraca, moderada e forte conforme descrito por Ramires e Saldanha

em 2002;

Na agressão fraca ocorre o Favorecimento o aparecimento de células em

processo de cariólise (CL) - que é uma dissolução do núcleo em três ou quatro

fragmentos menores em decomposição (SNEL, 1985), sendo similar ou processo

fisiológico de renovação do epitélio. A Agressão de baixa intensidade permite o correto

reparo tecidual na qual as células agredidas podem, no decorrer da migração para a

superfície do epitélio, sofrerem lise completa desaparecendo da camada de coleta celular

(STICH; ROSIN, 1983). Já na agressão moderada a ação pode ocorrer nas células

epiteliais da camada basal, afetando diretamente o núcleo celular. No entanto, estas

células são mantidas no tecido enquanto viáveis, apresentando alterações do tipo

broken-egg (BE) e ou de MN (BHATTATHIRI et al., 1998). A agressão forte seria induzida

pela ação sinérgica de dois ou mais agentes clastogênicos, a alteração nuclear poderia

ser tão intensa a ponto de provocar o à perda do controle apoptótico, podendo ainda

levar a formação de mais de um MN por célula (STICH; ROSIN, 1983).

A contagem de MN subestima metodologicamente a sua ocorrência real.

Isto acontece porque, durante o processo de divisão celular, o fragmento cromossômico

ou cromossomo inteiro perdido do núcleo pode: a) ser reincorporado a um dos dois

núcleos filhos, b) ir para fora do citoplasma de ambas células filhas, ou c) ficar no

citoplasma de uma das células filha na forma de micronúcleo. Nos dois primeiros casos,

não se observa perda do material cromossômico. (RAMIREZ; SALDANHA, 2002)

A freqüência de MN está correlacionada diretamente com a probabilidade

da ocorrência de alterações do DNA celular, sendo a alteração nuclear mais

correlacionada com o processo de carcinigênese (ROBERTS, 1997). Embora não indique

necessariamente a existência de uma pré-neoplásica (RAMIRES; SALDANHA, 2002).

A aplicações de comparações de freqüência de MN entre diferentes

populações encontram discrepância na literatura (TABELA 6). Já que se torna difícil

compatibilizar as diferenças metodológicas entre os inúmeros laboratórios (ADHVARYU;

DAVE; TRIVEDO, 1991), sugere-se que produzam controles citogeneticamente mais

padronizados nas investigações a fim de não somente diminuir os erros aleatórios, isto é,

a variabilidade entre os observadores, como também eliminar os erros sistemáticos

decorrentes da análise microscópica (GAREWAL et al, 1993).

Tabela 6 - Frequência de MN utilizadas como referências controles em diferentes investigações de

mutagenicidade descritas na literatura

População

controle de

idade

(média ou

intervalo)

sexo

N°de

indivíduos

N°células

analisadas

por indivíduo

Freqüência de

MN por 1000

células

Autor

fumantes e 20->50 15 mínímo de 500 3

20 Stích e Rosin

1983

alcoólicos

mascadores de 34 minimo de 500 4,00 Stich; Stich e Rosin., 1985

fumo com betel

Mascadores de 32,70 M/F 15 Mínimo de 1000 1,93 Adhvaryu; Dave e Trivedi, 1991

noz de areca

pacientes com 37,68 MIF 25 ;03000 3,80 Sarto et al., 1987

carcinomas

orais

trabalhadores de 33,00 M 19 3000 0,47 Diaz; Fonseca e Fernandez, 1990

indústria de

tintas

usuários de rapé 61,40 F 15 conversão para 1,58 Tolbert; Shy e Allen, 1991

1000

mascadores de 14 mínímo de 500 5,00 Stich; Stich e Rosin, 1985

noz de betel

mascadores de 17-42 b MIF 29 1000 1,75 Kayal et al., 1993

qualquer fumo e

alcoólicos

mascadores de 15-45

MIF 10 1000 1,83 Kayal et al., 1993

qualquer fumo e

alcoólicos

mascadores de 20-25 d

13 1000 1,00 Kayal et al., 1993

qualquer fumo e

alcoólicos

mascadores de 20-25 c MIF 15 1000 1,90 Kayal et al., 1993

qualquer fumo e

alcoólicos

enfermeiros 34,60 MIF 25 1000 0,17 Machado-Santelli

expostos á et al.,1994

drogas

neoplásicas

indivíduos 30-42 F 5 de 2500 a 5600 1,62 Titenko-Holland

saudáveis' et al.,1994

trabalhadores 47 ;27 M 15 1500 2,18 Surrallés et al., 1997

expostos ao

benzeno

usuários de rapé

19 1,348 1,80 Roberts, 1997

Nota: ‘ grupo controle não utilizado em comparação com população exposta; b,c,d regiões da índia; • testes não paramétricos.

O teste do micronúcleo pode ser instrumento de triagem diagnóstica

para prevenção e conduta clínicas em indivíduos sob risco carcinogênico tais como os

expostos a agentes biotóxicos ambientais. Por ser uma técnica simples, prática, não

invasiva e de baixo custo permite, com facilidade, o monitoramento individual de

pacientes com carcinomas orais, sua evolução clínica, recidivas, surgimento de novas

neoplasias, lesões leucoplásicas bem como alterações tópicas causadas por

biopoluentes mutagênicos, através do controle intra-individual de diferentes tecidos e

inter-individual de populações. (RAMIREZ et al., 1999).

7 CONCLUSÕES

Por meio dos resultados provenientes da metodologia empregada neste

estudo, podemos concluir que:

1- A comparação da freqüência de micronúcleos nas regiões de mucosa

jugal indica que o trauma mecânico, assim como a ação conjunta do

fumo e álcool, podem contribuir estatisticamente para o

desenvolvimento de Micronúcleos;

2 - A utilização de colutórios bucais, em curto prazo, não foi capaz de

causar aumento na freqüência de Micronúcleos.

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APÊNDICE - Termo de consentimento livre e esclarecido

Eu, __________________________________,RG____________, abaixo qualificado,

DECLARO para fins de participação em pesquisa, na condição de que fui devidamente esclarecido

da minha participação no do Projeto de Pesquisa intitulado Avaliação de Micronúcleos em

Células Epiteliais Bucais desenvolvido pelo Cirurgião Dentista especialista em periodontia

Ricardo Kern do Curso de Mestrado em Odontologia da Universidade Estadual de Ponta Grossa

quanto aos seguintes aspectos:

a) Esta pesquisa se trata de uma pesquisa clínica na qual farei parte como paciente, ciente dos

meus compromissos de seguir as orientações e cuidados a mim passados.

b) Será realizado um breve exame clínico para que se possa efetuar a marcações sobre o índice

de placa bacteriana e a coleta de células da mucosa bucal. O procedimento de coleta das

células epiteliais da mucosa da bochecha é procedimento indolor, não invasivo e rápido

realizado com uma leve fricção com uma escova de cerdas macias apropriada.

c) O Pesquisador irá me fornecer os produtos de bochecho necessários gratuitamente.

Disponibilizando seus telefones para que eu possa entrar em contato para relatar qualquer

dúvida ou desconforto.

d) Será realizada documentação sobre o consumo do total de álcool ingerido durante cada

período da pesquisa, sendo ainda, que o pesquisador se compromete sobre o sigilo absoluto

sobre os dados referentes a cada participante.

e) Possuo a liberdade de me recusar a participar ou retirar meu consentimento, em qualquer

fase do estudo, sem penalização alguma e sem prejuízo ao seu cuidado.

Nome:............................................................................................

RG:..................... .......Data de nascimento:........ / ........ / ...... Sexo: M ( ) F ( )

Endereço: ............................................ nº ........................... Apto: .................

Bairro:.....................................Cidade:...........................Cep:................Tel.:.................

DECLARO, outrossim, que após convenientemente esclarecido pelo pesquisador e ter entendido o

que me foi explicado, consinto voluntariamente em participar desta pesquisa.

______________________________

Assinatura do Declarante

ANEXO A – Questionário de consumo de bebidas alcoólicas

Qual é o seu consumo?

É importante saber o que seria uma unidade de álcool em cada dose que você consome,

porque o que pode ser uma dose para você pode não ser uma dose efetivamente. Abaixo encontra-

se uma tabela sobre o que seria considerada uma unidade de álcool em diferentes tipos de drinks:

• 1 copo de cerveja ou chopp

• 1/2 dose de pinga, whisky ou qualquer tipo de destilados (pinga, vodka, gin, cognhac, etc)

• 1 copo típico de vinho

• 1 taça de champagnhe

• 1 cálice de licor ou vinho do porto

= 1 UNIDADE / 1 DOSE

Levando em conta o que seria uma unidade de álcool, preencha diariamente a tabela abaixo

durante uma semana, escrevendo o número de doses ou unidades de álcool consumidas durante

todo o dia. Não pense só na noite.

PERIGO: As doses em casa costumam serem mais generosas do que as doses do bar. Mesmo em

alguns bares, o famoso “chorinho” pode significar uma segunda dose. Perceba realmente quantas

doses estão sendo consumidas em um único copo.

Dias da semana Tipo de bebida Unidades Total

Diário

Segunda-feira

Terça-feira

Quarta-feira

Quinta-feira

Sexta-feira

Sábado

Domingo

TOTAL SEMANAL = ________________

ANEXO B – Questionário de hábitos

Nome: _______________________________________________________________

Email: _______________________________________________________________

Tipo de Hábitos

Faz uso de bebidas alcoólicas? ( ) sim ( ) não Já fez? ( ) sim ( ) não

Início do consumo: ____ anos Término do consumo ___ anos Abstinência:____anos

Tipo de bebido: _________________________________________________________

Intensidade do consumo: 1 ( ), 2 ( ), 3 ( ), 4 ( )

Intensidade – 1 para cada dose de destilado ou para cada cerveja ou para cada ½ garrafa de vinho por dia,

mas não todos os dias. Considera-se ainda, (1) para quem bebe somente nos finais de semana, (2) para quem

bebe moderadamente durante a semana e fins de semana, (3) para quem bebe moderadamente intercalado

com aumento de consumo, como por exemplo em fins de semana, (4) Para quem tem alto consumo todos os

dias.

Fuma? ( ) sim ( ) não Já fumou? ( ) sim ( ) não

Início do tabagismo: ____ anos Término do tabagismo: ____ anos Abstinência:____anos

Tipo de cigarro/fumo _____________________________________________________

Intensidade do consumo: 1 ( ), 2 ( ), 3 ( ), 4 ( )

Intensidade - (1) pouquíssima de 1-2 cigarros por dia; (2) menos que 10 cigarros; (3) entre 10-20 cigarros

dia; (4) mais que 20 cigarros – 1 maço por dia.

Toma café: ( ) Sim ( ) Não

Freqüência: ( ) só pela manhã ( ) 3x ao dia ( ) várias

Medicação: ( ) sim ( ) não Tipo: ________________________ Tempo: ____________

Antibiótico nos últimos 3 meses? ( ) Sim Qual? _______________________________

Bochecha com algum colutório específico? ( ) Sim Qual? ________________________

Raios X: ( ) Sim Quantidade: _____________________________________________

Hábito de consumo de chá ou mate? ( ) Sim Freqüência: ________________________

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