ads:
Universidade de Brasília
Instituto de Ciências Biológicas
Departamento de Botânica
Clonagem e Estudo da Expressão do Gene da mio-Inositol 3-Fosfato
Sintase (MIPS) em maracujazeiro (Passiflora edulis Sims f. flavicarpa
Degener)
Emanuel Felipe Medeiros Abreu
Brasília-DF
2006
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Clonagem e Estudo da Expressão do Gene da mio-Inositol 3-Fosfato
Sintase (MIPS) em maracujazeiro (Passiflora edulis Sims f. flavicarpa
Degener)
Dissertação apresentada ao
Departamento de Botânica, do
Instituto de Ciências Biológicas,
da Universidade de Brasília, como
parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de MESTRE
EM BOTÂNICA.
Emanuel Felipe Medeiros Abreu
Orientador: Francisco José Lima Aragão
Brasília-DF
2006
ii
ads:
Este trabalho foi realizado no laboratório de transferência de genes da Embrapa
Recursos Genéticos e Biotecnologia, sob orientação do Dr. Francisco José Lima
Aragão.
iii
Clonagem e Estudo da Expressão do Gene da mio-Inositol 3-Fosfato
Sintase (MIPS) em maracujazeiro (Passiflora edulis Sims f. flavicarpa
Degener)
Emanuel Felipe Medeiros Abreu
Esta dissertação foi julgada adequada para obtenção do título de
Mestre em Botânica e aprovada em sua forma final pelo programa de Pós-
graduação em Botânica da Universidade de Brasília.
____________________________________________
Dr. Francisco José Lima Aragão
Presidente da Banca Examinadora-Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia
____________________________________________
Dra. Diva Maria de Alencar Dusi
Membro - Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
____________________________________________
Dr. Luiz Alfredo Rodrigues Pereira
Membro - Universidade de Brasília (UnB)
____________________________________________
Dr. Giovanni Rodrigues Vianna
Membro - Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
iv
Dedico esta Dissertação de
Mestrado ao Brasil, que
anda tão carente de
conhecimentos e valores.
Espero que um dia eu possa
ajudá-lo a se tornar em uma
grande nação.
v
Agradecimentos
É com muita emoção e satisfação que finalizo mais uma etapa da minha jovem
vida profissional. Estou realmente feliz com este acontecimento, pois quando sai do
meu querido Ceará para tentar conquistar novos horizontes em Brasília, não imaginava
que iria conseguir alcançar com tamanha avidez os objetivos almejados. Embora
existisse uma forte determinação de buscar fazer o melhor. Mas considero que nada
disso seria factível sem a ajuda das pessoas que pretendo lista abaixo.
Primeiramente, agradeço a Deus, por entender que minha vida pertence a ele, e
todas as coisas só são possíveis através da sua permissão.
Aos meus pais, Joaquim e Lúcia, por serem os principais responsáveis por esta
conquista. Pois, além da vida, amor, educação, valores, personalidade e palavras de
incentivo, estiveram comigo durante todo o período do mestrado, mesmo estando a
centenas de quilômetros de mim.
Ao meu querido irmão Henrique, pelas palavras de incentivo, torcida e carinho
sempre que nós tinhamos a oportunidade de conversar.
Ao meu orientador Dr. Francisco J. L. Aragão, que sempre esteve presente em
todas as fases do mestrado, ensinando, incentivando, e principalmente, orientando para
que eu adquirisse uma boa formação acadêmica.
Ao meu primeiro orientador, Prof. Francisco Campos, pela oportunidade de
estagiar na Embrapa Cenargen. Para você minha eterna gratidão e respeito.
Aos meus queridos avós, Raimundo Abreu e Stela, por serem minhas referências
de vida e por estarem presentes em todos os momentos, dispostos a ajudar quando
necessário.
Ao meu querido tio Tadeu, que me ajudou na revisão do artigo científico, e por
ser um exemplo a ser seguido por mim e por qualquer pessoa que queira ser um
cientista respeitado.
Aos meus tios, tias, primos e demais familiares que sempre estiveram na torcida
transmitindo muitas palavras de carinho, incentivo e confiança.
Aos meus primos, Joãozinho e Mara, por me receberem tão bem em sua casa
quando vim fazer a prova do mestrado na UnB.
vi
À minha amada namorada Kenny, que esteve comigo em boa parte dessa
jornada, dando-me apoio, palavras de confiança, carinho e amor. Sem a sua presença
tenho certeza que este caminho teria sido muito mais árduo.
À Dona Viana que sempre se mostrou solicita e fez coisas por mim que só uma
mãe faria por um filho.
A toda família da Kenny, especialmente ao Junior e Karine, que me receberam
de braços abertos em sua família, permitindo que eu tivesse um convívio familiar
mesmo longe da minha família.
Ao meu amigo Osmundo Brilhante, que me recebeu tão bem na sua casa desda
primeira vez que estive em Brasília, e sempre buscou me aconselhar, incentivar e
orientar, dando uma importante contribuição para minha formação.
Aos meus amigos de caminhada, Érico e Paulo Henrique, pelo ótimo convívio
em nossa república de Cearenses, onde sempre buscamos manter o respeito e tolerância
entre nós.
A minha amiga de caminhada e colega de graduação, Carla Letícia, que sempre
esteve perto de mim, mesmo distante, acreditando, incentivando, e passando palavras de
carinho todas as vezes que tínhamos oportunidade de conversar.
Ao Prof. Luiz Alfredo, pela sua co-orientação e por se mostrar disponível a
ajudar e contribuir com a minha formação.
À Prof
a
. Conceição Eneida, que contribuiu muito na fase de apresentação do
projeto de mestrado.
À Dra. Diva Dusi, pelas valiosas sugestões durante a qualificação e defesa final
da dissertação.
Ao meu amigo e colega de trabalho Giovanni Vianna, que contribuiu muito na
fase de defesa do projeto, e por sempre se mostrar disponível a ajudar nas técnicas do
laboratório.
À Gabriela Araujo, pela grande contribuição que me deu durante o mestrado.
À grande profissional Elsa, que com seu jeito materno sempre esteve disponível
a ajudar com as coisas do laboratório.
A todos os meus amigos do Laboratório de Transferência de Genes, Nicolau,
Bárbara, Sharon, Wel, Gustavo, Maria Laine, Andréia, Marilha, Hugo, Lívia, Angélica,
Thaís, Luiza, Betúlia, Paula, Natália, Aline, Cristiano, Luiz, Nayche, Sérgio, Ana Paula,
Margarete, Daniela, Érica, Arlei.
vii
Ao pessoal do Laboratório de Apomixia, Elisangela, Ana Luiza, Larissa e Érica,
pelo ótimo convívio no trabalho.
Aos meus colegas de curso, pelo excelente convívio e amizade durante o
mestrado. Espero poder reencontrá-los em uma nova caminhada.
Ao Cenargen e todos os funcionários, que direta ou indiretamente contribuíram
para a realização desta jornada.
A todos os professores do mestrado, que sem dúvida deram uma contribuição
importante na minha formação acadêmica e profissional.
A atual coordenadora do mestrado, Prof
a
. Dalva Graciano, que me incentivou,
aconselhou, e foi uma figura amiga durante o mestrado.
A todos os funcionários da coordenação do mestrado, Flávia, Alexandre, e de
maneira especial ao Iriodes, que contribuíram muito para o cumprimento deste trabalho.
Aos amigos Orlando e Andréia, pelo convívio e grande ajuda durante a fase de
impressão da dissertação de mestrado.
Finalmente, a todas as pessoas que de uma forma ou de outra passaram pelo meu
caminho, e deixaram algo de bom.
viii
Sumário
Sumário de Figuras xi
Sumário de Tabelas xii
Abreviaturas xiii
Resumo xiv
Abstract xv
1. Introdução 16
1.1. Aspectos gerais da família Passifloraceae 16
1.2. A espécie Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Degener 17
1.3. Importância econômica da cultura do maracujazeiro 17
1.4. Metabolismo do mio-inositol e seus derivados 20
1.5. Características da enzima mio-inositol 3-fosfato sintase (MIPS) 24
1.6. Expressão do gene MIPS em condições de estresse abiótico 27
2. Objetivos 30
3. Material e Métodos 31
3.1. Clonagem de um fragmento do gene MIPS do maracujazeiro (Passiflora edulis) 31
3.2. Rapid Amplification of cDNA Ends (5´ RACE e 3´ RACE) 32
3.3. Análise da expressão do gene PeMIPS por RT-PCR 34
3.4. Análise da expressão do gene PeMIPS sob condições de estresse por frio e calor 35
3.5. Análise de Southern blot para verificação do número de cópias do gene MIPS no genoma de
cinco espécies diferentes de Passiflora
35
3.6. Filogenia do gene MIPS 36
4. Resultados e Discussão 38
ix
4.1. Clonagem e sequenciamento do gene MIPS de maracujazeiro (Passiflora edulis) 38
4.2. Análise da proteína PeMIPS 42
4.3. Análise da expressão do gene PeMIPS 43
4. 4. Análise da expressão do gene PeMIPS sob condições de estresse por frio e calor 45
4.5. Análise de Southern blot para verificação do número de cópias do gene MIPS no genoma de
cinco espécies diferentes de maracujazeiro
47
4.6. Análise filogenética do gene PeMIPS 50
5. Conclusão
52
6. Referências Bibliográficas
53
Anexo 1 Soluções e Reagentes 60
Anexo 2 Submissão das seqüências ao Genbank 65
Anexo 3 Resumo do trabalho apresentado no 52° Congresso Brasileiro de Genética 71
Anexo 4 Artigo concluído e submetido ao periódico Annals of Botany 73
x
Sumário de Figuras
Figura 1. Esquema representativo da via enzimática e funcional do mio-inositol e
derivados segundo Styer (2000)
23
Figura 2. Reações da rota de síntese do mio-inositol 3-fosfato segundo Stein &
Geiger (2002)
26
Figura 3. Modelo da enzima MIPS proposta por Stein & Geiger (2002) 29
Figura 4. Modelo espacial cheio da enzima MIPS 29
Figura 5. PCR 5´ e 3´ RACE do gene PeMIPS 33
Figura 6. Seqüência completa do cDNA do gene PeMIPS e da proteína deduzida
in sílico
41
Figura 7. Predição in sílico da seqüência da proteína PeMIPS 42
Figura 8. RT-PCR do gene PeMIPS em distintos órgãos e durante o
desenvolvimento da semente
44
Figura 9. RT-PCR do gene PeMIPS em plantas oito semanas após a germinação,
submetidas a condições de frio e calor
46
Figura 10. Análise de Southern blot no genoma do maracujazeiro 49
Figurar 11. Análise filogenética das seqüências de cDNA do gene MIPS 51
xi
ABREVIATURAS
C
DNA - DNA complementar
°C - graus Celsius
DNA - ácido desoxirribonucléico
DNTP - desoxinucleotídeos trifosfatos
DTT - ditiotreitol
IP
3
- inositol 1,2,3-fosfato
IP
6
- fitato
InsP
6
- fitato
NaCl - cloreto de sódio
NaOH - hidróxido de sódio
E.U.A. - Estados Unidos da América
M - molar
P - fósforo
pb - pares de bases
p/v - peso por volume
kb - quilo base (1.000 bases)
RNA - ácido ribonucléico
g - força gravitacional
rpm - rotação por minuto
µ - micro (10
-6
)
n - nano (10
-9
)
U - unidades de enzima
Ω - ohms (unidade de resistência elétrica)
µF - micro Faraday
kV - quilo Volts
~ - aproximadamente
mL - mililitros
ton - tonelada
ha - hectare
kV/cm - quilo volte por centímetro
xiii
Resumo
A mio-inositol-1L-fosfato sintase (MIPS) é a enzima responsável pela conversão
de D-glucose 6-fosfato a 1-L-mio-inositol-1-fosfato, primeiro e limitante passo na via
de síntese de todos os compostos derivados do inositol. Os inositol-fosfolipídios, assim
como outros compostos derivados do inositol, têm um papel fundamental no tráfico de
membrana e rotas de sinalização, estocagem e transporte de auxinas, biossíntese de
ácido fítico e parede celular, e produção de moléculas relacionadas ao estresse. No
presente trabalho, nós caracterizamos um cDNA do gene MIPS de sementes de
Passiflora edulis f. flavicarpa (PeMIPS1) e investigamos a sua expressão espacial, bem
como mudanças na transcrição em plantas submetidas ao estresse causado pelo frio e
calor Para estas análises, uma seqüência do cDNA do gene MIPS foi isolada por PCR
(5´e 3´RACE) e os níveis dos transcritos foram analisados usando RT-PCR semi-
quantitativo durante o desenvolvimento da semente, óvulo, grão-de-pólen, folha, caule,
pétala, glândula foliar e em resposta ao estresse. A seqüência completa do cDNA do
gene PeMIPS foi isolada, clonada e caracterizada. Adicionalmente, o número de cópias
do gene PeMIPS clonado foi determinado por análise de Southern blot no genoma de
Passiflora edulis, Passiflora eichleriana, Passiflora caerulea, Passiflora nitida e
Passiflora coccinea. Esta análise indicou que o DNA genômico pode conter diversas
seqüências de outros genes MIPS, mas uma única cópia do gene PeMIPS clonado foi
encontrado no genoma de P. edulis, P. eichleriana, P. caerulea, P. nitida e P. coccinea.
A análise da expressão por RT-PCR revelou a presença de transcritos de PeMIPS em
óvulos, grãos-de-pólen, folhas e durante os estágios do desenvolvimento da semente,
com um pico nove dias após a polinização. Verificou-se ainda, que o gene PeMIPS é
diferencialmente regulado sob condições de estresse causado pelo frio e calor em
resposta à presença ou ausência de luz. Portanto, o presente trabalho sugere que o
PeMIPS tem um importante papel no estabelecimento de programas de
desenvolvimento e na resposta das plantas à mudanças ambientais.
xiv
Abstract
Myo-inositol-1L-phosphate synthase (MIPS) catalyses the conversion of D-
glucose 6-phosphate to 1-L-myo-inositol-1-phosphate, the first and rate-limiting step in
the biosynthesis of all inositol-containing compounds. Inositol phospholipids play a
vital role in membrane trafficking and signalling pathways, auxin storage and transport,
phytic acid biosynthesis, cell wall biosynthesis, and production of stress-related
molecules. In the present study, we characterised an MIPS cDNA from developing
Passiflora edulis f. flavicarpa (PeMIPS1) seeds and investigated its spatial and
differential expression, as well as changes in its transcription during exposure of
growing plants to cold and heat stresses. MIPS encoding gene was isolated by PCR
methods and the transcript levels were examined using semi-quantitative RT-PCR
during seed development, ovules, pollen grains, stem, leaves, petals, leaf gland and in
response to heat and cold stress. In addition, the copy number of the cloned PeMIPS
gene in the genome of Passiflora edulis, Passiflora eichleriana, Passiflora caerulea,
Passiflora nitida and Passiflora coccinea was determined by Southern blot analyses.
Full-length cDNA clone of the PeMIPS1 from P. edulis was isolated and characterised.
Southern blot analyses indicated that the genomic DNA might have diverse sequences
of MIPS-encoding genes and one copy of the cloned PeMIPS1 gene in the genomes of
P. edulis, P. eichleriana, P. caerulea, P. nitida and P. coccinea. RT-PCR expression
analyses revealed the presence of PeMIPS1 transcripts in ovules, pollen grains and
leaves, and during the seed developmental stages, where it was observed a
transcriptional peak at the ninth days after pollination. The PeMIPS1 gene is
differentially regulated under cold- and heat-stress, presenting a light-responsive
transcription. Experimental data suggest that PeMIPS1 plays an important role in the
establishment of developmental programs and during the response of plants to
environmental changes. The PeMIPS1 is differentially regulated during cold and heat
stress, presenting a light-response pattern, indicating that the extension of the inositol
pathway is an important aspect for environmental stress response.
xv
1. Introdução
1.1. Aspectos gerais da família Passifloraceae
O gênero Passiflora compreende cerca de 500 espécies; é o maior gênero na família
Passifloraceae (Rendle, 1959; Maout & Decaisne, 1976; Hickey & King, 1988). Esta
família encontra-se largamente distribuída nos trópicos, sendo que 90% das espécies são
originárias das Américas. No Brasil, os gêneros Passiflora e Dilkea são os únicos existentes
(Lopes, 1994).
A família Passifloraceae pertence à ordem Malpighiales (Cronquist, 1988), que é
constituída de um agrupamento natural de famílias originárias das Theales, uma ordem
primitiva. As plantas desta família apresentam-se na forma de trepadeiras vigorosas. Suas
folhas podem ser arredondadas ou partidas, com bordos serreados. Nota-se uma variação
muito grande no tamanho e forma das folhas, sendo as basais bem maiores do que as folhas
dos ramos terminais e florais (Jorgensen et al., 1984). As flores são de tamanho e forma
variados, apresentando-se grandes e em forma de tubo (subgêneros Passiflora e Tacnsonia)
ou pequenas (subgênero Decaloba) (Jorgensen et al., 1984). As flores mostram ainda ampla
gama de coloração, podendo ser encontradas em tons de branco, laranja, vermelho, roxo,
amarelo e azul. Os frutos são arredondados ou alongados de coloração esverdeada,
amarelada, alaranjada ou com manchas verde-claras. As sementes são achatadas e pretas,
envolvidas por um arilo gelatinoso de coloração amarelada translúcida.
As espécies de maracujazeiros (Passiflora) são consideradas em sua grande maioria
perenes, no entanto, algumas são anuais, como é o caso de P. grandis (Vanderplank, 1996).
Existem cerca de 150 a 200 espécies originadas do Brasil que podem ser utilizadas como
alimento, remédios e ornamento, muitas delas com finalidade múltipla. Apesar da ampla
variabilidade genética existente no gênero, espécies que produzem frutos comestíveis
constituem-se aquelas que apresentam maior importância econômica. Segundo Pereira et al
(1971), existem cerca de 70 espécies com frutos comestíveis.
16
1.2. A espécie Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Degener
Denominado de maracujá-amarelo ou maracujá-azedo, trata-se de uma trepadeira
sublenhosa, glabra e vigorosa. As folhas têm em média 10 cm de comprimento; são
trilobadas, com margem serreada, face superior lustrosa e com pecíolo biglanduloso
(Bruckner, 2002). As flores são axilares e solitárias, hermafroditas, brancas com franjas
roxas. Os filamentos da corona são em quatro ou cinco séries, com pétalas e sépalas
brancas, oblongas, de cor púrpura na base e branca no ápice, que se abrem a partir do meio
dia e se fecham à noite.
A flor possui androginóforo colunar e bem desenvolvido. O androceu é formado por
cinco estames, com filetes livres e inseridos abaixo do ovário. As anteras são dorsifixas. O
ovário é globoso, unilocular, multiovulado. O fruto é uma baga globosa, com 5,0 a 7,5 cm
em seu maior diâmetro, amarelo quando maduro, com pericarpo pouco espesso, contendo
numerosas sementes ovais, reticuladas pretas e polpa ácida e aromática. As sementes têm
entre 5 a 6 mm de comprimento por 3 a 4 mm de largura.
A polinização desta espécie é feita por insetos, sendo a mamangava (Xylocopa spp.)
o principal agente polinizador (Akamine & Girolami, 1959). O maracujazeiro é uma
espécie alógama obrigatória (May & Spears Jr., 1988) e a eficiência da polinização é um
dos fatores que mais influenciam sua frutificação.
O maracujá-amarelo (P. edulis) é uma planta nativa da América do Sul e cultivada
principalmente em regiões tropicais e subtropicais, tais como Havaí, Quênia, Índia,
Austrália, Caribe e Brasil. Existem divergências com relação à sua origem, mas é provável
que esta espécie tenha se originado no Brasil.
1.3. Importância econômica da cultura do maracujazeiro
A cultura do maracujazeiro tem expressiva importância para a economia brasileira,
por ser responsável pela criação de empregos no meio rural, para a produção de frutos, e na
área urbana, em decorrência da industrialização do suco concentrado. Os mercados destes
produtos têm crescido e a produção é substancialmente maior que aquela de décadas
anteriores. Por se tratar de uma fruta pouco conhecida, desperta interesse do mercado
17
internacional, gerando divisas para o país pela exportação do suco. A espécie mais utilizada
nos plantios comerciais brasileiros é a Passiflora edulis Sims. f. flavicarpa Deg., ou
maracujá-amarelo, destinado ao consumo in natura e à indústria de processamento de sucos
e seus derivados.
Embora o setor alimentício seja o principal responsável pela demanda desta cultura,
a indústria farmacêutica tem tido grande interesse na cultura do maracujá. Estudos
farmacológicos têm mostrado que o maracujazeiro possui inúmeros compostos com
propriedades medicinais. O uso desta planta como um medicamento foi descrito pela
primeira vez no Peru em 1969, por um pesquisador espanhol chamado Monardus (Taylor,
1996). Desde então, várias espécies de Passiflora vêm sendo extensivamente usadas no
sistema tradicional de terapia médica em muitos países. No oeste da Índia, México, Países
Baixos e América do Sul, as raízes de maracujá são manipuladas para o uso como sedativo
e vermífugo. Na Itália, a planta é usada como anticonvulsivo e sedativo. No Brasil, espécies
conhecidas de maracujá são usadas como antiansiolítico, sedativo, diurético e analgésico
(Oga et al., 1984).
Entre os setores do agronegócio brasileiro, a produção, comercialização e
processamento de frutos constituem-se atualmente como um dos mais promissores.
Mudanças nos padrões de demanda, tanto no Brasil quanto no exterior, acompanhados por
progressos tecnológicos, têm permitido o crescimento do mercado de frutas e derivados à
taxas superiores aos dos demais produtos alimentares (Lima & Cunha, 2004).
Neste cenário, a cadeia frutícola surge como um importante instrumento para
promover o desenvolvimento de diversas regiões brasileiras, pois permite a obtenção de
maior renda por área cultivada, tornando mais viável os sistemas produtivos baseados em
pequenas e médias propriedades. Enquanto um hectare plantado com grãos gera um retorno
médio de 100 a 200 dólares, um hectare cultivado com frutícolas pode alcançar valores
entre 3.000 a 6.000 dólares, dependendo da fruta selecionada e dos preços vigentes. Além
disso, um hectare cultivado com fruteiras pode gerar de dois a seis empregos, contra apenas
um emprego direto por hectare de grãos (Savitci et al., 1994).
O maracujá é comercializado, principalmente, sob três formas: fruta fresca, suco
concentrado e bebidas prontas. No Brasil o suco de maracujá tem se mantido em terceiro
18
lugar entre os sucos produzidos, atrás apenas dos de laranja e caju (Bruckner & Melleti,
2001).
O Brasil é o maior produtor mundial de maracujá, seguido da Colômbia, Peru,
Equador, África do Sul, Austrália, Sri Lanka, Nova Guiné, Havaí e Taiwan. No Brasil, a
cultura tomou grande impulso a partir de 1970, quando foi expandida para a região Norte e
Nordeste para atender à demanda das indústrias de suco concentrado para exportação
(Chagas, 1991).
O suco de maracujá ocupa o segundo lugar na pauta das exportações brasileiras de
sucos, que movimenta um mercado mundial de cinco bilhões de dólares por ano. A maior
parte do suco é exportada na forma concentrada (50° Brix) (Leite et al., 1994), existindo
também comércio para o suco engarrafado pronto para o consumo, com concentração de
14° Brix.
Os mercados consumidores do suco de maracujá produzido no Brasil são o europeu
(principalmente Holanda) e o norte-americano, que absorvem cerca de 90% das
exportações. Este mercado é considerado emergente, necessitando apenas de uma garantia
de continuidade do fornecimento ao longo dos anos (Ruggiero et al., 1996; Lima & Cunha,
2004).
Na última década, grandes flutuações nas áreas plantadas com maracujá têm
ocorrido, refletindo diretamente sobre a produção e o preço. Também é comum em todas as
regiões de cultivo, o caráter itinerante da cultura. Em geral surgem os primeiros plantios,
seguidos de uma enorme expansão de área, e em um período variado de três a cinco anos
praticamente desaparecem. Este fato se deve principalmente a problemas fitossanitários e
ausência de técnicas de manejo adequadas e de tecnologias para a criação de variedades
mais produtivas, comprometendo a longevidade e a produtividade dos pomares.
A produtividade dos pomares brasileiros de maracujá é bastante variável; a média
nacional está em torno de 10 ton/ha/ano. Essa média é considerada baixa e se deve à não
utilização de tecnologias de produção recomendadas para a cultura. A produtividade é
ainda menor em pomares semicomerciais ou naqueles em que os produtores cultivam
maracujá para consumo próprio, muito comum na região Norte e Centro-Oeste do país. Já
em pomares com melhor nível tecnológico, tem-se conseguido elevar a produtividade, em
virtude da adoção de práticas culturais importantes (Melleti & Maia, 1999). Essas práticas
19
consistem na utilização de variedades melhoradas, adubações parceladas e equilibradas,
polinização manual, tratos culturais adequados e o controle de pragas e moléstias. Na
maioria dos pomares, o uso das recomendações tem sido parcial, limitado pela pequena
disponibilidade de capital ou por determinados hábitos locais. Nesses casos, a produção
média é de 15 a 20 ton/ha/ano. A produtividade brasileira no ano de 2002 foi de 14
ton/ha/ano, 40 % maior que a média nacional histórica, enquanto a produtividade no Havaí
é de 45 ton/ha/ano (IBGE, 2004). Desta forma, para que a cultura do maracujá possa se
solidificar, atingindo níveis de produção cada vez mais altos no Brasil, faz-se necessário o
incremento dos conhecimentos científicos que permitam subsidiar o desenvolvimento de
novas tecnologias para esta cultura.
1.4. Metabolismo do mio-inositol e seus derivados
O mio-inositol e seus derivados são componentes importantes para o crescimento e
desenvolvimento das plantas. Entretanto, não existem relatos de estudos envolvendo a
presença destes componentes no maracujazeiro (Passiflora edulis) e em muitas outras
espécies de plantas. Diversas funções podem ser atribuídas ao mio-inositol e derivados.
Além da reserva de fosfato os mio-inositol fosfatos estão envolvidos em muitos processos
de rotas celulares como, transdução e regulação de sinal, regulação da síntese de ATP
(adenosina trifosfato) (Safrany et al., 1999), transporte e estocagem de auxina, biossíntese
de parede celular, endocitose e tráfico de vesículas (Saiardi et al., 2002) e produção de
moléculas relacionadas ao estresse (Loewus & Murthy, 2000). Participam ainda, do
remodelamento da cromatina, reparo e recombinação de DNA (York et al., 1999),
expressão de genes e exportação de mRNA (Shen et al., 2003).
Entre as várias formas de mio-inositol fosfatos, o ácido fítico é o composto mais
abundante nas células. Esta é a maior fonte de fósforo presente nas sementes, acumulando-
se também em outros órgãos e tecidos de plantas como polens, raízes, tubérculos e caules
(Raboy, 1997). Em plantas, este composto controla concentrações de fósforo inorgânico,
funcionando como importante reserva de mio-inositol, minerais e fósforo para a utilização
durante a germinação da semente e crescimento da plântula (Strother, 1980). O ácido fítico
é também encontrado nas células animais. Entretanto, em plantas a função primária deste
20
composto não está ligada com formas de estocagem de fósforo ou mio-inositol. Seu maior
papel está na sinalização e mobilização de cálcio de reservas intracelular (Lemtiri-Chlieh et
al., 2003).
O ácido fítico, assim como outros derivados do mio-inositol são sintetizados a partir
da glucose 6-fosfato que é convertida para 1D-mio-inositol 3-fosfato (IP
1
) pela enzima mio-
inositol 3-fosfato sintase (MIPS) (Loewus et al. 1990; Yoshida et al. 1999; Loewus &
Murphy 2000) (Figura 1). Seguidas fosforilações na molécula de mio-inositol conduzem à
formação de seus derivados, como o ácido fítico (IP
6
) e o mio-inositol 1,2,3-fosfato (IP
3
),
importante molécula sinalizadora na célula.
As vias de biossíntese dos derivados do mio-inositol são pouco conhecidas.
Entretanto, sabe-se que as plantas possuem outras enzimas como, a mio-inositol quinase
(MIK), que pode produzir IP
1
a partir de inositol (Figura 1) (English et al., 1966; Loewus et
al., 1982). Num estudo temporal do desenvolvimento e maturação de sementes de feijão
mungo (Vigna mungo), atividade da MIK não pôde ser detectada, mas a MIPS foi
encontrada em alta atividade duas semanas após a floração, precedendo a acumulação de
ácido fítico (Majumder & Biswas, 1973). Em contraste, ambas as atividades de transcrição
de MIPS e MIK foram detectadas na camada de aleurona de semente de arroz, sendo este o
local predominante de biossíntese e acúmulo do ácido fítico (Tanaka et al., 1976; Yoshida
et al., 1999). Enzimas chave na síntese de inositol e derivados como a MIK e IMP (inositol
monofosfato sintase), são cada vez mais compreendidas e suas funções melhor
caracterizadas (Figura 1).
Com relação as atividades das enzimas responsáveis pela síntese de diferentes
compostos derivados do inositol, e suas respectivas funções. Um estudo com dois mutantes
recessivos de milho (Zea mays) (Ipa 1 e 2) contendo baixos níveis de ácido fítico,
identificou-se que os mesmos eram defeituosos na biossíntese de ácido fítico durante o
desenvolvimento da semente. No caso do mutante Ipa 1, descobriu-se que este era incapaz
de produzir mio-inositol. Com isso não acumulava, nem produzia mio-inositol monofosfato
e intermediários de polifosfatos para a biossíntese do ácido fítico na semente. E o segundo,
o mutante Ipa 2, continha ácido fítico reduzido na semente e acumulo de intermediários de
mio-inositol fosfato (Raboy et al., 2000). Sabe-se que o gene Ipa 2 do milho codifica uma
mio-inositol fosfato quinase (ZmIPK) pertencente à mesma família de genes do Ins(1,3,4)P
3
21
5/6 quinase (MIK) (Shi et al., 2003), que codifica uma enzima responsável pela adição de
fosfato no anel de inositol para a síntese do ácido fítico.
Em um estudo mais recente, um outro mutante de milho (Ipa 3) foi caracterizado e
seu gene isolado. Este mutante possuía reduzido conteúdo de ácido fítico na semente e
acúmulo de mio-inositol, mas não possuía intermediários de mio-inositol fosfato. Inferiu-se,
portanto, que o gene Ipa 3 do milho codificava uma MIK (mio-inositol quinase) (Shi et al.,
2005).
22
MIK
IMP
Rotas de
sinalização
Rotas de
metila
ç
ão
Rotas de
con
j
u
g
ação
Rotas de
oxida
ç
ão
Estocagem
de fósforo
Figura 1. Esquema representativo da via enzimática e funcional do mio-inositol e
derivados segundo Styer (2000). A enzima mio-inositol 3-fosfato sintase (MIPS) realiza
um passo chave na síntese dos inositois, catalisando a reação de síntese de mio-inositol 3-P
a partir da glicose 6-P. Outras enzimas como a inositol monofosfato sintase (IMP) e a mio-
inositol quinase (MIK) produzem compostos derivados ao mio-inositol 3-fosfato.
23
1.5. Características da enzima mio-inositol 3-fosfato sintase (MIPS)
Nos últimos anos, com as descobertas das inúmeras propriedades de rota celular do
mio-inositol e derivados, muitos estudos envolvendo as enzimas que fazem parte da via de
síntese dos mio-inositois têm sido realizados. Neste cenário, a enzima MIPS (Figura 3)
assume um papel fundamental, pois é o primeiro passo da via de síntese do mio-inositol.
MIPS é a enzima que converte glucose 6-fosfato em mio-inositol 3-fosfato, através
de reações envolvendo oxidação, enolização, ciclização intramolecular e redução (Figura
2). Nos eucariontes e procariontes esta enzima utiliza NAD
+
como co-fator para suas
reações catalíticas em seu domínio conservado (Figura 4) (Majumder et al. 1997).
Há alguns anos duas formas de MIPS, citosólica e cloroplasmática, foram
encontradas em tecidos de plantas. A primeira estava associada a várias reações
importantes do metabolismo celular, e a segunda associada à membrana da tilacóide, que é
regulado pelas condições de luz (RayChaudhuri & Majumder, 1996; Majumder et al.,1997;
RayChaudhuri et al., 1997).
MIPS é membro de uma família multigênica em algumas espécies de plantas. Em
Arabidopsis thaliana o gene MIPS (Atmips) consiste de Atmips-1 (Johnson, 1994), Atmips-
2 (Johnson & Burk, 1995) e Atmips-3 (Ishitani et al., 1996). E as proteínas dos genes
Atmips-1 e Atmips-2 possuem massa molecular de 56.5 kD e 56.3 kD (Tabela 1),
respectivamente. Contudo, não se tem referência da massa molecular da proteína do gene
Atmips-3. Em espécies de soja (Glycine max) e milho (Zea mays), estima-se conter na
família do gene MIPS no mínimo quatro e sete membros, respectivamente (Larson &
Raboy, 1999).
Os genes e as correspondentes enzimas MIPS já foram isolados em mais de 70
organismos diferentes, incluindo uma grande variedade de procariontes, animais e plantas.
Estudos realizados com as seqüências do gene e da proteína MIPS, encontradas em
diferentes organismos, revelaram que seus domínios catalíticos funcionais encontram-se
bastante conservados (Majumder et al., 2003). Esta constatação indica que o gene
praticamente não sofreu grandes mutações ao longo da evolução das espécies, e
consequentemente, sua funcionalidade tornou-se indispensável para o metabolismo de
diversos organismos.
24
Tabela. 1. Número de acesso de algumas seqüências do gene MIPS. As seqüências podem
ser acessadas pelo GenBank (www.ncbi.nih.nlm.gov
).
Nº de acesso Fonte N° de
aminoácidos
Predição da massa
molecular (kD)
a
AAC07613
b
Aquifex aeolicus 364 40.7
U04876 Arabidopsis thaliana-1 511 56.5
AL022605 Arabidopsis thaliana-2 510 56.3
U66307 Brassica napus 509 56.2
AY382834 Glycine max 511 56.5
AF056325 Hordeum vulgaris 510 56.2
U32511 Mesembryanthemum crystallinum 512 56.8
AAB85594
b
Methanobacterium Thermoautotrophicum 361 40.8
AB032073 Nicotiana paniculata 510 56.4
AB012107 Oryza sativa 510 56.2
X87371 Sacchromyces cerevisiae 537 61.2
Z11693 Spirodela polyrrhiza 510 56.4
CAB38887
bc
Streptomyces coelicolor 361 39.9
AF120146 Triticum aestivum 510 56.3
AF56326 Zea mays 510 56.2
a Massa molecular calculada usando o programa EditSeq (Lasergene Software, DNAstar)
b Seqüência pode ser acessada no GenPept (www.genelynx.org)
c Gene putativo
25
Figura 2. Reações da rota de síntese do mio-inositol 3-fosfato segundo Stein & Geiger
(2002). (A) A enzima MIPS utiliza o NAD
+
como co-fator para suas reações de oxiredução.
(B), (C) e (D) Intermediários do mio-inositol 3-fosfato envolvidos nas reações de
enolização, aldol ciclização e redução nos demais sítios catalíticos da MIPS.
26
1.6. Expressão do gene MIPS em condições de estresse abiótico
Estresses abióticos como o salino, causado pelo frio ou calor, hídrico e outros, têm
uma influência negativa no crescimento e desenvolvimento de muitas espécies de plantas
susceptíveis. Isto é resultado da inibição ou ausência de atividade catalítica de muitas
enzimas, canais protéicos e outras proteínas metabolicamente essenciais, primariamente
envolvidas nestes processos (Bohnert & Shevelena 1998; Blumwald 2000; Burssens et al.,
2000; Quesada et al., 2000; Wei et al., 2000). Contudo, a susceptibilidade dos organismos
aos vários tipos de estresse envolve não só os mecanismos fisiológicos (moleculares), mas
os morfológicos e anatômicos.
Em se tratando de mecanismos fisiológicos de adaptações às condições térmicas,
muitas plantas e outros organismos poiquilotérmicos (não têm um mecanismo interno que
regule a temperatura do seu corpo) adquirem capacidade de se adaptar à temperatura do
ambiente ajustando a fluidez da membrana, o metabolismo, e o perfil da expressão de genes
(Thomashow 1999). Temperatura baixa, por exemplo, é um dos mais importantes fatores
ambientais que influencia a distribuição, crescimento, desenvolvimento e sobrevivência das
plantas. Plantas de regiões temperadas podem aumentar sua capacidade de tolerância ao
frio quando são expostas a temperaturas muito baixas. Este fenômeno é conhecido como
aclimatação ao frio (Chinnusamy et al., 2006). A chave deste processo está diretamente
ligada à influência do frio na indução da expressão de genes. Como no caso da indução das
desaturases de lipídios, que ao alterar a composição dos lipídios podem contribuir com a
tolerância ao frio (Gibson et al. 1994).
Neste contexto, podemos citar também a influência do gene MIPS na biossíntese de
compostos envolvidos na tolerância aos estresses abióticos, como o D-pinitol e D-ononitol,
D-glucoronato usado na síntese de compostos da parede celular, fosfolipídios
polinsaturados, glicoproteínas, gomas, e mucilagens (Nelson et al., 1998; Bray et al., 2000;
Rathinasabapathi, 2000). Entretanto, o MIPS não é o único gene da via de síntese do
inositol e seus derivados envolvidos no metabolismo de estresses abióticos. Genes como o
di-mio-inositol 1,1´-fosfato sintase (Scholz et al., 1992), que forma a di-mio-inositol 1,1´-
fostato, maior soluto intracelular encontrado em archeobactérias hipertermofílicas; e o gene
inositol-monofosfato dependente de Mg
2+
, que produz inositol livre, envolvido na síntese
27
de compostos com propriedades anti-oxidativas (Majumder et al., 2003), também são genes
fundamentais no metabolismo do estresse abiótico.
28
Figura 3. Modelo da enzima MIPS proposta por Stein & Geiger (2002). A enzima é
estruturalmente trimérica. Os dois monômeros coloridos de vermelho e azul representam
uma unidade assimétrica e o monômero colorido de verde compreendendo uma outra
unidade estrutural.
Figura 4. Modelo espacial cheio da enzima MIPS. Os átomos da proteína estão em verde
enquanto os átomos do co-fator NAD
+
estão em roxo, segundo o modelo de Stein & Geiger
(2002).
29
2. Objetivos
Objetivo Geral
Isolar, clonar e caracterizar a expressão temporal e espacial do gene MIPS do maracujazeiro
(Passiflora edulis) (PeMIPS)
Objetivos Específicos
1. Clonar e sequenciar a região codificante completa do gene MIPS de P. edulis.
2. Caracterizar espacial e temporalmente a expressão do gene MIPS por meio de análises
moleculares em folha, flor, caule e durante o desenvolvimento da semente do
maracujazeiro;
3. Estudar o efeito do estresse por calor e frio sobre a transcrição do gene MIPS em
plântulas de maracujazeiro.
4. Estimar o número de cópias do gene MIPS no genoma de espécies de Passiflora, através
de análise de Southern blot.
5. Realizar um estudo filogenético do gene MIPS em diferentes espécies de plantas.
30
3. Materiais e Métodos
3.1. Clonagem de um fragmento do gene MIPS do maracujazeiro (Passiflora edulis)
Para a amplificação e clonagem de um fragmento do gene MIPS, o RNA total da
semente de maracujá foi isolado seguindo o protocolo do kit de extração Micro-to-Midi
Total RNA Purification System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a partir de 250 mg de
sementes (Huang et al., 2000). O DNA genômico excedente presente nas amostras de RNA
foi eliminado por meio de tratamento das mesmas com DNAse. O RNA total foi utilizado
para a síntese do cDNA usando Superscript III kit (Invitrogen
TM
, Carlsbad, CA, USA) de
acordo com as recomendações do fabricante.
A PCR foi realizada em um termociclador PTC-100 (MJ Researcher) em 25 µL de
solução contendo 40 ng do cDNA, sintetizado a partir de mRNA de semente de maracujá,
60 mM Tris-SO
4
(pH 8.9), 18 mM (NH
4
)
2
SO
4
, 2 mM MgSO
4
, 250 nM de cada dNTP; 200
nM de cada primer e 5U da enzima taq DNA polimerase Platinum High Fidelity
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A mistura foi desnaturada a 94 °C (2 min) e submetida a
34 ciclos de amplificação (94 °C por 30 s, 55 °C por 1 min, 68 °C por 3 min) com um ciclo
final de 10 min a 68 °C. Os primers degenerados PeMIPSF 5`
TTCATCAATGGCAGCCCHCARAACAC 3´ e MIPSPeR2 5`
TCACTTGTAYTCCARRATCATGTTATT 3´ (Y=C ou T; H= A, T ou C; R=A ou G)
foram utilizados para amplificar uma seqüência de 693 pb que corresponde a um fragmento
da seqüência codificante do gene mio-inositol 3-fosfato sintase (MIPS) de maracujazeiro.
Após a PCR, amostras foram aplicadas no gel de agarose 1% (ver Anexo I) por 1
hora a 100 V. Após a eletroforese os fragmentos correspondentes a 693 pb (gene MIPS)
foram extraídos do gel utilizando o kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN). Em seguida,
realizou-se a clonagem do fragmento correspondente à parte da região codificante do gene
MIPS no vetor de clonagem pCR2.1 TOPO 3.9 Kb (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),
seguindo o manual de instruções do fabricante, gerando o vetor pTOPOMIPSPe. O vetor
pTOPOMIPSPe foi amplificado e purificado utilizando-se o kit Flexi prep (Pharmacia
Biotech), e seqüenciado utilizando-se os primers universais M13 e T7 em seqüenciador
automático (ABI Prism1 3700, Foster City, CA, USA). A seqüência obtida foi comparada
31
com aquelas depositadas no banco de dados do National Center for Biotechnology
Information (GenBank; www.ncbi.nih.nlm.gov) e do Institute for Genomic Research
(TIGR; www.tigr.org).
3.2. Rapid Amplification of cDNA Ends (5´ RACE e 3´ RACE)
As amplificações das extremidades 5´ e 3´ do gene MIPS foram realizadas com o
GeneRacer Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). Quatro microgramas de RNA total foram
tratados com uma unidade de Calf Intestinal Phosphatase (CIP) para retirada do
grupamento fosfato da extremidade 5´. Em seguida, procedeu-se a eliminação do 5´ cap e
foram adicionados adaptadores nas duas extremidades contendo seqüências para primers
(nested primers) específicos nestas regiões por ligação com a enzima T4-RNA-Ligase. Foi
gerado o cDNA e a partir deste foram amplificadas ambas regiões utilizando-se a enzima
SuperscriptIII (transcriptase reversa; DNA polimerase RNA dependente) (Invitrogen,
Carlsbad, CA) nas condições descritas para a enzima com 1,5 minutos de alongação. Com a
utilização do par de primers MIPSPeRACEF 5´ GTGAACATCCTGACCACGTTG 3´ e
GeneRacer 3´, complementares ao adaptador da região 3´, gerou-se um fragmento de
aproximadamente 0,4 kb na extremidade 3´ e o par MIPSPeRACER 5´
GAGGTGTACTCGTCCATAGC 3´ (reverse) e GeneRacer 5´ (forward), complementar ao
adaptador da região 5´, foi utilizado para gerar um fragmento de 1,5 kb na extremidade 5´
(Figura 5). Ambos foram clonados no vetor pCR2.1 TOPO 3.9 Kb (Invitrogen, Carlsbad,
CA) e sequenciados. As seqüências das extremidades 5’ e 3´ foram adicionadas à posição
correta por análise de pareamento no programa Blast 2 sequence (Altschul et al., 1990).
32
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
Figura 5. PCR 5´ e 3´ RACE do gene PeMIPS. A. O cDNA foi sintetizado a partir do
mRNA por uma transcriptase reversa (RT-PCR) que utiliza como primer um oligodT. B.
Cópias de um fragmento de 693 pb do cDNA do gene PeMIPS foram amplificadas por
PCR utilizando como primers P1 (MIPSPeF) e P2 (MIPSPeR
2
). C. A extremidade 5´ do
cDNA do gene PeMIPS foi amplificada com os primers P3 (GeneRacer 5´) e P4
(MIPSPeRACER), produzindo um fragmento aproximado de 1,5 kb. D. A extremidade 3´
foi amplificada com os primers P5 (MIPSPeRACEF) e P6 (GeneRacer 3´), produzindo um
fragmento aproximado de 0,4 kb. E. Obtenção da seqüência completa do cDNA, após
análise de pareamento.
33
3.3. Análise da expressão do gene PeMIPS por RT-PCR
Para a análise da expressão do gene PeMIPS, foi utilizado RNA total de semente em
diferentes estágios de desenvolvimento, óvulo, grão-de-pólen, caule, folha, pétala e
glândula foliar do maracujazeiro. Os RNA provenientes das diferentes amostras foram
isolados com o kit Micro-to-Midi Total RNA Purification System (Invitrogen, Carlsbad,
CA), e o cDNA do gene MIPS sintetizado a partir do RNA total pela utilização da enzima
transcriptase reversa de acordo com o protocolo do kit SuperScript
TM
III Reverse
Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA). Em seguida realizou-se a PCR utilizando
iniciadores específicos para o mRNA de interesse.
Para a PCR foi preparada uma reação com volume final de 25 µL, contendo um
volume de cDNA estabelecido de acordo com o controle interno da reação (óvulo 0,6 µL;
grão-de-pólen 4,5 µL, caule 0,5 µL; folha 0,9 µL; pétala 0,7 µL; glândula foliar 0,7 µL;
semente com três dias 5 µL; nove 1 µL; quinze 1,5 µL; vinte e um 0,5 µL e vinte e sete
0,5 µL), 10 mM TRIS-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 30 mM de MgCl
2
, 4 mM de cada dNTP,
1,5 U de Taq polimerase (Invitrogen
TM
) e 0,2 µM do par de primer específico para o gene
MIPS de maracujazeiro (MIPSPeF e MIPSPeR
2
), o volume final foi ajustado com água. As
condições de tempo e temperatura da PCR foram de 95 °C (5 min), para desnaturar, e 20
ciclos de amplificação (95 °C por 1 min, 55 °C por 1 min, 72 °C por 1 min) com um ciclo
final de 7 min a 72 °C. O número de ciclos foi previamente determinado para que as
análises de RT-PCR fossem semi-quantitativas. Após a PCR, realizou-se a eletroforese das
amostras em gel de agarose 1%.
Como controle interno da RT-PCR semi-quantitativa foi utilizado um fragmento de
aproximadamente 358 pb do gene constitutivo EF1α (fator de alongamento celular) do
maracujazeiro. Este fragmento foi amplificado a partir de cDNA sintetizado seguindo o
protocolo do kit SuperScript
TM
III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA), com
os primers EF1F (5´-TGTTGCTGTTAAGGATTTGAAGCG-3´) e EF1R (5´-
AACAGTTTGACGCATGTCCCTAAC-3´). Os fragmentos do gene da EF1α de P. edulis
foram clonados e seqüenciados nesse trabalho e depositados no GenBank com os números
de acesso DQ447160 e DQ447161 (Anexo 2). As condições de tempo e temperatura da
PCR foram as mesmas da reação de amplificação do gene MIPS.
34
3.4. Análise da expressão do gene PeMIPS sob condições de estresse por frio e calor
Para a análise da expressão do gene PeMIPS sob condições de estresse por frio e
calor, plantas após oito semanas de germinadas em sala de cultura com temperatura (26 ± 2
°C) e fotoperíodo (16 h de luz e 8 h de escuro) definido, foram colocadas em câmara de
crescimento sob condições variadas de tempo (8 e 16 h), temperatura (5, 12, 27 e 37 °C) e
luminosidade (claro e escuro), combinadas entre si. Os RNAs de folhas das plantas tratadas
foram extraídos e isolados com o kit Micro-to-Midi Total RNA Purification System
(Invitrogen, Carlsbad, CA), e o cDNA do gene MIPS sintetizado a partir do RNA total pela
utilização da enzima transcriptase reversa de acordo com o protocolo do kit SuperScript
TM
III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA). Em seguida, realizou-se a PCR
utilizando iniciadores específicos para o mRNA de interesse.
Para a PCR foi preparada uma reação com volume final de 25 µL, contendo cDNA
num volume estabelecido de acordo com o controle interno da reação, 10 mM TRIS-HCl
(pH 8,4), 50 mM KCl, 30 mM de MgCl
2
, 4 mM de cada dNTP, 1,5 U de Taq polimerase
(Invitrogen
TM
) e 0,2 µM do par de primer específico para o gene MIPS de maracujazeiro
(MIPSPeF e MIPSPeR
2
), o volume final foi ajustado com água. As condições de tempo e
temperatura da PCR foram de 95 °C (5 min), para desnaturar, e 20 ciclos de amplificação
(95 °C por 1 min, 55 °C por 1 min, 72 °C por 1 min) com um ciclo final de 7 min a 72 °C.
Como controle interno da RT-PCR semi-quantitativa utilizou-se o gene EF1α (fator de
alongamento celular) do maracujazeiro seguindo as mesmas condições do gene MIPS.
3.5. Análise de Southern blot para verificação do número de cópias do gene MIPS no
genoma de cinco espécies diferentes de Passiflora
Para a análise de Southern blot, primeiramente realizou-se a extração de DNA
genômico a partir de 3 g de folha fresca de cinco espécies diferentes de maracujazeiro (P.
edulis, P. eichleriana, P. caerulea, P. nitida e P. coccinea). As folhas foram colocadas no
almofariz e adicionado nitrogênio líquido para congelamento instantâneo. As folhas
congeladas foram trituradas com a ajuda de um pistilo até a obtenção de um pó fino. O pó
foi rapidamente transferido para um tubo de polipropileno contendo 15 mL de tampão
35
CTAB (Anexo 1) pré-aquecido a 65 °C e incubado nessa temperatura entre 30 minutos a
uma hora, agitando a cada 10 minutos. Em seguida, adicionou-se 1 volume de clorofórmio:
álcool isoamílico (24:1) ao tubo. Ao final da incubação a amostra foi centrifugada por 10
minutos a 5.000g e a fase aquosa (fase superior) transferida para novo tubo. A extração foi
repetida duas vezes com clorofórmio: álcool isoamílico (24: 1) (Romano, 1998).
Para a precipitação do DNA no extrato adicionou-se 0,6 volume de isopropanol
gelado ou 2,5 volumes de etanol absoluto gelado, a amostra foi centrifugada por 20 minutos
a 10.000g, e o sobrenadante descartado. O precipitado foi lavado com aproximadamente 5
mL de etanol 70 %. Por fim, o precipitado foi secado e dissolvido em 200 a 500 µL de TE
(Anexo 1), e incubado a 4 °C por meia hora ou mais.
Os DNA genômicos (15 µg) extraído das folhas de P. edulis, P. eichleriana, P.
caerulea, P. nitida e P. coccinea foram digeridos separadamente com as enzimas de
restrição EcoRI, XhoI e HindIII (150 U). Após a digestão as amostras foram aplicadas no
gel de agarose 1%, e a eletroforese realizada com aproximadamente 0,5 a 1 V/cm. Após a
eletroforese as amostras foram transferidas do gel para a membrana de nylon HyBond N+
(Romano, 1998). A hibridização foi realizada usando um fragmento de 693 pb do gene
MIPS de Passiflora como sonda. As sondas foram marcadas com α
32
P dCTP (3000 Ci/mol)
usando-se primers aleatórios do DNA Labeling Kit (Pharmacia Biotech).
3.6. Filogenia do gene MIPS
A relação entre o gene PeMIPS e os genes MIPS1 de outras 31 espécies de plantas
foi determinada pelo alinhamento com as seqüências disponíveis no GenBank
(www.ncbi.nih.nlm.gov) e do TIGR (www.tigr.org). Somente as seqüências codificantes
completas foram usadas para a análise. O alinhamento foi executado usando o algoritmo do
CLUSTAL W (Thompson et al., 1994). As análises filogenéticas foram realizadas usando o
programa MEGA versão 3.1 (Kumar et al., 2004). As freqüências médias de cada
nucleotídeo eram similares (T = 23 %, C = 23 %, A = 27 %, G = 26 %), mas uma relação
elevada de transição e transversão foram observadas. Assim, para considerar esta
probabilidade desigual de tipos de substituição, o princípio Kimura 2-parameter (Kimura,
1980) foi usado e as distâncias entre cada par das seqüências foram computadas. As árvores
36
filogenéticas foram construídas usando o algoritmo Neighbor Joining (NJ) (Saitou & Nei,
1987) com opção de eliminação completa. Os valores de bootstrap foram computados
usando 10.000 repetições para avaliar a robustez dos agrupamentos.
37
4. Resultados e Discussão
4.1. Clonagem e sequenciamento do gene MIPS de maracujazeiro (Passiflora edulis)
Para a clonagem do gene MIPS, seqüências de cDNA de diferentes espécies de
plantas presentes no Genbank foram confrontadas no programa DNA MAN version 4.0
(Lynnon Biosoft). As regiões conservadas foram identificadas para a construção dos
primers degenerados MIPSPeF e MIPSPeR. A PCR realizada com os primers mencionados
amplificou um fragmento de DNA com 693 pb, usando como fita molde cDNA sintetizado
de mRNA extraído de sementes de maracujá em diferentes estágios de desenvolvimento. O
fragmento de DNA gerado foi seqüenciado e novamente confrontado, no programa Blast 2
sequence, com seqüências de cDNA do gene MIPS presentes no Genbank. Este fragmento
foi clonado no vetor pCR2.1 TOPO 3.9 Kb (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), gerando o
vetor pTOPOMIPSPe.
Após a amplificação e clonagem de um fragmento do gene PeMIPS, prosseguiu-se
com a amplificação completa da seqüência do cDNA deste gene, utilizando como
ferramenta o kit 5´e 3´ RACE. Para o RACE foram sintetizados dois novos primers,
MIPSPeRACEF e MIPSPeRACER, que juntamente com os primers do kit RACE
(GeneRace 3´ e GeneRace 5´) foram utilizados para amplificação das extremidades do
cDNA do gene PeMIPS. A amplificação da extremidade 5´ foi realizada com a utilização
dos primers GeneRace 5´ e MIPSPeRACER, gerando um fragmento de 1,5 kb. E a
amplificação da extremidade 3´ foi realizada com os primers GeneRace 3´ e
MIPSPeRACEF, gerando um fragmento de 0,4 kb. Ambos os fragmentos foram clonados
no vetor pCR2.1 TOPO 3.9 Kb (Invitrogen, Carlsbad, CA) e sequenciados. Ao final, a
seqüência completa do gene PeMIPS foi obtida, mostrando conter 1.954 pb (Figura 6). A
seqüência obtida foi comparada com outras 31 seqüências completas depositadas no
GenBank e TIGR, e apresentou um alto grau de similaridade, de 74% a 86% (Tabela 2).
Uma análise realizada no programa TargetP 1.1 (Emanuelsson et al., 2000) mostrou
que a enzima PeMIPS não possui qualquer sinal de endereçamento para compartimentos
38
como apoplasto, retículo endoplasmático ou plastídios. Isso demonstra que possivelmente
se trata de uma proteína citoplasmática.
Com a obtenção da seqüência codificante completa do gene estudado no presente
trabalho, análises in sílico foram realizadas. Em relação à tradução da proteína, dos 1.954
pb do cDNA amplificado 1.533 pb encontravam-se em fase aberta de leitura. A análise de
predição da proteína putativa apresentou 510 aminoácidos com identidade aproximada de
85% a 93% quando comparada aos aminoácidos das proteínas MIPS de outras espécies de
plantas com seqüências depositadas no Genbank e TIGR. Chun et al. (2003) ao isolar e
caracterizar o gene MIPS de Sesamum indicum, verificaram após análises de predição da
proteína, que a mesma possuía 510 aminoácidos, com massa molecular total de
aproximadamente 56 kD. Estes valores de massa molecular foram compatíveis aos valores
calculados de outras proteínas MIPS (Majumder et al. 1997). Em soja (G. max), o gene
MIPS1 foi isolado e caracterizado, e observou-se que dos 1.791 pb do cDNA amplificado
1.533 pb encontravam-se em fase aberta de leitura; por predição sua proteína putativa
também possuía 510 aminoácidos, com massa molecular de 56,5 kD (Hegeman et al.,
2001).
Ao analisarmos a região 3´ não traduzida (3´ UTR), constatou-se que esta possui
268 pb com duas seqüências putativas de sinais de poliadenilação (ATTAA e AATAA), a
260 e 251 pb da cauda poli(A). Sinais de poliadenilação na região 3´ UTR, podem ser
encontrados em diferentes cDNA de muitas espécies de plantas, animais e até leveduras.
Em S. indicum dois sinais de poliadenilação foram encontrados a 39 e 24 pb, anteriores à
cauda poli (A) no cDNA do gene MIPS (Chun et al., 2003).
39
Tabela 2. Alinhamento do gene MIPS de P. edulis com seqüências codificantes completas
do gene MIPS de outras espécies.
Fonte/ N° de acesso Tamanho da Seqüência
Codificante (pb)
Similaridade (%)
Citrus paradise/ (Z32632)
a
1524 83
Arabidopsis thaliana / (U04876)
b
1533 79
Phaseolus vulgaris / (AM048843)
b
1533 81
Oryza sativa / (AB012107)
b
1533 78
Spirodela polyrrhiza / (Z11693)
b
1533 76
Zea mays / (AF56326)
b
1533 78
Porteresia coarctata / (AF412340)
b
1539 75
Sesamum indicum / (AF284065)
b
1533 82
Xerophyta viscosa / (AY323824)
b
1533 78
Avena sativa / (AB059557)
b
1533 77
Glycine Max / (AY382834)
b
1533 83
Avicennia marina / (AY028259)
b
1530 80
Nicotiana tabacum / (AB059557)
b
1533 81
Brassica napus / (U66307)
b
1533 78
Hordeum vulgare / (AF056325)
b
1533 78
Triticum aestivum / (AF120148)
b
1533 79
Mesembryanthemum
crystallinum / (U32511)
b
1539 81
Gorssypium hirsutum / (TC27410)
a
1533 83
Aquilegia formosa x pubescens / (TC14836)
a
1533 80
Vitis vinifera / (TC45187)
a
1533 84
Lotus japonicus / (TC8275)
a
1533 81
Medicago trunculata / (TC93972)
a
1533 80
Allium cepa / (TC248)
a
1533 78
Pinus sp./ (TC64990)
a
1533 74
Populus sp./ (TC19238)
a
1533 86
Solanum tuberosum / (TC112573)
a
1533 80
Saccharum officinarum / (TC65413)
a
1533 78
Lycopersicon esculentum / (TC154132)
a
1533 81
Actinidia arguta / (AY005128)
b
1095 82
Tripolium pratense / (AB236831)
a
1536 80
Sueda maritima / (AF433879)
b
1533 77
a
Acessos encontrados no TIGR
b
Acessos encontrados no Genbank
40
134 pb untranslated 5´sequence (5´UTR)
AATAACACAACCACACAAAGGCTTCAGAGAGTTGCGAAAGCAGATTAGCTCCTCTCTTTGTTTGGCTTTGGGCCTTTTGGGTTCTCTTCTCG
TTTTAATCATCCACAGTTCTCTCCCCTTCCTGCTAACAAA
1 ATGTTCATCGACACGTTTAAGGTTGAGAGTCCTAACGTTAAGTACACAGAGGATGAGATT
1 M F I D T F K V E S P N V K Y T E D E I
61 CACTCGGTGTACAACTATGAGACCACTGAGCTTGTTCATGAGAACAGGAATGGTACCTAT
21 H S V Y N Y E T T E L V H E N R N G T Y
121 CAGTGGACTGTCAAACCCAAAACTGTCCAATACGAATTCAAGACCAGCATTCATGTCCCC
41 Q W T V K P K T V Q Y E F K T S I H V P
181 AAACTCGGGGTTATGCTCGTGGGGTGGGGAGGAAACAATGGATCGTCTCTCACCGGCGGT
61 K L G V M L V G W G G N N G S S L T G G
241 ATCATAGCCAACCGAGAGGGAATCTCCTGGGCGACCAAGGACAAGGTGCAGCAAGCCAAC
81 I I A N R E G I S W A T K D K V Q Q A N
301 TACTTTGGCTCGCTAACCCAGGCTTCAACTATCCGAGTTGGGTCTTTCAATGGAGAGGAG
101 Y F G S L T Q A S T I R V G S F N G E E
361 ATTTATGCTCCATTCAAAAGCCTGCTCCCCATGGTGAGCCCCGATGACGTTGTTATTGGA
121 I Y A P F K S L L P M V S P D D V V I G
421 GGATGGGACATAAGTGACATGAACTTGGCTGACGCCATGGCCAGGGCAAAAGTCTTCGAC
141 G W D I S D M N L A D A M A R A K V F D
481 ATTGATCTGCAGAAACAACTCAGGCCCTACATGGAATCCATGATCCCACTACCCGGAATA
161 I D L Q K Q L R P Y M E S M I P L P G I
541 TATGACCCTGATTTCATTGCTGCCAACCAAGGGTCACGTGCCAACAATGTGATCACAGGC
181 Y D P D F I A A N Q G S R A N N V I T G
601 TCCAAGAAAGAACAACTTCAGCAAGTCATCAAGGACATCAGGGAGTTTAAGGAAAAAAAC
201 S K K E Q L Q Q V I K D I R E F K E K N
661 AAGGTAGACAAGGTGGTTGTGCTGTGGACTGCCAACACAGAGAGGTACAGCAATGTCGTC
221 K V D K V V V L W T A N T E R Y S N V V
721 GTGGGGCTAAATGACACCATGGAGAACCTCATGGCTGCACTGGAGAGGAATGAATCAGAG
241 V G L N D T M E N L M A A L E R N E S E
781 ATATCTCCATCAACTTTGTATGCCTTGGCCTGTGTGTTGGAAAATGTTCCTTTTGTGAAC
261 I S P S T L Y A L A C V L E N V P F V N
841 GGAAGCCCCCAGAACACCTTTGTTCCAGGGTTGATTGATCTGGCTATCAAGAGGAACAGT
281 G S P Q N T F V P G L I D L A I K R N S
901 TTGATTGGTGGGGATGACTTTAAGAGTGGTCAGACCAAAATGAAGTCCGTCCTGGTGGAT
301 L I G G D D F K S G Q T K M K S V L V D
961 TTCCTTGTTGGTGCTGGGATCAAGCCAACGTCGATAGTGAGCTACAACCATCTGGGCAAT
321 F L V G A G I K P T S I V S Y N H L G N
1021 AATGACGGCATGAATCTGTCAGCGCCGCAAACTTTCCGTTCCAAGGAGATCTCCAAGAGC
341 N D G M N L S A P Q T F R S K E I S K S
1081 AATGTTGTAGACGACATGGTCTCCAGCAATGGAATACTCTATGAACCTGGTGAACATCCT
361 N V V D D M V S S N G I L Y E P G E H P
1141 GACCACGTTGTGGTCATTAAGTATGTGCCATACGTGGGGGATAGCAAGAGGGCTATGGAC
381 D H V V V I K Y V P Y V G D S K R A M D
1201 GAGTACACCTCGGAGATATTCATGGGTGGAAAGAGCACTATAGTGCTACACAATACGTGT
401 E Y T S E I F M G G K S T I V L H N T C
1261 GAAGACTCCCTGCTGGCTGCACCCATCATCCTGGACTTGGTTCTTCTCGCTGAGCTCAGT
421 E D S L L A A P I I L D L V L L A E L S
1321 ACCAGGATCCAGCTGAAAGCCGAGGGAGAGGGAAAGTTTCATTCTTTCCACCCGGTGGCT
441 T R I Q L K A E G E G K F H S F H P V A
1381 ACCATCCTCAGTTACCTCACAAAGGCTCCTCTGGTTCCCCCAGGGACGCCGGTAGTGAAT
461 T I L S Y L T K A P L V P P G T P V V N
1441 GCACTTTCAAAGCAGCGTGCAATGCTGGAGAACATATTGAGAGCTTGTATTGGATTGGCT
481 A L S K Q R A M L E N I L R A C I G L A
1501 CCAGAGAATAACATGATTTTGGAATACAAGTGAAGTATTAAGAAGAATAACAAGGATGAT
501 P E N N M I L E Y K *
1561 GGTGGGGAGCAGACCAGTTCATAAGCTGTAGAAACAATGAATGTTCCCTTTTCTCTTTCC
AATCCAGTGTTTATTGATGTCTGTCTGATATTTGCCATTACTAGGCATATTAGTTCTCTATGTTCTGGCTTTTAGCGTTGTGTAGGCTTTTA
GCCCCTCTGCTCTGGCATTTTCAATGACCGAGCTACTCTTTTCATGTGGAAATAGTTCATAAATATAAAACTGTCTATAAATTCTGTTCAAA
AAAAAAAAAAAAAAA
268 pb untranslated 3´sequence (3´UTR)
Figura 6. Seqüência completa do cDNA do gene PeMIPS e da proteína deduzida in
sílico. A seqüência 5´ UTR e 3´ UTR possuem 134 e 268 pb, respectivamente. O realce em
vermelho indica os codons de iniciação e terminação. O realce em amarelo os sinais de
poliadenilação. E as letras em azul a cauda poli (A).
41
4.2. Análise da proteína PeMIPS
A dedução da seqüência de aminoácidos da proteína PeMIPS foi utilizada para
comparar com a composição de aminoácidos de outras proteínas MIPS de plantas com
acessos no Genbank e TIGR. A análise revelou que a proteína PeMIPS contém quatro
motivos de polipeptídios altamente conservados que podem ser encontrados em outras
espécies de plantas: GWGGNNG (domínio 1), VLWTANTERY (domínio 2),
NGSPQNTFVPGL (domínio 3) e SYNHLGNNDG (domínio 4) (Figura 7). Estes motivos
também foram encontrados em proteínas MIPS de animais e microrganismos, como
Anopheles gambiae (XM320685), Drosophila melanogaster (AF071103), Homo sapiens,
(AF207640), Xenopus laevis (BC077437), Aspergillus fumigatus (XM744144), Pichia
pastoris (AF078915), Entamoeba histolytica (Y11270) e Leishmania amazonensis
(U91965). Os motivos apresentados são essenciais para a funcionalidade da enzima MIPS,
por serem domínios relacionados com ligações do co-fator NAD
+
e de reações de catálise
da enzima (Majumder et al., 1997; Bachhawat & Mande, 1999). Esta constatação indica
que o gene e a proteína praticamente não sofreram grandes mutações ao longo da evolução
das espécies, e conseqüentemente, a manutenção da funcionalidade tornou-se indispensável
para o metabolismo de diversos organismos.
MFIDTFKVESPNVKYTEDEIHSVYNYETTELVHENRNGTYQWTVKPKTVQYEFKTSIHVPKLGVMLVGWGGNN
GSSLTGGIIANREGISWATKDKVQQANYFGSLTQASTIRVGSFNGEEIYAPFKSLLPMVSPDDVVIGGWDISD
MNLADAMARAKVFDIDLQKQLRPYMESMIPLPGIYDPDFIAANQGSRANNVITGSKKEQLQQVIKDIREFKEK
NKVDKVVVLWTANTERYSNVVVGLNDTMENLMAALERNESEISPSTLYALACVLENVPFVNGSPQNTFVPGLI
DLAIKRNSLIGGDDFKSGQTKMKSVLVDFLVGAGIKPTSIVSYNHLGNNDGMNLSAPQTFRSKEISKSNVVDD
MVSSNGILYEPGEHPDHVVVIKYVPYVGDSKRAMDEYTSEIFMGGKSTIVLHNTCEDSLLAAPIILDLVLLAE
LSTRIQLKAEGEGKFHSFHPVATILSYLTKAPLVPPGTPVVNALSKQRAMLENILRACIGLAPENNMILEYK*
Figura 7. Predição in sílico da seqüência da proteína PeMIPS. O realce em amarelo
indica os domínios catalíticos conservados da proteína.
42
4.3. Análise da expressão do gene PeMIPS
Na análise de expressão do gene MIPS de P.edulis utilizou-se RNA total de
diferentes partes da planta: óvulo (Ov), grão-de-pólen (PG), caule (St), folha (L), pétala (Pt)
e glândula foliar (LG) (Figura 8A), e também de sementes em diferentes estágios de
desenvolvimento (Figura 8B). Para esta análise, realizou-se uma RT-PCR semi-quantitativa
que tinha como gene controle o fator de alongamento celular de P. edulis (PeEFα). Todos
os parâmetros da reação foram estabelecidos a partir do gene controle, que foi clonado e
seqüenciado pela primeira vez neste trabalho. Somente após a padronização da RT-PCR
realizou-se uma reação definitiva com os dois genes.
A expressão do gene PeMIPS nos órgãos do maracujazeiro foi observada
unicamente em óvulo, grão-de-pólen e folha; nenhum sinal de transcritos pôde ser
observado em caule, pétalas e glândula foliar (Figura 8A). Na semente, foi detectada
expressão em todos os estágios de desenvolvimento analisados. Contudo, observou-se o
nível máximo de expressão, com presença de um pico marcante, no nono dia após a
polinização (Figura 8B). Apesar da baixa freqüência de trabalhos caracterizando a
expressão do gene MIPS em plantas. Estudos com S. indicum, também revelaram a
expressão do gene MIPS em folha, caule e raiz; embora na folha os níveis de transcritos
mostraram-se maior do que nos demais órgãos investigados (Chun et al., 2003). Em soja
(G. max), foram detectados transcritos em cotilédones germinados, raízes e folhas jovens,
flores, embriões somáticos no estágio globular, e até em sementes em diferentes estágios de
desenvolvimento. Especialmente nas sementes de soja, a expressão do gene MIPS ocorreu
nos primeiros estágios de desenvolvimento, com sementes de até 10 mm de comprimento
(Hegeman et al., 2001). Diferentemente dos resultados de expressão encontrados em soja, a
expressão do gene PeMIPS nas sementes de P. edulis ocorreu durante todos os estágios
analisados, observando-se apenas um pico no nono dia após a polinização.
43
Figura 8. RT-PCR do gene PeMIPS em distintos órgãos e durante o desenvolvimento
da semente. A. Análise da expressão do gene PeMIPS em diferentes órgãos do
maracujazeiro: óvulo (Ov), grão-de-pólen (PG), caule (St), folha (L), pétala (Pt) e glândula
foliar (LG). B. Análise da expressão na semente em diferentes estágios de
desenvolvimento: três, nove, quinze, vinte e um, e vinte e sete dias após a polinização.
Todos os parâmetros da reação foram estabelecidos a partir do gene PeEFα (Fator de
alongamento celular de P. edulis).
44
4. 4. Análise da expressão do gene PeMIPS sob condições de estresse por frio e calor
O efeito da temperatura e da luz nos níveis de transcrição do gene PeMIPS
endógeno foi estudado em plantas de maracujazeiro (P. edulis) com oito semanas após a
germinação. Os resultados revelaram que em condições de frio (5 ºC e 12 ºC), na ausência
de luz, o gene PeMIPS teve superexpressão nas primeiras 8 horas com um acentuado
decrescimo a 5 °C após 16 horas (Figura 9A). Enquanto na presença de luz, os padrões de
expressão foram bastante diferentes dos tratamentos no escuro, apresentando os níveis de
expressão semelhantes com 8 e 16 horas a 5 ºC, e um pico a 12 °C após 16 horas (Figura
9B). Já em altas temperaturas (27 ºC e 37 ºC), no escuro, foi observado um discreto
aumento na expressão após 16 horas (Figura 9A). E na presença de luz, um pico de
expressão a 27 ºC com 16 horas. Excepcionalmente, a 37 ºC os níveis de expressão foram
quase indetectáveis em ambos os tempos (Figura 9B). O presente resultado corrabora com a
hipótese da influência da luminosidade e temperatura sob a regulação do gene MIPS das
espécies estudadas.
Em batata (Solanum tuberosum), foi observado que a luz induz nas folhas um
aumento drástico no nível de expressão do gene MIPS (Keller et al., 1998). Estes fatos
reforçam a hipótese da influência da luz sob a expressão e atividade da proteína MIPS.
RayChaudhury et al., (1997) estudando a proteína MIPS de cloroplasto de algas e plantas
superiores, observaram um aumento da atividade desta proteína sob condições de luz.
Entretanto, mecanismos moleculares de expressão, regulação e até atividade da MIPS não
são somente influenciados pela luz. Muitos estudos têm mostrado que este gene pode ser
regulado em várias ocasiões. Surpreendentemente, em Citrus sinensis submetido a
herbivoria e a danos mecânicos, viu-se que a transcrição do gene MIPS foi induzida com
um pico após 48 horas e uma gradual diminuição após 96 horas (Mozoruk et al., 2006).
Estes resultados corroboram com o fato de que rápidas mudanças de inositol-fosfatos em
diferentes sistemas de plantas têm sido observadas por diferentes estímulos, incluindo
choque osmótico e ao frio, luz e elicitores bióticos (Perera et al., 2006). Muitos dos genes
regulados por estes fatores também podem ser induzidos pelo ácido abscísico (ABA)
(Ishitani et al., 1997; Seki et al., 2002; Li et al., 2006). Em arroz, plantas submetidas a
tratamentos com ABA induziram o acúmulo de transcritos do gene MIPS 2 a 4 horas após o
45
início do tratamento (Yoshida et al., 2002). Sabe-se que o ABA tem um papel fundamental
na aclimatação das plantas ao frio (Li et al., 2006). Muitas plantas de regiões temperadas
têm a capacidade de se aclimatar ao frio aumentando sua tolerância quando expostas as
baixas temperaturas (Chinnusamy et al., 2006). Entretanto, o maracujazeiro, assim como
outras espécies originadas de regiões tropicais e subtropicais, é sensível ao frio. Nestas
espécies as baixas temperaturas podem levar ao estresse por desidratação, que impede a
absorção de água pelas raízes e o transporte para as folhas (Levitt, 1980).
Figura 9. RT-PCR do gene PeMIPS em plantas oito semanas após a germinação,
submetidas a condições de frio e calor. A. Na ausência de luz. B. Na presença de luz.
Todos os parâmetros da reação foram estabelecidos a partir do gene PeEFα (Fator de
alongamento celular de P. edulis).
46
4.5. Análise de Southern blot para verificação do número de cópias do gene MIPS no
genoma de cinco espécies diferentes de maracujazeiro
O Southern blot foi realizado com a finalidade de estimar o número de cópias do
gene MIPS no genoma de cinco espécies diferentes de maracujazeiro (P. edulis, P.
eichleriana, P. caerulea, P. nitida e P. coccinea). Neste experimento foi usado como sonda
um fragmento de 693 pb do cDNA do gene PeMIPS que se encontrava clonado no vetor
pTOPOPeMIPS. Durante o preparo da sonda, o fragmento foi digerido com a enzima de
restrição EcoRI, liberando-o do vetor de clonagem. Ainda com relação à sonda, realizou-se
uma análise de possíveis sítios de restrições no interior da seqüência com o programa DNA
MAN version 4.0 (Lynnon Biosoft), para garantir que durante a reação de restrição não
fosse formado fragmentos menores da sonda, podendo alterar desta forma o resultado.
Entretanto, Chun et al. (2003) ao tentarem estimar o número de cópias do gene MIPS em S.
indicum, utilizaram como sonda a seqüência completa de cDNA do gene estudado, que era
de 1.845 pb. Hegeman et al. (2001) também utilizaram como sonda a seqüência completa
do cDNA do gene MIPS de soja (G. max), que era de 1.791 pb. Embora em muitos
trabalhos utilizem-se seqüências completas de cDNA para estimar o número de cópias do
gene MIPS no genoma de muitos organismos, em Mesembryanthemum crystallinum e A.
thaliana, foi utilizado um fragmento de cDNA de aproximadamente 300 pb como sonda
(Ishitani et al., 1996). Indicando que o tamanho da sonda não é fator limitante neste tipo de
análise.
Com relação à hibridização, as amostras de DNA genômico de folha das cinco
espécies de maracujazeiro foram digeridas separadamente com três enzimas de restrição
(EcoRI, XhoI e Hind III), produzindo quinze amostras diferentes do DNA. A membrana
contendo as quinze amostras de DNA foi lavada em baixa e alta estringência (Figura 10).
Em baixa estringência, um grande número de bandas fortes foram visíveis na membrana em
todas as amostras, que desapareceram quando a mesma foi lavada em alta estringência.
Digestões com HindIII em condições de alta estringência apresentaram diferentes padrões
de hibridização entre as cinco amostras de maracujazeiro, revelando um polimorfismo no
sítio de restrição desta enzima. Uma única banda de hibridização foi verificada nas
amostras digeridas com XhoI. O resultado obtido em condições de baixa estringência indica
47
que poderão existir diversas seqüências do gene MIPS no DNA genômico das espécies
analisadas. Entretanto, uma única banda de aproximadamente 3 kb que foi detectada sob
condições de alta estringência (digestão com XhoI) indica que o genoma de P. edulis, P.
eichleriana, P. caerulea, P. nitida e P. coccínea possui uma cópia do gene PeMIPS que foi
clonado no presente trabalho (Figura 10). Pesquisas têm mostrado que este gene é membro
de uma família multigênica em algumas espécies de plantas. Por exemplo, em A. thaliana o
gene MIPS (Atmips) consiste de Atmips-1 (Johnson, 1994), Atmips-2 (Johnson & Burk,
1995) e Atmips-3 (Ishitani et al., 1996). Em soja (G. max) e milho (Z. mays), estima-se
conter na família do gene MIPS no mínimo quatro a sete membros, respectivamente
(Larson & Raboy, 1999). Contraditoriamente, o maracujazeiro parece possuir uma única
cópia deste gene no seu genoma. Desta forma, o presente resultado mostra-se bastante
significativo, pois se trata do primeiro estudo do gene MIPS com planta frutífera, além de
ser a primeira espécie de planta estudada que possui uma única cópia deste gene em seu
genoma. Uma análise ainda necessita ser realizada no sentido de identificar outros genes
similares presentes no genoma de P. edulis.
48
Figura 10. Análise de Southern blot no genoma do maracujazeiro. Os DNAs extraídos
de folhas de P. edulis (Pe), P. eichleriana (Pei), P. caerulea (Pce), P. nítida (Pn) e P.
coccínea (Pco) foram digeridos com as enzimas de restrição EcoRI (E), HindIII (H) e XhoI
(X). Um fragmento de 693 pb do cDNA do gene PeMIPS foi utilizado como sonda no blot
sob baixa e alta estringências. O marcador de peso molecular (em kb) está indicado no lado
esquerdo.
49
4.6. Análise filogenética do gene PeMIPS
A análise filogenética do gene PeMIPS reuniu todos os acessos de plantas do
Genebank e TIGR que continham as seqüências codificante completa de cDNA, separando
os diferentes genes MIPS em grupos taxonômicos bastante distintos (Figura 11). Após a
análise, percebeu-se que a árvore filogenética havia agrupado três principais ramos
taxonômicos. No primeiro, reuniram-se todas as monocotiledôneas, com exceção do
Triticum aestivum, que surpreendentemente ficou ligado às dicotiledôneas, e a Spirodela
polyrrhiza, que é uma dicotiledônea e ficou próxima às monocotiledôneas. No segundo, as
gimnospermas, com o gene MIPS de Pinus sp. como único representante. E no terceiro, o
grupo da árvore com maior número de representantes, as dicotiledôneas, dividida em seis
ordens principais: Brassicales, Caryophylales, Solanales, Lamiales, Malpighiales e Fabales.
Além de grupos com representantes únicos, como Vitis vinifera, Allium cepa, Actinidia
arguta, Aquilegia formosa x pubescens, Citrus paradise e Gorssypium hirsutum (Figura
11). Com relação ao gene MIPS de P. edulis, este ficou agrupado na mesma raiz do gene
MIPS de Populus sp. Sendo ambas as espécies pertencetes à ordem Malpighiales. Muitos
outros estudos envolvendo análises filogenéticas do gene MIPS corroboram com o
resultado apresentado no presente trabalho. Styer (2000) estudando a expressão do gene
MIPS em plantas, Chun et al. (2003) estudando o gene MIPS de S. inducum e Chatterjee et
al. (2004) com o gene MIPS de Synechocystis sp, encontraram padrões semelhantes em
suas árvores filogenéticas.
50
Figura 11. Análise filogenética das seqüências de cDNA do gene MIPS. As seqüências
foram retiradas dos bancos de acesso, Genebank e TIGR e os agrupamentos foram
realizados usando 10.000 repetições (máxima parcimônia). São acessos da árvore: Pisp =
Pinus sp., Xv = Xerophyta viscosa, Os = Oryza sativa, Pc = Porteresia coarctata, Hv =
Hordeum vulgare, So = Saccharum officinarum, Zm = Zea mays, As = Avena sativa, Sp =
Spirodela polyrrhiza, Ta = Triticum aestivum, Bn = Brassica napus, At = Arabidopsis
thaliana, Ac = Allium cepa, Sm = Sueda maritima, Mc = Mesembryanthemum
crystallinum, Le = Lycopersicon esculentum, Nt = Nicotiana tabacum, St = Solanum
tuberosum, Am = Avicennia marina, Si = Sesamum indicum, Aa = Actinidia arguta, Vv =
Vitis vinifera, Afp = Aquilegia formosa x pubescens, Cp = Citrus paradise, Posp = Populus
sp., Pe = Passiflora edulis, Gh = Gorssypium hirsutum, Tp = Tripolium pratense, Mt =
Medicago trunculata, Lj = Lotus japonicus, Gm = Glycine max, Pv = Phaseolus vulgaris.
51
5. Conclusão
O presente trabalho sugere papéis importantes para o gene MIPS não só no
metabolismo básico, mas também no estabelecimento de programas de desenvolvimento e
resposta das plantas a mudanças ambientais. Os resultados demonstraram que o gene MIPS
de Passiflora edulis clonado (PeMIPS), é preferencialmente expresso em folhas, grãos-de-
pólen, óvulos e sementes nove dias após a polinização. O PeMIPS é diferentemente
regulado durante o estresse ao frio e calor e em resposta a presença da luz, indicando que as
vias subseqüentes após a síntese de mio-inositol são importantes na resposta ao estresse
ambiental. Supomos que essa resposta tenha uma correlação com a adaptação ecológica do
maracujazeiro, que por ser uma espécie adaptada a ambientes tropicais e subtropicais,
possui tolerância a períodos curtos de frio (em torno de 12 °C) sem sofrer injúrias, mas não
tolera temperaturas mais baixas por um tempo prolongado. Nosso conhecimento acerca da
relação estresse e expressão gênica ainda está longe de ser completa, e existem lacunas,
principalmente no que diz respeito a espécies tropicais. Conseqüentemente, outros genes
envolvidos com a resposta ao estresse devem ser estudados, clonados e caracterizados.
Além disso, são necessários estudos para localização de PeMIPS em compartimentos sub
celulares de distintos tecidos vegetais, assim como silenciamento gênico específico em
plantas transgênicas para a melhor compreensão do seu papel durante o desenvolvimento da
semente.
52
6. Referências Bibliográficas
AKAMINE, E.K.; GIROLAMI, G. (1959) Pollination and fruit set in the yellow passion
fruit. Havaí: University of Hawaii, p. 44, ( Universisty Hawaii Technical Bulletin, 39).
ALBERTS B, JOHNSON A, LEWIS J, RAFF M, ROBERTS K, WALTER P. (2004)
Biologia molecular da célula. Trad. Ana Beatriz Gorini da Veiga et al. – 4. ed. Porto
Alegre: Artmed. p. 451-452.
ALTSCHUL, S.F., GISH, W., MILLER, W., MYERS, E.W., LIPMAN, D.J. (1990) Basic
local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410.
BACHHAWAT, N. & MANDE, S.C. (1999) Identi.cation of the INO1 gene of
Mycobacterium tuberculosis H37Rv reveals a novel class of inositol 1-phosphate
synthase enzyme. J Mol Biol. 291:531-536.
BLUMWALD, E. (2000) Sodium transport and salt tolerance in plants. Curr Opin Cell
Biol 12:431-434.
BOHNERT, H.J., SHEVELEVA, E. (1998) Plant stress adaptations – making metabolism
move. Curr Opin Plant Biol 1:267-274.
BRUCKNER, C.H.; MELLETI, L.M.M.; OTONI, W.C.; ZERBINI JUNIOR, F.M. (2002)
Maracujazeiro. In: Melhoramento de Fruteiras Tropicais. Viçosa: UFV, p.373-410.
BRUCKNER, C.H.; MELLETI, M.C. (2001) Maracujá: tecnologia de produção, pós-
colheita, agroindústria, mercado. Porto Alegre: Cinco Continentes, p. 395.
BURSSENS, S., HIMANEN, K., VAN DE COTTE, B., BEECKMAN, T., MONTAGU,
M.V., INZE, D., VERBRUGGEN, N. (2000) Expression of cell cycle regulatory genes
and morphological alterations in response to salt stress in Arabidopsis thaliana. Planta
211:632-640.
CHAGAS, C.M. (1991) Doenças viróticas e similares do maracujazeiro no Brasil. In:
RUGGIERO, C. (Coord.). A cultura do maracujá no Brasil. Jaboticabal: Funep, p.
175-186.
CHATTERJEE, A., MAJEE, M., GHOSH, S., MAJUMDER, A. L. (2004) sll1722, an
unassigned open reading frame of Synechocystis PCC 6803, codes for L- myo-inositol
1-phosphate synthase. Planta. 218:989-998.
53
CHUN, J.A.; JIN, U.H.; LEE, J.W.; YI, Y.B.; HYUNG, N.I.; KANG, M.H.; PYEE, J.H.;
SUH, M.C.; KANG, C.W.; SEO, H.Y.; LEE, S.W.; CHUNG, C.H. (2003) Isolation
and characterization of a myo-inositol 1-phosphate synthase cDNA from developing
sesame (Sesamum indicumL.) seeds: functional and differential expression, and salt-
induced transcription during germination.
Planta. 216:874-880.
CRONQUIST, A. (1988) The evolution and classification of flowering plants. New York:
The New York Botanical Garden, Bronx, New York, p. 554.
EMANUELSSON, O., NIELSEN, H., BRUNAK, S., VON HEIJNE, G. (2000) Predicting
subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence.
Journal of Molecular Biology. 300:1005-1016.
ENGLISH, P.D.; DIETZ, M.; ALBERSHEIM, P. (1966) Myo-inositol kinase: partial
purification and identification of product. Science, v. 151, p. 198-199.
GIBSON, S., ARONDEL, V., IBA, K., AND SOMERVILLE, C. (1994). Cloning of a
temperature-regulated gene encoding a chloroplast omega-3 desaturase from
Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 106: 1615–1621.
HEGEMAN, C.E., GOOD, L. L., GRABAU, E. A. (2001) Expression of D-myo-Inositol-3-
Phosphate Synthase in Soybean. Implications for Phytic Acid Biosynthesis. Plant
Physiology. 125: 1941-1948.
HICKEY, M .; KING, C. (1988) 100 families of flowering plants. Cambridge University
Press, Cambridge, p. 130-133.
HUANG L, LEE J, SITARAMAN K, GALLEGO A, RACHTCHIAN A. (2000) A New
Highly Sensitive Two-Step RT-PCR System. Focus. 22:6-7.
INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA (IBGE). Produção
agrícola municipal – Culturas temporárias e perenes, v. 29, http://www.ibge.gov.br
.
(03 setembro 2004).
ISHITANI, M.,
MAJUMDER, A. L., BORNHOUSER, A., MICHALOWSKI, C. B.,
JENSEN,R. G., & BOHNERT, H. J. (1996) Coordinate transcriptional induction of of
myo-inositol metabolism during environmental stress. Plant J. 9:279-293.
JOHNSON, M.D. & BURK, D.H. (1995) Isozyme of 1-myo-inositol-1-phosphate synthase
from Arabidopsis. Plant Physiol. 109:721-726.
54
JOHNSON, M.D. (1994) The Arabidopsis thaliana myo-inositol-1-phosphate synthase.
Plant Physiol. 105:1023-1024.
JORGENSEN, P.M.; LAWESSON, J.E.; HOLM-IELSEN, L.B. (1984) A guide to
collecting passionflowers. Annuals of the Missouri Botany Garden, St. Louis, v.71,
p. 1172-1174.
KIMURA, M. (1980) A simple method for estimating evolutionary rates of base
substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J. Mol. Evol.
16:111-120.
LARSON, S.R.; RABOY, V. (1999) Linkage mapping of maize and barley myo-inositol 1-
phosphate synthase DNA sequences: correspondence with a low phytic acid mutation.
Theoretical and Applied Genetics. 99 (1-2):27-36.
LEITE, R.A.S.;BLISKA, F.M.M.;GARCIA, A.E.B. (1994) Aspectos econômicos da
produção e mercado. In: ITAL, Maracujá. Campinas: ITAL, p. 154-176.
LEMTIRI-CHLIEH, F., MACROBBIE, E.A., WEBB, A.A., MANISON, N.F.,
BROWNLEE, C., SKEPPER, J.N., CHEN, J., PRESTWICH, G.D. AND BREARLEY,
C.A. (2003) Inositol hexakisphosphate mobilizes an endomembrane store of calcium in
guard cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.100, p. 1091-1095.
LIMA, A.A.; CUNHA, M.A.P. (2004) Maracujá: produção e qualidade na passicultura,
Cruz das Almas: Embrapa, p 396.
LOEWUS FA, MURTHY PPN (2000) Myo-Inositol metabolism in plants. Plant Sci 150:
1-19.
LOEWUS, F.A (1990) Inositol metabolism in plants, In: Boss WF, Morre DJ, Loewus FA
(eds) Wiley-Liss, Inc, New York. 9:13-19.
LOEWUS, M.W., SASAKI, K., LEAVITT, A.L., MUNSELL, L., SHERMAN, W.R. AND
LOEWUS, F.A. (1982) Enantiomeric form of myo-inositol-1-phosphate produced by
myo-inositol-1-phosphate synthase and myo-inositol kinase in higher plants. Plant
Physiol., v. 70, p. 1661-1663.
LOPES, S.C. (1994) Citogenética do maracujá, Passiflora spp, In: São José, A.R.
Maracujá produção e mercado. Vitória da Conquista: UESB, p. 19-23.
55
MAJUMDER AL, CHATTERJEE A, GHOSHDASTIDAR K, MAJEE M (2003)
Diversi.cation and evolution of L-myo-inositol 1-hosphate synthase. FEBS Lett.
533:3-10.
MAJUMDER AL, JOHNSON MD, HENRY SA (1997) 1L-myo-Inositol-1–phosphate
synthase. Biochim Biophys Acta. 1348:245-256.
MAJUMDER, A.N.L. & BISWAS, B.B. (1973) Further characterization of phosphoinositol
kinase isolated from germinating mung bean seeds. Phytochemistry. v. 12, p. 315-319.
MAOUT, L. E.; DECAISNE, J. (1976) A general system of botany. Longmans, Green
London and Company. p. 446-449.
MAY, P.G.; SPEARS JÚNIOR, E.E. (1988) Andromonoecy and variation in phenotypic
gender of Passiflora incarnata (Passifloraceae). American Journal of Botany. v. 75,
p.1830-1841.
MELLETI, L.M.M; MAIA, L.M. (1999) Maracujá: produção e comercialização.
Campinas: Instituto Agronômico, p. 62.
OGA, S., DEFREITAS, P.C.D., GOMES DA SILVA, A.C., HANADA, S. (1984)
Pharmacological trials of crude extracts of Passiflora alata. Planta Medica, 51, p. 303-
306.
PEREIRA, A.L.C.; CAMPACCI, C.A.; CIANCIULLI, P.L. (1971) Maracujá: seu cultivo,
espécie e moléstias. In: Congresso Brasileiro de Fruticultura, Campinas. Anais
Campinas: SBF, p. 641-658.
PERERA, I.Y.; HUNG, C.Y.; BRADY, S.; MUDAY, G.K.; BOSS, W.F. (2006) A
universal role for inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated signaling in plant
gravitropism. Plant Physiology. 140: 746-760.
QUESADA V, PONCE MR, MICOL JL (2000) Genetic analysis of salttolerant mutants in
Arabidopsis thaliana. Genetics. 154: 421-436.
RABOY, V. (1997) Accumulation and storage of phosphate and minerals. In: Larkins BA,
Vasil IK (eds) Cellular and molecular biology of plant seed development. Kluwer
Publishers, The Netherlands, pp 441-477.
RABOY, V.; GERBASI, P.; YOUNG, K.; STONEBERG, S.; PICKETT, S.; BAUMAN,
A.; MURTHY, P.; SHERIDAN, W.; ERTL, D. (2000) Origin and seed phenotype of
maize low phytic acid 1-1 and low phytic acid 2-1. Plant Physiol, v. 124, p.355-368.
56
RAYCHAUDHURI A, HAIT NC, DASGUPTA S, BHADURI TJ, DEB R, MAJUMDER
AL (1997) L-myo-inositol 1-phosphate synthase from plant sources: characteristics of
the chloroplastic and cytosolic enzymes. Plant Physiol. 115:727-736.
RAYCHAUDHURI A, MAJUMDER AL (1996) Salinity induced enhancement of L-myo-
inositol 1-phosphate synthase in rice (Oryza sativa L.). Plant Cell Environ 19:1337-
1342.
RENDLE, A.B. (1959) Classification of flowering plants. Cambridge University Press,
Cambridge, p. 211-213.
ROMANO, E. (1998) Manual de transformação genética de plantas. In: extração de DNA
de tecidos vegetais. Embrapa, Brasília, 309p.
RUGGIERO, C.; SÃO JOSÉ, A.R.; VOLPE, P.A.; OLIVEIRA, J.C.; DURIGAN, J.F.;
BAUMGATNER, J.C.; SILVA, J.R.; NAKAMURA, K.; FERREIRA, M. E.; KAVATI,
R.; PEREIRA, V. DE P. (1996) Maracujá para exportação: aspectos técnicos da
produção. Brasília: EMBRAPA-SPI, p. 64.
SAFRANY, S.T., CAFFREY, J.J., YANG, X.N., SHEARS, S.B. (1999) Diphosphoinositol
polyphosphates: The final frontier for inositide research? Biological Chemistry.
380:945-951.
SAIARDI, A., SCIAMBI, C., MCCAFFERY, J.M., WENDLAND, B., SNYDER, S.H.
(2002) Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America. 99: 14206-14211.
SAITOU, N.; NEI, M. (1987) The neighbor-joining method - a new method for
reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution. 4 (4):406-425.
SAVITCI, L.A.; GASPARINO-FILHO, J.; MORETTI, V.A. (1994) Identificação do
potencial da fruta brasileira. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE ECONOMIA E
SOCIOLOGIA RURAL, 32., Brasília, 1994. Anais. Brasília: Sociedade Brasileira de
Economia e Sociologia Rural, v. 2, p. 969-979.
SCHOLZ, S., SONNENBICHLER, J., SCHAFER, W., AND HENSEL, R. (1992) Di-myo-
inositol-1,1´-phosphate: A new inositol phosphate isolated from Pyrococcus woesei,
FEBS Lett. 306: 239-242.
57
SHEN, X.; XIAO, H.; RANALLO, R.; WU, W.H.; WU, C. (2003) Modulation of ATP-
dependent chromatin-remodeling complexes by inositol polyphosphate. Science, v.
299, p. 112-114.
SHI, J.; WANG, H.; HAZEBROEK, J.; ERTL, D.S.; HARP, T. (2005) The maize acid 3
encondes a myo-inositol kinase that plays a role in phytic acid biosynthesis in
developing seeds. The Plant Journal, v. 42, p. 708-719.
SHI, J.; WANG, H.; WU, Y.; HAZEBROEK, J.; MEELEY, R.B.; ERTL, D.S. (2003) The
maize low-phytic acid mutant Ipa2 is caused by mutation in an inositol phosphate
kinase gene. Plant Physiol., v. 131, p. 507-515.
STEIN AJ, GEIGER JH (2002) The crystal structure and mechanism of 1-L-myo-inositol-
1-phosphate synthase. J Biol Chem 277:9484-9491.
STROTHER, S. (1980) Homeostasis in germinating seeds. Annals of Botany, v. 45, p.
217-218.
STYER J (2000) Regulating inositol biosynthesis in plants: myo-inositol phosphate
synthase and myo-inositol monophosphatase. MS thesis. Virginia Polytechnic Institute
and State University, Blacksburg.
TANAKA, K., YOSHIDA, T. AND KASAI, Z. (1976) Phosphorylation of myo-inositol by
isolated aleurone particles of rice. Agric. Biol. Chem., v. 40, p. 1319-1325.
TAYLOR; L. (1996) Maracujá, Herbal Secrets of the Rainforest. Prime Publishing Inc.,
Austin, TX.
VANDERPLANK, T. (1996) Passion flowers. Cambridge Press, MIT, p 224.
WEI, J.Z., TIRAJOH A., E.ENDY J., PLANT, A.L. (2000) Characterization of salt-
induced changes in gene expression in tomato (Lycopersicon esculentum) roots and the
role played by abscisic acid. Plant Sci. 159:135-148.
YORK, J.D.; ODOM, A.R.; MURPHY, R.; IVES, E.B.; WENTE, S.R. (1999) A
phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required for
efficient messenger RNA export. Science, v. 285, p. 96-100.
YOSHIDA, K.T.; WADA, T.; KOYAMA, H.; MIZOBUCHI-FUKUOKA, R.; NAITO, S.
(1999) Temporal and spatial patterns of accumulation of the transcript of myo-inositol-
1-phosphate synthase and phytin-containing particles during seed development in rice.
Plant Physiol., v.119, p. 65-72.
58
ZHOU JR.; ERDMAN JW. (1995) Phytic acid in health and disease. Crit. Rev. Food Sci.
Nutr. 35(6):495-508.
59
Anexo 1
Soluções e Reagentes
60
DTT 1M
Dissolver 3,09 g de DTT em 20 mL de acetato de sódio 10 mM, pH 5,2. Esterilizar por
filtração. Distribuir em alíquotas de 1 mL e estocar a –20 ºC.
TE pH 8,0
Componente Quantidade Concentração final
Tris-HCl 1 M, pH 8,0 1 mL 10 mM
EDTA 500 mM, pH 8,0 200 µL 1 mM
H
2
O q.s.p. 100 mL
TBE 10X
Dissolver 108 g de Tris base, 55 g de ácido bórico e 40 mL de EDTA 500 mM, pH 8,0, em
água destilada. Completar o volume até 1litro.
SDS 20%
Dissolver 200 g de SDS em 700 mL de água destilada, em banho-maria a 50 °C, no
mínimo. Completar o volume até 1 L com água destilada.
Solução de Denhardt 50X
Dissolver lentamente em 50 mL de água destilada, em agitador magnético, 1g de BSA, 1g
de Ficoll tipo 400 e 1 g de PVP. Completar o volume até 100 mL com água destilada.
Dividir em alíquotas e armazenar a -20 °C.
Gel de agarose 1%
Para preparar 100 mL de gel. Pesar 1 g de agarose e dissolver por aquecimento em tampão
TBE 0,5 X.
61
Tampão SSPE 20X
Componente Quantidade Concentração final
NaCl 175,3 g 3 M
NaH
2
PO
4
.H
2
O 27,6 g 0,2 M
Na
2
.EDTA.
2
H
2
O 7,4 g 20 mM
H
2
O q.s.p. 1 L
Ajustar o pH para 7,4 com 10 N NaOH.
Tampão SSC 20X
Componente Quantidade Concentração final
NaCl 175,3 g 3 M
Citrato de sódio 88,2 g 0,3 M
H
2
O q.s.p. 1 L
EDTA 500 mM, pH 8,0
Adicionar 186,1 g de Na
2
.EDTA.2H
2
O a 800 mL de água destilada e homogeneizar com
agitador magnético. Ajustar o pH para 8,0 com NaOH (aproximadamente 20 g de NaOH
em pastilhas).
O EDTA não irá solubilizar totalmente até que a solução atinja o pH 8,0. Completar o
volume até 1 litro. Esterilizar em autoclave.
Glicerol 10%
Misturar 10 mL de glicerol puro a 90 mL de água destilada e autoclavar.
62
Tampão Tris HCL 1 M
Dissolver 121,1 g de Tris base em 800 mL de água destilada. Ajustar o pH adicionando
HCl concentrado, nas seguintes quantidades:
pH HCl
7,4
70 mL
7,6 60 mL
8,0
42 mL
Solução de pré-hibridização
Componente Quantidade Concentração Final
SSC 20X 12,5 mL 5 X
Solução de Denhardt 100X 2,5 mL 5X
SDS 10% 2,5 mL 0,5%
DNA de esperma de salmão 10 mg/mL 100 µL 20 µg/mL
Água q.s.p. 50 mL
Solução de Lavagem I
Componente Quantidade Concentração Final
SSC 20X 50 mL 2X
SDS 10% 5 mL 0,1%
Água q.s.p. 500 mL
Solução de Lavagem II
Componente Quantidade Concentração Final
SSC 20X 25 mL 1X
SDS 10% 5 mL 0,1%
Água q.s.p. 500 mL
63
Solução de Lavagem III
Componente Quantidade Concentração Final
SSC 20X 2,5 mL 0,1X
SDS 10% 5 mL 0,1%
Água q.s.p. 500 mL
64
Anexo 2
Submissão das seqüências ao Genbank
65
LOCUS DQ489558 1951 bp mRNA linear PLN 16-
MAY-2006
DEFINITION Passiflora edulis f. flavicarpa myo-inositol 1-phosphate
synthase
(mips) mRNA, complete cds.
ACCESSION DQ489558
VERSION DQ489558.1 GI:95104694
KEYWORDS .
SOURCE Passiflora edulis f. flavicarpa
ORGANISM Passiflora edulis f. flavicarpa
Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta;
Tracheophyta;
Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; core
eudicotyledons;
rosids; eurosids I; Malpighiales; Passifloraceae; Passiflora.
REFERENCE 1 (bases 1 to 1951)
AUTHORS Aragao,F.J.L. and Abreu,E.F.M.
TITLE Passiflora edulis f. flavicarpa mRNA for myo-inositol 1-
phosphate
synthase (mips gene)
JOURNAL Unpublished
REFERENCE 2 (bases 1 to 1951)
AUTHORS Aragao,F.J.L. and Abreu,E.F.M.
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (11-APR-2006) Embrapa Recursos Geneticos e
Biotecnologia,
Embrapa, PqEB W5 Norte, Brasilia, DF 70770-900, Brazil
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..1951
/organism="Passiflora edulis f. flavicarpa"
/mol_type="mRNA"
/db_xref="taxon:237848
"
/note="forma: flavicarpa"
gene
1..1951
/gene="mips"
CDS
133..1665
/gene="mips"
/codon_start=1
/product="myo-inositol 1-phosphate synthase"
/protein_id="ABF51620.1
"
/db_xref="GI:95104695"
/translation="MFIDTFKVESPNVKYTEDEIHSVYNYETTELVHENRNGTYQWTV
KPKTVQYEFKTSIHVPKLGVMLVGWGGNNGSSLTGGIIANREGISWATKDKVQQANYF
GSLTQASTIRVGSFNGEEIYAPFKSLLPMVSPDDVVIGGWDISDMNLADAMARAKVFD
IDLQKQLRPYMESMIPLPGIYDPDFIAANQGSRANNVITGSKKEQLQQVIKDIREFKE
KNKVDKVVVLWTANTERYSNVVVGLNDTMENLMAALERNESEISPSTLYALACVLENV
PFVNGSPQNTFVPGLIDLAIKRNSLIGGDDFKSGQTKMKSVLVDFLVGAGIKPTSIVS
YNHLGNNDGMNLSAPQTFRSKEISKSNVVDDMVSSNGILYEPGEHPDHVVVIKYVPYV
GDSKRAMDEYTSEIFMGGKSTIVLHNTCEDSLLAAPIILDLVLLAELSTRIQLKAEGE
GKFHSFHPVATILSYLTKAPLVPPGTPVVNALSKQRAMLENILRACIGLAPENNMILE
YK"
ORIGIN
1 aataacacaa ccacacaaag gcttcagaga gttgcgaaag cagattagct
cctctctttg
61 tttggctttg ggccttttgg gttctcttct cgttttaatc atccacagtt
ctctcccctt
66
121 cctgctaaca aaatgttcat cgacacgttt aaggttgaga gtcctaacgt
taagtacaca
181 gaggatgaga ttcactcggt gtacaactat gagaccactg agcttgttca
tgagaacagg
241 aatggtacct atcagtggac tgtcaaaccc aaaactgtcc aatacgaatt
caagaccagc
301 attcatgtcc ccaaactcgg ggttatgctc gtggggtggg gaggaaacaa
tggatcgtct
361 ctcaccggcg gtatcatagc caaccgagag ggaatctcct gggcgaccaa
ggacaaggtg
421 cagcaagcca actactttgg ctcgctaacc caggcttcaa ctatccgagt
tgggtctttc
481 aatggagagg agatttatgc tccattcaaa agcctgctcc ccatggtgag
ccccgatgac
541 gttgttattg gaggatggga cataagtgac atgaacttgg ctgacgccat
ggccagggca
601 aaagtcttcg acattgatct gcagaaacaa ctcaggccct acatggaatc
catgatccca
661 ctacccggaa tatatgaccc tgatttcatt gctgccaacc aagggtcacg
tgccaacaat
721 gtgatcacag gctccaagaa agaacaactt cagcaagtca tcaaggacat
cagggagttt
781 aaggaaaaaa acaaggtaga caaggtggtt gtgctgtgga ctgccaacac
agagaggtac
841 agcaatgtcg tcgtggggct aaatgacacc atggagaacc tcatggctgc
actggagagg
901 aatgaatcag agatatctcc atcaactttg tatgccttgg cctgtgtgtt
ggaaaatgtt
961 ccttttgtga acggaagccc ccagaacacc tttgttccag ggttgattga
tctggctatc
1021 aagaggaaca gtttgattgg tggggatgac tttaagagtg gtcagaccaa
aatgaagtcc
1081 gtcctggtgg atttccttgt tggtgctggg atcaagccaa cgtcgatagt
gagctacaac
1141 catctgggca ataatgacgg catgaatctg tcagcgccgc aaactttccg
ttccaaggag
1201 atctccaaga gcaatgttgt agacgacatg gtctccagca atggaatact
ctatgaacct
1261 ggtgaacatc ctgaccacgt tgtggtcatt aagtatgtgc catacgtggg
ggatagcaag
1321 agggctatgg acgagtacac ctcggagata ttcatgggtg gaaagagcac
tatagtgcta
1381 cacaatacgt gtgaagactc cctgctggct gcacccatca tcctggactt
ggttcttctc
1441 gctgagctca gtaccaggat ccagctgaaa gccgagggag agggaaagtt
tcattctttc
1501 cacccggtgg ctaccatcct cagttacctc acaaaggctc ctctggttcc
cccagggacg
1561 ccggtagtga atgcactttc aaagcagcgt gcaatgctgg agaacatatt
gagagcttgt
1621 attggattgg ctccagagaa taacatgatt ttggaataca agtgaagtat
taagaagaat
1681 aacaaggatg atggtgggga gcagaccagt tcataagctg tagaaacaat
gaatgttccc
1741 ttttctcttt ccaatccagt gtttattgat gtctgtctga tatttgccat
tactaggcat
67
1801 attagttctc tatgttctgg cttttagcgt tgtgtaggct tttagcccct
ctgctctggc
1861 attttcaatg accgagctac tcttttcatg tggaaatagt tcataaatat
aaaactgtct
1921 ataaattctg ttcaaaaaaa aaaaaaaaaa a
68
LOCUS DQ447161 358 bp mRNA linear PLN 05-
APR-2006
DEFINITION Passiflora edulis translation elongation factor 1a-2 (EF1a2)
mRNA,
partial cds.
ACCESSION DQ447161
VERSION DQ447161.1 GI:90895962
KEYWORDS .
SOURCE Passiflora edulis
ORGANISM Passiflora edulis
Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta;
Tracheophyta;
Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; core
eudicotyledons;
rosids; eurosids I; Malpighiales; Passifloraceae; Passiflora.
REFERENCE 1 (bases 1 to 358)
AUTHORS Abreu,E.F.M. and Aragao,F.J.L.
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (14-MAR-2006) LTG, Embrapa Recursos Geneticos e
Biotecnologia, PqEB W5 Norte, Brasilia, DF 70770-900, Brazil
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..358
/organism="Passiflora edulis"
/mol_type="mRNA"
/db_xref="taxon:78168
"
gene
<1..>358
/gene="EF1a2"
CDS
<1..>358
/gene="EF1a2"
/codon_start=2
/product="translation elongation factor 1a-2"
/protein_id="ABE01408.1
"
/db_xref="GI:90895963"
/translation="VAVKDLKRGFVASNSKDDPAKEAANFTAQVIIMNHPGQIGNGYA
PVLDCHTSHIAVKFSEILTKIDRRSGKELEKEPKFLKNGDAGFVKMIPTKPMVVETFS
EYPPLGRFAVRDMRQTV"
ORIGIN
1 tgttgctgtt aaggatttga agcgtggttt tgtggcctca aactccaagg
atgatcctgc
61 caaggaggca gccaacttca cagcccaagt tatcatcatg aatcaccccg
gccagattgg
121 aaatggttat gccccagtcc tcgactgcca cacatcccac attgctgtga
aattttctga
181 aattctgacc aagattgata gacgatctgg taaggagctt gagaaggagc
ccaagttctt
241 aaagaacggt gatgccggat ttgtgaagat gattcccacc aagcccatgg
tggtggagac
301 tttttctgag taccctccac ttggtcgttt cgctgttagg gacatgcgtc aaactgtt
69
LOCUS DQ447160 358 bp mRNA linear PLN 05-
APR-2006
DEFINITION Passiflora edulis translation elongation factor 1a-1 (EF1a1)
mRNA,
partial cds.
ACCESSION DQ447160
VERSION DQ447160.1 GI:90895950
KEYWORDS .
SOURCE Passiflora edulis
ORGANISM Passiflora edulis
Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta;
Tracheophyta;
Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; core
eudicotyledons;
rosids; eurosids I; Malpighiales; Passifloraceae; Passiflora.
REFERENCE 1 (bases 1 to 358)
AUTHORS Abreu,E.F.M. and Aragao,F.J.L.
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (14-MAR-2006) LTG, Embrapa Recursos Geneticos e
Biotecnologia, PqEB W5 Norte, Brasilia, DF 70770-900, Brazil
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..358
/organism="Passiflora edulis"
/mol_type="mRNA"
/db_xref="taxon:78168
"
gene
<1..>358
/gene="EF1a1"
CDS
<1..>358
/gene="EF1a1"
/codon_start=2
/product="translation elongation factor 1a-1"
/protein_id="ABE01407.1
"
/db_xref="GI:90895951"
/translation="VAVKDLKRGYVASNSKDDPTKEAANFTSQVIIMNHPGQIGNGYA
PVLDCHTSHIAVKFSEILTKIDRRSGKELEKEPKFLKNGDAGFVKMIPTKPMVVETFS
EYPPLGRFAVRDMRQTV"
ORIGIN
1 tgttgctgtt aaggatttga agcgtgggta tgttgcttcc aactcgaagg
atgatcctac
61 aaaggaggct gccaacttca cctctcaggt catcatcatg aaccaccctg
gacagatcgg
121 caacggatac gccccagtgc tcgactgcca cacatcacac attgccgtca
agttttctga
181 aatcttgacc aagatcgaca ggcggtctgg caaggagctg gagaaagagc
ccaaattctt
241 gaagaacggt gatgctggat tcgtgaagat gattcctacc aagcccatgg
tggtggagac
301 cttctccgag taccctcctc ttggtcgatt tgctgttagg gacatgcgtc aaactgtt
70
Anexo 3
Resumo do trabalho apresentado no 52° Congresso Brasileiro de Genética
71
Cloning and Characterization of the Expression of MIPS1 Gene from Passiflora edulis
f. flavicarpa.
Abreu, EFM (1,2); Fischmann, GDPA (1); Aragão, FJL (1)
(1) Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. (2) Departamento de Botânica,
Universidade de Brasília.
Key words: Passiflora edulis, MIPS.
Inositol, a ubiquitous compound found in all organisms, participates in such cellular
functions as, membrane trafficking, signaling, stress protection, cell wall biosynthesis,
hormonal homeostasis, regulation of cellular metabolism and growth control. In plants,
myo-inositol-1-phosphate, is synthesized from glucose 6-phosphate in a reaction catalyzed
by the enzyme myo-inositol-1-phosphate synthase (EC 5.5.1.4) which is encoded by myo-
inositol-1-phosphate synthase (MIPS). We have recently demonstrated that the expression
of MIPS1 gene in developing soybean (Glycine max) seeds is essential for both cotyledon
and embryo development. In this work, we report the isolation of a full-length MIPS cDNA
of 1,954 bp from developing seeds of passion fruit (Passiflora edulis f. flavicarpa)
designated PeMIPS1. The full-length was entered into de NCBI Genbank database using
the accession number DQ489558. In addition, we characterized the expression of the
putative gene during seed development and other organs, such as stem, petals, leaves,
ovules, microspores and leaf glands. Our results demonstrated that MIPS1 gene from P.
edulis is expressed at high-level only in early cotyledonary stages (3-9 days after
pollination). This fact may suggest that the conversion of glucose 6-phosphate to myo-
inositol-1-phosphate occurs earlier in seed development. Southern blot analysis revealed
the presence of a single copy of the gene in the genome. Phylogenetics analysis showed the
gene bears a similar root with other MIPS sequences from other species of the order
Malpighiales. Similar MIPS encoding sequences from other Passiflora species of Amazon
and Brazilian Cerrado origins, are being cloned and sequenced.
72
Anexo 4
Artigo concluído e submetido ao periódico Annals of Botany
73
Isolation and characterization of a myo-inositol-1-phosphate synthase gene from
yellow passion fruit (Passiflora edulis f. flavicarpa) expressed during seed development
and environmental stress
EMANUEL F. M. ABREU
1,2
and FRANCISCO J. L. ARAGÃO
1
*
1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Laboratório de Introdução e Expressão de
Genes, PqEB W5 Norte, 70770-900, Brasília,DF, Brazil.
2
Universidade de Brasília, Departamento de Botânica, Instituto de Ciências Biológicas, CP
04457, 70919-970, Brasília, DF, Brazil.
Running title: Characterization of a MIPS gene from yellow passion fruit (P. edulis)
* Author for correspondence. E-mail [email protected]
74
Background and Aims: Myo-inositol-1L-phosphate synthase (MIPS) catalyses the
conversion of D-glucose 6-phosphate to 1-L-myo-inositol-1-phosphate, the first and rate-
limiting step in the biosynthesis of all inositol-containing compounds.
Inositol
phospholipids play a vital role in membrane trafficking and signalling pathways, auxin
storage and transport, phytic acid biosynthesis, cell wall biosynthesis, and production of
stress-related molecules. In the present study, we characterised an MIPS cDNA from
developing Passiflora edulis f. flavicarpa seeds and investigated its spatial and differential
expression, as well as changes in its transcription during exposure of growing plants to cold
and heat stresses.
Methods: MIPS encoding gene was isolated by PCR methods and transcript levels were
examined using semi-quantitative RT-PCR during seed development and in response to
heat and cold stress. In addition, the copy number of the cloned PeMIPS1 gene in the
genome of Passiflora edulis, Passiflora eichleriana, Passiflora caerulea, Passiflora nitida
and Passiflora coccinea was determined by Southern blot analyses.
Key Results: Full-length cDNA clone of the PeMIPS1 from P. edulis was isolated and
characterised. Southern blot analyses indicated that the genomic DNA might have diverse
sequences of MIPS-encoding genes and one copy of the cloned PeMIPS1 gene in the
genomes of P. edulis, P. eichleriana, P. caerulea, P. nitida and P. coccinea. RT-PCR
expression analyses revealed the presence of PeMIPS1 transcripts in ovules, pollen grains
and leaves, and during the seed developmental stages, where it peaked at nine days after
pollination. The PeMIPS1 gene is differentially regulated under cold- and heat-stress,
presenting a light-responsive transcription.
75
Conclusions: Experimental data suggest that PeMIPS1 plays an important role in the
establishment of developmental programs and during the response of plants to
environmental changes. The PeMIPS1 is differentially regulated during cold and heat
stress, presenting a light-response pattern, indicating that the extension of the inositol
pathway is an important aspect for environmental stress response.
Key words: Passiflora, passion fruit, MIPS, myo-inositol-1L-phosphate synthase, gene
expression, abiotic stress
76
INTRODUCTION
Myo-inositol-1L-phosphate synthase (MIPS) (EC 5.5.1.4) and myo-inositol
monophosphatase (IMP) (EC 3.1.3.25) are involved in the de novo inositol biosynthesis
pathway (Loweus and Loweus, 1983, Loweus, 1990; Raboy 2002). MIPS catalyzes the
conversion of D-glucose 6-phosphate to 1-L-myo-inositol-1-phosphate (MIP), the first and
rate-limiting step in the biosynthesis of all inositol-containing compounds.
Inositol is a
negative feedback inhibitor of this conversion (Majumder et al., 1997). IMP catalyzes the
dephosphorylation of MIP to produce inositol. An alternative route to produce intracellular
inositol pools is by recycling or scavenging inositol phosphates through the
phosphatidylinositol signalling pathway and by myo-inositol polyphosphate breakdown (for
review see Downes et al., 2005).
Inositol phospholipids play a vital role in membrane trafficking and signalling
pathways, auxin storage and transport, phytic acid biosynthesis, cell wall biosynthesis, and
production of stress-related molecules (Loewus, 1990; Loewus and Murthy, 2000;
Stevenson et al., 2000; Downes et al., 2005). The phosphorylated derivatives are essential
as a phosphorus store and as a second messenger in signal transduction. In addition, myo-
inositol polyphosphates participate in chromatin remodelling, gene expression and mRNA
export (Odom et al., 2000; Shen et al., 2003). Recently, we demonstrated that the lack of
expression of GmMIPS in immature soybean seeds leads to an absence of accumulation of
phytate globoids and seed development (Nunes et al., 2006).
Inositol phosphate biosynthesis pathway in developing seeds is poorly understood
(Hitz et al., 2002; Shi et al., 2005). Hegeman et al
(2001) found detectable levels of MIPS
77
protein mainly during seed development, indicating high-level expression only in early
cotyledonary stages. This fact suggests that the conversion of glucose 6-phosphate to myo-
inositol-1-phosphate occurs earlier in seed development. It is also suggested that inositol
and the o-methyl inositol esters function in salt tolerance by protecting cellular structures
from reactive oxygen species such as hydrogen peroxide, and by controlling turgor pressure
(for review see Loewus and Murthy, 2000). MIPS is the first enzyme in a metabolic
pathway to D-pinitol, which is a cyclic sugar alcohol involved in the tolerance of drought
stress that accumulates to higher concentrations in salt-tolerant legumes (Bohnert and
Sheveleva, 1998; Bray et al., 2000).
MIPS coding sequences have been isolated and characterised for some plant
species, such as Spirodela polyrrhiza (Smart and Fleming, 1993), Arabidopsis thaliana
(Johnson, 1994), Citrus paradisii (Abu-Abied and Holland, 1994), Mesembryanthemum
crystallinum (Ishitani et al., 1996), Nicotiana tabacum (Hara et al., 2000), Glycine max
(Hegeman et al., 2001), Hordeum vulgare (Larson and Raboy, 1999), Oryza sativa
(Yoshida, 1999), Zea mays (Larson and Raboy, 1999) and Sesamum indicum (Chun et al.,
2003). MIPS-encoding sequences represent multigene families in some plant species. Seven
sequences were found in maize (Larson and Raboy, 1999), two in Arabidopsis
(Johnson
and Sussex, 1995), at least four in soybean (Hegeman et al., 2001) and at least three copies
in S. indicum (Chun et al., 2003). The MIPS gene from M. crystallinum may also belong to
a multigene family as suggested by low-stringency Southern analysis (Ishitani et al., 1996).
The multiple MIPS genes in plant species may be applied to attune its differential
expression to specific physiological functions.
In this study, we have characterised an MIPS cDNA from developing Passiflora
edulis seeds and examined its spatial and differential expression, as well as changes in its
78
transcription during exposure of growing plants to cold and heat stresses. Few studies have
characterised MIPS gene expression in tropical species. The yellow passion fruit
(Passiflora edulis f. flavicarpa) is rich in ascorbic and malic acids, niacin, riboflavin,
carotenoids, alkaloids (mainly harman) and the juice is slightly sedative. The fruit is
commercially important in Australia, USA (Hawaii and Southern Florida), South Africa
and Brazil. (Knight and Sauls, 2005). Despite its importance, there is no information about
genes associated with seed development and that are responsive to environmental stress.
MATERIALS AND METHODS
Plant Material
Leaves from P. edulis, P. eichleriana, P. caerulea, P. nitida and P. coccinea from
the Amazon and Brazilian Cerrado (high-altitude savannah) were collected from the
Germplasm Collection at Embrapa Cerrados (Planaltina, DF, Brazil). Fruits from P. edulis
f. flavicarpa were collected from plants cultivated in the field. For Southern analyses,
leaves were protected from light with aluminium foil for two days and harvested. Seeds
used for obtaining plants for abiotic stress assays were purchased from Feltrin Sementes
(Farroupilha, RS, Brazil). Plant tissues were harvested, frozen immediately in liquid
nitrogen and stored at -80°C until DNA or RNA extraction.
Cloning the PeMIPS1 gene
79
Total RNA was extracted using the RNAeasy kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)
from 200 mg of fresh tissue from immature embryos. Remaining genomic DNA was
eliminated by DNase digestion of the RNA samples. Eight micrograms of total RNA were
used to produce total cDNA using the Superscript III kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
Degenerated primer MIPSPeF (5´-TTCATCAATGGCAGCCCHCARAACAC-3´) and
MIPSPeR2 (5´-TCACTTGTAYTCCARRATCATGTTATT-3´) (H=A or C or T; R=G or
A; Y=C or T) based on conserved regions of available plant MIPS gene were used to
amplify an internal sequence from the PeMIPS1 gene. RT-PCR reactions were carried out
in a thermocycler (PTC-100, MJ Researcher, USA) in 50 µl solution containing 40 ng of
cDNA, 60 mM Tris–SO
4
(pH 8.9), 18 mM (NH
4
)
2
SO
4
, 2 mM MgSO
4
, 250 nM of each
dNTP; 200 nM of each primer, 5 U of Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). The mixture was treated at 95°C (5 min) and subjected to
35 cycles of amplification (95°C for 1 min, 55°C for 1 min, 68°C for 1 min) with a final
elongation cycle of 5 min at 68°C. The fragments were cloned into the pCR2.1 TOPO
vector for PCR products (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and sequenced by using
universal M13 and T7 primers on automatic sequencer (ABI Prism 3700).
To obtain a full-length PeMIPS1 cDNA sequence, 5´- and 3´-rapid amplifications of
cDNA ends (RACE)-PCR were carried out. Gene-specific primers were designed from the
internal sequenced fragment and the cDNA end was amplified by using the 5´- and 3´-
RACE System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), using the reverse-specific nested primer
MIPSPeRACER (5´-GAGGTGTACTCGTCCATAGC-3´) in combination with the
GeneRacer
TM
5´-Primer (Invitrogen), and the forward-specific primer MIPSPeRACEF (5´-
GTGAACATCCTGACCACGTTG-3´) in combination with GeneRacer
TM
Oligo dT
80
(Invitrogen). Nested-PCRs were carried out as described above. PCR products were cloned
into the pCR2.1 TOPO vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and sequenced.
Phylogenetics
The relationship between the PeMIPS1 and the MIPS1 genes from another 31 plant
species was determined by aligning it with sequences available at GenBank
(www.ncbi.nih.nlm.gov) and the TIGR Gene Indices (www.tigr.org). Only complete coding
sequences were used for analysis. The alignment was performed using CLUSTAL W
(Thompson et al., 1994). Phylogenetic analyses were carried out using the MEGA
(Molecular Evolutionary Genetic Analysis) version 3.1 software program (Kumar et al.,
2004). Mean frequencies of each nucleotide were similar (T = 23%, C = 23%, A = 27%, G
= 26%), but a high transitions:transversions ratio was observed. Thus, to consider this
unequal probability of the substitution types, the Kimura 2-parameter (Kimura, 1980) was
used to compute distances between each pair of sequences. Phylogenetic trees were then
constructed using the neighbour-joining algorithm (Saitou and Nei, 1987). Bootstrap values
were computed using 1,000 replicates to evaluate support for the groupings.
RT-PCR expression analysis
Developing seeds [3, 9, 15, 21 and 27 days after pollination (dap)], leaves, ovules,
pollen grains, stems, leaf glands, and petals were removed from plants cultivated under
field conditions and used for total RNA extraction as described above. For abiotic stress
assays, plants eight weeks after germination maintained at room temperature and light
81
intensity 10 µmol.m
-2
.s
-1
were transferred to a growth chamber (Conviron, Winnipeg, Canada) at 5, 12,
27 and 37°C, 85% relative humidity, under darkness or light intensity of 200 µmol.m
-2
.s
-1
for a period of 8
and 16h. Leaves were collected for total RNA extraction as described. Total RNA was used
to produce cDNA using the reverse transcriptase Superscript III (Invitrogen, Carlsbad, CA,
USA), according to the protocol suggested by the manufacturer. PCR reactions were carried
out as described above, except that Taq DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)
was used and that 25 ng of cDNA was used as a template, in reactions with 20 cycles of
amplification. The number of amplification cycles was previously optimised in order to
stop the reaction at the exponential stage, ensuring that amplification was semi-quantitative.
Primers MIPSPeF and MIPSPeR2 were used to amplify a 693 bp fragment from the
PeMIPS sequences. As an internal control, primers EF1F (5´-
TGTTGCTGTTAAGGATTTGAAGCG-3´) and EF1R (5´-
AACAGTTTGACGCATGTCCCTAAC-3´) were utilised to amplify 358 bp within the
passion fruit housekeeping gene, PeEFα, elongation factor EF-1α (
GenBank accessions
DQ447160 and DQ447161; cloned and sequenced in this work). PCR reactions with total RNA
presented no amplified fragments, while PCR reaction with genomic DNA presented a higher
fragment for both PeMIPS1 and
EF-1α genes, suggesting presence of intron(s) within the
sequence. Fragments of the MIPS-encoding sequence amplified from expressing plant tissues
were cloned into the pGEMT-Easy and sequenced. Experiments were repeated three times.
Genomic Southern blot analysis
82
Genomic DNA was isolated from leaves using the DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen,
Valencia, CA, USA). Southern blotting was carried out as described (Sambrook and
Russell, 2001). Genomic DNA (15 µg) was digested with EcoRI, HindIII and XhoI,
separated on 1% agarose gel and transferred to a nylon membrane (Hybond N+, Amersham
Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK). Hybridization was carried out at 55°C using
the 693 bp internal fragment from PeMIPS1 gene, labelled with α
32
P dCTP (3,000 Ci.mol
-
1
) using a random primer DNA labelling kit (Amersham Pharmacia Biotech,
Buckinghamshire, UK) according to the manufacturer’s instructions. Membranes were
washed twice in 2X SSC (1X SSC = 150 mM NaCl and 15 mM sodium citrate), 0.1% (w/v)
SDS at room temperature for 15 min and once in 1X SSC, 0.1% (w/v) SDS at 65°C for 15
min. Stringent washing was carried out using 0.1X SSC, 0.1% (w/v) SDS at 65°C for 15
min prior to exposing the membrane for autoradiography.
RESULTS
Isolation of an MIPS-encoding gene from P. edulis.
A full-length MIPS cDNA of 1,951 bp was isolated from developing passion fruit
seeds and entered into the NCBI GenBank database with the accession number DQ489558.
The cDNA contains one open reading frame of 1,533 bp encoding 510 amino acids. In the
3’-nontranslational region, the putative polyadenylation signal sequences (AATAA and
ATTAA) were found upstream of the poly (A) tail. The nucleotide sequence of PeMIPS1
gene coding region was compared with sequences of MIPS genes from 31 plant species
83
available in the GenBank and TIGR databases and showed a high similarity (from 74% to
86%). The deduced amino acid sequence was used to compare the amino acid composition
of the PeMIPS1 polypeptide to those of other plant MIPS. The analysis revealed a high
similarity of 85 to 93%. The TargetP 1.1 (Emanuelsson et al., 2000) and ChloroP
(Emanuelsson et al., 1999) program algorithms predicted no signal, chloroplast transit or
mitochondrial targeting peptides in the N-terminal region of the PeMIPS1.
The PeMIPS1 polypeptide contains four highly conserved motifs found in other
plant species: GWGGNNG (domain 1), VLWTANTER (domain 2), NGSPQNTFVPGL
(domain 3) and SYNHLGNNDG (domain 4). These motifs are found in animal and
microorganism species, such as Anopheles gambiae (GenBank accession No. XM320685),
Drosophila melanogaster (GenBank accession No. AF071103), Homo sapiens, (GenBank
accession No. AF207640), Xenopus laevis (GenBank accession No. BC077437),
Aspergillus fumigatus (GenBank accession No. XM744144), Pichia pastoris (GenBank
accession No. AF078915), Entamoeba histolytica (GenBank accession No. Y11270) and
Leishmania amazonensis (GenBank accession No. U91965).
Phylogenetic analysis divided MIPS genes into clusters in agreement with
taxonomic differentiation (Figure 1). The rootless phylogenetic tree obtained in the
phylogenetic analysis of MIPS genes showed four main branches. The first includes the
Pinnus sp, the only gymnosperm species present. The second main branch encompasses the
sequences of monocots. The third branch is formed by MIPS from S. polyrrhiza, an aquatic
plant. The fourth main branch comprises the sequences of dicotyledonous species.
Surprisingly, Triticum aestivum rooted with dicotyledonous species. The branch of the
dicotyledonous species was split into six conspicuous observable sub-branches. The main
sub-branch is formed by species from the order Fabales (Glycine max, Tripolium pratense,
84
Lotus japonicus, Medicago truncatula and Phaseolus vulgaris). P. edulis MIPS rooted with
Populus sp.; both species are from the order Malpighiales. The other sub-branches are
formed by the orders Solanales (Solanum tuberosum, Nicotiana tabacum and Lycopersicon
esculentum), Lamiales (Sesamum indicum and Avicennia marina), Brassicales (Arabidopsis
thaliana and Brassica napus) and Caryophylales (Mesembryanthemum crystallinum and
Sueda maritima) (Figure 1).
Southern analysis of MIPS-encoding genes in five species of Passiflora
Southern blot analyses were performed to determine the sequences related to the
PeMIPS1 clone in the Passiflora species genome. Genomic DNA was digested with EcoRI,
HindIII and XhoI separately and probed with the 693-bp internal fragment from PeMIPS1
gene. At low stringency, a high number of strong bands were visible, which disappeared
when the blot was washed at high stringency (Figure 2). Digestions with HindIII presented
a distinct pattern among species showing a polymorphism within the enzyme site. A single
hybridizing band was observed with XhoI digestions (Figure 2B). Results obtained under
low-stringency conditions indicated that there might be diverse sequences of MIPS-
encoding genes in genomic DNA. The strong signal in one band, approximately 3 kb,
obtained under high-stringency conditions after digestion with XhoI, indicated that the
genome of P. edulis, P. eichleriana, P. caerulea, P. nitida and P. coccinea may have one
copy of the cloned PeMIPS1 gene.
Levels of PeMIPS1 transcripts in organs and developing seeds of P. edulis
85
RT-PCR expression analyses were carried out to detect endogenous PeMIPS1
transcripts in different P. edulis organs and developing seeds. Results revealed the presence
of PeMIPS1 transcripts in ovules, pollen grains and leaves, and no signal could be observed
in stems, petals or leaf gland (Figure 3A). PeMIPS1 transcripts were observed in all seed
developmental stages analysed. However, the expression peaked in seeds at nine days after
pollination (Figure 3B). As development progressed, MIPS transcript levels decreased. A
similar level of the PeEFα (elongation factor EF-1α) housekeeping gene was observed for
all RT-PCR amplifications.
The 693 bp-fragment that corresponds to the PeMIPS1 encoding
sequence amplified from expressing tissues was sequenced and revealed 100% identity with
the cloned PeMIPS1 gene.
Levels of PeMIPS1 transcripts in response to cold- and heat-stress under light and dark
conditions
The effect of temperature and light on the transcript levels of the endogenous
PeMIPS1 gene was studied in growing plants (eight weeks after germination). Results
revealed that under dark conditions PeMIPS1 transcripts were upregulated during a short
period under cold stress (5°C), whereas at higher temperatures (27ºC and 37°C),
transcription levels increased slightly after 16h (Figure 4A). The highest expression levels
were observed at 12ºC at 8 and 16h, with a slight decrease at 16h. Plants exposed to 5°C
showed PeMIPS induction after 8h of cold stress but a decrease at 16h. Enhanced
transcription of the PeMIPS1 gene was also observed after 16h at 27°C but not at 37°C,
which showed the lowest amounts of transcripts compared to control (Figure 4A). Under
86
continuous light conditions (Figure 4B), enhanced PeMIPS1 transcription was observed
after 16h at 12°C and 27°C, when compared to the transcriptional level observed after 8h
(Figure 4B). PeMIPS1 transcripts were quasi undetectable at 37°C.
DISCUSSION
The phylogenetic tree constructed on the basis of multiple alignments of MIPS
genes shows clear segregation of these genes into monocotyledonous and dicotyledonous. It
is possible that the divergence of MIPS genes happened after the divergence of
monocotyledons and dicotyledons. Alignment of the DNA sequence of the gene-encoding
plant-MIPS revealed remarkable evolutionary conservation. The presence of conserved
sequences and conservative changes observed in a wide range of organisms indicates the
central role that this enzyme plays in biological systems. MIPS catalyzes the synthesis of
myo-inositol 1-phosphate, which is a precursor to compounds connected to essential
cellular functions, such as phosphorus storage, signal transduction, actin remodelling,
membrane trafficking, stress protection, hormonal homoeostasis and cell-wall biosynthesis
(Loewus and Murthy, 2000; Stevenson et al., 2000; Downes et al., 2005).
Genomic Southern blot suggests that several MIPS, MIPS-related genes or
pseudogenes might be present in the five studied Passiflora species. However, only one
copy of the cloned PeMIPS1 gene was found in the genome of P. edulis, P. eichleriana, P.
caerulea, P. nitida and P. coccinea. Although several copies of the MIPS-encoding genes
have been observed in plant genome, the exact copy number for each gene from MIPS
family members has not been determined for most species. In rice, genomic Southern
analysis suggested that a single gene encoding the RINO1 gene was present in the genome
87
(Yoshida et al., 1999). Seven sequences were found in maize (Larson and Raboy, 1999),
two in Arabidopsis
(Johnson and Sussex, 1995), two in common ice (Ishitani et al., 1996)
and at least four in soybean (Hegeman et al., 2001). The multiple MIPS genes in crop
plants may be used to attune differential MIPS expression to specific physiological
functions.
Transcripts of the PeMIPS1 were detected in ovules, pollen grains, developing seeds
and leaves of plants cultivated in field conditions. However, no signal was observed in
stems, petals or leaf gland. This demonstrated that the expression of the PeMIPS1 gene is
organ-specific and such differential regulation would coordinate inositol metabolism with
cellular growth (Ishitani et al., 1996; Majumder et al., 1997). In soybean, steady-state RNA
levels of the GmMIPS1 gene were higher in developing seeds than in other tissues,
including flowers, leaves, germinating cotyledons, and somatic embryos (Hegeman et al.,
2001). In silico northern analyses generated from Soybean EST database predict an
expression pattern of four highly similar MIPS-coding sequences. ESTs from GmMIPS3
were only observed in leaf and bud libraries, while ESTs from GmMIPS1 were only
observed in immature cotyledons (Hegeman et al., 2001). In addition, data from 15 EST
libraries showed that GmMIPS1 is the seed preferred gene, although it is expressed in other
tissue types while the GmMIPS2 is expressed in many tissues but not in developing seeds
(Hitz et al., 2002). This suggested that the expression of distinct MIPS genes is spatially
controlled by regulatory sequences. In S. indicum SeMIPS1 transcription was observed in
leaves, stem, root and developing seeds (Chun et al., 2003). In rice, transcripts of an MIPS-
encoding gene (RINO1) accumulated at high levels in developing seeds, but not in leaves,
roots or flowers (Yoshida et al., 1999). Our data suggested that the MIPS-encoding
sequences might present a distinct pattern when compared to other plants. However, more
88
studies should be conducted to associate MIPS gene transcription with specific
environmental conditions.
A marked peak in MIPS RNA level was observed nine days after pollination,
showing that the gene is regulated at the transcriptional level during seed development.
Similar results were observed in soybean. GmMIPS transcript was observed in cotyledons
at the earliest developmental stages, with a peak in 2- to 4-mm seeds (Hegeman et al.,
2001). In contrast, no recognisable differences in levels of SeMIPS1 gene transcription
were found between developing stages of S. indicum seeds (Chun et al., 2003).
Our results suggest that conversion of glucose-6-P to myo-inositol-1-phosphate
occurs earlier in P. edulis seed development. This expression pattern of PeMIPS1 may be
correlated with the accumulation of phytate, which is a storage reserve of phosphorus in
seeds (Loewus and Murthy, 2000). It has been assumed that MIPS is a key regulatory
enzyme in the biosynthetic pathway of phytate (Yoshida et al., 1999). However, we
recently observed absence of seed development in transgenic soybean plants silencing the
GmMIPS1 gene (Nunes et al., 2006). This suggests that MIPS expression during early
stages of seed development is closely related to the essentiality of inositol biosynthesis for
several biochemical pathways in plants (Downes et al., 2005), rather than phytate
accumulation. In this work all sequenced PCR-amplified fragments presented 100%
identity with the cloned PeMIPS1 gene. P. edulis may have other MIPS-coding genes, and
sequences are highly similar; because of this and the fact that we have not used sequence-
specific primers for RT-PCR analysis, we cannot definitively conclude that the PeMIPS1
gene is the only MIPS-encoding gene expressed in the organs studied.
Plants are exposed to a wide range of abiotic and biotic stimuli for which effective,
fitness-based responses must be applied. Both high and low temperatures are important
89
environmental signals for all living organisms; they are the most important environmental
factors that limit geographical distribution, growth, development, and survival of many
plant species. Most plants from temperate regions can increase tolerance to freezing
temperatures by being exposed to low non-freezing temperatures, a process known as cold
acclimation (Chinnusamy et al., 2006). However, plants from tropical and subtropical
origins are sensitive to chilling temperatures (0°C–10°C) and are assumed to be incapable
of cold acclimation. RT-PCR analyses were carried out to analyse the effect of cold and
heat stress on the transcript levels of PeMIPS1. Results revealed that PeMIPS1 transcripts
were upregulated, after a short period (8h) under cold stress (5°C), which decreased after
16h (Figure 4A). It has been shown that sugars and ABA have similar effects on MIPS
gene transcriptional levels (Yoshida et al., 2002). These molecules induced transcript
accumulation of the MIPS-encoding gene (RINO1) in rice. mRNA accumulation revealed
that the highest accumulation level occurred 2-4 h after initiation of the combined treatment
and the signal declined thereafter (Yoshida et al., 2002). In M. crystallinum, salinity stress
was observed to induce fivefold the upregulation of MIPS mRNA expression and free
inositol accumulation approximately tenfold (Ishitani et al., 1996). Interestingly, our results
were similar to those observed in Citrus sinensis submitted to herbivory from xylem-
feeding leafhopper and to mechanical damage. Both treatments induced an MIPS transcript
that peaked after 48 h of treatment and was only slightly increased after 96 h (Mozoruk et
al., 2006). These results agree with the documented fact that rapid changes in inositol
phosphates have been observed in different plant systems with many different stimuli,
including osmotic and cold shock, light and biotic elicitors (Perera et al., 2006).
Many of the genes regulated by biotic and abiotic factors can also be induced by the
phytohormone abscisic acid (ABA) or by osmotic stress treatment (Ishitani et al., 1997;
90
Seki et al., 2002; Li et al., 2006). Indeed, high and low non-freezing temperatures and
osmotic stresses appear to have several features in common. Low temperatures can lead to
dehydration stress by impairing water absorption by the roots and water transport to the
shoots (Levitt, 1980). In addition, ABA is known to play an important role in cold
acclimation (Li et al., 2006). Plants adapt to ambient temperature by adjusting membrane
fluidity, metabolism, and gene expression profiles (Levitt, 1980; Murata and Los, 1997;
Thomashow, 1999). In this context, MIPS catalyzes the first-committed and rate-limiting
step in the biosynthesis of compounds involved in the tolerance of abiotic stress, such as D-
pinitol and D-ononitol, D-glucuronate used in the production of cell wall components,
polyunsaturated phospholipids, glycoproteins, gums, and mucilage (Miquel et al., 1993;
Nelson et al., 1998; Bray et al., 2000; Rathinasabapathi, 2000).
Under continuous light conditions PeMIPS1 transcripts were upregulated in most
temperatures tested, except at 37°C (Figure 4B). In potato, it was observed that light
drastically increased StIPS-1 (an MIPS-encoding gene) transcript level in leaves (Keller et
al., 1998). Earlier studies revealed the presence of algal and higher plant chloroplastic
inositol synthases that exhibit enhanced activity during growth under light conditions
(Adhikari et al., 1987; RayChaudhury et al., 1997). In addition, two forms of enzymatically
active MIPS have been detected in the chloroplasts of Oryza sativa. The 80 kDa subunit is
the predominant species in dark-grown etioplasts while light/dark-grown chloroplasts
accumulate the 60 kDa subunit. It appears that a light- and salt-mediated interplay of
protease and kinase system regulates the processing and activation of the chloroplast
inositol synthases in higher plants (Hait et al., 2002). There are few studies on the possible
importance of inositol biosynthesis on light-dependent pathways. A plastid-located
pathway from inositols to D-glucuronate and further to L-ascorbate has been postulated
91
(Loewus, 1988). Apparently, L-ascorbate supports chloroplast integrity under stress
conditions which require protection against radical oxygen species. Nelson et al (1998)
suggested that myo-inositol acts to facilitate sodium sequestration, protect photosynthesis
and sustain membrane biosynthesis. It seems that in the common ice, photosynthesis can
simultaneously control root growth via inositol supply and osmotic stress protection via
ononitol and pinitol availability in the roots. The sequence analysis of the predicted
PeMIPS1 indicated that the N-terminal region contains no signal, chloroplast transit or
mitochondrial targeting peptides. It suggests that PeMIPS1 encodes a cytosolic rather than
an organelle-addressed MIPS protein. However, the absence of a convincing transit peptide
in PeMIPS1 does not preclude its targeting to a plastidic site for inositol synthesis. A MIPS
from M. crystallinum that does not contain a transit peptide for chloroplast import presented
enhanced activity only in chloroplasts from light-grown, salt-tolerant rice plants
(RayChaudhuri and Majumder, 1996). Moreover, experimental data have suggested that a
MIPS enzyme from Phaseolus vulgaris, which does not have a recognizable transit peptide,
is also present in plasma membranes, plastids, mitochondria, endoplasmic reticule, nuclei,
and cell walls (Lackey et al., 2003). Additionally, the program PSORT (Prediction of
Protein Sorting Signals and Localization Sites in Amino Acid Sequences) predicted a
conserved transmembrane motif (CEDSLLAAPIILDLVLLAELSTR), located
approximately 68 amino acids from the carboxy terminus in both Phaseolus vulgaris and P.
edulis MIPS.
92
CONCLUSION
The experimental data presented here suggest important roles for MIPS not only in
basic metabolism, but also in the establishment of developmental programs and during the
response of plants to environmental changes. Results demonstrated that a MIPS-encoding
gene cloned from P. edulis, called PeMIPS1, is preferentially expressed in leaves, pollen
grains, ovules and seeds nine days after pollination. The PeMIPS1 is differentially
regulated during cold and heat stress, presenting a light-response pattern, indicating that the
extension of the inositol pathway is an important aspect for environmental stress response.
There is correlation of these results with ecological adaptation of passion fruit, a typical
species adapted to tropical and subtropical environment that endures winter chills for a
short period without injury, but does not tolerate severe or prolonged freezing. Our
knowledge of stress proteins/genes is still far from complete, and there are lacunae with
respect to behaviour in tropical plant species. Consequently, other stress-responsive genes
should be studied, cloned and characterised. Additionally, studies are required for
localization of PeMIPS1 in subcellular compartments of distinct plant tissues, as well as
MIPS silencing in transgenic plants, to develop a greater understanding of its role during
seed development.
ACKNOWLEDGMENTS
We are grateful to Dr. Marcelo Fidelis Braga (Embrapa Cerrados, Brazil) and Fundação
Zoobotânica do Distrito Federal (Brasília, Brazil) for providing some of the samples used in
93
this study, and Prof. Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira (Universidade Federal do Ceará,
Brazil) for critical reading of the manuscript.
LITERATURE CITED
Abu-Abied M, Holland D. 1994. The gene c-ino1 from Citrus paradisi is highly
homologous to tur1 and ino1 from yeast and Spirodela encoding for myo-inositol
phosphate synthase. Plant Physiology 106: 1689.
Adhikari J, Majumder AL, Bhaduri TJ, DasGupta S, Majumder AL. 1987.
Chloroplast as a locale of L-myo-inositol 1-phosphate synthase. Plant Physiology 85:
611-614.
Bohnert HJ, Sheveleva E. 1998. Plant stress adaptations – making metabolism move.
Current Opinion in Plant Biology 1: 267-274.
Bray EA, Bailey-Serres J, Weretilnyk E. 2000. Response to abiotic stress. In: Buchanan
BB, Gruissem W, Jones RL, eds. Biochemistry and Molecular Biology of Plants.
Rockville: American Society of Plant Physiologists, 1158–1203.
Chinnusamy V, Zhu J, Zhu J-K. 2006. Gene regulation during cold acclimation in plants.
Physiologia Plantarum 126: 52–61.
Chun JA, Jin UH, Lee JW, Yi YB, Hyung NI, Kang MH, Pyee JH, Suh MC, Kang
CW, Seo HY, Lee SW, Chung CH. 2003. Isolation and characterization of a myo-
inositol 1-phosphate synthase cDNA from developing sesame (Sesamum indicum L.)
seeds: functional and differential expression, and salt-induced transcription during
germination. Planta 216: 874-880.
94
Downes CP, Gray A, Lucocq JM. 2005. Probing phosphoinositide functions in signaling
and membrane trafficking. Trends in Cell Biology 15: 259-268.
Emanuelsson O, Nielsen H, Brunak S, von Heijne G. 2000. Predicting subcellular
localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence. Journal of
Molecular Biology 300: 1005-1016.
Emanuelsson O, Nielsen H, von Heijne G. 1999. ChloroP, a neural network-based
method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein
Science 8: 978-984.
Hait NC, RayChaudhury A, Das A, Bhattacharyya S, Majumder AL. 2002. Processing
and activation of chloroplast L-myo-inositol 1-phosphate synthase from Oryza sativa
requires signals from both light and salt. Plant Science 162: 559-568.
Hara K, Yagi M, Koizumi N, Kusano T, Sano H. 2000. Screening of wound-responsive
genes identifies an immediate-early expressed gene encoding a highly charged protein
in mechanically wounded tobacco plants. Plant and Cell Physiology 41: 684-691.
Hegeman CE, Good LL, Grabau EA. 2001. Expression of D-myo-Inositol-3-phosphate
synthase in soybean. Implications for phytic acid biosynthesis. Plant Physiology 125:
1941–1948.
Hitz WD, Carlson TJ, Kerr PS, Sebastian SA. 2002. Biochemical and molecular
characterization of a mutation that confers a decreased raffinosaccharide and phytic
acid phenotype on soybean seeds. Plant Physiology 128: 650-660.
Ishitani M, Majumder AL, Bornhouser A, Michalowski CB, Jensen RG, Bohnert HJ.
1996. Coordinate transcriptional induction of myo-inositol metabolism during
environmental stress. Plant Journal 9: 537-548.
95
Ishitani M, Xiong L, Stevenson B, Zhul J-k. 1997. Genetic analysis of osmotic and cold
stress signal transduction in Arabidopsis: interactions and convergence of abscisic
acid-dependent and abscisic acid-independent pathways. Plant Cell 9: 1935-1949.
Johnson MD, Sussex IM. 1995. 1-L-myo-inositol 1-phosphate synthase from Arabidopsis
thaliana. Plant Physiology 107: 613-619.
Johnson MD. 1994. The Arabidopsis thaliana myo-inositol 1-phosphate synthase
(EC5.5.1.4). Plant Physiology 105: 1023-1024.
Keller R, Brearley CA, Trethewey RN, Müller-Röber B. 1998. Reduced inositol content
and altered morphology in transgenic potato plants inhibited for 1D-myo-inositol 3-
phosphate synthase. Plant Journal 16: 403-410.
Kimura M. 1980. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions
through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution
16: 111-120.
Knight RJ, Sauls JW. 2005. The Passion Fruit. University of Florida IFAS Extension
HS60.
Kumar S, Tamura K, Nei M. 2004. MEGA3: Integrated software for Molecular
Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics
5: 150-163.
Lackey KH, Pope PM, Johnson MD. 2003. Expression of 1L-myo-inositol-1-Phosphate
Synthase in Organelles. Plant Physiology 132: 2240-2247.
Larson SR, Raboy V. 1999. Linkage mapping of maize and barley myo-inositol 1-
phosphate synthase DNA sequences: correspondence with a low phytic acid mutation.
Theoretical and Applied Genetics 99: 27-36.
96
Levitt J. 1980. Responses of plants to environmental stress. Chilling, Freezing and High
temperature stress, Vol. 1. Academic Press, New York, NY: 137-141.
Li Y, Lee KK, Walsh S, Smith C, Hadingham S, Sorefan K, Cawley G,. Bevan MW.
2006. Establishing glucose- and ABA-regulated transcription networks in Arabidopsis
by microarray analysis and promoter classification using a relevance vector machine.
Genome Research 16: 414- 427.
Loewus FA, Loewus MW. 1983. myo-Inositol: its biosynthesis and metabolism. Annual
Review of Plant Physiology 34: 137-161.
Loewus FA, Murthy PPN. 2000. Myo-Inositol metabolism in plants. Plant Science 150: 1-
19.
Loewus FA. 1988. Ascorbic acid and its metabolic products. In: Preiss, J, ed. The
Biochemistry of Plants. New York: Academic Press, 85-107.
Loewus FA. 1990. Inositol biosynthesis. In: Morré DJ, WF, Loewus FA, eds. Inositol
Metabolism in Plant. New York: Wiley-Liss, 13-19.
Majumder AL, Johnson MD, Henry SA. 1997. L-myo-inositol-1-phosphate synthase.
Biochimica et Biophysica Acta 1348: 245-256.
Miquel M, James D, Dooner JH, Browse J. 1993. Arabidopsis requires polyunsaturated
lipids for low temperature survival. Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America 90: 6208-6212.
Mozoruk J, Hunnicutt LE, Cave RD, Hunter WB, Bausher MG. 2006. Profiling
transcriptional changes in Citrus sinensis (L.) Osbeck challenged by herbivory from
the xylem-feeding leafhopper Homalodisca coagulata (Say) by cDNA macroarray
analysis. Plant Science 170: 1068-1080.
97
Murata N, Los DA. 1997. Membrane fluidity and temperature perception. Plant
Physiology 115: 875-879.
Nelson DE, Rammesmayer G, Bohnert HJ. 1998. Regulation of cell-specific inositol
metabolism and transport in plant salinity tolerance. Plant Cell 10: 753-764.
Nunes ACS, Vianna GR, Cuneo F, Amaya-Farfán J, Capdeville G, Rech EL, Aragao
FJL. 2006. RNAi-mediated silencing of the myo-inositol-1-phosphate synthase gene
(GmMIPS1) in transgenic soybean inhibited seed development and reduced phytate
content. Planta 224: 125-132.
Odom AR, Stahlberg A, Wente SR, York JD. 2000. A role for nuclear inositol 1,4,5-
trisphosphate kinase in transcriptional control. Science 287: 2026-2029.
Perera I Y, Hung CY, Brady S, Muday GK, Boss WF. 2006. A universal role for
inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated signaling in plant gravitropism. Plant
Physiology 140: 746-760.
Raboy V. 2002. Progress in breeding low phytate crops. Journal of Nutrition 132: 503-505.
Rathinasabapathi B. 2000. Metabolic engineering for stress tolerance: installing
osmoprotectant synthesis pathways. Annals of Botany 86: 709-716.
RayChaudhuri A, Majumder AL. 1996. Salinity-induced enhancement of l-myo-inositol
1-phosphate synthase in rice (Oryza sativa L.). Plant, Cell and Environment 19:
1437-1442.
RayChaudhury A, Hait NC, DasGupta S, Bhaduri TJ, Deb R, Majumder AL. 1997. L-
myo-inositol 1-phosphate synthase from plant sources: characteristics of the
chloroplastic and cytosolic enzymes. Plant Physiology 115: 727-736.
98
Saitou N, Nei M. 1987. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing
phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4: 406-425.
Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edn. New
York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Seki M, Narusaka M, Ishida J, Nanjo T, Fujita M, Oono Y, Kamiya A, Nakajima M,
Enju A, Sakurai T, Satou M, Akiyama K, Taji T, Yamaguchi-Shinozaki K,
Carninci P, Kawai J, Hayashizaki Y, Shinozaki K. 2002. Monitoring the
expression profiles of 7000 Arabidopsis genes under drought, cold and high-salinity
stresses using a full-length cDNA microarray. Plant Journal 31: 279-292.
Shen X, Xiao H, Ranallo R, Wu WH, Wu C. 2003. Modulation of ATP-dependent
chromatin-remodeling complexes by inositol polyphosphates. Science 299: 112-114.
Shi J, Wang H, Hazebroek J, Ertl DE, Harp T. 2005. The maize low-phytic acid 3
encodes a myo-inositol kinase that plays a role in phytic acid biosynthesis in
developing seeds. Plant Journal 42: 708-719.
Smart CC, Fleming AJ. 1993. A plant gene with homology to D-myo-inositol-3-
phosphate synthase is rapidly and spatially upregulated during an abscisic-acid-
induced morphogenic response in Spirodela polyrrhiza. Plant Journal 4: 279-293.
Stevenson JM, Perera IY, Heilmann I, Persson S, Boss WF. 2000. Inositol signaling and
plant growth. Trends Plant Science 5: 252-258.
Thomashow MF. 1999. Plant cold acclimation: Freezing tolerance genes and regulatory
mechanisms. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 50:
571-599.
99
Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity
of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-
specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22: 4673-
4680.
Yoshida KT, Fujiwara T, Naito S. 2002. The synergistic effects of sugar and abscisic acid
on myo-inositol-1-phosphate synthase expression. Physiologia Plantarum 114: 581–
587.
Yoshida KT, Wada T, Koyama H, Mizobuchi-Fukuoka R, Naito S. 1999. Temporal and
spatial patterns of accumulation of the transcript of myo-inositol-1-phosphate synthase
and phytin-containing particles during seed development in rice. Plant Physiology
119: 65-72.
100
Figure Legends
FIG. 1. Bootstrap consensus phylogenetic tree of myo-inositol-1-phosphate synthase
(MIPS) genes from plant species. The tree includes sequences of MIPS available in
GenBank and TIGR databases. Abbreviation of the species and accession number of each
sequence are: Aa: Actinidia arguta (AY005128); Ac: Allium cepa (TC248); Afp: Aquilegia
formosa x pubescens (TC14836); At: Arabidopsis thaliana (U04876); As: Avena sativa
(AB059557); Am: Avicennia marina (AY028259); Bn: Brassica napus (U66307); Cp:
Citrus paradise (Z32632); Gm: Glycine max (AY382834); Gh: Gorssypium hirsutum
(TC27410); Hv: Hordeum vulgare (AF056325); Lj: Lotus japonicus (TC8275); Le:
101
Lycopersicon esculentum (TC154132); Mt: Medicago trunculata (TC93972); Mc:
Mesembryanthemum crystallinum (U32511); Nt: Nicotiana tabacum (AB059557); Os:
Oryza sativa (AB012107); Pv: Phaseolus vulgaris (AM048843); Pisp: Pinus sp.
(TC64990); Posp: Populus sp. (TC19238); Pc: Porteresia coarctata (AF412340); So:
Saccharum officinarum (TC65413); Si: Sesamum indicum (AF284065); St: Solanum
tuberosum (TC112573); Sp: Spirodela polyrrhiza (Z11693); Sm: Sueda maritima
(AF433879); Tp: Tripolium pratense (AB236831); Ta: Triticum aestivum (AF120148); Vv:
Vitis vinifera (TC45187); Xv: Xerophyta viscosa (AY323824); Zm: Zea mays (AF56326).
Bootstrap values >50% are displayed on the nodes.
102
FIG. 2. Southern blot analysis of MIPS gene in the genome of Passiflora species. Genome
of P. edulis (Pe), P. eichleriana (Pei), P. caerulea (Pca), P. nitida (Pn) and P. coccinea
(Pco) were digested with EcoRI (E), HindIII (H) and XhoI (X). Membrane was probed with
103
the 693 bp internal fragment from PeMIPS1 gene at low- (A) and high-stringency of
washing conditions.
FIG. 3. Differential transcription of the PeMIPS1 gene from passion fruit (P. edulis) in
different organs (A) and developing seeds (B) 3, 9, 15, 21 and 27 days after pollination
(dap). Ov: ovules, PG: pollen grains, St: stem, L: leaves, Pt: petals, LG: leaf gland. The
upper bands are consistent with the expected fragment amplified from the PeMIPS1 gene
and the lower band corresponds to transcripts from the PeEFα gene (elongation factor EF-
1α) (internal control).
104
FIG. 4. Effects of temperature and light on transcription of the PeMIPS1 gene in leaves of
passion fruit plants eight weeks after germination. Plants were exposed for 8 and 16 h at
different temperatures under dark (A) and continuous light intensity of 200 µmol.m
-2
.s
-1
(B)
conditions. C is a plant before treatment (maintained at room temperature and light
intensity of 10 µmol.m
-2
.s
-1
). The upper bands are consistent with the expected fragment
amplified from the PeMIPS1 gene and the lower band corresponds to transcripts from the
PeEF
α
gene (elongation factor EF-1α) (internal control).
105
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
