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Universidade de Brasília
Instituto de Ciências Biológicas
Departamento de Botânica
Clonagem e estudo funcional do promotor do gene DREB da mamoneira (Ricinus
communis L.)
Angélica Taveira Morais
Brasília-DF
2008
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Trabalho desenvolvido no Laboratório de Transferência de Genes da Embrapa Recursos
Genéticos e Biotecnologia, sob orientação do Dr. Francisco José Lima Aragão.
iv
Clonagem e estudo funcional do promotor do gene DREB de mamoneira (Ricinus
communis L.)
Angélica Taveira Morais
Esta dissertação foi julgada e adequada para obtenção do título de Mestre em
Botânica e aprovada em sua forma final pelo programa de Pós-graduação em Botânica
da Universidade de Brasília.
Comissão Examinadora
__________________________________________________________
Dr. Francisco José Lima Aragão
Presidente da Banca Examinadora-Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.
Dr. Luis Alfredo Rodrigues Pereira
Membro-Universidade de Brasília-UnB
Dra. Kenny Bonfim
Membro- Ministério da Saúde-MS
v
A DEUS, por toda proteção e graça...
...o milagre da vida...
Aos meus pais Dina & Tião, pelo amor,
apoio e entendimento...
À minha irmã Leila, pelo carinho...
Ao meu amado Alípio pelo carinho e
compreensão...
vi
À DEUS pela vossa existência em minha vida com graças e bênçãos e por
proporcionar-me pessoas maravilhosas ao meu redor, como...
Epígrafe
Meus pais amá
veis, Geraldina e Sebastião por
toda a dedicação, carinho
e ensinamentos em toda esta jornada e na realização deste projeto,
Minha irmã Leila pelo carinho cotidiano,
O Pesquisador e Orientador Francisco José Lima Aragão pelo seu imenso
apoio, amizade e credibilidade na realização deste trabalho,
O Pesquisador Giovanni Rodrigues Vianna, por sua infinita amizade e
incentivo durante o trabalho,
O Pesquisador e amigo Sérgio pela confiança e auxílio,
O pesquisador Dr. Elíbio Rech;
O pesquisador Dr. Cristiano Lacorte pelas conversas esclarecedoras,
O pesquisador Dr. Luiz Alfredo pelas contribuições engrandecedoras no
projeto,
Os técnicos do laboratório Luiz e Warley, pela amizade e ensinamentos,
À dona Izabel pelo carinho e orações,
À amiga simplesmente Elsa, pelo apoio e dedicação,
À amiga, companheira e animadora Thais Cipriano (conseguimos
amiga!),
Os amigos do laboratório de transferência de genes, por toda a
convivência, Nayche, Cristina, Vânia, Aline, Daniele, Emanuel (aulas de
botânica!), Gabriela, Fernanda, Andréa Rachel, Well, Renata, Hugo,
vii
Bárbara Dias, Margareth, Luisa, Natália, Betúlia, Paula,
Gustavo,Nicolau, Sharon, Érica os quais proporcionam um ambiente
agradável e descontraído,
Às amigas Maria Laine, Kenny e Aysi, pelo apoio e palavras positivas,
Aos colegas do laboratório de Apomixia,
À colega e Dra. Marli Catarina do laboratório nutrigenômica vegetal-
LGN pelo incentivo e conversas descontraídas de apoio!
À amiga Bruna pela amizade e apoio (“o fumo será transformado!”),
Às amigas Thais Palácio, Franciele e Renatinha pela amizade acolhedora
e fiel,
À amiga paraense Cibelle pela grande amizade, compreensão e apoio
(transformaremos este fumo amiga!),
À amiga e fisioterapeuta Marilza pela amizade e ensinamentos de “boa
postura colunar!”
Aos meus colegas de curso de Mestrado pelas conversas culturais...,
Aos professores do Departamento de Botânica pelos incentivos e
orientações,
Aos meus tios e tias, primos e primas, minha vovó Ângela e demais
familiares que sempre me incentivaram à conclusão deste projeto,
Ao meu sogro Seu Raimundo e minha sogra Dona Ceiça pelo carinho,
amizade e apoio inestimável,
A minha querida cunhada Aline por toda amizade,
Ao meu amado, querido e companheiro Alípio,por todo amor, ternura,
apoio e paciência e compreensão por toda esta jornada por sempre acreditar
e animar dia-a-dia!Amo-te!
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À Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia por oferecer a
capacidade de realização deste trabalho.
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Índice de figuras.................................................................................
Índice de tabelas................................................................................
Abreviaturas...........................................................................................
Resumo...................................................................................................
Abstract...................................................................................................
1. Introdução .......................................................................................
1.1. Relações hídricas da célula vegetal ..........................................
1.2.Mecanismos que proporcionam a ocorrência do déficit
hídrico..................................................................................................
1.3.Principais efeitos ao vegetal ocasionada durante o estresse
hídrico..................................................................................................
1.4.Rspostas moleculares e bioquímicas durante o estresse
hídrico..................................................................................................
1.5.Reconhecimento do estresse hídrico.........................................
1.6.Mecanismos de proteção à maquinaria celular.........................
1.7.Gene DREB....................................................................................
1.8.A espécie Ricinus communis L.-Mamoneira..............................
1.9.Importância econômica da cultura da mamoneira....................
1.10.Transformação genética de plantas .......................................
1.11.Utilização de genes marcadores de seleção............................
2. Objetivos..........................................................................................
3. Materiais e Métodos........................................................................
3.1. Clonagem de fragmento da região codificante do gene DREB de
Ricinus communis L..........................................................
3.2. Clonagem do promotor do gene DREB de Ricinus communis L.
......................................................................................
3.3. Construção do vetor de expressão para a transformação genética de
plantas de Nicotiana tabacum.......................................
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3.4. Transformação genética de plantas de Nicotiana
tabacum.................................................................................................
3.4.1.Transferência do vetor para Agrobacterium
tumefaciens...........................................................................................
3.4.2.Co-cultura com fragmentos foliares de Nicotiana
tabacum.................................................................................................
3.4.3.Regeneração das plantas transformadas...........................
3.5.Análises da presença da proteína PAT........................................
3.6.Análise da expressão do promotor do gene DREB de mamona em
plantas transgênicas de Nicotiana tabacum sob condições de estresse
hídrico.....................................................................................
3.7.Análise filogenética da região codificante do gene RcDREB de
mamona.................................................................................................
4.Resultados e Discussão.....................................................................
4.1.Clonagem e sequenciamento do promotor do gene DREB de
mamona.............................................................................................
4.2.Construção do vetor e transformação genética de plantas de fumo
via Agrobacterium tumefacies.............................................
4.3.Detecção da proteína PAT no tecido foliar de plantas de fumo
regeneradas..... .........................................................................
4.4. Estudo da expressão do promotor do gene RcDREB em folhas de
fumo transgênico..............................................................
4.5. Estudo filogenético do promotor do gene DREB de Ricinus
communis L. .........................................................................
5.Conclusão.........................................................................................
6.Perspectiva do trabalho.................................................................
7. Referências Bibliográficas...........................................................
Anexo 1. Soluções e Reagentes
Anexo 2. Resumo do trabalho apresentado no 16º Congresso Brasileiro
de Floricultura e Plantas Ornamentais- 3ºCongresso Brasileiro de Cultura
de Tecidos de Plantas- 1º Simpósio de Plantas Ornamentais Nativas
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Figura 1: Mecanismo de percepção do estresse hídrico..................
Figura 2. Esquema da clonagem de fragmento da região codificante e
posterior obtenção do promotor DREB......................
Figura 3. TAIL-PCR..............................................................................
Figura 4. Seqüência do promotor (em vermelho) e do fragmento da região
codificante (verde) do gene DREB de R. communis L. ....
Figura 5. Vetor final pRCDREB1pro utilizado para a transformação genética
de fumo.....................................................
Figura 6. Estágios de desenvolvimento dos fragmentos foliares de fumo
após a transformação com Agrobacterium...........................
Figura 7. Teste realizado com extrato de folhas de fumo para detecção da
proteína PAT.....................................................................
Figura 8. Expressão do gene gus em plantas de fumo sob condições de
estresse hídrico..............................................................
Figura 9. Análise filogenética das seqüências do gene DREB........
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Tabela 1. Primers específicos degenerados utilizados na amplificação do
fragmento da região codificante do gene DREB Ricinus communis
L............................................................................
Tabela 2. Seqüência dos primers da série operon utilizada no ensaio TAIL-
PCR.................................................................................
Tabela 3. Seqüência dos Nested primers utilizados na técnica da TAIL-
PCR............................................................................................
Tabela 4. Programa realizado em cada ensaio da TAIL-
PCR.....................................................................................................
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DNA Ácido desoxirribonucléico
DNTP Desoxinucleotídeos trifosfatos
DTT Ditiotreitol
DREB/CBF Dehydration-responsive element binding protein/C-repeat-binding factor
DRE/CRT Dehydration-responsive element/C-repeat
NaCl Cloreto de sódio
NaOH Hidróxido de sódio
E.U.A. Estados Unidos da América
M Molar
Pb Pares de bases
p/v Peso por volume
Kb Quilo base (1.000 bases)
RNA Ácido ribonucléico
Xg Força gravitacional
Rpm Rotação por minuto
Micro (10
-6
)
Nano (10
-9
)
U Unidades de enzima
Ohms (unidade de resistência elétrica)
mL mililitros
tail-PCR Thermal asymmetric interlaced-Polymerase Chain Reaction
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Um dos principais estresses que restringem a capacidade e a eficiência da planta
realizar os processos bioquímicos importantes é a falta de água. As conseqüências para o
vegetal vão desde alterações no volume celular à desnaturação de importantes proteínas, e
dependendo da intensidade do estresse, poderá ocasionar a morte da planta. Com isso, as
plantas apresentam mecanismos bioquímicos que respondem ao estresse hídrico. Estas
respostas envolvem as funções de muitos genes que podem ocorrer em segundos ou levar
horas, conferindo ao vegetal a capacidade de tolerar aquela condição desfavorável. Um dos
mecanismos gênicos envolvidos na geração de respostas ao estresse hídrico em plantas, é
mediado pela expressão do gene DREB-CBF (Dehydration-responsive element binding
protein/C-repeat-binding factor). Este gene codifica para uma proteína regulatória, proteína
DREB, um fator de transcrição que está envolvido na ativação de outros genes relacionados à
tolerância ao estresse hídrico. Então, iniciamos um trabalho para a obtenção e caracterização
biológica do promotor do gene DREB da mamoneira (Ricinus communis L.), conhecidamente
uma planta com grande tolerância à seca, por meio da técnica da TAIL-PCR. Com a finalidade
de estudar a expressão deste promotor sob condições de estresse hídrico, realizamos a
construção quimérica do promotor ao gene repórter gus, originando um vetor final denominado
pRCDREB1pro, utilizado para transformar plantas de fumo (Nicotiana tabacum). Folhas de
uma planta transgênica foram utilizadas em um ensaio de simulação de estresse hídrico. Os
resultados revelaram a expressão do gene gus, sob o controle do promotor DREB, apenas nas
condições de estresse. Uma análise filogenética do gene RcDREB clonado mostrou que se
trata de um gene do grupo A-5 (gene envolvidos com resposta aos estresses hídrico e salino).
Este trabalho será a base para geração de plantas agricultáveis tolerantes ao estresse hídrico.
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The water deficit is the main stress that restricts the capacity and efficiency of the
plant to conduct important biochemical processes. The consequence for the plant is the
modification of cellular volume and denaturizing of important proteins. According to intensity
of the stress condition, it can cause plant death. Plants have biochemical mechanisms to
tolerance water-stress and respond to these conditions with an array of biochemical and
physiological alterations, which involve functions of many gene expressions, which may occur
within a few seconds or within minutes or even hours to promote the ability of the plant to
survive stress. The dehydration responsive element binding proteins (DREB) are important
transcription factors that induce a set of water stress- related genes. In this work we aimed
the isolation of a DREB gene promoter from castor bean (Ricinus communis L.), known as a
plant that presents a strong tolerance to drought. The TAIL-PCR was used to isolate the
5´region of a DREB-like gene (here called as RcDREB). To study the expression induced by
this promoter under water-stress condition, we constructed a chimeric gene with the RcDREB
promoter controlling a reporter gene (gus). The final vector (named pRCDREB1pro) was used
to transform tobacco plants (Nicotiana tabacum). Leaves from a transgenic plant were used in
a simulator assay for water-stress. The results revealed that the gus gene expression under
control of the RcDREB gene promoter was observed only under 4 to 8-h stress condition. A
phylogenetic analysis with cloned RcDREB gene showed that it belongs to the group A-5
(genes that are water- and salinity stress responsive). This work will be the foundation to
generate crop plants tolerant to water stress.
Introdução
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A produtividade de uma planta depende de vários fatores ambientais ou externos que
possibilitam aos vegetais condições favoráveis ao crescimento e ao desenvolvimento (Slater et
al., 2003). Estas condições ambientais, como a presença de dióxido de carbono,
disponibilidade de água e de macros e micros nutrientes, que fornecem à planta matéria bruta
para os processos metabólicos (Raven et al., 2001), influenciam de modo crucial na fisiologia
do vegetal. Entretanto, se houver alguma alteração no ambiente no qual a planta está inserida,
que comprometa significativamente a sua morfofisiologia, o vegetal disponibilizará de
mecanismos bioquímicos envolvendo a expressão de muitos genes (Bajaj et al., 1999), com a
finalidade de tolerar àquela alteração ambiental, caracterizada como estresse, a qual é
desfavorável ao vegetal (Taiz & Zeiger, 2004). Este estresse pode ser tanto biótico, que
envolve a interação com outros organismos vivos como plantas daninhas e patógenos, quanto
pode ser abiótico como excesso de herbicidas, intensa luminosidade, presença de metais
pesados, excesso ou falta de água e alta concentração salina. Estas oscilações ambientais
comprometedoras trazem conseqüências negativas tanto para a planta quanto para a
sociedade, a qual depende da produtividade e do rendimento de uma determinada cultura
(Slater et al., 2003; Taiz & Zeiger, 2004).
Um dos principais estresses que restringem a capacidade e a eficiência da planta
realizar os processos bioquímicos importantes é o estresse hídrico, ocasionado, pelo déficit de
água. Este pode ser definido como “todo conteúdo de água de um tecido ou célula que está
abaixo do conteúdo de água mais alto exibido no estado de maior hidratação” (Taiz & Zeiger,
2004).
O ambiente que propicia este déficit são a seca, alta salinidade e condições de baixa
temperatura (Shinozaki et al., 1997; Bajaj et al., 1999; Cascardo et al., 2001; Seki et al., 2003).
Esta falta de água também pode ocasionar estresse osmótico nas plantas (Zhu et al., 1997). As
conseqüências para o vegetal vão desde alterações no volume celular à desnaturação de
importantes proteínas, e dependendo da intensidade do estresse, poderá ocasionar
desidratação ou até mesmo a morte (Bray, 1997).
Introdução
2
Com isso, as plantas apresentam mecanismos bioquímicos que respondem ao
estresse hídrico (Seki et al., 2003). Estas respostas envolvem as funções de muitos genes que
podem ocorrer em segundos ou dentro de minutos a horas, conferindo ao vegetal a capacidade
de tolerar àquela condição desfavorável (Bray, 1997).
Vários trabalhos têm identificado um grande número de genes envolvidos nestas
respostas o que possibilita uma melhor compreensão desses mecanismos de tolerância ao
déficit hídrico. Um dos mecanismos gênicos envolvidos na geração de respostas ao estresse
hídrico em plantas, é mediado pela expressão do gene DREB. Este gene codifica para uma
proteína regulatória, proteína dreb, um fator de transcrição que está envolvido na ativação de
outros genes relacionados à tolerância ao estresse hídrico (Seki et al., 2003).
Baseado nisso, este trabalho pretende estudar a funcionalidade do promotor do gene
DREB de Ricinus communis L. em plantas de fumo submetidas à diferentes condições de
estresses abióticos.
1.1. Relações hídricas da célula vegetal
A água oferece, por meio de suas importantes propriedades químicas e físicas, um
alto potencial de características funcionais, os quais são determinantes e fundamentais para
a vida de um vegetal (Taiz & Zeiger, 2004). Dessa maneira, a água proporciona um ambiente
adequado para a ocorrência da maioria das reações bioquímicas celulares, influenciam na
estrutura de muitas proteínas, ácidos nucléicos, polissacarídeos, dentre outros elementos
constituintes celulares, além de ser o melhor solvente conhecido, podendo desta forma, ser
transportado ao longo do corpo da planta, o que possibilita as relações hídricas entre as
células.
A capacidade da molécula de água exercer grande influência funcional e estrutural
às células vegetais a torna um fator limitante aos processos de crescimento e
desenvolvimento (Taiz & Zeiger, 2004). A absorção desta importante molécula envolve a
participação dos tecidos condutores especializados da planta (xilema e floema) e da própria
característica física e química da água que favorece a entrada pelas raízes.
Introdução
3
O potencial hídrico celular é um dos importantes mecanismos determinantes na
fisiologia vegetal, pois proporciona à planta disponibilidade da molécula de água,
favorecendo desta maneira, um ambiente propício às reações bioquímicas necessárias.
Entretanto, essa disponibilidade pode ser afetada ou influenciada por dois importantes
fatores:
Concentração:
Representa o efeito dos solutos dissolvidos no potencial hídrico. A presença dos
solutos reduz a energia livre da molécula de água, diminuindo desta maneira o potencial
hídrico. Este efeito dos solutos é denominado potencial osmótico ou potencial de solutos.
Pressão:
Referido como potencial de pressão caracteriza-se pela pressão hidrostática da
solução. Podendo ser positivo, no qual há aumento do potencial hídrico, ou negativo, quando
há diminuição do potencial hídrico. Dentro das células vegetais, esta pressão, que é positiva,
é chamada de pressão de turgor, pois resulta numa pressão contra a parede celular
proveniente da absorção de água por osmose. Esta pressão turgor é essencial ao vegetal,
pois, vivendo na maioria das vezes em um ambiente hipotônico (maior potencial hídrico e
menor concentração de solutos), a pressão mantém o turgor da célula. O turgor celular
aumenta a rigidez de células e tecidos e oferece a distensão das paredes celulares durante o
crescimento celular. Em plantas não lenhosas, a pressão turgor oferece suporte ao vegetal
contribuindo com a estabilidade mecânica, por meio da absorção de solutos pelo vacúolo,
gerando uma força osmótica para absorção de água, possibilitando uma rigidez estrutural ao
vegetal. Entretanto, a pressão hidrostática pode ser negativa, fato que ocorre no xilema e nas
paredes entre as células vegetais, o que contribui para o transporte ao longo do corpo da
planta.
1.2. Mecanismos que proporcionam a ocorrência do déficit hídrico
O fluxo de água, por ser um mecanismo passivo, ocorre como conseqüência às
forças físicas, de uma região de alto potencial hídrico para uma de baixo potencial hídrico, ou
seja, para uma região de baixa energia livre (Taiz & Zeiger, 2004). As plantas absorvem água
Introdução
4
quando o potencial hídrico for menor em relação ao potencial hídrico do solo. Esta diferença
provém principalmente da perda de água pela transpiração. Processo caracterizado pela
participação de estruturas especializadas, os estômatos, constituídos por duas células-
guarda as quais formam um poro ou abertura (ostíolo). Os estômatos localizam-se
principalmente na região adaxial das folhas, podendo também ser encontrado nos caules,
mas em menor quantidade. Esta perda de água pela transpiração é devido à aquisição da luz
solar e o dióxido de carbono (CO
2
). Pois, para o vegetal obter a energia luminosa e o CO
2
, os
quais são fundamentais ao processo fotossintético, deverá ocorrer a exposição da área da
superfície foliar para adquirir maior captação. Entretanto, cria-se também uma área de
superfície para a transpiração, pois para o CO
2
ser absorvido, ele deve estar associado à
molécula de água. Então, ao mesmo tempo em que a planta expõe a superfície foliar para os
raios luminosos e ao CO
2
, há perda de vapor de água. Portanto, o vegetal deve controlar
este balanço hídrico. Uma das maneiras de evitar a excessiva perda de água é por meio de
uma barreira cobrindo as paredes celulares externas das células epidérmicas das folhas e do
caule, esta camada denomina-se cutícula. (Raven et al., 2001).
Assim, grande parte da perda de água ocorre via estômato. Este movimento
estomático acontece em conseqüência às oscilações da pressão turgor no interior das
células-guarda. Portanto, a abertura ocorre pelo deslocamento do potencial osmótico da
água para dentro das células-guarda como conseqüência do acúmulo de solutos no interior
das mesmas, originando um aumento na pressão turgor. Já o fechamento acontece pela
diminuição na pressão turgor originada pela diminuição de solutos no interior das células-
guarda.
Quando a demanda de água excede o fornecimento, ou seja, quando a velocidade
de transpiração excede ou torna-se superior ao suprimento de água, ocorrerá déficit hídrico
celular que poderá ocasionar sérios danos ao vegetal (Bray, 1997). Este déficit também é
propiciado por demais fatores como alta concentração salina e condições de baixa
temperatura (Bray, 1993).
Introdução
5
1.3. Principais efeitos ao vegetal ocasionados durante o estresse hídrico
Dependendo de sua intensidade, o déficit hídrico poderá ocasionar diversas
conseqüências ou danos ao vegetal (Bray, 1993). Conforme esta intensidade aumenta, as
camadas superiores do solo são, na maioria das vezes, as primeiras a secar, ocasionando
vários efeitos à planta em decorrência da desidratação, como por exemplo, mudanças no
volume celular, desequilíbrio no gradiente do potencial hídrico, redução do turgor celular,
ruptura da integridade da membrana plasmática, desnaturação de proteínas, aumento na
concentração de solutos, aumento do hormônio ácido abscísico (ABA), abscisão foliar e
fechamento em resposta ao ABA, diminuição da superfície foliar e fotossíntese limitada no
interior dos cloroplastos.
A taxa fotossintética é geralmente proporcional à disponibilidade da superfície foliar.
Esta área foliar está relacionada ao turgor celular. Se há diminuição de água, as células
contraem-se, as paredes celulares afrouxam, a membrana plasmática se torna mais espessa
e comprimida, tendo uma menor área a partir deste momento, e ocorrerá uma diminuição na
pressão de turgor. Esta redução na pressão influencia as atividades e mecanismos
correlacionados ao turgor celular, como a própria expansão foliar e alongamento das raízes.
A expansão foliar é mais sensível do que a taxa fotossintética. Porém, o estresse
hídrico influencia na fotossíntese e no funcionamento estomático. Quando acontece o
estresse, os estômatos se fecham e inibem a ocorrência da transpiração, podendo aumentar
a eficiência da água. Entretanto, a potencialidade do déficit hídrico inibe a fotossíntese e a
eficiência do uso da água é diminuída. Há redução dos fotossintetizados exportados das
folhas.
As mudanças no turgor das células-guarda são fortemente influenciadas pela
disponibilidade de volume celular. A perda do turgor celular ocorre como conseqüência da
evaporação da água. E essa diminuição de água favorece ou promove a perda de solutos a
partir das células-guarda.
1.4. Respostas moleculares e bioquímicas durante o estresse hídrico
Introdução
6
A capacidade da planta manter suas atividades metabólicas enquanto se encontra
desidratada é mediada por mecanismos de respostas moleculares e bioquímicos, os quais
envolvem as funções de diversos genes específicos, que confere ao vegetal o potencial de
tolerar àquela condição desfavorável. Esta resposta inicia-se primeiramente com a
percepção do estresse promovida por rotas de transdução de sinais (Bray, 1993).
Conseqüentemente, estas respostas, as quais irão proporcionar mudanças fisiológicas nas
plantas, dependerão de vários fatores, como o genótipo, espécie, idade e o estádio de
desenvolvimento da planta, tipo celular, compartimento subcelular e potencial da perda de
água.
Um grande número de genes que estão envolvidos na resposta tem sido descrito e
caracterizado. Estes genes induzidos pelo estresse funcionam não apenas para proteger a
célula, por meio de síntese de importantes proteínas, mas também na regulação de genes na
transdução de sinais (Shinozaki et al., 1997). Assim, os produtos gênicos são classificados
em dois grupos:
Proteínas funcionais:
Caracterizam-se por protegerem a célula contra a desidratação. Incluem:
→ Proteínas de canais hídricos (aquaporinas): Envolvidas no movimento de água
através da membrana plasmática;
→ Enzimas envolvidas na síntese de osmoprotetores: Relacionadas com o acúmulo
de solutos no citosol, com a finalidade de promover a manutenção do turgor celular;
→ Proteínas protetoras de macromoléculas e membranas celulares: Incluem as
proteínas de embriogênese tardia -LEA (Late Embryogenesis Abundant); as chaperonas
moleculares, como a HSP 70 BiP (70 kDa Heat Shock Binding Protein) e proteínas
anticongelamento;
→ Enzimas detoxificantes: Relacionadas com a neutralização de radicais livres
provenientes do estresse oxidativo, o qual é um efeito secundário do estresse hídrico.
→ Proteases.
Proteínas regulatórias:
Introdução
7
Caracterizam-se na regulação da transdução de sinais e na expressão gênica.
Incluem:
→ Proteínas quinases;
→ Fatores de transcrição (proteína DREB, por exemplo).
1.5. Reconhecimento do estresse hídrico
Para promover a resposta de tolerância ao estresse hídrico, é necessário
primeiramente o reconhecimento do estresse, ou seja, a percepção das modificações ligadas
à perda de água pela planta. Em seguida, há um “disparo” ou início da cascata da
transdução de sinais que ativará genes específicos, que posteriormente oferecerá respostas
bioquímicas à planta (figura 1) (Shinozaki et al., 1997).
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Percepção do Sinal
Transdução do Sinal
Expressão Gênica
Produtos Gênicos
Proteínas Funcionais:
Proteínas de
canais;
Osmoprotetores;
LEA;
Chaperonas;
Enzimas
Detoxificantes;
Proteases
Proteínas Regulatórias:
Fatores de
Transcrição;
Proteínas Quinases;
Introdução
8
1.6. Mecanismos de proteção à maquinaria celular
Com a finalidade de tolerar a desidratação por meio da redução do potencial
osmótico, este ajuste, o qual promove manutenção do turgor celular, é caracterizado pelo
acúmulo de solutos no interior da célula. Estes solutos são denominados de osmoprotetores,
osmólitos ou solutos compatíveis. No início da perda de água, ocorre primeiramente um
acúmulo de íons dentro dos vacúolos, e isto gera uma mudança no balanço hídrico da célula.
Assim, para manter o equilíbrio hídrico celular, há acúmulo destes osmoprotetores, os quais
não oferecem prejuízos à célula. Os principais solutos compatíveis acumulados são: manitol,
prolina, glicina, betaína, trealose, frutano, D-ononitol e poliaminas (Bajaj et al., 1999). A
potencialidade dos osmólitos foi descoberta primeiramente em plantas de tabaco
transformadas com o gene oriundo da E. coli, mtlD, que codifica uma enzima que faz parte
da síntese de um soluto compatível, o manitol 1-fosfato-desidrogenase. A superexpressão
desse osmoprotetor em plantas de fumo transgênicas conferiu a capacidade de tolerar alta
concentração salina (Zhu et al., 1997). Desde então muitos trabalhos foram desenvolvidos
com a finalidade de caracterizar genes que codificam estes osmoprotetores, objetivando à
tolerância ao estresse hídrico, como por exemplo plantas de fumo foram transformadas com
o gene TPSI, proveniente de um fungo, que codifica a enzima 6-fosfato sintetase, que produz
o osmólito trealose, conferiu a estas plantas um aumento na tolerância à seca (Bajaj et al.,
1999).
Outras importantes proteínas envolvidas na proteção celular vegetal durante o
estresse hídrico, são as proteínas LEA. Estas foram identificadas primeiramente em fases de
maturação e dessecação do desenvolvimento de sementes (Bray, 1993; Zhu et al., 1997), e
desempenham uma proteção crucial à planta durante a falta de água. E esta capacidade
Figura 1: Mecanismo de percepção do estresse hídrico. (Adaptado de
Shinozaki et al., 1997)
Tolerância ao Estresse Hídrico
Introdução
9
provém de suas características químicas, as quais envolvem a hidrofilidade e composição
básica dos aminoácidos o que permite a retenção da molécula de água e impedimento da
cristalização de importantes proteínas durante a desidratação; renaturação de proteínas mal
dobradas (atividade chaperônica) e seqüestro de íons. Há pelo menos seis grupos (grupo 1 a
6) de genes lea identificados e caracterizados de acordo com suas funções específicas
(Bray, 1993).
Há também as enzimas detoxificantes, as quais estão envolvidas no estresse
oxidativo. Este estresse, o qual é um efeito secundário da maioria de outros estresses
bióticos e abióticos, incluindo o déficit hídrico, surge como conseqüência da produção de
radicais livres (superóxido, peróxido de hidrogênio e radical hidroxil), os quais ocasionam
danos à célula desde a fragmentação de cadeias peptídicas à lesões irreversíveis no DNA
(Bajaj et al., 1999). Assim, enzimas detoxificantes são expressas com o objetivo de
neutralizar estes radicais. Incluem superóxido dismutase, ascorbarto peroxidase, glutathiona
S-transferases e hidrolases solúveis (Shinozaki et al., 1997).
1.7. Gene DREB
O mecanismo da transcrição gênica é controlado pela interação de proteínas
específicas denominadas de fatores de transcrição, que reconhecem seqüências reguladoras
específicas presentes nos promotores dos genes (Taiz & Zeiger, 2004). Diferentes genes
induzidos pelo déficit hídrico, alta concentração salina e estresse pelo frio são regulados por
rotas de sinalização que ocasionam a ativação desses fatores de transcrição.
Um dos fatores de transcrição estudado é o Dreb/CBF (Dehydration-responsive
element binding protein/C-repeat-binding factor) que se liga a uma região específica presente
em diversos genes relacionados com a tolerância ao estresse hídrico. Esta região possui
uma seqüência conservada –GCCGAC- denominada de DRE/CRT (Dehydration-responsive
element/C-repeat) (Agarwel et al.; 2006).
Introdução
10
Diversos genes DREB tem sido estudados e caracterizados em várias espécies de
plantas, tais como Arabidopsis, trigo, centeio, tomate, milho, arroz, cevada e colza (Bo Hung
& Liu, 2006). Os genes DREB podem ser divididos e dois grupos de acordo como o estresse
envolvido: DREB1, relacionado com a tolerância a baixas temperaturas- estresse do frio- e
DREB2 associado com a tolerância à falta de água. Todas as proteínas DREB possuem um
domínio altamente conservado chamado ERF/APE2, que estão envolvidos na resposta à
expressão do hormônio etileno e a morfogênese floral, respectivamente (Huang & Liu, 2006;
Shinozaki et al.; 1997).
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De acordo com Chierice & Claro Neto (2001) “a origem desta planta é muito discutida,
já que existem relatos, em épocas bastante longínquas, de seu cultivo na Ásia e na África. A
diversificação de um grande número de variedades desta planta, encontradas tanto no
continente africano, como no asiático, dificulta o estabelecimento de uma procedência efetiva
da mamona. A facilidade de propagação e de adaptação em diferentes condições climáticas
propiciou à mamona ser encontrada ou cultivada nas mais variadas regiões do mundo, como
no norte dos Estados Unidos da América e na Escócia”. Ainda de acordo com esse autor, “no
Brasil, a mamona foi trazida pelos portugueses com a finalidade de se utilizar seu óleo para
iluminação e lubrificação de eixos de carroças. O clima tropical, predominante no Brasil,
facilitou o seu alastramento. Assim, hoje podemos encontrar mamoneira em quase toda
extensão territorial, como se fosse uma planta nativa, e em cultivos destinados à produção de
óleo”. Desta forma, seu cultivo pode ser favorável principalmente em regiões semi-áridas
brasileiras, uma vez que a mamona apresenta a característica de ser tolerante à seca, além de
possuir um fácil manejo (Kouri, et al., 2004), propiciando um desenvolvimento sócio-econômico
nestes locais desprovido de culturas adaptadas ao clima seco.
Pertencente à Ordem Gereniales, Família, Euphorbiaceae, Gênero Ricinus, Espécie R.
communis L., a mamoneira é uma planta, oleaginosa, heliófila, arbustiva, podendo apresentar
um certo nível de xerofitismo, possui uma grande capacidade de adaptação à diferentes
ambientes e é exigente em calor, necessitando de períodos secos para a manutenção dos
Introdução
11
frutos, e sendo sensível ao excesso de umidade no solo. Apresenta crescimento dicotômico,
polimórfico, com baixa eficiência no processo fotossintético C3, o que promove ser uma
espécie de morfologia e fisiologia complexa.
A mamoneira tem 2n = 20 cromossomos e este número é constante em todas as suas
subespécies e formas. Seu porte é na maioria das vezes classificadas em anão (altura inferior
a 1,8m), médio (altura variando entre 1,8 a 2,5 m), alto (altura variando entre 2,5 a 5,0 m) e
arbóreo (altura superior a 5m).
A cor do caule pode variar de vermelha à arroxeada, e pode possuir uma cobertura
serosa, podendo aparecer nas inflorescências e nos pecíolos. As folhas apresentam também
variações na cor, verde-claro ou vermelho-escuro, dependendo da presença do pigmento
antocianina; são longas, com pecíolo fistuloso e comprido, com glândulas nectaríferas,
alternas, peltadas ou palmatodigitadas.
A mamona apresenta uma haste principal, a qual possui uma inflorescência terminal
denominada racemo primário. Depois de seu surgimento, começa a aparecer nos nós, logo
abaixo do primeiro racemo, as ramificações laterais das hastes. Geralmente, a mamona, pode
apresentar dois ou três ramos, que surgem simultaneamente, na respectiva ordem: o primeiro é
situado no primeiro nó logo abaixo do racemo primário, o segundo no nó dois e o terceiro no nó
três; cada um desses ramos é finalizado em um racemo, chamado secundário.
Da mesma maneira, aparecem novos ramos logo após da formação dos secundários,
terminado também em racemos, chamado terciários. Estes racemos comportam flores
masculinas na parte inferior e feminina na superior, e esta condição de planta monóica.
Entretanto, pode acontecer o aparecimento, mas raramente, no ápice da inflorescência, flores
hermafroditas (Kouri, et al., 2004). Sendo uma cápsula tricoca e apresentando formas variáveis
em tamanho, o fruto pode possuir a presença de papilas ou espinhos agrupados em racemos.
Podendo ser deiscente, semideiscente e indeiscente. Sua semente também pode ter uma
variação em formatos e cores.
Introdução
12
1.9. Importância econômica da cultura da mamoneira
Devido as suas propriedades químicas diferenciadas presentes nas moléculas
constituintes de seu óleo, a mamoneira (Ricinus communis L.) apresenta um grande valor
econômico e social, o que proporciona a ser uma das principais oleaginosas do mundo (Beltrão
et al., 2003). E estas características químicas que incluem a alta concentração do ácido graxo
ricinoléico, cerca de 90%, e um grupamento hidroxila (OH), o que torna o óleo mais viscoso,
solúvel em álcool a baixa temperatura, além de adquirir uma estabilidade química e física,
possibilita ao óleo da mamona ser matéria prima para inúmeros produtos industrializados,
como por exemplo, resinas, vernizes, lubrificantes, plásticos, fibras sintéticas, podendo ser
encontrado até em cosméticos (Embrapa Algodão, 2006; Moraes et al., 2004).
Após o processamento industrial da semente, em cada tonelada de óleo extraído, há
produção de aproximadamente 1,28 toneladas de torta. Esta tem principal funcionalidade como
adubo orgânico e fertilizante, sendo imprópria para consumo animal. Este impedimento é
proporcionado pela sua toxicidade, em razão da presença da proteína ricina, que mata a célula
eucariótica por inibição da síntese protéica (Halling et al., 1985); e desencadeamento de
processos alérgicos provenientes da existência do complexo alergênico, pertencentes à classe
das albuminas 2S. Portanto, apesar da mamona ser inadequada à alimentação animal, ela
apresenta uma importância grandiosa na indústria. Esta valoração proporciona a essa
oleaginosa ser cultivada comercialmente em mais de 15 países, sendo que a Índia, a China e o
Brasil são respectivamente, nesta ordem, os maiores produtores mundiais (Embrapa Algodão,
2006).
Porém, a área de cultivo da mamona não está restrita apenas à finalidade na aplicação
industrial, mas também na participação na produção do biodiesel. Este é caracterizado como
combustível biodegradável oriundo de fontes naturais renováveis como óleos vegetais e
gordura animal (http://www.biodiesel.gov.br/, acessado em 06/07/2006). Apesar deste
biocombustível também ser obtido por outros óleos vegetais tais como girassol, babaçu, o
pinhão-manso, amendoim, soja, dentre outras, a mamona apresenta um maior destaque neste
processo de obtenção desta fonte energética, propiciado por suas características químicas
Introdução
13
importantes e também pelo seu caráter fisiológico, pois é uma planta que apresenta tolerância
à seca, o que promove um aumento gradativo da sua área de cultivo, favorecendo um
desenvolvimento socioeconômico em diversos Estados brasileiros.
Apesar de existir muitos estudos sobre os efeitos do estresse hídrico sobre a
morfologia da mamona, há poucos trabalhos desenvolvidos em relação aos genes envolvidos
na tolerância ao estresse hídrico. Assim, é importante compreender os mecanismos de
expressão gênica durante estas condições desfavoráveis.
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A obtenção de plantas com caracteres fenotípicos desejáveis ocorre há muitos anos
por meio de melhoramento clássico. Entretanto, este mecanismo convencional de
transferência gênica esbarra em alguns problemas tais como, o reduzido pool gênico de
algumas espécies, ligação de genes e a não compatibilidade sexual. Assim, tendo na
natureza a fonte da variabilidade genética, a utilização das técnicas da engenharia genética,
comumente denominada de tecnologia do DNA recombinante, oferece a capacidade de
inserir novos caracteres em uma planta específica (Brasileiro et al., 1998).Por definição,
transgênico é um organismo de constituição genética alterada pela introdução controlada de
gene (s) de outro organismo sem a ocorrência de fecundação (Zanatta, 2003).
Para obtenção de plantas transformadas é necessário primeiramente a identificação
do gene responsável pelo caractere fenotípico desejável em um organismo doador, em
seguida a seleção de um vetor de transferência ou da técnica mais adequada para a
transformação do organismo e, finalmente a identificação do receptor para o gene de
interesse.
Existem dois métodos utilizados para inserção de genes em plantas, o primeiro é o
método indireto, caracterizado pelo uso de microrganismos, os quais inserem seu material
genético ao receptor; o segundo método é o direto, e implica na inserção do gene de
interesse por meio de mecanismos químicos ou físicos. No mecanismo indireto há a
Introdução
14
participação da Agrobacterium tumefaciens. As agrobactérias são microrganismos
predominantemente do solo, aeróbicas, Gram-negativas e possuem o formato de bacilos,
além de não formarem esporos. Sua potencialidade de introdução de genes ao receptor
refere-se à maneira de introdução do material genético, pois uma vez que parte do material
genético bacteriano fará parte do material genético vegetal, mudando desta maneira a
expressão gênica da planta, ela apresenta a capacidade de infectar o hospedeiro e ocasionar
danos prejudiciais, como a doença galha-da-coroa, a qual possui aspecto tumoral no local da
infecção. Esta doença está relacionada com a presença de um plasmídio, presente na
Agrobacterium tumefaciens, com alto peso molecular (150 a 250 Kb) denominado de
plasmídio Ti (Tumor inducing). Neste plasmídio há uma região específica, o T-DNA
(Transferred DNA), o qual é transferido do microrganismo para o hospedeiro vegetal, e esta
transferência é mediada pela ativação de genes da região vir, um regulon composto de seis a
oito operons, da Agrobacterium tumefaciens. Com isso, os novos genes inseridos no material
genético vegetal serão transcritos e ocasionará um desequilíbrio no balanço hormonal da
planta, provocando um crescimento desordenado de células e originando a constituição do
tumor no local da infecção.
Portanto, esta maneira de inserção do gene ao hospedeiro é utilizada para obter
plantas transformadas, o que caracteriza a Agrobacterium tumefaciens um “engenheiro
genético” natural. Inicialmente é necessário obter linhagens nas quais o T-DNA original é
deletado, processo ocorrido pela dupla recombinação. Em seguida, é construído o vetor com
o gene de interesse, o qual será clonado entre as extremidades do T-DNA. Estes vetores
podem ser binários, tendo a capacidade de reproduzir independentemente do plasmídio ou
co-integrados, originados de vetores intermediários. Estes não são capazes de replicar em
Agrobacterium, mas se integram ao plasmídio Ti por meio da recombinação simples, por
meio de uma região de homologia ao T-DNA da linhagem desarmada, constituindo o vetor
co-integrado. Posteriormente, há inserção de um dos vetores à linhagem desarmada, isto é,
com a deleção ocorrida no T-DNA, através da conjugação triparental, eletroporação ou
choque térmico.
No mecanismo de transformação direta, utilizam-se dois principais procedimentos, a
Introdução
15
eletroporação de protoplastos e a biobalística. O primeiro caracteriza-se pela introdução do
gene de interesse por meio de aberturas ou poros feitos a partir de um pulso de alta
voltagem em protoplastos (células vegetais sem a parede celular), permitindo desta maneira
integração do transgene à célula vegetal.
Denominado também de acelerador de partícula, gene gun ou biolística, o sistema
biobalístico, foi proposto inicialmente por Sanford et al, (1987), e o mecanismo de ação é
ocasionado por meio da utilização de microprojéteis de metais pesados, acelerados com a
finalidade de inserir o material genético ou outras moléculas em células e tecidos in vivo.
Partículas de ouro ou tungstênio são cobertas com o material genético de interesse e são
aceleradas, em condições de vácuo, a velocidades superiores a 1.500 Km/h sobre o tecido
ou célula-alvo, sem prejudicar o material vegetal. A aceleração destas micropartículas pode
ser realizada por uma onda de choque com energia suficiente para deslocar uma membrana
carreadora contendo as micropartículas cobertas com o material genético. A onda de choque
pode ser provocada por uma explosão química (pólvora) (Sanford et al, 1987), por uma
descarga de gás hélio a alta pressão (Sanford et al., 1991; Aragão et al., 1996), pela
vaporização de uma gota de água decorrente de descarga elétrica com alta voltagem e baixa
capacitância (McCabe et al., 1988; Christou, 1993) ou com baixa voltagem e alta
capacitância (Rech et al., 1991; Aragão et al., 1992; 1993;), ou por uma descarga de ar
comprimido (Morikawa et al., 1989). Os sistemas que utilizam gás hélio sob alta pressão e
descarga elétrica possuem uma melhor potencialidade na eficiência de obtenção de altas
freqüências de transformação em diferentes espécies vegetais (Rech & Aragão, 1998).
Vários equipamentos relacionados com aceleração de micropartículas foram desenvolvidos
em vários países, desde os Estados Unidos até a China, passando pelo Brasil, onde no
Laboratório de Transferência de Genes, do Centro de Recursos Genéticos e Biotecnologia
da Embrapa, foi desenvolvido acelerador de micropartículas (Aragão, 2003).
1.11 Utilização de genes marcadores de seleção
Com a finalidade de impedir a formação de plantas quiméricas e diminuir o número
Introdução
16
de eventos não transformantes, o gene marcador de seleção oferece um potencial dominante
às plantas transformadas, aumentando deste modo a sua freqüência (Aragão et al., 2000).
Inseridos juntamente com o gene de interesse, a expressão dos genes marcadores
ocorre por meio da síntese de um produto ou proteína com atividade enzimática que irá
oferecer às células transformadas resistência a um determinado substrato, antibiótico ou
herbicida, permitindo que apenas células transformadas cresçam (Zanatta, 2003). Portanto, a
utilização de gene marcador permite diferenciar o material transformado do não
transformado.
Segundo Brasileiro & Aragão (2001), a eficiência do marcador de seleção depende
das características do agente seletivo, que irá inibir o crescimento das células não
transformadas; do gene marcador de seleção e do material vegetal.
Os genes marcadores que conferem às plantas resistência à antibióticos mais
utilizados em transferência gênica são o gene neo ou nptII, gene marcador primeiramente
empregado em transformação de plantas (Bevan et al., 1983), o qual possibilita a resistência
aos antibióticos canamicinas A,B e C; neomicinas e gentamicinas A. Tem-se o gene hpt, que
codifica para a enzima higromicina fosfotransferase (HPT) e oferece resistência ao antibiótico
higromicina (van den Elzen et al., 1985).
Sathasivan et al., (1990) obteve plantas tolerantes a herbicidas da classe das
Imidazolinonas por meio da utilização do gene marcador de seleção ahas mutado, isolado
previamente de Arabidopsis thaliana. Este gene codifica para a enzima acetohidroxiácido
sintase (ahas), também denominado como acetolactato sintetase (ALS), que catalisa uma
reação da via na biossíntese dos aminoácidos valina, leucina e isoleucina, e apresenta uma
mutação na posição 653 o que impede o reconhecimento do herbicida à enzima e
conseqüentemente não exercendo sua função inibitória.De acordo com Aragão et al. (2000),
no mecanismo de transformação gênica, a utilização do gene mutado ahas, resulta em um
aumento significativo do número de transformantes de soja, além de ser eficiente para
diversas cultivares.
Introdução
17
Objetivos
18
2
2
.
.
O
O
b
b
j
j
e
e
t
t
i
i
v
v
o
o
s
s
G
G
e
e
r
r
a
a
l
l
Clonar e estudar a funcionabilidade do promotor do gene DREB isolado da
mamoneira (Ricinus communis L.)
E
E
s
s
p
p
e
e
c
c
í
í
f
f
i
i
c
c
o
o
s
s
1. Isolar, clonar e caracterizar a seqüência do promotor do gene tipo DREB da
planta Ricinus communis L.
2. Obter plantas transgênicas de Nicotiana tabacum expressando o gene
repórter gus, sob o controle do promotor do gene DREB de Ricinus communis L.
3. Analisar a expressão do gene repórter gus sob o controle do promotor do
gene RcDREB em tecidos foliares de plantas transgênicas de Nicotiana tabacum (expressão
heteróloga) expostas a condições de estresse hídrico.
Materiais & Métodos
19
3
3
.
.
M
M
a
a
t
t
e
e
r
r
i
i
a
a
i
i
s
s
e
e
M
M
é
é
t
t
o
o
d
d
o
o
s
s
3.1. Clonagem de fragmento da região codificante do gene DREB de Ricinus
communis L.
A partir de regiões conservadas identificadas em alinhamento de seqüências tipo DREB
(DREB-like) e CBF (C-Repeat Binding Factor), foi realizado o alinhamento usando o programa
MEGA versão 3.1 (Kumar et al., 2004) e construídos primers específicos degenerados (Tabela
1). Posteriormente, foi amplificado o fragmento de interesse a partir do DNA genômico de
mamona utilizando os primers específicos por meio da técnica de Reação de Polimerase em
Cadeia (PCR). Esta reação foi realizada em um termociclador PTC-100 (MJ Research) em um
volume final de 50 l
de solução contendo 20ng de DNA, extraído de folha de mamona de
acordo com Doyle & Doyle (1987) 600mM Tris-SO
4
(pH 8.9), 18mM (NH
4
)
2
SO
4,
50mM de
MgSO
4,
10mM de dNTP, M
0,10 de cada primer específico e 5U/ l
de Platinum Taq High
Fidelity (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).A mistura foi desnaturada a 94.0º C por 2 minutos e
submetida a 35 ciclos de amplificação (94.0º C por 30 segundos, 55.0º C por 30 segundos,
68.0º C por 1 minuto) finalizando com um ciclo de 10 minutos a 68.0ºC. O fragmento foi
aplicado no gel de agarose 2% (Anexo 1) por 1 hora a 100V, depois extraído e purificado
utilizando o Kit Wizard SV Gel e PCR Clean-Up System (Promega) e clonado no vetor de
clonagem pGEM-T-Easy (Promega), seguindo as instruções do fabricante.
O vetor foi amplificado, purificado e seqüenciado, utilizando-se os primers universais M13
R e M13F, em um seqüenciador automático ABI Prism1 3700, Foster City, CA, USA.
Tabela 1. Primers específicos degenerados utilizados na amplificação do fragmento da
região codificante do gene DREB Ricinus communis L.
Primers degenerados DREB 392 DREB 297
Seqüência
5’ GCGACGTCRTGGRCA
CGAGCGGC 3’
5’ TGGGTGGSGGAAATT
AGAGARCC 3’
Materiais & Métodos
20
R corresponde à base nitrogenada G ou A; S corresponde à base nitrogenada G ou C.
3.2.Clonagem do promotor do gene DREB de Ricinus communis L.
Para a obtenção do promotor foi realizado um ensaio de TAIL-PCR (Liu & Whittier,
1995), constituído de várias reações de PCR’s primários, secundários e terciários, utilizando 20
primers aleatórios da série Operon (www.operon.com) (Tabela 2) em combinação com primers
internos denominados de Nested primers (Tabela 3) construídos a partir da região interna do
fragmento isolado.
Tabela 2. Seqüência dos primers da série Operon utilizados no ensaio TAIL-PCR.
Primers da série OPERON Seqüência
5’→3’
OPE 1 CCCAAGTGCC
OPE 2 GGTGCGGGAA
OPE 3 CCAGATGCAC
OPE 4 GTGACATGCG
OPE 5 TCAGGGAGGT
OPE 6 AAGACCCCTC
OPE 7 AGATGCAGCC
OPE 8 TCACCACGGT
OPE 9 CTTCACCCGA
OPE 10 CACCAGGTGA
OPE 11 GAGTCTCAGG
OPE 12 TTATCGCCCC
Materiais & Métodos
21
OPE 13 CCCGATTCGG
OPE 14 TGCGGCTGAG
OPE 15 ACGCACAACC
OPE 16 GGTGACTGTG
OPE 17 CTACTGCCGT
OPE 18 GGACTGCAGA
OPE 19 ACGGCGTAGT
OPE 20 AACGGTGACC
Tabela 3. Seqüência dos Nested primers utilizados na técnica da TAIL-PCR.
Nested primers RCNESTEDR RCR2
Seqüência 5’AACAGGAGCGAATAAGAACC 3’ 5’ATCCTTGACCGCTTGTTC 3’
Cada PCR foi realizado com o primer específico associado aos da série Operon em um
termociclador PTC-100(MJ Research) num volume final de 25 l
contendo cerca de 20ng de
DNA, 600mM Tris-SO
4
(pH 8.9), 18mM (NH
4
)
2
SO
4,
50mM de MgSO
4,
10mM de dNTP mixture,
M
0,10 de cada primer específico e 5U/ l
de Platinum Taq High Fidelity ( (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA), sendo que, o produto final da reação primária foi diluído em água estéril
1:50 l
e secundária 1:100 l
, as quais foram utilizadas como molde na reação secundária e
terciária, respectivamente. Além disso, cada reação possuía determinado programa específico
de amplificação do fragmento (Tabela 4; Figura 2).
Materiais & Métodos
22
Tabela 4. Programa realizado em cada ensaio da TAIL-PCR.
Reação PCR Primário Secundário Terciário
Primers
utilizados
DREB 392
Série Operon
RCNESTEDR
Série Operon
RCR2
Série Operon
Programa
realizado no
termociclador
1. 95.0º POR 2:00
2. 94.0º POR 0:30
3. 62.0º POR 1:00
4. 72.0º POR 2:30
5. GO TO 2, 4X
6. 94.0º POR 0:30
7. 25.0º 5:00
8. RAMPING TO 68.0º
À 0,3ºC
9. 72.0º POR 2:30
10. 94.0º POR 0:30
11. 62.0º POR 1:00
12. 72.0º POR 2:30
13. 94.0º POR 0:30
14. 62.0º POR 1:00
15. 72. POR 2:30
16. 94.0º POR 0:30
17. 44.0º POR 1:00
18. 72.0º POR 2:30
19. GO TO 10, 14X
20. 72.0º POR 5:00
21. 4.0º FOREVER
22. END
1. 95.0º POR 2:00
2. 94.0º POR 0:30
3. 64.0º POR 1:00
4. 72.0º POR 2:30
5. 94.0º POR 0:30
6. 64.0º POR 1:00
7. 72.0º POR 2:30
8. 94.0º POR 0:30
9. 44.0º POR 1:00
10. 72.0º POR 2:30
11. GO TO 2, POR 14
X
12. 72.0º POR 5:00
13. 4.0º FOREVER
14. END
1. 94.0º POR 0:60
2. 44.0º POR 1:00
3. 72.0º POR 2:30
4. GO TO 1 POR 19 X
5. 72.0º POR 5:00
6. 4.0º FOREVER
7. END
Posteriormente, as amostras provenientes do PCR secundário e terciário foram
aplicadas no gel de agarose a 1%, e as bandas obtidas foram extraídas do gel e purificadas
utilizando o Kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). Foi realizada a inserção
do fragmento ao vetor de clonagem pGEM-T-Easy (Promega), seguindo as instruções do
fabricante. O vetor foi purificado e seqüenciado utilizando-se os primers universais M13 R e
M13F. A seqüência foi comparada com aquela já previamente obtida.
Materiais & Métodos
23
Figura 2. Esquema da clonagem de fragmento da região codificante e posterior obtenção do promotor
DREB.
3.3. Construção do vetor de expressão para a transformação genética de plantas de
Nicotiana tabacum
Para a re-amplificação da região 5’ do promotor, foram construídos primers específicos
RcDPNcoR (5’TCCATGGATGGAGACAAATAATCACTC 3’)
Promotor 5’ cód. Região clonada
3’ cód.
Poly A
DREB 392 DREB 297
DREB 392
Ope n(n>20)
PCR Primário
RCNESTEDR
PCR Secundário
RCR2
PCR Terciário
Promotor do gene DREB
Materiais & Métodos
24
e RcDPKpn (5’CGGTACCCCCTTAGGACTATACACCTC3’) com a adição de um sítio de NcoI
e um de KpnI, respectivamente (região sublinhada).
Em seguida, foi realizada a amplificação por PCR do promotor a partir do DNA
genômico da mamona. Esta reação foi realizada em um termociclador PTC-100(MJ Research)
em um volume final de 50 l
contendo cerca de 20ng de DNA, 600mM Tris-SO
4
(pH 8.9),
18mM (NH
4
)
2
SO
4,
50mM de MgSO
4,
10mM de dNTP mixture, M
0,10 de cada primer
específico e 5U/ l
de Platinum Taq High Fidelity (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A mistura
foi desnaturada a 94.0º C por 1 minuto e submetida a 35 ciclos de amplificação (94.0º C por 30
segundos, 55.0º C por 30 segundos, 68.0º C por 1 minuto e 30 segundos) finalizando com um
ciclo de 5 minutos a 68.0ºC. A amostra foi aplicada ao gel de agarose 2% por 1 hora a 100v,
foi extraído do mesmo e purificado utilizando o Kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System
(Promega) e clonado ao vetor de clonagem pGEM-T-Easy (3.015 pb) (Promega), seguindo as
instruções do fabricante. Para a construção do vetor de expressão para a transformação de
fumo, foi utilizado o vetor pCAMBIA 3201 (11.459 pb) (CAMBIA, Camberra Austrália), o qual
apresenta o gene gus que codifica a enzima
-glucuronidase (GUS) e o gene bar que confere
tolerância ao herbicida fitotóxico glufosinato de amônio.
Foi retirado deste vetor, através dos sítios das enzimas EcoRI (5’CACGTG3’) e
NcoI,o promotor 35S do Vírus do Mosaico da Couve-flor (CaMV). O promotor do gene DREB
foi retirado do vetor de clonagem pGEM-T-Easy (Promega) por meio das enzimas EcoRI e
NcoI, e inserido entre os sítios de EcoRI e NcoI do vetor pCAMBIA 3201 originando o vetor
final para a transformação de plantas de fumo, denominado pRCDREB1pro.
3.4. Transformação genética de plantas de Nicotiana tabacum (fumo)
3.4.1.Transferência do vetor para Agrobacterium tumefaciens
O vetor pRCDREB1pro foi introduzido em Agrobacterium tumefaciens linhagem LBA
4404, de acordo com Lacorte & Romano (1999). Após a transformação das bactérias, foi
realizada a extração de DNA total de Agrobacterium (Lacorte & Romano, 1999) e feito PCR,
Materiais & Métodos
25
nas mesmas condições descritas em 3.3, com a finalidade de verificação da presença do vetor.
Uma vez confirmada a presença do vetor nas agrobactérias, estas foram utilizadas na
transformação de plantas de Nicotiana tabacum (fumo).
3.4.2. Co-cultura com fragmentos foliares de plantas de Nicotiana tabacum via
Agrobacterium tumefaciens
Cem microlitros da linhagem de Agrobacterium LBA 4404 contendo o vetor pRCDREB1pro
foram inoculadas em 10mL de meio LB (Miller, 1972) contendo os antibióticos 100mg/L
rifampicina, 50mg/L estreptomicina e 25mg/L de cloranfenicol. A cultura foi realizada por 16 h
a 28º C sob agitação a 100rpm até a fase exponencial de crescimento (A
600nm
=1,5). Após a
obtenção da cultura bacteriana, folhas jovens de Nicotiana tabacum cv. Xanthi, cultivadas
em casa de vegetação sob condições parcialmente controladas de temperatura (20 a 30ºC) e
umidade (~70%), foram esterilizadas com 1% hipoclorito de sódio e Tween-20 (1 gota para
cada 100 ml) por 15 minutos. Em seguida, realizada enxágües em água estéril por seis
vezes.
As folhas foram cortadas em quadrados de 1,0 cm
2
com auxílio de uma lâmina de
Bisturi estéril, sobre uma placa de Petri umedecida com água deionizada estéril para mantê-
los hidratados.
Os explantes foliares foram adicionados à co-cultura em temperatura
ambiente por 10 min e com leve agitação, depois transferidos para uma placa de Petri com
papel de filtro estéril com a finalidade de retirar o excesso de bactérias. Em seguida foram
colocados ao meio MS (Murashige & Skoog, 1962) sólido contendo 1mg/L de BAP (Anexo 1)
48 horas a 28ºC, em ambiente escuro, mantendo a face adaxial em contato com o meio.
3.4.3. Regeneração de plantas transformadas
Ao término da co-cultura, os explantes foram transferidos para meio de regeneração (MS
contendo 2mg/L de BAP, 300mg/L de timentin e 4mg/L do agente seletivo herbicida fitotóxico
glufosinato de amônio. As placas foram mantidas em câmara de crescimento sob fotoperíodo
Materiais & Métodos
26
de 16 h à temperatura de 27 ± 2ºC. Os explantes foram cultivados por duas semanas e os
calos separados e transferidos para novo meio de regeneração com o agente seletivo
específico. Os brotos transformados foram adicionados meio de enraizamento (meio MS
contendo 0,1mg/L de ANA (Anexo 1) com o agente seletivo priorizado). Quando as plantas
atingiram aproximadamente 5 cm de altura foi realizadas análises moleculares para detecção
da proteína PAT (fosfinotricina acetiltransferase).
a. Análise da presença da proteína PAT
Foi realizado o imunoteste TraitCheck Crop and Grain Kit (Trait LL Test Kit; Strategic
Diagnostic Inc. www.sdix.com) para a detecção da proteína PAT (fosfinotricina acetil
transferase) expressada pelo gene bar em plantas de fumo regeneradas após a
transformação genética.
3.6. Análise da expressão do promotor DREB de mamona em tecidos foliares de plantas
de fumo transgênicas sob condições de estresse hídrico
Foi realizado o método qualitativo por meio do ensaio histoquímico da atividade
enzimática da
-glucuronidase de acordo com Jefferson et al.(1987). As folhas da planta
transgênica foram cortadas em quadrados de 1,0 mm
2
com auxílio de uma lâmina de Bisturi
estéril, totalizando nove pedaços e colocadas em placas de Petri divididas em três grupos. As
folhas foram transferidas por um período de 0, 4 e 8 horas em um dessecador com umidade
relativa de 20%. Como controle foram usados tecidos de plantas de fumo não-transgênicas.
Também foram utilizadas plantas transformadas com o vetor pCAMBIA3201 (com a construção
CaMV35S::gus) e o vetor pCAMBIA(-)GUS com a seqüência codificante do gene gus sem a
presença de um promotor. Após o tratamento de estresse, os tecidos foram submetidos ao
ensaio de GUS histoquímico de acordo com Jefferson et al. (1987).
Materiais & Métodos
27
3.7. Análise filogenética da região codificante do gene RcDREB
Com a finalidade de identificar o grupo (A1 a A6) a que pertence o gene RcDREB
cujo promotor foi isolado neste trabalho, foi feita uma análise filogenética usando a seqüência
protéica do gene depositada no TIGR (www.tigr.org). A análise filogenética foi realizada
usando o programa MEGA versão 4 (Kumar et al., 2004). As árvores filogenéticas foram
construídas usando o algoritmo Neighbor Joing (NJ) (Saitou & Nei, 1987) com opção de
eliminação completa. Os valores de bootstrap foram computados usando 1.000 repetições
pra avaliar a robustez dos agrupamentos.
Resultados & Discussão
28
4
4
.
.
R
R
e
e
s
s
u
u
l
l
t
t
a
a
d
d
o
o
s
s
e
e
D
D
i
i
s
s
c
c
u
u
s
s
s
s
ã
ã
o
o
4.1. Clonagem e sequenciamento do promotor DREB de Ricinus communis L.
A reação de PCR realizada com os primers degenerados (desenhados a partir do
alinhamento de seqüências tipo DREB e CBF de várias espécies e depositadas no GenBank)
possibilitou a obtenção de um fragmento de 845pb, o qual foi clonado ao vetor pGEM-T-Easy
(Promega) e seqüenciado. A seqüência obtida foi comparada com outras seqüências
completas do gene DREB depositadas no GenBank e apresentou um alto grau de similaridade
de 42-98%. Esse resultado demonstrou que o fragmento pertence a uma região interna
codificante do gene DREB de mamona. Desta forma, com a seqüência conhecida realizou-se a
construção dos Nested primers, e em combinação com vinte primers aleatórios da série
Operon, foi realizado a TAIL-PCR. Considerada uma técnica altamente sensível e podendo ser
aplicada em genomas complexos (Liu, et al., 1995), a Thermal Asymmetric Interlaced PCR
(TAIL-PCR) permite a amplificação de fragmentos de DNA adjacentes a uma seqüência
conhecida. A metodologia utiliza um conjunto de primers específicos juntamente com outros
primers aleatórios, sendo que o anelamento ocorre em diferentes ciclos e temperaturas, o que
caracteriza o método ser mais vantajoso, razão pelo qual a TAIL-PCR foi escolhida neste
trabalho pela especificidade e eficiência em relação a outras técnicas de PCR. De acordo com
as diferenças de amplificação dos fragmentos entre as PCR’s, foram escolhidas as bandas que
apresentavam mais especificidade entre os ciclos realizados (figura 3). Após o sequenciamento
das bandas, iniciamos um estudo in silico utilizando o programa Tfsitescan/dynamicPlus para
verificar a presença do promotor nos fragmentos. O resultado da análise revelou que a banda
denominada R6 (obtida com a combinação dos primers OPE6 e RCR2) possui o promotor
pertencente à família gênica DREB com tamanho de 1025 pb, (figura 4)
Resultados & Discussão
29
Figura 3. TAIL-PCR. Fragmentos obtidos nos ciclos primários e secundários (A) com as
combinações de primers específicos e da série OPE. (B) Detalhes do PCR secundário (S) e
Primário (P) para obtenção da banda R6 específica que corresponde ao fragmento contendo a
sequencia 5´ (promotor) do gene RcDREB.
1Kb
Terciário
Resultados & Discussão
30
TCACAAAGAAAAAGAAAATGGTTGAAAATTTTAGCAAGTTATATTAAAAATTAAAAATTTAAAATATAGT
TGTGCTCATTTTACACATATATGATAAGAGTTGAATAAAAGTATGGTCTGGACATGTTTGGCCCCAGTGA
ACCAAAGAAAAATATCATATCATAATCCCTTAGGACTATACACCTCACTCTTCCTTTTATTCATTCATTA
AACTATTTTTATAAACAATATCTCTCAGCATAAACAATATCTCCAATTTGATATTGTAATTTATGATAAT
AGATTAAATTTTCATTTTTCAAATGCTGAAAATTATTATTTTCATGTGTATACTATAATGCAAGAAATAA
GTTTTAGAAACCTACAACATTTTATAATTTGTTTATTTATTTTATTAATAAATTATAATTTTATTAATTT
TAAATATAGCTTTATAATTTGTTTATTTAAATTTATTATATAGTAATTAATTTATATTTAATATAAAAAG
AATATTTTTATAGTATATATACTTGTTTTAAATAAAAATTACTTCAAAAAATATACAAACGAGGAAGGCA
TTCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCCTCTCTTTCTCTCTCGCCCTATAAGGGAAACAA
CATAAACACACCCTTCACACTCGCACAGACAACAGCACAAAGCCTTTCTTTTTCATTTTTCTTTCCCTTT
AAACAATTTCCACAAAGATTTGTGTCGGTGAATTTGGATTTTCTATCTTTATTTTCTTTTTCCCCTTATC
AAACCCCATCTCTTAATATTAAAATAAAAAACAAAACCCAAAAATCACAATCAACGTGTAAGCTTACCTG
AATGACACCCCCGTTTCTTTTCATACCCAGCTGAGCAGAGCTCTACCCATGAAAACCCATCTTCTCTAAA
CTAAACTCCTTCCTCCATGAAAGCTCGGTAACATCTTCGCTTAGGTTTCTTCAATTTTTTTTAGTGATAC
AAAAAATAAAAAAGAAGAAATTCGAGTGATTATTTGTCTCCATACATGGAAATGGAAGGCGAAACGGAG
M E M E G E T E
AAGGTGATAACAAGGAAACGAGGAGGAGGAGGAATAGAGAGGGAGAGGCCTTTTAAAGGGATAAGGATG
K V I T R K R G G G G I E R E R P F K G I R M
AGAAAGTGGGGAAAGTGGGTGGCTGAGATAAGAGAACCGAACAAGCGGTCAAGGATTTGGTTAGGTTCT
R K W G K W V A E I R E P N K R S R I W L G S
TATTCGACTCCTGTTGCGGCCGCTCGAGCCTATGACACGGCGGTTTTCTATTTGAGAGGCCCGTCTGCA
Y S T P V A A A R A Y D T A V F Y L R G P S A
AGGCTTAATTTTCCCGAGTATTTGGCAGGAGAAAGTATTAGCGGCGGCGGCGGCGGCGGTGATATGTCG
R L N F P E Y L A G E S I S G G G G G G D M S
GCTGCTTCGATAAGGAAGAAAGCTACTGAGGTTGGAGCTAGAGTCGATGCT
A A S I R K K A T E V G A R V D A
Figura 4. Seqüência do promotor (em vermelho) e do fragmento da região codificante (cinza)
do gene DREB de R. communis L. A seqüência com letras azuis corresponde ao fragmento
inicialmente obtido com a utilização de primers degenerados.
4.2. Construção do vetor e transformação de plantas de fumo via Agrobacterium
tumefaciens
Com o propósito de estudar a funcionabilidade do promotor do gene RcDREB, foi
construído um cassete quimérico contendo a região codificante do gene gus (presente no
vetor pRCDREB1pro) (Figura 5). Este vetor foi utilizado para transformação de plantas de
fumo (Figura 6). O fumo foi escolhido por ser uma planta modelo, de mais fácil
transformação, enquanto o protocolo de transformação genética de mamona ainda não é
rotineiro e com freqüência de transformação muito baixa. Foi realizada uma curva de seleção
(dados não mostrados) com o agente seletivo glufosinato de amônio (GA) com a finalidade
Resultados & Discussão
31
de estabelecer a concentração do mesmo nas transformações. A curva demonstrou que se
poderia usar concentrações entre 1 e 4 mg/L de GA para selecionar brotos em regeneração.
Figura 5. Vetor final pRCDREB1pro utilizado para a transformação genética de fumo.
Resultados & Discussão
32
Figura 6. Estágios de desenvolvimento dos fragmentos foliares de fumo após a transformação
com Agrobacterium. (A) Explantes excisados após a co-cultura. (B), (C) e (D) Brotos
regenerandos a partir dos fragmentos foliares transformados. (E) Plântula de fumo em meio de
enraizamento, três meses posterior à transformação genética.
4.3. Detecção da PAT no tecido foliar em plantas de fumo regeneradas
As plantas regeneradas após a transformação genética foram submetidas ao teste
TraitCheck Crop and Grain Kit (Trait LL Test Kit- Strategic Diagnostic Inc. www.sdix.com), para
a verificação da presença do gene bar. O ensaio baseia-se na utilização de uma tira que é
colocada numa pequena quantidade de extrato da planta que contém a proteína PAT (proteína
fosfinotricina acetiltransferase). O anticorpo (anti-PAT) ligado a um polímero colorido se lida à
proteína PAT. Em seguida é realizada uma cromatografia e o anti-PAT associado ao polímero
poderá se ligar ao anticorpo específico contra PAT formando uma linha colorida na tira. A
membrana possui duas zonas de captura, uma específica para a proteína PAT e uma
específica para o anticorpo acoplado ao reagente colorido que não reagiu. Estas zonas de
Resultados & Discussão
33
captura exibem uma coloração avermelhada quando o sanduíche e/ou os reagentes coloridos
não reagidos são capturados nas zonas específicas da membrana (Figura 7). Com os
resultados confirmados para a presença do transgene bar. Este teste demonstrou que apenas
uma planta em um total de cerca de 100 plantas demonstrou a presença do transgene. A baixa
freqüência de transformação observada, associada ao alto número de escapes (plantas não-
transgênicas) está provavelmente ligada à concentração de GA utilizada. Provavelmente, uma
concentração maior poderia gerar um menor número de escapes e um maior número de
plantas transgênicas. A concentração de bactéria durante a co-cultura e a duração da co-
cultura são fatores importantes e determinantes na transformação. Na presença de latas
concentrações de bactérias, o tecido pode apresentar reações de hipersensibilidade a
Agrobacterium. Em condições de baixas concetrações, somente um pequeno número de
células vegetais podem ser transformado (Curtis et al., 1995). Geralmente o gene de interesse
é co- transferido juntamente com o gene de seleção. Porém, plantas transformadas podem
expressar o gene de seleção, mas não o gene de interesse ou vice-versa. Esta ocorrência
pode ser pela não-integração ou uma parcial integração de um dos transgenes (geralmente
quando ele está ao lado da extremidade da esquerda do T-DNA), ou há um silenciamento
provocado por co-supressão, epistasia ou um efeito do sítio de inserção. Além disso, um longo
período de cultura in vitro, pode ocasionar variações somaclonais por mutações insercionais da
região T-DNA. (Brasileiro & Dusi, 1998)
Resultados & Discussão
34
Figura 7. Teste realizado com extrato de folhas de fumo para detecção da proteína PAT. (1)
Teste com a planta de fumo transgênica, o aparecimento da linha inferior demonstra a
presença da proteína PAT. (2) Controle negativo realizado com folha de fumo não-
transformada, apenas a linha controle negativo foi observada.
4.4. Estudo da expressão do promotor do gene RcDREB em folhas de fumo transgênico
Para um estudo da funcionabilidade do promotor do gene RcDREB foi realizado um
ensaio histoquímico com tecidos foliares colocados em condições de dessecação (figura 8).
Resultados & Discussão
35
Figura 8. Expressão do gene gus em plantas de fumo sob condições de estresse hídrico. NT:
Planta de fumo não transgênica. (-):: gus: Planta de fumo sem promotor (vetor fechado).
5’RcDREB::gus: planta transgênica com a fusão do promotor do gene RcDREB e a região
codificante do gene gus. 35S::gus promotor do gene CaMV35S fusionado a região codificante
de gus.
Recentes pesquisas têm identificado e estudado diversos fatores de transcrição que
são importantes na regulação das respostas aos estresses bióticos e abióticos em plantas
(Argawal, et al., 2006; Abreu & Aragão, 2007). Os genes DREB têm sido isolados e
caracterizados de uma grande variedade de plantas, como Arabidopsis (Liu et al., 1998),
canola (Jaglo et al., 2001), trigo (Park et al., 2001), cevada (Choi et al., 2002), arroz (Doubozet
et al., 2003), soja (Liu et al, 2005) e fumo (Park et al., 2001). Estes genes podem ser
classificados, em relação à resposta ao tipo de estresse, em DREB1 e DREB2, conferindo
resposta a baixas temperaturas e ao déficit hídrico, respectivamente (Seki et al., 2003).
Como mostrado na figura 8, a expressão do gene gus foi diferenciada nas folhas de
fumo transformadas com o gene quimérico com o promotor do RcDREB controlando o gene
gus. Quando as folhas foram expostas a uma condição que simula o estresse hídrico por um
período de 4 h, foi possível observar a expressão gênica (visualizada pela reação histoquímica
Resultados & Discussão
36
de GUS), mostrando que o promotor tem resposta a esse estresse. A expressão se manteve
por um período de 8h (Figura 8). Não se observou expressão quando as plantas foram
transformadas com o vetor sem promotor ou em plantas não transgênicas. Como esperado,
plantas transformadas com o promotor CaMV35S controlando o gene gus mostraram
expressão durante todo o período, mesmo quando as folhas não foram submetidas ao estresse
(Figura 8). O estudo da expressão dos genes DREB é diferenciado em períodos submetidos ao
estresse abiótico. O DREB1 de Arabidopis foi induzido em 10 minutos a 4ºC e DREB2 foi
induzido no mesmo tempo, mas em condições de déficit hídrico e estresse salino (Doubozet et
al., 2003). Em arroz, a indução do gene DREB2 foi após 24 horas de desidratação e condições
de salinidade (Argawal et al., 2006). Estes trabalhos indicam que o estudo da expressão dos
genes DREB está relacionado com a exposição ao estresse abiótico, em que a indução
ocorrerá nestas condições desfavoráveis. Como observado na figura 8, o promotor pertencente
à família DREB conduziu a expressão do gene gus., após 4 horas de período de déficit hídrico.
Yamaguchi-Shinozaki e Shinozaki (1993) analisaram a expressão do gene gus controlado pelo
promotor RD29A (responsive drought 29 A) em plantas de Arabidopsis e de fumo em condições
de estresse abiótico. O resultado revelou alta tolerância à desidratação, baixa temperatura e
condições de estresse salino.
Como pode ser visto, os controles positivos, por possuir o promotor CaMV35S, que é
considerado de forte expressão em raízes, caules, folhas e pétalas de plantas de fumo (Odell
et al., 1985), apresentou coloração azul nos três tempos estabelecidos, permitindo a análise
comparativa com a planta de fumo transformada com o vetor pRCDREB1pro . Embora a
reação enzimática da GUS (vista pela coloração azul) pareça ser mais intensa nas folhas
com o CaMV35S::gus que em RcDREB::gus, este não é um ensaio quantitativo. Narusaka et
al.,( 2003) analisaram a expressão do gene gus controlada pelo promotor do gene RD29A
em condições de estresse hídrico e salino em plantas de Arabidopsis demostrando o nível de
expressão do gene repórter em condições de desidratação.
A expressão do gene DREB1 de Arabidopsis, controlada pelo promotor 35S conferiu
tolerância ao estresse hídrico e a baixa temperatura em plantas de tomate durante 21 dias,
porém houve retardo no crescimento e desenvolvimento da planta (Hsieh et al., 2002).
Resultados & Discussão
37
Batatas transformadas com o gene DREB1 de Arabidopsis, controlada por um promotor de
um gene relacionada ao estresse hídrico, RD29A, conferiu tolerância ao frio, mas não houve
influência no desenvolvimento do vegetal (Behnam et al., 2007). Estes estudos podem
indicar que a expressão dos genes DREB ocorre somente em condições de estresse
abiótico. Resposta molecular e bioquímica que reflete a capacidade do vegetal dispor de
mecanismos genéticos e acionar cascatas e rotas fisiológicas visando proteção à estrutura
celular.
Portanto, a identificação de promotores de genes induzidos pelo estresse hídrico é
importante para o desenvolvimento de estratégias funcionais apenas nesta condição. Esses
promotores, utilizados em construções quiméricas, poderão ser utilizados em plantas de
interesse agronômico como soja e feijão, possibilitando uma maior adaptação sob condições
de estresse hídrico.
4.5. Estudo filogenético do promotor do gene DREB de Ricinus communis L.
Foi realizada uma análise filogenética utilizando a seqüência proteíca DREB de
Ricinus communis correspondente ao gene RcDREB cujo promotor foi clonado neste estudo.
Foram reuniu alguns acessos do GenBank contendo seqüências das proteínas DREB e tipo-
DREB de várias espécies plantas. Esta análise mostrou que estas proteínas se agruparam
de acordo com a classificação da família gênica DREB (Figura 9). A família DREB apresenta
dois grandes grupos principais, DREB1 e DREB2 (Seki et al., 2003). Dois genes homólogos
do DREB1A (DREB1B e DREB1C) e um gene homólogo ao DREB2A (DREB2B) foram
isolados de Arabidopsis (Liu et al., 1998). Também foram identificados e caracterizados em
plantas de Arabidopsis dois genes homólogos de CBF1 (CBF2 e CBF3) (Gilmour et al., 1998;
Medina et al., 1999). O gene CBF1 é idêntico ao DREB1B; CBF2 e CBF3 são idênticos ao
DREB1C e DREB1A, respectivamente (Argawal et al., 2006). E o gene CBF4 é homólogo ao
gene CBF/DREB1, isolado e estudado da planta Arabidopsis (Haake et al., 2002).
Resultados & Discussão
38
Entretanto, pela importância na ativação e expressão de outros genes relacionados a
estresse abiótico e conseqüentemente na geração de respostas bioquímicas e fisiológicas, a
família gênica DREB pode também ser subdividida em seis pequenos grupos (A-1, A-2, A-3,
A-4, A-5 e A-6) (Sakuma et al., 2002). Após a análise, percebeu-se que a árvore filogenética
havia agrupado 5 grupos principais. O primeiro grupo, A-1 (Grupo DREB 1/CBF3) inclui os
genes que são induzidos por baixa temperatura, mas não pela seca ou alta salinidade. O
grupo A-2 (Grupo DREB2A) estão envolvidos em respostas ao déficit hídrico e condições de
alta concentração salina, porém não apresentam respostas à baixa temperatura.
A análise filogenética mostrou que o promotor do gene RcDREB alvo deste estudo está
incluído na grupo A-5 (os está colocada a maioria dos DREB2), relacionado com a resposta ao
estresse hídrico e são dependentes do acúmulo do ABA. Resposta bioquímica estudada neste
trabalho, em que a ativação do gene repórter gus, controlado pelo promotor do gene DREB de
mamona, foi iniciada em condições de déficit hídrico nas folhas de fumo transformada.
A expressão do gene DREB1 é extensivamente estudado em diferentes e culturas
agrícolas, entretanto um pequeno número de espécies de plantas tem sido estudado para a
expressão e caracterização do gene DREB2 (Argawal, et al., 2006). Desta forma, se ressalta a
importância do estudo de identificação e funcionabilidade dos genes da família DREB 2, a qual
confere tolerância ao déficit hídrico.
Durante o estresse abiótico, a concentração do hormônio ABA é alterada,
principalmente em períodos de déficit hídrico (Bray, 1993). Muitos genes relacionados à
resposta ao estresse abiótico são ativados pelo acúmulo deste hormônio, porém outros
grupos gênicos não estão precisam de um sinal biológico da presença do ABA. Desta forma,
há rotas bioquímicas que dependem do hormônio e outras rotas ocorrem de maneira
independente do acúmulo do ABA ( Shinozaki & Yamaguchi-Shinozaki, 1997).
Os grupos A-1 e A-2 pertencem a rota bioquímica independente do ABA. Os grupos
A-4, A-5 e A-6 pertencem à rota dependente do hormônio e, portanto requerem biossíntese
de proteínas específicas para a ativação de genes relacionados ao estresse hídrico (Liu et
al., 2007; Shinozaki & Yamaguchi-Shinozaki, 1997).
Resultados & Discussão
39
Figura 9. Análise filogenética das seqüências do gene DREB. As seqüências foram retirados
dos bancos de acesso GenBank e os agrupamentos foram realizados usando 1.000 repetições
(máxima parcimônia). São acessos da árvore: GmDREB1 (Glycine max): AAP47161; GhDBP1
(Gossypium hirsutum): AAO43165; GmDREB3 (Glycine max): ABB36646; OsRAP (Oryza
sativa): XP_468111; NaDBF1 (Narceus americanus): ABA43697; GmDREBc (Glycine max):
AAP83131; GmDREBa (Glycine max): AAT12423; TaDREB1(Triticum aestivum): AAL01124;
OsDREB2A (Oryza sativa):AAN02487; ZmDBF1 (Zea mays): AAM80486; GhDBP2 (Gossypium
hirsutum): AAT39542; GmDERBb (Glycine max):AAQ57226; HvCBF6 (Hordeum vulgare):
AAX23701; TaCBF6 (Triticum aestivum): AAX28964; ElCBF3 (Enicurus leschenaulti):
AAX57257; OsDREB1A (Oryza sativa): AAN02486; OsDREB1D (Oryza sativa):BAD67595;
AsCBF1 (Avena sativa): CAJ21276; BCBF1 (Hordeum vulgare): AAK01088; ScCBF-like2
(Secale cereale):AAL35759; TaCBF1 (Triticum aestivum): AAL37944; OsDREB1C (Oryza
sativa): BAA90812; HvCBF2 (Hordeum vulgare):AAM13419; OsDREB1E (Oryza sativa):
AAX23722; CaCBF1B (Capsicum annuum): AAQ88400; Cb-CBF (Capsella bursa-pastoris):
AAR26658; LeCBF1 (Lycopersicon esculentum):AAK57551; BnCBF (Brassica napus):
AAL38243; PaDREB1 (Prunus avium):BAD27123, OsDREB1D (Oryza sativa): AAX23723;
ZmDBF2 (Zea mays): AAM80485 ;OsPAP (Oryza sativa): NP_922723; TINY2 (Arabidopsis
thaliana): AAX38232. Em destaque na cor vermelho está a posição da análise da seqüência
proteíca DREB de Ricinus communis correspondente ao gene RcDREB na árvore filogenética.
Resultados & Discussão
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Conclusão
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Foi obtida uma seqüência regulatória (5´) do gene DREB de Ricinus communis. Esta
seqüência foi obtida usando a técnica de TAIL-PCR que se mostrou altamente eficiente
para esse fim.
A expressão do promotor do gene DREB de mamona foi observada como dependente de
condições de estresse hídrico, sendo iniciada após 4 horas de estresse.
O promotor obtido da mamona pertence à família gênica DREB grupo A5, caracterizado
na resposta ao estresse hídrico e pertencente à rota dependente do acúmulo de ABA.
Estes resultados são muito importante do ponto de vista biotecnológico, uma vez que é
fundamental termos seqüências regulatórias que sejam funcionais apenas sob a
condição de estresse, o que permite a expressão de genes que conferem tolerância ao
déficit hídrico, sem que ocorram respostas indesejáveis.
Perspectivas do trabalho
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Novas transformações devem ser efetuadas, com a finalidade de se obter mais
plantas transgênicas. Desta forma se poderá analisar a expressão do gene gus sob o
controle do promotor clonado neste estudo em um maior número de indivíduos. Também
haverá a necessidade de se estudar sua funcionabilidade em diversas partes da planta
transformada, além da folha, incluindo flor, grão de pólen, caule e raiz, em diferentes
condições de estresse hídrico, salino e frio. Além de estudar o efeito na presença do ABA.
Não há muitos estudos sobre a expressão dos genes DREB em tecido-específico. Shen et al,
(2003) analisaram a expressão do gene AtDREB2 e AhDREB1 em raiz, caule e folhas em
plantas de Triticum aestvum.
Contribuindo à pesquisa, será realizada Northern blot e RT-PCR semi-quantitativo,
além das análises histoquímicas, citoquímica e fluorimétrica da atividade da
-
glucuronidase (ensaio quantitativo) sob condições de estresse abiótico em plantas de fumo
transgênicas. Em nossa perspectiva de trabalho, esperamos submeter um artigo mostrando
o estudo da expressão do promotor do gene tipo DREB de mamona em função da resposta a
fatores de estresses ambientais.
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Gel de agarose 1%
Para preparar 100mL de gel. Pesar 1g de agarose e dissolver por aquecimento em tampão
TBE 0,5X.
TBE 10X
Dissolver 108g de Tris base, 55 g de ácido bórico e 40mL de EDTA 500mM, pH 8,0, em água
destilada. Completar o volume até 1 litro.
EDTA 500Mm, pH 8,0
Adicionar 186,1g de Na
2
EDTA.2H
2
O a 800mL de água destilada e homogeneizar com agitador
magnético. Ajustar o pH para 8,0 com NaOH (aproximadamente 20g de NaOH em pastilhas). O
EDTA não irá solubilizar completamente até que a solução atinja o pH determinado. Completar
o volume até 1 litro e depois esterilizar em autoclave.
Reguladores de crescimento utilizados no trabalho
Nome Classe Peso
molecular
Solvente/Concentração
estoque
Modo de
esterilização
Condições
de
estocagem
(solução)
BAP(6-
benzilaminopurina
ou 6-
enziladenina)
Citocinina 225,2 NaOH 1N 0,01 a 5mg/ml Autoclave ou
filtração
0 a 5ºC
ANA (Ácido
naftalenoacético)
Auxina 186,2 NaOH 1N 0,01 a
10mg/ml
Autocalve 0 a 5ºC
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Clonagem e Estudo Funcional do Promotor do Gene DREB de Mamona –Ricinus
communis L.
Morais, Angélica Taveira
1
; Aragão, Francisco José Lima
2
1
Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Botânica na Universidade de Brasília (UnB),
Campus Universitário Darcy Ribeiro, Asa Norte, Caixa Postal 04457,CEP 70910-970, Brasília,
Distrito Federal, fone (61) 3307-2828, e-mail: angelicataveira@gmail.com;
2
Pesquisador da
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Embrapa-Cenargen), Parque Estação Biológica
- PqEB - Av. W5 Norte (final), Caixa Postal 02372, CEP 70770-900, Brasília, Distrito Federal,
Fone: (61) 3448-4700 ,e-mail:aragao@cenargen.embrapa.br.
Um dos principais estresses que restringem a capacidade e a eficiência da planta realizar os
processos bioquímicos importantes é a falta de água. As conseqüências para o vegetal vão
desde alterações no volume celular à desnaturação de importantes proteínas, e dependendo
da intensidade do estresse, poderá ocasionar a morte da planta. Com isso, as plantas
apresentam mecanismos bioquímicos que respondem ao estresse hídrico. Estas respostas
envolvem as funções de muitos genes que podem ocorrer em segundos ou levar horas,
conferindo ao vegetal a capacidade de tolerar aquela condição desfavorável. Um dos
mecanismos gênicos envolvidos na geração de respostas ao estresse hídrico em plantas, é
mediado pela expressão do gene DREB-CBF (Dehydration-responsive element binding
protein/C-repeat-binding factor). Este gene codifica para uma proteína regulatória, proteína
DREB, um fator de transcrição que está envolvido na ativação de outros genes relacionados à
tolerância ao estresse hídrico. Trabalhos indicaram que uma maior expressão do gene DREB
de arroz em plantas transgênicas de Arabidopsis, aumentaram a tolerância deste por períodos
de falta de água. Então, temos trabalhado para a clonagem do gene DREB de mamona,
conhecidamente uma planta com grande tolerância a seca, e superexpressá-lo em plantas de
tabaco e assim estudar as respostas de tolerância à seca nesta planta modelo. Para isso,
clonamos a região completa do promotor, e estamos concluindo o seqüenciamento da região
codante. Esperamos no futuro extrapolar os melhores resultados, em caso positivo, para
culturas de maior importância.
PALAVRAS-CHAVE: Estresse hídrico; DREB; Ricinus communis L.
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