( PDF ) Atividade inseticida de espécies de Trichilia frente à lagarta-do-cartucho do milho Spodoptera frugiperda

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

“ATIVIDADE INSETICIDA DE ESPÉCIES DE Trichilia

FRENTE À LAGARTA-DO-CARTUCHO DO MILHO

Spodoptera frugiperda”

LILIANE NEBO*

Dissertação apresentada como

parte dos requisitos para obtenção

do título de MESTRE EM

QUÍMICA, área de concentração:

QUÍMICA ORGÂNICA.

Orientador: Prof. Dr. Paulo Cezar Vieira

* Bolsista FAPESP

São Carlos - SP

2008

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Milhares de livros grátis para download.

Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da

Biblioteca Comunitária da UFSCar

N361ai

Nebo, Liliane.

Atividade inseticida de espécies de trichilia frente à

lagarta-do-cartucho do milho spodoptera frugiperda / Liliane

Nebo. -- São Carlos : UFSCar, 2008.

157 f.

Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São

Carlos, 2008.

1. Química orgânica. 2. Produtos naturais. 3. Atividade

inseticida. 4. Spodoptera frugiperda. 5. Trichilia. 6.

Meliaceae. I. Título.

CDD: 547 (20

)

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DEDICO ESTE TRABALHO

À MEMÓRIA DO MEU PAI, DENE NEBO

À MINHA MÃEZINHA QUERIDA, OLGA FUMICO NEBO

E A TODA MINHA FAMÍLIA, PELO AMOR E DEDICAÇÃO

E POR ESTAREM SEMPRE AO MEU LADO.

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Paulo Cezar Vieira pelo apoio, ensinamentos e orientação durante a

realização deste trabalho.

Aos Professores, Dr. João Batista Fernandes, Dra. Maria Fátima das Graças

Fernandes da Silva, Dr. Edson Rodrigues Filho e Dra. Arlene Gonçalves Corrêa,

pelos ensinamentos e colaboração.

Aos demais professores do DQ-UFSCar pela contribuição na minha formação.

À Dra. Andréia Pereira Matos pelos ensinamentos, paciência, carinho e

principalmente sua amizade.

Aos técnicos Waldir, Doraí, Paulo e Luciana pelo apoio durante este trabalho.

Aos meus amigos do Laboratório de Produtos Naturais da UFSCar, pela

amizade, troca de experiências e ótimo convívio.

As alunas de iniciação científica Daniela, Alini e Érika que colaboraram com o

desenvolvimento deste trabalho.

Aos amigos dos laboratórios de CLAE, SÍNTESE, MASSAS, RMN E LSPN,

em especial à aluna Bruna do LSPN.

À minha mãe, aos meus irmãos, cunhados, cunhada, sobrinhas e sobrinhos,

muito obrigada pelo amor, carinho e incentivo na realização deste sonho.

À minha irmã Carol pela amizade, conselhos e por me apoiar sempre.

Às demais pessoas que direta ou indiretamente contribuíram para a realização

deste trabalho.

À FAPESP, pela bolsa concedida.

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

AcO Acetato

AcOEt Acetato de etila

ax Axial

CCDA Cromatografia em camada delgada analítica

CDCl

Clorofórmio deuterado

OD Metanol deuterado

CG-EM Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas

Diclorometano

CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência

COSY

Correlated spectroscopy

O Água deuterada

Dubleto

Duplo-dubleto

Duplo-quadrupleto

Duplo-tripleto

ddd

Duplo-duplo-dubleto

ddt

Duplo-duplo-tripleto

eq Equatorial

ESI

Electrospray ionization

ESI/MS Espectrometria de massas por ionização por electrospray

eV Elétron volt

h Altura

HMBC

Heteronuclear Multiple Quantum Correlation

HSQC

Homonuclear Single Quantum Correlation

Hz Hertz

IE Impacto eletrônico

Constante de acoplamento

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

Multipleto

MeOH Metanol

MHz Mega hertz

m/z

Relação massa/carga

nm nanômetro

OMe Metoxila

p. Página

RMN

H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN

C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono

Singleto

Singleto largo

tripleto

UR Umidade relativa

Deslocamento químico em partes por milhão

Diâmetro

Ȝ Comprimento de onda

LISTA DE TABELAS

VII

LISTA DE TABELAS

TABELA 1.1: Classificação morfológica da família Meliaceae segundo

Pennington e Styles

(PENNINGTON, 1975)

TABELA 3.1: Identificação dos códigos dos extratos 25

TABELA 3.2: Resultado do ensaio realizado com as frações: Tslm1,

Tslm2, Tslm3 e Tslm4 na concentração de 10,0 mg/mL

em triplicata

TABELA 3.3: Resultado do ensaio realizado com as frações: Tslm1-Fr1

a Tslm1-Fr6 na concentração de 10,0 mg/mL em triplicata

TABELA 3.4: Resultado do ensaio realizado com as frações: Tslm1-

Fr4(1) a Tslm1-Fr4(5) na concentração de 10,0 mg/mL

em triplicata

TABELA 3.5: Resultado do ensaio realizado com as frações: Tslm1-

Fr4(4)-1 a Tslm1-Fr4(4)-6 na concentração de 10,0

mg/mL em triplicata.

TABELA 3.6: Resultado do ensaio realizado com a fração Tslm1-Fr3(2)

na concentração de 10,0 mg/mL em triplicata.

TABELA 3.7: Identificação dos códigos dos ácidos graxos 38

TABELA 3.8: Resultado do ensaio realizado com as frações Tflcm1 a

Tflcm4, na concentração de 10,0 mg/mL em triplicata

TABELA 3.9: Compostos identificados na fração Tslm1-Fr4(4)-2,

obtidos via CG-EM

TABELA 3.10: Compostos identificados na fração Tslm1-Fr3(2), obtidos

via CG-EM

TABELA 3.11: Compostos identificados na fração Tslm1-Fr4(4)-3,

obtidos via CG-EM

TABELA 3.12: Compostos identificados na fração Tslm1-Fr4(3), obtidos

via CG-EM

LISTA DE TABELAS

VIII

TABELA 3.13: Dados de RMN de

H de N-metilprolina (XX) e

comparação com a literatura

TABELA 3.14: Dados de RMN de

H de 4-hidroxi-N-metilprolina (XXI)

e comparação com a literatura

TABELA 3.15: Dados de RMN de

C de N-metilprolina (XX) e

comparação com a literatura

TABELA 3.16: Dados de RMN de

C de 4-hidroxi-N-metilprolina (XXI)

e comparação com a literatura

TABELA 3.17: Dados de RMN de

H da uridina (XXII) e comparação

com a literatura

TABELA 3.18: Dados de RMN de

H da uracila (XXIII) e comparação

com a literatura

TABELA 3.19: Dados de RMN de

C da uridina (XXII) e comparação

com a literatura

TABELA 3.20: Dados de RMN de

H da ent-catequina (XXIV) e

comparação com a literatura

TABELA 3.21: Dados de RMN de

C da ent-catequina (XXIV) e

comparação com a literatura

TABELA 3.22: Dados de RMN de

H do ácido 5-O-cafeoilquínico

(XXV) e comparação com a literatura

TABELA 3.23: Dados de RMN de

C do ácido 5-O-cafeoilquínico

(XXV) e comparação com a literatura

TABELA 3.24: Dados de RMN de

H de 11ȕ-acetoxiobacunona (XXVI)

e comparação com a literatura (XXVIa).

TABELA 3.25: Dados de RMN de

C de 11ȕ-acetoxiobacunona (XXVI)

e comparação com a literatura (XXVIa).

100

TABELA 3.26: Dados de RMN de

H de (XXVII) e comparação com a

literatura (XXVIIa)

108

LISTA DE TABELAS

TABELA 3.27: Dados de RMN de

C de (XXVII) e comparação com a

literatura (XXVIIa).

109

TABELA 3.28: Dados de RMN de

C da aglicona do sitosterol (XXVIII)

e comparação com a literatura

117

TABELA 3.29: Dados de RMN de

C do grupo glicosil (XXVIII)e

comparação com a literatura

118

TABELA 4.1: Extratos brutos das partes dos frutos de T. elegans e T.

claussenii

126

TABELA 4.2: Extrato bruto das inflorescências de T. catigua 128

TABELA 4.3: Frações provenientes do fracionamento do extrato Tslm 129

TABELA 4.4: Frações provenientes do fracionamento do extrato Tflcm 134

TABELA 4.5: Frações provenientes do fracionamento do extrato Tcsem 137

TABELA 4.6: Frações provenientes do fracionamento do extrato Tsem 137

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1.1: Estrutura dos limonóides gedunina e azadiractina 3

FIGURA 1.2: Os triterpenos eufol (III) e tirucalol (IV) 3

FIGURA 1.3: Substâncias que representam os principais tipos de

esqueletos dos limonóides de Meliaceae

FIGURA 1.4: O limonóide heudebolina 6

FIGURA 1.5: Árvore adulta de Trichilia claussenii. Em destaque

folhas com flores, frutos maduros sementes, casca e

madeira

FIGURA 1.6: Ȗ-lactonas e ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alcenóicos

isolados dos frutos de Trichilia claussenii

FIGURA 1.7: Esteróides isolados dos frutos de Trichilia claussenii 10

FIGURA 1.8: Árvore adulta, folhas e flores de Trichilia catigua 10

FIGURA 1.9: Limonóides isolados de sementes de Trichilia catigua 11

FIGURA 1.10: Folhas e frutos de Trichilia elegans ssp. elegans 12

FIGURA 1.11: Seco-A-protolimonóides isolados de sementes de

Trichilia elegans

FIGURA 1.12: Limonóides isolados de sementes de Trichilia elegans 14

FIGURA 1.13: Limonóides isolados de sementes de Trichilia elegans 15

FIGURA 1.14: Cumarinas isoladas dos frutos de Trichilia elegans 15

FIGURA 1.15: Ciclo de vida da Spodoptera frugiperda 17

FIGURA 3.1: Estrutura do TMOF, indicação da região do peptídeo

em que foram baseados os ácidos não peptídicos

FIGURA 3.2: Espectro de RMN

H da fração Tslm1-Fr4(4)-2 (400

MHz, CDCl

)

FIGURA 3.3: Cromatograma da fração Tslm1-Fr4(4)-2 49

FIGURA 3.4: Ampliação do cromatograma da fração Tslm1-Fr4(4)-2 50

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 3.5 Espectros de massas referente aos picos 2, 3 e 5 obtidos

via CG-EM.

FIGURA 3.6: Espectros de massas referente aos picos 6, 8 e 9 obtidos

via CG-EM

FIGURA 3.7 Espectros de massas referente aos picos 11, 12 e 13

obtidos via CG-EM

FIGURA 3.8: Espectros de massas referente aos picos 14, 15 e 16

obtidos via CG-EM.

FIGURA 3.9: Espectros de massas referente aos picos 17, 20 e 21

obtidos via CG-EM

FIGURA 3.10: Espectros de massas referente aos picos 23, 25 e 26

obtidos via CG-EM

FIGURA 3.11: Espectros de massas referente aos picos 27, 29 e 30

obtidos via CG-EM

FIGURA 3.12: Espectro de RMN

H da fração Tslm1-Fr3(2) (400

MHz, CDCl

)

FIGURA 3.13: Cromatograma da fração Tslm1-Fr3(2) 59

FIGURA 3.14: Cromatograma da fração Tslm1-Fr4(4)-3 63

FIGURA 3.15: Principais fragmentos observados nos espectros de

massas das Ȗ-lactonas

FIGURA 3.16: Espectros de massas referente aos picos 23 e 25 obtidos

via CG-EM.

FIGURA 3.17: Espectros de massas referente aos picos 26, 27 e 30

obtidos via CG-EM

FIGURA 3.18: Espectros de massas referente aos picos 31, 32 e 33

obtidos via CG-EM

FIGURA 3.19: Espectro de RMN de

H da fração Tslm1-Fr4(4)-3 (100

MHz, CDCl

)

LISTA DE FIGURAS

XII

FIGURA 3.20: Espectro de RMN de

C da fração Tslm1-Fr4(4)-3

(100 MHz, CDCl

)

FIGURA 3.21: Cromatograma da fração Tslm1-Fr4(3) 72

FIGURA 3.22: Espectro de massa referente ao pico 25 obtido via CG-

FIGURA 3.23: Espectros de massas referente aos picos 30 e 31 obtidos

via CG-EM

FIGURA 3.24: Espectro de RMN de

H dos aminoácidos: N-

metilprolina (XX) e 4-hidroxi-N-metilprolina (XXI)

(400 MHz, D

FIGURA 3.25: Ampliação do espectro de RMN de

H dos

aminoácidos: N-metilprolina (XX) e 4-hidroxi-N-

metilprolina (XXI) (400 MHz, D

FIGURA 3.26 Espectro de RMN de

C dos aminoácidos: N-

metilprolina (XX) e 4-hidroxi-N-metilprolina (XXI)

(100 MHz, D

FIGURA 3.27: Espectro de RMN de

H de XXII e XXIII (400 MHz,

OD)

FIGURA 3.28: Ampliação do espectro de RMN de

H de XXII e

XXIII (400 MHz, CD

OD)

FIGURA 3.29: Mapa de correlações HSQC de XXII e XXIII (400

MHz, CD

OD)

FIGURA 3.30: Mapa de correlações HMBC de XXII e XXIII (400

MHz, CD

OD)

FIGURA 3.31: Espectro de RMN de

H da ent-catequina (XXIV) (400

MHz, CD

OD)

FIGURA 3.32: Expansão do espectro de RMN de

H da ent-catequina

(XXIV) (400 MHz, CD

OD)

LISTA DE FIGURAS

XIII

FIGURA 3.33: Espectro de RMN de

C da ent-catequina (XXIV) (100

MHz, CD

OD)

FIGURA 3.34: (A) Espectro de RMN de

H do ácido 5-O-

cafeoílquínico (XXV) (400 MHz, CD

OD). (B)

Ampliação do espectro de RMN de

H de XXV

FIGURA 3.35: Mapa de correlações HSQC do ácido 5-O-

cafeoílquínico (XXV) (400 MHz, CD

OD)

FIGURA 3.36: Mapa de correlações HMBC do ácido 5-O-

cafeoílquínico (XXV) (400 MHz, CD

OD)

FIGURA 3.37: (A) Espectro de RMN de

H de 11ȕ-acetoxiobacunona

(XXVI) (400 MHz, CDCl

). (B) Ampliação do espectro

de RMN de

H de XXVI

101

FIGURA 3.38: Espectro de RMN de

C de 11ȕ-acetoxiobacunona

(XXVI) (100 MHz, CDCl

)

102

FIGURA 3.39: Mapa de correlações HSQC de 11ȕ-acetoxiobacunona

(XXVI) (400 MHz, CDCl

)

102

FIGURA 3.40: Mapa de correlações HMBC de 11ȕ-acetoxiobacunona

(XXVI) (400 MHz, CDCl

)

103

FIGURA 3.41: Ampliação do mapa de correlações HMBC de 11ȕ-

acetoxiobacunona (XXVI) (400 MHz, CDCl

)

103

FIGURA 3.42: Espectro de RMN de

H de XXVII (400 MHz, CDCl

) 110

FIGURA 3.43: Espectro de RMN de

C de XXVII (100 MHz, CDCl

) 110

FIGURA 3.44: Espectro de Cosy

H-

H de XXVII (400 MHz, CDCl

) 111

FIGURA 3.45: Mapa de correlações HSQC de XXVII (400 MHz,

CDCl

)

111

FIGURA 3.46: Mapa de correlações HMBC de XXVII (400 MHz,

CDCl

)

112

FIGURA 3.47: Ampliação do mapa de correlações HMBC de XXVII

(400 MHz, CDCl

)

112

LISTA DE FIGURAS

XIV

FIGURA 3.48: Espectro de massas (ESI no modo positivo) do

limonóide (XXVII)

113

FIGURA 3.49: Espectro de RMN de

H do 3-ȕ-O-ȕ-glucopiranosil

sitosterol (XXVIII) (400 MHz, Piridina-d

115

FIGURA 3.50: Ampliação do espectro de RMN de

H do 3-ȕ-O-ȕ-

glucopiranosil sitosterol (XXVIII) (400 MHz, Piridina-

115

FIGURA 3.51: Espectro de RMN de

C do 3-ȕ-O-ȕ-glucopiranosil

sitosterol (XXVIII) (100 MHz, Piridina-d

116

LISTA DE FLUXOGRAMAS

FLUXOGRAMA 4.1: Obtenção dos extratos de espécies de Trichilia 127

FLUXOGRAMA 4.2: Procedimento geral de partição líquido-líquido

dos extratos metanólicos

129

FLUXOGRAMA 4.3: Fracionamento da fração Tslm1 e Tslm1(Fr-3) 130

FLUXOGRAMA 4.4: Fracionamento da fração Tslm1Fr(4) e

Tslm1Fr(4)-4

131

FLUXOGRAMA 4.5: Fracionamento da fração Tslm3 133

FLUXOGRAMA 4.6: Fracionamento da fração Tflcm1 135

FLUXOGRAMA 4.7: Fracionamento da fração Tflcm2 136

FLUXOGRAMA 4.8: Fracionamento da fração Tcsem2 139

FLUXOGRAMA 4.9: Fracionamento da fração Tsem2 140

FLUXOGRAMA 4.10: Fracionamento do extrato Tseh 141

LISTA DE GRÁFICOS E ESQUEMAS

XVI

LISTA DE GRÁFICOS

GRÁFICO 3.1: Resultado do ensaio de toxicidade realizado com

extratos de T. elegans na concentração de 1,0 mg/mL

em quintuplicata

GRÁFICO 3.2: Resultado do ensaio realizado com extratos de T.

elegans na concentração de 10,0 mg/mL

GRÁFICO 3.3: Resultado do ensaio realizado com extratos de T.

claussenii na concentração de 10,0 mg/mL

GRÁFICO 3.4: Resultado do ensaio realizado com extrato de T. catigua

na concentração de 10,0 mg/mL

GRÁFICO 3.5: Resultado do ensaio realizado com os ácidos graxos

(C5-C16) na concentração de 1,0 mg/mL em triplicata

GRÁFICO 3.6: Resultado do ensaio realizado com os ácidos graxos

(C5-C16) na concentração de 10,0 mg/mL em triplicata

LISTA DE ESQUEMA

ESQUEMA 3.1: Metodologia geral utilizada na obtenção de substâncias

ativas

RESUMO

ATIVIDADE INSETICIDA DE ESPÉCIES DE Trichilia FRENTE À

LAGARTA-DO-CARTUCHO DO MILHO Spodoptera frugiperda – Este

trabalho apresenta o estudo fitoquímico e os ensaios biológicos realizados com

os extratos orgânicos dos frutos e sementes das espécies Trichilia claussenii, T.

elegans e inflorescências T. catigua sobre Spodoptera frugiperda. Dentre os

extratos ensaiados, os extratos metanólicos das sementes de T. claussenii e

inflorescências de T. catigua foram os que apresentaram a mais alta atividade

inseticida, com 64,0 e 64,4 % de mortalidade, respectivamente. O estudo

biomonitorado do extrato metanólico das sementes de T. claussenii levou a

identificação dos ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alquenóicos, substâncias ativas

neste extrato. Do extrato metanólico das inflorescências de T. catigua foi isolado

o flavonóide ent-catequina, associado à atividade inseticida encontrada neste

extrato. Ácidos graxos com cadeias metilênicas variando entre C-5 a C-16 foram

testados sobre S. frugiperda. Ensaios mostraram que os ácidos hexanóico,

nonanóico e decanóico apresentaram altas taxas de mortalidade na concentração

de 10,0 mg/mL. Através do estudo dessas três espécies foi possível isolar e ou

identificar as substâncias: ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alquenóicos, Ȗ-lactonas, 4-

hidróxi-N-metilprolina, N-metilprolina, uridina, uracila, ent-catequina, ácido 5-

O-cafeoilquínico, os esteróides 3-ȕ-O-ȕ-D-glucopiranosil sitosterol, ȕ-sitosterol,

campesterol, estigmasterol e sitostenona. Sendo os limonóides 11ȕ-

acetoxiobacunona e 1,2–diidro-1Į-acetoxi-11ȕ-acetoxi-14,15-epoxicneorina R

isolados pela primeira vez no gênero Trichilia.

XVII

ABSTRACT

INSECTICIDAL ACTIVITY OF Trichilia SPECIES AGAINST ON FALL

ARMYWORM Spodoptera frugiperda. This work presents the phytochemical

study and biological assays carried out with organic extracts of fruits and seeds

from Trichilia claussenii, T. elegans and inflorescence from T. catigua against

S. frugiperda. Among the extracts assayed, the methanol extracts of seeds from

T. claussenii and inflorescence from T. catigua presented the highest insecticidal

activity, with 64,0 and 64,4 % of mortality, respectively. The bioassay-guided

study of the methanol extract of seeds from T. claussenii led to identification of

Ȧ-phenylalkyl and alkenyl fatty acids, active substances in this extract. The

flavonoid ent-catequin was isolated from the methanol extract of inflorescence

from T. catigua and it was associated with the insecticidal activity found in this

extract. Fatty acids with the methylene chains ranging from C-5 to C-16 were

assayed against S. frugiperda. Tests showed that the hexanoic, nonanoic and

decanoic acids, displayed the highest rate of mortality at concentration of 10,0

mg/mL. The study of the three species allowed isolating and identifying the

following compounds: a mixture of Ȧ-phenylalkyl and alkenyl fatty acids, Ȗ-

lactonas, 4-hydroxy-N-methylproline, N-methylproline, uridine, uracile, ent-

catequin, 5-O-cafeoylquinic acid and the steroids 3-ȕ-O-ȕ-D-

glucopyranosilsitosterol, ȕ-sitosterol, campesterol, estigmasterol e sitostenone.

The limonoids 11ȕ-acetoxyobacunone and 1,2-dihiyro-1Į-acetoxy-11ȕ-acetoxy-

14,15-epoxycneorin R were isolated for the first time from a Trichilia species.

XVIII

SUMÁRIO

1- Introdução 2

1.1 – A família Meliaceae 2

1.2 – O gênero Trichilia 5

1.2.1 - Trichilia claussenii C. DC. 8

1.2.1.1 – Constituintes químicos anteriormente isolados de frutos de

Trichilia claussenii C. DC.

1.2.2 – Trichilia catigua A. Juss. 10

1.2.2.1 – Constituintes químicos anteriormente isolados de sementes de

Trichilia catigua A. Juss.

1.2.3 - Trichilia elegans ssp. elegans A. Juss 12

1.2.3.1 - Constituintes químicos anteriormente isolados de frutos e

sementes Trichilia elegans A. Juss.

1.3 Considerações sobre Spodoptera frugiperda

(J. E. Smith, 1797)

(Lepidóptera: Noctuidae)

1.4 – Atividade de espécies de Trichilia sobre Spodoptera frugiperda 18

1.5 – A busca de novos compostos inseticidas para o controle de insetos-

praga

2 – Objetivos 21

3 – Resultados e Discussões 23

3.1 - Busca de substâncias com atividade inseticida sobre Spodoptera

frugiperda

3.1.1 - Extratos de espécies de Trichilia 24

3.1.2 - Avaliação da atividade inseticida dos extratos brutos de Trichilia

ssp. sobre lagarta Spodoptera frugiperda

3.1.2.1 - Ensaios biológicos realizados com o extrato metanólico das

sementes de T. claussenii

XIX

SUMÁRIO

3.1.2.2 - Ensaios biológicos realizados com ácidos graxos 37

3.1.2.3 - Ensaios biológicos realizados com o extrato metanólico das

inflorescências de T. catigua

3.2 – Substâncias isoladas e identificadas 42

3.3 – Identificação estrutural 47

3.3.1 - Identificação dos ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alquenóicos (I-VIII) 47

3.3.2 - Identificação das Ȗ-lactonas (IX-XIX) 61

3.3.3 – Identificação dos aminoácidos N-metilprolina (XX) e 4-hidroxi-

N-metilprolina (XXI)

3.3.4 - Identificação da uridina (XXII) e uracila (XXIII) 79

3.3.5 - Identificação do flavonóide ent-catequina (XXIV) 84

3.3.6 - Identificação do ácido 5-O-cafeoilquínico (XXV) 89

3.3.7 – Determinação estrutural dos limonóides 94

3.3.7.1 – Identificação do limonóide 11ȕ-acetoxiobacunona (XXVI) 95

3.3.7.2 – Identificação do limonóide 1,2 –diidro-1Į-acetoxi-11ȕ-acetoxi-

14,15-epoxicneorina R (XXVII)

104

3.3.8 – Identificação dos esteróides 114

3.3.8.1 – Identificação de 3-ȕ-O-ȕ-glucopiranosil sitosterol (XXVIII) 114

3.3.8.2 – Identificação da mistura do esteróides (XXIX a XXXII) 119

4 – Procedimentos Experimentais 121

4.1 – Materiais e Métodos 122

4.2 – Equipamentos 123

4.3 – Material Botânico 125

4.4 – Preparação dos materiais vegetais e obtenção extratos brutos de T.

catigua, T. elegans e T. claussenii

125

4.4.1 – Obtenção dos extratos brutos dos frutos de T. claussenii e T.

elegans

125

4.4.2 – Obtenção dos extratos brutos da inflorescência de T. catigua 127

SUMÁRIO

4.5 – Fracionamento dos extratos de espécies de Trichilia 128

4.5.1 – Fracionamento do extrato Tslm 128

4.5.1.1 – Fracionamento da fração Tslm1 130

4.5.1.2 – Fracionamento da fração Tslm3 132

4.5.2 – Fracionamento do extrato Tflcm 134

4.5.2.1 – Fracionamento das frações Tflcm1 e Tflcm2 135

4.5.3 – Fracionamento dos extratos Tcsem e Tsem 137

4.5.3.1 – Fracionamento da fração Tcsem2 139

4.5.3.2 – Fracionamento da fração Tsem2 140

4.5.3.3 – Fracionamento do extrato Tseh 141

4.6 – Reação de esterificação com diazometano 142

4.7 – Ensaio biológico 143

4.7.1 - Ensaios de toxicidade realizados sobre Spodoptera frugiperda 143

5 – Conclusões 145

6 – Referências Bibliográficas 150

XXI

PARTE 1

INTRODUÇÃO

1 – INTRODUÇÃO

1.1 - A família Meliaceae

A família Meliaceae, pertencente à ordem Rutales, é constituída por

51 gêneros de plantas lenhosas que se distribuem em regiões tropicais e

subtropicais de ambos os hemisférios terrestres. O número de espécies é de

aproximadamente 1400

(BANERJI, 1984). Os gêneros encontrados no Brasil são

Cedrela, Cabralea, Swietenia, Carapa, Guarea e Trichilia, sendo os três

primeiros exclusivamente americanos (PENNINGTON & STYLES, 1975).

As meliáceas, geralmente são árvores de grande porte, conhecidas

pela qualidade de suas madeiras (mogno, cedro-rosa, canjerana) (BANERJI &

NIGAN, 1984), elas também se destacam pela bioatividade de vários de seus

metabólitos secundários, principalmente os limonóides. Esta classe de compostos

tem apresentado diversos tipos de atividades biológicas, tais como:

antiparasitária, citotóxica, antimalárica, antiviral, antibacteriana e principalmente

inseticida (BRAY et al., 1990; CHAMPAGNE et al., 1992).

A química dos limonóides de Meliaceae começou em 1960, com o

isolamento da gedunina (I) (FIGURA 1.1) de Entandrophragma angolense

(TAYLOR, 1984). A partir de então muitos limonóides têm sido isolados de

espécies desta família, sendo a azadiractina (II) (FIGURA 1.1) de Azadirachta

indica (Meliaceae) (BUTTERWORTH & MORGAN, 1968) o mais conhecido. A

azadiractina possui um grande potencial inseticida, apresentando atividade frente

a várias espécies de insetos. Este composto interfere no funcionamento das

glândulas endócrinas que controlam a metamorfose em insetos, impedindo o

desenvolvimento da ecdise (REMBOLD, 1989).

INTRODUÇÃO

OAc

AcO

OCH

GEDUNINA - I AZADIRACTINA - II

FIGURA 1.1 - Estrutura dos limonóides gedunina e azadiractina.

A azadiractina apresenta atividade fagoinibidora, que constitui uma

das atividades mais relevantes relatadas para as plantas da família Meliaceae

(LEE et al., 1991), seu efeito foi comprovado para aproximadamente 300

espécies de insetos (MARTINEZ, 2002).

Quimicamente, os limonóides são derivados de triterpenos

tetracíclicos, eufol (III) ou tirucalol (IV) (FIGURA 1.2), onde ocorrem várias

oxidações e rearranjos, levando à formação de diferentes tipos estruturais

(CONNOLLY, 1983). Segundo a classificação de proposta por Taylor (1984), os

limonóides isolados de Meliaceae podem ser divididos em onze grupos

principais, de acordo com o padrão de esqueleto carbônico apresentado

(FIGURA 1.3).

III H-20

VH-20

FIGURA 1.2 - Os triterpenos eufol (III) e tirucalol (IV).

INTRODUÇÃO

HO OH

OAc

MeO

OAc

AcO

HOCO

AcOH

havanensina

GRUPO 1

gedunina

GRUPO 2

andirobina

GRUPO 3

mexicanolídeo

GRUPO 4

fragmalina

GRUPO 5

ivorensato de

melita

GRUPO 6

obacunol

GRUPO 7

nimbina

GRUPO 8

toonafolina

GRUPO 9

evodulona

GRUPO 10

prieurianina

GRUPO 11

FIGURA 1.3 – Substâncias que representam os principais tipos de esqueletos dos

limonóides de Meliaceae (TAYLOR, 1984).

INTRODUÇÃO

1.2 - O gênero Trichilia

Segundo a classificação morfológica de Pennington e Styles

(PENNINGTON, 1975) o gênero Trichilia encontra-se na mesma sub-família que

os gêneros Melia e Azadirachta (TABELA 1.1.) e, portanto, existe a

possibilidade de se isolar de Trichilia substâncias semelhantes às isoladas de

Melia e Azadirachta.

TABELA 1.1. Classificação morfológica da família Meliaceae segundo

Pennington e Styles

(PENNINGTON, 1975).

Sub-famílias Tribos Gêneros

Swietenioideae Cedreleae

Cedrela, Toona

Swietenieae

Khaya, Neobeguea, Soymida, Chukrasia

Entandrophragma, Pseudocedrela, Lovoa

Schmardaea, Swietenia

Xylocarpeae

Carapa, Xilocarpus

Melioideae Turraeeae

Munronia, Naregamia, Turraea, Nymania

Humbertioturraea, Calodecaryia

Melieae

Melia, Azadirachta

Vavaeeae

Vavaea

Trichilieae

Trichilia, Walsura, Pseudobersama

Pterorhachis, Cipadessa, Ekerbegia

Lepidotrichilia, Owenia, Malleastrum

Astrotrichilia

Aglaieae

Aglaia, Lansium, Aphanamixis

Reinwardtiodendron, Sphaerosacme

Guareeae

Heckeldora, Cabralea, Ruagea, Turreanthus

Guarea, Chisocheton, Megaphyllaea

Synoum, Anthocarapa, Pseudocarapa

Dysoxylum

Quivisianthoideae Sandoriceae

Sandoricum, Quivisianthe

Cuparonianthoideae

Cuparonianthus

INTRODUÇÃO

O gênero Trichilia apresenta aproximadamente 230 espécies

(RAMÍREZ et al., 2000) e tem ocorrência na América tropical, África e região

Indo-Malaio. É um dos gêneros que possui o maior número de espécies na

família. Dentro da sub-família Melioideae é o gênero que apresenta maior

número e tipos de limonóides

(PENNINGTON, 1981).

Os limonóides do grupo 8 (FIGURA 1.3), com anel C-seco, são os

mais ativos contra insetos (azadiractina) e parecem restritos aos gêneros Melia e

Azadirachta. Porém, a heudebolina, um limonóide com anel C-seco, foi isolado

de Trichilia heudelotii (ADESIDA et al., 1973) e este é um dos motivos do

interesse no estudo de espécies do gênero Trichilia.

OAc

FIGURA 1.4 - O limonóide heudebolina

Vários limonóides foram isolados de diversas espécies de Trichilia

(ADESIDA & OKORIE, 1973; CHAN et al., 1973; CONNOLY et al., 1979;

MULHOLAND & TAYLOR, 1980; JOLAD et al., 1980; 1981a; ARENAS &

RODRÍGUEZ-HANN, 1990; TINTO et al., 1991; CORTEZ et al., 1992; 2000;

INADA et al., 1994; MUSKA et al., 1995; GARCEZ et al., 1997; 2000;

RODRÍGUEZ-HAHN et al., 1996; RAMÍREZ et al., 2000; MATOS, 2006;

WANG et al., 2008).

Além dos limonóides, outras classes de substâncias têm sido isoladas do

gênero Trichilia: esteróides de T. hirta (CHAURET et al., 1996), esteróides e

cumarinas de T. estipulata (CORTEZ et al., 1998), sesquiterpenos (GARCEZ, et

INTRODUÇÃO

al., 1997b), lignanas e Ȗ-lactonas (PIZZOLATTI et al., 2002; 2004) de T.

catigua, triterpenos do tipo tirucalano de T. hispida (JOLAD et al., 1980, 1981b)

e de T. connaroides (INADA et al., 1994), esteróides pregnanos de T.

schomburgkii (TINTO et al., 1991; KETWARU et al., 1993) e de T.

connaroides (ZHANG et al., 2003; WANG et al., 2008), protolimonóides de T.

elegans (GARCEZ et al., 1996); protolimonóide glicosilado de T. prieuriana de

(OLUGBADE et al., 2000), triterpenos do tipo cicloartano, ácidos Ȧ-fenil

alcanóicos e alcenóicos, Ȗ-lactonas, esteróides androstanos e pregnanos e

sesquiterpenos de T. claussenii (PUPO et al., 1996; 1997a; 1998 e 2002),

sesquiterpenos, triterpenos e esteróides de T. lepidota (PUPO et al., 2002),

cumarinas de T. elegans (MATOS, 2006).

Diversos trabalhos comprovando a atividade inseticida de Trichila

ssp. sobre Spodoptera frugiperda têm sido realizados (MIKOLAJCZAK et al.,

1987; 1989; RODRÍGUEZ & VENDRAMIM, 1996; 1997; ROEL et al., 2000;

WHEELER et al., 2001a; 2001b; BOGORNI & VENDRAMIM, 2003; 2005;

MATOS et al., 2006).

INTRODUÇÃO

1.2.1 – Trichilia claussenii C. DC.

Trichilia claussenii é popularmente conhecida como catiguá-

vermelho, catiguá, quebra-machado. É uma espécie nativa do Brasil e ocorre

desde Minas Gerais e Mato Grosso do Sul até o Rio Grande do Sul, na floresta

latifoliada semidecídua (tipo floresta onde as árvores perdem de forma parcial ou

total suas folhas durante a época mais seca e mais fria do ano).

A árvore atinge altura de 6 a 12m (FIGURA 1.5) (LORENZI, 1994),

sua madeira é leve, compacta, medianamente resistente e moderadamente

durável, sendo apropriada para marcenaria leve, forros, lambris e acabamentos

internos em construção civil.

Florescem durante os meses de agosto-outubro e os frutos (FIGURA

1.5) amadurecem em janeiro-março.

FIGURA 1.5 – Árvore adulta de Trichilia claussenii. Em destaque folhas com

flores, frutos maduros, sementes, casca e madeira (LORENZI, 1994).

INTRODUÇÃO

1.2.1.1 – Constituintes químicos anteriormente isolados de frutos

de Trichilia claussenii C. DC.

O estudo químico realizado com os frutos de T. claussenii resultou

no isolamento Ȗ-lactonas (1-4), ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alquenóicos (5-6)

(PUPO et al., 1996; 1998), e os esteróides ȕ-sitosterol e estigmasterol (7-8)

(FIGURA 1.6 e 1.7).

1 n=11 3

2 n=9

n = 6 a 11

m + n = 9 e 10

FIGURA 1.6 – Ȗ-lactonas e ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alcenóicos isolados dos

frutos de Trichilia claussenii

INTRODUÇÃO

FIGURA 1.7 – Esteróides isolados dos frutos de Trichilia claussenii

1.2.2 – Trichilia catigua A. Juss.

Trichilia catigua é popularmente conhecida como catiguá, caatiguá,

cedrinho, mangalô-catigá e angelim-rosa. São árvores com cerca de 10m de

altura e flores de coloração branco-amareladas, frutos cápsulas, avermelhados

com apenas uma semente (FIGURA 1.8). Suas flores são encontradas no período

de setembro a outubro e os frutos de dezembro a janeiro. Ocorrem de São Paulo

até o Rio Grande do Sul.

Popularmente, da casca produz-se uma tintura amarelada que é usada

externamente contra reumatismo, hidropsia e, ainda é inseticida, purgativa e em

dores moderadas é tônica. O óleo da casca é empregado, com muito bom

resultado, no tratamento de eczemas rebeldes, da psoríasis e herpes.

FIGURA 1.8 – Árvore adulta, folhas e flores de Trichilia catigua

INTRODUÇÃO

1.2.2.1 – Constituintes químicos anteriormente isolados de

sementes de Trichilia catigua A. Juss.

Das sementes de T. catigua foram isolados os limonóides:

angolesato de metila (9) mistura epimérica de fotogedunina (10-11), cedrelona

(12) e 11-ȕ-metoxicedrelona (13) (FIGURA 1.9) (MATOS, 2006).

COOMe

OAc

10 -H-23

11 -H-23ȕ

12 R= H

13 R = ȕ-OMe

COOMe

OAc

10 -H-23

11 -H-23ȕ

12 R= H

13 R = ȕ-OMe

FIGURA 1.9 – Limonóides isolados de sementes de Trichilia catigua

INTRODUÇÃO

1.2.3 - Trichilia elegans ssp. elegans A. Juss

Trichilia elegans ssp. elegans A. Juss., conhecida popularmente

como “Cachuá”, produz madeira resistente e durável, sendo a casca empregada

em curtumes. Possui ampla dispersão no país, sendo encontrada desde Goiás até

Santa Catarina e, em Mato Grosso do Sul, ocorre em matas semidecíduas,

apresentando-se como uma arvoreta de três a seis metros de altura. É uma planta

apícola, cuja floração é observada de outubro a dezembro e com frutos

encontráveis no período de janeiro a março. Estes se apresentam como cápsulas

trivalvares ovaladas e pubescentes, medindo cerca de 6 mm de comprimento,

enquanto as sementes, pretas, são parcialmente envoltas por um arilo de

coloração alaranjada

(POTT, 1994).

Fotos: Liliane Nebo

FIGURA 1.10 – Folhas e frutos de Trichilia elegans ssp. elegans

INTRODUÇÃO

1.2.3.1 - Constituintes químicos anteriormente isolados de frutos e

sementes Trichilia elegans A. Juss.

O estudo químico das sementes de T. elegans ssp elegans, resultou

no isolamento de três seco-A-protolimonóides (14 a 16)

(GARCEZ et al., 1996),

oito limonóides (17-24), além dos limonóides 7-desoxo-7E-acetokiadaninas A e

B (25 e 26), 7-desoxo-7E-hidroxikiadaninas A e B (27 e 28)

e 7-desoxo-7D-

hidroxikihadanina (29)

(GARCEZ et al., 1997; 2000).

MeO

AcO

R = R = R =

OAc

14 15 16

FIGURA 1.11 – Seco-A-protolimonóides isolados de sementes de Trichilia

elegans

INTRODUÇÃO

AcO

17 R=X 19 R=X

18 R=Y 20 R=Y

R R

21 X H, DOAc

22 Y H, DOAc

23 Y O

24 X O

FIGURA 1.12 – Limonóides isolados de sementes de Trichilia elegans

INTRODUÇÃO

R R

Y OAc

X OAc

X OH

Y OH

FIGURA 1.13 – Limonóides isolados de sementes de Trichilia elegans

Dos frutos de T. elegans foram isoladas as cumarinas 6,7-

dimetoxicumarina (30), 6-metoxi-7-hidroxicumarina (31) e 7-hidroxicumarina

(32) (MATOS, 2006) (FIGURA 1.14).

OHO O

HO O

OHO O

HO O

FIGURA 1.14 – Cumarinas isoladas dos frutos de Trichilia elegans

INTRODUÇÃO

1.3 Considerações sobre Spodoptera frugiperda (J. E. Smith, 1797)

(Lepidóptera: Noctuidae)

Esta espécie foi reconhecida como praga do milho em 1797, nos

Estados Unidos e hoje é relatada como causadora de injúrias em plantações de

milho ao Sul dos Estados Unidos, México, Américas do Sul e Central.

Este inseto também é considerado praga de outras culturas, tais

como feijão, arroz, cana-de açúcar, trigo, aveia, alfafa e hortaliças.

Larvas do inseto, no primeiro e segundo ínstares, alimentam-se de

folhas sendo que a partir do terceiro passam, no caso da cultura do milho, a atacar

o cartucho da planta podendo levá-la à morte. O período larval varia de 12 a 30

dias (COSTA et al., 1984; VALICENTE & CRUZ, 1991). Nos últimos ínstares,

medem aproximadamente 5 cm e apresentam coloração que varia do marrom,

verde até quase preta (FIGURA 1.15).

Findo o período larval, as lagartas penetram no solo, onde se

transformam em pupas de coloração avermelhada medindo cerca de 10mm de

comprimento. A duração da fase pupal varia de 7 a 27 dias (VALICENTE &

CRUZ, 1991).

INTRODUÇÃO

FIGURA 1.15 - Ciclo de vida da Spodoptera frugiperda.

Os adultos de S. frugiperda apresentam longevidade de aproximadamente

10 dias a temperatura de 25°C, umidade relativa de 60,0 % e fotofase de 14

horas. A ovoposição é realizada no período noturno. Os ovos são depositados em

massas com cerca de 150 unidades, podendo uma fêmea colocar até 1000 ovos. O

período de incubação é de aproximadamente 3 dias a temperatura entre 25 a

29°C, umidade relativa de 70,0 % e fotofase de 12 horas (PATEL, 1981). O ciclo

de vida da S. frugiperda dura em média de 32 a 46 dias (COSTA, 1984,

VALICENTE & CRUZ, 1991).

INTRODUÇÃO

1.4 – Atividade de espécies de Trichilia sobre Spodoptera

frugiperda

Diversos trabalhos comprovando a atividade inseticida de Trichilia spp.

sobre Spodoptera frugiperda (J. E .Smith) têm sido realizados. MIKOLAJCZAK

& REED (1987) realizaram um dos primeiros trabalhos testando a atividade

inseticida de Trichilia sobre S. frugiperda. Os extratos etanólicos testados de T.

pallida, T. connoroides, T. prieureana, T. roka e T. triphyllaria causaram

mortalidade igual ou superior a 80,0 % das lagartas, sendo que apenas a última

espécie não afetou a sobrevivência do inseto. MIKOLAJCZAK et al., (1989),

avaliaram a toxicidade das sementes de dez espécies pertencentes à família

Meliaceae sobre S. frugiperda e constataram que os extratos etanólicos e

hexânicos de T. roka incorporados à dieta artificial, apresentaram 100,0 % de

mortalidade larval a 400 e 10.000 ppm, respectivamente. Já o extrato etanólico a

80 ppm afetou a fase larval, causando uma redução no peso da lagarta (25,0 %) e

um alongamento na fase larval (4,6 dias) em relação ao controle.

Diversas espécies de meliáceas (incluindo cinco espécies de Trichilia)

foram avaliadas em relação a S. frugiperda, extratos aquosos a 5,0 % de diversas

estruturas vegetais foram testados através da incorporação em dieta artificial

(20mL do extrato/100g de dieta). Foram constatadas grandes variações na

bioatividade considerando-se as espécies e os órgãos vegetais utilizados. A maior

eficiência foi obtida com os extratos de folhas e caules de T. pallida e de M.

azedarach e caules (ramos) de Cabralea canjerana, onde foi registrada

mortalidade larval de 100,0 %, destacando-se os caules de T. pallida e C.

canjerana, onde essa mortalidade ocorreu já nos dois primeiros ínstares,

resultando em bioatividade similar à registrada para o extrato de semente de A.

indica (incluída como padrão de atividade inseticida). Menor atividade foi

encontrada com as demais espécies de Trichilia, observando-se inibição

alimentar (resultando em menor peso pupal) com o uso de extratos de caules

INTRODUÇÃO

(ramos) de T. catigua e folhas de T. casaretti e inibição do crescimento

(caracterizado pelo alongamento da fase larval) nos tratamentos com caules

(ramos) de T. clausenii. Nenhum efeito apreciável sobre o inseto foi constatado

nos demais tratamentos com espécies de Trichilia (folhas de T. catigua, T.

clausenii e T. elegans e caules (ramos) de T. elegans e T. casaretii)

(RODRIGUEZ & VENDRAMIM, 1996; 1997).

Além dessas espécies, alguns extratos orgânicos de T. pallida

também afetaram a sobrevivência de S. frugiperda (ROEL & VENDRAMIM,

1998; ROEL, 2000). Em relação a extratos aquosos, houve redução significativa

no dano causado à cultura do milho pela praga com aplicações de extratos de T.

americana e T. havanenesis.

Estudando o efeito de diferentes concentrações do extrato aquoso de

ramos e folhas de T. pallida na sobrevivência e desenvolvimento de S. frugiperda

criada em folhas de milho, verificou-se que o extrato de ramos a 5% provocou

100% de mortalidade larval até o 7º dia após o início do tratamento, com

atividade inseticida similar a do extrato de sementes de A. indica (utilizada como

padrão). A 1%, a mortalidade, nesse extrato, variou de 70,0 a 100,0 % e a 0,1%

houve redução da sobrevivência e do peso pupal e alongamento da fase larval. O

extrato de folhas a 5,0 % provocou mortalidade variável de 17,0 a 55,0 %

(dependendo do genótipo) até o 7º dia e de 100,0 % ao final da fase, enquanto

que a 0,1 % reduziu o peso pupal (TORRECILAS & VENDRAMIM, 2001).

MATOS et al. (2006) avaliaram a atividade biológica dos extratos

orgânicos de folhas e ramos de três espécies de Trichilia (T. catigua T. claussenii

e T. elegans) sobre S. frugiperda, através da incorporação dos extratos hexânico,

metanólico e hidrometanólico à dieta artificial. Os extratos hexânico e metanólico

de folhas e o hexânico de ramos de T. claussenii na concentração de 1000 ppm

foram os mais eficientes apresentando mortalidade larval de 80,0, 70,0 e 60,0 %

respectivamente.

INTRODUÇÃO

1.5 – A busca de novos compostos inseticidas para o controle de

insetos-praga

A lagarta-do-milho, Spodoptera frugiperda

(J.E.Smith), é uma das principais pragas da cultura do

milho, podendo seu dano levar à redução de 34% a

40% na produção, dependendo principalmente do

estágio de cultura em que ocorre o ataque, e prejuízos

que chegam a 400 milhões de dólares-ano no Brasil

(VALICENTE & CRUZ, 1991, CRUZ 1995). A

utilização de inseticidas sintéticos tem sido o principal

método de controle da praga, porém seu uso indiscriminado e incorreto tem

aumentado o número de aplicações e diminuído sua eficiência, principalmente

devido ao surgimento de populações de insetos resistentes. Tal uso agrava o

problema de contaminação dos produtos agrícolas, agricultores e do ambiente.

Desta forma, medidas de controle que causem menor impacto ambiental são de

primordial importância, o que vem estimulando o ressurgimento do uso de

plantas inseticidas como promissora ferramenta para controle de insetos.

Visando a busca de novos inseticidas naturais com menor impacto

ambiental, o grupo de Produtos Naturais da UFSCar tem realizado estudos com

várias plantas pertencentes à ordem Rutales sobre a S. frugiperda . Deste modo,

BATISTA-PEREIRA et al. (2002) avaliaram a atividade do flavonóide astilbina,

isolado de Dimorphandra mollis (Fabaceae). ROCHA (2004) realizou o estudo

fitoquímico de Adiscanthus fusciflorus (Rutaceae), T. pallida e T. rubra

(Meliaceae) visando à busca de compostos que alterem a biologia do inseto.

Trabalhos semelhantes foram realizados com as espécies Trichilia catigua, T.

elegans e T. claussenii (PEREIRA, 2001; MATOS, 2006) e Siphoneugena

densiflora (Mirtaceae) e Vitex polygama (Verbenaceae) (GALLO et al., 2006).

PARTE 2

OBJETIVOS

2 – OBJETIVOS

O presente trabalho apresenta os seguintes objetivos:

i Determinar a atividade inseticida dos extratos dos frutos, sementes e

inflorescências de espécies de Trichilia sobre Spodoptera frugiperda;

i Isolar e identificar os constituintes químicos das espécies de Trichilia

elegans, T. catigua e T. claussenii que forem ativos sobre Spodoptera

frugiperda.

i Determinar a atividade inseticida das substâncias isoladas

PARTE 3

RESULTADOS

E DISCUSSÕES

RESULTADOS E DISCUSSÕES

3 – RESULTADOS E DISCUSSÕES

3.1 – Busca de substâncias com atividade inseticida sobre

Spodoptera frugiperda

3.1.1 - Extratos de espécies de Trichilia

Todos os extratos foram submetidos aos ensaios biológicos, e a

partir dos resultados obtidos, os extratos foram selecionados e posteriormente

fracionados. As frações e subfrações procedentes dos extratos ativos foram

biomonitoradas, a fim de isolar e identificar as substâncias ativas (ESQUEMA

3.1).

Planta

Extrato bruto

Ensaios

biológicos

Partições

Ensaios

biológicos

Procedimentos

Cromatográficos

Frações

Substâncias

Ensaios

biológicos

Elucidação

estrutural

ESQUEMA 3.1 - Metodologia geral utilizada na obtenção de substâncias ativas

RESULTADOS E DISCUSSÕES

3.1.2 – Avaliação da atividade inseticida dos extratos brutos de

Trichilia ssp. sobre à lagarta Spodoptera frugiperda

Na fase inicial do trabalho, a fim de constatar quais extratos apresentavam

atividade inseticida, foram realizados ensaios de toxicidade com os extratos

brutos de Trichilia elegans, T. claussenii e T. catigua frente à S. frugiperda,

conforme metodologia descrita no item 4.7, p.143. Nesta etapa, foram utilizados

os extratos brutos dos frutos e sementes de T. elegans e claussenii e também as

inflorescências de T. catigua (TABELAS 4.1 e 4.2, ps.126 e 128). Os extratos

foram identificados por códigos que podem ser observados na TABELA 3.1.

TABELA 3.1 - Identificação dos códigos dos extratos

Casca dos frutos Hexânico Tcfeh

Metanólico Tcfem

Hidrometanólico Tcfea

Trichlia

Semente Hexânico Tseh

elegans

Metanólico Tsem

Hidrometanólico Tsea

Casca da semente Hexânico Tcseh

Metanólico Tcsem

Hidrometanólico Tcsea

Hexânico Tflch

Trichilia

Inflorescências Metanólico Tflcm

catigua

Hidrometanólico Tflca

RESULTADOS E DISCUSSÕES

Casca dos frutos Hexânico Tcflh

Metanólico Tcflm

Hidrometanólico Tcfla

Trichlia

Semente Hexânico Tslh

claussenii

Metanólico Tslm

Hidrometanólico Tsla

Casca da semente Hexânico Tcslh

Metanólico Tcslm

Hidrometanólico Tcsla

Desta forma, primeiramente utilizou-se os extratos de T. elegans na

concentração de 1,0 mg/mL com dose média de 0,149 ȝg/mg de larva.

Ctl

Hid

Cascas dos frutos

Cascas das

Sementes

Semente

H M HM

H M HM Controle

Controle H M HM

H M HM

% Mortalidade

H = Ext. hexânico; M = Ext. metanólico; HM = Ext. hidrometanólico

Ctl

Hid

Cascas dos frutos

Cascas das

Sementes

Semente

H M HM

H M HM Controle

Controle H M HM

H M HM

% Mortalidade

H = Ext. hexânico; M = Ext. metanólico; HM = Ext. hidrometanólico

GRÁFICO 3.1 – Resultado do ensaio de toxicidade realizado com os extratos de

T. elegans na concentração de 1,0 mg/mL em quintuplicata

*Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo Teste de Tukey (P < 0,05).

RESULTADOS E DISCUSSÕES

Ao verificar os resultados obtidos do ensaio com os extratos brutos

de T. elegans na concentração de 1,0 mg/mL, observou-se baixas porcentagens

de mortalidade. Uma vez que, esses resultados poderiam estar relacionados a

concentração inicial escolhida, optou-se pelo aumento da concentração na

realização dos demais ensaios.

Assim, os extratos brutos de T. elegans, T. claussenii e T. catigua

foram ensaiados em quintuplicata na concentração de 10,0 mg/mL, onde as doses

médias observadas foram de 9,70, 10,33 e 14,30 ȝg/mg de larva,

respectivamente. Os resultados obtidos são mostrados nos Gráficos 3.2, 3.3 e 3.4.

Cascas dos frutos

Cascas das

Sementes

Semente

H M HM

H M HM Controle

Controle H M HM

H M HM

% Mortalidade

H = Ext. hexânico; M = Ext. metanólico; HM = Ext. hidrometanólico

ab ab

Cascas dos frutos

Cascas das

Sementes

Semente

H M HM

H M HM Controle

Controle H M HM

H M HM

% Mortalidade

H = Ext. hexânico; M = Ext. metanólico; HM = Ext. hidrometanólico

ab ab

GRÁFICO 3.2 – Resultado do ensaio realizado com os extratos de T. elegans

na concentração de 10,0 mg/mL

*Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo Teste de Tukey (P < 0,05).

RESULTADOS E DISCUSSÕES

Cascas dos frutos

Cascas das

Sementes

Semente

H M HM

H M HM Controle

Controle H M HM

H M HM

% Mortalidade

H = Ext. hexânico; M = Ext. metanólico; HM = Ext. hidrometanólico

64,0a

abc

Cascas dos frutos

Cascas das

Sementes

Semente

H M HM

H M HM Controle

Controle H M HM

H M HM

% Mortalidade

H = Ext. hexânico; M = Ext. metanólico; HM = Ext. hidrometanólico

64,0a

abc

GRÁFICO 3.3 – Resultado do ensaio realizado com os extratos de T. claussenii

na concentração de 10,0 mg/mL

*Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo Teste de Tukey (P < 0,05).

% Mortalidade

Inflorescências

M HM

Controle

H = Ext. hexânico; M = Ext. metanólico; HM = Ext. hidrometanólico

64,4a

% Mortalidade

Inflorescências

M HM

Controle

H = Ext. hexânico; M = Ext. metanólico; HM = Ext. hidrometanólico

64,4a

GRÁFICO 3.4 – Resultado do ensaio realizado com os extratos de T. catigua

na concentração de 10,0 mg/mL

*Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo Teste de Tukey (P < 0,05).

RESULTADOS E DISCUSSÕES

Ao verificar os resultados dos ensaios de toxicidade realizados com

os extratos de T. elegans nas concentrações de 1,0 e 10,0 mg/mL (GRÁFICOS

3.1 e 3.2, ps. 26 e 27), notou-se que não houve grandes modificações na

mortalidade.

Entretanto, ao realizar os ensaios com os extratos de T. claussenii

(GRÁFICO 3.3, p. 28) e T. catigua (GRÁFICO 3.4, p. 28), observou-se que os

extratos metanólicos das sementes de T. claussenii (Tslm) e das inflorescências

de T. catigua (Tflcm) foram os extratos que apresentaram as mais altas

porcentagens de mortalidade. Desta forma, esses extratos foram selecionados

para estudos posteriores e bioensaios.

3.1.2.1 - Ensaios biológicos realizados com o extrato metanólico

das sementes de T. claussenii

A partir dos resultados obtidos do ensaio de toxicidade realizado

com o extrato metanólico das sementes de T. claussenii (64,0 % de

mortalidade), este foi fracionado através da partição líquido-líquido

(FLUXOGRAMA 4.2, p. 129). Foram obtidas quatro frações (TABELA 4.3,

p.129) Tslm1 (Hexano), Tslm2 (CH

), Tslm3 (AcOEt) e Tslm4

(MeOH/H

O).

As frações obtidas foram ensaiadas sobre S. frugiperda

(metodologia, p. 143) em triplicata, na concentração de 10,0 mg/mL com dose

média de 14,75 ȝg/mg de larva.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

TABELA 3.2 – Resultado do ensaio realizado com as frações: Tslm1, Tslm2,

Tslm3 e Tslm4 na concentração de 10,0 mg/mL em triplicata.

Frações Mortalidade (%)

Controle 6,66c

Tslm1 70,00a

Tslm2 24,81bc

Tslm3 26,67bc

Tslm4 43,33ab

Dose média: 14,75 ȝg/mg larva

*Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo Teste de Tukey (P < 0,05).

Através do ensaio realizado com as frações Tslm1 a Tslm4,

observou-se que a fração Tslm1 foi a que apresentou a maior taxa de

mortalidade (70,0 %) sobre S. frugiperda. Desta forma, a amostra Tslm1 foi

fracionada (FLUXOGRAMA 4.3, p. 130) e as 6 frações obtidas foram ensaiadas

sobre S. frugiperda.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

TABELA 3.3 – Resultado do ensaio realizado com as frações: Tslm1-Fr1 a

Tslm1-Fr6 na concentração de 10,0 mg/mL em triplicata.

Frações Mortalidade (%)

Controle 10,00b

Tslm1-Fr1 31,00ab

Tslm1-Fr2 46,66ab

Tslm1-Fr3 70,00a

Tslm1-Fr4 66,66a

Tslm1-Fr5 36,67ab

Tslm1-Fr6 23,33b

Dose média: 13,43 ȝg/mg larva

*Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo Teste de Tukey (P < 0,05).

A partir dos resultados observados neste ensaio, as amostras Tslm1-

Fr3 e Tslm1-Fr4 foram refracionadas. Do refracionamento da amostra Tsml1-

Fr4 (FLUXOGRAMA 4.4, p. 131) foram obtidas 5 frações, as quais foram

submetidas ao ensaio biológico.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

TABELA 3.4 – Resultado do ensaio realizado com as frações: Tslm1-Fr4(1) a

Tslm1-Fr4(5) na concentração de 10,0 mg/mL em triplicata

Frações Mortalidade (%)

Controle 6,66c

Tslm1-Fr4(1) 26,67bc

Tslm1-Fr4(2) 13,33bc

Tslm1-Fr4(3) 43,33ab

Tslm1-Fr4(4) 73,33a

Tslm1-Fr4(5) 30,00bc

Dose média: 12,49 ȝg/mg larva

*Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo Teste de Tukey (P < 0,05)

Os resultados descritos na TABELA 3.4 mostraram que a fração

Tslm1-Fr4(4) apresentou maior porcentagem de mortalidade sobre S.

frugiperda. Através da análise do espectro de RMN de

H da amostra Tslm1-

Fr4(4) observou-se sinais característicos dos ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e

alquenóicos sugerindo então, que estes compostos poderiam estar associados à

atividade inseticida encontrada para esta amostra.

A fração Tslm1-Fr4(4) foi então refracionada (FLUXOGRAMA

4.4, p. 131), e as frações obtidas foram submetidas ao ensaio biológico.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

TABELA 3.5 – Resultado do ensaio realizado com as frações: Tslm1-Fr4(4)-1 a

Tslm1-Fr4(4)-6 na concentração de 10,0 mg/mL em triplicata.

Frações Mortalidade (%)

Controle 10,00b

Tslm1-Fr4(4)-1 42,96ab

Tslm1-Fr4(4)-2 70,00a

Tslm1-Fr4(4)-3 47,77ab

Tslm1-Fr4(4)-4 34,44ab

Tslm1-Fr4(4)-5 16,67b

Tslm1-Fr4(4)-6 36,67ab

Dose média: 11,02 ȝg/mg larva

*Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo Teste de Tukey (P < 0,05)

Através dos resultados obtidos neste ensaio (TABELA 3.5, p. 33), a

fração Tslm1-Fr4(4)-2 foi analisada através do espectro de RMN

H, onde foram

observados sinais característicos dos ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alquenóicos.

Para identificação do tamanho das cadeias metilênicas dos ácidos Ȧ-fenil

alcanóicos e alquenóicos, uma pequena alíquota da amostra foi esterificada

(procedimento: p.142), e posteriormente analisada via CG-EM.

Pela análise via CG-EM (procedimento, item 4.2, p. 123) foram

identificados os tamanhos das cadeias metilênicas desses ácidos (TABELA 3.9,

p. 50), que variaram entre 10 a 15 carbonos.

n = 6 a 11

Ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alquenóicos

RESULTADOS E DISCUSSÕES

A análise desta amostra via CG-EM também possibilitou a

identificação de constituintes minoritários presentes nesta fração (TABELA 3.9,

p. 50).

Através das porcentagens das áreas dos picos obtidas pela análise

via CG-EM desta amostra observou-se, 75,50 % dos ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e

alquenóicos e 14,50 % de ácidos graxos.

A partir dos resultados obtidos, pode-se constatar que a atividade

tóxica encontrada no extrato metanólico das sementes de T. claussenii seria

devido principalmente à presença dos ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alquenóicos

neste extrato.

Como citado anteriormente, a fração Tslm3-Fr3 (Mortalidade 70,0

%, TABELA 3.3, p.31) foi refracionada (FLUXOGRAMA 4.3, p. 130) e foram

obtidas 7 frações. Todas as frações foram analisadas através do experimento de

RMN

H, e na amostra Tslm3-Fr3(2) foram observados sinais característicos dos

ácidos Ȧ-fenil alcanóicos. Esta amostra foi então submetida ao ensaio biológico

sobre S. frugiperda, apresentando 58,89 % de mortalidade.

TABELA 3.6 – Resultado do ensaio realizado com a fração Tslm1-Fr3(2) na

concentração de 10,0 mg/mL em triplicata.

Frações Mortalidade (%)

Controle 10,00b

Tslm1-Fr3(2) 58,89a

Dose média: 11,54 ȝg/mg larva

*Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo Teste de Tukey (P < 0,05)

Para identificação dos ácidos foi adotado o mesmo procedimento

citado anteriormente.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

Através da análise via CG-EM foram identificados os ácidos Ȧ-

fenil alcanóicos, com cadeias metilênicas variando entre 12 a 15 carbonos e

ácidos hexadecanóico e octadecanóico (TABELA 3.10, p. 60).

n = 8 a 11

Ácidos Ȧ-fenil alcanóicos

Através das porcentagens das áreas dos picos obtidas pela análise

via CG-EM desta amostra observou-se: 85,44 % dos ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e

14,56 % de ácidos graxos (C-16 e C-18).

A partir dos ensaios biológicos juntamente com o estudo

fitoquímico realizado com o extrato metanólico das sementes de T. claussenii,

pode-se constatar que as substâncias que apresentavam toxicidade sobre S.

frugiperda eram o conjunto dos ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alquenóicos.

Matos (2006) avaliou a atividade biológica dos extratos hexânico,

metanólico e hidrometanólico dos frutos de T. claussenii sobre S. frugiperda,

através da incorporação dos extratos à dieta artificial na concentração de 1000,0

mg/kg. O extrato metanólico dos frutos de T. claussenii foi o mais eficiente

causando 90,0 % de mortalidade, sendo observado que as larvas alimentadas

com dieta artificial tratada com este extrato morreram antes de empuparem.

Desta forma, os ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alquenóicos identificados nos frutos

de T. claussenii (PUPO et al., 1996), podem também estar relacionados à

atividade encontrado no extrato metanólico dos frutos de T. claussenii.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

Há na literatura o relato da atividade inseticida dos ácidos 7-fenil

eptanóico e 7-fenilept-4-enóico sobre Manduca sexta (Lepdoptera: Sphingidae),

Heliothis virescens (Lepdoptera: Noctuidae) e Helicoverpa zea (Lepdoptera:

Noctuidae) (VANDERHERCHEN et al., 2005). Ensaios por injeção abdominal

foram realizados com os ácidos 7-fenileptanóico e 7-fenilept-4-enóico na dose

de 50 ȝg/inseto em lagartas de 4° instar de M. sexta, H. zea e H. virescens. Para

ambos ácidos e insetos foram observadas mortalidades na faixa de 55,0 a 70,0

n = 3

Ácido 7-fenileptanóico

O estudo da atividade inseticida dos ácidos 7-fenileptanóico e 7-

fenilept-4-enóico foi realizado devido a essas substâncias serem análogos não

peptídicos do TMOF (Trypsin Modulating Oostatic Factor).

O TMOF (decapeptídeo) é um hormônio originalmente isolado dos

ovários do inseto Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) que regula a biossíntese do

sistema digestivo nos mosquitos. Foi verificado através de ensaios, que larvas de

mosquitos alimentados com este hormônio apresentavam inibição do

crescimento e desenvolvimento. Estudos do TMOF mostram que este

decapeptídeo inibe a biossíntese da tripsina prejudicando a síntese de proteínas

necessárias para o desenvolvimento e reprodução apresentando altos índices de

mortalidade, para mosquitos alimentados com este hormônio

(VANDERHERCHEN et al., 2005).

RESULTADOS E DISCUSSÕES

FIGURA 3.1: Estrutura do TMOF, indicação da região do peptídeo em que

foram baseados os ácidos não peptídicos.

A atividade do TMOF também foi observada em Diaprepes

abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae) besouro do citrus e Heliothis virescens

(Lepdoptera: Noctuidae) lagarta do tabaco.

VANDERHERCHEN et al. (2005) verificaram através de ensaios

com TMOF e análogos não peptídicos do TMOF em M. sexta, que os análogos

não peptídicos do TMOF apresentam um modo de ação ainda desconhecido,

diferente do modo de ação do TMOF em mosquitos. Desta forma, o modo de

ação dos ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alquenóicos em S. frugiperda ainda é

desconhecido.

3.1.2.2 - Ensaios biológicos realizados com ácidos graxos

Devido à presença minoritária do ácido hexadecanóico em ambas as

amostras, o ensaio de toxicidade foi realizado com este ácido. Visto que não

havia nenhum relato na literatura de ensaios de toxicidade de ácidos graxos com

cadeias metilênicas entre 5 a 16 carbonos sobre S. frugiperda, ensaios com estes

ácidos comerciais foram realizados.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

TABELA 3.7 – Identificação dos códigos dos ácidos graxos

Ácidos graxos Código

Ácido pentanóico

Ácido hexanóico

Ácido heptanóico

Ácido octanóico

Ácido nonanóico

Ácido decanóico

Ácido dodecanóico

Ácido hexadecanóico

Os ensaios de toxicidade com ácidos graxos sobre S. frugiperda

foram realizados conforme metodologia descrita no item 4.7 p.143, nas

concentrações de 1,0 e 10,0 mg/mL em triplicata.

Contr. A B C D E F G H

Ácidos graxos

% Mortalidade

Contr. A B C D E F G H

Ácidos graxos

% Mortalidade

Dose média: 1,42 ȝg/mg larva

*Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo Teste de Tukey (P < 0,05)

GRÁFICO 3.5 - Resultado do ensaio realizado com os ácidos graxos (C5-C16)

na concentração de 1,0 mg/mL em triplicata

RESULTADOS E DISCUSSÕES

100

120

Contr. A B C D E F G H

Ácidos graxos

% Mortalidade

abc

bcd

Dose média: 13,78 ȝg/mg larva

*Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo Teste de Tukey (P < 0,05)

GRÁFICO 3.6 - Resultado do ensaio realizado com os ácidos graxos (C5-C16)

na concentração de 10,0 mg/mL em triplicata

Através dos resultados obtidos, verificou-se que o ácido

hexadecanóico (H) não apresentou alta porcentagem de mortalidade nas

concentrações 1,0 e 10,0 mg/mL, demonstrando que este ácido apresenta baixa

toxicidade se comparado ao conjunto dos ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alcenóicos,

entretanto não podemos descartar a ocorrência de sinergismo entre a mistura

desses compostos.

Observou-se também que os ácidos hexanóico, nonanóico e

decanóico na concentração de 10,0 mg/mL apresentaram as mais altas

porcentagens de mortalidade de 90,0, 96,67 e 96,67 %, respectivamente.

Entretanto, na concentração de 1,0 mg/mL, não foram observados resultados

significativos para nenhum dos ácidos.

Relatos da atividade tóxica dos ácidos graxos em outros tipos de

insetos foram encontrados. PENÃFLOR et al. (2004) realizaram ensaios de

toxicidade por aplicação tópica com ácidos graxos sintéticos com cadeias

metilênicas entre 5 a 9 carbonos na dose de 0,1 mg/inseto em Atta sexdens

RESULTADOS E DISCUSSÕES

rubropilosa (formiga cortadeira). Os ácidos graxos que apresentaram atividade

tóxica para formiga cortadeira foram os ácidos hexanóico e heptanóico, que

diminuíram a longevidade mediana de 12 dias (controle) para 10 e 9 dias,

respetivamente.

MANSSON et al. (2006) verificaram a atividade anti-alimentar dos

ácidos graxos (C6 a C13) em Hylobius abietis (L.) (Coleóptera: Curculionidae)

besouro do pinho. Testes de escolha mostraram que os ácidos graxos com

cadeias metilênicas entre C-6 a C-11 foram ativos. Entretanto, o ácido

nonanóico em 4,0 ȝmol/cm

foi o mais ativo dentre os ácidos utilizados nos

testes.

3.1.2.3 - Ensaios biológicos realizados com o extrato metanólico

das inflorescências T. catigua

A partir dos resultados obtidos do ensaio de toxicidade realizado

com o extrato metanólico das inflorescências de T. catigua (64,4 % de

mortalidade, GRÁFICO 3.4 p. 28), este foi fracionado através da partição

líquido-líquido (FLUXOGRAMA 4.2, p. 129). Foram obtidas quatro frações

(TABELA 4.4, p. 134): Tflcm1 (Hexano), Tflcm2 (CH

), Tflcm3 (AcOEt) e

Tflcm4 (MeOH/H

O).

As frações obtidas foram ensaiadas sobre S. frugiperda

(metodologia, p. 143) em triplicata, na concentração de 10,0 mg/mL com dose

média de 17,01 ȝg/mg de larva.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

TABELA 3.8 – Resultado do ensaio realizado com as frações Tflcm1 a Tflcm4,

na concentração de 10,0 mg/mL em triplicata .

Frações Mortalidade (%)

Controle 6,66b

Tflcm1 50,0a

Tflcm2 50,0a

Tflcm3 20,83ab

Tflcm4 13,33ab

Dose média: 17,01 ȝg/mg larva

*Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo Teste de Tukey (P < 0,05).

A partir dos resultados observados, as frações Tflcm1 (50,0 %

mortalidade) e Tflcm2 (50,0 % mortalidade) foram selecionadas para o

prosseguimento dos estudos.

Do refracionamento de Tflcm2 (FLUXOGRAMA 4.7, p. 136) foi

isolado o flavonóide ent-catequina (XXIV), que devido à pequena quantidade de

massa isolada, não pode ser ensaiada sobre S. frugiperda. Entretanto, foi

observado na literatura o relato da atividade do flavonóide ent-catequina sobre S.

frugiperda. Leite (2005) verificou através de ensaios de ingestão, que a

substância ent-catequina nas concentrações de 1, 10 e 50 mg/kg apresentava

mortalidade larval de 50,00, 53,33 e 66,67 %, respectivamente.

Os dados observados mostram que provavelmente o flavonóide ent-

catequina possa estar associado à atividade encontrada no extrato metanólico das

inflorescências de T. catigua (Tflcm).

O estudo da fração Tflcm1 (FLUXOGRAMA 4.6, p. 135) foi

realizado, porém nenhuma substância foi identificada. Esforços foram realizados

para isolamento de substâncias que poderiam estar relacionadas à atividade

observada, entretanto a grande quantidade de pigmentos nas amostras e as

quantidades de massa dificultaram o trabalho.

SUBSTÂNCIAS ISOLADAS E IDENTIFICADAS

3.2 – Substâncias isoladas e identificadas

Ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alcenóicos

Procedência: Sementes de T. claussenii

Isolamento: ps. 130 e 131

Identificação: p. 47

Atividade Biológica: p. 29

I n = 6

II n = 7

III n = 8

IV n = 9

V n = 10 insaturação

VI n = 10

VII n = 11 insaturação

VIII n = 11

Ȗ-lactonas

Procedência: Sementes de T. claussenii

Isolamento: ps. 130 e 131

Identificação: p. 61

IX n = 5

X n = 7

XI n = 9

XII n = 11

XIII n = 7

XIV n = 9

XV n = 9

XVI n = 11

XVII

XVIII

XIX

SUBSTÂNCIAS ISOLADAS E IDENTIFICADAS

COO

XXI

4-hidroxi-N-metilprolina

Procedência: Sementes de T.

claussenii

Isolamento: p. 133

Identificação: p. 74

N-metilprolina

Procedência: Sementes de T.

claussenii

Isolamento: p. 133

Identificação: p. 74

XXII

Uridina

Procedência: Sementes de T.

claussenii

Isolamento: p. 133

Identificação: p. 79

Uracila

Procedência: Sementes de T.

claussenii

Isolamento: p. 133

Identificação: p. 79

XXIII

SUBSTÂNCIAS ISOLADAS E IDENTIFICADAS

COOH

XXIV

OHO

Ácido 5-O-cafeoilquínico

Procedência: Casca das sementes

de T. elegans

Isolamento: p. 139

Identificação: p. 89

XXV

ent-catequina

Procedência: Inflorescência de T.

catigua

Isolamento: p. 136

Identificação: 84

Atividade Biológica: p. 41

XXVI

AcO

11ȕ-acetoxiobacunona

Procedência: Sementes de T.

elegans

Isolamento: p. 140

Identificação: p. 95

XXVII

AcO

1,2 –diidro-1Į-acetoxi-11ȕ-

acetoxi-14,15-epoxicneorina R

Procedência: Sementes de T.

elegans

Isolamento: p. 140

Identificação: p. 104

SUBSTÂNCIAS ISOLADAS E IDENTIFICADAS

3-ȕ-O-ȕ-glucopiranosil sitosterol

Procedência: Sementes de T. claussenii

Isolamento: p. 133

Identificação: 114

XVIII

ȕ-sitosterol (mistura)

Procedência: Sementes de T. elegans

Isolamento: p. 141

Identificação: p.119

XIX

XXX

campesterol (mistura)

Procedência: Sementes de T. elegans

Isolamento: p. 141

Identificação: p. 119

XXXI

estigmasterol (mistura)

Procedência: Sementes de T. elegans

Isolamento: p. 141

Identificação: p. 119

SUBSTÂNCIAS ISOLADAS E IDENTIFICADAS

sitostenona (mistura)

Procedência: Sementes de T. elegans

Isolamento: p. 141

Identifica

ão:

. 119

XXXII

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

3.3 – IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

3.3.1 - Identificação dos ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alquenóicos (I-

VIII)

n = 6 a 11

A mistura dos ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alquenóicos (I-VIII) foi

isolada do extrato metanólico das sementes de T. claussenii. As substâncias I a

VIII, já foram isoladas anteriormente das folhas e frutos de T. claussenii (PUPO

et al., 1996).

Os ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alquenóicos (I-VIII) foram

identificados através do espectro de RMN

H e principalmente pela análise via

CG-EM. Os dados obtidos foram concordantes com a literatura (PUPO et al.,

1996).

A partir dos resultados obtidos dos ensaios biológicos, a amostra

Tslm1-Fr4(4)-2 foi analisada. No espectro de RMN de

H desta amostra

(FIGURA 3.2, p. 48) foram observados sinais característicos de hidrogênios

aromáticos em į 7,15-7,28 (m, 5H), dois tripletos em į 2,59 (J = 7,6 Hz, 2H) e į

2,34 (J = 7,4 Hz, 2H), referente aos hidrogênios benzílicos e Į-carbonílicos,

respectivamente. Foram observados também sinais entre į 1,20-2,00

característicos da cadeia metilênica, e um sinal minoritário em į 5,34 (t, J = 4,4

Hz) referente à hidrogênios olefínicos. A partir da análise realizada do espectro

de RMN de

H, observou-se que havia nesta fração a mistura dos ácidos Ȧ-fenil

alcanóicos e alquenóicos.

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5

32.535.203.15 2.832.00 1.540.27

7.287

7.266

7.256

7.249

7.182

7.164

7.147

5.354

5.341

5.330

2.614

2.595

2.575

2.359

2.341

2.322

1.640

1.625

1.607

1.589

1.568

1.299

1.254

0.896

0.879

0.862

FIGURA 3.2: Espectro de RMN

H da fração Tslm1-Fr4(4)-2 (400 MHz,

CDCl

)

Para identificação do tamanho das cadeias metilênicas dos ácidos

Ȧ-fenil alcanóicos e alquenóicos, uma pequena alíquota da amostra foi

esterificada (procedimento, p. 142), e posteriormente foi realizada a análise dos

ésteres metílicos via CG-EM (condições, p. 123). A análise da fração Tslm1-

Fr4(4)-2 via CG-EM possibilitou a identificação dos ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e

alquenóicos e ácidos graxos presentes na amostra (FIGURA 3.3, p. 49).

Os ésteres referentes aos ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alquenóicos

analisados via CG-EM, foram nomeados como substâncias I’ a VIII’.

OMe

n = 6 a 11

I’ a VIII’

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

Nos espectros de massas das substâncias I’ a VIII’ (FIGURAS 3.8

a 3.11), observou-se a perda de fragmento com m/z de 32, referente à perda de

MeOH. Para as substâncias com cadeia metilênica saturada (I’ a IV’, VI’ e

VIII’), observou-se através dos respectivos espectros de massas, o pico base em

m/z 91, referente ao íon tropílio. Já para os espectros de massas das substâncias

V’ e VII’, com insaturação na cadeia lateral, o pico base foi de m/z 104.

m/z 91 m/z 104

Os ácidos graxos foram identificados comparando-se os espectros

de massas obtidos aos espectros de massas existentes na biblioteca de dados do

CG-EM.

9 8

1819

FIGURA 3.3: Cromatograma da fração Tslm1-Fr4(4)-2 (Condições, p. 123)

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

FIGURA 3.4: Ampliação do cromatograma da fração Tslm1-Fr4(4)-2

TABELA 3.9: Compostos identificados na fração Tslm1-Fr4(4)-2, obtidos via

CG-EM

Pico [M]

Nome t

(min.)

200 Decanoato-10-oxo de metila 12,230

202 Octanodioato de metila 12,361

216 Nonanodioato de metila 13,713

200 Ácido p-toluenosulfônico-etil-éster 13,928

213 N-etil-N,4-dimetil-benzenosulfonamida 15,864

242 Tetradecanoato de metila 15,948

256 Pentadecanoato de metila 17,107

268 Hexadecenoato de metila 17,949

270 Hexadecanoato de metila 18,217

282 Heptadecenoato de metila 19,017

262 Ȧ-fenil decanoato de metila 19,242

296 Octadecenoato de metila 20,029

276 Ȧ-fenil undecanoato de metila 20,295

290 Ȧ-fenil dodecanoato de metila 21,348

304 Ȧ-fenil tridecanoato de metila 22,317

316 Ȧ-fenil tetradecenoato de metila 22,953

318 Ȧ-fenil tetradecanoato de metila 23,222

330 Ȧ-fenil pentadecenoato de metila 23,848

354 Docosanoato de metila 23,913

332 Ȧ-fenil pentadecanoato de metila 24,131

382 Tetracosanoato de metila 25,755

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

FIGURA 3.5: Espectros de massas referente aos picos 2, 3 e 5 obtidos via CG-

EM.

Substância: Decanoato-10-oxo de metila

Substância: Octanodioato de metila

Substância: Nonanodioato de metila

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

FIGURA 3.6: Espectros de massas referente aos picos 6, 8 e 9 obtidos via CG-

EM.

Substância: Ácido p-toluenosulfônico-etil-éster

Substância: N-etil-N,4-dimetil-benzenosulfonamida

Substância: Tetradecanoato de metila

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

FIGURA 3.7: Espectros de massas referente aos picos 11, 12 e 13 obtidos via

CG-EM.

Substância: Pentadecanoato de metila

Substância: Hexadecenoato de metila

Substância: Hexadecanoato de metila

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

FIGURA 3.8: Espectros de massas referente aos picos 14, 15 e 16 obtidos via

CG-EM.

Substância: Heptadecenoato de metila

Substância: Ȧ-fenil decanoato de metila

Substância: Octadecenoato de metila

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

FIGURA 3.9: Espectros de massas referente aos picos 17, 20 e 21 obtidos via

CG-EM.

Substância: Ȧ-fenil undecanoato de metila

Substância: Ȧ-fenil dodecanoato de metila

Substância: Ȧ-fenil tridecanoato de metila

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

FIGURA 3.10: Espectros de massas referente aos picos 23, 25 e 26 obtidos via

CG-EM.

Substância: Ȧ-fenil tetradecenoato de metila

Substância: Ȧ-fenil tetradecanoato de metila

Substância: Ȧ-fenil pentadecenoato de metila

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

FIGURA 3.11: Espectros de massas referente aos picos 27, 29 e 30 obtidos via

CG-EM.

Substância: Docosanoato de metila

Substância: Ȧ-fenil pentadecanoato de metila

Substância: Tetracosanoato de metila

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

Através das identificações dos ésteres referentes aos ácidos Ȧ-fenil

alcanóicos e alquenóicos via CG-EM, pode-se confirmar a presença das

substâncias I a VIII na fração Tslm1-Fr4(4)-2.

Não foi possível realizar a identificação de alguns picos

minoritários presentes no cromatograma, visto que somente os dados de seus

respectivos espectros de massas eram insuficientes para a caracterização de

outras substâncias. Isso porque estes picos representavam substâncias

minoritárias na amostra e também analisando o espectro de RMN de

H não foi

possível obter maiores informações sobre estas substâncias, não permitindo

assim as suas caracterizações.

O ácido p-toluenossulfônico-etil-éster e N-etil-N,4-dimetil-

benzenossulfonamida identificados são derivados do Diazald e provavelmente

foram obtidos através da reação de esterificação dos ácidos desta fração.

Através dos resultados obtidos dos ensaios biológicos, a amostra

Tslm1-Fr3(2) também foi analisada. No espectro de RMN de

H desta fração

foram observados sinais característicos dos ácidos Ȧ-fenil alcanóicos. Assim, o

mesmo procedimento foi adotado para caracterização dos ácidos e através da

análise realizada (CG-EM: condições, p.123), as substâncias III, IV, VI e VIII e

também os ácidos hexadecanóico e octadecanóico foram identificados nesta

amostra.

Com relação à biogênese dos ácidos, Pupo et al. (1996) propõem

que os ácidos Ȧ-fenil alcanóicos seriam biossintetizados através da condensação

das unidades C

-C

com cadeias policetídicas de vários tamanhos. Vieira et al.

(1983) propõem que os ácidos Ȧ-fenil alcanóicos seriam intermediários

biogenéticos das Ȗ-lactonas.

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0

33.256.643.193.15 2.87 1.40

7.287

7.266

7.256

7.250

7.183

7.165

2.615

2.596

2.576

2.361

2.342

2.324

1.663

1.644

1.626

1.608

1.589

1.569

1.256

0.897

0.881

0.863

FIGURA 3.12: Espectro de RMN

H da fração Tslm1-Fr3(2) (400 MHz,

CDCl

)

FIGURA 3.13: Cromatograma da fração Tslm1-Fr3(2) (Condições, p.123)

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

TABELA 3.10: Compostos identificados na fração Tslm1-Fr3(2), obtidos via

CG-EM

Pico

[M]

Nome t

(min.)

270

Hexadecanoato de metila

18,234

298

Octadecanoato de metila

20,288

290

Ȧ-fenil dodecanoato de metila

21,327

304

Ȧ-fenil tridecanoato de metila

22,331

318

Ȧ-fenil tetradecanoato de metila

23,215

332

Ȧ-fenil pentadecanoato de metila

24,114

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

3.3.2 - Identificação das Ȗ-lactonas

n = 5, 7, 9 e 11

IX a XII

n = 7 e 9

XIII e XIV

n = 9 e 11

XV e XVI

XVII

XIX

XVIII

O conjunto de Ȗ-lactonas (IX a XIX) foi identificado no extrato

metanólico das sementes de T. claussenii. As substâncias XI, XII e XV-XVIII,

já foram isoladas anteriormente dos frutos de T. claussenii (PUPO et al., 1998).

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

As Ȗ-lactonas (IX a XIX) foram identificadas através do espectro

de RMN de

C e principalmente pela análise via CG-EM. Dados da

literatura foram utilizados para análise do conjunto das Ȗ-lactonas (PUPO et al.,

1998, PIZZOLATTI et al., 2004).

No espectro de RMN de

H da fração Tslm1-Fr4(4)-3 (FIGURA

3.19, p. 69) foram observados sinais característicos da unidade Ȗ-lactônica em į

4,45 (dq, J = 6,4 e 3,2 Hz) e į 4,31 (dd, J = 5,2 e 3,0 Hz) referente à hidrogênios

carbinólicos, e um sinal de metila em į 1,44 (d, J = 6,4 Hz). Foram observados

também sinais de hidrogênios aromáticos em į 7,16-7,29 (m, 5H), multipleto em

į 2,59 e um dubleto em į 2,34 (J = 8,60 Hz), característicos de hidrogênios

benzílicos e Į carbonílicos, respectivamente.

No espectro de RMN de

C da fração Tslm1-Fr4(4)-3 (FIGURA

3.20, p. 69), foram observados sinais de carbonos aromáticos (į 128,4, į 128,2 e

142,9), carbinólicos (į 78,7 e į 71,2), Į-carbonílicos (į 47,6 e į 33,7) e de

carbono carboxílico (į 177,5). Além de vários sinais em į 23,0-29,6 referente

aos carbonos metilênicos.

Devido à presença de sinais no espectro de RMN de

H e

C que

poderiam caracterizar tanto o conjunto de Ȗ-lactonas quanto os ácidos Ȧ-fenil

alcanóicos e alquenóicos, uma pequena alíquota da amostra foi esterificada

(procedimento, p. 142), e posteriormente analisada via CG-EM (condições: p.

123).

Na análise realizada via CG-EM da amostra Tslm1-Fr4(4)-3, pode-

se observar a presença das Ȗ-lactonas, ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alcenóicos e

ácidos graxos. Pupo et al. (1998) propõem que os ácidos Ȧ-fenil alcanóicos

seriam intermediários biogenéticos das Ȗ-lactonas, através da condensação das

unidades C

-C

com cadeias policetídicas de vários tamanhos e a condensação

com o ácido pirúvico, seguido da ciclização do anel lactônico. Deste modo, a

identificação dos ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alquenóicos e ácidos graxos

juntamente com as Ȗ-lactonas reforçam a biossíntese proposta.

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

FIGURA 3.14: Cromatograma da fração Tslm1-Fr4(4)-3 (Condições, p.124)

TABELA 3.11: Compostos identificados na fração Tslm1-Fr4(4)-3, obtidos via

CG-EM

Pico [M]

Nome t

(min.)

200 Decanoato-10-oxo de metila 12,243

216 Nonanodioato de metila 13,722

200

Ácido p-toluenosulfônico-etil-éster

13,925

213

N-etil-N,4-dimetil-benzenosulfonamida

15,872

248 9-fenilnonanoato de metila 18,144

270 Hexadecanoato de metila 18,216

262 Ȧ-fenil decanoato de metila 19,245

274 Ȧ-fenil undecanoato de metila 20,299

290 Ȧ-fenil dodecanoato de metila 21,316

304 Ȧ-fenil tridecanoato de metila 22,275

316 Ȧ-fenil tetradecenoato de metila 22,953

318 Ȧ-fenil tetradecanoato de metila 23,197

330 Ȧ-fenil pentadecenoato de metila 23,842

332 Ȧ-fenil pentadecanoato de metila 24,123

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

Pico [M]

Nome t

(min.)

290 Ȗ-lactona (IX) 24,317

318 Ȗ-lactona (XIII) 25,581

328 Ȗ-lactona (XV) 26,230

318 Ȗ-lactona (X) 26,566

346 Ȗ-lactona (XIV) 28,152

356 Ȗ-lactona (XVI) 29,049

346 Ȗ-lactona (XI) 29,570

374 Ȗ-lactona (XII) 33,825

Os espectros de massas das substâncias (IX-XVI) (FIGURAS 3.16

a 3.18, ps. 66 a 68) confirmaram a presença da unidade lactônica através dos

fragmentos com m/z 129, 116, 111 e 99, e para o anel aromático o fragmento m/z

91 referente ao íon tropílio.

m/z 129

m/z 111 m/z 99

m/z 116

m/z 91

m/z 129

m/z 111 m/z 99

m/z 116

m/z 91

FIGURA 3.15: Principais fragmentos observados nos espectros de massas das

Ȗ-lactonas

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

IX n = 5 [M]

= 290

X n = 7 [M]

= 318

XI n = 9 [M]

= 346

XII n = 11

[M]

= 374

As substâncias IX-XII foram identificadas através dos seus

respectivos picos dos íons moleculares, que possibilitaram a determinação de

suas cadeias metilênicas. A configuração relativa dos substituintes nas Ȗ-

lactonas (IX-XII) foi definida através de comparações dos dados dos espectros

de RMN de

H e

C e também pela intensidade dos fragmentos observados em

seus respectivos espectros de massas em relação à literatura (PUPO et al., 1998).

As Ȗ-lactonas possuem três centros estereogênicos na unidade

lactônica possuindo então, oito isômeros possíveis. Desta forma foi observado

através da análise do cromatograma dois picos (t

= 25,585 min. (pico 25) e

28,152 min. (pico 30), FIGURAS 3.16 e 3.17, p. 66 e 67) com [M]

de 318 e

346 referentes às substâncias XIII e XIV, respectivamente. Os espectros de

massas dos compostos XIII e XIV apresentaram fragmentos típicos das Ȗ-

lactonas e os picos dos íons moleculares idênticos às substâncias X (pico 27) e

XI (pico 32) apresentando-se, portanto como diastereoisômeros das Ȗ-lactonas X

e XI. Já as substâncias XV ([M]

328) e XVI ([M]

356) apresentam-se como

derivados da Ȗ-lactonas através da perda de água.

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

No espectro de massas da substância XVI (t

= 29.049, p. 68) além

do pico [M]

356 referente à XVI, notou-se também a presença de outro pico

com m/z 346, que possivelmente devido a presença dos fragmentos

característicos das Ȗ-lactonas, poderia caracterizar para este pico à mistura da

substância XVI com um diastereoisômero da substância XIII.

Os ácidos graxos e as demais substâncias foram identificados

comparando-se os espectros de massas obtidos aos espectros de massas

existentes na biblioteca de dados do CG-EM.

FIGURA 3.16: Espectros de massas referente aos picos 23 e 25 obtidos via CG-

EM.

Substância: Ȗ-lactona IX

Substância: Ȗ-lactona XIII

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

FIGURA 3.17: Espectros de massas referente aos picos 26, 27 e 30 obtidos via

CG-EM.

Substância: Ȗ-lactona XV

Substância: Ȗ-lactona X

Substância: Ȗ-lactona XIV

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

FIGURA 3.18: Espectros de massas referente aos picos 31, 32 e 33 obtidos via

CG-EM.

Substância: Ȗ-lactona XVI

Substância: Ȗ-lactona XI

Substância: Ȗ-lactona XII

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5

16.645.24 3.682.83 1.27 1.04 0.960.64

7.290

7.270

7.262

7.253

7.185

7.167

4.461

4.453

4.444

4.437

4.428

4.420

4.320

4.308

4.300

2.616

2.597

2.577

2.361

2.342

2.323

1.824

1.642

1.626

1.609

1.588

1.443

1.427

1.301

1.254

0.880

0.863

FIGURA 3.19: Espectro de RMN de

H da fração Tslm1-Fr4(4)-3 (100 MHz,

CDCl

)

150 100 50

177.504

142.943

128.390

128.207

125.534

78.735

77.336

77.021

76.699

71.279

47.616

36.001

33.752

31.526

29.709

29.563

29.468

29.072

27.637

24.722

23.338

14.124

13.729

FIGURA 3.20: Espectro de RMN de

C da fração Tslm1-Fr4(4)-3 (100 MHz,

CDCl

)

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

Ao realizar a análise do espectro de RMN

H da fração Tslm1-

Fr4(3), também foram observados sinais referentes aos ácidos Ȧ-fenil alcanóicos

e alquenóicos, ácidos graxos e as Ȗ-lactonas. Desta forma, o mesmo

procedimento foi adotado para identificação das respectivas substâncias.

Através da análise via CG-EM (condições, p.124) da amostra

Tslm1-Fr4(3), observou-se a presença das Ȗ-lactonas X-XII e XIV-XVI já

detectadas na fração Tslm1-Fr4(4)-3, e também a presença das Ȗ-lactonas XVII

a XIX.

O espectro de massa da substância XVII apresentou os fragmentos

característicos da unidade Ȗ-lactônica, apresentando como pico base m/z 116,

entretanto, não foi observado o fragmento m/z 91 característico do anel

aromático, sugerindo que a Ȗ-lactona estaria ligada a uma cadeia metilênica

(FIGURA 3.22, p. 72).

Os espectros de massas de XVIII e XIX mostraram que ambos

possuíam íons moleculares idênticos ([M

] m/z de 338) e fragmentos típicos das

Ȗ-lactonas. A identificação da substância XVIII foi realizada através da

comparação dos dados do espectro de massas em relação à literatura (PUPO et

al., 1998). Deste modo, a Ȗ-lactona XIX apresenta-se como diastereoisômero de

XVIII.

XVII

XVIII

XIX

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

TABELA 3.12: Compostos identificados na fração Tslm1-Fr4(3), obtidos via

CG-EM

Pico [M]

Substância t

(min.)

200 Decanoato-10-oxo de metila 12,238

216 Nonanodioato de metila 13,713

200 Ácido p-toluenosulfônico-etil-éster 13,928

213

N-etil-N,4-dimetil-benzenosulfonamida

15,869

256 Pentadecanoato de metila 17,110

268 Hexadecenoato de metila 17,948

270 Hexadecanoato de metila 18,227

282 Heptadecenoato de metila 19,021

284 Heptadecanoato de metila 19,266

296 Octadecenoato de metila 20,041

296 Octadecenoato de metila 20,088

298 Octadecanoato de metila 20,275

290 Ȧ-fenil dodecanoato de metila 21,307

326 Eicosanoato de metila 22,161

304 Ȧ-fenil tridecanoato de metila 22,272

318 Ȧ-fenil tetradecanoato de metila 23,196

312 Ȗ-lactona (XVII) 23,464

332 Ȧ-fenil pentadecanoato de metila 24,088

338 Ȗ-lactona (XIX) 25,056

338 Ȗ-lactona (XVIII) 25,883

328 Ȗ-lactona (XV) 26,224

318 Ȗ-lactona (X) 26,511

346 Ȗ-lactona (XIV) 28,143

356 Ȗ-lactona (XVI) 29,032

346 Ȗ-lactona (XI) 29,503

374 Ȗ-lactona (XII) 33,794

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

FIGURA 3.21: Cromatograma da fração Tslm1-Fr4(3) (Condições, p.124).

FIGURA 3.22: Espectro de massa referente ao pico 25 obtido via CG-EM

Substância: Ȗ-lactona XVII

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

FIGURA 3.23: Espectros de massas referente aos picos 30 e 31 obtidos via CG-

Substância: Ȗ-lactona XIX

Substância: Ȗ-lactona XVIII

Os demais picos presentes nos cromatogramas das frações Tslm1-

Fr4(3) e Tslm1-Fr4(4)-3 não puderam ser identificados, visto que somente os

dados de seus respectivos espectros de massas eram insuficientes para a

caracterização das mesmas. Isso porque estes picos representavam substâncias

minoritárias na amostra e através da análise do espectro de RMN de

H não foi

possível obter maiores informações sobre estas substâncias, impossibilitando

assim as suas caracterizações.

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

3.3.3 – Identificação dos aminoácidos N-metilprolina (XX) e 4-

hidroxi-N-metilprolina (XXI)

COO

XX XXI

Os aminoácidos XX e XXI foram isolados em mistura do extrato

metanólico das sementes de T. claussenii. As substâncias XX e XXI já foram

isoladas anteriormente das folhas de T. claussenii (PUPO, 1997b). As estruturas

foram determinadas com base em espectros de RMN de

H e

C e através dos

dados da literatura (PUPO, 1997b).

No espectro de RMN de

H (FIGURA 3.24, p. 77) observou-se a

presença de sinais referentes à hidrogênios de carbonos ligados a heteroátomos

em : į 3,90 (dd, J = 10,0 e 7,2 Hz, 1H); į 3,15-3,22 (m, 1H) e į 3,72-3,78 (m,

1H), referentes aos hidrogênios, H-2, H-5a e H-5b, respectivamente de XX. Da

mesma forma, o espectro de RMN

H apresenta em į 4,20 (dd, J = 11,0 e 7,0

Hz, 1H); į 3,15-3,22 (m, 1H) e į 3,97 (dd, J = 12,6 e 5,0 Hz, 1H) sinais

referentes aos hidrogênios, H-2, H-5a e H-5b, respectivamente de XXI. Foram

observados também dois singletos em į 2,94 e į 3,05 integrando três

hidrogênios, referente a duas metilas ligadas a heteroátomos. Através das

integrações dos sinais observados no espectro de RMN de

H, pode-se

caracterizar a presença da mistura dos aminoácidos XX e XXI. A análise dos

dados obtidos via RMN de

H e

C, juntamente com os dados da literatura,

confirmaram as substâncias N-metilprolina (XX) e 4-hidroxi-N-metilprolina

(XXI).

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

TABELA 3.13: Dados de RMN de

H de N-metilprolina (XX) e comparação

com a literatura

XX PUPO, 1997b

H (400 MHz, D

O) (400 MHz, D

2 3,90 (dd, J = 10,0 e 7,2 Hz) 3,78 (dd, J = 9,6 e 7,2 Hz)

3a 2,41-2,54 (m) 2,36 (m)

3b 2,06-2,27 (m) 1,79-2,09 (m)

4a 2,06-2,27 (m) 1,79-2,09 (m)

4b 2,06-2,27 (m) 1,79-2,09 (m)

5a 3,15-3,22 (m) 3,04 (dt, J = 11,6, 8,4 e 8,4 Hz)

5b 3,72-3,78 (m) 3,62 (ddd, J = 12,0, 7,6 e 4,8 Hz)

2,94 (s) 2,75 (s)

TABELA 3.14: Dados de RMN de

H de 4-hidroxi-N-metilprolina (XXI) e

comparação com a literatura

XXI PUPO, 1997b

H (400 MHz, D

O) (400 MHz, D

2 4,20 (dd, J = 11,0 e 7,0 Hz) 4,07 (dd, J = 10,8 e 7,2 Hz)

3a 2,41-2,54 (m) 2,36 (ddt, J = 14,0, 7,2, 2,0 e 2,0 Hz)

3b 2,06-2,27 (m) 2,12 (ddd, J = 13,5, 10,5 e 4,8 Hz)

4 4,80 (m)* 4,50 (m)

5a 3,15-3,12 (m) 3,06 (dt, J = 13,2, 2,0 e 2,0 Hz)

5b 3,97 (dd, J = 12,6 e 5,0 Hz) 3,82 (dd, J = 13,2 e 4,8 Hz)

3,05 (s) 2,92 (s)

* Encoberto pelo sinal da água.

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

TABELA 3.15: Dados de RMN de

C de N-metilprolina (XX) e comparação

com a literatura

XX PUPO, 1997b

C (400 MHz, D

O) (100 MHz, acetona-d

)

2 73,6 70,5

3 31,6 28,7

4 25,7 22,8

59,2 56,2

43,6 40,6

COOH 173,4 173,7

TABELA 3.16: Dados de RMN de

C de 4-hidroxi-N-metilprolina (XXI) e

comparação com a literatura

XXI PUPO, 1997b

C (400 MHz, D

O) (100 MHz, acetona-d

)

2 73,0 70,0

3 41,0 38,2

4 72,3 69,5

5 65,6 62,6

46,0 43,1

COOH 175,8 172,9

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0

4.113.072.74 2.171.921.531.341.00

4.88

4.85

4.83

4.80

4.79

4.73

4.22

4.20

4.18

3.99

3.98

3.95

3.94

3.92

3.90

3.88

3.75

3.74

3.73

3.22

3.20

3.18

3.15

3.05

2.94

2.54

2.51

2.50

2.48

2.46

2.27

2.26

2.24

2.22

2.16

2.15

2.11

2.07

2.05

FIGURA 3.24: Espectro de RMN de

H dos aminoácidos: N-metilprolina (XX)

e 4-hidroxi-N-metilprolina (XXI) (400 MHz, D

4.3 4.2 4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2

1.921.611.381.281.00

4.228

4.213

4.202

4.181

3.994

3.983

3.962

3.950

3.927

3.908

3.903

3.885

3.784

3.769

3.761

3.750

3.731

3.721

3.220

3.203

3.183

3.179

FIGURA 3.25: Ampliação do espectro de RMN de

H dos aminoácidos: N-

metilprolina (XX) e 4-hidroxi-N-metilprolina (XXI) (400 MHz, D

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

FIGURA 3.26: Espectro de RMN de

C dos aminoácidos: N-metilprolina (XX)

e 4-hidroxi-N-metilprolina (XXI) (100 MHz, D

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

3.3.4 - Identificação da uridina (XXII) e uracila (XXIII)

XXIII

XXII

As substâncias XXII e XXIII foram isoladas em mistura do extrato

metanólico das sementes de T. claussenii. As estruturas foram determinadas com

base em espectros de RMN em uma e duas dimensões, e pela comparação com

dados da literatura (YALÇIN et al., 2003; SILVA, 2007).

O espectro de RMN de

H (FIGURAS 3.27 e 3.28, p. 82) mostra

dois dubletos em į 7,98 (J = 8,0 Hz, 1H) e į 5,78 (J = 8,0 Hz, 1H) referentes aos

hidrogênios olefínicos H-6 e H-5, respectivamente de XXII. Da mesma forma,

este mostra dois dubletos em į 7,46 (J = 7,6 Hz, 1H) e į 5,68 (J = 7,6 Hz, 1H)

referentes aos hidrogênios olefínicos H-6 e H-5, respectivamente, de XXIII.

Foram observados também, um dubleto em į 5,90 (J = 5,0 Hz, 1H) o qual foi

atribuído ao hidrogênio H-1’(XXII); dois tripletos em į 4,23 (J = 5,0 Hz, 1H) e

į 4,19 (J = 5,0 Hz, 1H) referentes aos hidrogênios H-2’ e H-3’ de XXII

respectivamente. Em į 4,05 (dd, J = 6,80 e 3,40 Hz, 1H); 3,85 (dd, J = 11,4 e

3,4 Hz, 1H) e em 3,75 (dd, J = 11,4 e 3,4 Hz, 1H), observou-se os sinais

referentes ao hidrogênio H-4’ e os hidrogênios diasterotópicos H-5’a e H-5’b,

respectivamente.

No mapa de correlações HMBC (FIGURA 3.30, p. 83), pode-se

observar para a substância XXII, as correlações dos hidrogênios: H-6 (į 7,98, d)

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

com os carbonos em į 89,0 (C-1’), į 102,0 (C-5), į 153,0 (C-2) e į 167,0 (C-4),

e para H-5 (į 5,78, d) foram observadas as correlações com os sinais į 142,0 (C-

6) e į 167,0 (C-4). Da mesma forma, observaram-se para a substância XXIII as

correlações: H-6 (į 7,46, d) com os carbonos em į 101,0 (C-5), į 153,0 (C-2); į

167,0 (C-4); e para H-5 (į 5,68 d) a correlação com o carbono em į 143,0

referente ao C-6.

Os sinais dos demais carbonos para as substâncias XXII e XXIII,

foram atribuídos através da análise do mapa de correlações HSQC (FIGURA

3.29, p. 83).

TABELA 3.17: Dados de RMN de

H da uridina (XXII) e comparação com a

literatura

XXII SILVA, 2007

H (400 MHz, CD

OD) (400 MHz, DMSO)

5 5,78 (d, J = 8,0 Hz) 5,62 (d, J = 8,0 Hz)

6 7,98 (d, J = 8,0 Hz) 7,87 (d, J = 8,0 Hz)

1’ 5,90 (d, J = 5,0 Hz) 5,77 (d, J = 5,4 Hz)

2’ 4,23 (t, J = 5,0 Hz) 4,01 (t, J = 5,2 Hz)

3’ 4,19 (t, J = 5,0 Hz) 3,96 (t, J = 5,0 Hz)

4’ 4,05 (dd, J = 6,8 e 3,4 Hz) 3,82 (dd, J = 7,0 e 3,3 Hz)

5’a 3,85 (dd, J = 11,4 e 3,4 Hz) 3,60 (dd, J = 12,0 e 3,3 Hz)

5’b 3,75 (dd, J = 11,4 e 3,4 Hz) 3,54 (dd, J = 12,0 e 3,3 Hz)

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

TABELA 3.18: Dados de RMN de

H da Uracila (XXIII) e comparação com a

literatura

XXIII SILVA, 2007

H (400 MHz, CD

OD) (400 MHz, DMSO)

5 5,68 (d, J = 7,6 Hz) 5,65 (d, J = 7,6 Hz)

6 7,46 (d, J = 7,6 Hz) 7,50 (d, J = 7,6 Hz)

TABELA 3.19: Dados de RMN de

C da Uridina (XXII) e comparação com a

literatura

XXII SILVA, 2007

C (400 MHz, CD

OD) (400 MHz, DMSO)

2 153,0 151,0

4 167,0 163,5

5 102,0 101,7

6 142,0 140,6

1’ 89,0 87,7

2’ 74,0 73,5

3’ 70,0 69,8

4’ 85,5 84,6

5’ 61,0 60,8

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

FIGURA 3.27: Espectro de RMN de

H de XXII e XXIII (400 MHz, CD

OD)

FIGURA 3.28: Ampliação do espectro de RMN de

H de XXII e XXIII (400

MHz, CD

OD)

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

H-6

H-6 (XXIII)

H-5 (XXIII)

H-5

H-1’

H-4’

H-2’

H-3’

H-5’

H-6

H-6 (XXIII)

H-5 (XXIII)

H-5

H-1’

H-4’

H-2’

H-3’

H-5’

FIGURA 3.29: Mapa de correlações HSQC de XXII e XXIII (400 MHz,

OD)

FIGURA 3.30: Mapa de correlações HMBC de XXII e XXIII (400 MHz,

OD)

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

3.3.5 - Identificação do flavonóide ent-catequina

OHO

XXIV

O flavonóide ent-catequina (XXIV), foi isolado do extrato

metanólico das inflorescências de T. catigua.

Este flavonóide foi caracterizado através dos espectros de RMN de

H e

C e pela comparação com dados da literatura (NAHRTEDT et al., 1987;

LEITE, 2005).

O modo de oxidação do anel A foi definido, através da análise do

espectro de RMN de

H (FIGURA 3.31, p.87) de XXIV, devido a presença de

dois dubletos com constantes típicas de acoplamento meta (J=2,4 Hz) em į

5,86 e 5,94, relativos a H-8 e H-6 respectivamente.

Os hidrogênios H-2’, H-3’ e H-6’ foram atribuídos aos valores de

deslocamentos químicos: duplo dubleto em į 6,72 (J=1,9 e 8,1 Hz) atribuído a

H-2’ devido ao seu acoplamento orto (J = 8,1 Hz) com H-3’ (į 6,77, d, J = 8,1

Hz) e meta (J = 1,9 Hz) com H-6’ (į 6,84, d, J = 1,9 Hz)

O anel C foi caracterizado pela presença de um dubleto em į 4,57

(J = 8,0 Hz), atribuído a H-2, que acopla com H-3 (į 3,98, m). A configuração

2,3-trans foi determinada pela constante de acoplamento (J = 8,0 Hz) observada,

e pelo valor de C-2 em į 83,0. A presença do sinal referente à H-2, indicou a

ausência da dupla ligação entre C-2 e C-3, e o sinal em į 69,0 no espectro de

RMN de

C (FIGURA 3.33, p. 88) foi atribuído ao carbono carbinólico em C-3.

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

Para os hidrogênios diasterotópicos H-4Į e H-4ȕ observou-se um

duplo dubleto em į 2,85 (J = 16,2 e 5,2 Hz), sendo correspondente a H-4Į,

devido ao seu acoplamento geminal com H-4ȕ (J = 16,2 Hz) e acoplamento

pseudo-equatorial-axial com H-3 (J = 5,2 Hz). O duplo dubleto em į 2,51 (J =

16,2 e 8,0 Hz) foi atribuído ao H-4ȕ, devido ao seu acoplamento pseudo-diaxial

com H-3 (J = 8,0 Hz).

Os sinais observados no espectro de RMN de

C estão de acordo

com os dados da literatura para ent-catequina (NAHRTEDT, et al., 1987;

LEITE, 2005) (TABELA 3.21, p. 86).

TABELA 3.20: Dados de RMN de

H da ent-catequina (XXIV) e comparação

com a literatura

H XXIV NAHRTEDT, 1987

(400 MHz, CD

OD) (400 MHz, acetona-d

)

2 4,57 (d, J = 8,0 Hz) 4,54 (d, J = 7,8 Hz)

3 3,98 (m) 3,98 (m)

4 2,85 (dd, J = 16,2 e 5,2 Hz) 2,86 (dd, J = 16,0 e 5,4 Hz)

4 2,51 (dd, J = 16,2 e 7,8 Hz) 2,52 (dd, J = 16,0 e 8,5 Hz)

6 5,94 (d, J = 2,4 Hz) 6,02 (d, J = 2,1 Hz)

8 5,86 (d, J = 2,4 Hz) 5,87 (d, J = 2,2 Hz)

2’ 6,72 (dd, J = 8,1 e 1,9 Hz) 6,7 a 6,9 m

3’ 6,77 (d, J = 8,1 Hz) 6,7 a 6,9 m

6’ 6,84 (d, J = 1,9 Hz) 6,7 a 6,9 m

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

TABELA 3.21: Dados de RMN de

C da ent-catequina (XXIV) e comparação

com a literatura

C XXIV NAHRTEDT, 1987

(100 MHz, CD

OD) (100 MHz, acetona-d

)

2 83,0 82,9

3 69,0 68,5

4 28,7 28,5

5 157,0 157,9

6 96,5 96,4

7 157,0 157,6

8 95,7 95,6

9 157,0 156,9

10 101,0 100,9

1’ 132,4 132,3

2’ 120,2 120,1

3’ 116,3 116,2

4’ 146,6 146,2

5’ 146,4 146,2

6’ 120,2 120,1

valores intercambiáveis

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

FIGURA 3.31: Espectro de RMN de

H da ent-catequina (XXIV) (400 MHz,

OD)

FIGURA 3.32: Expansão do espectro de RMN de

H da ent-catequina (XXIV)

(400 MHz, CD

OD)

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

FIGURA 3.33: Espectro de RMN de

C da ent-catequina (XXIV) (100 MHz,

OD).

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

3.3.6 - Identificação do Ácido 5-O-cafeoilquínico

COOH

XXV

O ácido 5-O-cafeoilquínico (XXV) foi caracterizado através de

RMN em uma e em duas dimensões e pela comparação com os dados da

literatura (MERFORT et al., 1992, VALENTE, 2003).

No espectro de RMN de

H de XXV (FIGURAS 3.34, p. 92) foram

observados sinais característicos de hidrogênios olefínicos em į 7,56 (d, J = 15,4

Hz, H-7’) e į 6,28 (d, J = 15,4 Hz, H-8’), com constantes de acoplamento (J =

15,4 Hz) típicas para a configuração trans do ácido cafeíco. Observou-se

também, três sinais de hidrogênios aromáticos: um dubleto em į 7,05 (H-2’)

com J = 1,8 Hz, devido ao acoplamento com hidrogênio H-6’ (meta); em į 6,91

um duplo dubleto (H-6’) com J = 1,8 Hz (meta) e J = 8,2 Hz (orto), e um

dubleto em į 6,77 (H-5’) com J = 8,2 Hz (orto), devido ao acoplamento com

hidrogênio H-6’.

Os hidrogênios carbinólicos aparecem em į 3,74 como um duplo

dubleto (H-4ax) com J = 10,3 e 2,8 Hz, causado pelo acoplamento com H-5ax e

H-3eq, respectivamente; em į 5,38 (H-5ax) um triplo dubleto com J = 10,3 Hz

(acoplamento: H-4ax e H-6ax) e 4,8 Hz (acoplamento: H-6eq); e um singleto em

į 4,22 referente ao H-3ax.

Os hidrogênios metilênicos (H-6ax, H-6eq, H-2ax e H-2eq)

aparecem como um multipleto em į 2,03-2,26. Os sinais e as constantes de

acoplamento dos hidrogênios referentes ao ácido quínico, coincidem com a

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

conformação preferida do ácido quínico, segundo a literatura (MERFORT et al.,

1992).

Todos os sinais de hidrogênios observados no espectro de RMN de

H foram atribuídos e correlacionados aos seus respectivos carbonos, através do

mapa de correlações HSQC (FIGURA 3.35, p. 93). Já os carbonos quaternários

foram atribuídos através do mapa de correlações HMBC (FIGURA 3.36, p. 93).

Os dados obtidos foram concordantes com os dados da literatura (VALENTE,

2003).

TABELA 3.22: Dados de RMN de

H do ácido 5-O-cafeoilquínico (XXV) e

comparação com a literatura

H XXV VALENTE, 2003

(400 MHZ, CD

OD) (400 MHZ, CD

OD)

2 2,13 (m) 2,18 ax (dd, J = 14,9 e 3,2 Hz)

2,04 eq (ddd, J = 14,9, 5,4 e 1,9 Hz)

3 4,22 (sl) 4,18 eq (dtd, J = 5,4 e 3,2 Hz)

4 3,74 ax (dd, J = 10,3 e 2,8 Hz) 3,73 ax (dd, J = 9,1 e 3,2 Hz)

5 5,38 ax (td, J = 10,3 e 4,8 Hz) 5,33 ax (td, J = 9,1 e 4,0 Hz)

6 2,24 eq (m) 2,23 eq (ddd, J = 14,9, 4,0 e 1,9 Hz)

2,03 ax (m) 2,08 ax (dd, J = 14,9 e 9,1 Hz)

2' 7,05 (d, J = 1,8 Hz) 7,05 (d, J = 1,9 Hz)

5' 6,78 (d, J = 8,2 Hz) 6,78 (d, J = 8,2 Hz)

6' 6,91 (dd, J = 8,2 e 1,8 Hz) 6,95 (dd, J = 8,2 e 1,9 Hz)

7' 7,56 (d, J = 15,4 Hz) 7,56 (d, J = 15,9 Hz)

8' 6,28 (d, J = 15,4 Hz) 6,27 (d, J = 15,9 Hz)

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

TABELA 3.23: Dados de RMN de

C do ácido 5-O-cafeoilquínico (XXV) e

comparação com a literatura

C XXV VALENTE, 2003

(100 MHZ, CD

OD) (100 MHZ, CD

OD)

1 * 76,2

2 38,2 38,3

3 72,5 71,3

4 74,5 73,5

5 71,5 72,0

6 39,8 38,8

7 * 177,1

1’ 126,0 127,8

2’ 115,2 115,3

3' 145,0 146,8

4’ 148,0 149,6

5’ 116,0 116,5

6’ 123,0 123,1

7’ 147,0 147,1

8’ 115,2 115,3

9’ 169,0 168,7

* Valores não observados nos experimentos de RMN

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

FIGURA 3.34: (A) Espectro de RMN de

H do ácido 5-O-cafeoílquínico

(XXV) (400 MHz, CD

OD).(B) Ampliação do espectro de RMN de

H de XXV.

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

H-7’

H-6’

H-8’

H-5’

H-2’

H-5

H-3

H-4

H-6

H-2

H-7’

H-6’

H-8’

H-5’

H-2’

H-5

H-3

H-4

H-6

H-2

FIGURA 3.35: Mapa de correlações HSQC do ácido 5-O-cafeoílquínico (XXV)

(400 MHz, CD

OD)

FIGURA 3.36: Mapa de correlações HMBC do ácido 5-O-cafeoílquínico

(XXV) (400 MHz, CD

OD)

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

3.3.7 – Determinação estrutural dos limonóides

AcO

XXVI

XXVII

OAc

AcO

XXVIa

Os limonóides XXVI e XXVII provenientes do extrato metanólico

das sementes de T. elegans, estão sendo relatados pela primeira vez no gênero

Trichilia. O limonóide (XXVIa) acetato de 11ȕ-acetoxiobacunila isolado de

Cedrela odorata (KIPASSA et al., 2008) foi utilizado como modelo na

caracterização do anel furânico ligado ao C-17 dos limonóides XXVI e XXVII.

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

3.3.7.1 – Identificação do limonóide 11ȕ-acetoxiobacunona

AcO

XXVI

O limonóide XXVI foi caracterizado através de RMN em uma e

duas dimensões, e pela comparação com dados da literatura do limonóide com

estrutura semelhante a XXVI (KIPASSA et al., 2008).

No espectro de RMN de

H de XXVI (FIGURA 3.37, p. 101)

foram observados sinais característicos do anel furano em į 7,42 (sl, H-21), į

7,40 (t, J = 1,76 Hz, H-23) e į 6,35 (sl, H-22). No espectro de RMN de

(FIGURA 3.38, p. 102), o anel furano foi caracterizado pelos sinais em į 119,5

(C-20), į 141,4 (C-21), į 109,6 (C-22) e į 143,3 (C-23). Estas atribuições foram

confirmadas através do mapa de correlações HSQC de 23 (FIGURA 3.39, p.

102).

No espectro de RMN de

H observou-se também a presença de seis

sinais de metilas como singletos em į 1,08, 1,45, 1,50, 1,53, 1,60 e 2,19. Os dois

singletos integrando para um hidrogênio cada, em į 3,74 e į 5,45 foram

atribuídos a H-15 e H-17, respectivamente. As atribuições dos sinais de H-15 e

H-17 e a presença de um anel D į-lactônico com epóxido entre C-14 e C-15,

foram confirmadas através das correlações observadas no mapa de correlações

HMBC (FIGURA 3.40, p. 103).

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

As atribuições dos deslocamentos químicos de C-15 (į 53,5) e C-17

(į 78,0) foram realizadas através da análise do mapa de correlações HSQC de

XXVI. No mapa de correlações do HMBC foi observada a correlação do sinal

em į 1,08 (s, Me-18) com os sinais em į 36,3 e į 63,9, atribuídos aos carbonos

tetrassubstituídos C-13 e C-14 respectivamente.

No espectro de RMN de

H, a presença de uma ligação dupla

conjugada a uma carbonila no anel A, foi determinada pela presença de dois

dubletos em į 6,01 e į 6,55 (J = 12,1 Hz) atribuídos aos hidrogênios olefínicos

H-2 e H-1. Os carbonos da dupla ligação foram caracterizados em į 153,3 (C-1)

e į 122,4 (C-2), através da análise do mapa de correlações HSQC.

As atribuições realizadas para H-1 e H-2, assim como a presença de

uma carbonila conjugada em C-3 (į 166,4), foram confirmadas através do mapa

de correlações HMBC.

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

Foram observadas através do mapa de correlações HMBC, as

correlações dos sinais em į 1,45 (s, Me-28) e į 1,53 (s, Me-29) com os carbonos

C-4 (į 83,7) e C-5 (į 56,6). Deste modo pode-se propor a existência de um anel

A İ -lactônico Į-ȕ insaturado na estrutura do limonóide XXVI.

Os sinais dos hidrogênios H-5, H-6Į e H-6ȕ foram atribuídos

através da análise do espectro de RMN de

H e das constantes de acoplamento

observadas. O hidrogênio H-6ȕ (t, į 3,01, J = 14,2 Hz) apresenta um

acoplamento geminal com H-6Į e diaxial com H-5 (dd, į 2,56, J = 14,2 e 4,5

Hz), com a mesma constante de acoplamento (J = 14,2 Hz). A constante de

acoplamento equatorial-axial de H-6Į (dd, į 2,44, J = 14,2 e 4,5 Hz) com H-5 é

de 4,5 Hz.

Além dos sinais de carbonos carboxílicos atribuídos a C-16 e C-3, o

espectro de RMN de

C (FIGURA 3.38, p. 102) de XXVI apresentou mais um

sinal de carbonila não conjugada em į 205,8, atribuído a C-7. Esta atribuição foi

confirmada através de comparações realizadas com a literatura (GARCEZ et al.,

1997).

Os singletos em į 1,50 (Me-30, į 19,4) e 1,61 (Me-19, į 17,9)

foram atribuídos através dos mapas de correlações HSQC e HMBC.

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

O sinal em į 5,71 (dd, J = 6,1 e 2,2 Hz) foi atribuído H-11 devido a

correlação com carbono em į 68,3, observado através do mapa de correlações

HSQC. A localização do grupamento acetoxílico no anel C (C-11), foi

evidenciada devido à presença do sinal em į 1,83 (m, H-12) no espectro de

RMN de

H. Essas atribuições foram confirmadas através de dados da literatura.

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

TABELA 3.24: Dados de RMN de

H de 11ȕ-acetoxiobacunona (XXVI) e

comparação com a literatura (XXVIa).

H XXVI KIPASSA, 2008 (XXVIa)

(400 MHZ, CDCl

) (600 MHZ, CDCl

)

1 6,55 (d, J = 12,1 Hz) 6,29 (d, J = 12,6 Hz )

2 6,01 (d, J = 12,1 Hz) 5,94 (d, J = 12,6 Hz)

5 2,56 (dd, J = 14,2 e 4,6 Hz) 2,50 (dd, J = 13,1 e 2,4 Hz)

6Į

2,44 (dd, J = 14,2 e 4,6 Hz) 2,12 (ddd, J = 15,4, 2,6 e 2,4 Hz)

6ȕ

3,01 (t, J = 14,2 Hz)

1,94 (ddd, J = 15,4, 13,1, e 2,4

Hz)

4,56 (dd, J = 2,6 e 2,4 Hz)

9 2,15 (s) 2,49 (d, J = 4,6 Hz )

11 5,71 (dd, J = 6,1 e 2,2 Hz) 5,60 (ddd, J = 9,8, 5,5 e 4,6 Hz)

12 1,82 (m) 2,33 (Į, dd, J = 14,3 e 9,8 Hz)

1,51 (ȕ, dd, J = 14,3 e 5,5 Hz)

15 3,74 (s) 3,55 (s)

17 5,45 (s) 5,59 (s)

18 1,08 (s) 1,21 (s)

19 1,61 (s) 1,53 (s)

21 7,42 (sl) 7,40 (t, J = 1,6 Hz)

22 6,35 (sl) 6,32 (d, J = 1,0 Hz)

23 7,40 (t, J = 1,76 Hz) 7,39 (s)

28 1,45 (s) 1,34 (s)

29 1,53 (s) 1,45 (s)

30 1,50 (s) 1,34 (s)

11-OAc 2,19 (s) 2,15 (s)

7-OAc

2,13 (s)

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

100

TABELA 3.25: Dados de RMN de

C de 11ȕ-acetoxiobacunona (XXVI) e

comparação com a literatura (XXVIa).

XXVI KIPASSA, 2008 (XXVIa)

(100 MHZ, CDCl

) (150 MHZ, CDCl

)

153,3 149,8

122,4 120,0

166,4 166,4

83,7 83,9

56,6 45,5

38,9 27,0

205,8 74,1

51,8 42,0

49,5 49,5

43,8 45,5

68,3 67,7

40,8 36,5

36,3 37,6

63,9 68,6

53,5 55,2

166,2 166,7

78,0 78,0

20,3 17,2

17,9 19,4

119,5 119,7

141,1 141,3

109,6 109,7

143,3 143,4

31,8 31,8

26,3 25,5

19,4 20,1

OAc

21,4 21,2

169,9 169,7

OAc

-- 21,5

-- 169,7

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0

ppm

3.26 3.21 3.012.932.172.00 1.35 1.301.251.17 1.11 1.101.041.00

1.085

1.449

1.502

1.531

1.610

1.821

1.836

2.150

2.191

2.423

2.433

2.457

2.470

2.545

2.556

2.580

2.592

2.982

3.017

3.053

3.748

5.453

5.702

5.716

5.994

6.024

6.350

6.544

6.574

7.398

7.402

7.421

7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 6.2 6.1 6.0 5.9 5.8 5.7 5.6 5.5 5.4

ppm

2.00 1.351.17 1.111.041.00

5.453

5.702

5.716

5.994

6.024

6.350

6.544

6.574

7.398

7.402

7.407

7.421

FIGURA 3.37: (A) Espectro de RMN de

H de 11ȕ-acetoxiobacunona (XXVI)

(400 MHz, CDCl

). (B) Ampliação do espectro de RMN de

H de XXVI.

101

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

200 150 100 50

205.84

169.91

166.38

166.20

153.37

143.33

141.07

122.47

119.54

109.60

83.68

77.99

77.32

77.00

76.69

68.32

63.90

56.59

53.54

49.51

43.78

40.78

39.84

36.29

31.81

26.30

21.48

20.28

19.41

FIGURA 3.38: Espectro de RMN de

C de 11ȕ-acetoxiobacunona (XXVI)

(100 MHz, CDCl

)

Me-18

Me-28

Me-29

Me-30

Me-19

H-12

H-6Į

H-9

OAc

H-6ȕ

H-5

H-15

H-17

H-11

H-2

H-1

H-22

H-23

H-21

Me-18

Me-28

Me-29

Me-30

Me-19

H-12

H-6Į

H-9

OAc

H-6ȕ

H-5

H-15

H-17

H-11

H-2

H-1

H-22

H-23

H-21

FIGURA 3.39: Mapa de correlações HSQC de 11ȕ-acetoxiobacunona (XXVI)

(400 MHz, CDCl

)

102

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

FIGURA 3.40: Mapa de correlações HMBC de 11ȕ-acetoxiobacunona (XXVI)

(400 MHz, CDCl

)

FIGURA 3.41: Ampliação do mapa de correlações HMBC de 11ȕ-

acetoxiobacunona (XXVI) (400 MHz, CDCl

)

103

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

3.3.7.2 – Identificação do limonóide 1,2 –diidro-1Į-acetoxi-11ȕ-

acetoxi-14,15-epoxicneorina R

AcO

XXVII

O limonóide XXVII foi caracterizado através de RMN em uma e

duas dimensões, ESI/MS e também pela comparação com dados da literatura do

limonóide 1,2-diidro-1Į-acetoxielegantina B (XXVIIa), semelhante ao XXVII

(GARCEZ et al., 1997a).

No espectro de RMN de

H de XXVII (FIGURA 3.42, p. 110)

foram observados sinais característicos do anel furano em į 7,41 (t, J = 2,0 Hz,

H-23), į 7,38 (s, H-21) e į 6,32 (d, J = 2,0 Hz, H-22). No espectro de RMN de

C (FIGURA 3.43, p. 110), o anel furano foi caracterizado pelos sinais em į

119,2 (C-20), į 141,1 (C-21), į 109,5 (C-22) e į 143,5 (C-23). Estas atribuições

foram confirmadas através do mapa de correlações HSQC de XXVII (FIGURA

3.45, p. 111).

No espectro de RMN de

H observou-se também a presença de sete

sinais de metilas como singletos em į 1,06, 1,25, 1,42, 1,59, 2,11, 2,15 e 3,67.

Os dois singletos integrando para um hidrogênio cada, em į 3,92 e į 5,50 foram

atribuídos a H-15 e H-17, respectivamente. As atribuições dos sinais de H-15 e

H-17 e a presença de um anel D į-lactônico com epóxido entre C-14 e C-15,

104

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

foram confirmadas através das correlações observadas no mapa de correlações

HMBC (FIGURA 3.46, p. 112).

Os deslocamentos químicos de C-15 (į 55,4) e C-17 (į 76,4) foram

determinados através da análise do mapa de correlações HSQC (FIGURA 3.45,

p. 111) de XXVII. No mapa de correlações do HMBC (FIGURA 3.46, p. 112)

foi observada a correlação do sinal em į 1,06 (s, Me-18) com os sinais em į

76,4 (C-17), 38,6 (C-13), 67,2 (C-14) e 34,8 (C-12).

O mapa de correlações HSQC mostra o sinal em į 34,8 (C-12) se

correlacionando com o sinal em į 1,25 (m, 1H), atribuído ao hidrogênio H-12b.

Através do espectro de Cosy

H-

H observou-se o acoplamento do hidrogênio

H-12b (į 1,25, m) com o sinal em į 1,80 (m, 1H), atribuído ao H-12a.

No espectro de Cosy

H-

H (FIGURA 3.44, p. 111) também foi

possível observar o acoplamento dos hidrogênios H-12a e H-12b com o

hidrogênio em į 5,35, atribuído a H-11. O acoplamento do H-11 (į 5,35, m) ao

hidrogênio em į 3,20 (m, 1H) atribuído à H-9, foi observado através do espectro

de Cosy

H-

H. A presença de um sinal em į 2,15 (s, 3H) se correlacionando

com o sinal em į 170,2 no mapa de correlações HMBC, evidenciou a presença

do grupo acetoxílico na posição 11.

No espectro de RMN de

H, a presença de uma ligação dupla

exocíclica entre C8-C30 foi determinada pela presença dos sinais em į 5,35 (m,

1H) e į 5,55 (m, 1H) atribuídos aos hidrogênios olefínicos da posição 30. O

105

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

deslocamento químico de C-30 (į 125,7) foi determinado através do mapa de

correlações HSQC, confirmando o anel B seco para este limonóide.

Os sinais em į 5,55 (m, 1H) e į 2,11 (s, OAc) no espectro de RMN

H evidenciaram a presença do grupo acetoxílico no anel A. No espectro de

Cosy

H-

H observou-se o acoplamento do hidrogênio em į 5,55 (m, H-1) com

os hidrogênios em į 3,08 (d, J = 16,5 Hz, 1H) e į 3,32 (m, 1H) atribuídos aos

hidrogênios H-2a e H-2b. Os carbonos C-1 (į 72,0) e C-2 (į 36,5) foram

caracterizados através do mapa de correlações HSQC.

A presença do sinal em į 170,6 observado no espectro de RMN de

C, característico de carbono carboxílico foi atribuído a C-3, sendo coerente

com os dados da literatura (GARCEZ et al., 1997a).

Foram também observadas através do mapa de correlações HMBC,

as correlações dos sinais em į 1,42 (s, Me-28) e į 1,59 (s, Me-29) com os

carbonos C-4 (į 84,5) e C-5 (į 45,7).

AcO

Os sinais dos hidrogênios H-5 e H-6 foram atribuídos através do

espectro de RMN de

H e por comparações com a literatura.

No espectro de RMN de

C (FIGURA 3.43, p. 110) observou-se

sinais em į 52,2 e į 173,1 atribuídos ao grupo carbometoxílico em C-7. Essa

atribuição foi confirmada através do mapa de correlações HMBC.

106

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

O singleto em į 1,25 (Me-19) apresentou correlação no HSQC com

o sinal em į 20,0, atribuído ao C-19.

Nos espectros de RMN de

H e RMN

C do limonóide XXVII

foram observados alguns sinais com má resolução, Garcez et al. (1997a) relatam

que a má resolução dos sinais presentes nos espectros de RMN de

H e

C de

compostos que possuem anel B-seco e İ-lactônico no anel A, seria devido ao

impedimento rotacional em torno da ligação C-9/C-10. Este impedimento pode

ser causado por substituintes presentes no anel A. Desta forma, os sinais

relativos aos prótons situados na vizinhança da ligação citada se mostram mais

alargados.

O espectro de massas (ESI) no modo positivo do limonóide XXVII

(FIGURA 3.48, p. 113) apresentou um pico em m/z 625 [M+Na]

correspondente ao aduto de sódio, de acordo com a fórmula molecular

proposta para este limonóide.

A partir da análise dos experimentos realizados, juntamente com os

dados da literatura pode-se confirmar a estrutura do limonóide XXVII.

O limonóide XXVIIa foi utilizado como modelo para comparação

dos dados da estrutura XXVII.

AcO

XXVIIa

107

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

108

TABELA 3.26: Dados de RMN de

H de XXVII e comparação com a literatura.

H XXVII GARCEZ, 1997a (XXVIIa)

(400 MHZ, CDCl

) (300 MHZ, CDCl

)

1 5,55 (m) 5,34-5,56 (m)

2a 3,08 (d, J = 16,5 Hz) 3,06 (d, J = 16,5 Hz)

2b 3,32 (m) 3,25-3,47 (m)

5 3,20 (m) 3,25-3,47 (m)

6a 2,10 (m) 2,03-2,17 (m)

6b 2,75 (m) 2,66 (dd, J = 18,3 e 3,1 Hz)

9 3,20 (m) 3,19 (d, J = 6,8 Hz)

11 5,35 (m) 5,34-5,56 (m)

12a 1,80 (m) 1,94 (t, J = 12,2 Hz)

12b 1,25 (m) 1,57-1,78 (m)

15 3,92 (s) 3,91 (s)

17 5,50 (s) 5,34-5,56 (m)

18 1,06 (s) 1,12 (s)

19 1,25 (s) 1,12 (s)

21 7,38 (s) 6,01 (s)

22 6,32 (d, J = 2,0 Hz) 6,23 (s)

23 7,41 (t, J = 2,0 Hz) --

28 1,42 (s) 1,44 (s)

29 1,59 (s) 1,55 (s)

30a 5,35 (m) 5,34-5,56 (m)

30b 5,55 (m) 5,34-5,56 (m)

OAc 2,11 (s) e 2,15 (s) 2,15 (s) e 2,18 (s)

OMe 3,68 (s) 3,68 (s)

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

109

TABELA 3.27: Dados de RMN

C de XXVII e comparação com a literatura.

XXVII

(100 MHZ, CDCl

)

GARCEZ, 1997a (XXVIIa)

(100 MHZ, CDCl

)

71,5 71,6

36,5 36,5

170,6 171,6

84,5 84,6

45,7 45,7

34,8 34,7

173,1 173,0

136,6 136,0

51,6 51,5

48,5 48,0

69,3 68,5

34,8 34,1

38,6 39,0

67,2 67,4

55,4 55,0

166,1 164,9

76,4 76,6

15,4 15,7

20,0 24,4

119,2 161,7

141,1 98,1

109,5 123,4

143,5 168,6

33,8 34,0

24,6 21,2

125,7 126,3

OAc

170,2 170,3

21,4 21,4

OAc

170,0 170,7

21,6 21,5

OMe 52,2 52,4

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

110

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0

4.033.27 3.09 3.012.862.00 1.990.98 0.93

Chloroform-d

7.414

7.409

7.386

7.263

6.322

5.586

5.565

5.521

5.502

5.381

5.361

5.344

5.329

3.918

3.678

3.492

3.335

3.194

3.103

3.064

2.757

2.151

2.112

2.047

1.816

1.590

1.427

1.254

1.066

FIGURA 3.42: Espectro de RMN de

H de XXVII (400 MHz, CDCl

)

FIGURA 3.43: Espectro de RMN de

C de XXVII (100 MHz, CDCl

)

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

FIGURA 3.44: Espectro de Cosy

H-

H de XXVII (400 MHz, CDCl

)

Me-18

Me-19

Me-28

Me-29

2 OAc

H-6aH-6b

H-2a

OMe

H-15

H-11

H-1

H-17

H-22

H-30

H-21

H-23

H-12

Me-18

Me-19

Me-28

Me-29

2 OAc

H-6aH-6b

H-2a

OMe

H-15

H-11

H-1

H-17

H-22

H-30

H-21

H-23

H-12

Me-18

Me-19

Me-28

Me-29

2 OAc

H-6aH-6b

H-2a

OMe

H-15

H-11

H-1

H-17

H-22

H-30

H-21

H-23

H-12

FIGURA 3.45: Mapa de correlações HSQC de XXVII (400 MHz, CDCl

)

111

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

FIGURA 3.46: Mapa de correlações HMBC de XXVII (400 MHz, CDCl

)

FIGURA 3.47: Ampliação do mapa de correlações HMBC de XXVII (400

MHz, CDCl

)

112

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

[M+Na]

FIGURA 3.48: Espectro de massas (ESI no modo positivo) do limonóide

XXVII.

113

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

3.3.8 – Identificação dos esteróides

3.3.8.1 – Identificação do 3-ȕ-O-ȕ-glucopiranosil sitosterol

114

A substância XXVIII foi isolada do extrato metanólico das

sementes de T. claussenii e a sua estrutura foi determinada com base em

experimentos de RMN de

H e

C e por comparação com dados da literatura

(SAKAKIBARA et al., 1983).

Através dos espectros de RMN de

H e

C de XXVIII (FIGURAS

3.49 e 3.51, ps. 115 e 116) observou-se um duplo dubleto em į 4,58 (J = 11,6 e

2,4 Hz) (RMN de

H) e į 102,5 (RMN de

C) correspondente ao H-1’ e o

carbono anomérico, sinais nas regiões į 4,00 a 5,20 referentes aos hidrogênios

carbinólicos também foram observados.

O espectro de RMN de

H de XXVIII mostra vários sinais nas

regiões de į 0,67 a 2,76 indicando a presença de hidrogênios metílicos e

metilênicos característicos do esqueleto esteroidal.

Os sinais observados no espectro de RMN de

C estão de acordo

com os dados da literatura para o esteróide 3-ȕ-O-ȕ-glucopiranosil sitosterol.

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

ppm

TMSPyridine-d5

Pyridine-d5

0.000

0.675

0.690

0.868

0.886

0.909

0.928

0.946

0.994

1.011

1.100

1.261

1.279

1.297

1.407

1.742

1.752

1.894

1.976

2.485

2.513

2.731

2.757

2.764

3.997

4.072

4.093

4.288

4.303

4.310

4.319

4.434

4.447

4.561

4.566

4.589

4.595

5.056

5.075

5.358

5.370

7.223

7.592

8.731

FIGURA 3.49: Espectro de RMN de

H do 3-ȕ-O-ȕ-glucopiranosil sitosterol

(XXVIII) (400 MHz, Piridina-d

4.6 4.5 4.4 4.3 4.2 4.1 4.0 3.9 3.8

4.596

4.589

4.566

4.561

4.447

4.434

4.417

4.404

4.340

4.319

4.310

4.303

4.297

4.288

4.266

4.093

4.072

4.052

4.012

4.005

3.997

3.982

3.977

3.964

3.953

3.937

3.926

FIGURA 3.50: Ampliação do espectro de RMN de

H do 3-ȕ-O-ȕ-

glucopiranosil sitosterol (XXVIII) (400 MHz, Piridina-d

115

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

FIGURA 3.51: Espectro de RMN de

C do 3-ȕ-O-ȕ-glucopiranosil sitosterol

(XXVIII) (100 MHz, Piridina-d

116

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

117

TABELA 3.28: Dados de RMN de

C da aglicona do sitosterol (XXVIII)e

comparação com a literatura

C XXVIII

(100 MHz, Piridina-d

)

SAKAKIBARA, 1983

(50 MHz, Piridina-d

)

1 37,5 37,5

2 30,3 30,2

3 78,5 78,5

4 40,0 40,0

5 140,9 140,9

6 122,0 121,8

7 32,2 32,1

8 32,1 32,1

9 50,3 50,3

10 37,0 36,9

11 21,3 21,3

12 39,3 39,3

13 42,5 42,5

14 56,8 56,9

15 24,5 24,5

16 28,6 28,6

17 56,2 56,3

18 12,0 12,0

19 19,5 19,4

20 36,4 36,4

21 19,0 19,1

22 34,2 34,3

23 26,3 26,5

24 46,0 46,1

25 29,4 29,5

26 19,2 19,2

27 20,0 20,0

28 23,4 23,4

29 12,2 12,2

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

118

TABELA 3.29: Dados de RMN de

C do grupo glicosil (XXVIII)e

comparação com a literatura

C XXVIII

(100 MHz, Piridina-d

)

SAKAKIBARA, 1983

(50 MHz, Piridina-d

)

1’ 102,6 102,5

2’ 75,4 75,3

3’ 78,6 78,6

4’ 71,7 71,7

5’ 78,1 78,4

6’ 62,8 62,8

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

3.3.8.2 – Identificação da mistura do esteróides

Os esteróides

-sitosterol (XXIX), campesterol (XXX),

estigmasterol (XXXI), e sitostenona (XXXII) são de ampla ocorrência no reino

vegetal. Estes esteróides foram isolados em mistura do extrato hexânico das

sementes de T. elegans.

XXXI

XXXII

XXX

XXIX

A mistura de esteróides foi identificada através da análise dos

experimentos de RMN de

H e

C, CG/EM (condições: p. 123) e os dados

obtidos foram concordantes com a literatura. (SUGA & KONDO, 1974;

SAKAKIBARA et al., 1983).

119

IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

120

PARTE 4

PROCEDIMENTOS

EXPERIMENTAIS

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

122

4 – Procedimentos Experimentais

4.1 – Materiais e Métodos

Ƈ Solventes utilizados para cromatografia:

Solventes comerciais destilados no DQ/UFSCar

Solventes P.A. da Merck, Sinth, Vetec e Labsynth

Solventes de grau cromatográfico da JTB para análises em CLAE

Ƈ Solventes utilizados em RMN:

Deuterados da Merck, Isotec Inc. e Aldrich (TMS 0,03%)

Ƈ Reagentes utilizados na reação de esterificação:

N-metil-N-nitroso-4-toluol-sulfonamida (Diazald) – Merck

KOH P.A. – Merck

Ƈ Fases estacionárias para cromatografia:

- Cromatografia em coluna de vidro:

Sílica gel 60 (70-230 mesh) da Merck

Sílica gel 60 (230-400 mesh) da Merck

Florisil da Merck

Sephadex LH-20 da Amersham Pharmacia Biotech AB

- Cromatografia em camada delgada analítica (CCDA):

Cromatofolhas – Sílica gel F

254

Al TLC 20 x 20 cm da Merck

Reveladores: radiação UV (254 e 360 nm) e vanilina em ácido sulfúrico

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

123

4.2 – Equipamentos

Ƈ Espectrômetros de Ressonância Magnética Nuclear

Brüker DRX 400 MHz

Brüker ARX 200 MHz

Ƈ CG-EM

GC – 17A Shimadzu, CG/MS – QP 5000 Shimadzu

Coluna DB-5 (30m x 0,25mm)

Ionização por impacto eletrônico (IE) (70 e.V)

Todas as análises via CG-EM foram realizadas utilizando:

Temperatura do injetor: 250°C

Temperatura do detector: 280°C

Modo: split

Volume de injeção: 1ȝL

Programações de temperatura utilizadas nas análises:

 Mistura dos esteróides:

- Programação de temperatura: 150°C (1 min.); 6°C/min. até 280°C; 280°C

(15min.)

 Ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alcenóicos

- Programação de temperatura: 70°C (2 min.); 10°C/min. até 290°C; 290°C

(20min.)

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

124

 Ȗ-lactonas

- Programação de temperatura: 70°C (2 min.); 10°C/min. até 290°C; 290°C

(20min.)

Ƈ Espectrômetro de Massas

MICROMASS QUATTRO LC

As análises foram realizadas no Laboratório de Espectrometria e Massas (LEM)

– DQ/UFSCar

Modo de ionização:

Substância: XXVII ESI (modo positivo)

Ƈ CLAE

Cromatógrafo: Shimadzu LC-8A (preparativo) com válvula de reciclo, injetor

Rheodyne 7123 com loop de 500,0 ȝL

Detector: UV-VIS, Shimadzu SPD-6AV

Coluna: Asahipak GS-310 2G (h x I = 50,0 x 2,15 cm) com fase polimérica.

Ƈ Evaporadores

Büchi – modelo rotavapor R – 114 – DQ-UFSCar

Büchi – modelo EL – 131 – DQ-UFSCar

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

125

4.3 – Material Botânico

Os frutos de T. claussenii e T. elegans foram coletados em

Piracicaba/SP (coleta realizada em dezembro de 2004) no Campus da Escola

Superior de Agricultura “Luiz de Queiróz” (ESALQ) e identificados pelo

botânico Dr. Ricardo Ribeiro Rodrigues, professor daquela instituição. As

inflorescências de T. catigua foram coletadas (fevereiro de 2007) no mesmo

local e identificadas pelo Dr. Ricardo Ribeiro Rodrigues.

4.4 – Preparação dos materiais vegetais e obtenção extratos brutos

de T. catigua, T. elegans e T. claussenii

4.4.1 – Obtenção dos extratos brutos dos frutos de T. claussenii e T.

elegans

Os frutos de T. claussenii e T. elegans foram secos em estufa de

circulação de ar a 40°C, por aproximadamente 7 dias e posteriormente separados

em exocarpo (casca do fruto), arilo (casca da semente) e semente e então moídos

em liquidificador. Após a moagem, foi realizada a extração à temperatura

ambiente e em repouso, com solventes em ordem crescente de polaridade

(hexano, MeOH e MeOH/H

O 1:1) durante 7 dias (FLUXOGRAMA 4.1, p.

127). Após a evaporação dos solventes foram extraídos os extratos brutos

descritos na TABELA 4.1.

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

126

TABELA 4.1: Extratos brutos das partes dos frutos de T. elegans e T. claussenii

Planta

Parte do Fruto

Massa (g)

Código do

extrato*

Massa

extrato

(g)

Exocarpo (70,164) Tcfeh 1,135

Tcfem 7,008

Tcfea 6,156

Arilo (5,333) Tcseh 0,125

T. elegans

Tcsem 2,270

Tcsea 0,553

Semente (14,591) Tseh 0,200

Tsem 9,341

Tsea 1,352

Exocarpo (56,796) Tcflh 15,587

Tcflm 4,700

Tcfla 3,596

Arilo (7,966) Tcslh 1,763

T. claussenii

Tcslm 0,702

Tcsla 0,181

Semente (35,127) Tslh 7,118

Tslm 4,539

Tsla 2,144

* h:hexano; m:MeOH; a: MeOH:H

O 1:1

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

Extrato Hexânico

Torta

Extrato Metanólico Torta

Torta

Material Vegetal

Extrato Hidrometanólico

FLUXOGRAMA 4.1: Obtenção dos extratos de espécies de Trichilia .

a) Extração com n-hexano por sete dias.

b) Extração com metanol por sete dias.

c) Extração com metanol/água na proporção de 1:1 por sete dias

4.4.2 – Obtenção dos extratos brutos da inflorescência de T.

catigua

Os extratos das inflorescências de T. catigua foram secos em estufa

de circulação de ar a 40°C, por aproximadamente 7 dias e após a moagem, foi

realizada a extração conforme descrito anteriormente (FLUXOGRAMA 4.1, p.

127). Após a evaporação dos solventes foram extraídos os extratos brutos

descritos na TABELA 4.2.

127

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

128

TABELA 4.2: Extrato bruto das inflorescências de T. catigua

Planta Massa (g)

Código do

Extrato*

Massa do

extrato (g)

T. catigua

Inflorescências Tflch 0,384

(16,795) Tflcm 4,229

Tflca 2,985

* h:hexano; m:MeOH; a: MeOH:H

O 1:1

4.5 – Fracionamento dos extratos de espécies de Trichilia

4.5.1 – Fracionamento do extrato Tslm

De acordo com os resultados obtidos dos ensaios biológicos dos

extratos de Trichilia ssp. sobre S. frugiperda (item 3.1.2, p. 28), o extrato

metanólico das sementes de T. claussenii (Tslm) foi fracionado através da

partição líquido-líquido, conforme o procedimento descrito no FLUXOGRAMA

4.2.

Do extrato Tslm foram obtidas 4 frações após evaporação dos

solventes: hexano, CH

, AcOEt e MeOH/H

O, conforme descrito na

TABELA 4.3.

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

Extrato Metanólico

Fração hexânica

Fração MeOH/H

Parte hidroalcoólica

Parte hidroalcooólica

MeOH/H

Hexano

Fração AcOEt

Fração CH

AcOEt

Extrato Metanólico

Fração hexânica

Fração MeOH/H

Parte hidroalcoólica

Parte hidroalcooólica

MeOH/H

Hexano

Fração AcOEt

Fração CH

AcOEt

FLUXOGRAMA 4.2: Procedimento geral de partição líquido-líquido dos

extratos metanólicos

TABELA 4.3: Frações provenientes do fracionamento do extrato Tslm

Extrato

Metanólico

Fração Solvente Massa (g)

Tslm1 Hexano 0,380

Tslm

Tslm2 CH

0,057

(4,539g) Tslm3 AcOEt 1,004

Tslm4 MeOH/H

O 3,098

As frações obtidas da partição líquido-líquido (TABELA 4.3) foram

ensaiadas sobre S. frugiperda (item 3.1.2.1, p. 30). As frações ativas foram

submetidas a sucessivos fracionamentos.

129

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

4.5.1.1 – Fracionamento da fração Tslm1

Fr-1

15,8 mg

Fr-1

15,8 mg

Fr-3

47,0 mg

Fr-3

47,0 mg

Fr-2

5,5 mg

Fr-2

5,5 mg

Fr-5

43,5 mg

Fr-5

43,5 mg

Fr-.6

51,4 mg

Fr-.6

51,4 mg

Fr-4

203,3 mg

Fr-4

203,3 mg

Tslm1

366,5 mg

Tslm1

366,5

Fr-3(1)

8,2 mg

Fr-3(1)

8,2 mg

Fr-3(3)

2,5 mg

Fr-3(3)

2,5 mg

Fr-3(2)

6,6 mg

Fr-3(2)

6,6 mg

Fr-3(5)

1,5 mg

Fr-3(5)

1,5 mg

Fr-3(6)

6,2 mg

Fr-3(6)

6,2 mg

Fr-3(4)

5,2 mg

Fr-3(4)

5,2 mg

Fr-3(7)

12,8 mg

Fr-3(7)

12,8 mg

Ácidos Ȧ-fenil alcanóicos

e alquenóicos (I-VIII)

Ácidos Ȧ-fenil alcanóicos

e alquenóicos (I-VIII)

Ácidos Ȧ-fenil alcanóicos

e alquenóicos (I-VIII),

Ȗ-lactonas (IX-XIII e XV-XVI)

e ácidos graxos

Ácidos Ȧ-fenil alcanóicos

e alquenóicos (I-VIII),

Ȗ-lactonas (IX-XIII e XV-XVI)

e ácidos graxos

Condição 1

Condição 2

FLUXOGRAMA 4.3: Fracionamento da fração Tslm1 e Tslm1(Fr-3)

Å Foi realizada reação de metilação em pequenas alíquotas das amostras para análise via

CG/EM

Condição 1:

- Coluna em sílica gel (70-230 mesh), I = 3,5 cm e h = 30,0 cm

- Gradiente de Eluição: Hexano100%, Hex/AcOEt (99:1/98:2/95:5/9:1/8:2/7:3/1:1), AcOEt

100%, AcOEt/MeOH (99:1/98:2/95:5/9:1/8:2/7:3/1:1), MeOH 100%.

Condição 2:

- Coluna em sílica gel (70-230 mesh), I = 2,0 cm e h = 14,5 cm

- Gradiente de Eluição: Hexano100%, Hex/AcOEt (99:1/98:2/95:5/9:1/8:2/7:3/1:1), AcOEt

100%, AcOEt/MeOH (99:1/98:2/95:5/9:1/8:2/7:3/1:1), MeOH 100%.

Código: T = Trichilia; s = sementes; l = claussenii; m = metanólico

130

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

Fr-4(1)

25,2 mg

Fr-4(1)

25,2 mg

Fr-4(3)

14,4 mg

Fr-4(3)

14,4 mg

Fr-4(2)

40,6 mg

Fr-4(2)

40,6 mg

Fr-4(5)

38,7 mg

Fr-4(5)

38,7 mg

Fr-4(4)

84,4 mg

Fr-4(4)

84,4 mg

Tslm1(Fr-4)

203,3 mg

Tslm1(

203,3

Fr-4(4)-1

12,0 mg

Fr-4(4)-1

12,0 mg

Fr-4(4)-3

8,1 mg

Fr-4(4)-3

8,1 mg

Fr-4(4)-2

10,9 mg

Fr-4(4)-2

10,9 mg

Fr-4(4)-5

10,2 mg

Fr-4(4)-5

10,2 mg

Fr-4(4)-6

26,9 mg

Fr-4(4)-6

26,9 mg

Fr-4(4)-4

12,2 mg

Fr-4(4)-4

12,2 mg

Ácidos Ȧ-fenil alcanóicos

e alquenóicos (I-VIII)

Ácidos Ȧ-fenil alcanóicos

e alquenóicos (I-VIII)

Condição 3

Condição 4

Ácidos Ȧ-fenil alcanóicos

e alquenóicos (I-VIII)

Ȗ-lactonas (X-XII, XIV-XIX)

e ácidos graxos

Ácidos Ȧ-fenil alcanóicos

e alquenóicos (I-VIII)

Ȗ-lactonas (X-XII, XIV-XIX)

e ácidos graxos

Ácidos Ȧ-fenil alcanóicos

e alquenóicos (I-VIII)

Ȗ-lactonas (IX-XVI)

e ácidos graxos

Ácidos Ȧ-fenil alcanóicos

e alquenóicos (I-VIII)

Ȗ-lactonas (IX-XVI)

e ácidos graxos

FLUXOGRAMA 4.4: Fracionamento da fração Tslm1(Fr-4) e Tslm1(Fr-4)-4

Å Foi realizada reação de metilação em pequenas alíquotas das amostras para análise via

CG/EM

Condição 3:

- Coluna em sílica gel (70-230 mesh), I = 3,0 cm e h = 22,0 cm

- Gradiente de Eluição: Hexano100%, Hex/AcOEt (99:1/98:2/95:5/9:1/8:2/7:3/1:1), AcOEt

100%, AcOEt/MeOH (99:1/98:2/95:5/9:1/8:2/7:3/1:1), MeOH 100%.

Condição 4:

- Coluna em sílica gel (70-230 mesh), I = 2,2 cm e h = 15,0 cm

- Gradiente de Eluição: Hexano100%, Hex/AcOEt (99:1/98:2/95:5/9:1/8:2/7:3/1:1), AcOEt

100%, AcOEt/MeOH (99:1/98:2/95:5/9:1/8:2/7:3/1:1), MeOH 100%.

Código: T = Trichilia; s = sementes; l = claussenii; m = metanólico

131

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

132

Das frações Tslm1(Fr3) e Tslm1(Fr4)-4 foram isolados os ácidos

Ȧ-fenil alcanóicos e alcenóicos (I-VIII) e também o conjunto de Ȗ-lactonas (IX-

XIX).

4.5.1.2 – Fracionamento da fração Tslm3

O fracionamento do subextrato Tslm3 (FLUXOGRAMA 4.5) levou

ao isolamento da N-metilprolina (XX), 4-hidroxi-N-metilprolina (XXI), uridina

(XXII), uracila (XXIII) e do esteróide glicosilado (XXVIII).

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

Fr-1

88,0 mg

Fr-1

88,0 mg

Fr-3

295,0 mg

Fr-3

295,0 mg

Fr-2

106,4 mg

Fr-2

106,4 mg

Fr-5

401,0 mg

Fr-5

401,0 mg

Fr-4

64,6 mg

Fr-4

64,6 mg

Tslm3

1,004 g

Tslm3

1,004 g

Condição 1

Condição 2

8 frações

Condição 2

10 frações

Fr-4(7)

7,4 mg

Fr-4(7)

7,4 mg

Fr-5(2)-3

3,8 mg

Fr-5(2)-3

3,8 mg

Condição 2

7 frações

4-hidroxi-N-metilprolina (XX)

e N-metilprolina (XXI)

4-hidroxi-N-metilprolina (XX)

e N-metilprolina (XXI)

Uridina (XXII)

e Uracila (XXIII)

Uridina (XXII)

e Uracila (XXIII)

Fr-2(5)

52,1 mg

Fr-2(5)

52,1 mg

Condição 2

4 frações

Fr-4(7)

10,0 mg

Fr-4(7)

10,0 mg

Esteróide

glicosilado (XXVIII)

Esteróide

glicosilado (XXVIII)

Fr-5(2)

40,0 mg

Fr-5(2)

40,0 mg

FLUXOGRAMA 4.5: Fracionamento da fração Tslm3

Condição 1:

- Coluna Sephadex LH-20, I = 3,5 cm e h = 76,0 cm

- Eluente: MeOH, MeOH/H

O (1:1) (modo gradiente)

Condição 2:

- Coluna Sephadex LH-20, I = 2,0 cm e h = 56,0 cm

- Eluente: MeOH

Condição 3:

- Coluna Sephadex LH-20, I = 2,0 cm e h = 56,0 cm

- Eluente: MeOH/H

O (1:1)

Código: T = Trichilia; s = sementes; l = claussenii; m = metanólico

133

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

134

4.5.2 – Fracionamento do extrato Tflcm

O extrato metanólico das inflorescências de T. catigua (Tflcm) foi

fracionado através da partição líquido-líquido de acordo com procedimento

descrito no FLUXOGRAMA 4.2. Foram obtidas 4 frações após evaporação dos

solventes: hexano, CH

, AcOEt e MeOH/H

O, conforme descrito na

TABELA 4.4.

TABELA 4.4: Frações provenientes do fracionamento do extrato Tflcm

Extrato

Metanólico

Fração Solvente Massa (g)

Tflcm1 Hexano 0,160

Tflcm

Tflcm2 CH

0,091

(4,100g) Tflcm3 AcOEt 0,833

Tflcm4 MeOH/H

O 2,877

As 4 frações oriundas do extrato Tflcm foram ensaiadas sobre S.

frugiperda (item 3.1.2.3, p. 40). As frações ativas foram submetidas a sucessivos

refracionamentos.

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

4.5.2.1 – Fracionamento das frações Tflcm1 e Tflcm2

Fr-1

90,7 mg

Fr-1

90,7 mg

Fr-3

11,4 mg

Fr-3

11,4 mg

Fr-2

2,5 mg

Fr-2

2,5 mg

Fr-5

32,2 mg

Fr-5

32,2 mg

Fr-4

24,2 mg

Fr-4

24,2 mg

Tflcm1

160,0 mg

Tflcm1

160,0

Fr-1(2)

8,5 mg

Fr-1(2)

8,5 mg

Fr-1(4)

12,1 mg

Fr-1(4)

12,1 mg

Fr-1(3)

40,1 mg

Fr-1(3)

40,1 mg

Fr-1(5)

9,6 mg

Fr-1(5)

9,6 mg

Fr-1(5)

20,4 mg

Fr-1(5)

20,4 mg

(3)-1 a (3)-6

Condição 1

Condição 2

FLUXOGRAMA 4.6: Fracionamento da fração Tflcm1

Condição 1:

- Coluna Sephadex LH-20, I = 2,5 cm e h = 40,0 cm

- Eluente: MeOH/CH

(1:1)

Condição 2:

- Coluna Sephadex LH-20, I = 2,0 cm e h = 32,0 cm

- Eluente: MeOH/CH

(1:1)

Código: T = Trichilia; fl = inflorescências; c = catigua; m = metanólico

135

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

Fr-1

6,2 mg

Fr-1

6,2 mg

Fr-3

42,0 mg

Fr-3

42,0 mg

Fr-2

21,3 mg

Fr-2

21,3 mg

Fr-5

10,5 mg

Fr-5

10,5 mg

Fr-4

11,0 mg

Fr-4

11,0 mg

Tflcm2

91,0 mg

Tflcm2

91,0

Fr-3(1)

3,8 mg

Fr-3(1)

3,8 mg

Fr-3(3)

5,0 mg

Fr-3(3)

5,0 mg

Fr-3(2)

6,0 mg

Fr-3(2)

6,0 mg

Fr-3(5)

15,0 mg

Fr-3(5)

15,0 mg

Fr-3(4)

12,0 mg

Fr-3(4)

12,0 mg

ent-catequina (XXIV)

Condição 3

Condição 4

FLUXOGRAMA 4.7: Fracionamento da fração Tflcm2

Condição 3:

- Coluna Sephadex LH-20, I = 2,0 cm e h = 56,0 cm

- Eluente: MeOH

Condição 4:

- CLAE Polimérica – Asahipak GS-310 2G (h x I = 50,0 x 2,15 cm)

- Eluente: MeOH

- vazão: 3,0 mL/min.; Ȝ = 217 e 254 nm.

Código: T = Trichilia; fl = inflorescências; c = catigua; m = metanólico

136

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

137

4.5.3 – Fracionamento dos extratos Tcsem e Tsem

Os extratos metanólicos das sementes e cascas das sementes de T.

elegans (TABELA 4.1, p. 126), foram fracionados através da partição líquido-

líquido, de acordo com o procedimento descrito no FLUXOGRAMA 4.2. As

frações obtidas após evaporação dos solventes estão descritas nas TABELAS

4.5 e 4.6.

TABELA 4.5: Frações provenientes do fracionamento do extrato Tcsem

Extrato

Metanólico

Fração Solvente Massa (g)

Tcsem

Tcsem1 Hexano 0,182

(2,270 g) Tcsem2 AcOEt 0,643

Tcsem3 MeOH/H

O 1,175

TABELA 4.6: Frações provenientes do fracionamento do extrato Tsem

Extrato

Metanólico

Fração Solvente Massa (g)

Tsem1 Hexano 0,687

Tsem

Tsem2 CH

0,499

(9,341 g) Tsem3 AcOEt 1,307

Tsem4 MeOH/H

O 6,847

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

138

Após a análise dos espectros de RMN

H das frações provenientes

do fracionamento dos extratos Tsem e Tcsem, decidiu-se pelo isolamento das

substâncias presentes nestes extratos.

Da fração Tcsem2, foi isolado o ácido 5-O-cafeoilquinico (XXV)

(FLUXOGRAMA 4.8). Já a fração Tsem2, após sucessivos refracionamentos

(FLUXOGRAMA 4.9) foram isolados os limonóides XXVI e XXVII.

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

4.5.3.1 – Fracionamento da fração Tcsem2

Fr-1

111,6 mg

Fr-1

111,6 mg

Fr-3

90,0 mg

Fr-3

90,0 mg

Fr-2

23,5 mg

Fr-2

23,5 mg

Fr-5

39,5 mg

Fr-5

39,5 mg

Fr-4

35,4 mg

Fr-4

35,4 mg

Tcsem2

300,0 mg

Tcsem2

300,0

Fr-3(1)

13,7 mg

Fr-3(1)

13,7 mg

Fr-3(2)

9,2 mg

Fr-3(2)

9,2 mg

Fr-3(3)

52,0 mg

Fr-3(3)

52,0 mg

Ácido 5-O-cafeoilquínico (XXV)

Condição 1

Condição 2

FLUXOGRAMA 4.8: Fracionamento da fração Tcsem2

Condição 1:

- Coluna Sephadex LH-20, I = 2,5 cm e h = 76,0 cm

- Eluente: MeOH

Condição 2:

- Coluna Sephadex LH-20, I = 2,0 cm e h = 56,0 cm

- Eluente: MeOH

Código: T = Trichilia; cs = cascas das sementes; e = elegans; m = metanólico

139

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

4.5.3.2 – Fracionamento da fração Tsem2

Fr-1

234,0 mg

Fr-1

234,0 mg

Fr-3

22,0 mg

Fr-3

22,0 mg

Fr-2

113,6 mg

Fr-2

113,6 mg

Fr-5

144,0 mg

Fr-5

144,0 mg

Fr-4

85,4 mg

Fr-4

85,4 mg

Tsem2

499,0 mg

Tsem2

499,0

Condição 3

Condição 4

8 frações

Condição 4

10 frações

Fr-4(3)-4

3,8 mg

Fr-4(3)-4

3,8 mg

Fr-4(3)-5

1,3 mg

Fr-4(3)-5

1,3 mg

Limonóide (XXVII)

Limonóide (XXVI)

Fr-2(5)

42,1 mg

Fr-2(5)

42,1 mg

Fr-4(3)

32,0 mg

Fr-4(3)

32,0 mg

Condição 5

6 frações

Condição 5

7 frações

Limonóide (XXVII)

Fr-4(3)-4

3,8 mg

Fr-4(3)-4

3,8 mg

FLUXOGRAMA 4.9: Fracionamento da fração Tsem2

Condição 3:

- Coluna Sephadex LH-20, I = 2,5 cm e h = 76,0 cm

- Eluente: MeOH/CH

(1:1)

Condição 4:

- Coluna Sephadex LH-20, I = 2,0 cm e h = 56,0 cm

- Eluente: MeOH/CH

(1:1)

Condição 5:

- CLAE Polimérica – Asahipak GS-310 2G (h x I = 50,0 x 2,15 cm)

- Eluente: MeOH/CH

(7:3)

- vazão: 3,0 mL/min.; Ȝ = 217 e 254 nm.

Código: T = Trichilia; s = sementes; e = elegans; m = metanólico

140

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

4.5.3.3 – Fracionamento do extrato Tseh

O extrato Tseh foi fracionado, e levou ao isolamento dos esteróides

(XXIX a XXXII)

Fr-1

43,5 mg

Fr-1

43,5 mg

Fr-3

6,4 mg

Fr-3

6,4 mg

Fr-2

31,5 mg

Fr-2

31,5 mg

Fr-5

27,3 mg

Fr-5

27,3 mg

Fr-.6

62,0 mg

Fr-.6

62,0 mg

Fr-4

7,2 mg

Fr-4

7,2 mg

Tseh

200,0 mg

Tseh

200,0

Condição 1

Fr-5

22,0 mg

Fr-5

22,0 mg

Mistura dos

esteróides (XXIX-XXXII)

Mistura dos

esteróides (XXIX-XXXII)

Condição 2

10 frações

Fr-3-6

6,4 mg

Fr-3-6

6,4 mg

FLUXOGRAMA 4.10: Fracionamento do extrato Tseh

Condição 1:

- Coluna em sílica gel (70-230 mesh), I = 2,0 cm e h = 30,0 cm

- Gradiente de Eluição: Hexano100%, Hex/AcOEt (99:1/98:2/95:5/9:1/8:2/7:3/1:1), AcOEt

100%, AcOEt/MeOH (99:1/98:2/95:5/9:1/8:2/7:3/1:1), MeOH 100%.

Condição 2:

- Coluna em sílica gel (70-230 mesh), I = 1,5 cm e h = 22,0 cm

- Gradiente de Eluição: Hexano100%, Hex/AcOEt (99:1/98:2/95:5/9:1/8:2/7:3/1:1), AcOEt

100%, AcOEt/MeOH (99:1/98:2/95:5/9:1/8:2/7:3/1:1), MeOH 100%.

Código: T = Trichilia; s = sementes; e = elegans; h = hexânico

141

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

142

4.6 – Reação de esterificação com diazometano

Para realização da reação de esterificação, adicionou-se uma

solução de diazometano em éter etílico às amostras até não ser mais observada a

liberação de gás de N

A solução de diazometano foi preparada dissolvendo-se 1,0 g de p-

toluilsulfonilmetilnitrosamida (diazald) em 15,0 mL de éter etílico. A solução

(em balão de destilação) foi posteriormente resfriada em banho de gelo, onde

foram adicionados 1,0 g de hidróxido de potássio em 10,0 mL de etanol. Após 5

minutos a solução etérea de diazometano foi destilada em banho de óleo a 65°C,

o destilado foi coletado sobre éter etílico em banho de gelo.

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

143

4.7 – Ensaio biológico

4.7.1 - Ensaios de toxicidade realizados sobre Spodoptera

frugiperda

Os ensaios biológicos realizados sobre S. frugiperda foram realizados

no Laboratório de Bioensaios do Departamento de Química da UFSCar, a 25 ±

1°C, UR de 70 ± 5% e fotofase de 12h. Para realização dos testes, criação de S.

frugiperda (J. E. Smith) foi mantida em laboratório sendo as lagartas

alimentadas com dieta artificial (KASTEN et al., 1978; PARRA, 1986) e os

adultos com solução de mel a 10%.

Os ensaios de toxicidade realizados neste trabalho, basearam-se na

metodologia descrita por PAULA et al. (2000). Para realização dos bioensaios,

foram preparadas soluções das amostras em acetona e/ou água.

Foram utilizados grupos de 10 larvas de Spodoptera frugiperda no

segundo instar (5 dias), onde cada grupo foi transferido para placas de Petri. As

médias dos pesos dos grupos de insetos foram obtidas pelas medidas realizadas

em balança analítica. Em cada inseto 1ȝL da solução em acetona ou água, foi

aplicado topicamente, via uma micro-seringa. Para evitar a possível morte do

inseto, em cada grupo de larvas foram colocadas pequenas porções (300,0mg)

da dieta artificial. Este processo foi realizado uma hora após a aplicação da

solução. O controle foi realizado sobre as mesmas condições; 1 ȝL de acetona

ou água, foi aplicado em cada inseto.

A mortalidade dos insetos foi verificada após 48horas. Todos os

experimentos e o respectivo controle foram realizados em replicatas.

Na primeira etapa do trabalho, foram realizados ensaios de toxicidade

para verificar quais extratos apresentavam atividade inseticida. Os ensaios com

os extratos hexânicos, metanólicos e hidrometanólicos de Trichilia ssp., foram

realizados primeiramente na concentração de 1mg/mL e posteriormente na

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

144

concentração de 10mg/mL, já as frações obtidas das análises cromatográficas

foram todas realizadas na concentração de 10mg/mL.

PARTE 5

CONCLUSÕES

146

5 – CONCLUSÕES

O estudo fitoquímico das espécies T. catigua, T. elegans e T.

clausseni proporcionou o isolamento e identificação do conjunto dos ácidos Ȧ-

fenil alcanóicos e alquenóicos, Ȗ-lactonas, 4-hidróxi-N-metilprolina, N-

metilprolina, uridina, uracila, ent-catequina, ácido 5-O-cafeoilquínico,

limonóides 11ȕ-acetoxiobacunona, 1,2–diidro-1Į-acetoxi-11ȕ-acetoxi-14,15-

epoxicneorina R e os esteróides 3-ȕ-O-ȕ-D-glucopiranosil, sitosterol, ȕ-

sitosterol, campesterol, estigmasterol e sitostenona.

Os limonóides 11ȕ-acetoxiobacunona, 1,2–diidro-1Į-acetoxi-11ȕ-

acetoxi-14,15-epoxicneorina R isolados de T. elegans estão sendo relatados pela

primeira vez no gênero Trichilia. Já as Ȗ-lactonas IX e X estão sendo relatadas

pela primeira vez na espécie T. claussenii.

A partir dos ensaios biológicos realizados com os extratos

orgânicos dos frutos, sementes e inflorescências das espécies T. catigua, T.

elegans e T. claussenii na concentração 10 mg/mL, foram observados que os

extratos metanólicos da semente de T. claussenii e inflorescências de T. catigua

apresentaram as maiores porcentagem de mortalidade sobre S. frugiperda. O

biomonitoramento do fracionamento do extrato metanólico das sementes de

claussenii juntamente com a identificação estrutural das substâncias isoladas

mostraram que o conjunto dos ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alquenóicos foram às

substâncias ativas no ensaio de toxicidade sobre S. frugiperda. Essas substâncias

apresentam-se como uma nova classe química inseticida, visto que era esperado

que os limonóides estivessem relacionados à atividade inseticida encontrada

para espécies da família Meliaceae.

Os ensaios de toxicidade realizados com ácidos graxos (C5-C16) na

concentração de 1,0 mg/mL não apresentaram altas taxas de mortalidade,

entretanto na concentração de 10,0 mg/mL observou-se que os ácidos

CONCLUSÕES

147

hexanóico, nonanóico e decanóico apresentaram resultados interessantes (90,0,

96,67 e 96,67 %, respectivamente).

A atividade do extrato metanólico das inflorescências de T. catigua

sobre S. frugiperda, provavelmente está relacionada à presença do flavonóide

ent-catequina, que através de ensaios de ingestão nas concentrações de 1, 10 e

50 mg/kg apresentaram mortalidade larval de 50,00, 53,33 e 66,67 %,

respectivamente (LEITE, 2005).

O estudo fitoquímico biomonitorado por ensaio biológico realizado

neste trabalho contribuiu para a descoberta da atividade biológica de algumas

substâncias, mostrando ser uma ferramenta muito importante para a descoberta

de compostos ativos.

Espera-se que os ensaios biológicos aqui reportados estimulem o

estudo do conjunto dos ácidos Ȧ-fenil alcanóicos e alquenóicos identificados, a

fim de conseguir uma substância, que sendo ativa possa servir de protótipo para

o desenvolvimento de novos inseticidas sobre a lagarta-do-cartucho do milho

Spodoptera frugiperda.

CONCLUSÕES

148

PARTE 6

REFERÊNCIAS

BIBLIOGRÁFICAS

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

150

6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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