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i
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
MESTRADO EM FARMACOLOGIA / ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM
FARMACOLOGIA
ESTUDO DOS EFEITOS DO DIABETES, DA HIPOTERMIA E DO
BLOQUEIO DE ÓXIDO NÍTRICO SINTETASE NO ESCAPE VASCULAR E
NA TAQUIFILAXIA DO RIM ISOLADO DE COELHO
RICARDO LIRA DE OLIVEIRA
Fortaleza – Ceará
2003
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ii
Ricardo Lira de Oliveira
ESTUDO DOS EFEITOS DO DIABETES, DA HIPOTERMIA E DO
BLOQUEIO DE ÓXIDO NÍTRICO SINTETASE NO ESCAPE VASCULAR E
NA TAQUIFILAXIA DO RIM ISOLADO DE COELHO
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em
Farmacologia / Área de Concentração em Farmacologia da
Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial
para obtenção do grau de mestre.
Orientador: Prof. Dr. Manassés Claudino Fonteles
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FORTALEZA – CE
2003
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iii
O51e Oliveira, Ricardo Lira
Estudo dos efeitos do diabetes, da hipotermia e do
bloqueio de óxido nítrico sintetase no escape vascular e
na taquifilaxia do rim isolado de coelho / Ricardo Lira de
Oliveira – Fortaleza, 2003
148f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Manasses Claudino Fonteles.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do
Ceará. Departamento de Farmacologia e Fisiologia
1. Diabetes mellitus. 2. Escape vascular. 3. Óxido
nítrico. 4. Hipotermia. I Título.
CDD 616.462
iv
Esta Dissertação foi submetida como parte dos requisitos
necessários à obtenção do Grau de Mestre em Farmacologia / Área de
Concentração em Farmacologia, outorgado pela Universidade Federal do
Ceará, e encontra-se à disposição dos interessados na Biblioteca de Pós-
Graduação do Centro de Ciências da Saúde da referida Universidade.
A citação de qualquer trecho desta Dissertação é permitida, desde
que seja feita de conformidade com as normas da ética científica.
Ricardo Lira De Oliveira
Dissertação aprovada em 18 /11 / 2003.
Examinadores:
Prof. Dr. Manassés Claudino Fonteles
(Orientador da Dissertação)
Profa. Dra. Geanne de Matos Cunha
Universidade Federal do Ceará
Profa. Dra. Helena Serra Azul Monteiro
Universidade Federal do Ceará
v
Dedico este trabalho à memória de
meu querido pai, Júlio, que me deu vida, amor
e amparo nos momentos de adversidade. Jurista
nato e autodidata, seu extraordinário talento
profissional e sua obstinação na busca de ideais
deixaram-me um legado perene de inspiração e
perseverança.
vi
AGRADECIMENTOS
− Ao meu orientador e amigo, Dr. Manassés Claudino Fonteles, que
detectou minha vocação, desde os tempos de monitor da disciplina de
Farmacologia Clínica Aplicada à Odontologia; que me encorajou desde
o princípio e pavimentou meu caminho até a concretização de um
sonho, materializado nesta dissertação.
− A minha família, especialmente meus pais, por seu amor a mim e
pelo apoio nos momentos mais decisivos de minha vida.
− Ao meu querido amigo e colaborador, o Prof. Nilberto Robson Falcão
Nascimento, cujo altruísmo e cujo talento foram imprescindíveis à
conclusão deste trabalho.
− À amiga e colega, Dra. Marta Regina Kerntopf, por sua imensurável
bondade e sua disposição em prestar auxílio nas horas críticas; sua
colaboração, também foi importante para a finalização deste trabalho.
− Às professoras, Dra. Geanne de Matos Cunha e Dra. Helena Serra
Azul Monteiro, por terem prontamente aceito compor minha banca de
avaliação.
− Aos bolsistas Max, Beatriz e Lucila, pelas incontáveis horas de
trabalho no laboratório.
− Ao funcionário Jociê Andrade Silva, pelos inestimáveis serviços
prestados no biotério da Unidade de Pesquisas Clínicas/UFC.
vii
− Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico (CNPq), pela
ajuda financeira.
− A todos os meus colegas de turma da pós-graduação, pelos
momentos de alegria e ajuda mútua durante o convívio em sala de aula
e laboratório.
− A todos aqueles, amigos ou colegas de trabalho, cujos nomes
eventualmente não estejam aqui explicitados, mas que, de forma direta
ou indireta, cooperaram para que eu pudesse levar a termo esta
dissertação.
− Às humildes e inocentes criaturas, cujas vidas foram imoladas em
nome do avanço médico-científico e dos benefícios que ele pode
prestar às pessoas, a saber, a cura de moléstias e a mitigação do
sofrimento humano.
viii
SUMÁRIO
Página
LISTA DE FIGURAS..........................................................................
X
LISTA DE TABELAS..........................................................................
XI
LISTA DE GRÁFICOS........................................................................
XIII
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS.......................
XVII
RESUMO............................................................................................
XIX
ABSTRACT........................................................................................
XX
1. INTRODUÇÃO...............................................................................
1
1.1. O Endotélio e o Tônus Vascular..........................................
1
1.2. Revisão de Literatura...........................................................
9
1.2.1. A via L-arginina/Óxido Nítrico....................................... 9
1.2.1.1 Óxido Nítrico Sintetases (NOS)........................ 14
1.2.1.2. Inibidores de NOS........................................... 17
1.2.1.3. A medição do NO............................................ 20
1.2.2.1. Características da L-arginina e seu papel na
fisiologia humana...........................................
22
1.2.2.2. Transporte de L-arginina através da
Membrana Celular..........................................
32
1.2.3. A Disfunção Endotelial no Diabetes............................ 40
1.2.4. O Estresse Oxidativo.................................................... 51
1.2.5. O Escape Vascular....................................................... 66
1.2.6 A hipotermia.................................................................. 73
2. OBJETIVOS...................................................................................
77
3. MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................
78
3.1. Sistema de perfusão.............................................................
79
3.2. Medidas fisiológicas.............................................................
80
3.3. Protocolo de perfusão..........................................................
82
3.4. Produtos químicos...............................................................
85
3.5. Análise Estatística................................................................
85
ix
4. RESULTADOS...............................................................................
87
4.1. Grupo Controle.....................................................................
87
4.2 Diabéticos não tratados e tratados......................................
88
4.3. Bloqueio de NOS e Hipotermia............................................
102
5. DISCUSSÃO..................................................................................
117
5.1. Normoglicêmicos versus Diabéticos..................................
117
5.2. Efeitos da Hipotermia e do Bloqueio de NOS....................
121
6. CONCLUSÕES..............................................................................
125
7. PERSPECTIVAS...........................................................................
127
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................
128
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
A Ach interage com receptores da célula endotelial
liberando substâncias vasodilatadoras derivadas do
endotélio (Impacto da Hipertensão no envelhecimento
vascular, São Paulo: Roche, 1995).................................
2
Figura 2.
Via L-arginina-NO, da passagem do aminoácido até o
relaxamento do músculo liso da parede do vaso
(modificado de Moncada e Higgs, 1993).........................
12
Figura 3.
Quadro representativo da nomenclatura das NOS.........
17
Figura 4.
Inibidores de NOS: LNMMA, L-NAME e LNOARG são
análogos da L-arginina, os quais competem pela Óxido
Nítrico Sintetase (NOS), bloqueando a síntese do NO...
19
Figura 5.
Destinos Metabólicos da L-arginina................................
26
Figura 6.
Mecanismo postulado para a difusão facilitada: uma
proteína de membrana (permease) muda de
configuração ao se ligar a um determinado tipo de
molécula, transportando-a ao meio intracelular a favor
de um gradiente de concentração, (GUYTON e HALL,
1996)................................................................................
34
Figura 7.
Concentração de uma substância e capacidade de
difusão através de membrana, onde ocorre difusão
simples e difusão facilitada. A linha tracejada mostra o
fluxo máximo....................................................................
36
Figura 8.
Interconversão dos principais grupos de flavonóides.
(Adaptado de DOMINGUES, 1973).................................
61
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.
Pressões de perfusão de rins isolados de coelhos
normais e diabéticos submetidos a três infusões de
NOR, (valores medidos a cada 5 min)..............
90
Tabela 2.
Pressões basais de perfusão pela infusão contínua de
NOR em leito arteriolar de rins isolados de coelhos
normoglicêmicos e com diabetes aloxânico, não
tratados e tratados com GSH 1µΜ e rutina 1µΜ
(valores medidos a cada 5 min)......................................
92
Tabela 3.
Pressões basais de perfusão pela infusão contínua de
NOR em leito arteriolar de rins isolados de coelhos
normoglicêmicos e com diabetes aloxânico, não
tratados e tratados com GSH (1µΜ) e rutina (1µΜ) .......
94
Tabela 4.
Pressões máximas de perfusão pela infusão contínua
de NOR em leito arteriolar de rins isolados de coelhos
normoglicêmicos e com diabetes aloxânico, não
tratados e tratados com GSH (1µΜ) e rutina (1µΜ)........
96
Tabela 5.
Escape vascular após infusão contínua de NOR em
leito arteriolar de rins isolados de coelhos
normoglicêmicos e com diabetes aloxânico, não
tratados e tratados com GSH (1µM) e rutina (1µM)........
98
Tabela 6.
Incremento pressórico após infusão contínua de NOR
em leito arteriolar de rins isolados de coelhos
normoglicêmicos e com diabetes aloxânico, não
tratados e tratados com GSH (1µM) e rutina (1µM).........
100
Tabela 7.
Pressões de perfusão durante uma sequência de três
infusões de NOR (com intervalos de 20 min) em leito
arteriolar de rins isolados de coelhos normoglicêmicos
e tratados com L-arginina e D-arginina (ambas a 1µM)..
105
Tabela 8.
Pressões basais de perfusão pela infusão contínua de
NOR em leito arteriolar de rins isolados de coelhos sob
hipotermia (25
o
C), tratados com LNMA (10µm), L-nitro-
arginina (10µM), D-arginina (1µM) e L-arginina (1µΜ)....
107
Tabela 9.
Pressões máximas de perfusão pela infusão contínua
de NOR em leito arteriolar de rins isolados de coelhos
sob hipotermia (25
o
C), tratados com LNMA (10µm), L-
nitro-arginina (10µM), D-arginina (1µM) e L-arginina
(1µM)...............................................................................
109
xii
Tabela 10.
Escape vascular de leito arteriolar de rins isolados de
coelhos após infusão contínua de NOR, submetidos a
hipotermia (25
o
C) e a tratamento com LNMA (10µM), L-
nitro-arginina (10µM), D-arginina (1µM) e L-arginina
(1µM)...............................................................................
111
Tabela 11.
Incremento pressórico após infusão contínua de NOR e
m
leito arteriolar de rins isolados de coelhos, submetidos
hipotermia (25
o
C) e tratamento com LNMA(10µM
L-nitro-arginina (10µM), D-arginina (1µM) e L-arginin
(1µM).................................................................................
113
Tabela 12.
Pressões máximas após três infusões de NOR (curvas
1, 2 e 3, com intervalos de 20 min entre cada uma) em
leito arteriolar de rins isolados de coelhos e submetidos
a hipotermia (25
o
C) e a tratamento com LNMA (10µM),
L-nitro-arginina (10µM), D-arginina (1µM) e L-arginina
(1µM)...............................................................................
115
xiii
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1.
Pressões de perfusão em rim isolado de coelho a partir
dos grupos controle (euglicêmicos) e diabéticos. Efeitos
da NOR infundida três vezes por 20 min, com
intervalos de 20 min para lavagem. Nos animais
diabéticos, as pressões basais e máximas estão
bastante elevadas e as curvas apresentam maior
inclinação. Além disso, nos animais normais - ao
contrário dos diabéticos - é perceptível o fenômeno de
taquifilaxia. *p<0.05; **p<0.01; #p<0.001 (ANOVA, teste
de Tukey).........................................................................
91
Gráfico 2.
Comparação entre as pressões de perfusão em leito
arteriolar de rins isolados de coelhos e submetidos a
infusão de NOR. Foram usados animais
normoglicêmicos e diabéticos não tratados e tratados
com GSH (1µM) e rutina (1µM). Os diabéticos não
tratados apresentam pressões basal e máxima
superiores às dos normoglicêmicos, além de um
prejuízo no escape. O tratamento com GSH parece
reduzir as pressões basal e máxima dos diabéticos,
além de exibir recuperação no escape. Todavia, o
tratamento com rutina não altera significativamente as
pressões basais do grupo diabético, mas aumenta a
reatividade vascular noradrenérgica e o escape.
*P<0.05; ***P<0.0001 (Testes ‘T’ não pareados em
relação ao grupo normoglicêmico)..
..................................................
93
Gráfico 3.
Comparação entre as pressões basais do leito
arteriolar de rins isolados de coelhos quando
submetidos a infusão de NOR. Utilizou-se um sistema
de perfusão aberto com solução de Krebs-Henseleit.
Constata-se que os níveis pressóricos basais acham-
se elevados nos animais diabéticos em relação aos
normoglicêmicos, sendo que o tratamento com
glutationa reduzida (GSH) reduz parcialmente esse
efeito, ao passo que a rutina provoca um ligeiro
aumento. *p<0.05 em relação ao grupo normoglicêmico
**p<0.001 em relação ao grupo normoglicêmico
(ANOVA, teste de Tukey)................................................
95
xiv
Gráfico 4.
Comparação entre as pressões máximas de perfusão
no leito arteriolar de rins isolados de coelhos, quando
submetidos a infusão de NOR. A perfusão foi realizada
em sistema aberto, com solução de Krebs-Henseleit.
Em todos os grupos de animais diabéticos - inclusive
naqueles tratados com glutationa reduzida (GSH) e
rutina, a pressão máxima atingida é superior à do
grupo de euglicêmicos. No entanto, o tratamento com
GSH provoca pequena redução em relação aos
diabéticos não tratados. *p<0.05 em relação ao grupo
normoglicêmico **p<0.01 em relação ao grupo
normoglicêmico. ***p<0.001 em relação ao grupo
normoglicêmico................................................................
97
Gráfico 5.
Comparação entre os escapes vasculares do leito
arteriolar renal de coelhos normoglicêmicos e com
diabetes aloxânico, após infusão de NOR nos rins
isolados e perfundidos em sistema aberto, com solução
de Krebs-Henseleit. Durante a perfusão, percebeu-se
uma drástica redução do escape nos animais
diabéticos em relação aos normoglicêmicos. Por outro
lado, os tratamentos com glutationa reduzida (GSH) e
rutina, ambas a 1µM, elevaram os escapes para níveis
estatisticamente indistinguíveis daqueles do grupo
normoglicêmico (embora o tratamento com rutina
pareça intensificar o escape mais do que o tratamento
com GSH). No grupo normoglicêmico, 80% dos rins
perfundidos apresentaram escape, ao passo que, no
grupo diabético, apenas 43%. *p<0.05 em relação ao
grupo normoglicêmico; teste ‘t’ não pareado...................
99
Gráfico 6.
Comparação entre os incrementos pressóricos do leito
arteriolar renal de coelhos normoglicêmicos e
diabéticos, após infusão de NOR nos rins isolados.
Utilizou-se solução de Krebs-Henseleit em sistema de
aberto de perfusão. Nos animais diabéticos, estando os
níveis basais aumentados, observa-se uma redução no
incremento pressórico relativo. Os tratamentos com
GSH (1µM) e rutina (1µM) parecem restaurá-lo. No
entanto, os dados não atingiram o nível de confiança
de 95% (ANOVA). Incremento Pressórico= (Pmax -
Pbas).100/Pbas...............................................................
101
xv
Gráfico 7.
Pressões de perfusão em rim isolado de coelho a partir
do grupo controle e dos grupos tratados com L-
arginina (1 µΜ) e D-arginina (1 µΜ). Efeitos da NOR
infundida por 20 min três vezes consecutivas, com
intervalos de 20 min para lavagem. Percebe-se que, no
grupo tratado com a forma 'L' do aminoácido
(conhecido substrato para a síntese de NO), ocorre
uma lentificação da curva pressórica, bem como uma
redução drástica na pressão máxima atingida e no
escape vascular nas três curvas - resultados opostos
àqueles obtidos com a forma 'D' do aminoácido, a qual
pode servir como falso substrato para a via do NO.
*p<0.05; **p<0.01 (ANOVA teste de Tukey)....................
106
Gráfico 8.
Comparação entre as pressões basais do leito arteriolar de
rins isolados de coelhos quando submetidos a infusão de
NOR. Utilizou-se um sistema de perfusão aberto com
solução de Krebs-Henseleit. Tanto o grupo sob hipotermia
(25
o
C) como os tratados com análogos da L-arginina
parecem apresentar pressões basais superiores às do
grupo controle, sendo que apenas o tratamento com L-nitro-
arginina (10
µ
M) mostrou resultados estatisticamente
significativos em relação ao controle. O tratamento com L-
arginina (1
µ
M) parece reduzir as pressões basais. *p<0.05
em relação ao grupo D-arginina **p<0.001 em relação ao
grupo controle.........................................................................
108
Gráfico 9.
Comparação entre as pressões máximas do leito
arteriolar de rins isolados de coelhos quando
submetidos a infusão de NOR. Utilizou-se um sistema
de perfusão aberto com solução de Krebs-Henseleit.
Tanto o grupo sob hipotermia (25
o
C) como os tratados
com LNMA (10 µM), L-nitro-arginina (10 µM) e D-
arginina (1 µM) apresentam pressões máximas mais
elevadas do que a do grupo controle. No entanto, o
tratamento com L-arginina (1 µM) reduz a pressão
máxima consideravelmente. *p<0.05 em relação ao
grupo controle **p<0.01 em relação ao grupo controle
e p<0.001 em relação ao grupo D-arginina.....................
110
xvi
Gráfico 10.
Comparação entre os escapes vasculares do leito
arteriolar renal de coelhos euglicêmicos, após infusão
de NOR. Os rins foram isolados e perfundidos em
sistema aberto com solução de Krebs-Henseleit. Os
dados foram obtidos dos grupos controle, sob
hipotermia (25
o
C) e tratados com LNMA (10 µM), L-
nitro-arginina (10 µM), D-arginina (1 mM) e L-arginina
(1 µM). O grupo submetido a hipotermia apresentou os
escapes mais baixos de todos, ao passo que o grupo
da L-arginina apresentou os valores mais elevados.
Todavia, não se atingiu o nível estatístico de 95% de
confiança em qualquer dos grupos se comparados ao
controle (ANOVA e teste ‘t’ não pareado).......................
112
Gráfico 11.
Comparação entre os incrementos pressóricos de rins
isolados de coelhos, perfundidos, em sistema aberto,
com solução de Krebs-Henseleit e após infusão de
NOR. A hipotermia (25
o
C) e a adição de LNMA (10µM)
tendem a elevar o incremento, ao passo que os
tratamentos com L-nitro-arginina (10µM) e D-arginina
(1µM) parecem reduzi-lo. Todavia, o único resultado
estatisticamente significativo em relação ao controle foi
a redução do incremento pressórico pelo tratamento
com L-arginina (1µM). Incremento Pressórico= (Pmax -
Pbas).100/Pbas **p<0.01 em relação ao grupo controle
(ANOVA, teste de Tukey)................................................
114
Gráfico 12.
Comparação entre as pressões máximas atingidas
durante uma sequência de três infusões de NOR
(curvas 1, 2 e 3) em rins isolados de coelhos, com o
intuito de avaliar o fenômeno de taquifilaxia. Valores
obtidos dos grupos controle, sob hipotermia (25
o
C) e
tratados com LNMA (10 µM), L-nitro-arginina (10 µM),
D-arginina (1 µM) e L-arginina (1 µM). Nenhum deles
alcançou diferenças significativas (p<0,05; testes 't'
pareados). No entanto, o grupo controle é o de
resultados mais uniformes, registrando pequenos
decréscimos na segunda e na terceira curva..................
116
xvii
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS
Ach
Acetilcolina
ADMA
Dimetil arginina assimétrica
COX
Cicloxigenase
DAG
Diacilglicerol
DMID
Pacientes diabéticos insulino-dependentes
DMNID
Pacientes diabéticos não insulino-dependentes
eNOS
Óxido nítrico sintetase endotelial
ET
Endotelina
EV
Escape Vascular
FRDE
Fator de relaxamento derivado de endotélio
FRP
Fluxo renal plasmático
GC
Guanilil ciclase
GFAT
Glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase
GH
Hormônio do crescimento
GlcNAc
N-acetilglicosamina
GMPc
Monofosfato cíclico de guanosina
GSH
Glutationa reduzida
G-S-S-G
Glutationa oxidada
GTP
Trifosfato de guanosina
HA
Hipertensão arterial
HIV
Vírus da imunodeficiência humana
IFN
Interferon
IL
Interleucina
iNOS
Oxido nítrico sintetase induzível
IP
Incremento pressórico
IP
3
Trifosfato de inositol
KM
Constante de meia saturação
xviii
L-NAME
NG-MetiL-éster-nitro-L-arginina
LNMA
Nitro-metiL-L-arginina
LNMMA
NG-monometil L-arginina
LNOARG
N(omega)-nitro-L-arginina
LPS
Lipopolissacárides
NAD
Nicotinamida adenina dinucleotídeo
nNOS
Óxido nítrico sintetase neuronal
NO
Óxido nítrico
NOR
Noradrenalina
OGT
O-GlcNAc transferase
PA
Pressão arterial
PAF
Fator de agregação plaquetária
PAI
Inibidor de ativador de plasminogênio
PARP
Poli (ADP-ribose) polimerase
PG
Prostaglandina
PKC
Fosfato quinase C
P
máx
Pressão máxima de perfusão
P
mín
Pressão mínima de perfusão
PP
Pressão de perfusão
RNAm
RNA mensageiro
SHR
Ratos espontaneamente hipertensos
SNC
Sistema nervoso central
SNP
Sistema nervoso periférico
SOD
Enzima superóxido dismutase
STZ
Estreptozotocina
TGF
Fator de crescimento tumoral
TNF
Fator de necrose tumoral
TX
Tromboxano
xix
VEGF
Fator vascular endotelial de crescimento
VFG
Velocidade de filtração glomerular
V
máx
Velocidade máxima
ZDF
Ratos diabéticos obesos Zucker
xx
RESUMO
Estudo dos efeitos do diabetes, da hipotermia e do bloqueio de óxido nítrico
sintetase no escape vascular e na taquifilaxia do rim isolado de coelho.
Ricardo Lira De Oliveira
Orientador: Prof. Dr. Manassés Claudino Fonteles
Dissertação de Mestrado em Farmacologia – UFC, 2003
O endotélio exerce relevante papel no controle do tônus vascular,
produzindo substâncias vasoativas relaxantes e constritoras – entre as primeiras,
o gás óxido nítrico, produzido a partir do aminoácido L-arginina e um conjunto de
enzimas chamadas óxido nítrico sintetases (NOS). Esse estudo avaliou os efeitos
da L-arginina, bem como de inibidores de NOS sobre o escape vascular e a
taquifilaxia de rins de coelhos. Além disso, os efeitos do diabetes e da hipotermia
também foram estudados.
Rins de coelhos normais e com diabetes aloxânico foram perfundidos
com solução de Krebs-Henseleit em um sistema aberto e a norepinefrina (NOR)
10
-6
M foi infundida por três períodos consecutivos de 20 min cada, com intervalos
de 10 min para lavagem. No grupo controle, L-arginina e D-arginina foram
adicionadas (ambas a
1µΜ
, bem como os inibidores de NOS, nitro-metiL-L-
arginina (
10µΜ
) e
n(omega)-nitro-L-arginina
(
10µΜ
). Esse grupo foi também
submetido a hipotermia (25
o
C). Os rins de animais diabéticos foram agrupados
em não tratados e tratados com glutationa reduzida
(1µΜ)
e rutina
(1µΜ).
O tratamento com LNOARG elevou a pressão basal (p<0.001). O
tratamento com L-arginina reduziu tanto a pressão basal (p<0.05) como a máxima
(p<0.01). O tratamento com nitro-metiL-L-arginina elevou a pressão máxima
(p<0.05). O diabetes elevou tanto a pressão basal (p<0.001) como a máxima
(p<0.01).
Nos rins do grupo controle, a infusão de NOR promoveu uma intensa
vasoconstrição, a qual foi menos intensa durante o segundo e o terceiro período
de infusão – caracterizando o fenômeno de taquifilaxia. Os rins sob hipotermia
exibiram taquifilaxia apenas no segundo período. Mas, o grupo tratado com L-
arginina não mostrou taquifilaxia – ao contrário, os valores tornaram-se mais altos
a cada período de infusão de NOR. Todavia, precisamos encarar esses resultados
com reserva, pois não atingiram significância estatística ao nível desejado, ou
seja, p<0.05.
O grupo diabético mostrou um escape bastante reduzido se comparado
ao grupo controle (p<0.05), mas esse efeito foi parcialmente revertido pelo
tratamento com glutationa reduzida e rutina. Dentre os rins do grupo de animais
euglicêmicos, aqueles tratados com L-arginina – mas não com D-arginina –
exibiram um escape elevado se comparados aos do grupo controle. Contudo, esse
resultado também não alcançou significância estatística, isto é, p<0.05. A
hipotermia, por sua vez, mostrou uma redução no escape, novamente sem o nível
de significância almejado (p<0.05).
xxi
ABSTRACT
The effects of diabetes, hypothemia and nitric oxide sinthase blockade on
vascular escape and tachyphylaxis in the rabbit isolated kidney.
Ricardo Lira de Oliveira.
Mentor: Manassés Claudino Fonteles.
Master Degree Dissertation in Pharmacology-UFC, 2003
The endothelium plays a crucial role in the vascular tone, releasing
relaxing and contracting factors – among the first ones the gas nitric oxide,
produced from the amino acid L-arginine and a group of enzimes called nitric oxide
synthases (NOS). This study evaluated the effects of L-arginine as well as NOS
inibitors on vascular escape and tachyphylaxis of rabbit kidneys. Furthermore the
effects of diabetes and hypothermia were studied also.
Normal and alloxan treated diabetic rabbit kidneys were perfused with
Krebs-Henseleit solution in a non-recirculating system and norepinephrine (NO) 10
-
6
M was infused for three subsequent periods of 20 min each, with an inteval of 10
min for drug wash-out. In the control group L-arginine and D-arginine were added
to the solution (both
1µΜ)
as well as the NOS inibitors L-NMA
(10µΜ)
and
LNOARG
(10µΜ)
. This group was also submitted to hypothermia (25
o
C). The
kidneys from diabetic animals were separated in non treated and treated with GSH
(1µΜ)
and rutin
(1µΜ).
The treatment with the NOS inibitor LNOARG increased the basal
(steady state) pressure (p<0.001). The L-arginine treatment decreased both basal
(p<0.05) and maximal (p<0.01) pressures (after NOR infusion). The nitro-methyL-
L-arginine treatment increased the maximal pressures (p<0.05). Diabetes
increased both basal (p<0.001) and maximal (p<0.001) pressures.
In the control kidneys the infusion of NOR promoted an intense
vasoconstriction, which was less intense during the second and the third periods of
infusion- what is called tachyphylaxis. The kidneys under hypothermia showed
tachyphylaxis only in the second period. But the group treated with L-arginine didn’t
show tachyphylaxis – instead the values became higher and higher at each period
of infusion of NOR. However we should be cautious about these results since they
didn’t reach a p<0.05 value.
The diabetic group showed a substantially decreased escape when compared to
control (p<0.05), but this effect was partially reversed by the treatment with GSH
and rutin. In the kidneys from euglycemic rabbits those treated with L-arginine –
but not D-arginine – showed an increased escape when compared to control. But
this result wasn’t significant. Hypothermia showed a decreased escape too that
wasn’t significant, either.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. O Endotélio e o Tônus Vascular
O endotélio vascular tem importante função na regulação da
resistência periférica e, portanto, na regulação da pressão arterial (PA)
sistêmica. As células endoteliais têm participação direta nos
mecanismos contráteis e relaxadores da microcirculação através da
produção de substâncias vasoativas que atuam localmente,
modulando o tônus das células musculares lisas da parede dos vasos
adjacentes (Figura 1). A produção dessas substâncias é ativada por
alterações na concentração de mensageiros intracelulares, como
monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) e cálcio, a partir de
interações das células endoteliais com constituintes do plasma (por
exemplo, plaquetas). As substâncias vasoativas podem ser
classificadas em duas classes: fatores relaxantes - óxido nítrico (NO),
prostaciclina (PGI
2
) e fator hiperpolarizante derivado do endotélio - e
fatores constritores - endotelina, tromboxano, angiotensina II e radicais
oxigenados livres - do endotélio (MONCADA e HIGGS, 1993;
BARRON, 1993; LOSEKANN, 1997).
2
Figura 1. A Ach interage com receptores da célula endotelial liberando
substâncias vasodilatadoras derivadas do endotélio Impacto da
Hipertensão no envelhecimento vascular, São Paulo: Roche, 1995.
O endotélio vascular também inativa substâncias vasoativas,
como serotonina e bradicinina. Há evidências de desequilíbrio na
síntese endotelial de vasodilatadores e vasoconstritores na gênese da
hipertensão arterial (HA) sistêmica. A disfunção da célula endotelial
pode causar HA pelo aumento de produção de agentes
vasoconstrictores, como endotelina, ou pela reduzida liberação de
agentes vasodilatadores, como óxido nítrico (MONCADA e HIGGS,
1993; SELLIGMAN, et al., 1994).
3
Outro importante mecanismo no controle da contração e
relaxamento da microcirculação é a formação de ácido aracdônico, a
partir de fosfolipídeos da membrana celular. A ação da ciclo-oxigenase
(COX) sobre o ácido aracdônico resulta na produção de uma série de
metabólitos que podem levar à vasoconstricção ou vasodilatação.
Entre estes metabólitos, estão a prostaciclina (PGI
2
) e o tromboxano
A2 (TXA
2
). PGI
2
promove vasodilatação e determina inibição da
agregação das plaquetas ao endotélio e TXA
2
induz vasoconstricção e
agregação plaquetária, aumentando a possibilidade de fenômenos de
trombose na microcirculação. O equilíbrio da produção desses
metabólitos, de ações opostas, é responsável pela adequação da
atividade das células endoteliais (LOSEKANN, 1997).
A temperatura também é uma variável relevante para o tônus
vascular. O efeito vasoconstritor do frio é conhecido do homem desde
longas datas – compressas de gelo têm sido usadas com êxito para
reduzir edemas. OHATA, et al, 2000, mediram os níveis séricos de
nitrato e nitrito em dois grupos de pacientes submetidos a circulação
extra-corpórea, um com perfusão a 28
o
C e outro a 34
o
C. Os
resultados demonstraram níveis significativamente mais baixos no
primeiro grupo, sugerindo que a queda na produção de NO está
envolvida no aumento da resistência vascular sistêmica (RVS) e,
4
conseqüentemente, da pressão arterial (PA), em pacientes submetidos
a perfusão sob hipotermia.
Uma patologia muito comum nos países desenvolvidos, o
diabetes, está claramente envolvida na disfunção endotelial.
NASCIMENTO (2004), trabalhando com corpos cavernosos de coelhos
com diabetes aloxânico, demonstrou um déficit da ordem de 40% no
relaxamento mediado por óxido nítrico (NO), em relação ao grupo
controle. Com efeito, os portadores de diabetes tipo I e II compartilham
a geração deficiente de NO a partir da L-arginina. Essa deficiência
reflete-se, em parte, pelas medidas diretas dos níveis plasmáticos de
nitrato e nitrito. Diversos fatores influenciam a produção e o
metabolismo do NO. Vejamos: como parte do metabolismo natural da
L-arginina, certas quantidades de inibidores naturais de NOS são
formados – por exemplo, a dimetil-arginina assimétrica ou ADMA.
Normalmente, a ADMA não se acumula no sangue, pois é rapidamente
eliminada na urina. Todavia, uma função renal comprometida, como
conseqüência do envelhecimento (acima de 20% dos americanos com
mais de 60 anos têm diabetes tipo II) ou por doença – o que ocorre no
diabetes –, pode impedir a eliminação deste inibidor de NOS,
limitando, por conseqüência, a produção de NO (BURKE, 1999).
Ademais, as óxido nítrico sintetases (NOS) são enzimas dependentes
5
de pH, demonstrando atividade em condições ligeiramente alcalinas,
mas sendo suprimidas em pH ácido (BURKE, 1999). Sabe-se que o
diabetes gera uma condição denominada cetoacidose, a qual faz
decrescer o pH plasmático. Essa condição pode estar entre os fatores
que contribuem para a produção deficiente de NO. Uma oxigenação
adequada também é necessária para a atividade das NOS. Contudo, a
circulação é notadamente prejudicada no paciente diabético. Por outro
lado, a hiperglicemia associada ao diabetes faz com que a glicose
incorpore-se à hemoglobina. A hemoglobina glicosilada liga-se
fortemente ao NO na forma de nitrosotiol (GOW, et al., 1999). Retido, o
NO não fica prontamente disponível para manter o relaxamento
muscular. BRODSKY, et al., 2001, demonstraram que a exposição
aguda das células endoteliais à glicose – em níveis detectados no
plasma de diabéticos - resulta em uma significativa redução nas
respostas do NO a certos agonistas da eNOS, a saber, bradicinina e
A-23187. Além disso, nesse mesmo trabalho, verificou-se uma
acentuada redução na concentração de NO em condições de
hiperglicemia. Por sua vez, OBROSOVA, et al., 2003, detectaram
estresse oxidativo intensificado no córtex renal de ratos diabéticos.
Em suma, acidose metabólica, baixa oxigenação e/ou
acúmulo de ADMA, efeito tipo scavenging da glicose sobre o NO,
6
estresse oxidativo, bem como a ligação do NO à hemoglobina, são
fatores que devem ser tomados em conta na averiguação das causas
do decréscimo na síntese ou nos níveis de NO. O conjunto dessas
condições pode contribuir para a precária circulação nos diabéticos. É
importante frisar que o baixo metabolismo do NO em tais pacientes
também é considerado por alguns pesquisadores como a causa das
neuropatias periféricas comumente associadas ao diabetes.
Por último, precisamos considerar certos mecanismos
mantenedores da homeostase vascular – são eles o escape vascular e
a taquifilaxia. O primeiro consiste em uma redução progressiva do
tônus vascular durante um estímulo pressor prolongado, como ocorre
durante a infusão contínua de agonistas adrenérgicos; a segunda
consiste, em sentido farmacológico amplo, na dessensibilização rápida
de quaisquer receptores celulares quando submetidos a ligações
repetitivas com agonistas, sendo, portanto, um fenômeno dependente
da freqüência do estímulo. Na área de abrangência desta dissertação,
taquifilaxia representará a perda progressiva da resposta pressora dos
leitos vasculares quando submetidos intermitentemente à ação de
agentes vasoconstritores.
7
Em 1984, GREENWAY publicou importante trabalho
retrospectivo que precedeu a reativação das investigações sobre o
escape vascular, em leitos arteriais mesentérico e hepático (LAUTT,
1977; LAUTT, 1986).
A produção de mediadores vasoativos com possível relação
com escape foi verificada por BENVENISTE, 1974, e FURCHGOTT e
ZAWADSKI, 1980. O primeiro descobriu os efeitos do Fator de
Ativação de Plaquetas (Platelet-Activating Factor – PAF) e o segundo,
o Fator de Relaxamento Endotélio-Dependente ou EDRF (Endotelium-
Derived Relaxing Factor), mais tarde identificado como equivalente ao
óxido nítrico (NO).
Um estudo com leito mesentérico de gatos, submetido a
estímulos elétricos nas terminações simpáticas, permitiu a FOLKOW,
et al. (1964), observar o seguinte fenômeno – quando se aplicava o
estímulo, os valores pressóricos subiam vertiginosamente, atingiam
um valor limite para, em seguida, decrescerem aos níveis basais,
mesmo com a manutenção do estímulo inicial. Uma seqüência de
estudos investigaria o fenômeno até a década seguinte, entre eles,
DRESEL e WALLENTIN, 1966; GREENWAY, et al., 1967;
JOHANSON, et al., 1970; HANSON, 1972; LUTZ e HEINRICH, 1973;
8
LAUTT, 1977; LAUT e GRAHAM, 1977; FINK e BRODY, 1978;
GREENWAY, et al., 1967; RICHARDSON e JOHANSON, 1969;
HENRICH e LUTZ, 1971; FARA e ROSS, 1972; FONTELES et al.,
1974; FONTELES e JESKE, 1980. Empregando técnica similar à de
Folkow ou por meio de estímulo adrenérgico, esses pesquisadores
identificaram o fenômeno de escape vascular em outros dois leitos –
hepático e renal. Os trabalhos de FONTELES et al., 1974 e
FONTELES, et al., 1980, guardam estreita relação com este trabalho,
pois investigaram a ocorrência de escape sob estímulo adrenérgico em
leito renal, inclusive em condições de hipotermia.
Quanto à taquifilaxia, vários mecanismos foram propostos
para explicá-la: 1) alterações na afinidade do receptor celular à droga
indutora; 2) diminuição do número de receptores disponíveis para a
ligação; 3) aumento da disponibilidade do agonista para as células,
individualmente; 4) diminuição da recaptação ou da inativação do
neurotransmissor; e 5) perda do fator endotelial modificador da
resposta vascular frente a determinados agonistas (O’MALLEY, et al.,
1986).
9
1.2. Revisão de Literatura
1.2.1. A via L-arginina/Óxido Nítrico
O óxido nítrico (NO) é uma das mais versáteis moléculas
ativas do organismo. Essa pequena e simples molécula, talvez a
menor de todas as produzidas pelos mamíferos, tem efeitos
interessantes que vão desde a manutenção inicial da vida, através do
controle da circulação placentária, ou a indução do início da vida
através da regulação das contrações uterinas no trabalho de parto, até
efeitos letais demonstráveis, por exemplo, no choque séptico. O óxido
nítrico é um importante neurotransmissor com capacidade
potencializadora, atuando na memória e no aprendizado,
apresentando também ações endócrinas, autócrinas e parácrinas. A
sua ação na imunorregulação está presente na inflamação e nos
mecanismos de autoimunidade. Essa molécula tem suscitado a
revisão de muitos conceitos da medicina moderna, principalmente em
neurologia, cardiologia, nefrologia e gastroenterologia.
A evidência inicial de óxidos de nitrogênio no metabolismo
veio de experimentos que demonstraram produção de nitratos em
camundongos germ-free no início da década de 80 (GREEN, et al.,
10
1981). Em 1985, demonstrou-se que macrófagos ativados por
lipopossacárides bacterianos eram capazes de levar à produção de
nitritos e nitratos (STUHER e MARLETTA, 1985). Na seqüência,
evidenciou-se que a L-arginina era o substrato e a L-citrulina era
formada como co-produto (HIBBS, et al., 1987). Também naquela
década, FURCHGOTT e ZAWADZKI (1980), investigavam um fator
vasodilatador lábil, associado ao endotélio vascular (endothelium-
derived relaxing factor – EDRF ou FRDE). Na década de 1980,
concluiu-se ser o óxido nítrico responsável pela atividade biológica do
EDRF (IGNARRO e et al., 1987; MONCADA, et al., 1988). Nessa
época, também identificou-se o óxido nítrico como o produto da reação
de oxirredução da L-arginina (MARLETTA, et al., 1988).
Até então, o NO era, apenas, conhecido como mais um
poluente atmosférico. Em contraste, sua participação em vários
sistemas biológicos é hoje bem documentada, incluindo regulação da
PA, neurotransmissão (que pode responder por várias funções,
incluindo a formação da memória), inibição da ação plaquetária,
inibição da síntese total de proteínas pelo fígado e papel ainda não
bem estabelecido na regulação adrenal (MONCADA, et al., 1991;
MONCADA e HIGGS., 1993).
11
NO é um gás e radical livre altamente difusível. A síntese do
NO na célula endotelial do vaso permite a atividade em estruturas
vizinhas, como a musculatura lisa da parede vascular, onde pode
produzir relaxamento e conseqüente vasodilatação (MONCADA e
HIGGS, 1993; MACALLISTER e VALLANCE, 1994). O relaxamento
vascular dependente do endotélio parece diminuído em pacientes com
HA essencial, sugerindo que a deficiente geração de NO possa
contribuir para o desenvolvimento de níveis pressóricos elevados
(BERNHEIM, 1997; FORTE, et al., 1997). Tratamentos com inibidores
da síntese de NO induzem resposta hipertensiva em animais,
acompanhada por diminuição na excreção de sódio, que pode se
tornar irreversível por dano glomerular (GABBAI, 1995). O NO é
sintetizado por uma família de enzimas - as NO sintetases - a partir do
aminoácido L-arginina, através de uma via metabólica denominada
rota L-arginina-óxido nítrico (Figura 2). A ação das NO sintases (NOS)
sobre a L-arginina leva à formação de NO e citrulina, sendo a citrulina
um metabólito aparentemente inativo desta reação. O tratamento com
L-arginina previne o desenvolvimento de HA em animais predispostos,
causa redução rápida da pressão arterial sistólica (PAS) e diastólica
(PAD), quando o aminoácido é infundido em pessoas saudáveis e em
pacientes com HA primária (MONCADA, et al., 1991; MONCADA e
HIGGS, 1993).
12
Figura 2. Via L-arginina-NO, da passagem do aminoácido até o
relaxamento do músculo liso da parede do vaso (modificado de
Moncada e Higgs, 1993)
13
O óxido nítrico (NO) inicia e mantém a vasodilatação através
de uma cascata de eventos biológicos que culmina no relaxamento
das células musculares lisas que revestem as artérias, veias e vasos
linfáticos. A despeito de ser um processo um tanto complexo, a
seqüência de eventos que são deflagrados pelo óxido nítrico é descrita
a seguir:
− O NO é sintetizado a partir da L-arginina nas células endoteliais e
difunde-se até a camada de células musculares lisas dos vasos.
− Uma vez tenha alcançado a célula muscular, o NO se liga a uma
enzima, a guanilil ciclase (GC), ativando-a.
− Ativada, a GC é capaz de clivar dois grupos fosfato a partir de outro
composto chamado guanosina trifosfato (GTP). Isto resulta na
formação de monofosfato cíclico de guanosina (cGMP), o qual é
usado para fosforilar proteínas, inclusive a proteína muscular
contrátil chamada miosina.
− Uma vez fosforilada, a miosina relaxa, resultando na vasodilatação;
essa dilatação prossegue até que uma enzima do tipo fosfatase
14
dissocie o grupo fosfato da miosina (o que pode ser retardado, por
exemplo, pelo sildenafil ou pela teofilina).
Além de ser um potente vasodilatador e inibidor da adesão e
agregação plaquetárias, o óxido nítrico reduz a aderência de leucócitos
no endotélio vascular e, também, suprime a proliferação de células da
musculatura lisa vascular por inibição de fatores de crescimento. O
conhecimento das NO-sintetases (NOS) é de extrema importância
científica, não só para o entendimento de novos mecanismos
fisiopatológicos, mas, também, por ser um alvo à descoberta de novas
intervenções terapêuticas (COOKE e DZAU, 1997).
1.2.1.1 Óxido Nítrico Sintetases (NOS)
As NOS, do ponto de vista bioquímico, são uma família de
enzimas complexas que catalisam a oxidação da L-arginina para
formar óxido nítrico e L-citrulina. As três formas humanas da NOS
identificadas até agora, eNOS (endotelial), nNOS (neuronal), e iNOS
(induzida), são encontradas nos cromossomos humanos 7, 12 e 17,
respectivamente, e assim foram nomeadas, com base nos tecidos nos
quais foram primeiramente clonadas e caracterizadas (REES, et al.,
1989; COOKE e DZAU, 1997).
15
A atividade da NOS endotelial (eNOS) está por trás da ação
do NO na regulação do tônus vascular e da função plaquetária. Sua
inativação limita a contribuição do NO na homeostase dos vasos e
resulta num aumento do tônus vascular e da adesão e agregação
plaquetárias. A via de transdução de sinal, que leva à ativação da
eNOS, no seu curso completo, encontra-se representada na figura 3,
onde se observa que a atividade da eNOS é regulada pela
concentração de cálcio livre intracelular e pelo complexo
Ca
++
/calmodulina. A eNOS é uma proteína expressa de maneira
constitucional associada, predominantemente, com a fração
subcelular, sugerindo que a enzima nativa é uma proteína componente
da membrana. Recentes e detalhadas análises da associação da
eNOS com a membrana celular, mostraram que esta enzima está
localizada no Complexo de Golgi, bem como em estruturas específicas
na membrana identificadas como cavéolas. A associação da eNOS
com uma região da membrana plasmática, na qual estão concentradas
várias chaves dos complexos de transdução de sinal (como as
proteínas G), tem, provavelmente, profunda repercussão na atividade
enzimática bem como na sua acessibilidade aos processos
intracelulares da via de liberação do NO, incluindo processos não
associados ao aumento do cálcio intracelular (SCHMIDT, et al., 1994;
WANG e MARSDEN, 1995; FLEMING e BUSSE, 1999).
16
A NOS neuronal (nNOS) está presente nas células
neuronais centrais e periféricas, bem como nas células epiteliais. Sua
atividade também é regulada por Ca
++
e calmodulina. Suas funções
incluem regulação duradoura da transmissão sináptica no sistema
nervoso central, regulação central da pressão sangüínea, relaxamento
do músculo liso e vasodilatação via nervos nitrérgicos periféricos. Tem
sido envolvida também na morte de neurônios no acidente vascular
cerebral (FORSTERMANN, et al., 1994).
A expressão da enzima NOS induzível (iNOS) se manifesta
em uma multidão de células diferentes, incluindo macrófagos, células
endoteliais, células da musculatura lisa vascular e miócitos cardíacos,
depois de estimulação com lipopolissacárides (LPS), citoquinas (como
IL-1β, TFN-α, TFN-γ, IL-6) e outros. Por estas características tem
importante papel em atividades antimicrobianas, antiparasitárias e
antineoplásicas (FORSTERMANN, 1995). Esta isoforma não é
regulada pelo cálcio. Ela produz grande quantidade de NO que tem
efeito citostático nas células alvo parasitadas via inibição de enzimas
férricas, causando fragmentação do DNA. A indução da iNOS está
envolvida na fisiopatologia das doenças auto-imunes e no choque
séptico (FORSTERMANN, et al., 1994). Há diferentes nomenclaturas
17
das isoformas das NOS, de modo que apresentamos um resumo dos
possíveis nomes de cada isoforma.
Figura 3. Quadro representativo da nomenclatura das NOS
1.2.1.2. Inibidores de NOS
Inibidores inespecíficos são aqueles que inibem tanto a
eNOS como, também, a iNOS. Sendo derivados metilados e nítricos
da L-arginina, atuam por competição. Entre eles, os mais conhecidos
são o L-NMMA, o L-NAME e o LNOARG (Nω-nitro-L-arginina). Como
outro exemplo, pode-se mencionar a dimetilarginina assimétrica
(ADMA) que é um inibidor endógeno circulante da NOS. Estudos
recentes demonstraram que o nível plasmático de ADMA está
positivamente relacionado a fatores de risco para aterosclerose,
18
sugerindo-se que este antagonista endógeno da NOS possa ser um
marcador de aterosclerose (MIYAZAKI, et al., 1999).
Os inibidores específicos têm afinidade pela isoforma iNOS.
São eles os glicocorticóides (como a dexametasona), a
aminoguanidina, a L-canavanina, a N6-(1-imioetil)-lisina e a 2,4-
diamino-6-hidróxi-pirimidina. O conhecimento dos inibidores
específicos das NOS é de fundamental importância para ensaios
farmacológicos experimentais e terapêuticos (Figura. 4). Algumas
comparações entre as atividades das diferentes isoformas são dignas
de apresentação dentro da proposição da discussão dos conceitos
básicos. Como já foi dito, a eNOS é uma enzima que tem sua
localização associada à membrana, enquanto que as formas iNOS e
nNOS são amplamente citossólicas (COOKE e DZAU, 1997). Uma
outra diferença existente entre as isoformas da NOS é em relação à
quantidade e a duração da produção de NO. A molécula de NO é
sintetizada por um curto período de tempo (segundos a minutos)
quando decorrente da ativação enzimática da eNOS ou nNOS. Em
contraste, a iNOS só se expressa depois da ativação celular e então
produz NO por, um relativamente longo período de tempo (horas a
dias).
19
Figura 4. Inibidores de NOS: LNMMA, L-NAME e LNOARG são
análogos da L-arginina, os quais competem pela Óxido Nítrico
Sintetase (NOS), bloqueando a síntese do NO.
20
Derivados metilados da L-arginina, que incluem a N
G
-
monometil L-arginina (LNMMA) e nitro-arginina-metil-éster (L-NAME),
podem acumular-se no plasma em algumas situações patológicas –
como insuficiência renal aguda. A inibição das NOS por estes
compostos pode, em parte, explicar a presença de HA nestas
circunstâncias (MONCADA e HIGGS, 1993). Como já foi dito, o NO é
um importante fator na vasodilatação homeostática e previne a
agregação e adesão plaquetária.
1.2.1.3. A medição do NO
A mensuração do NO produzido e de sua atividade, pela
instabilidade já descrita, é realizada de maneira indireta. Dosagens
mais ou menos sofisticadas são efetuadas, desde técnicas de biologia
celular e de imunocitoquímica, passando pela avaliação dos níveis
intracelulares ou urinários de monofosfato 3’- 5’ - cíclico de guanosina
(GMPc), chegando à dosagem de nitrito, nitrato inorgânico e citrulina
(MONCADA e HIGGS, 1993; GABBAI, 1995). Nitrato inorgânico é o
metabólito final, estável, do NO e pode ser medido no soro ou na urina,
como índice de produção de NO. A citrulina, por sua vez, é produzida
juntamente com o NO, a partir da ação das NO sintetases e constitui,
também, possível marcador para a produção de NO. Há, ainda,
21
possibilidade de dosagem de nitrito no plasma (encontrado em
quantidades menores que o nitrato). Em água, ultrafiltrado e plasma, o
NO é oxidado a nitrito (que é estável por várias horas). No sangue
total, entretanto, nitrito é rapidamente convertido a nitrato (MONCADA
e HIGGS, 1993; ROBERTS, 1993; GABBAI, 1995). Investigadores têm
usado o índice nitrito/nitrato como marcador da produção de NO
(GABBAI, 1995). A partir da dosagem destes metabólitos da rota da L-
arginina, muitos trabalhos têm tentado mostrar a relação entre
produção deficiente de NO e diversos estados fisiopatológicos. A
busca do conhecimento dessa rota levou os autores à mensuração dos
mais variados produtos de degradação do NO em animais de
experimentação (CONRAD e VERNIER, 1989; WEINER, 1989; DENG,
et al., 1996; PODJARNY, et al., 1997) e em humanos (NOBUNAGA, et
al., 1996; SCHNEIDER, et al., 1996; SELLIGMAN, et al., 1994;
SMARASON, et al., 1997). O Monofosfato 3’- 5’ - cíclico de guanosina
(GMPc), por exemplo, tem sido utilizado na tentativa de determinar a
atividade da rota de L-arginina-óxido nítrico (SCHNEIDER, et al.,
1996). Por sua vez, a dosagem plasmática de L-arginina circulante já
foi utilizada em algumas circunstâncias para avaliação nutricional de
pacientes em diálise (REYES, et al., 1994). No entanto, esse dado
apenas evidencia o montante de L-arginina à disposição da célula, no
meio extracelular. O transporte desse aminoácido através da
22
membrana pode sugerir a disponibilidade para o meio intracelular, que
é onde ocorre a ativação da rota que chega à produção de NO.
1.2.2.1. Características da L-arginina e seu papel na fisiologia humana
L-arginina é um aminoácido básico de ocorrência natural, o
qual participa de muitas reações bioquímicas associadas à fisiologia
normal do organismo. Encontrada na maioria das proteínas que
consumimos em nossa dieta diária, a L-arginina tanto pode ser
metabolizada para favorecer a síntese de glicose como pode ser
degradada para produzir energia, a depender das necessidades do
corpo. Além de ser requerido para a síntese protéica e inúmeras outras
reações, esse aminoácido é também conhecido como precursor
imediato da substância vasodilatadora encontrada nos vasos arteriais
– o fator de relaxamento derivado de endotélio (FRDE). O óxido nítrico
não deve se confundido com o óxido nitroso (N
2
O), também conhecido
como gás hilariante (MAHER, 1994).
O uso de aminoácidos individuais como agentes terapêuticos
ou suplemento alimentar tem se tornado muito popular. Associado a
esse uso está o desejo pelos supostos efeitos que a terapia com
aminoácidos possa proporcionar. Todavia, para a maioria dos
23
aminoácidos, toxicidades potenciais podem se manifestar como
resultado de desequilíbrio nutricional (MAHER, 1994). Como as dietas
conhecidas ao público normalmente não expõem as pessoas a tal
desequilíbrio, deve-se ter cautela quanto à implementação de regimes
alimentares a longo prazo, pois certos efeitos súbitos podem escapar à
detecção inicialmente. Como em toda farmacoterapia, os efeitos
benéficos do uso de L-arginina precisam ser avaliados frente aos
potenciais riscos. Apenas mediante o conhecimento de ambos os
fatores – benefício e risco – uma decisão quanto ao uso deste
aminoácido pode ser tomada pelo paciente (MAHER, 1994).
A L-arginina é tradicionalmente classificada como aminoácido
não essencial em adultos porque pode ser sintetizada endogenamente
a partir da L-citrulina. Todavia, em crianças muito pequenas e em
outras situações caracterizadas pela rápida proliferação tissular –
como após infecções ou trauma –, a síntese endógena de L-arginina
pode não ser suficiente para atender à demanda por esse aminoácido.
Assim, a L-arginina pode ser classificada como “semi-essencial” em
certos episódios (REYES, et al., 1994).
Boa parte da síntese endógena da L-arginina a partir da L-
citrulina ocorre nos túbulos proximais do rim. Aí ela ocorre de modo a
24
reagir, via ciclo de Krebs, com a amônia oriunda do metabolismo dos
compostos nitrogenados – convertendo-a na prontamente excretável e
pouco tóxica uréia (PETERS e NOBLE, 1996). Sem essa via
metabólica, a amônia acumular-se-ia nos tecidos, ocasionando
injúrias. Como evidência da importância da inclusão de L-arginina na
nutrição, dietas experimentais pobres em L-arginina resultam em
rápido aumento na amonemia. Uma porção menor de L-arginina ocorre
no fígado, mas a maior parte dela é metabolizada subseqüentemente
pela arginase hepática, raramente alcançando a circulação sanguínea.
A L-arginina normalmente corresponde a cerca de 5-7 % do
total de aminoácidos presentes na dieta típica de um adulto saudável.
Embora algumas proteínas encontradas nos alimentos possam conter
níveis ligeiramente mais altos deste aminoácido que outras, há pouca
diferença entre as proteínas mais completas nesse respeito. A L-
arginina distribuída via trato gastrointestinal é absorvida no jejuno e
íleo. Um sistema específico de transporte – o sistema y+, do qual
falaremos posteriormente - facilita o processo e também é responsável
pelo transporte de outros aminoácidos básicos, L-lisina e L-histidina.
Cerca de 60% da L-arginina absorvidos são metabolizados pelas
células gastrointestinais, de modo que apenas 40% alcançam a
circulação sanguínea. A natureza parece ter ‘projetado’ a maioria das
25
proteínas de tal modo que uma relativamente balanceada mistura está
presente nelas, ou seja, a única maneira de suprir um indivíduo
seletivamente de L-arginina seria suplementando sua dieta com esse
aminoácido (MAHER, 1994).
Além de seu papel como componente de muitas proteínas, a
L-arginina têm diversos outros destinos metabólicos, como mostra a
figura 5.
26
Figura 5. Destinos Metabólicos da L-arginina
27
Ao passo que muito interesse foi desenvolvido pela via
nitrérgica, é importante frisar que uréia, L-ornitina, L-prolina, L-
glutamato e poliaminas tais como a putrecina também são produzidos
a partir da L-arginina. A creatina - composto de armazenamento de
grupos fosfato altamente energéticos – é formada da L-arginina e é
essencial à contração muscular. A reação de descarboxilação da L-
arginina (via L-arginina descarboxilase) produz agmatina, a qual se
sabe interagir com mesmos receptores a que se ligam os agentes anti-
hipertensivos centrais, como a clonidina (LI, et al., 1994). Existe, pois,
a possibilidade de que parte do efeito anti-hipertensivo observado nos
tratamentos com L-arginina poderia ser resultado da ação da agmatina
nos centros regulatórios cardiovasculares.
A L-arginina também é protagonista no processo de secreção
de importantes hormônios. Estes incluem hormônio do crescimento
(GH), insulina, glucagon, aldosterona, somatostatina e catecolaminas
adrenais (PETERS e NOBLE, 1996). Por exemplo, a administração de
30g de L-arginina EV é usada rotineiramente para diagnosticar a
incompetência da hipófise em secretar GH. Além disso, há uma série
de condições fisiopatológicas que respondem ao tratamento com L-
arginina, tais como angina pectoris, arterioscleriose, doença arterial
coronariana, hipercolesterolemia, hipertensão, câncer de mama,
28
nefroesclerose associada ao diabetes melito e esterilidade associada à
oligospermia (BOGER, et al., 1998; LERMAN, et al., 1998; PARK,
1992; SANDERS, 1995; KLAHR, 1999; SCHACHTER, et al., 1973).
Em estudos, nos quais administra-se cloridrato de L-arginina
parenteralmente, tem se verificado acidose metabólica e alterações em
alguns eletrólitos (potássio, por exemplo). No entanto, isto só se
verifica com superdosagens do cloridrato administradas
parenteralmente, não se seguindo à administração de doses mais
modestas pela via oral. Dos estudos disponíveis sobre a administração
oral de L-arginina a humanos, poucos relatam efeitos adversos após
tratamento agudo ou crônico. Um caso em 1992 demonstrou a
duplicação da taxa de síntese de proteínas tumorais em pacientes com
câncer de mama que receberam 30g/dia de L-arginina durante 3 dias
(PARK, et al., 1992). Todavia, numerosos estudos anteriores
(TACHIBANA, et al., 1985; BARBUL, 1986) e posteriores
(BRITTENDEN, et al., 1994; HEYS, et al., 1998) àquele relato falharam
em reproduzir tais achados. Com base em sua farmacologia, a L-
arginina tanto pode ter atividades pró como anti-tumor. Por outro lado,
levando-se em conta que os efeitos desse aminoácido em pacientes
com atividade tumoral maligna não são bem compreendidos, deve-se
exercer extrema cautela quanto a suplementá-lo na dieta. Doses de
29
até 30g/dia têm sido geralmente bem toleradas, raramente
apresentando sintomas adversos como náusea ou diarréia. Nenhuma
alteração na função hepática, na glicemia ou na concentração
plasmática de eletrólitos tem sido observada. Um estudo com 9 g/dia
relatou um paciente com lesões recorrentes de herpes labial, as quais
regrediram após a interrupção do uso da L-arginina. Em um estudo
recente com 24 pacientes com hipercolesterolemia que receberam 14
g diárias por 12 semanas, não se detectaram alterações na insulina
plasmática, hormônio do crescimento (GH) nem em diversas outras
substâncias presentes no plasma. Tampouco se notaram alterações
nos parâmetros hematológicos, exceto um pequeno aumento na
uremia (TANGPHAO, et al., 1999). Não houve relatos sobre quaisquer
efeitos adversos nesse estudo. L-arginina (9 g diárias) administrada
por 6 meses a pacientes anginosos não parece ter causado qualquer
efeito indesejável (LERMAN, et al., 1998).
Um estudo recente utilizou um suplemento alimentar
contendo L-arginina (6 g diários) durante 7 dias a 43 pacientes com
hipercolesterolemia, demonstrando boa tolerância e respostas
vasodilatadoras. Este produto consistia em um suplemento alimentar
contendo vitaminas B6, B12, C, E, folato e niacina, associados a
proteínas. O produto pareceu altamente eficaz em promover saúde
30
cardiovascular e nenhum efeito adverso foi relatado (MUELLER,
1999).
Como resultado do papel fisiológico do NO no sistema
cardiovascular, uma série de precauções e contra-indicações ao uso L-
arginina deve ser considerada. Em razão do efeito vasodilatador do
NO associado ao choque séptico, pacientes com infecções severas
provavelmente não devem receber L-arginina. Como o NO é capaz de
promover angiogênese, pacientes com retinopatia diabética também
não devem receber L-arginina. Como descrito acima, pacientes com
tumores ativos devem evitar suplementação de L-arginina. Já que os
estudos anteriormente relatados falham em documentar sérios efeitos
adversos associados ao uso suplementar desse aminoácido, há a
necessidade de mais estudos que possam detectar toxicidades
súbitas. Na falta de experimentos especialmente voltados a este tema,
deve haver cautela no uso de L-arginina em crianças, grávidas,
lactentes, idosos e aqueles com a função renal ou hepática seriamente
comprometida (MUELLER, 1999).
Produtos à base de L-arginina estão disponíveis como
suplementos dietéticos, normalmente na forma de cápsulas e tabletes.
Recentemente, um novo produto foi desenvolvido. Trata-se de uma
31
associação do aminoácido a uma série de antioxidantes, vitaminas e
fibras os quais podem proporcionar benefícios a pacientes com doença
cardiovascular ou outras (MUELLER, 1999).
32
1.2.2.2. Transporte de L-arginina através da Membrana Celular
A célula é a unidade funcional de todos os organismos vivos
e cada célula é cercada por uma membrana plasmática. Essa
membrana é seletivamente permeável, contendo proteínas
especializadas no transporte de substâncias para dentro e para fora,
de maneira a manter adequado equilíbrio com o meio. Algumas
propriedades da membrana dependerão das diferentes funções
especializadas da célula (FERVENZA, 1990; ALBERTS, et al., 1994;
GUYTON e HALL, 1996). Estas propriedades poderão estar alteradas
em diferentes doenças, ajudando a identificá-las adequada e, talvez,
precocemente. Situações como hipertensão arterial (HA), uremia e
transplante renal têm sido estudadas, evidenciando disfunções
celulares e defeitos no transporte de membrana, prováveis fatores
envolvidos na patogênese dessas entidades (FERVENZA, 1989;
FERVENZA, 1990; OLLOFOSSON, 1995; MENDES, et al., 1997).
A membrana celular é a barreira que controla a passagem de
moléculas entre a célula e seu meio. Esta função de barreira é crucial
para permitir que a célula mantenha a concentração interna de solutos,
que é diferente do compartimento extracelular. Ela é composta de uma
camada lipídica, na qual as proteínas estão embebidas junto com
33
pequena quantidade de carboidratos, tendo uma grande quantidade de
funções, além de barreira física. Permite o transporte seletivo de
substratos, promove a transmissão de sinais químicos e provê um
ambiente adequado às funções intracelulares (ALBERTS, et al., 1994).
Transporte de íons inorgânicos e pequenas moléculas orgânicas,
através da camada lipídica, é realizado por proteínas especializadas,
cada qual com responsabilidade de transferir um íon específico,
molécula ou grupo de íons e moléculas. As células podem transferir
macromoléculas e mesmo grandes partículas através de suas
membranas, mas o mecanismo envolvido, na maioria dos casos, é
diferente. A presença de sistemas de transporte especializados
possibilita que as células estabeleçam ajustes homeostáticos, quando
das mudanças do meio externo e interno (FIGUEIREDO, 1995).
A passagem através da membrana celular ocorre por dois
processos básicos: difusão (também chamado de transporte passivo) e
transporte ativo. Embora existam variações desses dois mecanismos
básicos, difusão é a passagem de substâncias - molécula a molécula -
pelos espaços intermoleculares da membrana ou em combinação com
uma proteína transportadora. A energia que produz a difusão é a do
movimento cinético da matéria. Nos mecanismos de transporte ativo,
há exigência de uma fonte adicional de energia para criar e manter
34
gradientes iônicos, permitindo que a célula ajuste seu meio interno
(GUYTON e HALL, 1996).
Figura 6. Mecanismo postulado para a difusão facilitada: uma proteína
de membrana (permease) muda de configuração ao se ligar a um
determinado tipo de molécula, transportando-a ao meio intracelular a
favor de um gradiente de concentração (GUYTON e HALL, 1996).
35
Transporte passivo pela membrana pode se dar por difusão
simples ou facilitada, como ilustra a figura 6. Na difusão simples, a
passagem ocorre pelos espaços intermoleculares da membrana, por
movimento cinético das moléculas ou íons, sem necessidade de
fixação a proteínas da membrana. A difusão facilitada exige a
interação de proteína transportadora e diferença de gradiente. A L-
arginina é transportada por difusão facilitada (AVILA-CHAVEZ, 1997;
DEVES, et al., 1992; MENDES, et al., 1997). O processo pelo qual um
sistema de transporte transfere moléculas através da membrana
envolve um transportador com sítios específicos para essa molécula.
Quando todos os sítios estão ocupados e todos os carregadores
saturados, a taxa de transporte, através da membrana, é máxima para
esta molécula, e a essa taxa denominamos V
máx
. Em adição, cada
carregador tem uma característica de ligação, constante com seu
substrato, denominada KM . O KM é igual, para uma determinada
concentração de substrato, ao valor encontrado quando a taxa de
transporte atinge metade do seu nível máximo: KM é a constante de
meia saturação (ALBERTS, et al., 1994; FERVENZA, 1990; DEVES, et
al., 1992; DEVES e BOYD, 1998).
Os processos de transporte facilitado transmembrana
ocorrem através de proteínas. No caso da L-arginina, sabe-se haver
36
dois sistemas de transporte estabelecidos: y+ e y+ L. A função desses
transportadores pode ser avaliada de forma análoga à função de
enzimas. Emprega-se cinética enzimática através da fórmula de
Michaelis-Menten (ELLORY e YOUNG, 1982; DEVES, et al., 1992;
DEVES e BOYD, 1998).
Figura 7. Concentração de uma substância e capacidade de difusão
através de membrana, onde ocorre difusão simples e difusão facilitada.
A linha tracejada mostra o fluxo máximo.
Os mecanismos de transporte transmembrana têm
despertado o interesse dos pesquisadores há várias décadas. Sabe-
se, há décadas, da permeabilidade da membrana de eritrócitos para
aminoácidos (LUCIO, et al., 1991). FERVENZA em 1990 descreveu
37
detalhado estudo de sistemas de transporte de membrana na
insuficiência renal, usando como modelo o eritrócito. Sabe-se,
também, que os glóbulos vermelhos podem conter aminoácidos em
concentrações mais altas do que o meio extracelular (ELLORY e
YOUNG, 1982). ELLORY, et al. 1982, estudaram sistemas de
transporte para aminoácidos em eritrócitos. Sistemas de transporte
através da membrana celular podem acumular aminoácidos contra
gradiente de concentração; as propriedades cinéticas não podem ser
explicadas por difusão passiva (ELLORY, et al., 1982). WINTER e
CHRISTENSEN em 1964, descreveram dois sistemas saturáveis de
captação de aminoácidos; um para aminoácidos neutros e outro, de
baixa capacidade, para alanina e glicina. CHRISTENSEN, et al. (1948)
descreveram sete sistemas de transporte para aminoácidos, mas
somente cinco estão presentes em eritrócitos humanos. Os cinco
sistemas, bem caracterizados e cineticamente analisados são; y+ ,
ASC, gly, L e T. Um novo sistema, denominado y+L, foi descrito, em
1992, em eritrócitos humanos, com alta afinidade por lisina e leucina
(DEVES, et al., 1992).
Experimentos demonstraram que a rota biossintética do NO
está condicionada ao suprimento de arginina extracelular (PALMER, et
al., 1988), de modo que o transporte deste aminoácido é
38
transitoriamente sobre-regulado por agonistas da produção de NO
(BOGLE, et al., 1991). A velocidade de captação é variável e o
mecanismo por trás de um influxo aumentado de arginina ao
citoplasma pode estar ligado a uma hiperpolarização de membrana
induzida por agonistas.
Os métodos para monitorar o rápido influxo de arginina nas
células endoteliais são úteis para avaliar o ritmo de produção do NO. O
transportador de aminoácidos é inibido por outros aminoácidos
catiônicos e assemelha-se ao sistema y+ identificado em outros tipos
celulares. Análogos da arginina - incluindo L-NMMA e L-NAME -
inibem as NO sintases (NOS). Todavia, a L-NMMA também inibe o
transporte de L-arginina, ao passo que L-NAME não é capaz de fazê-
lo. Por outro lado, bradicinina e ATP estimulam simultaneamente o
transporte de L-arginina e a liberação de NO via NOS constitutiva.
Muito embora o transporte de L-arginina e a geração de NO –
estimulados por agonistas – não estejam acoplados diretamente, um
aumento no suprimento do aminoácido pode prover um mecanismo
para geração sustentada de NO. Evidências recentes sugerem que
eNOS, o sistema Y
+
e MAP quinases estão co-localizados no
complexo de cavéola associado à plasmalema de células endoteliais.
39
Experiências com macrófagos revelaram que a captação dos
inibidores de NOS L-NMA e L-NNA é mediada por dois mecanismos
diferentes. A ativação dessas células mediante citocinas resulta em
uma sobre-regulação da captação de L-NMA, mas não afeta o
transporte de L-NNA. A caracterização dos sítios de transporte revelou
que a captação da primeira ocorre por meio de um transportador de
aminoácido catiônico (sistema y+), enquanto que um transportador de
aminoácido neutro (sistema L) contribui para a captação da segunda
(SCHMIDT, KLATT e MAYER, 1994).
O sistema y+ é específico e carrega aminoácidos básicos,
como L-lisina e L-arginina (HENDRY, 1992). É um sistema seletivo, de
baixa afinidade e alta capacidade, que pode ser identificado em
eritrócitos humanos e de carnívoros (SILVER, et al., 1996). O sistema
y+L, de alta afinidade e baixa capacidade, é o segundo sistema
responsável pelo transporte de L-lisina e L-arginina (DEVES, et al.,
1992). Resumindo: o transporte de L-arginina ocorre primariamente
via transportador de aminoácido y+, é saturável (acima de uma faixa
fisiológica de concentração) e independe de Na
+
; além disso, a L-
arginina também é transportada através da membrana celular pelo
sistema mais recentemente descoberto, y+L. O estudo do influxo de L-
arginina, através da membrana celular, é o exame de um processo da
40
rota metabólica L-arginina-óxido nítrico. Esse segmento da rota
merece maiores investigações para avaliação dos mecanismos
fisiológicos e fisiopatológicos relacionados à PA.
1.2.3. A Disfunção Endotelial no Diabetes
O diabetes altera a função de vários tipos celulares incluindo
o endotélio, as células musculares lisas e as plaquetas (BECKMAN, et
al., 2002). A hiperglicemia, o excesso de ácidos graxos livres e a
resistência à insulina, três características maiores da perturbação
metabólica, provocam disfunção endotelial. A diminuição da síntese do
óxido nítrico, que se acompanha do aumento das concentrações de
endotelina–1 e angiotensina II, conduz a um aumento da
vasoconstrição e da inflamação e promove a trombose (VERMA e
ANDERSON, 2001). O diabetes contribui para a instabilidade da assim
chamada placa ateromatosa (associada a um tipo de arteriosclerose),
o qual confere estabilidade mecânica à cápsula fibrosa da referida
placa (UEMURA, et al., 2001). Quando o desdobramento do colágeno
aumenta e a síntese diminui, a placa pode romper mais facilmente e
levar à formação de trombo. O próprio fenômeno trombótico está
agravado pela produção do fator tissular que é pró-coagulante. O
diabetes estimula a atividade aterogênica das células musculares lisas
41
vasculares. As lesões ateroscleróticas avançadas em diabéticos têm
menos células musculares lisas (LIBBY, 2001) e, portanto, são mais
propensas a ruptura e formação de trombo. Finalmente, a diminuição
da função plaquetária pode participar, de forma significativa, na
formação do trombo. A função plaquetária mostra, nos diabéticos,
diminuição da produção de NO e prostaciclina, aumento da produção
de fibrinogênio, entre outras alterações (VINIK, et al., 2001). Estes
desvios fisiológicos condicionam alterações dos radicais livres de
oxigênio e perturbação da homeostase do cálcio, que, no seu conjunto,
explicam o aumento do potencial trombótico característico do diabetes.
Realizaram-se investigações da atividade da NOS
plaquetária em pacientes diabéticos insulino-dependentes (DMID) e
não dependentes (DMNID), os quais foram caracterizados pelo
aumento da ativação plaquetária e da atividade da Na+/K+ ATPase da
membrana de plaquetas em dezenove pacientes DMID, vinte e um
DMNID e, como controle, em trinta e um pacientes saudáveis. A
expressão da NOS mostrou uma relação positiva significativa com a
atividade de Na+/K+ ATPase em pacientes diabéticos, tornando
possível a hipótese de que uma atividade diminuída da NOS possa ter
um papel na patogênese das complicações vasculares diabéticas
(RABINI, et al., 1998). O radical NO é um possível mediador precoce
42
das lesões das células beta-pancreáticas no diabetes DMID. Existem
diferentes isoformas da NOS no contexto das lesões imunológicas das
células beta, sendo que o papel da iNOS é o mais relevante. A iNOS
da célula beta é semelhante e codificada pelo mesmo gene no
cromossomo 17 da iNOS expressada em macrófagos e em outras
células nucleadas. A ativação da iNOS depende da transcrição do
gene e da re-síntese da enzima, e o NO parece induzir um feedback
negativo na expressão da iNOS. Enquanto o RNAm da iNOS é
induzido somente pela interleucina-1 beta (IL-1 beta), nas células
produtoras de insulina em roedores, são necessárias a combinação de
duas (IL-1 beta + interferon gama [IFN-gama]) ou três (IL-1 beta + IFN-
gama + TNF alfa) citoquinas. Para a ativação da iNOS em células
pancreáticas humanas, a regulação dos genes da iNOS e outros
genes relacionados com as células beta é complexa e difere, em
vários aspectos, do que se observa em macrófagos. Existem também
importantes diferenças na regulação da iNOS entre células
pancreáticas de roedores e células humanas. Um conhecimento
detalhado da regulação molecular destes genes nas células beta pode
ser um instrumento experimental no desenvolvimento de novas
abordagens para a prevenção da destruição precoce das células
pancreáticas beta em pacientes DMID (EIZIRIK, et al., 1996).
Evidências indicam que a insulina pode, in vivo, sub-regular a via de
43
liberação da iNOS. A via da iNOS é sobre-regulada em ratos e
camundongos com tendência ao diabetes e associa-se no processo
auto-imune. Alguns experimentos, entretanto, indicam que a produção
de NO por macrófagos e a expressão do RNAm da iNOS estão
também aumentadas em roedores tornados diabéticos pela injeção de
estreptozotocina (STZ) em que não há um componente auto-imune
primário. A administração de insulina reduz a produção de NO em
roedores com tendência ao diabetes e naqueles com diabetes induzido
pela STZ. Finalmente, a insulina diminui a produção de NO por
macrófagos em animais normais. Estes resultados indicam que o
paradigma auto-imune é inadequado para explicar o aumento do NO
no diabetes.
Como um mecanismo potencial para explicar a regulação da
produção do NO mediada pela insulina, o TGF-beta 1 pode estar
envolvido porque: 1) macrófagos de ratos diabéticos produzem menos
TGF-beta 1 do que macrófagos de animais normais; 2) o nível
circulante de TGF-beta 1 é mais baixo em ratos diabéticos e; 3) a
administração de insulina aumenta a TGF-beta 1 em ratos normais.
Estes resultados juntos evidenciam que o aumento de NO no diabetes
não é somente a causa mas, também, um efeito da destruição de
44
células beta e resultante, em parte, de uma atividade imunorreguladora
da insulina até aqui desconhecida (STEVENS, et al., 1997).
A produção aumentada de NO é descrita no rim diabético e é
considerada como envolvida na hiperfiltração glomerular. O
mecanismo preciso da produção de NO no rim diabético é, entretanto,
desconhecido. Um estudo recente compara a localização da
expressão da isoforma eNOS em tecido renal de ratos portadores de
diabetes induzida pela STZ e ratos 5/6 nefrectomizados, esclarecendo
o papel essencial da eNOS na hiperfiltração glomerular nos estados
precoces da nefropatia diabética. Em ratos diabéticos, o diâmetro das
arteríolas aferentes, do volume glomerular, o clearance de creatinina e
o NO
2
/NO
3
urinário aumentam após a indução de diabetes. As
arteríolas eferentes, entretanto, não se alteram. O tratamento com
insulina ou L-NAME restaura o diâmetro das arteríolas aferentes, o
volume glomerular, o clearance de creatinina e os níveis de NO
2
-
/NO
3
-
.
A expressão da eNOS nas arteríolas aferentes e nos glomérulos de
ratos diabéticos aumenta durante os estágios precoces da doença,
mas não se alteram nas arteríolas eferentes. O tratamento com
insulina ou L-NAME diminui a expressão da eNOS em arteríolas
aferentes e nos glomérulos. Em contraste, a expressão da eNOS
encontra-se sobre-regulada em ambas as arteríolas, aferente e
45
eferente, e nos glomérulos de ratos 5/6 nefrectomizados, onde se
observam dilatação das arteríolas aferentes e eferentes e aumento dos
glomérulos. Tratamento com L-NAME melhora a expressão da eNOS e
a dilatação das arteríolas. Conclui-se que o aumento da síntese de NO
pela eNOS em arteríolas aferentes e células endoteliais glomerulares,
em resposta ao estado hiperglicêmico, pode causar uma dilatação
preferencial de arteríolas aferentes, o que, em conseqüência, induz a
dilatação e hiperfiltração glomerulares (SUGIMOTO, et al., 1998).
Um outro estudo foi dirigido para investigar o papel do NO na
patogênese da hiperfiltração e hiperperfusão glomerulares em ratos
com diabetes induzido pela STZ. Para a avaliação do papel do NO na
hiperfiltração, mediram-se as concentrações plasmáticas e urinárias de
NO
2
-
/NO
3
-
, produtos metabólicos estáveis do NO e a expressão
protéica das três isoformas da NOS em ratos com diabetes induzida
pela STZ. Investigaram-se, também, as alterações hemodinâmicas
renais, como a velocidade de filtração glomerular (VFG) e o fluxo renal
plasmático (FRP), em resposta à administração aguda e crônica de L-
NAME em ratos diabéticos e controles. Os ratos diabéticos exibiram
níveis plasmáticos e urinários de NO
2
-
/NO
3
-
aumentados após 28 dias
de injeção de STZ, e a excreção total de NO
2
-
/NO
3
-
foi,
aproximadamente cinco vezes maior nos ratos diabéticos do que nos
46
ratos controles. As três isoformas da NOS (nNOS, INOS e eNOS)
estavam todas aumentadas no córtex renal, enquanto permaneceram
inalteradas na medula renal no 28º dia. A VFG e o FRP estavam
significantemente elevados nos ratos diabéticos, e a inibição aguda da
síntese de NO pelo L-NAME atenuou as alterações hemodinâmicas
renais nos ratos diabéticos. Esses estudos concluem que a síntese de
NO está aumentada em ratos diabéticos, devido a um aumento da
expressão da NOS, e que o bloqueio crônico atenua a hiperfiltração e
hiperperfusão renais nesses animais. Em adição, os ratos diabéticos
exibem melhora das respostas hemodinâmicas renais pela inibição
aguda do NO com aumento da excreção urinária de NO
2
-
/NO
3
-
. Esses
resultados sugerem que a produção excessiva de NO pode contribuir
para a hiperperfusão e hiperfiltração renais nos estágios precoces do
diabetes (CHOI, et al., 1999).
Finalmente, é importante tentar estabelecer ligações entre
NOS, insulina e hipertensão arterial. Tem sido descrito que o
tratamento com a insulina melhora a hipertensão em pacientes com
diabetes melito. Os mecanismos do efeito anti-hipertensivo da insulina,
entretanto, necessita ser completamente elucidado. Um estudo
investigou um possível envolvimento do NO na redução da pressão
arterial pela insulina em ratos diabéticos obesos Zucker (ZDF – Zucker
47
diabetic fatty), um modelo experimental de diabetes não dependente
da insulina. Os animais foram divididos em três grupos e tratados por
quatro semanas com injeções subcutâneas diárias de insulina (25U/k)
com ou sem a administração do inibidor inespecífico L-NAME
(50mg/kg/dia). Solução salina foi injetada pela via subcutânea nos
grupos controles. Durante o período experimental, o ganho de peso foi
maior no grupo tratado com insulina do que nos animais controles, ao
passo que a ingestão de água foi, consideravelmente menor no grupo
tratado com insulina. O tratamento com a insulina resultou em
decréscimo da glicemia e da pressão arterial e em um aumento
plasmático de metabólitos do NO e da atividade da NOS em tecido
aórtico. O tratamento com L-NAME não só bloqueou o efeito anti-
hipertensivo da insulina, mas também a atividade das NOS. Estes
achados sugerem que a insulina reduz a pressão arterial em ratos ZDF
por estimular a expressão da NOS e a produção de NO
(KAWAGUCHI, et al., 1999).
Um artigo recente de GARCIA SORIANO, et al., 2001, indica
que a ativação de poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) é um
importante fator na patogênese da disfunção endotelial no diabetes.
Esses autores descobriram que a destruição das ilhotas pancreáticas
com estreptozotocina, em ratos, induzia hiperglicemia grave, produção
48
de oxidante intravascular, ativação de PARP nos vasos sanguíneos e
uma perda da função endotelial. Demonstraram também que a
disfunção endotelial em ratos diabéticos é dependente de PARP. Em
experiências ex vivo, demonstraram que a inibição da ativação PARP
com inibidor PJ34t de PARP restituía a função vascular normal sem
alterar os níveis de glicose sistêmicos. As experiências in vitro
utilizando células endoteliais pulmonares de ratos tipo selvagem, e
com deficiência de PARP demonstraram que níveis elevados de
glicose são um estímulo poderoso para a ativação de PARP. Esses
estudos demonstraram também que a ativação de PARP através de
níveis elevados de glicose depende, pelo menos em parte, da
formação de radicais superóxido. As espécies oxidantes são indutores
endógenos de DNA de cadeia simples, o que ativa a PARP (PIEPER,
et al., 1999). Tem sido demonstrado que os radicais livres derivados
do oxigênio são gerados em células endoteliais expostas a elevados
níveis de glicose (NISHIKAWA, et al., 2000). O estudo de GARCIA
SORIANO, et al., 2001, confirmou e expandiu essas descobertas
anteriores. Esses autores especulam que as espécies reativas de
oxigênio são os ativadores prováveis de PARP no endotélio diabético.
No que diz respeito à questão de qual é o mecanismo celular da
disfunção endotelial mediada por PARP no modelo animal do diabetes,
sugerem que a crise energética que se desenvolve na célula endotelial
49
como resultado da agressão oxidante estimula a ativação de PARP. A
PARP é uma enzima nuclear de células eucarióticas que tem sido
associada a lesões de DNA (PIEPER, et al., 1999). Foi demonstrado
que ativação de PARP está ligada a lesões de células induzidas por
oxidante através de uma série complexa de passos que se seguem à
lesão de DNA e à ativação de PARP, tem lugar uma rápida depleção
de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD) intracelular (forma
oxidada) e ATP, conduzindo à disfunção celular. A PARP também tem
sido implicada no processo de expressão genética pró-inflamatória em
estudos anteriores (ZINGARELLI, et al.,1998).
Ainda em 2001, BROWNLEE, por meio de uma ampla
revisão, sintetizou os danos vasculares mediados pela glicose em
quatro mecanismos principais:
1. Fluxo aumentado na rota metabólica dos polióis – uma
enzima, a aldose redutase reduz os aldeídos gerados pelas espécies
reativas de oxigênio (ROS) a álcoois inativos, e glicose a sorbitol,
usando NADPH como co-fator. Em células onde a atividade dessa
enzima é suficiente para depletar os níveis de GSH, o estresse
oxidativo eleva-se.
50
2. Aumento na produção intracelular de produtos finais
avançados de glicação (AGE) – a modificação covalente de proteínas
intracelulares por precursores de AGE altera diversas funções
celulares. Além disso, a modificação de proteínas de matriz
extracelular causa interação anormal com outras proteínas de matriz e
integrinas. Por sua vez, a alteração de proteínas plasmáticas por
precursores de AGE cria ligantes que se conectam a receptores de
AGE, resultando em mudanças na expressão genética em células
endoteliais e mesangiais, bem como macrófagos.
3. Ativação de proteína quinase C (PKC) – a hiperglicemia
aumenta a concentração de diacilglicerol (DAG), o que ativa PKC.
Essa ativação tem uma série de conseqüências patogênicas, afetando
a expressão das NOSe, da endotelina-1 (ET-1), do fator vascular
endotelial de crescimento (VEGF), do fator de crescimento tumoral-β
(TGF- β) e diversos outros.
4. Fluxo aumentado da rota metabólica da hexosamina – o
intermediário glicolítico frutose-6-fosfato é convertido em glicosamina-
6-fosfato pela enzima glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase
(GFAT). A glicosilação intracelular pela adição de N-acetilglicosamina
51
(GlcNAc) à serina e à treonina é catalisada pela enzima O-GlcNAc
transferase (OGT). Um excesso na adição de GlcNac a resíduos de
serina e treonina de fatores de transcrição como o Sp1, eleva a
produção de fatores como o inibidor do ativador de plasminogênio
(PAI-1), TGF-β e diversos outros.
Essa incursão ao complexo território da disfunção endotelial
no diabetes abre portas à compreensão mais profunda de algumas das
expressões clínicas dessa doença, referidas na discussão bem
elaborada e esclarecedora que os autores apresentam. Elas estão
subjacentes a fenômenos clínicos como a isquemia silenciosa, a
neuropatia autonômica, a instabilidade da placa, a perturbação da
coagulação e a miocardiopatia diabética.
1.2.4. O Estresse Oxidativo
Radicais livres são espécies químicas que têm um elétron
não-pareado em um orbital externo, o que as faz extremamente
instáveis. Reagem espontaneamente com moléculas inorgânicas ou
orgânicas, em especial lípides, proteínas e ácidos nucléicos.
52
O termo estresse oxidativo refere-se ao conjunto de efeitos
deletérios que radicais livres derivados de oxigênio exercem sobre as
células. O oxigênio carrega um notável paradoxo, se, por um lado, é
indispensável à vida de organismos aeróbicos como aceptor de
elétrons, por outro, pode gerar metabólitos lesivos às células destes
mesmos organismos. A formação de intermediários reativos de
oxigênio provavelmente ocorre de forma contínua na célula, a qual
dispõe de mecanismos para inativá-los. Sistemas associados ao
transporte e trocas de oxigênio produzem radicais livres como
subprodutos da atividade metabólica normal. Muitos destes sistemas
possuem íons metálicos como o ferro, que ao passar do estado ferroso
Fe
++
ao férrico Fe
+++
, isto é, de um estado de óxido-redução ao outro -
doando ou aceitando elétrons -, podem catalisar a formação de
radicais livres. A geração de vários tipos tóxicos de O
2
ocorrem em
circunstâncias patológicas, incluindo reações inflamatórias. Diversas
classes de moléculas são susceptíveis ao ataque de O
2
, incluindo
proteínas, aminoácidos, lipídios, além de ácidos graxos
poliinsaturados, que também reagem com O
2
, formando
hidroperóxidos. Tais hidroperóxidos contribuem para a deterioração e
disfunção em células e membranas celulares (LARSON, 1988). Os
danos também incluem alterações enzimáticas e danos no DNA.
Essas alterações oxidativas são as responsáveis por uma série de
53
doenças degenerativas - as angiopatias, por exemplo. Hoje existe uma
grande discussão, por exemplo, em relação à doença de Alzheimer,
causada pela presença de radicais livres, através do acúmulo de B
amilóide. A liberação dessa proteína conduz, por fragmentação, à
formação de radicais livres, que modificam as membranas dos
neurônios (HENSLEY, 1994). Como já foi dito, o estresse oxidativo
também está envolvido na patogênese da nefropatia diabética
(OBROSOVA, et al., 2002). Uma das mais importantes conseqüências
da “toxicidade” da glicose sobre os tecidos-alvos, no que diz respeito
às complicações diabéticas, é a produção aumentada dos derivados
reativos de oxigênio. A hiperglicemia inibe o transporte de elétrons no
complexo III da cadeia transportadora mitocondrial, aumentando a
meia-vida de radicais livres intermediários da ubiquinona e,
conseqüentemente, reduzindo o oxigênio a superóxido (BROWNLEE,
2001).
Neste momento, é importante ressaltar que os intermediários
reativos do oxigênio, a despeito de seus efeitos deletérios, podem ter
papel positivo in vivo, como o seu envolvimento em produções
energéticas, fagocitoses, regulação no crescimento celular e sinais
intercelulares bem como em sínteses de importantes compostos
biológicos.
54
Entre as fontes mais importantes de radicais livres estão: a
hemoglobina, o sistema de oxidação conhecido como citocromo P450
e a cadeia respiratória nas mitocôndrias. A maior parte do oxigênio
consumido nas células vai para a fosforilação oxidativa (O
2
→ H
2
O).
Porém, muitas enzimas, que funcionam em várias vias metabólicas,
geralmente usando íons metálicos como co-fatores, transferem
elétrons a aceptores como O
2
ou NAD. No fígado, a ação dessas
enzimas (oxidases) pode chegar a 1/3 do consumo de O
2
do tecido.
A redução do O
2
a 2H
2
O por inserção direta de dois pares de
elétrons é um processo energeticamente difícil devido a peculiaridades
dos elétrons nos orbitais externos. Não fosse isso, a coexistência de
oxigênio molecular com organismos vivos seria improvável. Essa
dificuldade é diminuída pela adição sucessiva de elétrons um a um. A
adição do primeiro elétron produz o íon superóxido:
O
2
+ e
-
→ O
2
-
Este é facilmente protonado a HO
2
(radical hidroperoxil),
que reage com outro radical igual e se transforma em H
2
O
2
e O
2
.
55
O
2
-
+ H
+
↔ HO
2
•
HO
2
• + O
2
-
+ H
+
→ H
2
O
2
+ O
2
Portanto, qualquer sistema que produza O
2
-
logo conterá
H
2
O
2
. Além disso, na presença de íons ferro, duas outras reações
importantes ocorrem entre o íon superóxido e o peróxido de hidrogênio
(água oxigenada):
O
2
-
+ Fe
+++
→ Fe
++
+ O
2
H
2
O
2
+ Fe
++
→ Fe
+++
+ OH
-
+ OH•
Esta é a reação de Fenton (RICE-EVANS, 1996). Através
dela é gerado o radical livre hidroxila OH•, que, dentre os radicais
livres, é uma das espécies mais reativas, ainda mais que o íon
superóxido. Omitindo-se a participação do ferro, que funciona como
catalisador e só atua como aceptor e doador de elétrons, temos a
reação de Haber-Weiss:
H
2
O
2
+ O
2
- → O
2
+ OH
-
+ OH•
56
Em resumo, a produção inicial do íon superóxido resultará,
através destes intermediários, na produção do radical livre hidroxila.
Radicais livres tipo hidroxila são também produzidos na radiólise da
água por radiações ionizantes.
H
2
O → H• + OH•
O organismo desenvolveu um sistema de defesa antioxidante
contra a ação maléfica dos radicais livres. Esses sistemas incluem
alguns antioxidantes produzidos pelo organismo (endógenos) e outros
obtidos por uma dieta alimentar (exógenos). Os primeiros incluem
enzimas como peroxidase, catalase e superóxido dismutase (SOD), a
qual metaboliza o superóxido, peróxido de hidrogênio e peróxidos
lipídicos. As segundas defesas - não enzimáticas - incluem glutationa
(GSH), peptina-histidinas, proteínas de ligação cobre-transferrina e
ferritina, ácido di-hidrolipóico, reduzido CoQ10, melatonina, urato e
tióis protéicos do plasma. Cada uma destas defesas complementa a
outra, de modo que uma alteração em uma delas provoca danos
causados pelos intermediários reativos de oxigênio (BUETTNER,
2001; BARROS, 2003).
57
Examinemos, agora, algumas vias de inativação de radicais:
1. O íon superóxido pode ser inativado espontaneamente a H
2
O
2
e O
2
.
2. Além disso, a enzima superóxido-dismutase (SOD) catalisa a
seguinte reação (que é mais rápida):
O
2
-
+ O
2
-
+ 2H
+
→ H
2
O
2
+ O
2
A enzima é encontrada em todos organismos aeróbicos, no
citossol e nas mitocôndrias, e tem, como parte da molécula, íons
metálicos (cobre, zinco ou manganês).
3. A enzima catalase é importante para impedir o acúmulo de peróxido
de hidrogênio. Catalisa a reação:
H
2
O
2
+ H
2
O
2
→ 2H
2
O + O
2
A catalase de fígado de boi contém 4 porções hemes e
decompõe 44.000 moléculas de H
2
O
2
por segundo. Peroxidases fazem
reação semelhante.
58
4. O tripeptídeo glutationa é amplamente distribuído em seres vivos,
sendo constituido de γ-glutamil-cisteinil-glicina. Normalmente, está
na forma reduzida, isto é, o radical -SH da cisteína está intacto.
Representa-se como GSH. Este radical pode facilmente doar um
hidrogênio a radicais livres hidroxila, sob catálise da enzima glutationa-
peroxidase, produzindo água. Também pode reduzir peróxido de
hidrogênio a água:
2 OH• + 2G-SH → 2H
2
O + G-S-S-G
H
2
O
2
+ 2G-SH → 2H
2
O + G-S-S-G
(G-S-S-G: Glutationa oxidada)
A glutationa oxidada é novamente reduzida pela enzima
glutationa-redutase, que catalisa a reação:
G-S-S-G + NADPH + H
+
→ 2G-SH + NADP
+
A glutationa participa de diversas vias de proteção da célula
contra radicais livres: destruição de peróxidos endógenos e radicais
59
livres hidroxila, manutenção de grupos SH em proteínas e
detoxificação de produtos exógenos (BUETTNER, 2001).
As substâncias que neutralizam os radicais livres ou seus
efeitos são chamadas antioxidantes. Alimentos antioxidantes são
aqueles ricos em substâncias que podem “varrer” os radicais livres ou
então fortalecer a membrana celular, para que os danos do
“bombardeamento” não afetem o núcleo e o DNA da célula. Os
benefícios do consumo de alimentos antioxidantes são imensos, como
proteção contra doenças degenerativas. Certos alimentos, como peixe,
nozes, frutas e diversos óleos vegetais são fontes ricas de
antioxidantes. Frutos e vegetais, por sua vez, são ricos em fenóis,
ácidos fenólicos, linhases, taninos e flavonóides (BARROS, 2003).
Os flavonóides compõem uma ampla classe de substâncias
de origem natural, cuja síntese não ocorre na espécie humana.
Entretanto, tais compostos possuem uma série de propriedades
farmacológicas que os fazem atuar sobre sistemas biológicos.
Conseqüentemente, muitas dessas propriedades atuam de forma
benéfica para a saúde humana. Estudando sua ação como
antioxidante, pesquisas envolvendo não só flavonóides, como também
os seus precursores biossintéticos, foram bastante desenvolvidas
60
(RICHARDSON, et al., 1974; PRATT e BIRAC, 1979; RIOS, et al.,
1992). Atualmente, já foram identificadas mais de quatro mil
substâncias pertencentes ao grupo dos flavonóides (PETERSON e
DWYER, 1998).
Estruturalmente, os flavonóides constituem substâncias
aromáticas com 15 átomos de carbono (C15) no seu esqueleto básico,
sendo compostos fenólicos, que possuem nessa estrutura anéis
aromáticos C6-C3-C6. O esqueleto C15 dos flavonóides é
biogeneticamente derivado do fenilpropano (C6-C3) e três unidades de
acetato (C6). Portanto, flavonóides são derivados de benzo-gama-
pirona de origem vegetal (YOKOZAWA, et al., 1997), podendo haver
facilmente interconversão entre eles (Figura 8).
61
Figura 8. Interconversão dos principais grupos de flavonóides.
(Adaptado de DOMINGUES, 1973).
62
A existência de uma grande diversidade estrutural dos
flavonóides é explicada pelas modificações que tais compostos podem
sofrer, tais como: hidroxilação, metilação, acilação, glicosilação, entre
outras (KOES, et al., 1994).
Consumidos em grandes proporções dentro de uma dieta
humana regular, os flavonóides são encontrados em vegetais,
legumes, frutas, chás de ervas, mel, entre noutros produtos de
consumo cotidiano. Apesar do termo "flavonóide" derivar do latim
flavus, que significa amarelo, observa-se que os grupos flavonóis e
flavonas são incolores e que a classe das antocianinas possuem
substâncias que variam no seu espectro de coloração do verde ao
azul.
Diversos ensaios in vivo e in vitro vêm comprovando e determinando
a ampla variedade das atividades biológicas dos compostos flavonóidicos.
Segundo RATTY e DAS, 1998, algumas dessas propriedades
farmacológicas já foram observadas ( RUSZNYAK and SZENT-GYORGI,
1936). Destacam-se, dentre outros, os seguintes efeitos dos flavonóides
sobre os sistemas biológicos: capacidade antioxidante (esta constitui a
atividade mais elucidada pelos estudos até agora desenvolvidos); atividades
antiinflamatória e de efeito vasodilatador; ação antialérgica; atividade contra
63
o desenvolvimento de tumores, anti-hepatotóxica, antiulcerogênica; efeito
antiplaquetário, bem como ações antimicrobianas e antivirais. Pesquisas
recentes demonstraram que alguns flavonóides atuam na inibição da
replicação viral do agente causador da Síndrome da Imunodeficiência
Humana – HIV (LIN, et al., 1997).
Sabe-se que os flavonóides podem inibir vários estágios dos
processos que estão diretamente relacionados com o início da
aterosclerose, como ativação de leucócitos, adesão, agregação e
secreção de plaquetas (HLAVODEC, 1986), além de atividades
hipolipidêmicas (LIN, et al., 1986) e aumento de atividades de
receptores de LDL (KIRK, et al., 1998). Diversos compostos
flavonoídicos de diferentes plantas, uma vez extraídos, isolados,
identificados e quantificados, foram transformados quimicamente e
empregados em ensaios biológicos para avaliações dos seus
potenciais farmacológicos sobre lipídios em ratos (SANTOS, et al.,
1999a; NAGEM, et al., 1995; SANTOS, et al., 1999b).
Segundo ANTON e BERETZ, 1990, as propriedades
farmacológicas dos flavonóides ainda não foram totalmente avaliadas.
Após uma década de avanços nessa linha de pesquisa, pode-se
afirmar que novos estudos toxicológicos e farmacológicos devem ser
64
realizados, uma vez que a ampla diversidade estrutural desses
compostos - bem como a capacidade de interação com outras
substâncias, nos leva a imaginar que novas descobertas ainda podem
e devem ser realizadas.
A atividade antioxidante dos flavonóides é devida à sua
grande capacidade em captar/sequestrar os radicais livres, formar
complexos com íons metálicos e inibir a peroxidação lipídica das
membranas celulares através do ataque de espécies reativas de
oxigênio às camadas fosfolípidicas. Os flavonóides inibem também
enzimas responsáveis pela formação de ânions superóxido, tais como,
a xantina oxidase, proteína quinase C, assim como cicloxigenase,
monoxigenase microssomal, succinoxidase mitocondrial - todas elas
geradoras de espécies reativas de oxigênio (RICE-EVANS, 1996).
Numerosos flavonóides ligam-se eficazmente a íons metálicos, tais
como Fe
++
e Cu
+
, que são conhecidos por induzirem estresse oxidativo
em sistemas biológicos, atuando como catalisadores nos danos
causados pelos radicais de oxigênio. Há evidências de que flavonóides
podem interagir e penetrar nas bicamadas lipídicas das membranas,
mostrando que estes podem alterar as barreiras destas membranas.
Estes efeitos podem explicar diversos fatores, como conformação e
lipossolubilidade de drogas. Os flavonóides, alterando a
65
permeabilidade das membranas celulares, podem ser um fator crítico
na explicação de muitas das suas atividades biológicas. Flavonóides
também modulam a resistência dos vasos sanguíneos, causando um
aumento na fluidez lipídica.
A ação dos ácidos fenólicos como ácido caféico, ácido
clorogênico e seus isômeros, incluindo ácido 4-O-cafeioil-quínico e
ácido ferúlico, mostrou sua potencialidade em diminuir efeitos
deletérios (PINCEMAIL, et al., 1987). PRATT e BIRAC (1979)
estudaram os efeitos da quercetina, quercitrina, myricetina, myricetina-
3-monoglucosídeo, quercetina 3-monoglucosídeo e quercetina 3-
triglucosídeo, extraídos de sementes de diversas plantas. A
determinação da atividade antioxidante foi feita utilizando etanol
absoluto e fazendo determinações espectrométricas, enquanto RIOS,
et al., 1992, testaram os efeitos de cinco flavonóides glicosilados de
Sideritis javalambrensis como inibidores da peroxidação de lipídeos
nos microssomas. RICHARSON, et al., 1974, testaram o efeito de
flavonas e derivados de flavonas como antioxidantes em amostras de
leite e comprovaram a eficácia de suas ações. Antioxidantes naturais,
principalmente os compostos fenólicos, também foram encontrados em
vários vegetais (HAREL e KANNER, 1984; FARR, et al. 1988;
66
SHEABAR e NEEMAN 1988; ZHAO, et al. 1989; NAMIKI 1990; PRATT
e HUDSON 1990; LOLIGER 1991 e KANNER, et al., 1994).
Alguns fatores externos como a poluição, fumo, álcool, sol
em excesso, distúrbios de sono, stress, drogas, alterações constantes
do peso, excesso de atividade física, entre outros, contribuem para o
aumento de radicais livres e alterações da aparência da pele. Para
combater os radicais livres, a ingestão de alimentos antioxidantes é
fundamental, pois ajuda a diminuir o seu efeito, e aparentemente,
retarda o processo de envelhecimento precoce.
1.2.5. O Escape Vascular
Como dissemos anteriormente, entende-se por escape
vascular (EV) a reversão da resposta pressora vascular, mesmo
mantido o estímulo vasoconstritor. Muitos estudos foram feitos na
tentativa de desvendar seu(s) mecanismo(s). Todavia, trata-se ainda
de um tema não esclarecido. Dentre as hipóteses propostas para
explicá-lo, podemos citar:
67
a) Redistribuição do fluxo sangüíneo para outros leitos, principalmente
no leito mesentérico, através das anastomoses árterio-venosas
(FOLKOW, 1964).
b) Dilatação das arteríolas (SCANVIK, 1973); posteriormente, essa
hipótese foi contestada por RICHARDSON e JOHNSON, 1969;
FARA e ROSS, 1972 e GUTH e SMITH, 1976, cujos trabalhos, em
conjunto, demonstraram que o fenômeno ocorria tanto por estímulo
ganglionar como por agentes vasoconstritores.
c) Uma depleção dos neurotransmissores ou uma falência na
transmissão (JOHNSON, et al., 1970). Diversos estudos
enfraqueceram esta teoria. Vejamos: o escape ocorre mesmo em
estimulação de baixa freqüência, o que dificilmente esgotaria as
reservas de NOR. Alguns vasos sequer exibem escape. Para a
teoria de a fadiga neuronal explicar esse padrão de resposta da
microvasculatura, a depleção de neurotransmissores deveria
ocorrer seletivamente na proximidade dos vasos de resistência,
mas não em outros microvasos. O escape não pode ser
considerado como uma fadiga induzida por métodos artificiais, já
que estímulos fisiológicos também promovem esse fenômeno.
Quarto, o fato do aumento da freqüência de estimulação após o
68
escape ter ocorrido causa vasoconstricção, indicando que
neurotransmissor adicional pode existir. Finalmente, ocorre escape
mesmo quando a NOR é infundida por via endovenosa e
constantemente.
d) Distribuição seletiva das fibras adrenérgicas vasoconstrictoras, o
que envolveria os receptores α-adrenérgicos (DRESSEL e
VALLENTIN, 1966). Todavia, ROSS, 1971, sugeriu que o fenômeno
de EV relaciona-se mais à natureza do agente vasopressor, não à
distribuição dos receptores adrenérgicos.
e) Efeito mediado por receptores β-adrenérgicos. No entanto, vários
pesquisadores descartaram esta hipótese (HEINRICH, et al., 1974;
SINGBARTL e HENRICH, 1974 e GREENWAY, et al., 1976).
Ademais, demonstrou-se a ocorrência de EV com agente não-
adrenérgico, no caso angiotensina II (FIGUEIREDO, 1995).
Como se vê, trata-se fenômeno complexo, cuja natureza os
estudos realizados nas últimas quatro décadas têm, cada vez mais,
demonstrado ser multifatorial. De fato, inúmeras foram as tentativas
para a explicação do EV. Entretanto, seu mecanismo preciso ainda
69
permanece desconhecido. Alguns autores sugerem o envolvimento da
liberação de mediadores vasodilatadores ainda não identificados,
secundários à estimulação nervosa simpática, ou à administração de
substâncias vasoconstritoras (RICHARDSON e JOHNSON, 1969;
FONTELES et al., 1974; FERREIRA e FONTELES, 1988).
Diversos experimentos controlados procuram analisar o efeito
sobre o EV de variáveis isoladas como, por exemplo, a temperatura. A
influência da temperatura neste processo foi demonstrada por
FONTELES, et al., 1974, em rins isolados de coelho, que observou
uma maior intensidade de escape na temperatura do banho de infusão
de 25ºC quando comparada a 35ºC.
Estudos com leito renal de ratos hiper e normotensos
também demonstraram a ocorrência de EV, embora no grupo dos
animais hipertensos esse fenômeno tenha ocorrido com menor
intensidade (FONTELES e JESKE, 1976).
Em 1989, REMARK, et al., propuseram uma explicação para
o EV na circulação intestinal - vasodilatadores seriam secretados por
neurônios. O escape induzido pela estimulação simpática na
circulação intestinal de rato foi significativamente inibido pelo
70
tratamento prévio com capsaicina na vida neonatal, pela sua aplicação
aguda em nervos periarteriais e por sua injeção aguda no lúmen
jejunal. De acordo com essa teoria, a vasoconstrição levaria a um
estado de hipóxia, com a formação de metabólitos locais e de outros
fatores alterados pela má perfusão tecidual. Em resposta, a ativação
de mecanoceptores e quimioceptores - através de reflexos axônicos -
poderia estimular fibras sensitivas a liberarem substâncias
vasodilatadores. Estudos de OHYANAJR, et al., 1991, apoiaram essa
tese.
Outras linhas de pesquisa sugerem que o EV é o resultado
da competição entre mecanismos locais e neuronais. Por exemplo,
cogitou-se a hipótese de o receptor α
2
ser o sítio específico no qual a
competição anteriormente citada ocorre (FABER, 1988). Deveras, o
bloqueio do receptor α
2
aumentou a capacidade da circulação
intestinal de cães de escaparem da estimulação simpática; e o
percentual de escape foi significativamente aumentado pela ioimbina
(CHEN, et al., 1991).
Em 1972, foi iniciada a averiguação do papel das
prostaglandinas no fenômeno de EV (McGIFF, et al.). A infusão de
NOR em rins de cão promovia, inicialmente, uma redução do fluxo
71
sangüíneo renal; curiosamente, ocorria, a seguir, um aumento do fluxo.
Paralelamente a essa elevação do fluxo, foi observado um aumento na
concentração sangüínea de prostaglandinas. Observou-se ainda que,
na ausência do escape, não havia alterações na concentração de
prostaglandinas no sangue venoso. Trabalhos com rins isolados de
coelho demonstraram que um inibidor de cicloxigenases (COX) – a
indometacina - promovia uma redução na intensidade de EV. Como as
prostaglandinas dependem da ação destas enzimas para serem
formadas, este resultado sugere a participação destes eicosanóides na
regulação da PA durante o EV (FONTELES, et al., 1974).
Experimentos posteriores confirmaram essa hipótese (FONTELES e
MOREIRA LIMA, 1984; FONTELES e FORTI, 1993).
Outro composto avaliado em rins isolados de coelho foi o
fator de agregação plaquetária (PAF), tendo sido demonstrado o
relevante papel do PAF endógeno nos processo vasoativos e
hemodinâmicos, incluindo o EV. Todavia, o PAF exogenamente
administrado mostrou-se completamente ineficaz (FERREIRA, et al.,
1989).
O controle local, principalmente através do endotélio
vascular, representa um importante mecanismo de controle do fluxo e
72
da pressão sangüínea (COWLEY, 1992). Certos metabólitos liberados
pelos tecidos em determinadas condições fisiológicas podem agir
como mediadores da vasodilatação. Entre estas condições, podemos
citar a hipóxia e a tensão de cisalhamento, pois ambos são potentes
indutores da liberação de óxido nítrico (NO), sendo considerados os
sinais fisiológicos mais importantes de vasodilatação endotélio
dependente (ALMEIDA, et al., 1993).
Outro fator local apontado na participação da vasodilatação
observada no EV é o pH tecidual – expresso pela concentração
plasmática de íons H
+
. Segundo uma teoria, a vasodilatação inicial
induzida pelo agente vasopressor ou estimulação ganglionar levaria a
um acúmulo de metabólitos ácidos e, conseqüentemente, a uma
acidose local que, por sua vez, promoveria uma inibição dos
receptores α
2
pós-sinápticos e, conseqüentemente, uma redução na
eficácia da noradrenalina em deflagrar a contração do músculo liso
vascular. Por essa razão, os níveis de pressão iniciais não poderiam
ser mantidos, resultando no EV (CHEN e SHEPHERD, 1991).
O NO também foi objeto de interesse no estudo do EV. Um
experimento no qual foram utilizados inibidores de NOS (análogos da
L-arginina) demonstrou a inibição do escape observado no leito
73
hepático de ratos induzido por etanol (OSHITA, et al., 1993). Todavia,
um estudo posterior com ratos anestesiados não confirmou esse
resultado, ainda que o uso de L-nitro-arginina (L-NA) tenha promovido
certas alterações na cinética do escape (FIGUEIREDO, 1995).
Outros experimentos demonstraram que o seccionamento
bilateral do nervo vago intensificava o fenômeno de EV, ao passo que
o pré-tratamento com reserpina ou indometacina retardavam o início
do fenômeno. Por outro lado, os animais que receberam guanetidina e
a L-nitro-arginina antes do experimento apresentaram uma menor
velocidade para atingir a PA mínima após a máxima ter sido registrada
(FIGUEIREDO, 1995).
1.2.6 A hipotermia
As constatações de que a hipotermia sem formação de gelo
reduz a demanda metabólica das células e retarda ou previne a morte
celular despertou o interesse dos pesquisadores e fomentou o
emprego desse recurso na clínica e no laboratório (BELZER e
SOUTHARD, 1986; RATYCH, et al., 1986). Todavia, temperaturas
hipotérmicas – com ou sem formação de gelo – também podem
resultar em morte celular (MACLEAN e EMSLIE-SMITH, 1997). O
74
resfriamento local de um vaso sanguíneo resulta em uma redução do
fluxo em razão de dois fatores associados: aumento da viscosidade do
sangue e vasoconstrição local (KILLIAN, 1981; KULKA, 1961;
LAPRELL-MOSCHNER, et al., 1983). A estase intravascular pode
desenvolver-se, levando a uma anóxia tecidual (LAPRELL-
MOSCHNER, et al., 1983) e acidose metabólica (MACLEAN e
EMSLIE-SMITH, 1997). A situação pode se agravar pela formação de
gelo extracelular, o qual danifica a camada íntima dos vasos
sanguíneos e, em particular, leva a uma perda da integridade do
endotélio (BOWERS, et al., 1973; RABB, et al., 1974). Além disso, o
gelo extracelular pode induzir edema tecidual. A perda do controle
endotelial e o edema comprometem a habilidade do corpo de ‘reabrir’ a
microvasculatura, levando a isquemia e morte celular.
A exposição a temperaturas relativamente baixas altera as
características fisiológicas e bioquímicas das células, com perda de
gradientes transmembrana de íons e barreiras funcionais de
membrana, bem como a ativação de fosfolipases (HOCHACHKA,
1986; KANNAGI e KOIZUMI, 1979). Alguns relatos têm sugerido que a
injúria ao órgão após o resfriamento pode ser atribuída a danos ao
endotélio e à parede do vaso, induzidos pela hipotermia.
75
Há uma série de alterações celulares associadas à
fisiopatologia das injúrias induzidas pela hipotermia nas células
endoteliais HOCHACHKA (1986) sugeriu que, a baixas temperaturas,
há uma perda de energia celular e as bombas de íons transmembrana
tornam-se inativas. O resultado é uma substancial mudança nas
concentrações iônicas intracelulares. Uma elevação no cálcio
citossólico poderia resultar em ruptura do citoesqueleto e ativação de
fosfolipases, proteases e endonucleases (ORRENIUS, et al., 1989;
NICOTERA e ORRENIUS,1992), comprometendo as funções da
membrana e das organelas. Células endoteliais resfriadas até 22
o
C e
estimuladas com bradicinina mostram uma concentração intracelular
de cálcio significativamente mais alta do que quando se encontram a
37
o
C (WANG, et al., 1993). Em contraste, a concentração basal não
estimulada permanece inalterada. Uma mudança na concentração
intracelular de cálcio, por sua vez, pode ocasionar a rápida liberação
das reservas internas desse íon (RITTENHOUSE-SIMMONS, et al.,
1979; BALLOU, et al., 1986; REHFELDT, et al., 1993).
O resfriamento não somente altera as funções da membrana
celular, mas também está associado a mudanças físicas na
membrana. Em geral, as membranas celulares em normotermia
encontram-se em um estado líquido cristalino e, sob hipotermia,
76
passam por uma transição para fase gel (CROWE, et al., 1989;
QUINN, 1985). Estudos mostraram que quanto maior a temperatura da
fase de transição da membrana, maior a sensibilidade da célula ao
resfriamento (HANSEN, 1993; PARKS, et al., 1992). Além disso,
experimentos com diversos tipos celulares demonstraram que a injúria
induzida pelo resfriamento é bifásica, relacionada à temperatura de
fase de transição (KRUUV, et al., 1983 e 1985). Por exemplo, as
células endoteliais da veia umbilical humana têm fase de transição de
membrana a 15,9
o
C. A incubação de células a 23
o
C resultou em
uma linear e gradual decréscimo das células sobreviventes ao longo
do tempo, fenômeno não notado a 4
o
C (HANSEN, 1994).
As alterações celulares associadas à exposição de células
endoteliais à hipotermia incluem: perda de energia, inibição de bomba
de membrana, mudanças nas concentrações citossólicas de íons,
ativação de enzimas, ruptura de citoesqueleto, formação de radicais
livres, deformação e morte celular.
77
2. OBJETIVOS
O presente experimento tempo por objetivos avaliar a reação do
leito vascular renal de coelhos à infusão de noradrenalina (NOR), sendo os
rins perfundidos em diferentes condições e tratamentos, a saber:
I. em situação de normalidade (grupo controle);
II. sob hipotermia (25
o
C);
III. adicionando-se bloqueadores de NOS (D-arginina, L-NMA e
L-nitro-arginina);
IV. adicionando-se substrato para a via do NO (L-arginina); em
diferentes condições metabólicas (diabetes aloxânico);
V. adicionando-se GSH (a rins isolados de animais diabéticos);
VI. adicionando-se rutina (a rins isolados de animais
diabéticos).
Os parâmetros utilizados são: pressões basal e máxima em cada
curva, escape vascular, incremento pressórico relativo e taquifilaxia.
78
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Coelhos Califórnia, de ambos os sexos, provenientes da
Cunicultura do Departamento de Zootecnia da Universidade Federal do
Ceará, pesando em média 1,5 kg , foram mantidos em jejum alimentar e
com livre ingestão de água nas 24 horas prévias aos experimentos
realizados no Laboratório de Farmacologia Renal e Metabólica da Unidade
de Pesquisas Clínicas da Faculdade de Medicina da UFC. O diabetes foi
induzido por meio de aloxana IP (150mg/kg) e os animais foram usados
após a terceira semana, com níveis de glicemia iguais ou acima de
200mg%. Os animais foram anestesiados com injeção intraperitoneal de
uretana (1200 mg/kg) e pentobarbital (40mg/kg de peso), administrada por
injeção intramuscular no membro inferior. Por meio de uma incisão
abdominal mediana – indo do processo xifóide até a região púbica –
obtinha-se o acesso ao interior da cavidade abdominal. Uma vez expostas,
as vísceras eram rebatidas para a direita, expondo o rim esquerdo, o
primeiro a ser removido. Após limpeza cuidadosa da gordura perirrenal,
eram expostos e identificados os vasos renais, realizando a amarra da
artéria renal próximo à aorta abdominal. A seguir, artéria e veia renais eram,
em conjunto, bloqueadas com pinça hemostática. Para remover o rim,
seccionava-se a veia renal junto à pelve renal e o ureter, em seu terço-
médio. O rim era então colocado em uma placa de Petri contendo solução
79
de Krebs-Henseleit (KH) (KREBS e HENSELEIT, 1932) e procedia-se à
canulação arterial com tubo de polietileno PE 50. Iniciava-se, de imediato, a
infusão com solução de KH, ao mesmo tempo em que o ureter era também
canulado com tubo de polietileno. Na seqüência, o órgão era levado ao
sistema onde recebia solução de KH com pH entre 7.35 e 7.40, aerado com
mistura de 95% de O
2
e 5% de CO
2
, com temperatura média de 37ºC,
decorridos, em média, 5 minutos desde a canulação da artéria renal.
Mantendo-se o animal anestesiado, procedia-se à retirada do rim direito
após cerca de 120 minutos, seguindo-se os mesmos tempos cirúrgicos já
descritos. Em nenhum grupo se removeu a cápsula renal.
3.1. Sistema de perfusão
O sistema de perfusão adotado é o mesmo descrito por
FONTELES, et al. (1973), e sua principal característica é a de ser aberto,
utilizando o perfusato sem recirculação. Esquematicamente, o sistema é
composto por:
a. Bomba peristáltica marca Watson-Marlow, previamente calibrada para
perfusão de 4,0 ml/minuto;
80
b. Membrana silástica Travenol para oxigenação, acoplada à bomba de
perfusão e por onde circula o perfusato aerado, com pH final entre 7,2
- 7,4;
c. Sistema de aquecimento composto por termostato com temperatura
mantida em 37 +/- 1ºC;
d. Bomba de Infusão Imbracrios, calibrada para infusão de 0,1ml/minuto;
e. Manômetro para registro das variações na pressão de perfusão.
f. Sistema para captação de bolhas.
3.2. Medidas fisiológicas
Foram estudadas as seguintes medidas da dinâmica de perfusão renal:
a. Pressão de Perfusão (PP): refere-se à pressão existente em todo o
leito vascular renal, e registrada a intervalos de 5 minutos ao longo de
todo o experimento. É medida por manômetro e expressa em mmHg.
81
b. Escape vascular (EV): Consideramos haver presença de escape
renovascular quando, à pressão máxima obtida com a infusão contínua
de noradrenalina (NOR), registrava-se decréscimo da pressão de
perfusão, independentemente de situarem-se os valores mínimos ao final
do período de infusão do α agonista. O escape foi calculado segundo
HENRICH e LUTZ (1971), FARA e ROSS (1972), adaptado por
FONTELES, et al., (1974), sendo expresso em porcentagem de acordo
com o que segue:
Onde:
P
máx
- pressão de perfusão máxima obtida após a infusão da substância
vasoconstritora, antes do escape;
P
mín
- pressão de perfusão mínima observada durante a infusão de
NOR, após o escape;
P
i
é a pressão de perfusão registrada imediatamente antes da infusão
do α agonista.
c. Incremento pressórico máximo: expressa a relação entre a variação
máxima de pressão após a infusão de NOR e a pressão obtida
imediatamente antes da infusão. A fórmula matemática é:
82
Os parâmetros são os mesmos do item anterior.
d. Taquifilaxia: segundo a observação gráfica, as curvas de infusão de NOR
caracterizam-se por uma tendência à queda dos valores pressóricos
máximos, ao longo de todo o experimento. Assim, a observação de três
curvas de infusão de NOR, intercaladas por períodos de lavagem da
preparação, mostra uma tendência ao decaimento dos níveis
pressóricos. Não há expressões matemáticas para a medida da
taquifilaxia. Medimo-la pela comparação entre os pontos máximos das
diferentes curvas.
3.3. Protocolo de perfusão
Logo após a colocação no sistema, o rim era perfundido com
solução KH (mM/L: NaCl 120, KCl 3, MgSO
4
.7H
2
O 0.62, NaH
2
PO
4
.H
2
O 14,
NaHCO
3
25, CaCl
2
.2H
2
O 2, glicose 8), tendo os tempos experimentais sido
divididos em:
83
a. Período de Controle (20 minutos): necessário à lavagem do leito
vascular renal, retirada de restos sangüíneos e estabilização da pressão
de perfusão;
b. Períodos de Infusão de Noradrenalina (20 minutos): compostos de
três etapas de infusão de NOR 10
-6
M a uma vazão de 4 ml/min, iniciada
a primeira imediatamente após o período de controle;
c. Períodos de Lavagem (10 minutos cada): lavagem com líquido de
perfusato, intercalada aos períodos de infusão de NOR.
Todas as substâncias estudadas foram adicionadas à solução de
KH. Os grupos de estudo foram assim divididos:
a. Grupo controle (n = 20)
b. Estudo com hipotermia – 25
o
C (n = 7)
c. Estudo com arginina (n = 12 )
c.1. Perfusato adicionado de L-arginina 1 µM (n = 6)
c.2. Perfusato adicionado de D-arginina 1 µM (n = 6)
d. Estudo com bloqueadores de NOS (n = 15)
d.1. Perfusato com Nitro-L-arginina 10 µM (n = 11)
84
d.2. Perfusato com L-NMA 10 µM (n = 4)
e. Estudo com diabetes aloxânico e antioxidantes (n = 17)
e.1. Perfusato convencional (n = 7)
e.2. Perfusato com GSH 1 µM (n = 5)
e.3. Perfusato com rutina 1 µM (n= 5 )
85
3.4. Produtos químicos
a. Reagentes utilizados no preparo da solução de Krebs-Henseleit: NaCl,
KCl, NaHCO
3
, MgSO
4
, NaH
2
PO
4
, CaCl
2
, Glicose (Merck).
b. Reagentes utilizados no preparo da solução vasoconstrictora: Bitartarato
de Noradrenalina, Ácido Ascórbico (Sigma).
c. Anestésicos: uretana e pentobarbital sódico (Merck).
d. Substrato para a via do NO: L-arginina (Sigma).
e. Bloqueadores de NOS: Nitro-L-arginina, LMNA e D-arginina (Sigma).
3.5. Análise Estatística
Os dados foram submetidos à análise estatística em computador
PC com programa Graphpad Prism, versão 3.0. Calcularam-se, para todos
os dados, a média e o erro padrão da média. Para as análises
comparativas utilizaram-se os seguintes métodos: ANOVA (teste de Tukey
para comparação múltipla) e testes ‘t’ pareados e não pareados, com um
nível de confiança de 95%.
86
Os efeitos dos vários tratamentos sobre a fisiologia renal foram
estudados através de análise de variância para comparação de valores
referentes às pressões basais e máximas de perfusão, bem como escape
vascular e incremento pressórico relativo, nas diversas fases do
experimento correspondentes à infusão de noradrenalina (NOR).
87
4. RESULTADOS
O aspecto geral das curvas pode ser dividido em quatro fases: I –
um platô de estabilização, durante os 20 min de lavagem; II – uma súbita e
acentuada elevação da pressão de perfusão, a partir da infusão de NOR; II
– um trecho em que o incremento pressórico diminui rapidamente, tendendo
a um platô e, finalmente, IV – uma redução da pressão, mesmo mantida a
infusão de NOR (escape vascular). Todavia, a variação individual pode ser
acentuada – por exemplo, em algumas curvas não se observa o fenômeno
de escape, o mesmo ocorrendo com a taquifilaxia, fatos esses já descritos
por vários autores. Ademais, a hipotermia, o bloqueio de NOS e o diabetes
aloxânico têm pronunciados efeitos sobre as pressões basais e máximas,
influindo também na ocorrência de escape e taquifilaxia. Analisemos, agora,
o comportamento das curvas em cada grupo:
4.1. Grupo Controle
Os valores pressóricos das três curvas de pressão arteriolar renal dos vinte
animais do grupo controle estão representados – ao lado do grupo dos
diabéticos – na tabela 1 e gráfico 1. Esses apresentaram pressão basal
média de 62.88 +
2.29 mmHg (tabela 3 e gráfico 3) e pressão máxima
média de 152.25 +
10.02 mmHg (tabela 4 e gráfico 4). Além disso, o grupo,
88
como um todo, registrou um EV de 11.95 + 2.43 %. Dos 20 rins perfundidos,
apenas 4 (20%) não apresentaram escape e, caso fossem excluídos, o
valor médio subiria para 14.93 +
2.53 %. O incremento pressórico do grupo
foi de 148.42 +
17.43 %. As pressões máximas atingidas em cada uma das
três curvas de infusão de NOR – 152.25 +
10.02, 146.85 + 9.19 e 142.10 +
7.56 mmHg – mostram uma tendência à taquifilaxia. Todavia, a comparação
desses valores por teste ‘t’ pareado não atingiu o nível de confiança de
95%.
4.2 Diabéticos não tratados e tratados
O diabetes aloxânico produziu importantes alterações na resposta
do leito arteriolar renal durante as três sessões de infusão de NOR: curvas
mais íngremes e valores mais elevados em comparação com o grupo de
animais normoglicêmicos (tabela 1 e gráfico 1). Por outro lado, os
tratamentos com GSH (1µΜ) e rutina (1µΜ) influem no aspecto das curvas:
no primeiro, embora haja um aumento na velocidade de elevação da
pressão - tanto em relação ao grupo controle como ao próprio diabético -,
observa-se uma redução nos valores máximos atingidos, acompanhada de
uma recuperação do escape; no segundo, vê-se um aumento na resposta
vascular à NOR, com incremento na inclinação da curva de pressão, a qual
89
atinge valores mais altos que os dos grupos controle e diabéticos não
tratados, embora também haja uma recuperação do escape (tabela 2 e
gráfico 2). As pressões de perfusão, tanto basais (tabela 3 e gráfico 3) como
máximas (tabela 4 e gráfico 4), mostraram-se muito elevadas no grupo de
diabéticos, bem superiores às do grupo controle (chegando à ordem de 50%
para a máxima, com p<0.01, e 46% para a mínima, com p<0.001). Ademais,
o grupo dos diabéticos mostrou uma grande redução no escape vascular –
da ordem de 90% - em relação ao grupo controle (tabela 5 e gráfico 5). De 7
rins perfundidos, 4 (57%) não apresentaram escape e, caso fossem
excluídos, o valor médio subiria de 1.33 +
0.88 % para 3,11 + 1,64 %, ainda
bem inferior ao do grupo normoglicêmico.
Os tratamentos com GSH e rutina elevam o escape para níveis
intermediários entre os animais diabéticos não tratados e os
normoglicêmicos, sendo estatisticamente indistinguíveis desses últimos
(tabela 5 e gráfico 5). Por outro lado, os incrementos pressóricos relativos
nos grupos dos diabéticos – não tratados e tratados - são estatisticamente
indistinguíveis daquele do grupo normoglicêmico (tabela 6 e gráfico 6).
90
Tabela 1. Pressões de perfusão de rins isolados de coelhos normais e
diabéticos submetidos a três infusões de noradrenalina (valores medidos a
cada 5 min).
Pressões de Perfusão (mmHg)
Normoglicêmicos (n = 20) Diabéticos (n = 7)
C1
C2
C3
C1
C2
C3
63,15 + 2,24 65,10+ 2,35 64,45 + 2,18 98,57 + 5,70 # 90,85 + 5,75 # 81,42 + 7,40
63,35 + 2,25 65,00 + 2,58 65,15 + 2,75 97,71 + 5,92# 92,28 + 5,99 # 82,57 + 7,50*
62,15 + 2,50 64,30 + 2,90 64,40 + 3,20 98,00 + 5,58 # 91,14 + 5,88 # 83,42 + 8,34*
122,80 + 9,83 132,25 + 8,81 133,55 + 7,39 157,42+ 6,52 188,00 +6,45 ** 181,14 + 5,27*
146,85 + 9,79 139,95 + 8,22 138,15 + 7,40 201,42+ 3,22 206,85 + 7,28 # 208,57 + 5,75 #
146,15 + 9,88 143,50 + 8,98 136,90 + 7,52 208,57+13,77* 204,57 + 7,19** 210,00 + 5,58 #
143,40 + 9,57 140,05 + 8,26 135,90 + 7,78 209,71+11,79**
204,00 +
7,80**
207,71 +
6,08 #
*p<0.05; **p<0.01; #p<0.001, (ANOVA, teste de Tukey)
Nota: estão representados as médias e os erros padrões das médias
91
0 25 50 75 100 125 150
0
50
100
150
200
250
Normoglicêmicos
Tempo (min)
Diabéticos
*
**
#
##
****
**
#
#
#
#
*
#
#
#
*
*
Pressão de Perfusão
(mmHg)
Gráfico 1. Pressões de perfusão em rim isolado de coelho a partir dos
grupos controle (euglicêmicos) e diabéticos. Efeitos da NOR infundida três
vezes por 20 min, com intervalos de 20 min para lavagem. Nos animais
diabéticos, as pressões basais e máximas estão bastante elevadas e as
curvas apresentam maior inclinação. Além disso, nos animais normais - ao
contrário dos diabéticos - é perceptível o fenômeno de taquifilaxia. *p<0.05;
**p<0.01; #p<0.001 (ANOVA, teste de Tukey)
Nota: estão representados as médias e os erros padrões das médias.
92
Tabela 2. Pressões de perfusão pela infusão contínua de GSH em leito
arteriolar de rins isolados de coelhos normoglicêmicos e com diabetes
aloxânico não tratados e tratados com GSH 1µΜ e rutina 1µΜ (valores
medidos a cada 5 min).
Pressões de Perfusão
(mmHg
Normoglicêmicos
(n = 20)
Diabéticos
(n = 7)
Diabéticos+GSH
(n = 5)
Diabéticos+Rutina
(n = 5)
63,15 + 2,24 98,57 + 5,70 79,20 + 6,77 105,60 + 2,92
63,35 + 2,25 97,71 + 5,92 78,00 + 7,48 105,60 + 2,92
62,15 + 2,50 98,00 + 5,58 80,40 + 7,98 104,80 + 2,80
122,80 + 9,83 157,42 + 6,52 183,60 + 10,77 222,80 + 8,73 ***
146,85 + 9,79 201,42 + 13,22 * 204,00 + 12,55 * 245,60 + 8,49 ***
146,15 + 9,88 208,57 + 13,77 * 199,20 + 10,30 * 243,20 + 3,26 ***
143,40 + 9,57 209,71 + 11,79 * 200,80 + 10,89 * 236,00 + 3,84 ***
*
p<0.05; ***p<0.0001 (Testes ‘t’ não pareados)
Nota: estão representados as médias e os erros padrões das médias.
93
0 10 20 30 40
0
50
100
150
200
250
300
Normoglicêmicos
Diabéticos
Diab+rutina
Diab+GSH
Tempo (min)
Pressão de Perfusão
(mmHg)
*
*
*
***
***
***
***
Gráfico 2. Comparação entre as pressões de perfusão em leito arteriolar
de rins isolados de coelhos e submetidos a infusão de NOR. Foram usados
animais normoglicêmicos e diabéticos não tratados e tratados com GSH
(1µM) e rutina (1µM). Os diabéticos não tratados apresentam pressões
basal e máxima superiores às dos normoglicêmicos, além de um prejuízo no
escape. O tratamento com GSH parece reduzir as pressões basal e máxima
dos diabéticos, além de exibir recuperação no escape. Todavia, o
tratamento com rutina não altera significativamente as pressões basais do
grupo diabético, mas aumenta a reatividade vascular noradrenérgica e o
escape. *P<0.05; ***P<0.0001 (Testes ‘T’ não pareados em relação ao
grupo normoglicêmico)
Nota: estão representados as médias e os erros padrões das médias.
94
Tabela 3. Pressões basais de perfusão pela infusão contínua de NOR em
leito arteriolar de rins isolados de coelhos normoglicêmicos e com diabetes
aloxânico, não tratados e tratados com GSH (1µΜ) e rutina (1µΜ).
Pressões Basais (mmHg)
Normoglicêmicos
(n = 20)
Diabéticos**
(n = 7)
Diabéticos + GSH*
(n = 5)
Diabéticos + Rutina**
(n = 5)
62.88 + 2.29 98,09 + 5,69** 79,20 + 7,38* 105,20 + 2,76**
* P < 0,05 em relação ao grupo normoglicêmico (ANOVA, teste deTukey)
** P < 0,001 em relação ao grupo normoglicêmico (ANOVA, teste de Tukey)
Nota: estão representados as médias (dos valores medidos em t
0
, t
5
e t
10
) e os erros padrões das
médias.
95
Gráfico 3. Comparação entre as pressões basais do leito arteriolar de rins
isolados de coelhos quando submetidos a infusão de NOR. Utilizou-se um
sistema de perfusão aberto com solução de Krebs-Henseleit. Constata-se
que os níveis pressóricos basais acham-se elevados nos animais diabéticos
em relação aos normoglicêmicos, sendo que o tratamento com glutationa
reduzida (GSH) reduz parcialmente esse efeito, ao passo que a rutina
provoca um ligeiro aumento. *p<0.05 em relação ao grupo normoglicêmico
**p<0.001 em relação ao grupo normoglicêmico (ANOVA, teste de Tukey)
Nota: estão representados as médias
(dos valores medidos em t
0
, t
5
e t
10
)
e os
erros padrões das médias
.
96
Tabela 4. Pressões máximas de perfusão pela infusão contínua de GSH em
leito arteriolar de rins isolados de coelhos normoglicêmicos e com diabetes
aloxânico, não tratados e tratados com GSH (1µΜ) e rutina (1µΜ).
Pressões Máximas (mmHg)
Normoglicêmicos
(n=20)
Diabéticos**
(n=7)
Diabéticos + GSH*
(n=5)
Diabéticos + Rutina***
(n=5)
152.25 + 10.02
211,71 + 12,92
207,20 + 11,46
249,60 + 4,57
* P < 0,05 em relação ao grupo normoglicêmicos (ANOVA,Tukey's test)
** P < 0,01 em relação ao grupo normoglicêmicos (ANOVA,Tukey's test)
*** P < 0,001 em relação ao grupo normoglicêmicos (ANOVA,Tukey's test)
Nota: estão representados as médias e os erros padrões das médias.
97
Gráfico 4. Comparação entre as pressões máximas de perfusão no leito
arteriolar de rins isolados de coelhos, quando submetidos a infusão de
NOR. A perfusão foi realizada em sistema aberto, com solução de Krebs-
Henseleit. Em todos os grupos de animais diabéticos - inclusive naqueles
tratados com glutationa reduzida (GSH) e rutina -, a pressão máxima
atingida é superior à do grupo de euglicêmicos. Todavia, o tratamento com
GSH provoca pequena redução em relação aos diabéticos não tratados.
*p<0.05 em relação ao grupo normoglicêmico **p<0.01 em relação ao grupo
normoglicêmico. ***p<0.001 em relação ao grupo normoglicêmico
Nota: estão representados as médias e os erros padrões das médias.
98
Tabela 5. Escape vascular após infusão contínua de GSH em leito arteriolar
de rins isolados de coelhos normoglicêmicos e com diabetes aloxânicos,
não tratados e tratados com GSH (1µM) e rutina (1µM).
Escape Vascular (%)
Normoglicêmicos
(n=20)
Diabéticos*
(n=7)
Diabéticos + GSH
(n=5)
Diabéticos + Rutina
(n=5)
11,95 + 2,43
1,33 + 0,88
5,95 + 2,67
9,33 + 1,33
* P < 0,05 em relação ao grupo normoglicêmico (Teste ‘t’ não pareado)
Nota: estão representados as médias e os erros padrões das médias.
99
Gráfico 5. Comparação entre os escapes vasculares do leito arteriolar renal
de coelhos normoglicêmicos e com diabetes aloxânico, após infusão de
NOR nos rins isolados e perfundidos em sistema aberto, com solução de
Krebs-Henseleit. Durante a perfusão, percebeu-se uma drástica redução do
escape nos animais diabéticos em relação aos normoglicêmicos. Por outro
lado, os tratamentos com glutationa reduzida (GSH) e rutina, ambas a 1µM,
elevaram os escapes para níveis estatisticamente indistinguíveis daqueles
do grupo normoglicêmico (embora o tratamento com rutina pareça
intensificar o escape mais do que o tratamento com GSH). No grupo
normoglicêmico, 80% dos rins perfundidos apresentaram escape, ao passo
que, no grupo diabético, apenas 43%. *p<0.05 em relação ao grupo
normoglicêmico (teste ‘t’ não pareado)
Nota: estão representados as médias e os erros padrões das médias.
100
Tabela 6. Incremento pressórico após infusão contínua de GSH em leito
arteriolar de rins isolados de coelhos normoglicêmicos e com diabetes
aloxânico, não tratados e tratados com GSH (1µM) e rutina (1µM).
Incremento Pressórico
(%)
Normoglicêmicos
(n=20)
Diabéticos
(n=7)
Diabéticos + GSH
(n=5)
Diabéticos + Rutina
(n=5)
148,42 + 17,43 119,13 + 15,08 165,52 + 22,90 139,20 + 9,92
Nota: estão representados as médias e os erros padrões das médias; nenhum grupo apresentou
diferença estatisticamente significativa em relação ao controle.
101
Gráfico 6. Comparação entre os incrementos pressóricos do leito arteriolar
renal de coelhos normoglicêmicos e diabéticos, após infusão de NOR nos
rins isolados. Utilizou-se solução de Krebs-Henseleit em sistema de aberto
de perfusão. Nos animais diabéticos, estando os níveis basais aumentados,
observa-se uma redução no incremento pressórico relativo. Os tratamentos
com GSH (1µM) e rutina (1µM) parecem restaurá-lo. No entanto, os dados
não atingiram o nível de confiança de 95% (ANOVA). Incremento
Pressórico= (Pmax - Pbas).100/Pbas
Os resultados estão representados em médias e os erros padrões das
médias.
102
4.3. Bloqueio de NOS e Hipotermia
Os tratamentos com L-arginina ou seus análogos resultaram em
alterações significativas nas pressões de perfusão em relação ao grupo
controle. O grupo da L-arginina (1µΜ) mostrou uma curva pressórica mais
lenta, com uma discreta tendência à redução dos valores basais (11%) e
uma acentuada redução dos valores máximos (47%), em relação aos do
grupo controle (tabelas 7,8 e 9; gráficos 7,8 e 9), tendo essa última marca
atingido nível de significância de 99% em relação ao controle (p<0,01).
Todavia, o tratamento com D-arginina (1µΜ) exibiu resultados opostos –
uma curva íngreme, com pressões basais superiores (30%) e pressões
máximas mais elevadas (25%) do que as do grupo controle (tabelas 7,8 e 9;
gráficos 7,8 e 9). O grupo tratado com L-NMA (10µΜ) mostrou significância
estatística (p<0,01) em relação ao controle, registrando um aumento de
cerca de 44% na pressão máxima média (tabela 9 e gráfico 9). No entanto,
tal tratamento não afetou significativamente as pressões basais (tabela 8 e
gráfico 8). Por sua vez, o grupo tratado com L-nitro-arginina (10µΜ)
registrou uma elevação de cerca de 40% na pressão basal em relação ao
controle (p<0,001;tabela 8 e gráfico 8). Todos os tratamentos com análogos
da L-arginina mostraram uma tendência de redução do escape vascular, ao
passo que o grupo da própria L-arginina mostrou tendência à elevação
desse parâmetro (tabela 10 e gráfico 10). Todavia, nenhum desses grupos
103
atingiu a significância estatística de 95%. Quanto ao incremento pressórico
relativo, apenas o grupo tratado com L-arginina atingiu o nível de confiança
desejado (p<0,01), mostrando uma redução de cerca de 70% (tabela 11 e
gráfico 11). Os análogos da L-arginina mostraram ora elevação ora redução
do incremento, mas sem significância estatística.
No corrente estudo, a perfusão de rins isolados de coelhos sob
hipotermia constante (25
o
C) produziu, em relação ao grupo controle,
elevação das pressões basais - da ordem de 12% - e máximas – da ordem
de 18% - (tabelas 8 e 9; gráficos 8 e 9), bem como redução de cerca de
45% no escape (tabela 10 e gráfico 10). Todavia, esses resultados precisam
ser encarados com reserva, já que não alcançaram significância estatística
de 95%.
O parâmetro mais errático desse trabalho foi seguramente a
taquifilaxia – nenhum dos grupos mostrou resultados estatisticamente
satisfatórios (P<0,05; testes ‘t’ pareados). O grupo controle foi o único a
registrar certa regularidade no comportamento da curva média: pequenos
decréscimos nos valores pressóricos máximos a cada ciclo de infusão de
NOR, na segunda e na terceira curva – cerca de 4% de C1 a C2 e 3% de
C2 a C3 (tabela 12 e gráfico 12). O grupo tratado com L-arginina não
mostrou taquifilaxia – ao contrário, os valores máximos aumentaram com a
104
repetição das infusões. O grupo sob hipotermia mostrou um decréscimo de
cerca de 11% de C1 a C2 – caracterizando taquifilaxia –, mas nenhum
decréscimo de C2 a C3. No entanto, tais resultados também devem ser
vistos com reserva, pois, ficaram aquém do nível de confiança de 95%.
105
106
0 25 50 75 100 125 150
0
50
100
150
200
250
D-arginina
Controle
L-arginina
Tempo (min)
Pressão de Perfusão (mmHg)
*
*
*
**
**
**
** **
**
**
**
*
*
Gráfico 7. Pressões de perfusão em rim isolado de coelho a partir do grupo
controle e dos grupos tratados com L-arginina (1 µΜ) e D-arginina (1 µΜ).
Efeitos da NOR infundida por 20 min três vezes consecutivas, com
intervalos de 20 min para lavagem. Percebe-se que, no grupo tratado com a
forma 'L' do aminoácido (conhecido substrato para a síntese de NO), ocorre
uma lentificação da curva pressórica, bem como uma redução drástica na
pressão máxima atingida e no escape vascular nas três curvas - resultados
opostos àqueles obtidos com a forma 'D' do aminoácido, a qual pode servir
como falso substrato para a via do NO. *p<0.05; **p<0.01 (ANOVA teste de
Tukey)
Nota: estão representados as médias e os erros padrões das médias.
107
Tabela 8. Pressões basais de perfusão pela infusão contínua de GSH em
leito arteriolar de rins isolados de coelhos sob hipotermia (25
o
c) e tratados
com LNMA (10µM), L- nitro-arginina (10µM), D- arginina (1µM) e L- arginina
(1µM).
Pressões Basais (mmHg)
Controle
(n = 20)
Hipotermia
(n = 7)
LNMA
(n = 4)
L-Nitro-
arginina**
(n = 11)
D-arginina
(n = 6)
L-Arginina*
(n = 6)
62.88 + 2.29 70.85 + 2.98 70.58 + 4.00 87.42 + 7.12 82.00 + 4.23 56.44 + 3.97
* P < 0,05 em relação ao grupo L-nitro-arginina (ANOVA,Tukey's test)
** P < 0,001 em relação ao grupo controle (ANOVA,Tukey's test)
Nota
: estão representados as médias
(dos valores medidos em t
0
, t
5
e t
10
)
e os erros padrões
das médias.
108
Gráfico 8. Comparação entre as pressões basais do leito arteriolar de rins
isolados de coelhos quando submetidos a infusão de NOR. Utilizou-se um
sistema de perfusão aberto com solução de Krebs-Henseleit. Tanto o grupo
sob hipotermia (25
o
C) como os tratados com análogos da L-arginina
parecem apresentar pressões basais superiores às do grupo controle,
sendo que apenas o tratamento com L-nitro-arginina (10 µM) mostrou
resultados estatisticamente significativos em relação ao controle. O
tratamento com L-arginina (1 µM) parece reduzir as pressões basais.
*p<0.05 em relação ao grupo D-arginina **p<0.001 em relação ao grupo
controle
Nota: estão representados as médias
(dos valores medidos em t
0
, t
5
e t
10
)
e os
erros padrões das médias.
109
Tabela 9. Pressões máximas de perfusão pela infusão contínua de NOR em
leito arteriolar de rins isolados de coelhos sob hipotermia (25
o
c) e tratados
com LNMA (10µM), L- nitro-arginina (10µM), D- arginina (1µM) e L- arginina
(1µM).
Pressões Máximas
(mmHg)
Controle
(n = 20)
Hipotermia
(n = 7)
LNMA
(n = 4)
L-Nitro-
arginina
(n = 11)
D-arginina
(n = 6)
L-Arginina*
(n = 6)
152.25+10.02
180.42+12.28
219.00+10.34
191.09+14.75
191.33+3.21
80.66+3.67
* P < 0,05 em relação ao grupo L-nitro-arginina (ANOVA,Tukey's test)
** P < 0,001 em relação ao grupo controle (ANOVA,Tukey's test)
Nota:
estão representados as médias e os erros padrões das médias.
110
Gráfico 9 - Comparação entre as pressões máximas do leito arteriolar de
rins isolados de coelhos quando submetidos a infusão de NOR. Utilizou-se
um sistema de perfusão aberto com solução de Krebs-Henseleit. Tanto o
grupo sob hipotermia (25
o
C) como os tratados com LNMA (10 µM), L-nitro-
arginina (10 µM) e D-arginina (1 µM) apresentam pressões máximas mais
elevadas do que a do grupo controle. No entanto, o tratamento com L-
arginina (1 µM) reduz a pressão máxima consideravelmente. *p<0.05 em
relação ao grupo controle **p<0.01 em relação ao grupo controle e p<0.001
em relação ao grupo D-arginina
Nota: estão representados as médias e os erros padrões das médias.
111
Tabela 10. Escape vascular de leito arteriolar de rins isolados de coelhos
após infusão contínua de GSH, submetidos a hipotermia (25
o
C) e a
tratamento com LNMA (10µM), L-nitro-arginina (10µM), D-arginina (1µM) e
L-arginina (1µM).
Escape Vascular
(%)
Controle
(n = 20)
Hipotermia
(n = 7)
LNMA
(n = 4)
L-Nitro-
arginina
(n = 11)
D-arginina
(n = 6)
L-Arginina
(n = 6)
11,95+2,43 6,49+2,17 10,01+2,37 9,55+4,51 8,18+2,29 25,49+12,74
Notas
: estão representados as médias e os erros padrões das médias; nenhum grupo
atingiu significância estatística (ANOVA e teste ‘t’ não pareado).
112
Gráfico 10 - Comparação entre os escapes vasculares do leito arteriolar
renal de coelhos euglicêmicos, após infusão de NOR. Os rins foram
isolados e perfundidos em sistema aberto com solução de Krebs-Henseleit.
Os dados foram obtidos dos grupos controle, sob hipotermia (25
o
C) e
tratados com LNMA (10 µM), L-nitro-arginina (10 µM), D-arginina (1 µM) e
L-arginina (1 µM). O grupo submetido a hipotermia apresentou os escapes
mais baixos de todos, ao passo que o grupo da L-arginina apresentou os
valores mais elevados. Todavia, não se atingiu o nível estatístico de 95% de
confiança em qualquer dos grupos se comparados ao controle (ANOVA e
teste ‘t’ não pareado).
Nota: estão representados as médias e os erros padrões das médias.
113
Tabela 11. Incremento pressórico após infusão contínua de GSH em leito
arteriolar de rins isolados de coelhos e submetidos a hipotermia (25
o
C) e a
tratamento com LNMA (10µM), L- nitro-arginina (10µM), D-arginina (1µM) e L-
arginina (1µM).
Incremento Pressórico
(%)
Controle
(n = 20)
Hipotermia
(n = 7)
LNMA
(n = 4)
L-Nitro-
arginina
(n = 11)
D-arginina
(n = 6)
L-
Arginina***
(n = 6)
148.42+17.43 159.28+18.78 198.00+33.66 118.18+13.40 134.94+15.17 43.06+11.24
** P < 0,01 em relação ao grupo controle (ANOVA,Tukey's test)
Notas
: estão representados as médias e os erros padrões das médias.
114
Gráfico 11 - Comparação entre os incrementos pressóricos de rins isolados
de coelhos, perfundidos, em sistema aberto, com solução de Krebs-
Henseleit e após infusão de NOR. A hipotermia (25
o
C) e a adição de LNMA
(10µM) tendem a elevar o incremento, ao passo que os tratamentos com L-
nitro-arginina (10µM) e D-arginina (1µM) parecem reduzi-lo. Todavia, o
único resultado estatisticamente significativo em relação ao controle foi a
redução do incremento pressórico pelo tratamento com L-arginina (1µM).
Incremento Pressórico= (Pmax - Pbas).100/Pbas **p<0.01 em relação ao
grupo controle (ANOVA, teste de Tukey)
Nota: estão representados as médias e os erros padrões das médias.
115
Tabela 12. Pressões máximas após três infusões de GSH (curvas 1, 2 e 3, com
intervalos de 20 min entre cada uma) em leito arteriolar de rins isolados de
coelhos e submetidos a hipotermia (25
o
c) e a tratamento com LNMA (10µM), L-
nitro-arginina (10µM), D- arginina (1µM) e L- arginina (1µM).
Pressões Máximas
(mmHg)
durante 3 infusões de NOR
Controle
(n = 20)
Hipotermia
(n = 7)
LNMA
(n = 4)
L-Nitro-
arginina
(n = 11)
D-arginina
(n = 6)
L-Arginina
(n = 6)
152.25+10.02 180.42+12.28 219.00+10.34 191.09+14.75 191.33+3.21 80.66+3.67
146.85+9.19 159.28+7.00 224.00+2.94 199.18+10.06 184.33+8.50 82.83+5.38
142.10+7.56 159.00+11.93 216.75+6.75 198.72+7.98 189.33+5.97 88.66+3.25
Notas
: estão representados as médias e os erros padrões das médias; nenhum grupo
alcançou significância estatística (teste ‘t’ pareado).
116
Gráfico 12. Comparação entre as pressões máximas atingidas durante uma
sequência de três infusões de NOR (curvas 1, 2 e 3) em rins isolados de
coelhos, com o intuito de avaliar o fenômeno de taquifilaxia. Valores obtidos
dos grupos controle, sob hipotermia (25
o
C) e tratados com LNMA (10 µM),
L-nitro-arginina (10 µM), D-arginina (1 µM) e L-arginina (1 µM). Nenhum
deles alcançou diferenças significativas (p<0,05; testes 't' pareados). No
entanto, o grupo controle é o de resultados mais uniformes, registrando
pequenos decréscimos na segunda e na terceira curva
Nota: estão representados as médias e os erros padrões das médias.
117
5. DISCUSSÃO
Na discussão dos resultados anteriormente descritos,
analisaremos, basicamente, os efeitos (I) do diabetes, (II) da hipotermia e
(III) do bloqueio de NOS na reatividade vascular – relacionando os achados
do conjunto de experimentos realizados ao longo dos últimos anos com
aqueles que obtivemos em nosso trabalho.
5.1. Normoglicêmicos versus Diabéticos
Os resultados de nosso trabalho estão em consonância com os
de diversos autores (BRODY e DIXON, 1964; CSEUZ et al.,, 1973;
SZENTIVANYI e PÉK, 1973, e CHRISTLIEB, 1976). O diabetes aloxânico
intensificou a resposta adrenérgica do leito arteriolar renal dos coelhos. Em
1964, BRODY & DIXON mediram a pressão arterial no quadril de ratos e
também verificaram que os valores estavam elevados durante o diabetes
aloxânico. Da mesma forma, CSEUZ, et al., 1973, trabalhando com aortas
de ratos diabéticos, constataram uma exacerbação da resposta à NOR.
Estudos com seres humanos demonstraram igualmente um aumento na
resposta alfa-agonista do leito vascular conjuntival de pacientes diabéticos
(SZENTIVANYI & PÉK, 1973). Em 1979, COSTA e FORTI e FONTELES
realizaram um trabalho sobre a sensibilidade noradrenérgica em rins
118
isolados de coelhos com diabetes aloxânico. Todavia, ao contrário de
diversos outros autores, tais experimentos revelaram um decréscimo na
resposta noradrenérgica. Aventou-se a possibilidade de uma alteração na
conformação do α-receptor, hipótese que parece ser reforçada pelo trabalho
de CSEUZ, et al., 1973, no qual um β-bloqueador – o propranolol –
conseguiu bloquear o α-receptor. Outra possibilidade poderia ser a redução
na população de receptores ou alterações nos sítios do Ca
++
, especialmente
em pequenos vasos de resistência pré- e pós-capilares (FOLKOW, 1976).
Por outro lado, não se pode desconsiderar a hipótese de que a atenuação na
resposta adrenérgica, verificada por FONTELES & COSTA e FORTI no trabalho
supracitado, talvez represente um estágio precoce nas alterações patogênicas do
diabetes.
Em 1998, COSTA e FORTI e FONTELES voltaram a investigar o
relaxamento dependente de endotélio em rins de coelhos diabéticos. Houve
um decréscimo na resposta vasodilatadora à Ach (10
-7
M a 10
-5
M)
e à
bradicinina (10
-8
M a 10
-7
M), efeito esse revertido pela administração de um
doador de NO – o nitroprussiato de sódio (10
-8
M a 10
-7
M). Tais resultados
reforçam a tese de que, no diabetes, o prejuízo na vasodilatação está ligado
à resposta celular endotelial, o que acarretaria alterações no escape.
O corrente estudo revelou um prejuízo na capacidade de
relaxamento do leito arteriolar renal dos animais com diabetes aloxânico -
expresso por pressões basais e máximas aumentadas e escape reduzido,
119
em relação aos animais normoglicêmicos. Com efeito, uma exagerada
responsividade à NOR em leito arteriolar renal de coelhos diabéticos foi
constatada por BERETTA-PICCOLI & WEIDMANN, em 1981. BRODSKY, et
al. (2000), demonstraram que a exposição aguda de células endoteliais
humanas a glicose, a níveis detectados no plasma de pacientes diabéticos,
resulta em significativa deficiência na resposta a agonistas das eNOS
(bradicinina e A-23187). Ainda segundo o mesmo trabalho, a própria glicose
exerce efeito tipo “scavenging” sobre o NO, reduzindo sua concentração em
soluções puras de NO, às quais se acrescentou o carboidrato. Em conjunto,
tais achados indicam que a hiperglicemia promove a inativação química do
NO, conseqüentemente, contribuindo para a elevação dos níveis
pressóricos basais e máximos, sob ação da NOR, bem como uma reduzida
capacidade de escape.
Em nossa pesquisa, fizemos uma ampla revisão bibliográfica
sobre a glutationa (GSH) – um importante tripeptídeo endógeno que
desempenha uma variedade de importantes funções fisiológicas e
metabólicas nas células de todos os mamíferos, incluindo neutralização de
radicais livres (AKERBOOM, et al., 1984). No presente trabalho, a glutationa
foi utilizada para aferir a participação do estresse oxidativo na redução do
escape vascular do leito renal de coelhos diabéticos. A conjugação da GSH
serve para limitar e regular a reatividade de compostos eletrofílicos e
120
metais, além de facilitar seu transporte através da membrana celular, de
modo a eliminá-los do organismo. Ademais, em muitos casos, tais
conjugações resultam na formação de intermediários biológicos essenciais.
Por exemplo, a S-nitrosoglutationa, um intermediário relativamente estável,
resultante de uma reação não enzimática do NO com a GSH intracelular,
parece apresentar as mesmas funções biológicas do próprio NO
(IGNARRO, 1990). A glutationa é biossintetizada principalmente no fígado,
a partir de três aminoácidos precursores: L-glutamato, L-cisteína e glicina.
Todos os organismos aeróbios estão sujeitos ao estresse oxidativo, isto é,
os efeitos deletérios dos assim chamados compostos reativos de oxigênio,
como peróxido e peróxido de hidrogênio. No diabetes, esse estresse é
intensificado (OBROSOVA, et al., 2002). Trabalhando com ratos
espontaneamente hipertensivos (SHR), ABEYWARDENA e HEAD (2001)
fizeram interessantes achados: anéis de vasos sanguíneos tratados com L-
nitro-arginina exibiam resposta vasoconstritora à Ach, resposta essa que foi
parcialmente abolida pela adição de rutina. Todavia, a contração induzida
apenas pela L-nitro-arginina não foi abolida por esse antioxidante, sugerindo
diferentes mecanismos envolvidos na contração espontânea e naquela
induzida por Ach. Desse modo, o efeito do tratamento com rutina em leito
arteriolar renal de coelhos normoglicêmicos merece ser investigado no
futuro, sobretudo para justificar o incremento pressórico.
121
5.2. Efeitos da Hipotermia e do Bloqueio de NOS
Em alguns leitos vasculares, como as artérias sistêmicas e as
coronárias, a hipotermia progressiva – de 37
a 20
o
C - pode induzir
vasodilatação, possivelmente mediada por receptores muscarínicos
(PEARSON, et al., 1998). SPEZIALI, et al., 1993, trabalhando com artérias
cerebrais médias de cordeiros recém-nascidos, isoladas e perfundidas com
solução de Krebs e submetidas a hipotermia progressiva – de 37
a 21
o
C -,
observaram uma elevação na contratilidade dos vasos. Por outro lado, os
pré-tratamentos com um inibidor α-adrenérgico inespecífico – a fentolamina
(10
-5
M) –, um inibidor de NOS – L-NAME (10
-4
M) – e um inibidor de COX –
a indometacina (10
-5
M) – não afetaram a resposta contrátil à baixa
temperatura. Tais achados sugerem que as vias adrenérgica, do óxido
nítrico e das COX não desempenham papel importante na resposta
pressora induzida por hipotermia. Por outro lado, a maior contratilidade do
leito arteriolar renal, quando submetido a hipotermia (25
o
C), pode, pelo
menos em parte, dever-se à inibição de bombas transmembrana – hipótese
proposta por HOCHACHKA (1986) –, resultando em aumento dos níveis
intracelulares de cálcio e ativação de fosfolipases, as quais, por sua vez,
podem causar a rápida liberação das reservas internas desse íon. COSTA e
122
FORTI e FONTELES (1989) demonstraram uma correlação entre os níveis
intracelulares de cálcio e a taquifilaxia – um aumento na concentração
desse íon no perfusato foi suficiente para reverter a taquifilaxia, pelo menos
ao nível da segunda curva. No grupo sob hipotermia, só foi observada
taquifilaxia ao nível da terceira curva (tabela 12 e gráfico 12).
A via do NO está, sem sombra de dúvida, implicada na reatividade
vascular. Todavia, os mecanismos pelos quais a L-arginina aprimora a
função endotelial ainda não estão totalmente esclarecidos. Sabe-se que
esse aminoácido é um precursor do NO, facilitando a vasodilatação
endotélio-dependente em humanos e animais hipercolesterolêmicos, além
de reduzir ateromas em animais experimentais. LEKAKIS, et al. (2002),
administrando L-arginina a pacientes hipertensos, verificaram uma melhora
da vasodilatação mediada por fluxo na artéria braquial. Por outro lado, altas
doses, tanto de D-arginina quanto de L-arginina, causam hipotensão em
indivíduos normotensos, indicando que esse efeito pode não envolver a via
do NO (CALVER, et al., 1991). Em nosso estudo, os efeitos opostos da D-
arginina em relação à L-arginina, sugerem que os aminoácidos competem
em diversos pontos da via metabólica do NO – desde o sistema
transportador y+ até o sítio de ligação da eNOS –, contribuindo para a uma
síntese diminuída de NO, e, conseqüentemente, um prejuízo na capacidade
vasodilatadora do leito arteriolar arteriolar renal. No entanto, segundo
123
LEKAKIS, et al. (2002), há sérias razões para questionar a tese de que a L-
arginina sirva apenas como mero substrato para síntese de NO. Deveras,
em células cultivadas, a disparidade entre os altos níveis intracelulares de
L-arginina comparados ao KM para a eNOS (FOSTERMANN, et al., 1994)
sugere outros papéis para o aminoácido. ARNAL, et al., (1995) sugerem
que a L-arginina talvez favoreça a liberação de NO via reversão do efeito
inibitório da L-glutamina. Outro mecanismo seria a redução do estresse
oxidativo vascular (BOGER, et al., 1997 e 1998). Por sua vez, GIUGLIANO,
et al. (1997), demonstraram, em um estudo in vivo, que a infusão
endovenosa de L-arginina em seres humanos acentua a captação de
glicose mediada por insulina através do aumento do fluxo sanguíneo
periférica. Curiosamente, QUYYUMI (1998) verificou que a infusão
endovenosa de ambos os enantiômeros da arginina em pacientes com
doença aterosclerótica coronariana favoreceu a dilatação endotélio-
dependente em resposta à Ach. PEREZ, et al. (1998), também constataram
que L-arginina e D-arginina podem, a altas concentrações (100 µM), exercer
efeito semelhante - bloqueiam receptores histamínicos (H1) que medeiam a
contração da traquéia de cobaias. Todavia, é sabido que a L-arginina, mas
não a D-arginina, é capaz de reverter o efeito de inibidores de NOS sobre o
relaxamento da musculatura lisa vascular (MONCADA, et al., 1991). Em
nosso experimento, o tratamento com L-arginina produziu resultados
124
teoricamente esperados – redução das pressões basais e máximas, bem
como incremento do escape. O tratamento com D-arginina teve efeitos
opostos, confirmando o papel relevante do NO na capacidade de
relaxamento do leito arteriolar renal. Deveras, o uso do isômero não natural
da L-arginina resultou, no corrente trabalho, na exacerbação da resposta
pressora à NOR e prejuízo do escape vascular – o que pode ser
interpretado como resultado de uma inibição da via enzimática do NO, já
que essa tem especificidade pela L-arginina, não convertendo seu isômero
‘D’ em NO (MAHER, 2000). Nesse respeito, CRAEGER, et al, 1992,
constataram, que a L-arginina – mas não a D-arginina – é capaz de
melhorar a resposta vasodilatadora endotélio-dependente em humanos
hipercolesterolêmicos. Por outro lado, NAGASE, et al., 1997, propuseram,
uma rota não enzimática para a produção do NO, a partir de uma reação do
peróxido de hidrogênio tanto com L-arginina como D-arginina. Esse é um
campo que merece mais investigação no futuro.
125
6. CONCLUSÕES
O diabetes eleva os valores pressóricos tanto basais como
máximos no leito arterial de rins isolados de coelhos, infundidos com NOR,
além de reduzir o escape vascular. O tratamento dos rins isolados com GSH
reverte parcialmente esses efeitos. Por sua vez, o tratamento com rutina
eleva os valores pressóricos e também reverte parcialmente a queda no
escape.
O tratamento de rins isolados de coelhos normoglicêmicos
com L-arginina aumenta a capacidade de relaxamento do leito arteriolar,
ante a NOR, reduzindo a pressão máxima atingida e o incremento
pressórico relativo, além de mostrar uma tendência à elevação do escape
vascular. Por outro lado, o uso de análogos do aminoácido pode elevar
tanto a pressão basal como a máxima, embora não altere significativamente
o escape vascular.
A hipotermia (25
o
C) pode elevar a contratilidade vascular do
leito arteriolar renal, além de reduzir o escape vascular.
A taquifilaxia é um fenômeno perceptível ao se infundir NOR
repetidamente em rins isolados de coelhos, podendo ser afetado tanto pela
126
hipotermia quanto pelo estímulo ou bloqueio da via do NO. No entanto, tais
efeitos precisam ser melhor investigados no futuro.
127
7. PERSPECTIVAS
Em experimentos futuros, devemos incrementar alguns elementos
do protocolo de pesquisa em relação à Metodologia, tais como:
- Agrupar os animais por níveis glicêmicos;
-Tratar previamente os animais com L-arginina e seus análogos,
bem como com antioxidantes.
-Comparar rins íntegros e sem endotélio.
-Utilizar outros bloqueadores: ODQ, L-NAME, indometacina,
aminoguanidina etc.
-Induzir diabetes com STZ e acompanhar perfil glicêmico.
-Analisar o perfil lipídico.
-Tratar animais euglicêmicos com antioxidantes.
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